平成23年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 30

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査。

⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成。

⑶

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報。
（事業実績）
回
第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30

年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,000

研究調査委託５件 18,097千円
４
12,064７
17,000９
18,100８
11,681
２
5,151
２
2,764
３
1,900
１
500
１
2,000
２
5,000
２
4,000
３
4,000
２
2,500
４
7,000
３
5,500
３
6,500
２
5,000
２
16,000
１
9,720
０
０
０
０
０
０
０
０
０
０

© The Ito Foundation

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、本年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，本年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で31年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第30回（平成23年度）助成事業における12件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
平成24年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.30 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2012
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

目

次

亜鉛欠乏予防効果を持つ食肉成分の探索とその効果についての食品科学的研究神戸

大朋（京都大学大学院生命科学研究科）

1

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についての研究（Ⅲ）
六車

三治男・久保田



大樹・河原

聡
7

（宮崎大学農学部）

畜産副生物由来（ヘム鉄）摂取によるスポーツ栄養への効果についての研究―栄養摂取状況の観察による貧血改善の試み―
松本

恵・鈴木

淳也・勝又



美紀＊・長谷川強＊・野口智博（日本大学文理学部体育学科，＊ILS株式会社）19

低温乳酸発酵による食肉タンパク質の組織構造と加熱ゲル物性に関する研究
芳賀


聖一・林

利哉

（名城大学農学部）

28

糖修飾 LEA タンパク質の利用を基盤とする食肉の新しい凍害防御技術の確立
本城

賢一・井倉



則之・野間

誠司

（九州大学大学院農学研究院）

35

粉末茶による食肉および食肉製品中の糞便系大腸菌群の制御についての研究岡崎貴世（四国大学生活科学部）

42

新規発光デバイスを用いた食肉の質を落とさない殺菌法の開発
高橋


章・芥川

正武・馬渡

一諭・下畑

隆明

（徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部）

48

食肉製品の調理中に起こるメイラード反応の消長と安全性の検討
大塚


譲１・山口

敬子２・能見祐理１（１お茶の水女子大学生活環境教育研究センター，２日本女子大学家政学部食物学科）

54

試食パネルによる黒毛和種牛肉の脂肪酸組成，香気成分，呈味成分と食味性との関連に関する研究鈴木啓一１・横田祥子１・塩浦	 山田

宏陽１・飯田信一３・佐久間文子２・弘典３（１東北大学大学院農学研究科，２日本女子大学，３家畜改良センター）© The Ito Foundation

61

ii
牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究
山之上

稔・矢野

恵子・上田

修司・井原



一高・豊田

淨彦

（神戸大学大学院農学研究科）

68

食肉のきめに対する迅速かつ客観的な評価手法の研究
入江正和（宮崎大学農学部）

戸澤

あきつ・佐藤76

最高級豚肉を目指した生産方式の解明
衆介（東北大学大学院農学研究科）© The Ito Foundation

83

iii

CONTENTS
Prevention against zinc deficiency by the use of meat component（s）increasing
zinc absorption in the intestinal epithelial cells
Taiho Kambe（Graduate School of Biostudies, Kyoto University）

1

Functional components sourced from bovine, porcine and poultry：Comparative study
on bioactive peptides.（Ⅲ）
Michio Muguruma, Daiki Kubota and Satoshi Kawahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

7

Effect of sports-nutrition-supports by intake of heme-iron on women athlete．
―Trial of the anemia improvement by the observation of the nutrition consumption―
Megumi Matsumoto, Junya Suzuki, Miki Katsumata ＊ , Tsuyoshi Hasegawa ＊，Tomohiro Noguchi（Nihon University, College of Human and Sciences, ＊ ILS Inc.） 

19Changes in the heat-induced gel structure and physical properties of muscle protein
fermented with psychrotropic lactic acid bacteria
Seiichi Haga and Toshiya Hayashi（Faculty of Agriculture, Meijo University）

28

Establishment of novel cryoprotective method for meats using glycated LEA protein
Ken-ichi Honjoh, Noriyuki Igura and Seiji Noma
（Faculty of Agriculture, Graduate School, Kyushu University）

35

The use of powder tea leaf to control the fecal coliforms in meat and meat products
Kiyo Okazaki（Faculty of Human Life Science, Shikoku University）

42

Development of a sterilization system, which keeps the quality of meat, by using a newlight-emitting device
Akira Takahashi, Masatake Akutagawa, Kazuaki Mawatari, Takaaki Shimohata．
（Institute of Health Biosciences, The University of Tokushima Graduate School）

48

Morbidity and safety for the maillard reaction occurred during cooking of meat products
Yuzuru Otsuka １, Keiko Yamaguchi ２, and Yuri Nomi １
１（ Institute of Environmental Science for Human Life, OchanomizuUniversity，２

Department of Food and Nutrition, Japan Women's University）

© The Ito Foundation

54

iv
Study on the relation between fatty acid composition, flavor, taste component of Japanese
black beef meat and eating quality by tasting panel
Keiichi Suzuki １, Shoko Yokota １, Shioura Hiroaki １, Fumiko Iida ２, Shinichi Yamada ３, 
Hironori Sakuma ３（１Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University ２Japan Women's University, 
3National Livestock Breeding Center） 

61Intramuscular free fatty acids related to beaf eating quality
Minoru Yamanoue, Keiko Yano, Syuji Ueda, Ikko Ihara and Kiyohiko Toyoda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

68

A rapid objective method for evaluating meat grain
Masakazu Irie
（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki） 

76Interpreting the production system for high quality pork
Akitsu Tozawa and Shusuke Sato
（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

© The Ito Foundation

83平成23年度

1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

亜鉛欠乏予防効果を持つ食肉成分の探索とその効果についての食品科学的研究
Prevention against zinc deficiency by the use of meat component（s）
increasing zinc absorption in the intestinal epithelial cells

神

戸

大

朋

（京都大学大学院生命科学研究科）

Taiho Kambe（Graduate School of Biostudies, Kyoto University）

Zinc deficiency is world-wide health problem and recent reports have estimates that morethan 25％ of the world population is at risk of zinc deficiency. Hence a strategy enabling
efficient zinc absorption is of importance. In the intestinal epithelial cells, the zinc transporter
ZIP4（SLC39A4）plays an essential function for zinc absorption. ZIP4 gene is mutated inhumans with the rare, autosomal recessive genetic disease acrodermatitis enteropathica, which
is known as the only severe zinc deficiency. Exogenous expression of ZIP4 results in increasesof zinc contents in the cells, suggesting that a food factor increasing ZIP4 expression should bea potential enhancer of zinc absorption in the intestinal epithelial cells. In this study, we
examined the efficacy of meat component（s）to increase ZIP4 expression by the use of therapid screening system using mouse Hepa cells. We prepared over 50 extracts from various
meats（beef, pork, chicken）using an aqueous acid or alkaline solution, methanol or ethyl
acetate, and examined their effects on ZIP4 expression. However, we did not find the significant
activity of increasing ZIP4 expression in any meat（s）extracts. We will continue to screen
more extracts after re-examining extraction methods.
Meanwhile, we established a novel system to judge the activity of meat component（s）onexpression of human ZIP4 using MDCK FLp-InTMT-Rex cells. The MDCK cells are the firstones, in which we can investigate the efficacy of food component（s）on expression of humanZIP4 because it has been difficult to establish the cells stably expressing human ZIP4. Afterfinding the meat extracts in the rapid screening system using Hepa cells, we will evaluate theirefficacies using the MDCK system.

１．目

がちであるが，近年，先進国においても，高齢者を中的心にして亜鉛欠乏患者が増加しており，欧米科学

亜鉛は，味覚・免疫機能・創傷治癒力等に重要誌において“much ignored global health problem”

な役割を果たす必須微量栄養素である１）。その欠として警鐘が鳴らされる機会も増えてきた２）。最乏は，途上国においてのみ問題となると考えられ新のデータでは途上国を中心に全世界人口の約© The Ito Foundation

2

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Zinc adequate

Zinc deﬁciency
N

Apical membrane

Zn2+

C

ZIP4

C

lysosomes

Basal membrane
図１ Cartoon of the regulation of ZIP4 expression by zinc status in theenterocytes. Left: when zinc is adequate, ZIP4 protein is not detected on
the apical membrane but is degraded in the lysosomes. Right: when zincbecomes deficient, ZIP4 protein accumulates on the apical membrane.

25％が亜鉛欠乏傾向にあると試算されており，健吸収を促進する食品因子が同定できれば，亜鉛欠

康な社会生活を送る上で亜鉛欠乏を予防すること

乏の予防に大きく貢献することが可能となるのはは極めて重要となっている。

明らかである。

飽食の時代にある我が国においても亜鉛欠乏は亜鉛の吸収は，小腸上皮細胞に発現する亜鉛ト大いに懸念される栄養問題の一つであり，国民のランスポーターZIP４を介して行われる。ZIP４

２～３割が亜鉛欠乏傾向にあるとの試算も出されは先天性亜鉛欠乏症の原因ともなる亜鉛吸収におている。特に，高齢者，女性においてその傾向がける必須分子である４，５）（図１）。そのため，ZIP

強いことも報告されており３），来るべき超高齢社

４の発現を促進する食品因子は，亜鉛欠乏の予防会を迎えるにあたり，亜鉛欠乏を予防する効果的に特に効果的であると考えられ，事実，ZIP４をな手法の確立が望まれている。亜鉛は，日々の食過剰に発現させた細胞内の亜鉛量は増加すること事から摂取され，消化管（十二指腸・空腸）からが知られる６，７）。我々は，食品中に含まれる亜鉛

吸収される。従って，亜鉛を充足させるには，亜吸収促進活性を有する因子はZIP４の発現を促進

鉛含量の高い食材を摂取することが重要となる

するとの仮説に従い，ZIP４発現促進因子の探索が，消化管からの亜鉛吸収効率は30％程度と低に適したスクリーニング系を構築した。本スク

く，摂取した亜鉛が効率良く吸収されている訳でリーニング系は，腸管上皮細胞に匹敵する鋭敏なはない。この事実を考慮すると，体内への亜鉛吸感度で，ZIP４の発現を増加させる食品因子を簡収量を増加させるためには，亜鉛含量の高い食品便に探索できる系となっている。本研究は，このを摂取することに加え，消化管からの亜鉛吸収効

スクリーニング系を用いてZIP４の発現を促進す

率を高めることが肝要となる。そのため，亜鉛のる食肉成分を探索・同定し，亜鉛欠乏の予防に役© The Ito Foundation

亜鉛欠乏予防効果を持つ食肉成分の探索とその効果についての食品科学的研究立てることを目的に実施した。
２．方

3

３．結果と考察

法

3 . 1 ZIP４発現促進活性を持つ食肉サンプル

2 . 1 ZIP４発現促進活性を持つ食肉サンプルのスクリーニング
加熱（100℃，５分）・非加熱処理を施した食肉のスクリーニング
市販の食肉（牛，豚，鶏）をリン酸緩衝液に懸サンプル（牛，豚，鶏），また，脂溶性因子の溶濁した後，加熱（100℃，５分）
・非加熱処理を施出を意図して，メタノール，酢酸エチルにより食し，各２種類のサンプルとして調製した。それら

肉サンプル抽出画分を得た。これら抽出画分を，を終濃度0.1％でスクリーニング用細胞の培養液

スクリーニング細胞であるマウスHepa細胞培養に添加して24～36時間培養した後，細胞から全細液に加え，24～36時間培養することでスクリーニ

胞タンパク質を回収してタンパク質を定量し，各ングを実施した。同時に，細胞内亜鉛量の増加の20μgをimmunoblot解析に用いた。１次抗体には目安となるメタロチオネインプロモーターを利用

抗ZIP４モノクローナル抗体を500倍希釈したもしたSEAPレポーターアッセイを実施した（メタのを使用し，２次抗体にはHRP標識抗マウスIgG

ロチオネインは，５つのmetal response element

抗体を3000倍に希釈して使用した。これまでに大を有しているため，亜鉛量の増加に極めて鋭敏に豆抽出物において，最も強いZIP４発現促進活性

反応し，転写を活性化させる）。同一サンプルにを見出しているため，本課題ではその抽出物の活おいて数回解析し，幾つかのロットを作成してそ性を基準に，より強力な活性を持つ因子を探索しの再現性を確認したが，現段階では，これまでにた。なお，本スクリーニングで使用する抗ZIP４

大豆抽出物で見出しているZIP４発現促進活性よモノクローナル抗体は，マウスZIP４のアミノ末りも強力にZIP４の発現を促進させる，あるいは，端領域（シグナル配列を除くアミノ末端から第一SEAP活性を有意に増加させる活性を有する因子

膜貫通領域の直前まで，28～328aa）を抗原としを認めることができなかった（図２）。また，熱て作成し，マウス腹水より調製したものである。

により活性が変化することを期待し，熱処理した

2 . 2 ヒトZIP４を指標とした食肉由来因子のサンプルについても解析を行ったが，活性を増強させる効果は観察されなかった。今回用いたサン

評価系の構築イリノイ大学のJack Kaplan教授より分与してプル調製条件が適当でない可能性も残されている

頂いたMDCK FLp-InTMT-Rex細胞株にヒトZIP４

ため，今後，サンプル抽出方法に改良を加え，さ遺伝子を導入した。導入にはpcDNA5/FRT/TOらに多くの食肉を用いた解析を実施していく。

ベクターを使用し，ハイグロマイシンによる耐性を指標にヒトZIP４安定発現株を選別した。ヒト3 . 2 ヒトZIP４を指標とした食肉由来因子の評価系の構築ZIP４のカルボキシル末端にはHA tagを挿入し，上述のスクリーニングはマウス細胞を用いて実MDCK細胞膜上での発現部位を解析できるよう施しており，また食肉サンプルのin vivoでの効果に考慮した。

もラットを用いた個体レベルでの亜鉛吸収率の評
価系で実施することを計画している。従って，上記スクリーニング系においてマウスZIP４に対して認められた食肉サンプルの活性が，ヒトZIP４© The Ito Foundation

4

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Soy

ZnA

ZnD
beef

ZIP4
ZnA

ZnD
beef

ZIP4
ZnA

ZnD

Soy

ZIP4

pork
ZnD ZnA

Soy

ZIP4chicken
ZnD

ZnA

ZIP4

chicken

図２ Screening of the efficacy of meat component（s）to increase ZIP4 expression.

Mouse Hepa cells were cultured in the presence of the extracts prepared frommeat（beef, pork, chicken）components for 24 h. ZnA; zinc adequate, ZnD; zinc
deficient, Soy: soybean extracts. Total cellular proteins（20μg）prepared from
Hepa cells cultured in the indicated conditions were subjected to immunoblot
analysis.

に対しても同様の効果を発揮するかどうか検証すの Jack Kaplan 教 授 よ り 分 与 し て 頂 い た MDCKることは極めて重要となる。すなわちスクリーニ

FLp-InTMT-Rex細胞にヒトZIP４遺伝子を導入しング・動物実験でのin vivoでの評価，ヒトZIP４た。本株を用いる利点は，通常時にはZIP４の発に対する細胞レベルでの解析を組み合わせること現を非常に低レベルに維持するが，タモキシフェ

で，亜鉛吸収に及ぼす食品因子の探索を高い精度

ンの添加により発現を誘導することができる点にで実施できる体制を整えることができる。そこある。本株を用いた結果，これまで困難とされてで，ヒトZIP４を発現する細胞株を用いた評価系

いたヒトZIP４過剰発現株の樹立に成功した（図を構築することを目的に，腸管上皮細胞と同様に３）。発現させたヒトZIP４がアピカル膜上に安極性細胞であるCaCO２細胞やMDCK細胞にZIP定に発現することも確認できているため，本株を４を過剰発現させる細胞株の樹立を試みた。これ使用することで，ヒトZIP４の効果を詳細に解析までの知見により，ZIP４を過剰発現させた株をすることが可能となる。上記スクリーニングで樹立することは困難であることが知られており，

ZIP４発現促進活性を持つ食肉サンプルを認めた

実際にCaCO２細胞やMDCK細胞を用いて過剰発場合には，本株を用いて，ヒトZIP４に対する効

現株は樹立できなかった。そこで，イリノイ大学

果も評価する予定である。

© The Ito Foundation

5

亜鉛欠乏予防効果を持つ食肉成分の探索とその効果についての食品科学的研究

Dox : -

1

+

-

2

+

-

3

+

-

4

B

ZnSO4

+

Dox

+

αZIP4

-

A

100

150 （μM）

24 48

24 48 （hr）

αZIP4
CBB staining

CBB staining

図３

Establishment of MDCK cells expressing human ZIP4 to evaluate the activity of meat component（s）on theexpression of human ZIP4. A, MDCK FLp-InTMT-Rex cells stably expressing human ZIP4-HA were established.
ZIP4 expression is under control of a tetracycline-inducible promoter, and therefore the MDCK cells increasehuman ZIP4 expression when cultured in the presence of doxycycline（dox）. B, Expression of human ZIP4 isregulated by zinc status. The MDCK cells（clone No. 1 in A）cells were cultured in medium containing dox for 24 h
to induce human ZIP4 expression, and then the cells were cultured in the presence of the indicated concentrationsof ZnSO4 without dox for 24 or 48 h. Expression level of human ZIP4 decreases in the presence of higher zincconcentrations.

亜鉛を効率良く吸収させる食品因子は，亜鉛欠率を高める因子として機能することが予想され乏症の予防のために最も安全で有効な手段である。食肉より抽出したサンプルのZIP４発現促進る。食生活の簡便化が進む先進諸国においては，

効果や細胞内の亜鉛取り込み活性についてスク

潜在型の亜鉛欠乏患者数は今後ますます増加する

リーニングを実施したが，現在までのところ，そことが予想されており，人々の健康増進のため，れほど強力な活性を持つ因子を見出すことはでき

亜鉛吸収促進因子を同定する意義は極めて大きなかった。今後，抽出方法などを再検討し，さらい。現在，食肉サンプルから，強いZIP４発現促に解析を進める予定である。一方，活性因子を見

進活性を有するものは見出せていないが，今後，出した後，ヒトZIP４に対する効能を評価する系

さらに解析を進めて行き，活性因子の同定に結びを 構 築 す る こ と を 目 的 に ，極 性 細 胞 で あ る

つけたいと考えている。ZIP４発現促進活性を持

MDCK細胞を用いた評価系を確立した。本細胞

つものについては，①構造決定，および構造活性の樹立によって，食肉由来因子のヒトZIP４に対相関，②その作用メカニズムの解明，③動物実験する効能を評価することが可能となるため，本成によるin vivoでの効能評価，を実施する計画を立果は，今後の研究の進展に大きく貢献するものにてている。

なると考えている。

４．要

約

ZIP４は，消化管からの亜鉛吸収に必須の役割を果たす亜鉛トランスポーターである。体内亜鉛
吸収量をコントロールする鍵分子として機能して

文 献１）
 Hambidge M. : Human zinc deficiency, J Nutr
130, 1344Ｓ～1349Ｓ, 2000.
２）
 Haase H, Mocchegiani E and Rink L. : Correlation
between zinc status and immune function in theelderly. Biogerontology, 7, 421～428, 2006.

おり，その発現を増加させる因子は，亜鉛吸収効© The Ito Foundation

6

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

３） Kogirima M, Kurasawa R, Kubori S, Sarukura N,
Nakamori M, Okada S, Kamioka H and Yamamoto
S. : Ratio of low serum zinc levels in elderly
Japanese people living in the central part of Japan.
Eur J Clin Nutr, 61, 375～381, 2007.
４） Wang K, Zhou B, Kuo YM, Zemansky J and
Gitschier J. : A novel member of a zinc transporterfamily is defective in acrodermatitis enteropathica.
Am J Hum Genet, 71, 66～73, 2002.
５） Küry S, Dréno B, Bézieau S, Giraudet S, Kharfi M,
Kamoun R and Moisan JP. : Identification of
SLC39A4, a gene involved in acrodermatitis

enteropathica. Nat. Genet, 31, 239～240, 2002.
６）
 Kambe T and Andrews GK. : Novel proteolytic
processing of the ectodomain of the zinctransporter ZIP4（SLC39A4）during zinc deficiency
is inhibited by acrodermatitis enteropathica
mutations. Mol Cell Biol, 29, 129～139, 2009.
７）
 Weaver BP, Dufner-Beattie J, Kambe T and
Andrews GK. : Novel zinc-responsive posttranscriptional mechanisms reciprocally regulate
expression of the mouse Slc39a4 and Slc39a5 zinctransporters（Zip4 and Zip5）. Biol Chem, 388, 1301
～1312, 2007.

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平成23年度

7

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についての研究（Ⅲ）
Functional components sourced from bovine, porcine and poultry：
Comparative study on bioactive peptides. III

六 車 三 治 男・久 保 田 大 樹・河原聡（宮崎大学農学部）

Michio Muguruma,Daiki Kubota and Satoshi Kawahara（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

This research aimed to compare the biological and functional properties as well as
physiological effects of beef, pork and chicken protein hydrolysates. The year before last, we
examined the antihypertensive effects by determining the IC50 value of the three mentioned
species. Last year, we evaluated the antioxidative activities of hydrolysates of biceps femorismuscles from beef, pork and chicken.
In the current study, the muscles hydrolyzed with pepsin, trypsin and pancreatin, andthen determined their antioxidative efficiency. The antioxidative activity of the hydrolysates
was determined by the DPPH radical scavenging assay and the ORAC antioxidant assay. Meathydrolysates showed the high antioxidant activity by the DPPH radical scavenging assay andthe ORAC antioxidant assay. However, there are differences in the other factors for giving theantioxidative activity including amino acid sequence of those hydrolysates. For instance, Cys
shows strong antioxidant activity that is considered to be specific for electron transfer reaction.
On the other hand, though Trp also has been showing a strong activity, as it indicates only fortransferring atom of hydrogen during its reactions. Beef and pork peptides may show
antioxidant activity in specific manner that are influenced by His and Trp. Antioxidant activityof chicken peptides are small and far from other meat peptides especially when compared tobeef and pork. In ORAC evaluation, Trp pattern similar to Trp in chicken one, in which we
hypothesize that Trp may be very important amino acid.The results showed that the meathydrolysate was composed with moderate amount of hydrophobic amino acids which might
contribute to the high antioxidant activity. The fraction with molecular weight lower than 1
kDa exhibited the high antioxidative activity.
We conclude that meat in the three species contain peptides that may serve several
purposes. Based on its remarkable ACE inhibitory activity and antioxidative activity, wesuggest that the functional peptides from meat hydrolysates may have potential applications asfunctional food, which could be used as sources of nutraceutical compounds.

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8
１．目

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）しか示さず，グルタチオンはDPPHの紫色が確認

的できないほど強力な抗酸化活性を示した。これは畜産食品の消費量は約半世紀の間に急増した

グルタチオンが電子供与反応に基づく抗酸化力をが，これは我が国が長寿国になった要因の一つと有している証拠であると考えられた。また食肉ペも考えられる。一方，日本人のライフスタイルのプチドがカルノシンよりも高い活性を示した理由

変化に伴い，生活習慣病の患者が増加しており，としては，食肉に含有される様々なペプチドによ

国民の健康への関心は極めて高くなっている。食る相乗効果であると推測された。

肉は良質なタンパク質を豊富に含み，近年，筆者

一方，ORAC法にて測定した結果，各種食肉共らも含めて血圧降下作用などの保健的機能性につに非常に高い抗酸化化活性を有することが確認さいての研究が進められている。しかし，各種

れた。各種食肉間でそれらの値に有意差は認めら

食肉の生理活性を詳細に比較検討した研究はあまれなかったが，同濃度のカルノシンと近似した値

り報告されていない。

が得られた。このように単純に活性値を比較した

１～８）

そこで，初年度は我が国の死亡原因の２～３位

だけでは各種食肉間に有意差は認められなかったを占める心疾患，脳血管疾患の原因と深くかかが，食肉を構成するアミノ酸に注目し，ORAC法

わっている高血圧症の予防に及ぼす各種食肉を消による抗酸化活性の経時変化を見ると，牛肉およ

化酵素により分解して生じたペプチド混合物のア

び豚肉と鶏肉では抗酸化活性の性質が異なること

ンギオテンシン変換酵素（ACE）の阻害によるが明らかになった。特に重要なアミノ酸は高い電高血圧予防効果について比較検討した 。その結子供与活性を示すCys，高い水素供与活性を示す

果，市販の牛肉，豚肉および鶏肉を用いて，それTrpであることが示唆された。

９）

らを加熱後，消化酵素のペプシンおよびトリプシ

そこで本年度の研究では，食肉のペプチドを構ンで処理すると鶏肉，豚肉，牛肉の順にACE阻成するアミノ酸やペプチドの極性に着目しながら害活性が増加することが認められた。

ラジカル消去活性の発現に重要なペプチドの条件

さらに昨年度は，日本人の死因第一位になり，を調査した。すなわちDPPH法およびORAC法を

その増加が続いているがん発症危険因子の中で用い，アミノ酸を抗酸化活性機序に基づいて分類

も ，特 に 活 性 酸 素 種（ROS : Reactive Oxygen

した。またその分類結果を基に，食肉タンパク質

Species）と呼ばれる悪性の酸素ROSを消去する

酵素分解物のようなペプチド混合物においても抗能力を発現する抗酸化活性に及ぼす各種食肉酵素

酸化活性機序の推定が可能であるのか調査した。

分 解 ペ プ チ ド の 効 果 を DPPH（1,1-Diphenyl-2-

さらに食肉を構成するアミノ酸を分析し，分析結

Picrylhydrazyl） 法 と ORAC （Oxygen Radical

果通りにアミノ酸を混合して食肉様アミノ酸混合

10）Absorbance Capacity）法により比較検討した 。

物を調製した。これら食肉様アミノ酸混合物と食DPPH法にて調査した結果，各種食肉間ではタ

肉ペプチド混合物の抗酸化活性を比較すること

ンパク質濃度1.0㎎/mlでおよそ40μＭトロロック

で，アミノ酸組成から抗酸化活性機序の推定が可ス相当量の抗酸化活性を示した。また，食肉酵素能であるのか調査し，アミノ酸組成が抗酸化活性

分解物の添加濃度依存的に抗酸化活性は増加し機序の決定にどれだけ影響を与えているのか検討た。畜種間の活性に有意差は認められなかった。

した。これらアミノ酸組成だけでなくペプチドの既知の抗酸化物質のカルノシンは痕跡程度の活性極性もラジカル消去反応に関係があると考えられ© The Ito Foundation

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についての研究（Ⅲ）

9ることから，本年度の研究では疎水性の差を利用

2.3

タンパク質の定量

して低疎水性ペプチド混合物および高疎水性ペプ

酵素未処理の食肉タンパク質の定量はBiuret

チド混合物を調製し，ペプチドの極性と抗酸化活法11）により行った。すなわち，タンパク質溶液に性との関係についても検討を加えた。

対し，４倍量のBiuret試薬を加えて常温で30分間

このように本研究の目的は，どのようなアミノ

反 応 さ せ た 。 反 応 液 を 島 津 UV-VIS

酸を含有したペプチドが，あるいはどのような立Spectrophotometer 2450型分光光度計（吸光度：体構造のペプチドがROSの消去に有効なのかを

540nm）にて測定した。また分解物であるペプチ明らかにすることにより，食肉タンパク質酵素分ドについてはUV法12）を適用し，測定を行った。

解物の抗酸化活性機序の推定を行い，ペプチドがすなわちタンパク質溶液の215nmの吸光度から抗酸化活性を発現するために必要な条件を解明

225nmでの吸光度を差し引き，144倍した時の数

し，食肉の価値の向上に貢献していくことである。

値をタンパク質濃度とした。測定には上記と同じ

２．方
2.1

分光光度計を使用した。

法

実験材料

2.4

アミノ酸分析

⑴

標準アミノ酸溶液の調製

市販の宮崎県産の各種食肉（牛肉・豚肉・鶏肉

標準アミノ酸混合液ANⅡ型（和光純薬工業株

いずれもモモ肉）を酵素分解用実験材料として用式会社），標準アミノ酸混合液Ｂ型（和光純薬工

いた。

業株式会社），1.25mMアスパラギン溶液，2.5mM

2 . 2 食肉タンパク質酵素分解物（MPs : Meat

グルタミン溶液，2.5mMトリプトファン溶液それぞれ１mlを混合し，0.2Ｍクエン酸緩衝液（pH2.2）

Peptides）の調製
食肉由来タンパク質分解ペプチドの調製は以下

で全量を25mlとした。
クエン酸緩衝液は0.2Ｍクエン酸一水和物（和のとおりである。
各種食肉のミンチ肉50ｇに蒸留水100mlを添加

光純薬工業株式会社）200mlに0.2Ｍクエン酸三ナ

してフードプロセッサー（Panasonic MK-K48）

トリウム二水和物（和光純薬工業株式会社）３を用いて30秒間，２回ホモジナイズして均質化しmlを加え，pH2.2とした。

た。70℃で30分間インキュベート後，このホモ⑵

ジェネートをHClでpH1.8に調整し，胃粘膜由来

各種MPs溶液に３％スルホサリチル酸（和光

ペプシン（１：10000）（和光純薬工業株式会社）

純薬工業株式会社）を加え，冷蔵庫で１時間静置を0.01ｇ添加して攪拌しながら37℃で２時間イン

してタンパク質を沈殿させた。その後，3000rpm

キュベートした。NaOHを用いてpH6.8に調整し，で15分間遠心分離を行った。上清を0.45μｍセル

10分間煮沸した後，試料の温度を40℃まで低下さ

ロースアセテートメンブレンフィルタ（アドバンせた。さらにトリプシン（和光純薬工業株式会

ティック東洋）でろ過し分析試料とした。これを社）およびパンクレアチン（同会社）をそれぞれ

全自動アミノ酸分析機（JIC-500，日本電子株式

0.01ｇ添加し，再び攪拌しながら37℃で２時間イ

会社）で分析した。

ンキュベートした。最後に10分間煮沸した試料を食肉タンパク質酵素分解物（MPs）とした。

遊離アミノ酸分析⑶ 加水分解アミノ酸分析（MPsの加水分解によって得られるアミノ酸の分析）
R.J. Simpsonらの方法13）に準じ，４Ｍメタンス© The Ito Foundation

10

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

ルホン酸加水分解を行った。80％エタノールで抽

ミノ酸混合物（再構成MPs）を調製した。

出されたMPsを遠心濃縮機（CVE-200，東京理科

遊離アミノ酸分析データを基にした場合，20種

機器株式会社）で粉末化した。この粉末試料10㎎

類のＬ-アミノ酸およびカルノシン（Car），アンを試験管に秤量し，４Ｍメタンスルホン酸（和光

セリン（Ans）の総量を100％として混合し，溶純薬工業株式会社）１mlを加えた。またアスピ媒には80％エタノールを用いた。また加水分解アレーター（WP-15，ヤマト科学株式会社）および

ミノ酸分析データを基にした場合，20種類のＬ－

超音波脱気装置（MUS-10，東京理科機器株式会

アミノ酸量を100％として混合し，溶媒には80％社）を用い，試験管内を真空状態にし，封管した。

エタノールを用いた。

ヒートブロック（DTU-１Ｃ，タイテック株式会

2.6社）を用い，110℃で24時間加水分解を行い，3.5M

DPPHラジカル消去活性の測定は，DPPH分光

NaOH 1 mlを添加，中和し，0.2Ｍクエン酸緩衝

測 定 法 に 準 じ て 行 っ た 15）。す な わ ち ，400 μM

液（pH 2.2）8 mlを加え，サンプルとした。0.45

DPPH， MES（2-morpholino-etanesulphonic acid）

μｍセルロースアセテートメンブレンフィルター

buffer，20％エタノールを同量ずつ加え，混液をにてろ過し，分析試料とした。これを全自動アミ作製した。混液を0.9ml分注し，80％エタノール

ノ酸分析機で分析した。

を240μlとサンプルを60μl加え，20分間反応させ⑷

トリプトファン（Trp）の定量

M.K. Gaitondeらの方法

DPPHラジカル消去活性の測定た。その後，サンプルを加えた順に前述の分光光に従い，各種食肉の度計にて吸光度520nmで測定した。また，サンプ

Trp含有量を測定した。試験管にMPs（ペプチドルの代わりに，0.2mM Trolox（Sigma社）を使っ

濃度20㎎/ml）（酵素処理後，0.45μｍセルロースて 標 準 と し て 測 定 し ，検 量 線 か ら サ ン プ ル のアセテートメンブレンフィルターでろ過したもTrolox相当量を算出した。MES BufferはMESをの）0.5ml，試薬Ａ（ニンヒドリン250㎎に（酢

