平成29年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 36

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成⑶ 食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査に優れた業績が認められる研究者の表
彰⑷

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報（事業実績）
年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,80069
66,00071
69,00074
75,000© The Ito Foundation

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で37年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第36回（平成29年度）助成事業における74件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告とともに，第３回となります伊藤記念財団賞授賞事業の授賞者とその業績概要と学会等事業助成の概要をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
平成30年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.36 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2018
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

研究助成事業目

次

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌効果とメカニズム解析
章一１・山城作道

梨沙１・三沢達也２（１琉球大学医学部保健学科生体代謝学分野，


佐賀大学大学院工学系研究科電気電子工学専攻）

3

本

8

２

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明田和久（神戸大学大学院農学研究科）

市販食肉より分離されたリステリアのストレス応答に関する研究


落合

由嗣・吉川

悠子（日本獣医生命科学大学）

13

潤（慶應義塾大学理工学部機械工学科）

19

食品加工機器の信頼性と安全性向上のための基礎的研究

小茂鳥

食肉の高品位熟成に寄与する可食性蓄熱マイクロカプセルの開発小林敬（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻）

24

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅲ）


根

岸

晴

夫（中部大学応用生物学部）

31

オリーブ葉抽出液が食肉タンパク質の加熱ゲル物性および嗜好性に及ぼす影響小川雅廣・Agus Bahar Rachman・赤澤

隆志（香川大学農学部応用生物科学科）

37

食肉加工品のコク味増強を可能とするグルタチオンアナログの発酵生産法の開発


伊

藤

智

和（名古屋大学大学院生命農学研究科）

46

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変（Ⅱ）


滝

田

禎

亮（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻）

51

ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割


西

村

敏

英（女子栄養大学栄養学部）

59

原聡（宮崎大学農学部）

68

ドライエイジング牛肉に特徴的な香気成分に関する研究河

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価（Ⅱ）
山之上
市村


稔１・趙

さやか２・吉田婭楠１・中田悠介１・上田由香２・羽原

正秋３・池崎

修司１・秀和３（１神戸大学大学院農学研究科，２食肉科学技術研究所，３株式会社INSENT）© The Ito Foundation74

ii
食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅱ）
市村

さやか・高橋吉田

真佐郎・中村

由香・猪口

幸信・
昭仁＊

由美・服部

（一般社団法人食肉科学技術研究所，＊北海道大学）

80

霜降り豚肉の香味に寄与する因子に関する研究
松石


昌典・小林

優多郎

（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

89

加熱肉に生じる赤色に対するカルノシンの影響
中村

幸信・江田

芳崇・吉田



由香・猪口

由美

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

97

牛心臓由来新規脂質代謝改善ジペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究長岡利（岐阜大学応用生物科学部）

104

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究


若

松

純

一（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）107

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン摂取の有用性
後藤（大分大学医学部

孔郎・正木

孝幸・柴田

洋孝

内分泌代謝・膠原病・腎臓内科学講座）

113

野生動物肉の食料資源としての利用に関する研究：生理活性機能の検討
坂田


亮一・竹田

志郎・時田

昇臣＊

（麻布大学獣医学部，＊日本獣医生命科学大学動物科学科）

118

機能性畜産副生成物を用いた糖尿病合併高血圧症の改善を目指した開発研究
吉川


豊・糸井

亜弥

（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

123

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析


河

合

慶

親（徳島大学大学院医歯薬学研究部）

129

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究
林

利哉・長澤



麻央・芳賀

聖一・小川

幸彦＊

（名城大学農学部，＊名城大学農学部附属農場）

135

本

140

牛経済形質に関わる新規 DNA 多型の探索松大和（東海大学農学部応用動物科学科）

リキッドバイオプシーによる非侵襲的牛体外受精胚の遺伝子スクリーニング


杉

村

智

史（東京農工大学大学院グローバルイノベーション研究院）

146

肉用鶏の筋芽細胞を用いた食肉の特性評価に資する遺伝子の探索


高谷

智英・鏡味

© The Ito Foundation

裕（信州大学農学部）

149

iii
県集団における和牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効果検証


笹

﨑

晋

史（神戸大学大学院農学研究科）

155

谷

162

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索青大希（秋田県畜産試験場）

黒毛和種肥育牛の肥育状態を生体評価する血中バイオマーカーの開発


松

橋

珠

子（近畿大学先端技術総合研究所）

166

弘・髙橋

秀之（九州大学大学院農学研究院）

172

選抜した黒毛和牛精子の受精能評価
飯田

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能評価栁川

洋二郎・永野昌志（北海道大学大学院獣医学院）

178

長期不受胎牛の受胎率向上に向けた単為発生胚移植の効果
白砂


孔明・岩田

尚孝・濱野

晴三＊・柳沼日佳里＊（東京農業大学農学部畜産学科，＊家畜改良事業団家畜バイテクセンター）

183

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明
武田久美子・西野景知＊・今井昭＊＊（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，

 茨城県畜産研究センター肉用牛研究所，＊＊広島県立総合技術研究所畜産技術センター）＊

190

肥育前雌牛における卵子の能力不足を解消する培養技術の開発
平尾


雄二・武田

久美子・的場理子（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

198

近赤外光照射による牛凍結胚の品質改善効果に関する研究


横尾

正樹・佐藤

勝祥（秋田県立大学生物資源科学部）

204

胚ゲノム活性化および胚盤胞形成時期における新規代謝プロセスに基づく牛体外受精胚の体外培養法の改善


山

田

雅

保（京都大学農学研究科）

209「豚の一腹産子数を一頭増やす」子宮の免疫調節を担う精漿タンパクの特定奥山

みなみ（大分大学医学部医学科）

214

牛精液および受精卵の未凍結保存に向けた過冷却促進物質の配合デザイン


星

野

由

美（広島大学大学院生物圏科学研究科）

221

アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響（Ⅱ）
小林

仁（宮城大学食産業学群）

226

乳牛の卵胞嚢腫における副腎由来ホルモンの関与と卵胞嚢腫共存卵胞由来の卵母細胞の正常性清水隆（帯広畜産大学生命・食料科学研究部門）© The Ito Foundation

230

iv
子宮内膜炎罹患牛における特異的脂質メディエーターの同定と新規高感度診断法の開発
大澤

幸久＊・北原健司・村田豪（宮崎大学農学部獣医学科産業動物臨床繁殖学研究室，

＊

東京大学大学院農学生命科学研究科放射線動物科学研究室）

236

新規 DNA メチル化網羅探索法を用いた牛の精液性状の評価法開発


山崎

淳平・永野

昌志（北海道大学大学院獣医学研究院）

243

牛肉の生産性向上に資する安全なマダニ・マダニ媒介感染症防除法の開発


八田

岳士・坪川

大悟（北里大学医学部）

249

昌宏（宮崎大学農学部獣医解剖学研究室）

254

牛胸腺器官培養法の確立


脇谷

晶一・保田

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明と診断法の確立


山

下

泰

尚（県立広島大学生命環境学部）

259

鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルス耐性機構の解明：感染細胞における初期応答の
品種間比較
松


鵜

彩

（鹿児島大学共同獣医学部附属越境性動物疾病制御研究センター）

265

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析


小

野

久

弥（北里大学獣医学部）

271

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析
黒木

香澄・竹下

奈知子・吾郷

孝康＊・関崎良輔・渡辺勉（東京大学大学院農学生命科学研究科食の安全研究センター，
＊

現所属：日本大学歯学部基礎自然科学分野（化学））278

野生動物が保菌する腸管出血性大腸菌の特徴解析とリスク評価井口純（宮崎大学農学部）

285

農場で発生する腸炎にカラス由来のウエルシュ菌はどのように関与しているか？
―MLST 法による遺伝学的解析での検討―


上

塚

浩

司（茨城大学農学部）

291

肺エコーとプロカルシトニン値を用いた牛の非定型肺炎と細菌性肺炎の簡易迅速鑑別診断システム


鈴

木

一

由（酪農学園大学獣医学群）

300

鼻咽腔における PRRS および豚インフルエンザウイルス感染症の病態解析


平

井

卓

哉（宮崎大学農学部）

305

真（鹿児島大学共同獣医学部）

310

感染性Ａ型インフルエンザウイルスの迅速検出系の確立
小澤

肉用牛生産におけるアシドーシス予防をめざしたルーメン内乳酸代謝性細菌群の特定

福© The Ito Foundation

間直希（帯広畜産大学）

317

v
食肉家畜における原虫感染症の血清診断法の開発と血清疫学的研究
西川

義文・正谷

達謄＊

（帯広畜産大学原虫病研究センター，＊鹿児島大学共同獣医学部）

322

心臓あるいは横隔膜を用いたオーエスキー病ウイルス抗体検査法の確立前田健（山口大学共同獣医学部）

328

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索―より効果的なワクチン接種部位を求めて―
市居

修・中村

鉄平・小千田

圭吾・山下



祐輔・池田

哲平

（北海道大学大学院獣医学研究院）

332

畜産分野における抗菌剤使用量削減に有効な手段の探索に関する研究（Ⅱ）―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティ水準および適正飼養因子との関連―
杉浦


勝明・松田

真理・礒村

れん

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

337

初乳に含まれる抗菌因子の機能を利用した子牛の下痢症予防


磯

部

直

樹（広島大学大学院生物圏科学研究科）

344

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御
佐藤

繁・櫛引

史郎＊

 （岩手大学農学部共同獣医学科，＊農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究部門）

350

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響


高田

良三・香川

龍太郎・立原可南子（新潟大学農学部）

356

瞳（信州大学農学部）

362

黒毛和種仔牛の免疫能を高める機能性飼料の探索


米倉

真一・時田

産褥牛に起きる急性肝ストレス亢進と肝ビタミンＥ体内動態関連遺伝子発現抑制に対するRhizopus oryzae 水抽出物給与の予防効果に関する研究
芳賀

聡１・石崎

宏１・狩野

友佳２・鈴木武人２（
 １国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，２麻布大学獣医学部）

366

Lactococcus 属乳酸菌を用いて調製した発酵乳給与が離乳子豚の飼料摂取量および増体成績を改善する要因の解明
守谷


直子・兼松

伸枝・成田

卓美・木元

広実

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

372

ビタミンＡ強化代用乳が黒毛和種子牛の哺育・育成期における生育へ及ぼす影響


小

野

晴

美（福岡県農林業総合試験場）

378

子牛の強健性と発育能力を高める初期栄養強化プログラムの開発


松

崎

正

敏（弘前大学農学生命科学部）

384

骨格筋の成長と筋線維型決定におけるストレス応答ホルモンの影響


佐

藤

勝

祥（秋田県立大学生物資源科学部）© The Ito Foundation

389

vi
亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発


神

戸

大

朋（京都大学大学院生命科学研究科）

394

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発（Ⅱ）
石

垣

元

気１・荒

井

昌

和２・福

山

喜

一１

（１宮崎大学農学部附属フィールド科学教育研究センター住吉フィールド，

２

宮崎大学工学部）

400

乳牛における高糖分イネ WCS（ホールクロップサイレージ）多給による高繁殖型飼養管理システムの確立山口

昇一郎・浅岡

壮平・馬場

武志・川島

千帆＊

（福岡県農林業総合試験場，＊帯広畜産大学フィールド科学センター）406

ルーメンアシドーシス防除を目指した新規ルーメン幹細胞培養モデルの開発鈴木裕（北海道大学大学院農学研究院）

411

司

418

哺乳子牛の下痢を低減する発酵代用乳の開発
庄則章（山形県立農林大学校）

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ保因牛における病態解析猪熊壽（帯広畜産大学畜産学部）

425

飼養環境下の牛群における新規「カビ毒（マイコトキシン）防除法」の検証―飼料へのフラクトオリゴ糖添加が牛消化管バリア機能に与える臨床的評価
髙木

光博・宇野

誠一＊

（山口大学共同獣医学部，＊鹿児島大学水産学部）

430

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の抑制と機能性家畜飼料への応用



木下

英樹・原口

梨花・山中

猛・服部

法文・

神鷹

孝至・實田

正博・本田

憲昭・森川

充実・

金子

博・中野

佑志・浦部

一浩・石田

光晴＊

（東海大学農学部，＊宮城大学食産業学群）© The Ito Foundation

435

vii

CONTENTS
Disinfection of drug-resistant bacteria by gas plasma and analysis of the mechanisms
Akikazu Sakudo1, Risa Yamashiro1 and Tatsuya Misawa2（1Laboratory of Biometabolic Chemistry, School of Health Sciences, University of the Ryukyus,
Department of Electrical and Electronic Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Saga

2

University） 

3

Identification of the main factor determining the taste of Jidori meat
Kazuhisa Honda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University） 

8Studies on stress response of Listeria monocytogenes isolated from retail meats
Yoshitsugu Ochiai and Yuko Yoshikawa（Nippon Veterinary and Life Science University） 

13Basic study on improvement of food processing machine
Jun Komotori（Department of Mechanical Engineering, Faculty of Science and Technology, Keio University） 

19

Preparation of edible thermal storage capsule for the high-quality aging of meat
Takashi Kobayashi（Division of Food Science and Bitechnology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University） 

24

Study on processing technology and characteristics of fermented meat products produced using
lactic acid bacteria cultures for dairy products（Ⅲ）
Haruo Negishi（College of Bioscience and Biotechnology, Chubu University） 

31

Effects of olive leaf extracts on rheological properties and hedonic aspects of meat protein gel
Masahiro Ogawa, Agus Bahar Rachman and Takashi Akazawa（Department of Applied Biological Science, Faculty of Agriculture, Kagawa University） 

37

Development of a fermentative production method of glutathione analogs
Tomokazu Ito（Department of Applied Molecular Biosciences, Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya
University） 

46

Modification of substrate specificity of microbial transglutaminase by protein engineering（Ⅱ）
Teisuke Takita（Kyoto University, Graduate School of Agriculture, Division of Food Science and Biotechnology） © The Ito Foundation

51

viii
Contribution of aroma compounds and lipids to “koku attributes” of pork sausages
Toshihide Nishimura（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University） 

59

Study on flavor components of dry-aged beef
Satoshi Kawahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

68Intramuscular free fatty acids related to deliciousness of Japanese Black Wagyu beef and its
taste-traits analyzed by an electronic taste sensing system, Part Ⅱ
Minoru Yamanoue1, Yanan Zhao1, Yusuke Nakada1, Shuji Ueda1, Sayaka Ichimura2,
Yuka Yoshida2, Masaaki Habara3 and Hidekazu Ikezaki3（1Graduate School of Agricultural Science, Kobe University, 2Japan Meat Science and Technology
Institute, 3INSENT, Inc.） 74Effect of hypoxanthine on the improvement of taste during postmortem aging of meat (II）Sayaka Ichimura, Masao Takahashi, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida, Yumi Inoguchi andAkihito Hattori＊（Japan Meat Science and Technology Institute，＊Hokkaido University） 

80Studies on factors contributing to taste and aroma of marbled pork
Masanori Matsuishi and Yutaro Kobayashi（School of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life
Science University） 89

Effect of carnosine on the red color arising in cooked meat
Yukinobu Nakamura, Yoshitaka Eda, Yuka Yoshida and Yumi Inoguchi（Japan Meat Science and Technology Institute） 

97

Basic study of the development of an innovative hypocholesterolemic food materials using anovel hypocholesterolemic dipeptide derived from cattle heart peptide
Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University） 

104

Dietary effect of meat protein on anti-obesity and lipid metabolism
Jun-ichi Wakamatsu（Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University） 

107

Efficacy of carnosine intake on the prevention of sarcopenia related with obesity
Koro Gotoh, Takayuki Masaki and Hirotaka Shibata（Department of Endocrinology, Metabolism, Rheumatology, and Nephrology, Faculty of Medicine, Oita
University） 

113© The Ito Foundation

ix
Study on game meat utilization as a food stuff ; Assessment of the physiological activity of thisfood stuff
Ryoichi Sakata, Shiro Takeda and Norio Tokita＊（School of Veterinary Medicine, Azabu University, ＊Department of Animal Science, Nippon Veterinary
and Life Science University） 

118

Improvement effect of natural component derived from animal product on the blood pressure in
fructose-induced hypertension rats with diabetes mellitus
Yutaka Yoshikawa and Aya Itoi
（Department of Health, Sports and Nutritions, Kobe Women’s University）

123

Effects of nucleic acids from meat and other foods on the functions of intestinal cells
Yoshichika Kawai（Graduate School of Biomedical Sciences, Tokushima University） 

129

Retort processing and cold lactic acid fermentation induce protein degradation and functional
peptides derivation in myofibrillar protein system
Toshiya Hayashi, Mao Nagasawa, Seiichi Haga and Yukihiko Ogawa＊（Faculty of Agriculture, Meijo University, ＊Experimental Farm, Meijo University） 

135

Novel gene polymorphisms identification related to cattle economic traits
Hirokazu Matsumoto（Department of Animal Science, School of Agriculture, Tokai University） 

140

Non-invisible genetic screening of in vitro fertilized bovine embryos by liquid biopsy
Satoshi Sugimura（Institure of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology） 

146

Exploration of the genes to assess meat characteristics using skeletal muscle myoblasts frommeat-type chickens
Tomohide Takaya and Hiroshi Kagami（Faculty of Agriculture, Shinshu University） 

149

Investigation on the effect of genetic markers on beef quality in prefectural populations ofJapanese Black cattle
Shinji Sasazaki（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University） 

155

The search for genetic polymorphisms involved in behavioral stress response in slow-growing
meat type chickens
Daiki Aoya
（Akita Prefectural Livestock Experiment Station） © The Ito Foundation

162

x
Identification of microRNA biomarker candidates for assessment of fattening Japanese Black
cattleTamako Matsuhashi（Institute of Advanced Tecnology, Kindai University） 

166

Evaluation for capacitation of selected bull spermatozoa
Hiroshi Iida and Hideyuki Takahashi（Kyushu University, Faculty of Agriculture, Department of Zoology） 

172

Novel method for evaluating capacitation ability of bovine sperm using oviductal epithelial cells
and evaluation of sex sorted sperm function
Yojiro Yanagawa and Masashi Nagano（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University） 

178

The effect of bovine parthenogenesis embryo transfer to previously artificially inseminatedcows
Koumei Shirasuna, Hisataka Iwata, Seizo Hamano＊ and Hikari Yaginuma＊（Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture, Department of Animal Science, ＊ Livestock
Improvement Association of Japan, Inc.） 

183

Effect of antioxidant supplementation on quality improvement of cryopreserved bull semen
Kumiko Takeda, Kagetomo Nishino＊ and Akira Imai＊＊（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, Beef Cattle Institute, ＊Ibaraki Prefectural
Livestock Research Center, ＊＊Hiroshima Prefectural Livestock Research Center） 

190

Development of in vitro oocyte production systems to optimize oocyte resources residing in
ovaries from beef calves before fattening
Yuji Hirao, Kumiko Takeda and Satoko Matoba（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） 

198

Effects of near-infrared laser irradiation on frozen bovine embryos
Masaki Yokoo and Katsuyoshi Sato
（Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University） 

204

Improvement of in vitro culture of in vitro fertileized bovine embryos on the basis of novel
metabolic processes during embryonic genome activation and blastocyst formation
Masayasu Yamada（Graduate School of Agriculture, Kyoto University） 

209

Identification of seminal plasma proteins responsible for regulating immune system in porcine
uterus “to increase litter size”
Minami W Okuyama（Faculty of Medicine, Oita University） 214© The Ito Foundation

xi
The blend design of supercooling facilitating materials for non-cryopreserve of bovine semen
and early embryo
Yumi Hoshino（Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University） 

221

Effects of adipokine and insulin resistance on the bovine fertility（Ⅱ）
Jin Kobayashi（School of Food Industrial Sciences, Miyagi University） 

226

Involvement of corticosteroid on ovarian cystic follicles and quality of oocyte of follicles
coexisting with cystic follicle in dairy cow
Takashi Shimizu（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Department of Life and Food Science）

230

Identification of specific lipid mediators in the cow with endometritis and development of anovel sensitive diagnostic method
Takeshi Osawa, Takahisa Murata＊ and Go Kitahara（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Sciences, Faculty of Agriculture, Universityof Miyazaki, ＊Department of Animal Radiology, The University of Tokyo） 236

A novel genomic screening system for DNA methylation to evaluate bovine spermatozoa
Jumpei Yamazaki and Masashi Nagano（Graduate School of Veterinary Medicine, Hokkaido University） 

243

Development of the safety protective strategy against tick and tick-borne diseases for the
improvement of beef productivity in cattle industry
Takeshi Hatta and Daigo Tsubokawa（Kitasato University School of Medicine） 249

Optimization of bovine thymic organ culture
Shoichi Wakitani and Masahiro Yasuda（Laboratory of Veterinary Anatomy, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 254

Study of reproductive disorders in pigs caused by iron deficiency in the ovary and establishmentof its diagnostic methods
Yasuhisa Yamashita（Department of Life and Environment Science, Prefectural University of Hiroshima） 

259

Elucidation of the resistance mechanisms for highly pathogenic avian influenza virus inchickens-early antiviral response in infected cells
Aya Matsuu（Transboundary Animal Diseases Research center, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima
University） 

265© The Ito Foundation

xii
Livestock-associated S. aureus in chicken: virulence, resistance and pathogenesis
Hisaya Ono（Kitasato University School of Veterinary Medicine） 271

Comprehensive analysis of the behavior of Campylobacter and coexistent bacteria in chicken
food chain
Kasumi Kuroki, Nachiko Takeshita, Ryosuke Ago, Takayasu Watanabe＊ and Tsutomu Sekizaki（Research Center for Food Safety, Graduate School of Agricultural Life Science, The University ofTokyo, ＊present affiliation: Department of Chemistry, Nihon University School of Dentistry） 

278

Characterization and risk evaluation of enterohemorrhagic Escherichia coli isolated from wild
animals
Atsushi Iguchi（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

285

How the wild crow-derived Clostridium perfringens relate to the occurrence of enteritis indomestic animals in farms ? －Genetical characterization of C. perfingens strains by MLST
analysis－
Koji Uetsuka（Ibaraki University, College of Agriculture） 291

Simply and rapid differential diagnosis system of bovine atypical and bacterial pneumonia using
a pulmonary echography and plasma procalcitonin levelKazuyuki Suzuki（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University） 

300

Pathological analysis of PRRS and swine influenza virus infection in the nasopharynx
Takuya Hirai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 305

Establishment of rapid detection system of infectious influenza A viruses
Makoto Ozawa（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University） 

310

Profiling of lactic acid metabolizing bacterial group in the rumen to prevent from rumen
acidosis in beef cattle production
Naoki Fukuma（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine） 

317

Development of serodiagnosis system for protozoan parasite infection in food animals and its
seroepidemiological study
Yoshifumi Nishikawa and Tatsunori Masatani＊（National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary
Medicine, ＊Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University） © The Ito Foundation

322

xiii
Establishment of serological method against pseudorabies virus using myocardium or diaphragmKen Maeda（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Yamaguchi University） 

328

Study of mucosa-associated lymphoid tissues in farm animals－to identify more effective regions
for their vaccination－
Osamu Ichii, Teppei Nakamura, Keigo Kosenda, Yusuke Yamashita and Teppei Ikeda（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University） 

332

Epidemiological analysis of the factors affecting the use of veterinary antimicrobials at farmlevel in Japanese pig farms－the relationship between veterinary antimicrobial usage, on-farmbiosecurity level and animal welfare indicators－
Katsuaki Sugiura, Mari Matsuda and Ren Isomura（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo） 

337

Inhibition of diarrhea in calf by utilizing colostrum antimicrobial components
Naoki Isobe（Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University） 

344

Prediction and control of subacute ruminal acidosis in periparturient dairy cows
Shigeru Sato and Shiro Kushibiki＊（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University, ＊National
Institute of Livestock and Grassland Science） 

350

Effects of rice feeding on growth performance and protein (amino acids) metabolism of weaning
piglets
Ryozo Takada, Ryutaro Kagawa and Kanako Tachihara（Faculty of Agriculture, Niigata University） 

356

Screening for functional feeds that enhance the immune function in Japanese Black calves
Shinichi Yonekura and Hitomi Tokita（Faculty of Agriculture, Shinshu University） 

362

Study on the preventive effects of administration of aqueous extracts of Rhizopus oryzae on thepuerperal acute hepatic stress and suppression of vitamin E related genes expression in cows
Satoshi Haga1, Hiroshi Ishizaki1, Yuuka Kanou2 and Takehito Suzuki2（1Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, 2School of Veterinary Medicine, Azabu
University） 

366

Dietary effects of fermented milk prepared with Lactococcus genus on growth performance andfecal microbial community in weaning piglets.
Naoko Moriya, Nobue Kanematsu, Takumi Narita and Hiromi Kimoto-Nira（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO） © The Ito Foundation

372

xiv
Effects of vitamin A content in calf milk replacer on blood parameters and development ofJapanese Black calves
Harumi Ono（Fukuoka Agricultural and Forestry Research Center） 

378

Development of intensified neonatal feeding program for improved health and growth insuckling calves
Masatoshi Matsuzaki（Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University） 

384

The effect of stress hormone on the proliferation of myoblast and the determination of muscle
fiber typeKatsuyoshi Sato
（Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University） 

389

Studies on a feed for improving zinc nutrition by the use of zinc transporters
Taiho Kambe（Graduate School of Biostudies, Kyoto University） 

394

Development of soybean production technique by living multi method with tropical grasses insouthwestern Japan
Genki Ishigaki1, Masakazu Arai2 and Kiichi Fukuyama1（1Sumiyoshi Livestock Science Station, Field Science Education Research Center, Faculty of Agriculture,
University of Miyazaki, 2Faculty of Engineering, University of Miyazaki） 

400

New system development of high fertility by feeding large amounts of a diet comprising sugarrich rice whole crop silage in lactating dairy cows
Shoichiro Yamaguchi, Sohei Asaoka, Takeshi baba and Chiho Kawashima＊（Fukuoka Agricultural Research Center, ＊Field Center of Animal Science and Agriculture, Obihiro
University of Agriculture and Veterinary Medicine） 406

Establishment of a novel culture model of bovine rumen epithelial cell using tissue stem cell
culture method
Yutaka Suzuki（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University） 

411

Development of the fermented milk which reduces the loose bowel of a calves
Noriaki Shoji（Yamagata Prefectural College of Agriculture and Forestry） 

418

Analysis for pathophysiology of heterozygous individual with cholesterol deficiency in Holstein
cattleHisashi Inokuma（Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine） © The Ito Foundation

425

xv
Monitoring natural feed contamination of mycotoxins in cattle herd and its prevention-clinicalevaluation of protecting effects of intestinal epithelial integrity by supplemented fructooligosaccharides
Mitsuhiro Takagi and Seiichi Uno＊
（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Yamaguchi University, ＊ Faculty of Fisheries, Kagoshima
University） 

430

Bactericidal effect of multi-drug resistance bacteria using lactic acid bacteria and developmentof functional domestic animal fodder
Hideki Kinoshita, Rinka Haraguchi, Takeshi Yamanaka, Norifumi Hattori, Takashi Kotaka,
Masahiro Saneda, Kensho Honda, Atsumi Morikawa, Hiroshi Kaneko, Yushi Nakano, Kazuhiro
Urabe and Mitsuharu Ishida＊（School of Agriculture, Tokai University, ＊School of Food, Agricultural and Environmental Sciences,
Miyagi University） 

435© The Ito Foundation

xvi

伊藤記念財団賞
目

須

田

義

次

人（宮城大学食産業学部ファームビジネス学科教授）

黒毛和種ゲノム DNA メチル化多型と肉質形質との関係に関する研究 河原聡（宮崎大学農学部応用生物学科科

451

教授）

食肉脂質の食品栄養学的再評価に関する研究 © The Ito Foundation

452

xvii

学会等事業助成目次

日本食肉研究会の平成 29 年度事業助成実施報告
日本食肉研究会会長

根岸晴夫（中部大学応用生物学部） 455「食肉の安全性に関する公開シンポジウム」―食肉に由来する感染症とその予防―に関する開催
報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

久和

茂（東京大学） © The Ito Foundation458

研究助成事業© The Ito Foundation

3

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌効果とメカニズム解析
Disinfection of drug-resistant bacteria by gas plasma and analysis of themechanisms

作道章一１・山城梨沙１・三沢達也２（１琉球大学医学部保健学科生体代謝学分野，２佐賀大学大学院工学系研究科電気電子工学専攻）

Akikazu Sakudo１, Risa Yamashiro１ and Tatsuya Misawa２（１Laboratory of Biometabolic Chemistry, School of Health Sciences, University of the Ryukyus,
２Department of Electrical and Electronic Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Saga University）

Recently, the growing risk of disease from drug-resistant pathogens has become a huge
public health concern. Drug resistance is possibly due to extensive and indiscriminate use ofantibiotics, which leads to the evolution of drug-resistant bacteria. In this study, we investigatedwhether gas plasma technology is effective as a disinfectant against drug-resistant bacteria. A
dielectric barrier discharge（DBD）plasma torch was applied to suspensions of Escherichia coli.
The results showed that the viable cell count of E. coli was reduced to undetectable levels after
2 min of plasma treatment. Furthermore, similar results were observed for E. coli transformed
with a plasmid encoding an ampicillin-resistant gene, indicating that the plasma is similarly
effective against both drug-resistant and non-resistant E. coli. In addition, lipopolysaccharide
degradation and DNA injury of the E. coli cells were detected by Limulus test and polymerase
chain reaction, respectively. Taken together, these findings suggest that the mechanism ofaction of the plasma is unlikely to differ between drug-resistant and normal bacteria. Therefore,
this plasma method may be especially useful for eliminating not only normal bacteria but also
drug-resistant bacteria.

１．目（MRSA），バ ン コ マ イ シ ン 耐 性 腸 球 菌（VRE）

的などがある４）。食品に関わるサルモネラなどの薬

近年，細菌の薬剤耐性化が世界的問題となって剤耐性菌が蔓延しているということは，食中毒患いる。薬剤耐性化により，細菌は抗生物質に対す者の抗生物質の治療が困難になることを意味す

る抵抗性を獲得する。米国では食肉汚染サルモネ

る。さらに，食品中に薬剤耐性菌が存在した場合，

ラの80％以上が薬剤耐性菌であり，さらに50％以

薬剤耐性遺伝子が腸内の常在細菌に伝播し，耐性上が多剤耐性菌であると報告されている。我遺伝子のリザーバーとなってしまう可能性があが国のサルモネラも多くが薬剤耐性菌であるとさる。そして，耐性菌が腸内に生息することで，抗れる１）。これらの薬剤耐性サルモネラの他に，主生物質の服用が耐性菌の選択的増殖を引き起こし

な薬剤耐性菌にはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌てしまう。これらのことから，薬剤に頼らない形

１～３）© The Ito Foundation

4

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

での食品の殺菌技術が必要とされている。しか菌の生菌数を計測するため，アンピシリン（50し，我が国では，諸外国では認められている放射mg/L）を含むもしくはアンピシリンを含まない

線照射による食品の殺菌は，ジャガイモの発芽防LB寒天培地に蒔き，37℃で一晩培養後にコロニー

止以外の目的には認められておらず，薬剤耐性菌を カ ウ ン ト し て Colony forming unit（CFU）をにも有効と考えられる物理的殺菌技術として食品算出した。

に用いることができるのは，加熱のみである。

2.3

プラスミド

最近，申請者らは，物理的処理技術の一つであ

アンピシリン耐性遺伝子を持つプラスミドであるガスプラズマを用いて，サルモネラを含む様々

る pPRO-EX-HT-CAT （Life Technologies） をな細菌の殺菌に成功した

使用した。

。しかし，薬剤耐性

５～７）

菌と非耐性菌のガスプラズマ感受性が同じかどう

2.4かは分かっていない。

プラスミドの導入（トランスフォーメーショ

そこで，本研究では，ガスプラズマ処理による
薬剤耐性菌と非耐性菌の感受性を比較した。さらン）は常法９）に従い行った。
2 . 5 Polymerase chain reaction（PCR）とPCRに，プラズマ処理が引き起こす生化学変化を解析
し，ガスプラズマ耐性菌が出現しうるメカニズム
なのかについて考察した。
２．方
2.1

トランスフォーメーション

産物のDNAシークエンシング
Bacterial 16S rDNA PCR Kit（Takara bio）を用いて，16S rDNAの増幅をインストラクション
に従い行った。また，PCR産物はDNAゲル電気法

泳動後にQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）

大気圧プラズマトーチを用いてゲル抽出を行った後，ABI PRISM3100

絶縁体である筒状のセラミックスの周囲を銅板で覆い，筒内部に金属のメッシュを配置したプラ

Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いてダイレクトシークエンシングに供した。

ズマトーチを用いた 。銅板とメッシュ間に電圧

2.610 kV，周波数10 kHzの高周波パルスを印加し，誘電リムルスカラーKY

８）

リムルステスト
テストワコー（和光純体バリア放電（DBD：Dielectric barrier discharge）

薬）を用いてエンドトキシンであるリポポリサッ

によるプラズマを発生させた。生成したプラズマ

カライド（LPS）の定量を行った。

は，エアーポンプ（水作：水心SSPP-2S）を用い

2.7て筒先端から3.5 L/minの流量で放出させた。サGraphPad Prism 7（GraphPad Software）を用

ンプルは時計皿上に20μL滴下し，筒先端までのいてNon-repeated ANOVA followed by Bonferroni

距離を20 mmに固定し処理を行った。

correctionにより有意差検定を行った。

2.2

供試細菌と培養供試細菌として大腸菌Escherichia coli（DH5α

統計解析

３．結果と考察

Competent Cells, Takara bio）を用いた。プラズ

まず，大腸菌DH5 αにpPRO-EX-HT-CATをマ処理に供するサンプルは，アンピシリン（50トランスフォーメーションし，アンピシリン含有mg/L）を含むもしくはアンピシリンを含まない

LB寒天培地で一晩セレクション後，コロニーを

LB（Luria Broth）液体培地中で37℃で24時間培

ピックアップした。そのコロニーをLB液体培地

養した大腸菌を使用した。プラズマ処理後の大腸に懸濁し，アンピシリン含有LB液体培地および© The Ito Foundation

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌効果とメカニズム解析

5

非含有LB液体培地中で24時間培養した。それら

CFU/ml（１min）であり，いずれの時間においから回収した大腸菌に対して大気圧プラズマトーてもアンピシリン含有培養と非含有培養の間で有チを用いた処理を行った。その結果，プラズマ処

意な生菌数の違いは見られなかった（Fig.１）。

理によりいずれの大腸菌も生菌数が低下し，また，pPRO-EX-HT-CATをトランスフォーメー

pPRO-EX-HT-CATをトランスフォーメーショ

ションした大腸菌とトランスフォーメーションしンした大腸菌をアンピシリン入りLB液体培地でていない大腸菌をアンピシリン非含有LB液体培

培養したものはプラズマ処理前（０min）の生菌地で培養したものをプラズマ処理して比較した場

数 は 2.4X10 CFU/ml（０ min）で あ っ た の に 対合も前者は2.1X10 ７ CFU/ml（０min）と1.8X10 ４

し，１minのプラズマ処理により1.4X10５ CFU/

CFU/ml（１ min）で あ っ た の に 対 し ，後 者 はmlと生菌数が低下した（Fig.１）。一方，この大2.5X10７CFU/ml（０min）と7.8X10４CFU/ml（１

腸菌をアンピシリン非含有LB液体培地で培養しmin）と 両 群 に 有 意 な 違 い は 見 ら れ な か っ た

た も の は 2.2X10 CFU/ml（０ min）と 1.4X10（Fig.２）。さらに，２min処理ではいずれの条件

６Viable cell number［CFU/ml］

６

５

NS

107
10

NS

6

105
104
103
102
101
100

0

1

2

0

1

2

Plasma treatment［min］
Fig. 1 E. coli cells transformed with pPRO-EX-HT-CAT and selected in ampicillin-containing LB agar wereViable cell number［CFU/ml］

proliferated either in ampicillin-containing LB liquid medium（■）or in non-drug-containing LB liquid medium（□），and then subjected to plasma treatment for 0-2 min, and counted.
NS：not significant（■vs□）
NS

108
107
106

NS

105
104
103
102
101
100

0

1

2

0

1

2

Plasma treatment［min］
Fig. 2 E. coli cells transformed with pPRO-EX-HT-CAT, selected in ampicillin-containing LB agar, and proliferated in

non-drug-containing LB liquid medium（■），and non-transformed E. coli cells proliferated in non-drugcontaining LB liquid medium（□）were subjected to plasma treatment for 0-2 min and counted.
NS：not significant（■vs□）．

© The Ito Foundation

6

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）の大腸菌においても生菌数は検出限界以下となっ

ンし，アンピシリン非含有LB液体培地で24時間た（Fig.１，
２）。

培養後の大腸菌もプラスミドを導入していない大次に，プラズマ処理が大腸菌の構成成分に与え腸菌のいずれもプラズマ処理を行うことで16sる影響を明らかにするために，DH5αに対して大rDNAの増幅が抑制されていた（Fig.４）。このこ

気圧プラズマトーチを用いた処理を行い，リムルとから，プラズマ処理により，大腸菌のDNAがステストによるLPSの解析やPCRによるDNAの損傷を受けるものと考えられた。また，このPCR解析を行った。リムルステストではプラズマ処理

産 物 の シ ー ク エ ン ス は Escherichia coli strain

時間に伴い，吸光度が低下したため，LPS lipid

DH5α chromosome, complete genome Genbank

Aの分解が確認された（Fig.３）。これらのことかAccesion Number NZ_CP026085.1と５’→３’方向

ら，プラズマ処理により，大腸菌の細胞壁が分解で0.9925±0.0035％（N＝４）の相同性があり，３’

さ れ る も の と 考 え ら れ た 。PCR で は 大 腸 菌 に→５’方向でも0.9948±0.0034％（N＝４）と高い

pPRO-EX-HT-CATをトランスフォーメーショ

相同性を示したことから，大腸菌DH5αの16sEndotoxin［EU/ml］

1000

100

10

＊＊
＊＊

1

0 min

1 min

2 min

Plasma treatment［min］
Fig. 3 E. coli cells treated with plasma were subjected to the Limulus test. Endotoxin was reduced after plasma

treatment for 0-2 min．＊＊p＜0.01（vs 0 min）.

100 bp［min］ 0DH5α
Amp（-）

1

pPRO-EX-CAT DH5α
Amp（-）

1 kbp

2

0

1

2

Fig. 4 Non-transformed E. coli cells proliferated in non-drug-containing LB liquid medium（DH5α Amp（-））andE. coli cells transformed with pPRO-EX-HT-CAT, selected in ampicillin-containing LB agar, and proliferated in
non-drug-containing LB liquid medium（pPRO-EX-CAT DH5α Amp（-））were subjected to plasma treatment for
0-2 min and PCR for 16S rDNA.
100 bp：100 bp DNA ladder marker；1 kbp：1 kbp DNA ladder marker© The Ito Foundation

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌効果とメカニズム解析

rDNAが増幅されていたことが確認された。
ガスプラズマは活性種（ラジカル等）や紫外線などの複合的効果で酸化ストレス作用をもたらして，殺菌作用を持つものと推測される。したがって，どのような殺菌因子により今回観察されたDNA損傷や細胞壁の分解が誘導されるのかについて，今後詳細に解析することで殺菌メカニズムが明確になるものと考えられる。
４．要約

本研究により，ガスプラズマ処理による薬剤耐性菌と非耐性菌の感受性に違いがないことが明らかになった。さらに，細胞壁の成分であるLPSや核のDNAがプラズマ処理により損傷を受けていることが分かった。これらの変化は薬剤耐性の有無とは無関係に生じる変化であるため，ガスプラ
ズマは薬剤耐性菌に対しても有効と考えられた。
文献１） 伊藤均：薬剤耐性細菌の放射線殺菌効果，食品照射，41（1-2）：９～13，2006．
２） Hofacre, C. L., White, D. G., Maurer, J. J., Morales,
C., Lobsinger, C., Hudson, C.：Characterization of
antibiotic-resistant bacteria in rendered animal
products, Avian Dis.，45（4）：953～961，2001．

7３） Sofos, J. N., Kochevar, S. L., Bellinger, G. R.,
Buege, D. R., Hancock, D. D., Ingham, S. C., Morgan,
J. B., Reagan, J. O., Smith, G. C.：Sources and extent
of microbiological contamination of beef carcasses inseven United States slaughtering plants, J. Food.
Prot.，62（2），140～145，1999．
４） Calfee, D. P.：Methicillin-resistant Staphylococcus
aureus and vancomycin-resistant enterococci, andother Gram-positives in healthcare, Curr. Opin.
Infect. Dis.，25（4），385～394，2012．
５） Shintani, H., Sakudo, A.：Gas Plasma Sterilizationin Microbiology：Theory, Applications, Pitfalls and
New Perspectives, Caister Academic Press, Poole,
UK，2016．
６） Sakudo, A., Shintani, H.：Sterilization anddisinfection by plasma：Sterilization mechanisms,
biological and medical applications, NOVA Science
Publishers, Hauppauge, New York，2011．
７） Maeda, K., Toyokawa, Y., Shimizu, N., Imanishi, Y.,
Sakudo, A. ： Inactivation of Salmonella by nitrogengas plasma generated by a static induction thyristor
as a pulsed power supply, Food Control，52，54～59，
2015．
８） Sakudo, A., Miyagi, H., Horikawa, T., Yamashiro,R., Misawa, T.：Treatment of Helicobacter pylori
with dielectric barrier discharge plasma causes UV
induced damage to genomic DNA leading to cell
death, Chemosphere，200，366～372，2018．
９） Green, M.R., Sambrook, J.：Molecular Cloning：
A Laboratory Manual（Fourth Edition）,Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York，2012．

© The Ito Foundation

8

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明
Identification of the main factor determining the taste of Jidori meat

本

田

和

久

（神戸大学大学院農学研究科）

Kazuhisa Honda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

Jidori is one of tasty and popular meats in Japan. However, the main factor determining
the taste of Jidori meat have not been identified. In the present study, quantitative analyses
were performed on the general biochemical components, free amino acids, inosine
5ʼ-monophosphate（IMP）,and proteins in the thigh meat of Jidori and broiler chickens in order
to identify the candidate substances influencing the palatability of chicken meat. The paired
preference test for boiled thigh meats of Jidori and broiler revealed that Jidori was significantly
preferred in Koku and Jizokusei. However, the most of amino acids levels in Jidori chickens
were significantly lower than broilers, whereas no significant difference in IMP levels wasobserved between them. The amino acids and IMP contents are not the causes of characteristicfeature of Jidori chicken meat. Further studies are needed to elucidate the relationshipbetween other molecules and the palatability of Jidori chicken meat.

１．目

いるが，地鶏肉の美味しさの決定要因が明らかに的されないまま，増体性のみによって地鶏の品種改

地鶏肉は我が国が誇る優れた食味の食材であ良が進められれば，地鶏肉の価格低下は達成されり，その美味しさは我が国鶏肉市場の約９割を占ても，その美味しさが損なわれてしまうことが懸める安価なブロイラーの肉とは一線を画す。しか念される。ここで，フランスにおいては，国の基しながら，地鶏肉は鶏肉としては高価格であるに準に適合した赤ラベルが貼られた鶏肉（赤鶏）もかかわらず，牛肉の肉質等級のような品質を保が，高価格にもかかわらずフランス国内の鶏肉市

証し得る評価基準が確立されていない。そのた場の３割以上を占める。この事実が示すように，

め，平成11年に地鶏肉のJAS規格が決定されて以我が国においても，地鶏肉の美味しさを保証する

降も，地鶏肉とブロイラー肉との美味しさの違い

基準が確立され，その基準に応じて市場価格が決が十分に消費者に認識されず，その市場拡大が思定されれば，地鶏肉においても和牛や赤鶏のよううように進まない状況が続いている。それゆえ，な確固たる市場が形成される可能性が高いと判断

地鶏肉の価格低下による需要増加を目的として，される。そのためには，地鶏肉の美味しさの要因

地鶏の品種改良による増体性の改善が進められてを科学的に明らかにする必要がある。

© The Ito Foundation

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明

9

地鶏肉の美味しさは，「適度な歯ごたえ」や加えた後，４℃で３時間，振とうした。その後，「うま味」という言葉で表現される。このうち，不溶物を濾過して除去して得られた濾液を，アミ「適度な歯ごたえ」は骨格筋の筋線維組成の相違

ノ酸分析（ワコーパックⓇワコーシルⓇ-PTC4.0，に基づくものであることが示唆されている１）が，和光純薬工業株式会社），および核酸関連物質分

地鶏肉の「うま味」の要因についてはいまだ明ら

析（AtlantisⓇ dC18 Column，日本ウォーターズ

かにされていない。例えば，地鶏肉とブロイラー

株式会社）に供した。官能検査結果はマン・ホ

鶏肉の抽出液に含まれるアミノ酸や核酸関連物質

イットニーのＵ検定により，その他の結果はスの含量には大きな違いは見られない

チューデントのｔ検定により，それぞれ統計解析

。しかし

２～４）

ながら，これらの報告は非加熱のミンチ肉の抽出した。

液を分析したものであり，実際に食する鶏肉の呈2.2

味成分を分析しているとは言えない。

０日齢のブロイラーおよび地鶏を購入し，神戸

熟成に伴う鶏肉タンパク質の変化

本研究では，地鶏肉と市販のブロイラー鶏肉を

大学の動物飼育室で出荷日齢（ブロイラー６週

用いて，官能検査による地鶏肉に特徴的な美味し

齢，地鶏12週齢）まで市販の飼料を用いて飼育しさを明らかにするとともに，そのアミノ酸組成おた。炭酸ガスによる麻酔下で安楽死後，右もも肉

よびもも肉タンパク質の熟成による変化を明らかの大腿二頭筋を速やかに摘出し，液体窒素で凍結にすることに基づき，地鶏肉の美味しさの決定要後，－80℃に保存した。左もも肉は冷蔵で48時間因を解明する。

保存後，大腿二頭筋を摘出し，液体窒素で凍結後，

２．方
2.1

－80℃に保存した。凍結組織は冷凍のまま粉砕法

し，二次元電気泳動（ディスクラン-Ｒ，パジェ
ランAce，アトー株式会社）に供した。

地鶏肉の美味しさの特徴解析

市販の国産ブロイラーと地鶏（ひょうご味どり）のもも肉（各10個）の上ももを約１cm幅に３．結果と考察

２枚スライスし，３倍量の１％食塩水を加えた官能検査の結果，地鶏肉はコク（＋1.0，p＜0.05）

後，90℃以上で15分間湯煎し，１枚を10名のパネと味の持続性（＋0.7，p＜0.05）に富む鶏肉であラーを用いた官能検査に供した。評価項目は，［香ることが明らかになった。しかしながら，湯煎鶏り（鶏肉らしい香り，獣臭，異臭，全体の強さ），

肉に含まれるアミノ酸の量はブロイラーの方がむ

風味（鶏肉らしい風味，獣風味，異風味，全体のしろ多く，核酸関連物質含量にも有意な差は見ら強さ），食感（咀嚼しやすさ，歯ごたえ，ジュー

れなかった（Table１）。これらの結果から，地鶏

シー感，噛み切りやすさ），および味（うま味，

肉の美味しさはコクと味の持続性にあること，そ

甘味，酸味，塩味，苦味，異味，コク，脂っこさ，の美味しさの決定要因に，熟成等によるアミノ酸

まろやかさ，持続性，全体の強さ）］とし，それ含量の増加に基づくものではないこと，およびうぞれの項目について，標準検体を基準値０とした

ま味物質であるイノシン酸も関与しないことが示

上下３段階（＋３，とても強い；＋２，強い；＋唆された。

１，やや強い；－１，やや弱い；－２，弱い；－二次元電気泳動の結果，地鶏肉において特徴的

３，とても弱い）で判断させた。また，湯煎したなスポット，あるいは熟成により減少するスポッ

鶏肉の残りの１枚をミンチ後，３倍量の超純水をトは認められなかったが，解糖系酵素であるエノ© The Ito Foundation

10

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table １ Comparison of amino acids and nucleic acidrelated

components between Jidori and broiler chicken muscles
Jidori

Broiler

Amino acids
Asp

87 ±

6

131 ±

Glu

205 ±

13

282 ± 27＊＊

6＊＊

Ser

194 ±

17

269 ± 26＊

Gly

251 ±

15

419 ± 50＊

His
Ala

154 ±
636 ±

20
22

392 ± 42＊＊643 ± 37

Pro

124 ±

6

233 ± 24＊

Tyr

50 ±

5

153 ± 17＊＊

Val

88 ±

7

237 ± 25＊＊

Met
Cys

26 ±
75 ±

7
7

106 ± 13＊＊140 ± 7＊＊Ile
56 ± 5
Leu
78 ± 7Phe
48 ± 5
Lys
112 ± 8
Nucleic acid-related components
IMP
119 ± 24HxR
446 ± 45Hx
195 ± 21108 ± 16＊229 ± 29＊132 ± 11＊＊283 ± 41＊
118 ± 21602 ± 82262 ± 36

Values are means ± S.E.M.（nmol/ml，n＝5）．
＊，＊＊；p＜0.05，p＜0.01，respectively．

ラーゼについて，ブロイラーに比べて地鶏できわ

これまでの種々の鶏肉の食味比較に関する報告

め て 濃 い ス ポ ッ ト が 検 出 さ れ た （data not

においては，湯煎したむね肉６），湯煎した赤身（皮shown）。この結果は，地鶏肉はブロイラー鶏肉と脂肪を除いたもの）のもも肉スライス３），オーに比べて解糖系の代謝が活発であることを示唆す

ブンで熱処理した皮なしもも挽肉のパティ７），る。卵用鶏の一種である白色レグホンの雄ヒナにオーブンで熱処理した浅胸筋，深胸筋，あるいは

おいては，エノラーゼを含むいくつかの解糖系酵

大腿二頭筋８），オーブンで熱処理したもも肉を冷

素は，遅筋よりも速筋で多く発現することが報告

蔵後，室温に戻したもの９）が用いられており，実されている５）。しかしながら，一般に，地鶏肉は際に食する鶏肉の調理法とは必ずしも一致していブロイラー鶏肉に比べて赤みが強いこと，およびない。官能検査に供する検体は均一性が求められ赤みが強い肉は遅筋であると認識されている。そることから，このような調理法が用いられている

れゆえ，地鶏肉においては，筋線維型にかかわらが，我が国においては，むね肉に比べて脂肪分がず，解糖系の代謝が活発である可能性が示され多く，ジューシーなもも肉の需要が多いことかた。これらのことから，地鶏肉においては，解糖ら，本研究では，実際に食する調理法（鍋料理）系の中間代謝産物の含量がブロイラー鶏肉よりもに近い方法で調製したもも肉を官能検査に供し多い可能性があると考えられることから，今後，た。また，地鶏とブロイラーの間で肉の呈味成分

解糖系中間代謝産物含量が鶏肉の美味しさに及ぼ含量を比較した報告においては，比内地鶏とブロす影響について明らかにする必要があると考えら

イラーの浅胸筋の一般成分，アミノ酸，無機質，れた。

および脂肪酸組成からは肉の食味に影響する成分© The Ito Foundation

11

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明は特定できないこと４），名古屋コーチンとブロイ

かにすることにより，地鶏肉の美味しさの決定要

ラーのもも肉から調製したスープ中のアミノ酸の因を明らかにできるかもしれない。

濃度は，ブロイラーの方がむしろ高いこと３），ロー
ストしたもも肉の遊離アミノ酸含量は，名古屋

４．要

約

コーチンおよび三河赤鶏に比べてブロイラーの方本研究では，地鶏肉の美味しさの決定要因を明が多いこと ，および会津地鶏，名古屋コーチン，

らかにする目的で，官能検査による地鶏肉の美味

およびブロイラーの皮無むね肉の遊離アミノ酸含しさの特徴解析と，そのアミノ酸および核酸関連量の比較では，多くの遊離アミノ酸がブロイラー

物質含量との関連，ならびに熟成によるタンパクで多いこと が報告されている。本研究において質含量の変化を調べた。その結果，地鶏肉はコク

は，これまでの報告で調べられてきた調理前の鶏と味の持続性に富むこと，その美味しさにはアミ肉抽出液や鶏肉スープではなく，実際に食する機ノ酸および核酸関連物質の含量は関与しないこと

会の多い湯煎調理した鶏肉に残存する呈味成分とが示唆された。さらに，地鶏とブロイラーにおいしてアミノ酸および核酸関連物質を分析したが，ては，解糖系代謝における相違があることから，これまでの報告と同様，地鶏肉に多く含まれる呈今後，地鶏肉の美味しさと解糖系中間代謝産物と味成分はなかった（Table１）。それゆえ，地鶏肉の関連について明らかにする必要性が示された。

９）２）に特徴的な美味しさ（コクと味の持続性）の決定
要因は，アミノ酸や核酸以外の要因（例えば，糖代謝や脂質代謝に関連する低分子）による可能性が高いと判断された。
鶏肉の肉質については日齢４，10），あるいは飼育
形態11，12）により影響を受けることが報告されている。また，地鶏肉においては雌雄の飼育期間が異なる場合も多く，例えば，本研究に供したひょうご味どりは，雄は90日齢，雌は110日齢まで飼育することが推奨されている13）。さらに，極端な例
としては，比内地鶏においては雄の鶏肉は味が劣ることから，雌しか鶏肉生産用に供されない場合が多い。それゆえ，雄の比内地鶏の食味改善を目的に雄ヒナの効率的な去勢方法が検討されているほどである14）。今回，官能検査に用いた市販の地
鶏肉を雌雄鑑別し，そのデータを解析したとこ
ろ，雄の地鶏は鶏肉らしい香りが強く，雌の地鶏
はコク，味の持続性，およびまろやかさが強い傾向が認められた（data not shown）。今後，地鶏肉の性の違いによる美味しさの違いと上述の糖代
謝や脂質代謝に関連する低分子等との関連を明ら

文献１） 尾関教生，吉田行夫，加藤貞臣，河村孝彦，伊藤
孝夫，申七郎：名古屋コーチン（名古屋種）鶏肉の食品組織学的特性（第１報）もも肉の結合組織について，調理科学，25，301～305，1992．
２） 山田未知，山田幸二：市販の会津地鶏肉における遊離アミノ酸と脂肪酸組成について．，日本食生活学
会誌，24，177～182，2013．
３） 松石昌典，加藤綾子，石毛教子，堀剛久，石田雄祐，
金子紗千，竹之中優典，宮村陽子，岩田琢磨，沖谷明紘：名古屋コーチン，ブロイラーおよび合鴨肉の食味特性の比較，日本畜産学会報，76，423～430，
2005．
４） Fujimura, S., Koga, H., Takeda, H., Tone, N.,
Kadowaki, M., Ishibashi, T. ： Chemical compositionsof pectoral meat of Japanese native chicken, Hinaijidori, and broiler of the same and marketing age,
Animal Science and Technology ， 67 ， 541 ～ 548 ，
1996．
５） Lebherz, H. G., Petell, J. K., Shackelford, J. E.,
Sardo, M. J.：Regulation of concentrations ofglycolytic enzymes and creatine-phosphate kinase
in “fast-twitch” and “slow-twitch” skeletal musclesof the chicken, Archives of Biochemistry andBiophysics，214，642～656，1982．
６） Fujimura, S., Muramoto, T., Katsukawa, M.,
Hatano, T., Ishibashi, T.：Chemical analysis andsensory evaluation of free amino acids and5ʼ-inosinic acid in meat of Hinai-dori, Japanesenative chicken.-comparison with broilers and layer© The Ito Foundation

12

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

pullets, Animal Science and Technology ，65 ，610 ～
618，1994７） Kiyohara, R., Yamaguchi, S., Rikimaru, K.,
Takahashi, H.：Supplemental arachidonic acidenriched oil improves the taste of thigh meat of
Hinai-jidori chickens, Poultry Science，90，1817～1822，2011．
８） Sasaki, K., Motoyama, M., Tagawa, Y., Akama, K.,
Hayashi, T., Narita, T., Chikuni, K. ： Qualitative andQuantitative Comparisons of Texture Characteristics
between Broiler and Jidori-niku, JapaneseIndigenous Chicken Meat, Assessed by a Trained
Panel, The Journal of Poultry Science，54，87～96，2017．
９） 小出あつみ，山内知子，大羽和子：ロースト鶏腿
肉の理化学的特性および嗜好特性，日本調理科学会
誌，40，138～145，2007．

10） 岩本久雄：鶏骨格筋の構造と産肉生理，西日本畜産学会報，50，７～13，2007．
11） 嶋澤光一，荒木勉：飼育形態が特産肉用鶏の肉色と筋線維特性に及ぼす影響，日本家禽学会誌，36，371～376，1999．
12） 仁木隆博，佐伯祐里佳，家入誠二，米田一成，荒木朋洋，芝田猛：飼育形態が特産肉用鶏の成長，産肉性および脂肪蓄積に及ぼす影響，日本暖地畜産学
会報，55，157～166，2012．
13） 地 鶏 銘 柄 鶏 ガ イ ド ，ひ ょ う ご 味 ど り ，www.
j-chicken.jp/anshin/sanchi4_28_03.html
14） Rikimaru, K., Takahashi, H., Nichols, M. A.：An
efficient method of early caponization in slowgrowing meat-type chickens, Poultry Science ，90 ，1852～1857，2011．

© The Ito Foundation

13

市販食肉より分離されたリステリアのストレス応答に関する研究
Studies on stress response of Listeria monocytogenes isolated from retail
meats

落

合

由

嗣・吉

川

悠

子

（日本獣医生命科学大学）

Yoshitsugu Ochiai and Yuko Yoshikawa（Nippon Veterinary and Life Science University）

Listeria monocytogenes is recognized an important foodborne pathogen. Contamination inmeat has been shown to be higher than any other foods. However, the high prevalence of thepathogen in meat remains unclear. We hypothesized that the unique stress responsecontributes to highly successful colonization of the pathogen in meat processing environments.
In the present study, we investigated the survival of L. monocytogenes strains following lethal
H２O２（60mM）and acid（pH values from pH 2.5 to pH 3.5 adjusted with HCl）exposure.
Series of persistent strains isolated repeatedly from pork or chicken over six months wereused for the survival analyses. Exposure to H２O ２ and acid was performed under two
temperatures of 20℃ and 37℃．The comparative analyses among the groups of persistentstrains from pork or chicken showed the differences in the survival following to exposure tolethal H２O２ and acid, whereas they were identical serologically and genetically. These findings
strongly support the strain-specific variability in stress response of L. monocytogenes. The
magnitude of the differences in the survival in the group of the persistent strains from pork
was likely to be higher than that from chicken, which may reflect the strains from pork inhighly variable environments. Notably, we found high susceptibility of the persistent strainsfrom chicken to acid exposure, suggesting that the persistent isolates isolated from chicken
have few opportunities to be subjected to acid in their growth environments. Therefore, we
propose the usage of acid substance in meat processing environments to control
L. monocytogenes. In addition, we need further investigation of stress response, including acidtolerance response, of this pathogen isolated from meat to elucidate persistence over extended
periods of time in the environments.

１．目

引き起こす。欧米諸国ではリステリアによる集団的発生が相次いで発生しており，米国では本菌に汚食中毒原因菌のListeria monocytogenes（リス

染された食品の廃棄措置によって甚大な経済損失

テリア）は，高齢者などの易感染者には敗血症やが起きている。日本ではリステリア症の発生率が髄膜脳炎，妊婦には死流産，健常者には胃腸炎を欧米諸国より低く，ほぼすべてが散発発生であ© The Ito Foundation

14

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

る１）。しかし，日本におけるリステリアの食品汚

食品加工環境を想定した20℃，および宿主環境を染率は欧米諸国と同等であることが報告されてい想定した37℃の２つの温度条件で曝露解析を行っる２）。リステリアによる食品汚染の多くは，食品た。

加工施設で発育している菌が汚染源となって起きていると考えられる。またリステリアの中には，

２．方法

生息環境で長期間にわたって発育する特徴をもっ

2.1

用いた菌株

た「持続汚染株」の存在が知られている３）。持続本研究では，1997年12月から1998年６月にかけ

汚染株は，繰り返して食品を汚染する可能性があて同一店舗で購入された市販鶏ひき肉，あるいはるため特に問題視されている。

豚ひき肉から繰り返し分離された一連の菌株群を

我々は食肉を中心としたリステリアの汚染状況用いた。鶏肉由来株は血清型1/2ｂ，豚肉由来株を解析し，食肉が食品の中で高頻度に汚染されては血清型1/2ｃに分類され，またMulti-virulence-

いることを明らかにした 。さらに牛肉，鶏肉おlocus sequence typing７）による遺伝子型別で鶏肉

よび豚肉における汚染状況の比較解析から，鶏肉

由来株間，あるいは豚肉由来株間で同一の遺伝子が高い汚染率を示すとともに，人から高頻度に分型に分類された背景から持続汚染株と示唆され離される血清型1/2ａ，1/2ｂおよび４ｂによってた。豚肉および鶏肉由来持続汚染株としてそれぞ汚染されていることを見出した。ここで，食肉のれ，９株および11株を用いた（Table１）。さらに

リステリア汚染率が高い理由として，食肉由来リリステリア研究で多く用いられるEGD-e株も用い

ステリアが他から分離される菌株とは異なった性た。

４）状を有することに起因する可能性が考えられた。
リステリアは汚染源の食品加工環境において，様々なストレスに曝露されていると想定される。
それゆえ，食肉由来のリステリアは様々なストレスに高い耐性を示し，食肉を取り扱う環境でより多くの菌が生残して汚染率が高くなるという可能性が考えられた。また我々はこれまでに，同一店舗の同じ食肉から半年間にわたって繰り返し分離
され，同一血清型および遺伝子型に分類されたことから，持続汚染株と考えられる一連の菌株を得た５）。このような持続汚染株は特に高いストレス応答能力を有していると考えられたため，本研究では食肉由来持続汚染株のストレス応答性を解析した。ストレスとして，菌の生息環境および宿主内環境で頻繁に曝露されると予測される酸および過酸化水素（H２O２）を用いた。また，研究室で多く用いられるEGD-e株がH２O２曝露下で曝露温
度依存的な生残性を示すことが分かったため６），

Table 1 Persistent strains used in the present study
StrainSampling date or year

Persistent strain isolated from pork
75Ｐ1
10 Feb. 1998
76Ｐ1
10 Feb. 1998
78Ｐ1
11 Feb. 1998
90Ｐ5
11 Mar. 1998
92Ｐ3
12 Mar. 1998
100Ｐ1
15 Apr. 1998
104Ｐ4
17 Apr. 1998
114Ｐ2
22 May 1998
117Ｐ5
10 June 1998
Persistent strain isolated from chicken
69Ｃ3
14 Dec. 1997
72Ｃ3
9 Feb. 1998
72Ｃ5
9 Feb. 1998
77Ｃ1
11 Feb. 1998
87Ｃ4
10 Mar. 1998
91Ｃ3
12 Mar. 1998
97Ｃ5
13 Apr. 1998
99Ｃ4
15 Apr. 1998
103Ｃ4
17 Apr. 1998
109Ｃ1
20 May 1998
116Ｃ1
10 June 1998

© The Ito Foundation市販食肉より分離されたリステリアのストレス応答に関する研究

2.2

菌株の培養

高い生残性を示した菌株は，37℃でも高い傾向が－80℃で凍結された供試菌株をBHI寒天培地に接種し，37℃で24時間培養した。次いで培地上に形成されたコロニーをBHIブロスに接種し，37℃で一晩培養した。
2.3

15

みられた。さらに，調査期間の後半に分離された菌株の生残性が低くなる傾向がみられた。
酸に対する応答性の解析では，pH2.5の酸性化
BHIに対し，20℃および37℃でそれぞれ，120分

菌株のストレス曝露

間 お よ び 15 分 間 曝 露 し た 。得 ら れ た 生 残 率 を

ストレス曝露には，上記の培養液を0.6％酵母

Fig. 1CおよびFig. 1Dで示す。菌株間で比較した

エキス添加トリプトソイブロスで培養し，OD660

ところ，酸曝露に対する生残性にも著しい多様性が0.3（対数増殖期）に達したものを用いた。菌が観察された。また，H２O２曝露における生残性量をおよそ３×10 CFU/mlにしてPBSで洗浄しのように，20℃で高い生残性を示した菌株は37℃た。得られた菌を致死的濃度である60mMのH２O２

でも高いこと，調査期間の後半に分離された菌株を添加したPBSおよび塩酸でpH2.5～3.5にした酸の生残性が低くなる傾向が観察された。ここで統性化BHIに曝露した。曝露温度条件は20℃および計解析を行ったところ，H２O２曝露と酸曝露の生37℃とし，160rpmの振とう条件で行った。指定

残性に相関性のあることが示された。

７する時間まで曝露した後，10倍段階希釈して寒天培地に接種した。寒天培地として，H２O２曝露し3 . 2 鶏肉由来持続汚染株のストレス暴露に対する生残性た 菌 の 培 養 に は １ ％ ピ ル ビ ン 酸 ナ ト リ ウ ム・

鶏ひき肉から連続して分離された持続汚染株群

0.6％酵母エキス添加トリプトソイ寒天培地，酸の11株，およびEGD-e株をH２O２ および酸に曝露

曝露した菌の培養には0.6％酵母エキス添加トリ

した後の生残性を解析した。

プトソイ寒天培地を用いた。培地上に出現したコ

H２O２に対する応答性解析では，菌株を致死的

ロニー数から菌数を求め，生残率を算出した。

濃度のH２O２に20℃および37℃でそれぞれ，150分
間および30分間曝露して解析した。得られた生残３．結果と考察率をFig. 2AおよびFig. 2Bに示す。菌株間で生残3 . 1 豚肉由来持続汚染株のストレス暴露に対性を比較したところ，20℃では，豚肉由来株のように調査期間の後半に分離された菌株の生残性がする生残性
豚ひき肉から連続して分離された持続汚染株群

低くなる傾向が観察された。一方，37℃では顕著の９株およびEGD-e株をH２O２および酸に曝露しな多様性が観察されず，すべての菌株が高い生残

た後の生残性を解析した。

性を示した。

致死的濃度のH ２ O ２ に対する応答性の解析で一方，鶏肉由来持続汚染株群は高い酸感受性をは，菌株のストレスに対する曝露時間を20℃およ示した。すなわち，37℃，15分間の条件でpH2.5

び37℃でそれぞれ，120分間および30分間とした。

の酸性化BHIに曝露したところ，EGD-e株を含む得られた生残率をFig. 1AおよびFig. 1Bに示す。

すべての菌株が寒天培地上にコロニーを形成しな生残率を菌株間で比較したところ，豚肉由来持続かった。37℃，15分間の条件でpH3.0の酸性化

汚染菌株群は同一の血清型および遺伝子型に分類

BHIへの曝露では，72Ｃ３株を除くすべての菌株された一方で，H２O２曝露に対する生残性には著が寒天培地上でコロニーを形成しなかった一方，

しい多様性が観察された。また，20℃で相対的に72Ｃ３株は平均2.6log CFU/mlの減少が観察され© The Ito Foundation

16

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

-0.5

-1.0

-1.0

-1.5

-1.5
log (N/N0)(B) 0.0-0.5log (N/N0)(A) 0.0

-2.0
-2.5

-2.0
-2.5

-3.0

-3.0

-3.5

-3.5

-4.0

-4.0

-4.5

-4.5

Strain

Stain

-1

-1

-2

-2

-3

-3

log (N/N0)(D) 0

log (N/N0)

(C) 0

-4
-5

-4
-5

-6

-6

-7

-7

-8

-8

StrainStrainFig. 1 Survivals of persistent L. monocytogenes strains isolated from pork. The strains were subjected to lethal H２O２

at 20℃ for 120 min（A）or 37℃ for 30 min（B）, and to acidified HCl adjusted to pH2.5 20℃ for 120 min（C）or
37℃ for 15 min（D）.Counts of bacterial survival were transformed to logarithmic reduction based on the formula：log（N/N0）, where N is the bacterial density after time points of stress exposure and N0 is the initial bacterial
density.

たものの，菌の生残が確認された。さらに，72Ｃ

20℃，45分間曝露して得られた生残性を比較した

３株と同じ鶏肉から分離された72Ｃ５株の酸曝露

ところ，同様な傾向が観察された。

でも菌の生残が確認された。以上から，鶏肉由来

以上から，鶏肉由来持続汚染株は低いH２O２感持続汚染株群の間でも酸曝露への応答性に多様性

受性を示す一方，高い酸感受性を示すことが明ら

が 観 察 さ れ た 。次 に ，37 ℃，25 分 間 の 条 件 でかとなり，H２O２および酸感受性の間に関連性のpH3.5の酸性化BHIに曝露したところ，菌株すべない知見が得られた。これは食肉を取り扱う環境ての生残が確認された（Fig. 2D）。pH3.0で生残状態を反映している可能性がある。酸への曝露機性を示した72Ｃ３株および72Ｃ５株は，pH3.5で会が多いチーズの製造工程からは，酸に低感受性も他の菌株よりも高い生残性を示した。残りの菌のリステリアが分離されている８）。一方，生鮮食

株間で比較したところ，豚肉由来株群のように，肉を取り扱う環境では酸曝露の機会が少ないた

調査期間の後半に分離された菌株の生残性が低く

め，高い酸感受性のリステリアが長期間にわたっな る 傾 向 が 観 察 さ れ た 。ま た pH3.0 の BHI にて持続発育した可能性が考えられる。以上の知見© The Ito Foundation市販食肉より分離されたリステリアのストレス応答に関する研究

-0.5

-1.0

-1.0

-1.5

-1.5
log (N/N0)(B) 0.0-0.5log (N/N0)(A) 0.0

-2.0
-2.5

-2.0
-2.5

-3.0

-3.0

-3.5

-3.5

-4.0

-4.0

-4.5

-4.5

StrainStrain

(C) 1

(D) 0

0

-1

-1

-2

-2

log (N/N0)log (N/N0)

17

-3
-4

-3
-4
-5

-5
-6

-6

-7

-7

StrainStrainFig. 2 Survivals of persistent L. monocytogenes strains isolated from chicken. The strains were subjected to lethal

H２O２ at 20℃ for 150 min（A）or 37℃ for 30 min（B）, and to acidified HCl adjusted to pH3.0 20℃ for 45 min（C）
or that adjusted to pH3.5 at 37℃ for 25 min（D）.

は，食肉を取り扱う環境における酸の使用がリス
テリアの制御に有効な可能性を示唆している。し3 . 3 食肉由来持続汚染株のストレス応答性の総括

かし，72Ｃ３株のような相対的に低い酸感受性を本研究では，共通汚染源に由来すると示唆され示す菌株の存在は，生息環境が酸に曝露される機た持続汚染株群の間でストレス応答性に多様性の会があっても菌が生残できる可能性を示していあることを示した。このことは，リステリアのスる。しかし本研究では，ごく一部の条件で酸曝露

トレス応答性において菌株依存的に多様性があるを行ったのみであり，様々な条件での曝露検討がという報告を強く支持している10，11）。また，特に必要である。また，菌をあらかじめ弱酸で処理す

豚肉由来持続汚染株群のストレス応答性は著しいることで，致死的な酸曝露に対する生残性が増強

多様性を示した。以上の知見は，豚肉由来株およされるという報告があるため ，弱酸処理した持び鶏肉由来株が生息した環境の違いが影響してい続汚染株のストレス応答性も解析する必要がある。

るかもしれない。すなわち，豚肉由来株の生息し９）ていた環境の変化は著しく，それに伴いストレス
応答性の異なる菌株が出現した可能性がある。さ© The Ito Foundation

18

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

らに豚肉および鶏肉由来株群ともに，調査期間の後半に分離された菌株が低い生残性がみられたが，この理由については不明である。多様性の獲得機序として，生息環境の変化に伴って菌がストレス応答性を変えた，あるいは汚染源にいる菌の集団が，同一の菌型を示す一方でストレス応答性に多様性のある菌から構成されているなどの可能性が考えられる。
４．要約

リステリアによる食肉汚染率は他の食品よりも高いため，本菌による食中毒を予防するためには，食肉のリステリア汚染を制御することが有効と考えられる。我々は食肉由来リステリア菌株のストレス応答性が高い汚染率に関与している可能性があると考えた。本研究では，食肉から繰り返
し分離され，同一菌型に分類された持続汚染株群のストレス応答性を解析した。豚肉あるいは鶏肉から半年間にわたって繰り返し分離された一連の菌株を致死的濃度のH２O２および酸に曝露して生残性を検討した。それぞれの食肉から分離された菌株群間で，ストレス応答性に多様性が観察された。特に豚肉由来株群は，生残性の多様性が顕著にみられた。一方，鶏肉由来株は酸感受性の高く，食肉を取り扱う環境で酸に曝露される機会が少ないことが関連していると考えられた。以上から，食肉を取り使う環境で，酸をリステリア制御のために適用することが有用な可能性を示す一方，酸に対する応答性のさらなる解析が必要と考えられた。
文献１） Yamane, K., Suzuki, S., Shibayama, K.：
Estimation of listeriosis incidence in Japan based on
the laboratory data of MHLWʼs nosocomial infection
surveillance（JANIS）in 2008-2011. Infectious Agents
Surveillance Report，33，247～248，2012．
２） Okutani, A., Okada, Y., Yamamoto, S., Igimi, S.：

Overview of Listeria monocytogenes contamination in
Japan, International Journal of Food Microbiology，93，
131～140，2004．
３） Carpentier, B., Cerf, O.：Review-Persistence ofListeria monocytogenes in food industry equipment
and premises, International Journal of Food
Microbiology，145，1～8，2011．
４） Ochiai, Y., Yamada, F., Batmunkh, O., Mochizuki,M., Takano, T., Hondo, R., Ueda, F.：Prevalence ofListeria monocytogenes in retailed meat in theTokyo metropolitan area, Journal of Food
Protection，73，1688～1693，2010．
５） Ochiai, Y., Yamada, F., Mochizuki, M., Takano, T.,
Hondo, R., Ueda, F.：Biofilm formation under
different temperature conditions by a single
genotype of persistent Listeria monocytogenes
strains, Journal of Food Protection，77，133～140，
2014．
６） Ochiai, Y., Yamada, F., Yoshikawa, Y., Mochizuki,M., Takano, T., Hondo, R., Ueda, F.：Sequential
transition of the injury phenotype, temperaturedependent survival and transcriptional response in
Listeria monocytogenes following lethal H２O２
exposure, International Journal of Food
Microbiology，259，52～58，2017．
７） Chen, Y., Zhang, W., Knabel, S. J：Multivirulence-locus sequence typing identifies single
nucleotide polymorphisms which differentiate
epidemic clones and outbreak strains of Listeria
monocytogenes, Journal of Clinical Microbiology,
45，835～846，2007．
８） Faleiro, M. L., Andrew, P. W., Power, D.：Stressresponse of Listeria monocytogenes isolated fromcheese and other foods, International Journal of
Food Microbiology，84，207～216，2003．
９） OʼDriscoll, B., Gahan,C. G., Hill, C. ： Adaptive acidtolerance response in Listeria monocytogenes：
isolation of an acid-tolerant mutant which
demonstrates increased virulence, Applied andEnvironmental Microbiology，62，1693～1698，1996.
10） Adrião, A., Vieira, M., Fernandes, I., Barbosa, M.,
Sol, M., Tenreiro, R. P., Chambel, L., Barata, B.,
Zilhao, I., Shama, G., Perni, S., Jordan, S. J., Andrew,
P. W., Faleiro, M. L.：Marked intra-strain variationin response of Listeria monocytogenes dairy isolates
to acid or salt stress and the effect of acid or salt
adaptation on adherence to abiotic surfaces,
International Journal of Food Microbiology，123，142～150，2008．
11） Skandamis, P. N., Gounadaki, A. S., Geornaras, I.,
Sofos, J. N.：Adaptive acid tolerance response of
Listeria monocytogenes strains under planktonic andimmobilized growth conditions, International Journalof Food Microbiology，159，160～166，2012．

© The Ito Foundation

19

食品加工機器の信頼性と安全性向上のための基礎的研究
Basic study on improvement of food processing machine

小 茂 鳥

潤

（慶應義塾大学理工学部機械工学科）

Jun Komotori（Department of Mechanical Engineering, Faculty of Science and Technology, Keio University）

Atmospheric-controlled induction-heating fine particle peening（AIH-FPP）using Cr andMo shot particles in a N ２ atmosphere was introduced to improve the electrochemical
characteristics of AISI 316 austenitic stainless steel used for food processing machine. The
surface microstructure of the AIH-FPP-treated specimen was characterized using scanningelectron microscopy（SEM）and energy dispersive X-ray spectrometry（EDX）. AIH-FPP canbe used to form transferred and diffused layers of shot particles on the surface of austenitic
stainless steel. The thickness of the diffusion layers of Cr shot particles tended to increase withthe heating time in the AIH-FPP process, whereas the Cr concentration at the surface tended
to decrease. Electrochemical polarization tests were performed in 3 wt％ NaCl ＋ H２SO４ and20 wt％ NaCl environments at 343 K using a three-electrode electrochemical cell connected to
a computer driven potentiostat to examine the corrosion resistance of austenitic stainless steel
treated with AIH-FPP. The pitting potential of the AIH-FPP-treated specimen was higher
than that of the untreated specimen. In particular, there was clear improvement in the pitting
potential of austenitic stainless steel by AIH-FPP with Cr shot particles following peening withMo shot particles. AIH-FPP using Cr and M oshot particles in a N２ atmosphere is an effective
method of improving the electrochemical characteristics of austenitic stainless steel.

１．緒ていると思われる。我々の口に運ばれる食品の製論

造過程は，厳密に管理され十分な安全性が確保さ食肉の流通には，その加工プロセスの効率化をれるということは，消費者の立場からは当然と考追求する必要はあるが，安全性の確保が最も重要えていることである。しかしこの当たり前と考えな課題と言える。とくに，我々消費者は，レトルられている事柄に関しても，これを実現するため

ト食品など最近では加工された商品をよく手にすには，製造者側は多大なる努力を払っているもの

る。したがって，この製造プロセスの安全性確保と申請者は考えている。本申請は，我々の有するが重要と言える。

技術シーズを活用することで，その一助になるこ

最近では『食の安全』という言葉を耳にすることがあるが，この一語には，多くの意味が含まれとを期待して企画・立案したものである。
本研究では，食品加工機械に用いられる，圧延© The Ito Foundation

20

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

ローラやカッターを想定して，それに適した金属験 片 に 機 械 加 工 し た 後 ，一 方 の 端 面 を #320 ～表面の改質プロセスを提案することを目的とした#1200のエメリ紙により研磨した。この試験片を基礎研究を実施する。具体的にはまず，加工機械

IHコイルの内側に設置した後，粒子噴射ノズルの現状における問題点を，実際に機械を製造する（内径６mm）からＮ２ガスを供給し，チャンバー

会社とユーザーである食品会社を訪問して聞き取

内の雰囲気置換を行った。設置した酸素濃度計

り調査を実施しながら明確にする。なお，現状で（測定公差±0.3％）の数値が0.0％となったことをはすでに述べたとおり，耐食性，耐摩耗性および確認した後，Fig.２に示す熱サイクルでAIH-FPP

耐疲労性のさらなる向上が必要と考えている。つを施した。以後，AIH-FPPを施した試験片のシ

ぎに，実際カッターや圧延ローラに利用されていリーズ名を投射粒子－基材番号で呼称する。

る金属素材に対する表面改質を実施する。

Cr粒子を用いたAIH-FPPがステンレス鋼の耐微 粒 子 ピ ー ニ ン グ （FPP ： Fine Particle
Peening）は，圧縮残留応力の付与
粒の微細化

３，
４）

食 性 に 与 え る 影 響 を 調 べ る た め ，処 理 温 度

や，結晶1100℃，投射時間30ｓ，粒子投射後の加熱保持時が可能なことに加え，投射粒子の間０，25，60，100ｓで処理した試験片を準備した。

一部を被処理面に移着

５，６）

１，２）

させることができるた

め，材料表面の化学組成を変化させる簡便な表面

なお，粒子投射は投射圧力0.5MPa，粒子供給量
0.2g/sの条件で行った。

処理技術としても注目を浴びている。近年，工業

つぎに，Cr，Mo粒子を用いたAIH-FPPがステ

分野では新しい表面処理技術の開発への期待が高ンレス鋼の耐食性に与える影響を調べるため，処

まってきており，このFPPについても，既存の装理温度1100℃，各粒子の投射時間を30ｓとして，

置に対して種々の改良が行われている。とくに最一つの試験片に対して二度AIH-FPPを行った。

近提案された ，処理雰囲気を制御し，かつ被処投射比はCr：Mo＝９：１，
８：２とし，各投射

理材を加熱した状態でFPPを施すことが可能な雰

比につき粒子投射の順番を変えた試験片を作製し囲気制御高周波誘導加熱微粒子ピーニング（AIH-た。

７）

FPP：Atmospheric-controlled Induction-Heating

またCr，Mo粒子を用いたAIH-FPPが炭素鋼のFine Particle Peening）は，酸化スケールの形成

耐 食 性 に 与 え る 影 響 を 調 べ る た め ，処 理 温 度を抑制しつつ，被処理面に粒子移着層および拡散

1100℃，各粒子の投射時間を30ｓとし，投射比層を形成させることが可能である。本申請では，

Cr：Mo＝８：２でAIH-FPPの２段階投射を行っ

このAIH-FPPを用いて，金属製素材の表面改質た。

を行い，それを食品加工機器に利用することを想作製した試験片に対しては，電界放射型走査型

定して基本特性の評価を行う。ここでは，Cr，

電 子 顕 微 鏡（Field Emission Scanning Electron

Mo粒子を用いたAIH-FPPが炭素鋼の耐食性に及Microscope：FE-SEM），エネルギー分散型Ｘ線分

ぼす影響について明らかになった事柄を報告する。

光装置（Energy Dispersive X-ray spectrometer：
EDX），Ｘ線光電子分光装置（X-ray photoelectron

２．実験方法spectroscope：XPS），光学顕微鏡および微小硬被処理材には，機械構造用炭素鋼（S45C），

さ計を用いた分析を行った。被処理面の結晶構造

オーステナイト系汎用ステンレス鋼（SUS316）

分析には，Ｘ線回折（X-ray diffraction：XRD）を用いた。同材をφ5mm，厚さ４mmの円盤型試装置を用い，Ｘ線入射角度10°，Ｘ線源CuKa（波© The Ito Foundation

21

食品加工機器の信頼性と安全性向上のための基礎的研究

Fig. 1 Macroscopic view of AIH-FPP treated surface

Current density, mA/cm２

100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
-0.5

0

0.0

Potential, V v.s. Ag/AgCl
Fig. 2 Anoidic poralization curves

長0.154nm），電圧40kV，電流40mA，2θ＝20～

不動態域が得られた20％Mo－80％Crの投射比を90°の条件で行った。表面改質層の腐食特性の評

投射条件として設定した。Fig.１に各粒子投射後

価は，３電極法によるアノード分極試験によりの試験片のマクロ観察結果を示す。どちらの試験

行 っ た 。参 照 電 極 に は ，飽 和 カ ロ メ ル 電 極

片でも粒子が移着している様子が分かる。また，（Saturated Calomel Electrode：SCE）を ，対 極炭素鋼はステンレス鋼と比べ耐酸化性に劣る。そとしてはプラチナ電極を用いた。分極試験は，のため酸化の影響に敏感であり，２段階投射によ70℃の20％NaCl溶液中で行った。

る試験片への影響が懸念されたが，同図より，
Mo酸化物やCr酸化物に特有の緑がかった色は見

３．実験結果および考察

受けられなかった。

前項の結果から，CrおよびMo粒子を用いた

Fig.２に作製した試験片の腐食試験結果を示

AIH-FPPによってステンレス鋼の耐食性が大幅す。同図より，２段階投射を施した炭素鋼の動電に向上することが明らかとなった。そこで本項で位分極曲線は，安定した不動態域や明確な孔食電は，同処理を炭素鋼に対して適用し，耐食性に及位を示しておらず，電流密度が緩やかに上昇し続ぼす影響を調べることとする。

けていることが分かる。そのため，腐食の初期の

前項のステンレス鋼の結果から，最も安定した段階から隙間腐食が進展し続けた可能性が考えら© The Ito Foundation

22

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

れる。一方で急激な電流密度の立ち上がりがなは向上するものの，耐隙間腐食性能に課題を残す

かったことは，試験終了時まで，試験片表面の崩結果となったことが明らかとなった。

壊が起きず，Crの再不動態化が進んでいたことつぎに，粒子の投射ごとの断面の変化を追うたを示している。ステンレス鋼が不動態を維持でき

め，SEMおよびEDXによる断面観察を行った。

ない腐食環境下でも，隙間腐食が進展しきらな

Fig.４にその結果を示す。同図より，１段階目のかったことから，ステンレス鋼と比べて耐隙間腐処理後の断面観察結果より，Mo粒子が基材表面

食性能に劣る一方で，Cr不動態化能力に優れてに移着していることが分かる。また，この時点でいることが明らかとなった。

はMoの基材への拡散は進んでいないことが分か

つぎに，隙間腐食がどのように進展したのかをる。一方で，２段階目の処理後の断面観察結果よ調べるため，光学顕微鏡による断面観察を行っり，基材表面近傍の20μm程の範囲にわたって，た。Fig.３にその結果を示す。断面はこれまでとCrおよびMoの両方が含まれる層が創製されたこ

同様，ナイタールによるエッチングを施した。同とが分かる。

図より，基材最表面で拡散層の破壊が見られるほ

つぎに，この改質層についてより詳細な検討をか，拡散層直下で隙間腐食が進行していることが加えるため，改質層のある範囲で基材表面から深分かる。このことから，CrとMoの２段階投射をさ方向へのポイント分析を行った。Fig.５にその用いてAIH-FPPを施した炭素鋼は，Cr粒子のみ結果を示す。同図より，FeおよびCrの濃度が深を用いたAIH-FPPを施した炭素鋼と比べ耐食性

さ方向へと傾斜的に推移していることが分かる。

Fig. 3 Optical micrographs of corroded region

Mo

Fe

After Cr FPP

After Mo FPP

CrFig. 4 EDX maps analyzed at the longitudinal sections of the specimens© The Ito Foundation

23

食品加工機器の信頼性と安全性向上のための基礎的研究
100

Cr concentration, wt％

80
60
：Fe

40

：Mo
：Cr

20
0
0

4

8

12

16

20

Depth from surface of specimen, μm
Fig. 5 Depth-directional element concentration

このことからAIH-FPPによって，Cr元素が基材
表面から拡散していることが分かった。またMo
は，Crのような傾向はみられないことが分かる。
ここでマッピングの結果から，Crが基材最表面に，Moが基材最表面からやや下部を中心として分布していることが分かった。そのため，２段階
投射の影響により，移着したMo粒子の一部が，Crの衝突とともに基材と折り畳み変形を繰り返し内部へと押し込まれた可能性が考えられる。
４．要

約

本研究では，CrおよびMo粒子を用いたAIHFPPにより炭素鋼およびステンレス鋼の耐食性を改善することを試みた。また，主に耐食性の観点から検討・考察を加えた。その結果，CrおよびMo粒子を用いたAIH-FPPによって，炭素鋼にCr
およびMoの拡散層が形成されたことが明らかとなった。形成された拡散層により，基材のCr再文献１） Shiozawa, K., Lu, L.：Fatigue & Fracture ofEngineering Materials & Structures，25，813～822，
2002．
２） Ko, H. N., Itoga, H., Hasegawa, T., Kagaya, C.,
Nakajima, M.：Transactions of the Japan Society of
Mechanical Engineers（series A），68 ，484 ～ 490 ，
2002．
３） Takagi, S., Kumagai, M.：The Japan Society for
Precision Engineering，72，1079～1082，2006．
４） Todaka, Y., Umemoto, M., Watanabe, Y., Tsuchiya,
K.：Journal of the Japan Institute of Metals，67，
690～696，2003．
５） Kameyama, Y., Komotori, J., Shimodaira, E.：
Journal of Material Testing Research Association ofJapan，48，53～56，2003．
６） Kameyama, Y., Komotori, J.：Journal of Materials
Processing Technology，209，6146～6155，2009．
７） Ito, T., Kikuchi, S., Kameyama, Y., Komotori, J.,
Fukazawa, K., Misaka, Y., Kawasaki, K.：Journal of
the Japan Institute of Metals，74，533～539，2010．
８） Fukuoka, T., Ujiie, Y., Komotorim, J., Fukazawa,K., Misaka, Y., Kawasaki, K.：Effects of Processing
Parameters on Characteristics of Surface Modified
Layers Generated by Atmospheric Controlled IHFPP System, Procedia Engineering, Vol.10 ， 1503 ～
1508，2011．

不動態化力はステンレス鋼を上回る可能性がある
ことが明らかとなった。これらの結果は，申請者らが提案したAIH-FPP処理により耐食性の高い鋼の実現を示唆するものである。

© The Ito Foundation

24

食肉の高品位熟成に寄与する可食性蓄熱マイクロカプセルの開発
Preparation of edible thermal storage capsule for the high-quality aging of
meat

小

林

敬

（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻）

Takashi Kobayashi（Division of Food Science and Bitechnology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

Heat storage microcapsule containing oil would be a candidate for the improvement of theaging process of meat. To select the best oil for the thermal storage, the differential scanningcalorimetry（DSC）analysis of various plant oils（olive, coconut, palm kernel, and palm oils）
was performed. DSC analysis of coconut oil showed that peak for freezing was ca. 3.3℃,
indicating the best thermal storage of the aged meat would be coconut oil. The microcapsulecontaining coconut oil was prepared using a rotor-stator homogenizer through complex
coacervation by mixing coconut oil with gelatin and gum arabic at various oil contents. The
microcapsule was then crosslinked by transglutaminase. The scanning electron microscopy（SEM）of the prepared samples showed that the microcapsules with maximum diameter of
20μm were formed by coacervation. Coconut oil in each microcapsule showed higher freezing
point（ca. 11℃）than the pure one（3.3℃）by the DSC analysis. It would be due to the effect ofwall material（gelatin and gum arabic）. Because the sticky property of the microcapsule withhigher oil contents hindered well-handling, the highest oil content was practically 67％. The
heat storage capacity of the microcapsule was evaluated using a pseudo meat model in anenvironmental test apparatus. The capacity was much higher when the oil content was higher.
In addition, microcapsule also played a role as a thermal insulator due to the low heat
conductivity of the wall material. When the ambient temperature changed between －8 to
28℃, the microcapsule exhibited its heat storage capacity, and the temperature of the pseudomeat was kept between 5 to 23℃. Although the temperature range was relatively higher, thisresult indicates the applicability of the edible microcapsule to the heat storage.

１．目て，温度は常に変化しうる。この温度変化を最小的限にすることは，低コストで高品位な熟成肉を提近年，熟成肉が注目されるようになってきた。

供することに貢献できる。蓄熱材を利用すると，高品位な熟成肉を製造するためには，厳密な温度

温度変化を小さくすることができるが，現状で管理が重要となる。一方，加工や流通過程においは，食品用蓄熱材の開発は道半ばである。

© The Ito Foundation

食肉の高品位熟成に寄与する可食性蓄熱マイクロカプセルの開発

25

蓄熱材の主成分である相変化材料は，塩類など

ン（山梨）から購入した。トランスグルタミナーを含む無機系と，有機系材料に分類できる。有機ゼ（Activa TI，味の素）は，Modernist Pantry

系材料としては，パラフィン類などのアルカンが（Eliot, ME, USA）から購入した。そのほかの試頻用されている薬は和光純薬またはナカライテスク（京都）から。パラフィンは毒性が低く，

１～３）炭素鎖長に応じて広い温度範囲で利用できる，過購入した。

冷却度が小さい，安価であるなどの利点を有して

2.2

おり，服飾や建築系材料における相変化材料とし油脂またはマイクロカプセルを示差走査熱量分ては非常に適している 。これらの相変化材料を

析（DSC）に供した。DSCパンに１～８mgのサマイクロカプセルとして用いることで，融解時のンプルを入れ，クリンパによりシールした。これ

漏出などが防止できる。マイクロカプセルを作製

を次の条件によりDSC分析した。油脂の種類が多する際には，ポリスチレン５），アクリル樹脂６，７）

いため，分析開始温度および最低温度は油種に応やシリカゲルなどが包括剤として用いられる。

じて変化させた。20～60℃（油脂に依存）→－30～

一方，パラフィンの毒性は低いものの，食品用－50℃へ－２℃/minで降温；－30～－50℃で３途として利用することはできない。また，上述の分間保持；－30～－50℃→20～60℃へ２℃/min

包括剤も可食性とは言いがたい。そこで，動植物で昇温。

油を用いた相変化材料を可食性包括剤により包括

2.3化することで，食品加工用途に適した可食性マイ

ゼラチン13ｇに247mLの水を加え，約40℃に加クロカプセルの製造につながると考えられる。

熱して溶解し，５wt％のゼラチン溶液を調製し４）４）

示差走査熱量（DSC）分析

マイクロカプセルの調製

ゼラチンとアラビアガムを用いることで複合コた。別途，アラビアガム13ｇを247mLの水に溶解

アセルベートが形成される 。複合コアセルベー

した。40～50ｇのゼラチン水溶液にココナッツ油

トは強固な表面を持つ微粒子（マイクロカプセ

を2.5～40ｇ添加し，ゼラチン量の１～20倍量のル）であり，ゼラチンを含む場合には，トランス

ココナッツ油が含まれる液を調製した（ゼラチ

グルタミナーゼによって架橋を形成し，粒子の強ン：ココナッツ油＝１：１，
１：２，
１：３，
１：

度を改善できることが期待される。コアセルベー

５，１：10，１：20の各サンプルを用意した。以トに油脂を封入すれば，可食性物質のみからなる

下，１：１マイクロカプセルなどと表記する）。

マイクロカプセルを作製することができると考え

この液をローターステーター型ホモジナイザーられる。本研究では，これらの材料を包括剤とし（ポリトロン）を用いて，16000rpmで２分間撹拌て利用することで，蓄熱マイクロカプセルの作製

し，エマルションを調製した。ここで得られたエを試みた。さらに，作製したマイクロカプセルのマルションを撹拌しつつ，等重量（40～50ｇ）の

蓄熱性能の評価もあわせて実施した。

アラビアガム水溶液を徐々に添加した。次いで，

８）

２．方

法

2.1

料

材

0.1mol/L HCl を 徐 々 に 添 加 し ，撹 拌 し な が ら
pH4.0に調整した。室温で30分間撹拌を続けた後，４℃に冷却した。これにより，複合コアセルベー

ゼラチンおよびアラビアガムは和光純薬（大トとした。

阪）から購入した。オリーブ油，ココナッツ油，

コアセルベートにトランスグルタミナーゼを

パーム油，およびパーム核油はカフェ・ド・サボ

１％の終濃度となるように添加した。この懸濁液© The Ito Foundation

26

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）（control）とした。さらに，ココナッツ油を含まないコアセルベートを１：０マイクロカプセルとして，コアセルベート自体の影響の検証用とした。また，１：20マイクロカプセルはべとつきが大きいため，本検討の対象からは外した。
マイクロカプセルを充填したプラスチック
チューブを環境試験器（SH-642，ESPEC）に入れ，温度を変動させ，それに伴う疑似肉片の温度変化をデータロガー（GL242，グラフテック）で記録した。温度プログラムの設定は以下のとおり
Fig. 1 Schematic diagram for the evaluation apparatusof the heat storage microcapsule.

とした。15℃で保持（２時間），30℃へ昇温，30℃で保持（30分間），－10℃へ降温，－10℃で保持（30分間），30℃に昇温。次いで，降温と昇を４℃で一晩撹拌した。また，架橋剤の影響を評

温を再度繰り返した。最終的には，15℃の設定温価するために，トランスグルタミナーゼの代わり度を保持させた。実際の庫内温度は，データロに１％のグルタルアルデヒドを懸濁液に添加し，ガーで記録した。

４℃で一晩撹拌した。
これらの処理により得られた懸濁液を－30℃で３．結果と考察凍結させた。次いで，凍結乾燥機を用いて，懸濁3.1

液を凍結乾燥させた。得られた乾燥物をワンダー

オリーブ油，ココナッツ油，パーム油，およびクラッシャー（大阪ケミカル）を用いて粉砕し，パーム核油の融点および凝固点をDSCにより測マイクロカプセルを得た。

定した（Fig.２）。オリーブ油は－40℃付近に凝油脂のDSC測定

なお，必要に応じて，油脂を添加しないコアセ

固ピークを有し，－７℃付近で融解ピークを示し

ルベートも調製し，ココナッツ油の有無による影

た。一方，その他の油脂は－５～20℃の間に凝固響の評価に使用した。

による発熱ピークが観測された。また，融解によ

2.4マイクロカプセルの蓄熱性能評価

る吸熱ピークは，ココナッツ油およびパーム核油

Ｋ型熱電対をエポキシ樹脂に封入して約2.4ｇについては20℃付近に，パーム油については－20の疑似肉片（35mm×９mmφ）を作製し，蓄熱～40℃の広い範囲でなだらかな吸熱ピークが観測性能の評価に供した（Fig.１）。疑似肉片を50mLされた。これらの結果を合わせると，肉の熟成に容のプラスチック製遠心チューブに入れ，チュー

適した温度帯である１℃前後に発熱ピークを有す

ブ内を12.3～33.0ｇのマイクロカプセルで充填しる油脂としてココナッツ油が適していることが示た。なお，チューブ内に２ｇのシリカゲルを入れ，唆された。そこで，ココナッツ油を用いたマイク

吸湿を防ぐとともに，充填の際には約５mmの高ロカプセルの調製を試みた。

さから50回以上タッピングを行い，密に充填した。

3.2

マイクロカプセルの特性

プラスチックチューブ内にマイクロカプセルを粉砕前のマイクロカプセルをSEM観測した。

充 填 せ ず ，疑 似 肉 片 の み を 入 れ た も の を 対 照トランスグルタミナーゼ処理およびグルタルアル© The Ito Foundation

27

Exo

食肉の高品位熟成に寄与する可食性蓄熱マイクロカプセルの開発

Fig. 2 DSC thermograms for various plant oils and fats.

Fig. 3 Scanning electron microscope（SEM）images for the preparedmicrocapsules before milling. Images for microcapsule crosslinked bytransglutaminase at（A1）x220 and（A2）x2.00k；and those by
glutaraldehyde at（B1）x500 and（B2）x2.50k.

デヒド処理を施したマイクロカプセルのいずれに裂が確認された（Fig.３ A2）。これは，真空下においても，球状の粒子が観測され，粒径は最大でおけるココナッツ油の蒸発に起因するとみられ，20μm程度であった（Fig.３）。そして，架橋処理

マイクロカプセルが生成している証拠の１つと言の方法による明確な影響は認められなかった。まえる。

た，SEM観測の際に，真空下における粒子の破粉砕前にはいずれのマイクロカプセルからも油© The Ito Foundation

平成29年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Exo

28

Fig. 4 DSC thermograms for various microcapsules with different coconut

oil contents.

脂の漏出は確認できなかった。また，粉砕後におでは，11.9℃まで凝固ピーク温度が上昇した。含

いても，１：１，１：２，１：３，１：５の各マ油率が上昇するに従い凝固ピーク温度は低下し，イクロカプセルについては，油脂の漏出は認めら

１：20マイクロカプセルでは，10.2℃で凝固ピーれなかった。この場合，マイクロカプセルの含油クが観測された。このことから，包括剤であるゼ率は最大で67％であった。１：10および１：20マ

ラチンあるいはアラビアガムがココナッツ油の凝イクロカプセルには80％以上の油脂が含まれてお固における過冷却に影響を及ぼすことが示唆されり，粉砕により，油脂の漏出が起こった。その結た。

果，マイクロカプセルがべとつき，付着性の高い

3.4

粉体となったことから，67％（１：５マイクロカ

マイクロカプセルの蓄熱性能を評価するためプセル）が実用的な含油率と言える。そして，67に，空気中での疑似肉片（control）およびココ～80％の間に粉砕により油脂の漏出を招かない，

ナッツ油を含まないコアセルベート（１：０マイ

最大含油率が存在することになる。

クロカプセル）中での疑似肉片の温度変化もあわ

3.3

マイクロカプセルのDSC分析

蓄熱性能の評価せて測定した。Fig.５に各マイクロカプセルの蓄

ココナッツ油を含むマイクロカプセルのDSC

熱性能を示す。空気中（control）においても疑分析を実施した（Fig.４）。対照として，ココナッ

似肉片の有する熱容量の関係から，温度変化に遅ツ油のみも分析したところ，3.3℃付近で凝固にれが出た。また，１：０マイクロカプセルを用い伴う発熱ピークが観測され，凝固エンタルピーはた場合の結果ではさらに，温度変化が小さくなっ

102J/gであった。一方，１：１マイクロカプセル

た。一般に，蓄熱材などの相変化材料は熱伝導率© The Ito Foundation

食肉の高品位熟成に寄与する可食性蓄熱マイクロカプセルの開発

29

Fig. 5 Evaluation of the heat storage capacity of various microcapsules.

が小さい４，９）。これは，マイクロカプセルの熱伝

controlが28～－８℃の範囲で変化したが，マイ導率が小さく，その断熱能が現れた結果であるとクロカプセル中では20～２℃の範囲に収まった。

考えられる。

このことから，蓄熱マイクロカプセルは融解，凝ココナッツ油を含むマイクロカプセルを蓄熱評

固に伴う潜熱の出入りと，断熱能を兼ね備えるこ

価に供したところ，測定開始後25分付近で，約とで，食肉の温度変化を小さくすることに寄与で21℃での油脂の凝固による発熱が観測された。こきると考えられる。一方，マイクロカプセル化にれは，蓄熱能が発揮されたことを示唆している。

伴い，油脂の凝固点が上昇した。熟成肉の温度保一方，DSC分析より得られた結果（10℃付近）よ

持には，より融点の低い油脂を用いることが望まりも大幅に高い温度での凝固開始が観測されたこ

しく，今後の課題と言える。

とにもなる。これは，蓄熱マイクロカプセルの断熱能が，ココナッツ油の凝固と複合して現れた結４．要

約

ココナッツ油およびゼラチン，アラビアガムを果であると思われる。
また，マイクロカプセル中の含油率が高いほど用いてコアセルベートを形成させ，それをトラン

温度変化は遅くなり，温度の振れ幅も小さくなっ

スグルタミナーゼで架橋することにより，蓄熱マ

た。１回目の加温，冷却ステップ（２～3.5ｈ）

イクロカプセルを作製できた。このマイクロカプ

では，28～－８℃の範囲でcontrolは変動した。

セルは相変化に伴う潜熱の出入りと断熱能を併せ一方，１：５および１：10マイクロカプセル中で持っており，含油率が高いほど蓄熱能は高く，温の温度振幅は小さく，23～５℃の範囲に収まっ

度変化を小さくできた。その結果，本研究で検討た 。２ 回 目 の ス テ ッ プ（3.5 ～ ５ ｈ）で は ，したマイクロカプセルの作製方法は，可食性蓄熱© The Ito Foundation

30

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

マイクロカプセルの供給手段として有用なものであった。
文献１） Farid, M. M., Khudhair, A. M., Razack, S. A. K.,
Al-Hallaj, S.：A review on phase change energy
storage：materials and applications, Energy
conversion and management ，45（9），1597 ～ 615 ，
2004．
２） Zalba, B., Marín, J. M., Cabeza, L. F., Mehling, H.：
Review on thermal energy storage with phasechange：materials, heat transfer analysis andapplications, Applied thermal engineering ，23（3），251～83，2003．
３） Pielichowska, K., Pielichowski, K.：Phase changematerials for thermal energy storage, Progress inmaterials science，65，67～123，2014．
４） Zhang, H., Wang, X., Wu, D.：Silica encapsulationof n-octadecane via sol-gel process：a novel
microencapsulated phase-change material withenhanced thermal conductivity and performance,
J Colloid Interface Sci，343（1），246～55，2010．
５） Döğ üş cü, D. K., Altıntaş, A., Sarı, A., Alkan, C.：
Polystyrene Microcapsules with Palmitic-Capric

Acid Eutectic Mixture as Building Thermal Energy
Storage Materials, Energy and Buildings，2017．
６） Chaiyasat, P., Noppalit, S., Okubo, M., Chaiyasat,
A.：Innovative synthesis of high performance poly
（ m e t h y l m e t h a c r y l a t e ）m i c r o c a p s u l e s w i t hencapsulated heat storage material by
microsuspension iodine transfer polymerization （msITP）,Solar Energy Materials and Solar Cells，157，
996～1003，2016．
７） Alkan, C., Sarı, A., Karaipekli, A., Uzun, O.：
Preparation, characterization, and thermal
properties of microencapsulated phase changematerial for thermal energy storage, Solar Energy
Materials and Solar Cells，93（1），143～7，2009．
８） X i n g , F . , C h e n g , G . , Y a n g , B . , M a , L . ：Microencapsulation of capsaicin by the complex
coacervation of gelatin, acacia and tannins, J Appl
Polym Sci，91（4），2669～75，2004．
９） Li, M., Wu, Z., Kao, H., Tan, J.：Experimental
investigation of preparation and thermal
performances of paraffin/bentonite composite phasechange material, Energy conversion andmanagement，52（11），3275～81，2011．

© The Ito Foundation

31

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅲ）
Study on processing technology and characteristics of fermented meatproducts produced using lactic acid bacteria cultures for dairy products（Ⅲ）

根

岸

晴

夫

（中部大学応用生物学部）

Haruo Negishi（College of Bioscience and Biotechnology, Chubu University）

We have studied about the application of lactic acid bacteria（LAB）for yogurt into
fermented meat products, i.e. fermented pork jerky. The present study was conducted toelucidate the effect of co-cultivation with other LABs on fermentation rate of the selected
Lactobacillus single strains. The selected 11 strains of Lactobacillus groups were evaluatedduring incubation for 12 h in MRS broth or for 5-6 h in 10％ skim milk at 37℃．The
stimulation of growth of Lb. mucosae（ME-470）or Lactobacillus（Lb.）pentosus（ME-480）
was observed by the co-cultivation with other strains of Lactobacillus group in MRS broth.
The fermentation rate of 11 single strains of Lactobacillus group was generally promoted byco-cultivation with Streptococcus（St.）thermophilus. Especially, the co-cultivation of Lb. casei（ME-462），Lb. salivaricus（ME-465），Lb. zeae（ME-466）or Lb. pentosus（ME-480）with St.
thermophilus were effective in enhancement of fermentation rate in 10％ skim milk. Thesestrains are good candidates for investigation in meat to utilize as starter for the fermented
pork jerky.

１．目

sakei, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Pediococcus

的（Ped.）acidilactici, Lb. brevis, Lb. alimentarius,

乳酸菌の働きとして，有害菌の抑制作用のほLb. casei, Lactococcus lactis, Ped. Pentosaceus,

か，整腸，アレルギー症状の緩和，および免疫賦

Leuconostoc pseudomesenteroidesなどのホモ発酵型

活などの生体調節作用が報告されている 。近年，乳酸菌，およびStaphylococcus（Staph.）carnosus，

乳酸菌の利用は乳製品，野菜飲料，チョコレート，

Staph. xylosus, Staph. saprophyticus, Staph.

医薬品などのほか，歯磨きなど非食品分野へも拡

equorumなどのグラム陽性およびカタラーゼ陽性

大している。一方，食肉製品の分野では発酵ソー球菌である２）。発酵ソーセージでは，乳業界で汎セージに限定され，新たな食肉加工品への利用は用される乳酸菌の利用は少なく，プロバイオティ

みられない。一般に発酵ソーセージに利用される

クス機能への研究は進展していない。

１）

乳酸菌スターターとしては，Lactobacillus（Lb.）

本研究では，食肉加工への乳酸菌の利用技術を© The Ito Foundation

32

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

開発するために，典型的なヨーグルト用乳酸菌であ

みやかに－80℃に冷凍保管した。

るLb. delbrueckii subsp. bulgaricusとStreptococcus

St. thermophilusは，前報で示したように，再（St.）thermophilusを利用した食肉の発酵技術に

構成肉発酵ジャーキーに使用した乳酸菌スター

ついて研究を進めている。平成27年度の本助

ターのLb. bulgaricus/St. thermophilus混合乳酸

成研究では，再構成肉発酵ポークジャーキーの加菌末（DVS YC-380；Christian Hansen）から分工技術の開発とその特徴について報告した。平成

離して上記手順で凍結保存した。

３～５）

28年度７）は再構成発酵ジャーキーの品質に及ぼす

凍結菌株の賦活は次の手順で行った。凍結乳酸

乳酸菌の作用として，高齢者にとっても食べやす

菌株を解凍し，その１白金耳を15ml ppチューブ

いテクスチャーとするために，タンパク質分解活のMRS液体培地に接種した。37℃のインキュベー

性の高い乳酸菌の検討，および発酵ジャーキーのターに18時間培養した後，培養したMRS brothの

栄養成分の特徴を明らかにした６）。今年度は，昨

菌体を懸濁してから，その１白金耳を５ml MRS

年度の検討でタンパク質分解活性が比較的高い培地に接種し，37℃のインキュベーターで18時間

Lactobacillus属乳酸菌11種を選択し，食肉におけ培養して賦活した。

る発酵性や菌数を向上させることを目的として，

2.2

発酵速度に及ぼす共培養効果について検討を行っ

上記2.1で調製した乳酸菌含有MRS brothを未使用のMRS brothまたは10％脱脂乳培地に10％の

た。
２．方
2.1

乳酸菌の培養試験

割合で添加して培養した。MRS brothの場合は法

37 ℃，12 時 間 培 養 し ，２ 時 間 ご と に 培 養 中 の
MRS brothの濁度を600nmで測定した。10％脱脂

乳酸菌

Table１の11種類のLactobacillus属乳酸菌につ乳培地の場合は37℃，５―６時間培養し，培養開いて検討した。これらの乳酸菌株は前報同様の方

始２時間後，その後は１時間ごとに培養中の脱脂法 に 従 っ て 処 理 を し て 使 用 し た 。す な わ ち ，

乳のpHと酸度を滴定法で測定して滴定酸度としLactobacilli MRS broth（Difco Laboratories Inc.）て算出した。

で嫌気的に賦活培養（37℃，18時間）後に菌体を2.3

回収し，10％脱脂乳培地に懸濁し，使用時まです

MRS brothまたは10％脱脂乳で培養中の乳酸菌

Table１

乳酸菌の生育速度と発酵速度の評価

11 different species of Lactobacillus groups used for the experiment
Species

Strains

Species

Strains

Lb. gasseri

ME-459Lb. fermentum

ME-467

Lb. casei

ME-462

Lb. helveticus

ME-468Lb. plantarum

ME-463

Lb. mucosae

ME-470Lb. rhamnosus

ME-464

Lb. parabuchneri

ME-478

Lb. salivarius

ME-465

Lb. pentosus

ME-480Lb. zeae

ME-466

Lactobacillus groups

Streptococcus groups
St. Thermophilus

ST© The Ito Foundation

33

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅲ）の生育速度と発酵速度は，pHと酸度の経時的変のLactobacillus属乳酸菌株には共培養による生育化によって評価した。

性の向上効果はみられなかった（図省略）。

（１）pH測定3 . 2 Lactobacillus 属 乳 酸 菌 11 種 類 と St.

pH メ ー タ ー （SevenEasy ； Mettler Toledo,

thermophilusとの共培養効果

Greifensee, Switzerland）で培養液に直接電極を

Lb. delbrueckii subsp. bulgaricusとSt.

挿入して測定した。

thermophilusとの共生効果はよく知られており，（２）酸度測定

Lb. bulgaricusが産生するペプチド，アミノ酸を100mlビーカーに試料９ｇ，蒸留水９mlを採取

St. thermophilusが利用して代謝が促進され，一し，フェノールフタレイン溶液を指示薬として加方，活発になったSt. thermophilusから生成されえ，0.1N NaOH溶液で滴定を行った。滴定の終るギ酸，二酸化炭素がLb. bulgaricusに供与され点は試料の微紅色が30秒ほど保たれる点を限度とる関係にあり，それぞれの単株による培養よりもし，酸度は滴定量から次式により算出した。滴定

発酵速度は大きく高まる。この二つの菌の共生関終了時のpHは8.4程度である。

係は典型的なヨーグルトの製造に利用されてい酸度＝試料の滴定量（ml）×0.009×100（ｇ）／試料量（ｇ）
2.4

る 。そ こ で Lactobacillus 属 乳 酸 菌 11 種 類 と St.
thermophilusとの共培養効果について検討を行っ

乳酸菌数の測定

た。Table１で示したように，前述3.1で使用した乳酸菌数の測定は，BCP加プレートカウントア

８種類の乳酸菌にLactobacillus属３菌種（ME-

ガール（日水製薬，東京）を使用し，35―37℃，

459，467，468）を追加して培養試験を行った。

72±３時間培養して，形成した黄変集落を乳酸菌

発酵速度の評価は酸度の測定によって行った。

数として計測した。

その結果，Fig.２（c）（- m）に示したように，いずれのLactobacillus属乳酸菌もSt. thermophilus

３．結果と考察
3.1との共生効果がみられた。特に共培養効果が顕著

Lactobacillus属乳酸菌８種間の共培養効果

で あ っ た Lactobacillus 属 乳 酸 菌 と し て は ，Lb.

昨年度に検討した26種類のLactobacillus属の中casei （ME462）, Lb. salivaricus （ME465）, Lb.

から，10％脱脂乳培地および10％豚ひき肉／0.5％zeae（ME466），およびLb. pentosus（ME480）でグルコース／0.5％酵母エキス懸濁液中においてあった。この４菌種は単株で使用するよりもSt.

生 育 性 が 良 好 で あ っ た ８ 種 類 の 乳 酸 菌 株 ME-

thermophilusと共生させた方が，効率よく酸度が462，463，464，465，466，470，478，480につい上昇し発酵速度が速くなることが明らかになった。

て，それぞれ２種類を共存させたときの生育性に

これらLactobacillus属乳酸菌とSt. thermophilus

及ぼす効果を調べた。MRS broth培養中の菌数変との共培養の機構については不明であるが，Lb.

化は600nmでの濁度測定により行った。

bulgaricusとSt. thermophilusとの共生関係と類似

その結果，Lb. mucosae（ME-470）（Fig. 1（a））

した機構が考えられる。

と Lb. pentosus（ME-480）（Fig. 1（b）
）は 他 の

今後，豚肉の系における４菌種のLactobacillus

７種類のLactobacillus属乳酸菌と共存させること

属乳酸菌の発酵性を検討し，発酵ポークジャー

により生育性の向上効果が認められ，その効果のキーの乳酸菌スターターの候補として開発を進め

程度はME-480で大きかった。一方，残り６種類る。

© The Ito Foundation

34

平成29年度Turbidity (600nm）

3
2.5

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）(a) ME‒470 : Lb. mucosae

2
1.5
1

ME‒470, Single

0.5
0

0

6

ME‒462+ME‒470
ME‒465+ME‒470
ME‒478+ME‒470

Turbidity (600nm）

3
2.5

8
10
incubation Time (h)ME‒463+ME‒470
ME‒466+ME‒470
ME‒480+ME‒470

12
ME‒464+ME‒470
ME‒470, Single(b) ME‒480 : Lb. pentosus

2
1.5
ME‒480, Single

1
0.5
0

0

6

ME‒462+ME‒480
ME‒465+ME‒480
ME‒478+ME‒480

810Incubation Time (h)ME‒463+ME‒480
ME‒466+ME‒480
ME‒480, Single

12
ME‒464+ME‒480
ME‒470+ME‒480

Fig. 1（a）（，b） Effect of co-culture with Lactobacillus groups on the growth rate of

Lactobacillus single strain
（a）Lb.
mucosae（ME-470）single strain,（b）Lb. pentosus（ME-480）single strain

3.3

培養中の乳酸菌数の変化

共培養の効果が大きかったLb. casei（ME462）

４．要

約と効果が小さかったLb. helveticus（ME-468）に

本研究では，食肉加工への乳酸菌の利用技術をついて，St. thermophilusと共培養させた際の脱開発するために，典型的なヨーグルト用乳酸菌である

脂乳培地内の乳酸菌数の変化と酸度の変化についLb. delbrueckii subsp. bulgaricusとSt. thermophilusて測定した（Fig.３（n）（o），）
。培養を始めてかを利用した食肉の発酵技術について研究を進めて

ら酸度は経時的に上昇して行くが，いずれの菌にいる。食肉中での乳酸菌の発酵性や菌数を向上さ

ついても菌数レベルには大きな変化は認められせることを目的として，発酵速度に及ぼす共培養

ず，酸度が0.7％に達した時期に菌数が約10倍に効果について検討を行った。８種類のLactobacillus

増えた。以上より，酸度の上昇は菌数の増殖と必属乳酸菌から２種類を組み合わせた共培養の場

ずしもパラレルの関係にはないが，乳酸菌による合，Lb. mucosae（ME-470）とLb. pentosus（ME-

乳酸発酵の代謝は進行していることが示唆された。

480）は他の７種類のLactobacillus属乳酸菌との組み合わせによって共生効果が観察された。11種類のLactobacillus属乳酸菌とSt. thermophilusと© The Ito Foundation

35(c) ME459：Lb. gasseriME‒4590.8

ME‒459+ST

0.6
0.4
0.2

1

0

2

3
4
5
Incubation Time (h)6(d) ME462：Lb. caseiME‒462

0.8

Titratable Acidity0ME‒462+ST

0.6
0.4
0.2

1

0

2
4
Incubation Time (h)ME‒463ME‒463+ST

0.4
0.2
2

3

4

5

Titratable AcidityME‒467ME‒467+ST

0.6
0.4
0.2
0

0.4
0.2
0

1

1

2

3
4
Incubation Time (h)ME‒468ME‒468+ST

0.6
0.4
0.2
0

1

0

2

3
4
Incubation Time (h)134Incubatation Time (h)56(g) ME465：Lb. salivariusME‒465ME‒465+ST

0.6
0.4
0.2

1

0

2

3

4

5

6

(h) ME466：Lb. zeaeME‒4660.8

ME‒466+ST

0.6
0.4
0.2
0

1

0

2

3
4
Incubation Time (h)5(l) ME478：Lb. palabuchneri

0.8

ME‒478ME‒478+ST

2

3
4
Incubation Time (h)

0.6
0.4
0.2

5

(j) ME468：Lb. helveticus

0.8

0

0.8

0
0

Titratable Acidity

Titratable Acidity
Titratable Acidity
Titratable Acidity(i) ME467：Lb. fermentum

0.8ME‒464+ST

0.6

Incubation Time (h)1ME‒464

Incubatation Time (h)0.60(f) ME464：Lb. rhamnosus

0.85(e) ME463：Lb. plantarum

0.8

0

1

0

0

Titratable Acidity

Titratable Acidity

1

Titratable Acidity

Titratable Acidity

Titratable Acidity

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅲ）

1

0

5

(m) ME480：Lb. pentosusME‒4800.8

ME‒480+ST

0.6
0.4
0.2
0

5

0

2

3
4
5
Incubation Time (h)6(k) ME470：Lb. mucosae
ME‒4700.8

ME‒470+ST

0.6
0.4
0.2
0

0

2

3
4
5
Incubation Time (h)6Fig. 2（c）（m）
 Effect of co-cultivation with St. thermophilus（ST）on the fermentation rate of Lactobacillus single strains
（c）Lb.
gasseri ME-459，（d）Lb. pentosus ME-462，（e）Lb. plantarum ME-463，（f）Lb. rhamnosus ME-464，（g）Lb.
salivarius ME-465，（h）Lb. zeae ME-466，（i）Lb. fermentum ME-467，（j）Lb. helveticus ME-468，（k）Lb. mucosae
ME-470，（l）Lb. palabuchneri ME-478，（m）Lb. pentosus ME-480© The Ito Foundation

Titratable Acidity

1(n) Lb. casei (ME462) +ST
LAB (log cfu/g)

0.8

12

Acidity

10
8

0.6

6

0.4

4

0.2
0

1
Titratable Acidity

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

2
0

2

3
4
Incubation Time (h)56(o) Lb. helveticus (ME‒468) +ST
LAB (log cfu/g)

0.8

0

12

Acidity

10
8

0.6

6

0.4

4

0.2
0

LAB (log cfu/g）

平成29年度

2
0

2

3
Incubation Time (h)45LAB (log cfu/g）

360Fig. 3（n），（o）
 Changes in titratable acidity and LAB counts during co-cultivation of

Lactobacillus single strains with St. Thermophilus（ST）in 10％ skim milk.
（n）Lb.
casei（ME462）single strain,（o）Lb. helveticus（ME-468）single strainの共培養では，すべての組み合わせで，さらに大きな共生効果が観察された。特に共生効果が大き
い Lactobacillus 属 乳 酸 菌 と し て は ， Lb. casei（ME462）， Lb. salivaricus （ME465）， Lb. zeae
（ME466），およびLb. pentosus（ME480）であった。現在，この４菌種とSt. thermophilusとの組
み合わせについて，発酵ポークジャーキーの乳酸菌スターターとして検討中である。

文献１） 飯野久和，信田幸大：乳酸菌とビフィズス菌のサイエンス，第１版，京都大学学術出版会，京都，495～551，2010．
２） Feiner, G., Starter cultures. In “Meat products
handbook”（Woodhead Publishing Limited,
Cambridge），pp.327-331，2006．
３） 大橋勝太郎，根岸晴夫：日本畜産学会報，82，53～60，2011．
４） 大橋勝太郎，根岸晴夫：日本食品科学工学会誌，
59，447～455，2012．
５） Ohashi, K., Negishi, H.：Food Science andTechnology Research，20，679～685，2014．
６） 根岸晴夫：平成27年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，34，23～28，2016．
７） 根岸晴夫：平成28年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，35，46～51，2017．

© The Ito Foundation

37

オリーブ葉抽出液が食肉タンパク質の加熱ゲル物性
および嗜好性に及ぼす影響
Effects of olive leaf extracts on rheological properties and hedonic aspects ofmeat protein gel

小川雅廣・Agus Bahar Rachman・赤澤隆志（香川大学農学部応用生物科学科）

Masahiro Ogawa, Agus Bahar Rachman and Takashi Akazawa（Department of Applied Biological Science, Faculty of Agriculture, Kagawa University）

Olive leaf has been reported to contain a large amount of polyphenol which possesses highantioxidant activity. Olive leaf extract（OEx）was prepared from fresh olive leaves, and OEx
was applied to chicken breast sausage. OEx contains 13.8％（w/w powder）polyphenol as
gallic acid equivalent. Addition of 0.05 to 0.5％（w/w）OEx to minced meat increased themodulus of elasticity, coefficient of viscosity, and breaking stress strain of chicken sausage gel.
Those increasing effects were dependent on OEx concentration. 0.5％ OEx caused 100％
increase in modulus of elasticity，74％ increase in coefficient of viscosity, 67％ increase in
breaking stress, and 33％ increase in breaking strain. OEx also improved water-holding
capacity of chicken sausage. Sensory evaluation analysis of OEx-containing sausages showedthat sausage with 0.5％ OEx is more preferred than control sausage without OEx in terms offlavor, texture and overall impression. Furthermore, OEx was effective to prevent textural
deterioration occurring during frozen storage, showing that sausage with OEx exerts highfreeze tolerance. The improvement in rheological property of sausage gel was due tointeraction between polyphenol derivatives, such as decarboxymethylated form of
3,4-dihydroxyphenylethanol-elenoic acid dialdehyde（3,4-DHPEA-EDA）, named oleacein, andmuscle proteins, such as myosin. Decarboxymethylated form of 3,4-DHPEA-EDA havecarbonyl groups in the molecule, and those groups may interact with ɛ-amino groups and SH
groups of muscle protein; resulting in the enhancement of protein interaction. The above
results suggest that OEx can be a potential ingredient to improve the texture of chicken
sausage and to prevent textural deterioration of sausage induced by frozen-storage.

１．目

る。オリーブの産業利用は，果実を圧搾して得ら的れるオリーブオイルや塩漬けしたピクルスが中心

オリーブ（学名：Olea europea L.）はモクセである。一方，オリーブの葉っぱの利用は，オリー

イ科の常緑樹である。我が国におけるオリーブのブ茶や養殖魚（ハマチ）の餌として利用されてい栽培は香川県を中心に西日本各地で行われているものの，果実に比べると利用用途は少ない。オ© The Ito Foundation

38

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

リーブの果実と葉っぱの成分を比較すると，果実にはオイルが多量に含まれているのに対し，葉っぱにはポリフェノールが多く含まれている。大山
らの報告

１）

によればオリーブ葉には7.3～8.2％（w/w）のポリフェノールが含まれる。

２．方法

2 . 1 オリーブ葉抽出物の調製とポリフェノー
ルの分析法
オリーブ葉を25～40℃の温度で２日間乾燥し，近年，タンパク質ゲルの物性改良剤として天然

その後粉砕し，オリーブ葉乾燥粉末に対して10倍物由来のフェノール性化合物の利用が注目されて量（w/w）の純水を加え，４℃で１時間抽出をいる。具体的には，クロロゲン酸，カテキン，ケ

行った。この抽出液を遠心分離にかけ，上清を凍

ルセチンなど植物に含まれるポリフェノールがあ結乾燥機にかけて粉末を得た。この粉末をオリーげられる。ゼラチン，牛乳，大豆，卵白などの食ブ葉抽出物（OEx）として本実験に使用した。

品タンパク質に対して，クロロゲン酸などのポリOExのポリフェノール含量はFolin-Ciocalteu法

フェノールをアルカリ，過酸化水素，酸化酵素をで ，ま た Oleuropein 含 量 は ODS カ ラ ム（Shim-

使ってキノン体に変換させてから添加することpack CLC-ODS）を使ったHPLC分析により調べ

で，タンパク質分子とタンパク質分子を架橋させた。また，OExに含まれる成分の同定は（株）島タンパク質のもつ乳化安定性，泡沫安定性，ゲル

津製作所製のLC/MS（イオン化法はESI，カラムは形成性を改善することが報告されている 。ゲル

shim-pack-CLC-ODS25 CM（M）4.6×250mm ，形成性に関しては，没食子酸にポリフェノール酸

LC装置はLC-20AD，質量分析計はLCMS2020）化酵素（ラッカーゼ）を作用させて作った没食子

で行った。

２）

酸のキノン体をゼラチンゲルに添加するとゲル強2.2

度が高くなるとの報告がある 。また，茶葉から鶏むね肉の挽き肉200ｇに対し，純水40mL，食作られる緑茶，ウーロン茶，紅茶の抽出物を卵白

塩3.6ｇ，ポリリン酸1.0ｇ，ショ糖5.0ｇを加えミに加えて加熱した卵白ゲルは無添加のものよりもキサーで混合後，0.05～0.5％（w/w）の４種類の硬くなることが報告されている４）。茶葉のなかに濃度のOExを加え，再び混合した。その後，クレはカテキンなどのポリフェノールやその誘導体がハロンPVDCケーシング（φ17.5mm）につめて，多く存在することから，ポリフェノール関連物質

70℃で30分間加熱した。加熱後のソーセージを以がゲルの物性改変に寄与しているものと考えられ後の実験に供した。

３）

ソーセージの作製る。オリーブの葉には，茶葉や他の植物葉には存

2.3

ソーセージの物性測定

在しないオリーブ独自のポリフェノールが多量にソ ー セ ー ジ の 物 性 は ，ソ ー セ ー ジ を 直 径

含まれている。代表的なものにオレウロペイン

17.5mm，高さ10mmの円柱状に切ったものの破（Oleuropein）がある。本研究では，oleuropein

断強度測定とクリープ測定により評価した。破断などオリーブ特有のポリフェノールを多量に含む

強 度 測 定 は ゲ ル に 直 径 ３ mm の 円 柱 状 プ ラ ン

オリーブ葉抽出物（以後，OExと呼ぶ）を物性改

ジャーを1.0mm/secの速度で挿入し応力歪み曲線

良剤として鶏肉ソーセージに添加したときに，を得た。その曲線から破断応力と破断歪み率を算ソーセージのゲル物性および嗜好性にいかなる変出した。クリープ測定は，直径30mmの円盤型プ化が現れるのか調べることを目的とした。

ランジャーを10mm/secの速度で加圧し２分間かけてクリープ曲線を得て，その曲線より弾性係© The Ito Foundationオリーブ葉抽出液が食肉タンパク質の加熱ゲル物性および嗜好性に及ぼす影響

数，粘性係数を算出した。
2.4

39の４項目を評価してもらった。

ソーセージの水分含量，離水率，色調2.8

ソーセージの凍結融解

ソーセージの水分含量は１ｇのソーセージを加熱調理したソーセージを－20℃で１週間冷凍

105℃で恒量に達するまで加熱することによって保存し，解凍後にソーセージの物性と色調（白色求めた。離水率は円柱状に切ったソーセージゲル度）を調べた。この冷凍保存と解凍のサイクルををクリープ測定で使用したプランジャーで上から１サイクルとして，２サイクル，３サイクル，４

圧縮したときにゲルから漏れでた水分をろ紙に吸サイクル行った各ソーセージについても物性と色収させ，圧縮前後のゲルの重量を測定して求め調（白色度）を調べた。

た。ソーセージの色調はソーセージの内部をカッ2 .9

天然アクトミオシン（NAM）の調製

ターで切断した切り口の色を色差計（カラーアナ

鶏むね肉の挽肉から，水溶性タンパク質を除去

ライザー色差計TES-135Ａプラス，佐藤測定器社

後，0.6M NaCl-20mMリン酸ナトリウム緩衝液製）で測りＬ ，ａ ，ｂ 値を求めた。白色度は（pH7.0）で抽出を行い，抽出物に10倍量の純水を以下の式から求めた。

加えて沈殿させたものを天然アクトミオシン

＊

＊

＊

２
0.5
Whiteness＝100－［（100－Ｌ＊）＋ａ＊２＋ｂ＊２］

2.5（NAM）試料とした。
2 . 10NAMの表面疎水性測定

3.5mg/ml NAM溶液に0.05～0.5％（w/v）OEx

微細構造観察ソーセージの微細構造観察用の試料は，まずを添加後，NAMとOExの混合溶液の表面疎水性

ソーセージをグルタルアルデヒドで固定後，四塩を ， プ ロ ー ブ と し て 1-anililonaphthalene-8-化オスミウムで固定し，エタノールで脱水した。

sulphonic acid（ANS）を使ってBenjakulらの方

その後凍結乾燥を行った。ソーセージの微細構造

法５）に従って測定した。

の観察は，日本電子（株）の卓上走査電子顕微鏡

2 . 11（JCM-6000）で形態観察（高真空モード，加速2.10と同様の方法でNAM溶液とOExを混合後，

電圧：15kV，倍率：1000倍）した。
2.6

NAMの電気泳動

70℃30分間加熱した。このNAM溶液に，0.48M

ソーセージタンパク質の変性温度

NaCl，6.4M urea，１％SDSを加えて凝集したタ

加熱前のソーセージ原料100mgを試料セルに，ンパク質を溶解させた。その後，SDS-PAGEを

Al２O３100mgをリファレンスセルに加え，示差走
査熱量計（Setaram Micro-DSC VII, Caluire，フ行った。
2 . 12 天然アクトミオシンのアミノ基およびランス）で，昇温速度1.2℃/minで20℃から90℃まで測定した。
2.7

チオール基の定量
2.10と同様の方法でNAM溶液とOExを混合後，官能検査

2.11と同様の方法で加熱，溶解を行った。溶解後パネリスト15名（25～50歳，平均30歳，男女比のNAM試料の一級アミノ基量はオルトフタルア

率＝７：８）に，OEx無添加ソーセージ，0.1％

ルデヒド法，チオール基量はEllman法で測定した。

OEx添加ソーセージ，0.5％OEx添加ソーセージ

2 . 13 NAMと相互作用するOEx中の成分の特定の３種類のソーセージを，赤色灯を照射した官能５mg/ml NAM溶液に0.11％（w/v）OExを添検査室で提供した。パネリストには，３種類の加後，70℃30分間加熱した。NAMとOExの混合

ソーセージの味，食感，ジューシーさ，総合評価

液に，トリクロロ酢酸を加えタンパク質を沈殿さ© The Ito Foundation

40

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

せた。上清すなわちタンパク質と結合しないOEx

かった。弾性係数，粘性係数，破断応力，破断歪

画 分 の 成 分 を ，ODS カ ラ ム（Shim-pack CLC-

み率はいずれもOExの添加濃度を増やすにつれODS）を使ったHPLCにより分析（Abs280nm）し，て増加した。弾性係数は0.5％OExの添加で無添

NAMを混合しなかったOExのHPLC分析結果と加のものの2.0倍になった。粘性係数，破断応力，比較した。

破断歪み率はそれぞれ74％，67％，33％増加した。
水分含量もOExの添加によって若干ではあるが３．結果と考察高くなった。通常であればゲルの水分含量が高く

OEx添加ソーセージの物性と官能評価

なると，ソーセージゲルは柔らかくなるのが一般

本研究で使用したOExには１ｇのOEx粉末当的である。本研究でOExを添加した場合には水分たり没食子酸（GAE）換算で138mgのポリフェ含量は高くなったがゲルは柔らかくならなかっノールが含まれていたことから，OExのポリフェた。よって，OExにはソーセージの弾力性を向上

ノール含量は13.8％（w/w）になる。このOEx粉させ，粘性も高める作用があると言える。また，末を0.05～0.5％添加した鶏むね肉ソーセージを作

破断歪み率も高まったことから，OEx添加により製した。Table１に，ソーセージの白色度，水分壊れにくいゲルを作ることができると分かった。

含量，離水率，弾性係数，粘性係数，破断応力，

また，OExの添加により離水率が低下していたこ

破断歪み率を示す。白色度はOExを添加すると濃とから，ゲルの保水性も向上することが分かった。

度依存的に低下した。0.5％OExの添加で５％低OEx添加ソーセージの微細構造をFig.１に示下した。この白色度の低下は褐色を呈しているす。対照区のOEx無添加ソーセージと0.05％添加

OExが加わったことにより生じたものと思われソーセージではそれほど違いは観察されなかったる。水分含量はOExの添加によって増加する傾向

が，0.1％以上のOEx添加ソーセージでは違いがを示した。0.5％OExの添加で水分含量が３％増みられた。特に顕著な違いがみられた0.3％OEx

加した。離水率は水分含量の結果とは逆に，OExと0.5％OEx添加ソーセージでは無添加のものとの 添 加 に よ っ て 減 少 し た 。0.5 ％ OEx の 添 加 で比べてゲル組織が密になっていることが分かっ

13％減少した。このことよりOExを添加することた。このような物性や微細構造の違いにOExがどによってソーセージの保水性が高まることが分のように関わっているのかを知るために，DSCを

3.1

Table 1 Water content, expressible moisture, and rheologicalproperties of sausage containing OEx
Creep test

Breaking test

OEx（％）
added

Whiteness（％）

Water content（％）

Expressible
moisture（％）

Modulusofelasticity
E０（10４
N/㎡）

CoeficientofviscosityηN（10７
Pa･s）

Breaking
stress（10５
N/㎡）

Breaking
strain（％）

0.0（Control）

80.28

68.12±0.29ａ

12.31±0.50ａ

2.91±0.16ａ

1.61±0.12ａ

3.80±0.21ａ

43.96±0.81ａ

0.05

79.86

68.11±0.05ａ

11.74±0.04ｂ

2.96±0.13ｂ

1.90±0.15ｂ

4.09±0.35ｂ

47.97±0.75ｂ

0.10

78.24

68.51±0.18ｂ

11.20±0.01ｃ

3.53±0.13ｃ

1.98±0.14ｃ

5.39±0.35ｃ

57.74±1.67ｃ

0.30

76.42

69.69±0.18ｃ

10.80±0.21ｄ

4.56±0.13ｄ

2.79±0.09ｄ

5.81±0.75ｄ

57.79±1.01ｄ

0.50

75.29

70.36±0.08ｄ

10.69±0.12ｅ

5.86±0.11ｅ

2.80±0.14ｅ

6.37±0.30ｅ

58.39±0.03ｅ

Data are presented as mean±SD（n=6）and different superscript letters（a-e）indicate significant difference（P＜0.05）.

© The Ito Foundationオリーブ葉抽出液が食肉タンパク質の加熱ゲル物性および嗜好性に及ぼす影響
Control

0.3% OEx

0.05% OEx

0.5% OEx

41

0.1% OEx

Fig. 1 Microstructure of OEx-containing sausage observed by scanning electron microscopy
The magnification of images was 1000 times.

使って調べた。0.1％OExを含むタンパク質の変あったが，総合評価は若干低かった（Table２）。

性温度は無添加のタンパク質と変わらないが，

一方，0.5％OExを添加したソーセージは，ジュー

0.3％，0.5％OExを添加したタンパク質では，シーさは無添加のものよりも低い傾向がみられた

53℃付近のピークすなわちミオシンの変性温度がものの，フレーバー，食感の評価が高く，総合評

２℃ほど高くなっていた。この変性温度の上昇に価もよかった。0.5％OExと無添加のソーセージ

はOExのなかの何らかの成分とミオシンとの相とで特に大きな差は0.6ポイントの差がみられた互作用が関係していることが考えられる。

食感であったことから，食感の評価が上がって総OEx無添加のソーセージ，0.1％OEx添加ソー合評価がよくなったものと考えられる。

セージ，0.5％OEx添加ソーセージの３種類のソー3.2

セージの官能検査を実施した。0.1％OExを添加

OExを添加した鶏むね肉ソーセージの長期のしたソーセージは，フレーバー，ジューシーさ，

冷凍保存性を予測するために，－20℃での凍結融

食感（硬さ）が無添加のものよりも好スコアで解のサイクルを繰り返して，色調と物性を調べ© The Ito Foundation

OEx添加ソーセージの冷凍保存性

42

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 2 Sensory evaluation of chicken breast sausage containing OEx
OEx（％）added

Flavour

Juiciness

TextureOverall
impression

Control3.33±1.11ａ

3.53±1.12ｂ

3.40±1.24ａ

4.06±1.03ｂ

0.1％

3.60±0.98ｂ

3.60±0.91ｃ

3.60±0.91ｂ

3.86±0.83ａ

0.5％

3.86±0.99ｃ

3.46±1.12ａ

4.00±0.92ｃ

4.20±0.96ｃ

Flavour was asked using a five-scale（1 to 5）with 1 “very-odd” and 5 “very-typical”；juiciness, with １ “not-juicy” and 5 “highlyjuicy”；texture, with 1 “very-soft” and 5 “very-firm”；and overall impression, using a Likert five-scale（1 to 5）with 1 “nonacceptable” and 5 for “highly-acceptableʼ. Data are presented as mean ± SD（n=15）and different superscript letters（a-c）indicate
significant difference（P＜0.05）.Photos shown below shows the samples provided to panelists.

Control

0.1% OEx

0.5% OEx

た。ソーセージの白色度はOExの添加の有無に関0.1％OExの添加で表面疎水性は２倍，0.5％OEx

わらず，凍結融解を繰り返すごとに低下していっ

添加で約4.5倍に増加した。この表面疎水性の向た。また，減少率はいずれのOEx濃度を含むソー上にはタンパク質分子間の相互作用も関与していセージでもほぼ変わらなかった。凍結融解後のることが考えられる。そこで，OEx存在下でのソーセージの破断強度も調べた。OEx無添加の

NAMのSDS-PAGEを行った。SS結合を還元しな

ソーセージは４サイクル（４週間で４回）の凍結

いままのNAMのSDS-PAGEでは，OEx無添加の融解を繰り返すことによって，破断応力が34％減

NAMはミオシン重鎖（約200kDa），アクチン（約少，破断歪み率が14％減少したのに対して，0.1％

40kDa）のバンドがみられたのに対し，OExを添

OExおよび0.5％OExを添加したソーセージでは，加したNAMではミオシン重鎖のバンドがみられ破断応力，破断歪み率の低下はほとんどみられななかった（Fig.２の－Reducing agent）。また，

かった。このことより，OExを添加することで冷いずれのNAMにも分離（下層）ゲルの最上部

凍保存によって起こるソーセージの物性変化を抑（泳動開始点）にバンドが認められた。泳動開始

制できることが分かった。

点のバンドは分子量が400kDa以上の高分子量で3.3

OExとタンパク質の相互作用あることを意味しており，通常はミオシン重鎖のOExの添加によって鶏むね肉ソーセージの物

重合体がそこに現れる。この泳動開始点のバンド性は著しく変化した。この物性の変化にはゲル形

は，OEx添加NAMの方が無添加のNAMよりも成に関わるタンパク質の物理化学的性質の変化が太いことから，OExの添加はミオシン重鎖の重合伴っていることが考えられる。そこで，まずOExを促進することが示唆された。

を加えたNAMの表面疎水性を調べた。OExを加一方，SS結合を還元したNAMでは，非還元のえるとNAMの表面疎水性は著しく向上した。

NAMのSDS-PAGEとタンパク質バンドに違いが© The Ito Foundationオリーブ葉抽出液が食肉タンパク質の加熱ゲル物性および嗜好性に及ぼす影響+Reducing agent‒Reducing agent

1

2

3

4

5

43

6

7

8

9

10

11

kDa

MHC

198
112
87
59
47

Actin

33
27
20

Fig. 2 SDS-PAGE patterns of OEx-containing NAM that was heated at 70℃

Lane 1, molecular weight marker ； lanes 2 and 7, control ； lanes 3 and 8, 0.05 ％OEx ； lanes 4 and 9, 0.1 ％ OEx ； lanes 5 and 10, 0.3％ OEx；lanes 6 and 11, 0.5％
OEx. Samples after reduction using β-mercaptoethanol were loaded in lanes
7-11．MHC is myosin heavy chain.

みられた（Fig.２の＋Reducing agent）。OEx無

りも低かった。しかも両官能基の減少量はOExの添加NAMでは，ミオシン重鎖に相当する太いバ

濃度を増やすほど大きくなり，0.5％OExの添加

ンドは認められたが，泳動開始点にはほとんどバでSH基は94％，アミノ基は82％減少した。このン ド が み ら れ な か っ た 。こ の こ と は ，非 還 元

ようにOExによってSH基と一級アミノ基が顕著

NAMにみられた泳動開始点のバンド，すなわちに減少していたことより，ミオシン重鎖のシステ

ミオシン重鎖の重合体の正体はすべてSS結合をイン残基の側鎖のSH基およびリジン残基の側鎖介した架橋であることを示す。一方，OEx添加のアミノ基が架橋に関わっていることが示唆されNAMでは，ミオシン重鎖に相当するバンドのほた。

かに，泳動開始点にも太いバンドが観察された。

3 . 4 タンパク質の架橋に関わるOEx成分の特定

以上の結果より，OEx添加により形成されたミオ

OExの添加によって食肉のゲル化因子ミオシ

シン重鎖の重合体は，一部がSS結合を介した架ン分子（重鎖）と別のミオシン分子（重鎖）が架橋であるが，大部分はSS結合以外の架橋による橋を形成し，重合していることが分かった。そこものであることを意味している。よって，OExにで，OExに含まれるどの成分がミオシンの重合によって引き起こされるタンパク質の相互作用は関与しているのかを調べた。Fig.３にNAMを混

SS結合以外の架橋結合によると分かった。OEx

合 す る 前 の OEx の HPLC ク ロ マ ト グ ラ ム と ，を添加したNAMのSH基と一級アミノ基量を調べ

NAM を 混 合 後 に NAM タ ン パ ク 質 を 除 去 し た

たところ，両官能基の含量はOEx無添加のものよOEx画分のHPLCクロマトグラムを示す。NAM© The Ito Foundation

44

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

90

A280nm (arbitary unit)

80

Ⅱ

70
60
50

Ⅲ

Ⅰ

40

Ⅳ

30
20
10
0
-10

0

10

20

30

40

50

60

Retention Time(min)Peakm/z（negative-ion mode）

Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ

377
403
555
319
539
539

Phenolic compound
Carboxymethylated form of 3,4-DHPEA-EDA
Oleoside methylester/Elenolic acid glucoside
Hydroxyoleuropein
Decarboxymethylated form of 3,4-DHPEA-EDA
Oleuropein
Oleuropein isomer/Oleuroside

Fig. 3 HPLC chromatogram of OExtreated with NAM

Dotted line represents chromatogram of OEx without NAM and solid line,chromatogramof OEx with NAM.

との混合前のOExのクロマトグラム（Fig.３の点

後にタンパク質を除去したOEx画分のクロマト線）において，最も大きなピークは，49.27minのグラム（Fig.３の実線）をみると，全体的なピーピークⅡであった。このピークの成分は質量分析

クパターンは，NAMと混合前のOExの溶出パ

m/z 319であったことから，Decarboxymethylated

ターンと類似しているが，全体的にピークの高さ

form of 3,4-dihydroxyphenylethanol-elenoic acidと面積は小さかった。最も面積の減少が大きかっ

dialdehyde（3,4-DHPEA-EDA）（別名：Oleacein）

たのはピークⅡであったことより，ミオシンなどと推定された。二番目に大きかったのは49.69min

NAMタンパク質と最も多く結合するのはピークの ピ ー ク Ⅲ で ，m/z 539 で あ っ た こ と か ら ，Ⅱの成分Decarboxymethyl form of 3,4-DHPEA-

Oleuropeinと推定された。三番目に大きかったの

EDAであると言える。この化合物は脱カルボキは，46.95minのピークＩで，m/z 555，403，377

シメチル型のオレウロペインアグリコンで，分子をもつ三つの分子イオンピークが認められたこと

内に３つのケトン基をもつ。これらのケトン基がより，Hydroxyoleuropein, Oleoside methylester/

ミオシンのリジン残基の ɛ アミノ基やシステイン

Elenolic acid glucoside, Carboxymethylated form

残基のSH基と反応して，ミオシン重鎖間での重of 3,4-DHPEA-EDAの混合物が含まれていると合を引き起こし，その結果，硬くて粘度の高い密予想される。四番目に大きかった50.44minのピー

なネットワーク構造もったソーセージゲルが形成

クⅣは，m/z 539であったことからOleuropeinのされたと推察される。

異性体であると推定される。一方，NAMを混合© The Ito Foundationオリーブ葉抽出液が食肉タンパク質の加熱ゲル物性および嗜好性に及ぼす影響

４．要約

本研究では，オリーブ葉の水抽出物OExを加えたソーセージの性質を物理化学的手法および官能検査により評価した。OExを添加することにより，白色度は低下したが，水分含量は若干上昇した。物性については，OExを添加することでソーセージは硬くなり，保水性も向上した。官能検査の結果も0.5％OExを添加することで，食感（硬さ）の評価が向上し，その結果として総合評価も向上した。ソーセージを冷凍保存したあとの物性を調べたところ，OEx添加ソーセージは無添加のものよりも冷凍保存しても変質しにくいことが明らかとなった。以上のことよりOExの添加は多少の着色をもたらすものの，ソーセージなど食肉ゲ
ル状食品の物性改良剤として有用であり，冷凍45

文献１） 大山憲一，柴﨑博行，大西茂彦，柴田英明，小川雅廣：香川県産飼料用オリーブ葉のポリフェノール
含量に及ぼす保存方法の影響，日本食品科学工学会
誌，63，570～574，2016．
２） Liu, F., Ma, C., Gao, Y., McClements, D.J.：FoodGrade Covalent Complexes and Their Application as
Nutraceutical Delivery Systems：A Review,
Comprehensive Reviews in Food Science and Food
Safety，16，76～95，2017．
３） Yan, M., Li, B., Zhao, X., Yi, J.：Physicochemical
properties of gelatin gels from walleye pollock（Theragra chalcogramma）skin cross-linked bygallic acid and rutin, Food Hydrocolloids，25，907～
914，2011４） Hatanaka, Y., Yamaguchi, A., Kobayashi, O.,
Muro, T.：Electron Microscopic Analysis of theEffects of Tea Extract on Strength Improvement of
Egg White Gels, Food Science and Technology
Research，15，5～10，2009．
５） Benjakul, S., Seymour, T.A., Morrissey, M.T., An,
H.：Physicochemical Changes in Pacific Whiting
Muscle Proteins during Iced Storage, Journal of
Food Science，62，729～733，1997．

ソーセージの品質保持にも役立つことが明らかとなった。

© The Ito Foundation

46

食肉加工品のコク味増強を可能とするグルタチオン
アナログの発酵生産法の開発
Development of a fermentative production method of glutathione analogs

伊

藤

智

和

（名古屋大学大学院生命農学研究科）

Tomokazu Ito（Department of Applied Molecular Biosciences, Graduate
School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

Recently, glutathione analogs are reported to act as kokumi substances, which capable ofenhancing the intensities of salty, sweet and umami tastes, by binding to the calcium-sensing
receptor. These analogs have the potential for use in the food industries as the food taste
modifier and/or enhancer. An efficient method for the production of these analogs enable theindustrial application of these compounds. In this study, we tried to develop an efficient
production method of γ-glutamyl-valyl-glycine（γ-EVG）, the most potent kokumi substancereported so far. This report shows that an engineered Escherichia coli cells that overexpresses
mutated γ-glutamyl-cysteine synthase（gshA）and glutathione synthase（gshB）facilitated theefficient production of γ-EVG.

１．目

ン酸，OA）が報告された。このようなコク味化

的

合物は，食肉加工品を含めた食品の呈味向上に寄

コク味とは，それ自体は呈味を示さないもの

与するのみではなく，おいしさを維持したまま，の，甘味，塩味，酸味，苦味，うま味の基本５味

食品中の塩分，脂肪分，糖質の制限を可能にし，の「味の持続性」「ひろがり」「厚み」を増強する

また，製造現場においては，品質向上やコストダものと定義される。近年の研究によって，コク味

ウンも可能とする。また，減塩やカロリーオフをがカルシウム感知受容体（CaSR）を介して認知

介して，我々の健康増進，さらには食料問題にもされることが見出され，このアゴニストとして，貢献可能な有用な食品添加物質候補であると予想

グ ル タ チ オ ン（γ-Glutamyl-cysteinyl-glycine）

される。

や，その類縁体のγ-グルタミルペプチドが同定

これら化合物を産業用途で利用する際には，化された 。さらにグルタチオンと比べ，数倍から合物の安価かつ安定的な供給が要求される。前述

10倍以上のCaSR活性化能を有する化合物として，したγ-EVGやOAは，現在市販品が入手可能で

γ-Glutamyl-valyl-glycine （γ-EVG） や， γ

あるが，きわめて高価である。この要因として，-Glutamyl-2-aminobutyryl-glycine（オフタルミ

市場規模の問題もあろうと思われるが，現状で化

１）© The Ito Foundation

食肉加工品のコク味増強を可能とするグルタチオンアナログの発酵生産法の開発

学合成品のみが利用可能である点があげられる。
我々は最近，ある種のE. coli欠損株が菌体内にOAを高濃度蓄積することを見出し２），同菌をプ
ラットフォームに用いたOA生産法を開発してき47

３．結果と考察3 . 1 E.coliを用いたオフタルミン酸合成系の改良によるγ-EVG生産性の付与た 。本研究では，当該微生物を用いた，他のグ申請者らは先行研究によって，E. coli ⊿yggS

ルタチオンアナログ，特にγ-EVGの新規な発酵⊿ggt ⊿miaA 三 重 欠 損 株 （⊿YGM） に GshA

生産法を開発することを目的とし研究を行った。

（S495F）およびGshBを共発現させた株を用い，

３）

２．方

これを１mMのGlu，2-aminobutyrate，Glyを含法

んだＭ９培地で培養することで，約0.3 mMのオγ-EVGの生産には，グルタチオンを含めた

フタルミン酸が生産法可能となることを報告してγ-グルタミルペプチドの分解能を減弱させ，Valいる３）。そこで，オフタルミン酸生産と同様のスおよびATP生産量を増強させたE. coli ⊿yggS⊿

トラテジーを用い，γ-EVGの生産が可能か検証

ggt⊿miaA三重欠損株（⊿YGM）に，E. coli由した。上記菌株を１mMのGlu，Val，Glyを含む

来GshAの各種変異体およびGshBをpCA24Nベク

Ｍ９培地で培養したが，γ-EVGの生産は認めら

タ ー に よ っ て 共 発 現 さ せ た 株 を 用 い た ３）。

れなかった。Hibiら４）によって報告されたGshA

γ-EVG は 過 剰 発 現 さ せ た 変 異 型 GshA お よ びの結晶構造の活性中心付近の構造を子細に検証す

GshBによってGlu，Val，Glyより菌体内で合成さると，この活性中心にはγ-EVのVal側鎖を収容れ，培地中へ排出される（Fig.１）。各種E. coli

できるだけの十分なスペースがないことが示唆さ

株は，30μg/mlのクロラムフェニコールを含むれた（Fig.２）。そこで，活性中心空間の拡張を

LB培地中で一晩培養し，PBSリン酸バッファーで洗菌した後に，１mMのGlu，Val，Glyおよび

L -Glu + L -Val

0.1 mM IPTGを含むＭ９最少培地中に初期OD600

ATPが1.0となるように植菌した。30℃にて24時間振

GshA
ADP

とう培養した後の培地中に生産されたγ-EVG濃
度 を HPLC を 用 い て 定 量 し た 。本 研 究 で は ，GshA ，GshB 共 発 現 ベ ク タ ー 上 の GshA の ，γ-EVのVal側鎖収容に関与すると予想されたＩ

γ‒Glu‒Val (γ‒EV)

135とＱ144，およびフィードバック阻害および酵ATP

素活性に関与すると予想されたＳ495に各種変異

GshB
ADP

を導入することで，γ-EVG生産能の付与，およびその生産性の向上を図った。また，前培養条件等の検証により，GshAおよびGshBの発現量増大法について検証するとともに，Ｍ９培地中の金属イオンがγ-EVG生産性へ与える影響についても検証した。

γ‒Glu‒Val‒Gly (γ‒EVG)
Fig. 1 Synthetic pathway of γ-EVG

The abbreviations are as follows；GshA, glutamate-cysteine ligase；GshB, glutathione synthase© The Ito Foundation

48

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Wild‒type
Tyr300

Tyr300Gln298Tyr241Gln298Tyr241
Tyr131
Leu135

Gln144Tyr131
Leu135

Gln144

L135I/Q144N
Tyr300

Tyr300Gln298Tyr241Gln298Tyr241
Tyr131

Asn144

Ile135

Tyr131
Ile135

Asn144

Fig. 2 Stereoview of the residues surrounding the Cys-analog moiety of sulfoximine-based inhibitor of wild-type GshA

and the putative structure of L135I/Q144N mutant of GshA. The sulfoximine-based inhibitor was represented ingreen. Mutated residues were shown in gray. The putative space that accommodate the Val side chain of γ-EV iscircled. The pictures were generated by using Pymol software（http://www.pymol.org）（PDB ID：1VA6, see（4））

Table１ Mutants of GshAs used in this study
The following mutations were introduced into the gshA
gene of the GshA and GshB co-expression plasmid.
Strain No.

Mutations on GshA

１

S495F

２

L135I/Q144N/S495F

３

L135I/Q144N/S495I

４

L135V/Q144N/S495F

５

L135M/Q144N/S495F

６

L135S/Q144N/S495F

７

L135I/Q144D/S495F

８

L135I/Q144V/S495F

９

L135I/Q144I/S495F

10

L135S/Q144A/S495F

11

L135I/Q144S/S495F

12

L135I/Q144T/S495F(kDa)
97-66--

←GshA

45--

←GshB

31-21--‒ IPTG+ IPTG

Fig. 3 Effect of cultivation condition on the expression

levels of GshA and GshB. The E. coli ⊿ YGM strain
harboring pCA24N-GshA（L135I/Q144N/S495F）-GshB were precultured in the LB medium
containing Cm in the absence （-IPTG）or presenceof 0.1 mM IPTG （+IPTG）， IPTG in the preculture
significantly induced the expression leves of GshA
and GshB.

© The Ito Foundation

49

食肉加工品のコク味増強を可能とするグルタチオンアナログの発酵生産法の開発

Table 2 Effect of GshA mutations and medium on γ-EVG productivity
E. coli ΔyggSΔggtΔmiaA that harbors mutated GshA and GshB co-expression plasmid were precultured in LB medium
in the presence or absence of 0.1 mM IPTG.
The cells were washed with PBS and inoculated to the M9 medium containing 1 mM Glu, Val and Gly and 0.1 mM IPTG.
The M9（Mn２＋）indicates the replacement of MgSO４ with MnCl２．
Strain No.
１
２

Mutations on GshA

Medium of preculturing

S495F
L135I/Q144N/S495F

LB
LB

Medium of culturing
M9＋E/V/G
M9＋E/V/G

γ-EVG productivity
（μM）
N. D.
10

２

L135I/Q144N/S495F

LB＋IPTG

M9＋E/V/G

87

２

L135I/Q144N/S495F

LB＋IPTG

M9（Mn２＋）＋E/V/G

240

３

L135I/Q144N/S495I

LB＋IPTG

M9＋E/V/G

167

３

L135I/Q144N/S495I

LB＋IPTG

M9（Mn２＋）＋E/V/G

222

４
５

L135V/Q144N/S495F
L135M/Q144N/S495F

LB＋IPTG
LB＋IPTG

M9＋E/V/G
M9＋E/V/G

60
35

６

L135S/Q144N/S495F

LB＋IPTG

M9＋E/V/G

N.D.

７
８
９
10
10

L135I/Q144D/S495F
L135I/Q144V/S495F
L135I/Q144I/S495F
L135S/Q144A/S495F
L135S/Q144A/S495F

LB＋IPTG
LB＋IPTG
LB＋IPTG
LB＋IPTG
LB＋IPTG

M9＋E/V/G
M9＋E/V/G
M9＋E/V/G
M9＋E/V/G
M9（Mn２＋）＋E/V/G

N.D.
15
N.D.
154

11
12

L135I/Q144S/S495F
L135I/Q144T/S495F

LB＋IPTG
LB＋IPTG

M9＋E/V/G
M9＋E/V/G

290
78
N.D.

