文部科学省科学研究費新学術領域「コンピューティクスによる物質デザイン：複合相関と非平衡ダイナミクス」
平成23年度第１回研究会
2011年10月7日

理論計算によるコイルドコイルを用いた銅蛋白質のデザイン
ー銅複核活性中心の理論設計ー
大阪大学蛋白研究所
鷹野 優

Outline
1. 研究計画
2. 銅蛋白質の活性中心の電子状態
2-1.酸素運搬蛋白質 ヘモシアニン
2-2. シトクロムc 酸化酵素のCuA部位

1. 研究計画

理論計算によるコイルドコイルを用いた機能性遷移金属蛋白質の演繹的デザイン
代表者	  	  鷹野 優 （大阪大学蛋白質研究所）	  	   	  研究の総括	  	   	  理論計算の実施	  連携研究者	  	  田中 俊樹 （名古屋工業大学大学院工学研究科）	  	   	  設計蛋白質の作成および検証	  	  研究協力者	  	  重田 育照 （大阪大学大学院基礎工学研究科）	  	  	  分子力場の開発	  	  	  理論計算手法に関するアドバイス	  	  喜多 真琴・奥山 折緒 （大阪大学蛋白質研究所）	  	  	  理論計算の補佐	  	人工蛋白質の設計
人工蛋白質	
オーダーメードで新規機能性物質を作る
蛋白質の機能発現に何が必要かを分子レベルで理解How?	

金属蛋白質の活性中心の量子化学計算	
heme	  a	  in	  CcO	  Takano	  and	  Nakamura,	  	  J.	  Comput.	  Chem.	  2010,	  31,	  954.	  	

SP+	  in	  Reac/on	  center	  Yamasaki,	  Takano,	  and	  Nakamura,	  	  J.	  Phys.	  Chem.	  B	  2008,	  112,	  13923.	

Enhanced	  charge	  transfer	  SP without Protein
SP with Protein
Experiment

Enhanced	  electronic	  asymmetry	  蛋白質の機能発現では、活性中心が固有に持つ性質を蛋白質環境が強め、制御している

研究方針	

コイルドコイル	
繊維状蛋白質の基本構造	

Leu	
Val	
Leu	
Asn	Leu	Val	d	 d	a	 a	d	 d	

Leu	

ROP蛋白質(PDB ID: 1ROP)	 疎水相互作用による安定化	Branden	  and	  Tooze	  「タンパク質の構造入門」第2版	  Val	
Leu	a	 a	Asn	d	 d	Leu	a	 a	d	αへリックス同士がまきついた超らせん構造
7残基反復

Leu	d	Val	Leu	

人工銅蛋白質の例 ‒ブルー銅‒d	a	d	a	d	a	d	a	

Shiga	  et	  al.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2010,	  132,	  18191.	  研究対象
複核（二核）銅蛋白質
Cys	 Met	

シトクロムc酸化酵素のCuA部位
電子移動

ヘモシアニン

His	

His	

Glu	

Cys	

His	

His	

His	

S	
Cu	
S	

His	

酸素運搬O	
Cu	

Cu	
O	

His	

Cu	

His	

平成23年度研究方針	

2. 銅蛋白質の活性中心	

2-1. シトクロムc 酸化酵素のCuA部位	

What is CuA?	
Cyt cCuA
CuAe–	  CuBHeme aHeme a3

O2	  H2O	  catalyGc	  site	  bovine	  cytochrome	  c	  oxidase	  (PDB	  ID:	  1V54)	

O2	  +	  4	  Cytc2+	  +	  8H+in	  	  H+	  2H2O	  +	  4Cytc3+	  +	  4H+out	  CcO	  is	  a	  terminal	  redox-­‐driven	  proton	  pump	  in	  the	  cell	  respiratory	  chain.	  	  Reducing	  of	  dioxygen	  to	  water	   	  	  Proton	  transloca/on	  across	  the	  membrane	  The	  CuA	  site	  funcGons	  as	  an	  electron	  mediator	  between	  cytochrome	  c	  and	  heme	  a.	  Molecular structure of CuA	Cys 196
Cyt cCuA
CuA

Met 207e–	  CuBHeme aHeme a3

O2	  His 204
Cu	

H2O	  catalyGc	  site	  S	Cu	S	

Glu 198
oxidized state:

CuII‒CuI

reduced state:

CuI‒CuI 	CuI‒CuIIHis 161
Cys 200

Geometrical variety ofthe Cu2S2 core of the CuA siteS	

4.3

S−S	  /	  Å	  	4.2

Cu	

Cu	

4.1

S	4
3.9
3.8
3.7
2.3

2.35

2.4

2.45

2.5

Cu–Cu	  /	  Å	  	2.55

2.6

A great variety of the molecular structure!	