蒸留水に溶解し，NaOHでpH６に調製したもの

酸：0.6Ｍリン酸＝３：２）溶液10mlを加えたもを使用した。

14）の）ま た は 試 薬 Ｂ（ニ ン ヒ ド リ ン 250 ㎎ に（ギ2.7

ORAC法による抗酸化活性の測定

酸 ： 塩 酸 ＝ ３ ： ２）溶 液 10ml を 加 え た も の）（独）農研機構九州沖縄農業研究センターの報

0.5mlを加え，10分間煮沸し，さらに３mlのエタ

告 を も と に 改 良 し て 測 定 し た 16 ～ 19）。す な わ ち

ノールを加え，冷却した。分光光度計にて試薬Ａ

96wellマイクロプレートに81.6nMフルオレセイを含む溶液は385nm，試薬Ｂを含む溶液は390nm

ンを200μl，サンプル20μlを添加し，マイクロプ

で吸光度を測定した。

レートリーダー（TECAN GENios Multifunction

なおTrp含有量（μＭ）は次の式で算出した。

FluorescenceVirginia, USA）に て 37 ℃ で 励 起 波

Trp含有量（μＭ）＝（Eb－1.6Ea）／3.95＋Ea

長485nm，蛍光波長520nmにおける蛍光強度を測Ea：試薬Ａを用いて測定した吸光度の値定した。10分後200mM AAPH75μlを添加し，同Eb：試薬Ｂを用いて測定した吸光度の値

条件にて２分間隔で45回測定した。またORAC値

2 . 5 食肉様アミノ酸混合物（再構成MPs）のは Net AUC（Area Under Curve）＝AUC sampleAUC blankを用いて算出した。検量線作成には

調製
MPsの遊離アミノ酸分析および加水分解アミノ酸分析により算出されたデータを基に食肉様ア

Trolox（125，250，500，1000μＭ）を使用した。
2.8© The Ito Foundation

ペプチド混合物の逆相カラムによる分画

11

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についての研究（Ⅲ）

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により
５Ｃ18-AR-Ⅱ（4.6×250㎜）（ナカライテクス株式会社）の逆相カラムを用いて，豚肉MPsを極性のTable１ The amounts of antioxidant amino acids inhydrolysates of beef, pork and chicken．
Unit (mg/100g）
Antioxidant amino
acids

Beef

Pork

Chicken

Cys

0.72

0.29

0.36

Met

7.43

4.63

5.33

Tyr

9.13

5.40

5.82

10AD送液ポンプを用い，流速0.5ml/min，注入

His

17.16

12.86

6.92

量100μlで行った。ペプチドの検出には，コン

Trp

1.84

1.30

2.04

違いに基づいて分画した。溶離液には0.1％TFA
含有アセトニトリル溶液を用いた。分析中は溶離液を脱気装置（DGU-14Ａ，島津社）に通し，LC-

ピューターで制御された検出器（SPD-10AVP，
島津社）を用い，検出波長は215nmで行った。
2 . 9 各フラクションのゲルろ過高速液体クロれ260.31，277.42，172.34㎎/100ｇであり，これマトグラフィーによる分子量分布の分析

までの報告20）のとおり牛および豚肉にはカルノシ

逆相カラムで分画した各フラクションの分子量

ンが豊富に含まれ，鶏肉にはアンセリンが豊富に分 布 を TSKgelG2000SWXL（7.8 ㎜ I.D. x 30 ㎝ ）含まれていた。さらにTrpはわずかに鶏肉MPsが（東ソー株式会社）のゲルろ過カラムを用いて分牛および豚肉MPsよりも多く含まれていた。また画した。溶離液には0.1％TFA含有45％アセトニ

加水分解によって生じたアミノ酸を分析した結果

トルル溶液を用い，流速0.8ml/min，注入量20μl

でも鶏肉MPsは他の食肉と比較してHis含量が低で行った。

く，Trpを多く含む傾向があった（Table１）。M.K.
Gaitondeらの方法で食肉中のTrp含量を調査した

３．結果と考察際にも有意な差は見られなかったが，これまでの

まず，MPsに含まれるアミノ酸が抗酸化活性機報告と一致して鶏肉は他の食肉と比較してTrpを序の決定にどれだけ影響を与えているのか調査し多く含有している傾向があることを確認した21）。

た。すなわちMPsのアミノ酸分析を行い，分析結

前 報 に お い て ，ア ミ ノ 酸 の 抗 酸 化 持 続 能 を果に基づいてアミノ酸を混合し，食肉様アミノ酸

ORAC法にて解析すると，抗酸化力には電子供与混合物（再構成MPs）を調製した。さらにこれら（ET）型と水素供与（HAT）型に大きく分類さ再構成MPsの抗酸化活性を評価した。

れることを示した10）。ET型とはここではCys，グ

前報において牛および豚肉MPsは主にHis，鶏ルタチオン，トロロックスのようにDPPHラジカ

肉MPsは主にTrp由来の抗酸化活性を発現する可ル消去活性が高く，一定時間フルオレセインの分能性を認めた 。そこで抗酸化活性の測定に用い解を100％阻害し，ある時点から急激に活性が低たMPsの遊離アミノ酸およびMPsを加水分解し下するパターンを持つ物質のことを言う。HATて生じるアミノ酸（㎎/100ｇ）を分析した結果，型とはHis，Met，Tyr，Trp，カルノシンなどを食肉間で含有アミノ酸の違いが確認された。遊離指し，経時的にフルオレセインが分解されていく

アミノ酸分析において特に大きな違いはHisおよパターンを持つ物質のことである。

10）

びHis含有ペプチドであるカルノシン，アンセリ

昨年度の研究で報告したように，TrpはHAT

ン含有量であった。His，カルノシン，アンセリ

活性に最も重要なアミノ酸であり，微量でも大きンの合計量は牛肉，豚肉，鶏肉MPsの順にそれぞな活性を示すことが示唆された10）。MPsの両アミ© The Ito Foundation

12

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

60

DPPH activity (μM TE)

50
40
30
20
10

N.D.

N.D.

Chicken B FAA P FAA

C FAA

0
Beef

Pork

B HAA P HAA

C HAA

MPs / Amino acids mixture like MPs (1.0 mg/ml)
Fig.１ DPPH radical scavending activity of beef, pork, chicken and amino acids mixtures reconstituted

according to the analyzed data. B:Beef; P: Pork, C:Chicken, FAA: meat like amino acids mixtures
reconstituted according to the data based on free amino acids, HAA: meat like amino acids mixtures
reconstituted according to the data based on total amino acids. TE: Trolox Equivalent.

ノ酸分析結果ともにHis含量が少なく，Trp含量

豚・鶏肉様アミノ酸混合物））は10～25μM TEのが多いことが示されたことから，鶏肉MPsはTrp活性を示したが，これはもとのMPsよりも低い活の影響を大きく受けた抗酸化活性を示した可能性性であった。“FAA”がET活性を示さなかったが考えられた。

理由としては“FAA”は“HAA”と比較して強このようにMPsのようなペプチド混合物の抗力なET活性を示すCysの含量が少なかったこと

酸化活性機序の決定には各種ペプチドのアミノ酸（“FAAにはおよそ0.05％，“HAA”にはおよそ組成が重要である可能性がある。そこで各種MPs

0.2％のCysが含まれていた）が考えられた。またの遊離アミノ酸および加水分解アミノ酸を分析

MPsの方が“HAA”よりも高いET活性を発現しし，さらにその結果に基づいて各種アミノ酸を混た理由はペプチド特有の立体構造に起因する活合し，MPsを再構成した。次に，これら各種再構性，またペプチド同士による相乗効果が働いた可成MPsがET活性およびHAT活性いずれの抗酸化能性が考えられた。

活性機序を示すのか調査した。

さらに“HAA”のET活性がCysだけに由来す

DPPH法を用いた場合，再構成MPs遊離アミノるものだったのか調査するためにCys溶液，すな

酸混合物（以下“FAA”と略す（BFAA，PFAA，

わ ち BHAA ，PHAA ，CHAA の 平 均 Cys 濃 度

CFAAはそれぞれ牛・豚・鶏肉様アミノ酸混合（0.0215㎎/ml）を調製し，ET活性を評価した。

物））はBFAAが痕跡程度の活性を示した以外，データには示していないが，この溶液は“HAA”

全て活性は検出されなかった（Fig.１）。また再よりも高いET活性（およそ80μM TE）を示し

構成MPs加水分解アミノ酸混合物（以下“HAA”

た。従って“HAA”のET活性がCys溶液より低と略す（BHAA，PHAA，CHAAはそれぞれ牛・い値を示した理由はアミノ酸の混合操作ミスや© The Ito Foundation

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についての研究（Ⅲ）

13*p<0.01

ORAC activity (μM TE)

2000

1500

1000

500

0
Beef

Pork

Chicken B FAA P FAA C FAA B HAA P HAA C HAA

MPs / Amino acids mixture like MPs (1.0 mg/ml)
Fig.２ Oxygen radical absorbance capacity（ORAC）of beef, pork, chicken and amino acids mixtures

reconstituted according to the analyzed data. B:Beef; P: Pork, C:Chicken, FAA: meat like amino acids
mixtures reconstituted according to the data based on free amino acids, HAA: meat like amino acids
mixtures reconstituted according to the data based on total amino acids. TE: Trolox Equivalent.

種々のアミノ酸間での活性相殺効果などに由来す

さらにMPsと再構成MPsの抗酸化活性を比較る可能性も考えられた。つまり“HAA”が示し

す る と DPPH ラ ジ カ ル に は ペ プ チ ド の 状 態 ，たET活性の大部分はCys由来であると示唆され

AAPH由来ペルオキシルラジカルの場合にはアた。

ミノ酸の状態がラジカルの消去に有利な傾向にあまたORAC法を用いた場合（Fig.２），“FAA”

ることが示唆された。DPPHラジカルには１種類，

および“HAA”はMPsよりも有意に高い活性を

AAPH由来のペルオキシルラジカルには５種類

示 し ，活 性 値 の 高 い 順 に“FAA”，“HAA”，のアミノ酸がラジカル消去に関与するが，この数MPsとなった。さらに抗酸化活性の経時的変化をの違いが再構成MPsの各種実験系における抗酸調査すると“FAA”および“HAA”は主にHis化活性の差である可能性が高いと考えられた。

系統の抗酸化活性を示した可能性が高いと推測さ以上の結果からペプチド混合物のアミノ酸組成れた。これは含有抗酸化アミノ酸のうち，Hisがは抗酸化活性機序の決定に大きな影響を与えてい最も多く含まれていたことに起因すると考えられることが確認できた。また加水分解アミノ酸分析

る。再構成MPsはもとのMPsと類似したHis由来

はタンパク質酵素分解物の抗酸化活性機序の推定の活性，つまり高いHAT活性を示した。しかしに利用できる分析法であると考えられた。しかしながら単にアミノ酸を混合しただけでは本来のながらアミノ酸組成だけがペプチドの抗酸化活性

MPsと同じ活性を示すことはなかった。また特に機序を決定する要因ではない。もしアミノ酸組成“HAA”は“FAA”の結果と比較すると，よりだけが抗酸化活性機序の決定に関与するのなら，MPsに近い抗酸化活性を示した。

Cysを多く含まない限りET活性を発現しないと© The Ito Foundation

14

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）*p<0.01

DPPH activity (μM TE)

100
80
60
40
20
0

Pork(60μl)

F1(60μl)F1(200μl)

F2(60μl)F2(200μl)

Fig.３ DPPH radical scavending activity of pork, fraction 1 andfraction2. F1:fraction 1; F2: fraction 2, TE: Trolox Equivalent．

高い。例えば牛乳ホエータンパク質由来のTrp-考えられるからである。
現在，DPPH法を用いて様々なET活性を有す

Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile ， Trp-

る抗酸化ペプチドが単離・精製されている。例え

Tyr-Ser ， Trp-Tyr-Ser-Leu ， Trp-Tyr-Ser-Leu-

ばカゼイン由来のLeu-Val-Tyr-Pro，Pro-Ile-His，Ala26，27）などが報告されている。

Pro-Val-Leu ，Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu22），マ グ

次に，ペプチドが抗酸化活性を発現するために

ロ煮汁由来のPro-Ser-His-Asp-Ala-His-Pro-Glu，

重要な要素であると考えられるペプチドの極性とPro-Lys-Ala-Val-His-Glu ，Pro-Ala-Gly-Tyr ，Val-

ラジカル消去反応との関係について調査した。極

Asp-Tyr-Pro ，などが報告されている。このよ

性はペプチドが抗酸化活性を発現するために重要

うにET活性発現に重要なアミノ酸であると考えな要素であることが示唆された。そこでペプチドられるCys含有のペプチドはあまり報告されていとラジカルとの相互作用に関与する極性に着目ない。これら抗酸化ペプチドのアミノ酸配列の特し，ペプチドの極性と抗酸化活性との関係につい

徴はＮ末端にVal，Leu，Proなどの疎水性アミノて調査した。抗酸化物質とラジカルとの反応には酸を有し，Ｃ末端にPro，Gluを有しているもの

極性が関与している可能性が高い。しかしながらが多い 24）。つまりペプチドがET活性を示すさらペプチドの極性と抗酸化活性との関係を研究した

なる要因の一つとしてペプチドの極性が関与して例はほとんどない。そこで，HPLCを用いて疎水いる可能性がある。特にDPPHラジカルは疎水性性の低いフラクション１および疎水性の高いフラのラジカルであり，極性はペプチドとDPPHラジクション２のペプチド混合物を調製して各フラク

カルとの親和性に寄与しているかもしれない25）。

ションの抗酸化活性を測定した。

23）

一方ORAC法で精製された抗酸化ペプチドはあ

DPPH法を用いた場合（Fig.３），サンプルを60まり報告されていないが，Ｎ末端がTrp-Tyrで始μl添加した時は両フラクション間に活性の有意

まるペプチドが数種発見されており，本研究で示差は見られなかったが，200μl添加するとフラク

したとおりORAC法で高い活性を示すTrpやTyr

ション１は２と比較して有意に高い活性を示しを含むペプチドが高いHAT活性を示す可能性がた。また豚肉MPsに占めるフラクション１および© The Ito Foundation

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についての研究（Ⅲ）

15*p<0.01
1400

ORAC activity (μM TE)

1200
1000
800
600
400
200
0

0.5 mg/ml
Pork

1.0 mg/ml 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml
F1
F2

Fig.４ ORAC activity of pork, fraction 1 and fraction 2. F1:fraction 1;

F2: fraction 2, TE: Trolox Equivalent．

50000
40000
F1 1.0mg/ml

RFU

30000

F1 0.5 mg/ml

20000

F2 1.0 mg/ml
F2 0.5 mg/ml

10000
0

0

20

40

60

80

100

Time (min)Fig.５ Fluorescence decay curves of fluoresein induced by AAPH in thepresence of Fraction 1 and fraction 2. RFU: relative fluoresence unit;
AAPH：2,2'-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride.
F1: fraction 1; F2: fraction２.

２の構成比はそれぞれ21.2％および78.8％でありmlの比較ではDPPH法を用いた時と同様にフラク

MPsは比較的疎水性の高いペプチドを多く含ん

ション１の方がより高い活性を示した。さらに抗でいたことが判明した。DPPH法にて，MPsとフ酸化活性の経時的変化を調査すると（Fig.５），

ラクション２（添加量60μl）の活性を比較する

若干だがフラクション１（1.0㎎/ml）はET型にとほぼ等しいことから，MPsは主にフラクション

近いパターンを発現している可能性が示唆され２由来の抗酸化活性を発現している可能性が示唆た。これはフラクション１が比較的高いET活性された。

を示したことが原因だと推測された。またフラク

一方，ORAC法を用いて抗酸化活性を測定した

ション２（1.0㎎/ml）は牛および豚肉MPs同様にところ（Fig.４），0.5㎎/mlでの比較では各フラク

His由来のHAT型抗酸化活性機序を有している可ション間で大きな差は見られなかったが，1.0㎎/

能性が示唆された。

© The Ito Foundation

16

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

各フラクションに存在するペプチドの分子サイ結果，連続的に酵素処理肉を投与した自然発症高ズも抗酸化活性に影響を与えた可能性がある。そ

血圧ラットおよび自然発症糖尿病ラットにおいて

こで各フラクションの分子量分布を分析すると，血圧降下作用を示すと共に，血糖値を低下する傾フ ラ ク シ ョ ン １（1,000Da ～ 100Da）は フ ラ ク

向を認めた30，31）。

ション２（分子量7,500Da～700Da）よりも分子

これらの結果を総合的に判断すると，生活習慣

量の小さなペプチドが多く存在した。従って極性病予防につながる効果を食肉に期待できるのではの差だけでなく，ペプチドの分子サイズもラジカないかと考えられ，食肉全体の価値を高めること

ルとの相互作用に影響を及ぼした可能性がある。

につながる結果であり，食肉消費の拡大に貢献し

最近，エビ製品の加工工程の副産物として生成さていくことが期待される。

れる加水分解物のアミノ酸組成と分子量分布について検討し，分子量1,000以下の成分で40.4％の疎

４．要

約

水性アミノ酸を含む画分に高い抗酸化活性を認

本研究はアミノ酸および食肉タンパク質酵素分

め，100℃以上の加熱でも安定であると報告され解物（MPs）に関してMPsの抗酸化活性機序をている 。本研究で得られた結果も分子量的には推定するとともに，ペプチドが抗酸化活性を発現一致していた。

するために重要な条件を調査した。

28）

様々な溶媒を用いて焼き栗から抽出してきた成DPPH法およびORAC法のデータからアミノ酸分の抗酸化活性（DPPH法）を測定するとメタを抗酸化活性機序に基づいて分類すると，ET型

ノール抽出液の活性が最も高く，次いで水，そしはCys，HAT型はHis，Met，Tyr，Trpとなった。

て最も低い活性を示したのがアセトンなどの疎水

特にCysおよびTrpは微量でも高い抗酸化活性を性の高い溶媒であるという報告 もあり，さらに示すことから，ペプチドの抗酸化活性発現に重要

他の食品においても低疎水性溶媒で抽出した画分

なアミノ酸だと考えられた。次に食肉タンパク質の抗酸化活性が高い傾向にあるという研究結果が

酵素分解物の抗酸化活性機序の推定を試みた結多数報告されている。以上の結果からペプチドと果，MPsの抗酸化活性機序は主にHAT型であり，各種ラジカルとの反応には疎水性度に起因する親牛および豚肉MPsはカルノシンやアンセリンな和性が関与し，疎水性の比較的低いペプチドがラどHis由来の活性，また鶏肉MPsはTrp由来の抗ジカルの消去に有効である可能性が高いと考えら

酸化活性を発現している可能性が示唆された。

29）

そこで含有アミノ酸と抗酸化活性機序との関係れた。
一連の本研究で得られた成果から，牛肉，豚肉を詳細に調査するために，MPsを再構成した。加および鶏肉を用いて，それらを加熱後，消化酵素

水分解アミノ酸分析の結果を反映した再構成のペプシン，トリプシンやパンクレアチンで処理

MPsはよりもとのMPsに近い活性を示し，His由

すると鶏肉，豚肉，牛肉の順にACE阻害活性が来の抗酸化活性を発現した可能性が示唆された。

増加することが認められた。また，抗酸化活性も，DPPH法を用いた場合，再構成MPsはもとのMPs

有意差は認められないものの各食肉加水分解物はより低い活性を示し，ORAC法を用いた場合，再高い抗酸化活性を示した。また，我々は豚肉の消構成MPsはもとのMPsより高い活性を示した。各化酵素分解物を自然発症高血圧ラットおよび自然種ラジカルを消去できる抗酸化アミノ酸の種類が発症糖尿病ラットを用いた持続投与実験を行った

異なることを考慮すると，特にDPPHラジカルの© The Ito Foundation

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についての研究（Ⅲ）

消去にはペプチド特有の立体構造も重要な要素になると考えられた。
さらにペプチドとラジカルとの相互作用に関わる要素，特に極性に着目し，豚肉MPs由来の低疎水性ペプチド混合物および高疎水性ペプチド混合物の抗酸化活性を測定した。各種ラジカルの消去には低疎水性のペプチドが有効である可能性が考えられ，ペプチドと各種ラジカルとの反応には疎水性度に起因する親和性が関与することが示唆された。
アミノ酸組成は抗酸化ペプチドに重要な要素である。しかしアミノ酸配列もまた抗酸化活性発現に重要な要素である。アミノ酸残基が適正に配列されて初めて抗酸化活性が増強される。ペプチドの抗酸化活性の発現について，様々な機構が提案されているが未知の部分が多い。従って今後はア
ミノ酸配列の抗酸化活性への影響および，抗酸化ペプチドの作用機構についてより詳細に研究していく必要がある。
本研究で得られた成果から，各種食肉を加熱後，消化酵素のペプシン，トリプシンやパンクレ
ア チ ン で 処 理 す る と 鶏 肉 ，豚 肉 ，牛 肉 の 順 に
ACE阻害活性が増加することが認められた。また，抗酸化活性も，有意差は認められないものの
各食肉加水分解物は高い抗酸化活性を示した。これらの結果から，いずれの食肉を摂取しても生活習慣病予防につながる効果を食肉に期待できることが示唆された。
文 献１） 在原圭三：最新畜産物利用学，斉藤忠夫，西村敏
英，松田幹編集，朝倉書店，122～124，2007．
２） Katayama, K., Fuchu, H., Sakata, A., Kawahara, S.,
Yamauchi, K., Kawamura, Y., Muguruma, M. : AsianAust. Anim. Sci. J., 16, 417～424, 2003.
３） Katayama, K.,Tomatsu, M., Fuchu, H., Sugiyama,M., Kawahara, S., Yamauchi, K., Kawamura, Y.,
Muguruma, M. : Anim. Sci. J., 74, 53～58, 2003.
４） Katayama, K.,Tomatsu, M., Kawahara, S.,

17

Yamauchi, K., Fuchu, H., Sugiyama, M., Kawamura,Y., Muguruma, M. : J. Agric. Food Chem., 52, 771 ～
775, 2004.
５）
 Katayama, K., Jamhari., Mori, T., Kawahara, S.,
Miake, K., Kodama, Y., Sugiyama, M., Kawamura,Y., Nakayama, M., Maruyama, M., Muguruma, M. :J. Food Sci., 72, S702～S706, 2007.
６）
 Katayama, K., Anggraeni, H.E., Mori, T., Ahhmed,
A.M., Kawahara, S., Sugiyama, M., Nakashima, T.,
Mayuyama, M., Muguruma, M. : J. Agric. Food
Chem., 56, 355～360, 2008.
７）
 Muguruma, M., Ahhmed, A.M., Katayama, K.,
Kawahara, S., Maruyama, M., Nakamura, T. : Food
Chem., 114, 516～522, 2009.
８）
 Ahhmed, A. M., Muguruma, M. : Meat Sci., 86,
110～118, 2010.
９） 久保田大樹，アブドラティフアーメド，河原聡，
六車三治男：平成21年度食肉に関する助成研究調査
成 果 報 告 書 ，（財）伊 藤 記 念 財 団 ，28 ，１ ～ ９ ，
2010．
10）
 久保田大樹，河原聡，六車三治男：平成22年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，（財）伊藤記念財団，29，29～39，2010．
11） 奥村宣明：タンパク質実験ノート抽出と分離精製，岡田雅人・宮崎香編集，羊土社，27～31，1996．
12）
 Murphy J.B., Kies, M.W. : Biochim. Biophys. Acta,45, 382～384, 1960.
13）
 Simpson R.J., Neuberger M.R., Liu, T.Y. : J. Biol.
Chem., 251, 1936～1940, 1976.
14）
 Gaitonde, M.K., Dovey, T. : Biochem. J., 117, 907～911, 1970.
15） 篠原和殻，鈴木建夫，上野川修一：食品機能研究
法，株式会社光琳，218～220，2000．
16）
 沖智之，竹林純，山崎光司：食品機能マニュアル
集 第 Ⅱ 集 ，（社）日 本 食 品 科 学 工 学 会 ，79 ～ 86 ，
2008．
17）
 Huang, D., Ou, B., Hmpsch-Woodill, M., Flanagan,
J.A., Prior, R.L. : J. Agric. Food Chem., 50, 4437～
4444, 2002.
18）
 Garcia-Macias, P., Ordidge, M., Vysini, E.,
Waroonphan, S., Battey, N.H., Gordon, M.H., Hadley,P., John, P., Lovegrove, J.A., Wagstaffe, A. : J. Agric.
Food Chem., 55, 10168～10172, 2007.
19）
 Bao, L., Yao, X-S., Tsi, D., Yau, C-C., Chia, C-S.,
Nagai, H., Kurihara, H. : J. Agric. Food Chem., 56,
420～425, 2008.
20）
 近藤君夫，戸井田仁一，蟻川幸彦，小原忠彦：長野県産の食肉の遊離アミノ酸，長野県工業技術総合
セ ン タ ー 食 品 技 術 部 門 研 究 報 告 ，３ ，36 ～ 44 ，
2010．
21）
 五訂増補日本食品標準成分表，文部科学省報告書，
2005．
22）
 大 前 允 人 ： Lactococcus lactis と Streptococcus
thermophilusで製造した新規発酵乳の機能特性に関する研究，74，2008．

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18

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

23） Jao, C.L., Ko, W.C. : Fish. Sci., 68, 430, 2002.
24） Rajapakse, N., Mendis, E., Byun, H.G., Kim, S.K. : J.
Nutri. Biochem., 16, 562～569, 2005.
25） Serpen, A., Gokmen, V., Fogliano, V. : Meat Sci,
90, 60～65, 2012.
26） Hernandez-Ledesma, B., Davalos, A., Bartolome,B., Amigo, L. : J. Agric. Food Chem., 53, 588 ～ 593,
2005.
27） Hernandez-Ledesma, B., Amigo, L., Recio, I.,
Bartolome, B. : J. Agric. Food Chem., 55, 3392～3397,
2007.
28） Zhao, J., Huang, G.R., Zhang, M.N., Cjen, W.W.

Jiang, J.X. : Am. J. Food Tech., 6, 904～913, 2011.
29）
 沖智之，佐藤麻紀，白土英樹，工藤康文，須田郁
夫：焼き栗の殻に含まれる抗酸化成分，九州農業研
究発表会専門部会発表要旨集，72，45，2009．
30）
 六車三治男，難波靖，丸山眞杉，中村豊郎：平成19年度食肉に関する成分等の調査研究事業委託研究
報 告 書 ，（財）日 本 食 肉 消 費 総 合 セ ン タ ー，15 ～35，2008．
31）
 六車三治男，難波靖，丸山眞杉，中村豊郎：平20
年度食肉に関する成分等の調査研究事業委託研究報告書，（財）日本食肉消費総合センター，35～52，
2009．

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平成23年度

19

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

畜産副生物由来（ヘム鉄）摂取によるスポーツ栄養への効果についての研究―栄養摂取状況の観察による貧血改善の試み―
Effect of sports-nutrition-supports by intake of heme-iron on womenathlete.
―Trial of the anemia improvement by the observation of the nutrition
consumption―

松本

恵・鈴木

淳也・勝又

美紀＊・長谷川

強＊・野口

智博

＊

（日本大学文理学部体育学科， ILS株式会社）

Megumi Matsumoto, Junya Suzuki, Miki Katsumata＊，Tsuyoshi Hasegawa＊，Tomohiro Noguchi（Nihon University, College of Human and Sciences, ＊ILS Inc．）

Athletes frequently undergo anemia due to rigorous training, reducing food intake forweight control and destruction of erythrocyte by repeated sole impulse. In addition, menses
make it difficult for females to improve anemia. In this study, to investigate effect of
combination with supplementation and nutritional counselling, intervention trial for female
athletes appealing anemia symptoms was performed. Capsules containing heme-iron were usedas supplement（14mg/day of Fe）. Nutritional counselling was based on iron status（blood
hemoglobin（Hb）, serum ferritin（Fer）, soluble transferrin）, nutrient status and energy
expenditure（records of food intake, activity logs and training load）. Thirty female subjects（20.2±1.3years old, Hb : 12.4±0.7mg/dL, Fer : 17.8±13.7ng/mL）from the fencing, the runninglong jump, the handball and the volleyball players took test capsules every day for 2 months
without nutritional counselling. Subjects whom initial values of Hb and Fer were respectively
above 11.5 mg/dL and 10 ng/mL（n＝20）improved their iron status, but not remained
subjects（n＝10）. Next, these 10 subjects who trained excessively and showed low Hb and Ferlevel took test capsules for further 2 months with nutritional counselling. Supplementation ofheme-iron with increasing of food-derived mineral and protein intake by nutritional counsellingsignificantly increased blood iron levels. Furthermore this combination decreased“negative
moods”, increased“vigor”without constipation. In conclusion, the supplementation of hemeiron is available for sports anemia of female athletes. Combination with long-term
supplementation of heme-iron and nutritional counselling could enhance effect of improving
sport anemia of the highly-trained athletes.

