平成26年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 33

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査。

⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成。

⑶

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報。
（事業実績）
回
第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33

年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26

© The Ito Foundation

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,800ご挨拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で34年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第33回（平成26年度）助成事業における58件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
平成27年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.33 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2015
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

目

次

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究


増

田

俊

哉（徳島大学大学院ソシオ・アーツ・アンド・サイエンス研究部）

1

豚血液由来食品素材の給与が脂質代謝に及ぼす影響

上曽山博（神戸大学大学院農学研究科）

9

田敏（県立広島大学生命環境学部）

14

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究津治

食肉の給与が海馬のタンパク質リン酸化および遺伝子発現に及ぼす影響


豊田

淳・下西

ひかり・後藤達彦（茨城大学農学部）

19

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究
市村

さやか・中村



幸信・吉田

由香・服部

昭仁

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

23

調理加工食肉・肉製品の機能性成分およびその発現に関する研究
六車

三治男・木本早紀・川北

久美子・竹之山愼一（南九州大学健康栄養学部）

30

整輝（一般社団法人家畜改良事業団家畜改良技術研究所）

39

牛肉の匂いに及ぼす熟成と加熱調理の影響

小林

正人・佐々木

短波帯交流電界による真空包装食肉加工品の迅速殺菌


植

村

邦

彦（農業・食品産業技術総合研究機構食品総合研究所）

46

可視・近赤外分光可視化法による生肉の微生物汚染状況の非破壊評価


牧野義雄・モハメド

カムルザマン（東京大学大学院農学生命科学研究科）

51

牛肉に関する消費者ニーズの研究―内因性価値と外因性価値の特定
広岡


博之・長命

洋佑＊

＊

（京都大学大学院農学研究科， 九州大学大学院農学研究科）

56

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関する研究


都甲

潔・田原

祐助（九州大学システム情報科学研究院）

63

レトルト加熱処理を施した筋原線維タンパク質の培養骨芽細胞の分化に及ぼす影響
林


利哉・深見

渉・小川
＊

幸彦＊・芳賀聖一（名城大学農学部， 名城大学農学部附属農場）© The Ito Foundation68

ii
メタボロミクス解析による黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の探索
啓一１・飯田鈴木


文子２・小松智彦３・庄司則章３・加藤和雄１（１東北大学大学院農学研究科，２日本女子大学，３山形県総合農業センター）

73

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定早川徹（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

79

畜産物由来ヘム鉄摂取が発育期スポーツ選手に及ぼす影響～食事摂取状況と体組成・気分の変化から～


坂元

美子・吉川

豊（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

84

冠動脈疾患患者における食肉類の摂取と血中アミノ酸・脂肪酸組成，
動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子との関連に関する研究木庭

新治１・横田裕哉１・小林洋一１・高尾哲也２

中嶋克行３・高田明和４（１昭和大学医学部，２昭和女子大学，３群馬大学，４浜松医科大学）

90

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす分子機能解明


岡

本

芳

晴（鳥取大学農学部）

97

愛（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

101

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明


西村

敏英・江草

新規機能性脂肪酸，フィタン酸の定量分析法の確立


河原

聡・仲西

友紀（宮崎大学農学部）

109

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第４報）
山之上

稔・西田

昌弘・趙

婭楠・上田

修司

井原

一高・豊田

淨彦



（神戸大学大学院農学研究科）

116

金属表面洗浄時における食肉由来汚れの脱離特性に及ぼす外部電位印加の効果


今村

維克・石田

尚之（岡山大学大学院自然科学研究科）

121

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立


福

田

智

一（東北大学農学研究科）

127

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発


久米

新一・王

蒙東・谷口

紗耶（京都大学大学院農学研究科）

134

スカトールによる胆汁酸代謝の撹乱：ヒト・家畜の健康維持を目指したその制御


石塚

敏・清水

英寿（北海道大学大学院農学研究院）

139

春（地方独立行政法人北海道立総合研究機構農業研究本部畜産試験場）

143

肉牛用発酵 TMR の飼料特性の評価
 齋

藤

早

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発


木

下

英

樹（宮城大学食産業学部フードビジネス学科）© The Ito Foundation

149

iii
食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のための基礎研究


友

永

省

三（京都大学大学院農学研究科）

156

初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及ぼす影響


髙

橋

秀

之（九州大学農学部附属農場）160

黒毛和種子牛に対する血清亜鉛濃度の基準値の設定および亜鉛添加による臨床的な疾病予防効果の検討
乙丸

孝之介・窪田

力・時森

麻紀子＊

＊



（鹿児島大学共同獣医学部， 北薩農業共済組合）

164

和牛肉に含まれる機能性成分を左右する要因の検索


平

山

琢

二（琉球大学農学部）

168

黒毛和種ゲノム DNA メチル化多型と肉質形質との関係に関する研究


須

田

義

人（宮城大学食産業学部）

173

堅

博

久（宮崎大学農学部獣医学科）

179

牛白血病ウイルスの垂直伝播に関する研究

目

人の食品由来回虫症の感染源対策：牛と家禽の疫学的役割と制御法の探索
野中

成晃・丸山

治彦＊・吉田彩子＊・桐野有美

堀井

洋一郎・三澤

尚明・上村

涼子



＊

（宮崎大学農学部， 宮崎大学医学部）

184

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用


帆保

誠二・野口

倫子（鹿児島大学共同獣医学部）

189

食肉として消費される野生動物における食中毒菌の保有調査


安藤

匡子・中馬

猛久（鹿児島大学共同獣医学部）

194

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量佐々木

瑞穂＊・北原羊介・上松

豪＊＊・大澤健司＊＊（宮崎大学テニュアトラック推進機構，＊NOSAIみやざき，＊＊宮崎大学農学部）

199

I 型インターフェロン応答性カタボリック活性の検出による牛妊娠検出技術の開発


高

橋

昌

志（北海道大学大学院農学研究院）

204

黒毛和種の脂肪交雑形成に影響するビタミン A を輸送する RBP4 の DNA 多型探索


平野

貴・原

ひろみ・半澤惠（東京農業大学農学部）

210

黒毛和種の雌牛における空胎期間を短縮させる遺伝的要因の解明
佐々木慎二（独立行政法人家畜改良センター）

216

牛胚盤胞期胚における耐暑性付与に関する研究
阪谷



美樹・森

美幸＊

（（独）農研機構九州沖縄農業研究センター畜産草地研究領域，＊

福岡県農林業総合試験場生産環境部）© The Ito Foundation

219

iv
ラテックス凝集反応による抗豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗体検出系の開発
堀江


晃聖＊

真行・上野

（鹿児島大学共同獣医学部附属越境性動物疾病制御研究センター，

＊

鹿児島大学共同獣医学部動物衛生学分野）

226

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発


高

島

誠

司（信州大学繊維学部）

231

肥育前雌子牛の摘出卵巣からの胚生産の試み
的場


理子・平尾

雄二・武田

久美子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所）

236

生体内卵子吸引・体外受精・胚移植による子豚生産技術の開発
吉岡

耕治・的場

理子＊

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究所，＊畜産草地研究所）

242

血清中アミロイド A およびエンドトキシン活性値を指標とした牛複合性呼吸器疾患の早期予後診断システムの構築


鈴

木

一

由（酪農学園大学獣医学群獣医学類）

248

豚流行性下痢ウイルスのウイルス受容体の検索
白戸


憲也・松山

州徳・田口

文広＊

（国立感染症研究所ウイルス第３部第４室，＊日本獣医生命科学大学獣医学部獣医学科）

253

牛精子における暑熱ストレス耐性に関与する要因解析


山

中

賢

一（佐賀大学農学部）258

猛久（鹿児島大学共同獣医学部）

264

腸管内細菌による牛腸管外臓器汚染要因の解明
中

馬

腫瘍細胞のモノクローナリティー性状を応用した牛白血病新規診断法の開発
猪熊壽（帯広畜産大学畜産学部）

271

潔（岡山大学大学院環境生命科学研究科）

277

牛卵管機能に及ぼす夏季暑熱ストレスの影響～性ホルモン受容体とヒートショックタンパク質の関係性～


山本

ゆき・奥田

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究長岡利（岐阜大学応用生物科学部）

282

牛用腸溶性生菌剤カプセルが牛の腸内細菌相に与える影響
瀬山


智博・平康

博章・吉田

弦・笠井

浩司

（地方独立行政法人大阪府立環境農林水産総合研究所）

287

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用
神


谷

亘

（大阪大学微生物病研究所感染症国際研究センター臨床感染症学研究グループ）© The Ito Foundation

294

v
赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討


小針

大助・岡山

関口

敏・乗峰

毅（茨城大学農学部）

299

潤三（宮崎大学農学部）

304

豚流行性下痢の感染拡大リスクに関する研究

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定
山崎

瑞穂・戸水

一志・河野

幸雄・渡邊

敏夫＊・杉本喜憲＊＊（広島県立総合技術研究所畜産技術センター，＊独立行政法人家畜改良センター，



＊＊



公益社団法人畜産技術協会附属動物遺伝研究所）

308

食肉に寄生する人獣共通幼線虫の分子生物学的種同定法の開発


黄

鴻堅・平

健介（麻布大学獣医学部）

314

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発
ツェンコヴァ

ルミアナ・窪田
竹村



陽介・古川

豪・ジョージ茜

バザール（神戸大学大学院農学研究科生体計測工学研究室）© The Ito Foundation

319

vi

CONTENTS
Studies on fresh meat color preservation by use of the potent reducing activity of polyphenols
Toshiya Masuda（Institute of Socio-Arts and Sciences, University of Tokushima）

1

Effects of dietary porcine blood-derived food ingredient on lipid metabolism
Hiroshi Kamisoyama（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

9

Functional peptides derived from fermented meat products
Harutoshi Tsuda（Faculty of Life and Environmental Sciences, Prefectural University of Hiroshima）

14

Effects of meat supplementation on hippocampal protein phosphorylation and gene expression
Atsushi Toyoda, Hikari Shimonishi and Tatsuhiko Goto
（College of Agriculture, Ibaraki University）

19

Studies on the formation of specific meat taste in cured meat products
Sayaka Ichimura, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida and Akihito Hattori（Japan Meat Science and Technology Institute）

23

The investigation of functional properties and its expression in cooked and processed meats
Michio Muguruma, Saki Kimoto, Kumiko Kawakita and Shinichi Takenoyama（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University）

30

The effect of aging and heat-cooking on the profile of aroma volatiles of beef
Masato Kobayashi and Seiki Sasaki（Maebashi institute of animal science, Livestock improvement association of Japan, Inc）

39

Inactivation of microorganisms in packed meat products by radio frequency heating
Kunihiko Uemura（National Food Research Institute, NARO）

46

Non-destructive analysis of spatial contamination of raw meat by microorganisms using visualand near-infrared multispectral imaging
Yoshio Makino and Mohammed Kamruzzaman（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

© The Ito Foundation

51

vii
A study on consumers’ needs for beef - identifying intrinsic and extrinsic quality values
Hiroyuki Hirooka and Yosuke Chomei ＊（Graduate School of Agriculture, Kyoto University, ＊ Graduate School of Agriculture, Kyushu
University）

56

A study on quantification and visualization for taste of wagyu beef using a taste sensor
Kiyoshi Toko and Yusuke Tahara（Graduate School of Information Science and Electrical Engineering, Kyushu University）

63

Effect of retort processing on the osteoblast growth promoting activities of porcine myofibrillar
proteinToshiya Hayashi, Wataru Fukami, Yukihiko Ogawa ＊ and Seiichi Haga
（Faculty of Agriculture, Meijo University, ＊ Experimental Farm, Meijo University）

68

Search for index related to delicious of Japanese Black Cattle Beef Meat by metabolomic
analysis
Keiichi Suzuki １, Fumiko Iida ２, Tomohiko Komatsu ３, Noriaki Shoji ３ and Kazuo Katoh １（１Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, ２Japan Women’s University, ３LivestockExperiment Station of Yamagata Integrated Agricultural Research Center）

73

The identification of myosin rod region involved in the solubilization under the low ionicstrength condition
Toru Hayakawa（Department of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and Veterinary
Medicine）

79

Influence of heme-iron supplement derived from animal production absorption on the athlete of
growth phase
Yoshiko Sakamoto and Yutaka Yoshikawa（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women’s University）

84

Studies on relationship between meat intake level and the composition of blood amino acids,
fatty acids, atherogenic lipoproteins and/or thrombotic factors in patients with coronary
heart diseases
Shinji Koba １, Yuuya Yokota １, Youichi Kobayashi １, Tetsuya Takao ２, Katsuyuki Nakajima ３ andAkikazu Takada ４（１Showa University School of Medicine, ２Showa Women’s University, ３Gunma University, ４Hamamatsu
University School of Medicine）

90

Molecular function analysis of lipid metabolism induced by porcine liver powder
Yoshiharu Okamoto（Faculty of Agriculture, Tottori University）

© The Ito Foundation

97

viii
Studies on clarification of the compounds involved in “koku attributes” of pork sausages
Toshihide Nishimura and Ai Egusa（Department of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary andLife Science University）

101

Establishment of a method for quantitative analysis of a novel functional fatty acid, phytanicacid
Satoshi Kawahara and Tomonori Nakanishi（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

109

Intramuscular free fatty acids related to beef eating quality, PartⅣ
Minoru Yamanoue, Masahiro Nishida, Anan Cho, Syuji Ueda, Ikko Ihara and Kiyohiko Toyoda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

116

Investigation of the effects of applied surface electric potential on the removal behavior of meatborne soilings on metal surface during cleaning
Koreyoshi Imamura and Naoyuki Ishida（Graduate School of Natural Science and Technology, Okayama University）

121

Establishment of bovine and swine derived hepatocytes for the lipid metabolism and infection
study
Tomokazu Fukuda（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

127

Effects of functional components in grass on enhancing immunoglobulin in colostrum
Shinichi Kume, Mengdong Wang and Saya Taniguchi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

134

Dysregulation of bile acid metabolism by skatole : Control of the regulation towards healthpromotion in both humans and livestock
Satoshi Ishizuka and Hidehisa Shimizu（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

139

Estimation of feed characteristics of fermented total mixed ration for beef cattle
Waka Saito（Hokkaido Research Organization, Agriculture Research Department, Aminal Research Center）

143

Bactericidal effect of multi-drug resistance bacteria using lactic acid bacteria and developmentof functional domestic animal fodder
Hideki Kinoshita（Miyagi University, Department of Food Management, School of Food, Agricultural and Environmental
Sciences, Department of Food Management）

© The Ito Foundation

149

ix
Basic study for the establishment of the method to increase carnosine-related dipeptide levels inmeats
Shozo Tomonaga（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

156

Effect of myostatin control during early growth period on meat quality of Japanese Black cattle
Hideyuki Takahashi（Kuju Agricultural Research Center, Kyushu University）

160

Basal serum zinc value in Japanese Black calves and effect of supplemental zinc in JapaneseBlack calves against clinical diseases
Konosuke Otomaru, Chikara Kubota and Makiko Tokimori ＊（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, ＊ Hokusathu Agricultural Mutual Aid
Associations）

164

The factor of functional component on Wagyu meat
Takuji Hirayama（Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

168

The research for relationships among genome DNA methylation polymorphism and carcass
traits in Japanese beef cattle
Yoshihito Suda
（School of Food, Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

173

Studies on perinatal transmission of bovine leukemia virus
Hirohisa Mekata（Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

179

A countermeasure against the infectious source of human toxocariasis and ascriasis : An
epidemiological role of cattle and chickens and development of a control measure
Nariaki Nonaka, Haruhiko Maruyama ＊ , Ayako Yoshida ＊ , Yumi Kirino, Yoichiro Horii, Naoaki Misawa and Ryoko Uemura（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ＊ Faculty of Medicine, University of Miyazaki）

184

Application of bronchoalveolar lavage to specify offending bacterium of the pneumonia to cow
medical treatment
Seiji Hobo and Michiko Noguchi（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

189

Examination of food-borne bacteria in wild animals intended for consumption
Masako Andoh and Takehisa Chuma（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

© The Ito Foundation

194xStandard operation procedures for Japanese Black cattle related to reproductive performance
Yosuke Sasaki, Mizuho Uematsu ＊ , Go Kitahara ＊＊ and Takeshi Osawa ＊＊（Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki, ＊ NOSAI Miyazaki, ＊＊ Faculty ofAgriculture, University of Miyazaki）

199

Detection of type I interferon-mediated catabolic activity in blood and somatic cells for earlypregnancy diagnosis
Masashi Takahashi（Research Faculty of Agriculture, Department of Animal Science, Lab of Animal Breeding andReproduction）

204

Identification of polymorphisms on retinol binding protein 4（RBP4）gene in Japanese black
cattleTakashi Hirano, Hiromi Hara and Kei Hanzawa（Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture）

210

Genetic analysis for days open in Japanese Black cattle
Shinji Sasaki（National Livestock Breeding Center）

216

The study of thermotolenrace in bovine blastocysts
Miki Sakatani and Miyuki Mori ＊（Livestock and Grassland Research Division, Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, National Agriculture＊

and Food Research Organization（NARO）,  

Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center） 

219

Development of latex agglutination tests for detection of antibodies against porcine reproductive
and respiratory syndrome viruses
Masayuki Horie and Kosei Ueno ＊（Transboundary Animal Diseases Research Center, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima
University, ＊ Laboratory of Animal Hygiene, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima
University）

226

Development of porcine/bovine germline stem cell technology using novel growth factor
Seiji Takashima（Faculty of Textile Science and Technology, Shinshu University）

231

Production of embryos using growing oocytes derived from the ovaries removed bovine calvesbefore fattening
Satoko Matoba, Yuji Hirao and Kumiko Takeda（NARO Institute of Livestock and Grassland Science）

© The Ito Foundation

236

xi
Production of piglets by ovum pick up, in vitro embryo production and embryo transfer
Koji Yoshioka and Satoko Matoba ＊（National Institute of Animal Health, ＊ NARO institute of Institute of Livestock and Grassland Science,
National Agriculture and Food Research Organization）

242

Establishment of early prognostic systems for Bovine Respiratory Diseases Complex using
serum amyloid A and plasma endotoxin activity
Kazuyuki Suzuki（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

248

Studies on the cellular receptor for porcine epidemic diarrhea virus
Kazuya Shirato, Shutoku Matsuyama and Fumihiro Taguchi ＊（Laboratory of Acute Respiratory Viral Diseases and Cytokines, Department of Virology III, National
Institute of Infectious Diseases, ＊ Department of Veterinary Science, Faculty of Veterinary Medicine,
Nippon Veterinary and Life Science University）

253

Analysis of factors related to heat stress tolerance in bovine spermatozoa
Ken-ichi Yamanaka（Faculty of Agriculture, Saga University）

258Enterobacterial contamination of extraintestinal organs in cattle
Takehisa Chuma（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

264

Development of new diagnostic methods for bovine leucosis by using monoclonarity of tumor
cell
Hisashi Inokuma（Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine）

271

Effects of summer heat stress on the bovine oviductal functions~ Relationship between the receptors of sex steroid hormones and heat shock proteins ~Yuki Yamamoto and Kiyoshi Okuda（Graduate School of Environmental and Life Science, Okayama University）

277

Basic study of the development of an innovative hypocholesterolemic food materials using cattle
heart peptides
Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

282

Effect of administration of the enteric coated probiotic capsule on bacterial flora in cattle
intestine
Tomohiro Seyama, Hirofumi Hirayasu, Gen Yoshida and Koji Kasai（Local incorporated administrative agency Research Institute of Environment, Agriculture and Fisheries,
Osaka Prefecture）

287© The Ito Foundation

xii
Establishment of reverse genetics system for animal coronavirus
Wataru Kamitani（Laboratory of Clinical Research on Infectious Diseases, Research Center for Infectious Disease Control,
Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University）

294

Prediction technique of parturition by IR depth sensor in beef cattle
Daisuke Kohari and Tsuyoshi Okayama（Colloge of Agriculture, Ibaraki university）

299

Study on risk analysis of porcine epidemic diarrhea
Satoshi Sekiguchi and Junzo Norimine（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

304

Prediction of genomic breeding values for meat color defined by myoglobin content inlongissimus muscle of Japanese Black cattle
Mizuho Yamasaki，Kazushi Tomizu，Sachio Kouno，Toshio Watanabe ＊ and Yoshikazu
Sugimoto ＊＊（Hiroshima Prefectural Technology Research Institute，Livestock Research Center，＊ National Livestock
Breeding Center，＊＊ Shirakawa Institute of Animal Genetics）

308

Development of molecular biological method for species identification of zoonotic nematodelarvae found in meat
Hong-Kean Ooi and Kensuke Taira（Faculty of Veterinary Medicine, Azabu University）

314

Development of rapid and non-destructive diagnostic system for cowʼs estrus and pregnancy
Roumiana Tsenkova, Yosuke Kubota, Akane Furukawa, Go Takemura and George Bazar（Biomeasurement Laboratory, Kobe University Graduate School of Agricultural Science）

© The Ito Foundation

319

1

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究
Studies on fresh meat color preservation by use of the potent reducing
activity of polyphenols

増

田

俊

哉

（徳島大学大学院ソシオ・アーツ・アンド・サイエンス研究部）

Toshiya Masuda（Institute of Socio-Arts and Sciences, University of Tokushima）

The reduction of MetMb to MbO2 changes the color of meat from brown to the moredesirable bright red.
The effect of polyphenols from the plants known as herbs and spices on the reduction ofmetmyoglobin was investigated. Potent activity in the reduction of MetMb to oxymyoglobin
was observed for three flavonols, kaempferol, myricetin, and quercetin. A mechanism for the
reduction by one of the active flavonols, quercetin, was proposed based on analytical results forredox reaction products derived from quercetin. This suggested the importance of a highpropensity toward reduction of the flavonol structure, and rapid convertibility of a quinone
form to a phenol form by a water addition.
The effect of the polyphenols in the presence of cysteine, as a more potent nucleophile,
was also investigated. Although some polyphenols did not show any reducing activity frommetmyoglobin to oxymyoglobin individually, they show highly potent activity in the presenceof cysteine.

１．目

オキシミオグロビン（MbO２）によるが，この状的態はそれほど安定的ではなく，中心鉄がキレート

加工，保蔵中における食品の変色は，食品の市

酸素により３価に酸化され，褐色のメトミオグロ

場価値を下げるとともに，もしそれが食品成分のビン（MetMb）となる。一般に消費者には，新劣化反応を伴う時は，栄養価の低下のみならず，

鮮な食肉のイメージがあるMbO２の色が好まれ，安全性にも関わる重要な問題となる。ところで，食肉の加工，流通段階において，その鮮赤色を保食肉の色は，色素タンパク質ミオグロビンによ持する技術が使われているが，それぞれ一長一短る。ミオグロビンは，鉄イオンをキレートしたヘがあり現在でも様々な問題を抱えている１）。

ムタンパク質で，その色は，主に中心鉄イオンのところで，古くから食肉の加工に利用されてき酸化還元状態に依存するとされる。食肉の鮮赤色

た香辛料などにはポリフェノールが多く含まれては，酸素をキレートした２価の鉄イオンを有するいる。それらのポリフェノールのなかには，強い© The Ito Foundation

2

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

還元性と抗酸化機能が認められているものが存在ら求めた。各生成物のMSデータは，XEVOQ-

し，その機能によりミオグロビンのキレート鉄のTOFMSによって以下のように得た。さらに溶液

酸化状態をコントロールできることが期待できる。

５μｌを１および３時間後に採取し，分離条件：

本研究では，ミオグロビンとの還元的相互作用

カラム，コスモシール５Ｃ18-AR-II（4.6mm×が可能なポリフェノールを選抜し，そのポリフェ

250mm，５μｍ）；流量，0.5ml/min；溶媒Ａ，１％

ノールにより褐色のMetMbを鮮赤色のMbO２ に酢酸超純水，溶媒Ｂ，アセトニトリル（LC-MS

変化させることで，食肉の新鮮色を保持する新技グレード）。グラジエント条件は：５％―100％溶術の確立を目的としている。今年度は，ポリフェ媒Ｂ（80分）。MS条件は，モード，ネガティブ

ノールによるメトミオグロビンの還元オキシミオ

ESI；キャピラリー電圧，2.4kV；コーン電圧，

グロビン化を中心に検討を行った結果を報告する。

40Ｖ；イオン源温度，150℃；脱溶媒和温度，

２．方
2.1

500℃；コーンガス流量50ｌ／時間；脱溶媒ガス法

流量，1000l/h；MSE 低衝突エネルギー，６Ｖ；

MetMb-MbO２の遷移測定

MSE 高衝突エネルギー，20―30Ｖ；各ピークの化

96ウェルマイクロプレートに，50m mol/lのリ合物の元素組成は，MassLynxソフトウェアｖ4.1

ン 酸 緩 衝 液 （pH7.4 ， 140 μｌ）， 120 μmol/lを用いて脱プロトン化分子イオンの高分解能MS

MetMbまたはMbO２，同緩衝液（150μｌ），およ

データから算出した。

びサンプルDMSO溶液（10μｌ）を続いて添加した。マイクロプレートを，プレートリーダ中で

2 . 3 ケルセチンからの生成物Ⅰ，Ⅱ，Ⅱの調製と構造解析

37℃，３時間反応させ，１時間間隔で波長582とケ ル セ チ ン （50mg） の ア セ ト ニ ト リ ル

500nmの吸光度を測定した。また，反応の開始時（50ml）および水（50ml）の溶液に塩化鉄90mgと終了時に可視スペクトル（450－650nm）も得を 添 加 し ，１ 時 間 ，37 ℃ で 攪 拌 し た 。溶 液 はた。MbO２ の濃度は次の式で計算した。
：MbO ２

Chelex100のカラム（10ｇ）に通し，溶出液を真（μmol/l）＝（89.7×Ａ 582）－（32.9×Ａ 500）
。な

空で濃縮乾固した。得られた残留物を，以下の条

お，MetMbとMbO２ 間の酸化還元変換効率は，件下で分取HPLCにより精製した。
：カラムコス

各MbO２ とMetMbの初期濃度（60μmol/l）を得

モシル５Ｃ18-AR-II（20mm×250mm，５μｍ）；

られたMbO２濃度と比較し，％として表した。

流速9.0ml/min；溶媒，0.1％トリフルオロ酢酸水

2 . 2 MetMb還元反応中のケルセチン生成物の―アセトニトリル85：15（v/v）；保持時間18―24分の溶出液を回収濃縮後，生成物Ⅰ（40mg）をHPLCおよびLC-MS分析
サンプルとしてケルセチンを用いた上記反応液－得た。生成物Ⅰ：HR-ESIMS（m/z）［M－H］；

から，１時間間隔で，５μｌサンプリングし，以Calcd for C15H ９ O ８ , 317.0297 ，found ，317.0284；

下の条件で分析した。
：カラム，コスモシール５

UV λ max（ア セ ト ニ ト リ ル -H2O）325（sh）,

Ｃ18-AR-II（4.6mm×250mm，５μｍ）；流量，

292nm； 1H-NMR（acetone-d6）δ 7.64（1H, d, J

1.0ml/min；溶媒：Ａ，１％酢酸水，溶媒Ｂ，ア＝2.4Hz），7.57（1H, dd, J＝8.1 and 1.8Hz）, 6.92

セトニトリル；グラジエント条件：５％―100％溶（1H, d, J＝8.1Hz），6.13（1H, brd, J＝1.2Hz）6.12

媒Ｂ（40分）。検出：280nm。反応混合物中の各（1H, brd, J＝1.2Hz），6.13（2H，brs）。生成物Ⅱ生成物の濃度は各物質を用いて作成した検量線か（１mg）と生成物Ⅲ（３mg）は，アセトニトリ© The Ito Foundation

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究3

ル － 水 １ ： １ （v/v）100ml で ， ケ ル セ チ ン

なお，フラボノ－ルに属するケルセチン，ミリセ（55mg）をFeCl３（99mg）で２時間酸化した後，チン，ケンフェロールは，溶解性の問題から300

反応液をChelex100カラム（10ｇ）処理し，分取

μmol/lの測定結果であるため，褐変化を示した

HPLCにより二つのピーク（保持時間，14―16分

ミリセチンを除いては，アスコルビン酸に匹敵すと22―25分）から生成物ⅡとⅢを単離した。生成

る活性が期待できた。そこで，ケルセチンを用い物 Ⅱ （プ ロ ト カ テ ク 酸）： ESIMS （m/z）153て，さらにMetMbの還元オキシ化の機構の解明［M－H］－；UVλmax（アセトニトリル-H2O-酢酸）を進めた。

292，260nm： H-NMR（DMSO-d6）δ8.30（1H,1

3 . 2 MetMbの還元時のケルセチン生成物のbrs），7.31（1H, d, J ＝ 1.8Hz），7.26（1H, J ＝ 8.2

HPLC分析

and 1.8Hz），6.76（1H, J＝8.2Hz）。生成物Ⅲ（2,4,酸化還元の原理に基づくとケルセチンは6-trihydroxyphenylglyoxylic acid）：ESIMS（m/MetMbの還元反応中に酸化されていると考えらz）193 ［M－H］ （40 ％ ）， 195 （40 ％ ）， 177

れ る 。そ こ で ，反 応 中 の ケ ル セ チ ン の 変 化 を（50％），153（100％）；UVλmax（アセトニトリ

HPLCにより経時的に分析した。HPLCにより，

ル-H2O-酢酸）292nm； H-NMR（DMSO-d6）δ

ケルセチン（17.8分）に加えて３つの顕著なピー

5.62（2H, s）。

クが7.8分（生成物Ⅱ），8.3分（生成物Ⅲ）
，およ

－

1

び11.3分（生成物Ⅰ）の保持時間に観察された。

３．結果と考察

これらのピーク物質の経時的変化をFig.２にまと

3 . 1 ポリフェノールによるMetMbの還元オキ

めた。Fig.２より，MetMbの還元オキシ化反応の進行に従って，ケルセチンが減少し，まず生成物

シ化
アスコルビン酸は強力にMetMbを還元するこⅠが蓄積する。その後，生成物Ⅱと生成物Ⅲが蓄とが知られている 。しかし，インビトロでこの積していることが分かった。おそらく，生成物Ⅰ還元に必要な正確な濃度はまだ報告されていなはケルセチンから第一酸化物であること，またⅡい。そこで，pH7.4のリン酸緩衝液中MetMb（60とⅢは，Ⅰから二次酸化物であることが予想されμmol/l）へのアスコルビン酸濃度（60から2400た。ケルセチンによるMetMbの還元オキシ化は，μmol/l）の効果を調べた。その結果，600μmol/l

１時間までに完了し，その後，MbO２濃度は変化のアスコルビン酸が，37℃でMetMbを還元し，しないことを考え合わせると，生成物ⅡとⅢは３時間後に初期量の80％相当のMbO２を生成する

MbO２ レベルの維持に貢献するが，MetMbの還ことが分かった。この条件を用いて，20種のポリ

元にはケルセチンそのものが最も大きく関与してフェノールのMetMb還元能を測定した。Fig.１にいるであろうと考えられた。

２）

は，各ポリフェノールによるMetMbからのMbO２3.3の生成率を示した。多くのポリフェノールは，ア

生成物Ⅰ―Ⅲの化学構造を1H-NMR，UVおよびスコルビン酸と比べると弱い還元オキシ化能を示

MS分析により決定した。その結果，それらはケすに留まったが，ケルセチン，ミリセチン，ケン

ルセチンの酸化物および酸化的分解産物であるこ

フェロール，シナピン酸は顕著な還元MbO２生成とが明らかになり，Ⅱはプロトカテク酸，Ⅲは能を示し，カテキン，ノルジヒドログアイアレチ

2,4,6-trihydroxyphenylglyoxylic acidと判明した。

ン酸，タキシフォリン，モリンがこれに続いた。

なお，生成物Ⅰはケルセチンの酸化キノン由来の© The Ito Foundation

生成物Ⅰ，Ⅱ，およびⅢの同定

4

平成26年度Caﬀeic acid

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）(+)-Catechin

Dihydrocaﬀeic acid

Chlorogenic acidMbO2 (％)

50
25
0

0

1

2

3

0

Ferulic acid

1

2

3
0
Time (h)Gentisic acid

1

2

3

0

1

Hydroxytyrosol

2

3

2

3

Morin

MbO2 (％)

50
25
0

0

1

2

3

0

Nordihydroguaiaretic acid1

3 0
Time (h)2

Protocatechuic acid

1

2

3

0

Resveratrol

1

Rosmarinic acidMbO2 (％)

50
25
0

0

1

2

3

0

Sinapic acid1

03Time (h)2Syringic acid

1

2

3

0

1

2

3

Vanillic acid

Taxifolin

MbO2 (％)

50
25
0

0

1

2

3

0

Kaempferola

12Luteolina

30Time (h)

1

2

3

0

Myricetina

1

2

3

Quercetina

MbO2 (％)

50
25
0

0

1

2

3

0

1

2

0
3
Time (h)

1

2

3

0

1

2

3

Fig. 1 Effects of polyphenols（600 or 300μmol/l）on MetMb reduction.
 Results are expressed as mean ± standard deviation（SD）（n ＝ ６）． aActivity of kaempferol, luteolin, myricetin,and quercetin was measured at 300 μmol/l because of their solubility is below 600 μmol/l. bData on myricetin after
1 h are low of accuracy due to the dark brown color of the solution mixture.

© The Ito Foundation

5

Concentration(μmol L-1)

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究生成物で，互変異性体混合物として存在している300可能性が考えられた３）。

200

100

0

3 . 4 ミオグロビンの酸化還元状態に対するケ

:Ⅰ
:Ⅱ
:Ⅲ
:Quercetin

ルセチンおよびその酸化生成物の効果
ミオグロビンの酸化還元状態に対する各酸化生成物の影響を調べた。各化合物（60―300μmol/l）

0

1

2

Time(h)を共存させたMetMbおよびMbO２溶液中のMbO２

3

Fig. 2 Time-course analytical data for I-III in thereaction of quercetin and MetMb.

ネルＡとＡ’より，濃度にかかわらずケルセチン

MetMb

Quercetin

MbO2

100

100

Ａ
MbO2 (％)

80

MbO2 (％)

濃度の変化の結果をFig.３に示した。Fig.３のパ

60
40
20
0

0

1

2
Time
（h）

I

0

1

2
Time
（h）

40
20
2
Time
（h）

3

B’

40
20
0

MbO2 (％)

60

1

2
Time
（h）

0

1

2
Time
（h）

80
60
40
20
0

3

3

C’

100

80

0

1

60

3

C

100

0

80

MbO2 (％)

MbO2 (％)

20

II

MbO2 (％)

20

100

40

0

40
0

B

60

0

60

3

100
80

Ａ’

80

0

1

2
Time
（h）

3

III

80

MbO2 (％)

MbO2 (％)

100

D

100
60
40
20
0

60
40
20
0

0

1

2
Time
（h）

3

○：60 µmol L -1 ●：150 µmol L -1

D’

80

0

△：300 µmol L -1

1

2
Time
（h）

3

▲: without sample

Fig. 3 MetMb reduction and MbO2 oxidation of quercetin, I, Ⅱ, and Ⅲ.
 Panels A, B, C, and D refer to MetMb reduction. Panels A', B', C', and D' refer to MbO2 oxidation. Data areexpressed as mean ± standard deviation（SD）： note that most SD values are smaller than the symbols used in thegraph.

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6

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）
OH
HO

O

OH
OH

OH

Redox

O

MetMb
MbO2
O

OH
HO

O

HO

OH

O

OH

O

OH
HO

O

OH
O

HO

O
OH

OH

O

O

OH

OH

O

OH

OH
OH

Ⅰ

MbO2

OH

O

O

OH

MetMb
Redox

MetMb
MbO2

O
OH

HO

O

O

OH

O

HO

O

OH

OH

MbO2

OH

OH
OH

MetMb

O

O
Hydrolysis

O

HO

OH O

OH
O

O

OH2

OH
HO

OH
O

OH2

O

O
HO

O
OH O

O-H
O
OH

HO

HO
OH

O
OH O

O
O
OH

OH
OH

OH
O
OH
OH

Ⅱ

O
Ⅲ

Fig. 4 Proposed mechanism for MbO2 production from MetMb by quercetin..

はMetMbを還元し，MbO２ にすることができる

は，生成物ⅠのMetMbとMbO２ への効果を見たが，MbO２そのものに対しては酸化を引き起こす結果である。MetMbの還元オキシ化もMbO２ 酸

ことが示された。抗酸化性の強いポリフェノール化効果も，ケルセチンに比べて相当低くなり，一がMbO ２ を酸化させることは以前に報告してお方で濃度効果が見られるようになった。パネルC,り，ケルセチンにも同様なプロオキシダントが存

C’, D, D’は，生成物ⅡおよびⅢの効果を示してい

在することが示唆された。Fig.３のパネルＢとＢ’

るが，いずれもほとんど効果が認められなかった。

© The Ito Foundation

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究

以 上 の 解 析 結 果 か ら ，ケ ル セ チ ン に よ る
MetMbの還元オキシ化の化学的メカニズムをFig.

7

3 . 5 ポリフェノール酸化物のMbO２ へのプロ
オキシダント効果軽減の試み

４に提案した。まず，ケルセチンはMetMbを還食肉の鮮赤色化につながる，ポリフェノールに元オキシ化し，食肉鮮赤色色素であるMbO２を生よるMetMbの還元を経たMbO２ の生成は，ケル成させる。しかし，Ｂ環にキノンが形成した酸化

セチンのようなフラボノ－ルによってある程度達

ケルセチンは，MbO２酸化を促進する。ケルセチ

成される可能性が示された。しかしながらその効

ンのキノン物質は今までのところ単離されていな

率 は 高 い と は 言 え な い 。そ の 理 由 と し て ，いが，その水付加物は確認されており，これが今

MetMbの還元オキシ化の際に生じ，MbO２ の酸回の生成物Ⅰの互変異性体に当たる。すなわち，化を促進するケルセチン酸化物の不活性化が不十MetMbの還元オキシ化によって生じたケルセチ分であるためと考えられた。ケルセチンの場合，ン酸化物に迅速に水が付加し，酸化ケルセチンに酸化物の不活性化は水の付加による。そこで，水よるMbO２酸化効果（プロオキシダント効果）がより求核性の高い物質を共存させれば，不活性化軽減される。生成物Ⅰおよびその異性体は弱いな効果をより高められると予想した。そこで，水酸

がらMetMbを還元することができる。その際生基より求核性の高いチオール基を有する食品成分

じたさらなるケルセチンからの酸化物が加水分解としてシステインの共存を検討した。なお，シスされることにより，不活性な生成物ⅡとⅢに変換

テインは還元性を示すと言われているが，されたと考えられる。

MetMbに対する還元能はない。Fig.５にポリフェ
ノールと同量のシステインを加えた時のMetMb

100

MbO2 (%)

80

600µmol/L

300µmol/L+Cysteine(600µmol/L)+Cysteine(300µmol/L)

60

40

20

0

ys
+C
cid
ic a diinll
Va ic ac ys
Cinll
Va olin +xifsyTa lin+C
xifo cids
Ta ngicaCyri
cid id +
Sy
a
c
i
c
ca
rign
Sy arini cidasm
Ro arinic Cysl+sm
Ro ratro
sve rol
Re
s
t
y
a
r
C
s
+
y
sve
Re etin
+C
erc
cid
s
Qu etin uic aCy
id cid +churc
Qe ocate ic ac
a
u
t
tic
Pro atech aiare acid
ou
tic
toc
g
Pro iyhdr uaiaredg
Nro yhdro ysCdi
Nro etin +ric
My tin
s
rice
y
C
My
+
oin
Mr
s
Cy
rin
Mo olin +e
Lut inysC+leol
Lut npfero
s
e
Cy
ol
Ka
fer
l+
p
o
em tyrosKa
xy oolyssdro
Hy xytyr+C
dro acid
Hy
ic
id
ntis
Ge sic ac Cysd+nti
Ge ic aci
ys
+C
rul
d
d
i
i
c
c
Fe
ica
ca
ruli oaﬀe cacid sFecCy
ydr ﬀeiDih oca acid +yrdcDih oeinidorg nc ac
Clh
ei
s
o
Cy
lorg
Ch hin +tecys
Ca hin+C
tec cid
Ca c aﬀei
Cacidc a Cys)ﬀei
Ca teien( ys)sCy ien(CsteCy

Fig. 5 Effects of polyphenols（600 or 300μmol/l）on MetMb reduction in the presence of cysteine（600 or 300μmol/l）．
 The results are expressed as mean ± standard deviation（SD）（n ＝ ３）and ＊ shows significantly different data
against data from the corresponding experiment in the absence of cysteine（t-test, p＜0.05）．

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8

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

からのMbO２の生成率を示した。ケルセチンではシステインを共存させる方法を検討した５）。そのシステイン効果はあまり見られなかったが，その確立ならびに機構の詳細解明については，今後の他のポリフェノール，特に還元性が強いとされて研究課題となった。

いるにもかかわらず，MetMb還元オキシ化効果の見られなかったポリフェノールに顕著な活性が確認された。さらにそれらの効果は高く，十分に食肉を鮮赤化するに値するものと評価できる。今
後は，このシステイン共存による高鮮赤色化効果のメカニズム解明に取り組む予定である。
４．要

約

本研究によって，香辛料などに多く含まれるポ
リフェノールにより，食肉の新鮮さを示す鮮赤色
オキシミオグロビンを還元的に発生できることが分かった。なお，その発生能は，還元性の強いポ
リフェノールの中でもフラボノ－ルに属すケルセチンに顕著に見られた４）。そのメトミオグロビン
生成機構を考察した結果，さらなるオキシミオグ
ロビン化の手法として，求核性の高い生体成分・文
献１） Mancini, R. A., Hunt, M. C. : Current research inmeat color, Meat Sci.，71，100～121，2005．
２） Tukahara, K., Yamamoto, Y. : Kinetic studies on
the reduction of metmyoglobins by ascorbic acid, J.
Biochem., 93，15～22，1983．
３） Jørgensen, L. V., Cornett, C., Justesen, U.,
Skibsted, L. H., Dragsted, L. O. : Two-electron
electrochemical oxidation of quercetin andkaempferol changes only the flavonoid C-ring, Free.
Rad. Res.，29，339～35，1998．
４） Inai, M., Miura, Y., Honda, S., Masuda, A.,
Masuda, T. : Metmyoglobin reduction by
polyphenols and mechanism of the conversion ofmetmyoglobin to oxymyoglobin by quercetin, J.
Agric. Food Chem.，62，893～901，2014．
５） Miura, Y., Inai, M., Honda, S., Masuda, A.,
Masuda, T. : Reducing effects of polyphenols on
metmyoglobin and the in vitro regeneration ofbright meat color by polyphenols in the presence of
cycteine, J. Agric. Food. Chem.，62，9472～9478，
2014．

© The Ito Foundation

9

豚血液由来食品素材の給与が脂質代謝に及ぼす影響
Effects of dietary porcine blood-derived food ingredient on lipid
metabolism

上 曽 山

博

（神戸大学大学院農学研究科）

Hiroshi Kamisoyama（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

It is well known that edible meat products and by-products are notable sources of
essential nutrients such as protein, minerals, and vitamins. However, there is little attention to
the biological functions of these products. In Japan, blood is not usually used as a food material,
and therefore, has been wasted as a by-product. In the present study, we have investigatedthe effects of dietary heme iron and exercise on abdominal fat accumulation in high-fat dietfed mice. Dietary heme iron tended to decrease the weight of the epididymal adipose tissue inmice. In contrast, exercise significantly decreased the weight of the perirenal adipose tissue inmice. Dietary heme iron increased the mRNA levels of lipoprotein lipase, adipose triglyceridelipase, and hormone sensitive lipase in the epididymal adipose tissue. The mRNA level of PPARδ
tended to be increased by exercise. These results suggest that the heme iron and exercise
decreased abdominal fat accumulation by different mechanisms in the high-fat diet-fed mice.

１．目の「抗肥満」の重要性はさらに高まると判断され的る。

高齢化社会を迎えつつある我が国においては，

欧米では，家畜の畜産副生物を食品として活用

ごく近い将来，介護医療に要する費用の急激な増する文化が根付いている。例えば，血液はブラッ

加は避け得ないと言われているが，その介護医療

ドソーセージとして食される。我が国においてが必要となる疾患の主因とされている動脈硬化をも，畜産副生物のうち，消化管や肝臓等の可食臓引き起こすメタボリックシンドロームの原因とな器は食用として，その他の非可食臓器類についてる肥満の効果的な予防法は未だ見出されていなは飼料・肥料用として，それぞれ有効に利用されい。また，2011年のWHOの発表によれば，我がているが，保存や流通に費用が掛かる血液につい国における60歳以上の高齢者の割合は人口の30％ては，我が国においては食文化がないこともあ（世界最高）を占める。それ故，今後は，介護医

り，多額の費用を掛けて廃棄（あるいは，環境へ療に繋がるメタボリックシンドローム予防のため流出）されている。それ故，血液の有効利用法の© The Ito Foundation

10

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

10分，15m/minで10分，20m/minで10分，３お開発が極めて重要な課題となっている。
鉄分補給用の食品素材として用いられてきた豚

よび４日目は15m/minで10分，20m/minで10分，の血球画分を酵素分解して得られる水溶性ヘム鉄

25m/min で 10 分 ，５ 日 目 は 15m/min で ５ 分 ，の給与は，高脂肪食性肥満マウスにおける内臓脂20m/minで５分，25m/minで20分，それぞれ運肪組織重量を減少させる傾向を示す。本研究

動を負荷した。２週目以降は，週３日，25m/min

では，畜産副生物である血液の食品素材としてので１日30分間の運動を負荷し，４週間後，24時間

利用法拡大のための一環として，最も一般的な肥絶食し，体重を測定した後，麻酔下で腹部大静脈満抑制法である運動と，ヘム鉄との併用効果につより採血後，安楽死させ，肝臓，腓腹筋，精巣上いて明らかにする目的で，高脂肪食性肥満マウス

体周囲脂肪組織，および腎周囲脂肪組織の重量をにおける運動負荷と水溶性ヘム鉄給与が内臓脂肪それぞれ測定した。また，脂肪組織および腓腹筋

蓄積に及ぼす影響について調べた。

からセパゾ－ルRNA （I ナカライテスク株式会社）

２．方

１，２）

を用いて総RNAを抽出し，脂質代謝関連遺伝子法の発現を7300Real Time PCR System（アプライ

水溶性ヘム鉄を０あるいは３％含む高脂肪食飼

ドバイオシステムズジャパン株式会社）および料（Table１）を６週齢のICRマウス（日本エスエ

THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（東洋紡績株

ルシー株式会社）に，４週間給与した。その間，

式会社）を用いたリアルタイムPCRにより解析しトレッドミルを用いて，各試験飼料給与区の半数た 。リ ア ル タ イ ム PCR に 用 い た プ ラ イ マ ー はのマウスに，初日は５m/minで10分，10m/min

Table２に示した。統計解析は二元配置分散分析

で10分，15m/minで10分，２日目は10m/minでにより行った。

Table l Composition of experimental diets

Table 2 Primers used for quantitative RT-PCR（g/100g diet）
Control

Heme iron

Casein21

18

L-Cystein

0.39

0.39

Corn starch

20.94

20.94

Sucrose8.9

8.9

Soybean oil

22

Beef tallow

32.9

32.9

Cellulose

6.5

6.5

Mineral mixture１）

1.3

1.3

Vitamin mixture２）

1.7

1.7

CaHPO4・2H2O

0.71

0.71

CaCO3

2.1

2.1

Potasium citrate

1.3

1.3

Choline-tartrate

0.26

0.26

Heme iron

03

PPAR-δ

CPT-1b

UCP2

UCP3

LPL

ATGL

HSL

RPS17

１）AIN-93G Mineral mixture (Japan SLC, INC., Shizuoka, Japan）
２）AIN-93G Vitamin mixture (Japan SLC, INC., Shizuoka, Japan）© The Ito Foundation

Forward5ʼ-GCC ACA ACG CAC CCT TTG-3ʼ

Reverse5ʼ-CCT TCT CTG CCT GCC ACA GT-3ʼ

Forward5ʼ-GTG CAA GCA GCC CGT CTA G-3ʼ

Reverse5ʼ-TTG CGG CGA TAC ATG ATC AT-3ʼ

Forward5ʼ-TGA TGT GGT CAA GAC GAG ATACAT G-3ʼ

Reverse5ʼ-CAG TGA CCT GCG CTG TGG TA-3ʼ

Forward5ʼ-TTT TGC GGA CCT CCT CAC TT-3ʼ

Reverse5ʼ-TGG ATC TGC AGA CGC ACC TT-3ʼ

Forward5ʼ-GAT GGA CGG TAA CGC GAA TG-3ʼ

Reverse5ʼ-TAC AGG GCG GCC ACA AGT-3ʼ

Forward5ʼ-CCT CAG GAC AGC TCC ACC AA-3ʼ

Reverse5ʼ-TTG AAC TGG ATG CTG GTG TTG-3ʼ

Forward5ʼ-GGC GAA AAG GCA AGA TCA AA-3ʼ

Reverse5ʼ-CAT CGT GCG TAA ATC CAT GCT-3ʼ

Forward5ʼ-CCG GGT CAT CAT CGA GAA GT-3ʼ

Reverse5ʼ-GCG CTT GTT GGT GTG GAA GT-3ʼ

11

豚血液由来食品素材の給与が脂質代謝に及ぼす影響
240
Liver (g)

20

2

0

Control Exercise Heme Exercise
iron+ hemeiron

Exercise
Heme ironInteraction

2.5

1
0.5

10
0

Eqididymaladipose tissue (g)

1.5

30

P > 0.05
P = 0.064
P > 0.05

1.5
1
0.5
0
Control Exercise

Heme
iron

Exercise+ hemeiron

Perirenal adipose tissue weight (g)Body weight (g)

50

0.7
0.6

Control Exercise Heme Exercise
iron+ hemeiron

Exercise
Heme ironInteraction

P < 0.05
P > 0.05
P > 0.05

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

Control Exercise Heme Exercise
iron+ hemeiron

Gastrocnemius muscle (g)

0.2
0.15
0.1
0.05
0
Control Exercise Heme Exercise
iron+ hemeironFig. 1 Effect of heme iron on body weight and the weights of liver, adipose tissues, and gastrocnemius musde in high-fat diet-fed mice. Data represent the mean±SEM for seven mice in each group.

３．結

組織重量は運動により有意に減少した（Fig.1，P

果＜0.05）。腓腹筋のPPARδのmRNA量は，運動

水溶性ヘム鉄の給与はマウスの体重，褐色脂肪により増加する傾向を示した（Fig.2，P＝0.062）

組織重量および腓腹筋重量には影響を及ぼさなが，CPT1b，UCP２およびUCP３のmRNA量にかったが，精巣上体周囲脂肪組織重量を減少させは有意な変化は認められなかった（Fig.２）。精る傾向を示した（Fig.1，P＝0.064）。腎周囲脂肪

巣上体周囲脂肪組織のLPLおよびHSLのmRNA量© The Ito Foundation

12

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

LPL

PPARδ
Exercise
Heme ironInteraction30

P = 0.062
P > 0.05
P > 0.05

1500

Arbitrary unit

Arbitrary unit

25
20
15

Exercise
Heme ironInteraction

10

P > 0.05
P < 0.05
P > 0.05

1000

500

0
Control Exercise

5

Heme

Exerciseiron+ hemeiron

0Control

Exercise

Heme

Exerciseiron+ hemeATGL

iron

Exercise
Heme ironInteraction300

CPT-1bArbitrary unit

250

25

Arbitrary unit

20

P > 0.05
P = 0.084
P > 0.05

200
150
100
50

15

0
Control

10

Exercise

Heme

Exerciseiron+ heme
iron

5

HSL

0
Control

Exercise

Heme

Exerciseiron+ heme120

metabolism-related genes of the gastrocnemius
muscle in high-fat diet-fed mice. Data represent themean±SEM for seven mice in each group.

Arbitrary unit

ironFig. 2 Effect of heme iron on the mRNA levds of lipid

は，水溶性ヘム鉄給与により有意に増加し（Fig.3,

80

40

Control

与により増加する傾向を示した（Fig.3, P＝0.084）。
察

P > 0.05
P < 0.05
P > 0.05

0P＜0.05），ATGLのmRNA量も，水溶性ヘム鉄給４．考Exercise
Heme ironInteraction

Exercise

Heme

Exerciseiron+ hemeironFig. 3 Effect of heme iron on the mRNA levels of lipid

本実験において，水溶性ヘム鉄の給与はマウスの精巣上体周囲脂肪組織重量を減少させる傾向を

metabolism-related genes of the epididymal adipose
tissue in high-fat diet-fed mice. Data represent themean±SEM for seven mice in each group.

示した。一方，運動は，マウスの腎周囲脂肪組織© The Ito Foundation

豚血液由来食品素材の給与が脂質代謝に及ぼす影響

13

重量を有意に減少させた。これらのことから，水し，運動の負荷は，腎周囲脂肪組織重量を減少さ

溶性ヘム鉄と運動では，内臓脂肪蓄積を抑制するせた。また，運動は腓腹筋におけるPPARδの部位に相違があることが示された。

mRNA量を増加させる傾向を示し，水溶性ヘム

運 動 負 荷 区 に お い て ，腓 腹 筋 の PPAR δ の鉄の給与は，精巣上体周囲脂肪組織におけるトリmRNA量が増加する傾向を示した。PPARδは脂グリセリド代謝関連酵素群のmRNA量を増加さ肪酸酸化を促す転写因子として知られている 。

せる，あるいは増加させる傾向を示した。これら

今回，PPARδの標的遺伝子であり，ミトコンドの結果から，水溶性ヘム鉄と運動は，それぞれ異リアにおける脂肪酸酸化の律速酵素であるなる機構によって，内臓脂肪蓄積を抑制することCPT1bが示唆された。

３）

４）のmRNA量には有意な変化は認められなかったものの，そのmRNA量の変動は，PPAR
δのそれと類似したものであった（Fig.２）。こ
れらの知見と我々の結果から，運動は，腓腹筋における脂肪酸酸化を亢進させる可能性が示された。
水溶性ヘム鉄の給与により，精巣上体周囲脂肪組織における血中トリグリセリドの取り込みの律
速酵素であるLPL５），貯蔵トリグリセリド分解の律速酵素であるATGLおよびHSL５，６）のmRNA量が，有意に増加，あるいは増加する傾向を示した。
この原因については不明であるが，水溶性ヘム鉄
給与により，脂肪組織におけるトリグリセリドの代謝回転の増加あるいは脂肪細胞以外の細胞（例
えば，マクロファージ）の数の減少が原因である可能性も考えられる。今後，その詳細な機構について明らかにする必要があろう。
５．要

約

本研究では，畜産副生物の利用法開発のための一環として，運動負荷と水溶性ヘム鉄給与が高脂肪食給与マウスの内臓脂肪蓄積に及ぼす影響について調べた。水溶性ヘム鉄の給与は，マウスの精巣上体周囲脂肪組織重量を減少させる傾向を示

文献１） 上曽山博：抗肥満或いは美容効果を有する食品素材としての豚血液の有効利用法の開発，公共財団法人伊藤記念財団．食肉に関する助成研究調査成果報
告書，31，６～11，2013．
２） 上曽山博：豚血液由来抗肥満素材による内臓脂肪蓄積抑制機構の解明，公益財団法人伊藤記念財団．
食肉に関する助成研究調査成果報告書，32，６～
11，2014．
３） Houten. S. M., Wanders, R. J. A. : A general
introduction to the biochemistry of mitochondrial
fatty acid β-oxidation, J. Inherit Metab Dis., 33,
469～477，2010．
４） Jucker, B. M., Yang, D., Casey, W. M., Olzinski, A.
R., Williams, C., Lenhard, S. C, Legos, J. J., Hawk, C.
T., Sarkar, S. K., Newsholme S. J. : Selective
PPARdelta agonist treatment increases skeletal
muscle lipid metabolism without altering
mitochondrial energy coupling: an in vivo magnetic
resonance spectroscopy study, Am J Physiol
Endocrinol Metab., 293, E1256-Ｅ1264，2007．
５） Zechner, R., Zimmermann, R., Eichmann, T. O.,
Kohlwein, S. D., Haemmerle, G., Lass, A., Madeo, F. :FAT SIGNALS-lipases and lipolysis in lipid
metabolism and signaling, Cell Metab., 15， 279～
291，2012．
６） Schweiger, M., Schreiber, R., Haemmerle, G.,
Lass, A., Fledelius, C., Jacobsen, P., Tornqvist, H.,
Zechner, R., Zimmermann, R. : Adipose triglyceridelipase and hormone-sensitive lipase are the major
enzymes in adipose tissue triacylglycerol catabolism,
J Biol Chem., 281，40236～40241，2006．

© The Ito Foundation

14

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究
Functional peptides derived from fermented meat products

津

田

治

敏

（県立広島大学生命環境学部）

Harutoshi Tsuda（Faculty of Life and Environmental Sciences, Prefectural University of Hiroshima）

The purpose of this study was to investigate a functionality of fermented meat products.
Lactobacillus plantarum JAB2001 was used as a starter culture for the fermented meatproduct. The inhibitory activity of angiotensin I-converting enzyme was shown in the extractof the fermented meat. The fraction that inhibited ACE was purified with a reverse-phase
HPLC and a size-exclusion HPLC. Peptides and amino acids were not observed in the fraction
after SDS-PAGE and an amino acid sequence analyses. An unfermented meat patty showed no
ACE inhibitory activity. Consequently, the ACE inhibitory substance was suggested to be
produced via fermentation process with strain JAB2001, although the main part of thesubstance was still unknown. On the other hand, various spices including white pepper, which
was used in the production of the fermented meat, were applied to the ACE inhibitory activity
analysis. Extraction of cumin and clove with boiling water showed high ACE inhibitory
activity, while white pepper showed no activity. Thus, an application of cumin and clove would
contribute to a functional processed meat products with ACE inhibitory activity.

１．目

コールアミンの放出を促進するため血圧を上昇さ的せる。さらに副腎皮質ホルモンであるアルドステ

ア ン ギ オ テ ン シ ン 変 換 酵 素 （Angiotensin

ロンの分泌を促進するため，腎臓でNaの再吸収

Converting Enzyme, ACE）は生体の肺血管内皮促進，水の貯留および循環血流量の増大をもたら細胞から分泌され，末梢の血圧を調節するレニン

し，血圧を相乗的に上昇させる。また，ACEは－アンギオテンシン系に関与している。アミノ酸

降圧系であるカリクレイン・キニン系において，10残基のアンギオテンシンⅠ（DRVYIHPFHL）

血管拡張作用をもつ短鎖ペプチドである降圧物質には目立った生理活性はないが，ACEの作用に

ブラジキニンなどを破壊する作用もある。ACE

よってＣ末端のHis-Leuが遊離してアミノ酸８残は昇圧物質の生成のみならず，降圧物質の破壊を

基のアンギオテンシンⅡが生成する。このアンギ伴うことで昇圧への関与が大きい酵素である。そオテンシンⅡは直接作用として末梢毛細血管を収のため，ACEの活性を阻害すれば，昇圧作用を縮させるとともに交感神経や副腎を刺激し，カテもつアンジオテンシンⅡの生成が阻害されると同© The Ito Foundation

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究

15時に降圧作用をもつキニン類の破壊も防止され，質および16S rDNAの解析結果から菌種を同定し血圧上昇の抑制に効果的である。

たものである４）。また，いずれの菌株も食塩や硝これまでに400種類以上のACE阻害物質が食品

酸塩を添加した調製挽肉に接種した際，良好な生から分離されており，実際に機能性食品として利育性を示し，25℃で48時間発酵したときpHを4.8用 さ れ て い る も の も あ る 。た と え ば ，

以下にするものである５）。

１）

Lactobacillus helveticusをスターターとした発酵

2.2

乳から２種類のトリペプチドがACE阻害ペプチ

発 酵 食 肉 の 調 製 は 中 江 ら ６） を 参 考 に し た

ドとして分離されている２）。これまでに報告され（Table１）。牛すね肉，豚背脂肪およびタマネギているACE阻害物質の多くはペプチドであるが，は４㎜のミンチにして用いた。菌体懸濁液は，菌近年，フラバノールなどのポリフェノール類が株をMRS液体培地で継代培養したのち遠心分離

ACE阻害活性を示すことが報告されている３）。

（1,000×Ｇ，10分）して集菌・菌体洗浄を繰り返

食肉の発酵

本研究では，Lactobacillus plantarum JAB2001

したのち等量の水に懸濁したものを用いた。調製をスターターとした発酵食肉におけるACE阻害

食肉に菌体懸濁液を１％加え25℃，約80％RHで物質を探索した。食肉製品は加工・調理の過程で48時間培養したものを発酵食肉とした。

塩分が多くなるため，一般に高血圧症などの症状

2.3を引き起こす食事の一つと考えられがちだが，ターメリック，サフラン，コリアンダー，クミ

ACE阻害物質を著量に含む発酵食肉であればそン，シナモン，ホワイトペッパー，ナツメグおよ

うしたリスクを低減できる可能性がある。本研究びクローブの熱水抽出物をACE阻害活性試験にの目的は，鮒ずし由来の乳酸菌を用いた発酵食肉供した。香辛料0.5ｇを５mlの熱水に加え，よく製品から，ACE阻害物質を探索することである。

撹拌したのち遠心分離（1500×Ｇ，15分）し，上

２．方
2.1

使用香辛料

澄液を熱水抽出物とした。

法

2.4

ACE阻害活性の測定

前報と同じ。

使用菌株

試験にはLb. plantarum JAB2001を用いた。こ2.5

ACE阻害物質の粗精製の菌株は琵琶湖周辺の伝統的乳酸発酵食品「フナ前報と同じ。

ズシ」を分離源とするものであり，生理学的諸性

2 . 6 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

Table 1 C omponent of fermented meat

最終的に得られた画分をSDS-PAGE分析に供

Ratio（％）

した。プレキャストゲル（ｅ-パジェルE-T15S，72.3

ATTO）を用い，試料処理および泳動条件等はPorcine backfat

15

Common salt

2.0

説明書に準じた。バンドの染色にはクマシーブリ

Potassium nitrate

0.05

Glucose

0.5

White pepper

0.2

最終的に得られた画分を凍結乾燥し，粉末に純

Onion

9

水を加えた。約600pmol分をガラスファイバー

Cell suspension

1.0

ディスクに吸着させ分析に供した。分析機器にはComponent
Beef shank

リアントブルー（CBB）を用いた。
2.7© The Ito Foundation

アミノ酸配列の解析

16

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

プロテインシーケンサPPSQ-33Ａ（島津）を用い，エドマン分解法によるアミノ酸配列の解析を
行った。
３．結
3.1

Table 2 ACE inhibitory activities of an unfermented

meat patty and the fraction after reverse-phase
HPLC and size-exclusion HPLCACE Inhibitory activity（％）

果

Unfermented meat patty

ND＊

Fraction＊＊46.3（7.5）＊＊＊＊：Not Determined（less than５％ACE inhibitory activity）

発酵食肉のACE阻害活性

Lb. plantarum JAB2001 で 発 酵 し た 食 肉 製 品＊＊：Fraction including the peak（13.70min) in Figure１＊＊＊：Figures in parenthesis are standard deviation（n＝３）

100ｇを500mLの水に懸濁し70℃で30分間の加熱
処理後，遠心分離（10,000×Ｇ，20分）した。回収した上澄液のpHを8.3に調整したのち，1.5Ｌの
5

冷エタノールを徐々に加え生成した沈殿物を除去したものをエバポレーターで約300mLまで濃縮し10た。濃縮液を凍結乾燥し，得られた粉末を10mLの水に溶解したものを試料とした。この試料の15ACE阻害活性は29.7±11.2％であった。
3.2

13.70

ACE阻害物質の精製
20

上記の抽出試料をHPLCに供し，５分ごとに分画した。高いACE阻害活性が認められた画分を25

さらに同条件の逆相HPLCに供し，３つの画分を得た。得られた画分のうち，高いACE阻害活性30を示したものをサイズ排除カラムに供した。５分ごとに分画し，高いACE阻害活性を示した画分を再び同条件の逆相HPLCに供した。この時のACE阻害活性は46.3％であった（Table２）。また，

Fig. 1 A chromatogram of the ACE inhibitory fraction

obtained with size-exclusion HPLC.

ACE阻害物質の分子量はサイズ排除HPLCの結果
から，300-1,000と推測された（Fig.１）。

阻害物質はフラバノール等のポリフェノール類でこの画分をSDS-PAGEに供したところバンドある可能性が高いと考えた。ポリフェノール類をが確認できなかった。分子量が小さすぎる，ある

多く含む食品として香辛料があり，この実験においはCBB染色で染まりにくいペプチドであるこ

いても発酵食肉の調製においてホワイトペッパーとが考えられたため，さらにアミノ酸配列の解析を使用している。そこで，種々の香辛料を用いてを行った。解析の結果，アミノ酸のピークは出現ACE阻害活性を測定し，本実験で得られたACEしなかった。それゆえ，この画分にはアミノ酸が阻害物質がホワイトペッパー由来のものであるか

ほぼ含まれていないと考えられた。

確認した。

以上のことから，このACE阻害物質がペプチ
ド で あ る 可 能 性 は 低 い 。推 測 さ れ る 分 子 量 とACE阻害物質としての報告例

３）から，このACE

3.3

香辛料のACE阻害活性

香辛料の熱水抽出物のACE阻害活性をTable３に示した。クミンとクローブでは高いACE阻害© The Ito Foundation

発酵食肉製品由来の機能性ペプチドに関する研究

17

Table 3 ACE inhibitory activities of spices extracts

多い香辛料である。この二つの香辛料を利用した

Spice

ACE inhibitory activity（％）

加工食肉製品は嗜好性の側面から消費者に受け入Turmeric

ND＊

れられやすいと考えられる。また，これら香辛料

Saffron

ND

Coriander

NDの抽出物を加工食肉に添加することにより，加工

Cumin
Cinnamon

食肉製品にACE阻害活性を付加し，機能性加工

84.4（3.16）＊＊

食肉製品の創製に寄与することができると考えら

41.4（8.92）

White pepper

ND

NutmegND

Clove

95.6（3.81）

れた。
４．要

＊：Not determined＊＊：Figures in parenthesis are standard deviation（n＝３）．

約

本研究では発酵食肉製品の機能性について検討した。特にACE阻害活性に着目した。発酵食肉

活性が確認できたが，ホワイトペッパーでは阻害製品の調製には，既に食肉中での生育性が良好で活性が認められなかった。

あることが明らかとなっているフナズシ由来の乳

ホワイトペッパーの抽出液においてACE阻害

酸桿菌を用いた。この菌株を用いてそれぞれ発酵

活性が見られなかったこと，および未発酵の食肉

食肉を調製し，抽出液を逆相HPLCおよびサイズ

パティではACE阻害活性は見られなかったこと

排除HPLCに供した。得られたACE阻害画分につから，JAB2001株をスターターに用いた発酵食肉

いてSDS-PAGEおよびアミノ酸配列の解析試験から分離したACE阻害物質は発酵過程においてを行ったが，画分にペプチド様の物質が含まれて生産されたものである可能性が高い。その物質はいる可能性は非常に低かった。一方，ホワイト

ペプチド様のものではなかったことから，タンパ

ペッパーを含む種々の香辛料においてACE阻害

ク質以外の物質から生成したと考えられた。すな

活性を測定したところ，クミンとクローブにおいわち，ホワイトペッパーあるいはタマネギに含まて高いACE阻害活性が見られた一方でホワイトれるポリフェノール類が発酵過程において変換しペッパーでは阻害活性は見られなかった。また未ACE阻害作用を示すようになったと考えられた。

発酵の食肉パティにおいてもACE阻害活性は見

今後，この物質の同定を行う必要がある。

られなかった。これらの結果からこの発酵食肉製

香辛料の機能性についての研究は，芳香性物
質，抗菌活性および漢方薬としての保健効果など品が示したACE阻害物質はJAB2001株による発酵過程において生産したものと考えられた。

様々な分野で進められているが，ACE阻害活性についての報告はほとんどない。本実験ではホワ
イトペッパーを含む種々の香辛料におけるACE
阻害活性を調べた。その結果，クミンおよびクローブの熱水抽出物において高いACE阻害活性が見られた。クミンはセリ科の植物の種子であり，カレーの香りの元となっている香辛料である。またクローブはフトモモ科の植物のつぼみであり，甘い芳香を有し，肉料理に使われることが文
献１） 西川研次郎監修：食品機能性の科学，産業技術
サービスセンター，379～413，2008．
２） Nakamura, Y., Yamamoto, N., Sakai, K., Takano, T.
: Antihypertensive effect of sour milk and peptides
isolated from it that are inhibitors to angiotensin
I-converting enzyme, J. Dairy Sci. ， 78 ， 1253 ～
1257，1995．
３） Actis-Goretta, L., Ottaviani, I. J., Fraga, G. D. :Inhibition of angiotensin converting enzyme activity
by flavanol-rich foods, J. Agric. Food Chem. ， 54 ，© The Ito Foundation

18

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

229～234，2006．
４） Tsuda, H., Kubota, K., Matsumoto, T., Ishimi, Y. :Isolation and identification of lactic acid bacteria in
traditional fermented sushi, Funazushi, from Japan.
Food Sci. Technol. Res.，18，77～82，2012．
５） Tsuda, H., Matsumoto, T., Ishimi, Y. : Selection oflactic acid bacteria as starter cultures for fermented
meat products, Food Sci. Technol. Res.，18，713～
721，2012．
６） 中江利孝，片岡啓，宮本拓：発酵ひき肉製品の製造と生化学的性状に関する研究，食肉に関する助成
研究調査成果報告書，５，298～304，1986．

© The Ito Foundation

19

食肉の給与が海馬のタンパク質リン酸化および遺伝子発現に及ぼす影響
Effects of meat supplementation on hippocampal protein phosphorylationand gene expression

豊

田

淳・下

西

ひかり・後

藤

達

彦

（茨城大学農学部）

Atsushi Toyoda, Hikari Shimonishi and Tatsuhiko Goto
（College of Agriculture, Ibaraki University）

Recently, the patients suffering from brain disorders such as depression or dementia are
increasing, because of rapid aging and stressful condition in Japanese society. To reduce therisk of incidence of these diseases, the alternate approaches such as improvement of eating
habits are attempted. We have tried to elucidate the chronic effect of diets containing driedbeef meat on the brain function and behaviors. In this study, we focused on the plasma aminoacids in the central nervous system. The rats fed beef-containing diets for 28 days, and then
we analyzed the concentration of amino acids in the blood plasma. As a result, plasma
phenylalanine and tryptophan significantly increased in the group fed beef-containing diet (10g/kg of diet) compared with control group and the group fed beef-containing diet (100 g/kg of
diet). Because these amino acids are precursors for dopamine and serotonin in the brain,
respectively, which are related to mental disorders. It should be investigated the relation
between these blood plasma amino acids and intracerebral neurotransmitters and theexpression patterns of genes related to mood disorders in future.

１．目の薬剤治療は長期間にわたることが多く，重大な的副作用（自殺企図のリスク増加，攻撃性の増加）

本研究の目的は，食肉の摂取が脳の高次機能への報告もされていることから，発症後の治療のみ与える影響を分子レベルで網羅的に解明することならず，予防（未病）対策にも早急に取り組むべである。

きといえる。

近年の日本では，急激な高齢化の進行やさまざ

私どもは，日々の食生活を通してこれらの中枢

まなストレスの増加によって，うつ病や認知症な神経系の疾患，特に精神疾患を予防できないかとどの中枢神経系に起因する疾患の患者数が増加し考え，農畜水産物および乳製品などの食品で中枢ている 。そのような現状に加え，東日本大震災

神経系の機能を改善させる可能性のあるものを探とその後の原発事故によるうつ病やPTSD等の患索している２）。現在までにもいくつかの農畜水産者の増加が懸念されている。これらの精神疾患へ

物および食物由来の機能性因子について研究を１）© The Ito Foundation

20

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

行ってきたが，本研究では食肉に含まれる成分が析している。

中枢神経系の機能へどのような影響を与えるか，

脳の海馬と呼ばれる部位は，記憶や学習に重要

生化学的に解析を行いたいと考えて，25年度からな役割を担っており，てんかんやアルツハイマー本研究課題を遂行している 。

型認知症，うつ病，統合失調症など精神疾患を含

３）

食肉には必須アミノ酸がバランスよく含まれて

むさまざまな中枢神経系疾患に深く関与すると考おり，末梢や中枢で神経伝達物質として機能する

えられている９）。本研究課題では，牛肉の摂取に

セロトニンやノルアドレナリン等の原料となるこ

よる脳への影響を海馬に絞って解析することで，とが知られている 。セロトニンについてはうつ中枢神経系疾患に対してどのような効果を持つの病患者の脳内で健常人よりも低い濃度である症例

か，科学的に解明しようと考えた。そこで，本研が知られ，うつ病等精神疾患の発症と深く関連す究では海馬の神経伝達物質の動態に影響する血漿ることが知られている５）。ノルアドレナリンにつアミノ酸に焦点を当て，牛肉を給与した後の血漿いても，不安障害やうつ病などいくつかの精神疾

アミノ酸を分析し，その影響を調査することにし患との関連が示唆されている。これらの精神疾患た。

４）はSSRIのような抗うつ剤の投薬，あるいは認知行動療法などで治療することが多く，それらの治２．方法療が奏功するケースもあるが，一方，どのような

2.1

４週間の牛肉含有飼料の給与試験

治療法を用いても治癒しない難治性うつ病の存在

給与試験については，先行研究と同様な方法でも知られており，患者のQOLを維持・改善する

行った３）。－30℃で保存した牛肉（大腿二頭筋，

うえで重大な問題になっている。うつ病は生活習千葉県産ホルスタイン牛）を４℃で解凍後，ナイ

慣の乱れなどが引き金になることも知られておフで破断し，ミンチ器で破砕した。ミンチ肉を真り，うつ病予防には睡眠，栄養などを充分取るこ

空パック後，凍結乾燥して，牛肉粉末を得た。ことが有効であると考えられている。また，適度なれを精製粉末飼料（AIN93G，オリエンタル酵母）運動にもうつ病発症を予防する可能性のあることへ添加して牛肉含有飼料とした。

が示唆されている 。特に栄養については，近年，

５ 週 齢 で 飼 育 室 へ 導 入 し た Wistar ラ ッ ト

消化管内微生物と精神疾患の関係が示唆されてお（チャールズリバー）は，予備飼育期間１週間をり，脳腸相関の観点から欧米を中心に盛んに研究経て牛肉含有飼料の給与を開始した。動物飼育はされている７）。また，赤身を多く含む牛肉は，適すべて茨城大学農学部中小動物舎で実施した。

６）

正量を摂取することでうつ病や不安障害に対する対照群（Control, C）と牛肉給与群①（10ｇ/

リスクを減らすことが，オーストラリアで行われkg diet, LB）， 牛 肉 給 与 群 ② （100 ｇ /kg diet,

た疫学調査によって明らかになっている 。以上HB）の３群に分け，それぞれ３頭ずつ用いた。

より，私どもは食肉成分にはうつ病などの精神疾牛肉含有飼料の給与は28日間続けて行った。給与患に対して予防的な効果を期待できるのではと考期間中は，摂食量および体重を定期的に測定しえており，本研究課題では，実際に長期間食肉た。なお，動物実験については，茨城大学農学部（牛肉）を経口摂取した場合，摂取しない場合と中小動物舎のラット専用飼育室で行った。予備飼

比較して脳内ではどのような分子機構の変化が生育の時期からラットを個別ケージに収容し，単飼

じるのか，実験動物（ラット）を用いて詳細に解した。水と飼料は自由摂取とし，室温22℃，湿度

８）© The Ito Foundation

食肉の給与が海馬のタンパク質リン酸化および遺伝子発現に及ぼす影響

21

50％，12時間の明暗サイクル（６：00点灯，18：験期間をとおしてLB群が他の２つの群（C, HB）

00消灯）の環境下で飼育した。茨城大学動物実験よりも恒常的に摂食量が多く，また体重も高く推

委員会の規則に則り，本委員会の承認を受けて実移したことから３），それらが血漿アミノ酸濃度の施した。

高値に結び付いた可能性が示唆された。なかでも

2.2

牛肉給与試験後の血液のアミノ酸分析

LB群における血漿フェニルアラニンおよびトリ

2 . 1の給与試験終了後，ラットの腹部大動脈よプトファン濃度は，他の２群よりも有意に高かっり血液を採取した。血漿を前処理後，内部標準とた（Fig.１）。１％の牛肉粉末飼料をラットに28

してアミノ酸安定同位体を加え，誘導体化し，日間給与することによって，フェニルアラニンと55℃で10分間インキュベートした。室温になるま

トリプトファンの血漿中濃度が上昇するメカニズで放置した後，UPLC/MS/MSによりアミノ酸分ムの詳細は，今後，解析すべき課題である。本研析を行った。

究は，比較的低濃度の牛肉粉末でも効果を発揮で

2.3

統計処理

きる可能性を示唆した結果であり，食肉産業上，統計処理については，一元配置および二元配置

現実的で意義のある成果であると考える。また，の分散分析をエクセル統計2006（SSRI）により血漿スレオニン，チロシン，メチオニンの各濃度

行 っ た 。ま た ，多 重 比 較 法 に つ い て は ，については，LB群が牛肉給与群②（100ｇ/kg

Bonferonni法を用いた。

diet, HB）と比較して有意に高かった（Fig.１）。
末梢のフェニルアラニン，トリプトファンは，血３．結果と考察

液脳関門を通過し，脳内でそれぞれドーパミン，

3 . 1 牛肉含有飼料の給与がラットの血漿アミノ酸濃度に及ぼす影響

セロトニンに変換される。また，チロシンも同様にドーパミンに変換される。脳におけるセロトニ

牛肉含有飼料あるいは対象飼料を28日間給与しンやドーパミンは，うつ病や統合失調症，パーキ

たラットの血漿アミノ酸の分析を行った。アルギ

ンソン病などさまざまな中枢神経系の疾患発症とニンについては，本分析条件ではピークが得られ関係しているため，比較的低濃度の牛肉粉末含有

ず，定量が不可能であった。これについては，ア

飼料でこれらの血漿アミノ酸濃度が上昇したこと

ルギニン分析用の最適条件を見出して，再度定量

は食肉の栄養科学上，意義深い。今後は，実際にすることが必要である。その他の19種類のアミノ

脳内のアミノ酸，モノアミンの濃度が牛肉含有飼酸（ヒスチジン，アスパラギン，タウリン，セリ料の摂取でどのように変動するかを調査する予定

ン，グルタミン，グリシン，アスパラギン酸，グである。また，牛肉摂取による脳内の遺伝子発現

ルタミン酸，スレオニン，アラニン，プロリン，

への影響を調査する。特に精神疾患発症と深く関

リジン，チロシン，メチオニン，バリン，イソロ

係する海馬における遺伝子発現をDNAマイクロ

イシン，ロイシン，フェニルアラニン，トリプトアレイなどを用いて網羅的に解析する予定である。

ファン）については，本方法で定量可能であった。
定量結果であるがアミノ酸濃度の全体的な傾向

４．要約として，牛肉給与群①（10ｇ/kg diet, LB）が他

最近の日本では，高齢化の急激な進行や多様なの２つの群よりも高かった。メカニズムの詳細はストレスの増加によって，うつ病や認知症などの不明であり，統計学的に有意ではないものの，試

中枢神経系疾患の患者数が増加しており，食習慣© The Ito Foundation

22

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

3
2.5
2
1.5

C

1

LB

0.5

HB

0

s

Hi

l
t
r
r a
s
y
p u
o
a u er ln
Gl As Gl Th Al Pr Ly Ty Me Va
As Ta S G

Ile Leu Phe Trp

Fig. 1 Relative values of plasma concentration of amino acids in rats fed the diets containing dried powder of beef

meat. C, control（n＝３）；LB, 10g/kg diet（n＝３）；HB, 100g/kg diet（n＝３）．

でこれらの疾患を予防や治療ができないか検討さ達物質および遺伝子発現について精査する必要がれている。本研究では，慢性的な食肉の摂取が脳ある。

にどのような影響をもたらしているのか解明することを目的とした。今年度は，脳の神経伝達物質の動態に深く関係する血漿中のアミノ酸に着目
し，28日間の牛肉含有飼料の給与が，ラットの血
漿中アミノ酸濃度に及ぼす影響について解析した。その結果，28日間，牛肉含有飼料（10ｇ/kg
diet）を給与することで，フェニルアラニンとト
リプトファンの血漿中濃度が上昇することが明らかとなった。これらのアミノ酸はそれぞれドーパ
ミン，セロトニンの前駆物質であり，精神疾患発症とも深く関係することから，牛肉の摂取が中枢において機能性を発揮する可能性が示唆された。
今後，これらの血漿アミノ酸の変動と脳内神経伝

文献１） 厚生労働省ホームページ http://www.mhlw.go.jp/
kokoro/speciality/data.html
２） 茨 城 大 学 農 医 連 携 プ ロ ジ ェ ク ト http://iucamibaraki.wix.com/iucam
３） 豊田淳，平成25年度食肉に関する助成研究成果報
告書，32，53～56，2014．
４） Nagasawa, M., et al., Animal Science Journal,
83，493～498，2012．
５） Berton, O., et al., Nature Reviews Neuroscience, 7,137～151，2006．
６） Agudelo, LZ., et al., Cell，159，33～45，2014．
７） Savignac, H. M., et al., Behavioural Brain
Research, 287，59～72，2015．
８） J a c k a , F . N . , e t a l . , P s y c o t h e r a p y a n d
Psychosomatics，81，196～198，2012．
９） Nestler, E. J., et al., Neuron，34，13～25，2002．

© The Ito Foundation

23

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究
Studies on the formation of specific meat taste in cured meat products

市

村

さやか・中

村

幸

信・吉

田

由

香・服

部

昭

仁

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

Sayaka Ichimura, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida and Akihito Hattori（Japan Meat Science and Technology Institute）

We evaluated the enhancement of the taste of cured meat during maturation by sensory
analysis. Although nitrite（NaNO2）was essential for the development of the taste of cured
meat, a certain period for maturation of raw meat, regardless of the presence of nitrite, wasnecessary for the enhancement of the taste. Some fractions increasing in raw meat during thematuration, which were the heat-stable sarcoplasmic and nitrogen containing compounds, wereinvolved in the enhancement of the taste.
We tried to identify the compounds involved in the enhancement of the taste of cured
meat during the maturation. The changes in the amount and fractions of nitrogen compounds
were examined in the salted-meat immersed in a ２％ NaCl solution without NaNO2 from 0 to
168 hrs incubation. The concentration of hypoxanthine（Hx）gradually increased, while
inosine-5’-monophosphate（IMP）decreased during the incubation. The concentration of Hx inthe salted-meat was lower than that of IMP after incubation for 72 hrs, while Hx increased
after 168 hrs of incubation. The addition of Hx to model samples in a dose-dependent fashion
enhanced the taste. It was concluded that Hx is essential for the enhancement of the taste of
cured meat products.

１．目の繁殖の抑制および塩漬フレーバーと称される塩的漬肉特有の風味の発現に寄与しており，塩漬フ

亜硝酸塩や食塩から成る塩漬剤で原料肉を処理する塩漬は食肉製品の製造において重要な工程でレーバーの発現以外の特性については，既におおむねその機構は解明されている。

ある。塩漬には，原料肉に塩漬剤を直接すり込む

塩漬フレーバーとは，塩漬熟成中に次第に強ま

乾塩漬と，塩漬剤を溶かしたピックルと呼ばれる

る塩漬食肉製品にのみ共通する風味のことであ

塩漬液に漬け込む湿塩漬があり，日本では，主にる。パルマハムやハモンセラーノのようなヨー湿塩漬が工業的に採用されている。塩漬は，保水

ロッパ産の生ハムは，１年以上の長期乾塩漬によ性や結着性の発現，特徴的な肉色の固定，微生物り付与された強い風味が特徴的である。一方，日© The Ito Foundation

24

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

本では短期間の湿塩漬が主流であるが，日本農林

検討するとともに，原料肉の塩漬けに伴う耐熱性規格の熟成ソーセージ類，熟成ベーコン類および筋漿画分中の含窒素成分の変化から塩漬熟成に伴

熟成ハム類の規格では，塩漬における熟成期間

う特有の味の増強に関与する因子を特定した。

（それぞれ３，５，７日間以上）を定めている。このような塩漬熟成を経て製造された食肉製品は，

２．方
2.1

強い風味を有する。

法

原料

塩漬フレーバーに関するこれまでの研究は，風

市販黒豚ロース肉から豚胸最長筋を切り出し，味，すなわち香りと味を同時に感知する官能試験

実験設計に合わせて厚さ５mmの薄切り肉，あるに基づいて報告されてきたがいは挽肉にした。

，実際は，香り

１，２）と味は別の感覚であり，香りは揮発成分を嗅覚で2.2感知し，味は遊離アミノ酸や核酸関連物質のよう挽肉に等量の0.1M NaCl溶液を加えガラス棒をな水溶性成分を味覚で感知している。塩漬フレー

用いて混合し，3,000×ｇ，４℃で10分間遠心分バーの発現機構を官能試験によって解明する場合離した。得られた上清（筋漿画分）を100℃で20には，香りと味を正確に区別して評価すべきであ

分間加熱後，3,000×ｇ，４℃で10分間遠心分離る。

した。最終的に得られた上清をmeat-extract（耐

亜硝酸塩は塩漬フレーバーの発現に必須であり，さらに，食肉の加熱の際に生じる脂質酸

１，３）meat-extractの準備

熱性筋漿画分）として使用した。
2.3

官能試験用試料の準備。

官能試験Ⅰ，Ⅱ，ⅢおよびⅣに用いる湿塩漬モ

また，塩漬フレーバーの香りに関わる成分についデル試料を調製した。ピックルはNaClを２％，ては，塩漬肉に特有の揮発性化合物が同定されて亜硝酸ナトリウム（NaNO２）を200ppmになるよいる。一方，塩漬フレーバーの味に関わる成うに調製した。官能試験Ⅰでは，薄切り肉を４℃分についての研究はなく，塩漬肉のみに存在する

で２，72および168時間塩漬した。官能試験Ⅱでような呈味成分は特定されていない。遊離アミノ

は，あらかじめ薄切り肉を２％NaCl溶液に４℃

酸や低分子ペプチド等の呈味成分が塩漬熟成に伴で168時間漬け込み，その後NaNO２ を200ppmにう特有の味の増強に寄与していると推定されていなるように加えて４℃で２時間塩漬した。官能試

るが，同様に呈味成分であるイノシン酸（IMP）

験Ⅲでは，薄切り肉を重量で50％のmeat-extract

量は熟成期間中に減少することが報告されておを含むピックルで４℃，２時間塩漬した。官能試

り ，塩漬肉特有の味の発現機構は複雑で多様で験Ⅳでは，薄切り肉をHxの濃度が０，４，８およあると考えられる。塩漬熟成に伴う特有の味の発

び16mMになるように添加したピックルに４℃で現機構が解明されれば，塩漬熟成期間の短縮や，２時間塩漬した。各官能試験における試料とピッより味わい深い製品の生産が可能になるであろう。

クルは１：１（重量）で塩漬し，70℃で20分間加本研究の目的は，香りの影響を排除した官能試

熱後，氷冷した。モデル試料は各官能試験に供す

化臭を抑制することも明らかにされている

４，５）

６，
７）

８）

験法を用いて塩漬熟成に伴う塩漬肉特有の味の発るときに室温に戻した。

現機構の解明である。今回は，湿塩漬のモデル試

2.4

料を用いて塩漬肉特有の味の強さに対する塩漬熟

塩漬肉に特有な味のみを評価するため，パネリ

成期間，亜硝酸塩および耐熱性筋漿画分の関与を

ストは鼻をノーズクリップで閉じた状態で評価し© The Ito Foundation

官能試験食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究25

た。ピックルで４℃，２時間塩漬した試料を基準器のUV波長は190nmから400nm（Waters2996，

試料とし，基準試料と，官能試験Ⅰ，Ⅱ，Ⅲおよ

Waters社製）とした。

びⅣの各モデル試料における塩漬肉特有の味の強さを比較した。味の強度は５段階で評価し，基準

Salted-meat中のIMPおよびHx含量は，北田らの方法９）で測定した。

試料と比較した場合に味がかなり弱い場合を－２2.7

点，やや弱い場合を－１点，差がない場合を０点，すべての結果は平均値±標準誤差で算出し，Ｆやや強い場合を＋１点，かなり強い場合を＋２点とした。パネリストは，食肉製品の官能評価技術に熟練したJASの官能検査員とそれに準ずる者９

統計処理

およびＴ検定を行った。
３．結果と考察名とし（男性６名，女性３名），各官能試験は２

3.1

回実施した。

（１） 塩漬熟成期間

2.5

salt-extractの準備

塩漬肉特有の味の増強に関与する要因

塩漬肉特有の味の増強に対する塩漬熟成期間の挽肉に等量の２％NaCl溶液を加え，０，72お関与について，官能試験Ⅰで調製した塩漬時間のよび168時間漬け込んだ。温度は特定JAS規格の異なるモデル試料（２，72，168時間）を用いて上限である10℃とし，各時間漬け込んだ原料肉を調べた結果，基準試料と比較して，72時間塩漬しsalted-meatと定義した。salted-meatの一部は，た試料では味の強さはほとんど変化しないが，

IMP お よ び Hx 含 量 の 測 定 に 使 用 し ，残 り の

168時間塩漬した試料では強い味が認められた

salted-meat は ，salt-extract の 調 製 に 用 い た 。

（ｐ＜0.05）。この強い味は，熟成食肉製品の味に

salted-meatにNaCl濃度が0.1Ｍになるように蒸留

共 通 す る「旨 味」「複 雑 さ」「濃 厚 さ」お よ び

水を加えてホモジナイズした後，3,000×ｇ，４℃「ハーモニー」が増強された味わいと表現するこで10分間遠心分離した。得られた上清はmeat-とができた。一定期間以上の塩漬熟成により，香extract と 同 様 に 処 理 し ，最 終 的 な 上 清 を salt-

りに関係なく塩漬肉特有の味自体が強まることが

extractと定義した。

示唆された。

2 . 6 salt-extractおよびsalted-meat中の呈味
成分の化学的分析（２） 亜硝酸塩
168時間の塩漬熟成で塩漬肉特有の味が強まる

salt-extract中の窒素濃度は，燃焼法により測ことに対するNaNO２ の関与について，官能試験定した（スミグラフNC-220Ｆ，（株）住化分析セ

Ⅱで調製したモデル試料を用いて調べた（Fig.

ンター製）
。

１）。前処理をした試料は，前処理をしなかった

salt-extract中の含窒素成分の分画は，ゲルろ基準試料と比較して明らかに強い味が認められた

過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 用 い て 行 っ た 。salt-（ｐ＜0.05）。原料肉を塩漬前に168時間NaCl溶液

extractを0.45μｍセルロース膜で精製し，高速液に漬け込むことにより，NaNO２ による塩漬は２

体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー（HPLC）（Waters2695,

時間程度の短い時間であっても，強い味が発現しWaters社製）に供した。カラムは分画可能な分たということである。また，前処理のみを施した子 量 領 域 が 100 ～ 5000 の TSK-gel G2500PWXL ，

試料では塩漬肉特有の味の発現は認められなかっ7.8mmID×30cm（（株）東ソー社製）を用い，溶た。つまり，塩漬肉特有の味の発現にはNaNO２

出条件は0.1M NaCl溶液で流速0.8ml/min，検出が必須ではあるが，塩漬熟成に伴う強い味の発現© The Ito Foundation

26

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）にはNaNO２ はほとんど関与せず，NaCl溶液への3 . 2 塩漬食肉製品の味の増強に関与する成分

漬け込みに伴う原料肉自体の熟成が大きく関与しの同定ていると示唆された。

NaNO２ 非存在下で熟成に伴って変化する原料（３） meat-extract

肉の筋漿画分中の含窒素成分に着目し，塩漬肉特

原料肉の熟成中に増加する成分と，塩漬肉特有

有の味の増強に関与する成分の同定を試みた。

の味の増強に関与する成分を探索する目的で官能第一に，２％NaCl溶液に10℃，０―168時間漬

試 験 Ⅲ を 設 計 し た 。挽 肉 か ら 調 製 し た meat-

け込んだ原料肉から調製したsalt-extract中の全extractは，耐熱性の筋漿画分であり，含窒素成

窒素濃度を測定した結果，168時間の漬け込みに分である遊離アミノ酸や低分子ペプチド，あるい伴うsalt-extractの全窒素濃度に変化は認められは核酸関連物質を多く含むと考えられる。このなかった。本結果から，168時間漬け込み中に，

meat-extractをピックルに加えて調製したモデル

原料肉中のタンパク質のような高分子量の成分が試料について，味の増強に対するmeat-extractのアミノ酸や低分子ペプチドといった低分子量の成添加効果を調べた（Fig.２）。meat-extract添加

分へ分解されていないと推定された。

試料は，不添加試料と比べ味の強さが明らかに強第二に，ゲルろ過クロマトグラフィーを用いかった（ｐ＜0.05）。含窒素成分は食品の味に寄て，漬け込み期間中のsalt-extractにおける含窒

与することから，本結果における味の増強は

素成分の動態を調べた。まず，アミノ酸やペプチ

meat-extractに存在する含窒素成分によって引きドに関連する220nm，あるいは280nmに極大吸収起こされると示唆された。

を持つ画分に関して，漬け込み時間の経過に伴う

10～13）

クロマトグラムの変化は観察されなかったことから，原料肉中の筋原線維構成タンパク質や結合組
織構成タンパク質といった不溶性の構造タンパク
very strong 2very strong 2＊

equal 0
unpretreatedpretreated

weak-1

strength of taste

strength of taste＊
strong 1

Fig. 1 Effect of the pretreatment without sodium nitrite

on the taste of cured meat.
 Sliced meat was immersed in a ２ ％ NaCl solution
without NaNO2 for 168 hrs as a pretreatment, cured
with a pickle containing ２％ NaCl and 200 ppm
NaNO2 at ４ ℃ for 2 hrs, and then heated at 70 ℃ for
20 min. The strength of the taste of the samples
pretreated was compared with that of the standard
samples（N＝14）．
 Asterisk; significantly different（p＜0.05）．

strong 1

equal 0without extract

with extract

weak-1

Fig. 2 Effect of the extract on the taste of cured meat.
 The sliced meat was cured with a pickle

containing２％NaCl, 200ppm NaNO2 and 50％（v/v）
of the extract at ４℃ for 2 hrs, and then heated at
70℃ for 20 min. The strength of the taste of thesample with the extract was compared with that of
the standard samples（N＝16）．
 Asterisk; significantly different（p＜0.05）．

© The Ito Foundation

27

1.0

concentration（μmol/g meat）

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究
（A）

0.5
0.0
1.0

（B）

intensity（AU）

0.5
0.0
1.0

a

a

3
2

X

X
b

1
0

2

72
curing periods（hrs）

168

the salted-meat incubated with the 2％NaCl solution
for various periods.
 Minced meat was mixed to an equal weight of２％
NaCl solution, and then incubated for 0, 72 or 168
hrs at 10 ℃. The concentrations of IMP and Hx inthe salted-meat were analyzed by the method of
Kitadaet et al. Histograms show mean values
obtained from 4 samples±standard errors.
 Bars with different capital and lowercase letters
are significantly different（p＜0.05）．

（D）

0.5
0.0
（E）

0.5
0.0
0

4

Fig. 4 Changes in the concentration of IMP and Hx in

0.0

1.0

5

Y

IMP
Hx

6

（C）

0.5

1.0

7

10

20
30
retention time（min）

40

Fig. 3 Gel filtration chromatograms of the fractions of

the salt-extract monitored at 250 nm.
 A fractionation of nitrogen compounds in the saltextract incubated for 0（A）or 168（B）hrs at 10 ℃
was carried out by gel filtration chromatography.
The changes of nitrogen compounds were detectedby a spectrophotometer using 250 nm. The
calibration substances of typical ATP-related
compounds included in meat, IMP（C）， Ino （D）
and Hx（E）， were also applied to a gel filtration
chromatography.

第４画分の主要成分を同定するため，核酸関連物
質（IMP, INOおよびHx）のクロマトグラムと比較した結果，第４画分の保持時間とHxの保持時間とが一致した（Fig.3E）。また，168時間の漬け込みによって消失した第１画分の保持時間はIMPと一致した（Fig.3D）。Hxは，食肉の死後の熟成期間中にIMPが分解されて生成し，魚肉においては腐敗の指標として用いられている14）。
第三に，０，72および168時間２％NaCl溶液で漬け込んだsalted-meat中のIMPとHxの濃度の変質の分解によるアミノ酸やペプチドの生成はほと化を調べた（Fig.４）。０から168時間の漬け込み

んど進んでいないと推定された。一方で，核酸関期間中にHxが増加し，IMPが減少しており，72

連物質に関連するUV250nm付近に極大吸収を持時間まではHxよりもIMP濃度の方が高いが，168

つ画分において，０から168時間の漬け込み前後

時間では，IMPよりもHx濃度の方が高くなったでクロマトグラムに大きな変化が観察された（ｐ＜0.05）。これは，２％NaCl溶液への漬け込み（Fig.３）。漬け込み０および168時間の２つのク中にIMPが分解し，Hxが生成したことを示す。

ロマトグラムを比較すると，第１および第３画分

IMPは食品中の「旨味」として広く認知されておの面積は168時間の漬け込みによってほとんど消り15～17），グルタミン酸やカリウムイオンとともにえたのに対し，第４画分の面積は168時間の漬け

鶏肉の味に寄与する主要成分であると報告されて込み後に明らかに大きくなった（Fig.3B）。このいる 18）。一方，これまでにHxが食肉の味に寄与© The Ito Foundation

28

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）とから 19），Hxの持つ苦味が熟成食肉製品のおいvery strong 2

strength of taste＊＊

strong 1

equal 0weak-1

しさに寄与している可能性が考えられる。
約

４．要

A 0
B 0.7

4
2.4

8
3.7

16
7.0

concentration of hypoxanthine

本研究では，塩漬熟成に伴う塩漬肉特有の味の発現機構について調べた。塩漬肉特有の味は，香りに関係なく，塩漬熟成期間および耐熱性筋漿画
分中の未知成分によって増強した。また，亜硝酸

Fig. 5 Effect of Hx on the taste of cured meat.
 The sliced meat was cured with the pickle

containing ２ ％ NaCl, 200 ppm NaNO ２ and various
concentrations of hypoxanthine（0, 4, 8 and16μmol/ml）at ４ ℃ for 2 hrs, and then heated at 70 ℃ for 20
min. The strength of the taste of the samples withHx was compared with that of the standard ones（N＝12）． A and B show concentration of Hx in the
pickle（ μmol/ml pickle） and meat（ μmol/mg
meat），respectively.
 Asterisk; significantly different（p＜0.05）．

塩は塩漬肉特有の味の発現には必須であるが，塩漬熟成に伴う味の増強には直接関与しないことが示唆された。
原料肉の塩づけに伴って顕著に増加する耐熱性
筋漿画分中の含窒素成分はヒポキサンチン（Hx）であった。Hxを添加したピックルで作製したモデル試料は，短時間の塩漬にもかかわらず塩漬肉
特有の味が強く発現した。以上の結果から，塩漬するか否かを調べた例はない。本結果は，塩漬肉熟成に伴う特有の味の増強にはHxが必須であるの味の増強におけるHxの寄与はIMPよりも高いと結論した。

ことを示唆しており，長期間塩漬した食肉製品ではIMP濃度は低くHxの濃度が高いという報告によっても支持される 。
８）

第四に，塩漬熟成に伴う塩漬肉特有の味の増強に対してHxが寄与しているか否かを明らかにするため，官能試験Ⅳで調製した様々な濃度のHxを含むピックルで２時間塩漬したモデル試料を官能試験に供した（Fig.５）。Hx添加試料は，Hx不添加試料と比較して強い味を示し，その強度はHxの濃度に依存して強まった。モデル試料中のHx濃度が3.7μmol/g meat以上の場合，Hx不添
加の試料と比較して有意差が認められたことから（ｐ＜0.05），Hxが亜硝酸塩によって発現した塩漬
肉特有の味を増強することが確認された。
本研究により，Hxは塩漬熟成に伴う塩漬肉特
有の味の増強に必須であると結論された。従来はHxが食肉の味に関与する成分として研究されてこなかったが，Hxは苦味を呈する成分であるこ

文献１） Macdonald, B., Gray, J. I., Stanley, D. W., Usborne,
W. R., Journal of Food Science ， 45 ， 885 ～ 904 ，1980．
２） Shahidi, F., Rubin, L., D’Souza, L. A., Teranishi, R.,
Buttery, R. G., CRC Critical Reviews I Food Scienceand Nutrition，24，141～243，1986．
３） Brown, C. L., Hedrick, H. B., Bailey, M. E.,
Journal of Food Science，39，977～979，1974．
４） Sato, K., Hegarty, G., Journal of Food Science,
36，1098～1102，1971．
５） Igene, J. O., Yamauchi, K., Pearson, A. M., Gray, J.
I., Aust, S. D., Food Chemistry，18，１～18，1985．
６） Ramarathnam, N., Rubin L. J., Diosady, L. L.,
Journal of Agricultural and Food Chemistry ， 39 ，344～350，1991ａ．
７） Ramarathnam, N., Rubin, L. J., Diosady, L. L.,
Journal of Agricultural and Food Chemistry ， 39 ，1839～1847，1991ｂ．
８） Escudero, E., Mora, L., Aristoy, M., Toldrá, F.,
Meat Science，89，536～539，2011．
９） Kitada, Y., Hasuike, A., Sasaki, M., Tanigawa, K.,
Horiuchi. R., Yumiba, H.，日本食品工業学会誌，30，
151～154，1983．
10） Yamasaki, Y., Maekawa, K., Agricultural© The Ito Foundation

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究
Biological Chemistry，42，1761～1765，1978．
11） N i s h i m u r a , T . , K a t o , H . , F o o d R e v i e w s
International，４，175～194，1988．
12） Buscaihon, S., Berdague, J. L., Bousset, L., Cornet,
M., Gandemer, G., Touralle, C., Monin, G., Meat
Science，37，229～243，1994．
13） Kawai, M, Okiyama, A., Ueda, Y., Chemical
Senses，27，739～745，2002．
14） Hughes, R. B., Jones, N. R., Journal of the Scienceof Food and Agriculture，17，434～436，1966．
15） Yamaguchi, S., Physiology & Behavior ，49 ，833
～841，1991．

2916） Y a m a g u c h i , S . N i n o m i y a , K . , J o u r n a l o f
Nutrition，130，４，9215～9265，2000．
17） Kurihara, K., Kashiwayanagi, M., Journal of
Nutrition，130，9315～9345，2000．
18） Fujimura, S., Kawano, S., Koga, H., Takeda, H.,
Kadowaki, M., Ishibashi, T,. Animal Science andTechnology (Japan），66，43～51，1995．
19） Tikk, M., Tikk, K., Tørngren, M. A., Meinert, L.,
Aaslyng, M. D., Karlsson, A. H., Andersen, H. J.,
Journal of Agricultural and Food Chemistry ， 54 ，7769～7777，2006．

© The Ito Foundation

30

調理加工食肉・肉製品の機能性成分およびその発現に関する研究
The investigation of functional properties and its expression in cooked andprocessed meats

六

車

三治男・木

本

早

紀・川

北

久美子・竹之山愼一（南九州大学健康栄養学部）

Michio Muguruma, Saki Kimoto, Kumiko Kawakita and Shinichi Takenoyama（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University）

This research aimed to study and compare the biological and functional properties as well
as physiological effects of hydrolysates of pork meat treated with various kinds of heat
treatment and processing ; in vitro tests. All samples separately hydrolyzed with pepsin andtrypsin and then subjected to SDS-PAGE and HPLC analysis. Angiotensin I converting
enzyme（ACE）inhibitory activity of the hydrolysates was determined by rabbit lung enzyme.
The antioxidant activity of the hydrolysates was determined by the DPPH radical scavenging
assay.
SDS-PAGE results suggest that each sample was degraded by enzyme treatment. HPLC
patterns indicate that the main peak in each samples digested for 2h contains bioactive
peptides（MW less than 6000）. However, undigested samples of raw meat and raw ham
slightly differ from each other. In comparison, HPLC patterns insignificantly varied in samplesof raw meat, heat treated meat and processed meat products, which were digested for 2h. The
pork loin meat treated with various heating methods showed a very similar ACE inhibition
percentage, although processed meat products showed lower ACE inhibition percentage. The
pork loin meat treated with various heating methods also showed a very similar DPPH
inhibition activity, although loin roll and bacon showed higher DPPH inhibition activity.
Based on their remarkable ACE inhibitory activity and antioxidant activity, we suggestthat the hydrolysates from cooked and processed pork meats may have potential applications
as functional food.

１．目

費低迷の一つの要因と考えられている。このよう的な状況の中，乳製品の発酵乳を中心に血圧低下ペ

近年，ライフスタイルの変化や多様化に伴い，

プチドを含む機能性食品の研究・開発が行われ，生活習慣病が増加し，国民の健康への関心は極め

消費者の健康に寄与できる食品としてのイメージて高くなっている。とくに，畜産食品に代表されが定着している１）。一方，食肉は栄養豊富な食品

る動物性食品は，健康に負の影響を及ぼすというとして古くから認識されてはいたものの，機能性イメージを持つ消費者が多く，食肉・肉製品の消食品としてのアプローチが遅れていた。しかし，© The Ito Foundation

調理加工食肉・肉製品の機能性成分およびその発現に関する研究31

食肉は良質なタンパク質を多く含んでおり，近ム），ロースハム（加熱食肉製品）およびベーコ

年，疾病予防作用などの保健的な機能性に関するン（加熱食肉製品）を購入し，実験試料とした。
2.2

研究が進められている１）。

生ロース肉の各種調理加工

食 肉 に は ，ア ン ギ オ テ ン シ ン Ⅰ 変 換 酵 素

筋線維の配列が把握しやすい生ロース肉（３（ACE）の阻害による高血圧症予防の期待があるmm厚）を対象とした。一方，湿式加熱法（煮る，ことが報告されている 。食肉によるこれらの効

100℃，30秒間），乾式加熱法（炒める，フライパ

果は主にペプチドに由来する。食肉タンパク質はンで両面を30秒ずつ処理），誘電電動加熱法（マ酵素消化によりペプチドを生成し，その機能性をイクロ波，National NE-NS５電子レンジにより発揮する。現在，食肉由来血圧降下作用ペプチド

500Ｗ，２分間処理）およびスチームコンベクに関しては筆者らの研究も含めていくつか検出さション加熱法（Sharp Healsio AX-1000により，れている２～９）。さらに，我々は，各種食肉を消化ウオーターグリルの条件で，80℃，10分間加熱）

酵素のペプシン，トリプシンやパンクレアチンでにより，生ロース肉（３mm厚）を処理した試料処理すると，鶏肉，豚肉，牛肉の順に血圧上昇抑を加熱調理肉とした。

２）

制活性（ACE阻害活性）が増加することを明ら

2.3

食肉および各種酵素による調製

かにした10）。また，抗酸化活性も，有意差は認め

食肉由来ペプチドの調製は以下のとおりである。

られないものの各種食肉加水分解物は高い抗酸化各種加熱調理食肉および食肉製品のミンチ肉に活性を示すことも認め，いずれの食肉を摂取して２倍量の蒸留水を添加してフードプロセッサー

も生活習慣病予防につながる効果を食肉に期待で（Panasonic MK-K61）を用いて30秒間，２回ホきることを明らかにした11）。これらの一連の研究

モジナイズした。このホモジェネートを酵素未処

は，主として生の食肉を用いて得られた結果であ理の食肉タンパク質サンプル「生肉（０ｈ）」とる。しかし，われわれが食肉を食する際には，調し た 。そ の 後 ，こ の ホ モ ジ ェ ネ ー ト を HCl で理加工した食肉や肉製品を摂取する場合が一般的

pH1.8 に 調 整 し ，胃 粘 膜 由 来 ペ プ シ ン（１ ：である。

10000）（和光純薬工業株式会社製）をタンパク質

そこで，調理加工した食肉・肉製品を摂取した量（食肉重量当たり20％のタンパク質が含まれる

際にも，生体調節機能を有する機能性成分が産生ことを仮定した）に対して1/1000倍量添加し，攪されるかどうかや，それら機能性成分の発現様式

拌しながら37℃で１時間インキュベートした。

についても検討することを本研究の目的とした。

NaOHを用いてpH6.8に調整し，10分間煮沸した

２．方
2.1

後，溶液温度を40℃まで低下させた。この溶液を法

ペプシン消化サンプル「ペプシン（１ｈ）」とした。さらにトリプシン（和光純薬工業株式会社）

実験材料

食肉材料として，肉類のなかでも消費量が多

およびパンクレアチン（同会社）をそれぞれペプ

く，食肉加工の主要な原料となっている豚肉を実シンと同量添加し，再び攪拌しながら37℃で１時

験材料として使用した。市販の宮崎県産の豚ロー

間インキュベートした。最後に10分間煮沸した試

ス肉を購入し，各種加熱処理原料肉として用い料を食肉由来ペプチドとした。この溶液をペプシた。一方，加工食肉製品としては，国産メーカー

ン・トリプシン処理サンプル「ペプシン／トリプ

が製造した生ロースハム（うすぎりシン（２ｈ）」とした。

ラックスハ© The Ito Foundation

32

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

なお，食肉タンパク質「生肉（０ｈ）」および

2.6

タンパク質の定量

各反応段階で得られた酵素消化により生じたペプ

酵素未処理の食肉タンパク質「Whole」の定量

チド混合物を0.45μｍセルロースアセテートメン

はBiuret法13）により行った。すなわち，タンパクブレンフィルター（アドバンティック東洋（株））

質溶液に対し，４倍量のBiuret試薬を加えて常温にてろ過した試料を実験に供した。

で30分間反応させた。反応液を島津製作所㈱製

2 . 4 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

UV-VIS Spectrophotometer1240 型 分 光 光 度 計（吸光度：540nm）にて測定した。また分解物で得られた試料の分子種やそれらの酵素反応によあるペプチドについてはUV法14）を適用し，測定る分解の程度を調べるためにドデシル硫酸ナトリを行った。すなわちタンパク質溶液の215nmの吸

ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-

光度から225nmでの吸光度を差し引き，144倍しPAGE）をLaemmliの方法12）で行った。アクリルた時の数値をタンパク質濃度とした。測定には上アミド濃度10～20％のグラジエントゲルを用いて記と同じ分光光度計を使用した。

スラブ型の泳動槽で行った。ゲルバンドの染色は
ク ー マ シ ー ブ リ リ ア ン ト ブ ル ー Ｒ -250（Bio-

2 . 7 アンギオテンシンⅠ変換酵素（ACE）阻
害活性の測定RAD Laboratories）により行い，脱色には10％

Cushumanの方法15）に準じて測定した。ACEは

酢 酸 を 用 い た 。ま た ，分 子 量 マ ー カ ー と し てウサギ肺由来アンギオテンシンⅠ変換酵素

SDS-PAGE Molecular weight standards, High（ACE, Peptidyldipeptidase, EC3.4.1

Range およびLow Range（BIO-RAD社製）を使社）を用い，0.25Ｍホウ酸緩衝液で１unit/mlに用した。

調整し，測定時には0.25Ｍホウ酸緩衝液で60unit/

2 . 5 ゲルろ過高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

5.1，シグマ

mlに希釈し使用した。ACEとの反応基質としては合成基質であるヒプリル－Ｌヒスチジル－Ｌロ

溶 離 液 に は 0.05 Ｍ リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液

イシン（HHL，ナカライテスク社）を使用した。

（pH7.0）300mM NaClを用いた。分析中は溶離液

HHLは塩化ナトリウム（和光純薬工業），0.25Ｍを脱気装置（DGU-14Ａ，島津製作所（株））に

ホウ酸緩衝液をそれぞれ0.608Ｍ，0.1Ｍになるよ

通 し ，カ ラ ム は TSK-GEL G 2000SWXL（7.8 ×

うにMilliQ水を用いて調整した溶液で溶解した。

300mm）（東ソー株式会社），送液ポンプはLC-

試料６μｌに60unit/mlのACE溶液20μｌおよ20AD（島津製作所㈱）を用い，流速2.0ml/min，

び7.6mM HHL溶液50μｌを添加し37℃で30分間

注入量20μｌで行った。

反 応 さ せ た 。反 応 は 0.1NHCl（和 光 純 薬 工 業）

ペプチドの検出には，検出器（SPD-10AVP，554μｌを加えて停止させた。反応後には酢酸エ

島津製作所㈱）を用い，検出波長は280nmで行っ

チル（ナカライテスク）1.5mlを加えてACEの作た。さらに分子量マーカーとしてBSA（MW：

用により遊離した馬尿酸を振とう抽出し，67,000），シトクロームＣ（MW：13,000），アプ

2500rpm（1000×ｇ），15分間遠心分離を行った。

ロチニン（MW：6,500），リボフラビン（MW：

上清の酢酸エチル層を１ml分取し，100℃，10分376）を用いた。

間の加熱により蒸発乾固させた。乾固した馬尿酸を回収するために１ＭのNaCl溶液を１ml加えボルテックスを行った。溶解した馬尿酸吸光度を© The Ito Foundation

調理加工食肉・肉製品の機能性成分およびその発現に関する研究

228nmで測定した。

33

3 . 1 SDS-PAGEおよびゲルろ過HPLCによる阻害率は酵素分解物の吸光度をＳ，酵素分解物

分子量分布の分析の代わりにMilliQ waterを加えた時の吸光度を調理加工した食肉および食肉製品から，それらＣ，あらかじめACEを失活させてから反応させの消化酵素による消化過程で産生される機能性成た時の吸光度をＢとして次式より求めた。

分（機能性ペプチド）の産生過程を検討した。ま2.8

阻害率（％）＝｛（Ｃ－S/C－Ｂ）｝×100

ず，SDS-PAGEによるサンプル全体のタンパク

DPPHラジカル消去活性の測定

質の分子量分布およびゲルろ過HPLCによる消化DPPHラジカル消去活性の測定は，DPPH分光
測 定 法 に 準 じ て 行 っ た 。す な わ ち ，400 μM
16）による食肉タンパク質分解の経時的変化の観察と分子量分布の測定を行った（Fig.１，２）。

DPPH，MES（2-morpholino-etanesulphonic acid）

対象の生ロース肉から，ペプシン処理によりミ

buffer，20％エタノールを同量ずつ加え，混液をオシン重鎖（MW：230,000）が分解を受け分子作製した。混液を0.9ml分注し，80％エタノール

量が97,000以下の成分に分解された（Fig.1，lane

を240μｌとサンプルを60μｌ加え，20分間反応3）。さらにトリプシンおよびパンクレアチン処理させた。その後，サンプルを加えた順に前述の分により，大部分のアクチン分子（MW：42,000）

光光度計にて吸光度520nmで測定した。また，サも低分子ペプチド（MW12,000以下）に消化されンプルの代わりに，0.2mM Trolox（Sigma社製）

た（lane４）。湿式加熱法（lanes５～７），乾式を使って標準として測定し，検量線からサンプル

加熱法（lanes８～10），誘電電動加熱法（lanes11のTrolox相当量を算出した。MES BufferはMES～ 13）お よ び ス チ ー ム コ ン ベ ク シ ョ ン 加 熱 法

を蒸留水に溶解し，NaOHでpH６に調製したも（lanes14～16）により処理した試料は，ほぼ同様のを使用した。

の酵素処理による分解の程度を示した。ただ，生ロース肉のペプシンによる処理後のバンド（lane３．結果と考察

３）と各加熱処理区のバンド（lane６，
９，12，

一般的に食肉を食する際には，加熱調理した食15）を比較すると，アクチンよりも高分子のバン

肉や肉製品を摂取する場合が多い。本研究は，調ドの量が極めて少ないことから，加熱処理をした

理加工した食肉および食肉製品を摂取した際にロース肉の方が酵素（ペプシン）処理により分解

も，生体調節機能を有する機能性成分が産生されされやすいことが判明した。これらの結果は，豚るかどうかについて検討することが目的である。

ロース肉から調製した筋原線維タンパク質をペプ

これまでの食品素材からの生体調節機能の一つで

シン，キモトリプシン，トリプシンで処理したとある血圧上昇抑制活性（ACE阻害活性）の研究

ころ，どの酵素でも未変性タンパク質に比べ，変は，タンパク質派性ペプチドの検索が中心である性タンパク質は容易に分解された結果３）と一致しことや，Stamlerらの報告17）からタンパク質摂取た。さらにトリプシンおよびパンクレアチン処理量の増加は血圧降下に有効であるとされることな（酵素処理２ｈ）をすると，筋肉タンパク質は分

どから，本実験においても食肉を複数の酵素によ

子量6,000付近を中心としたブロードなバンドにり処理した過程でのタンパク質分解物の出現状況

分解された。

や，分解されて出現したペプチド混合物のACE

一方，生ハム，ロースハムおよびベーコンを用阻害活性やDPPHラジカル消去活性を測定した。

いて検討した結果でも，生ロース肉や各種加熱処© The Ito Foundation

34

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩ ⑪ ⑫ ⑬ ⑭ ⑮ ⑯ ⑰

235,000
120.000
91.000116,000
91,00049,00048.00036,00038.00029.50021.000Fig. 1-a SDS-PAGE pattern of time course hydrolization of digested samples. 1 & 17 (molecular weight marker）； ２ ～４（０，１and 2h digestion time of raw meat）；５～７（０，１and 2 digestion time of boiled meat）；８～10（０，１and 2h digestion time of fried meat）11～13（０，１and 2h digestion time of microwave heated meat）；14～16（０，１and 2h digestion time of superheated steam meat）．

①

⑱

⑲

⑳

㉑
･

㉒
･

㉓
･

㉔
･

㉕･

㉖
･

⑰

235,000

91,000120.000
91.00049,00048.000116,000

38.00036,00029.50021.000Fig. 1-b SDS-PAGE pattern of time course hydrolization of digested samples. 1 & 17 (molecular weight marker）； 18 ～

20（０，１ and 2h digestion time of raw ham）；21 ～ 23（０，１ and 2 digestion time of loin role）；24 ～ 26（０，１and 2h digestion time of bacon）．

© The Ito Foundation

35

M.W.=54,000

M.W.=6,000

M.W.=6,000

M.W.=6,900
M.W.=4,200
M.W.=1,700

M.W.=240

Raw meat (0h)Absorbnce at 280 nm

Absorbnce at 280 nm

調理加工食肉・肉製品の機能性成分およびその発現に関する研究

Raw meat (2h)M.W.=6,200

M.W.=240

Boiled meat(2h)M.W.=6,200

M.W.=6,200

M.W.=240

Fried meat (2h)M.W.=240

M.W.=240

Microwave heated meat (2h)Superheated steam meat (2h)Fig. 2-a HPLC pattern of time course hydorolization of raw meat, boiled meat, fried meat, microwave heated meat andAbsorbance at 280 nm Absorbance at 280 nm Absorbance at 280 nm

superheated steam meat.

M.W.=6,200

M.W.=54,000

M.W.=6,000

M.W.=1,500

M.W.=240

Rawham (0h)Rawham (2h)M.W.=8,600

M.W.=6,000

M.W.=1,500

M.W.=240

Loin roll (0h)Loin roll (2h)M.W.=8,800

M.W.=5,800

M.W.=240

M.W.=240

Bacon (0h)Bacon (2h)Fig. 2-b HPLC pattern of time course hydorolization of raw ham, loin roll and bacon.

理したロース肉から得られた結果とほぼ同様の筋（Fig.2a & 2b）。すなわち，加熱処理をしていない

肉タンパク質の分解パターンが観察された

生ハムと加熱工程が加わったロースハムおよび© The Ito Foundation

36

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ベーコンでは，筋肉タンパク質の変性の度合いに処 理 し た ロ ー ス 肉 は い ず れ も 93 ～ 95 ％ の 高 い起因した酵素処理による筋肉タンパク質の分解様ACE阻害率を示した。一方，３種類の加工食品

式が認められた。

から得られた酵素分解物は，86～88％のACE阻HPLCの分析結果より分子量20,000Da以上の食害活性を示した。

肉タンパク質は6,000Da以下に分解されることが以上の結果から，市販の豚ロース肉を用いて，明らかになり，各種プロテアーゼとの反応によるそれらを各種加熱調理後，消化酵素のペプシン，

高分子タンパク質の低分子化が確認された。豚肉

トリプシンおよびパンクレアチンで処理すると高の加工調理処理によりペプシン消化による影響のいACE阻害活性が発現することが認められた。

受 け や す さ に 若 干 の 違 い が 生 じ ，分 解 過 程 のまた，本実験条件下では，加工食肉製品も豚ロー

HPLCパターンは異なったが，トリプシンおよびス肉を各種加熱調理した試料と比較すると若干低

パンクレアチン処理後（２ｈ）のHPLCパターン

い値であるが，既知のACE阻害ペプチドであるは，ほぼ同様のパターンを示した。ペプシンとト

カルノシンよりも高いACE阻害活性を有するこリプシンで２時間酵素消化した食肉由来ペプチドとが明らかになった。

のピークを各種調理加工および食肉製品で比較す

3.3

ると，どれも分子量6,000～1,000Daの間にピーク

Fig.４に，生ロース肉，各種調理加工処理ローを有していることが確認された。いずれの分解物

ス肉および３種類の食肉製品をペプシン，トリプ

も低分子量のピークの増加が認められ，機能性ペシンおよびパンクレアチン処理後得られた酵素分

プチドの発現が期待された。

解物の抗酸化活性をDPPHラジカル消去法により3.2

ACE阻害活性の測定比較検討

DPPHラジカル消去活性の比較検討測定した結果を示した。

生ロース肉，各種調理加工処理ロース肉および各種加熱調理肉は，ペプシン処理１時間，その３種類の食肉製品ともに消化酵素による処理で，後のトリプシンおよびパンクレアチン処理１時間

食肉タンパク質のほとんどが6,000Da以下に分解の合計２時間の酵素処理で，高いDPPHラジカル

されていることが確認された。そこで酵素処理に消去活性を発現した。これらの結果は食肉由来機

よるACE阻害活性の比較検討を行った。

能性成分の畜種別差異の比較検討をした際のFig.３に，生ロース肉，各種調理加工処理ロー

DPPHラジカル消去活性18）よりもわずかに高い値

ス肉および３種類の食肉製品をペプシン，トリプであった。また，各種加熱調理豚ロース肉およびシンおよびパンクレアチン処理後の，各種加熱処

生ハムを用いて，ペプシン，トリプシンおよびパ

理および食肉と酵素処理により0.45μｍセルロー

ンクレアチンで処理するとDPPHラジカル消去活

スアセテートメンブレンフィルタを透過した画分性が増加する傾向が認められた。

のACE活性阻害率を示した。また，ペプシン処

一方，ロースハムおよびベーコンを酵素処理す

理１時間，その後のトリプシンおよびパンクレア

ると有意に高いDPPHラジカル消去活性を示し

チン処理１時間の合計２時間の酵素処理で，既知た。この結果は，これらの製品を製造する際に添のACE阻害剤であるカルノシンの阻害活性と同加される調味料等に含まれる抗酸化物質由来の活等かそれ以上のACE阻害活性が発現することが性が付加されたものと考えられる。我々は，各種認められた。なお，有意差は認められないものの，

食肉の消化酵素分解物における抗酸化作用の比較

湿式加熱法，乾式加熱法，誘電電動加熱法により検討を行い，牛肉，豚肉，鶏肉の消化酵素分解物© The Ito Foundation

調理加工食肉・肉製品の機能性成分およびその発現に関する研究

37

ACE inhibitory activity(％)

100
95
90
85
80
75

Ra
w

m
ea
Bo
t
ile
d
M
m
ic
ea
ro
Fr
t
w
ie
a
d
Su
ve
m
pe
he
ea
rh
at
t
ea
ed
te
m
d
ea
st
t
ea
m
m
ea
t
Ra
w
ha
m
Lo
in
ro
ll
Ba
co
n

70

Fig. 3 Associated graph shows the value of ACE inhibition percentages.

