PCRを用いたコイとフナ類及びキンギョの雑種F3が有するゲノムの推定
メタデータ

言語: ja
出版者:
公開日: 2022-09-26
キーワード (Ja):
キーワード (En):作成者: 正岡, 哲治, 名古屋, 博之, 岡本, 裕之, 荒木, 和男,
藤原, 篤志, 小林, 敬典
メールアドレス:
所属: 水産研究・教育機構, 水産研究・教育機構（退職）,
水産研究・教育機構, 水産研究・教育機構（退職）,
水産研究・教育機構, 水産研究・教育機構

URL

https://fra.repo.nii.ac.jp/records/64

DNA鑑定, 12, 27-40（2021）

PCRを用いたコイとフナ類およびキンギョの雑種F3が有するゲノムの推定
Estimation of genome composition of F3 hybrids amongcarp, crucian carp, and goldfish using PCR methods.
正岡哲治1，名古屋博之2，岡本裕之1，
荒木和男1，藤原篤志1，小林敬典1
Tetsuji Masaoka1*, Hiroyuki Nagoya2, Hiroyuki Okamoto1, Kazuo Araki1,
Atushi Fujiwara1 and Takanori Kobayashi1
1

国立研究開発法人水産研究・教育機構水産技術研究所，
2

元国立研究開発法人水産研究・教育機構増養殖研究所

1

Fisheries Technology Institute, Japan Fisheries Research and Education Agency

2

National Research Institute of Aquaculture, Japan Fisheries Research and Education

Agency*Corresponding author：Tel：0596-58-6411. Fax：0596-58-6413. E-mail：tmasa@fra.affrc.go.jp

Abstract
Carp（Cyprinus carpio ）,Carassius fish, and goldfish（Carassius auratus）are popularcyprinid species bred for use in aquaculture as a food source, in aquaria, and biologicalresearch in many countries. Hybrids derived from a cross between carp and Carassius
fish containing the genome of crucian carp and goldfish have been artificially produced
for use as food and aquarium fish. We obtained a third generation of diploid and triploidhybrids（F3）derived from crosses between the F2 hybrid of family 1［F1 hybrid（C.

carpio ♀ × Carassius cuvieri ♂）♀ × C. carpio ♂］♀ and C. auratus ♂ and crossbetween the F2 hybrid of family 2［F1 hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）♀ × C.

cuvieri♂ ］ ♀ and C. auratus♂. However, it is difficult to estimate the genome

composition of the F3 hybrids by morphological measurement. We previously developed（1）analysis by
three methods of species distinction between carp and Carassius fish：
PCR amplification using carp- and crucian carp-specific primers targeting the IGF-1
gene region,（2）PCR-RFLP analysis of the TGF-beta gene region, and（3）PCR-RFLP
analysis of the mitochondrial 16S ribosomal RNA gene region. In this study, we
estimated the genome composition of eight F3 hybrids by these methods. We estimatedthat five F3 hybrids contained the genomes of C. carpio , C. cuvieri , and C. auratus . Thus,─ 27 ─

the five F3 hybrids are considered to be allotriploids and include the genomes of threefish species. We estimated that two F3 hybrids contained the genomes of C. carpio and C.

auratus . We also estimated that one F3 hybrid contained the genomes of C. cuvieri and
C. auratus . Thus, these three F3 hybrid types are considered to be diploid hybrids.
Moreover, all the eight F3 hybrids were estimated to contain the mitochondrial DNA
derived from C. carpio as the maternal species.
Key words
carp, crucian carp, goldfish, genome, hybrid
はじめにの卵を産生すると推測されている（名古日本をはじめとする温暖な地域の湖沼屋ら 2016）。さらに，名古屋ら（2018）は，や河川に分布しているコイ科のコイ

コイとゲンゴロウブナの交雑後代F1の雌（Cyprinus carpio ）やフナ属（Carassius ）とコイ雄またはゲンゴロウブナ雄とを交魚種は，食用だけでなく観賞魚，生物学雑した交雑後代F2 と，キンギョの雄をの実験生物等として利用されている

交雑して交雑後代F3 を作出し，これら（Nelson 2006）。さらに，選抜育種によの倍数性をフローサイトメトリーによっりコイからニシキゴイ，フナ属魚種からキて調査したところ，２倍体（2n）と３倍ンギョ（Carassius auratus）も開発され，体（3n）が混在していることを報告して観賞魚，生物学の実験生物等として利用いる（Figure 1）。また，名古屋ら（2018）

