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原著

Norovirus の代替指標として Feline Calicivirus を用いた
手洗いによるウイルス除去効果の検討
1）

東京都健康安全研究センター微生物部，2）麻布大学獣医学部

森大江功次１）香子２）林酒井志直１）
沙知２）

野口やよい１）
原元宣２）

甲斐諸角明美１）
聖１）（平成 18 年 2 月 24 日受付）
（平成 18 年 4 月 26 日受理）

Key words : Norovirus（NV）, viral gastroenteritis, feline calici virus（FCV）, glove juice test, washing hand
要旨

ノロウイルス（NV）による集団胃腸炎は事例数，患者数ともに毎年上位をしめ，その予防対策の構築が求められている．しかし NV は現在培養系が確立されていないため，その不活化の条件などに不明な点も多い．そこでノロウイルスと同じカリシウイルス科に属するネコカリシウイルス（FCV）が培養可能であることに着目し，手洗いによるウイルス除去効果についてウイルス感染価と遺伝子量を指標にアルコール，クルルヘキシジン，第四級アンモニウム塩，成分としてヨード化合物，トリクロサン，フェノール誘導体を含むハンドソープを用いて検討を行った．その結果，流水によるすすぎのみでもウイルス量が 100 分の 1 程度に減少することが明らかとなった．手洗い時にハンドソープを使用することにより，さらにウイルス量の減少傾向が強まったことから，手洗いはウイルス性胃腸炎の発生予防および拡大防止に非常に有効な手段であることが示唆された．
〔感染症誌

序80：496〜500，2006〕

な背景から，有効な手洗いによるウイルスの除去は，

文

ノロウイルス（Norovirus：NV）による食中毒や感他の食中毒起因細菌の場合と同様に，食中毒の発生予染症は毎年冬季を中心に多発し，NV による食中毒は防や，施設内の胃腸炎流行の拡大防止のために重要で

１）

病因物質別事件数としても毎年上位を占める ことかあると考えられる．

らも，その予防対策の構築が求められている．従来，

しかし NV は現在のところ，人工的な培養ができな

ウイルス性胃腸炎は冬季のカキなど二枚貝の生食に起いため，その不活化の条件などを実験室で確認するこ因するものが主と考えられてきたが，最近では貝類にとができず，有効な予防対策を講じるための科学的根よると推定される事例は集団例の 1!
3 以下である．貝拠が乏しい．そこでノロウイルスと同じカリシウイル類の喫食以外に感染経路が推定された事例としては，

ス科に属するネコカリシウイルス（Feline Calici Vi-

ウイルスを保有する調理者により調理過程でウイルス

rus：FCV）がネコ腎臓由来の培養細胞である CRFKに汚染された食品を喫食したと推定される事例，幼稚細胞中で増殖可能であることに着目し，本ウイルスを園や病院，高齢者施設などの施設内でみられる，食品NV の代替指標として用い，手洗いによるウイルス除を介さないヒトからヒトへの伝播によると推定される去効果の検討を行った．

事例などが多く認められている２）．また，施設内感染材料および方法

事例においては汚物の処理にあたった施設職員がウイ

1．供試ウイルス株ルスに感染して発症する場合があるほか，非発症の職

FCV のワクチン株である F9 株を用いた．CRFK３）

員からウイルスが検出される場合もある ．このよう別刷請求先：（〒169―0073）東京都新宿区百人町 3―24―1
東京都健康安全研究センター微生物部ウイルス研究科
森功次

細胞に F9 株を感染させて培養し，得られたウイルス液を分注し，―80℃ に凍結して各検討時まで保存した．
2．使用薬剤
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手洗いによるウイルス除去効果

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Ta
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ionAlcohol70%ethyla
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Chlor
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dine0.
1% gulconatechlor
hexi
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50mL

Quater
nar
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ndsoapA

0.
1% benzalko
ni
um chloride
75mg/mlpo
vi
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50mL
1mL

Ha
ndsoapBHa
ndsoapC

TriclosanI
sopropylmethylphe
nol1mL
1mLs
pray3timesTa
ble2 Sequencesofprimersa
ndprobeforrealti
mePCRtodetectFCV F9strain
Primer（Position）
F93F：5’Tgc
ggTCgATTATTCCAAAt
g3（4’4624482）
F93R：5’CgATCggAAAAgTAACgAAggA3（4’5484527）
Probe（Position）
F93：5’FAMTTCgACCCAATCgCCTCgTgTCagTAMRA3’（44864509）

