平成28年度

食肉に関する
助成研究調査成果報告書

公益財団法人

伊藤記念財団

VOL. 35

「伊藤記念財団」設立趣意書
私，伊藤傳三は，昭和３年食肉加工業を創業して以来五十有余年の永きにわた
り食肉加工品の製造販売に従事して参ったところであります。
この間，昭和47年からは日本ハム・ソーセージ工業協同組合理事長，社団法人
日本食肉加工協会理事長，加えて，ハンバーグ・ハンバーガー協会理事長等の重責を担わせていただく等，業界団体の役員を勤めさせていただいてきたところであります。
こうした中で昭和55年，はからずも勲二等瑞宝章受章という身にあまる栄誉に浴したのでありますが，受章に際し私自身の過ぎ来し方を振り返り，食肉及び食
肉加工業界の行く末に思いを致し，２つの事柄を決意致しました。
第１は，食肉加工団体の指導体制の若返りであり，第２は，食肉加工業の基礎的研究の充実であります。
諸情勢が激しく変わりつつある中で食肉加工業界をさらに大きく発展させるには，新しいリーダーの登場が望ましいことは論をまちません。また，食肉加工品については，これまでも日本独自の技術開発は行われてきましたものの，いずれも企業内技術であると言っても過言でなく，大学等における基礎的研究の不足が将来の日本の食肉加工業の発展を遅らせるおそれがあり，この現状を打破する必要があると考えたところであります。
以上のような基本的考えの下に私は，食肉関係団体等の役員を辞すると共に，
食肉及び食肉加工に関する基礎的かつ広汎な研究を行い，あるいは助長するための財団の設立を発起するものであります。
昭和56年６月
設立発起人© The Ito Foundation

伊

藤

傳

三

Philosophy Behind the Establishment of
the Ito Foundation
Approximately half of a century has passed since I established a meat
packing corporation for commercial products in 1928. While involved in thisbusiness, I have had occasion to serve as chairman of the boards of trustees
of several organizations related to the meat industry, such as the HamSausage Industrial Association of Japan in 1972, the Meat Packing Industrial
Association of Japan, and the Hamburg-Hamburger Association of Japan.
In 1980, unexpectedly, I was highly honored to receive the Order of the
Sacred Treasure, Gold and Silver Star from the emperor in acknowledgement of my contributions to the meat industry and improved human nutrition
during my career. This illustrious award provided a strong impetus for me toact on my long-standing concern for the future of meat packing industries.
My commitment to the establishment of a new research foundation for thepromotion of meat science was based on two fundamental philosophies : first,
leadership of the Association of the Meat Packing Industry should be transferred to people with novel ideas and, second, an advanced system for basic
research should be established in meat industries. Clearly, fresh leadership isneeded in changing situations for intensive development in the meat packing
industry. Although some technical product developments have been achievedin certain individual corporations, the lack of basic research in meat scienceat universities and other research organizations certainly will impede future
development of Japanese meat packing industries. It is urgent to end the stagnation in the meat industry through research support.
On the basis of these philosophies, I myself will resign from any official
positions in meat-related associations and will establish a new researchfoundation to support and promote basic and applied research in meat
science.
Denzo Ito, Founder
June© The Ito Foundation

1981

事 業 の あ ら ま し（目

的）本財団は，食肉に関する研究及び調査を行い，もって畜産業及び食品産業の振興と国民食生活の安定に資することを目的とする。
（事業）

本財団は，上述の目的を達成するため，次の事業を行う。
⑴

食肉の生産，処理，加工等に関する基礎的研究及び調査⑵

食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査を行う大学等の研究機関に対する助成⑶ 食肉の生産，処理，加工等に関する研究又は調査に優れた業績が認められる研究者の表
彰⑷

食肉の生産，処理，加工等に関する情報の普及及び広報（事業実績）
年度
昭和57年度
58
59
60
61
62
63
平成元年度
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28

第１回
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35

研究調査助成48件 60,000千円
52
54,40060
49,80062
48,00070
53,00079
58,90095
70,50086
74,25079
60,00070
50,00086
60,00081
60,00081
60,00082
65,00081
69,10078
59,00082
60,00067
47,00057
41,00053
37,00058
40,00055
41,00055
48,00056
48,00011
10,00012
10,00015
16,90011
10,000
11
10,40012
12,00013
13,00038
37,00058
54,80069
66,00071
69,000© The Ito Foundation

ご

挨

拶

当伊藤記念財団は，伊藤ハム株式会社の創業者故伊藤傳三による巻頭の「設立趣意書」に掲げた趣意をもって，昭和56年７月３日に財団法人として農林水産大臣から設立を許可され、平成24年４月１日に公益財団法人伊藤記念財団に移行登記したものであり，事業の内容は，「事業のあらまし」にあるとおりであります。
おかげ様で当財団は，平成24年度からは公益財団法人として活動することとなり，その活動は本年で36年となります。この間，当財団の研究調査助成事業の存在が畜産関係の方々の間に浸透いたし，事業内容も逐次充実して参りつつあります。
これは，ひとえに関係各位のご指導ご鞭撻の賜と深く感謝申し上げるとともに，今後とも，
食肉加工等の基礎的研究の充実を希う創設者の意志にそって，益々食肉産業ひいては畜産業の振興及び国民食生活の安定のために役立つべく，更に努力を重ねて参りたいと存じております。
本書は，第35回（平成28年度）助成事業における71件の研究調査助成対象研究者の皆様からいただいた研究成果報告とともに，第２回となります伊藤記念財団賞授賞事業の授賞者とその業績概要と学会等事業助成の概要をとりまとめたものでありますが，以上の目的にしたがって，食肉産業の基礎的研究等に携わる諸氏の研究の一助ともなれば幸甚でございます。
平成29年11月

理事長

伊

藤

功

一

Dear Sir：
I am very pleased to send you and your organization a complimentary copy of theresearch reports of the Ito Foundation. This research foundation was founded by the late
Mr.Denzo Ito to advance research in meat science. The research reports are publishedannually. Unfortunately, the articles are largely in Japanease ; however, in the future wehope to contribute to the international development of meat science. Any constructive
suggestions or critiques from others involved in meat-related research would be accepted
gratefully.
You will find out philosophy behind the establishment of the Ito Foundation describedby Mr.Denzo Ito, in the research report of the Ito Foundation, Vol.35 enclosed here. We
appreciate any interest you may have in our research efforts.
It is my great pleasure to publish this report as the chief director.
Sincerely yours,
Nov. 2017
Koichi Ito
The chief director
The Ito Foundation© The Ito Foundation

i

研究助成事業
目次

食肉製品製造に使用される各種リン酸塩によるアクトミオシンのアクチンとミオシンへの解離に関する研究


松

石

昌

典（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

3

食肉加工品添加物，亜硝酸塩によるメタボリックシンドローム改善作用の解明


宮

本

理

人（徳島大学大学院医歯薬学研究部医薬品機能生化学分野）

9

トリプトファン添加による有害細菌の増殖抑制ならびに不活化：食肉および加工品製造工程
における活用と作用メカニズムの解明


小

関

成

樹（北海道大学大学院農学研究院）

13

新規アクチン結合タンパク質から豚肉の柔らかさの要因に迫る


灘

野

大

太（名古屋大学大学院生命農学研究科）

19

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影響（Ⅱ）：オートファジーと食肉の肉質の関連性


仲西

友紀・河原

聡（宮崎大学農学部応用生物科学科）

25

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その３）


西村

敏英・江草

愛（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

31

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定早川徹（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

40

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅱ）


根

岸

晴

夫（中部大学応用生物学部）

46

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響
市村

さやか・中村

幸信・吉田



由香・服部

昭仁

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

52

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価
山之上

稔１・趙

婭楠１・西田昌弘１・中田悠介１

上田修司１・羽原

正秋２・池崎秀和２

（１神戸大学大学院農学研究科，２株式会社INSENT）

61

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変


滝

田

禎

亮（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻）

67

大規模ゲノム解析による腸管出血性大腸菌の国際的伝播経路の解明
李謙

一（国立感染症研究所細菌第一部）© The Ito Foundation76

ii
新規な発酵食肉製品の機能性について（Ⅱ）
六車

三治男・川越

聖人・木本

早紀・川北

久美子・竹之山愼一（南九州大学健康栄養学部）

81

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究長岡利（岐阜大学応用生物科学部）

89

肥満に伴う認知症の発症予防に対する豚肉摂取による腸内環境改善効果の有用性
後藤


孔郎・正木

孝幸・柴田

洋孝

（大分大学医学部内分泌代謝・膠原病・腎臓内科学講座）

93

畜産物由来サプリメントの新規評価法の開発


吉川

豊・糸井

亜弥（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

98

豚肝臓由来ペプチドが肝線維化に及ぼす影響（Ⅱ）


實

安

隆

興（神戸大学大学院農学研究科）

103

黒毛和種における RBP4 多型と枝肉形質の関連解析


平野

貴・原

ひろみ・半澤惠（東京農業大学農学部）

107

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚の他慢性呼吸器感染症への抗病性機構に関する研究および肉豚生産における抗病性育種豚の有効性に関する考察
晶子１,２・吉野佐久間

智法２・須田野地

淳良１・高橋義人３・麻生伸和１久２（１宮城県畜産試験場，２東北大学大学院農学研究科，３宮城大学食産業学部）

114

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究（Ⅱ）


古川

力・野村

こう・高橋

幸水（東京農業大学農学部）

120

二（公益社団法人畜産技術協会附属動物遺伝研究所）

126

黒毛和種で致死に関与するゲノムコピー数多型の探索


佐々木

慎

黒毛和種牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効果検証


笹

﨑

晋

史（神戸大学大学院農学研究科）

130

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」の DNA 識別手法の確立
伊藤直弥１,３・関谷

正男１・佐藤慎一２・大竹剛２・都築政起３（１山口県農林総合技術センター，２独立行政法人家畜改良センター，３

広島大学大学院生物圏科学研究科）

135

優良肉用家畜増産のための受精卵移植の基盤となる高品質卵子の選抜眞鍋昇（大阪国際大学人間科学部）

143

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発


高島

誠司・高木

優二・保地

眞一（信州大学繊維学部・農学部）

148

種雄牛における精子メチル化可変部位の特性評価
武田

久美子・小林栄治（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）© The Ito Foundation

153

iii
肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究
的場


理子・平尾

雄二・武田

久美子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

牛の超早期妊娠因子（Super‒EPF）ELISA


松原

158

による受精・着床診断

和衛・小岩佳夏子・平田統一（岩手大学農学部）

165

弘（北里大学獣医学部）

171之（山形大学大学院理工学研究科）

180

軌（農業・食品産業技術総合研究機構生物機能利用研究部門）

186

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定（Ⅱ）


坂口

実・菊池

元宏・三浦

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発（Ⅱ）


阿

部

宏

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の同定と検証


細江

実佐・古澤

アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響小林

仁（宮城大学食産業学部）

191

豪（宮崎大学農学部獣医学科）

196

雄牛の新たな繁殖機能評価法の開発
北原

牛の受胎性に関与する排卵後の黄体と主席卵胞の位置関係の人為的制御に関する研究


松

井

基

純（帯広畜産大学畜産学部獣医学科）

202

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した牛精液および受精卵の未凍結保存


星

野

由

美（広島大学大学院生物圏科学研究科）

208

亮太朗（日本獣医生命科学大学獣医学部）

213

お灸は牛の卵巣機能の向上をもたらすか？


三浦

日本の養豚場における動物用抗菌剤使用に及ぼす要因の疫学的解析―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティレベルの関係―
杉浦


勝明・松田

真理・礒村

れん・ナイジェル CL クワン（東京大学大学院農学生命科学研究科農学国際専攻国際動物資源科学研究室）

219

食鳥と体皮膚に対するカンピロバクターの付着メカニズムの解明


三

澤

尚

明（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

225

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究２（コンベンショナル豚）
鈴木


亨・大橋

誠一・須田

遊人

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

230

遺伝子操作技術を駆使した生後感染型アカバネウイルスの病原性決定基の同定と流行ウイルス予測への応用


正

谷

達

謄（鹿児島大学共同獣医学部）

235

ジビエとして食される野生動物が保有する食中毒菌の薬剤耐性


安

藤

匡

子（鹿児島大学農水産獣医学域獣医学系）© The Ito Foundation

240

iv
肉用子牛におけるマイコプラズマ感染症の新たな迅速診断用 PCR 法の構築と肉用農場におけるマイコプラズマ感染症予防への応用
樋口

豪紀・岩野

英知＊

（酪農学園大学獣医学群獣医学類獣医衛生学ユニット，

＊

酪農学園大学獣医学群獣医学類獣医生化学ユニット）244

肉養鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する感受性松鵜彩（鹿児島大学共同獣医学部附属越境性動物疾病制御研究センター）249

リコンビナント抗原を用いたエゾシカにおける肝蛭症の血清診断法の確立と疫学調査による家畜・ヒトに対するリスク分析
関

まどか・福本晋也＊（岩手大学農学部共同獣医学科，＊帯広畜産大学原虫病研究センター）

256

野生獣肉の食肉利用に関する寄生虫性食中毒危害の科学的分析


山

﨑

朗

子（岩手大学農学部）

262

カンピロバクターフリーブロイラーの分別出荷を目的とした養鶏場即時検出システムの確立
山崎

渉・イスラムイブラヒム

サビック（宮崎大学農学部獣医学科）

270

毒素原性大腸菌易熱性毒素を迅速に検出するイムノクロマトグラフィーの開発


有

満

秀

幸（藤田保健衛生大学医学部）

276

わが国の家畜におけるＤ型インフルエンザウイルス感染の実態調査


堀本

泰介・村上

晋（東京大学大学院農学生命科学研究科）

283

牛由来黄色ブドウ球菌の増殖阻止を可能にする牛ポリクローナル抗体の特性解析


野地

智法・米山

裕（東北大学大学院農学研究科）

288

食肉により媒介されるトキソプラズマ原虫感染症に対する新規血清診断法の確立
玄

学南・高

洋・郭

白藤


焕平・Adjou Moumouni PF

梨可・菅沼

啓輔・相馬

武久＊

（帯広畜産大学原虫病研究センター，＊マルピー・ライフテック株式会社臨床検査部）

297

ゲノム疫学的アプローチによる豚抗酸菌症の実態解明
大屋

史人＊・岩本賢司・丸山朋忠＊＊・西内由紀子＊＊＊（岐阜大学応用生物科学部，＊京都大学大学院医学研究科，

＊＊

神戸市環境保健研究所，＊＊＊大阪市立大学医学部）

302

データマイニング技術を用いた牛白血病ウイルス感染の免疫動態解明に関する研究


関口

敏・乗峰

潤三（宮崎大学農学部）

307

肉用牛の出血性腸炎で認められる腸管病原性微生物の混合感染と病態との関連
桐野


有美・目堅
＊

博久＊・野中成晃（宮崎大学農学部， 宮崎大学テニュアトラック推進機構）© The Ito Foundation

312v
ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成促進：筋成長期での制御による食肉特性の向上を目指して
川口

舞・柴田

歩実・大宅

水野谷

航・中村



俊平・松吉

祐児

真子・辰巳

隆一

（九州大学大学院農学研究院）

319

粗飼料サイレージの発酵品質改善のためのサイレージ密度計測手法の開発
大


越

安

吾

（地方独立行政法人北海道立総合研究機構農業研究本部根釧農業試験場）

326

籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の実規模での開発（Ⅱ）
有賀

小百合・佐藤衆介（帝京科学大学生命環境学部）

334

代謝性疾患と関連病態の発症におけるスカトールおよび胆汁酸の役割
石塚

敏・清水

英寿＊

（北海道大学大学院農学研究院，＊島根大学生物資源科学部）



339

Lactococcus 属乳酸菌で調製した発酵乳給与による離乳子豚の免疫機能の改善と生産性の向上
守谷


直子・兼松

伸枝・田島

清・成田

卓美・木元

広実

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

345

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発
石垣


元気・福山

喜一

（宮崎大学農学部附属フィールド科学教育研究センター住吉フィールド）351

哺乳期の長日処理による黒毛和種の代謝調節安尾しのぶ（九州大学大学院農学研究院）

356

田

360

耕作放棄地を利用しためん羊生産体系の確立の試み

中智夫（麻布大学獣医学部）

竹笹サイレージの肉用鶏への給餌による食中毒菌の制御とプロバイオティクスの開発


谷口

喬子・三澤

尚明（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

365

牛由来肝臓細胞における薬物代謝関連遺伝子の解析
吉


岡

都

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構・動物衛生研究部門）

371

山間地耕作放棄地内野草放牧と畜舎内濃厚飼料多給で生産されたサフォーク種ラム肉の食味および呈味成分の比較
石田

元彦・西村

苑夏・矢地

浅野


彩加・吉田

桂吾・長井

誠・小西

彩乃
康子

（石川県立大学生物資源環境学部）

376

黒毛和種肥育牛への穀物飼料増給に対するルーメン微生物相の応答に関する研究

小池聡（北海道大学大学院農学研究院）© The Ito Foundation

383

vi
糖代謝産物および終末糖化産物がブロイラーの生産性に与える影響の解明


橘

哲也・牧野

良輔（愛媛大学大学院農学研究科）

388

動－静脈差でみる，発育不良豚の成長に必要なアミノ酸および他の栄養成分の推定


塚

原

隆

充（京都府立大学大学院生命環境科学研究科）

395

直浩・佐藤

401

肉質向上に資するアミノ酸栄養の基礎研究


佐藤

祐介・二瓶

より子（宇都宮大学農学部）

中鎖脂肪酸に着目した人工乳改良による離乳期子牛の発育改善
福森

理加１，２・増田１

洋史２・長尾慶和１，２

２（ 宇都宮大学農学部附属農場， 東京農工大学大学院連合農学研究科）

406

ストレスホルモンによる日本短角種牛由来筋芽細胞の増殖と筋線維型への影響


佐

藤

勝

祥（秋田県立大学生物資源科学部）

412

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発
木下


英樹・石川

潤一＊

（東海大学農学部バイオサイエンス学科，＊宮城大学大学院食産業学研究科）© The Ito Foundation

417

vii

CONTENTS
Studies on the dissociation of actomyosin into actin and myosin induced by various phosphates
used for manufacture of meat products
Masanori Matsuishi（School of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life
Science University） 3

Molecular mechanisms underlying beneficial effects of nitrites ameliorating metabolic syndromes
Licht Miyamoto（Medical Pharmacology, Inst. of Biomedical Sciences, Tokushima University）

9

Bacterial control by using tryptophan: Application to meat and meat products processing andinvestigation of its reaction mechanism
Shigenobu Koseki（Research Faculty of Agricultural Science, Hokkaido University） 

13Understanding of factors involved in pork meat tenderness through analysis of a novel actinbinding protein
Daita Nadano（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University） 

19

Effect of autophagy on postmortem proteolysis in skeletal muscle（II）: Relationship between
autophagy and meat quality
Tomonori Nakanishi and Satoshi Kawahara（Department of Biochemistry and Applied Biosciences, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）



25

Studies on clarification of the compounds involved in“koku attributes”of pork sausages（III）
Toshihide Nishimura and Ai Saiga Egusa（Department of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary andLife Science University） 

31

Identification of myosin rod region involved in the solubilization under the low ionic strength
condition
Toru Hayakawa（Department of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

40© The Ito Foundation

viii
Study on processing technology and characteristics of fermented meat products produced using
lactic acid bacteria cultures for dairy products（II）
Haruo Negishi（College of Bioscience and Biotechnology, Chubu University） 

46

Effect of hypoxanthine on the improvement of taste during postmortem aging of meat
Sayaka Ichimura, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida and Akihito Hattori（Japan Meat Science and Technology Institute） 

52

Intramuscular free fatty acids related to deliciousness of Japanese Black Wagyu beef and its
taste-traits analyzed by an electronic taste sensing system
Minoru Yamanoue1, Yanan Zhao1, Masahiro Nishida1, Yusuke Nakada1, Shuji Ueda1, Masaaki
Habara2 and Hidekazu Ikezaki2（1Graduate School of Agricultural Science, Kobe University, 2INSENT, Inc．
）

61

Alteration of the substrate specificity of transglutaminase by protein engineering
Teisuke Takita（Graduate School of Agriculture, Division of Food Science and Biotechnology, Kyoto University） 

67

Large scale genome analyses of enterohemorrhagic Escherichia coli for exploring internationaltransmission routes
Ken‒ichi Lee（Department of Bacteriology I, National Institute of Infectious Diseases） 76

Functional properties of novel fermented meat products（Ⅱ）
Michio Muguruma, Masato Kawagoe, Saki Kimoto, Kumiko Kawakita and Shinichi Takenoyama．
（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University） 

81

Basic study of the development of an innovative hypocholesterolemic food materials using cattle
heart peptides
Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University） 89

Efficacy of intestinal flora improvement by the pork intake on the prevention of dementia
related with obesity
Koro Gotoh, Takayuki Masaki and Hirotaka Shibata（Department of Endocrinology, Metabolism, Rheumatology, and Nephrology, Faculty of Medicine, Oita
University） 

93

Development of new evaluation method for supplement derived from animal productYutaka Yoshikawa and Aya Itoi
（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women’s University） © The Ito Foundation98

ix
Effect of dietary peptides derived from porcine liver on hepatic fibrosis（II）
Takaoki Saneyasu（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University） 

103

Association analysis between RBP4 gene polymorphisms and carcass traits
in Japanese black cattle
Takashi Hirano, Hiromi Hara and Kei Hanzawa（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture） 

107Study of the anti‒disease mechanism for chronic respiratory infections in Landrace pigs
selectively bred for Mycoplasmal Pneumonia of Swine（MPS）resistance and the effectivenessof anti‒disease breeding regarding pork production
Akiko Sakuma1, 2 Jyunryo Yoshino1, Nobukazu Takahashi1, Tomonori Nochi2, Yoshihito Suda3 andHisashi Aso2
（１Miyagi Livestock Experimental Station, Miyagi, Japan, ２Graduate School of Agricultural Science,
Tohoku University, ３Department of Food, Agriculture and Environment, Miyagi University） 

114

Sustainability of genetic diversity in original pig strains used for branding pork（II）
Tsutomu Furukawa, Koh Nomura and Yukimizu Takahashi（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture） 

120

Reverse genetic screen for copy number variation associated with lethality in Japanese Black
cattleShinji Sasaki（Shirakawa Institute of Animal Genetics, Japan Livestock Technology Association） 

126

Investigation on the effect of genetic markers for beef quality in Japanese Black cattle
Shinji Sasazaki（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University） 

130

Establishment of a DNA‒based discriminating method for Jidori“Chosyu‒Kurokashiwa”
genetically derived from“Kuro‒Kashiwa”，a National Natural Treasure of Japan
Naoya Ito1,3, Masao Sekiya1, Shinichi Sato2, Tsuyoshi Ohtake2 and Masaoki Tsudzuki3（1Yamaguchi Prefectural Agriculture and Forestry General Technology Center, Livestock Technology
Research Department, 2National Livestock Breeding Center, 3Graduate School of Biosphere Science,
Hiroshima University） 

135

Selection of high quality egg for embryo transplantation to produce high‒quality meat livestock
Noboru Manabe（Department of Human Sciences, Osaka International University）

143

Development of porcine/bovine germline stem cell technology using novel growth factor
Seiji Takashima, Yuji Takagi and Shinichi Hochi（Faculty of Textile Science and Technology and Faculty of Agriculture, Shinshu University）

© The Ito Foundation

148

x
Characterization of differentially methylated sites in bull spermatozoa DNA
Kumiko Takeda and Eiji Kobayashi（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

153

Study of in vitro embryo production using growing oocytes collected from ovaries removed
from beef calves before fattening
Satoko Matoba, Yuji Hirao and Kumiko Takeda（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

158

Fertilization and implantation diagnosis by Super‒early pregnancy factor（Super‒EPF）ELISAof cattle
Kazuei Matsubara, Kanako Koiwa and Toh‒ichi Hirata（Faculty of Agriculture, Iwate University）