DPPH activity (μM TE)

400
350
300
250
200
150
100
50

n
co

ll

Ba

ro
in

m
ha

w

Lo

t
ea
m

Ra

ea

Su

pe

rh

ea

te

d

st

ea

m

m

at
ed

e

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d
av
w
ro

ic
M

t

t
ea
m

ea
m

Fr
ie

d
ile
Bo

Ra

w

m

ea

t

t

0

Fig. 4 Effects of various kinds of heat treatment and processing on DPPH radical scavenging activity of each sample.

TE: Trolox equivalent.

に，抗酸化物質であるカルノシンと同等以上の抗トリプシンおよびパンクレアチンで処理すると高酸化活性を認めている 。本研究の結果では，そい抗酸化活性が発現することが認められた。

19）の際に豚肉で得られた以上の高い抗酸化活性が確
認できた。

４．要

約

以上の結果から，市販の豚ロース肉を用いて，本研究は，調理加工した食肉・肉製品を摂取しそれらを各種加熱調理後，消化酵素のペプシン，た際にも，生体調節機能を有する機能性成分が産© The Ito Foundation

38

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

生されるかどうかや，それら機能性成分の発現様式についても検討することを目的に実施した。
SDS-PAGE分析により，各種加熱処理をした
豚ロース肉の方がペプシン処理により分解されやすいことが判明した。これは，未変性タンパク質に比べ，変性タンパク質は容易に酵素分解されたためと考えられた。さらにトリプシンおよびパン
クレアチン処理をすると，各種加熱ロース肉および肉製品ともに，筋肉タンパク質は低分子化し，
分子量6,000付近を中心としたブロードなバンドに分解された。またHPLC分析からも，各種加熱
肉および肉製品ともにそれらの酵素分解物は，分子量6,000～1,000Daの間にピークを有していることが確認された。いずれの分解物も低分子量のピークの増加が認められ，機能性ペプチドの発現が期待された。
各種加熱調理後，消化酵素のペプシン，トリプ
シンおよびパンクレアチンで処理すると高いACE阻害活性が発現することが認められた。また，加工食肉製品も豚ロース肉を各種加熱調理した試料と比較すると若干低い値であるが，既知のACE阻害ペプチドであるカルノシンよりも高い
ACE阻害活性を有することが明らかになった。
さらに，各種加熱処理肉および食肉製品ともに，高い抗酸化活性の発現も認められた
以上，調理加工した食肉・肉製品を摂取した際にも，生体調節機能を有する機能性成分が産生されることが明らかになった。
文献１） 斉藤忠夫，西村敏英，松田幹編著：最新畜産物利
用学，朝倉書店，123～124，2007．

２） Arihara, K., Nakashima, Y., Mukai, T., Ishikawa,T., Itou, M., Meat Sci.，57，319～324，2001．
３） Katayama, K., Fuchu, H., Sakata, A., Kawahara, S.,
Yamauchi, K., Kawamura, Y., Muguruma, M., AsianAust. Anim. Sci. J.，16, 417～424，2003．
４） Katayama, K,. Tomatsu, M., Fuchu, H., Sugiyama,M., Kawahara, S., Yamauchi, K., Kawamura, Y.,
Muguruma, M,. Anim. Sci. J.，74, 53～58，2003．
５） Katayama, K., Tomatsu, M., Kawahara, S.,
Yamauchi, K., Fuchu, H., Sugiyama, M., Kawamura,Y., Muguruma, M., J. Agric. Food. Chem.，52, 771～
775，2004．
６） Katayama, K., Jamhari, Mori, T., Kawahara, S.,
Miake, K., Kodama, Y., Sugiyama，M., Kawamura, Y.,
Nakayama, M., Mayuyama, M., Muguruma, M. J.
Food.Sci., 72，S702～706，2007．
７） Katayama, K., Anggraeni, H. E., Mori, T.,
Ahhmed, A. M., Kawahara, S., Sugiyama, M.,
Nakashima, T., Mayuyama, M., Muguruma, M. J.
Agric. Food. Chem.，56, 355～360，2008．
８） Muguruma, M., Ahhmed, A. M., Katayama, K.,
Kawahara, S., Maruyama, M., Nakamura, T., Food.
Chem.，114, 516～522，2009．
９） Ahhmed, Muguruma, M., Meat Sci. ， 86 ， 110 ～
118，2010．
10） 六車三治男，日本暖地畜産学会報，55（２），85～91，2012．
11） 竹田志郎，久保田大樹，竹之山愼一，河原聡，六車 三 治 男 ，日 本 暖 地 畜 産 学 会 報 ，57（２），141 ～
145，2014．
12） Laemmli, U. K., Nature., 227，680～685，1970．
13） 岡田雅人，宮崎香：タンパク質実験 ノート抽出と分離精製，羊土社，29，1996．
14） Murphy, J. B., Kies, M., W. Biochim. Biophys.
Acta, 45，382～384，1960．
15） Cushman, D. W., Cheung, H. S., Biochem.
Pharmacol.，20，1637～1648，1971．
16） Balyasnikova, I. V., In Vitro Cell Dev. Biol.
Anim.，34，545～554，2001．
17） Stamler, J., Elliott, P., Kesteloot, H., Nichols, R.,
Claeys, G., Dyer, A. R., Stamler, R., Circulation., 94，
1629～1634，1996．
18） 六車三治男，久保田大樹，河原聡：平成23年度食肉に関する助成調査成果報告書，（公財）伊藤記念財団，30，７～18，2012．
19） 竹田志郎，久保田大樹，竹之山愼一，河原聡，六車 三 治 男 ，日 本 暖 地 畜 産 学 会 報 ，57（２），141 ～
145，2014．

© The Ito Foundation

39

牛肉の匂いに及ぼす熟成と加熱調理の影響
The effect of aging and heat-cooking on the profile of aroma volatiles of
beef

小

林

正

人・佐々木

整

輝

（一般社団法人家畜改良事業団家畜改良技術研究所）

Masato Kobayashi and Seiki Sasaki（Maebashi institute of animal science, Livestock improvement association of Japan, Inc）

In this study, the aromatic volatiles were analyzed from beeves, which were aged bycommon wet aging, long term aging as dressed carcass and dry-aging. The samples wereobtained from national meat suppliers, and those were aged with usual manner of their own
processing plants. Raw meat samples and heat-cooked samples were extracted by organic
solvent and the resultant fractions were analyzed by the gas chromatography and the gas
chromatograph-mass spectrometry（GC-MS）. The variety and the amount of the volatiles
increased dramatically during the dry-aging, however no appreciable change was observed in
the long term aged beeves. The volatiles increased during the cooking with heat.
The GC-MS analysis revealed that lactones, alcohols, aldehydes, acetoin, pyrazine
derivative were main aromatic volatiles. In addition to those compounds, 2-phenylethyl alcohol
was newly identified in sweet and floral fraction. 2-Phenylethyl alcohol is well known as acomponent of a flavor of tomato and other fruits, and is also known as an attractive scent for
insects of roses and other flowers. However, there is no reports about beef aroma. Although,2-phenylethyl alcohol was scarcely detected in the Holstein beef before aging, it increased
dramatically during the dry-aging and remained in the beef after the cooking with heat. Thesefindings suggested that 2-phenylethyl alcohol may contribute to the floral aromas of dry-aged
beef.

１．目

ジング技術が普及するに伴い，熟成によって生じ的る香りも注目されている。しかし，牛肉の香りを食品のおいしさは，味，匂い，テクスチャーの分析する適切な方法がないため研究成果は必ずし３要素で構成されるが，匂いは味と感じられるたも多くはない。そこで，本研究では，牛肉の匂い

め，好ましい香りはおいしさにとって最も重要な物質の効果的な分析法を開発し，熟成した牛肉の要素と考えられている。牛肉の加熱香気はおいし

好ましい香りの候補物質を絞り込み，物質を同定さの重要な要素とされ，さらに近年，ドライエーすることを目的とした。

© The Ito Foundation

40

平成26年度２．方
2.1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

キ ャ ピ ラ リ ー カ ラ ム （InertCAP PureWAX,

法

0.25mm×60ｍ）を用い，120℃で２分間加熱して気化した物質をトラップして昇温分析した。相対牛肉

乳雄肥育牛肉については，22日間から53日間ドピーク強度はジブチルヒドロキシトルエンを内部

ライエージングした肉を８検体およびと畜後11日

標準として算出した。質量分析は，ガスクロマト

以内の冷蔵保存牛肉８検体を用いた。日本短角種

グラフ質量分析装置（島津GCMS-QP2010Ultra，については，４日間から35日間枝肉として冷蔵庫

以下GC/MS）を用い，キャピラリーカラム（DB-内で保存・熟成した肉15検体，黒毛和種について

WAX, 0.25mm×60ｍ）を用い，昇温分析した。

は９日間から30日間冷蔵保存・熟成した肉13検体

検出した主なピークをNIST（2014年版）データを用いた。熟成は，国内の食肉加工販売業者の自ベースを用いて検討し化合物名を推定した。

社マニュアルに従って行われた。肉試料は，入手後分析まで－30℃で凍結保存し，分析時に解凍し3.1てひき肉とした。
2.2

３．結果および考察
揮発性物質の抽出および精製法

揮発性物質は，牛肉を90％メタノールとヘキサ

抽出

揮発性物質の分析には，20ｇのひき肉を生またン混液で抽出し，匂い物質を90％メタノールに抽は170℃のホットプレートで軽く焦げ目がつくま出し，同時に単純脂質をヘキサンで抽出除去する

で焼き，90％メタノール40mlとヘキサン40mlを方法が有効で，これにより，多量に含まれる中性

加えて30秒間ホモジナイズし，メタノール層を回脂肪などの単純脂質がほぼ除去された。水溶性物

収し，さらに４回ヘキサンで洗浄した。メタノー

質の除去はジクロロメタン・メタノール・水系混

ル層にジクロロメタン20mlと0.1Ｍリン酸緩衝液

合溶媒からジクロロメタンに転溶することで，牛（pH6.0）40mlを加えて混和後静置し，ジクロロ

臭い酸臭の除去はpH６のリン酸緩衝液を用いる

メタン層を分取して硫酸ナトリウムで脱水し，つことで，匂い物質と極性が類似した未同定の脂質いでシリカゲル（ワコーゲルＣ-100）を３ｇ加えはシリカゲルを用いたバッチ法により除去するこて混和後ろ過し，ヘキサンを２ml加えて減圧濃とが有効であった。

縮して最終的に１mlとし，その20μｌを分析に

匂い物質は弱い極性を持ち，水溶性があるので，牛肉を水と加熱して得た脂質層を加温して揮用いた。
質量分析用試料は，ひき肉１㎏を用い，上記の発した物質を分析する一般的な方法１）では，匂い50倍規模で抽出操作し，ヘキサン５mlに転溶し物質が熱水に残留し，また脂肪のトラップ効果のた。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー

ために脂肪層からの回収率が低いということが懸で 精 製 し ，さ ら に ヘ キ サ ン 溶 液 を 固 相 抽 出

念されるが，今回の方法では，脂肪交雑の高い牛（Agilent, BondElute SI）により分画し，匂いを肉からも揮発性物質を抽出することができた。

有する分画を１mlヘキサン溶液とした。
2.3

3.2

ガスクロマトグラフ

揮発性物質の検出

生の乳雄牛肉に含まれる主要な揮発性物質は，揮発性物質の分析は，ヘッドスペースサンプ

平均13種類であり（Fig.1A），加熱調理によってラーを装備したガスクロマトグラフ装置

わずかに増加した（Fig.1B）。ドライエージング（PerkinElmer, Clarus580GC，以下GC）を用い，された乳雄牛肉では，生の状態で平均78種類の物© The Ito Foundation

41

牛肉の匂いに及ぼす熟成と加熱調理の影響
A

C

10
1
0.1

0.01
0

B

20

40

80
100
time(min.)Raw Holstein beef before aging

0.1

0.010

20

40

0.1

20

40

60

80

100
time(min.)80

100
time(min.)

100

Relative abundance

1

1

Raw dry-aged Holstein beef

D

10

10

0.01
0

60

100

Relative abundance

100

Relative abundanceRelative abundance

100

10
1
0.1

0.010

60

80
100
time(min.)Cooked Holstein beef before aging

20

40

60

Cooked dry-aged Holstein beef

Fig. 1 Relative abundance of volatiles in raw and cooked meat1
0.1

Relative abundance

10

20

30

40

50

60

70

90 100time (min.)Raw Japanese Short Horn beef aged as carcass

10
1
0.1
10

20

30

40

50

60

70

80

90 100time (min.)Cooked Japanese Short Hornbeef aged as carcass

10
1
1

0.1

0.01
0

80

100

0.01
0

100

Relative abundance

10

0.01
0
B

C

100

10

20

30

40

50

60

70

80

90 100time(min.)80

90 100time(min.)Raw Japanese Black beefD

100

Relative abundanceRelative abundance

A

10
1
0.1

0.01

0

Fig. 2 Relative abundance of volatiles in raw and cooked meat

© The Ito Foundation

10

20

30

40

50

60

70

Cooked Japanese Black beef

42

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

質が検出され（Fig.1C），加熱調理によって平均の状態で揮発性物質が少なく，加熱により揮発性65種類の物質が検出された（Fig.1D）。枝肉で冷

物質数が増加した。

蔵保存した日本短角種牛肉では，生の状態で33種3.3類の物質が検出され（Fig.2A），加熱調理によっ

固相カラムで分画した試料を用いて，揮発性物ても検出数は変化しなかった（Fig.2B）。黒毛和質の同定を行った。その結果，94種類の物質が同種では，生の状態で平均18種類の物質が検出され定され，匂いを持つ物質は，ラクトン類が16種類，（Fig.2C），加熱調理によって保持時間が10分から

アルコールが23種類，アルデヒドは11種類，ケト30分の物質が増加し，相対ピーク強度も増加した

ンが３種類，2,5-ジメチルピラジンおよびバニリ（Fig.2D）。

ンであり，これらは既報とおおむね一致していた

これらの結果から，乳雄牛肉では，ドライエー

揮発性物質の同定

２～５）（Table１）。

ジングによって揮発性物質が増加し，加熱調理後

ドライエージング香気は，固相抽出によりナッも揮発性物質が肉に含有されることが確認されツ様で甘い花のような匂い分画，グリーン臭分た。枝肉で熟成された日本短角牛肉では，検出さ画，脂っぽく牛臭い分画に分かれたが，甘い花のれた物質数がドライエージング肉の約半数であような分画で保持時間50.2分に特徴的なピークがり，匂いは明らかに弱かった。黒毛和種では，生検出された。この物質は，分子イオンが122，ベー

Table1 Chemical compounds detected in the extract from aged beefgroup

compoundgroup

lactoneγ-Butyrolactone
γ-Hexanolactone（3H）
2-Furanone, 5-ethyldihydro-5-methylγ-Heptanolactone
γ-Nonalactone
γ-Decalactone
γ-Undecalactone（3H）
2-Furanone, dihydro-5-（2-octenyl）γ-Crotonolactone
δ-Dodecalactone
2H-Pyranmehanol, tetrahydro-2,5-dimethylδ-Valerolactone
δ-Tetradecalactone
2H-Pyran-2-one, terahydro-6-undecyl2H-Pyran-2-one, terahydro-6-tridecylOctadecen-4-olide

aldehyde

Butanal, 3-methyl-alcohol

1-Butanol
1-Butanol, 2-methyl1-Butanol, 3-methyl3-Buten-1-ol, 3-methyl2-Pentanol
1-Hexanol
2-Hexanol
3-Hexanol
1-Heptanol
2-Heptanol
1-Hexanol, 2-ethyl2-Nonanol
1-Octanol
2-Octen-1-ol
1-Nonen-4-ol
1-Nonanol
1-Dodecanol
1-Tetradecanol
1-Hexandecanol
3-Heptadecanol

HexanalHeptanal
NonanalBenzyl alcohol
Phenylethyl Alcohol

Pentanal, 3-methylPentadecanalcompoundketoneAcetoin
3-Hexanone
2-Heptanone

9-Octadecenal

Vanillin

Vanillin

Benzaldehyde

pyrazine

Pyrazine, 2,5-dimethyl

Hexadecanal
Heptadecanal
Octadecanal© The Ito Foundation

43

牛肉の匂いに及ぼす熟成と加熱調理の影響スピークが91であり，これに加えてフラグメント分析した結果，保持時間が一致したことから，

イオンは104，103，102，92，91，89，77，65，

フェニルエタノールと同定した。

63，51，50，39，31であり，これらはGC/MSにラクトン類は2（3H）―フラノン誘導体（γ-ラク

内蔵されている２－フェニルエチルアルコールトン）と2H-Pyran-2-one誘導体（δ-ラクトン）（以下フェニルエタノール）のNISTのデータベーであり，甘い花のような匂いを持つ分画で多く検スと一致し，類似度は97であったことから，フェ出された。ラクトン類は，桃の缶詰のような匂い

ニルエタノールと推定された。そこで標準物質をがあるが，焼肉の匂いとは質が異なることから，

90
90Relative abundance

70
60
50
40
30
20
10
0
0

22～25

50～53days

4～10

Dry-aged Holstein beef

29～35days

Japanese Shorthorn beef
aged as dressed carcass

Fig. 3 Relative abundance of phenylethanol in dry-aged Holstein beef and Japanese Short Horn beef aged as dressedcarcass

80

Rerative abundance

70
60
50
40
30
20
10
0
raw

cookedbefore aging
Holstein beefraw

cookedraw

cookedraw

cookeddry-agedJapanese Black beef

Fig. 4 Relative abundance of phenylethanol in raw and cooked meat

© The Ito Foundation

Japanese Short Horn beef

44

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

焼肉の匂いの中心物質と考えるのは現状では難しい。 2（3Ｈ）―フラノン誘導体と2H-Pyran-2-one

約４．要

誘導体は，水酸基が結合すると典型的な甘い香り

牛肉の匂い物質の効果的な分析法を開発し，異を生じるが，今回の結果では水酸基を結合したそなった方法で熟成した牛肉の好ましい香り物質のれらの誘導体は確認されなかった。

絞り込みと同定に取り組んだ。一般的な含気熟

2,5-ジメチルピラジンは，ドライエージング肉

成，枝肉での長期熟成，およびドライエージングのナッツ様の匂いに似た焦がした豆のような匂い

牛肉を用いて，熟成および加熱調理によって生じを持ち，バニリンは，甘い匂いを持つ物質である

る揮発性物質ならびに匂い物質を調べた。牛肉が，今回検出されたピークはいずれも小さく，匂は，国内の食肉加工販売業者から，各社のマニュ

いの中心物質とは考えにくかった。

アルに従って熟成されたものを用いた。香気分画

アルコール類とアルデヒド類は，グリーン香気

は，ひき肉にした試料から溶媒抽出によって抽出を持つが，ナッツ様の匂いとは異なっている。ケ

し，GCおよびGC/MSで分析した。揮発性物質は，

トン類のうち最も量が多かったのはアセトインでドライエージングによって著しく増加したが，枝あり，バター様の脂っぽい匂いがあることから，肉での長期熟成では大きな変化が見られなかっドライエージング肉の匂いに関与することが推定た。また，揮発性物質は加熱調理によって増加しされた。

た。匂いを有する物質として，アセトイン，アル3 . 4 ２―フェニルエタノールの熟成および調コール類，アルデヒド類，ラクトン類が検出されたほか，今回新たにフェニルエタノールの存在が理による変化
今回新たに同定されたフェニルエタノールにつ確認された。フェニルエタノールは，ドライエー

いて，熟成および調理による変化を検討した。乳ジングによって著しく増加し，加熱調理後も大半雄肉では，フェニルエタノールはドライエージン

が肉に残留することから，ドライエージング肉にグ実施前の生肉では検出されず，ドライエージン

含まれる甘い花様の匂いに寄与することが示唆さグ22日～25日で高く，50日～53日で低い値であっれた。

た（Fig.３）。これは，２ヶ月以上の長期間のドライエージングを行うと特有の匂いが消滅すると謝

辞いう食肉加工業者の経験則と符合する結果であっ本研究で用いた熟成肉の一部は，株式会社宝山

た。一方，日本短角種の枝肉での保存では，明らの荻澤紀子氏を中心とするドライエージングに取かな増減は見られなかった。両者の熟成期間は同り組む食肉加工者および料理店の皆さんから提供等であるので，熟成の方法によって生成量が異ないただいた。また，ガスクロマトグラフ質量分析

るものと考えられた。

装置による物質の同定は，株式会社島津製作所分

加熱調理によるフェニルエタノールの変化を検析計測事業部グローバルアプリケーション開発セ

討した結果，乳雄生肉では加熱調理でわずかに検ンター斎藤良弘氏に依頼した。ここに感謝する。

出され，ドライエージング肉では加熱調理で減少したものも見られた（Fig.４）。黒毛和種牛肉では，加熱調理で増加し，日本短角種牛肉では明らかな変動はなかった。

文
献１） Watanabe, A., Ueda, Y., Higuchi, M., Shiba, N. :Analysis of volatile compounds in beef fat bydynamic-headspace solid-phase microextraction© The Ito Foundation

牛肉の匂いに及ぼす熟成と加熱調理の影響
combined with gas chromatography-mass
spectrometry, Journal of Food Science，73，1220～
1225，2008．
２） Hartmut, M., Liebich, David, R., Douglas, Albert,
Zlatkis, Francoise, Mueggler-Chavan, A. Donzel :Volatile components in roast beef, Journal of
Agricultural and Food Chemistry ， 20 ， 96 ～ 99 ，
1972．
３） 佐藤雅彦，中村豊郎，本間清一，阿部宏喜，佐藤朗好，藤巻正生：和牛，乳牛および輸入牛肉の香気

45と呈味成分について，日本畜産学会報，65，142～
148，1993．
４） 松石昌典，久米淳一，伊藤友己，高橋道長，荒井
正純，永富宏，渡邉佳奈，早瀬文孝，沖谷明紘：和牛肉と輸入牛肉の香気成分，日本畜産学会報，75，
409～415，2004．
５） 田口聡子，高橋理沙，安原久美子，浅野雅子，飯田文子：調理法の異なる黒毛和種去勢牛の香気成分について，日本女子大学紀要，60，23～27 ，2013．

© The Ito Foundation

46

短波帯交流電界による真空包装食肉加工品の迅速殺菌
Inactivation of microorganisms in packed meat products by radio
frequency heating

植

村

邦

彦

（農業・食品産業技術総合研究機構食品総合研究所）

Kunihiko Uemura（National Food Research Institute, NARO）

Plastic packed meat is popular because of its convenience and its sanitation. To inactivate
microorganisms in a beef, it is therefore necessary to heat it by a heat source from outside.
Unfortunately, heating degrades the color and quality of the meat. Radio-Frequency（RF）
heating was thus used to inactivate microorganisms in a plastic packed beef, andmicroorganism inactivation by RF heating was subsequently compared to that by conventional
heating. 5 logarithmic order reduction of the Escherichia coli in packed beef was achieved by
RF heating for 45 s, the RF heating time was reduced to one-18th that of conventional heating.
Some discolor of the beef was prevented by the shorter heating time of RF hearing.

１．目

クロ波加熱の間に位置する周波数帯の交流のこと的を称する。ジュール加熱はオーミック加熱とも呼2011年４月下旬から５月上旬にかけて，富山県

ばれ，一対の電極間に食品材料を密着させて食品を中心に５人の死亡者を出したユッケによる腸管材料に流れる電流により加熱するもので，魚肉す

出血性大腸菌食中毒事件が発生し，消費者の食肉

り身，パン生地，各種ソース，豆腐などの加熱調の安全性に関する不安が高まっている。食肉の安理に利用されている１，２）。また，ジュール加熱の電全性を高めるために，一般的に加熱処理が行われ界強度を100倍以上に高めた交流高電界処理と呼ているが，ユッケのように加熱による食肉の色やばれる液状食品の殺菌処理が開発され，果汁の新成分の熱変性が望ましくない場合がある。そこ

しい殺菌技術として実用化が進められている３～６）。

で，本研究では短波帯加熱を用いて牛肉の迅速・一方，マイクロ波加熱は，家庭に普及した電子レ均一加熱を行うことで，牛肉の色変化を抑えつンジで利用されているように，マグネトロンで作

つ，牛肉内部の十分な殺菌を実現することを目指られたマイクロ波の電磁波をレンジの庫内に導入した。短波帯加熱（RF）とは３～30MHzの周波

し，レンジ庫内に形成した定在波により，庫内の数で，300kHz以下の周波数を用いるジュール加

食品を非接触で加熱するものである。周波数が高熱と，300MHz～３GHzの周波数帯を用いるマイ

くなると，電極と食品が密着していなくとも，電© The Ito Foundation

47

短波帯交流電界による真空包装食肉加工品の迅速殺菌

気エネルギーが食品に伝わる性質をもつようにな

2.2

る。したがって，短波帯の交流もこの性質を有し恒温水槽を80℃に設定し，大腸菌を植菌した牛ており，電極と食品の間にプラスチックフィルム

ひき肉をジプロックに入れたものを温水中に一定のような絶縁膜を隔てた場合でも，短波帯の交流

時間浸漬することにより加熱した。加熱中は肉のエネルギーを食品に伝え，食品を加熱することが中心および表面に挿入した熱電対により１秒ごと可能であることを味噌の加熱で示した 。野菜やの温度を測定した。加熱後は，ジプロックごと牛畜肉の短波帯加熱については，欧州で報告例があ

ひき肉を速やかに氷水中に浸漬して冷却した。

７）

る

2.3

が，包装済み畜肉の短波帯加熱に関して，

８～15）

2.1

短波帯加熱処理150mm×150mm×106mmの水槽中に150mm×

これまでに報告例はない。
２．方

従来の加熱処理160mm × ３ mm の チ タ ニ ウ ム 製 電 極 ２ 枚 を法

100mm間隔で平行に設置し，両電極間の中央に肉塊を入れたジプロックを配置し，ジプロックの試験材料

近くのスーパーで購入した牛肉（青森県産，肩外側の水槽内に60℃の温水を満たした（Fig.１）。

ロース）を材料として使用した。指標菌として，肉塊の中心，表面，および水道水中に光ファイ

大腸菌Escherichia coli（JCM1649）を10mLの液バー温度計（Neoptx, RFX-04，Canada）を挿入

体培地（標準ブイヨン，栄研）に接種し，37℃でし，１秒ごとに各部の温度を記録した。27MHz,

12時間振とう培養して大腸菌培養液を得た。600

4kW の 短 波 帯 高 周 波 電 源（Advanced Energy,

ｇの牛肉をミートチョッパーでひき肉にしたもの

CESAR2740, USA） か ら 整 合 器 （Asuteck,に大腸菌培養液を10mL接種し，手で均一に分布

NM5M27, Japan）を経由して，両電極に２kW短するように混錬した。植菌したひき肉を約60ｇず波の短波帯交流を印加した。肉塊の中心部の温度つ採取し，ハンバーグ状に整形した牛ひき肉を加が所定の値に到達したら短波帯交流の印加を停止

熱用の試料とした。

し，直ちに，氷水に浸漬して冷却した。

Optical ﬁber
thermometer

Vi

Beef burger
Plastic bag
Tap water

Fig. 1 RF heating setup and the equivalent circuit© The Ito Foundation

C ﬁlm

R beef

C ﬁlm

48
2.4

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

釈培養し，37℃で24時間培養後，形成されたコロ

色差の測定

未加熱および各種加熱を行った牛ひき肉の表面
お よ び 中 心 部 の 色 を 分 光 型 色 彩 差 計（MinoltaMC-5）で測定し，赤みの強度を示すａ＊ 値を色３．結果および考察
3.1

変化の指標とした。
2.5

ニー数をカウントした。

残存菌数の測定

温度履歴

Fig.２に，ジプロックに入れた60ｇの牛ひき肉

加熱処理した牛肉ひき肉隗の中心部および周辺を80℃の温槽中で15分間浸漬加熱した牛ひき肉の部から約３ｇサンプルを採取した。サンプルを10

中心部および表面部の温度変化を示す。80℃の温倍量のリンゲル溶液とともにストマッカーで粉砕

浴中で，15分間加熱した時点で，ひき肉中心部おした抽出液を菌測定用試料とし，適宜リンゲル溶

よび表面の温度はそれぞれ73℃，78℃まで上昇し液で希釈したものをデスオキシコレート培地に混た。一方，２kWのRF加熱を行った場合，牛ひき9080Temperature [℃]

70
60
50
40

Center30

Surface

20
10
0

0

200

400
600
Heating time [s]

800

1000

Fig. 2 Temperature records at the center and surface of a beef burger by a conventional heating at 80℃

9080
Temperature [℃]

70
60
50

Center40

Surface30

Tap water

20
10
0

0

10

20

30
40
50
Heating time [s]6070Fig. 3 Temperature records at center and surface of the beef burger and in tap water by RF heating© The Ito Foundation

49

短波帯交流電界による真空包装食肉加工品の迅速殺菌

肉中心部の温度はRFを印加した50ｓまで直線的加熱した牛ひき肉の中心部（in）と表面（out）に上昇し，中心部および表面部の温度はそれぞれに残存した大腸菌数を示した。図より，従来加熱

81℃，79℃まで上昇した。周辺の水は肉よりも昇の５分と短波帯加熱の45ｓは約２対数オーダー，

温速度が遅く，RF印加終了時に68℃まで上昇し従来加熱の15分と短波帯加熱の60秒が約５対数た（Fig.３）。

オーダーに減少した。

3 . 2 従来加熱処理および短波帯処理が牛肉中

3 . 3 従来加熱処理および短波帯処理が牛肉のの大腸菌に与える影響

色に与える影響

Fig.４Ａ，Ｂにそれぞれ従来加熱および短波帯

Fig.５Ａ，Ｂにそれぞれ従来加熱および短波帯

1.0E＋08

1.0E＋08
1.0E＋07

Survived E.coil [cfu/g]

Survived E.coil [cfu/g]

1.0E＋07
1.0E＋06
1.0E＋05
1.0E＋04
1.0E＋03
1.0E＋02
1.0E＋01
1.0E＋00

m
at

re

nt

U

A

t
en

m

(5

H

C

,

in

H

C

)
in

,
in

)
ut

o

m

(5

H

C

,

)
in

in

5m

(1

H

C

,
in

1.0E＋06
1.0E＋05
1.0E＋04
1.0E＋03
1.0E＋02
1.0E＋01
1.0E＋00

)
ut

5m

m
at

re

nt

(1

U

Conventional heating（CH）

t

en

o

B

RF

n)

,i

s
45

(

RF

,
5s

(4

t)

ou
RF

n)

,i

s
50

(

RF

,
0s

t)

ou

(5

Redio Frequency heating（RF）

25.00

25.00

20.00

20.00

Redness a*

Redness a*

Fig. 4 Effect of heating time on survived E. coli by conventional heating and radio frequency heating

15.00
10.00
5.00

A

t
en

m

t
ea

r

nt

10.00
5.00

0.00

U

15.00

H

C

in

5m

(

)

n
,i

C

H

m

(5

,

in

H

C

)

t
ou

in

5m

(1

Conventional heating（CH）

)

n
,i

H

C

,

5m

in

0.00

)

t
ou

t

en

re

nt

(1

U
B

m
at

RF

(4

,
5s

)

RF

)

ut

in

(4

5

o
s,

RF

(5

,
0s

)

RF

o
s,

0

(5

Redio Frequency heating（RF）

Fig. 5 Effect of heating time on the color by conventional heating and radio frequency heating© The Ito Foundation

)

ut

in

50

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

加熱した牛ひき肉の断面（in）と表面（out）の色差計の赤み成分（ａ ）の変化を示した。従来＊

加熱および短波帯加熱に関わらず，温度が高いほ
ど赤みが低減した。ただし，短波帯加熱を行った
サンプルは従来加熱のものよりいずれも，５ポイント程度，赤みが高いことがわかった。
４．要

約

プラスチック包装された畜肉加工品を均一，迅速に加熱および殺菌する目的で，短波帯加熱を行った。プラスチックパックの牛ひき肉に均一に添加した大腸菌は，水中で27MHz，２kWの短波帯交流の印加により，５対数オーダー低減した。
従来加熱で同程度の殺菌効果を与えるためには，80℃の温浴に15分間浸漬する必要があった。また，短波帯加熱は処理時間が短いため，牛肉の変色が抑えられることがわかった。短波帯の電力を高めて加熱効率を上げることにより，包装済みの牛肉をさらに短時間で均一加熱することが可能になると考えられ，ユッケのような生食に近い牛肉
加工食品を提供できることが期待される。
文献１） de Alwis, A. A. P., Fryer, P. J.：The use of direct
resistance heating in the food Industry, Journal of
Food Engineering, 11, 3e27, 1990．
２） Zhi-Sheng Liua, Sam, K. C., Changa, Li-Te Li,
E i z o T a t s u m i ：E f f e c t o f s e l e c t i v e t h e r m a ldenaturation of soybean proteins on soymilk
viscosity and tofu’s physical properties, Food
Research International，37，８，815～822，2004．
３） Uemura, K. Isobe, S.：Developing a new
apparatus for inactivating Escherichia coli in saline
water with high electric field AC, J. FoodEngineering，53，203～207，2002．
４） U e m u r a , K . I s o b e , S ：D e v e l o p i n g a n e w
apparatus for inactivating Bacillus subtilis spore inorange juice with a high electric field AC underpressurized conditions, J. Food Engineering, 56 ，
325～329，2003．
５） Uemura, K., Kobayashi, I., Inoue, Takashi.：Inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris inorange juice by high electric field alternating
current, Food Science Technology Research，15，３，
211～216，2009．
６） Uemura, K., Kobayashi, I., Inoue, Takashi.：Inactivation of Bacillus subtilis Spores in Orange
Juice and the Quality Change by High Electric Field
Alternating Current, Japan Agricultural Research
Quarterly，44，１，61～66，2010．
７） 植村邦彦，高橋千栄子，小林功：短波帯加熱処理による包装済み味噌の酵素の失活，日本食品科学工学会誌，61（２），95～99，2014．
８） V. Orsat, Y. Garie’py, G. S. V. Raghavan, D.
Lyew，：Radio-frequency treatment for ready-toeat fresh carrots, Food Research International，34，527～536，2001．
９） L. Laycock, P. Piyasena, G. S. Mittal：Radio
frequency cooking of ground, comminuted andmuscle meat products, Meat Science， 65， 959 ～
965，2003．
10） Nigel P. Brunton, James G. Lyng, Wenqu Li,
Denis A. Cronin, Desmond Morgan, Brian
McKenna ： Effect of radio frequency（RF）heatingon the texture, colour and sensory properties of acomminuted pork meat product， Food ResearchInternational，38，337～344，2005．
11） B. M. McKenna, J. Lyng, N. Brunton, N. Shirsat：
Advances in radio frequency and ohmic heating ofmeats, Journal of Food Engineering， 77， 215～
229，2006．
12） Lu Zhang, James G. Lyng, Nigel P. Brunton：
Quality of radio frequency heated pork leg andshoulder ham, Journal of Food Engineering， 75，
275～287，2006．
13） Xueyan Tang, James G. Lyng, Denis A. Cronin,
Caroline Durand ： Radio frequency heating of beefrolls from biceps femoris muscle, Meat Science，
72，467～474，2006．
14） Alina Jakób, Jolanta Bryjak, Halina Wójtowicz,
Viera Illeová, Július Annus, Milan Polakovic：
Inactivation kinetics of food enzymes during ohmic
heating, Food Chemistry，123，369～376，2010．
15） Jian Wang, Kunchalee Luechapattanaporn, Yifen
Wang, Juming Tang：Radio-frequency heating ofheterogeneous food-Meat lasagna, Journal of FoodEngineering，108，183～193，2012．

© The Ito Foundation

51

可視・近赤外分光可視化法による生肉の微生物汚染状況の非破壊評価Non-destructive analysis of spatial contamination of raw meat by
microorganisms using visual and near-infrared multispectral imaging

牧

野

義

雄・モハメドカムルザマン（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Yoshio Makino and Mohammed Kamruzzaman（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

According to the public reports by Ministry of Health, Labour and Welfare, foodborne
diseases caused by eating meat have been continuously occurring. However, conventional
method to count viable cells on the surface of the meat is a sampling method. This means thatleak of inspection is unavoidable. In the present study, nondestructive and rapid prediction of
viable cells on the surface of meat samples by measuring two dimensional spectral absorbanceusing a hyperspectral camera was proposed. According to the observation results, appearanceof meat surface changed overtime. This may be caused by the increase of viable cells andchanges in properties of components included in the samples. A partial least square regression
model was made to predict the number of standard plate count bacteria as the dependent
variable by entering 2nd derivative of spectral absorbance values as the independent variables
measured using the meat samples. The number of viable cells was predicted in the accuracy at
the coefficient of determination as 0.76 and root mean square error as 0.45 CFU cm － 2．This
method may be effective for screening hygienically safe meat products at the meat factories orthe butcher shops.

１．目

取扱い法が詳細に記述されている。

的

しかし，いかに厳重な取扱いがされていても，

厚生労働省の「食中毒統計資料」によれば，年

食中毒の原因となる微生物による汚染の有無を確

間数万件の食中毒が発生している。2011年には生認しなければ，真に安全な生肉を出荷し続けるこ牛肉を食するユッケを原因とする食中毒が発生とは困難である。微生物汚染を発見する方法としし，これを受けて厚生労働省は「生食用牛肉の規て，主に平板寒天測定法が従来から用いられてい格基準」を制定・施行した。さらに，全国食肉事る。しかし，培養を必要とし，汚染状況が判明す業協同組合では，食肉加工現場における衛生管理

るまでに１～２ｄを要することから，消費期限のに活用するため，2014年３月に「食肉衛生マニュ

短い生肉の衛生管理に適する方法であるか疑問がアル」を公表した。この中では，食肉の衛生的な残る。また，検査試薬等ランニングコストがかか© The Ito Foundation

52

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

るなど他の短所も認められるが，さらに懸念され菌数と菌株の種類を分光分析で予測する研究をるのは，抜き取り検査であるため，検査漏れの可行った。研究代表者（牧野）らは，紫外可視分光

能性が否定できないことである。

分析および蛍光分光分析と偏最小二乗回帰分析

一方，非破壊検査は，操作が簡便な上に検査対（PLSR）の組み合わせにより，豚肉表面で増殖し象を傷つけないという長所がある。医療など多くた10２ ～10７ CFU cm－２ の範囲の一般性菌数を相の分野において，検査法は破壊法から非破壊法へ関係数0.9以上の精度で予測する研究２～４）を行うと置き換えられる傾向にあり，食品分野では，Ｘとともに，特許２件５，６）を取得した。しかし，す線による異物検査，近赤外分光分析による果実類

べて１点あるいは広範囲の平均的な微生物汚染をの糖度測定等において実用化されている。非破壊

予測するにとどまっている。

であれば全数検査が可能になることから，検査漏れの懸念がなくなる。

一方，研究分担者（Kamruzzaman）がかつて所属したダブリン大学の研究チームが，ハイパー

そこで本研究では，光センシングによる食肉のスペクトルカメラを使用した最先端の研究７，８）を微生物汚染状況の非破壊検査法に関する研究を行っており，PLSRを併用して，非破壊で成分分行った。光の中でも，過去の研究で微生物検査に布を評価する手法を明らかにした。さらに，赤肉有効であることが確認されている電磁波「可視・（牛肉，豚肉，ラム肉）の種類を偏最小二乗判別

近赤外光」を選択した。また，一画素ごとに分光分析によって非破壊で見分ける手法も明らかにし

反射／吸収スペクトルを記録できる「ハイパースている９）。

ペクトルカメラ」を使用した。二次元空間におけ

本研究成果が食肉加工場に導入されれば，衛生

る分光データの取得が可能になることから，部分的な取扱いに加えて微生物汚染の有無を確認した的な微生物汚染状況や広い範囲を対象とした菌のうえで出荷できるため，生肉の安全性と，生肉に種類や菌数の可視化なども可能になる。

対する消費者の信頼が増す効果が得られる。

研 究 代 表 者 （牧 野），研 究 分 担 者（Kamruzzaman）は，これまで，ハイパースペ

２．方法

クトルカメラを用いた生肉品質の非破壊検査と品東京都内の精肉店から購入した牛肉，ラム肉，質にかかわる成分の可視化に関する研究に取り組豚肉を実験試料とした。食肉にはもともと付着しんでいる。研究室内にて共同で利用している統計ている雑菌の増殖状況を標準寒天培地による常法解析ソフトウェアを用いて牛肉の品質予測モデル

で調べるとともに，分光吸収スペクトルを測定を作成したところ，偏最小二乗回帰分析（PLSR）

し，非破壊推定を試みた。

により国際照明委員会CIELABの明度（L ），水

２cmの厚さに成型した食肉試料をハイパース

分保持力，pHおよび水分に対して，交差検証相

ペクトルカメラ（Fig.１）で継時的に撮影し，分

関係数はそれぞれ0.91，0.83，0.80および0.94，交光吸収スペクトルデータを得た。ハイパースペク

差検証最小二乗誤差はそれぞれ1.93，0.33，0.03

トルカメラのハードウエア（JFEテクノリサーチ

および0.45の高い精度で予測可能であった。

㈱）について説明する。光源は150Ｗキセノンラ＊

微生物の種類や数を非破壊で予測する学術研究

ンプと150Ｗタングステン－ハロゲンランプの混については，2010年頃から報告されるようになっ

合光源を使用し，可視～近赤外の広い範囲で強いた。Siripatrawan et al.

光照射を可能にすることにより，測定精度を向上

１）は，液体培地中の大腸© The Ito Foundation

53

可視・近赤外分光可視化法による生肉の微生物汚染状況の非破壊評価
A

CameraLamb

SpectrographIllumination

Pork

SampleTranslation
stage

Lamb

Beef

Computer

Pork

Fig. 1 Hyperspectral imaging system applied in thepresent study（JFE Techno-Research Co.）

B

Beef

Pork
Lamb

させる。光センサーは12ビット（4096諧調）の精

Pork

度で光の強弱を判定できるCCDカメラ，分光器
は透過型回折格子，レンズは16 mmのものを使Beef用した。すべての光学部品は光学ベンチにて固定した状態で試料をカメラ撮影するため，試料，光

Lamb

Beef

源，光センサーの幾何学的位置関係が常に不変である。これは，再現性の高い計測データを得るた

Fig. 2 Appearance of beef, pork and lamb meats on（A）

めに有効である。400～1,000 nmの波長範囲の分

the first day and（B）the fifth day from the start ofstorage

光反射／吸収データを５nmごとに取得した（原スペクトルの取得）。
分光吸収スペクトルを測定後，食肉表面の一般

３．結果と考察

生菌数を寒天平板法で測定した。培地は，３ＭTM実験に使用した食肉試料の外観変化をFig.２に

ペトリフィルム TM 培地生菌数測定用ACプレート示した。貯蔵開始１日後と５日後の外観を比較し（スリーエムたところ，外観に違いがみられた。日数の経過にジャパン㈱）を使用した。

取得した画像データの解析は，科学計算用プロ

よって菌数が増えたことと，食肉の成分が継時的

グ ラ ミ ン グ 言 語 MATLAB 2014a（MathWorks,に変化し，外観色に影響を及ぼしたと考えられInc.） で 行 っ た 。「Image Processing Toolbox」

た。また，得られた一般生菌数の値の範囲は，4.0を使用してハイパースペクトルカメラで取得した～7.5 CFU cm－２であった。

「.psf」ファイルをMATLABに取り込み，統計処

Fig.３には，PLSRを用い，食肉表面の一般生理するための専用スクリプトファイル（ｍファイ

菌数を分光吸収スペクトルから非破壊で予測したル）を 作 成 し ，デ ー タ 解 析 を 行 っ た 。ま ず ，

結果を示した。検量の決定係数（Ｒ２）は0.81，

Savitzky-Gorey法によって原スペクトルを二次微

最小二乗誤差（RMSE）は0.39 CFU cm－２ であっ分スペクトルに変換し，説明変数とした。次に一た。検証のＲ２は0.76，RMSEは0.45 CFU cm－２で般生菌数を目的変数として定義し，説明変数とのあった。Williams and Norris10）は，モデル式の決関係をPLSRによってモデル化した。

定係数が0.66～0.81の範囲であれば，スクリーニングに有効な水準であると述べている。本研究で© The Ito Foundation

54
8

平成26年度Predicted γ
Slope0.806780
0.770335

Oﬀset
1.133170
1.358892

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

RMSE
0.391099
0.451228

R-Square
0.806780
0.760842

7

6

5

4

Measured γ
4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

Fig. 3 Relationship between measured and predicted plate count values on the surface of meats. Open and closed

circles denote the calibration and validation results.
Full lines denote the linear regression results.

作成したモデル式は，微生物汚染あるいは腐敗しを併用した生肉の衛生管理である11）。すなわち，た食肉のスクリーニングに適用可能な精度と考え

光センシングの特徴である非接触という利点を生られた。

かし，非破壊検査による全品のスクリーニングへ

本研究で対象とする光センシングは，非破壊検の応用が考えられる。その結果，深刻な微生物汚査であることから，迅速，簡便，低ランニングコ

染が疑われる検体を製造ライン上で発見・選別ストという特徴点があげられるが，最大の利点

し，当該検体についてのみ，従来法による検査を

は，検体に対し非接触であるため，全数検査が可行い，汚染が起きた原因を追究するという手段が能になることである。

考えられる。そうすれば，検査漏れの心配がなく

従来から行われている製造・出荷ラインにおける衛生管理の基本的手法は抜き取り検査である。
当該検査を高頻度で行えば安全確保の可能性は高なるうえに，時間やコストの削減にもつながる。
４．要約

まるが，検体は処分せざるを得ないため，出荷品

厚生労働省の報告によれば，食肉を原因とするが減ってしまう欠点がある。しかも，検査には熟食中毒の報告が後を絶たない状況である。一方，練を必要とし，化学薬品を使用する，カウント可

通常の衛生検査は破壊検査であるため，抜き取り能なコロニーが形成されるまで１～２ｄを要する

法に頼らざるを得ず，検査漏れの危険性が避けらなど，見直すべき点も多い。その一方で，本研究れない。そこで本研究では，ハイパースペクトルで用いる手法である光センシングは，従来法と比カメラを利用して，分光吸収スペクトルを格納し較して，必ずしも測定精度は高いとは言えない。

た二次元画像を撮影することにより，非破壊かつそこで考えられるのは，破壊検査と非破壊検査

迅速に食肉表面に存在する微生物数を推定する方© The Ito Foundation

可視・近赤外分光可視化法による生肉の微生物汚染状況の非破壊評価法について検討した。食肉を数日保存した結果，表面に継時的な変化が認められた。これは，菌数と内容成分の変化が原因と推定された。菌数は，
分光吸収スペクトルデータから，検証のＲ２0.76，
RMSE 0.45 CFU cm －２ の精度で予測可能であった。以上の結果から，本研究で提案した方法は，食肉の衛生状態をスクリーニングするには適切な方法であると考えられた。
文献１） Siripatrawan, U., Makino, Y., Kawagoe, Y., Oshita,S., Sensors and Actuators B: Chemical ，148 ，366 ～
370，2010．
２） Oshita, S., Al-Haq, M. I., Kawagishi, S., Makino, Y.,
Kawagoe, Y., Ye X., Shinozaki, S. Hiruma, N., Journalof Food Engineering，107，262～267，2011．
３） Oto, N., Oshita, S., Kawagishi, S., Makino, Y.,
Kawagoe, Y., Al-Haq M. I., Shinozaki, S., Hiruma, N.,
Journal of Food Engineering，110，９～17，2012．

55４） Oto, N., Oshita, S., Makino, Y., Kawagoe, Y.,
Sugiyama, J., Yoshimura, M., Meat Science，93，579～585，2013．
５） 大下誠一，叶旭君，牧野義雄，川越義則，篠崎聰，
比留間直也：鮮度測定方法および鮮度測定装置，特許第5171366号
６） 大下誠一，川岸誠司，牧野義雄，川越義則，大戸尚美，篠崎聡，比留間直也：微生物の数または量を測定する方法および装置，特許第5386752号
７） Kamruzzaman M., ElMasry, G., Suna, D. W.,
Allen, P., Analytica Chimica Acta ，714 ，57 ～ 67 ，
2012．
８） Kamruzzaman, M., ElMasry, G., Suna, D. W.,
Allen, P., Innovative Food Science and Emerging
Technologies，16，218～226，2012．
９） Kamruzzaman, M., Barbin, D., ElMasry, G., Suna,
D. W., Allen, P., Innovative Food Sci. Emerging
Technol.，16，316～235，2012．
10） Williams, P., Norris, K. ： Near-Infrared
Technology in the Agricultural and Food Industries,
2 nd ed., 163, American Association of Cereal
Chemists, St. Paul, Minnesota, USA，2001．
11） 牧野義雄（監修：山本重夫）：農産物・食品検査法の新展開，53，シーエムシー出版，東京，2010．

© The Ito Foundation

56

牛肉に関する消費者ニーズの研究―内因性価値と外因性価値の特定
A study on consumersʼ needs for beef－identifying intrinsic and extrinsic
quality values

広

岡

博

之・長

命

洋

佑＊

（京都大学大学院農学研究科，＊九州大学大学院農学研究科）

Hiroyuki Hirooka and Yosuke Chomei＊（Graduate School of Agriculture, Kyoto University, ＊Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

Beef quality concept can be divided into intrinsic quality values （which are thecharacteristics of beef itself）and extrinsic quality values（which are associated to the socio －economic factors such as price, brand, origin and human health concern）. A national － wide on－ line survey was conducted to identify the motivational factors（beef quality values）affecting
consumers’ beef purchasing decision in Japan. The principal component analysis revealed thatthree principal components（importance of overall intrinsic quality value, aging and cooking）
and five principal components（importance of overall extrinsic quality value, safety, fleshiness,
price and production information）were obtained for intrinsic and extrinsic beef quality,
respectively. Price was the most important extrinsic quality value related with consumers’ beefpurchasing decision but there was no relation with other extrinsic quality values. The highcorrelation coefficient of principal components between overall intrinsic and extrinsic quality
values was found, indicating that consumers who totally stress intrinsic beef quality also tend
to determine the purchasing choice according to extrinsic quality values. The significant
demographic（region, age, job status, civil status and presence of child）effects on principal
components for intrinsic and extrinsic quality were observed. The daily consumers’ beefpurchase price was influenced by importance of price and both overall intrinsic and extrinsic
quality values of consumers but the magnitudes and direction of the influences differed among
the regions where consumers live. The results from the present study can be used to help
identify factors to positively influence purchasing decisions within targeted markets in different
regions.

１．目

し，消費者は霜降り牛肉は高価で，赤身肉は安価的と考えていた。しかし，近年，テレビのグルメ番

わが国では，これまで枝肉市場における枝肉価

組やインターネット情報を通じて，牛肉に関する

格は，主に脂肪交雑の程度によって決定され，そさまざまな情報が簡単に手に入るようになり，消の価格がそのまま小売段階での牛肉価格に反映

費者のニーズは多様化してきている。

© The Ito Foundation

57

牛肉に関する消費者ニーズの研究―内因性価値と外因性価値の特定

消費者のニーズと言っても，牛肉の価値は，牛調査によって月に２，３回以上牛肉を購入してい肉そのものが持つ価値（内因性価値と呼ぶ）と外る全国の女性消費者1,040人を対象に（１）牛肉部からの情報によって決まる価値（外因性価値と購買時における内因性価値と外因的価値に関連す呼ぶ）の２つが考えられる 。前者の内因性価値る質問項目の重要度を聞き取り，（２）内因性価には，BMSナンバーをはじめとする枝肉形質や値と外因性価値に関する質問項目から主成分分析

脂肪酸組成，肉の色や脂肪の色などの外観などがによって主成分を抽出し，それらの主成分に対すあり，後者の外因性価値としてはブランド，放牧る消費者の属性の影響を調べ，（３）それらの主飼育，遺伝子操作飼料の給与の有無，アニマル

成分が消費者の日常の牛肉の購買価格に及ぼす影

ウェルフェアや環境負荷への配慮，安全・安心性

響を特定し，これからの消費者ニーズに応える牛などの信頼性の確保，有機飼育牛肉（オーガニッ

肉のあり方を提案することを目的とした。

１）クビーフ）などが挙げられる。
DeVuystら２）は，米国の枝肉格付基準に対する

２．材料および方法

消費者の認知度を調べ，予想したよりも消費者が調査はインターネットアンケート会社のマクロ

枝肉格付に対する正しい知識を持っておらず，そミルに依頼し，月に２，３回以上牛肉を購入してのことが特に肉質に対する認識を誤った方向に導いる全国の女性消費者を対象に，2014年12月17日

く可能性を指摘している（米国の枝肉格付基準でから2014年12月22日にかけてインターネットアン

は脂肪交雑は高く評価されているが，消費者の認ケートを実施した。調査対象として，25歳以上64識はまったく逆であった）。

歳以下の女性消費者を年齢層（25歳-34歳，35-44

わが国では，消費者を対象とした研究はこれまら

４）歳，45-54歳，55-64歳）別に均等な人数になるよや佐々木う1040名をランダムに抽出した。その内訳は，が，一般公開のイベントに訪れた来訪者を対Table１に示すとおりである。注意すべき分類とで少なかったが，SasakiとMitsumoto３）

象に牛肉に関するアンケート調査を実施し，肉質に対するニーズや購買時の着目点を調べているが，これらの研究では外因的価値については検討されていない。
申請者はこれまでインターネットアンケートを用いて首都圏や京阪神の消費者の霜降り牛肉と赤
身肉へのニーズを調べ５），さらに熊本県の消費者による褐毛和種牛肉に対する認知と意識，その付

Table 1Profiles of respondents

RegionNumber

Percent

Hokkaido

99

9.5

Tohoku

109

10.5

Kanto

208

20.0

Chiubu

191

18.4

Kinki

225

21.6

加価値に関する研究を行ってきた６）。これらの研究

Chugoku and Shikoku

93

8.9

で用いたインターネットアンケートは，近年，多数

Kyushu115

11.1

Gender Female

1040

100.0

25－34

260

25.0

の消費者を対象とした意識調査方法として有効なツールとなっている。消費者に牛肉に関する意識調査をインターネットアンケートを利用して実施

Age

35－44

260

25.0

２，７）

。

45－54

260

25.0

そこで本研究では，インターネットアンケート

55－64

260

25.0

した研究は，国外でもいくつか報告されている© The Ito Foundation

58

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

して，居住地に関しては三重県を近畿地域に分類

項目を取り上げた。また外因性価値と関係する質

し，また職の有無に関してしては自営業も含めて問項目としては，消費期限，加工年月日，牛の「個定職を持っているか否かで分類した。

体識別番号」，「BSE検査済」の表示，「放射能検牛肉を購買する際に重視する項目として19項目

査済」の表示，販売店（または販売組織）の「信を用意し，それぞれの項目に対して，「非常に重頼度」，国産・海外産などの「産地名」，「松阪牛」視している」から「まったく重視していない」まや「神戸牛」などの産地・銘柄の「ブランド」，

での７段階を割り当て，回答を得た。そのうち，

企業名・農場名などの「生産者」の情報，家畜に内因性価値に関係する質問項目としては，肉の色給与された「飼料」の情報，家畜に投与されたやつやなどの「見た目」，「バラ」や「肩ロース」「医薬品」の情報，価格の12項目を取り上げた。

などの「部位」，霜降りの度合い，赤身部分の多次に，内因性価値と外因性価値のそれぞれに関さ，肉の周りの脂肪の薄さ，牛肉の熟成の度合い，

する質問項目に関して，主成分分析を実施し，内「焼肉用」や「ステーキ用」などの「用途」の７

因性価値と外因性価値に関して得られた主成分間Table 2The results from principal component analysis

Items1）
Appearance
Retail cut
Degree of marbling
Degree of leanessThinness of fat
Aging of beef
End usage

Intrinsic quality value2）
Mean

PC1

PC2

PC3

5.58
5.40
4.90
5.15
5.03
4.10
5.16

0.377
0.390
0.407
0.398
0.402
0.318
0.346

－0.459－0.2970.107－0.155－0.013
0.798
0.170

0.122
0.349
0.185
－0.515－0.542－0.044
0.518

0.518
0.518

0.114
0.632

0.109
0.741

Proportion
Cumulative

Extrinsic quality value3）
Mean

PC1

PC2

PC3

PC4

PC5

Durable life
Package dateTracebility number
BSE tested
Radioactibity tested
Creditability of shop
OriginBrand name
Information on farm and farmer
Information on feed
Information on medicine

5.69
5.28
3.28
3.80
3.90
4.75
5.32
4.49
4.00
3.59
3.59

0.174
0.224
0.302
0.343
0.348
0.298
0.260
0.272
0.345
0.348
0.342

0.515
0.397
－0.216－0.172－0.158
0.138
0.315
0.158
－0.061－0.231－0.249

0.403
0.526
0.184
0.053
0.016
－0.358－0.440－0.390－0.0520.107－0.173－0.163－0.026
0.150
0.170
0.047
－0.158－0.419－0.0720.111－0.067－0.036－0.018－0.427－0.416－0.382－0.047
0.275
0.392
0.346

Price

5.92

0.046

0.462

0.137
－0.129

0.159
0.804

0.297
0.231

0.495
0.495

0.162
0.657

0.074
0.732

0.063
0.795

0.052
0.847

Proportion
Cumulative

1）evaluated by 7－point scale from not at all important（1）to very important（7）2）Intristic quality value；PC1 Importance of oveall intristic quality, PC2 Importance of aging, PC3 Importance of cooking3）Extristic quality value ； PC1 Importance of oveall extristic quality, PC2 Importance of safety, PC3 Importance of freshness, PC4
Importance of price, PC5 Importance of production information© The Ito Foundation

59

牛肉に関する消費者ニーズの研究―内因性価値と外因性価値の特定の相関を調べて，内因性価値と外因性価値の関連た。第１主成分は価格以外の質問項目と関連性の性を明らかにした。さらに抽出された主成分に関高いもので，「外因性価値全般重視因子」とした。

して，居住地，年齢層，職の有無，未既婚，子ど第２主成分は，消費期限や加工年月日，産地や価もの有無およびそれらの交互作用を変動因として格と関連性が高かったので「安全性重視因子」と最小２乗分散分析を行ってそれらの変動因の影響した。第３主成分は，産地名やブランドよりも消を調べた。

費期限や加工年月日の牛肉の鮮度に関する項目と最後に購買価格に対する各主成分の影響を標準

関連性が高かったので「鮮度重視因子」とした。

化偏回帰係数によって表した。標準化偏回帰係数

第４主成分は，価格と強い関連性があるので「価は，購買価格を従属変数，各主成分を独立変数と格重視因子」とした。最後の第５主成分は主としする重回帰分析を行い，得られた偏回帰係数を標て生産情報と関連性が高かったので「生産情報重準偏差で標準化したものである。求められた標準

視因子」とした。

化偏回帰係数は，消費者の購買価格に対する各主

内因性価値に関する主成分と外因性価値に関す成分の重要度を表す指標になると考えられる。

る主成分間の相関はTable３に示すとおりである。
外因性価値全般重視因子は，内因性価値全般重視

３．結果および考察

因子と正の高い相関があった（ｒ＝0.52）。この牛肉の内因性価値に関連する質問項目の平均値

ことから，外因性価値を全般的に重視している消と主成分分析の結果はTable２に示すとおりであ

費者は，内因性価値も全般的に評価する傾向にある。内因性価値に関する質問項目の中で最も重要ることがうかがえた。価格は外因性価値項目の一視されている項目は「見た目」で，「霜降りの度

つであるが，その他の外因性価値項目との関連性合い」や「熟成の度合い」に関する消費者の重要が低く（Table２の外因性価値の第１主成分では度は相対的に低かった。

他とは異なる関係にある），さらに価格重視因子

内因性価値に関する主成分分析では，寄与率がは内因性価値とも関連性が低く（ｒ＝－0.042），

10％を超える３主成分を抽出した。第１主成分はどの質問項目とも関連性が高かったので「内因性価値全般重視因子」とした。第２主成分は熟成のTable 3 Correlation coefficients of principal components

between intrinsic and extrisic quality values

度合いのみと関連性が高かったため「熟成重視因子」とした。第３の主成分は，部位や用途と関連

Intrinsic quality value1）
Extrinsic quality values2）

PC1

PC2

PC3

PC1

0.52

0.255

0.025

PC2

0.429

－0.3370.179

PC3－0.0260.088－0.019PC4－0.042－0.067－0.088

PC5

0.04

0.098

－0.017性が強かったので「調理重視因子」とした。
他方，牛肉の外因性価値に関連する各質問項目の平均値と主成分分析の結果はTable２に示すとおりである。外因性価値の中で最も重要度の高かった質問項目は「価格」で，安全性や生産情報

1）Intristic quality value ; PC1 Importance of oveall intristic

に関する質問項目の重要度は相対的に低い傾向で

quality, PC2 Importance of aging, PC3 Importance ofあった。外因性価値に関連する質問項目は12項目

2）Extristic quality value ; PC1 Importance of oveall extristicと多かったので，主成分分析では寄与率が５％をquality, PC2 Importance of safety, PC3 Importance of超えるものまで取り上げ，５つの主成分を抽出しproduction information

cooking

freshness, PC4 Importance of price, PC5 Importance of© The Ito Foundation

60

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

他の牛肉の価値因子とは異なっていることが示唆れた。近年，赤身牛肉の評価の高まりとともに熟された。このことから，価格を重視するかどうか成技術が話題となっているが，熟成は内因性価値は牛肉の内因的あるいは他の外因的な価値とは異の１項目であるにもかかわらず，消費者から外因なり，消費者の経済状況や社会環境によって強く性価値として評価されている可能性が示唆された。

影響されているものと推察された。また，熟成重

Table４は，主成分に対する消費者の属性の効

視因子は，外因性価値全般重視因子と中程度の関果を調べた最小２乗分散分析の結果を示したもの

連性が認められ（ｒ＝0.255），熟成を重視するかである。表中の数字は有意確率を示したもので，否かは外因性価値と関連している可能性が示唆さ数値が0.05以下であればその属性が統計的に有意Table 4 Demographic effects on principle components (figures are significance levels from least squares analysis ofvariance)
Intrinsic quality value

Demographic
variables
Regian（R）
Age（A）
Job（J）
Civil status（M）
Presence of child（C）
R×A
R×J
R×M
R×C
J×M
J×C

6
3
1
1
1
18
6
6
6
1
1

Extrinsic quality value

PC1

PC2

PC3

PC1

PC2

PC3

PC4

PC5

0.435
0.054
0.788
0.081
0.295
0.008
0.559
0.654
0.248
0.786
0.097

0.775
0.102
0.330
0.104
0.754
0.500
0.269
0.007
0.336
0.865
0.170

0.598
0.579
0.143
0.718
0.007
0.340
0.332
0.471
0.279
0.624
0.705

0.989
0.001
0.236
0.082
0.749
0.907
0.750
0.796
0.244
0.865
0.482

0.588
0.340
0.455
0.571
0.022
0.092
0.302
0.300
0.760
0.036
0.000

0.031
0.051
0.912
0.787
0.661
0.317
0.878
0.326
0.474
0.038
0.511

0.199
0.073
0.071
0.256
0.155
0.071
0.621
0.247
0.467
0.983
0.412

0.641
0.731
0.251
0.310
0.844
0.449
0.541
0.787
0.365
0.686
0.748

1）Intristic quality value ; PC1 Importance of oveall intristic quality, PC2 Importance of aging, PC3 Importance of cooking2）Extristic quality value ; PC1 Importance of oveall extristic quality, PC2 Importance of safety, PC3 Importance of freshness, PC4
Importance of price, PC5 Importance of production information

Table 5 Standardized regression coefficients when daily beef purchase price were used as dependent variable
RegionAll regions

Hokkaido

Tohoku

Kanto

Chubu

Kinki

Chugokuand
Shikoku

KyushuPC1
PC2
PC3
Extrinsic quality value2）

0.196
0.019
0.086

0.342
－0.0760.055

0.299－0.0030.038

0.229－0.0340.179－0.029－0.0070.050

0.231－0.033
0.106

0.237
0.068
0.136

0.251
0.245
0.007

PC1
PC2
PC3
PC4
PC5

0.113
－0.119－0.161－0.232－0.0430.173－0.244－0.037－0.267－0.087

0.063
0.021
0.010
－0.093－0.007－0.005－0.310－0.236－0.181－0.1230.270
0.049－0.186－0.2480.013

0.177－0.108－0.147－0.3220.017

0.036－0.134－0.101－0.204－0.0480.107－0.071－0.140－0.303－0.128Intrinsic quality value1）1）Intristic quality value ; PC1 Importance of oveall intristic quality, PC2 Importance of aging, PC3 Importance of cooking2）Extristic quality value ; PC1 Importance of oveall extristic quality, PC2 Importance of safety, PC3 Importance of freshness, PC4
Importance of price, PC5 Importance of production information© The Ito Foundation

牛肉に関する消費者ニーズの研究―内因性価値と外因性価値の特定61であると判断できる。第１主成分の内因性価値全100ｇあたり356円であった。日常の牛肉購買価格

般重視因子に関しては，居住地と年齢層の交互作に対する個々の主成分の重要度を標準偏回帰係数用のみが統計的に有意であった。年齢層の高い消によって示した結果がTable５である。全データ

費者ほど内因性価値を重視する傾向にあったがを対象に分析した結果，牛肉購買価格に最も大き（ｐ＝0.054），北海道に住む消費者では内因性価な影響を示しているのが，外因性価値の第４主成値全般重視因子は35-44歳で最も高かったのに対分である価格重視因子で，価格を重視している消して，中部地域や九州地域に住む消費者では45-54

費者ほど安価に牛肉を購入する傾向が認められ歳の年齢層で最も低かった。第２の熟成重視因子

た。また，内因性価値を全般に重視している消費では居住地と未既婚の交互作用が有意で，北海道者は高価格で牛肉を購買し，また鮮度を重視してや中部地域に住む消費者は既婚の人ほど熟成を重いる消費者は低価格で牛肉を購買していることが視しているが，他の地域では未婚の消費者ほど熟示唆された。その一方で，生産情報因子は購買価成を重視することが示唆された。第３の調理重視

格にほとんど影響を及ぼしておらず，わが国の現因子に関しては，子どもの有無が有意で，子ども状は，生産情報が牛肉の購買意欲に大きな影響をのある消費者ほど用途や部位を重視していた。

及ぼしていないと推察された。

一方，外因性価値に関しては，第１の外因性価同様の分析を地域別に行ったところ，中部地域

値全般重視因子については年齢層が高い消費者ほに住む消費者は内因性価値よりも外因性価値を全ど外因性価値を重視していた。また，第２の安全般的に重視する傾向があり，外因性価値を重視す

性重視因子においては職の有無と未既婚の交互作

る消費者ほど牛肉を高価で購買する傾向があっ用が有意で，定職を持っている消費者では未婚のた。また，九州地域に住む消費者は熟成を重視し消費者ほど安全性を重視しているのに対して，定ている消費者ほど高価に牛肉を購買しており，東職を持っていない消費者では既婚の消費者ほど安北地域に住む消費者は，内因性価値以外にはほと全性を重視していた。また，職の有無と子供の有

んど牛肉の購買価格に影響を与えていないことが無の交互作用も有意で，定職を持っている消費者示された。

では子どもを持つ消費者ほど安全性を重視してい本研究では，日本中での牛肉の購買に地域間差るのに対して，定職を持っていない消費者では子のあることを示したが，世界的に見ても牛肉の価どもを持たない消費者ほど安全性を重視してい値に対する消費者の反応は，国や地域によって異た。鮮度重視因子では，北海道に住む消費者が最なり，たとえばヨーロッパでは地球環境問題やアも鮮度を重視しており，近畿地域に住む消費者がニマルウェルフェアに対する配慮や遺伝子操作飼最も軽視していることが示された。また，職の有料の不給与などへの関心が高く，そのような外因

無と未既婚間の交互作用が有意で，定職を持って的価値を持つ牛肉は高く評価されているのに対しいる消費者は，未婚者ほど鮮度を重視しているのて，米国ではこれらの問題に対する関心の低いこに対して，定職を持っていない消費者では既婚者とが知られている８）。

ほど鮮度を重視していることが示唆された。以上

わが国では，近年，脂肪交雑一辺倒の価値評価の結果から，牛肉の外因性価値は，消費者の属性から脂肪酸組成や官能評価などの他の牛肉の質にによってかなり影響されることが推察された。

関する検討が盛んに行われている。また，牛肉の本研究では，日常の牛肉購買価格の平均値は価格に関する検討も行われているが，価格以外の© The Ito Foundation

62

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

外因性価値に関する検討は，その価値そのものが視因子」，「熟成重視因子」，「調理重視因子」の３

消費者の主観に基づく割合が高く，科学的でない

主成分，外因性価値として「外因性価値全般重視などの理由からこれまでほとんど行われてこな因子」，「安全性重視因子」，「鮮度重視因子」，「価かった。しかしながら，先進国を中心に世界的に格重視因子」，「生産情報重視因子」の５主成分をも牛肉の内因性価値のみならず，外因性価値を重抽出した。価格は最も重要な外因性価値であった

視して消費者は牛肉を購買しており，その外因性

が，内因性価値や他の外因性価値とは異なる性質

価値の重要性はますます高まっていると考えられを持っていた。「内因性全般重視因子」と「外因ている。

性全般重視因子」の間には正の高い相関があり，これからの牛肉消費は，霜降り一辺倒から多様

この結果から内因性価値を重視している消費者はになると予想される。特に，欧米の傾向を見てい外因性価値も重視して牛肉を購買していることがると近い将来，外因性価値の重要性はますます高示唆された。また消費者の属性は，内因性価値やまってくると考えられる。最近，わが国でも健康

外因性価値に関する主成分に少なからず影響を与面への配慮から赤身肉を求める消費者や熟成など

えていることが示唆された。日常の牛肉の購買価の牛肉の保存方法，生産履歴に興味を持つ消費者

格は，全体としては「価格重視因子」，「内因性全も出てきている。今後は，欧米並みに牛肉生産に

般重視因子」，「外因性全般重視因子」によって影伴う環境負荷の低減やアニマルウェルフェアへの響されていたが，その影響の大きさと方向性は消配慮，牛肉の安全性などに関心が高まり，そのよ

費者の住んでいる地域によって異なっていた。本

うな点を保証された牛肉にプレミアムが付加され研究の結果は，異なる対象地域の市場における消て高価で販売されることも考えられる。本研究の費者の牛肉購買行動に関与する牛肉の価値基準を

結果は，わが国の女性消費者の牛肉購買行動の解特定するのに役立つものと考えられた。

明の一助になることが期待され，生産者や流通業者はこのような消費者の消費行動の変化にいち早
く気付き，そのような新しい消費者ニーズに応える牛肉生産にシフトしてゆくことも，持続的な牛肉生産を考えるうえで肝要であろうと推察される。
４．要

約

牛肉の価値は，牛肉そのものが持つ価値（内因性価値と呼ぶ）と外部からの情報によって決まる
価値（外因性価値と呼ぶ）の２つが考えられる。
本研究は，25歳から64歳までの女性消費者を対象に全国規模のインターネットアンケート調査を実施し，牛肉の購買時において重要視している価値基準について調べることを目的とした。主成分分

文献１） Hocquette, J F., Botreau, R., Picard, B., Jacquet, A.,
Pethick, D. W. Scollan, N. D., Meat Science, 92, 197 ～
209，2012．
２） DeVuyst, E. A., Lusk, J. L., DeVuyst, M. A.,
Journal of Animal Science, 92, 3142～3148，2014．
３） Sasaki, K., Mitsumoto, M., Animal Science
Journal, 75, 369～376，2004．
４） 佐々木啓介，三本充，合崎秀男，日本畜産学会報
77，67～76，2006．
５） 広岡博之，畜産の情報，276，57～62，2012．
６） 広岡博之，食肉に関する助成研究成果報告書，
32，39～46，伊藤記念財団，2014．
７） Thilmany, D. D., Umberger, W. J., Ziehl, A. R.,
Renewable Agriculture and Food Systems, 21 ， 1892
～203．
８） Lusk, J. L., Roosen, J., Fox, J. A., American
Journal of Agricultural Economics， 85， 16 ～ 29,2003．

析の結果，内因性価値として「内因性価値全般重© The Ito Foundation

63

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関する研究
A study on quantification and visualization for taste of wagyu beef using ataste sensor

都

甲

潔・田

原

祐

助

（九州大学システム情報科学研究院）

Kiyoshi Toko and Yusuke Tahara（Graduate School of Information Science and Electrical Engineering, Kyushu University）

In this study, we evaluated characteristics of the taste sensor membranes at 50°C
（dissolution temperature of beef tallow）and the interaction between beef tallow and the taste
sensor membranes to establish an objective evaluation technique of quantification andvisualization for taste of wagyu using the taste sensor. The umami sensor responses to wagyu
did not show definite differences between wagyu grades（A2, A3, A5）． It indicates thenecessity of the evaluation between the grade A, B and C which are expected to show
differences of sensory score and taste qualities, as a first step. The umami sensor responses to
MSG and MSG including beef tallow were different, since sensor characteristics for CPA valueof the umami sensor were changed by measuring of sample including beef tallow once. These
results indicated that the umami sensor can become a new evaluation technique ofquantification and visualization for taste of wagyu.

１．目

価可能としている味覚センサ１，２）を応用し，和牛的の「味」を客観的に数値化，可視化する評価技術

ヒトの感じる味には，基本五味と呼ばれる塩の構築を目的としている。

味，酸味，うま味，苦味，甘味があり，味物質は，

牛肉は肉の種類や部位によって，その軟らかさ

味蕾に存在する受容体やイオンチャネルで受容さや脂肪の入り具合など，肉の性質が異なる。油脂れる。また，渋味，辛味といった広義の味がある。

は味を有していないと考えられるが，牛肉の美味

食品に含まれる油脂成分は味に大きく影響するとしさにおいて重要な要素を占め，肉中の味物質やいわれているものの，具体的な役割の解明は食品

味受容機構に影響を与えることで味が変化すると分野において重要な課題となっている。牛肉の食考えられ，味覚センサを用いた客観的な評価方法

味は，「味」，「食感」，「香り」等の総合的な要素を検討する必要がある。また，肉中の油脂は，コから成ると考えられている。本研究は，脂質高分

ク味を有する味物質に影響があると考えられる。

子膜電極を用いて食品や医薬品の味を客観的に評

コク味とは，基本五味および基本五味の周辺の味© The Ito Foundation

64

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）の厚み，広がり，持続性，まとまりなどを増強す

れる１～４）。この吸着により起こる膜電位変化は後る効果を持つとされている。味覚センサを用いた味の指標として用いられており，CPA値と呼ばコク味の評価には，うま味物質が脂質高分子膜にれている。

吸着することによって生じる膜電位変化である後通常，味覚センサの測定は室温で行うが，本研

味測定値（CPA ; Change of membrane Potential

究では油脂が溶解する50℃条件下５）で測定を行っcaused by Adsorption）が利用されている１，２）。

た。また，測定中のサンプル溶液の蒸発を防ぐた

申請者が開発した味覚センサは，「味」を数値

めに，センサ電極がサンプル溶液に挿入される時。

（電位計測）以外は蓋をした。これまでの研究か

味覚センサは，生体系における味蕾の代わりに，ら，うま味センサ，酸味センサ，塩味センサは，脂質高分子膜を味物質の受容およびトランス

常温測定と比べると相対値は増加したが，標準偏デューサーとして利用し，味物質との静電相互作

差は小さく，再現性が高いセンサ応答が確認で用や物理吸着による膜電位変化から，味を評価す

き，50℃条件下でも使用できる。また，苦味センることができる。味覚センサはこれまでに，ビーサを用いた苦味サンプルの測定（CPA）では，

ル，日本酒，お米，肉類，野菜，果物等種々の食

常温での測定と同程度のセンサ応答および高い再品の味の数値化に成功しているが，肉類に関して現性が確認できている６）。

化できる世界初の装置として知られている

３，４）は，脂肪がセンサ応答の感度と脂質高分子膜の耐2.2

久性に悪影響を及ぼすために，肉の味に重要とさ牛肉の測定には，和牛サーロイン（肉質等級Ａ２，

れる脂肪を除去して評価を行っているのが現状で

Ａ３，Ａ５）を用いた。サンプル調整は，以下のある。本研究は，和牛の味に重要な役割を担う脂とおり行った。①牛肉を厚さ１cm×４cm×５cm

肪を脱脂することなく評価可能な技術の構築を目に切断後，室温で１時間解凍した。②フライパン

指すものである。

で牛肉表面を60秒，裏面を90秒加熱した。③処理

２．方
2.1

味覚センサを用いた牛肉の測定

した牛肉および等量の味覚センサ基準液をフード法

プロセッサーで１分間ミキシングして混合した。

味覚センサを用いた測定④ガーゼを用いて固形分を除去した。⑤得られた

実験には，（株）インテリジェントセンサーテ

サンプル溶液を基準液で100倍希釈し，これらをクノロジー社製の味覚センサ（味認識装置TS-

測定用サンプル溶液とした。味覚センサの測定は5000Ｚ）およびセンサ電極を使用した。測定手順

50℃で行い，測定ごとに新しいエタノール含有洗は，①センサを基準液（30mM KCl, 0.3mM酒石浄液を交換し，センサ電極がサンプル溶液に挿入酸）に浸漬し，膜電位を測定（Vr），②サンプル

される時以外はサンプル溶液の蒸発を防ぐために溶液に浸漬し，膜電位を測定（Vs），③基準液で蓋をした。

軽く洗浄した後，再び基準液に浸漬し，膜電位を2.3測定（V’r）した。①と②の膜電位の差（Vs－Vr）

うま味センサ膜の油脂の有無によるグルタミンを相対値としており，これは先味の指標として用酸ナトリウム（MSG）吸着量の差異を検討する

いられている。①と③の膜電位の差（V’r －Vs）

ため，分光光度計（マイクロプレートリーダー，

は，脂質高分子膜上の味物質が吸着したことによ

Bio-Rad Laboratories, Inc.）を用い吸着量の測定

る膜の電荷密度と構造の変化によって引き起こさ

を行った。まず，濃度既知の300mM MSG溶液の© The Ito Foundation

うま味センサの吸着特性

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関する研究

65

吸光度を測定した後，シャーレに製膜したうま味いことから，サンプル間の差異が大きかったと考

センサ膜に300mM MSG溶液を滴下し，上澄み液えられる。従って，測定サンプルの選別方法や，を取り出して吸光度を測定した。得られた吸光度調整方法に関して検討する必要がある。

から300mM MSG溶液の吸着量を算出した。次に，また，官能試験を行ったが，各味質の強度に対溶解した油脂をシャーレ中の膜に浸し，一定の時する肉質等級間の差異は認められなかった。アン

間 後 取 り 出 し て か ら 膜 を 洗 浄 し ，再 び 300mM

ケートによると，油の味を強く感じるため，各味MSG溶液を滴下し，上澄み液を取り出して吸光質の強度を評価することが難しいという記述が多度を測定した。グルタミン酸の測定は，酵素活性

く，各味質強度の評価をするための官能試験方法を利用した比色法を用いたヤマサＬ-グルタミンを検討する必要があると考えられる。今後は，同酸測定キットⅡ（ヤマサ醤油㈱）を用いた。味覚

一の等級ではなく，官能および味質に違いが出やセンサの測定で使用するエタノール含有洗浄液

すいと期待される歩留等級間の評価を行う必要がは，測定回数の増加とともに油脂で汚染されるこあると考えられる。

とが考えられるため，測定ごとに新しい洗浄液に

3.2

交換した。

うま味は，牛肉の味を評価するうえで重要な味質であると考えられる。また，肉中の油脂は，コ

３．結果と考察
3.1

うま味センサのセンサ特性

ク味を有する味物質に影響があると考えられる。
コク味とは，基本五味および基本五味の周辺の味

味覚センサを用いた牛肉の測定

塩味，酸味，うま味，苦味，渋味センサを用いの厚み，広がり，持続性，まとまりなどが増強さて，味覚センサによる和牛サーロインの測定をれた結果の味とされている。味覚センサを用いた行った。塩味，酸味，苦味，渋味センサは，肉質

これまでの研究から，うま味のCPA値とコクに等級によらず数mV程度しかセンサ応答が得られ関連性があることが示唆されている１）。そこで，なかった。Fig.１に，牛肉の重要な味質であるう

うま味センサを用いて，うま味物質であるグルタ

ま味センサの測定結果を示した。測定は，肉質等

ミン酸ナトリウム（MSG）および油脂を含有し級ごとに３サンプル行ったが，サンプルごとにセたサンプルを用いたうま味センサのセンサ特性をンサ応答が異なり，肉質等級の差異を評価するこ評価した。その結果，一度油脂を含有したサンプとができなかった。うま味センサの標準偏差は低ルを測定したうま味センサは，MSGおよび牛脂含有MSGに対し，異なる応答を示すことが分かっ

Relative value (mV)

0

:A5,

:A3,

た。

:A2

Fig. ２ に う ま 味 セ ン サ の 相 対 値 を ，Fig. ３ に
CPA値を示した。Fig.２より，一度油脂を測定し-15たセンサ電極でMSG溶液を測定すると，油脂を-30含有したMSG溶液の相対値はMSG溶液より大きかった。通常のうま味センサは，MSG濃度の増-45Sample A

Sample B

Sample C-60

Fig. 1 Relative value of umami sensor to wagyu

加とともに負の方向に増加する挙動を示すことか
ら，相対値の負の方向に増加するという挙動は油脂の有無にかかわらず同様といえる。Fig.３より，© The Ito Foundation

66

平成26年度:MSG,:MSG + 10% beef tallow

8
Adsorbed amount (μmo/cm2)

Relative value (mV)0

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

-40

-80

-120

10

30

100

Fig. 2 Relative value of umami sensor to MSG and MSG＋10％beef tallow

CPA value (mV)

20

:MSG,

2

300 mM MSG

300 mM MSG + 10% beef tallow

Fig. 4 Adsorbed amount of MSG on lipid polymer

membrane

いることから，うま味の後味（コク）の評価に応:MSG + 10% beef tallow

用できることが期待される。
3.3

10

うま味センサの吸着特性

3 . 2から，一度油脂を含有したサンプルを測定すると，油脂の有無がCPA値に反映されること

0

-10

4

0

300

MSG concentration (mM)6が示された。CPA値は，味物質の脂質高分子膜への吸着に反映することが分かっているため，
10

30

100

300

MSG concentration (mM)

MSGに対する吸着量の評価を行った。シャーレに製膜した脂質高分子膜（うま味センサ膜）に油

Fig. 3 CPA value of umami sensor to MSG and

脂を滴下したものを用い，300mM MSGと油脂

MSG＋10％beef tallow

10％含有300mM MSGの吸着量をFig.４に示した。
CPA値は，300mM MSGで＋15mV，牛脂10％含

うま味センサの膜は，油脂が吸着することで，有 MSG で ０ mV を 示 し ，MSG お よ び 油 脂 含 有

MSGの吸着量が変化することでセンサ応答に影

MSGともに，濃度に対し正の方向に増加するこ響が出ると予想したが，興味深いことにMSGのとが分かった。通常，MSGのCPA値は，10mM

吸着量に大きな差異は見られなかった。MSGのMSGの時，０mV程度であり，濃度の増加ととも吸着量は油脂の有無にかかわらず同程度であり，に負値方向に増加し，300mMの時，－40mV程度

Fig.３のように異なるCPA値を示す理由を明らかを示す。つまり，一度油脂を測定したうま味センにすることはできなかったが，本知見は油脂の味

サは，油脂を測定しないセンサと比較して，相対に対する影響を評価できる新たな評価となること

値においては膜電位応答に大きな変化はないが，が期待できる。今後は，油脂の吸着量に関して評

CPA値に関しては応答特性の正負が逆転すると価を行うとともに，膜に対する相互作用を明らかいうことが分かった。油脂を含有したMSG溶液にする必要がある。

のCPA値はMSG溶液のCPA値に比べ負の値をとっているのが特徴的である。このCPA値の応答特性変化は，油脂の有無による違いを認識して

４．要

約

本研究は味覚センサを利用して，和牛の「味」© The Ito Foundation

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関する研究を客観的に数値化，可視化する評価技術の構築を目的とし，油脂が溶解する50℃条件下で味覚セン
サを用いた和牛の評価およびうま味センサの応答

謝

67

辞
本研究で用いた和牛は，伊藤ハム株式会社様から提供頂いた。ここに謝意を表す。

特性について評価を行った。和牛サーロイン（肉質等級Ａ３，Ａ２，Ａ５）のセンサ応答では，肉質等級による差異は見られなかった。今後は，同一の等級ではなく，官能および味質に違いが出やすいと期待される歩留等級間の評価を行う必要があると考えられる。また，一度油脂を測定したう
ま味センサは，CPA値においてセンサ応答特性が変化し，うま味物質であるMSGにおいて，油脂の有無によるセンサ応答の差異を確認した。本
知見は，油脂の味に対する影響を評価できる新た文献１） Y. Kobayashi, M. Habara, H. Ikezaki, R. Chen, Y.
Naito, K. Toko, Sensors，10，3411～3443，2010．
２） Y. Tahara, K. Toko, IEEE Sensors Journal， 13（８），3001～3011，2013．
３） K. Toko, Biomimetic Sensor Technology,
Cambridge University Press, UK，2000．
４） K. Toko (ed), Biochemical Sensors, Pan Stanford
Publishing, Singapore，2013．
５） 兼松弘，木下葉子，新谷勛，松本太郎，油化学，
28（５），344～347，1979．
６） 都甲潔，田原祐助：平成25年度食肉に関する助成
調査成果報告書，伊藤記念財団，32，34～38，2013．

な評価手法となることが期待される。

© The Ito Foundation

68

レトルト加熱処理を施した筋原線維タンパク質の培養骨芽細胞の分化に及ぼす影響
Effect of retort processing on the osteoblast growth promoting activitiesof porcine myofibrillar protein

林

利

哉・深

見

渉・小

川

幸

彦＊・芳

賀

聖

一

（名城大学農学部，*名城大学農学部附属農場）

Toshiya Hayashi, Wataru Fukami, Yukihiko Ogawa＊ and Seiichi Haga
（Faculty of Agriculture, Meijo University, ＊Experimental Farm, Meijo University）

In this study, muscle protein degradation and expression of food functionality by retortprocessing were investigated using myofibrillar protein as a simple model system of meatproduct. Free amino acid and peptide contents significantly increased during retort processing
compared to heating at 70℃（control）．Therefore, we suggest that retort processing may leadto degradation of myofibrillar proteins as a result of exposure to extremely high temperatures.
Furthermore, growth-promoting activities in an osteoblast-like cell culture, i.e., alkaline
phosphatase and collagen synthesis activities of osteoblast-like cell cultures, were significantly
higher in the retorted myofibrillar protein than those in the protein heated at 70℃. These
results suggest that retort processing may contribute to derivation of low molecular weight
peptides and improvement in functionalities of meat products.

１．目

維の小片化，その他のタンパク質の分解もより顕的著にみられることを明らかにしている１）。このよ

当研究室では伝統的食品加工技術の活用による

うな加熱や発酵に伴うタンパク質分解，特に筋原食肉製品の高付加価値化を目指し，発酵や加熱と線維タンパク質の分解は，製品の好ましいテクス

いった加工処理が食肉の品質に及ぼす影響についチャー発現において，負の影響をもたらすものとて多面的に追究してきた。その結果，モデル考えられるが，一方で機能面においては，機能性

ソーセージを用いた製品レベルにおいて，120℃

ペプチド生成によるメリットをもたらすことが期以上の高温に及ぶレトルト加熱によって著しい物

待できる。従って，低温乳酸発酵やレトルト加熱性低下が起こるとともにタンパク質の分解が生に伴うタンパク質分解挙動の詳細を明らかにし，じ，その結果，低分子ペプチドが増加することをかつ機能性発現の有無を評価することは，食肉の見出している

機能改善を追究するうえで極めて意義深いといえ

１～３）。また，低温乳酸発酵を施すこ

４，５）とによりモデル製品の物性や組織構造が著しく変化し，加えてα-アクチニンの分解に伴う筋原線る。
そこで本研究では，食肉の主要タンパク質であ© The Ito Foundation

69

レトルト加熱処理を施した筋原線維タンパク質の培養骨芽細胞の分化に及ぼす影響

る筋原線維タンパク質を単純モデル系として用いて，まずはレトルト加熱処理を施した筋原線維タンパク質におけるペプチド・遊離アミノ酸の量的

Brelliant Blue R-250により行った。
2 . 4 培養骨芽細胞（MC3T3-E1）の分化指標
評価

変化を調べ，かつ骨芽細胞の分化賦活能を評価す

独立行政法人理化学研究所から購入した骨芽細ることで，レトルト加熱によるタンパク質分解と胞様株MC3T3-E1（RCB1126）を使用した。本

機能性発現の有無について検討を行った。

細 胞 の 培 養 に は 100U/ml Penicillin, 0.1mg/ml
Streptomycin, 4 mM L-Glutamine

２．実験材料と方法
2.1

を

含

む

Minimum Essential Medium Eagle’s（α -MEM）

試料調製

培地（SIGMA）を用い，10％FBS（MultiSerTM）

できる限り脂肪と結合組織を取り除いた新鮮なを添加して継代・前培養等を行った。培養はすべ

豚ロース肉から，一部改変したPerry and Grey６），てCO２インキュベーター（37℃，５％CO２）内でEtlinger行った。

７）

らの方法に準じて筋原線維を調製し，最 終 的 に 0.6M-NaCl ・ 50mM リ ン 酸 緩 衝 液

細胞濃度2.5×10 ５ cells/mlに調整したMC3T3（pH6.0）に対して透析，遠心分離（35,000×ｇ，-E1を3.5φディッシュに播種し，増殖培地（10％15分，４℃）して得られた上澄み画分を筋原線維

FBSを含むα-MEM）で３日間培養した。その試料とした。終濃度を15㎎/mlに調整した筋原線

後，新鮮なα-MEM培地に交換し，試料タンパ

維タンパク質溶液を，レトルト殺菌釜（花木製作

ク質濃度が５㎎/mlの各試料を培地に対して10％

所，HC-VA型）を用いて，120℃，130℃および（v/v）になるように添加して，３日間培養を行っ140℃でそれぞれ15分間加熱した。また，70℃でたものを以下の実験に供した。

30分間加熱したものを対照区とした。いずれの加試料添加後３日間培養した細胞の表面（3.5φ

熱処理区も，加熱後速やかに氷冷を行った。各加デ ィ ッ シ ュ ） を PBS で ３ 回 洗 浄 後 ， 0.25M

熱試料を遠心分離（35,000ｇ，15分，４℃）し，Sucrose水溶液0.5mlを添加し，セルスクレイパー

得られた上澄みを蒸留水に対して透析（Spectra/

にて細胞を剥離・回収した。回収した細胞を超音

por CE, M.W.：500），凍結乾燥したものを最終波破砕機（トミー精工，UD-201）で10秒間破砕試料とした。

した後，破砕液を遠心分離（2,000×ｇ，3min）

2.2

ペプチド・遊離アミノ酸量の測定して得られた上清を活性測定試料とした。

上記凍結乾燥試料を蒸留水で溶解させ，等量のアルカリホスファターゼ（ALP）活性測定に４％トリクロロ酢酸（TCA）を加えることによはラボアッセイTMALP（和光純薬）を用いた11）。

り２％TCA可溶性画分を調製し，三上ら８）の方

すなわち，96穴プレートに基質溶液（ｐ-ニトロ法に準じてペプチド量を，ニンヒドリン法 に準フェニルリン酸）100μｌと細胞破砕液の上清20

じて遊離アミノ酸量を測定した。

μｌ加え，37℃で30分間保温した後，反応停止液

９）2 . 3 ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリル

80μｌを加え，405nmの波長で吸光度を測定した。
キット付属のｐ-ニトロフェノール標準溶液を用

アミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
上記の水溶性タンパク質画分のタンパク質分布

いて作成した検量線より試料中のｐ-ニトロフェ

を SDS-PAGE10）（ア ク リ ル ア ミ ド 濃 度 ： 7.5 ～ノール（n mol/ml）を算出した。また細胞破砕20％）により調べた。ゲルの染色はCoomassie

液 の タ ン パ ク 質 濃 度 を BCA 法 に 基 づ く BCATM© The Ito Foundation

70

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Protein Assay Kit（PIERCE）用いて測定し，以Blankは10％の各試料を含むα-MEMとした。

下のようにALP活性値（n mol/min/μg protein）

３．結果と考察を算出した。

3.1

タンパク質分解に及ぼす影響

これまでにモデルソーセージを用いた製品レベ

ALP活性値（n mol/min/mg protein）＝p-Nitrophenol (n mol/ml） × 30 （min）

ルにおいて，レトルトや低温乳酸発酵処理によって食肉中のタンパク質が分解し，低分子ペプチド／細胞タンパク質量（μg/ml）が派生することを確認している１，12）。そこで本実
コラーゲンの定量はSircolTM Soluble Collagen験では，筋収縮の本体であり，主要タンパク質でAssay Kit（Biocolor Ltd）を用いて行った 。すある筋原線維タンパク質をモデル系に用いて，レ

なわち，試料添加後３日間培養した後の培養上清

トルト加熱がタンパク質分解に及ぼす影響につい200μｌにSircol dye reagent 1mlを加えて30分間てペプチドと遊離アミノ酸量を調べることにより

撹 拌 し た 後 ，遠 心 分 離（10,000 × ｇ ，10min ，

検討した。

11）

25 ℃ ）し て 得 ら れ た 沈 殿 画 分 に Alkali reagent

その結果，レトルト加熱を施すことにより，ペ1mlを加えて撹拌し，沈殿を溶解させた。この沈

プチド（Fig.1A），遊離アミノ酸量（Fig.1B）の

殿溶解液の吸光度（550nm）を測定した。キット

いずれも，対照区である70℃加熱区と比較して有付属のコラーゲン標準溶液を用いて作製した検量意（ｐ＜0.01）に高い値を示し，特に，140℃加線よりコラーゲン濃度を算出した。なお，各試料

熱区が最も顕著であった。
次に，レトルト加熱によるタンパク質分布の変Peptide content（mg/g protein）

120

d

(A)

100
b

80

c

60
40

a

20

Free amino acid content（mg/g protein）

中に含まれるコラーゲン量を考慮するため，

1.4

c

1.2
1
b

0.8
0.6

a
a

0.4
0.2

0
70℃

(B)

120℃ 130℃ 140℃

070℃

120℃ 130℃ 140℃

Fig. 1 Effect of retort processing on the peptide（A）and free amino acid contents（B）of the myofibrillar protein.
Data represent the means±SD of at least three independent experiments.
Values with different superscript letters are significantly different（p＜0.01）．

© The Ito Foundation

71

0.045
0.04

(A)

0.035

b

c

0.6

b
Collagen content（mg/ml）

ALP activity（nmol/min/μg protein）

レトルト加熱処理を施した筋原線維タンパク質の培養骨芽細胞の分化に及ぼす影響

a

0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
70℃

120℃ 130℃ 140℃

(B)

d

0.5
0.4
0.3

c
a
b

0.2
0.1
0

70℃

120℃

130℃

140℃

Fig. 2 Effect of peptide fractions from 70℃ heated and retorted myofibrillar protein on the ALP（A）and collagensynthesis（B）activity of MC3T3-E1 cells.
Data represent the means±SD of at least five independent experiments.
Values with different superscript letters are significantly different（p＜0.05）．

化をみるためにSDS-PAGEを行ったところ，デー（Fig.2A）。130℃加熱区も対照区と比較して有意タには示していないが，70℃加熱区で明瞭にみら（ｐ＜0.05）に高く，120℃以上の加熱によって生れたミオシンヘビーチェーン（200kDa）とアク

じるペプチドには骨芽細胞のALP活性の促進にチン（42kDa）の染色強度が120℃以上の高温加作用する可能性が示唆され，その程度は，骨形成熱によって著しく低下するとともに，20kDa以下にポジティブに作用するとされるβ-クリプトキの低分子領域の染色強度が強くなる傾向がみられサンチン（10－８ ～10－６ Ｍ）に相当する活性値でた。

あった14）。

これらのことより，筋原線維タンパク質の分解

一方のコラーゲン量では，対照区である70℃加は，加熱温度上昇に依存して昂進することが示唆

熱区とレトルト加熱区を比較すると，120℃加熱された。

区で有意（ｐ＜0.01）に低い値を示したものの，

3.2

130℃以上の加熱区では有意（ｐ＜0.05）に高い

骨芽細胞の分化に及ぼす影響

骨芽細胞の分化指標として石灰化の促進に働く値を示した（Fig.2B）。これらのことより，130℃

ALP活性や骨の構成成分であるコラーゲン量が以上の加熱によってコラーゲン合成能の活性化にしばしば用いられる作用するペプチドが生じたものと推察される。

。これらを指標にレトル

11，13）

ト加熱を施した筋原線維の骨芽細胞分化に及ぼす

今後はレトルト加熱によって派生する活性因子

影響について検討した結果をFig.2AとFig.2Bにその特定を急ぐとともに，低温乳酸発酵の影響につれぞれ示した。対照区である70℃加熱区とレトル

いても引き続き検討を続けたい。

ト加熱区のALP活性値を比較すると，いずれの加熱区も有意（ｐ＜0.05）に高い値を示し，特に本研究成果の一部は，公益財団法人伊藤記念財

120 ℃ 加 熱 区 と 140 ℃ 加 熱 区 が 高 い 値 を 示 し た団の支援によって得られたものであり，ここに深© The Ito Foundation

72

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

く感謝申し上げます。また，名城大学農学部食品れる可能性が示唆された。

機能学研究室の学生・院生諸氏に深謝申し上げま
す。
４．要

約

食肉の主要タンパク質である筋原線維タンパク質を単純モデル系として用いて，レトルト加熱処
理を施すことによる筋原線維タンパク質のタンパ
ク質分解と機能性発現の有無について検討を行った。
筋原線維タンパク質に120～140℃のレトルト加
熱処理を施すことによって，遊離アミノ酸ならびにペプチド量が，加熱温度上昇に伴って有意に増加し（ｐ＜0.01），超高温加熱によって，筋原線
維タンパク質の分解が生じることが示唆された。
培養骨芽細胞の分化に及ぼす影響についても，
アルカリホスファターゼ活性，コラーゲン量のいずれも，70℃加熱区と比較して有意に高い値を示
し（ｐ＜0.05），いずれの指標も140加熱区が最も高い値を示した。
以上のことより，レトルト加熱によって筋原線
維タンパク質は分解し，その結果生じた低分子ペプチド群に骨芽細胞の分化を賦活する因子が含ま文献１） 芳賀聖一，林利哉，大場正春，坂田亮一：名城大
学総合研究所総合学術研究論文集，８，91～96，
2009．
２） 芳賀聖一，ミートジャーナル，36（１），107～
113，1999．
３） 藤田利宗，林利哉，芳賀聖一，日本食品科学工学
会誌，53（８），423～429，2006．
４） Hayashi, T., Toyoda, N., Arakawa, M., Haga, S.,
Int. Cong. Meat Sci. Technol., 56, E60 ， １ ～ ４ ，
2010．
５） Hayashi, T., Washio, S., Arakawa, M., Taguchi, M.,
Toyoda, N., Haga, S., Int. Cong. Meat Sci. Technol.,
57, P395，１～４，2011．
６） Perry, S. V., Grey, T. C., Biochem. J.，64，184～
192，1956．
７） Etlinger, J. D., Zak, R., Fischman D. A., J. Cell
Biol.，６，123～141，1976．
８） 三上正幸，長尾真理，関川三男，三浦弘之，日本
畜産学会報，66（７）630～638，1994．
９） 日本化学会編実験化学講座23，「生物化学Ⅰ」，丸善，東京，124～130，1964．
10） Laemmli, U. K., Nature，227，680～685，1970．
11） Choi, E. M., Biochem. Pharmacol.，70，363～368（2005）
12） Hayashi, T., Kato, K., Haga, S., J. Res. Inst. Meijo
Univ.，７，71～80，2009．
13） 芹澤篤，鳥羽保宏，月刊フードケミカル，23（３），24～29，2007．
14） Uchiyama, S., Yamaguchi, M., J. Cell. Biochem.，
95，1224～1234，2005．

© The Ito Foundation

73

メタボロミクス解析による黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の探索
Search for index related to delicious of Japanese Black Cattle Beef Meatby metabolomic analysis

鈴木啓一１・飯田文子２・小松智彦３・庄司則章３・加藤和雄１（１東北大学大学院農学研究科，２日本女子大学，３山形県総合農業センター）

Keiichi Suzuki1, Fumiko Iida2, Tomohiko Komatsu3, Noriaki Shoji3 and Kazuo Katoh１（１Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University，２Japan Womenʼs University，
３Livestock Experiment Station of Yamagata Integrated Agricultural Research Center）

The panel test and the chemical analysis of Japanese Black Cattle Brand beef were done.
In addition, to search for the index related to delicious beef, metabolomics analysis of the beef
sample was executed. The multiple regression analysis of which the independent variants were
the sugar and amino acid content, and the dependent variate was a desirable taste of the panel
test of 35 brand beefs was done and five high beef and five low beef of a desirable taste werechosen by this multiple regression equation. The evaluated high group of desirable taste beef
was higher in IMP and Carnocine ＋ Taurin than the low group of desirable taste beef. As aresult of metabolomics analysis, the desirable taste low group beef was higher in
Octanoylcarnitine, Spermidine, Glutathione（GSSG）_divalent, Phosphorylcholine and γ-GluCys than high group beef. These results suggested that these compounds be likely to berelated to an undesirable taste.

１．目

場合にモノ不飽和脂肪酸の割合の違いがどの程度的食味性に影響を及ぼすかを訓練パネルにより比較

我が国の黒毛和種牛肉は，都道府県や家畜改良検討してきた２）。さらに，黒毛和種牛肉６つの銘センターなどが実施する直接検定，現場後代検定

柄牛肉についてパネルテストと化学成分の分析をの成績から推定した育種価に基づく種雄牛の選抜行った。その結果，パネルテストの「好ましいうとその効率的利用など育種改良技術と飼養管理技

ま味」に関しては，銘柄間の差が認められ，さら術の改善が相まって，枝肉重量はもとより脂肪交に，この項目と生肉および焼肉のイノシン酸など

雑などの肉質は劇的に向上してきた 。しかし，ATP関連物質，カルノシン，タウリン，アンセ

長期的な視点から，新たな肉質評価基準が模索さ

リン濃度が有意な正の相関を示し，牛肉の美味しれており，より付加価値の高い美味しい牛肉の指さに関わる指標として重要であることが示唆され標づくりが課題となってきている。申請者らは，た３）。そこで，本研究では特長のある黒毛和種銘

これまで牛肉について，BMSNo.性を一定とした

柄牛肉を対象として牛肉サンプルの網羅的メタボ

１）© The Ito Foundation

74

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ロミクス解析を実施し，牛肉の美味しさに関わる

2 . 3 糖，ATP関連物質，アミン酸成分による指標を探索することを目的とした。

主成分分析と重回帰分析
35 頭 の 銘 柄 牛 を 特 徴 付 け る た め ，糖 成 分 ，法

２．方ATP関連物質およびアミノ酸等の成分による主牛肉サンプルは，仙台，山形，岩手，神戸，岐

成分分析を行った。次に，パネルテストの結果に阜県，沖縄県の食肉市場に出荷された銘柄牛肉

より，特に，「好ましいうま味」の評価項目を従「仙台牛」，「山形牛」，「前沢牛」，「神戸牛」，「飛属変量（Ｙ），アミノ酸，糖およびATP関連物質

騨牛」，「石垣牛プレミアム36ヶ月肥育牛」，「石垣を独立変量（Ｘ）とした重回帰分析を行い，好ま

牛プレミアム40ヶ月肥育牛」の肉質等級「Ａ４～

しいうま味に関する重回帰分析を行った。得られ５」，「雌」のサーロイン牛肉５頭ずつ，合計35頭た重回帰式から得られた好ましいうま味推定値Ｙ分を用いた。

の値の高低それぞれ５頭ずつの牛肉を選び出し，

2.1

パネルテストメタボロミクス解析用のサンプルとした。

真空パック冷凍保存した牛肉を２℃の冷蔵庫で2.4

メタボロミクス解析

24時間かけて解凍した。訓練されたパネルによ凍結ロース牛肉の中心部から肉を約50㎎採材しり，６つの銘柄牛の食味テストを行った。パネル

速やかに１mlエッペンチューブに入れ，ドライ

テストの方法は，原則として３つの銘柄牛肉を３アイスにて－80℃で凍結保存した。凍結保存した点比較法により，次に別の３つの銘柄牛肉を同様

サンプルをメタボロミクス解析の業者に送り，に３点比較法により，10人のパネルにより銘柄牛

CE-TOSMSによるメタボロミクス解析を行った。

肉についてそれぞれ合計５回のテストを行った。

解析は，ヒューマン・メタボローム・テクノロ

パネルテスト項目は，「やわらかさ（はじめの一ジー株式会社に委託した。アミノ酸，有機酸，糖噛み）」「やわらかさ（咀嚼時）」「線維感」「多汁

リン酸および核酸を含む候補化合物160ピークに性」「総合的食感」「良い牛くささ」「悪い牛くさついて「好ましいうま味」推定値高低間の有意差さ」「風味の強さ」「好ましいうま味」「総合評価」

検定を行った。さらに，160のピークを用いて主の10項目である。評価は１から８の段階で数字の成分分析とパスウエイ解析を行った。

大きい方が優れている。
2.2

アミノ酸・ジペプチド，糖成分の分析

３．結果と考察

生肉と同時に，パネルテストと同じ条件で処理

はじめに，35頭の銘柄牛肉について，糖成分，した牛肉（焼き肉）からもサンプルを採材した。

ATP関連物質およびアミノ酸等による主成分分

サーロイン牛肉の一部200～250㎎を粉砕してから析を行った。その結果をFig.１に示した。第１主ホモジナイズし，ヘキサン５mLで脱脂してから成分と第２主成分により銘柄牛が分類されることヘキサンを吸引除去した。その後，アセトニトリが明らかとなった。第１主成分と第２主成分の因

ル3.5mLを添加し，70％アセトニトリル（５mL）

子負荷量により，第１主成分は，Ser, Met, Thr,とした。0.45μｍのフィルターを通したもの１mL

Ileなどのアミノ酸の因子負荷量が大きなウエイ

を高速液体クロマトグラフィで分析した。得られト を 占 め る 。一 方 ，第 ２ 主 成 分 は IMP, DNA,たクロマトグラフィの各アミノ酸のピーク強度を

HxR, CarTa, AnsなどのATP関連物質やアミノ酸

標準アミノ酸のピーク強度と比較算出した。

により特徴付けられることが明らかとなった© The Ito Foundation

75

メタボロミクス解析による黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の探索

Table 1 S ummary of the eigenvalues and principal

Prin2

components

4 +

M

Item

3 +
H

H

I

S

2 +

I

H
SH
H

M

S

1 +

I

J

JS

S

I
0 +

J

K
-1 +

K
I

J

J

M

K

K

Y
K

-2 +

M
Y

-3 +

Y

Y
Y

M

-6

-4

-4 +
-8

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

Prin1

Prinl

Item

Prin2

Eigenvalue％

59.4

Eigenvalue％

12.6

Ser

0.232

IMP

0.431

Met

0.231

DNA

0.393

Thr

0.230

HxR

0.358

Ile

0.230

CarTa

0.346

Phe
Val

0.228
0.228

Ans
Glyco

0.307
0.202

Tyr

0.227

Pro

0.187

Glut

0.226

FruMa

0.159

Ala

0.220

Glu

0.076

Leu
Lys

0.217
0.216

Sugar
Rib

0.073
0.050

Sugar
His
Trp

0.215
0.214
0.210

Ala
His
Arg

0.026
0.014
0.013

Fig. 1 Plot of principal components（PC）1 and 2 foreach brand beef.
 S
 ymbols of Y, M, S, H, K, I, J shows each brand
beef.

Table 2 Comparison of giucose, amino acids between

favorable taste group
Favorable taste groupHigh（Table１）。特に第２主成分は，ATP関連物質とCarnocine＋Taurinにより特徴付けられることか
ら「好ましいうま味」成分を示すことが明らかとなり，銘柄牛により異なることがわかった。
次に，パネルテストの「好ましいうま味」を従
属変量，糖成分，アミノ酸，ATP関連物質を独立変量とした重回帰分析の結果，以下の重回帰式が得られた。
Ｙ＝－ 3.74136Ｘ１－0.67641Ｘ２＋0.08438Ｘ３＋6.37086，Ｒ２＝0.4832
ここで，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３はそれぞれイノシトー
ル，Ｋ値，Carnocine＋Taurinである。
３つの化学成分を上記の式に当てはめて推定されたＹの値の高低により，35頭の牛肉から上下５頭ずつ10頭の牛肉を選んだ。選抜した高低10頭の牛肉のパネルテストの「好ましいうま味」，糖成
分，ATP関連物質，アミノ酸・ペプチド各成分のうち，有意差のある形質の平均値をTable２にFavorable taste
Glycogen
RiboseGluucose
Sugar
IMP
HxR
DNA
Kvalue
Glu
Ser
His
Thr
Ala
Car＋Tau
Ans
Tyr
Val
Met
Ile
Amino acides
CarTauAns
Amino＋Peptide

Low

Mean

sd

Mean

sd

6.48
2.88
0.34
1.10
2.48
1.15
0.89
3.44
0.66
0.61
0.54
0.79
0.31
3.02
12.21
2.39
0.35
0.48
0.25
0.30
10.88
14.60
25.48

0.15
1.32
0.12
0.22
0.45
0.22
0.28
0.56
0.09
0.16
0.16
0.14
0.08
0.47
2.06
0.46
0.09
0.11
0.07
0.07
1.76
2.20
3.69

6.07
1.45
0.22
0.75
1.89
0.24
0.53
2.23
0.89
0.46
0.36
0.57
0.22
2.37
7.91
1.80
0.24
0.36
0.18
0.22
8.81
9.71
18.52

0.44
0.88
0.03
0.18
0.39
0.15
0.08
0.16
0.06
0.06
0.04
0.16
0.03
0.14
1.67
0.27
0.04
0.08
0.05
0.05
0.52
1.86
2.34

Number of High and Low goup was ５．
Free amino acid：nmol/g WW, Sugar：μg/gWW示した。それらの中で，糖成分ではGlycogen，© The Ito Foundation

76

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 3 List of compounds that are significantly different between high and low favorable taste
Relative Area
Compound nameComparative Analysis

Low

OctanoylcarnitineHigh

Low vs High

Mean

sd

Mean

sd

Ratio

p-value

8.0E-04

2.5E-04

4.2E-04

1.6E-04

1.9

0.0093

Spermidine

3.1E-03

5.5E-04

2.3E-03

3.4E-04

1.3

0.0210Glutathione(GSSG)_divalent

1.2E-02

1.9E-03

7.7E-03

3.4E-03

1.5

0.0241

XA0033

7.8E-04

1.9E-04

5.5E-04

1.3E-04

1.4

0.0278

Phosphorylcholine

7.3E-03

1.7E-03

5.3E-03

1.3E-03

1.4

0.0321γ-Glu-Cys

6.1E-04

5.9E-05

4.0E-04

1.6E-04

1.5

0.0408β-Ala-Lys

3.7E-03

1.3E-03

2.3E-03

1.2E-03

1.6

0.0497

ATP関連物質ではIMP，アミノ酸ではCar＋Tau

対的に高くなっており，これらの化合物が高いこについて「好ましい味」で高が低よりかなり高いとが好ましくない味に関連することが示唆された。
Fig.２には，10頭の牛肉に関してメタボロミク

値が示された。
「好ましいうま味」高低の牛肉のメタボロミク

ス解析候補化合物を対象とした主成分分析の結果

ス解析の結果，160の候補化合物のうち統計的にを示した。第１主成分について見ると，高と低の有意な差が検出されたのはTable３に示した７つ

それぞれ１個体ずつ極端に高い個体と低い値の個の化合物である。このうち，Octanoylcarnitine,体が存在するが，全体として高も低もばらついて

Spermidine, Glutathione （GSSG）_divalent,

いる。一方，第２主成分については高の１個体がPhosphorylcholine，γ-Glu-Cysの５つの化合物

極端に高い値を示しているが全体としては高が低については，The Human Metabolome Database

より低い値となっている。第１主成分の因子負荷に解説があるが，それらの機能は以下のとおりで

量 に つ い て 見 る と ， Diethanolamine, myo-

ある。いずれも「好ましいうま味」が低い方が相Inositol 1-phosphate, myo-Inositol 3-phosphate,
Cystathionine, Glycerol, Hexanoic acid な ど の 化

8

H13

High
Low

6

L14

２主成分の因子負荷量の高い化学成分を見ると

PC２(13.9％)

4

Xanthine, Cytidine, Isoglutamic acid,

2

L-5

0

Theobromine, Glutathione （GSSG）_divalent,

L29

-2

L-4

Phosphorylcholine, Spermidineなどメタボロミク
ス解析の結果，有意差の認められた５つの化合物

H27
H8

の

-4

H15
-6
-15

学成分の負荷量が高い値となっているが，それらの牛肉の生理学的機能は不明である。しかし，第

L-12

H30
-10

-5

0

PC1(39.7％)

5

10

15

Fig. 2 Plot of principal components（PC）1 and 2 ofmetabolome for high and low favorable taste beefbrand.

うち， Glutathione（GSSG）_divalent,

Phosphorylcholine, Spermidineが因子負荷量の上位にランクされており，またγ-Glu-Cysは因子負荷量が低にランクされていた。よって，第２主成分はこれらの５つの化合物によって特徴付けら© The Ito Foundation

メタボロミクス解析による黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の探索れる因子と考えられる。

77

内レベルも精密に制御されていることから，ポリ

これらの５つの化合物の代謝経路を見ると，アミンは細胞増殖およびその制御の過程で重要な

Glutathione（GSSG）_divalent は 尿 素 回 路 と 関 連役割を果たす物質の一つであると考えられている。

ア ミ ノ 酸 の 代 謝 に 関 連 す る 。二 分 子 の 還 元 型

さらに，γ-Glu-Cysは，グルタミン酸とシス

Glutathione が ジ ス ル フ ィ ド 結 合 に よ っ て つ な

テインがペプチド結合したGlutathioneの前駆体が っ た 酸 化 型 の Glutathione（GSSG）で あ る 。

であり，グルタミン酸－システインリガーゼにGlutathioneは，細胞内で発生した活性酸素種や，よってグルタミン酸とシステインからγ－グルタ

過酸化物と反応してこれを還元して消去するが，ミルシステイン合成酵素によりγ－グルタミルシ

自 ら は 酸 化 さ れ 酸 化 型 Glutathione と な る 。

ステインが合成され，さらにGlutathione合成酵

Glutathioneの生理的機能は，生体内の主要な抗素によってグリシンと反応しGlutathioneに変換

酸化成分であるチオールの細胞内での環境を維持

さ れ る 。 よ っ て ， γ － Glu-Cys は Glutathione

することや，さらに，様々な毒物・薬物・伝達物（GSSG）_divalentと関連する化学物質と言える。

質を細胞外に排出させ細胞を解毒する機能があ

ところで，コク味は，甘味，塩味，酸味，苦味，る。細胞中の還元型グルタチオンと酸化型グルタ

うま味の５基本味では表せない味で，基本味だけチオンの比率は，しばしば細胞毒性の評価指標とではなく，厚み・ひろがり・持続性・まとまりなし て 科 学 的 に 用 い ら れ る 。従 っ て ，酸 化 型

ど基本味の周辺の味をも増強した味と考えられて

Glutathione（GSSG）が多いことは生体内の状況

い る 。こ の コ ク 味 機 能 を 有 す る 物 質 と し て はがあまり良くない結果を反映していることになる

Glutathioneが知られている。Glutathioneは，３と思われる。

つのアミノ酸から成るペプチドで玉ねぎやニンニ

４）

また，Phosphorylcholineはグリシン，セリン

クなどに多く含まれる他，食品に広く見られる。

とトレオニン代謝経路，グリセロリン脂質代謝経

これ自身は味を感じさせないものの，他の味の厚路の中のコリンとシチジン二リン酸コリンの間のさ，持続性，広がりを引き出す効能を持つと言わ中間体の中のコリンの前駆代謝物質であり，脂質れている。

代謝とアミノ酸の代謝の経路に関係する物質であ35頭の銘柄牛肉のパネルテストで好ましい味とる。人間の肝腫瘍ではPhosphorylcholine濃度が関連した化学成分であるIMP，カルノシン＋タウ

上昇することが知られている。

リンなどの化学成分と，「好ましいうま味」の高さらに，Spermidineはポリアミンに分類され低牛肉のメタボロミクス解析の結果，抽出されたる有機化合物で，細胞代謝の際にRNAポリメラー

化学成分との関連を見ると，いずれも負の相関をゼの一種である酵素T7 RNAポリメラーゼを活性示 し ， こ れ ら の 中 で Spermidine と IMP,化するのに利用されることがある。アルギニンか

SpermidineとCarnocine＋Taurinとの間にはそれら生体アミンのプトレシン，Spermidineが生成

ぞれ－0.56（Ｐ＜0.10）と，－0.61（Ｐ＜0.05）のされる。ポリアミンの生理的機能は多年にわたる

負の相関が得られた。従って，ポリアミンの一つ研究にも関わらずまだ十分には解明されていなであるSpermidineの生理学的機能が何らかの形い。しかし活発に増殖する組織にはポリアミンがで好ましい味と関連するIMPやカルノシン＋タウ

多量に含まれているだけではなく，そのような組リンの量を抑制している可能性が高い。

織ではポリアミン代謝が活発であり，また，細胞以上，本研究では，牛肉の規格（肉質等級４以© The Ito Foundation

78

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

上）や性を雌に統一した上で，特徴のある全国の高に評価された牛肉が低に評価された牛肉より，

銘柄牛肉をサンプルの分析型試食パネルテストをIMP, Carnocine＋Taurinなどの成分が高いこと

行い，パネルテストで明確な差が認められる牛肉

明らかとなった。メタボロミクス解析の結果，好について，メタボロミクス解析を行い，好ましい

ましいうま味の低い方が高い方よりも味に関連する化学成分の探索とそれらを作り出す

Octanoylcarnitine, Spermidine, Glutathione

生体の代謝状態を網羅的に検討して，美味しさに（GSSG）_divalent, Phosphorylcholine ， γ -Glu-

関わる指標を特定することを試みた。その結果，Cysの５つの化合物が高くこれらの化合物は好ま５つのメタボロームが重要な指標として検索されしくない味に関連している可能性が示唆された。

た。これらの化学物質の生体内での機能と肉質との関係をさらに調べることで美味しい牛肉生産ための科学的指標を構築する必要があると考える。
４．要

約

黒毛和種銘柄牛肉について試食パネルテストと化学分析を行い，牛肉の美味しさに関わる指標を探索するため牛肉サンプルの網羅的メタボロミク
ス解析を実施した。35頭の銘柄牛肉の糖成分，アミノ酸を独立変量とし，パネルテストの好ましい味を従属変量とした重回帰分析を行い，推定した回帰式により好ましい味の牛肉高低５頭ずつを選び，メタボロミクス解析を行った。好ましい味の文
献１） 家畜改良センター，全国域での種雄牛および繁殖
雌牛の遺伝的能力の推移について，http://www.nlbc.
go.jp/pdf/data/trend26s.pdf，2015．
２） 鈴木啓一，横田祥子，塩浦宏陽，島津朋之，飯田文子：試食パネルによる黒毛和種牛肉の食味性に及ぼす肉質等級，性と脂肪酸組成の影響の評価，日本
畜産学会報，84，375～381，2013．
３） 鈴木啓一，横田祥子，塩浦宏陽，飯田文子，山田信一，佐久間弘典：試食パネルによる黒毛和種牛肉の脂肪酸組成，香気成分，呈味成分と食味性との関連に関する研究，公益財団法人伊藤記念財団 平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，30，
61～67，2013．
４） Pastore, A., Piemonte, F., Locatelli, M., Lo Russo,A., Gaeta, L. M., Tozzi, G., Federici, G.：
Determination of blood total, reduced, and oxidized
glutathione in pediatric subjects, Clin., Chem. 47 ，1467～1469．2003．

© The Ito Foundation

79

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定
The identification of myosin rod region involved in the solubilization under
the low ionic strength condition

早

川

徹

（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

Toru Hayakawa（Department of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Meat is rich in high quality proteins containing all essential amino acids for human.
However, meat has not been utilized as a supplementary protein food to the extent of milk orsoybean products due to the low degree of solubility of meat proteins. If meat proteins could
be solubilized in a low ionic strength solution or water, meat could be used in various ways,
such as a liquid diet. Myosin, one of the major proteins in meat, is also insoluble in low andphysiological ionic strength solutions. We already have shown that myosin was solubilized in a
low ionic strength solution containing L-histidine and that structural change of rod region of
myosin was caused by solubilization. In this study, we tried identifying the detail region of
myosin rod involving the solubilization under the low ionic strength condition. Although thesurface hydrophobicity of 1700-1755 amino acids residue of myosin heavy chain, located in rod
region of myosin, was increased by solubilization, there was no difference in the surface
charges between solubilized protein in low ionic strength solution with L-histidine and that inhigh ionic strength solutions. The 1700-1755 amino acids residue region of myosin rod could
not be involved in the solublization of myosin in a low ionic strength solution containing
L-histidine.