目的とし，活性中心を構成するＬ135およびＱ144を有するGshAおよびGshBの発現株は１mMのに，L135IおよびQ144N変異を導入した（Table１，

Glu，Val，Glyを含むＭ９培地で87μMのγ-EVG

Fig.２）。L135I/Q144N/S495F変異を有するGshAの生産が可能となった（Strain no.2，Table２）。

およびGshBの共発現プラスミドを有する⊿YGM

3 . 1 Ｌ135，Ｑ144，Ｓ494の変異によるγ-EVG

株は，１mMのGlu，Val，Glyを含むＭ９培地での生産性の増強

10μＭのγ-EVGを生産した（Strain no.2，Table

前述したようにＬ135およびＱ144がγ-EVGの２）。Ｌ135およびＱ144がγ-EVGの生産におけ

生産におけるホットスポットである可能性が示唆

るホットスポットである可能性が示唆された。

された。また，先行研究においてＳ495はGshAの

しかしながら，このγ-EVGの生産量はほぼ同

フィードバック阻害に関与し，S495F変異によっ様のプロトコールによって行われたオフタルミンてその脱感作が可能となることが示されてい３）酸の生産量（～300μM，）と比べ著しく低かっる３）。そこで，GshA，GshB共発現プラスミド上た。この要因を検証したところ，本株において，のGshAのＬ135，Ｑ144，Ｓ495に各種変異を導入

GshAおよびGshBの発現量が低い可能性が示唆さした。なお，今回作成した変異株は前述のL135I/

れた（Fig.３，γ-IPTGのレーン参照）。そこで，

Q144N/S495F変異を含め12種類であり，その詳

両酵素の発現量の向上を図る目的で培養条件を各

細はTable１に記載した。各種変異を有するGshA

種 検 証 し た 。そ の 結 果 ，前 培 養 時 に お い て ，およびGshB発現ベクターを⊿YGM株へ導入し，IPTGを0.1 mM添加することでGshAおよびGshB

これを0.1 mM IPTGを含むLB培地で前培養し，の発現量を顕著に増大可能であることを見出した

１mMのGlu，Val，Glyを含むＭ９培地における（Fig.３，＋IPTGのレーン）。この前培養条件を

γ-EVGの生産量を検証した。その結果，L135I/用いることで，前述のL135I/Q144N/S495F変異

Q144N/S495I変異を有するGshAおよびGshBを共© The Ito Foundation

50

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

発 現 さ せ た⊿YGM を 用 い る こ と で （strain

強を検証した。GshAにおけるＬ135およびＱ144

no.3），167μMのγ-EVGを，またL135I/Q144A/

がγ-EVGの生産におけるホットスポットである

S495F変異を有するGshAおよびGshBを共発現さ可能性を見出した。Ｌ135，Ｑ144，Ｓ495の各種

せ た⊿YGM（strain no.10）に よ っ て 154μM の変異型GshA，およびGshBの共発現株を作製し，γ-EVGの生産が可能となった（Table２）。そのこ の う ち ， L135I/Q144N/S495F 変 異 ， L135I/

他変異体を用いた際のγ-EVGの生産性は変わら

Q144N/S495I 変 異 ，L135I/Q144A/S495F 変 異 をないか，むしろ低下した（Table２）。

有するGshAを用いることで，γ-EVGの生産性

3 . 2 培地中金属イオンの置換によるγ-EVGが顕著に増大することを見出した。また，前培養
条件，および本培養条件における，IPTG添加，生産性の向上の存在下でGluと各およびMg２＋⇒Mn２＋への置換がそれぞれγ-EVG

種のアミノ酸およびATPを基質としてγ-グルタの生産性の向上にきわめて効果的であることを示

ミルジペプチドを生成するが，補因子となる金属した。最終的に，E. coli ⊿yggS⊿ggt⊿miaA三イオンが基質特異性に影響する 。Mg

存在下重欠損株（⊿YGM）にL135I/Q144A/S495F変異

ではγ-EV生成活性はVmax＝59 mol/mg/h，Km＝を有するGshAおよびGshB共発現プラスミドを導27.1 mMであるのに対し，Mn２＋存在下ではVmax＝

入 し た 株（strain no.10）を 用 い ，こ れ を LB ＋

95 mol/mg/h，Km ＝21 mMであると報告されて0.1mM IPTG 培 地 で 前 培 養 し ，１ mM の Glu ，いる。Vmax/Kmを活性の指標とすれば，Mn

存在

Val，Glyを含むMg２＋ ⇒Mn２＋ 置換Ｍ９培地で培下におけるγ-EV生成活性はMg２＋のそれと比較養することで，290μMのγ-EVGの生産が可能とし約２倍である。現在まで用いてきた培養条件なった。培地へ添加した各種アミノ酸濃度を基に（Ｍ９培地）にはMg

計算すると約30％の生産効率でγ-EVGを生産可

GshAはMg

２＋

またはMn

２＋

５）

２＋

２＋

２＋

は含まれていたが，Mn２＋は含まれていなかった。すなわち，現在までの検討条件下では，Mg２＋

依存的な触媒反応による

γ-EVの生産性を観察していた。そこで，Ｍ９最少培地中のMgSO４ をMnCl２ に置換し，その影響を検証した。前項においてγ-EVGの生産量が高かった，３株，すなわちL135I/Q144N/S495F変
異 ， L135I/Q144N/S495I 変 異 ， L135I/Q144A/
S495F変異を有するGshA発現株（strain no.2，3，10）を用いた。その結果，strain no.2，strain no.3，
strain no.10を用いることによってそれぞれ，240
μM，222μM，290μMのγ-EVGの生産が可能となった（Table２）。
４．要

能な新規生産法が確立された。
文献１） Ohsu, T., Amino, Y., Nagasaki, H., Yamanaka, T.,
Takeshita, S., Hatanaka, T., Maruyama, Y.,
Miyamura, N., Eto, Y.：J Biol Chem，8，1016～1022，
2010．
２） Ito, T., Yamauchi, A., Hemmi, H., Yoshimura, T.：
J Biosci Bioeng，122，689～693，2016．
３） I t o , T ., T o ko r o , M ., H o r i , R., H e m m i , H .,Yoshimura, T. ： Appl Environ Microbiol, 84, e0280602817，2018．
４） Hibi, T., Nii, H., Nakatsu, T., Kimura, A., Kato, H.,
Hiratake, J., Oda, J.：Proc Natl Acad Sci USA，101，
15052～15057，2004．
５） Kelly, B. S., Antholine, W. E., Griffith, O. W.：J Biol
Chem，277，50～58，2002．

約

オフタルミン酸高生産株をプラットフォームとしたγ-EVG生産の可能性およびその生産性の増© The Ito Foundation

51

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変（Ⅱ）
Modification of substrate specificity of microbial transglutaminase by protein
engineering（Ⅱ）

滝

田

禎

亮

（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻）

Teisuke Takita（Kyoto University, Graduate School of Agriculture, Division of Food Science and Biotechnology）

To obtain the transglutaminase from Geobacillus stearothermophilus（GsTgl）with Histag, which is soluble and binds to Ni ２＋ affinity gel, I constructed eight expression systems. Of
them, two enzymes with His-tag in the C-terminus were purified by the affinity
６）, its characteristic C-terminal short extension ischromatography. In one（GsTgl⊿EX27（His）
５
（His）
６）
, a（Asp-Ser）
５ linker is inserted between
eliminated and in the other（GsTgl（DS）

the C-terminus and His-tag. Based on fluorescence resonance energy transfer, I succeeded inmeasuring the initial rate. I purified fifteen active-site mutants of GsTgl⊿EX27（His）６ andcompared their activity. Surprisingly, most of them exhibited higher activity than the wildtype. I introduced both of the N-terminal domain（N-179 or N-195）and C-terminal domain（His）
６ into a Kanamycin-resistance（180-C or 196-C）of TEM1 β-lactamase and GsTgl（DS）５conferring plasmid. E. coli BL21（DE3）harboring the plasmid that contains N-195，196-C,
６ was unable to grow on a agar plate containing ampicillin and IPTG atand GsTgl（DS）５（His）

37℃, while that harboring the plasmid, in which Gln and Lys residue are introduced into N-195
and 196-C（around the breakpoint）, respectively, was able to grow. However, the latter was
unable to grow when the Gln residue was replaced with Asn or when the catalytic Cys117 of
５
（His）
６
GsTgl was replaced with Ala. These results strongly suggest that in cells, GsTgl（DS）

catalyzed the crosslinking of the two domains of TEM1 β-lactamase. Thus, I succeeded inconstruction of an efficient screening systems for GsTgl with substrate specificity altered byrandom mutagenesis.

１．目から，TGは，アシル受容体（Lys残基）と異なり，的アシル供与体（Gln残基）に対する認識は厳密でトランスグルタミナーゼ（TG）によるタンパクあり，Asn残基は，複数のTGにおいて利用され質の架橋は，食肉の弾力性や食感の改善に大きなない。この理由として，Gln残基のメチレン基と効果をもたらす。現在，Streptomyces mobaraensis

疎水性残基の相互作用が重要であることが示唆さ由来のTGが商品化されている。これまでの研究れている１）。TGにより，大きく食肉の弾力性や© The Ito Foundation

52

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

食感の改善をもたらすためには，未活用のAsn残端にHis-tagを付加し精製されているB. subtilisの基を効率的に利用できる新規なTGの取得が望まTglとの配列比較から３），GsTglのＣ末端には，れ る 。最 近 ，Bacillus subtilis 由 来 TG（Tgl）の27アミノ酸残基の伸長配列（EX27）があること

結晶構造と特性が報告された 。Tglは，最小のが明らかになっている４）。本研究では，部位特異TGであり，S.mobaraensis由来のTGに対し類似

的変異導入およびランダム変異導入により，Asn性を示さない。

残基を利用するGsTgl変異体酵素を取得すること

２）

昨年度，申請者は，中等度好熱菌のGeobacillusを目的とする。

stearothermophilusからTgl（GsTgl）をクローニ

GsTglの15種の変異体について（Fig.１），酵素

ングし，tagをもたないGsTgl（pET11a-GsTgl）

反応解析を行う。精製を迅速にするため，可溶性の発現精製に成功し，QuikChange（QC）法によ

でNiアフィニティー担体に結合するHis-tag配列

り，14種の変異体を作成した。また，His-tag配をもつGsTglの発現系の構築を再度試みる。さら列をもつGsTglの発現系も２種構築した：（１）に，GsTglのランダム変異導入ライブラリーから

Ｎ 末 端 に His-tag 配 列（pET42a（-GST）（His）６

目的の基質特異性をもつものを効率的にスクリー

GsTgl）；（２）Ｃ末端にHis-tag配列（pET22b-

ニングできる発現系を構築する。カナマイシン耐

GsTgl（（His）６）。しかし，（His）
６ GsTglは，可溶性遺伝子を有するpET-42ａを用い，TEM1 β-性発現したが，Niアフィニティー担体に結合しなラクタマーゼ（TEM1）の２断片（切断部位周辺

かった。GsTgl（His）６は，不溶性であった。両酵にGlnとLys残基を導入）として発現させ，Tglの素は，変性状態では上記担体に結合した。これら

架橋反応により生じる複合体に起因するアンピシの結果は，Ｃ末端に付加したHis-tagが，タンパ

リン分解活性を指標にスクリーニングする系の構

ク質内部に埋もれている可能性を示唆した。Ｃ末築を試みる。

Fig. 1 Active site of Bacillus subtilis Tgl.

The site-directed mutations introduced in GsTgl are shown using the structure of

Bacillus subtilis Tgl（PDB code 4Pa5）．

© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変（Ⅱ）

２．方
2.1

2.3

法

53

GsTglの酵素活性測定法の検討

Lys-Ala-MCA（KA-MCA）は ペ プ チ ド 研 究

His-tagをもつGsTglの発現系の構築

所 か ら 購 入 し た 。 Z-Asp-Gln-Met-Asp-AFC

2 . 1 . 1 GsTgl の Ｃ 末 端 と His-tag 配 列 の 間 に（Z-DQMD-AFC）は，Bachemから購入した。
両ペプチドを，GsTgl（DS）（
５ His）
６（2.6μM）存（Gly-Ser）
４リンカー配列の挿入
pET22b-GsTgl（His）
６ の Ｃ 末 端 の His-tag 配 列

在下に，37℃で反応させた（100μl）。反応後，10μlに3,000μlの水を加え，励起波長325 nmで，の直前には，XhoIサイトが存在する。
本サイトに，リンカーを挿入した（pET22bGsTgl
（GS）
（His）
４
６）
。

蛍光強度（FI）を測定した。
2 . 4 ランダム変異導入のための大規模スク

2 . 1 . 2 GsTgl の Ｃ 末 端 と His-tag 配 列 の 間 に

リーニング系の構築
2.4.1（Gly-Ser）
５リンカー配列の挿入
pET22b-GsTgl
（GS）
（His）
４
６ を鋳型に，PCRを完全長TEM1の発現系の構築

pUC19を鋳型にPCRし，SnaBIとBamHIで処理し，pET42a（-GST）に導入した（pET42a（-GST）行った。
PCR断片を，NdeIとBamHIで処理し，pET11aに導入した（pET11a-GsTgl
（GS）５
（His）
６）
。
2 . 1 . 3 GsTgl の Ｃ 末 端 と His-tag 配 列 の 間 に-TEM1）。
本発現系では，TEM1はＮ末端に（His）６ をもつ（（His）６-TEM1）。
2.4.2（Asp-Ser）
５リンカー配列の挿入
pET11a-GsTgl（GS）（
５ His）
６を，SphI と BamHI

TEM1断片化のための切断点の決定

TEM1のGlu195とLeu196の間を切断点として得られる２つの酵素断片を用い，タンパク質断片で切断し，pUC19に導入した。
これを鋳型に，QC法により，（Gly-Ser）
５ リン

相補アッセイを行った結果，アンピシリン分解活性が回復したという報告がある５）。上記切断点は，カーを（Asp-Ser）
５リンカーに置換した。
これをNdeIとBamHIで切断し，GsTgl断片を

TEM1分子の中心に位置するαへリックスのＣ末

pET11aに導入した（pET11a-GsTgl（DS）（
５ His）
６）。

端側に位置する。そこで，切断点はこのαへリッ2 . 1 . 3 GsTglのＣ末端伸長配列（EX27）を除

クスの両端のＴ179とＭ180の間とＥ195とＬ196の間とした。

去しHis-tag配列の付加
pET11a-Tglを鋳型に，PCRを行い，EX27をTEM1断片のクローニング

Ｎ末端側断片（Ｎ-179）とＣ末端側断片（180-除去したGsTgl断片を得た。
本断片をNdeIとXhoIで切断しpET22bに導入しＣ）の ク ロ ー ニ ン グ は 以 下 の よ う に 行 っ た 。
pUC19を鋳型にPCRし，PstIとBamHIで処理し，た（pET22b-GsTgl⊿EX27
（His）
６）
。
2.2

2.4.3

pUC19に導入した（pUC19_N-179とpUC19_180-C）。

GsTglの精製

His-tag付加GsTglの精製は以下の方法で行っ

Ｎ末端側断片（Ｎ-195）とＣ末端側断片（196-た 。菌 体 を 20mM Tris-HCl（pH 7.4）に 懸 濁 しＣ）の ク ロ ー ニ ン グ も ，同 様 の 方 法 で 行 っ た

超音波破砕した。遠心上清（20,000×g, 30min）（pUC19_N-195とpUC19_196-C）。

を Profinity IMAC Ni-Charged Resin （Biorad）

2.4.4に供した。同緩衝液で洗浄し，200 mMイミダゾー

pUC19_N-179 と pUC19_N-195 か ら SnaBI とルを含む緩衝液で溶出した。

TEM1のＮ末端側断片の発現系の構築

BamHIで切り出し，pET42a（-GST）に導入した© The Ito Foundation

54

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）（pET42a（-GST）_N-179とpET42a（-GST）_N-195）。

とpET42a（-GST）_N-195_196-CのそれぞれのＣ

本発現系では，TEM1のＮ末端側断片はＮ末端

末端断片の終止コドン下流のSacIとNotIサイトにに（His）６をもつ（Ｎ-179とＮ-195）。
2.4.5

導入した（pET42a（-GST）_N-179_180-C_GsTgl

TEM1のＣ末端側断片の発現系の構築

QC 法 に よ り ， pUC19_180-C に 開 始 コ ド ン（NdeIサイト）を導入した。

（DS）
５（ His）
６ とpET42a（ -GST）_N-195_196-C_
GsTgl（DS）
５ His）（
６）
。
2 . 4 . 8 TEM1の２断片とGsTglの共発現系へ

続いて，終止コドンを除去しXhoIサイトを導
入した。

の変異導入
QC 法 に よ り ，pET42a（-GST）_N-179_180-C_得られたベクターをNdeIとXhoIで処理し，180Ｃ断片をpET22bに導入した（pET22b_180-C）。
pUC19_196-Cを用い，同様の方法で，196-Ｃ断片をpET22bに導入した（pET22b_196-C）。
2 . 4 . 6 TEM1のＮ末端とＣ末端側断片の発現

GsTgl（DS）
５ His）（
６ のN-179にT179Q変異を導入した。
続 い て ，180- Ｃ に M180K 変 異 を 導 入 し た（pET42a（-GST）_N-179/T179Q_180-C/M180K_
GsTgl
（DS）（
５ His）
６）。
同様に，pET42a（-GST）_N-195_196-C_GsTgl

系の構築
QC法により，pET22b_180-CとpET22b_196-CのT7 promoter上流にStuIサイトを導入した。
続いて（His）６ 直後の終止コドンの後に，StuI
サ イ ト を 導 入 し た（pET22b_180-C（StuI）
２と
pET22b_196-C（StuI）
２）
。

（DS）（
５ His）
６ の Ｎ -195 と 196- Ｃ に そ れ ぞ れ ，
E195Q 変 異 と L196K 変 異 を 導 入 し た（pET42a（-GST）_N-195/E195Q_196-C/L196K_GsTgl（DS）（
５ His）
６）。
また，QC法により，pET42a（-GST）_N-195/

pET22b_180-C（StuI）
２ を，StuIで処理し，T7

E195Q_196-C/L196K_GsTgl（DS）
５（ His）
６のpromoterをふくむ180-Ｃ断片を，pET42a（-GST）_

Ｎ-195にE195N変異を導入した（pET42a（-GST）

N-179のＮ-179の終止コドン下流のStuIサイトに_N-195/E195N_196-C/L196K_GsTgl（DS）（
５ His）。

導入した（pET42a（-GST）_N-179_180-C）。同様

さらに，QC法により，pET42a（-GST）_N-195/に ，pET22b_196-C（StuI）
２ の T7 promoter を ふ

E195Q_196-C/L196K_GsTgl（DS）（
５ His）
６のGsTgl

くむ196-Ｃ断片を，pET42a（-GST）_N-195に導（DS）（
５ His）
６ にC117A変異を導入した（pET42a

入した（pET42a（-GST）_N-195_196-C）。

（-GST）_N-195/E195Q_196-C/L196K_GsTgl（DS）
５

2 . 4 . 7 TEM1の２断片とGsTglの共発現系の
構築

（His）
６/C117A）。
2 . 4 . 9 GsTglとTEM1断片の共発現プラスミ

QC 法 に よ り ，pET11a-GsTgl
（DS）
（His）
５
６の

ドを有する大腸菌のアンピシリン感受性

T7 promoter上流にSacIサイトを導入した。

試験

続いて，GsTgl
（DS）
（His）
５
６ の終止コドン直後作製したpET42a（-GST）由来ベクターを，大のBamHIサイトの下流にNotIサイトを導入した

腸菌BL21（DE3）に導入し，カナマイシン（50（pET11a-GsTgl（DS）
５ His）（
６-SacINotI）。

μg/ml）含有LB培地（５ml）に植菌し37℃で一pET11a-GsTgl
（DS）５
（His）
６ -SacINotIをSacIと晩振とう培養した。この培養液１mlをカナマイ

NotI で 処 理 し ， T7 promoter を ふ く む GsTgl

シン（50μg/ml）と１mM IPTG含有LB培地（５

（DS）
（His）
５
６断片を，
pET42a（-GST）_N-179_180-Cml）に加え，15℃で12時間，振とう培養した。

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タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変（Ⅱ）

55

この培養液100μlを，アンピシリン（100μg/ml）

用いたWestern blot解析で，すべてのHis-tagをとIPTG（１mM）含有寒天培地に塗布し，37℃

もつGsTglについてバンドが確認された（Fig.２

で24時間静置した。

（C））
。しかし，Ni２＋ カラムに結合し精製できたのはGsTgl（DS）５（His）
６ とGsTgl⊿EX27
（His）
６の

３．結果と考察
3.1

みであった（Fig.２（D））。これらの結果は，昨GsTglの発現年度の考察を強く支持した。

Fig.２に示すように，培養温度を15―20℃に下

3.2

GsTglの酵素活性測定法の検討げることで，作製したすべての発現系で，細胞全Fig.３に示すように，50μM KA-MCAと50μM

画分（Fig.２（A））と可溶性画分（Fig.２（B））

Z-DQMD-AFC を 2.6μM GsTgl（DS）
５
（His）
６存

でGsTglが確認された。また，抗His-tag抗体を在下に37℃で反応させ，励起波長325 nmで蛍光Fig. 2 SDS-PAGE and Western blot analysis of wild-typeGsTgls.

（A）
SDS-PAGE of cells.（B）SDS-PAGE of the soluble fractions. After sonication of the cells andcentrifugation, the supernatants were analyzed by SDS-PAGE. （C）Western blot analysis of thecells.（D）Purified wild-typeGsTgls.

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56

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

スペクトルを測定すると，390 nm付近のピーク（C）），390 nmのFIは変化しなかった（Fig.３（B））
。

が減少し，443 nm付近にピークが生じ増加した

3 . 3 GsTgl⊿EX27（His）６変異体の精製とFRET（Fig.３（A））
。これは，両ペプチドの架橋に伴うによる活性比較

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の存在を示唆

Fig.４に示すように，15種の変異体を作成し均した。KA-MCA濃度を20―50μMとし，同様の一に精製した（Fig.４（A））。50μM KA-MCAと測定をしたところ，443 nmの蛍光強度（FI）は50μM Z-DQMD-AFCを，酵素存在下に37℃でKA-MCA濃度の増加とともに増加したが（Fig.３

反応させ，443 nmのFIの増加から初速度を得た。

0A
F7
0Y
F7
0W
E1
16
A
E1
16
D
C1
17
A
W1
50
A
W1
50
F
Y1
73
A
Y1
73
F
E1
89
A
E1
89
D
N1
90
A
N1
90
Q
H2
02
A

F7

(kDa)

Ma
rke
r
WT

GsTglΔEX27(His)6

200
116
66
45

31

22
14

30

20
15
10

Fig. 3 Measurement of GsTgl
（DS）
５
（His）
６ activity by

FRET.

（A）
Time-course of fluorescence emission spectra.
０
The reaction was performed at pH 8.0 and 37℃.［E］=2.6μM.［KA-MCA］０=50μM.［Z-DQMD-AFC］０=50μM. The reaction mixture（10μl）was mixed withwater （3,000μl）and, the fluorescence spectra were
measured at λex=325 nm. The spectra at 0，0.5，1，1.5，
2.5，and 4 hr after reaction are shown（from top tobottom at 390 nm, respectively）. The similar
measurements were done with different concentrationsof KA-MCA：○，20μM；●，30μM；□，40μM；
and ■ ，50μM ．（B）
The fluorescence intensity（FI）
change at 390 nm.（C）The FI change at 443 nm.

0A

F7

0

F7
0Y
F7
0W
E1
16
A
E1
16
D
C1
17
A
W1
50
A
W1
50
F
Y1
73
A
Y1
73
E1 F
89
A
E1
89
D
N1
90
A
N1
90
Q
H2
02
A

5

WT

Activity (Fl・hr‒1・µM‒1)25

GsTglΔEX27(His)6

Fig. 4 SDS-PAGE and activity of the wild-type andmutants of GsTgl⊿EX27（His）
６．

（A）
SDS-PAGE of the purified enzymes．
（B）
Activity of the purified enzymes.The reaction was
performed at pH 8.0 and 37 ℃ , and the FI change at
０443 nm was measured atλex=325nm.［KA-MCA］=50μM.［Z-DQMD-AFC］
０=50μM.［E］
０=1-6μM.
The activity was obtained by dividing the initialrate（FI/hr）by the enzyme concentration.

© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変（Ⅱ）

この値から活性を比較した（Fig.４（B））
。多くの変異体が，野生型（WT）に比べ，高い活性を

57

3 . 4 ランダム変異導入のための大規模スク
リーニング系の構築有した。注目すべきことに，触媒残基と推定されFig.５に，作成したpET42a（-GST）由来プラ

るCys117をAlaに置換した変異体も高い活性を示

スミド（Fig.５（A））とアンピシリンとIPTG含した。今後は，生成物をHPLCで分取し，構造を有寒天培地での生育結果を示す（Fig.５（B））
。

決定する必要がある。

N-179_180-C（His）
６ とN-195_196-C
（His）
６ は，生

Fig. 5 Construction of screening systems for GsTgl with substrate specificity altered by random mutagenesis.

（A）
Plasmids constructed. All plasmids were constructed on the basis of pET-42 ａ（-GST）, which confers Kanamycin
resistance and in which the region of glutathione S-transferase is removed. TEM1 β-lactamase or both of the
５
（His）
６
N-terminal domain（N-179 or N-195）and C-terminal domain（180-C or 196-C）domain, and GsTgl（DS）
were introduced into the plasmid.（B）Ampicillin susceptibility testing. E. coli BL21（DE3）harboring each plasmid
was inoculated on a LB agar plate containing 100μM ampicillin and 1 mM IPTG and incubated overnight at 37℃.

Fig. 5© The Ito Foundation

58

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

育しなかった。これは，これら２種のTEM1断片の新規発現系の構築に成功した。FRETによる

対は，BL21（DE3）中で，複合体を形成しないか，

GsTglの酵素活性測定法を検討した。GsTglの15形成しても本来のTEM1構造をとらないことを示

種の変異体を精製し，上記の活性測定法を適用す唆 し た 。こ れ ら に ，GsTgl 遺 伝 子 を 導 入 し たることで，活性を比較した。結果として，活性上N-179_180-C_GsTgl（DS）（
５ His）
６とN-195_196-C_

昇をもたらす変異を明らかにした。GsTglのラン

GsTgl（DS）（His）
５
６も，生育しなかった。しかし，

ダム変異ライブラリーから，目的の基質特異性を

TEM1断片の切断部位周辺にGlnとLys残基を導もつものを効率的にスクリーニングする系を確立

入 し た と こ ろ ， N-179/T179Q_180-C/M180K_

した。

GsTgl
（DS）５
（His）
６ は生育しなかったが，N-195/
E195Q_196-C/L196K_GsTgl
（DS）
（His）
５
６は生育
した。これらは，細胞中で，TEM1断片のＮ-195と196-Ｃは，安定な複合体を形成しないが，導入したＱ195残基とＫ196残基をGsTglが架橋されると本来の構造をとり，アンピシリン分解活性を示
す よ う に な る こ と を 示 唆 し た 。こ の 考 え は ，
N-195/E195N_196-C/L196K_GsTgl（DS）
５
（His）
６
とN-195/E195Q_196-C/L196K_GsTgl
（DS）
（His）
５
６
/C117Aが生育しなかったことから支持される。
このように，pET42a（-GST）_N-195_196-C（His）
６を用い，Ｎ-195のＥ195と196-ＣのＬ196に変異を導入することにより，目的の基質特異性をもつ
GsTglを，ランダム変異ライブラリーから，効率的にスクリーニングする系を確立した。本発現系には，アンピシリン濃度を上昇させることにより，高活性な目的変異体を効率的にスクリーニン
グできることである。
４．要

約

文
献
１） Chica, R. A., Gagnon, P., Keillor, J. W., Pelletier, J.
N.：Tissue transglutaminase acylation：proposedrole of conserved active site Tyr and Trp residues
revealed by molecular modeling of peptide substratebinding, Protein Sci.，13，979～991，2004．
２） Fernandes, C. G., Placido, D., Lousa, D., Brito, J. A.,
Isidro, A., Soares, C. M., Pohl, J., Carrondo, M. A.,
Archer, M., Henriques, A. O.：Structural andfunctional characterization of an ancient bacterialtransglutaminase sheds light on the minimal
requirements for protein cross-linking, Biochemistry，
54，5723～5734，2015．
３） Plácido, D., Fernandes, C. G., Isidro, A., Carrondo, M.
A., Henriques, A. O., Archer, M.：Auto-induction andpurification of a Bacillus subtilis transglutaminase（T g l ）a n d i t s p r e l i m i n a r y c r y s t a l l o g r a p h i ccharacterization, Protein Expr. Purif. ，59 ，1 ～ 8 ，
2008．
４） Zilhão, R., Isticato, R., Martins, L. O., Steil, L.,
Völker, U., Ricca, E., Moran, C. P. Jr., Henriques, A.
O.：Assembly and function of a spore coatassociated transglutaminase of Bacillus subtilis, J
Bacteriol.，187，7753～7764，2005．
５） Wehrman, T., Kleaveland, B., Her, J. H., Balint, R. F.,
Blau, H. M.：Protein-protein interactions monitored
in mammalian cells via complementation of betalactamase enzyme fragments, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.，99，3469～3474，2002．

可溶性に発現しNi２＋カラムで精製できるGsTgl© The Ito Foundation

59

ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割
Contribution of aroma compounds and lipids to “koku attributes” of porksausages

西

村

敏

英

（女子栄養大学栄養学部）

Toshihide Nishimura（Faculty of Nutrition Science, Kagawa Nutrition University）

It is well known that pork sausage is very popular as one of delicious foods. However, theclarification of factors involved in its deliciousness has not been known yet.
In the previous research, the sensory characteristics in taste, aroma and texture of porksausage were clarified by sensory evaluation. The addition of umami compounds to sausages
was also shown to enhance the intensity and lastingness in the retronasal aroma sensation of
pork sausage. This result indicated that umami compounds contribute to “koku attribute” ofpork sausages. Furthermore, the analyses of aroma compounds of smoked and non-smokedpork sausages showed that common aroma compounds were clarified to be β-Pinene，
3-Carenem, D-Limonene, Octanal, Nonanal, Caryophyllene, Methyl eugenol. However, there isno evidence that fat contributes to the enhancement of “koku attributes” as well as umami
compounds. So, this research was carried out to clarify the role of fat on the retronasal aroma
sensation of “koku attributes” in pork sausages.
First, the sensory characteristics of three kinds of pork sausages containing different
amounts of fat were examined by sensory evaluation. Sensory analyses showed that addition of
fat make the richness and lastingness of flavor of pork sausage stronger as well as the intensityof umami taste. This result indicates that fat has the enhancement effect on “koku attribute” by
the lastingness of aroma sensation. On the other hand, there is no effect of addition of fat on
the enhancement of the spicy aroma sensation in pork sausage.
GC/MS analyses of aroma released from pork sausages containing different amounts of fat
have shown that β-Pinene，3-Carene, D-Limonene, Octanal, Nonanal, Caryophyllene, Methyl
eugenol were identified in these all sausages. The amount of these aroma compounds released
from sausage has been shown to decrease by addition of fat into sausage, indicating that fat
was able to hold aroma compounds. From these results, the lasting effect of aroma sensation in“koku attribute” of sausage was also shown to be enhanced by addition of fat.

© The Ito Foundation

60
１．目

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

性を官能評価で解析し，ポークソーセージの官能的的特徴として，うま味，持続感，濃厚な味，広が

近年，多くの食品にコクという言葉が表示さりのある味，深みのある味，香ばしい，後をひくれ，おいしさの代名詞のように使用されている。

香り，広がりのある香り，スモーキー，スパイシー

しかし，コクには，これまでにきちんとした定義

な香り，弾力，歯ごたえ，ジューシー，プリプリがないため，製造者が独自の基準で評価して，表など，全部で22項目の用語を見出し，ポークソー示しているのが現状である。そこで，我々は，コセージの食味性には，コクに当てはまる感覚が存

クが味，香りならびに食感のすべての刺激で形成在することを明らかにした。また，ソーセージにされるものであり，多くの刺激で形成される複雑

添加されているうま味物質は，ポークソーセージ

さ，その刺激が口腔内で膨らむ広がりならびにその口中香を強く感じさせると同時に，風味の複雑れが持続する持続性の３つの要素で形成される感

さや味の持続性を強く感じさせることから，コク覚であると定義した。また，コクのある食べ増強物質であることが判明した。さらに，ポーク

物に関して，その形成メカニズムを研究していソーセージから抽出した香気成分を臭いかぎガスる。その中で，食べ物の複雑さは，熟成，発酵，クロマトグラフィー（GC-O）と質量分析ガスク

加熱などの処理により形成されると考えている。

ロマトグラフィー（GC/MS）で解析し，ポーク

また，その複雑な刺激の広がりと持続性を増強す

ソーセージの特徴的な臭いに寄与する候補成分をる物質として，うま味物質と脂質が重要な役割を特定した。ノンスモークソーセージでは16種類の果たしていることを明らかにしてきた香気成分が検出され，GC/O分析を用いたAEDA

１～３）

。

４～６）

ポークソーセージは，食べ物の中でもとりわけ法により，16成分のうち，β-Pinene（生シイタ

美味な食べ物の１つであり，最も消費量の多い食

ケ，森，豆），3-Carene（卵スープ，青臭い），肉製品である。そのおいしさは，うま味，独特のD-Limonene（酸 っ ぱ い ，青 臭 い ，除 光 液），

香りならびに食感によることはよく知られてい

Acetic acid（酸っぱい，酢），Copaene（カメムシ，る。これまでの，ポークソーセージの香気成分にきゅうり，草），Methyl eugenol（焦げ，カラメル，関する研究では，Mottram

８）

醤油，ハーブ）が，ノンスモークソーセージの特の報告により，硝酸アルキル，ベンゾニトリル，

徴的な臭いに寄与する候補成分として特定ならび

４-メチル-２-ペンタノン，２-ブチル-２-オクテに同定された。これらの６成分は，スモークソー

ナールなどの香気成分が亜硝酸塩を添加したもの

セージにおいても検出されていたことから，すべから多く検出されることが明らかとなっているて原料の豚肉由来，または香辛料由来であると推が，食肉製品のおいしさに関する研究は，ほとん察された。スモークソーセージでは，これらに加どなされていない。そこで，我々はポークソー

えて，燻煙由来のポークソーセージを特徴付ける

セージの食味性に関する研究を手掛けた。まず，香気成分としてp-Cresol（醤油，脂，スモーク）

ポークソーセージの製造では，調味料としてうまと 2,6-Dimethoxy-phenol（ス モ ー ク ，煙）の 存

味物質を添加すると同時に，適量の脂肪を添加し在が明らかとなった。このように，ポークソーていることから，これらの物質によるコク形成・セージが，特徴のある香りを有する複雑さを有増強メカニズムに焦点を当て，研究をしている。

し，味わいに広がりや持続性を有するコクのある先の研究食品であることを明らかとしてきた。しかし，

７）

やRamarathnam

において，ポークソーセージの食味

９～11）© The Ito Foundation

ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割

61

ソーセージの製造時に添加する脂肪が，ソーセー

味の持続性は飲み込んだ後の感覚を評価してもジの食味性に与える影響に関しては，まったく研らった。評価方法は評点法を用い，各評価項目に究されていない。

対して，点数で評価した。評価の点数は，－３（非そこで，本研究では，これまでの研究成果を基

常に弱い）から＋３（非常に強い）で適した強さにして，ポークソーセージの原料として添加してを選択してもらった＊２。官能評価の結果についている脂質に着目し，これがコクの形成にどのようの統計処理は，一元配置による分散分析法を用いに関わっているかを解明することを目的とした。

て行い，有意差の検定には，５％危険率によるｔ

２．方
2.1

検定を用いた。

法＊１，古川秀子「おいしさを測る」幸書房12）を

供試材料

参照

脂質添加量の異なる３種類のソーセージ（通常＊２，別添官能評価用紙（Table１）を参照

量添加製品，1/2量添加製品，無添加製品）を調2.4製した。冷凍保存しておいたものを，袋ごと流水ａ）モノトラップ（シリカモノリス捕臭剤）にをかけて解凍し，官能評価用試料として用いた。
2.2

官能評価用の試料の調製方法

ポークソーセージの香気成分分析

よる香気成分の捕集
各 ソ ー セ ー ジ を 細 切 し た 後 ，５ ｇ を 取 り ，

ホ ー ロ ー 鍋（24cmφ×10cm）に水を張り，40mlのバイアル瓶に入れたものを，60℃で２時90℃まで加熱したお湯の中で，袋ごと加熱した。

間加熱した。この間に揮発したヘッドスペース香

袋に入ったソーセージの中心温度が，50℃に達し気成分をMono trap（シリカモノリス捕臭剤：たことを確認し，官能評価のサンプルとした。加ジーエルサイエンス）で捕集した。

熱が終了したソーセージは，半分に切断し，２本ｂ）GC/MSによる香気成分の同定に分けてから皿に盛りつけた。

ａ）で調製した試料をGC/MS（Agilent 7890A

2.3

官能評価

GC-System, Agilent 7693 Auto-sampler, Agilent

パネリストには，基本五味の識別，ならびに各

Technologies 5975C inert MSD with Triple-

味の濃度識別ができ，２カ月以上の訓練を行った

Axis Detector）に供し，香気成分を同定した。

者を選定した。パネリストは，延べ15名により分析は，GC（GC-2014，（株）島津製作所）で，評価を行った。パネリスト１名あたり，添加脂肪CP-wax 52 CB （30m x 0.25mm i.d., 0.25μm film

量の異なる３種類のソーセージを各種類１本ず

thickness）（ジーエルサイエンス（株））カラムをつ，計３本を提供した。官能評価では，前試料の用いた。また，各成分の量的な変化は，サンプル

影響をなくすため，次のサンプルを評価する前に添加した内部標準物質で補正して算出し，比較に，蒸留水で口濯ぎを実施した。

した。

＊１

Table１に示すように，評価項目は，スパイシー
な香りの強さ，うま味強度，塩味強度，風味の広３．結果と考察がり，風味の持続性の５項目とした。特に，風味3.1の広がりと持続性は，コクの感覚の要素に相当す

通常量脂肪添加の製品，通常の1/2量脂肪添加るものとして，評価項目に加えた。また，風味のの製品ならびに，脂肪無添加の製品を調製し，ス

広がりは10回噛んだ後に感じた感覚の強さを，風パイシーな香りの強さ，うま味強度，塩味強度，© The Ito Foundation

脂肪含量の異なるソーセージの食味性62

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 1 ソーセージの官能評価用紙（The sheet for sensory evaluation of sausages）
平成

年

月

日

名前

・ポークソーセージを10回以上咀嚼し，項目①から順番に評価して下さい。
・サンプルは，左から順番に評価してください。

・下記のスケールを参考に，各評価項目についてＡ，Ｂ，Ｃを点数（－３，－２，－1,0，＋１，＋２，＋３）で評価し，
 の評価値に試料の記号を付けて下さい。尚，風味の広がりは，10回咀嚼した後に感じた感覚を評価してください。風味の持続性は，
そ飲み込んだ直後の強さを評価してください。
・評価するサンプルを変える毎に，必ず，口濯ぎを行ってください。
非常に
弱い

かなり
弱い

やや
弱い

どちら
でも
ない

やや
強い

かなり
強い

非常に
強い

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

＜記入例＞
B

①

②

③

④

⑤

A

C

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

（－３）

（－２）

（－１）

（０）

（＋１）

（＋２）

（＋３）

スパイシーな
香りの強さ

うま味の強さ

塩味の強さ

風味の広がり風味の持続性© The Ito Foundation

63

ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割
Table 2 脂肪含量がポークソーセージの食味性に与える影響（The effect of added fat content on sensory

quality of pork sausages）

脂肪の添加量スパイシーな香り

うま味

塩味

風味の広がり風味の持続性

無添加

0.27±1.61ａ－0.60±0.95ａ－0.07±0.93ａ－0.27±1.24ａ－0.60±1.40ａ

1/2量添加－0.33±1.49ａ

0.53±0.62ｂ

0.47±0.62ａ

0.27±0.93ａ

0.07±0.85ａ

通常量添加

0.07±1.77ａ

1.53±1.09ｃ

1.53±1.15ｂ

1.87±0.62ｂ

1.47±1.02ｂ

注：同じ評価項目列において，異なるアルファベット（a, b, c）間では，有意差があることを示している。ｎ＝15

スパイシーな香り
2.00
1.50
1.00
0.50

風味の持続性

うま味

0.00
-0.50
-1.00

風味の広がり；無添加，

塩味；1/2量添加，；通常添加量Fig. 1 Difference in sensory quality among three kinds of pork sausages containing different amounts of fat

風味の広がり，風味の持続性の５項目に関する官強さを増強することは知られているが，そのメカ能評価を行った。その結果をTable２とFig.１にまニズムは明らかにされておらず，そのメカニズム

とめた。

の解明は興味深い課題である。塩味強度に関して

スパイシーな香りの強さは，脂肪の添加量の違は，無添加製品と通常量添加製品との間で，有意いで有意な差は認められなかった。パネリストの差が認められ，脂肪含量が多いほど，塩味が強くコメントでは，脂肪無添加ソーセージで肉っぽいなることが明らかとなった。この結果は，脂肪添香りがしたとの記載があったので，今後はスパイ

加量により，添加食塩量を少なくすることが可能

スの香りと肉っぽい香りを区別して評価をするこであることを示している。現在，食塩摂取量の取とにより，より正確な食味性が評価できると思わり過ぎが問題となっているので，脂肪添加量で減れた。

塩できるかもしれないが，食肉製品の製造では，うま味の強さと塩味の強さに関しては，脂肪含

食塩は製品の味わいに影響を与えるだけでなく，量が多くなるにつれて強くなると評価された。う

品質にも影響を与える。特に，食塩を減らすと結

ま味の強さは，脂肪の添加量に応じて，有意にう着性の低下につながるので，トランスグルタミ

ま味が強くなることが判明した。脂肪がうま味のナーゼなどの結着補強をすることで，減塩製品の© The Ito Foundation

64

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

開発が可能になる可能性が考えられる。

は，食味性に違いが認められ，脂肪含量が多いほ風味の広がりならびに持続性に関しても，添加ど，風味の広がりや持続性が強いことが明らかとする脂肪含量が多くなるにつれて，強くなることなった。この理由として，脂肪が香気成分を保持が明らかとなった。しかし，脂肪添加量が通常量している可能性が示唆された。また，これまでのの半分では，風味の広がりや持続性が強くなるも研究において，脂質に保持される香気成分は，のの，有意な差は認められなかった。添加脂肪量

log Pと呼ばれる脂溶性の度合いにより，結合性が通常量であると，ソーセージの味わいが有意にが異なることが知られている。そこで，ソーセー

広がり，持続性が強くなることが判明した。

ジの特徴的な香気成分量が，添加された脂肪含量

我々の研究では，タマネギ搾汁液から香気成分

で，異なるか否かについて検討した。具体的には，の保持効果を有する物質として，β-シトステ

ソーセージをバイアル瓶に入れ，60℃で２時間加ロールならびにスティグマステロールといった植熱した時に，バイアル瓶中に放出される香気成分

物ステロールが，香気成分を結合させ，食べ物のを捕集し，それらをGC/MSで分析し，香気成分

香りを保持する効果があることが判明した。脂質の特定とその量的な違いを調べた。

によるこの効果は，風味の持続性を強め，コクを得られたGC/MSのクロマトグラムをFig.２～

増強することが明らかとなっている５）。

４に示した。Fig.２は脂肪無添加製品の，Fig.３

今回の結果から，ポークソーセージでは，添加は1/2量添加製品の，Fig.４は通常量添加製品のする脂肪含量を適量とすることで，うま味や塩味

分析結果を示している。各図に示してあるＡ～Ｇを増強するだけでなく，風味の広がりや持続性をは，それぞれβ-Pinene，3-Carene, D-Limonene,

強め，コクを増強することが明らかとなった。

Octanal, Nonanal, Caryophyllene, Methyl
eugenolであり，今回の分析で検出された成分で

3 . 2 脂肪含量の異なるソーセージにおける香ある（Table３）。また，Table３には，それぞれの気成分の特定とそれらの量的な違い

製品での放出された香気成分量を示した。

脂肪含量の異なるノンスモークソーセージで（高さ）
140000130000無添加

120000110000検出100000
90000

B

80000

強

70000

度

60000

A

50000

C

E

G

F

D

40000
30000
20000
10000

時間

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

保持時間（分）Fig. 2 GC-chromatogram of aroma compounds extracted from non-smoked pork sausage without addition of fat© The Ito Foundation

65

ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割（高さ）

1/2 量添加140000130000120000110000検出100000
90000

B

80000

強

70000

度

60000

C

A

50000

D

G

E

F

40000
30000
20000
10000

時間

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

保持時間（分）Fig. 3 GC-chromatogram of aroma compounds extracted from non-smoked pork sausage containing 50％ of regular fat

content（高さ）
140000

通常量添加

130000120000110000100000

検

90000

出

80000

強
度

70000
60000

A

50000
40000

B C
D

E

G

F

30000
20000
10000

時間

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

保持時間（分）Fig. 4 GC-chromatogram of aroma compounds extracted from non-smoked pork sausage containing regular fat content

GC/MSによる分析の結果，複数の香気成分が豆の臭いと，3-Careneは卵スープ，青臭い臭いと，検出された。そのうち，過去のノンスモークソー

D-Limoneneは酸っぱい，青臭い臭いと，Methyl

セージの分析でも検出された香気成分として，

eugenolはスパイス，カレー粉，漢方薬の臭いとTable３に示した７成分が同定された。

評価されている。

これらは，β-Pinene，3-Carene, D-Limonene,

Fig.２～４とTable３を見ると，添加した脂肪含

Octanal, Nonanal, Caryophyllene, Methyl

量が多いほど，ソーセージから放出された香気成eugenolであった。β-Pineneは生シイタケ，森，

分 量 が 少 な い こ と が 明 ら か と な っ た 。ま た ，© The Ito Foundation

66

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 3 脂 肪 含 量 の 異 な る ソ ー セ ー ジ か ら 放 出 さ れ た 香 気 成 分 量 の 違 い（Thedifferences in aroma compounds released from three kinds of pork sausages
containing different amounts of fat）
検出された化合物量（高さ；×10３）

保持時間（分）推定化合物名

無添加

1/2量添加

通常量添加

10.05

β-Pinene（A）

10.9

10.3

8.5

10.86

3-Carene（B）

37.9

30.2

24.9

11.74

D-Limonene（C）

37

26.1

19.4

12.67

Octanal（D）

19.1

8.8

3.8

14.37

Nonanal（E）

36.7

14.3

10.3

17.94

Caryophyllene（F）

22.1

9.6

8.1

21.06

Methyleugenol（G）

9.5

4.3

3.8

β-Pineneと3-Careneの放出量は，脂肪添加量に応た。本研究では，添加される脂肪量が異なるソー

じて，比例的に減少していた。一方，D-Limonene,

セージを作成し，脂肪含量の違いが食味性ならび

Octanal, Nonanal, Caryophyllene, Methylに香りの持続性に及ぼす影響を調べた。

eugenolは，脂肪が添加されると急激に放出量が官能評価では，脂肪の添加量が増えるとうま味減少することが明らかとなった。このことは，と塩味の感じ方を強めることが明らかとなった。

β-Pineneと3-Careneは，脂肪と比較的弱い結合

また，味わいの広がりや持続性を強め，コク増強をしているが，それ以外の成分は脂肪と比較的強効果を示すことが明らかとなった。一方，スパイい結合をしており，60℃の加熱により，放出されシーな香りの強さには影響を与えなかった。

にくかったと推察された。

次に，GC/MSにより，それぞれのソーセージ

以上の結果から，ポークソーセージの製造で添から放出される香気成分とその含量を調べた。そ加されている脂肪は，ポークソーセージに特徴的の結果，添加される脂肪含量に関わらずβ-Pinene

な複数の成分を保持していることが明らかとなっ（生シイタケ，森，豆），3-Carene（卵スープ，

た。脂肪に保持されている香気成分は，喫食時に青 臭 い），D-Limonene（酸 っ ぱ い ，青 臭 い），

口腔内に徐々に香気成分を放出するため，ソーOctanal, Nonanal, Caryophyllene, Methyl

セージの味わいの持続性を強め，コクを増強して

eugenol（スパイス，カレー粉，漢方薬）が検出いると推察された。また，脂肪の添加含量の違いされた。これらは，いずれもノンスモークソー

は，喫食時の味わいの違いをもたらしている可能

セージで検出された成分であった10）。また，これ性が考えられる。

らの成分量は，脂肪含量が多くなると放出されに

４．要

くくなることが判明した。この結果は，ソーセー

約

ジに添加されている脂肪が，ソーセージの特徴をポークソーセージは，美味な食品の１つであ示す香気成分を保持し，味わいの持続性を強めてり，コクのある食品と考えられている。以前の研いることが明らかとなり，ソーセージのコクの増究において，ポークソーセージの製造時に添加さ強に寄与していると推察された。

れるうま味物質が，口中香の感じ方と持続性を強今後は，ポークソーセージの香りの特徴に大きめ，コクの増強に寄与していることを明らかにしく寄与している香気成分として同定された香気成© The Ito Foundation

ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂質の役割

分の標品を組み合わせて，ポークソーセージの香りを再現できるか否かを調べる必要がある。
文献１） 西村敏英：コクの要素と寄与成分を活かした食品
開発，食品と開発，53（6），20～23，2018．
２） 西村敏英：食品のおいしさを改善するコク増強物
質のチョイ足し技術，月刊フードケミカル，９，23～27，2017．
３） 西村敏英：食肉のおいしさとそれを引き出すコクとは！，JATAFFジャーナル，３（12），29～35，
2015．
４） Nishimura, T., Goto, S., Miura, K., Takakura, Y.,
Egusa, S. A., Wakabayashi, H.：“Umami compounds
enhance the intensity of retronasal sensation ofaromas from model chicken soups”, Food
Chemistry，196，577～583，2016．
５） Nishimura, T., Egusa, S. A., Nagao, A., Odahara,
T., Sugise, T., Mizoguchi, N., Nosho, Y.：“Phytosterols in onion contribute to a sensation of
lingering of aroma, a koku attribute”, Food

67

Chemistry，192，724～728，2016．
６） 西村敏英：食肉のおいしさを引き出すうま味物質の役割，食肉の科学，57（2），177～180，2016．
７） Mottram, D. M.：“Organic Nitrates and Nitriles
in the Volatiles of Cooked Cured Pork”, J. Agric.
Food Chem，32，343～345，1984．
８） Ramarathnam, N., Rubin, L.J., Diosady, L.L.：“Studies on meat flavor. 3. A novel method fortrapping volatile components from uncured andcured pork”，J. Agric. Food Chem.，41（6），933～
938，1993．
９） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明，平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，33，101～108，2015．
10） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その２），平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，34，72～80，2016．
11） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その３），平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，35，31～39，2017．
12） 古川秀子：おいしさを測る-食品官能検査の実際，
幸書房，1994．

© The Ito Foundation

68

ドライエイジング牛肉に特徴的な香気成分に関する研究
Study on flavor components of dry-aged beef

河

原

聡

（宮崎大学農学部）

Satoshi Kawahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Dry-aged beef is believed to have different and preferred flavor by some consumers tothat of wet-aged（i.e., vacuum packaged）beef. In this study, we tried to compare the volatilecompounds from both cooked wet-aged and dry-aged beef qualitatively and quantitatively.
The wet-aged beef from Japanese Black cow was prepared at 5℃ for 30 days with vacuum
packaging, whereas the dry-aged beef was prepared in an aging cellar designated forprocessing of dry-aged meat at 1℃ at 73％ humidity under 2 m/sec of wind speed for 42 days.
Unfortunately, there is no difference in sensory profiles among the aging methods in this study.
The detailed reason was not known, but it might due to the population of contaminating
microbes on the meat. Volatile compounds isolated and identified in each aged beef arecomposed of the aldehydes and the ketones that are typically detected in cooked beef. The
amounts of volatile compounds in the dry-aged beef were higher than those in the wet-aged
one, although there is no difference in those compounds qualitatively. This would be caused by
the accelerated oxidative reactions between concentrated solids in the dry-aged beef. The
higher amount of volatiles could contribute to the production of aroma and flavor of dry-aged
beef, but this would not be necessary to improve their palatability for consumers.

１．目

マスコミにより大きく紹介されたこともあり，的ブームとなっている。

近年，一部の消費者の間で「熟成肉」の評価がこのような背景から，我々は保冷庫メーカーと高まっている。インターネットなどの情報では，協働して，衛生的な品質に配慮したドライエイジ

一般に流通している「熟成肉」は，その製造方法

ング牛肉の製造方法および同製品を製造するためや製造条件に特別な定めはないものの，家畜のとの専用保冷庫（セラー）の開発研究を実施してき殺後の熟成期間を比較的長くとったものを指す。

た。一連の研究において，ドライエイジング牛肉「熟成肉」の中でも，真空包装技術が食肉流通にの試作製造，成分分析を含めた品質評価，ならび導入される以前のように，無包装で長期間冷蔵保に消費者型官能評価試験を繰り返し実施した結存された乾燥熟成肉（ドライエイジング肉）は，

果，消費者が感じる官能特性については食感およ© The Ito Foundation

ドライエイジング牛肉に特徴的な香気成分に関する研究

び香りと風味の変化が主たるものであることなどの知見を得た。

69に供した。
官能検査は，宮崎県都城市内の一般消費者60名

それに対して，食肉成分等の分析結果では，ド（年齢20歳代～60歳代，男性28名，女性32名）をライエイジングを行うことにより遊離アミノ酸の対象にして，洋食店の店舗を借り上げて実施し量は劇的に増加するものの，それらの組成に大きた。約２cm角のサイコロ状に整形した肉を，肉な差異はなく，基本的な呈味特性に大きな違いが重量に対して0.4％の食塩で調味し，約250℃に加ないこと，遊離アミノ酸の生成量に食肉の微生物

温したグリルパンで加熱調理した。加熱後，直ち（細菌および真菌類）の明確な影響は認められなに評価者に提供し，香りの強さと好み，味の濃さ

い，などの知見が得たところである。

と好み，食感の硬さと好みに関して評価するよう

これらの結果から，少なくとも消費者のレベル求めた。評価は10cmのラインスケールにより行

において感知される長期熟成肉と一般的な食肉とい，最も低評価であることを意味する左端からのの相違点は，食感および香気成分であると推測し距離をノギスで測定し，数値化した。

た。そこで本申請課題では，食肉の香りに着目し，香気成分の分析試料は，熟成肉を１cm×１cm

ドライエイジング牛肉およびウェットエイジング

×３cmに整形し，220℃のオーブン内で中心温度

牛肉との比較を通して，ドライエイジング牛肉をが74℃に達するまで加熱して調製した。加熱肉を特徴付けている香気成分を同定することを目標と直ちに樹脂包装中に入れ密閉し，30℃のインキュして実施した。

ベーター中に１時間放置した後，包装中に揮散し２．方た香気成分を固相カラム（NeedlEx有機溶剤用，

法

信和化工）に捕集した後，GC-MS分析を行った。

供試材料に，黒毛和種経産牛のロース肉（サーまた，加熱肉の粗熱をとった後，包丁で細切し，

ロイン）を用いた。同一個体から得た左右のパーブレード型のホモゲナイザー（AM-７，日本精ツをそれぞれウェットエイジングあるいはドライ

機製）を用いて氷冷下にジクロロメタンで抽出しエイジングに供した。ウェットエイジングは低密た 。 そ の 後 ， 抽 出 液 を solvent assisted flavor

度ポリエチレン製の包材で真空包装した後，５±

evaporation（SAFE，桐山製作所製）にて揮発１℃の冷蔵庫内でと畜日から30日後まで静置し性成分の減圧蒸留を行った。蒸留物をジクロロメた。その後，分析と官能検査まで，包材に包装しタンに再溶解し，クデルナ・ダニッシュ濃縮器でたまま－70℃で保存した。

濃縮した後，GC-MS分析を行った。

ド ラ イ エ イ ジ ン グ は ，庫 内 環 境 を 温 度 １ ±GC-MS分析は，DB-WAX（30ｍ×0.25mmφ，１℃，相対湿度73±２％，風速２ｍ／秒に調節し膜 厚 0.25μm ， J&D Scientific） を 装 着 し た

たドライエイジング・セラー試作機（フジキン

GCMS-QP5050（島津製作所製）により行った。

社，都城市）内にと畜日から42日後まで静置し分析条件は，キャリアガス，He；気化室温度，た。その後，肉塊表面の乾燥した部分をトリミン

200℃；カラム温度，40～220℃（40～100℃までグし，可食部をウェットエイジング肉と同様に真５℃／分，100～220℃まで10℃／分）；イオン化

空包装し，冷凍庫内で保存した。なお，ドライエ

電圧，70eV；スキャンレンジ，33―400m/zとした。

イジング肉可食部は一般生菌，腸内細菌科菌群，
真菌についての衛生検査を実施した後，官能検査© The Ito Foundation

70

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

因であるかもしれない。ドライエイジング肉の好３．結果と考察

気への微生物の関与については不明な点が多く，

本研究で調製した熟成牛肉の官能評価結果をTable１に示す。官能検査の結果では，熟成に伴その形成機構については今後も慎重に検討する必要があると考えられた。

う変化は主に肉の硬さについて検知され，ウェッ本研究において，加熱した熟成肉のヘッドス

トエイジングを施した肉が有意に軟らかいと判断

ペースから単離・同定できた揮発性物質は32種でされた。この点については，ウェットエイジング

あり，主要なものをTable２にまとめた。熟成方

肉の水分含量が70％代であったのに対して，ドラ法の違いはアルデヒド類やケトン類の生成量に明

イエイジング肉の水分含量は60％まで低下してい確な影響を及ぼしていることが観察され，ドライたことに起因すると考えられた。しかし，ドライ

エイジング肉ではこれらの化合物の検出量が総じ

エイジング肉の硬さの好ましさについては明確なて増加した。これらの化合物の多くは，加熱に伴差はなかったことから，水分含量の低下に伴う食うアミノ―カルボニル反応や脂質酸化の進行によ感の変化は消費者の嗜好性に適わないものではなり生成するものである。その要因として，ドライ

いと考えられた。一方，「香り」や「味」の項目

エイジング肉において水分含量が低下することにについては，熟成方法の違いにより評価が若干向

より相対的に固形分含量が増加したことが，加熱上する傾向が認められたが，その差異は明確なもの際に起こる上記の酸化反応の速度に影響を及ぼのではなかった。「総合的な好ましさ」についてしたものと推測された。

も特筆するべき差異は認められなかった。

個々の化合物に注目した場合，ケトン類ではまた，本試験で調製したドライエイジング肉で2,3-butandione（ジ ア セ チ ル）や 3-hydroxy-2-は，特徴的とされる「ナッツ臭」の発生も検知さ

butanone（アセトイン）の生成量がドライエイ

れなかった。ナッツ臭の発生には食肉上に発生すジング肉で増加した。これらは乳製品の好気や風る微生物，特にThamnidium属（エダケカビ属）

味の形成に主要な役割を果たしている化合物であの関与が示唆されている１）。一方で，本研究では，り，香料としても使用されている。牛肉において肉の衛生を担保できるよう，専用に開発したセは，バター様の風味と関連していると古くから考ラー（熟成庫）を用いてドライエイジング肉を製えられている。

造したことが，特徴的な好気の生成を抑制した一一 方 ，ア ル デ ヒ ド 類 で は methyl butanal や

Table 1 Consumer palatability scores of grilled beef

Aroma

Taste

TextureOverall liking

Wet-agedDry-aged

Intensity

45.1±23.0

46.5±21.1

Liking59.9±16.859.3±17.0

Intensity

61.7±19.1

64.0±16.7

Liking63.2±21.564.4±22.3

Hardness

34.3ａ±23.845.9ｂ±21.7

Liking60.3±21.2

61.9±17.4

65.1±22.5

63.6±26.1

Values with different superscripts are significantly different（p＜0.05）© The Ito Foundation

ドライエイジング牛肉に特徴的な香気成分に関する研究

71

Table 2 Major volatile compounds（ng/g sample）of cooked beef in the headspace
Volatile compoundWet-agedDry-aged

Acetaldehyde

6.92±1.79

8.73±1.93

Butanal0.22±0.08

0.27±0.06

Pentanal2.80±0.48

3.43±0.34

Hexanal102.0±24.5122.7±19.1

Heptanal
Octanal1.44±0.11
5.69±0.29

1.71±0.35
6.38±0.54
11.87±1.99

Aldehydes

Nonanal7.85±0.37

Decanal0.66±0.06

1.26±0.20

2-Methyl butanal

89.91±28.83

193.7±56.2

3-Methyl butanal
Benzaldehyde

3.88±0.99
6.54±0.82

9.35±3.21
6.80±0.81

Phenyl acetaldehyde
Sum of aldehydes

6.31±1.97
249.8±37.9

10.34±5.19393.7±59.8

99.16±7.4793.24±13.38
1009±228
319.5±67.0
1521±238

91.02±23.46
292.4±37.6
1104±261
405.4±76.5
1893±275

42.82±3.89
5.86±0.61
48.67±3.89

22.41±6.73
14.46±3.93
40.01±7.80

159.4±115.6
258.4±331.1
453.3±350.7

36.45±25.26
118.6±111.7
167.5±114.5

6.96±0.28
1.78±0.03
9.53±0.28

5.96±2.04
1.760.27
8.39±2.06

Ketones
2-Propanone
2,3-Butandione
2-Butanone
3-Hydroxy-2-butanone
Sum of ketones
SulfidesDimethyl sulfide
Dimehyl disulfide
Sum of sulfides
Pyrazines
2,5-Dimethyl-pyradine
Trimethyl-pyrazine
Sum of pyrazines
AlkansHeptanOctan
Sum of alkans

The data was shown as the average±standard deviation of 3 samples.

phenyl acetaldehydeなどが，ドライエイジング酸であり，熟成肉の香りや風味の形成に一定の役

肉において増加した。チョコレート，ナッツ類，割を果たしていると推測される。

チーズなどで典型的に検出されるmethyl butanal

加熱肉から溶媒抽出し，SAFE法により減圧蒸は麦臭，トースト臭，ナッツ臭，あるいはロース留して得た揮発性化合物のうち，今回，単離・同ト臭などに関与すると考えられている。また，

定できたものは，ヘッドスペース法より若干多phenyl acetaldehydeは，日本で伝統的に食されい，39種類であった。その主要なものをTable３ているハツタケの青草臭や甘い臭いに関連するとに示す。SAFE法による分析では，ヘッドスペー

報告されている 。これらの化合物はストレッス法で検出された主要な揮発性成分に加えて，フカー分解により生成することが知られており，イ

ラン類やラクトン類が検出された。これらの化合ソロイシンやロイシン，あるいはフェニルアラニ

物は，ドライエイジング肉において増加する傾向ンから生成する。これらのアミノ酸は長期熟成をが認められた。

２）

施した牛肉において顕著に増加する苦味系アミノ

ヘッドスペース法とSAFE法の結果を比較する© The Ito Foundation

72

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 3 Major volatile compounds（ng/g sample）extracted from cooked beef by SAFE
Volatile compoundWet-agedDry-aged

Aldehydes
Pentanal

10.07±4.34

12.34±4.79

Hexanal259.9±40.1

380.4±45.5

Heptanal

3.74±1.19

4.19±0.93

Octanal12.75±5.1714.28±1.81

NonenalDecanal36.89±6.02
7.81±1.84

50.20±5.92
13.57±4.75

2-Methyl butanal

425.9±174.6

986.4±75.2

3-Methyl butanal

16.48±10.25

43.96±4.33

Benzaldehyde

11.12±1.98

13.59±0.96

Phenyl acetaldehyde
Cyclobutanal

50.47±11.53
2.90±0.16

101.3±18.5
2.52±0.76

892.9±180.1

1676±206

Sum of Aldehydes
Ketones
2-Butanone
3-Hydroxy-2-butanone
Sum of ketones
SulfidesDimethyl sulfone
Sum of sulfides
Pyrazines
Ethyl-3-phridinecarboxylate
Furans
2-Phenyl furan
Lactones
Buthyllactone
γ-Pentalactone
δ-Pentolactone
γ-Nonalactone
Sum of lactones
AlkansHeptan
Octan
NonaneSum of alkans

102.7±48.9

239.2±37.1

79.18±23.6
197.4±42.7

97.76±11.1
336.9±32.3

50.59±1.0452.18±1.2831.56±3.20
41.23±5.40206.7±6.6145.9±10.2

28.03±5.31

40.44±18.79

58.01±4.93
51.93±8.47
6.31±1.58
125.4±12.8243.1±16.285.85±13.16
96.59±16.30
8.39±2.31
160.6±30.79
351.45±37.31

40.72±11.72
14.53±1.86
0.24±0.01
60.21±4.2133.60±11.30
12.56±1.63
0.21±0.01
49.80±5.38

The data was shown as the average±standard deviation of 3 samples.

と，主要な成分に大きな違いは認められず，熟成そのものの実施は容易であり，かつ，揮発性の高方法を比較するうえでの分析手法の差異は認めらい物質の検出においてはSAFE法よりも有利であれなかった。SAFE法では食肉中に微量に存在し，ると考えられた。しかしながら，鼻先で検知する

かつ，比較的揮発性が低い化合物の検出において揮発性の高い成分と咀嚼に伴い口中で揮発する低利点があると考えられた。一方で，食肉研究の領

揮発性成分が相互に関与して食味が形成されるこ域ではまだ実施例が少なく，参照できる知見がほとを考えると，今後，低揮発性成分に関するデー

ぼないことは本法の最大の弱点であると考えられタを蓄積していくことも重要であると考えられた。

る。それに対してヘッドスペース法は，広く食肉以上の結果をまとめると，ドライエイジング肉の好気分析の手法として用いられており，データに特徴的な揮発性成分を検出・同定することはでの蓄積が多い。また，SAFE法と比較すると分析

きず，熟成方法による成分の差異はないものと考© The Ito Foundation

ドライエイジング牛肉に特徴的な香気成分に関する研究73えられた。一方，ドライエイジング肉では揮発性識については課題が残された。熟成肉から単離・物質の量が増加する傾向が認められた。このこと同定された揮発性化合物は，加熱した牛肉から一は，肉の香りや味わいを深めることに寄与してい般的に検出されるストレッカーアルデヒド類やケると推測されるが，このことが直接，消費者の嗜トン類が主要なものであり，定性的には熟成法に好性や製品の受諾性に影響するわけでもないと判よる影響は認められなかった。一方，揮発性化合断された。今後もドライエイジング肉の試作と分物の量はドライエイジング肉で多くなり，このこ析知見を蓄積し，熟成と食味の関連について検討とがドライエイジング肉の食味性に何らかの影響を続けたい。

を及ぼしていると推測された。

４．要約

ウェットエイジングおよびドライエイジングを施した牛肉に生じる揮発性成分の定性的あるいは定量的な差異を明らかにすることを目標として，
本研究を実施した。今回調製した熟成肉の消費者
型官能評価の結果，熟成法の違いによる好気の差

文献１） Kotula, K. L., Kotula, A. W.：Fresh Red Meat, In
the Microbiological Safety and Quality of Food（edby Lund BM. et al.）, Aspen Publishers, Inc., ML,
USA，2000．
２） Miyzawa, M., et al.：Character impact odorants
from wild mashroom（Lactarius hatsudake）used inJapanese traditional food, Flavour Fragr. J.，25，197～201，2010．

異あるいは食味性の差異は検知されず，ドライエ
イジングにより香りがよくなるという一般的な認© The Ito Foundation

74

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価（Ⅱ）
Intramuscular free fatty acids related to deliciousness of Japanese Black
Wagyu beef and its taste-traits analyzed by an electronic taste sensing
system, Part Ⅱ

山之上 稔１・趙 婭楠１・中田 悠介１・上田 修司１・
市村 さやか２・吉田 由香２・羽原 正秋３・池崎 秀和３（１神戸大学大学院農学研究科，２食肉科学技術研究所，３株式会社INSENT）

Minoru Yamanoue１, Yanan Zhao１, Yusuke Nakada１, Shuji Ueda１,
Sayaka Ichimura２, Yuka Yoshida２, Masaaki Habara３ and Hidekazu Ikezaki３（１Graduate School of Agricultural Science, Kobe University,
２Japan Meat Science and Technology Institute, ３INSENT, Inc.）

The aim of this study was to investigate the effects of changes in intramuscular free fatty
acids（FFAs）during postmortem aging on taste-traits of water-soluble extracts（broth）of
Japanese Black Wagyu beef. Changes in fatty acids composed of intramuscular fat areconsidered to contribute to beef aroma. However, the relationship between those changes andtaste-traits of beef remains poorly understood. Recently, results from an electronic taste
sensing system which determined taste-traits of meat and meat products have been reported
by several researchers. In this study, effects of intramuscular FFAs on taste-traits in beefbroth from boiled longissimus thoracis muscles of Holstein and Japanese Black Wagyu cattle at
21-days postmortem were investigated using the electronic taste sensing system and sensory
evaluation. As the results, deliciousness of Japanese Black Wagyu beef broth was strongly
suggested to relate to the increased amounts of intramuscular FFA, even though the amountsof taste substances such as inosic acid in Japanese Black Wagyu beef were less than those in
Holstein beef. In Japanese Black Wagyu beef broth, richness shown in the results of tastetraits analysis and sensory evaluation coincided each other, so richness can be probably used
as an index of deliciousness of Japanese Black Wagyu beef.

１．目

筋内脂肪の影響では，わが国では脂肪交雑の多さ

的が高品質の牛肉として評価されているが，同程度

牛肉のおいしさは，熟成中に増加するペプチの筋内脂肪量の牛肉でもおいしさに優劣のあるこ

ド，アミノ酸や核酸関連物質などの呈味物質に加とが知られている。近年，筋内脂肪量だけでなくえて，脂肪交雑として知られる筋内脂肪が風味や脂肪の質，すなわちトリアシルグリセロールの構

軟らかさなどの食味性に影響して変化する

成脂肪酸が牛肉の風味要因になることが示されて

。

１～３）

© The Ito Foundation

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価（Ⅱ）

いる１）が，牛肉は長期間の熟成を経て加熱後に食されており，熟成および加熱で筋内脂肪が変化

２．方

75

法

し，遊離脂肪酸（FFA）の量や組成に変化が起

2.1

きている可能性がある。その解明のために平成23

試薬は特に表記してあるものを除き，ナカライ～26年度に伊藤記念財団からの研究助成を受けテスク社もしくは和光純薬工業株式会社の特級試て，熟成および加熱前後の牛肉肉汁中の遊離脂肪薬を用いた。牛肉試料は，伊藤ハム（株）食肉事

酸の量および組成の変動を分析した４，５）。その結業本部から購入した黒毛和種およびホルスタイン

果，食味性の良い黒毛和種牛肉では熟成に伴い肉種枝肉の第６～７肋骨間のロース部を用いた。

試薬および牛肉試料

汁中の遊離脂肪酸量が増加し，その組成は筋内脂

2.2

熟成および加熱牛肉の調製肪であるトリアシルグリセロールの脂肪酸組成とロース部の牛肉を４℃で保存し，と畜後７日目，14日目，および21日目にロース芯から無作為異なることを見出した。
一方で，牛肉のおいしさに密接に関連するペプに採取した牛肉片を４cm×５cmの大きさで厚さ

チド，アミノ酸や核酸関連物質などの呈味物質と１cmの肉片に整形した。120℃に加熱したホット

併せて，味要素としての遊離脂肪酸の影響を明らプレートで内部温度が65～70℃になるように表裏かにするためには，それらの物質の総和で感知さを各130秒間加熱した。

れる味の評価が要求され，ヒトによる官能評価が2.3

現在ではもっとも有効な方法である。近年，食熟成21日目に牛肉の各４ｇを採取し，佐々木ら

肉・肉製品の呈味性を客観的に評価する機器分析の方法９）に従って調製した煮出し液から，低温固法の一つに，味覚センサを備える味認識装置６）を化による脂肪除去を行った煮出し肉汁サンプルを利用した報告例が増えてきている

調製した。

が，味覚セ

７～９）

煮出し肉汁サンプルの調製

ンサによる牛肉の呈味性評価では最適かつ統一さ

2.4

れた分析方法に課題が残されている。平成28年度

加熱牛肉の５ｇを細切し，蒸留水中でホモジナに伊藤記念財団からの研究助成を受けて味覚セン

イズ後の懸濁液をろ過し，加熱肉汁サンプルとしサによる呈味性分析に供するための最適なサンプ

た。ろ液に終濃度が80％になるようにエタノール

ル調製法を確立するために，種々の前処理方法でを加え，室温で１時間静置後にろ過し，除タンパ

調製した肉汁サンプルの味覚センサ分析結果と消ク質したろ液をロータリーエバポレーターで蒸留

費者型官能評価の結果を比較した結果，煮出し法

乾固した乾固物を５mlの蒸留水に溶解し，サンで調製した肉汁サンプルの味覚センサ分析値と官プルとした。TSK gel ODS-100Ｖ（東ソー株式能評価が近似することを明らかにした 。それを会社）を装着したHPLC（日立Ｌ-6000シリーズ）踏まえて本研究では，煮出し法で調製した黒毛和に10μｌのサンプルをアプライ後，リン酸溶液で

種牛肉肉汁サンプルを用いて味覚センサ分析およ

溶出し，波長254nmで検出した。定量は同条件でび分析型官能評価による標準的な肉汁分析方法を分離した外部標準で行った。

10）

核酸関連物質の定量

試みるとともに，筋内遊離脂肪酸に関連する味の

2.5

FFA量の測定

特徴を見出した。

加熱肉汁サンプル中のFFA量はNEFA C-テス
トワコー（和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。測定方法は指示書に従い，オレイン酸を標© The Ito Foundation

平成29年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

準に波長550nmにおける吸光度から検量線を作成した。
2.6

味覚センサ分析と畜後21日目に胸最長筋から牛肉片を採取した。牛肉片から煮出し法で肉汁サンプルを調製し，６種類のセンサを備える味認識装置（INSENT
社，SA402B）で呈味性を分析した。
2.7

官能評価

と畜後21日目の牛肉から煮出し肉汁サンプルを調製し，訓練された５人のパネリストによってホ

ATP Related Compounds（mg/100g of beef）

76

60
50
40
30
20
10
0

ルスタイン種牛肉肉汁に比較した黒毛和種牛肉肉汁の各味要素を７段階の評点法で評価した。
2.8

統計処理

黒毛和種およびホルスタイン種牛肉の肉汁サン
プル間の結果の比較については，Studentのｔ検

7

14

21

Postmortem Time（days）
Fig. 1 Changes in ATP related compounds of soluble

extracts（broth）prepared from cooked JapaneseBlack Wagyu beef during postmortem aging.
Total（）； ADP（）； AMP（）； IMP（）；HxR（）；Hx（）.（n＝5）.

定により有意差検定を行った。
た。この結果は，日本短角種牛肉をと畜後４℃で３．結果と考察

10日間保存し，その間の核酸関連物質量の変化を黒毛和種牛をと畜後，４℃で７，14，21日間熟調べたこれまでの報告に一致した11）。６種類の核成後に加熱した牛肉から調製した加熱肉汁サンプ

酸関連物質量を合わせた核酸関連物質総量は，熟ル中の核酸関連物質量を測定した結果をFig.１に成７日目で100ｇ筋肉当たり52.7mgから熟成21日示す。ATPは検出されず，ADPおよびAMPは熟目で29.0mgと熟成日数の経過に伴いほぼ半減し

成 ７ 日 目 で 100 ｇ の 筋 肉 当 た り 0.451mg お よ び

た。

1.84mgから熟成21日目で0.104mgおよび1.31mgへ

ホルスタイン種および黒毛和種の加熱肉汁サンとごく微量の含量ながら，それぞれ減少する傾向

プル中に含まれるIMP量はいずれも熟成に伴い減であった。IMPは熟成７日目で100ｇの筋肉当た少した（Fig.２）。両品種間のIMP量の変化を比り28.3mg，熟成14日目で8.96mg，熟成21日目で較すると，ホルスタイン種肉汁のほうが黒毛和種

1.52mgと熟成日数の経過に伴い減少した。一方のものよりもIMP量が多い傾向で，熟成14日目とで，ヒポキサンチンは熟成７日目で100ｇの筋肉

21日目の牛肉から調製した両品種の肉汁サンプル

当たり10.6mg，熟成14日目で17.7mg，熟成21日間に有意差が認められた（p＜0.05）。またホルス目で18.4mgと熟成日数の経過に伴い増加した。黒タイン種および黒毛和種の加熱肉汁サンプル中に毛和種の加熱肉汁サンプルで検出されたADP，

含まれるヒポキサンチン量はいずれも熟成に伴い

AMP，IMP，イノシンおよびヒポキサンチンの増加する傾向（Fig.３）で，両サンプル間のヒポ５種の核酸関連物質の中で，ADP，AMPおよびキサンチン量を比較すると，ホルスタイン種肉汁

IMP量は熟成日数の経過に伴って減少する傾向でサンプル中のヒポキサンチン量が黒毛和種牛肉のあり，ヒポキサンチン量は増加する傾向であっそれよりも多い傾向であったが，両品種間に有意© The Ito Foundation

Amounts of IMP（mg/100g of beef）

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価（Ⅱ）
40

村ら13）はヒポキサンチンが塩漬肉の味の強さを濃35

度依存的に高めることを報告している。このヒポ
キサンチン量の熟成による増加が牛肉に苦味を与

30

＊

25

えると同時に味の強さを高めることで，熟成による牛肉呈味性の向上に寄与している可能性が考え

20

られる。

＊

15

ホルスタイン種牛肉の加熱肉汁サンプル中の10

FFA 量 は ，熟 成 ７ 日 目 で 100 ｇ の 筋 肉 当 た り

54.37mgであり，熟成21日目で4.41mgでわずかに0増加する傾向であったが熟成による有意差は見ら7

1421
Postmortem Time（days）

Fig. 2 Changes in the amounts of IMP in Japanese Black

Amounts of Hypoxanthine（mg/100g of beef）

77

れなかった（Fig.４）。黒毛和種牛肉の加熱肉汁
サンプル中のFFA量は熟成７日目で100ｇの筋肉

Wagyu and Holstein beef broth during postmortem
aging.
Japanese Black Wagyu beef broth，■；Holstein beefbroth，□.
＊
 p＜0.05 between bovine breeds（n＝4）.

当たり5.45mgで，熟成21日目に5.98mgへと増加

25

量が多い黒毛和種牛サンプルのFFA量が多い傾する傾向であったが，有意差は見られなかった。
一方，両品種間のFFA量を比較すると，ホルス
タイン種牛の加熱肉汁サンプルに比べて筋内脂肪向であり，熟成21日目では両品種間に有意差が認20められた（p＜0.05）。
熟成21日目で採取後の黒毛和種牛肉から煮出し

15

肉汁サンプルを調製し，呈味性を味覚センサで調べた（Fig.５）。その結果，ホルスタイン種の熟10成21日目の煮出し肉汁サンプルをコントロールとしたとき，黒毛和種牛肉の煮出し肉汁サンプルで

5

0

は苦味雑味，渋味刺激および旨味コク値は高値
で，旨味および甘味値は低値であることが示され7た。味覚センサ値で高値であった苦味雑味，渋味

14
21
Postmortem Time（days）

Fig. 3 Changes in the amounts of hypoxanthine inJapanese Black Wagyu and Holstein beef brothduring postmortem aging.
Japanese Black Wagyu beef broth，■；Holstein beefbroth，□.（n＝4）．

刺激および旨味コク値のBMS No.による変化を見
ると，筋内脂肪量の増加に伴いそれらの味要素は増加することが分かった（data not shown）。熟
成21日の煮出し肉汁サンプルを分析型官能評価で調べた結果，Fig.５に破線で示すように黒毛和種差はなかった。これらの核酸関連物質がホルスタ

牛肉の煮出し肉汁サンプルではホルスタイン種牛

イン種牛肉で多い理由は，黒毛和種牛肉に比べて肉より旨味コク値は高値で，味覚センサ分析結果

筋内脂肪量が少ないことが考えられる12）。ヒポキと類似した結果であった。しかし味覚センサ分析

サンチンは苦味を呈することが知られており，市で低値であった旨味および甘味値もまた高値であ© The Ito Foundation

78

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

り，ヒトの感覚ではホルスタイン種牛肉に比べて結果と官能評価の相違の理由は，味要素を検出す

黒毛和種牛肉が味のバランスが良く，よりおいしる各センサの特性によるものと考えられる。味覚

いことを示唆する結果であった。味覚センサ分析

センサを備える味認識装置による分析と分析型官能評価で一致する味要素は旨味コク値であること

Amounts of FFA（mg/100g of beef）

8が明らかになった。

＊

7

４．要

6

約

本研究の目的は，熟成後に加熱された黒毛和種

5牛肉から抽出した水溶性抽出物（肉汁）の呈味性

4に及ぼす筋肉内遊離脂肪酸（FFA）の影響と呈3味の特徴を明らかにすることであった。これまで

2

筋肉内脂肪を構成する脂肪酸は牛肉の香りに影響することが報告されているが，牛肉におけるそれ

10

らの変化と呈味性の関係は十分によく理解されて7

14いない。近年，味覚センサを備える味認識装置を

21

Postmortem Time（days）

用いて食肉および肉製品の呈味性を調べた報告がFig. 4 Changes in the amounts of FFA in Japanese

なされているが，本装置で熟成後21日目に加熱しBlack Wagyu and Holstein beef broth during
postmortem aging.
Japanese Black Wagyu beef broth，■；Holstein beefbroth，□．
＊
 p＜0.05 between bovine breeds（n＝4）．

た黒毛和種牛肉から調製した肉汁サンプルの味の特徴を調べ，比較のために訓練されたパネリスト
による官能評価を行った。その結果，イノシン酸
3 Sourness
2

Sweetness

Acid bitterness

1
0
－1
－2

Richness

Astringency－3－4

Aftertaste fromastringency

Umami

Bitterness

Saltiness

Fig. 5 Comparison of taste-traits between Japanese Black Wagyu and Holstein beef broth at 21-days postmortem byan electronic taste sensing system and sensory evaluation as control of Holstein beef broth.

Japanese Black Wagyu beef broth, dotted and broken lines（n＝4）；Holstein beef broth, solid line（n＝2）．Electronic

taste sensing system（）；sensory evaluation（）．

© The Ito Foundation

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価（Ⅱ）のような呈味物質は少ないが筋内脂肪の多い黒毛和種牛肉では，旨味コク値がホルスタイン種牛肉
サンプルに比べて両分析法でともに高値で検出された。またそれは筋肉内FFAの増加に関連していた。味覚センサによる旨味コクの分析値が牛肉のおいしさの指標になる可能性がある。
文
献１） Westerling, D. B., Hedrick, H. B.：J. Anim. Sci.，
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９） Nodake, K., Numata, M., Kosai, K., Kim, Y. J.,
Nishiumi, T.：Anim. Sci. J.，84，613～621，2013．
10） 山之上稔・趙婭楠・西田昌弘・中田悠介・上田修
司・羽原正秋・池崎秀和：平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，35，61～66，2017．
11） Watanabe, A., Tsuneishi, E., Takimoto, Y.：J. Food
Sci.，54，1169～1172，1989．
12） Suzuki, K., Shioura, H., Yokota, S., Katoh, K., Roh,S., Iida, F., Komatsu, T., Syoji, N., Sakuma, H.,
Yamada, S.：Anim. Sci. J.：88，421～432，2017．
13） Ichimura, S., Nakamura, Y., Yoshida, Y.,
Hattori, A.：Anim. Sci. J.，88，379～385，2017．

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80

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅱ）
Effect of hypoxanthine on the improvement of taste during postmortem
aging of meat（Ⅱ）

市村

さやか・高橋真佐郎・中村

幸信・吉田

由香・猪口

由美・服部

昭仁＊

（一般社団法人食肉科学技術研究所，＊北海道大学）

Sayaka Ichimura, Masao Takahashi, Yukinobu Nakamura,
Yuka Yoshida, Yumi Inoguchi and Akihito Hattori＊（Japan Meat Science and Technology Institute，＊Hokkaido University）

It is well known that taste of meat is improved by aging. We have already reported thathypoxanthine（Hx）is essential for the improvement of meat taste during aging. In this study,
we focused on the bitter taste inherent to Hx, to clarify the role of Hx in the improvement ofmeat taste.
First, the effects of some bitter substances（Hx, Arginine and quinine sulfate）on meattaste were examined using the soup prepared from pork aged for 7days by sensory
evaluations. The sensory analyses showed that the strength of umami and kokumi tastes（thickness and continuity）of the soup was enhanced by all the bitter substances added.
However, as the concentrations of these bitter substances were increased, resulting in thestronger bitter taste of the soup, the effect of bitter substances on the enhancement of umami
and kokumi tastes was lost.
Subsequently, we carried out the preliminary trials to ascertain whether the ratio of theconcentration of Hx and inosine monophosphate（IMP）, which was a precursor of Hx, wasinvolved in the enhancement of the strength of umami and kokumi tastes. The results from thetrials showed that the strongest umami and kokumi tastes were evoked by the survival ofnearly equal amounts of IMP and Hx in the soup, and suggested that the strength of umami
and kokumi tastes was enhanced by the interaction of Hx with umami substances.
Furthemore, the enhancement of tastes by interaction between Hx and umami substances
was examined in 0.5% NaCl solution, to eliminate the influence of intrinsic components of meaton umami and kokumi tastes. The sensory analyses showed that the interaction between Hx
and glutamic sodium（Glu）brought about the enhancement of umami and kokumi tastes andthe suppression of bitter taste. On the other hands, there was little enhancement by the
mixture of Hx and IMP, unless the concentration of IMP was higher than one of Hx. Actually,
IMP was gradually degraded to Hx during aging of meat. Therefore, Hx and Glu might benecessary for the improvement of meat taste during aging.

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食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅱ）

１．目

81

とも明らかにしている５）。

的

しかし，Hxについては，これまで味の観点か

食肉の熟成は，と畜後に硬直した筋肉の軟化を

らの研究報告はほとんどなく，食肉の味に関与す

主たる目的としているが，同時に熟成によって風る物質としては否定的な見解であるTikkiらの報

味が改善することも知られており，現在では食品

告があるのみである６）。Hxは苦味を呈し，そのとしての「おいしさ」を獲得するために行われて閾値は0.73μmo/mlと報告されている７）。一般に，いる。この風味の改善は，熟成に伴う酸臭や獣臭

苦味は好ましくない味として捉えられているが，の消失，アミノ酸や低分子ペプチドの増加等が関

近年では食品によっては嗜好性に寄与するとの報与することが報告されている。また，近年で告も少なくない８，９）。そのため，Hxの呈する苦味は食肉のコクについての研究が進んでおり，スーが食肉に含まれる様々な物質と作用し，結果としプ全体にまろやかさや厚みのある酸味を付与するて熟成肉特有の味を形成する可能性がある。今ペプチドについて報告されている 。しかしなが後，食肉の熟成に伴う風味の改善におけるHxのら，熟成肉特有の風味は複雑な化学的・生物的反関与機構が明らかにされれば，食肉の熟成適期お応によって制御されており，全容は解明されていよびおいしさを判断する新たな指標を提示するこない。

とも可能となる。

１，２）

３）

我々は，これまで熟成に伴う食肉の味の改善機

そこで，本研究では熟成肉特有の味へのHxの構を解明することを目的として，食肉中に含まれ呈する苦味の関与について明らかにするため，豚る呈味物質の一つである核酸関連物質の変動と官肉から調製したスープを用いて旨味およびコク味

能評価の関係を中心に研究を進めてきた。食肉中の増強に対する苦味の影響を官能試験により調べのATPは，と畜直後にすみやかに分解され，旨た。また，これまで食肉の味においてグルタミン

味物質として広く認知されているイノシン酸酸と並んで主要な役割を担うと考えられてきた（IMP）となって蓄積し，その後の熟成によってHxの前駆体であるIMPの関与を明らかにするた

さらに分解されてヒポキサンチン（Hx）に変換

め，豚肉スープにIMPおよびHxを加え，旨味おする。我々は，平成28年度の本助成研究において，

よびコク味の変化と両者の濃度比の関係を予備的畜種に関係なく，長期間の熟成により旨味およびに調べた。さらに，食肉由来の成分の影響を排除

コク味が顕著に増強した試料にはIMPはほとんどし，0.5％NaCl溶液にHxとIMPおよびグルタミン

含まれず，Hxが多く蓄積していることを報告し

酸ナトリウム（Glu）を混合した時の味に変化にた 。さらに，豚肉から調製したスープにHxのついても調べた。

４）

濃度を変えて加えると，一定の濃度まではHxの濃度に依存してスープの旨味およびコク味が増強

２．方法

することを報告した４）。これらの結果は，食肉の2.1

味の改善にHxが関与している可能性を強く示しと畜後２日間経過した冷蔵豚肉ロース４本ている。また，食肉のみならず，ハムやソーセー（LWD種）の胸最長筋を挽肉にして混合し，４℃

ジといった塩漬食肉製品においても，塩漬熟成ので５日間熟成した。熟成後の挽肉を非通気性の袋過程で顕著に増加する呈味成分の一つがHxであ（S-WRAP, Star Plastic Industry Inc.）に 入 れ てり，塩漬肉特有の味の増強にHxが必須であるこ

沸騰水中で20分間加熱した後，氷水で冷却した。

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豚肉スープの調製

82

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

生じたドリップを回収し，10,000ｇ，30分間，４℃

比 較 し て 非 常 に 強 い 場 合 に ＋ ３ ，強 い 場 合 にで遠心分離して得られた上清を５Ａろ紙でろ過し＋２，やや強い場合に＋１，同じ強さの場合に０，たろ液を豚肉スープとし，使用するまで真空状態

やや弱い場合に－１，弱い場合に－２および非常で－30℃で保管した。

に弱い場合に－３点とした。パネルは，味覚識別2.2

豚肉スープの成分分析

テストならびに熟成期間の異なる豚肉から調製し2. 1で調製した豚肉スープの窒素濃度を燃焼法

たスープを用いた訓練を実施した当研究所に所属

で（ス ミ グ ラ フ NC-220F ，（株）住 化 分 析 セ ン

する分析型パネル（33±5.6歳，男性２名，女性

ター製），pHをガラス電極を用いて（PH-METER３名）とした。なお，香りの影響を極力排除する

F52，HORIBA製），核酸関連物質の濃度を北田ため，鼻腔を閉じた状態で評価した。

らの方法で測定した 。また，遊離アミノ酸濃度10）試験２．豚肉スープの味の増強とヒポキサンチ

は，試料に蒸留水および10％スルホサリチル酸溶

ンおよびイノシン酸の濃度比の関係

液を加えてホモジナイズ後に遠心分離し，得られ2. 1で調製した豚肉スープを内在するHx含量がた上清をヘキサン洗浄したものを高速アミノ酸分0.3μmol/ml，IMP含量が2.0μmol/mlとなるよう析計（Ｌ-8900，（株）日立ハイテクサイエンス社に超純水で希釈した後，NaClが0.5％になるよう製）で測定した。

に加えてコントロールとした。コントロールに

2.3

官能試験

IMPおよびHxを次の濃度になるように加え，試試験１．苦味物質添加による豚肉スープの味の験１と同様に官能試験に供した。Conc.1：Hx 1.6μmol/ml ，conc.2：IMP 4.0μmol/ml ，conc.3：

増強
2. 1で調製した豚肉スープを内在するHx含量がHx 1.6μmol/ml・IMP 4.0μmol/ml，conc.4：Hx

苦味閾値以下の0.5μmol/mlとなるように超純水

4.0μmol/ml・IMP 4.0μmol/ml。なお，試験回数で希釈した後，NaClが0.5％になるように加えては１回のみとした。

コントロールとした。苦味物質としてHx，アル試験３．ヒポキサンチンと旨味物質の相互作用

ギニン（Arg）および硫酸キニーネ（Qui）を次

IMPを2.0μmol/mlあるいは4.0μmol/ml含む溶の濃度になるようにコントロールに加えて官能試

液に，Hxが０，0.7，1.6，4.0および8.0μmol/ml

験に供した。Hx：0.8（閾値相当），1.6および3.2になるように加えて官能試験に供した。また，

μmol/ml ，Arg ： 0.05（閾 値 相 当）
，0.1 お よ び

Gluを0.2％含む溶液にも同様にHxを加えて官能0.2％，Qui：0.0025，0.005（苦味識別テスト相当）試験に供した。なお，すべての試料には豚肉スーおよび0.01μmol/ml。室温にした各試料を試飲

プと同様に0.5％になるようにNaClを加え，試飲カップに５ml入れて２カップずつランダムに提カップに５ml入れて２カップずつ，Hxの濃度が供した。なお，試験は２回実施した。

薄い方から順に提供した。試験回数は１回とした。

官能試験の評価項目は，基本五味およびコク味

官能試験の評価項目は，塩味，苦味，旨味およとした。コク味は黒田らおよび西村らの定義を用

びコク味（濃厚感および持続性）とした。評価のい，厚み（thickness）は「味が濃い，こってり

方法は採点法とし，評価の尺度は６段階で，まっしている」，持続性（continuity）は「旨味の後たく感知しない場合は０，非常に弱く感知した場味」をそれぞれ評価した11，12）。評価の方法は採点

合に＋１点，弱く感知した場合に＋２，感知した法とし，評価の尺度は７段階で，コントロールと場合に＋３，強く感知した場合に＋４および非常© The Ito Foundation

83

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅱ）に強く感知した場合に＋５とした。パネルは試験

意差検定はｔ検定を用いて行い，有意水準は５％１と同様の５名とした。

とした。

2.4

統計処理

３．結果と考察

すべての官能試験の結果はパネル５名の平均値で算出した。また，試験１についての統計学的有3.1

豚肉スープの成分分析

豚肉スープに含まれる遊離アミノ酸および核酸
関連物質等の分析結果をTable１に示した。調製

Table１ Profile of the pork soup
6.142
768.7
0.084

したスープにはHxが0.97μmol/ml含まれていた。

Asp
Thr
Ser
Glu
Gly
Ala
Val
Cys
Met
Ile
Leu
Tyr
Phe
Trp
Lys
His
Arg
Pro

7.2
10.1
13.6
14.7
14.6
32.9
11.1
0.0
7.5
8.8
15.8
9.9
7.6
2.3
14.4
4.7
12.5
4.9

含量を考慮してHxの苦味閾値を下回るように超

IMP
INO
Hx

3.30
2.47
0.97

して苦味の識別テストに用いられる硫酸キニーネ

pHnitrogen（mg/100ml）
Na（％）

free amino acids（mg/100ml）

ATP-related compounds（μmol/ml）

そのため，官能試験に用いる際には内在性のHx
純水で希釈してから使用することとした。
3.2

苦味添加による豚肉スープの味の増強

Hxの特質の一つである苦味が豚肉スープの旨味およびコク味の増強に関与するかどうかを明らかにするため，豚肉スープに代表的な苦味物質を加えて官能試験に供した際の味の変化を評価した。加えた苦味物質は，研究対象であるHxの他に，食肉中に含まれ，かつホタテ貝のコクの主要因子とされるアルギニン９）および官能パネルに対とした。なお，コントロールとして苦味物質不添

3with 0.8μmol/ml of Hx
with 1.6μmol/ml Hx
with 3.2μmol/ml of Hx

strength of taste

2

＊
1

＊
＊

＊

＊

＊

0
salty

－1

sweetysour

bitterumami

thickness

continuity＊

Fig. 1 Effect of hypoxantine（Hx）on the taste of soup prepared from pork

The strength of taste of soups with addition of Hx were comparared withthat of soup without addition of Hx. Histgrams show mean values. The
values of astersks are significantly different（p＜0.05）．

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84

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

加の豚肉スープを用いた。

トロールと苦味の強さはほとんど変わらずに旨味

まず，Hxを加えた豚肉スープの評価結果をFig.

および濃厚感のみ増強した（ｐ＜0.05）。さらに，１に示した。加えたHxの濃度は内在性の0.5μ1.6μmol/mlでは持続性も有意に増強した（ｐ＜mol/mlを考慮し，閾値程度の0.8，その２倍の1.60.05）。また，3.2μmol/mlの場合はコントロール

および４倍の3.2μmol/mlの３段階とした。評価

よりも苦味をやや強く感知し，旨味およびコク味の結果，Hxが0.8および1.6μmol/mlの場合，コンの増強は確認できなかった。この結果は，Hxが3

with 0.05％ of Arg
with 0.1％ of Arg
with 0.2％ of Arg

strength of taste

2
＊

＊

＊

umami

thickness

continuity

＊
＊

1

＊

＊
0
salty

sweetysour

bitter

－1

Fig. 2 Effect of arginine（Arg）on the taste of soup prepared from pork

The strength of taste of soups with addition of Arg were comparared withthat of soup without addition of Arg. Histgrams show mean values. The
values of astersks are significantly different（p＜0.05）．
3

with 0.0025μmol/ml of Qui
with 0.005μmol/ml of Qui
with 0.01μmol/ml of Qui

strength of taste

2
＊
＊

1

＊＊

＊

bitter

umami

＊

＊

thickness

continuity

＊

0
salty

sweetysour＊－1Fig. 3 Effect of quinine sulfate（Qui）on the taste of soup prepared from pork

The strength of taste of soups with addition of Qui were comparared withthat of soup without addition of Qui. Histgrams show mean values. The
values of astersks are significantly different（p＜0.05）．

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85

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅱ）

ある一定の濃度までは豚肉スープの旨味，濃厚感

豚肉スープに加えた濃度に依存して増強すること

および持続性が増強するが，Hxの濃度が高すぎが確認された。一方で，苦味自体をやや強く感知ると旨味およびコク味が増強しないことを示し，する濃度を豚肉スープに加えると，味のバランス

平成28年度の本助成研究結果とも一致した 。

が崩れて苦味が突出してしまい，旨味およびコク

４）

続いて，Argを加えた豚肉スープの評価結果を味は増強しないことも明らかになった。我々は，Fig.２に示した。加えたArgの濃度はHxと同様に

Ｈ27年度の本助成研究において，食肉に亜硝酸塩

内在性の0.0065％を考慮して0.05（閾値相当），0.1

等を加えて塩漬熟成した際の旨味およびコク味のおよび0.2％の３段階とした。評価の結果，Argが増強について，本研究と同様にHxおよび苦味物

0.05および0.1％の場合，コントロールと苦味の強質（カフェインおよび硫酸キニーネ）の関与を調

さはほとんど変わらずに旨味が増強した（ｐ＜べている。その結果，苦味の種類にかかわらず，

0.05）。さらに，0.1％では濃厚感および持続性が一定の濃度の苦味は塩漬肉の旨味およびコク味を有意に増強した（ｐ＜0.05）。また，0.2％の場合，増強する可能性が示唆されており，本研究の結果

Hxを3.2mol/ml添加した場合と同様にコントロー

とも一致した13）。すなわち，塩漬の有無にかかわ

ルよりも苦味をやや強く感知し，旨味およびコクらず食肉の熟成に伴う旨味およびコク味の増強機

味の増強は確認できなかった。

構の一つとして，Hxの呈する苦味が関与するこ豚肉スープにQuiを加えた場合についても，Hx
およびArgと同様に苦味をほとんど感知しない程とが示唆された。
3 . 3 豚肉スープの味の増強とヒポキサンチン度の濃度では豚肉スープの旨味およびコク味が増およびイノシン酸の濃度比の関係強する一方で，Quiを0.01μmol/ml加えると苦味

これまで豚肉スープの旨味およびコク味の増強をやや強く感知し，旨味およびコク味の増強は確へのHxの呈する苦味の関与について調べてきた。

認できなかった（Fig.３）。

一方で，Hxの前駆体のIMPは，従来食肉の味へ

以上の結果は，苦味物質の種類にかかわらず，の寄与が大きいと考えられており，その存在も否

それ自体の呈する苦味をほとんど感知しない程度定できない。そこで，豚肉スープの旨味およびコの量を豚肉スープに加えた場合，豚肉スープの旨ク味が最も強く発現するHxおよびIMPの濃度比

味およびコク味が増強することを示している。さが存在すると仮定し，調製した豚肉スープにHx

らに，コク味に関しては，ある一定の濃度まではあるいはIMPを加えて官能評価し，両者の濃度比

Table 2 Effect of hypoxantine and IMP on the taste of soup prepared from pork
concentration of
ATP-related compounds（µmol/ml）
Hx

IMPcontrol

0.3

conc.1

1.6

conc.2conc.3
conc.4strength of taste
salty

umami

bitterthickness

continuity

2.0

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

2.0

－0.20

1.20

0.40

1.20

1.80

0.3

4.0

－0.20

0.80

0.60

1.00

1.80

1.6

4.0

0.00

1.00

0.60

0.80

1.00

4.0

4.0

0.40

1.60

0.60

1.20

1.80

© The Ito Foundation

86

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 3 Effect of concentrations of hipoxantine on the strength oftaste by IMP or Glu.
addition of Hx（µmol/ml）

IMP
2.0µmol/ml

IMP
4.0µmol/ml

Glu
0.2％

stength of taste
salty

umami

bitterthickness

continuity

0.0

2.4

3.0

0.0

1.6

1.6

0.7

3.0

3.0

1.0

1.2

0.8

1.6

3.0

2.2

0.8

1.0

1.0

4.0

3.0

3.0

2.4

2.4

3.0

8.0

3.0

3.0

2.4

2.2

1.8

0.0

2.4

3.2

0.0

2.0

2.5

0.7

2.4

3.0

1.0

1.8

2.2

1.6

2.6

3.2

0.8

2.4

2.0

4.0

3.2

3.4

1.0

2.4

2.8

8.0

2.8

3.4

1.8

2.8

2.4

0.0

2.40

3.00

0.00

1.60

1.60

0.7

2.20

3.60

0.60

1.80

2.80

1.6

2.40

3.40

0.60

2.40

3.20

4.0

2.20

3.40

2.00

3.00

3.20

8.0

2.00

2.80

2.00

3.20

2.40

について予備的に検討した。なお，コントロール

IMPの両者が等量程度の割合でスープに含まれたはHxおよびIMP不添加の豚肉スープとした。

場合に最も旨味およびコク味が強い傾向を示し

HxあるいはIMPを加えた豚肉スープの評価結た。一方，conc.１とconc.３の比較により，Hxが1.6

果をTable２に示した。まず，conc.１でHxのみを

μmo/mlの時にIMPの濃度を高くしても旨味およ

1.6μmo/mlになるように加えた場合，Fig.１で示

びコク味に変化がなく，Hxが一定量存在する場

した結果と同様にコントロールと比較して旨味，合は，IMPの旨味およびコク味の増強への寄与が濃厚感および持続性が増強した。続いて，conc.

低いことが示唆された。以上の結果は，Hxが単２でIMPのみ4.0μmo/mになるように加えた場に食肉の旨味およびコク味を増強するのではな

合，conc.１のHxのみ添加と同様に旨味，濃厚感

く，食肉に内在するIMPあるいは旨味物質と相互および持続性の増強が確認されたが，conc.１よ

作用して好ましい味わいが形成する可能性を示す。

りは旨味および濃厚感の増強程度がやや低い傾向

3.4だった。さらに，conc.３および４でHx，IMPのHxと旨味物質の相互作用を調べるため，食肉両者を濃度比を変えて加えた場合，いずれもコン

由来の成分の影響を排除し，0.5％NaCl溶液にHx

トロールと比較すると旨味およびコク味の増強がとIMPあるいはGluのみを混合した時の味の変化認められたが，conc.４のHx，IMPともに4.0μを予備的に調べた。

ヒポキサンチンと旨味物質の相互作用

mo/mlになるように加えた場合の方がconc.３の官 能 試 験 の 結 果 を Table ３ に 示 し た 。ま ず ，Hxが1.6，IMPが4.0μmo/mlよりも強く，また，

IMP2.0μmo/ml溶液にHxを混合した場合，Hxがconc.１のHxが1.6，IMPが2.0μmo/mlの時と同程

1.6μmo/mlまではHxの影響をほとんど受けずに度であった。つまり，濃度にかかわらず，HxとIMP自体の旨味およびコク味が評価された。一© The Ito Foundation

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響（Ⅱ）

87

方，Hxを4.0μmo/ml以上加えると，Hx不添加のあったのはIMPよりもGluであり，少なくとも熟場合よりも濃厚感および持続性が増強する傾向を成肉特有の味の発現にはHxおよびGluが必須であ示した。また，IMP4.0μmo/ml溶液にHxを混合ると考えられる。また，実験3.1で，食肉の熟成した場合，Hxが4.0μmo/mlまではHxの影響をほに伴う旨味およびコク味の増強機構の一つとしとんど受けないが，Hxを8.0μmo/ml加えるとHxて，Hxの呈する苦味が関与することが示唆され不添加より濃厚感がやや増強する傾向を示した。

た。実際の食肉においては熟成に伴いHx以外にし た が っ て ，IMP の 濃 度 に か か わ ら ず ，Hx がもアミノ酸やミネラル等の様々な苦味物質が蓄積

IMPよりも多く存在する場合に濃厚感を強く感じしていると考えられる。しかし，Hxの苦味閾値る傾向が認められた。反対に，塩味，旨味およびはアルギニンやロイシン等のアミノ酸と比較する

持続性についてはIMPが2.0，4.0μmo/mlいずれときわめて低く ９，14），なおかつ長期間の熟成にの場合もHxによる増強を確認できなかった。まよって閾値の数倍量まで食肉中に蓄積する４）。すた，結果は示していないが，0.5％NaCl溶液にHx

なわち，Hxが食肉の熟成に伴う味の増強に必要のみを4.0μmo/ml加えたときの苦味の強さは3.0

な苦味の主要な役割を担う可能性がある。

であり，IMPがHxの呈する苦味を抑制する可能性が示唆された。

今後，HxとIMPおよびGluの相互作用を追求し，熟成肉特有の好ましい味わいの形成機構を解明す

続いて，Glu0.2％溶液にHxを混合した場合，Hxが4.0μmo/mlまでは旨味が増強する傾向であるが，それ以上加えると増強しない傾向にあり，
また，濃厚感および持続性は，混合するHxの濃ることにより，「食肉の熟成適期を判断する客観的な指標」の提案を目指したい。
４．要

約

度に依存して増強する傾向を示した。なお，Hx

食肉は熟成することにより風味が改善する。本の混合により苦味も強くなるが，その程度は弱研究では，と畜後の味の改善におけるHxの関与

く，IMPと同様にGluがHxの呈する苦味を抑制すについて調べた。Hxの性質の一つに苦味がある。

る可能性が示された。すなわち，0.5％NaCl溶液

そこで，食肉の旨味およびコク味の増強にHxの中でGluとHxを混合すると，旨味，濃厚感および呈する苦味が関与するか否かについて明らかにす

持続性が増強し，Hx自体の呈する苦味は抑制さるため，豚肉から調製したスープにHx，アルギ

れることが示された。

ニンおよび硫酸キニーネを加えて官能試験に供し実験3. 2で豚肉スープにおけるHxおよびIMPのた。その結果，苦味の種類にかかわらず，それ自濃度比とスープの味の関係を予備的に調べた結体の苦味をほとんど感知しない程度の苦味は豚肉

果，両者が等量程度の割合で含まれた場合に旨味

スープの旨味およびコク味を増強することが示唆

およびコク味の増強が顕著であった。しかし，実された。続いて，Hxの前駆体であるIMPとHxの際の食肉においては熟成に伴いIMPはほとんど消濃度比が豚肉スープの味の増強に関与するかにつ失するため，HxとIMPが等量の状態になる可能

いて予備的に調べると，スープ中にHxとIMPが性は低い。一方で，熟成に伴うタンパク質の分解等量程度存在するときに旨味およびコク味が最もにより，IMPと同様に旨味を呈すGluも熟成前の強くなり，Hxが旨味物質と相互作用する可能性

数倍量にまで増加する。本実験において，Hxとが示された。さらに，食肉由来の成分の影響を排の混合により旨味およびコク味の増強が顕著で除し，0.5％NaCl溶液中でHxと旨味物質による相© The Ito Foundation

88

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

互作用について調べた結果，HxはGluと相互作用
し，苦味自体は抑制されつつ旨味およびコク味が増強する傾向がみられた。一方，IMPについては，
Hxとの相互作用はほとんど認められないが，Hx
よりもIMP濃度が高いときに濃厚感が増強する傾向がみられた。実際の食肉においては，熟成に伴いIMPは分解されてHxに変換するため，熟成肉
特有の風味の発現にはHxおよびGluが必須であると考えられた。
文献１） N i s h i m u r a , T . , K a t o , H . ：F o o d R e v i e w s
International，4，175～194，1988．
２） Nishimura, T., Rhue, M. R., Okitani, A., Kato, H.：
Agricultural and Biological Chemistry ，52 ，2323 ～
2330，1988．
３） Ishi, K., et al.：Journal of Home Economics ofJapan.，46，229～234，1995．
４） Ichimura, S., Nakamura, Y., Yoshida, Y., Hattori,
A.：平成28年度食肉に関する助成研究調査報告書，35，52～60，2016．
５） Ichimura, S., Nakamura, Y., Yoshida, Y., Hattori,
A.：Animal Science Journal，88，379～385，2017．
６） Tikk, M., et al.：Journal of Agricultural and Food
Chemistry，54，7769～7777，2006．
７） K o n o s u , S . ：F o o d t a s t e c h e m i s t r y , A C S
Symposium series, No.115 ， 185 ～ 203 ， American
Chemical Society, Washing-ton. DC，1979．
８） H u b e r , L . , K l o s t e r m e y e r , H . ：Milchwissenschaften，29，449～455，1974．
９） Michikawa, K.：Nippon Shokuhinn Kagaku
Kogaku Kaishi，42（12），982～988，1995．
10） Kitada, Y., Hasuike, A., Sasaki, M., Tanigawa, K.,
Horiuchi R., Yumiba, H.：日本食品工業学会誌，30，
151～154，1983．
11） Kuroda, M., Yamanaka, T., Miyamura, N.：日本味と匂学会誌，11（2），175～180，2004．
12） Nishimura, T.：日本味と匂学会誌，19（2），163～
166，2012．
13） Ichimura, S., Nakamura, Y., Yoshida, Y., Hattori,
A.：平成27年度食肉に関する助成研究調査報告書，
33，23～29，2015．
14） Ninomiya, K.：調理科学，１，No.４，185～197，
1968．

© The Ito Foundation

89

霜降り豚肉の香味に寄与する因子に関する研究
Studies on factors contributing to taste and aroma of marbled pork

松

石

昌

典・小

林

優多郎

（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

Masanori Matsuishi and Yutaro Kobayashi（School of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science,
Nippon Veterinary and Life Science University）

In order to clarify factors responsible for aroma and taste of marbled pork, sensory
evaluation, analyses of free amino acids, dipeptides, aroma components and fatty acids were
performed on marbled neck meat and lean silverside ham. Sensory evaluation demonstrated
that there was no significant difference in strength of umami taste between two meats,
although neck meat had a significantly stronger sweet and fatty aroma（retronasal aroma）
than silverside ham. Measurement of free amino acids and dipeptides revealed that glutamine
was significantly more abundant in neck meat than in silverside ham, although methionine,
leucine, phenylalanine, anserine and carnosine were significantly more abundant in silverside
ham than in neck meat. There were no significant differences in the amount of glutamic acidand other amino acids as well as total amount of amino acids between two meats. Analysis ofaroma components showed that neck meat tended to have larger amount of 2-ethyl-1-hexanol,
butyrolactone, gamma-heptalactone and gamma-nonalactone than silverside ham, indicatingthat those compounds could contribute to a sweet and fatty aroma. On the other hand,oxidation products such as aldehydes tended to be more abundant in silverside ham than inneck meat. Analysis of fatty acid composition demonstrated that myristic acid, palmitic acid,
palmitoleic acid and heptadecenoic acid were significantly more abundant in neck meat thansilverside ham, however arachidonic acid was significantly more abundant in silverside hamthan in neck meat, suggesting to be responsible for larger amount of lipid oxidation products
such as aldehydes in silverside ham than neck meat.

１．目がみられる。例えば，Tokyo-Xやフジロックな的どである。これらの肉の脂肪含量は５―10％に達豚肉は日本で精肉としてよく消費される食肉のする。これらには，品種改良により系統豚として一つである。近年，豚肉のブランド化がすすみ，生み出されたものと，パンなどの食品廃棄物を給様々なブランドが生み出されているが，その中に餌して，リジンインバランスにより生み出されたは，赤身の中に脂肪交雑して霜降りになったものものがある１，２）。

© The Ito Foundation

90

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

それらのおいしさの原因は，交雑脂肪が軟らか

官能評価では，香りは香気物質が揮散しにくい口さと滑らかな食感をもたらし，特定の呈味成分や中香を選択し，鼻孔の開閉により味と口中香を明香気成分が豊かな味や香りをもたらしていること

確に区別して，それらの特性を正確にとらえた。

にあるだろうことが予想される。このうち，食感

また，機器分析では呈味成分を測定するとともについては，テクスチュロメーターなどの物性測に，GC-MS（ガスクロマトグラフィー - 質量分析）

定と官能評価により，一般の豚肉（LWD（ランを実施して香気成分を明らかにした。これによドレース×ラージホワイト×デュロック）など）

り，ネック肉の美味しさに寄与する味と香りの成より軟らかく，ジューシーであることが確認され分を明らかにすることを目的とした。

ている 。味については，LWDと比べてうま味
３）

は差がなく，脂っぽさが強い傾向にあると報告さ

２．材料と方法

れている４）。そして，呈味成分のアミノ酸と核酸

2.1

関連物質が測定されているが，一般の豚肉との有

市販の国産豚肉のネック肉（広頚筋）およびモ

意な差は認められていない 。他方，香気成分に

モ肉（そともも；半腱様筋と大腿二頭筋で構成）

ついては，豚臭さと獣臭さが一般の豚肉より少なを購入して使用した。品種はLWDである。官能く，アルデヒド類などの脂質酸化生成物が少ない

評価では３個体の各肉を使用した。各個体の肉のとされている 。

購入を確実にするために，購入日を３日以上空け

３）

４）

材料

これらのうち，味と香りについては，和牛肉にて購入し，その購入した日に官能試験を行った。

おけるラクトン類 のような，霜降り豚肉の美味

アミノ酸分析，香気成分分析および脂肪酸組成分

しさにポジティブな貢献をする因子については明析ではそれぞれ別の３個体，３個体，４個体の各らかになっていない。また，交雑脂肪の多いこと

肉を使用した。各個体の肉の購入を確実にするたがどのように影響しているのかも明らかになってめには，購入日を３日以上空けて購入した。アミ

いない。この原因の一つは，官能評価が味と口中ノ酸分析に使用した肉は，購入した日に除タンパ

香（retoronasal aroma）を区別しないで行われ，クした分析用試料を調製して，分析まで－80℃に香りは口中香ではなく鼻先香で評価されているこ保存した。香気成分分析に使用した肉は，ひき肉とにあると考えられる。この場合，味と香りの特にしたのちバイアルに詰めて－80℃で保存し，分性が正確にとらえられておらず，鼻先では香気物

析するときには４℃に１時間放置して解凍して使質が揮散して香りが実際より弱く感じられている用した。脂肪酸組成分析に使用した肉は，一旦可能性がある。また，別の原因として，脂肪の含－80℃で冷凍保存し，分析するときは４℃に一晩量が和牛肉の平均40―50％に比べると低いため放置して解凍して使用した。

５）に，脂肪による特徴の発現が小さく，官能評価あネック肉およびモモ肉いずれにおいても皮下脂

るいは機器分析で一般豚肉との差をとらえきれて肪と約１cm以上の結合組織を除去した赤身部分

いない可能性がある。

を試験用試料とした。

そこで，まず，霜降り豚肉の極端なモデルとし

2.2

官能評価

て，脂肪含量が20％程度あるいはそれ以上になる

官能評価では，試験用試料より縦約４cm，横豚のネック肉を対象として，その味と香りを官能

約２cm，厚さ約0.4cm肉片を作成した。この肉片評価および機器分析により評価した。このときの２―３個を沸騰浴中に保持した300mLの１％食塩© The Ito Foundation

霜降り豚肉の香味に寄与する因子に関する研究

91

水に３分間入れて加熱したものを加熱肉片としSPME フ ァ イ バ ー （Divinyl-benzen （DVB）/て，ただちに官能評価に供した。

Carboxen（CAR）/Polydimethylsiloxane（PDMS）

まず，訓練したパネリストでネック肉とモモ肉

StableFlexTM, SUPERCO社製）を入れ，ニードルを食べ比べ，その特徴の違いを表す言葉を出し合からのHeガスでパージさせながら20分間香気成い，評価すべき項目を選択した。それにより，味分の捕集を行った。

については肉様のうま味，香りについては甘い

SPMEにより捕集した香気成分をGC-MS（GC-

脂っぽい香り，食感については，滑らかさとザク

MS-QP2010SE，島津製作所製）を用いて分析をザクしたような独特の歯ごたえを評価することに行った。カラムはTC-WAX（0.25mm×60ｍ，決定した。これらの項目について，９名の訓練し

GL-Science社製）を使用し，カラム温度は50℃たパネリストが，ネック肉とモモ肉の間でその程（４min）→190℃（４℃/min）で分析を行った。

度を２点識別法で比較した。なお，パネリストは各ピークのフラグメントパターンはNISTライブ

アイマスクをしてすべての評価を行った。ノーズ

ラリーを用いて定性解析を行った後，市販の標準クリップで鼻孔を閉じて香りの情報を遮断した状品を用いてマススペクトル，リテンションタイム

態で，舌で知覚できるものを味とした。同状態での一致を確認した。得られた結果は内部標準法を食感も評価した。ノーズクリップを外して鼻孔を用い，添加した1,2-dichlorobenzenのピーク面積

開けたときに，口腔から鼻腔に抜ける気体で初めを１としたときの相対含量で示した。

て知覚できるものを香り（口中香）とした。
2.3

2.5

脂肪酸組成分析

遊離アミノ酸とジペプチドの分析

常法 にしたがい，各試料のひき肉をエタノー

試験用試料をミンサーで２度挽きし，得られた

ル性水酸化カリウムで加熱ケン化した後，酸性下

ひき肉５ｇに対して，４倍量の冷却純水を加え，でジエチルエーテル―ヘキサンを用いて脂肪酸を０℃で17,500rpm，１分間ホモジナイズした。ホ抽出した。得られた脂肪酸をメチルエステル化

モジネートを４℃，10,000×gで20分間遠心分離

し，ガスクロマトグラフィーで分析定量した。ガし，上清を得た。上清１mLに対して等量の３％

スクロマトグラフィーは水素炎イオン化検出器付

スルホサリチル酸を添加して４℃で一晩放置しきガスクロマトグラフ（GC-15A型，島津製作所

た。この混合物を４℃，10,000×gで10分間遠心製）を用いて行った。分析条件は以下のとおりであ

分離して，上清を0.45μｍのフィルターに通してる。カラム：CP-SIL88（WCOT FUSED SILICA，分析用試料とした。全自動アミノ酸分析機JLC-

0.25mm×50ｍ）（VARIAN社製）。カラム温度：

500/V（日本電子（株），東京）で分析した。

160℃（３min）→230℃（３℃/min）（５min）。

2.4

７）

加熱香気成分の捕集と香気成分分析

香気成分の捕集には，ダイナミック―ヘッドス

注入口温度：250℃。検出器温度：250℃。スプリット比：50：１．キャリアガス：He。

ペースSPME（固相マイクロ抽出）法６）を用いた。

2.6

試験用試料を２度挽きして得たひき肉２ｇと内部官能評価の結果は，２項検定で解析した。遊離標 準 （10ppm 1,2-dichlorobenzen/diethyl ether）

アミノ酸分析，香気成分分析，および脂肪酸組成

10μLを10mL容ガラスバイアルに封入し，バイア分析の結果はｔ-検定で解析した。

ル上部のセプタムを通して毛細管とニードルを挿入して，これを100℃で加熱した。毛細管内部に© The Ito Foundation

統計処理

92

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

めとするその他の遊離アミノ酸および総遊離アミ３．結果と考察
3.1

ノ酸の量には両肉間で有意差はみられなかった。

官能評価

この結果は，官能評価でうま味の強さに有意差が訓練したパネリストが加熱したネック肉とモモ

なかったことに反映されているのであろう。ま肉の，肉様のうま味，甘い脂っぽい香り，滑らか

た，これは脂肪含量の多いTokyo-Xと少ない一さ，および，ザクザクしたような独特の歯ごたえ

般豚との比較でも遊離アミノ酸量には有意な差がの程度を比較した（Table１）。その結果，うま味なかったと報告されていること３）とも類似していの強さはネック肉とモモ肉で有意な差がなかっる。

た。一方，甘い脂っぽい香り，滑らかさ，および，

3.3

ザクザクしたような独特の歯ごたえは，ネック肉

ネック肉とモモ肉のヘッドスペースの香気成分の方がモモ肉よりも有意に（p＜0.001）高い程度をSPME法により捕集してGC-MSで分析した結にあった。これらの結果から，霜降りのネック肉

果，アルカン類６種，芳香族化合物５種，アルデのおいしさには，香味のうち甘い脂っぽい香りがヒド類10種，ケトン類６種，アルコール類16種，貢献していると推定された。滑らかさと独特の歯酸類10種，エステル類４種，ラクトン類９種，そ

ごたえについては本研究ではそれ以上追求しなの他４種を同定して定量した。アルコール類でかった。

は，2-ethyl-1-hexanolがモモ肉よりもネック肉

3.2

遊離アミノ酸量とジペプチド量の比較に多い傾向にあった（Fig.１）。アルデヒド類でネック肉とモモ肉の呈味成分として，遊離アミは，benzaldehydeをはじめとする同定されたほノ 酸 と ジ ペ プ チ ド の 分 析 を 行 い ，そ の 結 果 を

とんどの化合物がネック肉においてモモ肉より少Table２に示した。グルタミンはネック肉の方がない傾向にあった（Fig.２）。他方，ラクトン類で有意に（p＜0.01）多かったが，メチオニン，ロはbutyrolactone，gamma-heptalactone，gamma-

イシン，フェニルアラニンはモモ肉の方が有意に

nonalactoneがモモ肉よりネック肉に多い傾向が（p＜0.05あるいはp＜0.01）多かった。ジペプチドあったが，gamma-hexalactone, delta-octalactone,

では，アンセリンとカルノシンがモモ肉の方に有delta-decalactone, gamma-undecalactone,

意に（p＜0.05とp＜0.01）多かった。しかし，うgamma-dodecalactoneはネック肉よりモモ肉にま味を有するアミノ酸であるグルタミン酸をはじ多い傾向にあった。（Fig.３）。これ以外の化合物

香気成分の比較

Table 1 Paired difference test for boiled neck meat and silverside ham meat of pork１）
Item

Number of panelists indicating ahigher level for

Difference２）

Neck meat

Silverside ham

Intensity of umami

11

16

NS

Sweet and fatty odor

26

1

＊＊＊

Smoothness

26

1

＊＊＊

Characteristic chewiness

26

1

＊＊＊

１）Data is the sum of three experiments. Nine panelists participated in every experiment.
２）Significant difference is indicated with ＊＊＊（p＜0.001). NS, not different.

© The Ito Foundation

93

霜降り豚肉の香味に寄与する因子に関する研究
Table 2 Composition of free amino acids and dipeptides of neck meat andsilverside ham

Mean±SD（µmol/g meat）

Difference

Neck meat

Silverside ham

P-Ser
Tau

0.00 ± 0.00
5.23 ± 1.77

0.02 ± 0.00
2.89 ± 0.67

NS
NS

Asp

0.72 ± 0.03

0.72 ± 0.14

NS

Thr

0.32 ± 0.06

0.30 ± 0.04

NS

Ser

0.36 ± 0.03

0.40 ± 0.02

NS

Asn

0.11 ± 0.04

0.11 ± 0.01

NS

Glu

0.37 ± 0.09

0.41 ± 0.01

NS

Gln

1.72 ± 0.09

1.06 ± 0.09

＊＊

Gly

1.97 ± 0.32

1.43 ± 0.19

NS

Ala
Cit

3.16 ± 0.39
0.15 ± 0.05

2.52 ± 0.26
0.07 ± 0.01

NS
NS

Val
Met

0.33 ± 0.10
0.08 ± 0.00

0.38 ± 0.06
0.16 ± 0.04

NS

Ile
Leu

0.20 ± 0.06
0.33 ± 0.06

0.27 ± 0.03
0.47 ± 0.05

NS

Tyr
β-Ala
Phe
Orn
His
Lys
Arg
Hypro
Pro

0.15 ± 0.02
0.41 ± 0.23
0.18 ± 0.02
0.05 ± 0.01
0.11 ± 0.01
0.32 ± 0.06
0.00 ± 0.00
0.04 ± 0.01
7.57 ± 2.79

0.23 ± 0.05
0.54 ± 0.20
0.30 ± 0.04
0.04 ± 0.03
0.12 ± 0.02
0.33 ± 0.05
0.00 ± 0.00
0.02 ± 0.00
3.44 ± 1.88

NS
NS

Total

23.87

16.23

NS

Free amino acids

4.88

2.77

＊

＊

＊＊

NS
NS
NS
NS
NS
NS

Dipeptides
Ans

0.57 ± 0.04

1.13 ± 0.17＊

Car

25.78 ± 5.25

47.32 ± 1.08＊＊

NS, not significant；＊，p＜0.05；＊＊，p＜0.01.

類 で も ，decane, dodecane, p-xylene, hexanal はしれない。逆に，2-ethyl-1-hexanol, butyrolactone,

ネック肉の方が多い傾向にあったが，それ以外のgamma-heptalactone，gamma-nonalactone な ど

化合物はモモ肉の方が多い傾向にあった（図に示のネック肉に多い化合物は，甘い脂っぽい香りにしていない）。脂肪含量の多いネック肉のアルデ

貢献している可能性がある。しかし，SPMEでのヒド類などの香気成分が脂肪含量の少ないモモ肉

今回の分析は測定値のばらつきが大きいため，よより少ない傾向があることは，飯塚ら４）が脂肪含

り精度の高い分析法で確かめる必要がある。

量の多いTokyo-X豚肉に脂肪含量の少ないバー

3.4

クシャー種とLWD種に比べてアルデヒド類などネック肉とモモ肉の脂肪酸組成を分析した。

の脂質酸化生成物が少ないと報告していることとTable３に示したように，ミリスチン酸，パルミ

類似している。霜降り状態であることがこのよう

チン酸，パルミトオレイン酸，ヘプタデセン酸はな類似した結果をもたらす原因になっているのかもモモ肉よりネック肉に有意に多かったが，アラキ© The Ito Foundation

脂肪酸組成の比較

Fig. 2 Aldehydes obtained from neck meat and silverside ham.

© The Ito Foundation

2,

s-

tra
n

ns

tra

Closed bar and open bar show neck meat and silverside ham, respectively.

de

ad

ec

D

ie
n

al

al

al

en

ec

nd

U

-2
-

en

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-D

ns

-4
-

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l A )lc
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l
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l

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D

2-

th
et

-M

en

ct

-O

ct

O

1-

l

l

no

an

ta

ol

-o

-3

l

-

no

xy

an

ex

-H

l-1

-2

-e

(2

2-

tra

-6

+)

)-(

(S

l,

no

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Et

hy

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H

1-

en

ct

O

1-

ex

H

1-

ta

ho

et

Pe
n

1-

-m

,1

ol

et

2-

an

relative amount

平成29年度

Be

tra

ta
n

ep

H

al

an

ex

H

relative amount

op

Pr

2-

94
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

7

6

5

4

3

2

1

0

Fig. 1 Alcohols obtained from neck meat and silverside ham．

Closed bar and open bar show neck meat and silverside ham, respectively.

6

5

4

3

2

1

0

95

霜降り豚肉の香味に寄与する因子に関する研究
0.12

relative amount

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02

Closed bar and open bar show neck meat and silverside ham, respectively.

Table 3 Fatty acid composition of neck meat and silverside ham
Mean±SD（％）†
Neck meat

Silverside ham

Decanoic acid
Lauric acid
Myristic acid

0.2 ± 0.03
0.1 ± 0.0
1.6 ± 0.05

0.1 ± 0.0
0.1 ± 0.0
1.2 ± 0.05

Pentadecanoic acid
Palmitic acid
Palmitoleic acid
Heptadecanoic acid
Heptadecenoic acid
Stearic acid
Oleic acid
Linoleic acidn-3 Linolenic acidArachidic acid
Eicosenoic acid
Eicosadienoic acid
Eicosatrienoic acid

0.1 ± 0.03
25.8 ± 0.52
3.5 ± 0.36
0.5 ± 0.04
0.3 ± 0.03
13.5 ± 0.71
43.7 ± 0.93
8.2 ± 0.49
0.5 ± 0.05
0.2 ± 0.0
0.7 ± 0.09
0.3 ± 0.0
0.2 ± 0.03

0 ± 0.0
22.7 ± 0.85
2.4 ± 0.31
0.4 ± 0.13
0 ± 0.0
13.3 ± 0.95
43.6 ± 3.35
11.3 ± 3.37
0.4 ± 0.10
0.1 ± 0.05
0.6 ± 0.13
0.4 ± 0.13
0.4 ± 0.13

Arachidonic acid

0.7 ± 0.12

2.3 ± 0.82

Difference

NS
NS
＊＊＊

NS
＊＊
＊

NS
＊＊＊

NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
＊

†，Fatty acids are described as percentage of total fatty acids. NS, not significant；＊，p＜0.5；＊＊，p＜0.01；＊＊＊，p＜0.001．

© The Ito Foundation

ne
ac
al
ec

od
D
a.
m
am

.g

am
.g

Fig. 3 Lactones obtained from neck meat and silverside ham.

Fatty acids

to

ne
ac
al
ec

nd
-U
a.
m

el
.d

am
.g

to

ne
ac
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D
ta

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ne
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Bu

-H

ty

ex

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la

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ct

to

on

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ne

0

96

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

ドン酸はネック肉よりモモ肉に有意に多かった。

有意に多く，メチオニン，ロイシン，フェニルア

他の脂肪酸には両肉間に有意な差はなかった。多ラニン，アンセリン，カルノシンは有意にモモ肉

価不飽和脂肪酸であるアラキドン酸がモモ肉に多に多かったが，グルタミン酸やその他のアミノ酸かったことが，酸化生成物であるアルデヒド類がおよびアミノ酸の総量には有意な差がなかった。

モモ肉に多かった理由の１つかもしれない。高崎

香気成分を分析した結果，ネック肉には，アルらはTokyo-X，バークシャー種，LWD種のロー

コ ー ル 類 の 2-ethyl-1-hexanol ，ラ ク ト ン 類 のスの脂肪酸組成を調べて，オレイン酸がTokyo-X

butyrolactone, gamma-heptalactone, gamma-

で 47.38 ％，バ ー ク シ ャ ー 種 で 45.47 ％ で あ り ，nonalactoneがモモ肉より多い傾向にあり，これ

LWD種の42.88％よりも有意に高い含量であるこらが甘い脂っぽい香りに寄与する可能性が示されとを示している 。本研究のネック肉とモモ肉のた。他方，アルデヒド類などの脂質酸化生成物はオレイン酸含量は約44％であり，バークシャー

モモ肉の方がネック肉より多い傾向にあった。脂

種，LWD種とあまり差がない。したがって，オ肪酸組成分析では，ミリスチン酸，パルミチン酸，

レイン酸含量は，部位差よりも品種差が大きいこ

パルミトオレイン酸，ヘプタデセン酸はモモ肉よとが示唆される。他方，彼らの報告では，アラキ

りネック肉に有意に多かったが，アラキドン酸はドン酸含量はバークシャー種で約１％である以外

ネック肉よりモモ肉に有意に多かった。アラキド

は，他の２種では微量とされている。また，リノー

ン酸がモモ肉に多いことは脂質酸化生成物が多ル 酸 含 量 は Tokyo-X で 4.66 ％ と 低 く ，バ ー ク

かった原因であることが示唆された。

３）

シャー種とLWD種では７―８％であり，今回のネック肉と大きな差がない。今回モモ肉で得られた，アラキドン酸2.3％とリノール酸11.3％という高い値は，部位差を示しているのであろう。
４．要約

霜降り豚肉の香味に寄与する因子を明らかにするために，霜降りになっているネック肉と赤身のモモ肉について，官能評価，遊離アミノ酸分析，
香気成分分析，脂肪酸組成分析を行った。官能評
価では，うま味の強さに関しては，ネック肉とモモ肉に有意差はないが，甘い脂っぽい香り（口中香）については，ネック肉はモモ肉よりも有意に文献１） 入 江 正 和：日 本 養 豚 学 会 誌 ，39 ，221 ～ 254 ，
2002．
２） 入江正和：食肉の栄養・機能と健康2017「「豚肉」
礼賛！」，公益財団法人日本食肉消費総合センター，
東京，６～15，2017．
３） 高崎禎子，飯塚佳子，鈴木亜由美，伊藤米人：日本調理科学会誌，38，404～409，2005．
４） 飯塚佳子，高崎禎子，鈴木亜由美，森田香絵，相島鐵郎：日本食品科学工学会誌，53，23～30，2006．
５） 松石昌典，久米淳一，伊藤友己，高橋道長，荒井
正純，永富宏，渡邉佳奈，早瀬文孝，沖谷明紘：日本畜産学会報，75，409～415，2004．
６） Watanabe, A., Ueda, Y., Higuchi, M., Shiba, N.：
Journal of Food Science，73，420～425．2008．
７） 堤忠一：エーテル抽出法，日本食品工業学会食品分析法編集委員会（編）食品分析法，光琳，東京，
126～127，1982．

強いことが明らかになった。遊離アミノ酸とジペプチドを分析した結果，グルタミンはネック肉に© The Ito Foundation

97

加熱肉に生じる赤色に対するカルノシンの影響
Effect of carnosine on the red color arising in cooked meat

中

村

幸

信・江

田

芳

崇・吉

田

由

香・猪

口

由

美

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

Yukinobu Nakamura, Yoshitaka Eda, Yuka Yoshida and Yumi Inoguchi（Japan Meat Science and Technology Institute）

Cooked meat, which was boiled at 85℃ for one hour, was repeatedly washed with distilledwater and acetone to dilute and remove water-soluble components, water and lipid, resulting
in a powder. The cooked meat powder（CMP）was used to study the formation of denatured
globin hemochrome（d-hemo）from carnosine. The d-hemo was formed by the addition of
reducing agent to CMP. In the present of reducing agent, CMP with carnosine had higher
values of a＊ and C＊ than that without imidazole related compounds. The stability of d-hemo
formed in the addition of carnosine was pH-dependent. The d-hemo stabilized in the conditionof neutral and alkaline than that of acid on the oxidation during the storage of 24 hours.
Increasing carnosine concentration enhanced the stability of d-hemo at pH 6. Thus, it wassuggested that carnosine formed d-hemo. Histidine and imidazole were also same mode on thecondition of pH and the oxidation during the storage, indicating that imidazole group of
carnosine coordinated to iron in the heme. The present results demonstrated that the
suppression of color reversion in cooked meat could be operated by the condition of lower pH
and the oxidation of iron.

１．目

済的損失は大きく，その機構の解明と解決策が望的まれている。

食肉の色調は，その品質に影響する因子の１つ

加熱肉の赤色現象は，Pink color defect（PCD）である。食肉の色調について，多くの消費者は，と称され，その研究は古くから行われている。

生の食肉は“赤色”，加熱された食肉は“褐色”とPCD は ２ つ の ケ ー ス に 分 類 さ れ ， １ つ は認識している。しかし，衛生的に加熱殺菌された“Persistent pink （PP）”， も う １ つ は “Color

食肉であっても，赤色を呈する現象が見られる。

reversion（CR）”である。PPは赤色が加熱直後

この加熱肉の赤色現象は，先の消費者の認識と異から認められる。CRは赤色が加熱直後には認めなることから，消費者によって“食肉の加熱不られず，一定時間経過後に認められる。過去の研足”あるいは“健康被害につながる異常”と判定

究では，特にPPの原因として，未変性ミオグロされる。この結果によって食肉産業界が受ける経ビンの残存１），亜硝酸塩の存在２，３），不完全燃焼© The Ito Foundation

98

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）に伴うガスの発生４），シトクロームｃ５，６）の存在，た。加熱した挽肉（加熱肉）は，以下の操作に

ニコチンアミドの存在などが示されている。

よって，水溶性成分，水分および脂質を希釈ある

他方，CRの原因については，変性グロビンヘモ

いは除去し，粉末化した。まず，加熱肉に10倍量

クロム（d-hemo），すなわち“変性したグロビンの蒸留水を加えて，ホモジナイズし，遠心分離

分子と２価鉄に含窒素化合物などが配位したポル（10,000×ｇ，５分間）して沈殿を得た。同水処

フィリン錯体”の形成と考えられているが理は，さらに２回行った。次に，水処理して得ら

７，８）

，

１，９，10）れた沈殿に対して，最初の加熱肉重量の５倍量のいまだ不明な点が多い。
PCD に 関 す る 過 去 の 研 究 で は ，ヘ モ ク ロ ム

アセトンを加え，振とう（５分間）し，遠心分離（hemo）を形成する含窒素化合物としてニコチン（10,000×ｇ，５分間）して沈殿を得た。同様のアミドが示されている。また，hemoの形

アセトン処理は，さらに２回行った。最後は，試成に関する生化学的な研究では，イミダゾール

料をろ紙（No. 5A，桐山製作所）で吸引ろ過し，（Imd）やＬ-ヒスチジン（His）によるhemoの形

残渣を回収した。室温でアセトンが揮発するまで成が明らかにされている 。他方，食肉がＬ-カ

静置した残渣をCMPとした。

５，７，８，11）12）

ルノシン（Car）やＬ-アンセリンなどのイミダ

2.3

ゾールペプチドを豊富に含むことは，機能性研究

CMPにおけるd-hemoの形成に対するpH，貯から注目されている 。これらの食肉中の濃度は，

蔵時間およびCar濃度の影響を以下の方法で検討

ニコチンアミド（ナイアシンとして）と比べるした。CMP0.5ｇを透明の遠沈管（ポリプロピレと，最大で100倍程度高い 。さらに，Imd等にン製）に採取し，Car，HisおよびImdを添加したよりhemoが形成されることは，イミダゾールペ

あるいは添加しないクエン酸緩衝液（pH５）おプチドによるhemoの形成が推定されるが，これよびリン酸緩衝液（pH６，７，８）を５ml加えて，に関する知見はない。

試験液とした。蒸留水のみを加えた試験液も調製

13）

14）

CMPにおけるd-hemoの形成

本研究の目的は，イミダゾール基を有するCarした。試験液中の各種物質の終濃度は，CMPのに着目し，Carによるhemoの形成について検討

ヘム色素が0.3 - 0.4mg，Carが３（0.013mol）おすることによって，CRの発生機構およびその解よび30mgとし，HisとImdは0.013molとした。続決策を明らかにすることにある。

けて，試験液に亜ジチオン酸ナトリウム0.05ｇを

２．方
2.1

加え還元した後，遠心分離（10,000×ｇ，５分間）

法

して沈殿を得た。遠沈管の壁にある沈殿を遠沈管の外側から分光測色計（CM-2500d，コニカミノ

材料

市販の豚（バークシャー種）の大腰筋（試料数

ルタ（株））により測定した。測定後，試験液中３）を使用した。Car，HisおよびImdの標準品は，の沈殿を軽い撹拌で均一化し，４℃の暗所で24ｈ

シグマアルドリッチから購入した。

静置した後，遠心分離（10,000×ｇ，５分間）し2.2

た。得られた沈殿を先と同様に分光測色計に供し加熱肉パウダー（CMP）の調製

豚の大腰筋の目立った脂肪と結合組織は除去た。

し，穴径５mmのプレートで挽肉とした後，厚さ2.4を８mmとし，真空パック（約0.8kPa）した。真分 光 測 色 計 に よ る 測 定 条 件 は ，測 定 径 φ ８

空パックした挽肉は，85℃の湯浴で１時間加熱しmm，光源Ａ，10°視野とし（AMSA，2012），付© The Ito Foundation

分光測色計による分析

99

加熱肉に生じる赤色に対するカルノシンの影響

属の白色校正板（L＊97.08，a＊－0.01，b＊0.11）に不溶である性質を利用し，加熱肉中の水溶性成よる校正を行った。分析によりCIE L （明るさ），分，水分，脂質を希釈あるいは除去したd-hemoa ＊ （赤），b ＊ （黄），C ＊ （彩度），h（色相角）おを含むCMPの調製を試みた。

＊

よびR（反射率）を得た。Rは360 - 740nmの波長調製したCMPのタンパク質含量は98％以上で域において10nmごとに測定し，各波長のRからあり，CMPに酸性アセトン溶液を加えると，そ730nmのRを差し引いて補正した反射率スペクトの液は赤色～褐色を呈し，酸性ヘマチンのスペク

ル を 得 た 。d-hemo 形 成 の 程 度 は ，Schwarz ら

トルを示した。CMPはヘムを含み，その全ヘム（1998）の方法を参考にし，％R560nm - ％R730nm

色 素 含 量 は 153 ― 312ppm で あ っ た 。さ ら に ，／％R540nm - ％R730nmによって相対的に比較した。

CMPに蒸留水と還元試薬を加えて得られる沈殿

2.5

11）

は赤色を呈し，赤色は数時間単位で保持された。

理化学分析

タンパク質含量は燃焼法（スミグラフNC-22，

その反射スペクトル（Fig.１）は560nm，530nm，（株）住化分析センター），pHの測定はpHメー

420nmに谷があり，過去の研究におけるd-hemo

ター（Ｆ-52，堀場製作所），全ヘム色素含量はのスペクトルと一致した５～８，11，12）。

AMSAの方法15）（酸性アセトン抽出）により行っ

CMPの利点は，hemo形成の可能性がある成分

た。また，この酸性アセトン抽出液は，分光光度が希釈あるいは除去され，濃縮されたヘムを含む計（U-3900H，日立製作所）によりスペクトルをことである。CMPが呈する色調は，ミオグロビ測定した。

ン以外の加熱変性タンパク質を含むため，加熱肉に近い。還元試薬によってCMPが赤色を呈する

３．結果と考察
3.1

ことは，ヘムの鉄の還元に由来することから，CRが発生した加熱肉中の鉄は還元状態にあるこ

CMPの諸性質とが示唆される。したがって，CRの発生を抑制

加熱肉における赤色の原因の１つは，d-hemo，この加熱によって生するには，鉄の酸化が有効な手段であろう。含窒

じたd-hemoは，各種溶媒に不溶なため，加熱肉

素化合物の添加なしでhemoが形成される理由は，からの抽出は実現していない 。このd-hemoがCMPに存在する様々なタンパク質に由来する含と考えられているが

１，９，10）８）

0-5

Rx‒R730nm

-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
-45

370

410

450

490

530

570

610

650

690

730

Wavelength（nm）
Fig. 1 Reflectance spectrum of CMP immediately after the treatment with reducing agent.

© The Ito Foundation

100

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

窒素の官能基が鉄に配位した可能性が考えられの谷と560nmのさらに大きな谷があり，hemoの

５）

る 。

特徴を示した。hemoの形成度を表すrHemoは，

3 . 2 CMPへのCar添加による色調とd-hemo形

０ｈでCar 3mg添加と無添加で違いはなかった。

成に対するpH，貯蔵時間およびCar濃度のHisやImd添加の０ｈのa＊ とC＊ 値は，Car添加と影響

同様に無添加より高かった。pHの影響に関して

Car，HisおよびImd添加と無添加のCMPに還は，すべての０ｈのa＊ 値とrHemoが，酸性域で元試薬を添加し，その後一晩空気下，４℃にて貯低かった。したがって，酸性域でのhemoの形成蔵した。還元試薬添加直後（０ｈ）と一晩静置しの不安定性が示された。また，この結果から，た（24 ｈ）試 料 を 分 光 測 色 計 に 供 し ，結 果 をCRの発生を抑制するためには，低pHの環境が有Table１に示した。

効と考えられる。

CMPの色調は，Car等の試薬の添加に関係なく，

24 時 間 の 貯 蔵 の 影 響 に 関 し て は ，無 添 加 の還元試薬の添加によって褐色から赤色へと変化し

CMPは貯蔵後，褐色へと変化した。この変化は，た。まず，０ｈにおいて，Car 3mg添加のa と24ｈのa＊，C＊値およびrHemoがすべてのpHで０

C＊値は，無添加より高かったことから，Car添加

ｈより低く，色相角が高いことに現れていた。まによってCMPの色調は“鮮やかな赤”になった

た，貯蔵後のスペクトルの谷は浅くなった（Fig.

と言える。他方，スペクトルに関して（Fig.２と２ ABCD）。これらの結果は，貯蔵によるヘムにFig.３），０ｈのすべてのスペクトルには，530nm

おける鉄の酸化，すなわちhemoから“ヘミクロ＊Table 1 Effects of pH, storage time and carnosine concentration on CIE color and indicator of hemochrome formation.
a＊b＊Storage time（h）

No agents

Carnosine

pH

3mg

pH

30mg

pH

HistidinepH

Imidazole

pH

5
6
7
8
5
6
7
8
5

C＊

Storage time（h）

Storage time（h）

Hue angle

rHemo１

Storage time（h）

Storage time（h）

0

24

0

24

0

24

0

24

0

24

9.0
9.8
10.1
10.1
10.3
10.1
10.4
10.6
9.8

7.3
7.7
8.4
8.4
7.9
8.3
10.3
10.5
8.1

12.6
12.3
12.4
12.1
12.6
12.4
12.4
12.3
12.6

12.4
12.8
12.7
12.6
12.2
12.7
12.6
12.4
13.1

15.5
15.8
16.0
15.8
16.3
16.0
16.3
16.3
16.0

14.4
14.9
15.3
15.2
14.5
15.2
16.3
16.3
15.4

54.5
51.6
50.8
50.4
50.9
50.9
50.2
49.3
52.0

59.3
58.7
56.8
56.6
57.2
56.9
50.9
50.0
58.3

1.09
1.12
1.15
1.16
1.09
1.12
1.14
1.15
1.10

0.98
1.01
1.09
1.09
0.96
0.99
1.12
1.13
1.01

13.3
13.1
12.7
12.1
12.8
12.6
12.4
11.8
12.5
12.0
11.7

16.0
16.3
16.4
16.0
16.3
16.3
16.3
15.9
16.2
16.2
16.5

16.1
16.1
16.0
14.3
16.2
16.4
16.6
14.1
15.6
16.1
16.0

51.0
49.4
48.3
50.6
50.0
49.2
48.5
49.4
47.7
47.1
45.5

55.9
54.9
52.8
58.0
52.1
50.6
48.7
56.9
53.1
48.6
47.1

1.13
1.16
1.17
1.09
1.12
1.15
1.15
1.11
1.15
1.17
1.18

1.10
1.13
1.14
0.96
1.10
1.13
1.15
0.97
1.08
1.16
1.17

6

10.1

9.0

12.5

7
8
5
6
7
8
5
6
7
8

10.6
11.0
10.2
10.5
10.7
10.8
10.3
10.9
11.1
11.5

9.3
9.7
7.6
10.0
10.4
11.0
7.7
9.4
10.6
10.9

12.4
12.3
12.4
12.5
12.3
12.2
12.0
12.0
11.8
11.7

１rHemo；reflectance estimator of hemochrome, ％R560nm-％R730nm/％R540nm-％R730nm, higher ratio more.

© The Ito Foundation

101

加熱肉に生じる赤色に対するカルノシンの影響

Rx‒R730nm

-10

-5

（Ａ）

-15
-20
-25
-30

500

550

600

-15
-20
-25

0h
24h
450

（Ｂ）

-10
Rx‒R730nm

-5

0h
24h

-30

650

450

500

Wavelength（nm）
-5

-15
-20
-25

450

500

550

600

650

-15
-20
-25

0h
24h

-30

600

（Ｄ）

-10
Rx‒R730nm

Rx‒R730nm

-5

（Ｃ）

-10

550

Wavelength（nm）

0h
24h

-30

650

450

500

Wavelength（nm）

550

600

650

Wavelength（nm）

Fig. 2 Reflectance spectra of CMP without imidazole related compounds on pH 5（A），6（B），7（C）and 8（D）andprolongation of storage time from 0h（opened circle）to 24h（closed circle）．

-5

-15
-20
-25
-30

500

550

600

-15
-20
-25

0h
24h
450

（Ｂ）

-10
Rx‒R730nm-10
Rx‒R730nm

-5

（Ａ）

-30

650

0h
24h
450

500

Wavelength（nm）

Rx‒R730nm

-10

-5

（Ｃ）

-10
Rx‒R730nm

-5

-15
-20
-25
-30

0h
24h
450

500

550

600

550

600

650

Wavelength（nm）

650

（Ｄ）

-15
-20
-25
-30

0h
24h
450

Wavelength（nm）

500

550

600

650

Wavelength（nm）

Fig. 3 Reflectance spectra of CMP with carnosine of 3 mg on pH 5（A），6（B），7（C）and 8（D）and prolongation ofstorage time from 0h（opened circle）to 24h（closed circle）．

© The Ito Foundation

102

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

ム”あるいは“ヘミクロモーゲン”への変化と考HisやImdより複雑な構造であるため，比較的鉄えられた。

に配位し難いためであろう。

Car 3mg添加の場合，24ｈのa＊ ，C＊ 値および本研究は加熱肉に発生する赤色が，食肉由来の

rHemoは，酸性域では無添加と同様に０ｈよりCarによって形成されるd-hemoから生じ得るこ

低く，色相角は高かった。また，貯蔵後のスペクとを示した。この場合，赤色が生じた加熱肉の安トルの谷は浅くなった（Fig.３ AB）。さらに，24

全性は問題ないと言える。この機構には，鉄の還ｈのpH５と６の間で比較すると，pH６のa＊とC＊元が必須であり，加熱肉中の鉄が還元状態にある

値はpH５より高く，色相角は低かった。中～アことの原因究明は今後の検討課題である。さらルカリ性域では，無添加と異なり，０と24ｈの間に，我々はCarによって形成されたd-hemoの安でa とC 値，rHemo，色相角およびスペクトル定性に対する食品添加物の影響，Carが色調や酸の形状に違いはなかった（Fig.３ CD）。酸性域に化防止の面で発色剤の代替物となる可能性についおける結果は，無添加と同様に貯蔵による鉄の酸て検討している。

＊＊

化に起因すると考えられた。他方，中性～アルカ
リ性域における結果は，鉄の酸化の抑制を意味

４．要約

し，Car添加によって形成されたhemoの安定化

Carによるd-hemo形成を検討するために85℃を示唆している。次にCar濃度を増やした場合，

で１時間加熱した肉からCMPを調製した。CMP

pH６での貯蔵によるa ，C 値およびrHemoの低は還元試薬添加によってhemoを形成した。Car下，色相角の増加が抑制され，hemoの安定性がと還元試薬を添加したCMPは，無添加と比べて，高められた。これらの結果から，Carはd-hemo

強い赤色を呈した。Carによって形成されたhemoを形成したと考えられた。

の安定性はpHに依存し，24時間の貯蔵による酸＊＊HisやImd添加の場合，pH５，
７および８での化に対して，酸性域より中性～アルカリ性域で高貯蔵に対するa とC 値，色相角およびrHemoのかった。Car濃度の増加は，pH６でのhemoの安変化は，同濃度のCarと同様で，pH５では鉄の酸定性を高めた。したがって，Carはhemoを形成化が進行し，pH７と８では抑制されたと考えらしたと考えられた。Car，HisやImdによるhemoは，れた。他方，pH６での貯蔵に対する各数値の変pHや貯蔵による酸化に対して同様の様式を示し

化も，鉄の酸化の進行を示したが，酸化の程度はたことから，Carによるhemo形成において，そCarに比べて低い傾向が認められた。CarとHisやのImd基が鉄に配位していると考えられた。CR

Imdによるhemoが，pHや貯蔵による酸化に対しの抑制には，低pHと鉄の酸化の環境が有効であて同じ様式を示したことから，Carによるhemo

ろう。

＊

＊

の形成は，そのImd基が鉄に配位することによって生じると考えられた。今回のImd関連物質によるhemo形成がpH依存性を示した原因は，各種物質が有するImdのpKaやCMP中の変性グロビンの構造が高pHでよりオープンになり，ヘムが露出したことが考えられる。さらに，pH６における
Carと他物質間のhemoの安定性の違いは，Carが文
献１） Trout, G. R.：Journal of food science，54，536～
544，1989．
２） Froning, G. W., Daddario, J., Hartung, T. E.,
Sullivan, T. W.：Poultry science，47，1672～1673，
1968．
３） Ahn, D. U., Maurer, A. J.：Poultry science ，66 ，1957～1960，1987．

© The Ito Foundation

加熱肉に生じる赤色に対するカルノシンの影響
４） Cornforth, D. P., Rabovitser, J. K., Ahuja, S.,
Wagner, J. C., Hanson, R., Cummings, B.,
Chudnovsky, Y.：Journal of agricultural and foodchemistry，46，255～261，1998．
５） Ahn, D. U., Maurer, A. J.：Poultry science ，69 ，
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６） Girard, B., Vanderstoep, J., Richards, J. F.：
Journal of food science，55，1249～1254，1990．
７） Brown, D. W., Tappel, A. L.：Food research，22，
214～221，1957．
８） Cornforth, D. P., Vahabzadeh, F., Carprnter, C. E.,
Bartholomew, D. T. ： Journal of food science ， 51 ，1132～1135，1986．
９） Ghorpade, V. M., Cornforth, D. P.：Journal of foodscience，58，51～52，89，1993．

10310） Mancini, R. A., Kropf, D. H., Hunt, M. C., Johnson,
D. E.：Journal of muscle food，16，16～26，2005．
11） Schwarz, S. J., Claus, J. R., Wang, H., Marriott N.
G., Graham, P. P.：Journal of muscle food，9，101～
110，1998．
12） Akoyunoglou, J.-H. A., Olcott, H. S., Brown, W.
D.：Biochemistry，2，1033～1041，196313） Boldyrev, A. A., Aldini, G., Derave, W.：
Physiological reviews，93，1803～1845，2013．
14） 日本食品標準成分表2015年版（七訂），文部科学
省科学技術・学術審議会資源調査分科会，201515） Meat Color Measurement Guidelines, American
Meat Science Association，80～81，2012．

© The Ito Foundation

104

牛心臓由来新規脂質代謝改善ジペプチドを活用した
革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究
Basic study of the development of an innovative hypocholesterolemic foodmaterials using a novel hypocholesterolemic dipeptide derived from cattle
heart peptide

長

岡

利

（岐阜大学応用生物科学部）

Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Only a few reports have dealt with the effects of animal protein and animal proteinhydrolysate on cholesterol metabolism. The cattle heart protein hydrolysate ultra-filtrate（HPHU, MW < ca. 1,000 Da peptides fraction） derived from HPH imparts a stronger
hypocholesterolemic activity than HPH in rats. After purification of HPHU by a reverse phase
chromatography and gel filtration chromatography, we try to identify the active
hypocholesterolic peptide derived from HPHU using in vitro assay related to micellar solubilityof cholesterol in vitro. Finally, we identified for the first time the hypocholesterolemic dipeptide,
XY derived from HPHU in rats. XY exhibited a hypocholesterolemic action in rats fed a highcholesterol diet. Oral administration of XY induced a significant increase in HDL-cholesterollevel in rats. Fecal cholesterol, acidic steroids and total steroid excretion were significantly
increased by XY treatment compared to control group.

発現することを発見し検討している２，３）。また，

的

１．目

主要な食糧資源でありながら，従来ほとんど検討

一般に，大豆タンパク質などの植物性タンパクがなされていない畜産食品素材のうち，牛肉ペプ

質は，カゼインなどの動物性タンパク質と比較しチド，牛レバーペプチドが体内コレステロール低１）て，抗動脈硬化作用を有すると考えられている 。

下作用を有することも見出した６）。さらに，昨年

しかし，現在活発に行われている有効成分の検討

度の研究で，動物性食餌タンパク質である牛肉ににより，このような血清コレステロール低下

再度着目し，畜産資源の高度有効利用という観点

作用は動物性素材にも見られることが明らかにさから，廃棄部位を含めた各部位である牛肉，牛心れている。実際に，私は，牛乳の乳清タンパク質臓，牛赤血球，牛血漿加水分解物を用いた研究をが，動物性タンパク質でありながら大豆タンパク行った結果，特に牛心臓加水分解物（HPH）が質よりも，強力な血清コレステロール低下作用を強力なコレステロール代謝改善作用を発現するこ２～10）© The Ito Foundation

牛心臓由来新規脂質代謝改善ジペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究とを発見した７）。
我々の既報

８，
９）

105

た。実験群は以下である。
の研究手法を用いて，牛心臓タ

ンパク質加水分解物（HPH）のコレステロール

１）対照群：高脂肪高コレステロール食（HFC）
２）XY群：ジペチドXY投与群（HFCXY）

低下作用機構を明らかにした。コレステロールミ

Wistar系雄ラット４週齢を実験に使用した。ジ

セル溶解性はカゼインよりもHPHで有意に低下

ペプチドXYは14日間ゾンデによって経口投与しした。Caco-２細胞のコレステロール吸収抑制はた。解剖前８時間絶食後に解剖し，血液を採取し，

カ ゼ イ ン ミ セ ル よ り も HPH ミ セ ル で 有 意 に 高

遠心分離により血漿を得て，マイナス80度で保管かった。血清コレステロールはカゼインよりもし た 。な お ，実 験 結 果 の 統 計 的 分 析 に は ，HPHで有意に低かった。放射性コレステロール

Studentsʼt-testを用いた。

で測定したコレステロール吸収はカゼインと比べ実験の結果（Table１）から，体重増加量，食てHPHで有意に減少し，HPHのコレステロール

餌摂取量，肝臓重量には，群間で有意な変化は認低下作用は空腸のコレステロール吸収阻害によるめられなかった。血清コレステロールは対照群ものである。HPH由来の牛心臓タンパク質加水（HFC）と比較して，XY投与群（HFCXY）で有分解物の限外濾過物（HPHU，分子量約1000ダル

意に低下した。血清トリグリセリドは，対照群トン以下のペプチド分画物）は，ラットにおいて（HFC）と比較して，XY投与群（HFCXY）で低HPHよりも強力なコレステロール低下作用を示

下傾向を示した。また，肝臓コレステロールレベ

10）

すことを発見し報告した 。

ル も 対 照 群（HFC）と 比 較 し て ，XY 投 与 群

ペプチド混合物であるHPHUのコレステロール（HFCXY）で有意に低下した。さらに，糞中へ代謝改善作用に寄与する活性ペプチドを特定するのコレステロール，胆汁酸（酸性ステロイド）やために，HPHU由来ペプチドの分画精製を実施し，総ステロイド排泄量は，対照群（HFC）と比較

分画物を用いてin vitroのコレステロールミセル

して，XY投与群（HFCXY）で有意に増加した。

溶解性試験を行った 。活性ペプチド候補の活性

我々が牛心臓から世界で最初に発見したコレステをラットによる動物実験で評価した結果，世界初

ロール代謝改善ジペプチドは，コレステロール吸のコレステロール代謝改善ジペプチド（XY：ア

収抑制作用を発揮することを明らかにした。今後

ミノ酸配列は特許の関係で非公表）を発見した。

はより詳細なジペプチドの作用機構の解明が望ま

そこで，今回はジペプチドXYの血清コレステ

れる。

11）

ロール低下作用機構を解明するために，肝臓脂質や糞中へのステロイド排泄量について分析した。

３．要約

私たちはHPH由来の牛心臓タンパク質加水分

２．方法，結果，考察

解物の限外濾過物（HPHU，分子量約1000ダルト

牛心臓由来ペプチド分画物であるHRHUgf3-

ン以下のペプチド分画物）は，ラットにおいてRPIB2からジペプチドXY（アミノ酸配列は特許

HPHよりも強力なコレステロール低下作用を示の関係で非公表）を同定したので，ジペプチド

すことを発見し報告した。そこで，ペプチド混合

XYについて，高コレステロール血症ラットにお物であるHPHUのコレステロール代謝改善作用にいて，脂質代謝に対する影響を評価した。高コレ寄与する活性ペプチドを特定するために，HPHU

ステロール食の食餌組成は既報 に従って調製し由来ペプチドの分画精製を逆相クロマトグラ

11）© The Ito Foundation

106

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table１ The effects of dietary XY on metabolic parameters in rats fed a high fat-cholesterol diet.

Body weight gain（g/14d）
Food Intake（g/d）
Liver weight（g/100 g body weight）
Serum（mg/dl）
Total Cholesterol（a）
Triglyceride
HDL-Cholesterol（b）
LDL＋VLDL-Cholesterol
Atherogenic index（a）/（b）
Liver（mg/g liver）
Total Lipids
Cholesterol
Triglyceride
Feces
Dry weight（g/3d）
Acidic steroids（mg/3d）
Neutral steroids（mg/3d）
Cholesterol
Coprostanol
Total
Total steroids

HFC

HFCXY

58.0±1.99.6±0.1
5.9±0.260.2±3.4
9.9±0.4
6.0±0.1

245.4±14.1
358.7±75.3
59.1±3.2
186.2±16.0
3.2±0.4

165.9±2.0＊＊＊
179.1±20.9
77.4±2.4＊＊
106.8±3.9＊＊
1.4±0.1＊＊

259.6±8.6
37.4±1.8
96.9±5.5

235.8±5.2＊
24.2±0.7＊
99.6±5.1

2.4±0.2
111.3±8.0

3.1±0.1＊
146.1±7.3＊

94.6±7.8
1.2±0.495.8±8.2
207.2±15.9128.4±3.7＊＊
0.4±0.3
128.8±3.8＊＊
274.9±8.3＊＊

１．Values are means±SEM, n＝5．Asterisks indicate different from Control group（＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001）.
２．Values were calculated as follows：LDL＋VLDL cholesterol＝Total cholesterol-HDL cholesterol.
３．Total steroids＝Acidic steroids＋Neutral steroids

フィーやゲル濾過クロマトグラフィーにより実施
し，分画物について，in vitroのコレステロール
ミセル溶解性試験を行った。in vitroコレステロー
ルミセル溶解性の低下作用を発揮する活性ペプチ
ド混合物を質量分析した結果，数種の候補ペプチドが含まれることを明らかにした。そのうちの活性候補ペプチドをラットによる動物実験で評価した結果，世界初のコレステロール代謝改善ジペプ
チド（XY：アミノ酸配列は特許の関係で非公表）を発見した。そこで，今回はXYの血清コレ
ステロール低下作用を解明するために，肝臓脂質や糞中へのステロイド排泄量について分析した。
その結果，XY投与により，血清コレステロール
低下時には，肝臓コレステロールレベルも低下した。また，糞中へのコレステロール，胆汁酸（酸性ステロイド）や総ステロイド排泄量が増加した。

文献１） Carroll, K. K., Hamilton, R. M. G.：J. Food Sci.，40，
18，1975．
２） Nagaoka, S., Kanamaru. Y., Kuzuya, Y., Kojima, T.,
Kuwata, T. ： Biosci. Biotch. Biochem. ，56 ，1484 ，
1992．
３） 長岡利：日本栄養・食糧学会誌，49，303，1996．
４） Iwami, K., Sakakibara, K., Ibuki, F. ： Agric. Biol.
Chem.，50，1217，1986．
５） Sugano, M., Goto, S., Yamada, Y., Yoshida, K.,
Hashimoto, Y., Matsuo, T., Kimoto, M.：J. Nutr.，120，
977，1990．
６） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，336，1998.
７） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，378，1999．
８） Nagaoka, S., Miyazaki, H., Oda, H., Aoyama, Y.,
Yoshida, A.：J. Nutr.，120，1134，1990.
９） Nagaoka, S., Miwa, K., Eto, M., Kuzuya, Y., Hori, G.,
Yamamoto, K.：J. Nutr.，129，1725，1999．
10） Nakade, K., Kaneko, H., Oka, T., Ahhmed, A. M.,
Muguruma, M., Numata, M., Nagaoka, S.：Biosci.
Biotechnol. Biochem.，73，607，2009．
11） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，91，2015.

© The Ito Foundation

107

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究
Dietary effect of meat protein on anti-obesity and lipid metabolism

若

松

純

一

（北海道大学北方生物圏フィールド科学センター）

Jun-ichi Wakamatsu（Field Science Center for Northern Biosphere, Hokkaido University）

We examined the dietary effect of meat protein on obesity and lipid metabolism by using
a high fat diet-induced obesity model. The significant differences in rat body weight were notobserved between groups. Regarding the weight of any white adipose tissue （WAT）（epididymal WAT, mesenteric WAT and perirenal WAT）,there were no significant differences
between groups. Moreover, regarding the weight of interscapular brown adipose tissue（BAT）
as well as quadriceps femoris muscle, there were no significant differences between groups. On
the other hand, although there was no significant difference in the liver weight between
groups, liver fat content of chicken protein group was lower compared with the other groups.
R elative mRNA expression of lipogenesis-related enzymes in the liver of chicken and beef
protein groups was significantly lower than those of casein groups. Although relative mRNA
expressions of fatty acid trafficking-related enzymes in the liver of chicken protein groups
were significantly higher than those of the other groups, relative mRNA expressions of fatty
acid degradation-related enzymes of chicken protein group were significantly higher thanthose of beef group. Consequently, Chicken protein might suppress the accumulation of fat in
the liver.