されている（Nelson 2006）。また，育種は，このことから上記交雑後代F2は２倍の観点から新しい優良家系を作出するた性（2n）の卵と半数性（n）の卵を産生し

め，コイとフナ属魚種は人為的に属間交たと推測している。異種間交雑を利用す

雑されてきた（Anil et al. 2016, Cherfas

る交雑育種や３倍体（3n）および４倍体

et al. 1994, Delomas et al. 2016, Gomelsky（4n）に代表される倍数性育種においては，and Schneider 2012, Hamaguchi 1961,

妊性等の生物学的特性を推測するため，

Liu et al. 2001, Liu 2010, 名古屋ら 2016，

倍数性だけでなく，ゲノムの組成も把握

小 島1983, Ojima et al. 1975, Takayama

することが重要となる。しかし，交雑後

et al. 1961）。このうち，名古屋ら（2016）

代F3の外部形態やフローサイトメトリー

はフローサイトメトリーによる１細胞あ等によるDNA量の測定では，ゲノムの組たりのDNA量の測定から，コイ雌とゲ成を推測することはできなかった。

ンゴロウブナ（Carassius cuvieri ）雄の一方，様々な生物種でPCRを用いた種

交雑後代F1 が２倍体（2n）であったの判別手法が開発されており，魚介類では雑に対し，この交雑後代F1 雌とコイ雄ま種の判別にも利用されつつある（Kednapat

たはゲンゴロウブナ雄とを交雑した交雑

et al. 2018, Masaoka et al. 2015, 2018,

後代F2は，全て３倍体（3n）であった

McKeown et al. 2015, Schmidt et al.

と報告している（Figure 1）。これから，

2015）。著者らも各遺伝子のDNA多型を用コイ雌とゲンゴロウブナ雄の交雑後代F

いて，コイと在来のフナ属魚種（ギンブナ

雌は，コイのゲノム１個とゲンゴロウ，ゲンゴ（Carassius auratus langsdorfii ）ブナのゲノムを１個有する２倍性（2n）ロウブナ，ニゴロブナ（Carassius auratus１─ 28 ─

grandoculis ），ナガブナ（Carassius auratus

そこで，上記PCR解 析とPCR-RFLP解

subsp. 1））（以降「フナ類」）とを判別でき析を用いて，名古屋ら（2018）が作出しるpolymerase chain reaction（PCR）およた，上記コイとゲンゴロウブナおよびキ

び PCR-restriction fragment length

ンギョの交雑後代F3のゲノム組成を推定

polymorphism（PCR-RFLP） のDNAマ ー

した。また，交雑後代F3が受け継いでいカーを開発し，これらが人工交配で作出したるミトコンドリアDNAの種類について

コイとフナ類の雑種F １の判別にも利用できるも確認した。

ことを確認した（正岡ら 2013, 2014, 2015,
2016）。また，屋外飼育池を用いてコイと材料と方法

フナ類の自然産 卵試 験を実 施し，上記

供試魚

DNAマーカーの一部を用い，自然産卵に親魚種としてコイとゲンゴロウブナおより得られた仔魚に雑種が存在することをよびキンギョ（リュウキン）をそれぞれ確認した（正岡ら 2017, 2018）。さらに，上１個体用いた（Figure 1, Table 1）。また，

記PCR解 析とPCR-RFLP解 析から，キン

コイの雌とゲンゴロウブナ雄を人工交雑

ギョはコイと異なるバンドパターンが得らして作出した交雑後代F1（以降，F1）をれることを確認した（正岡ら 2019）。

１個体と，このF1雌とコイ雄を人工交雑

Figure 1. Formation scheme for F3 hybrids among C. carpio , C. cuvieri , and C. auratus（ryuukin）.

─ 29 ─

して作出した交雑後代F2（以降，家系１

イのDNAを特異的に増幅するコイ判別用のF2）およびF1雌とゲンゴロウブナ雄を（for carp）プライマーセットまたはフナ類人工交雑して作出した交雑後代F（以降，2およびキンギョのDNAを特異的に増幅す家系２のF2）を各１個体用いた（Figure

るフナ類判別用（for Carassius ）のプラ

1, Table 1）。さらに，
家系１のF2雌とリュ

イマーセットをそれぞれ用いて，PCRにウキン雄を人工交雑して作出した交雑後

よりIGF-1遺伝子の増幅を行った。PCR反代F3（以降，家系１のF3）を６個体と，家応液は，1μlのDNA溶液，2μlの2.5 mM

系２の F2雌とリュウキン雄を人工交雑して

dNTPおよび10×緩衝液（100 mM Tris-

作出した交雑後代F3（以降，家系２のF3）HCl（pH 8.3）
, 500 mM KCl, 30 mM MgCl2,を２個体用いた（Figure 1, Table 1）。