１．目

塩濃度溶液に水溶化させることが可能となれば，的

食肉タンパク質の利用性が拡大するだけでなく，食肉は必須アミノ酸を豊富に含む良質なタンパ

新たな食肉製品の開発も期待できる。

ク質供給源であるが，そのタンパク質の大半は水

これまでに食肉タンパク質の水溶化を試みた報および低塩濃度溶液に対して不溶性を示す。一

告がいくつかある。Krishnamurthyらは鶏胸筋を方，高塩濃度溶液に対しては80％程度の食肉タン

水と低塩濃度溶液（25-150mM）での洗いを繰り

パク質が溶解するとされるが，高濃度の塩を含む返すことで筋原線維タンパク質の90％以上を溶解ため食味性などの観点から食品への利用は現実的できたと報告したが１），Itoらはこの方法では筋原ではない。もし，食肉タンパク質を水もしくは低線維タンパク質の水溶化を再現できなかったと© The Ito Foundation

80

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

し，超音波処理を加えることで80％以上の溶解度

Table 1. List of PCR primers used in this study.

を得ることができたと報告した 。最近では，

Primer Sequgnce

２）

Takaiらがアルギニンの添加により生理的塩濃度

Restriction
enzyme＃759

5'-tttgaattcCTAattgcgggcttcctgg-3'

EcoRI

＃761

5'-tttgaattcCTActtcagggccagctgc-3'

EcoRI上させたと報告している 。また，Itoらの報告に＃763

5'-tttaattcCTAtctaagaatgttcttgagatc-3'

EcoRI

よると，筋原線維タンパク質の溶解度を向上させ＃765

5'-tttgaattcCTActtgttgactgtgactctgc-3'

EcoRI

るには，ミオシンの抽出率を向上させることが重＃815

5'-tttaagctttgACAGAGCGCTCGAGAA
AAG-3'

HindIII

要であることも示されている２）。我々はこれまで＃816

5'-tttaagctttgACTGAAGAGAAGGCCAAGAAG-3'

HindIII＃817

5'-tttaagctttgGGCAAGAAGCAAATTCAGAAG-3'

HindIII＃818

5'-tttaagctttgCTCCAGGATCTGGTGG
AG-3'

HindIII（150-200 mM）におけるミオシンの溶解性を向３）に，ミオシンの水もしくは低塩濃度溶液における溶解性について検討したところ，ミオシン単独では超音波処理を施さずともヒスチジンを含む超低塩濃度溶液（１mM）に対して溶解すること（以下，水溶化）を明らかにした４）。

LMM

ミオシンは主要な食肉タンパク質の一つであり，２本の重鎖と４本の軽鎖からなる六量体のタンパク質である。生体筋肉組織においては，多数のミオシンが会合し，“太いフィラメント”と呼ばれる重合体として存在している。また，ATPの

1700

1924
1755

分解とアクチンとの相互作用を繰り返すことで筋るが，非筋細胞ミオシンの重合体形成においてはその尾部領域が重要な役割を担っていることが示
唆されている５～８）。ミオシンの水溶化においても，
ミオシン尾部（Ｌ-メロミオシン．以下，LMM）の構造変化が関わっていることを明らかにしたが９），詳細な水溶化機構は不明のままである。本研究で1756-1811

1813 1868

肉を収縮させる機能も有している。ミオシンの“太いフィラメント”の詳細な形成機構は未解明であ

1700-1755

1756 1811

1869

1813-1868
1869-1924

Fig. 1 Diagram of myosin heavy chain constructs.These

constructs were expressed in E. coli. Construct
1700-1755 was expressed with promers #759 and#815 ， 1756-1811 was expressed with primers #761
and #816，1813-1868 was expressed with primers#763 and #817 ，and 1869-1924 was expressed withprimers #765 and #818．Construct 1700-1755 was
only examined in this study.

は，ミオシンの水溶化機構を明らかにすることを目的とし，水溶化現象に関与しているミオシン尾シン重鎖１Ｃ（NM_001113709）をもとに，アミ部領域の特定を試みた。

ノ酸残基1700番目から1924番目までを四分割する

２．方
2.1

よ う に 設 計 し た（Table 1, Fig. １）。精 製 し た

法

LMMフラグメントは，0.6 M KCl，５mMリン酸

LMMフラグメントの作製

緩衝液，pH 7.2からなる透析外液に対して透析し，LMM フ ラ グ メ ン ト の 作 製 に は ， Profinity

これを対照とした。このLMMフラグメントを，

eXactTM Protein Purification System（Bio-Rad）

１mM KCl，５mMヒスチジンからなる溶液に対を用いた。LMMフラグメントは，鶏骨格筋ミオ

して透析し，これを水溶化LMMフラグメントと© The Ito Foundation

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定81した。さらに，ヒスチジン添加の影響を見るためもＣ末端に近い1869-1894アミノ酸残基領域のに，0.6 M KCl，５mMヒスチジンからなる透析

LMMフラグメントはまったく発現が確認できな外液に対して透析したLMMフラグメントも調製かった。この結果から，以降の実験にはミオシンした。

尾 部 の 1700-1755 ア ミ ノ 酸 残 基 領 域 を 模 し た

2.2

LMMフラグメントを用い，研究を進めた。

表面疎水性

LMMフラグメントの表面疎水性の測定は，ミオシン尾部は，ほぼ全域にわたり，二本のαGuerrieriらの方法に従った 10）。LMMフラグメン-ヘリックスが絡まるコイルドコイル構造がとら

ト溶液200μlに，3.2 mMアニリノナフタレンスル

れている11）。このコイルドコイル構造の形成には，ホン酸（ANS）溶液20μlを加え，よく混ぜた。

アミノ酸同士の疎水結合が優位であり，よってタ

室温で10分間静置させた後，励起波長380 nm，ンパク質構造内部に配位されるアミノ酸は疎水性

蛍光波長475 nmにおける蛍光強度を分光蛍光光

アミノ酸であることが多い 12）。ここでは，LMM

度計（FP-6200，日本分光）で測定し，表面疎水

フラグメントの水溶化処理による表面疎水性の変性とした。

化を見ることで，構造変化の指標とした。疎水性

2.3

ネイティヴ-PAGEを認識する蛍光プローブとしてANSを用い，水ネイティヴ-PAGEは，４％ポリアクリルアミ

溶化条件下でLMMフラグメントと反応させ，励

ドゲル（ビス比＝29.2：0.8）を濃縮ゲルに，10％起波長380 nmにおける蛍光波長475 nmでの蛍光ポリアクリルアミドゲル（同ビス比）を分離ゲル強度を測定した。その結果，高塩濃度条件下ではに用いた。泳動後のゲルは，0.1％クマシーブリ

ヒスチジンの有無による蛍光強度の差は見られな

リアントブルーＲ-250溶液で染色し，５％メタ

かったが，水溶化条件下でのLMMフラグメント

ノール-酢酸溶液で脱色した。

ではより強い蛍光が見られ，水溶化条件下ではLMMフラグメント分子表面の疎水性が増大して３．結果と考察いることが分かった（Fig.２）。つまり，このこ

我々はこれまでにミオシンがヒスチジンを含むとは，ミオシンの1700-1755アミノ酸残基領域に

超低塩濃度溶液に溶解することを発見し ，水溶

おいて水溶化により構造変化が生じていることを化条件下においてミオシンの尾部領域に構造変化示唆している。

４）が起きていることも明らかにした 。そこで，本ミオシンの重合体形成には，尾部領域間の静電的研究では，水溶化の際に構造変化が起きている尾相互作用が大きく関与しているとされている５，６）。

部領域を特定し，水溶化現象を明らかにすること

ミオシンが水溶化するためには重合体からの解離を目的とした。まず，構造変化領域の特定のためが必須であり，重合体から解離するためにはタンに，ミオシン尾部のＣ末端250残基領域を分割しパク質分子表面の電荷の変化が必要になるだろたような変異タンパク質（LMMフラグメント）う。そこで，水溶化したLMMフラグメントの表の作製を行った。その結果，1700-1755アミノ酸

面電荷の変化をネイティヴ-PAGE法により検証

残基領域を模したLMMフラグメントは発現量もした。その結果，水溶化条件下のLMMフラグメ

多く，精製することができたが，他のLMMフラ

ントは，高塩濃度下およびヒスチジンを含む高塩

グメントは精製に十分な発現量が得られず，以降

濃度下におけるLMMフラグメントと移動度に違の実験に供することができなかった。特にもっといがないことが示され，この尾部領域においては

９）© The Ito Foundation

82

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

水溶化による表面電荷の変化は起きないことが分

Fluorescence intensity

200

かった（Fig.３）。
150以上の結果から，ミオシン尾部の1700-1755ア
ミノ酸残基領域において，水溶化条件下では表面100

疎水性が増大するような構造変化が生じているものの，水溶化に不可欠と考えられる表面電荷の変500化は起きておらず，この領域には水溶化に関連す
1 mM KCI 5 mM His

0.6 M KCI

0.6 M KCI 5 mM His

Fig. 2 Surface hydrophobicity of construct 1700-1755 in a

low ionic strength solution containing L-histidine.
The fluorescence intensity of ANS-construct complex
was obtained with a spectrofluorophotometer.
Excitation and emission wavelength were 380 nm
and 475 nm, respectively.

る部分は含まれていないことが分かった。ミオシ
ン の 重 合 体 形 成 に は ，重 合 反 応 ド メ イ ン（assembly competence domain, ACD）と呼ばれる領域が必須であるとされており５），この領域もしくは近接する領域について検討することで水溶化の詳細を明らかにすることができるかもしれな
い。

1

2

４．要

3

約

本研究では，ミオシンの水溶化現象の解明を目的とし，水溶化に関与しているミオシン尾部領域の特定を試みた。ミオシン尾部の1700-1755アミノ酸残基領域では，水溶化条件下において表面疎水性の増大が見られたものの，表面電荷には変化がなく，この領域は水溶化現象との関連性が低い
ことが分かった。今後はミオシンの重合体形成に関与されているとされるACD領域（1876-1904ア
ミノ酸残基領域）における構造変化について，詳細に検討していく。

Fig. 3 Native-PAGE pattern of construct 1700-1755 in a

low ionic strength solution containing L-histidine.
Lane 1 : construct in a solution of 1 mM KCl and
5mM L-histidine; lane 2 : construct in a solution of
0.6M KCl ; lane 3 : construct in a solution of 0.6M
KCl and 5mM L-histidine.

文献１） Krishnamurthy, G., Chang, H. S., Hultin, H. O.,
Feng, Y., Srinivasan, S., Kellar, S. D. : Journal of
Agricultural and Food Chemistry ，44 ，408 ～ 415 ．
1996．
２） Ito, Y., Tatsumi, R., Wakamatsu, J., Nishimura, T.,
Hattori, A. : Animal Science Journal， 74， 417 ～
425．2003．
３） Takai, E., Yoshizawa, S., Ejima, D., Arakawa, T.,
Shiraki, K. : International Journal of Biological
Macromolecules，62，647～651，2013．
４） Hayakawa, T., Ito, T., Wakamatsu, J., Nishimura,T., Hattori, A. : Meat Science，82，151～154，2009．

© The Ito Foundation

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定５） Sohn, R. L., Vikstrom, K. L., Strauss, M., Cohen, C.,
Szent-Györgyi, A. G., Leinwand, L. A. : Journal of
Molecular Biology，266，317～330，1997．
６） Nakasawa, T., Takahashi, M., Matsuzawa, F.,
Aikawa, S., Togashi, Y., Saitoh, T., Yamagishi, A.,
Yazawa, M. : Biochemistry，44，174～183，2005．
７） Rosenberg, M., Strausmann, R., Ben-Ya’acov, A.,
Ronen, D., Ravid, S. : PLoS ONE，3, e1496，2008．
８）
Thompson, R. C., Buvoli, M., Buvoli, A., Leinwand, L.

83

A. : FEBS Letters，586，3008～3012，2012．
９）Hayakawa, T., Ito, T., Wakamatsu, J., Nishimura, T.,
Hattori, A. : Meat Science，84，742～746，2010．
10） Guerrieri, N., Alberti, E., LAvelli, V., Cerletti, P. :Cereal Chemistry，73，368～374，1996．
11）Crick, F. H. C. : Crystallographica ， ６ ， 689 ～
697，1953．
12） McLachlan, A. D., Stewart, M. : Journal of
Molecular Biology，98，293～304，1975．

© The Ito Foundation

84

畜産物由来ヘム鉄摂取が発育期スポーツ選手に及ぼす影響～食事摂取状況と体組成・気分の変化から～
Influence of heme-iron supplement derived from animal production
absorption on the athlete of growth phase

坂

元

美

子・吉

川

豊

（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

Yoshiko Sakamoto and Yutaka Yoshikawa（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women’s University）

Athletes of growth phase need a meal required for physical growth and an increase in themeal for the amount of physical exertion. However, experience of the players about the energy
intake or nutrients were very subtlety. Moreover, appropriate intake of nutrients such asvitamins and minerals for the athletes of growth phase are not shown in the dietary reference
intakes for Japanese. In this study, we checked the meal content, the hemoglobin values in the
blood, and body constitution of the athlete of growth phase. And, we confirm the effect ofheme-iron supplement derived from animal production on the hemoglobin values in the bloodor sensation of weariness obtained from the Profile of Mood States（POMS）test.

１．目

よばれている。貧血とは単位容積血液中の赤血球

的数またはヘモグロビン濃度が減少した状態をい発育期におけるスポーツ選手は，身体発育に必い，貧血症状としては，易疲労性や倦怠感，食欲

要な食事量に加え，トレーニング等による身体活不振，便秘，下痢，無月経，体動時の動悸，皮膚動量の増加に見合った，より多くの食事量を必要

粘膜の蒼白，頭痛，めまい，および，耳鳴りなどとするが，必要なエネルギー摂取量や栄養素の充があげられる２）。スポーツ選手の貧血は貧血症状

足に対する選手自身の認識は非常に薄く，日本人と同時に競技能力の低下をもたらすことが問題視の食事摂取基準にも，ビタミン，ミネラル等のされている２）。スポーツ貧血が起こる原因として，栄養素のスポーツ選手への適切な摂取量は示され鉄やタンパク質等の栄養摂取不足，ランニングやていない。

ジャンプ時の着地などへの衝撃による溶血，激し１）

適切な食事と栄養摂取ができていない場合，健い運動時の血流亢進による赤血球破壊による赤血

全な精神と肉体を育てることが不可能になるばか

球膜構造の可塑性の低下，および，発汗や尿・便りではなく，成長障害，疲労骨折，および，鉄欠などによる損失が報告されている３）。通常はヘモ乏性貧血など様々な障害の要因になる２）。特に，グロビン値が正常値（男性では14～18g/dl，女性

激しい運動が原因でおこる貧血はスポーツ貧血とでは12～16g/dl）４）であっても，激しい運動など© The Ito Foundation

畜産物由来ヘム鉄摂取が発育期スポーツ選手に及ぼす影響

85

で急激に赤血球やヘモグロビンが減少し，貧血の象者と同年代の男性，身体活動レベル３とし，タ症状を呈することもあり ，適切な栄養素の摂取

ンパク質（Ｐ），脂質（Ｆ），炭水化物（Ｃ）は基と基礎体力に見合ったトレーニングメニューの作

準エネルギー値からＰ：Ｆ：Ｃ＝15：25：60のエ成が必要と考えられている。また，貧血予防や改ネルギー比率で算出した。その他の栄養素は，日善を食品中に含まれる鉄分やタンパク質の摂取に本人の食事摂取基準（2010年版）において推奨量

よって期待できるのは，貧血の状態が軽度であるが設定されているものは推奨量を，設定されていか，潜在性鉄欠乏状態のときであり２），激しいトないもの（カリウム，リン，マンガン，ビタミンレーニングによって急激に貧血の症状を呈した場

Ｄ，ビタミンＥ，ビタミンＫ）は目安の量とした。

５）合には，医薬品の摂取をはじめとする治療を余儀

2.2なくされる。そのため，貧血の症状を呈する前に，非侵襲式血中ヘモグロビン量測定装置，アスト

簡便な検査や調査方法でアセスメントすることがリムFIT（シスメックス社製）を用いて血中ヘモ非常に重要である。

グロビン値を測定した。

そこで，本研究は，持久的能力が必要なスポーツであるサッカー選手の血中ヘモグロビン値と体組成を測定し，消費エネルギーや運動強度に見2.3

スポーツ貧血調査

エネルギー消費量調査

カロリーカウンターHJA-307IT（オムロン社
製）を用いて，エネルギー消費量を測定した。

合った栄養素摂取がなされているかについて，栄

2.4

身体計測

養調査と気分プロフィール検査（Profile of Mood

身長はSECA213（SECA社製）を用いて，体組States, POMS）を用いて疲労感を調査し，発育成はボディーコンポジションアナライザー

期スポーツ選手の体組成と疲労感との関連を検討

InBody720（株式会社バイオスペース社製）を用

し，畜産物由来ヘム鉄を摂取することによる，ス

いて測定した。

ポーツ貧血の予防効果に対する影響を検討するこ

2.5とを目的とする。

気 分 プ ロ フ ィ ー ル 検 査 （Profile of Mood

２．方

疲労感調査

States, POMS）を用いて気分尺度を算出した。

法

POMSは，アメリカの精神科医によって開発され調査対象は，京都府の高校サッカー部に所属した気分プロフィール検査であり，65の質問項目かている男子部員のうち，すべての測定ができた76

ら，緊張・抑うつ・怒り・活性・疲労・精神混乱名とした。対象チームは，全国大会出場経験のあの６つの尺度を測定することができる検査としてる比較的高レベルのチームである。

多方面で用いられている６）。

2.1

栄養摂取状況調査

対象者の保護者が，連続した３日間の食事内容

食事調査を行い，食事調査と同日の３日間カロを評量法で測定，自記式記入法で調査用紙に記入

リーカウンターを装着しエネルギー消費量を測定することで行った。エネルギーおよび栄養素摂取した。また測定と同時に，対象選手の身体計測，

量は栄養計算ソフトエクセル栄養君Ver.６（健帛

ヘモグロビン値測定，POMS心理テストによる疲社）を用いて算出した。エネルギーおよび栄養素

労感調査を行った。さらに，７月より畜産物由来

摂取量について，それぞれの基準値として，エネ

ヘム鉄3.5mg／日を３ヵ月間摂取させ，３ヵ月後

ルギーは日本人の食事摂取基準（2010年版）の対に身体計測，ヘモグロビン値測定，POMS心理テ© The Ito Foundation

86

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

人中41名（82.0％）がヘモグロビン値が増加してストによる疲労感調査を行った。
統計処理は，ヘモグロビンと体組成の変化についたが，２群では26人中16人（61.5％）しかヘモ

いてはｔ検定を，エネルギー・栄養素摂取量の２

グロビン値が増加していなかった。体組成につい群間の比較についてはMann-Whitney U検定をては，どちらの群も体重と体脂肪率が有意に増加行った。エネルギー・栄養摂取量の４群間の多重し，有意差は見られなかったものの，筋肉量の減比較についてはTukey-Kramerの方法によって少傾向が見られた。特に，２群で筋肉量の減少傾行った。Ｐ＜0.05を統計的に有意とした。

向が大きかった。エネルギー・栄養素摂取量は，ナイアシンが２群において有意に多く摂取してい本研究は，神戸女子大学ヒト倫理審査委員会

た。タンパク質，炭水化物，カルシウム，マグネ（承認番号Ｈ26-９）の倫理審査承認を受け，対象

シウム，ビタミンＡ，ビタミンＢ２において２群者とその保護者に対して，説明書を配布し口頭でとも基準値を満たしておらず，脂質と亜鉛につい説明したのち，被験者が20歳未満のため対象者とて１群で基準値を下回っていた。エネルギー消費

その保護者，サッカー部の監督に書面により同意

量よりもエネルギー摂取量のほうが上回っていたを得たうえで行った。

選手は76名中24名（31.6％）であり，エネルギーが充足できていない選手の方が多い結果となっ

３．結果と考察た。エネルギーが充足できている選手の方が，ビ3 . 1 サプリメントの摂取量別体組成の変化とタミンＤ，ビタミンＥを除くほとんどの栄養素において有意に多く摂取することができていた。

エネルギー・栄養素摂取量の比較
期間中，遠征などでサプリメントの摂取を忘れ

以上の結果から，体脂肪が増加した原因としていた選手など，毎日摂取できていなかった選手て，除脂肪を構成する材料となるタンパク質，カが多くいたため，サプリメントを摂取した日が40

ルシウムの摂取不足と脂質の摂取比率が高いこ

日以上であった選手を１群，40日未満であった選と，さらに脂質の代謝に補酵素として必要である

手を２群として各群のヘモグロビン値，身体組成

ビタミンＢ２の不足が推察される。また，エネルの３ヵ月後の変化をTable１に，エネルギー消費

ギー消費量に見合ったエネルギー摂取ができてお量，エネルギー摂取量，栄養素摂取量のサプリメ

らず，特にタンパク質と炭水化物の摂取量が少な

ント摂取前の値をTable２に示す。１群と２群のかったことから，筋肉量の減少が見られたと推察

サプリメント摂取日数とその人数をTable３に示される。特に２群において筋肉量の減少傾向が大す。１群のエネルギー消費量よりもエネルギー摂

きかったが，脂質のエネルギー比率が多く，２群取量のほうが上回っていた選手を１―ａ群，下のみ脂質の摂取量が基準値を上回っていたことが回っていた選手を１―ｂ群，２群のエネルギー消要因であると推察される。

費量よりもエネルギー摂取量のほうが上回っていサプリメントを多く摂取していた１群においてた選手を２―ａ群，下回っていた選手を２―ｂ群と有意にヘモグロビン値が増加し，増加率も高いこ

して，サプリメント摂取前の栄養素摂取量の比較とから，ヘモグロビン値の増加に，サプリメント

をTable４に示す。

摂取の有効性が示唆された。

ヘモグロビン値はどちらの群でも増加してお発育期スポーツ選手の理想的な体づくりにおいり，１群は有意な増加であった。また，１群は50て，特に筋肉量の増加に着目すると，エネルギー© The Ito Foundation

Table 2 The energy consumtion, energy intake, and nutritional intake of the target person
Proteign
（ｇ）

Fat
（ｇ）
379.0±127.6

Carbohydrate（ｇ）
3152±1460

Potassium（mg）
638±384

Calcium（mg）314±138

Magnesium（mg）

1443±307

1439±506

Phosphorus（mg）

9.8±3.0

10.4±7.1

Iron
（mg）

13.2±3.712.7±5,0

Zinc
（mg）

1.44±0.47

1.62±0.91

Copper（mg）

Energyintake（kcal）
85.8±26.3

299±79Energyconsumption（kcal）
102.2±33.2
543±1922740±781
3086±863

2887±345
360.6±112.3

0.90

group1（n＝50）
87.8±24.3

13.0

104.1±19.39.5

2690±631

1200

2949±240

350

group2（n＝26）
800

86.1

2700

116.2

465.0

3100

VitaminC
（mg）

3100

Folic acid（μｇ）

Reference

VitaminB12（μｇ）

VitaminK（μｇ）

VitaminB6（mg）

VitaminE（mg）

Niacin（mg）

VitaminD（μｇ）

VitaminB2（mg）

VitaminA（μｇ）

VitaminB1（mg）

Selenium（mg）
1.54±0.63

152±94289±407378±2228.1±4.4

9.4±10.8

7.5±5.6

1.72±0.84

630±935＊

41.88±15.4489±33

1.57±0.49

1.63±0.90

group1（n＝50）

1.60±0.47

133±89221±138348±1548.0±2.5

1.70

8.6±7.6

9.4±6.4

1.50

1.79±0.49

573±51580

45.64±8.23

89±19
8.0

100

4.5

240

900

2.4

35

1.40

group2（n＝26）

16.00

Reference＊：Ｐ＜0.05

Value are represent the mean±SD.

Table 1 The blood hemoglobin（HGB）concentration and physical situation of the target personpre170.5±5.7

post

NS

NS

P

59.8±7.4

57.8±9.2

pre60.7±7.460.1±7.3

post

＊

＊

P

24.7±2.624.3±2.6pre24.9±2.524.4±2.6

post

NS

NS

P

14.5±1.5

14.2±2.4

pre14.5±1.4

14.4±1.5

post

NS

NS

P

Intracellular water concent（l） Extracellular water concent（l）
P

170.5±5.7171.0±5.6

Body weight（kg）

post

＊＊

171.6±6.1

Height（cm）

15.0±1.3

NS

HGB（g/dl）

14.4±1.2

14.7±1.2

pregroup1（n=50）
14.4±1.0

post

NS

P

6.4±2.3

6.8±5.0

pre7.5±2.6

8.2±2.9

post

＊＊

＊

P

20.3±1.7

20.0±2.2

pre20.7±1.7

20.7±1.7

post

＊＊

＊

P

10.4±2.8

10.3±3.1

pre11.7±2.812.1±4.0

post

＊＊

＊＊

P

Body fat percentage（%）
pre29.3±3.8NSBMI

29.5±3.729.2±4.9

Amount of body fat（kg）

group1（n=50）

30.2±3.4

Skeletal muscle mass（kg）

group2（n=26）

group2（n=26）＊：Ｐ<0.05，＊＊：Ｐ<0.01，NS：not significant

Values are represent the mean ± SD.

© The Ito Foundation

87
畜産物由来ヘム鉄摂取が発育期スポーツ選手に及ぼす影響

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）
平成26年度882711±312

Energyconsumption（kcal）

2962±334

112±4180±242416±430

2630±759

3323±39289.3±18.7

132.4±40.1

Proteign
（ｇ）

＊＊

＊

Fat
（ｇ）
107.3±29.0
76.5±19.0

86.0±26.8

104.8±21.5

86.1

7.7±4.8

9.0±3.0

VitaminE
（mg）

＊＊ ＊＊

122.5±13.2
101.5±25.6
116.2

7.2±6.2

8.2±3.7

VitaminD
（μｇ）

＊

＊＊ ＊＊

3496±902

Energy intake（kcal）

＊＊

＊＊

3100

434±1891086±1628

VitaminA
（μｇ）

＊

＊＊

Table 4 The nutritional intake of the target persongroup1-a（n＝15）＊

2931±230

group1-b（n＝35）

2852±563＊＊ ＊＊group2-a
（n＝９）

3100

＊＊

Selenium（mg）

Referencegroup1-a（n＝15）
group1-b(n＝35）

355.2±120.7

469.4±101.5

330.0±74.7

493.3±153.0

Carbohydrate
（ｇ）

＊＊
＊＊ ＊＊

＊＊

465.0

200±78497±706

VitaminK（μｇ）＊

3028±967

3922±636

2581±688

4484±1895

Potassium
（mg）

＊＊
＊＊ ＊＊

＊

2700

1.33±0.44

2.03±0.76

VitaminB1
（mg）
＊＊

＊＊

533±210728±57514±256929±477

Calcium
（mg）

＊＊

†

800

1.31±0.42

2.39±1.25

VitaminB2（mg）＊＊

293±90379±59262±66434±184

Magnesium
（mg）

＊＊
＊＊ ＊

＊

350

36.13±8.2255.29±19.88

Niacin（mg）＊＊

8.2±2.915.5±10.8

Iron
（mg）

＊＊

＊＊ ＊

9.6±3.2

11.9±3.3

7.1±6.6

14.7±16.1

9.5

1770.5±161.7†

VitaminB12（μｇ）

1408.0±388.5

1234.6±272.7

1915.2±605.8

Phosphorus
（mg）

＊＊
＊＊ ＊＊

＊＊

1200

1.39±0.42

2.50±1.06

VitaminB6（mg）＊＊

10.6±2.6

12.9±4.1

16.1±2.80.90

1.42±0.50

1.91±0.49

1.31±0.30

2.34±1.38

Copper
（mg）

＊＊

＊＊

116±56235±112

VitaminC
（mg）

†

＊＊ †

17.4±6.2

Zinc
（mg）

＊＊

＊＊ ＊＊

＊

13.0

301±113558±303

Folic acid
（μｇ）

＊＊

＊＊ ＊

the people（n＝75）

number of days

number of people
0

1
3

1
10

1
14

1

20
21

1
1

23
24

1
3

25
26
27
30
31
32
34
35
36
37
39
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
64
67
68

1
2
1
2
1
1
1
2
3
1
1
3
2
3
5
1
2
1
1
3
2
5
1
2
1
1
1
2
1
2
3
1
1

69
74
76
84
85

1
1
1
1
1

87

1

194±116100

134±87＊＊ †12.8±11.8240345±155†2.04±0.422.4

8.9±7.4＊＊ ＊52.41±7.161.40

1.75±0.54＊＊ ＊＊1.89±0.23

16.00

44.51±10.86＊＊ †1.85±0.29

1.70

1.53±0.54＊

303±1431.50

1.56±0.52＊

9.8±1.780221±135＊10.9±5.3

8.0

7.8±2.7＊

886±7744.5

9.3±6.2© The Ito Foundationgroup2-b（n＝17）＊

100±26900592±501＊group2-a
(n＝９）

35

87±22

Table 3 The supplement intake days and the number of

467±148

group2-b(n＝17）†

Reference

炭水化物，脂質の理想的なエネルギー比率を満た†：Ｐ＜0.10，＊：Ｐ＜0.05，＊＊：Ｐ＜0.01
Value are represent the mean±SD.

消費量を上回るエネルギー摂取と，タンパク質と

畜産物由来ヘム鉄摂取が発育期スポーツ選手に及ぼす影響

した栄養摂取が必要であると考える。

89

用されている７）。特にオーバートレーニングの評

3 . 2 血中ヘモグロビン値と心理テストによる価としてモニターに汎用されていることからも７），
発育期スポーツ選手のメンタルヘルスをアセスメ

疲労感の変化
１群の男子スポーツ選手のヘモグロビン正常値

ントするツールの一つとして利用することができの指標である14g/dl以上の選手を１―１群，14g/

るといえる。本研究の結果からもスポーツ選手のdl未満の選手を１―２群に，２群のヘモグロビン

貧血予防のための簡便なアセスメント法として，

値が14g/dl以上の選手を２―１群，14g/dl未満の気分プロフィール検査の疲労度尺度が有効である選手を２―２群とし，POMS心理テストの「疲労」ことが示唆された。

を示す気分尺度であるＦ値の変化を，上昇，低下，変化無しに分けたときの人数の比率をFig.１に示す。

４．要

約

１―１，２―１群で疲労感が低下した選手がそれ発育期スポーツ選手の理想的な体づくりのため

ぞれ，54％，56％であり，１―２，２―２群で疲労に，筋肉量を維持・増加させるためには，消費エ感が低下した選手はそれぞれ22％，30％であっネルギー量に見合ったエネルギー摂取はもちろんた。逆に，１―１，２―１群で疲労感が上昇した選のこと，エネルギーを充足させるだけではなく，

手はそれぞれ34％，31％であり，１―２，
２―２群

タンパク質と炭水化物の充足を含む，理想的なエで疲労感が上昇した選手はそれぞれ44％と70％でネルギー比率の摂取が重要であることが示唆さあった。以上の結果から，ヘモグロビン値が増加

れ，そのことが疲労感の軽減にも有効であること

すると疲労感が減り，ヘモグロビン値が低下するも見出した。また，血中ヘモグロビン値の増加にと疲労感が上昇する選手が多く，特に疲労感の上

畜産物由来ヘム鉄摂取の有効性が示唆された。

昇に関しては２群でヘモグロビン値との間で顕著

発育期スポーツ選手の貧血の予防のための簡便なな傾向として表れており，血中ヘモグロビン値がアセスメント法として，気分プロフィール検査の疲労

疲労感に影響を与えることが示唆された。

感尺度が有効であることも本研究で明らかになった。

POMSは，現在各種スポーツのメンタルヘルスを知るための指標として使用され，トレーニングの強度と怪我やスポーツ障害の発生との関連を見る研究がなされるなど，多くのスポーツ現場で利

(%)

80
70
60
50
decreasing person

40

increasing person
unchanged person

30
20
10
0

group1-1group1-2group2-1group2-2

Fig. 1 The change of Fvalue in the target person

文献１） 厚生労働省策定：日本人の食事摂取基準［2015年
版］の概要，www.mhlw.go.jp/file/04-Houdouhappyou./0000041955.pdf，閲覧日2015/4/10２） 樋口満：公認アスレティックトレーナー専門科目
テキスト スポーツと栄養，財団法人日本体育協会，
48～55，財団法人日本体育協会，東京，2009．
３） 鯉川なつえ：陸上競技におけるスポーツ貧血の現状と対策，日本臨床スポーツ医学会誌，16（２），216～220，2008．
４） 坂本静男：貧血，臨床スポーツ医学，26（－），
148～152，2009．
５） 宮崎保：運動と貧血―発育期における運動と貧血
とくに鉄欠乏性貧血を中心にして―，体力科学，46，529～534，1997．
６） 横山和仁，下光輝一，野村忍：診断指導に活かす
POMS事例集，１，金子書房，東京，2010．
７） 横山和仁，下光輝一，野村忍：診断指導に活かす
POMS事例集，29～40，金子書房，東京，2010．

© The Ito Foundation

90

冠動脈疾患患者における食肉類の摂取と血中アミノ酸・
脂肪酸組成，動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子との関連に関する研究
Studies on relationship between meat intake level and the composition ofblood amino acids, fatty acids, atherogenic lipoproteins and/or thrombotic
factors in patients with coronary heart diseases

木庭

新治１・横田裕哉１・小林 洋一１・高尾 哲也２・
中嶋 克行３・高田 明和４（１昭和大学医学部，２昭和女子大学，３群馬大学，４浜松医科大学）

Shinji Koba1, Yuuya Yokota１, Youichi Kobayashi１, Tetsuya Takao２,
Katsuyuki Nakajima３ and Akikazu Takada４（１Showa University School of Medicine, ２Showa Women’s University,
３Gunma University, ４Hamamatsu University School of Medicine）

Background: Dietary information immediately before onset of acute coronary syndrome（ACS）remains to be limitted. We reported some essential amino acids were changed inpatients with ACS and diet might play an important role in metabolic disorder inatherosclerosis last year. The aim of the present study is to compare amino acids and fatty
acids between ACS patients and healthy men. In addition, we evaluate how dietary patternaffects amino acid and/or fatty acid compositions.
Methods and Results: The blood samples on admission of ACS in 161 male and 61 female
patients were compared with those in 50 age-matched healthy men. Diet immediately before
onset of ACS was assessed using self-administered diet history questionnaire（DHQL）.
Plasma fatty acids were measured using gas-chromatography and plasma amino acids were by
Liquid Chromatograph Mass Spectometer. Compared with control men, both male and female
patients with ACS had significantly higher levels of phenylalanine and glutamic acid, andsignificantly lower levels of essential amino acids, histidine, tryptophan, lysine, glutamine, andarginine, while total protein, total amino acids, LDL-cholesterol, and non-HDL-cholesterol werecomparable among the 3 groups. Plasma levels of arachidonic acid, eicosapentaenoic acid
（EPA）and docosahexaenoic acid（DHA）were significantly lower in male patients with ACS.
ACS male patients took significantly more dietary fat and carbohydrate despite similar totalenergy intake compared with the control. Plasma concentration of tryptophan was somewhat
negatively related with dietary intake of fat, animal fat, animal protein, and estimatedtryptophan levels. Plasma concentration of EPA and DHA significantly correlated with fish,
seaweeds, and omega-3 unsaturated fatty acid intake.
Conclusion: These suggest that some amino acids and fatty acids regulate key metabolic
pathways, and disturbance of amino acid metabolism may play an important role in onset of
ACS. Further studies are required to evaluate in larger number of patients.

© The Ito Foundation

冠動脈疾患患者における食肉類の摂取と血中アミノ酸・脂肪酸組成，動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子との関連に関する研究

１．目

91

－1.154×１（女性例では0.742）。
清クレアチニン（Cr）

的

食事摂取状況は自記式食事歴法質問票：self-

動脈硬化を予防・治療する食事として，脂肪制

administered diet history questionnaire（DHQL）

限食，炭水化物制限食，蛋白制限食などが提唱さを使用した１）。ACS入院患者に，発症前１ヶ月間れているが，その意義について，未だ十分には解の食事内容を想起してもらい，食物摂取頻度調査

明されていない。昨年本研究助成により，急性冠票に記入した。調査票の解析はDHQサポートセ症候群（ACS）発症時のアミノ酸組成，脂肪酸

ン タ ー（http://www.ebnjapan.org/）で 実 施 し組成と動脈硬化惹起性リポ蛋白（マロンデアルデ

た。健康男性は，採血前１ヶ月間の食生活を調査

ヒド修飾LDL, small dense LDLコレステロール，

した。

レムナントリポ蛋白コレステロール）との関連を

健康男性は昭和女子大学で，ボランティアで募検討した。ACS患者121人（男性101人）の解析集した。既往歴，服薬歴および喫煙歴のない健康結果 で は ，各 指 標 の 基準値と比較し，taurine,

男性53人を集めたが，空腹時血糖が126㎎/dl以上

asparatic acid, glutamic acid, alanine, cysteine,の糖尿病の疑いの判明した３人を除外した残り50

phenylalanine, β -alanine, ornitine が 高 値 で ，例をコントロール群とした。

asparagine, glutamine, tryptophan, arginine が 低

統計解析は健康男性（control men）, ACS男性値であった。特に糖尿病ではtryptophanがより患者（ACS men），女性患者（ACS women）の低値を示した。トリプトファンは魚介類，肉類に

３ 群 に 分 け ，群 内 比 較 は 分 散 分 析（ANOVA）

多く含まれ，その成因に良質な蛋白の摂取不足ので，群間比較はTucky post hoc testで行った。

可能性を考えた。今年度は，その結果に関して，

脂肪酸およびアミノ酸の血中濃度と食事内容とのさらに患者数を増やして検証し，健康人での結果

関連は，Spearmanの順位相関で解析した。なお，と比較した。またACS発症前１ヶ月間の食生活

脂肪酸組成の検討では，採血時に経口脂肪酸製剤を調査し，入院時の血中脂質・アミノ酸分画への服用者は除外した。

影響を評価することを目的とした。
２．方

３．結果と考察

法

3.1

臨床背景

ACSによる入院時に静脈血を採取し，血清とACS患者212人と健康男性50人の背景をTable１

血漿を分離した。血漿中の脂肪酸４分画をガスクに示す。ACS患者の80％が高血圧，40％が糖尿ロマトグラフィーで，アミノ酸39種類を高速液体病を併発し，20％の例で心筋梗塞や冠動脈血行再クロマトグラフィー質量分析計で測定した。血清

建術の既往を有していた。ACS男性の８例と女レムナント様リポ蛋白コレステロール（RLP-C）

性３例は血液維持透析治療を受けていたが，含めは免疫吸着法で，LDLコレステロール（LDL-C）て解析した。ACS男性９例，ACS女性２例は採はホモジニアス法で測定した。Non-HDLコレス

血時にｎ-３系多価不飽和脂肪酸薬を服用していテロール（non-HDL-C）は総コレステロールかた。

らHDLコレステロール（HDL-C）を引いて算出3.2

した。推算糸球体濾過量（eGFR）は以下の推算

主な血液蛋白および脂質濃度の検査結果を式で算出した。eGFR＝0.741×175×Age－0.203×血脂質組成の比較

Table２に示す。ACS患者は男女とも血清アルブ© The Ito Foundation

92

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 1 Clinical characteristic
Control men

ACS menACS women

50

161

51

Age

61.7±10.0

66.3±13.577.8±8.5

BMI

24.6±3.424.0±4.2

21.5±3.5

NumberHypertension

0

101

40

Diabetes（Insulin therapy）

0

40（6）

19（4）

Prior stroke

0

14

5

Hemodialysis

0

8

3

Prior malignancy

0

12

8

Prior coronary revascularization

0

29

9

Prior myocardial infarction

0

21

5

Smoking Former/Current

0/0

56/77

5/7

Calcium channel blocker

0

42

19

ACE-inhibitor

0

7

0

Angiotensin receptorⅡblocker

0

39

22

Beta-blocker

0

19

3

Anti-platelet agent（Dual）

037（16）

9（5）Anti-coagulant agent

0

4

1

Lipid-lowering agent（EPA or EPA/DHA）

0

42（9）

10（2）

Table 2 Blood chemistry
Data expressed as mean ± SD. The number in parenthesis expresses actual number of measured cases. Non-HDL-C ＝ non-HDLcholesterol, LDL-C ＝ LDL-cholesterol, HDL-C ＝ HDL-cholesterol, RLP-C ＝ remnant-like lipoprotein-cholesterol, eGFR ＝ estimate ofglomerular filtration rate, DHLA ＝ dihomogamma-linolenic acid, AA ＝ arachidonic acid, EPA ＝ eicosapentaenoic acid, DHA ＝docosahexaenoic acid，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001 by ANOVA．＊p<0.05 vs Healthy men by Tukey post hoc test
Control men

ACS menACS women

50

161

51

7.3±0.3（26）7.1±0.7

7.1±0.9Albumine, g/dl###

4.7±0.2（26）4.1±0.5＊

3.8±0.6＊§

Total bilirubin, mg/dl#

0.6±0.3（26）0.8±0.4

0.9±0.5＊

BUN, mg/dl#

14.0±2.5（26）20.5±12.9＊23.1±12.2＊

Creatinine, mg/dl

0.9±0.1（26）1.4±1.9

1.1±1.3

71.0±11.4（26）62.0±24.9

55.7±24.0＊

Non-HDL-C, mg/dl

148.2±33.4

141.9±40.1

141.7±42.5

NumberTotal protein, g/dl

eGFR, ml/min/1.73m２#

LDL-C, mg/dl

123.4±29.2

119.5±36.4

117.1±38.0

HDL-C, mg/dl

59.9±14.944.1±10.5＊46.9±12.2＊

RLP-C, mg/dl

7.4±9.0

5.8±4.6

5.2±3.8

DHLA, μg/ml

36.7±10.538.3±14.0

34.8±13.7

AA, μg/ml#

205.8±48.7

179.2±49.9＊

182.1±50.1

EPA, μg/ml##

82.7±46.3

62.1±44.5＊72.7±52.8

DHA, μg/ml###

154.7±52.8

121.7±44.9＊

141.8±60.3§© The Ito Foundation

冠動脈疾患患者における食肉類の摂取と血中アミノ酸・脂肪酸組成，動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子との関連に関する研究

93

Table 3 Comparison of plasma amino acids between control and ACS
Data are expressed as mean±SD．#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001 by ANOVA．
＊p＜0.05 vs Healthy men by Tukey post hoc test
Control men

ACS menACS women

50

161

51

2872.1±236.4

2895.0±492.7

2895.1±704.2

Essential amino acids，nmol/ml##

984.8±98.5

904.4±172.8＊

885.9±220.2＊

Threonine，nmol/ml

131.0±26.9176.5±242.2

189.9±233.0

Valine，nmol/ml

232.3±32.0

218.3±66.3

201.5±68.1

Methionine，nmol/ml

27.5±4.8

26.4±29.4

30.7±37.4

NumberTotal amino acids，nmol/ml

Isoleucine，nmol/ml

67.2±12.687.4±100.7

101.0±161.8

Leucine，nmol/ml

131.6±18.5

153.3±129.6

164.1±152.3

Phenylalanine，nmol/ml##

62.5±8.868.5±18.976.7±28.9＊§

Histidine，nmol/ml##

81.5±8.6

72.6±17.7＊72.1±23.3＊

Tryptophan，nmol/ml###59.2±9.1

40.3±11.2＊

37.5±11.7＊

Lysine，nmol/ml###

191.9±26.5162.1±35.4＊

164.5±50.5＊

Non-essential amino acids，nmol/ml

1887.3±188.3

1990.6±378.4

2008.9±528.6

3.6±0.7

259.5±838.6

403.8±927.4＊

102.4±17.0

130.7±104.9

137.0±92.0

Asparagine，nmol/ml##

46.0±6.0

38.8±15.5＊36.4±20.2＊

Glutamic acid，nmol/ml###

50.8±17.8

104.0±58.6＊

91.8±58.1＊

Glutamine，nmol/ml###

559.1±58.5

453.1±169.6＊

453.1±226.3＊

Proline，nmol/ml

174.0±59.3

184.0±95.8

157.8±67.2

Glycine，nmol/ml

203.5±28.6

186.3±55.6

185.3±71.8

Alanine，nmol/ml

396.3±82.6

405.5±182.2

392.9±258.6

Cysteine，nmol/ml

22.4±6.5

37.1±106.3

55.3±159.2

Thyrosine，nmol/ml

67.1±12.3

61.3±16.7

63.9±25.6

86.5±20.4

47.9±22.7＊

47.8±30.4＊

Aspartic acid，nmol/ml#
Serine，nmol/ml

Arginine，nmol/ml###

ミンが有意に低く，ACS女性で総ビリルビンがACS患者では，男女とも，必須アミノ酸濃度，

有意に高値であった。Non-HDL-C, LDL-Cは同ヒスチジン，トリプトファン，リジンが有意に低等であったが，ACS患者で非空腹時採血にも関値であった。フェニールアラニンはACS女性でわらず，HDL-CおよびRLP-Cが有意に低値であっ有意に高値であった。非必須アミノ酸濃度は同等た。dihomogamma-linolenic acid（DHLA）は同であったが，ACS患者で男女ともグルタミン酸

等 で あ っ た が ， arachidonic acid （AA）,

が有意に高値で，アスパラギン，グルタミン，アeicosapentaenoic acid（EPA）とdocosahexaenoic

ルギニンが有意に低値であった。昨年，本研究助

acid（DHA）はACS男性で健康男性に比し有意成で，グルタミン酸が酸化LDLと正相関を示したに低値であった。

ことを報告した。グルタミン酸が，脂質異常と酸

3.3化ストレスを惹起することが報告されている２～４）。

アミノ酸濃度の比較

血漿アミノ酸濃度の比較をTable３に示す。

今回の検討でも，グルタミン酸が男女ともACS© The Ito Foundation

94

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ジンは脂肪摂取量および炭水化物摂取量と有意な患者で著明に高値を示した。
3.4

負相関を，トリプトファン濃度は，脂肪摂取量，

食事内容の比較健康男性50人とACS患者27人でDHQLを実施で

動物性油脂，動物性蛋白および推定摂取トリプト

きたが，食事内容の詳細な解析はACS患者のみ

ファン濃度と有意な負相関を示した。トリプト採取できた。食事摂取エネルギー量，蛋白摂取量，ファンの血中濃度が，脂肪摂取量，動物性油脂，

脂肪摂取量，炭水化物摂取量の比較結果をTable

動物性蛋白および推定摂取トリプトファン濃度と４に示す。総エネルギー摂取量は同等であった

有意な負相関を示したことから，その機序としが，ACS男性患者で脂肪摂取量と炭水化物摂取て，摂取蛋白の不足よりも，アミノ酸の代謝障害

量が有意に高値であった。

が考えられた。慢性炎症等のストレス下では，ト3 . 5 異常値を示したアミノ酸濃度と食事内容

リプトファンからキヌレニンが産生され，セロトニンが枯渇する一方，ネオプテリンなどの炎症惹との関連
ACS患者で健康男性よりも低値であった必須起性物質の産生が増加する５）。トリプトファンはアミノ酸のヒスチジン，トリプトファン，リジン

糖代謝や炎症状態において非常に重要なアミノ酸と有意に高値であったフェニールアラニンと関連といえる。トリプトファンの代謝異常の解明が必する食事内容との関連をTable５に示す。ヒスチ

要である。

Table 4 Comparison of dietary pattern between control and ACS.
Mean±SD．#p＜0.05，##p＜0.01 by ANOVA．＊p＜0.05 vs Healthy men by Tukey post hoc test
Control men
NumberTotal energy intake，kcal

ACS menACS women

50

22

5

2115.3±436.1

2054.8±496.6

1932.8±852.9

Protein intake，ｇ67.2±27.9

66.1±18.7

71.8±37.6

Fat intake，ｇ#49.5±21.4

66.1±18.7＊

71.8±37.6

Carbohydrate intake，ｇ##

197.6±86.7

274.7±86.7＊

232.9±85.6

Table 5 Spearman’s correlation between plasma amino acid concentration and dietary intake

Fat intake (g）Carbohydrate intake (g）Animal protein
Animal fat
Seaweeds

Phenylalanine

Histidine

Tryptophan

Lysine－0.088（70）－0.349＊＊（70）－0.263＊（63）－0.109（63）0.097（70）－0.371＊＊（70）－0.231（63）－0.163（63）－0.376（20）－0.277（20）－0.657＊（13）0.132（13）0.144（20）0.096（20）－0.713＊＊（13）0.032（13）0.408（20）0.450＊（20）－0.222（13）0.190（13）Diary product－0.101（20）－0.080（20）－0.702＊＊（13）0.192（13）

Dietary phenylalanine－0.417（20）－0.269（20）－0.627＊（13）－0.181（13）Dietary Histidine－0.417（20）－0.292（20）－0.484（13）－0.077（13）－0.176（13）－0.027（13）Dietary tryptophan－0.408（20）－0.278（20）－0.638＊（13）Dietary Lysine－0.344（20）－0.245（20）－0.622＊（13）The number in parenthesis expresses actual number of measured cases.＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001© The Ito Foundation

冠動脈疾患患者における食肉類の摂取と血中アミノ酸・脂肪酸組成，動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子との関連に関する研究

95

Table 6 Spearman's correlation between plasma fatty acid and dietary intake
The number in parenthesis expresses actual number of measured cases．＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，45＊＊＊p＜0.001
Plasma AA

Plasma EPA

Plasma DHA

Fat intake (g）0.276＊（77）0.020（77）0.012（77）

Toal fatty acid intake (g）0.457＊（27）－0.196（27）－0.100（27）Monounsaturated fatty acid (g）0.513＊＊（27）－0.418（27）－0.067（27）Polyunsaturated fatty acid (g）0.446＊（27）－0.112（27）－0.004（27）Polyunsaturated fatty acid (n-3）（ｇ）

0.223（27）0.163（27）0.144（27）

Polyunsaturated fatty acid (n-6）（ｇ）

0.487＊（27）－0.140（27）－0.002（27）Plant oil (g）0.515＊＊（27）0.127（27）－0.151（27）Seaweed (g）－0.346（27）0.490＊＊（27）0.555＊＊（27）Fish (g）－0.277（27）0.543＊（27）0.460＊（27）Meat (g）0.409＊（27）0.047（27）0.001（27）

Egg (g）

0.436＊（27）－0.138（27）0.017（27）C18:1 (g）0.530＊＊（27）－0.192（27）－0.085（27）C18:2 (n-6）（ｇ）

0.499＊＊（27）－0.138（27）0.011（27）

C18:3 (n-3）（ｇ）

0.443＊（27）－0.092（27）－0.021（27）C18:4 (n-3）（ｇ）－0.395＊（27）0.625＊＊＊（27）0.412＊（27）C20:2 (n-6）（ｇ）

0.425＊（27）0.034（27）0.054（27）C20:4 (n-3）（ｇ）－0.350（27）0.639＊＊＊（27）0.423＊（27）C20:5 (n-3）EPA (g）－0.400＊（27）0.634＊＊＊（27）0.458＊（27）C22:5 (n-3）（ｇ）－0.214（27）0.539＊＊（27）0.340（27）C22:6 (n-3）DHA (g）－0.252（27）0.578＊＊（27）0.431＊（27）C24:1 (g）－0.203（27）0.480＊（27）0.292（27）

3 . 6 異常値を示した脂肪酸濃度と食事内容とした。ACS患者では，総摂取エネルギー量は同等であったが，脂肪および炭水化物摂取量が多の関連
健 康 人 よ り も 低 値 を 示 し た AA, EPA お よ びかった。

DHAと関連する食事内容を検討し，Table６に示

脂肪酸組成では，DHLAは同等であったが，す。AAは総脂肪酸量，不飽和脂肪酸量，特にAA, EPAとDHAはACS男性で健康男性に比し有ｎ-６系不飽和脂肪酸量と有意な正相関を示した。

意に低値であった。アミノ酸濃度では，男女とも

EPAとDHAは魚介類，海藻類およびｎ-３系脂肪ACS患者で，必須アミノ酸濃度，ヒスチジン，酸の推定摂取量と有意な正相関を示した。ACS

トリプトファン，リジンが有意に低値であった。

患者で魚介類を主体とした食事が不足している可フェニールアラニンはACS女性で有意に高値で能性が示唆された。

あった。非必須アミノ酸濃度は同等であったが，４．要ACS患者で男女ともグルタミン酸が有意に高値

約で，アスパラギン，グルタミン，アルギニンが有急性冠症候群（ACS）患者と健康男性の食事

意に低値であった。DHQLの分析により，ヒスチ

内容および血中脂肪酸濃度，アミノ酸濃度を比較

ジンは脂肪摂取量および炭水化物摂取量と有意な© The Ito Foundation

96

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

負相関を，トリプトファン濃度は，脂肪摂取量，
動物性油脂，動物性蛋白および推定摂取トリプト
ファン濃度と有意な負相関を示した。AAは総脂肪酸量，不飽和脂肪酸量，特にｎ-６系不飽和脂肪酸量と有意な正相関を示した。EPAとDHAは
魚介類，海藻類およびｎ-３系脂肪酸の推定摂取量と有意な正相関を示した。以上より，ACS患者で魚介類を主体とした食事が不足している可能性が示唆された。
ACS発症前または発症時に，アミノ酸代謝が障害され，動脈硬化惹起性リポ蛋白に影響を及ぼすことが示唆された。食事内容の調査を継続し，さらなる検証が必要である。

文献１） Okubo, H., et al. : Validation of self-reported
energy intake by a self-administered diet history
questionnaire using the doubly labeled water
method in 140 Japanese adults, Eur J Clin Nutr.,
62，1343～50，2008．
２） Park, C. H., et al. : Glutamate and aspartate
impair memory retention and damage hypothalamic
neurons in adult mice, Toxicol Lett., 115， 117 ～125，2000．
３） S i n g h , P . , e t a l . : P r o l o n g e d g l u t a m a t e
excitotoxicity : Effects on mitochondrial antioxidants
and antioxidant enzymes, Mol Cell Biochem，243，
139～145，2003．
４） Gobatto, C. A., et al. : The monosodium glutamate（MSG） obese rat as a model for the study of
exercise in obesity, Res Commun Mol Pathol
Pharmacol，111，89～101，2002．
５） Oxenkrug, G., et al. : Kynurenines and vitamin
B6: link between diabetes and depression, J
Bioinform Diabetes, 2013 Sep 14;1 （1） . pii: http://
openaccesspub.org/journals/download.php?file ＝
51-OAP-JBD-IssuePDF.pdf© The Ito Foundation

97

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす分子機能解明
Molecular function analysis of lipid metabolism induced by porcine liver
powder岡本

芳晴（鳥取大学農学部）

Yoshiharu Okamoto（Faculty of Agriculture, Tottori University）

We examined effects of degradation product from porcine liver（Liver Hi Ⓡ）on gene
expression related to lipid metabolism in HepG2 cells using real time PCR. In addition, weinvestigated liver function improvement effect of Liver Hi Ⓡ on animals with liver diseases. In
gene analysis, it was found that Liver Hi Ⓡ enhanced LDL receptor（LDLR）gene. In half ofcases with liver diseases, the levels of liver enzymes in the blood were decreased when Liver
Hi Ⓡ was administered. These data suggest that Liver Hi Ⓡ has a potency as a new functional
food.

１．目

筆者らは，以前に豚レバーパウダーの機能性を的調べた結果，特に悪玉と考えられるリポタンパク「2011年人間ドック現況（生活習慣病関連項目

質の分泌量が濃度依存的に有意に抑制することを異常頻度）」によると，肥満や高中性脂肪・高コ

明らかにした。このことより，同パウダーは脂質レステロール血症等の脂質異常症は年々増加傾向

代謝改善効果が期待される有望な機能性食品素材にあることが示されている 。中でも内臓脂肪蓄である可能性が高まった。さらに，高脂肪食負荷

積型の肥満は，メタボリックシンドロームの原因

モデル動物を用いて同パウダーの効果を検証したとされており，高血圧，脂質異常症，高血糖等の結果，同パウダーの摂取によってLDLコレステ

生活習慣病を引き起こす 。脂質異常症を発症す

ロールの減少，肝臓での脂肪滴減少および空砲変ると動脈硬化の危険性が高まるが，日本人の場合性・脂肪変性の減少が確認された３）。

１）

２）は，心筋梗塞患者の血中コレステロール値はそれ

本研究では，「豚レバーパウダー（レバーHi）」

ほど高くなく，中性脂肪が高値を示す例が多いとの脂質代謝改善効果をより詳細に検討するため，言われている。したがって，日本人の場合，中性

in vitro実験下でのHepG２ヒト肝癌細胞の脂質代

脂肪値を下げることは，狭心症，心筋梗塞，脳卒

謝関連遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにて確中などの動脈硬化性疾患を予防するために非常に認し，遺伝子レベルにおける作用機序を検討し重要であると考えられる。

た。また自然発症肝疾患罹患動物を用いて肝機能© The Ito Foundation

98

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

改善効果を調べた。
２．方
2.1

ファターゼ（ALP）が高値であった10例を対象とした。10例の内訳はTable１に示した。

法

レバーHiを１頭あたり0.5-1.5ｇ／日を30日間経

in vitro実験（発現遺伝子解析）

口投与し，投与前後での数値を比較した。

HepG２細胞（2.5×10 個）を12穴マイクロプ
５

レートに播種し，２日間10％FCSを含むDEM培

３．結果と考察

地で前培養後，1.0％BSAを含むDMEMのみ（未3.1

in vitro実験（遺伝子発現解析）

処 理 群） お よ び ， 本 培 地 （1.0 ％ BSA を 含 む

Table２に中性脂肪およびコレステロール合成

DMEM）に0.75mMオレイン酸（オレイン酸群）

系遺伝子，ならびにリポタンパク質関連遺伝子のま た は オ レ イ ン 酸 ＋ レ バ ー Hi（終 濃 度 2.0mg/

各群における発現量を示した。

ml，レバーHi群）を添加した培地に交換し，さ中性脂肪合成系遺伝子では，未処理群に比べてらに２日間培養を続けた。総RNAはTotal Quick

オレイン酸群およびレバーHi群ではSREBP-１ｃ

Gene RNA cultured cell kit S（富 士 フ イ ル ム 株

およびFASはわずかな増加が見られた。しかし

式 会 社）を 用 い て 回 収 し ，鋳 型 cDNA 合 成 は

オ レ イ ン 酸 群 と レ バ ー Hi 群 間 に 差 は 見 ら れ な

Prime Script RT reagent Kit（タカラバイオ株式かった。
コレステロール合成系遺伝子では，SREBP-２

会社）を用いて合成した。
リアルタイムRT-PCRは常法に従って行い，目は未処置群，オレイン酸群およびレバーHi群間に的遺伝子の発現量は，GAPDHに対する相対発現

ほとんど差はなかった。いっぽう，HMG-CoA

量で表し，未処理群を100とした（ｎ＝３）
。

reductase（HMG-CoA還元酵素阻害遺伝子）につ

自然発症肝疾患動物に対する効果

いては，未処置群とオレイン酸群間でほとんど差

鳥取大学農学部附属動物医療センターに来院しはなかったが，レバーHi群では，未処置群とオレた犬の中で，血液検査の結果，アラニンアミノ基

イン酸群と比べて遺伝子の発現量が約1.7倍に転移酵素（ALT），アスパラギン酸アミノトラン

なっていた。

2.2

ス フ ェ ラ ー ゼ（AST）お よ び ア ル カ リ フ ォ ス

リ ポ タ ン パ ク 質 関 連 遺 伝 子 で は ，ApoA1 ，Table 1 Summary of case
Case

Bleed

Age（year）

Sex

Body weight（㎏）Dose（/day）

1

Border Collie

12Female14

1.0

2Bernese Mountain Dog

5

Male

31

1.5

3

Shih Tzu

12

Male

5

1.0

4

Mix

13

Female121.05Golden Retriever

14

Female27

1.5

6

M. Dachshund

13

Male

6

1.0

7

Papillon

9

Female

1.5

0.5

8

Papillon

12

Female51.0

9M. Dachshund

11

Male

6

1.0

10

Pag

11

Male

11

1.0

© The Ito Foundation

99

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす分子機能解明

ApoB-100およびMTTPに関しては３群間に変化

CoA reductaseの遺伝子やLDLリセプター遺伝子は見られなかった。しかしながら，LDLRではレ発現の増強が確認された。すなわちレバーHiはス

バーHi群において，未処置群ならびにオレイン酸

タチン様作用を有していることが判明した。さら群と比較して，発現量が約4.4倍増加していた。

に今回の実験から，レバーHiはLDLRの発現を高生体内におけるコレステロール代謝は，以下のめることで，末梢組織および肝臓へのLDL回収率

とおりである 。食品中に含まれるコレステロー

を亢進し，血中脂質を改善することが判明した。

４）

ルは，小腸から吸収されて肝臓へ運ばれる。肝臓

3.2

自然発症肝疾患動物に対する効果

からはVLDLに結合した形で血中に分泌され，血レバーHi摂取前後での血中ALT, ASTおよび

中でLDLにまで代謝される。その後，LDLは各組

ALP 濃 度 を Table ３ に 示 し た 。そ の 結 果 ，血 中織の細胞膜表面に存在するLDL受容体により細ALT値（10例中６例），AST値（10例中８例）お胞中に取り込まれて末梢組織へと供給される。まよびALP値（10例中５例）の低下が確認された。

た肝臓細胞においてもLDL受容体は存在する。

筆者らは，これまでに高脂肪食負荷モデル動物を

血中脂質を低下させる薬剤として，スタチンが用いたレバーHiの効果について報告しており，レ

よく知られている。スタチンは，肝臓でのコレス

バ ー Hi の 摂 取 す る こ と に よ っ て LDL コ レ ス テ

テロール合成に関与しているHMG-CoA還元酵素

ロールの減少，肝臓での脂肪滴減少，および空砲を阻害することにより血液中のコレステロールを変性・脂肪変性の減少を確認している５）。今回測低下させる。また，肝細胞はスタチンにより，定した肝臓の酵素は，肝細胞が損傷を受けたとき

LDL受容体の発現やHMG-CoA reductaseの発現に放出されたものであるため，今回の結果からレが亢進され，コレステロールの合成や回収を促進

バーHiは肝細胞に直接作用し，細胞を賦活化してするが，先の同薬剤作用により，結果的にはコレいる可能性が示唆された。

ステロール合成レベルが抑制される。本実験にお著しく数値の減少が見られた症例６および７にいて，レバーHiを添加することにより，HMG-

ついて詳細を記述する。いずれも，胆嚢炎・胆泥Table 2 Expression of each gene
Gene

Un-treatedoleic acidoleic acid＋Liver-Hi

SREBP-1c

100.0±5.7139.1±10.1

158.0±9.2

FAS100.0±6.0129.8±9.2135.4±10.3

SREBP-2

100.0±6.2

102.5±12.4118.3±4.5

HMG-CoA reductase

100.0±2.8106.5±7.5171.0±8.0

ApoA1

100.0±3.1

91.2±9.0

100.0±3.1

Synthesis of triglycerides

Synthesis of choresterol

Lipoproteins

ApoB-100

100.0±10.0

122.9±2.3

81.3±5.7

MTTP

100.0±9.7

138.7±10.0102.7±4.2

LDLR

100.0±5.5

107.0±14.0442.4±13.0

SREBP；sterol regulatory element-binding protein，FAS；fatty acid synthase，SCD；stearoyl-CoA desaturase，MTTP；microsomal
triglyceride transfer protein，LDLR；LDL receptor© The Ito Foundation

100

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 3 Result of hematology
ALT（U/L）

Case

Pre

AST（U/L）
Post

Pre

ALP（U/L）
Post

Pre

Post

1

230.0

261.0

80.0

113.0

1511.01355.02

1925.02452.0

324.0

160.0

3176.08345.0

3

907.0

933.0

82.0

58.0

540.0

938.0

4

533.0

648.0

42.0

65.0

＞3500.0＞3500.0

5

60.0

21.0

23.0

18.0

479.0

189.0

6

429.0

82.0

79.0

30.0

495.0

276.0

7

382.0

99.0

37.0

29.0

1552.0

862.0

8

106.0

90.0

32.0

28.0

225.0

249.0

9

132.0

29.0

33.0

23.0

557.0

160.0

10

200.0

84.0

34.0

27.0

937.0

1334.0症のために胆嚢摘出を実施した。しかし，術後もことが判明した。また，実際の肝臓疾患を患って数値は改善されなかったため，ウルソデオキシいる動物に対してレバーHiを投与した結果，約半

コール酸20mg/kg（１日２回）およびグルタチ

数において肝酵素の改善が認められた。したがっオン15mg/kg（１日２回），ならびにレバーHiをて，レバーHiは有効な機能性食品となることが示

30日間経口投与した。その結果，30日後には顕著唆された。

な肝酵素値の低下が確認された。
以上，本研究の結果は，実際の肝臓疾患の動物においてもレバーHiが有効な機能性食品となることを示唆している。また投与期間中，食欲減退を含めて明らかな有害事象を認めなかった。
４．要

約

本研究の結果，遺伝子解析実験においてレバーHiを添加することにより，LDLRの発現が高まる

文献１） 平成19年国民健康・栄養調査報告，厚生労働省，
2008．
２） 佐藤隆一郎，日本栄養・食料学会誌，66，279～
285，2013．
３） 佐藤隆一郎，日本栄養・食料学会誌，56，127～
133，2003．
４） 福田伊津子，小土井理恵，久保麻友子，岡本隆志，
藤田 剛，芦田 均，生物工学会誌，87，129～134．
５） 岡本芳晴，平成25年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，伊藤記念財団，32，57～61，2014．

© The Ito Foundation

101

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明
Studies on clarification of the compounds involved in“koku attributes”

of pork sausages

西

村

敏

英・江

草

愛

（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

Toshihide Nishimura and Ai Egusa（Department of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science University）

In Japan, the term of“koku attributes”as well as taste, aroma and texture, is commonlyused to assess palatable foods. Although“koku attributes”has not been defined clearly yet, itis thought to be the sensation through richness（complexity）, body, mouthfulness and lingering（persistence）in terms of taste, aroma, and texture of foods.
This research was carried on to clarify the sensory characteristics and the compounds
involved in “koku attributes” of pork sausages. Sensory analyses showed that 12 terms such as
fatty, umami, salty, roasting, lingering, body, mouthful, deep, strong, complex, spicy and richtastes in taste factor, 5 terms such as roasting, lingering, mouthful, smoky and spicy aromas inaroma factor, 5 terms such as elasticity, chewy, juiciness, crunchy and firm feel in texture
factor were listed as sensory characteristics of pork sausages.
Sixteen micro molars of glutamic acids（Glu）and 3.4 μmoles of inosine 5’-monophosphate
were detected in 1 g of pork sausages. The amount of the former was 25.8 times higher thanthat of pork meat used as sausage materials. This high level of Glu seemed to be derived fromadded seasonings and result in the sensations of umami, lingering of taste, body andmouthfulness of flavor. GC/MS analyses for the aroma compounds of sausages has found thatmeaty, spicy and floral flavor compounds such as Caryophyllene, 2-Furanmethanol,“2（3H）-Furanone, dihydro-4-hydroxy”, Tetradecanoic acid,“Phenol，2,6-dimethoxy-4（2-propenyl）-”，cis-9-Hexadecanoic acid and Octadecanoic acid were detected. These compounds seemed
to give complexity in“koku attributes”of pork sausages.

１．目

さに寄与する呈味成分に関する研究は多く，グル的タミン酸やイノシン酸が主要なうま味成分である

食肉製品のおいしさに関する研究は，その原料ことが明らかとなっている。

となる牛肉，豚肉，鶏肉に関するものが多く，各一方，香気成分に関しては，加熱による香気成

食肉に含まれる呈味成分や加熱時の香気成分を分分の変化に関する多くのデータが蓄積されている

析した研究がほとんどである。その中で，おいしが，各食肉の特徴に寄与する香気成分の特定は，© The Ito Foundation

102

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

十分になされていないのが現状である。これま⑵ 「こく」発現に寄与する呈味成分の分析（遊で，和牛肉では，ラクトン類が和牛肉を加熱した
時の甘い香りに関わっていることが明らかとなっている 。また，鶏肉の不快臭の原因物質として，

離アミノ酸と核酸関連物質）⑶

ポークソーセージの香気成分分析

１）

2,4-デカジエナールが特定されており，その生成量が増えることにより，おいしさが低下すること

２．方2 . 1 官能評価によるポークソーセージの食味が知られている。しかし，豚肉を加熱した時の特徴的な香りやそれを原料としたポークソーセージのおいしさに寄与する香気成分は，ほとんど明ら

法

性の解析
試験１：官能評価用語表を用いたソーセージを特徴づける言葉の抽出

かにされていない。また，豚肉を主原料とした食基本五味について２カ月以上の訓練を受け，濃肉製品では，Mottram ２）やRamarathnamら ３）の度識別テストに合格したパネリスト12名を用い報告により，硝酸アルキル，ベンゾニトリル，４て，官能評価試験を実施した ６）。具体的には，-メチル-２-ペンタノン，２-ブチル-２-オクテ

JAS特級クラスのポークソーセージ（以下，「Ｊナールなどの香気成分が亜硝酸塩を添加した製品

特」と省略する）254ｇ（12本相当）を１Ｌの沸から多く検出されることが明らかとなっている。

騰水浴中で３分間茹でたものを試験に供した。パ

しかし，どの成分が食肉製品のおいしさに関わっ

ネリストには，「味・香り・食感」の３項目につているかは，ほとんど研究がなされていない。

いて，表１に記した「官能評価用語表」（味…85

申請者らは，これまで食肉のおいしさを解明す

項目，香り…87項目，食感…34項目）を渡し，「Ｊることを目的とし，食肉を熟成した時の呈味成分

特」を食して当てはまる項目を選択してもらった。

の変動ならびにそれにかかわるメカニズムに関す

試験２：「対照」を用いたソーセージの食味性る研究 を進めてきた。近年，食肉のおいしさの４）の比較研究に関して，うま味の役割を明らかにし，うま

試験１で決定した各官能評価用語について，絶味物質は食肉のレトロネーサルアロマを増強させ対尺度を付ける前段階として，JAS認定を受けてる働きがあることを解明した 。また，食べ物のいない比較的安価な価格で市販されている「対「こく」を定義するため，以下のような概念を提照」（「Ｊ特」と同じ会社にて製造されたもの，以案している。すなわち，食べ物の「こく」には，下，「対照」と省略する）を用い，２点比較を行っ

味，香り，食感が関わっており，より多くの刺激た。

５）がバランスよく与えられ，それらが広がり，持続することによりもたらされる現象であると提案している。

2 . 2 「こく」発現に寄与する呈味成分の分析（遊離アミノ酸と核酸関連物質）
ブレンダーで細切した５ｇの「Ｊ特」に対し，本申請課題では，この概念に基づいて，ポーク

20mlの冷Dwを添加後，10,000rpmで１分間，ホソーセージの官能的特徴と「こく」に寄与する成モジナイズした。得られたホモジネートを遠心分分を解明することを目的に，以下の３つの項目に離（10,000ｇ，10分間，４℃）し，上清に終濃度ついて検討を行った。

で３％となるようスルホサリチル酸を添加した。

⑴ 官能評価によるポークソーセージの食味性の除タンパク後の上清をアミノ酸自動分析計（日本解析電子）に供し，Gluの定量を行った。

© The Ito Foundation

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明

103

IMP の 分 析 に は ，ODS カ ラ ム（Pegasil-300

表１ 官能評価用語集
味

香り

アク
味わい深い
厚みのある味あっさりした味
後味
後をひく
甘味
甘酸っぱさ
脂っこい味
いやな味
うま味
熟れた味
えぐ味
塩味
奥の深い味
奥行きのある味
奥深い
重い味
辛味
軽い味
気品のある味
凝縮した味
強烈な味
きりっとした味
キレのある味くせのある味
くどい味
獣の味
濃い味
香ばしい味
焦げた味
心地よい味
快い味
こってりした味
さっぱりとした味
爽やかな味
酸味
刺激的な味
しっかりした味
しつこい味
渋味
滋味
シャープな味
重厚な味
上品な味
新鮮な味
すがすがしい味
すっきりとした味
繊細な味
素朴な味
だしっぽい味
淡泊な味
血の味
力強い味
土・泥の味
透明感のある味
独特の味
トロリとした味
苦味
濃厚な味
バランスが良い味
引き締まった味
ピリッとした味
広がりのある味
品のよい味
深みのある味複雑な味
ふくよかな味ふくらみのある味
フルーティーな味
フレッシュな味芳醇な味
ほっとする味ほどよい味
ほのかな・ほんのりした味
マイルドな味まろやかな味水っぽい味
みずみずしい味
緑の味
むせるような味
無味
やさしい味
柔らかな味
豊かな味
ワイルドな味

青くさい
アク
悪臭
味わい深い香りあっさりした香り
油臭さ
甘い香り
甘酸っぱい香りふくよかな甘い香り
後をひく香りアンモニア臭いやな香り
磯・海・塩の香り
熟れた香り
おいしそうな香り
重い香り
奥深い
おふくろの香り
かぐわしい香り
かすかな香り軽い香り
きりっとした香り
気品のある香りキレのある香り
強烈な香り
凝縮した香り臭み
薬臭い
くせのある香り
獣臭
濃い香り
芳ばしい
香ばしい
焦げた香り
心地よい香り快い香り
こってりとした香り
こんがりした香り
魚臭さ
さっぱりとした香り
爽やかな香り刺激的な香りしっかりした香り
しつこい香りシャープな香り
重厚な香り
上品な香り
新鮮な香り
すがすがしい香り
すっきりした香り
繊細な香り
素朴な香り
立ち上がる香り
淡泊な香り
血生臭い
土・泥臭さ
ツンとくる香り
独特の香り
生臭さ
苦い香り
濃厚な香り
醗酵臭
鼻につく香り華やかな香りバランスが良い香り
引き締まった香り
広がりのある香り
品のよい香り深みのある香り
複雑な香り
ふくよかな香り
ふくらみのある香り
フルーティーな香り
フレッシュな香り芳醇な香り
ほどよい香りほろ苦い香りほんのり・ほのかな香り
マイルドな香りまろやかな香りみずみずしい香り
緑の香り
むせるような香り
森の香り
やさしい香りやわらかい香り
豊かな香り
ワイルドな香りテクスチャー
しつこい
しっとり
渋い
固い
カリカリ
軽い
きめ
口当たり
クリーミー
こりこり
さくさく
ザクザク
さらさら
ざらざら
刺激的な
弾力
つるっとした
とろける
とろり
なめらか
ぬめり
ねっとり
喉越し
歯ごたえ
ぱさぱさ
バリバリ
ぱりぱり
ぴりっ
ふっくら
ふわっとした
ふんわり
ベタベタ
ほくほく
もったり
やわらかい

ODS SP100，センシュー科学）を用い，0.05mol/
L Triethylamine（pH5.0）を移動相としてアイソ
クラティック法で分析した。なお，カラム温度は40℃，検出には，260nmの波長を用いた。
2.3

ポークソーセージの香気成分分析

細切した５ｇの「Ｊ特」，あるいは「対照」を40ml容のバイアルに入れ，シリカモノリス捕集剤（Monotrap:GLサイエンス）を封入後，80℃で２時間，揮発性成分を回収した。揮発性成分を捕集したMonotrapは１mlの各溶媒（アセトン，エタノール，ジエチルエーテル，ヘキサン）で香気
成 分 を 脱 着 し ， GC/MS （Agilent 5977A GC/
MSD）に 供 し た 。カ ラ ム に は ，CP-wax 52CP
（varian）を用い，40℃（５min）→（10℃/min）→ 240 ℃（10min）の 昇 温 プ ロ グ ラ ム で 分 析 を行った。検出器にはFID（260℃）を使用した。
３．結果と考察3 . 1 官能評価によるポークソーセージの食味性の解析
試験１：官能評価用語表を用いたソーセージを特徴づける言葉の抽出
12名のパネリストの内，３名以上のパネリストが回答した項目について，表２にまとめた。特に，９名以上が選択した言葉には，味（風味）として「脂っこい，うま味，塩味，香ばしい味」が挙げられ，香りでは，焙煎時に感じられる「香ばしい」などが選択された。また，テクスチャーでは，「弾力，歯ごたえ，ジューシー」が選ばれた。これら
は，ソーセージを特徴づける食味であると考えられた。
一方，これら選択された官能評価用語の中には，尺度づけ（絶対評価）が難しいものが含まれていることが課題となった。そこで，続く試験２
では，尺度づけの足がかりとして，同一社製のラ© The Ito Foundation

104

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

表２ 官能評価用語表に基づいて選択されたソーセージを表現する言葉（人数は、その用語を選択したパネリスト数を表す）

９人以上

味

香り

脂っこい味

おいしそうな香り

うま味
塩味
香ばしい味

８人

５人

歯ごたえ
ジューシー

肉の香り

６～８人

ぱりぱり

５人

こりこり

しっかりした味

油（脂）臭さ

４人

なめらか

後をひく

５人

広がりのある香り
複雑な香り

濃厚な味

ほどよい香り広がりのある味

スモーキー

奥の深い味

奥深い
４人

芳醇な香り

上品な味

凝縮した香り深みのある味こってりとした香り

こってりした味

しっかりした香り

力強い味

立ち上がる香り３人

歯切れのよい
ふっくら

３人

ザクザク
プリプリした

重厚な香り

濃い味

奥深い

４人

９人以上

後をひく香り
味わい深い香り

凝縮した味
６人

６～８人

香ばしい

弾力

後味
味わい深い

７人

９人以上

テクスチャー

鼻につく香りキレのある味バランスが良い香り

しつこい味

ワイルドな香り

重厚な味

塩漬臭

複雑な味

スパイシーな香り

表３ ２点識別法によるポークソーセージの官能評価

スパイシーな味
厚みのある味奥行きのある味
心地よい味
３人

味

さっぱりとした味
だしっぽい味
芳醇な味
ほどよい味

ンクの異なる製品を使って比較を行った。
試験２：「対照」を用いたソーセージの食味性

香りの比較
表２に示された用語の中からパネリスト間で言葉のすり合わせを行い，意味が重複する言葉の集約と相対評価による数値化が可能である用語の絞り込みを行った。具体的には，「後味」と「後をひく」は同じ言葉として「持続感」に集約し，「濃い味」を「濃厚な味」にまとめた。さらに，「対照」を選 「Ｊ特」を選
択した人数
択した人数

評価項目

テクスチャー

脂っこい味

4

11

うま味

1

14＊

塩味

4

11

香ばしい味

1

14＊

持続感

0

15＊

濃厚な味

2

13＊

広がりのある味2

13＊

深みのある味

2

13＊

力強い味

4

11

複雑な味

1

14＊

スパイシーな味

213＊

厚みのある味

1

14＊

香ばしい

1

14＊

後をひく香り3

12＊

広がりのある香り

3

12＊

スモーキー

3

12＊

スパイシーな香り

1

14＊

弾力

1

14＊

歯ごたえ

0

15＊

ジューシー

0

15＊

ぱりぱり

2

13＊

プリプリした2

13＊＊：「Ｊ特」と「対照」で有意差あり。
ゴシック体で示した評価項目が「こく」の発現に必要な感覚を指す。

© The Ito Foundation

105

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明

1816

濃度(μmol/g)

14
12
10
8
6
4

Pro

Arg

Car

Ans

His

Lys

Phe

Tyr

NH3

アミノ酸

b-Ala

Ile

Leu

Val

Met

Ala

Gly

Gln

Glu

Thr

Ser

Asp

Urea

Tau

0

PEA

2

図１ ソーセージに含まれる遊離アミノ酸量

表４ 各溶媒の性質
無極性（低沸点）

無極性（高沸点）

極性（非プロトン）

極性（プロトン）

ジエチルエーテル

ヘキサン

アセトン

エタノール

「重厚な味」も「厚みのある味」に集約した。そで有意に強い（数値の横に＊付記）と判断されの結果，味を表現する用語としては，「脂っこいた。さらに，香りやテクスチャーの項目でも「Ｊ

味，うま味，塩味，香ばしい味，持続感，濃厚な特」が「対照」よりすべての項目で有意に強いと味，広がりのある味，深みのある味，力強い味，判断された。著者はこれまでに「こく」を「持続複雑な味，スパイシーな味，厚みのある味」の12

性，濃厚感，広がり」と定義している。今回の評項目が，香りを表現する用語としては，「香ばし

価項目では，表３中のゴシック体文字で示した項

い，後をひく香り，広がりのある香り，スモー

目が「こく」の発現に必要な感覚を指しており，

キー，スパイシーな香り」の５項目が，テクス

ポークソーセージの中にもこれら項目が見出されチャーを表現する用語としては，「弾力，歯ごた

たことは非常に興味深い。

え，ジューシー，ぱりぱり，プリプリ」の５項目

3 . 2 「こく」の発現に寄与する呈味成分の分が選ばれた。なお，この官能評価では，QDA法

析（遊離アミノ酸と核酸関連物質）の手順に則り，試験実施者からは用語決めに関し「こく」の発現にはうま味物質の存在が大きいてはパネリストに対し，一切の提案や誘導を行っと考えられる。そこで，「Ｊ特」に含まれる遊離ていないことを申し添える。

アミノ酸（図１）とイノシン酸含量の測定を行っ選択された上述の用語を用い，「Ｊ特」と「対た。図１に示すとおり，グルタミン酸が肉１ｇあ照」を２点評価した結果を，表３に示す。
「対照」

たり16μmol含まれていた。と畜後６日目の豚筋に比べて，味の項目では，「うま味，香ばしい（風肉中の遊離グルタミン酸量は0.62μmol/gと報告味），持続感，濃厚，広がり，深み，複雑，厚み」

されており，ソーセージ中の遊離グルタミン酸含© The Ito Foundation

106

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

量は，この25.8倍量含まれていることから，調味-Furanone, dihydro-4-hydroxy-（果物香）が多料由来であると推定された。

く検出された。なお，エタノールは溶媒がカラム

また，イノシン酸量は，肉１ｇあたり3.4μmolに保持される時間が長いため，アセトンで保持時含まれていた。イノシン酸は熱に弱いため，加工間が10分までに検出されるβ-Pinene（マツ精油）

ならびに調理中に分解すると考えられるが，測定や3-Carene（ローズマリー精油）は，検出されされた全量が熟成した原料肉のどれくらいに相当なかった。また，アセトンとヘキサンではセージ

するかについては，今後に調べるべき課題である。

やローリエを由来とするEucalyptol（10.3分）やグルタミン酸とイノシン酸は，ともに，うま味クミン由来のγ-Terpinene（10.7分）も検出されを認知できる十分量が含まれており，ソーセージ

た。

の風味増強を通して，「こく」の発現に寄与して一 方 ，ジ エ チ ル エ ー テ ル で は ，8.2 分 の βいると推察された。うま味物質による「こく」の-Pinene（マツ精油），9.4分の3-Carene（ローズ発現を明らかにするためには，調味料の入っていマリー精油），9.8分のα-Phellandrene（ユーカ

ないソーセージを調製し，官能評価した際に，先リ精油），10.4分のD-Limonene（レモン精油），の評価項目がどのように変化するのか確かめる必

11.7 分 の p-Cymene（ク ミ ン 香 気），15.1 分 の α

要がある。

-Copaene（木香），16.5分のCaryophyllene（クロー3.3

ポークソーセージの香気成分分析

ブ精油）などの植物由来の香気成分（アルカン）

初めに，香気物質の抽出方法の検討を行った。

が 検 出 さ れ た 。， こ れ ら の 他 に ， 13.4 分 のシリカモノリス担体に捕集された香気成分は化合

1-Hydroxy-2-butanone（コーヒー香），13.6分の

物により溶媒との親和性が異なる。そこで，今回

Nonanal （フ ロ ー ラ ル 香）， 14.7 分 のは，極性の有無ならびに，極性溶媒の場合にはプ

3-Furaldehyde（アーモンド香）などの香気成分

ロトン性の違う４種類の溶媒を使用し，抽出方法が複数検出された。

を検討した。なお，各溶媒の極性とプロトン性については，表４に示した。

検出総面積で比較すれば，香気成分の抽出量
は，アセトン＞エタノール＞ヘキサン＞エーテル

図２と図３に「Ｊ特」あるいは「対照」の香気の順で多くなり，アセトンではエーテルの３倍以成分を各溶媒で抽出した際の結果を示す。図２上の化合物が抽出された。しかし，ソーセージに（「Ｊ特」）および図３（「対照」）ともに，おおむは，食肉由来の香気成分だけでなく，香辛料の添ね同様のパターンが得られたが，溶媒ごとに検出

加や燻煙工程により，様々な香気物質が添加，生強度が異なる化合物も認められた。極性溶媒であ成，付着するため，溶媒を変えて，各化合物量のるアセトンとエタノールでは，無極性溶媒である

存在量を調べる必要があると考えられた。

ジエチルエーテルとヘキサンに比べ，12.9分の「Ｊ特」と「対照」で比較した場合，「Ｊ特」に

2-Propanone，1-hydroxy（刺激臭），14.6分の酢

おける香気成分検出総面積はいずれの溶媒におい酸（刺激臭），15.5分のギ酸（刺激臭），16.3分のても，「対照」の1/2しか検出されなかった。しかCaryophyllene （ク ロ ー ブ 精 油）
， 31.9 分 のし，Caryophyllene（クローブ精油；16.5分）や

Niacinamide ，33 分 の cis-10-Heptadecenoic acid

2-Furanmethanol （甘 い 香 ； 17.4 分）， 2 （3H）などが多く検出された。特にエタノールでは，アFuranone,dihydro-4-hydroxy （前セ ト ン に 比 べ て ， ギ 酸 と 26.5 分 の ２ （3H）

Tetradecanoic acid（ミ ス チ リ ン 酸 ； 27.2 分），© The Ito Foundation

述）
，

107

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明
アバンダンス
5000000
4800000
4600000
4400000
4200000
4000000
3800000
3600000
3400000
3200000
3000000
2800000
2600000
2400000
2200000
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000600000400000200000
0
時間－>

④

③

②
①
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00

分

図２ 使用溶媒の違いによる「Ｊ特」ソーセージの香気成分分析
 （①：エーテル，②：ヘキサン，③：アセトン，④：エタノール）

アバンダンス
5000000
4800000
4600000
4400000
4200000
4000000
3800000
3600000
3400000
3200000
3000000
2800000
2600000
2400000
2200000
2000000
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000600000400000200000
0
時間－>

④
③

① ②
6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00

図３ 使用溶媒の違いによる「対照」ソーセージの香気成分分析
 （①：エーテル，②：ヘキサン，③：アセトン，④：エタノール）© The Ito Foundation

分

108

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Phenol，2,6-dimethoxy-4（2-propenyl）-（肉様た。また，「こく」があると評価されたポークソー

香 ； 27.8 分），cis-9-Hexadecanoic acid（パ ル ミ

セージからは，原料である肉様香気と甘い香気成

トレイン酸；30.8分），Octadecanoic acid（ステ分が多く検出されており，これら香気成分が「こアリン酸；34.8分）の検出量は，「対照」のもの

く」の発現において，少なからず影響しているとより２倍以上多かった。今後は，GC-Oによるに推察された。さらに，ソーセージ「Ｊ特」には，

おい嗅ぎと検出された化合物の閾値を調べる必要

うま味物質が十分に含まれており，この風味増強があるが，今回，「Ｊ特」からは原料である肉様作用が「こく」付与の１つの要因であると推察さ

香気と甘い香気成分が多く検出されたことは，れた。

「こく」の発現において，少なからず影響があったと推察された。
４．要

約

本課題では，ポークソーセージの官能的特徴と「こく」に寄与する成分の解明を試みた。官能評
価の結果から，味を表現する用語としては，「脂っこい味，うま味，塩味，香ばしい味，持続感，濃厚な味，広がりのある味，深みのある味，力強い味，複雑な味，スパイシーな味，厚みのある味」の12項目が，香りを表現する用語としては，「香ばしい，後をひく香り，広がりのある香り，スモー
キー，スパイシーな香り」の５項目が，テクスチャーを表現する用語としては，「弾力，歯ごたえ，ジューシー，ぱりぱり，プリプリ」の５項目がソーセージを特徴づける用語としてあげられ文献１） 右田光史郎，高濱結花，高萩康，杉山尚弥，菊池圭祐，松石昌典，沖谷明紘，日食工誌，59，127～
138，2012．
２） Mottram, D. M. : Organic Nitrates and Nitriles inthe Volatiles of Cooked Cured Pork, J. Agric. Food
Chem., 32，343～345，1984．
３） Ramarathnam, N., Rubin, L. J., Diosady, L. L. :Studies on meat flavor. 3. A novel method fortrapping volatile components from uncured andcured pork, J. Agric. Food Chem. ，41（６），933 ～
938，1993．
４） Nishimura, T. : Mechanism Involved in the
Improvement of Meat Taste during Postmortem
Aging, Food Sci. Technol. Int. Tokyo， ４ （４），241～249，1988．
５） 後藤真吾，江草（雜賀）愛，高倉友紀子，西村敏
英：鶏だし中の呈味成分が畜肉だし香気に及ぼす影
響，日本食品科学工学会第60回大会講演集，143，2013．
６） 古川秀子：おいしさを測る―食品官能検査の実際，幸書房，1994．

© The Ito Foundation

109

新規機能性脂肪酸，フィタン酸の定量分析法の確立
Establishment of a method for quantitative analysis of a novel functional
fatty acid, phytanic acid

河

原

聡・仲

西

友

紀

（宮崎大学農学部）

Satoshi Kawahara and Tomonori Nakanishi（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

This study was carried out to develop a precise and convenient method using gas-liquid
chromatography with flame ionized detector for determination of phytanic acid and pristanicacid in lipids from ruminant foods, which are suggested to have physiological functions such as
insulin resistance. As a result, it was demonstrated that those fatty acids could be determinedby the internal standard method with a gas chromatograph equipped with a capillary columnof highly polar liquid phase. However some diastereomer of pristanic acid, i.e., both the SRR
form and SRS form, could not be fully separated with this method. It is reported that eachdiastereomer of those fatty acids would have different physiological effects. Therefore thismethod should be improved to precisely determine each diastereomer of those fatty acids.

１．目

推測される。そのような背景の中，近年，新規な的機能性脂肪酸の候補として，反芻動物に由来する脂肪の過剰摂取は肥満や動脈硬化など生活習慣

動物性脂肪中に含有されるフィタン酸（phytanic病の原因になることから，消費者は食事からの脂acid, 3,7,11,15-tetramethylhexadecanoic acid） が肪摂取を控える傾向がある。食肉などに含まれる

注目されている１）。

動物性脂肪は飽和脂肪酸に富み，高脂血症の原因

フィタン酸は分岐鎖脂肪酸の１種であり，クロ

食品になりやすいと一般に考えられている。まロフィルの構成要素であるフィトールの水素付加

た，食肉等の食味性は，それらに含有される脂質反応およびカルボン酸への酸化反応により生成すの含有量と正相関していることから，食味性に優ると考えられている（Fig.１）。フィタン酸の生れた食肉類の摂取はヒトの健康に害悪を及ぼす原成については未だ未知の部分が多いものの，反芻因になると見なされがちである。加えて，牛肉な

動物第一胃（ルーメン）中の微生物が関与すると

ど反芻動物に由来する食肉脂肪に比較的多く含有推測されている２）。近年，分子生物学的手法によされるトランス脂肪酸についての近年の規制も，り，フィタン酸がヒトなどのペルオキシソーム増

消費者への動物性脂肪の印象を悪化させたものと殖剤応答性受容体（PPAR）の外因性リガンドと© The Ito Foundation

110

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

なることが示され，高脂血症の改善や筋肉組織なた。また，本研究では，フィタン酸のα酸化代謝

どにおけるインスリン抵抗性の改善などの生体調物であるプリスタン酸（pristanic acid, 2,6,10,14-

節機能を発揮することが期待されている３）。

tetramethylpentadecanoic acid）の定量法につい

これまでに報告されたフィタン酸の定量分析法
はガスクロマトグラフ質量分析装置（GC/MS）ても併せて検討した。
２

材料および方法

であるため，必ずしも普及率は高くない。また，

2.1

試薬

質量分析法は既知物質の同定や未知物質の構造決

フィタン酸，プリスタン酸およびそれらのメチ定には有力なツールであるが，一般に定量性が低

ルエステル標品，内部標準物質として用いたトリ

く，食品のルーチン分析法としては課題を持つ。

コサン酸（Ｃ23：０）はすべてSigma社製のもの

そこで本研究では，より簡便かつ企業を含めた多を用いた。定性・分離確認に用いた脂肪酸メチルくの試験研究施設に設置されている水素イオン化

エステル混合物はスペルコ37種FAMEミックス

炎検出によるフィタン酸のガスクロマトグラフ分（スペルコ社製）を用いた。

によるものが大半である４～６）が，分析装置が高額

析（GC/FID）による分析定量法の確立を試み

2.2

装置および条件

ガスクロマトグラフ装置はオートインジェク
ターを装着した島津製作所製GC-2010を用い，検A

出器は水素炎イオン化検出器（FID）を用いた。
キャピラリーカラムはポリエチレン液相のN

SupelcowaxⓇ10（0.32mm I.D.×60ｍ，膜厚0.25μ

N
Mg

N

ｍ，スペルコ社製）あるいは90％シアノプロプロ

N

ピルポリシルフェニレン－シロキサン液相のBPX90（0.25mm I.D. × 100 ｍ ，膜 厚 0.25 μm ，
SGE Analytical Science社製）を使用し，それぞ

O
O

O

O

れを用いた場合のフィタン酸およびプリスタン酸

O－の分離度合を比較した。クロマトグラフへの試料導入量は1.0μＬ，スプリット比を100：１とする
スプリット注入法により行った。カラム温度は，Supelcowax の 場 合 ，160 ℃，８ 分 間 保 持 後 ，

B

220℃まで２℃／分で昇温させ，その後45分間保OHC持した。一方，BPX90の場合には，140℃，70分
間保持後，220℃まで２℃／分で昇温させ，５分間保持した。注入部および検出部温度はそれぞれ

O

250℃および260℃とした。キャリアーガスにはヘOH

Fig.1 Structures of chlorophyll（A），phytol （B） and

リウムを用い，線速度20㎝/minの流速で分析を行った。

phytanic acid（C）．

© The Ito Foundation

111

新規機能性脂肪酸，フィタン酸の定量分析法の確立

2.3

Ａ：各脂肪酸のピーク面積

脂肪酸含量測定

鶏肉脂質の抽出はFolchらの方法

７）

Ｂ：トリコサン酸メチルエステルのピーク面積に準じて行った。脂肪酸メチルエステル（FAME）の調

Ｃ：内部標準物質添加量（㎎）製はTakenoyamaらの方法

Ｄ：試料採取量（ｇ）

８）に準じて行ない，得ら れ た FAME を ，ケ イ 酸 カ ラ ム（Precep-C

Ｅ：フラクションＡのスパイク脂肪酸メチルエⓇ

Silica gel，和光純薬社製）を用いた固相抽出によ

ステルのピーク面積

り精製した後，GC分析に供した。フィタン酸おＦ：フラクションＢ以降のスパイク脂肪酸メチ

よびプリスタン酸の定量は内部標準法により，以ルエステルのピーク面積下の計算式にて定量計算を行った。

３

結果と考察

脂肪酸含量（㎎/100ｇ）＝Ａ×C/B/D×100

3.1

分析用GCカラムの検討

ただし，

FAMEの分離に一般的に用いられている中極〈計算式〉

a) 6000

16:0

Signal intensityt(μV)

5000
4000
3000
2000

16:1n‐7

15:1n‐5

1
17:1n
‐7

32

33

1000
0
24

25

26

27

b) 5000

28
29
30
Retention time(min)

4000
3000
2000

15:1n‐5

SRS/SRR
RRR

1000
0
24

25

26

27

31

c) 2500

16:0

Signal intensityt(μV)

Signal intensityt(μV)

1
17:0

2000

34

SRR
RRR
16:1n-7

17:1n‐7
17:0

1500
1000
500

28

0
28

Retention time(min)

29

30

31

32

33

34

Retention time(min)Fig.2 Elution profile of a commercial FAME mixture （a）and that containing methyl esters of pristanic acid （b）andphytanic acid（c）by a polar culmun（SupelcowaxⓇ10）．

© The Ito Foundation

112

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

a) 1800

16:0

1400
1200
1000
800 15:0
600

16:1n‐7

400

17:0

200
0
24

800
700
Signal intensityt(μV)

15:1n‐5

600

26

28

30
32
34
Retention time(min)36c) 45015:0

400

15:1n‐5500

SRS/SRR

400

RRR

Signal intensityt(μV)

Signal intensityt(μV)

1600

300
200
100
0
24 25 26 27 28 29 30
Retention time(min)

350
300
250

38

40

16:1n-7

17:0

SRR
SRS RRR

200
150
100
50
0
36 37 38 39 40 41
Retention time(min)Fig.3 Elution profile of a commercial FAME mixture （a）and that containing methyl esters of pristanic acid （b）andphytanic acid（c）by a highly polar culmun（BPX90）．

性カラム（SupelcowaxⓇ10）および液相に90％シ析を行う場合には，本研究で使用したものと同等

アノプロプロピルポリシルフェニレン－シロキサ

あるいはそれ以上の強極性液相を使用したキャピン液相を修飾した強極性カラム（BPX90）を用

ラリーカラムを用いることが望ましいと考えられいて，フィタン酸あるいはプリスタン酸を添加した。

た市販FAME混合物を分析した結果をFig.２およフィタン酸およびプリスタン酸はキラル中心をびFig.３に示す。いずれのカラムを用いた場合も，３カ所持ち，SRS，SRRおよびRRRのジアステ

両FAMEの分離が可能であったが，中極性カラレオマーが存在する（Fig.１）。各脂肪酸のジア

ムではフィタン酸のピークが17：０と完全に分離

ステレオマーの分離に関しては，フィタン酸につすることができなかった。フィタン酸やプリスタ

いては強極性カラムで３種を分離することができン酸が比較的多く含有される反芻動物由来の脂肪

たが，プリスタン酸についてはSRS体とSRR体のには，奇数の炭素を持つ飽和脂肪酸が少なからず分離は困難であった。この点については，天然の含有されている。そのため，フィタン酸の定量分

脂質にはSRR体とRRR体のみが検出されること© The Ito Foundation

113

新規機能性脂肪酸，フィタン酸の定量分析法の確立が知られており９），食品の分析を行ううえで，事3 . 2 内部標準法によるフィタン酸，プリスタ

実上の問題は生じないと考えられた。しかしながら，これら立体異性体間では脂肪酸の生理作用が異なることが示唆されていること

ン酸の定量
内部標準法による食品中のフィタン酸およびプから，食品のリスタン酸の定量性を確認するため，内部標準物

栄養機能を考察するに当たり，立体異性体の分離質としてトリコサン酸（Ｃ23：０）を用い，種々定量が必用になることが予測される。今後，よりの脂肪酸量比とピーク面積比を比較検討した。既最適化した分離条件を確立する必用があると考え知量の遊離フィタン酸あるいは遊離プリスタン酸られた。

標品とトリコサン酸（Ｃ23：０）の混合試料をメ

９）

チルエステル化し，強極性カラムを用いたGC分

Area ratio(Ax/As)

0.6

SRS
SRR

0.4

y = 0.5254x + 0.0095
R² = 0.9951

RRR

y = 0.252x + 0.0034
R² = 0.99551

0.2
0Area ratio(Ax/As)

1

y = 0.2246x + 0.002
R² = 0.99633

0

0.2

0.4

0.6

Mass ratio (

0.8

/

)

0.8
0.6
0.4

y = 1.002x + 0.0149
R² = 0.99566

0.2
0

1

0

0.2

0.4

0.6

Mass ratio (

/

0.8

)

1

Fig.4 The relation lines between mass ratio and area ratio of phytanic acids to internal standard material. Mx, mass ofanalysis species; Ms, mass of internal standard; Ax, area of analysis species; As, area of internal standard.

1.2
1

0.8

SRS/SRR

0.6

RRR
y = 0.8983x + 0.0013
R² = 0.99986

0.4
0.2
0

y = 0.2908x - 0.0009
R² = 0.99972

0

0.2

0.4

0.6

Mass ratio（

/

0.8

）

1

Area ratio（Ax/As）

Area ratio（Ax/As）

1

0.8
0.6
y＝1.1888x＋0.0004
R2＝0.99983

0.4
0.2
0

0

0.2

0.4

0.6

Mass ratio（

/

0.8

）

1

Fig.5 The relation lines between mass ratio and area ratio of pristanic acids to internal standard material. Mx, mass ofanalysis species; Ms, mass of internal standard; Ax, area of analysis species; As, area of internal standard.

© The Ito Foundation

114

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

析に供して混合試料のピーク面積を測定した。分

てはフィタン酸，プリスタン酸ともに検出限界以

析種と内部標準物質のピーク面積比（Ax/As）お下であった。鶏ひき肉中に添加した両脂肪酸量とよび混合試料中のそれぞれの重量比（Mx/Ms）

見積もられた定量値との平均的な誤差は，フィタからFig.４およびFig.５に示す関係線を得た。フィ

ン酸については約＋14％，プリスタン酸について

タン酸，プリスタン酸ともに，内部標準物質の重は約－５％であり，フィタン酸で若干多く見積も量比とピーク面積比は良好な直線関係を示し，内られる傾向が認められた。この点については，試部標準法による定量が可能であることが確認され行回数を増やし，同様の傾向が認められる場合にた。また，回帰直線の残差の標準偏差から，フィは定量結果に－10％程度の補正をかける必用があ

タン酸についてはMx/Ms＝0.003，プリスタン酸

るかもしれない。一方，７回の定量分析操作でのについてはMx/Ms＝0.005が検出限界であると推変 動 係 数（relative standard deviation）は ，総定された。

フィタン酸量については8.3％，総プリスタン酸

3 . 3 食肉中のフィタン酸およびプリスタン酸

量では4.5％であり，繰り返し精度はおおむね良好であった。しかし，プリスタン酸のRRR体にの定量
食肉中のフィタン酸およびプリスタン酸の定量

ついては，他の立体異性体より変動係数が高くに，今回確立した分析方法が適用できるかを確認なった。この点については，SRR体との分離状する目的で，食肉中の両脂肪酸の定量実験を行っ態の悪さ（Fig.３）がピーク面積の計算値に影響た。本研究では抽出時からの回収も考慮した実験を及ぼしているものと推測され，各異性体の定量を行うため，市販鶏ひき肉に既知量（0.5mg/100

性を向上するためには分析条件に改善を加える必

ｇ肉）のフィタン酸およびプリスタン酸標品を混用があると考えられた。

合して調製した試料から常法により総脂肪を抽出し，FAME調製を経て，GC分析を行った。同様

４

要

約

の試験を７反復行った結果をTable１に示す。な近年，反芻動物に由来する動物性脂肪中に含有

お，脂肪酸標品を添加していない鶏ひき肉についされる新規な機能性脂肪酸の候補として注目されているフィタン酸，およびその代謝産物であるプ

Table 1 Quantification of phytanic and pristanic acids inmeat sample

リ ス タ ン 酸 の ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ 分 析（GC/FID）による分析定量法の確立を試みた。種々の検討の結果，強極性液相のキャピラリーカラムを

estimated value（mg/100g meat）

RSD＊

SRS

0.106

8.2

SRR

0.315

8.3

が確認された。しかしながら，本研究での分析条

RRR

0.147

9.4

件では，特にプリスタン酸のジアステレオマーの

Total

0.568

8.3

一部を完全に分離することができなかった。フィ

SRS/SRR

0.355

5.4

RRR

0.119

14.0

Total

0.474

4.5

Fatty acid
Phytanic acid

Pristanic acid

＊RSD＝SD/average × 100

装着したガスクロマトグラフ分析により，内部標準法による両脂肪酸の定量分析が可能であること

タン酸，プリスタン酸の生理作用は異性体ごとに異なっていることが示唆されているため，今後，異性体レベルでの定量分析に関する確度を高めることができるよう，分析条件をより最適化する必© The Ito Foundation

新規機能性脂肪酸，フィタン酸の定量分析法の確立

要が認められた。
文献１） Young, J. F., Therkildsen, M., Ekstrand, B., Che, B.
N., Larsen, M. K., Oksbjerg, N., Stagsted, J. : Novel
aspects of health promoting compounds in meat,
Meat Sci.，95，904～911，2013．
２） Patton, S., Benson, A. A. : Phytol metabolism inthe bovine, Biochim. Biophys. ACTA., 125, 22 ～ 32 ，
1966．
３） Hellgren, L. I. : Phytanic acid-an overlookedbioactive fatty acid in dairy fat?, Ann. N.Y. Acad.
Sci., 1190，42～49，2010．
４） Allen, N. E., Grace, P. B., Ginn, A., Travis, R. C.,
Roddam, A. W., Appleby, P. N., Key, T. : Phytanicacid: measurement of plasma concentration by gasliquid chromatography-mass spectrometry analysis
and associations with diet and other plasma fatty
acids, Brit. J. Nutr.，99，653～659，2008．
５） Vetter, W., Schröder M. : Concentrations ofphytanic acid and pristanic acid are higher in

115

organic than in concentional dairy products fromthe German market, Food Chem.，119，746～752，
2010．
６） Che, B. N., Kristensen, T., Nebel, C., Dalsgaard, T.
K., Hellgren, L. I., Young, J. F., Larsen, M. K. : J.
Agric. Food Chem.，61，225～230，2014．
７） Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. : A
simple method for the isolation and purification of
total lipids from animal tissue, J. Biol. Chem., 226,
497～509，1957．
８） Takenoyama, S., Kawahara, S., Murata, H.,
Yamauchi, K. : Investigation of some preparation
procedures of fatty acid methyl esters for capillarygas-liquid chromatographic analysis of conjugatedlinoleic acid in meat, Anim. Sci. J.，70，336～342，
1999．
９） Che, B. N., Kristensen, T., Nobel, C., Dalsgaard, T.
K., Hellgren, L. I., Young, J. F., Larsen, M. K. :Content and distribution of phytanic aciddiastereomers in organic milk as affect by feed
composition, J. Agric. Food Chem.，61，225～230，
2013．

© The Ito Foundation

116

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第４報）Intramuscular free fatty acids related to beef eating quality, PartⅣ

山之上

稔・西田

昌弘・趙

婭楠・上田

修司・井原

一高・豊田

淨彦

（神戸大学大学院農学研究科）

Minoru Yamanoue, Masahiro Nishida, Anan Cho, Syuji Ueda, Ikko Ihara and Kiyohiko Toyoda（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

The aims of this study were to measure the lipase activities in water-soluble extract(broth) from Japanese Black Wagyu and Holstein beef during postmortem aging, and to prove
the influence of increase of the amounts of free fatty acid（FFA）on beef eating quality,
especially taste of beef broth. First, the standard curves for measurement of neutral lipase, acidlipase and acid phospholipase activities were figured with a 4-Methylumbelliferone. Then,measurement condition for each lipase activity with 4-Methylumbelliferyl-oleate as a lipase
substrate was examined. Sample beef slices were taken from carcass cross-section between
the sixth and seventh ribs of Japanese Black Wagyu and Holstein cattle and stored at ４℃
antiseptically. At 7-，14-and 21-days postmortem, beef broths were prepared from raw andcooked samples. The neutral lipase, acid lipase and acid phospholipase activities of both beefbroths were measured. As the results, neutral lipase activity of the broth prepared fromJapanese Black Wagyu beef was about two times higher than that of Holstein beef during
postmortem aging. Both acid lipase and acid phospholipase activities were low and remained
almost unchanged. Therefore, it is suggested that higher neutral lipase activity is possible torelate to increase in free fatty acid of Japanese Black Wagyu beef broth during postmortem
aging.

１．目

明らかにする目的で，死直後の筋内脂肪量や脂肪的酸組成に関する多くの知見が報告されている。し一般に，市販されている牛肉のおいしさに脂肪かしながら牛肉は摂食されるまでに長期間の熟成の影響は大きく，脂肪交雑として筋内脂肪量が多を経た後に加熱調理されており，それらの処理でいことが重要視されてきたが，近年では脂肪を構

筋内脂肪に変化が起きている可能性があるが，こ成する脂肪酸が牛肉のテクスチャーや風味を左右の件に関しての報告は少ない。また筋内脂肪変化することが示され，注目されている１～３）。肉牛のが牛肉の呈味性に及ぼす影響を調べた報告は見当飼育方法や品種差が筋内脂肪蓄積に及ぼす影響をたらない。本研究は，牛肉賞味時における筋内遊© The Ito Foundation

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第４報）

117

離脂肪酸の量および組成と牛肉のおいしさの関連薬を用いた。４-メチルウンベリフェリル-オレイについて解明を行っている。

ン酸および４-メチルウンベリフェロン標準品は

これまでに熟成および加熱前後の黒毛和種およシグマ－アルドリッチ社から購入した。牛肉試料

びホルスタイン種牛肉からクロロホルムとメタは，伊藤ハム（株）から購入した黒毛和種およびノールの混液で抽出した総脂質中の，また牛肉賞

ホルスタイン種枝肉の第６-７肋骨間のロース部

味時に口腔内に拡がる肉汁中のトリアシルグリセ

を用いた。

ロール（TG）量および遊離脂肪酸（FFA）量なら

2.2

びに脂肪酸組成の熟成および加熱に伴う変動を調

ロース部の牛肉を４℃で保存し，と畜後７日

べている。さらに肉汁の味覚センサー分析を

４～６）

熟成および加熱処理

目，14日目，および21日目にロース芯から牛肉片。

を無作為に採取して熟成および未加熱試料としそれらの結果，熟成中に筋肉内および肉汁中の遊た。一方，同期間熟成した牛肉ロース芯を４cm

離脂肪酸量は増加し，その増加は牛肉の加熱処理

×５cmの大きさで厚さ１cmの肉片に整形し，後でも変化しないことを明らかにした。またホル120℃に加熱したホットプレートで内部温度が65

スタイン種牛肉に比べて食味性の優れた黒毛和種～70℃になるように表裏を各130秒間加熱後に試牛肉の肉汁における遊離脂肪酸量は熟成に伴い有料を採取し，加熱試料とした。

行い，官能試験で加熱牛肉の食味性を調べた

５，６）

意に増加することを認めた。味覚センサーによる

2.3

酸味，苦味雑味，および旨味の熟成中の変化パ

未加熱および加熱牛肉の各４ｇに10 mlの蒸留

ターンは黒毛和種牛肉汁とホルスタイン種牛肉汁

水を加えて，10,000 rpmで２分間ホモジナイズしで類似していたが，それらの程度に差が認めらた。蒸留水を加えてメスシリンダーで15 mlに定れ，熟成中の肉汁における遊離脂肪酸量増加が黒容にし，よく混合して均質にした後，5,000 rpm

毛和種牛肉の呈味性に影響することを示唆する結で20分間の遠心分離を行った。遠心分離後，ろ過果であった 。これらのことから，黒毛和種牛肉した上清を10 mlに定容にして肉汁試料とした。

５）

肉汁試料の調製における肉汁遊離脂肪酸量の熟成に伴う増加がホ

2.4

リパーゼ活性測定

ルスタイン種牛肉よりも顕著である理由を解明す

肉汁中の中性リパーゼ活性，酸性リパーゼ活

ることは，黒毛和種牛肉のおいしさへの筋内遊離性，および酸性ホスホリパーゼ活性をHernández

脂肪酸の寄与を明らかにするうえで重要と考えら

ら（1999）の方法７）に従い励起波長／蛍光波長＝れる。本研究では，熟成中の黒毛和種およびホル355 nm/460 nm で 測 定 し ，４ - メ チ ル ウ ン ベ リ

スタイン種牛肉汁における酵素リパーゼ活性の変フェロン当量で示した。

化と，肉汁中の遊離脂肪酸量の変化に及ぼすリ2.5

パーゼ作用の影響を明らかにすることを目的にす

肉汁のpHをマルチ水質計（東亜ディーケーる。

ケー株式会社，MM-60Ｒ）で測定した。

２．方
2.1

pH測定

法

３．結果と考察

試薬および牛肉試料

食肉中の脂質の分解および酸化は風味の劣化や栄試薬は特に表記してあるものを除き，ナカライ

養的損失などを起こし，食肉の品質低下を招く７，８）。

テスク社もしくは和光純薬工業株式会社の特級試

牛肉脂肪の分解と遊離脂肪酸の蓄積は筋肉内在性© The Ito Foundation

A
y=3300.1x
R2=0.98361

8000
6000
4000
2000
0

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Amounts of 4-Methylumbelliferone（μg）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）
B
7000
6000
5000

y=89.229xR2=0.97914

4000
3000
2000
1000
0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Amounts of 4-Methylumbelliferone（μg）

Fluorescence Intensity（460nm）

平成26年度Fluorescence Intensity（460nm）

Fluorescence Intensity（460nm）

118

C
6000
5000
4000

y=78.755xR2=0.98141

3000
2000
1000
0

0 10 20 30 40 50 60 70

Amounts of 4-Methylumbelliferone（μg）

Fig.1 Standard curves for the various lipase activities of Japanese Black Wagyu and Holstein beef broths.

1400

Fluorescence Intensity（460nm）

ΔFluorescence Intensity/460nm/10minNeutral lipase（A），acidic lipase（B），and acidic phospholipase（C）activities were measured.

1200
1000
800
600
400

3000
2500
2000
1500
1000
500
0

200
0

7.5

pH

5.0

y=41.82xR2=0.99443

0

10

20

30
40
50
Time
（min）

60

70

Fig.3 Changes in neutral lipase activity during theFig.2 Effects of pH on the activity of neutral lipase inmeasurement time in Japanese Black Wagyu beefbroth prepared at 7-days postmortem（n＝２）．

Japanese Black Wagyu beef broth prepared at 21days postmortem（n＝２）．

ホリパーゼ（APL）のそれぞれの活性を測定すのリパーゼやホスホリパーゼによると考えられるる条件を検討した。基質である４-メチルウンベ

が，その経緯は未だ明確ではない。さらに熟成中

リフェリル-オレイン酸がリパーゼで分解されてに筋肉内に蓄積する遊離脂肪酸と牛肉のおいしさ

生じる４-メチルウンベリフェロンを当量として，との関連はまったく不明である。食味性に優れた検量線を作成した（Fig.１）。３種類のリパーゼ

黒毛和種牛肉を低温で貯蔵したときに起こる遊離活性測定条件の中で，NL活性測定条件では微量

脂肪酸量の顕著な増加と内在性リパーゼとの関連な４-メチルウンベリフェロン量で高い蛍光強度を解明することは，黒毛和種牛肉のおいしさへのを示した（Fig.1A）。そのためNL活性とAL活性

筋内遊離脂肪酸の寄与を明らかにするうえで重要の両リパーゼ活性の測定結果が競合する可能性をと考えられる。

調べた。Fig.２に示すように，NL活性はAL活性

まず牛肉内に存在すると考えられる中性リパーの測定条件であるpH5.0の低pHではまったく活性

ゼ（NL），酸性リパーゼ（AL），および酸性ホスを示さず，牛肉汁中のNL活性とAL活性の測定値© The Ito Foundation

119

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第４報）

0.2
0.15
0.1
0.05
0

AL

NL

APL

6.60

0.25
0.2
0.15

6.40

0.1
0.05
0

AL

NL

6.20

APL

Fig.4 Effects of postmortem aging on various lipase

activities in Japanese Black Wagyu and Holstein beefbroths（n＝２）．
 Each broth was prepared from raw samples fromJapanese Black Wagyu （A） and Holstein beef（B）
at appropriate postmortem days（7-days ，□ ； 14days， ；21-days，■）．

pH

B

0.25

Activity（μg/min/ml）

Activity（μg/min/ml）

A

6.00

5.80

5.60

は競合しないことが明らかになった。
牛肉汁中のNL活性の測定結果の一例をFig.３に示す。図から明らかなように測定した条件内で

Raw

CookedFig.5 Difference in pHs of the broths prepared from raw

and cooked Japanese Black Wagyu beef（□） andHolstein beef（ ）at 21-days postmortem（n＝２）．

は４-メチルウンベリフェロンの蛍光強度は直線的に増加し，本研究における測定条件が肉汁中の黒毛和種牛肉汁中のNL活性がホルスタイン種牛

中性リパーゼ活性測定に有効であることを示して

肉汁中のNL活性に比べて約２倍の高い値で推移いる。またALおよびAPL活性測定結果もNL活性することが，黒毛和種牛肉汁中の顕著なFFA量測定結果と同様であった（data not shown）。

増加の要因である可能性が考えられる。今回のリ以上の結果をふまえて，熟成中の黒毛和種およパーゼ活性は，両牛肉ともに２試料を用いた測定

びホルスタイン種牛肉から経時的に調製した肉汁の平均値で示しており，今後測定数を増やして検中のAL活性，NL活性，およびALP活性値の変化証することが必要であろう。

をFig.４に示す。黒毛和種牛肉汁中のAL活性お肉汁中のNL活性はpH5.0の低pHではまったく

よびALP活性は，熟成中にいずれも0.1μg/min/

活性を示さず，AL活性とは競合しないことを示

ml以下の低値で推移した。NL活性は熟成７日目

した（Fig.２）。しかし牛肉のpHは，筋漿に溶存に0.2μg/min/mlで，熟成中にわずかに増加するする物質の熟成中の変化により極限pHである傾向であった（Fig.4A）が，ホルスタイン種牛肉

pH5.6前後から若干上昇することが報告されてい汁中のNL活性は熟成期間を通じて約0.1μg/min/る９）。それ故，本研究における熟成21日目の牛肉

mlと低値のままであった（Fig.4B）。ホルスタイ

pHを，未加熱および加熱後に調製した肉汁試料

ン種牛肉汁中の他のリパーゼ活性は黒毛和種牛肉で測定した（Fig.５）。黒毛和種およびホルスタ

汁の場合とほぼ同様に低値で推移した。過去の報

イン種牛肉汁のpH値は，約6.0～6.5を示し，極限

告で黒毛和種牛肉では肉汁中のFFA量は熟成21

pHから中性側に上昇していた。また未加熱およ

日間に増加したが，ホルスタイン種牛肉肉汁のび加熱後に調製した肉汁のいずれでも黒毛和種牛

FFA量は熟成期間を通じてほぼ一定で，黒毛和肉汁のpHが高い値であった。熟成中のpH上昇が種牛肉と異なることを示している

黒毛和種牛肉汁中のNL活性を強め，FFA量の増

。熟成中の

５，６）

© The Ito Foundation

120

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

加にはたらいていることが示唆される。今回は調黒毛和種およびホルスタイン種種牛肉の第６～べていないが，牛肉汁のpH上昇が筋肉内のリパー

７肋骨間ロース部を４℃で保存し，と畜後７，

ゼ活性に及ぼす影響があるのかもしれない。

14，および21日目にロース芯から筋肉片を採取し以上の結果から，黒毛和種牛肉のおいしさと筋た。未加熱および加熱処理後の筋肉試料から水溶

内遊離脂肪酸増加の関連性を明確にするために，性画分を調製し，肉汁試料とした。未加熱肉汁試今後の研究では熟成中の黒毛和種およびホルスタ料の各リパーゼ活性を測定した結果，両牛肉汁中

イン種牛肉汁中のリパーゼ活性の特徴を確立し，の酸性リパーゼおよび酸性ホスホリパーゼ活性はpHをはじめとする諸条件によるリパーゼ活性の熟成期間を通じて低値で推移した。一方，黒毛和変化とその影響を明らかにすることが重要と考え

種牛肉汁中の中性リパーゼ活性はホルスタイン種ている。

牛肉汁の中性リパーゼ活性に比べて約２倍の高値

４．要で推移し，熟成中の黒毛和種牛肉汁のFFA増加

約に影響することが示唆された。

牛肉のおいしさへの筋内脂肪の影響を牛肉中の遊離脂肪酸量と咀嚼時の呈味性との関係から解明するために，これまでに明らかにした熟成および加熱による肉汁中の筋内脂肪量および呈味性の変化要因を，黒毛和種牛肉とホルスタイン種牛肉のリパーゼ活性の差異に着目して調べた。
まず牛肉内に存在すると考えられる中性リパー
ゼ，酸性リパーゼ，および酸性ホスホリパーゼのそれぞれの活性を測定する条件を検討した。リ
パーゼの基質である４-メチルウンベリフェリルオレイン酸が分解されて生じる４-メチルウンベ
リフェロンを当量として，検量線を作成した。また中性リパーゼおよび酸性リパーゼ活性の両測定で使用されるpH条件で中性リパーゼ活性を測定した結果，測定pHが異なると中性リパーゼ活性と酸性リパーゼ活性の作用が競合しないことを確

文献１） Westerling, D. B., Hedrick, H. B. : J. Anim. Sci.,
48，1343～1348，1979．
２） Melton, S. L., Amiri, M., Davis, G. W., Backus, W. R.
: J. Anim. Sci.，55，77～87，1982．
３） Mandell, I. B., Buchanan-Smith, J. G., Cambell, C.P.
: J. Anim. Sci.，76，2619～2630，1998．
４） 山之上稔，矢野恵子，上田修司，井原一高，豊田淨彦：平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報
告書，Vol.30，68～75，2012．
５） 山之上稔，大和彩弥香，上田修司，井原一高，豊田淨彦：平成24年度食肉に関する助成研究調査成果
報告書，Vol.31，42～48，2013．
６） 山之上稔，西田昌弘，上田修司，井原一高，豊田淨彦：平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報
告書，Vol.32，27～33，2014．
７） Hernández, P., José Navarro, J., Toldrá, F. : Z.
Lebensm Unters Forsch，208，110～115，1999．
８） Witte, C. V., Krause, G. F., Bailey, N. E. : J. Food
Sci.，35，582～585，1970．
９） Lawrie, R. A. : Lawrieʼs Meat Science, 6th ed., 221,
Woodhead Publishing Limited, Cambridge, 1998．

認した。

© The Ito Foundation

121

金属表面洗浄時における食肉由来汚れの脱離特性に及ぼす外部電位印加の効果
Investigation of the effects of applied surface electric potential on theremoval behavior of meat borne soilings on metal surface during cleaning

今

村

維

克・石

田

尚

之

（岡山大学大学院自然科学研究科）

Koreyoshi Imamura and Naoyuki Ishida（Graduate School of Natural Science and Technology, Okayama University）

When a metal surface contacts with meat, some components of the meat bind to the metal
surface. In this study, the attached components, originated from meat, were first analyzed byusing a Fourier transform IR spectroscopy. The IR spectra indicated that the main componentsof the attachment matter originated from meat comprised of fatty acids, esters, and proteins.
Hence, the next step of this study focused the effective methodologies for the removal ofadsorbed lipid and protein on metal surfaces. Stainless steel SUS 316L was used as a metal
surface. In this study,（i）alkaline cleaning,（ii）enzymatic cleaning and（iii）oxidation cleaning
by OH radicals generated by hydrolysis of hydrogen peroxide（H 2O2-electrolysis cleaning)were employed. The adsorbed fatty acids and esters could be removed by H2O2-electrolysis
cleaning while it remained after alkaline cleaning（and enzyme cleaning）at room temperature.
The adsorbed protein could be removed by the enzymatic（trypsin）cleanings, the rate ofwhich was increased with increasing the trypsin concentration. However, at the trypsin
concentration above 10 μg/mL, the adsorption of trypsin onto the stainless steel surface
became significant after once the adsorbed protein was removed. The application of electric
potential during the enzyme cleaning resulted in the further increase in the trypsin adsorption
and did not contribute to the increase in the cleaning rate. The H2O2-electrolysis cleaning was
also quite effective for the removal of adsorbed protein.