１．目る健康障害であり，パフォーマンスを著しく低下

的させる要因でもある１）。スポーツ貧血の原因の多貧血症状は女性スポーツの現場において頻発す

くは運動量の増加に伴って増加する鉄の必要量に© The Ito Foundation

20

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

見合う食事からの鉄摂取量が充足できないことに個人の栄養摂取状況が大きく関与していることがよると考えられる 。そのため，貧血症状を予防懸念される３，４）。

１）

または改善するためには，鉄が供給できる食品を本研究では，ヘム鉄の摂取による鉄栄養状態の積極的に摂取できるような食事指導が行われた改善効果とその効果におよぼす他の栄養成分の摂り，症状が重篤な場合は医師による鉄剤の投薬治

取状況の個人差について明らかにすることを目的療が施されている 。しかし，貧血症状を呈するとし，貧血症状の自覚症状を持ち，鉄栄養状態がことの多い女性アスリートの場合，新体操などの不良な女性スポーツアスリートにヘム鉄を継続的

審美系の競技者でプロポーションの維持のため，に摂取してもらい，その間の栄養摂取状況を観察

日常的に食事量を制限していたり，陸上長距離選する。この研究成果が，より効果的な鉄補給サプ

手のように激しい運動量で消費される鉄を食事のリメントの使用方法とその食事指導方法の発展のみで補うことが非常に難しいという例が多く，食一助となることを目指す。

２）

事指導の効果を発揮することが難しい。また，鉄剤の投薬治療は通院が必要であるため，重篤な症

２．方

法

状で無い限りは治療に踏み切らない選手も多く，

2.1

被験者

また，選手によっては，鉄剤の使用により，便秘被験者は，Ｎ大学に在籍する競技スポーツを行を誘発することがあり，治療に対して消極的になう女子大学生で本人に貧血症状の自覚症状がある

らざるをえない。そこで，貧血症状の予防や軽度ことを条件に募集し，血液中のヘモグロビン値の症状の改善のためには，鉄剤の投与治療よりも（Hb）が13.4g/dL以下，10.0g/dL以上，フェリチ

負担の少ない方法が期待される。

ン値（Fer）が40ng/mL以下，2.8ng/mL以上の

これまでに我々は鉄補給サプリメントとして，

軽度～中程度スポーツ貧血と考えられ，重篤で医畜産副生物由来のヘム鉄を用い，中・高校生競泳

師による治療が緊急を要しない平均20.2±1.3歳の選手の鉄栄養状態の改善が，競泳パフォーマンス

30名を選出した。各被験者の競技種目はバレーにおよぼす影響を調べてきた。その結果，ヘム鉄

ボール，バスケットボール，ハンドボール，陸上の摂取は，鉄栄養状態を改善し，トレーニングの

短距離・幅跳び，トライアスロン，水泳，ライフ効果を向上させ，パフォーマンスを改善すること

セービング，バトミントンで，競技歴は平均9.1

や，高強度のトレーニングによる心理的なストレ±1.8年であった。被験者には試験方法や考えらスを軽減する働きがあることを明らかにしてきれる不利益等について事前に十分に説明し，同意た。しかし，その鉄栄養状態の改善効果は選手にを得られる場合のみ試験に参加して頂いた。な

よって個人差が大きく，とくに女性の被験者で顕お，本研究は日本大学文理学部倫理委員会の承認著であった。貧血症状の改善には鉄の摂取量を増を得て実施された。

加させ，体内鉄プールを増加させることが重要で2.2あるが，体内鉄プールを増加させるためにはその試験開始前の血液検査により，被験者をHbが他の栄養成分の摂取状況の改善も重要であること

12.0g/dL，Ferが10ng/mL以上の20名を軽度貧血が考えられる。とくにタンパク質の摂取は鉄輸送

グループ，以下の10名を中度貧血グループに分タンパク質の確保のためにも十分に摂取すること

け，それぞれのグループにヘム鉄カプセル（ILSが望ましい。貧血症状の改善効果の差には被験者

株式会社，ヘムロン２Hi）を毎日朝と夕食時に© The Ito Foundation

介入方法

畜産副生物由来（ヘム鉄）摂取によるスポーツ栄養への効果についての研究

21

700㎎（鉄として７㎎），１日に合計1,400㎎（鉄た技術系トレーニングと，心肺機能の向上を目指

として14㎎）を２か月間継続的に摂取していただ

した持久系トレーニングと，筋力や筋量の増加をいた。１回目の介入期間では，食事や生活活動に目指した筋力トレーニングのそれぞれ１週間中の特別な制限は設けなかったが，中度貧血グループ

総量を聞き取りによって調査した。貧血症状の状のみ１回目の介入に引き続き，さらに２か月間，態が心理状態におよぼす影響については，気分プ

ヘム鉄カプセルを摂取してもらい，さらに，２週

ロフィール検査（金子書房，日本語版POMS短縮

間に１度，栄養面談を行い，サプリメントと栄養版）を用いて評価した。

指導を併用した。試験の前後で，血液検査，食事

2.4

摂取頻度調査，体組成測定，体調聞き取り，心理

栄養面談は，中度貧血グループの10名のみ，１テスト（POMS）を行い，鉄栄養状態の改善状況

回目の介入の終了後，１回30分程度で２週間に１を確認した。

度，血液検査の結果と食事調査や体調聞き取り，

2.3

測定項目

栄養面談

トレーニング内容を基に栄養指導を行った。指導

血液検査は，血液中のアルブミン（Alb），赤は，食事摂取基準2010を基準に，個々に指導計画

血 球 数（RBC），Hb ，ヘ マ ト ク リ ッ ト（Ht），を作成した。朝食の欠食の改善，タンパク質摂取

MCV，MCH，MCHC，血清鉄（Fe），総鉄結合量の増加，鉄分を多く含む野菜や肉類の摂取増能（TIBC），不飽和鉄結合能（UIBC）フェリチ

加，タンニンを多く含むコーヒー，紅茶，緑茶のン（Fer），亜鉛（Zn）について測定した。体組

摂取量の制限を中心に，個人の生活状況（寮や一成 は イ ン ピ ー ダ ン ス 法 （BOIOSPACE ， In

人暮らし，家族との同居等）やトレーニング内

Body520）を用いて，体重，体脂肪率，筋量を測

容，便秘や下痢の状況に合わせて行った。

定した。食事調査は１週間の思い出し方式による

2.5

食 事 摂 取 頻 度 調 査（建 帛 社 ，エ ク セ ル 栄 養 君

得 ら れ た デ ー タ は す べ て ，統 計 処 理 ソ フ ト

Ver6.0アドインソフトFFQgVer3.5）を用いて，（SAS Institute Japan, JMP ８）を 用 い て 平 均 値

総摂取カロリー，炭水化物，タンパク質，脂質，と標準誤差を算出した。各グループ間と各グルー

鉄，亜鉛などの各栄養成分摂取量，穀類，肉類，

プのPreとPostの測定値の比較はTukey-Kramer

野菜類，嗜好飲料などの食品群別摂取量の比較をのHSD検定を使用して確認した。各グループの行った。体調の聞き取りシートを作成し，日常的介入前後の測定値の変化はStudent-t検定を使用

な貧血の自覚症状として，“身体のだるさ”，“めして比較した。

まい”
，
“頭痛”
，
“吐き気”
，
“起床時の気分の悪さ”，“胃のむかつき”等，トレーニング中の感覚とし

統計処理

３．結果と考察て，“息切れ”，“だるさ”，“頭痛”，“筋肉痛”な

3.1

どの項目についてその症状の出現頻度を“全くな被験者30名の平均値はHbが12.4±0.7g/dL，い”から“いつもある”の５段階選択式の回答方

Ferが17.8±13.7ng/mLであった。１回目の介入法を用いて評価した。便秘や下痢についても鉄分

試験後の血液検査では，貧血の指標のMCV，の摂取の影響を確認するために，質問項目に加え

MCH，Hb，TIBC，UIBC，Ht値はヘム鉄カプセ

た。また，試験期間中のトレーニング量に関して，

ルを摂取することによって改善傾向が見られたゲームや競技の技術を向上させることを目的としが，有意な変化は見られなかった（Table１）。

© The Ito Foundation

血液検査結果22

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Table１ The concentrations of blood iron status in light anemia group and middle anemia group to oral

feeding heme-iron at Pre and Post.
1st
Middle anemia groupLight anemia group
Pre

Post

Pre

2st
Middle anemia
group

Post

Post

Alb, g/dL

4.7±0.06

4.6±0.1

4.6±0.06

4.5±0.1

4.7±0.07

RBC, 10４/μL

439.5±4.6453.0±3.1442.9±15.5451.4±15.7452.0±15.3

MCV, fL

90.1±0.9ab

91.6±0.7ａ

84.4±1.9ｂ

84.9±1.9ab

86.0±1.7ab

MCH, Pg

29.8±0.3ａ

30.0±0.2ａ

27.0±0.9ab

26.8±0.8ｂ

27.1±0.7ab

MCHC, ％

33.2±0.1

32.7±0.231.9±0.431.5±0.3

31.5±0.3

Ht, 10 /μL

39.5±0.4ab

41.5±0.3ａ

37.1±0.6ｂ

37.5±1.1ab

40.9±1.5ab

Reti, ‰

11.0±0.511.2±0.9

8.3±0.6

8.7±0.6

8.3±0.5

Hb g/dL

13.1±0.1ab

13.7±0.1ａ

11.6±0.2ｃ

12.1±0.4bc

12.6±0.3abc

Fe, mg/dL

93.5±9.7bc

151.3±11.4ａ

49.2±7.0ｃ

72.1±12.5bc

108.5±18.1ab

４

TIBC, μg/dL

322.6±9.3ｂ321.4±12.4ｂ

405.8±19.4ａ

409.5±19.2ａ

417.1±24.6ａ

UIBC, μg/dL

210.6±18.3ｂ

197.8±16.9ｂ

356.6±22.3ａ

337.4±20.3ａ

308.6±24ａ

Fer, ng/mL

31.4±1.9ｂ

41.9±3.1ａ

6.3±0.9ｃ

9.6±2.9ｃ

11.7±1.5ｃ

Zn, μg/dL

89.9±7.784.5±4.685.8±2.582.4±5.0

92.9±2.2

Values are represented as means±SEM（n=20 or 10）. Statistical analyses were performed by one-way analysis of variance. A
p-value≦0.05by a Tuhey-Kramer test amongthe five groups was considered to indicate statistical significance. Values for the oneway ANOVA test are indicatedas significant with differentletters.

RBC，MCHC，Alb，Znは介入前後で有意な変化3.2は無かった。Fe，Ferは軽度貧血グループで，介体重，体脂肪量，筋肉量に介入前後の全期間を入前（Pre）と比較して介入後（Post），有意に増通して，大きな変化は見られなかった（Table２）。

加したが，中程度貧血グループでは増加傾向に留介入期間は平成23年10月から３月までであった

まった。中程度貧血グループのみ継続した，２回が，本研究での被験者の競技種目ではほとんどの目の介入試験では，血清鉄が１回目のPreと比較

競技で試合期間が終了し，介入期間中に大きなトして２回目のPostで有意に増加した。中度貧血グ

レーニング内容の変化が無かったことや筋力ト

ループの２回目のFe，Hb，Ferの変化値は１回レーニングを積極的に取り入れている被験者が少目の変化値と比較して有意に高値を示し，軽度貧なかったことなどから，筋肉量や体脂肪量の変化

血グループの変化値に迫る値であった（Fig.１）。

が見られなかったのかもしれない。

体組成の変化

これらの結果より，ヘム鉄カプセルの２か月間の3.3

継続摂取は，血液検査から評価される貧血指標を

食事摂取頻度からの推定エネルギー摂取量やタ

軽度の貧血は改善したが，貧血症状が重い場合はンパク質摂取量，鉄摂取量，亜鉛摂取量は，中度

その効果が低いことが考えられた。しかし，食事

貧血グループの食事指導を行った２回目の介入後指導と併用し，ヘム鉄摂取をさらに２か月間継続で増加傾向が見られたが有意な変化は見られな

摂取することによって，血液の鉄状態を改善する

かった（Table３）。食品群では，タンパク質やカことが示唆された。

ルシウムの供給源の魚や小魚類，乳製品，鉄分の© The Ito Foundation

食事調査の結果

23

畜産副生物由来（ヘム鉄）摂取によるスポーツ栄養への効果についての研究
p=0.041p=0.041
1.4

70

1.2

60

1.0

50
Hb, mg/dL

Fe, mg/dL

80

40
30
20

0.8
0.6
0.4
0.2

10

0.0

0
Light

1st Middle

Light

2st Middle

1st Middle

2st Middle

p=0.009
p=0.01214
12
10

P<0.0001

Fer, ng/mL

8
6
4
2
0
Light

1st Middle

2st Middle

Fig.１ Changes in Blood Fe, Hb and Fer between Pre and Post in light anemia group and middle anemia

group to oral feeding heme-iron. Values are represented as means±SEM（n=20 or 10）.A p-value
by a Student-t test each groups was considered to indicate statistical significance.

Table２ Body weight and Body fat, Muscle mass in light anemia group and middle anemia groupto oral feeding heme-iron at Pre and Post.
1st
Middle anemia groupLight anemia group
Pre

Post

Pre

Post

2st
Middle anemia
group
Post

Weight, ㎏

56.5±2.3

57.2±2.553.4±1.353.9±1.354.7±1.4

Body fat, ％22.8±1.1

22.8±1.2

23.1±1.722.8±1.823.2±2.3

Muscle mass, ㎏

23.5±1.0

23.8±1.0

22.1±0.922.2±1.0

22.6±1.5

Values are represented as means±SEM（n=20 or 10）. Statistical analyses were performed by one-way analysis of variance. Apvaiue≦0.05by a Tukey-Kramer test among the five groups was considered to indicate statistical significance. Values for the oneway ANOVA test are indicated as significant with differentletters.

© The Ito Foundation

24

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Table３ Food intake and nutrientsin light anemia group and middle anemia group to oral feedingheme-iron at Pre and Post.
1st
Middle anemia groupLight anemia group

2st
Middle anemia
group

Pre

Post

Pre

Post

Post

Total energy, kcal

2381±252

2253±1762090±120

1964±1122111±176

Protein, g

75.4±9.475.2±5.2

66.5±6.0

67.7±5.872.3±5.0

Carbohydrate, g314.7±28.4

290.4±25.1

263.9±17.0

254.0±12.8

307.9±21.2

Fat, g81.6±10.280.3±5.866.2±4.968.8±5.875.7±7.2

Fe, mg8.2±0.9

7.9±0.8

7.2±0.8

6.6±0.6

8.3±0.8

Zn, mg9.5±1.3

9.2±0.7

7.9±0.8

7.9±0.7

8.7±0.6

Brightly coloredvegetables, g

78.1±22.1ab

74.0±21.2ab

38.7±7.6ｂ

61.5±15.4ab

101.8±12.6ａ

147.9±28.9149.7±35.5

78.4±18.3

102.9±19.5132.4±22.1

hypochromic
vegetable, gSeafood, g

43.6±14.5

38.0±6.935.0±7.742.0±12.0

54.7±11.2

Meat, g143.6±25.8144.0±18.5

106.9±22.7

106.9±16.9

97.7±17.2

Egg, g35.8±5.6

29.6±4.3

23.0±5.929.0±11.0

41.6±11.7

Dairy products, g

180.8±33.0

157.8±35.1

134.3±23.8

179.1±47.1

227.9±55.7

Small fish, g

2.8±1.6

2.7±1.2

2.0±0.92.4±1.2

3.8±1.2

Values are represented as means±SEM（n=20 or 10）. Statistical analyses were performed by one-way analysis of variance. A
p-value≦0.05 by a Tukey-Kramer test among the five groups was considered to indicate statistical significance. Values for the oneway ANOVA test are indicated as significant with differentletters.

Table４ Athletic career and training in light anemia group and middle anemia.
Light anemia group

Middle anemia group

Athletic career, years

9.1±1.89.1±1.6

Start athletic years age

9.1±1.2

10.8±1.1

Technical training
h/week

7.3±2.3

9.5±1.9

Endurance training
h/week

4.7±1.6

4.8±2.0

Strength training
h/week

2.8±1.2

1.9±0.7

Values are represented as means±SEM（n=20 or 10）. Statistical analyses were performedb y o n e - w a y a n a l y s i s o f v a r i a n c e . A p - v a l u e ≦0 . 0 5 b y a T u k e y - K r a m e r t e s tamongthefivegroups was considered to indicate statistical significance. Values for the oneway ANOVA test are indicated as significant with differentletters.

供給源である緑黄色野菜の摂取頻度が中度貧血グ

軽度貧血グループと中度貧血グループを比較しループで２回目の介入後増加する傾向が見られて，技術系トレーニング量で中度貧血グループのた。軽度貧血グループの１回目の介入前後では栄トレーニング量が高値，筋力トレーニングで定値

養摂取状況に変化は見られなかった。

を示す傾向が見られた（Table４）。日常的な体調3.4

体調の聞き取りとトレーニング量の聞き取りでは，個々のアンケート結果からヘム© The Ito Foundation

25

畜産副生物由来（ヘム鉄）摂取によるスポーツ栄養への効果についての研究
Table５ Chronic physical condition and physical condition in training in light anemia group and middle

anemia group to oral feeding heme-iron at Pre and Post.
1st
Middle anemia group

Pre

Post

Pre

Post

Post

Feel languid

3.5±0.3

3.1±0.1

2.8±0.2

2.8±0.3

2.9±0.2

Hardships of morning

3.7±0.4

3.8±0.2

3.1±0.2

2.9±0.3

2.6±0.3

Head feels heavy

2.9±0.5

2.8±0.5

2.5±0.3

2.1±0.4

2.1±0.2

Chronic
physicalcondition

Physicalconditionin training

2st
Middle anemia
groupLight anemia group

Headache2.8±0.4

2.6±0.4

2.3±0.3

2.2±0.4

1.9±0.3

Giddiness

3.3±0.5

2.6±0.2

3.2±0.3

2.9±0.3

2.4±1.5

Nausea1.6±0.3

1.3±0.2

1.7±0.2

1.6±0.3

1.5±0.3

Shortness of breath

2.6±0.3

2.4±0.3

3.3±0.3

2.7±0.3

2.5±0.15

Tired feeling

3.1±0.4

2.3±0.4

2.8±0.2

2.5±0.3

2.5±1.9

Muscular fatigue

2.8±0.5

2.8±0.3

2.7±0.2

2.0±0.3

1.9±0.3

Headache due to lackof oxygen2.6±0.4

2.5±0.4

1.9±0.3

1.7±0.2

1.6±0.3

Values are represented as means±SEM（n=20 or 10）. Statistical analyses were performed by one-way analysis of variance. A
p-value≦0.05by a Tukey-Kramer test among the five groups was considered to indicate statistical significance. Values for the oneway ANOVA test are indicatec as significant with differentletters.

Table６ Profile of Mood States in training in light anemia group and middle anemia group to oral

feeding heme-iron at Pre and Post.
1st
Middle anemia groupLight anemia group

2st
Middle anemia
group

Pre

Post

Pre

Post

Post

Tension-Anxiety

13.0±1.4ab

8.5±1.5ab12.7±1.5ａ

12.9±1.4ａ

7.6±0.9ｂ

DepressionDejection

10.6±2.1ab

9.5±2.3ｂ

16.0±1.3ａ

13.8±1.4ａ

5.8±1.5ｂ

Anger-Hostility

11.5±2.2ａ

8.8±2.6ab

16.0±1.8ａ

15.0±1.4ａ

4.4±0.9ｂ

Vigor

10.6±1.5ab

10.4±1.4ab

8.2±0.9ｂ

9.8±1.2ab

13.1±0.9ａ

Fatigue9.7±0.67.9±1.812.5±1.99.7±1.2

8.9±0.7

Confusion

12.6±1.4ab

9.3±1.7bc

14.9±0.6ａ

9.9±1.7bc

6.5±0.9ｂ

Values are represented as means±SEM（n=20 or 10）. Statistical analyses were performed by one-way analysis of variance. A
p-value≦0.05 by aTukey-Kramer test among the five groups was considered to indicate statistical significance. Vaiues for the oneway ANOVA test are indicated as significant with differentletters.

鉄を摂取して，“だるさがなくなった”，“朝，起考えられる。トレーニング中の感覚では筋肉疲労

きるのがつらくなくなった”などの自覚症状の改やトレーニング後の頭痛の出現が２回目の中度貧善を挙げる被験者がいたが，貧血症状の出現頻度

血グループのPostで１回目のPreと比較して改善の回答では大きな変化は見られなかった（Table

傾向が見られた。このことは，ヘム鉄カプセルの５）。これはそれぞれの自覚症状に個人差が大き

長期継続的摂取と栄養指導の併用がトレーニング

く，統計的な傾向を掴むことが難しかったことが時の疲労感も改善する可能性があることが考えら© The Ito Foundation

26

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

れた。なお，全介入試験期間を通して，両グルーングが重要であると言えるだろう。しかし，本研

プともに便秘や胃痛を訴える被験者は無かった。

究での栄養指導だけでは，有意に被験者のタンパ

3.5

ク質摂取を増加させることができず，血液検査の心理状態の変化

１回目の介入前後を比較して，軽度，中度貧血

Alb値も上昇しなかった。また，スポーツ選手にの両グループとも大きな変化は見られなかった

とって重要な筋量の増加や体脂肪の低下などを達が，中度貧血グループの２回目の介入試験では成することができず，食事の改善だけではタンパ“緊張―不安”，“抑うつ―落ち込み”，“怒り―敵

ク質の栄養状態を改善することが難しいことが考意”，“混乱”の項目で有意に低下した（Table６）。

えられた。貧血症状をもつスポーツ選手は酸素運“活気”の項目は有意に増加した。このことから，搬能力の低下や血流の低下などからタンパク質代

中度の貧血症状のスポーツ選手にヘム鉄のサプリ

謝にも影響があり，筋量の増量効率が低い可能性

メントと栄養指導を併用すると，気分や感情の状が考えられる５～７）。今後は，ヘム鉄カプセルとと態が改善され，「生き生きする」などのポジティ

もにタンパク質源の補給方法を工夫し，トレーニ

ブな感情が上昇することが明らかとなった。

ング内容のモニタリングや改善指導も併用した栄

3.6

総合考察

養サポートを検討する必要があり，その方法が確

ヘム鉄カプセルを２か月間継続的に摂取することによって，食事の改善や生活の改善指導がなくても，軽度の貧血症状の女性スポーツ選手であれ
ば，血液検査から評価される貧血症状の指標が改立されることがスポーツ選手にとって大変有用な情報になるであろう。
４．要

約

善されることが明らかとなった。本試験での軽度

女性スポーツアスリートにとって貧血はパ

貧血グループの被験者の血液検査結果は，一般のフォーマンスを著しく低下させる病状の一つで，貧血改善治療を必要とする指標と比較すると，す将来にわたっても健康被害が懸念される。スポー

べて正常の範囲内にあるが，アスリートが高いパ

ツ選手は運動量の増加や食事摂取量の減少，反復

フォーマンスを発揮することを目指すと，トップされる足裏の衝撃による赤血球の破壊などが原因

アスリートのHb値は14g/dL以上が望まれるたで貧血を頻発しやすい。とくに女性は月経の影響

め，ヘム鉄カプセル摂取による貧血指標の改もあり，貧血症状の改善が困難である。本研究で善効果は，競技成績の向上に効果があることが期

は，栄養指導による食事内容の改善と，ヘム鉄サ

待される。しかし，心理状態や体調の自覚症状にプリメントの併用による女性アスリートの貧血症は顕著な改善効果は見られなかったことから，栄状の改善効果を明らかにするために，貧血症状を養指導や生活改善指導のための面談を通したカウ

訴える女性アスリートにヘム鉄サプリメント

ンセリングが無かったことが関係していると考え（Fe, 14㎎/day）を長期間摂取してもらい，さらられた。このことは，ヘム鉄カプセルの摂取のみに血液検査，食事調査に基づく栄養面談を併用しでは，顕著な貧血改善効果が見られなかった中度

て行った。

５～７）

貧血グループの被験者が栄養指導を併用すること

被験者は20.2±1.3歳の女性30名で，試験開始前

によって，貧血指標の血液検査結果が改善し，心の血液中Hb値は12.4㎎/dL，Fer値は17.8ng/mL

理状態やトレーニング時の体調に改善効果が見らあった。２か月間のヘム鉄サプリメント摂取のみれたことによっても栄養指導を含めたカウンセリ

で食事指導を行わなかった場合，試験開始と終了© The Ito Foundation

畜産副生物由来（ヘム鉄）摂取によるスポーツ栄養への効果についての研究

後を比較して，Hb，Fer値の正常に近いグループ
はこれらの有意な増加が見られたが，11.5㎎/dL,
10ng/mL以下のグループでは貧血症状に有意な変化は見られなかった。そこで，顕著な改善効果が見られなかった，陸上幅跳び，ハンドボール，
バレーボールなどのスポーツ貧血が疑われる，
Hb，Fer値が低い10名の被験者に対して継続して２か月間，ヘム鉄カプセルの摂取とともに，食事指導を行い，食事からのミネラル，タンパク質の摂取を増加させたところ，有意に血清鉄値が上昇した。試験期間中は鉄剤に見られる便秘症状などは見られず，心理調査の結果も疲労感が減少し，「活気」が増加した。
以上の結果より，女性のスポーツ貧血の改善に
はヘム鉄カプセルの摂取が有効であるが，貧血症状が強く，運動量の多い選手には，食事指導をと

27

文 献
１）
目崎 登：女子スポーツ選手の貧血，The journalof clinical sports medicine，12（2）,164, 1995.
２）
溝口 秀昭：貧血の病態と治療，最近の進歩，日本
内科学会雑誌，93（9），1729～1738，2004．
３）
西山 宗六，中村 俊郎，井本 岳秋：女子長距離
ラ ン ナ ー の 貧 血 に 対 す る 亜 鉛 の 治 療 効 果 ，Thejournal of clinical sports medicine ， 12（10）,1192 ～
1195, 1995.
４）川野 因：スポーツ貧血発現における食事の役割（特集／スポーツ栄養に関する最近の話題），食品と開発，41（８），８～10，2006．
５）
Pelliccia A, Di Nucci GB. ： Anemia in swimmers，
fact or fiction? Study of hematologic and ironstatus in male and female top-level swimmers. Int J
Sports Med. 8，227～230, 1987.
６）
Rietjens GJ, Kuipers H, Hartgens F, Keizer HA. ：Red blood cell profile of elite olympic distance
triathletes. A three-year follow-up. Int J Sports Med.
23，391～396, 2002.
７）
 J Athl Train.：The International Olympic
Committee（IOC）consensus statement on periodic
health evaluation of elite athletes，March2009. 44，
538～557, 2009.

もなった長期間のサポートがその効果をより向上させることが示唆された。

© The Ito Foundation

28

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

低温乳酸発酵による食肉タンパク質の組織構造と加熱ゲル物性に関する研究
Changes in the heat-induced gel structure and physical properties ofmuscle protein fermented with psychrotropic lactic acid bacteria

芳

賀

聖

一・林

利

哉

（名城大学農学部）

Seiichi Haga and Toshiya Hayashi（Faculty of Agriculture, Meijo University）

The aim of this study is to investigate the heat-induced gel formation ability of muscle
protein fermented with lactic acid bacteria in cold temperature. We prepared and usedmyofibrillar protein having key-role for water-holding and binding properties in meat products
as a gelation model system. The myofibrillar protein were fermented with 2 strains ofpsycrotrophic lactic acid bacteria, Lactobacillus sakei D-1001 （commercial strain）and
Lactobacillus sakei No. 4（in-house strain: not fully identified）at 4℃, respectively. After heat
treatment at 70℃ for 30 min, physical properties and microstructure of resulting gels wereanalyzed.
Although fermentation profiles between 2 kinds of strain were not always same, bothmyofibrillar protein gels fermented with these lactic acid bacteria showed higher gel strengthand syneresis rate when compared with non-fermented gels. However, there was no distinct
difference in protein distribution between fermented and non-fermented samples. The resultsof differential scanning calorimetry analysis showed that lactic acid fermentation had strong
effect on thermal stability of myofibrillar protein. The gel microstructure of each fermented gel
appeared to have more fine and strand-type structure compared with that of non-fermented
gel. This was strongly supported by the results of image analysis on microstructure of the gels.
Although the changes in microstructure and physical properties of fermented gels could
be due to inter-and intra-molecular reactions caused by lactic acid fermentation, further
detailed examination will be needed.

１．目

点が存在するため，多くの課題を解決する必要が的ある。当研究室では，低温（５℃前後）で増殖可

発酵処理を施した食肉製品は防腐・保存効果の能な乳酸菌をスターターカルチャーとして利用し増大，発酵風味の付与等の発酵食肉製品特有の品

た発酵食肉製品の開発に関する基礎的研究を進め質が付与される。しかし，通常行われる発酵処理ている。低温発酵処理を施した筋原線維タンパクでは有害微生物による汚染リスク，嗜好面での難質はＺ帯崩壊による小片化が促進されるが，小片© The Ito Foundation

低温乳酸発酵による食肉タンパク質の組織構造と加熱ゲル物性に関する研究

29

化とpH低下の推移からpH5.5付近に変曲点のある

線維タンパク質のpHが5.3～5.4付近に達するまでことを見出した。

発酵処理を行った。その後，これらの試料を，そこで本研究では，pH低下に伴う筋原線維タ

70℃に設定したプロサーモバス（東京理化器械株

ンパク質の小片化率の推移曲線における変曲点付式会社，NTB-221型）を用いて30分加熱した。

近を発酵の終点とし，発酵処理を行った後の筋原

2.2

実験方法

線維試料の加熱ゲル化特性について検討した。

⑴

乳酸菌数の測定２．方調製した非発酵試料の10～10５倍希釈液と発酵法

試料の10５ ～10９ 倍希釈液をMRS培地にて30℃，

2.1

実験材料

48時間培養し，乳酸菌数（log CFU/ml試料）を⑴

乳酸菌スターターの調製算出した。

筋原線維タンパク質に接種する乳酸菌スター
ターとして，サンエイ糖化株式会社より譲渡され⑵

物性，離水率，溶解度の測定調製された非発酵・発酵の加熱ゲル試料をレオた 未 同 定 の 低 温 増 殖 性 乳 酸 菌 株 Lactobacillus

ナー（株式会社

sakei属の菌株No.４（以下No.４と略す）およ

フ ト ウ エ ア（山 電 株 式 会 社 ，破 断 強 度 解 析び，Lactobacillus sakei D-1001（以下Ｄ1001と略

Ver1.0）を用いて物性測定を行った。離水率は藤す）を用いた。

田ら４）の測定法に基づいて算出した。また，溶解

１）

山電，RE2-33005Ｓ）と解析ソ

冷凍保存した乳酸菌を流水中で解凍し，前培養度の測定は各加熱ゲル試料を遠心分離（35.000×ｇ，

後，更新処理後，遠心分離［（株）久保田製作所

15分，４℃，日立工業株式会社，CP70G型）し，6930ローターRA-３］（8,000×ｇ，10分，４℃）

その後，上澄み液をろ過して，上澄み画分と沈殿し，0.85％滅菌生理食塩水で洗浄を繰り返したも画分に分離した。得られた上澄み画分のタンパクのを乳酸菌スターターとした。

質濃度の加熱前タンパク質濃度に対する相対比率⑵

筋原線維タンパク質の調製を算出して溶解度とした。

市販豚ロース肉から脂肪と結合組織をできるだ⑶ SDS -ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動

け取り除き，約５㎝角のブロック肉に切り，フー（以下，SDS -PAGEと略す）

ドプロセッサーにかけて（30秒間）ミンチ状にし⑵で得られた各上澄み画分，沈殿画分，筋原線

た 。試 料 か ら の 筋 原 線 維 調 製 は Perry ら ，維タンパク質未加熱試料および離水液のタンパク

Etlingerら３）の方法を一部改変し実施した。得ら

質分布をSDS -PAGE（アクリルアミド濃度7.5％

れた筋原線維タンパク質を0.6M-NaClを用いて一～20％）により調べた。なお，沈殿画分はSDS添

晩 透 析 し ， 終 濃 度 が 15 ㎎ /ml と な る よ う に加のもと，ハンドホモゲナイザーで溶液状態にな

0.6M-NaClで希釈した。また，グルコースを筋原るまで完全にすりつぶして供試した。

２）

線維タンパク質の質量２％となるように，乳酸菌⑷

スターターを筋原線維タンパク質の質量３％とな試料として約60㎎秤量した未加熱試料と，リるように接種し，４℃の条件下で発酵処理を行っファレンスとして試料と同等量の蒸留水をそれぞた 。pH メ ー タ ー（HORIBA pH METER F-12）

れ銀密閉型容器に封入したものを用意し，この二を用いて１～２時間ごとにpHを測定し，Ｄ1001

つを超高感度型示差走査熱量計（セイコーインス

およびNo．４の乳酸菌スターターを接種した筋原

ツルメンツ株式会社，DSC6100）にセットして示© The Ito Foundation

示差走査熱量測定（以下，DSCと略す）30

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

7

9

7

6.5

6

pH

5
6
4
3
5.5

2
1

5

0

4

6

8

10

12

14

16

17

lactic acid bacterial counts（logCFU/gmeat）

8

0

Time
（hr）
Fig. 1 Changes in lactic acid bacterial counts and pH during lactic acid fermentation of myofibrillar

protein at ４℃.bacterial count(bar charts) : open bar, non-fermentation; striped bar , D1001; solid bar ,No.４ pH（line charts）：○，non-fermentation；□，Ｄ1001；●，No.４

差走査熱量測定を行った。測定温度は９～150℃の範囲で，昇温速度は1.0℃/minとした。
⑸ 走査型電子顕微鏡（以下，SEMと略す）

３．結果と考察⑴

発酵終点における乳酸菌数とpHの変化

非発酵区，Ｄ1001およびNo.４のスターターをによる微細構造の観察
２×３×３㎜程度にトリミングした各種加熱ゲ接種した発酵区を変曲点付近に達するまで，低温

ル化試料を，固定，洗浄，脱水置換し，臨界点乾下（約４℃）で保存し，pHの変化と乳酸菌数を燥機（HCP-２型，日立工業株式会社）により試測定した。Ｄ1001およびNo.４の変曲点はそれぞ

料を乾燥させた。乾燥試料に，イオンスパッタリ

れpH5.26，pH5.35であるためpH5.4付近を発酵終ング装置（日立工業株式会社，Ｅ-101）を用いて，点とした。

厚さが約300Åになるように白金を蒸着した。こFig.１に示すように乳酸菌数は，非発酵区ではの試料を，走査型電子顕微鏡［Ｓ-3000Ｈ型］を発酵区における発酵終点時で103 レベルを維持し用いて観察した。SEM画像により得られた画像ており，大きな変化は認められなかった。一方，は客観的に解析するため二値化処理 を行い，数Ｄ1001，No.４を接種した発酵区では，ともに10７

値化して物性との相関性について検討した。

～10８レベルを推移した。pHに関しては，Ｄ1001５）を接種した筋原線維タンパク質は約17時間で，No.４のそれは約14時間で変曲点付近に達した。

© The Ito Foundation

31

低温乳酸発酵による食肉タンパク質の組織構造と加熱ゲル物性に関する研究
Table 1 Comparison in the physical properties of heat-induced gels with or without fermentation

３

Breaking energy（J/m ）non-fermentation

D1001

No.４

316.9±206.4ａ

2352.4±1803.9ｂ

2068.3±1648.7ｂ

Modulus of breaking elasticity（N/㎡）

104.2±56.6ａ

1145.6±565.6ｂ

1013.5±500.0ｃ

Syneresis rate（％）

73.29±1.62ａ

76.69±2.19ｂ

75.88±1.43ｂ

Protein solubility（％）

6.60±0.04ａ

2.62±0.42ｂ

3.06±0.28ｂ

Values in same row with the same letters are not significantly different (P＞0.05）．