0.01 % gelatin），0.1μlの100 pmol/ulプ
ラ イ マ ー，0.1μlのTaKaRa EX Taq Hot

DNA抽出

Start Versionポリメラーゼ5U/μlに超純水

家系１と２のF3以外の個体は，エタノー

を加えて総量を20μlとした。プライマー配列

ル固定または冷凍保存した筋肉や鰭組織は前報（正岡ら 2013）と同じ（for carpプラからDNAを抽出した。また，家系１と２

イマーセットは，Forward primer（5’-3’）：のF3は孵化仔魚の全身からDNAを抽出しCAAAGCAAATAGGCACCTTG, Reverse

た。 組 織 片 また は 孵 化 仔 魚 を500μlのprimer（5’-3’）：GCATTGTGGTTCA

TNES-6M Urea緩 衝 液（Asahida et al.

CCTACAG, for Carassiusプライマーセット

1996） に 投 入 後，20mg/mlのProteinase

は , Forward primer（5’-3’）：CAAAG

K.10μlを加えて37℃で一晩反応した。
次に，

CAAATAGGCACCTTG, Reverse primer

フェノール・クロロホルムでDNAを抽出し，（5’-3’）：AACGCACAACTAGGCTAT

エ タ ノ ー ル 沈 殿 し た（Asahida et al.

GC）である。PCR反応では，94℃で５分間加1996）。こ れ を300μlの0.1倍 に 希 釈 し た

熱後，94℃で30秒，57℃で30秒，72℃で30

Tris-EDTA（10mM Tris, 1mM EDTA,

秒間のサイクルを30回行い，最後に72℃でpH 8.0）に溶解してDNAサンプルとした。

７分間の伸長を行った。このPCR反応液
3μlをとり，３％アガ ロー スゲ ルとTAE

コイとフナ類およびキンギョの判別用PCR（40 mM Tris-acetate, 2 mM EDTA）緩衝

IGF-1遺伝子のDNA多型を利用したコ液による100Vで約２時間の電気泳動を
─ 30 ─

行った。その後，ゲルをエチジウムブロ

適 温 度（Afa I，Hpy CH ４ IVは37 ℃，

マイドで染色（ゲル染色）し，紫外線照Tsp E Iは65℃）で16～18時間かけて切射下で撮影した。

断した。得られたPCR-RFLP反応液5μlを用いて電気泳動を行った。その後，ゲコイとフナ類およびキンギョの判別用

ルをエチジウムブロマイドで染色（ゲルPCR-RFLP染色）し，紫外線照射下で撮影した。

TGF-β遺伝子とミトコンドリアDNA
バンドパターンの確認とゲノムの推定の16S ribosomal RNA（16S rRNA） 遺伝子領域を用いたPCR- RFLP解析により，各PCRとPCR-RFLPの 電 気 泳 動 像 か供試魚間でバンドパターンを比較した。

ら，目視によりバンドパターンを確認しこれらのPCR反応液は，プライマー以外た。なお，コイ，ゲンゴロウブナ，キンはコイとフナ類およびキンギョの判別用

ギョのバンドパターンから，交雑後代の

PCRと同じである。なお，TGF-β遺伝子

バンドパターンを判定した。また，コイのプライマーは前報（正岡ら 2015）と同とフナ属のゲノムあるいはそれぞれの種じ（Forward primer（5’-3’）：TGTACAのゲノムを表していると考えられる上記

ACACGCTGAACCCC, Reverse primer

３種のバンドパターンから，交雑後代の（5’-3’）：TACAAATCCCTAAAGTGA

ゲノム組成を推測した。

CA）である。また，16SrRNA遺伝子は
結果

ユニバーサルプライマー（16SAR-L（5’-3’）：
CGCCTSTTKMHYAAAAACAT,

IGF-1遺伝子のPCRを行った結果，コ

16SBR-H（5’-3’）：CCGGTYTGAACTCAG

イはコイ判別用プライマーでのみ増幅産ATCAYGT）を 用 い た（Palumbi et al.