１．目

異物（汚れ物質）の混入や雑菌の繁殖により製品的品質を致命的に低下させる。そのため，製造装置

食肉は食品製造・加工プロセスにおいて大量にの洗浄は食品製造プロセス，とりわけ食肉を加調理・加工されている。食肉は，脂質やタンパク

工・調理するプロセスにおいては極めて重要な操質を高濃度に含んでおり，これを加工する装置や作である。しかし，脂質やタンパク質といった有器具表面にはそれらを主とする『汚れ』が付着す

機物質はステンレスなどの金属表面に対して高いる。この『汚れ』が製造装置内に残留すると，製吸着性を有しているため，その除去は容易ではな

造装置の機能を低下させるだけでなく，製品へのい。実際には，高温に熱したアルカリ水や酸性水，© The Ito Foundation

122

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

莫大な界面活性剤と時間を費やして，やっと，汚ル溶液；タンパク質：0.1mg/mL水溶液）に１時れの残留量を検出限界以下まで下げているのが現間以上接触させ，溶剤でリンス後，乾燥させるこ状である。従って，汚れ物質を完全に，そして，とでモデル汚れ物質を固着させた。H２O２-電気分

極力効率的（少ないエネルギー）に除去できる洗解洗浄実験は電解槽を装備した偏光解析装置を用浄技術の開発は極めて重要である。そこで，本研いた。あらかじめ脂質を吸着させた試料平板を電究では，まず，食肉由来汚れを構成する物質につ

解槽中の11mM H２O２ 水溶液（支持電解質20mM

いて検討した。ステンレス表面をモデル食肉素材

KClを含む）に浸し，ポテンショスタットを用いと接触させ，そのときの付着物質の成分と量を解て負電位を印加した（対極：白金，参照電極：析した。次に食肉汚れの主成分である脂質とタン

Ag/AgCl）。洗浄過程における試料平板上のモデ

パク質の各種洗浄除去を試みた。アルカリ洗浄，

ル汚れ物質の量（厚み）は偏光解析法により連続

酵素洗浄，薬剤（界面活性剤），H２O２-電気分解的に測定した。その他の洗浄実験では，ガラス製洗浄によるモデル脂質汚れ，モデルタンパク質汚

電気化学セル（200mL容量）にモデル汚れを付着れの脱離の有無および程度を調べた。また，各洗させたテストピースに設置し，加水分解酵素溶液

浄方法におけるモデル汚れ物質の付着表面の電位（Trypsin：1.0～1,000μg/mL）あるいはアルカリが脱離特性に及ぼす影響についても調査した。

溶液（0.1M NaOH）をガラスセルに注いだ。ス

２．方
2.1

ターラーで撹拌し，電位を印加する場合は，上述

法のポテンショスタットを用いた（対極：白金，参照電極：Ag/AgCl）。

食肉由来汚れの分析

表面材料としてはステンレスSUS316Lを用いた。片面を鏡面研磨したSUS316Lテストピースを

３．結果と考察

一定温度（室温or 180℃）に設定したホットプ

3.1

レート上に載せ，その上に市販のブタ挽肉を一定

Fig.１に豚挽き肉をあらかじめ180℃加熱した

時間被せた。これによりステンレス表面に食肉由

テストピースに押し付けた際に付着した物質の来汚れをを形成させた。テストピース表面上のあIRスペクトルを示す。加熱表面への接触時間にからさまな付着物を水洗によって除去し，残留しよって各吸収ピークの強弱に変化は見られるが，ているモデル汚れを高感度反射吸収法および全反本実験条件の範囲では，3000cm－１および1720cm－１

射吸収法－フーリエ変換赤外分光分析（RA-，

近傍に鋭い吸収が見られた。これらは脂質のアルATR-FTIR）により分析した。IRスペクトル中

キル鎖Ｃ-Ｈとカルボニル基Ｃ＝Ｏの伸縮振動にの検出ピークとその強度から，食肉由来汚れに含起因するピークである１）。また，1400cm－１ 近傍

まれる成分を推定した。

にアニオン化カルボキシル基の対称振動の吸収が2.2

食肉汚れの主成分分析

モデル脂質・タンパク質汚れの洗浄実験

見られることから，脂質はエステルだけでなく著

脂 質 と し て palmitic acid ，stearic acid お よ び

量の脂肪酸を含んでいるものと考えられる。まtripalmitinを用いた。タンパク質としては金属表

た，1650cm－１ 近傍にピークが見られ，とりわけ面に対する付着性が極めて高い牛血清アルブミン

非加熱試料でその吸収が顕著であった。さらに（BSA）を主に用いた。モデル汚れ物質はテスト

1550cm－１ 近傍にはステンレス表面に起因するマ

ピースをモデル汚れ溶液（脂質：１mMエタノー

イナスの反射ピークが見られているが，その同波© The Ito Foundation

金属表面洗浄時における食肉由来汚れの脱離特性に及ぼす外部電位印加の効果

123

数域に吸収帯の存在が認められる場合もあった。

3.2

それら1650cm

近傍のピークはそれ

まず，モデル脂肪酸汚れ（パルミチン酸，ステ

ぞれペプチド結合Ｃ＝Ｏ伸縮振動（アミドⅠ），アリン酸）を付着させたサンプルピースをアルカ

ペプチド結合Ｎ-Ｈ偏角振動（アミドⅡ）に対応

リ（0.1M NaOH）を用いて洗浄を試みたが，顕する 。従って，脂質汚れの主成分は脂質とタン著な脂肪酸付着層の脱離は確認できなかった（高パク質であると考えられる。

温（120℃オートクレーブ中）下にアルカリ洗浄－１，1550cm－１

１）

モデル汚れ物質の洗浄実験

また，さらに長時間，ひき肉を加熱した場合，ではほぼすべて除去することができた）。本実験

黒色の固い析出物が生じた。それら黒色析出物

では脂質汚れが数百～二千Åの厚みで比較的に密は，食肉の加熱過程で極めて除去が困難となるもに沈着しており（Fig.２），室温条件ではアルカの と 考 え ら え る が ，現 時 点 で は ，ATR お よ び

リおよび加水分解酵素が汚れの付着層に十分浸透RAS-FTIRとも解析可能なIRスペクトルは得らできなかったものと考えられる。一方，H２O２-電

れなかった。今後，拡散反射法など他の分析手法

気分解洗浄を行った結果，いずれの脂肪酸も－を用いて解析を進める予定である。

0.4V vs. Ag/AgCl以下の電位で脱離が認められ，その脱離は三段階で進行することが分かった（Fig.２）。
まず，（ⅰ）洗浄開始とともに表面に多層的に吸着していた分子が脱離し，付着層の厚みが数千Åから100～200Åまで減少する。その後，（ⅱ）

Unheatedしばらく付着層厚みは一定の値を示す。（ⅲ）さAbsorbance（arbit. unit）

らにH２O２-電気分解処理を続けると，再び脱離が進行し，付着層厚みが０に漸近する。印加電位がHeated for 30 s

低いほど（ⅰ）および（ⅲ）段階目における脱離は速やかに進行し，（ⅱ）の停滞期間も短くなる傾向があった。また，パルミチン酸とステアリン

Heated for 180 s

酸の脱離過程を比較すると脂肪酸のアルキル鎖が長いステアリン酸からなるモデル汚れの方が，脱離が生じる印加電位が低くなり，いずれの段階の脱離速度も低下する傾向があることがわかった。

Heated for 600 s

脂肪酸付着層のH２O２-電気分解洗浄の各段階におけるIRスペクトルを高感度反射法により測
4000

3500

3000
2500 2000
Wavenumbers（cm-1）

1500

1000

Fig.1 IR spectra for stainless steel surfaces that had

been contacted with pig meat at 180℃ for different
periods. The result for the unheated surface（contact
period: 10min）is also shown. All IR spectra were
measured by using an attenuated total reflection（ATR）method.

定した。その結果（Fig.３），脱離の一段階目と二段階目では吸着している物質が異なっており，第二段階においては，Ｃ-Ｈ結合をほとんどもたない，つまり，アルキル鎖が極端に短いカルボン酸のような物質が主に残留していることが示唆された。なお，第三段階の終盤では，付着残留物は© The Ito Foundation

Adsorption layer thickness（Å）

124

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Stearic acid

Palmitic acid2500

-0.2 V vs Ag/AgCl

0 V vs Ag/AgCl

2000-0.2 V

1500-0.4 V-0.4 V

1000-0.6 V-0.6 V

500
0

0

600

1200

1800 0

600

1200

1800

Treatment period（s）
Fig.2 Courses of decrease in（a）amount of palmitic and（b）stearic acid adsorbed on stainless steel surface during

H２O２-electrolysis cleaning（H２O２ conc.: 11mM）

ほとんど検出することはできず，H２O２-電気分解
洗浄により脂肪酸の完全な除去が可能であることが分かった。
0.04 Abs

モデル汚れ（エステル）物質としてトリパルミ
チンを付着させたサンプルピースを調製し，アルカ リ（0.1M NaOH）お よ び 加 水 分 解 酵 素（１Absorbancemg/mL Lipase）を用いて洗浄を試みた。しかし，室温でのそれら洗浄処理では，脂肪酸汚れと同様，脱離は確認できなかった。また，H２O２-電気50 s

分解洗浄も行ったが，１時間の処理で約半分除去できる程度しか除去できなかった。トリパルミチ
400 s

ンの付着層は極めて緻密で撥水性も非常に高いと考えられる。H２O２-電気分解洗浄では，汚れの付着面（金属表面）に過酸化水素が浸透・到達する

1200 s
3500

3000

2500

2000

1500

1000

Wavenumber［cm-1］
Fig.3 IR spectra of stainless steel surface, on which

palmitic acid was adsorbed and then treated for
different period by H2O2-electrolysis cleaning at －0.4V vs Ag/AgCl. IR spectra were measured byreflection absorption（RA）method.

ことでOHラジカルが発生し，これが汚れ物質を
酸化分解・可溶化することが前提となる ２，３）。
従って，脂質エステルのような緻密な汚れの付着層にはH２O２-電気分解洗浄は効果を発揮しにくかったものと考えられる。いずれの洗浄方法を用いるにせよ，モデル脂質エステル汚れを除去する© The Ito Foundation

160
140
120
100
80
60
40
20
0
0.001

after 10-min
0.01
0.1
Trypsin concentration（mg/mL）

125

0.25

after 60-min

1

Removal rate constant（s-1）

Remaining amount ofprotein on sample plate（%）

金属表面洗浄時における食肉由来汚れの脱離特性に及ぼす外部電位印加の効果

0.2
0.15
0.1
0.05
0
-1

Fig.4 Remaining amount of protein (BSA) on stainlesssteel SUS 316L surface after enzymatic cleaning(trypsin) for 10-min (open keys) and 60-min as afunction of trypsin concentration. The increases in
the protein adsorbed amount after 60 min wereconsidered to be mainly due to the adsorption oftrypsin onto the stainless steel surface.

-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
Applied potential（V vs Ag/AgCl）

0

Fig.5 Removal rate constants for stainless steel SUS

316L at H2O2-electrolysis treatments as a function of
applied potentials Bovine serum albumin was used
as a model protein.

うえでは，いかに緻密な汚れ層を弛緩するかが鍵

また，モデルタンパク質が酸性タンパク質であであり，汚れの弛緩技術が次の研究のターゲットることから，サンプルピースに負電位（－0.2Vとなる。

vs Ag/AgCl）を印加し，同様に洗浄実験を行っ次にモデルタンパク質汚れの洗浄実験を行った。その結果，10分後にはすでに付着層の増加がた。室温のアルカリ洗浄では単分子層程度残留し見られた。現時点では，付着層を形成しているタた。高温下でのアルカリ洗浄では完全に除去する

ンパク質の種類が特定できていないが，付着タンことができた。続いて，trypsinを用いた酵素洗

パク質とtrypsinの付着交換が外部電場の印加に浄を行った。酵素濃度を１μg/mLから１mg/mL

より，むしろ促進されてしまった可能性が考えらまで変化させた（pH８，37℃）。タンパク質の付れる。現在，trypsin以外のプロテアーゼについ着量は高感度FTIR測定によりIRスペクトルを測て印加電位と付着量の関係を検討しており，プロ

定し，そのアミドⅠバンドの吸収強度から評価しテアーゼの添加濃度が高くても（洗浄速度は高た（Fig.４）。その結果，酵素濃度が１μg/mLでい）プロテアーゼの付着が生じないようなプロテはほとんど洗浄効果は認められなかったが，それアーゼをピックアップしていく予定である。

以上では付着タンパク質の脱離が認められた。10モデルタンパク質汚れに対してH２O２-電気分

μg/mLでは，付着タンパク質は１次反応的に減解洗浄が有効であることは，既に筆者らは論文等

少し，約30分で付着タンパク質はすべて除去するで報告している２，３）。本研究においても，モデルことができた。酵素濃度がさらに高くなると10分

タンパク質であるBSAのステンレス表面におけ以内にモデルタンパク質汚れの除去が完了する

る付着層にH２O２-電気分解洗浄を適用した（Fig.

が，その後，再びタンパク質吸着層の増加が見ら５）。その結果，過酸化水素濃度が10mMの場合，れた。酵素濃度の増加とともにタンパク質吸着量

印加電位が－0.2V vs Ag/AgClからタンパク質のの 再 増 加 が 顕 著 に な る こ と か ら ，酵 素 で あ る

脱離が認められ，－0.6V vs Ag/AgClではおよそ

trypsinの吸着が生じたものと考えられる。

２分でモデルBSA汚れを除去することができた。

© The Ito Foundation

126

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

これまでの検討の結果，多くのタンパク質は同条かった。一方，H２O２-電気分解洗浄は脂肪酸を効

件で，およそ半分の時間で付着タンパク質の除去

果的に除去でき，エステル汚れに対してもある程が完了したことから，今回取り上げたタンパク質度の洗浄効果を示した。タンパク質汚れに対しては比較的密なタンパク質付着層を形成する可能性

は，いずれの洗浄方法も有効であった。しかし，が考えられる。

室温のアルカリ洗浄では単分子層程度のタンパク４．要質が残留し，酵素洗浄では酵素（trypsin）濃度

約に最適域が存在することが示唆され，外部電場の豚肉を室温および180℃でステンレス表面に接印加により酵素自身の付着が促進された。H２O２-

触させ，付着する汚れ成分をフーリエ変換赤外分

電気分解洗浄では極めて速やかにモデルタンパク

光分析により分析した。その結果，食肉汚れの主

質汚れを除去することができた。

成分は脂質（エステル，脂肪酸）とタンパク質であった。そこで，脂質およびタンパク質から成る
モデル汚れ物質に帯する（ⅰ）アルカリ洗浄，（ⅱ）酵素洗浄，（ⅲ）H２O２-電気分解洗浄の洗浄効果を比較した。緻密に積層した脂質汚れに対しては室温でのアルカリ洗浄は効果が認められず，
酵素洗浄もエステル汚れに対して効果を示さな

文献１） 堀口博，赤外吸光図説総覧，三共出版，東京，
1977．
２） Imamura, K., Tada, Y., Tanaka, H., Sakiyama, T.,
Nakanishi, K. : J. Colloid Interface Sci. ，250 ，409 ～
414，2002．
３） Imamura, K., Sakiyama, T., Nakanishi, K. :Langmuir，18，8033～8039，2002．

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127

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立
Establishment of bovine and swine derived hepatocytes for the lipid
metabolism and infection study

福

田

智

一

（東北大学農学研究科）

Tomokazu Fukuda（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

The liver is the one of the most important organs to regulate the lipid metabolism, andenergy production in the livestock. Furthermore, liver is critical organ for the infectious
diseases, such as type E hepatitis virus. For the molecular studies of these metabolic andinfectious diseases, the in vitro experimental system is quite useful. However, as far as weknow, there is no report for functional hepatocyte derived cell lines of the livestock.
Furthermore, recent advance in cell biology showed that expression of three cell cycle
regulators（Cyclin dependent kinase 4（CDK4），Cyclin D, teromerase（TERT））allows us toestablish the immortalized cell lines, which nature is close to the original cell in human. Our
previous study showed that the expression of these human derived factors enable us toestablish the immortalized cells from various types of animals, such as bovine, swine, andmonkey. Therefore, these situation leaded us to build the hypothesis that the expression ofthese three cell cycle regulators might useful to establish the hepatocyte derived immortalized
cells as well as bovine and swine. We cultured the primary derived bovine cell with two
condition, DMEM（Dulbecco Modified Eagle Medium）based medium（Condition 1），and
DMEM/Ham F12 based medium containing the various types of growth factor（Condition 2）.
In the primary culture, the hepatocyte efficiently attached to the bottom of the cultured dish,and showed cell growth. To be noted, the cell culture under the condition 1 was difficult to do
the passage. However, the hepatocyte obtained under condition 2 overcame the enzymatic
digestion process in the passage, and stable cell passage more than five generations.
Furthermore, we prepared the recombinant lenti and retroviruses which express the Enhanced
Green Fluorescence Protein（EGFP），and introduced into the hepatocytes obtained undercondition 2. Several percentage of colonies showed the positive expression of EGFP. Although
we need to find the more optimized condition for the genetic introduction, these information
would be the basic data to obtain the immortalized bovine derived hepatocytes.

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128

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ノムに異常を生じている３）。ある意味，ゲノムに１．研究の目的および背景異常を生じているので無限分裂が可能になったと肝臓は動物の体内で最大の大きさを持つ臓器のもいえる。多くのヒト由来のがん化を介した細胞ひとつである。肝臓は飼料を吸収し，脂質代謝な株は既にがん化しているために元の肝臓細胞の性ど主要なエネルギーを産生する。すなわち，家畜質を失っており，家畜の脂質代謝や感染症の研究の成長は肝臓の機能に大きく影響される。肝臓にに用いる材料としては適しているとはいえない。

おける遺伝子発現が家畜の筋肉内における脂肪蓄

一方，近年驚くことに元の細胞の性質をできる

積に大きく影響している可能性があり，家畜の肝限りそのままにして無限分裂が可能となる新たな臓細胞の詳細な機能解析は重要である。

技術が発展してきた。本技術はShiomiらによって

加えて肝臓は感染症の標的臓器でもある。代表

ヒトの培養細胞において初めて報告された４）。

的なものにブタのＥ型肝炎ウィルスが存在する。

我々は本方法がウシ，ブタ，サルを含む幅広い動

Ｅ型肝炎ウィルスはシカやイノシシの肉を介して物種において同様に無限分裂を可能にすることを感染した事例が存在する 。家畜ブタおよびイノ

見出し報告した５）。

１）

シシのＥ型肝炎の陽性割合は我が国においても高そこで我々はウシ肝臓細胞に関して，まず特殊

く，食の安全に対する重要な研究課題になっていな培地を使用し初代培養を行った。その後に細胞るが，そのウィルス増殖機構の詳細は不明な点がの元の性質を保持したまま無限分裂を可能とする多い。特にＥ型肝炎に感染した場合は対症療法しため，遺伝子導入のための基礎条件を検討した。

か存在せず，有効な治療法が存在しない。このよ
うな食の安全に関わるウィルスの増殖のメカニズ

２．材料および方法

ムを研究するのは試験管内で効率よくウィルスが2.1

増殖する肝臓細胞が必要である。しかし現在まで

ホルスタイン種，雄牛５週齢を２頭使用した。

に家畜由来かつ効率よく無限分裂する肝臓由来の動物を用いた実験内容に関して，東北大学実験動細胞は知られていない。

物委員会に実験内容を申請した。申請内容が委員

肝臓組織の培養前処理

上述した肝臓細胞であるが，肝臓由来であれば会にて吟味された後に認可を受けた。動物に鎮静

どのようなものでも良いわけではない。培養細胞剤を注入し，自発運動を減少させた後に頚動脈かであるが，元の正常組織の状態を可能な限り反映

ら放血を行い安楽死させた。その後肝臓組織約したものでなくては意味がない。前述したように100ｇを得た。肝臓組織内の血管にカニューレを家畜やヒトも含めて，元の肝臓細胞由来の性質を挿入し，コラゲナーゼを含む酵素液にて灌流を保持した培養細胞の樹立は報告されていない。そ行った。十分な量の酵素液で組織内の血液を除去の理由は肝臓細胞が試験管内に取り出された途端した後に，肝臓組織を細切した。さらに滅菌ガーに分裂能力を失うこと，加えて正常細胞は染色体

ゼによって細切組織を濾過し，比較的大きな組織の末端にあるテロメア配列の短縮によって無限に片を除去した。その後に得られた組織浮遊液を分裂できないことが原因である 。HepG２を代250Ｇにて５分間遠心分離を行った。遠心分離の表とするヒト由来の肝臓がん細胞は複数樹立され後 に 浮 遊 液 を DMEM/F12 基 礎 培 地（DMEM/ている。しかしこれらのがん細胞由来の細胞株はF12＋10％Fetal Bovine Serum（FBS）＋抗生物

がん化する過程もしくは細胞を株化する過程でゲ質）にて懸濁した。この操作を２回繰り返し，細２）© The Ito Foundation

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立させたpCL－10ＡプラスミドおよびpCMV-VSV-

胞浮遊液とした。
2.2

129

G-RSV-RevとQCXIN-EGFPを293Ｔ細胞に導入

肝臓組織の培養２種類の条件にて細胞培養を行った。主な培地

した。リポフェクションによる導入後48時間目に条件は２種類である。Condition１は高グルコー

10μＭのフォルスコリンを含む培地に交換し，さス DMEM（4.5g/L）に 100U/mL penicillin ，100

らに48時間培養を継続した。その後細胞上清を回μ g/mL streptomycin ， 10 ％ FBS ， 10nM

収後，0.45ｍのフィルターにて濾過を行った。さInsulin，5000KIU/Lアプロチニンを加えた従来

らに30mlの濾過細胞上清ウィルス液に10mlのポから報告のある条件である 。Condition２は新たリエチレングリコール6000を主成分とするウィルに本研究にて開発した培地である。Condition２

ス濃縮溶液を加えた。４℃で一晩静置し沈殿を形で は 高 グ ル コ ー ス DMEM/F12 に 100U/mL

成させた後に3500rpmにて１時間遠心分離を行っpenicillin，100μg/mL streptomycin，10％FBS，た。得られた組み換えウィルスペレットを1.5ml

10nM Insulin，EGF（Epidermal Growth factor），のCondition１もしくはCondition２の培養液にて

HGF（Hepatocyte Growth Factor）を 添 加 し た

サスペンドし感染用ウィルス液とした。これらの培地を用いた。培養プラスチックディッシュには詳細な手法に関しては我々の過去の原著論文を参

コラーゲン処理を行い，細胞の張り付きを加速さ照していただきたい７）。

６）

れるように前処理を行った。培養開始後，24時間，72時間後と経過観察を行った。細胞が培養ディッ2 . 4 組み換えウィルスの感染および導入した
EGFP遺伝子の発現の検出

シュ底面に一杯に増殖した時点でコンフルエント得られた初代培養肝臓細胞を3.5㎝プラスチッと判断し，継代操作を行った。継代に際してはアクディッシュあたり１Ｘ10５細胞播種した。翌日，キュターゼによって単一細胞にまで分散を行った。

感染用ウィルス溶液を曝露し37℃に設定したCO２

2 . 3 組み換えレンチおよびレトロウィルスのインキュベーター内で24時間感染を行った。感染後48時間後にオリンパス社蛍光顕微鏡FSX100に作成
肝臓細胞へ遺伝子導入を行うための最適条件を探索した。具体的には組み換えレンチおよびレトロ ウ ィ ル ス を 作 成 し た 。 Enhanced GreenてEGFPの蛍光を検出した。
３．結果および考察

Fluorescence Protein（EGFP）は 細 胞 が 生 存 しCondition １ お よ び Condition ２ で 培 養 を 行 った条件のまま遺伝子導入効率を観察できる有用なた。図１に培養開始後72時間目の画像を示す。

５）

マーカー遺伝子である 。我々はこのEGFPを発Condition１においては大型の核を持ち，磨りガ現するレンチウィルス（CSII-CMV-EGFP）おラス状の細胞質を持つ肝臓細胞と考えられる細胞

よびレトロウィルス（QCXIN-EGFP）を使用しが出現した（図１白矢印）。この細胞は増殖を継た。組み換えウィルスの作成にはヒト胎児由来腎続した。しかしCondition１によって得られた細臓上皮細胞である293Ｔを用いた。レンチウィル

胞群はアキュターゼによって酵素処理を行い剥離スの場合，リポフェクションによってパッケージしたところ，細胞の接着が行われることはなく継ン グ プ ラ ス ミ ド で あ る HIV-gp お よ び pCMV-

代 が 不 可 能 で あ っ た 。こ の 現 象 は 細 胞 分 散 に

VSV-G-RSV-Rev と CSII-CMV-EGFP を 導 入 し

0.05％のトリプシンを用いても同様であった。

た。レトロウィルスの場合，VSV-G領域を欠損

Condition２で培養を行ったところ，大型の核© The Ito Foundation

130

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Day3 after the starting of the culture
Condition2

Condition1

図１ 培養開始後72時間後の肝臓由来細胞の形態
 左側がCondition１，右側がCondition２で培養を行ったもの。白矢印は磨りガラス状の細胞質を持つ細胞群，黒矢印

は上皮様コロニーを形成した細胞群を示す。

Day7 after the starting of the culture
Condition2

Condition1

図２ 培養開始後，１週間目に認められた細胞コロニーの形態© The Ito Foundation

131

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立

DIC

EGFP

Merge

図３ EGFPを発現する組み換えレトロウィルス感染後の位相差および蛍光観察像
 D
 IC：位相差における細胞像，EGFP：蛍光管撮像，Merge：DICおよびEGFPの像の重ね合わせ。

を持ち磨りガラス状の細胞質を持つCondition１

入のための検討を行った。EGFPを発現するレトで得られたものと同様の細胞が得られた。しかし

ロウィルスを感染させ48時間後に観察した像が図

驚くべきことに培養72時間目から，Condition１３である。興味深いことにレンチウィルスによるで得られたものとは明らかに異なる形態を示す細感染を行ったがまったく遺伝子導入は認められな胞群が出現した。この細胞群は島状のコロニーをかった。一方，VSV-Gを表面蛋白として発現す形成した。加えて出現した島状のコロニーはアるレトロウィルスの場合，数パーセントであるがキュターゼによる細胞分散後も接着し，細胞の継遺伝子導入を認めた。図３に示すように蛍光を発代が可能であった。

するコロニーの出現を認めた。さらに遺伝子導入

その後，培養開始後７日目のコロニー像を示すの効率を高めることが必要であるが，本研究はウ（図２）。Condition１では既に細胞が継代不可能シ由来初代肝臓細胞に遺伝子導入を行った初めてな状況に達しているので結果を割愛する。一方，の試みである。

Condition２では島状に細胞がさかんに増殖し，従来まで行われていたウシ由来の初代肝臓細胞

上皮様の細胞から構成されるコロニーを形成しての培養は，いわば一回実験に使用すれば再使用がいた。

不可能な不安定なものであった。実験に用いる肝さらに驚くべきことにそれらのコロニーを構成

臓細胞は毎回動物を屠殺し，組織を灌流する必要する細胞の形態を観察すると，発生初期の肝臓にがあった。このような条件では実験操作における認められる二核細胞が認められた（図３）。また大きな誤差が含まれ，実験の再現性を得ることはコロニーの内部には脂肪滴の貯留も観察された。

難しい。加えて実験の回数分動物を屠殺する必要

これらの細胞集団は形態学的にある程度肝臓の細があり動物愛護上，研究のコスト削減上でも安定胞の機能を保持していると考えられた。

的に細胞継代できる肝臓細胞の初代培養技術が求

さらに無限分裂細胞を樹立するため，遺伝子導められている。本研究で得られた肝臓細胞は従来© The Ito Foundation

132

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）のものと細胞形態が異なり，島状に増殖する細胞るために最も重要な回転力を生む分子群であるの集団を構成した。肝臓には組織学的に様々な細胞で，ｐ16の蓄積は細胞周期の停止を誘導する。しが含まれることが知られている。肝臓を構成する

かしこのｐ16とCDK４の結合にはCDK４の24番

肝実質細胞や類洞上皮細胞，胆管上皮細胞，オ

目のアミノ酸が重要なはたらきをしており，変異

バール細胞，クッパー細胞などである。本研究に型CDK４は老化タンパク質であるｐ16の結合において得られた細胞が組織内のどの細胞に由来すよる抑制を受けない８）。したがって変異型CDK４

るか同定するためには今後の解析を待たなければ

およびCyclin Dを発現させた場合，細胞増殖が著ならない。しかし細胞の形態から，肝臓細胞に特名に加速されることになる。

徴的な二核細胞の出現や脂肪滴の貯留が認められ我々は従来の研究において，ヒト由来変異型

た。二核細胞は若齢の個体においてよく認められ

CDK４およびCyclin Dの発現によってウシおよる状態であり，加えて肝臓細胞は脂肪滴を貯留しびブタ由来の細胞であっても無限に分裂が可能にエネルギー代謝の中心臓器としての役割を果たすなることを見出した。この基本原理は肝臓細胞にことが知られている。このことから我々が本研究おいても同様であり，本手法の適用によって家畜で樹立した細胞は肝実質由来細胞である可能性が由来の肝臓細胞の無限分裂が可能になると考えら

存在する。

れる。

加えて我々はEGFPを発現する組み換えウィルスを使用し，遺伝子導入のための条件の最適化を４．要約行った。レンチウィルスとレトロウィルスを使用

肝臓は様々な脂肪代謝，エネルギー代謝を司る

したが，レンチウィルスにおいては遺伝子導入を重要な臓器である。加えて肝臓は家畜においてＥ認めなかった。一般にレンチウィルスは細胞の分型肝炎を代表とする感染症の標的臓器でもある。

裂，非分裂状態に関わらず遺伝子導入が可能であ

これらの肝臓の重要な機能を詳細に研究するためるが，レトロウィルスは核膜を通過する能力がなには試験管内での培養細胞の樹立が有用である

いために分裂細胞にしか導入できないとされていが，従来までにウシ，ブタ由来の安定的に維持でる。本研究における結果はいわばまったく逆の状

きる肝臓由来細胞の樹立の報告はない。

態となった。今回使用したレトロおよびレンチ

我々は異なる２種類の条件でウシ由来肝臓細胞

ウィルスは表面蛋白として共通のVSV-G遺伝子の 培 養 を 試 み た 。従 来 か ら 報 告 の あ っ たを使用している。肝臓由来の細胞においては組み

Condition１および新たに我々が行ったCondition

換えウィルスによる導入の効率が大きく異なる可２である。Condition１では従来の報告と同様に能性がある。

肝実質由来と考えられる細胞の増殖を認めたが，我々は今後，ウシ由来の肝臓細胞を無限分裂に

酵素処理による細胞分散および継代は不可能で導くために，変異型CDK4, Cyclin D, TERTを導あった。一方，Condition２では島状に増殖する入する予定である。細胞は老化するに従い，ｐ16

特殊な細胞形態を示す細胞群が出現した。この島と呼ばれる加齢性タンパク質が蓄積する。このタ状に増殖する細胞群は二核や脂肪滴の蓄積を認

ンパク質はCDK４タンパク質に結合し，CDK4-

め，肝臓細胞としての性質を一部保持していると

CyclinD 複 合 体 の 活 性 化 を 阻 害 す る 。CDK4-考えられた。さらにこれらの細胞を無限分裂細胞

CyclinD複合体は細胞周期においてG1-Sに突入すへ誘導するためにEnhanced Green Fluorescence© The Ito Foundation

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細胞の樹立

Protein（EGFP）を発現する組み換えレトロウィ
ルスを導入した。今後導入効率の改善が必要であるが，EGFP蛍光タンパク質を発現するコロニーの出現を認めた。今後変異型CDK4, Cyclin D遺伝子を導入する予定である。
文献１） Nishizawa, T., Takahashi, M., Endo, K., Fujiwara,
S., Sakuma, N., Kawazuma, F., Sakamoto, H., Sato, Y.,
Bando, M., Okamoto, H. : Analysis of the full-length
genome of hepatitis E virus isolates obtained fromwild boars in Japan, J Gen Virol, 86，3321～3326，
2005．
２） Hayflick, L., Moorhead, P. S. : The serial cultivationof human diploid cell strains, Exp Cell Res, 25, 585 ～
621，1961．
３） Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. : Human
hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major
plasma proteins and hepatitis B surface antigen,
Science, 209，497～499，1980．
４） Shiomi, K., Kiyono, T., Okamura, K., Uezumi, M.,
Goto, Y., Yasumoto, S., Shimizu, S., Hashimoto, N. :133

CDK4 and cyclin D1 allow human myogenic cells torecapture growth property without compromisingdifferentiation potential, Gene Ther, 18，857～866，
2011．
５） Donai, K., Kiyono, T., Eitsuka, T., Guo, Y., Kuroda,
K., Sone, H., Isogai, E., Fukuda, T. : Bovine andporcine fibroblasts can be immortalized with intact
karyotype by the expression of mutant cyclin
dependent kinase 4, cyclin D, and telomerase.
Journal of biotechnology, 176，50～57，2014．
６） Katoh, N., Miyamoto, T. : Protein kinase C and its
endogenous substrate proteins in isolated cow liver
parenchymal cells, J Vet Med Sci, 55, 481 ～ 483,
1993．
７） Donai, K., Kuroda, K., Guo, Y., So, K. H., Sone, H.,
Kobayashi, M., Nishimori, K., Fukuda, T. :Establishment of a reporter system to monitor
silencing status in induced pluripotent stem celllines, Analytical biochemistry, 443，104～112，2013．
８） Kuroda, K., Kiyono, T., Eitsuka, T., Isogai, H.,
Takahashi, K., Donai, K., Isogai, E., Fukuda, T. :Establishment of cell lines derived from the genus
macaca through controlled expression of cell cycle
regulators, Journal of cellular biochemistry, 116, 205～211，2015．

© The Ito Foundation

134

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発
Effects of functional components in grass on enhancing immunoglobulin incolostrum

久

米

新

一・王

蒙

東・谷

口

紗

耶

（京都大学大学院農学研究科）

Shinichi Kume, Mengdong Wang and Saya Taniguchi（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

Passive immunity is critical to the survival and health of neonates, and colostrum is asource of nutrients and immune components for neonatal calves. An adequate immune system
is required to prevent diarrhea in neonates, and colostral IgG and IgA of cows provide
protection against microbial antigens. Data from 19 Japanese Black multiparous cows werecollected to clarify the relationships among IgG, IgA，β-carotene, vitamin A and α-tocopherol contents in colostrum of cows in order to evaluate the role of fat-soluble vitamins
on colostral IgG and IgA production. Mean colostral IgG was 141mg/mL, ranging from 65 to
208mg/mL, whereas mean colostral IgA was 8.7mg/mL, ranging from 1.0 to 34.6mg/mL.
Colostral IgG increased with aging in multiparous cows. There were positive correlations
between colostral IgG and colostral vitamin A or colostral α-tocopherol in cows, and thehigher adjusted R2 was obtained in the prediction model of colostral IgG from age and colostralvitamin A. Colostral vitamin A was positively correlated with colostral β-carotene or colostral
α-tocopherol in cows, but there were no relationships between colostral IgA and colostral IgG
or colostral fat-soluble vitamins. These results indicate that fat-soluble vitamin contents incolostrum of cows may be changed in similar patterns and high colostral vitamin A is relatedwith high colostral IgG. Also, supplemental α -tocopherol may be useful to increase the IgA
antibody-secreting cells in the jejunum in lactating mice.

１．目

近畿産ブランド和牛のほ乳期発育改善」を実施

的し，黒毛和種子牛の発育改善と疾病予防に適した

わが国の肉用牛経営では規模拡大や生産性向上

新たな人工ほ乳技術を開発した。しかし，黒毛和が急速に進んでいるものの，下痢などによる子牛

種子牛には初乳由来の免疫グロブリンＧ（IgG）の損耗増加は黒毛和種繁殖経営に多大な経済的損と免疫グロブリンＡ（IgA）が不足して，下痢の失をもたらしている。代表研究者らは，農林水産

発生するケースが多数認められたため，母乳から省の実用技術開発事業で「ホエー代用乳を用いたの免疫成分の移行を高める方法を開発して，下痢© The Ito Foundation

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

135などの疾病を予防することが重要と考えられた。

テン，ビタミンＡおよびビタミンＥ含量を調べ，飼料中には栄養素だけでなく，家畜の生理機能

黒毛和種繁殖牛の初乳中免疫グロブリンの改善のや免疫機能を高める機能性成分が含まれているたための基礎データを得る。また，牧草中に豊富にめ，子牛の下痢予防では飼料中の機能性成分を活含まれているビタミンＥを妊娠・泌乳マウスに給用することが効果的である。特に，安全・安心な

与し，母乳中のIgA産生の作用機序を解明する。

牛肉生産では抗生物質などの使用量低減が求められるが，機能性成分を活用した下痢などの疾病予防方法の開発は抗生物質の使用量低減を可能にする。また，草食動物である牛は牧草中に豊富に含２．方法

2 . 1 黒毛和種繁殖牛の初乳中免疫グロブリンと脂溶性ビタミンの関係まれているβ-カロテンやビタミンＥなどを有効試験には，京都大学附属牧場で分娩した黒毛和利用して健康を維持しているが，筆者らはβ-カ

種経産牛19頭を用いた。分娩前の牛には日本飼養

ロテンによる新生子牛の下痢予防効果を見いだし

標準の繁殖牛のTDN要求量を満たすように，フた 。しかし，黒毛和種繁殖牛に良質の牧草が給スマ２kg／日とイタリアンライグラスサイレー

与されない場合には初乳中のβ-カロテンなどがジ，スーダングラスサイレージなどを給与し，分不足して，子牛の下痢発生率を高めることが危惧

娩直後に初乳を約100ml採取した。初乳中のIgG,された 。

IgAおよびIgM含量をELISA法で，β-カロテン，

１）２）

そこで，平成25年度には牧草主体に飼養した黒ビタミンＡおよびビタミンＥ含量を高速液体クロ

毛和種繁殖牛９頭から初乳を採取し，初乳中IgG,

マトグラフ法で測定し，初乳中の機能性成分（βIgA，β-カロテン，ビタミンＡおよびビタミン-カロテン，ビタミンＡとビタミンＥ）と免疫グＥ含量を調べたところ，初乳中脂溶性ビタミン含

ロブリン（IgGとIgA）の相関関係などをSASで量間に正の相関が認められただけでなく，初乳中解析した。さらに，黒毛和種繁殖牛の分娩前の体ビタミンＡとIgG間にも正の相関が認められたた

重と健康状態，その子牛の分娩時の体重と事故・め，繁殖牛のビタミン栄養の改善が初乳中IgG含疾病などの発生状況を調査した。

量の増加に効果的なことが示唆された。また，みかんに豊富に含まれているβ-クリプトキサンチ

2 . 2 泌乳マウスの免疫グロブリン産生におけるビタミンＥの影響

ンを泌乳マウスに給与したところ，空腸のIgA産

ICR系妊娠マウス15匹を対照区およびα-トコ

生細胞数と乳腺，空腸および回腸のIgAのmRNA

フェロール区に割り当て，交配後6.5日目から分発現量が増加したことから，β-クリプトキサン

娩後14日目までα-トコフェロールを飼料に添加

チンにはβ-カロテンと類似した腸管免疫改善効（120ppm）して給与した。仔マウスは，分娩２日果が認められた。しかし，黒毛和種繁殖牛の初乳後に雌雄各５匹ずつに間引きした。妊娠マウスとサンプルを増やして精度を高めることと，飼料由

新生仔マウスの体重と飼料摂取量は毎日測定し，来の機能性成分の給与による初乳中免疫グロブリ

分娩14日後に泌乳マウスからは血液，空腸，回腸ンの改善方法の開発が課題として残された。

および乳腺を，また新生仔マウスからは血液，胃以上のことを踏まえて，本研究では平成25年度

内容物，小腸および糞を採取した。血清，胃内容と同様に黒毛和種繁殖牛の初乳を採取し，初乳中

物，小腸，糞などのIgA濃度はELISA法で，小腸のIgG，IgA，免疫グロブリンＭ（IgM），β-カロと乳腺のIgA産生細胞数の計測は免疫染色法で，© The Ito Foundation

136

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

小腸と乳腺のIgA産生に関連する遺伝子の発現

中 の 平 均 IgA 含 量（範 囲）は 8.7mg/mL（1.0 ～（IgA C-region）はRT-PCR法で調べた。

34.6mg/mL）とともに変動が大きかったが，初乳中のIgG含量とIgA含量間には相関関係は認め

３．結果と考察られなかった（Table１）。初乳中IgG含量は加齢

3 . 1 黒毛和種繁殖牛の初乳中免疫グロブリンに伴って増加し（Ｐ＜0.01），初乳中のIgG含量は
初乳中ビタミンＡ含量（Ｐ＜0.01）および初乳中と脂溶性ビタミンの関係

３）

黒毛和種繁殖牛の初乳中の平均IgG含量（範α-トコフェロール含量（Ｐ＜0.05）と正の相関

囲）は141mg/mL（65～208mg/mL），また初乳が認められた（Fig.１）。初乳中ビタミンＡ含量

Table 1 Correlation between IgG, IgA and fat-soluble vitamins in colostrum of Japanese Black multiparous cows（n＝19）
．
Mean

SD

Min.

Max.

ｒ
IgG

IgA

Age, months

72.7

23.5

34.0

118.3

0.68＊＊

0.25

Gestation length, days

287.7

4.6

277.0

296.0

0.32

0.37

125.7

56.0

40.0

221.0

0.35

―0.07
―0.01

Colostrum
β-carotene，μg/dL
Vitamin A，μg/dL

490.5

259.4

69.0

1096.00.66＊＊

α-tocopherol，μg/dL

963.2

554.3

117.0

2606.0

0.53＊

0.17

IgA, mg/mL

8.7

9.7

1.0

34.6

0.32

―

IgG, mg/mL

140.9

32.2

65.0

208.0

―

―

＊＊Ｐ＜0.01，＊Ｐ＜0.05．

250
IgG（mg/mL）

IgA（mg/mL）

40
30
20
10
0

0

50

150
100

0

100 150 200 250
IgG（mg/mL）

R²= 0.43, P<0.01

24

250

200

IgG（mg/mL）

IgG（mg/mL）

200

50

250

150
100
50
0

R²= 0.46, P<0.01

48
72
96
Age（months）

120

R²= 0.28, P<0.05

200
150
100
50

0

400

800

1200

0

0

Vitamin A（μg/dL）

1000

2000

3000

α-tocopherol（μg/dL）

Fig. 1 Relationships between colostral IgG and colostral IgA, vitamin A，α-tocopherol or age in Japanese Black

multiparous cows（n＝19）．

© The Ito Foundation

R²= 0.48, P<0.001

1200

α-tocopherol（μg/dL）

Vitamin A（μg/dL）

牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

800
400
0

0

50

100 150 200 250

3000

R²= 0.40, P<0.01

2000
1000
0

0

1000

0

100

150

200 25040

R²= 0.62, P<0.001

2000

0

50

β-carotene（μg/dL）

IgA（mg/mL）

α-tocopherol（μg/dL）

β-carotene（μg/dL）
3000

137

400
800
1200
Vitamin A（μg/dL）

30
20
10
0

0

400
800
1200
Vitamin A（μg/dL）

Fig. 2 Relationships between colostral β-carotene and colostral vitamin A or α-tocopherol and relationships between

colostral vitamin A and colostral α-tocopherol or IgA in Japanese Black multiparous cows（n＝19）．

は初乳中β-カロテン含量（ｒ＝0.69；Ｐ＜0.001）

一方，黒毛和種経産牛の初乳中IgM含量（範お よ び 初 乳 中 α - ト コ フ ェ ロ ー ル 含 量（ｒ ＝囲）は 9.7mg/mL（1.2 ～ 22.2mg/mL）で あ り ，

0.78；Ｐ＜0.001）と正の相関が認められたが，初IgA含量と同様に変動が大きかった。牛の初乳中

乳中のIgA含量と脂溶性ビタミン含量間には相関に豊富に含まれている免疫成分はIgGであり，新関係は認められなかった（Fig.２）。また，初乳

生子牛の血清IgG濃度が10mg/mL以下になると中のIgG含量は年齢と初乳中ビタミンＡ含量を変

子牛の致死率が上昇する。また，初乳中のIgAは数にした重回帰式から精度良く推定できた。

腸管内腔の抗原の捕捉や腸管壁からの抗原の侵入以上の結果から，黒毛和種経産牛の初乳中の脂防止など，子牛の腸管免疫の主要な機能を担って溶性ビタミン含量は給与粗飼料によって大きく変いる。しかし，初乳中のIgMの役割についてはほ動したが，黒毛和種経産牛の初乳中脂溶性ビタミ

とんど調べられていないため，今後は黒毛和種繁

ン含量間に正の高い相関が認められたことから，殖牛の初乳中IgG，IgAおよびIgMの関係を調べ

牧草サイレージ主体で飼養した黒毛和種経産牛でることが必要である。

は初乳中脂溶性ビタミン含量が同様なパターンで変動することが推察された。また，初乳中ビタミ

3 . 2 免 疫 グ ロ ブ リ ン 産 生 に お け る α - ト コ
フェロールの作用機序の解明

ンＡ含量とα-トコフェロール含量が高いと初乳泌乳マウスの増体率および飼料摂取量と新生仔中のIgG含量も高くなったことから，高品質サイ

マウスの増体率にはα-トコフェロール給与によ

レージ給与は初乳中IgG含量の増加に貢献するこる影響は認められなかった。α-トコフェロールとが示唆された。

給与で泌乳マウスの空腸におけるIgA産生細胞数© The Ito Foundation

138

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）が増加した（Ｐ＜0.05）が，泌乳マウスの乳腺とトコフェロール含量と正の相関が認められ，初乳

回腸におけるIgA産生細胞数には影響しなかっ

中のIgG含量は年齢と初乳中ビタミンＡ含量を変た。泌乳マウスの血清IgA濃度と新生仔マウスの数にした重回帰式から精度良く推定できた。初乳血清，胃内容物，小腸および糞中のIgA濃度なら中ビタミンＡ含量は初乳中β-カロテン含量およびに泌乳マウスの空腸，回腸および乳腺におけるびα-トコフェロール含量と正の相関が認められ

IgA mRNA発現量には，α-トコフェロール給与

たが，初乳中のIgA含量は初乳中のIgG含量あるによる影響は認められなかった。

いは脂溶性ビタミン含量と相関関係が認められな以上の結果から，α-トコフェロールを120ppm

かった。以上の結果から，黒毛和種経産牛の初乳給与すると泌乳マウスの空腸におけるIgA産生細中脂溶性ビタミン含量は同様なパターンで変動

胞数が増加したことから，α-トコフェロールにし，初乳中ビタミンＡ含量が高いと初乳中のIgG

は腸管免疫改善効果のあることが推察された。黒含量も高くなることが推察された。また，α-ト

毛和種経産牛でも初乳中のIgG含量と初乳中α-

コフェロールを120ppm給与すると泌乳マウスのトコフェロール含量間に正の相関が認められたこ

空腸におけるIgA産生細胞数が増加したことかとから，α-トコフェロール給与は子牛の下痢予ら，α-トコフェロールには腸管免疫改善効果の防に効果的なことが示唆される。

あることが推察された。

４．要約

初乳中の免疫グロブリン産生に及ぼす脂溶性ビ
タミンの役割を明らかにするために，黒毛和種経
産牛19頭の初乳中IgG，IgA，β-カロテン，ビタ
ミンＡとα-トコフェロールの関係を調べた。初
乳中のIgG含量とIgA含量は変動が大きかったが，初乳中のIgG含量は加齢に伴って増加した。初乳中のIgG含量は初乳中ビタミンＡ含量およびα-文献１） Kume, S., Toharmat, T. : Livestock Production
Science, 68，61～65，2001．
２） Nishiyama, Y., Yasumatsuya, K., Kasai, K.,
Sakase, M., Nishino, O., Akaike, M., Nagase, T.,
Sugimoto, M., Ikeda, S., Kume, S. : Livestock Science,
137，95～100，2011．
３） Wang, M., Ikeda, S., Yoshioka, H., Nagase, H.,
Kitamura, S., Itoyama, E., Murakami, H., Sugimoto,M., Kume, S. : Animal Science Journal, 86, 673 ～ 678,
2015.

© The Ito Foundation

139

スカトールによる胆汁酸代謝の撹乱：
ヒト・家畜の健康維持を目指したその制御
Dysregulation of bile acid metabolism by skatole : Control of the regulation
towards health promotion in both humans and livestock

石

塚

敏・清

水

英

寿

（北海道大学大学院農学研究院）

Satoshi Ishizuka and Hidehisa Shimizu（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

Excess intake of animal proteins is involved in a variety of disease pathogenesis. However,
the mechanisms responsible for the pathogenesis remain to be elucidated. We investigated therelationship between skatole, an enterobacterium-derived dietary protein metabolite, and bile
acid metabolism. Male SD rats were fed a diet supplemented with or without skatole for 4
weeks. The dietary intervention did not affect the food intake, body weight, and some organ
weights including liver, kidney, and adipose tissues. The ingestion of skatole elevated total andsecondary bile acid concentrations in the feces, especially deoxycholic acid-related bile acids.
There is a trend to increase the amount of cholic acid and the taurine-conjugates in the portal
vein of the skatole-fed rats. There was a promotion of Cyp7a1 expression, the rate-limiting
enzyme of bile acid synthesis, in the liver of the skatole-fed rats. An increase of skatole
concentration by excess consumption of animal proteins is considered to be a responsible factor
for propagation of secondary bile acid concentrations in the gastrointestinal tract, which might
be involved in subsequent liver and colorectal carcinogenesis.

１．目

コール酸から，腸内細菌により生成される二次胆的汁酸であるデオキシコール酸（DCA）が，肝癌

近年，高脂肪食摂取による生活習慣病患者の増の発症に関与する１）。胆汁酸には多様な分子種が加が問題となっており，多様な病態を併発するメあり，動物種により代謝経路が異なる。そこで，

タボリックシンドロームが注目されている。高脂胆汁酸代謝の全貌を理解するために，各臓器等か肪食摂取では糞中の胆汁酸量の増加が見られ，肥らの抽出法と，抱合体を含む約30種類の分子種を

満では腸内細菌叢の撹乱が報告されている。胆汁

一斉分析する方法を確立した２）。生体内の様々な酸は，脂質の吸収に必須な胆汁成分であり，脂質部位の胆汁酸を網羅的に解析することで，特定のの過剰摂取や加齢により胆汁酸の分泌量が増大す

飼料を摂取した場合での胆汁酸代謝の評価を可能

ることが知られている。主要な一次胆汁酸であるにした。さらに我々は，胆汁酸が腸内細菌叢の調© The Ito Foundation

140

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

節因子であることを見いだした３）。

備飼育後，基本飼料を摂取させた対照群（ｎ＝一方，高タンパク質食を摂取することにより，

８），0.025％および0.05％スカトールを含む飼料

タンパク質由来のトリプトファン代謝物の産生がを摂取させた試験群（それぞれｎ＝７，ｎ＝８）増加することが知られている。タンパク質由来のとして４週間の試験期間を設定し，飼料は自由摂腸内細菌トリプトファン代謝物には，インドール取とした。試験期間終了時に採糞を行い，糞中胆系の化合物であるスカトール（３-メチルイン

汁酸組成をLC/MSで分析した。また，解剖時にドール）が含まれる。スカトールは，糞便臭や豚肝臓を採取してリアルタイムPCRを用いて胆汁酸

肉の臭みの原因として知られる物質であることが生合成関連因子の遺伝子発現解析を実施した。

以前から知られている。近年，スカトールが，胆実験２

汁 酸 合 成 抑 制 に 関 わ る farnesoid X receptor

試験群を対照群（ｎ＝10）および0.025％スカ（FXR）の活性を抑制するのみならず逆向きに亢

トール添加食群（ｎ＝11）とする以外は実験１と進するインバースアゴニストであることが報告さ同様な実験条件として飼育を行い，試験期間終了

れた 。また，男性ホルモンであるアンドロステ

時での糞，門脈血，肝臓および消化管内容物を採ロンが，肝臓におけるスカトール代謝を抑制する

取して胆汁酸組成を分析した。

４）

ことが知られており５），これが豚肉の臭みの原因となりうることが示されている。
これらの状況を踏まえると，スカトールが体内３．結果と考察
実験１で増加する状況では，胆汁酸合成の超過による

摂食量，体重，肝重量，腎重量，各種脂肪重量

FXRを介したネガティブフィードバックによるに群間差は見られなかった。スカトール添加食群抑制がかからず，胆汁酸分泌が増大し続ける可能

ではいずれも糞中総胆汁酸および二次胆汁酸の濃性が考えられる。一次胆汁酸分泌量の増加は，結度が有意に増加した（Fig.１）。中でもDCAとそ

果的にコレステロール排泄を増大すると期待されの 類 縁 体 で あ る 12- オ キ ソ リ ト コ ー ル 酸る。しかしながら，過剰な胆汁酸が消化管腔内に（12oLCA）および３-オキソ-12α-５βコラン酸分泌されると，管腔内における腸内細菌の作用に（３ｏ12α）が有意に増加していた。ラットにおより二次胆汁酸であるDCAを増やすことになり，ける一次胆汁酸としてはコール酸と，ケノデオキ

消化管粘膜のバリア機能の脆弱化，肝障害・肝癌

シコール酸から合成される複数のミュリコール酸のリスクなどを増大させることになる。

分子種が知られている。スカトールの摂取ではこ

そこで本研究では，食品タンパク質由来トリプ

れらのミュリコール酸分子種の濃度に有意な群間トファンの消化管内代謝産物であるスカトールに差が観察されなかったことから，スカトールによ着目し，腸内で増加したスカトールが胆汁酸代謝

る胆汁酸分泌量の増大は主にコール酸の分泌増加に及ぼす作用を解析した。

によるものと考えられた。肝臓における胆汁酸生

２．方

合成関連因子の発現解析を行ったところ，12α胆法

汁酸の合成に関わるCyp8b1発現に有意差は見られなかったものの，胆汁酸合成の律速酵素である

実験１
Sprague-Dawley 系 ラ ッ ト（５ 週 齢 雄 性）に

Cyp7a1の発現が0.025％スカトール群で有意に増AIN-93Ｇに準拠した基本飼料を与え５日間の予加した（Fig.２）。このことから，スカトール摂© The Ito Foundationスカトールによる胆汁酸代謝の撹乱：ヒト・家畜の健康維持を目指したその制御
Total BAs
10μmol/g wet feces

る傾向が見られた。また糞では，前述のDCA関

4

連胆汁酸濃度が有意に増加した。

2

スカトールは，食品タンパク質中のトリプト

0tCont 0.025% 0.050%

＊

3
2
1

3

0.

0.

C

＊

μmol/g wet fecesμmol/g wet feces

DCA-related BAs
4

ファンに由来することから，高タンパク質食の摂0%2

脈血でも，スカトール群で総胆汁酸濃度が増加す

6

05

4

8

また，胆汁酸が多量に吸収されると考えられる門

＊

5%

6

＊

on

μmol/g wet feces

＊

8

0

で総胆汁酸量が増加する傾向を示した（Fig.３）。

Secondary BAs

02

＊

10

取により体内で増えうる。一方で，スカトールは＊

食肉の臭みの原因とされていることから，状況次
第では食肉に含まれるスカトールを直接人間が摂2取する可能性が考えられる。このような，体内で

1

＊

＊＊

0

0
Cont 0.025% 0.050%

DCA 12oLCA 3o12α

Fig.1 F e c a l b i l e a c i d s i n t h e r a t s f e d s k a t o l e -supplemented diet. The values are means ± SEM, n＝ ７ or 8. Asterisks show significant difference fromcontrol.

Cyp7a1のスカトール濃度の増加が，結果としてコール酸
やDCAに代表される12α胆汁酸の体内での増加に関わることが示された。このことは，食肉由来の成分が人の代謝性疾患に大きく関与することを示すだけでなく，家畜の代謝を健全に保つことが人の健康維持にも繋がることを示している。
４．要

Cyp8b1

約3

動物性タンパク質の過剰摂取は，多様な生活習
2
1

0

0

C

on
t
0.
02
5%
0.
05
0%

1

慣病の発症に関わることが知られている。しかし，この病態発症に関わるメカニズムは未だに不明な点が多い。我々は，動物性タンパク質の過剰摂取によって腸内細菌により産生されるスカトー
0.
05
0%

＊

2

C
on
t
0.
02
5%

3

141

Fig.2 Liver cyp7a1 and cyp8b1 expressions in the rats

fed skatole-supplemented diet. The values aremeans ± SEM, n ＝ ７ or 8. Asterisks show significant
difference from control.

ルが胆汁酸に及ぼす影響について検証した。
Sprague-Dawley系雄性ラットを，対照群とスカ
トール摂取群に分け，４週間の試験飼育後に解剖を行った。スカトール摂取は，摂食量，体重，肝重量，腎重量，各種脂肪重量に影響しなかった。
糞中胆汁酸量をLC/MSで測定をしたところ，糞取による糞中胆汁酸濃度の増加は，肝臓における中の二次胆汁酸量が増加した。特に，二次胆汁酸

胆汁酸合成の増加によるものと推察された。

の一種であるデオキシコール酸とその関連胆汁酸

実験２

分子種の濃度が著明に上昇した。また門脈血でスカトールの添加濃度を0.025％として，ラッは，コール酸と肝臓におけるコール酸の抱合体でト体内の胆汁酸代謝を網羅的に解析した。その結あるタウロコール酸の増加傾向が観察された。肝果，消化管内ではスカトール摂取群の回腸内容物

臓で発現している胆汁酸合成の律速酵素である© The Ito Foundation

平成26年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）
BAs in portal vein

Total BAs
120

2.5

35

100

μmol/g wet feces

30

80

25
μM

60

20
15

40

10

20
0

C
A
TC
D
C
A
TL
C
A

A

Tβ
M

A

C

Tα
M

A

TC

A
C

C
D

A
C

β
M

A
C

es
fe
c

m

lo
n
co

m

cu

ce

ile
u

um

r

un

liv
e

1.5
1

0

0

je
j

＊

2

0.5

5

α
M

μmol/g contents

DCA-related BAs

40

C
on
Sk t
at
ol
e

142

BAs in ileal contents

μmol/g contents

25

＊

20
15
10

＊

5
＊

C
α A
M
C
β A
M
C
ω A
M
C
A
H
D
C
A
U
D
C
A
C
D
C
A
D
C
A
LC
A
H
C
A
U
C
7o A
D
C
7o A
LC
12 A
oL
C
3o A
12
α
TC
Tα A
M
C
Tβ A
M
C
Tω A
M
C
TH A
D
C
TC A
D
C
A
TD
C
A
TL
C
A
G
C
A

0

Fig.3 Bile acids in the liver, gastrointestinal contents, and feces in the rats fed skatole-supplemented diet. The values

are means±SEM, n＝７or 8. Asterisks show significant difference from control.

Cyp7a1の発現量を確認したところ，スカトール
摂取群において上昇が観察された。動物性タンパ
ク質の過剰摂取がもたらすスカトールの増加は，消化管内での二次胆汁酸の濃度上昇を招き，結果として肝臓や大腸での発がんに関与する可能性が
示された。
文
献
１） Yoshimoto, S., Loo, T. M., Atarashi, K., Kanda, H.,
Sato, S., Oyadomari, S., Iwakura, Y., Oshima, K.,
Morita, H., Hattori, M., Honda, K., Ishikawa, Y., Hara,
E., Ohtani, N. : Nature，499，97～101，2013．
２） Hagio, M., Matsumoto, M., Fukushima, M., Hara,

H., Ishizuka, S. : Improved analysis ofbile acids intissues and intestinal contents of rats using LC/ESIMS, J Lipid Res，50，173～80，2009．
３） Islam, K. B., Fukiya, S., Hagio, M., Fujii, N.,
Ishizuka, S., Ooka, T., Ogura, Y., Hayashi, T., Yokota,
A. : Bile acid is a host factor that regulates thecomposition of the cecal microbiota in rats.
Gastroenterology，141，1773～81，2011．
４） Gray, M. A., Pollock, C. B., Schook, L. B., Squires, E.
J. : Characterization of porcine pregnane X receptor,
farnesoid X receptor and their splice variants, Exp
Biol Med (Maywood），235，718～36，2010．
５） Gray, M. A., Squires, E. J. : Effects of nuclear
receptor transactivation on boar taint metabolism
and gene expression in porcine hepatocytes, J
Steroid Biochem Mol Biol，133，110～９，2013．

© The Ito Foundation

143

肉牛用発酵TMRの飼料特性の評価
Estimation of feed characteristics of fermented total mixed ration forbeef cattle

齋

藤

早

春

（地方独立行政法人北海道立総合研究機構農業研究本部畜産試験場）

Waka Saito（Hokkaido Research Organization, Agriculture Research Department, Aminal Research Center）

This study aimed to investigate chemical composition and fermentation quality offermented total mixed ration（TMR）for beef cattle, and its palatability and digestibility in beef
cattles. Grass silage（GS）based TMR for growing beef cattle producted butyric acid after
ensiling, and the fermentation quality of corn silage（CS）based TMR for fatting beef cattle
were good after ensiling. The palatability of GS based fresh TMR was significantly higher thanthat of fermented TMR（P<0.01）, whereas the treatments showed no significant effect on thefeed intake in the digestion trial. There was some different on the rumen fermentation between
on the GS and CS based TMR, while the apparent digestibility and nitrogen utilization showed
no differences between the treatments. In addition, total digestible nutrients content showedsimilar value. In conclusion, deterioration of fermentation quality and energy losses byfermentation were not observe between on GS and CS based TMR designed for beef cattle,
therefore they were useful feed to beef cattle.

１．目

してきた。しかしながら，肉牛生産農家ではサイ的

レージ調製に必要な機械や施設等を保有していな

近年の濃厚飼料価格高騰を背景に，自給飼料をいことが多く，サイレージを自家生産するには新活用した飼料給与体系の構築が求められており，たな投資が必要となる。このことが，サイレージ

特に濃厚飼料への依存度が高い肉牛では急務の課給与体系への転換の大きな課題となっている。

題となっている。我々は，濃厚飼料が多給されて近年，北海道では自給飼料生産の外部委託化がいる黒毛和種飼養体系において，栄養価の高い自進み，自給飼料生産とサイレージ調製を行い，サ給飼料である牧草サイレージ（GS）およびとうイレージと濃厚飼料の混合飼料（TMR：Total

もろこしサイレージ（CS）を用いることにより，Mixed Ration）を複数の農家へ供給するTMRセ

濃厚飼料給与量を削減し，かつ，慣行法と同等のン タ ー の 設 置 が 進 ん で い る 。地 域 に 存 在 す る

発育および牛肉生産が可能であることを明らかに

TMRセンターを活用することで，肉牛生産農家© The Ito Foundation

144

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

でも新たに投資することなく，サイレージを給与

Table1 Ingredients of experimental diets（% DM）

することが可能となる。

GSTMR

CSTMR①

CSTMR②

50－－

Corn silage

－

60

40

Steam rolled corn

35.4

29

35

Steam rolled barley

－

－

11

Soybean meal

14.6

11

6

牛 の 採 食 性 を 著 し く 低 下 さ せ る 。フ レ ッ シ ュWheat bran

－

－

8

TMRの貯蔵性を高めるために開発された発酵

DM：dry matter

TMRセンターでは，TMRを毎日調製し地域農家へ配送しているが，調整後そのまま給与するフ
レッシュTMRは微生物が増殖しやすく貯蔵性が悪い。好気的変敗により品質が低下したTMRは，

Grass silage

TMRは，フレッシュTMRを密封容器で数週間発酵させたもので，長期間の保存が可能であり開封査項目は，一般成分および発酵品質とした。

し て か ら の 好 気 的 変 敗 が 起 こ り に く い 。発 酵2.3

TMRの利用が可能となれば，一度に大量調製で黒毛和種経産牛８頭を用い，単房で飼養した。

きるため，１日あたりの給与量が少なくても肉牛

嗜好性は採食速度法により調査し，調査期間は予用TMRの調製が可能となり，肉牛生産農家でも備期３日および本期４日の計７日間とした。供試

TMRが利用できるようになる。

飼料の給与は，10：00から行い10分後の採食量を発酵TMRの嗜好性評価

そこで，本研究では黒毛和種のGS主体TMRお測定した。供試飼料の給与量は，乾物で２㎏程度

よびCS主体TMRを発酵TMRとして調製，保存しとした。給与場所による採食量の偏りをなくすた

た場合の発酵品質や貯蔵前後の品質変動，嗜好性

め，供試飼料を入れたコンテナを１日ごとに左右や消化性などの特性について検討した。

入れ替えた。

２．方
2.1

2.4

法

発酵TMRの消化特性評価

ルーメンカニューレを装着した黒毛和種去勢牛

供試飼料

４頭（開始時平均体重593±35kg）を用いて個別

粗飼料は，2013年に当場で生産されたタワーサのタイストールに繋留した。試験は，全糞尿採取

イロで調製したチモシー主体GSおよびCSを用い法による消化試験および窒素出納試験とし，１期た。供試飼料は，育成用を想定したGS主体TMR

14日間（予備期９日，本期５日）のクロスオー（GSTMR），肥育前期用および後期用を想定したバー法で実施した。飼料給与量は，維持TDN要CS主体TMR（CSTMR①およびCSTMR②）の３

求量の110％相当量とし，朝夕２回（９：00と種類とした。各TMRの原料構成をTable１に示し16：30）に分けて給与した。本期４日間においてた。発酵TMRの調製には，飼料混合用ミキサー

全糞および全尿を採取し，採取した糞および尿サおよびドラム缶サイロを用い，GSTMRは2014年

ンプルの一部を冷蔵保存した。各期最終日に冷蔵

４ 月 ９ 日 ， CSTMR ① は 2014 年 ６ 月 ４ 日 ，

保存した糞および尿サンプルを一定割合で混合

CSTMR②は2014年７月30日に調製した。

し，分析用サンプルとした。各期最終日の９：2.2

発酵TMRの品質評価

00，11：00，13：00，15：00，17：00，19：00に各発酵TMRの貯蔵期間は，GSTMRが34，56おルーメンカニューレよりルーメン内容液を採取

よび69日間，CSTMR①が36，48および57日間，し，４重ガーゼで濾過した後にpHを測定した。

CSTMR②が41，53，65および73日間とした。調pH測定後のルーメン内容液サンプルは，揮発性© The Ito Foundation

145

肉牛用発酵TMRの飼料特性の評価
Table2 Changes in chemical composition and fermentation quality of experimental diets after re-ensiling
GSTMR
Days

CSTMR①

CSTMR②

0

34

56

69

0

36

48

57

0

41

53

65

73

41.9

39.4

42.3

42.2

40.3

40.5

40.8

40.0

47.6

48.7

51.4

50.6

50.9

Chemical composition
DM（% FM）
CP（% DM）

15.9

17.1

15.7

17.4

12.4

12.4

12.8

12.1

12.4

11.8

12.4

12.3

12.0

aNDFom（% DM）

40.9

43.3

40.1

42.8

32.8

31.1

29.6

31.6

36.9

33.5

30.2

30.9

31.4

WSC（% DM）

2.7

2.3

1.1

1.4

5.0

4.0

3.8

4.4

5.8

3.7

3.1

3.5

3.9

Protein fraction（% CP）
CPs

25.6

35.1

33.2

31.7

45.7

51.2

53.4

52.5

35.3

45.1

42.0

41.3

44.5

CPd

54.1

57.0

53.0

52.3

67.2

67.1

68.5

68.9

59.1

61.6

62.2

58.3

60.1

Fermentation quality
pH

4.97

4.4

4.45

4.33

4.02

3.99

3.98

4.05

4.30

4.30

4.25

4.22

4.19

Lactic acid（% FM）

0.41

0.78

1.65

1.63

1.84

1.33

1.75

1.19

1.11

1.03

1.35

1.04

0.91

Acetic adid（% FM）

0.10

0.13

0.14

0.17

0.39

0.28

0.18

0.22

0.11

0.35

0.29

0.41

0.42

Propionic acid（% FM）

0.05

0.05

0.05

0.05

0.02

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Butylic acid（% FM）

0.61

0.68

0.60

0.41

0.11

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

VBN/TN（%）

5.51

5.28

5.12

6.52

4.44

4.53

5.26

3.52

1.63

2.85

3.20

3.57

3.52

V-score

59.0

59.4

59.8

57.7

98.4

99.4

99.5

99.9

100.0

98.9

99.3

98.4

98.3

DM ： dry matter ； FM ： fresh matter ； CP ： crude protein ； aNDFom ： α -amylase treated ash-free neutral detergent fiber ；WSC ： water soluble carbohydrate ； CPs ： soluble crude protein ； CPd ： degradable crude protein ； VBN/TN ： Ratio of volatilebasic nitrogen to total nitrogen
ND：not detected

脂肪酸およびアンモニア態窒素濃度測定まで－パク質が微生物等に分解され非タンパク態窒素に30℃で凍結保存した。

合成されたため１）と考えられるが，溶解性画分だ
けでなく分解性画分も増加したとする報告２）とは

３．結果と考察3.1

異なっていた。GSTMRでは，調整時および貯蔵

発酵TMRの品質評価

貯蔵前後の飼料成分値および発酵品質をTable２に示した。DMおよびCP含量は，TMRの種類
aNDFom含量は，CSTMR②で貯蔵により低下した が ， こ れ は 調 整 時 （０ day） サ ン プ ル の
aNDFom含量が想定よりも高いことから，サン
プル採取が均等になされていなかったことが起因していると考えられた。WSC含量は，貯蔵に伴い減少した。粗タンパク質中の溶解性画分は貯蔵に伴って増加したが，分解性画分について大きな変動はみられなかった。これは，発酵過程でタン

Fresh TMR
Fermented TMR

1.2
DM intake（kg/day）

および貯蔵日数に関わらず変動はなかった。

＊＊

1.4

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

GSTMR

CSTMR①

CSTMR②

Fig.1 Effects of feeding fresh and fermented total mixed

ration on feed intake in beef cows
＊＊Ｐ＜0.01© The Ito Foundation

146

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table3 Effects of feeding fresh and fermented total mixed ratoin on dry matter intake, digestibility andnitrogen balance of fresh and fermented total ratoin in beef steers
GSTMR

CSTMR①

CSTMR②fresh

fermented

fresh

fermented

fresh

fermented

5.6

5.6

5.1

4.9＊

5.2

5.4＊

DM

70.4

71.5

74.1

74.1

75.5

74.6

CP

68.7

68.6

66.5

68.3

68.9

68.9

DM intake（kg/day）digestibility（%）

aNDFom

67.5

71.6

59.3

52.1

56.3

52.1

Starch

90.5

91.7

97.7

95.5

97.1

97.0

TDN（%）

71.4

71.8

75.9

76.6

77.7

76.7

Ratio of nitrogen intake（%）
Feces N excretion

31.3

31.4

33.5

31.7

31.1

31.1

Urine N excretion

44.9

44.5

44.1

50.3

45.9

41.5

N retention

23.8

24.1

22.5

18.5

23.0

27.3

TDN：toral digestible nutrients＊P<0.05

Table4 Effects of fresh and fermented total mixed ration on ruminal profiles in beef steers
GSTMR

CSTMR①

CSTMR②fresh

fermented

fresh

fermented

fresh

fermented

pH

6.2

6.3＊

6.3

6.3

6.4

6.4

Ammonia nitrogen（mg/dl）

12.2

10.0

9.3

10.6

4.5

8.5＊

Total VFA（mmol/dl）

11.1

10.6

10.9

10.2

10.3

11.2

69.8

64.7＊

67.6

67.0

65.4

70.2＊

Propionete

15.8

17.1＊

14.5

17.0＊

18.2

13.5＊

Butyrate

10.5

13.3＊

12.6

8.8＊

10.3

8.9＊

VFA composition（mol %）Acetate

VFA：volatile fatty acid＊P<0.05

後にも酪酸が生成されていたが，CS主体TMRで的変敗が著しかったにも関わらず，フレッシュは貯蔵後の酪酸生成はみられなかった。

TMRの摂取量が多かった理由として，供試牛は3.2

試験開始前にフレッシュTMRに混合したCSを給発酵TMRの嗜好性評価

供 試 飼 料 の 乾 物 摂 取 量 を Fig. １ に 示 し た 。
GSTMRおよびCSTMR②では，フレッシュTMR

与されており，この摂取経験が嗜好性に影響を及ぼした可能性が示唆された。

と発酵TMRで摂取量に差はみられなかったが，

3.3

CSTMR①ではフレッシュTMRで有意に摂取量

フレッシュTMRおよび発酵TMR給与時におけが多くなった。CSTMR①の嗜好性試験は７月下る乾物摂取量，消化率および窒素分配率をTable

旬に実施しており，発酵TMRのpHが4.35である

３に示した。乾物摂取量にCSTMR①および②でのに対してフレッシュTMRでは6.21と高く好気差がみられたが，これは乾物含量の違いによるも© The Ito Foundation

発酵TMRの消化特性評価

147

肉牛用発酵TMRの飼料特性の評価

のでフレッシュTMR，発酵TMRともに給与され

発 酵 TMR で の 乳 酸 生 成 量 が 比 較 的 多 か っ た

た飼料はすべて摂取していた。消化率，TDN含GSTMRおよびCSTMR①ではプロピオン酸モル

量および窒素分配率には，すべてのTMRにおい

比が高く，既往の報告と一致していた。

て処理間で有意な差はみられなかった。これらの以上のことから，発酵TMRの再発酵による飼結果は，TMRの発酵調製が乳牛の飼料消化率や料成分および発酵品質の変動は小さく，フレッ

窒素出納に及ぼす影響は少ないとする報告 と一

シュTMRと発酵TMRでは嗜好性やルーメン内発致した。

酵に若干の違いはあるものの，飼料摂取量や消化３）フレッシュTMRおよび発酵TMR給与時におけ率，窒素利用性に負の影響はなく，発酵によるエる ル ー メ ン 内 容 液 性 状 を Table ４ に 示 し た 。

ネルギーロスも認められなかったことから飼料とGSTMRでは，発酵TMRでpH，プロピオン酸おして大きな問題はないと考えられた。しかしながよび酪酸モル比が高かった。CSTMR①では，発ら，本研究では短期間の嗜好性および摂取量の比

酵TMRでプロピオン酸モル比が高く，酪酸モル較しか行っていないことから，長期給与における比は低かった。CSTMR②では，発酵TMRでアン

採食性や生産性に及ぼす影響について検討が必要

モニア態窒素濃度および酢酸モル比が高く，プロである。

ピオン酸および酪酸モル比は低かった。大谷ら４）
は，分解性タンパク質含量の高い飼料の給与は尿４．要

約中の窒素排泄量を増加させ，ルーメン内アンモニ

肉牛用に調製した発酵混合飼料（TMR）の貯

ア態窒素濃度を上昇させることを報告している。

蔵前後の成分変動や発酵品質，嗜好性，消化特性

本試験においても，CSを主体とした発酵TMRのについて検討した。育成用牧草（GS）主体TMR

給与によりルーメン内アンモニア態窒素濃度の上では，貯蔵後にも酪酸生成が認められたが，肥育昇がみられた。ルーメン内で生成されたアンモニ

用とうもろこしサイレージ（CS）主体TMRの発

アは，微生物態タンパク質に合成されるか，ルー

酵品質は良好であった。GS主体TMRでは，フレッ

メン内膜から吸収され血液中に排出される。本試

シュTMRと発酵TMRで嗜好性に有意差が認めら

験では，血中尿素窒素濃度を測定していないが，れた（Ｐ＜0.01）が，消化試験での飼料摂取量に尿中の窒素排泄量に有意な差はみられなかったこ

は処理間で差はみられなかった。また，GS, CS主とから，ルーメン内で生成されたアンモニア態窒体TMRともにルーメン内発酵に若干の違いが認素についてはルーメン細菌により無駄なく利用さめられたものの，各成分消化率や窒素利用性に差れたと考えられる。発酵TMR給与によるルーメ

はなく，TDN含量も同等であった。以上から，ン内のプロピオン酸モル比の上昇が報告 されて肉牛用に設計したGSおよびCS主体TMRでは発酵

いるが，これは発酵TMRでは材料中の可溶性糖による品質低下やエネルギーロスは認められず，類から乳酸生成量が増加し，摂取した乳酸はルー

肉牛用飼料として利用可能であることが示された。

５）

メン内でプロピオン酸に変換されることに起因している。本試験の消化試験で用いたフレッシュ
TMRおよび発酵TMRの乳酸含量は，GSTMRで0.72％および1.64％，CSTMR①で0.85％および1.56％，CSTMR②で0.67％および0.94％であり，

文献１） 都丸友久，平林晴飛，群馬畜試研報，18，１～８，
2011．
２） 渡邊潤，植村鉄矢，佐藤寛子，加藤真姫子，秋田
畜試研報，23，１～８，2009．

© The Ito Foundation

148

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）３） 寺井智子，佐竹康明，家木一，岸本勇気，愛媛畜
研セ研報，１，2011．
４） 大谷文博，樋口浩二，小林洋介，野中最子，畜草研研報，14，23～35，2014．

５） 山本泰也，乾清人，浦川修司，平岡啓司，富田智明，
田中浩二，西川周司，中西博司，前澤卓，平成16年度関東東海北陸農業試験研究推進会議畜産草地部会
資料，46～47，2005．

© The Ito Foundation

149

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発
Bactericidal effect of multi-drug resistance bacteria using lactic acidbacteria and development of functional domestic animal fodder

木

下

英

樹

（宮城大学食産業学部フードビジネス学科）

Hideki Kinoshita（Miyagi University, Department of Food Management, School of Food,
Agricultural and Environmental Sciences, Department of Food Management）

Large amounts of antibiotics used for human therapy, as well as for farm animals, resulted
in the selection of pathogenic multidrug-resistant organisms（MDROs）. MDROs can cause
serious local and systemic infections that can be severely debilitating and even life threatening.
In this study, we studied on bacteriocins produced by lactic acid bacteria（LAB）as a usefuland safe substitute for antibiotics. When 908 of LAB culture supernatants were tested for
antimicrobial activity against Lactobacillus delbrueckii subsp. blugaricus JCM1002T and Bacillus
sp. C107, 373 and 461 samples showed antimicrobial activities against two indicator bacteria at41.1 and 50.8％，respectively. Six strains were selected and all strains were identified as
Lactococcus lactis. Antimicrobial resistant bacteria in porcine feces were counted using eachgrowth agar containing three antibacterial drugs, amikacin, imipenem, and ciprofloxacin.
Amikacin and ciprofloxacin resistant bacteria were higher than imipenem resistant bacteria. It
is thought that this corresponds to a history of antibiotic use. Further, 24 of MDROs that grewwith three-mixed growth culture were isolated and identified. Ten out of 24 isolated MDROs
were identified as Cellulosimicrobium sp. and all of them were killed by the culture
supernatants of selected LAB. Thus, LAB could reduce MDROs in feces of livestock and may
be applied to a functional feedstuff.

１．目

対し多剤耐性菌の対策推進を呼びかけたこともあ

的り，我が国においても使用する抗菌薬の種類を減

現在，病院での抗菌薬の過度の処方および家畜
餌への日常的な使用により，抗菌薬に耐性を示す

らすなど，家畜への抗菌薬使用について見直しが進められている。

菌が多く出現している。中でも複数の抗菌薬に耐一方，乳酸菌には様々な健康保健効果が知られ性を示す多剤耐性菌はヒトへの感染とその拡大がており，一部，抗生物質の代替品としての利用が危惧されている

検討されている３）。しかしながら，これらの試み。2010年にWHOが各国政府に

１，
２）© The Ito Foundation

150

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

は一定の効果は見られるものの，試験的な試みで

ル100μｌを添加し，37℃で一晩培養後，阻止円

あり，まだまだ子豚等の幼若動物については抗菌の大きさを測定した。活性値は，抗菌活性を示さ薬に頼らざるを得ないのが現状である。我々のこなかったものを「０」，ペニシリンカップ内のみ

れまでの研究で多剤耐性菌に対しても抗菌作用を

指標菌の生育が抑えられているものを「１」，阻示すバクテリオシンが存在することを明らかにし止円の直径が８mm以上，12mm未満のものをた。バクテリオシンは基本的に細胞膜に孔を形成「２」，阻止円の直径が12mm以上，18mm未満のすることによって殺菌的に働くため，耐性菌が出ものを「３」，18mm以上のものを「４」とし，現しづらいという特徴がある。そこで本研究では５段階で評価した。

豚糞便中における多剤耐性菌の分布調査を行うこ

WST法では，市販のMicrobial Viability Assayとで多剤耐性菌の潜在的リスク評価を行うととも

Kit-WST（同仁化学研究所，熊本）を使って添に，多剤耐性菌を指標菌としてバクテリオシンに付のマニュアルに従って試験した。活性値は，よる殺菌効果を検討し，機能性家畜飼料を開発す

WST-８ホルマザン生成により強く発色したもの

ることを目的とした。

を「０」，中間発色を示したものを「１」，まった

2.1

く発色しないものを「２」とし，３段階で評価し

法

２．方

た。

使用菌株と培養条件

また，３種混合培地で生育した耐性菌に対する抗菌活性試験のための乳酸菌は，宮城県産業技

抗菌活性試験も上記同様ペニシリンカップ法を用術総合センター保有の908菌株を用いた。培養はいて行った。結果は，阻止円の直径で示した。

MRS broth（Difco Laboratories, Detroit, MI,

2.3USA）を用い，２％接種により37℃で24時間培

薬剤耐性菌の分離と分布調査の目的で，本学坪養した。Lactobacillus delbrueckii subsp. blugaricus

沼農場から６検体（抗生物質投与無し３検体，有JCM1002 は ， MRS broth で 37 ℃， Bacillus sp.

り３検体），宮城県角田市の１農場から２検体

C107は，SCD培地（日水製薬株式会社，東京）（抗生物質投与有り）の豚糞便を採取し，試験まで30℃，それぞれ18時間，静置培養したものを指で－80℃で凍結保存した。凍結保存した試料を溶標菌として用いた。

解後，ペプトン水にて段階希釈し，10ppmシクロ

T

2.2

豚糞便からの耐性菌の分離と分布調査

ヘキシミドおよび３種類の抗生物質（アミカシ乳酸菌の抗菌活性試験

抗菌活性試験は，ペニシリンカップ法およびン；AMK, 12mg/ml，イミペネム；IPM, 12mg/

WST法により行った。ペニシリンカップ法では，ml，シプロフロキサシン；CPFX, 1mg/ml）をそLb. delbrueckii subsp. blugaricus JCM1002 を ，れぞれ単独，または混合した変法GAM寒天培地

WST法ではBacillus sp. C107を指標菌として用い（日水製薬株式会社，東京）およびSCD寒天培地て抗菌活性試験を行った。サンプルには，乳酸菌（日水製薬株式会社，東京）に混釈して，40℃での培養上清を用いた。

48および120時間培養してコロニーを生育させ，T

ペニシリンカップ法では，指標菌を１％となる

各培地における菌数をカウントした。変法GAM

よう接種した0.75％MRS agarを作成し，その上寒天培地は嫌気条件下で，SCD寒天培地は好気条にペニシリンカップ（外径８mm，内径６mm）

件下でそれぞれ培養した。３種混合培地で生育しを静置した。次にペニシリンカップの中にサンプた菌については釣菌し，豚糞便における薬剤耐性© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発

151

Table 1 The result of antibacterial test using LAB culture supernatants
Number of strains（%）
Activity levels

Against Lb. delbrueckii subsp.
blugaricus JCM1002T

Against Bacillus sp.C107

0535 （58.9）

447 （49.2）

1248 （27.3）

144 （15.9）

2

96 （10.6）317 （34.9）

3

19 （2.1）－

4

10 （1.1）－

Total

908 （100）

908 （100）

Table 2 Selected LAB strains producing antibacterial substances.
StrainSpecies

Source

MBR648Lactococcus lactis

Hosta sieboldii （species of plantain lily）

MBR652

Lactococcus lactis

Hosta sieboldii （species of plantain lily）

MBR653

Lactococcus lactis

Hosta sieboldii （species of plantain lily）

MBR655

Lactococcus lactis

Hosta sieboldii （species of plantain lily）

MBR656

Lactococcus lactis

Hosta sieboldii （species of plantain lily）

MBR738Lactococcus lactis

Gentiana triflora （species of gentian）

菌を得た。
2.4

ル 「２」 以 上） が 見 ら れ た 菌 株 は 125 菌 株

乳酸菌および耐性菌の簡易同定（13.8％）であった。また，Ｃ107株に対して抗菌

選抜乳酸菌および耐性菌について，16S rDNA活性を示した菌は461菌株（50.8％）であり，その相同性解析を行い，属レベルの簡易同定を行っの内，317菌株（34.9％）は高い抗菌活性を示した。PCRにより16S rDNAの全長配列を増幅し，た。本試験結果より，JCM1002T 株に対して高い

ダ イ タ ー ミ ネ ー タ ー 法 に よ り 3130 Genetic

抗菌活性を示し，かつ，Ｃ107株に対しても抗菌Analyzer（Applied Biosystems, Carlsbad, CA,

活 性 を 示 し た MBR648, MBR652, MBR653,

USA）にて配列解析を行った。配列解析の結果

MBR655, MBR656, MBR738 を 選 抜 し た （Tableから得られた塩基配列について，NCBIのBLAST２）。これらの菌株は，宮城県栗原市にある栗駒プログラムにより相同性検索にて菌種同定を行っ

山世界谷地原生花園から特別な許可を得て採取した。

たコバギボウシおよびエゾオヤマリンドウから分離された菌株であり，菌種同定を行った結果，い３．結果と考察

ずれもLactococcus lactisであった。Lc. lactisは，乳酸菌（908菌株）の培養上清を用いた抗菌活数多くの菌株でバクテリオシンの報告がなされて性試験の結果をTable１にまとめた。JCM1002 株

おり，世界50カ国以上で食品保存料として使用さに 対 し て 抗 菌 活 性 を 示 し た 菌 は 373 菌 株 で ，れているナイシンＡもLc. lactisが生産するバク41.1％であった。８mm以上の阻止円（活性レベ

テリオシンである。また，Lc. lactisは，ナイシT© The Ito Foundation

152

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ンＺ，ナイシンＱ，ラクトコッシンＱ，ラクトサ

1E+09

A

1E+08

ンＺなど様々な種類のバクテリオシンが報告され

1E+07

Viable cells（CFU/g）

イクリシンＱ，ラクティシンＱおよびラクティシている４）。今後詳細な解析が必要ではあるが，世界谷地の植物から分離したLc. lactisはバクテリ
オシンを産生している可能性が高く，分離源の特殊性から新奇バクテリオシンの可能性も示唆されFig.１に示した。AMK, IPM, CPFXの３種類の抗Viable cells（CFU/g）

う共通の特徴がある。本試験の結果，抗生物質の投与の有無，培養条件の違いに関わらず，AMK果となった。しかしながら，好気性菌ではその傾向は見られなかった。抗生物質非投与区では全体

1E+06

は３種混合培地で生育した菌は見られなかったのに対し，抗生物質投与区においては耐性菌が検出された。アミノグリコシド系抗生物質は飼料添加剤や動物用医薬品として頻用されており，フルオ
ロキノロン系抗生物質も動物用医薬品として使われていることから，同様の作用機序を持つAMKとCPFXに対し耐性を示す菌が多かったと考えられた。一方，カルバペネム系抗生物質は飼料や動

48h
120h

1E+05
1E+04
1E+03
1E+02
1E+00

C

1

2 3

4 5 6 7 8 9 10

1E+11
1E+10
1E+09
1E+08
1E+07
1E+06

48h
120h

1E+05
1E+04
1E+03
1E+02
1E+01
1E+00

酸やバクテリオシンなどの抗菌物質によって菌のた，興味深いことに抗生物質非投与区の糞便から

4 5 6 7 8 9 10

1E+07の菌数が少なかった。これは乳酸菌の産生する乳生育が抑えられていた可能性が考えられた。ま

2 3

1E+08

Viable cells（CFU/g）

投与区（代わりに乳酸菌を投与）では２桁低い結

1

1E+01

およびCPFXに耐性を示す菌が多く，IPM耐性菌

わらないか１桁低い程度であったが，抗生物質非

1E+02

1E+09

を持つ広域抗菌薬であり，殺菌的に作用するといは抗生物質を含まないコントロールとほとんど変

1E+03

1E+10

B

るが，いずれの抗生物質も幅広い抗菌スペクトル気性菌では，AMKおよびCPFXに対する耐性菌

48h
120h

1E+04

1E+00

生物質を混合した培地はそれぞれ作用機序が異なは比較的少なかった。抗生物質投与区における嫌

1E+05

1E+01

た。
各培地における豚糞便１ｇ当たりの耐性菌数を

1E+06

1

2 3

4 5 6 7 8 9 10

Fig.1 Viable cell counts of antimicrobial resistantbacteria using each growth agar containing three
antibacterial drugs. Porcine feces were diluted andspread on each growth agar containing nonantibacterial drug（1 and 6）, 12mg/ml of amikacin（2and 7）, 12mg/ml of imipenem（3 and 9）, 1mg/ml of
ciprofloxacin（4 and 8）, and three mix（5 and 10）.
The plates were incubated for 48 or 120 h at 40℃
under anaerobic condition（1-5）or aerobic condition（6-10）． Samples were used in（A）Tsubonuma
without antibacterial drug administration（n＝3），（B） Tsubonuma with antibacterial drug
administration （n＝3）， and （C） Kakuda with
antibacterial drug administration（n＝2）．

物用医薬品としての使用は認められていないた© The Ito Foundation

153

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発
Table 3 MDROs isolated from three-mixed agar
StrainSpecies

SourceGrowth agar

R01

Not identified

Tsubonuma A

mGAM

R02

Not identified

Tsubonuma B

mGAM

R03

Not identified

Tsubonuma B

mGAM

R04

Not identified

Tsubonuma B

mGAM

R05

Not identified

Tsubonuma B

mGAM

R06
R07

Not identified
Not identified

Tsubonuma B
Kakuda

SCD
mGAM

R08

Cellulosimicrobium sp.

KakudamGAM

R09

Cellulosimicrobium sp.

KakudamGAM

R10

Not identified

Kakuda

mGAM

R11
R12

Bacillus sp.
Cellulosimicrobium sp.

KakudaKakuda

mGAM
mGAM

R13
R14

Cellulosimicrobium sp.
Cellulosimicrobium sp.

KakudaKakuda

mGAM
mGAM

R15
R16
R17
R18
R19
R20
R21
R22
R23
R24

Cellulosimicrobium sp.
Cellulosimicrobium sp.
Not identified
Lactococcus lactis
Cellulosimicrobium sp.
Cellulosimicrobium sp.
Cellulosimicrobium sp.
Not identified
Not identified
Not identified

KakudaKakudaKakudaKakudaKakudaKakudaKakudaTsubonuma C
Tsubonuma C
Tsubonuma C

mGAM
mGAM
SCD
SCD
SCD
SCD
SCD
SCD
SCD
SCD

mGAM：modified GAM agar
Table 4 Antimicrobial activities against MDROs using the culture supernatant of selected LAB
Strain

MBR648

MBR652

MBR653

MBR655

MBR656

MBR738

R01
R02
R03

22
−

22
−

22
−

23
−

23
−

23
−

−

−

−

−

−

−

R04
R05
R06
R07

13
−
−
−

13
−
−
−

13
−
−
−

14
−
−
−

14
−
−
−

16
−
−
−

R08
R09
R10
R11
R12
R13
R14
R15
R16
R17

19
16
15
6
18
18
18
17
19

22
16
19
6
21
21
20
19
21

23
16
19
6
21
21
20
19
22

23
16
20
6
21
22
21
20
22

23
17
20
6
21
22
21
20
23

23
17
20
6
20
22
21
20
22

−
−
38
38
38

−
−
38
38
38

−
−
38
38
38

−
−
38
38
38

−
−
38
38
38

−
−
38
38
38

−
−
−

−
−
−

−
−
−

−
−
−

−
−
−

−
−
−

R18
R19
R20
R21
R22
R23
R24

※Each data indicates diameter of inhibitory zone（mm），「−」；non-inhibitory zone

© The Ito Foundation

154

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

め，IPM耐性菌は少なかったと考えられた。宮崎

する予定である。本試験では，多剤耐性菌を乳酸

らはカルバペネム薬の使用量の削減と使用期間の菌の産生する抗菌物質により殺菌できる可能性が制限により，IPM耐性緑膿菌と多剤耐性緑膿菌の示された。今後，さらなる詳細な研究を行い，機検出率が有意に低下したと報告しており，抗生物

能性家畜飼料の開発へと繋げたい。

質使用量と耐性菌の出現は密接に関連していることが示されている５）。さらに，我々が以前に行っ

４．要

約

た食品における耐性菌分布調査においても飼料添

近年，多量の抗生物質の使用により多剤耐性菌

加剤や動物用医薬品として使用されている抗菌物が数多く出現しており，ヒトへの感染拡大が危惧

質に対する耐性菌は多く検出され（未公表デーされている。そこで抗生物質に代わり，安全性のタ），本結果とも一致する。

高い乳酸菌のバクテリオシンを使用して，多剤耐３種混合培地で生育した耐性菌を計24株分離し性菌のリスクを低減できないかと考えた。まず，た（Table３, Table４）。これらの菌について簡易

乳酸菌908菌株について抗菌活性試験を行ったと同定を試みたところ，Cellulosimicrobium sp.がころ，JCM1002T 株に対して抗菌活性を示した菌

10菌株，Bacillus sp.が１菌株，Lc. lactisが１菌

は373菌株（41.1％），Ｃ107株に対して抗菌活性株となった。残り12菌株は未同定のままであり，を示した菌は461菌株（50.8％）であった。中で今 後 同 定 を 行 っ ていく予定である。

も高い活性を示した６菌株を選抜し，菌種同定を

Cellulosimicrobium属は，放線菌の一種であり，試みたところ，いずれもLc. lactisであり，バク堆肥などからよく分離される菌である 。また，

テリオシン産生の可能性が示唆された。また，豚

心内膜炎患者の血液から分離されるなどヒトへの

糞 便 中 の 耐 性 菌 数 測 定 の 結 果 ，AMK お よ び

日和見感染も見られる菌であり，AMKおよびCPFXの耐性菌が多く，IPM耐性菌は比較的少な

CPFXに耐性を示し，IPMについても耐性を示す

かった。これは飼料添加剤や動物用医薬品の使用菌がいることが報告されている 。本試験で分離頻度に依存している可能性が示唆された。３種混したすべてのCellulosimicrobium属の菌株は，選合培地で生育した菌を同定したところ，多くの抜乳酸菌の培養上清で生育が強く阻害された。まCellulosimicrobium sp.が検出された。これらすた，Bacillus sp. R11に対しては弱い活性を示し

べての薬剤耐性Cellulosimicrobium sp.は，選抜

たが，Lc. lactis R18には抗菌活性を示さなかっ乳酸菌の培養上清により生育が強く抑えられたこ

た。本試験で用いた培養上清はすべてLc. lactisとから，乳酸菌のバクテリオシンを用いて多剤耐であったことからＲ18株は同様の抗菌物質を生産性菌が殺菌できる可能性が示された。今後さらなしており，自己耐性を有している可能性が示唆さる研究を進めることで，多剤耐性菌を抑える家畜れた。本試験において，バクテリオシンのマスス用の機能性飼料開発が期待される。

６）

７）

クリーニングはJCM1002T株およびＣ107株を指標菌として行ったが，活性の強弱については菌種により異なることが考えられるため，活性が弱かったサンプルでも耐性菌には有効である可能性も十分考えられる。そのため，今後すべてのサンプルについて網羅的に耐性菌に対する抗菌効果を解析

文献１） Tsuji, A., Kobayashi, I., Oguri, T., Inoue, M.,
Yabuuchi, E., Goto, S. : An epidemiological study ofthe susceptibility and frequency of multiple-drugresistant strains of Pseudomonas aeruginosa isolated
at medical institutes nationwide in Japan, J InfectChemother，11，64～70，2005．

© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発
２） Hirakata, Y., Yamaguchi, T., Nakano, M.,
Izumikawa, K., Mine, M., Aoki, S., Kondoh, A.,
Matsuda, J., Hirayama, M., Yanagihara, K., Miyazaki,Y., Tomono, K., Yamada, Y., Kamihira, S., Kohno, S. :Clinical and bacteriological characteristics of IMPtype metallo-beta-lactamase-producing
Pseudomonas aeruginosa, Clin Infect Dis ，37 ，26 ～
32，2003．
３） Suda, Y., Villena, J., Takahashi, Y,. Hosoya, S.,
Tomosada, Y., Tsukida, K., Shimazu, T., Aso, H.,
Tohno, M., Ishida, M., Makino, S., Ikegami, S.,
Kitazawa, H. : Immunobiotic Lactobacillus jensenii
as immune-health promoting factor to improve
growth performance and productivity in postweaning pigs, BMC Immunol，15，24～41，2014．
４） 日本乳酸菌学会編，乳酸菌とビフィズス菌のサイ
エンス，初版，309～324，京都大学学術出版会，京都，
2010．

155

５） 宮崎博章，入江利行，素元美佐，溝口裕美，永山
眞紀：カルバペネム薬の使用制限下によるイミペネ
ム耐性緑膿菌と多剤耐性緑膿菌の検出率の推移，環境感染，21，162～167，2006．
６） Hayakawa, M., Yamamura, H., Nakagawa, Y.,
Kawa, Y., Hayashi, Y., Misonou, T., Kaneko, H.,
Kikushima, N., Takahashi, T., Yamasaki, S., Uegaki,Y., Terasawa, A., Takao, K., Mori, T., Ago, K., Saito,
N., Hasegawa, T. : Taxonomic diversity ofActinomycetes isolated from swine manure compost,
Actinomycetologica，24，58～62，2010．
７） Brown, J. M., Steigerwalt, A. G., Morey, R. E.,
Daneshvar, M. I., Romero, L. J., McNeil, M. M. :Characterization of clinical isolates previously
identified as Oerskovia turbata: proposal of
Cellulosimicrobium funkei sp. nov. and emended
description of the genus Cellulosimicrobium, Int J
Syst Evol Microbiol，56，801～804，2006．

© The Ito Foundation

156

食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のための基礎研究
Basic study for the establishment of the method to increase carnosinerelated dipeptide levels in meats

友

永

省

三

（京都大学大学院農学研究科）

Shozo Tomonaga（Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

For the first step to establish the method to increase carnosine-related dipepitdes inchicken breast meat, we investigated correlations among carnosine-related dipeptides and themolecular ion peaks derived from low-molecular-weight substances measured by gas
chromatography mass spectrometry-based metabolomics in the breast muscle of chickens.

１．目て，次に述べる研究を我々は遂行してきた。カル的ノシンもしくはカルノシン関連ジペプチドを高含

カルノシン関連ジペプチド（もしくはイミダ

有する鶏ムネ肉抽出物の経口投与は，ラットにおゾールジペプチド）であるカルノシン（β―アラ

ける抗うつ様行動効果６）やマウスにおける学習行

ニル―ヒスチジン），アンセリン（β―アラニル―１

動改善効果７）を有することを見出した。また，鶏―メチルヒスチジン）およびバレニン（β―アラニ

ムネ肉内のカルノシン関連ジペプチドをさらに増

ル―３―メチルヒスチジン）は，動物の筋肉に多く量できれば，さらなる機能性向上につながると考存在する。生理機能として抗酸化作用や緩衝作

え，鶏においてカルノシンとアンセリンの構成ア用２）などが認められている。さらに，摂取によるミノ酸であるβ―アラニンの投与によるムネ肉内

血圧低下効果 ，運動パフォーマンス向上効果

４）のカルノシンとアンセリン含量の増量を試みた結なども報告されて果８～10），ムネ肉のカルノシン含量がわずかに増えいる。一方，国内の畜産業において，「畜肉部位る条件があることを見出した10）。以上より，効果の余剰問題」が存在する。中でも家禽産業では鶏的な鶏ムネ肉内カルノシン関連ジペプチド増量法

ムネ肉が鶏モモ肉に比して嗜好性が低い結果，鶏の確立には，構成アミノ酸の投与以外の合成を刺

ムネ肉の市場価格が鶏モモ肉に比して低いことが激する条件を見出す必要性が示唆された。

３）

およびストレス反応緩和効果

１）５）

問題となっている。そこで，鶏肉における「畜肉構成アミノ酸の投与による筋肉内カルノシン関部位の余剰問題」の解決に貢献するために，鶏ム連ジペプチド含量の増量法は，鶏以外にも様々なネ肉に多いカルノシン関連ジペプチドに着目し動物種で報告されている。豚では，β―アラニン© The Ito Foundation食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のための基礎研究

157

だけでなく，カルノシンのもうひとつの構成アミて，鶏ムネ肉のカルノシン，アンセリン，β―アノ酸であるヒスチジンを同時摂取させることによ

ラニン，ヒスチジン，１―メチルヒスチジン，３―

り筋肉内カルノシン含量がわずかに増量した11）。

メチルヒスチジンおよびタウリンが定量可能であ

一方で，ラットではβ―アラニンの投与で顕著にることを確認し，カルノシン関連ジペプチド増量（10倍ほど）筋肉内カルノシン含量が増加した 。

法の確立に貢献できる可能性を示唆した14）。

12）

これら先行研究は，β―アラニン単独もしくはβ―次の段階として，本研究では，カルノシン関連

アラニンとヒスチジンの同時投与の試験である

ジペプチド増量法確立への基盤情報の取得を目指

が，最も増量に効果的な構成アミノ酸投与の諸条

して，上記の分析法を用いて，カルノシン関連ジ件（動物種，系統，畜肉部位，投与時期，投与期

ペプチド含量と関連する低分子成分の探索を試み

間および投与濃度など）の決定には至っていな

た。すなわち，市販の鶏ムネ肉中のカルノシン関い。さらに，カルノシンやアンセリンだけでなく

連ジペプチド，構成アミノ酸およびタウリン含量

バレニンの含量まで確認している報告は，我々がを定量分析し，同サンプルをガスクロマトグラフ

知る限り存在しない。我々は，構成アミノ酸，特質量分析計（GC/MS）の低分子成分の網羅的半にヒスチジンの投与からカルノシン関連ジペプチ

定量解析（メタボローム）にも供し，両分析結果

ド増量を試みる場合は，バレニン合成系の活性化を合わせて網羅的にカルノシン関連ジペプチドとは起こりうると考える。なぜなら，ヒスチジンをの相関を調べた。

構成アミノ酸とするカルノシンの合成促進だけでなく，ヒスチジンから３―メチルヒスチジンへの２．方法

代謝が促進された結果，３―メチルヒスチジンを異なる産地（国内３県）の鶏ムネ肉を各５～６

構成アミノ酸とするバレニンの合成促進にもつな

サンプル，合計17サンプルを京都市内の小売店かがる可能性があるからである。一方，β―アラニら入手した。凍結破砕装置（クライオプレス，マンの投与により，トランスポーターが拮抗するタ

イクロテックニチオン）で破砕して過塩素酸によウリンが減少する場合も認められていることかる除タンパク質処理後，UHPLC-MS/MSによるら，タウリンはカルノシン関連ジペプチド増AccQ-Tag誘導体化アミノ酸分析法13，14）を用いて，量のための有用な指標であると考えられる。以上

カルノシン，アンセリン，バレニン，β―アラニン，

より，鶏肉，豚肉など様々な畜肉におけるカルノ

ヒスチジン，１―メチルヒスチジン，３―メチルヒ

シン関連ジペプチドの増量法を正確に検討するた

スチジンおよびタウリンの定量を試みた。

めには，各畜肉部位，品種および飼養条件などに

UHPLC-MS/MS は ， AQUITY TQD（Waters）

おけるカルノシン関連ジペプチド３種類（カルノを用いた。定量法として内部標準法を用いた。内シン，アンセリンおよびバレニン）と全構成アミ部標準物質は，カルノシン，アンセリン，バレニノ酸（β―アラニン，ヒスチジン，１―メチルヒス

ン１―メチルヒスチジン，３―チルヒスチジン用にチジンおよび３―メチルヒスチジン）およびタウ

Ｌ―ヒスチジン（ring2-13C），β―アラニン用にグ

リン含量を把握することが有用であると考えていリシン―ｄ５およびタウリン用にＬ―グルタミン―

る。そこで我々は，超高速液体クロマトグラフ―

2, 3, 3, 4, 4-d５を採用した。同サンプルをGC/MS

タンデム型質量分析計（UHPLC-MS/MS）を用（QP2010-Ultra ， 島 津 製 作 所） に よ る Smart

いたAccQ-Tag誘導体化アミノ酸分析

Metabolites database（島津製作所）の分析条件

８～10）

13）

におい

© The Ito Foundation

158

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）を用いたメタボローム解析にも供した。次に，分（島津製作所）による低分子成分の同定を試みる

析結果からProfiling Solution（島津製作所）を用とともに，本データベースに存在しない場合は，

いてイオンピークデータを抽出した。成分の同定

保持指標の情報はないがより多くの化合物が登録より先にイオンピークから解析する理由は，採用されているデータベース（NISTなど）を用いた

し た デ ー タ ベ ー ス （今 回 は 前 述 の Smart

低分子成分の同定も試みる予定である。また，今Metabolites database）に登録されていない成分

回は，市販の鶏ムネ肉を用いたため，各サンプルも抽出できる可能性を残すためである。さらに，のと殺からの経過時間を制御することができな

これらイオンピークを用いた部分最小二乗回帰

かった。と殺からの経過時間は，測定物質によっ（PLS－R）による予測モデルを作成できた物質にては分析結果に影響を及ぼしうると考えられる。

おいて，モデルにおける寄与度の指標であるVIP

そこで，と殺直後の鶏ムネ肉においても，今回とが有意に高い（本研究では１以上かつ自身の標準同様の実験を検討中であり，今回の結果と合わせ誤差の２倍以上を有意とした）イオンピークの数て考察することを視野にいれている。さらに，「畜を調べることで，関連する成分を考察した。

肉部位の余剰問題」は，他の畜肉でも認められることから，他動物種の筋肉の解析を行うなど，

３．結果と考察

様々なデータを取得することも重要である。

鶏ムネ肉のカルノシン，アンセリン，バレニン，

総括すると，市販の鶏ムネ肉において，カルノ

β―アラニン，ヒスチジンおよびタウリンを定量

シン関連ジペプチドと相関を示す可能性がある低することができた。一方で，１―メチルヒスチジ

分子成分由来のイオンピークを抽出することがでンならびに３―メチルヒスチジンは，全サンプル

きた。今後は，「畜肉部位の余剰問題」の解決に

において定量下限を下回っていた。そこで，カル貢献するために，本研究の手法を用いてさらなるノシン，アンセリン，バレニン，β―アラニン，

基盤情報の収集に取り組む予定である。

ヒスチジンおよびタウリンに着目してGC/MS分
析により得られたイオンピーク（17,691個）を用

４．要約

いたPLS回帰モデルの作成を検討した結果，カル

本研究では，鶏ムネ肉のカルノシン関連ジペプノシン（Ａ＝２，R2X（cum）＝0.811，Q2（cum）

チド（カルノシン，アンセリンおよびバレニン）＝0.373），アンセリン（Ａ＝２，R2X（cum）＝含量の増量法確立への基盤情報を得るために，鶏0.796，Q2（cum）＝0.288）およびバレニン（Ａ

ムネ肉におけるカルノシン関連ジペプチドと，ガ＝４，R2X（cum）＝0.985，Q2（cum）＝0.643）

スクロマトグラフ質量分析計によるメタボロームを予測するモデルを作成することができた。各モ

解析によって得られた低分子成分由来のイオン

デルにおいて，VIPが有意に高いイオンピークとピークとの関連を探索した。

して，カルノシンでは1,361個，アンセリンでは354個，バレニンでは3,192個認められた。すなわち，これらイオンピークの源である低分子成分
は，各カルノシン関連ジペプチド含量と相関がある可能性を示唆している。今後は，これらイオン
ピ ー ク に 着 目 し て Smart Metabolites database

文献１） Kohen, R., Yamamoto, Y., Cundy, K. C., Ames, B.
N. : Proc Natl Acad Sci USA, 85, 3175～3179, 1988．
２） Abe, H. : Biochemistry（Mosc），65 ，757 ～ 765 ．
2000．
３） Niijima, A., Okui, T., Matsumura, Y., Yamano, T.,
Tsuruoka, N., Kiso, Y., Nagai, K. : Auton Neurosci.,© The Ito Foundation食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のための基礎研究
97，99～102．2002．
４） Maemura, H., Goto, K., Yoshioka, T., Sato, M.,
Takahata, T., Morimatsu, F., Takamatsu, K. : Int J
Sport and Health Sci.,４，86～94，2006．
５） Li, Y. F., He, R. R., Tsoi, B., Li, X. D., Li, W. X.,
Abe, K., Kurihara, H. : PLoS One, 7，e33190，2012．
６） Tomonaga, S., Yamane, H., Onitsuka, E., Yamada,S., Sato, M., Takahata, Y., Morimatsu, F., Furuse, M. :Pharmacol Biochem Behav., 89，627～632，2008．
７） 友永省三，栄養生理研究会報，52，37～44．2008．
８） Tomonaga, S., Kaji, Y., Tachibana, T., Denbow, D.
M., Furuse, M. : Anim Sci J., 76，249～254，2005．

159９） Tomonaga, S., Kaneko, K., Kaji, Y., Kido, Y.,
Denbow, D. M., Furuse, M. : Anim Sci J., 77, 79 ～ 86,2006．
10） Tomonaga, S., Matsumoto, M., Furuse, M. : J
Poult Sci. 49：307～311．2012．
11） Mei L, Cromwell GL, Crum AD, Decker EA.
Meat Sci., 49，55～64，1998．
12） Margolis, F. L., Grillo, M., Kawano, T., Farbman, A.
I. : J Neurochem., 44，1459～1464，1985．
13） Salazar, C., Armenta, J. M., Shulaev, V. :Metabolites,２，398～428，2012．
14） 友永省三，平成25年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，Vol.32，159～162，2014．

© The Ito Foundation

160

初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及ぼす影響
Effect of myostatin control during early growth period on meat quality ofJapanese Black cattle

髙

橋

秀

之

（九州大学農学部附属農場）

Hideyuki Takahashi（Kuju Agricultural Research Center, Kyushu University）

This study aimed to determine effects of feeding increased volume of high-fat milk during
early post-natal life on concentrations of metabolites in blood, the expression of key genes
regulating intermediary metabolism in skeletal muscle and the rate of growth of JapaneseBlack cattle. All calves were fed a high-fat milk replacer（crude protein，26 ％；crude fat，25.5％；total dissolved nitrogen，116％）．Control calves（n ＝ 4）were nursed with 500g（4L/day）milk replacer until 3 months of age and were then weaned. In the experimental group（n＝ 4），calves were nursed with 1,800g（9L/day）milk replacer until 3 mo and were thenweaned. From weaning to 7 mo, both groups were fed concentrate（1.5％ of body weight [BW]）and hay（ad libitum）. Body weight tended to be higher in the experimental group than in thecontrol group at 7 mo. Plasma concentrations of growth hormone（GH）tended to be higher at
3 month. However, there was no difference after weaning. Insulin like growth factor-1（IGF-1）
was significantly higher in the experimental group. Expression of myostatin mRNA tended to
be lower at 5 months, whereas there was no difference in myostatin expression at 7 months in
the M. longissimus thoracis of the experimental group compared with controls. These results
suggested that the plane of nutrition during early post-natal life influences the rate of growth,
myostatin mRNA expression after weaning in Japanese Black cattle.

１．目

な消費者のニーズに応えるために，霜降り肉の生的産だけでなく赤身肉の生産量を増加させることは黒毛和牛の生産現場では，穀物飼料の多給によ必須である。

る脂肪交雑を重視した牛肉生産システムが主流とミオスタチンは主に骨格筋において産生され，なっている。一方で，安価な海外牛肉の輸入量増

脂肪形成を促進する。一方で，ミオスタチンの欠加や健康志向の高まりによる赤身肉消費の増加に損は骨格筋量を増大して脂肪量を減少させる１）。

伴い，消費者の食肉嗜好は多様化してきている。

骨格筋中の筋細胞数やサシの元となる脂肪前駆細したがって，国内での牛肉生産においても，多様胞の増殖・分化は，初期成長期の栄養状態やホル© The Ito Foundation

初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及ぼす影響

161

モンにより影響される。近年，初期成長期に獲得（CP：26％，CF：25.5％，TDN：116％）を最大した代謝生理機能は，その後の成長や肉質に不可

1,800g/dayの条件で３ヵ月齢時まで給与し，３ヵ

逆的な影響を及ぼすことが報告されている。した月以降は体重比1.5％相当量の育成用濃厚飼料

がって，初期成長期の栄養素による内分泌管理で（CP：18％，CF：２％，TDN：72％）および粗ミオスタチンを制御し，その後の肉量や肉質をコ

飼料は飽食条件で管理した。一方，CONT-1区は，ントロールすることが可能となれば，効率的な黒EXP-1区と同様の代用乳をバケツ哺乳で500g/

毛和牛の赤身肉生産または霜降り肉生産が可能とdayの条件で３ヵ月齢時まで給与し，３ヵ月以降なると考えられる。成長ホルモン（GH）は筋タ

はEXP-1区と同様の飼養管理方法を施した。本

ンパク合成を促し，脂肪分解を促進する。GHに研究でのCONT-1区における代用乳の給与量は，より肝臓から分泌されるインスリン様成長因子-

肉用牛の日本飼養標準（中央畜産会，2008年）に１（IGF-1）は，筋肉・脂肪細胞増殖を増加させ基づき設定した。両区の供試牛は，生後14日で母る 。これらのホルモンは，栄養素や栄養状態の牛より分離し，哺乳ロボットによる哺乳試験を開変化に連動してその分泌を変化させ ，ミオスタ

始した。

２）

３）

チンと同様に骨格筋においてインスリン感受性をまた，生後から７ヵ月齢時までの各月において制御していることが知られている４）。したがって，

体重測定を行い，採血は３，５および７ヵ月齢時

GHやIGF-1は骨格筋で産生され筋形成や脂肪形に行い，胸最長筋（LT）の微量組織サンプルは成を調節するミオスタチンを介してその作用を発５および７ヵ月齢時にバイオプシー法を用いて採現していると強く示唆されるが，未だ研究されて取した。

いないのが現状である。そこで本研究では，黒毛2.2

和種子牛を用いて初期成長期の栄養素による内分

３，
５および７ヵ月齢時において，朝の給餌前

泌管理が成長やミオスタチン発現に与える影響をに，頸静脈よりヘパリン処理真空採血管を用いて検討した。

血液サンプルを採取した。すべての血液サンプル

２．方
2.1

血液サンプルは，室温で3,500×ｇ，30分間の遠心処理を行い，法

血漿サンプルを採取した。採取した血漿サンプル
は，分析を行うまで－35℃で保存した。

供試牛および飼養方法

本研究では，10頭の黒毛和種雄子牛を用いて，血液成分の分析項目は，GHおよびIGF-1とし，EXP-1区（ｎ＝５）およびCONT-1区（ｎ＝５）

これらの血漿成分はそれぞれ時間分解蛍光免疫測の２区に分割した。EXP-1区では，４種の異な定法（TR-FIA）を用いて測定した。

る血統の黒毛和種雄子牛５頭を選抜し，血統はそ2.3

れぞれ大分県の黒毛和種種雄牛である光平照，安LTの微量組織はバイオプシー法を用いて採取

金幸，寿恵福および成平照であった。一方で，し た 。サ ン プ ル 採 取 前 に ，ス キ ル ペ ン（Ltd.

CONT-1区では，４種の異なる血統の黒毛和種雄Intervet, Osaka, Japan）0.3mg/100kgBW の 筋 内

子牛５頭を選抜し，血統はそれぞれ大分県の黒毛

注 射 お よ び キ シ ロ カ イ ン （AsraZeneca KK,

和種種雄牛である萬福８，勝福平，寿恵福およびOsaka, Japan）5mlの皮下注射によって全身麻酔

玉吹雪であった。

および局所麻酔を行った後に，ニードルバイオプ

EXP-1 区 は ， 哺 乳 ロ ボ ッ ト に よ り 代 用 乳

バイオプシー

シーによって胸最長筋（LT）の微量組織サンプ© The Ito Foundation

162

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ルを採取した。LTは，７ヵ月齢時において，ニー＜0.01，P＜0.01，respectively）。

ドルバイオプシーにて第12－13胸椎間より総計８

体重の変化は，14日齢時および１ヵ月齢時から㎝の組織を採取した。採取した組織サンプルは，３ヵ月齢時にかけて，EXP-1区がCONT-1区と比直ちに液体窒素内で凍結させ，解析を行うまで－較し有意に高かった（Ｐ＜0.05）。また，離乳後80℃で保存した。

の４ヵ月齢時および７ヵ月齢時において，EXP-1

2.4

RNA抽出および定量的リアルタイムPCR

Total RNAは，ISOGEN（NIPPON GENE CO.,

区がCONT-1区と比較し有意に高い傾向が見られた（Ｐ＜0.1）。

LTD. Tokyo, Japan），クロロホルムおよびイソ

哺乳期間中である１ヵ月齢時から３ヵ月齢時にプロパノールによって抽出し，complementary

おいては，EXP-1区の体重がCONT-1区に比べ有DNA （以 下 ， cDNA） は ， SuperScript VILO

意に高かったことから，この期間では，単胃動物

Master Mix （Life Technologies Japan Ltd.