１．目

倍以上に増加した。体重過多や肥満は，循環器疾的患や糖尿病，脂質異常症，非アルコール性脂肪性時代の流れとともに，世界的に我々人間の肥満

肝疾患，筋骨格障害および癌のような生活習慣病が大きな問題となっている。主な要因として，脂の主因である。また，世界的に肥満とその代謝性質が多く含まれる高カロリーな食事の摂取増加

合併症の有病率は，ここ数十年間で大幅に増加しや，デスクワークのような仕事の仕方の多様性にている１）。このように肥満の危険性が知れ渡った伴う身体活動の低下があげられる。さらに2008年

ことにより，人々の健康への関心が高まっている。

に は 世 界 の 18 歳 以 上 の 39 ％（男 性 38 ％，女 性

我々はこれまでに，鶏肉は摂取後の体温上昇を40％）が体重過多，13％（男性11％，女性15％）

亢進することを明らかにした２，３）。さらに，鶏肉が肥満で，1980年から2014年で世界の肥満率は２タンパク質の体熱産生能は他の畜種の食肉タンパ© The Ito Foundation

108

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

ク質よりも高く，食肉の体熱産生能の違いには食肉タンパク質が寄与していることが示された４）。

２．方法

さらに，鶏肉タンパク質を配合した高脂肪・高

2.1

動物実験

ショ糖食を４週間摂取することで，褐色脂肪組織

供試動物として５週齢，Wistar系の雄ラットを（BAT）重量が大きくなり，精巣上体，腸間膜お用いた。馴化後の試験期間は５ヶ月間とし，高脂よび腎周囲の白色脂肪組織（WAT）重量が減少

肪・高ショ糖食（20％牛脂，20％ショ糖）を自由した（未発表データ）。このことから，鶏肉タンに摂食させた。試験期間中は３日に１回の頻度でパク質の長期摂取は，脂質代謝を促進してWAT

体重および摂食量を測定し，自由に水を摂取させの蓄積を抑制し，BATを活性化して増量や機能た。

の亢進をもたらすことが示され，鶏肉タンパク質

2.2には内臓型肥満に対して抗肥満効果がある可能性

鶏 肉（む ね ，も も 肉）
，牛 肉（も も 肉）か らが示された。しかし，体重増加を抑制する作用は

Ezoeらの方法３）に従って精製食肉タンパク質を確認できなかった。これは，鶏肉タンパク質の摂調製した。試験飼料は食餌性肥満を引き起こすよ

取期間が４週間と短かったことが原因かもしれな

うに，AIN-93G飼料を改変して20％牛脂，20％い。また，鶏肉タンパク質の摂取は内臓WATを

ショ糖を配合した高脂肪・高ショ糖食を調製し減少させたものの，骨格筋量を増加させることにた。馴化飼料のカゼイン配合量（20％）とタンパ

より体重に違いが現れなかった可能性も考えられ

ク質含量が等しくなるようにそれぞれの精製食肉

たが，骨格筋の重量は測定されていない。さらに，

タンパク質を配合した。

試験飼料の調製

抗肥満効果以外の脂質代謝亢進効果については未2.3

検討である。

ラットにジエチルエーテルで麻酔を行い，体重血液および各種組織の採取

食肉を構成しているタンパク質のアミノ酸組成

および腹囲を測定した後，直ちに血液，肝臓，白は畜種間で類似しているが ，個々のタンパク質色 脂 肪 組 織 （WAT） お よ び 褐 色 脂 肪 組 織でアミノ酸配列が少しずつ異なっている。そのた（BAT）を採取した。血液は後大静脈から採取し，め，消化されて生成するペプチドは摂取した食肉

血漿ならびに血清を得た。WATは精巣上体，腸の畜種によって異なるかもしれない。このため，間膜および腎周囲より採取した。BATは肩甲骨

鶏肉タンパク質摂取によるWAT蓄積抑制作用お間より採取した。肝臓，骨格筋，WATおよび

よびBAT活性化作用には，鶏肉タンパク質が消BATは実験に供するまで－80℃で保存した。

５）

化されて生じる特異的なペプチドが関与している

2.4

血中生化学検査

かもしれない。

血漿中のグルコース濃度（グルコースＣⅡ―テ

そこで本研究では，鶏肉タンパク質の長期摂取

ストワコー，和光純薬工業），血清中のトリグリがエネルギー消費の亢進に伴う抗肥満効果，ならセリド濃度（トリグリセライドＥ-テストワコー，

びに脂質代謝亢進効果をもたらすかどうかを解明

和光純薬工業），遊離脂肪酸濃度（NEFA C-テス

するために，鶏肉，牛肉タンパク質およびカゼイ

トワコー，和光純薬工業），コレステロール濃度ンを配合した高脂肪・高ショ糖食をラットに長期（コレステロールＥ-テストワコー，和光純薬工間給餌して遺伝子レベルでそのメカニズムを検討

業），GOTとGPT濃度（トランスフェラーゼＣ-した。

Ⅱテストワコー，和光純薬工業）は各々キットを© The Ito Foundation

109

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究

用いて定量分析した。
2.5

３．結果と考察

肝臓の脂肪定量

Soxhlet抽出器によるエーテル抽出法に基づい

3 . 1 食肉タンパク質の長期摂取が高脂肪・高

て行った。
2.6

ショ糖食摂食ラットの体重および臓器・組qPCR法

織重量に及ぼす影響

肝 臓 か ら 抽 出 し た 全 RNA か ら Transcriptor

鶏肉タンパク質が高脂肪・高ショ糖（それぞれFirst Standard cDNA Synthesis Kit（ロシュ）ま20％）食を長期摂取したラットの体重，肝臓，た は ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO）

WAT（精巣上体，腸間膜，腎周囲），BATおよを用いて，１本鎖cDNAを合成した。合成した１

び大腿四頭筋の重量に及ぼす影響を検討した。体

本鎖cDNA反応液40μｌのうち２μｌを鋳型とし，重および腹囲について，すべての群間で有意な差

KAPA SYBRⓇ FAST qPCR Kit（日本ジェネティ

は見られなかった（Fig.１）。また，WAT，大腿クス）を用いて，LightCycler 480を用いて定量

四頭筋重量についてもすべての群間で有意な差はPCR（qPCR）を行った。

見られなかった（Fig.２，３）。BAT重量について

Ⓡ

Ⓡ

2.7

は，鶏肉タンパク質群はカゼイン群と比べて大き統計処理

測定値は平均値±標準誤差で示した。エクセル

い傾向が見られた（p＝0.05）（Fig.２）。一方，肝（マイクロソフト）ならびにエクセル用統計アド

臓重量について鶏肉タンパク質群は牛肉タンパク

インソフト（エクセル統計2006

for Windows，

質群と比べて小さい傾向が見られた（p＝0.06）。

社会情報サービス）により，各測定値から得られさらに，鶏肉タンパク質群以外はやや脂肪肝の様たデータの一元配置分散分析を行い，Tukeyの多相を示していたため（データ示さず），肝臓の脂重比較検定によって有意差検定を行った。また，

質含量を測定したところ，鶏肉タンパク質群では等分散性が棄却された事象についてはKruskal-

牛肉タンパク質群と比べて有意に少なかった

Wallis検定を用いてSteel-Dwassの多重比較によ（Fig.４）。なお，摂食量は群間で有意差は見られり有意差検定を行った。p＜0.05をもって統計学なかった（データ示さず）。

的に有意であるとし，p＜0.1をもって統計学的に3.2

傾向があるとした。

試験期間終了後に採取した血液から，糖代謝の

B
N.S.

600
400
200
0

CP

BP

Cs

Abdominal
circumference (cm)Body Weight (g)A

血中の代謝関連成分

30

N.S.

20
10
0

CP

Fig. 1 Final body weight（A）and abdominal circumference（B）of rat
CP：Chicken protein, BP：Beef protein and Cs：Casein.

Data represent the mean±SEM（n=7）．N.S.：Not significant© The Ito Foundation

BP

Cs

110

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Adipose tissue weight (g/100 g BW)

A 2

N.S.

B

1

1

0

C

N.S.

2

CP

BP

0

Cs
N.S.

8

CP

D 0.2

BP

Cs
N.S.

P = 0.05

6
0.1

4
2
0

CP

BP

0

Cs

CP

BP

Cs

Fig. 2 Final WAT and BAT weight of rat

A：Epididymal WAT, B：Mesenteric WAT, C：Perirenal WAT, D：Interscapular BAT.
CP：Chicken protein, BP：Beef protein and Cs：Casein.

Weight (g/100 g BW)

Data represent the mean±SEM（n=7）．N.S.：Not significant

0.8

N.S.

0.7
0.6
0.5

CP

BP

Cs

Fig. 3 Final Quadriceps femoris muscle weight of rat

CP：Chicken protein, BP：Beef protein and Cs：Casein.

6

Liver fat content (%)

Liver weight (g/100 g BW)

Data represent the mean±SEM（n=7）．N.S.：Not significant

P = 0.06

4
2
0

CP

BP

Cs

6
4

b

ab

BP

Cs

a

2
0

CP

Fig. 4 Final liver weight（A）and liver fat content（B）

CP：Chicken protein, BP：Beef protein and Cs：Casein.

Data represent the mean±SEM（n=7）．ab：Different letters indicate significantly differences

between groups（p＜0.05）．

© The Ito Foundation

111

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関する研究指標となるグルコース，脂質代謝の指標となるトカゼイン群と比べて有意に低く，脂肪合成を促進

リグリセリド，NEFA，脂質代謝異常の指標とな

す る 脂 質 代 謝 関 連 転 写 因 子 で あ る SREBP-1c

る 総 コ レ ス テ ロ ー ル ，肝 臓 病 の 目 安 と な る

mRNA発現量は，鶏肉タンパク質群と牛肉タン

GOT，GPTの血中濃度およびGOT/GPT比を測

パク質群はカゼイン群と比べて有意に低かった。

定した。血中グルコース濃度について，鶏肉タン

一方，肝臓への脂肪酸の取込みに関与するCD36

パク質群は牛肉タンパク質群と比べて有意に高については，鶏肉タンパク質群が牛肉タンパク質

かった。また，血中NEFA濃度について，鶏肉タ

群およびカゼイン群と比べてmRNA発現量は有ンパク質群はカゼイン群と比べて有意に低かっ

意に高かった。また，脂肪酸の活性化に関与するた。一方，血中トリグリセリド，総コレステロー

ACSL３については，鶏肉タンパク質群が牛肉タ

ル，GOT，GPT濃度およびGOT/GPT比についンパク質群およびカゼイン群と比べて有意に高てはすべての群間で有意な差は見られなかった

かった。さらに，ミトコンドリアへの脂肪酸の取（データ示さず）。

込みに関与するFABP1 mRNA発現量は，鶏肉タ
ンパク質群が牛肉タンパク質群およびカゼイン群

3 . 3 肝臓における脂質・糖代謝関連遺伝子のと比べて有意に高かった。肝臓における脂肪分解

発現量
肝臓における脂肪酸合成に関与する遺伝子発現に 関 与 す る mRNA 発 現 量 は ，CPT1α お よ び

量について，G6PDおよびPFK mRNA発現量にLCAD mRNA発現量について，鶏肉タンパク質

ついて，鶏肉タンパク質群と牛肉タンパク質群は群は牛肉タンパク質群と比べて有意に高かった。

Relative mRNA expression

2.5
2

a

a

BP

ab

a ab

Cs

a
b

1.5
b

b

b

1
0.5

CP

a

a

a

a

a

b
b

b

b

b

a

a
b

b

a

ab
b

0

Lipogenesis

Fatty acid traﬃcking

Fatty acid degradation

Fig. 5 Relative mRNA expression levels of lipid metabolism-related enzymes in the liverCP：Chicken protein, BP：Beef protein and Cs：Casein.

The columns represent relative values of mRNA normalized to β-actin and expressed as the ratio of each mRNAin Cs groups
Data represent the mean±SEM（n=7）．
ab ：Different letters indicate significantly differences between groups（p＜0.05）．

© The Ito Foundation

112

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

また，肝臓における脂肪分解を促進する脂質代謝を，食事性肥満モデルを用いて検討した。体重に関連転写因子であるPPARα mRNA発現量につはすべての群間で有意差がなく，WAT，BATおいて，鶏肉タンパク質群では牛肉タンパク質群とよび大腿四頭筋重量にも有意差はなかったことか

比べて有意に高かった（Fig.５）。

ら，鶏肉タンパク質の長期摂取による抗肥満効果

本研究では，鶏肉タンパク質摂取によって，骨は見られなかった。一方，鶏肉タンパク質の長期格筋やBATによりエネルギー代謝が亢進する兆

摂取は脂肪肝を抑制する可能性が示された。そこ候は見られず，鶏肉タンパク質の長期摂取によるで，脂肪肝関連の遺伝子の発現量を定量的PCRの抗肥満効果は認められなかった。一方，肝臓での結果から，鶏肉と牛肉タンパク質の長期摂取は，脂質代謝に関連する遺伝子のmRNA発現量の結

肝臓での脂肪酸合成を抑制した。しかし，鶏肉タ果から，肝臓における脂質代謝は亢進して，脂肪ンパク質は，脂肪酸の取込みを促進したが，牛肉

肝抑制効果が認められた。鶏肉および牛肉タンパ

タンパク質よりも肝臓における脂肪酸の分解を促

ク質の摂取は，肝臓における脂肪酸合成遺伝子の進したことで，肝臓での脂肪蓄積を抑制したのか

発現を誘導するSREBP-1c mRNAの発現を抑制もしれない。

して，脂肪酸合成を抑制したと考えられる。また，
鶏肉タンパク質の摂取は脂肪酸の取込みを促進す
るものの，それ以上に脂肪酸の分解を促進したことで，肝臓での脂肪蓄積を抑制したのかもしれな
い。一方，牛肉タンパク質は，カゼイン群と比べて有意差はなかったが，脂肪酸の取込みを抑制したものの，脂肪酸分解も抑制したことから，結果的に肝臓での脂肪含量が増加したと考えられる。
肝臓に脂肪が蓄積する脂肪肝は放置すると，肝炎や肝硬変，肝臓がんに進行することがある６，７）。
以前は飲酒による脂肪肝が一般的であったが，近年は飲酒とは関連しない非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）も注目されている８，９）。よって，
鶏肉タンパク質の脂肪肝抑制効果は鶏肉の新しい機能として大いに期待される。
４．要

約

食後の体熱産生能の高い鶏肉タンパク質の長期摂取が抗肥満効果や脂肪肝改善効果に及ぼす影響

文献１） World Health Organization; Obesity a nd
overweight. 2018. Available from URL：http://
www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/
２） Wakamatsu, J., Fujii, R., Yamaguchi, K., Miyoshi,S., Nishimura, T., Hattori, A.：Anim Sci J. ，84 ，416
～425，2013．
３） Wakamatsu, J., Takabayashi, N., Ezoe, M.,
Hasegawa, T., Fujimura, T., Takahata, Y.,
M o r i m a t s u , F . , N i s h i m u r a , T . ：J N u t r S c i
Vitaminol.，59，516～525，2013．
４） Ezoe, M., Wakamatsu, J., Takahata, Y., Hasegawa,T., Morimatsu, F., Nishimura, T.：J. Nutr. Sci.
Vitaminol.，62，93～100，2016．
５） 香川芳子：五訂増補食品成分表2006，女子栄養大
学出版部，東京，2006．
６） Bugianesi, E., Leone, N., Vanni, E., Marchesini, G.,
Brunello, F., Carucci, P., Musso, A., Paolis, P.,
Capussotti, L., Salizzoni, M., Rizzetto, M.：
Gastroenterology，123，375～378，2002．
７） Hui, A. Y., Wong, V. W., Chan, H. L., Liew, C. T.,
Chan, J. L., Chan, F. K.：Alimentary Pharmacology& Therapeutics，21，407～413，2005．
８） Adler, M., Schaffner, F.：American Journal of
Medicine，67，811～816，1979．
９） Ludwig, J., Viaggiano, T. R., McGill, D. B., Oh, B.
J.：Mayo Clinic Proceedings，55，434～438，1980．

© The Ito Foundation

113

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン
摂取の有用性
Efficacy of carnosine intake on the prevention of sarcopenia related withobesity

後

藤

孔

郎・正

（大分大学医学部

木

孝

幸・柴

田

洋

孝

内分泌代謝・膠原病・腎臓内科学講座）

Koro Gotoh, Takayuki Masaki and Hirotaka Shibata（Department of Endocrinology, Metabolism, Rheumatology, and Nephrology, Faculty of Medicine, Oita University）

Obesity induces systemic low-grade chronic inflammation. Sarcopenia obesity is deeply
related with obesity-induced insulin resistance, expression of inflammatory cytokines andoxidative stress although the mechanism is uncertain. It is well-known that carnosine included
a lot in pork has action of anti-oxidant stress. The aim of this study is to clarify that the intake
of carnosine improves obesity-induced sarcopenia. Male rats were divided into four groups andkept for 2 months as follows, standard diet（Standard；20％ fat）-fed group, high-fat diet（HF；
60％ fat）-fed group, Standard-fed plus carnosine（250 mg/kg body weight）group, and HF-fed
plus carnosine group for 2 months. We evaluated 1）inflammatory cytokine levels, infiltration of
inflammatory macrophage（M1）in muscle, 2）IL-15 expression associated with enlargement ofmuscular fibers and laminin which plays a role in protecting these fibers in muscle, 3）fat
deposit in muscle. Carnosine treatment inhibited HF-induced inflammatory responses andinfiltration of M1 macrophage in muscle. Moreover, carnosine also reversed HF-induced
decrease of IL-15 as well as laminin expression and increase of fat deposit in muscle. Thus it issuggested that carnosine intake might be effective to prevent the development of sarcopenia
obesity.

１．目

デル動物において，筋線維の肥大化をもたらすマ的イオカインであるIL-15の発現が低下しているこ

加齢性筋肉減弱症（サルコペニア）は，寝たきとが明らかになっている。その原因の１つに骨格

りや要介護状態につながる転倒の原因として，そ筋内に浸潤した炎症性細胞由来のサイトカインがの成因解明や予防法の確立が注目されている。ま関与していると推測されている。肥満患者およびた，肥満・糖尿病などの代謝異常では，加齢ととそれに関連したサルコペニア患者の増加は世界的もに転倒頻度が増加することが指摘されている。

な問題となっている。肥満は，全身性炎症性疾患

今回申請者は，骨格筋から産生されるサイトカイと位置付けられており，筋肉にも炎症性変化がみンであるマイオカインに着目する。例えば肥満モられるとされている。サルコペニアには，動物性© The Ito Foundation

114

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

たんぱく質の摂取が推奨されているが，どの成分分）を摂取させ，通常食群と高脂肪食群に分けが有効かについては不明な点が多い。

る。さらに，各群をカルノシン添加群（250mg/

最近，豚肉や鶏肉に含まれる“カルノシン”はkg体重）とコントロール群に分ける。したがっ脳神経細胞を保護し，認知症発症を予防する効果て，通常食＋コントロール（ST＋control）群，があることが知られている。その他，カルノシン

通常食＋カルノシン（ST＋carnosine）添加群，

は抗酸化作用や疲労回復作用を有することも明ら

高脂肪食＋コントロール（HF＋control）群，高かになっている。実際，ラットの実験において，脂肪食＋カルノシン添加（HF＋carnosine）群のカルノシンは，脳重量減少の抑制効果があること

４群を作成し，２ヶ月飼育する。その後，以下のが明らかになり，これにはカルノシンの強い抗酸ような評価項目について検討する。

化作用が関連していることが示唆されている。こａ）大腿筋（骨格筋）内の炎症性サイトカイン

れまで，カルノシン摂取とサルコぺニアとの関連で あ る tumor-necrotizing factor（TNF）- αについての研究はあまり散見されない。本研究でおよび抗炎症性サイトカインであるIL-10発

は「カルノシン摂取がマイオカイン発現の増加を現，さらには速筋肥大誘導をもたらすIL-15

もたらす」という作業仮説を立証することを目的の発現を測定する。

としている。これが証明されれば，カルノシンをｂ）筋細胞を保護するとともに筋の再生・分化

多く含む豚肉や鶏肉の摂取が，速筋増加作用をもに重要な役割を果たすラミニンを用いて，骨たらすことでサルコぺニア発症予防に有用である

格筋の筋線維の評価を組織学的に評価する１）。

ことが示唆される。これと併せて，肥満による慢ｃ）骨格筋内の脂肪蓄積を評価するため，骨格性炎症の１つである内臓脂肪や肝臓内の炎症性変筋内の中性脂肪量を測定する。

化も改善することも期待される。今回，食餌誘導ｄ）骨格筋内の炎症性変化を評価するため，骨性肥満モデル動物を用い，カルノシンの摂取によ

格筋内のマクロファージ浸潤を組織学的に評るさまざまなマイオカイン合成の増加が，骨格筋価する。また，骨格筋内のTNF-α/IL-10での筋線維の肥大，筋肉内の炎症性変化，さらにはの評価も併せて行う。

筋肉内の異所性脂肪沈着，それぞれの改善をもた
らすかについて検討する。さらにこのようなマイオカインの増加が，肝臓や内臓脂肪にも良い影響を及ぼすかについても検討する。以上より本研究

３．結果と考察3 . 1 高脂肪負荷に伴う骨格筋内の炎症性変化に対するカルノシンの効果の目的は，豚肉や鶏肉摂取が骨格筋からのマイオ

高脂肪負荷によってTNF-αおよびIL-10発現

カイン発現を高め，骨格筋へのオートクライン的ともに増加したが，TNF-α/IL-10では有意に上なメカニズムによって筋肉そのものを改善させ，昇したことから，骨格筋内では炎症性変化をもた

サルコペニア発症予防に有用であることを証明すらしたことが認められた。それらの変化はカルノることである。

シンを経口投与により抑制された（Fig.１A-C）。

２．方

また，骨格筋内の炎症性マクロファージ（Ｍ１）法

浸潤について検討したところ，高脂肪負荷による雄ラットに通常食（ST；餌中の20％が脂肪成分）または高脂肪食（HF；餌中の60％が脂肪成

Ｍ１浸潤の亢進が，カルノシン摂取によって有意に抑制された（Fig.２）。

© The Ito Foundation

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン摂取の有用性
100

TNF‒ααlevelsin muscle

A

IL‒10levelsin muscle

B

115

3 . 2 高脂肪負荷に伴う骨格筋内IL-15の変化(pg/g tissue)*

80に対するカルノシンの効果

60

高脂肪負荷によって骨格筋でのIL-15発現が低40下するが，その低下はカルノシンを経口投与によ20り改善した（Fig.３）。また，骨格筋でのラミニ

0ST + control

ST +carnosine

HF + control

HF +carnosine* p<0.05 vs. ST + control

50(pg/g tissue)

40

ミニン発現の低下が，カルノシンによって改善した（Fig.４）。
3 . 3 高脂肪負荷に伴う骨格筋内の脂肪沈着の*30

ン発現を検討したところ，高脂肪負荷に対するラ変化に対するカルノシンの効果20

高脂肪負荷によって骨格筋での中性脂肪量が上10昇したが，その低下はカルノシン経口投与によりTNF‒αα/IL-10 ratioC

0

ST + control

ST +carnosine

HF + control

HF +carnosine* p<0.05 vs. ST + control

2.5

チドで・アラニン・ヒスチジンであり，特に豚やチジンの構成要素であるイミダゾールからイミダ

1.5

ゾールぺプチドと呼ばれ，内因性抗酸化物質とし

1ての役割を果たしている２，３）。カルノシンを摂取

0.5
0

カルノシンは・アラニンとヒスチジンのジペプ
牛の筋肉中に高濃度に存在する。これらは，ヒス*2改善した（Fig.５）。

したラットでは筋肉中のカルノシン含有量が装荷
ST + controlST +HF + control
carnosine

HF +carnosine* p<0.05 vs. ST + control

Fig. 1

するとともに筋肉脂質の過酸化や蛋白の酸化が抑制されることが知られている。
内臓肥満はインスリン抵抗性を基盤としたメタ

ST+
control

HF+
controlST+
carnosine

HF+
carnosineFig. 2© The Ito Foundation

116

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）
20(pg/g tissue)

80

*

60
40
20
0

ST + control

ST +carnosine

HF + control

HF +carnosine

Triglyceride levelsin muscle

IL‒15levelsin muscle

100

平成29年度(mg/g tissue)

*

15
10
5
0

ST + control* p<0.05 vs. ST + control
Fig. 3ST +carnosine

HF + control

HF +carnosine* p<0.05 vs. ST + control
Fig. 5ST+
control

HF+
controlST+
carnosine

HF+
carnosineFig. 4

ボリック症候群の基盤となる状態である。サルコ

る。加齢も肥満も独立して酸化ストレスを惹起す

ペニアと肥満の合併を表すサルコペニア肥満は単るが，組み合わされることによりさらに障害が促なる病態の組合せではなく，代謝異常や機能障害

進する４）。本研究では，抗酸化作用を有するカルがより強く認められる４）。また，肥満は全身の軽ノシンがサルコペニア肥満の状態を改善したこと

度慢性炎症性疾患とされており，事実，脂肪組織を考慮すると，カルノシンの摂取はサルコペニア

ではTNF-α，IL-1βなどの炎症性サイトカイン

肥満の発症予防に有効である可能性が示唆される。

が生成され，筋委縮やサルコペニアの進行につな

サルコペニア肥満は，高齢者の身体機能の低下

がると推測されている５）。このようなインスリンや代謝疾患と関連し，心血管疾患，死亡リスクを

抵抗性や炎症とサルコペニアを結びつける機序と高めるため，その治療法の確立が求められてい

して，酸化ストレスが考えられている 。酸化スる。サルコペニアに対しては，レジスタンス運動

トレスによりミトコンドリアや核内DNAが障害とタンパク質の補給の併用が除脂肪量を増加さされ，この蓄積がアポトーシスを刺激し，筋線維せ，筋力低下を改善することがメタ解析により報の委縮や筋細胞の喪失をきたすと考えられてい

告されており，ビタミンＤやタンパク同化ホルモ

４）© The Ito Foundation

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン摂取の有用性

117

ンであるテストステロン・インスリン・成長ホル

カルノシンは，肥満による骨格筋内での炎症反応

モンの補充も効果が期待されている 。しかしなを抑制させ，筋線維の増幅に必要なIL-15発現をがら，サルコペニア肥満に対する有用性は不明で高め，骨格筋内の脂肪沈着を低下させた。以上よある。さらに，インスリン抵抗性改善薬の効果がり，カルノシンを多くする豚肉の摂取は，サルコ期待されるが，サルコペニア肥満に対するエビデペニア肥満の発症もしくは進展予防に有効である

ンスは乏しいとされている。

ことが示唆される。

６）

骨格筋は運動器としての働きだけでなく，生理活性を持つ数多くのホルモン様活性物質（マイオ
カイン）を分泌する内分泌器官でもある。今後，カルノシン経口投与後におけるイリシンといった
マイオカインの発現の変化を検討する必要がある。
４．要

約

肥満は，全身性炎症性疾患と位置付けられており，サルコペニア発症の危険因子であるとされている。サルコペニア肥満の病態生理に関しては，
インスリン抵抗性，炎症性サイトカインの過剰発
現に伴う慢性炎症，酸化ストレスなどが関与しているとされているが，メカニズムの詳細は不明である。以前より，豚肉に多く含まれる“カルノシン”は抗酸化作用があることが知られているが，このような抗酸化作用がサルコペニア肥満に有用であるかは不明であった。以上より本研究では，「豚肉の摂取はサルコペニア肥満の進行予防効果をもたらす」ことを証明することを目的とした。

文献１） Sanes, J. R.：The extracellular matrix. Engel AG,
Franzini-Armstrong C（eds）, Myology, McGrawHill Inc, New York, pp242～260，1994．
２） Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T.,
Romero, I. A., Abbott, J. N.：Toxic effects of betaamyloid （25-35） on immortalised rat braine n d o t h e l i a l c e l l ：p r o t e c t i o n b y c a r n o s i n e ,homocarnosine and beta-alanine, Neurosci Lett，
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３） Fu, Q., Dai, H., Hu, W., Fan, Y., Shen, Y., Zhang, W.,
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４） Kohara, K.：Sarcopenic obesity in aging
population ： current status and future directions forresearch, Endocrine，45，15～25，2014．
５） Vincent, H. K., Raiser, S. N., Vincent, K.R.：Theaging musculoskeletal system and obesity-related
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361～373，2012．
６） Cermak, N. M., Res, P. T., de Groot, L. C., Saris, W.
H., van Loon, L. J.：Protein supplementation
augments the adaptive response of skeletal muscle
to resistance-type exercise training：a metaanalysis, Am J Clin Nutr，96，1454～1464，2012．

© The Ito Foundation

118

野生動物肉の食料資源としての利用に関する研究：生理活性機能の検討
Study on game meat utilization as a food stuff；Assessment of thephysiological activity of this food stuff

坂田

亮一・竹田

志郎・時田

昇臣＊

（麻布大学獣医学部，＊日本獣医生命科学大学動物科学科）

Ryoichi Sakata, Shiro Takeda and Norio Tokita＊（School of Veterinary Medicine, Azabu University，＊Department of Animal Science,
Nippon Veterinary and Life Science University）

The antioxidant activity and inhibitory effects on the blood pressure, an increase in whichcauses greater hypertension, in the digestive enzyme degradation products of venison were
investigated by DPPH radical elimination method and angiotensin I-converting enzyme（ACE）
inhibition activity, respectively. The results were compared with beef as the control. The
antioxidant test indicated the presence of activity in digestive enzyme decomposition productsof beef and venison and the DPPH radical scavenging activity in these products of venison tobe significantly higher compared to beef（p＜0.05）. The value for beef was essentially the sameas that in the literature. Consequently high antioxidant power in venison peptides wasconsidered to derive from animal meat. ACE inhibitory activity in digestive enzyme
degradation products of beef and venison was demonstrated by blood pressure increase
suppression. This activity in the enzyme degradation product of venison was shown to besignificantly higher than in beef（p＜0.05）. Based on these findings, it may be concluded thatenzymatically decomposed substances produced with venison digestion exert antioxidant
action which may become evident with consumption.

１．目

ンパク質で低脂肪なことから優れた栄養食材とし的ても注目されている。また適切に放血をされた個

日本各地で増加が確認されている野生鳥獣によ

体の肉は臭みも少なく，味も良いことから，地域る農作物被害は，ここ数年その額を200億円前後，振興の有望な資源として期待されている３，４）。し森林被害は約8,000ヘクタールと推移している１～３）。

かしながら，捕獲された個体のうち食肉として流被害対策の一環として，個体数管理のために捕獲通されているのは１割にとどまっているのが現状された野生獣を利活用することは地域活性化およである５）。

び地域経済において非常に重要である。鹿肉はジ

一方，近年の食品業界において，食品由来ペプ

ビエ肉として親しまれており，畜肉と比べて高タチドの生理活性機能の探索が盛んに行われてい© The Ito Foundation

野生動物肉の食料資源としての利用に関する研究：生理活性機能の検討

る。摂取した食品は生体内で消化作用を受けるこ

119でろ過した。

とで，タンパク質は分解されて低分子化し，生体

2.2

内に吸収される。その中でも，動物性食品は生理ペプチドの定量はChengらの方法９）により行っ活性を有する様々なペプチドなどに分解されるこた 。す な わ ち ，サ ン プ ル 溶 液 に 対 し 75 倍 量 のとが知られている。Saigaらは豚肉タンパク質

o-phtalaldehyde試薬を加えて，常温で２分間反由来のペプチドに抗酸化活性能があることを報告応させた。その反応液の吸光度（340nm）を分光している。Ahhmedら７）と竹田ら８）は，食肉の消光度計UV-1800型（島津製作所，京都）を用いて化酵素処理により生じるペプチド混合物に血圧降測定し，Gly-Leu相当量として算出した。

６）

下作用を有することと，抗酸化作用を有することペプチドの定量および分子量の推定

また，タンパク質が消化酵素によって低分子化されたことを確認するために，16％SDS-ポリア

をそれぞれ報告している。
そこで本研究では，鹿肉の食肉資源としての普クリルアミドゲル（PAGE）と，ゲルろ過HPLC

及促進に向けて，食肉と同様に生理活性機能を有で評価した。ゲルろ過HPLCでは分子量マーカーするか，シカと同類同亜目である牛を用いて比較として，牛血清アルブミン（M.W.＝66,000），シ検討を行った。

ト ク ロ ム C （M.W. ＝ 12,400）， ア プ ロ チ ニ ン

２．方
2.1

（M.W.＝6,500），リボフラビン（M.W.＝376）を法

使い溶出時間をもとに分子量を推定した。

実験材料および消化酵素分解物の調製

2.3

抗酸化試験

供試した牛肉は，神奈川県相模原市にある大学

抗 酸 化 作 用 の 評 価 の た め ，1,1-diphenyl-2-

近くの精肉店にて購入し，－30℃の冷凍庫内に保picrylhydrazyl（DPPH）ラジカル消去活性を，存した。鹿肉は長野県猟友会より，捕獲後24時間

DPPH分光測定法10）に準じて行った。すなわち，以内に解体された個体を冷凍状態で受け取り，保各種サンプルは70％エタノールで希釈し，ホモジ持した。

ナイズ後の遠心上清を分析試料とした。これと実験には，４℃の冷蔵庫内で１日かけて解凍し200mMのMES緩衝液，800µＭのDPPH溶液を混たものを使用した。摂取後の体内における消化吸

合し，20分間反応させ，520nmで吸光度を測定し収の条件を考慮して，挽肉量の２倍量の蒸留水でた。サンプルのラジカル消去率は以下の式で算出

攪拌後，70℃で30分間加熱した。その後，胃粘膜した。

由来の消化酵素であるペプシンを添加後37℃で２ラジカル消去率（％）＝{［A520nm （DPPH＋溶

時間加温を行い，すい臓由来の消化酵素であるト媒）］－［A520nm（DPPH＋サンプル）］}/［A520nm（DPPH

リプシンとパンクレアチンをペプシンと同量添加＋溶媒）］し，再び37℃で２時間加温を行った。

またTrolox（和光純薬工業，東京）をスタン

消化酵素を加えていないものを未処理区，ペプ

ダードとして，検量線を作成し，サンプルの抗酸

シンのみを添加した分解物をペプシン（pep）処化活性のTrolox相当量として以下の式で算出し理区，すべての消化酵素を加えた分解物をペプシた。

ン・トリプシン・パンクレアチン（pep/try/pan）

DPPHラジカル消去活性（nmol-Trolox相当量

処理区とし，各酵素分解物を遠心分離（6,000×g）／µl）＝分析試料の傾き（A520nm/（µl/assay））/

した後，その上清をろ紙No. 5A（東洋濾紙，東京）

Troloxの傾き（A520nm/（nmol/assay））© The Ito Foundation

120

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

2 . 4 アンギオテンシンⅠ変換酵素（ACE）阻認されなかったが，pep/try/pan処理区においては牛肉に比べて鹿肉が有意に高い消去率が認めら

害活性
アンギオテンシンⅠ変換酵素（ACE）阻害活れた（p＜0.05）。

に準じて行った。

また，ラジカル消去活性は，酵素未処理区のラ

す な わ ち ，各 種 サ ン プ ル と ACE, Hippuryl-L-

ジカル消去率（％）が低いことから，pep処理区

histidyl-L-Leucine（HHL）から切り出された馬およびpep/try/pan処理区で比較を行った。その尿酸を酢酸エチルで溶媒抽出後，凝縮乾固し，再結果，pep処理区において動物種間の有意差は確

溶解して228nmの吸光度を測定した。ACE阻害

認されなかったが，pep/try/pan処理区において率はサンプルを加えた吸光度をＳ，サンプルの代は牛肉に比べて鹿肉が有意に高い消去活性が認め

わりに超純水を加えた時の吸光度をＣ，あらかじられた（p＜0.05）（Fig.１）。

性は，ACE阻害活性測定法

11）

めACEを失活させてから反応させた時の吸光度報告されている牛肉のラジカル消去活性の数
値 と今回の数値が同程度であったことから，鹿をＢとして以下の式で算出した。

８）

阻害率（％）＝（Ｃ－Ｓ）/（Ｃ－Ｂ）×100

肉摂取時のペプチドが高い抗酸化力を有すること

またACE阻害活性はIC50 値を算出し，Gly-Leuが示唆された。
3.3

相当量として評価した。

ACE阻害率（％）は，各肉サンプル共に酵素

３．結果と考察3.1

ACE阻害活性試験

ペプチドの定量および分子量の推定

Table 1 Results with change in peptide concentration

ペプチドの定量については，各肉サンプルともSampleBeef

Venison22.2±2.4ａに消化酵素を添加していくことでペプチド量が有Enzyme untreated（mM）

25.6±2.3ａ

意に増加していることが確認された（p＜0.05）。

Pepsin treated（mM）

51.6±2.3ｂ

50.6±2.9ｂ

しかしながら，酵素未処理区，pep処理区およびPepsin・Trypsin・Pancreatin treated（mM）

79.0±4.0ｃ

75.7±6.6ｃ

pep/try/pan処理区では有意差が認められなかっ

Different letters indicate significant differences（ p ＜0.05）．

た（Table１）。

Data represent mean±SD（n＝3）．

また16％

SDS-PAGEにより，各肉サンプル

35が確認された。しかしながら，pep/try/pan処理区においてはゲル濃度を20％に変更しても動物種間における明確なバンドは見られなかった。そこ
で，ゲルろ過HPLCによって確認したところ，牛肉および鹿肉のpep/try/pan処理区の低分子量画分が12kDa以下に存在していることが認められた（データ省略）
。
3.2

抗酸化試験

µmol‒Troloxequivalent/l

ともに消化酵素処理に伴いタンパク質の低分子化

＊

30
25

pep treated20

pep/try/pantreated

15
10
5
0

beef

venisonFig. 1 Comparison of radical-scavenging activity in beef

ラジカル消去率（％）では，酵素未処理区およびpep処理区における動物種間による有意差は確and venison.

Data represent mean± SD（n＝3）．＊Significantly

different from beef（p＜0.05）© The Ito Foundation

野生動物肉の食料資源としての利用に関する研究：生理活性機能の検討

121

未処理区に比べてpep処理区およびpep/try/pan

今後は，哺乳類イノシシ亜目であるイノシシと処理区において活性が認められ，pep/try/pan処

その家畜種である豚を追加して，食肉とジビエ肉

理区では牛肉に比べて鹿肉に有意に高い阻害率での比較検討を行っていく。また，今回DPPHラ（％）が認められた（p＜0.05）（Fig.２）。

ジカル消去活性およびACE阻害活性の両方とも

またACE阻害活性を示すIC50値は，牛肉に比べ牛肉よりも活性が高く認められた鹿肉の消化酵素て 鹿 肉 が 有 意 に 高 い 活 性 を 示 し た（p ＜ 0.05）

処理ペプチドにおいて，その活性成分の同定を行（Table２）。

い，同定した成分をもとに純粋な有効成分においACE阻害率およびACE阻害活性ともに鹿肉がても比較検討を行う予定である。

牛肉に比べて高い活性を示したことから，食肉のまた，今回の試験に供した鹿肉は長野県猟友会

中で鹿肉が血圧上昇抑制作用を発揮する可能性がより入手した。野生シカは本来，生息地内の植生示唆された。

（植物）を採食して生活している。このため採食以上の結果より，捕獲された野生鳥獣の摂取をする植物やその栄養価値は季節によって異なるこ

想定し，消化酵素処理をした鹿肉と牛肉は，生理とが報告12）されている。すなわち，早春から初夏

活性機能を有する可能性があるペプチドへと低分においては草本植物を，夏季から秋季においては子化することが認められた。

木本葉部や堅果類を採食している。そして冬季には草本枯死部，針葉樹の葉部や樹皮を採食している。こうした採食物の違いは，鹿の消化過程の主＊Inhibitory activity (%)

90

体であるルーメン内消化に変化を与えることになり，体組織（筋肉や脂肪組織）の代謝に影響を及80

ぼすことが想定される。したがって鹿肉を構成す

70

Enzymeuntreated

6050

るアミノ酸も季節により変動するものと思われ

pep treatedる13）。今回の試験では鹿肉を消化酵素処理するこ

pep/try/pantreatedとによりペプチド混合物には抗酸化力や血圧上昇抑制効果のあることが認められたが，今後は鹿を40捕獲する時期や生息地の植生との関係性も明らか

30

beef

にする必要がある。

venisonFig. 2 Comparison of ACE-inhibitory activity in beef andvenison.
Data represent mean±SD（n＝3）．＊Significantly
different from beef（p＜0.05）

４．要

約

鹿肉の消化酵素分解物による抗酸化作用および
血圧上昇抑制作用について，牛肉を対照区とし，Table 2 Results of ACE-inhibitory activity for each

DPPHラジカル消去法およびACE阻害活性法によenzyme hydrolysate derived from meat

り検討した。抗酸化試験の結果，牛肉および鹿肉SampleBeef

Venisonの消化酵素分解物に活性が認められ，牛肉に比べ＊IC50（mM）

33.5±0.61ａ

18.6±1.3ｂ

鹿肉の酵素分解物において有意に高いDPPHラジ

Different letters indicate significant differences（p＜0.05）．
Data represent mean±SD（n＝3）．＊Peptide concentration
required to inhibit ACE activity by 50％．

カル消去活性が認められた（ p ＜0.05）。牛肉の値が文献値と同程度であったことから，鹿肉が動物© The Ito Foundation

122

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

肉由来のペプチドにおいて高い抗酸化力を持っていると考えられた。また血圧上昇抑制試験により，牛肉および鹿肉の消化酵素分解物にACE阻
害活性が認められ，牛肉に比べ鹿肉の酵素分解物に お い て 有 意 に 高 い 活 性 が 認 め ら れ た（p ＜0.05）。以上より，ヒトの消化により生じる鹿肉
酵素分解物は，高い抗酸化作用およびACE阻害
活性を有するため，生体内においてそれらの生理活性機能を発揮する可能性が高いと考えられた。
謝

辞

本研究の実施にあたり，実験を担当した麻布大学大学院の金子桜子院生（獣医学研究科博士課程
前期），ならびにジビエ利活用に関し沢山の資料をご提供いただいた押田敏雄先生（麻布大学名誉教授，日本ジビエ振興協会理事）に厚く御礼申し
上げます。
文
献
１） 農林水産省：鳥獣被害の現状と対策，2016年３月．
 http://www.maff.go.jp/j/seisan/tyozyu/higai/
pdf/h2803_meguji_zentai2.pdf.
２） 坂田亮一，時田昇臣，押田敏雄：野生動物肉の加工利用のための技術開発：加工適性に及ぼす血絞りと塩漬法の効果，平成27年度食肉に関する助成研究
成果報告書VOL.34，67～71，2016．
３） 押田敏雄，坂田亮一：「第４回日本ジビエサミット」に参加して，第72巻４号，279～297，2018．
４） 押田敏雄，西澤久友，坂田亮一：その場で処理・

ジビエカーの可能性，家畜衛生学会誌，43（4），175～183，2018．
５） 日本農業新聞：ジビエ“農村産業”に捕獲・加工・流通人材や施設整備後押し農水省がモデル事業，
2017年９月17日．https://www.agrinews.co.jp/p41922.
html
６） Saiga, A., Tanabe, S., Nishimura, T.：Antioxidant
activity of peptides obtained from porcine
myofibrillar proteins by protease treatment, Journalof Agricultural and Food Chemistry，51，3661～3667，
2003．
７） Ahhmed, A. M., Muguruma, M.：A review of meat
protein hydrolysates and hypertension, Meat
Science，86，110～118，2010．
８） 竹田志郎，久保田大樹，竹之山愼一，河原聡，六車三治男：各種食肉の消化酵素分解物における抗酸化作用の検討―その畜種別差異の比較検討―，日本
暖地畜産学会報，58，103～108，2015．
９） Cheng, F. Y., Lai, I. C., Lin, L. C., Sakata, R.：Thein vitro antioxidant properties of alcalasehydrolysate prepared from silkie fowl （Gallus
gallus）blood protein, Animal Science Journal ，87 ，921～928，2016．
10）（社）日本食品科学工学会：平成19年度農林水産
省補助事業（食料産業クラスター）食品機能性評価
マニュアル集第Ⅱ集，71～78，2007．
11）（社）日本食品科学工学会：平成20年度農林水産
省補助事業（食料産業クラスター）食品機能性評価
マニュアル集第Ⅲ集，68～73，2008．
12） Tokita, N., Nedu, M., Sakata, E., Takii, A.,
Tamura, A., Furubayashi, K., Tokita, T.：Nutritive
value of three sasa species in the Tanzawa
mountains as a winter food for sika deer, Wildlife
Conservation Japan，13，1～4，2011．
13） 時田昇臣，大橋りか，長谷川愛：野生鳥獣のジビ
エ活用：イノシシ及びニホンジカの機能性アミノ酸，
2017年度日本草地学会弘前大会講演要旨，p.122，
2017．

© The Ito Foundation

123

機能性畜産副生成物を用いた糖尿病合併高血圧症の改善を目指した開発研究
Improvement effect of natural component derived from animal product on the
blood pressure in fructose-induced hypertension rats with diabetes mellitus

吉

川

豊・糸

井

亜

弥

（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

Yutaka Yoshikawa and Aya Itoi
（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Womenʼs University）

There are various factors for adjustment of blood pressure, and the medicines are chosen
by guidelines. It is said that the angiotensin-converting enzyme（ACE）inhibitors affect therenin-angiotensin systems（RAS）, and decrease the blood pressure. They also preserve renal
function. In the present study, we investigated that the whether natural component derived
from animal product（globin and lever）had the ACE inhibitory effect in the in vitro
experiments. And we revealed that both globin and lever showed the high ACE inhibitory
effect. Fructose-induced hypertension rats with diabetes mellitus were taken as a globin（200or 400mg globin/kg/day）orally for about 10 weeks. At the end of study period, plasma, bloodvessel, lung, testis, and kidney ACE activity were measured by HPLC-UV technique. In thisstudy, there was significant decrease in ACE activity at the lung. Moreover, the ACE
inhibitory effects of the blood vessel or kidney tend to decrease. These results suggested thatglobin protein had decreasing effect of blood pressure.

１．目

が糖尿病の大血管合併症の発症リスクを２～３倍的増加させているという事実である２）。糖尿病と合生活習慣病の１つである糖尿病は，21世紀にお併する高血圧は，冠動脈疾患や脳血管障害といっいて，日本のみならず全世界中で患者数の増加がた動脈硬化性疾患の早期発症につながるだけでな

懸念されており，糖尿病の予防や治療法と同時にく，糖尿病の慢性合併症の進展に関与することが重篤な合併症の予防や治療法も併せて，早急に確懸念されている。英国の疫学調査では，２型糖尿

立しなければならない疾患である。2013年の調査

病患者において，正常血圧値群（＜125 mmHg）によると，世界の糖尿病人口は約３億８千万人にに対する高血圧値群（＞142 mmHg）における虚ものぼると言われている 。その中でも，特に近血性心疾患発症の相対危険度は1.82であり，脳卒

年問題となっているのは，糖尿病患者では健常者中発症の相対危険度に至っては2.99であり，血圧に比べ，高血圧を合併している率が高く，高血圧

レベルが高いほどそのリスクは有意に増加するこ

１）© The Ito Foundation

124

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）とが報告されている３）。
血圧を調整する機能の一つにレニン・アンジオ

２．方法

テンシン系から産生される物質の存在がある４）。

2.1

レニン・アンジオテンシン系における最初の基質

2.1.1

は，主に肝臓で合成されるアンジオテンシノーゲ

馬尿酸，リン酸水素二ナトリウム・十二水和ンである。このアンジオテンシノーゲンは，腎臓物，リン酸二水素カリウム，塩化ナトリウム，メで産生されるレニンという酵素によってアンジオ

タリン酸，HPLC用メタノール，HPLC用リン酸，

テンシンⅠへと変換される。アンジオテンシンⅠ

塩化カリウム，酢酸マグネシウム，スクロース，はさらにアンジオテンシン変換酵素（angiotensin

２-プロパノールおよびクロロホルムは和光純薬

converting enzgyme：ACE）によって，アンジ工業株式会社より購入した。トリス（ヒドロキシオテンシンⅡという物質へと変化する。このアンメチル）アミノメタンは純正化学株式会社より購

ジオテンシンⅡが血圧上昇に関わっている物質で入 し ，Hippuryl-His-Leu acetate salt（Hip-His-ある。そのため，ACEを阻害すれば，アンジオLeu）およびNonidet-P40はSIGMA-ALDRICH社

テンシンⅡは作られないため，血圧上昇を抑えるより購入した。また，今回使用した試料はILS（株）

ことができる。つまり，ACE阻害活性を測定すより入手した。なお，グロビンタンパク分解物は，ることにより，血圧低下への効果を検討すること

豚ヘモグロビンをアルカリプロテアーゼ処理およが可能である。

び限外ろ過膜処理によって調製した。

ACE阻害活性測定試験
試薬・試料

そこで我々は，機能性畜産副生成物の１つであ

2 . 1 . 2 グロビンタンパク分解物ならびに豚肝るグロビンタンパクを酵素分解して得られたペプ

臓由来レバーエキスのACE阻害活性

チド（「バリン―バリン―チロシン―プロリン」，

10％デキストリン含有の粉末グロビンならびに「バリン―チロシン―プロリン」，「バリン―スレ

レバーエキスをElix水を用いて溶かし，被験試料

オニン―ロイシン」など）の混合物であるグロビとして使用した。

ンタンパク分解物や豚肝臓由来レバーエキスに着ラットから採取した血漿50 µLに被験試料と目した。ジペプチドやトリペプチドなどのペプチ

100 mMリン酸緩衝液（pH8.3，300 mM塩化ナト

ド成分にはACE阻害作用があることが報告されリウム含有）を合わせて100 µLになるように加ているため ，グロビンタンパク分解物も血圧低

え，37℃で30分間プレインキュベートした。その下作用をもつ物質として期待される。本研究で後，リン酸緩衝液に溶解した５mM Hip-His-Leu

は，in vitro実験での畜肉由来グロビンならびにを150 µL加え，37℃で30分間プレインキュベー

豚肝臓由来レバーエキスのACE阻害活性の検討

ト後，２％メタリン酸を加え，反応を停止させた。

を行った。それに加えて，in vivo実験で畜肉由

これを４℃，4000 rpmで10分の遠心分離を２回

来グロビンをインスリン抵抗性と高血圧を併発し行い，上清20 µLを高速液体クロマトグラフィーているラットに摂取させ，血漿および各組織の（HPLC）で分析した６）。

５）

ACE活性の変化から高血圧治療への可能性を検2 . 1 . 3 血漿中および各組織（肺，睾丸，腎臓，

討した。

血管）中のACE活性の測定
深麻酔下で解剖し，摘出した各組織に30 mM
塩化カリウム，５mM酢酸マグネシウム，0.25 Ｍ© The Ito Foundation

機能性畜産副生成物を用いた糖尿病合併高血圧症の改善を目指した開発研究

125

スクロース，Nonidet-P40（0.5％）を含む50 mMるように，残りの２週間はグロビンタンパク分解

Tris-HCl buffer（pH7.8）を2.5 mL加え，ホモジ物の量が400 mg/kg体重となるように水道水で希ナイザーを用いて30回ホモジネートした。血管は釈した水溶液を使用した。飼育期間終了後，深麻30 mM塩化カリウム，５mM酢酸マグネシウム，

酔下で腹部大動脈から採血を行った後，各種臓器0.25 Ｍスクロース，Nonidet-P40（0.5％）を含む（血管，腎臓，肺，睾丸）を採取した。血液は遠50 mM Tris-HCl buffer（pH7.8）を500 µL加え，

心分離し，上澄みを採取することにより血漿を得

50回ホモジネートした。この溶液を４℃，20,600

た。血管，血漿，肺，睾丸，腎臓は－20℃で保存

ｇで30分間遠心分離を行い，得られた上清を酵素した。実験には，採取した血漿，各種臓器を室温溶液として使用した。血漿または上記で調整した

放 置 で 解 凍 し 使 用 し た 。群 間 の 有 意 差 は ，

酵素溶液50 µＬに100 mMリン酸緩衝液（pH8.3，

Microsoft Excel 2010を用い，Excel統計2012によ300 mM塩化ナトリウム含有）を50 µL加え，37℃

り，Tukey-Kramer法を用いて検定した。

で30分間プレインキュベートした。その後，リン

なお，本実験は，神戸女子大学動物飼育室利用

酸緩衝液に溶解した５mM Hip-His-Leuを150 µL

内規に従い，神戸女子大学動物実験倫理委員会の加え，37℃で30分間プレインキュベート後，２％承認を得たうえで実施した。

メタリン酸750 µLを加え，反応を停止させた。
これを４℃，4,000 rpmで10分の遠心分離を２回行い，上澄み液の20 µLをHPLCで分析した。
2.2

３．結果と考察3 . 1 グロビンタンパク分解物ならびに豚肝臓

動物実験

由来レバーエキスのACE活性の測定

日本エスエルシー株式会社より５週齢の10％デキストリン含有のグロビンタンパク分解

Wistar-kyotoラット３匹と自然発症高血圧ラッ

物は濃度依存的にACE活性を阻害し，IC50値はト（SHR）15匹を購入し，SHRのうち10匹に食塩

終濃度で0.072％となった（Fig. 1（A））
。また，レ

添加（0.3％食塩）高フルクトース食（57％フル

バーエキスも濃度依存的にACE活性を阻害し，

クトース）を与える２週間の予備飼育を行った。

そのIC50値は終濃度で0.078％であった（Fig. 1

その10匹を，35％グロビンタンパク分解物を水道（B））
。この結果は，先行研究である「システイ

水に溶かしたグロビン水溶液を自由摂取させる群

ン－トリプトファン」，「スレオニン―トリプト（SHR＋HF＋gro群，５匹），グロビン水溶液を摂ファン」などのジペプチドによるACE阻害活性

取させない群（SHR＋HF群，５匹）に分け10週の報告と相違なく７），含有成分のペプチド混合物

間飼育した。SHRのうち，食塩添加高フルクトー

がその活性成分であると推測できる。以上の結果

ス食で予備飼育をしていない残りの５匹は普通食

より，低濃度で効果を示しているグロビンタンパ（20％カゼイン食）を与え，グロビン水溶液を摂ク分解物をin vivo実験で使用することにした。

取させないcontrol群とし，また，普通食（20％3.2

カゼイン食）を与え，グロビン水溶液を摂取させ飼育期間中の体重変化をFig.２に示す。normal

ないWistar-Kyotoラット３匹をnormal群とし，群に比べてそのほかの群の平均体重は低い値と10週間飼育した。与えるグロビン水溶液についてなったが，高フルクトースかつ高食塩食を与えたは，投与開始から８週間は摂取するグロビンタン

SHR＋HF群とSHR＋HF＋gro群はほぼ同じ体重

パク分解物の量が１日あたり200 mg/kg体重とな変化をたどった。血漿中のACE活性の測定結果© The Ito Foundation

動物実験

126

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）
（Ｂ）

120

120

100

100

Inhibition ratio（％）

Inhibition ratio（％）

（Ａ）

80
60
40
20
0

80
60
40
20

0

2

4

6

8

0

10

0

2

4

6

8

10

Concentration of lever（％）

Concentration of globin（％）
Fig. 1 ACE inhibitory effect of globin（A）and lever（B）

450
400

Body weight（g）

350
300
250
200
150
100
50
0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Day
Fig. 2 Changes of body weights. Normal（◆），control（□），SHR ＋ HF（▲），and SHR ＋ HF ＋gro（○）．

をFig. 3（A）に示す。すべての群で有意差は見らられており，特にラットでは精巣中に肺や腎臓をれなかった。肺は血管内皮細胞からACEを産生・上回る量のACEが存在することが報告されてい放出しており，ACE阻害活性を観察するためにる ９）。睾丸中のACE活性の測定結果をFig. 3（C）

適した臓器である ８）。Fig. 3（B）に肺中のACE活に示す。今回の実験では，すべての群において有性の測定結果を示す。SHR＋HF＋gro群は，SHR

意差は見られなかった。腎臓から分泌されるレニ＋HF群に比べて有意に低下していた。多くの哺ンという酵素は，血圧を上げる作用をもつアンジ

乳動物の精巣にACEが多量に存在することが知オテンシンⅡというホルモンをつくる際に欠かせ© The Ito Foundation

127

機能性畜産副生成物を用いた糖尿病合併高血圧症の改善を目指した開発研究（Ａ）（Ｂ）
Plasma

Lung

100
80
60
40
20
normalcontrol

SHR+HF SHR+HF+gro

ACE activity（％）

ACE activity（％）

40

0normal60
40
20control

SHR+HF SHR+HF+gro

control

SHR+HF SHR+HF+gro（Ｅ）

Kidney250

80

normal60（Ｄ）
Testis

100

0

80

20

（Ｃ）
120

100

＊＊

＊＊

200

＊＊
＊＊

150
100
50
0

Blood vessel350

ACE activity（％）

0

＊＊

120

ACE activity（％）

ACE activity（％）

120

300
250
200
150
100
50

normalcontrol

SHR+HF SHR+HF+gro

0normalcontrol

SHR+HF SHR+HF+gro

Fig. 3 ACE activity of plasma（A），lung（B），testis（C），kidney（D），and blood vessel（E）.Significance：＊＊p＜0.01

ない物質であり，これによって腎臓は血圧を一定

SHR＋HF群とSHR＋HF＋gro群の間で有意な差に保つ手助けをしている。腎臓中のACE活性のが見られた。腎臓は血圧と関係する塩分や水分の測定結果をFig. 3（D）に示す。normal群とcontrol

調節や血圧を上げるホルモンの分泌，末梢血管に群に比べて，SHR＋HF群とSHR＋HF＋gro群で抵抗を与えるといった働きをしている10）。しかし，有意に高値を示した。血管中のACE活性の測定

腎臓の働きが悪くなると，血圧を調節する能力は結果をFig. 3（E）に示す。すべての群において有低下するため高血圧になる傾向がある。本実験の意な差は見られなかったが，SHR＋HF群に比べ結果では，高フルクトースかつ高食塩食の負荷にて，SHR＋HF＋gro群でACE活性が低下傾向によって，より腎臓に負担がかかり，ACE活性があることから，血圧降下作用を示すことが示唆さ上昇したということが考えられる。肺では，SHRれた。

＋HF＋gro群において他の群よりも低い値が得ら以上の結果から，SHRラット10匹に食塩添加れたので，グロビン水溶液によって肺のACE活（0.3％食塩食）高フルクトース食（57％フルク性が阻害される可能性がある。さらに，最も血圧トース食）を与え，２週間の予備飼育を行うことの上昇に寄与すると言われている血管中のACEで，高血圧とインスリン抵抗性を合わせ持つモデ

活性もグロビン水溶液の摂取により下がる傾向がルとなっていると考えた。血漿，腎臓，肺，睾丸

認められ，グロビン水溶液は血圧低下への作用がおよび血管中のACE活性の測定については，腎期待できる。

臓ではnormal群に対してSHR＋HF群とSHR＋
HF＋ gro群 ，control群に対してSHR＋HF群とSHR＋HF＋gro群で有意に差が見られ，肺では４．要

約In vitro実験から，食肉由来天然成分であるグ© The Ito Foundation

128

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

ロビンタンパク分解物ならびに豚肝臓由来レバー

康福祉学部健康スポーツ栄養学科の学生諸氏に多

エキスには強いACE阻害活性があることが明らくの協力を頂いたことを深謝いたします。

かとなった。また，グロビンタンパク分解物を高血圧モデル動物に投与し，各組織中のACE阻害
活性を測定すると，グロビンタンパク分解物には肺において有意なACE阻害活性があり，腎臓や血管にもACE活性を抑制する傾向をもつことが証明された。今後は血圧測定も同時に行い，最適な投与量の検討，ならびに，グロビンタンパク分
解物中のどの成分がACE阻害活性に寄与しているのかを，検討していく必要がある。
謝

辞

本実験において，グロビンタンパク分解物ならびに豚肝臓由来レバーエキスをご提供いただい
た，ILS株式会社様には深くお礼申し上げます。

文献１） IDF Diabetes Atlas, International DiabetesFederation, 6th edn，2013．
２） The Mainichi Medical Journal，7，668，2006．
３） Davis, T. M., Millns, H., Stratton, I. M., et al.：Arch Intern Med，159，1097，1999．
４） 久保鈴子監：薬理学の基本が分かる事典，西東社，東京，186～187，2011．
５） 藤野高大，塩田健太朗，根本友里香ら：日本水産学会誌，83，607，2017．
６） Horiuchi, M., Fujimura, K., Terashima, T., et al.：J Chro，233，123，1982．
７） Baichuan D., Xiaojun, N., Zhenya, Z., et al.：J. Agric. Food Chem.，65，9774，2017．
８） 櫻林郁之介監：今日の臨床検査，南江堂，東京，458～459，2009．
９） 山口高正，関根雅恵，池北雅彦ら：薬学雑誌，
105，491，1985．
10） 片山善章，柏森裕三，長村洋一監：新版臨床化学
第３版，講談社，東京，273～275，2014．

また，本実験を進めるに当たり，神戸女子大学健© The Ito Foundation

129

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析
Effects of nucleic acids from meat and other foods on the functions ofintestinal cells

河

合

慶

親

（徳島大学大学院医歯薬学研究部）

Yoshichika Kawai（Graduate School of Biomedical Sciences, Tokushima University）

We usually eat animals, plants, and/or microorganisms as daily foods. Therefore, our dietnecessarily contains their biological constituents, such as proteins, lipids, carbohydrates, andnucleic acids. However, as compared with three major nutrients （proteins, lipids,
carbohydrates）, less attention has been paid on the nutritional and biological consequences offood-derived nucleic acids. In addition, “standard tables of food composition in Japan” donʼt yet
include the information of nucleic acid contents. We then focused on the importance of nucleic
acid contents in our foods and of the potent functions of food-derived nucleic acids in our body.
We have recently developed a method for measurement of food-derived nucleic acids andfound that the nucleic acid contents significantly differ between each food. Especially, it was
found that matcha（powdered green tea）, soybean, and chicken meat contain abundant nucleic
acids. We also found by agarose-gel electrophoresis that the molecular weights of food-derived
nucleic acids decreased during cooking with heat. In vitro enzymatic digestion with pancreaticand intestinal enzymes also decreased the molecular weights of nucleic acids. Next, weinvestigated the beneficial functions of food-derived nucleic acids on intestinal cells, because
intestinal cells can be exposed to higher concentrations of food constituents. Using
differentiated Caco-2 cells as a model of small intestine, it was found that food-derived nucleic
acids, especially from soybean and chicken meat, induced the mRNA expression of claudin-4
and mucin 2, both of which contribute to the barrier functions of intestinal cells. Cooking withheat scarcely affected the activity for mRNA induction, whereas enzymatic digestion
significantly attenuated the activity. These results suggest that eating soybean and/or chicken
meat might contribute to enhanced barrier functions of intestinal cells through intake of
biologically active nucleic acids from these foods.

１．目

ンパク質，脂質，糖質のほかビタミン，ミネラル

的などの栄養素が含まれている。これら栄養素の機

ヒトは動物，植物，あるいは微生物由来の食品

能性については，これまでに多くの研究がなされを日常的に摂取している。これらの食品には，タており，すでに食品・栄養学的意義が確立されて© The Ito Foundation

130

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）いる。一方で，核酸は遺伝情報を担う生体高分子

粉砕したものを用い，粉末状の薄力粉，きな粉，としてすべての生物に存在しており，これらを食

青のり，抹茶やスキムミルク，液状の豆乳はその品として摂取する際には，常に一定量の食品由来まま用いた。また，人参，しめじ，バナナ，肉類

核酸を摂取していることになる。しかし，食品中や魚類は，ある程度すりつぶしたものを使用した。

の核酸量については食品成分表に記載がなく，栄2.2

養素あるいは機能性分子としての役割についても核酸の定量はQantiFlourⓇ（Promega）を用いて不明である。そこでまず，食事として摂取する核行った。RNA定 量はQantiFlour Ⓡ RNA System，

酸量を明らかにする必要があると考えた。我々はssDNA定量はQantiFlourⓇ ssDNA System，dsDNA

食品からの核酸の抽出方法について検討し，様々

定 量 は QantiFlour Ⓡ dsDNA System（い ず れ もな食品に含まれる核酸量の測定を試みてきた。まPromega）を用いて行った。

核酸の定量

た，食品によって核酸の分子サイズが異なること

2.3も示唆された。これらの結果を受け，本研究課題

Caco-２細胞は，10％FBS含有DMEM培地に非では様々な食品の核酸量の測定と分子サイズの検必須アミノ酸溶液を加えたものを培地として用い討を行うことを一つめの目的とした。また，腸管た。プレートに撒いた細胞はコンフルエントに細胞を用いた食品由来核酸の機能性についての予なった日から適宜培地を交換しながら21日間培養備検討から，大豆と鶏ミンチ肉由来核酸で腸管のを続け，小腸上皮様に分化させた。培養培地を除バリア機能を高める傾向が認められた。そこで，

いてPBSで洗浄後，食品から抽出した核酸を総核

大豆・鶏ミンチ肉に加え，他の食品由来核酸の腸酸量が１mg/mlとなるようDMEM培地で希釈し，管細胞に対する機能性についても検討を行うこと

１ウェルあたり300µl処理した。

核酸処理

を二つめの目的とした。さらに，実際に摂取する

2.4

食品は加熱処理や，体内では消化を受けたりす

細胞をPBSで洗浄し，Sepasol-RNA I Super Gる。そこで，加熱・消化の核酸機能への影響につ（Nacalai Tesque）を用いてRNAを抽出した。逆いても検討を行うこととした。

転 写 反 応 は ReverTra AceⓇ qPCR RT Master

２．方
2.1

定量的RT-PCR

Mix with gDNA Remover （TOYOBO） を 用 い

法て 行 っ た 。 PCR は THUNDERBIRDⓇ SYBRⓇ

核酸抽出方法qPCR Mix（TOYOBO）を 用 い て LightCyclerⓇ

ビーズ式細胞破砕装置専用チューブ（トミー精Nano シ ス テ ム（Roche）に て 行 っ た 。ま た ，工，TM-625S）に粉末類は50mg，固体，液体類

Caco-２細胞の分化状態についてはRecombinant

は200mg量り取り，ビーズ（ジルコニアZB-30）

Human TNF-α処理によるIL-８のmRNA発現量を７個入れ，核酸抽出用バッファーを加えた後，の増加を指標に評価した。プライマーの塩基配列冷却したビーズ式細胞破砕装置（トミー精工，を以下に示した。

MS-100MR）にセットし，5000rpmで３分破砕し【GAPDH】

た。65℃で10分ごとに転倒混和し30分インキュ

GATGAGAAGTATGACAACAGCCT（forward）

ベート後，10000×ｇで10分遠心した。上清を回AGTCCTTCCACGATACCAAAGT（reverse）

収し，フェノール試薬を用いた核酸抽出を行っ【IL-8】

た。なお，穀類である精白米，大豆はミキサーで

AGAGTGATTGAGAGTGGACC（forward）© The Ito Foundation

131

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析

ACTTCTCCACAACCCTCTG（reverse）

た（Fig.１）。また，鶏肉の部位別の核酸量につ【Mucin2】

いては，鶏むね肉，鶏ミンチ肉，鶏もも肉の順に

AACGGCCTGCAGAGCTATTC（forward）

多く，鶏肉間で約250mgの差があった。藻類であATCTTCTGCATGTTCCCAAACTC（reverse）

る青のりは325mgと比較的核酸量が多かった。魚【Claudin-4】

類 に お い て は ，ま ぐ ろ に 比 べ て 鮭 の 核 酸 量 が

TTGTCACCTCGCAGACCACT（forward）

257mgと３倍以上も多かった。今回の核酸の定量

CAGCGAGTCGTACACCTTG（reverse）

結果から，食品100ｇあたり約10―1000mgという2.5

核酸の人工消化実験方法

幅広い量の核酸が含まれることが分かった。ま膵 液 は ， Pancreatin （TOKYO CHEMICAL

た，比較的核酸を多く含むといわれている肉類やINDUSTRY）50mgを１mlリン酸緩衝液に溶解・

魚類や大豆に比べて，抹茶には２倍以上も核酸が懸 濁 し て 調 製 し た 。ま た ，腸 液 は ，Intestinal

多く含まれていることが明らかとなった。

acetone powders from rat （SIGMA）100mg をまた，抽出した食品の核酸組成を調べたとこ

１mlリン酸緩衝液に溶解・懸濁後，遠心上清をろ，全体的にssDNAとRNAが最も多く，dsDNA使用した。また，対照実験用に消化酵素の失活をの割合がおよそ10％以下と最も少なかった。この目的として，100℃，30分の加熱処理を行った。

組成は食品により異なり，ssDNAが特に多い食

消化反応は，核酸50µlに膵液を100µl添加して，品はうどん，薄力粉，抹茶であり総核酸量の60―

37℃で60分振とうさせた。次いで，腸液を100µl

80％を占めていた。RNAが特に多い食品は大豆，添加して，37℃で90分振とうさせて反応させた。

しめじ，青のり，豆乳であり総核酸量の60―70％

３．結
3.1

を占めていた。食品により核酸の組成が異なり，

果全体としてdsDNAよりもssDNAとRNAの割合が

食品中の核酸量の定量多いことが明らかとなった。

様々な食品からの核酸の抽出と定量を試みた。

3.2

様々な食品に含まれる核酸の分子サイズ

食品と微生物から抽出した核酸の分子サイズに1792mgと最も多く，次いで大豆が1056mgであっ

ついて，アガロースゲル電気泳動により確認し

2000
1500
1000
500
豆乳

バナナ

抹茶

青のり

© The Ito Foundation

人参Fig. 1 Nucleic acid contents in various foods

スキムミルク

鮭

しめじ

薄力粉

まぐろ

精白米

うどん

鶏むね肉

鶏もも肉

鶏ミンチ肉

0

大豆

Nucleic acid（mg/100g of food）

その結果，食品100ｇあたりの核酸量は抹茶で

132

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

た。なお，泳動する核酸量が同じ量となるようにた。人参では1000bp付近の高分子の核酸が特に揃えた（Fig.２）。その結果，食品ごとに分子サ多くみられた。

イズの異なる核酸が含まれていることが確認され

3 . 3 分化Caco-２細胞における食品由来核酸

た。また，ほとんどの食品由来核酸で高分子側かの機能性

ら低分子側まで幅広い分子サイズの核酸が検出さ

分化Caco-２細胞に１mg/mlの食品由来核酸をれたが，鮭と豆乳由来核酸では3000bp付近の比４ 時 間 処 理 し ，RT-qPCR に よ り claudin- ４ と

較的高分子領域の核酸がほとんどみられなかっmucin２のmRNA発現量について評価した（Fig.

3000 bp3000 bp1000 bp
500 bp1000 bp
500 bp

豆乳

抹茶

＊

青のり

＊

人参

しめじ

鮭

まぐろ

薄力粉

うどん

精白米

鶏むね肉

鶏もも肉

鶏ミンチ肉

0

大豆

means ±S.D. (n≧3,*p<0.05)

Mucin 2

3

＊

2.5
2
1.5

豆乳

抹茶

青のり

人参

しめじ

鮭

＊

＊

＊

薄力粉

まぐろ

うどん

＊

鶏むね肉

鶏もも肉

鶏ミンチ肉

大豆

コントロール

0

精白米

1
0.5

＊

Relative mRNA expression (fold)

＊

1
0.5
コントロール

Relative mRNA expression (fold)＊

1.5

means ±S.D. (n≧3,*p<0.05)

Fig. 3 Effects of food-derived nucleic acids on claudin-4 and mucin 2

expression in differentiated Caco-2 cells© The Ito Foundation

バナナ

2

豆乳

Claudin‒4
2.5

抹茶

青のり

人参

しめじ

鮭

まぐろ

マーカー

薄力粉

うどん

精白米

鶏むね肉

鶏もも肉

鶏ミンチ肉

大豆

マーカー

Fig. 2 Agarose-gel electrophoresis of various food-derived nucleic acids

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析

133

３）。その結果，claudin-４のmRNA発現量につバリア機能への影響について検討を行った（Fig.

いては大豆，青のり，抹茶，豆乳由来の核酸で有５）。その結果，claudin-４のmRNA発現につい意な増加がみられた。鶏肉由来核酸では有意ではては，大豆，精白米由来核酸で加熱により減少す

な い も の の 増 加 傾 向 が み ら れ た 。Mucin ２ のる傾向がみられ，鶏肉由来核酸で加熱により増加

mRNA発現量については，人参由来の核酸で有する傾向にあったが，全体的に顕著な変化はみら

意な増加がみられた。その他にも，鶏ミンチ肉と，れなかった。Mucin２のmRNA発現については，異なる種類の鶏肉，青のり，抹茶由来核酸で増加

大豆，精白米由来核酸で加熱により増加する傾向

傾向がみられた。一方で，大豆由来核酸では有意がみられ，鶏肉由来核酸で加熱により減少する傾な減少がみられた。また，精白米，薄力粉，うど向にあったが，こちらも全体的に顕著な変化はみん，まぐろ由来の核酸で有意な減少がみられた。

られなかった。よって，食品の加熱は核酸の機能

3 . 4 食品の加熱による核酸の分子サイズの変性に大きな影響を与えないことが示唆された。

化

４．要

抽出した核酸をアガロースゲル電気泳動に供

約し，加熱による分子サイズの変化を検討した。そ本研究では様々な食品を用いて核酸の量，組の結果，試験したすべての食品で加熱により高分

成，分子サイズ，機能性について評価を行い，様々

子領域のバンドが薄くなり，およそ500bp以下のな食品由来の核酸が腸管バリア機能に関する機能

低分子領域のバンドが濃くなったことから，食品性を高める活性がみられた。特に，抹茶，大豆，の加熱により核酸の分子サイズが減少することが人参，鶏肉には比較的多くの核酸が含まれてお分かった（Fig.４）。一方で，鶏もも肉においてり，これらの核酸には腸管バリア機能増強活性がはおよそ3000bpの高分子の核酸が残っているこ認められた。また，加熱や消化によって核酸サイとが確認された。

ズが減少し，これが機能性に影響を与えることが食品の加熱による核酸の機能性の変化示された。今後，Caco-２細胞におけるバリア機

加熱した食品由来の核酸を用いて，核酸の腸管能増強効果については作用メカニズムの解析を進

3.5＋：加熱あり－：加熱なし3000 bp1000 bp
500 bp精白米－ ＋ － ＋
鶏むね肉

鶏もも肉

鶏ミンチ肉

大豆

マーカー

－ ＋ － ＋ － ＋

Fig. 4 Effects of cooking with heat on molecular weights of food-derived

nucleic acids© The Ito Foundation

134

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

2.5
2＋ : 加熱あり－ : 加熱なし

＊

1.5
1

＊

0.5
0

－

＋

－

＋

－

＋

精白米

＋

鶏むね肉

－

鶏もも肉

＋

鶏ミンチ肉

－

大豆

コントロール

Relative mRNA expression (fold)

Claudin‒4

Mucin 2

2.5
2
1.5
＊

＊

0.5
0

＋

－

＋

－

＋

精白米

－

鶏むね肉

＋

鶏もも肉

－

鶏ミンチ肉

＋

大豆

－

＊

1

コントロール

Relative mRNA expression (fold)means ±S.D. (n≧3,*p<0.05)

means ±S.D. (n≧3,*p<0.05)

Fig. 5 Effects of cooking with heat of food-derived nucleic acids on theiractivity to induce claudin-4 and mucin 2

める必要がある。また，活性に起因する核酸の分腸管に対する機能性を検証することも重要な課題

子サイズや配列についても詳細な解析が必要となである。

る。将来的には，実験動物により食品由来核酸の© The Ito Foundation

135

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維
タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究
Retort processing and cold lactic acid fermentation induce protein
degradation and functional peptides derivation in myofibrillar protein
system

林

利哉・長澤

麻央・芳賀

聖一・小川

幸彦＊

（名城大学農学部，＊名城大学農学部附属農場）

Toshiya Hayashi, Mao Nagasawa, Seiichi Haga and Yukihiko Ogawa＊（Faculty of Agriculture, Meijo University，＊Experimental Farm, Meijo University）

Muscle protein degradation and expression of inhibitory activity on angiotensin
I-converting enzyme by cold lactic acid fermentation and retort-processing were investigatedusing myofibrillar protein as the simple model system of cured meat product. In result, freeamino acid and peptide contents significantly increased by retort processing or cold
fermentation compared to that of control（70℃-heated）. The sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis analysis indicated that the band intensities of low molecularweight（＜30 kDa）proteins obtained from fermented and retorted samples were slightly
stronger than those obtained from control samples. Therefore, it was suggested that retortprocessing and cold fermentation may lead to degradation of myofibrillar proteins as a result of
these treatments. Furthermore, inhibitory activity on angiotensin I-converting enzyme wassignificantly higher in fermented myofibrillar protein than that in the protein heated at 70℃ .
On the other hand, although the inhibitory activities on angiotensin I-converting enzyme ofretort-processed samples were slightly higher than those of control（70℃-heated）, there were
not significant differences in that activity between retorted and control one. These results
suggest that these processing treatments, especially cold fermentation may contribute toderivation of low molecular weight peptides and improvement in functionalities of cured meatproducts.

１．目

について種々追究してきた１～３）。その結果，低温的乳酸発酵を施すことによりモデルソーセージの物

著者らはこれまで，発酵や加熱といった伝統的性や微細構造が大きく変化することに加え，筋原

食品加工技術の活用による食肉製品の高付加価値

線維の小片化やタンパク質の分解等も顕著にみら化を目指し，低温増殖性乳酸菌による低温発酵やれることを明らにしている１）。また，120℃以上

レトルト加熱処理が食肉製品の品質に及ぼす影響の高温加熱であるレトルト加熱によっても著しい© The Ito Foundation

136

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

物性低下が起こるとともに，タンパク質の分解がぞれ15分間加熱したものをレトルト加熱区とし生じ，その結果として遊離アミノ酸や低分子ペプ

た。また，同じ筋原線維タンパク質溶液にグルチドが増加することも併せて見出している４，５）。

コースが２％（w/v）となるように添加し，さらこういった発酵や加熱に伴うタンパク質分解，特に乳酸菌スターター，
Lactobacillus sakei No.4（L.

に食肉の主要タンパク質である筋原線維タンパクsakei）を筋原線維タンパク質溶液１mlあたり10６

質の分解は，ソーセージ等の製品におけるテクス

個レベルとなるように接種し，４℃の低温下で静チャーの発現において，負の影響をもたらすもの

置したものを発酵区とした。発酵期間中，１～２と考えられるが，その一方で，機能性という視点

時間ごとにpHを測定し，乳酸菌を接種した筋原においては，場合によっては有益な機能を有する

線維タンパク質溶液のpHが5.3付近に達するまで

低分子ペプチドが生成するという付加価値をもた

発酵処理を行った後，70℃で30分間，加熱処理をらす可能性も考えられる。したがって，低温乳酸施した。単に70℃で30分間加熱したものを，レト

発酵やレトルト加熱に伴うタンパク質分解挙動のルト加熱と発酵試験共通の対照区とした。いずれ

詳細を明らかにし，かつ機能性発現の有無を評価の試料も，加熱後速やかに氷冷を行った。各加熱することは，食肉・食肉製品の機能改善を図るう

試料を遠心分離（35,000ｇ，15分，４℃）し，得

えできわめて意義深いといえる。

られた上澄みを蒸留水に対して透析（Spectra/

そこで本研究では，食肉の主要タンパク質である筋原線維タンパク質を単純モデル系として用い

por CE，M.W.：500）し，凍結乾燥したものを最終試料とした。

て，低温増殖性乳酸菌を用いた低温発酵やレトル

2.2

ト加熱処理を施した筋原線維タンパク質における

上記凍結乾燥試料を蒸留水で溶解させ，等量のペプチド・遊離アミノ酸の量的変化を調べ，かつ４％トリクロロ酢酸（TCA）を加えることによアンジオテンシンⅠ変換酵素（ACE）阻害活性

り２％TCA可溶性画分を調製し，三上ら８）の方等を評価することで，単純モデル系におけるタン法に準じてペプチド量を，ニンヒドリン法９）に準パク質分解と機能性発現の有無について検討をじて遊離アミノ酸量を測定した。

行った。

2 . 3 ドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

２．実験材料と方法
2.1

ペプチド・遊離アミノ酸量の測定

上記の遠心上澄み画分のタンパク質分布を

試料調製

SDS-PAGE10）（アクリルアミド濃度：7.5～20％）

できる限り脂肪と結合組織を取り除いた新鮮な
豚ロース肉から，一部改変したPerry and Grey ，
６）

Etlinger らの方法に準じて筋原線維を調製し，最７）

終的に0.6M-NaCl・50mMリン酸緩衝液（pH6.0）

により調べた。ゲルの染色はCoomassie Brelliant
Blue R-250により行った。
2 . 4 アンジオテンシンＩ変換酵素（ACE）阻
害活性に対して透析，遠心分離（35,000×ｇ，15分，ACE阻害活性は，ACE（シグマ）と合成基質４℃）して得られた上澄み画分を筋原線維試料とHip-His-Leu（ペプチド研究所）を用い，Cushman

した。終濃度を15mg/mlに調整した筋原線維タとCheungの方法 11）に準じて測定した。すなわち

ンパク質溶液を，レトルト殺菌釜（花木製作所，

ACEと基質が反応した結果，遊離する馬尿酸を

HC-VA型）を用いて，120℃および130℃でそれ酢酸エチルで抽出し，その吸光度（228nm）を測© The Ito Foundation

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究

137

定する方法である。試料タンパク質濃度が0.5～

処理区では，ペプチド量については対照区も含め5.0mg/mlの範囲で阻害活性を求め，酵素活性をたいずれの加熱区よりも高い値を示したが，遊離

50 ％ 阻 害 す る の に 必 要 な 試 料 タ ン パ ク 質 濃 度

アミノ酸については，対照区よりも高いものの，（mg/ml）を算出した（IC50）。

レトルト加熱区よりは低い値を示した。次に，各加工処理によるタンパク質分布の変化をみるため

３．結果と考察にSDS-PAGEを行った（Fig. 2A，B）。その結果，

3 . 1 低温発酵ならびにレトルト加熱処理が筋70℃加熱区で明瞭にみられた分子量３～４万前後

原線維タンパク質の分解に及ぼす影響のバンドが，120，130℃の加熱によって減少し，

これまでにモデルソーセージを用いた製品レベ

分子量２万より下の領域のバンドの染色強度が強ルにおいて，低温乳酸発酵やレトルト加熱処理にくなる様子がみられた。特により高温の130℃加よって食肉中のタンパク質が分解し，遊離アミノ

熱区においてそれが顕著であった。一方の発酵区

酸や低分子ペプチドが派生することを確認していでは，対照区でみられた明瞭なバンドはほぼ消失

る。そこで本研究では，筋収縮の本体であり，した。これは，pH低下による筋原線維タンパク

主要タンパク質である筋原線維タンパク質をモデ質の酸沈殿と，乳酸菌の働きによるタンパク質のル系に用いて，低温乳酸発酵やレトルト加熱がタ分解に起因するものと推察される。後者の可能性

ンパク質分解に及ぼす影響について，ペプチドとは先に述べたペプチド量の著しい増加とよく符合

遊離アミノ酸量を調べることにより検討した。

する。

１，
４，
５）

プチド（Fig. 1A），遊離アミノ酸量（Fig. 1B）のした筋原線維タンパク質のACE阻害活性

いずれも，対照区である70℃加熱区と比較して有血圧上昇抑制作用のin vitro指標として使用さ意（ｐ＜0.05）に高い値を示し，加熱温度依存的

れ，降圧薬のターゲットとしてもよく知られるに値が上昇した。一方のL. sakeiを接種した発酵ACEの阻害活性を指標に，レトルト加熱と低温

100

＊

（Ａ）

＊

80
＊

60
40
20
0

70℃ 120℃(control)130℃ fermented(L.sakei)Free amino acid content (mg/g protein)

3 . 2 低温発酵ならびにレトルト加熱処理を施

Peptide content (mg/g protein)

その結果，レトルト加熱を施すことにより，ペ

1.2

＊

（Ｂ）

1
0.8
0.6

＊
＊

0.4
0.2
0

70℃ 120℃ 130℃ fermented(control)(L.sakei)

Fig. 1 Effect of retort processing or cold fermentation on the peptide（A）and free aminoacid contents（B）of the myofibrillar protein.

Data represent the means±SD of at least three independent experiments（＊，p＜0.05

versus the control）．

© The Ito Foundation

138

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

（Ａ）

（Ｂ）

(control)(control) (L.sakei)

Fig. 2 Effect of retort processing（A）or cold fermentation（B）on the SDS-

PAGE patterns of myofibrillar protein.

乳酸発酵を施した筋原線維タンパク質の機能性発0.3

現の有無について検討した結果をFig.３に示し

0.25

ト加熱区のACE阻害活性値（IC50）を比較すると，120，130℃のいずれの加熱区も，わずかではあるが低い値を示し，有意ではないが加熱温度上

IC 50(mg/ml)

た。その結果，対照区である70℃加熱区とレトル

昇に依存的な傾向もみられた。一方，低温増殖性

02

0.1
0.05

乳酸菌L. Sakeiを接種した発酵区では，対照区と0比較して有意に低い値を示し，低温乳酸発酵にように，いずれの処理区の場合もペプチド量の大幅な増加がみられたことから，これらの活性因子がペプチド体と仮定した場合，系中に含まれる活性の総量も大幅に増えているものと推察され
る12）。
今後は，低温乳酸発酵ならびにレトルト加熱処

70℃(control)

よって，ACE阻害活性指標値であるIC50の低下，すなわち阻害活性の上昇が確認された。先述した

＊

0.15

120℃

130℃
(L.sakei)

Fig. 3 Effect of salt-soluble fractions from retorted or

fermented myofibrillar protein on the ACEinhibitory activity.
D ata represent the means± SD of at least fiveindependent experiments（＊，p＜0.05 versus thecontrol）．

４．要約

理によって派生する活性因子の特定を急ぐととも

食肉の主要タンパク質である筋原線維タンパクに，他の機能性指標についても検討を加えたい。

質を単純モデル系として用いて，レトルト加熱処

本研究の成果は，公益財団法人

伊藤記念財団理，あるいは低温増殖性乳酸菌を用いた低温発酵の支援によって得られたものであり，ここに深く処理を施すことによる筋原線維タンパク質のタン

感謝申し上げます。また，名城大学農学部食品機

パク質分解と機能性発現の有無について検討を

能学研究室の学生・院生諸氏に深謝申し上げます。

行った。

© The Ito Foundation

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究

筋原線維タンパク質に120，130℃のレトルト加
熱処理を施すことによって，タンパク質分布パ
ターンに大きな変化がみられたことに加え，遊離アミノ酸ならびにペプチド量の加熱温度上昇に伴う有意な増加が確認され，超高温加熱によって，筋原線維タンパク質の分解が生じることが示唆された。また，低温発酵処理によっても同様にペプ
チド量の増加がみられたが，遊離アミノ酸についてはレトルト加熱区ほどの顕著な増加はみられなかった。
血圧上昇抑制作用のin vitro指標であるACE阻
害活性については，発酵区では有意かつ顕著な活性の上昇がみられたが，レトルト加熱区ではその程度はわずかであり，その差も有意なものではな
かった。
以上のことより，レトルト加熱ならびに低温乳
酸発酵処理によって筋原線維タンパク質は分解

139

文
献
１） 芳賀聖一・林利哉・大場正春・坂田亮一：名城大
学総合研究所総合学術研究論文集，８，91～96，
2009．
２） 芳 賀 聖 一：ミ ー ト ジ ャ ー ナ ル ，36（1），107 ～
113，1999．
３） 藤田利宗・林利哉・芳賀聖一：日本食品科学工学
会誌，53（8），423～429，2006．
４） Hayashi, T., Toyoda, N., Arakawa, M., Haga, S. ：Int. Cong. Meat Sci. Technol., 56, E60，2010．
５） Hayashi, T., Washio, S., Arakawa, M., Taguchi, M.,
Toyoda, N., Haga, S.：Int. Cong. Meat Sci. Technol.,
57, P395，2011．
６） Perry, S.V., Grey, T. C.：Biochem. J.，64，184～
192，1956．
７） Etlinger, J. D., Zak, R., Fischman, D. A.,：J. Cell
Biol.，6，123～141，1976．
８） 三上正幸・長尾真理・関川三男・三浦弘之：日本
畜産学会報，66，630～638，1994．
９） 日本化学会編：実験化学講座23，「生物化学Ｉ」，
丸善，東京，124～130，1964．
10） Laemmli, U. K.：Nature，227，680～685，1970．
11） Cushman, D. W., Cheung, H. S.：Biochem.
Pharm.，20，1637～1648，1971．
12） 伊部さちえ・吉田恵子・熊田薫：日本食品科学工学会誌，53，189～192，2006．

し，その結果生じた低分子ペプチド群にACEを阻害する因子が含まれる可能性が示唆された。

© The Ito Foundation

140

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索
Novel gene polymorphisms identification related to cattle economic traits

松

本

大

和

（東海大学農学部応用動物科学科）

Hirokazu Matsumoto（Department of Animal Science, School of Agriculture, Tokai University）

Japanese Black cattle are valued around the world for their excellent beef marbling score.
These days, fatty acid composition is considered another important economic trait for beef
cattle, because higher concentrations of monounsaturated fatty acids are considered tocontribute to beef palatability. Fatty acid composition in meat is known controlled by genetic
factors. In this study, we tried to investigate the influence of bovine MMP14 gene, one ofcandidate genes controlling fatty acid composition, on economic traits in beef. For this purpose,sequence comparison of the CDS and promoter region was performed, resulting two silencemutations in the CDS and three DNA polymorphisms in the promoter region were identified.
One of the polymorphisms in the promoter region（g.-1723 bp A＞C）was selected for
association study between genotypes and economic traits, which was suggested to be boundby transcription factors influencing on muscle or adipose differentiation. The g.-1723 bp A＞C
had a significant effect on C16：1（p＝0.0187）and A/A type indicated 0.7％ higher percentage
of C18：0 than C/C type. These results suggest that the MMP14 g.-1723 bp A＞C is a usefulgenetic marker for breeding in beef cattle.

１．目（Ｃ18：１）やパルミトレイン酸（Ｃ16：１）等的の一価不飽和脂肪酸の含有率が増加すると食肉の日本を代表する肉用牛である黒毛和種はその脂食味性が向上すると言われており，より質の高い肪交雑能力の高さから世界中で高く評価されてい牛肉を作出するためには筋肉内脂肪の一価不飽和る。脂肪交雑は食肉の霜降りの度合いを示し，枝脂肪酸含有率を高めることが有効である。

肉単価を決めるうえで最も重要な指標の一つであ

一般に枝肉形質は飼料や性など様々な要因による。しかしながら，霜降りの度合いが高すぎるとる影響を受けるが，脂肪酸組成は飼養管理や季

むしろ食味性が低下してしまうため，近年脂肪交節，月齢等の環境要因に加え，品種や種雄牛の効雑に代わる新しいおいしさの指標が模索されてい果等の遺伝的要因にも大きく影響される。したる。その一つとして，脂肪の質に影響する形質でがって，脂肪酸組成の改良では遺伝学的アプロー

ある脂肪酸組成が注目を集めている。オレイン酸

チが有効である。そこで，我々は先行研究におい© The Ito Foundation

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索

141て網羅的遺伝子発現解析を用いた脂肪酸組成に関東京）によりその組成（Ｃ14：０，Ｃ14：１，Ｃ

与する新規遺伝子の同定を試みた 。その結果，

16：０，Ｃ16：１，Ｃ18：０，Ｃ18：１，Ｃ18：

ACACAやELOVL5，FADS2，MMP14等の遺伝２）を測定した。

１）

子が脂肪酸代謝に関与する新規候補遺伝子として2.2浮上した。これらのうちACACA，ELOVL5，

ウシMMP14遺伝子（AC_000167.1）の各エク

FADS2の各遺伝子ではプロモーター領域においソンを含むDNA領域をPCR法により増幅させるてDNA多型が同定され，これらの多型は脂肪酸

プ ラ イ マ ー セ ッ ト を Oligo7（Molecular Biology

組成を含む複数の枝肉形質に効果を持つことが明Insights, Vondelpark, CO） に よ り 作 製 し た 。

らかにされた。したがって，この遺伝子発現

PCR 酵 素 に は Go-Taq Ⓡ （Promega Corporation,

解析でスクリーニングされた遺伝子群は，脂肪酸

Madison, WI）を使用した。プライマー配列およの不飽和化に関連する有力な候補であると考えら

び PCR 条 件 は Table １ に 示 し た 。ま た ，ヒ トれる。

MMP14遺伝子ではプロモーター活性を持つDNA

２～４）

多型探索

ウシMMP14（matrix metallopeptidase 14）遺領域がすでに明らかにされている５）。この領域と伝子は第10番染色体上に位置する10個のエクソン高い相同性を持つウシMMP14遺伝子の上流領域から構成される8,480bpの遺伝子であり，コラー

約２kbp（－2057～＋186）を本遺伝子のプロモーゲン等の細胞外基質の分解を行う膜結合型メタロ

ター領域とみなし，プライマーセットを作製したプロテイナーゼをコードする。本遺伝子は血管新（Table１）。

生や骨形成，脂肪細胞の分化等様々な生体機構の得 ら れ た PCR 産 物 は Exo-sapIT（affimetrix,

調節に関与するが，枝肉形質との関わりは不明でCleveland, OH）を 用 い て 精 製 し た 。精 製 し たある。本研究ではこのMMP14遺伝子を対象とし，PCR 産 物 は BigDye Terminator v3.1 （Thermo

新規DNA多型の探索およびその経済形質に対す

Fisher Scientific, Wilmington, DE） で 蛍 光 標 識る効果を検証した。

し ， ABI 3500xl （Thermo Fisher Scientific） に

２．方
2.1

より塩基配列決定した。この反応にはPCR増幅に法用いたものと同じプライマーを使用した（Table

供試動物

１）
。鋳型になるPCR産物を５’末端と３’末端の両平成14年から平成26年の間全国の牧場で肥育され，現場後代検定に供せられた黒毛和種487個体

方向から塩基配列決定することで実験の正確性を評価した。

をサンプルとして用いた。多型探索はこれらのう

塩基配列決定により得られたデータはChromas

ちから家系に偏りがないように選出した８個体をにより可視化し，ClustalWを用いて比較するこ対象とした。DNA抽出はこれら個体の筋肉からとで多型探索を行った。CDS領域で同定した多型

フェノールを用いて実施した。枝肉形質（枝肉重についてはEMBOSS Transeqによりアミノ酸置量，ロース芯面積，ばら厚，皮下脂肪厚，推定歩換の有無を確認し，mRNA二次構造への影響を

留，BMS）は社団法人日本食肉格付協会の格付

Visual Gene Developerにより評価した。プロモーにより評価された格付値を用いた。また，定法にター領域で同定した多型については，転写因子結

従い脂肪組織より脂肪酸を抽出・メチル化し，ガ合配列への影響をALGGEN-PROMOを用いて予

スクロマトグラフGC4000（ジーエルサイエンス，

測した。

© The Ito Foundation

142

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table１ Oligonucleotide primers used for sequencing
Target region

Primer（5’→3’）

Tm（℃）

Size (bp）Exons2，3

F：TTCTTCCAGACCCACTGCCA
R：CGTGATGTGAGAAAGGCCGC

60

720

Exon4

F：AGAAGTGCCGGGTCAGACAA
R：AGTTCCAGCGAGGGTTGTGT

60

770

Exon5

F：TACATCTGGTCCCTTCTCTCGC
R：CGGTGTCAAAGTTCCCATCACA

60

930

Exon6

F：TCTGCTGCTTGTCTCCTCCA
R：GTTACAGTCCACGGGGTTGC

60

547

Exons7，8

F：TGAAGTCGCTTAGTCGTGTCCA
R：AGTGCCTTCTTCAGGGAGACAT

62

734

Exon9

F：TGGTGAATCCAGTCCCAGGT
R：TCTCGGTCTTTCGTCCTGCT

58

274

Exon10

F：TGGTGCTATAGTTACCCGGCTR：CAAGTGCAGAGCCCAGACATT

60

811

Promoter（－2057～－1184）

F：AAGAACGGGCTATAAAACCACTG
R：ACAGAAAAGTTGACCATCAGCAA

60

874

Promoter（－1201～－384）

F：GATGGTCAACTTTTCTGTCTCCC
R：CCTAAATTGCCTTTCTGTGGTGG

60

818

Promoter（－492～＋186）

F：TGCTTAGAAGGAAAAAGTGTCCC
R：TCCGATCCGGGGCTGCTCTCTCG

60

679

F：forward primer；R：reverse primer

2.3

遺伝子型判定JMP7（SAS Institute, Cary, NC）を 用 い て 分 散

g.-1723 bp A＞C多型に対し，PCR-RFLP法に分析を行い，各効果の最小自乗平均値に対してよ る 遺 伝 子 型 判 定 を 行 っ た 。こ の 多 型 を 含 む

Tukey-Kramerの有意差検定を実施した。分析モ

DNA 領 域 は 5’-TGGCAAGAAAATACTATCA

デルには遺伝子型の他，屠殺月齢および性の要因

GTTTTCCT-3’ お よ び 5’-ATGGGAGTCGGGAAを加えた。解析集団では種雄牛の偏りが少なかっ

ATCTGG-3’のプライマーセットで増幅させた。

たため，この効果は分析モデルから除外した。

PCR反応は95℃で２分熱変性させた後，熱変性（95℃，30秒），アニーリング（60℃，30秒），伸
長反応（72℃，30秒）を40サイクル行った。得られ た PCR 産 物（189bp）は AluI（New England

３．結果と考察3 . 1 ウシMMP14遺伝子における新規DNA多型の同定

Biolabs, Ipswich, MA）により制限酵素処理した。

塩基配列決定の結果，CDS領域において２個のg.-1723 bp A＞C多型のＡ型を持つPCR産物は認

新規DNA多型（g.5176 bp C＞T，g.7096 bp C＞

識されず，Ｃ型を持つPCR産物からは149bpおよT）を同定した（Fig. 1a，b）。g.5176 bp C＞T多

び40bpの制限酵素処理産物が生じることが予想型ではいずれの対立遺伝子も第192番目のアミノされた。

酸がアスパラギン酸となることが予想されたた

2.4

め，この塩基配列の変化はMMP14タンパク質の統計解析

遺伝子型が枝肉形質と筋肉内脂肪における脂肪機能や構造には影響しないと考えられた。また，酸組成に及ぼす効果について検討するため，

g.7096 bp C＞T多型においても，いずれの対立遺© The Ito Foundation

143

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索

a

F

D

G

TT CG ACGG C

F

D

G

TT CG ATGG C

b

F

D

E

F

D

E

TTT G ACG AA

TTT G ATG AA

d

c

e

CAG ATAG ATGG CCC

AATAG TTTAA GAATAAAA GG

CAG ATAG CTGG CCC

AATAG TTTT AA G AAATAAA GGG

Fig. 1 Identification of DNA polymorphisms in bovine MMP14 gene.

Sequence comparison revealed two silence mutations, g. 5176 bp C＞ T（a）and g.

7096 bp C＞ T（b）, in the CDS and three DNA polymorphisms, g.-1723bp A＞ C（c）,g.-871bp-＞ T（d）and g.-831bp A＞ G（e）,in the promoter region.

伝子も第390番目のアミノ酸がアスパラギン酸にnot shown）。

なることが予想された。サイレンス突然変異でプロモーター領域では３個の新規DNA多型

あってもmRNA二次構造に影響を与える可能性（g.-1723bp A＞C，g.-871bp-＞T，g.-831bp A＞があり，タンパク質の翻訳効率やmRNAの安定

G）が 同 定 さ れ た（Fig. 1c-e）。g.-1723bp A ＞ C

性に関与することがある。しかしながら，CDS領

多型のＡ型ではYY１およびNF-InsE2/3の各転域で同定した２個のDNA多型ではいずれのディ

写因子が結合する可能性があり，Ｃ型ではCP2，

プロタイプにおいてもmRNAの二次構造に大きNF-1，CREMtaw，E12，myogeninおよびMyoD

な違いはなく，これらの多型はmRNAの二次構の各転写因子の結合が予想された（Fig. 2a）。g.-

造に影響を及ぼさないことが示唆された（data871bp-＞Ｔ多型は１塩基の挿入であり，-873か© The Ito Foundation

144

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

b

a

c

Fig. 2 Putative transcription factor biding sites in the MMP14 promoter region.

Three DNA polymorphisms, g.-1723bp A＞C（a）, g.-871bp-＞T（b）and g.-831bp A＞G（c）,

were predicted to alter the bindings of transcription factors.

ら-871の位置に存在する３個のＴ塩基が４個に増枝肉形質および脂肪酸組成に対する効果を分散分加する多型である。Ｔ塩基が３個の場合はBR-

析により調べた。その結果，g.-1723bp A＞C多CZ3が，４個の場合はGT-１がそれぞれ結合する型はＣ16：１含有率に対する有意な効果（p＝可能性がある（Fig. 2b）。g.-831bp A＞G多型で0.0187）を持つことが認められた（Table２）。こは，Ａ型ではDEF：GLO：SQUAおよびHELIOSの効果を詳細に検討するため，遺伝子型ごとにＣが ， Ｇ 型 で は PUR alpha, PUR beta, EIIaE-A,

16：１含有率の最小自乗平均値を比較した。A/

R2 ，お よ び COE ２ の 結 合 が 予 想 さ れ た（Fig.

A型は4.22％，A/C型は4.11％，C/C型は3.52％だっ2c）。これら転写因子が遺伝子発現に及ぼす影響

た。A/A型とC/C型の間には有意差（p＜0.05）

は不明だが，g.-1723bp A＞C多型のＡ型で結合が確認され（Table３），g.-1723bp A＞C多型がＣが予想されたYY１は脂肪細胞の機能に関わる転16：１含有率に対するDNAマーカーとして活用

写因子の一つである。また，本多型のＣ型で結合可能であることを示唆した。

が予想されたmyogeninおよびMyoDは筋肉細胞の分化を制御することで知られる転写因子であ

４

要

約

る。これらの転写因子は肉質に影響する可能性が日本を代表する肉用牛である黒毛和種はその高あるため，g.-1723bp A＞C多型を以降の解析にい脂肪交雑により高く評価される品種だが，近年供した。

では新たな改良指標として脂肪酸組成が注目され

3 . 2 g.-1723 bp A＞C多型が枝肉形質およびている。一価不飽和脂肪酸の含有率の増加は食肉の食味性向上につながり，その改良には遺伝学的

脂肪酸組成に及ぼす効果
PCR-RFLP法によるg.-1723bp A＞C多型の遺アプローチが有効であるとされている。本研究で伝子型判定の結果，黒毛和種集団487個体のうちは脂肪酸代謝に関与する新規候補遺伝子の一つ

A/A型の個体が400個体，A/C型が78個体，C/C

MMP14遺伝子に対する多型探索および同定した型が９個体だった。したがって，遺伝子型頻度はDNA多型の経済形質に対する効果の検証を行っ

A/A型が0.82，A/C型が0.16，C/C型が0.02であり，た。その結果，CDS領域において２個のサイレン

対立遺伝子頻度はＡアリルが0.90，Ｃアリルが0.11

ス突然変異，プロモーター領域において３個のだった。このDNA多型の黒毛和種集団におけるDNA多型を同定した。プロモーター領域で同定© The Ito Foundation

145

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索
Table 2 Comparison of carcass traits and fatty acidcomposition between genotypes of the g.-1723 bp
A＞C

Trait

g.-1723 bp A＞C

Carcass traits

ns

Carcass weightns

Rib-eye areans

Rib thickness

ns

Subcutaneous fat thickness

ns

Yield estimate
Beef marbling score

ns
ns

Fatty acid composition

ns

Ｃ14：0

ns

Ｃ14：1

ns

Ｃ16：0
Ｃ16：1

ns
＊

Ｃ18：0
Ｃ18：1
Ｃ18：2

ns
ns
ns

＊p＜0.05；ns（non-significant）

Table 3 Effect of the g.-1723bp A＞C on fatty acid composition
g.-1723bp A＞C
Trait

A/A（n＝400）

A/C（n＝78）

C/C（n＝９）

Ｃ16：1（％）

4.22±0.05ａ

4.11±0.09a, b

3.52±0.25ｂ

Values are expressed as means with standard error by least squares estimates．
a, bMeans with different superscripts differ significantly at p＜0.05（Tukeyʼs HSD analysis）．

した多型のうちg.-1723 bp A＞C多型は肉質に影響し得る転写因子が結合することが予想されたため，本多型が枝肉形質および脂肪酸組成に及ぼす効果を分析した。g.-1723 bp A＞C多型はＣ16：１含有率に対する有意な効果（p＝0.0187）を持ち，A/A型はC/C型よりは0.7％含有率が増加することが確認された。以上より，MMP14遺伝子のg.-1723 bp A＞C多型はDNAマーカーとして活用可能であることが示唆された。
文献１） 松本大和，小栗佑介，水野雄仁，石田孝史，小林郁雄，祝前博明，齋藤邦彦，笹子奈々恵，小林栄治，
久下志朗，本多健，笹崎晋史，大山憲二，万年英之：
黒毛和種の背最長筋を用いた網羅的遺伝子発現解析，
動物遺伝育種研究，41（1），７～14，2013．
２） Matsumoto, H., Sasaki, K., Bessho, T., Kobayashi,E., Abe, T., Sasazaki, S., Oyama, K., Mannen, H.：
The SNPs in the ACACA gene are effective on fatty
acid composition in Holstein milk, Molecular Biology
Reports，39（9），8637～8644，2012．
３） Matsumoto, H., Shimizu, Y., Tanaka, A., Nogi, T.,
Tabuchi, I., Oyama, K., Taniguchi, M., Mannen, H.,
Sasazaki, S.：The SNP in the promoter region of thebovine ELOVL5 gene influences economic traits
including subcutaneous fat thickness, Molecular
Biology Reports，40（4），3231～3237，2013．
４） Matsumoto, H., Nogi, T., Tabuchi, I., Oyama, K.,
Mannen, H., Sasazaki, S.：The SNPs in the promoter
regions of the bovine FADS2 and FABP4 genes areassociated with beef quality traits, Livestock
Science，163，34～40，2014．
５） Lohi, J., Lehti, K., Valtanen, H., Parks, W. C.,
Keski-Oja, J.：Structural analysis and promoter
characterization of the human membrane-type matrix
metalloproteinase-1 （MT1-MMP）gene, Gene， 242（1-2），75～86，2000．

© The Ito Foundation

146

リキッドバイオプシーによる非侵襲的牛体外受精胚の遺伝子スクリーニング
Non-invisible genetic screening of in vitro fertilized bovine embryos byliquid biopsy

杉

村

智

史

（東京農工大学大学院グローバルイノベーション研究院）

Satoshi Sugimura（Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology）

Preimplantation genetic screening is widely used for sexing and breeding. A disadvantageof the genetic screening is that it requires biopsy of the embryo, which may affect embryo
viability because of inevasible method. Here we tried to detect in vitro fertilized（IVF）bovine
embryo derived DNA from the spent medium as noninvasive genomic screening. G-TL
medium which is human embryo culture medium was suitable for single bovine IVF embryo
culture. Whole genome amplification（WGA）with optimized PEP-PCR was effective forsimple detection of trace DNA. The DNA purified from spent medium was amplified by WGA,
and as a result, bovine specific sequence was detected from the medium. The method may
allow genetic screening including sexing and breeding applicability with noninvasiveness incattle production.

１．目

省の「酪農及び肉用生産の近代化を図るための基的本方針」にも示されている。しかし，性選別精液

乳用後継牛の激減により，生乳生産量が減少しを利用した場合，選別による精子生存性へのダている。他方，和牛繁殖農家戸数の減少により和メージにより人工授精の初回受胎率が30％程度で牛素牛価格が高騰しており，その生産性拡大が急あること，また，限られた個体に由来する性選別務となっている。そのため，生乳生産を行う雌牛

精液のみの使用に限られることなどが問題となっ（乳用後継牛）を計画的に確保しつつ，和牛繁殖ている。一方で，受精卵移植における性の人為的

雌牛や肥育用の和牛子牛（素牛）も増産する必要制御として，マイクロマニピュレーターを用いてがある。これらの課題を解決する既存の方法とし胚の一部を切除／分離し性を判別する方法があげて，乳牛に雌の性選別精液を人工授精して後継牛

られる１）。この方法では細胞からDNAを単離しを生産しつつ，性選別精液を人工授精しない残り

性特異的遺伝子をPCR等で検出することで性を特の乳牛群には和牛受精胚を移植することで和牛生定している。また，この方法を用いることで，性産する方法が試みられている。これは，農林水産

判別のみならず将来経済的損失が危惧される遺伝© The Ito Foundation

リキッドバイオプシーによる非侵襲的牛体外受精胚の遺伝子スクリーニング

147

的不良形質や，経済的に重要視されている遺伝型

2.4を胚移植前に予知することが可能となる。しかしPEP-PCRにより全ゲノム増幅を行った。トーながら，胚の一部を切除もしくは分離することでタ ル 10µl に な る よ う に ラ ン ダ ム プ ラ イ マ ー，

移植後の生育や出生後の状態に負の影響を与える

DNAポリメラーゼ，dNTPを含む反応ミックスことが示唆されているほか，マイクロマニピュに加え，サーマルサイクラーによりPCRを行った

レーターといった特殊機器や熟練技術が必要なこ（92℃１分，37℃２分，55℃４分を55サイクル）。

PEP-PCRとからその実用化・普及には至っていない。本研

2.5

究では，マイクロマニピュレーターを用いず，かPEP-PCR産物を鋳型としてBovine1.715サテラ

つ，胚を一切傷つけず，牛体外受精胚の遺伝子をイトDNA配列をプライマー（Ｆ：5ʼ-TGGAAGC

スクリーニングする新技術を開発する。すなわ

AAAGAACCCCGCT-3，Ｒ：5ʼ-TCGTCAGAAA

ち，体外発生過程で胚から培地中に放出された

CCGCACACTG-3ʼ）としたPCRを行った。反応cell free DNAを採取し，その遺伝情報を解析す

条件は以下のとおりである。96℃３分の後，95℃る技術を開発することを目的とする。

１分，58℃１分，72℃0.5分を33サイクル。PCRを電気泳動を行いウシ特異的配列の検出を行った。

２．材料・方法
2.1

PCRとウシ特異的配列の検出

2.6

胚の培養

統計解析

胚盤胞形成率の統計解析には分散分析を用い，食肉処理場由来卵巣から卵丘細胞卵子複合体（COCs）を採取した。COCsは５％牛血清および0.1IU/ml卵胞刺激ホルモン添加HEPES-TCM199

post-hocテストにはTukey-Kramer法を用いた。
３．結果・考察で20―22時間培養した。BO液により体外受精後，3.130µlヒト用胚発生培地（G-TL, Global（GLB），

単一培養の最適化を行うため，培養液の種類をSAGE 1 step medium（S1S），NAKA IVF medium

検討した。通用，牛胚の培養には，牛血清や牛血ONESTEP medium（OSM））で７日間培養した

清アルブミンが含まれるため，培地由来の牛核酸（38.5℃，５％CO２，5％Ｏ２，90％Ｎ２）。

のコンタミを防ぐため，市販されている４種類の

2.2

実験１

ヒト用発生培地を用いた。結果，胚盤胞への発生

受精胚からのDNA抽出

PCRチューブ１つに対し体外受精胚１つ，全液率はG-TL：40％，GLB：35.6％，SIS：27.5％，

量５µl，Proteinase K0.8％，Triton X-1000.5mg/

OSM：32.5％と有意差はないもののG-TL区で最mlとなるように調整し，37℃20分，90℃7.5分でも胚盤胞への発生が高かった。牛用血清含発生培処理した。解析まで－80℃で保存した。

地で培養した場合の胚盤胞形成率が34.2％だった

2.3

ことから，市販されているヒト用発生培地が牛受培養液からのDNA精製

Cell free DNAは断片化された状態で放出され精卵の単一培養に適していることを示唆しているる。そこで，小さいゲノム情報を持つウイルスの（Fig.１）。以降の実験ではG-TLを発生培地に用DNA精製に適したQIAmp MinElute Virus Spin

いることとした。

Kitを用いた。解析まで－80℃で保存した。

3.2

実験２

PEP-PCRの最適化を行うため，１胚盤胞由来
DNAを用いてマグネシウム濃度を検討した。結© The Ito Foundation

胚盤胞形成（％）

148

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）50

侵襲的に牛体外受精胚の遺伝子情報をスクリーニ

40

ングできる可能性が示された。これまで，ヒト胚を用いた研究でのみ，受精胚培養の培地からの30

cell-free DNA解析が成功していた２，３）。今回の成20

果はヒト以外の動物種では初めての成果である。

10

今後は今回開発した手法を用いて性判別，遺伝性

0

a
1a

R

C

G

TL

LB

G

S
S1

疾患，染色体異常の診断を行っていく予定である。
SM

O

４．要

Fig. 1 異なる発生培地を用いたウシ体外受精胚の発生率

約

牛受精胚の培養後の培養液からウシ特異的配列の検出に成功した。今後は，この技術を性選別，発生培地

ゲノム育種，遺伝性疾患の検出，染色体異常の検出に応用していく予定である。

Fig. 2 受精卵培養後の発生培地から検出されたウシ特異的配列

果，2.2mMでもっとも増幅効率が高かった。最適化した全ゲノム増幅法により１割球より抽出したDNAを増幅させ，ウシ特異的配列（Bovine1.715）の検出を行ったところ，ウシ特異的配列が検出さ
れた。
3.3

実験３

続いて，牛受精胚の単一培養後の培養液からのDNA精製と得られたDNAの全ゲノム増幅を試みた。WGAは研究１で最適化した方法を用いた。
その結果，解析したすべての培地中からのウシ特異的配列の検出に成功した（Fig.２）。

文献１） Hirayama, H., Kageyama, S., Moriyasu, S., Hirano,T., Sugimoto, Y., Kobayashi, N., Inaba, M., Sawai, K.,
Onoe, S., Minamihashi, A.：Genetic diagnosis of
claudin-16 deficiency and sex determination inbovine preimplantation embryos, J Reprod Dev，50，613～618，2004．
２） Vera-Rodriguez, M., Diez-Juan, A., JimenezAlmazan, J., Martinez, S., Navarro, R., Peinado, V.,
Mercader, A., Meseguer, M., Blesa, D., Moreno, I.,
Valbuena, D., Rubio, C., Simon, C.：Origin andcomposition of cell-free DNA in spent medium fromhuman embryo culture during preimplantation
development, Hum Reprod，33，745～756，2018．
３） Xu, J., Fang, R., Chen, L., Chen, D., Xiao, J. P.,
Yang, W., Wang, H., Song, X., Ma, T., Bo, S., Shi, C.,
Ren, J., Huang, L., Cai, L. Y., Yao, B., Xie, X. S., Lu,
S.：Noninvasive chromosome screening of humanembryos by genome sequencing of embryo culture
medium for in vitro fertilization, Proc Natl Acad Sci
USA，113，11907～11912，2016．

以上，受精胚養後の発生培地を用いることで非© The Ito Foundation

149

肉用鶏の筋芽細胞を用いた食肉の特性評価に資する遺伝子の探索Exploration of the genes to assess meat characteristics using skeletal
muscle myoblasts from meat-type chickens

高

谷

智

英・鏡

味

裕

（信州大学農学部）

Tomohide Takaya and Hiroshi Kagami（Faculty of Agriculture, Shinshu University）

Skeletal muscle tissues of broiler chickens rapidly develop and grow compared with thoseof layer chickens. Myoblasts which are myogenic progenitor cells play central roles during
muscle development and growth, suggesting that the cell characteristics of broiler myoblasts
are critically important for meat production. Thus identification of the genes which are
specifically expressed in broiler myoblasts will be useful as genetical markers for selective
breeding, improving feed efficiency, and quality evaluation of the meat. In this study, we
compared cell growth, myogenic differentiation, and gene expression of the primary-cultured
myoblasts between UK Chunky（UKC）as broiler chicken and White Leghorn（WL）as layer
chicken. In growth medium, the numbers of UKC myoblasts were significantly larger than WL
myoblasts after 48 h of culture. And the ratio of proliferating EdU-positive cells weresignificantly higher in UKC myoblasts than WL myoblasts. In differentiation medium, the ratioof myosin heavy chain-positive myocytes and myotubes were significantly higher in UKC
myoblasts than WL myoblasts. These results clearly indicated that UKC myoblasts possess
remarkable capabilities of cell proliferation and myogenic differentiation compared with WL
myoblasts. It suggets taht such cell characteristics of UKC myoblasts actively contribute to thewell-developed skeletal muscle of broiler chickens. To explore the genes specifically expressedin broiler myoblasts, comprehensive gene expression patterns of UKC and WL myoblasts at
day 0, 1, and 2 in differentiating conditioin were analyzed by RNA sequencing. We successfully
identified the genes differentially expressed between UKC and WL myoblasts; 640 genes at day
0, 608 genes at day 1,677 genes at day 2. Notably, expression patterns of 336 genes wereconsistently different throughout differentiation process. Functional analyses of these geneproducts will elucidate the mechanism how broiler myoblasts actively proliferate anddifferentiate.

© The Ito Foundation

150
１．目

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

探索したので，その結果を報告する。

的

近年，特に開発途上国では，人口増加に加えて

２．方法

一人当たりの食肉消費量が著増しており，世界的

2.1

鶏筋芽細胞の初代培養と筋分化誘導

な食肉需要が高まっている。肉用鶏の飼料効率

鶏筋芽細胞の採取，初代培養，および筋分化誘（0.5）は，肥育豚（0.3）や肥育牛（0.1）と比較

導は，高谷らの方法を用いた １）。肉用鶏としてして非常に高い。徹底した育種改良により，過去

UK Chunky 種 （UKC）， 卵 用 鶏 と し て White

50年間で肉用鶏の成長率は１日25ｇから100ｇにLeghorn種（WL）を用いた。孵卵器で培養した上昇した。安価で良質なタンパク質であり，宗教

鶏の10日胚の後脚の骨格筋組織を摘出し，コラゲ的な禁忌も少ない鶏肉は，過去40年で最も高い生

ナーゼ処理によって分散させた筋芽細胞を，コ産量増加率を示している。日本国内の鶏肉生産量

ラーゲン処理した培養皿に播種し，37℃，５％も，消費者の国産志向などを反映して増加傾向で

CO２条件下で培養した。増殖中の未分化な筋芽細推移している。ところが，日本で市販されている胞は，増殖培地（RPMI1640培地，20％牛胎児血

鶏肉の約98％はブロイラーであり，その原種鶏は清，１％非必須アミノ酸，１％鶏胚抽出物，２

ほぼ100％を輸入に依存している。鶏肉の安定供

ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子）で培養した。

給という点で我が国は危機的状況にあり，有用な増殖培地で培養中の筋芽細胞を分化０日目と定義

国産鶏（地鶏）の開発が喫緊の課題である。

した。2.0×10５個の筋芽細胞を，コラーゲン処理

加えて，先進諸国では，健康意識の高まりと嗜し た 30 mm 径 の 培 養 皿 に 播 種 し ，分 化 培 地

好の多様化から，高付加価値の鶏肉が求められて（DMEM培地，２％牛胎児血清）で培養することいる。地鶏はその代表例であり，多彩な品質を謳

で筋分化を誘導した。

う様々な品種が提供されている。しかし，これら

2.2の鶏肉＝鶏骨格筋の遺伝的な特性を厳密に評価す

DAPI染色により筋芽細胞の核を染色した。骨る方法は確立されていない。筋肉組織の特性は，格筋の最終分化マーカーであるミオシン重鎖の染飼料・飼育環境・個体の生育段階による後天的な色は以下の方法で行った。筋芽細胞を２％パラホ

影響を受けるため，各品種に固有な特性を明確に

ルムアルデヒドで固定し，0.2％Triton溶液で透抽出するのは困難である。

過処理した後，マウスモノクローナル抗ミオシン

細胞組織化学染色

そこで本研究では，骨格筋の前駆細胞である筋

重鎖（MHC）抗体（MF20）で蛍光免疫染色し芽細胞に着目した。筋芽細胞は細胞分裂によってた。ミオシン重鎖陽生細胞の核の数を，すべての増殖した後，筋細胞へと分化する。分化した筋細核の数で除した値を，ミオシン重鎖陽性細胞率と胞は互いに融合して多くの筋管を形成し，筋管がして計測し，筋分化の指標とした。

さらに成長・融合して骨格筋線維が形成される。

筋芽細胞の増殖は，チミジンのアナログである

したがって，筋形成において中心的な役割を果た

EdUの取り込みによって評価した。10 µMのEdU

す筋芽細胞の遺伝子発現パターンは，鶏肉の特性

で３時間処理した筋芽細胞をClick-iT EdU Alexaと密接な関係があると考えられる。

Fluor Imaging Kit（Thermo）で染色し，EdU陽本研究では，肉用鶏と卵用鶏から採取した筋芽性細胞率を計測した。

細胞を用い，肉用鶏で特徴的に発現する遺伝子を© The Ito Foundation

151

肉用鶏の筋芽細胞を用いた食肉の特性評価に資する遺伝子の探索

2.3

RT-PCR（Fig.１）。また，細胞分裂に伴うゲノムDNAの複

Trizolを用いて筋芽細胞のRNAを回収した。

製の指標であるEdU陽性率は，UKC筋芽細胞でReverTra Ace qPCR RT Master Mixを用いて，49％であり，WL筋芽細胞の35％を有意に上回っRNA を 逆 転 写 し ，cDNA を 合 成 し た 。GoTaq

た（Fig.２）。これらの結果から，UKC筋芽細胞

qPCR Master Mix（Promega）を 用 い て ，定 量はWL筋芽細胞と比較して活発に細胞分裂をし，的 PCR を 行 っ た 。PCR 反 応 に は StepOne Real-

増殖することが明らかになった。

Time PCR System （Applied Biosystems） を 用

次に，分化培地でUKC筋芽細胞とWL筋芽細胞

いた。PCR産物は，アガロースゲル電気泳動したの筋分化を誘導し，24時間ごとに，骨格筋の最終後，エチジウムブロマイド染色によって検出した。

分化マーカーであるMHCの免疫染色を行った

2.4

RNAシーケンス（Fig.３）。分化誘導１日目および２日目において，

ため，RNAシーケンスを行った。RNAシーケン
スは，東京農業大学生物資源ゲノム解析センターとの共同研究で行った。分化０，１，
２日目の筋芽細胞からRNAを精製し，Illumina TruSeq RNA
Library Prep kit v2を用いてシーケンスライブラ
リを調整した。Illumina HiSeq 2500を用いて，シングルリードで100塩基のシーケンス反応を行った 。シ ー ケ ン ス に よ っ て 得 ら れ た 配 列 を ，Gallus_gallus-5.0 Assembly （Genebank
assembly accession：GCA_000002315.4）に マ ッ
ピングし，遺伝子を同定した。このとき，１塩基の 不 一 致 を 許 容 し た 。 Trimmed mean of M

Number of myoblasts（×10^4 cells）

筋芽細胞で発現する遺伝子を網羅的に定量する

**

50
40
30

**

20

WL

*

10
0

UKC

0h

24h

48h

72h

96h

Fig. 1

Number of UKC and WL myoblasts cultured in growth

medium. Graphs represent mean±SD．＊p＜0.05，＊＊p＜0.01. n＝３．

values正規化によってシーケンスのリード数を正60

規化し，発現量を算出した。発現量が２倍以上*

50（p＜0.05）変動している遺伝子を抽出し，解析をEdU+ cells (%)

行った。
３．結果と考察3 . 1 肉用鶏と卵用鶏の筋芽細胞の増殖・分化
能の比較

40
30
20
10

肉用鶏UKCと卵用鶏WLの筋芽細胞を増殖培地0で培養し，24時間ごとの細胞数を計測した。培養
48時間後には，UKC筋芽細胞の数はWL筋芽細胞の1.7倍（p＜0.05）に達し，96時間後に至るまで，
UKC筋芽細胞数はWL筋芽細胞を有意に上回った

WL

UKC

Fig. 2Ratio of EdU-positive UKC and WL myoblasts cultured

in growth medium. Graphs represent mean ± SD ． ＊ p ＜0.05. n＝４．

© The Ito Foundation

152

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）
40

50

*
Fusion index (%)

MHC+ myocytes (%)

40
30
20

*

10
0

Day 0

Day 1

20

□ WL
■ UKC

10

0

Day 2

*

30

*

Day 0

Day 1

Day 2

Fig. 3Ratio of MHC-positive myocytes （left panel）and fused myotubes （right panel）derived from UKC

and WL myoblasts at day 0, 1, and 2 in differentiation medium. Graphs represent mean±SD．＊p＜0.05.
n＝４.

UKC筋芽細胞のMHC陽性率はWL筋芽細胞を有本研究では，多様な外来因子を認識して免疫反意に上回った。また，成熟した多核の筋管の割合

応を誘導するToll様受容体（Toll-like receptor；を示す細胞融合率も同様に，分化誘導１日目およTLR）遺伝子群の発現を解析した。鶏には10種

び２日目において，UKC筋芽細胞で有意に高い

類のTLR遺伝子（TLR1A，TLR1B，TLR2A，値を示した。これらの結果から，UKC筋芽細胞

TLR2B，TLR3，TLR4，TLR5，TLR7，TLR15，はWL筋芽細胞と比較して高い筋分化能を示すこTLR21）が 存 在 す る ２）。RT-PCR の 結 果（Fig.

とが分かった。

４），WL筋芽細胞ではすべてのTLR遺伝子が発以上のことから，WL筋芽細胞と比較して，現しているが，UKC筋芽細胞ではTLR1Aの発現

UKC筋芽細胞は活発な細胞分裂によって急速には検出されなかった。免疫細胞を多数含む脾臓組

増殖した後，速やかに成熟した筋管に分化するこ織からRNAを抽出し，同様のRT-PCRを行ったとが明らかとなった。このようなUKC筋芽細胞

結果，UKCおよびWLの両方の脾臓ですべてのの性質が，卵用鶏の２-３倍の速度で成長する肉

TLR遺伝子が発現していることを認めた。この用鶏の骨格筋線維の形成に貢献していることが強ことから，TLR1A遺伝子は，UKC筋芽細胞でのく示唆された。

み特異的に発現が抑制されていることが明らかに

3 . 2 肉用鶏と卵用鶏の筋芽細胞におけるToll

なった。
近年，肉用鶏では，過剰に発達した筋組織内で様受容体遺伝子群の発現の比較
我々はこれまで，UKC筋芽細胞とWL筋芽細胞

生じる炎症が大きな問題となっている３）。この炎

で ，筋 芽 細 胞 特 異 的 に 発 現 す る 転 写 因 子 群症の原因には諸説あるが，発症機序の詳細は不明（PAX3，PAX7，MYF5，MYOD1，MYOGなど）である。TLRは細胞内にシグナルを伝達するこやミオシン軽鎖および重鎖（MYL1，MYL3，とで，インターロイキンなどの炎症性サイトカイ

MYH1，MYH7B）の遺伝子発現を比較してきた。

ンの放出を誘導するなど，免疫疾患に深く関与す© The Ito Foundation

153

肉用鶏の筋芽細胞を用いた食肉の特性評価に資する遺伝子の探索
TLR

１A

１B

2A

2B

3

4

5

7

15

21

Myoblasts

WL

UKC

SpleenWL

UKC

Fig. 4T otal RNAs from myoblasts and spleen of UKC and WL chickens were

subjected to RT-PCR to amplify cDNAs of TLR genes. PCR products werethen subjected to agarose gel electrophoresis.

る 受 容 体 で あ る 。本 研 究 で 明 ら か に な っ た ，た結果が真に骨格筋系の細胞に起因するものであ

UKCおよびWL筋芽細胞におけるTLR遺伝子群のるかどうかは定かではない。

発現パターンの違いが，肉用鶏の筋組織で生じる

そこで本研究では，UKCとWLの筋芽細胞にお炎症と関連しているかについて，今後の研究で明ける遺伝子発現を網羅的に比較・定量するためらかにしていきたい。

に，RNAシーケンスを行った。分化０，１，２日

3 . 3 肉用鶏と卵用鶏の筋芽細胞における遺伝目のUKCおよびWL筋芽細胞からRNAを精製した。分化誘導は独立して３回行い，各群n＝３と子発現パターンの網羅的解析
上記の実験から，UKCとWLの筋芽細胞では増した。すべてのサンプルで，各2,000万以上のリー殖・分化能が明らかに異なること，UKCとWLのドを取得した後，ニワトリゲノムにマッピングし筋芽細胞で明確に発現パターンが異なる遺伝子がて遺伝子を同定し，正規化したカウント数から遺存在することが明らかになった。このような性質

伝子発現量を算出した。

の相違は，UKCとWLの筋芽細胞で発現する遺伝発現が変動していた遺伝子を解析した結果，子群によって既定されていると考えられる。これ

UKCとWLの筋芽細胞を比較した場合，分化０日まで，肉用鶏の胸筋組織における遺伝子発現の飼目では640個の遺伝子が，分化１日目では608個の料依存的な変化を網羅的に調べたDNAマイクロ遺伝子が，分化２日目では677個の遺伝子の発現

アレイが異なることが明らかになった（Fig.５）。このや，肉用鶏と卵用鶏の胸筋組織の遺伝子４）の解析結果がウチ336個の遺伝子は，分化過程を通じてUKCと報告されている。しかし胸筋組織は，筋線維や筋WLの筋芽細胞で発現量が異なっており，両品種

芽細胞以外にも，血管，血球，脂肪，線維など多で異なる筋芽細胞の形質に重要な役割を果たして数の細胞腫を含むサンプルであり，解析で得られいることが考えられた。また，UKCとWLの筋芽発現を調べたRNAシーケンス

５，６）© The Ito Foundation

154

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

つながることが期待される。将来的には，地鶏な

UKC vs WL, day 2 (677 genes)

どさらに多数の品種の筋芽細胞における遺伝子発20029

UKC vs WL, day 0(640 genes)

195

336
80

現を調べることで，鶏の筋形成や鶏肉の品質に寄112
80

UKC vs WL, day 1(608 genes)

与する遺伝子群の立体的な理解につながると考えられる。
謝Fig. 5

Venn diagram of the number of the genes differentiallyexpressed between UKC and WL myoblasts at day 0, 1,
and 2 in differentiation condition. The genes was definedas；fold change≥2, p＜0.05, n＝３．

辞

RNAシーケンスに多大なるご協力を頂きまし
た東京農業大学の浜口悠先生，小林久人先生，河野友宏先生，そして本研究の実験で中心的な役割

細胞でそれぞれ，分化に伴って発現が変化する遺を果たしてくれた信州大学大学院の二橋佑磨君に伝子も抽出した。特に分化０日目と２日目では，心より感謝申し上げます。

UKC筋芽細胞では1,307個，WL筋芽細胞では1,204個の遺伝子の発現が変化していた。これらの遺伝子群の中には，筋分化に重要な因子が多数含まれて い る と 推 測 さ れ る 。こ れ ら を 比 較 し ，特 に
UKC筋芽細胞でのみ発現が変化する遺伝子を特定することで，UKC筋芽細胞が示す高い筋分化能力を実現している因子を特定できるのではないかと考えている。今後さらに解析を進め，UKC
筋芽細胞が有する旺盛な細胞増殖・分化能の機構を解明できれば，肉用鶏の特性検定に有用な遺伝マーカーの開発，肉用鶏の品種改良，肉用鶏の飼料要求率の改善などへの貢献が期待される。
４．要約

本研究により，肉用鶏UKCと卵用鶏WLでは，骨格筋形成で中心的な役割を果たす筋芽細胞の性質が明確に異なっていることが明らかになった。
遺伝子発現解析の結果，UKCとWLの筋芽細胞では，TLR遺伝子をはじめ，多くの遺伝子群の発現パターンが異なることが分かった。肉用鶏で特異的な発現パターンを示す遺伝子群を追及することで，鶏肉の生産に資する遺伝マーカーの確立に

文
献１） Takaya, T., Nihashi, Y., Kojima, S., Ono, T.,
Kagami, H.：Autonomous xenogenic cell fusion ofmurine and chick skeletal muscle myoblasts, Anim
Sci J，88，1880～1885，2017．
２） Temperley, N. D., Berlin, S., Paton, I. R., Griffin, D.
K., Burt, D. W.：Evolution of the chicken Toll-likereceptor gene family：a story of gene gain and geneloss, BMC Genomics，9，62～73，2008．
３） Kawasaki, T., Yoshida, T., Watanabe, T.：Simple
method for screening the affected birds withremarkably hardened pectoralis major muscles
among broiler chickens, J Poult Sci，53，291～297，
2016．
４） Kong, B. W., Song, J. J., Lee, J. Y., Hargis, B. M.,
Wing, T., Lassiter, K., Bottje, W.：Gene expressionin breast muscle associated with feed efficiency in asingle male broiler line using a chicken 44K oligo
microarray. I. Top differentially expressed genes,
Poult Sci，90，2535～2547，2011．
５） Zheng, Q., Zhang, Y., Chen, Y., Yang, N., Wang, X.
J., Zhu, D.：Systematic identification of genes
involved in divergent skeletal muscle growth rates
of broiler and layer chickens, BMC Genoics，10，87，
2009．
６） Kong, B. W., Hudson, N., Seo, D., Lee, S., Khatri, B.,
Lassiter, K., Cook, D., Piekarski, A., Dridi, S.,
Anthony, N., Bottje, W.：RNA sequencing for global
gene expression associated with muscle growth in asingle male modern broiler line compared to afoundational Barred Plymouth Rock chicken line,
BMC Genomics，18，82，2017．

© The Ito Foundation

155

県集団における和牛肉の美味しさに関わる遺伝子
マーカーの効果検証
Investigation on the effect of genetic markers on beef quality inprefectural populations of Japanese Black cattle

笹

﨑

晋

史

（神戸大学大学院農学研究科）

Shinji Sasazaki（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

In this study, we investigated the effect of the PLAG1 gene polymorphism on oleic acidpercentage（C18：1）in four Japanese Black cattle populations（JB1：n ＝ 900，JB2：n ＝ 560，
JB3：n ＝ 456，JB4：n ＝ 450）
．We genotyped the PLAG1 polymorphism（rs109231213）for four
populations and then analyzed the effects on carcass weight（CW）and C18：1. As a result,the polymorphism was significantly associated with carcass weight in four populations（P<0.001）in agreement with previous reports. In addition, it also had significant effect on
C18：1 in JB1, JB2 and JB3（P<0.05）. Turkey-Kramerʼs honestly significant difference test
revealed that qq genotype indicated higher percentage of C18：1 than QQ genotype in JB1
and JB2（1.62 and 2.23, respectively）, while the qq genotype showed lower carcass weight infour populations. These results suggested that the PLAG1 gene polymorphism would be useful
as DNA marker for C18：1 in Japanese Black population.

１．目

種において，上記のPLAG１遺伝子多型は様々な的集団において効果が認められていることから，枝PLAG1 （Pleomorphic adenoma gene 1） は 14番染色体に存在する遺伝子であり，胎児期に特に肉重量に対する責任変異であると考えられている３～５）。

多く発現し（Pendevilleら2006），細胞増殖や細一方で，PLAG１遺伝子の存在する14番染色体

胞分化に影響を及ぼす遺伝子を調節することによにおいて脂肪酸組成に対するQTLが報告されてり，牛の発育制御に関与することが知られていいる。Kawaguchiら（2018）は黒毛和種集団に対る 。このような機能によりPLAG１遺伝子は成するGWASにより14番染色体19Mb付近にオレイ長に関わる様々な形質に対する責任遺伝子としてン 酸 含 有 率（Ｃ 18 ： １）に 対 す る QTL を ６），

いくつもの先行研究で報告されている。Karimら

Kellyら（2014）はアンガスやヘレフォードなど（2011）は ，牛 の 体 長 ・ 体 高 に 関 わ る 多 型 を７品種からなる集団に対するGWASにより14番

PLAG１遺伝子内に同定している 。また黒毛和

染色体16～31MbにＣ16：０，Ｃ18：０に対する

１）

２）© The Ito Foundation

156

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

QTLを同定している７）。さらに上記のPLAG１遺目的とした。

伝子多型において脂肪酸組成との関連がいくつか

２．方報告されている。黒毛和種においてＣ16：１との法

関連が８），韓牛においてはＣ20：１との関連がそ

2.1

れぞれ報告されている 。一方，PLAG１遺伝子

PLAG１遺伝子内多型の枝肉形質と脂肪酸組成の機能面を考慮すると脂肪酸組成に直接影響を及に対する効果の検証には以下に示す４集団を用いぼすとは考えにくく，Sasagoら（2016）も脂肪た。枝肉重量，ロース芯面積，ばら厚，皮下脂肪

酸組成との関連はPLAG１遺伝子と連鎖不平衡の厚，推定歩留，BMSで構成される枝肉形質は，関係にある遺伝子によるものであると考察してい社団法人日本食肉格付協会の格付により評価される 。しかしながら上記の14番染色体における脂た格付値を用いた。各集団の表現型値の平均値は肪酸組成に対するQTLの報告や，PLAG１遺伝子

Table１に示した。DNA抽出のためと殺後に頸部多型と脂肪酸組成との関連が認められていること

筋肉組織を採取した。

９）

８）

供試動物

を踏まえると，PLAG１遺伝子周辺に脂肪酸組成2.1.1

兵庫県黒毛和種集団（JB１）に対する原因変異が存在している可能性が十分に

平成22年から24年の間に枝肉評価を受けた，兵
庫県黒毛和種集団900頭で，平均と殺月齢±標準考えられる。
そこで本研究では複数の黒毛和種集団を用いて偏差は31.83±1.37であった。と殺後に脂肪酸組成

PLAG１遺伝子と脂肪酸組成，特にＣ18：１とのの測定のため，胸最長筋の筋肉内脂肪を採取した。

関連を調査し，黒毛和種におけるＣ18：１改良の

2.1.2

宮崎黒毛和種集団（JB２）

DNAマーカーとしての有用性を検討することを宮崎県下で肥育され2006年４月～2007年10月まTable１ Summary statistics of carcass traits and fatty acid composition in four Japanese Black populations．
Trait

JB１

JB２

JB３

JB４

Mean

SD

Mean

SD

Mean

SD

Mean

SD
55.97

Carcass weight（kg）

388.3439.63

432.0646.87

446.1841.92

450.99Rib eye area（cm２）

52.50

7.06

55.44

7.31

56.07

7.44

56.27

8.58

Rib thickness（cm）

6.65

0.66

7.46

0.80

7.66

0.85

7.71

0.87

Subcutaneous fat thickness（cm）

2.36

0.67

2.38

0.70

2.38

0.69

2.87

0.79

Yield estimate（％）

73.70

1.19

74.08

1.26

74.10

1.25

73.66

1.46

BMS

5.83

0.93

6.07

1.98

6.43

2.20

6.44

2.24

2.16

0.47

2.64

0.65

2.75

0.58

2.67

0.59

Fatty acid composition（％）
Ｃ14：０
Ｃ14：１

0.98

0.24

0.89

0.35

0.93

0.24

0.88

0.30

Ｃ16：０

23.61

3.07

24.35

3.27

27.38

2.36

26.94

2.06

Ｃ16：１

4.42

0.69

2.75

0.71

3.79

0.64

3.91

0.78

Ｃ18：０

10.55

1.64

19.43

3.45

10.73

1.39

11.50

1.66

Ｃ18：１

53.32

3.50

48.00

5.20

51.90

3.31

51.71

2.93

Ｃ18：２

2.07

0.44

1.95

0.47

2.52

0.58

2.31

0.78

MUFA

60.03

3.87

51.63

5.40

56.62

3.29

56.50

3.10

SFA

37.81

3.96

46.42

5.47

40.86

3.37

41.11

3.15

© The Ito Foundation

県集団における和牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効果検証

157

でに出荷された560個体の黒毛和種集団を供試し2.4た。これらは，平均と殺月齢±標準偏差は29.10

PLAG１遺伝子内多型rs109231213の枝肉形質±1.62であった。と殺後に脂肪酸組成測定のため，および脂肪酸組成に対する効果を検証するために

腎周囲脂肪組織を採取した。

最小二乗法による分散分析（ANOVA）を行っ

2.1.3

統計解析

岐阜県黒毛和種集団（JB３）た。さらに枝肉重量とＣ18：１に関して遺伝子型

岐阜県内で飼養されている黒毛和種集団2,193に よ る 効 果 を 詳 細 に 調 査 す る た め に Tukey-

頭から血統情報および環境情報を考慮して選抜しKramer の honestly significant difference（HSD）

た456頭を用いた。平均屠殺月齢±標準偏差は検定を行った。兵庫県黒毛和種集団では遺伝子28.32±1.09であった。と殺後に脂肪酸組成測定の型，性別，種雄牛，出荷年，出荷月，と殺月齢のため，胸最長筋の筋肉内脂肪を採取した。

効果を，宮崎県黒毛和種集団では遺伝子型，性別，

2.1.4

現場後代検定牛集団（JB４）

種雄牛，と殺月齢の効果を，岐阜県黒毛和種集団

2002年から2012年に全国和牛登録協会により行では遺伝子型，と殺月齢の効果を，現場後代検定

われた現場後代検定で供された黒毛和種450頭を牛集団では遺伝子型，性別，年度，と殺月齢の効供試した。平均と殺月齢±標準偏差は28.58±1.35

果を考慮した。また屠殺月齢に関して，１次回帰であった。と殺後に脂肪酸組成測定のため胸最長および２次回帰として分散分析に加え，その効果

筋の筋肉内脂肪を採取した。

を考慮した。

2.2

脂肪酸組成測定

脂肪酸組成はクロロフォルム・メタノール法に

３．結果

よる定法に従い胸最長筋内脂肪もしくは腎周囲脂

本研究では，PLAG１遺伝子内多型rs109231213

肪組織から脂肪酸を抽出し ，メチル化後，ガスについて黒毛和種４集団（JB1，JB2，JB3，JB4）

クロマトグラフＧ-3000（HITACHI，東京）を用の遺伝子型判定を行った。ｑアリル頻度はそれぞいて脂肪酸組成（Ｃ14：０，Ｃ14：１，Ｃ16：０，

れ0.462，0.329，0.224，0.236であった。各集団にＣ16：１，Ｃ18：０，Ｃ18：１，Ｃ18：２）を測おける遺伝子型頻度，個体数および遺伝子頻度を定した。次いで脂肪酸組成から一価不飽和脂肪酸

Table２に示した。

10）含有率（MUFA），飽和脂肪酸含有率（SFA）を

４集団における枝肉形質，脂肪酸組成に対する効

計算した。
2.3

PLAG１遺伝子内多型rs109231213の黒毛和種果を検証するために，分散分析を行った（Table

遺伝子型判定PLAG１遺伝子多型において，Karimら（2011）３）。その結果，JB１では枝肉重量，ロース芯面積，によって報告された牛の体高に関するQTNはBMS ，C14 ： 0 ，C16 ： 0 ，C16 ： 1 ，C18 ： 0 ，

PCRによる増幅が困難であるため ，黒毛和種にC18：1，MAFA，SFAに対して，JB２では枝肉おいて高い連鎖不平衡（ｒ２ ＝0.998）にあること

重量，ロース芯面積，皮下脂肪厚，推定歩留，が報告されているFJX_250879多型（rs109231213）

C16：0，C18：0，C18：1，MUFA，SFAに対しを遺伝子型判定に用いた 。rs109231213について，JB３では枝肉重量，ロース芯面積，C18：1，てKarimらが行った方法（2011）と同様の方法を

C18：2，MUFAに対して，JB４では，枝肉重量，

用いて黒毛和種４集団に対して遺伝子型判定を

ロース芯面積，バラ厚，BMS，C14：0，C18：

行った 。

０に対して５％水準で効果が認められた。

２）

３）

２）

© The Ito Foundation

158

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 2 Genotype and allele frequency of PLAG1 gene polymorphism in fourJapanese Black populations．

Population

Genotype frequency（n）ＮAllele frequency

QQ

Qq

qq

Ｑ

ｑ

JB１

900

0.247
（222）

0.582
（524）

0.171
（154）

0.538

0.462

JB２

560

0.471
（264）

0.400
（224）

0.129
（72）

0.671

0.329

JB３

456

0.614
（280）

0.325
（148）

0.061
（28）

0.766

0.224

JB４

450

0.587
（264）

0.356
（160）

0.058
（26）

0.764

0.236

Table 3 Significance test of the PLAG1 polymorphism using ANOVA for carcass

traits and fatty acid composition in four Japanese Black populations．

Trait

JB１

JB２

JB３

JB４

Carcass weight（kg）＜0.0001＜0.0001＜0.0001＜0.0001

Rib eye area（cm２）＜0.0001＜0.0001

0.03410.0029Rib thickness（cm）

ns

ns

ns

0.0061

Subcutaneous fat thickness（cm）

ns

0.0027ns

ns

ns

0.0405ns

ns

0.0074ns

ns

0.0081

Yield estimate（％）
BMS
Fatty acid composition（％）
Ｃ14：０

0.0319ns

ns

0.0380

Ｃ14：１

ns

ns

ns

ns

Ｃ16：０

＜0.0001

0.0227

ns

ns

Ｃ16：１

＜0.0001

ns

ns

ns

Ｃ18：０

＜0.0001

0.0422ns

0.0003

Ｃ18：１＜0.0001

0.00280.0429

ns

Ｃ18：２

ns

ns

0.0364ns

MUFA＜0.0001

0.00130.0243ns

SFA＜0.0001

0.0024ns

ns

Table 4 Effect of PLAG1 gene polymorphism on carcass weight and C18：1 in four Japanese Black populations．
Carcass weight

Ｃ18：１

QQ

Qq

qq

QQ

Qq

qq

JB１

392.57ａ±5.16383.36ｂ±4.91

361.81ｃ±5.5152.62ａ±0.4453.53ｂ±0.4254.24ｃ±0.47

JB２437.67ａ±3.84426.11ｂ±6.35399.22ｃ±4.28

48.11ａ±0.41

48.88ab±0.46

50.34ｂ±0.68

JB３453.1ａ±2.42439.15ｂ±3.33

413.78ｃ±7.76

51.59ａ±0.20

52.32ａ±0.27

52.69ａ±0.63

JB４455.55ａ±8.84429.26ｂ±3.65

389.07ｃ±2.9051.70ａ±0.18

52.24ａ±0.2251.84ａ±0.54

a, b, c : Means with different subscript are significantly different between genotypes.

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県集団における和牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効果検証

159

さらに枝肉重量およびＣ18：１に対して，遺伝研究で用いたJB１- JB３の県集団ではすべてに

子型間における効果を詳細に調査するために

おいてＣ18：１との関連が認められたことから，

Tukey-KramerのHSD検定を行った（Table４）。

その他の県集団においてもＣ18：１との関連が認

枝肉重量においてはQQ型がqq型に比べ最小二乗

められる可能性が比較的高いと考えられる。

平均値がJB１では30.76㎏，JB２では38.43㎏，JB

Sasago ら（2016）は ，黒 毛 和 種 に お い て 本

３では39.35㎏，JB４では66.48㎏有意に高い値をPLAG１多型とＣ16：０との有意な関連を報告し示した。また，Ｃ18：１においては，qq型がQQているが，これはPLAG１遺伝子と連鎖不平衡に型に比べ最小二乗平均値がJB１では1.62％，JB２

ある他の遺伝子の影響によるものであると推察しでは2.23％有意に高い値を示した。一方で，JB３ている８）。本研究において，集団によってＣ18：ではqq型のほうが高いＣ18：１を示す傾向があ１に対する効果が異なっていたことからも，本るものの，遺伝子型間での有意な差は認められな

PLAG１多型が脂肪酸組成に対する責任変異と連かった。

鎖不平衡の関係にあることが示唆される。すなわ

４．考

ち，３つの県集団においてｐ値に差が認められた

察のは集団によって遺伝的構造が異なっており，原

本研究では，枝肉重量に関わるPLAG１遺伝子

因変異との連鎖不平衡の程度に差があるためであ多型に着目し，複数の黒毛和種集団を用いて，ると考えられる。例えばJB３において５％有意

PLAG１遺伝子とＣ18：１との関連について調査水準を満たしてはいるもののJB１とJB２に比べし，Ｃ18：１改良におけるDNAマーカーとして低い関連が認められたのは連鎖不平衡の程度が低の有用性について検討した。

いためだと考えられる。今後，原因変異が同定さ遺伝子型判定の結果，各集団内においてアリル

れれば各県におけるＣ18：１に対するより詳細な頻度に極端な偏りは認められず，本研究で用いた効果が確認され，DNAマーカーとしてのより有黒毛和種４集団はこれまでに本多型に対して選抜

用性が高まると期待される。

の影響を強く受けていないことが示唆された。こTukey-KramerのHSD検定では，枝肉重量にの結果は，これまでの黒毛和種の育種改良におい

おいてはこれまでの報告どおり４集団でQQ型がて枝肉重量に対して強い選抜が行われていないこ

qq型に比べて枝肉重量が有意に高い値を示した。

とを反映していると考えられる。

一方Ｃ18：１についてはJB１とJB２においてqq

分散分析の結果，４集団ともに枝肉重量に関し

型がQQ型に比べ有意に高い値を示した。JB３にてはこれまでの報告と同様にきわめて高い有意性

おいては有意差が認められなかったものの，アリで 関 連 が 認 め ら れ た（ｐ ＜ 0.0001）。一 方 ，Ｃ

ルの効果について同様の傾向を示した。今回調査

18：１に関しては，JB４を除く３つの県集団にした集団ではｑアリル頻度が0.224～0.462と比較

おいて関連が認められた（ｐ＜0.05）。JB４にお的低く，Ｃ18：１の増加に対して選抜に大きな余いてＣ18：１との関連が認められなかった要因と地があると考えられ，Ｃ18：１に対するDNAマー

しては，JB４は様々な県からの個体で構成されカーとして有用であることが示唆される。しかしる集団であり，PLAG１遺伝子多型とＣ18：１とながら，Ｃ18：１を増加させるｑアリルは枝肉重の関連の有無，関連の程度が各県によって異なる量を低下させる効果を示していることからＣ18：ことが要因であると考えられる。しかしながら本１に対するDNAマーカーとして利用する際には，© The Ito Foundation

160

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

枝肉重量に対する影響について配慮が必要である果からPLAG１遺伝子は，枝肉重量に対しての配と考えられる。

慮は必要であるが黒毛和種においてＣ18：１に対

本研究の結果，PLAG１遺伝子が３県の黒毛和する有用なマーカーとなり得ることが示唆された。

種集団でＣ18：１との関連が認められたことか
ら，他の県集団においても関連が認められる可能性が示唆された。また，遺伝子型間でＣ18：１に差が認められたことから，枝肉重量の低下に配慮が必要なものの，PLAG１遺伝子多型が黒毛和種の18：１改良におけるDNAマーカーの一つとして有用であることが示唆された。
５．要

約

枝肉重量の原因遺伝子として報告されている
PLAG１遺伝子について，複数の黒毛和種集団を用いてオレイン酸含有率（Ｃ18：１）に対する効果の有無を調査し，DNAマーカーとしての可能性を検討することを目的とした。対象集団として，兵庫県黒毛和種900頭，宮崎県黒毛和種560頭，
岐阜県黒毛和種456頭，現場後代検定牛450頭を供試した。これら４集団においてPLAG１多型の遺伝 子 型 判 定 を 行 い ，分 散 分 析 お よ び TukeyKramerのHSD検定によって，各集団における枝肉重量およびＣ18：１に対する効果を調査した。
遺伝子型判定を行った結果，各集団でのＱアリルの頻度は兵庫県集団で0.538，宮崎県集団で0.671，
岐阜県集団で0.776，現場後代検定牛集団で0.764であった。続いて分散分析を行ったところ，枝肉
形質では４集団ともに有意な関連が認められた（ｐ＜0.0001）。また，Ｃ18：１においては，現場
後代検定牛集団を除く３集団で有意な関連が認められ，ｐ値はそれぞれ，兵庫県集団で＜0.0001，
宮崎県集団で0.0028，岐阜県集団で0.043となった。
またTukey-KramerのHSD検定では，qq型がQQ型に比べてＣ18：１が兵庫県集団および宮崎県集団で高い値を示した。一方，岐阜県集団では遺伝
子型間での有意差は認められなかった。以上の結文献１） Voz, M. L., Agten, N. S., Van de Ven, W. J. M.,
Kas, K.：PLAG1, the main translocation target inpleomorphic adenoma of the salivary glands, is apositive regulator of IGF-II, Cancer Research ，60 ，
106～113，2000.
２） Karim, L., Takeda, H., Lin, L., Druet, T., Aeias, J.
A., Baurain, D., Cambisano, N., Davis, S. R., Farnir, F.,
Grisar,t B., Harris, B. L., Keehan, M. D., Littlejohn, M.
D., Spelman, R. J., Georges, M., Coppieters, W.：
Variants modulationg the expression of achromosome domain encompassing PLAG1 influence
bovine stature, Nature Genetics，43，405～415，2011.
３） Nishimura, S., Watanabe, T., Mizoshita, K.,
Tatsuda, K., Fujita, T., Watanabe, N., Sugimoto, Y.,
Takasuga, A.：Genome-wide association study
identified three major QTL for carcass weight
including the PLAG1-CHCHD7 QTN for stature in
Japanese Black cattle, BMC Genetics，13，40，2012.
４） Hoshiba, H., Setoguchi, K., Watanabe, T.,
Kinoshita, A., Mizoshita, K., Sugimoto, Y., Takasuga,
A.：Comparison of the effects explained byvariations in the bovine PLAG1 and NCAPG genes
on daily body weight gain, linear skeletal
measurements and carcass traits in Japanese Blacksteers from a progeny testing program, Animal
Science Journal，84，529～534，2013.
５） Takasuga, A.：PLAG1 and NCAPG-LCORL in
livestock, Animal Science Journal ，87 ，159 ～ 167 ，
2016.
６） Kawaguchi, F., Kigoshi, H., Nakajima, A.,
M a t s u m o t o , Y . ：P o o l - b a s e d g e n o m e - w i d e
association study identified novel candidate regions
on BTA9 and 14 for oleic acid percentage inJapanese Black cattle, Animal Science Journal, inpress，2018.
７） Kelly, M. J., Tume, R. K., Fortes, M., Thompson, J.
M.：Whole-genome association study of fatty acidcomposition in a diverse range of beef cattle breeds,
American Society of Animal Science，92，1895～1901，
2014.
８） Sasago, N., Abe, T., Sakuma, H., Kojima, T., etal.：Genome-wide association study for carcass
traits, fatty acid composition, chemical composition,
sugar, and the effects of related candidate genes inJapanese Black cattle, Animal Science Journal，88，
33～44，2016.
９） Kim, H. J., Aditi Sharma, Soo Hyun Lee, Doo HoLee, et al.：Genetic association of PLAG1, SCD,

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県集団における和牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効果検証
CYP7B1 and FASN SNPs and their effects on
carcass weight, intramuscular fat and fatty acidcomposition in Hanwoo steers （Korean cattle）,
Stichting International Foundation for Animal
Genetics, doi：10.1111/age.12523，2016.

16110） Folch, J., Lees, M., Stanley, GHS.：A simple
method for the isolation and purification of total
lipids from animal tissues, The Journal of Biological
Chemistry，226，487～509，1957.

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162

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索
The search for genetic polymorphisms involved in behavioral stressresponse in slow-growing meat type chickens

青

谷

大

希

（秋田県畜産試験場）

Daiki Aoya
（Akita Prefectural Livestock Experiment Station）

In this study, whole-genome sequencing of bulked DNA samples was performed in order
to discover candidate regions of behavioral stress response-related gene in slow-growing meat
type chicken “Jidori”．Blood samples and data of female Hinai-Jidori chickens previously
tested behavioral stress response were used for this study. Based on the results of the
behavioral test, individuals with high or low behavioral stress response were selected toprepare two virtual testing groups. For each group, DNA was extracted from blood samples ofindividuals, mixed in equal amount, and sequenced.
As a result of the sequence analysis, about 11,000,000 loci of variant were detected. Fromthem, variants with high impact were selected for statistical analysis. The ratio of variant bases
to total coverage depth was regarded as the frequency of variant in the group at each locus.
By chi-squared test, 6,153 loci were detected as regions with significantly different frequencies
of variant between two groups. Among these loci, 2,732 have been defined.
This research provided preliminary findings about behavioral stress response-related
gene in Jidori. However further studies on the relationship between polymorphism and stressresponse and the effects of variants on gene expression and function are necessary.

１．目

運動できることから，歯ごたえのある締まった肉的質が評価されている一方で，その育成過程におい本研究は，地鶏産業における生産性向上に資すては圧死事故の発生が大きな問題となっている。

るため，鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺そこで申請研究者は，圧死事故の発生に関与すると考えられる行動的ストレス反応性に着目し，伝子を探索する試みである。
現在，全国各地において，在来種や日本鶏を交鶏における行動的ストレス反応性の品種間差や生配に利用した地鶏が生産されている。地鶏は日本産性との関連について調査した結果，比内地鶏の農林規格等の飼養基準によって，平飼いや放し飼

初生時における行動的ストレス反応性と，その後いにより飼養することとされており，鶏が自由にの発育や悪癖（つつき；feather pecking）の発© The Ito Foundation

163

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索

生との間に有意な関連があることを明らかにした。

異なる２つの仮想の調査群を作成した。TIへの初生時のストレス反応性には，遺伝的な要因が誘導に複数回の試行を必要とし，かつ持続時間が大きく影響していると推察されるため，育種改良

短かった個体を抽出してTI Short群（ｎ＝31）とへの応用が期待されるが，改良効率を向上させる

し，一度目の試行でTIに誘導され，かつ持続時とともに，同様の問題を抱える全国各地の地鶏生

間が180秒に到達した個体群をTI Long群（ｎ＝産現場へ速やかに技術を普及するためには，鶏の30）とした。両群のTI試験のスコアをFig.１およ行動的ストレス反応性に関与する遺伝子を明らか

びFig.２に示す。

にして，マーカーアシスト選抜を可能にする必要がある。しかしながら，現在のところこの分野に250関する有力な知見は存在しない。
そこで本研究では，これまでに行動的ストレス
DNAを抽出して全ゲノムシークエンスを行い，参照配列に対する変異塩基の頻度を行動的ストレス反応性の異なる群間で比較することにより関連

TI duration

反応性を調査した供試個体から採取した血液より

150
100

遺伝子を探索した。
２．方
2.1

50

法

材料

反応試験に供した，882羽の比内地鶏メスのデー
タと血液サンプルを用いた。

180

TI Short

TI Long

Fig. 1 Duration of Tonic immobility

Statistical analysis was performed by t-test by thenull hypothesis described below.
H０：μTI Short＝180

Tonic Immobility試験

応試験として，Tonic Immobility（TI緊張不動）１）
寝かせて胸部を軽く押さえ，ヒナが不動姿勢をとった時点で静かに手を放し，不動状態の持続時
間，すなわちヒナが起き上がるまでの時間を，180秒を上限として測定した。なお，手を放して

4

Number of trials

試験を用いた。ヒナを仰向けにして木製の台座にから５秒以内にヒナが起き上がった場合は，TIに誘導されなかったものとして，直ちに誘導操作

3
2
1

3.16

1

TI Short

TI Long0を繰り返し，TIが誘導されるまでの試行回数を記録した。

p < 0.001

5

行動的ストレス反応性を評価するための行動反

2.3

15.12

0

平成27年６月から平成29年６月までの間に行動

2.2

p < 0.001

200

Fig. 2 The number of trials for TI induction

Statistical analysis was performed by t-test by the

調査群の作成TI試験の結果から，行動的ストレス反応性のnull hypothesis described below.
H０：μTI Short＝１© The Ito Foundation

164

平成29年度

2.4

DNAバルクサンプルの調製

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）（assembly名：Gallus_gallus-5.0 accession番号：

調査群に選抜された各個体の血液サンプルから
DNeasy Blood & Tissue Kit（キアゲン

GCF_000002315.4）を参照配列としてマッピング

ヒルデし，変異を検出した。変異の種類は一塩基置換，

ドイツ）を用いてゲノムDNAを抽出した。

挿入変異および欠失変異とした。なお，リードの抽出したDNAサンプルの濃度を50ng/μｌに調整

クリーニングにはTrimmomatic２），マッピングにした後，群ごとに等量ずつ混合しDNAバルクサ

はBWA-MEM３），変異の検出にはLoFreq４）ソフ

ンプルを調製した。

トウェアをそれぞれ用いた。

ン

2.5

全ゲノムシークエンス

2.6

候補遺伝子の探索

DNAバルクサンプルの全ゲノムシークエンス

検出された変異のうち，アノテーション結果よは，タカラバイオ株式会社に委託して実施した。

り影響が大きいと予測されるもの，すなわち転サンプルは品質検定として濃度，純度および断片

写，スプライシングおよび翻訳の開始または終了化の有無を確認した後，TruSeq DNA PCR-Free

に影響を与えるもの，ならびにアミノ酸配列ある

Library Prep Kit（イルミナア

いはタンパク質の構造に重篤な影響を与える可能メリカ）を用いてシークエンスライブラリーを作性があるものを抽出し，両群における変異塩基の製した。作製はTruSeq DNA PCR-Free Library

頻度を比較することにより候補遺伝子の探索をPrep Reference Guideに沿って行われた。なお，行った。両群における変異塩基の頻度は，当該部

本解析においては，２つのライブラリーを混合し位における全冗長度に占める変異塩基の割合とてシークエンシングしたため，アダプターはサン

し，カイ二乗検定により頻度の違いの有意性を検

プルを選別するためのindex付きのものを用いた。

定した。

サンディエゴ

作製したシークエンスライブラリーは品質検定後

３．結果と考察に混合され，シークエンス解析に供された。クラ
スター形成およびシークエンス解析に使用した機各群においてシークエンス解析により検出され器はそれぞれ，cBot Cluster Generation System

た全変異の数ならびに影響度が大きいと予測され

お よ び HiSeq X Five Sequencing System（と もた変異の数をTable１に示す。これらの変異のうにイルミナ）で，操作は両機器の標準プロトコル

ち，影響度が大きく，群間でその頻度が有意（ pによった。

＜0.05）に異なったものの数は6,153座位であっシークエンス解析により得られた塩基配列情報

た。このうち，すでに機能が明らかになっている（リード）は，アダプターおよび低品質領域を除ものは同一遺伝子内の変異を含めて2,732座位で去したうえでセキショクヤケイのゲノム配列あった。この中には，ストレス反応に関連する神

Table１ The number of variants detected by whole-genome resequencing of bulked DNA

sample.