物（バンドパターンA）が見られ，ゲン

1991）。TGF-β遺伝子のPCR反応では，ゴロウブナとキンギョはフナ類判別用プ

94℃で５分間加熱後，94℃で30秒，58℃

ライマーでのみ増幅産物（バンドパター

で30秒，72℃で30秒間のサイクルを35回ンB） が 見 ら れ た（Figure 2a，2b， コ

行い，最後に72℃で７分間の伸長を行っ

イはレーン１，ゲンゴロウブナはレーン

た。 ま た， ミ ト コ ン ド リ アDNAの16S

２，キンギョはレーン３）。これに対し，

rRNA遺伝子のPCR反応では，94℃で５コイとゲンゴロウブナのF １ と家系１と分間加熱後，94℃で30秒，55℃で30秒，２のF2は，上記２種類のプライマーをそ

72℃で30秒間のサイクルを35回行い，最れぞれ用いたPCRで増幅産物（バンドパ

後に72℃で７分間の伸長を行った。

ターンAおよびB）が得られた（Figure

TGF-β遺伝子のPCR-RFLP解析では，

2a，2b，F1はレーン４，家系１のF2はレー

PCR産物を２Uの制限酵素Afa I（Rsa I）。家系１
ン５，家系２のF2はレーン６）（TaKaRa）， ま た はHpy CH4 IV（NewのF3では，６個体全てで上記２種類のプ

England Biolabs） を 用 い て 切 断 し た。

ライマーをそれぞれ用いたPCRで増幅産

ミトコンドリアDNAの16S rRNA遺伝子物（バンドパターンAおよびB）が得らのPCR-RFLP解析では，PCR産物を2Uのれ た（Figure 2a，2b， 家 系 １ のF3 の制 限 酵 素Tsp E I（TOYOBO） を 用 い

No. １～６はレーン７～12，Table 2）。

て切断した。また，制限酵素処理は総量

これに対し，家系２のF3では，No. 1は10ulで行い，PCR産物３μlを各酵素の至上記２種類のプライマーをそれぞれ用い─ 31 ─たPCRで増幅産物（バンドパターンAおバンドと約160bpの長さのバンドおよび

よびB）が得られたのに対し，No. 2はフ約280bpの長さのバンドを含むゲンゴロ

ナ類判別用プライマーでのみ増幅産物

ウブナ特異的なバンドパターンB（レー（バンドパターンB）が見られた（Figure

ン２）が見られた（Figure 4）。キンギョ

2a，2b，家系２のF3のNo. 1と２はレー

は約170bpの長さのバンドと約440bpのン13，14，Table 2）。

長さのバンドを含むキンギョ特異的なバ

TGF-β遺伝子におけるAfa I（Rsa Ⅰ）

ンドパターンC（レーン３）が見られたを用いたPCR-RFLP解析では，コイは約（Figure 4）。ゲンゴロウブナのバンドパ

250bpの長さのバンドと約380bpの長さ

ターンBに対し，コイのバンドパターンのバンドを含むコイ特異的なバンドパ

Aのみに見られるバンドがなかったた

ターンA（レーン１）が見られ，ゲンゴ

め，F1と家系１と２のF2（レーン４～６）

ロウブナとキンギョは約620bpの長さのは，バンドパターンBであるのか，あるバンドを含むフナ類およびキンギョ特異

いはバンドパターンAとバンドパターン

的なバン ド パ タ ー ンB（ レ ー ン ２，３）

Bを合わせたバンドパターンABであるが見られた（Figure 3）。また，F １と家のか確認できなかった（Figure 4）。家系１と２のF2は，両者のバンドを合わせ系１のF3のNo. １，２，４，６（レーン７，たバンドパターンAB（レーン４～６）

８，10，12）と，家系２のF3のNo. １とが見られた（Figure 3）。家系１のF3の２（レーン13，14）は，上記と同様にゲNo. １～６と，家系２のF3のNo. １におンゴロウブナのバンドパターンBとキン

いても，両者のバンドを合わせたバンド

ギョのバンドパターンCを合わせた，バパターンAB（レーン７～13）が見られンドパターンBCであるのか，これにコた（Figure 3）。これに対し，家系２のイのバンドパターンAも含めたバンドパ

F3のNo. ２は，フナ類およびキンギョ特ターンABCであるのか確認できなかっ

異的なバンドパターンB（レーン14）がた（Figure 4）。家系１のF3のNo. ３と５見られた（Figure 3）。

（レーン９と11）は，コイとゲンゴロウ

一方，Hpy CH4 IVを用いたPCR-RFLP

ブナに共通の約280bpの長さのバンドは解析では，コイは約280bpの長さのバンド見られたが，約120bpのゲンゴロウブナ（ 塩 基 配 列 からほぼ 同じ 長さ（277bpと特異的バンドは見られず，キンギョ特異