165

Novel standard for artificial insemination timing based on different estrous detection criteria incattle（II）
Minoru Sakaguchi, Motohiro Kikuchi and Hiroshi Miura（School of Veterinary Medicine, Kitasato University）

171

Development of novel system for quality evaluation of bovine embryos by analysis of
mitochondrial function（II）
Hiroyuki Abe（Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University）

180

Identification of endometrium cell‒derived factors involved in the early development of bovine
embryoMisa Hosoe and Tadashi Furusawa（Institute of Agrobiological Sciences, NARO）

186

Effects of adipokine and insulin resistance on the bovine fertility
Jin Kobayashi（School of Food, Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

191

Research on novel evaluation of reproductive function in bull
Go Kitahara（Development of Veterinary Science, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

196

Study of artificial regulation of locational relationship between corpus luteum and dominantfollicle after ovulation which relate to fertility of dairy cattle
Motozumi Matsui（Department of Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

© The Ito Foundation

202

xi
Preservation of bovine semen and embryo by supercooling using an amino acid that effectively
inhibits ice crystal formation
Yumi Hoshino（Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University）

208

Does the Moxibustion have positive effect to ovarian function？
Ryotaro Miura（Department of Veterinary Medicine, Nippon Veterinary and Life Science University）

213

Epidemiological analysis of the factors affecting the use of veterinary antimicrobials at farmlevel on Japanese pig farms－the relationship between veterinary antimicrobial usage and on‒farm biosecurity level－
Katsuaki Sugiura, Mari Matsuda, Ren Isomura and Nigel CL Kwan
（Laboratory of Global Animal Resource Science, Department of Global Agricultural Sciences, Graduate
School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

219

Elucidation of attachment manner of campylobacters on the skin surface of chicken carcasses
Naoaki Misawa（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

225

Experimental infection with porcine deltacoronavirus in conventional pigs
Tohru Suzuki, Seiichi Ohashi and Yuto Suda
（National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research Organization, NARO）


230

Identification of pathogenic determinant of Akabane virus by using reverse genetics andapplication for endemic prediction of virus
Tatsunori Masatani（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

235

Drug resistance of food‒borne bacteria isolated from game meat animals
Masako Andoh（Research field in Veterinary Medicine, Agriculture, Fishery and Veterinary Medicine Area, Kagoshima
University）

240

A novel PCR methods for rapid screening of Mycoplasma infection of beef calf and theirapplication for the prevention of Mycoplasma infection in beef farm
Hidetoshi Higuchi and Hidetomo Iwano ＊（Animal Health Lab., Faculty of Vet. Med., Rakuno Gakuen Univ., ＊ Veterinary Biochem., Faculty of Vet.
Med., Rakuno Gakuen Univ．）

244© The Ito Foundation

xii
Susceptibility of broiler chicken lines to high pathogenic avian influenza virus
Aya Matsuu（Transboundary Animal Diseases Research center, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima
University）

249

Immuno‒diagnosis of fasciolosis in ezo deer using recombinant antigens to examine risk oftransmission for livestock and human
Madoka Ichikawa‒Seki and Shinya Fukumoto＊（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University, ＊ National
Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）


256

Parasitological research for game meat hygiene
Akiko Yamazaki（Department of Agriculture, Iwate University）

262

Establishment of pen side diagnosis system for segregation of Campylobacter‒negative flocks inchicken broiler farms
Wataru Yamazaki and Islam Ibrahim Sabike（Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

270

Development of immunochromatography for rapidly detecting heat‒labile enterotoxin produced
by enterotoxigenic Escherichia coli
Hideyuki Arimitsu（Fujita Health University School of Medicine）

276

Surveillance on influenza D virus infection in livestock in Japan
Taisuke Horimoto and Shin Murakami（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

283

Characterization of bovine polyclonal antibodies that are capable of inhibiting the growth ofStaphylococcus aureus isolated from cows
Tomonori Nochi and Hiroshi Yoneyama（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

288

Establishment of new sero‒diagnostic method against food‒borne toxoplasmosis
Xuenan Xuan, Yang Gao, Huanping Guo, Paul Franck Adjou Moumouni, Rika Umemiya‒Shirafuji,
Keisuke Suganuma and Takehisa Soma ＊（National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary
Medicine, Veterinary Diagnostic Laboratory, ＊Marupi Lifetech Co., Ltd. Ikeda, Osaka, Japan）

© The Ito Foundation

297

xiii
Research on actual insights into transmission routes of Mycobacterium avium in pigs by
genomic ecological approach
Kenji Ohya, Fumito Maruyama＊, Tomotada Iwamoto＊＊ and Yukiko Nishiuchi＊＊＊（Department of Applied Biological Sciences, Gifu University, ＊Graduate School of Medicine, Kyoto
University, ＊＊Kobe Institute of Health, ＊＊＊Osaka City University Medical School）

302

Study of immune dynamics in bovine leukemia virus infection using data minig techniques
Satoshi Sekiguchi and Junzo Norimine（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

307

Co‒infection of Eimaria and enteropathogenic microbes and its role in the pathophysiology of
haemorrhagic enteritis in beef cattle
Yumi Kirino, Hirohisa Mekata＊ and Nariaki Nonaka（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, ＊ Organization for Promotion of Tenure Track）

312

Slow‒myofiber generation induced by dietary polyphenol feeding to growing animals, towardenhancing meat quality
Mai Kawaguchi, Ayumi Shibata, Shunpei Ohya, Yuji Matsuyoshi, Wataru Mizunoya, Mako
Nakamura and Ryuichi Tatsumi（Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

319

Development of silage density measurement method for improving fermentation quality offorage silage
Ango Ohkoshi（Hokkaido Research Organization, Agricultural Research Department Konsen Agricultural Experiment
Station）

326

Development of commercial based animal welfare friendly broiler production system byunhusked rice feeding in Japan（II）
Sayuri Ariga and Shusuke Sato
（Teikyo University of Science, Faculty of Life and Environmental Sciences）

334

Role of skatole and bile acids in development of metabolic diseases
Satoshi Ishizuka and Hidehisa Shimizu＊（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University, ＊Faculty of Life and Environmental Science,
Shimane University）

339

Feeding milk fermented with a Lactococcus strain to weaning piglets ameliorates growth
performance, but not immune function
Naoko Moriya, Nobue Kanematsu, Kiyoshi Tajima, Takumi Narita and Hiromi Kimoto‒Nira（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

© The Ito Foundation

345

xiv
Development of soybean production technique by living multi method with tropical grasses insouthwestern Japan
Genki Ishigaki and Kiichi Fukuyama（Sumiyoshi Livestock Science Station, Field Science Education Research Center, Faculty of Agriculture,
University of Miyazaki）

351

Control of metabolism in Japanese black cattle by postnatal exposure to long photoperiod
Shinobu Yasuo（Faculty of Agriculture, Kyushu University）

356

Attempt to establish a new sheep production system in abandoned farmland
Toshio Tanaka（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

360

Control of foodborne bacteria in poultry by feeding of bamboo silage and development ofprobiotics from the silage
Takako Taniguchi and Naoaki Misawa（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

365

Cytochrome P450 expression in SV40 large T antigen‒immortalizes bovine liver cell lines
Miyako Yoshioka（National Institute of Animal Health, NARO）

371

Comparison of the taste and the taste components in the meat between Suffolk lambs fattened bygrazing on wild grass in abandoned fields in hilly area and those fattened by high concentrates
diet in feeding barns
Motohiko Ishida, Sonoka Nishimura, Ayaka Yachi, Ayano Yoshida, Keigo Asano, Makoto Nagai
and Yasuko Konishi（Faculty of Bioresources and Environmental Sciences, Ishikawa Prefectural University）

376

Response of rumen microbiota to grain‒diet level during fattening period in Japanese Black
cattleSatoshi Koike（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

383

Studies on the effect of sugar metabolite and advanced glycation endproducts on broiler
production
Tetsuya Tachibana and Ryosuke Makino（Graduate School of Agriculture, Ehime University）

388

Use of venous‒to‒arterial difference for the determination of amino acid and other metabolites
that can complement the growth of runt piglets
Takamitsu Tsukahara（Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University）

© The Ito Foundation

395

xv
Basic studies on the improvement of meat quality by amino acid supplementation
Yusuke Sato, Naohiro Nihei and Yoriko Sato
（Utsunomiya University, School of Agriculture）

401

The effect of medium‒chain fatty acids supplementation with calf starter on growth in calvesduring the weaning period
Rika Fukumori1, 2 , Yoji Masuda2 and Yoshikazu Nagao1, 2（１University Farm, Department of Agriculture, Utsunomiya University, ２The United Graduate School of
Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

406

The effect of stress hormone on the myoblast derived from Japanese shorthorn cattle
proliferation and exchanges the muscle fiber typeKatsuyoshi Sato
（Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University）

412

Bactericidal effect of multi‒drug resistance bacteria using lactic acid bacteria and developmentof functional domestic animal fodder
Hideki Kinoshita and Junichi Ishikawa＊（Department of Bioscience, School of Agriculture, Tokai University, ＊Graduate School of Food,
Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

© The Ito Foundation

417

xvi

伊藤記念財団賞
目江草（雜賀） 愛（日本獣医生命科学大学応用生命科学部

次

食品科学科食品機能化学教室

食肉ならびにその副生物を由来とする機能性ペプチドに関する研究 

岡

村

雅

史（北里大学獣医学部

口右二（茨城大学農学部

431

准教授）

養鶏場および食鳥処理現場における鶏肉の食中毒菌汚染の実態とその対策 

宮

講師）

432

教授）

筋漿タンパク質による筋原線維加熱ゲル化促進作用に関する研究 © The Ito Foundation

433

xvii

学会等事業助成目次

第 17 回アジア・大洋州畜産学会議開催報告
公益社団法人日本畜産学会

理事長

小泉聖一 

437

日本食肉研究会の助成事業実施報告
日本食肉研究会会長

根岸晴夫（中部大学応用生物学部） 438

食肉の安全・安心および安定的生活を脅かす家畜感染症に関する国際研究集会開催報告
岩手大学農学部附属動物医学食品安全教育研究センター© The Ito Foundation

センター長

鎌田洋一 

440

© The Ito Foundation

研究助成事業© The Ito Foundation

© The Ito Foundation

3

食肉製品製造に使用される各種リン酸塩によるアクト
ミオシンのアクチンとミオシンへの解離に関する研究
Studies on the dissociation of actomyosin into actin and myosin inducedby various phosphates used for manufacture of meat products

松

石

昌

典

（日本獣医生命科学大学応用生命科学部食品科学科）

Masanori Matsuishi（School of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science University）

In this study, it was examined whether various phosphates dissociate free actomyosin or
actomyosin restrained in myofibrils by gel filtration chromatography and SDS-PAGE. Whenactomyosin solubilized in 0.6 M KCl was subjected to a Sepharose CL-2B column equilibrated
with a 0.6 M KCl solution, myosin heavy chains and actin monomers were detected together infraction No.16 eluted from the column. Thus, actomyosin is not dissociated under these
conditions. When actomyosin treated with 8 mM pyrophosphate（PYP）, tripolyphosphate（TRP）or inosine-5ʼ-monophosphate（IMP）in 0.6 M KCl was subjected to the column
equilibrated with 0.6 M KCl solutions containing those phosphates, in all cases, almost myosin
heavy chains and actin monomers were detected in fraction No.24 and 34 separately, although
little protein was detected in fraction No.16. These results indicate that actomyosin is
dissociated into actin and myosin with those phosphates. When actomyosin treated with 8 mM
PYP or IMP in 0.2 M KCl was subjected to the column equilibrated with 0.2 M KCl solutions
containing 8 mM PYP or IMP, myosin heavy chains and actin monomers were detected in
fraction No.26 and 33 separately. On the treatment with TRP, myosin heavy chains and actinmonomers were found together in fraction No.16. Thus, it is clarified that in 0.2 M KCl PYP
and IMP can dissociate actomyosin, however TRP solubilizes whole actomyosin without
dissociation. When myofibrils treated with 8 mM PYP or TRP were centrifuged and theobtained supernatants were subjected to a column equilibrated with a 0.2 M KCl solution
containing 8 mM PYP or TRP, myosin heavy chains and actin monomers were detected
together in fraction No.16. However, no protein was detected in all fractions in the case of IMP.
Above results demonstrated that PYP and IMP dissociate actomyosin in both of 0.6 and 0.2 M
KCl, however, TRP dissociates actomyoisn only in 0.6 M KCl. Furthermore, although PYP and
TRP can release actomyosin from particular restraints in myofibrils, actomyosin liberated frommyofibrils would not be dissociated into actin and myosin because of another binding like ahoop which is not cleaved by PYP and TRP.

© The Ito Foundation

4

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

した。この混合物を遠心分離して上清を得て，そ的

１．目

れに純水を加えてKCl濃度を0.2Ｍにした。希釈後

食肉製品製造に使用されるピロリン酸塩に生じた沈殿を集めて，そのKCl濃度を0.6Ｍにし（PYP）やトリポリリン酸塩（TRP）などの無機てアクトミオシンを溶解させた。このような希釈

ポリリン酸塩は，アクトミオシンをアクチンとミ法を３回繰り返してアクトミオシンを精製した。

オシンに解離させることにより，食肉からのミオ筋原線維はYangらの方法７）で調製した。

シンの抽出を高め，低塩濃度でも結着性や保水性2.3の高い製品を製造することを可能にしていると言ゲル浸透クロマトグラフィーでは分画分子量がわれている 。著者らは，0.2M KCl下でアクトミ

７万～4000万のSepharose CL-2B（GE Helthcare

オシンは不溶性であるが，解離して生じるアクチ

Bio-Sciences AB, Sweden）カ ラ ム（φ ２ cm ×ンとミオシンは可溶性であるという性質を利用し80cm）を用いた。0.6M KCl存在下でのクロマトて，有機リン酸塩である5ʼ-イノシン酸塩（IMP）

グラフィーでは，1.67mg/mlアクトミオシンをが，アクトミオシンをアクチンとミオシンに解離

20mM Tris-HCl（pH 7.2）/2 mM NaN3/0.6 M

させることを示した 。さらに，IMPがモデルソー

KCl（0.6Ｋ-液）あるいは８mMリン酸塩を含む0.6

セージにおいてPYPと同等の結着性と保水性のＫ-液中で０℃に１時間インキュベートした後，３）改善効果を有すること ，および，IMPが食肉の

6,500×ｇで15分間遠心分離した。得られた上清

熟成中の解硬因子の候補の一つであることを示しを0.6Ｋ-液あるいは８mMリン酸塩を含む0.6Ｋ-

た 。しかし，このようなリン酸塩の中で，アク液で平衡化したカラムにかけた。0.2M KCl存在

トミオシンをアクチンとミオシンに解離すること

下でのクロマトグラフィーでは，1.67mg/mlアクが分子量の変化として明確に示されているのは

トミオシンあるいは4.17mg/ml筋原線維を20mM

ATPのみである 。

Tris-HCl（pH 7.2）
/2 mM NaN3/0.2 M KCl（0.2

１）

２）

４）

５）

ゲル浸透クロマトグラフィー

本研究では，PYP，TRPおよびIMPをアクトミ

Ｋ-液）あるいは８mMリン酸塩を含む0.2Ｋ-液中

オシンと筋原線維に作用させて，ゲル浸透クロマ

で０℃に１時間インキュベートした後，6,500×

トグラフィーとSDS-PAGEで分析することによｇで15分間遠心分離した。得られた上清を0.2Ｋ-

り，アクトミオシンのアクチンとミオシンへの解液あるいは８mMリン酸塩を含む0.2Ｋ-液で平衡

離および筋原線維からのアクトミオシンの遊離を化したカラムにかけた。

分子量の変化として明らかにすることを目的とした。

コレクター（アドバンテック，東京）で分取した。各フラクションのタンパク質濃度は280nmの２．材料と方法
2.1

吸光度あるいはTakara Bradoford Protein Assay

材料

Kit（タカラバイオ（株），滋賀）でモニターした。

市販の鶏胸肉（浅胸筋）を用いた。
2.2

カラムからの溶出液を６mlずつフラクション

2 . 4 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動

アクトミオシンと筋原線維の調製

アクトミオシンは常法（SDS-PAGE）

によって調製した。ひ

６）

き肉に６倍量のWeber-Edsall溶液（0.6M KCl/0.04
M NaHCO3/0.01 M Na2CO3）を加えて24時間抽出

溶出したタンパク質はSDS-PAGEで分析し８），
アクチン，ミオシンの挙動を調べた。
分子量マーカー（タカラバイオ（株），滋賀；© The Ito Foundation

食肉製品製造に使用される各種リン酸塩によるアクトミオシンのアクチンとミオシンへの解離に関する研究

5

ホスホリラーゼ b（PB）＝9.7万，血清アルブミ

た。ミオシン重鎖（分子量20万）とアクチンモノ

ン（SA）＝6.6万，オボアルブミン（OA）＝4.4マー（分子量4.5万）はフラクションNo.16に一緒

万，カルボニックアンヒドラーゼ（CA）＝2.9万，に検出された。また，少量のミオシン重鎖とアクトリプシンインヒビター（TI）＝２万，リゾチー

チンモノマーがそれぞれ単独でフラクション

ム（LZ）＝1.4万）を使用した。

No.25とフラクションNo.30に検出された。したがって，この条件では多くのアクトミオシンはア３．結果と考察クチン，ミオシンに解離せずにカラムから溶出し

3 . 1 0.6M KCl存在下で各種リン酸塩がアクトたと考えられた。
アクトミオシンに８mM PYPを作用させたもミオシンの挙動に与える影響
アクトミオシンにリン酸塩を添加せずに0.6Mのを遠心分離して得た上清を，0.6M KCl存在下

KCl存在下でSepharose CL-2Bカラムにかけ，溶でSepharose CL-2Bカラムにかけた結果，Fig.１

出物をSDS-PAGEで分析した結果をFig.１に示しではアクトミオシンが検出されたフラクション

fraction number
Fig. 1 SDS-PAGE of fractions eluted from a Sepharose CL-2B column on which supernatant of actomyosin treated with

0.6 M KCl was applied.
The column was equilibrated with 0.6K-solution（20 mM Tris-HCl（pH 7.2）
/2 mM NaN3/0.6 M KCl）. W, wholeactomyosin without centrifugation ; L, loaded sample ; M, molecular weight marker ; MH, myosin heavy chain ; AM,
actin monomer ; PB, phosphorylase b ; SA, serum albumin ; OA, ovalbumin ; CA, carbonic anhydrase ; TI, trypsin
inhibitor.

fraction number
Fig. 2 SDS-PAGE of fractions eluted from a Sepharose CL-2B column on which supernatant of actomyosin treatedwith 0.6 M KCl and 8 mM PYP was applied.
The column was equilibrated with 0.6K-solution containing 8 mM PYP. Abbreviations on the pictures of gels are

the same as those in Fig.1.

© The Ito Foundation

6

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

No.16には少量のミオシン重鎖が検出された。他れた（図は示していない）。この結果は，TRPが方，多量のミオシン重鎖がフラクションNo.24にアクトミオシンをアクチンとミオシンに解離させ

検 出 さ れ ，ア ク チ ン モ ノ マ ー が フ ラ ク シ ョ ン

ることを明確に示している。

No.34に検出された（Fig.２）。この結果は，粘度

3 . 2 0.2M KCl存在下で各種リン酸塩がアクト変化から推定されていたPYPによるアクトミオ
シンのアクチンとミオシンへの解離

ミオシンの挙動に与える影響

が分子の大アクトミオシンに８mM PYPを作用させたもきさの変化によって明確に示されたことを意味しのを遠心分離して得た上清を，0.2M KCl存在下ている。

でSepharose CL-2Bカラムにかけた。Fig.３に示

９）

アクトミオシンに８mM IMPを作用させたもしたように，フラクションNo.16には何も検出さのを遠心分離して得た上清を，0.6M KCl存在下

れず，ミオシン重鎖とアクチンモノマーがフラク

でSepharose CL-2Bカラムにかけた結果，フラク

ションNo.26とフラクションNo.33にそれぞれ分か

ションNo.16には少量のアクトミオシンが検出されて検出された。この結果は，0.6M KCl存在下

れ，フラクションNo.24とフラクションNo.34にミと同様に，0.2M KCl存在下でもPYPによりアクオシン重鎖とアクチンモノマーがそれぞれ分かれ

トミオシンがアクチンとミオシンに解離することて検出された（図に示していない）。この結果よを示している。同様に，アクトミオシンに８mMり，IMPは溶解度の変化から推定されていたIMPを作用させたときもアクチンとミオシンに解２）とおり，アクトミオシンをアクチンとミオシンに解離した（図は示していない）。
他方，アクトミオシンに８mM TRPを作用さ離させることが明らかとなった。
アクトミオシンに８mM TRPを作用させたもせたものを遠心分離して得た上清を，0.2M KClのを遠心分離して得た上清を，0.6M KCl存在下

存在下でSepharose CL-2Bカラムにかけた結果，でSepharose CL-2Bカラムにかけた結果，フラク

多くのミオシン重鎖とアクチンモノマーはフラクションNo.16にはほとんど何も検出されず，フラションNo.16に一緒に検出された（Fig.４）。これクションNo.24とフラクションNo.34にミオシン重は，0.2M KCl存在下では，TRPはアクトミオシ

鎖とアクチンモノマーがそれぞれ分かれて検出さンを解離させることなく，丸ごと溶解させること

fraction number
Fig. 3 SDS-PAGE of fractions eluted from a Sepharose CL-2B column on which supernatant of actomyosin treatedwith 0.2 M KCl and 8 mM PYP was applied.
The column was equilibrated with 0.2K-solution（20 mM Tris-HCl（pH 7.2）
/2 mM NaN3/0.2 M KCl）containing 8

mM PYP. Abbreviations on the pictures of gels are the same as those in Fig.1.

© The Ito Foundation

食肉製品製造に使用される各種リン酸塩によるアクトミオシンのアクチンとミオシンへの解離に関する研究

7

fraction number
Fig. 4 SDS-PAGE of fractions eluted from a Sepharose CL-2B column on which supernatant of actomyosin treatedwith 0.2 M KCl and 8 mM TRP was applied.
The column was equilibrated with 0.2K-solution containing 8 mM TRP. Abbreviations on the pictures of gels are

the same as those in Fig.1.

fraction number
Fig. 5 SDS-PAGE of fractions eluted from a Sepharose CL-2B column on which supernatant of myofibrils treated with

0.2 M KCl and 8 mM PYP were applied.
The column was equilibrated with 0.2K-solution containing 8 mM PYP. Abbreviations on the pictures of gels are

the same as those in Fig.1.