Type of variant
SNP

Insertion

Deletion

Variant withhigh impact

TI Short group

9,906,644

589,831645,444

54,340

TI Long group

10,052,316

604,306

658,082

55,534© The Ito Foundation

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の探索

165

経伝達物質であるモノアミンや，自律神経に関連れた。これらの中から影響度の高い変異を選び，する神経伝達物質であるアセチルコリンの関連遺各座位における，全冗長度に占める変異塩基の割伝子が複数含まれていた。

合を群における変異の頻度であると仮定して，カ本研究で用いた手法は，シークエンス解析におイ二乗検定により群間で有意に頻度の異なる領域

ける冗長度を利用して両群の変異頻度を仮定したを調べたところ，6,153座位が検出された。このものであり，これらの結果をもってストレス反応

うち，機能が明らかとなっているものは2,732座

性の関連遺伝子であると結論付けることはできな位であった。今後は，個体レベルの多型とストレ

いが，これまでにヒトや他の動物種において報ス反応性との関連解析や当該領域の変異が遺伝子告の発現および機能にもたらす影響について調査を５，６）されているストレス関連神経伝達物質の関連遺伝子が検出されたのは非常に意義深いことで行う必要がある。

ある。今後は候補領域について個体レベルの多型解析を行い，ストレス反応性との関連を解析するとともに，当該領域の変異が遺伝子の発現および機能にどのような影響をもたらすかを解析することで，地鶏の行動的ストレス反応性関連遺伝子の特定を目指す。
４．要

約

地鶏の行動的ストレス反応性関連遺伝子の候補
領域を探索するため，次世代シーケンサーによる
DNAバルクサンプルの全ゲノムシークエンスを行った。比内地鶏のメスを用いて初生時に実施した行動反応試験の結果をもとに行動的ストレス反応性の異なる調査群を作成し，血液から抽出したDNAを群ごとに等量ずつ混ぜ合わせ，シークエ
ンス解析に供した。

文献１） Jones, R. B.：The tonic immobility reaction of thedomestic fowl：a review, W Poultr Sci J，42，82～
96，1986．
２） B o l g e r , A . M . , L o h s e , M . , U s a d e l , B . ：Trimmomatic：A flexible trimmer for Illumina
sequence data, Bioinformatics，30，2114～2120，2014.
３） Li, H.：Aligning sequence reads, clone sequences
and assembly contigs with BWA-MEM，2013．
４） Wilm, A., et al.：LoFreq：A sequence-quality
aware, ultra-sensitive variant caller for uncoveringcell-population heterogeneity from high-throughput
sequencing datasets, Nucleic Acids Res，40，11189～
11201，2012．
５） Lesch, K. P., et al.：Association of anxietyrelated traits with a polymorphism in the serotonintransporter gene regulatory region, Science，274，1527～1531，1996．
６） Brunner, H. G., Nelen, M., Breakefield, X. O.,
Ropers, H. H., van Oost, B. A.：Abnormal behavior
associated with a point mutation in the structuralgene for monoamine oxidase A, Science，262，578～
580，1993．

解析の結果，約11,000,000座位の変異が検出さ© The Ito Foundation

166

黒毛和種肥育牛の肥育状態を生体評価する
血中バイオマーカーの開発
Identification of microRNA biomarker candidates for assessment of
fattening Japanese Black cattle

松

橋

珠

子

（近畿大学先端技術総合研究所）

Tamako Matsuhashi（Institute of Advanced Tecnology, Kindai University）

At present, the farmer has no way of knowing the fattening condition of cattle until they
are shipped and slaughtered. If it is possible to identify the condition of cattle during thefattening period, efficient and stable production of high quality beef can be realized. In thisstudy, we focused on microRNAs as a possible in vivo biomarker. Small RNA-seq with sera
was condacted to construct noninvasive diagnostic technology（Liquid biopsy）to identify
comprehensive blood microRNAs associated with carcass traits. Forty nine offspring of a
specific bull were extracted from young steers which a farmer began fattening from 2009 to
2010. Blood samples were collected for the first time in the early stage of fattening at 12 to 15
months of age, and the second time at the middle stage of fattening at 18 to 21 months of age.
In addition, individual information and carcass traits were collected. Six animals with highgrade carcass traits and 6 animals with low grade carcass traits were selected from thesurveyed group. MicroRNA was extracted from their serum and small RNA-seq was
performed. As a result, it was shown that a sufficient amount of microRNA was extracted from
1 ml of bovine serum and it was possible to construct a library for small RNA-seq. Further
analysis of results from small RNA-seq is expected to identify microRNAs involved in theformation of high-quality carcass traits of Japanese black cattle and to construct diagnostic
techniques using fattening biomarker microRNAs reflecting the state of fattening.

１．目れる黒毛和種の優れた産肉成績は個体の遺伝的能的力と農家の飼養管理とによって生み出される。し米国などとの二国間交渉（FTA）や新たな枠

かし多くの場合，農家は肥育牛を出荷するまで牛組みのTPPの発効が現実的になる中で外国産牛の出来具合（肥育状態）を知ることはできない。

肉に負けない国産牛肉の生産体制を構築するためもし牛の肥育状態を肥育期間中に把握することがに，高品質な和牛肉を安定的に生産できる新たな可能になれば，農家は需要に適った肥育状態の牛技術の開発が求められている。脂肪交雑に代表さを選択的に出荷したり，肥育状態に合わせて飼養© The Ito Foundation

黒毛和種肥育牛の肥育状態を生体評価する血中バイオマーカーの開発

167

管理条件を修正することにより，高品質な牛肉を生体内で筋肉発育や脂肪交雑形成と関連を示すマ

安定的に生産できるようになると期待される。

イクロRNAを把握する必要がある。また，研究そこで申請者らは，牛の肥育状態を生体評価すで用いたマイクロRNAマイクロアレイは，搭載る肥育バイオマーカーを開発することを目的に，されている牛マイクロRNAの種類が少ないうえ肥育牛の腎周囲白色脂肪組織やと畜時血液を用い情報が外国品種に基づいていることから，脂肪交た網羅的プロテオーム解析を実施し，枝肉形質と雑など黒毛和種に特徴的な枝肉形質に関連するマ

関連のみられた複数の肥育バイオマーカー候補タ

イクロRNAを十分検出できていない恐れがある。

ンパク質を報告してきた。現在はこれらの成そこで本研究では，肥育期間中の牛から定期的に果を国内全域で実用化するため，遺伝的背景や飼採血した血液を用いてRNAシークエンス法によ養環境の異なる複数地域の協力を得て肥育期間中

る網羅的解析を行い，黒毛和種の枝肉成績と関連の牛から経時的に採血を行い，肥育バイオマー

する新規マイクロRNAを含む血中マイクロRNA

カータンパク質群の効果検証と実用化へ向けたの探索を行うことを目的とした。肥育状態を反映

データの整備を進めている。

する肥育バイオマーカーマイクロRNAが特定で１～４）

さらに申請者らは牛の肥育状態を反映する，よきれば，さらに簡便な診断法を確立することで，り有効な新たな生体指標を開発するため，血中に将来的には肥育牛を生体評価し，最適な時期の出含まれるマイクロRNAに着目して研究を進めて荷や飼養管理の改善を実現し，結果として高品質いる。マイクロRNAは，ゲノム上の非コード領

な牛肉の安定的かつ効率的な生産を実現できるよ域から合成される比較的新しく見つかった短鎖

うになると期待される。

RNAであり，共通配列を持つ複数の伝令RNA（mRNA）に結合してその発現を抑制制御する。

２．方法

特にがん研究ではがん細胞の種類によって特徴的

2.1

供試材料

なマイクロRNAが合成され細胞外に分泌される

2009年から2010年にかけて特定農家に導入されことから，新たな生体内バイオマーカーとして注た黒毛和種肥育牛から，特定種雄牛産子の去勢牛

目され，すでに一部はがんマーカーとして実用化

49頭を抽出し調査群とした。生後12～15ヶ月齢のされている。特に最近では一部のがんマーカーマ

肥育前期に１回目の採血，18～21ヶ月齢の肥育中

イクロRNAが，エクソソームという細胞外分泌期に２回目の採血を行い，併せてと畜時の枝肉格小胞に封入されるなどして血中や尿中に存在する

付成績および個体情報を収集した。調査した49頭

ことが明らかとなり，体液や分泌液を活用した患から枝肉重量が400kg未満の個体および副産物の者への負担が少ない非侵襲的診断技術（リキッド

廃棄があった個体を除いた後，BMSナンバーおバイオプシー）としての可能性が大いに期待されよびロース芯面積が調査群の平均から±0.5σよている。申請者らはまず，Affymetrix社のジーン

り外れた個体を選抜し，枝肉格付成績上位群およチップを用いたマイクロRNAマイクロアレイ解

び下位群として血清を分離回収した。

析によりと畜時血清の網羅的マイクロRNA探索

2.2を行い，枝肉成績と関連するマイクロRNAが血miRCURY Exosome Isolation Kit-Serum and

液中に存在することを明らかにした５）。しかし，

plasma（EXIQON）を用いて血清１mlからエクソ

肥育中の状態を把握するのであれば肥育期間中にソームを回収し，miRNeasy Micro Kit（QIAGEN）© The Ito Foundation

エクソソーム内包型マイクロRNAの回収168

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）を用いてエクソソーム内包型マイクロRNAを含むtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAは
Agilent 2100 Bioanalyzer System を 用 い Agilent

３．結果と考察3 . 1 牛血清からのエクソソーム内包型マイク

Small RNA Kit（Agilent）で ，濃 度 と 品 質 を 確

ロRNAの回収認した。

肥育期間中に採血を行った調査群（49頭），お2.3

small RNA-seq用ライブラリの調整

よび枝肉成績上位群（６頭）そして下位群（６

抽 出 し た total RNA は ，NEBNext Multiplex頭）として選抜された個体の採血時の月齢およびSmall RNA Sample Prep Set for Illumina Set 1

枝肉形質値の基本統計量はTable１のとおり。枝（New England Biolabs）を用い，付属のプロト

肉格付成績上位群と下位群との間で採血時の月齢

コルに従ってライブラリ調整を行った。調整したおよびと畜月齢には差がなかったが，枝肉重量，

ラ イ ブ ラ リ は QIAQuick PCR Purification Kit

ロース芯面積，ばらの厚さ，歩留基準値，そして（QIAGEN） で 精 製 後 ， Agencort AMPure XP

BMSナンバーは，上位群の方が下位群より値がBeads（BECKMAN COULTER）で サ イ ズ セ レ

大きく成績が良かった。血清１mlからエクソソー

ク シ ョ ン し ，Agilent DNA 1000 Kit（Agilent）

ムを回収しマイクロRNAの抽出を行った結果，で濃度と品質の確認を行った。

平 均 12.0ng の total RNA が 回 収 さ れ た 。Agilent

2.4

small RNA-seq解析

2100 Bioanalyzer Systemで測定を行った結果，

作 成 し た small RNA ラ イ ブ ラ リ は ，Illumina

回収されたtotal RNAは21nt前後のマイクロRNA

HiSeq2500によるsmall RNA-seq解析に供した。

を主とするsmall RNAが大部分を占めており，リ

解析は，東京農業大学生物資源ゲノム解析セン

ボソームRNAやmRNAといった長鎖のRNAはほ

ター生物資源ゲノム解析拠点事業による共同研究

とんど含まれていなかった（Fig.１）。このことにより実施した。

から，今回採用した手法によって目的とするマイクロRNAが必要量回収できることが確認された。
3.2

small RNAライブラリの調整

次に，回収されたtotal RNAの1/4量から半量を用いてSmall RNAライブラリ調整を行った。
Table１ Number of animals, average number and standard deviation of the surveyed age and carcass traitsof the survey group, the low score group, and the high score group, respectively．

Traitssurvey group

Number of animals
1st blood sampling, months of age
2nd blood sampling, months of age
Slaughtered, months of age
Carcass weight, kg

49
13.5± 0.7
19.4± 0.7
28.7± 1.1
442.8±48.1613.7± 0.6
19.7± 0.6
28.7± 1.3
425.0±22.2ｂ

Thoracic longissimus muscle area, cm２

59.1± 9.4
8.5± 0.9
2.9± 0.774.6± 1.3
8.7± 1.852.7± 2.9ｂ
8.2± 0.4ｂ
3.0± 0.673.7± 0.7ｂ
6.0± 0.6ｂ

Rib thichness, cm
Subcutaneous fat thickness, cm
Estimated yield
B.M.S. rank

Low group

High group

P value613.4± 0.819.3± 0.828.5± 0.9502.3±34.1ａ＜0.00174.7± 8.1ａ
9.1± 0.5ａ
3.0± 0.676.2± 1.5ａ

＜0.001＜0.01

11.5± 0.8ａ

＜0.001＜0.01

P values indicate the difference of the average value between the low score group and the high score group.

© The Ito Foundation

黒毛和種肥育牛の肥育状態を生体評価する血中バイオマーカーの開発

ﬂuorescence intensity(A) (FU)

Marker4nt

Small RNA region

miRNA
region21nt(sec)

migration time(B) (FU)
ﬂuorescence intensity

169

Marker25nt
No ribosomal RNA(sec)migration time

Fig. 1 Detection of exosome-encapsulated microRNA

recovered from serum by Agilent 2100 Bioanalyzer.
（A）
Detection of small RNA by small RNA chip. （B）
Detection of high molecular RNA by RNA 6000 Nanochip.

Agilent 2100 Bioanalyzer Systemで鎖長を確認しすることは困難と考えられた。サイズセレクショ

た と こ ろ ，次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ る small

ン後のSmall RNAライブラリの量は平均200.8ng

RNA-seq解析に十分な量のライブラリが合成さであった。

れていた。一方，一部のライブラリサンプルにお3.3

いてアダプターダイマーの生成と残留が確認され調整したsmall RNAライブラリは，共同研究機

た（Fig. ２ A）。ラ イ ブ ラ リ 半 量 か ら Agencort

関である東京農業大学生物資源ゲノム解析セン

AMPure XP Beadsを用いてアダプターダイマー

タ ー で Illumina HiSeq2500 を 用 い た small RNA-の除去を試みたところ，ライブラリに含まれるア

seqを実施した。その結果，のべ24,725Mbaseのダプターダイマーの割合を半分以下に減らすことデータが得られた。現在はシーケンス結果の解析に成功した。しかし，多くのライブラリサンプルを進めているところである。

small RNA-seq

でアダプターダイマーを完全に除去するには至ら

3.4

なかった（Fig.２ B, C）。今回採用したビーズを今後は，得られたマイクロRNAデータの解析用いる方法では解析対象とするsmall RNAライブ

により，枝肉成績上位集団あるいは下位集団で特ラリ（鎖長147nt前後）を大幅に失うことなくア

徴的な発現を示すマイクロRNAの選定を行う。

ダプターダイマー（鎖長126nt程度）だけを除去

さらに新たな検体を追加して選出されたマイクロ© The Ito Foundation

今後の展開

170

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）(A) (FU)
ﬂuorescence intensity

Small RNA libraries
Adapterdimer

Marker
1500ntMarker15nt(sec)

migration time
ﬂuorescence intensity(B) (FU)

Small RNA libraries
Adapterdimer

Marker
1500ntMarker15nt(sec)

migration time
ﬂuorescence intensity(C) (FU)

Adapterdimer

Marker
1500ntMarker15nt

migration time(sec)

Fig. 2 Detection of synthesized small RNA libraries

（A）
Synthesized small RNA libraries before size selection
with AMPure XP Beads.（B）Small RNA libraries after
size selection with AMPure XP Beads. （C）Adapterdimer removed by size selection

RNAの肥育バイオマーカーとしての有効性を検

国内では黒毛和種の枝肉成績の向上は重要な研証するとともに，各マイクロRNAと肥育時期と究課題だが，黒毛和種は日本固有の品種であるこの関連解析を行い，選定されたマイクロRNAがとから，海外ではほとんど研究が行われていな

特 異 的 な 発 現 を 示 す 時 期 を 特 定 す る 。ま た ，い。黒毛和種の肥育とマイクロRNAに関連する

TargetScan等の公共データベースを利用して標研究として，飼養環境や骨格筋の種類とマイクロ的遺伝子を推定し，脂肪交雑をはじめとする枝肉RNAとの関連を報告した研究がある６～８）。しか形質の形成における機能解析にもつなげていきた

し，肥育中の黒毛和種から枝肉形質，特に脂肪交いと考えている。

雑と関連する血中マイクロRNAを同定した報告© The Ito Foundation

黒毛和種肥育牛の肥育状態を生体評価する血中バイオマーカーの開発

171

はまだなく，枝肉形質と関連することが確認されカーマイクロRNAを用いた診断技術の構築が期たマイクロRNAを肥育バイオマーカーとし，牛待される。

におけるリキットバイオプシー診断技術として実用化した例は他の品種でもまだ報告されていない。
４．要

約

農家は肥育牛を出荷するまで牛の出来具合を知ることはできない。しかし，もし牛の肥育状態を
肥育期間中に把握することが可能になれば，高品
質な牛肉の効率的かつ安定的な生産が実現できる。そこで本研究では，新たな生体内バイオマー
カーとして注目されているマイクロRNAに着目し，非侵襲的診断技術（リキッドバイオプシー）の構築が期待される血液を分析対象として，
small RNA-seqを実施して枝肉形質と関連する血中マイクロRNAの網羅的同定を試みた。本研究の結果，牛血清１mlからでもマイクロRNAの抽出とsmall RNA-seq用のライブラリの構築が可能であることが示された。今後は得られたsmall
RNA-seq解析を進めることにより，黒毛和種の高品質な枝肉形質の形成に関わるマイクロRNA

文献１） 池上春香，松橋珠子，永井宏平，宮本圭，大林賢伍，
坂口慎一，松本和也：関西畜産学会報，175，１～10，2018．
２） 池上春香，小林直彦，松橋珠子，武本淳史，吉廣
卓哉，井上悦子，加藤里恵，加藤博己，田口善智，
天野朋子，森本康一，中川優，入谷明，松本和也：
日本畜産学会報，83（3），281～290，2012．
３） 池上春香，永井宏平，松橋珠子，小林直彦，武本
淳史，吉廣卓哉，井上悦子，樋口智香，守田昂太郎，
内堀翔，天野朋子，田口善智，加藤博己，入谷明，
松 本 和 也：日 本 畜 産 学 会 報 ，86（2），141 ～ 152 ，
2015．
４） 永井宏平，吉廣卓哉，井上悦子，池上春香，園陽平，
川路英哉，小林直彦，松橋珠子，大谷健，森本康一，
中川優，入谷明，松本和也：日本畜産学会報，79（4），467～481，2008．
５） 松橋珠子，池上春香，森本学，永井宏平，山口壮輝，
塚口智将，樋口智香，守田昂太郎，宮本圭，坂口慎一，
松本和也：関西畜産学会報，174，38，2017．
６） Muroya, S., Shibata, M., Hayashi, M., Oe, M.,
Ojima, K.：PLoS One, 11（9）, e0162496，2016．
７） Muroya, S., Ogasawara, H., Hojito, M.：PLoS One,
10（8）, e0136475，2015．
８） Muroya, S., Taniguchi, M., Shibata, M., Oe, M.,
Ojima, K., Nakajima, I., Chikuni, K.：Journal ofAnimal Science，91（1），90～103，2013．

の特定や，肥育状態を反映する肥育バイオマー© The Ito Foundation

172

選抜した黒毛和牛精子の受精能評価
Evaluation for capacitation of selected bull spermatozoa

飯

田

弘・髙

橋

秀

之

（九州大学大学院農学研究院）

Hiroshi Iida and Hideyuki Takahashi（Kyushu University, Faculty of Agriculture, Department of Zoology）

In order to improve the success rate of bovine artificial insemination, the quality
evaluation method for frozen spermatozoa is essential. The purposes of this study are theevaluation of bovine spermatozoa sorted by a new “motile sperm collector” as well as
development of the evaluation method for activated spermatozoa. This study especially focusedon the effects of calyculin A（Phosphatase inhibitor）about immunolocalization of Phospho-Ser/
Thr PKA substrate, protein phosphorylation, and motility of spermatozoa. After washing offreeze-thaw bovine spermatozoa, cells were cultured in IVF100 medium or BO medium.
Immunofluorescense microscopy was performed to examine the effects of calyculin A on
spermatozoa cultured for 90 min in IVF100 medium in the absence or the presence of 100 nM
calyculin A. In the absence of calyculin A, Phospho-Ser/Thr PKA substrate was detect at the
post-acrosome, neck, and principal piece of flagella of spermatozoa. On the other hand,incubation with calyculin A brought about additional distinct immunostaining of Phospho-Ser/
Thr PKA substrate at the annulus. Immunoblot analysis with the anti-Phospho-Ser/Thr PKA
substrate antibody revealed that calyculin A promoted phosphorylation of 35kDa protein as
well as de novo phosphorylation of 50 kDa and 75 kDa proteins in the insoluble fraction of
spermatozoa. In the absence of calyculin A, large part of spermatozoa showed zigzag
advancing motility, while most spermatozoa cultivated in the presence of calyculin A showed
more straight advancing motility with reduced velocity. These data suggested that calyculin A
promoted de novo protein phsphorylation in sperm flagella as well as subsequent modificationof sperm motility.

１．目

63％，2013年44％，肉用牛では1989年67％，2013

的

年53％となっており，かなり低下している。受胎

我が国における牛の交配のほとんどは凍結精液率低下による経済的損失は大きい。人工授精によを用いた人工授精で行われているが，受胎率はこる受胎率の低下には雄雌双方の要因が関与していこ15年間で低下し続けている。我が国における牛ると考えられており，雄側からの要因解明の取り

人工授精における初回受胎率は，乳用牛で1989年

組みも必要である。肉用牛の黒毛和種は，繁殖雄© The Ito Foundation

173

選抜した黒毛和牛精子の受精能評価

牛の飼育数の減少等によって子牛不足が常態化しcalyculin A で 処 理 し 活 性 化 を 誘 起 す る と ，ており，受胎率の向上に向けた取り組みが急務で

TEKTIN3（TEKT3）が後先体領域から赤道部ある。優秀な遺伝形質をもつ種牛の一部では，精へと移動することを報告した３）。赤道部は受精の液性状が正常であるにもかかわらず実際には受胎際に卵形質膜と融合する部位であり，TEKT3が率が低い場合がある。低受胎率を示す精液は，精受精能獲得に関わっていることを示唆する。本研

子活力，生存率，精子濃度等の精液性状に基づく

究は，活性化前の精子，活性化した精子について，

検査では発見することが困難な場合がある。実際

分子マーカー（TEKT3，phospho-PKA substrate，に，種雄牛（黒毛和牛）の体外受精の研究におい

PNA lectin）を用いて，選抜優良精子およびクて，受精率で５倍，胚発生率で４倍の相違が品種

ルード精液精子を蛍光顕微鏡観察によって染色パ間にあることが報告されており ，種雄牛の精液

ターンを比較するとともに，ウェスタンブロットの品質（精子の活性や受精能力）が受精に重大なおよび精子運動性解析（CASA）によってリン酸

影響を与えることが判明している。本研究の目的

化タンパク質の動態と精子の運動活性を検討する。

１）

は，「新規運動性精子捕集器」（研究資料提供契約のため詳細は記載不可）を使用して良好な運動性

２．方法を示す黒毛和牛の優良精子を選抜するとともに，精子の培養：凍結精子を37℃で30秒解凍し，種雄牛の精液の品質を分子マーカーを用いて検定

BO培地４）にて２回洗浄した後，低吸着性ディッする方法を確立することである。

シュにて60～120分間CO２インキュベーターにて精子は受精能獲得を経て卵との受精が可能にな培養した。培養には２種の培地（BO培地またはる。受精能獲得を経た精子は文字どおり受精能力

IVF100培地）を使用した。培養後精子を遠心にがあるが，鞭毛運動に関しては，受精能獲得の際よって回収し，免疫染色用には３％パラホルムアに対称性を示す鞭毛の屈曲運動から，非対称性のルデヒドにて精子を固定した後，抗体にて染色し力強い鞭毛運動（超活性化）へと変化すると考えた。ウエスタンブロット用には，回収した精子をられており，超活性化に至った精子の鞭毛では，

S-EDTA（10mM Tris，１％SDS，75mM NaCl，

多数のタンパク質のリン酸化が起きていることが24mM EDTA，pH7.6）によって可溶化し，上清

報告されている。リン酸化を引き起こす細胞内シとペレットに分けてSDS-PAGEにてタンパク質

グナルとしてcAMP依存性プロテインキナーゼＡを分離し，PVDFメンブランに転写した。用いたの活性化がよく知られている。本研究では，凍結培地の組成，薬剤，抗体等を下記に記す。

種雄牛精子を用いて，cAMP依存性プロテインキ＜培地＞

ナーゼＡの活性化，および超活性化を誘起するとBO 培 地 ： 112mM NaCl ， 4mM KCl ， 0.5mM

報 告 さ れ て い る calyculin A （phosphatase

MgCl２，0.8mM NaH２PO4，10mM Hepes，1.25mM

inhibitor）２）に焦点をあて，分子マーカーの動態，

pyruvate，25mM NaHCO３，2mM CaCl２，0.01g/

タンパク質のリン酸化，精子の運動性を検討した。

L phenol red，1.8g/L glucose，1.2g/L bovine serum

我々はこれまで，ラット，マウス，牛等の動物

albuminの精子を用いて，テクチンタンパク質（TEKTs，

IVF100培地：BO培地を基礎培地として，ヘパ精子の鞭毛および頭部の構成分子）の分子局在にリンナトリウム（176単位／mg）を7.5mg/L，カ

つ い て 研 究 を 行 っ て き た 。牛 精 子 を cAMP ＋

フェイン10mMを添加した培地。

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174

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）＜活性化試薬＞

ＡはTEKT3とPNAの染色パターンが正常で，パdbcAMP （N6, 20-O-Dibutyryladenosine

ターンＢではアクロゾームは正常であるが30,50-cyclic monophosphate sodium salt）

TEKT3の染色性が低い精子，パターンＣは精子

calyculin A（Wako Pure Chemical）

頭部の形状が異常を呈しTEKT3の染色も異常を＜染色に用いたマーカー＞

呈する精子，パターンＤはPNA染色（アクロゾー

FITC-PNA（EY Lab）：アクロゾーム形態の判定に使用

ム）が異常でかつTEKT3染色性が低い精子である。比較の結果，ソーティングした精子では，パHoechst（Sigma Chemical Co.）
：核染色用

ターンＡが92％以上あり，ソーティングしない場

anti-TEKT3 antibody：精子の活性化に伴い移合にはパターンＡは85.73％であった。よって，動する精子構成分子

凍結精子をソーティングすると，より高品質の精

anti-phospho-PKA substrate antibody （Cell

子が得られることが判明した（Table１）。

Signaling Technology）：PKAによりリン酸化さ3 . 2 IVF100 で 培 養 し た 精 子 に お け るれる分子。活性化により局在が変化するため，活Phospho-Ser/Thr PKA substrateの局在：性化の指標として有用。

calyculin Aの影響
＜形態学的変化＞

３．結果と考察3.1

精子をBOで洗浄した後，IVF100およびIVF100

ソーティング効果の検証＋calyculin Aで90分培養し，Phospho-Ser/Thr

精子をBO培地で洗浄した後，「新規運動性精子

PKA substrate（Protein kinase Aによりリン酸捕集器」によって精子をソーティングし，その後化される基質分子）に対する抗体で精子を染色し精子を固定して，TEKT3抗体とPNA-FITC（アた。Fig.２とFig.３に示すとおり，IVF100培養精

クロゾームの同定）にて染色し，ソーティングし子 で は ， 64.1 ± 4.75 ％ の 精 子 に お い て post-ていない精子と比較した。染色パターンをFig.１

acrosome, neck, principal piece of flagella が 染 色のようにＡ～Ｄの４パターンに分けた。パターン

され（パターンⅢ），IVF100＋calyculin Aでは，Pattern A

Pattern B

Pattern C

Pattern D

Fig. 1 Immunostaining patterns of sorted bovine spermatozoa. Spermatozoa sorted

by “a novel motile sperm collector” were stained with the anti-TEKT3
antibody（red, arrows）. Samples were counter-stained by PNA-FITC（green）
to label acrosome. Spermatozoa were divided into four types by staining
patterns（A, B, C, and D）．

© The Ito Foundation

175

選抜した黒毛和牛精子の受精能評価
Table１ Quantitative analysis of spermatozoa labeled by the anti-TEKT3 antibody and

PNA-FITC.

Pattern

Ａ（％）

Ｂ（％）

Ｃ（％）

Ｄ（％）

Sorted sperm A

93.63±3.65

1.80±1.56

2.55±2.17

2.03±1.14

Sorted sperm B

92.85±1.55

2.99±2.22

2.56±0.90

1.61±1.92

Non-sorted sperm

85.73±2.59

6.00±0.98

1.21±0.56

7.06±1.96

Staining patterns on spermatozoa are categorized into four types. A：normal staining for both
TEKT3 and PNA, B ： Normal staining of PNA without TEKT3 staining, C ： Abnormal staining
for both TEKT3 and PNA, D：abnormal staining of PNA without TEKT3 labeling. Average±SDare shown（n＝3）

Pattern Ⅰ

Pattern Ⅱ

Pattern Ⅲ

Pattern Ⅳ

IVF1006.23±1.16％

0.75±0.78％

64.1±4.75％

0.14±0.24％

IVF100 + calyculin A

2.07±1.43％

0.47±0.31％

0.49±0.50％

73.01±4.61％

Staining
patterns

Fig. 2 Quantitative analysis of staining patterns for Phospho-Ser/Thr PKA substrate on

sperm head after 90 min incubation in the presence or absence of 100 nM calyculin A.
Staining patterns were divided into four（I～IV）：pattern I：distinct labeling only at thesubequatorial segment；pattern II：distinct labeling at the postacrosome region；pattern
III ： distinct labeling at the neck region （an arrowhead）； pattern IV ： distinct labelingat both the neck region（an arrowhead）and annulus（an arrow）．

Fig. 3 Immunofluorescence microscopy demonstrating the localizationof Phospho-Ser/Thr PKA substrate（red）in bovine spermatozoa
incubated for 90 min in IVF100 medium in the absence（A）or
presence（B）of 100 nM calyculin A. Immunostained spermatozoa
were counter-stained by PNA-FITC（green）to label acrosome.
Arrowheads and arrows indicate neck region and the annulus ofspermatozoa, respectively. Bar：5µm．

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176

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

73.01±4.61％の精子において，さらにannulusが化分画（ペレット）に分けて電気泳動した。ブロッ

強 く 染 色 さ れ た （パ タ ー ン Ⅳ）
。つ ま り ，トをanti-Phospho Ser/Thr substrate antibodyに

calyculin A添加によって精子annulus部が新たにて染色し，リン酸化タンパク質を検出した。その染色され（Fig. 3 Bの矢印），annulusにリン酸化

結果，calyculin A処理によって，35kDタンパク

タンパク質が蓄積することが判明した。IVF100

質のリン酸化が増強され，50kDaと75kDaのタンにはヘパリンとカフェインが含まれているが，ヘパク質の新たなリン酸化が観察された（Fig.４）。

パリン，カフェイン添加のみではannulus部のリ同様な実験をIVF100, IVF100＋calyculin A添加

ン酸化は起きないことも判明した。annulus部に条件下でも行い，同様な結果を得た。これらの結は精子運動性に関わる多種のセプチン分子の局在

果は，calyculin AはProtein kinase Aの基質となが報告されており ，セプチン分子のリン酸化がるPhospho Ser/Thr substrateのリン酸化を増強起きているかが今後の検討課題である。

することを示唆する。

５）

3.3

＜リン酸化タンパク質の変化＞

精子の運動性に与えるcalyculin Aの影響

な鞭毛運動によるサーキュラーな精子の運動）が添加条件下で２時間培養した。その後精子を回収

起き，それとともにタンパク質リン酸化も誘起さ

し，S-EDTA bufferで処理後，可溶化分画と不溶れると報告されている２）。凍結精子を用いた我々

kD
97
66
45
30

S

P

S P

S

P
kD

S P

dbcAMP

ControlP

Control

S

S

dbcAMP+calyculin A

培地＋dbcAMP，BO培地＋dbcAMP＋calyculin A

no incubation

calyculin Aで処理すると，超活性化（非対称的dbcAMP+calyculin A

した後，700g 7min遠心して回収し，BO培地，BO

dbcAMP

牛 精 子 （非 凍 結 精 子） を cAMP 依 存 的 に

no incubation

牛凍結精子を融解した後，BO培地で２回洗浄

P

S

P

S

P

100
75
50
37
25

20
Fig. 4 Effects of 100 nM calyculin A on the phosphorylation of bovine sperm proteins. Spermatozoa

were incubated in BO medium for 120 min without additive（Control）, in the presence of
0.1mM dbcAMP, or 0.1mM dbcAMP ＋ 100nM calyculin A. Spermatozoa without incubation
were included as “no incubation”. After incubation, spermatozoa were dissolved in S-EDTA.
Insoluble pellet（P）and soluble proteins（S）were separated by SDS-PAGE, and separated
proteins were processed to either Coomassie brilliant blue staining（left panel）or to
immunoblot analysis with the anti-Phospho-Ser/Thr PKA substrate antibody（right panel）.
Arrows indicate phosphorylated proteins.Molecular standards areshown on the left
（Mr x10-３）.

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選抜した黒毛和牛精子の受精能評価

177のCASAによる観察では，一部の精子においてPhospho-Ser/Thr PKA substrate の 蓄 積 を 促 進

サーキュラーな運動が認められたが，多くはスするとともに，35kDタンパク質のリン酸化の増ムーズな直線的運動を示すものが多く，また速度強および50kDaと75kDaのタンパク質の新たなリも 顕 著 に 減 少 し て い た 。精 子 の 直 線 速 度 は ，ン 酸 化 を 引 き 起 こ す こ と が 判 明 し た 。ま た ，calyculin A非存在下では85～100µm／秒であっcalyculin A存在下では，直線的で頭部の振り幅

たが，calyculin A存在下では速度が約1/2以下にが少ない運動性を示す精子が増加する傾向にあっ

低 下 し た 。 ま た ， 頭 部 振 動 数 （Hz） へ のた。

calyculin Aの影響は認められなかったが，頭部振幅（µm）はcalyculin Aによって顕著に減少した。すなわち，calyculin A存在下では，精子は直線的で頭部の振り幅が少ない運動性を示す傾向があった。この結果については，多品種の精子を用いたさらなる検討が必要である。
４．要

約

本研究の目的は「新規運動性精子捕集器」を使用して良好な運動性を示す黒毛和牛の優良精子を選抜するとともに，種雄牛の精液の品質を分子
マーカーを用いて検定することである。「新規運動性精子捕集器」によるソーティングは，アクロ
ゾーム形態およびTEKT3染色性の観点から，精子の品質を高めることが分かった。また，培養精子に対するcalyculin Aの影響を形態学的，生化学的，および精子運動性の点から検討した。その文
献１） 岡田綾子，森本一隆，栗原昭宏：牛の体外受精技
術―種雄牛による受精率および発生率の違い―，鳥取畜試研報，27，１～４，1998．
２） Mizuno, Y., Isono, A., Kojima, A., Arai, M. M.,
Noda, T., Sakase, M., Fukushima, M., Harayama, H.：
Distinct segment-specific functions of calyculin
A-sensitive protein phosphatases in the regulationof cAMP-triggered events in ejaculated bull
spermatozoa, Mol Reprod Dev，82，232～250，2015.
３） Tsukamoto, M., Hiyama, E., Hirotani, K., Gotoh, T.,
Inai, T., Iida, H.：Translocation of Tektin 3 to theEquatorial Segment of Heads in Bull Spermatozoa
Exposed to Dibutyryl cAMP and Calyculin A, Mol
Reprod Dev，84，30～43，2017．
４） Brackett, B. G., Oliphant, G.：Capacitation ofrabbit spermatozoa in vitro, Biol Reprod，12，260～
274，1975．
５） Kuo, Y. C., Shen, Y. R., Chen, H. I., Lin, Y. H.,
Wang, Y. Y., Chen, Y. R., Wang, C. Y., Kuo, P. L. ：SEPT12 orchestrates the formation of mammaliansperm annulus by organizing core octamericcomplexes with other SEPT proteins, J Cell Sci，128，
923～934，2015．

結 果 ， calyculin A は ， 精 子 annulus 部 へ の© The Ito Foundation

178

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能評価
Novel method for evaluating capacitation ability of bovine sperm using
oviductal epithelial cells and evaluation of sex sorted sperm function

栁

川

洋二郎・永

野

昌

志

（北海道大学大学院獣医学院）

Yojiro Yanagawa and Masashi Nagano（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

Recently sex-sorted sperm have widely used in the dairy and beef industry. However, theconception rate of them is usually low compare to those of conventional sperm. It is said that
one of the reason for low fertility is due to short longevity inside the oviduct, but there is no
methods to prove the hypothesis. Requirement for fertile sperm is binding ability to oviductal
epithelial cells, capacitation ability and longevity to keep those abilities. The purpose of present
study is to establish novel method for evaluating those factors using oviductal epithelial cells.
Oviducts derived from slaughter house were divided into isthmus and ampulla. Epithelial cells
were collected from both parts separately and incubated for 2 days. Isthmic epithelium was
low in number of collection and ciliated cells after incubations. After 2 days incubations,
epithelium was co-incubated with sperm for evaluating binding rate of sperm and detachmentfrom epithelium using calcium ionophore. About 80％ of sperm bind to epithelium but most ofthem were not specific binding to cilia. Also, they did not detach from epithelium by calcium
ionophore. For further study, we need to improve the recovery rate of isthmic epithelium andincubation methods, and also may be another method for evaluation using molecule related tosperm-oviduct binding.

１．目るなど，食肉の生産に対する大きく寄与すること的が期待できる。しかし，人工授精受胎率の低下が我が国の乳牛および肉牛はそのほとんどが凍結問題視されている現在において性選別精液の受胎精液を用いた人工授精により生産されており，近率（38-44％）は通常の凍結精液（55-60％）に比

年ではおよそ90％の確率で望む性別の産子を得る

べさらに低く１），性選別精液による人工授精受胎ことができる性選別精液の利用が拡大している。

率の向上が強く望まれている。販売されている性性選別精液の活用によって，肉牛においては経済

選別精液の機能評価としては，通常精液の評価と的価値の高い雄牛を効率的に作出できるほか，産同様な精子生存性および運動性が検査されてお肉能力の高い雌牛から後継雌牛を確実に獲得できり，性選別精液についてもこれらの項目に問題が© The Ito Foundation

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能評価

179ないとされている。しかし，実際は性選別精液を究室へと運んだ。研究室到着後，生殖器より卵管使用した人工授精については世界的に受胎率の低を採取し，HBSSで洗浄した後，周囲の余分な組下が認められ，これは卵管内での生存時間が短い

織を切除した。卵管を子宮側から卵巣側まで３つためであると推察されているが，既存の検査ではの領域に区分し，子宮側を卵管峡部，卵巣側を卵精子の生存時間を評価する方法は確立されていな

管膨大部と判定した。卵管峡部および卵管膨大部

い。

は，両端１cmを除去し，卵管１本につき３cm程

精子は精液の凍結融解の過程で傷害を受け，生度を各部位におけるサンプルとした。

存率および運動性の低下の他にも細胞膜および細2.2

胞小器官の形態的・機能的変化を起こす 。さら採取した卵管を切開し，メス刃を用いて表面をに性選別精子については，精子を蛍光染色したの擦り，卵管上皮細胞を掻き取った。掻き取った細ち雌雄の性染色体サイズの違いによるDNA量の胞は10mlのHBSS中に懸濁した。HBSSに66IU/

差異をフローサイトメーターにより選別する過程

ml牛脾臓由来トリプシン（T9201，Sigma）およにおいても傷害を受けていると考えられる。性選

び80IU/ml DNase Iを添加した後，スターラーで別精液を凍結せず，人工授精に用いる場合，精液撹拌しながら36℃で30分間反応させた。反応後，作製後１日までの人工授精では受胎率が通常精液

細胞浮遊液を70µmフィルターでろ過し，50mlのの場合とほぼ同程度であることが報告されてい遠沈管に回収した。さらに細胞浮遊液を入れている 。そのため，性選別精液が凍結過程においてた容器を2.5mlのDMEMで洗浄し，同様にフィル

受ける傷害は通常精液とは異なると考えられる。

ターでろ過した。ろ過後の細胞浮遊液は180×ｇ

子宮内に注入された精子は，卵管峡部に到達し，で５分間遠心した。遠心後，上清を除去し，混入

卵管上皮細胞の線毛に付着して卵子が排卵・輸送した赤血球の溶血処理のために，１mlの0.017M

されるまで待機している。この間，卵子侵入に関Tris-HCl（pH7.65）を加え，ピペッティングにわる機能（受精能）を獲得し，卵子が卵管峡部により沈殿物を再懸濁した。懸濁後さらに４mlの到達するまで生存性を保持していれば受精するこ

Tris-HClを加え，180×ｇで10分間遠心し，上清とができる。そのため，良質精子の条件として，を除去した。その後，５mlのDMEMを用いて，卵管峡部における上皮細胞への付着能，受精能獲沈殿した細胞を再懸濁し，180×ｇで10分間の遠得能および生存性と受精能を維持する能力（寿心を行い，細胞を洗浄した。洗浄後，上清を除去命）が求められる。そこで本研究では培養卵管上し，10％FBS加DMEM/F12液で再懸濁した。

２）３）

卵管からの上皮細胞の回収

皮細胞を用いて精子の雌生殖道内における卵管上2.3

皮付着能，受精能獲得能および寿命の評価法の新細胞浮遊液の細胞数を，血球計算盤を用いて計数し，細胞数が10×10 ５ /wellとなるように，コ規開発を目的とした。
２．方
2.1

卵管上皮細胞の培養

ラーゲンをコーティングした96wellプレートに播法種した。プレートは37℃，５％CO２環境下で２日

卵管の採取

間培養を行った。細胞の生存性は，播種直前にト食肉検査場において，と殺後30分以内の雌牛より子宮，卵管および卵巣を採取した。それぞれのリパンブルー染色により評価し，生存率が80％以上であったものを実験に供した。

生殖器は切り離さず，そのまま氷上で保管し，研© The Ito Foundation

180
2.4

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

凍結融解精液の処理

１頭のホルスタイン種由来（JP3H56094）の凍結精液を実験に供した。凍結精液は精液入りのス
トローを37℃の温水中に40秒以上浸漬して融解し

３．結果

3 . 1 卵管峡部および膨大部における上皮細胞
回収効率，線毛および接着性の比較た。融解した精液は1.5mlサンプルチューブに移卵管１本あたりの細胞回収数は，卵管峡部が4.2

し，DPBS（－）を１ml加えた後500×ｇで５分±1.1×10５個（3.0－5.2×10５個）で，卵管膨大部

間遠心する洗浄の工程を２回くり返した。洗浄後が82.3±8.0×10５個（74.0－90.0×10５個）であり，の精子はDMEMで再懸濁し，精子浮遊液の精子

卵管峡部の方が有意に少なかった。採取直後で濃度を血球計算盤により測定した。

は，峡部，膨大部のいずれにおいても，活発な運

2.5

実験計画

動を示す線毛細胞が観察された。一方，培養２日

実験１．卵管峡部および膨大部における上皮細胞

目においては両者において線毛細胞数は減少し，回収効率，線毛および接着性の比較

特に峡部より採取した上皮細胞においては，膨大

卵管峡部および卵管膨大部それぞれより卵管上部由来の細胞と比較して線毛細胞はより少なかっ

皮細胞を採取し，回収細胞数，線毛の有無，well

た。また，卵管峡部および膨大部由来の上皮細胞の底面への細胞の接着性を比較した。実験は３回

いずれにおいても，一部がwellの底に生着したが，くり返した。

完全に底面を覆うようなシート状には生育しな

実験２．精子の卵管上皮細胞への付着能および受かった（Fig.１）。

精能獲得能評価試験

3 . 2 精子の卵管上皮細胞への付着能および受２日間培養した卵管峡部由来の上皮細胞を容れ

精能獲得能評価試験

たwellに，精子数が10×10 /wellとなるように精卵管峡部由来上皮細胞と精子を30分間インキュ子浮遊液を添加し，37℃，５％CO２で30分間のイ

ベーションした後に卵管上皮細胞に付着していた

ンキュベーションを行った。インキュベーション

精子は，81.2±5.1％（76.8-86.8％）であった。し後，位相差倒立顕微鏡下でwell内を観察し，視野かし，精子は細胞自体に非特異的に付着してお５中の卵管上皮細胞へ付着している精子および浮遊している精子数を数え，精子の卵管上皮細胞への付着率を算出した。１回の実験で３視野観察し，実験は３回くり返した。また，付着精子の受精能獲得状況を調べるため，１µMのカルシウムイオ
ノフォアＡ23187を添加し，卵管上皮細胞からの離脱状況を確認した。
2.6

統計解析

卵管峡部および卵管膨大部より採取した細胞の，卵管１本あたりの数はスチューデントのｔ検定により比較した。統計解析にはJMP Pro（13.1.0,
SAS institute Japan，東京）を用いｐ＜0.05を有意とした。各データは平均値±標準偏差で示した。

Fig. 1 Oviductal epithelial cell seeded to 96 well. Onlysome of the cell attached to the bottom of the well.

© The Ito Foundation

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能評価

181

いることで線毛以外の部分に非特異的に結合しているため，精子正常の正確な評価を実施することは不可能である。また非特異的な結合が多かった
ことがカルシウムイオノフォア処理による離脱が誘導されなかった要因であると考える。卵管上皮細胞がwellの底面に生着しない理由は明らかではなく，今後は培地や培養条件などを改善する必要がある。
精子は卵管峡部の上皮細胞からは受精能獲得のみで離脱できるが，卵管膨大部の上皮細胞からはFig. 2 Sperm binding to the isthmic epithelium notspecific to cilia of the cell.

受精能獲得のみならず授精直前に特有なハイパー
アクチベーション状態になることが必要であるということが分かっており，両上皮細胞の精子に対り ，線 毛 へ の 特 異 的 付 着 は 認 め ら れ な か っ たする結合能と役割は異なることが示唆されてい（Fig.２）。また，カルシウムイオノフォアを添加る４）。通常，精子は卵管峡部の上皮細胞と結合後，しても，精子は卵管上皮細胞から離脱せず，付着離脱し卵子と受精に至るため，本研究の目的であしたままであった。

る精子の性状評価のためには実際の結合箇所であ４．考る卵管峡部の上皮細胞を使用した方法が必要であ察る。しかし，卵管峡部から回収できる細胞数はと本研究では卵管峡部および膨大部は同一の長さても少なく１本の卵管から採取された細胞でで採取したが，卵管膨大部の方が太いため管腔内96wellプレートの１wellへの播種が限界である。

の表面積は卵管膨大部の方が大きいことが推察さ

国内の食肉処理場における処理頭数から考えるとれる。この表面積の違いが卵管峡部における回収

十分量の発情周期中の時期が適切な卵管を定期的細胞数が膨大部に比べ有意に少なかったことの一に採取することは困難であると推察されるため，因であると考えられた。また体外における卵管膨今後は卵管峡部由来上皮細胞の回収率の向上や機大部の上皮細胞の精子付着能は24時間以上維持さ能維持に加え，卵管に発現する精子に結合する

れるのに対し，卵管峡部の上皮細胞は８時間程度

Lewis Aなどの分子５）を利用した評価系の開発がしか機能を維持されないとされ，さらに卵管峡部必要であると考える。

の細胞は卵管膨大部の細胞と比べ脆弱で喪失が速いと報告されている４）。これらの卵管峡部の上皮

５．要

約

細胞の特性により，本研究において回収細胞数が性選別精液の使用が拡大しているが通常精液と少なかったことおよび線毛細胞の消失が卵管膨大比較して受胎率が低いことが問題となっており，部の上皮細胞と比較して速かったと考えられた。

これは卵管内での生存時間が短いためであると推精子が卵管峡部由来上皮細胞へ高い確率で結合し察されているが，既存の検査では精子の生存時間

たが，卵管の線毛細胞が消失したことおよび上皮を評価する方法は確立されていない。良質精子の細胞がシート状に生育せず線毛部以外が露出して条件として，卵管峡部における上皮細胞への付着© The Ito Foundation

182

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

能，受精能獲得能および生存性と受精能を維持す

シウムイオノフォア処理による離脱も観察されなる能力（寿命）が求められる。そこで本研究ではかった。卵管上皮細胞の培養方法の改善ととも

培養卵管上皮細胞を用いて精子の雌生殖道内におに，精子と上皮細胞の結合に関わる分子を用いたけるこれらの能力を評価する方法を新規開発する評価系の開発も必要であると考えられた。

ことを目的とした。食肉処理場より採取した卵管を卵管峡部と卵管膨大部に分け，それぞれから卵管上皮細胞を採取し２日間培養した。卵管峡部由来の上皮細胞は卵管膨大部由来の上皮細胞に比べ回収細胞数が少なく，また培養後の線毛細胞の数も少なくなっていた。２日間の培養後に精子を共培養し卵管上皮細胞への精子付着率およびカルシ
ウムイオノフォアによる離脱について調査した。
精子の80％は卵管上皮細胞に付着していたが，線

文献１） DeJarnette, J. M., Leach, M. A., Nebel, R. L.,
Marshall, C. E., McCleary, C. R., Moreno, J. F.：J
Dairy Sci，94，3477～3483，2011．
２） Watson, P. F.：Anim Reprod Sci，60，481～492，
2000．
３） Xu, Z. Z.：J Dairy Sci，97，7298～7304，2014．
４） Ardon, F., Markello, R. D., Hu, L., Deutsch, Z. I.,
Tung, C. K., Wu, M., Suarez, S. S.：Biol Reprod，95，
1～7，2016．
５） Suarez, S. S., Revah, I., Lo, M., Kölle, S.：Biol
Reprod，59，39～44，1998．

毛以外の場所への非特異的な付着が目立ち，カル© The Ito Foundation

183

長期不受胎牛の受胎率向上に向けた単為発生胚移植の効果
The effect of bovine parthenogenesis embryo transfer to previously
artificially inseminated cows

白

砂

孔

明・岩

田

尚

孝・濱

野

晴

三＊・柳

沼

日佳里＊

（東京農業大学農学部畜産学科，＊家畜改良事業団家畜バイテクセンター）

Koumei Shirasuna, Hisataka Iwata, Seizo Hamano＊ and Hikari Yaginuma＊（Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture, Department of Animal Science,＊Livestock Improvement Association of Japan, Inc.）

Repeat breeding is a major problem in the daily industry all over the world, with anincidence ranging from 15％ to 20％ of lactating animals in Japan. Repeat breeder cows aredescribed as subfertile animals without any anatomical or infectious abnormalities that do not
become pregnant until after the third or later breeding attempt, or that remain infertile after
numerous services.
Importantly, we and other groups reported that transfer of embryo, which derived in vitro
fertilization（IVF）, on Days 7 to 9 after estrus to previously artificial insemination（AI）in
repeat breeding cows clearly improved pregnancy rate. However, using this technique, thereason why the conception rate improves is unknown and the problem of high twin risk is left.
In the present study, we hypothesized that transfer of parthenogenesis（PA）embryos could
be an alternative tools to fertilized embryo transfer for improvement of pregnancy rate inrepeat breeding cows. Before using of PA embryos in in vivo, we confirmed mRNA expressionof interferon tau（IFNT）, a pregnancy recognition factor in ruminants, in PA embryos,
suggesting that PA embryos produce IFNT. At blastocyst stage both before freezing and afterthawing, the levels of IFNT mRNA was higher in PA than in IVF embryos. In in vivo transfer
experiment, we confirmed that the transfer of PA embryos did not become a conceptus
product in cows. Plasma progesterone concentrations were significantly higher in PA embryotransfer to previously AI compared with AI alone. Also, we investigated mRNA expression of
Mx2, one of interferon-stimulated genes as a maker of IFNT signal, in peripheral blood
leukocytes. Transfer of PA embryo alone did not increased Mx2 mRNA. In pregnant cows,
Mx2 mRNA expression was significantly increased in PA embryo transfer to previously AI
compared with AI alone. These results suggests that ET to previously AI is available as areproductive assistance technology and PA embryo could became a therapeutic tool ofpregnancy in repeat breeding cows.

© The Ito Foundation

184
１．目

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

そこで申請者らは，IFNTを産生するとされる

的単為発生胚（PA胚）を追い移植することにより，近年，我が国の酪農家戸数および乳牛飼養頭数

受精卵を用いた追い移植効果を代替でき，双子発は減少を続ける現状に加え，乳牛の繁殖成績の低生を防ぐ新たな追い移植技術の開発に繋がるので下が深刻な問題となっている。その問題が解決ではないかと考えた。PA胚とは，卵子が精子と受きないことには，生乳生産量の不足や乳用後継牛

精することなく雌の遺伝子のみで発生した胚のこの確保が危惧されることに至ると考えられる。さとであり，薬剤で卵子を活性化するだけで作製がらに，長期不受胎牛が増加しており，繁殖経費の可能であるため体外受精のコスト削減なども可能

増大や空胎期間の延長，ひいては更新による生乳である。しかし，PA胚追い移植の受胎性向上効

生産の機会の喪失など，酪農経営に及ぼす打撃は果の有無や安全性などは不明である。
本研究では，利用用途のないＦ１卵子を用いた直接的である。
長期不受胎牛の中には，疾病による繁殖不良のPA胚を追い移植に用いることを追求し，双子受雌と生殖器および発情周期の異常がないにも関わ胎によるリスク回避手法の開発や基礎的知見を得らず３回以上の人工授精で受胎しないリピートブ

ることを目的とし，①PA胚のIFNT産生能力，②

リーダーとに大別されるが，後者は全乳用牛飼養

PA胚を追い移植することでAI由来胚の受胎や妊頭数の15―20％も存在していると推定されてい娠維持に悪影響はないのか，③PA胚移植には

１）

る 。

IFNTを補充する効果があるのか，の３点を検討

一方，乳用種雌牛は性選別精液で純粋交配を行した。

い後継牛の効率的な確保のみならず，胚移植による和牛生産や黒毛和種精液を人工授精する交雑種

２．方法（Ｆ１）生産のための資源としての重要性が増し

2.1

ている。

2 . 1 . 1 牛体外受精胚卵ならびにPA胚の作製

これら，長期不受胎牛への対処方法の確立は，
我が国畜産業の抱える喫緊の課題である。

実験１

牛未成熟卵子を卵巣の卵胞から吸引採取し，TCM199＋５％FBS添加培地（基礎培地）中で22

最近，リピートブリーダーに対し人工授精後７～24時間の成熟培養を行い，成熟卵子とした。次～８日に受精卵移植を行う“追い移植”により受いで，以下の方法により体外受精ならびに単為発胎効果が見られ，リピートブリーダーに対する実生処理を行った。

用的な繁殖対策になり得ることが考えられてい体外受精は，既報に基づき行った４）。

る１，２）。追い移植の実施によって妊娠成立に至る

単為発生処理は，成熟卵子の裸化処理を施し，機序は不明であるが，追い移植由来の胚から生産

７％エタノール添加PBS（＋）中に１分間浸漬されるインターフェロンタウ（IFNT：胚から産し，次いでシクロヘキシミド（10µg/ml）および生される妊娠認識物質 ）が積極的に妊娠成立へサイトカラシンＢ（５µg/ml）添加基礎培地中で関与することが予想される。一方，追い移植では５～６時間培養した。

３）

子宮内に人工授精および受精卵移植由来の２つの体外受精胚（以下，IVF胚）ならびに単為発生

胚が共存する可能性が想定され，双子発生による処理胚は，ともに基礎培地中で卵丘細胞との共培分娩事故の発生の可能性が否定できない。

養を７～８日間行い，胚盤胞までの発生を促し© The Ito Foundation

長期不受胎牛の受胎率向上に向けた単為発生胚移植の効果た。培養終了後，遺伝子発現解析のために胚を回
収した。
2.1.2

遺伝子発現解析のために細胞を回収した。
2.3

凍結保存

185

実験３

東京農業大学付属農場の黒毛和種雌牛を使用作製した胚盤胞期のIVF胚ならびにPA胚の凍し，①AI単独区（ｎ＝６），②PA胚移植区（ｎ結保存は，以下の方法で行った。すなわち，修正＝４）ならびに③AI＋PA胚移植区（ｎ＝15）を

TCM-199＋20％子牛血清を基礎培地とし，10％設定した。

グリセロール＋0.25Ｍシュクロース添加基礎培地

発情日をDay０とし，AIをDay１に，PA胚移（凍結培地）中でグリセリン平衡を行い，凍結培

植（非黄体側子宮角に移植）をDay７に実施し地とともに0.25mlストローに胚を吸引，封入した。

た。Day7，Day14，Day21およびDay28に継時的

次いで－６℃に設定したプログラムフリーザーにに採血を行い，血漿中プロジェステロン（Ｐ４）ストローを導入し，植氷後－0.33℃／分で－25℃

濃度をEIA法で測定した。また，末梢血白血球かまで緩慢冷却し，液体窒素中にストローを投入しらRNAを抽出し，リアルタイムPCR法を用いてて凍結保存した。

IFNT応答遺伝子であるMx2 mRNA発現を解析

凍結前および融解後の胚からRNAを抽出し，した。発情周期が回帰しない個体は，Day40におリアルタイムPCR法を用いてIFNT mRNA発現をいて超音波画像診断装置で子宮内を観察し，胚の解析した。

有無を検証することで妊娠鑑定を行った。

2.1.3

培養上清の回収IVF胚ならびにPA胚の発生培養を終えた後，それぞれの培養液を回収し，－20℃で保存した。
2.2

実験２

３．結果と考察
3.1

PA胚のIFNT産生能力の検討

IVF胚およびPA胚を作製し，凍結前および凍免疫細胞の単離のために雌牛の脾臓を用いた。
脾 臓 組 織 約 100 ｇ を 切 り 出 し ，0.25 ％ ヘ パ リ ン

結後における胚のIFNT mRNA発現量をリアル
タイムPCR法で測定した（Fig.１）。

-PBSを加えながら懸濁し，懸濁液を70µmフィル

凍結前では，IVF胚よりPA胚でIFNT mRNA

ターで濾過して遠心処理を行った。次いで上清を発現量が３倍程度高かった。凍結後は凍結前より除 去 し ，溶 血 さ せ る た め に ACK Lysing Bufer

もIFNT mRNA発現量が低下したが，凍結前と同3mLを加え10分間静置後，再び0.25％ヘパリン

様にIVF胚よりもPA胚でIFNT mRNA発現量が-PBSを添加して遠心処理を行った。さらに上清高かった。

を除去し，0.25％ヘパリン-PBSで洗浄し，免疫細胞を単離した。

PA胚はIVF胚と同等以上のIFNT産生能力を有することが報告されていることから５），PA胚は免疫細胞の培養には，抗生物質と５％FBS添加のRPMI－1640を基礎培地として用いた。免疫細効率的にIFNTを産生するツールである可能性が考えられた。

胞は，１×10 cell/wellの濃度で48wellプレート

胚から産生されたIFNTは子宮内で働くだけでに播種した。IVF胚およびPA胚が免疫細胞に及はなく，子宮静脈から全身に放出され，免疫細胞

ぼ す 影 響 を 検 討 す る た め ，回 収 し た 培 養 上 清や黄体組織など様々な細胞・組織に影響を及ぼ（Condition medium）を免疫細胞培養液中に添加す。本研究で作製したPA胚がIFNTを産生し，そして６ならびに24時間培養し，培養液を除去しての他の細胞に影響を及ぼすことが可能であるかを

７© The Ito Foundation

186

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 1 IFNT mRNA expression in IVF- or PA-derived embryos.

Fig. 2 ISG15 mRNA expression in bovine spleen cells at 6 and 24 h after treatment of IVF- or PA-

embryo derived condition medium.

検討した（Fig.２）。IVF胚およびPA胚の培養液ている。PA胚から産生されたIFNTも同様に，免を免疫細胞に添加し，６および24時間後のISG15

疫細胞の機能変化を誘導できる可能性が考えられ

mRNA発現量を検証した。一般的に，IFNTを含た。

むＩ型IFNは細胞膜の受容体に結合し，ISG15や3.2

Mx２などのIFN応答遺伝子の発現を刺激するこDay40において受胎が確認された個体は，①AIとから，ISG15やMx２はIFN応答の指標と考える

単独区で４頭（ｎ＝６），②PA胚移植区で０頭ことが可能である。本実験において，どちらの培（ｎ＝４），③AI＋PA胚移植区で９頭（ｎ＝15）

養液を添加しても対照区よりもISG15 mRNA発であった。①と③の受胎率に有意な差は見られな

現量が増加した。このことから，IVF胚およびかった。

Ａ胚移植後の血中Ｐ４濃度の測定

PA 胚 の 培 養 液 中 に は IFNT が 分 泌 さ れ ，そ のPA胚移植区では，発情周期の延長効果が見ら

IFNTは免疫細胞への応答性を有することが明られたものの超音波画像診断による受胎産物は確認かになった。

されなかった。

IFNTは“異物”である受胎産物が母体から拒AI＋PA胚移植区で受胎が確認された牛は，全絶されないよう，母体の免疫細胞に作用すること

頭で妊娠が継続し分娩に至った。また，難産などで「妊娠免疫寛容」を誘導する可能性が提案されは見られず，子牛も順調に成長をしていることを© The Ito Foundation

187

長期不受胎牛の受胎率向上に向けた単為発生胚移植の効果確認した。Hirayamaらは６），Code３の受精卵とは黄体からのＰ４分泌を刺激しないことが分かっ

PA胚（３個）を共移植すると，Day40の時点でている７）。１つの可能性として，黄体機能維持やは妊娠率が上昇したが，Day90においては逆に流妊娠認識に重要なプロスタグランジン（PG）Ｅ

産した個体が増加したと報告している。今回実施

２が考えられる８）。実際に，IFNTはPGE２産生

したAI＋PA胚移植区の受胎率は60％であり，妊を子宮内で増加させ，PGE２は黄体細胞のＰ４合娠150日～210日までの時点で流産を起こした個体

成を刺激する作用を持つ９）ことから，IFNTで誘はいなかった。今回の研究結果と直接の比較は条導されたPGE２がオートクライン因子として黄体件が異なるために困難ではあるが，１個のPA胚に作用し，Ｐ４合成・分泌を刺激した可能性が考を追い移植で用いたことから子宮内で過剰な炎症えられる。また興味深いことに，長期不受胎牛で応答やそれに続く流産が起きず，PA胚の移植に

は子宮内膜上皮細胞中のPGE２合成酵素の遺伝子

対する安全性では問題がないと判断することがで発現量が少なく，黄体を維持するPGE２の合成がきた。

少ないために早期胚死滅が起こると報告されてい血中Ｐ４濃度の推移をTable１に示した。Day21

る 10）。AI＋PAにおいてＰ４濃度が上昇したこと

における血中Ｐ４濃度は，AI＋PA胚移植区の不から，長期不受胎牛で合成が少ないとされている受胎よりも受胎した牛において有意に高かった。

PGE２を上昇させることで妊娠成立を向上させる

Day28では，AI＋PA胚移植の不受胎およびPA胚可能性が期待される。しかし，今回実験で使用し移植区の血中Ｐ４濃度は２ng/mL以下まで低下たのは長期不受胎ではない正常な黒毛和種雌牛でした。AI＋PA胚移植区の受胎およびAI受胎区であるため，今後は長期不受胎と判断されたホルスはDay28においても高い血中Ｐ４濃度を維持した

タイン種雌牛を用いて，より詳細な検討を実施す

が，AI＋PA胚移植の受胎区で有意に高い値だっる必要がある。

た。

3 . 3 末 梢 血 白 血 球 に お け る IFNT 応 答 遺 伝

Day21およびDay28においても同様に，PA胚追い移植で受胎した区でAI受胎区よりも高いＰ
４濃度を維持したことから，AI由来およびPA由子・Mx2 mRNA発現変動の検討
末梢血白血球中のMx2 mRNA発現量の推移を
Fig.３に示した。

来の胚が共存した場合には，何らかの方法で黄体

AI 単 独 区 で 受 胎 し た 牛 で は ，Day21 で Mx2

機能（Ｐ４分泌）が刺激される機構が存在する可mRNA発現が増加したが，不受胎の牛（data not

能性があると考えられる。PA胚を追い移植した

shown）では変化は見られなかった。PA胚移植

Ｐ４刺激効果の候補因子としてはIFNTが想定さ区では，Mx2 mRNA発現はほとんど変動しなかっれるが，in vitroの実験においてIFNTは直接的にた。AI＋PA胚移植区の不受胎の牛では，Day７

Table 1 Plasma P4 concentrations at Days 7, 14, 21, and 28 after AI
Plasma P4（ng/ml）

Day 7

Day 14

Day 21

Day 28

AI：Pregnancy

1.5＋0.5

3.6±0.6

4.7±0.7a，b4.1±0.7ｂ

PA：Non pregnancy

2.0±0.5

3.4±0.6

1.3±0.6ｃ

1.8±0.5ｃ

AI+PA：Pregnancy

2.6±0.4

6.7±0.4

6.5±1.1ａ

7.2±1.1ａ

5.5±1.1

3.7±0.6ｂ

1.8±0.6ｃ

AI+PA：Non pregnancy

1.8±0.3© The Ito Foundation

188

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 3 Mx2 mRNA expression in bovine blood immune cells.

からDay28にかけてMx2 mRNA発現が徐々に増PA胚を追い移植することでPA胚由来のIFNT補加した。一方，AI＋PA胚移植区で受胎した牛の充効果が得られることが明らかとなった。

Mx2 mRNA発現はDay21で大きく増加した。AI

今後，リピートブリーダーを用いてPA胚追い＋PA胚移植区の受胎した牛のMx2 mRNA発現移植を実施することで，PA胚を追い移植するこは，その他の実験区と比較し，Day21で約３倍以とによる受胎性向上効果があるのか，その分子メ上高かった。

カニズムを解明する必要がある。

反芻家畜の妊娠認識時期において，子宮から放出されたIFNTは，生体の様々な組織や細胞（肝臓・乳腺・黄体・末梢血白血球）においてIFN応
答遺伝子の発現を刺激することが報告されている 11 ～ 14）。ま た ，過 去 の 報 告 に お い て ，PA 胚 は
IFNTを産生し，母体末梢血白血球のIFN応答遺伝子mRNA発現を上昇させることが分かっている６）。
今回の解析では，Mx2 mRNA発現はAI受胎区
よりもPA胚を追い移植した受胎区が高い値で推移した。つまり，AI由来胚と共同して，PA胚由来で分泌されたIFNTが相加的にMx2 mRNA発現を刺激した可能性がある。PA胚のIFNT産生量
やMx2 mRNAの刺激機構など，今後の詳細な検討が必要である。
以上の結果から，PA胚を移植しても産子にはならず，AI由来胚の妊娠に悪影響を及ぼす可能性が低いことが明らかとなった。また，AI後に参考文献１） Dochi, O., Takahashi, K., Hirai, T., Hayakawa, H.,
Tanisawa, M., Yamamoto, Y., Koyama, H.：The useof embryo transfer to produce pregnancies in
repeat-breeding dairy cattle, Theriogenology ，69 ，
124～128，2008.
２） Hamano, S.：追い移植による繁殖救済，日本胚移植学誌，38，６，2016.
３） Imakawa, K., Anthony, R. V., Kazemi, M., Marotti,
K. R., Polites, H. G., Roberts, R. M.：Interferon-likesequence of ovine trophoblast protein secreted byembryonic trophectoderm, Nature，330，377～379，
1987.
４） Hamano, S., Kuwayama, M. ： In vitro fertilizationand development of bovine oocytes recovered fromthe ovaries of individual donors：A comparison
between the cutting and aspiration method,
Theriogenology，39，703～712，1993.
５） Kubisch, H. M., Rasmussen, T. A., Johnson, K.
M.：Interferon-tau in bovine blastocysts following
parthenogenetic activation of oocytes：pattern ofsecretion and polymorphism in expressed mRNA
sequences, Mol Reprod Dev，64，79～85，2003.
６） Hirayama, H., Moriyasu, S., Kageyama, S., Sawai,K., Takahashi, H., Geshi, M., Fujii, T., Koyama, T.,
Koyama, K., Miyamoto, A., Matsui, M., Minamihashi,
A.：Enhancement of maternal recognition of© The Ito Foundation

長期不受胎牛の受胎率向上に向けた単為発生胚移植の効果
pregnancy with parthenogenetic embryos in bovine
embryo transfer, Theriogenology，81，1108～1115，
2014.
７） Shirasuna, K., Matsumoto, H., Matsuyama, S.,
Kimura, K., Bollwein, H., Miyamoto, A.：Possible roleof interferon tau on the bovine corpus luteum andneutrophils during the early pregnancy,
Reproduction，150，217～225，2015.
８） Arosh, J. A., Banu, S. K., Kimmins, S., Chapdelaine,P., Maclaren, L. A., Fortier, M. A.：Effect ofinterferon-tau on prostaglandin biosynthesis,
transport, and signaling at the time of maternal
recognition of pregnancy in cattle：evidence ofpolycrine actions of prostaglandin E2,
Endocrinology，145，5280～5293，2004.
９） Spencer, T. E., Burghardt, R. C., Johnson, G. A.,
Bazer, F. W.：Conceptus signals for establishment andmaintenance of pregnancy, Anim Reprod Sci，82-83，
537～550，2004.
10） Wagener, K., Pothmann, H., Prunner, I., Peter, S.,
Erber, R., Aurich, C., Drillich, M., Gabler, C.：
Endometrial mRNA expression of selected proinflammatory factors and mucins in repeat breeder
cows with and without subclinical endometritis,
Theriogenology，90，237～244，2017.

18911） Shirasuna, K., Matsumoto, H., Kobayashi, E.,
Nitta, A., Haneda, S., Matsui, M., Kawashima, C.,
Kida, K., Shimizu, T., Miyamoto, A.：Upregulation ofInterferon-stimulated Genes and Interleukin-10in
Peripheral Blood Immune Cells During Early
Pregnancy in Dairy Cows, J Reprod Dev ，58 ，84 ～
90，2012.
12） Yankey, S. J., Hicks, B. A., Carnahan, K. G., Assiri,
A. M., Sinor, S. J., Kodali, K., Stellflug, J. N., Ott, T.
L.：Expression of the antiviral protein Mx inperipheral blood mononuclear cells of pregnant andbred, non-pregnant ewes, J Endocrinol, 170, R711，2001.
13） Yang, L., Wang, X. L., Wan, P. C., Zhang, L. Y.,
Wu, Y., Tang, D. W., Zeng, S. M.：Up-regulation of
expression of interferon-stimulated gene 15 in thebovine corpus luteum during early pregnancy, J
Dairy Sci，93，1000～1011，2010.
14） Bott, R. C., Ashley, R. L., Henkes, L. E.,
Antoniazzi, A. Q., Bruemmer, J. E., Niswender, G. D.,
Bazer, F. W., Spencer, T. E., Smirnova, N. P.,
Anthony, R. V., Hansen, T. R.：Uterine vein infusionof interferon tau （IFNT）extends luteal life span inewes, Biol Reprod, 82，725～735，2010.

© The Ito Foundation

190

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明
Effect of antioxidant supplementation on quality improvement ofcryopreserved bull semen

武

田

久美子・西

野

景

知＊・今

井

昭＊＊

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，
茨城県畜産研究センター肉用牛研究所，＊＊広島県立総合技術研究所畜産技術センター）＊

Kumiko Takeda, Kagetomo Nishino＊ and Akira Imai＊＊（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, Beef Cattle Institute,＊Ibaraki Prefectural Livestock Research Center, ＊＊Hiroshima Prefectural Livestock Research Center）

It is known that spermatozoa suffer various damage by freezing. It is thought that seminal
plasma containing excessive reactive oxygen species（ROS）induces oxidative stress andincreases sperm nuclear DNA damage during the manufacturing process of frozen semen. The
aim of this study was to clarify the efficiency of antioxidants, such as reduced glutathione（GSH）and astaxanthin supplemented to bull spermatozoa before freezing, to improve
fertilization ability after artificial insemination. Semen was collected from each of three bulls
and the freezing extender was supplemented with GSH before the cooling step ofcryopreservation process. We assessed the sperm motility, DNA fragmentation index（DFI）,
and developmental ability of embryos after in vitro fertilization（IVF）. The supplementation of
GSH to the freezing extender did not affect sperm motility, however, DFI showed a significant
increase in one of the bulls. Nonetheless, developmental rate of IVF embryos was improved inall bulls, the degree of effect showed difference among bulls and ejaculates. We examined theuse of lipid-soluble astaxanthin by solvents, commercially available water-soluble solutions, andegg yolks containing high astaxanthin. The use of egg yolks containing high astaxanthin had
no adverse effect on motility. The results suggest that supplementation of antioxidants tosemen cryopreservation extender has a beneficial and protective effect on bull sperm fertility.

１．目

低いものが存在している。凍結融解後の精液は活的力が凍結前の25－75％に低下し，精子機能が低下

わが国における牛の人工授精による受胎率はこする。凍結精液の製造過程もしくは利用時に過剰こ15年間で低下し続けており，受胎率の向上に向な活性酸素種（ROS）を含む精漿が酸化ストレ

けた取り組みは急務である。種雄牛候補の一部にスを惹起し，精子の成熟，先体反応，運動性など

は，精液性状が正常でも凍結ダメージを受けやすに影響を及ぼすとともにDNAダメージを与え

いもの，また人工授精に使用してみると受胎性のる１，２）。ヒトの男性不妊の多くはROSによる精子© The Ito Foundation

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明

191

核DNAダメージによるものであると考えられてう添加し，凍結を経ない場合の精子運動性への影

おり，妊娠率の低下，胚発達の障害，流産に関係

響をSMASで測定した。

すると指摘されている３，４）。近年，還元型グルタチオン（GSH）等の抗酸化物質の添加によって精子の受精能を改善しようとする試みが行われており，その効果が期待されている

2 . 2 GSH添加凍結精液のDNAダメージ率の測定
精子核DNAダメージを検出する方法として，。そこで申末端トランスフェラーゼによってDNA断片化を請者らは，牛凍結精液製造時にあらかじめ抗酸化標識する方法（TUNEL法）を用いた ４，７）。凍結物質を希釈液へ添加することにより凍結融解時に精液を融解後，蛍光標識によるTUNEL法の市販キッ発生する酸化障害を低減すれば，結果的に牛凍結

ト（In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein,

保存精液の人工授精や体外受精の効率アップに繋

Roche社）を用い，既報に従って染色を行った８，９）。

がるのではないかと考えた。しかし，抗酸化物質

TUNEL陽性精子（＝DNA断片化あり）は蛍光顕の利用にあたりその効果やマイナス面について詳

微鏡下（Ｂ励起蛍光フィルター）において検出細な検討はされていない。また，脂溶性抗酸化物

し，DNA断片化指数（DFI）値を求めた。

５，６）

質については培養液や凍結精液希釈液へ容易に溶解しないため，研究はあまり進んでいない。本研2 . 3 凍結前後でGSHを添加した精液を用いた体外受精試験

究課題では，精子受精能向上効果の期待できる

2 . 1で作成したGSH添加凍結精液について既報

GSHの利用性を明らかにするとともに脂溶性抗に従い体外受精試験を行った10）。15℃で一晩保存

酸化物質であるアスタキサンチン（Ax）の利用したと場由来卵巣より未成熟卵子を吸引採取し，方法について検討を行うことを目的とする。

24時間成熟培養した。成熟卵子を20 mg/ml BSA

２．方および10 IU/mlノボヘパリン（持田製薬）を含法

むBO培地に移した。凍結融解後の精液は10mM

2 . 1 GSHを添加した凍結精液の製造および運

カフェインを含むBO培地で２回洗浄し，精子濃度を１×10７/mlに希釈した。希釈精子を卵子の動性への影響農研機構畜産研究部門で飼養している３頭の雄ドロップに等量加え，５時間38.5℃，5％CO２ の牛（Ｎ１～Ｈ３）より採取した新鮮精液を凍結試

インキュベーター内で共培養を行った。その後，験に用いた。精液の凍結方法は家畜人工授精講習

受精卵はIVD101培養液（機能性ペプチド研）で会テキスト（一般社団法人日本家畜人工授精師協

38.5℃，5％CO２ ，5％Ｏ２ のインキュベーター内会）を参考にし，手動で行った。精液と混合するで培養し，培養２日目の分割数および８日目の胚前の希釈液に最終濃度が1，5，10 mMとなるよ

盤胞期数を調査した。

うGSH（SIGMA）を添加した（GSH添加凍結精凍結融解後の精子にGSH添加した場合の体外液）。凍結精液を38℃の温湯中で融解後，精子運受精への効果をみるため，GSHを添加していない

動性を精子運動解析装置（SMAS牛用，富士平工

凍結精液の融解後に1，5，10 mMとなるようGSH業）で測定した。精子の活力は運動活発性（４段を添加し，既報６）に従って37℃で30分インキュ階分類）への重み付けにより算出した。

ベートした。その後，BO培地で２回洗浄し，体また，雄牛（Ｎ１，Ｎ２）より採取した新鮮精液を50倍希釈し，GSHを1，5，10 mMとなるよ外受精試験に用いた。
2 . 4 GSHの添加が体外受精胚発生率へ与える© The Ito Foundation

192

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

影響～種雄牛や採取ロットの違い～

釈液に用いた。

広島県立総合技術研究所畜産技術センターでは，種雄牛や採取ロットの違いにおける体外受精①～③の方法で作成した凍結精液を融解し，精子運動性をSMASで測定した。

胚発生率への影響について精査を行った。まず，雄牛（Ｎ１，Ｎ２）より採取した新鮮精液を50３頭の種雄牛（Ｈ１～Ｈ３）から採取月齢の異な倍希釈し，前述の方法でAxを添加し，凍結を経る各３ロットの凍結精液を用いて種雄牛および採ない場合の精子運動性に及ぼす影響をSMASで測取ロットによる体外受精胚発生率の違いについて定した。Ax/Dの代わりに，細胞毒性のより低い

検 討 し た 。体 外 受 精 手 法 は 従 来 法 に 従 い 行 っと考えられるテトラヒドロフラン12）でAx粉末をた11）。続いてそのうち２頭の種雄牛（Ｈ１，Ｈ２）

溶解したもの（Ax/T）を用いた。Ax/Tについについて採取月齢の異なる各２ロットの凍結融解て は 最 終 濃 度 （w/w） を 0.0001％， 0.005％，

後の精液に2 . 3 と同様の方法でGSH処理を行い0.001％となるように溶解液を0.1 µL/mL，1 µL/（１mM，５mM），体外受精胚発生率への効果を

mL，5 µL/mL添加した。Ax/AおよびAx/Bは原検討した。また，２頭の種雄牛（Ｈ１～Ｈ２）に液を，0.5 µL/mL，5 µL/mL，25 µL/mL添加しついて採取日の異なる各３ロットのGSHを添加たが，原液の濃度は異なっていたため，最終濃度した凍結精液を作成し，融解後の運動性について（w/w）はそれぞれ，Ax/A；0.00055％，0.0055％，

調査した。

0.0275％，Ax/B；0.000265％，0.00265％，0.01325％

2 . 5 アスタキサンチンを凍結精液希釈液に添となった。
Ax/A，Ax/B，Ax/Eを用いた方法で作成した加する方法の検討
脂溶性抗酸化物質であるアスタキサンチン（Ax）は以下の３つの方法を用いて希釈液への添

凍結精液を融解し，2 . 2 と同様に，蛍光標識によるTUNEL法によりDFIを求めた。
Ax/D，Ax/A，Ax/Eを用いた方法で作成した加を行い凍結精液を製造した。
①Ax粉末（WAKO）を有機溶媒（ジメチルス
ルホキシド，DMSO；Ax/D）に溶解させた後に凍結精液を融解し，2 . 3 と同様に，体外受精試験を行った。

希釈液へ添加した。Ax/Dについては1％（w/w）

2 . 6 アスタキサンチン高含有鶏卵を用いた精を１次希釈液に５µL/mL，10 µL/mL，40 µL/mL

液凍結法が精子運動性へ与える影響～種雄

添加し，最終濃度（w/w）を0.0025％，0.005％，

牛や採取ロットの違い～

0.020％とした。

茨城県畜産センター肉用牛研究所においては牛②水溶化Ax（A社製；Ax/AおよびＢ社製；

凍結精液の製造を機械化しており，均一な品質のAx/B）を希釈液へ添加した。Ax/Aについては１

凍結精液製造が可能なことから，Ax/Eの利用性

次希釈液に１µL/2 mL，10 µL/2 mL，50 µL/2 mLについて種雄牛や採取ロットによる違いの詳細な添加し，最終濃度（w/w）は0.000275％，0.00275％，

検討を行った。５頭の種雄牛（Ｉ１～Ｉ５）につ0.01375％とした。また，Ax/Bについては１次希

いて採取日の異なる３～７ロットの精液につい釈液に２µL/2 mL，20 µL/2 mL，100 µL/2 mL添て，通常卵およびAx/Eを用いた希釈液による凍加し，最終濃度（w/w）は0.000265％，0.00265％，

結精液製造を行った。凍結融解後，牛精子画像解0.01325％とした。

析装置（C-IMAGING，コンピックス社製）によ③Ax高含有鶏卵（市販品，Ax/E）の卵黄を希り生存性（運動精子数率）および運動性（移動速© The Ito Foundation

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明

度）を計測した。

193なったとも考えられた。TUNELでの評価においてはGSHの添加が精子凍結融解の際のDNAダ

３．結果と考察

メージの低減とはならないことが示唆された。

3 . 1 精液へのGSH添加が精子運動性に及ぼす

3 . 3 凍結精液へのGSH添加が体外受精胚発生

影響率へ与える影響雄牛（Ｎ１，Ｎ２）より採取した新鮮精液に精液の凍結前にGSHを添加した場合，全３頭のGSHを添加した場合，精子生存率および活力への雄牛で体外受精後の胚発生率への効果が認められ

影響はみられなかった（p＞0.05）。また，雄牛（Ｎ

た（Fig.２，Ｎ１～Ｎ３）。体外受精後の胚盤胞２）由来のGSH添加凍結精液について融解後の期胚発生率の低いＮ２で凍結希釈液へのGSH添

運動性をSMASで計測したところ，１mMの添加

加効果は最大であり，10 mM添加区で最も高かっ区で移動速度が若干上がる傾向がみられたが，精た。Ｎ２は，3 . 2 の結果から，GSH添加によって子運動性への影響はみられなかった。

DFI値が非常に高くなる結果が得られたが，体外受精後の胚発生率への悪影響はみられず，逆に向3 . 2 GSHを添加した凍結精液のDNAダメージ

上する結果となった。

率の測定
雄牛（Ｎ１～Ｎ３）由来のGSH添加凍結精液

一方，Ｎ２について凍結融解後の体外受精前にについて融解後のDFIを調査したところ，雄牛Ｎ

GSH添加処理を行ったところ，体外受精胚発生率２の２ロットでGSH添加によるDFI値が約70％とへの影響は１mM区で最大となることが示唆さ

著しい増加がみられた（Fig.１）。3 . 1 で計測した

れ，効果が示された（Fig.２，Ｎ２ʼ）。

Ｎ２凍結精液の生存率が30％程度だったことか

3 . 4 GSHの添加が体外受精胚発生率へ与えるら，死亡精子核内に滲入したGSHによりDNAの影響～種雄牛や採取ロットの違い～

Ｓ-Ｓ結合が脆弱化されDFI値＝非生存精子率と３頭の種雄牛（Ｈ１～Ｈ３）の凍結精液を体外

100

DFI (%)

80
60
40
20
0

N1
Fresh

N3
0mM

1mM

N2‒1
5mM

N2‒3

10mM

Fig. 1 The DNA fragmentation index（DFI）analyzed by TUNEL in

fresh semen, and frozen-thawedsemen supplemented with GSH,
obtained from three bulls（N1, N2, N3）.

© The Ito Foundation

194

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

受精に用いたところ，発生率には種雄牛による違次にロット差のみられたＨ１と胚盤胞発生率のいがみられた。すなわち，Ｈ１は分割率において他低かったＨ２について凍結融解後の精液にGSHの種雄牛より低い値を示した（68.8％ vs. 82.9％，

処理を施し，体外受精胚発生率を調査した結果，88.6％，p＜0.01）が，胚盤胞発生率においては分割率や胚盤胞発生率の低いロットでGSH添加

Ｈ２がＨ１より低い値を示した（23.7％ vs. 33.6％，

効果が認められるなど発生率改善への効果が認め

p＜0.05）。また，Ｈ１については分割率にロットられた（Table１）。

差がみられた。

A）

B）

100

100

60

a

a

b

a

80

b
c

aa

b

b

40

b

20

a
ac

c

a

0

N1

N3
1mM

0mM

N2
5mM

Blastocyst ％b

80

Cleaved ％そこで，これらの種雄牛（Ｈ１，Ｈ２）につい

10mM

60
40
20

b
a

0

N2'

b

b
a

N1

a

0mM

N3
1mM

b

b b

N2
5mM

ab

a

10mM

a

N2'

Fig. 2 Comparison of IVF results among bull spermatozoa obtained from three bulls（N1, N2, N3）supplemented withor without GSH（0, 1, 5, 10 mM）before freezing steps, and, bull spermatozoa（N2ʼ）treated with or without GSH（0, 1, 5, 10 mM）just before IVF.A）Percentage of embryo cleavage（％of total incubated embryos）,B）Percentageof blastocyst development（％ of total incubated embryos）.abc ； Bars within each bull with different letters differ（p＜0.05）.

Table 1 IVF results of frozen-thawed bull spermatozoa treated with GSH before IVF.
Bull

Age
(months）

Ｈ１

16.6

61.8

Ｈ２

33.3

70.0

GSH

Motility
before IVF（+++％）

Total
oocytesCleaved（％）

Blastocyst

（％）

０mM
１mM
５mM

23.3
31.7
31.7

84
84
81

68
75
69

（81.0）（89.3）（84.0）

33
36
30（39.3）（42.9）（37.0）

０mM

22.5

95

43

ａ
（45.3）

１mM
５mM

24.4
23.8

102
101

65
78

（63.7）ｂ
（77.2）ｂ15
20
33（15.8）ａ（19.6）ab（32.7）ｂ

０mM
１mM
５mM

30.0
35.0
35.0

86
93
89

74
82
76

（86.0）（88.8）（85.4）

28
32
28（32.6）（34.4）（31.5）

０mM

23.8

101

54

ａ
（53.5）

１mM
５mM

26.9
26.3

96
94

66
65

ｂ
（68.8）ｂ（69.1）

20
23（19.8）（24.0）

26（27.7）

a, b；Numbers within columns with different superscripts differ（p＜0.05）.

© The Ito Foundation

195

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明て GSH 添 加 凍 結 精 液 の 製 造 を 各 ３ ロ ッ ト ず つ

精液へのAx/A，Ax/Bの添加では添加量に伴っ行った。凍結融解後の精子運動性を調査したとこて運動性が低下すること，細胞毒性の低いと考えろ，GSH添加による運動性低下はみられなかった。

られるAx/Tの場合，一部運動性の改善がみられた（Fig. 3 A）。

3 . 5 アスタキサンチンを凍結精液希釈液に添

Ax/A，Ax/B，Ax/Eにより凍結前にAxを添加する方法の検討①Axを有機溶媒に溶解し（Ax/D, Ax/T），希

加した場合，凍結融解後の精子運動性は，Ax/A

釈液へ添加した場合，顕微鏡下の観察でAxの結やAx/Bを用いた場合は無添加区より低くなる傾晶の析出が観察された。次に②水溶性Ax（Ax/A,

向がみられたが，Ax/Eを用いた場合は運動性へ

Ax/B）および③Ax高含有鶏卵（Ax/E）についの悪影響はみられなかった（Fig. 3 B）
。また，ては希釈液に添加後も顕微鏡下でAxの結晶は観DFIを検討したところ，精子DNAダメージへの察されず，十分溶解していると考えられた。

悪影響はみられなかった。

A)

N1

AX/A

100

50

0

N2

AX/T

100

50

0

1

10

50

0

50

0

1

10

0

50

100

100

100

50

50

50

0

B)

0

1

10

0

50

0

1

10

0

50

100

50

50

50

1

10

N2

1

10

50

0

1

10

50

Ax/E

100

0

0

Ax/B

Ax/A

100

0

AX/B

100

50

0

0

1

10

50

N2

0

C

Ax/E CN1

Ax/E C

N2‒1

Ax/E

N2‒2

Fig. 3 A） Motility of fresh ejaculated spermatozoa（N1 and N2）supplemented with astaxanthin（Ax/A,

Ax/B, and Ax/T）measured by SMAS. Ax/A and Ax/B, commercially available water-soluble
solutions;Ax/T, dissolved in tetrahydrofuran. B）Motility of frozen-thawed spermatozoa supplemented
with astaxanthin（Ax/A, Ax/B, Ax/E）. Spermatozoa（N2）were supplemented with Ax/A and Ax/B.
Spermatozoa（N1, N2-1，and N2-2）were frozen using control egg yolk（C）, or astaxanthin-rich egg
yolk（Ax/E）.

© The Ito Foundation

196

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 2 Sperm motility parameters measured by CASA. Spermatozoa were frozen

using control egg yolk, or astaxanthin-rich egg yolk（Ax/E）．
Viability（％）

Velocity（µm/s）

Bull

Age
(months）

Control

Ax/E

Control

Ax/E

IB１

26.6

62.2±3.760.8±6.8

102.8±18.9

92.2±15.0

IB２

28.8

62.9±3.3

63.6±3.5

100.7±16.5

94.8±4.0

IB３

61.3

60.2±1.754.4±15.1

94.2±9.374.1±29.1

IB４

81.3

57.4±1.8ａ

66.3±3.7ｂ

92.8±13.878.4±8.5

IB５

88.6

60.2±3.556.6±5.988.6±10.078.9±23.8

a, b；Numbers within columns with different superscripts differ（p＜0.05）.

Ax/D，Ax/A，Ax/EによるAx添加凍結精液を示す雄牛もしくは採取ロットについてGSH添について，体外受精後の胚発生率を検討したとこ

加効果が高いことが明らかとなった。しかし体外

ろ，Ax/Dでは添加効果がみられなかったが，受精において効果のみられた１頭の雄牛ではかAx/AおよびAx/Eでは分割率において効果のみ

えってGSH添加に伴いDNAダメージの検出されられるものもあった。

る精子が増える結果となった。体外受精前のGSH

以上はまだ検討段階であるが，精子に与えるダ処理効果に雄牛やロットによっての違いがみられ

メージの少なさ，体外受精胚発生率への効果かたことから，今後，添加効果の期待できる雄牛をら，Ax/E利用が有利と考えられた。

対象としてGSHを添加した凍結精液を製造し，受3 . 6 アスタキサンチン高含有鶏卵を用いた精液凍結法が精子運動性へ与える影響～種雄

精能への効果を検証する。
脂溶性抗酸化物質であるアスタキサンチンの添加方法については，有機溶媒や水溶化製品の利用

牛の違い～
精液凍結時にAx/Eを利用した場合の精子運動には運動性低下の影響がみられ，凍結希釈液にア性に与える影響を精査した結果，Ax/Eの使用にスタキサンチン高含有卵黄を用いた凍結方法の有よる生存率および移動速度の変動は採取日によっ利性が示された。今後はアスタキサンチン高含有て異なっていた。雄牛ごとの調査では，５頭中１鶏卵を用いた凍結精液について精液の品質や受精頭で生存率が高くなるものもみられた（Table２）。

能への効果を検証する。

４．要

約

本研究は，凍結精液の製造過程で抗酸化物質をあらかじめ添加することで，凍結融解時に精子が受ける酸化ダメージを低減し，受精能を改善することが目的である。抗酸化物質である還元型グルタチオン（GSH）の添加が牛凍結精液の品質に与える影響を，精子活力，精子生存率，DNAダ
メージ，体外受精による胚発生率等を指標として精査した。その結果，体外受精において低発生率

文献１） Chenm S. J., Allam, J. P., Duan, Y. G., Haidl, G.：
Influence of reactive oxygen species on humansperm functions and fertilizing capacity including
therapeutical approaches, Arch Gynecol Obstet，288，
191～199，2013.
２） Silva, P. F., Gadella, B. M., Colenbrander, B.,
Roelen, B. A.：Exposure of bovine sperm to prooxidants impairs the developmental competence ofthe embryo after the first cleavage, Theriogenology，
67，609～619，2007.
３） Henkel, R., Hajimohammad, M., Stalf, T.,
Hoogendijk, C., Mehnert, C., Menkveld, R., Gips, H.,© The Ito Foundation

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解明
S c h i l l , W . B . , K r u g e r , T . F . ：I n f l u e n c e o f
deoxyribonucleic acid damage on fertilization andpregnancy, Fertil Steril，81，965～972，2004.
４） Evenson, D. P.：The Sperm Chromatin Structure
A s s a y（ S C S A（（ R ）））a n d o t h e r s p e r m D N A
fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear
DNA integrity as related to fertility, Anim Reprod
Sci，169，56～75，2016.
５） Barbato, V., Talevi, R., Braun, S., Merolla, A.,
Sudhakaran, S., Longobardi, S., Gualtieri, R.：
Supplementation of sperm media with zinc,
D-aspartate and co-enzyme Q10 protects bull
sperm against exogenous oxidative stress andimproves their ability to support embryo
development, Zygote，25，168～175，2017.
６） Gadea, J., Gumbao, D., Canovas, S., GarciaVazquez, F. A., Grullon, L. A., Gardon, J. C.：
Supplementation of the dilution medium afterthawing with reduced glutathione improves function
and the in vitro fertilizing ability of frozen-thawedbull spermatozoa, Int J Androl，31，40～49，2008.
７） Sharma, R. K., Sabanegh, E., Mahfouz, R., Gupta S.,

197

Thiyagarajan, A., Agarwal, A.：TUNEL as a test for
sperm DNA damage in the evaluation of maleinfertility, Urology，76，1380～1386，2010.
８） Takeda, K., Uchiyama, K., Kinukawa, M., Tagami,T., Kaneda, M., Watanabe, S.：Evaluation of sperm
DNA damage in bulls by TUNEL assay as aparameter of semen quality, J Reprod Dev，2015.
９） 武田久美子：精子核DNAダメージを利用した牛凍結精液品質評価の試み，日本胚移植学雑誌，38，
71～74，2016.
10） Takeda K., Kobayashi E., Akagi S., Nishino K.,
Kaneda M., Watanabe S.：Differentially methylated
CpG sites in bull spermatozoa revealed by human
DNA methylation arrays and bisulfite analysis, J
Reprod Dev，2017.
11） 岩水正，尾方康弘，田澤直子，原田佳積，白須洋，
堀内俊孝：ウシ体外受精胚の凍結保存，広島県獣医学会雑誌，13，59～62，1998.
12） Boesch-Saadatmandi, C., Rimbach, G., Jungblut,A., Frank, J.：Comparison of tetrahydrofuran, fetal
calf serum, and Tween 40 for the delivery ofastaxanthin and canthaxanthin to HepG2 cells,
Cytotechnology，63，89～97，2011.

© The Ito Foundation

198

肥育前雌牛における卵子の能力不足を解消する培養技術の開発
Development of in vitro oocyte production systems to optimize oocyte
resources residing in ovaries from beef calves before fattening

平

尾

雄

二・武

田

久美子・的

場

理

子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Yuji Hirao, Kumiko Takeda and Satoko Matoba（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

This study aims to produce competent eggs from growing oocytes residing in the ovary ofbeef calves castrated before fattening. Our previous studies have suggested a poor
developmental competence of oocytes that had fully grown in those ovaries, but the adverse
effect（s）of immature ovaries was reduced when growth was completed in vitro during thelast 14 days. Thus, the detrimental effect of immature ovaries could be eliminated when oocyte
growth was achieved in vitro. Growing oocytes were collected from the ovaries of calves at 8
to 12 months of age and classified according to size：Class A, oocytes not greater than 80 µm
in diameter；Class B, oocytes approximately 100 µm. Preantral follicles containing Class A
oocytes were embedded in collagen gel and cultured for 28 to 32 days. So far, no culture
systems can sufficiently support growth of Class A oocytes. Class B oocytes were cultured as
oocyte-granulosa cell complexes for 14 days. A calf was born from a Class B oocyte of a calf
which itself was a result of culture of Class B oocytes of a calf. This achievement suggests thatconsecutive productions of calves by using in vitro growth of oocytes can contribute toshortening the generation intervals. The effect of the presence or absence of corpus luteum inthe calves had little impact on the viability and growth of Class B oocytes, supporting ourhypothesis of the efficacy of using the in vitro oocyte growth technology on the calf ovary.
With respect to Class A oocytes, although the survival for 4 weeks in vitro was possible,
oocytes at the end of culture were not fully grown, being similar to the size of Class B oocytes.
Further improvement of culture systems for Class A with a focus on efficient growth isessential.

１．目

ようとするものである。去勢によって廃棄される

的

黒毛和種の卵巣は毎年約２万個にのぼり，それら本研究は，肥育前雌子牛（以下，若齢雌牛）から摘出されて廃棄される卵巣から，発育途上卵母細胞を採取して発育・成熟させ，受精卵を生産しを活用できれば素性・血統が明らかで良質な形質を持つ和牛雌牛の後代確保が可能となる。
2014年以降，申請者らは若齢雌牛の卵巣の利用© The Ito Foundation

肥育前雌牛における卵子の能力不足を解消する培養技術の開発

199について検討し，子牛生産が可能な卵母細胞が存していたものとしてCL（＋），黄体がなかった牛在すること，しかし未熟な卵巣で発育した卵母細をCL（－）と表す。

胞の多くは胚発生能が低いことなどの知見を得2.2

た 。一方，２週間の体外発育を経た卵母細胞で卵巣から卵胞あるいは卵母細胞・卵丘細胞（顆は未熟卵巣による悪影響が少ない可能性も示され

粒膜細胞）複合体をメスで切り出し，発育段階にた 。この考えを進めれば，去勢時に分類Ａ：発応じてＡ，Ｂ，Ｃに分類し（Table１），本研究で育完了までに４週間程度の発育途上卵母細胞，分はＡとＢを培養に供した。

１）

１）

類Ｂ：発育完了まで２週間程度の発育途上卵母細卵胞の切り出しおよび分類

2 . 3 卵胞／卵母細胞・顆粒膜細胞複合体の培

胞 ，分 類 Ｃ：発 育 後 の 卵 母 細 胞 と 分 け た 場 合養（Table１），卵巣の影響を受ける度合いはＡ＜Ｂ

分類Ａの卵胞をコラーゲンゲルに包埋して28～＜Ｃになると考えられる。

32日間まで培養した。

この仮説を検証するにはすべての分類で卵母細分 類 Ｂ の 発 育 途 上 卵 母 細 胞 に つ い て は ，既胞を発育完了させうる培養系が必要となるが，培報養技術で成熟卵子が得られるのは分類ＣとＢであ胞・顆粒膜細胞複合を２週間の培養を行った。分

り，Ａは体外培養の恩恵を最も多く享受する可能

類Ｂの培養系はほぼ確立され，すでに複数の産子性があるにも関わらず，適当な培養系が存在しなが誕生している。未熟卵巣の影響から２週間隔離い。４週間の培養系で卵母細胞を発育させることされ，培養系が存在する点でバランスのとれた発ができれば仮説を検証することができる。

育段階であり，胚発生能力を調べるには分類Ｂが本研究では，発育段階がＢの卵母細胞からは未２，３）に従い，インサートメンブレン上で卵母細適している。

熟卵巣の悪影響を解消する技術を開発して産子を体外成熟後の卵子については，定法による体外生産することを目的とし，Ａの卵母細胞について受精を行い，つづいて個別識別卵子・胚培養シス

は超長期培養系の開発を目的とした。

テムで培養した。

２．方
2.1

法

３．結果と考察卵巣3.1

分類Ａに含まれる卵母細胞

肥育前雌子牛（８～12ヶ月）から卵巣を摘出

卵胞腔形成前の卵胞の直径と卵母細胞の直径とし ，左 右 い ず れ か あ る い は 両 方 の 卵 巣 に 黄 体の関係をFig.１に示す。当初，直径約80µmの卵（corpus luteum）が存在していた牛を性成熟に達母細胞を分類Ａとする計画であったが，実際にはTable 1 Classification of follicles/oocytes according to size after collection from theovary of beef calves

Class

Follicle diameter（mm）

Approximate average
diameter of oocytes（µm）

Estimated length of culture
period necessary to give fullgrowth（Days）

Ａ

0.1＜Ø＜0.3

40－80

28－32

Ｂ

0.5＜Ø＜0.8

100

14

Ｃ＊

2＜Ø＜6

120

0

＊Class C oocytes were not used in the present study.

© The Ito Foundation

200

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

直径40～80µmの幅広い集団となった。本研究で代目は2015年11月に割去した卵巣由来の体外発育

は卵胞腔形成前の卵胞をすべて分類Ａとして培養

卵母細胞から誕生した雌の産子である（2016年９することとした。直径300µm以下の卵胞では卵母月）。その個体にも卵巣割去が行われ，体外発育

細胞と卵胞の直径はほぼ直線的な関係にあり

卵母細胞から成熟卵子が作製された。二世代目の（Fig.１），同じサイズの卵母細胞を集めるには卵卵母細胞・顆粒膜細胞複合体（以下，複合体と記胞のサイズを揃える必要がある。胞状卵胞では状す）をFig.３に示す。インサートメンブレン上に況はまったく異なり（分類Ｂ），卵胞腔の急激な配置された複合体はドームを形成した（Fig. 3

拡大が卵胞を急速に発育させるため，卵母細胞のA）。拡大したものをFig. 3 Bに示す。卵母細胞が発育は相対的に著しく遅くなる。その結果，比較退行した複合体ではドームは形成されない（Fig.

的広い範囲のサイズの卵胞から類似のサイズの卵

3 A中の矢印）。すなわち，ドーム形成は卵母細母細胞が集まる。すなわち，分類ＡはＢよりも培胞の生存を強く示唆するものである。ドームの天養開始時の卵母細胞の発育段階を揃えるのが困難

蓋部分を破ることによって，卵母細胞・卵丘細胞である。直径200µm程度の卵胞では直径約50µm（顆粒膜細胞）複合体を採取する（Fig. 3 C）
。こから60µmの卵母細胞が含まれていた（Fig.１）。

の技術をうまく利用すれば，世代間隔の短縮に貢3.2

分類Ｂの卵母細胞の培養

分類ＡおよびＢの培養前後の卵母細胞の直径分布をFig.２に示す。まず，分類Ｂについては，
「若

140
130

齢雌牛の未利用卵子資源として期待される卵母細の誕生がある。このような例はほかにない。一世

Oocyte diameter (μm)

90.0Class BCL (ー)

55.3

98.8

97.6

114.2

96.3

115.2

n=17

n=26

n=59

n=48

n=35

n=29

110

Oocyte diameter

して，二世代の連続した体外発育培養由来の産子CL (＋)

120

胞の利用効率の最大化」を目的として掲げ，２週間の培養を行った。本研究期間中の重要な成果とClass A

μm

100
90
80
70
60
50
40
30
20

80.0

10

70.0

0

60.0
50.0

Fig. 2 Comparison of the diameters of oocytes before

40.0
y = 0.2309x + 13.999
R² = 0.7489

30.0
20.0
10.0
0.0

0.0

50.0

100.0 150.0 200.0 250.0 300.0

Follicle diameter (μm)

Fig. 1 A scatter plot of diameters of growing follicles

and oocytes after collection from the ovaries of beef
calves.

and after culture. Class A oocytes were grown infollicles embedded in collagen gels. Class B oocytes
were cultured as oocyte-granulosa cell complexeson the membrane inserts. The day of follicle/
oocyte-granulosa cell complexes collection was
designated Day 0. CL（+）， oocytes from the ovaries
of calves that had corpus luteum in one ovary or
both ovaries；CL（-），oocytes from a pair of ovaries
without corpus luteum. Numbers above the box
plots indicate the mean diameter （µm） of theoocytes in that group.

© The Ito Foundation

肥育前雌牛における卵子の能力不足を解消する培養技術の開発

201

Fig. 3 Morphology of the oocyte-granulosa cell complexes of Class

B,collected from follicles 0.5-0.8mm in diameter, for 14 days. A）
Oocyte-granulosa cell complexes that formed a domelike structure.
The structure was not developed when the oocyte had degenerated（arrow）. B）Enlarged images of a complex. C）Oocyte-cumulus cellcomplexes recovered on Day 14 from the dome.

献できることが示された。

題となる。単位体積当たりでは体外発育卵母細胞

分類Ｂの卵母細胞は平均で直径96～97µmからの持つミトコンドリアDNAのコピー数は生体内

約115µmへと発育した（Fig.２）。体積にして約

発育卵母細胞と同等であることが判明している。

69％の増大であった。CL（＋）区とCL（－）区

しかし，発育の完了が卵子としての最低限の基準との間に明確な違いは認められなかった（Fig. 2

であることを考えると，最終的にはすべての卵母

B）。体外発育中の生存率もCL（＋）区が81.4％

細胞を120µm以上へと体外発育させることが理想であり，82.9％のCL（－）区と同等であった。こである。

れらの結果は，分類Ｂの卵母細胞は（今回は用い卵母細胞の発育を改善する可能性を持つ添加因なかった）分類Ｃの卵母細胞ほど個体の性成熟の子として，顆粒膜細胞の分化を誘導するために卵影響を受けないとする仮説を支持するものであ母細胞が放出するGDF９がある。たとえば，マる。また，生存率はこれまでに報告されている分

ウスの卵母細胞・顆粒膜細胞複合体にGDF９を類Ｂの体外発育培養の結果よりもやや低い値を示作用させると顆粒膜細胞の形態に顕著な影響を及したが，直径についてはほぼ同等であった 。今ぼす。しかし，効果の持続性やきわめて高額な培後，若齢雌牛か否かに関わらず，直径115µm未満

養液になるなどの課題がある。現在，牛の卵母細の卵母細胞を120µm以上へと発育させることが課

胞・顆粒膜細胞複合体では2.5µg/mlの濃度で培３）© The Ito Foundation

202

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

養を行っているが，結論を得るにはさらなる検討

し，分類Ａには培養後まで基底膜が残存しているが必要である。

ことがあり，切開時に卵母細胞を潰さないように

3.3

分類Ａの卵母細胞／卵胞の培養留意する必要がある。採取された複合体の形態は

分類Ａの卵胞培養の様子をFig.４に示す。基本
的にTaketsuruら

体外発育後の分類Ｂの複合体と類似していた。体の方法に従ったものである。

外成熟を試み，裸化した卵母細胞をFig. 4 Fに示

ただし培養液への血漿の添加は行っていない。ます。第一極体の放出はほとんど認められなかった。

ず，二次卵胞に周囲の結合組織が付着したものを

分類Ａの卵母細胞／卵胞を４週間の長期培養でメス で 切 り 出 し た（Fig. 4 A）
。拡大するとFig.

生存させることは可能となった。しかし，発育は4 Bのように見える。コラーゲンゲル中に卵胞を不十分であった（Fig.２）。４週間の培養で分類

包埋すると（Fig. 3 C）
，卵胞付近の組織がコラーＢの培養開始時の直径と同等か，わずかに上回る

ゲンゲルに伸展した。培養を継続することにより程度であった。この課題を解決するためには培養

明確な卵胞腔が形成された（Fig. 4 D）
。その中か系の改善と，分離した卵母細胞のサイズに見合うら卵母細胞・卵丘細胞複合体を採取した（Fig. 4

適切な培養期間の設定をいずれも高い水準で達成

E）。分類Ｂの場合は卵胞の基底膜を培養開始時する必要がある。

４）に除去するため，培養の最後に卵母細胞・卵丘細本研究は，未熟卵巣で発育する時間が短いほど胞複合体を容易に回収することができる。しか未熟卵巣の悪影響が少ないとする仮説に基づく。

Fig. 4 Morphology of preantral follicles（Class A）during culture and oocyte-granulosa cell complexes

at the end of culture period of 28 to 32 days. A）Isolated preantral follicles. B）Enlarged image ofan preantral follicle shown in A. The oocyte is indicated（arrow）. C）Follicles developing antral
cavities during growth in a collagen gel. D）Antral follicles on Day 28. E）Oocyte-cumulus cellcomplexes recovered from antral follicles grown in collagen gels. F）Denuded oocytes after anover-night culture of the complexes shown in E.

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肥育前雌牛における卵子の能力不足を解消する培養技術の開発

203

分類Ｂの卵母細胞に関しては，黄体の有無によるとした。材料には肥育前雌子牛（８～12ヶ月）か

影響が小さく，仮説を支持する情報が得られた。

ら摘出した卵巣を用い，卵胞あるいは卵母細胞・卵母細胞に一定の割合で発育できないものが含ま

卵丘細胞（顆粒膜細胞）複合体をメスで切り出しれる問題は，若齢雌牛由来に限らず生じることかて分類し，培養に供した。分類Ａの卵胞はコラー

ら，本研究が進展することにより卵子の体外作出

ゲンゲルに包埋して28～32日間培養した。分類Ｂの大きな課題の解決に繋がる可能性がある。まについては，卵母細胞・顆粒膜細胞複合を２週間た，二世代にわたる連続した体外発育培養由来の培養した。分類Ｂについては，割去した卵巣由来

産子が得られた。一方，分類Ａの卵母細胞が発育の体外発育卵母細胞として連続二世代目の個体がすることのできる超長期培養系の開発について誕生した。この技術をうまく利用すれば，世代間は，４週間の生存が可能になったとはいえ発育が隔の短縮に貢献できることが示された。分類Ｂの十分ではないことから，未熟卵巣の悪影響を検証

卵母細胞に関しては，若齢雌牛の黄体の有無によすることは現時点ではできない。発育完了に焦点る影響が小さく，仮説を支持する情報が得られを絞った超長期培養系の開発が必要である。

た 。今 後 ，若 齢 雌 牛 か 否 か に 関 わ ら ず ，直 径

４．要

115µm未満の卵母細胞を120µm以上へと発育させ約ることが課題となる。一方，分類Ａの卵母細胞の本研究は，去勢される若齢雌牛の卵巣に存在す

超長期培養系については，４週間の生存が可能でる発育途上卵母細胞を利用して受精卵を生産しよあるものの発育が十分ではないことから，発育をうとするものである。これまで，若齢雌牛の未熟完了させる目的に焦点を絞った培養系の改善が必な卵巣で発育した卵母細胞の多くは胚発生能が低要である。

いこと，しかし２週間の体外発育を経た卵母細胞には未熟卵巣による悪影響が少ないことを示す結果が得られている。そこで，去勢時に分類Ａ：発育完了までに４週間程度の卵母細胞，分類Ｂ：発育完了まで２週間程度の卵母細胞に分類し，未熟
卵巣での発育が短期間であるほど未熟卵巣の悪影
響が少ないとする仮説を立てた。技術的な問題として，分類Ａを十分に発育させうる培養系が存在しないことがある。本研究では，分類Ｂの卵母細胞からは産子を生産することを目的とし，分類Ａの卵母細胞については超長期培養系の開発を目的

文献１） 的場理子：公益法人伊藤記念財団平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，35，158～164，
2017．
２） Hirao, Y., Itoh, T., Shimizu, M., Iga, K., Aoyagi, K.,
Kobayashi, M., Kacchi, M., Hoshi, H., Takenouchi,
N.：Biol Reprod，70，83～91，2004．
３） Hirao, Y., Naruse, K., Kaneda, M., Somfai, T., Iga,
K., Shimizu, M., Akagi, S., Cao, F., Kono, T., Nagai, T.,
Takenouchi, N. ： Biol Reprod ，89 ，57 ，１ ～ 11 ，
2013．
４） Taketsuru, H., Takajo, A., Bao, R.-M., Hamawaki,A., Yoshikawa, M., Miyano, T.：J Reprod Dev ，57，
99～106，2011．

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204

近赤外光照射による牛凍結胚の品質改善効果に関する研究
Effects of near-infrared laser irradiation on frozen bovine embryos

横

尾

正

樹・佐

藤

勝

祥

（秋田県立大学生物資源科学部）

Masaki Yokoo and Katsuyoshi Sato
（Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University）

The improvement of the quality of frozen-thawed embryos is required for the efficient
cow-calf production system, because the quality of frozen-thawed embryos was significantly
lower than non-cryopreserved embryos. Recently, we reported that near-infrared laser
irradiation improved the quality of mouse embryo development in vitro and the live-birth rate
after embryo transfer. Therefore, in the present study, we investigated the effects of nearinfrared laser irradiation on the quality of frozen-thawed bovine embryos. Although, theirradiation of near-infrared laser was not impacted the embryo viability after thawing, thediameter and cell number of the surviving blastocysts were significantly increased byirradiation of near-infrared laser. From these results, we conclude that the near-infrared laser
method is also useful to improving the quality of frozen-thawed bovine embryos.

１．目

いる。

的

近年，胚移植の受胎率を向上させるための要因

今日，牛の胚移植技術は，優良家畜の増産や育の一つして，移植する初期胚のミトコンドリア機

種改良に有効な技術として実用化されている。最能との関連が報告されている。つまり，ミトコン

近は，優良肉用子牛の生産基盤強化を図るため

ドリア機能が高い胚を移植した場合，受胎率が向に，高品質な肉専用種子牛を生み出すための技術上することが明らかにされている１～３）。一方で，としても期待されている。１戸あたりの飼養頭数

凍結保存した胚は，胚のミトコンドリア機能が著が少ない我が国では，一度に多くの受卵牛（仮腹しく低下することも報告されており４），凍結胚移親）を準備できないため，牛胚移植技術を普及定植の受胎率の低下は，凍結過程における胚のミト着させるためには，あらかじめ凍結保存した胚をコンドリア機能の低下や損失が原因であると考え必要に応じて融解して利用する「凍結胚移植」のられる。

利用が不可欠である。しかしながら，ここ10年の最近，我々は，ミトコンドリア機能は近赤外領凍結胚移植は新鮮胚移植と比較すると受胎成績が域の光によって活性化でき，哺乳動物初期胚に照低く，牛凍結胚移植の受胎率向上が急務となって射することで，品質改善が可能であることを見出© The Ito Foundation

近赤外光照射による牛凍結胚の品質改善効果に関する研究205した。さらに，マウスを使用した実験では，近赤2.4

外光を照射した胚を移植することで，受胎成績を融解した胚盤胞を経時的に観察し，胚盤胞の生有意に改善することにも成功している５）。そこで存率を評価した。生存性の判定は，胞胚腔が膨張

本研究では，我々が見出した近赤外光による品質

しているものを生存胚盤胞，細胞が収縮し，発生改善技術を応用して，牛凍結胚に対する近赤外光が停止したものを死滅胚盤胞とした。また，生存照射の効果を調査し，牛凍結胚の品質改善技術と胚盤胞の品質を評価するために，融解後72時間後しても有用であるかを検証することを目的とした。

において生存していた胚盤胞の直径と，胚盤胞の

２．方
2.1

評価方法

構成細胞数を計測した。

法

３．結果と考察

牛体外受精卵の作出と場由来の牛卵巣から卵丘細胞―卵子複合体を牛凍結融解胚の生存性に及ぼす近赤外光照射の採取し，体外成熟培地（IVMD101培地；機能性

影響をFig.１に示した。凍結せずに培養した胚盤

ペプチド研究所）で22時間の体外成熟培養後，媒胞（未凍結区）と比較して，凍結保存した胚盤胞精液（IVF100培地；機能性ペプチド研究所）中の生存率は全体的に低下する傾向にあった。培養で体外受精した。６時間後に受精卵に付着していから72時間後の各試験区の生存率を比較すると，る 卵 丘 細 胞 を す べ て 剥 離 し ，体 外 発 生 培 地

未凍結区は72.2％であったのに対して，非照射区（CR1aa培地）で培養した。培養条件は38.5℃，

は45.7％，融解直後区は30.5％，融解３時間後区

５％CO２，95％空気とし，培養７日目に胚盤胞には27.7％だった。一方，培養72時間後に生存して到達している受精卵を凍結実験に使用した。

いた各試験区の胚盤胞の形態に着目して観察した

2.2

ところ，融解３時間後区は，非照射区や融解直後

牛体外受精卵の凍結と融解

培養７日目の胚盤胞は平衡化後，ガラス化液に区と比較し，有意に大きかった（Fig.２および

１分間浸漬して，素早く凍結用デバイス（Cryotec

Fig.３）。そこで，１個の胚盤胞を構成している

Animal；リプロライフ）に載せて，液体窒素中

細胞数を計測したところ，平均構成細胞数は未凍でガラス化凍結した。融解の際は，液体窒素から結区の胚盤胞は269.0±31.1個に対して，非照射区

Cryotec Animalを素早く取り出し，凍結保存しは100.3±12.5個，融解直後区は138.0±22.6個，融た胚盤胞を融解液，希釈液，洗浄液の順に浸漬し，解３時間後区は201.3±22.8個となり，融解３時間

最後は体外発生培地（CR1aa培地）中で72時間培

後区の胚盤胞は非照射区よりも有意に細胞数が多養した。

く，未凍結区の胚盤胞と同等の細胞数となった

2.3（Fig.４）。

近赤外光の照射近 赤 外 光 の 照 射 に は 近 赤 外 照 射 機 LTU-904

以上，本研究の結果では，牛凍結融解受精卵へ（Rian Corp.；波長904nm）を用いた。照射条件の近赤外光照射は，凍結融解胚の生存率を改善す

は３分間とし，近赤外光の照射タイミングは，融る効果は認められなかった。近赤外光には，凍結解直後（融解直後区）と融解３時間後（融解３時融解時にダメージを受けた胚を回復・修復するま間後区）の２実験区を設けた。また，近赤外光をでの効果は有していないのかもしれない。しかし照射せずに培養した胚盤胞を非照射区，凍結せずながら，生存胚盤胞においてはその品質を改善すに培養した胚盤胞を未凍結区とした。

る効果が認められたことから，融解後に生存した© The Ito Foundation

206

平成29年度aViability rate（％）

100
80

（Ａ）

ab

a

ab

ab

b
60

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）
（Ｂ）

（Ｃ）

a

a

ab

ab

b

b

ab

b

b

40

（Ｄ）

a

a

ab

ab

b

b

b

b

b

20
0

12

24

36

48

60

72

Culture time after thawing（h）
Fig. 1 Effects of near-infrared laser irradiation on the viability of frozen-thawed bovine

embryos.（A）non-cryopreserved,（B）non-irradiated,（C）irradiated at 0h after thawing,（D）
irradiated at 3h after thawing. a-b：p< 0.05, calculated using Chi-Square analysis.

Fig. 2 Representative microphotographs of frozen-thawed bovine

e m b r y o s c u l t u r e d f o r 7 2 h a f t e r t h a w i n g .（ A ） n o n cryopreserved,（B）non-irradiated,（C）irradiated at 0h afterthawing,（D）irradiated at 3h after thawing. All scale bars
indicate 100 µm.

胚盤胞に限っては品質を有意に改善させることが解直後よりも融解から３時間後が効果的であるこ示唆され，この方法を応用すれば，凍結保存胚のとが明らかとなった。Yamanakaら４）は，融解直受胎性を改善させる効果も期待できると考えられ後の受精卵内のミトコンドリアは小さく，その活る。

性も低い状態であるが，融解後1.5時間からミト

また，近赤外光の照射タイミングとしては，融コンドリア活性は少しずつ回復し，融解後６時間© The Ito Foundation

207

The diameter ofsurviving blastocysts（µm）

近赤外光照射による牛凍結胚の品質改善効果に関する研究
400
a

ab

300
b

b

316.3±22.2

210.9±17.0

228.3±13.3

299.1±23.3

（Ａ）

（Ｂ）

（Ｃ）

（Ｄ）

200
100
0

Fig. 3 Effects of near-infrared laser irradiation on the diameter of surviving

bovine blastocysts at 72h after thawing.（A）non-cryopreserved,（B）nonirradiated,（C）irradiated at 0h after thawing,（D）irradiated at 3h afterthawing. a-b：p<0.05, calculated using repeated measures of ANOVA
followed by Bonferroni correction.

The cell number ofsurviving blastocysts

350
300

a

250

ab

200

bc

150

c

100
50
0

269.0±31.1

100.3±12.5138.0±22.6

201.3±22.8

（Ａ）

（Ｂ）

（Ｃ）

（Ｄ）

Fig. 4 Effects of near-infrared laser irradiation on the cell number of surviving

bovine blastocysts at 72h after thawing. （A）non-cryopreserved,（B）nonirradiated,（C）irradiated at 0h after thawing,（D）irradiated at 3h afterthawing. a-c：p<0.05, calculated using repeated measures of ANOVA
followed by Bonferroni correction.

後には凍結前とほぼ同等まで回復することを報告も応用可能な近赤外光照射時期について，さらなしている。したがって，胚のミトコンドリア活性る検討が必要と考えられる。

がある程度回復した時期に近赤外光を照射するこ

現在，実用化されている牛胚盤胞の凍結方法にとで，胚盤胞のミトコンドリア活性を効率良く改は，本研究で使用した方法（超急速ガラス化法）

善させることができ，品質改善効果が発揮された以外に，緩慢凍結法も普及している。緩慢凍結法と考えられる。生殖補助医療においては，ガラスとは，耐凍剤（クライオプロテクタント）を浸透化凍結保存した胚盤胞は，融解後２～３時間の回させ，細胞外に氷晶を形成させることにより脱復培養を行ってから移植することが多いが，子牛

水・濃縮し，プログラムフリーザーを用いて毎分の生産現場では融解直後に移植するダイレクト移

0.3℃で－30℃まで緩慢に冷却する方法である。

植の需要が高い。したがって，生産現場において緩慢凍結法は，機械による一律の作業なので手間© The Ito Foundation

208

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

がかからず，移植時も超急速ガラス化法のように影響を調査した。凍結融解胚の生存率を改善する

凍結液を取り除く手間がないことから，子牛生産効果は認められなかったものの，生存胚盤胞にお現場で広く利用されている技術である一方，急速いてはその品質を改善する効果が認められた。本

ガラス化法と比較して，胚のミトコンドリア機能研究により，近赤外光照射は牛凍結胚の品質改善にダメージが出やすいことが報告されている 。

技術としても有用である可能性が示された。

６）

本研究の技術は，融解した胚盤胞に近赤外光を直接照射するだけの技術であることから，緩慢凍結
法で凍結した胚の生存性を改善できることも期待され，今後，緩慢凍結した胚にも応用することが十分に可能であると考えられる。
以上，我々が開発した近赤外光による胚の品質改善技術は，牛凍結胚の品質改善技術としても有用である可能性を示すことができた。しかしながら，凍結融解によって低下する胚の生存性を改善させる効果がなかったことから，今後は，凍結のダメージを軽減し，生存胚盤胞の割合を増やすことができる照射条件・方法を検討していくことが課題である。また，子牛生産現場で応用可能な照射条件・方法も検討する必要がある。将来的に，受精卵の凍結ダメージを軽減する技術が確立できれば，凍結胚の受胎率を改善することが期待さ
れ，凍結胚を利用した我が国の子牛生産技術のさらなる普及にもつながると考えられる。
４．要

約

文
献
１） 横尾正樹，伊藤－佐々木隆広，珠玖仁，末永智一，
阿部宏之：呼吸活性を指標とした胚の品質評価：マウス胚移植試験の成績と産子の正常性について，産婦人科の実際，59，1375～1379，2010.
２） Yokoo, M., Abe, H.：Analysis of respiratory
activity in the oocytes using by electrochemicalmeasurement system, Journal of Mammalian Ova
Research，29，170～174，2012.
３） Abe, H., Shiku, H., Yokoo, M., Aoyagi, S.,
Moriyasu, S., Minamihashi, A., Matsue, T., Hoshi,
H.：Evaluating the quality of individual embryoswith a non-invasive and highly sensitive
measurement of oxygen consumption by scanningelectrochemical microscopy, Journal of Reproduction
and Development, 52（supple）,s55-s64，2006.
４） Yamanaka, M., Hashimoto, S., Amo, A., ItoSasaki, T., Abe, H., Morimoto, Y.：Developmental
assessment of human vitrified-warmed blastocysts
based on oxygen consumption, Human Reproduction，
26，3366～3371，2011.
５） Yokoo, M., Mori, M.：Near-infrared laser
irradiation improves the development of mouse preimplantation embryos, Biochemical and BiophysicalResearch Communications，487，415～418，2017.
６） 戸嶋茂郎，高橋文昭：呼吸量計測によるウシ受精
卵超急速ガラス化凍結法の評価，表面技術，63，64～65，2012.

本研究では，牛凍結胚に対する近赤外光照射の© The Ito Foundation

209

胚ゲノム活性化および胚盤胞形成時期における新規代
謝プロセスに基づく牛体外受精胚の体外培養法の改善
Improvement of in vitro culture of in vitro fertileized bovine embryos on
the basis of novel metabolic processes during embryonic genome
activation and blastocyst formation

山

田

雅

保

（京都大学農学研究科）

Masayasu Yamada（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

In the early mouse embryo, pyruvate（P）is essential for their development beyond thezygotic genome activation（ZGA）at the 2-cell stage, and for nuclear translocation of
mitochondrial enzymes associated with metabolism of pyruvate to succinyl-CoA in TCA cycle
during the ZGA. Interestingly, the effects of P are almost substituted with addition of amembrane permeable form of α-ketoglutarate, dimethylα-ketoglutarate（dm-αKG）to -P
medium. The aim of this study was to examine the localization of pyruvate dehydrogenase（PDH）in in vitro fertilization（IVF）derived bovine embryos during ZGA at the 8-cell stage,
and the effects of P and/or dm-αKG on in vitro development of IVF bovine embryos beyond
the ZGA. Immunofluorescence staining of bovine embryos at the 8-cell stage with antibodies
against enzymatically both the active and the inactive forms of PDH（total PDH）revealed
that total PDH was localized not only to the mitochondrion, but also in the nuclear
compartment, but nuclear PDH was exclusively recognized by antibodies against phosphoPDH（inactive form）irrespective of the presence or absence of P and/or dm-αKG in
medium, suggesting that unlike the case of mouse embryo, nuclear translocation of active
mitochondrial PDH does not occur during the ZGA. Furthermore, it was found that addition of
4 mM dm-αKG to +P or -P medium significantly increased the developmental rates of IVF
bovine embryos to the blastocyst stage, compared with +P or -P medium without dm-αKG,
respectively. Further study is needed to clarify the mechanism for the promoting effect of dmαKG on in vitro development of bovine embryos.

１．目

くアセチルコエンザイムＡ（Ace-CoA）やαケ

的

トグルタル酸（αKG）の産生量の減少とそれにマウス前核期胚をピルビン酸除去培地で培養す伴うエピゲノムマークであるアセチル化およびメ

ると，胚は低エネルギー状態になり２細胞期で発チル化ヒストンの減少によるグローバルな転写活生を停止し，さらにエピゲノム修飾因子として働性の低下も起こることから，卵割期の発生におい© The Ito Foundation

210

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）て，ピルビン酸の供給は必須である１）。また，ピ2.2ルビン酸のAce-CoAへの代謝を触媒するピルビ

卵子の成熟培養液には，0.02AU卵胞刺激ホル

ン酸脱水素酵素（PDH）と，ミトコンドリア内

モン（FSH；アントリン，デンカ製薬）およびでのTCAサイクルのAce-CoAからスクシニル

10 ％ FBS を 添 加 し た TCM-199（シ グ マ ア ル ド

CoAへの代謝を触媒するクエン酸合成酵素などのリッチ）を用いた。成熟培養は38.5℃，５％CO２，

酵素が胚性ゲノムの活性化時期である２細胞期に95％空気の条件下で24時間行った。

体外成熟培養一時的に，そしてピルビン酸依存的にミトコンド

2.3

リアから核内へ移行し，そしてそのような酵素は

凍結精液は37℃の温湯中に30秒間浸漬して融解

核内でも活性を持つことから，Ace-CoAやαKG

した後，IVF100（機能性ペプチド研究所）によへの代謝が行われて，遺伝子発現の調節に関与しる遠心洗浄操作をマニュアルに従って行った。洗ていると考えられる。ヒト胚でも同様の酵素の核浄した精子は精子濃度が１×10７/mlになるよう内への移行が胚性ゲノムの活性化時期である４細にIVF100を加えて調整し，精子懸濁液とした。

胞期に起こることも報告された 。

35mmプラスチックシャーレに3.5µlのIVF100の

１）

体外受精

さらに興味あることに，培地からピルビン酸をドロップを作成して，その中に３回洗浄した成熟除去すると，上述のようにマウス胚は低エネル

卵子を20個ずつ導入した後に50µlの精子懸濁液をギー状態となり２細胞期で発生停止するが，その加えて38.5℃，５％CO２，95％空気の条件下で体培地に膜透過性を付与されたジメチルαケトグル

外受精を６時間行った。

タル酸（dm-αKG）を加えると，低エネルギー2.4

状態は改善されないのにも関わらず，２細胞期以体外受精を終了した卵子は，血清無添加TCM-

降の胚盤胞へ高率に発生するようになり，TCA

199培地の入った遠心チューブに移し，ボルテッ

サイクルの一部の酵素の核内移行も起こることがクスミキサーで90秒間攪拌して卵丘細胞を除去し明らかにされた 。

た。裸化卵をCR1aa培地で３回洗浄した後，あら

１）

体外培養

本研究では，牛体外受精胚の体外培養においかじめ200µlの発生培地を添加した低吸着性Ｕ底て，マウス胚と同様に胚性ゲノムの活性化時期で96ウエルプレートのウエルに５個／ウエルになるある８細胞期に，ピルビン酸依存的にPDHのミように導入し，それを38.5℃，５％Ｏ２，5％CO２，

トコンドリアから核内への移行が起こるのか，そ90％Ｎ２の条件下で８日間培養した。発生培地として牛体外受精胚の受精後の発生に及ぼすピルビ

し て ，５ ％ FBS 添 加 CR1aa 培 地（＋ Ｐ），５ ％ン酸とdm-αKGの培地への単独添加，あるいはFBS添加ピルビン酸不含CR1aa培地（－Ｐ），そ

両添加の効果について検討した。

して＋Ｐあるいは－Ｐに０-４mMのdm-αKGを

２．方
2.1

添加した培地を用いた。ただし，使用した培地に法

はおよそ0.4mMのピルビン酸を含むFBSが５％の

牛卵母細胞の採取

濃 度 で 付 加 さ れ て お り ，－ Ｐ 培 地 に お い て も

食肉処理場で採取した牛卵巣の直径３～６mm

0.02mMと微量ではあるがピルビン酸が含まれての卵胞より未成熟卵子を吸引採取した。体外成熟いることになる。媒精日を０日として２日目に卵培養には，細胞質が均一で卵丘細胞が数層緊密に割率を，そして８日目に胚盤胞発生率を調べた。

付着している未成熟卵子を用いた。

© The Ito Foundation

胚ゲノム活性化および胚盤胞形成時期における新規代謝プロセスに基づく牛体外受精胚の体外培養法の改善

2.5

免疫蛍光染色体外受精後３日目の８細胞期胚を４％パラホル

211

３．結果と考察ムアルデヒドで30分間室温処理することによって牛体外受精胚では，８－16細胞期に胚性ゲノム固定した。0.4％Triton Xを添加したPBS（PBST）の活性化が起こることから，８細胞期に活性型で30分間処理し，３％BSAを含むPBST（ブロッPDHがミトコンドリアから核内へ移行するのか

キング液）で30分間ブロッキング処理した後，ブを活性型と不活性型の両方を認識するPDH抗体

ロッキング液で希釈した１次抗体による処理を（Total PDH抗体）と不活性型を認識するリン酸

４℃で一晩行った。胚をPBSTで十分洗浄した後化PDH抗体を用いた免疫蛍光染色によって検討に，ブロッキング液で希釈した２次抗体で60分間した。ピルビン酸とdm-αKGの添加あるいは無室温処理した。ヘキスト33342（10µg/ml）溶液

添加に関わらず，それぞれの培地で発生した８細で20分間室温処理することによって核染色した。

胞期胚では，Total PDH抗体によってミトコンド

次に，胚をスライドガラス上にグリセリンでマウ

リ ア だ け で な く 核 も 染 色 さ れ た が ，リ ン 酸 化

ントした後に，蛍光顕微鏡（FSX100, Olympus,

PDH抗体では主に核内が染色された（Fig.１）。

Tokyo, Japan）によって観察した。

したがって，体外培養牛受精胚では，マウスおよ１次抗体として，活性型と不活性型PDHの両びヒト胚とは異なり，胚性ゲノムの活性化時期に方を認識するマウスモノクローナル抗体（１：50

おいても活性化型PDHは細胞質のミトコンドリ

希釈，sc-377092，Santa Cruz Biotech.）とリンアに局在し，ピルビン酸依存的な核内への移行は酸化PDH（不活性型）に対するウサギモノクロー

起こらないことが示唆された。

ナル抗体（１：50希釈，ab177461, Abcam），そ

牛胚では胚性ゲノムの活性化時期である８細胞して２次抗体として，Alexa594標識抗マウスIgG期において，PDHの核内への移行が起こらない

抗 体 （１ ： 100 希 釈 ， A11032, Invitrogen） と理由は今のところ不明であるが，着床前の初期胚Alexa488標識抗ラビットIgG抗体（１：100希釈，では８細胞期ごろからミトコンドリアは形態的か

A11034, Invitrogen）を使用した。

つ機能的に成熟するとともに，胚のエネルギー要
求性が高まる２）ことから，おそらくは，ミトコン

Fig. 1 Immunofluorescence staining of pyruvate dehydrogenase（PDH）in bovine

8-cell embryo cultured in +P medium with 4mM dm-αKG

a. Anti-PDH（total）antibody shows staining in nucleus and cytoplasm.

b . Anti-phospho-PDH antibody staining shows that PDH（inactive）

exclusively exists in nucleus.
c. Hoechst staining© The Ito Foundation

212

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 1 Effects of pyruvate and dimethy α ketoglutarate（dm- αKG）on development of bovine

embryos cultured in medium with or without pyruvate.

Pyruvate（mM）

0.40

No. of oocytes
examined

No.（%）of cleaved
embryos＊ ofNo.（%）
blastocysts

0126

107（84.9）b30（28.0）

1

114

91（79.8）27（29.7）b

4

124

96（77.4）a51（53.1）

0

116

90（77.6）6（ 6.7）c

4

118

98（83.1）

28（28.6）bdm-αKG（mM）＊Percentage is the ratio of blastocysts to cleaved embryos.
a, b Values with different superscripts within the same column are significantly different（p<0.05）

ドリア内でのPDHを含むTCAサイクルの多くのの維持と自己複製を促進し，逆に細胞膜透過性コ酵素の消失は，牛胚の発生にとって好ましくない

ハク酸を培地に添加することによってコハク酸に胚の低エネルギー状態を招くことになるからであ

対するαKGの比率（αKG/コハク酸）が低下す

ろうと推察される。今後，牛胚の胚性ゲノムの活るとES細胞の分化が促進されることが報告され性化と代謝との関係を明らかにすることは，そのた３，４）。ミトコンドリアでのTCAサイクルの中間発生メカニズムの解明にとって重要と考えられる。

代謝産物であるαKGは，ヒストン脱メチル化を次に，牛体外受精胚の胚盤胞への発生に及ぼす引き起こす酵素JmjC-domain containing histone

培地へのピルビン酸あるいはdm-αKG添加の効

demethylases（JHDM）やten-eleven translocation

果を検討した（Table１）。その結果，体外受精後（TET）タンパク質が酵素活性を発揮するうえで８日目の胚盤胞への発生率は，－Ｐ培地ではほと不可欠な分子であり５），実際にES細胞でのαKG/

んどの胚が８細胞期以前に発生を停止するのに対コハク酸の増加は，ヒストンやDNAの脱メチル

して，＋Ｐ培地では高率に胚盤胞へ発生した。

化による多能性および自己複製に関連する遺伝子

よって，体外培養における牛胚の胚盤胞への発生の発現を調節している３）。したがって，牛初期胚はピルビン酸に依存していることが分かる。一の胚盤胞への発生を促進するdm-αKGの効果は，

方，－Ｐあるいは＋Ｐ培地における牛体外受精胚

ミトコンドリアでのαKG/コハク酸の増加を引きの発生に及ぼすdm-αKGの効果について検討し起こし，ES細胞での作用機構と同様に，胚発生た結果，＋Ｐ培地における胚盤胞への発生率は１に必要な遺伝子発現のエピジェネティック調節にmM dm-αKG添加では無添加区と変わらないの

よって発揮されるのではないかと推察される。

に対して，４mM dm-αKG添加によって有意に増加した。また－Ｐ培地においても，４mMの４．要約

dm-αKGを添加することによって，胚盤胞期へ

本研究では，牛体外受精胚の胚性ゲノムの活性の発生率は無添加区に比べて有意に増加した。し化時期（８細胞期）におけるピルビン酸脱水素酵

たがって，dm-αKGはピルビン酸の濃度に関わ素（PDH）の局在について検討した。免疫蛍光らず牛体外受精胚の発生を促進する効果のあるこ

染色により，８細胞期胚ではリン酸化PDH（不とが明らかとなった。

活性型）が主に核内に観察されることから，活性

最近，dm-αKGがマウス胚性幹細胞の多能性型PDHは細胞質内のミトコンドリアに局在する© The Ito Foundation

胚ゲノム活性化および胚盤胞形成時期における新規代謝プロセスに基づく牛体外受精胚の体外培養法の改善ことが示唆された。この結果は，胚性ゲノムの活性化時期に活性型PDHがミトコンドリアから核内に移行するマウス胚やヒト胚とは異なる結果であった。次に牛体外受精胚の体外発生に及ぼすピルビン酸とdm-αKGの影響について検討した。
胚盤胞への発生はピルビン酸によって促進され，さらに－Ｐ培地あるいは＋Ｐ培地のいずれにおいても４mM dm-αKGによって胚盤胞への発生は無添加区に比べて有意に促進されることが明らか
となった。

213

文
献
１） Nagaraj, R., Sharpley, M. S., Chi, F., Braas, D.,
Zhou, Y., Kim, R., Clark, A. T., Banerjee, U. ： Cell ，168，210～223，2017．
２） Calarco, P. G., Brown, E. H. ： J Exp Zool ， 171 ，
253～83，1969．
３） Carey, B. W., Finley, L. W., Cross, J. R., Allis, C. D.,
Thompson, C. B.：Nature，518，413～416，2015．
４） TeSlaa, T., Chaikovsky, A. C., Lipchina, I.,
Escobar, S. L., Hochedlinger. K., Huang, J., Graeber,
T. G., Braasm D., Teitell, M. A. ： Cell Metab ， 24 ，485～493，2016．
５） Kaelin, W. G. Jr., McKnight, S. L.：Cell，153，56～69，2013．

© The Ito Foundation

214「豚の一腹産子数を一頭増やす」子宮の免疫調節を担う
精漿タンパクの特定
Identification of seminal plasma proteins responsible for regulating immune
system in porcine uterus “to increase litter size”

奥

山

みなみ

（大分大学医学部医学科）

Minami W Okuyama（Faculty of Medicine, Oita University）

For the establishment and maintenance of pregnancy, physiological factors such as
immune system influence each other and play an important role. In human and mouse, it wasreported that seminal fluid changed the cytokine expression and induced regulatory T cells（T-reg）in uterine. It was also reported that pregnancy changed lymphocyte subsets inperipheral blood. In porcine, it was suggested that there was the relationship between thecytokine expression pattern of uterine and the fertility. However, there was no report that deal
with the changes in cytokine expressions and constitution of lymphocytes in porcine peripheral
blood related to reproductive event. In the present study, the effect of mating and seminal
plasma（SP）on cytokine expressions in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）was
evaluated in sows.
Total 8 breeding sows were used in this study. Blood samples were collected from threesows in luteal phase, and also collected during last 24 hours up to the mating and during 12 to
24 hours after the mating from 6 sows, 3 of those had injected 1,000 IU of equine chorionicgonadotropin（eCG）at weaning and the others without treatment. The mRNA expressions ofinterferon（IFN）-γ，interleukin（IL）-2，-4，-8，-10，-17 and Foxp3 in PBMC were measured
in realtime-PCR.
IL-2 expression in sows those had been injected eCG was higher than untreated（p <0.05）and IL-2 expression tended to decrease after mating（p=0.08）compared to before
mating. The values of IFN-γ，IL-4 and IL-17 expressions were varied largely between
individuals before mating, but the variation seems to be reduced after mating. It was suggested
that estrus or mating influenced to cytokine expressions in PBMC.
In conclusion, there were some changes in cytokine expressions of PBMC were observed.
Therefore, it is suggested that the systemic immune system changes as well as the uterine by
the reproductive stage.

© The Ito Foundation

「豚の一腹産子数を一頭増やす」子宮の免疫調節を担う精漿タンパクの特定

１．目

215

の変化は，精漿の子宮の免疫系への作用を介し的て，受胎率や産子数などの繁殖成績に影響を及ぼ

養豚現場では，離乳後の初回発情時に自然交配している。ヒトやマウスでは，全身の免疫系も局または人工授精を行うため，発情回帰日数を延長

所と同様に変化することが妊娠の成立および維持させずに交配を成功させることで効率的な生産がに影響していると考えられていることから，豚に行われる。このため母豚は離乳時に母豚に対しておいても末梢血の免疫系が同様に変化し，妊娠の馬絨毛性性腺刺激ホルモン（eCG）を投与し，離成立および維持に影響を及ぼしているのではない

乳後４～５日目に発情を誘起する処置として養豚かと推察される。そこで本研究では，精漿を利用

１）

場で広く実施されている 。

した豚の繁殖成績向上を目指し，豚の発情・交配

妊娠の成立・維持には母体の栄養状態や内分による末梢血中の免疫細胞に及ぼす影響を評価す泌，免疫応答など，様々な生理的な要因が関与しるため，末梢血から末梢血単核球（PBMC）を分ており，互いに作用することで生殖機能を調整し離し，ヘルパーＴ細胞が産生するサイトカインおている。特に免疫系の役割としては，生体防御とよび白血球遊走に関わるケモカインのmRNA発

免疫寛容がバランスを保ちながら働く必要があ

現について交配との関係を調べるため基礎データ

り，これらには子宮におけるリンパ球などの免疫の収集を行った。

細胞の出現やサイトカインによる免疫調節が関係している２）。近年，精漿中のタンパク質が交配時

２．方法に子宮内膜に作用し免疫機能を調節し受胎性に関

2.1

材料採取とPBMC分離

与することが分かってきた。

実験には，繁殖母豚８頭（Ｗ１頭，Ｌ１頭およ

妊娠の成立・維持に重要な役割を果たすと考えびWL６頭，０～３歳，未経産～７産）を使用しられている免疫細胞の一つにヘルパーＴ細胞があた。本研究は北海道大学動物実験委員会（承認番る。ヘルパーＴ細胞はサイトカインを産生するこ号15-0089）および酪農学園大学動物実験委員会とで免疫機能調節の中心的な役割を担うととも（承認番号VH17B2）に承認され，各大学の動物に，サイトカインや抗原提示細胞からの刺激を受実験規程に基づき実施した。母豚より血液を採取

け，Th1，Th2，Th17，制御性Ｔ細胞（T-reg）

し，1,710×ｇ，15分遠心し，血漿を分離し測定などのサブセットに分化する。豚では精漿が子宮まで－30℃で保存した。バフィコートを回収し内への白血球の浸潤やサイトカイン発現に影響を0.5mg/ml EDTA-2Na 添 加 DPBS（以 下 EDTA-

及ぼすこと や交配後に子宮内でヘルパーＴ細胞

PBS）で希釈懸濁した。５倍希釈パーコール溶液

やT-regが増加することが報告されている。まにその懸濁液を重層し，800×ｇ，30分遠心した

た，子宮への精漿の暴露が受胎率および産子数を後，上清とパーコール層の間にあるPBMCの層を増加させるとの報告もある５，６）。さらに，精漿を回収した。その後EDTA-PBSを加え，200×ｇで除いた希釈精子液で人工授精した豚に比べ，精漿

10分間遠心し，上清を捨てる洗浄を３回実施したを添加した希釈精子液で人工授精した豚ではその後，培養液に懸濁し，40µm Cell Strainerで濾過

産子数が多く，また子宮内膜組織中の授精から３し分離したPBMCを以降の実験に用いた。培養液

時間後のIL-２発現量が低いことが報告されていはる 。このように交配時に子宮で起きている免疫

100IU/mlペニシリン，100µg/mlストレプトマイ

３）

７）

４）

RPMI-1640 （R8758, Sigma-Aldrich）© The Ito Foundation

に

216

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

シン，10％牛胎子血清に調整した。
2.2

CT 法 を 採 用 し た 。測 定 に は THUNDERBIRDⓇPBMCの精漿添加試験

SYBRⓇ qPCR Mix（東 洋 紡 株 式 会 社）お よ び

３頭の母豚について分離したPBMCを培養液中LightCycler Ⓡ 480 ver.2 （Roche Diagnostics,

２×10６/mlに調整し，200×ｇで10分間遠心し，Indianapolis）を用いて測定した。増幅条件は，上清を捨て，再度培養液に懸濁したものをコント

初期変性（95℃，60秒間）の後，変性（95℃，15

ロール群，10％の精漿を添加した培養液に懸濁し秒間），アニーリング（60℃もしくは62℃，30秒

たものをSP群とし，それぞれ１mlずつ37℃，５％間）および伸長反応（72℃，45秒間）を45サイク

CO２条件下で１時間培養した。精漿は，３品種のル行った。

雄種豚計６頭より採取しプールしたものを－30℃2.4で保存し，培養液への添加より前に1.2µm径の滅

血漿中プロジェステロン（Ｐ４）およびエスト
ラジオール（Ｅ２）は既報８）の方法に従って測定

菌フィルターでろ過したものを用いた。
2.3

血漿中ステロイドホルモン濃度測定

リアルタイムPCRした。

得られたPBMCのうち１×10 ～１×10 細胞か
６

2.5

７

実験計画

らISOGENⅡ（ニッポンジーン）を用いて，添付

黄体期の血液材料は交配していない母豚３頭かの 指 示 書 に 従 い RNA を 抽 出 し た 。 さ ら にら，最も強い発情徴候を示した日から11～13日後

ReverTra Ace

qPCR RT Master Mix withに採取した。交配前後の血液材料は経産豚６頭かgDNA Remover（東洋紡株式会社）を用いて逆ら採取した。離乳時にeCG（動物用セロトロピン，

転写反応を行い，cDNAを得た。リアルタイム

あすかアニマルヘルス株式会社）を1,000IU筋肉

PCRによりIL-２，IL-４，IL-８，IL-10，IL-17，

注射して発情を誘起した３頭と，無処置の３頭かIFN-γおよびFoxp３のmRNA発現量を測定した

ら，離乳後の初回交配からその24時間前までの24（Table１）。内部標準にはUbiquitin Bを用い，ΔΔ

時間（交配前）および初回交配から12～24時間後Ⓡ

Table 1 Oligonucleotide primers and annealing temperature used for realtimePCR
Gene
IL-2
IFN-γ
IL-4
IL-10
IL-17
IL-8
Foxp3
Ubiquitin B

Primer（5'-3'）
F：GCTACAGAATTGAAACACCTTCAGT
R：GAGTCAGAGTTTTTGCTTTGACCTAF：TCAGTCAGCATCAAGGGTCA
R：GGGCAGAACAGAGAGGGTTA
F：TTCGGCACATCTACACAGACAC
R：TTCATGCACAGAACAGGTCA
F：TGGAAGACGTAATGCCGA
R：CCCTCTCTTGGAGCTTGCTAF：ACTCGGGCTGTATCAATGCTR：AGCCCACTGTCACCATCACT
F：TGCATAAATACGCATTCCAC
R：TTGTTGTTGCTTCTCAGTTCTCF：GCAGTCTCTGGAACAACAGC
R：CAATACAGCAGGAACCCTTG
F：TGTTGGCGGTTTCGCTGTTG
R：AGTGCGGCCATCCTCCAGCT＊Yamaguchi et al.，2013© The Ito Foundation

Size
（bp）

GenBank

Annealing
Tm（℃）

92

NM_213861

60℃

134

NM_213948

62℃

101

NM_214123.1

60℃

186

NM_214041

60℃

144

NM_001005729

60℃

198

NM_213867＊

60℃

131

NM_001128438

60℃

248

NM_001105309＊

60℃

「豚の一腹産子数を一頭増やす」子宮の免疫調節を担う精漿タンパクの特定

217までの12時間（交配後）に血液材料を採取した。

超音波画像診断により交配後採材時の卵胞の大発情鑑定は，朝夕２回の背圧試験による不動反応

きさはeCG処置母豚３頭で７～10mm，無処置母および外陰部所見により判定し，発情と判断され豚３頭のうち１頭は前卵胞が排卵しており，２頭た場合，自然交配または人工授精を行った。

は一部の卵胞が排卵していた。血漿中ステロイド

2.6

統計解析

ホルモン濃度の結果（Table２），Ｐ４濃度は交配統計解析については，各ステージのサイトカイ

前および交配後に比べ黄体期が有意に高かったン，転写因子，および血漿中ステロイドホルモン（ｐ＜0.01）。Ｅ２濃度は交配前が交配後に比べ有濃度は一元配置分散分析を行った後，Tukey-

意に高かった（ｐ＜0.05）（Table２）。また，Ｅ２

KramerのHSD検定を用いて比較した。交配前後

およびＰ４濃度は離乳時にeCG処置母豚と無処置のサイトカイン発現および血漿中ステロイドホル

母豚の間で有意な差はなかった。これらは母豚のモン濃度については二元配置分散分析を行い，離生殖ステージ中のホルモン変化を調べた報告９，10）

乳時のeCG投与の有無と交配前後が及ぼす影響にと一致する。無処置母豚は５～８日後，eCG処置

ついて比較し，Post hoc検定にはStudentのｔ検

母豚は離乳からより早い３～４日後に発情を示し定を行った。いずれの解析においてもｐ＜0.05をたことから，eCGによる発情誘起ができていたと有意差とした。

考えられる。
交配前後および黄体期におけるmRNA発現は３．結果と考察（Fig.１），いずれのサイトカインについても各ス

本研究では，豚の交配における末梢血のリンパテージ間で有意差はなかった。交配前後で変化傾

球への影響を検討するため，末梢血からPBMCを

向 が 認 め ら れ た IL- ２ ，IFN- γ ，IL- ４ お よ び

分離し，ヘルパーＴ細胞のそれぞれサブセットのIL-17のmRNA発現について，eCG処置母豚およ指標，すなわちTh１の指標としてIL-２および

び無処置母豚の個体ごとの交配前後の変化を

IFN-γ，Th２の指標としてIL-４およびIL-10，

Fig.２に示した。IL-２の発現量はeCG処置母豚に

Th17の指標としてIL-17，T-regの指標として転おいて有意に高く（ｐ＜0.05），また交配前に比写因子であるFoxp３のmRNA発現を測定した。

べ交配後に低下する傾向にあった（ｐ＝0.08）。

さらに，白血球を遊走させるケモカインとしてIFN-γ，IL-４およびIL-17の発現量はeCG処置

IL-８のmRNA発現を測定した。

の有無や交配前後で有意な差異は認められなかっ

Table 2 Plasma Progesterone and Estradiol concentration in reproductive cycle
Samples

BeforeAfter

P４ (ng/ml）

Mean±SD
Maximum conc.
Minimum conc.

17.9±6.0ａ
22.5
9.4

CL

1.0±0.7ｂ2.1
0.2

1.6±1.0ｂ
3.1
0.4

E２ (pg/ml）

Mean±SD
Maximum conc.
Minimum conc.

2.7±0.9AB
3.9
1.8

26.1±20.0Ａ
53.5
2.1

2.5±1.0Ｂ
4.5
1.2

CL：Samples in Luteal Phase
Before：Samples which were collected within 24 h before the first mating or AI
After：Samples which were collected within 12 to 24 h after the first mating or AIa, b：（p＜0.01，Tukey-Kramertest）
A, B：（p＜0.05，Tukey-Kramertest）© The Ito Foundation

218

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）‒3 IL‒2（×10 ）
3.0‒3（×10 ）‒3（×10 ）
8.0

1.5

2.0

1.0

1.0

0.5

0

0

0.10

IFN‒γ

IL‒10

6.0
4.0
2.0
0

（×10 ） IL‒17
8.0
‒4

0.08

1.0

0.6

4.0

0.04

0.4

2.0

0.02

0.2

0

0

IL‒8

0.8

6.0

0.06

IL‒4

C

（×10 ） Foxp3
‒3

L

f
Be

or

e

Af

te

0

r

C

L

Be

fo

re

Af

te

r

2.0
1.5
1.0
0.5
0

C

L

f
Be

or

e

Af

te

r

Fig. 1 Comparison of mRNA expression in PBMCs in reproductive cycle.

（Therewas no significant difference among groups. p＞0.05,Tukey-Kramer test）
CL：Samples in Luteal PhaseBefore：Samples which were collected within 24 h before the first mating or AI
After：Samples which were collected within 12 to 24 h after the first mating or AI‒3 IL‒2（×10 ）
3.0＊‒3 IFN‒γ（×10 ）
1.5

2.0

1.0

1.0

0.5

0

0.5 Before

After

0

0.5 Before（×10 ）IL‒4
8.0‒3（×10 ）IL‒17
8.0

6.0

6.0

4.0

4.0

2.0

2.0

0

Before

After

‒4

After

0

BeforeAfter

Fig. 2 Changes of cytokine expression in peripheral blood mononuclear cells in same sows. The diamonds（◇）

represent sows treated with eCG and the circles（〇）represent sows non-treated.

＊：higher in eCG treated sows（p＜0.05）compared with non-treatedBefore：Samples which were collected within 24 h before the first mating or AI

After： Samples which were collected within 12 to 24 h after the first mating or AI© The Ito Foundation

「豚の一腹産子数を一頭増やす」子宮の免疫調節を担う精漿タンパクの特定219たものの，交配前には大きかった個体間の差異がめ，個体間の差異も小さく，また交配の刺激や精交配後には縮小しており，またeCG処置母豚の方液の侵入によってサイトカイン発現が適正な水準

が無処置母豚に比べ，交配前の個体間の差異が大に調整された，あるいは発情終了に向けてサイト

きい可能性が示された（Fig.２）。本研究においカイン発現が元の水準に戻った可能性が考えられて交配前は離乳後の初回交配から24時間前までのる。

24時間に採材しており，この時期は発情に向けて培養したPBMCsへの精漿添加については予備

エストロジェンのピークや卵胞の発育など大きな試験として３頭のみで実施したが，いずれのサイ変化が予想されるため，個体の状態に差が大きトカインについてもコントロール群と精漿添加群

く，交配前のサイトカイン発現量もばらつきが大との間で有意差はなかった。それぞれの値を個別きくなった可能性が考えられる。また，交配後にに示したところ（Fig.３），個体差はあるもののついては初回交配後の12時間に採材しているた

IL-８，10および17においてコントロール群に比NDFig. 3 Individual values of mRNA expression in PBMCs in control（open bar）and SP-treated（black bar）condition.

Each value was calculated with the values before PBMC culture started as１.

© The Ito Foundation

220

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

べ精漿添加群における発現量が増加する変化が見測定し，交配および精漿の影響を評価した。

られた。IL-８は多くの細胞で産生される強力なIFN-γ，IL-４，-17については交配前に大き白血球を遊走させる因子である11）。豚の子宮内膜かった個体差が交配後に縮小したことから，発情においても交配から３時間後に子宮内膜IL-８発

または交配によりPBMCのサイトカイン発現が適現が増加し，特に精子や精液希釈液の影響で大き正な水準に調節されることが示唆された。

。子宮にお培養PBMCへの精漿添加によってIL-８発現がけるIL-８を含めたケモカインは，白血球を遊走増加したことから，精漿がPBMCにおいても遊走させ細菌の感染防止や受精に関与しない精子の除作用を惹起する可能性が示された。

く増加することが報告されている

12，13）

去などにより子宮環境を調節し，その役割は胚の生存に重要であると考えられ，今回の結果は13，14）生殖ステージに応じてPBMCのサイトカイン発
現に一部変化が認められたことから，豚において子宮局所と同様に全身の免疫系にも変化が生じる

それらを反映したものと考えられる。
妊娠の成立および維持において重要な役割を果ことが示唆された。

たすヘルパーＴ細胞のサブセットは互いに分化・活性化を抑制し合うことでバランスを保っている。マウスでは交配時に精漿が子宮に作用し，子宮および末梢血において交配後にT-regが増加する15）。ヒトでは妊娠時には子宮および末梢血においてTh１・Th２バランスがTh２優位になること，またT-regが増加することが知られており，
Th ２ 優 位 に よ る Th １ の 細 胞 性 免 疫 の 抑 制 やT-regの免疫抑制作用が，胚への免疫寛容・妊娠維持において重要な役割を担っている16，17）。このようにヒトやマウスでは，交配や妊娠に伴い生じる免疫系の変化が子宮局所だけでなく末梢血においても認められることが知られていることから，交配や妊娠は全身の免疫系に影響していると考えられる。本研究においてはヒトやマウスと同様の変化を豚で確認することはできなかったが，豚におけるヘルパーＴ細胞およびサイトカインの役割にはまだ不明な点が多いため，今後は動物種差を考慮したさらなる詳細な検討が必要である。
４．要

約

豚の交配における末梢血のリンパ球への影響を検討するため，末梢血からPBMCを分離し繁殖ス

文
献１） 齊藤利朗他：北畜会報，41，36～52，1999．
２） Ernerudh, et al. ： Am J Reprod Immunol ， 65 ，31～43，2011．
３） O'Leary, et al.：Reproduction，128，237～247，
2004．
４） Jalali, et al. ： Mol Reprod Dev ，81 ，270 ～ 281 ，
2014．
５） Murray, et al. ： J Anim Sci ， 56 ， 895 ～ 900 ，1983．
６） Mah, et al.：J Anim Sci，60，1052～1054，1985７） 奥山みなみ他：第108回日本繁殖生物学会大会講演要旨集，104，2015．
８） Yanagawa, et al.：J Reprod Dev ，61 ，61 ～ 66 ，
2015．
９） Robertson, et al. ： J Reprod Fertil ， 40 ， 133 ～
141，1974．
10） Noguchi, et al.：Reproduction，139，153～161，
2010．
11） 矢田純一：医系免疫学改訂12版，中外医学社，
378～384，2011．
12） Schuberth, et al. ： Theriogenology ， 70 ， 1174 ～
1181，2008．
13） Taylor, et al.：Reprod Domest Anim，44，180～
188，2009．
14） Lorenzen, et al.：Veterinary Research，46，116，2015．
15） Robertson, et al.：Biology of Reproduction，80，1036～1045，2009．
16） Wegmann, et al. ： Immunology Today ，14 ，353
～356，1993．
17） Saito, et al.：Am J Reprod Immunol ，63 ，601 ～
610，2010．

テージにおけるサイトカイン発現mRNA発現を© The Ito Foundation

221

牛精液および受精卵の未凍結保存に向けた過冷却促進物質の配合デザイン
The blend design of supercooling facilitating materials for non-cryopreserve ofbovine semen and early embryo

星

野

由

美

（広島大学大学院生物圏科学研究科）

Yumi Hoshino（Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University）

Cryopreservation is extensively used for the preservation of reproductive cells such as
sperm, oocyte and early embryo. This method offers a major advantage as the frozen material
can be preserved almost permanently in liquid nitrogen. However, DMSO and ethylene glycol
used in the preservation solution are known to be cytotoxic, and cellular damage by freezing
injury is responsible for the low fertilization and development rate. In this study, the validity ofplant-derived non-cryopreserve compounds were inspected with the aim of developing a nonfreeze preservation technology for the preservation of semen and early embryo. The coffee
extract was used as supercooling-accelerating substances. The component of the coffee extract
was caffeine, caffeic acid, ferulic acid, coumaric acid, chlorogenic acid. The suprecoolingfacilitating activity of caffeine was highest. The supercooling-promoting effect was observedwith coffee extract and caffeine during preservation of semen and 2-cell embryo for 14 days at－6℃．The viability and motility of the sperm were good by adding coffee extract or/and
caffeine, and structure of the cell membrane in the 2-cell embryo was maintained by adding.
As a result, in coffee extract and caffeine added group，2-cell embryos were developed toblastocyst even after 14 days preservation at －6℃．In this study, supercooling preservationof semen and embryos were achieved by using supercooling-accelerating substances such as
coffee extract and caffeine. When the appropriate condition can be built, non-cryopreserve ofsemen and early embryo would become possible.