同時間でのＤ1001とNo.４のpH推移を見ると，Ｄ成分分布をSDS -PAGEで検討した。その結果，

1001よりNo.４の方が常に低いpHを示し，同一菌

Fig.２に示すように，非発酵と発酵の未加熱試料

種でも菌株間での差異が認められた（Fig.１）。

には，筋原線維タンパク質の主要なバンドが明瞭⑵ 非発酵および発酵後の筋原線維加熱ゲルのに観察され，15時間前後の発酵処理では構成タン
パク質成分に特記される差異は認められなかっ

物性，離水率，溶解度の変化
非発酵および発酵試料の加熱ゲル物性，離水率

た。また，加熱ゲルにおいても同様で，ミオシン

および溶解度を測定した。その結果，Table１にヘビーチェーン（MHC）とアクチン（Actin）を示すように，両物性値とも発酵区において有意に主とするタンパク質がゲル形成の実質を担ってい（Ｐ＜0.01）高い値を示した。また，菌株間で比ることが明らかとなった。また，菌株間でも大き較すると，破断エネルギーでは両者間に有意差がな差異が確認できなかったことから，Ｄ1001と確認されなかったが，破断弾性率ではＤ1001よりNo.４では同一のタンパク質成分がゲル形成に関

No.４の値の方が有意に（Ｐ＜0.01）低い値を示与していることが判明した。

した。以上のように，発酵による物性値増大が明

これまで当研究室では，加熱前に様々な処理

らかとなり，菌株によりその影響が異なることが（発酵，凍結，レトルト処理）を施した食肉から示唆された。

調製した筋原線維タンパク質において，Ｚ帯の構次に，加熱ゲルの離水率を求めた（Table１）。

造に関わるα-アクチニンの離脱に伴う筋原線維

有意差は認められなかったものの発酵によって離の脆弱化を示唆しているが，本研究で行った15時

水量が増大する傾向にあることが示された。

間前後の発酵処理では未加熱ゲル試料と加熱ゲル

続いて，加熱前タンパク質量に対し，ゲル形成

試料においては発酵の有無による大きな差異が確に関与しなかったタンパク質量の比率を表すもの

認できず，今後さらなる検討を行うことにする。

として溶解度を測定した。その結果，非発酵区に⑷

対し発酵区は有意に（ｐ＜0.05）低い値を示し，続いて，発酵処理を施した筋原線維タンパク質発酵に伴ってゲル形成に関与するタンパク質量がの熱力学的特性をDSCにより調べた。本実験では相対的に増加したことを示すもので，物性値の変

非発酵およびＤ1001添加の発酵試料について，変化とよく対応していた。

性開始温度（Ｔ１），変性ピーク温度（Ｔ２）およ⑶タンパク質成分の分布変化

示差走査熱量測定

び変性エンタルピー（⊿Ｈ）を求めた。

先の結果より，発酵処理による物性値の上昇がその結果，非発酵区では，Ｔ１＝26.1℃，Ｔ２＝

認められたが，ゲル形成に関与するタンパク質の38.9 ℃，⊿ Ｈ ＝ 1.497mJ/ ㎎，発 酵 区 で は Ｔ １ ＝© The Ito Foundation

32

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

（KDa）
200

MHC

116
97.4

a-Actinin

66.2
45

Actin
TN-T
TM

31
21.5
14.4
6.5

M

Non F D1001

No.4

Unheated

Non F

D1001

No.4

Heat-indued Gel

Fig.２ Changes in the SDS-PAGE patterns of myofibrillar protein during lactic acid

fermentation. Non-F : non fermentation
M: marker MHC: myosin heavy chain TN-T: troponin-T

TM: tropomyosin

25.2℃，Ｔ２＝37.8℃，⊿Ｈ＝0.696mJ/㎎となった。

品の食感に強く反映されることについては，当研

すなわち，発酵を施すことにより熱感受性が若干究室において，あらゆるタンパク質ゲルを試料と高まり，かつ低い熱エネルギーによってゲル形成

して明らかにされつつあり，それが食品の食感，がなされていることが明らかとなった。

さらには栄養価を含めた食品の嗜好性の多くを決⑸

走査型電子顕微鏡による微細構造の観察定するものとして鋭意検討を重ねている。

以上のように，発酵の有無は筋原線維の加熱ゲ

前述したように，食肉製品の品質やその実質的ル物性に有意な差異をもたらした。これまで当研役割を果たす筋原線維タンパク質ゲルの物理的性

究室では食肉製品やそのタンパク質ゲルの物理学

質はその組織構造に支配されていると言っても過的特性は，その緻密な組織構造と密接な関係にあ言ではない。それを客観的に証明する手法としることを明らかにしてきた。そこで非発酵およびて，先のSEM画像を数値化し，統計手法により発酵加熱ゲルの微細構造をSEMによって観察し画像と機器測定値との関係を検討することは有益た。その結果，Fig.３に示すように発酵の有無はな情報を得るために必要と考える。データとしてゲルの微細構造に明らかな差異をもたらした。すは示さないが，発酵区は非発酵区に比べて緻密な

なわち，Ｄ1001およびNo.４の発酵加熱ゲルでは，

ネットワーク構造を形成しており，小さな空洞領

ネットワークが繊維状の構造物（strand-type）

域が数多く存在するというSEM画像の視覚情報に近いものとなり，非発酵に見られる凝集体が数と同様の結果が得られ，さらに，これら数値情報

珠状に連なるものとは明らかに異なっていた。

は他の機器測定値と相関性のあることを認めていこのような組織構造の違いがいわゆるゲル状食る。

© The Ito Foundation

低温乳酸発酵による食肉タンパク質の組織構造と加熱ゲル物性に関する研究

33

A

B

C

Fig.３ Comparison of the microstructures of the heat-induced gels with or without fermentation.

A: non-fermented gel B: fermented gel（D1001） C: fermented gel（No.４）
Scale bar in each image is ５μm.




４．要

タンパク質成分分布に大差のないことが判明し約た。次に，DSC測定により，タンパク質変性の転食肉製品の食感を初め，製品の品質の良否を決

移温度の若干のシフト，また，エンタルピーの低定する筋原線維タンパク質を試料として，市販の下は加熱ゲル形成において，発酵処理が強く影響

低 温 増 殖 性 乳 酸 菌（Lactobacillus sakei D-1001）

を及ぼしていることを裏付ける結果となった。さと当研究室が保有する同種の未同定の低温増殖性

らに，SEMによる組織構造解析では，発酵区に

乳 酸 菌（Lactobacillus sakei No. ４）を 用 い て 発

おいて繊維状の細かいネットワークが緻密な微細

酵加熱ゲルを作製した。非発酵と発酵試料につい構造を結果として形成し，それは画像解析によって，その加熱ゲルの物性測定，ゲル関与タンパクてさらに客観的に証明できた。以上のように発酵

質成分，DSC測定，SEMによる構造観察を行った。

処理による筋原線維加熱ゲルの物性変化や組織構

その結果，２種の菌株による発酵過程の推移は

造の差異は発酵処理によるタンパク質成分の分子異なっていたが，いずれの発酵区も非発酵区に比内および分子間の相互作用に影響されたものと推べ高い物性値を示し，離水率が高いことが示され察されるが，今後，さらなる検討を行い組織構造た。しかし，SDS -PAGEの結果より発酵試料の変化とゲル物性の関係を明らかにしていく予定で© The Ito Foundation

34

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）ある。
文 献１） 寺本華奈江，佐藤浩昭，孫麗偉，島村政基，田尾博明，和栗伸伍，林利哉，芳賀聖一：マトリックス
支援レーザー脱離イオン化質量分析法による低温増殖性乳酸菌の迅速同定及び分類，分析化学，56（12），1063～1070，2007．
２） S. V. Perry and T. C. Grey : Biochem.J., 64, 184,
1956.

３）
 J. F. Etlinger and D. A. Fiscman : Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 37, 516, 1972.
４） 藤田利宗，林利哉，芳賀聖一：レトルト加熱によるアクトミオシンゲルの物性変化に関する研究，食科工，53，（８）423～429，2006．
５） 芳賀聖一，岩切鉄矢，水野達也：食肉タンパク質
ゲル微細構造の画像解析とゲル物性に関する研究，
名城大学農学部学術報告，37，89～94，2001．

© The Ito Foundation

平成23年度

35

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

糖修飾LEAタンパク質の利用を基盤とする食肉の新しい
凍害防御技術の確立
Establishment of novel cryoprotective method for meats using glycatedLEA protein

本

城

賢

一・井

倉

則

之・野

間

誠

司

（九州大学大学院農学研究院）

Ken-ichi Honjoh, Noriyuki Igura and Seiji Noma
（Faculty of Agriculture, Graduate School, Kyushu University）

Effect of glycation through Maillard reaction on cryoprotective activity of lateembryogenesis abundant（LEA）protein was investigated. LEA and sugars including glucose,maltose and dextrin were simultaneously solubilized in water, and those were then lyophilized.
The resultant powders were heated at 80℃ for glycation of LEA through Maillard reaction.
Cryoprotective activity of glycated LEA was determined by measuring residual activity ofcryo-sensitive enzyme, lactose dehydrogenase（LDH）, after a freeze-thaw treatment in thepresence of the glycated LEA. Cryoprotective activity of LEA on LDH was concentrationdependently increased at concentrations ranging from 1 to 10μM. Therefore, the concentration
for comparing cryoprotective activity of LEA and glycated LEA on LDH was set at 1μM. The
LDH residual activity was increased to 118％ in the presence of LEA glycated with glucose
through heating for 1h comparing to unglycated LEA. The LDH residual activity was increased
to 124％ in the presence of LEA glycated with maltose through heating for 3h. Each increased
cryoprotective activity was estimated to be 2.43μM and 3.01μM concentration of unglycated
LEA, respectively. Glycation of LEA by dextrin decreased cryoprotective activity of LEA.
MALDI-TOF-MS analysis suggested that the LEA with the increased cryoprotective activity
was glycated with one molecule of glucose or maltose. Reversed phase chromatography
analysis showed that the increase in the hydrophilicity mediated by the glycation of LEA with
one glucose or maltose molecule was not pronounced. Drip from the minced beef after freezethaw treatment was reduced by the addition of BSA glycated with dextrin.

１．目

すなわち氷結晶の成長に伴う細胞膜の損傷やタン的パク質の変性が起こり，解凍時の多量のドリップ

食肉の食品的価値の保持には低温，特に冷凍温生成につながる。

度域での保存が望ましい。これは食肉内での化学

我々はこれまでの研究で，低温処理により耐凍反応および微生物増殖の速度を低下させることに性を獲得するChlorella vulgaris C-27から，強い起因する。しかし，冷凍速度が遅ければ，凍害，

凍 害 防 御 作 用 を 示 す late embryogenesis© The Ito Foundation

36

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

abundantタンパク質（LEA）を得た １）。本タン
パク質は，塩基性アミノ酸を含む親水性アミノ酸

２．方

法

に富んでおり，高い親水性を示す。LEAはこの

2.1

高い親水性によって水分子を補足し，氷結晶の構

既報 にしたがい，大腸菌を用いて発現させた造ならびに成長速度に影響を及ぼすことによって

LEAの発現と精製
１）

後，精製した。

凍害防御作用を示すと考えられている。一方，タ2.2

ンパク質の親水性は，メイラード反応による糖付

LEAとGlucose，Maltose，Dextrinをそれぞれ加により増強可能であることが分かっている。本

モル濃度比で１：10，１：10，１：１で水に混合

反応はタンパク質においては塩基性アミノ酸の側溶解した。Dextrinについては平均分子量3,500を鎖アミノ基に対して起こる特徴がある。

代表値として濃度計算に用いた。また，メイラー

糖付加LEAの調製

以上の背景を踏まえ，LEA中の塩基性アミノド反応の効率を考慮し，LEAとdextrinを混合溶

酸に糖を付加することによって親水性を増強すれ解後，NaOHを添加することでpHを８以上としば凍害防御作用の強化につながり，これを低濃度た。これらをそれぞれ凍結乾燥した後，気流式乾で食肉に添加すれば，凍結速度に依存せずに，ま熱器（Constant temperature oven DN - 41，Yamato）

た風味に影響を及ぼすことなく食肉の凍害を防止を用いて80℃で加熱したものを糖付加LEAとしできると考えた。

た。比較対象としてウシ血清アルブミン（BSA）

LEAのような凍害防御タンパク質の生理的意を用いた。BSAと糖類を水に混合溶解後，pH調義については多くの研究があり，凍害，乾燥など整を行わずに凍結乾燥した。その後，LEAと同のストレス耐性を増加させることが明らかになっ様 に 80 ℃ で 加 熱 す る こ と に よ り 糖 付 加 を 行 っている 。一方で，植物の葉に含まれる凍害防御た。

タンパク質を粗抽出物として食品に添加すること

2.3

で凍害防御を試みる研究もある。しかし，凍害防糖 付 加 LEA の 凍 害 防 御 活 性 は ， lactate

御タンパク質の作用増強を試みた例はない。メイ

dehydrogenase（LDH，ウサギ筋肉由来）の凍結

ラード反応による糖付加をタンパク質の熱安定性に伴う活性低下を抑制する作用を指標にして評価の向上やアレルゲン性の低下に利用する研究は国した。糖付加LEAをLDH溶液に添加し，エタノー

内外でよく行われている。しかし親水性の増

ルバスを用いて－20℃で一晩凍結させた。４℃で強を積極的に活用した研究は皆無に等しい。した

解凍した後，既報１）に従い残存LDH活性を測定

がって糖付加技術に基づくLEAの凍害防御作用した。また比較として，糖未付加のLEAタンパの増強とその利用は新しい試みである。

ク 質 ，糖 付 加 BSA ，糖 類（glucose ，maltose ，

２）

３～５）

本研究では，糖付加したLEAの利用を基盤とする新しい凍害防御技術の確立を目指す。そのた

糖付加LEAの凍害防御活性の評価

sucrose，trehalose，dextrin）のLDHに対する凍害防御活性を同様に調べた。

めにまず，LEAの凍害防御機能を増強する糖付

2.4

加条件を明らかにし，生成した糖付加LEAの特糖 付 加 LEA の 質 量 は MALDI-TOF-MS性を調べる。また，食肉の品質に及ぼす影響を検（AXIMA-CFR Plus, Shimadzu）を用いて評価し討することを目的とする。

た。マトリックスにはシナピン酸の50％アセトニ

糖付加LEAの特性解析

トリル飽和溶液を用いた。親水性は逆相クロマト© The Ito Foundation

37

糖修飾LEAタンパク質の利用を基盤とする食肉の新しい凍害防御技術の確立

（a）

（b）

LDH residual activity
（%）

140

LEA

120

BSA

（c）

160

140

140

120

120

100

100

80

80

60

y = 10.7x + 92.0
（R² = 0.9883）

60

40

10-8

10-6

10-4

10-2

Concentration
（M）

0

100

maltose80

sucrosedextrin

40
20

20

0
10-10

glucose

60

40

20

trehalose

0

2

4

6

LEA concentration
（μM）

0
10-5

10-3

10-1

101

Concentration（M）

Fig.１ LDH residual activity after freeze-thaw treatment in the presence of LEA and BSA（a）. Calibration curve

between LEA concentration and LDH residual activity（b）.LDH residual activity after freeze-thaw treatment in
the presence of sugars（c）.

グラフィーにおける溶出時間によって評価した。

結果の平均値を求めた。さらに，冷凍やけの有無使用した条件は以下のとおりである。溶離液：を視認した。

0.1％TFA（Ａ液）および0.1％TFA含有アセトニ
トリル（Ｂ液），グラジエント：０分（Ｂ液30％）→ 10 分（Ｂ 液 40 ％ ），流 速 ： 0.2ml ，カ ラ ム ：Atlantis T３，50×2.1㎜，３μｍ（Waters），カ
ラム温度：30℃，検出波長：220nm。
2.5

３．結果と考察
3 . 1 LEA，BSA，糖類の凍害防御活性の濃度依存性
糖付加がLEAの凍害防御活性に及ぼす影響を食肉に対する添加と品質評価調べるための予備検討として，糖未付加LEAお糖付加が食肉の凍害防御作用に及ぼす影響を調よびBSAの凍害防御活性の濃度依存性を調べた

べるために，先の実験において糖付加により最も（Fig. 1-a）。LDH残存活性は未凍結のLDH活性を

高い凍害防御活性を示したdextrin付加BSAを用100％として表した。LEAおよびBSAは１μＭ以

い て ，牛 ひ き 肉 の ド リ ッ プ 変 化 を 検 討 し た 。

上でLDHの活性低下を抑制したため，１μＭ以上

Dextrin付加BSAを脱イオン水に溶解し，牛ひきで凍害防御活性を示すと考えられた。特に，１肉に混合した後，４㎝φ×２㎝の円柱状に成形

μＭから10μＭの濃度域では凍害防御活性が顕著

し，－20℃の冷凍庫中で２日間凍結した。４℃でに増加したことから，この濃度域内で糖付加が解凍した時に生じるドリップ量を，ろ紙の上に置

LEAおよびBSAの凍害防御活性に及ぼす影響をいたときに生じる濡れ円の面積を測定することで調べるのが適当であると考えられた。そこで次評価した。コントロールとしてdextrinとBSAのに，LEA濃度と凍害防御活性の関係をより詳細

非加熱混合物の水溶液および同量の脱イオン水をに調べた（Fig. 1-b）
。結果は１μＭにおける凍害

添加した牛ひき肉についても検討し，各々３回の防御活性を100％として示した。０から５μＭの© The Ito Foundation

38

平成23年度LDH residual activity（%）

160

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

maltoseglucose

140

**

*

120

dextrin

*

**

100

*

80
60
40
20
0

0

0.5

1

0

1

2

3

4

5

6 0 10 20 30 40 50 60

Heating time（h）Fig.２ LDH residual activity after freeze-thaw treatment in the presence of LEA（rhombus）and BSA（square）

glycated with glucose, maltose and dextrin with heating at 80℃ for various periods. Symbols“＊＊”and“＊”showsignificant difference versus 0h heating at p＜0.01 and 0.05, respectively.

濃度範囲において，LEA濃度と凍害防御活性は

は加熱を行っていない上記LEA-糖混合物の凍害

良好な直線関係を示し，一次回帰式ｙ＝10.7ｘ＋

防御活性を100％として表した（Fig.２）。BSAに92.0（R ＝0.988）が得られた。

ついても同様の操作を行った。

２

同様に，各種糖類の凍害防御活性の濃度依存性

LEA-glucose混合物においては，加熱0.5時間以を調べた（Fig. 1-c）
。LDH残存活性は，未凍結の降は時間依存的に凍害防御活性の増加が認めら

LDHの活性を100％として表した。その結果，糖れ，１時間では凍害防御活性が加熱０時間，すな

類はおおむね10mM以上で凍害防御活性を示し

わちglucose未付加LEAの118％になった。一方でた。dextrinは凍害防御活性を示さなかったが，BSAでは加熱時間０から１時間で有意な凍害防これは凍結の際にdextrinが析出して濃度が低下

御活性の変化は認められなかった。
LEA-maltose混合物においては，加熱１時間かすることが原因であると考えられた。
3 . 2 糖付加がLEAおよびBSAの凍害防御活性

ら凍害防御活性が増加する傾向が認められ，３時間では最大の124％に達した。しかし５時間ではに及ぼす影響LEAとglucose，maltose，dextrinの混合物を117％になった。一方，BSAでは加熱時間０から様々な時間加熱することでLEAに糖を付加させ５時間で有意な凍害防御活性の変化は認められなた。これに水を加えて糖付加LEAの濃度を２μＭかった。

に調整し，LDH溶液と体積比１：１で混合した

LEA-dextrin混合物においては，加熱24時間後，も の を － 20 ℃ で 凍 結 さ せ た 。４ ℃ で 解 凍 後 ，LDH活性がdextrin未付加LEAの83％に低下しLDH活性を測定した。なお，このサンプル中にた。一方BSAでは20時間で約117％，53時間では LEA に 付 加 し て い な い glucose ，maltose ，141％に増加した。

dextrin分子もそれぞれ10μＭ，10μＭ，１μＭ以

凍害防御活性が118％に増加したLEA-glucose

下の濃度で含まれるが，Fig. 1-cの結果から凍害

１時間加熱，124％に増加したLEA-maltose３時

防御活性はまったく示さないと考えられる。結果

間加熱と同等の凍害防御作用を示すために必要な© The Ito Foundation

糖修飾LEAタンパク質の利用を基盤とする食肉の新しい凍害防御技術の確立

39

30000
LEA
LEA-glucose 1h
LEA-maltose 3h

μV

20000
10000
0
-10000

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Time
（min）
Fig.３ Reversed phase chromatograms of LEA and glycated LEA．

LEA濃度をFig. 1-bで得た一次回帰直線式から算Fig. ３ に 示 す 。LEA-glucose １ 時 間 加 熱 お よ び

出した。その結果，それぞれ2.43，3.01μＭとなっ

LEA-maltose３時間加熱の溶出時間は糖未付加

た。

LEAと同等であった。質量分析の結果から，糖以上の結果から，単糖類や二糖類のglucoseやは１分子付加しているのみであるため，溶出時間

maltoseを付加することによってLEAの凍害防御に影響を及ぼすほど親水性は増加していないと考活 性 が 増 加 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。ま た

えられた。なお，maltoseが２分子以上付加した

maltoseの結果から，凍害防御活性の増加には適LEAにおいては溶出時間の短縮が認められた。

した付加率があることが示唆された。一方でBSAしたがって，LEAにおいては，凍害防御活性のでは多糖類であるdextrinを付加することによっ増加は単純に親水性の増加にのみ依存するわけでて凍害防御活性の増加が認められ，タンパク質にはない可能性が考えられた。

よって凍害防御活性を増加させる糖の種類は異な

ゾチームの立体構造が変化することがシミュレー

ることが示唆された。
3.3

Maillard反応によるglucoseの付加によってリションされている６）。一方でLEAの凍害防御活性

糖付加LEAの特性解析

Glucose や maltose を 付 加 し た LEA の 質 量 をには特定の構造が必要であることが明らかになっ

MALDI-TOF-MSで分析した。LEA-glucose１時ている。凍害防御活性の増加機構を明らかにする

間加熱，LEA-maltose３時間加熱ともに，LEA分

ためには，LEAを付加した糖の数ごとに分取し子すべてではないものの，glucoseまたはmaltoseてそれぞれの凍害防御活性を調べることによっが１分子付加していた。また，LEAに糖が２分て，付加する糖の分子数と凍害防御活性の関係を子以上付加している場合は活性の増加が認められ明らかにすること，糖の付加がLEAのα-ヘリッなかった。したがって，糖が１分子のみ付加する

クス構造に及ぼす影響を明らかにすることが必要

ように加熱条件を最適化することによって，活性であると考えられる。

がより顕著に増加する可能性が考えられた。

3.4

食肉に対する添加と品質評価

糖付加がLEAの親水性に及ぼす影響を，逆相

肉は凍結解凍することにより，ドリップが生じ

HPLCにおける溶出時間により評価した。結果をる。これは凍結中に生成する氷結晶により組織が© The Ito Foundation

40

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）（a）Area of drip
（cm2）

（b）

140
120
100
80
60
40
20
0
Water

Mixture of BSA
and dextrin

BSA-dextrin

Fig.４ Drip from the minced beef after freeze-thaw treatment（a）. The minced beef was formed intocylindrical shape（4㎝φx2㎝）after mixing with mixture of BSA and dextrin solution, BSA
glycated with dextrin（BSA-dextrin）solution, or corresponded water. The area of drip was
measured from the pictures（b）．

損傷したことによると考えられる。今回の検討ではドリップが出やすい４℃における緩慢解凍を用

４．要

約

いたため，未凍結区と比較すると，凍結解凍区で

本研究では，糖付加したLEAの利用を基盤とは明らかにドリップの増加が認められた（Fig.

する新しい凍害防御技術の確立を目指し，まず

４）。しかし，dextrin付加BSA添加区ではコント

LEAの凍害防御活性を増加させる糖付加条件をロール（水添加区）と比較してわずかにドリップ

調 べ た 。そ の 結 果 ，80 ℃ で １ 時 間 加 熱 し て量の減少が認められた。dextrin付加BSAの水溶glucoseを付加させた場合，または80℃で３時間

液は，dextrinとBSAの混合物の水溶液と比較し加熱してmaltoseを付加させた場合に凍害防御活て，明らかな粘性の増加が認められたことから，性が増加した。このとき，glucoseおよびmaltose

dextrin付加BSAは肉中の保水性を上昇させ，そ分子はそれぞれ１分子付加していたが，この糖付の結果として凍結解凍に伴う氷結晶の増大を抑制

加に伴う顕著な親水性の増加は認められなかっしたと考えられた。なお，冷凍やけについては今た。凍害防御活性が増加したdextrin付加BSAを回の条件ではいずれの試験区でも認められなかっ

牛ひき肉に添加すると，わずかながらドリップのた。

減少が認められた。

© The Ito Foundation

糖修飾LEAタンパク質の利用を基盤とする食肉の新しい凍害防御技術の確立
文 献１） Honjoh, K., Matsumoto, H., Shimizu, H., Ooyama,K., Tanaka, K., Oda, Y., Takata, R., Joh, T., Suga, K.,
Miyamoto, T., Iio, M., and Hatano, S.：Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry，64，1656～1663,
2000.
２） Goyal, K., Walton, L.J. and Tunnacliffe,A.：
Biochemical Journal, 388, 151～157, 2005.
３） Aoki, T., Hiidome, Y., Kitahara, K., Sugimoto, Y.,
Ibrahim, H.R. and Kato, Y.：Food Research

41

International, 32, 129～133, 1999.
４）
 Aminlari, M., Ramezani, R. andJadidi, F.：Journalof the Science of Food and Agriculture, 85, 2617～
2624, 2005.
５）
 Lagemaat, J., Silván, J.M., Moreno, F.J., Olano, A.
and del Castilllo, M.D.：Food Research International,
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６）
 Yeboah, F.K., Alli, I., Yaylayan, V.A., Konishi, Y.
Chowdhury, S.F. and Purisima, E.O.：Bioconjugate
Chemistry, 15, 27～34, 2004.

© The Ito Foundation

42

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

粉末茶による食肉および食肉製品中の糞便系大腸菌群の制御についての研究
The use of powder tea leaf to control the fecal coliforms in meat and meat products

岡

崎

貴

世

（四国大学生活科学部）

Kiyo Okazaki（Faculty of Human Life Science, Shikoku University）

The inhibitory effect of powder tea leaf containing catechins on growth of Escherichia coli
was investigated. The powder tea leaf is produced in the final step of manufacturing process
and has good characteristics, such as a rapid and large extraction of catechins from tea leaf.
The extract of powder tea leaf（tea extract）exhibited growth inhibition of E. coli at low
concentration of initial cell（8.2×102 cfu/ml）, however its activity decreased with an increasein the initial cell concentration. Higher activity was recognized in an aqueous solutionof freezedried tea extract（tea solution）, which contained more catechins. Each tea extract, tea solution
and powder tea leaf was added to commercial minced meat which inoculated with E. coli cellsuspension（8.2×102 cfu/g meat）. After each meat was frozen for 24h and defrosted at room
temperature for 1h, the survival cell number in meat was measured. Tea solution showed astrong inhibitory effect against E. coli, but the effect was not enough to control the bacteria inminced meat. In the presence of chelate compounds, the effect of catechins in tea solution
increased. Survival cell（%）of E. coli in meats treated with a mixture of tea solution and 45
ppm EDTA or 300 ppm sodium citrate was 46.2% and 65.9%, respectively. These data supports
the possibility that an aqueous solution of freeze-dried powder tea extract is useful to control E.
coli, the fecal coliforms, in meat and meat products.

１．目

そこで，食肉および食肉製品を汚染する食中毒

的微生物，特に糞便系大腸菌群の制御を行うことを

平成23年４月，生肉ユッケを原因食品とする腸目的に，粉末茶利用の可能性の検討を行った。粉

管出血性大腸菌Ｏ111による集団食中毒が発生し，

末茶とは茶の製造過程（仕上げ切断操作）で生じ死者４名を含む多くの重症患者を出したことは記る細かい粉末状の茶葉で，通常飲用に利用される

憶に新しい。食肉の衛生的な取り扱いは食品の製

茶葉同様，多くの緑茶カテキンを含有している造・加工に携わるものにとって最優先されるべきが，形状が粉末であるためカテキンの溶出速度が事項であり，食による健康被害は決して起こして速く，また溶出量も多いという特徴を有する。そはならない。

のため，より一層効果的なカテキンの細菌増殖抑© The Ito Foundation

粉末茶による食肉および食肉製品中の糞便系大腸菌群の制御についての研究

43

（ECg）
，（－）
－カテキンガレート（Cg）および制作用が期待できると考えられる。
カテキンの抗菌作用に関しては，黄色ブドウ球

カフェイン（CF）の７種類を測定した。分析は，菌やグラム陰性桿菌１），病原性大腸菌２），ヘリコ

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によりバクター・ピロリ菌 やコレラ菌 など多種類の行った。茶抽出液および凍結乾燥茶液は移動相溶

微生物に対して増殖阻害作用を示すことが報告さ

液で希釈または溶解したあとフィルター（0.20μれ，さらにグラム陰性菌よりもグラム陽性菌に対ｍ）を通してHPLC試料とした。分析条件は以下

して高い活性を示す１）こと，カテキン類の中ではのとおりである。

３）

４）

ガロイル基を持つエピガロカテキンガレート（EGCg）が高い抗菌活性を示す

５）ことなどが報分析カラム：CAPCELL PAK C18UG120
S3：4.6㎜ i.d.×100㎜

告されている。カテキンの作用機構についても多移動相：0.5％リン酸：メタノール＝82：18

くの報告があり，その詳細に関してはまだ未解明

流速：0.8ml／分

なところもあるが，細胞膜へのカテキンの吸着に

カラム温度：40℃

よる膜の損傷作用 や過酸化水素発生による死滅

検出波長：215nm

作用

2.3

６）

であると考えられている。これらの知見を

７）

供試菌および培養

もとに本研究では，細菌汚染を受けやすいミンチ

糞 便 系 大 腸 菌 と し て ，大 腸 菌（Escherichia

肉が長期間保存されることを想定して，凍結・解

coli K12 W3110）を用いた。大腸菌は，L-broth

凍されるミンチ肉中に混在する大腸菌に対する粉（1.0％トリプトン，0.5％酵母エキス，0.5％塩化末茶カテキンの増殖抑制作用を測定した。

ナトリウム）に接種し，35℃で18時間前培養後，２．方

菌懸濁液濁度がOD660 ＝0.1（菌濃度：約１×10 ７

法

cfu/ml）となるように滅菌水で調製し，必要に応2 . 1 粉末茶の抽出液および凍結乾燥茶液の調製

じて滅菌水または液体培地で希釈して使用した。
2 . 4 茶抽出液および凍結乾燥茶液の増殖抑制

粉末茶は，2011年春，徳島県三好市山城町で生産された一番茶から生じたものを使用した。

効果の測定
茶抽出液原液をNutrient Broth（BD社，以後

粉末茶50ｇに85℃に加温した滅菌水150mlを加NB培地と略す）で２倍，2.5倍，3.125倍希釈したえた浸出液から茶葉を取り除いて茶抽出液（原液0.5mlと，NB培地でOD660＝0.0001または0.00001

液）とした。茶抽出液は必要に応じて滅菌水で希に調製した大腸菌懸濁液0.5mlを試験管内で混合釈して使用した。また，粉末茶50ｇに85℃に加温し（茶抽出液の最終希釈度は４倍，５倍，6.25倍

した滅菌水450mlを加えた浸出液を凍結乾燥し，となる），この混合液を35℃で24時間培養を行っ得られた乾燥粉末を滅菌水で再溶解したものを凍た。培養後の混合液をペプトン加生理食塩水（日結乾燥茶液として試験に用いた。

水製薬株式会社）で段階希釈を行い，XM-G寒天

2.2

カテキン類の定量分析

培地（日水製薬株式会社）の平板上に塗抹して形茶中のカテキン類として，（－）－エピガロカテ成されたコロニー数を計測し，菌数を算出した。

キ ン（EGC），（＋）－ カ テ キ ン（Ｃ），（－）
－エ

凍結乾燥茶液の増殖抑制効果は10w/v％溶液のピガロカテキンガレート（EGCg）
，（－）
－エピ

NB培地希釈液を用いて同様に測定を行った（凍カテキン（EC），（－）－エピカテキンガレート

結乾燥茶液の最終濃度は2.5，2.0，1.0w/v％となる）。

© The Ito Foundation

44

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Table１ Catechin components in tea extract and 10w/v％ aqueous

solution of freeze-dried tea extract（tea solution）.
Contents（㎎/ml）

Epigallocatechin（EGC）

tea extract

tea solution

33.5

38.1

Catechin（C）

00

Epigallocatechin gallate（EGCg）

7.35

10.3

Epicatechin（EC）

3.45

4.26

Epicatechin gallate（ECg）

1.60

2.24

Catechin gallate（Cg）

0.692

0.842

Caffeine（CF）

7.71

9.00

2 . 5 ミンチ中の大腸菌に対する茶抽出液および凍結乾燥茶液の効果測定

3 . 2 茶抽出液および凍結乾燥茶液の増殖抑制
効果

密閉できるビニル袋に市販の国産牛ミンチ50ｇ

食肉に茶抽出液等を添加する試験に先立ち，本とOD660＝0.01に滅菌水で調製した大腸菌液50μｌ

研究で調製した茶抽出液および凍結乾燥茶液の細を加えてよく混和したあと，茶抽出液（原液また菌増殖抑制効果を把握するため，液体培地中におは２倍希釈液）0.5mlを添加してよく揉み，24時ける効果を測定した。また，一般に抗菌性物質の間冷凍を行った。室温で解凍１時間後，ペプトン

増殖抑制効果は菌濃度の影響を受ける ８）ことか

加生理食塩水100mlを加えミンチとよく混和し，ら，菌濃度の異なる大腸菌懸濁液を用いて測定をろ過後，段階希釈し，XM-G寒天平板を用いてコ行った。その結果，Fig.１-aに見られるように，

ロニー数を計測した。大腸菌に対する増殖抑制効

菌濃度が8.2×10２cfu/mlのとき茶抽出液（希釈度

果は，茶抽出液の代わりに滅菌水0.5mlを添加し４倍）は，高い増殖抑制効果を示すことがわかった牛ミンチ中の菌数に対する残菌率（％）で評価た。しかし，菌濃度が高いとき（8.2×10 ３ cfu/

した。凍結乾燥茶液（1.0，5.0，10w/v％）につml）や希釈度が５倍になるとその効果は著しくいても同様の操作で測定を行った。さらに，粉末低下した。またデータは示さないが希釈度が6.25

茶（1.0ｇまたは0.5ｇ）の効果も測定した。

倍を超えた薄い茶抽出液を用いた場合はコント
ロールの菌数以上に大腸菌が増殖をしていた。こ３．結果と考察
3.1

れは，茶抽出液と菌液の混合溶液の培養温度がカテキン類含有量

35℃であったため大腸菌が増殖しやすい温度で茶抽出液および10％凍結乾燥茶液に含まれるカ
テキン類のHPLC定量結果をTable１に示す。カ

あったことや茶抽出液に含まれる栄養成分により大腸菌が増殖したことが理由と考えられた。

フェインを含むカテキン類含有量の合計値は，茶茶抽出液では大腸菌に対して十分な増殖抑制効

抽出液が54.3㎎/mlで，凍結乾燥茶液が64.7㎎/ml

果を示すことができないと考えられたため，抽出であった。カテキン類の中で高い抗菌活性を示す

液を凍結乾燥させてカテキン濃度を高めた凍結乾

EGCgの含有量は，それぞれ7.35㎎/ml，10.3㎎/

燥茶液の効果を検討した。Fig.１-bに見られるよmlであった。

うに，菌濃度が低い場合，凍結乾燥茶液は非常に© The Ito Foundation

45

粉末茶による食肉および食肉製品中の糞便系大腸菌群の制御についての研究

10

（a）

10
Log N
（cfu/ml）

Log N（cfu/ml）

8
6
4
2
0

Control

4

5

（b）

8
6
4
2
0

6.25

Control

2.5

dilution rate
（n）

2.0

1.0

concentration（w/v%）

Fig.１ Growth inhibition effects of tea extract（a）and a solution of freeze-dried tea extract（tea solution）（b）against

Escherichia coli. Tea extract was diluted stepwise with nutrient broth（NB）and tea solution prepared with NB
ranging in concentration from 1.0 to 2.5 w/v％. A mixture of tea extract or tea solution and cell suspension was
incubated at 35℃ for 24h.
Initial cell concentration：■，8.2×10２cfu/ml：■，8.2×10３cfu/ml.