を示している。

させた場合も同じであった（図は示していない）。

3 . 3 0.2M KCl存在下での各種リン酸塩による

一方，８mM IMPを作用させた場合は，フラク

筋原線維からのアクトミオシンの遊離ションNo.13-36には何も溶出しなかった（図は示

筋原線維に８mM PYPを作用させたものを遠していない）。これは，IMPは筋原線維からアク心分離して得られた上清を，0.2M KCl存在下でトミオシンを遊離させることができないことを示

Sepharose CL-2Bカラムにかけた。その結果，しており，先の報告４）に示された，アクトミオシ

Fig.５に示したように，ミオシン重鎖とアクチンンが筋原線維中に何らかの機構で拘束されておモノマーはフラクションNo.16の同じ位置に溶出り，PYPとTRPはその拘束を解除できるが，IMPした。したがって，PYPは筋原線維からアクトミは解除できないという推定を支持している。ま

オシンを解離させることなく丸ごと遊離させていた，PYPとTRPは，食肉からWeber-Edsall溶液

ることが判明した。これは，８mM TRPを作用で抽出された，つまり，すでに遊離しているアク© The Ito Foundation

8

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

トミオシンをアクチンとミオシンに解離させるこを解離させるが，TRPはアクトミオシンを解離とができる（Fig.２）。しかし，筋原線維中からさせずに丸ごと溶解させると考えられた。さら両者によって遊離してきたアクトミオシンは，そに，0.2M KCl下で筋原線維に各種リン酸塩を作れらによってもアクチン，ミオシンに解離されな用させて，上清をカラムにかけた結果，PYPといため，両タンパク質間には，タガのようなもうTRPではミオシン重鎖とアクチンモノマーはフ一つ別の結合があることが示唆される。

ラクションNo.16に一緒に検出されたが，IMPで

４．要は 何 も 検 出 さ れ な か っ た 。以 上 の 結 果 よ り ，

約

PYP, IMPは0.6Ｍおよび0.2M KCl下ではアクトミ

各種リン酸塩が遊離のアクトミオシンあるいはオシンを解離させるが，TRPは0.6M KCl下での筋原線維に組み込まれたアクトミオシンを解離さみアクトミオシンを解離させることが判明した。

せるかどうかをゲル浸透クロマトグラフィーとまた，PYPとTRPは0.2M KCl下でアクトミオシ

SDS-PAGEで調べた。0.6M KCl下で溶解していンを筋原線維中の拘束から外す作用を有しているる ア ク ト ミ オ シ ン を 0.6M KCl で 平 衡 化 し たが，筋原線維から遊離したアクトミオシンにはSepharose CL-2Bカラムにかけた結果，多くのミPYPとTRPによってもはずれない，タガのよう

オシン重鎖とアクチンモノマーはフラクション

な別の結合があるためにアクチンとミオシンに解No.16の位置に一緒に検出された。したがって，離しないと考えられた。

アクトミオシンは解離していないことが示された。0.6M KCl下で８mM PYP, TRP, IMPで処理したアクトミオシンの遠心上清をカラムにかけた
結果，いずれも，フラクションNo.16には少量のタンパク質のバンドしか検出されず，ミオシン重鎖とアクチンモノマーがフラクションNo.24とフラクションNo.34にそれぞれ分かれて検出された。
したがって，これら３種のリン酸塩によりアクト
ミオシンは解離したことが示された。また，0.2M
KCl下で８mM PYPとIMPで処理したアクトミオ
シンの上清をかけたときには，ミオシン重鎖とアクチンモノマーがフラクションNo.26とフラクションNo.33にそれぞれ分かれて検出された。一方，TRPではミオシン重鎖とアクチンモノマーのほとんどがフラクションNo.16に一緒に検出された。したがって，PYPとIMPはアクトミオシン

文献１） 山本克博：肉の機能と科学，朝倉書店，134～
160，2015．
２） Okitani, A., Ichinose, N., Koza, M., Yamanaka, K.,
Migita, K., Matsuishi, M. : Bioscience, Biotechnology
and Biochemistry, 72, 2005～2011, 2008.
３） Nakamura, Y., Migita, K., Okitani, A., Matsuishi,
M. : Animal Science Journal, 85, 595～601 ,2014.
４） Matsuishi, M., Tsuji, M., Yamaguchi, M.,
Kitamura, N., Tanaka, S., Nakamura, Y., Okitani, A. :Animal Science Journal, 87, 1407～1412, 2016.
５） Gergely, J. : Journal of Biological Chemistry, 220,917～926, 1956.
６） Szent-Györgi, A. : Myosin, actin and actomyosinmyosin B. In “Chemistry of Muscular Contraction,”
Academic Press, New York, pp.146-152, 1951.
７） Yang, R., Okitani, A., Fujimaki, M. : Agricultural
and Biological Chemistry, 34, 1765～1772, 1970.
８） Laemmli, U. K. : Nature, 227, 680～685, 1970.
９） Yasui T., Fukazawa T., Takahashi K., Sakanishi
M., Hashimoto Y. : Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 12, 399～404, 1964.

© The Ito Foundation

9

食肉加工品添加物，亜硝酸塩によるメタボリック
シンドローム改善作用の解明
Molecular mechanisms underlying beneficial effects of nitrites ameliorating
metabolic syndromes

宮

本

理

人

（徳島大学大学院医歯薬学研究部医薬品機能生化学分野）

Licht Miyamoto（Medical Pharmacology, Inst. of Biomedical Sciences, Tokushima University）

Nitrites substantially exist in our daily foods like processed meats and vegetables. Recent
studies have demonstrated beneficial effects of dietary nitrite against cardiovascular diseases.
We have previously reported blood pressure lowering and glomerular protective actions of
nitrite by reductive conversion into nitric oxide. In the current study, we further studied
metabolic consequences of the oral administration of nitrite to clarify metabolic effects of
dietary nitrite.
Sodium nitrite was administrated to male Wistar rats and ddY mice in drinking water for
one, two or four weeks with high fat diet（HFD）. In addition, we analyzed molecular effects ofnitrite stimulation on cells in culture.
The dietary nitrite ameliorated glucose tolerance with increase in insulin sensitivity. Body
weight was slightly decreased by administration of nitrite after two-weeks without changing
food intake, suggesting increase in energy consumption. Fasting plasma triglyceride level was
decreased. Lipogenic genes including SREBP1c were down-regulated in the livers from nitritetreated animals. Thus, dietary nitrites should suppress lipogenesis.
In human glomerular endothelial cells, we found that nitrites activate eNOS dependently
on 5ʼAMP-activated protein kinase（AMPK）, which is a master regulator of intracellularenergy status. Stimulation by nitrites activated AMPK also in hepatic cells with suppressing
acetyl-coA carboxylase, a typical substrate of AMPK catalyzing fatty acid synthesis. Therefore,
nitrites are supposed to ameliorate glucose and lipid metabolism through AMPK at least inpart.
Furthermore, we hypothesized involvement of endocrinological effects because of metabolic
profiles of nitrite-treated animals. We observed change in plasma levels of hormone A in theseanimals. Nitrite stimulation also altered secretion levels of hormone A producing endocrine
cells. We did not find any difference in the down-stream signals of the receptor for hormone A.
Thus, nitrites should improve metabolism by controlling endocrine systems as well as AMPK
activation.
In conclusion, we suggest that dietary nitrite ameliorates glucose and lipid metabolism
through AMPK activation as well as endocrinological regulation. Facilitation of eNOS-© The Ito Foundation

10

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

dependent and-independent nitric oxide production should mediate vasoprotective action of
nitrites, which may be beneficial to metabolism as well.

１．目

的

２．方

法

亜硝酸塩は食肉加工品を中心に現在極めて多く

メタボリックシンドロームの病態モデル動物との食品に添加されている。亜硝酸塩は赤みのある

して，３週間高脂肪食を負荷することにより，耐色調保持のみならず，風味を安定させ，ボツリヌ

糖能異常，肥満，および，軽度の脂質異常症など

ス菌繁殖を抑えるなど，食肉加工品の製造，保存，の代謝異常を呈した雄性Wistarラットあるいは

流通のうえで欠かせない利点を有しているが，発ddYマウスを用いた。亜硝酸塩として，亜硝酸ナ

がん性物質の一つである，ニトロソアミン生成のトリウムを用い，主に飲水中に添加することによ原因となるとして消費者から敬遠される物質の一り経口摂取させた。投与期間は１，２ないし，４つにもなっている。一方で，我々を含む複数のグ週間とした。細胞系として，ヒト正常腎糸球体由ループから近年，経口摂取された亜硝酸塩が血管

来血管内皮細胞（HGEC）を用いたほか，骨格筋保護作用を有する一酸化窒素（NO）に生体内にの培養細胞モデル系として，筋管様に分化させた

変化することが報告され，亜硝酸塩の有用性が急

C2C12細胞，肝臓の培養細胞モデル系として，

速に注目を浴びている。実際，海外では亜硝酸塩

Fao細胞および，ラット初代培養肝実質細胞を用の循環器系への有用性を目的とした複数の臨床試いた。さらに，後述する内分泌に対するモデル細験が開始されている。

胞を解析に用いた。

我々は亜硝酸塩の血管保護作用に関する解析を遺伝子発現量の変化ならびにリン酸化修飾はウ

様々な実験系を用いて解析していく中で，メタボ

エスタンブロッティングないし，リアルタイム

リックシンドローム様の代謝異常を呈する病態モ

PCRによるmRNA量の解析により検討した。耐デル動物において糖代謝，脂質代謝の双方を明ら

糖能は経口糖負荷試験により評価した。その他，

かに改善することを見出した。高齢化社会の進行

一般的な代謝学研究に用いられる実験手法に準じとともに糖尿病，脂質異常症などを含め，メタボて評価を実施した。

リックシンドロームの病態を呈する患者数が我が国をはじめ，多くの国々で急速に増加している。

３．結果と考察

食肉加工品や野菜のように，亜硝酸塩を多く含む

高脂肪食負荷マウスおよびラットに対し，亜硝食品の日常的な摂取がこれらメタボリックシンド

酸塩の経口負荷を行うと，空腹時血中中性脂肪

ロームの病態改善，および，予防に有用であれば

値，および，耐糖能の改善が認められた。これら

その社会的意義も極めて大きいと期待される。

の改善は投与開始後１週目からおおむね認めら

本研究では，経口摂取される亜硝酸塩のメタボ

れ，４週目までは少なくとも維持された。このとリックシンドローム様病態改善効果とその分子メ

き，インスリン負荷試験時の血糖推移が低下してカニズムを明らかにすることを目的とし，細胞レいたことから，耐糖能改善にはインスリン感受性

ベル，個体レベル双方の観点から解析を行った。

の亢進が関わることが示唆された。なお，２週間以上の投与を続けると高用量群において若干の体© The Ito Foundation

11

食肉加工品添加物，亜硝酸塩によるメタボリックシンドローム改善作用の解明

重低下が認められたが，このとき摂餌量に影響はなった。よって，亜硝酸塩はeNOS依存的，非依なく，エネルギー消費量の増大が示唆された。血存的，双方のメカニズムにより，NOの増大を引

中中性脂肪値が低下していたことから，肝臓におき起こし，血管や臓器の保護，ならびに，代謝改ける脂質代謝に関わる遺伝子発現量を評価したと善に寄与していると考えられる（Fig.２）。

ころ，脂肪酸酸化に関わる遺伝子群への亜硝酸塩

AMPKは肝臓や骨格筋などの組織においてはの影響は認められなかったが，SREBP1cをはじ

細胞内のエネルギー代謝調節を行うだけでなく，めとする，脂質合成系に関わる遺伝子群の発現量

全身の糖脂質代謝にも大きな影響を与えている。

低下が認められ，食餌性の亜硝酸塩負荷により，

そ こ で ，亜 硝 酸 塩 が こ れ ら の 組 織 に お い て も脂質合成の抑制が生じることが明らかとなった。

AMPKを介した代謝制御に関わるかどうかを培

亜硝酸塩はNO合成酵素非依存的に還元，もし養細胞系を用いて検討した。分化C2C12細胞におくは不均化反応によりNOに変換され，血管およいて，亜硝酸塩刺激によるAMPK活性化は弱い

び臓器保護的に働くことが示されてきた（Fig.

ものの認められ，Fao細胞においてはより顕著に１）。また，NOを介した作用は糖脂質代謝の観点認められた。さらに，AMPKの代表的な基質でからも有益であると考えられる。そこで，次にあり，脂肪酸合成に関わるacetyl-CoA carboxylase

HGECを用い，NO代謝および作用に関わるさまのリン酸化亢進も同時に認められた。よって，亜ざまな検討を実施した。その結果，亜硝酸塩は血硝酸塩によるAMPK依存性シグナルの活性化は管内皮細胞におけるNO合成酵素，eNOSのリン

血管内皮細胞のみならず，肝実質細胞などの糖脂酸化を促進し，eNOSの活性を促進する作用を併

質代謝制御に影響の大きい細胞系においても生じせ持つことを見出した。このとき，エネルギー代

ることが明らかとなった。以上より，亜硝酸塩は

謝 調 節 に 関 わ る 分 子 で あ る ，5ʼAMP-activated

肝臓や骨格筋などの末梢組織におけるAMPK活

protein kinase（AMPK）の活性化が生じること，性化を介し，インスリン感受性の亢進，耐糖能改および，eNOSのリン酸化はAMPK阻害薬により善，血中中性脂肪値低下などの糖脂質代謝改善作抑制されることから，亜硝酸塩は血管内皮細胞に用を引き起こしている可能性が明らかとなった

おけるAMPK-eNOSシグナルを促進し，eNOS依（Fig.２）。

存的なNO産生も増強していることが明らかと個体レベルの解析結果より，亜硝酸塩は末梢組Internal circulation of
dietary nitrates and nitrites
Nitrite【NO2‒】
NO3‒

AMPK

NOS
independent

NO2‒

eNOS

NO2‒

NO

NO3‒
＋
NO

vasodilation

Fig. 1 NOS-independent production of NO from nitrites

and nitrates

ACC etc.

metabolic eﬀects

Fig. 2 Possible molecular mechanisms of AMPK-

dependent metabolic actions of nitrites© The Ito Foundation

12

平成28年度Dietary
NO2‒

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

1. Direct conversion into NO
2. AMPK activation
3. Endocrinological alteration

NO-dependent vasoprotection
and metabolic improvement
NO-independent
metabolic amelioration

Fig. 3 Summary of our findings on the metabolic regulations by dietarynitrites

織におけるAMPK活性化のみならず，インスリ

骨格筋などの糖脂質代謝を促進することにより，ン以外のなんらかの内分泌系への影響を介した効

メタボリックシンドローム様の病態を改善すると果が考えられた。そこで，亜硝酸塩投与後の糖脂考えられる。この時の血中脂質指標の改善には

質代謝制御に関わるホルモンＡの血中レベルを評

AMPK依存性の脂質合成系抑制が主に寄与して価したところ，変動していることが判明した。ホいると思われる。さらに，亜硝酸塩は内分泌系にルモンＡを分泌する内分泌細胞の培養細胞モデル

作用し，生体内ホルモンレベルを制御することに系を用い，亜硝酸塩による刺激を行ったところ，より，糖脂質代謝を改善する作用も有しているこ

培養液中に分泌されるホルモンＡの濃度に同様のとが明らかとなった。本研究により，亜硝酸塩摂変化が認められた。一方，ホルモンＡの標的組織

取の健康維持，増進効果の一端が明らかとなり，の培養細胞モデル系に対し，亜硝酸塩による刺激

食肉加工品や野菜など，亜硝酸塩を多く含む食品を行ったが，ホルモンＡに対する受容体下流のシの安心につながるものと期待している。

グナルに対する影響は認められず，さらに，ホルモンＡと同時に亜硝酸塩刺激を行っても，同様になんら影響は認められなかった。よって，亜硝酸
塩はホルモンＡの作用自体に影響することなく，
ホルモンＡの内分泌系に作用することで糖脂質代謝を改善する可能性を新たに見出した。これまでの解析結果を考慮すると，AMPKとホルモンＡ
はいずれも個体レベルで生じた糖脂質代謝改善作用に関わっているものと考えられる（Fig.３）。
亜硝酸塩がホルモンＡの分泌，あるいは産生を調節する機構に関しては今後の課題であり，現在検討を進めている。
４．要

約

本研究の結果，亜硝酸塩の経口摂取による糖脂質代謝改善作用を再確認するとともに，その分子メカニズムとしてAMPK活性化の重要性が強く示唆された。亜硝酸塩はAMPK活性化を介し，

参考文献１） 宮本理人：血管関連疾患治療標的としてのAMPKの可能性，AMPK as a therapeutic target for vasculardiseases, 血管, 39（3）,93～100, 2016.（invited review）
２） 宮本理人：多角的アプローチによる新規生活習慣病治療戦略の開発研究，Yakugaku Zasshi（薬学雑誌），
136（5）, 751～9, 2016.（invited review）, Doi10.1248/
yakushi.15-00251
３） 宮本理人：メタボローム解析から見た運動療法による代謝改善メカニズムにおけるAMPK活性化の意
義，内分泌・糖尿病・代謝内科，第41巻，第５号（2015年11月号），354～360，2015．特集／代謝疾患とメタボローム（invited review）
４） Miyamoto, L. : Can Food Factors Provide us with
the Similar Beneficial Effects of Physical Exercise?
Food Sci. Biotechnol., 25（S）, 9～13, 2016.（invitedreview）
５） Miyamoto, L. : Significance of 5ʼAMP-activatedprotein kinase inmetabolomic regulation by skeletal
muscle contraction, J Phys Fitness Sports Med., 4（1）,93～102, 2015.（invited review）
６） Miyamoto, L., Egawa, T., Oshima, R., Kurogi, E.,
Tomida, Y., Tsuchiya, K., Hayashi, T. : AICAR
stimulation metabolome-widely mimics electricalcontraction in isolated rat epitrochlearis muscle, Am
J Physiol-Cell Physiol., 2013 ; 305（12）: C1214-22.

eNOS依存性のNO産生を増強することや，肝臓，© The Ito Foundation

13

トリプトファン添加による有害細菌の増殖抑制ならびに不活化：
食肉および加工品製造工程における活用と作用メカニズムの解明
Bacterial control by using tryptophan: Application to meat and meatproducts processing and investigation of its reaction mechanism

小

関

成

樹

（北海道大学大学院農学研究院）

Shigenobu Koseki（Research Faculty of Agricultural Science, Hokkaido University）

We previously reported that D-Tryptophan exhibits adverse physiological effects onbacterial physiology under osmotic stress. However, underpinning working mechanism of
D-tryptophan as an inhibitor and/or incompatible solute of bacterial growth has not yet been
investigated in detail. The present study firstly aimed at clarifying the effect of osmoticpressure induced by different osmolytes such as sodium chloride（NaCl）, potassium chloride（KCl）, and sucrose. Even at the same level of osmotic pressure, D-Tryptophan with NaClsignificantly inhibited growth of Escherichia coli the most, compared with KCl and sucrose.
Because the bacterial growth inhibition effect of D-tryptophan with NaCl showed the mosteffectively, we determined the optimum concentration combination of D-tryptophan and NaCl.
Growth inhibition/no growth inhibition boundary conditions as a function of D-tryptophan and
NaCl concentrations was clarified by a logistic regression model. We quantified that theminimum level of NaCl was 2.5％ w/v for E. coli growth inhibition with 40 mM D-tryptophan.
The higher NaCl concentration, the lower D-tryptophan concentration was needed. The
developed logistic regression model enabled us to set the condition of concentrations that needto inhibit bacterial growth. Furthermore, we examined the effect of working temperature
ranging from 15 to 46℃ on the bacterial growth inhibition induced by D-tryptophan. The
higher the reaction temperature, the more rapidly viable E. coli numbers were decreased. Thisphenomena trend would be attributed to activation of philological metabolism under the
optimum growth temperature. The results obtained in the present study would significantly
contribute to the development of a novel bacterial growth control strategy using D-tryptophan.

１．目

ような食品は従来製法の加工食品に比べ，加熱・的

加工強度が低いことから微生物学的な安全性を安

近年，世界的にも消費者は安全性だけでなく，定的に確保することが難しい。その結果，必然的

食品素材の持つ機能性・食感・香り等を保持したに消費期限を短く設定せざるをえない。消費期限

最小加工食品を望んでいる。しかしながら，このの短い食品は，短期間での消費が求められるが，© The Ito Foundation

14

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

必ずしも適切に流通・消費されないために，結果

ショ糖濃度を用いて調整することで種々の浸透圧として大量の廃棄を生み出す食品ロスの一要因とを有する環境を作成し，（1）で調製したE. coliをして世界中で大きな社会問題になっている。

接種して増殖挙動を検討した。PYG培地の浸透

食品ロスを低減するための，新たな微生物制御

圧を2.5MPa，3.4MPa，および4.2MPaの３条件に方法として，本研究では細菌のストレス応答時の上記の３種類の溶質を用いてそれぞれ調整した。

「適合溶質」の細胞質内への取り込みに注目した。

各物質にて浸透圧調製したPYG培地にＤ-トリプ

細菌細胞が浸透圧ストレスなどを受けた際に，トファンを40mM添加して25℃におけるE. coliのNa ，Ｋ 等のイオン性物質の取り込みなどに加増殖抑制効果を検討した。96穴マイクロプレート

えて，グリシンベタインやプロリンなどのアミノの各ウェルに，各条件の試料培地を180μＬずつ酸を適合溶質として取り込むことで細胞内の浸透分注した後，E. coli液を20μＬずつ接種した。調圧やpHなどの恒常性維持に重要な役割を果たし製したマイクロプレートを25℃に設定したマイクていることが知られている。一方で，正常に適合

ロプレートリーダー（BIO-RAD Laboratories製

溶質として作用する物質以外の取り込みが誤って

iMark）に設置し，10分ごとに120時間595nmに起きた場合には，代謝阻害を誘導することが報告

おける吸光度を自動的に連続測定し，増殖挙動とされている１～３）。このような物質は「非適合溶質」

した。

＋

＋

と呼ばれている 。

2 . 3 NaClおよびＤ-トリプトファン濃度を環

４）

細菌細胞が浸透圧ストレスに応答して，誤って適合溶質として機能しない非適合溶質を取り込む

境要因とするE. coliの増殖限界予測モデルの開発

ことによって，代謝阻害を誘導し，結果として増PYG培地を基礎培地として，NaCl濃度（２－

殖を抑制する，との仮説のもとに非適合溶質とし５％w/v），Ｄ-トリプトファン濃度（０-40mM）て報告のあるＤ-トリプトファンの細菌増殖抑制の種々の組み合わせ条件の培地を作成し，（1）で効果を明らかにして，新たな微生物制御技術の開調製したE. coliを接種して25℃における増殖挙動発を目的とした。

を前述（2）と同様に検討した。120時間培養後に2.1おける吸光度変化が0.05以上の場合に増殖と判定

法

２．方し，それ以下では非増殖と判定した。

供試細菌

同一の実験を５回反復して行い，増殖抑制／増Escherichia coli（ATCC 25922）をTryptic Soy

殖を判定した結果を，二値変数に対する多変量解

Broth中で37℃，24時間の前培養を３回繰り返し

析手法の一つであるロジスティック回帰分析によて，定常期に達した均一な細菌を用いた。本菌株

り，NaCl濃度とＤ-トリプトファン濃度を説明変は米国食品・医薬品安全局（US Food and Drug

数とする以下の式によりモデル化した。
P
log
（１－P
）＝Logit（P）＝a1＋a2Salt＋a3DTrp＋a4Salt×DTrp

Administration）が抗菌試験用標準菌株として採用している。

（1）

2 . 2 浸透圧ストレスがＤ-トリプトファンに

ここで，Pは増殖を抑制する確率を，SaltはよるE. coliの増殖抑制に及ぼす影響の解明

NaCl濃度を，DTrpはＤ-トリプトファン濃度を，

Peptone Yeast Glucose（PYG）培地を基礎培

aiは推定パラメータをそれぞれ表す。パラメータ地として，種々の塩化ナトリウム，塩化カリウム，の推定には統計解析環境Ｒ（Ver. 3.1.5）のglmを© The Ito Foundation

15

トリプトファン添加による有害細菌の増殖抑制ならびに不活化：食肉および加工品製造工程における活用と作用メカニズムの解明用いた。

圧のみに依存していないことを示していた。同一

2 . 4 Ｄ-トリプトファンによるE. coliの増殖

浸透圧条件において，NaClで浸透圧調製した場
合にのみ，高い増殖抑制効果を示したことから，抑制効果の温度依存性
PYG培地を基礎培地として，NaCl濃度を3.0％，

浸透圧上昇に伴い細菌の生体膜のNa＋ポンプが作

5.0 ％ の ２ 段 階 と し ，Ｄ - ト リ プ ト フ ァ ン 濃 度

動して５），それに伴いＤ-トリプトファンを細胞40mM 環 境 下 に お い て ，15 ℃，25 ℃，37 ℃，

質内に取り込み，増殖抑制効果を発現していると

43℃，および46℃の５段階におけるE. coliの増殖考えられる。今後，より詳細に作用機序を解明す

抑制効果を検討した。５日間の培養期間中のE.