手指衛生のための CDC ガイドライン４）に準じ，薬ウイルス液を摺りこんだ後「手洗いなし」および「流剤を選択した．すなわち，アルコール（70％ Ethyl Al-水によるすすぎのみ」についても同様の処理を行っcohol），消毒薬であるクロルヘキシジン（0.1％ Gulco-た．なおこれらの操作は各薬剤につき 4 回実施した．

natechlorhexidine），第四級アンモニウム塩（0.1％

手洗い後の MEM 培地回収液をフィルター（口径：Benzalkonium chloride），および成分としてそれぞれ0.22µm）でろ過したものを試料として，ウイルス感ヨード化合物（75mg!
mL

染価およびウイルス遺伝子量を測定することにより，Povidone-iodine），トリクロサン（Triclosan），フェノール誘導体（Isopropyl-手洗い効果を調べた．

methyl phenol）を含む手指洗浄用石けんをハンドソー

5．ウイルス感染価の測定

プ A，B，C として供試した（Table 1）．

試料を MEM 培地で 10 倍段階希釈列液を作製し，3．手洗い方法

96 穴プレートに単層培養した CRFK 細胞に接種しFCV のウイルス液 1.5mL を両手指に 20 秒間摺り100た．これを 5％CO2 存在下 37℃ で培養し，TCID50!

こんだ後，それぞれの薬剤によるもみ洗いを 10 秒，µL（Tissue Culture Infectious Dose 50％，組織培養流水によるすすぎを 15 秒行った．薬剤の量はポンプ

細胞における 50％ 感染量）を測定することによりウタイプの手指洗浄用石けん（ハンドソープ A，B，C）イルス感染価を求めた．

は一押し（1mL），希釈が必要なもの（クロルヘキシ6．FCV 遺伝子量の測定

ジンおよび第四級アンモニウム塩）については，添付

手洗い後のウイルス回収液 100µL から ProteinaseK

書に従い手指消毒用の濃度に調製し，両手指に十分行（WAKO）および CTAB（Cetyl Trymethyl Ammo-き渡るよう 50mL を使用した．またアルコールは 3 回

nium Bromid，ナカライテスク）を用いて RNA を抽噴霧し，10 秒間両手に摺りこんだ後，他の薬剤同様出７）した．次に，ウイルス性胃腸炎診断マニュアル８）にに流水によるすすぎを 15 秒間行った．すすぎ後は手したがって逆転写反応を行い，cDNA を作製した．に残った水をペーパータオルでふき取った．用いた薬FCV 遺伝子量の測定は Realtime剤の有効成分とそれぞれの使用量は Table 1に示したRealtime

とおりである．ては，プライマー設計ソフト Primaer Express（ABI）

PCR 法によった．

PCR 用のプライマーおよびプローブとし

4．手洗い効果の測定により FCV F9 株のポリメラーゼ領域に F9-3F!
F9-

米国 FDA が推奨する Glove Juice 法５）に基づいた森

3R のプライマーペアと TaqMan プローブとして F9-3

田らの変法６）により手洗い効果測定用試料を得た．

を設計し，依頼合成（ABI）した．それらプライマー

すなわち，MEM 培地を 20mL 入れたラテックスグおよびプローブの配列を Table 2に示した．また，定ラブに手洗い後の片手を挿入し，指頭 2 秒，指間 2 秒

量用のコントロールには，RNA 抽出時および逆転写（親指と人差し指間は 4 秒）を各 2 回，手のひら 10反応時のロスを考慮し，あらかじめ感染価の明らかな秒，手の甲 10 秒を各 1 回のもみ洗いをした後，グラ100µL のF9 株のウイルス液について 109〜100TCID50!