2.65

Spectroscopic studies
σu*	σg	Cu–Cu	  	  Cu–S	  	  interacGon	 interacGon	

Keeping CuA delocalized even in the low-symmetry protein environment
Stable electronic structure!	
Solomon,	  Xie,	  and	  Dey	  Chem.	  Soc.	  Rev.	  2008,	  37,	  623.	  Question	
What are required to make the characteristic σu* groundstate of the CuA site?
(variable	  molecular	  structure	  and	  stable	  electronic	  structure)	

Can we design electronic structures of metal cofactors?

Investigation of the electronic structure ofthe Cu2S2 core of the CuA siteGround	  state	  of	  the	  Cu2S2	  core?	  
Molecular	  structure	  	  CoordinaGng	  ligands	  	  CoordinaGng	  point	  charges	  ?	  

Electronic	  structure	  Electronic structure calculation	
C2S2	  core	
1V54B	  model	

1V54O	  model	

S	 S	 Cu	 Cu	 S	 Cu	 Cu	 S	 Method	  	  Density	  func/onal	  theory	  	  	  M06	  Basis	  sets	  Cu–Cu: 	  2.51	  Å	  S–S:	  	  3.77	  Å	  	  	  	Cu–Cu: 	  2.37	  Å	  S–S:	  	  3.87	  Å	  	  	  		  Cu:	  wachters	  +	  f	  	  others:	  6-­‐311++G(df,pd)	

Ground state of the Cu2S2 core	
σu*	  orbital	

πu	  orbital	πu	  orbital	

σu*	  orbital	
σu*	  state	πu	  state	∆E(σu*-­‐πu)	  =	  0.486	  eV	  	The πu state is the ground state of the Cu2S2 core.	

Orbital diagram of the Cu2S2
core in the πu state	
πu	
σu*	
dσ*	

πg*	
pσ*	

dπ*	
dδ*	
dδ	dπ	・	  ・	  ・	  ・	  ・	

dσ	σg	pπ*	pπ	pσ	

Ligand coordinating eﬀect	point	  charge	  model	  (q	  =	  –1.6	  to	  +0.2)	

S	 2.0	  Å	  	q	Cu	 point	  	  charge	

2.0	  Å	  	Cu	 q	point	  	  S	 charge	Method	  	  Density	  func/onal	  theory	  	   	  M06	  	  S	 2.0	  Å	  	2.0	  Å	  	q	q	Cu	 Cu	 point	  	  point	  	  charge	charge	
S	 Basis	  sets	  	  Cu:	  wachters	  +	  f	  	  others:	  6-­‐311++G(df,pd)	

Energy diﬀerence of σu*	  and	  πu	  states of the point charge model	
∆E	  =	  E(σu*)	  –	  E(πu)	
10.6u!E(" *-# ) / eV

0.8

1V54B
1V54O

u

0.4
0.2
0-0.2
-1.6

-1.2

-0.8
-0.4
Charge0NegaGve	  charges	  (e.g.	  lone	  pair)	  can	  make	  the	  σu*	  state	  more	  stable	  than	  the	  πu	  state.	  	  	The ground state changes.

When negative charges wereadded	
σu*	
dσ*	
dσ*	dπ*	dπ*	dδ*	dδ	dδ*	dπ	dπ	dδ	dσ	dσ	
Nega/ve	  charges	  were	  added.	

Stability	  changes	  ?	

πu	pσ*	pπ*	
pπ	pσ	

Ligand coordinating eﬀect 2	
Cys 196

Cys 196

Met 207

Met 207
His 204

His 204

Glu 198

Cys 200

His 161

ligand	  model	

Method	  	  Density	  func/onal	  theory	  	   	  M06	  	  Glu 198

Cys 200

His 161

ligand	  point	  charge	  (pc)	  model	

Basis	  sets	  	  Cu:	  wachters	  +	  f	  	  others:	  6-­‐311++G(df,pd)	  	  Total:	  1188	  func/ons	Energy diﬀerence of σu*	  and	  πu	  states of the ligand model	
core	ligand	  pc	ligand	

1V54B	

0.705	

0.390	

–0.197	

1V54O	

0.486	

0.198	

–0.337	

∆E	  =	  E(σu*)	  –	  E(πu)	

ElectrostaGc	  interacGons	  of	  His	  (q	  =	  –0.56)	  were	  not	  enough	  to	  	  stabilize	  the	  σu*	  state	  rather	  than	  πu	  state.	  	
CombinaGon	  of	  orbital	  and	  electrostaGc	  interacGons	  make	  	  the	  σu*	  state	  the	  ground	  state.	

