NGSの新たな利用法
Tailed PCR法を用いたライブラリー調製
June 13, 2014

本資料はwebinar後、下記リンク上にアップロードいたします。
http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss

小林 孝史
イルミナ株式会社
テクニカルアプリケーション サイエンティスト© 2012 Illumina, Inc. All rights reserved.
Illumina, illuminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium,iSelect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks ofIllumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

ターゲットシーケンスとは？
全ゲノムシーケンス

ターゲットシーケンス

特長特長

••

•
•

ゲノム全領域をシーケンス
ゲノム全体にわたる変異解析

考慮すべき点考慮すべき点

••
•

•
•
•
•

サンプルスループット
カバレッジは通常 30x程度
シーケンス費用がかかる

例
••
•

6

領域を絞ってシーケンス
高いカバレッジの解析が可能（低頻度変異の検出など）

ヒト全ゲノムシーケンス
微生物 de novo シーケンス
動植物リシーケンス など

領域外の変異情報のアクセス
ゲノム網羅的解析（コピー数）が難しい
カバレッジにむらがある
前処理（ライブラリー調製）に工夫が必
要例•••

エクソームシーケンス
疾患別パネル
16S 菌叢解析 など

⽬的とするターゲット領域ごとに適した⼿法を選択

ターゲット領域
⼿法

~3kb

~15kb

100~500kb

700Kb~15Mb

Tailed PCRLong PCR& Nextera

TruSeqCustomAmplicon

TruSight
Nextera Rapid
Capture Custom

Nextera Rapid
CaptureExome

Nextera XT

1536 箇所

Nextera

Nextera(1つの断⽚が550bp以下)

MiSeq

サイズ選択可能
FFPE対応MiSeq 250x2対応
マウス、ラット、ウシ

762Mb
3Gb
全エクソーム 全ゲノム

HiSeq

TruSeqなど

Tailed PCR法を選ぶか、TruSeq キットを選ぶか？
Tailed-PCR法
ターゲット領域が300bp~700bp (最終的なライブラリーサイズが430-830bp程度)
インデックスの数を96よりも（任意の配列で）増やしたい
カスタムシーケンスプライマーを使用したい断片の両端にプライマーを設計できる配列がある
フルサポートではないことをご了承いただける
TruSeq kitを使用（COVARISによる断片化の行程をスキップする）
ターゲット領域が300bp~700bp (最終的なライブラリーサイズが430-830bp程度)
インデックスの数は96以下でよい
PCR断片としてサンプルを持っている断片の両端の配列がランダム、変異がとても多いなどプライマー設計が難しいフルサポートが可能である
8

イルミナシーケンサーで解析するのに必要な構造
P5In2(i5)

R1SPDNA Insert

A

D

B

C

どれも必要な配列

P7

B

D

A

A: フローセルに結合するために必要な配列
B: シーケンスプライマー結合配列
C: 実際に解析される配列（インサート）
D: インデックス配列（多サンプル解析に対応）

弊社キットのアダプターの配列は下記のリンクで公表しております。
（MyIlluminaの登録が必要）
http://support.illumina.com/downloads/illumina-customersequence-letter.ilmn

9

R2SP

In1(i7)

どのアダプター配列を参照するか？

1) TruSeq adapterGAIIx/HiSeq/NextSeq/MiSeqのすべてで使用できるプライマーは自作

2) Nextera adapter

GAIIx, HiSeq (HighOutput, V3 kit)以外で使用できる
GAIIx, HiSeq (HighOutput, V3 kit)使用の場合はTruSeq Dual Index Primer Kitが必要
2-Step法を用いる場合はNextera XT Index kitを使用できる