るためには，生体膜のNa＋ポンプの活性を支持す

coliの生菌数をTryptic Soy Agerを用いた寒天平る遺伝子発現量等の解析が必要である。

板表面塗抹法にて，毎日計測した。

3 . 2 NaClおよびＤ-トリプトファン濃度を環境要因とするE. coliの増殖限界モデルの開３．結果と考察発

3 . 1 浸透圧ストレスがＤ-トリプトファンに実験結果を増殖抑制（○）／増殖（×）として評価し，NaCl濃度とＤ-トリプトファン濃度とのよるE. coliの増殖抑制に及ぼす影響
NaCl に よ っ て 浸 透 圧 調 製 を し た 場 合 に は関係をFig.２に示した。Ｄ-トリプトファン濃度

2.4MPa以上の浸透圧条件下で，Ｄ-トリプトファが40mMの際はNaCl濃度が2.6％以上，NaCl濃度

ンの添加によりE. coliの増殖を完全に抑制できた

5.0％の際はＤ-トリプトファン濃度が25mM以上（Fig. 1a）。一方で，同一の浸透圧条件下においてであればE. coliの増殖を完全に抑制した。
増殖確率の変化が示され，境界条件を見出すこと

増殖抑制効果が顕著ではなかった（Fig. 1b, 1c）。

ができた。これにより，E. coli増殖抑制に必要な

特にショ糖では4.2MPaの高浸透圧条件下においＤ-トリプトファン濃度とNaCl濃度との組み合わても，E. coliの増殖を完全に抑制できなかった。

せを容易に設定可能とした。両物質濃度の組み合

この結果は，Ｄ-トリプトファンの作用が浸透

わせによって増殖抑制効果が劇的に変化するが，0.4 （a）

KCl

0.3
Sucrose

0.2
0.1
0.0

NaCl
0

1
2
3
4
5
Incubation period（d）

0.4 （b）
0.3
0.2
Sucrose

0.1
0.0

KCl
NaCl
0

1
2
3
4
5
Incubation period（d）

Optical density at 595 nm（‒）

合には，Ｄ-トリプトファン添加によるE. coliのOptical density at 595 nm（‒）

式（1）のロジスティック回帰分析の結果より，Optical density at 595 nm（‒）

も，KClおよびショ糖によって浸透圧調製した場

0.4 （c）
0.3
0.2
Sucrose

0.1
0.0

KCl
NaCl
0

1
2
3
4
5
Incubation period （d）

Fig. 1 Effect of osmotic pressure（a）2.5 MPa,（b）3.4 MPa,（c）4.2 MPa adjusting by sodium chloride（solid line）,

potassium chloride（dotted line）, and sucrose（dashed line）on the growth inhibition of Escherichia coli with 40
mM D-tryptophan. Results are mean values of triplicate trials.

© The Ito Foundation

16

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

40

D‒tryptophan（mM）

35
30
25
20
15
10
5
2.0

2.5

3.0
3.5
4.0
NaCl（% w/v）

4.5

5.0

Fig. 2

Growth inhibition（○）/ no growth inhibition（×）boundary for E. coli
in PYG under various concentration combinations of sodium chloride andD-tryptophan at 25℃ incubation for 5days. The ○ and × represents growth
inhibition and no growth inhibition in all three triplicate experiments,
respectively. The model predictions from Eq.（1）were compared with thedata used to generate the model, to determine the effect of sodium chloride
concentration and D-tryptophan concentration during 25℃ incubation on
the potential for the inhibition of E. coli growth at three levels ofprobability : P＝0.1 ，P＝0.5 ，and P＝0.9 ．The interface with P＝0.5（thatis, a 50％ probability of recovery）is indicated by the solid lines. The dottedand dashed lines represent the predictions at P＝0.1（that is, a moreconservative estimate）and P＝0.9（that is, a less conservative estimate）,
respectively.

こ れ は E. coli が 一 定 以 上 の 浸 透 圧 ス ト レ ス と増殖速度に差はあるがいずれの温度においてもNaCl濃度に応答して，迅速に周囲のＤ-トリプト

E. coliは増殖した。NaCl濃度5.0％条件において，ファンを取り込むことが原因と考えられる。

25℃および37℃ではE. coliは増殖したが，15℃，

3 . 3 Ｄ-トリプトファンによるE. coliの増殖

43℃と46℃では増殖しなかった。
これらの結果は，温度上昇に伴いE. coliの代謝抑制効果の温度依存性
Fig.３に生菌数の対数変化量の経時変化を示し活性が高まることによって，Ｄ-トリプトファン

た。Ｄ-トリプトファン添加条件では，NaCl濃度の細胞内への取り込みも活発になり，増殖抑制効および保存温度によらず，E. coliの増殖を完全に果も高まったものと考えられる。E. coliの代謝活抑制することが確認された。特に保存温度25℃以性が最も高まる37℃から43℃の温度帯よりも46℃

上では，NaCl濃度3.0％環境下では43℃で５日目の死滅速度が高いことに関しては，NaClによるに，46℃で３日目にE. coliは検出限界以下にまで

浸透圧ストレス，Ｄ-トリプトファンの取り込み減少した。また，NaCl濃度5.0％条件では，46℃に加えて温度ストレスが加わり，相乗効果によっにおいて３日目からE. coliは検出限界以下にまでてE. coliを死滅させる効果となり，43℃よりも高減少した（Fig.４）。

い効果を発揮したと考えられる。

一方，Ｄ-トリプトファンを添加しない条件下においては，NaCl濃度3.0％では保存温度による© The Ito Foundation

17

トリプトファン添加による有害細菌の増殖抑制ならびに不活化：食肉および加工品製造工程における活用と作用メカニズムの解明
6

（a）

4

Survival ratio（log N/N0）

Survival ratio（log N/N0）

6

2
0
‒2
‒4
‒6

0

1

2

3

4

4
2
0
‒2
‒4
‒6

5

（b）

0

1

Incubation period（d）

2

3

4

5

Incubation period（d）

Fig. 3 Changes in the number of viable E. coli in PYG broth containing 3.0％ sodium chloride with（a）or（b）without

40 mM D-tryptophan at 15（▽）, 25（◇）, 37（□）, 43（△）and 46℃（○）for 5 days. Results are mean values withstandard errors of triplicate trials.
6

6

(a)

4
Survival ratio（log N/N0）

Survival ratio（log N/N0）

4
2
0
‒2
‒4
‒6

(b)

0

1

2
3
4
Incubation period（d）

5

2
0
‒2
‒4
‒6

0

1

2
3
4
Incubation period（d）

5

Fig. 4 Changes in the number of viable E. coli in PYG broth containing 5.0％ sodium chloride with（a）or without（b）

40 mM D-tryptophan at 15（▽）, 25（◇）, 37（□）, 43（△）and 46℃（○）for 5 days. Results are mean values withstandard errors of triplicate trials.

４．要１）Ｄ-トリプトファンによるE. coliの増殖抑制

約

効果は浸透圧ストレスのみによって誘導される

本研究では，食品の安全性・保存性向上を目指
して，新たな微生物制御技術の開発を最終的な目ものでなく，NaCl濃度が重要な役割を果たしている。

的とし，Ｄ-トリプトファンによるE. coliの増殖２）NaCl濃度，Ｄ-トリプトファン濃度を説明変抑制効果に関する基礎的な検討を行った結果，以数とする，E. coli増殖限界予測モデルを構築し，下の３点を明らかにした。

効果発現に必要な濃度条件の組み合わせを探索© The Ito Foundation

18

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）可能とした。
３） Ｄ-トリプトファンの取り込みによってE.
coliは死滅し，その死滅速度は温度依存性が明
確で，増殖の至適温度付近で最大の死滅速度になる。
文献１） Beales, N. : Adaption of microorganisms to cold
temperatures, weak acid preservatives, low pH, andosmotic stress : A Review, Comprehensive Reviewsin Food Science and Food Safety, 3, 1～20, 2004.
２） Shahjee, H. M., Banerjee, K., Ahmad, F. :Comparative analysis of naturally occurring L-aminoacid osmolytes and their D-isomers on protection ofEscherichia coli against environmental stresses,
Journal of Bioscience, 27（5）,515～520, 2002.
３） Sasaki, H., Takaki, A., Oshima, A., Ishida, A.,
Nagata, S. : Comparison of the function of L-and
D-proline as compatible solute in Escherichia coli
K-12 under high osmolarity, Annals of Microbiology,
57（2）,265～268, 2007.
４） Koseki, S., Nakamura, N., Shiina, T. : Growth
Inhibition of Listeria monocytogenes, Salmonella
enterica, and Escherichia coli O157 : H7 by
D-Tryptophan as an Incompatible Solute, J. Food
Prot. 78, 819～824, 20150５） Held, C., Neuhaus, T., Sadowski, G. : Compatible
solutes : Thermodynamic properties and biologicalimpact of ectoines and prolines, Biophysical
Chemistry, 152, 28～39, 2010.

© The Ito Foundation

19

新規アクチン結合タンパク質から豚肉の柔らかさの要因に迫る
Understanding of factors involved in pork meat tenderness throughanalysis of a novel actin-binding protein

灘

野

大

太

（名古屋大学大学院生命農学研究科）

Daita Nadano（Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University）

Tenderness has been regarded as one of the most important meat quality traits for eating
quality. Nonetheless, it is difficult to improve meat tenderness by traditional breeding methods.
Genome wide association studies have recently been conducted to obtain information for the
improvement and identified one gene as a candidate affecting the tenderness of pork meat.
Because the molecular mechanisms regulating meat tenderness remain unknown, we analyzed
the translated product of the gene in the present study. cDNA encoding the gene product was
obtained by reverse transcription-polymerase chain reaction and subcloned into the vectors forthe expression of the tagged protein in mammalian cells. The expression vectors wereintroduced into cultural cells by transient transfection. Expression of the tagged protein inthese cells was confirmed by immunoblotting with anti-tag antibody. Intracellular localizationof the protein was examined by immunocytochemistry of the transfected cells. The protein
was detected strongly in the peripheral region of the cell. Since our preliminary data have
implicated this protein as an actin-binding protein, co-staining of this protein with cytoskeletons
was performed. This protein was not obviously colocalized with cytokeratins or microtubules
and was colocalized with actin microfilaments near the inner surface of plasma membrane.
This protein was not colocalized with stress fibers, thick actin filaments in the cytoplasm.
Therefore, although this protein has an ability to bind to filamentous actin, the binding activity
seems to be strictly controlled within the cell, which is considered to provide a new insight into
the functions and importance of this protein.

１．目体）において，歯触り，舌触り，のど越しといっ的た食感が重要とされており，たとえば湿気を帯び食品における「おいしさ」は甘味，塩味といった味覚や香りなどの化学的特性とならんで食感

たせんべいがおいしくいただけないなど身近でよく理解できるところである。

（テクスチャー），外観，温度などの物理的特性においしさの物理的特性を支えるとされる食感によって決定される。食肉を含む固体（および半固ついて，本研究の主対象である食肉に焦点をあて© The Ito Foundation

20

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

ると，測定可能な食感パラメーターの中で特に柔素サイトが付加されており，これをFLAGタグ付

らかさは，ステーキ等の褒め言葉として普通に使きタンパク質の哺乳類細胞発現用ベクターに，同われているように直接的かつ印象的に消費者の感

ベクターのマルチクローニングサイトを利用して興に訴える力があり，食肉製造における新製品のクローニングを行った。得られたプラスミドベク

開発や販売戦略における成功のカギとなる 。柔ターについて，制限酵素処理産物のアガロースゲ

らかさについては市販の物性測定装置を用いて正ル電気泳動ならびにABI社のDNAシーケンサー

確かつ簡便に定量化が可能になった一方で，そもによる塩基配列により，（アミノ酸配列に影響をそもの食肉の素材自体の柔らかさを決定づける

もたらすような変異を含まない）当初の予定どお牛・豚・鶏等の内在性因子の種類と重要度についりの発現ベクターが得られたことを確認した。なては残念ながらいまだ不明な点が多いと言わざる

お，得られたプラスミドベクターについては，こを得ない。

れ 以 降 の 実 験 に 使 用 す る た め ，市 販 の キ ッ ト

１）

肉の柔らかさに限らず，哺乳類を含む高等動物の高度な機能・特性を司る因子は単一とは考えら（Roche Applied Science社製）を用いて大量に調製した。

れず，よって従来の遺伝的，生化学的なアプロー

また詳細は省略するが，同様にして緑色蛍光タ

チからの因子同定は極めて困難とされてきた。たンパク質（GFP）タグを付加した哺乳類細胞用発だこのような分野にも技術革新の新たな波が押し

現ベクターも作製し大量調整した。

寄せており，たとえば個体のすべての情報すなわ

次にクローニングされた遺伝子産物を発現さ

ち全ゲノムレベルでの関連解析（genome-wide

せ，これを免疫ブロッティングにより解析するこ

association study, GWAS）からその情報の一端ととした３）。上記の実験で作製したFLAGタグ付が明らかになってきており，その手法は改良を重きタンパク質の哺乳類細胞用発現ベクターを，ねながら食品を含めた産業的利用へと進められつ

10％牛胎児血清を含む細胞培養培地に37℃およびつある。そのGWAS応用の一例として，ごく最５％

近商用食用豚における肉の柔らかさに影響を与えとしてポリエチレンイミンを用いて導入した。遺る遺伝性因子の探索が行われた。その研究におい伝子導入後24時間培養した細胞を回収し，ラウリて有力とされた遺伝子の翻訳産物を分子レベルで

ル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミドゲル電気解析することを本研究の目的とする。

泳動（SDS-PAGE）用の試料緩衝液に溶解し煮

２．方CO2で培養した細胞株へ，遺伝子導入試薬

沸処理をした。これを10％ゲル用いたSDS-PAGE

法に供した後，セミドライ式ブロッティング法でポ

まず，目的とする遺伝子産物の発現系を構築し

リ フ ッ 化 ビ ニ リ デ ン（PVDF）膜（Millipore 社

た。入手が容易なこともあり，各種細胞株におい製）に転写した。PVDF膜を５％スキムミルクをて逆転写―ポリメラーゼ連鎖反応法により上記遺含むブロッキング液に浸した後，一次抗体として伝子産物の発現を調べた 。安定した発現が示さ

ウサギ抗FLAG抗体（Sigma社製）等タグに対すれた細胞株から得られた全cDNAおよび遺伝子特る抗体，次に二次抗体としてヤギ抗マウス免疫グ

異的なプライマーペアを用いて，同遺伝子翻訳産

ロブリンＧ血清（Bio-Rad社製）等と反応させ物のコード領域全長を含むcDNAを増幅した。上た。発色試薬であるイモビロンウェスタン化学発記のプライマーペアにはクローニング用に制限酵

光HRP基質（Millipore社製）等を用いて発色反

２）© The Ito Foundation

新規アクチン結合タンパク質から豚肉の柔らかさの要因に迫る

21

応を行い，ライトキャプチャー（アトー社製）をため，目的とするタンパク質のcDNAを調製し，使用してバンドを検出した。

FLAGまたはGFPタグ付きタンパク質として哺乳さらに蛍光免疫染色法により細胞内局在を観察

類細胞に発現させるためのベクターへのクローニすることとした 。滅菌済みのカバーガラスを入ングを行った。NCBI Gene（https://www.ncbi.

れた細胞培養用プレートに培養細胞を播種し，発nlm.nih.gov/gene）によると，本遺伝子には選択

現ベクターを免疫ブロッティングの場合と同様に的スプライシングの違いに由来する複数のアイソ

ポリエチレンイミンを用いて導入した。遺伝子導フォームが存在するが，今回クローニングされた

入後24時間培養した細胞を２％パラホルムアルデのはその中で最長のペプチド鎖のアイソフォーム

ヒドを用いて室温で15分間細胞を固定した。そのであった。得られた発現ベクターを培養細胞に導後，0.1％

Triton X-100を含む牛血清アルブミ

入し，免疫ブロッティングによって解析した結果

ン溶液で細胞透過およびブロッキング処理を行っをFig. 1Aに示す。45kDaと66kDaのマーカーの間た。ただし微小管観察の際には－20℃の冷メタに検出されたバンドは，計算分子量から目的とすノールで細胞を固定・透過処理した。FLAGタグ

るFLAGタグ付きタンパク質のバンドであると推付きタンパク質の検出に一次抗体としてウサギ抗定された。なお，詳細は省略するがGFPタグ付き

FLAG抗体，次に二次抗体として蛍光標識されたタンパク質の発現も同様に示された。

４）

抗マウス免疫グロブリンＧと反応させた後，カ目的とするタンパク質の発現が免疫ブロッティ

バーガラスごと細胞をスライドガラスに乗せて，ングにより示されたことから，同じFLAGタグ付

共焦点レーザー顕微鏡で観察した。GFPタグ付き

きタンパク質発現ベクターを培養細胞に導入し蛍タンパク質の場合にはGFP由来の緑色蛍光を検出

光免疫染色法により同タンパク質の細胞内局在をした。

観察した。核染色試薬であるヨウ化プロピジウム（PI）と共染色した結果をFig. 1Bに示す。特に細３．結果と考察

胞辺縁部においてFLAGタグ付きタンパク質の強まず，目的タンパク質の分子レベルでの解析の

A

B

（kDa）

IB：FLAGいシグナルが観察された。

FLAG

nuclei（PI）

200
97
66

45

31
Fig. 1 Expression of the FLAG-tagged protein was analyzed by immunoblotting（A）and

immunocytochemistry（B）© The Ito Foundation

22

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）細胞には大きく分けて３種類の細胞骨格，すな

質は細胞質におけるアクチンの太い繊維であるス

わちＧ-アクチンの重合体であるマイクロフィラ

トレスファイバーとは共局在しなかった（Fig.

メント（Ｆ-アクチン），上皮細胞の場合ケラチン

2Cの矢じり）。したがって，このタンパク質は単からなる中間系フィラメント，ならびにα-およ純なアクチン結合タンパク質とは考えにくく，細びβ-チューブリンから構成される微小管が知ら胞膜においてアクチンとの関わりで機能すると推れている 。筆者らの予備的な実験により，今回察された。データは省略するがGFPタグ付きタン

着目したタンパク質はアクチンとの結合性が示唆

パク質の場合にも同様の結果が得られた。

５）

されていたが詳細は不明であった。そこで，Ｆ-

アクチンとミオシンは筋肉タンパク質の多くをアクチンを含む細胞骨格との関連を精査すること占めており，筋原線維の細いマイクロフィラメンとした。これまでと同様にして，FLAGタグ付きトを形成するアクチンと太いフィラメントを形成

タンパク質発現ベクターの導入により同タンパクするミオシンとの結合が死後硬直の主要因であ質の発現細胞をカバーガラス上に用意し，ケラチる。両タンパク質の結合強度の減少が解硬（硬直ンとの共染色の場合には，パラホルムアルデヒド

解除）をもたらし，そのままでは食肉に適さないを用いて細胞を固定し，モルモット抗ケラチン

ことから熟成を経てから食用に供されることにな

K8/K18抗体（Progen社製）を用いてケラチン繊る。アクチンの変性が味覚に大きく作用すること

維を染色した。微小管との共染色の場合には，冷も明らかになっており，アクチンは肉の品質管理

メタノールで細胞を固定し，微小管をウサギ抗αという点から重要なタンパク質である。今回の解-チューブリン抗体（Thermo社製）で染色した。

析によって対象タンパク質はそのアクチンに細胞

マイクロフィラメントとの共染色の場合には，パ表面近くで作用することが示唆された。上述のとラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し，マイ

おり肉の柔らかさを含む食感は複数の因子の複雑

クロフィラメント特異的に結合するファロイジン

な相互作用によって最終的に決まってくるものとを蛍光標識したAlexa Fluor488ファロイジンコン

考えられる。今回の解析を契機として関連因子とジュゲート（Invitrogen社製）を繊維状アクチン

その役割の解明がさらに進展することが期待されの染色に用いた。

る。

染色像を拡大したものをFig.２に示す。まず，
FLAGタグ付きタンパク質はケラチンと共局在し

４．要約なかった。微小管との共染色において，FLAGタ

食肉のおいしさの物理的特性を支える食感におグ付きタンパク質に微小管のような繊維像はみらいて，最も重要なパラメーターのひとつは肉の柔れなかったが，細胞の先端部において一部共局在

らかさである。しかしながら食肉の素材自体の柔しているようにも観察された。ただしこれらの領らかさを決定づける牛・豚・鶏等の内在性因子の域は一般的に微小管を含め細胞骨格が密集するこ種類と重要度については残念ながらいまだ不明なとが知られており，結果の解釈に注意が必要と思点が多い。全ゲノムレベルでの関連解析から，ごわれた。最後に，マイクロフィラメントとの共染

く最近商用食用豚における肉の柔らかさに影響を色において，FLAGタグ付きタンパク質は細胞膜与える遺伝性因子の探索が行われた。その研究に近傍に存在するアクチンとの共局在が観察されたおいて有力とされた遺伝子の翻訳産物を分子レベ（Fig. 2Cの矢印）。一方でFLAGタグ付きタンパクルで解析した。対象とする翻訳産物の発現系を構© The Ito Foundation

新規アクチン結合タンパク質から豚肉の柔らかさの要因に迫る

A

FLAG

cytokeratin

B

FLAG

microtubules

C

FLAG

F-actin23

Fig. 2 Intracellular localization of the FLAG-tagged protein. Co-

staining with cytokeratin（A）, microtubules（B）, and actin
microfilaments（C）

築し，その細胞内局在を観察したところ，細胞辺縁部に多く存在することが示された。予備的な実験から示唆された細胞骨格との関連を調べたところ，同タンパク質は細胞膜近傍に存在するアクチ
ンフィラメントと共局在した。しかしながらスト
レスファイバーとは共局在しなかったことから，
同タンパク質のアクチン結合性の細胞内での厳密な制御が推察され，機能や重要性を解明する上での新たな指針が得られた。

文献１） Grunert, K. G., Bredahl, L., Brunsø, K. : Consumer
perception of meat quality and implications for
product development in the meat sector-a review,
Meat Sci., 66, 259～272, 2004.
２） Nakamura, M., Tomita, A., Nakatani, H., Matsuda,T., Nadano, D. : Antioxidant and antibacterial genes
are upregulated in early involution of the mouse
mammary gland: sharp increase of ceruloplasminand lactoferrin in accumulating breast milk, DNA
Cell Biol. 25, 491～500, 2006.
３） Moriya, H., Uchida, K., Okajima, T., Matsuda, T.,
Nadano, D. : Secretion of three enzymes for fatty
acid synthesis into mouse milk in association with
fat globules, and rapid decrease of the secreted
enzymes by treatment with rapamycin, Arch.

© The Ito Foundation

24

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Biochem. Biophys. 508, 87～92, 2011.
４） Nadano, D., Nakayama, J., Matsuzawa, S., Sato, T.,
Matsuda, T., Fukuda, M. N. : Human tastin, a prolinerich cytoplasmic protein, associates with themicrotubular cytoskeleton, Biochem. J. 364, 669～

677, 2002.
５） Hosono, H., Yamaguchi, N., Oshima, K., Matsuda,T., Nadano, D. : The murine Gcap 14 gene encodes anovel microtubule binding and bundling protein,
FEBS Lett. 586, 1426～1430, 2012.

© The Ito Foundation

25

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影響（Ⅱ）：オートファジーと食肉の肉質の関連性
Effect of autophagy on postmortem proteolysis in skeletal muscle（Ⅱ）：
Relationship between autophagy and meat quality

仲

西

友

紀・河

原

聡

（宮崎大学農学部応用生物科学科）

Tomonori Nakanishi and Satoshi Kawahara（Department of Biochemistry and Applied Biosciences, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

A number of studies have addressed the mechanism of proteolytic events during theconversion of muscle to meat; however, its precise mechanism is not fully understood.
Autophagy is the bulk degradation process for intracellular proteins in eukaryotic cells, andcontributes to homeostatic regulation of energy metabolism in skeletal muscle. In this study,
we investigated the effects of pre-slaughter autophagic status on chicken breast meat quality.
In experiment 1, normal broilers were fasted before slaughter for 48 h to induce autophagy,
whereas the control group had free access to a diet. Breast meat samples were collected andstored at 4℃ for 96 h, followed by evaluation of pH, color, water-holding capacity and the levelof free amino acids. In experiment 2, a similar evaluation was performed using broilers
administered with wortmannin, an inhibitor of autophagy. Results on experiment 1 indicatedthat postmortem pH decline in breast meat was inhibited and that relatively dark color wasobserved when broilers were fasted before slaughter. In addition, breast meat from fasted
broilers showed lower drip loss and a higher level of free amino acids than that from fed
broilers. Interestingly, fasting-induced changes in meat quality were almost completely
cancelled in experiment 2 where broilers were administered with wortmannin. These findings
suggest that autophagy is a mediator of metabolic reactions during the conversion of muscle tomeat in chickens, and could contribute to meat quality.