280bp）の２本のDNA断片から成ると推的な約440bpの長さのバンドが見られた

測される）を含むコイ特異的なバンドパ（Figure 4）。これから，コイのバンドパ

ターンA（レーン１）が見られた（Figure

ターンAとキンギョのバンドパターンC4）。ゲンゴロウブナは約120bpの長さのを合わせたバンドパターンACと確認で─ 32 ─

Figure 2. PCR amplification using carp- and crucian
carp-specific primers targeting the IGF-1 gene region
from C. carpio , C. cuvieri , C. auratus , and their hybrids.
Lane 1, C. carpio ; Lane 2, C. cuvieri ; Lane 3, C.
（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）;auratus ; Lane 4, F1 hybrid
1 F1 hybrid（C. carpio ♀ × C.
Lane 5, F2 hybrid of family ［♀ × C. carpio ♂]; Lane 6, F2 hybrid of family
cuvieri ♂）（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）♀ × C. cuvieri
2［F1 hybrid
1 F2 hybrid（F1 hybrid♂］; Lane 7-12, F3 hybrid of family ［♀ × C. carpio ♂）♀ × C.
（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）No. 1-6; Lane 13, 14, F3 hybrid of family 2
auratus ♂］（F1 hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）♀ × C.
［F2 hybrid♀ × C. auratus ♂）]No. 1, 2; M, 100-bp DNA
cuvieri ♂）size ladders. Arrows indicate 500 bp; A, B, Fragment
types; -, Not detect.
Figure 3. Restriction analysis of DNA amplified by
I Rsa I）
from C.
PCR of TGF-β gene digested with Afa （carpio , C. cuvieri , C. auratus , and their hybrids.
Lane 1, C. carpio ; Lane 2, C. cuvieri ; Lane 3, C. auratus ;（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）; Lane 5,
Lane 4, F1 hybrid
1 F1 hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri
F2 hybrid of family ［［F1♂）♀ × C. carpio ♂]; Lane 6, F2 hybrid of family 2
hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）♀ × C. cuvieri ♂］;1 F2 hybrid（F1 hybrid（C.
Lane 7-12, F3 hybrid of family ［♀ × C. carpio ♂）♀ × C.
carpio ♀ × C. cuvieri ♂）No. 1-6; Lane 13, 14, F3 hybrid of family 2
auratus ♂］（F1 hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）♀ × C.
［F2 hybrid♀ × C. auratus ♂）]No. 1, 2; M, 100-bp DNA
cuvieri ♂）size ladders. Arrows indicate 500 bp; A, B, Fragment
types; -, Not detect.
Figure 4. Restriction analysis of DNA amplified by
PCR of TGF-β gene digested with Hpy CH4 IV from C.
carpio , C. cuvieri , C. auratus , and their hybrids.
Lane 1, C. carpio ; Lane 2, C. cuvieri ; Lane 3, C. auratus ;（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）; Lane 5,
Lane 4, F1 hybrid
1 F1 hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri
F2 hybrid of family ［［F1♂）♀ × C. carpio ♂]; Lane 6, F2 hybrid of family 2
hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）♀ × C. cuvieri ♂］;1 F2 hybrid（F1 hybrid（C.
Lane 7-12, F3 hybrid of family ［♀ × C. carpio ♂）♀ × C.
carpio ♀ × C. cuvieri ♂）No. 1-6; Lane 13, 14, F3 hybrid of family 2
auratus ♂］（F1 hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）♀ × C.
［F2 hybrid♀ × C. auratus ♂）]No. 1, 2; M, 100-bp DNA
cuvieri ♂）size ladders. Arrows indicate 500 bp; A, B, Fragment
types; -, Not detect.

─ 33 ─

Figure 5. Restriction analysis of DNA amplified by PCRof 16S rRNA gene digested with TspE I from C. carpio ,C. cuvieri , C. auratus , and their hybrids.
Lane 1, C. carpio ; Lane 2, C. cuvieri ; Lane 3, C. auratus ;（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）; Lane 5,
Lane 4, F1 hybrid
1 F1 hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri
F2 hybrid of family ［［F1♂）♀ × C. carpio ♂]; Lane 6, F2 hybrid of family 2♀ × C. cuvieri ♂］;hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）1 F2 hybrid（F1 hybrid（C.
Lane 7-12, F3 hybrid of family ［♀ × C. carpio ♂）♀ × C.
carpio ♀ × C. cuvieri ♂）No. 1-6; Lane 13, 14, F3 hybrid of family 2
auratus ♂］（F1 hybrid（C. carpio ♀ × C. cuvieri ♂）♀ × C.
［F2 hybrid♀ × C. auratus ♂）]No. 1, 2; M, 100-bp DNA
cuvieri ♂）size ladders. Arrows indicate 500 bp; A, B, Fragment
types; -, Not detect.