3) Custom adapter

論文などを参照して設計する
トラブルシュートが難しい

10（プライマーは自作）

1) TruSeq adapter配列を参照する

11

TruSeq Adapterを参考にする場合（図はLTキットを参考にしたもの）
下記塩基配列がDNAインサート

P5配列*と書いた両端についたDNAを調製すれば解析可能

R1 Seq Primerが→向きに結合**

5’ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT –DNAインサート(下に続く)
3’ TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGA –DNAインサート(下に続く)DNAインサート(続き)AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3’
DNAインサート(続き)TCTAGCCTTCTCGTGTGCAGACTTGAGGTCAGTGTAGTGCTAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC 5’
Index1 Seq Primerが →向きに結合**
R2 Seq Primerが←向きに結合**

Index***

P7配列**P5, P7配列はフローセル上への結合とフローセル上でのDNA鋳型増幅（ブリッジPCR）に必要** 実際のプライマー結合部位は多少前後する可能性がある。
***このインデックス配列をサンプルごとに変えることで、MiSeqシーケンス後にサンプルごとにデータを分離できる

12TruSeq Adapter) 設計されるべきプライマー配列の一例
1-Step PCR
Tailed-PCR Forward Primer ：58 mer (P5側アダプター) + 領域特異的配列F⇒合計~ 80 mer ほど

5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-(領域特異的配列F)

Tailed-PCR Reverse Primer：
64 mer (P7側アダプター) + 領域特異的配列R ⇒ 合計 ~ 90 mer ほど
5’- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-(領域特異的配列R)

領域特異的配列F

P5側アダプター配列
P5

ゲノムDNA上の特定の領域

P7側アダプター配列(index配列を含む)
index
P7

領域特異的配列R

13TruSeq Adapter) 設計されるべきプライマー配列の一例
2-Step PCR1) 1st round PCR
1st PCR-F

5’- TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-(領域特異的配列F)

1st PCR-R

5’- GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-(領域特異的配列R)2) 2nd round PCR（プロジェクト間で併用可能）
2nd PCR-F
5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
2nd PCR-R
5’- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTP5

ゲノムDNA上の特定の領域
F

R
Index
P7

P5F

R
Index

14P7

TruSeq Adapter) 1-Step PCRと2-Step PCRのどちらを選ぶか？
1-Step PCRを用いた方法
・実験ステップが少ない・PCRによるバイアスがより小さい・長鎖のプライマーの作製が必要であるためコストが割高（HPLC精製以上）
・作製後にインデックスのスイッチができない

2-Step PCRを用いた方法
・実験ステップが多くなるためPCRによるバイアスがかかりやすくなる・プライマーが比較的短くなるためコストが割安
・1st round PCRの産物を取っておけば、インデックスを変えて再度解析可能

どちらもに共通する注意点・PCRでの増幅がうまくいかなかった際に、①長鎖プライマーが原因か②領域が増幅しにくい配列かの切り分けが困難（1-stepが顕著）

152) Nextera adapter配列を参照する

16

16S Metagenomics Sequencing Library Preparationを参照して設計

イルミナで公式にリリースした
16S rRNA 菌叢解析プロトコール– 16S解析用のライブラリー調製プロトコール
2-Step PCRを用いた方法
Nextera XT Index kit V2でインデックス配列を付加することにより384サンプルまでの同時解析が可能。
（Nextera XT Index kit V2 Set A-Dの購入が必要）

サポートウェビナー開催しました！

プロトコール(pdf): http://res.illumina.com/documents/products/appnotes/16s-metagenomic-library-prep-guide.pdf
17任意のターゲット領域を増幅させるためのプライマー

Forward Primer:
5ʹ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG- {ターゲット領域特異的な配列}
オーバーハング突出配列

ターゲット領域特異的な配列

Reverse Primer:
5ʹ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG- {ターゲット領域特異的な配列}

プライマーの5’末端に緑の配列を付加する。ターゲット領域は特定の領域を示す。
ターゲット領域<~550bp PCR断片

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Step 1: 目的の領域を増幅する１番目のPCR5’末端にオーバーハング配列を含むプライマーを使用
Tailed PCR でオーバーハング配列をつける