１．目

れば，それは高品質な食肉を効率的に生産する技的術の基盤になると考えられる。

食肉の熟成は筋タンパク質の分解を伴う反応でオートファジーは細胞内タンパク質のバルク分ある。カテプシンおよびカルパイン等のプロテ解経路である。近年の研究で，骨格筋の成長や機アーゼが熟成に関与することが広く知られている能におけるオートファジーの重要性が明らかにが１，２），一方で，食肉の熟成機構には未解明な点なったが３），これらの知見を食肉生産に応用させも多く残されている。食肉の熟成機構が解明された研究例は少なく，特に，熟成過程の筋タンパク© The Ito Foundation

26

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

質分解におけるオートファジーの役割は未解明で与した鶏を用いて実験１と同様の試験を行ったあった。このような背景の下，筆者らはマウス骨

（絶食群と対照群それぞれｎ＝４）。

格筋を用いた検討を行い，「と殺時のオートファ

2.2

ジーが骨格筋タンパク質の死後分解を加速する一pHメーター（Testo社製）および色差計（コニ因である」ことを明らかにしてきた（2015年日本

カミノルタ社製）を用いて，と鳥後０時間から96

畜産学会第119回大会）。また，プロテオーム解析

時間まで，pHと肉色を継時的に測定した。また，を用いた手法で，phospohglucomutase 1（PGM1）

保水性に関する評価として，ドリップロスと加熱

や lactate dehydrogenase A（LDHA）の 死 後 分損失を測定した。ドリップロスは，96時間貯蔵し解がオートファジーによって促進することも明らた後に－20℃で凍結させたムネ肉を用いて，解凍か に し て い る （17 AAAP Animal Science

後の水分損失率として算出した。加熱損失は，ドCongress）。PGM1やLDHAは食肉のpH，肉色，

リップロスを算出した後のムネ肉を，80℃の温湯

ドリップロスなどに関与する酵素であり，で加熱した際の水分損失率とした。また，加熱損

オートファジーと肉質の関連性が強く示唆される。

失を測定した後のムネ肉について，レオメーター

本研究の目的は，マウス骨格筋を用いた検討で（YAMADEN社製）で剪断力価を測定した。さら得られた上記のような知見を，食肉に応用するこに，と鳥後96時間貯蔵したムネ肉の遊離アミノ酸とにある。本研究では，肉用鶏を試験対象として，含有量も測定した。すなわち，ムネ肉を5.4％トと鳥時のオートファジーが熟成後の肉質に与える

リクロロ酢酸中でホモジナイズし，トリクロロ酢

影響を調査した。具体的には，栄養学的処置や薬酸をジエチルエーテルで除去することで遊離アミ理学的処置でオートファジーを制御した鶏からムノ酸の抽出を行い，これをLC/MS高速アミノ酸

ネ肉を採取し，96時間低温保存（熟成）した後

分析システム（島津製作所社製）を用いて分析しに，pH，肉色，保水性，剪断力価および遊離ア

た。

th

４，５）

ミノ酸含量の調査を実施した。
２．方
2.1

肉質に関する評価

３．結果と考察法

オートファジーは酵母から哺乳類までよく保存されたタンパク質分解機構であり，栄養飢餓時に実験動物と処置

７週齢の雄ブロイラー15羽（チャンキー：2642

活性化する６）。そこで本研究では，オート―ファ±41kg）を試験に供した。実験１では，骨格筋ジーを誘導するために，と鳥前に48時間絶食させにオートファジーを誘導する手法として，と鳥前る群を設けた。と殺前の絶食が最終的な肉質に影

48時間の絶食処置を施した（ｎ＝４）
。対照群は響を与えることは畜種を超えて広く知られていと鳥まで自由摂食条件下で飼育した（ｎ＝３）
。

る。長期間の絶食を強いられた動物の筋肉ではグ

イソフルラン麻酔下で頸動脈から放血することでリコーゲン量が低下する。このような筋肉では死と鳥し，各鶏からムネ肉を採取した。採取したム

後の乳酸蓄積，すなわちpH低下が抑制されるた

ネ肉は４℃で96時間保存し，pH，肉色，保水性，め，過度の絶食はDFD（Dark Firm Dry）肉の剪断力価および遊離アミノ酸含量などの肉質に関ような異常肉発生の一因と考えられている７）。とする評価に供した。また，実験２では，オートファ

鳥前の絶食がムネ肉のpHに与える影響を調査しジー阻害剤であるwortmanninを１mg/kg皮下投

た本研究の結果をFig. 1（Ａ）に示すが，絶食群© The Ito Foundation

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影響（Ⅱ）：オートファジーと食肉の肉質の関連性（A）

Normal chickens

7.5

7.0

Fasted

6.5

Eﬀect
Time

P-levelin two-way ANOVA＊＊＊

Treatment＊Interaction

N.S.

6.0

5.5

5.5
20

40

60

Fasted

6.5

6.0

0

Fed

7.0
pH

Fed

pH

Wortmannin-treated chickens

（B）

7.5

27

80

0

20

Time after sacriﬁce（h）

P-levelin two-way ANOVA
Time
＊＊＊
Eﬀect

Treatment

N.S.

Interaction

N.S.

40

60

80

Time after sacriﬁce （h）

Fig. 1 Postmortem changes in pH of breast meat. Normal broilers（A）or those administered with wortmannin（B）

were fasted before slaughter for 48 h, whereas the control group had free access to a commercial diet. The pH ofeach breast meat was measured by inserting electrodes into the incised surface using a pH meter. Data wereanalyzed by comparing groups using two-way ANOVA（factors : feeding condition and time after sacrifice）．

（A）

Fed

Wortmannin-treated chickens
60

FastedL value55
50

8b value

8

2
1
0

0

20
40
60
Time after sacriﬁce（h）

80

6
2
1
0

P-level in two-way ANOVA
Eﬀect
Time
TreatmentInteraction

L valuea valueb value

N.S.
＊
N.S.

N.S.
N.S.
N.S.

N.S.
N.S.（P=0.077）
N.S.

Fasted

50
45

6

Fed

55

45

a valueb value

L value60

a value（B）

Normal chickens

0

20
40
60
Time after sacriﬁce（h）

80

P-level in two-way ANOVA
Eﬀect

L valuea valueb valueTime
TreatmentInteraction

N.S.
N.S.
N.S.

N.S.
N.S.
N.S.

N.S.
N.S.
N.S.

Fig. 2 Postmortem changes in color of breast meat. Normal broilers （A） or thoseadministered with wortmannin（B）were fasted before slaughter for 48 h, whereas thecontrol group had free access to a commercial diet. The color of breast meat wasdetermined on the inside surface by measuring color parameter（L value : brightness, avalue: redness, b value : yellowness）with a colorimeter. Data were analyzed bycomparing groups using two-way ANOVA（factors : feeding condition and time aftersacrifice）．

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28

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

ではpHが有意に高く推移しており，これまでのと鳥前48時間の絶食によってＬ値，ａ値，ｂ値の報告結果を支持するものであった 。wortmannin

すべてが低下しており，Ｌ値には非絶食群との間は phosphatidylinositol-3 kinase（PI3K）の 阻 害に有意差が認められた（Fig.２（Ａ））
。一方，と剤である。PI3Kの中でもクラスⅢPI3Kがオート

鳥前にwortmanninを投与した鶏では絶食の効果

ファジーの進展に必須であることから，がほぼ見られず，Ｌ値，ａ値，ｂ値のいずれにもwortmanninはオートファジー阻害薬として広く

非絶食群との間に有意差は認められなかった。肉基 礎 研 究 に 使 用 さ れ て い る 。本 研 究 で ，

色は消費者の購買意欲や評価に影響を与える肉質

wortmannin を 皮 下 投 与 し た 際 の 結 果 を Fig. 1

特性の一つであり，今回の結果はと鳥時のオート（Ｂ）に示すが，興味深いことに，ムネ肉のpHに

ファジーの状態が鶏ムネ肉の肉質に影響を与える

与える絶食の効果はまったく観察されなかった。

ことを示している。

７）

これらの結果は，と鳥後のムネ肉のpH低下に与本研究ではさらに，各鶏から採取したムネ肉をえる絶食の影響の一部分をオートファジーが担っ用いて保水性評価も実施した。評価はドリップロていることを示唆している。

スと加熱損失を指標として実施しており，その結と鳥前の絶食はpHのみならず，肉色にも影響

果をそれぞれFig.３（Ａ）と（Ｂ）に示す。加熱を与えることが報告されている８）。本研究でも，損失については，wortmannin投与の有無に関わ（A）

Wortmannin-treated chickens

Normal chickens

＊＊
5

（B）
30

Fed

Normal chickens

30

20

10

0

Fed

5

0

Fastedcooking loss（％）

0

cooking loss（％）

10
drip loss（％）

drip loss（％）

10

FastedFed

FastedWortmannin-treated chickens

20

10

0

Fed

FastedFig. 3 Water-holding capacity in breast meat.（A）Drip loss was determined byweighting breast meat samples before and after a freeze-thaw process.（B）For cooking loss, breast meat samples were placed in a polyethylene bag andcooked at 80℃ in a water bath. Cooking loss was calculated as the difference
between weights before and after cooking. Differences between groups werecompared using Studentʼs unpaired t-test.

© The Ito Foundation

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影響（Ⅱ）：オートファジーと食肉の肉質の関連性（A）

Normal chickens
Fed
Fasted

0

P=
0.
05
3

P=
0.
03
4

＊

P=
0.
06
8

P=
0.
09
4

100

P=
0.
01
7

200
P=
0.
08
5

mg/100 g

300＊

Ala Arg Asn Asp Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Tyr Val（B）

Wortmannin-treated chickens

300
mg/100 g

29

Fed
Fasted200
100
0

Ala Arg Asn Asp Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Tyr Val

Fig. 4 Free amino acid contents in breast meat. Normal broilers（A）or those administeredwith wortmannin（B）were fasted before slaughter for 48 h, whereas the control group
had free access to a commercial diet. The amino acids were extracted from each breast
meat and quantitatively analyzed using a LC/MS system. Differences between groups
were compared using Studentʼs unpaired t-test.

らず，絶食群と非絶食群の間に明確な差は認めら

本研究では，呈味性の指標の一環としてムネ肉れなかった。一方で，ドリップロスに関しては，中の遊離アミノ酸含量を調査した。その結果を

wortmannin非投与の際，絶食によって保水性がFig.４に示すが，wortmanninを投与していない

向上することを示す結果が得られた。食肉の保水

鶏のムネ肉では，と鳥前の絶食によりグルタミン

性は，pHとの関係が深いことが古くから知られ酸とセリンの含有量が有意に増加していた（Fig.

ており，pH5.0付近で最低となる 。Fig. 1（Ａ）

４（Ａ））。アラニン，アルギニン，アスパラギンに示されるとおり，と鳥前48時間の絶食によりム酸，グリシンも増加傾向にあり，それ以外のアミネ肉のpHは高く推移しており，このことがドリッノ酸についてもほぼすべてが非絶食群より絶食群

プロスの低下につながったものと推察される。実で 高 値 を 示 し た 。し か し な が ら ，と 鳥 前 に際に，wortmannin投与下ではと鳥前の絶食がpH

wortmanninを投与した鶏では，このような変化に影響を及ぼさなかったが（Fig. 1（Ｂ））
，このはまったく認められず，非絶食群と絶食群ですべ

条件ではドリップロスに関して絶食群と非絶食群てのアミノ酸がほぼ同じ含有量となった（Fig.４の差は認められない。なお，本研究では剪断力価（Ｂ））。前述したとおり，オートファジーは細胞に関する評価も行ったが，wortmannint投与の有内タンパク質の主要分解経路の一つであり，栄養無に関わらず，絶食群と非絶食群の間に明確な差

飢餓時に活性化し，細胞内タンパク質をアミノ酸は見られなかった（データ不掲載）。

に分解する。本研究では，と鳥前の絶食により

９）© The Ito Foundation

30

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

オートファジーが活性し，それによってムネ肉中

非絶食群と比較した。実験２では，オートファの遊離アミノ酸含量が増加したものと思われる。

ジー阻害剤であるwortmanninを投与した鶏を用以上の結果より，と鳥前48時間の絶食が鶏ムネ

いて実験１と同様の試験を行った。実験１におい

肉のpH，肉色，保水性ならびに遊離アミノ酸含て，絶食群のムネ肉のpHは非絶食群より有意に量に影響を与えること，ならびにその効果の大部

高値を示した。肉色については，絶食によってＬ分がオートファジー阻害剤であるwortmanninに値，ａ値，ｂ値のすべてが低下しており，Ｌ値によって消失することが明らかとなった。このこと

は非絶食群との間に有意差が認められた。また，

はと鳥前のオートファジーの状態が食肉の肉質に絶食によりドリップロスの低下や遊離アミノ酸含影響を与えることを示唆している。しかしながら量の増加も認められた。一方で，加熱損失や剪断本研究は，48時間の絶食でどの程度オートファ

力価には明確な差は認められなかった。興味深い

ジーが誘導されているのか，wortmanninによりことに，pHや肉色，ドリップロス，遊離アミノ

どの程度オートファジーが阻害されているのかと

酸 含 量 に 与 え る 絶 食 の 効 果 は ，実 験 ２ のいった点，すなわちオートファジーの定量的解析

wortmannin投与下ではほぼ観察されなかった。

には至っていない。また，wortmanninはクラス以上のことから，と鳥前のオートファジーの状態

ⅢPI3K阻害を介してオートファジーを抑制する

が食肉の肉質に影響を与える一因であることが示が，wortmanninはそれ以外のクラスのPI3Kも阻唆された。

害し，各種成長因子やサイトカインまたはインス
リンなどのシグナル伝達にも干渉しうる点にも注意が必要である。食肉の肉質に与えるオートファ
ジーの影響を明らかにするためには，さらなる詳細な検討が必要と考えられる。
４．要

約

オートファジーは細胞内タンパク質のバルク分解経路であり，近年の研究で，骨格筋の成長や機能におけるオートファジーの重要性が明らかになりつつある。一方で，これらの知見を食肉生産の分野に応用した研究は進展していない。本研究では，鶏のムネ肉を用いて，食肉の肉質に与える
オートファジーの影響を調査した。実験１では，と鳥前の絶食でオートファジーを誘導する群を設定し，ムネ肉のpH，肉色，保水性（ドリップロス，

文献１） Koohmaraie, M., Geesink, G. H. : Meat Science, 74,
34～43, 2006.
２） Kitamura, S., Kudo, K., Chikuni, K., Watanabe, T.,
Nishimura, T. : Animal Science Journal, 81, 501～505,
2010.
３） Malicdan, M. C., Noguchi, S., Nonaka, I., Saftig, P.,
Nishino, I. : Neuromuscular Diorders, 18, 521～529,
2008.
４） Zelechowska, E., Przybyiski, W., Jaworska, D.,
Sante-Lhoutellier, V. : European Food Research andTechnology, 234, 883～894, 2012.
５） Ramanathan, R., Mancini, R. A., Konda, M. R. :Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 1550
～1555, 2009.
６） Mizushima, N., Komatsu, M. : Cell, 147, 728 ～ 741,
2011.
７） Newton, K. G., Gill, C. O. : Meat Science, 5, 223 ～
232, 1981.
８） Smith, D. P., Lyon, C. E., Lyon, B. G. : Poultry
Sience, 81, 1584～1588, 2002.
９） Hamm, R. : Advances in Food Research, 10, 355 ～
463, 1960.

加熱損失），剪断力価および遊離アミノ酸含量を© The Ito Foundation

31

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その３）Studies on clarification of the compounds involved in“koku attributes”ofpork sausages（Ⅲ）

西

村

敏

英・江

草

愛

（日本獣医生命科学大学 応用生命科学部 食品科学科）

Toshihide Nishimura and Ai Saiga Egusa（Department of Food Science and Technology, Faculty of Applied Life Science, Nippon Veterinary and Life Science University）

It is well known that smoked pork sausage is very popular food as one of delicious foods.
However, the clarification of factors involved in the deliciousness of pork sausages have notbeen known yet.
In the previous research, the sensory characteristics in taste, aroma and texture of porksausage were clarified by sensory evaluation. The addition of umami compounds to sausages
was also shown to enhance the intensity and continuity in the retronasal aroma sensation of
pork sausage. This result indicated that umami compounds contribute to“koku attribute”ofpork sausages. Furthermore, the analyses of aroma compounds of smoked pork sausages
showed that most aroma compounds detected seemed to be produced in the smoking process.
So, this research was carried on to clarify the characteristic aroma compounds derived frompork meat involved in the sensation of“koku attributes”in pork sausages.
First, the sensory characteristics contributing to smoked and non-smoked pork sausages
were examined by sensory evaluation. Sensory analyses showed that non-smoked porksausages showed stronger undesired aroma such as nasty or fishy aroma. On the other hands,
smoked pork sausage showed complexity, mouthfulness and continuity in taste and aroma
sensation involved in“koku attributes”of pork sausages. The smoking process was also shownto make the texture of sausage skin tougher.
GC/MS analyses have shown that 16 aroma compounds in non-smoked pork sausages
were identified, and GC/O and GC/MS analyses has shown that the characteristic aroma
compounds of non-smoked pork sausages were identified to be β-pinene, 3-carene, D-limonene,
acetic acid, copaene, methyleugenol in 16 aroma compounds detected. Since these 6 compounds
were also identified in smoked sausages in previous report, they seemed to be common aroma
compounds in pork sausages derived from pork meats and spices used as materials. p-cresoland 2, 6- dimethoxy-phenol identified as key compounds in only smoked pork sausages seemed
to be produced in the smoking process.

© The Ito Foundation

32

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）ていない。豚肉を主原料とした食肉製品では，

的

１．目

Mottram ４）やRamarathnamら ５）の報告により，申請者らは，これまで食肉のおいしさを解明す

硝酸アルキル，ベンゾニトリル，４-メチル-２-

ることを目的とし，食肉を熟成した時の呈味成分

ペンタノン，２-ブチル-２-オクテナールなどのの変動ならびにそれにかかわるメカニズムに関す香気成分が亜硝酸塩を添加した製品から多く検出る研究を進めてきた。その中で，うま味物質でされることが明らかとなっている。しかし，どのあるグルタミン酸は，熟成期間が長くなると増加

成分が食肉製品のおいしさに関わっているかは，することや，その増加に寄与する食肉特有の酵素

ほとんど研究がなされていない。

１）を見出し，それらの特徴を調べてきた。また，そ申請者らは，最近，食べ物のおいしさの要因とれらの酵素が食肉の熟成に伴う遊離アミノ酸の増して知られているコクの定義を試み，「食べ物の加に寄与する作用様式を解明した。さらに，熟成

コクは，味，香り，食感による多くの刺激によりに伴い生成するペプチドが，酸味を抑制する効果形成され，それらが広がりや持続する時に感じらを有し，食肉の熟成に伴う風味の向上に寄与してれる現象である」と提案している６）。また，うまいることを明らかにしてきた。

味物質が食べ物のレトロネーザルアロマを増強さ

近年，食肉のおいしさには，味だけでなく，香せる働きがあることを解明した７）。これらの成果りも重要であることが明らかとなっており，呈味から，食肉は，熟成，加熱することにより，多く成分の分析に加えて，香気成分の分析も盛んとの刺激物質が生成されると同時に，熟成に伴い増なっている。香気成分の研究では，加熱により生加するうま味物質が，コクの刺激に広がりと持続

じた香気成分，あるいは保存した時の香気成分の性を与えることを提唱している。

変化等に関するデータが多く蓄積されている。こ

昨年度は，ポークソーセージに添加されるうまれまで，和牛肉では，ラクトン類が和牛肉を加熱

味物質の味わいの感じ方への影響を解析し，うました時の甘い香りに関わっていることが明らかと味物質は口中香を強く感じさせると同時に，風味なっている２）。また，鶏肉の不快臭の原因物質との複雑さや味の持続性を強く感じさせることが明して，2, 4-デカジエナールが特定されており，そらかとなった８）。また，ポークソーセージからエーの生成量が増えることにより，おいしさが低下すテルで抽出した香気成分をGC/OとGC/MSで解ることが知られている。さらに，豚肉を原料とし

析 し た 結 果 ，caryophyllene（ク ロ ー ブ 精 油），

ただしの味わいに寄与する成分として，アセトー

2-methoxy phenol（脂，片栗粉，プラスチック），

ル，オクタン酸，δ-デカラクトン，デカン酸のcresol（醤油，脂，スモーク），methyl eugenol（焦４成分が特定されている 。このように，牛肉，げ，カラメル，醤油，ハーブ），2, 6-dimethoxy

豚肉，鶏肉の特徴に関して，香気成分の分析は多phenol（スモーク，煙）がスモークソーセージのくなされているが，各食肉の特徴に寄与する香気特徴的な臭いに寄与する候補成分として特定なら成分の特定は，十分に解明されていないのが現状

びに同定された。これらの成分には，フェノールである。

類の香気成分が多く，製造工程の燻煙時に生成さ３）

食肉の中でも，豚肉を加熱した時の特徴的な香れるチップ由来のものと考えられた。

りやそれを原料としたポークソーセージのおいし

そこで，本申請課題では，チップ由来の香気成さに寄与する香気成分は，ほとんど明らかにされ分を排除し，原料肉由来の香気成分の解析を目的© The Ito Foundation

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その３）33として，スモークを行っていないポークソーセー

2.4

ジを用いて再度コクの形成に関与する香気成分の昨年度に，スモークソーセージの香気成分を分特定ならびに同定を行った。
２．方
2.1

析しているので，今年度は，ノンスモークソー
セージの香気成分を分析し，昨年度明らかとなっ法たスモークソーセージの結果と比較検討した。昨

供試試料

年度の分析において，エーテル抽出がより多くの燻煙を行う通常の製造条件で製造されたポーク
ソーセージ（以下スモークソーセージ）と，燻煙を行っていないポークソーセージ（以下ノンス

香気成分を検出できたことから，本年度は，エーテル抽出のみでの香気成分分析を行った。
ａ：ノンスモークソーセージの特徴的な香りにモークソーセージ）を調製した。冷凍保存されていたソーセージを冷蔵庫（０℃）で一晩保存，解凍し，官能評価用試料の調製に用いた。
2.2

ノンスモークソーセージの香気成分分析

寄与の大きい香気成分の特定細切りした５ｇのソーセージに20mlのジエチ
ルエーテルを添加し，２℃で一晩保存して，香気

官能評価用の試料の調製方法

成分を抽出し，エーテル抽出試料とした。

ステンレス製鍋（24cmφ×12cm）に水を張

エーテル抽出試料をGC/Oに供し，臭い嗅ぎをり，鍋の中に，350mlの水を入れた４つの500ml

実施してノンスモークソーセージの香りに寄与の容のビーカーを入れて加熱した。ビーカー内の水大きい成分を特定した。分析は，GC（GC-2014，が沸騰したところで，各ビーカーにソーセージを（株） 島 津 製 作 所） で ， CP-wax52CB （30m x