と同様に下部消化管での代用乳由来のグルコース

Tokyo, Japan）を用いて，1.5μｇのtotal RNAよや脂肪の吸収および代謝が促されたことにより，り 合 成 し た 。 合 成 し た cDNA 1μL と SYBER

哺乳量の多かったEXP-1区の増体に繋がったもGreenをプレート内で混合し，Thermal Cyclerのと考えられる。一方で，離乳後の４ヵ月齢時かDice Real Time System（TaKaRa Bio, Shiga,

ら７ヵ月齢時においては，体重の差は離乳後に小Japan）によって定量的リアルタイムPCR処理をさくなったことから，哺乳期間中の代用乳のイン行った。その後，StepOne Plus Real Time PCR

パクトが少ないことが示唆される。

System（Life Technologies Japan Ltd., Tokyo,

血液成分は，血漿GH濃度はEXP-1区において，

Japan）によって，Myostatin（MSTN）の遺伝子

３ヵ月齢時に増加傾向が見られたが離乳後は両区発現量を測定した。また，本実験では内部標準遺の間に差は見られなかった。EXP-1区における伝子としてハウスキーピング遺伝子であるRPS18

哺乳条件は最大1,800g/dayであったが，３ヵ月齢を採用し，発現解析を行う遺伝子と併用して測定時の離乳に向けて75日齢から代用乳の給与量は漸を行うことによって，逆転写効率およびCt値を減され，３ヵ月齢時点ではEXP-1区の代用乳給

補正することとした。それぞれの遺伝子は，牛の与量はCONT-1区と同量であったため，GHに有塩基配列を元に設計されたプライマーを用いて測意な差が見られなかった可能性が示唆される。一定した。

方で血漿IGF-1濃度はEXP-1区において有意に高2.5い値を示した。さらに哺乳期間にGH濃度の上昇

統計処理

すべての実験データは，２対の標本におけるｔ検定を用いて有意差検定を行った。

傾向およびIGF-1の有意な増加が見られたことか
ら，初期成長期の栄養素により内分泌管理が可能であることが示唆される。今後は，哺乳期間中の３．結果と考察

代用乳最大給与期間を延長する必要があると推察

哺 乳 量 お よ び 摂 取 養 分 は EXP-1 区 に お い てされる。

３ヵ月間の哺乳期間に摂取した代用乳は，乾物量

遺伝子発現は，５ヵ月齢時においてEXP-1区で有意な差が見られた（Ｐ＜0.01）。また，代用のミオスタチン発現はCONT-1区と比較して発現

乳由来のCP（粗タンパク）摂取量およびCF（粗量の減少傾向が見られた。一方で，７ヵ月齢時の脂肪）摂取量は，EXP-1区が有意に多かった（Ｐミオスタチン発現は両区の間に差は見られなかっ© The Ito Foundation

初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及ぼす影響163た。したがって，初期成長期の栄養環境により離体重は１ヵ月齢時から３ヵ月齢時にかけて

乳後のミオスタチン発現が制御される可能性が示

EXP-1区がCONT－1区と比較し有意に高かった唆された。GHの投与によりミオスタチンは抑制（Ｐ＜0.05）。血漿成分はEXP-1区において３ヵ月される 。したがって，本試験では哺乳期間中の齢時に上昇傾向が見られたが，離乳後は両区の間GH濃度を有意に上昇させることができなかったに差は見られなかった。また，LTにおける５ヵことがミオスタチンの発現制御を離乳後に維持す

月 齢 時 の ミ オ ス タ チ ン 発 現 は EXP-1 区 がることができなかった原因であると推察される。

CONT-1区と比較し減少傾向が見られたが，７ヵ肉質に関しては，脂肪形成や筋線維型を示唆する

月齢時には差が見られなかった。以上より，初期遺伝子発現に変化が無かったことから肉質に差は成長期の栄養素による内分泌管理はミオスタチンないと考えられるが，今後の検討が必要である。

発現を制御する可能性が示唆された。

５）

総括すると，初期成長期の栄養素による内分泌管理はミオスタチン発現の制御が可能であることが示された。しかしながら，90日の哺乳期間のう
ち代用乳最大給与期間が45日間であり，代用乳のインパクトが少なかったために離乳後の血漿成分やミオスタチン発現に明確な差が見られなかったと推察された。
４．要

約

哺乳期間中の代用乳多給は子牛の成長を促進
し，初期成長期の栄養制御は，その後の増体や肉質に影響を及ぼす。しかしながら，初期成長期の栄養素による内分泌管理が成長やミオスタチン発
現に与える影響は不明な点が多い。そこで本研究では，黒毛和種子牛において，哺乳期間中における代用乳給与量の差が初期成長期の成長やミオス

文献１） Hayashi, S., Miyake, M., Watanabe, K., Aso, H.,
Hayashi, S., Ohwada, S., Yamaguchi, T. : Proc Jpn
Acad Ser B, Phys Biol Sci., 84，354～362，2008．
２） David, R. : Clemmons, J Clin Invest., 113, 25 ～ 27,
2004．
３） Takahashi, H., Kurose, Y., Suzuki, Y., Kojima, M.,
Yamaguchi, T., Yoshida, Y., Ogino, M., Hodate, K.,
Azuma, Y., Sugino, T., Kojima, M., Kangawa, K.,
Hasegawa, Y., Kobayashi, S. ; Domest Anim
Endocrinol, 37，55～60，2009．
４） Takahashi, H., Sato, K., Yamaguchi, T., Miyake, M.,
Watanabe, H., Nagasawa, Y., Kitagawa, E., Terada, S.,
Urakawa, M., Rose, M. T., McMahon, C. D.,
Watanabe, K., Ohwada, S., Gotoh, T., Aso, H. :Domest Anim Endocrinol, 48，62～68，2014．
５） Janny, M., Oldham, Claire, C., Osepchook, Ferenc
Jeanplong, Shelley, J., Falconer, Kenneth, G.,
Matthews, John V., Conaglen, David F., Gerrard,
Heather K., Smith, Richard J., Wilkins, James J., Bassand Christopher D., McMahon. : J physiol, 587, 669 ～
677，2009．

タチン発現に及ぼす影響を検討した。

© The Ito Foundation

164

黒毛和種子牛に対する血清亜鉛濃度の基準値の設定
および亜鉛添加による臨床的な疾病予防効果の検討
Basal serum zinc value in Japanese Black calves and effect of supplemental
zinc in Japanese Black calves against clinical diseases

乙

丸

孝之介・窪

田

力・時

森

麻紀子＊

（鹿児島大学共同獣医学部，＊北薩農業共済組合）

Konosuke Otomaru, Chikara Kubota and Makiko Tokimori＊（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University，＊Hokusathu Agricultural Mutual Aid Associations）

Zinc is known to play an important role in regulation of more than 200 enzymes cofactor
in the animal body, and is associated with various functions, including fetal development,
growth, tissue repair, ossification, reproductive system, appetite, and the immune system. The
main zinc deficiency disorders in cattle include swelling of the hocks and knees, as well as
parakeratosis of the skin. Recently, the blood zinc levels of Holstein and Angus calves havebeen reported. However, there have been no reports about the zinc level of Japanese Black
calves. Therefore, the current study was conducted to establish reference values of serum zincin growing stages of Japanese Black calves kept on ordinary farms in Kagoshima Prefecture,
Japan. Four hundreds sixty eight clinically healthy Japanese Black calves on 24 farms, frombirth to 8 months old, were used in the present study. Serum samples were collected once perhead and data were divided into three stage based on their age, which are at suckling stage（889 days of age; n ＝ 162），early growing stage（90-179 days of age; n ＝ 161）
，late growing
stage（180-269 days of age; n ＝ 145）
．The mean concentration of serum zinc in the sucklingstage（mean ± SD；102.7 ± 25.7 μ g/dl）was significantly higher than the early growing stage（93.8 ± 13.5 μ g/dl）（P<0.01）, and tended to be higher than the late growing stage（98.0 ±12.9 μ g/dl）（P<0.1）. The mean concentration of serum zinc in all stages were above 90μg/dl.
The serum zinc values obtained in this study are considered useful as indices for healthmanagement of Japanese Black calves. Further studies of are needed to clearly difference withclinical healthy calves and disease calves of the serum zinc value in Japanese Black calves.

１．目

や膝のふらつき，皮膚のパラケラトーシスなどが的報告されている３，４）。近年，ホルスタイン種子牛

亜鉛は生体内で200以上の補酵素としての役割

やアンガス種子牛における血液中の亜鉛濃度につを持つとともに，成長，組織修復ならびに免疫いての報告５，６）はされているが，これまで我が国機能などさまざまな機能に重要な役割を担って固有の品種である黒毛和種子牛についての報告はいる

されていない。そこで，本研究では鹿児島県内の。牛における亜鉛不足の症状としては肘１，
２）© The Ito Foundation

黒毛和種子牛に対する血清亜鉛濃度の基準値の設定および亜鉛添加による臨床的な疾病予防効果の検討

165

一般的な農場において飼養されていた黒毛和種子（２） 統計方法

牛を対象に血清亜鉛濃度の調査を行った。

得られたデータは平均±標準偏差で示した。各

２．方期の数値の比較には一元配置分散分析を行い，有法

意な差を認めた場合にはTukey-Kramer法により調査では，2014年９月から2015年３月の間に鹿検定した。５％未満の危険率を有意な差とし，児島県内の一般的な24農場で飼養されていた生後10％未満の危険率を差のある傾向とした。統計解から８ヵ月齢までの臨床的に健康な黒毛和種子牛

析にはSPSS Statistics 21（IBM，東京）を用いた。

468頭を供試した。供試牛は，各発育ステージに

３．結果と考察より哺乳期（８～89日齢：162頭），育成前期（90～179日齢：161頭），育成後期（180～269日齢：

哺乳期における血清亜鉛濃度（平均±SD；

145頭）に分類した。１農場につき約20頭の供試

102.7±25.7μg/dl）は，育成前期（93.8±13.5μ牛を選定し分類した。すべての子牛は代用乳にてg/dl）と比較し有意に高く（Ｐ＜0.01），育成後飼養され，２ヵ月齢から３ヵ月齢の間に離乳され期（98.0±12.9μg/dl）と比較し高い傾向であった。各農場おける子牛の飼養頭数は30頭から300た（Ｐ＜0.1）（Table１）。すべての期において血頭であり，すべて子牛は畜舎内で飼養されてい清亜鉛濃度の平均値は90μg/dl以上であった。各た。各農場における給与代用乳の種類は異なって農場における子牛の血清亜鉛濃度は個体としてのおり，給与粗飼料も稲ワラ，イタリアンライグラ

バラつきは見られたが，全体として低値を示す農

ス，オーツ，ローズグラスなど異なっており，さ場はなかった。

らに，給与されていた濃厚飼料の種類もさまざまであったが，基本的に日本飼養標準

日本において，繁殖農場で飼養されている黒毛を満たした

和種子牛のほとんどは８から９ヵ月齢で市場に出飼料給与を行っていた。供試牛からは，頚静脈よ荷される。それゆえ，本研究では８ヵ月齢までのり血清分離用真空採血管を用いて採血を行った。

子牛における血清亜鉛濃度を調査した。本研究に採取した血液は遮光下で20分常温に静置したのおいて，哺乳期の血清亜鉛濃度の平均値は，育成

ち，3,000rpmで20分間遠心して血清を分離し，前期と比較し有意に高く，育成後期と比較し高い－30℃で測定日まで保存した。

傾向であった。本研究において，哺乳期における（１） 亜鉛濃度検査

子牛は代用乳を給与されていたが，育成前期およ血清中の亜鉛濃度はアキュラスオートZn（シび育成後期における子牛はすでに離乳されており

ノテスト，東京）を用いて自動分析装置（7020

代用乳を給与されていなかった。それゆえ，血清型，日立ハイテクフィールディング，東京）にて

亜鉛濃度は，哺乳期では育成前期および育成後期測定を行った。

と比較し高かった要因の１つとして，代用乳中の７）

亜鉛濃度は高いことが推察された。代用乳には高Table１ Serum zinc values of Japanese Black calves
suckling stage（n＝162）

ealry growing stage（n＝161）

late growing stage（n＝145）

102.7±25.7ab

93.8±13.5ａ

98.0±12.9ｂ

Data are expressed as the mean±SD（μg/dl）. a indicate significantly difference between the groups（P＜0.01）. b indicate marginallydifference between the groups（P＜0.1）．

© The Ito Foundation

166

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

濃度の亜鉛が含まれていたものと推察された。血ていた生後から８ヵ月齢までの臨床的に健康な黒清亜鉛濃度の不足値は80μg/dl未満であると報告

毛和種子牛468頭を供試した。サンプルは１農場されている８）。本研究において，血清亜鉛濃度のにつき１回採取し，得られた血清亜鉛濃度データ

平均値はすべて90μg/dlを上回っていた。また，は哺乳期（８日齢～89日齢；ｎ＝162），育成前期

各農場における子牛の血清亜鉛濃度は個体として（90日齢～179日齢；ｎ＝161），育成後期（180日のバラつきは見られたが，全体として低値を示す

齢～269日齢；ｎ＝145）の３期に区分した。その農場はなかったために，子牛への経口的な亜鉛投結果，哺乳期における血清亜鉛濃度（102.7±25.7

与による血清亜鉛濃度の推移の観察や亜鉛添加にμg/dl；平均±SD）は，育成前期（93.8±13.5μよる疾病発症の予防効果を検討するまでには至らg/dl）と比較し有意に高く（Ｐ＜0.01），育成後なかった。しかしながら，本研究で得られた血清期（98.0±12.9μg/dl）と比較し高い傾向であっ亜鉛濃度は，今後，黒毛和種子牛のヘルスマネー

た（Ｐ＜0.1）。すべての期において血清亜鉛濃度

ジメントを行う上での１つの指標として，充分にの平均値は90μg/dl以上であり，不足値とされる利用可能であると考えられる。これまで乳用牛の80μg/dlを上回っていた。本研究において得られ血清亜鉛濃度は乳房炎に罹患すると低下すると報た血清亜鉛濃度は，黒毛和種子牛におけるヘルス

告されている９，10）。また，皮膚真菌症に罹患ある

マネージメントの１つの指標として利用可能であいは下痢症状を呈した子牛は，健康子牛と比較しる。今後，黒毛和種子牛における健康子牛と疾病

血清亜鉛濃度は低下していると報告されてい子牛との血清亜鉛濃度の相違を明らかにするととる。黒毛和種子牛の疾病の約30％は呼吸器病

もに，疾病子牛において亜鉛濃度が不足しているであるとされていることから13），今後，黒毛和種

場合には人工的な投与を行う研究を行うことも必子牛における健康子牛と呼吸器病発症子牛との血要であると考えられた。

11，12）

清亜鉛濃度の相違を明らかにするとともに，呼吸器病子牛において亜鉛濃度が不足している場合には人工的な亜鉛給与を行う研究も必要であると考
えられた。
４．要

約

亜鉛は生体内で200以上の補酵素としての役割を持つとともに，成長，組織修復ならびに免疫機能などさまざまな機能に重要な役割を担っている。近年，ホルスタイン種子牛やアンガス種子牛における血液中の亜鉛濃度についての報告はされているが，これまで我が国固有の品種である黒毛和種子牛について報告はなされていない。そこで本研究では鹿児島県内の一般的な農場において飼養されていた黒毛和種子牛を対象に血清亜鉛濃度の調査を行った。本研究では，24農場で飼養され文献１） Sandstead, H. H. : Understanding zinc: recent
observations and interpretations and interpretations,
The Journal of laboratory and clinical medicine,
124，322～327，1994．
２） Rink, L., Gabriel, P. : Zinc and the immune
system, Proceedings of the Nutrition Society ， 59 ，541～552，2000．
３） P r i c e , J . , W o o d , D . A . : Z i n c r e s p o n s i v eparakeratosis and ill-thrift in a Friesian calf,
Veterinary Record，110，478，1982．
４） Smart, M. E., Gudmundson, J., Christensen, D. A.
: Trace Mineral Deficiencies in Cattle : A Review.
The Canadian veterinary journal ，22 ，372 ～ 376 ，
1981．
５） Graham, T. W., Breher, J. E., Farver, T. B., Cullor,J. S., Kehrli, M. E., Oberbauer, A. M., Sandstead, H. H.
: Biological markers of neonatal calf performance :the relationship of insulin-like growth factor-I, zinc,and copper to poor neonatal growth, Journal ofanimal science，88，2585～2593，2010．
６） Pavlik, A., Jelinek, P., Matejicek, M., Illek, J. :© The Ito Foundation

黒毛和種子牛に対する血清亜鉛濃度の基準値の設定および亜鉛添加による臨床的な疾病予防効果の検討
Blood Plasma Metabolic Profile of Aberdeen Angus
Bulls during Postnatal Ontogenesis, Journal Acta
Veterinaria Brno，79，419～429，2010．
７） 農業・食品産業技術総合研究機構編：日本飼養標準肉用牛．中央畜産会，東京，2008．
８） Radostits, O. M., Gay, C. C., Hinchcliff, D. C.,
Constable, K. W. : Disease associated with nutritional
deficiencies. In: Veterinary Medicine, 10th Edition. A
textbook of the diseases of cattle, horses, sheep, pigs
and goats. 1698～1770, Saunders Ltd. London，2007．
９） E r s k i n e , R . J . , B a r t l e t t , P . C . : S e r u mconcentrations of copper, iron, and zinc during
Escherichia coli-induced mastitis, Journal of dairy
science，76，408～413，1993．
10） Middleton, J. R., Luby, C. D, Viera, L., Tyler, J. W.,
Casteel, S. : influence of Staphylococcus aureus

167

intramammary infection on serum copper, zinc, andiron concentrations, Journal of dairy science ， 87 ，976～979，2004．
11） Nisbet, C., Yarim, G. F., Ciftci, G., Arslan, H. H.,
Ciftci, A. : Effects of trichophytosis on serum zinclevels in calves, Biological Trace Element
Research，113，273～280，2004．
12） Ranjan, R., Naresh, R., Patra, R. C., Swarup, D. :Erythrocyte lipid peroxides and blood zinc andcopper concentrations in acute undifferentiateddiarrhoea in calves, Veterinary ResearchCommunications，30，249～254，2006．
13） 乙丸孝之介：育成牛におけるワクチネーションによる呼吸器病対策，家畜感染症学会誌，３，105～
110，2013．

© The Ito Foundation

168

和牛肉に含まれる機能性成分を左右する要因の検索
The factor of functional component on Wagyu meat

平

山

琢

二

（琉球大学農学部）

Takuji Hirayama（Faculty of Agriculture, University of the Ryukyus）

In this examination, we studied the effect of breed（Wagyu and F1）and sex（heifer andsteer）on the functionality composition of meat（39 head sample; Wagyu-heifer: 16 head,Wagyu-steer: 11 head, F1-steer: 12 head). In fatty acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid,milli strain acid, palmitoleic acid, oleic acid and linoleic acid were detected. In amino acid,aspartic acid, glutamic acid, asparagine, serine, glycine, threonine, alanine, lysine, proline,
histidine, arginine, tyrosine，2-amino-3-methylbutyric acid, methionine, tryptophan,
phenylalanine, iso leucine, leucine, glutamine, beta alanine, carnosine, towering, anserine andcystine were detected. In the meat of wagyu-heifers, carnitine, hematin, oleic acid, flavor,
sweetness, bitterness content were higher than in other meat. The results suggested thatflavor of beef meat was effected by breed. From this result, it is possible to explain the flavorof Matsusaka and Tajima beef（using wagyu-heifers）which is the worldwide brand. In future,
it will be necessary to consider the relation between the fattening period and the genetic
background.

１．目

立など，課題は山積みである。ダイエットなどで的取り上げられるカルニチンは，牛肉中に多量に含健康食ブームに関連して「牛肉」の持つ機能性有されるが，これまでの肥育法ではその含量は低が問われている。これまで牛肉，特に和牛肉は嗜下するとされており，新たな肥育技術の確立が要好品としての価値が高く機能性に関する意識は希求されている。また，カルノシンなどの運動能力薄であり，消費者視点もない場合が多かった。しを向上させる水溶性低分子化合物についても同様

かし，時勢を背景に今後の和牛肉の生産拡大を考なことが言われている状況であり，給与飼料や肥えた場合，和牛肉の持つ機能性を最大限にアピー

育期間などを含めた総合的な検討が必要である。

ルしていく必要がある。しかし，機能性を持った

これまでに報告されてきた牛肉の機能性とし牛肉，もしくは人の健康に貢献できる抗酸化作用て，健脳効果，脂肪燃焼促進作用，貧血予防効果，

を強く有する牛肉の安定的に生産できる技術の確

酸化抑制作用，血圧降下作用，体脂肪低減効果な© The Ito Foundation

和牛肉に含まれる機能性成分を左右する要因の検索169どがある。これまでの牛肉に対する“美味しい牛は飽和および不飽和脂肪酸に分けて分析し，アミ肉”に加えてこのような健康維持および健康促進

ノ酸組成は，旨み成分，甘み成分，苦み成分およにつながる機能性成分をより多く含有する牛肉のび機能性成分に分けて検討を行った。

安定的な生産を行うことで，和牛肉消費をより一層促進させ，産業の活性化に貢献できる。また，

３．結果と考察

牛肉の赤身肉には貧血予防に効果的とされるヘム

Fig.１にサンプル肉中に含まれるカルニチンお鉄や，脳機能を維持し，うつ病を改善するセロト

よびヘム鉄の割合を示した。肉中に含まれるカルニンを合成するトリプトファン，血圧降下作用，

ニチンおよびヘム鉄の割合は和牛の未経産牛肉，

肝機能向上作用があるタウリンといった機能性を

去勢牛肉およびＦ１去勢牛肉の順で低くなった。

有したアミノ酸が多く含まれていることが報告さ

Ｌ-カルニチンは，アミノ酸のＬ-リジンとＬ-メ

れており，牛肉の赤身部位は我々消費者の健康増

チオニンを原料として肝臓や腎臓で合成される機進において今後ますます重要な食材だと考えられ能性ペプチドで，特に反芻動物である牛や羊で合

る

１～３）

成能が高く，その肉中に多く含まれるとされてい一方，和牛に成長や肉質に関連の深い遺伝子型

る。また，Ｌ-カルニチンは放牧などで飼育され（GH, SCD, FASN）の存在が認められ，それら遺る繁殖牛の肉中に豊富に含まれることが報告され

伝子型の違いによって生長量や肉質が異なるとさている。また，ヘム鉄は赤身部分などの色が濃くれる報告があり，このような遺伝子型との関連性

肉色素含量が多い部位に多く含まれている。ヘムについても検討する必要がある。

鉄は鉄欠乏性貧血予防効果があるとされ，特に肉。

上述したことを背景に，今回の研究では，ミー

色素中のヘム鉄は，腸管での吸収率が野菜などにトエフェクトと呼ばれる機能性成分（カルニチ

含まれるヘム鉄に比べ高いことから，鉄欠乏性貧ン，アミノ酸，脂肪酸など）の牛肉中の含有量と血予防効果が高いと言われている。今回の調査か

品種や雌雄の関連性について検討し，機能性成分

ら，和牛肉はＦ１肉よりも多くのカルニチンおよにあたえる因子について検討することを目的とし

びヘム鉄が含まれている可能性が示唆された。また。

た，和牛でも未経産牛肉が去勢牛よりも，その割２．方合が増加する可能性が認められた。

法

Fig.２にサンプル肉中に含まれる脂肪酸組成を

本試験では，国内で肥育された黒毛和種未経産示した。飽和脂肪酸であるミリスチン酸，パルミ

牛16頭，黒毛和種去勢牛11頭，およびＦ１去勢牛

チン酸およびステアリン酸，モノ不飽和脂肪酸で12頭の合計39頭の牛肉を供試した。本試験で調査あるミリストレイン酸，パルミトレイン酸およびに用いた部位は胸最長筋とした。サンプル牛肉

オレイン酸，ジ不飽和脂肪酸であるリノール酸がは，サンプル採取後，分析に供するまで－30℃下検出された。脂肪酸割合では，オレイン酸割合がで保存した。分析項目は，得られた肉サンプル中最も高くなり，次いでパルミチン酸，ステアリンの総カルニチン，ヘム鉄，脂肪酸組成，およびア酸が高くなった。また，オレイン酸は和牛の未経

ミノ酸組成とした。得られた結果について，供試

産牛肉，去勢牛肉およびＦ１去勢牛肉の順で低く

牛の品種および性を要因として分析を行い，それなる傾向を示した。パルミチン酸は，和牛去勢牛らの関連性について検討した。なお，脂肪酸組成

肉が他の牛肉に比べ低くなる傾向にあった。ステ© The Ito Foundation

170

平成26年度160.0

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）
70.0: Carnitine（mg/100g）: Hematin
（%）

140.0
120.0

60.0

: SFA (%)

: MUFA (%)

wagyu-ox

F1-ox

50.0

100.0
80.0

40.0

60.0

30.0

40.0

20.0

20.0

10.0

0.0

wagyu-heifer

wagyu-ox

F1-ox

0.0

Fig. 1 Carnitine and hematin content of wagyu-heifer,wagyu-ox and F1-ox meat

wagyu-heifer

Fig. 3 SFA and MUFA content of wagyu-heifer,wagyu-ox and F1-ox meat60.0 （%）: Wagyu-heifer: Wagyu-ox: F1-ox50.0
40.0

そのことから，本調査において，美味しさの観点から和牛の未経産牛肉が最も高く評価される可能30.0

性が示され，オレイン酸含量との関連も含め，今20.0

後詳細に検討する必要があろう。またその一方

10.0

で，肉中脂肪酸の不飽和度は，肉質に関連する遺

0.0

C14_0

C14_1

C16_0

C16_1

C18_0

C18_1

C18_2

Fig. 2 Fatty acid composition of wagyu-heifer, wagyu-

ox and F1-ox meat

伝子多型との関連性が認められており，その点で今後，SCD遺伝子型やFASN遺伝子型などの肉中脂肪酸の不飽和化に関連性のある遺伝子多型の違いも含めて検討する必要があろう。またこれらのアリン酸はオレイン酸とは逆に和牛の未経産牛

遺伝子発現には肥育期間も関連している可能性が肉，去勢牛肉およびＦ１去勢牛肉の順で高くなるあることから，肥育期間についても合わせて検討

傾向を示した。この中でオレイン酸は牛肉の美味する必要があると考える。

しさの指標にも用いられる場合があり，本調査にFig.４にサンプル肉中に含まれるアミノ酸組成

おいて，和牛の未経産牛肉で最も高くなり，Ｆ１を示した。旨み成分とされるアスパラギン酸，グで最も低くなったことは我が国におけるブランド

ルタミン酸およびアスパラギン，甘み成分とされ牛肉の美味しさを考える上で大変興味深い結果でるセリン，グリシン，スレオニン，アラニン，リある 。

ジンおよびプロリン，苦み成分とされるヒスチジ

４）

Fig.３にサンプル肉中に含まれる脂肪酸組成をン，アルギニン，チロシン，バリン，メチオニン，

飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸に分けて示した。

トリプトファン，フェニルアラニン，イソロイシ

飽和脂肪酸の割合はＦ１去勢牛肉が他の牛肉に比ンおよびロイシン，機能性成分とされるグルタミ

べ高くなる傾向にあった。不飽和脂肪酸の割合はン，ベータアラニン，カルノシンとタウリン，ア

和牛の未経産牛肉，去勢牛肉およびＦ１去勢牛肉

ンセリンおよびシスチンが検出された。いずれのの順で低くなる傾向がみられた。肉中の不飽和脂

牛肉においてもカルノシンとタウリン割合が最も

肪酸割合は，食味官能評価試験とも関連性が高高くなり，さらに和牛の去勢牛肉が最も高く，次く，特に多汁性との関連性が示唆されている 。

いで和牛の未経産牛肉およびＦ１去勢牛肉の順と５）© The Ito Foundation

171

和牛肉に含まれる機能性成分を左右する要因の検索
12.0 （%）: Wagyu-heifer: Wagyu-ox: F1-ox

10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0

p

As

ut

Gl

n

As

r

Se

n

Gl

in

ys

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Ty

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Tr

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s

Ly

o

Pr

Fig. 4 Amino acid content of wagyu-heifer, wagyu-ox and F1-ox meat

なった。牛肉の美味しさと関連が深いとされるグ

さらに，和牛の未経産牛肉では機能性成分の一つ

ルタミン酸は，和牛の未経産牛肉が他の牛肉に比であるカルニチンやヘム鉄含量も高くなる傾向が

べて高くなる傾向にあり，脂肪酸組成と合わせ示されており，品種および性の影響がある可能性て，牛肉の美味しさという点で大変興味深い結果が高い。ただし，機能性成分全体としては，和牛が得られた６，７）。

の未経産牛肉は最も低くなっていることから，そFig.５にサンプル肉中に含まれる旨み成分，甘れらを構成するグルタミン，ベータアラニン，カみ成分，苦み成分および機能性成分割合を示し

ルノシンとタウリン，アンセリンおよびシスチンた。今回の調査において，肉中に含まれる旨み成割合について，今後詳細に検討する必要がある。

分，甘み成分および苦み成分割合は，いずれも和

今回の調査では，和牛の未経産牛肉が同じ和牛

牛の未経産牛肉，去勢牛肉およびＦ１去勢牛肉のの去勢牛肉やＦ１の去勢牛肉に比べ，機能性成分

順で低くなる傾向にあった。機能性成分は和牛のであるカルニチンやヘム鉄，美味しさに関連の深去勢牛肉が最も高く，次いでＦ１去勢牛肉およびいオレイン酸，さらに牛肉の旨み，甘みおよび苦和牛の未経産牛肉の順となった。牛肉の美味しさ

み成分などにおいて高くなる傾向がみられた。こに関連する旨み，甘みおよび苦みの成分割合が和れは，我が国を代表する世界的ブランドでもある

牛の未経産牛肉で最も高くなったことは，オレイン

松阪牛や但馬牛などの未経産牛を用いた和牛肉の酸含量と合わせて極めて興味深い結果を示した 。

美味しさを説明できる可能性があり，その点でこ８）

れら成分との関連性の重要性が示唆された。今後，肥育期間との関連についても検討する必要が

14.0
12.0

ある。その一方で，性の影響や品種の影響もあり，: Wagyu-heifer: Wagyu-ox: F1-ox10.0
8.0

それらの関連性に与える給与飼料や飼養環境の影
響も合わせて今後詳細に検討することが必要であ6.0

る。また，その一方で，美味しさに関連する遺伝4.0

子多型との関連も含めて検討する必要があろう。

2.0
0.0

FlavorSweetness

Bitterness

Fanctionality

Fig. 5 Fanctionality composition of wagyu-heifer,wagyu-ox and F1-ox meat

４．要

約

今回の研究では，ミートエフェクトと呼ばれる© The Ito Foundation

172

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

機能性成分（カルニチン，アミノ酸，脂肪酸など）の牛肉中の含有量と品種や雌雄の関連性について検討することを目的とし，国内で肥育された黒毛
和種未経産牛16頭，黒毛和種去勢牛11頭，および
Ｆ１去勢牛12頭の合計39頭の牛肉を供試して，試験を実施した。和牛の未経産牛肉が同じ和牛の去勢牛肉やＦ１の去勢牛肉に比べ，機能性成分であるカルニチンやヘム鉄，美味しさに関連の深いオ
レイン酸，さらに牛肉の旨み，甘みおよび苦み成分などにおいて高くなる傾向がみられ，牛肉の美
味しさが性と大きく関連している可能性が示唆され，次いで品種の違いも関連があることが考えられた。
文献１） 中井博康，池田敏雄，安藤四郎，小堤恭平，田村久子，荒牧秀俊：市場牛肉質性状の実態調査，畜産試験場年報，25，151～162，1987．

２） 岩間永子，谷田部隆，齋藤隆夫，合原義人：銘柄牛のうま味成分に関する試験研究，茨城県畜産セン
ター研究報告，43，32～34，2010．
３） 古賀照章，中島純子，近藤君夫，唐沢秀行：牛肉の脂肪酸組成およびアミノ酸組成に及ぼす各種要因について，長野県畜産試験場松本家畜保健衛生所，https://www.pref.nagano.lg.jp/enchiku/sangyo/
nogyo/chikusan/kairyou/documents/saport04.pdf ，
2008．
４） 平山琢二，北内毅，眞榮田知美，藤原望，平川守彦，及川卓郎：長期肥育和牛肉の食感および食味に関する官能評価について，日本暖地畜産学会報，56（１），67～71，2013．
５） 板倉弘重，柴田博，高田明和，松川正，西村敏英，
沖谷明紘：牛肉の魅力，（財）日本食肉消費総合セン
ター，８～65，2010．
６） 渡辺彰，滝本勇治，西村宏一，常石英作：肥育牛の各種筋肉間における熟成後の遊離アミノ酸およびタウリン含量の差異，日畜会報，60，303～305，
1988．
７） 本郷富士弥，加香芳孝：食肉の風味成分に関する
研 究 ，琉 球 大 学 農 学 部 学 術 報 告 ，第 20 号 ，253 ～
259，1973．
８） Hornstein, I., Crowe, P. E., Sulzbacher, W. L. :Constituents of meat flavor : beef, J Agr, Food
Chem，８，65～67，1960．

© The Ito Foundation

173

黒毛和種ゲノムDNAメチル化多型と肉質形質との関係に関する研究The research for relationships among genome DNA methylation
polymorphism and carcass traits in Japanese beef cattle

須

田

義

人

（宮城大学食産業学部）

Yoshihito Suda
（School of Food, Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

Heritabilities of quality, tenderness and marbling of meat of Japanese Black cattle（JB）
range between 0.3 and 0.6, and meat of JB, known as Wagyu, has become very popularworldwide for its quality. However the main mechanism of developing their characteristicfeatures are not well understood although many researchers have reported SNPs and QTLs
which may be concerning with them. Today, we know that DNA methylation to CG richregions in the upstream region of a start codon, ATG, controls the expression of many genes
on a genome wide level, and a part of methylation patterns（DMP）is specific by each tissueand differentiation stage. In its process, it might reflect the environmental effects such as
feeding condition, stress and so on. So the relationships among quantitative traits are affectedby environmental effects and these might also be affected by DNA methylation. This studyʼsaims are to examine relationships among DMP at the slaughter after fattening and economic
carcass traits of JB siblings of two sires. Genomic DNA samples were collected from adipose
tissues around the kidneys in each 100 JBs produced from 2 sires（Sire A and B）have parentchild relation, totaling of 200 JBs. To search DMP, EpiXplore Methylated DNA Enrichment Kit,
EpiScope Promoter qPCR Array（Human）and SYBR Premix Ex Taq GC（Perfect Real Time）
of TAKARA was used respectively. Correlation analysis and analysis of variance（ANOVA）
are performed by using SAS program, version 9.1. The CG rich regions in the upstream
regions of seven genes, APC_2, CDKN2A_1, CDKN2A_2, CDKN2B, GSTP1, MGMT and SFRP1
of 24 genes were very high DNA methylation level, and DMP in the other genes was similar
between 2 sires with parent-child relation. Additionally, CDKN2A_2 and RB1 was specificcondition. Correlation between subcutaneous fat thickness and CHFR was 0.73 at 5％
significance level in JBs of sire A.

１．目

は，日本食ブームとともに国内外で注目され，肥的育などの技術も我が国農家の固有なものと考えら

我が国の黒毛和種の脂肪交雑などの肉質特性れるようになっており，世界における優位性を© The Ito Foundation

174

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

保っている。近年，分子生物学的技術が発達し，性についてとても興味深いと考えられる。もし，ヒトや豚とともにゲノム解析が進んでいること

DNAメチル化度（一部の領域も含む）と枝肉成で，脂肪交雑や肉質特性に関わる分子形成メカニ

績との相関性が高い場合，若齢期あるいは初期分ズムの解明も近いと考えられてきたが，やはり量化ステージでの多型様式から早期に能力判定が可的形質である経済形質にはおびただしい数の遺伝能であり２），現行の改良モデルによる育種価の正子が関与しており，その貢献遺伝子群の特定や形確度を高めるものと期待できる。以上のことか

成機構の解明は困難を極めている。他方，特に霜ら，今回は親子関係にある２種雄牛由来のゲノム

降り特性は遺伝率が約60％と遺伝性が高く，特定DNAを供試して，ヒトゲノムでのメチル化促進

品種かつ特定家系での現出は貢献遺伝子群の存在領域とされる遺伝子上流域34領域を選択し，メチを強く期待させるものである。近年のQTL情報

ル化度（メチル化割合）を調査，比較した。また，やSNP情報の経済形質への寄与率は低く，２万か

それらと枝肉成績との相関解析も行った。

ら３万個あるとされる遺伝子群からこれらの情報を用いて量的形質に関わる貢献遺伝子を絞り込む

２．方法

ことは現段階では見通しが立っていない。また，

2.1

量的形質の多くは，遺伝要因のみならず環境要因

親子関係にある基幹種雄牛２頭（子Ａおよび父の影響も強いことから，改良マーカーとして安定Ｂ）の産子各100頭，計200頭の枝肉腎周囲脂肪を的にかつ早期に判断できるものとしては，遺伝要採取し，ゲノムDNAを抽出するまで－20℃で保因のみならず“環境要因”の両面を反映させるも管した。ゲノムDNAの抽出は，QIAamp Ⓡ DNAのであることが必須であり，また多くの遺伝子にMini Kitを用いた。以後，キット付属のプロトコ共通した分子メカニズムを持っていることが重要

ルに従って行った。

供試材料およびゲノムDNAの抽出である。本研究では，多型評価できるメカニズム

2.2のエピジェネティック機構，特にゲノムDNAの

Vibra cell（SONICS社）を用いて，抽出したメチル化機構に焦点をあてた。一般的に知られてゲノムDNAを冷却下で超音波剪断処理を行い断いるDNAのメチル化機構が基本的な考え方で，片化を行った。条件はAMPL30％で35秒とした。

遺伝子のmRNA発現量とタイミングを調節して

EpiXploreTM Methylated DNA Enrichment Kit

いるもので，プロモーター領域のCpGリッチ領域（タカラバイオ社）を用いてメチル化DNAの濃縮のシトシンをメチル化することで多くの遺伝子のを行った。以後の手順は，付属のプロトコルに発現量を共通して抑制する機構である。このメカ

従って行った。濃縮されたメチル化DNAを精製

ニズムが発生や分化の促進に伴って組織および環するためにエタノール沈殿法３）で行い，さらに境特異的に変化し，ゲノムワイドに変化して組織

CENTRI-SEP Spin Columns （Princetonの特性を構築することに強く貢献すると考えら

Separations社）を用いて精製した。得られたサれ，塩基配列非依存遺伝子発現調節機構と考えら

ンプルを以後の解析に用いた。

超音波破砕およびメチル化DNAの濃縮れる。黒毛和種の脂肪交雑は，たとえ同一の家系

2.3

や両親であっても，飼料，農家，期間，ほか様々解 析 に は EpiScope Ⓡ Promoter qPCR Array

な要因で同程度なものにならないことは知られて（Human）（タ カ ラ バ イ オ 社） お よ び SYBR Ⓡ

おり１），エピジェネティック機構との関係や相関

Premix Ex TaqTM GC （Perfect Real Time）（タ© The Ito Foundation

ゲノムDNAのメチル化割合の解析

黒毛和種ゲノムDNAメチル化多型と肉質形質との関係に関する研究

175

カラバイオ社）を用いた。以後は，付属のプロト化状態は，顕著な特徴であり，改良のためのエピコルに従った。各サンプルおけるDNAの相対量

ゲノムマーカーとして有効であることが期待されを推定するためにリアルタイムPCR法を用い，そた。さらなる発見として，種雄牛ＡおよびＢの産のときのThreshold（dRn）値を0.02に設定した。

子において，CCNA1，DAPK1，PTGS２，そしそ の 後 ，タ カ ラ バ イ オ 社 よ り 公 開 さ れ て い るてWT１の上流域は，それぞれ100％低メチル化

EpiScope Promoter qPCR Array Analysis Tool

状 態 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。加 え て ，を用いて高メチル化割合と低メチル化割合をそれ

CDH1，CHFR，そしてMLH１はそれぞれ高メチ

ぞれ算出した。本報告においては，高メチル化状

ル化割合が低い傾向であることが明らかとなっ態のDNA画分に関する解析結果を示した。

た。これらの知見は種特異的もしくは高能力牛が

2.4

統計解析

持つ選抜に伴う特異的な特徴である可能性があ

統計解析には，SAS（バージョン9.1）プログり，さらなる追跡調査に加えて細胞レベルでのIn

ラムおよびGLMプロシージャおよびCORRプロ

Vitro研究の実施が必要であると考えている４～６）。

シージャを用いて検討した。今回分析に用いた枝

種雄牛Ａにおいて枝肉重量（CW）とLINE-１

肉成績は，出荷月齢が有意であるものについて平

上流域の高メチル化割合との間に有意な正の相関

均月齢に線形補正し，高メチル化割合（メチル化（0.46）が認められた（Ｐ＜0.05）。さらには，皮度）の格付け間での比較，さらには相関解析を

下脂肪厚とBNIP３との間に有意な負の相関（－行った。相関解析では５％水準で無相関検定を0.48），そしてCHFRとの間に高い有意な正の相関行った。

（0.73）がそれぞれ認められた（Ｐ＜0.05）。特に，遺伝子CHFRは顕著に高い正の相関性があり，こ３．結果と考察の遺伝子はＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼを今回調査した遺伝子の上流域に関して，人およ

コードしており，筋肉細胞あるいは脂肪細胞におびウシゲノム情報をもとにBLAST解析を行い相ける機能性に影響を与える重要な因子であること

同性について検討したところ，すべての遺伝子上から，メチル化状態が枝肉形成に相関性があるこ流域において70％から80％程度一致していた。

とが推察された。この知見は，改良のための有効種 雄 牛 Ａ の 産 子 に お い て ，遺 伝 子 APC_2 ，なエピゲノムマーカーの存在を示唆するものと考CDKN2A_1，CDKN2B，GSTP1，MGMT，そしえられる。一方で，種雄牛Ｂにおいては，枝肉重てSFRP１の上流域においてはＡ３からＡ５まで

量とCDKN2A_１との間に有意な正の相関（0.49）

各格付け間で差異はなく，組織内の高メチル化割が認められた（Ｐ＜0.05）。他の形質については合が高い傾向にあった（Fig.１）。一方で，種雄

有意な相関は認められなかった。

牛Ｂの産子においても同様の傾向がみられたが，種雄牛Ａが子，種雄牛Ｂが父という親子関係に

特にCDKN2A_２は種雄牛Ｂの方が平均的に高ある高能力種雄牛であり，それらの産子におけるかった（Fig.２）。さらには，種雄牛ＡのRB１は34種類の遺伝子上流域の高メチル化割合の傾向は

格付けＡ４で高メチル化割合が高く，それ以外の類似している傾向にあったが，数種の特徴的な遺格付けでは低メチル化の割合が高いことが明らか

伝子上流域が明らかとなった。特に，CDKN2A_となった。この傾向は種雄牛ＢのＡ３においても２およびRB１はさらなる検討を要する興味深い確認された。この両遺伝子上流域におけるメチル

遺伝子上流域であると考えられた。また，種雄牛© The Ito Foundation

176

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
-20.0

APC_1
APC_2
BNIP3
BRCA1
CADM1
CCNA1
CDH1
CDKN2A_1
CDKN2A_2
CDKN2B
CHFR
DAPK1
FHIT
GSTP1
LOX
MGMT
MLH1
PTGS2
RASSF1_1
RASSF1_2
RB1
SFRP1
VHL
WT1

Relative methylation degree（%）

100.0

Searched genes
Fig. 1 Methylation degree in adipose tissue around the kidney of Sire Aʼs child■Ａ５□Ａ４ ■Ａ３

80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
-20.0

APC_1
APC_2
BNIP3
BRCA1
CADM1
CCNA1
CDH1
CDKN2A_1
CDKN2A_2
CDKN2B
CHFR
DAPK1
FHIT
GSTP1
LOX
MGMT
MLH1
PTGS2
RASSF1_1
RASSF1_2
RB1
SFRP1
VHL
WT1

Relative methylation degree（%）

100.0

Searched genes
Fig. 2 Methylation degree in adipose tissue around the kidney of Sire Bʼs child© The Ito Foundation■Ａ５□Ａ４ ■Ａ３

177

黒毛和種ゲノムDNAメチル化多型と肉質形質との関係に関する研究
Table 1 C o r r e l a t i o n s a m o n g c a r c a s s t r a i t s a n dTable 2 C o r r e l a t i o n s a m o n g c a r c a s s t r a i t s a n dmethylation degree of 28 upstream regions in 16
genes of the cattle produced from sire A.

methylation degree of 28 upstream regions in 16
genes of the cattle produced from sire B.

Gene

BMS

CW

LEA

RLT

SUB

Gene

BMS

CW

LEA

RLT

APC_1

0.18

0.08

0.14

－0.16

－0.30

APC_1

0.32

0.39

0.34

0.35

APC_2

0.11

－0.05

－0.20

－0.07

0.05

APC_2

0.09

－0.13

0.22

0.03

BNIP3

0.22

－0.26

0.24

－0.09

－0.48＊

BNIP3

0.26

－0.08

－0.34

－0.11

BRCA1

0.18

－0.28

0.04

0.05

－0.38

BRCA1

0.19

－0.13

－0.15

－0.19

CADM1

－0.31

0.27

－0.22

0.13

0.39

CADM1

0.04

0.18

0.41

0.28

CDH1

－0.07

0.11

－0.17

－0.22

－0.35

CDH1

0.13

－0.08

0.17

0.16

CDKN2A_1

0.08

－0.30

－0.10

－0.03

0.21

CDKN2A_1

－0.12

－0.02

0.09

－0.25

CDKN2A_2

0.22

－0.08

－0.06

0.21

－0.23

CDKN2A_2

0.19

0.49＊

0.40

0.45＊

CDKN2B

0.23

0.06

0.13

0.29

0.35

CDKN2B

－0.08

0.05

0.16

－0.28

CHFR

－0.17

0.26

－0.14

0.27

0.73＊

CHFR

0.33

－0.07

0.04

0.03

DAPK1

－0.20

0.41

－0.37

0.25

0.40

DAPK1

0.04

－0.29

－0.15

－0.09

FHIT

－0.21

－0.05

0.16

－0.03

0.03

FHIT

－0.06

－0.11

－0.22

－0.32

GSTP1

0.03

－0.15

0.31

0.03

－0.02

GSTP1

0.20

－0.35

－0.05

－0.25

MGMT1

0.14

－0.31

－0.05

0.00

0.24

MGMT1

0.36

0.17

0.13

0.27

MLH1

－0.17

0.33

0.05

0.08

－0.04

MLH1

－0.12

－0.16

－0.31

－0.07

RASSF1

－0.06

0.12

0.37

－0.30

－0.19

RASSF1

－0.11

－0.20

－0.13

－0.24

SFRP1

0.30

－0.36

0.12

－0.14

－0.24

SFRP1

－0.19

－0.07

0.00

－0.18

－0.07

0.46＊

－0.01

0.22

0.00

LINE-1

－0.39

0.14

－0.11

0.00

LINE-1

BMS ; bovine marbling score, CW ; carcass weight, LEA ; loin

BMS ; bovine marbling score, CW ; carcass weight, LEA ; loin

eye area, RLT ; Rib loin thickness, SUB ; Subcutaneous fat

eye area, RLT ; Rib loin thickness

thickness＊；It was at 5％ of significance level.

＊；It was at 5％ of significance level.

ＡおよびＢ間で比較すると，Ａの方の産子の枝肉

SNP解析情報の経済形質への寄与度はそれぞれ１

成績が良いことが知られており，CHFRの高メチ～５％程度と低いため，貢献遺伝子群の特定は困ル化割合との関係性が強いと推察された。これら

難とされている。そして，量的形質は遺伝およびの遺伝子に関するさらなる研究が重要であると考

環境要因の影響を受けると考えられ，正確度の高えられた７）（Table１, Table２）。

い育種改良には双方を総合的に考慮する必要があ

４．要る。そこで今回は，親子関係にある２種雄牛由来

約のゲノムDNAを供試して，ヒトゲノムでのメチ

黒毛和種の脂肪交雑をはじめとした良肉質は国

ル化促進領域とされる遺伝子上流域34領域を選択

内外で注目されている。その優れた経済形質へのし，メチル化度（メチル化割合）を調査，比較し貢献遺伝子群や形成機構は解明されていない。一た。また，それらと枝肉成績との相関解析も行っ方で，脂肪交雑特性など量的形質の遺伝率は約た。

60％と高く，その貢献遺伝子の存在が強く期待さ高能力種雄牛であるＡおよびＢ産子各100頭計

れたが，量的形質の発現に関与する遺伝子群は膨200頭の腎周囲脂肪由来ゲノムDNAを供試した。

大 で あ り ，塩 基 配 列 多 型 に 基 づ く QTL お よ び

ヒトでDNAメチル化の影響を受けることが明ら© The Ito Foundation

178

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

かになっている全34種の遺伝子プロモーター領域
を対象にタカラバイオ社製キットを用いてメチル
化DNA抽出濃縮およびリアルタイムPCR法との組み合わせにより脂肪組織内のDNAメチル化割合を算出した。また，DNAメチル化割合の結果と枝肉成績との相関解析を行った。その結果，種雄牛Ａが子，種雄牛Ｂが父という親子関係にある
高能力種雄牛であり，それらの産子における34種
類の遺伝子上流域の高メチル化割合の傾向は類似している傾向にあったが，数種の特徴的な遺伝子
上流域が明らかとなった。特に，CDKN2A_２およびRB１はさらなる検討を要する興味深い遺伝
子上流域であると考えられた。また，種雄牛ＡおよびＢ間で比較すると，Ａの方の産子の枝肉成績が良いことが知られており，CHFRの高メチル化
割合との関係性が強いと推察された。これらの遺伝子に関するさらなる追跡研究および細胞レベルでのIn Vitro研究が重要であると考えられた。

文献１） 横田祥子，杉田春奈，大友良彦，須田義人，鈴木
啓一：黒毛和種牛肉における脂肪酸組成と枝肉形質
および肉質形質との遺伝的関係，東北畜産学会報，
60（３），80～85，2011．
２） 佐々木裕之：エピジェネティクス入門，岩波書店，
2008．
３） Zeugin, J. A., Hartley, J. L. : Ethanol Precipitationof DNA. Focus,７（４），１～２，1985．
４） Esteller, M., Corn, P. G., Baylin, S. B., Herman, J.
G : A gene hypermethylation profile of humancancer. Cancer Res , 61（８），3225～3229，2001．
５） Kaneda, M., Akagi, S., Watanabe, S., Nagai, T. :Comparison of DNA methylation levels of repetitive
loci during bovine development, BMC Proc., Jun 3;5
Suppl 4:S3. doi：10.1186/1753-6561-5-S4-S3，2011．
６） Fraga, M. F., Ballestar, E., Paz, M. F., Ropero, S.,
Setien, F., Ballestar, M. L., Heine-Suñer, D., Cigudosa,
J. C,. Urioste, M., Benitez, J., Boix-Chornet, M.,
Sanchez-Aguilera, A., Ling, C., Carlsson, E., Poulsen,
P., Vaag, A., Stephan, Z., Spector, T. D., Wu, Y. Z.,
Plass, C., Esteller, M. : Epigenetic differences arise
during the lifetime of monozygotic twins, Proc Natl
Acad Sci USA, 102（30），10604～10609，2005．
７） Daugela, L., Nüsgen, N., Walier, M., Oldenburg, J.,
Schwaab, R., El-Maarri, O. : Measurements of DNA
methylation at seven loci in various tissues of CD1
mice, PLoS One, 7（９）, e44585. doi ： 10.1371/
journal.pone.0044585. Epub 2012 Sep７，2012．

© The Ito Foundation

179

牛白血病ウイルスの垂直伝播に関する研究
Studies on perinatal transmission of bovine leukemia virus

目

堅

博

久

（宮崎大学農学部獣医学科）

Hirohisa Mekata（Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Bovine leukemia virus（BLV）is the causative agent of enzootic bovine leukosis（EBL）.
Many BLV-infected cattle remain asymptomatic carriers of the virus. However，1-5％ develop
EBL, which is characterized by fatal lymphoma or lymphosarcoma several years after infection.
Understanding perinatal transmission of BLV is essential for constructing effective
countermeasures against BLV infection. However, the rate of perinatal transmission is
uncertain, as larger sample sizes are needed to assess this. This study investigated thefrequency of perinatal BLV infection under field conditions and evaluated some of the risk
factors associated with its occurrence. A total of 129 calves born to BLV-infected cows in 201314 in a herd in Kyusyu, Japan, were tested for infection immediately after birth and again at
one month of age using nested PCR. Maternal viral load, cattle breed, the presence or absenceof midwifery and the number of births per dam were evaluated to validate the risk factors
associated with perinatal infection. A total of 24（18.2％）calves were infected with BLV, ofwhich 14（10.8％）calves were infected through the transplacental and 10（7.7％）calvesthrough the birth canal routes. Maternal viral load was significantly correlated with thefrequency of perinatal infection. Fourteen of 29（48.2％）newborn calves born to dams withmore than 400 copies/10 ng of genomic DNA were infected with BLV at birth. Only nine of 95（9.4％）calves born to dams with fewer than 400 copies/10 ng were infected with BLV. No
statistical associations were found between perinatal infection and cattle breed, midwifery andnumber of births per dam. From the result of this study, identifying cattle with high viral load
（over 400 copies/10 ng）and transferring their use from dairy cows or breeding dams tofattening cows or donor cows for embryo collection will reduce the possibility of verticaltransmission in herds.

１．目

ロウイルス科デルタレトロウイルス属

的（Retroviridae Deltaretrovirus）に 属 す る 牛 白 血

地方病性牛白血病（以下，牛白血病）は，レト病ウイルスの感染を原因とし，白血病や悪性リン© The Ito Foundation

180

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

パ腫を主徴とする牛の届出伝染病である。感染牛な方法で感染牛の淘汰，非感染牛への更新をすすの約70％は無症状であり，25～30％がリンパ球がめる必要がある。市場など，外部から農場への牛著明に増加する持続性リンパ球増多症となるが，の導入は経済的な負担があること，現在の市場シ

外見上は臨床症状を伴わない。１～５％の感染牛

ステムでは確実に非感染牛を入手することが難しが感染から数年後に牛白血病・リンパ腫を発症いことから，牛白血病対策を実行・計画する農場

し，予後不良となる。また，と場で発症が発見さでは自家繁殖牛による感染牛の更新が感染率を下れた場合は全廃棄処分となる。2010～11年に行わげる主な方法となる。そのため，より実現性のあれた全国規模の調査で，乳牛，肉用牛の牛白血病る計画を立てるために牛白血病ウイルスの垂直感

ウイルス感染率はそれぞれ40.9％，28.7％であっ染リスクを正確に把握する必要がある。また，垂た 。発症牛の届出数も急増しており，予後不良

直感染を防ぐために垂直感染に関わるリスク因子

や全部廃棄による経済的な損失が大きな問題とを明らかにする必要がある。そこで，本研究ではなっている。また，これまではリンパ球の増加以

垂直感染の確率を調べるとともにリスク因子の解外に異常がないと考えられてきた持続性リンパ球析を行った。本研究成果は，農場における効率的増多症期においても，免疫細胞の疲弊化に伴う免な牛白血病対策の確立，牛白血病被害の軽減につ疫能低下や，生産性低下が報告され２～４），牛白血

ながる。

１）

病ウイルス感染による被害が想像以上に大きいことが明らかになりつつある。
牛白血病ウイルスは感染リンパ球を含む血液や

２．方
2.1

法

材料

母乳を介して伝播する。伝播経路は多岐にわた

九 州 の 一 貫 経 営 農 場（ホ ル ス タ イ ン 種 を 約り，サシバエなどの吸血昆虫，注射針や直検手袋

2,500頭，黒毛和種を約300頭，Ｆ１種を約300頭，の使い回し，出血を伴う器具の未洗浄連続使用でブラウンスイス種を約100頭飼養）において検体伝播する。また，水平伝播と比べて頻度は少の採材を行った。当該農場では母乳を介した牛白

ないものの，母乳を介した感染や妊娠および分娩

血病ウイルス感染を防ぐため，出産直後の子牛を時に母子間伝播することも知られている。牛

母牛から離し，凍結後に加温融解した初乳を与白血病ウイルスは感染後，プロウイルスとして感え，その後は代用乳を与えた。2013年１月～10月，

染牛の染色体に組み込まれ，生涯にわたって感染

12ヶ月齢以上の雌牛，計2,906頭から採血を行っが持続する。感染や発症を防ぐワクチン，治療法

た。すべての血液検体は遠心後（1,500ｇ，５分），

は存在しないため，牛白血病対策は牛白血病ウイ血清分離を行い，製品の指示書に従い，ELISA

ルスの感染を防ぐ以外に方法はない。

法による牛白血病ウイルス感染診断を行った

５～７）

８，９）

牛白血病対策として，感染牛の積極的淘汰が推（JNC社，東京）。2013年６月～2014年５月，前述

奨されている。西ヨーロッパやオセアニアの国々の方法により，牛白血病ウイルス感染と診断した

では，積極的淘汰の結果，牛白血病ウイルス清浄

母牛115頭および感染母牛より生まれた子牛129頭化が達成された。しかし，国や県からの補償（黒毛和種：54頭，Ｆ１種：64頭，ホルスタインがなく，感染率が高い日本において，感染牛の積

種：３頭，ブラウンスイス種：８頭）より分娩後極的淘汰は農家の経済的負担が大きいことから難24時間以内に採血を行った。また，生後31～45日

しい。そのため，経済的な負担の少ない，効率的

目，再度，子牛から採血を行った。

10，11）© The Ito Foundation

181

牛白血病ウイルスの垂直伝播に関する研究

2 . 2 プロウイルスの検出および感染時期の決播するとした過去の報告と比べても高い値となっている６，12）。その原因として，検出方法の違いが定
血液からのDNA抽出はWizard Genomic DNA考えられる。過去の報告で用いたゲル内沈降反応

Purification Kit（Promega社，Fitchburg，米国）

法と本研究で用いたnested PCR法では検出感度を用いた。抽出したDNAの濃度は分光光度計でが異なる。新生子牛では免疫系の発達が未熟なこ

測 定 し ，50 ng/ μl に 希 釈 調 整 し た 。抽 出 し たと，感染からの日数が十分に経過していないこと

DNAを鋳型として，牛白血病ウイルスのLongから，ウイルスに対する抗体産生が十分に行われterminal repeat領域およびenv遺伝子を標的としず，ゲル内沈降反応法で検出可能なレベルまで抗たnested PCR法を行った 。出生直後の検査で陽体価が上昇していない可能性がある。いっぽう，

性かつ31～45日齢の検査で陽性の子牛を胎盤感

nested PCR法ではウイルス遺伝子を検出するた染，出生直後の検査で陰性かつ31～45日齢の検査

め，新生子牛の抗体産生能に検査結果が影響されで陽性の牛を産道感染とした。

ない。新生子牛では良好な発育のために，出産後

９）

2.3

できるだけ早くに初乳を与える必要がある。これ

感染ウイルス量の測定

母牛の感染ウイルス量を測定するため，までの報告によると，移行抗体は最長９ヶ月齢まCycleave PCR Reaction Mixおよび牛白血病ウイで持続するため13），９ヶ月齢未満の子牛の牛白血ルス検出キット（TaKaRa社，大津）を用いて，病ウイルス検査はPCR法が適切である。本研究でReal-time PCR法を行った 。

は，出産直後と31～45日齢においてnested PCR

９）

2.4

法による検査を実施した。６頭の新生子牛で，出統計解析

胎盤・産道感染と母牛の感染ウイルス量，分娩

産後24時間以内の検査で陽性かつ31～45日齢の検介助の有無，出産回数，子牛の品種について統計

査で陰性であった。これと同様の報告は，以前に検定を行った。P＜0.05を有意差ありとした。

も行われている13）。この６頭に共通する点として，
single PCR法による40サイクルの増幅反応ではウ

３．結果と考察

イルス遺伝子を検出できなかった。このことか

牛白血病ウイルスに感染していた母牛129頭から，母親由来のウイルスゲノムなどの混入が影響ら生まれた子牛のうち，14頭（10.8％）で胎盤感していると思われる。以上から，PCR法による子染 が ，10 頭（7.7 ％ ）で 産 道 感 染 が 認 め ら れ た

牛の検査は１ヶ月齢以降に行うことがより適切と（Table１）。計18.6％で子牛への胎盤および産道感

考えられる。

染が起きたことになり，これは４～６％で垂直伝

胎盤・産道感染におけるリスク因子を明らかに

Table 1 The frequencies of perinatal BLV infection
Calf breed

Number of calves

Japanese Black

54

Ｆ1

64

Holstein
Brown-Swiss
Total

Transplacental

Birth canal infection

Total perinatal infection

7（12.9％）2（3.7）

9（16.6）7（10.9）7（10.9）14（21.8）

3

0（0）

0（0）

0（0）

8

0（0）

1（12.5）1（12.5）129

14（10.8）10（7.7）24（18.6）transmission© The Ito Foundation

182

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

するため，母牛の感染ウイルス量，分娩介助の有0.01）。このことから，母牛の感染ウイルス量が無，子牛の品種，母牛の出産回数と胎盤・産道感

産道・胎盤感染の重要なリスク因子であることが染の相関を比較した。これらの要因をリスク因子

明らかとなった。続いて，分娩介助の有無と胎の候補と考えた理由として，胎盤・産道感染のリ盤・産道感染の相関を比較した。分娩介助ありの

スクは新生子牛への暴露ウイルス量および暴露時

群では産道感染が20.0％（2/10）と介助なしの群間が影響すると考えたからである。つまり，母牛の6.1％（7/114）と比較して高い値となったが，の感染ウイルス量は新生子牛への暴露ウイルス量

これらの間に有意な違いはなかった（P＝0.15）。

に，分娩介助，子牛の品種，母牛の出産回数は分また，胎盤・産道感染と子牛の品種を比較する

娩の困難さに影響するため，子牛の産道に位置すと，Ｆ１種で21.8％（14/64），黒毛和種で16.6％

る時間の違い，つまりウイルスに暴露される時間（9/54），ホルスタイン種とブラウンスイス種で合に影響すると考えた。はじめに，母牛の感染ウイ

わせて9.1％（1/11）であった（Table１）。子牛のルス量と胎盤・産道感染の相関を比較したとこ

品種と胎盤・産道感染の間に有意な違いはなくろ，感染ウイルス量の増加に比例して，胎盤・産（P＝0.68），産子が母体に比べて小さいために分道感染の確率は増加した（Fig.１）。また，10 ng

娩が比較的容易であるＦ１群で最も高い感染率との抽出ゲノム中，牛白血病ウイルスの感染コピーなった。胎盤・産道感染と母牛の出産回数を比較

数が400 copies未満の群では胎盤・産道感染の起したところ，産道感染群の平均出産回数は4.87回，こる確率が9.4％（9/95）であったのに対し，そ

胎盤感染群は5.30回，感染なしの群は4.92回であれ以上の群では48.2％（14/29）であった（P＜り，それらの間に有意な違いはなかった（P＝: Birth canal（a）: Transplacental

20

Perinatal infection（%）

15

（b）

感染の間に相関する結果が認められなかったこと
いてはさらなる解析が必要である。

5

本研究から，牛白血病ウイルス感染母牛から生<200 <400 <600 <800 <1,000（n=87）（95） （111）（119）（122）p<0.0160

まれた子牛の18.6％で胎盤・産道感染することが明らかとなった。また，母牛の感染ウイルス量が重要なリスク因子であり，400 copies/10 ngを超40える高ウイルス量の感染母牛に限ると，48.2％の200

れたものの，子牛の品種，出産回数と胎盤・産道から，分娩の困難さが感染のリスクであるかにつ

1000.37）。分娩介助ありの群で高い感染率が認めら

<400
（95）

新生子牛が牛白血病ウイルスに感染して生まれる

>400
（29）

ことが明らかとなった。牛白血病ウイルスは主にViral loads of dams（copies/10 ng）
Fig. 1 Correlation between maternal viral loads andperinatal infection.
 （a）Rate of perinatal infection was proportional tomaternal viral load（b）Perinatal BLV infections
occurred in 9.4％ and 48.2％ of newborn calves bornfrom cattle with under and over 400 copies/10 ng,
respectively

水平感染で伝播する。そのため，感染牛の隔離，衛生対策が農場内での感染を防ぐために重要である。いっぽうで，感染率を下げるためには，非感染牛を増やす必要がある。繁殖母牛の感染ウイル
ス量を把握し，感染ウイルス量に基づいた更新計
画，分娩計画を立てることが，非感染牛の増加に© The Ito Foundation

牛白血病ウイルスの垂直伝播に関する研究183つながる。受精卵移植において，ドナーとなる母から生まれた新生子牛の血液を採材し，牛白血病

牛の感染状態は出産する子牛に影響しないことがウイルスの垂直感染の確率およびリスク因子に関明らかとなっている14，15）。そのため，感染ウイルする解析を行った。本研究の結果，感染母牛からス量の多い母牛より受精卵を採り，BLV非感染

生まれた子牛の18.6％で胎盤および産道感染が起牛に移植することで，BLVの感染リスクをゼロこることが明らかとなった。また，母牛の感染ウに抑えながら，感染ウイルス量の多い母牛の血統

イルス量の増加に比例して，胎盤・産道感染の確を維持することも可能である。

率が増加した。感染ウイルス量が多い母牛から生

多くのレトロウイルス感染症では，感染期間がまれた子牛（400 copies/10 ng以上）では48.2％

発症の重要なリスク因子である。そのため，垂直で垂直伝播するのに対し，少ない母牛から生まれ感染の制御は感染牛の減少だけでなく，発症牛のた子牛では9.4％で伝播した（P＜0.01）。いっぽ減少にもつながる可能性がある。このことからう，分娩介助の有無，子牛の品種，母牛の出産回も，牛白血病ウイルス感染対策は水平感染だけで数と胎盤・産道感染の確率に有意な違いはなかっ

なく，垂直感染対策も並行して行う必要がある。

た。以上から，すべての牛白血病ウイルス感染母

な お ， 本 研 究 成 果 は Mekata, H., Sekiguchi, S.,

牛を一律に淘汰・更新の対象とするのではなく，

Konnai, S., Kirino, Y., Honkawa, K., Nonaka, N.,

感染ウイルス量の多い母牛を把握し，優先的に更Horii, Y., Norimine, J. : Evaluation of the natural

新することが，牛白血病ウイルスの垂直感染対策

perinatal transmission of bovine leukaemia

ではより効率的である。

virus, Vet. Rec., doi: 10.1136/vr.102464, 2014 ．に誌上発表した。
４．要文
献１） Murakami, K., et al., Vet. Microbiol., 148, 84
88，2011．

約

地方病性牛白血病は牛白血病ウイルスの感染を原因とする牛の届出伝染病である。多くの感染牛は臨床症状を示さないものの，１～５％の感染牛は発症し，予後不良や全廃棄処分となるため，経済的な損失が大きい。近年，国内では牛白血病ウ
イルスの感染率が増加し，発症牛の届出が急増しているため，早急な対策が求められている。牛白血病ウイルスは水平および垂直感染で伝播する。
主な感染経路は水平感染であり，そのリスク因子については多くの報告が行われている。いっぽう，垂直感染は多量の検体入手が難しいこともあり，その確率やリスク因子など不明な点も多い。

～

２） Ikebuchi, R., et al., Vet. Res., 42, 103, 2011．
３） Della Libera, A. M., et al., Vet Res., 46, ２, 2015．
４） Gutiérrez, G., et al., BMC Vet Res., 10, 82, 2014．
５） Kohara, J., et al., Jpn. J. Vet. Res., 54, ５ ～ 30 ，
2006.
６） Lassauzet, M., L. et al., Am. J. Epidemiol., 133,
164～176，1991．
７） 大島寛一ら，日獣誌，43，79～81，1981．
８） Ferrer, J. F., et al., Science, 213, 1014～1016, 1981.
９） Mekata, H., et al., Vet. Rec., vetrec-2014 ～
102464, 2014.
10） Acaite, J., et al., Prev. Vet. Med., 82, 83～89, 2007.
11） Nuotio, L., et al., Prev. Vet. Med., 59, 43～49, 2003.
12） Thurmond, M. C., et al., Can. J. Comp. Med., 47,
316～319, 1983．
13） Gutierrez, G., et al., Vet. Microbiol., 151, 255 ～
263, 2011.
14） Eaglesome, M. D., et al., Vet. Rec., 111, 122 ～ 123,1982.
15） Hare, W. C., et al., Can. Vet. J., 26, 231～234, 1985.

本研究では，129頭の牛白血病ウイルス感染母牛© The Ito Foundation

184

人の食品由来回虫症の感染源対策：
牛と家禽の疫学的役割と制御法の探索
A countermeasure against the infectious source of human toxocariasis andascriasis : An epidemiological role of cattle and chickens and developmentof a control measure

野中 成晃・丸山 治彦＊・吉田 彩子＊・桐野 有美・堀井 洋一郎・三澤 尚明・上村 涼子（宮崎大学農学部，＊宮崎大学医学部）

Nariaki Nonaka, Haruhiko Maruyama＊, Ayako Yoshida＊, Yumi Kirino,
Yoichiro Horii, Naoaki Misawa and Ryoko Uemura（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ＊Faculty of Medicine, University of Miyazaki）

In order to evaluate human risk of infection with ascarid worms from beef and chicken
meat in the southern Kyushu, sero-prevalence against the parasites infection in cattle andchicken was investigated using the diagnostic system developed for humans. In cattle，35 ％showed positive reaction in the screening ELISA, and more than 50％ of those positives
showed ascarid worm species-specific reactions, indicating the possibility of infection of ascarid
worms（Toxocara and Ascaris）taken place at the farm level. On the other hand, more than
80％ showed positive reaction in the screening ELISA in chicken. As in cattle, species-specificreactions were observed in chickens. However, it can not be denied that false-positive reactions
may be involved in the result of chickens, and thus we are now performing an experimental
infection in chickens to evaluate the reliability and possible cross-reaction in the ELISA
systems using different antigens made from different ascarid worms. We also developed an
epidemiological tool for detecting Ascaris suum larvae in meat products by real-time PCR inthis study. We are planning to develop similar methods for detecting Toxocara canis and T.
cati. Based on the results obtained, we further plan an epidemiological study in farms having
sero-positive animals to clarify the conditions and factors for the ascarid infection in cattle andchickens, and want to establish a feasible countermeasure against the animal infection with theascarid worms and to contribute to the improvement of the food safety in Japan.

１．目

染した場合に，人の体内で幼虫が発育せずそのま的

ま体内移行するために引き起こされる疾病であ動物由来回虫症は，我が国を含め世界規模で問る。我が国においては，犬・猫回虫症の顕性患者

題となっている人獣共通寄生虫症で，動物の回虫は医学中央雑誌（1993年まで）に報告されている類，すなわち犬回虫，猫回虫，豚回虫等が人に感だけで約100名にのぼり１），また，全国レベルで© The Ito Foundation

人の食品由来回虫症の感染源対策：牛と家禽の疫学的役割と制御法の探索

寄生虫症患者の血清診断を行っている研究分担

185
Egg

者・丸山の研究室では1986年以降の動物由来回虫

Larva症累積症例数が1,000（約40例／年）を超えた。
ところが，動物由来回虫感染のほとんどは特徴的症状を欠き，そのため診断時に類症鑑別候補にあがらないため，感染を探知できないケース，すな
わち潜在的感染患者は相当数にのぼると考えられる。実際，血清疫学調査では数％の抗体陽性率が報告されている１）。豚回虫症についても，1990年
代半ばから問題視されるようになり，上記丸山研究室でも症例の数％は豚回虫によるものと推定しFig. 1 Transmission routes of ascarid worms to humansている。
動物由来回虫の人への感染は，かつては犬，猫，
豚の糞便中に排出される回虫卵の偶発的摂取が主

２．方法

要な経路であり，土壌の虫卵を直接口にしやすい

2.1

幼児の感染が主であった。しかし，近年，我が国

宮崎県の食肉・食鳥処理場において，肉用牛おでは，肉類の摂食，すなわち食肉に由来する感染

よび肉用鶏の血液材料を入手し，人用に開発され（Fig.１）が主になっている 。待機宿主となる牛

た，豚回虫成虫虫体抽出抗原（As-SWAP）を用や鶏などの家畜・家禽がこれらの回虫に感染した

いたスクリーニングELISA検査，および犬回虫

場合，幼虫は体内を移行し肝臓や筋肉に幼虫のま幼虫（Tc-ES）および豚回虫幼虫の排出分泌抗原

ま留まる。我が国では，食文化の変化により家畜（As-ES）を用いた回虫種特異ELISA検査を実施の肉や肝臓の生食が好まれるようになって食肉由した。牛の陽性／陰性カットオフ値は，健常牛の来回虫症が増加したと考えられ，実際，食生活の血清６検体の吸光度の平均に標準偏差の３倍を足共有で家族感染が起こっている 。特に南九州でした値とした。鶏のものは，ブロイラーを陰性コ

は，鶏肉の生食を好むという特有の食文化があ

ントロール群とみなし設定した。また，人用トキ

り，牛肉類はもとより鶏肉類（臓器を含む）の公

ソカラ症診断用ウエスタンブロット（WB）キッ

衆衛生上のリスクは他の地域と比べて高いと考え

ト（Toxocara WB IgG Kit, LDBIO）を牛・鶏用られる。

に改良して用い，犬・猫回虫（まとめてトキソカ

２）

３）

本研究では，人用診断システムの改良法を用いて，宮崎県の牛と鶏における抗体陽性率を調査し，検査法の信頼性評価のための感染実験を試みた。また，調査ツールとして食肉からの幼虫検出法を開発した。

食肉・食鳥処理場における調査ラ回虫）に対する特異抗体を確認した。
2 . 2 食肉からの回虫幼虫検出のためのrealtime PCR法の開発
豚回虫幼虫を検出するため，豚回虫に特異的なプライマーとプローブを作製し，これらを用いた
real-time PCR法による豚回虫幼虫検出の信頼性を評価した。

© The Ito Foundation

186

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

2 . 3 感染実験および抗原作成に必要な犬，猫，

カラ回虫感染が，逆にAs-ESに対する抗体陽性反応がTc-ESに対する反応より強い場合は豚回虫感

豚，鶏回虫卵の収集
宮崎県保健所および食肉・食鳥処理場へ協力を染が疑われる。スクリーニング検査陽性となった

依頼し，犬，猫，豚，鶏回虫の成虫を入手した。

105検体について回虫種特異検査を行ったところ，成虫を解剖し，子宮内より各種回虫の虫卵を収集

21.9％がトキソカラ回虫感染を，36.2％が豚回虫し，培養フラスコで培養して成熟虫卵を得た。

感染を疑う結果となった。トキソカラ回虫の感染

各種回虫幼虫の排泄分泌抗原の作製が疑われた20検体についてWB検査を行ったとこ

成熟虫卵の卵殻を，ガラスビーズを用いて機械

ろ，18検体がWB陽性であった（Fig.２）。第２回的に破壊し，強制的に感染期幼虫を得た。得られ目の調査は農家を特定して実施した。32農家123た幼虫を５％CO２下，37℃で培養し，培養上清を頭を検査した結果，スクリーニング検査陽性は14

濃縮して排泄分泌抗原を得た。

農家（44％）の24頭（20％）で検出された。この

2.4

2.5

うち，トキソカラ回虫の感染が疑われたものが９

感染実験

成熟虫卵の鶏への感染性を確認するため，各種検体（37.5％），豚回虫感染が疑われたものが15

成熟虫卵2,000個を鶏２羽ずつに経口投与し，３検体（62.5％）であった。この結果は最近報告さ日後に安楽殺して剖検し，腸管壁（鶏回虫），肝れた岐阜県の状況と同様と考えられた４）。トキソ

臓および肺（犬回虫，猫回虫，豚回虫）へ到達しカラ回虫の感染が疑われたもののうち，７検体がた幼虫数を計数した。豚回虫については，虫卵投WB陽性であった。農家別に見ると，９農家で豚与数を10,000に増加して追加実験を行った。次に，

回虫感染が疑われる牛のみ，２農家でトキソカラ

各種回虫卵を鶏（５羽／群）に経口投与し，各種回虫の感染が疑われる牛のみ検出された。残りの回虫抗原に対する抗体価の変化と虫種間の交差反

３農場では，両方の回虫感染が疑われる牛が検出

応性を評価するための実験を開始した。

された。これらの検査結果は，犬，猫，豚回虫感

2.6

農家における調査

染が広く牛で起こっている可能性を示唆するもの

飼育動物の感染状況および飼育環境の調査を行と考えられる。

うため，宮崎県および関連団体と今後の具体的実
施方法について協議を開始した。
３．結果と考察kd

3 . 1 食肉となる牛および鶏における各種回虫10075に対する抗体価の評価

（b）

50
37

（１）肉用牛まず，農家を特定しないという条件でウシ血清
300検体についてスクリーニング検査を行ったと
ころ，105検体（35％）が抗体陽性となった。そ25

Toxocara
spesiﬁcbands

20

こで，回虫種特異検査により感染虫種の特定を試みた。この検査では，Tc-ESに対する抗体陽性反応がAs-ESに対する反応より強い場合はトキソ

Anti-Tc-ES antibody（OD405nm）

（a）

1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

Negative Positive
WB

Fig. 2 Detection of Toxocara-specific antibodies byWestern Blots© The Ito Foundation

187

人の食品由来回虫症の感染源対策：牛と家禽の疫学的役割と制御法の探索（２）肉用鶏豚回虫幼虫を混入すると，幼虫２匹以上は100％

鶏についてもまず，農家を特定しないという条検出できるが，１匹を混入させた場合は検査の５件でブロイラー血清150検体および地鶏血清169検割程度でしか検出できず，本法の幼虫検出限界は体を検査した。ブロイラー血清のほとんどがOD

１匹以上２匹未満であることがわかった。一方，

値0.2以下の低い値を示したことを受け，便宜上，

本法は犬回虫および猫回虫とは交差反応を起こさ

陽性判定のCut-off値をOD値0.25とした。これをないこともわかった。今後は，本法の検出感度のもとにすると，地鶏に対するスクリーニング検査向上を図り，実際の食肉（牛肉類および鶏肉類）

では，86.4％が陽性反応を示した。回虫種特異検からの幼虫検出を行うとともに，同様の方法によ査を行ったところ，25.5％がトキソカラ感染を，り，犬，猫回虫の検出法の開発と野外応用も行う

34.9％が豚回虫感染を疑う結果となった。トキソ

予定である。

カラ回虫の感染が疑われた11検体についてWB検3 . 3 入手した各種回虫成熟虫卵の感染性およ査を行ったところ，10検体が陽性であった。２回

び抗体価推移と交差反応の評価実験

目の調査は農家を特定して実施した。９農家157

Table１に予備実験の結果を記した。鶏回虫は羽を検査した結果，スクリーニング検査陽性は鶏体内では体内移行をせず，腸管壁に侵入した

91.0％の鶏（全農家）で検出された。回虫種特異

後，再び管腔へ戻って成虫となる。そのため腸管検査に対する反応性は農家間で大きなばらつきが壁のみの検査を行ったが，鶏２羽から15匹および見られ，豚回虫，犬回虫および両方の感染が疑わ48匹の幼虫が検出された。他の回虫３種は体内移れる農家がそれぞれ２，２，３軒あった。残りの２行を行うため５～９），感染後３日目に幼虫が到達す軒では抗体反応は概して低かった。これらの検査

ると考えられる肝臓および肺を検査した。犬回

結果は，犬，猫，豚回虫感染が広く鶏で起こって虫，猫回虫は肝臓および肺から１～113匹の幼虫いる可能性を示唆するとも考えられるが，一方でが検出されたが，豚回虫は2,000個投与群ではど陽性反応を示す個体がかなりの数にのぼるため，の臓器からも幼虫を検出できなかった。そこで，感染実験を行って，用いた検査法の信頼性を精査

成熟虫卵のバッチを替え10,000個投与を行ったとする必要があると考えられた。

ころ，他と比べて少数ではあるが，肝臓および肺から幼虫を回収することができた。これを元に投3 . 2 Real-time PCR法による豚回虫幼虫の検

与虫卵数を犬，猫，鶏回虫は2,000個／羽，豚回出
本法により，幼虫１匹の検出が可能であること

虫は50,000個／羽に調整し，各種回虫抗原に対すがわかった。しかしながら，マウス肝臓500㎎にる抗体価の変化と各種抗原に対する交差反応性をTable 1 Number of larvae recovered from various organs of chickens inoculated with eggs of different ascarid worms
Parasite
species

Ascaridia
galli

Toxocara canis

Toxocara cati

Dose of
eggs

2,000

2,000

2,000

Ascaris suum
2,000

10,000

Organ

Intestine

Liver

Lung

Liver

Lung

Liver

Lung

Liver

Lung

Chicken 1

15

76

2

0

1

0

0

7

0

Chicken 2

48

106

7

4

45

0

0

1

0

© The Ito Foundation

188

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

評価する感染実験を現在行っている。
3.4にし，実行可能な対策を立案して，食の安全の確

農家における調査保に寄与したいと考えている。

計画では，食肉・食鳥処理場の調査で陽性個体が検出された地域や農家のうち，調査への協力に同意が得られた肉牛，養鶏農家を対象に飼育動物の感染状況および飼育環境の調査を行う予定であったが，並行して行っている検査法の信頼性評
価が十分にできていないことを鑑み，本年度は調査方法や調査体制の調整に留め実施しなかった。
これについては現在宮崎県や関連団体と調整中
で，来年度以降に実施する予定である。
４．要

約

南九州における人の動物由来回虫症の原因としての牛と鶏のリスクを評価するため，人用診断シ
ステムを改良して，牛と鶏における抗体陽性率を調査した。牛では35％がスクリーニング検査陽性となり，これらの50％以上で回虫種特異反応が認められ，農家において犬・猫（トキソカラ）およ
び豚回虫のどちらの感染も起こっている可能性が示唆された。一方，鶏では80％を超える地鶏がス
クリーニング検査陽性となり，これらには回虫種特異反応が認められた。しかしながら，鶏については偽陽性反応を拾っている疑いを否定できず，
現在感染実験を行ってその信憑性を評価している。また，今後の検査ツールとして，Real-time
PCR法による豚回虫幼虫の検出法を開発した。今後，犬・猫回虫幼虫検出法も開発予定である。今後は陽性動物が検出された農家において疫学調査を実施して動物への感染状況とその要因を明らか

文献１） 近藤力王至，Ⅳ線虫類，６，トキソカラ感染症，
大鶴正満，亀谷了，林滋生監修，日本における寄生虫学の研究，７，465～474，目黒寄生虫館，東京，
1999．
２） 佐藤宏：人獣共通感染症としての回虫症―アライ
グマ回虫症を中心に―，モダンメディア，51，177～
186，2005．
３） Yoshikawa, S., Nishiofuku, M., Moriya, K., Ouji, Y.,
Ishizaka, S., Kasahara, K., Mikasa, K., Hirai, T.,
Mizuno, Y., Ogawa, S., Nakamura, T., Maruyama H.,
Alao N. : A familial case of visceral toxocariasis due
to consumption of raw bovine liver, Parasitology
International，57，525～529，2008．
４） 釜井莉佳，松尾加代子，後藤判友，高島康弘，吉田彩子，丸山治彦，平健介，赤尾信明：牛におけるトキソカラ属回虫およびブタ回虫幼虫に対する抗体
保有状況調査，獣医寄生虫学会誌，13，１～６，
2014．
５） Taira, K., Saeed, I., Permin, A., Kapel, C.M.O. :Zoonotic risk of Toxocara canis infection throughconsumption of pig or poultry viscera, Veterinary
Parasitology，121，115～124，2004．
６） Taria, K., Saitoh, Y., Kapel, C.M.O., 2011.
Toxocara cati larvae persist and retain highinfectivity in muscles of experimentally infected
chickens, Veterinary Parasitology，180，287～291，
2011．
７） Taira, K., Saitoh, Y., Okada, N., Sugiyama, H.,
Kapel, C.M.O. : Tolerance to low temperatures of
Toxocara cati larvae in chicken muscle tissue,
Veterinary Parasitology，189，363～366，2012．
８） Olsen, A., Permin, A., Roepstorff, A. : Chickens
and pigs as transport hosts for Ascaris, Trichuris
and Oesophagostomum eggs, Parasitology，123，325～330，2001．
９） Y o s h i h a r a , S . , H a t t o r i , J . , N i s h i z o n o , K . ,Kawamura, A., Shimozaki, K., Nishida, Y., Oka, K.,
Tsuji, N. : Hirayama, N., Hepatic Lesions Caused byMigrating Larvae of Ascaris suum in chickens,
Journal of Veterinary Medical Science ， 70 ， 1129 ～
1131，2008．

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189

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用
Application of bronchoalveolar lavage to specify offending bacterium of
the pneumonia to cow medical treatment

帆

保

誠

二・野

口

倫

子

（鹿児島大学共同獣医学部）

Seiji Hobo and Michiko Noguchi（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Calf pneumonia is an infectious disease which does not only largely affect growth, but also
claims the lives of calves. In addition, it is one of the most significant diseases in veterinary
medicine. So far, specifying the offending bacterium of the pneumonia has been conducted bybacteriological analysis via nasal swabs. However, information obtained from the nasal swabs isoften inconclusive due to a large variety of bacterium existing in the nasal cavity mucosal
membrane of cows, even if they are healthy; the bacterium does not seem to connect directly
to the offending bacterium of the pneumonia. The present study aimed to specify the offending
bacterium of the pneumonia by analyzing nasal swabs and bronchoalveolar lavage fluid
obtained from 18 pneumonia-infected cows in bacteriology. As a result, Pasteurella multocida
and Mycoplasma bovis were mainly isolated from the bronchoalveolar lavage fluids of thepneumonia-infected cows. It was suggested that the isolated bacterium was significantly
related to the clinical condition. Moreover, the isolation agreement rates from the nasal swab
and the bronchoalveolar lavage fluid of the pneumonia-infected cows was 40.0％（P.
multocida）, and 35.3％（M. bovis）．The bacterium isolated from the cowsʼ nasal swabs did notnecessarily reflect the existence of the bacterium in the bronchoalveolar region. As a result,the pneumonia-infected area became clear. Therefore, it was assumed to be extremely difficult
to isolate the bacterial strain from the nasal swab, as well as to identify the principal causative
bacterium of the pneumonia.

１．目

聴診や打診をはじめとした身体検査および血液検的査を主体として実施されている。また，肺炎原因

子牛の肺炎は，その成長に多大な影響を及ぼす菌の特定は，主に鼻腔スワブの細菌学的検索によばかりか，生命をも奪いかねない感染症であり，り実施されている。しかし，肺炎の病態は複雑で獣医療において最も重要な疾患のひとつである。

あるため，これら診断法のみでその病態を十分に牛の肺炎の診断は，体温測定を含めた臨床検査，把握し診断することは困難な場合も少なくない。

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190

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

一方，牛肺炎の治療は，抗菌薬の全身投与を主体として行われる。しかし，牛における肺炎の抗て，水銀体温計で直腸温を測定するとともに，聴診により心拍数および呼吸数を計数した。

菌薬治療は，臨床経験に基づく知見や鼻腔スワブ

2.2からの細菌分離検査結果に基づいて実施されてい供試牛の頸静脈から気管支鏡検査直前に血液をるため，十分な治療効果が得られないことも少な

採取し，血液自動分析装置を用いて末梢血中の白

くない。これは，臨床経験に基づく知見は，あく

血球数，赤血球数，ヘモグロビン濃度およびヘマまでも肺炎原因菌を推定して抗菌薬を投与していトクリット値を測定した。

血液検査

ることから，当該牛の肺炎の治療に使用する抗菌2.3薬が有効であるかは不明であることが主な原因で供試牛を保定後，消毒用アルコールに浸漬したある。また，鼻腔領域には様々な細菌が恒常的に綿花を用いて鼻孔周辺を清拭した。続いて，培養存在していることから，肺炎発症牛の鼻腔スワブ用綿棒を可能な限り鼻腔深部まで挿入し，鼻腔粘を用いた細菌分離検査により特定された細菌が，膜を拭うことにより検体（鼻腔スワブ）を得た。

肺炎発症領域の情報を正確に反映していない可能

気管支鏡検査および気管支肺胞洗浄液の採取性も否定できない。

呼吸器検体の採取および処理

は，既報を参考に実施した１～５）。すなわち，非鎮

我々は，臨床的に健康で気道の内視鏡検査で異静下で供試牛の鼻孔から気管支鏡を挿入し，鼻腔常所見を認めない子牛の鼻腔領域には多数の細菌および咽喉頭部を観察した。その後，必要に応じが恒常的に存在するが，気管支肺胞領域からは細て２％塩酸リドカインによる気道粘膜の表面麻酔菌は分離されないことを証明した 。このことかを実施しながら，気管および気管支内腔を観察しら，本来細菌が存在しない気管支肺胞領域から細た。続いて，気管支鏡を罹患肺葉へとつながる気菌が分離された場合，真の肺炎原因菌であること

管支へと進め，気管支の直径が約5.5㎜の気管支を推察できるようになった。また，慢性化した肺に楔入した。

１）炎症例牛６頭の気管支肺胞領域からは，牛の主要楔入部位に37℃に加温した滅菌生理食塩水30

な肺炎原因菌であるPasteurella multocidaが６頭

mLを気管支鏡の鉗子孔から注入し，即座に回収

中２頭から，Mycoplasma bovisが６頭全頭から分した。同操作を計２回実施し，混和したものを検離され，これら細菌が肺炎病態の悪化に強く関与

体（気管支肺胞洗浄液：BALF）とした。得られしていることが明らかとなった 。

た検体は冷蔵状態で検査室へ搬送し，検体採取後

１）

本研究では，亜急性期～慢性期にある肺炎発症

３時間以内に各種検査に供した。また，BALFの牛の気管支肺胞領域から細菌分離を行い，牛の肺回収率を計測するとともに，白血球計算盤を用い炎原因菌を特定することを目的とした。

て有核細胞数（上皮細胞を除く）を計数した。

２．方
2.1

2.4

法

細菌分離検査得られた検体のうち，鼻腔スワブは300μl の滅菌生理食塩水に懸濁後，細菌分離検査に供した。

供試子牛および臨床所見

亜急性期～慢性期にあり，抗菌薬による加療か

またBALFは，遠心操作により100倍に濃縮したら24時間以上が経過した肺炎発症牛18頭（黒毛和後，細菌分離検査に供した。検体は，５％馬血液種；雄８頭，去勢１頭，雌９頭；5.0±1.8ヶ月齢含有コロンビア寒天培地（BA培地）およびマッ（平均値±標準偏差））を供試した。供試牛に対しコンキー寒天培地（MAC培地）にそれぞれ塗布© The Ito Foundation

191

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用された。BA培地は２種類の培養法（37℃；微好気 条 件：５ ％ CO ２ 下 お よ び 嫌 気 条 件 下）で ，

３．結果と考察

MAC培地は１種類の培養法（37℃；好気条件下）

3.1

臨床所見

で24～48時間培養された。

供試牛の平均直腸温度は39.4 ℃であり，健常牛培養後のBA培地から主要な細菌を分離し，純に比較し軽度に高体温であった（Table１）。この培養後にグラム染色検査および細菌同定検査（飛ことは，供試牛の多くが肺炎の急性期を過ぎてお行 時 間 型 質 量 分 析 法 ： Time of Flight Mass

り，著しい直腸温の上昇がなかったことに起因す

Spectrometry：TOF-MS）を実施し，菌種を同るものと思われた。心拍数は平均74.4回／分であ定 し た 。な お 本 研 究 に お い て は ，Mannheimia

り，健常牛に比較し顕著な変化は認めなかった

haemolytica, P. multocida お よ び Histophilus（Table１）。一方，呼吸数は平均73.3回／分であり，

somniを主要分離・同定対象細菌とした。

健常牛に比較し著しく増加していた（Table１）。

2.5

このことは，肺炎の発症ないし慢性化に伴い肺胞マイコプラズマ分離検査

マイコプラズマ分離検査は，細菌分離検査と同領域での換気能の低下が起こり，呼吸数を増加さ様の検体50μl をマイコプラズマ分離用寒天培地

せることにより体内への酸素の取り込みを維持しに塗布し，微好気条件（37 ℃；５％CO２）下でていることに起因すると推察された。

７日間培養（直接培養）するとともに，マイコプ

3.2

ラズマ増菌培地に接種（50μl ）し微好気条件下

末梢血中の白血球数は平均11,883／mm ３ であで２日間培養（増菌培養）することにより実施しり，健常牛に比較し軽度に増加していた。このこた。その後，増菌培養液は50μl をマイコプラズとは，肺炎に伴う感染が継続していることを示唆

マ分離用寒天培地に塗布し，微好気条件下で７日しているものと考えられた。しかし，肺炎の急性間培養された。培養後のマイコプラズマ分離用寒期に認められるような白血球数の急激な増加が認

天培地は，実体顕微鏡で観察するとともに，培地

められなかったことは，供試牛が急性期から慢性上の目玉状のコロニーについてTOF-MSを用い期に移行していることに起因すると推察された。

て同定された。

3.3

血液検査

気管支鏡所見Table 1 Findings of the clinical, blood and bronchoalveolar lavage fluid exermination in chronic pneumonia-

infected cows
Inspection item

Unit

Rectal temperature

Result（mean ± S.D.）（℃）

39.4 ± 0.4Heart rate

（beats/min）

74.4 ± 16.9

Respiration rate

（times/min）

73.3 ± 13.6

White blood count in the peripheral blood（/mm3）

11,883 ± 4,449

Red blood count in the peripheral blood（x104/mm3）

1,179 ± 184（g/dL）

12.4 ± 2.3

Hemoglobin concentration in the peripheral blood
Hematocrit in the peripheral blood（%）

41.0 ± 8.4

Recover rates in bronchoalveolar lavage fluid（%）

35.4 ± 11.9

Number of cells in bronchoalveolar lavage fluid（x105/mL）

36.3 ± 34.5

© The Ito Foundation

192

平成26年度a）b）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

すなわち，臨床症状や聴診により肺炎罹患部位が広範囲に至っていることが推察される症例では，多量の膿性粘液が気管内腔や気管支内腔に観察されることが明らかとなった。
3.4c）

細菌分離検査細菌分離検査では，P. multocidaが鼻腔スワブ

d）

18検体中５検体（27.8％）およびBALF18検体中
10 検 体 （55.6 ％ ） か ら ， M. haemolytica が
BALF18検体中１検体（5.6％）から分離された（Table２）。また，M. bovisは鼻腔スワブ18検体中Fig. 1 Bronchoscopic findings of the pneumonia-infected

cows a）Trachea, b）～d）Bronchus

６ 検 体（33.3 ％ ）お よ び BALF18 検 体 中 17 検 体（94.4 ％ ）か ら 分 離 さ れ た 。M. haemolytica, P.
multocidaおよびM. bovisは，牛の肺炎の主要原

供試牛18頭すべての気管には比較的多量の膿性因菌であり病態の悪化に強く関与すると考えられ粘液が観察された（Fig.１）。また，患部へとつていることから６，７），本研究で分離された細菌もながる気管支には多量の膿性粘液が観察され供試牛の病態悪化の主因となっているものと推察（Fig.１），病態の程度に応じた所見が観察された。

された。なお，肺炎発症牛の鼻腔スワブからは，Table 2 Results of bacterial isolation from nasal swab and bronchoalveolar lavage fluid in chronic pneumonia-infected

cows
P. multocida

M. haemoritica

H. somni

Animal No.

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18

Nasal
swab

BALF

Nasal
swab

BALF

Nasal
swab

―
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―

Mycoplasma bovis
Direct culture

BALF

BALF

Nasal
swab

BALF

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＋
―
＋
＋

P. multocida : Pasteurella multocida, M. haemoritica : Mannheimia haemolytica, H. somni : Histophilus somni
BALF : bronchoalveolar lavage fluid＋：Culture positive

Enrichment culture

Nasal
swab

―：Culture negative© The Ito Foundation

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用

193

健常牛の鼻腔スワブからの細菌分離結果と同様

学的に検索することにより牛の肺炎原因菌を特定に，これら分離細菌以外に多菌種の細菌が多数分することを目的とした。その結果，肺炎発症牛の離された。

気管支肺胞洗浄液からは，主にP. multocidaおよ一方，鼻腔スワブとBALFの両検体からの分離

びM. bovisが分離され，その病態に強く関与して細菌一致率は，P. multocidaでは40.0％（BALF

いることが推察された。また，これら細菌の鼻腔

分離陽性10検体中鼻腔スワブ分離陽性４検体），

スワブおよび気管支肺胞洗浄液からの分離陽性一M. haemolyticaでは0.0％（同，１検体中０検体），

致率は，それぞれ40.0％，35.3％であった。このM. bovisでは35.3％（（同，17検体中６検体））でことから，肺炎発症牛の鼻腔スワブから分離されあった。このことから，肺炎発症牛の鼻腔スワブ

る細菌は，必ずしも肺炎発症部位である気管支肺から分離される細菌は，必ずしも肺炎発症部位で胞領域における細菌の存在を反映しないことが明ある気管支肺胞領域における細菌の存在を反映しらかとなった。すなわち，鼻腔スワブから多菌種ないことが明らかとなった。すなわち，鼻腔スワかつ多数分離される細菌の検索結果をもって，肺ブから多菌種かつ多数分離される細菌の検索結果

炎の原因菌を同定することは極めて困難であるこをもって，肺炎の原因菌を推定することは極めてとが示された。

困難であることが示された。
本研究において，亜急性期から慢性期にある肺炎症例牛の気管支肺胞領域からは，牛の主要な肺炎原因菌が分離され，肺炎病態の悪化に強く関与しているものと考えられた。今後は，抗菌薬による治療を開始していない肺炎発症初期における気管支肺胞領域の細菌分離に関する情報を得，肺炎発症に関与する細菌を特定することが重要であると考えられた。これにより，牛肺炎の病態解明につながるものと思われる。
４．要

約

子牛の肺炎は，その成長に多大な影響を及ぼすばかりか，生命をも奪いかねない感染症であり，獣医療において最も重要な疾患のひとつである。
従来，肺炎原因菌の特定は，主に鼻腔スワブの細菌学的な検索により行われてきた。しかし，牛の鼻腔内腔には健常であっても多種の細菌が多数存在することから，鼻腔スワブから得られる情報は肺炎原因菌の特定には直結しないと思われる。本
研究では，肺炎発症牛18頭に対して鼻腔スワブの採取とともに，気管支肺胞洗浄液を採取し，細菌文
献１） 帆保誠二，野口倫子，安藤貴朗：肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用，
公益法人伊藤記念財団平成25年度食肉に関する助成
研究調査成果報告書，32，215～221，2014．
２） Hobo, S., Oikawa, M., Kuwano, A., Yoshida, K.,
Yoshihara, T. : Effect of transportation on thecomposition of bronchoalveolar lavage fluid obtained
from horses, Am. J. Vet. Res., 58，531～534，1997．
３） Hobo, S., Yoshihara, T., Oikawa, M., Jones, J. H. :Surfactant proteins in bronchoalveolar lavage fluidof horses : assay technique and changes following
road transport, Vet. Rec., 148，74～80，2001．
４） Ito, S., Hobo, S., Eto, D., Sato, H. : Bronchoalveolar
lavage for the diagnosis and treatment of pneumonia
associated with transport in thoroughbred
racehorses, J. Vet. Med. Sci., 63 ， 1263 ～ 1269 ，
2001．
５） Ito, S., Hobo, S., Kasashima, Y. : Bronchoalveolar
lavage fluid findings in the atelectatic regions ofanesthetized horses, J. Vet. Med. Sci., 65 ， 1011 ～
1013，2003．
６） Angen, O., Thomse, J., Larse, L. E., Larsen, J.,
Kokotovic, B., Heegaard, PM., Enemark, J.M. :Respiratory disease in calves: microbiologicalinvestigations on trans-tracheally aspirated
bronchoalveolar fluid and acute phase protein
response, Vet. Microbiol., 28，165～171，2009．
７） Maunsell, F. P., Woolums. A. R., Francoz, D.,
Rosenbusch, R. F., Step, D. L., Wilson, DJ., Janzen, E.
D. : Mycoplasma bovis infections in cattle, J. Vet.
Intern. Med., 25，772～783，2011．

© The Ito Foundation

194

食肉として消費される野生動物における食中毒菌の保有調査
Examination of food-borne bacteria in wild animals intended for
consumption

安

藤

匡

子・中

馬

猛

久

（鹿児島大学共同獣医学部）

Masako Andoh and Takehisa Chuma（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Consumption of wild game meat, especially deer and boar meat, is becoming popular inJapan as a result of population control of the animals intended to reduce wild animal-related
damage in human life. Processing of domestic animals is controled by legal hygiene regulations
to retain food safety. However, there are no legal regulations for handling wild game meat, andmost of the game meat goes to table without any inspections. To prevent foodborne diseases
from wild game meat, information of pathogens in the animals are important to establish
appropriate control measures. In this study, we investigated fecal samples from wild deers andboars for bacteria, Shiga-toxin producing Escherichia coli（STEC）, Salmonella spp.,
Campylobacter spp., and Staphylococcus aureus（SA）. Out of total 134 animals（70 deers and 64
boars），16（11.9 ％），1（0.7 ％），9（6.7 ％），and 13（9.7 ％）were positive for STEC,
Salmonella spp., Campylobacter spp., and SA, respectively. Within isolated STEC, serotype O157
（2 isolates）was included. Carrying of STEC and SA in deers was significantly higher（p<0.05）
compared to boars. Animals investigated in this study did not show any apparent clinical signs（e.g. diarrhea）.The results show presence of food-borne bacteria in wild deers and boars feces.
Careful handling of intestinal organs not to spill the contents when slaughtering is required toprevent possible bacterial contamination of wild game meat. Information on pathogens in wild
animals can help avoid inappropriate consumption and prevent wild game meat-borne infection
to humans.

１．目

伴い，食材としての利用も増え，ジビエとして狩的

猟肉を一般の人が食する機会も増えてきた。主に近年，野生のシカやイノシシなどの生育数が増
加し，様々な被害が全国で拡大している。農畜産

シカおよびイノシシが食用とされ，地域振興の資源としても活用されている。

業や生活環境保護の観点から，野生鳥獣の狩猟捕

野生動物を食する場合には，衛生的に飼育・処獲件数は年々増加している。狩猟捕獲数の増加に理される家畜と異なり，食中毒のリスクは不明で© The Ito Foundation

食肉として消費される野生動物における食中毒菌の保有調査195ある。野生シカおよびイノシシの解体はと畜場法

Time of Flight Mass Spectrometry （MALDI-の規制を受けず，その肉は公的な検査を受けずに

TOF MS）にて菌種の同定を行った。MALDI-

流通している。国内においても，ジビエを食した

TOF MSは，
autoflex speed TOF/TOF-KG（Bruker

ことによる様々な感染症が報告されており，細菌

Daltonics）を用いMALDI Biotyperソフトウエア

性食中毒も少数であるが報告されているにて解析し，スコア1.7以上で属の同定，2.0以上（http://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/

で種の同定可能と判定した。

bunya/kenkou_iryou/shokuhin/syokuchu/04.

（２） サルモネラhtml）。野生シカおよびイノシシにおける食中毒

糞便スワブをランバック寒天培地に塗抹し，起因病原体については，ウイルスや寄生虫に関す37℃にて一晩培養した。ピンク～赤色コロニーをる情報は集積されつつあるが，細菌類に関してはクローニングし，カタラーゼ試験，オキシダーゼ

情報が不足している。

試験，TSI培地，LIM培地，SC培地にて，生化学

安全な野生鳥獣肉の提供および消費には，適切性状を確認した。また，MALDI－TOF MSにてな安全性対策が必要であり，そのための基礎的菌種の同定を行った。

データが必要である。本研究では，食肉として消（３） カンピロバクター

費される野生シカおよびイノシシを対象とし，細糞便スワブをプレストン培地に接種，42℃，微菌性食中毒の中でも発生数の多い，大腸菌やサル

好気条件で二晩培養した。これをバツラー寒天培

モネラなどの腸内細菌科細菌，カンピロバクター

地に塗抹，42℃，微好気条件で二晩培養した。カ属細菌，およびブドウ球菌について保有状況を明

ンピロバクターと疑われるコロニーをクローニン

らかにする。これらの結果は，野生鳥獣を食用とグし，新鮮菌の位相差顕微鏡観察，カタラーゼ試して有効に活用するための基礎資料となり，安全験，オキシダーゼ試験，MALDI－TOF MSにてな食肉（ジビエ）の供給につながると考えられる。

菌種の同定を行った。

２．方

法

2.1

料

材

（４）
 病原性大腸菌（志賀毒素産生性大腸菌，
STEC）
糞便スワブをクロモアガーSTEC寒天培地（関2014年６月から12月に狩猟捕獲された野生シカ

東化学）に塗抹し，37℃にて一晩培養した。本培

70頭およびイノシシ64頭，計134頭の新鮮糞便を地は，病原性大腸菌は藤色のコロニーを形成し，用いた。これらの動物は，食用として解体処理さ紫外線を照射すると病原性大腸菌Ｏ157は蛍光せれた。

ず，他の病原性大腸菌は蛍光を発する特徴があ2.2

食中毒菌の分離と同定る。藤色コロニーをクローニングし，カタラーゼ（１） 黄色ブドウ球菌試験およびオキシダーゼ試験を行い，MALDI-

糞便スワブを７％食塩加ミューラーヒントン

TOF MSにて菌種の同定を行った。

（MH）培地に接種，37℃にて一晩培養した。こ2.3

れを卵黄加マンニット食塩寒天培地に塗抹し，（１）
 黄色ブドウ球菌のコアグラーゼ試験およ

37℃にて一晩培養し，卵黄反応が認められたコロ

病原性関連因子の解析
びエンテロトキシン産生試験

ニ ー を ク ロ ー ニ ン グ し た 。グ ラ ム 染 色 お よ び

コアグラーゼ試験は，ウサギプラズマ“栄研”

Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization（栄研化学）を用い，凝集試験を行った。エンテ© The Ito Foundation

196

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ロトキシン産生は，SET-RPLA「生研」（デンカ
生研）を用い，エンテロトキシンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ

３．結果と考察

産生を逆受け身ラテックス法にて検出した。

3.1（２） 大腸菌の病原性関連遺伝子検出，毒素産黄色ブドウ球菌，サルモネラ，カンピロバク

細菌の分離率ター，STECの分離頭数および分離率をTable１に

生試験および血清型決定
病原性関連遺伝子は，PCRにて検出した。新鮮まとめた。いずれかの細菌が分離された動物は，菌からインスタジーンDNA精製マトリクス（Bio-

シカ22頭（31.4％），イノシシ14頭（21.9％），合Rad）を用いてDNAを抽出し，PCRの鋳型とし計36頭（26.9％）であった。対象動物は肉眼で異た。VT１遺伝子（stx1)，VT２遺伝子（stx2），

常はなく便痢様の糞便はなかったが，これらの細細胞付着性因子遺伝子（eaeA）について既報の菌を保有していることが明らかになった。

方法に従って検出した１，２）。stx1 または stx2 陽性

各細菌の月別の分離率を，Fig.１，２，３に示しの場合，志賀毒素産生性大腸菌（STEC）と判定た。黄色ブドウ球菌は，６月から９月にかけて分した。

離され８月に最も多く，10月以降は分離されな

ベ ロ 毒 素（VT）産 生 に つ い て は ，VTEC-かった。サルモネラは，９月に分離された。カンRPLA「生研」（デンカ生研）を用い，VT１およピロバクターおよびSTECの分離率は月ごとの特びVT２産生を逆受け身ラテックス法にて検出し徴は見られなかった。しかし，カンピロバクター

た。病原性関連遺伝子が検出された株についてＯ

については分離株数が少ないため，継続した調査

抗原型を決定した。国内での食中毒事例として報が必要である。

告の多いＯ157，Ｏ26，Ｏ103，Ｏ104，Ｏ111，Ｏ

菌種により保有動物に偏りがあり，STECおよ

121，Ｏ145について，病原大腸菌免疫血清「生研」

び黄色ブドウ球菌はシカからの分離が多かった（デンカ生研）を用いスライド凝集法にて判定し（p＜0.05）。カンピロバクターおよびサルモネラ

た。

はイノシシからの分離のみであった。

2.4

3.2

統計学的解析

黄色ブドウ球菌

分離率の有意差検定は，Yates補正χ 検定に

分離株13株中，コアグラーゼ陽性11株，陰性２より行った。p＜0.05の場合，有意差があると判株であった。エンテロトキシンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ産定した。

生は，いずれの株も陰性であった。食中毒の原因

２となるエンテロトキシンは，今回調べた型の他にもＥ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ型があり，また，エンテロ

Table 1 Number and percentage of bacterial isolation-positive animals
Number ofanimalStaphylococcus aureus

Salmonella spp.

Campylobacter spp.

Shiga-toxin producing
Escherichia coli

ｎ

ｎ

％

ｎ

％

ｎ

％

ｎ

％

Deer

70

11

15.7Ａ

0

0

0

0

14

20.0Ｂ

Boar

64

2

3.1Ａ

1

1.6

9

14.1

2

3.1Ｂ

Total

134

13

9.7

1

0.7

9

6.7

16

11.9

A and B : There was a significant difference (p＜0.05) between deer and boar.

© The Ito Foundation

Isolation rate

食肉として消費される野生動物における食中毒菌の保有調査
70%

3.3

60%

サルモネラは，イノシシから１株のみ分離され

50%
Deer
Boar

30%
20%
0%

サルモネラ

た。保有率が低いことから，野生動物に起因する

40%

10%

サルモネラ食中毒の可能性は低いと考えられる。
3.4

カンピロバクター

カンピロバクターは，イノシシからのみ９株分
Jun

Jul

Aug

Sep Oct
Month

Nov

Dec

離された。菌種は，C. coliおよびC. lanienae各１

Fig. 1 Isolation rate of Staphylococcus aureus from wild

animals. S. aureus were isolated from deer during
June to September, while it was isolated from boar
only in August.

Isolation rate

197

株，C. hyointestinalis７株であった。人のカンピ
ロバクター食中毒の原因として最も多いC. jejuniは分離されなかったが，C. jejuniについで多いC.
coliが分離されたことから，イノシシは食中毒の50%

原 因 と な る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。ま た ，C.

40%

lanienaeおよびC. hyointestinalisは海外において30%

人への感染が報告されており４，５），これらの菌種

20%

Boar

10%
0%

による被害が発生する可能性もある。C. lanienae
は，動物の解体処理従事者から分離されており４），
経口以外にも人への感染ルートがあると考えら

Jun

Jul

Aug

Sep Oct
Month

Nov

Dec

れ，野生イノシシの解体時には注意が必要である。

Fig. 2 Isolation rate of Campylobacter spp. from wild

animals. The bacteria was isolated only from boar.

3.5

STEC

STECクロモアガー寒天培地にて藤色コロニー

Positive animal rateを形成し，病原性を持つと疑われる大腸菌は82株60%分離された。このうち，STECは19株（23.2％）

50%であり，stx1 保有は６株（7.3％）および stx2 保

40%

有は19株（23.2％）であった。EaeA保有株は11

30%

Deer
Boar

20%
10%
0%

株（13.4％）であった。動物１個体から異なる２株が分離されることもあった。各病原因子遺伝子の保有状況をTable２にまとめた。

Jun

Jul

Aug

Sep Oct
Month

Nov

Dec

STECは，イノシシよりもシカからの分離率がFig. 3 Positive animal rate for Shiga-toxin producing

Escherichia coli. The bacteria was isolated fromboar only in September.

高かった（p＜0.05）。しかし，VT遺伝子（本研究では stx2 のみ）と同時に eaeA を保有する株はイノシシ由来の２株（Ec58-1BY, Ec58-2BY）のみであった。VT産生は，VT１産生は stx1 保有

トキシン様毒素が16種ある 。今回の結果からは，と一致したが，VT２産生は stx2 保有と一致せず

野生シカ・イノシシが保有するブドウ球菌が食中検出できない株もあった（10/19株）。stx2 は抗原毒を起こす可能性は示されなかったが，今後，他型が多く，さらに同じ抗原型の中でも遺伝子に変の毒素についての解析も必要である。

異がある１）。今回のラテックス凝集反応では，野３）© The Ito Foundation

198

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 2. Number of Escherichia coli isolates carrying

pathogenic gene（s）．
Gene
（s）

血清型Ｏ157も含まれた。今回調査した動物では，下痢など異常の報告はなかった。以上のことか

Total number

Deer

Boar

stx1

6

5

1

stx2

19

16

3

eaeA

11

8

3

た。食用として狩猟動物を解体する際には消化管

stx1＋stx2

651の取り扱いに注意し，可食部位の腸管内容物によstx1＋eaeA000

る汚染を防ぐことが重要と考えられる。このよう

stx2＋eaeA202

stx1＋stx2＋eaeA

0

0

0

な野生動物における病原体保有状況などの情報提ら，野生シカおよびイノシシは，食中毒を起こす可能性のある細菌を保有することが明らかになっ

供は，適切な野生獣肉の取り扱い（衛生的な解体処理，生食をしないなど）につながると考えら

生動物由来株がVT２を産生していないのか検出れ，食中毒予防の効果が期待できる。

できなかったのか判定できず，抗原型の異なるVT２を産生する可能性も考えられる。
Ｏ抗原型が判明したのは，stx2およびeaeAを同時に保有する２株（Ec58-5BY, Ec58-2BY）で，血清型Ｏ157であった。野生動物が保有する株においては未知の抗原型の可能性もある。今回決定
できなかった毒素や血清型については，さらなる解析が必要であると考えられる。
４．要

約

食肉として消費される野生シカおよびイノシシ
における食中毒菌の保有状況を調査した。対象動物の27％から，志賀毒素産生性大腸菌，サルモネ
ラ，カンピロバクター，黄色ブドウ球菌のいずれかの細菌が分離され，分離率はそれぞれ11.9％，
0.7％，6.7％，9.7％であった。大腸菌および黄色ブドウ球菌は，イノシシよりもシカから多く分離された（p＜0.05）。カンピロバクターおよびサル

文献１） Scheutz, F., Teel, L.D., Beutin, L., Pierard, D.,
Buvens, G., Karch, H., Mellmann, A., Caprioli, A.,
Tozzoli, R., Morabito, S., Strockbine, N.A., MeltonCelsa, A.R., Sanchez, M., Persson, S., OʼBrien A.D. :Multicenter evaluation of a sequence-based protocol
for subtyping Shiga toxins and standardizing Stx
nomenclature, J Clin Microbiol., 50, 2951～2563, 012.
２） Chapman, T.A., Wu, X.Y., Barchia, I., Bettelheim,
K.A., Driesen, S., Trott, D., Wilson, M., Chin, J.J. :Comparison of virulence gene profiles of Escherichia
coli strains isolated from healthy and diarrheicswine, Appl Environ Microbiol., 72, 4782～4795, 2006.
３） Kadariya, J., Smith, T.C., Thapaliya, D. :Staphylococcus aureus and staphylococcal food-borne
disease: an ongoing challenge in public health,
Biomed Res Int., 2014, 827965, 2014．
４） Logan, J.M., Burnens, A., Linton, D., Lawson, A.J.,
Stanley, J. : Campylobacter lanienae sp. nov., a new
species isolated from workers in an abattoir. Int J
Syst Evol Microbiol,. 50, 865～872, 2000．
５） Bullman, S., OʼLeary, J., Corcoran, D., Sleator, R.D.,
Lucey, B. : Molecular-based detection of nonculturable and emerging campylobacteria in patients
presenting with gastroenteritis, Epidemiol Infect,
140, 684～688, 2012．

モネラは，イノシシから分離された。大腸菌には，© The Ito Foundation

199

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量
Standard operation procedures for Japanese Black cattle related toreproductive performance

佐々木

羊介・上松

瑞穂＊・北原豪＊＊・大澤健司＊＊（宮崎大学テニュアトラック推進機構，＊NOSAIみやざき，＊＊宮崎大学農学部）

Yosuke Sasaki, Mizuho Uematsu＊, Go Kitahara＊＊ and Takeshi Osawa＊＊（Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki, ＊NOSAI Miyazaki,＊＊Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Japanese Black is the most popular beef breed in Japan. The relationship between
management procedures and reproductive performance in cow-calf operation was investigated.
The target population for the present study comprised beef cattle farms located in Miyazaki
prefecture, Japan. A questionnaire survey was conducted by clinical veterinarians to ask the
production system and management procedures. A total of 189 farms were participated in thepresent study. The 189 farms were categorized into three groups based on the average cow
inventory: small（1 to 10 cows; n ＝ 72），middle（11 to 50 cows; n ＝ 90）and large（more than
51 cows; n ＝ 27）．Small farms had longer interval from calving to first service and lower
conception rate than large farms（P<0.05）. In small farms, cows served during winter andspring had lower conception rate than those during summer and fall（P<0.05）, whereas there
was no difference of conception rate among season in large farms. The results of questionnaire
survey showed small farms had higher proportions of farms remaining cows in the calving
room after service than large farms（P<0.05）. In addition, small farms had higher number ofcalving room per cow than large farms（P<0.05）. Cows in large farms had shorter weaning age
than those in small farms（P<0.05）. Large farms had higher proportion of farms using ICT
devices to predict the timing of parturition and to find estrus of cows compared to the otherfarms（P<0.05）. There was no difference of the amount of roughages per day among farm sizegroups, but large farms fed higher amount of concentrated feeding than small farms（P<0.05）.
In addition, many large farms had management to reduce cold stress. Based on these results,
we recommend improving performances of cows by feeding concentrate feeds more,
performing the practice to reduce cold stress, and introducing ICT technique to find estrus.