16S V3-V4領域か、カスタムアンプリコンに特異的な配列

F

ゲノムDNA(5ng/uL, 2.5uL)
ターゲット領域増幅のため25 CycleのPCR反応

2x KAPA HiFi HotStart Ready Mixによる増幅（日本ジェネティクス社様より入手可能）
http://www.n-genetics.com/feedback/kapa_la.pdf

R

16S V3-V4領域を増幅した場合550bpの断片として得られる50uLのPCRプロダクト(余剰プライマーを除くAMPure Beads精製後)のうち、5uLを次のPCR反応に用いる
19

Step 2: イルミナNextera XT Index Kit を使用して、シーケンスに必要なアダプター配列を付加する
Nextera XT Index kitプライマー(最大384種類のインデックス可能)

2x KAPA HiFi HotStart Ready Mixによる増幅（日本ジェネティクス社様より入手可能）
http://www.n-genetics.com/feedback/kapa_la.pdf

P5Index2

タグ付加のみの8 CycleのPCR増幅

16S V3-V4領域か、任意のターゲット領域がインサートとしてシーケンス解析される

Index
1P7

16S V3-V4領域を増幅した場合630bpのライブラリーが調製される
余剰プライマーを除くAMPure Beads精製後25uLの溶液として産物が得られるため、一部を変性してプールする。

20

3) Custom adapter配列を作製する

21

参考文献1：血漿DNAからのターゲットシーケンス

ケンブリッジ大学Rosenfeldラボ他からの文献
tagged-amplicon deep sequencing (TAm-Seq) という手法を開発。PCRでイルミナ次世代シーケンサー用のライブラリーを作製
癌患者に見られる血中癌細胞由来DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)のディープシーケンスを実施
TP53, EGFR, BRAF, KRAS など合計5995塩基をターゲットとして、38名の患者から採取した血漿を解析
TP53では 2% から 65% の変異を検出
一人の患者ではEGFRでは腫瘍の発見される15ヶ月前から血漿中のDNAに変異が検出

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参考文献1：血漿DNAからのターゲットシーケンス
2 step PCRプライマー配列は論文で公表されている

Forshew T, et al,. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep
sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med. 2012 May 30;4(136):136ra68.
23参考文献1：血漿DNAからのターゲットシーケンス
一般的な2-Step PCR疾患に関連した遺伝子のターゲット領域に合わせたプライマーを設計

10 ng human genomic DNAをテンプレートにする
35 cycle のPCR (Step1)
FastStart High Fidelity Enzyme Blend (Roche)を使用。

（次ページ）Step2のPCRへ

Forshew T, et al,. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep
sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med. 2012 May 30;4(136):136ra68.
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参考文献1：血漿DNAからのターゲットシーケンス

P5配列に相当
P7配列に相当

Barcode384種類、10塩基のバーコード（インデックス）配列
15 cycle のPCR (Step2)
FastStart High Fidelity Enzyme Blend (Roche)を使用。
AMPure Beadsで精製 (PrimerやPrimer dimerを除く)

5’5’-

カスタムプライマーを設計し、シーケンスを行う

Forshew T, et al,. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep
sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med. 2012 May 30;4(136):136ra68.
25参考文献2：MiSeq/HiSeqを使用した16S metagenomics

16S V4 領域をカスタムプライマーで増幅
インデックス配列は 2168 種類記載
HiSeq, MiSeq に対応
カスタムプライマーでシーケンス（別途合成が必要）
MiSeq では PhiX コントロールを 約50%(この時は47%)混ぜてラン
実際のサンプルシートの作成⽅法やランの仕⽅ までsupplementに 記載されている。
データ解析はMiSeq Reporterでは無く、著者らが開発したQIIMEというソフトウェアを使⽤

Caporaso JG, et al., Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.
ISME J. 2012 Mar 8.
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参考文献2：MiSeq/HiSeqを使用した16S metagenomics

http://www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/
Forward Primer は 60 mer