きた（Figure 4）。

のゲノムを示していると考えられる。まミトコンドリアDNAの16S rRNA遺伝子

Afa I（Rsa I）を用いたPCR-RFLP解
た，のTsp E Iを 用 い たPCR-RFLP解 析 で は，

析においても，F1と家系１と２のF2は，コイは約120bpと約310bpの長さのバンドをコイとゲンゴロウブナのバンドを合わせ含むコイ特異的なバンドパターンA（レーたバンドパターンAB（Figure 3，レーン１）が見られ，ゲンゴロウブナとキンギョ

ン４～６）が見られた。F1と家系１と２のは約245bpの長さのバンドを含むゲンゴロ

F2において，このバンドパターンAはコイ

ウブナとキンギョ特異的なバンドパターンのゲノム，バンドパターンBはゲンゴロウ

B（レーン２，３）が見られた（Figure 5）。

ブナのゲノムを示していると考えられる。

また，コイを雌親としているF1（レーン４）

TGF-β遺伝子におけるHpy CH4 IVを用いや，F1を雌親としている家系１と２のF2

たPCR-RFLP解析だけでは，F1と家系１と（レーン５，
６）および家系１と２のF2をそ２のF2（Figure 4，レーン４～６）は，ゲ

れ ぞ れ 雌 親としている家 系１と２のF3

ンゴロウブナのバンドパターンBである（レーン７～14）は，コイ特異的な約120bp

か，コイとゲンゴロウブナのバンドを合と約310bpの長さのバンドが見られ，ゲン

わせたバンドパターンABであるか確認でゴロウブナとキンギョ特異的は約245bpのきない（Figure 4）。しかし，上記IGF-1

長さのバンドは見られなかったため，バン

遺 伝 子のPCRとTGF-β遺 伝 子におけるドパターンAと確認できた（Figure 5）。

Afa I（Rsa I）を用いたPCR-RFLPの結果
から，Hpy CH4 IV を用いたPCR-RFLP解考察

析においても，
F1と家系１と２のF（Figure
2

コイとゲンゴロウブナのF1と家系１と4，レーン４～６）は，コイとゲンゴロウ

２のF2は，IGF-1遺伝子のコイ判別用プ

ブナのバンドを合わせたバンドパターン

ライマーを用いたPCRとフナ類判別用プABであると考えられた。また，これまでライマーを用いたPCRでそれぞれ増幅産にコイとゲンゴロウブナの交雑後代F1は物（バンドパターンAとバンドパターン

雑種２倍体であり，一部の雌が成熟してB） が 見 ら れ た（Figure 2a，2b， レ ー

コイとゲンゴロウブナのゲノムを１個ずつ

ン４～６）。F1と家系１と２のF2におい持つ2nの非還元卵を産生することが報告て，このバンドパターンAはコイのゲノされている（名古屋ら 2016，小島1983,

ム，バンドパターンBはゲンゴロウブナ

Ojima et al. 1975）。このため，F1は，コ─ 34 ─

イとゲンゴロウブナのゲノムを１個ずつえられた（Table 2）。また，家系１のF3持つ雑種２倍体であると推測される。まのNo. １，２，４，６ と， 家 系 ２ のF3のた，F1の雌がコイとゲンゴロウブナのゲ

No. １は，コイとゲンゴロウブナおよびノムを１個ずつ持つ2nの非還元卵を産

キンギョの３種類のゲノムを持つと推測生していた場合，これとコイ雄とを交雑された（Table 2）。

して作出した家系１のF2は，コイのゲノ

家系１のF3のNo. ３と５は，IGF-1遺伝

ムを２個とゲンゴロウブナのゲノムを１子のコイ判別用プライマーを用いたPCR個持つ雑種３倍体（異質３倍体）であるとフナ類判別用プライマーを用いたPCRと推測される。一方，F1の雌とゲンゴロ

でそれぞれ増幅産物（バンドパターンA

ウブナ雄とを交雑して作出した家系２のとバンドパターンB ）が見られた（Figure

F2は，コイのゲノムを１個とゲンゴロウ

2a，2b，レーン９と11，Table 2）。また，

ブナのゲノムを２個持つ雑種３倍体（異Afa I（Rsa Ⅰ）を用いたPCR-RFLP解析

質３倍体）であると推測される。

では，バンドパターンAB（Figure 3，レー２，
４，
６（Figure 4，
家系１のF2のNo. １，

ン９と11，Table 2）が 見 ら れ た。 上 記

レーン７，８，10，12）と，家系２のF3のPCR解析とPCR-RFLP解析において，ゲNo. １（Figure 4，
レーン13）においても，

ンゴロウブナとキンギョは同じバンドパ

上記と同様にHpy CH4 IVを用いたPCR-

タ ー ンBと な る（Figure 2a，2bお よ び

RFLP解析だけでは，ゲンゴロウブナのFigure 3，レーン２と３，Table 2）。こバンドパターンBとキンギョのバンドパのため，家系１のF3のNo. ３と５におい