© The Ito Foundation

200

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

る因子が黒毛和種牛の生産性に及ぼす影響を明ら

的

１．目

かにし，効率的な飼養形態の確立に寄与すること

黒毛和種牛の飼養戸数は年々減少する一方で，１農場あたりの飼養頭数は増加傾向にあり，少頭数飼育から多頭経営へと推移してきている１）。こを目的とする。
２．方法の多頭化と反比例して，黒毛和種牛の繁殖成績は2.1

年々低下しており，ここ20年で黒毛和種牛の受胎

宮崎県内における黒毛和種牛繁殖農場を対象と率は約10％低下している 。さらに，黒毛和種牛

して，農場の飼養形態と繁殖和牛に対する飼養管

繁殖農場は，国際競争力の激化や飼料や資材の高理についてアンケート調査を行った。調査は臨床

騰などの問題を抱えており，生産現場では繁殖成

獣医師の協力の下，各農家に聞き取り調査で行っ績を向上させる効率的な飼養形態の確立が求めら

た。

２）

2.2

れている 。
３）

調査対象とした集団調査に用いた質問票

生産現場における生産効率の低下は，単独ではアンケート調査を実施するために，黒毛和種牛

なく複数の要因が相まって影響していることが多繁殖農場の飼養形態と繁殖和牛に対する飼養管理

いため，問題点を正確に抽出することが非常に困について聞き取る調査票を作成した。調査票の作難である。その対策として，動物を「群」として

成は，臨床獣医師および畜産関連団体と協議して認識し，蓄積された生産データを活用する「繁殖行い，調査の対象とする項目を選定した。調査表

疫学」という手法がある。ブタ やニワトリ では，農場の飼養形態，分娩に関する飼養管理，種は，各個体から得られる莫大なデータを「群」と付けに関する飼養管理，給餌に関する飼養管理，して活用し，飼養形態や環境要因が繁殖成績に与暑熱・寒冷対策の実施，廃用に関する飼養管理のえるリスクを抽出し，生産現場に還元できるシス

６つのセクションで構築した。各々のセクション

テムがすでに整っているが，ウシではいまだにこに関する代表的な質問項目をTable１に示した。

４）

５）

2.3

の手法が十分に活用されていない。

生産記録の収集

日本では，2001年に牛海綿状脳症（BSE）が初

繁殖成績を算出するために，各農場における黒めて国内で確認されたことを発端に，ウシを一生

毛和種牛の生産記録を収集した。各生産記録は電にわたって監視するための個体識別番号システム

子ファイルとして抽出し，繁殖和牛の個体情報，が導入された。この個体管理システムは，各個体

分娩成績，種付け成績などを収集した。収集したの分娩や種付けといった生産イベントや血統情報

生産記録をもとに，各農場における繁殖成績を算を記録・保持し，大規模なデータベースを築き上出した。

は，乳用牛の牛群

また，各農場における飼養頭数をもとに，農場

健康管理の指標と繁殖成績の関連性について報告

を３つの飼養規模に分類した。分類の基準としし，ウシにおいても繁殖疫学の手法が生産現場にて，母牛の飼養頭数が１～10頭の農場を小規模農有効であることを示した。しかし，これまでに黒場，11～50頭の農場を中規模農場，51頭以上の農毛和種牛に対してこの手法を試みた報告は見当た場を大規模農場と分類した。

げている。近年，Nakadaら６）らない。そこで，本研究では黒毛和種牛農場の飼

2.4

養形態や飼養管理の実態調査を行い，飼養に関わ

統 計 解 析 に は SAS ソ フ ト ウ ェ ア Version 9.4© The Ito Foundation

統計解析

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量

201

Table 1 The questionnaire items in each section
SectionQuestionnaire items

Farm basic information

Average cow inventory
Type of barn
Distance from house to farmManagement for cows in calving

Days when pregnant cows move to calving barnDays when cows move from calving barn
Bedding materials

Management for cows during estrus

Methods for estrus detection
Days when estrus detection performs
Methods for pregnancy diagnosis

Feeding program

Feed amount of roughages per day
Feed amount of concentrate feeds per day
Feeding program in each season

Management to reduce heat stress and cold stress

Management to reduce heat stress
Management to reduce cold stress

Culling guidelines for cows

Culling guidelines for old-age cows
Culling guidelines for cows with reproductive failureManagement for replacement heifers（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）を用いた。

に種付けした母牛は夏または秋に種付けした母牛

飼養規模と繁殖成績の関連性に関して，よりも受胎率が低かったが（Ｐ＜0.05），大規模Continues variableの解析にはMIXED procedure

農家では季節間による受胎率の差がみられなかっによるA linear mixed-effects modelを，Binomial

た。

variableの解析にはGLIMMIX procedureによるa

母牛の飼養形態として，分娩前後の時期では，

mixed-effects logistic regression model を 用 い

すべての飼養規模グループにおいて，８割前後のた。有意な関連性がみられた項目に関して，多重農場が分娩房で母牛を飼育していた。一方，AI比較が必要な際はTukey-Kramerによる多重比較以降の時期では，母牛をスタンチョン牛舎で飼育を実施した。また，各飼養形態および飼養管理にしていた農場割合は大規模農場では67％であった

関して，飼養規模ごとに農場割合を比較し，これが，小規模農場では10％であり，大規模農場が有ら の 関 連 性 に 関 し て A linear mixed-effects

意に高かった（Ｐ＜0.05）。小規模農家は，AI以modelにて有意性を検定した。

降の時期もそのまま分娩房で飼育している農場の割合が大規模農場よりも高く（Ｐ＜0.05；49％

３．結果と考察vs.13％），飼養している母牛１頭当たりの分娩房本調査に協力した農場は189農場であった。189
農場の平均飼養母牛頭数は26頭であった。このの 数 も 有 意 に 多 か っ た（Ｐ ＜ 0.05 ； 0.75 部 屋
vs.0.18部屋）。

189農場の飼養規模別の農場数は，小規模農場が分娩に関する飼養管理として，妊娠末期に母牛72農場，中規模農場が90農場，大規模農場が27農を分娩房に移動する時期は分娩予定日の26日前，場であった。飼養規模と繁殖成績の関連性とし分娩後に母牛を分娩房から移動する時期は分娩後て，大規模農家は小規模農家と比較して，分娩か26日後であった。これらの時期は農場規模と関連ら初回種付けまでの日数が短く，受胎率が高く，性がみられなかった。しかし，大規模農家は，小そして人工授精回数が少なかった（Ｐ＜0.05）。

規模農場と比較して，子牛の離乳日齢が約35日早また，小規模および中規模農家では，冬または春

かった（Ｐ＜0.05）。また，母牛の分娩時期の予© The Ito Foundation

202

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

測方法として，目視による行動観察や乳房の張り

規模農場が小規模農場よりも少なかった（Ｐ＜を触診して予測している農場が８割以上存在し0.05；5.1回vs.8.5回）。

た。一方，牛温恵などの温度センサーや牛舎の設本研究では，小規模農場において，遅い発情回

置カメラなどのICT機材を活用している農場は，

帰および低い受胎率が認められた。これは，飼養

大規模農場で１割程度であり，小規模農場では形態および飼養管理に関する調査で得られた，子０％であった。

牛の離乳日の長さ，発情確認の手法，発情確認期

種付けに関する飼養管理として，発情確認を開間中における飼養形態が関連している可能性があ始するタイミングや発情誘起を行うタイミング

る。小規模農場では，子牛の離乳日が長く，子牛は，飼養規模と関連がみられなかった。母牛に対による授乳刺激が母牛の発情回帰を抑制している

してPGF２αの投与などの発情誘起を実施してい可能性がある。また，小規模農場では，他の農場

る農場割合は，大規模農場が小規模農場よりも有と比較して，牛歩計の使用割合が低く，ICT機器

意に高かった（Ｐ＜0.05；81％vs.60％）。発情確を用いた発情確認を実施している農場が少なかっ

認はほとんどの農場で朝夕２回実施され，発情確た。これらの機器は，目視による行動観察という認の手法としては，８割前後の農場が粘液，牛の主観的な評価に，客観的な評価を加えることがで鳴き声，牛歩計によって発情を確認していた。牛き，発情確認の精度を向上させることが可能であ歩計を使用している農場割合は，大規模農場ではる。さらに，AI以降も母牛を分娩房で飼育して100％であったが，小規模農場では75％であり，いる農場があるため，外陰部の状態や，母牛の行

大規模農場が有意に高かった（Ｐ＜0.05）。また，動観察を難しくしている可能性が考えられる。

妊娠診断の時期は，農場規模によって差はみられなかった。

また，小規模農場では，冬季における繁殖成績の低下が認められた。冬季には，繁殖成績だけで給餌に関する飼養管理として，粗飼料の成分なく，母牛の死産および難産のリスクが有意に上は，主にイタリアン，飼料イネ，エンバク，野草昇すると報告されており７），死産および難産を経が使用されていた。粗飼料の一日あたりの給与回

験した母牛はその後の繁殖成績が低下する傾向に数および給与量は，農場規模と関連性がなかったある８）。本研究の結果より，小規模農場では寒冷が，大規模農場では小規模農場よりも，授乳期，対策を実施している農場割合が極端に低く，さら妊娠期，妊娠末期のすべてのステージにおいて，に濃厚飼料の給与量が少ないことより，寒冷スト

濃厚飼料を多給していた（Ｐ＜0.05）。

レスに対する対策が十分に実施されていないと推

暑熱対策として，ほぼすべての農場が扇風機を設置していた。寒冷対策では，約７割の農場が風察される。今後は寒冷ストレスの軽減が繁殖成績の向上に寄与する可能性がある。

よけの設置を行っていた。また，ヒーターを設置

本研究では，疫学手法により，国内の繁殖和牛している農場割合は，大規模農場が小規模農場よの飼養形態および飼養管理の実情を明らかにしりも多かった（Ｐ＜0.05；81％vs.21％）。

た。本研究から得られた知見は，繁殖和牛生産農

廃用に関する飼養管理として，高齢を理由とし場における生産性の改善に貢献することができて廃用に供する年齢の基準はすべての飼養規模グる。国内では，飼養頭数の増加や生産者の高齢化

ループにおいて11歳齢であったが，不受胎を理由などの要因により，飼養形態や飼養管理が多種多として廃用に供するAI不受胎回数の基準は，大様化してきている。本研究で用いた研究手法は，© The Ito Foundation

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量

近年における生産形態の変化を定量化する手法として最適である。特に，本研究では現場の生産者を研究対象としているため，研究結果をすぐに現場に生かすことが可能である。現に，生産現場では数多くの生産記録が存在するが，大規模データ
ベースを解析するためには適切な統計処理および解析技術が必要となるため，これらの記録の活用はいまだ実用的ではない。今後はこれらの解析手法を確立し，繁殖和牛生産農場の生産性向上のための研究をさらに実施する必要がある。
４．要

約

本研究では，宮崎県内における黒毛和牛の繁殖農家を対象とし，飼養管理の実態と飼養規模との関連性を明らかにした。寒冷期における繁殖成績の低下に関して，寒冷対策の手法や，濃厚飼料の給餌量が影響している可能性がある。また，受胎率の低下に関連する要因として，子牛の離乳日齢が遅いこと，発情確認の手法にICT機器を導入していないこと，AI以降の飼養形態などが関連し

203

文
献
１） MAFF : The statistical yearbook of Ministry ofAgriculture, Forestry and Fisheries of Japan. 2013.
http://www.e-stat.go.jp/SG1/estat/List.do?lid ＝000001127029
２） 家畜改良事業団，受胎調査成績2013．
http://liaj.or.jp/giken/gijutsubu/seieki/jyutai.htm
３） Osawa, T. : International perspectives on theimpacts of reproductive technologies on foodproduction in Asia, Adv. Exp. Med. Biol. ，752 ．213
～228，2014．
４） Sasaki, Y., Koketsu, Y. : A herd management
survey on culling guidelines and actual culling
practices in three herd groups based on
reproductive productivity in Japanese commercial
swine herds, J. Anim. Sci.，90，1995～2002，2012．
５） Yassin, H., Velthuis, A. G. J., Boerjan, M., vanRiel, J. : Field study on broilers' first-week
mortality，Poult. Sci.，88，798～804，2009．
６） Nakada, K. : Shall We Start EpidemiologicalStudy Using Production Data in Japanese Dairy
Farms? J. Vet. Epidemiol.，17，５～９，2013．
７） Uematsu, M., Sasaki, Y., Kitahara, G., Sameshima,
H. and Osawa, T. : Risk factors for stillbirth anddystocia in Japanese Black cattle，Vet. J.，198，212～216，2013．
８） Sasaki, Y., Uematsu, M., Kitahara, G., Osawa, T.
and Sueyoshi, M. : Effects of stillbirth and dystocia
on subsequent reproductive performance inJapanese Black cattle，Vet. J., 200，462～463，2014．

ている可能性がある。これらの知見をもとに，繁殖生産性を向上させるために，飼養管理の改善点を明確にする必要がある。

© The Ito Foundation

204

Ⅰ型インターフェロン応答性カタボリック活性の検出による牛妊娠検出技術の開発
Detection of type I interferon-mediated catabolic activity in blood andsomatic cells for early pregnancy diagnosis

高

橋

昌

志

（北海道大学大学院農学研究院）

Masashi Takahashi（Research Faculty of Agriculture, Department of Animal Science, Lab of Animal Breeding and Reproduction）

The aim of this study was to investigate the type I interferon-mediated catabolic activities
of cathepsinB（CTSB）and lysosomes in blood and somatic cells for early pregnancy diagnosis.
Peripheral blood leukocytes（PBLs）separated from blood samples collected from non-pregnant
Holstein cows were used for experiments. Separated BPLs were used for RNA extraction
followed by RT-PCT to detect gene expressions of Type I interferon receptor subunits（IFNAR1 and R2）. Both genes were expressed in PBLs. Then the PBLs were cultured for 24
and 48h with or without recombinant bovine interferonτ（IFNτ）at 38.5 ℃ in a CO ２
incubator. After culture, PBLs were collected and used for gene expression analysis of MX1
and MX2, which are interferon-stimulated genes. CTSB gene expression was also detected
after IFNτ stimulation. IFNτ increased both MX1 and MX2, whereas CTSB was decreased
both in control and IFNτ administration. After staining of PBL with fluorescence dyes for
active CTSB and lysosomal activities, clear fluorescence signals were observed in nucleatedcells, not in anucleate cells such as erythrocytes. IFNτ administration did not clearly show theincrease of CTSB or lysosomal activities by showing the individual difference of cows. To
investigate the IFNτ-induced response of CTSB in somatic cells via possible signaltransduction pathway of Type I IFN receptor, cultured bovine fibroblasts were used for IFNτ
stimulation. Both IFNAR1 and R2 were expressed in fibroblast cells. After 20h of culture with
IFNτ，clear fluorescence signals of active CTSB were observed. These overall results indicate
the possibility of the establishment of IFNτ stimulation bioassay system for lysosomal andcathepsin activities by using appropriate somatic cells.

１．目への対策として早期妊娠診断技術を含めた受胎率的向上技術の開発が緊急に求められている。受精成

国内外で牛の人工授精後受胎率の低下や受精卵

立後，牛胚－母体間の妊娠認識には，胚から分泌移植による受胎率の横ばいが懸念されており，されるインターフェロン（IFN）τが子宮内膜細TPPやFTA締結による海外畜産製品の国内移入胞とのシグナル応答を介し，そのシグナルを受け© The Ito Foundation

Ⅰ型インターフェロン応答性カタボリック活性の検出による牛妊娠検出技術の開発

205た遺伝子群の応答によって妊娠成立，維持および皮細胞のみならず，他の細胞でもIFN受容体を介胎盤形成が進行する。反芻動物胎盤の形態上，子した応答が起こり，それによるカテプシン遺伝子

宮内に分泌されたIFNτタンパク質の母体血中へ発現のみならず酵素活性の増加も表現型として予の移行は起こらないとされており，実際に妊娠牛想される。併せて，不活性カテプシンの貯蔵器官

では血中IFNτの直接検出はされていない。しかであるリソソームもカテプシン活性の向上に伴っし，近年，IFNτが属するⅠ型IFNによって誘導た活性化も予想される。そこで，本研究では，①される遺伝子（ISGs）の発現が末梢白血球で検

末梢血球細胞へのINTτの刺激評価および，②体出される細胞へのIFNτ添加によるカテプシン応答性につ１～３）ことから，子宮内に産生されたIFN

τが検出限界以下の微量で血中に移行し直接ある
いは間接的に受容体を通して母体内血中細胞への妊娠シグナル応答を引き起こす傍証が得られていいて解析を行うことを目的とした。
２．方法

る。このことから，これまでにIFN応答性遺伝子2 . 1 非妊娠末梢白血球細胞でのカテプシン，であるMX１，２やISG15などのmRNA発現を指標

リソソームの発現・活性に及ぼすIFNτ応とした妊娠判定技術の開発が試みられているが，答性検出遺伝子の相対発現比較のため陰性対照区を設定す

非妊娠のホルスタイン経産雌牛より頸静脈からる必要があることや，細胞採取・調整に加えて機の採血を行い，白血球を分離した。分離白血球を器や時間を要するなどの課題も多く，簡易かつ高10％牛血清添加RPMI1640を用いて二回洗浄し実精度な判定手法を求める声も依然として多い。一験 に 供 し た 。採 取 し た 分 離 白 血 球 の 一 部 か ら方，細胞内の微小器官であるリソソーム内に蓄積

RNAを抽出，cDNA合成後，Ⅰ型インターフェ

され，不要なタンパク質や微小器官の異化・再利ロン受容体であるIFNAR-１，-２の遺伝子発現用に関わるシステインプロテアーゼは，異化（カをRT-PCRにて検出した。

タボリック）作用に加えて，細胞分化，癌化や組RPMI-1640培地に浮遊させた分離白血球浮遊

織再構築に深く関わることが知られている。近液を４ウェル培養皿に移し，（独）農業・食品産

年，ヒツジ子宮内膜でINTτによるシステインプ

業技術総合研究機構

ロテアーゼであるカテプシン群（カテプシンｓ）

博 士 よ り 分 与 を 受 け た recombinant IFN τ を遺伝子発現の誘導が判明し ，子宮上皮細胞膜上400IU/mlの抗ウイルス活性に調整し，添加した。

に存在するⅠ型IFN受容体を介したカテプシンの添加24および48時間後にサンプリングし，IFN応

発現と妊娠に伴う子宮内組織改編のシグナル応答

答遺伝子であるMX１，
２，およびカテプシンＢ機構の重要性への注目がなされている。しかし，遺伝子の発現を解析した。

４）子宮上皮を含む細胞でのIFN応答カテプシンの発

畜産草地研究所

木村康二

また，IFNτ添加20時間に白血球細胞を回収し，混和後，カテプシンＢ活性基質（MagicRed）を現応答に関する研究は未着手である。
加えて，体細胞や血球細胞など多くの細胞が免300倍に希釈して添加し，CO２インキュベータ中で疫反応に関わるIFNαに代表されるⅠ型IFNの応38.5℃，40分培養した。この際に同時に核染色試薬

答性を有することが知られており，妊娠血中の白であるHoechstを１μg/mlの濃度で同時に添加した。

血球でIFNτ由来刺激によるISGs発現が報告されリソソームの活性については，活性蛍光指示薬ている。このことは，IFNτが存在すれば子宮上であるLysoTrackerを1000倍の希釈倍率で添加© The Ito Foundation

206

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

し，カテプシン処理時と同様にHoechstを添加し，ところ，Ⅰ型IFNの受容体であるIFNAR-１，

40分間培養した。

-２の両サブユニットの遺伝子発現が検出された

活性指示薬でそれぞれ染色した白血球浮遊液を（Fig.１）。分離白血球浮遊液にIFNτを添加24時

マイクロスライドチャンバー（ibidi）に移し，蛍間後には，MX１および２の発現が誘導された光顕微鏡（Keyence）で赤色蛍光を検出，撮影し（Fig.2 a, b）。このことから，Fig.１で検出されたた。撮影画像はImageJを用いて画像解析し，蛍白血球に存在するⅠ型IFN受容体を介したIFNτ

光強度を計測・定量化した。

によるシグナル経路が働いていることが確認され

2 . 2 培養体細胞を用いたIFNτ応答性カテプた。しかし，カテプシンＢ遺伝子についてはIFNτ に よ る 発 現 誘 導 は 見 ら れ ず ，逆 に 減 少 し た

シン活性の検出
本計画での仮定として，Ⅰ型IFN受容体が存在（Fig.2 ｃ）。ヒトＣ型肝炎患者へのIFNτ投与後のすれば子宮上皮細胞のみならず他の体細胞でも末梢血単核細胞においてMX１，
２およびカテプシ

IFN受容体を介した応答が起こり，それによるカンC, K, Lの遺伝子発現の増加が見られること５）か

テプシン遺伝子発現のみならず酵素活性の増加も

ら，Ⅰ型IFNシグナル経路によって血液細胞での表現型として予想されることを実証するため，牛カテプシン誘導も影響を受けることが想定され線維芽細胞を用いてIFN受容体の発現の確認とた。今後は，Ｂ以外のカテプシンについても解析

IFNτ添加後のカテプシン活性誘導の有無についの必要がある。

て検討した。

また，IFNτ添加20時間に白血球細胞を回収し，

牛線維芽細胞を分散後，１ｘ105の濃度で８均一混和後，カテプシンＢおよびリソソーム活性

ウェルディッシュ（Thermo Scientific）に播種を検出したところ，有核細胞においてカテプシン

し，５％FCS添加DMEM中で80％程度の増殖確

Ｂ活性が検出され（Fig.３），若干の混入が見ら認後に試験に供試した。IFNτを400IU/mlの濃れた赤血球ではカテプシンＢ活性はまったく見ら度になるように培養液で希釈し，培養を開始しれなかった。このことは，リソソーム活性でも同た。対照区として，５％FCS添加DMEMを用い様に有核細胞のみでの活性発現であった。本実験

た。IFNτ添加20時間後に培養液を交換し，カテでは，分離リンパ球における活性を検出したが，

プ シ ン Ｂ 活 性 化 検 出 蛍 光 試 薬 を ５ ％ FCS 添 加

無核細胞である赤血球でまったく活性が見られな

DMEMで300倍に希釈して各区に添加した。カテ

かったことは，全血を用いた際に有核細胞のみ選

プシンＢ活性化検出蛍光試薬添加後，CO２ イン

択的に蛍光検出が可能であることが示唆され，今キュベーター中で40分間培養した。培養後同培養後の採血後，簡易迅速な活性検出に用いることが液で洗浄し，蛍光顕微鏡にてカテプシンＢの活性期待される。
分離リンパ球にIFNτ添加20時間後のカテプシ蛍光を検出した。

ンＢおよびリソソーム活性を画像解析によって活

３．結果と考察

性輝度計測を行ったところ，採材した個体で応答3 . 1 非妊娠末梢白血球細胞でのカテプシン，の違いが見られ，IFNτ添加による明瞭な影響はリソソームの発現・活性に及ぼすIFNτ応

見られなかった（Fig.４）。考えられる理由とし

答性検出て，カテプシンが不活化されて収納されているリ採取した分離白血球からRT-PCR解析を行った

ソソームは細胞の品質６），暑熱等の外部からの物© The Ito Foundation

Ⅰ型インターフェロン応答性カタボリック活性の検出による牛妊娠検出技術の開発
cow1

cow2

cow3

cow4

207

cow5

IFNAR1IFNAR2βactinFig. 1 E x p r e s s i o n o f I F N A R 1 a n d R 2 g e n e s i nExpression level relative to β-actin

peripheral blood leukocytes

MX1

a）
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

Fig. 3 peripheral blood leukocytes stained by cathepsinbcontrol
24h
48h

activity and hoechst for staining nuclei
 Cells showing cathepsin activities and stained
nucleai （bright cells）． Black cells with nofluorescence are erythrocytes（400x）n=5acontrol

その結果カテプシンＢの漏出が起こる７）ことが知IFN-τ

Expression level relative to β-actin

a vs b : p<0.05
b）

MX2

50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0

らびにカテプシンＢの漏出・活性化が起こり，IFN

control24h48h受容体を介した応答と混在した可能性が考えられる。今後は，全血を使用するなど，できるだけ細胞にストレスを与えない処理を行う必要がある。

b3 . 2 培養体細胞を用いたIFNτ応答性カテプ
a

n=5
IFN-τ

Expression level relative to β-actinc）（Fig.5 a）。IFNτ添加20時間後には活性化したカc

テプシンＢを示す赤色蛍光の顕著な増加が観察さacontrol

1

24h

0.8

48h

0.6
0.2

容 体 IFNAR- １ お よ び ２ の 発 現 が 確 認 さ れ た

Cathepsin B

1.2

0.4

シンＢ活性の検出
牛線維芽細胞におけるⅠ型インターフェロン受

a vs b : p<0.05

1.4

られている。このことから，細胞の分離，培養などの操作中の環境によってリソソームの活性化な

control

1.6

理，化学的なストレスによって容易に活性化し，bb化程度が少なかった。
本実験結果より，INFτによる応答シグナルは，
妊娠子宮内での上皮細胞に特異的ではなく，Ⅰ型

d0control

れた（Fig.5 b）。これに対して，対照区では活性dn=5

インターフェロン受容体を有する細胞でも起こることが明らかになった。羊へのIFNα投与によっIFN-τ
a vs b, c vs d : p<0.1

Fig. 2 Expression of MX1, 2 and cathepsin B genes in

non pregnant lymphocytes by IFN-τstimulationてIFNτと類似した黄体退行抑制効果８）やIFNτ
の投与によって体温が一過性に上昇することが報告されている９，10）。これらのことから，子宮，黄© The Ito Foundation

平成26年度

500
400
300
200
100
0

Fluorescent intensity oflysosomes(pixels)

c）
700
600
500
400
300
200
100
0

b）

Cow1-cathepsinB

c

IFN-τ

Cow1-lysosomal activity
＊＊

c

IFN-τ

Fluorescent intensity oflysosomes(pixels)

Fluorescent intensity oflysosomes(pixels)a）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

500

Cow2-cathepsinB

400

＊＊

300
200
100
0
d）

Fluorescent intensity oflysosomes(pixels)

208

350
300
250
200
150
100
50
0

c

IFN-τ

Cow2-lysosomal activity

c

IFN-τ
＊＊ : p<0.01

Fig. 4 Effect of IFN-τ on cathepsin and lysosomal activities of white blood cells collected from non-pregnant cows.

IFNAR1IFNAR2βactinCell1 Cell2 Cell3 Cell4

Cell1 Cell2 Cell3 Cell4

Cell1 Cell2 Cell3 Cell4a）b）Control

IFN τ

Fig. 5 Expression of type I interferon receptors and induction of cathepson B activity by IFN－τ in bovine fibroblast

cells（100x）© The Ito Foundation

Ⅰ型インターフェロン応答性カタボリック活性の検出による牛妊娠検出技術の開発

体などの生殖組織へのⅠ型IFNの共通作用や，生殖組織以外の組織・細胞への応答としての副作用の応答にはIFN受容体を介した応答としてのIFNのシグナルが働いていると言える。
本研究においては，生殖細胞以外の体細胞においてもIFNτによってシグナルの活性化が起こ
り，その結果として細胞内カテプシンの活性化という表現型として明瞭な反応が見られたことは興味深い。IFNτの作用としてのカテプシン－リソ
ソーム経路に関しては未解明な点が多いため，
IFNτが関与する妊娠に伴う新たな間接評価系としてのアッセイの開発が期待される。
４．要

約

本研究では，着床時牛受胎産物から産生される
IFNτ応答を検出・評価することを目的として，
細胞内の不要タンパク質等の異化に関わるリソ
ソームおよび，それに含まれる主要酵素であるカ
テプシンＢの活性に着目し，抹消白血球および繊維芽細胞におけるIFNτ応答性を検出した。白血球ではⅠ型IFN受容体の遺伝子が発現しており，
IFNτ添加によってMX１，２遺伝子の誘導が確認された。しかし，カテプシンＢ遺伝子発現誘導は見られず，リソソームおよびカテプシンＢの活性にもIFNτによる明瞭な誘導効果は見られなかった。これに対して，牛繊維芽細胞でのⅠ型
IFN受容体遺伝子発現および，IFNτ添加によるカテプシンＢ活性の促進が観察された。以上の結果より，Ⅰ型IFN受容体を有する細胞を適切に選ぶことにより，リソソームおよびカテプシンＢ活性を指標としたIFNτのバイオアッセイに用いる可能性が示唆された。

209

文
献
１） Kizaki, K., Shichijo-Kizaki, A., Furusawa, T.,
Takahashi, T., Hosoe, M., Hashizume, K. : Differential
neutrophil gene expression in early bovine pregnancy,
Reprod Biol Endocrinol.，11，１～10，2013．
２） Green, JC., Okamura, C.S., Poock, S.E., Lucy, M. C.
: Measurement of interferon-tau （IFN-tau）
stimulated gene expression in blood leukocytes for
pregnancy diagnosis within 18-20d after
insemination in dairy cattle, Anim Reprod Sci., 121，
24～33，2010．
３） Matsuyama, S., Kojima, T., Kato, S., Kimura, K. :Relationship between quantity of IFNT estimatedby IFN-stimulated gene expression in peripheral
blood mononuclear cells and bovine embryonicmortality after AI or ET. Reprod Biol Endocrinol.
10，１～10，2012．
４） Song, G., Spencer, TE., Bazer, F.W. : Cathepsinsin the ovine uterus: regulation by pregnancy,
progesterone, and interferon tau, Endocrinology，
146，4825～4833，2005．
５） Ji, X., Cheung, R., Cooper, S., Li, Q., Greenberg,
H.B., He, X.S. : Interferon alfa regulated gene
expression in patients initiating interferon treatment
for chronic hepatitis C, Hepatology，37，610～621，
2003．
６） Balboula, AZ., Yamanaka, K., Sakatani, M., Hegab,
A.O., Zaabel, S.M., Takahashi, M. : Cathepsin B
activity is related to the quality of bovine cumulus
oocyte complexes and its inhibition can improvetheir developmental competence. Mol Reprod Dev.，
77，439～448，2010．
７） Balboula, A.Z., Yamanaka, K., Sakatani, M.,
Kawahara, M., Hegab, A.O., Zaabel, S.M., Takahashi,
M. : Cathepsin B activity has a crucial role in thedevelopmental competence of bovine cumulus-oocyte
complexes exposed to heat shock during in vitro
maturation., Reproduction，146，407～417，2013．
８） Green, M.P., Spate, L.D., Bixby, J.A., Ealy, A.D.,
Roberts, R.M. : A comparison of the anti-luteolytic
activities of recombinant ovine interferon-alpha andtau in sheep, Biol Reprod，73，1087～1093，2005．
９） Matsunaga, S., Osawa, T., Geshi, M., Takahashi, H.,
Inumaru, S., Yokomizo, Y., Miyake, Y.I. : Effect of asingle intrauterine administration of recombinantbovine interferon-tau on day 7 of the estrous cycleon the luteal phase length and blood profile in dairy
cows, Res Vet Sci，93，381～385，2012．
10） Newton, G.R., Martinod, S., Hansen, P.J., Thatcher,
W.W., Siegenthaler, B., Gerber, C., Voirol, M.J. : Effectof bovine interferon on acute changes in bodytemperature and serum progesterone concentrationsin heifers, J Dairy Sci.，73，3439～3448，1990．

© The Ito Foundation

210

黒毛和種の脂肪交雑形成に影響するビタミンＡを輸送するRBP４のDNA多型探索
Identification of polymorphisms on retinol binding protein 4（RBP4）gene
in Japanese black cattle

平

野

貴・原

ひ ろ み・半澤惠（東京農業大学農学部）

Takashi Hirano, Hiromi Hara and Kei Hanzawa（Tokyo University of Agriculture, Faculty of Agriculture）

Excellent marbling is the greatest merit of beef from Japanese black cattle, and it is
known that the restriction of vitamin A improves marbling significantly. Vitamin A is absorbed
in the small intestine as retinyl ester（RE）, and transported to the liver. RE is then converted
to retinol（ROH）in the liver. To transport ROH to the target tissues（cells）, ROH binds to
RBP4, and the complex is released from liver into the circulatory system. Therefore, it issuggested that polymorphisms on RBP4 gene affects to marbling, and we tried to identify the
RBP4 polymorphisms in Japanese black cattle.
PCR was performed for a random Japanese black cattle population with primers
designed in flanking regions of each exons of RBP4, and the sequences of the PCR products
were determined. These sequences were compared with bovine RBP4 sequence（NM_001040475）and bovine genome sequence（UMD3.1）, and 3 SNPs were detected. Two of. The remaining
these SNPs located in the coding region（c.237C>G）and 3’UTR（c. ＊ 50A>G）
SNP located in an intronic region （c.355 ＋ 26C>T）. c.237C>G in coding region wassynonymous, and it was suggested that the polymorphism did not affect to RBP4 function. It
was predicted that c. ＊ 50A>G located in target sequences for two microRNA, bta-miR-2338
and bta-miR-485．Therefore, it was indicated that c. ＊ 50A>G might change regulation for
RBP4 transcripts by microRNA, and affect to marbling formation.

１．目

子200頭以上からなる父方半きょうだい家系によ的るQTL（Quantitative trait locus）解析が16頭の脂肪交雑は牛肉の価格を決定する重要な形質で種雄牛に対して実施され，脂肪交雑に関連する複あり，黒毛和種はその脂肪交雑に優れた品種であ

数 の 染 色 体 領 域 が 検 出 さ れ て い る １）。ま た ，る。これまでに，黒毛和種特定種雄牛の肥育牛産

EDG1（Endothelial differentiation sphingolipid© The Ito Foundation

黒毛和種の脂肪交雑形成に影響するビタミンＡを輸送するRBP４のDNA多型探索

211

G-protein-coupled receptor 1）, TTN（Titin）や性を防ぐ働きもあると考えられている。RBPには，

MYBPC1（Myosin binding protein C, slow type）

細胞内RBP１，細胞内RBP２，細胞内RBP３およの５’または３’UTRやプロモーター領域に位置す

び血漿RBP４のアイソフォームが存在する。血漿るSNPと脂肪交雑の関連が示されるなど，脂肪交

RBP４は，肝臓から血液（血漿）中に分泌される

雑関連遺伝子の探索が進められている。しかレチノールと結合して各臓器（細胞）へ輸送する

し，脂肪交雑形成メカニズムは不明な部分が多い。

役割を持っている11，12）。RBP4は６つのエクソン

黒毛和種の肥育は伝統的に濃厚飼料を多給し，からなり，ウシ26番染色体上に位置する6,200bp

粗飼料にβカロテン量の少ない稲わらを給与するに渡る遺伝子で，201個のアミノ酸をコードする。

ことで血中ビタミンＡを低レベルにして行われてまた，黒毛和種の脂肪交雑QTLは26番染色体上きたと考えられているでも検出されている１）。

２～４）。実際に，黒毛和種去５，６）

勢牛において血中ビタミンＡ濃度と脂肪交雑に有これらのことから，RBP4の多型は脂肪交雑形

意な負の相関があることが示されている 。また，

成に影響すると考え，黒毛和種における多型を探肥育牛に由来する脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を索することとした。

７）

ビタミンＡが抑制することも示されている 。
８）

ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体γ２．材料および方法（PPAR γ）は 脂 肪 細 胞 分 化 の マ ス タ ー レ ギ ュ

2.1

共試個体

レーターであり，レチノイドＸ受容体（RXR）

黒毛和種に存在するRBP4多型を探索するため。ビタの集団として，これまでに収集されていた生後20

ミンＡは，レチノール，レチナール，レチノイン

日以内に死廃した黒毛和種490頭から74頭を選抜

酸などの総称であり，レチノイン酸はレチノイン

した。これら74頭の選抜は，遺伝的偏りを低減さ酸受容体（RAR）と結合し，PPARγの発現を抑せるために同一種雄牛の産子が２頭を超えないよ

制するとともに，RARの発現を促進する。さらに，

うに行った。これらのゲノムDNAは，耳片組織

RARはRXRとヘテロ二量体を形成するため，をProteinase Kによって37℃で一晩反応した後，PPARγと競合する。その結果，PPARγとRXR

フェノール・クロロフォルムで処理することにの二量体が減少し，脂肪細胞分化が抑制されるとよって抽出した。抽出したゲノムDNAを20ng/μ

考えられている 。すなわち，ビタミンＡは筋肉Lの濃度に調整し，PCR反応のテンプレートとし内に存在する脂肪前駆細胞の分化を抑制しているて使用した。

とヘテロ二量体を形成する必要がある

９，10）

８）

が，ビタミンＡの給与を制限することで脂肪細胞

2.2ダイレクトシーケンシングの分化抑制が解除され，脂肪交雑形成が高まると

ウシRBP4を構成する６つのエクソンをそれぞれ増幅するために，各エクソンの外側にプライ考えられている。
ビタミンＡはレチニルエステルとして小腸絨毛マーを配置した（Fig.１, Table 1）。これら６種のから吸収され，リンパ管を経て肝臓へ送られたプライマーセットを使用してPCRを行った。PCR

後，レチノールに変換されて各臓器へ輸送され反応条件は，熱変性を94℃で２分，その後94℃でる。Retinol-binding protein（RBP）はレチノー

１分，アニーリングを60℃で１分，伸長反応を

ルと結合して脂溶性レチノールを可溶化し，輸送

72℃で１分を35サイクル繰り返し，最終伸長反応

するタンパクである。また，レチノールの細胞毒を72℃で10分間行った。得られた増幅産物を鋳型© The Ito Foundation

212

F

平成26年度

RBP4/ex1
Exon

RBP4/ex2

RBP4/ex3
RBP4/ex4

R2

1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

4

3

ATG

c.237C>GRBP4/ex6

RBP4/ex565c.355+26C>TTAG c.＊50A>G

Fig. 1 Position of primers, exons, and detected SNPs
1）Each box indicates exons of RBP4 gene. Shaded boxes were 3’ and 5’ UTR.
2）Arrows and dashed lines above exons indicate primers and amplified regions by each primers, respectively.
3）Filled triangle indicates SNP position.
4）ATG is initiation codon, and TAG is termination codon.
Table 1 Primers for each exons
Primer sequence（5'→3'）Size (bp）

GC content

RBP4-ex1

F
R

GCGCGTTATGCAAGTGCTGG
ACACCCACTCCATCTCGCTC

427

0.75

RBP4-ex2

F
R

ATGGGTGTGATGAGGGTCTG
GCGACGATGTTGTCTTGCAG

447

0.71

RBP4-ex3

F
R

GAGAACTTCGACAAGGCTCG
ACACACGTCCCAGTTACTGG

438

0.66

RBP4-ex4

F
R

TCCGTCTCTTAAAGTCAGTGC
AGTTCTGGCTACTTACACACG

407

0.59

RBP4-ex5F
R

TCTAACTGCTGTCAGAACTCC
AAAGGCCAGTGAAAGATCTGG

511

0.57

RBP4-ex6F
R

TTACAAGTACATCTAGCTGTCCGCTAGAACAGACCGAAGGTC

590

0.43

としてダイレクトシーケンシングを行った。塩基配列の決定は，Genetic Analyzer 3130（Applied

３．結果と考察

Biosystems, Foster City, CA, USA）で 電 気 泳 動

RBP4遺伝子多型を探索するために，黒毛和種

後 ， Sequencing Analysis version 5.2 に よ っ て

74頭のDNAを用いてダイレクトシーケンシング行った。

を行い，各エクソンについて14～68頭の塩基配列2.3を決定した（Table２）。これら決定した塩基配列

多型探索

決定した塩基配列とデータベースに登録されてを用いて，コード領域内に位置するエクソン３のいるウシRBP4塩基配列（NM_001040475）およc.237C>G，エクソン４の３’末端から26塩基下流

びウシゲノム配列（UMD3.1）を比較することにに位置するイントロン４のc.355＋26C>Tおよびよって多型を探索した。多型の探索および検出さエクソン６の３’非翻訳領域（UTR：untranslated

れたSNPが非同義置換であるかを，GENETYX-

region）に位置するc. ＊ 50A>Gの３種のSNPを検MACを用いて確認した。また，３’UTRに位置す出した（Fig.1, Table２）。これまでに，黒毛和種

るSNPについて，そのSNPがmicroRNAのターの SNP が ，黒 毛 和 種 肥 育 去 勢 牛 52 頭 の プ ー ル

ゲット配列に含まれるかをTargetScan（http://

DNAを用いた次世代型シーケンサーによる全ゲ

targetscan.org）によって解析した。

ノムリシーケンシングによって，網羅的に探索されている 13）。しかし，RBP4のエクソン１～４はread depthが不十分な領域に含まれ，SNP探索の© The Ito Foundation

213

黒毛和種の脂肪交雑形成に影響するビタミンＡを輸送するRBP４のDNA多型探索
Table 2 Detected SNPs on RBP4 gene

Primerｎ＊

SNP

Genomic
position＃
―

―

―

W/W

W/M

M/M

χ２

ｐ

Ｗ

Ｍ

―

―

―

―

―

―

―

―

―

―

RBP4-ex1

14

RBP4-ex2

24

―

―

―

―

RBP4-ex3

68c.237C>G（synonymous） 14,946,129

0.368（25） 0.529（36） 0.103（７）

1.300

＞0.1

0.632

0.368

RBP4-ex465

c.355＋26C>T（intron４） 14,945,816

0.262（17） 0.323（21） 0.415（27）

7.476

＜0.01

0.423

0.577

RBP4-ex5

45

―

―

―

―

―

―

67

c.＊50A>G（3'UTR）

14,940,784

8.238

＜0.01

0.544

0.466

RBP4-ex6―

AlleleFrequency

Genotype frequency(n）

―

―

―

0.382（26） 0.324（22） 0.294（20）

Ｗ：Reference type allele
Ｍ：Substitution type allele＊：Successfully sequenced individuals＃：UMD3.1

対象領域から外れていたため，c.237C>Gとc.355

３ ’UTR で 検 出 さ れ た c. ＊ 50A>G が microRNA の＋26C>Tは今回新たに検出されたSNPであった。

タ ー ゲ ッ ト 配 列 に 含 ま れ る か を TargetScan に

コード領域に位置するc.237C>Gの各遺伝子型

よ っ て 解 析 し た と こ ろ ，こ の SNP は ウ シ の頻度は，C/C型：0.37，C/G型：0.53およびG/G型：

microRNAであるbta-miR-2338とbta-miR-485の0.10であった。また，各アレル頻度はＣアレル：

ターゲットとなり得る配列内に位置することが示

0.63とＧアレル：0.37であったことから，黒毛和された（data not shown）。このことから，この３’種集団に置換型アレルが広まっていることが示さ

UTRで検出されたc.＊50A>Gは，microRNAによれた。しかし，このSNPはアミノ酸置換を伴わなるRBP4遺伝子の転写後調節を変化させ，脂肪交い同義置換であったことから，このSNPはRBP４

雑形成に影響する可能性が示された。

の機能に影響しないと考えられた。また，c.355

今回，各エクソンを増幅するプライマーを用い＋26C>Tはイントロンに位置することから，こて，ダイレクトシーケンシングを行い，各エクソのSNPもRBP４機能に影響しないと考えられた。

ン に つ い て 14 ～ 68 頭 の 塩 基 配 列 を 決 定 し た

c.355＋26C>Tの各アレル頻度は，Ｃアレル：0.42（Table２）。エクソン１とエクソン２の配列を決とＧアレル頻度：0.58であった。

定できた個体はそれぞれ14頭と24頭であった。こ３’UTRに位置するc.＊50A>Gの遺伝子型頻度とれら領域のGC含量は，高GC含量とされる0.65よアレル頻度は，A/A型：0.39，A/G型：0.36，G/

りも高い0.75と0.71であった（Table１）15）。このた

G型：0.25であり，Ａアレル：0.57，Ｇアレル：0.43

め，これらはPCR増幅および塩基配列決定が困難であった（Table２）。このことから，置換型アレな領域であり，塩基配列を決定できた頭数も他エ

ルが黒毛和種集団に広まっていることが示され

クソン領域と比べ，低くなったと考えた。

た。microRNAはmRNAの３’UTRに結合し，そRBP4遺伝子のエクソンおよびその近傍から３の翻訳を抑制するnoncoding RNAの一種であり，種のSNPが検出された。そのうち，３’UTRに位

３’UTRにおけるそのターゲット配列の変異は表置するc. ＊ 50A>Gは，microRNAのbta-miR-2338

現型に影響すると考えられ，実際に３’UTRの変とbta-miR-485のターゲット配列内に位置する可異と大腸ガンとの関連が示されている 。そこで，能性が示され，脂肪交雑形成に関連することも考14）© The Ito Foundation

214

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

えられた。また，今回用いた集団におけるc.355

形成に影響する可能性が示された。

＋26C>Tとc.*50A>Gの遺伝子型頻度は，HardyWeinberg平衡から外れていた（Table２）。今後
は，これらSNPが黒毛和種の脂肪交雑と関連するかを明らかにするとともに，遺伝子型頻度の偏り
が子牛死廃集団を用いたためなのかを確認するために，枝肉市場などで収集した枝肉成績が判明している正常に成長した集団を用いて，これらSNPと脂肪交雑との関連解析を行う必要がある。
４．要

約

黒毛和種は脂肪交雑に優れた品種であり，肥育
中期にビタミンＡ給与を制限することによって，
脂肪交雑形成が高まることが示されている。ビタ
ミンＡはレチニルエステルとして小腸から吸収され，肝臓に輸送される。肝臓でレチノールに変換され，標的臓器（細胞）に輸送するためにRBP４と結合して，肝臓から血中に分泌される。これらのことから，RBP4遺伝子の多型は脂肪交雑形成に影響すると考え，黒毛和種集団に存在するRBP4の多型を探索した。
黒毛和種74頭のゲノムDNAとウシRBP4の各エクソンを増幅するプライマーを用いてPCRし，得られた増幅産物をシーケンスした。決定した塩基配列とデータベース登録されているウシRBP4（NM_001040475） お よ び ウ シ ゲ ノ ム 配 列（UMD3.1）を比較したところ，３種のSNPが検出された。これらの２SNPsはエクソン内で検出され，コード領域と３’UTRに位置した。残りの１SNPはイントロンで検出された。コード領域のSNPは同義置換であり，RBP４機能に影響しないと 考 え ら れ た 。 ３ ’UTR の SNP は ， ２ 種 のmicroRNAのターゲット配列に位置することが予測された。このことから，黒毛和種に存在する
RBP4 遺 伝 子 の ３ ’UTR に 位 置 す る SNP は ，microRNAによる転写後調節に影響し，脂肪交雑

文献１） Takasuga, A., Watanabe, T., Mizoguchi, Y.,
Hirano, T., Ihara, N., Takano, A., Yokouchi, K.,
Fujikawa, A., Chiba, K., Kobayashi, N., Tatsuda, K.,
Oe, T., Furukawa-Kuroiwa, M., Nishimura-Abe, A.,
Fujita, T., Mizoshita, K., Ogino, A., Sugimoto, Y. :Identification of bovine QTL for growth and carcass
traits in Japanese Black cattle by replication andidentical-by-descent mapping, Mammalian
Genome，18，125～136，2007．
２） Yamada, T., Itoh, M., Nishimura, S., Taniguchi, Y.,
Miyake, T., Sasaki, S., Yoshioka, S., Fujita, T., Shiga,K., Morita, M., Sasaki, Y. : Association of single
nucleotide polymorphisms in the endothelial
differentiation sphingolipid G-protein-coupled
receptor 1 gene with marbling in Japanese Black
beef cattle, Animal Genetics，40，209～216，2008．
３） Sasaki, S., Itoh, T., Ogino, A., Kimura, H. : Effects
of a single nucleotide polymorpism in EDG1 andTTN genes with meat production and carcass traits
in Japanese Black beef cattle. 34th Conference ofInternational Society for Animal genetics abstract
book，168，2014．
４） Tong, B., Sasaki, S., Fujita, T., Yamada, T. :Association of the SNP in the MYBPC1 gene withmarbling in Japanese Black beef cattle. 34th
Conference of International Society for Animal
genetics abstract book，149～150，2014．
５） 社団法人畜産技術協会：ビタミンＡのコントロー
ルを用いた効率的肥育技術Q&A, Vol.２，29，2005．
６） 肉牛大辞典飼育の基本から最新研究まで，農分協，
2013．
７） 岡章生：黒毛和種肥育牛の肉質・増体に対するビ
タミンＡの影響，動物遺伝研究会誌，24，31～36，
1996．
８） 松井徹，鳥居伸一郎，矢野秀雄：ビタミンＡとウシの脂肪細胞分化，動物遺伝研究会誌，24，37～
44，1996．
９） Mandrup, S., Lane, M.D. : Regulating adipogenesis,
Journal of Biological Chemistry，272，5367～5370，
1997．
10） 今川正良：核内受容体PPARγを介した脂肪細胞
分化の分子機構，脂質栄養学，12，54～64，2013．
11） 渭原博：レチノール結合蛋白―４．生物試料分析，
34，354～358．2011．
12） Sun, H., Kawaguchi, R. : The membrane receptor
for plasma retinol-binding protein, a new type ofcell-surface receptor, International Review of Celland Molecular Biology，288，７～９．2011．
13） 平野貴，西村翔太，渡邊敏夫，高須賀晶子，半澤惠，
杉本喜憲：黒毛和種のDNAプールを用いた全ゲノム
リシーケンシングによる網羅的SNP探索とその評価，© The Ito Foundation

黒毛和種の脂肪交雑形成に影響するビタミンＡを輸送するRBP４のDNA多型探索
日本畜産学会報，84，319～325，2013．
14） Bhaumik, P., Gopalakrishnan, C., Kamaraj, B.,
Purohit, R. : Single nucleotide polymorphisms in
microRNA binding sites: implications in colorectal
cancer, The Scientific World Journal, 2014,

215

ID547154，2014．
15） Choi, J. S., Kim, J. S., Joe C. O., Kim, S., Ha, K. S.,
Park, Y. M. : Improved cycle sequencing of GC-rich
DNA template, Experimental and Molecular
Medicine，31，20～24，1999．

© The Ito Foundation

216

黒毛和種の雌牛における空胎期間を短縮させる
遺伝的要因の解明
Genetic analysis for days open in Japanese Black cattle

佐々木

慎

二

（独立行政法人家畜改良センター）

Shinji Sasaki（National Livestock Breeding Center）

The days open（DO）, which is the calving to conception interval, is an important trait
related to reproductive performance and profitability in cow－calf operation. To identify
quantitative trait loci for DO in Japanese Black cattle, we conducted a genome-wide association
study using 459 animals with extreme DO values selected from a larger group of 15,488
animals. We identified single nucleotide polymorphisms（SNPs）on bovine chromosome 2 thatwere associated with DO. Six SNPs were located in 8.5 kb-associated region, proved be in astate of high linkage disequilibrium. The association was replicated in a sample of 1,778 animals.
In the replicated population, the frequency of the reduced-DO allele（Q）was 0.63, and theeffect of allele substitution on DO was a decrease of 3.74 days. The results suggest that the Q
allele could serve as a useful marker in Japanese Black cattle to select animals with superior
DO performance.

１．目

そこで，本研究では空胎期間を短縮させる遺伝的的要因を明らかにするため，黒毛和種・雌牛の初肉用品種では，「雌牛が受胎し妊娠後，子牛を産から４産目までの３回の平均空胎期間を表型値分娩する。その後，次の繁殖サイクルに確実に入とし，SNP（１塩基多型）を用いたゲノムワイド

ること」が，肥育の素牛となる子牛生産の基盤で関連解析を行い，空胎期間に関連するゲノム領域

あり，食肉の生産の最初のステップとなる。黒毛を特定することを目的とした。

和種では，約１年１産を目標としている 。その本研究によって，空胎期間の短縮に関連するゲ

ためには，妊娠期間は分散が小さく平均289日でノム領域が特定できれば，関連領域を代表する多あるため，空胎期間（分娩から次の受精までの期型をDNAマーカーとして用いることで，種雄牛間）は約80日でなくてはならないが，平成21年度の後代雌牛の空胎期間の短縮が期待できる。空胎時点で115日と，空胎期間の短縮が求められて期間の短縮は，雌牛の飼養管理費を抑えるため生いる。また，個体の生涯生産性を高めるため，複産性の向上に直結する。また，本研究を起点に，数回の産時での空胎期間の短縮が望まれる。

関連領域のゲノム情報を詳しく調べることで，空１）

２）© The Ito Foundation

黒毛和種の雌牛における空胎期間を短縮させる遺伝的要因の解明

217

胎期間を短縮させる遺伝子と責任多型の同定が期

SNPが認められなくなったことから（Fig.1C）
，

待される。

この領域の量的形質遺伝子座は１つであることが２．方分かった。そこで，1,778頭の黒毛和種・雌牛で法

BovineHD0200028010の型判定を行い，空胎期

黒毛和種・雌牛15,488頭から初産から４産目ま間との関連を調査した結果，優良型多型頻度はでの３回の平均空胎期間を得た 。平均空胎期間63％で黒毛和種に一般的に認められる多型であが長い個体231頭（85パーセンタイル）と短い個り，優良型アレルをもつ個体では，空胎期間が3.74

体 228 頭 （15 パ ー セ ン タ イ ル） の 個 体 を ，日短縮することが分かった。今後，検証集団を増BovineSNP50K BeadChip（Illumina 社 ， version

やしDNAマーカーとしての信頼性を評価するとと

１）で型判定を行ったSNP情報を用いた。SNP情

もに，関連領域がどのようなメカニズムで空胎期

報から，型判定率が99％以上，マイナーアレル頻間の短縮に影響を与えるのか解析する必要がある。

３）

度が１％以上，ハーディーワインベルグ平衡度が４．要

0.001以上の33,303個のSNPを選抜した。次に，こ約

れらのSNP情報からゲノム関係行列を作成し，線本研究は，空胎期間を短縮させる遺伝的要因を

形混合モデル（GEMMAソフトウエア）で関連明らかにするため，黒毛和種・雌牛の初産から４解析を行った 。今回の解析では，多重検定を考

産目までの３回の平均空胎期間を表型値とし，慮しP＜1.5×10

SNPを用いたゲノムワイド関連解析を行い，空胎４）－６をゲノムワイドの有意水準とし期間に関連するゲノム領域を２番染色体に特定した。

た。今後，関連領域がどのようなメカニズムで空３．結果と考察

胎期間の短縮に影響を与えるのか明らかにするこ

関連解析の結果，ゲノムワイドに有意なSNPととで，DNAマーカーとしての信頼性が確保されし て ，２ 番 染 色 体 に ARS-BFGL-NGS-115142

空胎期間を短縮させる選抜に利用することが可能（97,368,169bp, odds ratio＝1.703，P＝1.15×10－６）になると考えられる。

が検出された（Fig.1A）。
関連部位を詳細に調べるため，約1,000頭の黒謝辞毛和種をIllumina BovineHD BeadChipで型判定

本研究は，公益社団法人畜産技術協会附属動物遺し た 約 58 万 個 の SNP を 参 照 デ ー タ と し て ，伝研究所杉本喜憲博士と国立大学法人岡山大学揖斐

BEAGLEプログラムでインピューテーションを隆之博士の協力の下に行われた。ここに感謝致します。

行った結果 ，２番染色体の関連領域の周辺に６３）

つの関連するSNPが検出され，約8.5kbpが連鎖不平衡であることが分かった（P＝1.50×10 －６ －3.92×10－８ ，D’＝１，r２ ＝0.813－１）（Fig.1B）。
次に，最も有意な関連が認められた多型である
BovineHD0200028010 （97,359,632 bp） を 共 変量として関連解析を行った結果，この領域に関連

文
献１） 農林水産省，家畜改良増殖目標，2011．
２） Wagyu Registry Association, Wagyu, 255，15～
19，2011．
３） Sasaki, S., Ibi, T., Watanabe, T., Matsuhashi, T.,
Ikeda, S., Sugimoto, Y., BMC Genet., 14，41，2013．
４） Zhou, X., Stephens, M., Nat Genet., 44，821～
824，2012．

© The Ito Foundation

218

平成26年度A

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ARS-BFGL-NGS-115142（BTA2）

7-log10
（P）

6
5
4
3
2
1

B

８
7

１

３

５

７

９ １１ １３ １５ １７１９ ２１２３２５２７２９chromosome
BovineHD0200028010
ARS-BFGL-NGS-115142-log10
（P）

6
5
4
3
2
1
０
97000000 97200000 97400000 97600000 97800000 98000000

C

position（b）
８

BovineHD0200028010

7-log10
（P）

6
5
4
3
2
1
０
97,000,000 97,200,000 97,400,000 97,600,000 97,800,000 98,000,000
position（b）

Fig. 1 Manhattan plot of the association of SNPs with OD in 459 Japanese Black cattle （A）Manhattan plot of the association of SNPs with DO in 459 Japanese Black cattle. The chromosomes are

distinguished with alternating colors（grey, odd numbers; black, even numbers）. The chromosome number isindicated on the x-axis. The dashed line is the Bonferroni genome-wide significance threshold（-log10（P）＝5.82）．
The vertical axis is broken for P-values below-log10（1）. SNPs positions are based on the UMD3.1 assembly of thebovine genome.
 （B）Regional plot of the locus on BTA2 associated with DO. SNPs from the 50K SNP chip are shown in black
filled triangles. The imputed SNPs are shown as unfilled circles.
 （C）A conditional analysis was performed by including a genotype of BovineHD0200028010, one of most closely
associated SNP on the BTA2, as a covariate in the model. An arrow indicates the BovineHD0200028010. Unfilled
circles and black filled diamonds represent P values in -log10 scale before and after conditioning, respectively.

© The Ito Foundation

219

牛胚盤胞期胚における耐暑性付与に関する研究
The study of thermotolenrace in bovine blastocysts

阪

谷

美

樹・森

美

幸＊

（（独）農研機構九州沖縄農業研究センター畜産草地研究領域，＊福岡県農林業総合試験場生産環境部）

Miki Sakatani and Miyuki Mori＊（Livestock and Grassland Research Division, Kyushu Okinawa Agricultural Research Center, National Agriculture and Food
Research Organization（NARO）,＊Fukuoka Agriculture and Forestry Research Center）

Low conception rate in dairy cattle in summer is a worldwide problem. One of the possible
reasons is high thermo-sensitivity of early stage embryos. The embryo transfer is a candidate
to improve low conception rate in summer. However, the conception rate of frozen-thawed
embryo transfer is still lower than that of fresh embryo transfer. Therefore, we conducted two
experiments to understand the reason of low conception rate in in vitro derived frozen embryotransfer in summer and to improve the detrimental effects of heat shock.
In experiment 1, we evaluated the effect of heat shock to frozen-thawed in vitro derived
blastocysts on survivability and gene expressions. The stress gene（HSPA1A）expression wasincreased not only by frozen-thawed treatment but also dramatically by heat shock treatment
after thawing. Besides, the surviving rate and re-expanding rate of blastocysts at 6 or 48 h
after thawing was decreased by heat shock treatment.
In experiment 2, we produced embryos with supplemented 5 mg/ml L-carnitine（Car-HS）
or P-glycoprotein induced（PP-HS）media before freezing. And then, the effect of heat shock
to frozen-thawed blastocysts were evaluated. There were no significant differences wereobserved in gene expressions. However, the rate of shrink blastocysts at 6 h after thawing was
lower in Car-HS and PP-HS than that in heat-shocked blastocysts. And the rates of living
blastocysts at 48 h after thawing were higher in Car-HS and PP-HS than that of heat-shocked
group. These results indicated that the supplementation of L-carnitine to culture medium or
induction of P-glycoprotein in embryos improved the detrimental effect of heat shock tofrozen-thawed blastocysts.
In conclusion, in vitro derived frozen-thawed blastocysts was sensitive and easily
damaged to heat shock. However, the supplementation of L-carnitine or induced
P-glycoprotein to embryos were seemed to improve the survivability to heat shock afterthawing.

© The Ito Foundation

220

平成26年度

１．目

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

子を38.5℃３％CO２10％Ｏ２87％Ｎ２下でグルコー

的ス不含修正Ｍ199培地（50個/500μl）にて６日

本研究では体外受精胚の凍結融解後の高温処理
が胚盤胞期胚の品質や生存性に及ぼす影響を検討

間，その後10％牛胎子血清（FBS）加Ｍ199培地
にて１日間培養して胚盤胞期胚を得た。

し，耐暑性の高い胚の作出法を確立することを目

2.2

的とした。

発生培養７日目に胚盤胞期まで達した胚を凍結

凍結・融解

近年，夏季の家畜における繁殖成績低下が大き保存した。胚は凍結液（５％エチレングリコー

な問題となっている。人工授精では，受精後２日

ル，６％プロピレングリコール，0.1Ｍスクロース，

目までの発生初期胚が高温により発生を阻害され４mg/ml牛血清アルブミン含PBS）に移した後，ることが繁殖成績低下の原因の一つと考えられ0.25 mlストロー（IMV）に移して平衡し，プロる。一方，胚移植では高温感受性が高い受精直後

グラムフリーザーで緩慢凍結した。0.3℃/分での発生初期を体外でバイパスできる点から，高温－30℃まで冷却した後，液体窒素中に移し保存しストレスの影響軽減が期待できる。

た。

体外受精胚は一度に胚を大量生産できるため，凍結保存したストローは空気中にて10秒保持し生体内受精胚と比較して生産効率が高く，胚を凍た後，30℃の温湯に10秒処理して融解した。融解

結保存することで利用性が格段に高まる。夏季に後の胚は100μＭ2－メルカプトエタノール，20％

体外受精由来凍結胚を活用することは，夏季の低FBS含Ｍ199ドロップに移し，回復培養を行った。

受胎を改善できる可能性が高い有望な戦略である

2.3と考えられる。しかし，夏季の体外受精凍結胚の胚盤胞は0.1％ポリビニルアルコールを含む

受胎率は新鮮胚移植と比較すると依然として低PBSにて洗浄した後，0.5 mlチューブに移し，解く，高温ストレスが凍結胚の融解後の生存性や品析まで－80℃で保存した。RNA抽出はRNeasy

質に及ぼす影響については未だ不明な点が多い。

plus micro kit（キアゲン）を用いて行い，逆転

そこで，本研究では高温が凍結融解後の体外受写反応は，Superscript III逆転写酵素（ライフテ

精胚に与える影響を形態的ならびに遺伝子発現解

クノロジー）を用いて実施した。18ｓリボゾーマ

析から明らかにするとともに，体外受精胚の凍結

ルRNA（RN18S1）を内部標準として，ヒート

融解後の胚の耐暑性を増強し，夏季にも受胎性がショックプロテイン70（HSPA1A）,POUドメイ

高い胚の作出法を検討した。

ンクラス５転写因子（POU5F1）,IFNτ（IFNT）,

２．方
2.1

遺伝子解析

CDX2（CDX2）の各遺伝子の発現（Table１）を法

定量PCRにて解析した。解析法はΔΔCT法を用

体外受精および発生培養

い，相対発現量を算出した。

食肉処理場由来卵巣より採取した卵子を

2.4

実験区

IVMD101培養液（機能性ペプチド研究所）にて

実験１：胚盤胞を凍結融解後，38.5℃５％CO２で38.5℃３％CO２10％Ｏ２87％Ｎ２条件で20時間成熟平衡化した回復培地に移し，38.5℃（対照Cryo-

培養を行い，その後BO液で希釈した凍結融解精con）または41.0℃（高温処理Cryo-HS）で６時

液（1.0x10７/ml）とともに38.5℃３％CO２10％Ｏ間培養した。６時間後に胚の形態を実体顕微鏡に87％Ｎ２下で５時間媒精をした。媒精終了後，卵て観察し，各区５胚を遺伝子発現解析用にサンプ

２© The Ito Foundation

221

牛胚盤胞期胚における耐暑性付与に関する研究
Table 1 Primer information
Gene
RN18S1

HSPA1A

POU5F1IFNT

CDX2Sequence（5’-3’）
F: AAACGGCTACCACATCCAAGG
R: GCGGAAGGATTTAAAGTGGACTCF: GACAAGTGCCAGGAGGTGATTT
R: CAGTCTGCTGATGATGGGGTTA
F: TGCAGCAAATTAGCCACATC
R: AATCCTCACGTTGGGAGTTG
F: TCCATGAGATGCTCCAGCAGT
R: TGTTGGAGCCCAGTGCAGA
F: GCAGCCAAGTGAAAACCAGG
R: GCTTTCCTCCGGATGGTGATリングした。残りの胚は，38.5℃５％CO２で融解
48時間まで培養を継続し，48時間後の胚の形態

Product length

Accession number

138

DQ066896

117

Ｕ09861

123

NM_174580.2

103

Ｘ65539118

NM_001206299

３．結果と考察（生存性）と直径を調査した後，各区３個の生存

3.1

実験１

胚盤胞を遺伝子解析用にサンプリングした。遺伝計34個（４反復）の胚盤胞について生存性の評

子発現は，凍結融解を行わなかった胚（fresh）

価 を 行 っ た 。Cryo-con 区 で は 融 解 ６ 時 間 後 にを基準として統計処理を実施した。

90％以上の胚が再拡張中または再拡張していた

実験２：胚発生培養時（０～７日目）に５mg/が，Cryo-HS区では再拡張中または再拡張した胚

mlＬ-カルニチン（Car-HS）または10μＭフォは55％であり有意に低かった（Table２）。融解48

ルスコリン，10μＭリファンピシン（PP-HS）

時間後の14個の胚では，Cryo-HS区で脱出率がを含む培地で作成した胚盤胞を凍結融解し，Cryo-con区と比較し有意に低く，胚の生存率，41.0℃で６時間高温処理を行った。６時間後に胚直 径 に つ い て も 有 意 に 低 い 値 を 示 し た（Tableの形態を実体顕微鏡にて観察し，各区５胚を遺伝３）。以上の結果は，凍結融解後の高温処理によ子発現解析用にサンプリングした。残りの胚は融

り胚は大きなダメージを受け，生存性が低下する

解48時間まで培養を継続し，48時間後の胚の形態こと，また回復が遅れ，品質が低下する可能性を（生存性）と直径を調査した。Ｍ199のみで培養し示唆している。

た胚を凍結融解後38.5℃（対照区：Con）またはFig.１に示すように未凍結の新鮮胚を指標とし41.0°
C（Con-HS）で６時間培養した胚と比較した。

た場合，ストレスマーカーであるHSPA1Aの発

2.5

現は凍結融解６時間後の対照区（Cryo-con）で統計処理

統計処理はStatviewまたはＲを用いた。遺伝子も有意に増加したが，Cryo-HSで劇的に増加し解析は分散分析法（Tukey-Kramer）で解析を行た。また，６時間後のCryo-HS区はCryo-con区

い，胚の生存性についてはカイ二乗検定法またはと比較しても有意にHSPA1Aの発現が高かった。

Fisherの正確検定を実施した。また胚直径は対応

しかしながら，48時間後にはHSPA1Aの発現はのないStudent t-testを用いて解析し，Ｐ値が0.05

新鮮胚と同レベルであった。

以下のものを有意であると判定した。

これまでの体外培養系の研究では，発生の進ん© The Ito Foundation

222

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 2 Effect of heat shock on blastocyst survival at 6 h after thawing（after heat shock）
Treatment

Number of blastocysts at 6 h after thawing（％）

n（replicate）

ShrinkExpanding

Expanded14（41.2）

17（50.0）ａ12（35.3）

7（20.6）ｃ

Cryo-con34（4）ａ3（8.9）

Cryo-HS34（4）ｂ15（44.1）

The different symbols indicate significant differences（a-b: P<0.01, a-c: P＜0.05）．

Table 3 Effect of heat shock on blastocyst survival and size at 48 h after thawing
Treatmentn（replicate）

Number of hatched blastocysts at 48 h
after thawing（％）

Diameter of blastocysts（μm）＊

Cryo-con14（3）ａ9（64.3）279.4±79.7ａ14（3）2（14.3）ｂ215.3±63.0ｂ

Cryo-HS＊

Excluded degenerated blastocysts（Cryo-con: the average of 13 blastocysts; Cryo-HS: the average of 10 blastocysts）． The

different symbols indicate significant differences（a-b：P＜0.05）．

A

c

80
60
5

b

4
3
2
1
0

a
fresh

a
cyyoconabcryocryocryo
HS con 48h HS 48h

POU5F1

IFNT

35

c

30

c

25
20
15
10
5
0

ab
fresh

b
cyyoconacryocryocryo
HS con 48h HS 48h

Relative gene expression（fresh=1）

100

Relative gene expression（fresh=1）

Relative gene expression（fresh=1）

C

B

HSPA1A

120

2.0
a

1.5
1.0

a

b

0.5
0.0

a

fresh

cyyoconabcryocryocryo
HS con 48h HS 48hFig. 1 Effect of heat shock to frozen-thawed blastocysts on gene expression
 Results are means ± SEM of the fold change relative to that on fresh blastocysts. Heat shock protein 70 kDa（HSPA1A, A）, interferon tau（IFNT, B）and POU domain, class 5, transcription factor 1（POU5F1, C）. Cryo-con:
blastocysts incubated at 38.5℃ for 6 h after thawing. Cryo-HS: blastocysts incubated at 41.0℃ for 6 h afterthawing. Cryo-con 48 h: blastocysts incubated at 38.5℃ for 48 h after thawing. Cryo-HS at 48 h: blastocysts
exposed at 41.0℃ for 6 h, then cultured at 38.5℃ for 42 h. The different symbols indicate P＜0.05．

だ胚盤胞は高温に対する耐性が高く，そのために葉（TE）から分泌されることが報告されてい受精卵移植技術は夏季の低受胎を改善する方法とる３）。つまり，栄養外胚葉の障害や細胞数がそのして有効である可能性が指摘されていた１，２）。し遺伝子発現量や分泌能に大きな影響を与える可能

かしながら，凍結融解によってもストレスマー性が高い。

カーであるHSPA1Aの発現が有意に増加し，高一方，胚盤胞で栄養外胚葉の内側に位置する内温処理によってそのストレスレベルは劇的に上昇

部細胞塊（ICM）で発現するPOU5F1は凍結融解することが示され，さらに胚の生存性，回復力もならびに高温処理による影響は認められず，48時

大きく阻害される可能性が示された。

間後にその発現が低下した。TE特異的に発現す

IFNTは６時間後のCryo-HS区でCryo-con区とるIFNTとICM特異的に発現するPOU5F1の発現比較し有意に低い値であった。IFNτは栄養外胚パターンが異なる理由として，Table２で示すよ© The Ito Foundation

牛胚盤胞期胚における耐暑性付与に関する研究

223

うに６時間後の高温処理区では拡張胚率が有意にれまでにも報告されており６，７），それらを改善す

低いことから胚盤胞細胞数に差がある可能性が示る培養法として，脂肪代謝を活性化し凍結時のダ唆される。Leidenfrostら４）の報告では，拡張前，

メージを低減するＬ-カルニチンの培養液添加８）

拡張，脱出胚盤胞の総細胞数ならびにTE細胞数や細胞膜安定やアポトーシス抵抗性を有する膜タはステージが進むことで有意に増加するものの，ンパク質であるＰ糖タンパク質増強による効果９，10）

ICM数は胚盤胞ステージによらず差がないことがが報告されている。実験１で示されたように，凍示されている。また，Moriらは５），体外培養胚の結融解後に高温に曝されることで，胚は強いスト

後期発生ステージでは細胞数と胚直径に正の相関レスを受け，その生存性が低下することが明らかがあり，胚直径が胚盤胞細胞数を推察する指標ととなった。そこで実験２ではこうした耐凍性効果

なる可能性を示している。つまり，発生が進んだが報告されている物質を利用し，凍結融解後の高融解後48時間の胚ではTE細胞数が増加すること

温による胚への悪影響を低減する効果を検討したで遺伝子発現が変化することが推察され，凍結融ところ，遺伝子発現に差は認められなかったもの

解や高温等の胚の外側から受ける障害に対して，の，高温処理後の胚の生存性や発生能が改善され

ICMはTEほど影響を受けにくい可能性が示唆さることが明らかとなった。
これまで，受精卵移植が夏季の牛受胎率低下改

れた。
3.2

善に有効である可能性が指摘されてきたが，今回

実験２

凍結前の発生培養７日目の胚発生率は対照区との結果は夏季における体外受精凍結胚移植は，融Ｌ-カルニチン添加，Ｐ糖タンパク質増強による解・移植した後に胚がダメージを受け，着床前に差は認められなかった（データ略）。凍結融解後生存性が損なわれている可能性が高いことを明ら

６時間では，Con-HS区で収縮胚率が他の３区とかにした。しかしながら，カルニチン添加等の耐比較し有意に高く，拡張胚率は有意に低かった凍性を高める培養法を用いることで，融解後の高（Table４）。一方，Car-HS区では他の３区と比較

温に対する耐性が高く，夏季の受精卵移植にも耐し有意に収縮胚が少なく，PP-HS区では６時間えうる胚を作出できる可能性が示唆された。

後の拡張胚率が他の３区と比較し有意に高かった。48時間後の生存率はCon-HS区で他の３区と比較し低い傾向（Ｐ＜0.1）が認められた。

４．要

約

本課題では，夏季の凍結融解体外受精胚の受胎

遺伝子発現に関しても実験１と同様に，高温処率が低い原因解明と改善法を検討する目的で２つ理をした３区（Con-HS区，Car-HS区，PP-HS区）の実験を実施した。実験１により体外受精胚を凍でHSPA1Aの発現がConと比較して有意に増加し結融解後に高温処理し，高温によって胚のストレた。しかしながら，Ｌ-カルニチン添加やＰ糖タ

スレベルが増加し，その生存性，発生能が阻害さンパク質の増強によるHSPA1A発現量への影響れることが明らかとなり，実験２では胚作成時には 認 め ら れ な か っ た 。他 の 遺 伝 子（POU5F1,

Ｌ-カルニチンを添加またはＰ糖タンパク質を増CDX, IFNT）に関しても高温処理の有無や添加強することで，凍結融解後の胚の生存性や発生能による発現量への影響は認められなかった（Fig.

が高温処理によっても低下しないことが示された。

２）。
凍結融解により胚の生存性が低下することはこ© The Ito Foundation

224

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 4 Effect of heat shock on blastocyst survival after thawing
Treatment

Number of embryos（％）at 6 h after thawing
ShrinkNumber of embryos（％）at 48 h after thawing

Expanding

Expanded

Total

LivingHatched

Total

Con

ａ
7（13.5）27（51.9）

18（34.6）ａ52

12（75.0）5（31.3）16

Con-HSｂ20（39.2）

20（39.2）

11（21.6）ａ51

7（43.8）†5（31.3）16

Car-HSａ5（7.7）

34（52.3）

26（40.0）ａ65

21（67.7）8（25.8）

31

PP-HS

ａ
6（9.4）

26（40.6）32（50.0）ｂ64

23（79.3）

3（10.3）29

Con: blastocysts incubated at 38.5℃ for 6 h after thawing. Con-HS: blastocysts incubated at 41.0℃ for 6 h after thawing. Car-HS:
blastocysts produced by supplementation of 5 mg/ml L-carnitine was incubated at 41.0℃ for 6 h after thawing. PP-HS: blastocysts
produced by supplementation of 10μM forskolin and 10μM rifampicin exposed at 41.0℃ for 6 h. The different symbols indicate
significant differences（a-b：P＜0.05，†：P＜0.1）．

A

B
HSPA1A
b
b

15.0

b

10.0
5.0
a

0.0

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

con

con

Con-HS Car-HS PP-HSC

Con-HS Car-HS PP-HSD
POU5F1

CDX2

2.5

Relative gene expression（con=1）

Relative gene expression（con=1）

INFT

1.2

Relative gene expression（con=1）

Relative gene expression（con=1）

20.0

2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

con

Con-HS Car-HS PP-HS

con

Con-HS Car-HS PP-HS

Fig. 2 Effect of heat shock to frozen-thawed blastocysts produced by supplementation of L-carnitine or enhancementof P-glycoprotein synthesis on gene expression
 Results are means ± SEM of the fold change relative to that on frozen-thawed blastocysts without heat shock

treatment. Heat shock protein 70 kDa（HSPA1A, A）, interferon tau（IFNT, B）, CDX2（CDX2, C）and POU
domain, class 5, transcription factor 1（POU5F1, D）.con: blastocysts incubated at 38.5℃ for 6 h after thawing. conHS: blastocysts incubated at 41.0℃ for 6 h after thawing. Car-HS: blastocysts produced by supplementation of
5mg/ml L-carnitine was incubated at 41.0℃ for 6 h after thawing. PP-HS: blastocysts produced bysupplementation of 10 mM forskolin and 10 mM rifampicin exposed at 41.0℃ for 6 h. The different symbols indicate
P＜0.05．

© The Ito Foundation

牛胚盤胞期胚における耐暑性付与に関する研究
文献１） Sakatani, M., Kobayashi, S., Takahashi, M., Mol
Reprod Dev.，67，77～82，2004．
２） Hansen, P.J., J Anim Sci.，77，36～50，1999．
３） Bazer F.W., J Anim Sci Biotechnol.，４，23～32，
2013４） Leidenfrost, S., Boelhauve, M., Reichenbach, M.,
Güngör, T., Reichenbach, H.D., Sinowatz, F., Wolf, E.,
Habermann F.A., PLoS One.，6，e22121，2011．
５） Mori, M., Otoi, T., Suzuki, T., Reprod Domest
Anim，37，181～184，2002
６） Fair, T., Lonergan, P., Dinnyes, A., Cottell, D.C.,
Hyttel, P., Ward, F.A., Boland, M.P., Mol Reprod
Dev.，58，186～195，2001．

225７） Moreira da Silva, F., Motelo, R., Reprod Domest
Anim.，40，205～209，2005．
８） Takahashi, T., Inaba, Y., Somfai, T., Kaneda, M.,
Geshi, M., Nagai, T., Manabe, N., Reprod Fertil
Dev.，25，589～599，2013．
９） Mori, M., Kasa, S., Isozaki, Y., Kamori, T.,
Yamaguchi, S., Ueda, S., Kuwano, T., Eguchi, M.,
Isayama, K., Nishimura, S., Tabata, S., Yamanouchi,N., Hattori, M., Reproductive Toxicology ， 35 ， 17 ～24，2013．
10） Mori, M., Kuwano, T., Kamori, T., Isozaki, Y.,
Nishihara, T., Yamauchi, N., Hattori, MA.,
Theriogenology，81，683～688，2014．

© The Ito Foundation

226

ラテックス凝集反応による抗豚繁殖・呼吸障害症候群
ウイルス抗体検出系の開発
Development of latex agglutination tests for detection of antibodies against
porcine reproductive and respiratory syndrome viruses

堀

江

真

行・上

野

晃

聖＊

（鹿児島大学共同獣医学部附属越境性動物疾病制御研究センター，＊鹿児島大学共同獣医学部動物衛生学分野）

Masayuki Horie and Kosei Ueno＊（Transboundary Animal Diseases Research Center, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University,＊Laboratory of Animal Hygiene, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） is the pathogen
responsible for PRRS, which causes significant economic losses in many countries including
Japan. To control and monitor PRRSV infection, antibody detection ELISA is widely used in
the swine industry. However, ELISA is relatively expensive and time-consuming, and needs
several special laboratory equipment. Therefore, novel serological methods are demanded by
the swine industry. Although many improved anti-PRRSV antibody detection systems havebeen reported thus far, none of them have been in practical use.
Latex agglutination test（LAT）is widely used for detection of antibodies against
pathogenic microorganisms in the swine industry. LAT has several advantages compared toother assays:（1）it is easy to perform and does not need laboratory equipment;（2）it usuallytakes less than 10 minutes to get the results;（3）it is usually cheaper than other methods.
Therefore, LAT has a potential to be an ideal serological assay for PRRSV. However, no LAT
has been reported to be applied to PRRSV thus far.
In this study, we developed a LAT for detection of anti-PRRSV antibodies. We expressed
recombinant PRRSV nucleocapcid（N）protein fused with glutathione S-transferase in
Escherichia coli, purified the protein using affinity chromatography, and coupled the purified
protein with latex beads. We first tested our LAT with sera from mice immunized withPRRSV N protein or small PRRSV GP5 peptide, which is also a structural protein of PRRSV
but antigenically unrelated to N, showing that the LAT specifically detected anti-PRRSV N
antibodies. Then we optimized our LAT with twelve swine serum samples. Although nonspecific agglutination was observed when directly testing sera, pretreatment with dilution
buffer, which was previously reported to suppress non-specific reaction in a LAT, significantly
improved the specificity of LAT. The results obtained by our LAT are almost identical tothose by a commercially available ELISA. Importantly, even including the pretreatment step,our LAT takes less than 40 min to gain the results. Our LAT can be a useful tool to control
and monitor PRRSV infections.

© The Ito Foundation

ラテックス凝集反応による抗豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗体検出系の開発

１．目

227

い，②検査にかかる時間が短い，③一検体から検的査が行えるため安価である。LATはこれまでに，

豚 繁 殖・呼 吸 障 害 症 候 群 ウ イ ル ス（porcine

オーエスキー病，トキソプラズマなど様々な感染

reproductive and respiratory syndrome virus:症の抗体検査法として実用化されているが，これ

PRRSV）は豚に感染し，母豚では繁殖障害を，までにPRRSに関する報告はない。

仔豚では呼吸器障害や発育不良を起こす。

本研究は上記の性質を備えた，迅速かつ簡便な

PRRSVは感染伝播力が強く強力なワクチンも存

抗PRRSV抗体検出系であるLATの開発を目的と在しないため，日本においてもPRRSV感染が蔓して行った。

延している。PRRSによる経済的被害は甚大で，国内における被害額は280億円と試算されてお

２．方法り１），PRRSVの清浄化は養豚産業における重要2.1

課題の一つである。PRRSV対策には徹底した衛PRRSVのＮ遺伝子，Nsp９遺伝子，GP５およ生管理に加え，確実に感染豚を摘発するための安び Ｍ 遺 伝 子 の cytoplasmid tail 部 分 を そ れ ぞ れ

価で迅速かつ信頼性の高い診断系が必要である。

pGEX-6P-1ベクタープラスミドへとクローニン

PRRSVの診断系は大きく遺伝子検出系と抗体検グした。得られたそれぞれのプラスミドを用いて出系に分けられる。遺伝子検出系では逆転写PCR

大腸菌BL21（DE３）株あるいはRosetta2（DE（RT-PCR）が，抗体検出系では主にELISAが使

３）株を形質転換した。組換えタンパク質の発現用されている。RT-PCRは操作に習熟が必要なうは以下のように行われた。それぞれのプラスミド

え，ウイルス遺伝子は一過性にしか血中に存在せを 保 持 す る 大 腸 菌 BL21（DE ３）株 あ る い はず，必ずしもRT-PCRの結果が感染の有無を反映

Rosseta2（DE３）株を50μg/mlアンピシリンをしているとは限らない。一方，PRRSVに対する含有する液体LB培地にて培養を行い，経時的に抗体は感染後１週間程度で上昇するため，抗体検

OD600を観察した。OD600＝0.15－0.27（発現タンパ

査系はPRRSVの過去の感染歴を反映し，PRRSV

ク質によって異なる）において最終濃度0.4mMののモニタリングとして有用である。しかし，現行

イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドの抗体検出系であるELISAは比較的時間がかか（IPTG）を添加し，組換えタンパク質の発現を誘るうえに，専用の読み取り機が必要となるため，導した。IPTG添加後，25℃で15～21時間（発現真の簡便な検査とは言い難い。

タンパク質によって異なる）の培養を行い，遠心組換えタンパク質の発現

ラテックス凝集反応（latex agglutination test:

にて大腸菌ペレットを回収した。得られた大腸菌

LAT）は抗原を結合させたラテックスビーズにペレットをBugBuster protein extraction reagent

検体（血清など）を混ぜ合わせるだけの極めて簡（Merck Millipore）にて懸濁し，添付のマニュア

便な抗体検出法である。血清中に抗原特異的抗体

ルに従って大腸菌を溶解した。大腸菌溶解物をが存在すると，抗体が抗原に結合することによっ

20,600×ｇ，15分，４℃で遠心した後，上清を可てビーズ同士を架橋し，ラテックスビーズの凝集

溶性画分，ペレットを不溶性画分として回収し，を目視で判定することができる。LATの利点とSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクマ

して，以下の３点があげられる：①操作がきわめシーブリリアントブルー染色にて組換えタンパクて簡単であり検出機器などの特別な設備がいらな

質の可溶性を検討した。可溶性画分に発現したタ© The Ito Foundation

228

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ンパク質を直径0.22μｍ孔のシリンジフィルター

2.6

にて処理し，タンパク質精製を行った。

PRRS X３エリーザキット（IDEXX）を用い，

2.2

ELISA

添付の説明書に従ってELISAを行った。マウス

組換えタンパク質の精製

組換えタンパク質はGST融合タンパク質であ血 清 を 用 い た 場 合 の み ，二 次 抗 体 と し てるため，Glutathione Sepharose 4B（GEヘルスケ

Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/ア）を用いて，添付の説明書に従って精製を行っ

HRP（Dako）を用いた。

た 。精 製 し た 組 換 え タ ン パ ク 質 は Centricon
Plus-20 （Millipore） を 用 い て PBS へ と バ ッ

３．結果と考察
3.1

ファーの置換を行った。
2 . 3 抗原タンパク質のラテックスビーズへの組換えタンパク質の発現

PRRSVのN, Nsp９の一部，GP５およびＭのcytoplasmid tail部分の組換えタンパク質の発現

結合Polybead Microspheres 1.00μm（Polysciences）に成功した。しかし，Ｎ以外のタンパク質はすべを用い，添付の説明書に従ってrGST-Nをラテッて 不 溶 性 で あ っ た こ と ，ま た Ｎ タ ン パ ク 質 は

クスビーズへと吸着させた。またブロッキング剤

PRRSVのウイルス株間で保存された抗原であるとして，①１％

牛血清アルブミン，②ブロッキ

ことから，Ｎタンパク質に集中して以後の研究をングワン（ナカライテスク），③ブロックエース行った。また，Ｎタンパク質もGSTを切断すると（DS フ ァ ー マ バ イ オ デ ィ カ ル），④ SuperBlock

凝集を起こし，不溶性となってしまうことが判明

Blocking Buffer（Thermo scientific）を用いた。

したので，GST融合Ｎタンパク質（rGST-N）を

以下，それぞれのブロッキング剤にて作成した精製抗原（Fig.１）として以後の実験を行った。

Ⓡ

LATの系をそれぞれLAT-１，-２，-３，-４と
する。
2.4

1

血清の前処理2

非 特 異 的 凝 集 の 抑 制 の た め ，dilution buffer（2.05％ glucose，0.8％ trisodium citrate，0.42％

55
43

２）
sodium chloride, and 0.1 ％ Tween 20）
にて血清の前処理を行った。血清の前処理は等量の血清34とdilution bufferを混合し，37℃30分の処理を行っ

26

た。
2.5

ラテックス凝集反応

ラテックス凝集反応は堀江らの方法 ３）に従い行った。ガラス板の上で５μｌの血清あるいは前処理済血清と５μｌのrGST-N結合ラテックス
ビーズを混ぜ，その後緩やかに撹拌したまま５分間反応させ，目視によって凝集を判断した。凝集を＋，非凝集を－，判断ができない場合を±とし
た。

(kDa)
Fig. 1 Purification of recombinant PRRSV nucleocapsid

protein. Recombinant PRRSV nucleocapsid protein
was expressed in E.coli and then purified by affinity
chromatography. The whole cell lysate and purified
protein were analyzed by SDA-PAGE and CBBstain. Molecular weight is shown on left side of thepicture. Lane 1, whole cell lysate; lane 2, purified
protein.

© The Ito Foundation

229

ラテックス凝集反応による抗豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス抗体検出系の開発
Table 1 Latex agglutination tests with mice sera
NumberImmunogen

ELISA

LAT-1

LAT-2

LAT-3

LAT-4

1

rN

+

+

+

+

+

2

+

+

+

+

+

3

+

+

+

+

+

4

－

－

－

－

－

5

GP5 peptide

－

－

－

－

－

6

－

－

－

－

－

Table 2 Optimization of latex agglutination tests with swine sera
Pretreatment（－）

Pretreatment（+）

Number

ELISA

LAT-1

LAT-2

LAT-3

LAT-4

LAT-1

LAT-2

LAT-3

LAT-4

1

－

+

－

+

+

+

－

－-

+

2

－

+

+

+

+

+

－

－

+

3

－

+

－

+

+

+

－

－

+

4

－

+

+

+

+

+

－

－

+

5

－

+

+

+

+

+

－

－

+

6

+

+

+

+

+

+

±

+

+

7

+

+

－

+

+

+

+

+

+

8

+

+

－

+

+

+

+

+

+

9

+

+

+

+

+

+

+

+

+

10

－

+

－

+

+

+

+

+

+

11

+

+

+

+

+

+

±

+

+

12

+

+

－

+

+

+

－

+

+

13

+

+

+

+

+

+

+

+

+

14

+

+

－

+

+

+

－

+

+

3 . 2 マウス血清を用いたラテックス凝集反応

は遅くとも５分以内に見られ，極めて迅速な判断が可能であった。

の評価
はじめに，マウス血清を用いてLATの検討を行った。陽性血清としてPRRSV Nタンパク質に3 . 3 豚血清を用いたラテックス凝集反応の評
価よ り 免 疫 し た マ ウ ス 血 清 を ，陰 性 血 清 と し て

次に６検体のELISA陽性野外豚血清，６検体

PRRSVのGP５の細胞外領域ペプチドにより免疫のELISA陰性野外豚血清を用いてLATの検討をしたマウス血清をそれぞれ３検体ずつ用いた。そ行った。血清とラテックスビーズを直接混合したの結果，LAT-１から-４すべての系において陽場合，LAT-１から-４まですべてのLATにおい性血清では凝集が見られ，陰性血清では凝集が見て ，非 特 異 的 反 応 が 観 察 さ れ た た め ，dilution

られなかった（Table１）。これらのことから，我々

bufferによる血清の前処理を行った。その結果，の作成したLATはPRRSVのＮタンパク質を特異

非特異的反応が著しく解消され，LAT-３におい的に検出できる系であると考えられる。また凝集てELISAとほぼ一致する結果が得られた（Table© The Ito Foundation

230

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

２）が，ELISA陰性にて凝集の見られる検体が行った結果，市販のELISAキットと同様の結果１つ見られた。この検体に関してはELISAではが得られた。次に野外豚血清を用いたLATを行っ陰性であるものの，他の陰性血清と比べて高い吸たが，血清とラテックスビーズを直接混合した場

光度を示しており，ELISAでは検出できないレ合，多くの検体で非特異的凝集が観察された。しベルの抗体が存在する可能性は否定できない。今かし，ブロッキング剤の検討と血清の前処理によ後，免疫蛍光抗体法やウエスタンブロット法など

り非特異的凝集は解消され，ELISAとほぼ同じによる検討が必要である。以上のことから，豚血結果を得た。我々の開発したLATは血清の前処

清においてLAT-３は抗Ｎタンパク質抗体の検出

理を含めて40分以内に結果が得られるにもかかわに使用可能であると考えられた。また豚血清におらず，市販のELISAに近い結果が得られており，いても，凝集は遅くとも５分以内に見られ，極め

今後PRRS対策における有用なツールとなる可能て迅速な判断が可能であった。今後はより多検体性を秘めている。今後さらに検体数を増やして検を検査し，感度，特異度などをELISAと比較す討を行うとともに，タンパク質精製，ブロッキン

る必要がある。

グなどの改良を行い，市販のELISAの代替とな

４．要る簡便な抗体検出系を目指す。

約

本研究は，より簡便な豚繁殖・呼吸障害症候群
ウイルス（PRRSV）の抗体検出法であるラテッ
クス凝集反応（LAT）の開発を目的として行った。
抗原として大腸菌において発現・精製した組換
えヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を用いた
LATを作成した。はじめにＮタンパク質におい文献１） 山根逸郎，日本獣医師会雑誌，63，413～416，
2010．
２） Yu, Z., Jin, M., Xu, X., Zhang, R., Zhou, H., Hu, Q.,
Wu, H., Qin, B., Tan, Y., Chen, H. Avian Dis., 50, 264～268, 2006．
３） Horie, M., Ogawa, H., Yamada, K., Hara, A., Bui,
V.N., Awad, S.S., Yoshikawa, R., Mase, M.,
Tsukamoto, K., Yamaguchi, S., Nakamura, K., Imai,
K., J Virol Methods, 161, 259～264, 2009．

て免 疫 し た マ ウ ス 血清を用いてLAT の評価を© The Ito Foundation

231

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発
Development of porcine/bovine germline stem cell technology using novel
growth factor

高

島

誠

司

（信州大学繊維学部）

Seiji Takashima（Faculty of Textile Science and Technology, Shinshu University）

Spermatogonial stem cells are foundation of male germ cell system. In 2003, cultured
spermatogonial stem cell, germline stem（GS）cells were established from immature mouse
testis. In the presence of glial cell line-derived neurotrophic factor, GS cells proliferated stably
with undifferentiated characteristics for more than two years and restored fertility to infertile
W/Wv recipient mice following transplantation into seminiferous tubule. In addition, GS cells
are available for gene modification of mice and rats, suggesting the benefit of livestock-derived
GS cell for livestock improvement. However, establishment of bovine-/pig-derived GS cells
remain to be archived. Main bottleneck is higher proliferative activity of their testis somatic
cells. Moreover, population of spermatogonia in their testis is smaller than that of rodents.
These data suggests that it is essential to exclude the testis somatic cells from the culture ofbovine-/pig-GS cells.
In this study, we tried to identify the cell surface markers for bovine-/pig-spermatogonia.
In addition, we also improved the method for enzymatic digestion of bovine-/pig-testis to obtainspermatogonia enriched-testis single cells. We assessed the capability of antibodies reactive formouse spermatogonia and found that ITGA6 is suitable marker for both bovine and pig
spermatogonia. Intracellular proteins, DDX4 and UCHL1 were also applicable to identify theirspermatogonia. In the enzymatic digestion, although collagenase type IV, suitable for digestionof murine testis stroma, did not digest bovine-/pig-testis stroma, we found that collagenase
type II and Liberase TL（mixture of collagenase and low concentration of thermolysin）wereeffective.

１．目る。この技術は1960年代から発展した卵子・初期的胚の培養・操作技術を基盤としているが，卵子自繁殖工学技術は，優良家畜の大量生産に大きく体が増殖しない細胞である点で，今後の技術革新貢献している。この中心を担っているのがメスのが頭打ちになる可能性がある。繁殖工学をさらに生殖細胞，つまり卵子を標的とした操作技術であ発展させるには，大きなパラダイムシフトが必要© The Ito Foundation

232

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）である。

己複製因子FGF２を用い，これまで成功例のな

申請者はこれまで，オスの生殖細胞「精子幹細い豚および牛の精子幹細胞の純化・培養法の確立

胞」をターゲットとしたまったく新しい繁殖工学を目的とし，研究を進めている。今回の報告では，技術の開発を行ってきた。精子幹細胞は精巣の精

牛・豚精巣より精子幹細胞を識別するための細胞細管の最外側に局在し，個体の生涯にわたり精子

表面マーカー探索と，牛・豚精巣から間質組織をを作り続ける，いわば精子の元となる細胞であ消化し精細管を回収しさらに精細管由来のシングる。この細胞は，自己複製促進因子Glial cell line-

ルセルを得るための精巣組織酵素処理条件検討を

derived neurotrophic factor（GDNF）の存在下，行った。

試験管内で２年以上の長期にわたり増殖させることが可能である１）。そしてその細胞を再び精巣内

２．方法

へ移植すると，生着し，精子形成を再開，子孫を2.1

作製することが可能である。この技術はこれまで

牛・豚精巣は長野県畜産試験場にて去勢によりに，マウス・ラット・ハムスターで確立されてい摘出されたものを譲渡していただき研究に供しる。申請者はこの精子幹細胞操作技術をよりた。牛は５ヶ月齢黒毛和種のもの，豚は大ヨーク

大型の家畜である牛・豚へ展開することを試みてシャー種とランドレース種のＦ１の４週齢およびきた。

８週齢のものを使用した。譲渡された検体は，氷１～３）

しかしながら，現在のところこうした試みは成功には至っていない。GDNFは精子幹細胞の増殖に必須であり，この因子によりげっ歯類の精子幹細胞培養が可能になった。しかしながらこの因子

精巣材料の入手

上で維持したまま研究室まで運搬し，PBS（－）
で血液などを洗浄した後各種実験に使用した。
2 . 2 牛・豚精子幹細胞純化のためのマーカー
探索は大型家畜の精子幹細胞を増殖させることはでき

牛・豚精巣組織を５mm四方程度の立方体に切なかった。つまり，大型家畜精子幹細胞を試験管

り出し，４％パラホルムアルデヒドにて４℃，一内で増殖させるには，GDNFに代わる新規自己複晩 か け て 固 定 し た 。次 に 30 ％ シ ョ 糖 溶 液 に て製因子の同定が必須であった。

４℃，一晩かけて凍結保護した後OCTコンパウ

申請者らは，上記研究と同時並行で，マウス精

ンドに包埋し，クリオスタットで10μｍの凍結切子幹細胞の自己複製メカニズムの解析を進めてき片を作成した。蛍光免疫染色については，上記方た。その研究過程で，GDNF非存在下で試験管内法で作成した切片よりOCTコンパウンドをPBSの精子幹細胞がどのくらいの期間生存できるかを（－）にて洗い流し，0.1％TritonX-100で透過処検討したところ，２週間以上にわたって生存し，理を行った後，一次抗体反応を行った。使用した速度は遅いものの対数増殖を示すことを見出し

抗体はTable１に記す。抗体反応は４℃で一晩行た。この現象を誘導していたのは培地添加物に含い，洗浄後二次抗体反応により可視化した。染色まれていたFGF２であった 。この発見は，「精後は50％グリセロール－PBS（－）に２μg/ml

子幹細胞の自己複製にはGDNFが必須である」と

Hoechst33342を加えた溶液で封入し，共焦点レー

いう10年以上にわたり信じられてきた定説を覆す

ザー顕微鏡で観察した。

４）

ものであった。
こうした背景から申請者は，自身が発見した自© The Ito Foundation

233

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発

2 . 3 牛・豚精巣からシングルセルを得るため

CDH1, GFRA１はそれぞれ２種類の抗体を用いて検証したが，精原細胞（精細管の最外側に位置の条件検討
牛・豚精巣はマウス精巣と異なり間質が豊富でする生殖細胞で，精子幹細胞を含む）を特異的にある。このため，マウス精巣細胞を単離するときに用いるCollagenase type IVを用いても，間質を除去した精細管を得ることができなかった。そTable 1 Summary of Immuno-/lectin-staining.
Bovine
4.5 months
oldPig
12 weeks
old

ConA

×

×

Collagenase type IIおよびtype IV（Sigma）は

DBA

Gonia

Gonia

２mg/mlでHBSS（＋）に溶解し，0.4μｍシリン

DSL

×

×

Marker

こで，精細管の形態を維持したまま間質を優先的に消化可能なコラゲナーゼの探索を行った。

ジフィルターで濾過滅菌して使用した。リベラー
ゼDL, DH, TL, TM, TH（Roche）はそれぞれ250
μg/mlでHBSS（＋）に溶解し使用した。

ECL

×

×

GSL1

×

×

GSL2

×

×

Jacalin××

精巣組織は鋭利なはさみで２mm角程度の大き

LCA

×

×

さに細切し，上記組成の消化酵素で37℃，15分酵

LEL

Gonia

×

PHA-E

×

×

PHA-L

×

×

PNA

×

×

素反応を行った。得られた精細管は300号のナイ
ロンメッシュで回収し，さらに0.25％トリプシ

Lectinン・１mM EDTAで消化することで精細管をシングルセルにした。

PSA

×

×

RCA120

Gonia

×

SBA

×

×

３．結果と考察

SJA

××

3 . 1 牛・豚精子幹細胞純化のためのマーカー

STL

×

×

sWGA

×

×

探索

UEA

×

×

申請者らはこれまでの検討で，ITGA6, CD9,

VVA

×

×

EPCAM, GFRA1, CDH1, M-CAMをマウス精子幹

WGA

×

×

細胞の表面分子マーカーとして同定してきた４～８）。

Goat
GFRA1

×

×

これらの表面抗原のうち，ITGA6, GFRA1, CDH

Mouse
GFRA1

×

×

ITGA6

"GoniaSertoli""GoniaSertoli"

Rabbit Ecad
（24E1）

××

Rat Ecad（ECCD2）

×

×

UCHL1

Gonia

Gonia

DDX4

Gonia

Gonia

PLZF

Gonia

×

ASGR1

Sertoli×

GATA4

Sertoli

Sertoli１について牛・豚精巣組織の免疫蛍光染色を行い，精子幹細胞マーカーとしての可能性を検証しSpermatogonial
marker（cell surface）

た。加えて，精子幹細胞表面に特異的な糖鎖を標識するレクチンのスクリーニングも同様の方法で行った。また，精子幹細胞に発現する細胞内分子
PLZF, PGP9.5, DDX４，およびセルトリ細胞特異Spermatogonial
marker（intracellular）

的に発現するGATA4, ASGR１についても検討を
Sertoli marker

行った（Table１）。
まず精子幹細胞表面マーカーについては，

×：non-specific staining© The Ito Foundation

234

平成26年度Hoechst

PLZF

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）
ITGA6

染色することはできなかった。一方ITGA６は

Bovine 4.5 mo old

牛・豚双方の精原細胞とセルトリ細胞を認識する
ことが確認された（Fig.１）。次に，すべての分化段階のマウス生殖細胞に発現するDDX４，精Pig 12 weeks old

原細胞を染色するPLZF，およびヒト精原細胞を染色するUCHL１の抗体を用いた場合，いずれの抗体も精原細胞を特異的に染色することができた（UCHL１染色：Fig.２）。加えて，マウスセルト

Fig. 1 Immunofluorescent staining for Bovine/Pig testis

with PLZF and ITGA6 antibodies. Although antiPLZF antibody reacted only with bovine
spermatogonia, anti-ITGA6 antibody reacted withboth spermatogonia.

UCHL1

特異的に発現するASGR１についても検討を行ったが，GATA４が牛・豚セルトリ細胞の核を染色し，ASGR１については特異的な染色像はみられなかった（GATA４染色：Fig.３）。さらに，

Bovine 4.5 mo old

Hoechstリ細胞を認識するGATA４，ヒトセルトリ細胞

精原細胞表面の糖鎖を特異的に認識する糖鎖のス
クリーニングも行った。牛・豚精原細胞はレクチンであるDBAに反応することが知られていたが，未解析のレクチンも存在していた。本研究では入Pig 12 weeks old

手可能な21のレクチンについて検証を行った。結果としてDBA以外のレクチンは精原細胞特異的な反応は示さなかった（Data not shown）。
以上の結果から，抗ITGA６抗体およびDBAが精子幹細胞を標識するうえで有用である可能性がFig. 2 Immunofluorescent staining for Bovine/Pig testis

with UCHL1 antibody. Both spermatogonia werepositive for UCHL1．

示された。これらは第一に，MACSやFACSを用いた精子幹細胞純化に応用できる。加えてこれらを蛍光標識し培地に加えることにより細胞を生きGATA4たまま識別できる，つまりライブイメージングがBovine 4.5 mo old

Hoechst

可能になると考えられる。また，牛・豚精原細胞を 識 別 で き る PGP9.5, DDX4, PLZF は 細 胞 表 面
マーカーではないためライブイメージングや細胞純化には応用できないが，Western blotや免疫染Pig 12 weeks old

色により精原細胞か否かを判別するのに有用であり，同様にGATA４はセルトリ細胞か否かを判別するのに使用可能である。
牛・豚精子幹細胞は未だ培養に成功した例がな
いため，光学顕微鏡で培養細胞が精子幹細胞か否Fig. 3 Immunofluorescent staining for Bovine/Pig testis

with GATA4 antibody. Both Sertoli cells werepositive for GATA4．

かを判別することはできない。本研究成果を生か© The Ito Foundation

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発

235

し精子幹細胞の純化法とライブイメージング手法

今後，2 . 3 の手法でシングルセルを調製するとが確立できれば，牛・豚精子幹細胞の試験管内培ともに，2 . 2 の手法を発展させ精子幹細胞の純化，養法確立の一助となると考えられる。

ライブイメージング法を確立し，これらを活用し

3 . 2 牛・豚精巣からシングルセルを得るための条件検討
牛・豚精巣はマウス精巣と異なり間質が豊富でて精子幹細胞の試験管内培養法の確立を目指す。
４．要

約ある。このため，マウス精巣細胞を単離するとき

本研究では，有用家畜である牛・豚精巣より精に用いるCollagenase type IVを用いても，間質子幹細胞を樹立するための基礎技術として，①精を除去した精細管を得ることができなかった。そ子幹細胞を標識するマーカーのスクリーニング，

こで，精細管の形態を維持したまま間質を優先的②牛・豚精巣細胞を調製するための酵素処理条件に消化可能なコラゲナーゼの探索を行った。検証の検討を行った。結果として，抗ITGA６抗体，

し た コ ラ ゲ ナ ー ゼ は Sigma の Collagenase type

およびDBAレクチンが牛・豚精子幹細胞標識にII，およびRocheのリベラーゼDL, DH, TL, TM,

有用であること，Collagenase type IIおよびリベTHである。そして４週齢豚精巣を検証に用いた。

ラーゼTLが豚精巣からシングルセルを調製する

豚精巣組織を上記酵素で37℃・15分間処理したのに有用であることを突き止めた。今後，これら

結 果 ，Collagenase type II ，お よ び リ ベ ラ ー ゼの基礎技術を組み合わせ，精子幹細胞の純化法，TLにより，豚精巣間質が消化されることを確認

ライブイメージング法の確立と，それらを応用しした。酵素処理後にナイロンメッシュ（#300）

た精子幹細胞の試験管内培養法の開発を進めたい。

を用いることで，効率よく消化された間質・間質
細胞と，精細管組織を分別できることも確認された。さらに得られた精細管は37℃・１分のトリプ
シン・EDTA処理により容易にシングルセルにすることが可能であった。
2 . 2 において精子幹細胞を標識可能な抗体・レクチンを同定したが，これらを用いて細胞を純化
しライブイメージングに持ち込むには精巣から効率よくシングルセルを調製する必要があったが，申請者がマウスで適用していた方法では牛・豚精巣の間質を消化し精細管を単離することができなかった。今回の検討により，牛・豚精巣から精細管を単離し，さらにそこからシングルセルを調製

文献１） Kanatsu-Shinohara, et al., Biol. Reprod, 69, 612 ～
616，2003．
２） Kanatsu-Shinohara, et al., Biol. Reprod, 78, 611 ～
617，2008．
３） Kanatsu-Shinohara, et al., Biol. Reprod, 85, 208 ～
217，2011．
４） Takashima, et al., Stem Cell Reports, ４ ， 489 ～
502，2015．
５） Shinohara, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,97，8346～8351，2000．
６） Kanatsu-Shinohara, et al., Biol. Reprod, 70 ，70 ～
75，2004．
７） Kanatsu-Shinohara, et al., PLos One, 6, e23663 ，
2011．
８） Kanatsu-Shinohara, et al., Biol. Reprod, 87，139，2012．

することに成功した。

© The Ito Foundation

236

肥育前雌子牛の摘出卵巣からの胚生産の試み
Production of embryos using growing oocytes derived from the ovaries
removed bovine calves before fattening

的

場

理

子・平

尾

雄

二・武

田

久美子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産草地研究所）

Satoko Matoba, Yuji Hirao and Kumiko Takeda（NARO Institute of Livestock and Grassland Science）

The aim of this study was to investigate if the production of embryos using growing
oocytes collected from the ovaries from calves just before fattening（approximately 9-monthold）is beneficial for the rescue of them as genetic resources. Immature oocytes with normal
size, approximately 120μm in diameter, were selected after aspiration of follicles on the calf
ovaries（IM oocytes as IM group）, matured（IVM）for 22-23 hours（h）, fertilized（IVF）for 6
h and cultured（IVC）for 9 days in vitro. Growing oocytes with small size, approximately 100
μm in diameter, were collected from dissected follicles of less than 1 mm in diameter andsubjected to in vitro growing culture on the membrane inserts in several candidatesʼ media for
14 days（IVG oocytes as IVG group）. IM and IVG oocytes were subjected to IVM-IVF-IVC.
Tentative embryos in both groups were cultured in the individual isolated microwell in culture
dishes. Embryos developed to the blastocyst stage in the IM group were lower than those
produced from cow ovaries from a local abattoir. When newly developed medium supplemented
with supplementation was used for in vitro growth culture of growing oocytes from calf
ovaries for 14 days, IVG oocytes showed increased diameter, volume and mitochondrial DNA
copy compared with those cultured without the supplementation. Blastocyst formation wasobserved in the IVG group. Total number of blastocysts derived from all the oocytes combinedwith the IM and IVG groups was 4.3 embryos per head per session when new developed
medium was used for in vitro growth culture. In conclusion, our approach suggested the double
benefits of embryo production after IVM-IVF using both grown oocytes and growing oocytes
collected from the same ovaries removed from calves before fattening. However, further study
is required to improve embryo development and confirm developmental competence of
produced embryos following transfer to the recipient cow.

１．目

は，しばしば飼養管理のしやすさから子牛の段階

的で肥育前に去勢（卵巣を摘出）されている。摘出

肉用牛，特に黒毛和種の雌牛の肥育においてされた卵巣の多くが現在は廃棄されているため，© The Ito Foundation

肥育前雌子牛の摘出卵巣からの胚生産の試み

237

これらの廃棄卵巣を利用することができれば，血た卵子について，卵細胞質の成熟度を，ミトコン

統の明らかな雌牛の後代を生産することが可能とドリアDNAコピー数を指標として体内で発育しなる。体外受精で用いる卵子は，少数で培養するた卵子と同等であるか否かを検証した。

と発生率が低いことが知られており ，発生率を１）高めるために多数の胚を集合培養することが一般

２．方法的である。しかし，摘出卵巣からの卵子採取は１

2.1

回限りであるため，１頭（卵巣は１頭あたり２民間農場で飼養されている黒毛和種の若齢雌子個）あたりの採取卵子数が少ない場合の発生率の牛（約９か月齢）から摘出された卵巣を，現地か向上が欠かせない。また，性成熟に達していない

ら実験室まで約５時間輸送して用いた。輸送後，若齢牛の未熟な卵巣から得られる卵子は既存の体直ちに通常サイズの卵子の採取を始め，体外成熟

外受精・培養法では発生率が低いという報告があ

培養を輸送後から約１時間後に開始した。これら

２）

る 。

の卵巣の直径２～６mmの卵胞から吸引採取した

我々は，すでに少数の卵子においても，体外培

直径約120μｍの未成熟卵子（通常サイズの卵子，養における発生能を最大限引き出せる個別識別可

IM oocytes区）と卵丘細胞の複合体に，既報７）の能な個別卵子・胚培養システムを開発している３）。

とおり体外成熟，体外受精および体外発生培養をさらに，若齢牛の未熟な卵巣には，成牛の成熟し実施した。すなわち，体外成熟は，５％新生子牛た卵巣に比べて多数の発育途上の卵胞を含む様々

血 清（NBS）と 0.02AU/ml FSH 添 加 TCM199 をな直径の卵胞があり，それらの卵胞には様々な直用い，22～23時間の培養により行った。体外受精

径の卵子や発育途上の卵母細胞が存在している。

には，黒毛和種種雄牛の凍結精液を融解して用い

これら卵胞卵子や発育途上の卵母細胞を廃棄せずた。成熟卵子は，90％パーコール密度勾配液で夾利用できれば，体外受精に用いる通常サイズの卵雑物を分離したのちにIVF100（機能性ペプチド子（直径約120μｍ）と合わせて雌子牛１頭から研究所）を用いて最終濃度を３×106 精子／mlに数多くの卵子を活用できる。また，今までに我々調整した精子と６時間媒精した。体外成熟と体外は，成牛から採取した直径約100μｍの中型卵母

受精は，38.5℃，５％CO２および95％空気の加湿

細胞の長期培養によって体外受精に用いることが気相下で行った。媒精後，卵子を裸化し，５％

可能な成熟卵子を得る技術を確立しており ，こNBS と 0.25mg/ml リ ノ ー ル 酸 ア ル ブ ミ ン 添 加

れらの発育途上の卵母細胞由来の子牛生産を可能

CR1aaを用い，38.5℃，５％CO２ ，5％Ｏ２ およびとしている 。

90％Ｎ２の加湿気相下で９日間の体外発生培養を

４）５）

若齢牛由来の卵子からの胚生産の検討

そこで，本研究では，体外受精に用いる通常サ実施した。発生培養には，個別識別培養皿８）を用

イズの卵子の培養技術および発育途上の中型卵母

い，卵子の発生能の検証と胚の生産性について，

細胞の体外受精発育技術を統合することにより，媒精後７～９日目の胚盤胞期胚への発生成績によ

若齢牛の卵巣を「新たな牛卵子資源」として最大り検討した。

限有効利用することを目的とした。また，卵子に数多く含まれているmtDNAは卵子や体外発育卵

2 . 2 若齢牛由来の卵母細胞からの胚生産の検討

母細胞の１個１個の正常性を体外受精前に評価す

通常サイズの卵子採取後に発育途上の卵母細胞ることが可能 と考えられることから，生産されの採取を開始し，その体外発育培養を輸送後から

６）© The Ito Foundation

238

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

約５時間後に開始した。発育途上卵母細胞の採取

2.3と体外発育培養および成熟培養は既報に従っ

直径約100μｍの卵母細胞を異なる抗酸化物質，

た。すなわち，2.1で卵胞吸引後の卵巣表面の皮ホルモン，グルココルチコイド等の混合物を添加

質を薄く切り出し，直径１mm未満の卵胞を２した培養液で２週間体外培養した。実験は２回実mMグルタチオン，５mMタウリン，１mMアス

施し，それぞれ異なる種類の混合物を未添加の区

コルビン酸２グルコシド（AA2G）および２mM（Ｓ１）および添加区（Ｓ２）とした。発育したジメチルウレアを添加したMEM中に採取した。

成熟卵子（IVG-IVM）の一部を卵丘細胞除去後，得られた卵胞を１mMピルビン酸ナトリウム，３

PVPを添加したPBS-で洗浄し，個別の卵子ごと

mM グ ル タ チ オ ン ，５ mM タ ウ リ ン ，１ mMに DNA 抽 出 キ ッ ト （QIAamp DNA micro Kit,

AA2G，20mg/mlポリビニルピロリドン（PVP）

Qiagen）を用いてDNAを抽出した（S1 ; n＝３，

添加MEM中で切開して直径約100μｍの発育途

S2 ; n＝４）。卵子１個あたりのミトコンドリア

上卵母細胞（IVG oocytes区）と顆粒膜細胞の複DNA（mtDNA） の コ ピ ー 数 の 計 測 は ，合体を採取し，14日間の体外発育培養を実施してCyclooxygenase-1（COX1）お よ び Cytochrome

卵母細胞を発育させた。体外発育培養の基本培養

B（CYTB）遺伝子をターゲットとしたリアルタ

液には，市販のTCM199あるいはMEM-αに５％イムPCR（LightCycler 1.5, Roche）により既報６）

ウシ胎子血清（FBS），4mMヒポキサンチンおよに従って行った。mtDNAコピー数のコントロー

び４％ポリビニルピロリドンを添加して使用しルとして，食肉処理場から採取した成牛卵巣由来

た。さらに，抗酸化物質，ホルモン，グルココル

体外成熟卵子（IVM）を用いた（S1 ; n＝３，S2

チコイド等の混合物を３種類の組み合わせで作成; n＝４）。

４）

し，基本培養液に添加してそれぞれ培養液Ⅰ，培
養液Ⅱ，培養液Ⅲとした。体外発育培養は，これ

作成卵子の分子レベルの正常性の検討

３．結果と考察らの培養液を入れたセルカルチャーインサート上

通常サイズの卵子において，卵丘細胞層が複数で，38.5℃，５％CO２，
５％Ｏ２ および90％Ｎ２ のまたは１層以上卵子周囲に付着した卵丘卵子複合

加湿気相下で行った。卵母細胞の直径を培養開始

体が体外受精に利用可能であり，１頭あたり平均

後１日（Day１）および培養14日後（Day14）に11.0個の体外受精可能卵子が採取できた。最近，

測定し，その数値をもとに体積を計算して培養の９か月齢の子牛に経腟採卵を実施した場合，平均前後で比較した。体外発育培養後の卵子の体外成

採取卵子数は11.7個であったとの報告２）があり，熟は，200μM AA2G, 1mMピルビン酸ナトリウ

本研究で使用した約９か月齢から採取した卵子数

ム，0.55mMシステイン，100ng/ml FSH, 500ng/と同等であった。採取卵子数は卵巣サイズに依存

ml LH, 10 ng/ml EGF，５％FBS添加TCM199をしており，性成熟前後の時期の子牛から得た卵巣用い，通常サイズの卵子と同気相下で同時間の培を用いる場合，通常サイズの卵子採取数の大幅な養により行った。また，成熟卵子の体外受精およ向上を望むことは困難であると考えられる。通常

び体外発生培養は，通常サイズの卵子と同様としサイズの卵子から発生した胚盤胞をFig. 1Aに示た。これら発育途上の卵母細胞の体外発育培養にした。これらの卵子の胚盤胞期胚への発生率は実より，体外受精可能な成熟卵子の生産や，その後

験回次によりバラツキが大きく，通常我々が食肉の体外受精による卵子の胚の生産性を検討した。

処理場由来の成牛卵巣の卵胞から採取した卵子に© The Ito Foundation

239

肥育前雌子牛の摘出卵巣からの胚生産の試み

Fig. 1 Representative images of the Day 7 embryos in individual microwells of culture dishes（Day 0 ＝ IVF）
. Embryos

were derived from immature oocytes of approximately 120μm（A）and 100μm in diameter after in vitro growthculture（B）, respectively. Note that □ indicate embryos developed to the blastocyst stage. The diameter of eachmicrowell was 287μｍ．

A（X105）µm399.8 120.2 102.6 120.5
Mean diameter Mean diameter
14
b
12

B

Distribution
75%
50%
25%

100.3 122.6
Mean diameter
a
a

%
240

b

b

a

Increase of oocyte volume

220

Oocyte volume

10
8

c

d

cd

6
4

180
160
140
120
Day1

100
80
60
40

2
0

200

n=65

n=55

n=123 n=113

Day 1 Day 14 Day 1 Day 14
Medium: II
Medium: I

n=68

n=66

Day 1 Day 14
Medium: III

a-d, P<0.05, Tukey test.

20
0n=55 n=113 n=66
I

II

III

Mediuma,b, P<0.05, Tukey test.

Fig. 2 In vitro growth of oocytes after isolation from calf ovaries. A）Increase of oocyte volume between Day 1 and Day

14 of culture. Three different types of media（I, II, and III）were used for culture of oocytes during the 14-day
culture period. B）The volume gained between Day 1 and Day 14. The volume on Day 1 was designated 100％．
When the type III medium was used, the increase of oocyte volume was the largest, resulting in a 1.8-fold increase.

比べて低率であった。Mullaartら２）らは，性成熟りの生産胚数が１回あたり平均約１個であること

後の９～10か月齢の子牛の胚盤胞期への発生率はを示している。本研究に使用した卵巣の由来に14.6％であったと報告している。これは１頭あた

は，性成熟に達した個体と達していない個体が混© The Ito Foundation

240

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

在しており，性成熟の前か後かの時期別による胚2.E+05た。
発育途上卵母細胞の直径と体積変化をFig.２に示した。採取後１日目の直径は平均100μｍ（範囲99.8～102.6μｍ）であった。基本培養液に，異なる抗酸化物質，ホルモン，グルココルチコイド
等の混合物を添加した培養液Ⅲで体外発育培養した場合，平均直径は生体内での最大直径である約125μｍに近い122μｍに達し，その体積は80％の増大が認められた。さらに，卵母細胞周囲の顆粒膜細胞によるドームの形成や卵母細胞の成熟に伴う卵丘細胞の膨潤化も正常であった。これらの一部の卵子について調べた結果，体外成熟，体外受精および胚発生も部分的に可能であった。生産しmtDNA copies/oocyte

発生能力の違いを検証する必要があると考えられ

IVM

IVG-IVM＊＊

2.E+05
1.E+055.E+040.E+00S1

S２

Fig. 3 Mitochondrial DNA（mtDNA）copy number per invitro matured oocyte in IVG oocytes was analyzed
by COX1 gene. In vitro growth media without（S1）and with the newly supplementation（S2）were used
for in vitro growth culture of IVG oocytes（IVG-IVM
group）. The IVM group indicates in vitro matured
oocytes from cow ovaries obtained from a local
abattoir. ＊＊；Significant difference was shown between
them（P＜0.01, t-test）．

た胚盤胞はFig. 1Bのとおりであった。生体内では卵母細胞はその発育期終了直前の約２週間で，異なることにより，顆粒膜細胞の増殖や機能に違

胚発生に必要な分子を内部に蓄える。本研究においが生まれ，その結果として卵子の正常性に影響いて，開発した体外発育培養用の培養液を用いるが及ぶものと考えられる。これらの結果から，小ことにより，体外で14日間発育した卵母細胞にお型卵母細胞は体外培養をすることにより，食肉処

いても，直径や体積の増大だけでなく，胚に発生理場由来の成牛の通常卵子と同等にmtDNAコするための変化が正常に進行していたものと考え

ピー数が増幅することが明らかとなった。

られる。

以上の結果から，通常サイズの卵子および発育発育途上の卵母細胞から作成した卵子の体外成途上の卵母細胞のどちらにおいても一部は胚生産

熟後の正常性の検討において，混合物を添加してが可能であり，最新の実験回次では１頭あたり計いないＳ１区では体外発育培養後の卵子の平均直4.3個の胚生産であったことから，当初の目的は径と体積の増大が認められず，mtDNAコピー数

意義のあることが確認された。しかし，胚の生産においても少ない結果となった（P ＜0.01, Fig.

数にはバラツキがあり，安定していないことが課

３）。一方，混合物を添加したＳ２区では体外発

題として残った。そのために，性成熟に達する前

育培養後の卵子の平均直径と体積が増大し，後の時期を分けて胚の生産性を検証するとともに

mtDNAコピー数においても成牛のそれと同等で発生率の向上を検討することが必要であると考えあった（P＞0.05, Fig.３）。これらの結果から，体られる。また，子牛を生産するためには，生産胚外発育培養液に添加する血清および酸化防止剤のを受胚牛に移植し，正常な受胎性の検証や産子が種類は卵子の正常性にも影響することが認められ得られるかについても検討する必要がある。

た。血清中には多種類の成長因子やステロイドホ
ルモンが含まれていることから，それらの濃度が© The Ito Foundation

肥育前雌子牛の摘出卵巣からの胚生産の試み

４．要

241

後は，胚の発生率の向上や生産胚の移植による受約胎性の検討が必要であると考えられる。

本研究では，しばしば肥育前に摘出・廃棄される黒毛和種の若齢雌子牛の卵巣を有効活用するために，卵巣から通常サイズの卵子および発育途上の卵母細胞を採取し，両区から体外培養を経て胚生産を行うことの可能性について検討した。通常
サイズの卵子からの胚生産は可能であったが，胚盤胞期胚への発生率にバラツキが大きく安定していなかった。発育途上の卵母細胞においては，体外発育培養に新たな添加剤を含む培養液を用いた
場合，卵子の直径，体積，mtDNAコピー数が体内発育卵子と同等となり，卵子の一部は胚盤胞期胚へ発生した。今回開発した体外発育培養方法により，通常卵子と発育途上卵母細胞から１頭あたり4.3個の胚を生産できた。このことから，肥育前に廃棄される若齢子牛の卵巣から，１回限りの卵子採取機会を有効活用して胚生産を行うという本研究の目的は意義があったことが示された。今文献１） Carolan, C., Lonergan, P., Khatir, H., Mermillod, P.,
Mol Reprod Dev.，45，145～150，1996．
２） Mulaart, E., Dotinga, F., Flapper, H., van de
Brink, A., Pietersma, N., Schouten, J., Reprod Fertil
Dev.，27，209～210，2015．
３） Matoba, S., Fair, T., Lonergan, P., Reprod Fertil
Dev.，22，839～851，2010．
４） Hirao Y, Somafai T, Naruse K.: J Reprod Dev ，60，68～72，2014．
５） Hirao, Y., Naruse, K., Kaneda, M., Somfai, T., Iga,
K., Shimizu, M., Akagi, S., Cao, F., Kono, T., Nagai, T.,
Takenouchi, N., Biol Reprod，89，１～11，2013．
６） Takeda. K., Srirattana, K., Matsukawa, K., Akagi,S., Kaneda, M., Tasai, M., Nirasawa, K., Pinkert, C.A.,
Parnpai, R., Nagai, T., J Reprod Dev., 58，323～329，
2012．
７） Matoba, S., Yoshioka, H., Matsuda, H., Sugimura,S., Aikawa, Y., Ohtake, M., Hashiyada, Y., Seta, T.,
Nakagawa, K., Lonergan, P., Imai, K., J Dairy Sci.,
97，743～753，2014．
８） Sugimura, S., Akai, T., Somfai, T., Hirayama, M.,
Aikawa, Y., Ohtake, M., Hattori, H., Kobayashi, S.,
Hashiyada, Y., Konishi, K., Imai, K., Biol Reprod, 83，
970～978，2010．

© The Ito Foundation

242

生体内卵子吸引・体外受精・胚移植による子豚生産技術の開発
Production of piglets by ovum pick up, in vitro embryo production andembryo transfer

吉

岡

耕

治・的

場

理

子＊

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究所・＊畜産草地研究所）

Koji Yoshioka and Satoko Matoba＊（National Institute of Animal Health, ＊NARO institute of Institute of Livestock and Grassland Science,
National Agriculture and Food Research Organization）

The objective of this research is to develop a system for piglet production by ovum pickup（OPU）, in vitro production（IVP）of embryos and embryo transfer. Firstly, to establish
culture system for a small number of oocytes or embryos, we evaluated the effect of different
incubation volumes and culture densities on fertilizing ability and developmental competencein vitro. Porcine oocytes derived from abattoir-obtained ovaries were matured, fertilized andthen cultured in vitro as follows: in groups of 50 oocytes in 500μl of medium for in vitro
maturation（IVM）, 20 oocytes in 100μl of medium for in vitro fertilization（IVF）and 20
embryos in 40μl of medium for in vitro culture（IVC）（Group I）; 20 in 100μl for IVM, 20 in
100μl for IVF and 20 in 40μl for IVC（Group II）; and 10 in 100μl for IVM, 10 in 100μl for
IVF and 10 in 40μl for IVC（Group III）. Rates of sperm penetration, cleavage and blastocyst
formation did not differ among the groups. Secondly, to increase the collection efficiency of
porcine oocytes by transvaginal ultrasound-guided OPU, the effects of aspiration pressure on
follicular oocyte collection were assessed. When oocytes were aspirated from ovaries of live
sows using 2 different aspiration pressures（80 or 100 mmHg）, a number of oocytes recoveredin 100 mmHg pressure was significantly higher than in 80 mmHg pressure. Finally, 81 oocytes
from 5 donor sows obtained by OPU were subjected to IVP. At 5 days after IVF, 47
transferable embryos at the morula and blastocyst stages（9.4 embryos per session）were
produced. When they were transferred into five recipient gilts（5-16 blastocysts per recipient）,
3 recipients became pregnant and farrowed a total of 12 live piglets. The present results
clearly demonstrate that porcine blastocysts can be produced by OVP-IVP and that they candevelop to full term after embryo transfer.