５本ずつ投入し，水温80℃で３分間加熱した。な

0.25mm i.d., 0.25μm film thickness）（ジーエルサ

お，この時のソーセージの中心温度は50℃付近にイエンス（株））カラムを用いた。分析条件は，達していることを確認した。加熱が終了したソー

40℃（５min）→（10℃/min）→240℃（10min）

セージは１本ずつアルミホイルで包装し，試料提の 昇 温 プ ロ グ ラ ム を 用 い た 。検 出 器 に は FID

供まで発砲スチロール内で保温した。また，官能（260℃）を使用した。臭い嗅ぎ装置は，Sniffer

評価の際に使用する口濯ぎ用の水は，ソーセージ

9000 System（アルファ・モス・ジャパン（株））の脂ならびに香辛料を口中から速やかに取り除くを用いた。ソーセージの特徴的な香りに寄与の大ため，約60℃に温めたイオン交換水を保温容器

き い 香 気 成 分 の 特 定 に は ， AEDA （Aroma（ステンレス製マグボトル）に入れて提供した。

extract dilution analysis）法を用い，エーテル抽

2.3

官能評価方法出試料を段階的に希釈したものを臭い嗅ぎに供しスモークソーセージとノンスモークソーセージた。最大希釈濃度2048倍希釈で検出できた香気成の食味性の比較を行うために官能評価には伊藤ハ分を，ソーセージの特徴的な香りに寄与の大きいム株式会社で製造された通常スモークソーセージ

香気成分とした。

と，スモークを行っていないノンスモークソー

ｂ：GC/MSによる香気成分の同定

セージを用いた。各ソーセージを１本ずつ提供

エ ー テ ル 抽 出 試 料 を GC/MS（Agilent7890A

し，試料を喫食し感じたことを記入してもらっ

GC-System, Agilent 7693 Auto-sampler, Agilent

た。なお，基本五味の識別ならびに，各味の濃度

Technologies 5975 inert MSD with Triple-Axis

識別ができ，２か月以上の訓練を行った４名をパ

Detecter）に供し，香気成分を同定した。分析条

ネリストに選定した 。

件は，GC/Oの場合と同様で，検出器にはMSを

９）© The Ito Foundation

34

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

ましくない香りを感じていた。また，皮が軟らか使用した。

いと評価したものも多かった。一方，スモーク

３．結果と考察ソーセージについては，味がしっかり感じられ，

3 . 1 スモークソーセージとノンスモークソー

複雑さ，濃厚感，広がりが強いなど，既述した「コクの定義」にあてはまる感覚をノンスモークソー

セージの官能的違い
はじめに，スモーク処理がソーセージの官能的セージより強く感じるパネルが複数いた。これ

特徴に及ぼす影響を明らかにするために，スモー

は，燻煙処理で生成される香気成分が付与される

クソーセージとノンスモークソーセージを官能評ため，ソーセージを食べたときの刺激の数が増え価した。官能評価項目については，味，香り，食ることにより，より複雑さが強くなったと推察さ感，見た目，味わい全体について気づいたことをれた。また，スモーク臭により，肉独特の味わい

すべて記入してもらった。４名の官能評価の結果が弱くなることもわかった。さらに，スモークにをTable１にまとめた。

より皮の食感に変化が生じ，硬くなる可能性が示

ノンスモークソーセージは，多くのパネリスト

唆された。このようにスモークソーセージとノンが肉の臭み，生臭い，獣臭が強いなど一般的に好スモークソーセージ間で味わいに，大きな違いがTable 1 スモークソーセージとノンスモークソーセージの官能的特徴＜スモークソーセージ＞
評価項目
味
香り
食感
色

味わい全体

評価

人数

甘味が強い

2

塩味が強い

2

うま味が強い4

スモーク臭が強い

4

皮が硬い

3

パリパリ感が強い

4

皮の色が濃い4

複雑さ（味わい）2

濃厚感が強い2

広がりが強い2

油っぽさが強い

1

肉汁が多い

2

＜ノンスモークソーセージ＞
評価項目

評価

人数

スパイスの味わいが強い

4

肉独特の香りが強い（臭み，生臭い，獣臭）

4

食感

皮がやわらかい4

色

皮の色が薄い3

あっさりしている（単純）

3

香り

味わい全体

注）スモークソーセージとノンスモークソーセージを食べ比べて強いと感じられる項目をあげてもらい，その結果をまとめた。人数は，その項目をより強いと感じた人数を示している。なお，パネリストは基本五味の識別ならびに各味の濃度識別ができ，２ヶ月以上の訓練を行った４名を用いた。

© The Ito Foundation

35

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その３）認められた。

Fig.１，Fig.２に示した。また，それぞれの試料

3 . 2 ポークソーセージの特徴的な風味に寄与の大きい香気成分の特定で検出された香気成分をTable２にまとめた。
Table２における網掛けの香気成分は，スモーク

１：GC/MSによるポークソーセージの香気成

ソーセージとノンスモークソーセージにおいて共に検出された香気成分である。

分の分析
スモークソーセージとノンスモークソーセージ

GC/MSによる分析の結果，スモークソーセーのエーテル抽出試料から得られたアロマグラムをジは22種類の香気成分，ノンスモークソーセージ

アバンダンス

検出強度

160000150000140000130000120000110000100000
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000

10000
時間-->

TIC：161215スモーク3.D\data.ms

22.63323.33723.65623.78823.91924.17224.27522.80823.09218.57122.29722.386
21.54721.62621.37214.15020.71320.4887.135
19.370

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00

保持時間（分）Fig. 1 GC-chromatogram of aroma compounds extracted from smoked pork sausages

アバンダンス23.41223.66023.78223.91424.14922.62823.24223.09414.14518.582

検出強度160000150000140000130000120000110000100000
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
時間-->

TIC：161215ノンスモーク1.D\data.ms

19.64522.27722.39721.38821.54012.296
11.493

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

保持時間（分）Fig. 2 GC-chromatogram of aroma compounds extracted from non-smoked pork sausages© The Ito Foundation

22.00

24.00

36

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 2 エーテルで抽出されたスモークソーセージとノンスモークソー

セージの香気成分の比較
スモークソーセージ

ノンスモークソーセージ

β-pinene

β-pinene

3-carene

3-carene

D-limonene

D-limonene

acetic acidacetic acidfurfuralbutanoic acidpropanoic acid
2-furanmethanol
copaenecopaenecaryophyllene

caryophyllene
2,4-decadienal

3-methyl-1,2-cyclopentanedione
2-methoxy-phenol
phenolmethyleugenol
p-cresol
6-octadecenoic acid2-octyl-cyclopropaneoctanaloleic acidcis-vaccenic acid
2-methoxy-3-（2-propenyl）-phenol
2,6-dimethoxy-phenol（E）-9-octadecenoic acidmethyleugenol
Icosene6-octadecenoic acid2-octyl-cyclopropaneoctanaloleic acidcis-vaccenic acid
2-methoxy-3-（2-propenyl）-phenol（E）-9-octadecenoic acidとによる原料肉の劣化等，今後検討が必要である。

では16種類の香気成分が検出された。
スモークソーセージにおいてのみ検出される香２：特徴的な風味に寄与の大きい香気成分の特

気 成 分 は furfural, butanoic acid, propanoic acid,

定と同定

2-furanmethanol, 3-methyl-1, 2-cyclopentanedione,

ノンスモークソーセージにおいて検出されたこ

2-methoxy-phenol, phenol, p-cresol, 2, 6-dimethoxy-

れらの香気成分の中で，寄与度の高い香気成分を

phenolの９種類，ノンスモークソーセージにおい

特定ならびに同定するためにAEDA法に基づき，て の み 検 出 さ れ る 香 気 成 分 は 2,4-decadienal,分析を行った。エーテル抽出試料を用いてGC/O

Icoseneの２種類であった。スモークソーセージ装置で臭い嗅ぎを行い，得られたクロマトグラムにおいてのみ検出されたこれら９種類の香気成分と，臭い嗅ぎの結果をもとに作成したアロマグラ

は，燻煙により付与された香気成分であるといえムをFig.３とFig.４に示した。なお，Fig.３のクロる。また，これら９種類の香気成分の中で，昨年マトグラムには希釈を行っていないエーテル抽出の助成による研究で寄与が大きいと推定された香試料を分析した結果を示した。

気成分であるp-cresol, 2, 6-dimethoxy-phenolは，Fig.３に示すように，希釈していないサンプル燻煙由来のポークソーセージを特徴付ける香気成では13か所で臭いが検知された。AEDA法に基分であることが明らかとなった。ノンスモーク

づき希釈した最大希釈濃度2048倍では，③，④，

ソーセージにおいてのみ2, 4-decadienal, Icosene⑤，⑥，⑧，⑩，⑬の７か所まで絞り込むことがが検出された理由については，燻煙を行わないこできた。したがって，これら７成分が本研究で用© The Ito Foundation

37

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その３）5.0
4.5②③④⑤ ⑦ ⑧⑥

μV(x10,000)
クロマトグラム ①

⑩

⑫
⑪

⑨

⑬

4.0
3.5
検出強度

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

min

保持時間（分）Fig. 3 GC/O-chromatogram of aroma compounds extracted from non-smoked pork sausages

希釈倍率FD2048
1024
512
256
128
64
32
1
1

2

3 4 56 78

9 10 11

12

13

ピーク番号
Fig. 4 Aroma-gram of non-smoked sausages analyzed by AEDA methods

いたノンスモークソーセージの香りの特徴に大きβ-pinene，④が3-carene，⑤がD-limonene，⑥

く寄与している成分であると推定された（Fig.

がacetic acid，⑩がcopaene，⑬がmethyleugenol

４）。

であると推定された。

これら７成分のうち，６成分は，臭い嗅ぎで得今回，ノンスモークソーセージの香りにおいられた香気成分の特徴とGC/MSの結果より候補て，寄与が大きいと推定されたこれら６成分は，物質が推定された（Table３）。GC/Oで検知され昨年の助成による研究においてもGC/MSによるたこれら７つの香気成分の特徴はそれぞれ，③が分 析 で 検 出 さ れ た 。 そ の た め ， β-pinene,「生シイタケ，森，豆」，④が「卵スープ，青臭い」

3-carene, D-limonene, acetic acid, copaene,⑤が「酸っぱい，青臭い，除光液」，⑥が「酸っmethyleugenolはすべて原料の豚肉由来，またはぱい，酢」，⑧が「ほこり，ゴム」，⑩が「カメム

香辛料由来であると推察された。その中でも，鷲シ，きゅうり，草」，⑬が「スパイス，カレー粉，尾（高倉）友紀子３）の報告により，豚だしの特徴

漢方薬」を連想させることが明らかとなった。ま的香気としてacetic acidがあげられていることかた，GC/MSにより，６つの成分，すなわち③がら，acetic acidは原料の豚肉由来であると推察さ© The Ito Foundation

38

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 3 ノンスモークソーセージからエーテル抽出された香気成分と候補物質
番号

香りの質（記述）候補物質
β-pinene

3

生シイタケ，森，豆4

卵スープ，青臭い

3-carene

5

酸っぱい，青臭い，除光液

D-limonene

6

酸っぱい，酢acetic acid8

ほこり，ゴム

該当なし

10
13

カメムシ，きゅうり，草スパイス，カレー粉，漢方薬

copaenemethyleugenol

れた。今回，ノンスモークソーセージの香りにおクソーセージの特徴的な臭いに寄与する候補成分

いて寄与が大きいとされた他の５成分が何由来のとして特定ならびに同定された。これらの６成分

香気成分であるのかは，香辛料を添加していないは，スモークソーセージにおいても検出されていポークソーセージを用いて再度検討する必要があたことから，すべて原料の豚肉由来，または香辛る。

料由来であると推察された。昨年度スモークソー

今回，スモークソーセージを特徴付けるとしてセージのキー化合物と推定された成分のうち，推定された香気成分と，肉由来の香りを含むと考

p-cresolと2, 6-dimethoxy-phenolは，ノンスモー

えられるノンスモークソーセージ特徴付ける香気

クソーセージで検出されなかったことから燻煙由

成分として推定された香気成分を組み合わせ，原来のポークソーセージを特徴付ける香気成分であ

料肉，香辛料，燻煙の香りを有するのが特徴であることが明らかとなった。

ると考えられるポークソーセージの香りを再現でソーセージの香りの特徴に大きく寄与している香

きるか否かを調べる必要がある。
４．要

今後は，スモークソーセージ，ノンスモーク
気成分として同定された香気成分の標品を組み合

約

わせ，原料肉，香辛料，燻煙の香りを有するのがポークソーセージは，美味な食品の１つであ特徴であると考えられるポークソーセージの香りる。本研究では，ポークセージの特徴を明らかにを再現できるか否かを調べる必要がある。そのたするため，スモークソーセージとノンスモーク

めには，ソーセージ中のこれらの香気成分を定量

ソーセージを用いて，それぞれの官能的特徴，並し，その存在比率に基づき標品を用いて再構成すびにソーセージに寄与する香気成分の同定を，る必要がある。

GC/OならびにGC/MSで行った。
GC/MSによる分析の結果，ノンスモークソー
セージでは16種類の香気成分が検出された。また，GC/O分析を用いたAEDA法により，16成分のうち，β-pinene（生シイタケ，森，豆），3-carene（卵スープ，青臭い），D-limonene（酸っぱい，
青臭い，除光液），acetic acid（酸っぱい，酢），copaene（カメムシ，きゅうり，草），methyleugenol（スパイス，カレー粉，漢方薬）が，ノンスモー

文献１） Nishimura, T. : Mechanism Involved in the
Improvement of Meat Taste during Postmortem
Aging, Food Sci. Technol. Int. Tokyo, 4（4）, 241～
249, 1988.
２） 右田光史郎，高濱結花，高萩康，杉山尚弥，菊池圭祐，松石昌典，沖谷明紘：日食工誌，59, 127～138,
2012．
３） Takakura, Y., Osanai, H., Masuzawa, T.,
Wakabayashi, H., Nishimura, T. : Characterization of
the key aroma compounds in pork soup stock by© The Ito Foundation

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その３）using an aroma extract dilution analysis, Biosci.
Biotechnol. Biochem., 78, 124～129, 2014.
４） Mottram, D. M. : Organic Nitrates and Nitriles inthe Volatiles of Cooked Cured Pork, J. Agric. Food
Chem. 32, 343～345, 1984.
５） Ramarathnam, N., Rubin, L. J., Diosady, L. L. :Studies on meat flavor. 3. A novel method fortrapping volatile components from uncured andcured pork, J. Agric. Food Chem., 41（6）, 933～938,
1993.
６） 西村敏英：食肉のおいしさとそれを引き出すコク39とは！，JATAFFジャーナル，3（12）, 29～35, 2015.
７） Nishimura, T., Goto, S., Miura, K., Takakura, Y.,
Egusa, S. A., Wakabayashi, H. : Umami compounds
enhance the intensity of retronasal sensation ofaromas from model chicken soups, Food Chemistry,
196, 577～583, 2016.
８） 西村敏英，江草愛：ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明（その２），平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.34，2016．
９） 古川秀子：おいしさを測る―食品官能検査の実際，幸書房，1994．

© The Ito Foundation

40

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定
Identification of myosin rod region involved in the solubilization under the
low ionic strength condition

早

川

徹

（帯広畜産大学畜産衛生学研究部門）

Toru Hayakawa（Department of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Myosin, one of major proteins in meat, was believed to be insoluble in water until we havereported that myosin could be solubilized in low ionic strength solution containing histidine.
The mechanism of the solubilization of myosin have not been clarified. We have alreadydemonstrated that surface charges of some regions in myosin C-terminus were shifted
negatively on solubilized condition（1 mM KCl, 5 mM histidine）. However, it was not clear
whether these changings of surface charge could be involved in solubilization of myosin in low
ionic strength condition. In this study, to identify the region which involves the solubilization of
myosin in low ionic strength solution containing histidine, two 56 amino acid residue fragmentsfrom myosin C-terminus region were determined whether they could be solubilized in low
ionic strength solution and could form polymers in physiological condition. These fragments
lack the ability of polymerization under the physiological condition, although they could besolubilized in low ionic strength solution regardless the presence of histidine. This means thatthese fragments could not interact with C-terminus region of myosin. However, this could notdeny which these regions have no relationship with solubilization of myosin. To clarify themechanism of solubilization of myosin, further research how histidine would affect thesefragments was needed.

１．目

肪分を多く含む部位もあり，高カロリー食品とい的うイメージが根強く，特に高齢者には敬遠されが食肉は必須アミノ酸を豊富に含む良質なタンパちである。そのような方々にも摂取しやすい液状

ク質供給源であり，私たちの健康な生活に欠くこもしくは粉末状の形態の食品の開発が望まれるとのできない食品の一つである。しかし，食肉はが，食肉に含まれるタンパク質の大部分は，水や調理によってもほとんど形状が変化せず，嚥下力

生理的塩濃度以下の低塩濃度溶液には溶けず，高や咀嚼力が弱くなった高齢者などにとっては食す

塩濃度溶液にしか溶解しない塩溶性タンパク質でることが困難な食品でもある。また，食肉には脂あるために，これらの形態への加工には多量の塩© The Ito Foundation

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定分が必要となり，食品としての価値は低くなると考えられる。そこで，塩の添加に依存せず，食肉

２．方

41

法

タンパク質を溶解させる水溶化技術を確立するこ

2.1とができれば，食肉タンパク質を様々な形態に加タンパク質フラグメントの作製には，Profinity

工できるようになり，その利用性が格段に広がる

eXactTM Protein Purification System（Bio-Rad）ことが期待される。

を用いた。タンパク質フラグメントは，鶏骨格筋タンパク質フラグメントの作製

これまでに，鶏胸筋を低塩濃度溶液で洗い，超ミオシン重鎖１Ｃ（NM_001113709）をもとに，音波処理を施すことで，食肉タンパク質の水溶化

Ｃ末端領域（アミノ酸残基1700-1941）およびＣを実現したが ，操作が煩雑であったため産業へ

末端領域内の56アミノ酸残基領域（アミノ酸残基の応用は困難であった。しかし，この一連の検討

1756-1811，1813-1868）を模するように設計しにより，食肉タンパク質の溶解性向上のためにた ４）（Fig. 1, Table１）。精製したタンパク質フラは，主なタンパク質の一つであるミオシンの抽出

グ メ ン ト は ，0.6M KCl ，5 mM リ ン 酸 緩 衝 液性を高めることが重要であることが示された。そpH7.2からなる高塩濃度溶液に対して透析し，そこで，筆者らは，食肉タンパク質の水溶化効率のの透析内液を以降の実験に供した。

１）

向上を目指し，鶏胸筋より抽出したミオシンをモ

2.2

デルとし，水溶化条件下におけるミオシンの挙動

精製した各タンパク質フラグメントをSDSポリについて検討を行った。ミオシンは一般に高塩濃アクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に

度溶液には溶解するが，生理的塩濃度およびそれ

供 し ，そ の 分 子 量 を 確 認 し た 。SDS-PAGE は以下の低塩濃度溶液中では自己会合し重合体を形

Schäggerの方法５）に従い，分離ゲルは16％ポリ成することが知られている。しかし，ミオシンを，アクリルアミドゲル（ビス比＝49.5：3）を，濃少量のヒスチジンを含む低塩濃度溶液に対して透縮ゲルは４％ポリアクリルアミドゲル（ビス比は析することで，その80％以上が溶解することが分同上）を用いた。泳動後の固定液には40％メタ

かった２）。また，この方法で水溶化したミオシン

ノールおよび10％酢酸からなる溶液を，染色液にの尾部領域（Ｌ-メロミオシン，LMM）はその分

は0.025％クマシーブリリアントブルー Ｇ-250お

子長が伸長していることが示され ，ミオシンのよび10％酢酸からなる溶液，そして脱色液には水溶化現象には，その尾部領域の構造変化が関係

10％酢酸溶液を，それぞれ用いた。

３）

SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動

していることが示唆された。そこで，本研究では，

2.3

ミオシンの水溶化現象におけるメカニズムの解明

各タンパク質フラグメントを，１mM NaClおのため，水溶化に関連するミオシンのアミノ酸残よび５mMヒスチジンもしくはTris-HCl, pH7.2か基領域を特定することを目的とし，特にミオシン

らなる透析外液に対して透析し，その透析内液を尾部領域に焦点をあて，その一部を模したタンパ

超遠心分離（100,000Ｇ，120分）した。超遠心分

ク質フラグメントを作製し，水溶化現象への関与

離により得られた上清を水溶化したタンパク質フについて検討した。

ラグメントとした。
2.4

タンパク質フラグメントの水溶化処理

SDS-PAGEによる分子間相互作用解析

各タンパク質フラグメントを，150mM NaClおよび５mM Tris-HCl, pH7.2からなる透析外液に© The Ito Foundation

42

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

C-terminus region（1700-1941）
1700

1941

1756 1811
1813 1868
Fig. 1 Diagram of myosin heavy chain constructs. These

constructs were expressed in E. coli. Construct 17001941（C-terminus region）was expressed with primers#636 and #815. Construct 1756-1811 was expressedwith primers #761 and #816, 1813-1868 was expressedwith primers #763 and #940, and 1869-1924 was
expressed with primers #765 and #818.

Table 1 List of PCR primers used in this study
Primer Sequence
#636
#761
#763
#815
#816
#940

Restriction enzyme

5ʼ-tttgaattctcactcttcctcttctatcttc-3ʼ
5ʼ-tttgaattcctacttcagggccagctgc-3ʼ
5ʼ-tttgaattcctatctaagaatgttcttgagatc-3ʼ
5ʼ-tttaagctttgacagagcgctcgagaaaag-3ʼ
5ʼ-tttaagctttgactgaagagaaggccaagaag-3ʼ
5ʼ-tttaagctttgacaagtggcaagaagcaaattcag-3ʼ

対 し て 透 析 し た 。そ の 透 析 内 液 を 超 遠 心 分 離（100,000Ｇ，120分）し，上清を回収後，チュー

EcoRI, STOP
EcoRI, STOP
EcoRI, STOP
HindIII
HindIII
HindIII

３．結果と考察

ブに残った沈澱を，高塩濃度溶液を加え再度溶解

ミオシンの生理的条件における重合体形成にすることで回収した。透析内液，上清および沈澱

は，Ｃ末端の約250残基領域が重要であるとされをそれぞれ上述のSDS-PAGEに供した。上清おていることから６），水溶化現象においてもこの領よび沈澱のいずれかの画分にバンドが出現するか域が関与していると考えられる。これまでに，筆どうかを確認することで，各タンパク質フラグメ

者は，この領域を分割した56アミノ酸残基のタンントが生理的塩濃度における重合体の形成を判断

パク質フラグメントを大腸菌によるタンパク質強した。また，Ｃ末端領域フラグメントと56アミノ制発現系により作製し，そのうちの二種類のタン酸残基領域フラグメントを混合した後に同様に処パ ク 質 フ ラ グ メ ン ト が ，水 溶 化 条 件（１ mM

理し，各タンパク質フラグメント同士における重NaCl, 5 mMヒスチジン）において表面電荷が変合体の形成についても確認した。

化することを明らかにした４）。そこで，本研究では，この二種類のタンパク質フラグメントにおけ© The Ito Foundation

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定

43る重合体形成能およびミオシンＣ末端領域との分

クトなミオシンは，骨格筋組織においても，また子間相互作用について検討し，これらの領域の水

in vitroにおいても規則正しく会合した重合体を溶化現象への関与について明らかにすることを目形成するため，タンパク質フラグメントを利用し的とした。

た検討においても，規則的な会合かどうかを考慮

タンパク質フラグメントの水溶化する必要がある。これまでに，インタクトなミオ

各タンパク質フラグメントの水溶化の有無につシンおよびLMMにおいて，ヒスチジンを含む低

いて確認するために，ヒスチジンを含む低塩濃度

塩濃度溶液に溶解することが示されているた溶液に対して各タンパク質フラグメントを透析

め２，３），本研究における水溶化条件下におけるミ

後 ，超 遠 心 分 離 し た 上 清 お よ び 沈 澱 を SDS-

オシンＣ末端領域のタンパク質フラグメントは規PAGEに供した。ミオシンＣ末端領域のタンパク則的な会合ではないと考えられる。

3.1

質フラグメントは，ヒスチジンの有無に関わら

3 . 2 生理的条件下におけるタンパク質フラグ

ず，低塩濃度溶液には溶解しなかったが，二種類メント間の相互作用の56アミノ酸残基タンパク質フラグメントはヒス各タンパク質フラグメントの生理的条件下におチジンの有無に関わらず，そのほとんどが低塩濃ける重合体形成能について検討するために，各タ度溶液に溶解した（Fig.２）。すなわち，56アミ

ンパク質フラグメントを生理的塩濃度溶液に対しノ酸残基タンパク質フラグメントはいずれも自身て透析し，超遠心分離後の上清および沈澱についのみで重合体を形成できない可能性が示唆されてSDS-PAGEに供した。ミオシンＣ末端領域タた。ミオシンＣ末端領域は重合体形成に必須な領

ンパク質フラグメントでは，上清にもバンドが確域であるとされており，この領域を含む250アミ

認され，低塩濃度条件とは異なり，三割程度が溶

ノ酸残基程度の長さのタンパク質フラグメントで解していた。一方，56アミノ酸残基タンパク質フは低塩濃度条件下で重合体を形成することが報告

ラグメントでは，低塩濃度条件と同様に，いずれされている。しかし，重合体を形成した場合のフラグメントにおいても沈澱画分にバンドが認においても，規則的な会合ではなく，単なる凝集

められなかった。すなわち，これらのタンパク質体となる場合もあることが示されている。インタ

フラグメントは自己会合による重合体形成能が欠

６～８）

1

2

3

4

C-terminus region

Construct 1756-1811

Construct 1813-1868
Fig. 2 SDS-PAGE patterns of solubilized constructs in low ionicstrength solutions. Lane 1 : suspension in solution of 1 mM
NaCl and 5 mM Tris-HCl, pH 7.2 ; lane 2: supernatant insolution of 1 mM NaCl and 5 mM Tris-HCl, pH 7.2 ; lane 3 :suspension in solution of 1 mM NaCl and 5 mM histidine ; lane
4 : supernatant in solution of 1 mM NaCl and 5 mM histidine.