ターンCを合わせた，バンドパターンBCては，バンドパターンAはコイを示してであるのか，これにコイのバンドパター

いるが，バンドパターンBがゲンゴロウ

ンAも含めたバンドパターンABCである

ブナかキンギョ或いは両者を示しているのか確認できなかった（Figure 4）。しか は 分 か ら な か っ た。 一 方，Hpy CH4かし，上記F3は，IGF-1遺伝子のコイ判IVを用いたPCR-RFLP解析において，家別用プライマーを用いたPCRとフナ類判系１のF3のNo. ３と５（Figure 4，レー

別用プライマーを用いたPCRでそれぞれ

ン９と11）は，コイとゲンゴロウブナに増幅産物（バンドパターンAとバンドパ共通の約280bpの長さのバンドと，キンターンB）が見られた（Figure 2a，2b，ギョ特異的な約440bpの長さのバンドは

レ ー ン ７，８，10，12，13，Table 2）。

見られたが，約120bpのゲンゴロウブナ

また，Afa I（Rsa I）を用いたPCR-RFLP解

特異的バンドが見られなかった。このた析では，上記F3はコイとフナ属魚種のバンド

め，コイのバンドパターンAとキンギョを合わせたバンドパターンAB（Figure 3，のバンドパターンCを合わせたバンドパ

レーン７，
８，10，12，13，Table 2）がターンACと確認できた（Figure 4，レー見られた。これらのバンドパターンAは

ン９と11，Table 2）。これらのPCR解析

コイのバン ド パ タ ー ン を 示 し て い る。

とPCR-RFLP解析の結果から，家系１のよって，Hpy CH4 IVを用いたPCR-RFLP

F3のNo. ３と５は，コイとキンギョのゲ

２，４，
解析において，家系１のF3のNo. １，

ノムを持つと推測された（Table 2）。

６と，家系２のF3のNo. １は，コイとゲン

家系２のF3のNo. ２は，IGF-1遺伝子のゴロウブナおよびキンギョのバンドを合

コイ判別用プライマーを用いたPCRではわせたバンドパターンABCであると考増幅産物が見られず，フナ類判別用プラ─ 35 ─

イマーを用いたPCRでのみ増幅産物（バ

これにより，家系１のF2の雌は，コイとンドパターンB）が 見られた（Figure 2a，

ゲンゴロウブナのゲノムを持つ２倍性

Afa I（RsaⅠ）
2b，
レーン14，Table 2）。また，（2n）の卵とコイのゲノムを持つ半数性を用いたPCR-RFLP解析では，家系２の（n）の卵を産生したと考えられた。また，

F3のNo. ２はバンドパターンB（Figure 3，

家系２のF2の雌は，コイとゲンゴロウブ

レーン14，Table 2）が 見られ た。上 記

ナのゲノムを持つ２倍性（2n）の卵とPCR解析とPCR-RFLP解析において，ゲ

ゲンゴロウブナのゲノムを持つ半数性

ンゴロウブナとキンギョは同じバンドパ（n）卵を産生したと考えられた。

ター ンBと な る（Figure 2a，2bお よ び

ミトコンドリアDNAの16S rRNA遺伝

Figure 3，レーン２と３，Table 2）。こ子におけるTsp E Iを用いたPCR-RFLP解のため，家系２のF3のNo. ２においては，

析では，コイは個体変異があり，約430bp

バンドパターンBがゲンゴロウブナかキの長さのバンドを含むコイ特異的なバン

ンギョあるいは両者を示しているかは分

ド パ タ ー ン が 見 ら れ る 個 体（ 正 岡 らからなかった。一方，Hpy CH4 IVを用2019）の他に，約310bpの長さのバンドをいたPCR-RFLP解析において，家系２の含むコイ特異的なバンドパターンが見られF3のNo. ２（Figure 4， レ ー ン14） は，る個体がある（Figure 6）（正岡ら データ

コイとゲンゴロウブナに共通の約280bp

未公表）。これは１塩基置換によりGATTの長さのバンドと，キンギョ特異的な約（Accession No. AB741887）がTspEⅠの認

440bpの長さのバンドおよび約120bpの

識 部 位 で あ るAATT（Accession No.