120

（a）

100
80

Survival cells（％）

Survival cells
（％）

100
80

60

60

40

40

20

20
0

（b）

1

2

dilution rate
（n）

1.0

0.5

0

10

powder tea leaf（g）

5.0
concentration（w/v%）

1.0

Fig.２ Growth inhibition effects of tea extract and powder tea leaf（a）, and an aqueous solution of freeze-dried tea

extract（tea solution）（b）against Escherichia coli in minced meat.After tea extract and tea solution were diluted
with sterilized water, 0.5ml of them were added to commercial minced meat（50g）which inoculated with E. coli
cell suspension（8.2×10２cfu/g meat）.Powder tea leaf was added directly. Each meat was frozen for 24h anddefrosted for 1h, survival cells in meat was measured.

高い増殖抑制効果を示した。この効果は，凍結乾見られるなど，有効カテキン量が減少し十分な抑燥茶液の濃度が下がってもほとんど低下しなかっ制作用を示すことができなかったと考えられた。

た。また，茶抽出液と凍結乾燥茶液に含まれるカ3 . 3 ミンチ中の菌に対する茶抽出液および凍

テキン含有量を比較してみると，1.0w/v％凍結

結乾燥茶の効果

乾燥茶液に含まれるEGCg量（1.03㎎）は，４倍茶抽出液，粉末茶そのもの，および凍結乾燥茶希釈された茶抽出液に含まれるEGCg量（1.84㎎）

液をミンチに添加し，ミンチ中の大腸菌に対するよりも少ないにも関わらず，高い増殖抑制効果を増殖抑制効果を測定した。Fig.２-aに見られるよ

示した。今回調製した茶抽出液には粘稠性があうに，希釈度１倍と２倍の茶抽出液はミンチ中のり，抽出液中でカテキン類が他の成分に吸着や結大腸菌の残菌率を低くし，増殖抑制効果を示すこ

合をしていると考えられた。また培養中に沈殿がとがわかった。一方，粉末茶そのものを添加した© The Ito Foundation

46

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

100

Survival cells
（%）

80
60
40
20
0

tea

EDTA

tea + EDTA sodium citrate tea + sodium
citrateFig.３ Growth inhibition effects of an aqueous solution of freeze-dried tea extract（tea）in the presenceof 45ppm EDTA or 300ppm sodium citrate against Escherichia coli in minced meat.

ミンチではカテキンの抑制効果は認められず，逆結果から推定できるように，より高い増殖抑制効に菌数の増加が認められた。粉末茶は細かく裁断果が得られると考えられる。

されているため断面から茶葉に含まれる栄養成分

3.4

キレート剤との併用効果が漏洩しそれらを栄養分として菌が増殖したと考凍結乾燥茶液単独では十分な増殖抑制効果が得えられる。したがって粉末茶をそのままミンチにられなかったことから，他の物質との組合せによ添加するのは微生物の抑制という点で逆効果になる併用効果を検討した。EDTAなどのキレート作

ることがわかった。さらに粉末茶には多くの微生用のある化合物はカテキンとの併用効果が高いこ物が付着しており（粉末茶１ｇあたりの一般生菌とが報告されている９）ことから，EDTAとクエン

数：2.0×10３cfu，真菌数：7.7×10３cfu，大腸菌

酸ナトリウムの併用を検討することとした。

群：陰性），粉末茶の直接添加は食品衛生上好ま

EDTAとクエン酸ナトリウムの大腸菌に対するしくないと考えられた。

最小発育阻止濃度（MIC）を液体培地希釈法10）で凍結乾燥茶液は10w/v％溶液の添加で大腸菌に測 定 し た と こ ろ ，そ れ ぞ れ 64ppm と 410ppm で対して増殖抑制効果を示した（Fig.２-b）。しかしあった。そこでMIC値のおよそ４分の３にあたる

ながら，ミンチ中の大腸菌を減少させるには十分

45ppmEDTAと300ppmクエン酸ナトリウムと，な効果とは言い難い。増殖抑制効果が低かった理

10w/v％凍結乾燥茶液との併用効果を検討した。

由として，ミンチに凍結乾燥茶液を添加した直後

それぞれ単独または併用でミンチに添加し，冷に冷凍操作を行ったため，カテキンがミンチ中の凍・解凍後の残菌率を測定したところ，凍結乾燥菌に作用する時間が不足していたのではないかと

茶液単独で71.4％，EDTA単独で83.5％，凍結乾考えられた。また今回の測定は，大腸菌の初発菌

燥茶液＋EDTA併用で46.2％，クエン酸単独で数をミンチ１ｇあたり8.2×10 cfuで行ったため，99.5％，凍結乾燥茶液＋クエン酸ナトリウム併用

菌濃度の影響を受けて増殖抑制効果が低下したとで65.9％になり，EDTAとクエン酸ナトリウムに考えられる。今回は実験結果の精度を考慮し初発併用効果が認められた（Fig.３）。

３

菌数を10４cfu程度に設定をしたが，本測定の10分

カテキンの作用機構は，細菌細胞表層部の損傷の１程度の初発菌数のミンチであれば，Fig.１の作用６）や過酸化水素を発生させ細菌を死滅させる© The Ito Foundation

粉末茶による食肉および食肉製品中の糞便系大腸菌群の制御についての研究

47

作用７）であることが報告されている。一方EDTA

作用する時間が短いことなどから，十分な併用効は細菌表層部にある結合部位に作用し，細胞膜の果は得られていないと考えられる。しかし条件を

強度を弱めて細菌の生育阻害を起こす11）ため，併変えることでより高いカテキンの増殖抑制効果が用効果が得られたと考えられる。前項でも述べた得られると考えられる。

ように，初発菌濃度が高いこと，凍結操作のためカテキンが大腸菌に作用する時間が短いことなどから，今回の測定では十分な併用効果は得られていないが，条件を変えることでより高い効果が得られると考えられる。
４．要

約

茶の製造過程で生じる細かい粉末状の茶葉（粉末茶）を利用し，食肉を汚染する大腸菌の増殖抑制を試みた。粉末茶の抽出液を調製し，大腸菌に対する増殖抑制作用を測定したところ，初発菌濃度が8.2×10２cfu/mlのとき茶抽出液は高い増殖抑制効果を示した。しかしその効果は菌濃度の影響を受けて著しく低下した。そこで抽出液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥粉末の溶液（凍結乾燥茶液）を試験に用いたところ，茶抽出液よりも高い効果を示した。次に，大腸菌で試験的に汚染した
市販牛ミンチに，茶抽出液，凍結乾燥茶液または粉末茶（茶葉）をそれぞれ添加し，凍結保存後解凍を行い，ミンチ中の大腸菌数を測定すると，粉末茶の直接添加では細菌増殖抑制効果は得られず，逆に茶葉に存在する菌（茶１ｇあたりの一般
生菌数：2.0×10３cfu，真菌数：7.7×10３cfu，大腸菌群：陰性）でミンチを汚染する恐れがあることがわかった。ミンチ中の大腸菌に対する増殖抑制効果は凍結乾燥茶液で最も高いことがわかったが，その効果はミンチ中の大腸菌を減少させるには十分とは言えなかった。そこで凍結乾燥茶液とキレート剤との併用を検討したところ，EDTAやクエン酸ナトリウムに併用効果が認められた。今回の測定条件は，ミンチ中の大腸菌の初発菌濃度

文 献１）
 Yoshiyuki Yoda, Zhi-Qing Hu, Wei-Hua Zhao :Different susceptibilities of Staphylococcus andGram-negative rods to epigallocatechin gallate. J.
Infect. Chemother. 10, 55～58, 2004.
２）
 西川武志，小林菜津美，岡安多香子，山田玲子，
磯貝恵美子，磯貝浩，山下利春：茶およびカテキン
含有飲料の病原性大腸菌に対する増殖抑制効果の検討．腸内細菌学雑誌．20，321～327，2006．
３）
 Katsuhiro Mabe, Masaki Yoshida, Itaro Oguni,
Tsuneo Takahashi : In Vitro and In Vivo Activities
of Tea Catechins against Helicobacter pylori. antimicrobial agents and chemotherapy. 43, 1788 ～ 1791,
1999.
４）
 Masako Toda, Sachie Okubo, H.Ikigai, T.Suzuki,
Yumiko Suzuki, T.Shimamura : The protective
activity of tea against infection by Vibrio cholerae
O1. Journal of Applied Bacteriology. 70, 109 ～ 112,1991.
５）
 Hajime Ikigai, Taiji Nakae, Yukihiro Hara,
Tadakatsu Shimamura : Bactericidal catechinsdamage the lipid bilayer. Biochimica et Biophysica
Acta. 1147, 132～136, 1993.
６） 熊澤茂則，中山勉：茶カテキン類と脂質膜との相互作用．化学と生物．49，243～249，2011．
７）
 Hideaki Arakawa, Masako Maeda, Sachie Okubo,
Tadakatsu Shimamura : Role of Hydrogen Peroxidein Bactericidal Action of Catechin. Biol.Phram.
Bull. 27, 277～281, 2004.
８）
 Daxin Zhang, Takuya Maeda, Hideaki Nagamuneand Hiroki Kourai : Bactericidal action of a bisquaternary ammonium compound against
vegetative cells and spores of Bacillus subtilis.
Biocontrol Science, 8, 101～110, 2003.
９） 中山素一，重宗尚文，徳田一，古田可菜子，松下知世，吉澤千尋，宮本敬久：緑茶抽出物の抗菌活性に対する食品添加物の影響．防菌防黴．36，569～
578，2008．
10）
 Kiyo Okazaki, Takuya Maeda, Hideaki
Nagamune, Hiroki Kourai : Antibacterial
Characteristics of N-Alkyl-2-alkylthiopyridinium
and N-Alkyl-4-alkylthiopyridinium Salts. Jpn. J.
Toxicol. Environ. Health. 43, 251～260, 1997.
11） 木田中，田口文章：細菌とキレート剤．防菌防黴．
35，567～581，2007．

が高いこと，凍結操作のためカテキンが大腸菌に© The Ito Foundation

48

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

新規発光デバイスを用いた食肉の質を落とさない殺菌法の開発
Development of a sterilization system, which keeps the quality of meat,by a new light-emitting device

高

橋

章・芥

川

正

武・馬

渡

一

諭・下

畑

隆

明

（徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部）

Akira Takahashi, Masatake Akutagawa, Kazuaki Mawatari, Takaaki Shimohata.
（Institute of Health Biosciences, The University of Tokushima Graduate School）

Sterilization of food is the most basic method to ensure the food safety, and is one of themost important issues related to food hygiene. In recent years, the food poisoning induced byenterohemorrhagic Escherichia coli infection became a major problem, and even confidence inthe safety of the meat has been shaken. And we need excellent sterilization method whichleaves no residue, has economically advantages, and maintains the quality of the meat.
We have been developing a disinfection system using light-emitting diode（LED）whichradiated the near-ultraviolet radiation（UVA）．In this system by using a UVA wavelength areunlikely to cause deterioration in the quality of food, and are different from "conventional
ultraviolet disinfection". Because the system used the LED, there are many advantages forfood processing, such as cheap and safety. In this study, we tried to develop the disinfection
system for meat.
We irradiated the meat with UVA by UVA-LED irradiation system. This system wasdesigned to maintain a constant humidity and temperature, and could sterilize E. coli, which
was added on the surface of meat, without the change of color or smell of meat. However thesterilizing effect on the bacteria that had adhered to the meat originally was very weak.
All the above, by the method of sterilization of meat by UVA-LED, the surface
sterilization only is effective and inside the meat is difficult to sterilize. It will be necessary to
improve the irradiation method of UVA or combination with other sterilization method in the
future.

１．目

おける最重要課題の一つである。「安全な食」を的提供する上で，食品の殺菌は基本手段の一つであ

我が国は先進諸国の一員となって久しいにも関る。今日までに食品に応じた様々な殺菌法が開発

わらず，未だに毎年のように食中毒の発生件数がされ，食品製造・加工分野に汎用されている。と1000件，患者数は2万人を超えている 1）状況にあころが，現行の殺菌法の中には問題点が指摘されることから，「食の安全」は我が国の食品衛生にるものも出てきている。例えば，カット野菜消毒© The Ito Foundation

新規発光デバイスを用いた食肉の質を落とさない殺菌法の開発

49には安価で容易な次亜塩素酸ナトリウムが多用さ開発した。本システムを用いて，UVA照射方法

れているが，残留塩素による健康被害や臭いの問

や温度，湿度等の最適化を行い，食肉へのUVA

題が指摘されている。また，生鮮食品や食感や風照射による殺菌効果を検討した。

味を重視する食品などへの殺菌には，従来から用いられている加熱等の殺菌法を適応しにくい場合

２．方

法

も少なくない。特に安全性や品質などの要求が高2.1

UVA照射装置

まっている近年では，このような従来の殺菌法の表面実装型の高出力発光ダイオード

問題点を解決する新しい殺菌法の開発が求められ（NC4U134A（T），日亜化学工業株式会社）を使ている。

用し，定電流電源に接続した。本照射装置は出力

現在，特に食肉の安全性に対する信頼が揺らい

光のピーク波長が385nmで250mW以上のUVA出でいる。昨今，生食による腸管出血性大腸菌感染力が可能である ２）。照射UVAの強さ（照度）はで大きな問題となったことから，現在では食肉の電流を変化させることにより調節を行った。

加工・流通過程における衛生管理の再確認と徹底

2.2

が強く叫ばれている。食肉の衛生管理は表面に付

食肉用ショーケース型の殺菌装置を開発した。

着した菌の殺菌消毒とその維持が重要とされてい本装置の天井部に12個のNC4U134A（T）を設置る。その殺菌消毒法の中にはアルコール処理，塩したLED基盤を取り付け，食肉へ上部から照射

素処理，加熱，トリミングなど幾つか実用化されできるようにした。装置内には温度及び湿度計をているものもあるが，薬品など残留物が残ること設置し，UVA照射時の変動をモニタリングした。

食肉用ショーケース型UVA殺菌装置

や食肉の品質低下などの問題が指摘されている。

2.3

そこで，食肉の品質を低下させず残留物を残さな検体に用いた食肉（牛ばら薄切り肉）は徳島市

い経済性に優れた殺菌法が求められている。

食肉サンプルの準備

内の精肉店から毎回100gずつ購入した。入手し我々は近紫外線―発光ダイオード（UVA-LED）

た食肉は実験に用いるまで４℃で冷蔵保存した。

を用いた殺菌システムの開発を行ってきた。本シ照射実験には１gに切り分けた肉の小片を用いた。

ステムは，これまで殺菌に用いられている紫外線

2.4（UVC）とは異なる波長の紫外線，UVAを用いる

１gに切り分けた食肉の小片を，１%NaCl含有

ことにより，食品の品質劣化を起こしにくい。まLuria-Bertani（LB）寒天培地プレートに表裏１た，省電力であるLEDを用いることでランニン度ずつ密着させ，食肉表面に付着している細菌をグコストを軽減できる。さらに，長寿命である培地に塗布した。37℃で20時間培養した後，培地LEDを用いることは，食品の加工機器等に求め

上 に 形 成 さ れ た 細 菌 の コ ロ ニ ー 数 （colony

られる安全性と耐久性を高めることができるな

forming unit, CFU）を計測した。

食肉の生菌数測定

ど，多くの利点が生まれる。そこで，本研究では

2.5

UVA-LEDを用いた食肉の品質維持が可能な表面

同じ精肉店から購入した食肉を照射用サンプル

殺菌システムの開発を目指した。

食肉に対するUVA照射用（以下，サンプルまたはS）と未照射コント本研究では，ショーケースを想定したUVA-

ロール用（コントロールまたはC）に１gずつにLED 殺 菌 シ ス テ ム の 開 発 を 目 指 し て ，食 肉 用

切り分けた。切り分けた肉片はフタ付きの滅菌

ショーケース型UVA殺菌装置のプロトタイプを

シャーレ内のアルミ箔の上に2片ずつセットした。

© The Ito Foundation

50

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

肉片の乾燥防止のため，アルミ箔の下には4mlの

3 . 2 食肉用ショーケース型UVA殺菌装置内温滅菌水で湿らせた紙を敷いた。また，UVA照射

度と湿度

時には食肉の乾燥を防ぐ目的でポリ塩化ビニリテ

開発した食肉用ショーケース型UVA殺菌装置

ン（食品包装用ラップフィルム，旭化成ホームプ

内の温度と湿度を測定した。UVAを照射しながロダクツ株式会社）を食肉の表面に貼り付けた。

ら３時間以上測定を行ったが，装置内の温度はUVA照射後，サンプル及びコントロールの肉

15 ℃ か ら 20 ℃ の 間 で ほ ぼ 一 定 で あ っ た（Fig.

片 を ア ル ミ 箔 上 で 細 か く 切 り 刻 み ， 10ml

２A）
。さらに，湿度は90～95％に維持すること

Phosphate Buffered Saline（PBS）とよく混和しができた（Fig.２B）。

た。PBSと混和した肉片の懸濁液1mlをPBSで段3.3

階希釈し，LB寒天培地プレートに塗布した。そ購入した食肉にUVA照射を行ったところ，食の培地プレートを37℃で20時間培養し，コロニー数を計測した。

食肉の色の変化

肉の色の変化はみられなかった（Fig.３）。
3.4

2 . 6 塗布用大腸菌の調製

食肉に付着させた大腸菌への殺菌効果

購入した牛肉の表面に大腸菌を塗布後，UVA

大腸菌，Escherichia coli DH5α，を1%NaCl含を３時間照射した。大腸菌の生存率はUVA照射

有LB液体培地で17時間振とう培養した。その後，

時間依存的に減少し（Fig.４），３時間のUVA照菌液をPBSで３回洗浄した。PBSに再懸濁し，分射ではLog生存率が－2.2±0.3（n=４）であった。

光 光 度 計 を 用 い て 吸 光 度 600nm で OD₆₀₀ ＝ 1.0

3 . 5 購入時食肉に付着していた細菌への殺菌（1mlあたり生菌数約10 個）に調整した。調整し8た大腸菌を肉片表面に100μlに塗布した後，肉片効果
購入時より食肉に付着していた細菌に対して，

へのUVA照射を行った。
2.7

菌の生存比の計算

下記の計算式にLog生存率を求めた（下記の式，参照）。
Log生存率の検討では同様の実験を４回繰り返し行い，平均±標準偏差で示した。
３．結果と考察
3.1

食肉の生菌数測定

食肉に付着している細菌の生菌数は，購入した（Ａ）

精肉店によって大きく異なっていた（Fig. 1）。
よって，食肉管理の衛生状態は精肉店の間に差があることが推測された。

Log生存率＝Log［（B）

Fig.１ M easurement of the number of bacteria which

had adhered to the meat originally.
The meats were purchased at different meat
shops（A and B）in Tokushima City.

UVA-LED照射群で形成された１ｇあたりのコロニー数
コントロール群で形成された１ｇあたりのコロニー数© The Ito Foundation］

51

新規発光デバイスを用いた食肉の質を落とさない殺菌法の開発

（B）
100.0

1

31

61

91

121 151 181

Humidity（%）

Temperature（℃）

（Ａ）
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0

50.0
0.0
1

31

61

Time（min）

91

121 151 181

Time（min）

Fig.２ Measurement of the temperature and humidity in the UVA sterilization system for the meat showcase.

Temperature（A）and humidity（B）in the UVA sterilization system for the meat showcase with irradiationof the UVA were measured during the more than 3 hours. The air in the UVA sterilization equipment wasstirred continuously by a fan.

C1

S1

C2

S2

C3

S3

C4

S4

C5

S5

C6

S6

Fig.３ Change in color of the meat.
 The meat was irradiated with UVA irradiation for 3 hours（S），or without irradiation（C），in the

UVA sterilization system for the meat showcase. The number of the image（1 to 6）indicated each of
the different portions in the meat.

UVA照射による殺菌効果を検討した（Fig.５）。

テム３，４）や空気殺菌システム５）を基に開発し，本３時間のUVA照射による殺菌効果はLog生存率

研究で食肉用に向けて最適化を行った。

が－1.4±0.3（n=４）であった。

今回試作したUVA-LED照射システムを用いて本研究開発では，食肉に対してUVA-LED照射

実際に食肉にUVAを照射したが，食肉の色や匂システムを試作し食肉表面に付着した細菌に対すいには変化は認められなかった。この結果は，る効果を検討した。このシステムは，我々がこれ

UVA照射は野菜の色や成分に影響を与えにくいまで試作してきたLED-UVAを用いた水殺菌シスという我々の報告結果６）と合致していることか© The Ito Foundation

52

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

（A）

（B）

（C）

Fig.４ Changes in the amount of bacteria adhering to the meat.
 The meat was irradiated with UVA in the UVA sterilization system for the meat showcase. Each piecesof the meat was divided in one gram. Before irradiation with UVA, E. coli（107 colony forming units）were
inoculated to the meat.（A）The meat after 3 hours irradiation with UVA. The colonies of E. coli on the LB
broth plates were shown before（B）or after（C）irradiation with UVA.

（A）

（B）

Fig.５ Changes in the amount of bacteria were attached to the meat at

the time of purchase.
Each pieces of the meat was divided in one gram. The bacteria,that had adhered to the meat originally, was irradiated with UVA
for 3 hours（A）or without irradiation（B）in the UVA sterilization
system for the meat showcase.

ら，食肉の品質にも影響しにくい可能性が考えら上のことから，本研究では①食肉からしみ出た脂れた。

質やアミノ酸・たんぱく質がUVAを吸収した，

本システムによるUVA照射は，食肉表面に塗または，②細菌が肉繊維の間に入り込んだ，こと布した大腸菌へ有意な殺菌効果がみとめられた。

により購入時点より付着している細菌へUVAがしかし，購入時点より食肉に付着している細菌に到達しなかった可能性が考えられた。

対しての殺菌効果は非常に小さかった。我々はこ以上より，UVA-LEDによる食肉の殺菌は表面

れまでに腸管出血性大腸菌やサルモネラ，カンピへは有効であるが，内部や深部の殺菌は困難であロバクターなど食肉に混入する可能性のある病原ると考えられた。よって，今後は他の殺菌方法と細菌に対して，LEDを用いたUVA照射が十分なの併用やUVA照射方法の更なる効率化や最適化

殺菌効果を有していることを報告している 。以の検討が必要であると考えられた。

３）© The Ito Foundation

新規発光デバイスを用いた食肉の質を落とさない殺菌法の開発

４．要

53

非常に小さかった。

約以上より，本研究で開発したUVA-LED照射シ

食品の殺菌は「食の安全」の確保において最もステムによる食肉へ殺菌効果は，表面へは有効で基本手段であり，重要な課題の一つである。近年，あるが，内部や深部への殺菌効果は低いと考えら食肉を介する腸管出血性大腸菌の食中毒が大きなれた。今後は他の殺菌方法との併用やUVA照射問題となり，食肉の安全性に対する信頼が揺らい方法の更なる効率化や最適化の検討が必要である

でいる。そこで食肉の品質を低下させず残留物をと考えられた。

残さない経済性に優れた殺菌・維持法が求められている。
我々は近紫外線―発光ダイオード（UVA-LED）を用いた殺菌システムの開発を行ってきた。この
殺菌システムは従来の殺菌線（UVC）とは異なる波長の近紫外線（UVA）を用いることにより，食品の品質劣化を起こしにくい。また，LEDを用いることはランニングコストの軽減や安全性・耐久性の向上などの利点が生まれる。そこで，本研究では近紫外線―発光ダイオードを用いた食肉の表面殺菌・品質維持システムの開発を目指した。
まず，食肉用ショーケース型のUVA-LED照射システムを試作した。本システムは湿度と温度を一定に保てるように設計した。本システムを用いて実際に食肉にUVAを照射したが，食肉の色や匂いには変化はみられなかった。さらに，食肉表面に塗布した大腸菌に対して，UVA照射は有意な殺菌効果がみとめられた。しかし，購入時より

文
献１）
 社団法人日本食品衛生協会：全国食中毒事件録―
厚生労働省食中毒統計資料より―, 2011.
２）
 紫外発光LED標準仕様書 ，No. 120518, 日亜化学
工業株式会社３）
 Hamamoto A, Mori M, Takahashi A, Nakano M,
Wakikawa N, Akutagawa M, Ikehara T, Nakaya Y,
Kinouchi Y.: New water disinfection system using
UVA-light emitting diodes. J Appl Microbiol, 103,2291～2298, 2007.
４）
 Mori M, Hamamoto A, Takahashi A, Nakano M,
Wakikawa N, Tachibana A, Ikehara T, Nakaya Y,
Akutagawa M, Kinouchi Y.: Development of a newwater sterilization device with a 365nm UV-LED.
Med Biol Eng Comput, 45, 1237～1241, 2007.
５）
 Gadelmoula M, Lian X, Maeda M, Aihara M,
Mawatari K, Hamamoto A, Harada Y, Yamato M,
Akutagawa M, Nakaya Y, Kinouchi Y, andTakahashi A：Suitability of Ultraviolet（A）- Light
Emitting Diode for Air Stream Disinfection. J Med
Invest, 56, 150～156, 2009.
６） Lian X, Maeda M, Yamato M, Mawatari K,
Akutagawa M, Nakaya Y, Kinouchi Y, Takahashi
A：New UVA-LED surface sterilization system forvegetables. Proceeding of LED general forum 2010,
83～84, 2010.

食肉に付着している細菌に対しては，殺菌効果は© The Ito Foundation

54

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

食肉製品の調理中に起こるメイラード反応の消長と安全性の検討
Morbidity and safety for the maillard reaction occurred during cookingof meat products

大

塚

譲１・山

口

敬

子２・能

見

祐

理１

（１お茶の水女子大学生活環境教育研究センター，２日本女子大学家政学部食物学科）

Yuzuru Otsuka１, Keiko Yamaguchi２, and Yuri Nomi１（Institute of Environmental Science for Human Life, OchanomizuUniversity１，
Department of Food and Nutrition, Japan Women's University２）

During food processing and cooking, various kinds of flavor compounds, colored substances
and toxic substances are produced by the Maillard reaction. Thus, it is important to investigate
the relationship between the Maillard reaction products and the cooking conditions. Therefore,
we investigated effects of the seasonings and reaction conditions on the Maillard reaction ofmeat using furosine and fluorescent compounds.
The addition of 1% NaCl decreased the Maillard reaction rate measured by furosine in
Glc-meat reaction. Furosine content was increased rapidly by pan-broiling and frying, but
increased slowly at the beginning of gas oven baking. The fluorescence of broiled meat showedmaximum at 333/425 nm（exc./em.）and are useful indicator of the Maillard reaction of meat
sample. The rate of increasing fluorescence in gas oven baked meat was lower than that of themeat heated by other cooking conditions.
In the present living environment, we are exposed to various carcinogens. We havevarious diseases when exposed to these carcinogens. 4-Methylimidazole, produced by theMaillard reaction, is carcinogens in foods. But its effect on gene expression or metabolism
mechanism remains to be unknown. Xenobiotic in the body is generally eliminated from thebody by activated drug metabolic enzymes. Mainly drug metabolizing enzyme groupcytochromeP450（CYP）family is known as oxygenase, it might be induced oxidative stress by
4-Methylimidazole. In this study, we examined effects of 4-Methylimidazole on gene expression
such as drug metabolic enzyme and antioxidative enzyme.
When Hep-G2 cells were added with 4-Methylimidazole, drug metabolic enzymes such as
CYP1A1, CYP1A2, and NQO1 and antioxidative enzymes gene expression such as SOD1 and
GPX1 significantly increased. Many genes were significantly increased（up）or decreased（down）its gene expression when measured by microarray, so we need to confirm this data by
real time PCR.

