■第21回日本放射光学会奨励賞受賞研究報告
X 線自由電子レーザーによる溶液環境コヒーレント回折イメージング法の開発
木村隆志
1.

（北海道大学電子科学研究所）

はじめに生体試料や緩やかに結合したナノ構造などを，溶液環境下において自然な状態のまま観察することは，試料本来の構造を調べ，生物学や化学上の働きを理解する上で欠かすことができない。しかし従来， X 線顕微鏡や電子顕微鏡といった高空間分解能観察が可能な顕微イメージング手法
では，一般的に化学固定や凍結固定といった試料処理が必要であり，取得された試料像が本来の構造をどこまで保持されているかについて，常に細心の注意を払う必要があった。また， X 線や電子線といった高エネルギーの測定プローブによる構造損傷もこれまで回避することが困難な深Fig. 1

刻な問題であり，得られる試料像の実効的な空間分解能が(Color onlne) Schematic drawing of XFEL coherent diŠraction imaging experiment with Microliquid enclosure array.

大きく制限されてきた13)。
筆 者 ら は こ れ ま で ， X 線 自 由 電 子 レ ー ザ ー （ X rayFreeElectron Laser: XFEL）の特徴を利用した，新たな回折パターンから試料像を求めるための手法としては，X 線イメージング技術を開発することによって，放射線計算機上での反復的な位相回復計算によって試料像を再構損傷を回避しながら，溶液環境下における試料の10 nm に成するコヒーレント回折イメージング法810)を利用してい迫る高空間分解能での可視化に成功してきた。パルス状コる。コヒーレント回折イメージング法の利点は，試料像をヒーレント X 線溶液散乱法（ PulsedX ray得るために結像光学素子を利用しないため，加工技術の精CoherentSolution Scattering: PCXSS）と名付けて開発を行ってい度に依存しない高空間分解能なイメージングを実現できるる手法の概略を Fig. 1 に示す4) 。本手法の大きな特徴とし点にある。 XFEL とコヒーレント回折イメージングを組ては， XFEL のシングルパルスを用いたコヒーレント回み 合 せ た 例 と し て は ， ウ イ ル ス 粒 子11) や 金 属 ナ ノ 粒折イメージングを行う点と，真空中で溶液試料からコヒー子12) ，葉緑体13) の計測といった例が報告されている。しレント回折パターンを効率よく計測可能な独自開発の溶液

かし，コヒーレント回折イメージング法は，寄生散乱を抑試料ホルダを利用する点が挙げられる。

制するために試料を真空中に設置した状態で計測が行われ兵庫県播磨の XFEL 施設 SACLA（SPring8 Angstrom

るため，これまで試料周囲の環境が厳しく制約されてきCompact freeelectron LAser）から発振される X 線レーた。筆者らは，コヒーレント回折イメージング法を X 線

ザーはパルス幅が 10 フェムト秒以下と，クーロン爆発に自由電子レーザーによる溶液中試料の計測に適用するためよる放射線損傷が生じるとされる時間スケールよりも短に，マイクロ液体封入アレイと名付けた溶液試料ホルダのい5)。さらに SACLA のシングルパルスには1011 photons/開発，検証を行ってきた。本稿では，このマイクロ液体封pulse 程度の強度があるため，適切に集光された X 線を利入アレイと，それを用いての SACLA でのコヒーレント用することによって，数百 nm サイズ以下の試料からシン回折イメージング実験について紹介を行う。

グルパルスの照射でコヒーレント回折パターンを取得することが可能である。そのため， X 線レーザーのシングルパルスで計測されたコヒーレント回折パターンを解析する

2.

マイクロ液体封入アレイを利用した溶液試料の導入ことによって，放射線損傷前の試料構造を求めることが可

マイクロ液体封入アレイ外観の写真を Fig. 2(a)に示す。

能になる。こうした原理に基づく計測を“DiŠract before

個別の溶液セル内部では，二枚の窒化ケイ素薄膜の間に 2destruct （破壊の前の回折）”といい， SACLA や米国のmm 厚以下の溶液層を，真空から隔離して保持できるようLCLS（Linac Coherent Light Source）において，イメーになっている。 XFEL での実験では，集光したシングルジング実験のみならず結晶構造解析などへも応用がなされパルスの X 線レーザー照射によって，試料のみならず溶ている6,7)。

液セルの構造も同時に破壊されてしまうため，独立した

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(C) 2017 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research放射光ニュース ■ 第21回日本放射光学会奨励賞受賞研究報告

Fig. 2(Color onlne) (a) Microliquid enclosure array chip and(b) Xray exposure window. We enclosed fluorescently
stained bacteria to confirm that MLEA chips can keep live
bacteria during XFEL experiment.