ブ内の MEM 培地を回収した．また，対照として FCV10 本の 10 倍段階希釈列を作製し，用いた．各希釈列

平成18年 9 月20日

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森

功次 他

Fig.1 Effectofhandwashingo
nFCV infectiousabilityinCRFK cells

Fig.
3 Comparisonofhandwashingmethods（handsoapB）

LL：rinsed under running water：washing for 10 sec with rinsing*：washing for 30 sec with rinsing*△：washing for 60 sec with rinsing*▲：washing for 10 sec 2 times with rinsing
after each time** ：rinsed under running water*：And rinsed under running waterFig.
2 Effectofha
ndwashingont
henumberofFCV genomecopies

手指を各薬剤で洗浄後，流水によりすすぎ，残り水をペーパータオルでふき取った後に MEM 培地によりウイルスを回収した場合には，いずれの薬剤を使用しても回収液に細胞毒性は認められないことを確認した．
2．ウイルス感染価からみた洗浄効果
手洗い後の手指に残るウイルスの感染価の減少，す：* And rinsed under running water

100µL を Fig. 1に示した．
なわち，回収液の TCID50!
手洗いなしの場合を基準に，流水すすぎのみの手洗いにより，約 1!
100，すなわち 0.64±0.5％ の感染価にのそれぞれ 100µL から試料と同様の方法により RNA減少した．

抽出および逆転写反応を行い，試料と同時に realtime

次に，手洗いに各薬剤を用いた場合，回収液のウイPCR 法で測定し，測定値から検量線を作成した．試

ルス感染価を流水すすぎのみの場合の値を基準に比較

料中の FCV 遺伝子量は得られた検量線から定量しすると，ハンドソープ A で 8.8±2.3％，ハンドソープた．この定量用コントロール 10 ポイントによる検量

B で 14.6±10.9％，ハ ン ド ソ ー プ C で 11.8±5.5％ に線の相関係数は 0.95〜0.96 であった．

それぞれ減少した．しかし，アルコール噴霧して流水

7．手洗い時間の検討によるすすぎ，あるいはクロルヘキシジンや第四級アハンドソープ B を用い，手洗い時間を 30 秒，60 秒，ンモニウム塩による手洗いでは，流水すすぎのみの場にそれぞれ 15 秒間流水すすぎを行うものおよび 10 秒

合と比較してウイルス感染価の減少傾向はみられなのもみ洗いと 15 秒の流れすすぎの組み合わせを 2 回かった．

くり返すものの 3 種とし，それぞれ 2 回ずつ実施し，3．ウイルス遺伝子量からみた洗浄効果

洗浄後の手指よりウイルスを回収した．回収したウイ

手洗い後の手指に残るウイルス遺伝子量を Fig. 2にルス液は前述と同様の方法により回収し，感染価およ示した．感染価同様に手洗い後の回収液の FCV 遺伝

び遺伝子量の測定を行った．

子量は，流水すすぎのみ手洗いにより，手洗いなしの成績

1．使用薬剤のウイルス感染価測定への影響の確認

場合に比較して，約 1!
100，すなわち 1.1±0.6％ に減少がみられた．

今回の検討に使用した薬剤は，いずれも直接 CRFK

各種薬剤について，FCV 遺伝子量を流水すすぎの細胞に作用させた場合，細胞毒性がみられた．
しかし，

み の 場 合 と 比 較 す る と，ハ ン ド ソ ー プ B で 1.7±
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手洗いによるウイルス除去効果

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1.6％，ハンドソープ C で 10.3±9.3％ にそれぞれ減少を繰り返した場合に，ウイルスの減少傾向がみられした．しかし，ハンドソープ A，クロルヘキシジン，た．このことから，より丁寧でより頻回の手洗いによ第四級アンモニウム塩およびアルコールを用いた場合りウイルス除去効果が高まることが示唆された．

ではウイルス遺伝子量の減少傾向はみられなかった．

従来からいわれている食中毒の予防対策のための三4．手洗い方法による除去効果の検討

つの要素として，病原体を「付けない」「，増やさない」，手洗いの時間および回数について検討した結果，も「殺す」という基本がある．しかし，ウイルス性胃腸

み洗い時間を 10 秒から 30 秒に増やした場合では明確炎では「増やさない」は当てはまらないため，「付けな減少傾向がみられなかった．一方，もみ洗い時間をない（除去）」，「殺す（不活化）」という二つの要素が60 秒にした場合は 10 秒の場合の 14.7％±6.86％，お重要となる．食品に付着したウイルスであれば加熱に

よ び も み 洗 い 10 秒 を 2 回 に し た 場 合 に は 1.23±よる不活化が有効１１）であり，施設環境であれば次亜塩0.17％ にそれぞれ遺伝子量が減少した（Fig. 3）．