ゲンゴロウブナ特異的バンドが見られFJ655285）になったことから，約430bpのた。これらから，Hpy CH4 IVを用いた

DNAが切断され，約310bpと約120bpの長PCR-RFLP解析においては，ゲンゴロウ

さの２本のバンドとして検出されたため

ブナおよびキンギョのバンドを合わせたと考えられた。本研究のF1は，約310bpのバンドパターンBCであると考えられた

長さのバンドを含むコイ特異的なバンド（Table 2）。よって，家系２のF3のNo. ２
は，ゲンゴロウブナとキンギョのゲノムを持つと推測された（Table 2）。
名古屋ら（2018）はフローサイトメト
リーによる倍数性の調査で，本研究と同じ交配区のF3は，２倍体（2n）と３倍体（3n）が混在していることを報告している。これと本研究結果から，F3のうち， 家 系 １ のF3のNo. １，２，４，６ と，家系２のF3のNo. １は，コイとゲンゴロ
ウブナおよびキンギョの３種類のゲノムを持つ完全異質３倍体で，家系１のF3のNo. ３と５は，コイとキンギョのゲノムを持つ雑種２倍体，家系２のF3のNo. ２
は，ゲンゴロウブナとキンギョのゲノムを持つ雑種２倍体であると推測された。
─ 36 ─

Figure 6. Schematic diagram of restriction
analysis o f DNA amplified by PCR o f
mitochondrial 16S rRNA gene digested with
Tsp E I.
Lanes 1, 2, C. carpio ; Lane 3, C. auratus ; Lane
4, C. auratus langsdorfii ; Lane 5, C. cuvieri ;Lane 6, C. auratus grandoculis; Lane 7, C.
auratus subsp. 1; M, 100-bp DNA size ladders.

パターンAであるコイを雌親としていた

ンギョ等のフナ属魚種は，移植先の在来（Figure 5，レーン１）。これに対し，ゲン

生物に悪影響を及ぼす問題が指摘されてゴロウブナとキンギョは約245bpの長さのい る が（Arthington 2006, Costedoat et

バンドを含むフナ属特異的なバンドパ

al. 2005, 2007, Crossman 1991, Hänfling

ターンBが見られた（Figure 5，レーン２，

et al. 2005, Holčík 1991），雑種が不妊で３）。コイを雌親に持つF1とこのF1を雌親あれば繁殖や交雑を通じた悪影響を軽減に持つ家系１と２のF2，さらにこれらのF2できる。このため，交雑後代の倍数性やを雌親に持つ家系１と２のF3は，バンド

ゲノム組成を推測することは重要となる。

パターンAであった（Figure 1, Figure 5,

今後もDNAの多型に基づくPCRを用いた

レーン４～14）。このため，ミトコンドリ

手法は，簡便なゲノム組成を推測できる

アDNAは母系遺伝するという理論通り，手法として利用できると考えられる。

これらの交雑後代はコイのミトコンドリア
謝辞

DNAを受け継いでいると考えられた。
魚類の交雑育種では，倍数性やゲノム

本研究の実施にあたり貴重な助言，便組成により，交雑後代の妊性等の生物学宜を図って頂いた国立研究開発法人水産的特性が大きく変わる（荒井ら 2017）。特研究・教育機構増養殖研究所育種研究セに異なるゲノムを有する雑種や３倍体がンターの方々に深謝する。本研究は国立

不妊であれば，高成長が期待されること

研究開発法人水産研究・教育機構の支援がある（荒井 1989, 荒井ら 2017, Suzukiを受けた。

and Fukuda 1971, 1973）。また，コイやキ

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【連絡著者】
正岡哲治
国立研究開発法人水産研究・教育機構水産技術研究所
養殖部門育種部育種基盤グループ〒519-0423

三重県度会郡玉城町昼田224-1

電話：0596-58-6411
FAX：0596-58-6413
E-mail：tmasa@fra.affrc.go.jp
Tetsuji Masaoka
Japan Fisheries Research and Education Agency, Fisheries Technology Institute,
Aquaculture Research Department, Aquatic Breeding Division224-1 Hiruta, Tamaki, Mie 519-0423, JAPAN
Phone：+81（0）596-58-6411, FAX：+81（0）596-58-6413
E-mail：tmasa@fra.affrc.go.jp【Running title】
Estimation of composition of genome in hybrid F3【Abbreviations】
水産機構水技研

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