500個以上の溶液セルを，12 mm サイズの 1 枚のシリコンチップ上に集積している。作製にはフォトリソグラフィやドライ・ウェットエッチングといった，一般的な半導体プロセス技術を利用している。これまで実験では主に 4.0～
5.5 keV の SACLA で利用可能な低光子エネルギーの領域を利用しているが，窒化ケイ素薄膜・溶液層を含めた全体の透過率として 9 割以上を確保している。
窒化ケイ素薄膜の X 線透過窓部は，およそ 20 mm × 20mm サイズの矩形の形状になっている。 Fig. 2 ( b)に，バクテリアを封入した X 線透過窓部の光学顕微鏡像を示す。

Fig. 3(Color onlne) (a) Coherent diŠraction pattern of a live M.
lacticum cell in saline solution, measured by singleshot illumination by a femtosecond XFEL pulse. (b) Reconstructed image of (a).

マイクロ液体封入アレイを真空中に一時間以上放置しても，内部の溶液環境は維持され，封入されたバクテリアも生存していることを確認している。溶液試料の封入は実験

グ用チャンバーである MAXIC（Multiple Application X

時にビームラインの側室でその場で行っており，周囲環境

ray Imaging Chamber)15)を利用しており，チャンバー内からのコンタミネーションを防ぐためにクリーンベンチを部に設置したマイクロ液体封入アレイ中の試料に対して，利用し， ISO クラス 1 程度の清浄な空間を確保した上で上流の全反射 X 線ミラー16)によっておよそ 1.5 mm に集光作業を行っている。

した XFEL を照射している。 MAXIC 中には二段のシリまたこの 20 mm 角の X 線透過窓部の形状は，試料上流コンブレード四象限スリットが設置されており，上述のからの寄生散乱を取り除くガードスリットの役割を効果的MLEA の矩形開口構造に加えて，上流光学系からの寄生に果たしている。コヒーレント回折イメージングでは，取散乱を除去するために使用している。コヒーレント回折パ得したコヒーレント回折パターンのノイズが，位相回復計

タ ー ン の 計 測 に は ， SACLA で 独 自 に 開 発 さ れ て い る算によって求められる試料像に直接影響を与えるため，寄MPCCD （ MultiPort ChargeCoupled Device )17) を利用し生散乱を低減できる本効果は極めて重要である。試料ホルて い る 。 MPCCD は タ ン デ ム に 配 置 し て お り ， 回 折 パ

ダ自身も寄生散乱の発生源になりうるが，二枚の窒化ケイターンの高角領域と低角領域を異なる配置で検出できるよ

素薄膜に囲まれた X 線照射部は，溶液層も含め平板状のうにしている。

構造をしているため，入射 X 線には一様な位相シフトは筆者らはまず，Microbacterium lacticum という乳製品中発生するものの，理想的には内部に存在する試料以外からに存在する微生細菌の XFEL イメージングを試みた4)。本の寄生散乱は生じない。 XFEL での結晶構造解析では液試料は細菌の中でもサブマイクロメートルと微小なサイズ

体ジェットによる試料導入も行われている14) が，円筒状を持つため，通常の光学顕微鏡による観察は困難であり細の形状をもつ液体ジェット自体からの強い寄生散乱が低角胞生物学的な知見はこれまでほとんど得られていなかっ散乱領域に生じるため，コヒーレント回折イメージング実た。本試料の研究に関しては，共和化工株式会社の環境微験用途に利用するのは現実には多くの困難が伴う。

生物学研究所の大島泰郎所長らと共同で行っている。生理食塩水中の M. lacticum に XFEL をシングルパルス照射

シングルパルス XFEL による溶液中試料コヒーレント回折イメージング

し，計測したコヒーレント回折パターンを Fig. 3 ( a )に示

筆者らは上記のマイクロ液体封入アレイを使用したコられるが，これは棒状の杆菌である M. lacticum の幅方向

ヒーレント回折イメージング実験を SACLA の BL3 を利の構造に起因するパターンであると推定される。干渉縞の用して行った。実験には，SACLA 供用の汎用イメージン縞間隔から，M. lacticum がおよそ194 nm の幅を持つこと

3.