１．目が広く用いられており，液体窒素中で半永久的な的保存が可能である。しかし，凍結により生じる細生殖細胞の保存は，優良形質をもつ家畜遺伝資胞膜へのダメージや，保存液に含まれる凍害保護源の活用や希少動物の遺伝子保存に有効であり，物質による細胞毒性は，現行の凍結保存法では避必要不可欠な技術となっている。細胞の長期保存けることができない１，２）。また最近の研究によるには，ガラス化法や緩慢凍結法などの凍結保存法と，保存液に含まれる凍害保護物質が受精卵移植© The Ito Foundation

222

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

後に子宮内で炎症を引き起こす原因になることも究では，植物由来の氷晶形成抑制物質を用いて，指摘されている。精子や受精卵がダメージを受け細胞毒性のない保存液で生殖細胞の未凍結保存のると，細胞の生存やその後の受精・発生に大きく可能性を検証するとともに，精液や受精卵を未凍影響する。これらの問題を回避するために，過冷結で保存するための過冷却促進物質の配合デザイ

却を利用した未凍結での保存法を検討する。関西ンを検討することとした。

大学の河原秀久教授らは，植物（ヒノキ，大根など）や食品廃棄物（コーヒー粕，あん粕など）か

２．方法

ら氷晶形成抑制物質を発見し，その抽出に成功し植物由来の抽出液に含まれる過冷却促進物質ている 。氷晶形成抑制物質には，不凍タンパク（氷晶形成抑制物質）を単離・精製し，含有成分

質や過冷却促進物質として分類されるものがあを分析することにより抗酸化効果や代謝制御に関る。これを適切な濃度で加えると，低温下でも氷わる物質を探索し，細胞保存に有効な成分を検討

核形成が抑制されるため，過冷却状態を維持させした。過冷却促進物質の単離・精製および含有成ることができる。一般に液体が凝固点以下でも固分の分析は，関西大学の河原秀久教授の協力を得

体にならない状態を過冷却というが，液体中に異た（Fig.１）。

３）

物が存在すると過冷却温度は上昇し凍結しやすく生殖細胞における過冷却保存の条件を検討するなる。しかし，氷晶形成抑制物質を添加することため，マウスを用いて予備実験を行った。まず，で過冷却温度を下げることが可能になるため，細ICR成熟雄マウスの精巣上体尾部より精子塊を採胞や組織の保存に有効であると考えられる。本研取した。採取した精子塊は，37℃に加温したUW

Fig. 1 The preparation of the coffee refuse extract containing supercooling-facilitating materials.

© The Ito Foundation

牛精液および受精卵の未凍結保存に向けた過冷却促進物質の配合デザイン

223

液（University of Wisconsin（ViaSpan），アステ

維持できることを確認した。また，この温度条件

ラス製薬）100µｌのドロップに10分間静置し，においては，14日間維持しても保存液の凍結は認

精子を自然に懸濁させた。均一に拡散した精子懸められず，細胞保存に有効であると判断した。

濁液10µｌは各保存液100µｌに希釈して過冷却保

精子をコーヒー粕抽出液またはカフェインを含存に供した。温度制御と過冷却維持には超低温ア

むUW液で１，３，７，14日間，－６℃で保存した

ルミブロック恒温槽（クライオポーター，サイニ

ところ，生存性および運動性に効果が認められたクス）を使用し，20℃から段階的（0.1℃／分）（Fig.２）。すなわち，UW液単独の保存液では保に温度を下げ，－６℃で１，
３，
７，14日間保存を

存14日後には運動性を有する精子は確認できな行った。温度回復時には，段階的（0.1℃／分）

かったが，コーヒー粕抽出液またはカフェイン添に温度を上げ，20℃で回収した。温度制御は，

加区では精子の運動性が認められた（コーヒー粕

Berendsenらの方法に準じて行った４）。精子の健抽 出 液 添 加 区 ： 23 ％，カ フ ェ イ ン 添 加 区 ：常性は，HTF培地で培養１時間後の生存性と運47％）。さらにコーヒー粕抽出液とカフェインの動性，その後の体外受精によって評価した。

混合添加区においては，さらにその効果は高く14受精卵の保存には，体外受精後２細胞になった日後に55％の精子で運動性が確認された。倒立顕ものを選別し，100µｌの保存液に浸漬して過冷

微鏡下での形態観察においては，保存後の精子形却保存を行った。保存条件は精子と同様であっ

態に異常は認められなかった。コーヒー粕抽出液

た。過冷却保存後，受精卵はKSOM培地で培養しに含まれる成分とカフェインが過冷却条件下にお胚盤胞までの発生率を調べた。マウスでの保存条

いても精子の運動性維持に効果を発揮したものと件に基づき，牛精液および受精卵の過冷却保存条考えられた。
受精卵の保存は２細胞期胚を対象とした。コー

件の検討を行った。

ヒー粕抽出液またはカフェインを含むUW液で最３．結果と考察

大14日間保存した。保存後の細胞骨格の正常性をコーヒー粕抽出液１mg/mlに含まれる成分を判定するため，F-actinおよびα-Tubulin抗体を分析したところ，カフェイン，カフェ酸，クロロ

用いた免疫蛍光染色を行った。UW液単独に比べ，

ゲン酸，クマル酸が主として含まれていることがコーヒー粕抽出液とカフェイン添加区において，明らかになった。それぞれの濃度と抗氷核活性値

細胞膜および微小管が安定していることを確認しを比較したところ，弱酸性フェノール層にカフェた。保存後の受精卵を体外培養し胚盤胞への発生

インが多く含まれ，抗氷核活性が最も高かった。

率を比較したところ，保存３日以降でコーヒー粕

カフェインは哺乳動物の卵子や受精卵の活性を維抽出液とカフェインの有効性が示された（Fig.

持する効果があり，培養液にも添加されることが３）。コーヒー粕抽出液とカフェインは単独でも多い５）。このことから，本研究ではコーヒー粕抽それぞれ効果を発揮するが，混合添加はより効果

出液とカフェインを過冷却促進物質として使用すが高い結果となった。

ることとした。それぞれ0.5または1.0mg/mlの濃以上の結果から，精子や受精卵の保存において度になるようUW液に添加し，氷晶形成抑制効果

コーヒー粕抽出液とカフェインを含むUW液が有（過冷却促進効果）を検証したところ，どちらも効であり，－６℃で14日間の未凍結保存が可能で－６℃～－12℃の温度条件下で安定して過冷却をあることを示した。一般的に生殖細胞の体外操作© The Ito Foundation

224

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 2 The motility of the sperm after 1, 3, 7 and 14 days supercooling preservation.

Fig. 3 he developmental rate to blastocyst after 1, 3, 7 and 14 days supercooling preservation.

過程では酸化ストレスが生じやすく，それによっ定性を維持する効果があったものと考えられた。

て生殖細胞はダメージを受ける６）。コーヒー粕抽本研究では，コーヒー粕抽出液とその成分であ出液に含まれるクロロゲン酸は抗酸化物質としてるカフェインをUW液に添加することで，精子とも知られており，抗酸化作用によって細胞が保護

受精卵の未凍結保存が可能であることを示した。

されたことも考えられる。また受精卵において動物種や対象細胞に最適な条件検討を行う必要はは，コーヒー粕抽出液添加区で細胞膜の安定性があるが，適切な条件を構築できれば，新規保存法

高かったことから，抽出液含有成分に細胞膜の安としての発展が期待されるため，引き続き生殖細© The Ito Foundation

牛精液および受精卵の未凍結保存に向けた過冷却促進物質の配合デザイン

225

胞の過冷却保存に有効な成分を探索し，保存条件

条件検討を行う必要はあるが，適切な条件を構築の最適化を図っていく予定である。

できれば新規保存法としての発展が期待される。

４．要

約

生殖細胞の保存には凍結保存法が広く用いられているが，細胞へのダメージは避けられず，融解後の受精や発生に影響を及ぼしている。現状の問題点としては，凍結により生じる細胞膜の損傷，保存液に含まれる凍害保護物質による細胞毒性，である。この問題を解決するために，本研究では植物由来の氷晶形成抑制物質を用いて，細胞毒性のない保存液で生殖細胞の過冷却保存（未凍結保存）の可能性を検証することとした。氷晶形成抑制効果が知られているコーヒー粕抽出液の有効成分を分析したところ，カフェイン，カフェ酸，ク
ロロゲン酸，クマル酸が含まれ，特にカフェイン
で抗氷核活性（過冷却促進効果）が高いことが明らかになった。そこで，コーヒー粕抽出液とカフェインを過冷却促進物質として保存液に添加し，その効果を検証した。その結果，コーヒー粕
抽出液とカフェインが精子や受精卵の過冷却保存に有効であり，－６℃の温度条件下で14日間の保存が可能であることを示した。保存効果はどちら

文献１） Mandawala, A. A., Harvey, S. C., Roy, T. K.,
Fowler, K. E.：Cryopreservation of animal oocytes
and embryos：Current progress and future
prospects, Theriogenology ，86（7），1637 ～ 1644 ，
2016．
２） Saragusty, J., Arav, A.：Current progress inoocyte and embryo cryopreservation by slow
freezing and vitrification, Reproduction，141（1），1～19，2011．
３） Kawahara, H., Tagawa, E., Watanabe, C., Hamada,J., Hamada, S.：Characterization of Anti-Ice
Nucleation Activity of the Extract from Coffee
Refuse, Biocontrol Sci，22（4），205～211，2017．
４） Berendsen, T. A., Bruinsma, B. G., Puts, C. F.,
Saeidi, N., Usta, O. B., Uygun, B. E., Izamis, M. L.,
Toner, M., Yarmush, M. L., Uygun, K.：Supercoolingenables long-term transplantation survival following
4 days of liver preservation, Nat Med ， 20 （7）， 790～793，2014．
５） Ariu, F., Bogliolo, L., Leoni, G., Falchi, L., Bebbere,
D., Nieddu, S. M., Zedda, M. T., Pau, S., Ledda, S.：
Effect of caffeine treatment before vitrification on
MPF and MAPK activity and spontaneous
parthenogenetic activation of in vitro matured ovine
oocytes, Cryo Letters，35（6），530～536，2014．
６） Agarwal, A., Aponte-Mellado, A., Premkumar, B.
J., Shaman, A., Gupta, S.：The effects of oxidative
stress on female reproduction：a review, Reprod
Biol Endocrinol，10（49），2012．

も混合区で高かった。動物種や対象細胞に最適な© The Ito Foundation

226

アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響（Ⅱ）
Effects of adipokine and insulin resistance on the bovine fertility（Ⅱ）

小

林

仁

（宮城大学食産業学群）

Jin Kobayashi（School of Food Industrial Sciences, Miyagi University）

The present study aimed to identify compounds related to fertility in bovine maternal
serum. In Experiment I, three cattle trying to pregnant with grazing because of infertility wereused. Blood samples were collected at the start of grazing and mating which subsequently
resulted in pregnancy. Sample were analyzed using metabolome analysis. In Experiment II, six
breeding cows which were scheduled for fix-time insemination were used. Blood samples werecollected at the immediately after delivery（2 weeks after delivery）and the insemination（6weeks after delivery）.Samples were analyzed using metabolic profile test（MPT）.The analysis
revealed four or six compounds, which were significant（p < 0.05）at mating compared to thestart of grazing or at the start of grazing compared to mating, respectively. There were nocompounds which increased more than two-fold at mating compared with the start of grazingor the start of grazing compared with mating（Exp I）. The results of MPT from six breeding
cattle showed that the blood glucose level at 6 weeks was less than 2 weeks in the cattle
becoming pregnant. In contrast, the blood glucose level increased in empty cattle（Exp II）.
Although the cause of infertility was unknown, energy metabolism was considered to be
involved in fertility.

１．目

れているものの，受胎率低下が止まらない状態が的続いており，その原因の解明が急務となっている。

近年，乳用牛の受胎率低下が世界的に続いてお肉用牛の受胎率が低下する中，不妊の繁殖牛をり，遺伝的な改良による乳量の増加がその原因と受託して妊娠させる不妊牛専門の牧場が少数ながもいわれ，深刻な問題となっている１）。一方，我ら全国的に開設されている。その一つであるＨ牧が国では肉用牛でも，人工授精による受胎率が継場は，受託した牛を放牧牧牛繁殖で飼養し，不妊続して低下が起きている 。不妊の要因として，となった繁殖牛を高率に妊娠させている。繁殖牛

急激な飼養頭数の上昇に伴う発情の見逃しや注入の人工授精による全国平均の受胎率が55.6％（家時期のずれなどの技術的な問題，脂肪交雑を重視

畜改良事業団，平成26年度）に対し，不妊牛を集した育種改良や飼養管理による影響などが指摘さめたＨ牧場の受胎率は８割以上としており，交配

２）© The Ito Foundation

アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響（Ⅱ）

227

方法の違い以外にも繁殖牛の妊孕性を改善する技

給与時を避け，牛を保定して頸静脈から凝固促進術がＨ牧場の飼養管理には含まれていると考えら

用シリカ微粒子添加（SST）管およびフッ化名ナれる。そこで，本研究では，Ｈ牧場に入牧して妊トリウム添加（NaF）管の真空採血管を用いて採娠した不妊牛の入牧時と入牧後の血液を比較する血を行った。採血後は保冷剤入りの保冷バッグにことで，Ｈ牧場で行われている妊孕性を回復させ入れ，宅配便で冷蔵のまま研究室に送付した。採る機序を調べ，現在繁殖牛で起きている受胎率低

血の翌日，研究室で20分間冷却遠心して血清分離下に関与するする原因の解明につなげることを目を行い，そのまま，または一旦－30℃で凍結保存的とした。

した後，血液生化学検査，ホルモンおよびアディ

初年目は，不妊牛の入牧時と入牧後の血液を用

ポサイトカインを測定した。測定項目は，ブドウ

いて，代謝プロファイルテスト（MPT）を行い，糖（Glu），尿素窒素（BUN），総コレステロール

牛群の栄養状態や健康状態から不妊に関与する血（T-cho），アルブミン（Alb），総タンパク質（TP），

液成分について調べた。今回は，Ｈ牧場への預託

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼによって妊孕性を回復した牛の，入牧時と入牧後（AST），ア ラ ニ ン ア ミ ノ ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼの血液を用いてメタボローム解析を行い，不妊に（GPT），アンドロステンジオン（Ａ４）とエスト関与する化合物の探索を行った。また，別の繁殖

ラジオール17β（Ｅ２），TNFαとした。

牧場の分娩後と種付け時の血液を採取しその後の妊否の結果から，血液成分と妊孕性との関係を調べた。

３．結果と考察3 . 1 試験Ⅰ：妊娠に至った不妊牛の血液成分

２．方のメタボローム解析法

入牧時と妊娠に至った交配時の血清サンプルに

2 . 1 試験Ⅰ：妊娠に至った不妊牛の血液成分

ついて精密質量分析を実施し，2,881種類の化合ピークが得られた。FDR（false discovery rate）のメタボローム解析
昨年調査した宮城県登米市南方町のＨ牧場で不有意水準５％以下で，入牧時と妊娠に至った発情妊牛として預託され妊娠に至った黒毛和種繁殖牛時（妊娠発情時）の化合物のピークについてｔ検から３頭を選び，入牧時と妊娠に至った交配時の討を行ったところ，入牧時のみに出現する化合物

血清を比較してメタボローム解析を行った。メタ

のピークは４種類，妊娠発情時のみに出現する化

ボローム解析には，液体クロマトグラフィー質量合物のピークは６種類であった。妊娠発情時に比分析法（LC：1200 series（Agilent），質量分析計：較して入牧時にあるいは入牧時に比較して妊娠発

LTQ Orbitrap XL （Thermo Fisher Scientific））

情時に２倍以上多いピークはともに検出されなを用い，（株）アプロサイエンスに依託して行っかった。
次に，二次元主成分分析（PCA）を用いてデーた。
試験Ⅱ：繁殖牛の分娩後のMPTと繁殖性

タセットを分析した。PCAプロットを作成し，宮城県登米市米山町Ｍ牧場の繁殖牛群から無作保存した血清サンプルを６つのグループに分けた

為に黒毛和種６頭を抽出し，第１回目の採血を分（Fig.１）。Factor１（第一主成分）は23.5％を示娩直後（分娩後約２週間），第２回目の採血を種し，50％を上回るfactorはみられなかった。この付け時期（分娩後１月半）に行った。朝夕の飼料ことから，今回用いた入牧時と妊娠に至った交配

2.2© The Ito Foundation

228

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

◆
◆

◆

◆

◆

◆

Fig. 1

Principal component analysis of infertile bovine serum. Blood samples
were collected at the start of grazing（◆）and mating（◇）which
resulted in pregnancy.

時の血清サンプルによるメタボローム解析では，なっている可能性も考えられる。供試牛はすべて

妊孕性に関与する要因の抽出は困難と判断された。

同じ牛房内で飼養され，妊娠に至らなかった２頭3.2

実験Ⅱ：繁殖牛の分娩後のMPTと妊孕性にBCSの減少など，深刻なエネルギー不足を示す

繁殖牛群の中から６頭を抽出し，分娩直後およ兆候はみられなかった。しかし，妊孕性とも関係

び種付け時期に採血を行い，その後の妊娠の有無の深い視床下部－下垂体－性腺軸の中央制御にもにより血液成分と妊孕性の比較を行った。供試牛

関与する可能性のあるエネルギーセンサー機能が６頭のうち，定時人工授精により受胎したのは４視床下部にあり，体重やBCSの変化のような表現

頭で，２頭に発情の再発がみられた。この妊娠牛

系に先行して内分泌的にエネルギーバランスが負と不妊牛の血液成分を比較したところ，妊娠牛でに傾いていることも考えられる。その制御のいくは種付け時期に血糖値が減少したのに対し，不妊

つかは内臓脂肪が産生するレプチンを介して行わ

牛では逆に上昇傾向を示した。一方，その他の血れていることも報告されている５，６）。肉用牛の繁液成分には，一定した傾向は認められなかった。

殖では，るい瘦による不妊とともに過剰な脂肪蓄

牛の血糖値は糖新生によって生成されるため，積による不妊も経験的に知られていることから，食餌に由来する糖質に影響を受ける単胃動物に比エネルギーバランスと受胎についてさらなる研究

べ比較的安定しており，単位動物と異なる反応をが必要である。

示す。エネルギー摂取が不足した場合，牛では糖新生が亢進するため，血糖値が一時的に上昇する

４．要約

ことが知られている３，４）。今回，不受胎となった

不妊牛専門の牧場に預託され，その後妊娠した繁殖牛にエネルギーの不足が起きていたと仮定す

牛３頭の入牧時と妊娠に至った発情時の血清につると，エネルギー不足が妊娠しなかった原因といてメタボローム解析を実施し，不妊に関与する© The Ito Foundation

アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響（Ⅱ）

化合物の探索を行った。入牧時のみに出現する化合物のピークは４種類，妊娠発情時のみに出現する可能物のピークは６種類であった。妊娠発情時に比較して入牧時に２倍以上多いピークおよび入牧時に比較して妊娠発情時に２倍以上多いピーク
は共に検出されなかった。次に，定時授精を行う
繁殖牛群から無作為に６頭を抽出し，分娩直後と分娩１月半後の血液成分と妊娠の有無を調べたところ，妊娠した牛と妊娠しなかった牛の血糖値の推移に違いがみられることが明らかとなった。
文
献１） Butler, W. R.：Energy balance relationships with229

follicular development, ovulation and fertility in
postpartum dairy cows, Livest Prod Sci ，83 ，211 ～
218，2003．
２） 家畜改良事技術研究所：受胎調査成績［インターネット上ホームページ］家畜改良事業団，前橋；［2018年３月10日引用］URL：http://liaj.or.jp/giken/
aboutus.html
３） 渡邉貴之，小西一之，熊谷秀一郎，野口浩正，武井直樹：日本畜産学会報，85（3），295～300，2014．
４） 渡邉貴之，小西一之：多頭飼養における黒毛和種
繁殖雌牛生産性向上のための代謝プロファイルテス
トを用いた飼養管理マニュアル，平成28年度版，１～159，独立行政法人家畜改良センター鳥取牧場，鳥取，2016．
５） Briana, D. D., Malamitsi-Puchner, A.：Reprod
Sci，16，921～937，2009．
６） Magni, P., Vettor, R., Pagano, C., Calcagno, A.,
Beretta, E., Messi, E., Zanisi, M., Martini, L., Motta,
M.：Endocrinology，140，1581～1585，1999．

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230

乳牛の卵胞嚢腫における副腎由来ホルモンの関与と卵胞嚢腫共存卵胞由来の卵母細胞の正常性
Involvement of corticosteroid on ovarian cystic follicles and quality ofoocyte of follicles coexisting with cystic follicle in dairy cow

清

水

隆

（帯広畜産大学生命・食料科学研究部門）

Takashi Shimizu（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Department of Life and Food Science）

After parturition, the increased concentration of cortisol in blood is observed in cow withuterine inflammation before formation of ovarian follicular cyst. Thus, the formation of follicular
cyst may be related to uterine inflammation of postpartum cow. The aim of the present study
is to examine the association of cortisol and noradrenaline（NA）in cystic follicles isolated frombovine ovary, and to examine the quality of oocyte of follicles coexisting with cystic follicle.
Exp. 1：Ovarian follicles were collected from slaughterhouse, and were divided to 3 categories;
preovulatory follicle（POF）, E 2-active follicular cyst（EAFC）, and E 2-inactive follicular cyst
（EIFC）. Follicular fluid（FF）, granulosa cells（GC）and theca cells（TC）were collected fromeach follicle stage. Estradiol（E2）, cortisol and NA in FF were measured by enzyme-immuno
assay（EIA）. Exp 2：Immature oocytes were collected from small follicles with or without
follicular cysts in ovary from slaughterhouse. After in vitro maturation culture of collected
immature oocytes, the matured oocytes were transferred to IVF 100 medium and fertilizedwith frozen-thawed bovine spermatozoa from the same bull. After 8 h of fertilization, groups of
30 presumptive zygotes were transferred to 300 μl droplets of IVD 101 medium overlaid withmineral oil and were cultured for 9 days in humidified air with 5％ CO２，5％ O２, and 90％ N２
at 38.5℃. Cleavage was evaluated at 2 days after fertilization, and the blastocyst rate wascalculated as the proportion of cleaved embryos that developed to the blastocyst stage at day 8
post-fertilization.
In exp1, cortisol concentration in FF of each follicle was the same level. The expression of
11βHSD1 in granulosa cells of EAFC was higher than those of POF and EIFC. NA
concentration in FF of EAFC was significantly lower than those of POF and EIFC. In exp.2,
the matured oocytes from follicles coexisting with follicular cyst were fertilized and thefertilization rate was the same as that of control oocytes. The embryos coexisting with follicular
cyst were developed to the blastocyst stage and the proportions of blastocysts weresignificantly low in coexisting with follicular cyst compared with healthy follicles.
The results from the present study suggest that noradrenaline may promote estrogenactive cystic follicle to estrogen-inactive cystic follicle with cortisol. Thus, noradrenaline may
induce the formation of cystic follicle in postpartum cow. In addition, cystic follicle may
influence quality of oocyte of small follicles coexisting with these follicles.

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乳牛の卵胞嚢腫における副腎由来ホルモンの関与と卵胞嚢腫共存卵胞由来の卵母細胞の正常性

１．目

231

外受精における受精率および胚発生率を検証する的ことにより，卵胞嚢腫が他の卵胞内卵母細胞に及乳牛の生産性を向上させるためには，分娩間隔が短く（空胎日数が短く），人工授精適期に排卵卵子が確実に受精することが重要である。このことは，産仔を計画的に得ることだけでなく，安定的なミルク生産にも寄与する。しかしながら，分ぼす影響を検討する（研究２）。
２．方法

2 . 1 研究１

卵胞嚢腫と副腎由来ホルモンとの関連性の検証

娩後に発症する卵胞嚢腫は乳牛の繁殖性低下（生

本研究では，食肉処理場由来の乳牛卵巣を用い産性阻害）を引き起こす要因の一つであり，人工て，卵巣内に黄体が存在することなく25mm以上

授精適期を延長させ，受胎率向上の妨げとなっての嚢腫卵胞を採取する。対照区として健常卵胞でいる。卵胞嚢腫の発症要因として，外的環境要因

ある排卵卵胞を採取する。採取した排卵卵胞およや疾病などによるストレス因子の関与があげられ

び卵胞嚢腫から卵胞液，顆粒層細胞および卵胞膜る。体内で生じるストレス因子は，副腎機能に影細胞をそれぞれ分離採取する。前述したように卵響することから，ストレス因子による副腎機能の胞嚢腫には，卵胞液中に高いＥ２濃度を保有する

亢進が卵胞嚢腫の発症に関与している可能性が考

高Ｅ２嚢腫卵胞と低いＥ２濃度である低Ｅ２嚢腫

えられるが，そのメカニズムに関しては不明であ

卵胞が存在することから，卵胞液中のＥ２濃度をる。副腎からは，ステレス因子に反応してコルチ測定し，高Ｅ２嚢腫卵胞と低Ｅ２嚢腫卵胞とに区ゾールが分泌されるとともに，神経伝達物質であ分した。また，採取した卵胞液は，酵素免疫法

るノルアドレナリンを分泌する。そこで，本研究（EIA）によりコルチゾール濃度を測定するととでは，嚢腫卵胞の卵胞液中コルチゾール濃度，ノ

もに，ノルアドレナリン測定キット（Abonova社

ルアドレナリン濃度およびエストラジオール（Ｅ製）を用いてノルアドレナリン濃度を測定した。

２）やプロジェステロン（Ｐ４）濃度を同時に測

さらに，分離採取した顆粒層細胞および卵胞膜細定することにより副腎機能と卵胞嚢腫との相互連胞からRNAを抽出して，コルチゾールを含むス

関を検証する（研究１）。

テロイド産生関連酵素群およびノルアドレナリン

卵胞嚢腫が治癒した後，その個体の繁殖性を見極めることは，生産性を持続させるためにもきわめて重要なことである。卵胞嚢腫が治療により治癒した場合，卵胞嚢腫と共存していた卵胞の中かに関係する交感神経系因子群の遺伝子発現を解析した。
2 . 2 研究２

卵胞嚢腫と共存した小卵胞内の卵母細胞の機能解析

ら次の排卵卵胞が発育することになる。通常とは本研究では，卵胞嚢腫と共存していた卵胞およ

異なる内分泌環境に曝された卵胞群のなかから将び非共存していた卵胞からそれぞれ未成熟の卵母来排卵する優勢卵胞が発育し，排卵期に達した排細胞を採取し，体外成熟させ，体外受精における卵卵胞から卵母細胞が放出されるが，その卵母細

受精率，および胚発生率を検証することにより，胞が受精能および発生能を有しているのかは不明

卵胞嚢腫が他の卵胞内卵母細胞に及ぼす影響を検である。そこで，本研究では，卵胞嚢腫と共存し討する。食肉処理場由来の牛卵巣を用いて，嚢腫ていた卵胞および非共存していた卵胞からそれぞ卵胞が付随している卵巣の小卵胞から卵母細胞をれ未成熟の卵母細胞を採取し，体外成熟させ，体採取し，体外成熟培地にて38.5℃，５％CO２ ，© The Ito Foundation

232

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

95％Airの条件で21時間培養した。成熟した卵母

81.6ng/mlであり，排卵前卵胞および高Ｅ２嚢腫

細胞を体外受精に供し，卵割率を求めた。さらに，卵胞に比べ低Ｅ２嚢腫卵胞で有意に低下した。排

胚盤胞期胚まで発生させ，その発生率を算出した。

卵前卵胞，高Ｅ２嚢腫卵胞および低Ｅ２嚢腫卵胞のE/P比は，それぞれ7.4±2.8，3.4±0.5，0.04±0.01

３．結果と考察であり，すべての卵胞間で有意な差が認められた。

3 . 1 卵胞嚢腫と副腎由来ホルモンとの関連性

排卵前卵胞，高Ｅ２嚢腫卵胞および低Ｅ２嚢腫
卵胞の卵胞液中コルチゾール濃度をFig.１に示しの検証について排卵前卵胞，高Ｅ２嚢腫卵胞および低Ｅ２嚢腫た。排卵前卵胞，高Ｅ２嚢腫卵胞および低Ｅ２嚢

卵胞の卵胞液中におけるＥ２濃度，Ｐ４濃度およ腫卵胞の間で有意な差は認められなかった。乳牛

びE/P比をTable１に示した。排卵前卵胞，高Ｅにおいて，LHのサージ状分泌の開始から排卵ま２嚢腫卵胞および低Ｅ２嚢腫卵胞における卵胞液での期間では，血中および排卵卵胞の卵胞液中の中のＥ２濃度は，それぞれ501.3±186.2ng/ml，

コルチゾール濃度が増加することが報告されてい255.6±40.9ng/ml，および8.6±1.6ng/mlであり，る１）。したがって，高Ｅ２嚢腫卵胞および低Ｅ２すべての卵胞間で有意な差が認められた。排卵前

嚢腫卵胞のコルチゾール濃度は排卵卵胞の時期か

卵胞，高Ｅ２嚢腫卵胞および低Ｅ２嚢腫卵胞におら一定濃度で維持されていると考えられる。このけ る 卵 胞 液 中 の Ｐ ４ 濃 度 は ，そ れ ぞ れ 77.6 ±ようなことから，排卵できずに発育を継続してい16.0ng/ml ， 87.1 ± 12.0ng/ml ， お よ び 517.1 ±る卵胞嚢腫内に存在する顆粒層細胞は，常にコルTable 1 Follicle size, concentration of steroid hormone and E/P ratio in follicular fluid of pre-ovulatory

follicle, E2-active follicular cyst and E2-inactive follicular cyst.
Preovulatory follicleE2-active follicular cyst

E2-inactive follicular cyst

8

17

35

Follicle diam.（mm）17.7±1.3ａ

28.6±1.0ｂ

30.8±1.0ｂ

Estradiol（ng/ml）

501.3±186.2ａ

255.6±40.9ｂ

8.6±1.6ｃ

Progesterone（ng/ml）

77.6±16.0ａ

87.1±12.0ａ

517.1±81.6ｂ

E/P ratio7.4±2.8ａ

3.4±0.5ｂ

0.04±0.01ｃ

Sample no.

cortisol conc. (ng/ml)

60
50
40
30
20
10
0

POF

EAFC

EIFC

Fig. 1 Concentration of cortisol in follicular fluid of

pre-ovulatory follicle（POF）,E2-active follicularcyst（EAFC）and E2-inactive follicular cyst
（EIFC）.All values are shown as mean±SEM.

© The Ito Foundation

乳牛の卵胞嚢腫における副腎由来ホルモンの関与と卵胞嚢腫共存卵胞由来の卵母細胞の正常性

233

チゾールに曝されており，細胞内に刺激が入力さの卵胞とコルチゾールの濃度が同程度であったこ

れていると推察される。コルチゾールは，顆粒層とから，この顆粒層細胞の能力は卵胞液中のコル細胞のＥ２産生を阻害することから２），卵胞嚢腫

チゾール濃度に反映されるほど大きなものではなのＥ２産生の抑制に長期間のコルチゾール曝露がいと推察される。このようなことから，高Ｅ２嚢

関与していることが推察される。興味深いこと

腫化卵胞の顆粒層細胞では11βHSD type１の遺に，高Ｅ２嚢腫卵胞の顆粒層細胞ではコルチゾン

伝子発現は高まっているものの，タンパク質発現か ら コ ル チ ゾ ー ル へ 変 換 す る 酵 素 で あ る 11 βあるいはその機能が他の因子によって阻害されてHSD type１の遺伝子発現が他の卵胞に比べ有意いる可能性が考えられる。

に高かった（Fig.２）。このことは，卵胞嚢腫内

卵巣内には交感神経線維が豊富に分布していに存在する顆粒層細胞ではコルチゾールの合成がる。卵巣内の神経の一部は血管に分布している促進されることを示していると考えられるが，他が，交感神経線維終末は卵巣間質や黄体および卵11βHSD 1
Granulosa cell

(a)
0.4

0.5

0.3

Arbitary unit

Arbitary unit

0.6

b

0.3
0.2
0.2
0.1

a

0.1
0.0

EAFC

0.4
0.3
0.2
0.1

a

POF

11βHSD 1
Theca cell

(b)

EICF

0.0

POF

EAFC

EIFC

Fig. 2 Expression of 11beta HSD in（a）granulosa and（b）thecal cells of POF, EAFC and

EIFC. All values are shown as mean ±SEM. Values with different letters（a, b）are
different between groups（p＜0.05）．

NE conc. in follicular Fluid (ng/ml)

＊

50

＊

40
30
20
10
0

POF

EAFC

EIFC

Fig. 3 Concentration of cortisol in follicular fluid of POF, EAFC and

EIFC. All values are shown as mean ±SEM.

 ：p＜0.05＊© The Ito Foundation

234

平成29年度Adr3β
Granulosa cell

1600

Adr3β
Theca cell

50

b

1400
Arbitary Unit

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

b

40

1200
1000

30

800

20

600
400
200

a

a

0

POF

EAFC

EIFC

10
0

a

a

POF

EAFC

EIFC

Fig. 4 Expression of Adr3β in（a）granulosa and（b）thecal cells of POF,

EAFC and EIFC. All values are shown as mean ±SEM. Values withdifferent letters（a, b）are different between groups（p＜0.05）．

Table 2 Effect of coexisting of cystic follicle on oocyte competence
No. of oocytes

Cleavage（％）

Blastocyst（％）

198

123（62.1）

48（24.2）

Ipsilateral63

35（55.6）＊＊4（6.3）

Contralateral

52

30（57.7）＊
7（13.5）

Haelthy follicle
Cystic follicle＊＊：p＜0.01，＊：p＜0.1

胞などに到達している。交感神経線維から分泌さ中に含まれるノルアドレナリンの増減がステロイ

れる神経伝達物質であるカテコールアミン（アドド産生機構に影響し，卵胞内の内分泌環境に変化

レナリン，ノルアドレナリン，ドーパミン）は，をもたらす可能性を示唆している。さらに，低Ｅ細胞膜上に存在する受容体を介してシグナルを細２嚢腫卵胞では卵胞膜細胞においてAdr３βの遺胞内に伝達することにより体内の恒常性の維持に伝子発現の増加が認められた（Fig.４）。卵胞膜

寄与している。本研究において，卵胞液中ノルア細胞は主要なＰ４産生細胞であり，ノルアドレナ

ドレナリン濃度は，健常な排卵前卵胞に比べて高リンによるＰ４産生の促進も報告されていること

Ｅ２嚢腫卵胞で有意に低下していた（Fig.３）。

から４），低Ｅ２嚢腫卵胞におけるステロイドホル

Paredesら３）は，牛卵胞嚢腫の卵胞液中ノルアド

モン産生機構にノルアドレナリンが影響を及ぼし

レナリン濃度が排卵前卵胞に比べて有意に低下すている可能性が示唆されたといえる。

ることを報告しており，本研究結果はParedesら

３）の研究結果と一致している。また，本研究では，

3 . 2 卵胞嚢腫と共存した小卵胞内の卵母細胞の機能解析

低Ｅ２嚢腫卵胞の卵胞液中ノルアドレナリン濃度

卵胞嚢腫が共存する卵巣内の小卵胞から採取しが，高Ｅ２嚢腫卵胞と比較して有意に高い値を示

た卵母細胞の卵割率および胚盤胞発生率をTable

していた。Paccinatoら

は，ノルアドレナリン２に示した。本研究では，卵胞嚢腫が存在する卵に暴露された顆粒層細胞においてＰ４産生が著し巣（同側）とそうでない卵巣（反対側）から，そく活発化することを報告している。これは卵胞液

れぞれ未成熟卵母細胞を採取した。体外成熟後に４）© The Ito Foundation

乳牛の卵胞嚢腫における副腎由来ホルモンの関与と卵胞嚢腫共存卵胞由来の卵母細胞の正常性

235

体外受精に供した卵母細胞の卵割率は，対照区でゾールが一定濃度存在する条件でノルエピネフリ

62.1％，同側で45.6％，反対側で57.7％であり，ンが介在する可能性が示唆された。

有意な差は認められなった。このことは，嚢腫卵

嚢腫卵胞と共存している卵胞から採取した卵母胞が存在している卵巣側，あるいはその反対側に細胞は，正常に受精をするが，その後の胚発生がある卵胞内の卵母細胞は，成熟して排卵可能な状悪くなることが示されたことから，卵胞嚢腫が仮態にまで発育することで受精が可能であることをに治療により治癒したとしても，嚢腫卵胞と共存示唆している。つまり，卵胞嚢腫の有無に関係なしていた期間の卵胞内の卵母細胞は嚢腫卵胞の影

く卵母細胞は受精をすることが可能なのかもしれ

響を受けている可能性が示唆された。このことない。

は，酪農現場における卵胞嚢腫治癒後の乳牛が，胚盤胞期胚の発生率をみてみると，対照区が24.2％，同側が6.3％，反対側が13.5％であり，対人工授精後に受胎しないことに関連するのかもしれない。

照区に比べ有意に減少していた。このことは，嚢腫卵胞が存在していた卵巣の小卵胞内にある卵母細胞は，胚盤胞までの発生が悪いことを示しており，胚発生に関連する因子が影響を受けている可能性を示唆している。
４．要

約

本研究では，嚢腫卵胞の卵胞液中には排卵卵胞と同程度のコルチゾールが存在していること，ま文献１） Acosta, T. J., Tetsuka, M., Matsui, M., Shimizu, T.,
Berisha, B., Schams, D., Miyamoto, A.：J Reprod
Dev，51，483～489，2005．
２） Zhu, H. S., Qian, Z., Liu, H. L., Bao, E. D.：Reprod
Biol Endocrinol，14，80，2016．
３） Paredes, A. H., Salvetti, N. R., Diaz, A., Dallard, B.
D . , O r t e g a , H . H . , L a r a , H . E . ：R e p r o d B i o l
Endocrinol，9，66，2011．
４） Pacciato, C. A., Montrezor, L. H., Collared, C. A. V.,
Vireque, A. A., Silva, A. A. R.：Reprod Biol
Endocrinol，10，95，2012．

たノルエピエフリン濃度は高Ｅ２嚢腫卵胞で低かったことから，牛卵胞嚢腫の発症にはコルチ© The Ito Foundation

236

子宮内膜炎罹患牛における特異的脂質メディエーター
の同定と新規高感度診断法の開発
Identification of specific lipid mediators in the cow with endometritis anddevelopment of a novel sensitive diagnostic method

大

澤

健

司・村

田

幸

久＊・北

原

豪

（宮崎大学農学部獣医学科産業動物臨床繁殖学研究室，
東京大学大学院農学生命科学研究科放射線動物科学研究室）＊

Takeshi Osawa, Takahisa Murata＊ and Go Kitahara（Laboratory of Theriogenology, Department of Veterinary Sciences, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki，＊Department of Animal Radiology, The University of Tokyo）

Objectives of this study were to clarify usefulness of esterase（LE）, myeloperoxidase（MPO）and lipid mediators as the biomarker for rapid and sensitive diagnosis of bovine
endometritis, and to elucidate association of bacterial infection with inflammation of theendometrium. In Experiment 1, endometrial and plasma samples were collected by cytobrushfrom 43 Holstein-Friesian cows at 3, 5, and 7 weeks postpartum for LE and MPO activities,
bacterial detection and profiles of the PMN％．Plasma samples were used for biochemical
analysis. The 43 cows were divided into healthy, subclinical endometritis（SE）and clinicalendometritis（CE）groups, which were classified differently at W3, 5, and 7 pp based on thedefinitions of SE and CE made for each of the three different weeks postpartum. In Experiment
2, intrauterine fluid samples were collected by uterine lavage from 5 cows with and another 5
cows without endometritis, and used for comprehensive lipid analysis. Albumin and BUN had aweak negative association with endometrial PMN％ at week 3. LE had an association with
PMN ％ in all weeks postpartum（p<0.05）. On the other hand, MPO had no association with
PMN％．Pathogenic bacterial detection rates were higher in cows with endometritis at week 3
and week 5. In Experiment 2, among 143 lipids, a total of 50 lipids were detected in the 10
cows, and of which level of 39 lipids were higher in cows with endometritis than in cows
without endometritis. It is concluded that serum Alb and BUN level, LE activity andpathogenic bacteria in endometrium sample, and some lipid mediators are possible candidates
for biomarkers of bovine endometritis.

１．目

で潜在性子宮内膜炎は現場で利用可能な診断方法的がなかったが，代表研究者らは自作の牛子宮内膜

子宮内膜炎は牛の子宮疾患の中で最も罹患率が細胞診用ブラシ（サイトブラシ）を用いて子宮内高く，受胎性を大きく低下させる疾患である。子膜における炎症の程度を子宮内膜上皮細胞中に占宮内膜炎は潜在性と臨床性に大別できる。これまめる多形核好中球（PMN）の割合（PMN％）と© The Ito Foundation

子宮内膜炎罹患牛における特異的脂質メディエーターの同定と新規高感度診断法の開発

237

して数値化することで潜在性子宮内膜炎を診断しすることが知られているが，現在までにPGE２以た結果，不受胎牛の約30％に潜在性子宮内膜炎が外にも脂質メディエーターが300種類以上も存在存在し，分娩後の初回排卵を遅延させることや血することが知られており，障害の部位や程度，ス

中グルコース濃度が低い個体は潜在性子宮内膜炎

テージによってこれらの産生が変化することで炎発症リスクが高いことなどを実証してきた症が巧みに制御されていることが明らかになって

。

１，２）

一方，臨床性子宮内膜炎は外子宮口からの異常滲

きた。

出物の排出（Purulent vaginal discharge：PVD）

そこで本研究では，牛子宮内膜炎の簡易，迅速を伴う場合と定義されているものの，PVDを有かつ高感度な診断方法確立の基礎データを得るた

しているにもかかわらず子宮内膜に炎症が観察さめにエステラーゼ，ミエロペルオキシダーゼおよ

れない例があり ，代表研究者らも子宮頸管炎にび脂質メディエーターのバイオマーカーとしての限局した症例の場合でも腟腔内に膿性排出物を認

有用性ならびに細菌感染と子宮内膜炎との関係をめる個体が少なからず存在することを示唆する結明らかにすることを目的として一連の実験を実施

果を得ている 。また，子宮内膜炎や蓄膿症は低

した。

３）

４）

受胎の原因となるものの全身症状を示さない点が犬の場合と異なり，PMN％が高い個体でも子宮２．方法

内膜から細菌が分離されない症例，またその逆も2.1

散見されるなど，子宮内膜における細菌感染と炎

2.1.1

症反応の詳細に関しては不明な点が多い。

宮崎県内の一酪農場（フリーストール牛舎）にこのように，牛の子宮内膜炎は潜在性，臨床性

子宮内膜炎の症状評価
供試動物て繋養のホルスタイン種経産牛43頭を供試した。

ともに正確な診断が求められていて，サイトブラ

2.1.2

シを利用することでその実態を明らかにする道筋

各供試牛における分娩後３週，５週および７週ができてきた。しかしながら，塗沫標本の作成やに腟検査，直腸検査，超音波検査を実施，生殖器鏡検は現場での診療の中で実施するのは依然としの所見を得た後，サイトブラシにて子宮内膜上皮て難しい側面がある。そこで，牛子宮内膜炎の迅および子宮内粘液を採取してスメア標本をスライ

速診断方法開発に際してのバイオマーカー候補とドガラスに作製すると同時に生理食塩水10mlにして，白血球由来エステラーゼおよびミエロペル

浸漬させてサンプル（生食浸漬サンプル）を得

オキシダーゼに着目した。

た。また，尾正中静脈より血液10mlを採取，遠一方，炎症性疾患において脂質メディエーター
の役割に注目が集まっている。炎症性疾患の発症

材料採取方法心分離して血漿サンプルを得た後，－20℃にて分析時まで保存した。

や進行には細胞膜のアラキドン酸から障害刺激に2.1.3

反応して即時に産生される脂質メディエーターが超音波検査により各個体における子宮内の液体重要な役割を持つ。近年，質量分析装置の開発が貯留の有無，卵巣所見（黄体および主席卵胞の有進み，超低分子で類似構造の多い脂質メディエー

無とサイズ，個数）を記録，メトリチェックによターの検出が可能となった。炎症時にはプロスタ

り子宮腟部における粘液性状（膿汁の混入割合）

グランジンＥ２（PGE２）が産生され，末梢血管がを記録した。また，子宮内膜スメア標本の鏡検に弛緩して血流が増加する結果，発熱や痛みが増強

よりPMN％を決定した。子宮腟部粘液性状およ© The Ito Foundation

検査項目

238

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

び子宮内膜スメアのPMN％により供試牛を健康の測定条件設定）を設定した後，精製したサンプ

牛，潜在性および臨床性子宮内膜炎罹患牛に分類

ルを対象に脂質を網羅的に探索した。

した。なお，分娩後３週，５週および７週それぞれにおける子宮内膜炎の定義に従って分類した。
血漿サンプルについて生化学検査を実施した。
生化学検査項目はアルブミン（Alb），血中尿素

３．結果と考察3.1

子宮内膜炎の症状評価

3 . 1 . 1 子宮内膜における炎症度（PMN％）と窒 素 （BUN），非 エ ス テ ル 型 遊 離 脂 肪 酸

血液生化学検査結果との関係（NEFA），βヒドロキシ酪酸（BHBA）および総分娩後３週のAlbとPMN％との間に弱い負の関

コレステロール（T-Cho）とした。また，生食浸係（p＝0.07）が認められた（Table１）。低Alb値

漬サンプルのエステラーゼおよびミエロペルオキ

が分娩後疾患と関連していることが知られておシダーゼ活性を測定した。子宮内膜サンプルよりり５），子宮内膜炎を含む周産期疾病リスクを予測

スワブを取り，細菌（好気性，嫌気性）培養とする指標の一つとして使える可能性がある。同様

MALDI-TOF質量分析計による菌種同定を行っに，分娩後３週と７週のBUNとPMN％との間にた。なお，分離細菌のうち，Trueperella pyogenes

弱い負の関係（３週：p＝0.07，７週：p＝0.08）

およびEscherichia coliを子宮内膜に対する病原が認められた。この結果は，分娩後２週および４性細菌とした。

週における低BUN値が分娩後５週および６週に2.2

脂質の網羅的探索と標的物質の選択

2.2.1

供試動物

おける子宮内膜炎罹患リスクを高めるという過去の報告２）に一致するものである。低BUN値の個

宮崎県内２箇所の酪農場（フリーストール牛

体は移行期における乾物摂取量が低下していたた舎）にて繋養のホルスタイン種経産牛計17頭（分めにエネルギーバランスの負の程度が大きくな娩後３週から13週）について上記2.1と同様の方

り，そのことが子宮内膜における易感染性につな法により子宮内膜炎の診断を実施し，健康牛11頭がっている６）ことが推察される。

および子宮内膜炎罹患牛６頭からそれぞれ５頭を3 . 1 . 2 白血球エステラーゼ（LE）およびミエ

無作為に選び，脂質の網羅的探索に供した。
2.2.2

ロ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ（MPO）活 性 と材料採取方法

PMN％との関係

各供試牛において診断的子宮洗浄の要領で両子分娩後３週，５週，７週のいずれにおいても宮角内に滅菌生理食塩水を計30ml注入後に回収

LE活性はPMN％との間に有意（p＜0.01）な正のした。回収液は遠心分離して上清をリピドーム解相関が認められた（Fig.１）。潜在性子宮内膜炎

析に，沈渣をPMN％算出に使用した。上清サン

罹患牛においてLE活性が高いという報告はこれ

プルは－30℃にて分析時まで保存した。

までもあるが７），本研究では分娩後３週という早2 . 2 . 3 質量分析装置を用いた脂質の網羅的探期における相関が最も高いということが明らかとなった。検査感度の向上という点においても分娩索（リピドーム）
得られた上清サンプルを用いて質量分析装置を後３週での診断は有用かもしれない。一方，牛の用いた脂質メディエーターの適切な抽出条件（固子宮疾患に関してMPO値とPMN％との関係を観相抽出カラムの選択，タンパクやマトリックスの察した報告は今回が初めてであるが，いずれの週

除去方法，脂質の抽出溶媒の選択，質量分析装置においても有意な関係は認められなかった。馬の© The Ito Foundation

239

子宮内膜炎罹患牛における特異的脂質メディエーターの同定と新規高感度診断法の開発
Table 1 Pearson correlation coefficients（r）of the relationship between PMN％，concentrations ofbiochemical parameters and body condition scores in postpartum dairy cows（n＝43）．

Biochemical indices

Week3

Week5

Week7

ｒ

p

ｒ

p

ｒ

p

Albumin

－0.26

0.07

－0.14

0.34

－0.10

0.53
0.08

BUN

－0.26

0.07

－0.20

0.19

－0.32

T-Chol

－0.20

0.18

2.05

0.99

－0.22

0.18

NEFA

2.97

0.84

－0.08

0.59

2.86

0.96

BHBA
BCS

－0.06
－0.22

0.69
0.12

－0.05
－0.20

0.23
0.20

－0.14
－0.10

0.38
0.50

Values of p ＝ 0.07 and p ＝ 0.08 showed tendency. The blood albumin, blood urea nitrogen（BUN）, Total cholesterol（T-cho）, non-esterified fatty acid（NEFA）and β-hydroxybutyric acid（BHBA）concentrations biochemicallyanalyzed from week 3, 5 and 7 postpartum. The body condition scores（BCS）were evaluated at Week 3, 5 and 7．

100

100

2A

60
R² = 0.5318
P < 0.01

40
20
0

0
(-)

1
(±)

2
3
(+)
(++)
Leukocyte esterase

30

40
50
MPO (ng/ml)

60

70

60

70

60

70

2E

80

60

PMN%

PMN%

20

100

2B

R² = 0.2187
P < 0.01

40

60

R² = 0.0223
P = 0.6

40
20

20

0
(-)

100

1
(±)

2
3
(++)
(+)
Leukocyte esterase0(+++)4

20

100

2C

80

30

40
50
MPO (ng/ml)

2F

80

60

PMN%

PMN%

P = 0.3400(+++)480

R² = 0.3325
P < 0.0140
20
0R² = 0.1163

60

20

100

0

2D

80
PMN%

PMN%

80

60

R² = 0.3087
P = 0.2

40
20

(-)0

1
(±)

2
(+)

(++)3

4

(+++)

0

20

Leukocyte esterase

30

40
50
MPO (ng/ml)

Fig. 1 Association of leukocyte esterase （LE）（n=43）and myeloperoxidase （MPO）（n=13）

concentrations with PMN％ from endometrial samples in dairy cows. Graphs A to C show
associations between LE and PMN％ at week 3（A）
, 5（B）, and 7（C）postpartum. Graph
D to F show associations between MPO and PMN％ at week 3（D）,5（E）and 7（F）．

© The Ito Foundation

240

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

100

D

87.5

90

75.0

80

B

76.5

70
60

55.5
A

50

C

44.5

42.3

40

33.3

30

d

b

a

10

16.7

0

25.0

SE
CE
HE
(n = 18) (n = 8) (n = 17)

22.6

50.0

47.1

20

22.2

CE
(n = 9)

6.5
HE
SE
CE
(n = 31) (n = 9) (n = 3)

11.5

W3

SE
(n = 8)

33.3

22.2

c

HE
(n = 26)

33.3

W5

W7

Fig. 2 Comparison of bacterial detection rates between healthy（HE）clinical endometritis（CE）

and subclinical endometritis（SE）groups in dairy cows（n=43）．The three groups wereclassified differently at W3, 5, 7 pp based on the definitions of SE and CE made for eachof the following three different weeks pp：W3；HE was defined as when the PMN％
were <18 and VMS was 0 to 2. SE was defined as when the PMN％ was ≥18 and VMS
was 0 to 2. CE was defined as when the PMN％ was ≥ 18 and VMS was 3 to 4. W5 ； HE
was defined as when the PMN％ was <6 and VMS was 0 to 1. SE was defined as when
the PMN％ was ≥ 6 and VMS were 0 to 1. CE was defined as when the PMN％ were ≥ 6
and VMS was 2 to 4. W7 ； HE was defined as when the PMN％ was <4 and VMS was 0
to 1. SE was defined as when the PMN％ was ≥4 and VMS was 0 to 1. CE was defined aswhen PMN％ was ≥4 and VMS was 2 to 4. a-b, A-B：p = 0.055ｃ－d, C-D：p<0.05

子宮疾患におけるMPO値測定の有用性は過去に完了するものの９），分娩後３週以降において子宮指摘されているが８），今回同様の結果が得られな内感染が認められる場合には臨床性および潜在性かった。その理由の一つとして発情周期における子宮内膜炎発症リスクが高くなることが本研究の変動の可能性があることから今後発情周期のス

結果から示唆された。

テージがMPO値に及ぼす影響についても精査す

3.2

脂質の網羅的探索と標的物質の選択る必要がある。

子宮洗浄液の上清サンプルについて脂質メディ

細菌検出率と子宮内膜の病態との関係

エーターの網羅的検索を行ったところ，143種類

分娩後３週では臨床性子宮内膜炎罹患牛におけの脂質のうち50種類が検出された。そのうち，子る細菌検出率および病原性細菌検出率が健康牛と宮内膜炎罹患牛において上昇が認められた脂質メ比較して高い傾向が認められた（p＝0.055）（Fig.

ディエーターは39種類であり，それらはPGF系，

２）。また，分娩後５週では潜在性子宮内膜炎罹

トロンボキサン系，アラキドン酸（AA）代謝産

患牛における細菌検出率および病原性細菌検出率

物，リノレン（LA）酸代謝産物，ジホモ-γ-リ

が健康牛と比較して有意（p＜0.05）に高かった。

ノレン酸（DGLA）代謝産物，エイコサペンタエ

通常，健康牛の場合分娩後３週までに子宮内の細ン酸（EPA）代謝産物であった。これらのうち菌を排除し，分娩後４から６週までに子宮修復がAA，LA，DGLAはｎ-６系脂肪酸であり，炎症

3.1.3© The Ito Foundation

子宮内膜炎罹患牛における特異的脂質メディエーターの同定と新規高感度診断法の開発

241性の脂質メディエーターとして知られている。一ミエロペルオキシダーゼおよび脂質メディエー

方，油糧種子をサプリメントとして投与した最近

ターのバイオマーカーとしての有用性ならびに細の試験10）では，分娩５週間前にヒマワリ油（高リ菌感染と子宮内膜炎との関係を明らかにすること

ノール酸：ｎ-６系多価不飽和脂肪酸）給与群，を目的として一連の実験を実施した。試験Ⅰでは菜種油（高オレイン酸：ｎ-９系一価不飽和脂肪

ホルスタイン種経産牛43頭を供試，分娩後３，酸）給与群，無給与群の３群に分けて分娩後25日

５，７週に腟検査，直腸検査，超音波検査を実施

前後での子宮内膜環境と35日までの卵巣動態へのした後，サイトブラシにて子宮内膜上皮および子影響を調べたところ，ヒマワリ油給与群では子宮宮内粘液サンプルを採取するとともに採血して血内膜環境に悪影響を与えることなく初回排卵日が漿サンプルを採取，生化学検査を実施した。試験より早く，分娩後35日までに排卵する個体の割合

Ⅱではホルスタイン種経産の子宮内膜炎罹患牛おも多かった。本研究と合わせ，これらの結果は，よび非罹患牛各５頭より子宮洗浄液を回収，脂質

正常な子宮修復過程において分娩前から分娩後早の網羅的探索に供した。その結果，分娩後３週の期（３週まで）では炎症促進性に働き，それ以降

AlbとPMN％との間に弱い負の相関（p＝0.07）の時期においては炎症抑制性に働いているというが，分娩後３週と７週のBUNとPMN％との間に仮説を支持するものである。

弱い負の相関（３週：p＝0.07，７週：p＝0.08）

今回，網羅的な検出モードで用いた脂質の濃度が認められた。LE活性は分娩後３，５，７週のい測定は相対的評価であったため，探索はできてもずれにおいてもPMN％との間に正の相関（p＜絶対的な評価に用いることはできなかった。炎症0.01）が認められた。一方，MPO値とPMN％との程度（子宮内膜PMN％）や原因菌を反映できの間には関係が認められなかった。また，分娩後る候補物質を選択後，対象物質の単独測定モード

５週では潜在性子宮内膜炎罹患牛における細菌検を用いて絶対濃度を測定する必要がある。また，出率および病原性細菌検出率が健康牛と比較して子宮内膜上皮サンプルは採取ごとに得られる細胞高かった（p＜0.05）。脂質メディエーターの網羅数が異なるが，細胞数を勘案したうえで脂質の絶的検索の結果，143種類の脂質のうち50種類が検対濃度を評価することが実用的な診断ツール開発

出され，子宮内膜炎罹患牛において上昇が認めらを実現するうえで必要となるだろう。さらに，個れたのは39種類であった。以上より，子宮内膜炎

体差も考慮し，発情周期や栄養状態に関係なく子の診断におけるバイオマーカーとして血清中Alb

宮内膜炎罹患によって特異的に上昇する物質を標およびBUN値，子宮内膜サンプル中のLE活性と的として絞り，健康牛，潜在性子宮内膜炎罹患牛

病原細菌，ならびに一部の脂質メディエーターがおよび臨床性子宮内膜炎罹患牛の各群における脂候補物質となることが明らかになった。

質構成および絶対量の相違を明らかにすることで，子宮内膜炎罹患牛に特異的な脂質メディエー
タープロファイルを決定する必要がある。
４．要約

牛子宮内膜炎の簡易，迅速かつ高感度な診断方法確立の基礎データを得るためにエステラーゼ，

文献１） Senosy, W. S., Uchiza, M., Tameoka, N., Izaike, Y.,
Osawa, T.：Theriogenology，72，1153～1162，2009．
２） Senosy, W., S, Izaike, Y., Osawa, T.：Reprod Dom
Anim，47，666～674，2012．
３） Dubuc, J., Duffield, T. F., Leslie, K. E., Walton, J. S.,
LeBlanc, S. J.：J Dairy Sci，93，5225～5233，2010．
４） Osawa, T., Neves, R. C., LeBlanc, S. J.：J Dairy© The Ito Foundation

242

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Sci, 94, E-Suppl 1，746，2011．
５） Van Sun, R. J.：Proc Am Assoc Bov Pract，37，
212～213，2004．
６） Huzzey, J. M., Veira, D. M., Weary, D. M., vonKeyserlingk, M. A.：J Dairy Sci，90，3220～3233，
2007．
７） Couto, G. B., Vaillancourt, D. H., Lefebvre, R. C. ：Theriogenology，79，103～107，2013．

８） Parrilla-Hernandez, S., Ponthier, J., Franck, T. Y.,
Serteyn, D. D., Deleuze, S. C.：Theriogenology，81，
936～940，2014．
９） Sheldon, I. M., Lewis, G. S., LeBlanc, S., Gilbert, R.
O.：Theriogenology，65，1516～1530，2006．
10） Salehi, R., Colazo, M. G., Gobikrushanth, M., Basu,U., Ambrose, D. J.：Reprod Fertil Dev，29，747～758，
2016．

© The Ito Foundation

243

新規DNAメチル化網羅探索法を用いた牛の精液性状の評価法開発
A novel genomic screening system for DNA methylation to evaluate
bovine spermatozoa

山

崎

淳

平・永

野

昌

志

（北海道大学大学院獣医学研究院）

Jumpei Yamazaki and Masashi Nagano（Graduate School of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

Aberrant DNA in spermatozoa has increasingly been appreciated as an important factor
that associates with male infertility and abnormal development of fetus in human medicine.
The aim of this study is to establish a novel genomic screening system for DNA methylation toevaluate bovine spermatozoa.
We studied three bloods and three pre/post sex sorting spermatozoa from bulls for a
genome-wide quantitative DNA methylation analysis with next-generation sequencing basedon sequential treatment of methylation sensitive/insensitive restriction enzymes. We had 21,801
CpG sites that were commonly obtained from all nine samples by newly established method（Bovine DREAM）. Clustering analysis with these CpG sites identified a clearly separated
cluster of blood samples from that of spermatozoa, indicating that Bovine DREAM is capable ofdifferentiating inter-tissue specificity. Then, we used only each of three spermatozoa samples
for clustering analysis and found that inter-individual difference is dominant over sex sorting
process. We also found several hundreds of differentially methylated CpG sites between pre/post sex sorting.
Bovine DREAM is found to identify inter-tissue and inter-individual difference byanalyzing tens of thousands of CpG sites for their DNA methylation level. The fact that there
were several hundreds of differentially methylated CpG sites prompted us to obtain more
spermatozoa samples to validate the finding in this study. We are also planning to analyze avariety of conditions that possibly affect sperm such as difference in feeding and season.
Associating these results with known sperm parameters and reproduction performance of bulls
will help identify the best CpG sites important to determine/predict sperm quality. Since DNA
methylation is easy, simple, and quick to be analyzed, future applications of DNA methylation
as a novel method would be anticipated.

© The Ito Foundation

244
１．目

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）の問題，特に種雄牛の精液性状の変化と受胎率低的下を関連づける重要なメカニズムであることを示

遺伝子のインプリンティング（刷り込み）現象

唆しているのではないだろうか？

とは，父方および母方由来対立遺伝子それぞれか

ところがこれまでの報告では，ヒトの遺伝子情らの特異的な発現様式を可能とするために厳密に報を外挿し限られた遺伝子部位の検討やヒトにお制御されている機構で，胚発生，新生子の発達，けるDNAメチル化のゲノムワイド解析デバイス

胎盤機能などに重要である１）。この機構を司る中を半ば強引に牛で用いたものであるため，網羅的心的存在がDNAメチル化であり，近年，ヒトのかつ信頼性のあるデータを提供することができて

男性不妊の原因となる乏精子症にこのDNAメチ

いない。また少ない遺伝子座に限定して検討する

ル化の異常が関わることが示唆されつつある 。

ことでは多数存在すると想定される未知のインプ

父方および母方の対立遺伝子それぞれで特異的にリンティング遺伝子を含めた網羅探索を可能とす

メチル化されている部位（インプリンティング遺る研究を行う必要性がある。

１）伝子）がヒトゲノムでは約100箇所同定されておそこで，我々は牛のDNAメチル化のゲノムワり，これらは配偶子形成の段階で形成されるが，イドな検討が可能となる解析法を樹立することでこれらインプリンティング遺伝子の適切なメチル

この２つの問題点の解決を試みた。今回は性選別化の喪失および子への伝達異常によりBeckwith-

前後の精液サンプルを用い，ウシ精子ゲノムにおWiedemann syndrome（BWS）といった発達異

ける網羅探索的なDNAメチル化解析を行った。

常につながることが判明している 。一方，近年
２）

シークエンス技術が発展し，エピジェネティクス
分野におけるゲノムワイドな解析法が様々に樹立され用いられている。その結果，精子におけるイ

２．方法

2 . 1 牛凍結精液におけるDNAメチル化のゲノ
ムワイド解析法の応用

ンプリンティング遺伝子だけでなく様々な異常な射出精液および性選別精液と末梢血液はジェネ

メチル化と男性不妊や胎児発達異常との強い関連

ティクス北海道から譲渡を受けたものを使用しが指摘されている 。また興味深いことに，肥満た。既知の細胞数を含む凍結精液サンプルをPBSなどの父親の状態が精子に反映され，子に伝わっで洗浄し，１×10６，２×10６，５×10６の精子数にていく現象もDNAメチル化で説明可能であるこ合 わ せ ゲ ノ ム DNA を DNA 抽 出 キ ッ トとが発表されている４）。

（QIAGEN） に よ っ て 抽 出 し た 。 Nanodrop

３）

興味深いことに，牛にもヒトのBWSと同様の（Thermo Fisher Scientific）に よ る 濃 度 測 定 を

表 現 型 を 示 す Large offspring syndrome（LOS）

行ったところ１×10６ の精子より約1.5μgのゲノが報告され，体外受精を用いた場合にその発生頻

ムDNAが抽出できることを確認した。また，こ度が高いことが判明している。さらに重要な点とのうちの100ngを１％アガロースの電気泳動にてして，この異常を呈する子牛にはヒトと同様にイ

泳動像を確認したところ，ゲノムDNAに大幅なンプリンティング遺伝子の伝達異常が起きている

切断は見られなかった。これらのことから，質おことが示されている 。この事実は，インプリン

よび量ともにDNAメチル化のゲノムワイド解析

ティングを伝える大元である精子におけるDNAに耐えうるゲノムDNAの抽出が可能であること

メチル化状態の変化が，臨床的に存在する未解明が確認された。

５）© The Ito Foundation

新規DNAメチル化網羅探索法を用いた牛の精液性状の評価法開発

次に，これらゲノムDNAに関しDREAM法６）による解析を行った。まず抽出したDNAより，
CCCGGGを共に認識配列とするDNAメチル化感

245

チル化データを得た。
３．結果と考察

受性／非感受性制限酵素ペアSmaI（NEB）にてはじめに精液サンプル由来のゲノムDNAより

25 ℃， ３ 時 間 ， 次 に XmaI （NEB） を 用 い て作製したライブラリの検討を行ったところ，ヒト

25℃，16時間の連続的処理により切断した。次にやマウスおよびイヌのサンプルで同様に行った場

Klenow（NEB）を 用 い て 切 断 末 端 を 平 滑 化 後合にはターゲットサイズの250-450bpにスメアパ

AmpureXP（Beckman Coulter）に よ る 精 製 をターンが見られるのに対し，牛の血液を含めたす行った。次に，シークエンス用アダプター（NEB）

べ て の サ ン プ ル に お い て 400bp と 500bp に 鋭 いを付加し，DNAを精製後，AmpureXPにより目

ピークパターンが現れた（Fig.１）。確認のため，的 の サ イ ズ（250-500bp）の 断 片 を 精 製 ，イ ン

イヌのサンプルと並行して行った場合でも，イヌデックスプライマー（NEB）を用いたPCR反応には見られず牛のサンプルのみに見られたため，により増幅を行い，次世代シークエンス用のライ

この現象は牛特異的であることが示唆された。こブ ラ リ 作 製 を 行 っ た 。得 ら れ た ラ イ ブ ラ リ をのバンドパターンの除去方法を模索したものの，

Qubit HS（Invitrogen）によって定量を行い，必その解決には至らなかったため，まずこれらのラ要量を（株）DNAチップ研究所に外注，バイオイブラリサンプルをシークエンス試行してみたと

アナライザー（Agilent）にてクオリティチェッ

ころすべてのサンプルで約1000万リードが得るこ

ク後，Illumina HiSeq3000を用いたシークエンスとができ，ライブラリの量に問題がないことが確を行った。得られたfastqシークエンスデータの認された。次にこのfastqシークエンスデータを

Bowtie２を用いたウシゲノムへのマッピング後，

Bowtie２によるウシゲノムにマッピングを行っ

Pythonスクリプトを用いたゲノムワイドDNAメ

たところ，得られたリードの約20％がウシゲノム

A1

B1 C1 D1 E1

F1 G1 H1 A2

B2

500bp
400bp

Fig. 1Quatlity check of libraries for Bovine DREAM. Genomic DNA from all 9 samples was used for library

preparations and then analyzed by Bioanalyzer. There are two sharp bands around 400-500 bp. Left；
DNA ladder, second from left to fourth；blood samples, and fifth to tenth；spermatozoa samples.

© The Ito Foundation

246

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

1.0

cowBC926

cowBC451

cowBC191

cowSpermS3

cowSpermN3

cowSpermS2

cowSpermN2

cowSpermS1

cowSpermN1

0.0

0.5

Height1.5

2.0

平成29年度Fig. 2

Clustering analysis with all nine samples. Three blood samples and six spermatozoa samples

were analyzed by 21801 CpG sites that commonly available for clustering analysis. Note thatblood samples showed a clearly separated cluster （Right cluster） from those by spermatozoa
samples（Left cluster）．

への単一のマッピングを示したが，その他約80％

その結果，49％がCpGアイランドと呼ばれるCpG

はウシゲノム上の複数領域にマッピングされるこサイトが密集している領域，また21％が遺伝子のとが判明した。また，同配列の増幅がライブラリ

プロモーター領域由来のCpGサイトであることが内に認められ，これらは他の動物種をサンプルに判明した。次に，それぞれのサンプルにおける用いた場合には見られないものであった。これら

DNAメチル化の相関を検討するためにクラスタの原因としてウシゲノム特有の繰り返し配列が原

リング解析を行ったところ，血液由来３サンプル

因となっていることが推測されるが，本法におけは精子由来６サンプルから大きく離れたクラス

るこの問題の克服点は現時点では見つかっておら

ターを形成した（Fig.２）。これはDNAメチル化

ず今後の検討が必要である。

パターンが血液と精子では大きく異なることを示

次に，約20％ながらもウシゲノムへの単一の唆 し ，Bovine DREAM に よ る ゲ ノ ム ワ イ ド な

マッピングが認められたシークエンスデータを用

DNAメチル化解析が組織間の相違を検出可能で

いてゲノムワイドなDNAメチル化データの取得あることを示している。

を試みた。まず，血液３サンプルおよび性選別前

次に性選別前３サンプル，性選別後３サンプル

３サンプル，性選別後３サンプルの全９サンプルの計６サンプルのみにおける精子の詳細な検討をにおいて共通してDNAメチル化の比較が可能で行うために，これらサンプルで共通して比較が可あった21801CpGサイトについて検討を行った。

能であった23432CpGサイトについて検討を行っ© The Ito Foundation

247

0.010

cowSpermS2

cowSpermN2

cowSpermS3

cowSpermN3

cowSpermS1

cowSpermN1

0.000

0.005

Height

0.015

0.020

新規DNAメチル化網羅探索法を用いた牛の精液性状の評価法開発

Fig. 3Clustering analysis with only six samples of spermatozoa. 23432 CpG sites that arecommonly available were analyzed for clustering analysis. Note that samples from same
individuals showed close cluster and separated from clusters by other individuals.

た。CpGアイランド，プロモーター領域におけるま た ， Carvalho et al. ７） に よ っ て 検 討 さ れ た

割合は49％，21％と前検討と同等であった。また

IGF2R遺伝子の近傍のDNAメチル化レベルは既クラスタリング解析では，性選別前後に関わらず

報と同じく性選別前後で変わりはなかった。今種雄牛個体による差が，性選別処理による違いよ後，これら変化の見られたCpGサイトについて対りも大きいことが判明した（Fig.３）。

象種雄牛数を増やすことによって確証を得るとと最後に，これら23432CpGサイトの定量的DNA

もに，性選別以外の条件（個体間，季節変動など

メチル化データを詳細に検討し，特異的変化を伴環境要因）によるDNAメチル化と既存の精液評

うサイトを同定しようと試みた。受胎率の低下に

価項目，さらには繁殖成績との関連を検討し，種影響を及ぼすと予想されるDNAメチル化の変化

雄牛の精液性状の変化と受胎率低下を関連づける

はインプリンティング遺伝子のDNAメチル化の根本的メカニズムの解明を目指すとともにDNA喪失および低下であると報告されているため，メチル化を指標とした牛凍結精子の新規評価法のDNAメチル化レベルが「射出精液＞処理後精液」

樹立による臨床的有用性と牛特有の新規インプリである箇所の探索をまず行った。それぞれ３サンンティング遺伝子候補の同定といった基礎研究へ

プルずつの平均DNAメチル化レベルを算出，性の貢献を目指す。

選別前後の差を計算し，性選別前が性選別後に比べ10％以上メチル化が高いCpGサイトを抽出した

４．要約

ところ，95CpGサイトがこれに該当した。また，

昨今，ヒトの精子における様々な異常なDNA

逆の傾向である性選別後が性選別前に比べ10％以メチル化と男性不妊や胎児発達異常との強い関連

上メチル化が高いCpGサイトは122箇所であった。

が指摘されている背景から，牛のDNAメチル化© The Ito Foundation

248

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）のゲノムワイドな検討が可能となる解析法を樹立

臨床的有用性と牛特有の新規インプリンティング

することで，種雄牛の精液性状の変化と受胎率低遺伝子候補の同定といった基礎研究への貢献を目

下を関連づける重要なメカニズムを解明すること指す。

を可能と考え，本研究ではまず性選別による影響を検討した。血液３サンプルおよび性選別前３サ
ンプル，性選別後３サンプルの全９サンプルにおいて次世代シークエンスにより約1000万リードを得ることができ，全９サンプルにおいて共通してDNAメチル化の比較が可能であった21801CpGサ
イトについてクラスタリング解析を行ったところ，血液由来３サンプルは精子由来６サンプルから大きく離れたクラスターを形成し，本ゲノムワ
イドなDNAメチル化解析が組織間の相違を検出可能であることを示した。次に性選別前３サンプ
ル，性選別後３サンプルの計６サンプルを用いた
クラスタリング解析では，性選別前後に関わらず
種雄牛個体による差が，性選別処理による違いよりも大きいことが判明した。また性選別によるDNAメチル化の差を認めるサイトが数百箇所認められた。今回樹立した牛のDNAメチル化のゲ
ノムワイド解析法が組織間の違い，および個体間の違いを同定することが可能であることを示し，また性選別によるDNAメチル化の差が認められたことから，今後対象種雄牛数を増やすことに
よって確証を得る予定である。また，様々な条件によるDNAメチル化と既存の精液評価項目，さらには繁殖成績との関連を検討し，種雄牛の精液性状の変化と受胎率低下を関連づける根本的メカ

文献１） Kobayashi, N., Miyauchi, N., Tatsuta, N.,
Kitamura, A., Okae, H., Hiura, H., Sato, A.,
Utsunomiya, T., Yaegashi, N., Nakai, K., Arima, T. ：Factors associated with aberrant imprint
methylation and oligozoospermia, Sci Rep，7，42336，
2017．
２） Elhamamsy, A. R.：Role of DNA methylation in
imprinting disorders：an updated review, J Assist
Reprod Genet，34，549～562，2017．
３） Kobayashi, H., Sato, A., Otsu, E., Hiura, H.,
Tomatsu, C., Utsunomiya, T., Sasaki, H., Yaegashi, N.,
Arima, T.：Aberrant DNA methylation of imprinted
loci in sperm from oligospermic patients, Hum Mol
Genet，16，2542～51，2007．
４） Donkin, I., Versteyhe, S., Ingerslev, L. R., Qian, K.,
Mechta, M., Nordkap, L., Mortensen, B., Appel, E. V.,
Jørgensen, N., Kristiansen, V. B., Hansen, T.,
Workman, C. T., Zierath, J. R., Barrès, R.：Obesity
and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of
Spermatozoa in Humans, Cell Metab，23，369～78，
2016．
５） Chen, Z., Hagen, D. E., Elsik, C. G., Ji, T., Morris, C.
J., Moon, L. E., Rivera, R. M.：Characterization of
global loss of imprinting in fetal overgrowth
syndrome induced by assisted reproduction, Proc
Natl Acad Sci USA，112，4618～23，2015．
６） Jelinek, J., Lee, J. T., Cesaroni, M., Madzo, J.,
Liang, S., Lu, Y., Issa, J. J.：Digital Restriction
Enzyme Analysis of Methylation （DREAM）,
Methods Mol Biol，1708，247～265，2018．
７） Carvalho, J. O., Michalczechen-Lacerda, V. A.,
Sartori, R., Rodrigues, F. C., Bravim, O., Franco, M.
M., Dode, M. A.：The methylation patterns of the
IGF2 and IGF2R genes in bovine spermatozoa are
not affected by flow-cytometric sex sorting, Mol
Reprod Dev，79，77～84，2012．

ニズムの解明を目指すとともにDNAメチル化を指標とした牛凍結精子の新規評価法の樹立による© The Ito Foundation

249

牛肉の生産性向上に資する安全なマダニ・マダニ媒介
感染症防除法の開発
Development of the safety protective strategy against tick and tick-borne
diseases for the improvement of beef productivity in cattle industry

八

田

岳

士・坪

川

大

悟

（北里大学医学部）

Takeshi Hatta and Daigo Tsubokawa（Kitasato University School of Medicine）

Milk and dairy products as well as beef production is greatly influenced by the strategy
to protect against tick and tick-borne diseases including piroplasmosis. Currently, no
antiprotozoal vaccines are available and thus the control of tick vectors is of utmost
importance. Until now, the control of these vectors depends mainly on the use of chemicalacaricides. The emergence of acaricide resistance in ticks due to improper use of theseacaricides is becoming a worldwide problem. Accordingly, there is an urgent need for a safe
preventive measure against these ticks such as vaccine development. A recombinant protein
vaccine（BM86）containing an 86 kDa protein localized on the digestive cell surface of theRhipicephalus microplus has a remarkable success against the feeding and reproduction of thistick species in Australia and South America. Therefore, the aim of this study is to evaluate thevaccine efficacy of BM86-orthologue in Haemaphysalis longicornis, the dominant tick in Japan.
Three genes including Hl86 have been successfully identified using molecular cloning tests.
Domain structure analysis using the predicted amino acid residues showed that they contained
multiple EGF-like domains and GPI anchor signal or transmembrane domain, suggesting to bemembrane proteins. In the trial experiment, larval ticks which have shown strong expressionof the said protein were infested on mice immunized with recombinant Hl86. The ticks mostly
survived, completed their feeding, and molted to the next stage. It is suggested that thevaccination of Hl86 alone may possibly be ineffective as a tick control strategy, in spite of theeffects of BM86 vaccination against R. microplus. Although the other two BM86-orthologues
have not been tested yet, it may be necessary to use the BM86 orthologues in combination
with a method that reduced the tick gut protease activity.

１．目

介疾病の予防対策の成否によって大きく左右され的る。抗原虫ワクチンなどが未開発の現状では，唯

牛肉や牛乳・乳製品の生産性向上は，国内外を一の予防手段として病原虫を媒介するマダニのコ問わずマダニ防除とピロプラズマ病などマダニ媒

ントロールに全精力が注がれ，いわゆる「殺ダニ© The Ito Foundation

250

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）剤」に依存してきた結果，頻回投与による耐性マを行い，Bm86-orthologue遺伝子の同定を試みた。

ダニの出現や薬物残留問題が台頭している。その得 ら れ た Bm86-orthologue 遺 伝 子 に つ い て ，ため畜産物への残留がなく，安全性が担保できる

ReverTra-Plus-（東洋紡）を用いたRT-PCRに新たな予防手段，すなわち安心・安全なワクチン

よる全長ORFを含むcDNAのクローニングによりの開発が求められている。

配列を決定した。

オウシマダニ中腸の消化細胞表面に局在する分

2.3

バイオインフォマティクス解析

子量86kDaの糖タンパク質（Bm86）の組換えタ

予測アミノ酸配列をもとに，ドメイン構造解析

ンパク質ワクチンは当該マダニの吸血防除に対しおよび各マダニ種由来Bm86-orthologue配列に対顕著な効果があることが報告されする相同性解析情報を得た。

，本分子の

１，２）

組換えタンパク質が1993年にHeber Biotec S.A.社

2 . 4 抗ペプチド抗体の作製および内在性タン（Havana, Cuba）より“Gavac Ⓡ”，続いて1994年

パク質発現の確認に Hoechst Animal Health 社 （Australia） よ り

Bm86-orthologueの予測アミノ酸配列をもと“TickGARD ”として上市された。そこで本研究に，ペプチドを合成しBSAをキャリアーとしたでは，国内最優占種であり，我が国の畜産業におペプチド抗原（Sigma-Aldrich）を作製し，ウサ

いて重要な小型ピロプラズマ病媒介マダニ種であギへ免疫することによって抗血清を得た。幼ダるフタトゲチマダニについて，その生活環を遮断

ニ・若ダニ・成ダニ各発育期別に粗抽出タンパク

しうるBm86-orthologue型組換えタンパク質ワク

質 液 を 作 製 し ，こ れ を 10 ％ ゲ ル 濃 度 の SDS-

チンの有効性について評価することを目的とした。

PAGEにて展開後，ウェスタンブロッティングにⓇ２．方供した。一次抗体には抗ペプチド抗体を1/100，

法

1/500，1/2500，1/7500の希釈系列で，二次抗体

2 . 1 フタトゲチマダニのマウス・ラットにおに は ，anti-Rabbit IgG（H+L）-AP ，1/5000 希
釈の条件で検討した。

ける吸血試験
ウサギにて継代飼育しているフタトゲチマダニ単2.5

為生殖系岡山株について，ワクチン実験における遺伝子ORFより，シグナル配列等を除く全長

実験区数を増やすことを目的とし，ウサギより小を pET49b ＋（Millipore, Novagen）の BamHI サ

型のマウスおよびラットにおいてフタトゲチマダ

イトに結合させ，大腸菌コンピテントセルに導入

ニの吸血および産卵が可能か，また継代維持が可した。コンピテントセルには，細胞質内における能かどうかを検証することを目的とした吸血試験

Ｓ-Ｓ結合形成能を向上させたE. coli B派生株を行った。

SHuffle T7 Express Competent E. coli（New2.2

組換えタンパク質の発現

England BioLabs）を使用した。

Bm86-orthologue遺伝子の同定

吸 血 後 ３ ～ ４ 日 目 の マ ダ ニ 中 腸 よ り TRI
reagent（Sigma-Aldrich）を用いてtotal RNAを2 . 6 ワクチントライアル：マウスへの免疫およびマダニによる攻撃試験

抽出し，次世代シーケンサーによるRNA-seq解

発 現 さ せ た タ ン パ ク 質 を COSMOGEL GST-

析および得られたリード配列のde novoアッセン

Accept（ナカライテスク）を用いてアフィニティ

ブリーとNCBI nrペプチドデータベースに対する

精 製 を 行 い ， 脱 塩 カ ラ ム PD-10 （GE Health

BLASTx解析によるトランスクリプトーム解析

Care） に て バ ッ フ ァ ー を PBS に 置 換 後 ，© The Ito Foundation

牛肉の生産性向上に資する安全なマダニ・マダニ媒介感染症防除法の開発

251

TiterMax Gold（TiterMax Inc. USA）ア ジ ュ バ

ろ ，１ 種 類 は 既 報 の Hl86 ３），残 り ２ 種 は 新 規

ントプロトコールに従い，８週齢のメスBalb/cマ

Bm86-orthologue遺伝子であるATAQ様遺伝子

ウス（５匹）を組換えタンパク質25µg/headに（HlATAQ1 お よ び HlATAQ2）で あ る こ と が 分て，皮下投与し免疫を行った。一方，コントロー

かった。各タンパク質アミノ酸配列より２次構造

ルにはアジュバントのみを投与した（３匹）。初のドメイン構造について調査した結果，Bm86

回投与後７日目と21日目に等量の抗原を追加免疫

family に 属 す る 分 子 は ，複 数 の 上 皮 成 長 因 子

し，22日目に幼ダニ約500匹を吸血させ，吸血お（Epidermal growth factor, EGF）様 ド メ イ ン でよび脱皮の成否について検討した。

構成されていた。ただし，分子種によって構成数に 差 が 認 め ら れ ， Bm86 で は ８ 個 ， Hl86 と３．結果と考察HlATAQ1は６個，HlATAQ2は５個であった。

3 . 1 マウス・ラットにおけるフタトゲチマダ

EGFドメインは，30～40アミノ酸からなり，６個の保存されたシステイン残基によって３組のジニ吸血実験系の確立
小動物用電気バリカンにて剃毛した背部に，スルフィド結合をつくることで定義される後生動

15ml（マウス）または50mL（ラット）ファルコ

物に特有なタンパク質の基本モジュールであり，ンチューブの一部（蓋側２cmを切断したもの）

このドメインを複数もつタンパク質（ラミニンやと晒し布を用いて作製した「マダニ繁殖用チャン

ニドゲン等）は，EGF受容体のような細胞表面

バー（以下チャンバー）」を，ゴム系多用途接着型のシグナル伝達受容体の活性化に関与している

剤で皺やヨレなく密着させ，６時間以上放置し乾

こ と が 示 唆 さ れ て い る ４）。 そ の 他 ， Hl86 と燥させた。チャンバー内にマウス一匹あたり幼：

HlATAQ1はBm86と同様にグリコシルホスファ

最大1,500匹，若：最大150匹，成：３匹，ラット

チジルイノシトール（glycosylphosphatidylinositol，一匹あたり幼：最大4,500匹，若：最大450匹，成：

GPI）アンカー型の膜タンパク質と予測された最大20匹を投入し，吸血し終えるまで飼育を継続

が，HlATAQ2は，Ｎ末端が細胞膜外，Ｃ末端がした。マウス・ラットともに，幼ダニと若ダニで細胞質内に配向する１型膜タンパク質と予測されは飽血したマダニが得られ，すべて脱皮することた（Fig.１）。先行して解析が進められたHl86にができ維持することができた。一方，成ダニではついては，特異抗体を用いた免疫蛍光抗体法によマウスでは吸血を終え産卵まで終えたが，ラット

り中腸細胞の上皮側に強く局在していることが示

を吸血させた成ダニは飽血する個体が少なく，ほ唆されており，局在予測に合致していることが示

とんど産卵することができなかった。以上より，

唆された３）。

マウスはマダニの吸血源として適しており，ワクチン実験にも有用であることが示唆された。一方

3 . 3 発育期別Bm86-orthologueタンパク質発現の有無

ラットは幼ダニ・若ダニの吸血源やワクチン実験

各発育期における未吸血マダニの全タンパク質解析に供することは可能だが，成ダニには不適当を抽出し，抗ペプチド抗体を用いたウェスタンブ

であることが分かった。

ロッティングによってその発現の有無を調査し

3.2

Bm86-orthologueの配列情報解析

た。作製した３種類抗体は，いずれも若ダニ，成フタトゲチマダニのBm86-orthologue遺伝子に

ダニ粗抗原に対する反応性は認められなかった。

ついて，３種候補遺伝子について解析したとこ

しかし，抗Hl86-ペプチド抗体は，幼ダニ粗抗原© The Ito Foundation

252

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 1 Predicted domain structure of Bm86 and Bm-orthologues from H. longicornis.

rectangle；signal peptides, circle；epidermal growth factor（EGF）-like domain,
rhombs；incomplete EGF-like domain, hexagon；glycosylphosphatidylinositol（GPI）anchor signal peptides, square；transmembrane region, arrow head；N-glycosylation site, stick；O-glycosylation site.

anti‒HlATAQ1

anti‒Hl86
kDa
220
120
100
80
60
50
40

M

1

2

3

M 5

4

6

7

8

anti‒HlATAQ2
M

9

10

11

12

Fig. 2 Western blotting analysis by using anti peptide antibody against the crude antigen

prepared from larval ticks. LaneM：Merker, Lane 1, 5, 9：1/100 dilution of antibody,
Lane 2, 6, 10 ： 1/500 dilution of antibody, Lane 3, 7, 11 ： 1/2500 dilution of antibody,
Lane 4, 8, 12：1/7500 dilution of antibody.

に強く反応性を示した（Fig.２）。Hl86の発現量600000については，幼ダニにおいて最も高発現であることが示唆されたが，他の２種（HlATAQ1および500000HlATAQ2）については，ペプチド抗体が反応しなかったか，または発現量が検出限界以下である

4000003.4

ワクチントライアル

３回免疫後の抗体力価は，コントロール群で4,000（中央値，Ｎ＝３），テスト群で74074.07（中央値，Ｎ＝５）であった（Fig.３）。攻撃試験にTiterと示唆されるが，現在のところ不明である。

300000200000

供した幼ダニは飽血し，その後回収した幼ダニを100匹ずつ逃走防止処置済みの小瓶にいれ，湿箱

100000（RH＞90％，25℃）にて保存し脱皮の有無を確認
0

したところ，テスト群・コントロール群ともに，すべての小瓶で99％以上の脱皮による若ダニへの変態を確認した。ワクチントライアルの結果からControl

1st

2nd

3rd

Fig. 3 Antibody titer after the indicated immunization.

Dot indicates the individual mouse.

© The Ito Foundation

牛肉の生産性向上に資する安全なマダニ・マダニ媒介感染症防除法の開発

253

Hl86抗原としてはさらなる改良の必要性がある。

ンパク質を抗原とする併用アプローチにて検討を

フタトゲチマダニと同様３宿主性マダニである

進めたい。

Ixodes ricinusにおける最近の研究でも，Bm86ホ
モログであるIr86-1，Ir86-2および両者の混合組換え抗原によるワクチン効果は認められない こ
５）とから，３宿主性のマダニ種では，中腸内におけるタンパク質分解酵素類の発現レベルが高く，取り込んだ抗体や補体の効果を打ち消している可能性が高い６）。すなわち，Bm86-orthologue等マダ
ニ中腸膜に存在する非暴露型抗原を基軸としたマ
ダニ防御ワクチンの開発には，これら酵素類を阻害する必要がある。
４．要

約

本研究では，フタトゲチマダニにおけるBm86orthologueの組換えタンパク質を基軸としたマダニワクチン開発の実現可能性に関し，その予備知
見を得ることを目的として検討を行った。その結果，幼ダニでの強発現が確認されたHl86の組換えタンパク質を単体で免疫した場合のワクチン効果
はきわめて低い可能性が示唆された。他の２種
Bm86-orthologueにおいては検討の余地はあるが，中腸内プロテアーゼ活性を低減させることが可能な阻害剤との併用が有効である可能性が高い。今後は，マダニの中腸プロテアーゼ組換えタ文献１） Willadsen, P., Riding, G. A., McKenna, R. V.,
Kemp, D. H., Tellam, R. L., Nielsen, J. N., Lahnstein,J., Cobon, G. S., Gough, J. M.：Immunologic control
of a parasitic arthropod. Identification of a protective
antigen from Boophilus microplus, J Immunol，
143
（4）
，
1346～1351，1989．
２） Rand, K. N., Moore, T., Sriskantha, A., Spring, K.,
Tellam, R., Willadsen, P., Cobon, G. S.：Cloning andexpression of a protective antigen from the cattle
tick Boophilus microplus, Proc Natl Acad Sci USA ，
86（24），9657～9661，1989．
３） Liao, M., Zhou, J., Hatta, T., Umemiya, R., Miyoshi,T., Tsuji, N., Xuan, X., Fujisaki, K.：Molecularcharacterization of Rhipicephalus（Boophilus）
microplus Bm86 homologue from Haemaphysalis
longicornis ticks, Vet Parasitol，146（1-2），148～157，
2007．
４） Engel, J.：EGF-like domains in extracellularmatrix proteins：localized signals for growth anddifferentiation? FEBS Lett，251（1-2），1～7，1989．
５） Coumou, J., Wagemakers, A., Trentelman, J. J.,
Nijhof, A. M., Hovius, J. W.：Vaccination against
Bm86 Homologues in Rabbits Does Not Impair
Ixodes ricinus Feeding or Oviposition, PLoS One, 10（4）, e0123495，2015．
６） Popara, M., Villar, M., Mateos-Hernandez, L., deMera, I.G., Marina, A., del Valle, M., Almazan, C.,
Domingos, A., de la Fuente, J.：Lesser protein
degradation machinery correlates with higher BM86
tick vaccine efficacy in Rhipicephalus annulatus
when compared to Rhipicephalus microplus,
Vaccine，31（42），4728～4735，2013．

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254

牛胸腺器官培養法の確立
Optimization of bovine thymic organ culture

脇

谷

晶

一・保

田

昌

宏

（宮崎大学農学部獣医解剖学研究室）

Shoichi Wakitani and Masahiro Yasuda（Laboratory of Veterinary Anatomy, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Early involution of thymus is a risk of low productivity in the livestock industry, because
the involution can result in decreased resistance to infection and prolonged duration of thesymptoms through the loss of thymic function in maturating T-cells which have a central rolein cell-mediated immunity. To establish ex-vivo system that enables us to uncover themechanism of early involution of bovine thymus and to develop a preventive method of theunwanted involution, this study aimed to optimize the organ culture method of bovine thymus.
Gas-liquid interphase method using hydrophilic polytetrafluoroethylene membranes and
RPMI-1640 media containing 12％ of bovine calf serum was applied to the sliced thymus ofJapanese Black cattle under three-months-old. The slices incubated at the condition of 7％ CO２
in air at 37℃ presented with decreased condense of lymphocytes in the lobule at the following
day. In the lobule, marginal region surrounded by the capsule showed higher dense oflymphocytes than the central region. Although the nuclear structure of thymic epithelial cells
both in the cortex and medulla had sustained for the first three days, almost all of the epithelial
nuclei indicated degenerative changes at the fifth day of incubation. Alternatively, outgrowthsof the interlobular connective tissue, including cell proliferation and increased layer of fiber,
were confirmed at the fifth day, and then neogenesis of adipose tissues expanded frominterlobular region to former lobule. As these sequential findings in histological alteration are
similar to the events during in-vivo thymic involution, our culture method could be an ex-vivo
model of bovine thymic involution.

１．目

による損失が多数発生しているのが現状である。

的

特に子牛の肺炎と下痢症は頻繁にみられ，これら畜産物を計画的に生産するためには，家畜の健感染症に対する防御には免疫系が重要な役割を康を保つことが欠かせない。しかし農林水産省が担っている。胸腺は病原体等の異物に対する細胞

公表する家畜共済統計表によると，平成27年度の性免疫を司るＴリンパ球の成熟・分化に不可欠な

加入頭数639万頭に対して疾病事故件数は239万

一次リンパ器官である。通常，胸腺は春期発動期

件，死廃事故頭数は38万頭にのぼるように，疾病

前後に齢退縮を開始するが，感染症・外傷・放射© The Ito Foundation

牛胸腺器官培養法の確立

255

線やステロイドホルモンの影響を受けて齢退縮が

眼的に胸腺の早期退縮が認められない生後３日始まる前に急性退縮（早期退縮）してしまうこと

齢，２週齢，３か月齢の個体を計３頭用いた。胸がある１）。

腺の胸葉を無菌的に採取後，クリーンベンチ内で胸腺の早期退縮を予防するには，そのメカニズ

約２mm角の組織片を作成した。12％牛胎子血清，ムを理解することが欠かせない。マウスを用いたペニシリンおよびストレプトマイシン（100U/ml

研究で胸腺の退縮は髄質上皮細胞の増殖機構の破および100µg/ml，Thermo Fisher Scientific）を綻が引き金になること２），その破綻にはIFN-α

含 有 す る RPMI-1640 培 地 （Thermo Fisher

が主要な役割を担うことが明らかにされている

Scientific） の 表 面 に メ ッ シ ュ フ ィ ル タ ー

が ，そのメカニズムが牛などの家畜でも同様に（Millicell Ⓡ Cell Culture Insert ，Merck）を 設 置

働いているかどうかは分かっていない。その外挿し，そのフィルター上に胸腺組織片を静置して性を検証するためには対象家畜の生体を用いて研

37℃，７％CO２気相条件下で気相液相境界面培養究を行うことが最も好ましいが，少なくとも牛のを行った。培養開始直前，１日後，３日後，５日

生体を用いた化合物の添加実験はマウス等の小型

後，７日後，14日後に培養胸腺組織片を20％中性動物を用いた同様の実験と比較して費用効率が著

緩衝ホルマリンで固定し，パラフィン切片を作製しく悪い。器官培養法は各種器官の組織片を体外してHE染色を施した後，光学顕微鏡下で観察しで維持するex vivo実験モデルである。生体を用いた。また，培養開始直前，１日後，３日後，５日た実験と比較して，器官培養法はより少量の化合後の胸腺組織片からISOGEN II（ニッポンジーン）

物を対象器官に直接添加できる利点がある。まを用いてRNAを抽出し，ReverTra AceⓇ（東洋紡）

た，細胞培養法では失われてしまう異種細胞間のを用いて逆転写反応を行った後にPower SYBRⓇ

相互作用を保持することができるため，器官培養

Green（Thermo Fisher Scientific）によるリアル

法は細胞培養法より生体に近い状態を再現するこ

タイムPCRを実施して培養胸腺内における遺伝子とができる。さらに，マウス等の小型実験動物と発現量を定量化した。統計学的解析にはTukeyの比較して，牛等の家畜では個体あたりの組織量が多重比較法を用いた。

３）多いため，器官培養法は小型実験動物よりも大型家畜に向いている実験系と考えられる。

３．結果と考察

以上の背景のように，牛胸腺の早期退縮メカニ

器官培養用に作成した胸腺組織片の組織構造をズムを解明し，その予防法を確立するためには，観察すると，小葉内はリンパ球が高密度に存在器官培養法を利用した実験を行うことが最も現実し，皮質と髄質の境界が明瞭に判別可能で正常な的であると考えられるが，器官培養法を牛胸腺に胸腺の組織構造を保持していることが確認でき適用した報告は現存しない。よって，本研究ではた。しかしながら，小片化作業の際の切断箇所にマウス胸腺器官培養法を基に４），牛胸腺器官培養

相当する被膜に覆われていない小葉の辺縁領域で法の至適条件を確立することを目的とする。

はリンパ球密度の低下が認められた（Fig.１）。

２．方

胸腺組織片の培養１日後，実質内のリンパ球の密法

度は培養前と比較して全体的に低下していたが，宮崎大学農学部獣医解剖学研究室に病理解剖の被膜直下の小葉辺縁領域におけるリンパ球の密度ために運び込まれた黒毛和種の廃用牛のうち，肉は比較的高かった（Fig.２）。上皮性細網細胞は© The Ito Foundation

256

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

異染色質と正染色質を区別可能なヘマトキシリン

して多く認められ始めたが，ヘマトキシリン淡染

淡染性で比較的大型の球形核を保持したものが多性の球形核を保持する上皮性細網細胞も多く存在

数認められた。髄質の細網細胞は皮質の細網細胞した。培養５日後，小葉間結合組織や被膜下結合と比較して細胞質がエオジン好性を示し，細胞の組織においてエオジン好性を示す線維性結合組織

形態が球形に膨張している様子を示すものも認めの増生が顕著に認められ始めた（Fig.３）。また，られた。この球形に膨張する像を示す細胞の核は目視ではあるが培養胸腺片が委縮しているように

すべて凝縮を示し，核の形態が正常を示す髄質のみられた。上皮性細網細胞は大部分が核の凝縮を細網細胞は多角形を示していた。

示し，小葉の辺縁では細胞質がやや塩基好性を有培養３日後，実質内のリンパ球の密度は辺縁領

し，未分化間葉系細胞とみられる細胞の集塊が認域を含めてより低下し，培養胸腺片の周囲にはやめられた。この細胞の増加は多数の上皮性細網細や乳白色を示す組織液が目立つようになった。細胞が生存していたとみられる培養３日後には起網細胞は核の凝縮を示すものが培養１日後と比較

こっていなかったため，上皮性細網細胞によって間葉系細胞の増殖が抑えられている可能性が示唆されるが，その証明にはさらなる研究を要する。
５日間の培養期間における胸腺内の遺伝子発現解析を行ったところ，培養３日後から５日後にかけて胸腺特有のサイトカインであるCcl17と胸腺上皮細胞と樹状細胞の表面マーカーであるCD205の発現が減少傾向を示した（Fig.４）。また，細胞傷害性Ｔ細胞とその前駆細胞が発現するCD8aの発現量もリンパ球の密度低下が組織学的に認められた培養３日後には培養開始直前と同等に維持

Fig. 1 A thymic slice prepared for the organ culture.

Scale bar：250µm

Fig. 3 A thymic slice adopted to the organ culture forFig. 2 A thymic slice adopted to the organ culture for aday. Lymphocytes are concentrated in the marginal
region of the lobule. Scale bar：500µm

five days. Connective tissue in interlobular andsubcapsular region indicates overgrowth.
Proliferated mesenchymal-like cells are expanding
to the lobule. Scale bar：250µm© The Ito Foundation

257

牛胸腺器官培養法の確立
2.5

Day0

Day1

Day3

Day5

2
1.5
1
0.5
0

Ccl17

CD205

CD8a

Fig. 4 Gene expression in the incubated thymus. Each column and error bar

indicates mean and standard error, respectively, of triplicate samples
derived from the same individual. The statistical difference has not been
derected.

されていたが，培養３日後から５日後にかけて減少傾向を示した。この結果はCD8aを発現するＴ細胞のクラスターが胸腺上皮細胞の産生する
Ccl17等のサイトカインの影響を受けて胸腺内に付着する可能性を示唆するが，その検証にはさらなる研究を要する。また，本研究で実施した遺伝
子発現解析ではいずれの遺伝子に関しても同一個体に由来するサンプルごとの偏差が大きく，培養期間に依存した有意差は認められなかった。２mm角の組織片では含まれる細胞構成が大きく異なる可能性があるため，遺伝子発現解析によって安定的な結果を得るためには組織片の大きさを再Fig. 5 A thymic slice adopted to the organ culture forfourteen days. Maturated adipose cells are shown in
the interlobular region. Cells in the former lobulealso contain large follicles. Scale bar：100µm考する必要があると考えられる。
培養７日後には未分化間葉系細胞とみられる細（Fig.５）。

胞が小葉内を占めるようになり，上皮性細網細胞

胸腺が齢退縮する際，リンパ球の減少，皮質とはエオジン好性の残骸として集塊状に認められる髄質の委縮が起こった後，中隔から脂肪細胞が次のみであった。小葉間結合組織では単胞性脂肪細

第に増加し，最終的には実質が脂肪組織で置き換

胞が集まった脂肪組織の出現が認められた。培養

えられる５）。本研究で行った牛胸腺の器官培養で14日後には小葉内にも線維性結合組織様の構造がは，初めに小葉内のリンパ球の密度が低下し，上認められたが，中隔の線維性結合組織が示すエオ

皮性細網細胞の退行性変化が完了したとほぼ同時

ジン好性は認められなかった。脂肪組織は中隔でに小葉間結合組織の増生が認められ，脂肪組織が多数認められるようになり，小葉内にも大型の小中隔から実質へと順次出現した。このように，本胞を有する白色脂肪細胞様の細胞が認められた研究の器官培養法は生体内の胸腺退縮の組織学的© The Ito Foundation

258

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

変化を模倣しており，胸腺退縮の体外モデルとなける脂肪組織の新生がみられ，14日後には小葉内り得ることが明らかになった。本培養法を用いれにおいても脂肪組織の新生は観察された。本研究ば，胸腺の退縮を防止する物質のスクリーニングで培養胸腺組織片内に認められた組織学的変化はを比較的小頭数の牛を用いて実施することが可能

生体内における胸腺の退縮過程と一致していること考えられる。また，そのような胸腺の退縮を防とから，本研究で実施した培養法は生体外の牛胸止する物質を本培養法に用いれば，より長期間牛腺退縮モデルとなり得ることが明らかになった。

胸腺を生体外で維持することが可能であると考え
られる。
４．要

約

胸腺の早期退縮は感染に対する抵抗性の低下や感染症の慢性化を招き，計画的な畜産物の生産を妨げる要因の一つと考えられている。牛胸腺の早期退縮メカニズムを解明し，その予防法を確立する前段階として本研究では牛胸腺器官培養法の確立を試みた。生後３か月齢未満の黒毛和種牛の胸腺に対し，12％牛胎子血清含有RPMI-1640培地
を用いて気相液相境界面培養を行ったところ，培養１日後に胸腺小葉内のリンパ球密度の低下，５日後に小葉間結合組織の増生が認められた。上皮性細網細胞は培養３日後まで正常な核の形状を示
すものが多数認められたが，５日後にはほとんど

文献１） Ansari, A. R., Liu, H.：Acute Thymic Involution
and Mechanisms for Recovery, Arch Immunol Ther
Exp，65，401～420，2017．
２） Sekai, M., Hamazaki, Y., Minato, N.：Medullary
thymic epithelial stem cells maintain a functional
thymus to ensure lifelong central T cell tolerance,
Immunity，41，753～761，2014．
３） Papadopoulou, A. S., Dooley, J., Linterman, M. A.,
Pierson, W., Ucar, O., Kyewski, B., Zuklys, S.,
Hollander, G. A., Matthys, P., Gray, D. H., de
Strooper, B., Liston, A.：The thymic epithelial
microRNA network elevates the threshold for
infection-associated thymic involution via miR-29a
mediated suppression of the IFN-αreceptor, Nat
Immunol，13，181～187，2011．
４） Anderson, G., Jenkinson, E. J.：Thymus organ
cultures and T-cell receptor repertoire
development, Immunology，100，405～410，2000．
５） Rezzani, R., Nardo, L., Favero, G., Peroni, M.,
Rodella, L. F. ： Thymus and aging ： morphological,
radiological, and functional overview, Age ，36 ，313
～351，2014．

の核が凝縮を示した。培養７日後には中隔内にお© The Ito Foundation

259

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明と診断法の確立Study of reproductive disorders in pigs caused by iron deficiency in theovary and establishment of its diagnostic methods

山

下

泰

尚

（県立広島大学生命環境学部）

Yasuhisa Yamashita（Department of Life and Environment Science, Prefectural University of Hiroshima）

We previously showed that the transferrin（TF）, carrier protein of trivalent iron ion（Fe3＋）
is accumulated in growing follicle in pig. In this study, to firstly investigate the mechanism ofiron ion uptake in growing follicle, expression of transferrin receptor, Tfr1 mRNA andintracellular localization of iron in granulosa/cumulus cells were detected. The expression of
Tfr1 mRNA was highly expressed in cumulus cells and granulosa cells through folliculardevelopment. When granulosa cells were primary cultured with FSH and TF-Fe3＋，a lot of
red fluorescence showing iron ions was detected. TF-Fe3＋ significantly induced Cyp19a1
mRNA expression in cumulus cells during in vitro maturation of cumulus-oocyte complexs（COCs）. Furthermore, the supplement of TF-Fe3＋ in FSH-contained medium where cultured
cumulus-oocyte complexs（COCs）significantly up-regulated formation rate of Molura
compared to control that were cultured with FSH alone. Thus, these results indicated that
uptake of TF derived-Fe3＋ via TFR1 in granulosa/cumulus cells were important for oocyte
maturation and developmental competence of oocyte, and its failure inhibit ovarian function
during follicular development. Almost 8％ of the follicular fluid showed low iron concentrationcompared to that collected from low COC expansion rate, implying that iron content in theovary is one of the causes of reproductive disorders in pig.

１．目

体形成ホルモン）により誘導されることから，こ的

れらが受容体の存在する卵胞の最外部を構成する哺乳動物では，卵巣から受精後に十分発生能を顆粒層細胞や卵の周りの卵丘細胞に作用し，間接有した卵が排卵されるが，その形成には，卵巣に的に卵が発生能獲得に関与すると考えられてきおける卵胞発育と排卵過程が重要であることが知た。しかし，FSHやLHの下流に存在する因子なられている。この卵胞発育と排卵は，それぞれ下どを考慮しても体外培養後の発生率は，体内のそ垂体から放出され，卵胞表面の血管を介して卵胞れと比較し著しく低い。我々は，卵胞表面に形成に作用するFSH（卵胞刺激ホルモン）とLH（黄される血管に着眼し，卵胞発育時の卵胞に特異的© The Ito Foundation

260

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）にトランスフェリン（TF）が血液中の４倍以上し，これらを添加した培地で１時間培養した区をも存在することを見出した。

TF-Fe３＋ 区とした。培養後，細胞内に取り込ま

TFは，主に肝臓で合成され，３価の鉄イオン（Fe３＋）を２分子抱合可能な鉄の担体タンパク質である。TFに対する受容体には主にTfr1と１，
２）

TFR２の２つのサブタイプが存在し，Fe３＋ を包れたFe２＋ に特異的に結合するFeRhoNox-１を添加し，この局在を蛍光顕微鏡で調べた。
2 . 2 実験２

卵胞発育環境におけるTF-Fe３＋の役割

合したTFはこれらの受容体と結合すると，細胞

卵胞発育時における鉄イオンの役割を調べる目

内にエンドソームとして取り込まれ，還元された的で，卵胞発育刺激を模倣した低濃度FSH（10ng/Feml）を添加した培地で培養した区をコントロー

２＋が細胞質中に貯蔵されることが報告されては，適時必要に応じてルとし，これに卵胞液中のFe３＋と結合したTF量

主にエネルギー合成，細胞増殖などを促進する。

（14mg/ml）を添加して培養した区を＋TF-Fe３＋

これまでにヒト，マウス，豚において，TF受容区として実験１と同様に回収した卵丘細胞卵複合体（TFR1）が卵胞に存在することは示されてい体（COC）を10あるいは12時間培養した。培養

るものの，その役割と繁殖障害との関係はまった

後の卵丘細胞における卵胞発育マーカー

く不明である。そこで本研究では，まず卵胞発育（Ccnd2，Cyp19a1）の発現（12時間），増殖細胞

および排卵時にTFにより卵胞に供給される鉄イを示すPCNA陽性細胞を蛍光免疫染色により染色オン（Fe）が卵成熟を誘導し，この破綻が卵し，PCNA陽性細胞数を調べた（10時間）。また，巣機能の低下と関係することを明らかにするため培養後のCOC形態を調べた（12時間）。さらに，に以下の研究を行った。

卵胞発育環境時にTF-Fe３＋ を添加することが卵いる。貯蔵されたFe

３～５）

２．方

３＋

２＋

成熟および発生能に及ぼす影響を調べるために，

法

2 . 1 実験１

卵胞発育環境でコントロール区およびTF-Fe ３＋
卵巣内の鉄取り込み制御因子の区で12時間培養後，高濃度FSH（１µg/ml）を添加した培地でさらに20，24，48時間培養した。培

発現と鉄の局在
食肉処理場由来の正常個体の豚の卵巣から卵胞

養後，排卵促進マーカー遺伝子（Has2，Ptx3，

サイズ別（３mm以下，３-５mm，５-８mm，Tnfaip6）の発現（20時間），COCの膨潤直径（48８mm以上）に顆粒層細胞を回収した。また，排時間），卵の核膜が消失し減数分裂が再開したこ

卵後に形成される黄体（CL）の開花期と退行期と を 示 す 指 標 の 卵 殻 胞 崩 壊（Germinal Vesicleも回収した。回収後，卵，卵丘細胞，顆粒層細胞

Breakdown；GVBD）率（24 時 間）と 卵 成 熟 がにおけるTF受容体（Tfr1）のmRNA発現をRT-完了したことを示す第二減数分裂中期

PCR法により調べた。またサイズ別に回収した顆

（Metaphase II；MII）率（48時間）を調べた。

粒 層 細 胞 と 黄 体 開 花 期 ，黄 体 退 行 期 の Tfr1

また一部のCOCを豚新鮮精液による体外受精にmRNA発現をRealtime RT-PCR法により検出し

供 試 し ，７ 日 間 発 生 培 養 し ，着 床 前 の 胚 盤 胞

た。TFにより供給されるFe（Blastocyst）率を調べた。

まれる際にFe２＋３＋は細胞内に取り込に還元され細胞内に蓄積される

こ と か ら ，顆 粒 層 細 胞 を 初 代 培 養 し ，FSH と
TF-Fe

３＋

を添加していない区をコントロールと

2 . 3 実験３

排卵環境におけるTF-Fe３＋の役

割
排卵期の鉄イオンの役割を調べる目的で，排卵© The Ito Foundation

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明と診断法の確立期を模倣した高濃度FSH（１µg/ml）とEGF（１ng/ml）を添加した培地で培養した区をコント
ロール，TFを添加した区を＋TF-Fe３＋区として
COCをさらに20，24，あるいは48時間培養した。

261

３．結果と考察3 . 1 実験１

卵巣内の鉄取り込み制御因子の発現と鉄の局在

培養後の排卵促進マーカー遺伝子（Areg；10時

卵胞発育時のTfr1の発現は，顆粒層細胞およ間，Ereg；15時間，Egfr；20時間，Has2；20時間，

び卵丘細胞に強く発現したが，卵にはまったく検Ptx3；20時間，Tnfaip6；20時間）の発現，COC

出されなかった（Fig. 1 A）。卵胞サイズ別に回の膨潤直径（48時間），卵成熟率（GVBD；24時収した顆粒層細胞におけるTfr1 mRNA発現を

間，MII率；48時間）を調べた。また一部のCOC

realtime RT-PCRにより検出した結果，Tfr1発を 体 外 受 精 し ，７ 日 間 発 生 培 養 後 胚 盤 胞

現は，すべての卵胞サイズで変化せず，黄体の開（Blastocyst）率を調べた。

花期および退行期においても恒常的に発現してい2 . 4 実験４：卵巣中鉄濃度の測定による卵巣た（Fig. 1 B）
。コントロール区におけるFe２＋ を示す赤色の蛍光像はまったく検出されなかった。

鉄不足による繁殖障害豚の推定
食肉処理場由来の豚からランダムに卵巣を採取

一方，TF-Fe３＋ を添加して培養すると，Fe２＋ をし（14個体分），１頭分の直径８mm以上のすべて

示す赤色の蛍光像が多数検出された（Fig. 1 C）。

の卵胞から卵胞液を１つの遠沈管に採取した。ここれらの結果から，卵胞発育期から黄体期にTF

れらの卵胞液中の鉄濃度濃度を測定し，血中鉄濃と結合したFe３＋ はTfr1を介して細胞内に取り込度が平均値よりも半分以下の低い個体群を選抜しむことが可能であることが明らかになった。

た。選抜した血中鉄濃度の低い個体群の卵巣から

3 . 2 実験２

回収したCOCを体外成熟培養し，COCの膨潤直径の役割からこれらの個体群における繁殖性を推定した。

卵胞発育環境におけるTF-Fe３＋

実験２では，まず卵胞発育期におけるTF-Fe３＋

Fig. 1 Expression of and localization of Fe２＋ in granulosa cells.
GC；granulosa cells, CC；cumulus cells© The Ito Foundation

262

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）の役割を検討した。その結果，卵丘細胞におけるイオンは核成熟には関与しないと考えられた。一卵胞発育マーカー遺伝子（Ccnd2，Cyp19a1）の方，胚盤胞率については，TF-Fe３＋ 区で高い値

発現は，コントロール区に比べ，TF-Fe３＋ 区にを示したことから，鉄イオンは卵の細胞質成熟をおいて有意に高い値を示した（Fig. 2 A，2 B）。

促進することが明らかになった。

また，PCNA陽性細胞もコントロール区に比べ3 . 3 実験３ 排卵環境におけるTF-Fe３＋の役割

TF-Fe３＋区において多く観察された（Fig. 2 C）。

卵胞発育期の後の排卵期におけるTF-Fe ３＋ 区

TF-Fe３＋ を添加した卵胞発育環境が，排卵環の役割を検討する目的で，排卵環境の高濃度FSH

境で培養後の卵成熟に及ぼす影響を調べた結果，添加時で検討し，排卵促進マーカー遺伝子の発現

Has2の発現には影響なかったが，Ptx3，Tnfaip6を調べた結果，Ptx3，Tnfaip6の発現はコントローの発現，COC直径はTF-Fe

区で有意に高い値

ル区とTF-Fe３＋ 区で差が認められなかったが，を示した（Fig. 2 D，2 E，2 F，2 G）。MII率にAreg，Ereg，Egfr，Has2の発現はコントロール

ついては，コントロール区とTF-Fe区で同程区に比べ，TF-Fe３＋ 区で有意に低い値を示した

度の値を示したが（Fig. 2 H）
，胚盤胞率はTF-Fe３＋（Fig. 3 A）
。このことから，排卵環境においては区で有意に高い値を示した（Fig. 2 I）
。これまで

ほとんどの排卵促進マーカー遺伝子の発現を負にの研究により，卵の成熟能には核が受精前の状態影響することが明らかになった。さらにMII率にへと変化する核成熟能と精子と受精後発生するこはTF-Fe３＋はまったく影響しなかったが（Fig. 3とが可能となる細胞質成熟の２つが存在すること

B），発生後の胚盤胞率に関してはコントロールが知られている。本研究ではMII率という核成熟区で20％程度であったものが，TF-Fe３＋ 区では能の指標についてはコントロール区とTF-Fe ３＋

まったく認められなかった（Fig. 3 C）
。以上の結区で差が認められず高い値を示したことから，鉄果から，卵胞発育期に蓄積するTF-Fe３＋ は卵胞

３＋３＋Fig. 2 Effect of supplement of TF-Fe３＋ in follicular development condition in in vitro on expressions offollicular development-related gene （A, B）, granulosa cell proliferation （C）, expressions of ovulation
related gene（D, E, F）,COC expansion（G）,and MII rate（H）,and blastocyst rate（I）．

© The Ito Foundation

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明と診断法の確立

263

Fig. 3 Effect of supplement of TF-Fe３＋ in ovulation condition in in vitro on expressions of ovulation-relatedgene（A）, MII rate（B）,and blastocyst rate（C）．

発育，卵成熟を促進する新規因子であることが明ら か に な っ た 。さ ら に ，そ れ に 続 く 排 卵 期 に
TF-Fe３＋ 区が存在することはマイナスに作用す

４．要

約

当研究室では，卵胞発育期の豚卵胞にはTFがることが明らかになった。
3 . 4 実験４を確立する予定である。

卵巣中鉄濃度の測定による卵巣

多量に蓄積することを見出した。TFは鉄イオン（Fe３＋）の担体タンパク質であることから，正常鉄不足による繁殖障害豚の推定
卵巣中の鉄濃度が平均値は，40.69±3.18µg/dl

な卵成熟にはTFにより供給される鉄イオンが重であり，この半分に満たない鉄濃度の低い個体群要であり，その破綻が繁殖障害となると仮説を立は，４サンプルであり（28.5％），その値は9.79±て，以下の研究を行った。まず，卵巣における2.02mg/mlであった（Fig. 4 A）
。卵巣鉄が正常なTfr1とTRF２の発現を調べた結果，Tfr1が卵胞の個体群のCOC形態は，卵丘細胞が十分に膨潤し顆粒層細胞と卵丘細胞に発現すること，TF-Fe３＋ていたが，鉄濃度の低い卵巣鉄由来のCOCでは依存的に顆粒層細胞に鉄が取り込まれることを明

この膨潤が不十分であった（Fig. 4 B）
。このことらかにした。また体外培養系を用いた解析によから，卵巣鉄の不足により卵胞発育，排卵過程がり，卵胞発育環境においてTF-Fe３＋ 依存的に卵阻害され，繁殖障害の一因となると考えられた。

胞発育マーカーと顆粒層細胞の増殖活性が増加す

今後は，正常個体のTF-Fe

濃度で培養するこることを明らかにした。さらに，その後続けて排とで，上昇するかを検討し，卵巣鉄不足が繁殖性

卵環境で培養すると卵成熟が促進され，体外受精を低下させる原因であることを確定診断する方法

後の発生能が向上することを明らかにした。一３＋© The Ito Foundation

264

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 4 Iron concentration distribution, and morphology of expansion of COC collected from between

normal and low iron amount in ovary.

方，卵胞発育環境を経ずに排卵環境でCOCを培養すると卵成熟が抑制され，胚発生が低下したことから，TF-Fe３＋ は卵胞発育期限的的に働く卵成熟促進因子であることが明らかになった。さらに，卵巣鉄の低い個体から採取したCOCを培養し，COCの膨潤直径を測定したところ，28.5％が低い値を示していたことから，卵巣鉄の不足により卵胞発育，排卵過程が阻害され，繁殖障害の一因となると考えられた。

文献１） Williams, J., Grace, S. A., Williams, J. M. ：Evolutionary significance of the renal excretion oftransferrin half-molecule fragments, Biochem. J.，201（0264-6021），417～419，1982．
２） Bowman, B. H., Yang, F. M., Adrian, G. S.：
Transferrin：Evolution and Genetic Regulation ofExpression, Advances in Genetics，25，1～38，1988.
３） A i s e n , P . ：T r a n s f e r r i n r e c e p t o r 1 , T h e
International Journal of Biochemistry & Cell
Biology，36（11），2137～2143，2004．
４） Hentze, M. W., Muckenthaler, M. U., Andrews, N.
C . ：B a l a n c i n g A c t s ：M o l e c u l a r C o n t r o l o f
Mammalian Iron Metabolism, Cell ，117（3），285 ～
297，2004．
５） Lawrence, C. M.：Crystal Structure of the
Ectodomain of Human Transferrin Receptor,
Science，286（5440），779～782，1999．

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265

鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルス耐性機構の解明：感染細胞における初期応答の品種間比較
Elucidation of the resistance mechanisms for highly pathogenic avian
influenza virus in chickens-early antiviral response in infected cells

松

鵜

彩

（鹿児島大学共同獣医学部附属越境性動物疾病制御研究センター）

Aya Matsuu（Transboundary Animal Diseases Research center, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Highly pathogenic avian influenza virus（HPAIV）causes severe clinical symptoms inchickens. The mechanisms underlying the highly pathogenic manifestation of the HPAIV inchickens has not been fully elucidated. In our previous study, we found the differences in thesensitivities to HPAIV among the different breeds of chicken. In this study, to understand theunderlying molecular differences in host response in the primary chicken embryo fibroblast（CEF）cells were isolated from two different chicken breed（SPF white leghorn and nativechicken）, and infected with HPAIV and low pathogenic avian influenza virus（LPAIV）. We
found that HPAIV replication in CEF cells isolated from native chicken were slightly inhibitedthan SPF white leghorn. Two chicken breed showed significantly different interferon, andinterferon stimulated genes mRNA expression pattern after infection. Although we could not
identify the host factor associated with increased resistance to HPAIV in native chicken, CEF
cells of this study may be useful model for determining the host defense mechanisms against
HPAIV through extensive genetic analysis.

１．目

大な被害をもたらす重要疾病の一つである。

的

家禽の中でも特に鶏はHPAIVに対する感受性

高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）は，家禽が高い。HPAI制圧のためには鶏における病原性に対して強力な病原性を有するＨ5あるいはＨ7亜発現機序の解明が不可欠であるが，その詳細は現型インフルエンザウイルスによって引き起こされ時点で十分に解明されていない。我々は平成28年

る疾患である。国内では2003年に79年ぶりに発生度研究において国産地鶏を用いた感染実験を実施が認められて以降，野鳥や養鶏場において散発的し，地鶏の中にはH5N8亜型HPAIVに対して耐性な発生が認められている。高病原性鳥インフルエ

を示す品種が存在することを明らかにした。この

ンザウイルス（HPAIV）に感染した鶏は急激なような異なる感受性の鶏はHPAIVに対する宿主

臨床症状の悪化を示し，またウイルスの強い伝播防御機構を解明するための有用なモデルとなる可性を有することから，HPAIは畜産界において甚能性に着目した。

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266

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

本研究ではウイルスと宿主の最初の攻防の場で11種類の遺伝子：インターフェロン（IFN-α，ある感染細胞におけるウイルス増殖性および宿主

IFN-β，IFN-λ），炎症サイトカイン（IL-6，応答性の違いを比較することを目的とし，HPAI

IL-8 ，IL1 β ，TNF- α），interferon stimulated

耐性地鶏および感受性SPF白色レグホン由来の初gene（Mx １ お よ び OAS ： 2ʼ5ʼ-oligoadenylate

代鶏胚線維芽（CEF）細胞を用いて，HPAIVお

synthetase），受容体（MDA5およびTLR3），のよび低病原性鳥インフルエンザウイルス

発現について解析を行った。

（LPAIV）の二種類のＡ型インフルエンザウイル
スの感染実験を行った。

2.1

高用量（10６EID50）のHPAIVおよびLPAIVを法

２．方

３．結果と考察感染させたCEF細胞内でのウイルス増殖についウイルス株て，品種間で明らかな違いは認められなかった。

本研究では2014年冬季に鹿児島県内の野鳥から

一方，低用量（10 ２ EID50）のHPAIVを感染した

分 離 さ れ た H5N8 亜 型 HPAIV で あ る A/duck/

後のウイルス増殖は，native-CEFにおいて有意Kagoshima/KU-70/2015

お よ び H11N9 亜 型に抑制された。LPAIVについても同様の傾向が

LPAIVであるA/duck/Kagoshima/T40/2014を用認められたが，品種間で統計学的有意差は認めらいた。

れなかった（Fig.１）
。

2.2

１）

Ⅰ型およびⅢ型インターフェロンmRNA発現

CEF細胞

SPF白色レグホン種および鹿児島県産地鶏由来

を Fig. ２ に 示 し た 。 SPF-CEF 細 胞 に お い ての10日齢の発育鶏卵から鶏胎子を取り出し，常法HPAIV感染後のIFNαおよびIFNβ発現が16時間によりCEF細胞を10％FBS添加DMEMに浮遊さ後にピークに達したのに対し，native-CEF細胞

せ，６ウェルプレートに添加し，37℃で培養を

は 24 時 間 後 に 同 レ ベ ル に 達 し た こ と か ら ，

行った（SPF-CEFおよびnative-CEF）。24時間

native-CEF細胞ではⅠ型インターフェロン発現後に接着していない浮遊細胞を除去し，PBSで細が遅延する傾向にあった。またLPAIV感染16～

胞を洗浄したのち，２種類のウイルス（10 EID50

24時間後にかけてのⅠ型インターフェロン発現にあるいは10 EID50）あるいはpolyI : Cを接種した。

ついてもnative-CEF細胞の方が低い傾向にあっ

接種後10，16，24時間後に細胞を洗浄したのち回た。一方Ⅲ型インターフェロンであるIFNγの発収し，RNAを抽出した。

現は二種類のウイルス感染10～24時間後において

２

６

2.3

native-CEF細胞の方が高い傾向にあった。過去

CEF細胞におけるウイルス増殖

回収したRNA1 µlを用いてSYBR Green real-の研究では，HPAIVに対して異なる感受性を示

time PCR（Agillent Brilliant Ultra SYBR

すアヒルと鶏由来胎子線維芽細胞を用いてQPCR）法によってＡ型インフルエンザウイルス

HPAIVに対する宿主応答を比較しているが，Ｍ遺伝子の増幅を確認した。

HPAIV耐性を示すアヒルに比べて鶏由来細胞に

2 . 4 CEF細胞における免疫関連遺伝子発現解

おいて，Ⅲ型インターフェロンのアップレギュ
レーションが確認されている２）。本研究では同じ

析
βアクチンを内部標準として，SYBR Green

動物種の中で品種によるインターフェロン発現様real-time PCR法を用いたΔΔ法により，以下の式の差が認められ，免疫応答性に違いが存在する© The Ito Foundation

viral RNA load (40-Ct)

viral RNA load (40-Ct)

鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルス耐性機構の解明：感染細胞における初期応答の品種間比較
55

(A)

SPF

native chicken

55

(B)

*
5

5
10hr

16hr

10hr

10hr

24hr

(C)

5

267

*

16hr

24hr

16hr

24hr

(D)

16hr

24hr

5

10hr

Fig. 1 Quantification of viral RNA by real-time RT-PCR. Cells were harvested from 3 eggs per groupe after 10, 16, and24 hours post（A）H5N8 10６EID50,（B）H5N8 10２EID50,（C）H11N9 10６EID50, and（D）H11N9 10２EID50 infection
and type A influenza virus M gene was analyzed using SYBR Green real-time PCR. ＊p＜0.05 between SPF chicken（white）and native chicken（black）．

type 1 IFN

type 3 IFN

(A)

(B)

(C)

Fig. 2 Comparison of Interferon mRNA expression. Cells were harvested from 3 eggs per group after 10, 16, and 24

hours post（A）poly I；C inoculation,（B）H5N8 10６EID50, and（C）H11N9 10６EID50 infection and interferon mRNA
expression was analyzed using real-time PCR ． ＊ p ＜ 0.05 and ＊ ＊ p ＜ 0.01 between SPF chicken（white circle）andnative chicken（black circle）．

© The Ito Foundation

268

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）可能性が疑われた。

れている２）。本研究においても特にSPF-CEFがインターフェロンにより誘導される抗ウイルス

IFN mRNAの発現が上昇するより早い段階でMx

遺 伝 子 IFN-stimulated genes（ISG）と し て Mx

１やOAS mRNAの発現が上昇しており，IFN非１およびOAS発現を評価した。Mx1 mRNA発現

介在性の応答を反映している可能性が疑われる。

については，SPF-CEF細胞においてpolyI:C刺激，

特にHPAIV感染24時間後のMx１およびOAS発現

HPAIVおよびLPAIV感染初期（10時間後）からがnative-CEFで有意に上昇していることから，

高 い 発 現 が 認 め ら れ た 。こ れ に 対 し て native-

ウイルス増殖抑制に関連する可能性が疑われる。

CEF細胞ではウイルス感染後期（16時間後）に一部の研究においてMx１遺伝子の一塩基多型と同レベルにまで上昇し，さらにHPAIV感染後24

インフルエンザウイルス耐性の関連性が示されて時間においてSPF-CEFよりも有意に高い発現がいる３，４）。本研究で用いた細胞のMx１遺伝子配列認められた。OAS mRNA発現はpolyI:C刺激後初については未実施であるものの，地鶏のMx１遺期（10時間）にSPF-CEFにおける有意な発現上

伝子ではこの多型が認められる確率が高いことを昇が認められたが，HPAIV感染後後期（24時間）

確認している（データ非表示）。このような多型にはnative-CEFの有意な発現上昇が認められ，とISG発現の違いとの関連性の解明は今後の課題

Mx1 mRNA と 類 似 し た 結 果 が 得 ら れ た（Fig.

である。

３）。近年の哺乳動物由来細胞を用いた研究では，

炎症性サイトカインとしてIL-6，IL-8，IL-1β，Ａ型インフルエンザウイルス感染によって，ISG

TNF-α mRNAの発現を比較したが，SPF-CEFの発現がIFN非依存的に誘導されることが指摘さ

およびnative-CEFの間で有意な差は認められなReceptors

ISGs
(A)

(B)

(C)

Fig. 3 Comparison of cytokine mRNA expression. Cells were harvested from 3 eggs per group after 10, 16, and 24

hours post（A）poly I；C inoculation,（B）H5N8 10６EID50, and（C）H11N9 10６EID50 infection and interferon mRNA
expression was analyzed using real-time PCR ． ＊ p ＜ 0.05 and ＊ ＊ p ＜ 0.01 between SPF chicken（white circle）andnative chicken（black circle）．

© The Ito Foundation

鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルス耐性機構の解明：感染細胞における初期応答の品種間比較

269

(A)

(B)

(C)

Fig. 4 Comparison of cytokine mRNA expression. Cells were harvested from 3 eggs per group after 10, 16, and 24

hours post（A）poly I；C inoculation,（B）H5N8 10６EID50, and（C）H11N9 10６EID50 infection and interferon mRNA
expression was analyzed using real-time PCR ． ＊ p ＜ 0.05 and ＊ ＊ p ＜ 0.01 between SPF chicken（white circle）andnative chicken（black circle）．

かった（Fig.４）。追加としてインターフェロン

れた情報を基に，今後はより網羅的解析を行い発誘導因子であるIRF-３およびIFR-７についても

現変動遺伝子の特定に向けた研究を遂行する予定

評価を行ったが，mRNAの発現について群間でである。

有意な差は認められなかった（データ非表示）。
本研究では，感染実験によって明らかなHPAI

４．要約耐性を示した地鶏由来CEF細胞において，細胞

高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）は家禽に内のウイルス増殖が抑制される傾向にあることを対して強力な病原性を有するＨ5あるいはＨ7亜型

明らかにした。この細胞において鶏宿主の自然免

インフルエンザウイルスによって引き起こされる疫に関連するmRNA発現について評価を行った疾患である。HPAI制圧のためには鶏における病と こ ろ ，① HPAIV お よ び LPAIV 感 染 後 の Ⅰ 型

原性発現機序の解明が不可欠である。本研究でIFN mRNA発現が有意に抑制されたのに対して，は，感染実験によってHPAIウイルスに対して異Ⅲ型IFN（IFNλ）発現が高い傾向にあった。②なる感受性を示した二種類の品種（地鶏およびISGであるMx1 mRNAの発現は，polyI:C刺激，

SPF 白 色 レ グ ホ ン） 由 来 の 初 代 鶏 胚 線 維 芽

HPAIVおよびLPAIV感染初期において低いもの（CEF）細胞を用いて，HPAIウイルス（HPAIV）の，その後逆転し特にHPAIV感染後24時間におおよび低病原性鳥インフルエンザウイルス

いて有意に高い発現を示した。このような地鶏に（LPAIV）の増殖性と，これに対する宿主応答をおける宿主応答性の違いが細胞内ウイルス増殖の比較した。その結果，HPAI耐性を示した地鶏由抑制に関与する可能性が疑われる。本研究で得ら

来CEF細胞において，細胞内のウイルス増殖が© The Ito Foundation

270

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

抑制される傾向にあった。この細胞において鶏宿
主の自然免疫に関連するmRNA発現について評価を行ったところ，地鶏由来細胞では，HPAIV
お よ び LPAIV 感 染 後 の Ⅰ 型 イ ン タ ー フ ェ ロ ン
mRNA発現が有意に抑制され，一方Ⅲ型インターフェロンmRNA発現は高い傾向にあった。さらにインターフェロンにより誘導される抗ウイルス
遺伝子の発現が，特にHPAIV感染後24時間において有意に高い発現を示した。本研究で得られた情報を基に，今後はより網羅的解析を行い，ウイ
ルス感染後の発現変動遺伝子の特定に向けた研究を継続する。

文献１） Ozawa, M., Matsuu, A., Tokorozaki, K., Horie, M.,
Masatani, T., Nakagawa, H., et al. ： Genetic diversityof highly pathogenic H5N8 avian influenza viruses
at a single overwintering site of migratory birds inJapan, 2014/15, Euro Surveill，20（20），2015．
２） Kuchipudi, S. V., Tellabati M., Sebastian, S.,
Londt, B. Z., Jansen, C., Vervelde, L., et al.：Highly
pathogenic avian influenza virus infection inchickens but not ducks is associated with elevatedhost immune and pro-inflammatory responses, Vet
Res,. 45：118. doi：10.1186/s13567-014-0118-3，2014.
３） Ewald, S. J., Kapczynski, D. R., Livant, E. J.,
Suarez, D. L., Ralph, J., McLeod, S., et al.：
Association of Mx1 Asn631 variant alleles with
reductions in morbidity, early mortality, viral
shedding, and cytokine responses in chickens
infected with a highly pathogenic avian influenza
virus, Immunogenetics，63（6），363～75，2011．
４） Wang, Y., Brahmakshatriya, V., Lupiani, B.,
Reddy, S., Okimoto, R., Li, X., et al.：Associations ofchicken Mx1 polymorphism with antiviral responses
in avian influenza virus infected embryos andbroilers, Poult Sci，91（12），3019～24，2012．

© The Ito Foundation

271

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析
Livestock-associated S. aureus in chicken：virulence, resistance andpathogenesis

小

野

久

弥

（北里大学獣医学部）

Hisaya Ono（Kitasato University School of Veterinary Medicine）

Staphylococcus aureus is one of the most common causes of zoonotic agents in the world,which are attributable to the infectious diseases and the contamination of food withenterotoxins in human and animals. In this study, to investigate the prevalence and pathogenic
factors of S. aureus in chickens in Japan, S. aureus isolates were cultured from chickens inslaughterhouses. The results showed that positive rates of S. aureus detected in the heads,
wings and legs were 22.6, 30.4 and 65.2 percent, respectively. The isolates cultured from leg
showed high frequency of S. aureus but a few of the isolates harbor Staphylococcal enterotoxin（SE）genes. In contrast, the isolates from head and wing harbor more SE genes. These results
suggest that the lineages of isolates from head and wing are different with that from leg.
Interestingly, mecA-gene was not detected in the S. aureus isolates but detected in high levelfrom the coagulase-negative staphylococci in this study. It is important to further analyze thegenetic background and pathogenicity for both of S. aureus and coagulase-negative
staphylococci isolated from chickens. Studies in vitro showed Staphylococcal enterotoxin A（SEA）co-localized in early endosome and endoplasmic reticulum at 30 min to 6 h after SEA
inoculation. In vivo study showed that SEA injection induced an inflammatory response tochickens, infiltration of inflammatory cells and allergic-related cells and expression ofproinflammatory cytokines. Our results would be vital clues to elucidate the mechanisms of S.
aureus infection in chicken.

１．目症候群を起こすことが知られている。近年，EU

的圏内および北米において家畜関連メチシリン耐性

黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は，

黄色ブドウ球菌（LA-MRSA）による疾病が問題

家畜・家禽に感染し多くの感染症を引き起こす重視されており，実際に家畜・家禽と高頻度に接触

要な病原菌である。ヒトにおいても黄色ブドウ球する農場関係者や獣医師でLA-MRSAが検出され菌は重要な感染症原因菌であり，種々の皮膚感染ている１）。さらに，流通している食肉およびその症，耐性菌による院内感染および毒素性ショック

食肉を購入した消費者からもLA-MRSAが検出さ© The Ito Foundation

272

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

れたことが報告されている２）。我が国においてもい，定法に従って各株のコアグラーゼ陽性またはLA-MRSAの主要な遺伝子型が家畜（主に豚）か

陰性を確認した。コアグラーゼ試験陽性株およびら検出されており，家禽においても実態を調査す

セフォキシチン耐性コアグラーゼ陰性株についる必要がある。海外と同様に，我が国でもLA-て ，さ ら に Chrobak ら の 方 法 に よ り multiplex

MRSAの増加が見込まれており，またLA-MRSA

PCRを実施し，ブドウ球菌種の同定とメチシリン

はそのほとんどが多剤耐性菌であるため，鶏にお耐性遺伝子であるmecAの検出を行った３）。分離

いて黄色ブドウ球菌感染症が増加することが予想したS. aureusのSE遺伝子はOmoeらの方法を改される。

変したmultiplex PCRにより検出した４）。

我々は黄色ブドウ球菌食中毒の原因毒素である

2.3

鶏培養細胞内におけるSEの動態

ブドウ球菌エンテロトキシン（SE）が鶏由来培

鶏由来マクロファージ細胞株HD11細胞を用い養細胞株に空胞の形成および炎症サイトカインのて細胞内におけるSEの解析を行った。ブドウ球産生を誘導することを見出した。SEによる鶏へ菌エンテロトキシンA（SEA）の免疫蛍光染色はの病原性は報告されておらず，本毒素が鶏におけHD11細胞を１×10５cells/mlにSEAを10µg/mlにるブドウ球菌感染症の成立および病態形成に関与なるように添加し，各時間培養後，免疫蛍光染色

する可能性が示された。本研究では，鶏におけるに使用した。固定は10％ホルムアルデヒド（関東ブドウ球菌感染症の病態解析を目的とし，鶏にお化 学 株 式 会 社）浸 透 処 理 は 0.1 ％

ける黄色ブドウ球菌およびメチシリン耐性菌の保（ナカライテスク）加PBSで行った後，２％正常有状況を調査し，分離された黄色ブドウ球菌の保ロバ血清でブロッキングした。１次抗体として抗有遺伝子を解析する。さらにSEの解析をin vitro

SEA抗体，抗初期エンドソーム抗原１（EEA１）

およびin vivoで行い，ブドウ球菌感染の成立お抗体（BD Biosciences）を用い，室温で１時間振よび増悪に重要な因子を明らかにする。

盪 し ， 反 応 さ せ た 。 ２ 次 抗 体 と し て Alexa

２．方
2.1

TritonX-100

FluorTM 488標識抗ウサギIgG抗体，Alexa FluorTM

法

594標識抗マウスIgG抗体（Invitrogen）を用いブドウ球菌の分離た。また，SEAと小胞体を２重染色するために，

食鳥処理場において一月当たり60～100羽，計

２ 次 抗 体 反 応 後 ， Concanavalin A Conjugates

500羽の鶏から菌を採取した。同一の鶏の体表３（Invitrogen）を反応させた。核の染色はDAPI

カ所（頭部，翼下および脚部）を滅菌した綿棒でsolution（同 仁 化 学 研 究 所）を 用 い た 。さ ら に拭い卵黄加マンニット食塩培地（栄研化学）に塗HD11 細 胞 に SEA を 添 加 後 ，cell counting kit-8

抹した。また一部の試料はセフォキシチンを加え（同仁化学研究所）を用いて細胞増殖を測定した。

た卵黄加マンニット食塩培地に塗抹した。37℃で

2 . 4 SEAに結合するHD11細胞タンパク質の24～48時間培養し，周辺の培地の黄変および卵黄反応が認められたコロニーをS. aureusと推定し
た。
2.2

探索
HD11細胞に２×Sample bufferを加え，細胞溶解液を作製し，Far Western blottingを行った。

ブドウ球菌種の同定とSE遺伝子の検出

SDS-PAGEを行い，HD11細胞溶解液を泳動後，

S. aureusと推定された分離株をコアグラーゼ

PVDFメンブレンへの転写と５％スキムミルクに試験に供した。ウサギプラズマ（栄研化学）を用

よるブロッキングを行った。SEAと，コントロー© The Ito Foundation

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析

273

ルとしてBSAを用い，それぞれ８µg/mlで４℃，浸漬して固定後，定法に従いパラフィン包埋およ

一晩振盪した。洗浄後，ウサギ抗SEA抗体１µg/

び HE 染 色 を 行 っ た 。ま た ，採 取 し た 皮 膚 を

mlをメンブレンの上に載せ，室温で１時間振盪

RNAiso（タカラバイオ）に浸漬後，－80で保存した。洗浄後，HRP標識抗ウサギIgG抗体（Bio-

した。説明書に従いRNAの抽出を行い，総RNARad）をPBS-Tで2,0000倍希釈し，室温で１時間を 回 収 し た 。 こ の RNA を ReverTra Ace

遮光しながら反応させた。化学発光シグナルの検（TOYOBO）を用いて逆転写し，THUNDERBIRD

出 は Clarity Western ECL Substrate （Bio-Rad）SYBR qPCR（TOYOBO）により増幅反応を行っを用いた。

た。プライマーはBerndtらの方法に従った５）。

2.5

質量分析

SDS-PAGEを行い，HD11細胞溶解液を泳動後，
Far Western Blottingで検出されたバンドと同じ

３．結果と考察3 . 1 鶏におけるLA-MRSAの調査とその病原

サイズのバンドを切り出した。切り出したゲルは遺伝子の探索株式会社日本プロテオミクスに質量分析を依頼

500羽の鶏の各部位から菌を分離・培養したとし，nano LC-MS/MSによりタンパク質の同定をころ，S. aureusの陽性率はそれぞれ頭部22.6％

行った。

（113/500），翼 下 30.4 ％（154/500），脚 部 65.2 ％2.6（326/500）であった（Table１）。脚部から高頻度

鶏へのSEAの接種と炎症の解析

養鶏場より８～10週齢のブロイラーおよびレイでS. aureusが分離されたがこれらの株は多くがヤーを購入し，背部の羽毛を除去後，皮内にSEA

SE遺伝子を保有していなかった（Table２）。一

お よ び コ ン ト ロ ー ル と し て PBS を 接 種 し た 。

方，頭部と翼下から分離されたS. aureusの70％

12,24,48時間後に皮膚を切除し形態学および免疫以上がSE遺伝子を保有していた（Table２）。以上

学的解析に供した。採取した皮膚を４％PFAにの結果から頭部および翼下から分離された菌株はTable 1 Prevalence of Staphylococcus aureus in Japanese chicken
Number of S. aureusharboring chickens（n＝500）（％）

mecA-positive S. aureus

113
154
326

22.6
30.4
65.2

0
0
0

Head
Wing
Leg

Table 2 SE gene types of S. aureus derived from chicken
SE gene types

Head（％）
ｎ＝77

Wing（％）ｎ＝84

Leg（％）
ｎ＝223

sed, seh, serseg, seI, sem, sen, seosed, ser, sey
sebseh, sersed, serseh
sec
no SE gene31（40.3）
19（24.7）6（7.8）
2（2.6）
0（0）
0（0）
0（0）
0（0）
19（24.7）

34（40.5）
17（20.2）
3（3.6）
2（2.4）
2（2.4）
1（1.2）
1（1.2）0（0）24（28.6）

41（18.4）9（4.0）
3（1.3）
4（1.8）
0（0）
0（0）
0（0）
2（0.9）
164（73.5）© The Ito Foundation

274

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

脚部の主要な菌株と異なる系統であることが示唆に存在する。本mecA陽性コアグラーゼ陰性菌がされる。またSE遺伝子の検出によりヒト・家畜

鶏飼育環境中において蔓延していることは，鶏に由来S. aureusで高頻度に見られるegc SEs（EG，

付着しているS. aureusにSCCmecが水平伝播しSEI，SEM，SEN，SEO）よりも，食中毒やアレ

MRSAへとなる可能性を提示するため，今後さらルギーに関与し産生量が多いSE遺伝子（SEB，なる解析が必要である。

SED，SEH，SER，SEY）が多数検出され鶏特有

3.2の毒素パターンをもつS. aureusにより疾病が起

免 疫 蛍 光 染 色 に よ っ て ，SEA 添 加 後 ５ 分 でこる可能性が示唆された（Table２）。今回MRSA

HD11細胞への結合が観察された。30分以降ではは検出されなかったが，興味深いことにmecAを細胞質内に取り込まれており，その後も経時的観保持するコアグラーゼ陰性のブドウ球菌が多数検察を行ったところ空胞が形成される24時間でも細出された。mecAは可動性遺伝子であるSCCmec

胞質内にSEAのシグナルが観察された（Fig.１）。

ブドウ球菌毒素によるin vitroでの病原性

Fig. 1 SEA translocates in HD11 cells.

Immunofluorescence analysis showed SEA signals are detected in HD11

cells during 30 min to 24 h after SEA inoculation.

© The Ito Foundation

BF：Bright field鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析

Ａ

Ｂ

Fig. 2 Immunostaining exhibits colocalization of SEA and organelles.

Ａ：SEA signals co-localized in early endosome（EEA1）at 30 to 60 min after SEA inoculation.

Ｂ：SEA co-localized in endoplasmic reticulum at 3 to 6 hour after SEA inoculation.
125
120

24 h

＊

Cell proliferation (%)

115

＊

＊

＊

110
105
100
140

120

48 h

＊
＊

＊

＊

100

80

RPMI 1

3

10

30

1

3

SEA

10

30

（µg/ml）

BSA＊

p<0.05 vs. RPMI

Fig. 3 SEA induced HD11 cell proliferation.

HD11 cells were incubated with SEA or bovine serum albumin（BSA）. SEA

significantly induced HD11 cell proliferation. BSA was used as negative control.

© The Ito Foundation

275

276

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

続いて初期エンドソームとの２重染色によって，認したところ，BSAを添加した細胞と比較してSEAは30分から90分で初期エンドソームに局在

SEAを添加した細胞では有意な細胞増殖が確認している像が観察された（Fig. 2A）。さらに小胞された（Fig.３）。さらにSEAに結合するHD11細体との２重染色では，90分から一部SEAのシグ

胞 タ ン パ ク 質 の 探 索 を 行 っ た 。Far Western

ナルが小胞体に重なり，３時間から６時間でSEA

blottingで検出されたバンドをSDS-PAGEを行っと小胞体の顕著な共局在が見られた（Fig. 2B）。

たゲルから切り出し，質量分析を行ったところ

以上の結果から，毒素は細胞内に取り込まれた

SEAに結合するHD11細胞タンパク質の候補とし後，エンドソームから小胞体へと移行することがて鶏のピルビン酸キナーゼ（PK）が浮上した。

示唆された。次にHD11細胞の増殖への影響を確

ウサギ抗PK抗体を用いてWestern blottingを行

A

PBS

SEA

B

*

RQ

80

200

60

150

40

100

20

50

0

PBS

SEA 25

C

0

24 h

*

100
80

48 h

*

60
40
20
PBS

SEA 250

PBS

SEA 25

48 h

*

PBS

SEA 25CXCLi2 (IL‒8 like)
15

12 h

*

10

RQ

IFN‒γ

8

24 h

*

100

2
PBS

SEA 25

250
150

4
0

300
200

6

5
0

10

50
PBS

SEA 250Fig. 4 Effect of SEA intradermal injection in chickens.

A：HE staining shows SEA injection induced infiltration of lymphocytes, heterophils

and eosinophils. B, C：SEA injection induced significant increase of interferon-γ（IFN-γ）and CXCLi2. RQ：relative quantification，＊p＜0.05© The Ito Foundation

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析

277

い，上記のSEA結合タンパク質とPKが同じ分子

またその保有するSE遺伝子型は従来知られてき量のバンドであることを確認した。SEA添加にたものと異なるパターンであった。MRSAは検出

よりHD11細胞が増殖すること（Fig.３）およびされなかった一方で，メチシリン耐性コアグラー

PKが２量体を形成すると細胞増殖が促進される

ゼ陰性ブドウ球菌が多数検出され，我が国の鶏特ことから ，現在SEAが細胞内で相互作用する重有 の ブ ド ウ 球 菌 系 統 の 存 在 が 示 唆 さ れ た 。in

要な分子としてPKの解析を進めている。

vitroおよびin vivoにおける研究により，SEsが鶏６）

3 . 3 黄色ブドウ球菌由来物質による鶏への病に対して炎症反応を惹起し，特にアレルギー関連
細胞の反応も見られたことから鶏ブドウ球菌感染

原性
鶏のS. aureus感染症におけるSEsの関与を明らかにするため，SEAを鶏に投与し，SEsの鶏にお症における劇的な症状の解明への端緒が見出された。

ける病原性への関与を検討した。皮内にSEAを投与した組織のHE染色像では，皮内，皮下ともに偽好酸球の出現が確認され炎症が惹起されたことが示された（Fig. 4A）。また皮内には赤血球が確認され，出血が引き起こされたことが示唆された。さらに好酸球および好塩基球の出現が認められ，アレルギー様の反応が起きていることが示唆された。一方，陰性対照としてPBSを投与した皮膚ではこれらの変化は確認されなかった（Fig.
4A）。次に炎症性サイトカインおよびケモカインの発現を定量的PCRで測定した。SEA投与12から48時間後でIFN-γ，CXCLi２およびIL-６で発現の上昇が見られた（Fig. 4Bおよび4C）。以上の結果から，SEAは単体で鶏の皮膚組織において炎症を誘導し，鶏のS. aureus感染症における病態形成への関与が示唆された。
４．要

約

本研究では我が国の家禽におけるブドウ球菌感
染の実態を調査し，鶏における黄色ブドウ球菌感染症の解明を目的とした。食鳥処理場で鶏500羽
からブドウ球菌の分離を試みたところ，頭部，翼下および脚部からそれぞれ22.6％，30.4％および65.2％と高頻度に黄色ブドウ球菌が分離された。

文献１） Lekkerkerk, W. S., van Wamel, W. J., Snijders, S.
V., Willems, R. J., van Duijkeren, E., Broens, E. M.,
Wagenaar, J. A., Lindsay, J. A., Vos, M. C.：What Is
the Origin of Livestock-Associated MethicillinResistant Staphylococcus aureus Clonal Complex 398
Isolates from Humans without Livestock Contact?
An Epidemiological and Genetic Analysis, J. Clin.
Microbiol，53，1836～1841．2015．
２） Tang, Y., Larsen, J., Kjeldgaard, J., Andersen, P. S.,
Skov, R., Ingmer, H.：Methicillin-resistant andsusceptible Staphylococcus aureus from retail meatin Denmark, Int. J Food Microbiol ，249 ，72 ～ 79 ，
2017．
３） Chrobak, D., Kizerwetter-Świda, M., Rzewuska,
M., Moodley, A., Guardabassi, L., Binek, M.：
Molecular characterization of Staphylococcus
pseudintermedius strains isolated from clinicalsamples of animal origin, Folia Microbiologica，56，
415～422，2011．
４） Omoe, K., Hu, D-L., Takahashi-Omoe, H., Nakane,A., Shinagawa, K.：Comprehensive analysis ofclassical and newly described staphylococcal
superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus
isolates, FEMS Microbiol. Lett，246，191～198，2005.
５） Berndt, A., Wilhelm, A., Jugert, C., Pieper, J.,
Sachse, K., Methner, U.：Chicken Cecum Immune
Response to Salmonella enterica Serovars ofDifferent Levels of Invasivenessm, Infect. Immun, 75，
5993～6007，2007．
６） Gao, X., Wang, H., Yang, J. J., Liu, X., Liu, Z-R.：
Pyruvate Kinase M2 Regulates Gene Transcription
by Acting as a Protein Kinase, Mol. Cell，45，598～
609，2012．

© The Ito Foundation

278

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析
Comprehensive analysis of the behavior of Campylobacter and coexistentbacteria in chicken food chain

黒木

香澄・竹下

奈知子・吾郷良輔・渡辺

孝康＊・関崎勉（東京大学大学院農学生命科学研究科食の安全研究センター， 現所属：日本大学歯学部基礎自然科学分野（化学））＊Kasumi Kuroki, Nachiko Takeshita, Ryosuke Ago, Takayasu Watanabe＊ and Tsutomu Sekizaki（Research Center for Food Safety, Graduate School of Agricultural Life Science, The University of Tokyo，＊present affiliation：Department of Chemistry, Nihon University School of Dentistry）

Campylobacteriosis is a serious bacterial food-borne disease mainly caused byCampylobacter jejuni and C. coli. The colonization of Campylobacter in the chicken intestine
occurs on broiler farms and that induces the bacterial contamination to chicken meats
throughout the food chain from farm to fork. Also, it is known that the contaminatedCampylobacter can survive on the chicken meat, despite the fact that they are microaerophilic
bacteria which cannot live long under the atmospheric oxygen tension. Other studies suggested
that coexisting bacteria would help Campylobacter to survive for long periods outside the host.
In this study, we observed the bacterial population structure and dynamics in chicken meats tounderstand the relationship between Campylobacter and other bacteria in the retail shops using
16S rRNA gene-based metagenomic analysis, in addition to the investigation of contamination
rates of Campylobacter in chicken meats. A total of 40 packed chicken products were tested bynested PCR combined with an enrichment culture, with 75％ of the products found to be
Campylobacter-positive. As a result of 16S rRNA gene-based metagenomic analysis, it was
shown that the abundance ratio of Pseudomonas was more than 30％，suggesting that thechicken meat was the favorable environment for Campylobacter because Pseudomonas would
help the survival of Campylobacter under the aerobic conditions. Furthermore, some bacteria
existing in chicken intestines such as Ruminococcus and Helicobacter were detected from
Campylobacter-positive meats, but the contamination of 23 bacterial taxa were predicted to be
derived from other sources except broiler chickens. In addition, principal coordinate analysis
showed that the bacterial composition of chicken meat was similar among samples in eachretail store regardless of the presence or absence of Campylobacter. These results suggest thatcross-contamination occurred in not only slaughterhouses but also retail stores and otherplaces. The microbiota in retail stores are complicated by the cross-contamination in various
stages of the food chain, and the prevention of cross-contamination in retail stores may lead to
improvement of control strategies against Campylobacter.

© The Ito Foundation

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析

１．目

279

生理食塩水を試料として収集した。ストマッカー

的を使用せず，手で鶏肉を揉んだ理由としては，機

カンピロバクター食中毒は日本での発生件数が械操作による本菌の死滅があげられる。収集した最多の細菌性食中毒で，同菌に汚染された鶏肉を試料は5000×ｇで５分間遠心した後，上清を捨摂 食 す る こ と で 発 症 す る 。主 な 原 因 細 菌 はて，沈渣を含む５mlの試料を以降の実験（2 . 3

Campylobacter jejuni と Campylobacter coli で あ増菌培養と2 . 4

り，養鶏場で鶏腸管内に定着し，食肉処理場で鶏使用した。

肉に付着することが知られている。

16S rRNAメタゲノム解析）に

2 . 3 増菌培養とnested PCR法によるカンピロ

１，２）

本菌に汚染された鶏肉が消費者に喫食されるまバクター遺伝子の検出での数日間，本菌は微好気性細菌であるにもかかBolton培地（Oxoid）が10ml入った３本の試験

わらず，大気中の鶏肉表面上で生き続け，食中毒

管に2.2で調製した試料を１mlずつ分注し，アネを引き起こしている。培養実験を用いた調査によ

ロパック・微好気（三菱ガス化学）と角型ジャーり，本菌とPseudomonasを共培養することで，（三菱ガス化学）による微好気条件の下42℃で48

本菌の大気中での生存期間が延びることが示され時間培養した。培地を遠心後に得られた沈殿物をており３），鶏肉上での本菌の生存にも他の細菌が滅菌生理食塩水で洗浄後，フェノール・クロロホ

影響を与えている可能性がある。これまでにも本

ルム抽出法を用いてDNAを抽出し，C. jejuniま

菌の動態を食肉加工場などで調べた報告がある

たはC. coliの遺伝子が存在するかをnested PCRが，そのいずれも本菌のみを調べた報告であるた

法４）で確認した。プライマー配列とPCR条件は以め，他の細菌種と本菌の鶏肉上での関係性はいま前の報告に従った４）。Nested PCRの結果，３本だ不明である。そこで本研究は16S rRNA遺伝子の試験管中１本でも陽性であれば，元の鶏肉はカを標的としたメタゲノム解析を行うことで鶏肉上

ンピロバクターに汚染されていると判定した。

の細菌叢とカンピロバクターの関係性における基2.4

礎的知見を得ることを目的とした。

2 . 2で調整した試料のうち200µlをDNAの分解

２．方
2.1

16S rRNAメタゲノム解析

抑制作用のある溶液RNAlater Stabilizing Solution

法（Thermo Fisher Scientific）１ ml 中 に 入 れ ，

実験材料

DNA抽出を行うまで－20℃の冷凍庫に保管した。

東京都の小売店４店舗（A，B，C，D）で鶏肉試料を滅菌生理食塩水で洗浄後，PowerBiofilmⓇを10パックずつ購入し用いた。部位はムネ（ｎ＝DNA Isolation Kit（QIAGEN）を用いてDNAを

12），モモ（ｎ＝18），ささみ（ｎ＝５），レバー抽出した。ただし，細胞破砕に利用するビーズを（ｎ＝３），レバーとハツが同封されているもの

より破砕力の強いジルコニアビーズ（Toray）に（ｎ＝２）の５種類とした。

換 え ， 破 砕 力 の 強 い Beads Crusher µT-12

2.2

試料調整

（TAITEC）を用いて作業を行うことで，DNAの購入した鶏肉を125ｇ量り取り，ストマッカー

抽出効率を高めた。

袋に移した。ただし，125ｇに満たない鶏肉は全抽出したDNAにおける16S rRNA遺伝子のＶ３量を用いた。ストマッカー袋に滅菌生理食塩水を－Ｖ４領域を，PCR法で増幅し，高速シーケン

100ml入れ，袋越しに手で鶏肉を30秒揉んだ後のサーMiSeq（Illumina）を用いて塩基配列を決定© The Ito Foundation

280

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

した。決定した塩基配列は16S rRNAメタゲノム

告されたが９），本研究ではそれを上回る成績を得

解析用のパイプラインIM-TORNADO ５）を用いた。また，レバーの汚染率も過去の報告より高た処理に供した。また，各試料に存在する構成細く10），これらの汚染率の違いは鶏肉の汚染状況に菌やその比率，試料間の関連性などを，ソフトウェ

加えて，検査・検出方法の違いも反映されている

アQuantitative Insights Into Microbial Ecology

ことが考えられた。本菌は数百個程度の少ない菌（QIIME） およびＲ言語

を用いて精査した。

量でも食中毒を引き起こすため，高感度の検出方

統計学的処理として，データの正規性をＲ言語を法の選択が重要だと考えられる。本研究で用いた用いてShapiro-Wilk検定で判断した。データが正増菌培養法とnested PCR法を組み合わせた方法

規分布に従っていた場合は，等分散性をＦ検定あは感度，特異度ともに優れているため，過去の報

るいはBartlett検定で判断した。

告よりも高い検出率が得られたと考えられる。

６）７）3 . 2 16S rRNAメタゲノム解析による鶏肉中３．結果と考察
3.1の構成細菌の同定

市販鶏肉からのカンピロバクター検出率

3.2.1

主要な構成細菌

鶏肉中のカンピロバクターをnested PCRで検収集した試料の構成細菌（属レベル）およびそ出したところ，C. jejuni陽性検体の方がC. coli陽の比率を平均化した値を棒グラフで示した（Fig.

性検体よりも多かったが，レバーにおいてはすべ

１）。ささみ，モモ，ムネの主要な構成細菌はての検体でC. jejuniとC. coliの両方が確認された。

Pseudomonas, Acinetobacter, Jathinobacterium でカンピロバクター陽性率は75％と高く（30/40検あり，この３菌属だけで全体の約60％を占めてい体），特に内臓肉は100％汚染されていた（5/5検た。Pseudomonasだけで50％以上の存在率を占体）（Table１）。

める検体も存在しており，Pseudomonasが食肉

平成26年度に厚生労働省で実施された「と畜・の最も主要な構成細菌であることが明らかとなっ食鳥検査における疾病診断の標準化とカンピロバ

た。Pseudomonas属菌の存在がカンピロバクター

クター等の制御に関する研究」ではモモ肉の汚染の大気中における生存を助長しているとの報告が率が42％，ムネ肉の汚染率が40％という成績が報あるため３），鶏肉は本菌の生存に有利な環境であTable 1 Percentages of Campylobacter-positive chicken products in retail stores.
Percent positive（No. positive/Total）
Part

TenderStore AStore BStore CStore DTotal

C. jejuni C. coli

C. jejuni C. coli

C. jejuni C. coli

C. jejuni C. coli

C. jejuni C. coli Campylobacter spp.

60％0％（3/5） （0/5）60％
0％（3/5） （0/5）

60％
（3/5）

―

―

―

―

―

―

Thigh

71.4％
0％
（5/7） （0/3）60％
20％（3/5） （1/5）100％0％（6/6） （0/6）

―

―

77.8％
7.2％
（14/18）（1/14）

77.8％（14/18）

Breast100％0％（3/3） （0/3）0％60％（0/5） （3/5）50％0％（2/4） （0/4）

―

―

41.7％
25％
（5/12） （3/12）

66.7％（8/12）

Liver

―

―

―

―

―

―

100％
100％
（3/3） （3/3）

100％
100％
（3/3） （3/3）

100％
（3/3）

Liver & heart

―

―

―

―

―

―

100％
0％
（2/2） （0/2）100％0％（2/2） （0/2）

100％
（2/2）

© The Ito Foundation

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析

281

TenderThighBreastLiver
Liver & heart

Relative abundance (%)
Acinetobacter (3)Janthinobacterium (4)Lachnospiraceae (6)Staphylococcus (7)Brochothrix (8)Lactobacillus (10)Bacteria＊(11)Shewanella (12)Pseudomonas (1)Lactococcus (2)Aeromonas (5)Ruminococcaceae＊(9)＊Fig. 1 The bacterial composition in chicken meatsat the genus level.

Twelve bacterial genera are shown asthe predominanttaxa（＞5％）．＊These taxa were unclassifiable at the genus
level.

Store B

: Store B (Campylobacter-negative chicken): Store B (Campylobacter-positive chicken)

Store C0.0

0.1

: Store C (Campylobacter-negative chicken): Store C (Campylobacter-positive chicken)

95 % confidence ellipse

‒0.2

‒0.1

pc2 (12.4％)

0.2

0.3

: Store A (Campylobacter-negative chicken): Store A (Campylobacter-positive chicken)

Store A
‒0.3

‒0.2

‒0.1

0.0

0.1

0.2

pc3 (9.7％)

Fig. 2 Principal coordinate analysis（PCoA）showing the similarity of chicken samples ineach store.