© The Ito Foundation

44

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
1

2

3

4

5

6

C-terminus region

Construct 1813-1868
Construct 1756-1811

Fig. 3 SDS-PAGE patterns of constructs in physiological ionicstrength condition. Each fractions of mixture of construct
1756-1811 and 1700-941 were loaded in lane 1, 2 and 3. Eachfractions of mixture of construct 1813-1868 and 1700-1941 were
loaded in lane 4, 5 and 6. Lane 1 and 4 : suspension in solutionof 150 mM NaCl and 5 mM Tris-HCl, pH 7.2 ; lane 2 and 5:
supernatant in solution of 150 mM NaCl and 5 mM Tris-HCl,
pH 7.2 ; lane 3 and 6: precipitation in solution of 150 mM NaCland 5 mM Tris-HCl, pH7.2.

落していると考えられる。ミオシンの重合体形成

酸残基タンパク質フラグメントをミオシンＣ末端

はタンパク質表面の静電的相互作用によるとされ領域タンパク質フラグメントと高塩濃度条件下でており ，ミオシンの分子表面にはいくつかの正混合し，その後に生理的塩濃度溶液に透析するこまたは負の電荷クラスターが存在するため，正のとでタンパク質フラグメント間での重合体形成の電荷クラスターと負の電荷クラスターがお互いに有無を確認した（Fig.３）。その結果，いずれの引き付け合うことで重合する。今回用いた56アミ

56アミノ酸残基タンパク質フラグメントと混合しノ酸残基タンパク質フラグメントには，正もしくた場合においても，上清画分にのみ，56アミノ酸は負の電荷クラスターが存在するものの対となる残基タンパク質フラグメントを示すバンドが認め電荷クラスターが存在しない，もしくはどちらのられ，これら56アミノ酸残基タンパク質フラグメ

電荷クラスターも存在しないために，低塩濃度おントはミオシンＣ末端領域とは相互作用しないこ

よび生理的塩濃度条件下において重合しないものとが分かった。これまでのミオシンの重合体形成と考えられる。

メカニズムについて検討した報告においても，

６）

これら56アミノ酸残基領域がミオシンの水溶化

200アミノ酸残基以下のタンパク質フラグメントに関与しているかどうかを明らかにするために，が生理的塩濃度以下の条件で重合体を形成した例

正および負の電荷クラスターの両方を含有するＣはほとんどない６～８）。このことは，単一のタンパ

末端領域と生理的条件下において相互作用するか

ク質フラグメントにおいて正および負の両方の電どうかを検討する必要がある。そこで，56アミノ

荷クラスターを持ち合わせていないと，重合体を© The Ito Foundation

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の特定

45

形成するための相互作用がなされないことを示唆は，これら領域がミオシンの水溶化現象に関与ししている。これまでの検討により今回焦点を当てていることを否定するものではない。今後は，こた56アミノ酸残基領域は水溶化条件下でタンパク

れらアミノ酸残基領域におけるヒスチジンによる質分子表面の電荷が変化することが明らかとなっ作用について検討を進める。

ており，ミオシンの水溶化に関与している可能性が高いことが示されているものの４），これら領域の具体的な関与については明らかにすることができなかった。
４．要

約

本研究では，ミオシンの水溶化現象に関与しているアミノ酸残基領域を特定することを目的とし，特にミオシンＣ末端領域に焦点を当て，水溶化および分子間相互作用について検討を行った。
その結果，今回対象とした56アミノ酸残基領域を模した二種類のタンパク質フラグメントは低塩濃度溶液に対して溶解するものの，重合体形成能が欠落しており，また，ミオシンＣ末端領域とも相文献１） Ito, Y., Tatsumi, R., Wakamatsu, J., Nishimura, T.,
Hattori, A. : Animal Science Journal, 74, 417～425,
2003.
２） Hayakawa, T., Ito, T., Wakamatsu, J., Nishimura,T., Hattori, A. : Meat Science, 82, 151～154, 2009.
３） Hayakawa, T., Ito, T., Wakamatsu, J., Nishimura,T., Hattori, A. : Meat Science, 84, 742～746, 2010.
４） 早川徹：平成27年度食肉に関する助成研究調査報
告書，34, 29～33, 2016.
５） Schägger, H. : Nature Protocols, 1, 16～22, 2006.
６） Nakasawa, T., Takahashi, M., Matsuzawa, F.,
Aikawa, S., Togashi, Y., Saitoh, T., Yamagishi, A.,
Yazawa, M. : Biochemistry, 44, 174～183, 2005.
７） Sohn, R. L., Vikstrom, K. L., Strauss, M., Cohen, C.,
Szent-Gyorgyi, A. G., Leinwand, L. A. : Journal of
Molecular Biology, 266, 317～330, 1997.
８） Ricketson, D., Johnston, C. A., Prehoda, K. E. :Proceedings of the National Academy of Science, 107,
20964～20969, 2010.

互作用しないことが明らかとなった。この結果© The Ito Foundation

46

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅱ）
Study on processing technology and characteristics of fermented meatproducts produced using lactic acid bacteria cultures for dairy products（Ⅱ）

根

岸

晴

夫

（中部大学応用生物学部）

Haruo Negishi（College of Bioscience and Biotechnology, Chubu University）

In this study, the growth and proteolytic properties of 26 strains of Lactobacillus（Lb.）
groups were examined for the application to meat products, i.e. fermented pork jerky. The
mixed cultures of Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus（Lb. bulgaricus）and Streptococcus
thermophilus（Stc. thermophilus）were used as control. On the proteolytic activities, Lb. casei,
Lb. plantarum, Lb. rhamnosus, Lb. salivarius, Lb. zeae, Lb. mucosae, Lb. parabuchneri, and Lb.
pentosus were more higher among all tested lactic acid bacteria（LAB）. Especially, theproteolytic activities of Lb. zeae and Lb. parabuchneri may be higher than other LABs. The
SDS-PAGE patterns of myofibrillar proteins from 10％ pork muscle suspension during
fermentation with the selected 8 strains were almost similar. The rates of pH decreases during
fermentation with the 7 strains excluding Lb. mucosae in the pork suspension were almost
same to that of the control. The characteristics of the selected strains will be evaluated bymaking the fermented pork jerky. The nutrient components per 100g of fermented pork jerky
using the control cultures were rich in protein（40.5 g）and vitamin B group（2.57 mg）.
Functional components related to human health, including γ-aminobutyric acid（42.0 mg/100g）, L-carnitine（15.4 mg/100 g）, carnosine（493.0 mg/100 g）, and anserine（21.8 mg/100 g）
were also detected. Fermented pork jerky may be useful as a source of supply of proteins,vitamin B, or functional components.

１．目

クス食品が開発され，整腸，アレルギー症状の緩的和，および免疫賦活などの生体調節作用が報告さ

本研究は，ヨーグルトなどの発酵乳製品で汎用れている１）。一方，食肉加工の分野では発酵ソーされる乳酸菌の生物学的機能に注目し，食肉加工

セージの利用に留まり，今日まで乳酸菌の利用研への利用技術を開発することを目的として行った。

究はほとんどみられない。近年の腸内フローラの食品に対する乳酸菌の利用は乳加工の分野で活研究で，ますます乳酸菌の有益性が報告され，食発であり，発酵乳を中心に様々なプロバイオティ

品などへの応用性は広がっている。このような状© The Ito Foundation

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅱ）

47

況を踏まえ，著者らは，食肉加工への乳酸菌の新

コ ン ト ロ ー ル と し て ，前 報 の 再 構 成 肉 発 酵

規利用技術として，発酵ポークジャーキーの開発

ジャーキーに使用した乳酸菌スターターのLb.

研究を進めてきた２～４）。昨年度の本助成研究５）でbulgaricus/Stc. thermophilus混合乳酸菌末（DVS

は，再構成肉発酵ポークジャーキーの加工技術のYC-380 ； Christian Hansen），お よ び YC-380 か

開発とその特徴について報告した。引き続き，今ら分離したLb. bulgaricusとStc. thermophilusに

年度は再構成発酵ジャーキーの品質に及ぼす乳酸

ついても，上記の手順で凍結保存した。凍結菌株菌の作用として，高齢者にとっても食べやすいテの賦活は次の手順で行った。凍結乳酸菌株を解凍

クスチャーとするために，タンパク質分解活性のし，その１白金耳を15ml ppチューブのMRS液体

高い乳酸菌の検討，および発酵ジャーキーの栄養培地に接種した。37℃のインキュベーターに18時

成分の特徴について分析を行った。以下に，検討間培養した後，培養したMRS brothの菌体を懸濁結果について報告する。

してから，その１白金耳を５ml MRS培地に接種

2.1

し，37℃のインキュベーターで18時間培養して賦

法

２．方

活した。
2.3

豚肉試料

原料肉は，前報５）同様の方法に従って，輸入冷

１：脱脂乳寒天培地によるプロテアーゼ活性ス

凍豚もも肉（カナダ産）から脂肪や筋膜を除去

クリーニング

後，赤身肉から挽き肉（径3.2mm）を調製して実験に使用した。
2.2

乳酸菌の性能評価

10％脱脂乳/0.5％グルコース/0.5％酵母エキスの培養液に寒天15％を添加した脱脂乳寒天培地の乳酸菌

平板を作製し，この平板に孔径６mmの孔をあけ

Table１の（株）
明治食機能科学研究所から供与さた。賦活後の菌体懸濁液を脱脂乳寒天培地にあけれた26種類のLactobacillus属乳酸菌について検討た孔に20μl注入し，37℃で48時間培養し，孔のした。これらの乳酸菌株はLactobacilli MRS broth

周りのクリアゾーンの大きさでプロテアーゼ活性（Difco : Ref 288130）で嫌気的に賦活培養（37℃，を評価した。

18時間）後に菌体を回収し，10％脱脂乳培地に懸２：筋原線維に対する生育性

濁し，使用時まで速やかに－80℃に冷凍保管した。

MRS液体培地で賦活した乳酸菌を，10％豚ひTable 1 26 different species of Lactobacillus groups used for the experiment
Species

Strains

Species

Strains

Species

Lb. johnsonii

ME-455

Lb. rhamnosus

ME-464

Lb. delbruekii subsp. lactis

ME-473

Lb. acidophilus

ME-456

Lb. salivarius

ME-465

Lb. delbruekii subsp. bulgaricus

ME-474

Lb. crispatus

ME-457

Lb. zeae

ME-466

Lb. ruminis

ME-475

Lb. amylovorus

ME-458Lb. fermentum

ME-467

Lb. harvinensis

ME-476

Lb. gasseri

ME-459Lb. helveticus

ME-468Lb. panis

ME-477

Lb. brevis

ME-460Lb. reuteri

ME-469Lb. parabuchneri

ME-478Lb. buchneri

ME-461

Lb. mucosae

ME-470Lb. paraplantarum

ME-479Lb. casei

ME-462

Lb. oris

ME-471

Lb. pentosus

ME-480Lb. plantarum

ME-463

Lb. vaginalis

ME-472© The Ito Foundation

Strains

48

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

き肉/0.5％グルコース/0.5％酵母エキスから構成される肉懸濁液200mlに接種し，37℃，６時間発
酵し，０，２，４，６時間後のpHを測定した。

3 . 2 脱脂乳寒天培地によるたんぱく質分解活性スクリーニング
脱脂乳寒天培地にあけた円形の穴に乳酸菌培養

３：筋原線維のSDS-PAGE

液を接種し，37℃，18時間培養した。寒天培地の前述２で０，２，４，６時間発酵した肉懸濁液

穴の周囲には寒天培地に含まれる乳タンパク質が５mlを遠心分離（3,500rpm，４℃，15分）し，分解されて生じるクリアゾーンが観察された。こ沈澱部を回収して前報同様，Olsonらの方法６）での円形のクリアゾーンの直径を計測し，その大き電気泳動用の筋原線維を調製し，SDS-PAGEをさにより，タンパク質分解活性の強さを比較し行った。

た。その結果をFig.１に示した。前述の生育性の2.4

実 験 結 果 と 同 様 ，ME-462 ，463 ，464 ，465 ，

発酵ポークジャーキーの試作

再構成肉を利用した発酵ポークジャーキーの試

466，470，478，480，およびLb. bulgaricus/Stc.

と同様の手順で行った。ただし，豚挽

thermophilus 混 合 乳 酸 菌（YC-380）の プ ロ テ

き肉には濃縮乳酸菌カルチャーを10％の割合で混アーゼ活性が強いことが判明した。これら８種類合した。

のLactobacillus属の菌種は前述の生育性試験か

作は前報

５）

2 . 5 再構成発酵ポークジャーキーの栄養成
分，機能性成分の分析

ら，ホエイカルチャーでの生育性も優れていた。
3 . 3 豚肉懸濁液中における乳酸菌の生育性と一般組成は（一財）日本食品分析センターに，

プロテオリシス

γ-アミノ酪酸とビタミン類は（株）島津テクノ

脱脂乳寒天培地でプロテアーゼ活性が強い８種

リサーチに，カルノシン，アンセリン，およびカ類のLactobacillus属乳酸菌，および混合乳酸菌

ルニチンは（一社）食肉科学技術研究所に依頼分（YC-380）とその分離菌Lb. bulgaricusのMRS懸析した。その他の，pH，aw ，微生物検査は，前濁液を10％肉懸濁液に接種し，37℃で６時間発酵

報 に従って行った。

した。発酵中の豚肉懸濁液のpHをFig.２に示し

１）

た。ME-470株のLb.mucosaeとYC-380から分離

３．結果と考察

したLb. bulgaricusは他の菌に比べpH降下速度がLactobacillus属乳酸菌26種類の生育性

遅く，これらの菌を接種した発酵中の肉懸濁液か賦活した26種類のLactobacillus属乳酸菌と混合ら調製した筋原線維の濃度も低かった。残りの７

スターターYC-380，およびYC-380から分離した菌株とYC-380を接種した肉懸濁液のpH降下速度

Lb. bulgaricus, Stc. thermophilus を 10 ％ ホ エ イ

はほぼ同じであり，発酵中の肉懸濁液から調製し/0.5％酵母エキス/0.5％グルコース培養液に接種た筋原線維の濃度も同傾向を示し，その濃度は発し，37℃，８時間発酵した。発酵中の培養液の酵の進行とともに上昇した。発酵中のpH降下速

pH変化（図略）から，８時間の発酵で培養液pH

度が速いことは豚肉懸濁液における乳酸菌の生育が4.6に達した乳酸菌株は，ME-462，463，464，

性が優れていることを示し，懸濁液から調製した

465，466，470，478，および480の８種類で，こ筋原線維濃度が高いことは，発酵中の乳酸菌によれらの菌株の発酵性が良好であると判断した。

るプロテオリシス作用の強さを示唆している。次3.1に，乳酸菌による発酵中の豚肉懸濁液における筋
原線維タンパク質のプロテオリシスを調べるため© The Ito Foundation

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅱ）

49455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 ST

LB ST/LB

25

Diameter（mm）

20

15

10

5

0

Lactic acid bacteria
Fig. 1 Screening for proteolytic activities of lactic acid bacteria using 10％ skim milk agar plate.
Numbers of 455 to 480 show 26 different strains of Lactobacillus. ST, LB and ST/LB show Stc. thermophilus, Lb.

bulgaricus and a combination of both strains, respectively.
20μL of MRS broth cultures of each strain was added into the hole made in the skim milk agar plate and thenincubated for 2 days at 37℃. Diameters of clear zones formed in the outer of the hole after incubating were
measured.
6.5
6

pH

5.5
5
4.5
4

0

2

4

6

Fermentation time（h）
Fig. 2 pH changes of 10％ suspension of pork muscle during fermentation

using Lactic acid bacteria for 0, 2, 4 and 6 h at 37℃．
Lb. casei ME-462（－）, Lb. plantarum ME-463（□）, Lb. rhamnosus ME-

464（◆）,Lb. salivarius ME-465（◇）,Lb. zeae ME-466（▲）,Lb. mucosae
ME-470（△）, Lb. parabuchneri ME-478（●）, Lb. pentosus ME-480（○）,
Lb. bulgaricus（■）,YC-380（×）．
0.5％ glucose and 0.5％ yeast extract were added into the pork muscle
suspension.

に，筋原線維のSDS-PAGEを行った。

3 . 4 SDS-PAGEによる筋原線維の分解パターン
選抜した乳酸菌を接種した発酵中の豚肉懸濁液© The Ito Foundation

50

平成28年度Marker（kDa）

0

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

ME-462
2 4 6

0

ME-463
2 4 6

0

ME-4642 4 6 Incubation
Time（h）

227

MHC

116
97.2
66.4
55.6

α-actinin

45.0

actin
Troponin T

35.7

30kDa

29.0
20.1

Fig. 3 5-20％ SDS-PAGE patterns of myofibrillar proteins from the porksuspension during fermentation with LAB for 0, 2, 4 and 6 h at 37℃.
5-20％ gradient gel used.
Lb. casei ME-462, Lb. plantarum ME-463, Lb. rhamnosus ME-464
Table 2 Nutrient components of fermented restructured pork jerky

Energy（kcal/100ｇ）
Water（ｇ/100ｇ）
Protein（ｇ/100ｇ）
Carbohydrate（ｇ/100ｇ）
Fat（ｇ/100ｇ）
Mineral（ｇ/100ｇ）
Vitamin B1（mg/100ｇ）
Vitamin B2（mg/100ｇ）
Vitamin B6（mg/100ｇ）
Vitamin B12（μg/100ｇ）
γ-Aminobutyric acid（mg/100ｇ）＊
calculatedFermented Jerky＊
Pork（fresh ham）

280
34.3
40.5
10.2
8.6
6.4

128
73.0
22.1
0.2
3.6
1.1

1.07
0.36

0.96
0.23

0.51
0.63
42.0

0.33
0.30
―

using Standard Tables of Food Composition in Japan-2015-（Seventh

Revised Edition）

から調製した筋原線維のSDS-PAGEパターンか

ン重鎖，43kDaのアクチン，および10万付近のら，ME-470以外の７種の菌株はほぼ同程度のタ

α-アクチニンの分解がみられた。筋原線維タン

ンパク質分解性を示し，いずれの乳酸菌も同じ分

パク質の分解の程度には差があり，pH降下が速解パターンでプロテオリシスの現象が観察されく発酵性が優れている乳酸菌が強いタンパク質分た。ここではME-462，463，464の結果をFig.３

解作用を示した。特にLb. zeaeとLb. parabuchneriに示した。すなわち，pHが急激に低下する発酵のプロテアーゼ活性が強かった。

４時間以降で筋原線維の分解が顕著となり，筋原

3 . 5．栄養成分と機能性成分について

線維の主要タンパク質の分子量20万付近のミオシ

再構成発酵ジャーキーの栄養成分の組成を© The Ito Foundation

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅱ）

51

Table２に示した。豚もも肉（生）と比較すると，pentosus を 選 抜 し た 。な か で も Lb. zeae と Lb.

発酵ジャーキーは乾燥によって，いずれの成分も

parabuchneriのプロテアーゼ活性が強かった。筋増加し，特にタンパク質含量は40.5％と多く，タ原線維のSDS-PAGE分析から，これら乳酸菌のンパク質の良い給源となることを確認した。また

筋原線維タンパク質の分解パターンはほぼ同じで体内の様々なエネルギー代謝において重要な働き

あ っ た 。今 後 ，選 抜 し た 乳 酸 菌 の 発 酵 ポ ー クをするビタミンＢ群も比較的豊富に含まれた。まジャーキーへの利用性について検討予定である。本

た，γ-アミノ酪酸（GABA）が約40mg/100ｇ検研究で開発した，Lb. bulgaricus/Stc. thermophilus

出された。GABAは血圧降下や精神安定などの作混合菌による再構成肉の発酵ポークジャーキーの用が知られている。GABAを多く含む発芽玄米で栄養成分は，豚もも肉（生）と比較し，タンパク100ｇ中に10mg程度であることから，その４倍量

質含量が40.5％と多く，ビタミンＢ群が比較的豊が期待された。発酵ジャーキー中のGABAは，

富に含まれた。機能性成分として，γ-アミノ酪

Lb. bulgaricus/Stc. thermophilus混合菌によって酸40mg/100ｇ，
カルノシン493.0mg/100ｇ，アンセ生産されたものと考えられた。

リ ン 21.8mg/100 ｇ ， お よ び Ｌ - カ ル ニ チ ン

そ の 他 の 機 能 性 成 分 と し て ，カ ル ノ シ ン

15.4mg/100ｇが検出された。発酵ポークジャー

493.0mg/100ｇ，アンセリン21.8mg/100ｇ，およキーはタンパク質などの栄養成分や機能性成分のびＬ-カルニチン15.4mg/100ｇが検出された。

補給源として有用であると考えられた。

４．要

約

発酵ジャーキーなど，食肉加工への乳酸菌の利用技術を開発するために，26種類のLactobacillus
属乳酸菌を取り上げ，食肉加工への利用性を検討した。コントロールの乳酸菌は，前報の発酵ジャー
キーに使用したLb. bulgaricus/Stc. thermophiles
混合菌とした。豚肉中での生育性とタンパク質分解性が共に優れたLactobacillusとして，Lb. casei,
Lb. plantarum, Lb. rhamnosus, Lb. salivarius, Lb.
zeae, Lb. mucosae, Lb. parabuchneri ， お よ び Lb.

文献１） 飯野久和，信田幸大：乳酸菌とビフィズス菌のサイエンス，第１版，495～551，京都大学学術出版会，
京都，2010．
２） 大橋勝太郎，根岸晴夫：日本畜産学会報，82, 53～60, 2011.
３） 大橋勝太郎，根岸晴夫：日本食品科学工学会誌，
59, 447～455, 2012.
４） Ohashi, K., Negishi, H. : Food Science andTechnology Research, 20, 679～685, 2014.
５） 根岸晴夫：平成27年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，34, 23～28, 2016.
６） Olson, D. G., Parrish, F. C. Jr., Stromer, M. H. : J.
Food Sci, 41, 1036～1041, 1976.