© The Ito Foundation

食肉製品の調理中に起こるメイラード反応の消長と安全性の検討

１．目

55

理方法の違いがメイラード反応の進行に与える影的響について，370/440 nm（exc./em．）の蛍光強

食品の加工・調理・貯蔵の過程では成分間で度測定およびフロシンの定量により検討した。

様々な化学反応が起こり，食品の品質に影響を与2 . 2 4-Methylimidazoleが薬物代謝酵素，抗酸

えているが，その代表的な反応のひとつにメイ

化酵素遺伝子発現に与える影響について

ラード反応がある。この反応はアミノ化合物とカ

ヒト肝癌由来HepG２細胞を用い，様々な濃度

ルボニル化合物が共存すると起こる非酵素的褐変

の4-Methylimidazoleを添加後，MTT assay法に反応であり，糖やタンパク質などは食品や生体により細胞増殖曲線を作成し，細胞毒性について検普遍的に存在する基本構成成分であることから，討 し た 。細 胞 毒 性 が 見 ら れ な か っ た 250 μM

その重要性は明らかである。

4-MethylimidazoleをHepG２に添加し，４，８，

本研究では，実際の調理に即した条件下におい

16，24時間培養後RNA抽出を行い，それぞれ遺て，調味方法や調理条件が食肉中のメイラード反伝 子 発 現 の 変 化 に つ い て リ ア ル タ イ ム PCR や応に与える影響について明らかにすることにしDNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。

た。また，食肉の調理中に生成することが予想されるメイラード反応生成物4-Methylimidazoleの
安 全 性 に つ い て ，薬 物 代 謝 酵 素 遺 伝 子 で あ る
cytochrome P450（CYP）ファミリーやGST，さらにSODなどの抗酸化酵素等の遺伝子発現への影響を検討することにした。
２．方

３．結果と考察
3 . 1 食肉中の調味・調理操作がメイラード反応の進行に与える影響について
まず，lysineを用いたモデル反応系にて検討を行った。反応物である糖にスクロースを用いて，
NaCl添加による影響を検討した結果，スクロー

法

スはグルコースに比べて反応性が低いため，褐変

2 . 1 食肉中の調味・調理操作がメイラード反度，フロシン量ともに非常に低値を示し，NaCl
添加による影響を判別できなかった。比較のため応の進行に与える影響について
まず，lysine-スクロース（or グルコース）モに用いたグルコースでは，褐変度は加熱時間に伴

デル系におけるNaCl添加の影響を，470 nmにおい増加し，NaCl添加により有意に抑制された。

ける吸光度（褐変度）およびフロシンの定量によ

この結果は，過去に我々が行った実験と同様でり検討した。

あった１）。しかし，フロシン量は加熱１時間後に次に，食肉として牛挽き肉を用いて一般的な加増大がピークになったのを境に減少し，NaCl添

熱 調 理（フ ラ イ パ ン 焼 き ，200 ℃ ）に お け る

加による影響を確認できなかった。フロシンは反NaCl，グルコースあるいはスクロース添加がメ応中間体であるアマドリ化合物を反映した指標でイラード反応の進行に与える影響について，あるため，このような結果になったことが推察さ

370/440 nm（exc./em.）の蛍光強度測定およびフれた。実際の調味ではスクロースを用いることか

ロシンの定量により検討した。

ら，褐変度，フロシン量はメイラード反応の進行

さらに，調味された牛挽き肉（1.0％ NaCl，5.0％を評価する上で適切でない可能性が考えられた。

上白糖）を用いて，フライパン焼き（200℃），

次に，牛挽き肉をNaCl，スクロースあるいは

オーブン焼き（170℃），揚げ調理（140℃）の調

グルコースで調味したパティを用いてフライパン© The Ito Foundation

56

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

2500
Meat
Meat－Nacl

Furosine（mg/100g protein）

2000

Meat－Glc 5.0%
Meat－Glc 2.5%

1500

Meat－Sucrose 10.0%
Meat－Sucrose 5.0%

1000

Meat－Nacl－Glu 5.0%
Meat－Nacl－Glu 2.5%500

Meat－Nacl－Sucrose 10.0%
Meat－Nacl－Sucrose 5.0%

0
0

30

60

Time
（min）
The reaction conditions are described in“Materials and Methods”. The explanation of figure legends

was shown in Table 2. Each value is the mean of three determinations. ＊p＜0.05 by Tukey-Kramer
post-hoc test.Concentration of NaCl was 1.0％.
Fig.１ Amounts of furosineof pan-broiled（at 200℃）meat samples containing saccharide and NaCl

焼き（200℃）におけるフロシン量を測定した

熱後10分までに増大したが，加熱10分後以降フロ（Fig.１）。調味なし，NaClのみで調味したパティ

シン量の増加は見られなかった。それに対して，中にも，少ないながらもフロシンは存在していオーブン焼きでは加熱後15分までは増加しなかった。これは，牛挽き肉の中に元来グルコースが含たが，15分過ぎに直線的に増加した。この理由とまれていたためだと考えられた。スクロースで調して，オーブン焼きでは他の２種類の調理条件と味したパティも同様にフロシン量は少なかった。

比較して，加熱初期のサンプル内部の温度上昇が反応性が高いグルコースで調味した場合，添加量

緩やかであったことが考えられた。オーブン焼きに伴いフロシン量は増加したが，NaCl添加によと揚げ調理については，調味したパティの方がフり減少し，lysineを用いたモデル系と同様の結果

ロシン量は有意に多かった。しかしながら，各調が得られた。しかし，実際にはスクロースで調味理条件におけるフロシン量の差はほとんどなかっするため，フライパン焼きにおいてはスクロース

た。しがたって，これら３種の調理条件において，とNaClによる調味はフロシン量にはあまり影響

調味によるフロシン量への影響は少ないことが示しないことが示唆された。

唆された。

調理条件によるメイラード反応進行の違いを検

フロシン量ではメイラード反応の進行を正しく討するため，1.0％ NaCl，5.0％ 上白糖で調味した

反映していない可能性が考えられたことから，蛍

牛挽き肉パティを各々フライパン焼き，オーブン

光強度による評価を検討することにした。一般に焼き，揚げ調理して，各サンプルのフロシン量，メイラード反応由来の蛍光物質の測定には，励起サンプル内部温度を測定した（Fig.２）。フロシ波長（exc.）340～370 nm，発光波長（em.）420

ン量については，フライパン焼きと揚げ調理で加～470 nmがよく用いられている２）。また，in vivo

© The Ito Foundation

57

食肉製品の調理中に起こるメイラード反応の消長と安全性の検討

200
Furosine（mg/100g protein）

（B）

200
Furosine（mg/100g protein）

（A）

160
120
80
40
0

0

10

20
Time
（mn）

160
120
80
40
0

30

0

10

20
Time
（mn）

30

（C）

Furosine（mg/100g protein）

200
Meat
Tenperature
（℃）

160
120
80
40

Meat+Sucrose+Nacl
Meat temperature
Meat+Sucrose+Nacl
temperature

0
0

10

20
Time
（mn）

30

The reaction conditions are described in“Materials and Methods”. Each value is the mean of three determinations.
＊p＜0.05 by Tukey-Kramer post-hoc test. Meat was added with 5.0％ white superion soft sugar and 1.0％ NaCl.
Fig.２ Amounts of furosine of pan-broiled（A）and gas oven baked（B）and fried（C）meat samples
containing Sucrose and NaCl

A

B

1000.00

1000.00

0.00

0.00

220

900

220

900

The emission wavelengths was fixed to 425 nm, and excitation wavelength was scanned from 220 to 900 nm.
Fig.３ Fluorescence spectrums of raw meat sample（A）and meat sample pan-broiled

at 200℃ for 30 min（B）.

© The Ito Foundation

58

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

B
140

35000

120

30000

100

25000

Fluorescence intensity

Fluorescence intensity

A

80
60
40

20000
15000
10000

20
0

5000

0

5

10

15

20

25

30

0

0

5

10

15

20

25

30

Time
（min）

Time
（min）
Pan-broiled meatGas oven baked meatFried meat

Pan-broiled meatGas oven baked meatFried meat

The reaction conditions are described in“Materials and Methods”. Fluorescence was measured with

370/440 nm（A）and 333/425 nm（B）（exc./em.）.Each value is the mean of three determinations.
p＜0.05 by Tukey-Kramer post-hoc test.
Fig.４ Comparison of fluorescence intensity of meat samples heated by three kinds of cooking methods.
＊■Amino acid metabolism■Biological process unclassiﬁed■Carbohydrate metabolism■Cell cycle■Cell structure and motility■Cell surface receptor mediated signal transduction■Developmental processes■Immunity and defense■Intracellular protein traﬃc■Intracellular signaling cascade■Lipid, fatty acid and steroid metabolism■Nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism■Protein metabolism and modiﬁcation■Proteolysis■Signal transduction■Transport■others■unknown

250μM of 4-methylimidazole was added to HepG2 cell and RNA was extracted after 4 h. Then,microarray gene expression analysis was done.
Fig.５ The result of microarray gene expression analysis© The Ito Foundation

食肉製品の調理中に起こるメイラード反応の消長と安全性の検討

59における蛍光物質測定には，370/440 nm（exc./

を解析し，4-Methylimidazoleの遺伝子発現機構em.） や，350/450 nm（exc./em.） が用いられを明らかにしたい。

３）

４）ている。本研究で用いている牛挽き肉パティについ て 励 起 波 長 ，発 光 波 長 を 検 討 し た 結 果 ，

４．要

約

333/425 nm（exc./em.）で最も感度よく測定でき

本研究では，実際の調味方法や調理条件が食肉ることが明らかとなった。発光波長を425 nmに中のメイラード反応に与える影響について明らか設定し励起波長を220～900 nmでスキャンした結にすることにした。また，食肉の調理中に生成す果，加熱牛挽き肉サンプルは励起波長333 nmにることが予想されるメイラード反応生成物て極大ピークがみられ，未加熱の牛挽き肉サンプ

4-Methylimidazoleの安全性について，薬物代謝

ルにはこのような極大ピークはみられなかった

酵素遺伝子であるcytochrome P450（CYP）ファ

（Fig.３）。また，333/425 nm（exc./em.）で測定

ミリーやGST，さらにSODなどの抗酸化酵素等

した蛍光強度は，過去に報告された370/440 nmの遺伝子発現への影響を検討した。

（exc./em.）の測定と比べて300倍感度が良かった

グルコースと牛挽き肉の反応においてフロシン（Fig.４）。各調理条件における牛挽き肉サンプルの生成量でみると，１％ NaCl添加によりメイ中の蛍光強度は加熱時間に伴い増加しており，本ラード反応の速度は減少したが，スクロースでは測定法が加熱牛肉のメイラード反応の進行を反映

あまり差はなかった。フロシンの生成はフライパする指標として有効であることが示唆された。まン焼きと油による揚げ調理では急速に増加した

た，ほかの２種の調理条件と比べて，オーブン焼が，オーブン焼きでは緩やかに増加した。加熱しきの蛍光強度増加速度が最も緩やかであった。

た牛挽き肉の蛍光強度は333/425 nm（exc./em.）

3 . 2 4-Methylimidazoleが薬物代謝酵素，抗酸に最大値を有し，この波長は肉のメイラード反応

化酵素遺伝子発現に与える影響についての指標になることが示唆された。他の２つの調理

まず，マイクロアレイを行う際の添加濃度を検方法に比べてオーブンで加熱した肉製品の蛍光の討するため，4-Methylimidazoleの各濃度におけ増加速度は低かった。

る細胞毒性をMTT assayにより評価した。また，

また，Hep-G２細胞に250μM 4-Methylimidazole

CYP1A1，CYP1A2，SOD1，GPX1のリアルタを添加し４時間培養後のRNAを抽出しマイクロイムPCRを行い，各遺伝子の発現が上昇する時間

アレイ解析を行った結果，主にシグナル伝達を媒等を検討した結果，250μＭの添加濃度で培養し，介する細胞表面受容体に関連する遺伝子の発現の４時間後にRNAを抽出することに決定した。

上昇傾向がみられた。

上記の添加濃度で培養後，４時間後にRNAを抽出し，マイクロアレイによる解析を行った。結果，シグナル伝達を媒介する細胞表面受容体に関連する遺伝子の発現の上昇傾向がみられた（Fig.
５）。しかしながら，機能が不明な遺伝子も多く存在することから，個々の遺伝子について，今後
リアルタイムPCRでコンファームする必要がある。また，今回得られたマイクロアレイのデータ

文 献１）
 Yamaguchi, K., Noumi, Y., Nakajima, K.,
Nagatsuka, C., Aizawa, H., Nakawaki, R., Mizude, E.,
Otsuka, Y., Homma, T., and Chuyen, N.V.：Effectsof salt concentration on the reaction rate of Glc
with amino acids, peptides, and proteins. Biosci
Biotechnol Biochem., 73, 2379～2383, 2009.
２）
 Matiacevich, S.B., Santagapita, P.R., and Buera,
M.P.：Fluorescence from the maillard reaction andits potential applications in food science. Crit Rev© The Ito Foundation

60

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Food SciNutr., 45, 483～495, 2005.
３） Forbes, J.M., Yee, L.T., Thallas, V., Lassila, M.,
Candido, R., Jandeleit-Dahm, K.A., Thomas, M.C.,
Burns, W.C., Deemer, E.K., Thorpe, S.R., Cooper,
M.E., and Allen, T.J.：Advanced glycation end
product interventions reduce diabetes-accelerated

atherosclerosis. Diabetes, 53, 1813～1823, 2004.
４）
 Ahmed, N. and Thornally, P.J.：Advanced
glycation endproducts:what is their relevance todiabetic complications? Diabetes Obes. Metab., 9, 233～245, 2007.

© The Ito Foundation

平成23年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

61

試食パネルによる黒毛和種牛肉の脂肪酸組成，香気成分，
呈味成分と食味性との関連に関する研究
Study on the relation between fatty acid composition, flavor, taste componentof Japanese black beef meat and eating quality by tasting panel

鈴木啓一１・横田祥子１・塩浦 宏陽１・飯田 文子２・
山田 信一３・佐久間弘典３（１東北大学大学院農学研究科，２日本女子大学，３家畜改良センター）

Keiichi Suzuki１, Shoko Yokota１, Shioura Hiroaki１, Fumiko Iida２,
Shinichi Yamada３, Hironori Sakuma３（１Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University
２

Japan Women's University, ３National Livestock Breeding Center）

To produce an index of a delicious beef evaluation, relations among panel test items
evaluated with the training panel, the fatty acid composition, the amino acid and peptide
components, and the aroma components were examined using Japanese black cattle beef withknown BMS No. and fatty acid composition. The most contributed item to the“Overall
judgment”of the panel test item was“Desirable taste（56.9％）. The respective contribution
rates of“Good cattle aroma”,“Total texture”and“Strength of the flavor”to“Overall
judgment”were 22.8％, 2.1％ and 1.1％. Partial correlation of the panel test item and thechemical composition calculated by considering the BMS No. and sex showed significant
negative correlation of C16:0 and saturated fatty acid（SFA）and significant positive correlationof mono-saturated fatty acid（MUFA）with“Strength of flavor”, which suggests that the
MUFA is important for beef flavor. In the odor component, a significant, negative correlation
was shown respectively between alcohol, unsaturated aliphatic aldehydes, and “Good cattle
aroma”. Furthermore, although a significant positive relation of free amino acid and sugar to“Desirable taste”was expected, no significant correlation of these chemical compositions wasfound with“Desirable taste”. Comparison of brand beefs that had meat quality features isnecessary to specify the index for evaluation of delicious beef.

１．目

方で，新たな肉質評価基準が模索されており，よ的り付加価値の高いおいしい牛肉の指標づくりが課

国内で生産されている黒毛和種牛肉の脂肪交雑

題となってきている。牛肉の食味性に関しては，などの肉質は育種改良と飼養管理技術の改善によ

国産黒毛和牛に特異な香り成分（和牛香）や，最り劇的に変化してきている。このような変化の一

近ではオレイン酸などのモノ不飽和脂肪酸割合が© The Ito Foundation

62

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

関連しているとの報告がある。しかし，肉のおいそれぞれ10頭ずつ合計60頭分のロース肉を買い取

しさは，アミノ酸，脂肪酸組成などの他にも未解り，以下の分析を行った。はじめに，入手した真明の複合的な要素が加わったものと考えられる。

空パック冷凍保存された牛肉ロース部分から脂肪

我々は，昨年度貴財団の助成を受け，「試食パ酸組成分析のための脂肪を採材した。パネルテス

ネルによる黒毛和種牛肉の肉質等級，脂肪酸組成

ト用，アミノ酸とジペプチド分析用，香気成分分と食味性との関連に関する研究」により，45頭分

析用に分割し再度真空パック冷凍保存し，以下ののサーロイン牛肉についてBMSNo．
，性を一定と分析に使用した。

した場合にモノ不飽和脂肪酸の割合の違い（高中2.2

低の平均がそれぞれ60.09％，56.74％，53.41％）

採材した脂肪をｎ-ヘキサン（和光純薬）
を１mLがどの程度食味性に影響を及ぼすかを訓練パネル

加え激しく振とうした後，10分以上室温に放置により比較検討した。その結果，モノ不飽和脂肪

し，２N-NaOHメタノールを200μＬ添加し，約酸の効果は，「線維感」と「総合的食感」で有意１分間振とうする。さらに，ウォーターバスによだが，モノ不飽和脂肪酸割合「高」が「中」やり50℃で20秒間加温し，約１分振とうした後室温「低」より低い結果となった。また，「風味の強さ」に放置して冷却させ，塩酸メタノール試薬10（２と「総合判定」については，モノ不飽和脂肪酸がN-HCLメタノール；東京化成）を600μＬ添加し，「高」「低」よりも「中」で評価の高い結果が得ら

約１分間振とうした後，２層に分離した上層をれた。さらに，「総合判定」に最も寄与する官能

キャピラリーガラスピペットを使って別の共詮試

評価項目は，「好ましいうま味」（寄与率56.2％）

験管に分け取る。ブロックヒーターで50℃に加温であり，次いで「風味の強さ」（寄与率28.4％）

し窒素を噴きつけながらｎ-ヘキサンを揮発させだった。そして，「風味の強さ」と関連するのはて濃縮し，その後一定量のｎ-ヘキサンで希釈しモノ不飽和脂肪酸であることがわかった。これらてガスクロマトグラフィーにより脂肪酸組成を分の結果から，「好ましいうま味」に関与する理化

析する。この分析結果に基づき，モノ不飽和脂肪

学的成分の特定が極めて重要であることが明らか

酸の高，中，低の３グループに分けた。
2.3

となった。

脂肪酸分析

アミノ酸・ジペプチドの分析

本研究の目的は，おいしい牛肉評価の指標を作サーロイン牛肉の一部200～250㎎を粉砕してか成するため黒毛和種牛肉の肉質等級と脂肪酸組成

らホモジナイズし，ヘキサン５mLで脱脂してかが既知の牛肉を使い，訓練パネルにより評価されらヘキサンを吸引除去した。その後，アセトニト

た「好ましいうま味」と最も関連する脂肪酸組

リル3.5mLを添加し，70％アセトニトリル（５成，アミノ酸とペプチド成分，香気成分の効果をmL）とした。0.45μｍのフィルターを通したも検討し，黒毛和種牛肉の美味しさの指標を作成すの１mLを高速液体クロマトグラフィで分析した。

ることである。

得られたクロマトグラムの各アミノ酸のピーク強

２．方
2.1

度を標準アミノ酸のピーク強度と比較算出した。

法

2.4

香気成分の分析

香気成分は，サーロイン10gから抽出した脂肪

サンプルの入手

食肉市場に出荷された枝肉を流通業者の協力に0.2g を 用 い て ， Dynamic-HeadspaceSPME 法

より，BMSNo.４，
７，
９の去勢と雌の牛肉１㎏を１）（Watanabeら2008）
により捕集した後，GCMS© The Ito Foundation

試食パネルによる黒毛和種牛肉の脂肪酸組成，香気成分，呈味成分と食味性との関連に関する研究
Table１Result of multiple regression analysis on panel test.

N＝54

Independent Variables

Ｒ２

Ｘ１

Favorable taste

56.9

0.346

Ｘ２

Good cattle aroma

22.8

0.204

Ｘ３

Total texture

2.1

0.190

Ｘ４

Strength of flavor

1.1－3.074

Intercept

Dependent variable

coefficiency

Y（Overall judgment）

0.791

63

で測定した。香気成分の同定は，公表されている

量 ，他 の パ ネ ル テ ス ト 項 目 を 従 属 変 量 と し た

リテンショインデックスとNIST/EPA/NIHスペ

Stepwise法による重回帰分析を行った。さらに，

クトルデータベースのシミラリティーインデック

BMSNo.と性を考慮してパネルテスト項目と，脂ス（SI％）を用いて行った。同定した成分は，ラ肪酸組成，アミノ酸・ジペプチド，香気成分とのクトン類，ケトン類，アルコール類，飽和脂肪族

偏相関係数をSASのMANOVAオプションによりアルデヒド類，不飽和脂肪族アルデヒド類，酸類

計算した。

およびジテルペノイド類の７種類に分類し，統計分析に用いた。なお，測定値は，内部標準物質である1.2-ジクロロベンゼンに対する強度比とした。
2.5

パネルテスト３．結果と考察
BMSNo.（４，７，９）の性（去勢と雌）およびモノ不飽和脂肪酸（低，中，高）の牛肉54頭分に真空パック冷凍保存した牛肉を２℃の恒温槽中ついて実施した10項目のパネルテスト項目についで24時間かけて解凍した牛肉を使い，日本女子大て，「総合評価」を従属変量，残りの項目を独立学の訓練されたパネルにより，肉質等級の異なる変量として重回帰分析を行った結果をTable１に牛肉（BMSNo.４，７，９），性，モノ不飽和脂肪示した。総合評価に最も寄与している項目は「好酸割合（高，中，低）の異なる牛肉について，食ましい味」であり，56.9％の寄与率を示した。次

味 テ ス ト を 行 っ た 。パ ネ ル テ ス ト の 方 法 は ，いで，「良い牛くささ」が22.8％の寄与率を示し

BMSNo.４，７，９，性の異なる牛肉毎に，モノ不た。
「総合的食感」が2.1％，「風味の強さ」は1.1％飽和脂肪酸割合の低，中，高の肉を３点比較法にの寄与率だった。以上の結果から，パネルテストより行った。パネルテスト項目は，「やわらかさの「総合評価」に最も影響している項目は「好ま（はじめの一噛み）」「やわらかさ（咀嚼時）」「線しい味」，次いで「良い牛くささ」であることが維感」「多汁性」「総合的食感」「良い牛くささ」

分かった。

「悪い牛くささ」「風味の強さ」「好ましいうま味」「総合評価」の10項目である。
2.6

次に，「好ましい味」を含む「総合的食感」，「良
い牛くささ」，「悪い牛くささ」，「風味の強さ」，「総

統計解析

合評価」の６つのパネル項目と，化学成分として

統 計 解 析 に は SAS プ ロ グ ラ ム を 使 用 し た 。

の脂肪酸組成，香気成分，アミノ酸と糖成分との

BMSNo.（４，
７，
９），性（去勢と雌），モノ不飽

相 関 を 検 討 し た 。な お ，分 散 分 析 の 結 果 ，和脂肪酸割合（低，中，高）を要因とした分散分

BMSNo．と性が分析項目に明らかに影響するこ析とパネルテスト項目の「総合評価」を従属変とが示されたので，BMSNo.と性を考慮して推定© The Ito Foundation

64

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Table２ P artial correlation coefficients from error between panel test and fatty acids composition
Mean

SD

Texture

Good

Bad

Flav

Taste

Overall

ｃ140

2.59

0.44

0.38

0.12

0.04

－0.12

0.00

0.05

ｃ160

26.27

2.21

0.50

0.12

0.06

－0.34g

－0.10

－0.04

ｃ161

4.07

0.91

0.02

0.10

－0.01

0.25

0.15

0.15

ｃ180

11.65

1.96

0.05

0.00

0.06

－0.10

－0.07

－0.01

ｃ181

53.11

2.93

－0.51

－0.10

－0.06

0.28

0.12

0.02

ｃ182

2.31

0.6

0.00

－0.22

－0.11

0.00

－0.19

－0.18

SFA

40.51

3.38

0.44

0.11

0.08

－0.32g

－0.11

－0.03

MUFA

57.18

3.37

－0.45

－0.06

－0.06

0.32g

0.15

0.07

RATIO

1.43

0.2

－0.44

－0.07

－0.07

0.28g

0.11

0.04

Texture: Total texture, Good: Good cattle aroma, Bad: Bad cattle aroma, Flav: Strength of flavor, Taste ： Favorable
taste, Overall: Overall judgment. SFA: Saturated fatty acids, MUFA: Mono-unsaturated fatty acids ， RATIO: MUFA/SFA, Bold figure shows significant coefficient of correlation at５％．

した誤差の偏相関係数を計算して検討した。

DF＝48（１成分）およびジテルペノイド類（５成分）に脂肪酸組成については，Ｃ14：０，Ｃ16：０と分類した。分類した香気成分と香りに関するパネ

SFAが「総合的食感」と0.35，0.50および0.44のルテスト項目との相関をTable３に示した。アル

有 意 な 正 の 相 関 を 示 し た 一 方 で ，Ｃ 18：１ とコール類および不飽和脂肪族アルデヒド類と「良MUFAおよびRATIOは有意な負の相関を示し

い牛くささ」との間でそれぞれ有意な負の相関をた。一般に，飽和脂肪酸が多いと融点が高く，モ示した。また，有意ではないが，ケトン類や飽和ノ不飽和脂肪酸が多いと融点が低くなることが予

脂肪族アルデヒド類と「良い牛くささ」との間で想されるが，融点が高い方が「総合的食感」にはも負の相関を示した。和牛肉には，和牛香と呼ば良い影響をもたらすことは意外な結果といえる。

れる脂っぽく甘い香りが存在しており２），この和

逆に脂肪の融点が低いため，脂肪が溶けることで牛香の脂っぽい香りには，脂臭い香り（脂肪様香

線維感を生じることが食感には良くない結果に気）を有する一部のアルコール類やアルデヒド類なった可能性がある。また，「風味の強さ」は，などに加え，バター様の香りを有する一部のケト

Ｃ16：０，SFA（飽和脂肪酸）と負の有意な相ン類が寄与していることが報告されている（松石関を，MUFA（モノ不飽和脂肪酸）は正の有意

３）ら2004）。本研究において，これらの香気成分

な相関（0.32）を示し，モノ不飽和脂肪酸が風味と「良い牛くささ」との間で負の相関を示したのと関連することが示された。モノ不飽和脂肪酸がは，これらの香気成分に由来する脂っぽい香り「風味の強さ」に正の効果をもたらすことは妥当

が，「良い牛くささ」と反していたことが一つのな結果といえる。そのほかのパネルテスト項目と要因ではないかと考えられた。

はほとんど関連がないことが示された（Table２）。

最後に遊離アミノ酸，糖成分とパネルテスト項

香気成分は，22成分を同定し，それぞれラクト

目との相関をTable４に示した。遊離アミノ酸やン類（４成分），ケトン類（２成分），アルコール

糖成分は「好ましい味」との関連が期待された類（１ 成 分），飽 和 脂 肪 族 ア ル デ ヒ ド 類（６ 成が，「好ましい味」と有意な相関は検出されな分），不飽和脂肪族アルデヒド類（３成分），酸類

かった。Cys２が「総合食感」と正の有意な相関© The Ito Foundation

試食パネルによる黒毛和種牛肉の脂肪酸組成，香気成分，呈味成分と食味性との関連に関する研究

65Table３ Partial correlation coefficients from error between panel test

of aroma and volatile compounds.
Mean

SD

Good

Bad

Flav

Lactones

27.4

15.2

0.08

－0.14

－0.29

Ketones

78.7

36.6

－0.19

－0.06

0.13

5.1

1.8

－0.34

－0.15

0.17

Aliphatic aldehydes（saturated）

Alcohols

318.8

125.2

－0.28

－0.06

0.10

Aliphatic aldehydes（unsaturated）

153.8

74.5

－0.34

－0.17

0.03

Acids

4.1

0.9

0.06

0.10

－0.04

Diterpenoids

60.0

22.0

0.17

0.30

0.18

Good：Good cattle aroma, Bad：Bad cattle aroma, Flav：Strength of flavor,
Bold figure shows significant coefficient of correlation at ５％DF＝42を示した。また，「良い牛くささ」はTriptophan

は，より味に特徴のある銘柄牛肉などを対象としと正の相関を示した。糖成分のうち，Glycerolがたパネルテストや化学成分の比較検討を行うこと「良い牛くささ」とGlycogenが「悪い牛くささ」

がおいしい牛肉の指標作成のためには必要であると正の有意な相関を示した。

と思われる。

以上，本研究では，BMSNo．
，性，脂肪酸組成が明かな牛肉を分析型のパネルテストにより評価

４．要

約

し，パネルテスト項目とそれらの牛肉の化学成分

おいしい牛肉評価の指標を作成するため，黒毛としての香気成分，アミノ酸や糖類などの分析値

和種牛肉の肉質等級と脂肪酸組成が既知の牛肉をとの関連を検討した。パネルテストの「総合評使い，訓練パネルにより評価されたパネル項目と価」に最も寄与するパネル項目は「好ましい味」，

脂肪酸組成，アミノ酸とペプチド成分，香気成分

次いで「良い牛くささ」であり，「風味の強さ」との関連を検討した。パネルテスト項目の総合評

は比較的寄与率が低かった。最も寄与する「好ま価に最も寄与するパネル項目は，「好ましい味」

しい味」と化学成分との関連を検討したがいずれであり，次いで「良い牛くささ」，「総合的食感」の化学成分も関連が認められなかった。兵庫県畜「風 味 の 強 さ」の 順 だ っ た 。こ れ ら の 項 目 と産技術センターの報告では，但馬牛・神戸ビーフBMSNo．
，性を考慮して化学成分との偏相関を算と一般の牛肉との官能評価試験により焼肉の総合出した結果，「風味の強さ」は，Ｃ16：０，SFA（飽評価は「やわらかさ」，「風味」，「うま味」と，煮和脂肪酸）と負の有意な相関を，MUFA（モノ肉の総合評価，「風味」，「うま味」と高い相関が不飽和脂肪酸）は正の有意な相関を示し，モノ不あること，モノ不飽和脂肪酸割合は中程度の総合

飽和脂肪酸が風味と関連することが示された。香

評価の高いこと，食味評価とジペプチドとの関係

気成分では，アルコール類および不飽和脂肪族アではアンセリンが多くなると総合評価が低くなる

ルデヒド類と「良い牛くささ」との間でそれぞれことなどを報告している。本研究では，宮城県

有意な負の相関が示された。さらに，遊離アミノの食肉市場に出荷された牛肉を対照としたパネル

酸や糖成分は「好ましい味」との関連が期待されテストと化学成分との関連を検討したが，今後たが，「好ましい味」と有意な相関は検出されな

４）© The Ito Foundation

66

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Table４ Partial correlation coefficients from error between panel test and amino acids, sugar component．
Mean
Free amino acid（nmol/gWW）

Sugar（μg/gWW）

SD

Texture

Good

Bad

－0.13

－0.25

Flav

Taste

Overall

0.02

－0.01

－0.25

Aspartic acid

13.2

27.0

－0.18

Glutamic acid

156.1

104.2

0.03

0.06

0.07

－0.17

0.20

0.12

Asparate

44.9

61.2

0.00

－0.01

－0.01

0.04

0.23

0.16

Serine

193.4

83.0

0.12

－0.07

－0.08

0.12

0.20

0.22

Glutamine

3583.02088.0

－0.01

0.21

0.09

－0.12

－0.01

－0.06

Glycine

3.6

18.8

0.16

0.11

0.26

0.11

0.04

0.03

Histidine

402.9

134.8

－0.07

－0.12

－0.13

－0.03

0.15

0.07

Threonine

89.8

96.1

0.07

－0.07

－0.07

0.03

0.13

0.09

b-Alanine

19.1

40.9

0.15

0.12

0.08

0.26

0.00

0.03

Arginine

142.7

48.6

0.10

0.03

0.02

－0.01

0.05

0.07

Alanine2249.0

610.8

－0.09

0.04

－0.05

－0.13

0.07

0.01

Car＋Tau

3981.01495.0

0.18

－0.06

0.00

0.14

－0.02

0.07

Ans

467.8

320.2

0.12

－0.09

－0.01

0.12

0.12

0.16

Tyrosine

170.1

80.0

0.15

0.05

0.14

0.12

0.07

0.22

Cys２

87.3

40.6

0.16

0.19

0.25

0.12

0.18

0.35

Valine

190.4

98.4

0.12

0.02

0.11

－0.03

0.01

0.11

Methionine

53.7

87.1

0.13

－0.08

0.14

0.03

0.06

0.12

Triptophan

79.4

48.9

0.12

0.45

0.21

－0.04

－0.01

0.13

Phenylalanine

162.8

79.2

0.14

0.21

0.24

0.00

0.09

0.22

Isoleucine

131.7

133.6

0.16

－0.05

0.04

0.07

－0.01

0.03

Leucine

345.1

166.2

0.18

0.08

0.17

0.01

0.06

0.21

Lysine

69.5

55.0

0.11

－0.07

0.03

0.01

0.00

－0.10

Proline

22.1

60.0

0.12

0.01

－0.04

0.00

0.13

－0.07

Glycerol

737.6

133.5

0.09

0.30

0.05

－0.11

－0.15

0.00

Ribose

106.4

64.2

0.01

0.10

0.06

－0.21

0.09

0.08

Fructose

189.2

110.2

0.11

－0.07

0.11

0.04

0.01

0.18

Mannose

85.5

56.8

0.16

－0.01

0.12

0.02

0.09

0.22

Glucose

504.2

225.1

－0.02

0.10

0.13

0.13

0.00

0.18

Inositol

211.2

146.6

0.00

0.24

0.15

－0.11

0.04

0.09

total

1834.0

463.9

0.06

0.21

0.17

－0.02

－0.01

0.19

1.0

0.9

0.17

0.12

0.29

0.13

－0.04

0.14

GlycogenTexture: Total texture, Good: Good cattle aroma, Bad: Bad cattle aroma, Flav: Strength of flavor ， Taste: Favorable taste, Overall:
Overall judgment. Significant level of coefficient of correlation at05％

was 0.268． Bold figure shows significant coefficient ofcorrelation at５％．DF＝48．

かった。以上の結果から，おいしい牛肉評価につ謝辞

ながるパネルテスト項目と関連する化学成分を検本試験で分析に供した黒毛和種牛肉の入手につい出するには，肉質に特徴のある銘柄牛間の比較がて多大な協力を頂きました株式会社丸市に深甚の謝必要であると考えられた。

意を表します。

© The Ito Foundation

試食パネルによる黒毛和種牛肉の脂肪酸組成，香気成分，呈味成分と食味性との関連に関する研究
文 献１） Watanabe A, Ueda Y, Higuchi M, Shiba N ：Analysis of Volatile Compounds in Beef Fat by
Dynamic-Headspace Solid-Phase Microextraction
Combined with Gas chromatography-mass
spectrometry. Journal of food science. 73 ： C420 ～C425, 2008.
２） 沖谷明紘：食肉の風味形成に関する研究，日本栄67

養，食糧学会誌，第59巻（第１号），39～50，2006．
３）
 松石昌典，久米淳一，伊藤友己，高橋道長，荒井
正純，永富宏，渡邊佳奈，早瀬文孝，沖谷明紘：和牛肉と輸入牛肉の香気成分，日本畜産学会報，75，
409～415，2004．
４） 岡章生，岩本英治：黒毛和種去勢牛の枝肉性状および美味しさ成分と官能評価の関係，平成22年度兵庫県畜産技術センター成果発表会，2011.1．

© The Ito Foundation

68

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究
Intramuscular free fatty acids related to beef eating quality

山之上

稔・矢野

恵子・上田

修司・井原

一高・豊田

淨彦

（神戸大学大学院農学研究科）

Minoru Yamanoue, Keiko Yano, Syuji Ueda, Ikko Ihara and Kiyohiko Toyoda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

It has been known that marbling and fatty acid composition influence on quality ofJapanese Black Wagyu beef. Beef with the most desirable flavour has lower percentages ofsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids and higher percentage ofmonounsaturated fatty acids in the intramuscular fat. However, changes in the amount andfatty acid composition of intramuscular fat when beef is provided as a food have not beencleared yet.
The aim of this study was to analyze the changes in intramuscular fat of Japanese Black
Wagyu beef after postmortem aging and cooking. Sample meats were taken from carcass
cross-section between the sixth and seventh ribs of Japanese Black Wagyu cattle and stored at
4℃ antiseptically. At 7-, 14- and 28-days postmortem, total lipid was extracted with a mixtureof chloroform and methanol according to the Folch method. Total lipid was separated to eachlipid class such as triacylglycerol（TG）, free fatty acids（FFA）, cholesterol ester and others bysilica column chromatography and the amounts of those lipids were measured. On the other
hand, meat samples at 21-days postmortem were cooked to internal temperature of 65-70℃ andsupplied to above measurements. Separated lipids were esterified with BF3-MeOH and eachfatty acid composition was determined by GC analysis.
As the results, postmortem aging had no effect on the amounts and the fatty acidcomposition of total lipid and TG of intramuscular fat. But the amount of FFA increased
significantly during postmortem aging（P＜0.05）. Cooking caused no significant change in any
amounts and fatty acid composition of total lipid, TG and FFA. Thus, increased amount of FFA
in intramuscular fat during postmortem aging is possible to relate to eating quality of JapaneseBlack Wagyu beef.