PCoA was performed by R using UniFrac distance calculated by QIIME. Each sample is plotted by a symbol,which

is open for Campylobacter-negative and filledfor Campylobacter-positive.

ることが示唆された。一方，レバーとレバー・ハ

3.2.2

ツが同封されていた検体ではPseudomonasの平モモ肉とムネ肉の検体において，UniFrac距離

均存在率がそれぞれ１％，５％と，精肉に比べてを用いた主座標分析を行った成績をFig.２に示し低かった。また，レバーとレバー・ハツが同封さた。解析の結果，汚染・非汚染試料を示す点の距れていた検体の構成細菌は異なっており，同じ内離が近かったことから，両者の構成細菌に大きな臓肉でもハツの存在の有無で構成細菌に違いが生差はないことが示された（Fig.２）。また，各試じることが明らかとなった。

料は店舗ごとにクラスターを形成していたことか© The Ito Foundation

主座標分析

282

a.

b.

平成29年度Campylobacter‒negative chicken

Campylobacter‒
positive chicken

2

49

246

Bacteria detected only
from Campylobacter‒
positive chicken

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

ThighStore AStore B

BreastStore CStore AStore BStore C

: Chicken withthe bacterium: Chicken without
the bacterium

Helicobacter
Cryomorphaceae＊
Acidaminococcaceae＊
Butyricimonas
Megamonas

Fig. 3 Comparison of the bacterial composition between Campylobacter-negative and-positive chickens.

a） The Venn diagram shows the number of bacteria at the genus level. Campylobacter are included in 49 bacteria

detected only in Campylobacter-positive chicken. b） Five representative bacteria detected only in Campylobacterpositive chicken are shown. Each column represents a chicken sample.

ら（Fig.２），店舗内で交差汚染が起きている可いる細菌が２種類だったのに対し，汚染肉にのみ能性が示された。カンピロバクターの鶏肉への汚存在していた細菌は40種類以上確認されたことか

染は食肉処理場で起きることが過去に示されていら（Fig. 3a），カンピロバクターは加工処理過程

るが１，２），本成績から店舗内での交差汚染も鶏肉で汚染の伝播を意識しない扱い方によって汚染がの汚染率を上昇させている可能性が考えられた。

増大するものと考えられた。また，店舗間で汚染

3 . 2 . 3 カンピロバクター汚染肉と非汚染肉の肉にのみ存在している細菌の種類が異なっていたことから（Fig. 3b），食肉処理場由来の汚染だけ

構成細菌比較
汚染および非汚染肉に特有な構成細菌を調査したところ，非汚染肉にのみ存在している２種類の細菌属と汚染肉にのみ存在している49種類の細菌ではなく，店舗内でも本菌の汚染が起きる可能性について今後詳細に調べる必要がある。
3 . 2 . 4 Linear discriminant analysis（LDA）

属が確認された（Fig. 3a）。49種類の細菌のうち

effect size（LEfSe）解析

19種類の細菌（Ruminococcus，Helicobacterなど）

カンピロバクターに汚染されていた，あるいはは我々の過去の調査で鶏盲腸便および糞便でも確汚染されていなかったモモ肉とムネ肉に特徴的な認されていたことから，食肉処理場での処理過程

細菌を明らかにするためにLEfSe解析８）を行った

で便を介して鶏肉上に付着したと考えられた。ま結果，汚染肉に特徴的な14種類の細菌と，非汚染

た，盲腸便と糞便では認められなかった30種類の肉に特徴的な１種類の細菌が確認された（Fig.

細菌のうち，７種類は内臓肉からも検出されたた

４）。また，本解析で汚染肉に特徴的な細菌としめ，これらは内臓肉からの汚染が疑われた。一方，て確認された14種類の細菌のうち13種類の細菌は残りの23種類の細菌は鶏由来ではなく，食肉処理

我々の過去の調査で鶏盲腸便および糞便でも確認

場や小売店での運搬や作業の工程で付着した細菌

さ れ て い た 。一 方 ，非 汚 染 肉 に 特 徴 的 だ っ たの可能性が考えられた。非汚染肉にのみ存在してJanthinobacteriumは鶏盲腸便および糞便中に存© The Ito Foundation

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析

283

Staphylococcus
Kocuria
Lysobacter: Campylobacter-positive chicken enriched bacteria: Campylobacter-negative chicken enriched bacteria

Clostridium_XlVa
Tessaracoccus: Bacteria also detected in cecal feces of broilers

Erysipelotrichaceae*
Gordonia
Dietzia
Clostridium_XlVb
Helicobacter
Arthrobacter
Microbacterium
Lactobacillus
Firmicutes*
Janthinobacterium
6

4

2

0

2

4

6

LDA score (log10)
Fig. 4 Linear discriminant analysis（LDA）effect size（LEfSe）identified the most differentially abundant bacteria at

the genus level between Campylobacter-positive and-negative chicken（LDA score > 3, p＜0.05）．

C ampylobacter-positive chicken-enriched bacteria are indicated with black bars, and bacteria enriched inCampylobacter-negative chicken are represented with gray bars. Underlined bacteria were identified in cecal fecesof broilers in another study of us. ＊These taxa were unclassifiable at the genus level

在せず，非汚染肉でのみ確認された細菌とも一致ることが示唆された。またHelicobacterのようにしなかった。

鶏腸管内から本菌と挙動をともにしている細菌が汚染肉に特徴的な14種類の細菌のうち，汚染肉

複数確認された一方，鶏由来ではないと予想されのみに存在する細菌はHelicobacterのみだった。

る細菌も本菌と挙動をともにしていたことから，したがって，Helicobacterは食肉処理場でカンピ

フードチェーンにおける本菌の動態は複雑であ

ロバクターとともに盲腸便や糞便を介して鶏肉にり，様々な作業工程で鶏肉への汚染が起きる可能

付着し，その後，店舗内での交差汚染時にもカン性が示された。さらに，鶏肉のカンピロバクター

ピロバクターと挙動をともにしている可能性が示

汚染は食肉処理場だけではなく，小売店内でも起された。

こることが示唆されたため，小売店内での交差汚４．要染を防ぐことで本菌の汚染率減少に繋がる可能性約が示された。

増菌培養とnested PCR法を組み合わせて鶏肉のカンピロバクター汚染率を調査した結果，75％の鶏肉に汚染が認められた。また，16S rRNAメ
タゲノム解析により，鶏肉上にはカンピロバク
ターが大気中で生存するのを助長することが示されているPseudomonasが多く存在することが明らかとなり，鶏肉は本菌の生存に有利な環境であ文献１） García-Sánchez, L., Melero, B., Jaime, I.,
Hänninen, M. L., Rossi, M., Rovira, J.：Campylobacter
jejuni survival in a poultry processing plant
environment, Food microbiology ， 65 ， 185 ～ 192 ，
2017．
２） Sasaki, Y., Maruyama, N., Zou, B., Haruna, M.,
Kusukawa, M., Murakami, M., Yamada, Y.：© The Ito Foundation

284

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Campylobacter cross-contamination of chicken
products at an abattoir, Zoonoses and public health，
60，134～140，2013．
３） Hilbert, F., Scherwitzel, M., Paulsen, P., Szostak,
M. P.：Survival of Campylobacter jejuni under
Conditions of Atmospheric Oxygen Tension with
the Support of Pseudomonas spp, Applied andenvironmental microbiology，76，5911～5917，2010.
４） Inglis, G. D., Kalischuk, L. D.：Use of PCR for
direct detection of Campylobacter species in bovine
feces, Applied and environmental microbiology, 69，
3435～3447，2003．
５） Jeraldo, P., Kalari, K., Chen, X., Bhavsar, J.,
Mangalam, A., White, B., Nelson, H., Kocher, J., Chia,
N. ： IM-TORNADO ： a tool for comparison of 16S
reads from paired-end libraries, PLoS One, 9,e114804，2014．
６） Caporaso, J. G., Kuczynski, J., Stombaugh, J.,
Bittinger, K., Bushman, F. D., Costello, E. K., Fierer,N., Pena, A. G., Goodrich, J. K., Gordon, J. I., Huttley,
G. A., Kelley, S. T., Knights, D., Koenig, J. E., Ley, R.

E., Lozupone, C. A., Donald, D. M., Muegge, B. D.,
Pirrung, M., Reeder, J., Sevinsky, J. R., Turnbaugh, P.
J., Walters, W. A., Widmann, J., Yatsunenko, T.,
Zaneveld, J., Knight, R.：QIIME allows analysis ofhigh-throughput community sequencing data,
Nature methods，7，335～336，2010．
７） Ihaka, R., Gentleman, R.：R：a language for data
analysis and graphics, Journal of computational andgraphical statistics，5，299～314，1996．
８） Segata, N., Izard, J., Waldron, L., Gevers, D.,
Miropolsky, L., Garrett, W. S., Huttenhower, C.：
Metagenomic biomarker discovery and explanation,
Genome biology, 12，R60，2011．
９） 厚 生 労 働 科 学 研 究（食 品 安 全 確 保 推 進 研 究 事業）：と畜・食鳥検査における疾病診断の標準化とカ
ンピロバクター等の制御に関する研究平成26年度報
告10） Noormohamed, A., Fakhr, M. K.：Incidence andantimicrobial resistance profiling of Campylobacterin retail chicken livers and gizzards, Foodborne
pathogens and disease，9，617～624，2012．

© The Ito Foundation

285

野生動物が保菌する腸管出血性大腸菌の特徴解析とリスク評価
Characterization and risk evaluation of enterohemorrhagic Escherichia coli
isolated from wild animals

井

口

純

（宮崎大学農学部）

Atsushi Iguchi（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Enterohemorrhagic Escherichia coli（EHEC）is one of the most important groups of foodborne pathogens, because it can cause gastroenteritis that may be complicated by hemorrhagic
colitis or hemolytic-uremic syndrome（HUS）. Although cattle is considered to be a major
reservoir and an important source of EHEC infections in humans, wild deer also carried EHEC,
which may be involved in human infections. In Japan, the number of sika deer（Cervus nippon）
has increased and their habitat has expanded during the last two decades, and opportunities to
eat deer meat have also increased. However, the pathogenicity of deer EHEC strains forhumans remains to be elucidated. Here, we examined the potential pathogenicity of EHEC
carried by wild deer in Japan. The screening by the PCR revealed that 30.6 ％ of wild deerfeces（56/183）which were collected in Miyazaki, Ohita and Hyogo prefectures were positive
with EHEC. Most EHEC isolates from deer belonged to an O146 serogroup, and furthermore
they were classified into two subtypes O146：H21 and O146：H28. Phylogenetic analysis basedon the sequences of seven housekeeping genes demonstrated that the O146：H21 and theO146：H28 strains formed two distinct groups. Additionally it was revealed that EHEC O146
strains isolated from human were closely related to deer EHEC O146：H21 or O146：H28,
suggesting that the EHEC O146 which are shedding from deer has caused the infection tohumans. Good sanitary conditions should be used for deer meat processing to avoid EHEC
contamination, because EHEC is prevalent in deer and deer may be a potential source of EHEC
causing human infections.

１．目

者および家畜牛から分離されるEHECと比較して的共通点と相違点を明らかすることで，「野生動物本研究では，野生動物から分離される腸管出血

由来EHECのリスク評価」や「安全な野生鳥獣肉性大腸菌（EHEC；enterohemorrhagic Escherichia（ジビエ）の提供」に資するための基盤情報を得coli）の血清型，進化系統，保有病原因子などのることを目的としている。

特徴を明らかに，さらにそれら分離株を，ヒト患

EHECは下痢症や出血性大腸炎を引き起こし，© The Ito Foundation

286

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

患者の一部は溶血性尿毒症症候群や脳症を併発しや，そのジビエがヨーロッパでは伝統的な食材とて死に至ることから，最も注意が必要な食中毒原

して親しまれていることなどから，積極的な利活因 細 菌 の 一 つ に あ げ ら れ る 。わ が 国 に お け る

用の対象となった。しかし，野生のシカにはサル

EHECの感染者数は2009年以降毎年4,000件前後でモネラやEHEC，Ｅ型肝炎ウイルスや寄生虫など

推移しており，本菌による死亡者は2009年から

様々な病原体が潜んでおり，これまでにも生また2015年の間で49名にのぼっている（国立感染症研は加熱不十分なシカのジビエを喫食したことによ

究 所 報 告）。こ れ ま で の 調 査 ・ 研 究 な ど か らる感染事例が数多く報告されている１）。このよう

EHECの主な保菌宿主は家畜牛であると考えられな状況の中で，厚生労働省は2014年11月に解体方ており，家畜牛が保菌・排菌するEHECが食品や法や必要処置などを示した「野生鳥獣肉の衛生管

環境水などに汚染し，そこから直接または何かを理に関する指針」を通知した。しかし，国内の野介してヒトへと伝播していると考えられている。

生シカにおけるEHECの保菌実態に関する情報はそこでEHECの予防や低減などのために，畜産現少なく，ヒトへのリスクも不明な点が多い。野生場および畜産物が消費者へ流通するまでの複数箇

シカが保菌するEHECの種類や特徴，ヒト患者や所 で ，様 々 な 法 令 や ガ イ ド ラ イ ン に 基 づ い た

家畜牛から分離されるEHECとの関連性が明らか

EHEC対策が講じられている。2011年には富山県になれば，ジビエの処理・加工や消費において，等の焼肉チェーン店で提供された「牛ユッケ」がより具体的な衛生対策を立案・指導・啓発するこ

原因と考えられるEHECによる食中毒事件が発生とが可能となる。そこで我々は，野生のニホンシ

して５名が死亡した。この事件を受けて，食品衛カから分離されるEHECに注目し，その血清型や生法に基づく新たな規格基準（2011年10月には遺伝子型の特徴を明らかにするとともに，ヒト患「生食用牛肉の提供規制」，2012年７月には「牛生者などから分離されるEHECとの比較を行った。

レバーの提供禁止」）が定められた。しかし，この対策後も感染者数は減少しておらず，本菌の汚染源または感染経路の多様性が示唆された。

２．方
2.1

法

野生シカ糞便検体

近年，野生鳥獣の増加や生息域の拡大に伴う農2016年３月から2017年８月に宮崎県（141頭），

林業等被害が深刻化している。2014年に被害の防大分県（21頭），兵庫県（21頭）で捕獲された野止を主な目的として，従来の「鳥獣の保護及び狩生シカから採取した腸内容物（糞便）計183検体

猟の適正化に関する法律（鳥獣保護法）」が「鳥を用いた。

獣の保護及び管理並びに狩猟の適正化に関する法

2.2

律（鳥獣保護管理法）」に改正され，狩猟に伴うす べ て の PCR 反 応 に は KAPA Taq Extra

規制の一部が緩和された。さらに，国や地方自治

PCR法（KAPA BIOSYSTEMS）を用いた。

体から捕獲報奨金の交付や捕獲経費の補助などが志賀毒素１型遺伝子（stx1），志賀毒素２型遺始まった。一方で，これまで管理のために捕獲さ伝子（stx2），インチミン遺伝子（eae）の検出，れた野生鳥獣の多くは，埋没などにより廃棄され大腸菌の同定（E. coli-specific gyrB）にはTableていたが，それをジビエとして町おこしなどで利１で示すプライマーセットを用いた。

活用する動きが全国に広がった。特にシカについ

2.3ては，農作物被害の主要な原因害獣であること

EHECの保菌率を以下の方法で求めた。糞便© The Ito Foundation

EHECの検出と分離287

野生動物が保菌する腸管出血性大腸菌の特徴解析とリスク評価
Table 1 PCR primer sequences used in this study
Target

stx1
stx2
eae
gyrB

Product size

Sequence

gene

（bp）

LP30：CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG
LP31：CACCAGACAATGTAACCGCTG
LP43：ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG
LP44：GCGTCATCGTATACACAGGAGC
eae_univ_F：GACCCGGCACAAGCATAAGC
eae_univ_R：TCTCGCCAGTATTCGCCACC
Ecoli_gyrB_F：AGTGATCATGACCGTTCTGCA
Ecoli_gyrB_R：TTTGTCCATGTAGGCGTTCA

Reference

348

（2）

584

（2）

867

unpublished622

unpublished（２ｇ）を生理食塩水（４ml）に懸濁し，DHL寒株（2009から2016年にかけて，九州，四国，中国，

天平板培地（DHL寒天培地「ニッスイ」，日水製

近畿，東海，関東地方で分離）を用いた。PCR法薬）に一白金耳塗抹して37℃で18―24時間培養しで血清型を判定するとともに，stx1，stx2，eaeのた。生育した菌床を白金耳で掻き取って生理食塩保有を確認した。

水（300µl）に懸濁した。菌懸濁液からアルカリ

2.6

熱抽出法によりDNAを調整した後に，PCRによMultilocus sequence typing （MLST） に 用 いり stx1 と stx2 の 検 査 を 行 っ た （colony-sweep

ら れ る ７ つ の housekeeping 遺 伝 子 （adk ，

PCR）。さらにEHECの分離は以下の方法で行っ

fumC，gyrB，icd，mdh，purA，recA）の塩基た。colony-sweep PCRで陽性となった検体につ配列情報を用いて系統解析を行った。得られた配いて，上記検査で残しておいた菌懸濁液の段階希列を連結し（計3423bp），MEGA6.06ソフトによ釈液をDHL寒天平板培地に塗抹して37℃で18-24

るNeighbor-joining法で系統樹を作成した。さら時間培養して生育した単コロニーを１検体につきにWebツール（http://enterobase.warwick.ac.uk/

95コロニーから最大570コロニー釣菌してPCRに

species/ecoli/allele_st_search）を用いてsequenceよりstx1とstx2の検査を行った。EHEC（stx陽性

type（ST）の判定を行った５）。

株）についてはgyrBを標的としたPCRにより大腸菌であることを確認するとともに，eaeの検査
を行った。
2.4

系統解析

３．結果と考察
3.1

シカのEHEC保菌率

PCR法によるＯ：Ｈ血清型の判定

EHEC 保 菌 率 は ，stx1 単 独 が 0.5 ％（1/183），

Ｏ 群 お よ び Ｈ 型 の 遺 伝 子 型 判 定 は ，Wizard

stx2 単 独 が 26.2 ％（48/183），stx1 ＋ stx2 が 3.8 ％Genomic DNA Purification Kit（Promega）で 精（7/183）で，野生シカにおけるEHEC保菌率は少製したDNAを用いて，E. coli O-genotyping PCR

なくとも30.6％であることが確認された（Table

法２）。宮崎県だけでみると36.9％と他の地域より

３）

およびE. coli H-genotyping PCR法

４）

により

高いことから，野生シカのEHEC保菌率には地域

行った。
2.5

的な偏りがあるものと推察された。

ヒト由来EHEC O146株

東京食品技術研究所および国立感染症研究所から分与していただいたヒト由来EHEC O146計27

3.2

シカ由来EHECの特徴

EHEC陽性56検体のうち，36検体から195株の© The Ito Foundation

288

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 2 Prevalence of EHEC in deer
No. of positive samples with

No. of samples from which EHEC

screening PCR

could be isolated

Area

No. ofsamplesstx1 only

stx2 only

stx1＋stx2

stx1 only

stx2 only

stx1＋stx2

Miyazaki

141

1

44

7

1

28

5

Ohita

21

0

1

0

0

1

0

Hyogo

21

0

3

0

0

1

0

Total

183

1

48

7

1

30

5

EHECを分離した（Table２）。eaeの保有を確認し用いて系統解析を行った（Fig.１）。その結果，

た と こ ろ ，す べ て が 陰 性 で あ っ た 。血 清 型 は

Og146：Hg21（ST829，ST422）とOg146：Hg28

Og91：Hg14（１ 株），Og146：Hg21（163 株），（ST738）はそれぞれ異なる系統に属し，どちらOg146：Hg28（28株），Og148：Hg18（３株）のの系統群においてもシカ由来株とヒト由来株が近４種類が確認された。以上の結果から，Og146は縁な関係にあることが明らかとなった。以上の結シカが保菌するEHECの優勢Ｏ群であること，さ果から，野生のシカから排菌されたEHECがジビ

らにOg146の中でHg21とHg28に大きく分類されエや環境を介してヒトに感染している可能性が示ることが明らかとなった。これまでに報告のある

唆された。

野生シカ由来EHECのＯ群として，Kabeyaら

６）によるとＯ５，Ｏ７，Ｏ96，Ｏ130，Ｏ141，Ｏ

４．要約

146，Ｏ157，Ｏ166の８種類が，中村ら７）による

近年，ジビエとしての利用が進められている野とＯ11，Ｏ54，Ｏ84，Ｏ113，Ｏ146，Ｏ157の６

生シカを対象としたEHECの保菌調査を行い，そ種類が確認されており，Kabeyaらの調査においの保菌率は少なくとも30.6％であることが確認さてはＯ146が最優勢であった。また，海外においれた。分離されたEHECの多くはＯ146に属し，てもスペイン，アメリカ，ドイツ，アルゼンチン

Ｈ型の判定と系統解析から，EHEC O146は明らで野生または家畜化したシカからEHEC O146がかに系統が異なるO146：H21とO146：H28に分分離されている。一方で，家畜牛からEHEC

類されることが明らかとなった。これまでにヒト

O146が分離されるケースは限られており，国内から分離されたEHEC O146もシカ由来株と近縁においてはKobayashiら 12）が行った調査で乳牛な系統であったことから，EHEC O146の主な保111頭から分離したEHEC118株のうちＯ146は含菌宿主は野生のシカであり，そこから排菌された

まれておらず，Leeらが行った調査でも牛糞便

EHECがジビエや環境を介してヒトに感染してい由来EHEC112株のうちＯ146は含まれていなかっる可能性が示唆された。EHECのＯ146はこれまた。以上の結果から，EHEC O146はシカに親和でほとんど注目されていなかったが，海外で重症性の高いＯ群であることが予想された。

患者からの分離報告があることや，国内外で近年

3.3

８～11）

13）

検出数が増加傾向にあることを考慮すると，国内

系統解析
20 株 ，

においても注意が必要なＯ群の１つであると言え１株）とる。今後，さらにシカ肉の利用が普及すると予想

ヒト由来EHEC27株（すべてOg146）の計54株をされる中で，その安全性を確保するためには，シシ カ 由 来 EHEC27 株（Og146：Hg21
Og146：Hg28

６株，Og148：Hg18© The Ito Foundation

野生動物が保菌する腸管出血性大腸菌の特徴解析とリスク評価

289

Fig. 1 Phylogenetic relationship of EHEC O146 isolates from deer and human

カが保菌するEHECのヒトへのリスクを狩猟者や提供者，消費者が正しく理解し，その取り扱いに際して充分な注意を払う必要がある。

文献１） 高井伸二：野生鳥獣由来食肉の安全性確保に関する研究（平成23－25年度総合研究報告書），厚生労働省科学研究費補助金食品の安全確保推進研究事業，
2014．

© The Ito Foundation

290

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）２） Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P.：J Clin
Microbiol，33，248～250，1995．
３） Iguchi, A., Iyoda, S., Seto, K., Morita-Ishihara, T.,
Scheutz, F., Ohnishi, M.：Pathogenic E. coli Working
Group in Japan, J Clin Microbiol，53，2427～2432，
2015．
４） Banjo, M., Iguchi, A., Seto, K., Kikuchi, T., Harada,
T., Scheutz, F., Iyoda, S.：Pathogenic E. coli Working
Group in Japan, J Clin Microbiol,（accepted）
５） Wirth, T., Falush, D., Lan, R., Colles, F., Mensa, P.,
Wieler, L. H., Karch, H., Reeves, P. R., Maiden, M. C.,
Ochman, H., Achtman, M.：Mol Microbiol，60，1136～1151，2006．
６） Kabeya, H., Sato, S., Oda, S., Kawamura, M.,
Nagasaka, M., Kuranaga, M., Yokoyama, E., Hirai, S.,
Iguchi, A., Ishihara, T., Kuroki, T., Morita-Ishihara,T., Iyoda, S., Terajima, J., Ohnishi, M., Maruyama,
S.：J Vet Med Sci，79，834～841，2017．
７） 中村昴紀ら：第21回腸管出血性大腸菌感染症研究会プログラム・抄録集，p.27，2017．

８） Mora, A., López, C., Dhabi, G., López-Beceiro, A.
M., Fidalgo, L. E., Díaz, E. A., Martínez-Carrasco, C.,
Mamani, R., Herrera, A., Blanco, J. E., Blanco, M.,
Blanco, J. ： Appl Environ Microbiol ， 78 ， 2578 ～
2585，2012．
９） Eggert, M., Stüber, E., Heurich, M., FredrikssonAhomaa, M., Burgos, Y., Beutin, L., Märtlbauer, E. ：Epidemiol Infect，141，251～259，2013．
10） Franklin, A. B., Vercauteren, K. C., Maguire, H.,
Cichon, M. K., Fischer, J. W., Lavelle, M. J., Powell, A.,
Root, J. J., Scallan, E.：PLOS One, 8, e81512，2013．
11） Leotta, G. A., Deza, N., Origli,a J., Toma, C.,
Chinen, I., Miliwebsky, E., Iyoda, S., Sosa-Estani, S.,
Rivas, M.：Vet Microbiol，118，151～157，2006．
12） Kobayashi, H., Kanazaki, M., Ogawa, T., Iyoda, S.,
Hara-Kudo, Y. ： J Vet Med Sci ， 71 ， 363 ～ 366 ，
2009．
13） Lee, K., Kusumoto, M., Iwata, T., Iyoda, S., Akiba,
M.：Epidemiol Infect，145，1557～1566，2017．

© The Ito Foundation

291

農場で発生する腸炎にカラス由来のウエルシュ菌はどのように関与しているか？
―MLST法による遺伝学的解析での検討―
How the wild crow-derived Clostridium perfringens relate to theoccurrence of enteritis in domestic animals in farms？
―Genetical characterization of C. perfingens strains by MLST analysis―

上

塚

浩

司

（茨城大学農学部）

Koji Uetsuka（Ibaraki University, College of Agriculture）

In order to study how the wild crow-derived Clostridium perfringens（Cp）relate to theoccurrence of enteritis in domestic animals in farms, genetical characterization of Cp strains
were examined by multilocus sequence typing（MLST）analysis.
In this study, twenty-five Cp strains derived from the intestinal contents of 15 crows
were genetically analyzed by MLST, in that the 15 crows from which the 25 Cp strains derived
had been captured in Ibaraki prefecture. In addition, other previously published 13 Cp strains
derived from various hosts were also analyzed as reference strains for phylogenetic analysis.
As a result, wild crow-derived 25 Cp strains were classified into 16 sequence types（ST）.
Considering to the discrepancy of ST in pair of Cp strains derived from an identical crow, it
would be interesting to investigate the clonality of Cp strains in the intestine of healthy crow.
Furthermore, it was difficult to find any significant phylogenetic relationships between
wild crow-derived 25 Cp strains and 13 reference strains. Meanwhile, major 3 clusters were
found in the phylogenetic tree constructed by wild crow-derived 25 Cp strains, and it issuspected that each cluster show its own topographical distribution in Ibaraki prefecture,suggesting that the distribution of Cp strains in each cluster might have some relationshipwith the inhabitation and/or traveling of wild crows from which they derived. To verify thishypothesis, still much more Cp strains derived from wild crows in Ibaraki prefecture should be
examined genetically by MLST.

１．目性腸炎，牛や馬での出血性腸炎など，農場におけ的る家畜や家禽の腸炎の原因となることから，食肉

Clostridium perfringens（以後，ウエルシュ菌）
は，ヒトおよび動物の腸内細菌叢を構成する細菌の安定した供給において，大きな障害となってしまう。

の一種であり，産生する毒素の種類に応じて５つ

しかしながら，ウエルシュ菌は健常なヒトや動の毒素型に分類され，それぞれが鶏や豚での壊死物の腸内容物からも分離される一般的な腸内細菌© The Ito Foundation

292

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

である一方で，農場に侵入する野生鳥獣の排泄するウエルシュ菌は農場での腸炎の発生に関与して

２．方法いる可能性が推察されているものの，野生鳥獣が検体は茨城県の高病原性鳥インフルエンザ対策

保有するウエルシュ菌の多様性や分布を調査した

事業での留鳥の感染状況の調査のために平成26年

例はほとんど報告がない。

度の猟期に茨城県内で捕獲され，県北家畜保健衛

そこで我々は平成26年度，27年度と，茨城県で生所あるいは県南家畜保健衛生所に持ち込まれた

捕獲されたカラス，スズメ，ムクドリについて調

野生カラスであり，気管スワブおよびクロアカス

査を行い，それぞれの腸内容物からのウエルシュ

ワブでの簡易キットによるインフルエンザ検査で菌の分離の頻度，菌量および毒素型を調べ，スズ陰性と判定されたものから腸管を分与いただき，メ，ムクドリに比較して，カラスではウエルシュ

その腸内容物から分離されたウエルシュ菌株であ菌の分離頻度，菌量ともに著しく高く，外界へのる。検体として用いた腸管に，病変等は観察されウエルシュ菌の排泄にはこれら３種の留鳥の中でなかった。

はカラスの関与が最も大きいことを明らかにし，
平成28年度に学会報告を行った。

凍結保存してあった菌株を，10％卵黄カナマイ
シン入りCW寒天培地にて38℃で一晩嫌気培養

今回の研究助成で行った研究では，カラスからし，翌日プレートに発育したコロニーを掻き取分離されるウエルシュ菌が農場で発生する腸炎にり，エッペンチューブ内の滅菌MQ水中で撹拌し関与しているのかどうかについて，さらに検討をて10分間煮沸した。その後，遠心してDNAが含深めることを目的として，カラスから分離したウ

まれている上清を回収した。

エルシュ菌株をMultilocus Sequencing Typing法

MLST解析に使用する８種のハウスキーピング（MLST法）によって遺伝学的に解析し，NCBI

遺伝子のシーケンス解析はDeguchiらの論文を参GeneBankに登録されているウエルシュ菌の病原照して実施した１）。８種のハウスキーピング遺伝性株と比較して系統樹を作成し，農場での腸炎の子それぞれについてKAPA HiFi Hot Start Ready

発症への関与を遺伝学的に検証するものである。

Mix（KAPA BIOSYSTEMS：米国）を使用してMLST法とは，複数のハウスキーピング遺伝子

PCR反応を行い，その後，１％アガロースゲルでの配列データを用いるゲノムタイピングの手法で電気泳動を行い，増幅遺伝子の存在およびサイズある。この方法の利点として，自研究室の所有すを確認した。

る菌株だけでなく，世界中の研究室においてシー遺 伝 子 の 増 幅 が 確 認 さ れ た PCR 産 物 は ，クエンス解析されWeb上に公開された菌株とのFastGene Gel/PCR Extraction Kit（ニッポンジー

比較解析が可能になることがあげられる。したン：東京）を用いてキットの説明書に従って精製がって，自前の研究でシークエンス解析されたカ

し，BigDye Ⓡ Terminator v3.1 Cycle Sequencing

ラス由来菌株の遺伝学的性状を調べるのみなら

Kit（ThermoFisher Scientific：米 国）を 使 用 しず，病原性株など他のウエルシュ菌株との性状比

たサイクルシークエンス反応を行った。反応液較を可能にする非常に有用な手法であると考えては，エタノール沈殿により精製して，茨城大学農いる。これにより，相応の予防対策を行うための学部の遺伝子実験施設にあるABI PRISM 3130

一助となり，安定した食肉供給への貢献が期待でGenetic Analyzer （Applied Biosystems ： 米 国）

きるものと考えている。

を用いてシークエンス解析を行った。

© The Ito Foundation

農場で発生する腸炎にカラス由来のウエルシュ菌はどのように関与しているか？―MLST法による遺伝学的解析での検討―

293

け，既存の番号との区別のため100番台とした。

３．結果と考察

その結果，今回の分離菌25株は16種類の配列型

今回の研究では，平成26年度に茨城県内で捕獲（ST）に分類された（Table２）。具体的には，分されたカラス45羽の腸内容物から分離されたウエ離菌25株のうち５株が102型に分類され，これら

ルシュ菌118菌株をMLST法での解析に用いたが，５株は異なる３個体に由来していた。次に，２株

８つのハウスキーピング遺伝子の塩基配列がすべずつが104，105，106，113，115型に分類されたが，て適切に解読できてMLST解析を行うことができ

これら２株は同一個体に由来するペアであった。

たのは，最終的に15羽のカラスに由来する25株の残りの10菌株は別々のSTに分類された，菌株名

ウエルシュ菌株となった。

４と５は同一個体由来の分離株でありながら，そ

また，データベース上でゲノム遺伝子の全塩基

れぞれ102型と103型と別々のSTに分類された。

配列が公開されているウエルシュ菌株が13株あ同一個体に由来する菌株のペアの結果から，健り，これらを参照株として合わせて解析を実施し常なカラスの腸内に生息するウエルシュ菌のクた。これらの菌株はヒト由来の病原株が大半であローン性について考察した。パルスフィールドゲ

るが，牛由来が１株，農業関連が３株，工業廃水

ル電気泳動（PFGE）法を用いた研究において，から分離された環境由来が１株である。今回の研健康な鶏はいくつかの異なるウエルシュ菌のク究においてMLST法による遺伝学的解析を行った

ローンを保有し，これに対し壊死性腸炎を発症し分離株の一覧をTable１に示す。

ている鶏は１つまたは２つのクローンしか保有し3.1

配列型（Sequence type：ST）の解析ていないことが報告されている４）。さらにいくつ

今回のウエルシュ菌のMLST解析では，公開

かのゲノムタイピングによる研究において，健康データベースが設置されているWebサイトであな鶏には一般的に多数の異なる分離株が存在する

る PubMLST（https://pubmlst.org/）に 従 い ，のに対し，壊死性腸炎に罹患した鶏の腸管内では

colA，groEL，sodA，plc，gyrB，sigK，pgk，

単一タイプのウエルシュ菌による支配が示唆されnadAの８つのハウスキーピング遺伝子の塩基配ている２～５）。これらの報告から，今回の研究に使列を利用した。このデータベースには，８つのハ用した検体は健常なカラスの腸管であるので，遺ウスキーピング遺伝子ごとにそれぞれ塩基配列の伝的に多様なウエルシュ菌株を保有していること違いに基づくアレル番号が登録され，さらに８種が推察されるが，今回の研究で同一個体に由来すのアレル番号の組み合わせに基づき配列型

る２菌株で異なるSTに分類されたのは，菌株名（Sequence type：ST）が登録されている。

４と５だけであった。健常なカラスの腸内でのウ今回の研究においてMLST法による遺伝学的解析に用いた25株の分離菌株と13株の参照株についエルシュ菌のクローン性について今後さらに検討したいと考えている。

て，STの解析結果をTable２に示す。PubMLST

3.2の公開データベースに一致するアレル番号が登録

配列レベルでの菌株間の系統学的な関連性を調されていない場合には任意でアレル番号を付け，べるため，塩基配列データをMEGA７ソフトウェ

既存の番号との区別のため100番台とした。また，

アを使用して均一な長さにトリミングおよびアラ

この場合はアレル番号の組み合わせで決定する

インメントし，調整された８つのハウスキーピン

STの登録も存在しないため，任意のST番号を付

グ遺伝子の配列を連結し合計5870bpの配列デー© The Ito Foundation

系統学的解析

294

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 1 The list of Clostridium perfringens strains analyzed by MLST method in this study.
Wild crow-derived strain
Strain name

Strain-derived crow No.

Location of capture

Host name

1

K1-R1

Omitama

crow

4
5

K1-R2

Omitama

crow

12
14

K1-R5

Omitama

crow

23
27

K2-R2

Ibaraki-machi

crow

35
38

K6-R1

Ooarai

crow

48

K8-R2

Omitama

crow

57

K8-R3

Omitama

crow

68
74

K17-R2

Mito

crow

75

K17-R4

Mito

crow

M16
M17

M2-R6

Tsukuba

crow

M25
M26

M2-R9

Tsukuba

crow

M37

M5-R4

Inashiki

crow

M47
M48

M5-R5

Inashiki

crow

M57
M59

M5-R7

Inashiki

crow

M66
M67

M5-R8

Inashiki

crow

Reference strain
Strain name

Sequencing center

Host name

Relevance

str.F4969

J. Craig Venter Institute（JCVI）

Homo sapiens

PathogenWAL-14572

Broad Institute

Homo sapiens

Medicalstr. 13

Kyushu University, University of Tsukuba,
Kitasato University

Homo sapiens

Pathogen

FORC_003

Food-borne Pathogen Omics Research Center（FORC）―

Agricultural
Agricultural

JP55

University of Guelph―

str. JGS1495

J. Craig Venter Institute（JCVI）

Homo sapiens

Pathogenstr. JGS1721

J. Craig Venter Institute（JCVI）

Homo sapiens

Pathogen

JJC

Monash University―

Environmental

JP838

University of Guelph―

Agricultural

ATCC13124

J. Craig Venter Institute（JCVI）

Homo sapiens

Pathogenstr. JGS1987

J. Craig Venter Institute（JCVI）

Homo sapiens

Pathogen

F262

University of Guelph

Bos taurus

Medical

FORC_025

Seoul National University, Food-borne Pathogen
Omics Research Center（FORC）

Homo sapiens

Medical© The Ito Foundation

農場で発生する腸炎にカラス由来のウエルシュ菌はどのように関与しているか？―MLST法による遺伝学的解析での検討―

295

Table 2 Sequence type（ST）of strains analyzed in this study
strain nameallele No.
colA

groEL

sodA

plc

gyrB

sigK

pgk

nadA

sequence
type（ST）

wild crow-derived strain
1

1

101

1

101

1

4

8

101

101

4

101

6

1

7

1

5

4

1

102

5

102

102

1

4

3

5

1

1

103

12

102

19

1

4

3

5

1

1

104

14

102

19

1

4

3

5

1

1

104

23

4

8

5

4

2

7

1

11

105

27

4

8

5

4

2

7

1

11

105

35

4

20

101

102

1

24

12

102

106

38

4

20

101

102

1

24

12

102

106

48

6

103

102

5

5

2

2

3

107

57

103

104

103

103

101

101

8

103

108

68

26

105

1

24

102

4

101

104

109

74

4

106

1

4

2

2

1

105

110

75

4

107

3

4

3

2

4

13

111

M16

11

108

6

104

2

5

2

106

112

M17

4

1

3

4

3

2

1

4

5

M25

104

30

104

1

103

4

8

107

113

M26

104

30

104

1

103

4

8

107

113

M37

4

1

1

10

3

102

1

4

114

M47

101

6

1

7

1

5

4

1

102

M48

101

6

1

7

1

5

4

1

102

M57

105

104

105

103

104

101

8

108

115

M59

105

104

105

103

104

101

8

108

115

M66

101

6

1

7

1

5

4

1

102

M67

101

6

1

7

1

5

4

1

102

str. F4969

6

6

1

7

1

5

4

1

36

WAL-14572

106

4

6

105

3

103

1

109

116

str. 13

29

5

1

31

5

4

8

13

40

FORC_003

6

5

1

33

24

4

7

105

117

JP55

4

19

3

4

3

5

102

1

118

str. JGS1495

107

4

106

106

105

4

3

19

119

str. JGS1721

108

6

15

107

1

5

12

110

120

JJC

6

3

107

5

4

3

3

10

121

JP838

109

109

108

108

106

26

103

111

122

ATCC13124

1

1

1

1

1

1

1

1

1

reference strain

str. JGS1987

22

5

17

21

15

16

7

19

32

F262

26

29

5

109

3

24

104

112

123

FORC_025

4

110

1

6

4

4

3

1

124

© The Ito Foundation

296

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

タを用いて，カラス由来の25菌株についての系統由来するウエルシュ菌株である。これら38菌株に樹を作成した（Fig.１）。

ついて系統樹を作成してみたが，特に有意な関連

次に，データベース上でゲノム遺伝子の全塩基性など見出すことはできなかった。今後は，鶏の配列が公開されている既知のウエルシュ菌株であ農場で分離された病原性株と比較検討を行う予定

る13株を参照株として加え，合わせて38株の系統である。

樹を作成した（Fig.２）。

しかし，カラス由来の25菌株についての系統樹

カラス由来菌株はすべて健常なカラスの腸管か（Fig.１）において，菌株は大きく３つのクラス

ら採取されたものであり，参照株は様々な起源にターに分かれるように見受けられる。クラスター

Fig. 1 Phylogenetic trees of the 25 strains of wild crow-derived Clostridium perfringens obtained in our study. A

phylogenetic tree was constructed by Maximum Likelihood method. The reliability of the tree was assessed usingbootstrap method with 1000 replicates.

© The Ito Foundation

農場で発生する腸炎にカラス由来のウエルシュ菌はどのように関与しているか？―MLST法による遺伝学的解析での検討―

297

Fig. 2 Phylogenetic trees of the 25 strains of wild crow-derived Clostridium perfringens obtained in our study and the

13 reference strains previously published.

Isolates from this study are marked in No. or M-No. A phylogenetic tree was constructed by Maximum Likelihood

method. The reliability of the tree was assessed using bootstrap method with 1000 replicates.

ごとに菌株が分離されたカラスの捕獲場所を茨城玉市から稲敷市へと南北に伸びるクラスターＢに県の白地図上に書き込んでみると，クラスターＡ

重なるがそれよりも小さな分布が推察されたの菌株は大洗町，茨城町からつくば市への東西方（Fig. 3C）
。カラスの移動範囲はおよそ20kmから向（Fig. 3A），クラスターＢの菌株は水戸市，小30km程度と言われているが，３つのクラスター

美玉市から稲敷市への南北方向への分布が推察さの菌株の分布に対応して，３つのカラス群が生息れた（Fig. 3B）。またクラスターＣの菌株は小美あるいは移動しているという仮説を考えた。しか© The Ito Foundation

298

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 3 The distribution of wild crow-derived Clostridium perfringens strains in Ibaraki prefecture. The numbers are thestrain name and shown at the location where their host-crows had been captured. The strains belong to cluster A
in Fig.1 are shown in（A）,and cluster B in（B）,cluster C in（C）．

しながら，今回用いたカラス由来の菌株が25菌株と少なく，仮説を検証するには不十分であること

４．要約から，今後さらに解析菌株を増やし，菌株のクラ

野生カラスが保有するウエルシュ菌について，

スターとその分布の地域性の間の関連性を検討しMLST（Multi Locus Sequence Typing）法 に よていく予定である。

る遺伝学的解析を行った。解析は平成26年度の猟期に捕獲された15個体のカラスに由来するウエル© The Ito Foundation

農場で発生する腸炎にカラス由来のウエルシュ菌はどのように関与しているか？―MLST法による遺伝学的解析での検討―

299

シュ菌25株に加えて，データベース上にゲノム遺３つのクラスターの菌株の分布に対応して，３つ伝子の全塩基配列が公開されているウエルシュ菌のカラス群が生息あるいは移動している可能性が13株を参照株として追加し，合計38株について実推察された。今後さらに解析する菌株数を増や施した。その結果，カラスからの分離菌25株は16し，検討を続ける予定である。

種類の配列型（ST）に分類され，同一個体のカラスに由来する２菌株のSTについての考察から，健常なカラスの腸内に生息するウエルシュ菌のクローン性について，さらに検討する必要性が示唆された。また，カラスからの分離菌25株と参照株
13株との系統樹では，特に関連性を見出すことはできなかったが，カラスからの分離菌25株は大きく３つのクラスターに分かれ，分離菌の由来カラスの捕獲場所についてクラスターごとに茨城県内での分布に特徴があることが示された。これより

文献１） Deguchi, A., Miyamoto, K., Kuwahara, T., Miki, Y.,
Kaneko, I., Li, J., McClane, B. A., Akimoto, S.：PLoS
ONE, 4, e5598，2009．
２） Lacey, J. A., Johanesen, P. A., Lyras, D., Moore R.
J.：Avian Pathology，45，302～307，2016．
３） G h o l a m i a n d e k h o r d i , A . R . , D u c a t e l l , e R . ,Heyndrickx, M., Haesebrouck, F., Van Immerseel,
F.：Veterinary Microbiology，113，143～152，2006．
４） Nauer, B., Pedersen, K., Madsen, M.：Veterinary
Microbiology，94，257～266，2003．
５） Barbara, A. J., Trinh, H. T., Glock, R. D., Glenn, S.
J.：Veterinary Microbiology，126，377～382，2008．

© The Ito Foundation

300

肺エコーとプロカルシトニン値を用いた牛の非定型肺炎と細菌性肺炎の簡易迅速鑑別診断システム
Simply and rapid differential diagnosis system of bovine atypical andbacterial pneumonia using a pulmonary echography and plasma
procalcitonin level

鈴

木

一

由

（酪農学園大学獣医学群）

Kazuyuki Suzuki（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

The purpose of this study is to examine an association between an anti-inflammatory
effect of tulathromycin：15 membered ring macrolide antibiotics for cattle and plasma and
BALF endotoxin（ETX）activity and plasma procalcitonin value in ETX challenge model
calves. Fourteen healthy calves 25.8 ± 13.2 days of age were enrolled in this study. Calves weredivided into control group（n＝7）and Draxxin group（n＝7）．Control group received normal
saline solution（0.025ml/kg）each at day0, 3, 6, and 9. Likewise, Draxxin group received
tulathromycin（2.5mg/kg, Draxxin, Zoetis）intermuscularly. All calves received 2.5µg/kg of
O111：B4 lipopolysaccharide at day10 via indwelling catheter in jugular vein. We set the timeof endotoxin challenge at t＝0，and correct whole blood at t ＝ 30minute, 1, 2, 4, 8, 12, 24hours
from jugular vein into heparinized tube. Plasma endotoxin activity was measured by kinetic
turbidimetric（KTA）：limulus amebocyte lysate（LAL）based assay. Samples were diluted to
20 times and heated 80℃ for 10 minute. BALF endotoxin activity was measured by kinetic
chromogenic（KCA）：LAL based assay. Samples were diluted to 200 times. Procalcitoninconcentrations were measured by ELISA kit（Bovine Procalcitonin（PCT）ELISA Kit,
MyBioSource）. There were no significant differences between control group and Draxxin
group in plasma and BALF ETX activity. As for plasma procalcitonin concentrations, values
kept higher than pre in control group. But in Draxxin group, plasma procalcitonin values
decrease at t＝30minuites and 1hour after ETX challenge compared to pre. The present result
suggested that anti-inflammatory effect of tulathromycin participates in ETX cascade, notinhibiting ETX activity. As a result, plasma procalcitonin concentrations were low value inDraxxin group. We conclude that plasma procalcitonin value may be a useful diagnostic tool tosurmise a degree of inflammation. Further studies are needed in order to apply to clinical field.

© The Ito Foundation

肺エコーとプロカルシトニン値を用いた牛の非定型肺炎と細菌性肺炎の簡易迅速鑑別診断システム

１．目

301

マイシンの抗炎症作用と，炎症の指標としての血的中および気管支肺胞洗浄液（BALF）中エンドト

ヒト医療において血中プロカルシトニンは細菌，寄生虫，真菌感染時に特異的に上昇する炎症マーカーとして利用されている。血中プロカルシ
トニン濃度をもとに細菌性肺炎とマイコプラズマ

キシン活性値と血中プロカルシトニン濃度の関係について検討した。
２．方法

性肺炎の鑑別や抗生物質の投与の必要性を判断す

本研究では，牛用15員環マクロライドであるツることが可能で，治療方針の決定に役立つと同時

ラスロマイシン（商品名：ドラクシンⓇ，Zoetis）に不必要な抗生物質投与を防ぎ，結果として耐性を血漿消失半減期（ｔ1/2＝91時間）に相当する菌の出現を抑えることができると考えられる。

３日間隔で４回投与して血漿レベルを定常状態に生産動物医療においても食の安全という観点か保ちエンドトキシンをチャレンジした。

ら，耐性菌への対策は重要な課題となっている。

酪農学園大学附属動物医療センターで飼育して患畜の炎症の程度を把握することや細菌性肺炎といる健康子牛計14頭（対照群７頭，ドラクシン群

マイコプラズマ性肺炎の鑑別をすることは，その７頭）を用いた。供試牛の日齢および体重はそれ後の抗菌薬の使用など治療方針を決定する上で重ぞれ25.8±13.2日齢，36.2±7.2kgであった。品種要である。鑑別を迅速かつ適切に行うことで，不は，ホルスタイン種８頭，ジャージー種６頭で必要な抗生物質の使用を減少させ，現在大きな問あった。

題となっている薬剤耐性菌の出現を抑えることが対照群には生理食塩水0.025ml/kgを，ドラクシ

できる。生産動物医療において，患畜の血中プロン群には2.5mg/kgのツラスロマイシン（ドラクカルシトニン濃度を測定し炎症の程度の指標とし

シンⓇ ，Zoetis）を処置開始０日目，３日目，６て利用することが可能となれば，呼吸器疾患など日目，９日目に計４回筋肉内投与した。処置開始の炎症性疾患のガイドラインとなりうると考えら10日目に各供試牛に2.5µg/kgのＯ111：Ｂ４リポ

れる。

ポ リ サ ッ カ ラ イ ド（Lipopolysaccharides from

一方で，マクロライド系抗生物質は，細菌のリ

Escherichia coli, SIGMA）を頸静脈に留置したカ

ボソーム50Ｓサブユニットに結合してタンパク質

テーテルを介してチャレンジした（実験的全身性合成を阻害することで静菌作用を示す薬剤であ炎症モデル）。エンドトキシンをチャレンジしたる。さらに，新作用としてインターロイキン８

時点をｔ＝０時間と設定した。供試牛よりエンド（IL-８）の遊離阻害やNF-κＢの活性化抑制によトキシンチャレンジ前（pre），ｔ＝30分，１，２，

り抗炎症作用をもたらすことが知られており，ヒ４，８，12および24時間目に頸静脈より採血した。

ト医療では慢性炎症性疾患の治療にも応用されて採取した血液は直ちにヘパリン添加採血管に入いる。近年，肉牛の生産現場においても牛用15員

れ，3000回転で15分間遠心し，血漿を分離後－

環マクロライドであるツラスロマイシンが使用さ30℃以下で保存した。BALFは気管支鏡ガイド下れており，その抗炎症作用についても注目されてで採取した。あらかじめ回収前に肺胞内を生理食いる。

塩水で洗浄し，直後に生理食塩水100mlを肺胞内本研究ではエンドトキシンチャレンジモデルをに注入してその回収液をサンプルとした。肺胞洗用いて，牛用15員環マクロライドであるツラスロ

浄はpre，ｔ＝２，４および24時間の各時点で実施© The Ito Foundation

302

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

し，回収液は－30℃以下で保存した。

としてTukey Kramer testにより評価した。

血 漿 中 エ ン ド ト キ シ ン 活 性 値 は Limulus

３．結果と考察

Amebocyte Lysate （LAL） 法 で あ る Kinetic
Turbidimetric（KTA）法を用いて測定した。測ツラスロマイシン処理牛のエンドトキシンチャ

定時の前処理条件は20倍希釈，80℃で10分加温

レンジにおける血漿中ETX活性値の経時的変化

し，干渉物質を除去した。BALF中エンドトキシ

をFig.１に示した。対照群およびドラクシン群のン 活 性 値 は LAL 法 で あ る Kinetic Chromogenic

血漿中エンドトキシン活性値はｔ＝30分において（KCA）法を用いて測定した。測定時の前処理条それぞれ3.93±3.39および2.94±6.03EU/mLの最件は200倍希釈とした。血漿中プロカルシトニン

高 値 を 示 し ，pre 値 の 0.16 ± 0.75 お よ び 0.82 ±濃 度 は Bovine Procalcitonin （PCT）ELISA Kit

0.63EU/mLに対して有意な上昇を示した。しか（MyBioSource）を用いて所定の方法に則って測し，対照群およびドラクシン群間における血漿中定した。

エンドトキシン活性値の経時的変化に有意な差は

データは平均値±標準偏差で示した。pre値に認められなかった。対照群およびドラクシン群に対する各群内変動を二元配置分散分析法により解おけるBALF中エンドトキシン活性値は対照群は析した後，post-hoc testとしてDunnet法によりｔ＝２時間目において63.69±66.70，ドラクシン評価した。また，群間の平均値の差は二元配置分群はpreにおいて116.0±123.61EU/mLの最高値を散分析法により分散を評価した後，post-hoc test

示した。しかし，血漿中エンドトキシン活性値とPlasma endotoxin activity (EU/ml)

10
9
Cont

8

Drxx

7
6
5
4
3
2
1
0

Pre

30min

1hr

2hr

4hr

8hr

12hr

Time after the endotoxin challenge

24hrFig. 1 Graph depicting plasma endotoxin activity in endotoxin challenge models（mean ± SD）.

There are no significant differences between control group and Draxxin group.

© The Ito Foundation

肺エコーとプロカルシトニン値を用いた牛の非定型肺炎と細菌性肺炎の簡易迅速鑑別診断システム

303

700
650

Plasma Procalcitonin (pg/ml)

600
550
500
450
400
350
300

＊
＊

250
200

＊

＊

Cont
Drxx

pre

30min 1hr

2hr

4hr

8hr

12hr

24hr

Time after the endotoxin challenge
Fig. 2 Graph depicting plasma procalcitonin concentration in endotoxin challenge

models（mean ± SD）.In Drxx：Draxxin group, plasma procalcitonin concentration
decreased after endotoxin challenge. ＊：p＜0.05 vs pre by Dunnet.

同様にBALF中エンドトキシン活性値は両群の差スロマイシンを処置した子牛では無処置子牛と比は認められなかった。

較して血漿中プロカルシトニン濃度の上昇が認め

血漿中プロカルシトニン濃度の経時的変化をられなかった。血漿中エンドトキシン活性値と炎Fig.２に示した。対照群およびドラクシン群の血症の程度の関係は相関があることが知られている

漿中プロカルシトニン濃度はpreにおいてそれぞが，ドラクシン群でも対照群と同様の炎症が惹起

れ485.5±55.7および437.5±107.1pg/mlであった。

されているにも関わらず血漿中プロカルシトニン

対照群の血漿中プロカルシトニン濃度はエンドト

濃度の推移が低値であったことは興味深い。これ

キシンチャレンジによりチャレンジ直後から試験はツラスロマイシンを処置することによりエンド終了までやや高値を維持したが，ツラスロマイシ

トキシン由来であるIL-８などの炎症メディエー

ン処置をした子牛では対照群のそれよりも有意にターの活性抑制などのマクロライド系抗生物質の低値を推移した。またドラクシン群においてチャ

新作用によると思われる。それゆえに，マクロラ

レンジ後30分および１時間でチャレンジ前と比較

イド系抗生物質であるツラスロマイシンの抗炎症

して低値を示し，チャレンジ後１時間で最低値を作用は，エンドトキシンの暴露をうけても血漿中示した。

エンドトキシン活性値の上昇を抑制するのではな

エンドトキシンチャレンジモデルにおいて，血く，なんらかの機序でエンドトキシンカスケード

漿中エンドトキシン活性値ではツラスロマイシンに作用して炎症を緩和すると考えられた。その結処置の有無による差は認められなかったが，ツラ果，炎症性物質であるプロカルシトニンの分泌が© The Ito Foundation

304

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

抑制されるために無処置群と比較して血漿中プロ安全という観点から，抗生物質の適正使用は重要

カルシトニン濃度が低値を推移したと推察できる。

な課題であり，抗生物質投与の必要性を判断する

ヒト医療ではすでに血中プロカルシトニン濃度指標としての迅速な血中プロカルシトニン濃度測を用いて細菌性肺炎とマイコプラズマ性肺炎の鑑定法の確立が望まれる。一方で，肉牛の生産現場別に用いられており，牛医療においても炎症性疾でも利用されているマクロライド系抗生物質は静患の鑑別診断の補助ツールとしてその応用が期待

菌作用に加えて新作用としてサイトカインの遊離されている。本研究では，エンドトキシンチャレ抑制などの抗炎症作用をもつことが知られていンジモデル牛における炎症の程度が血漿中プロカ

る。本研究ではエンドトキシンチャレンジモデル

ルシトニン値を指標に把握できることから，血漿を用いて，牛用15員環マクロライドであるツラス

中プロカルシトニン値はその個体の炎症の程度をロマイシンの抗炎症作用と，炎症の指標としての知る良好なツールとなりうることが明らかになっ

血中および肺胞洗浄液（BALF）中エンドトキシ

た。

ン活性値と血中プロカルシトニン濃度の関係につ

今後は臨床現場での応用に向け，肺エコー検査

いて検討した。その結果，血漿中およびBALF中による細菌性肺炎とマイコプラズマ性肺炎の鑑別

エンドトキシン活性値は対照群およびツラスロマ

法と組み合わせることで血中プロカルシトニンにイシン処置群において差は認められなかった。血よる鑑別能を検証するとともに，抗生物質の使用

漿中プロカルシトニン濃度はエンドトキシンチェ

必要性を判断するためのカットオフ値の設定，よレンジ後に対照群では高値を維持したのに対し，り簡便な測定システムの構築を進める。

ツラスロマイシン処置群ではチャレンジ前よりも４．要低下した。エンドトキシンチャレンジモデル牛に約おける炎症の程度が血漿中プロカルシトニン値をヒト医療において血中プロカルシトニンは抗生指標に把握できることから，血漿中プロカルシト

物質の投与の必要性を判断する炎症マーカーとし

ニン値はその個体の炎症の程度を知る良好なツーて利用されている。生産動物医療においても食のルとなりうることが明らかになった。

© The Ito Foundation

305

鼻咽腔におけるPRRSおよび豚インフルエンザウイルス
感染症の病態解析
Pathological analysis of PRRS and swine influenza virus infection in thenasopharynx

平

井

卓

哉

（宮崎大学農学部）

Takuya Hirai（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

The objectives of the present study were to evaluate the nasopharyngeal lesion by PRRS
and SI infections in pigs. Totally 135 nasal swabs and 60 nasopharynx samples including nasalassociated lymphoid tissue（NALT）were collected from several pig farms in the Miyazaki
prefecture, Japan. Nested RT-PCR was used for detection of PRRS and SI viruses in nasal
swabs. Nasopharynx samples were examined by histopathology and in situ hybridization.
Thirty-four out of 135 nasal swab samples（25％）were positive for PRRS virus by nested
RT-PCR. In contrast，24（18％）samples were positive for SI virus. Various degrees ofnasopharyngitis were found in 34（57％）out of 60 samples. In the nasopharyngeal lesion,
neutrophils and macrophages infiltration in the nasopharyngeal duct, denatured/exfoliatedepithelium, and degeneration and necrosis of crypt epithelium were observed. In the cases withremarkable crypt lesion, numerous neutrophils infiltrated into the dilated lumen.
Nasopharyngitis was observed in high frequency（72％）in PRRSV-infected pigs.
Nasopharyngitis was also seen in 3 out of 8 SIV-infected pigs. The PRRS nucleic acids weredetected in the cytoplasm of cells resembling macrophages in the NALT by in situ
hybridization. These results confirm previous findings that PRRS and SI viruses are deeply
associated with nasopharyngitis. Our findings suggest that the PRRS virus replicates in themacrophages of NALT after nasal infection. The virus may be shed into the nasal discharge. It
is also speculated that the virus can reach to the lungs from NALT by viremia and causeinterstitial pneumonia.

１．目

菌の重感染により引き起こされる呼吸器病で，全的国の推定損失額は年間280億円と報告されている。

豚の呼吸器複合感染症は，豚繁殖・呼吸障害症

このため，養豚業界における呼吸器病対策が最も候群（PRRS）ウイルスをはじめ，豚インフルエ

重要な課題となっている。本症はPRRSが主とな

ンザ（SI）ウイルス，豚呼吸器コロナウイルス，り，上記の複数の病原体が複雑に関与して肺病変

豚サーコウイルスなどのウイルスのほか，各種細を形成する。PRRSはマクロファージに感染し，© The Ito Foundation

306

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

子豚に間質性肺炎を引き起こす。一方，SIウイル

3ʼ），（SI Pi2：5ʼ-AGCAATCTGAACTCC

スは呼吸器粘膜の上皮細胞に感染して上皮バリア

TCTAGTG-3ʼ）を用いてnested RT-PCRを実施

を障害し，他病原体の感染増加に影響すると推測した。SIウイルス陽性の症例については，肺のされている。

10 ％ 乳 剤 を 定 法 に よ り 作 製 し ，同 様 に nested

豚呼吸器病の病理発生機序の理解と予防対策の

RT-PCRを実施した。また，鼻腔スワブをサンプ確立のためには，呼吸器病ウイルスの侵入門戸でルとし，発育鶏卵の羊膜腔内接種によりSIウイル

ある上部呼吸粘膜における病原性ウイルスの増殖

スの分離を試みた。

性や病態を理解することが不可欠である。また，

2.2

鼻咽腔には鼻咽頭関連リンパ組織（NALT）が存

上記135頭の子豚を剖検し，NALTを含む鼻咽在し，感染初期における生体防御に重要な役割を腔および肺の採材が可能であった60頭を病理組織担っていると考えられる。養豚業界において子豚検査材料に供した。その他の症例は，死後変化がの呼吸器複合感染症が最重要課題となっているに

高度あるいは凍結のため，採材できなかった。

も関わらず，NALTを含む鼻咽腔の病態解析が進

NALTを含む鼻咽腔および肺は，４％パラホルム

展していないため，今回の研究の着想に至った。

アルデヒド（PFA）に約48時間固定した後，定本研究では，子豚の呼吸器複合感染症における鼻法に従ってパラフィン標本を作製し，ヘマトキシ

咽腔病変を明らかにし，呼吸器病の病理発生機序

リン・エオジン（HE）染色を行い，鏡検した。

と予防対策の確立の基礎的知見を得ることを目的

NALTにおける鼻咽腔炎の有無は，組織障害の程とする。また，事前調査をもとに，対象とする豚度および腔内へ浸潤する炎症細胞や変性・剥離上呼吸器病関連ウイルスをPRRSウイルスおよびSI

皮の程度をもとに病理組織学的に評価した。まウイルスに絞って行う。

た，鼻腔スワブにおいてPRRSウイルス陽性の検

２．方
2.1

病理組織学的検査

体を抽出し，肺のHE染色を作製後，肺病変の病法

理組織学的評価を行った。また，肺においてSIウ
イルス陽性の検体について，肺の病理組織学的評

ウイルス学的検査

2017年11月～2018年３月にかけて宮崎県県央部

価を行った。

の複数の養豚場にて死亡した子豚135頭から鼻腔

2 . 3 超高感度in situ hybridization（ISH）法

スワブおよび肺を採取した。綿棒を浸す液としによるPRRSウイルス感染細胞の検出て，ペニシリン・ストレプトマイシン（和光純

鼻腔スワブにてPRRSウイルス陽性の検体を選薬）入りの細胞培養培地（MEM培地；和光純

別し，NALTを含む鼻咽腔のパラフィン切片を作薬）を３ml用いた。TRIzol試薬（ThermoFisher）

製 し た 。脱 パ ラ フ ィ ン し た 切 片 は 洗 浄 後 ，で RNA 抽 出 し た 後 ， AccessQuick

RT-PCR

Proteinase K（タカラバイオ）でタンパク分解酵

System（プロメガ）を使ってPRRSウイルスの素処理（37℃，10分）し，４％PFAで室温10分間，

nested RT-PCRを実施した 。また，SIウイルス

後固定した。洗浄後に内因性ペルオキシダーゼのについては，プライマー（Po1：5ʼ-ATGGACG

処理を３％過酸化水素水で室温60分間行い，脱水

AAGAACAAGG ATTGC-3ʼ），（SI Po2：5ʼ-TC

系列を通し，切片を乾燥させた。cRNAプローブ

TCAGTTCAAGAGTGC TGGAG-3ʼ）および（SIは，PRRSウイルスのORF７領域プライマー２）のPi1：5ʼ-GCCCATAAGTCCTGCTTGCCTGC-

anti-sense側の５’領域にＴ７プロモーター領域のTM

１）© The Ito Foundation

鼻咽腔におけるPRRSおよび豚インフルエンザウイルス感染症の病態解析

307

配列を加え，in vitro transcription法にて作製し3.2

た 。プローブはハイブリダイゼーション溶液

本研究に供した135例中３例に肉眼的に鼻咽腔（コスモ・バイオ，東京）と混合して，切片に載病変が認められた。NALTを含む鼻咽腔（Fig.１）

せ ，50 ℃ で 16 ～ 18 時 間 反 応 さ せ た 。洗 浄 後 ，が採材可能であった60例のうち38例（63％）に

RNase処理を行い，HRP標識抗Dig抗体（Dako）

様々な程度の鼻咽腔炎がみられた。鼻咽腔病変とと反応させた。洗浄を挟んで，ビオチン化タイラ

して，腔内の好中球を主とした炎症細胞浸潤およマイド（Dako），HRP標識ストレプトアビジン

び粘液を混じる剥離上皮（Fig.２），陰窩部の壊（Dako）を反応させ，Liquid DAB（Dako）を用

死や好中球浸潤が認められた。陰窩病変が顕著ないたDAB反応で反応物を可視化した 。

症例では，陰窩が拡張し，腔内に好中球が多数浸

１）

１）

潤していた（Fig.３）。同部の上皮細胞は変性・３．結果と考察
3.1

病理学的検査壊死し，一部に糜爛が形成されていた。鼻咽腔炎
38例中３例に重度な炎症像が認められた。

ウイルス学的検査

本研究に供した135例中，鼻腔スワブにてPRRSNALTを含む鼻咽腔が採材可能であった60例のウイルスに陽性となった検体は34例（25％），SI

うち，鼻腔スワブにてPRRS陽性の症例は18/60

ウイルスに陽性となった検体は24例（18％）で例（30％）あり，鼻咽腔炎は13/18例（72％）にあった。PRRSウイルスおよびSIウイルスの両方みられた。一方，鼻腔スワブにてSI陽性の症例はに陽性を示した検体は２例であった。SIウイルス

8/60例（13％）あり，鼻咽腔炎のある症例は3/8陽性となった24検体の肺を用いてSIウイルスの例（38％）であった。

nested RT-PCRを実施した結果，１例の肺が陽鼻腔スワブのnested PCR検査にてPRRS陽性で性となった。SIウイルス陽性になった４検体の鼻あった34例のうち，７例の肺について病理組織学

腔スワブを発育鶏卵の羊膜腔内に接種してウイル的検査した結果，全例に肺炎が認められた。７例

ス分離を試みたが，SIウイルスは分離されなかっ中 ５ 例 に は ，肺 胞 壁 お よ び 肺 胞 腔 内 に マ ク ロ

た。

ファージが浸潤していた（Fig.４）。また，立方Fig. 1 Note the anatomical location of nasal-associatedFig. 2 Note infiltration of neutrophils and macrophages,

lymphoid tissue（NALT）in pig（arrows）．

cell debris and desquamated epithelial cells in thenasopharynx. HE.

© The Ito Foundation

308

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 3 Note infiltration of neutrophils, macrophages, andcell debris in the lumen of the crypt in the NALT.
HE.

Fig. 4 Note infiltration of macrophages in the alveolar

septa. HE.

Fig. 5 A；PRRSV nucleic acid was detected in thecytoplasm of the cells resembling macrophages in
the NALT. In situ hybridization. B ; Higher
magnification. In situ hybridization.

形のⅡ型肺胞上皮の過形成および炎症細胞浸潤にのうち13例（72％）に鼻咽腔炎が認められた。18

よる肺胞中隔の肥厚が認められた。また，nested

例のNALTを含めた鼻咽腔標本を用いて超高感度

RT-PCR検査にてSIウイルス陽性の１例の肺につISH法を実施したところ，４例が陽性になった。

いて，気管支上皮細胞の変性・剥離と軽度の炎症

陽性シグナルは陰窩周囲のNALTにおいて散在性細胞浸潤，肺胞マクロファージの増生がみられ，に検出された（Fig.５）。陽性細胞は形態学的に

気管支間質性肺炎が観察された。

マクロファージに類似していた。

3 . 3 超高感度ISH法によるPRRSウイルス感染

死亡した子豚135例中，NALTを含む鼻咽腔が採材可能であった60例を病理組織学的検査した結細胞の検出
鼻腔スワブにてPRRS陽性症例の中で，NALT

果，38/60例（63％）に鼻咽腔炎が認められたこを含めて鼻咽腔を採材できた症例は18例あり，そとより，死亡子豚に上部呼吸器病変が多いことが© The Ito Foundation

鼻咽腔におけるPRRSおよび豚インフルエンザウイルス感染症の病態解析

309

明らかになった。また，鼻腔スワブでPRRS陽性

かけて宮崎県県央部の養豚場にて死亡した子豚を示した症例において，鼻咽腔炎は高率（13/18

135例を剖検した。鼻腔スワブを用いて，PRRS

例：72％）に認められたことより，PRRSウイル

ウイルスおよびSIウイルスの検出を行い，NALT

スは鼻咽腔炎の一因として考えられた。一方，鼻を含む鼻咽腔を病理組織学的に検査した。135例

腔スワブにてSI陽性を示した症例において，鼻咽中，鼻腔スワブのPRRSウイルス陽性検体は34例

腔炎は3/8例（36％）であった。これは，SIウイ（25％），SIウイルス陽性検体は24例（18％）でルスの排泄期間が約１週間であり，ウイルス遺伝あった。NALTを含む鼻咽腔が採材可能であった子の検出できる期間も短いためと考えられた。

60例のうち38例（63％）に様々な程度の鼻咽腔炎

cRNAプローブを用いた超高感度ISH法により，がみられた。鼻腔スワブでPRRS陽性を示した症

PRRS陽性シグナルは陰窩周囲のNALTに存在す例において，鼻咽腔炎は高率（13/18例：72％）

る 細 胞 が 陽 性 を 示 し ，こ れ ら の 細 胞 は マ ク ロに認められた。一方，鼻腔スワブのSI陽性例におファージと考えられた。PRRSの標的細胞はマク

い て ，鼻 咽 腔 炎 は 3/8 例（36 ％ ）で あ っ た 。

ロファージであることが知られている。PRRSウNALTを含めた鼻咽腔標本を用いて超高感度ISH

イルスは経鼻感染後，鼻咽腔のNALTに存在する法を実施したところ，４例がPRRS陽性になった。

マクロファージで増殖することが示された。ま

以上より，死亡子豚に上部呼吸器病変が多く，鼻た，NALTで増殖したウイルスの一部が鼻汁とし咽腔炎の一因としてPRRSウイルスやSIウイルスて排泄されること，およびウイルス血症により肺の関与が示唆された。cRNAプローブを用いた超に到達して，間質性肺炎を引き起こすことが推察

高感度ISH法により，PRRS陽性シグナルは陰窩された。

周囲のNALTに存在する細胞にみられ，これらの

NALTを含む鼻咽腔が採材可能であった60例の細胞はマクロファージと考えられた。PRRSウイ

うち，nested RT-PCR検査にてSI陽性の症例は

ルスは経鼻感染後，鼻咽腔のNALTに存在するマ

鼻腔スワブで８例，肺で１例であった。今後，SI

クロファージで増殖することが示唆された。

ウ イ ル ス 検 出 用 の cRNA プ ロ ー ブ を 作 製 し ，

NALTで増殖したウイルスの一部が鼻汁として排NALTを含む鼻咽腔および肺の標本を用いた超高泄されること，およびウイルス血症により肺に到

感度ISH法を実施予定である。本法により，ウイ達して，間質性肺炎を引き起こすことが推察され

ルス感染細胞の分布等を明らかにできると思われた。

る。また，SIウイルスのレセプター分布についても調べる。鼻腔スワブにてSIウイルス陽性の検体は24例であったが，これらのうち４例を用いてウ
イルス分離を試みたが，陰性であった。残り20例の鼻腔スワブおよび１例の肺乳剤を用いて，SIウ
イルスの分離を実施する。
４．要

約

子豚の呼吸器複合感染症における鼻咽腔病変を文
献１） Trang, N. T., Hirai, T., Ngan, P. H., Lan, N. T.,
Fuke, N., Toyama, K., Yamamoto, T., Yamaguchi,
R.：Enhanced detection of Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus in fixed tissues by insitu hybridization following tyramide signal
amplification, J Vet Diagn Invest, May；27（3），326～31，2015．
２） Shin, J. H., Molitor, T. W.：Localization of porcine
reproductive and respiratory syndrome virus
infection in boars by in situ riboprobe hybridization,
J Vet Sci, Jun；3（2），87～96，2002．

明らかにするために，2017年11月～2018年３月に© The Ito Foundation

310

感染性Ａ型インフルエンザウイルスの迅速検出系の確立
Establishment of rapid detection system of infectious influenza A viruses

小

澤

真

（鹿児島大学共同獣医学部）

Makoto Ozawa（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Infectious influenza A viruses have been confirmed by means of classical virus isolation inembryonated chicken eggs or cultured cells, followed by virological analyses. Since theseprocedures require a couple of days, rapid detection methods for infectious influenza A viruses
are needed. To develop such a detection method, by using self-inactivating retroviral vectors,
human-，chicken-，and canine-derived cell lines that stably express recombinant influenza
virus-like RNAs encoding the green fluorescent protein（GFP）reporter genes were
established. These cell lines expressed GFP upon either transfection with plasmids for the
expression influenza viral proteins responsible for viral RNA transcription/replication or
infection with the influenza A virus laboratory strain A/WSN/33（H1N1）. The chickenderived recombinant influenza virus-like RNA-expressing cells exhibited the highest GFP
expression level among the established cell lines and specifically expressed GFP upon infection
with influenza A viruses of various subtypes within 12 hours after infection. Immunofluorescentassay with anti-influenza viral protein antibody revealed that only approximately 5％ of thevirus-infected cells indeed expressed GFP. Although further studies, such as cell cloning of theestablished cell lines, are needed to improve the GFP expression efficiency, our cell lines would
be useful to detect infectious influenza A viruses rapidly.

１．目

や遺伝子など，ウイルスの構成要素の一部を検出的する検査は開発・改良が進んでいるが，感染性をＡ型インフルエンザウイルスは，ヒトを含む
様々な動物種に感染して人獣共通感染症を引き起備えた「生きた」ウイルスの証明には，古典的なウイルス分離法が引き続き適応されている。

こす。とりわけ家禽で発生する鳥インフルエンザ

Ａ型インフルエンザウイルスは，検査検体の発は，その流行によって甚大な経済的被害をもたら

育鶏卵または培養細胞への接種および培養，さらす可能性があるため，ウイルスの種類によって家にその漿尿液や培養上清を用いた赤血球凝集試験

畜伝染病および届出伝染病に指定され，その迅速や遺伝子検査などのウイルス学的な解析を経て分かつ正確な検出が求められる。近年，タンパク質

離され，これらの検査作業には２～３日間を要す© The Ito Foundation感染性Ａ型インフルエンザウイルスの迅速検出系の確立

311

る。また，簡易検査あるいは遺伝子検査で陽性と選択薬剤ブラストサイジン（10µg/ml）を添加し判定された検体であっても，感染性ウイルスが分た10％牛胎児血清含有DMEM培地で培養した。

離されない事例は少なくない。例えば，高病原性

また，プラスミドを導入またはレトロウイルスベ

鳥インフルエンザウイルスが全国で確認された

クターを感染させた培養細胞の一部は，培養細胞

2016―17年冬季を含め，過去の野鳥検体検査の一選択薬剤ピューロマイシン（２µg/ml）を添加し部は，あらかじめ実施された簡易検査や遺伝子検た培地で培養した。

査で陽性反応が認められた検体からウイルスが分Ａ型インフルエンザウイルス８株のほか，Ｂ型

離されず，最終的に「陰性」と判断されている。

インフルエンザウイルスとニューカッスル病ウイウイルス分離の結果が確定するまでの数日間に，ルス各１株（Table１）を使用した。各ウイルス検体が回収された地域の住民や行政関係者は緊張株を接種した発育鶏卵を２日間培養し，その漿尿状態の中で様々な対応を迫られるほか，「鳥イン液を回収して－80°Ｃで凍結保存した後，MDCK

フルエンザ陽性」の情報が周辺の諸産業に多大な細胞を用いてプラークアッセイによりウイルス力

風評被害を与える。このような課題に対応するた価を測定した。

め，感染性Ａ型インフルエンザウイルスをより迅

2.2

組換えウイルス遺伝子発現プラスミド

速に検出する新たな検査手法の確立が求められて

Ａ 型 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 実 験 室 株 A/
WSN/33（H1N1）の野生型HA遺伝子（Fig. 1a）いる。
本研究では，感染性Ａ型インフルエンザウイルの翻訳領域を緑色蛍光タンパク質（GFP）レポー

スの迅速検出法を確立することを目的として，レター遺伝子の塩基配列へ置換した組換えウイルス

トロウイルスベクターをはじめとする遺伝子組み

遺伝子HA（0）GFP（0）（Fig. 1a）を発現する，換え技術を用い，ウイルス感染に応答して短時間ヒト由来RNAポリメラーゼＩプロモーター領域

でレポーター遺伝子を特異的に発現する培養細胞１）を備えたプラスミドpPolI/HA（0）GFP（0）（東株の樹立を試みた。

京大学医科学研究所・河岡義裕教授より分与）を

２．方
2.1

もとに，ウイルス遺伝子の転写・複製効率を上昇

法

させることが報告されているウイルス遺伝子３’細胞とウイルス

末端プロモーター領域の３箇所の点変異２）を導入

ヒト肺胞上皮由来Ａ549細胞および鶏胎児由来

し た プ ロ モ ー タ ー 変 異（promoter mutation；

DF-１細胞（いずれも東京大学医科学研究所・河PM）組換えウイルス遺伝子PM-HA（0）GFP（0）岡 義 裕 教 授 よ り 分 与）は 10 ％ 牛 胎 児 血 清 含 有（Fig. 1a）の 発 現 プ ラ ス ミ ド pPolI/PM-HA（0）DMEM培地で，犬腎臓由来MDCK細胞（東京大GFP（0）（Fig. 1b）を構築した。RNAポリメラー

学医科学研究所・河岡義裕教授より分与）は５％

ゼＩプロモーター領域は動物種特異性が高く，鶏新生子牛血清含有MEM培地でそれぞれ培養しな

由来DF-１細胞や犬由来MDCK細胞ではPM-HA

がら維持した。これらの細胞へウイルスを感染し（0）GFP（0）の十分な発現が期待できなかったた際には，TPCK処理トリプシン（0.5µg/ml）をため，pPolI/PM-HA（0）GFP（0）上の組換え

添加した0.15％牛血清アルブミン含有MEM培地

ウイルス遺伝子領域を鶏ならびに犬由来RNAポで培養した。レトロウイルスパッケージング用

リメラーゼＩプロモーター領域を備える各プラス

Plat-GP細胞（コスモ・バイオ社）は，培養細胞

ミド３）（いずれも東京大学医科学研究所・河岡義© The Ito Foundation

312

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 1 Viruses used in this study.
Virus

Influenza A virus

StrainHost＊（laboratory strain）
A/WSN/33（H1N1）

Human＊（laboratory strain）
A/Puerto Rico/8/33（H1N1）

Human

A/California/04/2009（H1N1）＊

Human

A/Aichi/75/2008（H3N2）

Human

A/environment/Kagoshima/KU-ngrI/2014（H6N2）

Environmental water

A/duck/Kagoshima/KU57/2014（H11N9）
A/swine/Japan/KU-HY5/2013（H1N1）

Duck
Pig

＊＊
A/canine/Korea/DJ-cd1/2009（H3N2）

Dog

Influenza B virus

B/Lee/1940＊（laboratory strain）

Human

Newcastle disease virus

B1＊＊＊（vaccine strain）

Chicken＊These viruses were kindly provided by Dr. Yoshihiro Kawaoka, University of Tokyo.
＊＊This virus was kindly provided by Dr. Young Ki Choi, Chungbuk National University, South Korea.
＊＊＊This virus was kindly provided by Dr. Kozo Takase, Kagoshima University.

Fig. 1 Schematic diagrams of recombinant influenza virus-like RNAs（a）and plasmids constructed in this study（b, c）（a）.

The coding region for the HA protein in wild-type HA gene is replaced by the open reading frame of green
fluorescent protein（GFP）in both HA（0）GFP（0）and PM-HA（0）GFP（0）genes. X in PM-HA（0）GFP（0）gene indicates three nucleotide mutations that were demonstrated to enhance the viral RNA promoter activity２）
introduced in the 3ʼ noncoding ends.（b）pPolI/, pPolIGG/, and pPolICL/PM-HA（0）GFP（0）encode the cDNAs
for PM-HA（0）GFP（0）genes under the control of human, chicken, and canine RNA polymerase I promoters（PolIpro）, respectively. PolI ter, mouse RNA polymerase I terminator.（c）pMX△U3-Puro/PolI-，pMX△U3-Puro/
PolIGG-，and pMX△U3-Puro/PolICL-PM-HA（0）GFP（0）encode cDNAs for mouse leukemia virus-derived
self-inactivating for the expression of PM-HA（0）GFP（0）genes under the control of human, chicken, andcanine RNA polymerase I promoters, respectively. 5ʼLTR, MLV 5ʼ long terminal repeat ； Pur, transcription unit for
Puromycin resistance gene；△U3 3ʼLTR, MLV U3 region-deleted 3ʼ long terminal repeat.

© The Ito Foundation感染性Ａ型インフルエンザウイルスの迅速検出系の確立

313

裕教授より分与）へクローニングし，鶏および犬

タ ー RV/PolI-PM-HA （0）GFP （0）, RV/

由来培養細胞内で組換えウイルス遺伝子を発現す

PolIGG-PM-HA （0）GFP （0）， お よ び RV/

るプラスミドpPolIGG/PM-HA（0）GFP（0およPolICL-PM-HA（0）GFP（0）を作出した。

び pPolICL/PM-HA （0）GFP （0）（Fig. 1b） を構築した。

2 . 4 プラスミドの導入およびレトロウイルス
ベクターの感染

続いて，pPolI/PM-HA（0）GFP（0）, pPolIGG/

構築した組換えウイルス遺伝子発現プラスミド

PM-HA（0）GFP（0）およびpPolICL/PM-HA（0）を は じ め ，す べ て の プ ラ ス ミ ド は

GFP（0）上の各動物種由来RNAポリメラーゼＩ

Lipofectamine3000 （Thermo Fisher Scientific

プロモーター―組換えウイルス遺伝子―RNAポ社）を用いて各種培養細胞へ導入した。また組換

リメラーゼＩターミネーター（動物種特異性が低えウイルス遺伝子発現レトロウイルスベクターはいターミネーター領域は全プラスミドに共通してViraDuctinレトロウイルス導入キット（コスモ・マウス由来）に至る遺伝子領域を，マウス白血病

バイオ社）を用いて培養細胞へ感染させた。

ウイルス由来自己不活型レトロウイルスベクター
パッケージングプラスミドpMX△U3

４）

にピュー

2 . 5 免疫蛍光染色法によるウイルス感染細胞の検出

ロマイシン耐性遺伝子発現ユニットを付加した

ウイルス感染細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗

pMX△U3-Puro（東京大学医科学研究所・河岡

浄後，Mildform 10N（和光純薬社）により固定し，

義裕教授より分与）へクローニングして，pMX

0.2％トリトンＸ-100（ナカライテスク社）およ△U3-Puro/PolI-PM-HA （0）GFP （0）, pMX

び１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩△U3-Puro/PolIGG-PM-HA （0）GFP （0），お水で処理した。続いて抗Ａ型インフルエンザウイ

よびpMX△U3-Puro/PolICL-PM-HA（0）GFP（0）

ルスNPタンパク質マウス単クローン抗体クロー（Fig. 1c）を構築した。

ン９Ｇ８（アブカム社）およびDyLight 594標識

A/WSN/33（H1N1）のPB2，PB1，PA，およ馬由来抗マウスIgG抗体（Vector Laboratory社）

びNPタンパク質の各発現プラスミドpCAGGS/を反応させて，蛍光顕微鏡下で細胞を観察した。

PB2 ， pCAGGS/PB1 ， pCAGGS/PA ， お よ び
pCAGGS/NP５）は，東京大学医科学研究所・河岡
義裕教授より分与された。
2.3

３．結果と考察3 . 1 プラスミドからの組換えウイルス遺伝子

レトロウイルスベクター

発現の確認

構築したレトロウイルスベクターパッケージン

構築した各プラスミドが，RNAポリメラーゼ

グプラスミドpMX△U3-Puro/PolI-PM-HA（0）Ｉプロモーター領域に対応する３種の動物種（ヒGFP（0）, pMX △ U3-Puro/PolIGG-PM-HA（0）ト，鶏，および犬）由来の培養細胞内において組

GFP （0）， あ る い は pMX △ U3-Puro/PolICL-

換えウイルス遺伝子HA（0）GFP（0）あるいは

PM-HA（0）GFP（0）を，水疱性口内炎ウイル

PM-HA（0）GFP（0）を発現することを確認す

スＧタンパク質発現プラスミドpCAGGS/VSV-G

る た め ， pPolI/HA （0）GFP （0）, pPolI/（東京大学医科学研究所・河岡義裕教授より分与）

PM-HA（0）GFP（0），およびpMX△U3-Puro/

とともにPlat-GP細胞へ導入して２日間培養し，PolI-PM-HA （0）GFP （0） を Ａ 549 細 胞 へ ，各組換えウイルス遺伝子発現レトロウイルスベク

pPolIGG/PM-HA（0）GFP（0）お よ び pMX △© The Ito Foundation

314

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

U3-Puro/PolIGG-PM-HA（0）GFP（0）を DF-

現 が 見 ら れ な い こ と を 確 認 し た う え で ，A/

１細胞へ，pPolICL/PM-HA（0）GFP（0）およWSN/33（H1N1）由来のPB2，PB1，PA，およびpMX△U3-Puro/PolICL-PM-HA（0）GFP（0）びNPタンパク質の各発現プラスミドを導入し，をMDCK細胞へ，それぞれ単独またはウイルス

さらに２日間培養後のGFP発現を検証した。いず遺伝子の転写・複製を担う４種類のウイルスタン

れのレトロウイルスベクター感染・プラスミド導

パク質PB2，PB1，PA，およびNPの各発現プラ入細胞においてもGFPの発現が見られた。これら

スミドとともに導入して，２日間培養後のGFP発の結果は，作出した各レトロウイルスベクター

現を検証した。いずれの組換えウイルス遺伝子発が，レトロウイルスベクター内のRNAポリメラー

現プラスミドも，４種類のウイルスタンパク質発

ゼＩプロモーターに対応する動物種由来の培養細現プラスミドとともに導入した細胞でのみ，GFP

胞内において，組換えウイルス遺伝子を発現したを発現した。これらの結果は，構築した各プラス

ことを示す。

ミドが，プラスミド上のRNAポリメラーゼＩプ
ロモーター領域に対応する動物種由来の培養細胞内において，組換えウイルス遺伝子を発現したことを示す。

3 . 3 組換えウイルス遺伝子安定発現細胞株の樹立
RV/PolI-PM-HA（0）GFP（0）を感染させたＡ 549 細 胞 ，RV/PolIGG-PM-HA（0）GFP（0）さらに，各組換えウイルス遺伝子発現プラスミ

を 感 染 さ せ た DF- １ 細 胞 ，お よ び RV/PolICL-

ド を 単 独 で 導 入 し た 培 養 細 胞 へ ，A/WSN/33

PM-HA（0）GFP（0）を感染させたMDCK細胞（H1N1） を 感 染 多 重 度 （Multiplicity ofを，それぞれピューロマイシン（２µg/ml）を添

Infection ； MOI）＝ 0.1 で 感 染 さ せ た と こ ろ ，加した培地で培養し，ピューロマイシン耐性細胞

pPolI/HA（0）GFP（0）を除くすべてのプラス株を樹立した。樹立したピューロマイシン耐性細ミド導入・ウイルス感染細胞において，感染後12胞株における組換えウイルス遺伝子PM-HA（0）

時間以内にGFPの発現が見られた。これらの結果

GFP（0）の発現を確認するため，いずれの細胞は，既報２）のとおりウイルス遺伝子３’末端のプでもGFPの発現が見られないことを確認したうえ

ロモーター領域に３箇所の点変異を導入されたウ

で ， A/WSN/33 （H1N1） 由 来 の PB2 ， PB1 ，イルス遺伝子が，野生型ウイルス遺伝子と比べてPA，およびNPタンパク質の各発現プラスミドを高い転写・複製効率を備えることを示す。

導入して，２日間培養後のGFP発現を検証した。

3 . 2 レトロウイルスベクターからの組換えウ

すべての細胞株においてGFPの発現が見られたが ，特 に RV/PolIGG-PM-HA（0）GFP（0）感

イルス遺伝子発現の確認
作出した各レトロウイルスベクターが，培養細染DF-１細胞におけるGFP発現が明瞭だった。さ胞内において組換えウイルス遺伝子PM-HA（0）ら に ，各 ピ ュ ー ロ マ イ シ ン 耐 性 細 胞 株 へ A/

GFP（0）を発現することを確認するため，RV/

WSN/33（H1N１）をMOI＝0.1で感染させたとPolI-PM-HA （0）GFP （0）, RV/PolIGG-PM-

ころ，すべての細胞株において感染12時間以内にHA（0）GFP（0），およびRV/PolICL-PM-HA（0）GFPの発現が見られたが，特にRV/PolIGG-PM-

GFP（0）を，Ａ549細胞，DF-１細胞，およびHA（0）GFP（0）感染DF-１細胞におけるGFPMDCK細胞へ，それぞれ感染させた。各感染細発現が明瞭だった。これらの結果は，３種の動物

胞を２日間培養して，いずれの細胞でもGFPの発種に由来する培養細胞をベースとして組換えウイ© The Ito Foundation感染性Ａ型インフルエンザウイルスの迅速検出系の確立

315

Fig. 2 GFP expression in recombinant influenza virus-like RNA-expressing cells upon virus infection. RV/PolIGG-PM-

HA（0）GFP（0）-transduced Puromycin-resistant DF-1 cells were infected with A/WSN/33（H1N1）（MOI＝0.1）
and stained with anti-influenza A viral NP monoclonal antibody at 12 hour post-infection. The stained cells wereobserved under fluorescent microscopy for detection of green（a, indicating the GFP expression）and red（b,indicating the influenza A viral NP expression）signals. The white arrows indicate the identical cells in eachfigure.

ルス遺伝子安定発現細胞株が樹立されたこと，中感染性Ａ型インフルエンザウイルス検出の感度をでも鶏由来DF-１細胞をベースとした細胞株が感検証するため，RV/PolIGG-PM-HA（0）GFP（0）染性Ａ型インフルエンザウイルスの迅速な検出に感染ピューロマイシン耐性DF-１細胞株へA/最も有用なことを示す。

WSN/33（H1N1）をMOI＝0.1で感染させて12時

3 . 4 感染性Ａ型インフルエンザウイルス検出

間培養した後，ウイルス感染細胞を免疫蛍光染色法により検出した。ウイルス感染陽性細胞のうちの特異性および感度の検証
組換えウイルス遺伝子安定発現細胞株を用いた

約 ５ ％ に お い て の み ，GFP の 発 現 が 見 ら れ た

感染性Ａ型インフルエンザウイルス検出の特異性（Fig. ２）
。 こ れ ら の 結 果 は ， 樹 立 し た RV/を検証するため，
RV/PolIGG-PM-HA（0）GFP（0）

PolIGG-PM-HA（0）GFP（0）感染ピューロマ

感染ピューロマイシン耐性DF-１細胞株へ，宿主

イシン耐性DF-１細胞のうち，Ａ型インフルエンや亜型の異なるＡ型インフルエンザウイルス８

ザウイルスの感染に応答してGFPを発現する細胞株，Ｂ型インフルエンザウイルスとニューカッス

は限定的であることを示す。

ル病ウイルス各１株（Table１）をそれぞれMOI

今後，樹立した組換えウイルス遺伝子安定発現＝0.1で感染させ，GFP発現を検証した。Ａ型イ細胞株のクローニングなど，GFP発現効率の改善

ンフルエンザウイルス８株すべてで，感染後12時へ向けた取り組みが必要なものの，これらの細胞間以内にGFPの発現が見られた一方，Ｂ型インフ株は感染性Ａ型インフルエンザウイルスの迅速なルエンザウイルスまたはニューカッスル病ウイル検出に有用となる。

スを感染させた細胞ではGFPの発現が見られなかった。これらの結果は，樹立したRV/PolIGG-

４．要約

PM-HA（0）GFP（0）感染ピューロマイシン耐

感染性Ａ型インフルエンザウイルスの速検出法

性DF-１細胞株において，Ａ型インフルエンザウを確立するため，ヒト，鶏，犬由来の各培養細胞

イルス感染特異的にGFPを発現したことを示す。

をベースに，緑色蛍光タンパク質（GFP）レポー

組換えウイルス遺伝子安定発現細胞株を用いた

ター遺伝子をコードした組換えウイルス遺伝子を© The Ito Foundation

316

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

安定的に発現する細胞株を，それぞれレトロウイに有用となる。

ルスベクターを用いて樹立した。これらの細胞株
は，ウイルス遺伝子の転写・複製を担うウイルス
タンパク質の各発現プラスミドの導入，ならびにＡ 型 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 実 験 室 株 A/
WSN/33（H1N1）の感染に応答して，GFPを発現した。樹立した細胞株の中でも最もGFP発現が明瞭だった鶏由来の組換えウイルス遺伝子安定発
現細胞株は，多様な亜型のＡ型インフルエンザウ
イルスの感染に応答して，感染後12時間以内にGFPを発現した一方で，Ｂ型インフルエンザウイ
ルスまたはニューカッスル病ウイルスを感染させた場合にはGFPを発現しなかった。抗ウイルスタ
ンパク質抗体を用いた免疫蛍光染色法により，Ａ
型インフルエンザウイルスを感染させた鶏由来組換えウイルス遺伝子安定発現細胞株の中で，実際にGFPを発現した細胞は約５％のみであった。今後，樹立した組換えウイルス遺伝子安定発現細胞株のクローニングなど，GFP発現効率の改善へ向文
献１） Watanabe, T., Watanabe, S., Noda, T., Fujii, Y.,
Kawaoka, Y.：Exploitation of nucleic acid packaging
signals to generate a novel influenza virus-based
vector stably expressing two foreign genes, J
Virol，77，10575～10583，2003．
２） Neumannm G,, Hobomm G.：Mutational analysis
of influenza virus promoter elements in vivo, J Gen
Virol, 76（Pt7），1709～1717，1995．
３） Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S.,
Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y.：Establishmentof canine RNA polymerase I-driven reverse
genetics for influenza A virus：its application for
H5N1 vaccine production, J Virol，82，1605～1609，
2008．
４） Ozawa, M., Shimojima, M., Goto, H., Watanabe, S.,
Hatta, Y., Kiso, M., Furuta, Y., Horimoto, T., Peters,
N. R., Hoffmann, F. M., Kawaoka, Y.：A cell-based
screening system for influenza A viral RNA
transcription/replication inhibitors, Sci Rep，3，1106，
2013．
５） Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S.,
Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R.,
Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y.：Generationof influenza A viruses entirely from cloned cDNAs,
Proc Natl Acad Sci USA，96，9345～9350，1999．

けた取り組みが必要なものの，これらの細胞株は感染性Ａ型インフルエンザウイルスの迅速な検出© The Ito Foundation

317

肉用牛生産におけるアシドーシス予防をめざした
ルーメン内乳酸代謝性細菌群の特定
Profiling of lactic acid metabolizing bacterial group in the rumen toprevent from rumen acidosis in beef cattle production

福

間

直

希

（帯広畜産大学）

Naoki Fukuma（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Feeding high grain diet to cattle can lead to an accumulation of lactate and reduced
buffering capacity in the rumen, known as ruminal acidosis. To minimize the effect of ruminal
acidosis, maintaining the activity of bacterial community scavenging lactate is important.
However, only small number of cultivated species have been reported as lactate utilizers, suchas Megasphaera elsdenii, Selenomonas ruminantium, Coprococcus catus, Veillonella parvula, andAnaerovibrio lipolyticus. In the present study, lactate-metabolizing bacterial community wasenriched by in vitro anaerobic culturing, and community structure was analyzed using Next
Generation Sequencing. For the DNA Amplicon-seq, partial bacterial 16S rRNA genes（theV3-V4 region）were amplified and sequenced using the Illumina MiSeq platform. The raw 16S
rRNA gene sequence data were analyzed by QIIME version 1.9.1. The MiSeq provided 206,361
sequences per sample, which was considered as enough quantity for microbial community
analysis. Results showed that some OTUs belonging to genus Selenomonas and Lactobacillus
were detected in the enriched culture. According to BLAST analysis, OTUs related to S.
ruminantium, a variety of Lactobacillus species, Pediococcus pentosaceus, and Allisonella
histaminiformans were indicated as lactate-metabolizing bacteria. These findings suggest thatminor bacterial species in the normal rumen are responsible for lactate metabolism.

１．目引される。これら代謝性疾患による死廃事故は牛的死 廃 用 頭 数 の 約 20 ％ を 占 め る と 報 告 さ れ て い

近年，肉用牛生産の効率化および肉質の高品質

る１）。よって，肉用牛生産においてアシドーシス化を図るために濃厚飼料を増給した家畜生産が行を予防することは経済的損失を防ぐためにきわめわれており，その際にアシドーシスを発症させるて重要な課題といえる。

ことがある。アシドーシスは第一胃（ルーメン）

アシドーシスの発症にはルーメン内の乳酸が大内発酵の停滞および牛個体の採食量の低下を招きく関与している。濃厚飼料に含まれるデンプン

き，鼓脹症，第一胃炎，肝膿瘍，蹄葉炎などが誘は，ルーメン内でデンプン分解菌により急速な分© The Ito Foundation

318

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

解・発酵を受け，最終発酵産物として乳酸が産生精製したDNAの16S rRNA遺伝子をPCR増幅される。乳酸が過剰蓄積されると，ルーメン内

し，MiSeqを用いてＶ３-Ｖ４領域の配列を解読

pHが低下する。これにより大部分のルーメン細した。得られた配列データを元に解析を行い，各菌が死滅し，発酵の停滞や採食量の低下を招く。

配 列 の 属 レ ベ ル お よ び Operational Taxonomic

したがって，乳酸の蓄積はアシドーシスの主要因

Unit（OTU）レベルでの系統分類を特定した。

であり，濃厚飼料増給下で乳酸の蓄積を解除する

イノキュラムの菌叢と集積培養物の菌叢を比較ことがアシドーシス予防の鍵を握る。本研究課題

し，集積培養により存在量が増加した属およびでは，ルーメン内で乳酸を代謝しうる細菌群を網OTUを乳酸代謝性細菌として特定した。分類群

羅的に特定することを目的とした。

の詳細を把握するために，各OTUの代表配列を

２．方

BLAST解析し，最近縁の細菌種との相同性を評

法

価した。

供試動物として，帯広畜産大学の畜産フィール
ド科学センター内で飼養されているカニューレ装

３．結果と考察

着済みのホルスタイン牛を用いた。牛個体ごとの次世代シーケンサー解析による取得塩基配列数

菌叢の差異を評価するため，４頭の牛（個体番号をTable１に示す。本試験で供試した８サンプル#298，#382，#663，#665）を使用した。ルーメ

からは，最も少ないもので93,837配列，平均でン内容物をカニューレから採取した後にガーゼで206,361配列を取得した。取得した配列の約93％

濾過し，得られたルーメン液をイノキュラムとしが菌叢解析に必要なクオリティーを満たしていて以下の試験に用いた。

た。次世代シーケンスによる菌叢解析では数万配

牛ルーメン内の乳酸代謝性細菌群を選抜するた列程度の解析深度があれば環境中の細菌種を検出

め，乳酸を唯一の炭素源とする培地 で集積培養可能であるという報告があり４），今回解析に用いを行った。培地20mlにルーメン液を0.1ml接種し，た配列数は十分であると考えられた。

２）

39℃で48時間のin vitro集積培養を行った。培地

細菌叢の群集構造解析の結果をTable２に示す。

作製から培養終了まではすべて嫌気条件下で行っ集積培養前のルーメン液内の菌叢は他の多くの報た。採取したルーメン液および集積培養物から遠告 ５）にあるとおりFirmicutes（41.68％）および

心分離により菌体を回収した。菌体からRBB＋

Bacteroidetes（42.28％）が優占的な分類門としてＣ法３）に従い，微生物由来DNAの抽出・精製を

検 出 さ れ た 。属 レ ベ ル の 分 類 群 と し て は行った。

Prevotellaが最優占（34.09％）であった。これら

Table 1 Number of sequences obtained and analysed in this study
Samples

Rumen Fluid

Lactate Enrichment

Mean

S.D．

121,924

206,361

74,333

144,385

114,220

191,61168,544

93.8％

93.7％

92.9％

#298

#382

#663

#665

#298

#382

#663

#665

Total Reads

255,273

277,380

279,673

93,837

263,982

204,935

153,884

Reads Passing Quality
Filtering

235,755

255,075

258,548

86,507

247,853

190,542％Reads Passing Quality
Filtering

92.4％

92.0％

92.4％

92.2％

93.9％

93.0％

© The Ito Foundation

319

肉用牛生産におけるアシドーシス予防をめざしたルーメン内乳酸代謝性細菌群の特定
Table 2 Distribution of taxa detected in the rumen fluid and lactic-acid enrichment culture
Taxonomyphylum Firmicutes

Rumen Fluid
#298

#382

#663

Lactate Enrichment

#665

Mean

#298

#382

#663

#665

Mean

45.44％ 34.01％ 37.47％ 49.80％ 41.68％

98.00％ 96.13％ 98.18％ 98.21％ 97.63％

unclassified family Lactobacillaceae
genus Lactobacillus

0.02％
0.01％

0.02％
0.01％

0.02％
0.02％

0.00％
0.02％

0.02％
0.01％

3.47％ 11.29％ 5.83％ 6.29％ 6.72％
7.05％ 24.78％ 12.54％ 26.27％ 17.66％

genus Pediococcus

0.00％

0.00％

0.00％

0.00％

0.00％

1.40％

0.04％

0.32％

0.22％

0.50％

genus Streptococcus

0.36％

0.72％

0.27％

0.78％

0.53％

0.01％

0.03％

0.00％

0.04％

0.02％

order Clostridiales

11.62％

6.89％

7.00％ 11.15％

9.17％

0.31％

0.81％

0.16％

0.34％

0.40％

unclassified family Clostridiaceae
genus Clostridium

0.51％
0.00％

0.36％
0.00％

0.42％
0.00％

0.90％
0.00％

0.55％
0.00％

0.01％
0.00％

0.02％
0.00％

0.01％
0.00％

0.01％
1.95％

0.01％
0.49％

unclassified family Lachnospiraceae

4.87％

2.85％

4.63％

3.86％

4.05％

0.10％

0.26％

0.13％

0.12％

0.15％

genus Butyrivibrio

5.95％

4.18％

6.66％

9.67％

6.61％

0.08％

0.38％

0.14％

0.19％

0.20％

genus Pseudobutyrivibrio

3.47％

2.66％

2.20％

1.84％

2.54％

0.00％

0.00％

0.00％

0.00％

0.00％

genus Shuttleworthia

0.58％

1.05％

0.31％

0.25％

0.55％

0.02％

0.02％

0.00％

0.01％

0.01％

unclassified family Ruminococcaceae
genus Ruminococcus
unclassified family Veillonellaceae
genus Selenomonas
genus Succiniclasticum
phylum Bacteroidetes
order Bacteroidales
unclassified family Paraprevotellaceae
genus CF231
genus YRC22
genus Prevotella
unclassified family RF16

0.15％ 0.77％ 0.15％ 0.28％ 0.34％
0.14％ 0.12％ 0.09％ 0.19％ 0.14％
0.01％ 0.03％ 0.01％ 0.02％ 0.02％
85.16％ 57.35％ 78.72％ 62.18％ 70.85％
0.10％ 0.22％ 0.09％ 0.11％ 0.13％
1.66％ 3.47％ 1.59％ 1.50％ 2.05％
0.12％ 0.42％ 0.08％ 0.19％ 0.20％
0.02％ 0.04％ 0.02％ 0.01％ 0.02％
0.00％ 0.05％ 0.00％ 0.00％ 0.01％
0.05％ 0.07％ 0.09％ 0.06％ 0.07％
1.35％ 2.43％ 1.29％ 1.11％ 1.54％

phylum Euryarchaeota
genus Methanobrevibacter
phylum SR1
unclassified SR1phylum Spirochaetes

6.38％ 5.19％ 5.30％ 8.74％ 6.40％
4.16％ 1.13％ 4.29％ 5.32％ 3.73％
0.93％ 1.10％ 0.64％ 1.35％ 1.00％
1.52％ 3.97％ 1.05％ 0.79％ 1.83％
5.06％ 3.89％ 4.66％ 5.13％ 4.69％
38.28％ 46.26％ 49.28％ 35.32％ 42.28％
2.07％ 3.40％ 1.36％ 2.98％ 2.45％
0.36％ 0.53％ 0.78％ 0.23％ 0.48％
0.29％ 0.87％ 0.35％ 0.50％ 0.51％
1.36％ 1.64％ 2.99％ 1.98％ 1.99％
31.62％ 37.12％ 40.67％ 26.98％ 34.09％
2.58％ 2.69％ 3.13％ 2.65％ 2.76％
5.11％ 10.29％ 4.17％ 5.58％ 6.29％
5.11％ 10.29％ 4.17％ 5.58％ 6.29％
3.93％ 0.53％ 2.72％ 1.01％ 2.05％
3.93％ 0.53％ 2.72％ 1.01％ 2.05％
1.87％ 2.56％ 0.81％ 1.72％ 1.74％
1.87％ 2.56％ 0.81％ 1.72％ 1.74％
0.59％ 1.41％ 1.60％ 1.00％ 1.15％
0.59％ 1.41％ 1.60％ 1.00％ 1.15％
0.98％ 1.34％ 0.70％ 1.06％ 1.02％
0.98％ 1.34％ 0.70％ 1.06％ 1.02％
0.50％ 1.10％ 0.55％ 1.13％ 0.82％
0.50％ 1.10％ 0.55％ 1.13％ 0.82％
0.89％ 0.29％ 0.84％ 0.75％ 0.69％
0.89％ 0.29％ 0.84％ 0.75％ 0.69％
0.36％ 0.50％ 0.72％ 1.13％ 0.68％
0.36％ 0.50％ 0.72％ 1.13％ 0.68％
0.33％ 1.24％ 0.50％ 0.37％ 0.61％

genus Treponema
phylum TM7
unclassified family F16
phylum Planctomycetes
unclassified family Pirellulaceae

0.33％
0.88％
0.88％
0.85％
0.85％

phylum Fibrobacteres
genus Fibrobacter
phylum Actinobacteria
unclassified family Coriobacteriaceae
phylum Verrucomicrobia
unclassified family RFP12
phylum Tenericutes
genus Anaeroplasma
phylum Lentisphaerae
unclassified family Victivallaceae
phylum Proteobacteria
genus Succinivibrio

1.24％
0.20％
0.20％
0.27％
0.27％

0.50％
0.48％
0.48％
0.16％
0.16％

0.37％
0.61％
0.61％
0.52％
0.52％

© The Ito Foundation

0.61％
0.54％
0.54％
0.45％
0.45％

0.11％
0.00％
0.00％
0.11％
0.11％
0.04％
0.04％
0.01％
0.01％
0.04％
0.04％
0.01％

0.46％
0.01％
0.01％
0.07％
0.07％
0.04％
0.04％
0.05％
0.05％
0.08％
0.08％
0.03％

0.11％
0.00％
0.00％
0.11％
0.11％
0.01％
0.01％
0.02％
0.02％
0.02％
0.02％
0.01％

0.13％
0.00％
0.00％
0.03％
0.03％
0.04％
0.04％
0.02％
0.02％
0.04％
0.04％
0.04％

0.20％
0.00％
0.00％
0.08％
0.08％
0.03％
0.03％
0.03％
0.03％
0.05％
0.05％
0.02％

0.01％
0.03％
0.03％
0.00％
0.00％
0.00％

0.03％
0.09％
0.09％
0.00％
0.00％
0.00％

0.01％
0.03％
0.03％
0.00％
0.00％
0.00％

0.04％
0.04％
0.04％
0.01％
0.01％
0.00％

0.02％
0.05％
0.05％
0.00％
0.00％
0.00％

0.00％
0.04％
0.04％
0.04％
0.04％

0.00％
0.02％
0.02％
0.02％
0.02％

0.00％
0.02％
0.02％
0.01％
0.01％

0.00％
0.03％
0.03％
0.03％
0.03％

0.00％
0.03％
0.03％
0.02％
0.02％

320

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）の傾向は本試験で用いた４個体通して確認されLongY６に近縁であり，それぞれ44.45％およびた。一方で，乳酸培地で集積培養後の細菌叢は大26.05％を占めていた。本研究で集積された16の部分をFirmicutesが占め（97.63％），Bacteroidetes

OTUのうち12のOTUがLactobacillus属細菌に近やFibrobacteresをはじめとする他の分類門はルー縁であった（L. plantarum, L. mucosae, L. panis,

メン液内と比較して存在量が減少した。

L. oris, L. brevis, L. secaliphilus, L. paracasei, L.

Firmicutes の 中 で は Selenomonas（70.85 ％ ）とpentosus, L. rapi）。こ の こ と か ら ，ル ー メ ン 内

Lactobacillus （17.66 ％ ） お よ び 未 分 類 のLactobacillus属細菌の多様な種が乳酸利用能を保Lactobacillaceae（6.72 ％ ）が 優 先 的 な 分 類 群 で有していることが示された。また，その他の２つあった。ルーメン内の乳酸利用菌として知られるの OTU は ， Pediococcus pentosaceus お よ び

Megasphaera, Coprococcus, Veillonella お よ び

Allisonella histaminiformansと99％以上の相同性

Anaerovibrioは本試験で用いたルーメン液からはを示したことから，これらの細菌種がルーメン内検出されなかった。

の乳酸代謝に貢献している可能性も示唆された。

乳酸培地による集積培養により，16のOTUレ

これら以外のOTUは通常のルーメン内の存在量

ベルでのグループがルーメン液中の存在量よりもは0.1％未満であることから，ルーメン内ではマ高密度で検出された。これらOTUの同定を行う

イナーな細菌種により，他菌種によって産生されため，各OTUの配列情報を取得しBLAST解析をた乳酸が代謝されている可能性が示された。

行った（Table３）。最優勢であった２つのOTUは
Selenomonas 属 の 細 菌 種 S. ruminantium subsp.
lactilytica TAM6421およびS. ruminantium strain

４．要約

反芻家畜生産においては，アシドーシスの原因

Table 3 The nearest relative of OTUs identified as lactic-acid metabolizing bacterial group#OTU ID

Relative abundance
（％）
RF＊
LE＊＊

Accession#

99436

1.022

44.648AP012292.1

2393860.325

26.053

EU327402.1

160548

0.004

5.844

MG754561.1

New.ReferenceOTU1100
4336763550894431608
725198518033
New.ReferenceOTU1712
773251

0.003
0.005
0.001
0.001
0.001
0.003
0.016
0.003

5.657
4.265
2.895
1.915
1.292
0.715
0.676
0.534

MF975714.1
MF099894.1
KP317736.1
MH045715.1
AM411002.1
MH045714.1
AB362751.1
MH045193.1

215963338852
New.ReferenceOTU2298

0.001
0.001
0.000

0.475
0.322
0.305

NR_028862.1
MG597114.1
KU985242.1

7129713851582

0.000
0.000

0.291
0.231

MF099894.1
KX010101.1

Description
Selenomonas ruminantium subsp. lactilytica
TAM6421
Selenomonas ruminantium strain LongY6
Lactobacillus plantarum strain Sourdough_
K11
Lactobacillus mucosae strain GML-6
Lactobacillus panis strain C-M2
Lactobacillus oris strain L75
Lactobacillus brevis strain CDB6
Lactobacillus secaliphilus strain TMW 1.1313
Lactobacillus paracasei strain CDB4
Lactobacillus pentosus strain NRIC 1830
Pediococcus pentosaceus strain P10

Identities （％）
462 ／ 465

99.4

461 ／ 465

99.1

453 ／ 465

97.4

462 ／ 465
462 ／ 465
462 ／ 465
463 ／ 465
454 ／ 465
462 ／ 465
463 ／ 465
462 ／ 465

99.4
99.4
99.4
99.6
97.6
99.4
99.6
99.4

Allisonella histaminiformans strain MR2
Lactobacillus mucosae strain R6

462 ／ 465
464 ／ 465

99.4
99.8

Lactobacillus plantarum strain UNQLp27
Lactobacillus panis strain C-M2
Lactobacillus rapi strain GeFf

463 ／ 465
462 ／ 465
463 ／ 465

99.6
99.4
99.6

＊RF, Rumen fluid＊＊LE, Lactate enrichment© The Ito Foundation

肉用牛生産におけるアシドーシス予防をめざしたルーメン内乳酸代謝性細菌群の特定となりうるルーメン内の乳酸蓄積を解消することが重要である。本研究では，乳酸代謝能を保有するルーメン内細菌種を網羅的に特定することを目的とし，乳酸培地による集積培養を行い培養物内の菌叢の群集構造解析を行った。本研究の結果から，S. ruminantiumが乳酸代謝性細菌群の大部分を占める優占種であることが示された。乳酸産生菌として知られるLactobacillus属細菌種のうち，多様な細菌種が乳酸代謝能を保有することが示された。また，通常のルーメン内では存在量が

321

文
献
１） 農林水産省：平成26年度家畜共済統計，2015．
２） Sato, T., Matsumoto, K., Okumura, T., Yokoi, W.,
Naito, E., Yoshida, Y., Nomoto, K., Ito, M., Sawada,
H. ： FEMS Microbiol. Ecol. ， 66 （3）， 528 ～ 36 ，
2008．
３） Yu, Z., Morrison, M.：BioTechniques，36，808～
812，2004．
４） Zheng, W., Tsompana, M., Ruscitto, A., Sharma, A.,
Genco, R., Sun, Y., Buck, M. J. ： Microbiome ， 3 ，48，2015．
５） Henderson, G., Cox, F., Ganesh, S., Jonker, A,
Young, W., Global Rumen Census Collaborators,
Janssen, P. H.：Scientific Reports，5，14567，2015．

0.1％未満のマイナーな細菌種により，乳酸が代謝されている可能性が示された。

© The Ito Foundation

322

食肉家畜における原虫感染症の血清診断法の開発と血清疫学的研究
Development of serodiagnosis system for protozoan parasite infection infood animals and its seroepidemiological study

西

川

義

文・正

谷

達

謄＊

（帯広畜産大学原虫病研究センター，＊鹿児島大学共同獣医学部）

Yoshifumi Nishikawa and Tatsunori Masatani＊（National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture andVeterinary Medicine，＊Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Diseases which cause damage on livestock production are reproductive disorders and calf
diarrhea by infections with pathogen. Pathogenic protozoan parasites, Toxoplasma gondii and
Neospora caninum cause reproductive disorders, and Cryptosporidium parvum triggers calf
diarrhea. In this study, we aimed to develop serodiagnosis system for the infection with thesepathogenic protozoan parasites and perform seroepidemiological studies in Hokkaido, Miyazaki
and Kagoshima prefectures in Japan. Based on the results from antigen screening andvalidation with the reference tests, we confirmed effectiveness of Cryptosporidium antigens
CpP23 and CpGP15, Neospora antigen NcSAG1 and Toxoplasma antigen TgGRA7. The ELISA
based on CpP23 and CpGP15 revealed that neonatal calf diarrhea associated with highseroprevalence of Cryptosporidium. The ELISA with NcSAG1 showed that seroprevalence rate
in abortion outbreak was significantly higher compared with farms with no record ofneosporosis. Although seroprevalence of anti-TgGRA7 was confirmed in Hokkaido andMiyazaki, further analysis should be required because of lower antibody levels. Thus,
seroepidemiological studies using ELISAs with these antigens showed infection risk in cattle in
Hokkaido and southern Kyushu. In order to minimize the damage of livestock production, early
diagnosis of the pathogenic protozoan infection should be required. Our results suggest
necessity of continuous survey for these protozoan infection in livestock in Japan.

１．目の繁殖障害と子牛の下痢症があげられる。しか的し，寄生虫感染症の研究については横断的な解析

食の安全性が注目されている現代で，食肉を介が十分になされていないのが現状である。我が国した人畜共通感染症に対応しヒトへの影響を抑えの食肉家畜における寄生虫感染症では，下痢症のることが緊急課題とされている。また，農場経営原因となるクリプトスポリジウム（Cryptosporidumを進める上で家畜生産に損害を与える疾病に注意

１）
spp.）
，繁 殖 障 害 の 原 因 と な る ネ オ ス ポ ラする必要があり，特にその２大疾病として感染性

２）（Neospora caninum）
およびトキソプラズマ© The Ito Foundation

食肉家畜における原虫感染症の血清診断法の開発と血清疫学的研究

323（Toxoplasma gondii）３）の汚染が現場レベルで危DNAからPCR法により４種類の候補遺伝子，

惧されているが，その実態は不明である。

CpP23，CpP2，CpGP15およびCpGP60を増幅した。

クリプトスポリジウムは，ヒトを含む脊椎動物

PCR 産 物 を そ れ ぞ れ 大 腸 菌 発 現 用 ベ ク タ ーの消化管などに寄生する原虫である。クリプトス

pGEX-6P1にクローニングし，グルタチオンＳトポリジウム・パルバム（遺伝子型１または２）はランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質とし病原性原虫としては唯一感染症法により特定病原て大腸菌で発現させた。大腸菌の可溶性画分から体等（四種病原体）に指定されており，ヒトや新グ ル タ チ オ ン ビ ー ズ を 用 い て CpP23 ，CpP2 ，

生子牛に重篤な下痢症を引き起こし，特に畜産業

CpGP15およびCpGP60の組換えタンパク質を作における生産性や公衆衛生的な観点からも汚染対製した４）。

策が急務となっている。ネオスポラは，牛・羊・

2.2

山羊，鹿などに感染する細胞内寄生性原虫であ

ネオスポラNc１株よりRNAを抽出し，RT-る。特に牛には流産，死産あるいは子牛の神経症

PCR法により20種類の候補遺伝子を増幅した。

状を主徴とする異常産を高率に引き起こす。ネオ

PCR産物をそれぞれ哺乳動物細胞発現用ベクター

スポラの感染例が世界中で報告されており，子牛

p3XFLAG-CMV-14にクローニングし，293Ｔ細と搾乳量の損耗などによる獣医・畜産領域での経胞へトランスフェクションすることで哺乳動物細

済的損失はきわめて大きい。細胞内寄生原虫のト胞内で発現させた。当該細胞から可溶性画分を調

キソプラズマによって引き起こされるトキソプラ

整し，抗原ライセートを作製した。ELISA法にズマ症は，世界的な広がりを見せる重要な人獣共よりネオスポラのマウス抗血清に対する反応性を通感染症である。ヒトでは妊婦が初感染した場

比 較 し ，抗 原 性 の 高 い 抗 原 と し て NcGRA6 ，合，流・死産や先天性トキソプラズマ症を引き起NcGRA7，NcSAG１を選定した。前述の方法にこすほか，エイズ患者や免疫抑制剤の投与を受けより，NcGRA6，NcGRA7，NcSAG１のGST融ている患者にトキソプラズマ性脳炎を起こすこと

合タンパク質を大腸菌で発現させ，組換えタンパが知られている。また，トキソプラズマの家畜へ

ク質を作製した４）。

ネオスポラの診断用抗原の作製の感染は直接的損耗による経済的被害だけではな

2.3

く，食肉を介してヒトに感染するリスクがあるこ

ト キ ソ プ ラ ズ マ PLK 株 よ り RNA を 抽 出 し ，とから，公衆衛生上きわめて重要な問題である。

RT-PCR法により39種類の候補遺伝子を増幅しそこで本研究では「家畜における原虫感染症のた。PCR産物をそれぞれ哺乳動物細胞発現用ベク

血清診断法の開発と血清疫学的研究」を提案し，

ターp3XFLAG-CMV-14にクローニングし，293

クリプトスポリジウム，ネオスポラ，トキソプラ

Ｔ細胞へトランスフェクションすることで哺乳動ズマの血清診断法を開発するとともに，我が国に物細胞内で発現させた。当該細胞から可溶性画分

おける食肉用家畜の原虫汚染リスクの基礎データを調整し，抗原ライセートを作製した。ELISAを取得することを目的とした。

法によりトキソプラズマのマウス抗血清に対する２．方トキソプラズマの診断用抗原の作製

反 応 性 を 比 較 し ，抗 原 生 の 高 い 抗 原 と し て法

TgGRA ７ を 選 定 し た 。前 述 の 方 法 に よ り ，

2 . 1 クリプトスポリジウムの診断用抗原の作製

TgGRA７のGST融合タンパク質を大腸菌で発現

ク リ プ ト ス ポ リ ジ ウ ム・パ ル バ ム の ゲ ノ ム

させ，トロンビン処理によりGSTを除いた組換え© The Ito Foundation

324

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

タンパク質を作製した５）。
2.4または抗牛horseradish peroxidase（HRP）標識

ELISA法total IgGを使用した４，５）。

組換えタンパク質を0.1µＭ，抗原ライセートを

2.5

被検血清

約 １ µg/ml と な る よ う に carbonate-bicarbonate

北海道の家畜保健衛生所，岩手大学，鹿児島大buffer （pH9.6） で 希 釈 し ， F96 MAXISORP

学，宮崎大学より提供された牛血清をELISA法

NUNC-IMMUNO PLATEに50µlずつ加えて４℃の評価に供した。

で 一 晩 保 存 し た 。 0.05 ％ Tween20 含 有 PBS（PBS-T）で洗浄後，３％スキムミルク含有PBS

３．結果と考察に よ り 37 ℃ で １ 時 間 ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た 。

クリプトスポリジウム抗体陽性牛血清（10検PBS-Tで洗浄後，３％スキムミルク含有PBSによ体）と陰性牛血清（10検体）を用いて，クリプト

り250倍希釈した１次抗体を50µlずつ加え37℃でスポリジウム抗原CpP23，CpP2，CpGP15および１時間反応させた。PBS-Tで６回洗浄後，３％

CpGP60 の 反 応 性 を ELISA 法 に よ り 比 較 し た

スキムミルク含有PBSにより10,000倍希釈した２（Fig.１）。CpP２では陽性牛血清に対する反応性

次抗体を50µlずつ加え37℃で１時間反応させた。

が認められなかったが，その他の抗原については

PBS-Tで６回洗浄し，基質溶液（0.1M citic acid,

陽性牛血清に対する特異的な反応が確認された。

0.2 M sodium phosphate，0.003％ H ２ O ２ , 0.1mg/

反応性の優れていたCpP23とCpGP15について，

ml 2,2ʼ-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-

野外牛血清を用いて解析を行った。北海道と岩手

sulphonic acid））を用いて暗室で１時間反応さ

県の牛血清を用い，下痢発生の頻度とクリプトス

せ，415nmにおける吸光度を測定した。１次抗体

ポリジウム抗体陽性の関連性を比較した（Table

はマウス血清または牛血清，２次抗体は抗マウス

１）。CpP23とCpGP15の反応性について単一抗原

Fig. 1 ELISA with recombinant antigens using sera from a farm with confirmed Cryptosporidium parvum-associateddiarrhea. Positive controls（PC, n＝10）and negative controls（NC, n＝10）were from the sera of cattle previously
infected with C. parvum and those of neonatal cattle before being given colostrum, respectively. Solid lines indicate
average values of the samples．＊indicates significant differences between positive and negative sera in CpP23, CpGP15,
and CpGP60 as determined by Student's t-test（ p＜0.01）．

© The Ito Foundation

325

食肉家畜における原虫感染症の血清診断法の開発と血清疫学的研究
Table 1 Seroprevalence of Cryptosporidium in Hokkaido, Iwate and Kagoshima Prefectures.
No. positive（％）

Neonatal calf diarrhea

Place

No. tested

CpP23

CpGP1513＊＊（9.8）

3＊＊（2.3）

both

25＊＊（18.8）

either

few

Iwate

133

19＊＊（14.3）

manyHanamaki, Iwate

92

39（42.4）

13（14.1）8（8.7）

44（47.8）

many（C. parvum related）
many（C. parvum related）

Shizukuishi, Iwate
Obihiro, Hokkaido

66
145

15（22.7）
75（51.7）

11（16.7）
94（64.8）5（7.6）
57（39.3）

21（31.8）
112（77.2）

303

129＊＊（42.6） 118＊＊（38.9） 70＊＊（23.1）

subtotal

177＊＊（58.4）＊＊The seroprevalences of each antigen were siginificantly higher in farms with many diarrhea cases than in the farms with few diarrhea

cases（Chi-square test, p＜0.01）．
Blood samples were collected in 2016．
Place in Kagoshima No. tested

No. positive（％）of anti-CpP23

Satsumasendai
Hioki

22
32

21（95.5％）32（100％）Kagoshima
Yuusui124
22

124（100％）
22（100％）Blood samples were collected in 2014-2015．

陽性の検体が複数存在していたため，いずれかの特異抗体の陽性率に着目した。下痢の発生頻度が低い農場ではクリプトスポリジウム抗体陽性率が18.8％であったが，下痢の発生頻度が高い農場（毎月発生）では58.4％となり，農場における下痢の発生とクリプトスポリジウム感染の関連性が推測された（p＜0.01）。鹿児島県での下痢の発生
頻度が高い農場から採材した血清では，４地域でほぼ100％の抗体陽性率であった（Table１）。今回の結果により，農場における下痢の発生とクリ
プトスポリジウム感染の関連性が示唆された。ク
リプトスポリジウム抗原CpP23とCpGP15を組み合わせたELISA法はクリプトスポリジウム感染の履歴を把握することができ，糞便サンプルを用いたクリプトスポリジウム検査と併用することで効果的な防疫対策が実施できると考える。
我が国のネオスポラ症確定診断には免疫染色法（IHC）による流産胎子からの抗原検出が必要である。一方，簡易血清診断では間接蛍光抗体法（IFAT）が使用されている。そこで，ネオスポ
ラの抗原スクリーニングにより選定した
NcSAG1，NcGRA6，NcGRA７を用いたELISA

Fig. 2 ELISA with recombinant antigens（A ： NcSAG1,

B：NcGRA7. C：NcGRA6）using bovine sera confirmed
neosporosis（IHC）and Neospora antibodies（IFAT）.
IHC-positive samples（n＝9）and IFAT-single positive
samples（n＝12）were used. Solid lines indicate
average values of the samples ．＊ indicates significant
differences as determined by Studentʼs t-test（ p＜0.05）．

© The Ito Foundation

326

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 2 Seoprevalence of Neospora caninum in a cattle herd with abortion case in Hokkaido and Kagoshima Prefectures.
Number of NcSAG1
Ab-positive（percentage）

year of sampling278

207（74.5％）

2010

171（Lactation period）

139（81.3％）

75（Dry period）

49（65.3％）

32（First pregnancy）

19（59.4％）

B

abortionｂ

62

22（35.5％）

2010C

abortionｃ

55

32（58.2％）

2013D

abortionｄ100

8（8.0％）

2012E

abortionｅ40

4（10.0％）2012

F

no record of neosporosis at sampling594

104（17.5％）

2007-2009G

no record of neosporosis at sampling240

63（26.3％）

2010-2011

Sample number in acattle herd

Place in Hokkaido

CategoryA

abortion outbreakａ

ａ37 cases of abortion occurred in 2010, and neosporosis was confirmed in this herd.
ｂ6 cases of abortion occurred in 2007-2008，and neosporosis was confirmed in this herd. Additionall, 8 cases of Neospora abortionwas confirmed in 2008-2009 in Bekkai and Nakashibetsu.
ｃ4 cases of abortion occurred in 2013, and neosporosis was confirmed in this herd.
ｄ8 cases of abortion occurred in 2012, and neosporosis was confirmed in this herd.
ｅ3 cases of abortion occurred in 2012, and neosporosis was confirmed in this herd.

Place in Kagoshima

No. tested

Number of NcSAG1 Abpositive（percentage）

Satsumasendai
Hioki
Kagoshima
Yuusui

22
32
124
22

3（13.6％）3（9.4％）
61（49.2％）
3（13.6％）

Blood samples were collected in 2014-2015．

法 に よ り ，ネ オ ス ポ ラ 流 産 に 関 連 す る 牛 血 清

では抗体陽性率が17.5％～26.3％であったのに対（IHC陽性９検体とIFATのみ陽性12検体）に対す

し，ネオスポラ感染による流産の集団発生が見らる反応性を比較した（Fig.２）。NcGRA６およびれた農場では74.5％であった。単発的なネオスポ

NcGRA７を用いたELISA法では，IFAT陽性検

ラ症の発生農場では，抗体陽性率に相関性は認め

体の検出効率が低かったが，NcSAG１を用いた

られなかった。鹿児島県の場合，鹿児島市で高い

ELISA 法 は 91.7 ％ の 検 出 率 で あ っ た 。ま た ，

抗体陽性率（49.2％）が認められたが，その他の

NcSAG１およびNcGRA７を用いたELISA法では

地域では9.4％～13.6％であった（Table２）。今回IHC陽性検体の検出率が100％であり，IHC陽性の結果により，NcSAG１を用いたELISA法はネ

検体の抗体レベルはIFAT陽性検体のものより高オスポラ症に関連する血清診断法に有効であるこい値であった（p＜0.05）。反応性の優れていたとが示された。NcSAG１抗体の陽性率の調査を

NcSAG１について，野外牛血清を用いて解析を進めることで，ネオスポラ症の実態が明らかにな行った。北海道の牛血清を用い，流産発生の頻度

ると思われる。

とネオスポラ抗体陽性の関連性を比較した

トキソプラズマの抗原スクリーニングにより選（Table２）。ネオスポラ症の発生報告のない農場

定したTgGRA７を用いたELISA法とトキソプラ© The Ito Foundation

327

食肉家畜における原虫感染症の血清診断法の開発と血清疫学的研究

Table 3 Specificity and sensitivity of TgGRA7-based ELISA in detecting IgG to Toxoplasma gondii infection in cattle sera

compared with the reference test LAT, and Seroprevalence of T. gondii in Hokkaido and Miyazaki Prefectures.
LAT

No. oftestedELISA

No. ofNo. of％ofpositive negative positivity

301

88

213

29.24

No. oftested301

LAT/ELISA positive

No. ofNo. of％ofpositive negative positivity
85

216

28.24

No. oftested301

No. ofNo. of％ofpositive negative positivity
71

230

23.59

95％CI
18.9-28.8

LAT＝Latex agglutination test, CI＝Confidence interval
LAT/ELISA positive＝samples that were simultaneously positive on both tests
95％CI calculated according to method descibed by at http://vassarstats.net/＊Kappa value：0.65, Sensitivity：84％，Specificity：88％

Place

No. tested

Number of TgGRA7 Abpositive（percentage）

Hokkaido

187

68（36.4％）

Miyazaki118

31（26.3％）

ズ マ の 市 販 キ ッ ト （ラ テ ッ ク ス 凝 集 試 験抗原スクリーニングと標準検査法との比較結果よ

（LAT），トキソテスト-MT，栄研社製＊現在り，クリプトスポリジウム抗原CpP23，ネオスポ

は販売中止）の相関解析を行った（Table３）。感ラ抗原NcSAG１，トキソプラズマ抗原TgGRA７

度84％，特異性84％，一致度（κ係数0.65）となの 有 効 性 を 確 認 し た 。こ れ ら 抗 原 を 使 用 し たり，TgGRA７を用いたELISA法とLATの相関性

ELISA法により血清疫学調査を実施したところ，が確認された。次に北海道と宮崎県の牛血清を用北海道と南九州において牛における病原性原虫感

い ，ト キ ソ プ ラ ズ マ 抗 体 の 陽 性 率 を 測 定 し た染のリスクが明らかとなった。家畜生産の損害を（Table３）。北海道で36.4％，宮崎県で26.3％の抗抑えるためにはこれら病原性原虫感染の早期診断

体陽性率が確認されたが，抗体レベルはカットオが必要であり，今後の継続的な調査の必要性が示

フ値近くに分布していた。今回の結果はNcGAR

唆された。

７を用いたELISA法の有用性を示唆しているが，我が国の牛におけるトキソプラズマ感染についてはさらなる解析による検討が必要とされる。
４．要約

家畜生産に損害を与える疾病に感染性の繁殖障
害と子牛の下痢症がある。病原性原虫のトキソプ
ラズマとネオスポラの感染は繁殖障害，クリプト
スポリジウムの感染は子牛の下痢症を引き起こす。本研究はこれら病原性原虫感染症の血清診断法の開発を目的とし，牛の飼養頭数の多い北海
道，宮崎，鹿児島を中心にした疫学調査を行った。

文献１） 西 川 義 文：化 学 療 法 の 領 域 ，32 ，108 ～ 115 ，
2016．
２） Nishikawa, Y. ： J. Vet. Med. Sci. ， 79 ， 1374 ～
1380，2017．
３） 西川義文，猪原史成：医学のあゆみ，259，952～
960，2016．
４） Fereig, R. M., AbouLaila, M. R., Mohamed, S. G.,
Mahmoud, H. Y., Ali, A. O., Ali, A. F., Hilali, M., Zaid,
A., Mohamed, A. E., Nishikawa, Y.：Acta Trop.，162，
206～211，2016．
５） Fereig, R. M., Mahmoud, H. Y. A. H., Mohamed, S.
G. A., AbouLaila, M. R., Abdel-Wahab, A., Osman, S.
A., Zidan, S. A., El-Khodary, S. A., Mohamed, A. E.
A., Nishikawa, Y.：Veterinary Parasitology：
Regional Studies and Reports，3-4，1～6，2016．

© The Ito Foundation

328

心臓あるいは横隔膜を用いたオーエスキー病ウイルス
抗体検査法の確立
Establishment of serological method against pseudorabies virus using
myocardium or diaphragm

前

田

健

（山口大学共同獣医学部）

Ken Maeda（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Yamaguchi University）

In Japan, pseudorabies virus（PRV）has been eradicated from pig farms in many
prefectures, but wild boars are naturally infected with PRV in prefectures where PRV has
been free among pig population. In this study, we tried to establish the simple and easy methodfor detection of anti-PRV antibody in wild boars. At first, ADV（gI）ELISA Kit（IDEXX）for
pig was applied for sero-surveillance of PRV infection among wild boars in Japan. The results
indicated that the kit is available for detection of antibody against PRV from wild boars andthat PRV has been still spreading in some prefectures where PRV is free from pig farms.
Furthermore, we carried out detection of anti-PRV antibody from meat juice of heart anddiaphragm of wild boars. The results indicated that anti-PRV antibody was successfully
detected from meat juices, but the concentration of antibody in meat juice was less than thatin sera. Therefore, it is recommended that meat juice should be used for screening of anti-PRV
antibody among wild boar population.

１．目

イルス感染死を我々は発見した（南昌平ら「アラ的イグマ集団死の死因究明」第159回日本獣医学会

オーエスキー病ウイルスは豚コレラウイルスに学術集会（2016），論文準備中）。これらは，豚で次ぐ国内での撲滅対策の標的となっている。しかの清浄化に成功している都道府県でも野生動物，

し，我々の調査により豚で清浄化が進み，ワクチ

特に猪でオーエスキー病が維持されていることをン接種を中止した都道府県において，いまだ野生意味している。さらには家畜での伝染病対策を行の猪に抗オーエスキー病ウイルス抗体が存在してう上で，野生動物における調査の重要性を示していることが判明している（Mahmoud HYA et al.

いる。

Pseudorabies virus infection in wild boars in

一方，猪での検査の重要性は多くの担当者が理Japan. J Vet Med Sci 2011 ．73：1535-1537）。さ解しているところではあるが，野生動物からの血らに，驚くべきことに2016年２月にはオーエス

清の採集の困難さ，ならびに血清を回収できてもキー病清浄県にてアライグマのオーエスキー病ウ溶血などの状態の悪さが調査の障害となってきた。

© The Ito Foundation心臓あるいは横隔膜を用いたオーエスキー病ウイルス抗体検査法の確立

本研究では，血清の状態が悪くても抗体検出が可能なオーエスキー病ウイルスの検出系を用い

329

臓器はジップロック（旭化成ホームプロダクツ株式会社）に入れて－20℃で保存した。

て，血清の代わりに採集が比較的容易な猪の心筋2.3および横隔膜のミートジュースより抗体の検出を

心臓あるいは横隔膜をいれたジップロックは使実施することにより，簡易に野生動物である猪に用まで－20℃に保存しておく。ジップロックは輪おけるオーエスキー病ウイルスに対する抗体の検ゴムで中央を縛り，上部に肉片がくるようにす

出系を確立することを目的にする。

る。そのジップロックをクリップなどで紐にぶら

２．方
2.1

ミートジュースの回収下げて，常温で５時間放置する。５時間後に，肉法

片を取り除き，ミートジュースを回収する。回収されたミートジュースは3,500回転で５分間４℃

血清

各地の狩猟あるいは有害捕獲にて捕獲された猪で 遠 心 し ，そ の 上 清 を 回 収 し て 実 験 に 用 い るから血清を回収した。関西Ａは2011―2017年に77（Fig.１）。

頭，関東Ａは2011年に56頭，山口県は2016―2018

2.4

年に43頭，中部Ａは2014―2017年に75頭，中部Ｂ血清およびミートジュースからのオーエスキー

は2014―2018年に99頭，関東Ｂは2014―2018年に病ウイルスに対する抗体価の検出にはADV（gI）

43頭，関東Ｃは2015―2018年に18頭，中国Ａはエリーザキット（IDEXX社）を用いた。キット

2017―2018年に31頭，中国Ｂは2017年に20頭の猪のプロトコールに従って実験を実施した。

ELISAから血清を回収した。回収された血清は使用まで

2.5－20℃で保存した。

オーエスキー病ウイルスには2016年に死亡した

2.2

ウイルス中和試験

アライグマから分離されたRC１株をVero細胞で臓器

山口県の狩猟者の協力のもと33頭の猪から心臓増殖し，80％プラーク減数試験（PRNT80）によと横隔膜を回収した。兵庫県では猪の解体場で３り５倍から２倍階段希釈した血清を用いて中和抗頭の猪から心臓と横隔膜を回収した。回収された

体価を求めた。

Fig. 1 実験方法

© The Ito Foundation

330

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

以上の結果より，IDEXX社の豚用のエリーザ

３．結果と考察

キットは野生猪にも応用可能であることが判明し

3 . 1 猪からのオーエスキー病ウイルスに対すた。また，猪の血清での抗体の判定はS/N比0.4以
下を抗体陽性とした。

る抗体検出
猪からのオーエスキー病ウイルスの抗体検出の3 . 2 全国の猪におけるオーエスキー病ウイル

ためにIDEXX社のADV（gI）エリーザキットのスに対する抗体保有率

条件検討を行った。関西Ａで捕獲された猪66頭の全国の猪の血清を用いてIDEXX社のキットで血清を用いてウイルス中和抗体価を比較した。中

抗体保有率の調査をした結果，関西Ａでは66頭中和抗体価１：10未満を陰性と判断した場合，Fig.

11頭（17％），関東Ａでは56頭中０頭（０％），山２のようにS/N比0.4以上を陽性と考えて良いの

口では67頭中０頭（０％），中部Ａでは75頭中０かもしれない。中和抗体価が１：10未満の個体の頭（０％），中部Ｂでは99頭中０頭（０％），関東

一頭（灰色）でS/N比が0.4未満となっているが，Ｂでは43頭中０頭（０％），関東Ｃでは18頭中０

再検討中である。以下の実験では，IDEXX社の頭（０％），四国Ａでは31頭中０頭（０％），四国

ADV（gI）エリーザキットを用いてS/N比が0.4

Ｂでは20頭中０頭（０％）がオーエスキー病ウイ未満の場合，猪においてオーエスキー病ウイルス

ルスに対する抗体を保有していた（Table１）。

に対する抗体の保有と判定した。

豚での清浄化が報告されている関西Ａにおいて

Table 1 IDEXX社のADV（gI）エリーザキットを用いた猪の抗体保有率調査

検査頭数

山口

関西Ａ

関東Ａ

関東Ｂ

関東Ｃ

中部Ａ

中部Ｂ

四国Ａ

四国Ｂ

67

66

56

43

18

75

99

31

20

陽性数

0

11

0

0

0

0

0

0

0

陽性率（％）

0

17

0

0

0

0

0

0

0

1.1
1.0
0.9
0.8

S/N比

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1
<1:10 1:10 1:20 1:40 1:160 1:320
中和抗体価
Fig. 2 ELISA結果と中和試験結果の比較（関西Ａイノシ

シ66頭）

Fig. 3 血清とミートジュースのS/N比の比較© The Ito Foundation心臓あるいは横隔膜を用いたオーエスキー病ウイルス抗体検査法の確立

331

猪では依然としてオーエスキー病ウイルスが蔓延以上となる場合があった。日本脳炎ウイルスやＥしていることが判明した。特に関西Ａでは非常に型 肝 炎 ウ イ ル ス で の 同 様 の 実 験 で は ，ミ ー ト

高い陽性率であり，かつアライグマにも致死的感

ジュースの抗体濃度は血清の５分の１であり，染が発生していることから，オーエスキー病ウイ

ミートジュースの抗体濃度が血清に比べて低いこ

ルスが動物間で伝播しており，豚への感染のリスとが再確認された。ミートジュースは確定診断にクも注意しなければいけないことが示された。

は適していないが，スクリーニング等には有用で

3 . 3 ミートジュースからのオーエスキー病ウ
イルスに対する抗体検出
血清および心臓と横隔膜が回収された個体は関あると期待される。
４．要

約

西Ａと山口の36個体となっている。IDEXX社の猪におけるオーエスキー病ウイルスの感染状況

キットを用いたELISAのS/N比をFig.３に示しを調査した結果，IDEXX社のキットが有用であた。１個体関西Ａ猪17-５の心臓と横隔膜のミーることが示された。血清からの検出により，豚でトジュースからオーエスキー病ウイルスに対するのオーエスキー病が撲滅された地域の猪に未だ抗体が検出された。また，関西Ａ猪17-６は血清

オーエスキー病ウイルスが蔓延していることが確で陽性であり，さらに心臓からのミートジュース認された。心臓と横隔膜のミートジュースを用いのS/N比が0.5123と豚では陽性判定となる0.6未満てオーエスキー病ウイルスの抗体を検出した結であった。また，血清で陰性が確認された34頭は果，抗体の検出に成功したが，血清で陽性であっ

心臓および横隔膜のミートジュースを用いた結果た個体がミートジュースでは陰性となる個体が存も陰性であった。

在しており，ミートジュースを用いた検出は血清

ミートジュースからもオーエスキー病ウイルスを用いた場合に比べて感度が低いことが判明しの抗体の検出に成功した。また，血清陰性の個体

た。検出感度が低いことから，ミートジュースはのミートジュースはすべて陰性となったことから

オーエスキー病ウイルス感染の確定診断ではな非特異反応なども検出されないことが確認され

く，地域の猪におけるオーエスキー病ウイルス感た。しかし，血清で陽性であった個体の一部の染状況のスクリーニングに有用であると期待されミートジュースは，S/N比が比較的低いものの0.4た。

© The Ito Foundation

332

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索―より効果的なワクチン接種部位を求めて―Study of mucosa-associated lymphoid tissues in farm animals―to identify more effective regions for their vaccination―

市居

修・中村

鉄平・小千田

圭吾・山下

祐輔・池田

哲平

（北海道大学大学院獣医学研究院）

Osamu Ichii, Teppei Nakamura, Keigo Kosenda, Yusuke Yamashita and Teppei Ikeda（Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University）

In recent years, the development of an ophthalmic vaccine is progressing rapidly and has
been put to practical use in respiratory diseases of chickens such as highly pathogenic avian
influenza. These methods target to mucosa-associated lymphoid tissues, in particular the roleof “eye-associated lymphoid tissue” would be important for the achievement of effective
ophthalmic vaccination. On the other hand, the anatomical and histological structures of eyerelated lymphoid tissues in cattle and pigs are still unclear. Therefore, in the present study, we
focused on “eye-associated mucosa” as well as “vaginal mucosa” to induce a host mucosal
immunity, assuming the future development of local mucosal vaccination in cattle and pigs. Our
histological analysis of eye-associated tissues in the cattle and miniature pigs revealed that the
mucosa-associated lymphoid tissues were developed in the bulbar conjunctiva rather than thepalpebral conjunctiva. Especially in the miniature pigs, mucosa-associated lymphoid tissue wasalso developed beneath epithelium of third eyelid mucosa and its excretory ducts. However, inthe both species, no vaginal mucosa-associated lymphoid tissue was found in this experiment.
Thus, in the present study, we found the eye-related lymphoid tissues and showed theircharacteristics in cattle and miniature pigs. In further study, we would continue to focus on thepossibility of mucosa-associated lymphoid tissue to realize the efficient immunity induction infarm animals.

１．目

ると考えられる。全身免疫誘導は病原体侵入後の的防御・回復に有効であるが，産業動物では乳房

産業動物の感染症予防には，ワクチン接種が不炎，牛ウイルス性下痢・粘膜病等および豚の各種可欠であり，全身免疫を誘導する“注射型ワクチ

呼吸器感染症等，難治性の粘膜感染症が頻発するン”が主体である。一方，多くの産業動物感染症

ため，粘膜免疫を誘導して粘膜への病原体侵入をでは，消化器，呼吸器および生殖器等の粘膜が病未然に防ぐことができる“粘膜型ワクチン”の開原体の侵入門戸となるため，IgAを主役とする局

発に大きな関心が寄せられている。

所粘膜免疫誘導による感染防御がより効果的であ

粘膜免疫では，粘膜関連リンパ組織（MALT）© The Ito Foundation

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索―より効果的なワクチン接種部位を求めて―333が主役となる。MALTは抗原提示細胞，Ｔ・Ｂ

口や直腸もその候補部位となるが，前者は食渣細胞等の細胞集団を一定の区画に配置し，かつ未に，後者は糞便に邪魔される。また，眼と腟の所

成熟リンパ球および抗原提示能をもつ樹状細胞の属リンパ節を考慮に入れると，眼は上部気道疾患

小さなクラスターを上皮細胞周辺に配置し，リンに，腟は付近の尿生殖器や乳房等への免疫誘導にパ球を機能的に成熟できる。MALTには特徴的有用である。本研究では，牛と豚の眼および腟のなろ胞被蓋上皮が存在し，特に抗原取り込み能を

MALTを精査し，既知のMALTと比較しながら，有する“Ｍ細胞”が重要である。Ｍ細胞は基底膜

その形態機能学的特徴をつかむことを目的とした。

側に樹状細胞等を集簇させ，外来抗原に対する粘２．方膜 免 疫 誘 導 に 重 要 な 役 割 を 果 た す 。代 表 的 な法

MALTとして，ワルダイエルの咽頭輪に存在す

2.1

る扁桃や鼻咽頭関連リンパ組織（NALT），腸管

本研究のすべての過程において，北海道大学な関連リンパ組織（GALT，パイエル板）がある。

らびに同学獣医学研究院における動物実験ガイド

鶏では，特にNALTを標的とした経鼻ワクチンがラ イ ン に 従 っ て 実 験 を 行 っ た（承 認 番 号 16-開発され，ヒトでも経鼻インフルエンザ生ワクチ

0074・16-0077，本研究院の動物実験プログラム

ン“フルミスト”が有名である。2015年に牛でははTSV２（牛伝染性鼻気管炎と牛パラインフルエ

Accreditation of Laboratory Animal Care

ンザ３型）経鼻ワクチンが実用化され，豚では回Internationalによる認証を受けている）。本学部

虫抗原を応用した粘膜免疫が検討されてきた。粘の実習で安楽死された雌のホルスタイン種成牛

膜型ワクチン接種には高価な医療基材や高度な技（ｎ＝４）および雌の交雑系成ミニ豚（ｎ＝４）

術を必要とせず，開発途上国への応用という点かを用いた。動物はいずれも微生物学的にコンベン

らも新たな技術として期待されている。

ショナルな環境で飼育された。安楽死後の個体を動物実験倫理および供試動物

The Association for the Assessment andさらに近年，点眼ワクチンの開発も日進月歩で用いて，抗原を模倣したシリカビーズ（Sicastar，あり，高病原性鳥インフルエンザ等，鶏の呼吸器

直径800nm）を眼瞼結膜と眼球結膜の間に滴下し疾患で実用化されている。これらはNALTに加えた。30分静置した後，動物から眼瞼，眼球結膜，て結膜関連リンパ組織や涙道関連リンパ組織，い腟前庭，腟および子宮頸腟部（腟円蓋を含む）をわゆる“眼関連リンパ組織（EALT）
”を標的と

採取した。

している。しかし，NALTに比べて，牛や豚の2.2

EALTについてはその構造すら明らかではない。

上記のように採取した臓器を10％中性緩衝ホル

重要なことに，MALTの構造は動物種で顕著にマリンあるいは４％パラホルムアルデヒドで固定異なり，豚は口蓋扁桃を欠き，牛では耳管扁桃がし，階段希釈アルコール系列で脱水後，定法に従発達する。それゆえ，今後の点眼・点鼻等によるいパラフィン包埋組織を作成した。眼瞼結膜およ

粘膜型ワクチンの開発には，これらの形態機能学

び眼球結膜，第三眼瞼，腟前庭，腟および子宮頸的見地によるMALTの基礎研究が重要である。

腟部の３μｍ厚組織切片を作成後，ヘマトキシリ

そこで報告者らは，牛と豚における将来の粘膜組織解析

ン・エオジン（HE）染色を施した。

型ワクチンの発展と普及を想定し，接種しやすい2.3

粘膜免疫誘導部位として“眼と腟”に注目した。

組織スライドグラスについて，BZ-X710（キー© The Ito Foundation

画像解析

334

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

エ ン ス ，大 阪 ，日 本）で 撮 影 ，あ る い は Nano

上皮で構成されており，杯細胞や粘膜上皮下のリZoomer 2.0-RS（浜松ホトニクス，静岡，日本）

ンパ球は少数であった。一方，両動物種ともに眼でバーチャルスライド化することで組織画像を得

球結膜には多数の杯細胞が出現し，粘膜上皮下のた。

リンパ球も豊富だった。また，牛の眼球結膜関連
リンパ組織ではリンパ球浸潤が発達する様式を示

３．結果と考察
3.1

したが（Fig.１），ミニ豚では明瞭なリンパ濾胞

眼関連リンパ組織（EALT）についてが複数認められた（Fig.２）。リンパ組織直上の牛およびミニ豚ともに眼瞼結膜は角化重層扁平眼球結膜粘膜は重層あるいは偽重層上皮で構成さFig. 1 Eye-associated lymphoid tissue（EALT）in cow.

Panels（a）and（b）show the bulbar conjunctiva-associated lymphoid tissues（BCALT）. Panels（c）and shows

the inset area of panels（a）and（b）, respectively. Panel（c）shows stratified or pseudostratified epithelial cells
and developed lymphoid tissue. In panel（d）,epithelium is obscure. HE staining.

Fig. 2 Eye-associated lymphoid tissue（EALT）in miniature pig.

Panel （a）shows the eye-associated tissues including eyelids （EL）and third eyelid （TEL）. Panel （b）and （c）

shows the lymphoid tissue found in TEL（arrows）. CL：cartilage. Panel（d）shows the lymphoid tissue foundbeside the duct from TEL. LU：lumen of duct. TELG：third eyelid gland. Panel（e）shows the border between
palpebral conjunctiva（PC）and bulbar conjunctiva（BC）.Lymphoid tissues are observed in BCC. HE staining.

© The Ito Foundation

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索―より効果的なワクチン接種部位を求めて―

335

れ，牛では上皮が欠如している粘膜関連リンパ組ある。動物のＭ細胞マーカーとして，マウスでは織もみられた。

Glycoprotein2 ３） が 汎 用 さ れ る が ， 豚 で は

さらにミニ豚では第三眼瞼部も観察した（牛にCytokeratin18 や Toll-like receptor（TLR）２ お

関しては検索中である）。第三眼瞼粘膜上皮下によび９が用いられ４），牛のＭ細胞はCytokeratin18

粘膜関連リンパ組織が発達しており，多数のリンやCyclophilin Aに陽性を示す５）。これまで牛や豚

パ濾胞構造も認められた（Fig.２）。また，粘液のEALT内Ｍ細胞に関する報告はなく，その詳細

腺を主体とする第三眼瞼腺がみられ，その導管周を今後明らかにしたい。

囲にも濾胞を含むリンパ組織が発達していた（Fig.２）。

本研究において，腟周囲に免疫関連リンパ組織はみつかっていない。報告者らは，自己免疫異常

牛とミニ豚の眼瞼組織を用い，投与したシリカ

モデル動物の性腺およびそれらに付属する生殖

ビーズを検索した。眼瞼粘膜上皮表面に付着する器，腎臓や尿管を病理学的に精査し，免疫と尿生

シリカビーズが認められた一方，上皮内に取り込

殖器の分子病態におけるクロストークを明らかにまれたビーズは見当たらなかった。

してきた６，７）。また，マウスの縦隔内脂肪組織に

3.2

腟関連リンパ組織について

新たなリンパ組織を発見した８）。この脂肪関連リ

両動物種ともに解析途中であり，これまで牛のンパ組織は，リンパ節やMALTと異なり，リン腟について検索を実施しているが，明瞭な粘膜関

パ濾胞を形成しない。また肺炎等，胸腔内の免疫

連リンパ組織はみつかっていない。

学的変化に反応して発達する９）。動物の腟におけ

3.3

考察

るMALTに関して明確な報告がないが，尿管炎

これまで報告者らは，自己免疫異常モデルマウ

モデル動物では，尿管周囲脂肪組織に炎症細胞がスの唾液腺・涙腺炎の進行に伴い涙中に免疫細胞浸潤するため７），まだ発見されていない尿生殖器が出現することを報告してきた１）。この細胞は涙周囲の脂肪関連リンパ組織が尿生殖器の免疫学的腺やEALTに由来すると考えられ，EALTの免疫機能を担うことも想定される。

学的重要性を着想させた。これまでの予備実験と我々の着目する眼粘膜は，ワクチン接種時に保して，牛，馬，猫およびマウスの結膜関連リンパ定は必要だが，忌避行動を起こしにくく呼吸器症

組織を発見しているが，今回は畜産分野において状にも左右されない。さらに，近傍リンパ組織と重要な牛と豚（ミニ豚）について検索した。組織して眼窩のリンパ節（いわゆる眼底リンパ節）が学的解析の結果，両動物種の結膜，特に眼球結膜存在するため，迅速かつ効果の高い免疫誘導が期に粘膜関連リンパ組織がみられた。

待される。腟粘膜は，接種時の保定を必ずしも必MALTの解析においては，その組織学的な検要とせず，忌避行動も起こさず，動物の健康状態

索に加え，抗原の取り込みに重要な役割を果たすにも左右されない。また，効率的な免疫誘導実現

Ｍ細胞の検出が重要である。本研究では，シリカのために，抗原が生体内で長期間持続する必要がビーズを模倣抗原として結膜部分に投与したあり，既存の産業動物用注射型ワクチンでは水酸が ，明瞭な取り込み像は見当たらなかった。死化アルミニウムゲルやリン酸アルミニウムゲル等

亡個体を用いている点やビーズの大きさなど，今のアジュバントを添加して，徐放性に抗原を放出

後のさらなる検討が必要である。また，牛や豚のする工夫がなされている。眼瞼および腟は薬剤のＭ細胞マーカーを利用した組織学的検出も重要で留置に適しており，ヒト医療では過去に下眼瞼留

２）© The Ito Foundation

336

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

置型のピロカルピン徐放剤（オキュサート）が使研究では牛と豚のEALTの存在を明らかにした。

用され，また産業動物では牛用の腟内留置型プロ

今後も，EALTを利用して効率的な免疫誘導を実

ジェステロン徐放剤（シダー1900）が広く使用さ現する可能性に着目したい。

れている。本研究で免疫誘導部位として着目する
眼および腟は留置および徐放暴露によって長期間の抗原刺激が可能な部位であり，今後も既存のワクチン接種部位よりも効率的な免疫誘導を実現す
る可能性に着目したい。
４．要約

近年，点眼ワクチンの開発は日進月歩であり，高病原性鳥インフルエンザ等，鶏の呼吸器疾患で実用化されている。これらは粘膜関連リンパ組織（MALT）を標的としており，特に点眼ワクチン
では“眼関連リンパ組織（EALT）”の役割が重要である。一方で，牛や豚のEALTの構造は明らかではない。本研究では，牛と豚における将来の粘膜型ワクチンの発展と普及を想定し，接種しやすい粘膜免疫誘導部位として“眼”，さらには“腟粘膜”に注目した。牛とミニ豚の眼周囲組織の解析の結果，両者ともに眼球結膜に発達した
MALTが認められた。特に後者では，第三眼瞼
粘膜および第三眼瞼腺の導管周囲にも発達した
MALTが認められた。これまでの解析では，腟

文献１） Kosenda, K., Ichii, O., Otsuka, S., Hashimoto, Y.,
Kon, Y. ： Clin Exp Ophthalmol ， 41 ， 788 ～ 797 ，2013．
２） Nagai, Y., Shiraishi, D., Tanaka, Y., Nagasawa, Y.,
Ohwada, S., Shimauchi, H., Aso, H., Endo, Y.,
Sugawara, S. ： Clin Exp Allergy ，45 ， 677 ～ 486 ，
2015．
３） Terahara, K., Yoshida, M., Igarashi, O., Nochi, T.,
Pontes, G. S., Hase, K., Ohno, H., Kurokawa, S.,
Mejima, M., Takayama, N., Yuki, Y., Lowe, A. W.,
Kiyono, H.：J Immunol，180，7840～7846，2008．
４） Tohno, M., Shimosato, T., Moue, M., Aso, H.,
Watanabe, K., Kawai, Y., Yamaguchi, T., Saito, T.,
Kitazawa, H.：Vet Res，37，791～812，2006．
５） Hondo, T., Someya, S., Nagasawa, Y., Terada, S.,
Watanabe, H., Chen, X., Watanabe, K., Ohwada, S.,
Kitazawa, H., Rose, M. T., Nochi, T., Aso, H.：Cell
Tissue Res，364，585～597，2016．
６） Otani, Y., Ichii, O., Otsuka-Kanazawa, S., Chihara,
M., Nakamura, T., Kon, Y.：Autoimmunity，48，402～411，2015．
７） Ichii, O., Chihara, M., Lee, S. H., Nakamura, T.,
Otsuka-Kanazawa, S., Horino, T., Elewa, Y. H., Kon,
Y.：Autoimmunity，50，114～124，2017．
８） Elewa, Y. H., Ichii, O., Otsuka, S., Hashimoto, Y.,
Kon, Y.：Cell Tissue Res，357，731～741，2014．
９） Elewa, Y. H. A., Ichii, O., Takada, K., Nakamura,T., Masum, M. A., Kon, Y.：Front Immunol，9，271，
2018．

粘膜関リンパ組織はみつかっていない。以上，本© The Ito Foundation

337

畜産分野における抗菌剤使用量削減に有効な手段の探索に関する研究（Ⅱ）―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティ水準
および適正飼養因子との関連―
Epidemiological analysis of the factors affecting the use of veterinary
antimicrobials at farm level in Japanese pig farms― the relationship between veterinary antimicrobial usage, on-farmbiosecurity level and animal welfare indicators ―

杉

浦

勝

明・松

田

真

理・礒

村

れ

ん

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Katsuaki Sugiura, Mari Matsuda and Ren Isomura（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Pig production sector is the heaviest antimicrobial user amongst livestock sectors. This
study aimed to analyze the relationship between on-farm biosecurity（BS）level, animal
welfare indicators and antimicrobial usage（AMU）in the hope to obtain useful information toachieve the best practice for lower AMU. Data on annual AMU based on prescription records
were collected from 121 pig farms under contract with members of the Japanese Association of
Swine Veterinarians（JASV）. Of these farms, 38 farms were selected for assessing BS level
and animal welfare level；pre-/post-weaning mortality rate（％）and dimensions for fattening
pig（㎡/head）. Multivariable linear regression analysis using BS scores/animal welfare
indicators as independent variables and AMU as dependent variables was performed. The
results showed that better site status and higher external BS scores in the category of “farmcontractors” and “replacement gilts” were strongly associated with lower oral AMU（p<0.001）,
suggesting that in order to reduce the group antibiotic treatments, famers should preferentiallyreinforce the entrance requirements against high risk visitors and improve the acclimation
procedures when introducing gilts. The site status, the external BS scores in the category of“replacement gilts” and “pig flows”（e.g. the completeness of all-in/all-out system）and the
pre-weaning mortality rate as an animal welfare indicator were the mutual significant factors
in more than 2 regression models. Further studies on cost-effectiveness analysis are needed tosupport the hypothesis that better BS level and higher animal welfare standards are effective
to reduce AMU.