１．目

卵巣から卵子を吸引する生体内卵子吸引（OPU）

的技術と卵子を体外で受精させ，非外科的胚移植が豚において，超音波ガイド下で経腟的に生体の可能な胚盤胞期まで発生させる胚の体外生産© The Ito Foundation

生体内卵子吸引・体外受精・胚移植による子豚生産技術の開発（IVP）技術を活用した胚移植による子豚生産シ
ステムを確立することを目的とする。遺伝的能力に優れた雌畜から受精卵（胚）を取り出し，それ

２．方

243

法

2 . 1 体 外 培 養 に お け る 胚 培 養 密 度 の 検 討

らの胚を他の雌畜（代理母：レシピエント）の子（Experiment１）

宮を借りて一時に多数の子畜を生産することので

食肉処理場から卵巣を得る場合と異なり，きる胚移植は，生体や精液による移動に比べ，疾OPUでは１個体から採取できる卵子の数は多く病を伝播する可能性は極めて低いことが報告されないと想定されることから，まず，少数の卵子でており，同技術を種豚の導入に利用できれば，伝もIVPによって効率よく胚盤胞期にまで発生させ染病の蔓延を招くことなく優れた種豚の生産や育ることのできる培養法を検討するため，胚の体外

種改良を行うことができる。しかし，すでに受精培養における培養液量や培養密度などの影響を調

卵移植産業として，一定規模の市場を有する牛とべた。食肉処理場由来と畜卵巣の卵胞から吸引採異なり，養豚生産農場での胚移植による子豚生産

取した未成熟卵子は，既報１）に従って体外成熟おシステムは未だ確立されていない。

よび体外受精した後，胚培養数／培養液量を20個

豚の子宮は長く蛇行しており，子宮頸管はらせ／40μｌ，10個／40μｌ，５個／40μｌ，10個／ん構造を持つため，胚の採取および移植は開腹手

20μｌおよび５個／10μｌとして体外培養を行術により外科的に行う必要があった。しかし近い，体外受精（媒精）後２日目の分割率，５日目

年，特殊な子宮深部注入用カテーテルを用いて非の胚盤胞への発生率および胚盤胞の細胞数を調べ外科的に胚を移植することにより，子豚が生産でた。

きることが報告されており，胚移植については，生産現場で実施可能な技術が確立されつつある。

2 . 2 体外成熟および体外受精における卵子培
養密度の検討（Experiment２）

一方，生体からの胚の採取については，現在でも卵胞から採取した卵子は，Table１に示す培養

開腹手術による外科的手法に頼らざるをえない状

密度で体外成熟，体外受精および体外培養を行況にある。牛では従来，人工授精後の胚を子宮灌い，体外受精および体外発生成績を比較した。な流により回収して，胚移植に利用していたが，お，媒精の最終精子濃度はいずれも１×10６／ml

OPU-IVP技術の進歩は，１個体から作出できるとした。

移植可能な胚盤胞の数を飛躍的に向上させ，胚移植技術のさらなる普及に貢献している。豚におい2 . 3 食肉処理場由来卵巣を用いたOPUにおける吸引条件の検討（Experiment３）ても，OPU-IVPによって胚盤胞を作出することと畜卵巣を用い，OPUに使用する生体内卵子ができれば，生体由来の移植胚作出から胚移植に採取針および吸引器によって60，80，100または至る工程を，開腹手術を行わず実施することが可

120mmHgの吸引圧でそれぞれ100個の卵胞を吸能となり，生産現場で利用可能な胚移植を活用し引し，回収卵子数を調べるとともに回収卵子の形た子豚生産システムとして，養豚における受精卵態を観察し，全体が卵丘細胞に囲まれ正常な形態

移 植 産 業 の 形 成 に 大 き く 貢 献 す る 。そ こ で ，を示す卵子（Grade A），卵丘細胞の一部が剥離

OPU-IVPによる胚盤胞の作出と，胚移植によるしている卵子（Grade B），裸化卵子（Grade C）

子豚の生産を目指す。

および変性卵子（Grade D）に分類し，その割合を調べた。

© The Ito Foundation

244

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 1 Culture density of oocytes or embryos in Experiment 2
Group

Number of oocytes or embryos/volume of culture medium
In vitro maturation

In vitro fertilization

In vitro cultureⅠ

50/500μl

20/100μl

20/40μlⅡ20/100μl

20/100μl

20/40μlⅢ

10/100μl

10/100μl

10/40μl

2 . 4 OPU に お け る 吸 引 条 件 の 検 討

2 . 5 OPU-IVPによる胚生産と胚移植による受胎性の検証（Experiment５）（Experiment４）
ドナーとしてランドレース，大ヨークシャー種

ドナーとして大ヨークシャー種経産豚５頭

およびそれらの交雑種経産豚12頭（29.0±6.7ヶ月（22.1 ± 0.5 ヶ 月 齢 ，159.1 ± 8.9kg）を 用 い た 。

齢，179.9±18.6kg）を用いた。黄体退行を誘起し，Experiment４と同様の方法で黄体退行誘起およ

同時に卵胞発育を同調させるため，排卵後８～11び卵胞発育同調処置を施し，初回PGF２α投与後５日目からジノプロストとして15mgのプロスタグ

日 目 に OPU を 実 施 し た 。 OPU に は UST-

ランジン（PG）Ｆ２α（パナセランHi, Meiji Seika

9106P-7.5あるいはHCV-4710MV（本多電子）をファルマ）を１日２回３日間筋肉内に投与し，さ経 腟 プ ロ ー ブ と し て 用 い ，卵 子 吸 引 圧 はらに５回目のPGF２α投与時（初回PGF２α投与後３100mmHgとした。採取した卵子は形態を観察し日目）から卵胞刺激ホルモン（アントリン，共立た後，体外成熟，体外受精，体外培養を行った。

製薬）２AUを１日２回２日間筋肉内に投与し得られた媒精後５日目の桑実胚および胚盤胞は，た。初回PGF２α投与後５日目にOPUを実施した。

発情を同期化した５頭のランドレース種×大ヨー

ドナーは移動式ストール内に入れ，緩衝材などでクシャー種交雑種未経産豚（6.9±0.7ヶ月齢，99.4

保定した後，鎮静剤（１％メシル酸マホプラジ±7.0kg）の子宮内へ外科的に移植した。１頭のン，マフロパン，DSファーマアニマルヘルス，

ドナーから生産された移植胚は，１頭のレシピエ

５ml 筋肉内），副交感神経抑制剤（２％ブチルス

ントへ移植し，受胎促進を目的として移植後６日

コポラミン臭化物，ブスコパン，日本ベーリン

目のレシピエントにエストラジオールプロピオン

ガーインゲルハイム，２ml 静脈内）および局所

酸エステル（オバホルモンデポー，あすか製薬）

麻酔剤（２％リドカイン，キシロカイン２％，ア

10mgを筋肉内投与した。胚移植後20日目に超音ストラゼネカ，３ml 尾椎硬膜外）を処置した。

波画像診断法による妊娠鑑定を実施し，妊娠が確

OPU に は UST-9106P-7.5 （ア ロ カ） を 経 腟 プ

認された豚は，分娩させ，産子数および産子の体

ロ ー ブ と し て 用 い ，卵 子 吸 引 圧 は 80 あ る い は重を計測した。

100mmHgとした。採取した卵子は形態を観察した後，体外成熟，体外受精，体外培養を行い，媒精後２日目の分割率，５日目の胚盤胞への発生率
および胚盤胞の細胞数を調べた。

３．結果と考察体外成熟および体外受精した後，胚培養数／培
養液量を５個／10μｌ，10個／20μｌ，５個／40
μｌ，10個／40μｌおよび20個／40μｌとして体外培養を行ったところ，５個／10μｌとした場合© The Ito Foundation

245

生体内卵子吸引・体外受精・胚移植による子豚生産技術の開発の 胚 盤 胞 へ の 発 生 率（６ ％ ）は 他 の 区（18 ～程度の割合で胚盤胞を作出できると考えられた。

24％）に比べ有意に低かった。また，卵子を50個

OPUを実施する際の吸引条件についてと畜卵／500μｌ，20個／200μｌおよび10個／100μｌと巣を用いて検討したところ，回収卵子率は吸引圧

して成熟培養を行い，体外受精および体外培養をを上げるに従い高くなり（80～91％），正常な形行ったところ，精子侵入率（56～63％）や正常受態を示すGrade Aの卵子の割合は100mgHgとし精率（34～39％）に差は認められなかった。また場合（19％），60mmHg（９％）に比べ有意にた，卵割率，胚盤胞への発生率および胚盤胞の細高かった。生体を用いてOPUを実施した場合，胞数は，グループ間に差を認めなかった（Table

１セッションあたり得られた卵子数は，吸引圧２）。これらのことから，OPUにより10個程度の80mmHg（13.7個）と比較して100mmHg（21.2個）

卵子を回収することができれば，食肉処理場由来

で有意に多かった（Table３）。胚盤胞への発生率の大量の卵子を用いた体外生産系を利用して，同は両区（26～29％）で差を認めなかった。１セッ

Table 2 Effect of ration of embryo number/medium volume on porcine in vitro embryo development
Category＊

No. of oocytes cultured

No. of cleaved embryos（％）

No. of blastocysts（％）

Cell number inblastocyst§

Group I140

74（52.9）29（20.7）48.2±14.7

Group II

140

77（55.0）33（23.6）47.4±20.0

Group III140

78（55.7）

31（22.1）

47.1±16.7＊See Table1．
§Mean±SD.

Table 3 Effect of aspiration pressure during oocyte harvesting on the recovery and subsequent IVP of embryos
No. of oocytes
cultured［per＊session］

No. of blastocysts＊［per session］

Cell number inblastocyst＊

79［13.7±5.5］ｂ75［12.5±5.8］22［3.7±4.3］

51.5±15.1

ａ127［21.2±6.5］111［18.5±8.0］29［4.8±4.5］

61.0±15.7

Aspiration pressure（mmHg）

No. of sessions

No. of oocytes
collected［persession］＊

80

6

100

6

＊Mean±SD.
a, bvalues with different superscript letters are significantly different（P＜0.05）．

Table 4 Pregnancy results after transfer of porcine embryos derived from oocytes collected by OPU
Donor ID

No. of oocytes
collected

No. of oocytes
culturedNo.（％）＊of
blastocysts

No.（％）＊of
transferable
embryos

Pregnancy

No. of piglets
born§（per litter）

No.14714

14

6（42.9）8（57.1）＋

6

No.14615

14

4（28.6）9（64.3）－－

No.15015

147（50.0）9（64.3）－－

No.14512

11

4（36.6）5（45.5）＋

2

No.15125

24

13（54.2）

16（66.7）＋

4

Overall［Number per
session］§

81［16.2±5.0］

77［15.4±5.0］34（44.2）［6.8±3.7］47（61.0）［9.4±4.0］

60％

12（4.0±2.0）［2.4±2.6］＊Percentage per oocytes cultured.
§Mean±SD.

© The Ito Foundation

246

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Fig. 1 Oocytes collected from a donor sow by OPU（left panel），transferable IVP embryos derived from the oocytes（center panel）and piglets obtained after transfer of the embryos（right panel）．

ションあたり，それぞれ3.7および4.8個の胚盤胞が得られ，豚のOPUでは100mmHgの吸引圧で卵胞を吸引することが適当であると考えられた。

４．要

約

本研究では，OPU-IVP技術を活用した胚移植

５頭のドナーから合計81個の卵子を回収したによる子豚生産システムの確立を目的とし，豚の（Table４）。このうち77個を体外成熟・体外受精・

OPU-IVPのための諸条件を検討するとともに，体外培養に供試し，47個（61.0％）の移植胚（桑得られたIVP胚を移植し，受胎性を検証した。ま

実胚および胚盤胞）を得た。胚盤胞への発生率はず，少数の卵子でもIVPによって効率よく胚盤胞

44.2％で，１セッションあたり平均6.8個の胚盤胞まで発生させることのできる培養法を検討するたおよび9.4個の移植胚を作出できた。体外生産胚

め，と畜卵巣から得た卵子を用いてIVPを行い，５～16個を５頭のレシピエントに移植したとこ

培養液量や培養密度などの影響を調べたところ，ろ，３頭が妊娠・分娩し，計12頭の子豚を得た

OPUにより10個程度の卵子を回収することがで（Fig.１）。分娩した豚の産子数は平均4.0頭で，１きれば，食肉処理場由来の大量の卵子を用いた体セッションあたり2.4頭の子豚を生産することが外生産系を利用して，同程度の割合で胚盤胞を作可能であった。豚では，腹腔内視鏡

あるいは超出できると考えられた。また，と畜卵巣および生によるOPUにより卵体を用いてOPUにおける吸引圧を検討したとこ

子吸引が可能であり，体外生産により胚盤胞が得ろ，豚のOPUでは100mmHgの吸引圧で卵胞を吸られる５）ことが報告されているが，OPUによっ引することが適当であると考えられた。さらに，て採取した卵子由来の体外生産胚の移植によって上記の条件を用いて５頭のドナーから合計81個の子豚を作出した報告はない。今回の研究では，卵子を回収した。このうち77個を体外成熟・体外

OPU-IVPを活用して豚胚を生産することが可能

受精・体外培養に供試し，ドナー１頭あたり9.4であり，外科的移植により子豚を作出することに個の移植胚を作出できた。体外生産胚５～16個を成功した。OPU-IVPの効率を改善し，非外科的５頭のレシピエントに移植したところ，３頭が妊胚移植により子豚を生産することが可能になれ

娠・分娩し，計12頭の子豚を得た。分娩した豚のば，生産現場においても採卵および胚移植を実施

産子数は平均4.0頭で，１セッションあたり2.4頭することができ，優良な遺伝資源を有効に活用すの子豚を生産することが可能であった。以上よることが期待できる。

り，OPU-IVPを活用して豚胚を生産することが音波ガイド経腟プローブ

３，４）

２）

© The Ito Foundation

生体内卵子吸引・体外受精・胚移植による子豚生産技術の開発可能であることを示し，外科的移植により子豚を作出することに成功した。
文献１） Mito, T., Yoshioka, K., Noguchi, M., Yamashita, S.,
Hoshi, H., Mol Reprod Dev., 80，549～560，2013．
２） Brüssow, K.P., Torner, H., Rátky, J., Hunter, M.G.,

247

Nürnberg G., Acta Vet Hung，145，189～196，1997．
３） Bellow, M.S., Didion, B.A., Davis, D.L,. Murphy, C.,
Ferguson, C.E., Godke, R.A., Day, B.N.,
Theriogenology, 55, 528（abstract），2001．
４） Ferguson, E., Bellows, S., Lemieux, F., Godke, R.,
J Vet Med Sci.，75，191～194，2013．
５） 生駒エレナ，鈴木千恵，石原康弘，小村喜久男，
大小田勉，丸野弘幸，日本養豚学会誌，51，45～
53，2014．

© The Ito Foundation

248

血清中アミロイドＡおよびエンドトキシン活性値を指標とした牛複合性呼吸器疾患の早期予後診断システムの構築
Establishment of early prognostic systems for Bovine Respiratory
Diseases Complex using serum amyloid A and plasma endotoxin activity

鈴

木

一

由

（酪農学園大学獣医学群獣医学類）

Kazuyuki Suzuki（School of Veterinary Medicine, Rakuno Gakuen University）

Severe Bovine Respiratory Disease Complex（BRDC）is a systematic inflammatory
response caused by endotoxin and similar to human inflammatory respiratory disease. The aimof this study was to investigate the relationships, if any, in plasma and bronchoalveolar lavage
fluid（BALF）activities of endotoxin in calves with lung inflammation associated with
Mycoplasma bronchopneumonia.
Seventeen healthy Holstein calves without Mycoplasma bovis infection were used in thisstudy as a control group. Seventeen calves were patients at the Rakuno Gakuen Unicersity
Veterinary Teaching Hospital showing clinical signs such as coughing, nasal discharge, fever,and pulmonary adventitious breath sounds. The M. bovis was detected in BALF of all 17 calves
by a PCR method based on 16S rRNA gene. Endotoxin activity in plasma and BALF weredetected by LAL-kinetic turbidimetric（KT）assay（EndosafeⓇ KTA ２ , Charles River,Charleston, SC, USA）. The mean values for each dependent variable were compared with thenormal values, using the Studentʼs t-test after analysis of ANOVA as F test. Receiver
operating characteristic（ROC）curves was used to characterize the sensitivity and specificity
of each parameter to Mycoplasma bronchopneumonia associated changes. The optimal cutoff
point for a test was calculated by the Youden index.
The calves with Mycoplasma were characterized by significantly higher in endotoxin
activity in plasma（0.334 EU/mL）and 105.8 EU/mL）. The proposed diagnostic cutoffs forendotoxin activity in plasma and BALF based on ROC analysis in detecting bronchopneumonia
were set at > 0.078 and > 6.05 EU/mL, respectively. BALF and plasma endotoxin activity value．Calves with severe respiratory signs
showed a significant positive correlation（r ２ ＝ 0.916）
caused by Mycoplasma infection indicate high endotoxin activity in the BALF and plasma.
Therefore, it is suggested that endotoxin in respiratory tract may be shifted into blood stream
via affected trachea and bronchi.

１．目の炎症性呼吸器疾患症候群に類似したエンドトキ

的シン由来の全身性炎症反応を伴うが，エンドトキ

重度の牛の複合性呼吸器疾患（BRDC）はヒトシンの関与は不明である。本研究ではLimulus© The Ito Foundation

血清中アミロイドＡおよびエンドトキシン活性値を指標とした牛複合性呼吸器疾患の早期予後診断システムの構築

249

Amebocyte Lysate（LAL）カイネティック法を評価した。二群間の平均値の差はStudentʼs-tまた用いてMycoplasma感染の認められたBRDC子牛はMann Whitney U検定，エンドトキシン活性値の肺胞洗浄液（BALF）および血漿中エンドトキ

によるBRDCの診断能はROC解析，BALFと血漿シン動態を評価した。また，健常および実験的炎中エンドトキシン活性値の相関性はSpearmanʼs

症性疾患子牛の血漿サンプルを用いてKinetic-rank testにより評価した。

Limulus amebocyte lysate assayを標準法とした

2.2

携帯型エンドトキシン活性値測定機（Endosafe-

健常な６頭の子牛にO111:B4-LPSを2.5μg/㎏

TM

PTS , Charles River社）の精度および正確度を静脈内投与して炎症病態を作出し，LPS投与後評価した。

0.5，1.0，12および24時間後の血液を採取した。

２．方
2.1

試験２

これらの血漿は20倍希釈した後80度で10分間加熱法

して測定に供した。エンドトキシン活性値の測定は標準法であるKTAおよびKCA法と，被験測定

試験１

本学で飼養管理している呼吸器疾患を罹患して法である携帯型エンドトキシン活性値測定器

いない健常な黒毛和種－ホルスタイン種交雑種（Endosafe PTSTM）を用いて行った。KCAおよび（Ｆ１）およびホルスタイン種子牛（対照群，ｎKTA法と被験測定法との相同性および相関性を＝17），ならびに呼吸器疾患の診断または治療のそれぞれFriedman検定およびPersonʼs product-

ため本学動物病院に入院，外来または往診した子

moment correlation coefficient を 用 い て 評 価 し牛（BRDC群，ｎ＝17）の肺胞洗浄液（BALF）

た。同様に精度および正確度は米国食品医薬局

および血漿を用いた。携帯型モバイルスコープ（FDA）および日本薬局方の推奨基準に基づいて（エ ア ウ ェ イ マ ネ ジ メ ン ト モ バ イ ル ス コ ー プ

評価した。

MAF-TM，オリンパス）を用いて常法によりBALFを採取し，その一部を16S rRNA遺伝子解３．結果と考察析に基づくPCR法によるMycoplasma bovisの検出3.1を行った。血漿は経静脈から採血した後，ヘパリ

エンドトキシン活性値は肺胞洗浄液および血漿

ン添加真空採血管で保存した後，30分以内に遠心の前処理方法の確立ならびに希釈倍率の設定を分離して得られた上清を用いた。エンドトキシン

行ったところ，BALFはエンドトキシン・フリー

活性値はBALFおよび血漿の前処理条件の確立な水で200倍希釈したものをそのまま測定に供し，ら び に 希 釈 倍 率 の 設 定 を 行 っ た 後 ，Kinetic

血漿は20倍希釈した後に80度10分加温した後に測limulus amebocyte lysate assay（Kinetic-LAL）

定に供した。Table１にエンドトキシン活性値の法 の う ち ， BALF を 発 色 合 成 基 質 法 （KCA:

測定法に対する正確度と精度を評価した。BALF

Kinetic chromogenic assay），血漿を比濁時間分

はKCA（ｎ＝34），血漿はKTA（ｎ＝50）によ析 法（KTA: Kinetic Thrbidimetric assay）を 用り測定したため，それぞれの正確度と精度を評価

いて測定した。

したところ，BALFおよび血漿中エンドトキシン

試験１

測定法および求められたエンドトキシン活性値

活 性 値 の 測 定 は FDA の 規 定 す る 添 加 回 収 率の測定精度および正確度は米国食品医薬局（spike recovery）， 変 動 係 数 （coefficient of（FDA）および日本薬局方の推奨基準に基づいて

variation）を満たしていた。従って，BALFと血© The Ito Foundation

250

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 1 Accuracy and precision for kinetic chromogenic（KCA）and thrbidimetric（KTA）in this study
Kinetic Chromogenic（KCA）n＝34
BALF
Spike Recovery

Ideal＊

Actual

50％―200％

93.3％（range 67.8％―153.9％）＜25％

0.71％（range０％―1.97％）

Coefficient of Variation
Lower Limited（100 diluted）

0.300EU/mL

Kinetic Thrbidimetric（KTA）n＝50
PLASMA
Spike Recovery

Ideal＊

Actual

50％―200％

119.3％（62.9％―198.1％）＜25％

0.47％（０％―9.6％）

0.060EU/mL

28/50

Coefficient of Variation
Lower Limited（20 diluted）＊：Range of Japanese Pharmacopoeia and FDAʼs recommended

漿のエンドトキシン活性値測定において，KCA

断能は有意であり，それぞれのカットオフ値はおよびKTAは有用な方法であると思われた。

6.05および0.078EU/mL以上で陽性と判定できた。

Mycoplasma bovisが検出された対照群およびまた，Speamanʼs rank testの結果から，BALFとBRDC群の子牛はそれぞれ0/17頭（０％）および血漿中エンドトキシン活性値は有意な正の相関を

17/17頭（100％）であった。Fig.１およびFig.２

示し（Fig.３，r２ ＝0.916），その直線回帰式も満に，BRDC子牛におけるBALFおよび血漿中エン

足のいく結果が得られた。これらの結果から，

ドトキシン活性値を示した。BRDC群のBALFおMycoplasma感染したBRDC重症例では，気道内

よび血漿中エンドトキシン活性値の中心値はでエンドトキシンが著増しており，その一部が血105.8および0.334EU/mLであり，対照群の2.34お漿中へ移行していることが示唆された。従って，

よび0.060EU/mLよりもそれぞれ有意に高値を示

BALF中エンドトキシン活性値が高いと血中移行し た（ｐ ＜ 0.001）。BALF（Se ＝ 81.3 ％，Sp ＝が多く，また血中移行したエンドトキシンによっ

84.6％）および血漿（Se＝92.9％，Sp＝100％）て全身徴候が増悪すると思われる。

800

105.8

600
400
200
0

2.43
Control
BRDC
p<0.001（Mann Whitney U-test）

Fig. 1 Endotoxin activity in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）in calves with BRDC

Endotoxin activity in PLASMA（EU/mL）

Endotoxin activity in BALF
（EU/mL）

においてエンドトキシン活性値によるBRDCの診

0.334

1.5

★

1.0
0.5
0

0.060
Control
BRDC
p<0.001（Mann Whitney U-test）

Fig. 2 Endotoxin activity in plasma in calves with BRDC

© The Ito Foundation

3.2

試験２

携帯型エンドトキシン活性値測定機器の臨床応用の可能性を模索するために，エンドトキシン
チャレンジにより炎症状態を作出した子牛から得られた血漿サンプルを20倍希釈した後，80度10分
間加温してエンドトキシン活性値を標準法である
KTAおよびKCAと携帯型エンドトキシン活性値
測定器（PTSTM）による測定結果を比較した。
KTA（r ＝0.963，ｐ＜0.001）またはKCA（r ＝２２

0.982，ｐ＜0.001）による測定値とPTSTM による

Endotoxin activity in PLASMA（EU/mL）

血清中アミロイドＡおよびエンドトキシン活性値を指標とした牛複合性呼吸器疾患の早期予後診断システムの構築

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

251

y = 0.0019x + 0.0951
R2 = 0.91639

0

200

400

600

800

Endotoxin activity in BALF
（EU/mL）

Fig. 3 Relationship between endotoxin activity in BALF

and plasma obtained from calves with BRDC

測定値を比較した結果，PTSTMの性能は標準法であるLALベースのアッセイ法と有意に異ならな

3.0

PTSTMは，牛の血漿中のエンドトキシン活性値を2.5評価するために，簡便かつ簡略化したシステムとして適用することが可能であることが示唆された。
４．要

約

KTA
（EU/mL）

か っ た（Fig. ４）。こ れ ら の 知 見 に 基 づ い て ，

2.0
1.5
1.0
KTA=1.054［PTS］- 0.005
r2=0.963
p<0.001

0.5

【目的】

0.0

重度の牛の複合性呼吸器疾患（BRDC）はヒト

0.0の炎症性呼吸器疾患症候群に類似したエンドトキ

用いてMycoplasma感染の認められたBRDC子牛の肺胞洗浄液（BALF）および血漿中エンドトキ
シン動態を評価した。

1.5
1.0
KCA=1.336［PTS］- 0.193
r2=0.982
p<0.001

0.5

0.0

Mycoplasma陰性の健常なホルスタイン子牛17頭を対照群とした。また，呼吸器症状を主訴に来院した呼吸器疾患子牛17頭をBRDC群とした。
BRDC群の子牛はすべてMycoplasma bovis陽性であった。BALFは200倍希釈して発色合成基質法，血漿は20倍希釈した後80℃，10分間加温処理
して比濁時間分析法によりエンドトキシン活性値

3.0

2.0

0.0

【材料と方法】

2.5

2.5
KCA
（EU/mL）

Amebocyte Lysate（LAL）カイネティック法を

1.0 1.5 2.0
PTS（EU/mL）

3.0

シン由来の全身性炎症反応を伴うが，エンドトキシンの関与は不明である。本研究ではLimulus

0.5

0.5

1.0 1.5 2.0
PTS（EU/mL）

2.5

3.0

Fig. 4 Correlation of endotoxin activity in serum

between the traditional kinetic limulus amebocyte
lysate（LAL）analysis and portable test system（PTSTM）．
 The endotoxin activities detected in serum
samples PTSTM positively corrected with those using
the kinetic turbidimetric（KTA: upper）and kinetic
chromogenic（KCA: bottom）assays by Pearsonʼsproduct-moment correlation coefficient.

を測定した。二群間の平均値の差はStudentʼs-tま© The Ito Foundation

252

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

たはMann Whitney U検定，エンドトキシン活性れの閾値は6.05および0.078EU/mL以上であった。

値によるBRDCの診断能はROC解析，BALFと血また，BALFと血漿中エンドトキシン活性値は有漿中エンドトキシン活性値の相関性はSpearmanʼs

意な正の相関を示した（r２＝0.916）。

rank testにより評価した。

【考察】

【結果】

Mycoplasma感染したBRDC重症例では，気道

BRDC群のBALFおよび血漿中エンドトキシン

内でエンドトキシンが著増しており，その一部が活性値の中心値は105.8および0.334EU/mLであ血漿中へ移行していることが示唆された。従っり，対照群よりも有意に高値を示した。BALF（Seて，BALF中エンドトキシン活性値が高いと血中＝ 81.3 ％， Sp ＝ 84.6 ％ ） お よ び 血 漿 （Se ＝移行が多く，また血中移行したエンドトキシンに

92.9％，Sp＝100％）においてエンドトキシン活よって全身徴候が増悪すると思われる。

性値によるBRDCの診断能は有意であり，それぞ© The Ito Foundation

253

豚流行性下痢ウイルスのウイルス受容体の検索
Studies on the cellular receptor for porcine epidemic diarrhea virus

白

戸

憲

也・松

山

州

徳・田

口

文

広＊

（国立感染症研究所ウイルス第３部第４室，＊日本獣医生命科学大学獣医学部獣医学科）

Kazuya Shirato, Shutoku Matsuyama and Fumihiro Taguchi＊（Laboratory of Acute Respiratory Viral Diseases and Cytokines, Department of Virology III, National Institute of Infectious
Diseases, ＊Department of Veterinary Science, Faculty of Veterinary Medicine, Nippon Veterinary and Life Science University）

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）, a causative agent of pig diarrhea, has recently
wrought great economic damage worldwide. PEDV infects only pigs, thus not other species,
and this may reflect the fact that only pigs have the viral receptor. One of the principal factors
determining viral species specificity is the cellular receptor with which the virus initiallyinteracts. Other coronaviral porcine diarrhea disease, transmissible gastroenteritis virus（TGEV）, utilizes the porcine aminopeptidase N（pAPN）as the cellular receptor. For TGEV,
vaccines for both piglets and sows were developed and the infection is well-controlled by
vaccination. In contrast, only a vaccine for sow was developed for PEDV, and the cellular
receptor for PEDV remains controversial. Similar to TGEV, pAPN also has been reported to be
the receptor for PEDV, although robust evidence is lacking. In the present study, we exploredwhether or not pAPN functions as a receptor for PEDV. HeLa cells expressing pAPN andpAPN-positive CPK cells failed to support PEDV infection, but both cell types were susceptible
to infection with transmissible gastroenteritis virus（TGEV）, which utilizes pAPN as afunctional receptor. In contrast, Vero cells were susceptible to PEDV infection regardless of theexpression status of pAPN. These results strongly suggested that pAPN failed to function as a
PEDV receptor. The soluble form of pAPN（pAPs）has been reported to enhance infection by
PEDV, but we could not confirm this in our present study. Furthermore, we showed that
PEDV failed to bind pAPN attached to hydrophobic magnetic beads, whereas TGEV did bind
to pAPN, showing that TGEV but not PEDV interacts with pAPN. These results collectively
suggest that pAPN is not a functional receptor for PEDV and does not interact with PEDV.
Further work on identification of receptor molecule（s）for PEDV is required.

１．目

るPEDウイルス（PEDV）によって引き起こされ的る豚の疾病で，下痢症を主徴とし，嘔吐，発熱，

豚流行性下痢（PED）はコロナウイルスであ水様性下痢等の症状を引き起こす。哺乳豚では極© The Ito Foundation

254

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

めて重症化しやすく，ほぼ100％の致死率を示す。

である。ウイルス受容体とウイルス構造タンパク

一方，成豚では死亡することはないが，食欲不振，

質の結合の解析を行うことができれば，ウイルス

体重減少等の症状が見られ，母豚が食欲不振で授感染阻止のための詳細な基礎データを得ることが乳停止し，子豚が衰弱死するケースも見られる。

できるし，抗ウイルス薬の開発も可能となる。

哺乳豚での致死率が極めて高いため，発生した場

従ってPEDVのウイルス受容体の特定を行うこと

合の経済的損失は極めて大きく家畜伝染病予防法

は基礎研究の推進のためにも非常に重要である。

に基づく届出伝染病に指定されている。

しかし近年，PEDVのウイルス受容体はTGEウイPEDは，国内では1980年代より散発的に発生

ルス（TGEV）と同様にブタのアミノペプチダーが見られ，1990年代に大規模な流行が見られた。

ゼＮ（pAPN）である，という報告がなされていその際に乳汁免疫を目的とする母豚用のワクチン

る１，２）。しかしこれらの論文にはpAPN発現細胞が開発され，一旦流行の終息を得た。その後ワクにおいてPEDVが多段階複製するという明らかな

チン未接種ケースなどで散発的発生が見られる程証拠がなく，pAPNがウイルス受容体であるか否度であった。しかし2000年代半ばより中国を中心かは議論の余地が残っている。そこで本研究ではとしたアジアで大流行が見られ，2013年にはアメPEDVにウイルス受容体の検索に先立って，報告

リカ大陸で初めて発生が見られ，現在も流行が拡されているpAPNが本当にPEDVのウイルス受容大中である。そしてついに日本国内でも沖縄，茨体であるか否かの再検討を行うことを目的とした。

城で発生したのをはじめ，青森，関東，中部，九州全域での大流行が発生し，既に数万頭の子豚が死亡している。

２．方

法

2.1

胞

細

PEDは子豚にとっては毒性が高く，家畜衛生

Vero 細 胞（CCL-81）は the American Tissue

的にも問題ではあったのだが，同じコロナウイル

Culture Collection （ATCC） よ り 入 手 し た 。

スによって引き起こされる豚伝染性胃腸炎

HeLa229（CCL-2.1）をHeLa細胞として用いた。

（TGE）に比べて致死率が低いと言われ，その点

pAPNを恒常的に発現するHeLa-pAPN細胞は，がPEDにとって不幸であったと言える。TGEはpAPNを発現するpCAGGSプラスミドとＧ418耐

母豚用と子豚用の両方のワクチンが開発され，効性遺伝子を持つpTargeTプラスミドをコトラン

果的な予防が行われている。また基礎研究も進

スフェクトすることで得た。豚由来細胞である

み，アミノペプチダーゼＮ（APN）がウイルス

CPK細胞を用いた。すべての細胞は５％ウシ胎受容体分子であることも明らかになり，その脅威

児血清を含むダルベッコ変法最小必須培地は激減している。一方でPEDは，母豚用ワクチ（DMEM, Sigma） で 培 養 し ， 継 代 に は Cell

ンはあるものの，未だにウイルス受容体すら不明

Dissociation Solution（Sigma）ま た は ト リ プ シ

であり，そのウイルス複製機構もいまひとつよくン（三光純薬）を用いた。

分かっていない。このような認識の甘さが，ワク

2.2

チン在庫の不足などの事態を招き，今回のような

PEDV MK株は日本生物科学研究所から分与さ大規模な再流行を招いているとも考えられる。

れた。PEDVは通常Vero細胞を用い，トリプシン

ウイルス

ウイルス受容体を明らかにすることは，ウイルを添加して培養するが，本実験ではPEDVをトリスの感染・複製機構を理解するうえで極めて重要

プシンフリーの状態でVero細胞に感染させ，３© The Ito Foundation

豚流行性下痢ウイルスのウイルス受容体の検索

255

日の培養の後，細胞ごと回収し，超音波破砕してウイルスが細胞に感染するためには，ウイルス

ウイルスストックとして用いた。ウイルス力価の膜タンパク質とウイルス受容体の結合が重要であ

測定は過去の報告どおりに行った３）。TGEV To-

る。そこでpAPNとPEDVが結合するか否かの検163株は動物衛生研究所から分与され，CPK細胞討を行った。材料と方法で示したように疎水性磁を用いて複製，力価測定を行った。

気ビーズにpAPNを結合させ（Fig.2a），PEDV，

2.3

TGEVと混合した後，磁石によりpAPN結合ビー

pAPN結合アッセイ

疎水性磁気ビーズ（Dynabeads M-270 Epoxy）

ズを精製し，ビーズ表面に結合しているウイルス

を豚マイクロソーム由来APNであるLAP（Sigma-

量 を リ ア ル タ イ ム PCR で 測 定 し た（Fig.2b）。

Aldrich）と１Ｍアンモニウム存在下で混合し，pAPN を 受 容 体 と し て 使 用 し て い る TGEV は37℃で一晩放置し，ビーズに結合させる。pAPN

pAPN存在下でウイルス吸着量が10倍上昇する

結合ビーズをイムノブロック（DSファーマ）でが，PEDVはpAPNの有無でウイルス吸着量の変ブロッキングした後，ウイルス液を混合し，37℃化が見られなかった。以上からPEDVはpAPNとで２-３時間培養し，ビーズに結合したウイルス

結合していないことが示唆された。

RNAを既報の方法であるウイルス特異的リアル
タイムPCRによって検出した３）。

また，Ohらの報告 １）では可溶性フォームのpAPN（sopAPN）を培養液に添加することで，トリプシンと同様にPEDV複製を促進するという３．結果と考察ことが報告されている。そこで本研究でもsopAPNにあるとおり，pAPNが本当にがPEDV複製に関与しているか否かの検討を行っ

PEDVのウイルス受容体としての機能があるか否た。Vero細胞にPEDVを感染後，pAPNを濃度をかを検討するため，PEDV非感受性のHeLa細胞

振って培地に添加し，３日または６日培養した後にpAPNを恒常的に発現させ（HeLa-pAPN），実にウイルス力価を測定した（Fig.３）。Ohらの論際にウイルス複製するか否かの検討を行った

文では0.024～2.4pg/mlのsopAPNの添加でトリプ（Fig.１）。まず各細胞におけるpAPN発現を調べ

シンと同様のウイルス複製を示すと述べている

たが，想定どおりHeLa-pAPNはヒトと豚両方のが，本実験の結果では14.8～1850ng/mlの濃度でAPNを発現しており（Fig.1a），その発現量は豚添加しても，トリプシンのようなウイルス複製促

腎 由 来 細 胞 の CPK の 170 倍 ほ ど で あ っ た

進効果は見られなかった。またpAPNをウイルス（Fig.1b）。ウイルスを細胞に感染させ，細胞およ受容体として使用するTGEVでもウイルス複製へび培養上清中のウイルス力価を調べたところ，の影響は見られなかった。従って，sopAPNは

pAPNを受容体として利用するTGEVはpAPNをPEDVウイルス複製の促進効果もないということ

発現するCPKおよびHeLa-pAPNのみで明らかなが示された。

海外の報告

１，
２）

複製を示した。一方，PEDVはVero細胞では複製を示したものの，pAPN発現細胞ではトリプシン

４．要

約

添加状況でさえ複製を示さなかった（Fig.1c）。

ウイルス受容体を明らかにすることは，ウイル

従ってpAPNの発現は非感受性細胞であるHeLa

スの感染・複製機構を理解するうえで極めて重要細胞にPEDVウイルス感受性をもたらさないことである。海外の報告により，PEDVのウイルス受が示された。

容体はTGEVと同様にpAPNである，という報告© The Ito Foundation

256

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

βactinhGAPDHhAPN
pAPN

Log TCID50/100μl

Log TCID50/100μl

1050Log PFU/100μl210HeLa(G418 control)

5HeLa-pAPN

4

Vero

3

Vero+trypsin

2

CPK

1
0

10
20
30
40
Hours post-infection

50

10
20
30
40
Hours post-infection

50

PEDV（Supernatant）

HeLa
HeLa+trypsin

3

HeLa(G418 control)
HeLaG418+trypsin

2

HeLa-pAPN
HeLa-pAPN+trypsin

1
0

0

0

4

3

HeLa

6

-1

PEDV（Cell）

4
Log PFU/100μl

10
20
30
40
Hours post-infection

Vero

2

CPK

3

ND
HeLa-pAPN

4

HeLa-G418_cont

50

TGEV（Supernatant）

7

6

-1

200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0 ND NDHeLa

TGEV（Cell）

7

Vero

CPK

HeLa-pAPN

HeLa(G418 control)

HeLa

c）

Relative expression

b）

a）

Vero
0

10
20
30
40
Hours post-infection

50

Vero+trypsin
CPK

Fig. 1 PEDV replication in HeLa－pAPN cells. a）Total RNAs were extracted from HeLa,

HeLa－G418, HeLa－pAPN, Vero, and CPK cells, and expression of pAPN mRNA wasconfirmed via PCR assay after first－stand cDNA synthesis. β－actin served as a positive
control for all cells and hGAPDH as a human cell control. hAPN－ and pAPN－encoding
mRNAs were amplified from the same samples. b）pAPN expression levels werecompared via real－time PCR usind the samples of Figure 1a. 18s rRNA served as aninternal control. The data were normalized and calculated using a comparative method,
and are expressed relative to the values of CPK cells （n＝4）. c） Cells were inoculatedwith trypsin－free PEDV or TGEV at an m.o.i. of 0.01 and incudated in 10 %TPB－DMEM
or 10 %TPB － DMEM with 1.25 μg/mL of trypsin at 37 ℃ . Cells and supernatants wereseparately collected at the indicated time points post－infection （0, 6, 18, 24, and 48h）,and viral titers determined. Titers are axpressed as PFU/100μL for PEDV and
TCID50/100μL for TGEV.（n＝5）

がなされていた１，２）。しかしこれらの報告はデー究ではpAPNがPEDVのウイルス受容体であるとタが懐疑的であり，pAPNがPEDVのウイルス受いうことを支持する積極的なデータはなく，容体であるか否かは議論の的となっていた。本研

pAPNはPEDVのウイルス受容体であることは考© The Ito Foundation

257

豚流行性下痢ウイルスのウイルス受容体の検索

a）

b）
- +
+ +

+
Log copies/1μl of RNA

260
160
110
80
60
kDa

PEDV

5.5
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

Log copies/1μl of RNA

APs
Beads

TGEV

p< 0.005

Inoculum

Control

APs

Inoculum

Control

APs

5.5
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

Fig. 2 APN－binding assays.

a） APs were bound to hydrophobic magnetic beads（Dynabeads M－270 Epoxy） and the beads were washed and blocked using
Immunoblock（DS Pharma Biomedical）. Binding of APs to beads was confirmed byWestern blotting. APs were detected using serum from rabbits immunized with
LAP ; authentic LAP（3.7ng） was used as a positive control. b）About 2.5×106
copies of PEDV or TGEV（in 100μL）, and the same amount of Immunoblock wasadded to beads and incubated at 37℃ for ２－３h. Next, the beads were washed fourtimes with PBS and the amounts of viral genomic RNA recovered from virions
were determined via real－time PCR, The data represent the averages of three
independent experiment.

3
2
1
0

8

PEDV
log PFU/welllog PFU/well

4

Sup.

Cell
3d

Sup.

Cell

TGEV

6
4
2
0

6d

Sup.

Cell
3d

0 14.8 74 370 1850 Trypsin+
Aminopeitidase (ng/ml)

0 14.8 74 370 1850
Aminopeitidase (ng/ml)

Fig. 3 Effects of soluble pAPs on PEDV and TGEV infection. PEDV or TGEV was

inoculated onto Vero or CPK cells at an MOI of 0.1. After virus adsorption, cells wereincubated in 10% TPB－DMEM containing the indicated concentration of pAPs（0, 14.8,
74, 370, and 1850 ng/mL）.After 3 or 6 days of incubation, cells and supernatants werecollected separately, and virus titers were determined（n＝6）．

えにくい結果となった。従って，他にPEDVの真のウイルス受容体分子が存在すると考えられ，これを明らかにすることはPEDV感染制御のための重要な知見となると考えられる。

文献１） Oh, J. S., Song, D. S., Park, B. K., J Vet Sci.，４，
269～275，2003．
２） Li, B. X., Ge, J. W., Li, Y. J., Virology.，365，166～
172，2007．
３） Shirato, K., Matsuyama, S., Ujike, M., Taguchi, F.,
J Virol.，85，7872～7880，2011．

© The Ito Foundation

258

牛精子における暑熱ストレス耐性に関与する要因解析
Analysis of factors related to heat stress tolerance in bovine spermatozoa

山

中

賢

一

（佐賀大学農学部）

Ken-ichi Yamanaka（Faculty of Agriculture, Saga University）

The objective of this study was to investigate the difference in heat stress tolerance of
spermatozoa among Japanese Black bulls. In vitro fertilization was performed by using semen
obtained from four bulls（A, B, C and D）. Heat stress（40.0 ℃）during in vitro fertilization did
not affect the pronuclear formation rate of embryos regardless of bulls. The developmental rate
to blastocyst stage was significantly decreased in embryos from bull A, B and C by heat stressduring in vitro fertilization, but not in bull C. Next, acrosome integrity of spermatozoa frombull A（with low heat stress tolerance）and D（with high heat stress tolerance）was observed
after thawing. There was no difference in the rate of spermatozoa with intact acrosome. In
addition, we examined effect of heat stress on mitochondrial activity of spermatozoa from bull
A and C at 6hr after thawing. Although the rate of spermatozoa with active mitochondria at
6hr after thawing significantly decreased in both control and heat stress groups, there was nodifference between bull A and C groups. In conclusion, the present results implicated that heatstress tolerance of spermatozoa would differ among Japanese Black bulls.

１．目

ロッパを原産とする西洋種の牛（Bos taurus）か的ら得られた精子および卵子をそれぞれ用いて体外

近年の地球温暖化等の気候変動による家畜への受精を行い，生産された胚の暑熱ストレス下でのストレスが畜産物の生産性へ及ぼす影響が危惧さ

発生能を比較した結果，ゼブー牛は西洋種のウシれている。繁殖能力に関していえば，夏季の受胎と比較して暑熱ストレスに対する耐性が高いとい率の低下が大きな問題となっており，その対策法

うことが報告されている１）。この結果は，ウシ生の開発は喫緊の課題といえる。夏季の低受胎率は殖細胞の暑熱ストレスに対する耐性が品種間で異卵子の品質低下，受精不成立，発生初期の胚死滅なることを示しており，夏季の受胎率の向上のたによる胚損耗などがその要因であることが知られめにはこれら暑熱ストレス耐性の高い品種の導入ている。このような背景のもと，近年，南アジア

が有効であるということを示唆している。

を 原 産 と す る ゼ ブ ー 牛（Bos indicus）と ヨ ー

しかしながら，牛肉の大部分を黒毛和種の精液© The Ito Foundation

牛精子における暑熱ストレス耐性に関与する要因解析

259

を人工授精することにより生産している我が国に胞質が均一かつ３層以上の卵丘細胞が付着していおいてはこれらの研究結果を直接応用することはる COCs を TCM199 （Gibco） に ５ ％ FBS困難であると考えられ，我が国の牛肉生産体系に（Corning），FSH（0.02 AU/ml；デンカ製薬）お適合した暑熱ストレス対策を講じることが要求さよびゲンタマイシン（10μg/ml ; Sigma-Aldrich）

れる。すなわち，黒毛和種内の候補牛の中から暑を加えた培地中で38.5℃，５％CO２，加湿条件下

熱ストレス耐性の高い精子を持つ個体を選別する

で22時間，体外成熟培養を行った。体外成熟後，ことが必要となる。これまで，我々は暑熱ストレ

卵丘卵母細胞複合体はIVF100（機能性ペプチド

スの胚発生能に及ぼす影響について研究してきた研究所）で３回洗浄後，50μｌのIVF100ドロッ

過程で黒毛和種内でも異なる種雄牛に由来する精プ内に移し，媒精まで38.5℃，５％CO２，加湿条子間で生産された受精胚の暑熱ストレス耐性が異件下で静置した。一方，精液は４頭の異なる黒毛なるという結果を得ている。具体的には，体外受和種雄牛から採取した人工授精用凍結精液を用い精または体外発生培養時に暑熱ストレス処理した

た。液体窒素内で凍結保存されている精液スト

場合，使用した精子の由来によって受精胚の発生

ローを取り出し，35～37℃の温水内で融解した。

率が著しく低下するもの，一方では，ほとんど発融解後，90％Percoll（GE Healthcare）が入った

生率が低下しないものというような現象が観察さ

遠心チューブに精液を滴下し，室温，800×ｇのれた。通常の培養温度で体外受精を行った場合は条件で10分間遠心を行った。遠心後，上清を捨て，精子間でこのような差が見られないことから，こ５mlのIVF100を加えて懸濁し，室温，600×ｇのの結果は同品種内でも精子の暑熱ストレス耐性に

条件で５分間遠心を行った。再度上清を捨て，精個体間で違い生じるということを示唆している。

子濃度が1.0×10７ 匹／mlになるようにIVF100でしたがって，そのような個体間での違いがどのよ調製した。調整した精子懸濁液50μlをCOCsがうな要因によって引き起こされているのかについ入っているドロップに加え，対照区では38.5℃，て明らかにすることで，暑熱ストレス耐性の高い

暑熱ストレス区では40.0℃の温度条件で，それぞ精子を持つ種雄牛の選別が可能になるかもしれな

れ５％CO２，加湿条件下で６時間媒精を行った。

い。しかしながら，これまで黒毛和種において種

媒精後，５％FBS添加TCM199に移し，ピペッ

雄牛精液間の暑熱ストレス耐性の違いについて詳

ティングにより卵丘細胞および精子を完全に取り細に検証を行った報告は少ない。

除き，SOF-BE１培地２）で洗浄し，50μlの同培

そこで，本研究では，異なる黒毛和種種雄牛か

地 ド ロ ッ プ に 15-25 個 ず つ 移 し ，38.5 ま た はら採取した精子間での暑熱ストレス耐性の違いを40.0℃，５％CO２，
５％O２ 加湿条件下で体外発生

引き起こしている要因を探索することを目的とす培養を行った。培養後，２日で分割率，８日で胚る。

盤胞形成率を評価した。

２．方
2.1

2.2

法

前核形成の観察

受精後の核相の観察はホールマウント法によりウシ体外受精胚の作製行った。媒精開始後10時間の受精胚をPBS（－）と場由来卵巣より，吸引採取法により直径約２で１回洗浄後，スライドガラスに載せ，ワセリン～６mm程度の卵胞から卵胞液ごと卵丘卵母細胞スポットを付けたカバーガラスをかぶせた。カル複合体（COCs）を採取し，実体顕微鏡下で卵細ノア液（酢酸：エタノール＝３：１）で固定し，© The Ito Foundation

260

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

１％オルセイン液で染色した。洗浄後，位相差顕2.5

精子ミトコンドリア活性の検出

微鏡下で核の形態を観察し前核形成率を算出した。

精子のミトコンドリア活性の検出はYamauchi

2 . 3 胚盤胞期胚のアポトーシス陽性細胞の検出

らの方法４）に修正を加えて行った。上述した体外

胚盤胞期胚のアポトーシス陽性細胞はTUNEL

受精と同様方法により精子濃度を1.0×10７匹／ml

法 を 利 用 し た In Situ Cell Death Detection Kitに 調 整 し ，500nM MitoTracker Ⓡ Red CMXRos（Roche Applied Science）を用いて検出した。胚（Molecular Probes） お よ び 25 μg/ml Hoechst

盤胞期胚を４％パラホルムアルデヒド溶液

33342（Sigma-Aldrich）を添加した反応液中で（pH7.4）中で20分間固定を行った。固定後，0.1％

38.5℃で20分間，インキュベーター内にて染色を

PVP-PBS 中 に 移 し ３ 回 洗 浄 後 ， 0.5 ％ Triton

行った。染色後，１mlのPBSを加え，600ｇで５X-100（ナカライテスク）添加PBSで20分間，透分間遠心し，上清を除去し，PBSで再懸濁し，ス

過処理を行った。0.1％PVP-PBS中で10分間，２

ライドガラスにスポットし，カバーガラスをかけ

回洗浄を行った。洗浄後，製造元の方法に従い調て蛍光顕微鏡で観察を行い，中片部に強い赤色蛍

整したTUNEL反応液に胚を移し37℃，60分間，光が見られる精子をミトコンドリア活性陽性としインキュべートした。反応後，0.1％PVP-PBS中て評価した。各実験区ともに100匹以上の精子にで５分間，３回洗浄を行った。VECTASHILD

おいて観察を行った。

Mounting Medium with DAPI （Vector

2.6Laboratories）でスライドグラスにマウントし，各実験ともに３回以上の反復によりデータを得

カバーガラスをかけ，蛍光顕微鏡により観察を行た。前核形成および体外発生成績についてはchi-い，各胚盤胞期胚における総細胞数およびアポ

square test，胚盤胞期胚における総細胞数，ア

トーシス陽性細胞数を測定した。総細胞数に対す

ポトーシス陽性細胞率，先体膜の正常性およびミる ア ポ ト ー シ ス 陽 性 細 胞 数 の 率 を Apoptosis

ト コ ン ド リ ア 活 性 に つ い て は Tukey-Kramer

indexとして算出した。

multiple comparison testによりそれぞれ有意水

2.4

準５％として検定した。

精子先体の正常性評価

精子先体の評価はTeradaらの方法

統計解析

３）

に修正を

加えて行った。上述した体外受精と同様方法によ３．結果と考察り精子濃度を3.0×10６匹／mlに調整した精子懸濁3 . 1 暑熱ストレス下での異なる黒毛和種雄牛液20μｌをスライドガラスに塗り，風乾させた後，に由来する間での受精能および体外発生能

メタノール（Sigma-Aldrich）で固定する。固定の比較

後，30μg/mlのFITC-PNA（Sigma-Aldrich）で

黒毛和種４頭から採取した凍結精液を用いて体38.5℃，30分間，染色を行った。PBSで洗浄後，外受精を行い，対照区および暑熱ストレス区におVECTASHILD Mounting Medium with DAPI を

け る 前 核 形 成 率（Table １）お よ び 体 外 発 生 率

滴下し，カバーガラスをかけて蛍光顕微鏡で観察（Table２）を調べた。前核形成率に関しては，種を行った。先体帽に強い緑色蛍光が見られるもの

雄牛間で数値にバラつきがあるが，対照区と暑熱をintact，先体帽の一部に緑色蛍光が見られるもストレス区間ではすべての種雄牛において有意なのをpartially damaged，緑色蛍光が見られない

差は見られず，暑熱ストレスによる前核形成率へものをdamagedとして評価した。

の影響は認められず，過去の報告と同様の結果で© The Ito Foundation

牛精子における暑熱ストレス耐性に関与する要因解析
Table 1 Effect of heat stress during in vitro fertilization

on pronuclear formation rate of bovine embryos
fertilized with semen from different JapaneseBlack bulls
Bull

261

牛と同様に胚盤胞期胚の発生率が低下する傾向は見られたが，その低下に有意性は認められなかった。対照区における発生率は種雄牛間で差が見られないにもかかわらず，前核形成率および体外発

HeatstressNo. ofembryosNo.（％）of embryos
formed pronucleus－

76

60（79.0）＋73

57（78.1）

められなかったことから種雄牛Ｃの精液は他の種－

57

46（80.7）

雄牛と比較して暑熱ストレス耐性が高いというこ＋

47

35（74.5）－50

41（82.0）とが示唆された。一方で，暑熱ストレスの影響を＋

37

34（91.9）－71

48（67.6）＋

61

36（59.0）

Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

生率において暑熱ストレス区での有意な低下が認受けた他の種雄牛に関していえば，分割率，胚盤
胞形成率ともに暑熱ストレス区で有意に低下した
種雄牛Ａの精液は暑熱ストレス耐性が低いということが示唆された。加えて，いずれの種雄牛も前Table 2 Effect of heat stress during in vitro fertilization

on in vitro development of bovine embryos
fertilized with semen from different JapaneseBlack bulls
Bull

Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ
a, bValues

核形成率に暑熱のストレスの影響がないことから，体外受精時の暑熱ストレスは前核形成後の胚に悪影響を与えていることが示唆された。
次に，種雄牛ＡおよびＣの精液を用いて得られHeat
stressNo. ofembryosNo.（％）ofcleavedembryosNo.（％）ofblastocysts

た胚の品質を評価するために胚盤胞期胚の総細胞

－

108

ａ
97（89.9）24（22.2）ａ数およびアポトーシス陽性細胞の検出を行った結＋

115

86（74.8）ｂ9（7.8）ｂ果（Table３），種雄牛間，処理区間いずれにおい－83

72（86.7）

19（22.9）ａ＋71

53（74.6）6（8.4）ｂても差が認められなかった。我々は体外受精時の－74

60（81.1）

17（23.0）＋8159（72.8）

13（16.0）まで発生した胚では品質に差がないという同様の－

94

66（70.2）

23（24.5）ａ

報告をしており７），本研究でも同様の結果が得ら＋

92

69（75.0）12（13.0）ｂ

れたといえる。また，暑熱ストレス耐性が異なる

with different superscripts between experimentalgroups （heat stress （－） vs. （＋）） within the bull are
significantly different（P＜0.05）．

暑熱ストレスによる発生停止を回避し，胚盤胞期ことが示唆された種雄牛ＡおよびＣの精液を以降の実験では用い，それら暑熱ストレス耐性の違いを引き起こす要因について検討を行うこととした。

あった 。体外発生率に関しては，種雄牛Ａ，Ｂ
５）およびＤにおいて暑熱ストレス区で対照区と比較

3 . 2 暑熱ストレス耐性の異なる精子の特徴解析

して胚盤胞期胚への発生率が有意に低下した。さ種雄牛ＡおよびＣの精子の特徴を解析するためらに，種雄牛Ａにおいては分割率にも暑熱ストレに，まず正常な受精過程に必要な精子先体の正常

ス区で有意な低下が観察された。体外受精時の暑性について融解直後の精液を用いて評価を行った

熱ストレスにより胚の発生率が低下することはこ（Table４）。先体の状態を３つに分類して比較をれまでにも報告されており，それらの報告と我々行った結果，各分類ともに種雄牛間で有意な差はの結果は一致するものであった６）。一方で，種雄見られず，70％程度の精子において正常な先体を牛Ｃにおいては暑熱ストレス区において他の種雄有していることが観察された。次に，融解直後，© The Ito Foundation

262

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 3 Effect of heat stress during in vitro fertilization

on total cell number and apoptosis incidence inblastosysts
Bull

Ａ

Ｃ

有意な差が認められたが，種雄牛間では，有意な差は認められなかった。本研究では精子の受精能に関与する要因について主に解析を行ったが，今HeatstressNo. ofblastcysts
examined

No. of cells/
blastocyst（mean±
SEM）

Apoptosis
index（mean
±SEM）

－

20

96.6±8.3

11.2±1.0＋997.9±7.6

11.6±1.5－

12

107.6±13.5

7.4±1.0

和種個体間においても精子の暑熱ストレス耐性に＋

10

101.8±14.5

7.9±1.4

違いがあることを示すとともに，これらの違いをThe data are means±standard errors.

回の結果からは種雄牛間での精子の暑熱ストレス耐性に影響を及ぼす要因について特定することはできなかった。しかしながら，今回の結果は黒毛生じさせる要因が受精後の初期胚発生過程にある可能性を強く示唆している。暑熱ストレスによるTable 4 Acrosome integrity of spermatozoa from two

Japanese Black bulls after thawing

胚の発生率の低下には細胞質内で活性酸素種が関与することが報告されており８），それらの除去に

Bull％ of spermwith intact
acrosome％ of spermwith partiallydamagedacrosome％ of spermwith damaged
acrosome

関与する遺伝子発現が精子間で異なり，暑熱スト

Ａ

71.8±0.4

16.0±0.2

12.2±0.2Ｃ

72.7±2.5

15.6±2.3

11.6±0.3

想される。したがって，今後はこれら精子により

The data are means±standard errors.

レス下での発生能に影響を及ぼしていることも予生産された胚の初期発生過程に着目するとともに，網羅的遺伝子解析などの分子生物学的なアプ

Table 5 Effect of heat stress on mitochondrial activity ofspermatozoa from two Japanese Black bulls at 6hr
after thawing

ローチを行う必要があると考えられる。
４．要

約

本研究では，異なる黒毛和種種雄牛から採取し

Bull

Post-thaw

38.5℃ for
6 hr

40.0℃ for
6 hr

Ａ

71.8±0.4ａ

16.0±0.2ｂ

12.2±0.2ｂ

た精液を用いて暑熱ストレス下での体外受精を行Ｃ72.7±2.5ａ

15.6±2.3ｂ

11.6±0.3ｂ

うことにより，種雄牛間での精子暑熱ストレス耐

The rates of sperm with active mitochondria are shown（means ± standard errors）．
a, bValues

with different superscripts within same row are

significantly different（P＜0.05）．

性の違いおよびそれらに影響する要因について検討することを目的とした。体外受精時に暑熱ストレスを付与した結果，いずれの種雄牛の精子を用いても前核形成率には影響が認められなかった

38.5℃（対照区）または40.0℃（暑熱ストレス区）

が，体外発生率では種雄牛間で暑熱ストレスに対で６時間培養した後の各種雄牛の精子におけるミする影響が異なることが示され，種雄牛間で精子トコンドリア活性の観察を行った（Table５）。その暑熱ストレス耐性が異なることが示唆された。

の結果，各種雄牛とも融解直後の精子では約70％

次に，これらの違いを引き起こす要因について調において強いミトコンドリア活性が観察され，両べるために，各種雄牛の精子の先体の状態やミト者に有意な差は認められなかった。一方で，６時

コンドリア活性について融解後や暑熱ストレス付間培養した後の精子においてはミトコンドリア活

加後に解析を行った。その結果，これらにおいて性を有する精子の割合は大きく低下し，対照区，

種雄牛間および実験区間で差は認められなかっ

暑熱ストレス区ともに融解直後の精子と比較してた。以上の結果から，黒毛和種個体間においても© The Ito Foundation

牛精子における暑熱ストレス耐性に関与する要因解析

精子の暑熱ストレス耐性に違いがあること，さらに，これらの違いを生じさせる要因が受精後の初期胚発生過程にある可能性が示唆された。今後はこれら精子により生産された胚の初期発生過程における網羅的遺伝子解析などの分子生物学的なアプローチを行うことが期待される。
文献１） Silva, C. F., Sartorelli, E. S., Castilho, A. C.,
Satrapa, R. A., Puelker, R. Z., Razza, E. M., Ticianelli,
J. S., Eduardo, H. P., Loureiro, B., Barros, C. M.,
Theriogenology，79，351～357，2013．
２） F i e l d s , S . D . , H a n s e n , P . J . , E a l y , A . D . ,Theriogenology，75，1466～1475，2011.

263

３） A b o a g l a , E . M . , T e r a d a , T . , B i o l o g y o f
Reproduction，69，1245～1250，2003．
４） Yamauchi, S., Nakamura, S., Lay, K. M., Azuma, T.,
Yakabi, T., Muto, N., Nakada, T., Ashizawa, K.,
Tatemoto, H., Journal Reproduction andDevelopment，55，558～565，2009．
５） Hendricks, K. E. M., Martins, L., Hansen, P. J.,
Journal Reproduction and Development，55，69～
74，2009．
６） Sugiyama, S., McGowan, M., Phillips, N., Kafi, M.,
Youngm, M., Reproduction in Domestic Animals，
42，271～274，2007．
７） Sakatani, M., Yamanaka, K., Balboula, A.Z.,
Takenouchi, N., Takahashi, M., Molecular
Reproduction and Development，82，36～47，2015．
８） Sakatani, M., Kobayashi, S., Takahashi, M.,
Molecular Reproduction and Development 67，77～
82，2004．

© The Ito Foundation

264

腸管内細菌による牛腸管外臓器汚染要因の解明
Enterobacterial contamination of extraintestinal organs in cattle

中

馬

猛

久

（鹿児島大学共同獣医学部）

Takehisa Chuma（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

In Japan, the sale and offering of raw beef liver was prohibited in 2012 because food-borne
infection in humans related to the consumption of raw beef liver were reported every year.
Because the source of contamination remains unclear, we investigated bacterial contaminationof the liver, mesenteric lymph node, kidney, and spleen of culled and fed cattle. The livers
without gross lesion of fed cattle were all aseptic（0/7，０％），whereas 7/16（43.8％）livers
without gross lesion from the culled cattle were contaminated. Escherichia coli was the
predominant species. The results of this study support the safety of extraintestinal organs
without gross lesion of fed cattle from bacteriological point of view.

１．目

ことが明らかになった。そこで，牛の生レバーを的安全に食す方法がないため，平成24年７月１日に牛の腸管内からは病原性大腸菌Ｏ157やカンピ

その販売・提供が全面的に禁止となった。しかし。食肉処ながら，牛の腸管外臓器の細菌汚染に係る要因は理場での解体過程では，牛枝肉がこれらの菌に汚わかっていない。近年，微生物，特に細菌を同定

染されるのを防ぐ対策が施されている。しかしなする手法として，質量分析法の一つであるMatrix

がら，牛の生レバーなどの喫食を原因としたこれ

Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of

らの菌による食中毒は後を絶たなかった。平成10Flight Mass Spectrometer（MALDI-TOF MS）

年～23年の間に牛の生レバーを原因とする食中毒が利用されて始めている３）。MALDI-TOF MSとが128件発生しており，患者数は852人と報告されはマトリックスにレーザー光を照射し，試料をイている。このうち22件（患者数79人）が腸管出血オン化させ，電圧をかけて真空管を走行させて，性大腸菌によって起きており，残りのほとんどがその成分の質量の違いから固有なマススペクトル

カンピロバクターによって占められていた。厚生を得る手法である。細菌の同定は，得られる固有

労働省による牛の臓器からの食中毒菌分離調査のマススペクトルとデータベースに登録されていで，牛胆汁や肝臓はこれらの菌に汚染されている

るどの細菌のスペクトルとのパターンが一致してロバクターが検出されることがある

１，２）© The Ito Foundation

腸管内細菌による牛腸管外臓器汚染要因の解明

265

いるかを照合することで行われる。この方法にした。この培養液を１白金耳とり，LB培地に接よって，寒天培地にコロニーが形成されれば１つ種して同条件で６から７時間震盪培養して得られのコロニーから所要時間10分ほどで同定が遂行さた培養液700μｌを12000rpmで５分間遠心し，沈れることから，その迅速性，簡便さ，ランニング

渣を得た。これにProteinase K（20mg/ml）10μ

コストの低さが利点としてあげられる。そこで，

ｌとCSB190μｌを混合した液に溶解し，これに本研究では，MALDI-TOF MSを用いて牛の腸1.5％アガロースゲルを200μｌ加え，モールドに管外臓器の細菌汚染状況を詳細に調査し，廃用牛入れて固まるまで約10分静置した。固まったプラと肥育牛との間で汚染の要因を比較検討した。さグ を Cell Lysis Solution （50mM Tris ， 50mM

らに，肝臓と他臓器から同時に菌が分離された例

EDTA，１％サルコシル，0.1mg/ml Proteinaseについて，その特徴を比較解析することにより菌K）5mlに入れ，24時間56℃で震盪した。

の生体内移行について解析した。

プラグは蒸留水で洗浄し，TE bufferで56℃，
15分間震盪洗浄を行った。これを３回繰り返した

２．材料と方法
2.1

後，プラグを４つに分け，その１片を制限酵素

材料の採取と菌株の分離，同定

XbaⅠで37℃，４時間処理した。処理したプラグ

鹿児島県内の食肉検査所に2012年８月から2013

を１％Pulsed Field Certified Agarose（Bio-Rad）年２月の間に計６回搬入された廃用牛43頭，肥育の 穴 に 入 れ ， 0.5 × TBE を 満 た し た Bio-Rad

牛 36 頭 の 肝 臓 ，脾 臓 ，腎 臓 ，腸 間 膜 リ ン パ 節

CHEF DRⅢを用いてInitial Timeを5.0秒，Final（MLN）を材料とした。食肉検査時に切り出されTime を 50.0 秒 ，gradient を ６ V/cm ，included

たこれらの臓器の表面をアルコール清拭し，加熱

angleを120°に設定し，14℃で24時間電気泳動ししたスパーテルで焼烙後，深部を切り出し無菌的た。１μg/mlのエチジウムブロマイドを加えたに採材し，血液寒天培地に直接スタンプした。そ蒸留水で20分染色し，UV照射でバンドを観察しの後，37℃，24から48時間ローソク培養を行い，た。

肉眼的に形状の異なる発育コロニーをもう一度血XbaⅠ処理で同じPFGEパターンを示した大腸液寒天培地に塗布し，純培養を行った。純培養後菌は上記と同じ条件でBlnⅠ処理による電気泳動の発育したコロニーをMALDI-TOF MSによりが行われた。

同定した。MALDI-TOF MSでスコアが1.7以上

2.3で同定可能であるとし，1.7未満であった株を同大腸菌のＯ群血清型には病原性大腸菌免疫血清

定不能とした。

大腸菌の血清型別「生研」（デンカ生研株式会社）の混合血清を用いカンピロバクターの分離を目的として，検体約てスクリーニングを行い，凝集が認められた場

１ｇをプレストン液体培地にて42℃，48時間微好合，該当した混合血清に含まれるＯ群血清を用い気で増菌培養後，CCDA培地に塗布し，同条件でて凝集の有無を確認した。

培養した。
2.2

2.4

vero毒素産生試験

パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）

逆受身ラテックス凝集反応試験によりvero毒分離された大腸菌をDHL寒天培地に塗布し，素 の 検 出 を 行 っ た 。大 腸 菌 を BHI 寒 天 培 地 で37℃，24時間好気培養した。発育したコロニーを

37℃，24時間培養し，平板の３分の１以上の菌体

２mlのLB培地に接種し，37℃，24時間好気培養を１mlのポリミキシンＢ溶液（5000U/ml）に混© The Ito Foundation

266

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

濁させ，37℃で30分間震盪させた。この間５分ごあり，24属に分けられた。E. coliが16株と最も多とに軽く混和した。培養菌液を6400rpmで10分間かった。
肥育牛では合計６株の細菌が分離され，遠心して得られた上清を毒素原液とした。Ｕ字マ

３株がE. coli，次いでAcinetobacter属が２株であイクロプレートの３列で毒素原液25μｌを２倍階り，残りの１株は同定不能であった。カンピロバ

段希釈し，それぞれの列にVT１およびVT２感作

クターは廃用牛，肥育牛のいずれからも分離されラテックス，対照ラテックス（デンカ生研株式会

なかった。

社）を分注した。プレートミキサーで震盪後，室3.2

温に一晩放置して凝集の有無を確認した。

43頭の廃用牛のうち16頭の肝臓が食肉検査で合３．結

廃用牛と肥育牛の肝臓と細菌汚染格と判定され，肥育牛では36頭のうち７頭の肝臓果が合格となった。合格と判定された廃用牛の肝臓3 . 1 廃用牛と肥育牛の臓器での細菌の分離頭で16頭中７頭（43.8％）から細菌が分離されたのに対して，肥育牛の合格と判定された肝臓からは数および分離率と菌株
廃用牛43頭のうち33頭（76.7％），肥育牛36頭

細菌が分離されなかった。

のうち４頭（11.1％）の臓器から細菌が分離され病変所見が認められた肝臓は廃棄処分された。

た。臓器別では，肝臓，MLN，腎臓，脾臓の細廃用牛では27頭の肝臓が廃棄され，最も多くみら

菌陽性率は廃用牛でそれぞれ39.5％（17/43），

れた病変所見は肝富脈斑（10頭：肝富脈斑のみ７46.5％（20/43），41.8％（18/43），23.3％（10/43）

頭，肝富脈斑＋その他の所見３頭），次いで鋸屑であり，肥育牛ではそれぞれ11.1％（4/36），2.8％

肝（６頭：鋸屑肝のみ４頭，鋸屑肝＋その他の所（1/36），０％（0/36），2.8％（1/36）であった。

見２頭）と続いた。肥育牛では19頭の肝臓が廃棄廃用牛から分離された細菌の種類と株数をされ，肝出血斑（14頭：肝出血斑のみ11頭，肝出Table１に示した。合計136株が分離され，このう

血斑＋その他の所見３頭）が最も多かった。廃棄

ち86株の細菌がMALDI-TOF MSで同定可能で処分となった肝臓は廃用牛，肥育牛のいずれからTable 1 廃用牛から分離された菌の種類と株数
菌

株数

E. coli

16

Bacillus属

12Streptococcus属

9

Corynebacterium属

8

Kocuria属

7

Staphylococcus属

5Enterococcus属

Moraxella属

4Chrysebobacterium属
Acidovorax属
Antrobacter 属
Dermacoccus属

Macrococcus属

3
Stenotorophomonas属

2

Neisseria 属 Pseudomonas 属 Trueperella 属 Agromyces 属 Brevibacterium 属
Viridibacillus属 Aerococcus属 Sphingomonas属 Paenibacillus属 Enterobacter属1

同定不能１）

50

合計

136

１）MALDI-TOF MSでスコアが1.7未満であった株© The Ito Foundation

267

腸管内細菌による牛腸管外臓器汚染要因の解明

も 細 菌 が 分 離 さ れ ，そ の 陽 性 率 は そ れ ぞ れに示した。４頭の廃用牛の肝臓と他臓器から同時

40.7％，21.1％であった。

に E. coli が 分 離 さ れ ，３ 頭（枝 肉 番 号 1467 ，
1479，3055）は肝臓とMLNから，１頭（枝肉番

3 . 3 同一廃用牛の肝臓と他臓器から分離され号3051）は肝臓と腎臓から同時にE. coliが分離さたE. coliの比較分離されたE. coliの株数および血清型をTable

れた（Table３）。枝肉番号3051の肝臓からは２株２に示した。E. coliは廃用牛11頭から計16株分離のE. coliが分離された。これら７株のE. coliのされ，臓器別では肝臓から９株，MLNから５株，XbaⅠ切断によるPFGEパターンは４種（A～D）

腎臓から２株分離され，脾臓では検出されなかっに分けられた（Fig.１）。枝肉番号1467，3051，

た。肥育牛では３頭から３株のE. coliが分離さ3055のそれぞれの肝臓と他臓器から分離された

れ，すべて肝臓由来であった。分離されたE. coli

E. coliのPFGEパターンと血清型は完全に一致しの血清型は６つに分けられた。廃用牛ではＯ63，

た 。枝 肉 番 号 1479 の 肝 臓 ，MLN 由 来 の E. coliＯ121，Ｏ125，Ｏ127ａの４つに分けられ，それL47株とＭ61株のPFGEパターンはバンド１本のぞれ１株，２株，４株，３株であった。６株はみの違いしかみられなかったことから，同一であuntypeableであった。肥育牛ではＯ１，Ｏ119，

ると判断した。また，これらの株はBlnⅠによる

Ｏ125がそれぞれ１株ずつみられた。分離された切断でも同様な結果が得られた。

E. coliはすべてvero毒素陰性であった。

察

４．考同一廃用牛の肝臓と他臓器から分離されたE.

本研究で用いたMALDI-TOF MSは多検体かcoliの血清型，PFGEパターンをTable３とFig.１

Table 2 廃用牛と肥育牛から分離されたE. coliの分離株数と血清型
分離頭数

分離株数

廃用牛

11

肥育牛

3

臓器別分離株数

血清型

肝臓

MLN

腎臓

脾臓

16

9

5

2

0

3

3

0

0

0

Ｏ1

Ｏ63

Ｏ119

Ｏ121

Ｏ125

Ｏ127ａ

ut１）

2

4

3

6

1
1

1

1

１）untypeable
Table 3 同一廃用牛の肝臓と他臓器から分離されたE. coliのPFGEパターンと血清型
枝肉番号
1467

1479

3051

3055

臓器

菌株

PFGEパターン（XbaⅠ）

血清型

肝臓

Ｌ24

Ａ

Ｏ27ａ

MLN

Ｍ27

Ａ

Ｏ127ａ

肝臓

Ｌ47

Ｂ

ut１）

MLN

Ｍ61

Ｂ’

ut

肝臓

Ｌ４

Ｃ

Ｏ125

肝臓

Ｌ３

Ｄ

Ｏ121

腎臓

Ｋ８

Ｄ

Ｏ121

肝臓

Ｌ18

Ｃ

Ｏ125

MLN

Ｍ29

Ｃ

Ｏ125

１）untypeable© The Ito Foundation

268

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

1

2

3

4

5

6

7

8

9

A

A

B

B’

C

D

D

C

C

Fig.１ 同一廃用牛の肝臓と他臓器由来E. coliのXbaⅠ切断によるPFGEパターン
 レーン１，
２：枝肉番号1467，それぞれ肝臓とMLN由来E. coli（Ｌ24，Ｍ27）
 レーン３，
４：枝肉番号1479，それぞれ肝臓，MLN由来E. coli（Ｌ47，Ｍ61）
 レーン５，６，７：枝肉番号3051，それぞれ肝臓，肝臓，腎臓由来E. coli（Ｌ４，Ｌ３，Ｋ８）
 レーン８，
９：枝肉番号3055，それぞれ肝臓，MLN由来E. coli（Ｌ18，Ｍ29）

らの細菌同定に役立ち，牛の臓器から様々な菌を用牛，肥育牛いずれからもカンピロバクターは分分離同定することができた。廃用牛の臓器から離されなかった。採材する部位，検体の量や数なは，腸内細菌であるE. coli，土壌由来と思われるどを増やし検討する必要があるかもしれない。

Bacillus属が多数分離された。廃用牛からの細菌

食肉検査時に合格と判定された肥育牛肝臓から分離率（76.7％）は肥育牛からの分離率（11.1％）

細菌はまったく分離されなかったが，廃棄処分とを 大 き く 上 回 っ て お り ，臓 器 別 で も 肝 臓 ，なった肝臓にはわずかながら菌が分離された例が

MLN，腎臓，脾臓のすべての臓器で廃用牛が肥あった。肥育牛の肝臓は細菌に汚染されることは育牛より高く，廃用牛の臓器は高いレベルで汚染あるものの，検査時に何らかの病変が認められ廃されていることが明らかになった。Enokimotoら

棄処分になっていると考えられる。一方，廃用牛の報告

では健康牛の肝臓の５％，Acikらの報の肝臓は食肉検査の合否に関わらず細菌が分離さ告５）では同様な試料の6.5％からそれぞれカンピれた。このことから，廃用牛の肝臓はたとえ検査

ロバクターが分離されているが，本研究では，廃合格といえども細菌学的には安全とは言えないこ

４）© The Ito Foundation

腸管内細菌による牛腸管外臓器汚染要因の解明とが明らかになった。

269

清型別，パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）

肝臓からE. coliが分離された廃用牛のうち，３による遺伝子型別，逆受身ラテックス凝集反応に頭は肝臓と同時にMLNから，１頭は肝臓と同時よるvero毒素の検出を実施した。43頭の廃用牛のに腎臓からE. coliが分離された。同一廃用牛の肝うち33頭，36頭の肥育牛のうち４頭の少なくとも臓と他臓器から同時に分離されたE. coliのPFGE

１つの臓器から細菌が分離された。分離された細パターン，血清型は一致したことから，腸内細菌菌のうち大腸菌，Bacillus属，Streptococcus属，であるE. coliはMLNに侵入したのち生体内を移Corynebacterium属がその上位を占めた。カンピ

行し，同時に複数の腸管外臓器を汚染しうること

ロバクターは廃用牛・肥育牛のいずれからも分離が示唆される。廃用牛は肥育牛と比較して搾乳やされなかった。廃用牛，肥育牛の肝臓の細菌陽性出産などによるストレスを受けていると考えられ率はそれぞれ41.9％，11.1％であった。食肉検査ており，腸内細菌叢の変動，免疫能の低下，外傷で合格となった肥育牛の肝臓からは細菌は分離さやストレスなどは，腸管内細菌が宿主の腸管粘膜れなかったが，廃用牛の合格肝臓では43.8％から

およびリンパ節を越えて生体内へ侵入する現象を細菌が分離された。MLN，腎臓，脾臓の陽性率引き起こすことが知られている。このようなは廃用牛でそれぞれ46.5％，41.8％，23.3％であっ現象が腸管外臓器での細菌汚染の要因となっていたが，肥育牛ではそれぞれ2.8％，０％，2.8％とる可能性としてあげられる。

低かった。全廃用牛のうち，８頭の廃用牛の肝臓６，７）

本研究により，牛の腸管外臓器の細菌汚染状況

か ら 大 腸 菌 が 分 離 さ れ た 。そ の う ち ３ 頭 で はが明らかになり，廃用牛の臓器は肥育牛より高い

MLNからも大腸菌が分離され，その血清型とレベルで細菌に汚染されていることがわかった。

PFGEパターンは肝臓からの分離株と一致した。

同一廃用牛の肝臓および他臓器から分離された大１頭の廃用牛からは肝臓と腎臓から同時に大腸菌

腸菌の血清型とPFGEパターンは一致し，廃用牛が分離され，両菌の血清型，PFGEパターンは一における腸内細菌の生体内侵入と臓器移行が示唆致した。vero毒素はすべての大腸菌で検出されなされた。

かった。廃用牛の肝臓からは検査の合否にかかわ

５．要らず菌が分離されたが，肥育牛の合格肝臓からは約分離されなかった。肥育牛の肝臓は廃用牛の肝臓

牛肝臓が細菌に汚染される要因は不明だが，加と比較して菌汚染率が低いものと思われる。同一

齢やストレス，栄養不良などにより生体防御能が廃用牛の肝臓および他臓器から分離された大腸菌低下すると腸管内細菌が生体臓器へ移行する可能のPFGEパターンは一致し，廃用牛における腸内性が考えられている。本研究では廃用牛と肥育牛

細菌の生体内侵入と臓器移行が示唆された。

の臓器における細菌汚染状況と汚染要因を調査した。鹿児島県内のと畜場に搬入された廃用牛43頭，肥育牛36頭の肝臓，腸間膜リンパ節（MLN），
腎臓，脾臓を材料とし，無菌的に血液寒天培地で培養後，発育した集落をMALDI-TOF MSを用いて同定した。カンピロバクターの分離にはプレストン培地，CCDA培地を用いた。大腸菌では血文
献１） Walker, C., Shi, X., Sanderson, M., Sargeant, J.,
Nagaraja, T. G. : Prevalence of Escherichia coli
O157:H7 in gut contents of beef cattle at slaughter,
Foodborne Pathog Dis.，７，249～55，2010．
２） Wesley, I. V., Wells, S. J., Harmon, K. M., Green, A.,
Schroeder-Tucker, L., Glover, M., Siddique, I. : Fecal
shedding of Campylobacter and Arcobacter spp. in© The Ito Foundation

270

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

dairy cattle, Appl Environ Microbiol.，66，1994～
2000，2000．
３） Wang, Z., Dunlop, K., Long, S. R., Li, L. : Mass
spectrometric methods for generation of protein
mass database used for bacterial identification, Anal
Chem.，74，3174～82，2002．
４） Enokimoto, M., Kubo, M., Bozono, Y., Mieno, Y.,
Misawa, N. : Enumeration and identification ofCampylobacter species in the liver and bile ofslaughtered cattle, Int J Food Microbiol.，118，259～63，2007．
５） Acik, M. N., Cetinkaya, B. : The heterogeneity ofCampylobacter jejuni and Campylobacter coli strains
isolated from healthy cattle, Lett Appl Microbiol.,
41，397～403，2005．
６） Gue, M., Sun, J. S., Boudier, T. : Simultaneous
localization of MLL, AF4 and ENL genes ininterphase nuclei by 3D-FISH: MLL translocation
revisited, BMC Cancer.，６，20，2006．
７） Herek, O., Kara, I. G., Kaleli, I. : Effects ofantibiotics and Saccharomyces boulardii on bacterialtranslocation in burn injury, Surg Today.，34，256～60，2004．

© The Ito Foundation

271

腫瘍細胞のモノクローナリティー性状を応用した
牛白血病新規診断法の開発
Development of new diagnostic methods for bovine leucosis by using
monoclonarity of tumor cell

猪

熊

壽

（帯広畜産大学畜産学部）

Hisashi Inokuma（Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine）

Monoclonal integration of bovine leukemia virus（BLV）proviral DNA into bovine
genomes was detected in peripheral blood from two clinical cases of enzootic bovine leukosis（EBL）without enlargement of superficial lymph nodes. A BLV-specific probe hybridized with
1 to 3 EcoRI and HindIII fragments in these 2 atypical EBL cattle by Southern blotting andhybridization, as well as in 3 typical EBL cattle. The probe also hybridized to a large numberof EcoRI and HindIII fragments in 5 cattle with persistent leukosis. These results suggest thatthe detection of monoclonal integration of BLV provirus into the host genome may serve as amarker of monoclonal proliferation and malignancy in difficult to diagnose EBL cattle.

が困難であり，病理解剖によりはじめて確定す的

１．目

る。近年，より信頼性の高いEBL発症マーカーと地方病性牛白血病（EBL）は牛白血病ウイルス

して血清チミジンキナーゼ（TK）活性が報告さ（BLV）によって引き起こされる牛の悪性腫瘍でれているが６），ラジオイムノアッセイが必要であある１～３）。EBLの臨床徴候は，一般的に食欲不振，

ることが欠点である。また他にも末梢血のイン

元気消失，生産性低下，体表リンパ節腫大等，非ターロイキン２受容体遺伝子やウィルムス腫瘍遺

特異的である。EBLの確定診断には体表リン伝子の発現などがEBLの発症マーカーとして研究

パ節または末梢血液中に腫瘍細胞を示すことが必されているが，感度と特異度に問題がある７）。し要 で あ る が ，通 常 体 表 リ ン パ 節 の 針 穿 刺 吸 引

たがって，EBL発症のための新しい診断マーカー（FNA）が行われる２）。しかし，FNAの感度と特が求められている。

１，
２）

異性は，それぞれ38～67％と25～80％であり ，

ヒトＴ細胞白血病ウイルス-１（HTLV-１）はまた，異型リンパ球の出現はEBL症例の10.4％のBLVに近縁のウイルスであり，成人Ｔ細胞白血みで認められる 。さらに，EBLでは体表リンパ病（ATL）を引き起こす。すべてのATL患者で節の腫大またはリンパ球増多症が認められないもは，腫瘍細胞内にHTLV１がモノクローナルに組のもあり ，このような症例では生前の確定診断

み 込 ま れ て い る こ と（monoclonal integration）

４）

５）

２）

© The Ito Foundation

272

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

が，サザンブロット解析により証明されている８，９）。

的にEBLと診断された。症例２は６歳のホルスタ

この知見は，ATL患者におけるリンパ球のモノイン種（ATY-２）で，突然の食欲廃絶と起立不クローン性増殖を示唆しており，感染リンパ球の能を呈し，体表および骨盤腔内のリンパ節腫脹は悪性転化マーカーとして用いられている。同

認められなかった。白血球数増多（13,400／μｌ）

様に，BLVのリンパ球への組込みはEBL発症牛と軽度のリンパ球増多症（9,916／μｌ）がみら

でも研究されている。BLVプロウイルスはれたが，血液塗抹標本では異型リンパ球は認めら

EBL発症牛の腫瘍細胞ゲノムに，１ないし複数個れなかった。BLV抗体陽性とリンパ球増多症か所組み込まれている。いっぽう，EBL発症のらEBL発症を疑ったが，生前には確定診断できな

前段階である持続性リンパ球増多症（persistent

かった。病理解剖では腹腔内リンパ節の腫大が認

lymphocytosis: PL）では，BLVプロウイルスはめられ，最終的にEBLと診断された。

10，11）

12～16）

13，16）

宿主ゲノムの様々な部位に組み込まれている３）。

対照として計13頭の牛を用いた（Table１）。典

これらの所見は，BLVプロウイルスの宿主ゲノ型的EBL発症牛３頭（TY-１～３）は，いずれもムへの組込みパターン解析が，感染細胞の悪性度

BLV抗体陽性で，体表リンパ節の腫大または末診断のマーカーとなりうる可能性を示唆してい梢血リンパ球数増多症が認められ，かつリンパ節る。これまで報告されたBLVプロウイルス組込または末梢血に腫瘍細胞が確認されて生前にEBL

みパターンの研究では，体表リンパ節の明らかなと診断された。残りの10頭は臨床的には健常であ腫大を伴う典型的EBL症例だけが材料として用い

り，陰性対照として用いた。４頭はBLV抗体陽られており，体表リンパ節腫大やリンパ球増加症

性かつPLを呈した（PL-１～４）。５頭はBLV抗を伴わない，いわゆる非定型EBLに対する臨床的体陽性であるがPLは認められなかった（BLV-１

有用性は評価されていない。本研究ではBLVプ～５）。１頭はBLV抗体陰性でリンパ球増多もみ

ロウイルス組込みパターン解析の非定型EBL発症られなかった（Ｎ１）。なお，リンパ球数基準はマーカーとしての有用性を検討した。

Bendixen’s keyを用いた。

２．方末梢血200μｌからQIAampⓇDNAミニキット

法（Qiagen）を用いてゲノムDNAを抽出し，分析ま臨床診断が困難であった非定型EBL発症牛２頭で－30℃で保管した。DNA約10μｇをEcoRIまを供した（Table１）。症例１は７歳のホルスタイ

た は HindIII（Roche Diagnostics）で 消 化 し ，ン種（ATY-１）で，発熱，咳，喘鳴，呼吸困難，

1.0％寒天ゲルで50Ｖ，7.5時間泳動したのち，起立困難を呈していたが，体表および骨盤腔内のPVDF膜に転写した12）。ハイブリダイゼーション

リンパ節腫脹は認められなかった。白血球数増多用のBLV tax遺伝子特異的プローブは，511bpの（12,900／μｌ）と軽度のリンパ球増多症（6,579

PCR 産 物 を ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 し ，／μｌ）がみられたが，血液塗抹標本では異型リ

CDP-Star（RPN3690, GE Healthcare）シ ス テ ム

ンパ球は認められなかった。BLV抗体は陽性でを用いて作成した17）。ハイブリダイゼーションはあった。EBL発症が疑われたが，直接的な証拠が

プローブ４ng/mlを用いて，65℃で実施した。シ

得られなかったため，喉頭炎と仮診断された。病

グナルは高性能オートラジオグラフィーフィルム

理解剖では腸間膜リンパ節，第四胃周囲リンパ節（アマシャム）を使用して検出した。

および喉頭周囲のリンパ節が腫大しており，最終© The Ito Foundation

273

腫瘍細胞のモノクローナリティー性状を応用した牛白血病新規診断法の開発
Table 1 Profiles of 2 atypical enzootic bovine leukosis（EBL）cattle and 13 control cattle
Group and ID

Breed

Sex

Age
White blood cell（months）
count（/ul）

Lymphocyte
count（/ul）

BLV
antibody

TK（U/L）

Clinical findings

Atypical EBL without lymphadenopathy
ATY-1

HF

F

94

12,900

6,579

+

51.0

Fever, cough, wheezing,astasia

ATY-2

HF

F

72

13,400

9,916

+

52.5

Anorexia, astasia

TY-1

HF

F

89

266,700

258,699+

1000.0Anorexia, depression,
anemia, diarrhea, astasia

TY-2

HF

F

50

104,000

102,960+

1000.0Anorexia, anemia,
lethargy,
lymphadenopathy

TY-3

HF

F

21

46,20043,890+40.0

Anorexia, depression,
lymphadenopathy

Control Animals
Typical EBL

Persistent lymphocytosis
PL-1

HF

F

69

16,700

10,251+NT

Clinically healthy

PL-2

HF

F

54

14,400

9,792

+

NT

Clinically healthy

PL-3

HF

F

53

14,30011,011+NT

Clinically healthy

PL-4

HF

F

46

14,70011,319+NT

Clinically healthy

BLV infection without persistent lymphocytosis
BLV-1

HF

F

66

8,300

5,395

+

NT

Clinically healthy

BLV-2

HF

F

64

7,500

4,050

+

NT

Clinically healthy

BLV-3

HF

F

61

6,900

3,657

+

NT

Clinically healthy

BLV-4

HF

F

53

9,700

6,208

+

NT

Clinically healthy

BLV-5

HF

F

41

8,600

4,730

+

NT

Clinically healthy

8,600

5,676

-

NT

Clinically healthy

Clinically normal without BLV infection
N-1

HF

F

51

HF : Holstein Friesian, F : Female, BLV : bovine leukemia virus, TK : tymidine kinase, NT : not tested

EcoRI断片でスメアパターンがみられ，残りの２３．結果と考察

頭では反応がみられなかった（Fig.２）。BLV-３

EBLおよび非EBL牛のハイブリダイゼーションと４の２頭にはHindIII断片においてもスメアパの結果をそれぞれFig.１とFig.２に示す。非定型

ターンが認められた。その他の牛では何の反応もEBL発症牛２頭と典型的EBL発症牛３頭では，いみられなかった。

ずれも１～３本の明白なバンドが認められた

BLVは牛のＢリンパ球に感染しDNAに無作為（Fig.１）。いっぽう，PL牛４頭では，BLVtax遺に組み込まれるため，腫瘍化していない牛では，

伝子特異的プローブが，多くの断片と反応しておBLVプロウイルスの組込みはポリクローナルでり，EcoRI断片では８kbp以上の部位に，またある12～14）。しかし，いったん細胞の悪性転化が生

HindIII断片では５kbp以上の部位にスメアとしじると，Ｂリンパ球はモノクローナルに増殖するて認められた（Fig.２）。BLV抗体陽性でPLを呈ため，BLVプロウイルスの組込み部位も特定のしていない５頭のうち３頭（BLV-３～５）では場所に集中する12～14）。このため，ハイブリダイゼー© The Ito Foundation

274

平成26年度M
kbp

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

N-1

ATY-1 ATY-2 Pr

E H

E H E H

M

N-1

TY-1

E H

E H

M

TY-2

TY-3

E H

E H

10
5
4
3
2

Fig. 1 Hybridization of the BLV tax probe to EcoRI and HindIII fragments in 2 atypical and 3 typical EBL cases. The

probe hybridized with 1 to 3 EcoRI and HindIII fragments in these cases. ATY-1 and 2: Atypical EBL. TY-1, 2
and 3: Typical EBL cases with obvious lymphadenopathy and/or remarkable lymphocytosis. N-1 : Negative
controls without persistent lymphocytosis or BLV infection. H: EcoRI digestion,H. HindIII digestion, M: Marker, Pr:
PCR product of 511 bp was used as the DNA probe.

kbp

M

N-1 PL-1 BLV-1 BLV-2 BLV-3 BLV-4 Pr Pr N-1
E H E HE H E H E H E H

E H

M PL-2 BLV-5 M PL-3 PL-4
E H E HE H E H

10
5
4
3
2

Fig. 2 Hybridization of the BLV tax probe to EcoRI and HindIII fragments in non-EBL cattle, including 4 cattle withpersistent lymphocytosis（PL）, 5 BLV infected cattle and 1 BLV-negative healthy cow. Integration patterns of the
5 PL cattle showed a ʻsmearʼ for both EcoRI and HindIII fragments. EcoRI fragments from three（BLV-3 ， 4 and
5）among five cattle with BLV infection without lymphocytosis showed a ‘smear’ pattern; however, samples fromthe remaining two cattle showed no smear. HindIII fragments from 2（BLV-3 and 4）among five cattle positive
for BLV infection without lymphocytosis showed also a ‘smear’ pattern. PL-1to 4 : Clinically normal cattle withpersistent lymphocytosis and BLV infection. BLV-1 to 5 : Clinically normal cattle with BLV infection but normal
lymphocyte counts. N-1 ： Negative control without persistent lymphocytosis or BLV infection. E: EcoRI digestion,
H: HindIII digestion, M : Marker, Pr: PCR product of 511 bp which was used as the DNA probe.

© The Ito Foundation

腫瘍細胞のモノクローナリティー性状を応用した牛白血病新規診断法の開発

275

ション解析を行うと，EBL発症牛では１または複く，臨床的に確定診断が困難であった非定型EBL

数の明瞭なバンドを形成することになる。このよ

発症牛２頭の末梢血から抽出したDNAを材料とうなモノクローナルな組込みパターンはEBL発症

して，サザンブロット解析を行ったところ，１～牛におけるＢリンパ球の腫瘍性増殖を示唆する。

３本の明白なバンドが認められた。BLVプロウ

逆に，PL牛またはBLV感染牛でみられたスメア

イルスはEBL発症牛ゲノムDNAにモノクローナ

パターンはBLV感染リンパ球のポリクローナル

ルに組み込まれてることが示された。いっぽう性を示唆するものである。BLV感染牛の中には，

BLV感染しているが発症していない牛のサザン

バンドがまったくみられないものもあったが，こブロット解析ではスメアが認められ，BLVプロ

れはBLV感染量が検出限界以下であったと考えウイルスの組み込みはポリクローナルであった。

られた。

サザンブロットとのハイブリダイゼーションを用

今回の結果は，腫瘍細胞におけるBLVプロウ

いたBLVプロウイルスの宿主ゲノムへの組み込

イルスのモノクローナルな組み込みに関する以前

みパターン解析は，非定型的EBLにおける発症の報告と一致するものである

マーカーとなりうることが示唆された。

。しかし，本研

３,16）

究では体表リンパ節腫大を伴わず，臨床的に診断が困難であった非定型EBL発症牛の末梢血から抽出したゲノムDNAを材料として用いており，
BLV プ ロ ウ イ ル ス の 組 み 込 み パ タ ー ン 解 析 のEBL発症診断マーカーとしての有用性を評価する
点がこれまでと異なる試みである。本研究の結果から，サザンブロットとハイブリダイゼーションを用いたBLVプロウイルスの組み込みパターン
解析は，非定型的EBLにおける発症マーカーとな
りうることが示唆された。また，末梢血塗抹標本の顕微鏡検査により異型リンパ球が認められない
EBL発症例においても，末梢血リンパ球が腫瘍性に増殖していることが示唆された。今後，本方法を臨床診断に応用するにあたっては，多くの症例を解析することにより，その感度と特異性について十分に検討する必要があると思われた。
本 研 究 の 成 果 は The Journal of Veterinary
Medical Science，76（2015）に掲載された。
４．要

約

本研究ではBLVプロウイルス組込みパターン
解析が非定型EBLの発症マーカーとして有用であるかどうかを検討した。体表リンパ節の腫大が無文
献１） Angelo’s, J. A., Thurmond, M. C. : Large Animal
Internal Medicine 5th ed.（Smith, B.P. ed.）, 1070～
1073．Mosby Elsevier, Burlington，2015．
２） Garry, F. : Rabun’s Diseases of Dairy Cattle, 2nded.（Divers T. J. and Peek, S. F. eds.）, 624～633．
Saunders Elsevier, St. Louis，2008．
３） Reed, V. I. : Can. Vet. J.，22，95～102，1981．
４） Washburn, K. E., Streeter, R. N., Lehenbauer, T.
W., Snider, T. A, Rezabek, G. B., Ritchey, W.,
Meinkoth, J. H., Allison, R. W., Rizzi, T. E., Boileau, M.
J. : J. Am. Vet. Med. Assoc.，230，228～232，2007．
５） Burton, A. J., Nydam, D. V., Long, E. D., Divers, T.
J. : J. Vet. Intern. Med.，24，960～964，2010．
６） Sakamoto, L., Ohbayashi, T., Matsumoto, K.,
Kobayashi, Y. Inokuma, H. : J. Vet. Diagn. Invest.，
21，871～874，2009．
７） Tawfeeq, M. M., Horiuchi, N., Kobayashi, Y.,
Furuoka, H., Inokuma, H. : J. Vet. Med. Sci.，75，1213～1217．2013．
８） Yamaguchi, K., Seiki, M., Yoshida, M., Nishimura,
H., Kawano, F., Takastuki, K. : Blood，63，1235～
1240，1984．
９） Yoshida, M., Seiki, M., Yamaguchi, K., Takatsuki, K.
: Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81，2534～2537，1984．
10） Cook, L. B., Melamed, A., Niederer, H., Valganon,
M., Laydon, D., Foroni, L., Taylor, G. P., Matsuoka,
M., Bangham, C. R. Blood，123，3925～3931，2014．
11） Takemoto, S., Matsuoka, M., Yamaguchi, K.,
Takatsuki, K. : Blood，84，3080～3085，1994．
12） Coulson, J., Daniel, R. C.W., Lavin, M. F. : Arch.
Viral.，119，13～23，1991．
13） Hetman, R., Clutter, Y., Mammerickx, M., Rotival,© The Ito Foundation

276

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

M. M., Bernardi, G., Burny, A., Chantrenne, H. : Proc.
Natl. Acad. Sci. USA，77，2577～2581，1980．
14） Hetman, R., Meunier-Rotival, M., Cortadas, J.,
Cuny, G., Ghysdael, J., Mammerickx, M., Burny, A.,
Bernardi, G. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，76 ，4822～4826，1979．
15） Murakami, H., Yamada, T., Suzuki, M., Nakahara,Y., Suzuki, K., Sentsui, H., Virus Res.，156，107～112，2011．
16） Onuma, M., Sagata, N., Okada, K., Ogawa, Y.,
Ikawa, Y., Oshima, K. : Microbiol. Immunol. 26 ， 813～820，1982．
17） Costa, J. M. P., Sumitra, L. M., Saguaro, A. C. : J.
Viral. Meth.，137，29～33，2006．

© The Ito Foundation

277

牛卵管機能に及ぼす夏季暑熱ストレスの影響～性ホルモン受容体とヒートショックタンパク質の関係性～
Effects of summer heat stress on the bovine oviductal functions～Relationship between the receptors of sex steroid hormones and heatshock proteins～

山

本

ゆ

き・奥

田

潔

（岡山大学大学院環境生命科学研究科）

Yuki Yamamoto and Kiyoshi Okuda（Graduate School of Environmental and Life Science, Okayama University）

Summer heat stress depresses fertility in cattle. Recently, we have shown that heat shockprotein（HSP）90 expression in the bovine oviduct in summer is higher than in winter.
Mammalian oviducts play key roles in fertilization, in early embryonic development and ingamete/embryo transport. Oviductal function is regulated by several steroid hormones. Since
HSP90 binds to receptors of these hormones and makes them activated in cytosol, highexpression of HSP90 in the oviduct can affect functions of steroid hormone receptors insummer. Here, we compared expressions of sex steroid hormone receptors（estrogen receptor
ERα，ERβ and progesterone receptor（PR））and glucocorticoid receptor（GRα），which also
binds to HSP90 in cytosol in bovine oviducts in winter and summer. The oviducts werecollected from 6 cows in winter and 6 cows in summer. All the cows were at ovulation day.
Messenger RNA expressions of ERα，ERβ and PR were insignificantly different in winter andin summer. Interestingly, GRα expression was lower in summer than in winter. In addition, theprevious study has shown that plasma concentrations of glucocorticoid show abnormality in
hot condition. Because of high expression of HSP90 and low expression of GRα in summer
season, the effects of steroid hormones on oviductal cells might be affected by high temperaturein summer season. Further study about the effects of high temperature on oviductal function
induced by steroid hormones is needed to clarify the mechanism of summer infertility in cattle.

１．目

どを引き起こし，受胎率を低下させることが報告的されている。そのため，近年の地球温暖化に伴い，牛において，夏季の気温の上昇による暑熱スト

より広い地域において夏季の受胎率低下が生じ，レス（heat stress; HS）は，発情徴候の微弱化，畜産業が損害を被ることが懸念されている。本研

卵胞の発育異常による排卵障害，初期胚の死滅な究では，雌性生殖器官である卵管に着目する。卵© The Ito Foundation

278

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

管は，受精および初期胚（受精卵）の発育の場でトロジェン受容体およびプロジェステロン受容あると同時に，配偶子／初期胚を輸送する生殖器体）およびグルココルチコイド受容体と，HSP90

官であることから１，２），卵管機能異常は初期胚のとの関係性を明らかにすることを試みた。

死滅に直結する。近年我々は，夏場の暑熱が牛卵管の熱ショックタンパク質90（HSP90）の発現を

２．方法

亢進させることを見出した３）。HSP90は，性ホル

2.1

牛卵管のサンプリング

モンであるエストロジェンやプロジェステロンの岡山市食肉センターならびに津山市食肉セン

受容体機能に密接に関係している。エストロジェ

ターより，と殺後30分以内の牛卵管（膨大部）を

ンおよびプロジェステロンは雌性生殖器官の機能採取した。採取した卵管は氷冷した生理食塩水中を支配するホルモンであり，卵管においては初期で保管し岡山大学まで輸送した。2011年11月21日

胚輸送のための平滑筋運動や上皮細胞の繊毛活性～2012年３月１日に採取した卵管を冬季サンプルを 調 節 す る 。性 ホ ル モ ン 受 容 体 は 細 胞 質 内 のとして，2012年７月23日～2012年９月６日に採取

HSP90と結合した状態でリガンドが結合可能な活した卵管を夏季サンプルとして実験に供した。な性化状態を保つ。そのため，夏季の暑熱条件下でお，冬季期間および夏季期間の平均気温はそれぞ

HSP90発現が亢進されることでリガンドが結合可

れ5.7℃および27.5℃であった。夏季期間の最低気能な性ホルモン受容体が増加し，過剰なシグナル

温と最高気温の範囲は22.1～36.8℃であり，かつが誘導されることで卵管機能に悪影響を及ぼす可同期間（46日間）のうち33日間において最高気温能性が考えられる。さらに，HSP90はグルココル

が33℃以上を記録した。乳牛は気温が25℃を超え

チコイド受容体にも結合することが知られているとストレスの影響を受け始めると言われておる。グルココルチコイドはいわゆるストレスホル

り，本研究で夏季期間に卵管を採取した牛は，十モンとして知られ，ストレスを受けると盛んに副分な暑熱ストレスを受けていたと推察される。な腎から分泌されることが知られている。グルココ

お気温に関する記録は気象庁ホームページ

ルチコイド受容体は細胞質中ではHSP90と複合体（http://www.jma.go.jp/jma/index.html）よ り 入を形成しており，リガンドであるグルココルチコ

手した。

イドと結合することによってHSP90との結合が切４）採取した卵管は，Okudaら（1988）の方法に断され，細胞核内に受容体が移行し，転写因子としたがって卵巣ならびに子宮の肉眼的所見によりして作用する。これまでに，暑熱ストレスを受け排卵周期を推定した。子宮広間膜より卵管を切りた牛の血中グルココルチコイド濃度が上昇するこ取り，余分な組織を除去した後，液体窒素中で凍とが報告されていることから，暑熱ストレスを受結および破砕し，total RNAならびにタンパク質

けた牛において，グルココルチコイド受容体の機の抽出に用いた。

能にも何らかの障害が生じている可能性も考えられる。

2 . 2 卵管組織中のTotal RNA抽出および第１鎖cDNAの合成

本研究では，暑熱下における卵管要因の不妊メ

液体窒素中で凍結した卵管組織より，定法に基カニズムを明らかにすることで，夏季暑熱下におづきtotal RNAを抽出した。抽出したRNAより，

いても家畜の繁殖効率を維持することを最終目標

iScriptTM Reverse Transcription Supermix forとし，卵管機能における性ホルモン受容体（エスRT-qPCR（BioRad Laboratories）を用いて第１© The Ito Foundation

牛卵管機能に及ぼす夏季暑熱ストレスの影響

279の結果，ERα，ERβならびにPR mRNA発現の，鎖cDNAを合成した。
2 . 3 R e a l t i m e R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n

夏季および冬季間における差異は認められなかっ

Polymerase Chain Reaction（RT-PCR）法

た（Fig.１）。このことから，性ステロイドホル

夏季および冬季における卵管組織中の卵巣ステ

モン受容体の発現自体に暑熱ストレスは影響を及

ロイドホルモン受容体およびグルココルチコイド

ぼさないと推察された。その一方で，排卵日の卵受容体遺伝子発現量を解析するため，Real-time

管におけるGRαのmRNA発現が，冬季と比較しRT-PCR法により各mRNA発現量を測定した。

て夏季においては低いことが明らかとなった

解析は比較Ct法を用いて行った。

（Fig.２）。GRのリガンドであるグルココルチコイ

2 . 4 卵管組織からのタンパク質抽出およびタドは，ストレスホルモンとして知られ，実際に暑熱ストレスを受けた牛において，血中のグルココ

ンパク質濃度測定
液体窒素で凍結した卵管組織から，タンパク質

ルチコイド濃度が異常となることがこれまでに明分解酵素阻害剤存在下，かつ氷冷下でホモジナイ

らかとなっている５，６）。副腎皮質から分泌されるズした。ホモジナイズ溶液を濾過し，回収した濾

グルココルチコイドは，血液を介して全身に廻り液をさらに超音波破砕した。その後遠心分離に渡り，それぞれの臓器・器官に発現するGRを介よって得た上清を回収してタンパク質サンプルとして炎症反応の抑制や様々なホルモン分泌に作用した。タンパク質サンプル溶液中のタンパク質濃する。グルココルチコイドのターゲットである炎度は，Bicinchonianate法により測定した。タン症メディエーターのひとつにプロスタグランディ

パク質標準液には牛血清アルブミン（Ｏ-1200μg/

ン（PG）があげられ，グルココルチコイドはPGml）を用いた。

の分泌を抑制することが，広範な組織において報2.5

共免疫沈降法およびWestern blotting法

告されている。一方で卵管におけるPGの重要な

HSP90と各受容体が細胞中で結合しているかど

役割のひとつに，初期胚の輸送に必須である平滑うかを解析するために，抽出したタンパク質サン

筋運動の調節があげられる。PGは平滑筋の収縮

プルを共免疫沈降に供した。抗HSP90抗体を磁気と弛緩を調節することで，ぜん動運動を含む卵管

ビーズに結合させ，抽出タンパク質サンプルと混平滑筋運動に関与している。本研究において夏季

和し，磁石によって集められた磁気ビーズ結合タ

卵管のGRα発現が抑制されたことから，夏季のンパク質中の卵巣ステロイドホルモン受容体なら環境によって血中グルココルチコイド濃度が異常

びにグルココルチコイド受容体の発現をWesternとなる他，リガンドを受け取る卵管側のレセプ

blot法により検出した。

ター発現量も影響を受けることが示された。このことから，通常期と比べて夏季の卵管では，グル

３．結果と考察

ココルチコイドによるPG分泌の抑制が低水準に

3 . 1 夏季および冬季におけるステロイドホル

とどまり，より大量のPG分泌が促されることで平滑筋運動に影響が及び，その結果，配偶子およ

モン受容体遺伝子発現量の比較
牛卵管組織におけるエストロジェン受容体（ERα お よ び ERβ）
，プ ロ ジ ェ ス テ ロ ン 受 容 体

び初期胚輸送に異常が生じて不受胎を引き起こす
可能性がある。

（PR）ならびにグルココルチコイド受容体（GRα）の夏季および冬季間での発現量比較を行った。そ© The Ito Foundation

1.5

Estrogen receptor α

1.0
0.5
0

Winter

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ERβ/GAPDH mRNA
（Arbitrary units）

ERα/GAPDH mRNA
（Arbitrary units）

平成26年度Summer

1.5

Estrogen receptor β

PR/GAPDH mRNA
（Arbitrary units）

280

1.0
0.5
0

WinterSummer

1.5

Progesterone receptor

1.0
0.5
0

WinterSummerFig. 1 Messenger RNA expressions of estrogen receptorα，estrogen receptorβ and progesterone receptorin bovine

GRα/GAPDH mRNA
（Arbitrary units）

oviducts（n＝６）in the ovulation day in winter（November21，2011-March 1, 2012）and summer（July23，
2012-September 6, 2012）.There were no significant differences（P＞0.05 ; Student’s t-test）．

Glucocorticoid receptor α
1.5a,b:P<0.05

a

1.0
b

0.5
0

WinterSummerFig. 2 Messenger RNA expressions of glucocorticoid receptorα in bovine oviducts（n＝６）in the ovulation day inwinter（November21，2011-March 1, 2012）and summer（July23，2012-September6, 2012）. Different superscript
letters indicate significant difference（P＜0.05 ; Student’s t-test）．

3 . 2 卵管における活性型ステロイドホルモン

高温条件によって卵管細胞のステロイドホルモンに対する反応性に変化が起こるか否かを，牛卵管受容体の発現性ステロイドホルモン受容体およびグルココル
チコイド受容体は，細胞質中でHSP90と結合する
こ と で 活 性 化 し ，リ ガ ン ド と 結 合 し た の ち に細胞培養法を用いて検討することを予定している。
４．要

約

HSP90と解離，リガンド－受容体複合体は核内に牛において，夏季の暑熱ストレス（summer

移行して転写因子として作用する。そこで細胞質

heat stress; HS）は受胎率を低下させる一因であ中における活性型ステロイドホルモン受容体量のる こ と が 知 ら れ て い る 。 Heat shock protein

変化を明らかにするために，HSP90と受容体との（HSP）は熱ストレスにより発現が増強されるタ結合を共免疫沈降法により検出することを試み

ンパク質で，牛卵管において，冬季と比較し夏季る。現在，タンパク質サンプルの調整や共免疫沈におけるHSP90の発現量が上昇することを，近年

降法，Western blot法の実験条件等の検討を進め

著者らが明らかとした。卵管は受精の場かつ初期ている段階である。

胚の輸送に重要な器官であり，卵管の機能は性ス
テロイドホルモンに支配されることが知られる。

今後，共免疫沈降法による活性型ステロイドホ

この性ステロイドホルモンの受容体は細胞質内でルモン受容体の発現量を明らかにするとともに，

HSP90と結合しており，夏季にHSP90の発現量が© The Ito Foundation

牛卵管機能に及ぼす夏季暑熱ストレスの影響

281

変化することで，ステロイド受容体の機能にも何季において，HSP90の発現量が上昇しグルココル

らかの影響が出る可能性がある。本研究では，性

チコイド受容体の発現量が低下することから，スステロイドホルモン受容体（ERα，ERβおよびテロイドホルモンによる卵管への作用に影響が生PR）と，同様にHSP90と結合することの知られじることが推察された。今後，高温環境がステロ

るグルココルチコイド受容体（GRα）の発現量

イドホルモンを介した卵管細胞機能制御にどのよを冬季と夏季で比較した。牛卵管（膨大部）は，うな影響を与えるかを明らかにする必要がある。

冬季および夏季それぞれ６頭の排卵日の牛から採取した。各受容体の遺伝子発現を冬季と夏季間で比較したところ，ERα，ERβならびにPRの発現量には冬季と夏季の間で有意な変化が認められなかった。その一方，GRαのmRNA発現量は，冬季と比較し夏季において低いことが明らかとなった。過去の報告において，ストレスホルモンであるグルココルチコイドの血中濃度は，暑熱ストレスを受けた牛において異常を示すことが知られており，本研究において，それを受け取る側の受容体の発現も異常となることが明らかとなった。夏文献１） Menezo, Y., Guerin, P., Euro J Obst Gynecol
Reprod Biol.，73，99～104，1997．
２） Greve, T., Callesen, H., Reprod Nut Develop，41，451～459，2001．
３） Kobayashi, Y., Wakamiya, K., Kohka, M.,
Yamamoto, Y., Okuda, K., Reproduction，146，103～
110，2013．
４） Okuda, K., Kito, S., Sumi, N., Sato, K., Vet Rec，
123，80～183，1988．
５） Abilay, T A., Mitra, R., Johnson, H D., J Anim
Sci.，41，113～117，1975．
６） Wise, M E., Armstrong, D V., Huber, J T.,
Hunter, R., Wiersma, F., J Dairy Sci.，71，2480～
2485，1988．

© The Ito Foundation

282

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール
代謝改善素材開発のための基礎研究
Basic study of the development of an innovative hypocholesterolemic foodmaterials using cattle heart peptides

長

岡

利

（岐阜大学応用生物科学部）

Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences，Gifu University）

Only a few reports have dealt with the effects of animal protein and animal proteinhydrolysate on cholesterol metabolism. The cattle heart protein hydrolysate ultra-filtrate（HPHU, MW ＜ ca. 1,000 Da peptides fraction）derived from HPH imparts a stronger
hypocholesterolemic activity than HPH in rats. Thus, after purification of HPHU by a reverse
phase chromatography and gel filtration chromatography, we try to identify the active
hypocholesterolic peptide derived from HPHU using in vitro assay related to micellar solubilityof cholesterol in vitro. Micellar solubility of cholesterol was significantly decreased by HPHU
RP1, RP2 or RP3（purified by a reverse phase chromatography）-group compared to CTHgroup. Micellar solubility of cholesterol was significantly decreased by HPHU gf3（purified by agel filtration chromatography）-group compared to CTH-group. Micellar solubility ofcholesterol was significantly decreased by gf3-RPI, gf3-RPII or gf3-RPIII（purified by areverse phase chromatography）-group compared to CTH-group.