１．目

成の影響が注目され，筋肉内の脂肪量だけでなく的

脂 肪 の 質 ，す な わ ち ト リ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル

牛肉のおいしさには脂肪の関与も大きく，筋内（TG）の脂肪酸組成において飽和脂肪酸（SFA）

脂肪が多いことや霜降りなどが重要視されていおよび不飽和脂肪酸（PUFA）が少なく，一価不る。一方で，近年では牛肉品質に与える脂肪酸組

飽和脂肪酸（MUFA）が多いほど牛肉は好まし© The Ito Foundation

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究

い風味を呈すると報告されている１～３）。しかしながら，これまで数多く報告されている牛肉生産時の筋内脂肪量や脂肪酸組成に関する知見が，牛肉

69

とする。
２．方

法

賞味時の食味性を直接反映しているか否かは不明

2.1

である。

試薬は特に表記してあるものを除き，ナカライ

試薬および牛肉試料

通常，牛肉は長期間の熟成を経て加熱調理後にテスク社もしくは和光純薬工業株式会社の特級試食されている。熟成の進行に伴い牛肉が酸化や酵薬を用いた。牛肉試料は，伊藤ハム（株）関西素の影響を受けて筋内脂肪に経時的変化が起きてミートセンターから購入した黒毛和種枝肉の第６いる可能性が考えられるが，熟成による筋内脂肪～７胸椎間のロース部を用いた。

の変化と牛肉のおいしさに関する報告は少ない。

2.2

熟成および加熱処理

また牛肉は生食することが少なく，焼く・煮る

ロース部の牛肉を４℃で保存し，と畜後７日などの加熱調理が行なわれる。加熱により香り，目，14日目，および28日目にロース芯から牛肉片

色，テクスチャー，味などが変化して食べやすくを無作為に採取して熟成試料とした。一方，同様なり，食中毒の原因となる細菌が死滅し，安全にに21日間熟成したロース芯から無作為に試料を採なる。一方で加熱は牛肉の栄養価の減少や脂質の取し，未加熱試料とした。残りのロース芯を４㎝

酸化を招き，条件によっては好ましくない匂いや×５㎝の大きさで厚さ１㎝の肉片に整形し，味の原因になり得る。そのため加熱による脂肪の120℃に加熱したホットプレートで内部温度が65

変化を明らかにすることは，牛肉のおいしさを向～70℃になるように表裏を各130秒間加熱後に試上させるうえで重要と考えられる。これまでに報料を採取し，加熱試料とした。

告されている加熱による牛肉脂肪の加熱変化はい
ずれも総脂質を対象としており ，総脂質中の４）

2 . 3 総脂質の抽出とトリアシルグリセロール
および遊離脂肪酸の分画

TGや遊離脂肪酸（FFA）の加熱変化を調べた報

熟成および加熱した牛肉試料からコルクボー

告は見当たらない。これら脂質クラスの加熱中のラーで無作為に１ｇを採取し（Fig.１），クロロ

変化に伴い，牛肉の筋内脂肪に変化が起ることがホルム20mlとメタノール10mlの混液を加えFolch予想される 。

法７）で総脂質を抽出して，エバポレーターで濃縮

４）

本研究では，主要な肉牛である黒毛和種の牛肉

後 ，定 量 し た 。10 ｇ の シ リ カ ゲ ル（WAKO

を試料として，熟成および加熱に伴う筋肉内の脂GEL）をガラスカラム（φ20㎜×300㎜）に充て肪量および遊離脂肪酸量と組成の変化を調べた。

んし，１mlのヘキサンに溶解した100㎎の総脂質

すなわち総脂質だけでなく，総脂質の大部分を占を添加した。ヘキサン：ｔ-ブチルメチルエーテ

めるTGや，酸化の影響を最も受けやすく食味とル＝100：1.5でコレステロールエステル画分を，の関連が示唆されているFFAの脂質クラスにつヘキサン：ｔ-ブチルメチルエーテル＝96：４でいても定量および脂肪酸組成分析を行った。TG

トリアシルグリセロール画分を，ヘキサン：ｔ-

は味の認識において化学受容されることはなく，ブチルメチルエーテル：酢酸＝100：２：0.2で遊

口中ではFFAの形で認識されると考えられる

離脂肪酸画分を順次溶出後に定量した。抽出したので，これらの結果から牛肉内の遊離脂肪酸に由

総脂質と分画した脂質クラスを薄層クロマトグラ

来する牛肉のおいしさを明らかにすることを目的

フィー法で展開し，精製度を確認した。

５，６）© The Ito Foundation

70

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Fig. 1 Rib eye after taking sample pieces from carcass cross-section

between the sixth and seventh ribs at 7-days postmortem.

2.4

薄層クロマトグラフィー（TLC）

TLCプレート（Merc社）の下端にヘキサンに３．結果と考察

溶解した30㎎/ml脂質試料を２μl添加した。展開抽出した総脂質をシリカゲルカラムに添加し，溶媒はヘキサン：ｔ-ブチルメチルエーテル：酢

順次異なる組成の溶離液で溶出した。分画後回収

酸＝80：20：１を用いた。展開後に50％硫酸溶液

した脂質クラスの薄層クロマトグラフィーの結果を噴霧し，130℃で８分間の炭化で脂質スポットをFig.２に示す。Fig.２-aは分画に供する前の総を検出した。

脂質であり，図に示すように，TG, FFA，コレ2.5

脂肪酸組成の測定

ステロール（FC），およびジアシルグリセロール

各脂質クラスから三フッ化ホウ素－メタノール（DG）他が含まれていた。Fig.２-bとFig.２-cは法で脂肪酸メチルエステル（FAME）を調製しTG画分とFFA画分の薄層クロマトグラフィーのた。30㎎/mlになるようにFAMEをヘキサンに溶結果である。それぞれ単一のスポットが認めら解し，ガスクロマトグラフ（GC）（島津GC-2014）

れ，TGおよびFFAともに単離されていることをで脂肪酸組成分析を行った。FAMEの分離はキャ確認した。

ピラリーカラム（Omega Wax30ｍ×0.25㎜）でと畜後の黒毛和種牛肉を４℃で熟成し，７日行い，カラム温度は180℃の恒温条件で，スプリッ

目，14日目および28日目に抽出した総脂質量を定

ト比は100：１で行った。検出器は水素炎イオン

量後，総脂質から分画したTGおよびFFAを定量化検出器（FID）を用いた。各脂肪酸の同定およした。その結果，黒毛和種牛肉の総脂質量は，７び組成分析は脂肪酸メチルエステル標準品（スペ

日目に100ｇ牛肉当たり35ｇであったのが，14日

ルコ社RM-６および37FAME Mix）と比較して目に37ｇ，28日目に36ｇであり，有意な変化は認行った。

められなかった（Fig.３）。TG量は，７日目に100ｇ牛肉当たり33ｇであったのが，14日目に33© The Ito Foundation

71

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究

（a）

（ｂ）

（ｃ）

Fig.２ TLC patterns of total lipid（a）, TG（b）and FFA（c）fractions separated by silica gel

*

12
10

40

8
30

TL (

) and TG (

6
20
4
10

0

2

7

14

28

) (mg / 100 g of beef )

50

FFA (

) (g / 100 g of beef )chromatography.TG, triacylglycerol; FFA, free fatty acid; FC, cholesterol; DG,
diacylglycerol．

0

Postmortem Time (days)
Fig.３ Changes in the amounts of TL, TG and FFA during postmortem aging of Japanese Black Wagyu



beef（n＝10）.
TL, total lipid; TG, triacylglycerol; FFA, free fatty acid.
＊，significant difference between 7- and 28-days postmortem（P＜0.05）.

© The Ito Foundation

72

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Table１ Fatty acid composition（％）
of intramuscular fat of Japanese Black Wagyu beef during Postmortem aging（n=10）.
Postmortem Aging Time（days）
７

14

28

Fatty Acid

TL

TG

FFA

TL

TG

FFA

TL

TG

FFA

Ｃ14：0

2.34±0.28

2.34±0.46

3.69±0.22

2.41±0.34

2.59±0.49

3.41±0.65

2.47±0.32

2.49±0.44

3.38±0.54

Ｃ14：1

0.66±0.24

0.67±0.24

nd

0.63±0.16

0.74±0.27

nd

0.66±0.24

0.72±0.26

nd

Ｃ15：0

0.31±0.05

0.31±0.05

nd

0.31±0.05

0.34±0.05

nd

0.36±0.11

0.33±0.05

nd

Ｃ16：0

26.1±2.49

26.1±3.87

34.1±4.15

26.3±2.5426.8±2.52

33.8±4.92

26.7±2.03

26.9±2.73

30.3±4.10

Ｃ16：1

3.59±0.79

3.33±0.50

2.79±0.51

3.63±0.57

3.54±0.76

3.13±1.19

3.39±0.54

3.54±0.60346±1.10

Ｃ17：0

0.88±0.14

0.86±0.14nd

0.89±0.16

0.91±0.16

nd

0.88±0.15

0.89±0.14

nd

Ｃ18：0

11.5±1.96

11.0±1.98

16.4±2.56

11.6±1.67

11.2±2.22

15.1±2.73

11.6±2.29

11.1±1.97

13.4±3.55

Ｃ18：1

48.8±1.90

47.7±3.16

37.5±6.13

48.4±2.50

47.8±3.03

40.1±4.59

48.1±2.32

47.8±3.03

41.2±7.82

Ｃ18：2

2.64±0.81

2.33±0.76

4.96±2.48

2.58±0.83

2.60±0.80

6.66±3.66

2.50±0.77

2.54±0.77

5.93±2.08

SFA

41.1±2.63

41.9±2.99

53.7±6.91

41.5±3.50

41.8±3.52

51.6±5.85

42.0±2.79

41.6±3.59

47.1±6.68

MUFA

53.0±2.05

52.5±2.33

40.9±5.94

52.7±2.89

52.1±2.84

42.3±4.93

52.1±2.36

52.0±2.69

44.0±8.83

PUFA

2.38±0.81

2.33±0.76

6.06±1.96

2.46±0.83

2.60±0.80

6.66±3.66

2.38±0.81

2.54±0.77

5.93±2.08

TL, total lipid; TG, triacylglycerol; FFA, free fatty acid.
nd, no detection．

ｇ，28日目に32ｇであり，同様に有意な変化は認

イン酸であり約48％を占めた。次に多く含まれる

められず，TGは総脂質において多くの量を占めのはパルミチン酸であり，約26％を占めた。これていた。これらの量はこれまで明らかになっていらの値は過去の報告９）と一致した。TGでも熟成る牛肉の脂質含量８）と一致した。総脂質量およびによる脂肪酸組成の変化は認められなかった。最TG量における個体間のばらつきは，霜降りの程も多く含まれているのはオレイン酸で，次に多く度の差によるものと考えられる。一方，FFA量

含まれるのはパルミチン酸であり，総脂質とよくは７日目に100ｇ牛肉当たり4.9㎎であったのが，似た脂肪酸組成を示した。これは総脂質の大半が14日目に5.9㎎に，28日目には8.4㎎へ有意に増加

TGで構成されているためと考えられる。またオした（Ｐ＜0.05）。熟成中に増加したFFAの由来

レイン酸をはじめとするモノ不飽和脂肪酸について現段階では不明である。TGからの遊離（MUFA）の割合が，飽和脂肪酸（SFA）よりもが考えられたが，牛肉中のTG量とFFA量の含量高く，黒毛和種牛肉に特徴的な風味の良さを示し差は大きく，両脂質クラス量の変化に相関は確認ている１，９）と推定された。牛肉試料から抽出したできなかった。

総脂質からカラムクロマトグラフィー法で分画し４℃で熟成中の黒毛和種牛肉から経時的に抽出たFFAをメチルエステル化しGCを用いて脂肪酸

した総脂質および総脂質から分画したTGならび組成を分析した。FFAの脂肪酸組成もまた熟成にFFAをメチルエステル化し，GCを用いて脂肪による変化は認められなかった。総脂質および酸組成を分析した結果をTable.１に示す。総脂質

TGの脂肪酸組成と比較したとき，FFAではオレ

では熟成による脂肪酸組成の変化は認められなイン酸割合が約39％と低く，パルミチン酸の割合かった。総脂質に最も多く含まれているのはオレが約36％と高かった。熟成に伴い黒毛和種牛肉内© The Ito Foundation

73

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究

20

50

8

) (mg / 100 g of beef )

16

4

FFA (

) (g / 100 g of beef )

60

40
12

TL (

) and TG (

30

20

10

0

Raw

Cooked0

Beef Sample
Fig.４ Changes in the amounts of TL, TG and FFA by cooking of JapaneseBlack Wagyu beef at 21-days postmortem（n＝７）．
TL, total lipid; TG, triacylglycerol; FFA, free fatty acid．

のFFA量が増加しているので（Fig.３），筋肉内

FFA量は未加熱試料で100ｇ牛肉当たり7.5㎎での各脂肪酸量も同様に増加していることが考えらあったが，加熱後でも9.9㎎と有意な変化は認めれる。近年の研究で，マウスとラットの舌上におられなかった。一般に食品と食用油脂を同時に加いて長鎖脂肪酸を受容する受容体の存在が明らか熱するとき，食品中の水分で油脂の加水分解が生になっており，その存在はヒトでも示唆されていじ，FFAやモノアシルグリセロールなどの量がる。ヒトの舌上に脂肪酸受容体が存在するの増加する10）。牛肉でも脂質と水分が混在するためであれば，熟成に伴うFFA量の増加は黒毛和種

食物として提供されるときの加熱により脂質に何

牛肉のおいしさに影響している可能性が考えられらかの変化がおこることが予測されたが，有意なる。

変化は認められなかった。加熱劣化が起こる温度

５，６）と畜後の黒毛和種牛肉を４℃で21日間熟成後には150℃から200℃程度とされており10），今回の実肉片を加熱調理した。加熱前後の試料から抽出し験では120℃の低い温度で牛肉を加熱したため加た総脂質および総脂質から分画したTGならびに熱による劣化や酸化が起こりにくかった可能性が

FFAの量を定量した。その結果，総脂質量は未考えられる。また油脂の熱劣化の場合，生成する

加熱試料で100ｇ牛肉当たり40ｇであったが，加FFAはすぐに二次酸化物へと変化するため加熱

熱後でも39ｇと有意な変化は認められなかった

油脂中にはほとんどFFAは存在しないので，加（Fig.４）。TG量は未加熱試料で100ｇ牛肉当たり

熱により増加したFFAが二次酸化物へと変化し35ｇであったが，加熱後でも34ｇと有意な変化はた可能性が考えられるが，いずれも明確ではない。

認められず，TGが総脂質の多くを占めていた。

４℃で21日間熟成後の未加熱および加熱牛肉試© The Ito Foundation

74

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Table２ Fatty acid composition（％）of intramuscular fat before（Raw）and after cooking（Cooked）

of Japanese Black Wagyu beef（n=7）.
Raw

CookedFatty Acid

TL

TG

FFA

TL

TG

FFA

Ｃ14：0

2.19±0.38

2.30±0.61

3.49±0.91

2.67±0.67

2.62±0.53

3.06±0.90

Ｃ14：1

0.73±0.22

0.66±0.12nd

0.85±0.17

0.82±0.23

nd

Ｃ15：0

0.28±0.07

0.24±0.20

nd

0.31±0.05

0.29±0.07

nd

Ｃ16：0

24.4±1.54

25.0±2.25

28.6±5.78

26.7±3.4126.2±2.33

27.8±2.21

Ｃ16：1

4.05±1.28

4.06±0.76

3.52±0.91

4.16±1.49

4.14±1.06

4.76±1.70

Ｃ17：0

0.71±0.17

0.81±0.18

nd

0.83±0.12

0.84±0.16

nd

Ｃ18：0

10.1±1.05

10.5±1.58

11.6±2.38

10.4±2.27

10.3±1.45

10.4±1.53

Ｃ18：1

52.3±1.82

50.8±3.79

44.2±7.61

49.0±3.80

49.6±3.32

45.6±5.17

Ｃ18：2

2.13±0.42

1.95±0.36

3.97±1.31

2.20±0.31

1.95±0.39

4.28±1.94

SFA

37.5±2.4438.8±4.2143.5±7.80

40.9±6.14

40.2±3.82

41.3±4.35

MUFA

57.1±2.1755.5±3.75

47.7±8.10

55.9±4.92

54.5±3.67

50.3±4.35

PUFA

2.13±0.42

1.95±0.36

3.97±1.31

2.20±0.31

1.95±0.39

4.28±1.94

TL, total lipid; TG, triacylglycerol; FFA, free fatty acid.
nd, no detection．

料から抽出し分画した各脂質クラスの脂肪酸組成ない。牛肉中の脂質が加熱による酸化の影響を受を分析した結果をTable.２に示す。いずれの脂質けたのであれば，通常飽和脂肪酸より酸化を受けクラスでも加熱による脂肪酸組成の有意な変化はやすい不飽和脂肪酸が減少すると考えられる。そ認められなかった。牛肉の加熱後に総脂質に最もれに反し，全飽和脂肪酸を炭素鎖の対応するモノ多く含まれているのはオレイン酸であり，約50％

不飽和脂肪酸に変える⊿９不飽和化酵素は，反芻を占めた。次に多く含まれるのはパルミチン酸で動物では加熱の影響で活性が失われることはないあり，約25％であった。また総脂質およびTGのと報告されている４）。さらに本研究では牛肉を21

両 脂 質 ク ラ ス で ，オ レ イ ン 酸 を は じ め と す る

日間熟成し，Sarriesら 11）は12日間熟成している

MUFAの占める割合が未加熱および加熱牛肉ののに対し，Ducketら12）はと畜後すぐに加熱を行っ両方で割合が高かった。一方，総脂質から分画している。したがって，牛肉において脂質の加熱変たFFAでも加熱前後における脂肪酸組成の変化

化は，加熱方法や貯蔵方法で異なり，また加熱やは認められなかった。総脂質およびTGの脂肪酸貯蔵に伴う不飽和化酵素活性の変化に影響を受け組成と比較すると，熟成後の牛肉試料と同様にると考えられる。

FFAでは加熱後にオレイン酸が約45％と割合が以上の結果，黒毛和種牛肉の熟成中の各脂質ク低くなり，パルミチン酸の割合は約28％へ増加しラス量の変化を調べたとき，総脂質およびTGにた。Sarriesら

は，加熱調理は牛肉から抽出しは変化が認められなかったが，総脂質中のFFA

た総脂質の脂肪酸組成に影響を及ぼさないと報告

量は熟成に伴い増加することが示された。また加している。しかしDucketらは加熱によってス

熱調理による各脂質クラスの量および脂肪酸組成

テアリン酸と飽和脂肪酸が増加し，多価不飽和脂への影響は認められなかった。熟成中のFFAの肪酸が減少することを報告しており，一致してい増加が何に起因するのかは現時点では不明である

11）

12）

© The Ito Foundation

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究

75が，これらの結果は，熟成後の牛肉中に増加した

量し，脂肪酸組成を分析した。その結果，熟成後

FFA量は食するときの加熱調理で変化しないこの牛肉中の総脂質量とTG量およびそれらの脂肪とを示唆している。近年FFAが水溶液中でうま酸組成に変化は認められなかったが，遊離脂肪酸

味を促進し，苦味や酸味などを抑制するといった量が有意に増加した（Ｐ＜0.05）。加熱前後の牛報告や，ラットにおける長鎖脂肪酸受容体の存在

肉では各脂質クラスの量および脂肪酸組成に変化を示唆する報告がある。したがって，黒毛和種は認められなかった。これらの結果から，黒毛和

牛肉の呈味に筋内脂肪が関与する可能性を考える

種牛肉の脂肪由来のおいしさに，熟成中に増加

とき，FFAの量が重要であると推測され，今後し，加熱調理でも影響を受けない遊離脂肪酸が関の研究で牛肉のおいしさとFFAの関連性につい与する可能性が考えられた。

13）て検討を進める必要がある。
４．要

約

牛肉のおいしさでは軟らかさへの脂肪の影響は大きく，筋内脂肪量が重要視されている。一方で，近年では牛肉品質に与えるトリアシルグリセロー
ルを構成する脂肪酸組成の影響が注目されている。しかしながら，これらの筋内脂肪量や脂肪酸組成に関する知見が，牛肉賞味時の食味性を直接反映しているか否かは不明である。本研究の目的
は，牛肉のおいしさに関連する筋内脂肪が，熟成
および加熱調理によりどのように変化するかを明らかにすることであった。
黒毛和種牛肉の第６～第７肋骨間ロース部を４℃で保存し，と畜後７，14，および28日目にロー
ス芯から筋肉片を採取した。Folch法に従って総脂質を抽出し，総脂質からシリカゲルカラムクロ
マトグラフィー法でトリアシルグリセロール（TG）および遊離脂肪酸（FFA）を分画し，それぞれ定量した。さらに各脂質クラスにおける脂肪酸組成の熟成による変化を分析した。一方，熟成21日目のロース芯を65～70℃で加熱調理後，加文 献
１）
 Westerling, D.B. and Hedrick, H. B. : J. Anim.
Sci., 48, 1343～1348, 1978.
２）
 Melton, S.L., Amiri, M., Davis, G.W. and Backus,
W. R. : J. Anim. Sci., 55, 77～87, 1982.
３）
 Mandell, I.B., Buchanan-Smith, J.G. and Cambel,
C.P. : J. Anim. Sci., 76, 2619～2630, 1998.
４）
 Jiang, T., Busboom, J.R., Nelson, M.L., O'Fallon, J.,
Ringkob, T.P., Joos, D. and Piper. K. : Meat Sci., 84,
86～92, 2009.
５） 松村成暢・伏木亨：化学と生物，48，114～120，
2010．
６）
 Pittman, D.W., Labban, C.E., Anderson, A.A. andO'Conner, H.E. : Chem. Senses, 31, 835～843, 2006.
７）
 Folch, J., Lees, M. and Stanley, G.H. S. : J. Biol.
Chem., 226, 497～509, 1957.
８） Cameron, P.J., Zembayashi, M., Lunt, D.K.,
Mitsuhashi, T., Mitsumoto, M., Ozawa, S. and Smith,
S.B. : Meat Sci., 38, 361～364, 1994.
９）
 Oka, A., Iwaki, F., Dohgo, T., Ohtagaki, S., Noda,
M., Shiozaki, T., Endoh O. and Ozaki, M. : J. Anim.
Sci., 80, 1005～1011, 2002.
10） 都築和歌子：平成20年度食肉に関する助成研究調
査報告書，No.22，99～108，2009．
11）
 Sarries, M.V., Murray, B.E., Moloney, A.P., Troy,
D. and Beriain, M.J. : Meat Sci., 81, 307～312, 2009.
12）
 Duckett, S.K., and Wagner, D.G. : J. Food Compo.
Anal., 11, 357～362, 1998.
13）
 Matsumura, S., Mizushige, T., Yoneda, T.,
Iwanaga, T., Tsuzuki, S., Inoue, K. and Fushiki, T. :Biomed. Res., 28, 49～55, 2007.

熱前後の試料から同様に各脂質クラスを分画・定© The Ito Foundation

76

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

食肉のきめに対する迅速かつ客観的な評価手法の研究
A rapid objective method for evaluating meat grain

入

江

正

和

（宮崎大学農学部）

Masakazu Irie
（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

The meat grain（the first muscle bundle）is an important factor for the texture and thecharacteristics. The earlier evaluation methods for meat grain are time-consuming or
subjective. Recent digital microscope developed by high technology may be used to evaluate
meat grain. A new prompt and objective evaluation method for meat grain was studied using
digital microscope, and applied to the difference between breeds. Longissimus thoracis muscles
were sampled from the carcass of 54 crossbred pigs（LWD）and 29 Berkshire pigs. In thehistological method, frozen sections were obtained from cubic samples and stained by
Hematoxylin-Eosin. In the microscope method, the images were obtained from raw cubic
samples and improved in high dynamic range（HDR）. The images of first muscle bundle area,
the major axis, the minor axis, and the perimeter were measured by the image analysis
method. The new evaluation method with the microscope was able to obtain the image of thefirst muscle bundle promptly and clearly by the automatic focus and the picture processing.
The measurements by the microscope method were strongly correlated with those byhistological method（r＝0.80～0.91）, showing the similar values. It was thought that the muscle
bundle area was more appropriate for meat grain than the major axis, the minor axis, and theperimeter. The muscle bundle area, the major axis, the minor axis, and the perimeter fromBerkshire pigs were significantly smaller than these from LWD cross breed pigs（p＜0.01）.
These results were shown that the digital microscope method for evaluation of meat grain was
nondestructive, accurate, and prompt, and the applicability was high, as shown in fine meatgrain of Berkshire pig．

１．目

肉のきめが良い（細かい）場合，肉表面はビ的ロードのような外観を呈し，見栄えがよいだけで食肉において肉のきめは見栄えやテクスチャー

なく，食感ではきめ細かさによる舌触りの良さをといった食味性に重要な影響を与える要因であ感じることができ，さらに細かな物理的構造ではり，牛・豚の枝肉格付においても肉質の重要な評

肉汁が保たれやすいため，多汁性にもプラスに影価項目にもなっている。肉のきめは科学的には筋響するとされる。

繊維の第一次筋束の大きさと定義されている 。
１）

きめは，このような重要な肉質項目であるにも© The Ito Foundation食肉のきめに対する迅速かつ客観的な評価手法の研究

77かかわらず，実際には客観的かつ迅速に評価する（LWD）と黒豚29頭の枝肉から，第５～６胸椎部か手法が無いため，ほとんど実際の検討対象となっら胸最長筋を採取した。試料は，用時まで－30℃ていない。枝肉格付においては，人が外観によっで凍結保存した。

て評価しているが，その客観性が課題である。

2.2

組織学的方法

理化学的調査法としては，一般的には組織切片

豚肉の胸最長筋サンプルを冷蔵庫内で自然解凍（凍結切片）を作成し，第一次筋束の面積を測定し，無作為に筋繊維方向に沿って１㎝角の組織切して評価するが，多大な手間と時間を要するた

片を２～３個切り出した。筋繊維の垂直切断面とめ，通常の肉質試験においてほとんど計測されて変形に注意しながら，ドライアイス－イソペンタ

いないのが実情である。

ン法で急速凍結した。

もし，肉のきめが迅速かつ客観的に測定できる

その後，クリオスタット（CM1850，LEICA社）

ようになれば，食肉流通での評価手段として役立を用いて５μｍの凍結切片を作成した。次に，切つだけでなく，肉のきめが細かいといわれる黒豚片をヘマトキシリン・エオジン法で染色した。さや但馬牛，あるいは和牛などの良さをPRする手らに，筋繊維切断面の写真撮影を行った。

段になり，さらには生産段階へフィードバックす2.3

マイクロスコープ法

ることによって，現在の肉質レベルを知ることが組織学的方法で利用した同一試料ならびに別試

でき，品質向上への新たな可能性が生まれてくる。

料を解凍し，ろ紙で表面の水分を軽く除き，表面

一方，近年の光学手法の発達は著しく，著者らをマイクロスコープ（本体：HVX-1000＋超小型は肉質評価に対して光学的測定法（光ファイバ

高性能ズームレンズ：VH-Z20R/VH-Z20W20～法，画像解析法など）を研究し２～５），実用化して200倍，キーエンス社）で観察した（Fig.１）。

きた。最近，著者は，肉質評価の研究のため，ママイクロスコープによる観察では，ステージにイクロスコープという新型の研究装置を導入し試料を置き，30倍で，オートフォーカス機能にた。この装置の長所は，顕微鏡と違い，細部の観よって自動で焦点を合わせた。さらに，筋束を見察においても焦点深度が深く，未固定のまま，すや す く す る た め ，ハ イ ダ イ ナ ミ ッ ク レ ン ジ

なわち生の組織のまま拡大観察できること，また（HDR）で原画像の画像改善を行い，最適な画像

画像処理ソフトが備わり，画像を明瞭化したり，を得た。

さらには三次元処理ができたり（立体視で，いろ2.4

いろな視点からの観察が可能）と，きめの評価法

組織学的方法とマイクロスコープ法により得ら

筋束の画像計測れた同一部位の両画像をパソコンに取り込んだ。

として期待できるものである。
そこで，本研究では，マイクロスコープを利用

画像はカラープリントし，その後の画像処理が容して，経済性や食味性に関連した肉のきめを客観易となるように第一次筋束の輪郭をマニュアルで的かつ迅速に評価する方法を確立することを目的囲んだ。その後，画像解析専用ソフト（Image-Proとした。