す。回折パターンに斜めの一方向に強く伸びた干渉縞が見

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が導かれるが，この結果は電子顕微鏡で観察されている
M. lacticum の形状と良く一致している。またコヒーレン

ト回折パターンから，反復的な位相回復計算によって求められた再構成試料像を Fig. 3(b)に示す。再構成試料像は典型的な M. lacticum の形状サイズとよく一致すると共に，内部に一様でない高イメージ強度領域が観察されていることが分かる。コヒーレント回折イメージングでは， X 線散乱能の高い領域が高イメージ強度領域として再構成されるため，この構造は生体内で比較的高い電子密度を持つ分子である DNA が偏在する領域ではないかと推定される。
切片化された試料を透過型電子顕微鏡により観察した結果からも，内部に核様体と思われる同様の構造が存在することが確認されている。
また非生物試料への応用として，ドラッグデリバリーなどへの応用が検討されている金ナノ粒子の自己組織化集合体18)の計測も試みている。集合体は，直径15 nm と30 nmの二種類の金ナノ粒子表面に，グルコース末端を持つフッFig. 4

素化オリゴエチレングリコールのリガンドを修飾することによって，溶媒中で200 nm サイズに凝集して自己組織化(Color onlne) (a)Experimental coherent diŠraction patternof a selfassembly of a mixture of 15nm and 30nm gold
nanoparticles in watercontained dioxane solution. (b)Reconstructed image of the assembly.

したものである。一般的な電子顕微鏡では溶液中の集合体を観察することは困難であり，また試料を乾燥させて観察した場合には，乾燥過程で試料構造が変化する懸念があっ子複合体などのイメージングが実現可能になると考えていた。本試料の評価は，北海道大学電子科学研究所の居城邦る。

治教授，新倉謙一准教授らと共同で行っている。SACLA

またこの他，溶液中における観察が興味深い対象として，でシングルショット計測したコヒーレント回折パターンを試料の反応に伴うダイナミクスのその場計測に取り組むこ

Fig. 4(a)に，試料の再構成像を Fig. 4(b)に示す。位相回復とも考えている。 XFEL による計測では，上述したよう伝達関数19) による再構成像の空間分解能評価では 13 nmにシングルパルスの照射で試料が破壊されてしまうため，程度が示唆され，実際に再構成試料像中でも15 nm の金ナ

同一試料の時間発展を継続して観察を行うことは困難であノ粒子を個別に識別することが可能である。さらに再構成る。しかし何らかの刺激をトリガーとして試料の状態を同試料像では集合体の外側に 15 nm 金ナノ粒子，内側に 30期することができれば，擬似的に試料の時間発展を計測すnm 金ナノ粒子が偏在する様子がはっきりと捉えられておることが可能になる。筆者らは現在，光をトリガーとするり，二層構造の特殊な自己組織化を行っていることを溶液ポンプ・プローブ実験手法やマイクロ流路型の溶液試料ホ中で直接観察することに成功した。

ルダの開発にも取り組んでおり，例えば複数の溶液を混合した際に生じるナノ集合体構造の形成過程といった，より4.

おわりに

本稿では，マイクロ液体封入アレイを利用した XFEL興味深い対象をその場イメージングすることによって解明していきたいと考えている。

シングルパルスによるコヒーレント回折イメージング実験について紹介を行い，具体的な計測例として生理食塩水中

謝辞の生細菌と自己組織化ナノ粒子集合体の計測例を示した。

本稿で紹介させていただいた研究は，非常に多くの方々

本手法は，溶液中に存在する試料をそのまま高空間分解能との共同研究によって遂行されたものです。中でも北海道観察することが可能な手段として，他のイメージング手法大学の西野吉則教授，台湾中央研究院の別所義隆客座教にない優れた特徴を持っており，今後生物学や材料科学の授，高輝度光科学研究センターの城地保昌チームリーダー発展に大きく寄与していけるものと期待している。また現には，研究の立ち上げ当初から多大なご指導をいただきま

在さらなる高空間分解能化を目指して， XFEL の集光強したことを，ここに深く感謝いたします。また，実験を遂度をより高めることが可能な実験装置の開発を，理化学研

行す る上 で様々 にご助 言ご 助力を いただ いた SACLA /究所や高輝度光科学研究センターと共同で進めている。現

SPring 8 の関係者の方々，特に理化学研究所放射光科学

状試料サイズは主にサブナノメートルサイズのものを計測総合研究センターの石川哲也センター長，矢橋牧名グルーしているが，新装置を利用することによって数十 nm 程度

プディレクター，高輝度光科学研究センターの登野健介の試料を観察することが可能になり，将来的には生体超分チームリーダー，試料の作製・評価する上で共和化工株式

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会社環境微生物学研究所の大島泰郎所長，森屋利幸博士，北海道大学電子科学研究所の居城邦治教授，新倉謙一准教授をはじめとする多くの方々に心より御礼を申し上げます。本研究は JSPS 科学研究費補助金（ 16H05989 ）などの支援を受けて実施しています。

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● 著者紹介 ●木村隆志
北海道大学電子科学研究所 助教
E mail: Takashi.kimura ＠ es.hokudai.
ac.jp
専門X 線光学，X 線イメージング，超精密加工［略歴］
2011 年大阪大学大学院工学研究科博士後期課程修了，博士（工学）取得。同年
より北海道大学電子科学研究所コヒーレント光研究分野助教。

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