発現することを発見し検討している２，３）。また，

的

１．目

主要な食糧資源でありながら，従来ほとんど検討

一般に，大豆タンパク質などの植物性タンパクがなされていない畜産食品素材のうち，牛肉ペプ

質は，カゼインなどの動物性タンパク質と比較しチド，牛レバーペプチドが体内コレステロール低１）て，抗動脈硬化作用を有すると考えられている 。

下作用を有することも見出した６）。さらに，昨年

しかし，現在活発に行われている有効成分の検討

度の研究で，動物性食餌タンパク質である牛肉ににより，このような血清コレステロール低下

再度着目し，畜産資源の高度有効利用という観点

作用は動物性素材にも見られることが明らかにさから，廃棄部位を含めた各部位である牛肉，牛心れている。実際に，私は，牛乳の乳清タンパク質臓，牛赤血球，牛血漿加水分解物を用いた研究をが，動物性タンパク質でありながら大豆タンパク行った結果，特に牛心臓加水分解物（HPH）が質よりも，強力な血清コレステロール低下作用を強力なコレステロール代謝改善作用を発現するこ２～10）© The Ito Foundation

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究とを発見した７）。

283

avant 25（GE Healthcare）高速液体クロマトグ

さらに，我々の既報の研究手法を用いて，

８～10）

牛心臓タンパク質加水分解物（HPH）のコレス

ラフィーにより，HiLoad 26/60 Superdex 30 pg（GE Healthcare）を用いて行った。

テロール低下作用機構を明らかにした。コレステ

2.3

ロールミセル溶解性はカゼインよりもHPHで有実験２で得られたサンプル（gf３）をRPCによ

意に低下した。Caco-２細胞のコレステロール吸り４分画（gf3-RPI～Ⅳ）し，CHOLミセル溶解

収抑制はカゼインミセルよりもHPHミセルで有性に対する影響を評価した。なお，実験２で得ら意に高かった。血清コレステロールはカゼインよれ た サ ン プ ル（gf ３）の RPC に よ る 分 画 は ，りもHPHで有意に低かった。放射性コレステロー

AKTa purifier 10 plus（GE Healthcare）により，ルで測定したコレステロール吸収はカゼインと比SOURCE 5 RPC ST 4.6/150（GE Healthcare）をべてHPHで有意に減少し，HPHのコレステロー用いて行った。

ル低下作用は空腸のコレステロール吸収阻害によるものである。さらに，HPH由来の牛心臓タン
パク質加水分解物の限外濾過物（HPHU，分子量約1000ダルトン以下のペプチド分画物）は，ラッ

実験３

なお，実験結果の統計的分析には，Duncan’sMultiple Range-Testを用いた。
３．結果と考察

トにおいてHPHよりも強力なコレステロール低3.1

下作用を示すことを発見し，報告した 。

Fig.１に，HPHUのRPCによる溶出パターンを

11）

そこで，本研究では，ペプチド混合物である

実験１

示した。

HPHUのコレステロール代謝改善作用に寄与する

HPHUのRPCによる分画物であるRP１，RP２，活性ペプチドを特定するために，HPHU由来ペプ

RP３はカゼイントリプシン加水分解物（CTH）

チドの分画精製を実施し，in vitroのコレステローと比較して，コレステロールミセル溶解性が有意

ルミセル溶解性試験を行った。

に低下した（Table１）
。

２．方
2.1

3.2

法

実験２

Fig.２に，HPHUのGFCによる溶出パターンを
示した。

実験１

HPHUを逆相クロマトグラフィー（RPC）によ

HPHUのGFCによる分画物であるgf３はCTH

り３分画（RP１～３）し，CHOLミセル溶解性と比較して，コレステロールミセル溶解性が有意に対する影響を評価した。なお，HPHUの逆相クに低下した（Table２）。

ロマトグラフィーによる分画は，島津高速液体ク

3.3

ロマトグラフィーにより，TSK-GEL ODS-80Ts

Fig.３に，gf３のRPCによる溶出パターンを示した。

（東ソー）を用いて行った。
2.2

実験３

HPHUのGFCによる分画物であるgf３はCTH

実験２

HPHUをゲル濾過クロマトグラフィー（GFC）と比較して，コレステロールミセル溶解性が低下により４分画（gf１～４）し，CHOLミセル溶解傾向を示し，さらに，gf３のRPCによる分画物で性に対する影響を評価した。なお，HPHUのゲルあるgf3-RPI，gf3-RPII，gf3-RPIIIでは有意に低濾過クロマトグラフィーによる分画は，AKTA

下した（Table３）。

© The Ito Foundation

284

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）
5

3500
3250

90

3000
80

2750
2500

70

ア

2250

60 セ

ト
ニ

2000

吸
光 1800
度

50 ト

1500

40

1250
30

1000
750

リ
ル
濃
度

20

500
10

250
0

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

min

0

リテンションタイム
RP1

RP2

RP3

Fig. 1Table 1 Effects of samples（5mg/ml）on micellar solubility of cholesterol
sampleconcentration

micellar solubility of cholesterol（％）

CTH

５mg/ml

90.6±3.3ｃ

HPHU

５mg/ml

79.2±2.6ｂ

HPHU RP１

５mg/ml57.4±1.4ａ

HPHU RP２

５mg/ml

72.2±1.2ｂ

HPHU RP３

５mg/ml

61.1±1.5ａ

１．The data are Means±SEM of 4 samples per group.
２．Means with different letters are significantly（P＜0.05）by Tukey’s multiple range test.
CTH：Casein Tryptic Hydolysate
HPHU：Cattle Heart Protein Hydrolysate Ultrafiltrate
HPHU RP：Cattle Heart Protein Hydrolyzate Ultrafiltrate Reverse Phase Chromatography Fractionate

なお，予備的な機器分析によるペプチド分析から，gf3-RPI，gf3-RPII，gf3-RPIIIは，種々のペHPHよりも強力なコレステロール低下作用を示すことを発見し，報告した。

プチドの混合物であることから，活性ペプチドのそこで，本研究では，ペプチド混合物である

特定のためには，さらなる分画精製が必要である。

HPHUのコレステロール代謝改善作用に寄与する

４．要活性ペプチドを特定するために，HPHU由来ペプ

約

チドの分画精製を逆相クロマトグラフィーやゲル

私たちはHPH由来の牛心臓タンパク質加水分

濾過クロマトグラフィーにより実施し，分画物に解物の限外濾過物（HPHU，分子量約1000ダルト

ついて，in vitroのコレステロールミセル溶解性

ン以下のペプチド分画物）は，ラットにおいて試験を行った。その結果，gf３のRPCによる分画© The Ito Foundation

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究
gf 2 gf 3

mAU（215nm）

gf 4

gf 1

4000

285

3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0

0

100

200

300

400

500

600

elution volume（ml）Fig. 2

Table 2 Effects of samples（5mg/ml）on micellar solubility of cholesterol
sampleconcentration

micellar solubility of cholesterol（％）

CTH

５mg/ml

90.7±3.3ｂ

HPHU

５mg/ml

79.1±2.6ａ

HPHU gf１

５mg/ml

95.6±1.7ｂ

HPHU gf２

５mg/ml96.2±2.3ｂ

HPHU gf３

５mg/ml

79.9±2.0ａ

HPHU gf４

５mg/ml105.4±3.4ｂ

１．The data are Means±SEM of 4 samples per group.
２．Means with different letters are significantly（P＜0.05）by Tukey’s multiple range test.
CTH：Casein Tryptic Hydolysate
HPHU：Cattle Heart Protein Hydrolysate Ultrafiltrate
HPHU gf1～4：Cattle Heart Protein Hydrolysate Ultrafiltrate Gel Filtation Fraction１～４

物であるgf3-RPI，gf3-RPII，gf3-RPIIIでは有意に低下した。活性ペプチドの特定のためには，さらなる分画精製が必要である。
文献１） Carroll, K. K., Hamilton, R. M. G. : J. Food Sci.，
40，18，1975．
２） Nagaoka, S., Kanamaru, Y., Kuzuya, Y., Kojima, T.,
Kuwata, T. : Biosci. Biotch. Biochem.，56，1484，
1992．
３） 長岡利：日本栄養・食糧学会誌，49，303，1996．

４） Iwami, K., Sakakibara, K., Ibuki, F. : Agric. Biol.
Chem.，50，1217，1986．
５） Sugano, M., Goto, S., Yamada, Y., Yosida, K.,
Hashimoto, Y., Matsuo, T., Kimoto M. : J. Nutr.，
120，977，1990．
６） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書
336，1998．
７） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書
378，1999．
８） Nagaoka, S., Awano, T., Nagata, N., Masaoka, M.,
Hori, G., Hashimoto, K. : Biosci. Biotech. Biochem.，
61，354，1997．
９） Nagaoka, S., Miyazaki, H., Oda, H., Aoyama, Y.,© The Ito Foundation

286

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

ABS 215nm(mAU)
6000

215 nm

RP I

5000

RP II

Conc BRP II I

Conc (%B)
120

RP IV

100

4000

80

3000

60

2000

40

1000

20

0

0
0

20

40

60

80

100

120

140

elution volume (ml)Fig. 3

Table 3 Effects of samples（5mg/ml）on micellar solubility of cholesterol
sampleconcentration

micellar solubility of cholesterol（％）

CTH

５mg/ml

90.6±3.3ｃ

HPHU

５mg/ml

79.0±2.6bc

HPHU gf３

５mg/ml

83.0±5.7ｃ

HPHU gf3-RPI

５mg/ml64.9±2.2ab

HPHU gf3-RPII

５mg/ml

65.3±2.1ab

HPHU gf3-RPIII

５mg/ml62.7±1.0ａ

HPHU gf3-RPIV

５mg/ml80.7±2.8ｃ

１．The data are Means±SEM of 4 samples per group.
２．Means with different letters are significantly (P＜0.05) by Tukey's multiple range test.
CTH : Casein Tryptic Hydolysate
HPHU : Cattle Heart Protein Hydrolysate Ultrafiltrate
HPHUgf3 : Cattle Heart Protein Hydrolysate Ultrafiltrate Gel Filtrate Fraction３
HPHUgf3-RPI ～ IV : Cattle Heart Protein Hydrolysate Ultrafiltrate Gel Filtrate Fraction 3 Reverse Phase Chromatography Fraction
I～IV

Yoshida A. : J. Nutr.，120，1134，1990．
10） Nagaoka, S., Miwa, K., Eto, M., Kuzuya, Y., Hori, G.,
Yamamoto, K. : J. Nutr.，129，1725，1999．

11） Nakade, K., Kaneko, H., Oka, T., Ahhmed, A.M.,
Muguruma, M., Numata, M., Nagaoka, S. : Biosci.
Biotechnol. Biochem.，73，607，2009．

© The Ito Foundation

287

牛用腸溶性生菌剤カプセルが牛の腸内細菌相に与える影響
Effect of administration of the enteric coated probiotic capsule on bacterial
flora in cattle intestine

瀬山

智博・平康

博章・吉田

弦・笠井

浩司

（地方独立行政法人大阪府立環境農林水産総合研究所）

Tomohiro Seyama, Hirofumi Hirayasu, Gen Yoshida and Koji Kasai（Local incorporated administrative agency Research Institute of Environment, Agriculture and Fisheries, Osaka Prefecture）

Effect of lactic acid bacterium, delivered by enteric capsule on intestinal flora of cattle wasdiscussed. The enteric coated capsules, containing 3＊10^11cfu of Lactobacillus coryniformis
subsp.（JCM 1099）for each were orally administrated to lactating cows once a day forconsecutive 7 days. Various DNA, including 16S rDNA of the administrated lactic acidbacterium were picked up from the feces, collected every 24 hours after the administration inorder to examine the changes in intestinal flora. DNA detection was done by the denaturing
gradient gel electrophoresis. The 16S rDNA of JCM 1099 was detected from a fecal sample of
one cow out of two, which were administrated with enteric capsules containing powdered JCM
1099, while none was detected from the cows treated with blank capsules and powdered JCM
1099 separately（control）. The changes in intestinal flora were analyzed by using Next
Generation Sequencer. No difference was seen in the change of relative abundances of
Lactobacillus between capsule administrated cows and control cows, nevertheless, there was asignificant change in relative abundances of Ruminococcus and Paraprevotella between two
groups. In addition, principal component analysis proved that the distribution of metagenomic
data from intestinal flora of capsule administrated cows and control cows tended to be
separated into two different groups by PCO 1 and PCO 2. These results suggest that intestinal
flora of cattle could be changed by administration of lactic acid bacterium using enteric coatedcapsule.

１．目のプロバイオティクスは畜産分野にも応用されつ的つある。鶏や豚，魚では，プロバイオティクスに近年，宿主に有益な作用をもたらす微生物を投よって増体率や免疫力の向上が確認されてい与することで，腸内細菌相の菌種構成を改善する

る４～６）。一方，反芻動物である牛では，巨大な第プロバイオティクスが，ヒトの健康維持に役立つ

一胃が微生物発酵槽となっており，経口摂取したという報告が多くなされている

乳酸菌がこの第一胃で希釈され，あるいは死滅す。そして，こ１～３）© The Ito Foundation

288

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

るため，腸には限られた菌種しか届いていないこ

CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCGとが明らかにされており ，生菌剤の直接経口投

CCC CCG CCC CCC CGG GAA CGT ATT CAC

与によるプロバイオティクス効果は期待できない。

CGC G-3’）10）を用いて，PCRで乳酸菌16S rDNA

我々は，成牛での乳酸菌製剤の利用の最大の障の増幅を行った。増幅条件は，初期変性94℃５分，壁が，第一胃での死滅や希釈にあると考え，これ35サイクルの変性94℃30秒，アニーリング60℃30らを防ぐため，乳酸菌を腸溶性カプセルに封入し秒，伸長72℃１分，最終伸長72℃７分とした。変た。このカプセルは，比重を1.3に，直径を６mm

性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）はDCodeに設定して，反芻を回避して速やかに反芻胃を通（Bio-Rad Laboratories, Inc., California, USA） を過する 。また，中性から弱酸性の第一胃液内で用いて，８％アクリルアミド，30～60％変性剤濃

溶解せず，下部消化管で崩壊あるいは溶解して，度勾配ゲルで60℃5.5時間，150Ｖ定電圧で200ng

内容物を放出する。この腸溶性カプセルを用いのPCR増幅産物の泳動を行った。

７）８）て，菌を生きたまま高濃度に牛の腸に届けて腸内

2.2

細菌相を変化させることができれば，牛用プロバ

ホルスタイン種泌乳後期牛４頭（平均分娩後日

イオティクスの可能性が広がる。そこで，本研究

数295±29日，平均体重670.3±52.9㎏）を供試し

では，乳酸菌を含有する腸溶性カプセルの投与がた。試験区は，１頭１日あたり3＊10^11cfuのJCM

牛の腸内細菌相に与える影響を検討した。

1099を含むカプセルを午前10時に牛（No.３-４）

２．方

実験２：カプセル投与試験に投与した。対照区は，同じタイミングで，３＊

法

10^11cfuのJCM 1099凍結乾燥菌粉末をPBSに懸2 . 1 実験１：乳牛排せつ物培地を用いた乳酸

濁して，試験区と同量のブランクカプセルとともに牛（No.１-２）に投与した。投与は１週間継続

菌培養試験
本研究では，文部科学省のナショナルバイオリして行った（１から７日目）。最初の投与直前と，

ソースプロジェクトを通じて，理研バイオリソー投与から24時間ごと，さらに最初の投与から14日

スセンターから提供を受けた牛排せつ物由来乳酸

目に排せつ物を直腸から約500ｇ回収した（１か菌 （JCM 1099 ; Lactobacillus coryniformis

ら８日目と14日目）。約500ｇの排せつ物を滅菌容

subsp.） を 使 用 し た 。 JCM 1099 は MRS 培 地

器内で均一になるように混合し，そのうち250mg（Becton, Dickinson and Company, New Jersey,

をDNA抽出に用いた。

USA）を用いて，30℃で培養し，以後の実験に抽出したDNAを鋳型に，16S rDNAのＶ３-Ｖ
４領域を増幅した。プライマーは16S Amplicon用いた。
既報の培養液の組成を参考に ，牛排せつ物をPCR Primer（Forward：5’-TCG TCG GCA GCG

含む培養液でJCM 1099を48時間培養し，PowerTCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT

soil DNA Extraction Kit（MO BIO Laboratories,

ACG GGN GGC WGC AG-3’，Reverse：5’-GTC

Inc., California, USA）でDNAを抽出した。そのTCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA

抽出DNAを鋳型として，リバースプライマーのGAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA

５’末端にGCクランプを付加した乳酸菌増幅用プ

ATC C-3’）を用いた11）。このPCR産物を用いて，

ラ イ マ ー ペ ア WBAC-F （5’-GTC GTC AGC

Illumina MiSeqシステム（Illumina, Inc., California,

TCG TGT CGT GAG A-3’），WBAC-R（5’-CGCUSA）で細菌相を解析した。得られたFASTQ

９）© The Ito Foundation

289

牛用腸溶性生菌剤カプセルが牛の腸内細菌相に与える影響

データはMG-RAST（https://metagenomics.anl.

の16S rDNAと，JCM 1099の16S rDNAのバンド

gov/）で解析を行った。データの帰属分類群推

位置が近接しており，１回のDGGEでは明瞭な鑑

定 は Ribosomal database project（RDP）を 利 用

別が不可能であったため，JCM 1099 16S rDNAした。

の位置を含む領域をアクリルアミドゲルから切り

2.3

出し，DNAを抽出した。この抽出DNAを鋳型と統計解析

各個体を変量効果，投与後経過時間と処理区をし て ，ネ ス テ ッ ド PCR と ２ nd DGGE を 行 い ，

固定効果として，一般化線形混合モデルで統計解

JCM 1099の16S rDNAの検出を試みた。ネステッ析を行った。解析はR statistical software（version

ドPCRには，JCM 1099の16S rDNA PCR産物塩

3.1.0；www.r-project.org）を使用した。

基配列（データ省略）を用いて，データベース上の 既 知 L.coryniformis 塩 基 配 列（Accession No.

３．結果と考察48hrs.

24hrs.

0hrs.

48hrs.

つ物中での生存性を，乳牛排せつ物培地を用いた

JCM1099
supplemented
cultureNegative
control
24hrs.

Marker

牛排せつ物由来の乳酸菌（JCM 1099）の排せ

0hrs.

菌培養試験

Positive control(JCM1099)

3 . 1 実験１：乳牛排せつ物培地を用いた乳酸培養試験で確認した。培養試験後のDNA抽出サ
ンプルのDGGE結果をFig.１に示す。JCM 1099は培養開始後48時間まで，死滅することなく検出することができた。ただし，培養開始直後と比較して，24時間後，48時間後ではバンドが薄くなっていることから，その生存数はやや減少傾向にあると考えられる。JCM 1099が牛排せつ物から採取，単離された菌であることと，この乳牛排せつ物培地を用いた乳酸菌培養試験の結果を合わせて考慮
すると，プロバイオティクスとして投与した場
合，一定期間，腸内で生存することが可能と推察された。そこで，以後の試験にもJCM 1099を用いることとした。なお，加熱殺菌した菌を用いて，同様の培養試験を行っており，死菌のDNAは24時間以内に分解されることを確認している（デー
タ省略）
。
3.2

実験２：カプセル投与試験

JCM 1099を凍結乾燥し，カプセル化してから
牛 に 投 与 し ，排 せ つ 物 を 継 時 的 に 回 収 し て ，
DGGE法で投与乳酸菌（JCM 1099）の16S rDNA検出を試みた。しかし，投与対象牛の常在乳酸菌

Fig. 1 Result of denaturing gradient gel electrophoresisof the PCR product that amplified 16S rDNA region
V7-8. DNA was extracted after static batch culture
fermentation. Negative control was not
supplemented any lactic acid bacterium, andpositive control was the amplified 16S rDNA of purecultured JCM 1099. 0hrs; DNA extraction was done
immediately after starting static batch culture
fermentation. 24hrs. and 48hrs; DNA extraction was
done after 24hours or 48hours later.

© The Ito Foundation

290

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

KP189215.1）と比較して２塩基の挿入があった

Markerの16S rDNAを検出した（Fig.２）。排せつ物から

cow Nos.4
Positive control(JCM1099)

与牛２頭のうち，１頭の排せつ物から投与乳酸菌

cow Nos.3

cow Nos.1にプライマーを設計した。その結果，カプセル投

cow Nos.2

capsulecontrol admin.

部位（塩基番号1012-1026）に３’末端がくるよう

JCM 1099の16S rDNAが検出できたのは，試験開始後６日目のサンプルだけであった。この理由
は，JCM1099は排せつ物中で死滅しにくいものの，増殖する能力を有しなかったために，排せつ物中の菌濃度が低くなっていたことによると考えられる。
腸内細菌相全体に占める乳酸菌割合とその変化を明らかにするため，次世代シーケンサを用いた
メタゲノム解析を実施した。各サンプルから，平
均147種の属が検出された（Table１）。相対存在比が0.5％以上の主要な19属について，投与期間中の相対存在比の変化をTable２に示す。有意差検定
は，各牛個体（No.１-４）を変量効果，経過時間と処理区を固定効果とした比較を一般化線形混合モデルで行った。RuminococcusとParaprevotella
では，それぞれの属が腸内細菌相に占める割合の経時変化について，試験区，対照区間に差があり（p<0.01）, Prevotella と Phaeocystis, Alkaliphilus
では，それぞれ差がある傾向が見られた（順にｐ＝0.0578，ｐ＝0.0517，ｐ＝0.0837）。Ruminococcus
は，対照区で試験開始前を基準とした相対値が投与期間を通じて増減しないのに対して，乳酸菌をカプセル化して投与した試験区では，明瞭に増加した。また，Paraprevotellaでは，対照区で減少

Fig. 2 Result of denaturing gradient gel electrophoresisof the PCR product that amplified 16S rDNA region
V7-8. DNA was extracted from the excrement ofsix days after the administration. Control; blank
capsule and freeze dried JCM 1099 powder wereadministered. Capsule admin.; Capsuled JCM 1099
was administered. Arrow head shows the 16S rDNA
of JCM 1099.

Table 1 average number of detected genera

しているのに対して，試験区では変動しなかった。

animalNos．

このことから，カプセル化乳酸菌の投与が，腸内

1

細菌相の一部の属の構成比に影響を与えることが2示された。一方，JCM 1099が属するLactobacillus

3については，区間に有意な差は見られなかった

4（ｐ＝0.7273）。これは，乳牛排せつ物培地を用い

a Control

treatment a

control
JCM 1099
capsuleadmin．

© The Ito Foundation

No. of average
detected
genera175,116140

79,300147

103,446150

74,872147

was administrated freeze dried JCM 1099 powder

and blank capsule.

た乳酸菌培養試験の結果のように，JCM1099が排No. of averagesequence
reads

291

牛用腸溶性生菌剤カプセルが牛の腸内細菌相に与える影響
Table 2 Changes of relative value of different bacterial genera
Relative value of abundances against to before administration
bacterial genera

treatmenta

day
1

day
2

day
3

day
4

day
5

day
6

day
7

day
8

Ruminococcus

capsuleadmin.

1.74

1.38

1.60

2.77

2.08

2.38

2.26

4.49

control

0.93

0.73

1.20

1.41

1.78

1.23

1.05

0.86

Paraprevotellacapsuleadmin.

0.21

0.44

1.11

0.96

0.98

0.85

0.76

0.77

control

1.37

0.71

0.52

0.54

0.44

0.15

0.21

0.48

Prevotellacapsuleadmin.

1.03

0.97

0.76

0.66

0.65

0.58

0.58

0.49

control

0.83

2.30

1.52

1.17

1.21

1.59

1.17

1.79

Phaeocystis

capsuleadmin.

0.83

0.83

0.77

0.68

0.86

0.72

0.61

0.60

control

0.91

1.03

0.62

0.86

0.95

1.16

0.99

1.06

Alkaliphilus

capsuleadmin.

0.94

0.92

0.89

0.96

1.20

1.05

0.96

1.14

control

0.70

1.38

2.27

1.87

1.29

2.04

1.49

2.46

Eubacterium

capsuleadmin.

0.79

0.71

0.89

0.76

1.07

0.98

0.92

0.78

control

1.14

0.82

2.37

2.22

1.22

2.01

2.30

1.30

Clostridium

capsuleadmin.

1.14

1.31

1.12

1.38

1.12

1.04

1.25

1.04

control

1.16

1.49

0.76

0.73

1.14

0.68

1.17

1.35

Bacteroides

capsuleadmin.

0.96

0.88

0.91

0.77

0.69

0.60

0.85

0.57

control

1.19

1.07

0.82

0.74

0.63

1.02

1.07

1.13

unclassified（derived from
Clostridiales）

capsuleadmin.

1.17

1.33

0.94

1.13

0.81

0.90

0.93

0.90

control

1.22

1.13

0.79

0.80

1.02

1.08

0.91

1.17

Chloroidium

capsuleadmin.

0.44

0.82

0.83

0.59

0.85

0.00

0.62

0.61

control

0.89

1.01

0.68

0.85

0.91

0.38

0.90

1.02

Alistipes

capsuleadmin.

1.23

0.96

1.09

0.95

0.91

1.01

1.03

0.73

control

1.19

0.95

1.42

0.90

0.81

0.90

0.97

0.89

capsuleadmin.

0.87

0.80

0.90

1.47

1.15

1.21

1.10

1.14

control

0.70

1.03

1.19

1.51

1.07

1.53

1.09

1.19

unclassified（derived from
Ruminococcaceae）
Porphyromonas

capsuleadmin.

0.99

1.12

0.89

0.84

0.66

0.88

0.75

0.70

control

1.41

1.27

0.87

1.09

0.95

1.03

0.88

0.85

Ethanoligenens

capsuleadmin.

1.04

1.27

1.02

1.06

1.07

1.62

1.12

1.29

control

0.80

0.77

0.53

1.13

0.85

1.06

0.96

1.13

capsuleadmin.

0.83

0.71

0.83

0.68

0.68

0.86

0.62

0.83

control

0.78

1.03

0.75

0.74

0.87

0.87

0.88

1.13

capsuleadmin.

1.13

1.22

1.11

1.07

1.03

0.93

1.04

0.70

control

0.67

0.99

0.83

0.81

0.69

0.70

0.84

0.86

capsuleadmin.

1.16

1.36

1.40

1.26

1.47

1.66

1.34

1.82

control

0.83

0.42

1.40

0.58

1.06

0.66

0.42

1.36

capsuleadmin.

1.68

1.02

0.91

0.94

1.08

1.64

0.85

1.01

control

1.63

1.38

0.75

0.84

2.18

2.79

1.69

1.13

unclassified（derived from
Peptostreptococcaceae）
Acetivibrio

Selenomonas
unclassified（derived from Bacteria）
Lactobacillus

capsuleadmin.

0.98

0.69

0.72

1.23

0.81

0.88

1.32

1.00

control

0.76

1.06

1.40

0.87

1.37

0.90

0.79

1.24

aControl was administrated freeze-dried L. coryniformis spp.（JCM 1099）powder and blank capsule.
b†，0.05＜ｐ＜0.1；＊＊，ｐ＜0.01© The Ito Foundation

significant
differenceb
＊＊

＊＊

†

†

†

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

n.s.

292

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

せつ物中で長く生存することが困難なことから，
1.5

投与後，腸内に定着，増殖することができなかったことに起因すると考えられる。Lactobacillusで-0.2

死滅していく一方で，毎日投与されることで，試PCO2対存在比が変化した理由は，JCM 1099は腸内で0.7

はなく，RuminococcusとParaprevotellaなどの相のことが菌対菌の直接的，あるいは宿主免疫機構-1.0

験期間内は一定数が常に腸内に存在しており，そ-1.8

やその他の菌を介した間接的な相互作用をもたらしたと推察される。
さらに，MG-RAST serverを用いて主成分解析を行った結果，カプセル投与前（Nos.1-2；▽，
Nos.3-4 ； ▼）と カ プ セ ル 投 与 終 了 後 ７ 日 目（Nos.1-2；△，Nos.3-4；▲），ブランクカプセル
およ び 粉 末 化 JCM 1099を投与している対照区（Nos.1-2；◇）のサンプルのプロットは主成分１と主成分２に広く分布しているのに対して，カプセル化したJCM 1099を投与している期間の試験区（Nos.3-4；■）のプロットは，主成分２の上方に集中し，他のプロットと区分できる傾向にあっ

-1.3

-0.5

0.07

0.7

1.4

PCO1

Fig. 3 Principal component analysis of the bacterial

composition.
 Each sample is shown in a different symbol
according to ▽ and ▼；before administration ofcapsules， △ and ▲；7 days later of finishingadministration，◇；treated with blank capsulesand powdered JCM 1099 separately（control）and■；administrated with enteric capsules, containing
powdered JCM 1099. Furthermore, animal Nos.1-2（control） are shown in white and Nos.3-4（administrated with enteric capsules, containing
powdered JCM 1099）are in black.

た（Fig.３）。これは，カプセル化したJCM 1099の投与により，腸内細菌相が，その他の細菌相と異なる，一定の細菌構成に収束する傾向にあったことを示唆するものである。

４．謝辞

本研究を実施するにあたり，実験の手法や分析

L.coryniformis spp.（JCM 1099）の カ プ セ ル

に関する御指導をいただきました北海道大学人獣投与によってRuminococcusとParaprevotellaの相共通感染症リサーチセンターの鈴木定彦教授，中対存在比が有意に増加し，主成分解析ではカプセ

島千絵准教授に深謝いたします。

ル投与区と対照区で区分できる傾向にあった。この結果から，反芻胃を有するため，経口摂取した

５．要

約

乳酸菌が死滅するとされる牛においても，乳酸菌

本研究では，反芻胃を通過可能な腸溶性カプセ

をカプセル化して投与することで，腸内細菌相にルに充填して経口投与した乳酸菌が牛の腸内細菌

変化をもたらし得ることが明らかになった。この相 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た 。 Lactobacillus

牛用腸溶性カプセルは，牛用のプロバイオティス

coryniformis subsp.（JCM 1099）3＊10^11cfuを含の可能性を示すものである。

有する腸溶性カプセルを泌乳牛に１日１回，７日間経口投与した。投与後24時間ごとの排せつ物からDNAを抽出して，投与した乳酸菌16S rDNAの© The Ito Foundation

牛用腸溶性生菌剤カプセルが牛の腸内細菌相に与える影響

検出と，腸内細菌相の変化を検討した。投与乳酸菌の16S rDNA検出は変性剤濃度勾配ゲル電気泳動 法 で 行 い ，カ プ セ ル 化 し た L. coryniformis
subsp.を投与した乳牛２頭のうち１頭から，投与
菌16S rDNAを検出した。一方，凍結乾燥した同量の菌粉末とブランクカプセルを投与した対照区
では，検出されなかった。腸内細菌相については，
次世代シーケンサを用いたメタゲノミクス解析を行 っ た 。カ プ セ ル 投 与 区 と 対 照 区 の 間 でLactobacillusの相対存在量の変化は見られなかっ
たが，RuminococcusとParaprevotellaでは有意な変化があった。さらに，主成分解析では，カプセ
ル投与区と対照区は主成分２により分離できる傾向にあった。以上から，腸溶性カプセルを用いて，乳酸菌を投与することで，牛の腸内細菌相を変化させ得ることが示された。

293

文
献
１） Andersson, H., Asp, N. G., Bruce, A., Roos, S.,
Wadstrom, T., Wold, A. : Journal of Nutrition，45，
58～75，2001．
２） Szajewska, H., Mrukowicz, J. : Journal of
Pediatric Gastroenterology and Nutrition，33，17～
25，2001．
３） Sanders, M. : Nutrition reviews，61（３），91～
99，2003．
４） Macha, M., Taras, D., Vahjen, W., Arini, A., Simon
O. : Archives of Animal Nutrition，58（６），443～
452，2004．
５） Timmerman, H. M., Veldman, A., van den Elsen,
E., Rombouts, F. M., Beynen, A. C. : Poultry
Science，85（８），1383～1388，2006．
６） Wang, Y., Tian, Z., Yao, J., Li, W. : Aquaculture，
277，203～207，2008．
７） Wang, C., Han, H., Gu, X., Yu, Z., Nishino, N. :Animal Science Journal，85，32～36，2014．
８） Adachi, T., Seyama, T., Hirayasu, H., Kasai, K.,
Fujitani, Y. : Japanese Patent Application No.017200/
PCT JP2015 052754, granted 31 January 2014．
９） Rycroft, C., Jones, M., Gibson, G., Rastall, R. :Journal of Applied Microbiology，91，878～887．
2001．
10） Lopez, I., Ruiz-Larrea, F., Cocolin, L., Orr, E.,
Phister, T., Marshall, M., Vander Gheynst, J., Mills, D.
: Applied and Environmental Microbiology，69（22），6801～6807，2003．
11） Kindworth, A., Pruesse, E., Schweer, T., Peplies, J.,
Quast, C., Horn, M., Glockner, O. : Nucleic Acids
Reserch，1～11，2012．

© The Ito Foundation

294

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用
Establishment of reverse genetics system for animal coronavirus

神

谷

亘

（大阪大学微生物病研究所感染症国際研究センター臨床感染症学研究グループ）

Wataru Kamitani（Laboratory of Clinical Research on Infectious Diseases, Research Center for Infectious Disease Control, Research Institute forMicrobial Diseases, Osaka University）

Coronaviruses are an enveloped virus carrying a long（～ 27kb）, single-stranded, positivesense RNA genome. Coronaviruses have been identified in mice, chickens, pigs, dogs, cats, andhumans. Coronaviruses are associated with respiratory, enteric, hepatic, and central nerves
system disease. Reverse genetic system is important and useful tool in Virology filed. However,in coronaviruses, the reverse genetic system is difficult to handle due to the long RNA genome.
Porcine Epidemic Diarrhea virus（PEDV）, which belongs to the genus alphacoronavirusis in
the family Coronaviridae, is the etiological agent of porcine epidemic diarrhea. Our purpose isto establish the reverse genetic system for PEDV to understand viral replication andpathogenesis of PEDV. For the system, we chose the Bacterial Artificial Chromosome（BAC）
to make the infectious clone. We amplified six cDNA fragments from PEDV（CV777 strain）
RNA and the fragments were sequentially cloned into BAC to generate the PEDV infectious
clone. Our PEDV infectious clone is useful to understand the replication and pathogenesis of
PEDV.

１．目

の感染は終息した。MERSコロナウイルスは，中的東地域でいまだにその感染が拡大しており，致死

近年，コロナウイルスによる感染症は，医学領率は30％以上であると報告されている。

域および獣医学領域において重要な感染症の１つ

一方，獣医学領域では，犬，牛，鳥などでコロである。医学領域においては，2002年度に発生しナウイルス感染症が知られている。2014年より国た重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS

内において豚流行性下痢症の原因ウイルスである

コロナウイルス），その10年後の2012年度に中東

PEDVの発生が問題となっている。

地域で発生している中東呼吸器症候群コロナウイ

ウイルス学領域においてウイルスゲノムに任意ルスが知られている。SARSコロナウイルスは世の変異を導入できる遺伝子操作系は，いまや基礎界中にその感染が拡大したが，幸運にも１年でそウイルス学に必須の方法である。しかしながら，© The Ito Foundation

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用

コロナウイルスは遺伝子ゲノムとして約30,000塩基のRNAを保有するため，コロナウイルスを用

２．方

295

法

いた遺伝子操作系は非常に困難であり，ごくわず

2.1

かのグループからの報告のみである

PEDVのCV777株を感染させた培養上清から，

。

１，２）

材料とコンストラクト

動物コロナウイルスの中でも，アウトブレイク

TRIzolを用いてウイルスRNAの抽出を行った。

している豚流行性下痢症コロナウイルス

抽出したウイルスRNAを用いて，SuperScriptII（PEDV）は，一度発生するとその経済損失は大（Invitrogen）にてウイルスcDNA合成を行った。

きく養豚業界においてコントロールしなければな

合成したcDNAを用いてTable１で示すPrimerをらないウイルス感染症の１つである。PEDVは，

用いてPEDVの遺伝子断片を順次合成した。各

コロナウイルス科αコロナウイルス属に分類さPEDVの遺伝子断片をサイトメガロウイルスのプれ，ワクチンは存在するが，それでもなお，発生ロモーターとBGHポリＡシグナルの間に挿入ししているのが現状である。

た。さらに，完全長のPEDV cDNAの３’末端に

PFDVによる感染予防あるいは感染防御のためは25塩基のA（polyA-25）を付加し，BGHポリには，PEDVのウイルス学的性状ならびに分子生

ＡシグナルとpolyA-25の間には，Ｄ型肝炎ウイ

物学的特徴を理解することが必須である。しかしルス由来のリボザイム配列を挿入することで，サながら，前述のようにコロナウイルスに対する遺イトメガロウイルスのプロモーターによって合成

伝子操作系は困難であり，PEDVに関する遺伝子されるPEDVの完全長のRNAの末端に余分な塩操作系はごく限られた報告しか存在しない 。

基配列が付加されないように構築した。各遺伝子

３）

そこで，本研究課題では，PEDVの遺伝子操作系 の 確 立 を Bacterial Artificial Chromosome

断片は内部の制限酵素サイトを用いることで，
PEDVの完全長のcDNAを構築した。

（BAC）シ ス テ ム を 用 い て 完 全 長 の PEDV の

2.2

大腸菌へのBACの形質転換

cDNAクローンの作製を試みる。

PEDVの各遺伝子断片とBACを制限酵素で処Table 1 Primer used for construction of PEDV infectious clone
Primer namePrimer Sequence

PEDV15’-cgcaatggtaccATCGATGTTAACAAAACACTT-3’PEDV25’-GAGCTCGCTTGCGGCCGCTCCTCCACTCTGGGATGTCTT-3’PEDV35’-TAGGTACAGTGGATCCTATACGTTTT-3’PEDV45’-TAAGCAGTGGAGGCCTTCACACAGAG-3’PEDV55’-CTCTGTGTGAAGGCCTCCACTGCTTA-3’PEDV65’-CCTGACCAGAATCGATGTAGCTGAGA-3’

PEDV75’-TCTCAGCTACATCGATTCTGGTCAGG-3’PEDV85’-TTTTGTTAACATCGATGTAATCTGGG-3’

PEDV95’-gtacagGGCGCCACTTAAAAAGATTTTCTATCTACG-3’

PEDV105’-GAACATCAATACGCGTGTAACGATGA-3’

PEDV115’-TCATCGTTACACGCGTATTGATGTTC-3’

PEDV125’-CTCAGGCCTAAAACGTATAGGATCCACTGTACCTA-3’© The Ito Foundation

296

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

理した後，約150ngのBACに対して，モル比でBigDye v1.1を用いて塩基配列を確認した。

１ ： ３ の PEDV の 遺 伝 子 断 片 を T4 ligase

次に，PEDVの27221塩基から28033塩基までを（TAKARA）を用いて，16℃でO/Nで反応を行っ人工遺伝子合成（Eurofine）により合成した。合た。その後，エタノール沈殿にて完全に塩を取り成した人工遺伝子合成配列とPEDVの24365塩基

除き，30ulのコンピテントセルNEB10beta（NEB）

から27222塩基の領域をPEDV１とPEDV２のプを用いてエレクトロポレーション法にて形質転換

ラ イ マ ー を 用 い て PCR を 行 い ，上 記 の BACを行った。

（pBAC_PEDV_MCS）に組み込むことで新たにエレクトロポレーションは，0.1mmギャップのキュベット（Nepagene）を用いて，1700Ｖの条
件でエポレーター（Roche）を用い行った。
2.3

pBAC_PEDV_MCS１を作製した。
次に（１番目の断片），PEDVの12493塩基から16353塩基をPEDV３とPEDV４のprimerを用いて増幅し上記のpBAC_PEDV_MCS１にBamHIとRed/ETによる相同組換え

PEDVの各遺伝子断片を制限酵素でBACに挿入するのが困難な時は，Red/ET Recombination

StuIの制限酵素を用いて挿入し，pBAC_PEDV_１とした。

System（GENE BRIDGES）を用いて行った。プ

次に（２番目の断片），PEDVの16328塩基からロトコールに従い，導入したい領域に50塩基の相20893塩基をPEDV５とPEDV６のprimerを用い同配列を持つセレクションマーカー遺伝子をPCRて増幅し上記のpBAC_PEDV_１にStuIとClaIのにより増幅し，Red/ETにより相同組換え反応を

制限酵素を用いて挿入し，pBAC_PEDV_１＋２

行った。次に，導入したい目的の配列に，50塩基とした。

の相同配列を持つ領域をPCRにて増幅し，セレク

次に（４番目の断片），PEDVの20868塩基からションマーカーと置き換わるように，Red/ETに24379塩基をPEDV７とPEDV８のprimerを用いて相同組換え反応を行った。

て増幅し上記のpBAC_PEDV_１＋２にClaIの制

2.4

Inverse PCRによる塩基配列の修復

塩基配列が報告されているCV777株と異なる場

限酵素を用いて挿入し，pBAC_PEDV_１＋２＋４とした。

合は，インバースPCR法によるmutagenesis kit

次 に（５ 番 目 の 断 片）
，PEDV の １ 塩 基 か ら（TOYOBO）を用いてデーターベースに報告され6827塩基をPEDV９とPEDV10のprimerを用いてている塩基配列になるように修復を行った。

増幅し上記のpBAC_PEDV_１＋２＋４にSfoIと2.5

MluIの制限酵素を用いて挿入し，pBAC_PEDV_

塩基配列の確認

塩 基 配 列 の 確 認 は ， Big Dye v1.1（Lifetechnologies）を 用 い て ，ABI PRISM 3100 に て

１＋２＋４＋５とした。
次に（６番目の断片），PEDVの6802塩基から12518塩基をPEDV11とPEDV12のprimerを用い塩基配列の決定を行った。
2 . 6 BACを用いたPEDV cDNAクローンの作て増幅し上記のpBAC_PEDV_１＋２＋４＋５にMluIとStuIの制限酵素を用いて挿入し，pBAC_

製手順
まず，BACにPEDVの遺伝子断片を挿入するに

PEDV_１＋２＋４＋５＋６とした。

あ た り ，BAC に ，SfoI, MluI, BamHI, StuI, ClaI

次に，PEDVのcDNAの５’末端とサイトメガロの制限酵素サイトを挿入しpBAC_PEDV_MCSをウイルスのプロモーター領域を制限酵素などの余

作 製 し た 。新 た に 付 加 し た 制 限 酵 素 の 配 列 は分な配列の付加なしに塩基配列をつなぎ合わせる© The Ito Foundation

297

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用

Sfol

Mlul
PEDV5

BamHl

PEDV6

PEDV1

Clal

PEDV2

Clal

PEDV4

PEDV3

Rsrll
A
（25） Rz

pBAC PEDV-FL

BGH

pCMV

Stul

Fig. 1 Strategy to assemble the PEDV infectious clone Six DNA fragment, generated by using PCR, were sequentially cloned into the plasmid pBelobac 11 to generate

the PEDV infectious clone（pBAC PEDV-FL）.Relevant restriction sites, pCMV promoter（pCMV）, HDV ribozyme（Rz）,BGH termination and polyadenylation sequence（BGH）are shown.

ために，Red/ET recombination systemを用いた。

Fig.１に示すようにPEDVの内部の制限酵素配なお，Fig.１で示す３断片目は，GenBankに報列を用いて，PEDVの完全長のcDNAを６つの断告されている配列（Genebank，アクセッション

片に分けた。その後，PEDVのそれぞれのcDNA

番号：AF353511.1）と異なる配列であった。そ断片をTable１のprimerを用いてPCRによって増のため，mutagenesis kit（TOYOBO）を用いて，幅し，制限酵素とligaseを用いて，BACに順番に報告されているCV777株に一致する塩基配列にな組み込んだ。
その後，挿入したPEDVのcDNA断片の塩基配るように修復を行った。
最 後 に （３ 番 目 の 断 片） を ， Red/ET
recombination systemを用いて，４番目の下流に列をシークエンスにより確認した。
今回用いたCV777株由来のサンプルにおいては，データーベース（Genebank，アクセッショ

挿入した。

ン番号：AF353511.1）に報告されているものと

３．結果と考察

以下の塩基配列が異なっていた。

今回，Bacterial Artificial Chromosome（BAC）

まず，はじめに，Ｓ遺伝子とORF３遺伝子のを用いて，豚流行性下痢症ウイルス（PEDV）の間に52塩基の欠損が認められた。この欠損によりCV777株を元に，感染性クローンの構築を試み

ORF３遺伝子が発現できなくなるため，inverse

た。感染性クローンは，PEDVの完全長cDNAの５’PCRを用いて欠損領域を修復した。

末端にサイトメガロウイルスのプロモーター配次に，34番目の塩基がＣからＴ，72番目の塩基列，そして，３’末端にBGHのポリＡシグナルをのＡが欠損，89番目から92番目の塩基TTCCが欠

挿入することで，培養細胞内でサイトメガロウイ

損，22156番目の塩基がＣからＴ，23323番目の塩

ルスのプロモーターから完全長のPEDVのmRNA基がＧからＡ，24461番目の塩基がＡからＣ，が産生される。さらに，PEDVのcDNAの３’末端26940番目の塩基がＣからＴへと変わっていた。

にＤ型肝炎ウイルスのリボザイム配列を挿入する

上記の欠損に関しては，PEDVのcDNAをクことで，25塩基のポリＡ配列を持つウイルスのローニング中に欠損したのか，あるいは，今回使

mRNAが培養細胞内で産生されるように構築し用したウイルスストックにすでに塩基の欠損が生た。

じていたのか，今後検討を進めて完全長のcDNA© The Ito Foundation

298

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

クローンを作製する必要があると分かった。

グループのみで成功している。豚流行性下痢症の今回，PEDVの完全長cDNAをBACに挿入する

原因ウイルスであるPEDVの感染は畜産業界に大ことができた。しかしながら，上述の欠損が認め

きな経済損失をもたらす。このPEDVの遺伝子操られたため，現在，Red/ETによる相同組換えシ作系を確立することは，PEDVのウイルス学的特ステムを用いて，欠損領域の修復を行っている。

徴および性質を理解するうえで必要な技術である。

今後，修復が完了後，pBAC_PEDV_FLを培養細今回，我々はBacterial Artificial Chromosome

胞に導入して組換えウイルスの回収を行う予定で（BAC）システムを用いて，PEDVのCV777株のある。

全長をBACに挿入することができた。今後，こ今回，用いたBACによるコロナウイルスの感のPEDVの感染性クローンとRed/ETによる相同染性cDNAの作製方法は，一度，BACに挿入した

組換えにより，任意の変異を加えた変異PEDVの後は，遺伝子の変異などが認められず，非常に安作製ならびにGFPなどの各種レポーター遺伝子を定してコロナウイルスのcDNAを保持できる方法

有するレポーターPEDVの作製を行うことによであり，Red/ETの相同組換えシステムと組み合り，PEDVの複製阻害薬のスクリーニングおよびわせることで，非常に簡便にGFPなどの外来遺伝

ワクチン候補の選択に役立つと思われる。

子を任意の場所に挿入できることが期待できる。
４．要

約

コロナウイルスは，遺伝子ゲノムとしてRNAを有し，ヒトおよび動物において重要なウイルス
感染症である。コロナウイルスは，RNAウイル
スの中で最長のおおよそ30,000塩基を有するエン
ベロープウイルスである。コロナウイルスの遺伝子操作系は，その取扱いが煩雑で，ごく限られた文献１） Yount, B., Curtis, K. M., Fritz, E. A., Hensley, L. E.,
Jahrling, P. B., Prentice, E., Denison, MR., Geisbert, T.
W., Baric, R. S., Proc Natl Acad Sci USA，100（22），12995～13000，2003．
２） Almazán, F., Dediego, M. L., Galán, C., Escors, D.,
Alvarez, E., Ortego, J., Sola, I., Zuñiga, S., Alonso, S.,
Moreno, J. L., Nogales, A., Capiscol, C., Enjuanes, L.,
J Virolo，80（21），10900～109006．
３） Chunhua Li, Zhen Li, Yong Zou, Oliver Wicht,
Frank J M van Kuppeveld, Peter J M Rottier,
Berend Jan Bosch, PLos one，8，e6997，2013．

© The Ito Foundation

299

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討
Prediction technique of parturition by IR depth sensor in beef cattle

小

針

大

助・岡

山

毅

（茨城大学農学部）

Daisuke Kohari and Tsuyoshi Okayama（Colloge of Agriculture, Ibaraki university）

Prediction of parturition time in breeding cattle using some predictive instruments is
helpful for breeding support. Although many sensors put on an animal’s body can facilitate
prediction of their parturition from changes of some pre-parturition behaviour, a more direct
and non-invasive sensing method was formulated using IR depth-sensor cameras. This study
clarified the sensing accuracy of IR depth sensor camera systems for assessing the preparturition behaviour of breeding cattle. Eight cattle delivered between May and November
2014 to the Field Science Center of Ibaraki University were used as subject animals. Two video
cameras and an IR depth-sensor camera were placed at the calving pen. The authors observed
four 24-h periods of pre-parturition behaviour such as posture change（standing, lying down）,
circling, tail lifting, and turning the head to the abdomen. The frequencies and percentages ofthese behaviours were calculated from the video observation data. Furthermore, these datafrom video and IR depth-sensor camera were compared and were used to calculateconcordance rates. Data were analyzed using software（R ver. 3.1.2; The R Foundation for
Statistical Computing）. The posture change frequency and the percentage of walking wereincreased 6 h before calving. Tail lifting was increased 5 h before calving. Turning the head tothe abdomen was increased 3 h before calving. Posture, circling and turning the head to theabdomen concordance rates were 90-100％．However, that of tail lifting decreased during 4 h
before calving because their condition exhibited some differences. These results demonstratethat the IR depth-sensor camera had high accuracy for detection of pre-parturition behaviourof cattle. Detection of tail lifting requires more definition to discriminate their conditions..

１．目

やかな管理により，輸入牛肉と和牛肉との質的差

的別化路線がとられてきた。しかしTPP交渉の結果

1991年の牛肉の輸入自由化以降，我が国の肉牛

によっては，関税が著しく低い値まで下げられる生産においては，高脂肪交雑系統の育種改良の増との報道もあるように，近年，日本の肉牛生産を進とそれぞれの系統の生産特性に合わせたきめ細めぐる状況は，一層厳しくなりつつある。加えて，© The Ito Foundation

300

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

担い手である農業就業人口は，昭和35年以降減少

では，動物の立体的な体型の経時的変化や分娩前の一途をたどっており，その高齢化も進んでいにおける特徴的な行動の変化をリアルタイムで数る。一方で，１戸あたりの飼養頭数は年々増加し値情報として直接捉えることが可能である。今回ていることから，これからの我が国の肉牛農家には，まず対象となる分娩前行動の挙動をモニタリ

は，飼養頭数の増加に対して現在の品質を維持しングし，次いでそれらの赤外線深度センサーによつつ，これまで以上に効率的かつ精密な管理が求る記録を試みた。

められているといえる。１頭あたりの生産単価の高い肉牛の生産においては，そのもととなる子牛２．方法の確実かつ効率的な生産が不可欠であるが，その2.1

中でも分娩時の事故は，子取り生産における大き調査は茨城大学付属フィールドサイエンス教育な問題の一つとなっている。特に逆子や難産時に研究センターの牛舎で行った。供試牛は，黒毛和は分娩介助が不可欠となることから，分娩予定日

種繁殖牛８頭で，分娩予定日の１～２週間前に通の前後は立ち会いに備えて繁殖牛の観察に気を配常飼育している妊娠牛群から奥行4.0ｍ，幅3.0ｍ

る必要がある。しかし，分娩は必ずしも予定どおの分娩房に移動し，調査に供した。給餌は１日１りに行われるケースばかりでなく，数日間にわ

回16時に乾草・デントコーンサイレージ・濃厚飼たって注意しなければならないことや実際に分娩料を給餌した。

供試牛と飼養方法が始まったとしても，人が寝静まった夜間に始ま2.2ることも多く，農家にとっては非常に労力が大き

本研究で使用した赤外線深度センサーカメラ

い作業となっている。まして前述のような飼養者（以下深度センサー）はASUS社製のXtion PROの高齢化に加えて，１戸あたりの飼養頭数の増加

LIVEであった。本深度センサーは，主に赤外線

は，分娩監視業務にとってさらなる負担となって照射部と深度センサーの２つの部分からなり，照おり，喫緊に対策が不可欠となる問題であると考射部から無数の赤外線レーザーを一様に照射し，えられる。

深度センサーカメラで照射範囲内の各反射光の分調査に使用した機器と設置方法

そこで本研究では，近年急速に低価格化が進ん

布の歪みを読み取ることから，対象の３次元情報で い る 赤 外 線 深 度 セ ン サ ー カ メ ラ（IR depthを得るものである。したがって，深度センサーは，

sensor camera）という３次元情報を取り扱うこ対象となる分娩房が撮影範囲内に収まるように，とが可能なセンサーカメラを使用し，繁殖和牛を床から高さ3.5ｍの位置に設置した。またデータ対象とした簡易かつ高精度の分娩予測技術の確立

記録のために防塵ケースに入れたノートパソコンのための研究を行った。牛の分娩予測の指標とし（U24A-PX3210R，ASUS社製）を設置した。さては，これまでにも分娩直前における仙骨靭帯のらに各行動の肉眼観察用に，分娩房の床から2.8変化や尾挙上運動の出現１），体温の低下２）や活動

ｍの位置にある牛舎の梁に赤外線暗視カメラ

量の増加，乳房の張り具合の変化などが知られて（S643TDN，株式会社ワイケー無線製，以下暗視おり，従来は１日何回かの肉眼観察やそれらを計カメラ）も２台設置した。

測するためのセンサー類を牛体に設置してモニタ2.3リングする手法が考えられてきた。しかし，我々暗視カメラと深度センサーによる録画は，分娩が応用を検討している赤外線深度センサーカメラ

予定日の約１週間前から開始した。暗視カメラは© The Ito Foundation

分娩前行動の録画と観察方法

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討

301

30フレーム／秒で，深度センサーは１フレーム／られた（Median：13.0回／ｈ，Mean：12.9回／ｈ）。

５秒で録画した。録画したデータのうち，分娩前

このように，行動型が大きく変化し，特に分娩至24時間分を解析に用いた。カメラデータはパソコ

近時にから急増するといった量的変化は，深度センの動画再生ソフトで，深度センサーデータはンサーで検知しやすいものと考えられた。

Processingを使用して，深度情報をカラースケー

一方，回転頻度は，分娩３時間前まではほとんル画像として生成し，観察を行った。調査項目はど見られなかったが，３時間前に中央値で１回／分娩房内での姿勢変化（立位・伏臥），回転（分ｈ（Mean：０ 回 ／ ｈ）
，２ 時 間 前 に 2.5 回 ／ ｈ

娩房内を旋回する行動），尾挙げ，屈曲（頭部を（Mean：0.8回／ｈ）と増加した。島根県畜産技

腹部側に向ける行動）の４項目とし，暗視カメラ

術センターの報告５）では，２時間半くらい前から

ではそれぞれの開始・終了時刻を，深度センサー

10数回以上見られるとのことであったが，本結果

では録画時に対象行動の実施の有無を記録した。

では，頻度上昇は見られたものの，その値はわず

2.4

統計解析

かであり，指標としては慎重に見極める必要があ

深度センサーおよび暗視カメラによる分娩前24るものと考えられた。

時間の各行動反応のデータは１時間ごとに集計し尾挙げ割合は，分娩前24～６時間前は中央値0.7た。なお，姿勢変化と回転，屈曲は１時間あたり～4.8％の間でほぼ一定に推移したが，その後，の出現頻度，尾挙げについては１時間あたりの出

５ 時 間 前 か ら 増 加 し 始 め（Median ： 6.9 ％，

現割合として算出した。また深度センサーの検知

Mean：25.2％），３時間前には８頭中６頭で，１精度確認のため，深度センサーと暗視カメラ両方

時 間 の 尾 挙 げ 割 合 は 50 ％ を 超 え（Median ：で撮影ができた個体について，５秒ごとの行動の72.5％，Mean：67.5％），２時間前には８頭中７実施・不実施を記録し，１時間ごとに結果の一致

頭（Median：100％，Mean：94.8％）で100％，率を算出した。データ解析にはＲ（version3.1.2）

１ 時 間 前 に は す べ て の 個 体 で 100 ％ と な っ たを使用した。

（Median：100％，Mean：100％）。また，尾挙げ割合は20～40％以上になると分娩まで持続的に実３．結果と考察
3.1

施されており，これを検知することにより，早く分娩前における母牛の行動変化て２時間以内に分娩がおこることが予測できる可

姿勢変化の頻度は，分娩24～７時間前にかけて能性が考えられた。

は，中央値が5.5～14.5回／ｈの範囲を推移したが，屈曲頻度は，分娩前24～４時間前の中央値は5.5

Miedema ら（2011） や ，Jensen（2012） と 同～18.5回／ｈと個体によって大きく異なった。３様に，分娩６時間前付近から徐々に中央値の上昇

時間前の中央値は20.5回／ｈ，２時間前は26.5回

が 見 ら れ は じ め た （Median ： 18.5 回 ／ ｈ ，／ｈ，１時間前は34回／ｈに増加した。しかし第Mean：23.9回／ｈ）。また，３時間前には一度低

一四分位範囲と第三四分位範囲の差は３時間前で下したが（Median：20.5回／ｈ，Mean：36.3回

36回，２時間前で13.5回，１時間前は30.5回と大／ｈ），２時間前に再び上昇し，８頭中６頭で１

きく，明確な増加傾向が認められるのは分娩１時

時間に５回以上姿勢が変化するようになった

間前くらいからであった。Jensen（2012）４）は，（Median：6.2回／ｈ，Mean：7.7回／ｈ）。１時

分娩２時間前から頻発すると報告しているが，個間前にはすべての個体で９回以上の姿勢変化が見

体差も大きく，この行動単体ではなく他の行動と３）

４）© The Ito Foundation

302

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

を目視で判別したものとの一致率を見ただけであの関係から判断する必要性も考えられた。
3 . 2 赤外線深度センサーによる分娩前行動のり，本来の利点である深度センサーの３次元情報を十分に活かしきれていないという問題もあっ

検知
牛舎の電圧の低下や停電などにより，一部の深た。特に尾の挙上状態には様々な段階があり，判度センサーデータの取得に失敗したため，データ

別には工夫が必要と考えられたが，これこそ本来が取れたのは３頭のみであった。それぞれの行動

３次元情報を扱う深度センサーの真骨頂である。

について，暗視カメラと深度センサーによる取得

現在，各種行動判別のため深度センサーで得られデータの１時間あたりの一致率を算出した結果，た３次元情報に基づく牛の骨格認識プログラムの姿勢変化で99.7％，回転で97.7％，屈曲について開発を試みており，今後それぞれの尾の挙上状態

は93.4％とやや落ちるが，それぞれ比較的高い精の情報と合わせて解析することにより，尾挙げ行度で行動が検知できていることが明らかとなった。

動の検知精度の向上が図れるとともに，より高精

一方，尾挙げについては，分娩４～２時間前に度な行動判別法の開発ができるものと考えている。

一致率が著しく低下した。特に２頭で分娩４時間前に15.0％と47.1％，もう１頭は分娩３時間前に４．要

約

24.3％，２時間前に15.0％まで低下した。この理本研究では，３次元情報を扱うことができる赤由として，一つはそれぞれ対象となる尾が深度セ

外線深度センサーカメラを用いた和牛の非侵襲的ンサーの撮影範囲外に出てしまっていたこと，も分娩予測技術の開発を目的として，予測指標とな

う一つは日光が深度センサーに干渉したことが影る和牛の分娩前24時間の行動反応の特定と赤外線響していたと考えられた。これは深度センサーの深度センサーによるそれら行動反応の記録精度に画角や強い日射による深度センサーの赤外光受光ついての調査を試みた。今回，評価分娩前行動とへの干渉によるものであり，撮影環境の整備で今した姿勢変化および尾挙げについては，分娩５～後改善可能と考えられた。一方，前述のデータ欠

６時間前になると，それまでと比べて大きく変化

損分を除外して再計算しても，分娩２～４時間前

することから，分娩至近状況を示す有効な予測指の一致率は30～40％であった。この原因として標となりうると考えられた。一方，回転，屈曲には，尾の状態により，尾挙げと判断できなかった

ついては，出現頻度が少なかったり，明確な特徴

ことが影響していたものと考えられた。特に，排が見られず，予測指標にはしづらいと考えられ

泄後や第一破水の前で多く見られる尾の付け根がた。また，指標行動とした姿勢変化，回転，屈曲

少し牛体から離れている状態は，尾根部の挙動が行動は，いずれも赤外線深度センサーによる検知

小さいためか，カラースケール画像のみではうま

精度は非常に高かったが，尾挙げについては微妙く判別できていなかった。母牛は分娩３～４時間な挙動の変化をとらえるためにはさらなる工夫が前からいきむことが多く，ここから第一破水まで必要であると考えられた。

は，この尾の状態が長かったため，この時間の一致率が低下したと考えられた。
しかし今回は，最初の試みとして深度センサーの行動データ取得状況を確認するために，あくま
で深度情報をもとに作成したカラースケール画像

文献１） 小迫孝実，井村毅，河野道治，野田博，日本草地学会誌，37，311～312，1991．
２） 池滝孝，山口光治，石黒敏夫，鈴木省三，帯大研報，13，13～18，1982．

© The Ito Foundation

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討
３） Miedema, H. M., Cockram, M. S., Dwyer, C. M.,
Alister, M. I. Applied Animal Behaviour Science，
132. 14～19，2011．
４） Jensen, M. B. : Applied Animal Behaviour Science,
139，195～202，2012．

303５） 島根県農林技術センター，畜産技術レポート第69号
https://ssl.pref.shimane.lg.jp/industry/norin/
gijutsu/chikusan/report/tikusan_gijutsu_report.
data/69_kitaka.pdf© The Ito Foundation

304

豚流行性下痢の感染拡大リスクに関する研究
Study on risk analysis of porcine epidemic diarrhea

関

口

敏・乗

峰

潤

三

（宮崎大学農学部）

Satoshi Sekiguchi and Junzo Norimine（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

The porcine epidemic diarrhea（PED）virus, a member of the Coronaviridae family, causes
acute diarrhea and dehydration in pigs, and it was first identified in Europe in 1971. PED has
widely spread in many Asian countries from 2012 and caused economic loss due to highmorbidity and mortality in neonatal piglets. In Japan, PED cases were usually detected withsyndromic surveillance based on clinical signs and symptoms. Syndromic surveillance system
can rapidly detect disease outbreaks, but not detect subclinically infected animals. In contrast,
active serosurvey at slaughterhouse enables to detect both infected animals showing clinicalsigns and subclinically infected animals of infected farms. Additionally, systematic survey atslaughterhouse is very useful in terms of collecting samples, biosecurity and animal welfare.
Thus, the aim of this study was to perform active serosurvey to detect infected animals, and todifferentiate free farms and infected farms at slaughterhouse. Blood samples of growingfinishing pig were collected at the slaughterhouse in Kyushu area from March 2014 to July
2014. Blood samples were collected from 13 case farms and 95 non-case farms. Seropositive
animals were detected in all case farms（100％），and in 15 out of 95 non-case farms（15.8％）．
This study showed evidence for the existence of subclinical infection with PED virus in noncase farms. In addition, all case farms had infected animals showing positive results withneutralization test. These results indicate active serosurvey system at slaughterhouse is moresensitive than syndromic surveillance system and useful to detect infected farms. To
differentiate susceptible farms and infected farms is very important for control measures,
especially in prevention of cross-contamination and epidemiological analysis. The data obtained
from this study is fed back to livestock hygiene service center and meat inspection center toutilize for effective preventive measures against PED outbreak.

１．目による豚の下痢を主徴とする急性感染症で，哺乳的豚での死亡率は時に100％に達する１，２）。米国では

豚流行性下痢（PED）は，PEDウイルス感染

2013年４月から大規模な流行が続いており，31州© The Ito Foundation

豚流行性下痢の感染拡大リスクに関する研究

で発生が確認されるなどいまだ収まる気配を見せておらず，むしろ深刻化している。同年10月には我が国で７年ぶりとなる発生が沖縄県で確認さ305識別することを目的とする。
２．方法

れ，その後わずか８ヵ月で38道県に感染が拡大

2.1

し，過去最悪の37万頭以上が死亡するなど被害がこれまでの受動的サーベイランスのデータか顕在化している。PEDの防疫措置には消毒など

ら，調査対象地域を宮崎県内のＡ地域およびＢ地のウイルス侵入対策の徹底や，PED発生農場か域とした。調査対象農場は発生農場が13農場，非ら非発生農場へのウイルスの混入を防ぐために両発生農場が95農場とした。検査試料はＡ地域およ

農場間における動物の移動を自粛する等の対策がびＢ地域それぞれに所在すると畜場にて採材を実施されている 。しかしながら，いまだにPED行った。採材は2014年３月から同年７月に行った。

３）

調査対象地域ウイルスが感染拡大する要因は明らかになってお

2.2

検査試料

らず，発生農場数は増加の一途をたどっている。

１農場あたり14～30頭の肥育豚（約190日齢）

我が国や米国で認定されているPED発生農場との放血血液を採取し，４℃，2000ｇで５分遠心後，は，豚が臨床症状を示し，PEDの診断検査で陽血清を－20℃で保存した。

性となった農場のことを示す。すなわち，症状を

2.3

中和試験

確認してから検査を依頼する現行の制度（受動的56℃で30分間非動化した血清50μl にイーグル

サーベイランス）ではウイルスに感染した状態でMEMを50μl 加え，96穴プレート１ウェルあたも豚が症状を示さない農場（不顕性感染農場），

り50μl ずつ２倍段階希釈系列を作成した。各あるいは生産者が症状に気づかない農場は検査のウェルに200TCID50/50μl に調整したPEDウイル

対象にならず非発生農場として扱われる。このこスNK94株（動物衛生研究所より供与）を50μlとは動物やヒト，物の移動によって不顕性感染農

ずつ添加し，37℃で１時間，反応させた。反応後，場から非感染農場にウイルスが侵入する可能性を10％FCSイーグルMEMで３×10５ 個／mlに調整示唆している。これに対し，症状の有無に関わらしたベロ細胞KY-５株（動物衛生研究所より供ずすべての調査対象農場から豚をランダムに抽出

与）の細胞浮遊液を100μl ずつ，すべてのウェ

して検査する方法（能動的サーベイランス）でルに添加し，37℃で７日間培養した。２ウェルとは，症状にとらわれず感染状態と非感染状態を識も細胞変性効果を抑制した検体を陽性と判定し，別することができる。感染農場と非感染農場を正希釈倍率から抗体価を測定した。

確に把握できれば，移動制限の徹底が可能になる

2.4

だけでなく，両者を比較し相違点を明らかにする

データは各群の平均値，中央値および標準偏差ことでウイルスの侵入・感染拡大の原因（リスクを算出し，両群間でウィルコクスンの順位和検定因子）を明らかにすることができる。また，PEDを行い，統計学的有意差検定を行った。なお，有ウイルス感染が猛威をふるう中，依然として感染

意水準は５％とした。

統計処理を免れている農場も少なくない。このことは非感

2.5

染農場に共通した感染を防ぐ要因（防御因子）が本研究で取り扱う農場情報や試料は生産者を含存在する可能性がある。そこで本研究は，能動的む畜産関係者の同意の下，実施しているものであサーベイランスを用いて感染農場と非感染農場をり，「国立大学法人宮崎大学個人情報保護規則」© The Ito Foundation

人権の保護および法令等の遵守への対応

306

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

および「国立大学法人宮崎大学保有個人情報管理

非発生農場における陽性率は18.5％（12/65）で規定」を遵守するものである。

あった。この結果から，両地域において非発生農場の中に不顕性感染農場が存在していることが明３．結果と考察らかとなった。発生農場については両地域ともす

中和試験の結果，感染が確認された農場はＡ地

べての農場で陽性が認められた。感染農場におい域 で 25 ％（9/36），Ｂ 地 域 で 26.4 ％（19/72）でて陽性を示した個体の割合は発生農場で平均あった（Table１）。そのうち，Ａ地域での非発生

46.7％±0.25，非発生農場で平均33.3％±0.30で，農場における陽性率は10％（3/30），Ｂ地域での両群間における有意な差は認められなかった（Fig.１）。このことは，PEDウイルスに感染した

Table 1 Results of neutralization test for PED virus

infection in case and non-case farms in area A and
B
Area

Ａ

Ｂ

StatusTotalnumberof farms

Numberofpositive
farms

Numberofnegative
farms

Positive
rate

Case

6

6

0

100.0％

Noncase

30

3

23

10.0％

Total

36

9

23

25.0％

Case

7

7

0

100.0％

Noncase

65

12

53

18.5％

Total

72

19

53

26.4％

農場では症状の有無に関わらず，ウイルスが群内で伝播していることを意味している。また中和試
験の抗体価は発生農場由来の感染豚が平均で4.3±6.97，非発生農場由来の感染豚が平均で2.5±
1.00で，両群に有意な差は認められなかった。本
研究では中和試験による血清学的な検査によって感染歴の有無を診断しており，ウイルス自体の存在を証明するものではない。そのため感染リスクを直接的に評価することは難しいが，抗体価の結果から，発生農場と不顕性感染農場の感染リスクはほぼ同等と考えられた。よって，感染農場と非感染農場を明確に識別することは，衛生管理上，％非常に重要であると思われる。
現在PED発生農場の確定診断には糞便を用い80

たPCRによる遺伝子検査が用いられている。しかしながら，糞便へのウイルス排泄期間は短いた

60

め，糞便を用いたPCRによる遺伝子検査の検出感度は満足できるものではない。そこで本研究では40

中和試験による血清学的検査を用いて感染の有無を診断した。中和試験を用いれば，PEDウイル

20スに対する特異抗体が検出でき，感染の有無を正確に把握することができる。PEDワクチンは母0豚に接種するため肥育豚を調査対象とする今回のCase

Non-case

サーベイには影響がない。また，中和試験で用い

Fig. 1 Percentage of positive animals for neutralization

test in case and non-case farms. There is not asignificant difference between case and non-case
farms

る血液の採材は，作業の効率化を図るためと畜場で実施したことも本研究の特徴である。と畜場で行う大きな利点は，複数の農場の肥育豚が一か所© The Ito Foundation

豚流行性下痢の感染拡大リスクに関する研究307に集められる点にある。これにより，一度に複数とを目的とする。その結果，PED非発生農場由の農場の豚血液を短時間で入手することが可能と

来豚の中から感染豚が確認された。このことは不なる。さらに，バイオセキュリティが厳重な農場

顕性感染農場の存在を示唆し，防疫対策を強化す

では関係者を除いて場内へ入ることができない

るうえで重要なリスク因子になりうると考えられが，と畜場であればこの問題も解決される。このた。

ように，と畜場は家畜伝染病の発生を監視する上で非常に有用な場所であり，国内外において様々な家畜伝染病の監視プログラムに利用されている４，５）。今後は本研究の成果を食肉衛生検査所や家畜保健衛生所にフィードバックし，衛生管理対策の強化や疫学調査研究に活用する予定である。
４．要

約

本研究は，能動的サーベイランスを用いてPED
ウイルスの感染農場と非感染農場を識別し，衛生対策やPEDの感染拡大要因の解明に役立てるこ文献１） Chen, Q., Li, G., Stasko, J., Thomas, J. T.,
Stensland, W. R., Pillatzki, A. E., Gauger, P. C.,
Schwartz, K. J., Madson, D., Yoon, K. J., Stevenson, G.
W., Burrough, E. R., Harmon, K. M., Main, R. G.,
Zhang J. : J Clin Microbiol.，52，234～243，2014．
２） Song, D., Park, B. : Virus Genes.，44，167～175，
2012．
３） Dee, S., Clement, T., Schelkopf, A., Nerem, J.,
Knudsen, D., Christopher-Hennings, J., Nelson, E. :BMC Vet Res.，10，１～９，2014．
４） Lynch, J. A., Silva, P. : Rev Sci Tech. ，32 ，409 ～
416，2013．
５） Kaneene, J. B., Miller, R., Meyer, R. M. : Vet
Microbiol.，112，273～282，2006．

© The Ito Foundation

308

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わる
ゲノム育種価の推定
Prediction of genomic breeding values for meat color defined bymyoglobin content in longissimus muscle of Japanese Black cattle

山崎

瑞穂・戸水

一志・河野

幸雄・渡邊

敏夫＊・杉本喜憲＊＊（広島県立総合技術研究所畜産技術センター，＊独立行政法人家畜改良センター，＊＊

公益社団法人畜産技術協会附属動物遺伝研究所）

Mizuho Yamasaki, Kazushi Tomizu, Sachio Kouno, Toshio Watanabe＊ and Yoshikazu Sugimoto＊＊（Hiroshima Prefectural Technology Research Institute, Livestock Research Center，＊National Livestock Breeding Center，＊＊Shirakawa Institute of Animal Genetics）

The color of Japanese Black cattle beef influences desirability to consumers. However,breeding for this purpose has barely advanced. In Japan, beef color is evaluated using the beefcolor standard number（BCS No.）established by the Japan Meat Grading Association.
However, BCS No. is a trait which is not a continuous value but an ordered categorical data
ranging from No. 1 to 7. This trait is unsuitable for genomic analysis because it is evaluatedsubjectively based on visual inspection and tends to be classified to only three categories（No.3-5）．In addition, no genetic locus has been reported to be associated with beef color sofar. In the present study, we attempted to estimate genomic breeding values of the myoglobin（Mb）content, a major component of meat pigmentation using genome-wide SNP array data.
Mb content in the fat-free dry matter of longissimus muscles from 768 Japanese Blacksteers were determined, and SNPs were genotyped with the Illumina BovineLD or the
GeneSeek SuperLD SNP arrays. The Mb content increased as the BCS number increased. The
heritability of Mb content was estimated to be 0.43, which is higher than 0.29, the estimatedheritability of the beef marbling standard（BMS）score, suggesting that Mb content may be
used as a novel indicator for genetic improvement of beef color trait.
The genomic breeding values estimated with SNP data were strongly correlated withbreeding values estimated with pedigree information（r＝0.79）．In the present study, theaccuracies of both breeding values were low because of the small number of myoglobin content
records. In the future, it is important to improve the accuracy of breeding value estimation for
purpose of the breeding of Mb content trait. For further investigation, collection of more SNP
data and Mb content records is needed.

１．目を大きく左右し，流通業者からの改善要望も大き的

いがその育種改良は進んでいない。我が国では，黒毛和種牛肉において肉色は消費者の購買行動

肉色の評価指標として，日本食肉格付協会の定め© The Ito Foundation

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定

る 「BCS No.（Beef Color Standard Number）」があるが，格付員の目視による主観的評価である

２．方

309

法

こと，評価区分が少なく黒毛和種牛肉の大部分が2.1

３区分（No.３～５）に格付けされることから，広島県産黒毛和種去勢肥育牛768頭について，育種改良の指標としては適用しにくいと考えられと畜後に第６～７肋骨間のロース芯部分を採取しる。同様の理由から，ゲノム解析にも適さず，こた。採取した肉について，赤身肉中のみに存在す

れまでゲノム上の関連領域の報告もない。

るMbを正確に評価するため脂肪含量を排除した

ミオグロビン含量の測定

一方，黒毛和種牛の遺伝的能力評価には，形質

無脂肪乾物中Mb含量を求めた。具体的には，情報と血統情報に基づく「育種価」が広く活用さ

Boccardら３）の方法によりMb含量，ソックスレー

れ て い る が ， 近 年 ， 高 密 度 な SNP （Single

抽出法により脂肪含量，凍結真空乾燥法により水Nucleotide Polymorphism）情報が利用できるよ

分含量を測定し，無脂肪乾物中Mb含量を算出しうになり，ゲノム全体に分布するSNPが変数とした。

てすべての遺伝的要素を説明するとの仮定に基づ

2.2

く，「ゲノム育種価」の研究が進められ，その活広島県内に後代牛を持つ種雄牛36頭について，用が期待されている。ゲノム育種価の利点には，788頭の後代肥育牛との血縁関係から計算された血統情報では評価できなかった全きょうだいの能

相加的血縁行列情報を用いて，アニマルモデル

力差を評価できることや，SNP情報が得られればBLUP法により，無脂乾物中Mb含量の遺伝分散

形質情報のない若齢牛の段階で評価できること等と残差分散を推定し，遺伝率および育種価（以後がある１）。欧米では乳牛の種雄牛選抜において後「後代育種価」と記述）を算出した。枝肉６形質

代検定を中止し，改良速度を高めるためゲノム育についても，同様に38,861頭の後代肥育牛との血種価により選抜する手法への見直しが進んでお縁関係から，遺伝率および後代育種価を算出した。

種雄牛後代育種価の算出

り，黒毛和種牛においても実用化が期待されてい

2.3

SNPタイピングる。

肥育牛768頭のロース芯，種雄牛36頭の精液か

我々はこれまでに，肉の色素の主要成分である

ら，核酸自動分離装置（NA-3000，倉敷紡績株式

ミオグロビン（Mb）の含量が，牛肉の肉色を左会社）によりDNAを抽出した。肥育牛について右する要因であり，BCS No.とも相関があること

Illumina BovineLD（Illumina）もしくはGeneSeek

を明らかにしている２）。黒毛和種牛において従来SuperLD（GeneSeek），種雄牛についてIlluminaの評価指標である枝肉６形質（枝肉重量，ロースBovineHD（Illumina）によりSNP情報を得た。得

芯 面 積 ，バ ラ 厚 ，皮 下 脂 肪 厚 ，歩 留 基 準 値 ，られた情報のうち，個体・SNPあたりのコールレー

BMS基準値）以外の新たな評価項目を設け，ゲト＜0.95，ハーディー・ワインベルグ平衡からのノム育種価により効率的に改良することは，黒毛乖離Ｐ＜0.001，マイナーアリル頻度＜0.01のSNP

和種牛和牛間でのさらなる差別化・高付加価値化を除いた。さらに，肥育牛のSNP情報については，に大きく貢献するものと考える。従って本研究でソフトウェアBEAGLE3.3.2（Browning, University

は，BCS No.に代わってMb含量を肉色の新たなof Washington）により50Ｋ情報へデータ補完を評価指標とし，ゲノム上の関連領域の検出とゲノ行い，最終的に739頭の33,800SNPを以後の解析

ム育種価による遺伝的能力評価を試みた。

に利用した。

© The Ito Foundation

310

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

SNP効果推定，ゲノム育種価算出

回数：50,000，反復回数：50,000，サンプリング：

肥育牛のSNP型から計算されるゲノム関係行列

10回ごと，SNPが効果を持たないと仮定する比を用いて，G-BLUP法（AI-REML法）により，

率：0.95）。ゲノム育種価の評価精度を検証する

無 脂 乾 物 中 Mb 含 量 お よ び 枝 肉 ６ 形 質 の 遺 伝ため，「後代育種価」と「ゲノム育種価」の相関（SNP）分散と残差分散を推定し，遺伝率および係数を求めた。

2.4

種雄牛の育種価（以後「ゲノム育種価」と記述）

３

結果と考察

畜場）。また別に，ベイズＢ法によって，分散成

3.1

ミオグロビン含量の分布分を推定し，SNP置換効果を算出した（Burn-in

本集団における無脂乾物中Mb含量（mg/100を算出した（母数効果：と畜年次・出荷月齢・と50
45

Mb-content (mg/100ｇ,solid-not-fat)

40

No.3

No. of steers

35

No.4

30

No.5

25
20
15
10
5
0

15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49

Fig. 1 Distribution of Mb content in the fat-free dry matter of longissimus muscles by BCS No.
 A total of 768 Japanese Black steers were examined.
 Means of Mb content were 22.5（No. 3）, 26.5（No. 4）, and 29.7（No.5）．

Table 1 Genetic（Vg）and residual（Ve）variance and heribility ± standard deviation（h２）estimated for Mb content,

carcass weight（CW）, longissimus muscle areas（LMA）, rib thickness（RT）, subcutaneous fat thickness（SFT）,
yield estimates（YE）,and beef marbling scores（BMS）using G-BLUP and BLUP
G-BLUP
Trait

Vg

BLUP
Ve

h２±SE

Vg

Ve

h２±SE

Mb content

12.65

17.10

0.43±0.08

6.32

11.43

0.36±0.11

CW

1658.211117.380.60±0.08

980.751376.820.42±0.02

LMA

26.20

32.43

0.45±0.08

30.45

33.65

0.48±0.02

RT

0.24

0.39

0.37±0.08

0.26

0.55

0.32±0.02

SFT

0.28

0.42

0.40±0.08

0.38

0.34

0.52±0.02

YE

0.88

0.95

0.48±0.08

1.11

0.89

0.55±0.02

BMSNo.

0.06

0.15

0.29±0.08

0.23

0.25

0.49±0.02© The Ito Foundation

311

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定ｇ）の平均値±標準誤差は26.72±4.72，最大値はの0.29および0.49やロース芯面積の0.60および0.42

48.97，最小値は14.09であった。我々の以前の報と同程度もしくはやや大きい値で，肉色の新たな告同様２），無脂乾物中Mb含量はBCS No.に比例し育種改良指標として十分利用可能であると考えらて多くなる傾向が認められた（Fig.１）
。

れる。

3.2

3.3

分散成分の推定

SNP効果の推定

ゲノム関係行列および相加的血縁行列による無１番染色体上に高い効果が推定されるSNPが複

脂乾物中Mb含量の遺伝率は，それぞれ0.43およ

数存在し（Fig.2A），１番染色体以外は，おおむび0.36と比較的近い値となった（Table１）。枝肉

ね染色体上に配置されたSNP数に依存した効果が６形質の遺伝率についても比較的近い値であっ推定された（Fig.2B）。最も効果が高いと推定さた。この結果からMb含量の遺伝率は，黒毛和種

れたSNPは１番染色体上155.7Mb付近に存在し，

牛の改良指標として用いられているBMS基準値

アリル置換効果は＋2.558mg/100ｇ，SNPが説明(A)

variance explained by SNPs (odd chr.)

0.09

3.0

variance explained by SNPs (even chr.)

0.08

2.5

SNP eﬀects (odd chr.)

0.07

2.0

SNP eﬀects

Variance explained by SNP

0.10

SNP eﬀects(even chr.)

0.06

1.5

0.05
0.04

1.0

0.03
0.02

0.5

0.01

0.0
2500000000

2400000000

2300000000

2200000000

2100000000

2000000000

1900000000

1800000000

1700000000

1600000000

1500000000

1400000000

1300000000

1200000000

1100000000

900000000

1000000000

800000000

700000000

600000000

500000000

400000000

300000000

200000000

0100000000

0.00

(B)
2
1.5
1
0.5
0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223242526272829

Fig. 2 （A）Effects of SNP substitutions and variance explained by SNP for Mb content estimated by the BayesB

method A total of 33,800 SNPs of 739 Japanese Black steers were used.
 （B） Variance explained by SNP for each chromosome© The Ito Foundation

312

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

y = 0.6907x - 0.0554
R² = 0.6249

86

r=0.79

4

-8

-6

-4

0

-2

-2

0

2

4

6

BLUP

2

-4
-6
G-BLUP
Fig. 3 Scatter plot of breeding values calculated using G-BLUP（genomic breeding values）and BLUP（true breedingvalues）for Mb content
 Genomic and true breeding values were estimated in 36 Japanese Black bulls.

Table 2 Correlation coefficient（r）between genomic breeding values and true breeding values Accuracy of genomic breeding values and true breeding values
Trait

ｒ

Mb content
CW

G-BLUP

BLUP

Mean

Max.

Min.

Mean

Max.

Min.

0.79

0.82

0.94

0.72

0.59

0.90

0.22

0.78

0.88

0.96

0.81

0.98

0.99

0.94

LMA

0.31

0.83

0.95

0.73

0.98

0.99

0.93

RT

0.37

0.80

0.93

0.69

0.98

0.99

0.92

SFT

0.34

0.81

0.94

0.71

0.97

0.99

0.94

YE

0.37

0.84

0.95

0.75

0.98

0.99

0.94

BMS No.

0.76

0.76

0.92

0.64

0.98

0.99

0.94

する分散は0.832，寄与率（全相加的遺伝分散にに存在するが，この付近では効果の高いSNPは検占 め る SNP が 説 明 す る 分 散 の 割 合）は 0.062 で出されなかった。

あった。このSNPは細胞内のシグナル伝達に関与

3.4

す る リ ン 脂 質 切 断 酵 素 で あ る phospholipase

無脂乾物中Mb含量において，相加的血縁行列

C-like２遺伝子上に存在する。次に効果が高いとによる育種価予測値とゲノム育種価の相関係数は推定されたSNPは，１番染色体上21.9Mb付近に0.79と高い相関を示した（Fig.３, Table２）。枝肉

存 在 し ，ア リ ル 置 換 効 果 は － 0.44mg/100 ｇ ，６形質における相関係数は，枝肉重量0.78，ロー

SNPが説明する分散は0.089，寄与率は0.007であっ

ス芯面積0.31，バラ厚0.37，皮下脂肪厚0.34，歩た。なお，Mb遺伝子は５番染色体上74.2Mb付近

留基準値0.37，BMS基準値0.76であり，無脂乾物© The Ito Foundation

ゲノム育種価算出

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲノム育種価の推定

313

中Mb含量の相関が枝肉６形質よりも高かった。

想定されるが，極端にMb含量が低い場合には，

しかし今回，後代育種価の算出に用いた個体数が見た目を損なうことも考えられる。その他に食味

枝肉６形質（38,861個体）に比べてMb含量（788への影響として，Mbはヘム鉄を有すが，鉄含量個体）で少ないために，Mb含量の後代育種価のが牛肉らしい香りに影響するとの報告もある５）。

正確度が低いという課題があり，今後は形質情報

これらを踏まえ，Mb含量の育種改良をどの程度を持った個体を増やすことで改善し，再度検討すまで行うべきか検討する必要がある。

る必要がある。後代育種価種雄牛36頭の平均正確度は，枝肉６形質の枝肉重量0.98，ロース芯面積４．要

約0.98，バラ厚0.98，皮下脂肪厚0.97，歩留基準値

本研究では，黒毛和種牛において，肉色の新た

0.98，BMS基準値0.98に対して，無脂乾物中Mb

な評価指標として無脂乾物中ミオグロビン含量を含量では0.59であった。

用い，ゲノム育種価による能力評価を試みた。無本研究では，黒毛和種牛の新たな付加価値・差

脂乾物中ミオグロビン含量は，BCS No.と相関し，別化要素となることを期待して，無脂乾物中Mb

比較的高い遺伝率を持つことから，肉色のより的含量のゲノム育種価による評価を試みた。今後，確な育種改良指標となりうると考えられる。肥育

生産現場でゲノム育種価により種雄牛選抜を行う

牛739頭を訓練群としたゲノム育種価は，後代育には，現在利用されている後代育種価と同程度の種価と高い相関（0.79）を示し，種雄牛選抜に有高い評価精度の実現が重要であり，そのためには効であることが示唆された。一方，今回の研究で形質情報およびSNP情報を持つ肥育牛集団の拡大

は，ミオグロビン含量情報を持つ肥育牛数が少なが有効である。必要な肥育牛集団の規模についていために，後代育種価の正確度が低いという課題

は，渡邊らが，黒毛和種肥育牛で枝肉６形質を対もある。今後，ミオグロビン含量を対象にゲノム

象に3,686頭の肥育牛を用いて，種雄牛22頭を評

育種価を活用した種雄牛選抜を行うためには，高価した際の報告がある 。現在，黒毛和種牛の種い推定精度を実現することが重要であり，訓練群

雄牛選抜において，後代育種価が算出できない若を拡大してさらに検討する必要がある。

４）

齢牛は両親の後代育種価の平均である「期待育種価」により選抜される。渡邊らは，期待育種価と後代育種価，ゲノム育種価と後代育種価の相関について，ロース芯以外の５形質でゲノム育種価の方が高かったと報告しており，無脂乾物中Mb含量においてもこの程度の精度が確保されれば，早期選抜の手段として実用化可能と考える。従って今後は，数千頭程度まで肥育牛のSNP情報を追加してゲノム育種価の精度を高め，さらに詳細な検討する必要がある。
一方で，現在黒毛和種牛肉の肉色は淡いほど評
価が高いことから，Mb含量を下げる育種改良が文
献１） 広岡博之：畜産の研究，66，1181～1188，2012．
２） 河野幸雄，坂井宏行，長尾かおり：肉用牛研究会
報，68，27～29，2005．
３） Boccard, B., Buchter, L., Casteels, E., Cosentino, E.,
Dransfield, E., Hood, D. E., Joseph, R. L., Macdougall,
D. B., Rhodes, D. N., Schon, I., Tinbergen, B. J.,
Touraille, C. : Livestock Production Science，８，385～397，1981．
４） 渡邊敏夫，北村夕貴，花田敬吾，小林宙，杉本喜憲：日本畜産学会第119回大会講演要旨，170，2015．
５） Mateescu, R. G., Garmyn, A. J., TaitJr., R. G.,
Duan, Q., Liu, Q., Mayes, M. S., Garrick, D. J.,
VanEenennaam, A. L., VanOverbeke, D. L., Hilton, G.
G., Beitz, D. C., Reecy, J. M. : J. ANIM.SCI.，91，1067～1075，2013．

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314

食肉に寄生する人獣共通幼線虫の分子生物学的種同定法の開発
Development of molecular biological method for species identification of
zoonotic nematode larvae found in meat

黄

鴻

堅・平

健

介

（麻布大学獣医学部）

Hong-Kean Ooi and Kensuke Taira（Faculty of Veterinary Medicine, Azabu University）

The presence of zoonotic nematode larvae in meat pose a hazard to food safety, and there
is a need to clarify the species of the nematode involved, so as to provide more information for
identifying the source of contamination and origin of the infection of nematode larvae inhumans. Thus, we developed a PCR-based molecular biological method for species identificationof zoonotic nematode larvae found in meat. We developed the LAMP method for theidentification of these nematode. The target nematode larvae were Toxocara canis, the large
round worm of dogs, and Toxocara cati, the large round worm of cats. We constructed LAMP
species-specific primer sets for T. canis and T. cati using the nucleotide sequences for the
ITS-2 gene. We found that our primer sets were useful and specific for the identification of therespective toxocarids. There was no cross-reaction to other ascaridoids worms, such as Ascaris
suum or Baylisascaris procyonis, in our LAMP reactions for T. canis and T. cati, respectively.
This implies that the LAMP method we have developed can be used in the field for identifying
T. canis and T. cati larvae in the meat.

１．目

輸入症例を含めた散発的な約10例のみが報告され的ている１）。しかしながら，近年の日本でもキツネ

家畜や家禽の筋肉には，トリヒナTrichinellaなどの野生動物の筋肉などからはトリヒナが検出

spp.（旋毛虫）およびトキソカラ属回虫Toxocara

されていることから２，３），家畜や家禽におけるトspp.の幼虫が寄生し，これらの幼虫は生肉や加熱

リヒナ感染については警戒を強める必要がある４）。

不十分な肉料理や肉製品の摂食によってヒトに感

トキソカラ属回虫は，犬や猫等のコンパニオン

染する。トリヒナ症（旋毛虫症）については，特動物に普通にみられる身近な寄生虫で，幼虫がヒに豚肉を感染源とするヒト寄生例が世界的に多トに寄生すると幼虫移行症（トキソカラ症）を引

く，年間１万人以上（致死例を含む）の患者が発き起こす。近年，特に日本では，牛や鶏の肝臓や生している。日本におけるヒトの症例は，1981年

肉の生食を原因とするトキソカラ症例が増えておの熊肉の生食を原因とした集団発生症例以後は，り，食肉を介するトキソカラ症が注視されるよう© The Ito Foundation

食肉に寄生する人獣共通幼線虫の分子生物学的種同定法の開発になってきた５，６）。鶏の筋肉や肝臓にトキソカラ

315

保存した。

属回虫幼虫が寄生してヒトの感染源になり得るこ

2.3とは知られているが，農場の家畜・家禽におけるLAMP 法 に 用 い る プ ラ イ マ ー は Primer

トキソカラ属回虫幼虫の感染実態はいまのところ

Explorer V３（栄研社）を用いて，付属の手順不明である 。

書に準じて作成した。設計はrDNAのITS２領域

７）

プライマー設計

本研究は，家畜・家禽の筋肉に寄生するトリヒの５’側から，Ｆ３領域，Ｆ２領域，Ｆ１領域，

ナおよびトキソカラ属回虫の幼虫の簡易・迅速なＢ１領域，Ｂ２領域，Ｂ３領域という６つの領域

分子生物学的種同定法の開発を目的とするものを利用して実施し，末端の自由エネルギーが－４で，まず，トキソカラ属回虫の種特異的DNA断

kcal/mol以下になるように設定した。Tm値は，片を検出するためのLAMP法を開発する。本研究F1cおよびB1c領域で65℃前後（64～66℃），Ｆ２

により，簡易・迅速な食肉製品の寄生虫検査が確領域，Ｂ２領域，Ｆ３領域，Ｂ３領域で60°Ｃ前

立されれば，これを応用して，食肉製品の安心・後（59～61℃），ループプライマーは65℃前後

安全が保障できるようになる。

（64～66℃）に設定した。以上のように設計した

２．方
2.1

プライマーをTable１に示した。

法

2.4

LAMP法

Loopamp DNA amplification（栄研社）を用い

寄生虫DNA

犬 回 虫 Toxocara canis お よ び 猫 回 虫 Toxocaraて付属の手順書に準じてrDNAのITS２領域を増

catiのDNA抽出には，自然感染動物の糞便から採幅した。反応液は，１x Reaction buffer 12.5μl ，材した虫卵を用いた。糞便から精製した虫卵は，

Bst DNA polymerase１μl ，FIBとBIPプライマー

0.5％ホルマリン液中で室温４週間培養後，供試のそれぞれ40pmol，Ｂ３とＦ３プライマーのそするまで10℃で保存した。また，検査法の種特異

れ ぞ れ ５ pmol ，鋳 型 DNA ２ μ l お よ び 蒸 留 水

性の確認のため，豚回虫Ascaris suumおよびア（DW）で，総量25μl になるように調整した。増ライグマ回虫Baylisascaris procyonisのDNAをそ

幅反応は，伸長・合成反応を65℃で60分間を行

れぞれ虫卵および幼虫から抽出し，比較対象とし

い，80℃２分間で酵素を失活させ反応を停止させ

た。

た。

2.2

DNA 増 幅 産 物 は 10 倍 希 釈 SYBR GREEN I

DNAの抽出

それぞれの虫卵あるいは幼虫をTE Buffer10ml（Invitrogen, Taiwan）の１μl を注加して反応さの入った15ml試験管に入れ，2000rpmで３分間遠せた後，蛍光発光の目視により確認した。また，心して上清を除き，MilliQ water 10mlを加えた。

DNA増幅産物の２％アガロース電気泳動を行い，この作業を３回繰り返して虫卵または幼虫を洗浄

エチジウムブロマイドで染色した後，UVライトした。それぞれの虫卵または幼虫の約10～100個

で紫外線をあてて蛍光発光の有無を確認した。

をパスツールピペットで1.5ml容エッペンチュー

また，検出限界DNA量を調べるために10ng

ブに入れ，バイオマッシャ―Ⅱ（Nippi社）で粉DNA（２μl of template）を基にして10倍段階希

砕後，QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を釈でサンプルを調整し，同様のLAMP法を行った。

用いて，付属の手順書に準じて核DNAの抽出を行った。抽出したDNAは供試するまで－20℃で© The Ito Foundation

316

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 1 Nucleotide sequences of primers for the ITS-2 loop-mediated isothermal amplification of Toxocara canis

and Toxocara cati.
Parasite Primer typeT. canis

T. catiSequence（5’-3’）

LengthＦ３TGTGATTAACGCGCAAGGTT

20Ｂ３GCTGCCACAACCAAACA

18

FIP（F1c＋F2） CTTGGCAAGGTACGCTGTACAGGTGCATTCGGTGAGCTATG

42

BIP（B1c＋B2） TCGCACAAGAAATGGCTGTCGTGGCCGTATCGTGAAGCAA

40

Ｆ３TGCACAAGAAATCGCTGTCG

20

Ｂ３

TCAACCATTCACGCGCATT

19

FIP（F1c＋F2） GCTGGAGGCCATATCGTGAAGGTTTGCTCGTGAAGAGGCG

40

BIP（B1c＋B2） GCGTTGTTTGTTGTTGCTTGGCCCTTCTTCAAGCAGCCGATG

42

報 の Toxocara cati（Genbank accession numbers:

３．結果と考察Y09493）およびToxocara canis（Y09489）の配列

Toxocara canisおよびToxocara catiの特異的なと一致した。今回用いたToxocara canisのDNAサrDNAのITS－２領域塩基配列を検出するために２ンプル（10ng DNA in２μl template）における当つのプライマーセットを設計し，これらを用いて上LAMP法の検出限界DNA量は10fgであった。

述のToxocara属回虫２種，豚回虫，およびアライ

Toxocara属回虫やTrichinella属線虫の幼虫はグマ回虫の各DNAを用いてLAMP反応を行ったヒトに寄生して病気を起こすことから，人獣共通（Table１）。Toxocara catiのプライマーセットにお感染症として重要である。これらの幼虫は形態的

いては，Toxocara catiのDNAでのみ増幅産物のバな区別が難しいことから，分子生物学的鑑別が有ンドが２％アガロース電気泳動で認められたが，T.

用である６）。今回，ヒトに寄生して病気を起こす

canis，A. suumおよびB. procyonisでは認められな

Toxocara属回虫の重要種であるToxocara canisおかった。また，蛍光目視検出試験でも，T. catiのよ び Toxocara cati の 特 異 的 DNA を 検 出 す る

DNA増幅産物のみが肉眼で緑色にみえたが，T.

LAMP 法 が ほ ぼ 確 立 で き た 。LAMP 法 は ，Bst

canis，A. suumおよびB. procyonisでは茶色のまま

polymeraseを使用するために増幅の効率が高く，で変色はみられなかった（Fig.１）。Toxocara canis

一定の温度で反応が進むことにより，PCR法の場のプライマーセットにおいては，Toxocara canisの合よりも比較的短い時間で増幅を行うことができ

DNAでのみ増幅産物のバンドが２％アガロース電る。また，SYBR GREEN Iによる反応液の変色

気泳動で認められたが，T. cati，A. suumおよびB.

によって簡単に特異的DNA断片の増幅が判断でprocyonisでは認められなかった。また，蛍光・目きる。感度が高くかつ簡便・迅速であることか

視検出試験でも，T. canisのDNA増幅産物のみがら，LAMP法は特に食肉検査や検疫の現場では，緑 色 を 発 し た が ，T. cati ，A. suum お よ び B.

有用性が高いと考える。一方，適切なLAMPプラ

procyonisでは茶色のままで変色はみられなかった

イマーを設計することは，容易でない。今回，（Fig.２）。２％アガロース電気泳動で認められた最Trichinella spiralis と Trichinella pseudospiralis

下 位 の バ ン ド の 塩 基 配 列 を み る と ，今 回 ののLAMP法の開発も試みたが，これらは未だ確立

Toxocara catiおよびToxocara canisの配列は，既されていない。今後，Trichinella属線虫を種特© The Ito Foundation

317

食肉に寄生する人獣共通幼線虫の分子生物学的種同定法の開発

M

1

2

3

4

5

2000 bp1000 bp
500 bp200 bp

A
1

2

3

4

5

B
Fig. 1 Specificity of Toxocara cati LAMP primer set.（A）Agarose gel electrophoresis. Lanes（M）100 bp DNA ladder;（1）Baylisascaris procyonis;（2）T. canis;（3）T. cati;（4）Ascaris suum; and（5）Negative control.（B）Visual detectionof LAMP products after addition of 1μl of 1/10 dilution of SYBR Green I. Positive sample（3, T. cati）turned green
while negative samples remained orange（1, B. procyonis; 2, T. canis; 4, A. suum; and 5, negative control.）

M

1

2

3

4

5

2000 bp1000 bp
500 bp200 bp
A
1

2

3

4

5

B
Fig. 2 Specificity of Toxocara canis LAMP primer set.（A）Agarose gel electrophoresis. Lanes（M）100 bp DNA ladder;（1）Baylisascaris procyonis;（2）T. canis;（3）T. cati;（4）Ascaris suum; and（5）Negative control.（B）Visual
detection of LAMP products after addition of 1 ul of 1/10 dilution of SYBR Green I. Positive sample（2, T. canis）
turned green while negative samples remained orange（1, B. procyonis; 3, T. cati; 4, A. suum; and 5, negative
control.）© The Ito Foundation

318

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

異的に検出する適切なプライマーを設計し，これAscaris suum や ア ラ イ グ マ 回 虫 Baylisascaris

らを検出するLAMP法を開発する予定である。家

procyonisとの交叉反応を示さなかった。今回設

畜・家禽の筋肉に寄生する主な人獣共通寄生線虫計したLAMP法プライマーセットは犬回虫や猫であるトリヒナおよびトキソカラ属回虫の幼虫の回虫の幼虫を検出・同定することが可能であるこ

簡易・迅速な分子生物学的種同定法が開発されれとから，食肉に寄生するこれらの幼線虫を検出す

ば，これを応用して，食肉製品の安心・安全が保る方法として有用であると考える。

障できるようになると考える。
４．要

約

食肉に寄生する人獣共通寄生幼線虫について，
PCR法を基礎とした分子生物学的種同定法の開発を試みた。すなわち，LAMP法を犬回虫Toxocara
canisおよび猫回虫Toxocara catiの同定に応用した。犬回虫および猫回虫のITS-２領域の塩基配列を種特異的に検出するLAMP法用プライマー
セットを設計し，LAMP法を行ったところ，犬回虫および猫回虫のDNAそれぞれにおいて種特異的に反応が起こることが確認された。また，これらのToxocara属のプライマーセットは，豚回虫

引用文献１） Yamaguchi, T., Ohbayashi, M, Ooi, H. K. : ICT
6th Trichinellosis（Kim K.W. ed.）, 274 ～ 279, State
University of New York Press, Albany, 1985．
２） Kanai, Y., Inoue, T., Mano, T., Nonaka, N.,
Katakura, K., Oku, Y. : Jpn. J. Vet. Res.，54，175～
182．2007．
３） Ooi, H. K., Kamiya, M., Ohbayashi, M. : Jpn. J.
Vet. Res.，35，87～97，1987．
４） Alkarmi, T., Behbehani, K., Abdou, S. Ooi, H.K. :Jpn. J. Vet. Res.，38，139～146，1990．
５） Taira, K., Saitoh, Y., Okada, N., Sugiyama, H.,
Kapel, C. M. O. : Vet. Parasitol. ， 189 ， 238 ～ 239 ，
2012．
６） Taira K., Saitoh Y., Kapel C. M. O. : Vet.
Parasitol.，180，287～291，2011．
７） Taira, K., Yanagida, T., Akazawa, N., Saitoh, Y. :Vet. Parasitol.，196，397～400，2013．

© The Ito Foundation

319

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発
Development of rapid and non-destructive diagnostic system for cow’s
estrus and pregnancy

ツェンコヴァ

ルミアナ・窪田

陽介・古川

茜・竹村

豪・ジョージバザール（神戸大学大学院農学研究科生体計測工学研究室）

Roumiana Tsenkova, Yosuke Kubota, Akane Furukawa, Go Takemura and George Bazar（Biomeasurement Laboratory, Kobe University Graduate School of Agricultural Science）

The purpose of this research is to develop a system which enables us to diagnose cow’s
estrus non-destructively, rapidly and easily by means of near infrared spectroscopy（NIRS）
and Aquaphotomics proposed as new NIRS analytical method recently. Aquaphotomics is themethod that can measure changes of solutes in solution by observing water NIR spectra which
is changed by changes of solutes, so this method is very useful to measure changes in bio
systems.
This research examines the possibility that NIR spectra of milk and foremilk of dairy cows
can be used to diagnose estrus which caused by sexual hormone（progesterone）．
17 cows whose estruses were induced by hormone infusion were used. Sampling period
contained planned estrus days in the middle of it.
Progesterone concentration of serum samples was measured by enzyme immunoassay
which was used as conventional method to measure sexual hormone. Progesterone
concentration decrease just before estrus period, so we divide the samples high progesterone
period and low progesterone period.
From the results of milk and foremilk, the important wavelength ranges which showedchanges of progesterone were investigated. In the future, with knowledge acquired, we will try
to construct a small, cheap NIR sensor for easy and fast estrus detections.

１．目

手法を開発している。アクアフォトミクスは，さ的

まざまな物質と水分子と光の相互関係を分析し，本研究では近赤外分光法とアクアフォトミクス

迅速かつ包括的に生体の情報を得るという新たなを用いて，牛の発情・妊娠を非破壊，迅速かつ簡科学の概念である。あらゆる生体の大部分は水分便に診断可能なシステムの開発を行う 。

で構成されるため，この手法で生体の溶質の微量１）

当研究グループでは近年，近赤外分光法の解析な変化を水の吸収スペクトルを通しての測定が可において，アクアフォトミクスという新たな分析能となる。同手法を用いた既往研究としては，生© The Ito Foundation

320

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

乳中の成分分析２），乳牛における乳房炎診断３～５）

牛Ｒ-Ｗ）は発情同期をせず，かつ非発情時期のがあり，近年では，ジャイアントバンダ およびコントロール牛群とした。

６）

オランウータン７）の尿スペクトルから水分子構造

スペクトル測定用のサンプルは，生乳と前搾りが尿中物質濃度を反映していることが示唆され，

乳とし，生乳については，牛Ａ-Ｗ（発情同期牛：迅速かつ非破壊の絶滅危惧動物発情診断への応用

17頭，コントロール牛：６頭），前搾り乳では，可能性が示された。

牛Ｄ-Ｗ（発情同期牛：14頭，コントロール牛：本研究ではこの手法を用いて，牛の発情・妊娠６頭）から採材した。生乳と前搾り乳についてはに関するホルモンの分泌状況から牛の発情・妊娠各牛につき，発情予定期間を中間に前後１週間毎時に特徴的な近赤外スペクトルパターンを明らか

日，午前と午後に採材し，コントロール牛も同様にし，これを非破壊，迅速かつ簡便に検出する診に採材した。また，性ホルモン測定のために血清断システムを開発する。将来的にはこのシステム

サンプルも合わせて採材した。

を用いて畜産農家が日々の業務の中で利用できる

生 乳 と 前 搾 り 乳 は 設 置 型 近 赤 外 分 光 器 XDS

小型，安価かつ簡易なセンサーを開発することを（Metrohm社）により40℃の温度条件下で，光路目指す。

長１mmで全サンプルの400-2500nm（解析領域

特に本稿では牛の発情について，発情時期の直は水の第一倍音領域である1300-1600nm）のスペ

前に血液や生乳中でその濃度が急低下するという

ク ト ル を ３ 本 連 続 測 定 し た 。血 中 Ｐ ４ 濃 度 は特徴を持つ，性ホルモンであるプロジェステロン

Kinoshitaら６）の手法に基づいてエンザイムイム（以下，Ｐ４）濃度に基づく発情診断を目的とした。

ノアッセイ（EIA）法を用いてマイクロプレート

２．方

リーダーiMark（BioRad社）で測定した。

法

本年度の研究成果として，「生乳午前」，「生乳

牛の発情時期の直前には，血中Ｐ４濃度が大き午後」，「前搾り乳午前」，「前搾り乳午後」の４種く低下することが報告されている 。また，血中類の各乳サンプルでのスペクトル解析結果を報告

Ｐ４濃度の変化は生乳中の同濃度に反映され，高

する。

８）

い相関関係があることがわかっている 。従って，
９）

本研究では発情時期を含む一定期間，供試牛から

３．結果および考察

血液，生乳，前絞り乳をサンプルとして採取し，3.1

EIA法による血中Ｐ４濃度測定

すべてのサンプルの近赤外スペクトルを測定し牛の性周期は約21日間であり，その中で卵巣内た。また，血清サンプルは，各供試牛から60mLに黄体が形成され，血中プロジェステロン濃度が採血し，37℃で30分間インキュベートを行った後高い値を保つ時期（以下，高Ｐ４ 期）と黄体が退に０℃，3000rpmの条件下で15分間遠心分離を行

行して低い値を保つ時期（以下，低Ｐ４ 期）があい精製した。

り，高Ｐ４期と低Ｐ４期の境界では，Ｐ４濃度の急低

本実験では，供試牛として兵庫県立農林水産技

下が観察される。発情は，血中Ｐ４ 濃度の急低下

術センター淡路農業技術センターのホルスタインが起きた３－４日後（人工授精適期）に発生す

牛23頭を用いた。23頭の内，17頭（発情同期牛る。その性周期を利用するホルモン製剤による発Ａ-Ｑ）はホルモン製剤によって発情同期された情の誘起は，膣内留置型ホルモン製剤（PRIDも発情同期牛群れとし，残りの６頭（コントロール

しくはCIDR）を挿入し，人工的に牛の体内Ｐ４濃© The Ito Foundation

321

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

度を高い水準に保ち，適当な期間留置した後，製Leave-one cow-out法を用いて，Ｐ４ 濃度変化に剤を除去することで体内Ｐ４ 濃度を人工的に急激関係する波長を抽出した。Leave-one cow-out法に低下させることで行う。

とは，サンプル群から供試牛１頭分のサンプルをEIA法による血清中Ｐ４濃度（ng/ml）を測定し除き，残りの全供試牛のサンプルの差スペクトルた結果，コントロール牛を除くすべての牛で，膣を平均し，Savitzky-Golay法に基づく二次微分を

内留置型ホルモン製剤の除去前後でＰ４ 濃度に大適用することで，ピークを示す波長領域を探索

きな高低差が確認され，ホルモン製剤による体内し，全供試牛の頭数回ループすることにより，再Ｐ４ 濃度の操作は成功していたことが確認された現性の高い波長領域を抽出する手法である。
本研究においては，前搾り乳サンプルにおいて（Fig.１）。
3 . 2． 生乳および前搾り乳におけるスペクト

は20ループ，生乳サンプルにおいては23ループで解析を行った。また，全ループの80％以上で抽出

ル解析（１） 差スペクトルによるＰ４ 濃度変化に関係された各波長領域において，最も抽出された回数が多い波長をＰ４ 濃度変化に関係の深い波長群でする波長の抽出
近赤外分光器により３回連続で測定した各乳ス
ペクトルを平均し，スペクトルのランダムノイズ低あると見なした（Table１）。
（２） Ｐ４ 濃度変化に関係する波長を用いてア減のために平滑化を行った後，ベースライン補正とクアグラムによるＰ４濃度診断

し て MSC（Multiplicative Scattering Correlation）

Leave-one cow-out法により抽出された代表波を適用した。その後，高Ｐ４期と低Ｐ４期の各乳ス長を用いて，アクアグラムによるＰ４ 濃度診断を

ペクトルを平均し，差スペクトル（高Ｐ４ 期-低行った。アクアグラムとは，次式により特定波長Ｐ４期）を算出した。

の吸光度を標準化した値（アクアグラム値）をレーダーチャートとして図示したものである。こ20

Treated cows

18

Control cows

16
14
12
10
8
6
4
2

Experiment day

Fig. 1 Concentration of serum samples measured by EIA© The Ito Foundation

18

17

16

15

14

13

ou
t)

11

12

(P

RI

D

10

9

0

8

P4 concentration in blood[ng/mL]

各乳スペクトルから算出した差スペクトルから

322

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

Table 1 Represented wavelengths related to P４ concentration change picked up by Leave-one cow-out
Milk（AM）

Milk（PM）

Foremilk（AM）

Foremilk（PM）

Wave iength（nm）

Wave length（nm）

Wave length（nm）

Wave length（nm）1363.51305.5

1326

1429

1407

1326

1414

1447.51443.51414

1423.51475

1467.51423.51453.51525

1480

1431.51464.51561.5

1490

1488

1473

1580

1504

1500

1483

1534.5

1536

1493

1551

1550

1506

1566

1522
1540
1555
1568.51584.51595.5(a)1363.51
1551

1534.5

1551

0

-0.5

-0.5

1443.5 1534.5

1467.5

1504

1550

1555

1473

0.5
0

1550

1453.5

1506

1483

1483
1493

(d)
1429
1
1326
1580
1431.5

1488

1429
1

0.5
0

Low P41447.5

1580

-1

-1

1475

1561.5High P4
Low P4

Fig. 2 Aquagrams of treated cows（left）and control cows（right）
 （a）milk AM,（b）milk PM,（c）foremilk AM,（d）foremilk PM© The Ito Foundation

0
-0.5

1525

High P4

0.5-0.5

1561.51500

1500

1423.51464.5

1493

-1

1536

1414

1473

Low P4

1566

1326
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
-0.8

1522

High P4

-0.5

1488

1568.51464.5

Low P4

0

1536

1522
1506

1305.511431.51453.5

-1

1480

-0.5
-1

-0.5

1584.5High P4

1305.511326

1595.51423.501568.51467.5

1490

1480

0.5

1414

1555

1504

1566

1584.51443.5

1326
1
0.5

-1

-1

(b)

1595.5

1407

0.5

0

1490

(c)

1363.5
1

1407

0.5

1447.5

1475

1525

323

Sensitivity and speciﬁcity(%)

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システムの開発

90.0
80.0
70.0

83.3

83.3
76.5

70.6

71.4

66.7

60.0

50.0

42.9

40.0

Sensitivity (%)

33.3

Spesiﬁcity (%)

30.0
20.0
10.0
0.0

Milk (AM)Milk (PM)Foremilk(AM)

Foremilk(PM)

Fig. 3 Sensitivity and specificity of each sample type aquagram

れにより，高Ｐ４期と低Ｐ４期を視覚的に比較する

標により，アクアグラムによる乳中Ｐ４ 濃度変化

ことが可能となる。

診断の精度を検討した。

Aqgλ：

χλ－χλ
σλ

感度（％）＝

Aqgλ：波長λのアクアグラム値

Ｐ４診断パターンを示した発情同期牛数

特異度（％）＝

χλ：サンプルのλにおける吸光度

全発情同期牛数×100

Ｐ４診断パターンを示さなかったコントロール牛数
全コントロール牛数×100

χλ：λにおける全サンプルの吸光度の平均
σλ：λにおける全サンプルの吸光度の標準偏差２つの指標の値を算出した結果，特に前搾り乳（午前）を用いた場合に78％以上の感度およびアクアグラムによるＰ４ 濃度診断の結果，各乳83％以上の特異度を得ることができた（Fig.３）。

サンプルについて，各波長で高Ｐ４期と低Ｐ４期のまた，生スペクトルなどから，牛ごとの顕著な個間にアクアグラム値の差が見られ，大部分の発情体差が認められたが，代表波長を用いたアクアグ

同期牛が同じ差のパターンを示していることがわ

ラムに関しては，異なる個体の間で共通した結果かった（Fig.２）。これらについて，ｔ検定（有を得ることができたことからも，本手法の有用性

意水準５％）を行った結果，発情同期牛群では，が示された。

生乳（午前）の1467.5nmおよび1480nm以外の波長において有意差が認められた。しかし，コント

上記の結果から，生乳と前搾り乳の近赤外スペ

ロール牛群では全波長で有意差が認められなかっクトルの解析結果から，午前の前搾り乳がＰ４ 濃たため，発情同期牛群から得られた代表波長にお度診断に最適なサンプル種であり，すべてのサン

ける高Ｐ４ 期と低Ｐ４ 期の差のパターン（以下，Ｐ４

プル種で70％以上の感度が得られたことから，特診断パターン）を用いて，感度と特異度２つの指

定波長を用いたアクアグラムによる乳中Ｐ４ 濃度© The Ito Foundation

324

平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.33）

診断の可能性が示された。また，波長の帰属から発情時期付近では水素結合の強固な水構造が支配的であるという傾向が見られ，同傾向は先行研究の結果と類似していることから，動物の発情診断において本手法が有用である可能性が示された。
４．要

約

本研究では近赤外分光法と，近年提唱されている近赤外分光法における新たな分析手法であるアクアフォトミクスを用いて，非破壊，迅速かつ簡便に牛の発情診断を行うシステム開発を目的とする。アクアフォトミクスとは，水溶液中の溶質の変化に伴う水分子の変化を近赤外スペクトルの変化から読み取る手法であり，生体内の変化を診断するのに適している。本研究では生乳と前搾り乳の近赤外スペクトルから，血清中のＰ４ 濃度の変化をとらえることで，発情診断の可能性を検討した。従来の性ホルモン濃度測定法であるEIA法により，ホルモン製剤によって発情を同期した計17頭の牛のＰ４濃度の変化を測定し，高Ｐ４期と低Ｐ４期の近赤外スペクトルを解析することで，午前の前搾り乳がＰ４ 濃度診断に最適なサンプル種であると示された。今後は，得られた知見を用いて小型，安価で簡易なセンサーの開発を目指す。

文献１） Tsenkova, R. : Introduction aquaphotomics:
Dynamic spectroscopy of aqueous and biologicalsystems describes peculiarities of water, Journal ofnear infrared spectroscopy，17，303～314，2009．
２） Tsenkova, R., Atanassova, S., Itoh, K., Ozaki, Y.,
Toyoda, K. : The World Wide Web at: Near infrared
spectroscopy for biomonitoring: Cow milk
composition measurement in a spectral region from1, 100 to 2. 400 nm 1, Journal of animal science，
78，515～522，2000．
３） Tsenkova, R. : Atanassova, S., Morita, H., Ikuta, K.,
Toyoda, K., Iordanova, I.K., Hakogi, E. : Near
infrared spectra of cows’ milk for milk qualitye va l ua t i o n: di s e a s e di a gno s i s a nd pa t ho ge n
identification, Journal of near infrared spectroscopy，
14（６），363～370，2006．
４） Tsenkova, R. : Introduction aquaphotomics:
Dynamic spectroscopy of aqueous and biologicalsystems describes peculiarities of water, Journal ofnear infrared spectroscopy，17，303～314，2009．
５） Morita, H., Kuroki, S., Ikuta, K., Tsenkova, R. :Real-time near infrared spectral monitoring of
mammary gland for inflammation diagnosis in dairy
cows, Journal of near infrared spectroscopy，21（５），427～433，2013．
６） Kinoshita, K., Miyazaki, M., Morita, H., Vassileva,
M., Tang, C., Li, D., Ishikawa, O., Kusunoki, H.,
Tsenkova, R. : Spectral pattern of urinary water asa biomarker of estrus in the giant panda, Scientific
Reports，２，856，2012．
７） 木下こづえ：近赤外分光法を用いた野生動物の生理モニタリング技術の開発，第30回記念近赤外フォー
ラム講演要旨集，つくば，91～94，2014．
８） 中尾敏彦：最新・乳牛の繁殖管理指針，酪農総合研究所，136，2000．
９） R o e l o f s , J . B . , V a n E e r d e n b u r g , F . J . C . M . ,Hazeleger, W., Soede, N.M., Kemp, B. : Animal
reproduction science，91，337～343，2006．

© The Ito Foundation

平成26年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：食肉および食肉製品の食品的価値，加工技術及び家畜生産技術の向上に関する研究又は調査
単位：千円
研

究

課

継続
年数

題

ポリフェノールの強力な還元性を利用した食肉新鮮色の保持研究

代 表 研 究 者
所増田

徳島大学大学院
ソ シ オ・ア ー
ツ・ア ン ド・サ
イエンス研究部

800

博

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

俊哉

属

機

関

助成金額

代表研究者名豚血液由来食品素材の給与が脂質代謝に及ぼす影響

H.24～

上曽山

発酵食肉製品由来の機能性ペブチドに関する研究

H.24～

津田

治敏

県立広島大学
生命環境学部700

食肉の給与が海馬のタンパク質リン酸化および遺伝子
発現に及ぼす影響

H.25～

豊田

淳

茨城大学農学部

1,000

食肉製品の塩漬熟成に伴う呈味性発現に関する研究

服部昭仁（一社）食肉科学
技 術 研 究 所

1,000

調理加工食肉・肉製品の機能性成分およびその発現に
関する研究

六車三治男

南 九 州 大 学
健康栄養学部

1,000

牛肉の匂いに及ぼす熟成と加熱調理の影響

小林正人

一般社団法人
家畜改良事業団
家畜改良技術
研
究
所

1,000

短波帯交流電界による真空包装食肉加工品の迅速殺菌植村邦彦

農 業・食 品 産 業
技術総合研究
機構食品総合研
究所

800

可視・近赤外分光可視化法による生肉の微生物汚染状
況の非破壊評価

牧野義雄

東京大学大学院
農学生命科学研
究科

800

牛肉に関する消費者ニーズの研究―内因性価値と外因性価値の特定広岡

博之

京都大学大学院
農 学 研 究 科

800

都甲

潔

九 州 大 学システム情報科 学 研 究 院

1,000

レトルト加熱処理を施した筋原線維タンパク質の培養
骨芽細胞の分化に及ぼす影響

林利哉

名城大学農学部800

メタボロミクス解析による黒毛和種牛肉の美味しさに関わる指標の探索鈴木啓一

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の
特定

早川

徹

帯広畜産大学畜 産 衛 生 学
研 究 部 門800

味覚センサを用いた和牛の味の数値化と可視化に関す
る研究

H.25～

© The Ito Foundation

畜産物由来ヘム鉄摂取が発育期スポーツ選手に及ぼす影響～食事摂取状況と体組成・気分の変化から～

H.24～

坂元

美子

神戸女子大学
健康福祉学部1,000

冠動脈疾患患者における食肉類の摂取と血中アミノ酸・脂肪酸組成，動脈硬化惹起性リポ蛋白および血栓因子との関連に関する研究

H.25～

木庭

新治

昭和大学医学部

700

豚レバーパウダーの脂質代謝に及ぼす分子機能解明

H.25～

岡本

芳晴

鳥取大学農学部

1,000

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明西村敏英

日本獣医生命科
学大学応用生命科
学部

800

新規機能性脂肪酸、フィタン酸の定量分析法の確立

河原聡

宮崎大学農学部

700

山之上

稔

神戸大学大学院
農 学 研 究 科800

金属表面洗浄時における食肉由来汚れの脱離特性に及ぼす外部電位印加の効果

今村維克

岡山大学大学院
自然科学研究科800

脂質代謝および感染症研究のための豚・牛由来肝臓細
胞の樹立

福田

智一

東北大学農学
研
究
科

1,200

久米

新一

京都大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

スカトールによる胆汁酸代謝の撹乱：ヒト・家畜の健康維持を目指したその制御

石塚敏

北海道大学大学
院農学研究院

1,200

肉牛用発酵TMRの飼料特性の評価

齋藤早春

北海道立総合研究機構畜産試
験場

950

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性
家畜飼料の開発木下英樹

宮 城 大 学
食産業学部フードビジネス学科

850

友永

省三

京都大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

初期成長期のミオスタチン制御が黒毛和牛の肉質に及
ぼす影響

髙橋

秀之

九州大学農学部
附 属 農 場900

黒毛和種子牛に対する血清亜鉛濃度の基準値の設定および亜鉛添加による臨床的な疾病予防効果の検討

乙丸孝之介

鹿 児 島 大 学
共同獣医学部

700

和牛肉に含まれる機能性成分を左右する要因の検索平山琢二

琉球大学農学部

1,100

黒毛和種ゲノムDNAメチル化多型と肉質形質との関係に関する研究須田義人

宮 城 大 学
食 産 業 学 部

900

牛白血病ウイルスの垂直伝播に関する研究

目堅博久

宮崎大学農学部
獣 医 学 科1,000

人の食品由来回虫症の感染源対策：牛と家禽の疫学的役割と制御法の探索野中成晃

宮崎大学農学部

800

帆保

誠二

鹿 児 島 大 学
共同獣医学部

1,000

食肉として消費される野生動物における食中毒菌の保
有調査

安藤

匡子

鹿 児 島 大 学
共同獣医学部

900

繁殖疫学の手法を用いた黒毛和種牛繁殖農場の飼養形態の違いが繁殖成績に及ぼす影響の定量

佐々木羊介

宮 崎 大 学
テニュアトラック 推 進 機 構

1,000

Ｉ型インターフェロン応答性カタボリック活性の検出による牛妊娠検出技術の開発

高橋北海道大学大学
院農学研究院

1,000

牛肉のおいしさに影響する筋内遊離脂肪酸についての研究（第４報）牧草由来の機能性成分を用いた初乳中免疫グロブリンの改善方法の開発

食肉におけるカルノシン関連ジペプチド増量法確立のための基礎研究

肺炎原因菌の特定を目的とした気管支肺胞洗浄法の牛医療への応用

H.23～

H.25～

H.25～

H.25～

© The Ito Foundation

昌志

黒毛和種の脂肪交雑形成に影響するビタミンＡを輸送するRBP４のDNA多型探索

平野貴

東京農業大学
農
学
部

1,000

黒毛和種の雌牛における空胎期間を短縮させる遺伝的
要因の解明

佐々木慎二

（独） 家 畜 改 良
セ ン タ ー800

牛胚盤胞期胚における耐暑性付与に関する研究

阪谷美樹（独）農研機構九州沖縄農業研究セ ン タ ー

1,000

ラテックス凝集反応による抗豚繁殖・呼吸障害症候群
ウイルス抗体検出系の開発

堀江真行

鹿 児 島 大 学
共同獣医学部

1,200

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養
技術の開発

高島

誠司

信
繊

学
部

1,000

理子

国立研究開発法
人 農 業・食 品 産
業技術総合研究機構畜産草地
研
究
所

1,000

1,200

肥育前雌子牛の摘出卵巣からの胚生産の試み

的場

州
維

大
学

生体内卵子吸引・体外受精・胚移植による子豚生産技
術の開発

吉岡

耕治

国立研究開発法
人 農 業・食 品 産
業技術総合研究機構動物衛生研
究所

血清中アミロイドＡおよびエンドトキシン活性値を指標とした牛複合性呼吸器疾患の早期予後診断システム
の構築

鈴木

一由

酪農学園大学獣医学群獣医学類

1,200

豚流行性下痢ウイルスのウイルス受容体の検索

白戸憲也

国 立 感 染 症
研
究
所

1,200

牛精子における暑熱ストレス耐性に関与する要因解析山中賢一

佐賀大学農学部

1,000

腸管内細菌による牛腸管外臓器汚染要因の解明

中馬猛久

鹿 児 島 大 学
共同獣医学部

1,000

腫瘍細胞のモノクローナリティー性状を応用した牛白血病新規診断法の開発

猪熊壽

帯広畜産大学
畜 産 学 部

900

牛卵管機能に及ぼす夏季暑熱ストレスの影響～性ホルモン受容体とヒートショックタンパク質の関係性～山本

ゆき

岡山大学大学院
環境生命科学
研
究
科

1,000

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール
代謝改善素材開発のための基礎研究

長岡利

岐阜大学応用生 物 科 学 部

800

1,000

牛用腸溶性生菌剤カプセルが牛の腸内細菌相に与える
影響

瀬山

智博

地方独立行政法人大阪府立環境農林水産総合研
究所

動物由来コロナウイルスの遺伝子操作系の確立と感染予防への応用神谷亘

大 阪 大 学
微生物病研究所感染症国際研
究 セ ン タ ー

1,000

赤外線深度センサーによる和牛の分娩予測技術の検討

小針大助

茨城大学農学部

1,000

豚流行性下痢の感染拡大リスクに関する研究関口敏

宮崎大学農学部

900

和牛のミオグロビン含量を指標とした肉色に関わるゲ
ノム育種価の推定

山崎瑞穂

広島県立総合技術研究所畜産技術センター

1,000

食肉に寄生する人獣共通幼線虫の分子生物学的種同定
法の開発

黄

鴻堅

麻
獣

800

© The Ito Foundation

布
医

大
学

学
部

牛の発情・妊娠における迅速かつ非破壊診断システム
の開発
合

H.25～
計

© The Ito Foundation

ツェンコヴァ
ルミアナ

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

58件

54,800食肉に関する助成研究調査成果報告書
Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

平成26年度（Vol. 33）
2015年11月

発行

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