Plus version4.0 for windows，（株）プラネトロ

２．方
2.1

ン社）を用いて，二値化し，第一次筋束の面積，法

長径，短径，周囲長を測定した。１画像につき，数十個の筋束を選び，一試料あたり数画像を計測

供試試料

供試試料は，食肉市場において交雑種豚54頭した。

© The Ito Foundation

78

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Fig.１ Digital Microscope（Keyence Co. Ltd）

ba

Fig.２ Direct image（a）and processed image after high dynamic range procedure (b) by Microscope

2.5

が，ハイダイナミックレンジ（HDR）で画像改統計処理

凍結切片による組織学的なきめ（第一次筋束面善を行うと，より明瞭な画像にすることができた

積）の測定値とマイクロスコープで計測した測定（Fig.２）。これらの操作は，迅速で，手間もかか

値の関係を単回帰分析から検討した。また，一般

らず，容易であった。

の交雑種豚と黒豚の数値をｔ検定で比較検討した。

おり，カメラ部が小さく，本体と光ファイバーで

３．結果と考察
3.1

なお，マイクロスコープ装置は光源を内蔵してつながれ携帯型の可動式であり，様々な被写体に適用が可能である。さらに，マイクロスコープ装マイクロスコープによる画像

マイクロスコープによる画像をFig.２～３に示置は，顕微鏡や通常のカメラとは違い，焦点距離

す。原画像でも第一次筋束は明瞭に観察できたが大きく，レンズ部と試料とはある程度の距離を© The Ito Foundation食肉のきめに対する迅速かつ客観的な評価手法の研究

a

79

b

Fig.３ Images of porcine longissimus muscle by histological method（a）and Microscope method（b）

置いて観察でき，さらに画像処理によって試料形

ｒ＝0.91，周囲長ｒ＝0.87，長径ｒ＝0.86，短径状に凹凸があってもピントの合った画像を得るこ

ｒ＝0.80），個々の測定値もほぼ同じような値ととができるという特徴を有している。このことなった。なお，多少の違いが出るのは，組織の多は，専用の機器の開発が必要かもしれないが，流少の変形によるところが大きいかもしれない。こ通ラインにおける枝肉などの肉のきめの実用的なのことは，面積に比べ，長径や短径における若干評価も可能であることを意味している。

の相関係数の低下からも示唆される。なお，従来

3 . 2 マイクロスコープ法と組織学的方法によは顕微鏡下でのマニュアル測定のため，操作の煩雑さから面積ではなく長径や短径が計測されている画像の比較
同一サンプルの同一部位において，組織学的方

たが，形状の複雑さから面積の方がよりよいと思

法で得た画像をFig.３-aに，マイクロスコープでわれる。画像解析法では迅速に面積を計測できる得た画像をFig.３-bに示した。白いマーカーで囲ので，マイクロスコープ法によるきめの評価法とんでいる部分が同一の第一次筋束部分を示し，組

しては面積の測定が推薦される。

織学的方法による画像よりも明らかにマイクロス

3.3

コープによる画像の方がきめの観察が容易であっ国内外でも肉のきめは重視され，その研究が実た。組織学的方法による画像は，凍結解凍による施されてきた。国内の格付状況などは既に述べた筋繊維の収縮がみられ，結合組織も明瞭には観察６）
ところであるが，海外では，Purslow（2005）

できなかった。一方，マイクロスコープ法によるが筋肉内結合組織に関する総説，きめはgrainと画像では，凍結解凍操作後も第一次筋束や第二次して米国においても肉眼的に評価されていると筋束を明瞭に観察することができた。

し，その組織学的測定値は品種，月齢，性などに

次に，組織学的方法とマイクロスコープ法での測定値を比較するため，面積，長径，短径，周囲マイクロスコープ法とその他の方法

よって変化し，肉の食感（テクスチャー）との関連性には様々な知見があるとしている。

長における相関プロットをFig.４に示した。両方

きめの評価法の研究では，国内における農水省

法の測定値の相関はいずれにおいても強く（面積のサポートで，あるメーカーが，光反射を用いて© The Ito Foundation

80

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Area, cm2

Micrscope method

Micrscope method

3

2

1

r=0.91a1

2

3Histlogical method

8
6
4

0

Micrscope method

Micrscope method

3
2

6

0

2

Histlogical method

810Minor axis, cm1

r=0.80r=0.860c4Histlogical method

2

4

1

2

0

b

Major axis, cm5

r=0.87200Perimeter, cm

10

4

0

d

0

1

Histlogical method

Fig.４ Relationships between histological method and digital microscope method for muscle bundlearea（a）,perimeter（b）,major axis（c）and minor axis（d）

測定法を検討したことがあったが，うまく評価す

評価法は，従来の組織学的法に比べて優れておる こ と が で き な か っ た 。 近 年 ， Farouk らり，従来法にとって代わる方法であると考えられ

７）８）（2005）
は，顕微鏡や高解像度CCDカメラを用た。

いて，Fiber-bundle Alignmentの評価に利用し，

3.4

豚肉におけるきめの品種間比較

牛肉外観の主観的評価のサポートシステムとして上記で開発したマイクロスコープ法の応用性を９）応用している。また，TanとShadatadal（2001）

検討するために，黒豚とLWD交雑種間で比較しは通常のビデオカメラで撮影した牛生肉のマクロた第一次筋束の画像をFig.５に示した。LWD交雑

画像を解析し，きめの評価ではないが，硬い肉の種のきめは，黒豚のきめと比べて，明らかに大きものとやわらかい肉では画像に違いがあることをいことがわかる。
次に，LWD交雑種と黒豚間における第一次筋

明らかにしている。
本試験において，新しく開発したデジタル・マ

束の面積，長径，短径，周囲長の比較をFig.６にイクロスコープ法による第一次筋束であるきめの示した。LWD交雑種に比較して黒豚の第一次筋© The Ito Foundation

81

食肉のきめに対する迅速かつ客観的な評価手法の研究

ab
Fig.５ Images of longissimus muscle from LWD cross breed（a）and Berkshire breed（b）

1

5

Area

0.8

4

0.6

3

0.4

2

0.2

1

0

0

a

LWD

2

Berkshireb

Perimeter

LWD
1

Major axis

Berkshire

Minor axis

1.5
0.5

1

0.5

0

c

LWD

Berkshire

d

0

LWD

Berkshire

Fig.６ Breed difference in meat grain by microscope method

Muscle bundle area（a）,perimeter（b）,major axis（c）and minor axis（d）

束は，面積，長径，短径，周囲長ともに有意に低vs 0.75，短径：0.57 vs 0.37，周囲長：3.05 vs 1.93，

い 値 と な っ た（面 積：0.59 vs 0.26 ，長 径：1.20

ｐ＜0.01）。

© The Ito Foundation

82

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

以上の結果は，肉眼的に黒豚はきめが細かいと片を作成し，ヘマトキシリン・エオシン染色しいわれる従来の知見とも一致している。きめの細た．マイクロスコープ法では，肉片生試料のまま

かさの理由は，黒豚が中型種であることに起因し画像を得，ハイダイナミックレンジ（HDR）でていると思われる。第一次筋束の筋繊維数は大体

画像改善した。各画像は画像解析法によって第一

決まっており，黒豚は大型種と比べると筋繊維の次筋束の面積，長径，短径，周囲長を計測した。

直径が小さくマイクロスコープによる評価法は，生肉の塊のま，筋繊維が細いと，必然的に第10，11）

ま，オートフォーカスと画像処理によって迅速か

一次筋束も細くなると考えられる。
黒豚は他の大型種と比べ保水力やしまりが良い

つ明確に第一次筋束の画像を得ることができ，そとされ，肉眼的なきめが細かく，筋繊維は細いがの後の画像解析によってきめを容易に数値化する

歯ごたえがあることが特徴とされている。本知見ことができた。マイクロスコープ法による測定値

はきめが細かいという黒豚の特性だけでなく，保は，時間がかかる従来の組織学的方法の測定値と水力やしまり，歯ごたえの良さを説明するものかの相関が高く（ｒ＝0.80～0.91），類似した値を示もしれない。なぜなら，テクスチャーや保水力はした。また，解析の結果，きめを評価するには長その組織学的構造に大きく影響されるからであ

径，短径，周囲長より面積のほうがより適切である12，13）。

ると考えられた。黒豚の第一次筋束の面積，長径，

本法は，今後，他品種や性などの遺伝的条件，

短径，周囲長は，LWD交雑種のものよりも有意飼養管理などの条件の違いによってきめがどのよに小さかった（ｐ＜0.01）。以上より，マイクロ

うに変化するかの有効な方法となるであろう。まスコープにおけるきめの評価法は，迅速かつ非破た本法は，単にきめの大きさを測定するだけでな

壊で正確であること，さらに黒豚のきめの細かさ

く，筋周膜の結合組織量や厚さなどの測定にも応を実証できる応用性の高さがあることが示された。

用できると考えられ，幅広く応用される方法にな
るだろう。
４．要

約

肉のきめ（第一次筋束）はテクスチャーと関係
し，肉の特性を知る上で大切な要因である。従来のきめの評価法には客観性や手間に問題がある。
最近，ハイテク技術を採り入れたマイクロスコー
プという装置が開発され，これが肉のきめに利用できる可能性がある。そこで，マイクロスコープ
を用い，肉のきめの迅速かつ客観的な新しい評価手法を検討し，さらに，豚の品種によるきめの違いが評価できるかどうかといった応用性を検討した 。 交 雑 種 豚 54 頭 （LWD） と 黒 豚 （バ ー ク
シャー種）29頭の枝肉から，胸最長筋を採取した。組織学的方法では，立方体状試料から凍結切

文 献１）
 日本食肉研究会：食肉用語事典（新改訂版）．食肉通信社．2010．
２）
 入江正和：日本食品工業学会誌 40，747～754，
1993．
３）
 Irie, M.J.：Anim. Sci., 77, 2680～2683, 1999.
４）
 入江正和：日本養豚学会誌 39, 221～254，2002．
５）
 Irie, M., Oka, A., Iwaki, F：J. Sci. Food Agric., 83,
483～486, 2003.
６）
 Purslow, P.P.,：Meat Sci., 70, 435～447, 2005.
７）
 東芝エンジニアリング：肉の締まり及びきめの客
観的評価方法に関する調査報告書，1991．
８）
 Farouk, M.M., Zhang, S.X., Cummings, T.J.：
Muscle Foods, 16, 256～273, 2005.
９）
 Tan, J.L., Shatadal, P.：Meat Sci., 57, 341～346,
2001.
10）
 岩元久雄・尾野喜孝・川井田博・高原斉：日本畜産学会報，60, 261～272．1989．
11）
 Iwamoto, H., Kawaida, H., Ono,Y., Takahara, H.：
Jpn. J. Zootech. Sci., 54, 392～400, 1983.
12） 鈴木惇：畜産加工．朝倉書店，1989．
13）
 入江正和：食肉の科学，34, ９～15，1993．

© The Ito Foundation

平成23年度

83

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

最高級豚肉を目指した生産方式の解明
Interpreting the production system for high quality pork

戸 澤 あ き つ・佐

藤

衆

介

（東北大学大学院農学研究科）

Akitsu Tozawa and Shusuke Sato
（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

It is thought that the disease control may be difficult of the pigs in the grazing system.
The welfare level of pigs reared outside is assessed from the behavior, intestinal condition, andlung involvement. 44 pigs of LW were allocated to 3 groups; the grazing system withfermented TMR（Group 1 ; G-1, n＝14）, the grazing system with concentrates（Group 2 : G-2,n＝15）and the housing system with concentrates（Group 3 ; G-3, n＝15）.  The time budgets offeeding of ration, rooting, and feeding of grasses and soil were longer in pigs in both grazing
systems than in the housing system. The pH of feces was higher in the order of G-1, G-2, andG-3 at the all of early, middle, latter stages, and6.6±0.2, 6.2±0.3, and5.6±0.2, respectively, weresignificantly different mutually（P<0.05）. The numbers of all enterobacteria and Clostridium
cluster from feces were significantly lower in the grazing systems than the housing system（p<0.05）. It is concluded that the welfare level of pigs may be higher in the grazing systemthan in the housing system.

１．目

結果は，従来の報告と類似のものであった。一方，

的

放牧豚の放牧前・後の腸内細菌叢では，15種の選

家畜の飼育管理は生産性に影響を与えるだけで択培地のうち10種類で腸内細菌が減少し，そのうなく，家畜自身の健康にも影響を与える。養豚にちの４種類の培地では有意に減少するという新知おいても，飼育方式が生産性や肉質に及ぼす影見が得られた。そこで本研究では，放牧飼育によ響る最高級豚肉生産システムの開発につなげることや行動に及ぼす影響

１，
２，
４）

が，これまでも

１，３，６）

盛んに研究されてきている。しかし，放牧下での肥育豚の健康に関する研究は多くはなく，しかも損傷，疾病に関するものがほとんどである 。
５）

筆者ら は，農家における肥育豚の実態調査と７）

して，放牧飼育と５つの舎飼方式下での健康性にを目的に，以下の調査を行った。
⑴ 正常行動の発現から，精神的健康性を評価した。
⑵ 腸内環境，特に病原微生物の発現から，健康性阻害の可能性について評価した。

加え，健康性に影響すると考えられる腸内細菌叢⑶ 出荷時の肺病変の発現から，肥育豚の健康について比較した。損傷，疾病に関する健康性の性を評価した。また，その技術を支える放牧© The Ito Foundation

84

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

地の条件を明らかにする目的で，放牧地の植2.3

物被度の変化も調査した。
２．方
2.1

ンサンプリングで摂食行動のみを観察した。
腸内環境調査①糞便pH

糞便pHは肥育豚の直腸から直接採糞し，測定法した。採取した糞便を蒸留水で２倍に希釈撹拌
し，pHメーターで直接測定した。採糞は，放牧前，

供試豚と飼育方法

導入先が全て同じLW種の去勢雄44頭を用い放牧中（放牧後１ヵ月），放牧後期（放牧後２ヵた。それらを未利用飼料資源による発酵TMR飼月）の３回，全頭について行った。舎飼のGroup料を給与した放牧区（以下，Group１）14頭，配３も同時期に採糞した。

合飼料を給与した放牧区（以下，Group２）15頭，

2 . 4 腸 内 環 境 調 査②糞便中の全細菌とClostridium属菌の定量配合飼料を給与した舎飼区（以下，Group３）15
頭に振り分けた。飼養面積はGroup１で屋内面

放牧後期に糞便pHを測定した際に採取した糞

積 ： 3.57 ㎡ ／ 頭 ，放 牧 地 面 積 ： 82.7 ㎡ ／ 頭 ，便の一部を－80℃で凍結保存し，その後糞便中のGroup２で屋内面積：1.67㎡／頭，放牧地面積：

全 細 菌 と Clostridium 属 菌（Clostridium cluster

49.3㎡／頭，Group３で屋内面積：2.13㎡／頭でⅠ・Ⅱ）を定量した。凍結保存していた糞便からあった。放牧区への導入はおよそ70日齢，放牧開DNAを抽出し，リアルタイムPCR法により検体始は約80日齢で行った。放牧期間は2011年７月か

１ｇあたりの標的遺伝子コピー数を算出し，これら10月末であった。

を全細菌数およびClostridium属菌の菌数とした。

2.2

行動調査

2 . 5 出荷後の肺病変（マイコプラズマ性肺肥育豚の体重が約80㎏の時期（およそ140日齢）炎：MPS）評価に行動観察を行った。中間的な体重の個体を各肥育豚出荷時にと体から肺を取り出し，目視にGroupから６頭抽出し，９：30～16：30の計７時

より各個体のマイコプラズマ性肺炎病変の評価を間，調査した。

行った。病変程度の判定はR. F. W. Goodwin８）の放牧飼育のGroup１，２に関しては，目視によ方法に基づき肺病変の表面積割合をスコア化してり５分間隔のスキャンサンプリングで飼料の摂評価した。スコアが高いほど，肺の病変面積が広

食，野草の摂食，土壌の摂食，rootingについてかったことを示す。

観察し，全観察時間に対するそれぞれの行動時間2.6

配分を算出した。土壌の摂食とrootingを合計し放牧地の植物被度を，放牧開始後３週間は３日た“土壌との接触”時間配分も算出した。ブタは嗅もしくは４日おきに，その後は２週間おきに測定覚が優れており，強靭な鼻を利用して土を掘り起した。放牧地全体の植物被度を反映できる間隔で

こ す な ど ，周 辺 を 探 査 し ，可 食 物 を 掘 り 出 す

１ｍ×１ｍのコドラートを置いて測定した

rootingという行動レパートリーを持つ。この行（Group１：放牧地面積1,240㎡に対して42カ所，

動は，ブタで内的に強く動機づけられている行Group２：放牧地面積740㎡に対して18カ所）。被動

度はコドラートの面積（１㎡）を100％とし，植であることから，適切に発現させるべき正９，10）

常行動の指標として測定した。舎飼方式のGroup

放牧地の植物被度の変化物が被覆している面積（％）を測定した。

３では，ビデオカメラを給餌器の上部に設置して2.7

録画し，後日再生映像において５分間隔のスキャ

放牧飼育であるGroup１もしくは２と舎飼であ© The Ito Foundation

統計処理

85

最高級豚肉を目指した生産方式の解明
Table１ The percentage of time spent on each behavioral category by pigs in Group１～３
OutdoorBehavioural category

IndoorGroup 1
Mean

Group 2s.e.

P-value

Mean

s.e.

Group 3P-value

Mean

s.e.

Feeding

12.1

1.1

0.09

16.5

3.0

0.3

8.6

1.5

Grazing（grass）

9.9

1.0

―

4.5

1.3

―

―

―

Grazing（soil）

6.6

1.5

―

5.6

0.5

―

―

―

Rooting

7.9

2.6

―

3.8

1.0

―

―

―

Total

36.5

4.2

―

30.4

3.7

―

―

―

Contact to soil

14.5

3.8

―

9.3

1.4

―

―

―

s.e. : standard error of the mean
P-value : comparing with Group 3
contact to soil : Grazing（soil）＋Rooting

るGroup３の間でKruskal-Wallis検定を行った。

た。観察時間が日中に限られていたため，値が低有意差水準は５％とした。

くなっているが，摂食とrootingという内的に強く動機づけられた行動が自然状態のブタと同じよ３．結果と考察
3.1

うに発現していたということは，正常行動が適正

行動調査に発現していたと評価できる。

飼料の摂食時間は，発酵TMRを給与していた

土壌環境中に存在するといわれている

放牧飼育のGroup１で観察時間の12.1±1.1％，配Clostridium属菌の分析との関連で，放牧飼育の合飼料を給与していた放牧飼育のGroup２ではGroupに関しては土壌との接触状況についても調16.5 ± 3.0 ％，配 合 飼 料 を 給 与 し て い た 舎 飼 の査を行った。土壌の摂食とrootingを合わせた土Group３では8.6±1.5％であった（Table１）。放牧

壌との接触時間配分は，Group１で14.5±3.8％，飼育であったGroup１および２では飼料の摂食のGroup２で9.3±1.4％であった。両Group共に土壌

他に，野草と土壌の摂食がみられた。Group１にとの接触が盛んに行われていた。

おける野草の摂食時間配分は9.9±1.0％，土壌の3.2

摂食時間配分は6.6±1.5％であった。Group２に糞便pHは，放牧前および放牧中では，放牧飼

おける野草の摂食時間配分は4.6±1.3％，土壌の育で配合飼料を給与していたGroup２と舎飼で配

摂食時間配分は5.6±0.5％であった。放牧飼育で合飼料を給与していたGroup３では同じような値あるGroup１および２のrooting時間配分はそれぞを示したが，Group２では放牧後期で上昇した

れ7.9±2.6％，3.8±1.0％であった。

（6.22±0.27）（Table２）。放牧前・中は，肥育豚

腸内環境調査糞便pH

自 然 状 態 下 で 飼 育 さ れ た ブ タ で は ，摂 食 とが肥育前期の時期であったため，肥育前期飼料を

rootingに日中の活動時間の約50％を費やすとさ給与していたが，放牧後期には肥育後期飼料に変れ て い る 。本 研 究 に お い て も ，放 牧 飼 育 の更した。糞便pHは摂取飼料に大きく影響を受けGroup１および２では摂食とrootingをあわせた行

るため12，13），飼料を変更した影響があったことも

動時間配分が36.5±4.2％および30.4±3.7％であっ

糞便pH変化の理由の１つとして考えられる。放11）© The Ito Foundation

86

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）

Table２ Fecal pH of pigs in each Group during rearing at pasture．

（各Groupの糞便pHの経時的変化）
Periodprior
7.06±0.12

middleａ7.07±0.17

latterOutdoorGroup１ａ

6.63±0.24

ａGroup２5.94±0.32ｃ5.86±0.24ｃ6.22±0.27ｂIndoorGroup３5.75±0.25ｃ5.80±0.23ｃ5.61±0.24ｃ

Mean±S.D．
a, b, cMeans within a row lacking a common superscript letter differ（p＜0.05）

Table３ Total bacterial and Clostridium clusterⅠ，Ⅱ16S rDNA copies in pig feces
（検体１ｇあたりの標的遺伝子のコピー数）
Total bacterial 16S rDNA
（copies/g feces）
OutdoorIndoor

13.6±1.0×1011 ＊Group１

11

Group２16.2±3.6×10＊

12Group３3.3±1.0×10

Clostridium clusterⅠ，Ⅱ
16S rDNA（copies/g feces）

Abundance ratio（％）

5.8±5.2×1010＊

4.2±3.8†

2.4±2.1×1010＊

1.8±1.8＊

4.1±2.2×10

1112.4±6.4

Mean±S.D.
Abundance ratio : Clostridium clusterⅠ，Ⅱ16S rDNA/Total bacterial 16S rDNA＊：Significantly different from Group 3 at P<0.05 as determined by Kruskal Wallis test†：Significantly different from Group 3 at P<0.1 as determined by Kruskal Wallis test

牧飼育で発酵飼料を給与していたGroup１では，全細菌に対するClostridium属菌の割合はGroup

全期間を通して他の２つのGroupよりも高pHで２でGroup３よりも有意に低い値を示し（ｐ＜あった。これは上記したように，発酵飼料という0.05），Group１でも低い傾向を示した（ｐ＜0.1）。

摂取飼料による違いによる可能性も考えられる。

今回分析を行ったClostridium clusterⅠ・Ⅱは

糞便pHは腸内環境を反映する。放牧という飼

病原微生物である破傷風菌（C. tetani）やボツリ

育環境および発酵飼料という飼料の違いが，腸内ヌ ス 菌 （C. botulinum）， ウ ェ ル シ ュ 菌 （C.

pHを中性化すると考えられた。

perfringens）などが含まれている。このような病

3 . 3 腸 内 環 境 調 査

糞便中の全細菌とClostridium属菌の定量

原微生物および腸内有害菌を含むClostridium属
菌の存在量が，飼料の相違に関わらず放牧飼育を

全細菌の糞便１ｇあたりの標的遺伝子コピー数行ったGroup１，２で減少したということは，放は，放牧飼育を行っていたGroup１で13.6±1.0×

牧という飼育環境が有害腸内細菌相の減少に寄与

10 ，Group２で 16.2 ± 3.6 ×10 と 舎 飼 で あ った

する可能性を示唆する。

11

11Group３の3.3±1.0×1012よりも有意に少ない値を示した（ｐ＜0.05）（Table３）。これは放牧飼育を行う

3 . 4 出荷後の肺病変（マイコプラズマ性肺炎：MPS）評価

ことで糞便中の細菌数が減少したことを示している。

マイコプラズマ性肺炎の病変をスコア評価の結Clostridium属菌も同様に，Group１および２で果をTable４に示した。放牧飼育のGroup１，
２ははGroup３と比較して，糞便１ｇあたりの標的遺舎飼のGroup３よりも低い値を示していたが，有伝子コピー数が有意に減少していた（ｐ＜0.05）。

意な差ではなかった。放牧飼育を行うと空気環境© The Ito Foundation

87

最高級豚肉を目指した生産方式の解明
Table４ MPS score of each Group measured after slaughter

（と畜後のMPSスコア）
OutdoorMPS score

IndoorGroup１

Group２

Group３8.64±9.73

14.81±19.14

16.36±24.11

No significant differences among groups

Fig.１ Temporal change about coverage of grass at pasture．
（肥育豚放牧後の放牧地の植物被度の経時的変化）が改善するといわれている。今回の調査ではすべ摂食以外の効果，すなわち土壌摂取の効果等も示てのGroupで同じように肺病変が存在しており，唆される。

違いがみられなかったことから，導入先でのマイ放牧により糞便pHが中性化したことから，腸コプラズマ性肺炎の感染率が高かった可能性が考

内環境が変化したことが示唆され，それは糞便中えられた。

の腸内細菌の全細菌とClostridium属菌の低下と3.5いう形で明らかとなった。Clostridium属菌の主

放牧地の植物被度の変化

Group１の放牧地における植物被度は時間を追な生息場所は土壌および哺乳動物の消化管である

うごとになだらかに減少していったのに対し，が，行動観察では放牧豚が土壌との接触を盛んにGroup２の放牧地における植物被度は初めの10日行っているにもかかわらず，腸内有害菌を含んで間で急激に減少し，その後はなだらかに減少した

いるClostridium属菌が減少した。本放牧方式で（Figure１）。ブタは雑食動物であるため，自然環

は，餌と水は充足し，過酷な温熱環境から庇陰さ

境下では野草および土壌の摂食を行う 。植物にれ，正常行動は適正に発現した。肺病変やヒトか覆われている土地では積極的に植物を摂食する。

らの取扱いには差はなかったことから，放牧方式

Group２の１頭あたりの放牧地面積はGroup１とは舎飼方式に比較し，福祉性が高い飼育方式であ比較して６割程度であったため，１頭あたりに割ることが確認された14）。

９）り当てられる野草量が少なく，放牧初期の植物被度減少が著しかったと考えられる。この程度の面積においても放牧の効果がみられたことは，植物

４．要

約

放牧飼育は肥育豚にとって福祉性が高い飼育方© The Ito Foundation

88

平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.30）式だとされているが，健康管理が難しいといわれている。本研究では行動，腸内環境並びに出荷時の肺病変から，放牧飼育の福祉性を評価した。
LW 種 去 勢 雄 44 頭 を 発 酵 TMR 給 与 の 放 牧 区（Group１；Ｇ-１，ｎ＝14），配合飼料給与の放牧区（Group２：Ｇ-２，ｎ＝15），配合飼料給与の舎飼区（Group３；Ｇ-３，ｎ＝15）にわけ，比較した。両放牧区で，舎飼区よりも飼料摂食並びにrootingや野草・土壌の摂食の時間配分が長かった。放牧前・中・後期の３回にわたって測定した
糞便pHは，全期間を通じＧ-１，Ｇ-２，Ｇ-３の順に低く，放牧後期ではそれぞれ6.6±0.2，6.2±
0.3，5.6±0.2で，互いの差は有意であった（Ｐ＜0.05）
。全細菌並びにClostridium属菌の標的遺伝
子コピー数は，舎飼に比べて放牧で有意に少なかった（ｐ＜0.05）。出荷後の肺病変調査には差が認められなかった。以上より，肥育豚の放牧方
式は，舎飼方式に比べて，福祉性が高い飼育方式
であることが確認された。
文献１） P. Barton Gade : Effect of rearing system andmixing at loading on transport and lairage
behaviour and meat quality : comparison of outdoor
and conventionally raised pigs. Animal, 2, 902～911,
2008.
２） J. Gentry, J. McGlone, M. Miller, and J. Blanton:
Environmental effects on pig performance, meat
quality, and muscle characteristics, Journal ofAnimal Science, 82, 209～217, 2004.
３）
 J. H. Guy, P. Rowlinson, J.P. Chadwick, and A.
Ellis : Behaviour of two genotypes of growingfinishing pig in three different housing systems,
Applied Animal Behaviour Science, 75, 193～206,
2002.
４） J. H. Guy, P. Rowlinson, J. P. Chadwick, and A.
Ellis : Growth performance and carcass

characteristics of two genotypes of growingfinishing pig in three different housing systems,
Animal Science, 74, 493～502, 2002.
５） J. H. Guy, P. Rowlinson, J.P. Chadwick, and A.
Ellis: Health conditions of two genotypes ofgrowing-finishing pig in three different housing
systems: implications for welfare, Livestock
Production Science, 75, 233～243, 2002.
６） J. Dailey and J. McGlone : Pregnant gilt behavior
in outdoor and indoor intensive pork production
systems, Applied Animal Behaviour Science, 52, 45～52, 1997.
７） 戸澤あきつ，稲元民夫，佐藤衆介：様々な飼育方
式と比較した場合の放牧肥育豚の健康性の特徴，
Animal Behaviour and Management, 47, 63, 2011.
８） R. F. Goodwin and P. Whittlestone : Enzootic
pneumonia of pigs: immunization attempts
inoculating Mycoplasma suipneumoniae antigen byvarious routes and with different adjuvants. British
Veterinary Journal, 129, 456～64, 1973.
９） E. S. E. Hafez, L. J. Sumption and J. S. Jakway :The Behaviour of Swine, in:The Behaviour ofDomestic Animals（Ed. by E. S. E. Hafez）, pp. 334～369, Bailliere Tindall, London, 1963.
10） M. Studnitz, M. Jensen, and L. Pedersen: Why dopigs root and in what will they root? A review on
the exploratory behaviour of pigs in relation toenvironmental enrichment, Applied Animal
Behaviour Science, 107, 183～197, 2007.
11） A. Stolba and D. Wood-Gush：The behaviour ofpigs in a semi-natural environment, Animal
Production, 48, 419～425, 1989.
12） R. van Winsen, B. Urlings, L. Lipman, J. Snijders,
D. Keuzenkamp, J. Verheijden, and F. van Knapen:
Effect of fermented feed on the microbial
population of the gastrointestinal tracts of pigs,
Applied and Environmental Microbiology, 67, 3071
～3076, 2001.
13） N. Canibe and B. Jensen: Fermented andnonfermented liquid feed to growing pigs : Effecton aspects of gastrointestinal ecology and growth
performance, Journal of Animal Science, 81, 2019 ～
2031, 2003.
14） L. Cox and J. Cooper: Observations on the preand post-weaning behaviour of piglets reared incommercial indoor and outdoor environments,
Animal Science, 72, 75～86, 2001.

© The Ito Foundation

平成23年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食 肉および食肉製品の食品的価値（機能性，栄養性，好味性，安全性など）及び加工技術の向上
に関する研究又は調査
単位：千円
整理
番号

研

究

調

査

の

テ

ー

マ

継続
年度

代 表 研 究 者
属

機

関

助成金額

代表研究者名所

神戸

京都大学大学院
生命科学研究科800

研29

亜鉛欠乏予防効果を持つ食肉成分の探索とその効果についての食品科学的研究

研30

食肉由来機能性成分の畜種別差異の比較検討についての研究（Ⅲ）

H.21～

六車三治男

宮
農

学
部

1,000

研21

畜産副生物由来（ヘム鉄）摂取によるスポー
ツ栄養への効果についての研究―栄養摂取状況の観察による貧血改善の試み―

H.21～

松本

恵

日 本 大 学 文 理
学部体育学科1,200

研６

低温乳酸発酵による食肉タンパク質の組織構造と加熱ゲル物性に関する研究

H.22～

芳賀

聖一

名城大学農学部

800

研19

糖修飾LEAタンパク質の利用を基盤とする食肉の新しい凍害防御技術の確立

本城賢一

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,000

研22

粉末茶による食肉および食肉製品中の糞便系
大腸菌群の制御についての研究岡崎貴世

四 国 大 学生 活 科 学 部

1,000

研12

新規発光デバイスを用いた食肉の質を落とさない殺菌法の開発高橋章

徳島大学大学院
ヘルスバイオサイエンス研究部

1,200

研23

食肉製品の調理中に起こるメイラード反応の消長と安全性の検討

大塚譲

お茶の水女子大学生活環境教育研究センター800

研15

試食パネルによる黒毛和種牛肉の脂肪酸組成，香気成分，呈味成分と食味性との関連に
関する研究

鈴木

啓一

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

研28

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究山之上稔

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

研10

食肉のきめに対する迅速かつ客観的な評価手
法の研究

入江

正和

宮崎大学農学部

1,000

研16

最高級豚肉を目指した生産方式の解明

佐藤衆介

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,200

12件

12,000

合

H.22～

計

© The Ito Foundation

大朋

崎

大
学

食肉に関する助成研究調査成果報告書「Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products」

平成23年度（Vol. 30）
2012年11月

発行

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