素酸等の薬剤や紫外線などによるウイルスを不活化す

考る方法１２）１３）がある．しかし次亜塩素酸は，その皮膚へ察

手洗いの効果を人工的に培養できない NV の代替指の刺激等から手指の洗浄に用いるのは適当ではない．

標ウイルスとして FCV を用いて検討した．評価方法

今回の検討により，手洗いには物理的なウイルス除去としては，手洗いの効果を，①組織培養によるウイル効果が確実にあることが確認できた．流水によるすす

ス感染価の測定による不活化効果と，② realtime PCR

ぎのみでも 100 分の 1 程度にウイルスの量が減少する

法によるウイルス遺伝子量の定量による除去効果の二ことに加え，手洗い時に洗浄作用や不活化作用を持つつの指標を用いて比較検討した．

ハンドソープを利用することで一層の効果が期待でき

流水によるすすぎのみの手洗いによるウイルスの除る．さらに，もみ洗いの時間を長く，あるいはもみ洗去効果を，手洗いなしの場合と比較すると，ウイルスいの回数を増やすことによりウイルス除去効果が高ま

感染価，ウイルス遺伝子量ともに 100 分の 1 程度に減る結果が得られた．

少していることから，手洗いの物理的な効果により手今後，これらのデータを，すでに報告されている細指に付着したウイルス量が 100 分の 1 程度に減少する菌に関しての検討成績とあわせて，調理従事者，保育ものと推定された．

園等の集団生活に関係する職員，病院などの施設で介クロルヘキシジン，第四級アンモニウム塩およびア護等にあたる職員等に情報提供し，啓蒙活動を展開しルコールには流水すすぎのみの場合と同程度のウイルていくことが，ウイルス性に限らず，有効な集団胃腸ス除去効果，不活化効果を示したに過ぎなかった．ク

炎の予防や拡大防止に重要である．

ロルヘキシジンに関しては，エンテロウイルス等のエンベロープのないウイルスについては不活化効果がな
９）いことが報告されている ．そのことも同様にエンベロープを持たない FCV に対して不活化効果がみられなかった一因と考えられた．
ウイルス感染価の減少効果のみられたハンドソープ
A，B，C はいずれも界面活性剤を含む市販の製品であった．このことから，薬剤に含まれる成分に加えて，手洗いの際に洗浄効果のあるものが，よりウイルス除去効果が大きいと考えられた．
ヨード化合物を成分として含むハ ン ド ソ ー プ A
は，流水すすぎのみの場合と比較して，ウイルス感染価の減少傾向はみられたが，ウイルス遺伝子量には減少傾向がみられなかった．これは今回の検討に用いたハンドソープに含まれるヨード化合物（ポビドンヨード）に本ウイルスの不活化作用があるため１０）と推定された．
さらに，効果的な手洗い方法を検索する目的で，感染価および遺伝子量で減少効果のみられたハンドソー
プ B を用いて，手洗いの時間および回数を検討した
ところ，手洗い時間をある程度長く，あるいは手洗い
平成18年 9 月20日

文献1）厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課：

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森功次 他

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type 40 and feline calicivirus. Appl Environ Microbiol 2003；69（7）：3979―85.

Effects of Handwashing on Feline Calicivirus Removal as Norovirus surrogate
Kohji MORI１）, Yukinao HAYASHI１）, Yayoi NOGUCHI１）, Akemi KAI１）, Kyoko OHE２）,
Sachi SAKAI２）, Motonobu HARA２） & Satoshi MOROZUMI１）
1)

Department of Microbiology, Tokyo Metropolitan Institute of Public Health,2)
School of Veterinary Medicine, Azabu University

Viral gastroenteritis caused by Norovirus (NV) mainly appears during the winter season. In fact, outbreaks and patients with NV gastroenteritis are the major cause of community disease in the winter. Strategies to avoid gastroenteritis caused by NV are thus needed. No effective method for evaluating virus inactivation and removal exists for of NV, which cannot be cultured using cell-lines. Trials using Feline Calici Virus(FCV；a member of the calicivirus family) as a NV surrogate have been conducted by culturing FCV in
CRFK cells.
By washing oneʼs hands, about 99％ of the viruses can be removed, compared with simply rinsing
oneʼs hands in running water. Washing oneʼs hands with alcohol, chlorhexidine, quaternary ammonium, or 3
other kinds of hand soaps (containing povidone-iodine, triclosan, and isopropylmethyl phenol, respectively),
was also effective for removing viruses. These results suggest that washing oneʼs hands may be an effectivemethod of preventing viral gastroenteritis.

感染症学雑誌 第80巻 第 5 号