© The Ito Foundation

338
１．目

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

ことを目的とした。

的

２．材料と方法2016年４月に薬剤耐性アクションプランが発表され，2020年までに畜産分野で分離される大腸菌

2 . 1 農場における抗菌剤使用量データなどののテトラサイクリンに対する耐性率を2014年の収集および算出方法

45 ％ か ら 33 ％ に 下 げ る と い う 目 標 が 設 定 さ れ農場における抗菌剤使用量データは，日本養豚た１）。耐性率を下げるためには，耐性菌の選択圧

開業獣医師協会（JASV）の会員獣医師とコンサを下げることが有用であり，そのためには抗菌剤

ルティング契約を結ぶ養豚農家（Ｎ＝121）からの使用量を削減する必要がある。日本における動収集した。2015年１月１日～12月31日の１年間に物用抗菌剤の半分は豚用に販売されており ，養これらの農場を対象に発行されたすべての抗菌剤

豚分野での抗菌剤使用量の削減はきわめて重要度

処方記録（品目名，販売単位規格，数量）のデーが高い。しかし抗菌剤使用量の削減は，感染性疾

タを指示書集計システム（伊藤貢JASV会員獣医病の発生リスクを高め，畜産経営に多大な影響を師が開発したシステム）を用いて統合抽出した。

及ぼす可能性がある。

WHOのATCvet分類に基づき，日本での販売が２）

養豚農家の感染症対策には，①感染症の農場へ認可されている動物用抗菌剤のうち豚を対象畜種の侵入リスクおよび農場内でのまん延リスクを下として含むすべての製品に７桁の抗菌剤コードをげる方法，仮に侵入した場合でも家畜が感染・発付与したリストを作成し，13の抗菌剤クラスおよ症しないように②ワクチン接種，③予防的な抗菌び42の薬剤を投与経路別に有効成分重量（グラ剤投与を行う方法がある。また，④アニマルウェ

ム）で算出した。抗菌剤コードは１桁目に投薬経

ルフェアの確保も家畜のストレスを軽減し感染症

路，２および３桁目に抗菌剤クラス，４から６桁への抵抗力を高める効果があることからヨーロッ

目に製品番号，７桁目に包装単位を設定した３）。

パ諸国では奨励され，日本でも東京オリンピック

2015年の農場別の年間出荷頭数値については，での食料供給に向けて一部の農家で取り組みが検「PigINFO（JASVおよび農研機構動物衛生部門

討されている。これらの方法は互いに補完的であにより共同開発された生産性に関するベンチマー

り，抗菌剤の使用量はこれらの方法のどれを組みキングシステム）」で収集されたデータを用いた。

合わせて実施するかの戦略検討により決まると考これらのデータを用いて，次式により2015年におえられる。

ける出荷豚１頭当たりの抗菌剤使用量を算出した。

本研究は，畜産農家における動物用抗菌剤の使用と関連し，かつ畜産農家にとって実現可能な措置として考えられる農場バイオセキュリティ（BS）水準およびアニマルウェルフェア水準と農2015年出荷豚一頭当たりの有効成分重量（ｇ／頭）＝2015年処方の有効成分重量（ｇ）
2015年年間出荷頭数（頭）場レベルでの動物用抗菌剤使用量との関係につい

2.2て疫学的解析を行い，感染症対策の戦略に影響を農場BSレベルの評価には，「BioAsseT（大竹及ぼす要因を上記の２因子と仮定し，各要因の戦聡 JASV 会 員 獣 医 師 他 か ら な る PRRS 撲 滅 推 進

略への影響度を推定することにより，抗菌剤に依

４）
チームJAPAN）」
により開発された農場BSレベ

存しない予防対策の推進に有効な手段を探索する

ルのスコアリングシステム）を参考に，新たに質© The Ito Foundation

農場BSレベルの評価

畜産分野における抗菌剤使用量削減に有効な手段の探索に関する研究（Ⅱ）―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティ水準および適正飼養因子との関連―

339

Table 1 Categories of the biosecurity level assessment tool, their number of questions, their allotment of scores, theircontents asked and the results from 38 farms.

Categories
A. SiteSub-Categories# Questions Subtotal Scores Average

1.Site conditions

B. External Biosecurity

Subtotal

SD

Max

4

16

9.58

3.75

16.00

Min Contents
3.67 Site conditions.

18

24

13.08

3.63

20.73

5.61 Prevent disease-causing agenst from entering/leaving farms.

2. Replacement Glits

3

4

1.90

0.79

3.56

0.44 Introduction and acclimation of replacement gilts.

3. Personnels

2

4

2.26

1.11

4.00

0.00 Entrance requirements for employees.

4. Transport Vehicles

4

4

2.77

0.71

4.00

1.00 Status of transport vehicle use.

5. Manure & Carcass

5

4

2.53

0.73

4.00

1.13 Status of manure and carcass disposition.

6. Vermin Controls

2

4

2.23

0.89

3.33

of vermin control against rodents and wild
0.00 Status
birds.

7. Farm Contractors
C. Internal Biosecurity

Subtotal

2

4

1.39

1.12

4.00

0.00 Entrance requirements for farm contractors.

26

24

12.38

3.71

21.48

6.31 Prevent the spread of disease on farms.

8. Pen Layouts

2

4

2.05

1.09

4.00

0.00 Status of pen layouts.

9. Pigflows

6

4

2.07

0.95

3.67

0.00 Status of AIAO implementations and pig treatments.

10. Cleaning & Disinfection

9

4

2.58

0.66

3.70

1.04 Status of cleaning & disinfections on each pen.

11. Personnels

2

4

1.09

1.06

4.00

0.00 Status of clothes change implementations of employees.

12. Injection Needles

3

4

1.45

1.21

4.00

0.00 Status of needle change implementations.

13. Delivery Stalls

4

4

3.14

0.71

4.00

1.00 Status of delivery stall managements.

48

―

―

―

―

―

Total

―

問票を作成し，2017年７月～12月の期間にアンとは一致しないが，BSレベルはPRRS等の重度のケート形式で回収した。本アンケートはＡ．立地，

伝染性疾患が流行しないかぎり大きく変化するこ

Ｂ．農場外BS，Ｃ．農場内BSの３大項目からなり，とはないと考え，本研究ではこれらの農場で重度それぞれＡ．
農場の立地条件，Ｂ．
農場への病原体

伝染性疾患の発生がなかったことを確認した上での侵入防止，Ｃ．
農場内における病原体の伝搬防査定結果を採用し，現時点で入手可能な最新の止の水準を測定することを目的としている。これ

データを用いた。

らの３大項目は合計13の小評価項目からなり，評価は現場で実践されうる最大限の対策がとられて

2 . 3 アニマルウェルフェアの観点からの適正飼養指標の決定いる場合はＡ評価，まったく取られていない場合

欧州委員会が定義する養豚に関するアニマル

はＥ評価とし，４点満点で評価した（Table１）。

ウェルフェア基準は，1991年に制定（欧州連合，従来，立地条件はＢ．
農場外BSに含まれてきたが，

EU指令91/630/ECC）された後，2008年に改正

他の項目と異なり自助努力での改善が難しい項目（EU指令2008/120/ECC）された「豚の保護のたであることから独立させ大項目Ａ．
立地とした。

めの最低基準を定める理事会指令」に基づくもの

Ａ．立地条件では，近隣の農場との位置関係や公である５）。主要な規定には①体重別の豚１頭当た

道およびと畜場との距離を評価した。大項目に関りの十分な飼養面積の確保，②豚房のスノコ床のしては，立地BSスコアは16点満点，農場外BSス

利用面積の制限，③豚房の水はけ効率を考慮したコアは24点満点，農場内BSスコアは24点満点で床面積の確保，④群飼の実施（妊娠豚の受胎後４算出した。小項目に関しては，各質問に対する結週間から分娩１週間前までの期間のストール飼育

果の平均値を採用した。2015年「PigINFO」に参禁止），⑤群飼における十分な給餌量および咀嚼

加し，かつ2015年の年間抗菌剤使用量データを提要求を満たす粗飼料の確保，⑥病豚の隔離房の設出した農場のうち，アンケートが回収された38農

置，⑦豚房の気温，⑧遊具の設置，⑨習慣的な断場を解析の対象とした。アンケート実施期間は抗尾・切歯の禁止，等がある。EU加盟国は本指令

菌剤使用量調査および「PigINFO」の参加期間に基づき国内法を制定しこれらの基準を実施して© The Ito Foundation

340

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Input Data

Fattenings Area (㎡）A＃of Stock after Weaning (heads)

B

Total pen size of weaners and fattenings.
in delivered month.

# of Live Birth (heads)

Output Data
as Animal Welfare Indicators

Density of Fattenings (㎡/head)=A/BC

in delivered month.
Excluding # of stillbirth.

# of Weaned Piglets (heads)
in delivered month.

# of Death after Weaning (heads)
in delivered month.
Including culled pigs.

Pre-weaning Mortality Rate(%)=｛1-(D/C)｝*100

D
Post-weaning Mortality Rate(%)= E/D*100
E

Fig. 1 Definition formula for calculating animal welfare indicators in delivered month.

いる。特に，動物用抗菌剤使用量の低減に成功し量との関係性について回帰分析モデルを用いて解ているデンマーク・オランダ

ではEU指令に対析を行った。多変量解析を行うにあたって，統計応し，自主的な強化規制を設けている 。本国で学的に有意な説明変数をステップワイズ法で検討は2016年に社団法人畜産技術協会により「アニマした。統計分析はすべてSPSS Ver.24（IBM）を

ルウェルフェアの考え方に対応した豚の飼養管理用いて行い，統計学的有意水準はｐ＜0.05とした。

６）

７）

指針」 が公表されたが，養豚現場では作業効率８）が重要視される傾向があることに加え，飼養ス

３．結果と考察

ペースの絶対的な不足により，アニマルウェル

3.1

フェア基準の達成に積極的に取り組む農場は少な

38 農 場 に お け る 2015 年 出 荷 豚 頭 数 は 平 均

いのが現状である。本研究では，家畜の快適性に

16936.01頭（標準偏差SD＝25963.93）となり，ば配慮した飼養管理を徹底することで家畜へのスト

らつきが認められた。2015年出荷豚１頭当たりのレスが減少し，疾病発生および抗菌剤を使用する

抗菌剤総使用量は平均25.61ｇ（SD＝22.66）で治療機会が低減されると考え，死亡率が低いほどあった。そのうち経口抗菌剤が97％以上を占めてアニマルウェルフェア水準が高いと仮定した。適おり，使用量が最も多かった抗菌剤はテトラサイ

正飼養指標には，現在「Pig INFO」において収クリン系（47.92％）で，次いでマクロライド系

集可能なデータである「肥育密度（㎡／頭）」，（13.26％），ペニシリン系（10.54％），サルファ剤「哺 乳 中 死 亡 率（％ ）」お よ び「離 乳 後 死 亡 率（9.05％）であった。テトラサイクリン系使用量（％）」の年間平均値を採用した。各指標の月ごとの内訳は，オキシテトラサイクリン59.86％，ドの定義式はFig.１のとおりである。

キシサイクリン31.93％，クロルテトラサイクリ

2.4

記述統計

ン8.21％であった。

統計解析

説明変数となる因子と従属変数である抗菌剤使用

自記式質問表によるBSレベル査定結果のＡ．立© The Ito Foundation

畜産分野における抗菌剤使用量削減に有効な手段の探索に関する研究（Ⅱ）―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティ水準および適正飼養因子との関連―

341

Table 2 Results of multivariable general linear regression models（n＝38）．The figure shows the most fitted combinations

judged by adjusted R２ value.The boldface shows independent variables with significance in more than 2 different
dependent variables.
Dependent Variables
Independent Variables

Total Oral
Antimicrobial
Usage

A. Site1. Site conditions－0.367

B. External
Biosecurity

2. Replacement Glits－0.274

Doxycycline
Usage

Thiamphenicol
Usage

Penicillins
Usage

Sulfonamides
Usage

Macrolides
Usage

Fluoroquinolones
Usage

Standardized Coefficients（β）－0.529－0.223

3. Personnels
4. Transport Vehicles
5. Manure & Carcass－0.287

6. Vermin Controls－0.412

7. Farm Contractors
C. Internal
Biosecurity－0.3308. Pen Layouts－0.5509. Pigflows－0.289－0.375

0.441

0.456

0.329

0.428

－0.552

10. Cleaning & Disinfection
11. Personnels
12. Injection Needles
13. Delivery Stalls
D. Animal Welfare 14. Density of Fattenings
Indicators
15. Pre-weaning Mortality Rate

0.582

16. Post-weaning Mortality Rate
Adjusted R２

0.376

0.541

0.689

0.260

0.531

0.283

0.285

p-value＜0.001＜0.001＜0.0010.001＜0.001＜0.001＜0.001

38

38

38

38

38

38

38

ｎ

地スコアは平均9.58点（SD＝3.75）
，Ｂ．
農場外BS

場内BSおよびＤ．
適正飼育因子の影響は認められ

スコアは平均13.08点（SD＝3.63）
，Ｃ．
農場内BS

なかった。豚の飼養密度が低い地域に位置し農場

スコアは平均12.38点（SD＝3.71），であった。各が隔絶されること，また長期間農場にて飼育され小項目の結果はTable１のとおりである。

る更新豚の導入に関する対策を講じ，他の農場に

Ｄ．
適正飼養指標の結果は，肉豚飼養面積は平出入りする頻度が高い工事業者への入場規則を徹

均1.40㎡／頭（SD＝0.79），哺乳中死亡率は平均底することにより，群投与される経口抗菌剤使用

11.36％（SD＝3.49），離乳後死亡率は平均6.71％

量の低減につながることが示唆された。豚舎の立（SD＝3.64）であった。

地条件は既に建設された豚舎での改善は難しい

3 . 2 養豚場における抗菌剤使用量と農場BSレ

が，同等レベルで重要な因子である農場外BSの強化が求められる。

ベルおよび適正飼養因子との関連
農場における抗菌剤使用量を目的変数とし，農次に全体説明力が高いドキシサイクリン，チア場BSレベルおよび適正飼養指標を説明変数に用ンフェニコール類，サルファ剤の使用量を目的変いた多変量解析の結果はTable２のとおりである。

数としたモデルでは，いずれも使用量に影響する

経口抗菌剤使用量に影響する因子として，影響要因に適正飼養因子が含まれた。ドキシサイクリ

力の大きい順にＡ．
立地条件，Ｂ．
農場外BSスコンおよびチアンフェニコール類の使用量に影響力

アの小項目７．
工事業者および２．
更新豚に関するを及ぼす共通因子には，影響力の大きい順に哺乳BS対策があげられる（ｐ＜0.001）。モデルの全体

中死亡率，離乳後死亡率およびＣ．農場内BS小説明力（Adjusted R 値）は37.6％と低く，Ｃ．
農

項目９．
ピッグフローがあげられ（各々ｐ＜0.001），

２© The Ito Foundation

342

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

双方ともに哺乳中死亡率の改善が最も有用な対策

改善することで抗菌剤使用量の低減につながるこであると考えられる。哺乳中死亡率の改善には初とが示唆された。

乳の十分な給与ならびにそれに伴う貧血対策，分今後は品質認証基準を参考とした母豚中心のア

娩舎の保温，去勢や断尾に際する子豚のストレス

ニマルウェルフェア水準評価方法を確立するこ軽減があげられる。一般的にアニマルウェルと，また重要なBS対策の向上に掛かる経費およ

フェアの観点における適正飼養基準では，長期間び労力を推定する費用・有効度分析の研究を進め

農場で飼養される母豚を対象とした基準が多く設ることにより，抗菌剤使用量削減のために有効なけられており，肉豚の死亡率が適正飼養指標とし具体的方策を特定できると考える。最後に，本研て正しく反映されているかの検討が必要である。

究における抗菌剤使用量データおよびアンケート

一方，サルファ剤の使用量に影響する因子では，の収集に協力くださった，日本養豚開業獣医師協

肉豚飼養面積が広いほど，またＣ．
農場内BS小項

会 （JASV） 会 員 獣 医 師 お よ び 生 産 者 ，目６．害獣管理のスコアが低いほど多く使用して「PIGINFO」関係者の皆様に深謝する。

９～11）

いた。その原因としてサルファ剤は安価な第一選択薬の一つであり，肉豚飼養面積が広く疾病管理４．要

約がしやすい農場において，グレーサー病などの日本研究では，日本養豚開業獣医師協会（JASV）

和見感染対策として予防的に使われた可能性が考会員獣医師とコンサルティング契約を結ぶ38農場

えられるが，さらなる調査が必要である。さらに，について，①2015年の出荷肉豚１頭当たりの年間

農場内のネズミや野鳥対策が不足している農場に抗菌剤使用量データ，②自記式質問表による農場

おいて害獣により媒介されるサルモネラ症などのバイオセキュリティレベル（BS）の評価結果お対策として使用されたと考えられる。

よび③ベンチマーキングから得られたアニマル

されるフルオロウェルフェアに基づく適正飼養指標を用いて，農キノロン系使用量に影響する因子として，Ｃ．
農場における動物用抗菌剤使用量における各要因の場内BSの小項目９．ピッグフローのスコアが高い

影響度について疫学的解析を行った。その結果，ほど使用量が少なかった（ｐ＜0.001）。この小項

経口抗菌剤使用量に影響する因子として，影響力

目９．
ピッグフローでは，各生産ステージの豚舎の大きい順にＡ．
立地条件，Ｂ．
農場外BSスコアのall-in/all-out（AI/AO）の徹底レベルや病豚・の小項目７．工事業者および２．更新豚に関する対

出荷残り豚の扱いが評価対象となっている。棟単策があげられた（ｐ＜0.001）。豚の飼養密度が低位での完全なAI/AOの実施や病豚の早期隔離ない地域に位置し農場が隔絶されること，また長期

どの個体管理の徹底により，二次選択薬のフルオ

間農場にて飼育される更新豚の導入に関する対策

ロキノロン系抗菌剤による治療が必要となるようを講じ，他の農場に出入りする頻度が高い工事業

な大腸菌性下痢症や胸膜肺炎の発生が減少してい者への入場規則を徹底することにより，群投与さるとも推測される。

れる経口抗菌剤使用量の低減につながることが示

最後に，最重要抗菌剤に定義

12）

本研究では現時点で入手可能なデータを基に，唆された。次に各抗菌剤使用量における共通因子

抗菌剤使用量と農場BSレベルおよび適正飼養指として，BS水準では①農場の立地条件，②農場標との間の関連が認められた。農場BSレベルので長期飼養される更新豚の導入に関する条件およ

向上に加え，哺乳期の疾病管理を改善し死亡率をび③ピッグフロー（各生産ステージの豚舎のAI/© The Ito Foundation

畜産分野における抗菌剤使用量削減に有効な手段の探索に関する研究（Ⅱ）―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティ水準および適正飼養因子との関連―

AOの徹底レベルや病豚・出荷残り豚の扱い），
また適正飼養指標としては哺乳期死亡率があげられ，これらの改善が抗菌剤使用量の低減につながることが示唆された。
今後は母豚を中心としたアニマルウェルフェア
水準評価方法の確立および重要なBS対策の向上の費用・有効度分析の研究を進めることにより，抗菌剤使用量削減のために有効な具体的方策を特定できると考える。
参考文献
１） 農林水産省：薬剤耐性（AMR）対策アクション
プラン2016―2020．農林水産省ホームページ，2016．
 http://www.maff.go.jp/j/syouan/tikusui/yakuzi/
pdf/yakuzai_honbun.pdf
２） 松田真理ら：日本における家畜バイオマス重量当たりの抗菌剤使用量の評価―細井らの方法とEUの方法による評価結果の比較―，家畜衛生学雑誌，42，
191～197，2017．
３） 松田真理ら：養豚場における抗菌剤使用量の測定のための豚用抗菌剤IDリストの作成の試み，日本獣医師会雑誌，71（1），15～17，2018．
４） PRRS 撲 滅 推 進 チ ー ム JAPAN：http://site-pjet.
com/５） The Council of the European Union ： COUNCIL
DIRECTIVE 2008/120/EC of 18 December 2008―

343

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http://eur-lex.europa.eu/eli/dir/2008/120/oj
６） E u r o p e a n M e d i c i n e s A g e n c y ：S a l e s o fveterinary antimicrobial agents in 30 European
countries in 2015 ―Trends from 2010 to 2015
Seventh ESVAC report, October 2017.
 http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/
document_library/Report/2017/10/WC500236750.
pdf７） Wageningen UR Livestock Research：Report
273 EU-Welfare legislation on pigs, March 2010.
http://edepot.wur.nl/136142
８） 社団法畜産技術協会：アニマルウェルフェアの考え方に対応した豚の飼養管理指針，http://www.maff.
go.jp/j/chikusan/sinko/attach/pdf/animal_
welfare-10.pdf９） ピッグフォーラム22：『養豚の教科書』ベネット，
2016．
10） 中村高志：「子豚が生まれてからすぐやるべきこと！」，『Pig Journal』2014年３月号，p12-15，アニ
マル・メディア社，2014．
11） Xavier Manteca, Bryan Jones：Improving farmanimal welfare,1st edition, p175-200，Wageningen
Academic Publishers, the Nederlands，2013．
12） WHO：Critically important antibacterial agentsfor human medicine for risk management strategies
of non-human use, 2005.
 http://apps.who.int/iris/bitstream/
10665/43330/1/9241593601_eng.pdf?ua=1&ua=1© The Ito Foundation

344

初乳に含まれる抗菌因子の機能を利用した子牛の下痢症予防
Inhibition of diarrhea in calf by utilizing colostrum antimicrobial
components

磯

部

直

樹

（広島大学大学院生物圏科学研究科）

Naoki Isobe（Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University）

The present study was undertaken to find the preventing methods of diarrhea in calf byinvestigating the relationship between antimicrobial components in colostrum and diarrhea. In
the first experiment, blood was collected from calves at 0, 1 and 30 days after birth. Plasma
concentrations of IgA and IgG were dramatically increased at 1 day compared with those at 0day, followed by the decrease at 30 days. This results indicates that immunoglobulin was
moved through intestine wall to blood circulation directly without digestion. In the second
experiment, blood, saliva and feces were collected from calves at 0, 1, 7, 14, 28 and 50 days after
birth. Colostrum was also collected. Concentrations of IgA, IgG and LAP（antimicrobial
components）in colostrum fed calves without diarrhea tended to be higher than those withdiarrhea. Calves without diarrhea showed higher IgA concentration in serum and feces at 1day. Since IgA in colostrum absorbed through intestine wall into blood within 1 day after birth,high concentration of IgA in serum and feces must be due to its high amount in colostrum.
LAP concentration was increased at 7 days followed by gradual decrease towards to 50 days,
whereas, there is no significant difference between calved with and without diarrhea. These
results suggest that immunological antimicrobial components in colostrum was associated with
the incidence of diarrhea in calf, which has important implications toward controlling thediarrhea in calf.

１．目

道だけでも十数億円にものぼる。子牛の消化管感

的染時の主な症状が下痢であり，これを防ぐことは肉牛を生産するためには子牛の日増体量を最大効率的な成長にとって非常に重要となる。

にすることが重要である。子牛が感染症にかかる

子牛の感染症を防除するためには高い免疫機能と増体量が激減するため，感染症予防には細心のを維持させることが重要となる。子牛の免疫機能注意が払われている。しかし，全国の消化器病には，母牛の免疫グロブリンを豊富に含んだ初乳による出生子牛の死廃事故別頭数は12,000頭でありよって得られる“移行免疫”と，子牛自身が制御（平成23年度家畜共済統計表），その被害額は北海する“獲得免疫”の二つがある。そのうち，生後© The Ito Foundation

初乳に含まれる抗菌因子の機能を利用した子牛の下痢症予防345

最初の生体防御機構は，前者の初乳中に含まれる液を採取して，遠心分離して血清を分離した。血

移行抗体によるものであり，その移行抗体量は，清中のIgAおよびIgGの濃度を酵素免疫測定法で初乳の質，量および給与時間に影響を受ける。

測定した。

現在の初乳給与法は，「生後６時間以内に，１回２Ｌの初乳を飲ませること」が推奨されてい2 . 2 子牛の唾液，血清および糞中の抗菌因子と下痢との関係る。しかし今までは，初乳給与のタイミングや量初乳を摂取した後に唾液，腸管および血中の免については研究されてきたが，初乳の成分につい疫物質が変化すると考えられるので，これらのサては十分に検討されてこなかった。

ンプル中のIgA，IgGおよびLAP（抗菌物質のひ

我々は牛乳に多くの種類の抗菌物質が含まれていることを示してきたとつ）を調べた。生後０，１，７，14，28，50日目

１～５）。これらは広い抗菌スの血液（７頭），６，14，28，50日目の唾液（10頭）

ペクトラムを有しており，子牛下痢症の原因となを採取した。また，糞（７頭）は生後直後と１日るウイルス，細菌，寄生虫および真菌などに対し後に採取した。血液は遠心分離後血清を分離しても抗菌性を示すことが知られている。さらに，た。唾液は約５cm四方の脱脂綿を子牛の口腔内抗菌物質は初乳だけでなくそれ以降の常乳でも高に約10秒留置し，唾液を吸収させた。その脱脂綿濃度で含まれている。したがって，これらの抗菌の一部を切り取り，唾液分離用の遠心チューブ

物質は，子牛内の病原体の排除に働き，下痢症を（サリベット，ザルスタット社）に入れ，遠心分予防していることが強く示唆される。また，我々離することにより唾液を分離した。糞は凍結乾燥

はこの抗菌因子の牛乳中濃度が母牛個体によってした後，50mgを１mlトリス緩衝液内で攪拌した

顕著に異なることを発見した６）が，なぜこのよう後，遠心分離し，その上澄みを用いた。血清，唾

な違いが出るのかは未だに不明である。また，唾

液，糞および初乳について，IgAおよびIgG濃度

液中にも多くの抗菌物質が含まれており，これらを，唾液および初乳についてはLAP濃度も測定

は子牛個体によって濃度差が認められた。しかした。そして，これらの濃度と子牛の下痢発生とし，個体差の原因とその結果どのような生理的違の関係を調べた。

いが出るのかは明らかになっていない。
そこで本試験では，初乳および唾液中の抗菌物

３．結果と考察

質を考慮に入れた子牛下痢の予防法を確立するこ

生後０，１および30日目の子牛の血液中IgAおとを目的として，抗菌物質の濃度と子牛の下痢症

よ び IgG 濃 度 を 測 定 し た（Fig. １）。IgA お よ びとの関係を調べた。

IgG濃度ともに生後１日目で激増し，その後30日

２．方目にかけて減少した。生後24時間以内の子牛の腸法

管では初乳中のタンパク質が分解されることなく

子牛血清中の免疫グロブリンの濃度変化

直接吸収されると言われていることから，IgAお

初乳中の免疫物質としての免疫グロブリン

よびIgGのような免疫グロブリンも消化管から直（IgA，IgG）は子牛の腸管から直接吸収され，血接血中に移行したと考えられる。しかし，生後30中に移行すると言われているため，これを確認し日目になると，乳中のIgAおよびIgGの濃度が初た。

乳に比べて低下することから子牛の血清中濃度も2.1

生後０，１および30日目の子牛（８頭）から血低下したと思われる。また，乳中にこれらの免疫© The Ito Foundation

IgA concentration (µg/ml)

平成29年度600

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

IgA
IgG concentration (mg/ml)

346

500
400
300
200
100
0

0

30

1

25

IgG

20
15
10
5
0

0

Days after birth130Days after birthFig. 1 Changes in IgA and IgG concentrations in calf serum

Body weight ratio

2.5
2Diarrhea
No diarrhea

*

*

1.5
1
0.5
0

0 7 14 21 28 35 42 49
Days after birthFig. 2 Body weight of calves with and without diarrhea Asteriskmeans significant difference between groups（p＜0.05）

グロブリンがあったとしても，30日後では消化管それらに比べて有意に重かった。これらは下痢をから吸収されないので，血清中の濃度も低下した

すると体重の増加が顕著に遅くなることを改めてのだろう。生後30日においてIgGよりもIgAの濃示したものである。

度の方が７日目に対する低下割合が顕著であっこの体重の差が初乳の影響かを調べた結果，初た。IgAは主に粘膜免疫として働いており，血中乳中のIgA，IgGおよびLAP濃度すべてで下痢をから結合組織へ移行した形質細胞から分泌されしなかった子牛が飲んだ初乳の方が下痢をした子て，腸管内へ入り ，腸管内の病原体を攻撃する。

牛のそれらに比べて高い傾向であった（Fig.３，

したがって，IgAは血液内よりも腸管内に存在す

Ｐ＝0.39，0.08，0.21）。したがって，初乳中の抗るため，濃度が低下したと考えられる。そこで，

菌物質が子牛の免疫機能に影響を及ぼしている可実験２では腸管内のIgAの存在を確認するために能性が示唆された。

７）

また，初乳が子牛の免疫機能に影響を及ぼすか

糞中の濃度も測定した。
実験２で用いた子牛の体重変化を，０日目を１を調べた結果，唾液中のIgAの濃度はいずれの区とした割合で示した（Fig.２）。下痢を起こしたでも生後28日目に比べて50日で増加する傾向が認

子牛の方が体重増加が緩やかで，生後28および50められた（Fig.４）。唾液腺では多くの形質細胞

日目では，下痢をしてない子牛の方が下痢をしたが分布しており，これらがIgAを分泌し，導管を© The Ito Foundation

347

IgA

3.2
3.0
2.8
2.6

+

－

IgG

LAP concentration (ng/ml)

3.4

IgG concentration (mg/ml)

IgA concentration (mg/ml)

初乳に含まれる抗菌因子の機能を利用した子牛の下痢症予防

80
60
40
20
0

+

diarrhea

60

LAP

40
20

－

0

+

diarrhea－

diarrhea

Fig. 3 IgA, IgG and antimicrobial peptide（LAP）concentrations in colostrum fed

to calves with and without diarrhea

IgA concentration (µg/ml)

IgA
saliva600

Diarrhea
No diarrhea

500
400
300
200
100
0

0

7

serum

500

14 21 28 35 42 49

2500

400

2000

300

1500

200

1000

100

500

0

0

7

14 21 28 35 42 49

0

feces

0

1

Days after birth

IgG
Ig Gconcentration (mg/ml)

saliva0.06

serum
Diarrhea
No diarrhea

0.04

60

40
30

feces

40

20
0.02
0

20

10
0

7 14 21 28 35 42 49

00

7 14 21 28 35 42 49

0

0

1

Days after birthFig. 4 IgA and IgG concentrations in saliva, serum and feces of calves with and without diarrhea

通って唾液とともに口腔内へ分泌されている８）。

なかった。今後はさらに頭数を増やして検討する

このような唾液腺によるIgAの分泌は生後28日以必要がある。

降に始まるのかもしれない。しかし，下痢を起こ

初乳中のIgAの一部は腸管から吸収され血中にした区では14日目でも高くなった。これは下痢を入り，残りが糞として体外に排出される。１日目

起こす病原体が口腔に侵入したことにより，唾液

の糞中IgA濃度を区間で比較すると，下痢を起こ

中にIgAが増えた結果と考えられる。しかし，唾さなかった子牛の方が高い傾向を示した（Fig.

液中のIgAの濃度において区間の間に有意な差は

４，Ｐ＝0.19）。また，１日目の血清中IgAの濃度© The Ito Foundation

LAP concentration (ng/ml)

348

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

LAPの濃度に有意な違いはなかった。この点にDiarrhea4

ついては今後さらに例数を増やして検討する必要

No diarrhea

がある。
４．要

2

約

初乳および唾液中の抗菌物質を考慮に入れた子
0

0

7

14

21

28

35

42

49

Days after birthFig. 5 LAP concentration in saliva of callves with andwithout diarrhea

牛下痢の予防法を確立することを目的として，抗菌物質の濃度と子牛の下痢症罹患との関係を調べた。まず，生後０，１および30日目の子牛から血液を採取して，血清中のIgAおよびIgGの濃度を測定した。IgAおよびIgG濃度ともに生後１日目も下痢を起こさなかった子牛の方が高い傾向を示で激増し，その後30日目には減少した。１日目でした（Fig.４，Ｐ＝0.14）。このように，糞中およ濃度が高くなったのは，初乳中のIgAおよびIgG

び血清中いずれも下痢を起こさなかった方が高い

が消化管から直接血中に移行した結果と考えられ濃度であったことは，上述した初乳中のIgAの濃る。次に，生後０，１，７，14，28，50日目の血液，度が高かったことによるものと考えられ，初乳中

６，14，28，50日目の唾液を採取した。また，生IgAは下痢の抑制に重要である可能性が示唆され後直後と１日後には糞も採取した。血清，唾液，た。

糞および初乳のIgA，IgG濃度およびLAP濃度を

血清中および糞中のIgGの濃度の変化はIgAと測定し，これらの濃度と子牛の下痢発生との関係似ており，１日目で増加しその後減少した（Fig.

を調べた。初乳中のIgA,IgGおよびLAP濃度は下４）。したがって，初乳中のIgGが消化管から吸痢を起こさなかった子牛が飲んだものの方が下痢収されたり，糞中に排出されたと考えられた。唾

を起こした子牛のそれらに比べて高い傾向であっ

液中のIgGは生後７～14日で少し増加しその後減た。生後１日目の糞および血清中IgA濃度は，下少した。IgGは粘膜免疫の機能はないので，これ痢を起こさなかった子牛の方が起こした牛に比べらのIgGは初乳の由来と考えられる。

て高かった。初乳中IgAの一部は腸管から吸収さ唾液には多くの抗菌物質が含まれており，そのれ血中に入り，残りは糞とともに排出されるの一つがlingual antimicrobial peptide（LAP）であで，初乳中IgAが多かったため，血清および糞中る。これは，乳房内でも活発に合成されており，

IgA濃度も高かったと考えられる。唾液中のLAP

乳中に含まれているが，唾液中にも存在して濃度は７日目に高くなりその後徐々に減少したいる。子牛の唾液中LAP濃度を測定したところ，が，区間に有意差はなかった。以上の結果から，出生直後は濃度が低かったが，１日目で急増し，初乳中の免疫関連抗菌物質は下痢の抑制に関与しその後徐々に減少した（Fig.５）。初乳中のLAPており，これを用いた下痢予防の可能性が示されは常乳に比べて高いことから，７日目の唾液中

た。

１，２）

LAP濃度が高いのは，初乳に含まれていたLAPが混入したのかもしれない。このLAPが腸管の免疫に重要と考えられるが，下痢の有無によって© The Ito Foundation

初乳に含まれる抗菌因子の機能を利用した子牛の下痢症予防文献１） Isobe, N., Nakamura, J., Nakano, H., Yoshimura,Y. ： Journal of Dairy Science ， 92 ， 2691 ～ 2695 ，2009．
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Science Journal，80，446～450，2009．
３） Zhang, G. W., Lai, S. J., Yoshimura, Y., Isobe, N.：
Veterinary Microbiology，170，125～134，2014．
４） Zhang, G. W., Lai, S. J., Yoshimura. Y., Isobe, N.：
The Veterinary Journal，202，89～93，2014．
５） Srisaikham, S., Suksombat, W., Yoshimura, Y.,

349

Isobe, N.：Animal Science Journal，87，423～427，
2016．
６） Kawai, K., Akamatsu, H., Obayashi, T., Nagahata,
H., Higuchi, H., Iwano, H., Oshida, T., Yoshimura, Y.,
I s o b e , N . ：V e t e r i n a r y I m m u n o l o g y a n d
Immunopathology，153，298～301，2013．
７） S u z u k i , K . , N a k a j i m a , A ：I n t e r n a t i o n a l
Immunology，26，489～494，2014．
８） Matsukawa, S., Ueno, K., Sugino, T., Yoshimura,Y., Isobe, N.：Animal Science Journal, （in press）
2018．

© The Ito Foundation

350

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御
Prediction and control of subacute ruminal acidosis in periparturient dairy
cows

佐

藤

繁・櫛

引

史

郎＊

（岩手大学農学部共同獣医学科，＊農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究部門）

Shigeru Sato and Shiro Kushibiki＊（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University,＊National Institute of Livestock and Grassland Science）

The objectives of this project are to clarify the current incidence rate and pathogenesis of
subacute ruminal acidosis（SARA）in dairy cows using radio transmission pH measurement
system, and further, to assess the diagnostic availability for post-partum SARA at the prepartum stage. Ten dry period and multiparous Holstein cows（A herd, n＝2；B herd, n＝4；C
herd, n＝4）were used in this experiment, and the amount and composition of diets were
thoroughly managed. The nutritional management during the transition period, and milk yieldand breeding performance at the post-partum were monitored. Rumen fluids were collected at
3 weeks pre-partum and 2, 4, and 6 weeks post-partum for analysis of VFA, ammonia, andlactic acid, LPS activity. Furthermore, liver tissues were biopsied at 3 weeks pre-partum and 2
and 6 weeks post-partum, and transcriptomic dynamics were evaluated using microarray
method.
As a result, ruminal pH decreased dramatically, and the difference between maximum andminimum within diurnal changes（diurnal deviation）maximized at the post-partum comparedwith the pre-partum. During 2 weeks after parturition, 1 of 2 cows in A herd, 2 of 4 cows in B
herds, and 1 of 4 cows in C herd were diagnosed with SARA（ruminal pH ＜ 5.6 for more than
3 hours daily）,and total incidence rate was 40％（4 out of 10 cows）. Furthermore, SARA cows
showed higher diurnal deviation at the pre-partum compared with non-SARA cows.
In conclusion, the use of wireless pH sensor during the transition period can detect SARA
at the post-partum stage, and the prediction or prevention of the post-partum SARA might bepossible at the pre-partum stage through an analysis of liver transcriptomic dynamics.

１．目

持・向上させるために濃厚飼料が多給され，その的結果，潜在性第一胃アシドーシス（SARA）が増

乳牛の泌乳量は栄養管理や育種改良の進展に加している。SARAは濃厚飼料などの易発酵性飼

よって飛躍的に増加してきた。一方で泌乳量を維料の多給により揮発性脂肪酸（VFA）の産生量© The Ito Foundation

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御

351と吸収量のバランスが崩れて第一胃液pHが低下

１）を用い，野外の周産期乳牛を対象として栄養し，第一胃内細菌の死滅によって細胞壁からリポ管理状態などSARAの発症リスクと病態生理を解

ポリサッカライド（LPS）の遊離が亢進する病態

析し，さらに，分娩前における分娩後SARAの発である 。分娩後に発生するSARAは，代謝病（生症予知と制御の可能性を検討する。そのため，「周産病）および繁殖障害の発生と密接な関連のある産期乳牛におけるSARA発症のリスク解明」とことが示唆されており，農家経営に多大な影響を「SARA発症牛における第一胃LPSカスケードと及ぼす代謝障害リスクである。

病態の解明および分娩前における分娩後SARAの１）

本研究の目的は，申請者らが開発した無線伝送

発症予知」の課題に取り組む。なお，実験と採材を用いて，乳牛の分娩後に多発および動物の飼養管理は，岩手大学動物実験委員

するSARAの発生状況と発症リスクを明らかに会の承認を得て実施した（承認番号 A201452-2）。

式pHセンサ

２～５）

し，将来的には分娩前の段階で分娩後SARAの発

2.1

供試牛群および供試牛症予知と制御を目指すことである。これによっ

野外実態調査と病態解明に関する調査は，移行て，乳牛の周産期に発生する種々の生産病を予防

期の給与飼料内容や飼養管理状況が明らかな３牛

し，乳牛の健康を維持して食品としての牛乳と食群において，乾乳期の経産牛10頭（Ａ牛群・２肉の安全確保に貢献したいと考えている。

頭，Ｂ牛群・４頭，Ｃ牛群・４頭）を対象として

具体的には，乳牛の周産期における栄養管理状行った。移行期における給与飼料などの飼養管理

況が第一胃液pHの変動や第一胃内発酵（VFA，状況，さらに分娩後の泌乳量と繁殖成績を調査し乳酸）に及ぼす影響，LPSの第一胃内産生と体内た。なお，供試したすべての牛において分娩前後移行による生体反応，栄養吸収に関連するインスに臨床的異常は認められなかった。

リン感受性の変化に及ぼす影響を解析する。さら2.2に，SARAの病態生理解明を基盤として，正常な第一胃液はカテーテルを用いて経口的に，血液第一胃発酵機能の維持による分娩後SARAの制御は頸静脈から真空採血管を用いて，いずれも分娩効果や生産病の低減効果を検討する。

前３週，分娩後２週，４週および６週の計４回採

２．方

採材

取した。また，肝組織は生検（自動生検針エース

法

カット14Ｇ×115mm 22mmタイプ，タスク（株），

申請者らが開発した無線伝送式pHセンサ（Fig.

Fig. 1 Appearance of the pH sensor of a radio transmission pH measurement system. The pH sensor（A）, which is

184 g in weight, 30 mm in diameter, and 145 mm in length, was composed of a small-grass electrode（B）and
antenna.

© The Ito Foundation

352

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

栃木）により分娩前３週と分娩後２週と６週の計３回採取した。
2.3

検査項目および方法

３．結果と考察3 . 1 周産期乳牛におけるSARA発症のリスク

2 . 3 . 1 第一胃液pH，VFA，アンモニア態窒解明
３牛群の10頭において，分娩前３―２週から分

素および乳酸濃度
第一胃液pHは，無線伝送式pHセンサを用いて

娩後６―８週までの間，第一胃液pHを連続測定

分娩前３―２週から分娩後６―８週までの間，10した結果（Fig.２），pH値は分娩日以降に著しく分間隔で連続測定した。VFA濃度の測定は，ガ低下し，分娩前に比べて低値，かつ１日の最大値

スクロマトグラフィー（HITACHI-163型，日立，と最小値との差異（日内較差）が増大する傾向が東京）を用いて行った。アンモニア態窒素濃度の認められた。Ａ牛群では２頭中１頭，Ｂ牛群では測定は，窒素自動蒸留装置（ケルティックオート

４頭中２頭，Ｃ牛群では４頭中１頭において，分1035型，アクタック，東京）を用いた水蒸気蒸留

娩後２週以内に１日あたり３時間以上にわたって法で，乳酸濃度の測定は，市販の乳酸測定キット

第一胃液pHが5.6以下の値を示し，これらの牛は（Ｆキット，D-/L-乳酸，R-Biopharm，ドイツ）

分娩後SARAと診断され，その発症率は40％（10を用いて行った。

頭中４頭）であった。なお，分娩後SARA牛では

2.3.2

非SARA牛に比べて，分娩前および分娩後におけ

第一胃液LPS活性値

LPS 活 性 値 は ， LAL （Limulus amebocyte
lysate）試薬（パイロクロム，生化学工業，東京）を用いたカイネティック比色法により測定した。
2.3.3

る第一胃液pHの日内較差が大きい傾向が認められた。
これまでに，乳牛の周産期における第一胃液
pHの変化を観察した報告２，６）およびSARAの予防

肝臓の遺伝子解析

肝臓の遺伝子解析は，組織から総RNAを抽出を目的とした報告６，７）はあるが，分娩前の第一胃した後，マイクロアレイ法およびリアルタイム

液pHの変動による分娩後SARAの摘発を目的とPCR法により行った。マイクロアレイ法は，約した研究はみられない。また，周産期の飼養管理

15,000のウシ遺伝子を搭載したウシ・オリゴDNA

状況と生産病の発生との間に関連があるとされて

マ イ ク ロ ア レ イ（Agilent Technologies, USA）

いるが，本課題のように飼養管理状況と第一胃液を使用した。RNAサンプルからのcDNA合成，pHの連続的変化との関係を検討した研究はみら

cDNA か ら の Cyanine3（Cy3）-CTP 標 識 cDNAれない。今後の解析によって，分娩前後の乳牛にの合成，標識cRNAの精製，ハイブリダイゼーショ

おける第一胃液pHの変動のほか，飼料給与方法

ン，洗浄，スキャンおよびデータ解析の一連の操などの飼養管理法とSARA発症との関係が明らか作を行った。

になると考えている。なお，本課題おいて，分娩

2.4

統計解析

前後における飼養管理状況の調査は，すでに終了

マ イ ク ロ ア レ イ 法 の デ ー タ は Ingenuity

しており，現在，飼養管理状況とSARA発生とのPathway Analysisソフトウェア（IPA, Ingenuity

関係性について解析中である。また，第一胃液とSystem, USA）を用い，統計処理はGene Spring

血液は，分娩前２週，分娩後２週，４週および６

GX12.0（Agilent Technologies, USA）を 用 い て

週の計４回のサンプリングを終了しており，解析した。

VFA，アンモニア態窒素，乳酸およびLPS活性© The Ito Foundation

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御

353

Fig. 2 Long term recording of the ruminal pH in the periparturient 10 cows（3 herds）from 2 weeks before parturition

to 6 weeks after parturition. The ruminal pH decreased markedly after parturition, and the frequency of ruminal
pH below 5.5 increased markedly in the 1-2 weeks after parturition.The circadian variations of the ruminal pH
were regular in the pre-parturient period, however, it was irregular and larger in the post-parturient period.

値を解析中である。これらデータが出揃った段階

3 . 2 SARA 発 症 牛 に お け る 第 一 胃 LPS カ ス

で栄養管理上のSARA発症リスクを評価する予定

ケードと病態の解明および分娩前におけるである。

分娩後SARAの発症予知© The Ito Foundation

354

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 3 Relationship in the mRNA levels of genes related to amino acid metabolism, small molecule biochemistry, cellularfunction and maintenance in the SARA cattle. Red symbols denote significantly （p≤0.05）increased mRNA levels,
whereas green symbols denote significantly（p≤0.05）decreased mRNA levels.

肝組織は，生検により分娩前３週，分娩後２週ように野外の周産期乳牛を対象とした実証的研究と６週の３回，すでにサンプリングを終了していはみられない。今後の解析によって，分娩前後のる。現在，マイクロアレイ法による網羅的遺伝子

乳牛における肝組織中のエネルギー関連遺伝子の解析（Fig.３）およびリアルタイムPCR法によるほか，分娩後SARA牛においてLPSカスケードや

特 定 遺 伝 子 の 発 現 解 析 の た め に RNA お よ び

酸化ストレスと関連のある遺伝子の発現状況が明cDNAサンプルを調整中であり，数ヶ月以内に解らかになると考えている。

析を終了する予定である。これら解析データが出揃った段階で，肝組織における遺伝子発現状況に

４．要約

ついて，分娩後SARAの発症牛と非発症牛との比無線伝送式pHセンサを用いて，乳牛の分娩後較，さらには，分娩後SARA牛の分娩前と分娩後に多発するSARAの発生状況と発症リスクを明らとの比較を行い，肝組織における遺伝子発現の面

かにし，将来的には分娩前の段階で分娩後SARAから，SARAの病態解明にアプローチするとともの発症予知と制御を目指す目的で以下の試験をに，分娩前における発症予知の可能性について検行った。試験は移行期の給与飼料内容や飼養管理討する予定である。

状況が明らかな３牛群において，乾乳期の経産牛

SARA牛の肝組織における遺伝子発現，特にSARAに起因したLPSの影響に関する報告10頭（Ａ牛群・２頭，Ｂ牛群・４頭，Ｃ牛群・４や頭）を対象として行った。移行期における給与飼

SARA牛の第一胃粘膜における遺伝子発現に関す料などの飼養管理状況，分娩後の泌乳量と繁殖成る報告10，11）はあるが，いずれも実験的に誘発した績を調査した。分娩前３週，分娩後２週，４週おSARA牛を対象として観察したもので，本課題のよび６週に第一胃液を採取し，VFA，アンモニ

８，９）© The Ito Foundation

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症予知と制御

ア態窒素および乳酸濃度のほか，LPS活性値を測定した。また，分娩前３週，分娩後２週と６週に生検により肝組織を採取し，マイクロアレイ法によって網羅的遺伝子解析を行った。
その結果，第一胃液pHは分娩後に著しく低下
し，分娩前に比べて低値で推移し，１日の最大値と最小値との差異（日内較差）は増大する傾向が認められた。Ａ牛群では２頭中１頭，Ｂ牛群では４頭中２頭，Ｃ牛群では４頭中１頭において，分娩後２週以内にSARAが発生し，その発生率は40 ％（10 頭 中 ４ 頭）で あ っ た 。な お ，分 娩 後
SARA牛では非SARA牛に比べて，分娩前後における第一胃液pHの日内較差が大きい傾向が認められた。
以上のように，周産期における第一胃液pHの連続測定により，分娩後SARAの摘発が可能であり，さらに，肝組織の遺伝子発現解析の結果を加味 す る こ と に よ っ て ，分 娩 前 に お け る 分 娩 後
SARAの発症予知が可能になると考えられた。

355

文
献
１） Sato, S. ： Anim Sci J, doi ： 10.1111/asj.12415 ，
2015．
２） Sato, S., Mizuguchi, H., Ito, K., Ikuta, K., Kimura,A., Okada, K. ： Prev Vet Med ， 103 ， 274 ～ 279 ，
2012．
３） Sato, S., Kimura, A., Anan, T., Yamagishi, N.,O k a d a , K . , M i z u g u c h i , H . , I t o , K . ：V e t M e dCommun，36，85～89，2012．
４） Sato, S., Ikeda, A., Tsuchiya, Y., Ikuta, K.,
Murayama, I., Kanehira, M., Okada, K., Mizuguchi,
H.：Vet Med Commun，36，85～89，2012．
５） Nagata, R., Yo-Han, K. I. M., Ohkubo, A.,
Kushibiki, S., Ichijo, T., Sato, S.：J Dairy Sci，101，1～13，2018．
６） H a s u n u m a , T . , U y e n o , Y . , A k i y a m a , K . ,Hashimura, S., Yamamoto, H., Yokokawa, H.,
Yamaguchi, T., Itoh, M., Mizuguchi, H., Sato, S.,
Hirako, M., Kushibiki S. ： Anim Feed Sci Technol ，
221，215～225，2016．
７） U y e n o , Y . , A k i y a m a , K . , H a s u n u m a , T . ,Yamamoto, H., Yokokawa, H., Yamaguchi, T.,
Kawashima, K., Itoh, M., Kushibiki, S., Hirako, M.：
Anim Sci J，88，119～124，2017．
８） Chang, G., Zhuang, S., Seyfert, H-M., Zhang, K.,
Xu, T., Jin, D., Guo, J., Shen, X.：Oncotarget，6（36），38578～38590，2017．
９） Guo, J., Chang, G., Zhang, K., Xu, T., Jin, D., Bilal,
M. S., Shen, X.：Oncotarget，6（36），38578～38590，
2017．
10） Yo-Han, K., Nagatam R., Ohtanim N., Ichijom T.,
Ikutam K., Sato, S. ： Front Microbiol. doi ： 10.3389/
fmicb.2016.01575，2016．
11） Yo-Han K., Touji, N., Kizaki, K., Kushibiki, S.,
Ichijo, T., Sato, S., Physiol Genomics, doi：10.1152/
physiolgenomics.00086.2016，2016© The Ito Foundation

356

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響
Effects of rice feeding on growth performance and protein（amino acids）
metabolism of weaning piglets

高

田

良

三・香

川

龍太郎・立

原

可南子

（新潟大学農学部）

Ryozo Takada, Ryutaro Kagawa and Kanako Tachihara（Faculty of Agriculture, Niigata University）

In this study, we investigated the effects of feeding rice on growth performance andprotein（amino acids）metabolism of weaning piglets. Sixteen weaning piglets with an average
initial weight of 7.5 kg were divided into two groups. One group was fed a corn-soybean mealbased diet, and the other was fed a rice-soybean meal diet, containing about 46％ of corn or
rice, respectively. A two weeks growth trial was conducted and growth performance, liver
lysine-ketoglutarate reductase activity, plasma urea nitrogen, glucose, insulin and free aminoacids concentration were measured. The average daily gain（g/d）and feed efficiency（gain/feed）in rice group were significantly higher than in corn group. Liver lysine-ketoglutarate
reductase activity tended to be lower（ p＝0.073）in rice group than in corn group. Plasma
urea nitrogen concentration in rice group was significantly lower than in corn group. Plasma
glucose and insulin concentrations were significantly higher in rice group than in corn group.
Plasma free valine, isoleucine and tryptophan concentration were significantly higher in ricegroup than in corn group. On the other hand, plasma histidine concentration in rice group was
significantly lower than in corn group. Overall, these results show that rice feeding affect theprotein and amino acids metabolism and growth performance is improved in weaning piglets.

１．目

で多くなされている。一方，イネは東南アジアを的中心にして栽培されている主要穀物であり，その離乳子豚は，母豚からの急激な隔離・消化管の穀実であるコメは食用や飼料用に供されてきた。

未成熟・母乳から穀物主体の飼料への急変・複数

しかし，わが国においては，コメの価格が比較的の腹兄弟の同一豚房での飼育等，多くのストレス高いこともあって，家畜の飼料としてのコメ（飼がかかり，しばしば発育の停滞や下痢の発生が起料用米）の利用はほとんどされていなかった。そきる。さらにこの時期の発育停滞はその後の肥育のような状況下において，食用米価格の低迷や食成績に大きく影響を及ぼすとされていることから

料自給率向上，水田維持等の理由から，約10年前

離乳子豚に対する飼料栄養に関する研究がこれまから急激に飼料用米の利活用が叫ばれるように© The Ito Foundation

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響357なった。最近，牛，豚，鶏に対する飼料用米の研液，肝臓を採取して各主成分や酵素活性を測定し究報告が増加してきた。一方，海外に目を向けるた。

と，基本的に欧米ではイネは栽培されている量が2.1

少ないため，飼料用米の研究実績はきわめて少な

2.1.1

い。わずかにスペインのMateosらのグループ

飼料の配合割合をTable１に示した。

３，
４，
６，
９）

とオーストラリアのPluskeらのグループ

飼養試験
離乳子豚を用いる実験。

が離試験区：対照区・・・・ト ウ モ ロ コ シ を 約

乳子豚に対する飼料用米の研究を行っており，飼47％配合した対照飼養成績の改善や下痢発生の軽減効果が報告されて料いる。そのような中で，当研究室を中心とした研

飼料用米区・・トウモロコシを飼料

究グループは離乳子豚に対する飼料用米の新規機用米（玄米）で完全能性を解明する研究に着手した（新たな農林水産

代替した飼料用米飼

省 政 策 を 推 進 す る 実 用 技 術 開 発 事 業 ，2009 ～

料

７，８）

2011）
。その結果，得られた飼料用米の特性は以供試動物：約25日齢の離乳子豚16頭を２試験

下のとおりである。

区に８頭ずつ振り分ける①飼養成績の改善，②下痢発生の軽減，③高価

試験期間：２週間。その間不断給餌，自由飲

である脱脂粉乳の配合割合を低下できる，④乾物

水の消化率はトウモロコシと比べて飼料用米が優れ

日増体量，飼料摂取量および飼料

る，等である。この中で，タンパク質蓄積量の有効率を求める。

力な指標である血漿中尿素態窒素濃度は飼料用米

分析項目：血中尿素態窒素，遊離アミノ酸濃給与で有意に低下することが明らかとなった。そ度。インスリン・グルコース濃度

こで本研究では飼料用米を離乳子豚に給与した時

肝臓中のリジン分解酵素（Lysineのタンパク質（アミノ酸）代謝に焦点をあて，タketoglutarate reductase，LKR）

ンパク質合成・分解・アミノ酸分解に関与する酵

活性

素活性や血中成分を解析し，飼料用米給与による離乳子豚のタンパク質（アミノ酸）代謝変動のメカニズムを明らかにする。
２．方

３．結果と考察
飼養成績の結果をTable２に示した。日増体量（g/d）は飼料用米区がトウモロコシ区に対して法

有意（p＝0.025）に高い値を示した。これは我々

本実験は，国立大学法人新潟大学の動物実験指の以前の報告２）とよく一致した結果であるが，こ針にしたがって計画し，実験計画検討専門委員の報告では日増体量とともに飼料摂取量（g/d）

会，動物実験倫理委員会の審査，承認を得て行っも同時に有意な高い値を示し，その結果として飼た。

料効率（gain/feed）は両試験区間でほぼ同じ値

約25日齢の離乳子豚を実験動物として用いた。

であった。ところが本実験では飼料摂取量におい飼料用米を約46％含む飼料を２週間給与する飼養て両試験区間に差は認められず，結果として飼料試験を行い，日増体量，飼料摂取量および飼料効効率は飼料用米区で有意（p＝0.011）に高くなる率を求めた。飼養試験終了後，子豚をと畜し，血値を示した。このような飼料効率の有意な上昇© The Ito Foundation

358

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 1 Composition of experimental diets（g/kg）
Item

Corn

Rice

Ingredients
Corn

466.9

―

Brown rice

―

460.9

Soybean meal

150

150

Soybean meal（extruder）

80

90

Dried skim milk
Soybean oil

200
60

200
55

Dicalcium phosphate

15

15

Calcium carbonate

6

6

Sodium chloride

5

5

L-lysine・HCl
DL-methionine

3
2.5

3.5
2.5

L-threonine
L-tryptophan

2
0.1

2.5
0.1

Vitamin mixture１）

4.5
2

4.5
2

2
1

2
1

15.1
211
90
70

15.1
215
90
73

15.5
9.2
10.4

16.3
9.8
10.9

2.7

2.9

Mineral mixture２）
Antibiotics３）
Chlomic oxide
Calculated chemical composition
ME（MJ/kg）
CP（g/kg）
Calcuium（g/kg）
Phosphorus（g/kg）
４）
L-lysine（g/kg）
DL-methionine＋cystine（g/kg）
L-threonine（g/kg）４）
L-tryptophan（g/kg）４）

１）Provided the following（per kg of diet）：retinol, 6mg; cholecalciferol，100µg；αtochopherol

acetate, 200mg；thiamine mononitrate, 2.5mg; riboflavin, 17.5mg；pyridoxine HCl, 1.25mg；
D-Ca pantothenate, 272.5mg；nicotinamido, 15mg；choline chloride, 1440mg.
２）Provided the following（per kg of diet）；Mn, 100mg; Fe, 100mg；Cu, 20mg；ZnCO３,

120mg；CaI２, 2mg.
３）Provided the following（per kg of diet）；avilamycin, 20mg titre；colistin sulfate, 20mg

titre；morantel citrate, 30mg titre４）Analysed data

Table 2 Growth performance of piglets fed a diet with corn or rice.
Corn

Rice

P-value7.4±0.2

7.6±0.2

0.498

188±18439±21313±17236±25529±39382±21

0.135
0.061
0.025

Initial body weight（kg）
Average daily gain（g/d）
0 to 1 week
1 to 2 week
0 to 2 week
Average feed intake（g/d）
0 to 1 week
1 to 2 week
0 to 2 week
Feed efficiency（gain/feed）
0 to 1 week
1 to 2 week

257±23561±27409±23270±24600±28435±25

0.703
0.345
0.461

0.729±0.043
0.789±0.039

0.870±0.057
0.879±0.046

0.068
0.159

0 to 2 week

0.770±0.032

0.881±0.02

0.011

Values are means±SE（n＝8）© The Ito Foundation

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響

は，少なくとも当研究室ではこれまでに得られて359

要はなかったのかもしれない。

おらず，今回が初めての結果である。海外の報告結果として飼料用米区の飼料効率がトウモロコ

においてもMateosらのグループ３，４，６，９）では飼料

シ区と比べて有意に改善されることとなった。成用米給与による飼料効率の上昇は報告していな

長の優れる豚にはより多くの栄養素が要求されるい。今回の実験において飼料効率が上昇した原因ことをよく示している。

について以下のことが推察される。近年の豚はそ

血漿中の尿素態窒素，グルコースおよびインスの成長能力が著しく改善されており，その結果とリン濃度の結果をTable３に示した。血漿中尿素

して栄養素要求量，特にアミノ酸要求量が高まっ

態窒素濃度は飼料用米区で有意にトウモロコシ区ている。その点をよく反映しているのが2012年に

よ り も 低 く な っ た 。こ の 結 果 は Yagami and

出 版 さ れ た NRC

で あ る 。こ こ で は 体 重 ７ ～Takadaの報告２）とよく一致した。体内の窒素蓄11kgの子豚のリジン要求量は1.53％となってい積量が飼料用米給与によって増加することを示唆る。一方，日本飼養標準では増体１kgに要すしている。それを裏付けるように血漿中グルコー

る真のリジン要求量を17.3ｇ/日としており，こス濃度およびインスリン濃度は飼料用米区で有意の値はかなり正確と思われるが，体重５～10kgに高かった。おそらく飼料用米給与によってインのリジン要求量は1.24％となっており，NRCのそ

スリン分泌が促進され，それの作用によってタンれよりも低くなっている。この原因は明確であ

パク質（アミノ酸）代謝が影響を受けたものと考り，日本飼養標準のこの体重の増体量が250ｇ/日

えられた。本実験の採血方法は，３時間の絶食のと低く設定しているためである。NRCではこの

後，50ｇの飼料を給与し，その１時間後に採血を間の増体量を335ｇ/日としている。我々の以前の行ったが，これはインスリン分泌の変動をより明

報告のリジン含量は1.3％であり，成長の優れ確にするためである。しかし実際の養豚現場ではる子豚に対してはやや不足であった可能性が高

不断給餌条件下であり，胃の中は常時飼料で満たい。飼料用米給与によってさらに増体量が高くなされていると思われる。したがってここで得られり，やや不足気味のアミノ酸を満たすために飼料た血漿インスリン濃度の変化が不断給餌条件下の摂取量が高くなっていたのかもしれない。飼料摂豚においても同様な結果が得られるかは検討する

取量を増やすことによってやや不足するアミノ酸必要がある。なお，血漿尿素態窒素濃度は不断給を満たす現象は豚ではよく知られている事実であ

餌条件および絶食・再給餌条件のいずれの採血方る。逆に本実験ではトウモロコシ区および飼料用法でも数値の絶対値は異なるものの，給与飼料間

米区の飼料中リジン含量は1.55％，1.63％と十分の反応はほとんど同様であることが得られているに高く，したがって飼料摂取量をあえて増やす必（未発表データ）。

２）

５）

１）

Table 3 Plasma urea nitrogen, glucose and insulin concentrations in piglets fed adiet with corn or rice．

Plasma urea nitrogen（mg/dL）
Glucose（mg/dL）
Insulin（µg/L）

Corn

Rice

P-value9.57±1.75
106±30.110±0.006

5.28±1.40119±30.148±0.015

0.033
0.013
0.035

Values are means±SE（n＝8）© The Ito Foundation

360

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 4 Liver lysine-ketoglutarate reductase（LKR）activity in piglets fed a dietwith corn or rice.

Corn

Rice

p-value1.17±0.072

0.95±0.082

0.073

LKR activity（µmole/min/g liver）
Values are means±SE（n＝8）

Table 5 Plasma free amino acids concentrations in piglets fed a diet with corn or rice.
Corn

Rice

p-value（µmol/L）
Essential amino acids
Threonine593±178691±271

0.406

Valine276±45328±410.005

129±30155±25220±4398±12
80±14
182±71172±7867±14132±26270±30195±3980±2362±11
221±92173±91
89±23

0.845
0.002
0.236
0.075
0.011
0.362
0.983
0.035

31±5
239±82200±79899±205570±126161±2729±5229±5
206±531103±160664±115164±47

0.447
0.773
0.872
0.043
0.143
0.861

Methionine
Isoleucine
LeucinePhenylalanine
Histidine
LysineArginine
Tryptpphan
Nonessential amino acids
Aspartic acid
Serineglutamic acid
Glycine
AlanineTyrocine
Values are means±SE（n＝8）

Table４に肝臓LKR活性の結果を示した。肝臓高まっていれば（リジンの分解が低くなっていれ

LKR活性は飼料用米区でトウモロコシ区よりもば）リジンの要求量は低くなるはずである。近年低くなる傾向（p＝0.073）が見られた。LKRは体の豚の成長能力は著しく改善されており，平均的内でのリジン分解の律速酵素である。したがってな増体量は高くなっている。それに応じてリジン

LKR活性が低いことは体内でのリジン分解が抑要求量は高くなっている可能性が高い。もし飼料

えられており，必須アミノ酸としての再利用が高用米給与によってリジン分解が抑制されればリジまっているものと考えられる。リジンは通常の飼ンの利用性は高くなり，成長能力の高い現在の豚料では第一制限アミノ酸となり，かつその要求量においても飼料中のリジン含量を高めることなくの絶対量も他の必須アミノ酸よりも高い。アミノ対応が可能になるかもしれない。

酸要求量を求めるとき，一般にはまずリジン要求

Table５に血漿中遊離アミノ酸濃度の結果を示量を定め，他のアミノ酸要求量はリジンに対するした。分岐鎖アミノ酸であるバリンおよびイソロ

理想タンパク質からの比率で求めている。したイシンの血漿中濃度は飼料用米区で明らかにトウがってリジンの体内代謝が変動することはリジン

モロコシ区よりも有意（それぞれp＝0.005および要求量にも影響を及ぼし，もしリジンの再利用が0.002）に高い値を示した。同様にトリプトファ© The Ito Foundation

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響361

ンも飼料用米区で有意（p＝0.035）に高い値で米区で有意に高くなった。これらの結果は，離乳あった。これらの変動については，おそらく体内

子豚に飼料用米を給与すると飼養成績は改善さ

での分解抑制が関与していると推定される。リジ

れ，タンパク質（アミノ酸）代謝は影響を受けてンはLKR活性が飼料用米区で低くなっているにタンパク質蓄積量が高まることを示している。

もかかわらず，血漿中遊離リジン濃度に統計的な有意差は認められなかった。この原因は不明であるが，リジンの体内での利用度（タンパク質合成の素材としての要求量が高い）が飼料用米区で高まっており，より多くのリジンがタンパク質合成に利用されたのかもしれない。なお，同じ分岐鎖アミノ酸であるロイシンは両試験区間で差はな
かった。これはトウモロコシ区の飼料中ロイシン
含量が飼料用米区よりも高い（1.91 vs. 1.78）ことが原因かもしれない。一方，ヒスチジン濃度はバリンやイソロイシンとは逆に，飼料用米区で有意に低くなった。このことは今後の検討課題であ
る。
４．要

約

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響について検討を行った。トウモロコシあるいは飼料用米を約46％含む飼料を離乳子豚（各試験区８頭ずつ）に給与し，２週間の飼養試験を行った。その結果，
日増体量および飼料効率は飼料用米区がトウモロ
コシ区よりも有意（p＝0.025，0.011）に優れていた。血漿中の尿素態窒素濃度は飼料用米区で有意に低く，また，グルコースおよびインスリン濃度は有意に高くなった。肝臓におけるリジン分解酵
素 で あ る Lysine-ketoglutarate reductase 活 性 は
飼料用米区でトウモロコシ区よりも低くなる傾向（p＝0.073）が認められた。血漿中の遊離バリン，
イソロイシンおよびトリプトファン濃度は飼料用

文献１） 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構：
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４） Mateos, G. G., Lopez, E., Latorre, M. A., Vicent, B.,
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diets that limit the amount of fermentable substrateentering the large intestine, Journal of Nutrition，126，
2920～2933，1996．
８） Pluske, J. R., Black, B., Pethick, D. W., Mullan, B. P.,
Hampson, D. J.：Effects of different sources andlevels of dietary fibre in diets on performance,
digesta characteristics and antibiotic treatment ofpigs after weaning, Animal Feed Science andTechnology，107，129～142，2003．
９） Vicente, B., Valencia, D. G., Serrano, M. P., Lazaro,R., Mateos, G. G.：Effects of feeding rice and thedegree of starch gelatinization of rice on nutrient
digestibility and ileal morphology of young pigs,
British Journal of Nutrition，101，1278～1281，2009.

© The Ito Foundation

362

黒毛和種仔牛の免疫能を高める機能性飼料の探索
Screening for functional feeds that enhance the immune function in
Japanese Black calves

米

倉

真

一・時

田

瞳

（信州大学農学部）

Shinichi Yonekura and Hitomi Tokita（Faculty of Agriculture, Shinshu University）

Calf diarrhea is a frequently occurring disease in Japanese black calf breeding farms；
hence, it is important to establish a prevention method. In this study, first we investigated therelationship between diarrhea and γδ T cells, which are believed to play an important role in
the immune function of young bovines, using Holstein calves. Second, we tried to find out alactobacillus which can elevate the proportion of γδ T cells and WC1 ＋ γδ T cells. In thefirst experiment, we found a significant negative correlation between the proportion of γδ T
cells and fecal score, and a significant negative correlation between the proportion of γδ T
cells or WC1 ＋γδ T cells and the fecal moisture content. Our findings suggested that the
proportion of γδ Tcells in the blood of two-week-old calves is significantly associated with thefragility of their immune function. In the second experiment, we could isolate 23 species oflactobacillus from sorghum silage and 22 species of lactobacillus from dent corn silage. We
found that one of lactobacillus from sorghum silage may have the ability to elevate theproportion of γδ T cells and WC1 ＋γδ T cells in vitro.

１．目

るためには，仔牛の免疫学的特性を配慮した疾病

的の予防法の開発が必要である。

仔牛の下痢症は，黒毛和種繁殖農家における多Ｔ細胞は，末梢血中のリンパ球の70～80％を占発疾病であり，死亡例も少なくない。さらに増体

めており，体を異物から守る免疫応答の司令塔をも遅延することも生じることから，下痢症の予防

担う大切な細胞集団である。Ｔ細胞は細胞表面に法の確立が重要である。仔牛は成牛に比べて免疫特徴的なＴ細胞抗原受容体を有し，外から入って機能が未熟なため，下痢症などの感染症を発症しきた異物を認識している。Ｔ細胞抗原受容体にはやすいことが知られている 。すなわち，仔牛がαβ鎖とγδ鎖の２種類が存在しているが，ほと下痢症等の感染症に罹患しやすいのは，仔牛の免

んどのＴ細胞がαβ鎖である。それに比べ，γδ

疫機能が未発達なためであるとの考えが広く受け

Ｔ細胞の割合はわずかしかない２）。しかし，γδ

入れられている。よって健康で強靭な仔牛を育てＴ細胞は幼若期の牛の末梢血中にある程度高い割

１）© The Ito Foundation

黒毛和種仔牛の免疫能を高める機能性飼料の探索合で存在し，成長とともにその割合が低下することが明らかとなっている３）。またγδＴ細胞はα

２．方

363

法

βＴ細胞よりも個体発生早期に分化するのが特徴

2.1

であり“innate T cel”と呼ばれている。加えて，

ホルスタイン仔牛６頭を用いた。生後すぐに母γδＴ細胞が自然免疫のパターン認識レセプター

牛から離して飼育した。生後24時間以内に初乳製であるToll様レセプター２を発現することから自剤900ｇ（IgGを150ｇ含む）を給餌した。その後

然免疫としての機能を有することが明らかとなっは ，milk replacer（CP 26 ％，TDN 110 ％ ）をている

700ｇ/日給餌し，Pelleted calf starter（CPN 25％，

。さらに牛γδＴ細胞はWC１とCD８４，５）の発現パターンによって，WC1 CD8 γδＴ細
＋

－

実験１

TDN 76％）と水は自由採食・飲水とした。

胞，WC1 CD8 γδＴ細胞に分類される。WC１

生後14日目に血液を採取し，フローサイトメト

分子は，215kDaの膜糖タンパク質であり，牛γリーを用いてγδＴ細胞およびWC１陽性γδＴ

δＴ細胞でのみ発現し，ヒトやマウスのＴ細胞で細胞の出現割合を測定した。また糞を採取し，糞は認められない。WC１陽性γδＴ細胞は，仔牛中の水分含量を測定するとともに，糞便スコアをの末梢血中に非常に高い割合で存在することか評価した。γδＴ細胞およびWC１陽性γδＴ細ら６），幼若期の牛の免疫機能の恒常性維持に重要胞の出現割合と糞便スコア，糞中の水分含量とのな役割を持つと考えられている。

相関は，ピアゾンの相関係数を用いて解析した。

－＋

これまで我々は黒毛和種牛２週齢時のWC１陽

2.2

実験２

性γδＴ細胞の出現割合と下痢症の治療回数との信州大学農学部附属農場で作製したソルガムサ

間に有意な負の相関があることを明らかにしていイレージ，デントコーンサイレージより乳酸菌をる。すなわちWC１陽性γδＴ細胞の出現割合が単離した。具体的には，乳酸菌を単糖がグルコー高い個体は下痢を発症しにくいことを見出した。

ス，フルクトース，キシロース，マルトースと異よって，仔牛の下痢発症を抑制する方法として，なる４種のMRS寒天培地で嫌気ジャーに入れてWC１陽性γδＴ細胞の出現割合を高める飼養技

培養後，得られたコロニーを液体培地に置換し培術がきわめて有効であると考える。Ｔ細胞の分化養した。液体培養により増殖した乳酸菌を回収には病原性の有無に関わらず細菌の成分が関与し後，凍結乾燥した。

ていると考えられており，安全に食べられる細菌

２週齢の黒毛和種仔牛の血液を採取し，末梢血として乳酸菌が注目さている。乳酸菌はＴ細胞を単核球を単離し培養した。サイレージから単離し含む免疫細胞の成熟や増殖活性を高めることが知た乳酸菌（100ng/ml）を７日間刺激し，刺激前られているが，牛のγδＴ細胞でのみ発現する後の細胞におけるγδＴ細胞およびWC１陽性γ

WC１陽性細胞と乳酸菌との関連性を検討した報∂Ｔ細胞の出現割合をフローサイトメトリーで解告は皆無である。よって本研究では，仔牛の免疫析した。スチューデントのＴ検定を用いて有意差

機能を高める機能性飼料の開発を目指す上で，を求めた（ｎ＝３，ｐ＜0.05）。

WC１陽性γδＴ細胞の出現割合を高める乳酸菌を探索した。さらに，ホルスタイン仔牛において

３．結果と考察も，WC１陽性γδＴ細胞の出現割合と下痢症と3.1の間に相関が認められるのか検討した。

γδＴ細胞，WC１陽性γδＴ細胞の出現割合© The Ito Foundation

実験１

364

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）と糞便スコアとの関連性を検討した。糞便スコア～６）の計23種の乳酸菌を単離することができは１～４段階でスコアが高いほど便が柔らかいこた。またデントコーンサイレージからは，グルとを示している。その結果，γδＴ細胞の出現割コースMRS寒天培地由来の乳酸菌を６種（デン合と糞便スコアとの間に有意な負の相関が認めらト―グル＃１～６），フルクトースMRS寒天培地

れた（ｐ＜0.05）。また，WC１陽性γδ細胞の出由来の乳酸菌を５種（デント―フル＃１～５），

現割合が低い牛ほど糞便スコアが高い傾向があっ

キ シ ロ ー ス MRS寒 天 培 地 由 来 の 乳 酸 菌 を ５ 種た（ｐ＝0.054）。続いて，γδＴ細胞，WC１陽（デント―キシ＃１～５），マルトースMRS寒天性γδＴ細胞の出現割合と糞中の水分割合との関培地由来の乳酸菌を６種（デント―マル＃１～

連性を検討した。その結果，γδＴ細胞および６）の計22種の乳酸菌を単離することができた。

WC１陽性γδＴ細胞の出現割合と糞中の水分割

続いて，ソルガムサイレージ由来の乳酸菌23種に合との間に有意な負の相関が認められた（ｐ＜ついて，γδＴ細胞およびWC１陽性γδＴ細胞

0.05）
。

の出現割合に及ぼす影響を検討した。その結果，

これまで我々は黒毛和種仔牛において，WC１

ソルガム―グル＃３を処理した末梢血単核球は，

陽性γδＴ細胞の出現割合が高い個体は下痢を発

γδＴ細胞およびWC１陽性γδＴ細胞の出現割症しにくいことを明らかにしている。本結果から合が高い傾向にあった（ｐ＝0.075）。本実験はホルスタイン仔牛も同様であることが明らかと100ng/mlの濃度で刺激したものであるため，現なった。生後30日以内の仔牛は，免疫機能は発達

在，より高い濃度で刺激した検討を行っているとしていないことから，初乳からの免疫グロブリンころである。またデントコーンサイレージ由来のが感染防御に大きな役割を果たす７）。本実験で用乳酸菌についても現在検討中である。

いた仔牛は，同一の初乳製剤で飼育したものであるから，各個体のγδＴ細胞の出現割合の違いは

４．要

約

初乳による影響ではないことが言える。よって，

これまで我々は黒毛和種においてWC１陽性γ

血中γδＴ細胞の出現割合は，仔牛の免疫機能のδＴ細胞の出現割合が高い個体は下痢を発症しに重要な指標であると考えられる。

くいことを見出している。よって，仔牛の下痢発

3.2症を抑制する方法として，WC１陽性γδＴ細胞

実験２ソルガムサイレージおよびデントコーンサイの出現割合を高める飼養技術がきわめて有効であレージより乳酸菌を単離した。単糖がグルコーると考える。そこで本研究では，仔牛の免疫機能

ス，フルクトース，キシロース，マルトースと異を高める機能性飼料の開発を目指す上で，WC１なる４種のMRS寒天培地を用いて単離を試みた。

陽性γδＴ細胞の出現割合を高める乳酸菌を探索

その結果，ソルガムサイレージからは，グルコー

した。さらに，ホルスタイン仔牛においても，

スMRS寒天培地由来の乳酸菌を７種（ソルガム

WC１陽性γδＴ細胞の出現割合と下痢症との間―グル＃１～７），フルクトースMRS寒天培地由に相関が認められるのか検討した。その結果，γ

来の乳酸菌を５種（ソルガム―フル＃１～５），

δＴ細胞の出現割合と糞便スコアとの間に有意な

キシ ロ ー ス MRS寒 天培地由来の乳酸菌を５種

負の相関が認められた。またγδＴ細胞および（ソルガム―キシ＃１～５），マルトースMRS寒WC１陽性γδＴ細胞の出現割合と糞中の水分割

天培地由来の乳酸菌を６種（ソルガム―マル＃１

合との間に有意な負の相関が認められた。ホルス© The Ito Foundation

黒毛和種仔牛の免疫能を高める機能性飼料の探索

タイン仔牛もγδＴ細胞の出現割合が高い個体は下痢を発症しにくいことが明らかとなり，血中γδＴ細胞の出現割合は，仔牛の免疫機能の重要な指標であると考えられた。また，ソルガムサイ
レージから23種，デントコーンサイレージより22
種の乳酸菌を単離することができ，ソルガムサイ
レージ由来の乳酸菌の一つは，γδＴ細胞およびWC１陽性γδＴ細胞の出現割合を高める効果を有している可能性が示唆された。今後，この乳酸菌の特性について検討するとともに，動物個体を用いた検討も行っていく予定である。

365

文
献
１） Acres, S. D., Saunders, J. R., Radostits, O. M.：
Canadian Veterinary Journal，18，113～121，1977．
２） Cai, J. L., Tucker, P. W.：Chemical Immunology，
79，99～138，2001．
３） Hein, W. R., Mackay, C. R.：Immunology
Today，12，30～34，1991．
４） Mak, T. W., Ferrick, D. A.：Nature Medecine，4，764～765，1998．
５） Prin, I., Silva-Santos, B., Pennington, D. J.：
European Journal of Immunology，43，1988～1994，
2013．
６） Rogers, A. N., Vanburen, D. G., Hedblom, E. E.,
Tilahum, M. E., Telfer, J. C., Baldwin, C. L. ： Journalof Immunology，174，3386～3393，2005．
７） Webster, A. J. ： Veterinary Record ，108 ，183 ～
187，1981．

© The Ito Foundation

366

産褥牛に起きる急性肝ストレス亢進と肝ビタミンＥ
体内動態関連遺伝子発現抑制に対するRhizopus oryzae
水抽出物給与の予防効果に関する研究
Study on the preventive effects of administration of aqueous extracts of
Rhizopus oryzae on the puerperal acute hepatic stress and suppression ofvitamin E related genes expression in cows

芳賀

聡１・石崎

宏１・狩野

友佳２・鈴木武人２（１国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門，２麻布大学獣医学部）

Satoshi Haga１, Hiroshi Ishizaki１, Yuuka Kanou２ and Takehito Suzuki２（１Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, ２School of Veterinary Medicine, Azabu University）

Blood alpha-tocopherol（α-Toc）, the most biologically active form of vitamin E,
concentrations decline gradually throughout the prepartum period, reaching the nadir after
calving in dairy cows. The α-Toc-related molecules（α-Toc transfer protein［αTTP］andafamin［AFM］）are expressed in liver. These molecules could regulate α-Toc transport andblood concentrations of α-Toc, however, these gene expression levels decreased after calving.
Therefore, the aim of this study was to evaluate the preventive effects of oral administration（OA）of aqueous extracts of Rhizopus oryzae（RU）on the puerperal acute hepatic stress andsuppression of α-Toc-related genes expression in dairy cows, which have remained elusive
until now. Six multiparous Holstein cows were used（from -3 to 3 weeks postpartum）forblood sampling and liver tissue biopsy. Treatments（each n＝3）were as follows：OA（10 g/day）of（ⅰ）RU（RU group）and（ⅱ）placebo（P group）from -3 weeks to 0 day
postpartum. Liver injury was assessed by the activities of serum aspartate transaminase（AST）
and alanine aminotransferase（ALT）, which in RU group were lower than those in P groupduring the puerperal period（from day 0 to 7 postpartum）. The serum α-Toc concentrations
declined gradually towards calving time. In puerperal period, the serum α-Toc concentrations
remained at a lower concentration. The αTTP, AFM, and other hepatic functional genes
mRNA expression levels in the liver were temporarily down-regulated during day 0-3 day
postpartum, and the hepatic mRNA levels of endoplasmic reticulum stress-induced unfolded
protein response marker increased at calving. However, we could not confirm the difference
between these data in two groups. These results indicate that the OA of RU（10g/day for
3weeks prepartum）may be able to prevent the liver injury after calving, while, could notshow clearly the preventive effects on the puerperal acute hepatic stress and suppression of α
-Toc-related genes expression in dairy cows.

© The Ito Foundation産褥牛に起きる急性肝ストレス亢進と肝ビタミンＥ体内動態関連遺伝子発現抑制に対するRhizopus oryzae水抽出物給与の予防効果に関する研究

１．目

367

抗酸化酵素等の肝機能遺伝子発現の抑制に加え，的αTTPやAFMの遺伝子発現も強く抑制されるこ

近年，繁殖農家数および子取り用雌牛の著減にとを見出している６）。すなわち，乳牛の健全性向

よる「肉牛の少子化」により，国内の肉牛生産基

上には，産褥期に起こる肝障害，急性肝ストレス

盤が深刻な危機に直面している。そのため，乳牛

亢進および肝機能遺伝子発現抑制を防ぎ，周産期から生産される，乳用雄子牛や受精卵移植による疾病リスクファクターである低α-Toc血症化を黒毛和種子牛が肉用素牛の重要な供給源となって予防する対策が必要である。

いる。しかし現状では，乳牛の高泌乳化や飼養規

接合菌類ケカビ科のRhizopus oryzaeはアジア

模の拡大により，個体管理や飼養管理は一層難し

諸国で紹興酒などの麹に用いられているが，そのくなっている。特に周産期疾病の増加は，繁殖遅抽出物は様々な生理活性を示す。近年，Suzuki

延そして供用期間の短縮にも直結し，乳牛から安らは四塩化炭素（CCl４）投与により誘発した肝定的な肉用素牛供給を大きく妨げる。すなわち，障害モデルラットにおいてRhizopus oryzae水抽

周産期における乳牛の健全性を向上させる技術の出物（RU）投与が肝障害を低減すること７），さ開発は酪農にとどまらず，いまや国内肉牛生産のらに，牛へのRU給与が肝臓から分泌されるイン観点からも喫緊の課題となっている。

スリン様成長因子-１（IGF-1）の血中レベルを分娩は子牛および生乳の生産上，絶対に回避で有意に増加させることを見出し，RUに肝障害抑きないイベントである。一方，乳牛における疾病

制作用や肝機能賦活化作用があることを示唆して発生率は，産褥期（分娩直後～１週間）に最も高いる。そこで本研究では，分娩前の乳牛へのRUく１），頻発する乳房炎，後産停滞や第四胃変位等

給与が産褥期に起きる肝障害，急性肝ストレス亢

のリスクファクターとして，産褥期の血中ビタミ

進および肝α-Toc体内動態関連遺伝子発現抑制

ンＥ（主にα-トコフェロール［α-Toc］）欠乏を予防するという仮説を立て，その検証を目的と（低α-Toc血症）が近年報告されている

した。

。α

２～４）

-Tocは強力な抗酸化機能および免疫調節機能を有しているが，動物体内では合成できないため，

２．方法

食餌やサプリメントにより摂取しなければならな

本研究計画は，国立研究開発法人農業・食品産

い。吸収されたα-Tocの体内動態は主に肝臓に業技術総合研究機構（農研機構）畜産研究部門動より調節されるが，そのメカニズムには，特異的物実験委員会の事前承認を得て「畜産研究部門動なα-Toc結合能を有し細胞内輸送等を担うα物実験等実施要領」に従って実施された。

-Toc transfer protein（αTTP）やafamin（AFM）

農研機構畜産研究部門畜産飼料作研究拠点（栃の発現が強く関与している 。しかし乳牛の場合，

木県那須塩原市）にて飼養され，2017年５月から分娩による多大な生理的ストレスや酸化ストレス

８月にかけて分娩したホルスタイン経産牛６頭をの増大および急激に始まる乳生産による代謝負担供試した。分娩予定日の３週間前から分娩３週間が肝臓にかかり，肝障害が亢進し肝機能が低下す後までの分娩移行期間を試験期間とした。産次おると考えられる。実際に著者らは分娩直後の高泌

よび分娩月を揃えつつ，３頭をRU区（産次：３

乳牛の肝組織において，急性的な肝臓の炎症応答± 0.6），３ 頭 を プ ラ セ ボ（Placebo：P）区（産と小胞体ストレスの亢進，そして，アルブミンや

次：３±0.6）に配置した。分娩予定日の３週間

５）© The Ito Foundation

368

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

前から分娩日まで毎日，夕方給餌（1600―1630）

析 装 置（Hitachi LABOSPECT）に よ り 分 析 し

前にRU製剤10ｇをRU区の牛に経口投与した。

た。肝組織におけるαTTP，AFM，IGF-1，ア

RU製剤は，米ぬか油かすおよびブドウ糖を賦形

ルブミン（ALB），カタラーゼ（CAT）および成剤としてRU粉末を重量10％含有する粉末剤であ熟 型 X-box binding protein 1 （XBP1s） の 各る。経口投与処理および賦形剤摂取によるプラセ

mRNA発現量は，既報６）に基づき，Q-RT-PCR

ボ効果を相殺するため，Ｐ区の牛にはRU粉末を法により測定した。統計解析は，各項目において，含まない賦形剤成分のみの疑似RU製剤10ｇをRU

個体を変動効果，処理区（Treat）およびサンプ区と同法により投与した。本試験における投与量

リング週（Week）を固定効果として混合モデル

および期間はSuzukiらの報告（第155回日本獣医（SAS）解析を行い，p＜0.05の場合に有意な差が学会発表）を参考にした。両区共にフリーストー

あり，p＜0.1の場合に差の傾向ありと判定した。

ルにて飼養し，分娩前後の期間のみ分娩房で単飼養した。給餌は日本飼養標準を基に給与量を算出

３．結果と考察し ，分 娩 前 は 市 販 の 乾 乳 期 用 配 合（CP20 ％，試験牛の体重およびBCSは分娩前と比較して分

TDN72％以上），コーンサイレージ（CP6.4％，

娩後に有意に減少したが（p＜0.05），各週におけTDN67％）およびイネ科乾草（チモシーまたはる両区間に有意差は見られなかった（データ略）。

クレイングラス：CP16.5％，TDN63％）を給与

血清中NEFAおよびBHBA濃度の推移では，分娩

し ，分 娩 後 は 市 販 の 搾 乳 牛 用 配 合（CP17 ％，前と比較して分娩後に有意に増加し（p＜0.01），

TDN74％以上），コーンサイレージ（同上）およ高泌乳牛の典型的な分娩移行期の負のエネルギー

びイネ科乾草（同上）を給与した。試験期間を通バランスを示した。産褥期以降では，RU区の血じて給与飼料にマグネシウム剤とビタミン剤を定清中NEFAおよびBHBA濃度がＰ区より低く推移

量添加補給し，自由飲水および鉱塩自由摂取とししたが，統計的な有意差はいずれも認められなた。また，分娩以降は毎日朝夕２回の搾乳を行っかった（データ略）。以上より，分娩前３週間のた。

RU給与（10ｇ/日）が分娩移行期のエネルギー代

分娩予定日の３週，１週間前，分娩直後（約14謝負荷に及ぼす改善効果は明らかにできなかっ時間以内），分娩３日後，１週，２週，３週間後た。一方，肝障害マーカーである血清中ASTおに頸静脈から採血して血清サンプルを得た。さら

よびALT酵素活性値（Fig. 1A，B）は，Ｐ区でに体重測定とボディコンディションスコア

は分娩直後から３日目まで増加し分娩１週間後に（BCS）記録を行った。肝臓組織サンプルは，分

おいても高値を示したが，RU区では産褥期にお娩予定日の３週間前，分娩直後（約14時間以内），

ける濃度上昇が小さく，AST活性はＰ区より低分娩３日後，１週，３週間後に，自動生検装置をい傾向（p＜0.1）を示し，そしてALT活性はＰ区

用いて既報６）に基づき採取した。血清中α-Tocよりも有意に低かった（p＜0.01）。これは，肝障濃度をHPLC法により測定した。血清中HDL，遊害モデルラットを用いたSuzukiら ７）の結果を支離脂肪酸（NEFA），βヒドロキシ酪酸（BHBA）

持しており，分娩前３週間のRU給与（10ｇ/日）

濃度および血清中アスパラギン酸アミノトランスが分娩に伴う肝障害に対し予防的な緩和効果を発フェラーゼ（AST），アラニンアミノトランス

揮した可能性が示唆された。

フェラーゼ（ALT）活性は分析委託して自動分

既報６）と同様，血清中α-Toc濃度は試験期間© The Ito Foundation産褥牛に起きる急性肝ストレス亢進と肝ビタミンＥ体内動態関連遺伝子発現抑制に対するRhizopus oryzae水抽出物給与の予防効果に関する研究

369

Fig. 1 Changes in serum levels and concentrations of peripartum dairy cows（RU vs. Placebo, each n ＝ 3）．A）aspartatetransaminase（AST）activities, B）alanine aminotransferase（ALT）activities, C）Alpha-tocopherol（α-Toc）
concentrations, and D）High-density lipoprotein（HDL）concentrations. The puerperal period（from day 0 to 7
postpartum）is denoted by the gray area. All data are expressed as means±SE.

を通じて有意に変動した（Fig. 1C，P＜0.01）。具に変動する傾向が認められ（p＜0.1），分娩３週

体的には，分娩３週間前から分娩にかけて漸減

間前と比較して分娩直後から３日後にかけてし，産褥期間は低値で推移した後，分娩３週間後

mRNA発現量が60～70％まで低下した。AFMにかけて漸増した。一方，各週における両区の値

mRNA発現量は，分娩前後の期間に有意な変化に有意差は確認されなかった。牛血中において最が認められ（p＜0.01），分娩３週間前と比較して，もメジャーなα-Tocキャリアである高密度リポ

分娩直後から３日後にかけてmRNA発現量が有タンパク（HDL）８）の血清中濃度も試験期間を通意に低下した。しかし，両発現量について各週にじて有意に変動し（Fig. 1D，p＜0.01），分娩３週

おける両区間に有意差は確認されなかった。ま間前から分娩にかけて漸減したが，分娩後すぐにた，肝機能遺伝子であるALB，CATおよびIGF-

濃度の上昇と分娩前レベル以上の値に達すること

1 mRNA発現量は（Fig. 2C-E），いずれも分娩３が確認され，産褥期における血中の低α-Toc濃

週間前と比較して産褥期に有意に減少し（p＜度の要因としての血中HDL濃度変化の寄与率は0.01），一 方 ，小 胞 体 ス ト レ ス マ ー カ ー で あ る

両区共に低いものと示唆された。そこで次に，肝XBP1s mRNA発現量は分娩直後に有意に増加し組織中のα-Toc体内動態関連遺伝子（αTTP，た（Fig. 2F，p＜0.01）。しかし，各週における両AFM）の mRNA 発 現 量 に つ い て 調 べ た（Fig.

区間の有意差はいずれも認められなかった。以上2A，B）。αTTP mRNA発現量は分娩前後の期間

より，分娩に伴う産褥期の急性肝ストレス亢進と© The Ito Foundation

370

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 2 Hepatic mRNA expression levels in peripartum dairy cows.（RU vs. Placebo, each n＝3）．A）α-tocopheroltransfer protein（αTTP）,B）afamin（AFM）,C）insulin-like growth factors-1（IGF-1），D）albumin（ALB）,E）
catalase（CAT）,and F）spliced form of X-box binding protein 1（XBP1s）.Messenger RNA expression levels of all
genes were normalized by arithmetic mean of the ribosomal protein S9 and β-actin mRNA expressions as
multiple housekeeping genes. The puerperal period（from day 0 to 7 postpartum）is denoted by the gray area. Alldata are expressed as means±SE.

肝α-Toc体内動態関連遺伝子発現抑制に対する，-Toc体内動態関連遺伝子発現抑制に対する「機分娩前３週間のRU給与（10ｇ/日）による予防効

能的」な予防効果は低い可能性が示唆された。今果は低い可能性が示唆された。

後は，投与量や投与期間などを再検討する予定で総括として，分娩前３週間のRU給与（10ｇ/ある。

日）は，分娩に伴う肝障害に対し有効な緩和効果

最後に，RU製剤および疑似RU製剤を製造し無を示すが，産褥期の急性肝ストレス亢進と肝α

償提供して頂きました株式会社牛越生理学研究所© The Ito Foundation産褥牛に起きる急性肝ストレス亢進と肝ビタミンＥ体内動態関連遺伝子発現抑制に対するRhizopus oryzae水抽出物給与の予防効果に関する研究に深謝いたします。また，本研究をサポート頂き

371

どを再検討する予定である。

ました畜産飼料作研究拠点技術支援センター那須
業務科諸氏ならびに試験牛に深謝いたします。
４．要

約

本研究では，分娩前の乳牛へのRU給与が産褥期に起きる肝障害，急性肝ストレス亢進および肝α-Toc体内動態関連遺伝子発現抑制を予防すると仮説を立て，その検証を試みた。分娩予定日の３週間前から分娩３週後までを試験期間とし，３頭をRU区，３頭をプラセボ（Ｐ）区に配置した。
RU区にはRU製剤10ｇを，Ｐ区にはRU成分を含まない疑似RU製剤10ｇを，それぞれ分娩３週間前から分娩日まで毎日経口投与した。定期的に採血，肝バイオプシーを行い，血液および肝組織サンプルを得て分析に供した。産褥期における血清
中ASTおよびALT酵素活性値は，RU区においてＰ区より低く推移した。血清中α-Toc濃度は分娩直後から分娩１週間後の産褥期間は低値で推移
し，肝組織中のα-Toc体内動態関連遺伝子（αTTP，AFM）のmRNA発現量も分娩直後から３日後にかけてmRNA発現量が低下した。しかし，
いずれも両区の値に有意差は確認されなかった。
また，肝機能遺伝子としてIGF-1，ALBおよび
CAT mRNA発現量および小胞体ストレスマー
カーであるXBP1s mRNA発現量についても両区間の有意差は認められなかった。以上より分娩前３週間のRU給与（10ｇ/日）は，分娩に伴う肝障害に対し有効な緩和効果を示すが，産褥期の急性
肝ストレス亢進と肝α-Toc体内動態関連遺伝子
発現抑制に対する「機能的」な予防効果は低い可文献１） Ingvartsen, K. L., Dewhurst, R. J., Friggens, N.
C.：On the relationship between lactational
performance and health：is it yield or metabolic
imbalance that cause production diseases in dairy
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Depleted serum vitamin E concentrations precede
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鈴木裕，北山峻，小林洋介，加藤和雄，盧尚建：ウ
シ組織におけるα-トコフェロール体内動態関連遺伝
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６） Haga, S., Miyaji, M., Nakano, M., Ishizaki, H.,
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能性が示唆された。今後は，投与量や投与期間な© The Ito Foundation

372

Lactococcus属乳酸菌を用いて調製した発酵乳給与が離乳
子豚の飼料摂取量および増体成績を改善する要因の解明
Dietary effects of fermented milk prepared with Lactococcus genus on
growth performance and fecal microbial community in weaning piglets

守谷

直子・兼松

伸枝・成田

卓美・木元

広実

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Naoko Moriya, Nobue Kanematsu, Takumi Narita and Hiromi Kimoto-Nira（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Fermented milk by lactic acid bacteria is expected to have a beneficial effect on not only
growth performance but also microbial community of the gut for weaning piglets. In this study,
Lactococcus lactis subsp. cremoris strain J50 from lactic acid bacteria collection of our institute
was used for the preparation of fermented milk, because this strain indicated some probiotic
properties in our previous study. Ten piglets（three weeks old）were allocated to milk fed
group and fermented milk fed group. The feeding experiment was carried out for 4 weeks.
The piglets of fermented milk fed group were assumed to take 12 ～ 14 log10 cfu of live strain
J50 every day. There is no significant difference in average dry matter intake and average
daily gain of both groups. Although fecal IgA and IgG concentrations were significantly
decreased after weaning, there is no significant difference in both groups. Fecal microbiota waschanged by the fermented milk feeding. At the phylum level, the relative abundance of
Bacteroidetes in fermented milk fed group decreased and the relative abundance of Firmicutes
increased compared with milk fed group. At the genus level, the abundance of Lactococcus
increased and the proportion of Escherichia/Shigella and Klebsiella decreased in fermented
milk fed group. The administration of fermented milk containing Lactococcus lactis subsp.
cremoris strain J50 may therefore may have a beneficial effect on gut microbiota of weaning
piglets.

１．目

低下することで大腸菌群やサルモネラ菌による感的染性疾病の増加も問題となっている。この時期の離乳直後の移行期の子豚は母豚からの分離や飼子豚に液状飼料を給与することは増体の改善に効

育群の再編など飼養環境の変化によりストレスを果があることが知られており１，２），液状飼料の給受ける。また，母乳から粉餌の人工乳への摂取飼

与は乾物摂取量を増加させるため，腸管絨毛が伸料の変化が原因となる消化不良性の下痢症の発生長するなど消化管が健全な状態に保たれ，子豚のや，母乳を通して受け取った移行免疫の抗体値が成長につながると考えられている３）。大塚らは，© The Ito Foundation

Lactococcus属乳酸菌を用いて調製した発酵乳給与が離乳子豚の飼料摂取量および増体成績を改善する要因の解明

373

離乳期の子豚を用いた試験を行ったところ，粉状株を，殺菌後30℃に冷却した牛乳に１％（wt/の人工乳を給与する場合と比較して，人工乳と発wt）添加し，30℃で一晩発酵させることで調製酵乳を混合した液状飼料の給与が飼養成績の改善した。牛乳および発酵乳は４℃で保管し，１週間に有益であったと報告している 。我々は平成28ごとに必要量を調製した。

４）

年度の本助成において，Lactococcus属乳酸菌を

2.2

発酵乳給与試験用いて調製した発酵乳の給与が離乳子豚の乾物摂試験には母豚２頭の産子であるLWD三元交雑

取量を増大させることを報告している。さらに，種の雌の離乳子豚10頭を用いた。供試子豚は３週

発酵乳には乳酸菌が生菌で多く含まれることか齢で離乳し，28℃に温度制御された動物飼育室のら，乳酸菌が子豚の消化管内でプロバイオティク

単飼用ケージに収容して４週間の飼養試験を行っスとして働くことにより腸内環境が改善する効果た。単飼用ケージの上部には子豚の保温のためにが期待される。

赤外線ランプを設置した。試験区は牛乳給与区

これまでにLactobacillus属乳酸菌やBacillus属（牛乳区）と発酵乳給与区（発酵乳区）の２区と細菌などのプロバイオティクスの摂取が大腸菌数し，供試子豚を腹，体重が等しくなるように５頭を低下させ，豚の腸内菌叢に有益な効果を及ずつ割り当てた。給与する基礎飼料には抗菌性飼ぼすことが報告されており，発酵飼料中に含まれ料添加物および生菌剤を含まない市販の人工乳後る乳酸菌の摂取は，消化管内において大腸菌群の期用（SDS No.２，フィード・ワン株式会社）を競合阻害に有効で，宿主の消化管環境を健全に保用いた。牛乳区の子豚には，基礎飼料と牛乳を現つ効果があると考えられている 。しかし，昔か

物比で１：２の割合で混合した飼料を，発酵乳区

ら乳業用乳酸菌として広く利用されてきたの子豚には，基礎飼料と発酵乳を現物比で１：２

Lactococcus属乳酸菌が，豚の腸内菌叢に及ぼすの割合で混合した飼料を，それぞれ９：00と15：

影響について調べた報告はない。そこで本試験で00に飽食となるように給与した。なお，本研究はは，離乳直後の子豚にLactococcus属乳酸菌を用

農研機構の動物実験等実施規程に従って実施した。

５，
６）

７）

いて調製した発酵乳を給与する試験を行い，離乳

2.3期の子豚の成長に及ぼす効果について検討した。

発酵乳給与試験中，飼料摂取量は毎日，体重は

２．方

測定項目

毎週測定した。試験開始前（３週齢）と試験終了

法

後（７週齢）に頸静脈より採血するとともに新鮮2 . 1 Lactococcus属乳酸菌を用いた発酵乳の調糞を採取した。血液については生化学性状と血液像（江東微生物研究所）を測定した。糞便はサン製
平 成 28 年 度 の 本 助 成 に お い て 選 抜 し た

プリング後すぐに－80℃で保存した。糞中の免疫

Lactococcus lactis subsp. cremoris J50株（以下J50

グロブリン（IgAおよびIgG）濃度については，

株）を発酵乳調製に用いた。J50株は畜産研究部

糞便100mgを10％FBS含有PBSに懸濁してホモジ門の乳酸菌ライブラリーに分離，保存されておナイズした後，遠心分離処理を行った上清についり，良好な乳発酵能を示す 。牛乳は畜産研究部て ELISA キ ッ ト（Bethyl Laboratories）を 用 い門で搾乳された生乳を80℃で30分間殺菌することて測定した。また，糞便100mgからリゾチームとで調製した。発酵乳は，あらかじめ８％スキムミ

アクロモペプチダーゼを用いた酵素法により細菌

ルクに接種して30℃で24時間培養しておいたJ50のゲノムDNAを抽出した。このサンプルについ８）© The Ito Foundation

374

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）て 16S rRNA 遺 伝 子 の メ タ ゲ ノ ム 解 析 を 行 い

は牛乳区0.47kgと発酵乳区0.44kg，飼料効率は牛（Macrogen Japan Corp.），牛乳区と発酵乳区の乳区0.63に対して発酵乳区0.58と，発酵乳区がわ

細菌叢を比較した。

ずかに低い値となった。血液生化学性状（Table

2.4

統計解析

１）は血漿中の総タンパク質，アルブミン含量，

統計解析には，SAS（バージョン9.4）プログ

アルブミン／グロブリン（A/G）比について，両ラムのGLMプロシージャを用いた。結果は平均

試験区に有意な差は認められず，発酵乳給与の影

値±標準誤差で表した。

響はなかった。血中の中性脂肪，総コレステロー
ル，HDLコレステロールおよびLDLコレステロー

３．結果と考察ル濃度（Table２）は，いずれも３週齢から７週

本試験で給与した発酵乳中のJ50株の菌数は調齢へ成長するに伴って有意に（ｐ＜0.05，ｐ＜

製直後において1012cfu/g，１週間貯蔵後において0.05，ｐ＜0.05，ｐ＜0.05）低下したが，発酵乳

10 cfu/gであった。これを給与した発酵乳区の子給与による影響は認められなかった。糞便中の豚 に お け る 乳 酸 菌 摂 取 量 は ，平 均 し て 10 ～IgAおよびIgG含量（Fig.１）は，離乳に伴って有10 cfu/dayであった。発酵乳給与試験期間中の１意に（ｐ＜0.05，ｐ＜0.05）低下したが，発酵乳

日あたり乾物摂取量は，牛乳区0.74kgに対して発給与による影響は認められなかった。

９

12

14

発酵乳給与試験終了日に牛乳区および発酵乳区

酵乳区0.76kgであった。平均日増体重量（ADG）

Table 1 Plasma biochemical parameters of experimental piglets
Total protein（g/dL）

Albumin（g/dL）A/G

Fe（µg/dL）

5.3
5.2

3.7
3.5

2.6
2.1

63.0
38.0

milk
3 weeks old
7 weeks old
fermented milk
3 weeks old

5.5

3.9

2.6

120.2＊＊

7 weeks old

5.5

3.9

2.4

186.8＊＊

Values are least squares means. n＝5. Piglets were fed basal diet with milk or fermented milk fromweaning at 3 weeks old for four weeks. The statistical comparisons were made in same colum withineach group. ＊＊；p＜0.05

Table 2 Plasma lipid profiles of experimenal piglets
Triglycerides

Total cholesterol

HDL cholesterol

LDL cholesterol（mg/dL）
milk
3 weeks old
7 weeks old

87.8
34.8＊＊

135.1

58.2

66.3

95.3＊＊

44.6＊＊

45.5＊＊

fermented milk
3 weeks old
7 weeks old

82.8
37.2＊＊

183.1
94.5＊＊

71.4
44.2＊＊

102.5
46.1＊＊

Value are least squares means. n＝5. milk, milk fed group from weaning at 3 weeks old for fourweeks；fermented milk, fermented milk fed group during weaning period. The statistical comparisonswere made in same colum within each group. ＊＊；p＜0.05© The Ito Foundation

Lactococcus属乳酸菌を用いて調製した発酵乳給与が離乳子豚の飼料摂取量および増体成績を改善する要因の解明

IgA（ng/mg feces）

120

IgG（ng/mg feces）
＊＊

140

＊＊

30

＊＊

25

100

20

80

＊＊

15

60

10

40

5

20
0

375

milk

fermented milk

3weeks old

0

7weeks oldmilkfermented milk

3weeks old

7weeks old

Fig. 1 Fecal IgA and IgG concentrations of milk and fermented milk fed pigs. Asterisks indicate P＜0.05 compared tomilk fed pigs（n＝5）．

100％

Distribution of phylum level phenotypes

90％
80％

OthersFirmicutes

70％

Candidatus

60％

Spirochaetes
Proteobacteria

50％

Planctomycetes

40％

Lentisphaerae
Bacteroidetes

30％

Actinobacteria

20％

Euryarchaeota

10％
0％

milk

fermented milk

Fig. 2 Representative fecal microbiota profiles of milk and fermented milk fed pigs.

の子豚から採取した新鮮糞便中の細菌叢構造の代菌群であった。Bacteroidetes門の割合は牛乳区で表例をFig.２に示した。この時期の子豚の糞便中38.7％に対して，発酵乳区では33.3％と有意に減の細菌叢はFirmicutes門とBacteroidetes門が優勢

少した（ｐ＜0.01）。一方Firmicutes門の割合は，© The Ito Foundation

376

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

牛乳区で55.3％に対して，発酵乳区では61.3％と後，試験数を増やして，離乳子豚の成長に及ぼす増大した。菌叢構造においてFirmicutes門の割合

発酵乳の給与効果やLactococcus属乳酸菌の摂取やその多様性は宿主の腸内環境に有益な効果をも効果について引き続き検討する必要があると考えたらすと考えられている。Hanらは９週齢の離乳られる。

子豚の糞便細菌叢を解析した結果，体重が小さい
子 豚 で は Firmicutes 門 の 割 合 が 小 さ い 一 方 ，

４．要約

Bacteroidetes門の割合が大きかったことを報告し離乳期の子豚の腸内環境の改善による成長促進ている 。また，Enterococcus faeciumをプロバ

効果を期待して，３週齢の雌の離乳子豚に発酵乳

イオティクスとして出生後の子豚に給与することを４週間給与する試験を行った。発酵乳調製にで 増 体 が 促 進 さ れ る こ と ，糞 便 細 菌 叢 のは，昨年度の本助成研究において離乳子豚の乾物

Bacteroidetes門の割合が低下し，Firmicutes門の摂取量を増加させる効果が認められた割合が増加することが報告されている 。本年度

Lactococcus lactis subsp. cremoris J50 株 を 用 い

試験では，J50株を用いて調製した発酵乳の給与た。発酵乳区の子豚では，発酵乳給与試験期間中

は，離乳期の子豚の乾物摂取量に影響を及ぼさなの乳酸菌摂取量が1012 ～1014cfu/dayであった。乾かったが，J50株を含む発酵乳の給与は離乳期の物摂取量，増体，飼料効率は，いずれも両試験区

子豚の菌叢構造に影響を及ぼすことが明らかとで差が認められなかった。糞便中のIgAおよびなった。属レベルでは，両試験区ともPrevotella属

IgG含量は離乳に伴って有意に減少したが，両試とLactobacillus属が糞便の優勢菌群であり，発酵験区に差は認められなかった。Lactococcus属乳乳区においては発酵乳に含まれるLactococus属の酸菌を含む発酵乳の給与は離乳子豚の糞便細菌叢

割合が有意に増加した（ｐ＜0.01）。また発酵乳に影響を及ぼし，牛乳区と比較して発酵乳区では区 で は Escherichia/Shigella 属 お よ び Klebsiella

Bacteroidetes門の割合が有意に減少し，Firmicutes

属，Veillonella属の割合が減少した（ｐ＜0.05，

門の割合が増大した。属レベルでは，発酵乳区に

ｐ＜0.1，ｐ＜0.05）。E. coliやKlebsiellaなどのグ

おいて発酵乳に含まれるLactococus属の割合が有ラム陰性桿菌は日和見感染により，消化管の炎症意に増加し，Enterobacteriaceae科のEscherichia/性疾患に関与していると考えられている。離

Shigella属およびKlebsiella属の割合が減少した。

乳期は，子豚の腸内細菌のバランスが大きく変化

離乳期の子豚にLactococcus属乳酸菌を含む発酵することで消化管疾患のリスクが大きくなること

乳を給与することで腸内環境が改善される可能性から，Lactococcus lactis subsp. cremoris J50株をが示唆された。

９）

10）

11，12）

用いて調製した発酵乳の給与は離乳期の子豚の腸内環境に有益である可能性が示唆された。
以 上 の 結 果 か ら ， Lactococcus lactis subsp.
cremoris J50株を用いて調製した発酵乳を離乳期の子豚へ４週間給与することによって，子豚の腸内細菌叢に有益な効果をもたらず可能性が示唆された。本年度の試験では，発酵乳給与による離乳期の飼養成績の改善が認められなかったが，今

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Lactococcus属乳酸菌を用いて調製した発酵乳給与が離乳子豚の飼料摂取量および増体成績を改善する要因の解明
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377

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© The Ito Foundation

378

ビタミンＡ強化代用乳が黒毛和種子牛の哺育・育成期
における生育へ及ぼす影響
Effects of vitamin A content in calf milk replacer on blood parameters anddevelopment of Japanese Black calves

小

野

晴

美

（福岡県農林業総合試験場）

Harumi Ono（Fukuoka Agricultural and Forestry Research Center）

We investigated the effects of different levels of vitamin A additive in calf milk replacer（CMR）on the blood parameters and growth rate of Japanese Black calves. The CMR used inthis experiment was“Calf Top EX Black”（TDN 108% CP 28% EE 18%）
. Experimental
animals were 15 calves（nine bulls and six heifers）. Three bulls and three heifers were given
CMR that was not supplemented with vitamin A（Control group）, three bulls and three heifers
were given CMR supplemented with vitamin A（50,000 IU/day; Group 1）, and three bulls were
given CMR supplemented with vitamin A（70,000 IU/day; Group 2）. Other than the quanity ofvitamin A supplement, all calves were maintained under the same conditins. We investigatedchanges in blood plasma retinol（Vitamin A1）levels, plasma α-tocopherol levels（Vitamin E）,
total cholesterol（T-Cho）, feed intake and growth rate of calves between the ages of 2 and 10
weeks. Although three were no marked differences in the measured parameters among groups,changes were more noticeable in the experimental groups（Group 1 and Group 2）than in theControl group. The findings showed that CMR supplemented with vitamin A had an influenceof plasma retinol levels. We considered that it is important to increase blood vitamin A levels
by giving CMR supplemented with vitamin A（>50,000 IU/dl）by 2 weeks of age in order tomaintain blood vitamin A levels at about 80 IU/dl. No clear differences in blood plasma α-tocopherol levels or T-Cho were observed in any of the animal groups. Blood α-tocopherollevels and T-Cho increased when the calves were given CMR（1.2 kg/day）between the agesof 3 and 8 weeks; however, blood α -tocopherol levels and T-Cho decreased when we reduced
the quanity of CMR from 1.2 kg/day after 8 weeks of age. These findings imply that CMR was
the main energy source of calves. Similary, no major differences were observed in live weight,
physical constitution and feed intake in all groups at ten weeks of age. We plan to extend thisstudy to an age of nine months to determine if any such differences arise. We will also attempt
to determine how much vitamin A is required in order to maintain blood plasma vitamin A
levels above 85 IU/dl in calves aged 2 and 7 weeks-old to ensure healthy growth.

© The Ito Foundation

ビタミンＡ強化代用乳が黒毛和種子牛の哺育・育成期における生育へ及ぼす影響

１．目

379

の摂取不足は腸粘膜発育停滞等などによる食欲低的下，下痢および飼料効率の低下等，生育に支障を黒毛和種子牛の哺育体系では，分娩後速やかにきたす恐れがある。そこで本研究では，哺育期に母牛から離し，高蛋白・低脂肪の代用乳を多給す

おいて，肉用牛の血中VitA制御閾（85～200IU/

る「強化哺育」により，通常の人工哺育と比較し４）dl）の下限値である血中VitA濃度85IU/dl以上をて哺育終了時の体重・体格が優れることが報告さ維持するために必要な代用乳へのVitA添加量をれている１）。しかし，哺育期の黒毛和種子牛の血明らかにすることを目的とした。

中ビタミンＡ（VitA）濃度について，自然哺育

２．方した子牛では，出生直後の約30IU/dlから７日齢

法には約60IU/dlと２倍に増加し，その後12週齢ま2.1

で徐々に増加して約100IU/dlに達するが，代用乳

Table１に供試牛の概要と試験区分を示した。

の み を 給 与 し た 場 合 ，出 生 か ら ３ か 月 齢 ま で

黒毛和種子牛15頭（雄９頭，雌６頭）を代用乳へ

60IU/dl 以 下 で 推 移 す る こ と が 報 告 さ れ て いのビタミンＡ（VitA）添加量の違いにより，対る。近年の種雄牛の改良により，黒毛和種子

照区（無添加）および５万IU区（５万IU／日添

牛は出生時体重が重く，増体性も向上しており，加）に雄・雌各３頭，７万IU区（７万IU／日添

現在使用されている代用乳では，哺育期における加）に雄３頭を配置した。試験は福岡県内１戸のVitA要求量を充足していないことが考えられる。

黒毛和種繁殖農家で実施し，試験期間は哺育期

VitAは，粘膜形成に不可欠な要素であり，VitA（２～10週齢）とした。

２，３）

供試牛と飼育期間ステージ

Table 1 List of examination calves

Group

SEX

Date of Birth

1s FatheStart week
age be gave
CMR

70,000IU

Male

2017/12/23
2017/12/31
2018/ 1/ 8

Mituhirateru
Sakio
Sigehisazakura
Average

0.6
1.4
1.1
1.0

Male

2017/11/29
2017/12/ 8
2017/12/12

Mituhirateru
Mituhirateru
Sakio
Average

1.3
2.7
2.1
2.0

Female2017/11/19
2017/11/23
2017/11/26

Mikunizakura
Takanokuni
Mituhirateru
Average

0.9
1.0
1.7
1.2

Male

2017/10/ 8
2017/11/16
2017/11/26

Mikunizakura
Mikunizakura
Fukuyasuteru
Average

1.3
0.7
1.7
1.2

2017/10/20
2017/11/18
2017/11/19

Satitadasakae
Kitahirayasu
Sigehisazakura

0.9
0.4
0.6

Average

0.6

50,000IU

Control
Female© The Ito Foundation

380

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

kg

2,500
2,000

Calf Milk Replacer（TDN:108%, CP:28%, EE:18%）
Dry Calf Starter（TDN:71.5%, CP:19%）

1,500
1,000
500
0

２Ｗ

３Ｗ

４Ｗ

５Ｗ

６Ｗ

７Ｗ

８Ｗ

９Ｗ

10Ｗ

age
Fig. 1 Feeding program of Calf Milk Replacer and Dry Calf Starter

2.2

試験方法

の頸静脈より血液を採取し，遠心分離によって得

VitA 添 加 材 は 市 販 代 用 乳 へ 添 加 さ れ て い るられた血漿中のVitAおよびビタミンE（VitE）濃VitA剤と同様のものを使用した。VitAの添加量

度をHPLC法により測定した。また，血漿中の総は５万IU区で５万IU／日，７万IU区で７万IU／

コレステロール（T-Cho）を乾式臨床化学分析

日 と し ，代 用 乳（現 物 当 た り 可 消 化 養 分 総 量装置（Spotchem SP-4410，Arkray）により測定（TDN）108％，粗タンパク質（CP）28％，粗脂した。代用乳摂取量は毎回の給与量と残量を測定

肪（EE）18％）に添加し，朝晩２回給与した。

することで，人工乳摂取量は毎日の給与量を記帳

代用乳と人工乳の給与プログラムをFig.１に示しし，１週間ごとに残量を測定することで調査した。代用乳の給与プログラムは全区で同様とし，た。統計処理は，雄は分散分析，雌はTukeyHSD

生後２週齢までに給与を開始した後，最大給与量により各試験区間の有意差検定を行った。

1.2kg／日を５週間給与，その後，段階的に減量して10週齢までに離乳した。人工乳の給与プログ

３．結果と考察

ラムも全区で同様とし，市販飼料（TDN71.5％，

雄雌における各試験区の血中VitA，VitEおよ

CP19％）を朝晩２回給与した。人工乳は３週齢

びT-Cho濃度の変化状況をFig.２に示した。雄のから給与を開始し，10週齢到達時に2.4kg／日ま血中VitA濃度は全区において，７週齢まで60IU/で増給した。飼育環境は個別飼いとし，飲水等のdl前後で推移した後，急激に上昇し，10週齢には飼養条件は全区で同様とした。

全区約100IU/dlとなった。試験区間に有意な差は

本研究は，「産業動物の飼養および保管に関す認められなかったものの，２～７週齢でVitA添る基準」（昭和62年10月９日総理府告示第22号）

加区が対照区よりも高い値で推移した。また雌でに基づいて実施した。

は，２～７週齢において対照区で40～50IU/dl，

2.3

調査項目

５万IU区で70～80IU/dlで推移し，その後，10週

体重と体格（体高・胸囲・腹囲）は２，10週齢齢には対照区で70IU/dl程度，５万IU区で110IU/時に測定した。試験開始以降１週間ごとに試験牛dl以上の値を示した。２，10週齢時において，© The Ito Foundation

381

ビタミンＡ強化代用乳が黒毛和種子牛の哺育・育成期における生育へ及ぼす影響

α－Tocopherol(mg/dl）

70,000IU
50,000IU
Control

60

800

70,000IU
50,000IU
Control

500
400
300
200
100

180

40

700

5W

6W
age

7W

8W

9W 10W

αｰTocopher（Female）
*

500
400
300

50,000IU

200

Control100
2W 3W 4W 5W 6W 7W 8W 9W 10W
age

T-Cho（Female）

160
T-Cho（mg/dl）

50,000IU

100

4W

600

180

120

3W

800

T-Cho（Male）

140

†

2W

0

Control†

60

70,000IU

T-Cho（mg/dl）*

2W 3W 4W 5W 6W 7W 8W 9W 10W
age

160

140
120
100

50,000IU

80

80
60

Control80

αｰTocopherol（Male）

600

0

100

2W 3W 4W 5W 6W 7W 8W 9W 10W
age

700

**

50,000IU

80

40Retinol（Female）

120
Retinol（IU/dl）

100

Retinol（Male）

α－Tocopherol（mg/dl）

Retinol（IU/dl）

120

60

2W 3W 4W 5W 6W 7W 8W 9W 10W
age

Control

2W 3W 4W 5W 6W 7W 8W 9W 10W
age

Fig. 2 E. Changes of blood plasma retinol，α-Tocopherol and T-Cho（mean±SE） ：Significant difference between the groups（p＜0.01）＊＊

＊：Significant difference between the groups（p＜0.05）
†：Significant difference between the groups（p＜0.10）

５万IU区が対照区よりも有意に高く（ｐ＜0.05），

蔵量が少なく，成牛よりも早くビタミンＡ欠乏症

約1.6倍の高い値を示した。

を発症することが知られている６）。血中VitAは，

子牛は，６週齢まで体内でβ-カロテンをVitA

今回の試験でも，雄子牛で７週齢，雌子牛で６週に変換できず５），この間，体外からのVitAの供給齢まで変動なく推移しており，その後，いずれもに依存する。また，若齢牛はVitAの体内での貯急激に上昇した。人工乳，代用乳のβカロテン含© The Ito Foundation

382

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

有量は非常に少ないことから，体内でのVitAの

我々は既報において，VitAを多給した黒毛和種

貯蔵能力が高まったことが推察された。雄の血中

子牛の血中VitE濃度が高く推移したことから，

VitA濃度について試験区間に有意な差は認めら

VitA給与による子牛生体内の脂質代謝向上の可れなかったものの，２～７週齢でVitA添加区が能性を報告した２）。しかし，今回の試験では，雌対照区よりも高い値で推移した。雌においても，３週齢の血中VitE濃度について対照区が５万IU

全期間を通じて５万IU区の血中VitA濃度が対照

区よりも有意に高い値を示すなど，既報と異なる区よりも高く推移した。このことは，代用乳への結果となったことは，今後の検討課題としたい。

VitA添加が，雄雌の別なく，血中VitA濃度に影

雄雌の血中T-Cho濃度は，全区で６週齢まで上響を及ぼしたことを示した。また，雌では試験開

昇し，７週齢以降低下した。いずれの週齢時にお始時である２週齢で，５万IU区が対照区よりもいても試験区間に有意な差は認められなかった

有意に高い血中VitA濃度を示した。これは，代（Fig.２）。血中T-Cho濃度の変化もVitE同様，代用乳給与開始の週齢が，対照区は0.6週齢と早い用乳給与プログラム（Fig.１）と同様の動きを示のに対し，５万IUは1.2週齢と遅く，母乳の給与した。本試験において，代用乳給与量の漸減時

期間が長かったことが一つの要因と考えられた。

（８～10週齢）に血中T-Cho濃度が低下したこと

つまり，初乳を含め，分娩初期の母乳を長期間摂から，代用乳を多給する今回の給与プログラムに取することで，子牛は母乳からのVitAを効率的おいて，人工乳への切り替え方法を改善する必要に吸収し，血中VitA濃度を急激に上昇させたと性が認められた。

考えられた。また，哺育期間を通じて血中VitA

試験牛の発育および飼料摂取状況をTable２に濃度を高位に維持するためには，２週齢までに血示した。10週齢時における雄雌の体重，体高，胸中VitA濃度をいかに上昇させるかが重要と考え

囲，腹囲について，試験区間に差はなく，試験期られた。

間中の日増体量にも差は認められなかった。ま雄の血中VitE濃度は，対照区と５万IU区で５た，代用乳，人工乳およびTDN，CP摂取量につ

週齢まで上昇し，その後10週齢には200mg/dl程いても，雄雌全区間において差はなかった（Table

度 ま で 低 下 し た 。７ 万 IU 区 で は ４ 週 齢 ま で２）。既報２）において我々は，哺育期間のVitA給450mg/dl程度で推移し，その後，同様に低下し与は哺育終了時の体重に影響を及ぼさないものの，た。すべての週齢時において，試験区間に有意なその後，育成期の発育性が向上し，育成期終了

差は認められなかった。雌の血中VitE濃度は，（９か月齢）時の体重が増加することを報告して対照区が４週齢時までに約700mg/dlまで急激にいる。今回の試験牛についても，今後，９か月齢上昇した後，低下した。５万IU区は９週齢まで時点までの生育を調査し，哺育期のVitA摂取量が400mg/dl程度で推移し，10週齢で急激に低下し発育性に及ぼす影響について検討する必要がある。

た。また，３週齢時において対照区が５万IU区

今 回 の 試 験 で は ，目 的 と し た 血 中 VitA 濃 度

よりも有意（ｐ＜0.05）に高い値を示した（Fig.

85IU/dl以上を維持することができなかったが，２）。雄雌全区において，血中VitE濃度の変化は哺育期間を通じて血中VitA濃度を高位に維持す

代用乳給与プログラム（Fig.１）と同様の動きをるためには，２週齢までに血中VitA濃度を十分示したことから，代用乳は哺育期における子牛へに上昇させることが重要であることが明らかにのVitEの主要な供給源であることが示唆された。

なった。また，分娩初期に母乳を長期間給与した© The Ito Foundation

383

ビタミンＡ強化代用乳が黒毛和種子牛の哺育・育成期における生育へ及ぼす影響
Table 2 Effect of Vitamin A on performance of calves．
WeightSex

Male

FemaleQuantity of Vit, AｎAdditon to CMR

2week
（kg）

10week（kg）

D.G

HeightChest
mearsuement

Abdominalgirth（2～10w）（kg/day）

（10w）
（cm）

（10w）
（cm）

（10w）
（cm）

Intake per day（kg）（2～10w）
DM

TDN

CMR

Calf
Starter

mean

SD

mean

SD

mean

SD

mean

SD

mean

SD

mean

SD

mean

SD

mean

SD

mean

SD

mean

SD

70,000IU

3

47.4

5.9

90.7

7.1

0.77

0.03

88.2

0.7

102.2

0.6

115.0

4.1

1.65

0.29

1.48

0.27

0.89

0.23

0.92

0.23

50,000IU

3

48.0

0.0

89.8

9.3

0.77

0.16

87.3

0.9

102.3

2.4

114.3

4.1

1.32

0.28

1.22

0.24

0.83

0.11

0.61

0.21

Control（0IU） 3

50.4

3.3

92.8

3.5

0.76

0.10

87.6

0.6

103.5

0.6

114.5

0.6

1.42

0.13

1.31

0.16

0.89

0.21

0.61

0.19

50,000IU

3

42.7

4.7

83.7

6.6

0.73

0.06

84.9

1.9

102.0

0.5

112.0

3.7

1.35

0.18

1.18

0.19

0.65

0.20

0.84

0.11

Control（0IU） 3

45.9

4.7

92.8

6.7

0.84

0.07

88.4

2.6

104.8

1.2

116.5

3.4

1.41

0.08

1.29

0.09

0.85

0.20

0.66

0.26

試験牛において，血中VitA濃度が上昇したこと

いて代用乳給与量の増減に準じて変動し，代用乳から，今後，母乳と代用乳からのVitA吸収効率

は子牛への主要なエネルギー供給源であることがの違いを解明することが重要と考えられた。

明らかとなった。飼料摂取，発育状況についても，

４．要

雄雌の各試験区間に差は認められなかった。今約後，９か月齢時点まで発育性を調査するととも代用乳中へのビタミンＡ（VitA）添加量の違に，人工哺育開始時に血中VitAを85IU/dl以上といが哺育期の血液性状および発育性に及ぼす影響

なるVitA添加量を解明することが必要である。

について検討した。黒毛和種子牛15頭を，対照区

キーワード：黒毛和種子牛，哺育期，代用乳，ビ（無添加），５万IU区（５万IU／日添加）に雄・タミンＡ

雌各３頭，７万IU区（７万IU／日添加）に雄３頭をそれぞれ配置した。VitA添加量以外の飼養謝辞

条件は全区同様とし，哺育期間（２～10週齢）中

本研究の実施にあたり，調査子牛の提供およびの血中VitA，ビタミンＥ（VitE）および総コレ

調査にご協力頂きました石橋牧場のご夫婦に心よステロール（T-Cho）濃度の推移および飼料摂り感謝いたします。

取状況，発育状況を調査した。
血中VitA濃度について，雄雌の各試験区間に明確な差異は認められなかったが，２～７週齢において，VitAを添加した区が無添加のものより高い値で推移したことから，代用乳へのVitA添加が，血中VitA濃度に影響を及ぼすことが明らかとなった。また，試験開始前の母乳給与期間が長かった試験区において，試験開始時（２週齢）から７週齢まで血中VitA濃度が70IU/dl程度と高く推移したことから，哺育期の血中VitA濃度を高 位 に 維 持 す る た め に は ，２ 週 齢 ま で に 血 中
VitA濃度を十分に上昇させる必要性が示唆された。血中VitE，T-Cho濃度についても，雄雌の文
献１） 小野晴美，浅岡壮平，林武司，磯崎良寛，家守紹
光：福岡県農林業総合試験場研究報告，３号，49～
56，2017．
２） Ono, H., Saito, A., Matuno, T., Hayashi, T., Ueda, S.,
Baba, T.：Different level of vitamin in Calf Milk
Replacer effect on calf blood parameters and calf
development on a Japanese Black cow, The 17th
AAAP Animal Science Congress，202，2016．
３） 吾郷英昭，大谷研文，奥田郁子，坂田昭次：黒毛和種子牛とその母牛の血中レチノール，β-カロチン
及びα-トコフェロール値の推移，山口県畜産試験場
報告，第16号，27～33，2000．
４） 日本飼養標準（肉用牛），2007．
５） ZINZEN.H：ロシュ飼料ゼミナール講演会，６，
58，1975．
６） 小野斉：日本畜産学会北海道支部会報，第25巻第３号，27～34，1983.

各試験区間に差は認められなかったが，全区にお© The Ito Foundation

384

子牛の強健性と発育能力を高める初期栄養強化プログラムの開発
Development of intensified neonatal feeding program for improved healthand growth in suckling calves

松

崎

正

敏

（弘前大学農学生命科学部）

Masatoshi Matsuzaki（Faculty of Agriculture and Life Science, Hirosaki University）

A feeding trial was conducted to clarify whether further acceleration of intensified milk
replacer feeding can improve growth and health status of suckling calves. Four Holstein bull
calves and one each of male and female Jersey calves were purchased from local dairy farmers
at the age of 1 week. They were housed in individual pens and raised on intensified calf
feeding programs “Calf top EX and EX black”（ZEN-RAK-REN）, which provided maximum
amounts of 1,200 and 1,000 g high protein milk replacer powders per day, respectively for
Holstein and Jersey calves. Control group followed the feeding programs instructed bymanufacturer taking 2weeks of accustom period for increased milk replacer feeding to attainmaximum amounts. Further acceleration by shortening the accustom period by approximately
1week was adopted to treatment group. Holstein calves consumed designed amounts of diet on
both treatments while Jersey calves were not able to consume the diet including milk replacerand starter. Accelerated Holstein calves showed higher growth rate on the 2nd weeks ofexperiment which corresponded to increased consumption of milk replacer. Health status
including fecal score was not affected by nutritional treatment. There was no appreciable
difference in weekly plasma measurements of metabolites, IL-6，IL-1b, TNF-α and IFN-γ．
The results suggest that nutritional acceleration of suckling calves should accord with their
growth potential and/or flame size.

１．目

生後早期の疾病予防が課題である。この時期の感的染症による発熱を伴う子牛の体調不良には抗生物哺育期の疾病をきっかけとした子牛の損耗・廃質投与による対症療法が効果を発揮することか

用は依然少なくなく，国内で生まれる子牛の消化ら，様々な抗菌性飼料添加物などを利用した疾病

器・呼吸器疾患による損耗率は１割にも達するも予防策の開発が試みられている。しかしながら，のと推計されている。子牛損耗・廃用のきっかけ

抗生物質や抗菌性飼料添加物に頼ることなく子牛となる疾病は，子牛自身の免疫機能の発達が盛ん

自身の強健性・抗病性を高めて哺育期の損耗率低になり始める１ヵ月齢頃以前に発生しており，出減をはかるとともに，早期の肥育開始が可能な発© The Ito Foundation

子牛の強健性と発育能力を高める初期栄養強化プログラムの開発

385

育能力の優れる肉用子牛の飼養システム開発が求する哺乳方式を対照区として，試験区（早期強化

められている。これまで，プレバイオティクスや区）においては代用乳粉末給与量を最大量に増大

プロバイオティクスなどの利用による抗病性向上

させる期間を約１週間前倒しして，より早期からやホエータンパク質を活用した代用乳の開発，高の栄養強化を試みた。

タンパク質代用乳の増量給与などによる子牛の毎日の給餌の際に，飼料摂取量を調査し，下痢発育促進技術が提案されている。しかしながら，軟便の発生状況を糞スコア（１：しっかり固い～

子牛自身の免疫機能の発達が盛んになり始める生５：水様）として観察記録するとともに，体重は後１ヵ月齢頃まで，すなわち子牛損耗の端緒とな毎週測定した。１週間間隔で朝の給餌前に頸静脈る疾病が発生する時期をターゲットとした栄養強血を採取して，グルコース，NEFA，乳酸および化プログラムの開発とその効果検証はなされていβ-ハイドロキシ酪酸の血漿中濃度を測定した。

ない。

さらに，血漿中のIL-6，IL-1b，TNF-αおよび

１）

そこで本研究では，高タンパク質代用乳を増量給与する哺育方式における代用乳増量給与スピー

IFN-γの濃度を牛サンプルの測定を対象とした
ELISAキットで測定した。

ドをさらに早期化して哺乳初期からの栄養強化を

２）
４週齢時には，Plessers et. al.（2015）の方法

試み，飼養成績ならびに下痢軟便の発生状況やに従って，LPS負荷試験による炎症反応評価を試

LPS負荷試験に対する応答，血中の代謝成分やサみ た 。LPS（Sigma L-4516 ，E. coli O127 ： B8）

イトカイン濃度に及ぼす影響を調査した。

の投与用量（0.3µg/kg体重）は，自然哺育育成中

２．方の子めん羊を用いて実施した予備試験により，血法

漿中サイトカイン濃度や直腸温の上昇などを引き

本実験は，弘前大学動物実験委員会による審査・承認を受け（A17005），動物実験に関する規則に従って実施した。
生後約１週齢のホルスタイン種雄子牛４頭，起こすものの重篤な臨床症状がみられないことを確認して設定した。
３．結果と考察

ジャージー種の雌雄子牛各１頭の計６頭を青森県

試験開始の１週齢時における供試牛の平均体重

内の酪農家より購入して飼養試験に供試した。ホはホルスタイン種が47.6kgとジャージー種の19.4kg

ルスタイン種およびジャージー種には，粗タンパの２倍以上と，両品種のフレームサイズの違いが

ク質含量が28％，粗脂肪含量はそれぞれ15％およ

明らかであった。Fig.１に代用乳摂取量の推移を

び18％の代用乳粉末を５倍量の温湯に溶解して10示したように，ホルスタイン種では残飼が発生す時と18時に２等分して給与した。ホルスタイン種

ることはなかったが，ジャージー種においては最への代用乳粉末の給与日量は600ｇから２週間か

大給与日量に相当する溶解した代用乳６kgを安けて最大1200ｇに増量して２週間給与した後，２

定的に摂取できるまでに至ることなく，離乳に向週間かけて代用乳給与量を漸減，固形のスター

けた給与量漸減の時期を迎えることとなった。

ター給与量を漸増，若干量の乾草を給与して７週

ジャージー種の供試牛においては朝夕いずれかの齢時に離乳した。ジャージー種では同様の哺乳プ

代用乳をほとんど摂取しない日が散見された。すログラムにおける代用乳粉末の最大給与量を1000

なわち，フレームサイズの大きく異なる両品種にｇとした。これら高タンパク質代用乳を増量給与

対して代用乳給与量が大差のない設定となってい© The Ito Foundation

386

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Holstein

JerseyFig. 1 Actual milk replacer intake of calves in control and accelerated intensified feeding group.

たため，両者の給与された栄養水準が異なり，ホまた，ジャージー種子牛では設定した７週齢の離ルスタイン種では不足，ジャージー種では過剰と乳時期においてもスターターの摂取量がきわめてなっていたものと推察された。実際，ホルスタイ

少なく，さらに１週間，１日１回の哺乳を継続せン種では１～２週齢時における日増体量が両試験ざるを得なかった。これらの結果は，フレームサ

区ともに低く，２～３週齢時には早期強化区で増イズの大きいホルスタイン種では本試験開始時期

体量が高まっていた（Table１）。一方，ジャージー

よりも早期の出生直後からの代用乳増給による初種では過剰量の代用乳を給与されていたにもかか

期栄養強化が可能なのに対して，ジャージー種のわらず，１～３週齢時を通じて両個体ともに日増ように小型な品種においては１回あたりの代用乳

体量は0.3kg程度にとどまっていた（Table１）。

給与量を少なくして給与回数を増やすなど慎重な© The Ito Foundation

子牛の強健性と発育能力を高める初期栄養強化プログラムの開発
Table１ Weekly average daily gains in calves fed on control or

accelerated intensified feeding regimen.
control

Holsteinaccelerated

p-value

ｎ＝2

ｎ＝2

1-2 week

0.14±0.04

0.10±0.19

0.82

2-3 week

0.57±0.07

1.06±0.13

0.04

3-4 week

1.24±0.12

1.08±0.01

0.21

4065♂

4064♀

1-2 week

0.33

0.35

N.A.

2-3 week

0.35

0.27

N.A.

3-4 week

0.09

0.80

N.A

JerseyHolstein

JerseyFig. 2 Fecal scores of calves in control and accelerated intensified feeding group. Fecal scores

were recorded from 1：firm and dry to 5：watery.

© The Ito Foundation

387

388

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

栄養強化が必要なものと考えられた。

認められず，これらを指標とした栄養強化の効果

Fig.２に示した糞スコアの推移をみると，両品
種とも日齢の進行とともに低い値へと安定していく傾向が認められたが，代用乳給与プログラムの違いによる差は明らかではなく，下痢軟便の発生に哺乳プログラムの影響は認められなかった。

判定や免疫機能の発達，強健性の評価は難しいものと考えられた。
４．要

約

高タンパク質低脂肪の代用乳を増量給与する哺

出生日が早く先行して試験を開始したホルスタ

育方式における代用乳増量給与をさらに早期化しイン種４頭の４週齢到達時に，LPS負荷試験を実て哺乳初期からの栄養強化を行い，発育および強施した。すべての個体においてLPS静注後10分程健性に及ぼす効果の検証を試みた。ホルスタイン

度から目視でも感知できるほどの頻脈と多呼吸が種の供試牛に対しては代用乳増量給与のスピード認められ，うち２頭が30分以内に斃死した。異常を速めることによる増体促進効果が認められたもを感知した時点で獣医師に連絡して指示を仰ぐとのの，ジャージー種の子牛においては安定的に摂ともに，生存した２頭については獣医師の往診を取可能な代用乳給与水準や給与回数の検討が必要

受けて抗炎症剤の投与，脱水・アシドーシス改善

なことが示された。代用乳増量給与時期の早期化のための補液，栄養補給，強肝剤の投薬治療などによる初期栄養強化は血中代謝成分やサイトカイにより快復した。Plessers et. al.は本研究で用いン濃度，糞スコアなどに対する目立った効果を認

たLPS 0.3µg/kg体重よりも多量の0.5µg/kg体重

められなかった。以上の結果から，フレームサイのLPS投与を行って子牛における急性期炎症反応

ズの異なる品種の子牛それぞれが持つ潜在的な発に対する評価モデルとしての有用性を報告してい育ポテンシャルに応じた初期栄養強化プログラム

る。と同時にLPS投与を行った８頭のうち１頭の開発の重要性が示唆された。

斃死を報告しており，静脈内へのLPS投与による負荷試験の実施には急性のエンドトキシンショッ
クに至らない用量の設定や標品の選択など綿密な予備検討が必要と考えられた。以上の事故を受けて，ジャージー種の供試牛に対するLPS負荷試験は断念することとした。
１週間間隔で採材した血漿サンプルについて分析を行った代謝成分ならびにサイトカインの濃度

文献１） 齋藤昭：哺乳子牛の栄養と飼養管理の変遷～“強化”哺育への道程～，家畜感染症学会誌，１，37～
47，2012．
２） Plessers, E., Wyns, H., Watteyn, A., Pardon, B.,
De Backer, P., Croubels, S.：Characterization of an
intravenous lipopolysaccharide inflammation modelin cakves with respect to the acute-phase response,
Veterinary Immunology and Immunopathology，
163，46～56，2015．

には，飼料処理ならびに日齢の進行に伴う影響は© The Ito Foundation

389

骨格筋の成長と筋線維型決定におけるストレス応答
ホルモンの影響The effect of stress hormone on the proliferation of myoblast and thedetermination of muscle fiber type

佐

藤

勝

祥

（秋田県立大学生物資源科学部）

Katsuyoshi Sato
（Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University）

In recent years, the idea of animal welfare is widespread in animal husbandry field. In
addition, stress adversely affects on productivity and the quality of animal product. So, it isvery important to reduce the stress of livestock. We have studied with attention to the novel
physiologically active peptide “apelin”，this hormone was known as stress related hormones.
Recently, the new possibilities as apelinʼs growth factor have being suggested. The aim of thisstudy, therefore, 1）to investigate that apelin promotes mouse growth 2）to investigate theeffect of apelin to Japanese short horn-derived muscle satellite cells growth and differentiation.
In Experiment 1, apelin intraperitoneal administration twice weekly significantly increased
weight gain of C57BL/6 mouse. In Experiment 2 with myoblast cell from Japanese shorthorn
cattle, apelin stimulated cell growth. And apelin decreased the expression level of slow MyHC
mRNA that is expressively expressed in type 1 muscle fibers at differentiation induction. From
this experiment, it became clear that apelin promotes weight gain of mice and promotes
proliferation of Japanese short horn-derived muscle satellite cells, suggesting the possibility of
apelin growth promoting effect.

１．目

芻動物のストレス反応において新規ストレス応答

的ホルモン「アペリン」が重要な役割を担っている

秋田県立大学付属フィールド教育研究センター

ことが明らかになっており，ヤギへの絶水刺激に（FC）で飼育されている日本短角種牛は，粗飼料

よってアペリン分泌が促進されることや，ヒツジの利用効率に優れており，放牧飼育に適しているにおけるストレスホルモン（AVPやACTH）分ことから，地元の飼料資源を有効活用できる食肉

泌促進作用を報告している１）。ところで，アペリ資源として大変魅力的である。我々は，ストレスンにはストレス応答因子としての働きだけでな

応答ホルモンを指標として，ストレスの少ない飼く，成長因子としての可能性が明らかになりつつ育環境の構築と生産性および肉質の改善を目標にある。ヒツジにおける成長ホルモン分泌促進作研究に取り組んでいる。これまでの研究から，反用１）や，マウス由来骨格筋細胞の細胞増殖促進作© The Ito Foundation

390

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

用２）が報告されている。これらのことから，アペ10µg（in100µl PBS）とした。試験区は，通常飼リンがストレス管理と生産性の向上という二つの料（動物実験用飼料MF，オリエンタル酵母工業

課題を結びつける指標となりうる可能性が期待さ株式会社）給餌区と高脂肪飼料（Quick Fat，日れる。

本クレア株式会社）給餌区を設け，それぞれにそこで本研究では，アペリンによる成長促進作

PBS投与区とアペリン投与区を設定し，計４区で用を検討することを目的として，マウスへのアペ試験を行った。各区に５匹ずつ供試し，１週間ごリン投与試験を行った。また，これらの研究成果とに体重を測定しながら，４週間試験を行った。

を牛へと応用することを目指し，日本短角種由来

試験開始０週の体重を100として体重増加率を計の筋衛星細胞を用いて細胞増殖，および筋線維型

算し，通常飼料給餌区と高脂肪飼料給餌区ごとに調節に与える影響を検討することを目的とした。

統計解析（ t 検定）を行った。ｐ＜0.05を有意差ありと判定した。

法

２．方2 . 2 日本短角種由来筋衛星細胞におけるアペ

本実験は，秋田県立大学動物実験委員会の承認を得て行った。

リン刺激の影響2 . 2 . 1 実験③

2 . 1 アペリンによるマウスの成長促進作用のの増殖におけるアペリン刺激の影響
三宅ら３）の方法に従って，秋田県立大学生物資

検討
2.1.1

日本短角種牛由来筋衛星細胞

実験①

アペリン投与量の検討

源科学部付属フィールド教育研究センターで飼育

C57BL/6（５週齢，雄）を用いてアペリン投与試験を行った。投与試薬は［Pyr1］-apelin-13（ペする日本短角種牛（６ヵ月齢，雄）の胸最長筋から筋衛星細胞を単離した。

プチド研究所）を用い，試験区は１匹あたり１，単離した筋衛星細胞は，ダルベッコ変性イーグ

10，100µg（in PBS 100µｌ）のアペリン投与区と，

ル培地（DMEM, high-glucose）に，牛胎児由来

対照区としてPBS投与区を設定し，各区に５匹ず血清（FBS）を10％，抗生物質（ペニシリン―ス

つ供試した。腹腔内投与15分後に採血を行い，トレプトマイシン）を１％，bFGF（線維芽細胞

EDTA-2Na（１mg/ml血液）の入ったチューブ増殖因子）を４ng/mlの濃度となるように添加しに血液を採取し，遠心分離（3,000rpm，４℃，た増殖用培地を用いて，37℃，５％CO２，95％O２

10分間）後の血漿サンプルを回収した。測定項目の条件下で培養を行った。

は血漿中のトリグリセリド濃度とし，トリグリセ
ライド

単離した日本短角種牛由来筋衛星細胞を用いＥ-テストワコー（和光純薬工業株式会て，アペリン刺激による細胞増殖への影響を検討

社）を用いて測定した。統計解析には，Tukeyのした。増殖用培地に［Pyr1］-apelin-13を0.1µM

多重比較検定を用い，ｐ＜0.05を有意差ありと判の濃度で添加した刺激用培地を作成した。６穴プ定した。

レートを用いて，１穴あたり９×10 ４ 個（1.0×

2 . 1 . 2 実験②

マウスへのアペリン投与によ10４ 個／cm２）程度になるように細胞を播種し，２日おきに培地を交換しながら，14日間培養をる体重の変化C57BL/6（５週齢，雄）を用いて週２回ずつの行った。通常の増殖用培地区を対照区とし，対照

アペリン腹腔内投与試験を行った。投与試薬は

区とアペリン刺激培地区それぞれに７枚のプレー［Pyr1]-apelin-13 を 用 い ，投 与 量 は １ 匹 あ た り

ト用いて培養を行った。培養開始から２日間間隔© The Ito Foundation

骨格筋の成長と筋線維型決定におけるストレス応答ホルモンの影響

391

で１枚のプレート（６穴分）の細胞を回収し，ト×Ｇ，４℃で15分間遠心分離した。その後，上清

リパンブルー染色後，血球計算盤を用いて細胞数のみを回収し，イソプロパノールを500µｌずつを測定した。統計解析には t 検定を用い，測定日

加えて数回転倒混和した後，室温で10分間静置ごとに試験区間の細胞数を比較した。ｐ＜0.05をし，12,000×Ｇ，４℃で10分間遠心分離した。上有意差ありと判定した。

清をアスピレートした後，70％エタノールを加2 . 2 . 2 実験④

え，同様にして遠心分離した。上清をアスピレー

分化誘導におけるアペリン刺トした後，回収したRNAをRNase-free-H２Oに溶激の影響
２％ウマ血清を加えたダルベッコ変性イーグル

解 さ せ た 。 逆 転 写 キ ッ ト （PrimeScript RT培地（DMEM, low-glucose）を分化誘導培地とreagent Kit with gDNA Eraser；タカラバイオ）

して，単離した筋衛星細胞の筋管細胞への分化能を用いてcDNAを作成した後，リアルタイムPCRを検討した。４穴チャンバースライドに細胞を播法（LightCycler Ⓡ 96 System, Roche）を 用 い て

種し，サブコンフルエント状態となるまで培養を

Ｉ型筋線維に発現するslow MyHC mRNAの発現続けた後，培地を分化誘導培地に変え，分化誘導量を解析した。用いたプライマーとPCR条件は，刺激を４日間行った。分化誘導刺激の後，三宅ら３）

堀川らの報告４）に従い，GAPDHを内部標準としの方法に従ってembryonic MyHCタンパク質のて相対定量解析を行った。統計解析には t 検定を染色を行った。

用い，Ｐ＜0.05を有意差ありと判定した。

この時，実験③と同様にして分化誘導培地に３．結果と考察［Pyr1]-apelin-13を1.0µMの濃度で添加し，分化

3.1

２日おきに培地交換を行いながら４日間培養したマウスへのアペリン投与による血漿中トリグリ

後，各ウェルにRNAiso Plus（タカラバイオ）を

セリド濃度の変動をFig.１に示す。PBS投与区の700µ ｌ ず つ 加 え て 細 胞 を 回 収 し た 。回 収 し た値（159.10 ± 14.84mg/dl）と 比 べ て ，ア ペ リ ン

RNAiso Plusにクロロホルムを200µｌずつ加えて10µg 投 与 区（100.16 ± 5.67mg/dl）お よ び 100µg

10秒間混和した後，室温で５分間静置し，12,000

投与区（104.83±9.08mg/dl）の値が有意に低下

Plasama triglyceride (mg/dl)

誘導時におけるアペリン刺激の影響を検討した。

200

実験①

a
a, b

150

b

b

10

100

100
50
0

PBS

1

apelin（μg / head）
Fig. 1 Changes in plasma triglyceride concentrations by apelin

administration. All data are expressed as mean±SEM. The different
letters are significantly different by Tukeyʼs multiple comparison test.

© The Ito Foundation

392

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

した（ｐ＜0.05）。このことから，アペリンは脂リン刺激試験の結果をTable３に示す。試験開始

質 代 謝 調 節 に 関 与 し ，そ の 作 用 は １ 匹 あ た り

４日目から10日目において，通常の増殖用培地区

10µg以上の投与によって効果が現れることが示の細胞数に比べてアペリン刺激区の細胞数が有意唆された。この結果を受け，実験②におけるアペに増えていた（ｐ＜0.05）。

リンの投与量を１匹あたり10µgとした。
3.2

3.4

実験②

実験④

単離した筋衛星細胞における分化誘導刺激の結マウスへのアペリン投与による体重増加率の変果 を Fig. 2（a） に 示 す 。 細 胞 染 色 の 結 果 ，動をTable１およびTable２に示す。通常飼料給餌

embryonic MyHCタンパク質の発現が観察され区の結果では，試験開始３週間後のアペリン投与たことから，本実験で単離した筋衛星細胞が筋管区の体重増加率（113.13±0.41％）が，PBS投与

細胞への分化能を有することが確認できた。ま区の体重増加率（107.43±1.47％）と比べて有意

た，分化誘導時におけるアペリン刺激試験におけに高い値となった（ｐ＝0.04，Table１）。また，る，Ⅰ型筋線維に特異的に発現するslow MyHC

高脂肪飼料給餌区の体重増加率では，試験開始１

mRNA発現量の変化をFig. 2（b）に示す。結果，週間後から４週間後まですべての時点において分化誘導時のアペリン刺激によってslow MyHC

PBS投与区よりもアペリン投与区の方が有意に高mRNA発現が有意に減少した。日本短角種牛由い値となった（すべてｐ＜0.05，Table２）。これ

来筋衛星細胞における，細胞増殖と分化誘導におらの結果から，アペリンがマウスの成長を促進す

けるアペリン刺激の結果は，マウス由来筋芽細胞る可能性が示唆された。

（C2C12）へのアペリン刺激試験の報告２）と一致

3.3

実験③

しており，アペリンが骨格筋の成長を促進させる

日本短角種由来筋衛星細胞の増殖におけるアペ可能性が示唆された。

Table 1 Effect of apelin on weight gain in normal diet group
0ｗ

1ｗ

2ｗ

3ｗ

4ｗ

PBS

100

106.48±1.33

106.29±1.62

107.43±1.43112.47±1.54

apelin100

107.19±0.32

101.45±2.50

111.13±0.41＊

115.06±0.88

All values are expressed as mean±SEM and analyzed by t-test．＊p＜0.05 vs. PBS group.
Table 2 Effect of apelin on weight gain in high fat diet group
0ｗ

1ｗ

2ｗ

3ｗ

4ｗ

PBS

100

112.86±1.46115.63±1.42121.42±1.42125.91±1.57

apelin100

117.21±1.23＊

123.06±0.87＊

127.89±0.80＊

133.83±1.12＊

All values are expressed as mean±SEM and analyzed by t-test．＊p＜0.05 vs. PBS group.
４

Table 3 Cell count of muscle satellite cells（×10
day2

day4

cells/well）from Japanese shorthorn cattle with apelin

day6

day8

day10

day12

day14

control40.6±3.9

102.3±4.6131.0±2.2

136.2±3.0168.8±3.7204.5±2.5210.2±6.0

apelin43.8±1.8

121.8±3.6＊139.3±0.7＊

157.7±5.2＊

194.1±5.2＊

198.1±1.9202.8±9.4

All values are expressed as mean±SEM, and analyzed by t-test．＊p＜0.05 vs. control group.

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骨格筋の成長と筋線維型決定におけるストレス応答ホルモンの影響
（a）

393

（b）

1.5
P=0.041
0.5
0control

apelinFig. 2 Effect of differentiation induction stimulation on myotube cells.（ a）Cells

immunostained using anti-embryonic MyHC. Bars 100µm.（ b）Change in
expression level of slow MyHC mRNA by adding apelin quantified by real-time
PCR. The values were normalized to GAPDH, and analyzed by t-test.

本試験で得られた以上の結果から，アペリンによる成長促進作用の可能性が示唆された。

ることが明らかになり，アペリンによる成長促進作用の可能性が示唆された。

約

４．要

進し，日本短角種由来筋衛星細胞の増殖を促進す

本試験では，アペリンによる成長促進作用および筋線維型調節への影響を検討することを目的とした。マウスへの腹腔内アペリン投与によって血漿中トリグリセリド濃度が有意に低下することが明らかになり，アペリンが脂質代謝調節に関与している可能性が示唆された。また，週２回ずつのアペリン投与によって，マウスの体重増加率が有意に増加することが明らかになった。日本短角種
由来の筋衛星細胞におけるアペリン刺激試験の結果，細胞増殖が有意に促進されることが明らかになった。また，筋管細胞への分化誘導時におけるアペリン刺激試験ではⅠ型筋線維に特異的に発現するslow MyHC mRNAの発現量が低下する結果が得られた。
本試験から，アペリンがマウスの体重増加を促

文献１） Sato, K., Takahashi, T., Kobayashi, Y., Hagino, A.,
Roh, S. G., Katoh, K.：Apelin is involved in
postprandial responses and stimulates secretion ofarginine-vasopressin, adrenocorticotropic hormone
and growth hormone in the ruminant, Domestic
Animal Endocrinology，42（3），165～72，2012．
２） 佐藤勝祥，堤優樹，小池晶琴，横尾正樹：マウス
由来筋芽細胞の増殖におけるストレス応答ホルモン
刺 激 の 影 響 ，秋 田 県 立 大 学 ウ ェ ブ ジ ャ ー ナ ル Ｂ ,Vol3，118～123，2016．
３） Miyake, M., Takahashi, H., Kitagawa, E.,
Watanabe, H., Sakurada, T., Aso, H., Yamaguchi, T.：
AMPK activation by AICAR inhibits myogenic
differentiation and myostatin expression in cattle,
Cell Tissue Res，349，615～623，2012．
４） Horikawa, A., Ogasawara, H., Okada, K.,
Kobayashi, M., Muroya, S., Hojito, M.：Grazinginduced changes in muscle microRNA-206 and-208b expression in association with myogenic gene
expression in cattle, Animal Science Journal，86（11），952～60，2015．

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394

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発
Studies on a feed for improving zinc nutrition by the use of zinc transporters

神

戸

大

朋

（京都大学大学院生命科学研究科）

Taiho Kambe（Graduate School of Biostudies, Kyoto University）

Zinc is an essential trace element as a second most abundant transition metal in biologicalsystems. Recent in silico studies indicate that approximately 10％ of the mammalian proteome
requires zinc for cellular activity, and its deficiency causes severe defects in life. Thus,
preventing zinc deficiency is critically important for growth promotion for livestock. In zincabsorption processes, the zinc transporter ZIP4, which is localized to the apical membrane in
the enterocytes, plays an essential role as a zinc uptake pathway. ZIP4 expression is decreasedin zinc sufficient conditions and thus increases of zinc contents in foods for livestock would
decreases zinc absorption rate. In addition to ZIP4, ZNT1, which is located to the basolateral
membrane of the enterocytes, plays a role by effluxing zinc into the portal blood. Thus, foodcomponent（s）that enables cell surface ZIP4 or ZNT1 expression, would lead to facilitating
zinc absorption. In this study, we screened food extracts possessing such activity by the use of
our screening systems named ZIP4-targeting or ZNT1-targeting. Moreover, we screened foodextracts, which possess the activities to increase expression or activities of ZNT transporters
involved in zinc transports into the breast milk using newly established two screening systems,
because the content of zinc significantly affects the good health and growth of child livestock
such as piglets. Our approaches would provide new information to achieve a feed for livestockby improving zinc nutrition through the use of zinc transporters.

１．目が亜鉛摂取量の増加に反比例して低下するため，的添加亜鉛の大部分は家畜の体内に吸収されず，糞亜鉛は家畜の成長にとってきわめて重要な必須尿とともに排出される。したがって，家畜におけ

微量栄養素である。特に，仔豚においては，亜鉛る亜鉛栄養の効果を十分に発揮させるには，亜鉛の添加が，成長促進，下痢の抑制，免疫力亢進効

摂取量を増加させることよりも，むしろ亜鉛吸収果を示すという報告が多数ある

効率を上昇させることが肝要となる。

。そのため，

１，２）

一般的な家畜用配合飼料には十分量の亜鉛が添加

消化管からの亜鉛吸収は，消化管上皮細胞の管されている。しかしながら，腸管での亜鉛吸収効

腔 側 膜 に 発 現 す る ZIP4 と 側 底 膜 側 に 発 現 す る

率が30％程度と低いこと，さらに，その吸収効率

ZNT1が重要であり，ZIP4が食事由来の亜鉛を細© The Ito Foundation

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発

395

胞内に取り込み，ZNT1が細胞から門脈への放出促進につなげることが可能となることが予想されを担う。亜鉛吸収効率を高めるには，両トランスる。亜鉛栄養改善飼料の開発につながる基盤の確ポーターの発現をともに高めることが重要とな立を目的として本研究を遂行した。

る。ZIP4は先天性亜鉛欠乏症・腸性肢端皮膚炎の原因遺伝子として同定されたタンパク質であり，消化管管腔からの亜鉛取り込みに必須の役割を果たす。消化管特異的にZIP4を欠損させたマ

２．方法

2 . 1 ZIP4およびZNT1発現を増強させる活性を有する因子の探索

ウスは，亜鉛の補充なしには成育することができ

ZIP4-targeting お よ び ZNT1-targeting 探 索 系

ない 。また，家畜では，牛においてlethal traitに使用する培養細胞を単層培養し，その培養液にA46と呼ばれる先天性の亜鉛欠乏症が存在する

終濃度0.1％となるように種々の食品抽出物を添が，その原因もZIP4の変異である４）。したがって，

加し，24時間培養した。細胞を回収して細胞膜画

ZIP4はヒトのみならず，家畜を含めたすべての分を調製し，タンパク質濃度を測定後，ウェスタ

ほ乳類の亜鉛吸収に必須のタンパク質となる。研ンブロット法にてZIP4およびZNT1の発現量を定究代表者は，これまでに，ZIP4の発現が亜鉛欠量した。ZIP4とZNT1の検出には抗ZIP4あるいは

乏依存的に増加するが，亜鉛十分時には速やかに

抗ZNT1モノクローナル抗体を使用した６，７）。

３）

消失することを分子レベルで証明している５，６）。
一方，上皮細胞に取り込まれた亜鉛を血流に放出

2 . 2 母乳中に亜鉛を輸送するZNT2の発現を促進させる因子の探索する役割を果たすZNT1に関しては，発現が亜鉛

ZNT2プロモーターの下流に分泌型ルシフェ

量に応じてタンパク質レベルで変動することを突

ラーゼ遺伝子（Cypridina Luciferase）を接続しき止めている（未発表データ）。これらの結果をたプラスミドを導入したマウス乳腺上皮HC11細基に，「ZIP4・ZNT1発現促進活性を持つ食品の胞の培養液に，食品抽出画分を終濃度0.1％とな

摂取→腸管でのZIP4・ZNT1発現の増大→亜鉛のる よ う に 添 加 し ， 24 時 間 培 養 し た 。 Pierce

吸収効率上昇→亜鉛欠乏を予防」というストラテ

Cypridina Glow Assay Kitを使用して培養液中にジーを考案し，これらの発現を増加させる因子を分泌されたルシフェラーゼ活性を測定した。

ス ク リ ー ニ ン グ で き る ZIP4-targeting お よ び
ZNT1-targeting因子探索系を構築した。また，

2 . 3 ZNT5-ZNT6ヘテロ二量体の亜鉛輸送活性を増強させる因子の探索

本研究では，乳児期という主に母乳を栄養源としZNT2に加えて，分泌経路の局在するZNT5-ている時期に着目し，上述のZIP4およびZNT1の

ZNT6ヘテロ二量体は，マウス以外のほ乳類の哺発現を介して消化管からの亜鉛吸収を促進する可乳中に亜鉛を輸送する活性があることが示唆され能性がある食品因子の探索だけではなく，母乳中ている８）。ヒトミエローマ細胞株を使用して，亜に亜鉛を輸送する活性を有することが知られる複鉛要求性酵素であるアルカリフォスファターゼ

数のZNTトランスポーターの発現や活性を増強（ALP）活性を指標にZNT5-ZNT6ヘテロ二量体させる効果を有する因子の探索も実施した。両探の亜鉛輸送活性評価できる系を構築し，上述の抽索によって見出された因子を組み合わせること

出物中から活性因子を探索した。ALP活性の測で，乳児期から成長期までの腸管での亜鉛吸収効

定には，p-nitrophenyl phosphateを基質として率を上昇させ，結果として，家畜の健康な成長の加水分解活性を測定した。

© The Ito Foundation

396
３

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

は，NMRやMSなどに供してその構造を決定し，結果と考察

ソヤサポニンBbとの比較から構造活性相関など

3 . 1 消化管からの亜鉛吸収を増強させる因子を詳しく検討することを計画している。一方，
ZNT1に関しては，ポジティブコントロールに使の探索
ZIP4-targeting お よ び ZNT1-targeting 探 索 系

用した亜鉛添加条件に匹敵するような有意な活性を用いて，種々の食品抽出物におけるZIP4およを有する抽出物を見出すことができなかった。こびZNT1の発現を増強させる因子を探索した結の理由としては，ZNT1の発現変化のリスポンス

果，新たに複数の抽出物にZIP4の発現を増強さがZIP4に比べて遅いため，大きな影響を与える

せる活性があることを見出した（Fig.１）。ZIP4因子を検出できなかった可能性が考えられる。しのスクリーニングには，これまでにZIP4の発現かしながら，ZNT1に関しては，これまでのとこ

増強因子として同定している大豆含有因子ソヤサ

ろ，発現を変化させる食品因子に関する情報がほ

ポニンBbを対象として使用したが ，いくつかの

とんどなく，本成分の同定を試みる意義は大きい抽出物でソヤサポニンBbに匹敵する活性を有すため，今後は親油性画分抽出物についても解析をることが明らかとなった。現在，活性が確認され進めて行く予定である。消化管からの亜鉛吸収た抽出物のいくつかについては，中圧カラムクロ

は，消化管上皮細胞においてZIP4とZNT1が連動

マトグラフィー等で，活性化合物の単離を試みてすることが重要と考えられるため，まだ試していおり，単一画分までに精製できた成分についてない食材を用いて，今後も本解析を進める予定で

９）

A

B
N

CX Bb

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ZIP4

ZNT1

CBB

CBB

N

CX Bb 111 12 13 14 15 16 17 18 19

20

N

Zn

N

Zn

1

2

3

4

5

6

7

8

9

11 12 13

14

15

16

17 18

19

21
ZNT1
ZNT1

ZIP4
CBB
CBB
CBB

N

CX Bb

1

22

23

24

25

26

27

28

29

ZIP4

CBB

Fig. 1 Screening of component（s）to increase ZIP4 and ZNT1 expression. A, Mouse Hepa cells were cultured

in the presence or absence of various food extracts （1-29）for 24 h. Membrane proteins （20µg）preparedfrom the cells were subjected to western blot analysis, and ZIP4 protein was detected by anti-ZIP4
antibody. S；zinc sufficient, D；zinc deficient, Bb：soybean extracts. B, CaCo2 cells were cultured withvarious food extracts（1-19）for 24 h, and total cellular proteins were subjected to immunoblot analysis,
and ZNT1 protein was detected by anti-ZNT1 antibody. In And B, the representative results are shown.
N：normal medium, CX：zinc deficient medium. Bb：soyasaponin Bb, Zn：zinc-sipplemented medium© The Ito Foundation

397

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発ある。亜鉛強化飼料の使用時に家畜の糞尿ととも鉛輸送に関わることが示されているZNT5-ZNT6に排出される余剰量亜鉛は重金属環境汚染源とし

ヘテロ二量体の亜鉛輸送活性評価系を構築し８），て問題となるため２），本アプローチから開発されスクリーニングに使用した。ZNT5-ZNT6ヘテロ

る亜鉛栄養改善飼料は，この余剰亜鉛の減少にも二量体の亜鉛輸送活性は，亜鉛要求性酵素である

貢献することが期待される。

ALP活性に反映されるため，ALP活性増強効果3.2を解析することで，ZNT5-ZNT6ヘテロ二量体の母乳中に亜鉛を輸送する活性を増強させ亜鉛輸送活性を評価することが可能となる10）。本る食品因子の探索
本アッセイ方法では，ZNT2プロモーターの活解析においては，弱いながらも活性を増強させる性がルシフェラーゼ活性に反映されるため，

食品抽出物を数種類見出しているが（Fig.３），

ZNT2の発現を増加させる食品抽出物の探索が可

今後，さらに強い活性を有する抽出物を探索して能となる。これまでのところ，ルシフェラーゼ活

いく予定である。これら２つの解析で見出された性を劇的に増加させる抽出物を見出すことに成功

因子については，今後，ラットを使用した動物実していないが（Fig.２），細胞種の検討を含めて験でその効果を検証する計画を立てており，因子

引き続き解析を進めて行く予定である。また，マ

同定後は速やかに実施したい。

ウス細胞の解析とはなるが，いくつかの抽出物で乳児期の亜鉛栄養が家畜の成長に重要であるこ

ZNT2タンパク質の発現を増加させている活性をとは，乳幼児期の豚に亜鉛を補充することで成長有する結果が得られているため（結果省略），牛が促進されることを示す結果が複数報告されていや豚のZNT2発現細胞を探索し，同様の解析を進ることからも明らかである。よって，本研究を継める計画を立てている。

続し，母乳中の亜鉛含量を増加させる手法を確立

また，本解析では，ZNT2と同様に母乳中の亜し，健康な家畜の成長につながる飼料開発の基盤

9000

RLU (1 x 1000)

8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0

A

B

C D

E

F

G H

I

J

K

L

M N O

P

Q

R

S

T

U

V W

抽出物
Fig. 2 Screening of component（s）to increase ZNT2 transcription.