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC TATGGTAATT GT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
P5配列

16S V4領域を増幅するための配列
Mは A/C の MIX 塩基Reverse Primer は 68 mer

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT TCCCTTGTCTCC AGTCAGTCAG CC GGACTACHVGGGTWTCTAAT
P7配列

インデックス１２塩基２１６８種類の組み合わせ27

16S V4領域を増幅するための配列
H は A/C/T の MIX 塩基
V は A/C/G の MIX 塩基W は A/T のMIX塩基参考文献2：MiSeq/HiSeqを使用した16S metagenomics

Read 1 sequencing primer:

TATGGTAATT GT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA

Read 2 sequencing primer:

AGTCAGTCAG CC GGACTACHVGGGTWTCTAAT

Index sequence primer:

ATTAGAWACCCBDGTAGTCC GG CTGACTGACTMiSeq cartridgeプライマーとカスタムシーケンシングプライマーで解析
PhiX 50%で解析（現在は5%で解析可能）

解析後はQIIMEで情報処理28

まとめ1kbp以上

ターゲット領域
300-550bp程度(<800bp以下)

Long PCR+ Nextera

基本的にフルサポート（検証済み）
キットの購入必要

TruSeq kitを使用（COVARISによる断片化の行程をスキップする）
基本的にフルサポート（検証済み）、キットを購入する必要がある。
GAIIx/HiSeq/NextSeq500/MiSeqのすべてに対応

Tailed-PCR法
1) TruSeq adapter GAIIx/HiSeq/NextSeq500/MiSeqのすべてに対応
1-step: stepは少ないがコスト高、PCR biasかかりにくい
2-step: stepは多いがコスト安、PCR biasかかりやすい2nd round PCRのプライマーはプロジェクト間で使いまわし可能

2) Nextera adapter GAIIx/HiSeq(HighOutput)ではPrimer Kitが別途必要
2-step: stepは多いがコスト安、PCR biasかかりやすい、
NexteraXT Index kitで384サンプルの同時解析が可能

3) Custom adapter
弊社で完全に検証できていない。
論文を参照する必要がある。プライマーの設計にコスト高。
最大で2168サンプルの同時解析が理論上できる

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多サンプル解析を実施する際の注意点
インデックスの組み合わせに注意（カラーバランスが悪いと振り分けの効率が低下します）
サポートウェビナー参照ください！

変性方法などは右の資料（cBotのユーザーガイド）などを参照し、変性後等量ずつプールください。

（次ページを参照）ライブラリーによってPhiXを添加ください。

TruSeq Amplicon以外でMultiplex PCRは推奨できません。
→サンプル間のクラスター比率が大きく変わるため
http://support.illumina.com/downloads/prepare_libraries_for_sequencing_miseq_15039740.ilmn
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運用に際しての注意点①Tailed-PCR法によるアンプリコンシーケンスはLow Diversityサンプルとなります。
→サポートウェビナーを参考にPhiX添加(5-30%)、MCS2.2/HCS2.2.38以上をご使用ください。
サポートウェビナー開催しました！

②キットで作製されたライブラリーを解析する場合に比べてサポート範囲が限られます。
下記のようなお問い合わせは基本的にサポートが難しいです。
例）自作のプライマーの配列が注文した配列と異なった。
シーケンスプライマーがG/C-richでTmが高くなり上手く解析できなかった。
増幅のためのPCR酵素がうまく働かずライブラリーが作製できなかった。
論文のプロトコールについて詳細を教えてほしい。

③お問い合わせをいただく場合には、細かく実験条件をお知らせください。

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ご清聴頂き誠にありがとうございました。
しばらくご質問をいただく時間を設けます。
過去のサポートウェビナー資料は、下記リンクからダウンロードできます(Recording/Document)。
http://www.illuminakk.co.jp/events/webinar_japan.ilmn?ws=ss

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