(eV)	

Orbital interaction	
σu*	
dσ*	
dσ*	
dπ*	

dπ*	

dδ*	
dδ	dδ*	dπ	dπ	dδ	Stability	  changes	  ?	

πu	pσ*	pπ*	
pπ	pσ	dσ	dσ	
an/bonding	  orbital	  interac/on	  between	  dσ*	  orbital	  of	  the	  Cu–Cu	  dimer	  and	  lone	  pair	  of	  the	  Nε	  atoms	  of	  the	  coordina/ng	  His.	

まとめ1	
1.

Even at the Cu‒Cu distance of the CuA site (2.3 Å‒ 2.6 Å),
the DFT calculations of the simple model give the πu ground state.
Antibonding interactions with the thiolate bridges

2.

Upon the shrink of the Cu‒Cu distance,the σu* state becomes close to the πu state in energy.
Stronger Cu‒Cu orbital interactions and weaker S‒S orbital interactions

3.

Addition of negative charges changes the ground state from the πu state tothe σu* state.
Electrostatic repulsion between negative charges and the dσ* orbitals.

4.

Combination of orbital and electrostatic interactions of ligands makes theσu* state the ground state.
Antibonding orbital interaction between dσ* orbital of the Cu‒Cu dimerand lone pair of the Ne atoms of the coordinating His.

2-2. 酸素運搬蛋白質
ヘモシアニンの活性中心

ヘモシアニン	
His204

His364

His173
Cu Cu

His324

His328カブトガニ	  ヘモシアニン	  His177

acGve	  site	  Hc	  is	  an	  oxygen	  transport	  protein	  found	  in	  arthropods	  and	  mollusks.	  
The	  acGve	  site	  contains	  a	  pair	  of	  copper	  atom,	  each	  of	  which	  is	  coordinated	  to	  three	  hisGdine	  residues.	  ●	  Reversible	  oxygen	  binding	  Oxygenated	  state	  Deoxygenated	  state	  目的	

Understanding the ligand coordination effects
in the reversible oxygen binding to Hc!

Natural orbital analysis
Binding energy

Density	  Func/onal	  Theory	  モデル	●	   Anmmonia	  (NH3)	  model	  ●	  Methylimidazole	  (MeIm)	  model	  OxyNH3	  +	  O2	  OxyMeIm	  +	  O2	  ●	  Synthe/c	  model	  (HB(3,5-­‐i-­‐Pr2pz3)	  Cu

OC

N

H

[Cu(L)]2O2 L = HB(3,5-i-Pr2pz3)

BOrbital interaction
LUMO(S)	

dxy+dxy	
SOMO +1

dxy–dxy	

SOMO+1	  (A)	SOMO-­‐1	  (S)	HOMO(A)	

SOMO–1SOMO +1

UBHandHLYP	  Cu:	  MIDI+d	  	  O,	  N,	  C:	  6-­‐31G(d),	  H:	  6-­‐31G	  軌道エネルギー	
E(a.u.)–0.93

OxyNH3!
"

OxyMeIm!
"Cu(L2)!
"!

O2

#v$

–10.9
–11.3
–12.3
–13.7
–14.6
–15.8

#v$
#h$

"
#h$

irreversible
binding(45.22kcal/mol)no binding(4.64kcal/mol)reversible
binding(13.75kcal/mol)

dxy+dxy
dxy–dxy

Ligands	  changes	  the	  orbital	  energy	  of	  the	  acGve	  orbitals	  (dxy+dxy	  and	  dxy–dxy)	  of	  the	  copper	  core.	  
The	  orbital	  interacGon	  between	  the	  acGve	  orbitals	  of	  the	  copper	  core	  and	  LUMO	  of	  oxygen	  molecule	  determines	  the	  strength	  of	  dioxygen	  binding.	  
UBHandHLYP	  Cu:	  MIDI+d	  	  O,	  N,	  C:	  6-­‐31G(d),	  H:	  6-­‐31G	  まとめ2	Binding	  energy	  	  NH3 	   	   	   	   	  4.6	  kcal/mol	  	  methylimidazole 	  13.8	  kcal/mol	  	  HB(3,5-­‐i-­‐Pr2pz3) 	  45.2	  kcal/mol	  Ligands	  coordinated	  to	  the	  copper	  core	  inﬂuence	  the	  oxygen	  binding	  process.	  
Ligands	  inﬂuence	  the	  orbital	  energies	  of	  the	  ac/ve	  orbital	  of	  the	  copper	  core	  (dxy+dxy	  and	  dxy–dxy),	  providing	  the	  strength	  of	  the	  orbital	  interac/on	  of	  the	  ac/ve	  site	  and	  oxygen	  molecule.