M ouse mammary gland HC11 cells stably expressing Cypridina Luciferase were established, in which its

expression is under control ZNT2 promoter. The HC11 cells were cultured with or without（-）various foodextracts（A-W）for 24 h, and the activity of luciferase secreted in the spent medium was measured. The
representative results are shown.

© The Ito Foundation

398

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

0.5

吸光度

0.4

0.3

0.2

0.1

0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

抽出物
Fig. 3 Screening of component（s）to facilitate ZNT5-ZNT6 zinc transport activity.

Human chronic myelogenous leukemia-derived HAP1 cells stably expressing mutant ZNT5 and ZNT6, andsecretary alkaline phosphatase（SEAP）were established. The ZNT5 mutant used in this study has reduced zinctransport activity, and thus SEAP is not fully activated. The HAP1 cells were cultured in medium in the presenceor absence（-）of various food extracts（1-35）for 24 h, and the activity of SEAP secreted in the spent medium
was measured. The representative results are shown.

の確立を目指したい。
４．要

健康な家畜の成長につながる飼料開発の基盤の確立を目指したい。

約

亜鉛栄養改善飼料の開発につながる基盤の確立

謝辞を目的として，消化管からの亜鉛吸収に機能する

本研究を実施するにあたり，ご援助賜りました

ZIP4およびZNT1の発現を増加させる食品因子の公益財団法人伊藤記念財団に厚く御礼申し上げま探索を実施した。結果，ZNT1の発現に影響を与す。

える抽出物を見出すことはできなかったが，新たに複数の抽出物にZIP4の発現を増強させる活性があることを見出した。また，家畜の成長に重要な要素となる母乳中亜鉛を増加させる食品因子の探索を実施した結果，弱いながらも母乳中の亜鉛輸送に関わるとされるZNT5-ZNT6ヘテロ二量体の亜鉛輸送活性を増強させる活性因子を見出すことに成功した。本研究でのアプローチを継続し，

文献１） Wang, Y., Tang, J. W., Ma, W. Q., Feng, J., Feng,
J . ：D i e t a r y z i n c g l y c i n e c h e l a t e o n g r o w t h
performance, tissue mineral concentrations, andserum enzyme activity in weanling piglets, Biol
Trace Elem Res，133，325～334，2010．
２） Cho, J. H., Upadhaya, S. D., Kim, I. H.：Effects of
dietary supplementation of modified zinc oxide on
growth performance, nutrient digestibility, blood
profiles, fecal microbial shedding and fecal score in© The Ito Foundation

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発
weanling pigs, Anim Sci J，86，617～623，2015．
３） Geiser, J., Venken, K. J., De Lisle, R. C., Andrews,
G . K . ：A M o u s e M o d e l o f A c r o d e r m a t i t i sEnteropathica：Loss of Intestine Zinc Transporter
ZIP4（Slc39a4）Disrupts the Stem Cell Niche andIntestine Integrity, PLoS Genet, 8, e1002766，2012．
４） Y u z b a s i y a n - G u r k a n , V . , B a r t l e t t , E . ：Identification of a unique splice site variant in
SLC39A4 in bovine hereditary zinc deficiency, lethal
trait A46：An animal model of acrodermatitis
enteropathica, Genomics，88，521～526，2006．
５） Kambe, T., Andrews, G. K.：Novel proteolytic
processing of the ectodomain of the zinc transporter
ZIP4 （SLC39A4）during zinc deficiency is inhibitedby acrodermatitis enteropathica mutations, Mol Cell
Biol，29，129～139，2009．
６） Hashimoto, A., Nakagawa, M., Tsujimura, N.,
Miyazaki, S., Kizu, K., Goto, T., Komatsu, Y.,
Matsunaga, A., Shirakawa, H., Narita, H., Kambe, T.,
Komai, M.：Properties of Zip4 accumulation during
zinc deficiency and its usefulness to evaluate zincstatus：A study of the effects of zinc deficiency
during lactation, Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol, 310, R459～468，2016．
７） Nishito, Y., Tsuji, N., Fujishiro, H., Takeda, T.,

399

Yamazaki, T., Teranishi, F., Okazaki, F., Matsunaga,A., Tuschl, K., Rao, R., Kono, S., Miyajima, H., Narita,
H., Himeno, S., Kambe, T.：Direct Comparison ofManganese Detoxification/Efflux Proteins andMolecular Characterization of ZnT10 as a
Manganese Transporter, J Biol Chem，291，14773～
14787，2016．
８） Kumar, L., Michalczyk, A., McKay, J., Ford, D.,
Kambe, T., Hudek, L., Varigios, G., Taylor, P. E.,
Ackland, M. L.：Altered expression of two zinctransporters, SLC30A5 and SLC30A6, underlies amammary gland disorder of reduced zinc secretion
into milk, Genes Nutr，10，487，2015．
９） Hashimoto, A., Ohkura, K., Takahashi, M., Kizu, K.,
Narita, H., Enomoto, S., Miyamae, Y., Masuda, S.,
Nagao, M., Irie, K., Ohigashi, H., Andrews, G. K.,
Kambe, T.：Soybean extracts increase cell surface
ZIP4 abundance and cellular zinc levels： a potential
novel strategy to enhance zinc absorption by ZIP4
targeting, Biochem J，472，183～193，2015．
10） Kambe, T., Matsunaga, M., Takeda, T. A.：
Understanding the Contribution of Zinc
Transporters in the Function of the Early Secretory
Pathway, Int J Mol Sci，18，2017．

© The Ito Foundation

400

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発（Ⅱ）
Development of soybean production technique by living multi methodwith tropical grasses in southwestern Japan

石

垣

元

気１・荒

井

昌

和２・福

山

喜

一１

（１宮崎大学農学部附属フィールド科学教育研究センター住吉フィールド，２宮崎大学工学部）

Genki Ishigaki１, Masakazu Arai２ and Kiichi Fukuyama１（１Sumiyoshi Livestock Science Station, Field Science Education Research Center, Faculty of Agriculture，
University of Miyazaki, ２Faculty of Engineering, University of Miyazaki）

Tropical grasses mainly utilized in southwestern Japan have exhibited that the dry matteryield is increased as the growth stage developed. However, the nutritive value such as crude
protein tends to be decreased strikingly as the growth stage developed. Therefore, theintroduction or breeding the new grass or crops which have high potential as high protein
source will be urgent problem. However, the practical success cases have not been reported insouthern-western region of Japan. The aim of study were to investigate the dry matter yieldof soybean（Glycine max）‘Tachinagahaʼ under two cultivation experiment. First experiment
was that Italian ryegrass（Lolium multiflorum）have been used as multi-living plant after 1st
cutting. Second experiment is to intercrop with rhodesgrass（Chloris gayana）and soybean.
For first experiment, the plant height and dry matter yield under the plowing-fertilizer plot
was the highest significantly（ p＜0.05）. Interestingly, these value under the living multi-nonfertilizer plot were higher that those under the living multi-fertilizer plot. The development
growth of the Italian ryegrass hampered the growth of soybean at the initial growth stage andthe subsequent stages. For second experiment, there is no significant differences for the plantheight of soybean between single-soybean sowing plot and rhodes grass-soybean intercropping
plot. For dry matter yield in flowering stage, there is no significant differences between singlesoybean sowing plot（37.9kg/10a）and rhodes grass-soybean intercropping plot（47.9kg/10a）.
However, in pods growing stage, the value of single-soybean sowing plot（107.9kg/10a）were
significant（ p＜0.05）higher than that of rhodes grass-soybean intercropping plot（65.0kg/10a）.
Finally, many kinds of insects were observed in this study. Especially, the damages by a kindof Popillia japonica were strikingly much have been observed. Therefore, it will be important
to introduce the insect resistant soybean cultivar in future.

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西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発（Ⅱ）

１．目

401

イズ生産技術を検討する必要がある。

的

本課題は，寒地型イネ科牧草または暖地型イネ

国内の西南暖地（主に西日本）において主に栽科牧草を利用した飼料用ダイズ生産の技術開発を培されている暖地型イネ科牧草は，生育段階が進目指し，春季におけるダイズ生産として，寒地型

むにつれて，乾物収量は増加するものの，タンパ

イネ科牧草イタリアンライグラスをリビングマル

ク質や消化性が著しく低下し，家畜における繁殖

チとして利用した生産体系（試験１）と，暖地型

障害や増体・発育の遅延が認められるケースがあ

イネ科牧草ローズグラスとダイズとの混播した場る。このことから，今後，高タンパク粗飼料とな合による生産体系（試験２）における収量生につるような作物を新たに探索，導入することが望まいて検討した。

れる。しかしながら，このような高タンパク粗飼料となるような作物が西南暖地において導入され法

２．方た例はない。最近，国内の寒冷地では，新しい高2.1

タンパク質供給源として，ダイズサイレージが注

春季におけるダイズ生産として，イタリアンラ

目されており，寒地型イネ科牧草イタリアンライ

イグラス品種ハヤテ（以下IRと記す）をリビン

グラスをリビングマルチとして利用することでダグマルチとして利用した場合（試験１）と，ロー

イ ズ を 栽 培 す る 技 術 を 確 立 し て い る（内 野 ら

ズグラス品種カリーデとダイズ品種タチナガハと2014） 。一方，南九州を含む西南暖地での牧草の混播した場合によるダイズ生産（試験２）につを利用した飼料用ダイズ生産の技術開発はまだ行いて検討した。本研究ではダイズ品種タチナガハ

われていない。著者らは，暖地型イネ科牧草リビを供試した。

１）

供試材料

ングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開2.2発を試みた（石垣2017） 。結果として，秋季に

試 験 は ，国 立 大 学 法 人 宮 崎 大 学 農 学 部 附 属

暖地型イネ科牧草ローズグラスのリビングマルチ

フィールド科学教育研究センター住吉フィールドとして用いると，ローズグラスの高い再生力およの圃場（北緯39°59ʼ，東経131°28ʼ，海抜12ｍ）

び生殖成長に伴う出穂茎の伸長により，ダイズのにて，2017年５月から2017年９月の期間に行っ初期生育およびその後の生育に負の影響を及ぼすた。供試土壌は，礫が比較的少なく，有機物に乏ことが明らかとなった。このことから，西南暖地

しい砂質土壌である。

２）

ダイズ栽培試験および収量性調査

での粗飼料生産体系において，ダイズ生産を組み

試験１は，IRの１番草刈り取り後（2017年５入れられるような栽培時期を，秋季以外で新たに月８日），試験区として耕起施肥区（Ｐ＋Ｆ＋），

検討する必要がある。南九州をはじめとする西南リビングマルチ施肥区（Ｍ＋Ｆ＋）およびリビン

暖地の多くの地域では，寒地型イネ科牧草イタリ

グマルチ無施肥区（Ｍ＋Ｆ－）を設けた。耕起施

アンライグラスの２番草の刈取りが５月上旬頃に肥区はロータリー（クボタ社）を用いて完全耕起は行われ，その後，トウモロコシなどの長大作物した。１区面積は15㎡（３×５ｍ）とし，すべてや暖地型イネ科牧草が作付けされる。今後，春季の処理区で畦長５ｍ，４本とした。各処理区の圃におけるトウモロコシとの混播，イタリアンライ

場配置は乱塊法を採用した。条間は75cm幅とし，グラスの２番草刈取り株をリビングマルチとしてダイズ播種は，ダイズ種子を株間６cmで１点１利用する技術や，ローズグラスとの混播によるダ粒播きの条件で点播した。施肥処理は，耕起施肥© The Ito Foundation

402

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

区およびリビングマルチ施肥区に，化成肥料でＮも高かった（P＜0.05）。リビングマルチ施肥区にを４kg，P２O５ を3.4kg，K２Oを2.9kg施用した。

おけるダイズ草高がリビングマルチ無施肥区より

調査は播種後１週目から発芽数を調査し，播種２も低かったのは，リビングマルチ施肥区における週間後から刈り取りまで各供試品種の草高を毎週

イタリアンライグラスが施肥後に著しく伸長し，記録した。刈り取りはダイズの開花期と莢伸長期

ダイズの伸長を抑制したためと考えられる。

に合わせて２回に分けて行い，乾物収量を調査しダイズ乾物収量は，開花期では，耕起施肥区で170.5kg/10a，リビングマルチ施肥区で80.0kg/10a，た。
試験２では，ローズグラス単播区（Ｒ＋Ｓ－）

リビングマルチ無施肥区で80.0kg/10aの順となおよびダイズ単播区（Ｒ－Ｓ＋），およびローズ

り，耕起施肥区が最も高かった（p＜0.05）。リビ

グラスとダイズの混播区（Ｒ＋Ｓ＋）を設けた。

ングマルチ施肥区およびリビングマルチ無施肥区

区画設計（面積，畝長，条間）は試験１と同じ条の処理間で有意差は認められなかった（Table１）。

件 で あ る 。2017 年 ５ 月 に ロ ー ズ グ ラ ス 種 子 を莢伸長期では，耕起施肥区で257.9kg/10a，リ

3.0kg/10aの播種量で散播した。ダイズ播種は試ビングマルチ施肥区で153.8kg/10a，リビングマ

験１と同じ条件である。施肥は，10ａ当たり換算

ルチ無施肥区で198.0kg/10aの順となり，耕起施

量で基肥として発酵牛糞１ｔ（Ｎ2.5％，P ２ O ５

肥区が最も高かった（p＜0.05）。リビングマルチ

4.0％，K２O2.1％），化成肥料でＮを４kg，P２O５

施肥区およびリビングマルチ無施肥区の処理間でを3.4kg，K２Oを2.9kg施用した。調査は播種後１有意差はないものの，リビングマルチ無施肥区に週目から発芽数を調査し，播種２週間後から刈り高い傾向が認められた。ダイズ乾物収量は，いず取りまで各供試品種の草高を毎週記録した。刈りれの処理区においても，開花期よりも莢伸長期の取りはダイズの開花期に行い，乾物収量および雑方が多収であった（Fig.１，Table１）。

草の混入割合について調査した。

3 . 2 暖地型イネ科牧草ローズグラスとダイズとの混播した場合（試験２）３．結果と考察

ダイズ発芽率は，ダイズ単播区およびローズグ

3 . 1 寒地型イネ科牧草イタリアンライグラス

ラス・ダイズ混播区の間には有意差は認められなをリビングマルチとして利用した場合（試かった（結果記載なし）。ダイズ草高は，播種後

験１）２，および10週目のいずれにおいても，ダイズ単土壌硬度（結果は支持強度として表示）は，土播区およびローズグラス・ダイズ混播区において

壌深度10cmにおいて，耕起施肥区（1.2kg/cm ）有意差は認められなかった。このことからダイズ

がリビングマルチ区（施肥区：6.3kg/cm ，無施の伸長は，ローズグラスと混播した場合は，ロー

肥区：6.9kg/cm ）よりも有意に低い値となっズグラスの伸長による有意な影響は受けないものた。その結果，播種後２週目の発芽率は，耕起施と推察される。ローズグラス草高も播種後２，６肥区（約70％）がリビングマルチ区（施肥区：

および10週目のいずれにおいても，ローズグラス

53％，無施肥区：57％）よりも有意に高い値と単播区およびローズグラス・ダイズ混播区においなった。草高は，播種後14週目の，耕起施肥区でて有意差は認められなかった（Fig.２，Table２）。

85cm，リビングマルチ施肥区で62cm，リビング

ローズグラス乾物収量は，開花期では，ローズ

マルチ無施肥区で74cmとなり，耕起施肥区が最グラス単播区（164.3kg/10a）とローズグラス・

２

２

２

© The Ito Foundation

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発（Ⅱ）

a

b

403

c

Fig. 1 Growth of soybean plants under different cultivation system. （Fig. 1a ； tilling and fertilizer treatment,

Fig. 1b；living-multi and fertilizer treatment, Fig. 1c；living-multi and non-fertilizer treatment）at 11th
July 2016．

Table 1 Soil hardness, germination rate and dry matter yield of soybean under different cultivation.
Cultivation

Soil hardness（kg/cm２）

Germination（％）

Dry matter yield（kg/10ａ）

Depth 0cm

Depth 10cm

1 week2 weeks

Flowering

Pod growing

M-F+

3.4±0.5ａ

6.3±0.2ａ38±1.1ａ52.8±0.7ｂ

80.0±29.6ａ

153.8±26.6ab

M-F-

3.4±0.4ａ

6.9±0.8ａ

48.4±7.8ａ

56.5±2.2ｂ

77.9±9.2ａ

198.0±32.5ｂ

P+F+

1.2±0.3ｂ

2.3±0.3ｂ

49.7±5.3ａ

68.8±3.6ａ

170.5±59.8ａ

257.9±31.4ａ

Values followed by different letters among different cultivationdiffer significantly（p＜0.05）by Tukey-test. M-F+, livingmulti and fertilizer：M-F-, living-multi and non-fertilizer：P+F+, plowing and fertilizer.

a

b

c

Fig. 2 Growthof material plants（rhodes grass and/or soybean）under different cultivation system.（Fig.

2a；tilling and fertilizer treatment, Fig. 2b；living-multi and fertilizer treatment, Fig. 2c；living-multiand non-fertilizer treatment）at 11th July 2016．

Table 2 Dry matter yield of rhodes grass, soybean and the amount of weeds under different cultivation.
Cultivation

Flowering
RhodesPod growing

Soybean

Weeds

RhodesSoybean

Weeds

R-S+

―

37.9±11.8

98.7±10.7ａ―

107.9±26.6

157.8±63.8

R+S-

164.3±55.1ａ―

66.4±17.6ａ

464.5±204.2―

67.7±18.1

R+S+

99.7±6.8ｂ

47.9±17.8

54.7±11.9ａ

493.1±301.6

65.0±16.0

146.4±59.3

Values followed by different letters among different cultivation differ significantly（p＜0.05）by Tukey-test. R-S+,
single-soybeancultivation：R+S-, single-rhodes grass sultivation：R+S+, soybean-rhodesgrass intercropping.

© The Ito Foundation

404

平成29年度a

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）bcFig. 3 Damage of soybean plants by insects observed during the experiment.（Fig. 3a；larva of Spodoptera litura,

Fig. 3b；Popillia japonica adults, Fig. 3c；Damage by Popillia japonica adults observed at 11th July 2016．

ダイズ混播区（99.7kg/10a）の間に有意差は認められたものの（p＜0.05），莢伸長期では，ローズ

3 . 3 西南暖地におけるダイズ生産で確認された虫害についてグラス単播区（464.5kg/10a）とローズグラス・

本試験期間中に，多くの種類の害虫が確認されダイズ混播区（493.1kg/10a）の間に有意差は認た。特にカメムシ科およびコガネムシ科の昆虫にめられなかった（Fig.３）。

よる食害が顕著であった（Fig.３）。マメコガネ

ダイズ乾物収量は，開花期では，ダイズ単播区

はコガネムシ科に分類される甲虫の一種であり，（37.9kg/10a）と ロ ー ズ グ ラ ス・ダ イ ズ 混 播 区

幼虫は地下部の根部を食し，成虫は地上部の葉部（47.9kg/10a）の間に有意差は認められなかったもを葉脈に沿って食する。このことから，西南暖地のの，莢伸長期では，ダイズ単播区（107.9kg/10a）の春季から夏季における飼料用ダイズ生産体系でが，ローズグラス・ダイズ混播区（65.0kg/10a）

は，耐虫性ダイズ系統の検討や害虫管理・防除法

よりも有意に高い値であった（p＜0.05）。

（阿久津1987）３）または栽培体系の検討（田澤・三本研究の結果，ダイズ単収として考えた場合，春季のIRリビングマルチ無施肥条件下におけるダイズ生産体系が，最も高いダイズ乾物収量を期待できると考えられる。しかしながら，本生産体

４）
浦2016）などのような害虫に対する諸対策を早急に講じる必要がある。
４．要

約

系では，ダイズの収穫期が８月頃になるため，そ高タンパク質飼料としてのダイズ生産が注目さの後の粗飼料または作物の作付けについて新たにれているが，飼料用ダイズ生産に使用可能な除草検討する必要がある。一方，ローズグラスとダイ剤が国内では登録されていない。そのため，寒冷ズの混播では，収穫後もローズグラスは再生し，地では，前植生をリビングマルチとして雑草防除

２番草として収穫することができる。このことかに利用した飼料用ダイズ生産体系が確立されていら，乾物収量として考えた場合には，ローズグラ

る。一方，西南暖地での飼料用ダイズ生産体系はスとダイズの混播による生産体系が西南暖地での確立されていない。本研究では，西南暖地におけ

高タンパク粗飼料として適用できるものと考えらる飼料用ダイズ生産技術の確立を目指し，寒地型れる。

イネ科牧草イタリアンライグラスをリビングマル
チとして利用した体系（試験１）と暖地型イネ科
牧草ローズグラスとの混播した体系（試験２）に© The Ito Foundation

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発（Ⅱ）

405

よるダイズ生産体系に関する基礎的研究を行っに高い値であった（p＜0.05）。本研究の結果，西た。試験１では，ダイズ草高および乾物収量は，

南暖地では，春季のIRリビングマルチ条件下に耕起施肥区が最も高い値を示した。リビングマル

おけるダイズ生産体系が，最も高い収量を期待でチ区では，リビングマルチ無施肥区がリビングマ

きると考えられた。

ルチ施肥区よりも，ダイズ草高および乾物収量が高い傾向が認められた。これはリビングマルチ施
肥における施肥処理が刈取り後のイタリアンライ
グラスの再生を助長し，ダイズの伸長が抑制されたものと考えられる。試験２では，ダイズ草高は，播種後２，６および10週目のいずれにおいても，ダイズ単播区およびローズグラス・ダイズ混播区において有意差は認められなかった。ダイズ乾物
収量は，開花期では，ダイズ単播区（37.9kg/10a）とローズグラス・ダイズ混播区（47.9kg/10a）の間に有意差は認められなかったものの，莢伸長期
では，ダイズ単播区（107.9kg/10a）が，ローズ

文献１） 内野宙，魚住順，嶝野英子，河本英憲，出口新：イタリアンライグラスをリビングマルチとして導入した飼料用大豆生産体系―大豆の播種時期が収量性に及ぼす影響について―，第237回日本作物学会講演
要旨，2014．
２） 石垣元気，福山喜一：西南暖地におけるイネ科リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発，伊藤記念財団研究助成成果報告，2017．
３） 阿久津四良：神奈川県平坦地の晩播大豆におけるダイズサヤタマバエおよびカメムシ類の発生と防除に関する研究，神奈川県農研研報129巻，p38～49，1987．
４） 田澤純子，三浦重典：関東地域の有機栽培に適したダイズ品種の特性および栽培体系，日作物紀行85巻，p23～32，2016．

グラス・ダイズ混播区（65.0kg/10a）よりも有意© The Ito Foundation

406

乳牛における高糖分イネWCS（ホールクロップサイレージ）
多給による高繁殖型飼養管理システムの確立
New system development of high fertility by feeding large amounts of a dietcomprising sugar-rich rice whole crop silage in lactating dairy cows

山口

昇一郎・浅岡

壮平・馬場

武志・川島

千帆＊

（福岡県農林業総合試験場，＊帯広畜産大学フィールド科学センター）

Shoichiro Yamaguchi, Sohei Asaoka, Takeshi baba and Chiho Kawashima＊（Fukuoka Agricultural Research Center，＊Field Center of Animal Science andAgriculture, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

The aim of this study was to investigate metabolic parameters and reproductive
performance in dairy cows by feeding large amounts of a diet comprising sugar-rich rice wholecrop silage（WCS）and adding a dietary supplement such as betaine to serve as an agent foramelioration of hepatic steatosis during the dry and postpartum periods. The experimental
diets consisted of two total mixed rations（TMR）consisting of grass silage and/or cured hay（control）or sugar-rich rice WCS（rice WCS，28％ of DM）. Rice WCS cows（n＝3）were
supplied with 50g of betaine by oral administration daily from 3 weeks pre-partum to 3 weeks
postpartum. Control cows（n＝2）did not receive betaine supplementation. Blood samples frommultiparous Holstein cows were collected once a week from 3 weeks pre-partum to 12 weeks
postpartum. The first postpartum luteal formation was confirmed using ultrasonography. The
TDN dry matter intake, milk yield, plasma glucose, total cholesterol, total protein and NEFA
did not differ between control and rice WCS cows. The plasma GGT in rice WCS cows tended
to be higher than in control cows（p＜0.1）. However, the TDN dry matter intake, plasma
glucose and total cholesterol in rice WCS cows remained slightly higher than in control cows
from 0 to 7 weeks postpartum. Days of the first postpartum luteal formation in rice WCS cows
were earlier than in control cows（p＜0.05）. In conclusion, the present study suggests that theresumption of postpartum ovarian function was earlier by feeding large amounts of a dietcomprising sugar-rich rice WCS.

１．目

400日前後と大きくかけ離れているのが現状であ的る。酪農現場では，従来から繁殖成績向上対策と国内における乳牛の受胎率は低下傾向にあり，してオブシンクなどのホルモン投与プログラムの生産子牛の減少は子牛価格の高騰や乳牛後継牛の利用等が行われてきたが，飼料からのエネルギー不足の要因となっている。都道府県における乳牛

摂取が乳生産のエネルギーを下回っている泌乳初の分娩間隔は，450日程度であり，理想とされる

期牛は，まずは飼料摂取量を最大化することが一© The Ito Foundation

乳牛における高糖分イネWCS（ホールクロップサイレージ）多給による高繁殖型飼養管理システムの確立407

験区：４産１頭，２産２頭）を用いた。試験牛は番の対策と考えられている１）。
近年，イネホールクロップサイレージ（WCS）

フリーストール牛舎で飼養し，ドアフィーダに用でモミが少なく茎葉に糖を多く含む「たちすずよって個体ごとに飼料摂取量を計測した。搾乳はか」が開発された 。乳牛に給与した場合に，従ミルキングパーラーで８：45と17：15の１日２回

来品種では，モミが消化されず糞として排泄され行った。試験期間は，分娩予定の３週間前から分てしまうという問題を，モミが少なく茎葉を長く娩後12週目までとした。採血および超音波画像診することで解決した画期的な品種とされている。

断装置による分娩後の卵巣診断は，１週間に１回「たちすずか」を乳牛に給与する事例は増えてい行った。血漿中の血糖，総蛋白，総コレステロー

るものの酪農現場では，従来品種同様に少量（乾ル，BUN，GOT（グルタミック・オキザロアセ

物で３～５kg程度）給与している事例がまだ多ティック・タランスアミナーゼ），およびGGTく，飼料特性を十分に活用しているとは言い難い。

（γ-グルタミルトランスフェラーゼ）は血液化学

一方，分娩後の体重減少に伴う血中の体脂肪の自動分析機（スポットケムSP-4410）によって測処理により卵巣からの発情ホルモン分泌に関与す

定 し た 。ま た NEFA（遊 離 脂 肪 酸）は キ ッ トる肝臓（インスリン様成長因子-１の産生）には（WAKO）によって分析した。すべての試験用飼多大な負担がかかっており，結果として発情の微料は，カッターで細断した粗飼料と濃厚飼料を合弱，または発情がこないことにより初回授精が遅わせ混合飼料（TMR）によって調製した。対照

れ ，分 娩 間 隔 延 長 の 一 因 と な っ て い る 。

区用TMRの養分含量は，TDN71％，CP15％，

Kawakamiら

はマウスにおいてアミノ酸の一種

NDF35％となるように場内産自給飼料（イタリであるベタインを給与すると肝臓への脂肪蓄積がアンライグラスまたはヒエサイレージ）を給与し抑制されること，中井らはベタインがルーメンた。なお，ヒエサイレージを給与する際には，流で完全に分解されずに小腸に流入することを報告

通 乾 草（オ ー ツ ヘ イ）を 併 用 し た 。試 験 区 用している。これまで脂肪肝対策として乳牛に給与

WCS用イネは，場内で生産した高糖分イネ「たした事例はないため，分娩後の体脂肪動員への対

ちすずか」を完熟期で刈り，乳酸菌（畜草２号，策として活用すれば繁殖性改善につなげられるか

雪印種苗）を添加後，ラッピングしたものを用いもしれない。

た。試験区のTMRは，TDN71％，CP15，NDF32％

２）

３）

４）

そこで，本研究では，高糖分イネWCSを泌乳となるように調整し，イネの配合割合は，28％

初期牛に多給（通常の２倍程度）して泌乳初期牛（乾物）とした。なお，イネWCS数量に限りがの飼料摂取量を向上させるとともに，ベタインをあったため，分娩後１週目までは対照区TMRを

分娩前後３週間給与することによってエネルギー

給与し，その後試験区TMRに変更した。試験区

バランスをすみやかに回復させ，さらに脂肪肝対には，分娩前３週間から分娩後３週間まで食品添策を行うことによって泌乳牛の繁殖性が改善でき

加物の無水ベタイン（日本甜菜製糖株式会社）をるかについて検討した。

50ｇ／日トップドレスで給与した。また分娩から２．方

分娩後１週間まで飼料用グリセリン（85-Ｓ，日法油株式会社）を500ml／日経口投与した。統計処

供試牛は福岡県農林業総合試験場で飼養するホ理は，ｔ検定で実施した。

ルスタイン種経産牛５頭（対照区：２産２頭，試© The Ito Foundation

408

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

穫時期が異なる高糖分WCSを泌乳中後期牛に給３．結果と考察与した場合において，完熟期刈りで調製した給与

TDN乾物摂取量，栄養状態を示す血中グルコー

飼料の方が，適期刈りと考えられていた糊熟期刈スおよび総コレステロール値は分娩後７週目までりの場合よりも泌乳牛の乾物摂取量が若干多い傾

有意差はないものの，試験区が高い傾向が認めら向にあり，発情ホルモン合成に深く関与する血糖れた（Fig.１およびFig.２）。肝機能障害を示す

値が有意に高く推移することも明らかにしてい

GGTは，試験区が高くなる傾向がある週が認める５）。本研究では，完熟期刈りの高糖分イネWCSられた（Fig.２，p＜0.1）。NEFAについては，差を３割程度TMRに配合し，泌乳初期牛に給与しが認められなかった。分娩後，超音波画像検査にたところ，有意差は認められないものの分娩後７よって初めて黄体が確認された日数は，対照区

週目までTDN摂取量は多い傾向を示し，また栄

54.0±9.0日，試験区22.3±3.0日であり，有意に試養状態を示す血糖値や総コレステロール値も高い

験区が短くなった（Fig.３，p＜0.05）。

傾向を示した。この分娩後のエネルギー状態の改

我 々 は ，泌 乳 中 後 期 牛 に 対 し て 高 糖 分 イ ネ

善は，卵巣機能の回復を高め，初回排卵を試験区

WCSに関する給与試験を実施したところ，本県において有意に早めたものと思われた。一般的にで一般的な自給粗飼料であるイタリアンライグラ

分娩後の初回排卵が早い方がその後の正常な卵巣

スサイレージ（開花期刈り）を乾物割合で３割配機能回復が早く，早期受胎につながることが報告合したTMRよりも高糖分イネWCS配合TMRをされている６）。したがって嗜好性の高い高糖分イ

給与した場合には，乾物摂取量がイタリアリンラ

ネWCSを多給することで繁殖性が向上する可能イグラスサイレージの半量代替（乾物割合で1.5性が示唆された。一方，分娩前後３週間のベタイ

割）で６％，全量代替（乾物割合で３割）で11％

ン の 効 果 に つ い て は ，ベ タ イ ン 給 与 期 間 中 の有意に向上し，多給することによって乾物摂取量

NEFAおよびGOTには差が認められず，GGTはがより向上することを明らかにした 。また，収有意に高くなる傾向にあった。GGTが高くなっ

５）

Rice WCS

Control

50.0
45.0

Milk yield (Kg/day)

TDN dry matter intake (Kg)

25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0

40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0.0

Postpartum weeks

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Postpartum weeks

Fig. 1 TDN dry matter intake and milk yields in control and rice WCS cowsfrom 0 to12 weeks postpartum.

© The Ito Foundation

乳牛における高糖分イネWCS（ホールクロップサイレージ）多給による高繁殖型飼養管理システムの確立
Rice WCS

Control

300.0

60.0

T‒cho (mg/dl)

Glucose (mg/dl)

70.0

50.0
40.0
30.0
20.0

150.0
100.0

0.0

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

70.0

6.0

60.0

5.0

50.0

GOT (IU/l)

T‒pro (g/dl)

200.0

7.0

4.0
3.0

30.0
20.0

1.0

10.0
0.0

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

80.0

0.50

60.0

NEFA (mEq/l)

70.0

40.0

†
†

30.0
20.0

0.40
0.30
0.20
0.10

10.0
0.0

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

0.60

90.0

50.0

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

40.0

2.0

0.0

GGT (IU/l)

250.0

50.0

10.0
0.0

409

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112

0.00

Postpartum weeks

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

Postpartum weeks

Fig. 2 Metabolic parameters in control and rice WCS cows from 3 weeks prepartum to 5 or 12

weeks postpartum. †Indicates differences of p＜0.1 between the treatment group.

た理由は，試験区が試験開始前から数値が高かっかについて再度検討する必要があるものと考えた影響が大きかったと考える。本試験の結果ではる。なお，試験区には分娩後１週間のグリセリン

ベタインの効果は必ずしも明らかにはできなかっの給与も行ったが分娩後１週間目の血糖には差がたが，今後例数を重ねるとともにボディコンディ

認められなかった。しかし分娩１週目の乳量にはションスコアが高い牛等でどのような影響がある

統計上差が認められないものの，10kg／日の増© The Ito Foundation

410

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）（ｎ＝３）には，分娩前後３週間にわたりベタイ＊
70

ンを50ｇ／日経口投与した。対照区（ｎ＝２）に

Days

60

は無処理とした。本試験は経産牛のみ用い，分娩50

前３週間から分娩後12週まで週１回採血した。分40

娩後の初回黄体形成は，超音波検査によって確認30した。TDN摂取量，乳量，血糖，総コレステロー

20

ル，総タンパクおよびNEFAとも試験区間で有意10差は認められなかった。GGTは，イネWCS区が0

Control

高くなる傾向にあった（ｐ＜0.1）。しかし，TDN

Rice WCS

Fig. 3 Days of the first postpartum luteal formation in

摂取量，血糖および総コレステロールは，イネ

control and rice WCS cows. ＊Indicates differencesof p ＜ 0.05 between the treatment group.Values are
mean±SEM.

WCS区が分娩後７週目までやや高く推移した。

加が認められた。栄養状態や繁殖への影響につい以上のことから，高糖分イネWCSを泌乳牛にては今後検討する必要があるものと考える。
以上のことから，分娩後の乳牛に高糖分WCS
用イネを給与すると乾物摂取量が多くなることで分娩後の初回黄体形成日数は，イネWCS区が有意に早くなった（ｐ＜0.05）。
多給することによって，エネルギーバランスが改善し，分娩後の卵巣機能の回復が早くなることが明らかとなった。

エネルギー状態が改善され，卵巣機能回復が早まることが明らかとなった。また，脂肪肝対策として給与したベタインの効果は，今回の試験では明らかではなかった。
４．要

約

本研究では，高糖分イネホールクロップサイ
レージ（WCS）を泌乳牛に多給し，かつ脂肪肝に効果があるとされるベタインを給与することで栄養状態や繁殖性が改善できるかどうかについて検討した。試験飼料は，グラスサイレージ単体または乾草と併用したTMR（対照区）および高糖分イネWCSで構成したTMR（イネWCS区，乾物文献１） Rensis, F., Scaramuzzi, R. J.：Theriogenology，60，1139～51，2003．
２） 松下景，飯田修一，出田収，春原嘉弘，前田英郎，
田村泰章：近畿中国四国農業研究センター研究報告，第11号，１～14，2012．
３） Kawakami, S., Han, K., Nakamura, Y., Shimada, K.,
Kitano, T., Aritsuka, T., Nagura, T., Ohba, K.,
Nakamura, K., Fukushima, M.：J Nutr Sci Vitaminol，
58，371～5，2012．
４） 中井朋一，菊地裕人，佐藤忠，佐渡谷裕朗，大谷昌之，花田正明，岡本明治：日獣会誌，60，131～
133，2007．
５） 福 岡 県 農 林 業 総 合 試 験 場 ： http://farc.pref.
fukuoka.jp/６） Kawashima, C., Sakaguchi, M., Suzuki, T.,
Sasamoto, Y., Takahashi, Y., Matsui, M., Miyamoto,
A.：J Reprod Dev，53，113～20，2006．

割合で28％配合）とした。イネWCS区の試験牛© The Ito Foundation

411

ルーメンアシドーシス防除を目指した新規ルーメン
幹細胞培養モデルの開発
Establishment of a novel culture model of bovine rumen epithelial cellusing tissue stem cell culture method

鈴

木

裕

（北海道大学大学院農学研究院）

Yutaka Suzuki（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

Developing a practical culture model of bovine rumen epithelial cells is required for better
understanding of molecular mechanism in cellular response and tissue regeneration undersubacute ruminal acidosis（SARA）.Recent advances in stem cell and cancer research revealed
the molecular event within stem cell niche which maintains stemness of tissue stem cells, andtherefore it enabled the refinement of tissue stem cell culture method. In the present study, we
aimed to identify tissue stem cell in bovine rumen tissue, and to establish a novel culturingmodel of ruminal epithelial cells by adapting tissue stem cell culturing method for human andmice gastrointestinal tract（GIT）. The result showed that several tissue stem cell markers
including SOX2 as a pivotal transcription factor for the maintenance of stemness expressed inrumen tissue from Holstein calves at 3 weeks of age. SOX2 expressing cells were located atbasale of rumen epithelia, in which Ki67 positive proliferating cells were also observed. Notably,
SOX2 and Ki67 double positive cells were detected at the same region, suggesting this cell
population plays important for the maintenance and regeneration of ruminal tissue via
providing intact and undifferentiated epithelial cells. Further in vitro study was conducted toestablish a culturing method of rumen epithelial cells. Rumen epithelial cells were grown by
the combination of culturing media containing ligand/inhibitor of WNT and BMP signaling, andgelatin-coating of culture dish. As these cultured cells expressed SOX2 and Ki67, this culturingmethod was considered to successfully mimic the rumen epithelial niche. These results might
contribute insights into cellular and molecular mechanism of rumen epithelium during SARA,
and are expected for the future application to screen protective agents against SARA.

１．目

いる。SARAの状態では，ルーメン内pHの低下

的によりルーメン上皮のバリア機能が損なわれ，細濃厚飼料の過給に起因する亜急性ルーメンアシ

菌や毒素が体内に流入すると考えられている１）。

ド ー シ ス（Subacute ruminal acidosis ： SARA）

しかし，その際の上皮組織の分子応答機序や，その発生が，肉牛・乳牛生産において問題となっての後の組織修復メカニズムについては詳細像が明© The Ito Foundation

412

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

らかにされていない。非モデル動物である牛のり行い，採取した組織はトリミング後に液体窒素

ルーメン上皮細胞は優れた細胞株が樹立されておにより急速凍結して，分析まで－80℃において保らず，これまで使用されていた初代培養系では継存した。

代可能回数や増殖性が低いという問題を抱えてい

2.2

た。

ホルスタイン種牛オス（３週齢～13週齢）より

ルーメン上皮細胞の単離と培養組織の維持や修復には未分化状態を維持した組

ルーメン組織を採取した。採取したルーメン組織

織幹細胞（または体性幹細胞）の働きが重要であから上皮絨毛を切り取り，遠沈管内で抗生物質をることが示されており，ルーメン組織においても添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）により10重要な役割を持つことが予想される。近年の再生回洗浄した。洗浄したルーメン絨毛を外科ハサミ

医療やがん研究の進展から幹細胞の未分化性維持に よ り 細 切 し ，Trypsin/EDTA を 加 え て 恒 温を担う微小環境（ニッチ）の解明が進み，オルガ

シェーカー内で60分間浸透培養することで，上皮ノイド培養法の開発などによる組織幹細胞の培養

細胞を剥離させた。浸透後の上清を回収し，遠心法の改良が行われている。牛のルーメンはマウス

分離（1,500rpm，４℃，10分間）により細胞ペの前胃や食道に近い性質を持つと考えられること

レットを回収した後，PBSにより２回洗浄した。

から，ヒトやマウスの胃や食道における研究知見

洗 浄 後 の 細 胞 ペ レ ッ ト は Advanced DMEM/が応用できると予想される。ルーメン上皮幹細胞

F-12，２％FBSにより懸濁した。細胞を播種すについてはその存在を示唆する報告はあるが詳細

る６ well plateはあらかじめ以下のいずれかの方な検討がなされておらず ，その同定と培養技術

法で表面処理を行った。フィーダー細胞培養ではの確立は，制約の多い非モデル動物である牛の消牛胎子線維芽細胞を約60％コンフルエントになる化管研究への応用が期待できる。

まで培養し，２時間のマイトマイシンＣ処理を

２）

本研究では，SARAにおけるルーメン上皮組織行った。細胞外マトリクスコーティング培養ではの応答・修復機序の解明への将来的な応用を見据

各ウェルに２mlの0.1％豚皮膚由来ゼラチン液をえ，ルーメン上皮における組織幹細胞の探索，お分注し，37℃にて２時間以上インキュベーション

よびそれを利用した利便性の高い新規ルーメン上した。いずれの方法においてもルーメン上皮細胞

皮細胞培養法を作出することを目的とした。

の播種前に，PBSでウェルを洗浄した。既報の組

２．方
2.1

成 を 基 に 調 製 し た 組 織 幹 細 胞 用 培 地 を ６ well法

plateを分注（２ml/well）し，採取したルーメン
上皮細胞を細胞密度100cells/cm２となるように播

消化管組織の採材

本研究では３週齢，13週齢，10カ月齢のホルス

種した３）。ルーメン上皮細胞は37℃，５％CO２，

タイン種牛オスより採取した消化管組織を分析用

飽和蒸気圧下で培養し，24時間ごとに培地交換をサンプルとして使用した。組織サンプルは国内の行い，120時間培養した。

研究機関より譲渡されたものであり，当該機関に2.3おける認可・規定に基づき採取された。供試牛はRNA抽出前試薬の添加前に，ルーメン組織は

出生後，市販の代用乳およびスターターで哺育凍結破砕し，培養ルーメン上皮細胞はPBSによりし，約８週齢で離乳した。ルーメンを含む消化管

洗 浄 し た 。組 織 ま た は 細 胞 を RNA 抽 出 試 薬

組織の採材は，深麻酔下で放血処理した供試牛よ（RNAiso plus, Takara）により溶解し，定法によ© The Ito Foundation

RNA抽出およびqRT-PCR

ルーメンアシドーシス防除を目指した新規ルーメン幹細胞培養モデルの開発

413

りtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAは識２次抗体を滴下し，室温にて１時間インキュ

Nanodrop（Thermo Scientific）による濃度・純

ベーションした。切片を洗浄・封入し，蛍光顕微度測定，およびアガロースゲル電気泳動による分鏡下で組織染色像を観察した。

解度の確認を行った。500ng/sampleのtotal RNA

2.6を 逆 転 写（Revertra-ase, TOYOBO）に 供 し ，

統計解析はOne-way ANOVAおよびTukey法

cDNAを作製した。作製したcDNAを用いてRT-による多重比較検定を行い，P＜0.05の場合にデーPCRまたはqRT-PCRを行い，標的遺伝子発現のタ間に有意差があるとした。

定性的または定量的解析を行った。
2 . 4 タンパク質抽出およびウエスタンブロッ
ト

統計

３．結果と考察3 . 1 ルーメン組織における幹細胞・未分化細RNAiso plusで溶解した組織より，定法に従っ

胞マーカーの発現てtotal proteinを抽出し，BCA法でタンパク質濃３週齢のホルスタイン種子牛より採取したルー

度 を 測 定 し た 。10µg/sample の total protein をメン組織における，組織幹細胞マーカーの候補遺

SDS-PAGE sample bufferと混合し，12.5％ポリ伝子の発現を解析した結果をFig. 1Aに示す。ルー

アクリルアミドゲルによるSDS-PAGEに供した。

メン組織において，重層扁平上皮組織の幹細胞

泳動後のゲルよりPVDFメンブレンにタンパク質

マーカーと考えられるTP63，AXIN2，ITGA6，を転写した。転写後のメンブレンは２％（w/v）

ITGB4，SOX2，および増殖細胞のマーカーとなのカゼインを添加したトリス緩衝生理食塩水

るMKI67のmRNA発現が確認された。これらの（TBS）により30分間ブロッキングし，希釈した遺伝子の中で，Ki67および転写因子として未分化

１次抗体液中で一晩インキュベーションした。メ

性の維持において特に重要と考えられるSOX2にンブレンは洗浄後，5000倍希釈したHRP標識２

ついてウエスタンブロット行ったところ，両者と次抗体液中で１時間インキュベーションした後，もにタンパク質レベルでの発現が確認された

イムノゼータ（和光純薬）を用いて，特異的バン（Fig. 1B）
。Xiangらの報告から，ルーメン上皮のドの化学発光検出を行った。

遺伝子発現パターンは食道・扁桃腺に近似してい

2.5

免疫染色

ることが示されている４）。本研究では既報におけ凍結保存したルーメン組織をクライオスタット

るSOX2やTP63といったヒト，マウスの食道上皮により，10µm厚で薄切した。組織切片をCREST

幹細胞マーカーがルーメン上皮幹細胞／未分化細コートスライドグラスにマウントし，室温でよく胞の同定に利用できると予想したが５），実際に解乾燥させた後，10％ホルマリン／PBSで15分間固析したすべてのマーカー候補遺伝子の発現が確認定した。固定した切片はTBSで10分間洗浄し，された。また，免疫染色法によりルーメン組織に

１％ Normal Goat Serum，２％ Caseinを添加しおけるSOX2およびKi67陽性細胞の局在を検討したTBSにより30分間ブロッキングした。Can get

たところ，両者ともに上皮組織基底部位においてsignal immunostain（TOYOBO）に よ り 希 釈 し

多数の陽性細胞がみられ，それらの一部は共陽性

た１次抗体液を組織切片に添加し，４℃で１晩イ細胞であった（Fig.２）。皮膚などの一般的な重ンキュベーションした。TBSにより切片を洗浄

層扁平上皮において，組織の修復などに関わる増し，ブロッキング液で1000倍希釈した蛍光色素標

殖細胞は基底部に位置することが知られている。

© The Ito Foundation

414

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Fig. 1 Gene and protein expression of stem/undifferenciated cell marker candidates in the rumen and other digestiveorgans. Tissue samples from male Holstein calves at 3 weeks of their age were subjected to RT-PCR and western
blotting. A shows mRNA expression of each gene in rumen（Rum）and PCR blanks（B）. B shows protein
expression of each gene in the indicated parts of digestive organ of same calves.

Fig. 2 Cellular location of SOX2 and Ki67 expressing cells in rumen epithelium. Rumen tissue samples from male

Holstein calves at 3 weeks of their age were subjected to immunostaing to visualize SOX2, Ki67 and the merged
image of SOX2 and Ki67. Bottom panels show magnified image of top panels. White arrows indicate SOX2+/Ki67+
cells. Scale bars represent 25μm（top）and 5µm（bottom）.

本実験の結果から，重層扁平上皮であるルーメン

期を明らかにする必要がある。離乳前の子牛の上皮組織の基底部において，未分化性を維持しつ

ルーメンは未発達であり，未分化細胞が多く存在

つ，増殖を繰り返して組織に細胞を供給する組織していると予想されるため，本実験では３週齢，

幹細胞的な機能を有する未分化細胞群が存在する

10週齢，10カ月齢のホルスタイン種牛オスよりことが示唆された。

ルーメン組織を採取し，ウエスタンブロット法に

3.2

幹細胞マーカーを高発現する時期の検討

より組織中のSOX2およびKi67の存在量を比較しルーメン組織から未分化細胞を効率的に回収すた。その結果，SOX2は予想に反して３週齢で最るためには，このような細胞群の存在量の高い時もタンパク質発現レベルが低く，13週齢，10カ月© The Ito Foundation

ルーメンアシドーシス防除を目指した新規ルーメン幹細胞培養モデルの開発

415

Fig. 3 Changes in SOX2 and Ki67 levels in rumen epithelium in growing calves. Tissue protein was extracted from therumen of male Holstein calves at 3 weeks, 13 weeks and 10 months of their age and protein levels of SOX2 andKi67 were quantified by western blotting. The specific bands of SOX2 and Ki67 are indicated（left）and relative
intensities of each protein bands normalized by Tubulin are shown（right）. Different alphabet letters represents
statistical significance：P＜0.05．

Fig. 4 Initial cellular adhesion and colony formation of cultured rumen epithelial cells. Rumen epithelial cells were

harvested from male Holstein calves at 3 weeks of age and cultured in tissue stem cell media on feeder cell or
gelatin-coated plate. Top panels：White arrows indicate adhered epithelial cells 24h post seeding in feeder cell or
gelatin-coated culture. Bottom panels：rumen epithelial cells demonstrated tissue stem cell-like colonies in both
culture conditions 120h post seeding. Scale bars represent 100µm.

齢と成長するに従い８倍程度まで量が増加したという他の重層扁平上皮組織にない性質を持つた（Fig.３）。一方でKi67は個体差が大きく，各週齢

め，より未分化な細胞のマーカーが存在しないか間で有意な差はなかった。本実験ではヒト・マウ

今後詳細に検討する必要性が示された。

スにおける食道疾病の研究から同定された幹細胞マーカーSOX2に着目した 。この研究では，採５）

3 . 3 ルーメン上皮細胞の単離と培養条件の検討取した細胞の幹細胞性はオルガノイド形成能を指

これまでの実験からルーメン上皮において未分標に評価されており，これと相関する他のマー化細胞の存在が示唆されたため，本実験ではこのカー遺伝子も同定されている。本実験の結果かような細胞群の単離および体外培養の可能性につら，成牛において組織幹細胞の存在が高まった可いて検討した。３週齢の子牛より採取したルーメ

能性は排除できないものの，SOX2陽性細胞よりン組織から単離した上皮細胞を，組織幹細胞培地

も未分化な細胞群が存在する可能性が考えられにおいてフィーダー培養（Feeder）した結果をる。ルーメン上皮は離乳期を境に分化・発達する

Fig.４に示す。また，ゼラチンコート（Gelatin）© The Ito Foundation

416

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

によるフィーダーフリー培養法についても同時にた。ECMはそれぞれに対応する受容体を介して検討した。細胞播種から24時間後のFeederおよ細胞と結合することで，細胞の生存や増殖を促進

びGelatinではウェル底面に付着した生細胞が確する。当グループの未発表データからルーメン組認された。また，播種後120時間では両培養条件

織ではコラーゲン類が高発現することから，この下においてルーメン上皮細胞はコロニーを形成しECMがルーメン上皮細胞の足場として重要であていた。次に，フィーダーフリー培養したルーメ

ると考えられ，二次元培養下でも上皮細胞が増殖

ン上皮細胞の性状を免疫染色により検討したとこしたと考えられる。本実験は培地およびECMのろ，SOX2，Ki67，ITGA6を発現していることが基礎的な培養条件検討であり，今後は細胞継代能確認された（Fig.５）。また，SOX2，Ki67についや未分化能の評価および分化培養法の検討が必要ては上皮細胞コロニー内の細胞間で発現量のばらである。しかしこの培養系は，SARAにおける上

つきがみられた。

皮細胞応答メカニズムの検討や治療薬の探索に応

組織幹細胞の培養法では生体内の幹細胞ニッチを模倣することが重要であり，幹細胞によるオートクラインや周辺細胞からのパラクラインを介したWnt，BMPなどのシグナル経路により組織幹細胞は維持されていると考えられている用できると期待される。
４．要

約

本研究では，ルーメンアシドーシス時の細胞応。本

答研究への応用を見据え，組織修復に関わるルー

実験においてもWntシグナル因子とBMP阻害因

メン組織幹細胞の同定と単離培養法の確立を目指

子を添加した幹細胞培地を使用することで幹細胞した。離乳前（３週齢）のホルスタイン種牛のコロニー様の形態を持つルーメン上皮細胞の培養

ルーメン組織における，組織幹細胞マーカー遺伝に成功した。また，ゼラチンコーティングによる子の発現を検討したところ，SOX2などの既報でフィーダーフリー培養が可能であることも示され示されている候補遺伝子群の発現がみられた。ま

３，６）

Fig. 5 The maintenance of undifferentiated state in cultured rumen epithelial cells. Rumen epithelial cells from Holsteincalves（3 weeks of age）were cultured using feeder-free method for 120h to form tissue stem cell-like colonies.
Immunofluorescence visualized SOX2 and Ki67 expressing cells（Top panels）and their corresponding DAPI
staining（Bottom panels）.Scale bars represent 100µm.

© The Ito Foundation

ルーメンアシドーシス防除を目指した新規ルーメン幹細胞培養モデルの開発

417

た，免疫染色により，ルーメン組織内ではSOX2可能となった。現在，培養細胞の詳細な性状解析とKi67の共陽性細胞が存在し，幹細胞性を維持しを行っており，今後は分化培養法を作出することつつ細胞増殖により組織に細胞を供給する細胞群

でルーメン上皮を精度よく模倣した培養モデルのがあることが示唆された。さらに，これらの細胞作出が期待される。

群の培養法を検討したところ，WntおよびBMP
シグナル制御因子を添加した培地を用いることでフィーダー細胞共存下およびフィーダーフリー条
件下で培養することが可能となった。これらの培養細胞はSOX2およびKi67を発現していたことか
ら，未分化性や増殖性が維持されていると考えられた。本研究により，ルーメン組織において増殖能を持つ幹細胞様の未分化細胞の存在が示唆され，その性質を維持しつつ体外培養を行うことが文
献１） Steele, M. A., et al.：J. Dairy Sci.，99，4955～4966，
2016．
２） Yohe, T. T., et al.：J. Dairy Sci.，99，7654～7660，
2016．
３） Yamamoto, Y., et al.：Nat. Commun.，7，1～10，
2016.
４） Xiang, R., et al.：PeerJ, 4, e1762，2016．
５） DeWard, A. D., et al.：Cell Rep.，9，701～711，
2014．
６） Sato, T., et al.：Nature，459，262～265，2009．

© The Ito Foundation

418

哺乳子牛の下痢を低減する発酵代用乳の開発
Development of the fermented milk which reduces the loose bowel of calves

庄

司

則

章

（山形県立農林大学校）

Noriaki Shoji（Yamagata Prefectural College of Agriculture and Forestry）

Loose bowel of calves is known to result in contracting pneumonia and suppressing the
growth of them. In order to restrain diarrhea of calves, feeding the fermented milk on them as
reducing measures of the diarrhea was studied. The feeding effect of the fermented milk
replacer, which was added lactic acid bacteria Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus
OLL1073R-1，was investigated. The feeding the fermented milk replacer on calves wasindicated to promote the growth and decrease diseases because of the improvement of
nutritional conditions and infection protective function, whereas the reducing effect of diarrhea
was obscure.

１．目たりする。そのため，肺炎の一因である子牛の下的痢を低減させることは，生産現場において非常に子牛の生産基盤の弱体化により黒毛和種子牛の生産頭数は減少しており，子牛価格は高値で推移

重要な課題である。
黒毛和種子牛は，乳用種や交雑種の子牛に比べ815千円／頭） 。そのため，繁て生時体重が小さくて，下痢が発生しやすい。子

殖経営における規模拡大や，肥育経営における繁牛の下痢は，細菌やウイルスなどの感染による感殖部門の導入が進みつつあるが，管理不十分によ染性下痢と，消化不良などによる食餌性下痢に大り子牛が疾病に罹り，発育不良となる事例が多く別される。感染性下痢に対しては，抗病性を十分見受けられる。子牛は抵抗力が弱いため病傷事故に発揮させる栄養とストレスの少ない適切な環境が発生しやすく（Ｈ27

約32万５千件） ，そのが重要である。また，食餌性下痢は未消化の乳成

うち約50％を下痢等の消化器関係が占める。子牛分が大量に小腸に流入することにより起きやすく

は下痢により栄養状態が不良となって発育が停滞なることから，母牛の栄養管理や代用乳の多回給しやすくなるとともに，免疫が低下して肺炎を併与が重要である。

している（Ｈ28１）２）発しやすくなる。哺乳や育成の段階で肺炎になる

我々は，黒毛和種子牛の下痢低減対策として発と，肥育中にも肺炎を発症しやすくなり，これに酵乳の給与に着目した。一部の酪農家では，下痢

より枝肉成績が低下したり，最悪の場合は死亡しの低減を目的として廃棄乳を加熱処理後に乳酸菌© The Ito Foundation

419

哺乳子牛の下痢を低減する発酵代用乳の開発を添加し，発酵乳としてから子牛に給与している検討事例がある。発酵乳は，pH４程度の酸性乳であ６社８製品の代用乳を５倍もしくは７倍量の温ることから，子牛の第４胃を酸性に保って有害な水で希釈し，Ｒ-１ヨーグルトを10％混合したのバクテリアの増殖を防ぐとともに，乳酸発酵によ

ち，40℃で24時間発酵させた。代用乳については

り乳成分が消化されやすくなっていることから食粗タンパク質と粗脂肪，調製した発酵代用乳につ餌性下痢に対しても有効である可能性が高い。しいてはEPSを測定した。

かし，廃棄乳が生じない黒毛和種繁殖経営では，

2 . 2 試験２

発酵乳の給与効果はほとんど検討されていない。

の検討

子牛への発酵代用乳の給与効果

ヒトでは，免疫賦活作用を有する乳酸菌株による分娩後約２週間で親子分離し人工哺乳している発酵乳（ヨーグルト）の摂取効果が報告されてお農場において，黒毛和種哺乳子牛に２種類の発酵り，第一胃が未発達で単胃動物に近い哺乳子牛に代用乳を給与し，血液および糞性状や腸内細菌叢

発酵乳を給与することにより，ヒトと同様に免疫等から給与効果を調査した。

力を高め，疾病が低減することが期待される。

発 酵 代 用 乳 は ，高 脂 肪 代 用 乳 Ａ（CP24 ％，そこで本研究では，市販代用乳とヒトで免疫賦

Fat25 ％ ） も し く は 高 タ ン パ ク 質 代 用 乳 Ｂ

活作用や感染防止効果が報告されている乳酸菌株（CP30％，Fat18％）を，それぞれメーカーが推を用いて，黒毛和種繁殖経営でも給与可能な発酵

奨する８倍もしくは５倍量の温水で溶解し，Ｒ-乳を試作し，発酵乳の給与による黒毛和種子牛の１ヨーグルトを10％添加し，40℃で24時間発酵さ下痢低減効果を検証した。

せて調製した。

２．方
2.1

供試牛は，当該農場で平成29年６～11月に出生法試験１した黒毛和種子牛を用い，代用乳Ａ，Ｂともに対
発酵代用乳の製造方法の検討

照区および試験区に各４頭ずつ配置した。代用乳

子牛の免疫賦活作用や感染防止効果が期待されの給与量はＡ，Ｂともに1000ｇ／日・頭とし，試る 菌 体 外 多 糖（EPS）の 産 生 能 が 高 い 乳 酸 菌

験区では代用乳の一部（代用乳Ａ：111ｇ／日，

Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus

Ｂ：167ｇ／日）を発酵代用乳ＡもしくはＢで代OLL1073R-１株から製造されたヨーグルト（製替した。代用乳および発酵代用乳はそれぞれ1/2

品名「明治プロビオヨーグルトＲ-１」）を用いて量を朝夕に分けて，離乳まで給与した。

次の条件で発酵代用乳を調製し，EPS含量の高い調製法を検討した。
試験1.1

おおむね45日齢時に血液と糞を採取し，血液性状（一般生化学検査，GC/MSによるメタボロー

EPS産生量を高める発酵条件の検討

ム解析，サイトカイン解析等），糞性状（pH，Ｍ社製代用乳（CP27％，Fat15.5％）を５倍量

VFA，IgA），腸内細菌叢（T-RFLP解析）ならの温水で希釈し，Ｒ-１ヨーグルトを10％混合しびに人工哺乳期間中の疾病罹患状況を調査した。

て発酵させた。発酵温度は35，40℃，発酵時間は
０，８，16，24，48時間とし，調製した発酵代用

３．結果と考察

乳のEPS，pH，遊離アミノ酸，総タンパク質，

3.1

総脂質，トリグリセリド，乳酸を測定した。

発酵条件の違いによる発酵代用乳の成分変化を試験1 . 2 EPS産生量を高める代用乳の成分の試験1.1

Table１に示した。発酵温度の違いによる大きな© The Ito Foundation

（FAA）濃度が有意に高かった。哺乳子牛にアミノ酸製剤を給与することによりアミノ酸が子牛の消化管から吸収されて血中FAA濃度が高まる３）ことから，発酵調製により大幅に増加した発酵代

用乳中のFAAが吸収されて血中濃度が高まったものと考えられた。３-ヒドロキシ酪酸（BHB）

は酪酸がルーメン絨毛粘膜で代謝されてできる物

質であり，子牛のルーメン発達の指標とされている４）。発酵代用乳は食道溝反射によりただちに第四胃に送られるため，ルーメンの発達に直接関与するとは考えづらいが，試験区においてBHBが© The Ito Foundation

3

3

3

3

3

3

24

48

8

16

24

48

3

16

3.6

3.6

3.9

3.9

3.6

3.7

3.9

4.1

2005

1711

1464

1095

1722

1317

1068

831

174

144

135

111

177

156

143

104

216

217

206

171

225

214

198

154

44

44

38

23

54

45

36

20

11

11

8

0

14

11

7

0

0

168

168

154

92

168

154

127

70

0

127

125

112

67

135

121

99

50

0

123

124

122

106

137

134

130

99

15

15

15

13

9

19

16

14

10

0

5

2

0

0

7

4

0

0

0

0

0

0

0

7

0

0

0

0

Arg

214

215

201

141

228

212

184

117

0

Ser

211

208

198

146

223

215

186

121

21

Pro

69

64

64

56

71

70

70

52

9

9

8

8

5

8

7

7

7

7

Cys2

0

0

0

0

4

0

0

0

0

Gly

Non-essential
Ala

Data are expressed as mean value（n＝3）．
IS％１：Relative intensity of the TMS derivative against the internal standard（0.1 mg/ml of 2-isopropylmalic acid）determined by GC/MS.
EPS２：Exopolysaccharide.

40

35

3

8

0

窒素が試験区で高く，良好な栄養状態にあると推12

供試牛の血液性状をTable２に示した。個体差

13

ことにより，EPS含量の高い発酵代用乳を調製で2380.1）であり，粗脂肪含量の高い代用乳を用いる

5.8

示した。粗脂肪とEPSの相関はｒ＝0.448（ｐ＜3

よび粗脂肪と発酵後のEPSとの分布図をFig.１にMet

８製品の代用乳を５倍もしくは７倍の温水で希0kgであった。希釈した代用乳の粗タンパク質おLysて約40℃で発酵させ，翌日の朝と夕に子牛に給与Pheきる可能性が示唆された（Fig.１）
。

His

試験２

Essential

が大きく有意ではなかったが，栄養状態の指標でThr

ある総コレステロール，トリグリセリド，尿素態

Ile

17

24

27

89

15

16

66

78

17

Glu

ると，作業が終了する夕方に発酵代用乳を調製しAmbient

察 さ れ た 。ま た ，試 験 区 で は 各 遊 離 ア ミ ノ 酸
Leu

0

0

3

12

0

0

13

14

0

Gln

おおむね安定した。生産現場の作業効率を考慮す

1 （mg/kg） Val
（IS％）

3.3
試験1.2

Time

することが望ましいと考えられた（Table１）
。

Temp

1012

1010

947

747

1090

1005

941

635

69

Total

まで増加し，pHや遊離アミノ酸濃度は24時間で（℃） （hr）

151 ± 28（112 ～ 185）
，124 ± 28（92 ～ 175）mg/

Amount of free amino acid（μmol/L）

釈して調製した発酵代用乳のEPS含量はそれぞれ

EPS２

3.7

3.7

3.8

3.8

3.7

3.7

3.8

3.9

3.9

3.4

3.4

3.4

3.5

3.9

3.9

3.5

3.4

3.0

（％） （％）

Total Total
protein fat

酵前と比べ約15倍と著しかった。EPSは48時間目

pHは増加した。特に遊離アミノ酸総量の増加は，発ｎpHは低下し，乳酸，EPSおよび各遊離アミノ酸

Lacticacid-2TMS

変化は認められず，発酵時間が長くなるにつれてMilk replacer
fermentation

3.2

平成29年度

Table 1 Component change of the fermented milk.

420
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

421

200

200

180

180

EPS（mg/kg）

EPS（mg/kg）

哺乳子牛の下痢を低減する発酵代用乳の開発

160
140
120
100

y = 22.54x + 74.157
R² = 0.2003

80
60

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

160
140
120
100
y = 15.382x + 80.042
R² = 0.1057

80

4.0

4.5

60

1.5

2.0

2.5

fat（%）

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

CP（%）

Fig. 1 EPS content correlation between fat and CP in the fermented milk replacer.
Table 2 Blood components
Milk replacer１

High fat

Treatment２

Control FermentedｎHigh protein

ProcMixed test３

Control Fermented

Milk replacer
Milk
Treatment×replacer
Treatment

4

4

4

4

GOT
GGT
Urea nitrogen
Total protein
AlbmineTotal choresterol
TriglycerideFree fatty acid
GlucoseCalcium
Retinolα-Tocopherol

（U/L）
（U/L）
（mg/dl）（g/dl）（g/dl）（mg/dl）（mg/dl）（mEq/L）（mg/dl）（mg/dl）（IU/dl）（μg/dl）

56
33
6.6
6.4
3.3
169
25
0.18
114
12.7
40
536

56
27
8.5
6.1
3.4
204
35
0.20
115
13.3
61
836

64
23
13.4
6.4
3.6
124
17
0.22
111
13.3
63
624

61
25
14.9
6.2
3.4
157
21
0.24
120
13.1
64
680

Tyrosine-3TMS
Phenylalanine-2TMS
Isoleucine-2TMS
Valine-2TMS
Leucine-2TMS
Proline-2TMS
Threonine-3TMS
Lysine-4TMS
3-Hydroxybutyric acid-2TMS
Threonic acid-4TMS
Uric acid-4TMS
Fructose-meto-5TMS（2）
Dopamine-4TMS

４
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）
（IS％）

1.5
50.0
7.1
55.6
11.0
8.6
20.8
76.1
12.5
3.4
7.1
1.2
5.2

1.9
61.4
8.1
62.2
12.8
9.7
20.8
66.4
17.5
2.8
8.9
2.6
5.8

1.6
57.4
8.7
75.3
16.0
10.1
26.1
84.9
19.4
3.2
6.0
1.3
5.2

2.8
88.5
15.2
119.1
27.4
13.5
42.0
131.4
21.9
1.9
7.6
1.7
6.2

IGF-1
GH

（ng/ml）（ng/ml）

68
6.8

90
17.6

80
7.1

92
6.1

TNF-α
IgG
IgA
LPS-binding protein
Serum amyloid A protein
Haptoglobin（pg/ml）（mg/ml）（μg/ml）（ng/ml）（mg/ml）（mg/ml）

231
8.5
62
742
46
63

133
9.0
73
509
24
11

262
11.0
67
494
16
2

145
8.0
65
578
29
57

＊
＊＊

＋
＋

＋
＋

＋
＋
＊＊
＊＊
＊＊
＊
＊
＊

＊
＊
＊
＊
＊

＋
＋

＋
＊
＊
＊
＊
＋

Data are expressed as mean value（n＝4）．
Milk replacer１：High fat：CP 24％，fat 25％；High protein：CP 30％，fat 18％．
Treatment２：Control：no fermented milk replacer；Fermented：fermented milk replacer was fed（1 L/day）．
ProcMixed test３：＊＊：ｐ＜0.01，＊：ｐ＜0.05，＋：ｐ＜0.1．
IS ％ ４ ： Relative intensity of the TMS derivatives against the internal standard （0.1 mg/ml of 2-isopropylmalic acid）,determinedby GC/MS.

© The Ito Foundation

422

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

高い傾向にあったことからルーメン絨毛の発達に生が抑えられ発育が向上６）したり，市販ヨーグルも関与する可能性が示唆された。子牛の発育に影トを添加した発酵初乳を代用乳に15％混合して給響するIGF-Ｉは試験区で高い傾向であった。血与することにより，下痢発症が極端に減少７）した

中IGF-Ｉ濃度は高栄養やアミノ酸投与により増りするとの報告がある。本試験では，代用乳の10大することから，発酵代用乳の給与により栄養状～15％程度を発酵代用乳に代替し，pH4.6程度の態が良好になるとともにアミノ酸吸収が促進され混合代用乳として給与したが，明瞭な下痢低減効てIGF-Ｉ濃度が高まったと考えられた。炎症性果を確認することはできなかった。しかし，発酵

サイトカインであるTNF-αは有意ではないもの

代用乳を給与することに血液中に次のような傾向の試験区で低い傾向にあり，IL-６は高タンパクがみられた。

代用乳の対照区で１頭，試験区で３頭が検出限界① 尿素態窒素，総コレステロール，トリグリ

以下であった。IFN-γとIL-４はほとんどの個体

セリドが高いことから，栄養状態は良好であで検出限界以下であった。免疫グロブリンや急性る。

期タンパク質（LBP，SAA，Hp）については個② 遊離アミノ酸やIGF-Ｉが高いことから，体差が大きく，処理区間の差は認められなかった（Table２）。

良好な発育が期待できる。
③ ３-ヒドロキシ酪酸が高いことから，ルーメン絨毛の発達が期待される。

Table３に糞の性状と腸内細菌叢の結果を示した。糞のpHはVFA含量と有意な負の相関（ｒ＝④ TNF-αやIL-６が低く肺炎や腸炎も少な－0.71）であり，有意ではないものの両代用乳とかったことから，腸内の感染防御機能の向上

も試験区においてVFA含量が少なくpHが高い傾による疾病低減が期待できる。

向であった。自然哺乳子牛の黒毛和種新生下痢の原因は，糞中乳酸濃度の増加とそれに伴うpH低下が一因であるが，発酵代用乳の給与により糞以上より，発酵代用乳の給与は哺乳子牛の発育向上に効果的である可能性が示唆された。

５）のpH低下に伴う下痢を低減できる可能性が示唆

約

４．要

さ れ た 。 腸 内 細 菌 叢 に つ い て は Clostridium

哺乳子牛の下痢は，肺炎の罹患と生育不足につ

subcluster XIVa（OTU517）の 割 合 の み 試 験 区

ながることが知られている。本研究では，哺乳子で有意に高かった。

牛の下痢低減による発育向上を目的として，菌体

人工哺乳期間中の供試牛の疾病罹患状況を

外 多 糖 の 産 生 能 の 高 い 乳 酸 菌 Lactobacillus

Table４に示した。高タンパク質代用乳では，試delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R- １ 株 を 代

験区において肺炎や腸炎に罹患する個体が少な

用乳に添加し，発酵させた発酵代用乳の給与効果

く，また，すべての個体で下痢を発症したが平均を検討した。下痢の低減効果は明瞭ではなかった

発症回数は対照区の約半分であった。一方，高脂が，発酵代用乳の給与により栄養状態の改善によ肪代用乳では，両区の疾病罹患頭数はほぼ同程度る発育の向上や，腸内の感染防御機能の向上によであったが，試験区において下痢の平均発症回数る疾病低減が期待されることが示唆された。

が多かった（Table３，Table４）。
全乳にクエン酸を添加してpH4.6とした酸性乳を子牛に給与することにより，哺乳中の下痢の発謝

辞本研究を進めるにあたり，発酵代用乳のEPS含© The Ito Foundation

423

哺乳子牛の下痢を低減する発酵代用乳の開発
Table 3 Feces components and intestinal flora.
Milk replacer１

High fatHigh protein

Treatment２

Control Fermented

Control Fermented

ｎ

4

4

4

4

6.90

7.29

7.16

7.38

（μmol/g）

107

79

105

88

Acetic acid

（％）

48.8

52.9

58.0

52.5

Propanoic acid

（％）

36.7

32.1

28.3

35.6

Isobutyric acid

（％）

1.9

2.2

1.7

1.8

Butyric acid

（％）

9.2

9.5

8.3

7.0

Isovaleric acid

（％）

2.5

2.6

2.1

2.2

Valeric acid

（％）

0.9

0.7

1.4

0.8

（μg/g）

97.6

125.9

352.1

193.1

pH
Total VFA

ProcMixed test３
Milk Treatment
replacer

Milk replacer
×
Treatment

VFA components

IgA
Intestinal flora

＊

OTU４

Bacteroidales

106 （％）

0.7

6.0

6.0

3.4

Clostridium cluster IX

110 （％）

1.8

0.3

0.0

1.6

Actinobacteria

124 （％）

0.4

0.5

0.7

1.9

Deltaproteobacteria

149 （％）

0.6

0.4

0.6

1.5

＋

Clostridium cluster IV

168 （％）

0.1

0.2

0.8

0.6

＊

Prevotella

317 （％）

8.5

9.3

6.1

11.5

Streptococcus

332 （％）

0.1

0.0

0.0

0.6

Clostridium cluster XI

338 （％）

0.6

0.1

1.4

0.2

None

359 （％）

0.8

12.7

2.8

1.5

Bacteroidales

366 （％）

8.0

7.7

6.6

8.8

Clostridium cluster IV

369 （％）

3.0

2.6

3.7

6.6

Bacteroides

469 （％）

24.5

22.8

25.1

18.7

Clostridium subcluster XIVa

494 （％）

3.4

2.6

1.9

2.5

Clostridium subcluster XIVa

505 （％）

0.6

0.9

0.7

0.7

Clostridium subcluster XIVa

517 （％）

1.0

1.8

0.7

4.2

Lactobacillales

520 （％）

0.1

0.0

0.2

0.1

None

643 （％）

0.0

0.3

0.3

0.4

Firmicutes

650 （％）

2.1

2.0

2.1

2.0

Betaproteobacteria

656 （％）

1.3

1.4

2.0

2.2

Lactobacillales

657 （％）

4.6

2.4

11.1

9.5

Clostridium cluster IV

749 （％）

10.6

9.7

8.4

5.6

Clostridium subcluster XIVa

754 （％）

0.7

1.4

0.1

0.2

None

772 （％）

0.4

0.3

0.0

0.4

None

853 （％）

1.7

1.9

2.1

2.1

Clostridium cluster IV

912 （％）

0.9

0.5

0.6

0.3

Clostridium cluster XI

919 （％）

2.0

1.1

1.3

1.8

Clostridium subcluster XIVa

940 （％）

6.2

4.3

4.7

4.7

Clostridium subcluster XIVa

955 （％）

10.3

3.8

6.4

3.1

None

968 （％）

2.0

1.2

1.0

1.5

None

985 （％）

0.5

0.2

0.6

0.1

Clostridium subcluster XIVa

990 （％）

2.6

1.6

1.8

1.8

＋
＋

＋

＊

＊

＋

Data are expressed as mean value（n＝4）．
Milk replacer１：High fat：CP 24％，fat 25％；High protein：CP 30％，fat 18％．
Treatment２：Control：no fermented milk replacer；Fermented：fermented milk replacer was fed（1 L/day）．
ProcMixed test３：＊＊：ｐ＜0.01，＊：ｐ＜0.05，＋：ｐ＜0.1．
OTU４：Operational taxonomic unit（base length peak detected by Nagashima procedure）．

© The Ito Foundation

424

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

Table 4 Type and frequency of contracted disease.
Milk replacer１

Higt fat

Treatment２

High protein

ControlｎFermented

Control

Fermented

4

4

4

4

Number３ Frequency４

Number３ Frequency４

Number３ Frequency４

Number３ Frequency４

Fever

2

1.5

3

1.0

3

2.0

1

1.0

Pneumonia

3

1.7

3

1.3

4

1.0

2

1.0

Enteritis

0

―

0

―

2

1.0

0

―

Diarrhea

4

1.8

4

2.8

4

3.3

4

1.8

Milk replacer１：High fat：CP 24％，fat 25％；High protein：CP 30％，fat 18％．
Treatment２：Control：no fermented milk replacer；Fermented：fermented milk replacer was fed（1 L/day）．
Number３：Number of contracted calves.
Frequency４：Average number of times on the contracted calves.

量，免疫および炎症関連項目，IGF-Ｉの分析に協力いただいた（株）明治所

研究本部乳酸菌研究

牧野聖也先生，（独）農研機構畜産研究部門
櫛引史郎先生，広島大学大学院生物圏科学研究科

杉野利久先生に感謝いたします。
文献１） 肉用子牛の取引頭数と価格，独立行政法人農畜産業振興機構HP，2018.
２） 平成27年度農業災害補償制度家畜共済統計表，農林水産省HP，2016.
３） 芝野健一，宇崎敬与，宮本孝明，三谷睦，山村佳宏，
森本啓介，佐野努：日齢体重が異なる黒毛和種子牛の血中アミノ酸濃度とアミノ酸製剤給与効果，家畜診療，59，685～696，2012．
４） 鈴田史子，横山竜太，山本和利，田中英隆，元村泰彦：肉用子牛を丈夫に育てる血中BHBを指標とした子牛の離乳時期と発育成績の検討，臨床獣医，25（7），24～28，2007．
５） 芝野健一，三輪岳宏：黒毛和種新生子牛における糞便中有機酸濃度の影響，家畜感染症学会誌，１，
19～23，2012．
６） 林田宏昭，成光昭男，伊東重雄：消化酵素剤添加
乳またはクエン酸添加乳の給与が乳用雌子牛に及ぼす効果，九州農業研究，59，1997．
７） 日下知加久，出石俊治：哺乳子牛における市販プ
レーンヨーグルト応用発酵乳の投与による下痢症予
防対策，家畜診療，45，541～545，1998．

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425

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ
保因牛における病態解析
Analysis for pathophysiology of heterozygous individual with cholesterol
deficiency in Holstein cattle

猪

熊

壽

（帯広畜産大学畜産学部）

Hisashi Inokuma（Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine）

This study was conducted to clarify the cholesterol level and clinical findings ofheterozygote calves with autosomal recessive cholesterol deficiency disorder, A total of 61
calves with mal-growth or weakness was divided into three groups-38 homozygotes, 8heterozygotes and 21 non-carrier（wild）base on polymerase chain reaction for the autosomal
recessive cholesterol deficiency disorder. The median values of serum total cholesterol（TC）
of homozygotes, heterozygotes and wild were 8.0, 36.0 and 47.0 mg/dl, respectively. TC level ofhomozygotes was significantly lower than those of heterozygotes and wild. TC level ofheterozygotes was lower than that of wild; however, the difference was not statisticallysignificant. One of eight heterozygotes calves, 91 days old, showed severe chronic diarrhea andvery low TC level of 11 mg/dl same as the level of homozygote calves. The heterozygote calf
also showed similar clinical and laboratory findings as homozygote calves, including systematic
muscular atrophy, facial change, diarrhea, microcytic hypochromic anemia and acanthocytosis.
These findings suggested that similar clinical findings as homozygotes can be expressed inheterozygote calves with autosomal recessive cholesterol deficiency disorder. It is possible thatthe heritance of this disease will be incomplete dominance instead of ʻrecessiveʼ.

１．目

Exon５への過剰な塩基挿入であり，遺伝様式は的

常染色体劣性遺伝とされている５，６）。本疾患遺伝

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症は子の始祖とされる種雄牛モーリンストームは生産

2015年に見出された新しい遺伝病で，罹患牛は著性が高く，その子孫の種雄牛は酪農家に人気があしい低コレステロール血症を呈して栄養不良に陥る。このため我が国のホルスタイン種におけるコ

り，６ヵ月以内に死亡する 。欧州で初発例が報

レステロール代謝異常症保因牛の頻度は比較的高告され ，その後2016年には日本でも確定診断さく，牛乳生産のみならず，国産牛肉の生産性にもれた発症牛が報告された３，４）。本症の原因はリポ大いに影響を与えている可能性がある。

１）２）タンパク質Apo B合成遺伝子の異常，すなわち本症が真に常染色体劣性遺伝疾患であれば，理© The Ito Foundation

426

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

論的にはホモ接合体だけが発症する。このため，の個体の割合をカイ２乗検定により比較した。

現在本病対策の基本は保因牛の摘発と交配計画にさらに，ヘテロ個体の臨床症状を観察するととよる発現リスクの低減が主である。実際，我が国もに，ホモ個体と同様の臨床症状を呈した１頭のでは平成29年３月からコレステロール代謝異常症

概要を記載した。

保因牛の精液は供給されていない。しかし，コレ
ステロール代謝異常症ヘテロ保因牛でも血清コレ３．結果と考察

ステロール濃度が低下しているという報告もあ3.1

り ，本症の遺伝様式については真に常染色体劣Menziらの方法によるPCRを用いてコレステ性なのかどうか明らかになっていない。ヘテロ保ロール代謝異常症の遺伝子診断を実施したとこ

因牛にもコレステロール代謝異常が発現するのでろ，61頭の供試牛はホモ32頭，ヘテロ８頭，ワイ

あれば，ホルスタイン種改良上および乳肉生産のルド21頭に分類された。

７）

ヘテロ接合体の血清コレステロール濃度障害となりうるが，その病態と発症機序には不明

各群のTC中央値はホモ群8.0mg/dl，ヘテロ群な点が多い。このため，本病ヘテロ保因牛にみら36.0mg/dl，ワイルド群47.0mg/dlであり，ホモ群れるコレステロール代謝異常の発現実態を把握すのTCは他の２群に比較して有意に低値であった

るとともに，発病機序を解明し，その対応策を提（p＜0.01，Fig.１）。いっぽう，ヘテロ群のTC値

案することが緊急の課題と考えられる。

はワイルド群と比較すると低い傾向を示したが，そこで，本研究ではコレステロール代謝異常症

有意差はなかった。

ヘテロ保因牛におけるコレステロールレベルと臨床症状発現の実態を把握し，生産性に及ぼす影響

120.0を考察することを目的とした。
法

本研究の対象牛は2007年４月から2018年１月までに発育不良，虚弱等を主訴として病性鑑定のため帯広畜産大学に搬入された１歳未満の牛で，病理解剖によっても形態的な先天異常や重度肺炎，

100.0

Total Cholesterol（mg/dL）

２．方

80.0
60.0
40.0
20.0

または腸炎等の明らかな原疾患が見出せなかった
61頭である。各症例からEDTAを抗凝固剤として0.0

採血した新鮮または保存血からDNAを抽出し，Menziらの方法によるpolymerase chain reaction（PCR）を用いて８），コレステロール代謝異常症についてホモ接合体（ホモ），ヘテロ接合体（ヘテロ）および非保因牛（ワイルド）に分類し，各群の血清コレステロール濃度（TC）を，マンホ
イットニーＵ検定を用いて比較した。また，各群のTC 20mg/dl未満を呈した個体と20mg/dl以上

Homo
HeteroWild（Ｎ＝32） （Ｎ＝８） （Ｎ＝21）

Fig. 1 Total cholesterol levels of 32 homozygotes（Homo）,

8 heterozygotes（Hetero）and 21 non-carrier（Wild）
calves with mal-growth or weakness. The data arerepresented by box-and-whisler diagram. The
median values of serum total cholesterol（TC）of
Homo, Hetero and Wild were 8.0, 36.0 and 47.0 mg/
dl, respectively. TC level of Homo was significantly
lower than those of Hetero and Wild. TC level ofHetero was lower than that of Wild; however, thedifference was not statistically significant.

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ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ保因牛における病態解析427

TC 20mg/dl未満と著しい低コレステロール血9mg/dlと顕著な低値を示したため，担当獣医師

症 を 示 し た 個 体 は ，ホ モ 群 で は 32 頭 す べ ては牛コレステロール代謝異常症を疑った。一般財（100.0％），ヘテロ群では８頭中２頭（25.0％），

団日本ホルスタイン登録協会の家畜改良データバ

ワイルド群では21頭中２頭（9.5％）であった。

ンク（http://www.rg.liaj.jp/hol/j1.do?fn=init）でホモ群のTC 20mg/dl未満を呈する個体の割合

血統情報を検索したところ，父牛は非保因牛では，他の２群に比べて有意に高かったが（p＜あったが，母牛は牛コレステロール代謝異常症保

0.01），ヘテロ群とワイルド群の間には有意差は因牛の可能性のあることが確認された。帯広畜産

認められなかった。

大学にてPCR検査によりヘテロ個体と診断された。

今回の検索ではヘテロ群のTC濃度はワイルド

症例は病性鑑定のため103日齢時に帯広畜産大群と比べて有意な差を認めなかったが，これら両学に搬入された。搬入時，症例は体温39.2℃，心群ではいずれも発育不良，虚弱等の臨床症状を呈拍数84回／分，呼吸数32回／分で，自力起立と歩する子牛を材料としている。このため，いずれの行可能であり，食欲もみられたが，削痩が顕著で子牛も栄養状態が悪く，コレステロール代謝異常

体格も小さかった（Fig.２）。全身の筋の萎縮，症以外の要因がヘテロ群およびワイルド群の低コ

後肢蹌踉，咬筋と側頭筋の萎縮による顔貌の変

レステロール状態に影響を及ぼしている可能性が化，眼球陥凹，四肢冷感および唾液粘液亢進がみ否定できない。Grossらは臨床上健常なヘテロ個られた。血液検査では小球性正色素性貧血がみら

体とワイルド個体のTCを比較して，ヘテロ群のれ，血液塗抹標本中に有棘赤血球が観察された。

TC（55±13）は，ワイルド群のTC（125±33）

搬入時の血液生化学検査でTC 11mg/dl，中性脂に比べて有意に低かったと報告している７）。ヘテ

肪濃度は３mg/dl未満であった。症例は104日齢

ロ個体の生産性について検討を行うためには，今に水様下痢を呈したが，糞便検査で寄生虫卵およ

後臨床上異常のない牛を用いてヘテロとワイルドの比較を行う必要があると考えられた。
3 . 2 ヘテロ接合体におけるコレステロール代
謝異常症発症
ヘテロ群８頭の主訴は体格小３頭，活気なし３
頭，下痢１頭，起立不能１頭であった。このうち，
難治性下痢を主訴とした１頭および起立不能を呈した１頭では著しい低TC値を示した（11.0および7.0mg/dl）。このTC値はホモ群のTC値とほとんど同じであった。これらのうち１頭について，
臨床経過および病理検索を詳細に観察することができたので，以下に概要を記載する。
当該ヘテロ症例は91日齢のホルスタイン種雌子
牛で，初診時に食欲不振と眼球陥凹，削痩および泥状便の排泄が認められた。感染性腸炎を疑って抗菌薬により治療されたが治癒しなかった。TC

Fig. 2 One of 8 heterozygotes calves, 91 days old,

showed severe chronic diarrhea and very low TC
level of 11 mg/dl same as the level of homozygote
calves. The heterozygote calf also showed similar
clinical and laboratory findings as homozygote
calves, including systematic muscular atrophy, facialchange, diarrhea, microcytic hypochromic anemia
and acanthocytosis.

© The Ito Foundation

428

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

びオーシストはみられなかった。また，末梢血をば，牛コレステロール代謝異常症も，不完全優性材料とした牛ウイルス性下痢ウイルス（bovine viralとなる可能性も考えられる８）。

diarrhea virus：BVDV）の reverse transcription-

現在，牛コレステロール代謝異常症のヘテロ個PCR検査も陰性であった。症例は105日齢に起立

体はキャリアとして広く生産活動に供されてお不能となり，予後不良と判断されて同日安楽殺さ

り，その症状発現の個体差は大きいものと考えられた（帯広畜産大学動物実験委員会承認番号28-33

れる。ヘテロ個体の生産性について今後検討する号）。

必要がある。また，牛コレステロール代謝異常症

病理解剖では，全身の筋の萎縮および脂肪織がは理論的には単一遺伝性疾患と考えられている少なく栄養状態の不良が認められた。病理組織所

が，コレステロール代謝に関わるAPOB以外の遺見では，消化管上皮細胞の壊死・剥離が散在性に伝子が関与している可能性も検討する必要がある

認められ，粘膜固有層では軽度の炎症細胞浸潤がと思われた。

観察された。
本症例はコレステロール代謝異常症ヘテロ個体

４．要約にも関わらず，慢性下痢，低コレステロール血症，

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘ

全身性の筋萎縮，貧血，有棘赤血球の出現といっ

テロ保因牛における病態を解析し，コレステロー

たホモ個体でみられる典型的な臨床徴候が認めらルレベルと臨床症状発現の実態を明らかにするたれた。子牛が慢性下痢，あるいは低コレステ

めに，発育不良，虚弱等を主訴とした子牛61頭をロール血症を呈し虚弱となる疾患の鑑別診断とし

ホモ38頭，ヘテロ８頭，ワイルド21頭に分類し，て，腸炎，吸収不良症候群，タンパク漏出性腸症，

その臨床病理学的所見を比較検討した。各群の血慢性膵炎などによる吸収不良，肝疾患または先天

清総コレステロール濃度（TC）の中央値は，ホ性門脈体循環シャントの存在によるコレステロー

モ 8.0mg/dl ， ヘ テ ロ 36.0mg/dl ， ワ イ ル ド 群

ル産生低下，あるいは甲状腺機能亢進症，悪性腫

47.0mg/dlであり，ホモ群のTCは他の２群に比較

瘍，脾腫や慢性炎症によるコレステロール異化亢

して有意に低値であったが，ヘテロ群のTC値は進があげられる。本症例では経過と臨床所見からワイルド群と比較すると低い傾向を示したものの寄生虫感染，コクシジウム感染またはBVDV感染

有意差を認めなかった。いっぽう，ヘテロ群のうによる腸炎も疑ったが，検査結果からは否定的で

ち１頭は，難治性下痢を呈した91日齢のホルスタあり，またその他の疾患についても臨床および病イン種雌子牛で，TC濃度はホモ群と同程度の著理学的検査から否定的であった。

しい低い値（11mg/dl）を呈した。本症例の臨床２，４）

牛コレステロール代謝異常症と類似のヒト疾患所見として，ホモと同様の全身筋萎縮，顔貌変化，に家族性低βリポタンパク血症があるが，これは下痢，小球性正色素性貧血および有棘赤血球がみ

低LDLコレステロール血症を認める常染色体優られた。これらの所見からヘテロ個体でも牛コレ性遺伝性疾患であり，その原因としてAPOB遺伝

ステロール代謝異常症ホモ個体と同様の病態が発

子変異が知られている。変異APOBにより短縮現する可能性が示唆された。本症の遺伝様式は

ApoBタンパク質が生成され，ホモ個体のみなら

ʻ劣性ʼではなく，不完全優性である可能性も考ずヘテロ個体も，低コレステロール血症を呈す

えられた。

る

。今後，本症例と同様の症例が蓄積されれ

９，10）© The Ito Foundation

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症ヘテロ保因牛における病態解析

謝辞本研究の遂行にあたり，貴重な症例をご紹介いただきました十勝NOSAI，NOSAIオホーツク，
NOSAIひがしの臨床獣医師各位，および症例の病理検索を担当いただいた帯広畜産大学，古林与吉安教授，堀内雅之助教，渡邉謙一特任助教に深謝いたします。
文献１） Kipp, S., Segelke, D., Schierenbeck, S.：Interbull，
49，49～53，2015．
２） Mock, T., Mehinagic, K., Menzi, F., Studer, E.,
Oevermann, A., Stoffel, M. H., Drogemuller, F.,
Meylan, M., Regenscheit, N.：J Vet Intern Med，30，
1369～1375，2016．
３） 鴇田直子，大脇茂雄，荻野敦，黒木一仁，堀内雅之，

429

猪熊壽：家畜診療，64，515～523，2017．
４） Inokuma, H., Horiuchi, N., Watanabe, K., et al.：Jpn J Vet Res，65，107～112，2017．
５） Kipp, S., Segelke, D., Schierenbeck, S., Reinhardt,
F., Reents, R., Wurmser, C., Pausch, H., Fries, R.,
Thaller, G., Tetens, J., Pott, J., Haas, D., Raddatz, B.
B., Hewicker-Trautwein, M., Proios, I., Schmicke, M.,
Grunberg, W.：J Dairy Sci，99，8915～8931，2016．
６） Schütz, E., Wehrhahn, C., Wanjek, M., Bortfeld, R.,
Wemheuer, W. E., Beck, J., Brenig, B.：PLoS One, 11,e0154602，2016．
７） Gross, J. J., Schwinn, A. C., Schmitz-Hsu, F., etal.：J Anim Sci，94，1761～1766，2016．
８） Menzi, F., Besuchet-Schmutz, N., Fragnière, M.：
Anim Genet，47，253～257，2016．
９） 石神眞人，山下静也，山村卓：低脂血症の病因，
診断，臨床化学，35，199～205，2006．
10） Hooper, A. J., Robertson, K., Champain, D., Hua, J.,
Song, S., Parhofer, K. G., Barrett, P. H. R., van
B o c k x m e e r , F . M . , B u r n e t t , J . R . ：C l i n i c a lBiochemistry，49，720～722，2016．

© The Ito Foundation

430

飼養環境下の牛群における新規「カビ毒（マイコトキシン）防除法」の検証―飼料へのフラクトオリゴ
糖添加が牛消化管バリア機能に与える臨床的評価
Monitoring natural feed contamination of mycotoxins in cattle herd and its
prevention-clinical evaluation of protecting effects of intestinal epithelial
integrity by supplemented fructo-oligosaccharides

髙

木

光

博・宇

野

誠

一＊

（山口大学共同獣医学部，＊鹿児島大学水産学部）

Mitsuhiro Takagi and Seiichi Uno＊
（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Yamaguchi University, ＊Faculty of Fisheries, Kagoshima University）

The objective of the present study was to evaluate the potential protective effects ofdifructose anhydride Ⅲ（DFAⅢ）supplementation in cattle feed using this urinary ZEN
monitoring system. DFA Ⅲ belongs to the group of small cyclic disaccharides used asprebiotics. It is also known to affect calcium homeostasis. Female Japanese Black cattle fromtwo fattening herds（Herd 1：n ＝ 10，Herd 2：n ＝ 20；age：9-10 months；mass：～ 300kg）
were used in this study. DFA Ⅲ（40 g/day；20 g top-dressed mornings and evenings）was
administered as a supplement to half of each herd for 2 weeks（Herd 1：n ＝ 5；Herd 2：n ＝10；DFAⅢ group）；the other cattle in each herd served as controls（Herd 1：n ＝ 5；Herd 2：
n ＝ 10）．Urine and blood samples were collected on the day before DFAⅢ supplementation（Day 0）, on Days 9 and 14 after supplementation, and again on Day 23（9 days after
supplementation ceased）. Zen concentrations in urine and its metabolites，α-zearalenol（α-ZOL）and β-ZOL, were measured using LC/MS/MS. Additionally, serum Ca, inorganic
phosphorus（iP）and Mg concentrations were measured, as DFAⅢ is known to affect theparacellular transport of calcium and also likely affects other bivalent ions through theintestinal epithelial cells barrier. The concentrations of ZEN in the mixture of roughage andconcentrates fed to the heifers was 0.27 mg/kg in Herd 1 and 0.22 mg/kg in Herd 2. Thesefindings confirmed that the ZEN contamination levels of the dietary feeds were at
approximately the same level in both herds and were below the threshold levels applied inJapan（< 1 mg/kg）. The urinary ZEN concentrations on Day 0 also revealed that each herd
had approximately the same level of ZEN contamination. When comparing the DFAⅢ andcontrol groups, significant differences（ p < 0.05）in ZEN were confirmed on Day 14（11.0 vs.
22.2 pg/mg of Creatinine）, in α-ZOL on Day 23（11.3 vs. 25.2 pg/mg of Crea）, in β-ZOL on
Day 14（8.6 vs. 25.4 pg/mg of Crea）and Day 23（12.7 vs. 34.3 pg/mg of Crea）, and in the ΣZEN（ZEN+β-ZOL+β-ZOL）on Day 9（11.6 vs. 38.3 pg/mg of Crea）and Day 14（31.0 vs.
63.9 pg/mg of Crea）, respectively. Moreover, although no differences were observed in either
serum Ca or Mg, the iP concentration in DFAⅢ -supplemented animals was significantly
higher than the control on Day 23（8.4 vs. 7.7 mg/dL）, suggesting a possible role of DFAⅢ intight-junction functions of intestine epithelial cells. These results suggest that the DFAⅢ
supplementation of dietary feed alters ZEN and ion adsorption levels in cattle. Our results
indicate for the first time that DFAⅢ supplementation may reduce the levels of mycotoxinsthat reach systemic circulation and are excreted in the urine. This preventive effect may be
associated with an improved tight junction-dependent intestinal barrier function.

© The Ito Foundation

飼養環境下の牛群における新規「カビ毒（マイコトキシン）防除法」の検証―飼料へのフラクトオリゴ糖添加が牛消化管バリア機能に与える臨床的評価

１．目

的

２．方

申請者らはこれまでに，Fusarium属真菌由来

2.1

431

法

黒毛和種牛群の概要とサンプリング法

マイコトキシン（MT）で，エストロジェン類似

黒毛和種肥育雌の２牛群（牛群１および２）を作用を持つことから家畜に繁殖障害などを引き起本実験に供した。両牛群ともに自家産粗飼料と購こす可能性が示唆されるゼアラレノン（ZEN）

入濃厚飼料が給与されており，試験開始前にLC/に着目し，実際に腸管から吸収されたMTレベル

MS/MS法による飼料中ZEN濃度分析を行った。

が反映される尿中ZEN（代謝物を含む）濃度測

２牛群から①無処置対照群15頭，②FOS添加群15定系を構築するとともに，本測定系はMT吸着剤

頭の計30頭を使用した。FOS添加は朝夕の給餌時

添加効果の客観的評価法としてきわめて有用であに 飼 料 に 添 加 し ，添 加 試 験 期 間 は Akbari らることを初めて報告している１～３）。飼料へのMT

４）（2015）のFOSに関する報告，および申請者らの吸着剤添加は，生産現場において実践可能な唯一

これまでのMT吸着剤添加試験結果を参照して２のMT防除法とされているが，我々の研究成果か週間とし，添加試験開始時（Day 0）と添加開始

らその効果はMTの種類や汚染レベル，吸着剤の９日目（Day 9），14日目（Day 14），および添加

添加方法などにより大きく影響を受けることを明

休 止 後 ９ 日 目 の 23 日 目（Day 23）に 陰 部 マ ッらかにしており，実際の添加効果はいまだ不明でサージ法にて尿サンプリングを行った。

ある。

2.2

最近，実験動物を用いたMT汚染飼料へのフラ
クトオリゴ糖（FOS）添加試験から，タイトジャ

飼料中ZEN濃度測定

３）
Fushimi ら（2014）の 報 告 に 従 い ，LC/MS/

MS法による公定法を用いて測定を行った。

ンクション（TJ）の「消化管バリア」機能増強

2.3による腸管からのMT吸収阻害効果が報告され尿サンプルの調整は我々の既報１）に従い，βた ４）。一 方 ，我 々 は す で に 子 牛 に 対 す る FOS-Glucuronidase/arylsulfatase 添 加 に よ る 前 処 理（Difructose anhydride Ⅲ）添加による消化管かを行った尿サンプルを固相抽出後にLC/MS/MSらの初乳中IgG吸収増強作用 ，および胃腸炎発

測定に供した。結果はZENとその代謝物α-およ症低減効果

びβ-ゼアラレノール（α-ZOLおよびβ-ZOL）

５）を報告している。したがって，我々６）の尿中MT濃度測定系を用いて飼料へのFOS添加

尿中ZEN濃度測定

濃度を測定した。

によるMT吸収低減効果が確認されれば，MT対

2.4

策がきわめて困難な生産現場での新規MT防除法

DFAⅢ添加による腸管TJ機能をモニターするとしてただちに臨床応用可能であり，世界的にもために，我々の既報に従って血清生化学検査を重要な科学的発見となることが期待できる。以上行った（使用器機：Labospect 7180 autoanalyzer,のことから，本申請課題においては，実験動物に

７）
Hitachi）。測定項目はカルシウム（Ca），マグ

おいて確認されたFOS添加による「TJの消化管

ネシウム（Mg），無機リン（iP）の各項目の測定

バリア」機能増強作用の有無を牛群において初めを行った。

て客観的に評価することを目的とする。

2.5

血清生化学検査

各成績の取りまとめ

尿中ZEN，α-ZOL，β-ZOLおよびそれらの合計値（ΣZEN）濃度，各血清生化学検査項目© The Ito Foundation

432

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

濃度は平均±SDで算出した。各項目について＜0.05），それらは２群間の飼料中ZENの吸収量

FOS 添 加 群 と 対 照 群 の ２ 群 間 で の 比 較 検 討 をの差を反映するものと推測された。なお，ZEN行った。

ではDay 14，α-ZOLではDay 23，β-ZOLでは
Day 9，Day 14およびDay 23においてコントロー

３．結果と考察

ル群がFOS添加群よりも有意に高い濃度となっ本試験では２牛群の15頭ずつからデータを得た（Fig.１）。

た。両牛群の飼料中ZEN濃度はそれぞれ0.27mg/

一方，血清生化学検査についてはCa，Mgにおkg（牛群１），0.22mg/kg（牛群２）とほぼ同値

ける２群間の差は確認できなかった。しかしiPにを示した。また，いずれのZEN濃度も日本で定おいては有意な差が認められ，Day 23においてめられている基準値（＜１mg/kg）を下回って

FOS 添 加 群 が 対 象 群 よ り も 有 意 に 高 い 濃 度 といたことから，本実験を行った両牛群において日なった（ p ＜0.05）（Fig.２）。これはDFAⅢ添加

常的に給餌されている飼料のZEN浸潤はきわめが腸管表面のTJバリア機能に何らかの影響を与て低いものであることが判明した。

えた結果を反映するものであると思われた。

２群間で比較を行った結果，尿中濃度はZEN，

ZENは雌性動物に繁殖障害を引き起こす可能

α-ZOL，β-ZOL，ΣZENのいずれにおいても性があるMTである。家畜生産において繁殖サイ

対照群がFOS添加群よりも有意に高くなり（ pクルが正常に営まれないことは経営状態を悪化さ

Control

ZEN

100

60

80

pg/mg Creapg/mg Crea

80

＊

40

＊

60
40
20

20
0

0

Day 9

Day 14

β‒ZOL

100
80

Day 23

＊
＊

60

＊

40

Day 0

Day 9

Day 14

Day 23ΣZEN

200

pg/mg Crea

Day 0pg/mg Crea

α‒ZOL

100

DFAⅢ

＊

150

＊

100
50

20
0

0

Day 0

Day 9

Day 14

Day 23

Day 0

Day 9

Day 14

Day 23Fig. 1 Results for the analysis of urinary concentrations of ZEN，α-ZOL，β-ZOL, and total ZEN（ΣZEN；ZEN+α-ZOL+

β -ZOL）during the experimental period, with or without DFA Ⅲ supplementation. ＊：Significant difference（p ＜0.05）between DFAⅢ and control group.

© The Ito Foundation

飼養環境下の牛群における新規「カビ毒（マイコトキシン）防除法」の検証―飼料へのフラクトオリゴ糖添加が牛消化管バリア機能に与える臨床的評価

iP
9.50
9.00

Control

我々はこれまでに尿中ZENやその代謝物の濃度

DFAⅢ

測定系を構築し，これにより牛群のMT浸潤状況＊＊

やMT吸着剤の添加効果を客観的に評価すること

8.50

mg/dl

433

8.00

が可能であることを報告している。DFAⅢは消

7.50
7.00

化酵素に対して難消化性のオリゴ糖であり，下部

6.50
6.00

消化管に未消化の状態で到達して腸内微生物に

5.50

Day 0

Day 9

Day 23

Day 14

よって分解利用されることでこれら微生物の増殖
や，微生物が分解することで生じる揮発性脂肪酸
が腸内を酸性化することでミネラルのイオン化をCa促進し，結果ミネラルの吸収量を増加させる効果

9.90をもたらすことが報告されている。さらに，ラッ

9.70

mg/dl

9.50

トの消化管や牛の十二指腸においてDFAⅢが腸

9.30
9.10

管のTJに作用してCa吸収能が上昇されることも8.90

報告されている ８～10）。本研究結果から，飼料中

8.70
8.50

Day 0

Day 9

Day 14

Day 23ZEN濃度は低いものの，飼料へのDFAⅢ添加により，尿中ZENおよびその代謝物濃度が低下す
ること，すなわち腸管からのZEN吸収が低下す

Mg

ることが明らかとなった。腸管からのZEN吸収

2.50
2.40

低下については，DFAⅢ添加により腸管TJの消

mg/dl

2.30
2.20

化管バリア機能が増強され，その結果として尿中

2.10ZEN濃度が低下した可能性，あるいは，DFAⅢ

2.00
1.90

添加により腸内有用微生物が増加し，良好な腸内

1.80
1.70

Day 0

Day 9

Day 23

Day 14

Fig. 2 Results for the concentration ofserum Ca, Mg, andiP during the experimental period.
：Significant
difference（p＜0.05）between DFAⅢ and control
group.
＊＊

細菌叢が維持されたことで腸管上皮細胞の細胞表面が安定したことによる腸管TJの消化管バリア機能の増強などが考えられる。今後は試験牛群数を増やして，その効果のさらに詳細な検証を行うとともに，DFAⅢの添加量や飼料への添加方法などもあわせて検証して，臨床応用に向けたデー

せる重要な要因となりうる。繁殖牛のエサである
粗飼料は管理が不十分なためにMTに汚染されている場合が多く，そのような飼料を摂取しZEN

タベースの拡充をはかる必要がある。
４．要

約やそのほか複数のMTに暴露されることで飼養環

黒毛和種肥育雌牛群におけるDFAⅢ添加によ境下にある牛群の繁殖性に多大なる影響が及ぶ危るMT吸収阻害効果を検証することを目的とし，険性がある。そのため，MT吸着剤の添加が生産

飼料へのDFAⅢ添加後の尿中ZENやその代謝物

現場では以前より実施されているが，その効果検

濃度の測定を行い，あわせてイオン吸収能の変化

証については十分になされているとはいえない。

を確認するために血清中イオン濃度の測定を行っ© The Ito Foundation

434

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

た。比較はDFAⅢ添加群と対象群各15頭ずつの２群間で，DFAⅢの添加は２週間継続し，朝と夕方の２回とした。Day ０（実験開始日），Day 9，Day 14 お よ び Day 23 に そ れ ぞ れ 採 尿 と 採 血 を行った。尿サンプルはLC/MS/MS法により尿中
ZEN，α-ZOLおよびβ-ZOL濃度の測定を行い，血清サンプルはCa，Mg，iP濃度の測定を行った。
その結果，DFAⅢ添加群において尿中ZEN，α-ZOL，β-ZOL濃度は対照群と比較して有意に低くなり，Day 23においてiP濃度が有意に高くなった。本研究結果から，飼料へのDFAⅢ添加により，尿中ZENおよびその代謝物濃度が低下する
こと，すなわち腸管からのZEN吸収が低下する
ことが明らかとなり，それはDFAⅢ添加により腸管タイトジャンクションの消化管バリア機能増強による腸管からのMT吸収阻害効果による可能性が示された。
文献１） Takagi, M., Uno, S., Kokushi, E., Shiga, S., Mukai,S., Kuriyagawa, T., Takagaki, K., Hasunuma, H.,
Matsumoto, D., Okamoto, K., Shahada, F., Chenga, T.,
Deguchi E., Fink-Gremmels J. ： J. Anim. Sci ，89 ，287～296，2011．
２） Hasunuma, H., Takagi, M., Kawamura, O.,
Taniguchi, C., Nakamura, M., Chuma, T., Uno, S.,
Kokushi, E., Matsumoto, D., Tshering, C., Deguchi, E.,
Fink-Gremmels, J.：J Anim Sci，90，1610～1616，
2012．
３） Fushimi, Y., Takagi, M., Hasunuma, H., Uno, S.,
Kokushi, E., Watanabe, U., Liu, J., Marey, M.,
Miyamoto, A., Otoi, T., Deguchi, E., Fink-Gremmels,
J.：World Mycotoxin J，7，367～378，2014．
４） Akbari P., Braber, S., Alizadeh, A., Verheijden, K.
A., Schoterman, M. H., Kraneveld, A. D., Garssen, J.,
Fink-Gremmels, J.：J Nutr，29，1604～1613，2015．
５） Matsumoto, D., Takagi, M., Hasunuma, H.,
Fushimi, Y., Ohtani, M., Sato, T., Okamoto, K.,
Shahada, F., Tanaka, T., Deguchi, E.：Asian
Australasian J Anim Sci，22，1640～1647，2009．
６） Takagi, M., Hasunuma, H., Matsumoto, D., Obi, T.,
Takase, K., Ohtani, M., Sato, T., Watanabe, U.,
Okamoto, K., Tanaka, T., Tshering, C., Deguchi E.：
Anim Nutri Feed Technol，11，147～158，2011．
７） Watanabe, U., Takagi, M., Yamato, O., Otoi, T.,
Tshering, C., Okamoto, K.：J Vet Med Sci，75，481～
487，2013．
８） Suzuki, T., Hara, H., Kasai, T., Tomita, F. ： Biosci
Biotechnol Biochem，62，837～841，1998．
９） Mineo, H., Hara, H., Shigematsu, N., Okuhara, Y.,
Tomita, F.：J Nutrition，132，3394～3399，2002．
10） Teramura, M., Wynn, S., Reshalaitihan, M.,
Kyuno, W., Sato T., Ohtani, M., Kawashima, C.,
Hanada, M.：J Dairy Sci，98，1～10，2015．

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435

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の抑制と機能性家畜飼料への応用
Bactericidal effect of multi-drug resistance bacteria using lactic acid bacteria
and development of functional domestic animal fodder

木下
本田

英樹・原口
憲昭・森川

梨花・山中
充実・金子

猛・服部
博・中野

法文・神鷹
佑志・浦部

孝至・實田
一浩・石田

正博・
光晴＊

（東海大学農学部，＊宮城大学食産業学群）

Hideki Kinoshita, Rinka Haraguchi, Takeshi Yamanaka, Norifumi Hattori, Takashi Kotaka, Masahiro Saneda,
Kensho Honda, Atsumi Morikawa, Hiroshi Kaneko, Yushi Nakano, Kazuhiro Urabe and Mitsuharu Ishida＊（School of Agriculture, Tokai University, ＊School of Food, Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

The bactericidal effect of multi-drug resistance bacteria and meat quality improving
effects by the administration of lactic acid bacteria to swine were tested in this study. Yogurt
made from 10％ skim milk by Lactococcus lactis MBR916 which is bacteriocin（Bac916）
producer was administered for 27 days. The weight gains were 21.0 kg in the control groupand 22.2 kg in the administration group, however, the feed demand rates were 3.47 and 3.64
during the administration period, respectively.
The total number of bacteria in the control group gradually increased whereas thenumber of bacteria were maintained during the administration period in the administrationgroup. The colistin-resistant bacteria also increased in the control group on day 27, whereas
the increase was remarkably suppressed in the administration group. It suggests the effect oflactic acid and the Bac916. In the microbiota analysis, the proportion of phylum Firmicutes
decreased in the administration group compared to the control group, and the proportion ofphylum Bacteroidetes increased. It suggested that Firmicutes which is gram positive bacteria
were killed by the Bac916．
In the meat quality analysis of the rib-eye, there was no significant difference in fatty acidcomposition whereas bitter amino acids were lower in the administration group. In the analysis
with a taste sensor, the acidity was lower in the administration group, however, it was thoughtthat the difference can not be felt. In the palatability test, although the meat color was judged
to be pale, terms of richness, flavor, and overall taste in the administration group were higher
than the control group.
Thus, administration of yogurt containing the Bac916 bacteriocin made from Lactococcus
lactis MBR 916 affects the porcine microbiota, and improves their meat quality.

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436

平成29年度

１．目

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

broth（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）に的植菌し24時間培養した。その後，２％摂取で同培

現在，複数の抗菌薬が効かなくなった多剤耐性菌が出現し，ヒトへの感染とその拡大が問題となっている。抗菌薬の開発と耐性菌の出現は

１，２）地，同条件にて２度継代培養した。MBR916株は30℃で，JCM1002株は37℃で培養した。
2.2

豚への投与飼料の検討

イタチごっこの様相を呈しているが，新しい抗菌

オートクレーブ殺菌したMRS broth，10％スキ薬が作られるとすぐに耐性菌が出現するため，新ムミルク，豆乳，10％米糠水を乳酸菌用の培地と薬の開発は遅れを取っている。そこで我々は，乳して用いた。MRS brothで継代培養したMBR916

酸菌のバクテリオシンにより多剤耐性菌が殺菌で株を２％摂取で各培地に接種し，30℃で18時間培きないかと考え，900菌株以上の乳酸菌からバク養した。培養後，0.22µmフィルターに通し濾液

テリオシン産生株をスクリーニングし，バクテリオを得た。本濾液を抗菌活性試験に供しバクテリオ

シンによる多剤耐性菌の殺菌が可能であることをシン産生性を試験した。

明らかにした 。特にLactococcus lactis MBR916

2.3（以下，MBR916株）のバクテリオシン（以下，

抗菌活性値の測定は，ペニシリンカップ法５）にBac916）は多くの多剤耐性菌に有効で，耐熱性より行った。JCM1002株を混合した寒天平板上に優れ，中性領域でも抗菌活性を示し，アクチにペニシリンカップを静置し，２ｎ倍ずつ希釈しナーゼＥに対して高い耐性を有することが明らかた濾液100µｌを添加し，37℃で一晩培養後，生になり，非常に有用なバクテリオシンであること

育阻止円の有無を測定した。阻止円が形成されるが示された３）。また，予備検討では糞便にBac916

最大希釈倍率を上清100µｌ当たりの抗菌活性値を混ぜた場合，耐性菌数の減少が見られた。しか（A.U./100µｌ）とした。

３）

抗菌活性試験

しながら，実際に豚に投与した場合どのようにな

2.4

豚への投与試験るのかを検証する必要があった。

東 海 大 学 農 学 部 付 属 農 場 に お い て ，バ ー ク

多剤耐性菌の対策は急務であるもののそれを普シャー種４頭を対照区２頭，投与区２頭に分けて及させるには経済的なメリットがないとなかなか肥育した。肥育後期に対照区は混合飼料（くみあ難しいと考えられる。乳酸菌には肉質改善効果がい配合飼料くまもとC-EX，ジェイエイ北九州く

報告されており ，同様の効果が見られれば普及

みあい飼料，福岡）を2.7kg/日，乳酸菌投与区はに繋がっていくと考えた。そこで，本研究では混合飼料に加え，乳酸菌を用いた２％ペプトン添

MBR916株を豚に投与し，豚糞便中の多剤耐性菌

加スキムミルク培地で培養したヨーグルトをの殺菌効果と肉質への影響について検討した。

0.3kg/日投与し，と殺まで27日間肥育した。ヨー

４）

２．方
2.1

グルト投与前（０日目），投与16日目および27日

法

目の糞便を回収し，薬剤耐性菌の測定と菌叢解析に用いた。また，体重を測定し飼料要求率を算出

使用菌株と培養条件

豚への投与試験では，MBR916株 を用いた。抗した。さらに，と殺後のロース芯の肉質の測定と菌活性試験の指標菌には，Lactobacillus delbrueckii

食味試験を行った。なお，本試験は東海大学動物

subsp. bulgaricus JCM1002Ｔ（以下，JCM1002株）

実験委員会で承認を得た後，適切な動物実験倫理を用いた。－80℃で保存されていた菌株をMRS規定等に則って実施した。

３）© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の抑制と機能性家畜飼料への応用

2.5

豚糞便における菌数測定

437た。解凍５日目のロース芯を３mmにスライスし，凍結保存していた豚の糞便サンプル１ｇを９３cm×３cmに成形した。80℃のお湯で１分間加mLの滅菌ペプトン水に懸濁し，10－１サンプルと熱し，対照区の豚肉を基準として比較し評価しした。段階希釈により10 サンプルまで希釈し，た。評価には食べる前に判断する項目として香希釈液１mlをシャーレに添加し，GAM寒天培地

り，肉色，食べてから判断する項目としてやわら（日水製薬株式会社，東京）を流し込みよく撹拌

かさ（食べ始め），やわらかさ（数回噛んだ後），して固めた。37℃で48時間嫌気培養し生菌数を求ジューシー感（多汁性），肉の甘味，肉様の味（コめた。また，硫酸コリスチン（８µg/ml）添加培ク），風味（香りを含む味の総評）の程度，風味

地でも同様に試験した。

（香りを含む味の総合）の好ましさ，脂っぽさ，

－10

2.6

総合的なおいしさの11項目について評価した。試

豚糞便の菌叢解析

上記菌数変化測定サンプルの投与前（０日目），
投与16日目，27日目の対照区および試験区のサン
プルをそれぞれ１ｇ採取し，ただちに－80℃にて
凍 結 し た 。 凍 結 し た サ ン プ ル を Novogene

験結果は５点法により点数化し，その平均値を求めた。
３．結果と考察

Corporation（Beijing, China）に依頼し，次世代各種培地でのバクテリオシン産生について試験

シーケンサーによる16S rDNAのＶ３-Ｖ４領域

したところ，MRS brothおよび10％スキムミルクの配列解析により菌叢解析を行った。

培地では16A.U./100µｌと抗菌活性が見られたこ

2.7とからバクテリオシンが産生されていることが示

肉質の測定

肉質はロース芯（第４～５胸椎）を用い全脂質唆された。一方，豆乳および糠培地では菌は生育含量測定（解凍１日目），脂肪酸分析（解凍１日

しているものの抗菌活性は見られなかった。そこ目），肉色測定（解凍１日目と５日目），ドリップ

で本試験では10％スキムミルク培地でヨーグルト

ロス（解凍５日目），クッキングロス（解凍１日を作製し豚に投与することとした。なお，発酵性

目 の サ ン プ ル を 80 ℃ で 30 分 間 加 熱）
，テ ク スを高めるために２％ペプトンをスキムミルクに混チャー試験（解凍５日目），遊離アミノ酸分析

ぜてから発酵させた。
ヨーグルトは混合飼料の上に添加する形で投与（解凍５日目）にて評価した。
2.8

したが，嗜好性は非常に高いと考えられた。水分

味覚認識装置による分析

解凍５日目にロース芯10ｇを精秤し，15％エタを多く含むためか，通常飼料だけと比較して食べノール溶液を50ml加え，ホモジナイザーで２分

終わる時間も短かった。また，投与期間中，下痢

間均質化した。これを3,000rpm，15分間遠心分や体調不調などの症状は観察されず安全性も特に離し，メスフラスコへ濾過した。残渣に75％エタ

問 題 な い と 考 え ら れ た 。増 体 重 は 対 照 区 でノール溶液を30ml加え，同様に遠心分離して濾

21.0kg，投与区で22.2kgで投与区の方が多かった

過し，15％エタノールで100mlに定容し試料溶液

が（Fig.１），投与期間中の飼料要求率は3.47およとした。本溶液を味認識装置（インテリジェント

び3.64と投与区の方が高くなった。これは投与しセンサーテクノロジー社，神奈川）にて分析した。

たヨーグルト量（300g/day）のためであると考2.9

え ら れ る が ，日 本 飼 養 標 準 の 肥 育 期（70 ～食味試験

嗜好型パネルとして学生６名をパネラーとし115kg）の飼料要求率は3.61であり，またスキム© The Ito Foundation

438

平成29年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

140

体重（Kg）

120
100
80
60
40
20
0

0

7

16

20

27

Days（日数））Fig. 1 Changing body weight during the administration period.
●：control group，■：administration group

生菌数（CFU/g）

1.40E+10

0 day

1.20E+10

16 days

27 days

1.00E+10
8.00E+09
6.00E+09
4.00E+09
2.00E+09
0.00E+00

未添加

硫酸コリスチン

未添加

対照区

硫酸コリスチン投与区

Fig. 2 Changing bacterial counts in the porcine feces during the administration period. Data shows bacterial counts（CFU）per one gram on GAM agar contain 8µg/ml colistin sulfate or not.

ミルクは単価もそれほど高くないため，特に問題となる値ではないと考えられた。

果であると考えられた。
Fig.３には菌叢解析の結果を示した。対照区，

糞便中の総生菌数とコリスチン耐性菌数を測定

投与区ともにFirmicutes門の割合が半数以上を占した結果をFig.２に示した。対照区の総菌数は時めており，次いでBacteroidetes門の割合が多かっ

間経過とともに増加したが，投与区では投与期間た。この２門で全体の９割以上を占めていた。対中同じ菌数で推移した。また，コリスチン耐性菌

照区と比較して投与区はFirmicutes門が割合がも対照区の16日目以外は同様の結果であった。特減って，Bacteroidetes門の割合が増えていた。投に投与27日目の対照区では総菌数の増加とともに与したヨーグルト中に含まれているバクテリオシ

コリスチン耐性菌も増加していた。一方で，ヨーンは類縁菌に作用する性質があるため，グラム陽グルト投与区ではその増加が顕著に抑えられてい性菌であるFirmicutes門の細菌が減った可能性がたことから，乳酸やBac916バクテリオシンの効考えられた。また，Firmicutes門の減少に伴い© The Ito Foundation

439

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の抑制と機能性家畜飼料への応用

Relative Abundance

1

OthersFibrobacteres
Verrucomicrobia
Euryarchaeota
Tenericutes
Cyanobacteria
Actinobacteria
Proteobacteria
Spirochaetes
Bacteroidetes
Firmicutes

0.75

0.5

0.25

3
N
O

LA

O
C

Group Name

C

B3

2
N

B2
LA

1
N
O
C

LA

B1

0

Fig. 3 Species relative abundance in phylum. The top ten species in the different taxonomic ranks were selected toform the distribution histogram of relative abundance. “Others” represents a total relative abundance of the rest
phylum besides the top 10 phylum. LAB means the administration group, and CON means the control group. The
numbers（1, 2 and 3）after the letters（LAB and CON）indicate 0, 16 and 27 days, respectively.

Bacteroidetes門の細菌が増えたと考えられた。糞た。今後は，大腸菌等の病原性に関連する菌のコ

便 に お け る Bacteroidetes 門 の 主 要 な 属 はリスチン耐性を試験する必要がある。

Bacteroides属である。Bacteroides属は稀に日和

ロース芯の肉質分析では，全脂質含量は対照区

見感染を引き起こすが，腸内細菌叢を構成する優2.43％，投与区2.54％となり投与区がやや高かっ

勢菌の１つであり，健康な場合では特に問題ない

たが，ロース芯の脂肪酸組成および筋肉間脂肪，細菌である。また，Bacteroides属は小腸パイエ

皮下脂肪内層，皮下脂肪外層の脂肪酸組成に大きル板細胞に対するIgA産生誘導能がLactobacillus

な差はなかった。遊離アミノ酸は，投与区の方が属乳酸菌よりも強いとする報告もあり ，腸管免やや低かった（Fig.４）。保水性とテクスチャー

疫において重要な働きをしている可能性が指摘さ試験では差がなかったが，肉色は１日目の赤色とれている。このことから，本ヨーグルト投与は，黄色が投与区で低かった。味認識装置による分析

免疫賦活化効果も期待できる可能性が考えられる

では，苦味雑味，渋味刺激，旨味，塩味，苦味，が，こちらについてはさらなる検証が必要であ

渋味，旨味コクではほとんど差がなかったもののる。また，Bacteroides属はコリスチン耐性を持

酸味については対照区が3.85，投与区が2.98となつことが知られている。本試験では，GAM寒天り，投与区の方が酸味が低いという結果となった培地に生育した糞便中のほとんどの菌がコリスチ（Fig. 5a）。しかしながら，本装置では１未満の差

ン耐性を示したが（Fig.２），グラム陽性菌であではヒトが違いを感じることが難しいとされているFirmicutes門とBacteroides属が優勢菌種である

るため，いずれの味覚認識においてもヒトが違いためそのような結果となった可能性が示唆されを感じるほどの差ではないと考えられた。食味試

６）© The Ito Foundation

440

平成29年度(a)

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.36）

遊離アミノ酸含量（μmol/g）

1.5

対照区

投与区

1.0

0.5

0.0

ン 酸 ン ン 酸 ン ン ン ン ン ン ン ン ン ン ン ン ン
リ ン ニ リ ン ミ シ ニ リ ニ シ シ シ ニ ニ ジ ジ ニ
ウ ギ オ セ ミ タ リ ラ バ オ イ イ ロ ラ ラ チ リ ギ
タ ラ レ
タ ル グ アチ ロ ロ チ ア ア ス
ル
メ ソ
ル β ヒ
ル グ
ア
パ ス
イ
グ
ニ
ス
ェ
ア
フ
アミノ酸名

遊離アミノ酸含量（μmol/g）

(b)
対照区

投与区

2.0

1.0

0.0

うま味系アミノ酸

甘味系アミノ酸

苦味系アミノ酸

Fig. 4 Free amino acid contents of the rib-eye of the pork. Individual（a）and systematic（b）

data of free amino acids were shown.

験では，肉色が淡いと判断され，肉様の味（コク），風味（香りを含む味の総合）の程度，風味４．要

約（香りを含む味の総合）の好ましさ，総合的なお本試験では豚への乳酸菌投与による多剤耐性菌

いしさの項目で投与区が高く評価された（Fig.

の殺菌効果と食肉改善効果を試験した。投与サン5b）。これらの結果から乳酸菌投与豚は消費者に

プルは抗菌活性が見られた10％スキムミルク培地

好まれる豚肉の生産ができる可能性が示唆されで作製したヨーグルトを用いることとした。増体た。腸内細菌叢が肉質に及ぼす影響は今後さらに

重は対照区で21.0kg，投与区で22.2kgと投与区の解明が必要だろう。

方が多かったが，投与期間中の飼料要求率は3.47
および3.64と投与区の方が高くなった。対照区の© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の抑制と機能性家畜飼料への応用

(a)
旨味コク

渋味

4
3
2
1
0
-1
-2

441

酸やBac916バクテリオシンの効果であると考え酸味られた。菌叢解析では，対照区と比較して投与区
苦味雑味

はFirmicutes門の割合が減って，Bacteroidetes門の割合が増えていた。これはバクテリオシンによ渋味刺激りグラム陽性菌であるFirmicutes門の細菌が殺菌されたためである可能性が考えられた。
ロース芯の肉質分析では脂肪酸組成に大きな差苦味はなかった。苦味系アミノ酸が投与区においてや

旨味や低い結果となった。味覚認識装置での分析で

塩味

対照区

は，酸味が投与区の方が低かったが，いずれの味覚認識においてもヒトが違いを感じるほどの差で投与区はないと考えられた。しかしながら，食味試験で(b)

5

総合的なおいしさ

は，肉色が淡いと判断されたものの，コク，風味，

香り

4
3

脂っぽさ

総合的なおいしさの項目で投与区が高く評価され肉色た。これらのことからBac916を含むMBR916株でやわらかさ１

2

え，肉質改善効果が期待できる。

1

風味２

やわらかさ２
ジューシー感（多汁感）

風味１
肉様の味（コク）対照区作製したヨーグルトの投与は，菌叢に影響を与

肉の甘味
投与区

Fig. 5 Comparison of the pork taste between the control

and administration groups.
（a）Analysis using a taste sensor,（b）Palatability
testby six panelists.

総菌数は時間経過とともに増加したが，投与区では投与期間中同じ菌数で推移した。また，特に投与27日目の対照区では総菌数の増加とともにコリ
スチン耐性菌も増加していた。一方で，投与区で文
献１） Tsuji, A., Kobayashi, I., Oguri, T., Inoue, M.,
Yabuuchi, E., Goto, S. ： J Infect Chemother ，11 ，64～70，2005．
２） Hirakata, Y., Yamaguchi, T., Nakano, M.,
Izumikawa, K., Mine, M., Aoki, S., Kondoh, A.,
Matsuda, J., Hirayama, M., Yanagihara, K., Miyazaki,Y., Tomono, K., Yamada, Y., Kamihira, S., Kohno, S.：
Clin Infect Dis，37，26～32，2003．
３） 石川潤一，木下英樹，菰田俊一，須田義人，石田
光晴：Milk Sci.，65，179～190，2016．
４） Suda, Y., Villena, J., Takahashi, Y., Hosoya, S.,
Tomosada, Y., Tsukida, K., Shimazu, T., Aso, H.,
Tohno, M., Ishida, M., Makino, S., Ikegami, S.,
Kitazawa, H.：BMC Immunol，15，24，2014．
５） Cholden, L. S. ： J. Bacteriol. ， 47 ， 402 ～ 403 ，
1944．
６） 細野朗：バクテロイデスと免疫，腸内細菌学雑誌，
27，203～209，2013．

はその増加が顕著に抑えられていたことから，乳© The Ito Foundation

平成29年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食肉に関する研究または調査（製造加工，食品的価値，家畜生産，飼料，疾病，食肉・食肉製品の流
通など）
単位：千円
研
Ⅰ

究

課

継続
年数

題

代

表

代表者名

研

究

者

所属機関

助成金額

食肉の品質，加工分野

薬剤耐性菌のガスプラズマ殺菌効果とメカニズム解析

作道章一

琉球大学医学部

1,000

地鶏肉の美味しさの決定要因の解明

本田和久

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

市販食肉より分離されたリステリアのストレス応答に
関する研究

落合

由嗣

日 本 獣 医 生 命科 学 大 学1,000

食品加工機器の信頼性と安全性向上のための基礎的研
究

小茂鳥

潤

慶 應 義 塾 大 学
理 工 学 部 機 械
工
学
科

1,000

食肉の高品位熟成に寄与する可食性蓄熱マイクロカプ
セルの開発

小林

敬

京都大学大学院
農 学 研 究 科
食品生物科学専攻

1,000

根岸

晴夫

中 部 大 学応 用 生 物 学 部

1,000

オリーブ葉抽出液が食肉タンパク質の加熱ゲル物性および嗜好性に及ぼす影響小川雅廣

香川大学農学部

1,000

食肉加工品のコク味増強を可能とするグルタチオンア
ナログの発酵生産法の開発伊藤智和

名古屋大学大学院
生命農学研究科

1,100

滝田

禎亮

京都大学大学院
農 学 研 究 科

1,200

ポークソーセージのコクの形成における香気成分と脂
質の役割

西村

敏英

女 子 栄 養 大 学
栄 養 学 部

1,000

ドライエイジング牛肉に特徴的な香気成分に関する研
究

河原

聡

宮崎大学農学部

1,000

山之上

稔

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅲ）

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変（Ⅱ）

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価（Ⅱ）

H.27～

H.28～

H.28～

© The Ito Foundation

Ⅱ

食肉の食品的価値

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの
影響（Ⅱ）

吉田

由香

食 肉 科 学 技 術
研
究
所

1,100

霜降り豚肉の香味に寄与する因子に関する研究松石昌典

日本獣医生命科学
大学応用生命科学部

1,000

加熱肉に生じる赤色に対するカルノシンの影響

中村幸信

食 肉 科 学 技 術
研
究
所

1,000

長岡

利

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,000

食肉タンパク質の抗肥満および脂質代謝促進効果に関
する研究

若松

純一

北 海 道 大 学
北方生物圏フィールド科学センター

1,000

肥満に伴うサルコペニア発症予防に対するカルノシン
摂取の有用性後藤孔郎

大分大学医学部

1,100

野生動物肉の食料資源としての利用に関する研究：生
理活性機能の検討

坂田亮一

麻布大学獣医学部

1,000

機能性畜産副生成物を用いた糖尿病合併高血圧症の改善を目指した開発研究吉川豊

神 戸 女 子 大 学
健 康 福 祉 学 部

1,000

食肉を中心とする食品由来核酸の腸管保護機能の解析河合慶親

徳島大学大学院
医歯薬学研究部

1,100

低温乳酸発酵ならびに超高温加熱処理を施した筋原線
維タンパク質モデル系におけるタンパク質分解と機能性発現に関する研究林利哉

名城大学農学部

900

牛経済形質に関わる新規DNA多型の探索松本大和

東海大学農学部
応用動物科学科

1,000

リキッドバイオプシーによる非侵襲的牛体外受精胚の遺伝子スクリーニング

杉村智史

東京農工大学大学
院グローバルイノ
ベーション研究院

900

肉用鶏の筋芽細胞を用いた食肉の特性評価に資する遺
伝子の探索

高谷

智英

信州大学農学部

900

笹﨑

晋史

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

地鶏の行動的ストレス反応性に関与する遺伝的多型の
探索

青谷

大希

秋田県畜産試験場

1,500

黒毛和種肥育牛の肥育状態を生体評価する血中バイオマーカーの開発

松橋珠子

近畿大学先端技術
総 合 研 究 所

1,300

選抜した黒毛和牛精子の受精能評価飯田弘

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,000

牛における卵管上皮細胞を用いた新規精子受精能獲得
能評価法の開発および性選別精子の受精能獲得能機能
評価

栁川洋二郎

北海道大学大学院
獣 医 学 院

1,000

長期不受胎牛の受胎率向上に向けた単為発生胚移植の効果

白砂

東 京 農 業 大 学
農学部 家畜学科

1,000

牛心臓由来新規脂質代謝改善ジペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研
究

Ⅲ

Ⅳ

H.28～

H.26～

遺伝育種分野繁殖分野

県集団における和牛肉の美味しさに関わる遺伝子マー
カーの効果検証

H.28～© The Ito Foundation

孔明

抗酸化物質添加による牛凍結精液の品質向上効果の解
明

武田久美子

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,000

肥育前雌牛における卵子の能力不足を解消する培養技
術の開発

平尾

雄二

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,000

近赤外光照射による牛凍結胚の品質改善効果に関する
研究

横尾

正樹

秋 田 県 立 大 学
生物資源科学部

1,000

胚ゲノム活性化および胚盤胞形成時期における新規代
謝プロセスに基づく牛体外受精胚の体外培養法の改善

山田雅保

京 都 大 学農 学 研 究 科

900

｢豚の一腹産子数を一頭増やす｣ 子宮の免疫調節を担う精漿タンパクの特定

奥山みなみ

大分大学医学部
医
学
科

1,000

星野

由美

広島大学大学院
生物圏科学研究科

900

小林

仁

宮 城 大 学
食 産 業 学 群

1,000

乳牛の卵胞嚢腫における副腎由来ホルモンの関与と卵胞嚢腫共存卵胞由来の卵母細胞の正常性

清水隆

帯 広 畜 産 大 学
生 命・食 料 科 学
研 究 部 門1,000

子宮内膜炎罹患牛における特異的脂質メディエーター
の同定と新規高感度診断法の開発

大澤健司

宮崎大学農学部
獣 医 学 科1,000

新規DNAメチル化網羅探索法を用いた牛の精液性状の評価法開発山崎淳平

北海道大学大学院
獣 医 学 研 究 院

1,000

牛肉の生産性向上に資する安全なマダニ・マダニ媒介
感染症防除法の開発

八田岳士

北里大学医学部

1,000

牛胸腺器官培養法の確立

脇谷晶一

宮崎大学農学部

1,000

卵巣の鉄不足に起因した豚における繁殖障害の解明と診断法の確立山下泰尚

県 立 広 島 大 学
生 命 環 境 学 部

1,000

松鵜

彩

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,000

鶏における家畜関連黄色ブドウ球菌の病原遺伝子および病態形成の解析

小野久弥

北里大学獣医学部

1,000

鶏肉フードチェーンにおけるカンピロバクターと共存する細菌の網羅的な挙動解析

黒木香澄

東京大学大学院
農 学 生 命 科 学
研
究
科

1,000

野生動物が保菌する腸管出血性大腸菌の特徴解析とリ
スク評価

井口

純

宮崎大学農学部

900

農場で発生する腸炎にカラス由来のウエルシュ菌はどのように関与しているか？―MLST法による遺伝学的解析での検討―

上塚浩司

茨城大学農学部

1,000

肺エコーとプロカルシトニン値を用いた牛の非定型肺炎と細菌性肺炎の簡易迅速鑑別診断システム

鈴木一由

酪 農 学 園 大 学
獣 医 学 群1,000

鼻咽腔におけるPRRSおよび豚インフルエンザウイル
ス感染症の病態解析平井卓哉

宮崎大学農学部

900

感染性A型インフルエンザウイルスの迅速検出系の確
立

小澤

真

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,000

Ⅴ

動物衛生分野

牛精液および受精卵の未凍結保存に向けた過冷却促進物質の配合デザイン
アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響（Ⅱ）

鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルス耐性機構の解明：感染細胞における初期応答の品種間比較

H.28～

H.28～

© The Ito Foundation

肉用牛生産におけるアシドーシス予防をめざしたルー
メン内乳酸代謝性細菌群の特定

福間直希

帯 広 畜 産 大 学

500

食肉家畜における原虫感染症の血清診断法の開発と血清疫学的研究西川義文

帯 広 畜 産 大 学
原 虫 病 研 究
セ ン タ ー

1,000

心臓あるいは横隔膜を用いたオーエスキー病ウイルス
抗体検査法の確立

前田健

山 口 大 学 共 同
獣 医 学 部

1,000

産業動物の粘膜関連リンパ組織の探索―より効果的なワクチン接種部位を求めて―市居修北海道大学大学院
獣 医 学 研 究 院

1,000

杉浦

勝明

東京大学大学院
農 学 生 命 科 学
研
究
科

900

初乳に含まれる抗菌因子の機能を利用した子牛の下痢
症予防

磯部

直樹

広島大学大学院
生物圏科学研究科

1,000

周産期乳牛における潜在性第一胃アシドーシスの発症
予知と制御

佐藤

繁

岩手大学農学部

1,300

離乳子豚への飼料用米給与が飼養成績およびタンパク質（アミノ酸）代謝に及ぼす影響高田良三

新潟大学農学部900

黒毛和種仔牛の免疫能を高める機能性飼料の探索

米倉真一

信州大学農学部

700

産褥牛に起きる急性肝ストレス亢進と肝ビタミンE体
内動態関連遺伝子発現抑制に対するRhizopus oryzae
水抽出物給与の予防効果に関する研究芳賀聡

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,100

守谷

直子

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,200

ビタミンA強化代用乳が黒毛和種子牛の哺育・育成期
における生育へ及ぼす影響小野晴美

福 岡 県 農 林 業
総 合 試 験 場

1,000

子牛の強健性と発育能力を高める初期栄養強化プログ
ラムの開発

松崎

正敏

弘 前 大 学
農学生命科学部

1,200

佐藤

勝祥

秋 田 県 立 大 学
生物資源科学部

1,400

神戸

大朋

京都大学大学院
生命科学研究科

1,200

元気

宮崎大学農学部
附属フィールド
科 学 教 育 研 究
セ ン タ ー

1,000

乳牛における高糖分イネWCS（ホールクロップサイ
レージ）多給による高繁殖型飼養管理システムの確立

山口昇一郎

福 岡 県 農 林 業
総 合 試 験 場

1,000

ルーメンアシドーシス防除を目指した新規ルーメン幹細胞培養モデルの開発鈴木裕

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,400

哺乳子牛の下痢を低減する発酵代用乳の開発

庄司

則章

山 形 県 立農 林 大 学 校

1,000

ホルスタイン種のコレステロール代謝異常症へテロ保因牛における病態解析

猪熊壽

帯 広 畜 産 大 学
畜 産 学 部

800

飼養環境下の牛群における新規「カビ毒（マイコトキシン）防除法｣ の検証―飼料へのフラクトオリゴ糖添
加が牛消化管バリア機能に与える臨床的評価髙木光博

山 口 大 学
共 同 獣 医 学 部

700Ⅵ

家畜飼養，飼料分野

畜産分野における抗菌剤使用量削減に有効な手段の探索に関する研究（Ⅱ）―動物用抗菌剤使用量と農場バ
イオセキュリティ水準および適正飼養因子との関連―

Lactococcus属乳酸菌を用いて調製した発酵乳給与が離乳子豚の飼料摂取量および増体成績を改善する要因の解明

骨格筋の成長と筋線維型決定におけるストレス応答ホ
ルモンの影響

H.28～

H.28～

H.28～

亜鉛トランスポーターに着目した亜鉛栄養改善飼料の開発
西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発（Ⅱ）

H.28～© The Ito Foundation石垣乳酸菌を用いた多剤耐性菌の抑制と機能性家畜飼料へ
の応用
合

計

H.26～

74件

木下

英樹

東海大学農学部

1,000
75,000© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞© The Ito Foundation

451

須

田

義

人

宮城大学食産業学部ファームビジネス学科

教授〔業績の課題名〕

黒毛和種ゲノム DNA メチル化多型と肉質形質との関係に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
黒毛和種の脂肪交雑などの遺伝率は約 60％と高く，効果の大きい遺伝子の存在が期待されるが，関連遺伝子数が膨大で絞り込みは困難を極めている。さらに，その他の経済形質に関する塩基配列多型情報の寄与も数％であり，より効果的な育種改良のためには環境効果を考慮した方法を検討する必要がある。遺伝子発現を制御する領域の DNA メチル化は，環境に応じて変化し遺伝子発現量を制御する。須
田氏はこれまで親子の２種雄牛の産子由来ゲノム DNA を供し，ヒトのメチル化促進領域である 34 領域を選択してメチル化度（メチル化割合）を調査した。そして枝肉成績との相関解析を行った結果，親子の種雄牛産子のメチル化割合は類似傾向にあること，特に CHFR（checkpoint with forkhead andring finger domain）や ASS1（Argininosuccinatesynthase）遺伝子の上流 CpG 領域におけるメチル化
割合と BMS や格付けとは有意な相関を認め，Ａ３ランク以下はＡ５に比べ有意にメチル化割合の高いことを明らかにした。DNA メチル化は飼養状況に起因する可能性があり，生産段階での仕上がりをモニターするバイオメーカーとして利用できる可能性を示唆する成果をあげている。
須田氏は，前述に加えて以下の様な研究成果をあげている。
１．牛の生理遺伝的指標の探索
牛の代謝成分や生理活性物質の血中動態に関する遺伝性を推定し，経済形質との相関性が高いことを明らかにし，血液成分の遺伝的改良マーカーとしての有用性を提示した。
２．モデル動物を用いた蓄積体脂肪における脂肪酸組成の遺伝的評価
モデル動物を供し，肉の脂質性状に影響するとされる脂肪酸組成に関する遺伝性を評価し，脂質化学的な遺伝的改良の可能性を報告した。これは国内で最も早く報告された先駆的な成果といえる。
３．反芻家畜の妊娠着床機構に関する研究（早期妊娠診断法の開発と免疫寛容物質の探索）
哺乳類の妊娠着床に伴う子宮内膜における特異的な妊娠関連因子の同定を共同で行い報告した。現在は受胎率向上を目指し免疫寛容因子を探索している。また，反芻動物の早期妊娠診断法として血中アミノ酸濃度変化をモニターし，多変量解析法で判別する方法を考案した。
４．豚の腸管フローラ制御による免疫能賦活化に関する研究
豚の慢性疾患を予防し生産性を高める目的で，機能性乳酸菌を探索・開発し，産肉性や免疫能への効
果と腸内フローラとの関係性を検討した結果，腸管免疫能を賦活化して抗病性を高め，肉質と共に産肉性を高めることを報告した。これらは，国際的に使用禁止されている抗菌剤の代替物開発に貢献する。
上記の研究成果は，牛や豚の健康を保ち，良肉質の生産効率を高めることに貢献することが期待される。

© The Ito Foundation

452

河

原

聡

宮崎大学農学部応用生物科学科

教授〔業績の課題名〕

食肉脂質の食品栄養学的再評価に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
食肉や食肉製品の食味性は，共存する脂肪の量に依存して向上する。一方で，飽和脂肪酸に富む動物
性脂肪の過剰摂取は肥満や脂質異常症の原因となるため，摂取量を抑制することが推奨されている。食
肉の食味性と健康上のリスクとのバランスに関する知見を得ることは，食生活の質を高める上で重要である。そこで河原氏は牛肉脂肪（牛脂）の健康リスクについての再評価ならびに動物性脂肪の含量と食味性についての評価を行った。
同氏は，牛脂および植物油を 12 ～ 22％添加した飼料を 28 日間ラットに摂食させた。22％牛脂を摂食したラットの血清脂肪濃度は，同レベルの植物油を摂取したラットより有意に高くなるが，牛脂の飼料添加量が 12％の場合，血清脂質濃度は植物油と同程度の値であることを認めた。また，牛脂を摂取したラットの肝臓脂質濃度および多価不飽和脂肪酸の組成は植物油摂取ラットのそれより低くなり，牛脂摂取ラット肝臓の脂肪酸化度は植物油摂取ラットのそれよりも低くなることを明らかにした。
一方，牛脂を添加した食肉製品（牛肉パテ）の食味性について検討し，牛脂添加量が 10％から 20％のときに最も食味性を呈し，その食味性は植物油を同レベル添加したものより優れていること，そして最も食味性を高める脂肪酸成分はパルミチン酸であることを明らかにした。また，ソーセージの場合には，牛脂や豚脂を 10％添加したものの食味性が最も高いことを示し，食肉製品については 10％から15％程度の脂肪量で十分に食味性を引き出せると結論した。
また同氏は，反芻動物に由来する肉や乳に含有される機能性脂肪酸に関する研究を行った。抗発がん作用を持つことで注目されている共役リノール酸（CLA）に着目し，牛脂は効率の良い CLA 補給源であり，食餌から吸収された CLA は中性脂質画分に優先的に蓄積されること，CLA の摂取により筋肉組
織中の不飽和脂肪酸含量が低下し，組織の脂質酸化が抑制されることなどを明らかにした。さらに，糖尿病の予防効果に対する期待から近年注目されているフィタン酸が免疫系に及ぼす影響を検討し，ヒト
血中に見出される濃度域においてフィタン酸が免疫系細胞の活性を抑制する可能性を見出した。

© The Ito Foundation

学会等事業助成© The Ito Foundation

455

日本食肉研究会の平成 29 年度事業助成実施報告
日本食肉研究会会長

根岸晴夫（中部大学応用生物学部）

１．はじめに
標記の事業の項目として，（公財）伊藤記念財団から今回助成を受けたのは（１）海外派遣事業の補助（国際食肉科学会議派遣），（２）国内における研究会でのセミナーの補助の２項目である。
（１）の助成は昨年８月に実施され，今年３月に行った（２）の項目まで，実施内容の概要を順次報告
するが，この助成を受けた団体である「日本食肉研究会」の概要について以下に報告する。
２．日本食肉研究会等の概要
本会は昭和34年（1959年）４月に発足し，食肉に関する分野について広く学界，業界，団体関係者がお互いの研鑽の場として，学術と産業の発展を目指し，活動を行ってきた。
本会では毎年，研究会大会（学術講演会）の開催，ならびに会誌として「食肉の科学」を発行している（平成３年に「肉の科学」を改称）。研究会は通常，日本畜産学会大会の開催に合わせて春に実施され，食肉および食肉加工に関連する分野のエキスパートによる特別講演，ならびに会員による研究発表を行い，活発な意見交換がなされている。「食肉の科学」の主な内容として，総説，解説，海外事情，
最近の文献紹介，研究会の発表要旨などが満載されている。
設立40周年の1999年に横浜で第45回国際食肉科学技術会議（International Congress of Meat Scienceand Technology，通称ICoMST）を開催し，会員相互一体となって運営を行った経緯がある。この国
際会議は毎夏に欧州と他の国々で交互に開催されている。その各国代表者会議での話し合いで，2022年（第68回）にわが国で再び開催する運びとなり，このICoMSTの成功に向けて国内受入組織である本研究会の果たす役割は大きい。
なお本年２月時点で，正会員170名（うち学生会員４名），特別会員30社，名誉会員９名，賛助会員７社である。
３．今回の助成結果（１）海外派遣事業の補助
国際食肉科学技術会議派遣助成として，第63回会議に本会から会員２名が参加した。このICoMST（International Congress of Meat Science and Technologの略称）は毎年８月中旬に開催され，本会からは，会長，副会長あるいは常任幹事の中から１名を派遣し，代表者会議に出席し，会議報告を研究会
機関誌の「食肉の科学」に掲載し内容を会員に周知することが研究会の中で義務づけられている。今年は８月13日（日）～18日（金）にコーク（アイルランド）で開催され（写真１），本助成により，松石昌典会員（日本獣医生命科学大学応用生命科学部）と坂田亮一会員（麻布大学獣医学部）が参加した。
コークはアイルランドの南部に位置し，首都ダブリンについで２番目に大きな都市である。会議全体
はよく組織され，登録時に配布されたプログラム（写真１）も内容が充実していた。日本からは，上記© The Ito Foundation

456
２名以外に農研機構畜産研究部門から，渡邊源哉氏が参加した。この会議の詳細は，食肉の科学（2017年２号）にその３名で報告した１）ので，参照されたい。今回開催地が日本からは遠かったせいか，日本の参加者が例年より少なかったが，デスクを会場に設置し，2022年日本開催のPRに３名が務めた（写真２）。
前回の本事業助成報告２）にも記載したが，2022年の第68回ICoMST開催準備のための情報収集，ならびに情宣活動を行う
ために，本研究会では準備委員会を立ち上げ，開催地を神戸国際会議場に決定している。今回の伊藤記念財団からの派遣助成により参加者は積極的に海外の研究者との学術交流を行い，日本での会議参加のアピールを大いに実施できた。
今年のICoMSTはオーストラリアのメルボルンで８月12日～
17日に開催された。わが国ではお盆の時期であるが４年後のわ

写真１ 今年の会議のプログラム，会議登録デスクで配布。

が国での開催を見据え，日本から多くの参加者があった。
（２）国内における研究会でのセミナーの補助「国際的な食肉研究のトップランナーを海外から招聘し，討論重視型の食肉ワークショップを開催するために，昨年度から外国人研究者を日本食肉研究会大会に招き，財団から助成を受
けこの事業を行っている。第１回目は，昨年３月30日に神戸大学国際文化学部で開催された第58回日本食肉研究会大会の中で特 別 講 演 と し て ド イ ツ か ら Prof. Schwägele（Max-RubnerInstitute, Kulmbach副所長）を招き，食肉中の微量残留物質の基準と分析法の話題を中心にセミナーを実施した２）。
この講演で，欧州の中心としてドイツが発信する研究情報の影響力と指導力を，日本の研究者にも知らせる機会となった。
今回は，日本畜産学会第124回大会に引き続き，東京大学農学部 本郷キャンパスで第59回日本食肉研究会大会にて，トルコ共和国からDr. Abdulatef Ahhmed（Y1ld1z Technical University
准教授）を招き，「Accreditation of Halal meat products and thediversity of their protein properties」の演題で，ハラルと畜の科学的検証について，また食肉としての機能性について特別講演が行われた。続いて，韓国のDr. Seon-Tea Joo（Gyeongsang National
University教授）により，「Health implication of consuming highly
marbled Hanwoo beef」の演題で，韓牛の肉質について講演があり，その脂肪酸組成から機能性に富む肉であることが示され© The Ito Foundation

写真２ 上：日本開催ＰＲポスター，

下：会場の一角に設置した日本コーナーのデスク。

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写真３ 質問に回答するDr. Ahhmed。

写真４ 韓牛の肉質について，熱弁をふるうJoo教授。

た。会場からも和牛との比較についてなど，活発な討論が行われた。
４．おわりに
伊藤記念財団からの学会・研究会など学術集団への活動助成は今年で２回目となり，私ども招く側も前回の経験で順調に招聘を実施することができた。
日本食肉研究会大会の席上，英語の講演であったが，通訳を入れる必要はなく，演者と参加者でのコ
ミュニケーションは十分図られたと判断する。この招聘の人選は今回も国際食肉科学技術会議で各国からの研究者が集うことを利用した。その前年にアイルランドでの会議で特別講演を行い，その講演内容とパフォーマンスで場内を沸かせたDr. Jooと交渉し，快諾を得た。本人は2010年のICoMST韓国開催時の組織委員会キーパーソンでもあり，2022年の日本開催のためのアドバイスを聞くことができた。また，
Dr. Ahhmedも2013年トルコで開催されたICoMSTのScientific committeeのメンバーで，招待講演者の選出などの担当経験があり，日本での留学経験があることから（鹿児島・宮崎大学連合大学院で学位取得），日本語も流暢で，今後より多くの情報の提供が期待できる。
参考資料
１） 松石昌典・渡邊源哉・坂田亮一：海外事情「第63回国際食肉科学技術会議に出席して」食肉の科学，VOL.58,
No.２，178～178，2017．
２） 根岸晴夫：日本食肉研究会への平成28年度事業助成実施報告，平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，
VOL.35，438～439，2017．

© The Ito Foundation

458「食肉の安全性に関する公開シンポジウム」―食肉に由来する感染症とその予防―に関する開催報告
公益社団法人日本獣医学会

代表理事

久和

茂（東京大学）〔日時〕平成29年９月15日（金）９：00－12：00〔場所〕国立大学法人鹿児島大学

農・獣医共通棟101講義室

本シンポジウムは，食肉に関連する食中毒や人の食肉由来感染症についての理解を深めるために，第160回日本獣医学会学術集会の期間中に下記のような内容で開催した。一般市民が自由に参加できるよ
うに参加費無料の公開シンポジウムとして開催し，100名以上が参加した。以下，本シンポジウムのプ
ログラムと各講演の概要を報告する。
〔プログラム〕
座長：関崎勉（東京大学・食の安全研究センター）

１．「サルモネラ食中毒の現状と対策」：岡村雅史（北里大学獣医学部人獣共通感染症学研究室）
２．「カンピロバクター食中毒とその制御」：三澤尚明（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）
３．「腸管出血性大腸菌感染症」：楠本正博（農研機構動物衛生研究部門）
４．「わが国における食肉由来寄生虫症」：丸山治彦（宮崎大学医学部寄生虫学分野）
５．「野生動物におけるＥ型肝炎ウイルス感染」：萩原克郎（酪農学園大学獣医学群）〔講演内容〕
１．「サルモネラ食中毒の現状と対策」
サルモネラ食中毒に対する問題意識は薄れつつあるようにみえるが，2011年に３人がサルモネラ食中毒により死亡しており，軽視できる状況にはない。さらに，欧州諸国を中心に，ブロイラーにおけるサルモネラに関するリスク評価が実施され，サルモネラ食中毒は生産，処理・加工，および消費を含むフードチェーン全体に存在することが示された。消費段階では，調理時の二次汚染のみならず，食肉の新鮮度と微生物学的清浄度の混同，無防備な生食の拡大も問題と考えられ，消費者への教育と啓発が不可欠である。
２．「カンピロバクター食中毒とその制御」
カンピロバクターによる食中毒事例の疫学調査から，感染源として，特に注意が必要な食品は鶏肉とその関連調理食品である。効果的なと体の殺菌方法はいまだ確立されていないのが現状で，カンピロバ
クターを含む食鳥肉由来の病原微生物の汚染を防止するためには，すべてのフードチェーンの過程においてHACCP方式に基づいた衛生管理によるリスク低減に努める必要がある。
３．「腸管出血性大腸菌感染症」
腸管出血性大腸菌（EHEC）による感染症は，血様下痢と激しい腹痛を主症状とする出血性大腸炎を引き起こすが，きわめて少ない菌量で感染が成立し，溶血性尿毒症症候群（HUS）や脳症等の生死に関わる重篤な合併症を数％の頻度で引き起こすことがある。腸管出血性大腸菌（EHEC）は主に食中毒© The Ito Foundation

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として飲食物を介して感染し，その感染源は食肉，野菜，果物，生牛乳，飲料水等，多岐にわたる。特に本菌を保有する健康な牛を起点とする食品汚染が社会において深刻な問題となり，腸管出血性大腸菌
感染症の流行を防止するためには，より効果的な様々な防疫体制が重要である。
４．「わが国における食肉由来寄生虫症」
食肉の摂取によって感染する寄生虫疾患のうち，国内で毎年一定数以上の患者が発生している疾患には，肺吸虫症と動物由来の回虫類による幼虫移行症がある。肺吸虫は国内では古くから猪の肉からの感染がよく知られているが，日本鹿の筋肉からも肺吸虫の生きた幼虫が検出されている。鹿肉関連の肺吸虫症例は岐阜県と大分県等，比較的狭い地域に集中していたことから，凍結せずに消費する「地産地消」
が感染のリスクを高めていることが考えられている。一方，回虫症は各種の回虫に感染した犬，猫，あるいは豚から排出された虫卵を直接口にするか，あるいはこれらの寄生虫に感染した動物の筋肉を加熱
不十分なまま摂取することで発生する。患者は中高年男性が多く，牛肉または牛の肝臓の生食歴が目立
ち，さらに最近では海外で牛肉や肝臓を食して感染したと考えられる症例が発生しており，啓発活動の重要性を浮き彫りにする事例となってきている。
５．「野生動物におけるＥ型肝炎ウイルス感染」
鹿や猪等の野生動物の肉を食材にする「ジビエ」を提供するレストランが増えてきている。過去，狩猟者人ロの減少と野生動物の保護政策が効果的に進められた背景もあり，鹿や猪等の個体数が全国的に増加し，農作物被害の増加が問題となってきている。それに対応して，狩猟による農作物被害の抑制を目的とし，地域振興と野生鳥獣を廃棄せずに流通させる活動が活発になってきた。ジビエには人に感染する寄生虫や細菌のみならず，Ｅ型肝炎を発症するウイルスが存在し，狩猟者や調理者が食肉として利用するための安全な処理・調理方法が必要になってきている。

© The Ito Foundation食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

平成29年度（Vol. 36）
2018年11月

発行

編集・発行 ― 公益財団法人伊藤記念財団
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