© The Ito Foundation

52

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響
Effect of hypoxanthine on the improvement of taste during postmortem
aging of meat

市村

さやか・中村

幸信・吉田

由香・服部

昭仁

（一般社団法人食肉科学技術研究所）

Sayaka Ichimura, Yukinobu Nakamura, Yuka Yoshida and Akihito Hattori（Japan Meat Science and Technology Institute）

In preceding study, we revealed that hypoxanthine（Hx）is essential for the enhancementof the cured meat taste during maturation. Because Hx accumulates in meat by thedegradation of inosine monophosphate（IMP）during postmortem aging, it is likely to play animportant role in the improvement of meat taste induced by aging. Therefore, we examined
the involvement of Hx in the taste of aged meat.
First, the concentrations of Hx and IMP, and the sensory analysis were preliminarily
determined in the dry- and wet-aged meats. The concentrations of Hx in the dry-aged beef
and pork were higher than those in the wet-aged ones, while the concentrations of IMP werehigher in the wet-aged beef and pork than in the dry-aged ones. The sensory scores, that is,strength of umami and kokumi tastes were also higher in the dry-aged beef and pork than the
wet-aged ones. Consequently, Hx may contribute to the improvement of meat taste more thanIMP.
To remove the influence of texture on the sensory evaluation of aged meat, the soups
were prepared from longissimus thoracis muscles of pork aged for 2 and 7 days, and then thetaste of the soups were evaluated by sensory analyses when several concentrations of Hx wereadded to the soups. The enhancement of bitter, umami and kokumi tastes were recognized by
the addition of Hx to the soups, and the enhancement was higher in soup prepared from pork
aged for 7 days than in that for 2 days. The enhancement by the addition of Hx to the soups
was in dose-dependent fashion up to a certain concentration of Hx. It was concluded that Hx isessential for the improvement of meat taste during postmortem aging.

１．目あり，食肉中に内在するカルシウムイオンやプロ的

テアーゼの関与によって軟らかさを獲得すること

食肉は，と畜後の一定期間低温で熟成することが明らかになっている１，２）。食肉の軟化と同時ににより好ましい食感および風味，すなわち「おい風味が改善することも明らかになっており，風味しさ」が発現する。熟成の主目的は食肉の軟化でのうち香りに関しては熟成に伴う酸臭や獣臭の消© The Ito Foundation

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響

53失が報告されている３）。一方，味に関しては遊離一つであるアルギニンが閾値を大きく越える濃度

アミノ酸や低分子ペプチドの増加が食肉の旨味や含まれるにも関わらず，苦味は増強せずに帆立貝

コク味の増強の主要因であると考えられていの味のコク味が増強すると報告している12）。我々

る４，５）。しかしながら，熟成に伴う食肉の風味のは，塩漬肉特有の味の増強へHxの呈する苦味が改善機構は複雑な化学的・生物的反応によって制関与するか否かについて調べた結果，苦味物質の御されており，詳細は明らかにされていない。

種類に関わらず，一定程度の苦味が塩漬肉の旨味

ハムやソーセージといった塩漬食肉製品もまやコク味の増強を惹き起こすことを明らかにしてた，塩漬熟成と称される塩漬期間が長いほど特有きた10）。また，Hxはアルギニンやロイシンといっの好ましい風味が増強することが知られている。

た食肉中の苦味を呈するアミノ酸と比較するとそ

我々は，これまでに塩漬熟成に伴い特有の味を増の閾値が低く12，13），なおかつ熟成に伴って閾値の強する因子について，食肉中の多くの呈味成分を数倍量まで食肉中に蓄積するため，食肉の苦味の含む筋漿画分に着目して探索してきた。その結鍵となる物質と推定される。

果，塩漬熟成の過程で顕著に増加するのはヒポキ

本研究の目的は，食肉のと畜後の熟成に伴う味サンチン（Hx）であり，これが塩漬肉特有の味の改善に対するHxの関与を明らかにすることでの増強に必須な成分であることを明らかにしてきある。そこで，まず予備的な試験として長期熟成

６）

た 。

した豚肉および牛肉中の核酸関連物質含量と官能Hxとは，食品中の旨味成分として広く認知さ試験の関係を調べた。次に，熟成期間の異なる豚

れている核酸関連物質，イノシン酸（IMP）が熟の胸最長筋からスープを調製し，そこへHxを加成に伴って分解したものであり，これまでに食肉えた時のスープの味の変化について，官能試験をの味に関与する成分としては否定されてきた

用いて苦味，旨味およびコク味の評価を中心に調

。

４，７）

一方で，長期間の熟成により風味が増強したヨー
ロッパ産の生ハムや，近年わが国で脚光を浴びているドライエイジングビーフでは，IMP含量は低
下しHx含量が増加している ８～10）。従来，食肉の味の改善には旨味物質であるグルタミン酸とIMP

べた。
２．方

法

2 . 1 長期間熟成した豚肉および牛肉の成分分
析および官能試験の寄与が大きいと考えられてきたが，塩漬熟成に３頭の三元豚および交雑種牛ロースの一方を無限らず，と畜後の熟成においても食肉中にHxが包装，０-１℃，湿度75％の条件で４週間ドライ蓄積するため，熟成による味の改善はグルタミン

エイジング，もう一方を真空包装して同様の条件

酸とIMPによる旨味の増強のみでは説明が困難ででウェットエイジングした後に胸最長筋を切り出ある。以上のことから，食肉の熟成に伴う味の改し，成分分析および官能試験に供した。熟成後の善へのHxの関与が強く示唆される。

胸最長筋をフードカッター（GM200，Retsch製）

Hxは，単体では苦味を呈し，その閾値は0.73で細切し，水分，タンパク質，脂質，遊離アミノ

μmo/mlと報告されている 。苦味は一般には好酸および核酸関連物質含量を測定した。また，熟ましくない味として捉えられているが，食品に成後の胸最長筋を厚さ５cm，縦５cm，長さ10cm

よっては嗜好性に寄与している場合もあり，角に切り出し，真空包装後に75℃の水浴中で50分

Michikawaらは帆立貝には苦味を呈すアミノ酸の間加熱後冷却し，厚さ５mmにスライスして官能11）© The Ito Foundation

54

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

試験に供した。評価法は７段階（０～６点）の採よび３μmol/mlとなるように加えた。

点法とし，旨味，コク味，および美味しさ（総合官能試験では，豚肉スープの塩味，苦味，旨味評価）を評価した。パネルは当研究所に所属するおよびコク味（厚みthickness，複雑さcomplexity，

分析型パネル３名とし，旨味およびコク味の評価

持続性continuity）の強さについて，７段階の採はノーズクリップを用いて鼻腔を閉じ香りの影響

点法で評価した。コク味は黒田らおよび西村らのを排除して試験した。

定義を用い，厚みは「味が濃い，こってりしてい

2.2

理化学分析

る」，複雑さは「味が複雑，深みがある」，持続性

水分含量は乾燥減量法により測定した。タンパ

は「旨味の後味」を評価した 15，16）。スコアは，各ク質含量および窒素濃度は燃焼法により測定した味について極めて弱いあるいは感じない場合を０（スミグラフNC-220Ｆ，（株）住化分析センター

点とし，反対に極めて強いあるいは感じる場合を製）。pH は ガ ラ ス 電 極 に よ り 25 ℃ で 測 定 し た６点とした。パネルは当研究所に所属する分析型（PH-METER F52，HORIBA製）。遊離アミノ酸

パネル５名とし，事前にパネルへ熟成期間の異な濃度は，試料に蒸留水および10％スルホサリチル

る豚肉を官能評価してもらい，評価尺度の摺り合酸溶液を加えてホモジナイズ後に遠心分離し，得わせを行った。また，試験時はノーズクリップをられた上清をヘキサン洗浄したものを高速アミノ

着用して鼻腔を閉じ，香りの影響を排除した。

酸分析計（Ｌ-8900，（株）日立ハイテクサイエン

2.5ス社製）で測定した。核酸関連物質濃度は，北田すべての官能試験の結果はパネル５名の平均値

らの方法で測定した 。

±標準誤差で算出し，統計学的有意差検定はＴ検

14）

2.3

統計処理

定を用いて行い，有意水準は５％とした。

豚肉スープの調製と畜後２日経過したチルド豚ロース３本（LWD種）の胸最長筋を挽肉にして混合し，半量を４℃で５日間熟成した。と畜２および７日目の挽肉に1.5倍量の0.1M NaClを加えてフードカッ

３．結果と考察3 . 1 長期熟成した食肉の成分分析および官能試験

ターで5,000rpm，30秒間混合し，非通気性の袋

我々は，平成27年度の本助成研究において，予（S-WRAP, Star Plastic Industry Inc.）に 入 れ て備的な試験として長期熟成した牛肉中の核酸関連

沸騰水中で20分間加熱した後，冷却した。生じた

物質含量と官能試験の関係を調べ，Hx含量が高ドリップを回収し，10,000ｇ，30分間，４℃で遠い試料の旨味およびコク味が強い傾向であること

心分離して得られた上清を５Ａろ紙でろ過したろを報告した 10）。すなわち，Hxが食肉の熟成に伴液を豚肉スープとし，使用するまで真空状態でう味の改善へ関与する可能性が示唆された。そこ－30℃で保管した。

で，本研究では，Hxの味への関与が畜種によっ2.4

豚肉スープの官能試験て違うかどうかを調べるため，牛肉と豚肉をウと畜２および７日目の豚肉スープに，内在性のHx含量を考慮してHxの濃度が２μmol/mlとなる

エットおよびドライエイジング法で熟成し，理化
学分析および官能試験へ供して比較した。

ように加え官能試験に供した。また，と畜７日目

まず，ウエットおよびドライエイジングした三の豚肉スープには，Hx添加による味の変化に対元豚および交雑牛の胸最長筋の一般成分値をする濃度依存性を調べるため，Hxの濃度が１おTable１に示した。豚肉，牛肉共に，水分，たん© The Ito Foundation

55

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響
Table 1 General constituent of aged pork and beef
pork

beef

wet-aged

dry-aged

wet-aged

dry-agedwater

ｇ/100ｇ

71.1

70.4

67.3

65.1

proteinfat

ｇ/100ｇｇ/100ｇ

24.3
4.1

25.0
3.1

22.9
8.6

23.6
8.6

Table 2 Concentration of amino acids and ATP-related compounds of aged pork and beef
pork

Asp
Thr

free amino acids（mg/100ｇ）

ATP-related compounds（μmol/ｇ）

beef

wet-aged

dry-aged

wet-aged

dry-aged

5.1
14.3

24.6
41.8

22.2
49.6

41.1
69.1

Ser

19.0

49.3

63.2

76.2

Glu
Gly
Ala
Val
Cys
Met
Ile
Leu
Tyr
Phe
Trp
Lys
His
Arg
Pro

27.0
16.9
35.9
17.5
0.0
17.2
17.1
29.6
18.5
17.9
1.6
20.4
6.7
21.2
5.3

75.9
37.3
70.8
47.4
0.0
34.4
37.5
64.2
39.0
40.0
3.4
59.7
20.7
51.4
18.8

70.3
42.2
118.6
87.1
0.0
52.1
64.2
119.2
7.4
77.2
0.0
95.6
30.6
56.3
17.6

111.1
54.7
145.3
106.4
0.0
53.5
74.3
130.3
28.1
82.1
9.4
128.8
41.9
45.3
41.0

IMP

3.2

1.2

0.4

N.D.

Hx

1.4

2.5

1.6

2.0

ぱく質および脂質含量において熟成条件の違いにングではIMPよりもHx含量の方が高かった。以よる大きな差がなく，ドライエイジングによる試上の結果から，牛肉，豚肉ともにドライエイジン

料の乾燥および濃縮はしていないと考えられた。

グした方が熟成の程度が進んでおり，特に豚肉は続いて，遊離アミノ酸含量および核酸関連物質含

ウエットおよびドライエイジングの熟成条件によ量をTable２に示した。遊離アミノ酸含量は，豚肉，る差が顕著だった。

牛肉ともにウエットエイジングよりもドライエイ

続いて，ウエットおよびドライエイジングした

ジングの方が顕著に高く，旨味を呈すアミノ酸で豚および牛の胸最長筋を75℃の水浴中で50分間真あるグルタミン酸は豚肉で2.8倍，牛肉で1.6倍高空加熱し，官能試験へ供した（Fig.１）。豚肉，

かった。核酸関連物質含量は，牛肉，豚肉ともに

牛肉共に，ドライエイジングの方がウエットエイ

ウエットエイジングよりもドライエイジングのジングよりも旨味，コク味が顕著に強く評価さ

Hx含量が高く，反対にIMPの含量は低かった。

れ，総合評価である美味しさの評価も高かった。

また，豚肉において，ウエットエイジングではまた，豚肉において熟成条件の違いによるコク味

Hx含量よりもIMP含量が高いが，ドライエイジの強さの差が顕著であり，熟成の程度がコク味の© The Ito Foundation

平成28年度

6.0

wet‒agedwet‒ageddry‒ageddry‒aged
6.0

5.4

5.0
strength of taste

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

5.0

4.6

4.0
3.0

3.0

3.0

3.0

2.0
1.0
0.0

5.4

4.9

5.0
strength of taste

56

4.9

4.0
3.0

3.0

3.0

umami

kokumi

3.0

2.0
1.0

umami

kokumi0.0
palatability

Porkpalatability

BeefFig. 1 Strength of taste of aged pork and beef

強さへ関与していることが推定された。以上の結試料を調製し，Hxが味の増強に関与するか否か

果は，畜種に関係なく，ドライエイジングした試を苦味，旨味およびコク味の評価を中心に調べた。

料のHx含量が高く，旨味およびコク味が顕著に

まず，と畜２および７日目の豚胸最長筋から調強いことを示しており，食肉の熟成に伴う味の改製したスープの成分分析の結果をTable３に示し

善へのHx関与の可能性が示唆された。反対に，た。２日目と７日目のスープを比較して顕著な差

IMP含量が高いウエットエイジングした試料の旨が認められたのは遊離アミノ酸および核酸関連物

味およびコク味は弱く，熟成に伴う味の改善への質であり，遊離アミノ酸は18種すべてにおいて熟IMPの寄与が低いことが示唆された。また，ドラ成に伴い増加した。核酸関連物質は，IMPが熟成

イエイジングした試料はウエットエイジングしたに伴い減少したのに対してHxは２倍に増加した。

試料より遊離アミノ酸含量が顕著に高く，遊離ア

また，窒素濃度に変化がないため，原料肉の構造

ミノ酸が熟成に伴う食肉の味の改善に不可欠であタンパク質の分解は進んでいないと考えられた。
続いて，と畜２および７日目の豚胸最長筋からることが示唆された。
Hx添加による豚肉スープの味の増強調製したスープにHxを加え，スープの味へのHx

長期熟成した豚肉および牛肉を用いて核酸関連の影響を官能試験により調べた。まず，２日目の物質含量と官能試験の関係を調べた結果，畜種に

スープについて，Hx不添加および添加したスー関係なく食肉の熟成に伴う味の改善へのHxが関

プを官能試験に供した（Fig.２）。Hxの添加濃度

与の可能性が示唆された。しかし，熟成に伴い発は，ドライエイジングした豚肉中のHx含量を参現した軟らかな食感や多汁性が官能試験へ少なか

考に十分に熟成された豚肉中の濃度を想定して２らず影響する可能性を否定できない。そこで，こμmol/mlとし，スープに内在する含量を考慮しれらの影響を排除したより単純な実験系で食肉のて加えた。官能試験の結果，Hxを添加したスー味へのHxの関与を官能的に評価するべく，豚肉

プの苦味，旨味，およびコク味はHx不添加のスーから水溶性以外の食肉成分を排除したスープ状のプと比較して強い傾向にあり，厚みは有意に強3.2© The Ito Foundation

57

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響
Table 3 Profile of the pork soup
2days-pork soup

7days-pork soup

5.83

5.88

pH
nitrogen（mg/100ml）

free amino acids（㎎/100ml）

ATP-related compounds（μmol/ml）

235

243

Asp

0.0

2.3

Thr

0.9

2.0

Ser

0.9

2.8

Glu

0.8

1.7

Gly

2.4

3.1

Ala
Val

5.1
2.3

7.4
3.4

Cys

0.0

0.0

Met

1.1

2.9

Ile
Leu

0.8
1.4

1.9
3.7

Tyr
Phe
Trp
Lys
His
Arg
Pro

0.7
0.5
0.0
1.0
0.0
0.6
0.0

2.4
2.0
0.0
2.5
0.7
2.2
0.0

IMP
INO
HX

0.99
0.61
0.15

0.70
0.95
0.30

6.0

without the addition of Hx
with 2 μmol/ml of Hx

strength of taste

5.0

4.0

3.0

3.8

3.6
3.0

3.8＊

2.4

3.6

3.2

3

3.0

3.8

2.6

2.4

2.0

1.0

0.0
salty

bitterumami

thicknesscomplexity

continuity

kokumiFig. 2 Effect of hypoxantine on the taste of soup prepared from pork aged for 2 days
The strength of taste of the soup prepared from pork aged for 2 days（without the addition ofHx）was compared with that of soup with 2μmol/ml of Hx. The vales of astersks are
significantly different（p＜0.05）.Histgrams show mean values.

© The Ito Foundation

58

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

6

without the addition oh Hx
with 2 μmol/ml of Hx

strength of taste

5

4.6＊

4

3

4.4＊

4.2
3.8

3.6＊
3

2.8

3

3

3

bitterumami

thickness

3

3

2

1

0
salty

complexity

continuity

kokumiFig. 3 Effect of hypoxantine on the taste of soup prepared from pork aged for 7 days
The strength of taste of the soup prepared from pork aged for 7 days（without the addition ofHx）was compared with that of soup with 2μmol/ml of Hx.
The vales of astersks are significantly different（p＜0.05）. Histgrams show mean values.

かった（ｐ＜0.05）。次に，７日目のスープにつの呈する苦味が関与していることを明らかにしていて，２日目と同様にHx不添加および添加したきた10）。本研究では，スープ中の遊離アミノ酸含

スープを官能試験に供した（Fig.３）。その結果，

量は熟成に伴い増加し，苦味を呈すロイシンやアHxを添加したスープの苦味，旨味はHx不添加のルギニンといった複数のアミノ酸も増加している

スープと比較して強く（ｐ＜0.05），コク味も強（Table３）。したがって，Hxを含めた苦味物質がい傾向であった。また，２および７日目のスープ

スープ中に一定程度存在することによりスープのはいずれもHx添加による塩味の変化がなかった。

味の増強効果が強まる可能性が考えられた。

以上の結果から，豚肉スープにHxを加えると苦ここで，Hxによるスープの味の増強に対する味，旨味およびコク味が増強することが確認され濃度依存性を調べるため，旨味およびコク味の増た。ここで，Hxを２μmol/ml加えた２日目と７強程度が強かったと畜７日目のスープへHxの濃日目のスープを比較すると，スープ中のHx濃度

度を変えて１～３μmol/mlになるように加えては同じであるが，７日目の方が不添加スープに対官能試験へ供した（Fig.４）。その結果，苦味，する添加スープの味の増強程度が強い傾向にあっ

旨味およびコク味のいずれも，Hx不添加のスーた。特に，旨味および厚みは７日目の方が顕著に

プと比較してHxが１～２μmol/mlの時に最も味強まった。この結果は，熟成に伴いスープ中の何が強くなった。一方で，３μmol/ml加えるとHx

らかの呈味成分が増えると，Hxとの相乗効果が不添加のスープとほとんど味の強さが変わらな

強まり，結果としてスープの味が増強することをかった。すなわち，Hx添加によるスープの旨味示唆している。我々は，平成27年度の本研究におおよびコク味の増強は一定の濃度までは濃度依存

いて塩漬熟成した場合の特有の味の増強にはHx

的で，一定のレベルを超えると認められなかっ© The Ito Foundation

59

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの影響
6.0

without the addition of Hx

with 1 μmol/ml of Hx

with 2 μmol/ml of Hx
5.0

＊ ＊

＊

＊
＊

4.0
strength of taste

with 3 μmol/ml of Hx
＊
＊

＊

3.0

2.0

1.0

0.0

salty

bitterumami

thicknesscomplexity

continuity

kokumiFig. 4 Concentration-dependency on the effect of hypoxantine on the taste of soup prepared from pork agedfor 7 days
The strength of taste of the soup prepared from pork aged for 7 days（without the addition of Hx）was

compared with that of soup with various concentatons of Hx（1, 2 and 3μmol/ml）．
The vales of astersks are significantly different（p＜0.05）. Histgrams show mean values.

た。ある程度までHxの濃度依存的に味が増強しまで味への関与が否定されてきたHxが不可欠でたことから，Hxが食肉の熟成適期をはかる指標あると推定された。今後は，食肉の味の増強へのとなり得ることが示唆された。また，Hxの濃度

Hxの作用機序について解明することにより，Hxが高いと旨味およびコク味が弱くなったことは，を含めた食肉の味に関与する主要因子を用いてドライエイジングをした食肉において問題視され「食肉の熟成適期を判断する客観的な指標」を提ている過熟成による味の低下現象と関連している

案していきたい。

可能性が考えられた。しかし，Hxの濃度が高い
場合に苦味自体も弱まっており，味の増強に対するHxの呈する苦味の関与について今後さらに検４．要約本研究では，と畜後の食肉の熟成に伴う味の改善に対するHxの関与について調べた。まず，長討する必要がある。
実際にHxが蓄積した状態の食肉中には，熟成期熟成した豚肉および牛肉中の核酸関連物質含量に伴い遊離アミノ酸や低分子ペプチド，有機酸，と官能試験の関係を予備的に調べた結果，Hx含ミネラル等の複数の呈味性分が同時に蓄積してお量が高いドライエイジングした試料の旨味およびり，これらが相互作用して熟成肉特有の味わいをコク味が顕著に強く，食肉の熟成に伴う味の改善

形成していると考えられる。しかしながら，本結へのHx関与の可能性が示唆された。反対に，果から，熟成した食肉特有の味の発現には，これIMP含量が高いウエットエイジングした試料の旨© The Ito Foundation

60

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

味およびコク味は弱く，食肉の熟成に伴う味の改善へのIMPの寄与が低いことが示唆された。次に，食感の影響を排除したより単純な実験系として，熟成期間の異なる豚の胸最長筋から調製したスープにHxを加えた時の味の変化について官能試験を用いて調べた。その結果，スープにHxを加えると苦味，旨味およびコク味が増強し，その増強の程度は熟成期間の長い原料肉から調製したスープの方が強かった。また，Hx添加によるスープの味の増強は，一定の濃度まで濃度依存的であることが確認された。本結果から，熟成された食肉特有の味の発現にはHxが不可欠であると推定された。
文献１） Takahashi, K. : Animmal Science Journal, 70, 1～
11, 1999.
２） Hattori, A., Takahashi, K. : The Journal of
Biochemistry, 103, 809～814, 1988.
３） 松石昌典：食肉の科学，36, 183～198, 1995.
４） N i s h i m u r a , T . , K a t o , H . : F o o d R e v i e w s
International, 4, 175～194, 1988.

５） Nishimura, T., Rhue, M. R., Okitani, A., Kato, H. :Agricultural and Biological Chemistry, 52, 2323～
2330, 1988.
６） Ichimura, S., Nakamura, Y., Yoshida, Y., Hattori,
A. : Animal Science Journal, 88, 379～385, 2017.
７） Escudero, E., Mora, L., Aristoy, M., Toldrá, F. :Meat Science, 89, 536～539, 2011.
８） S h i b a t a , K . , Y o s h i d a , Y . , M a t s u n a g a , T . ,Nakashima, M., Inoguchi, Y., Shinmura, H., Hattori,
A.：食肉の科学，54（2）, 165～174, 2013.
９） Escudero, E., Mora, L., Aristoy, M., Toldrá, F. :Meat Science, 89, 536～539, 2011.
10） Ichimura, S., Nakamura, Y., Yoshida,Y., Hattori,
A.：平成27年度食肉に関する助成研究調査報告書，33, 23～29, 2015.
11） K o n o s u , S . : F o o d t a s t e c h e m i s t r y , A C S
Symposium series, No.115, 185 ～ 203, American
Chemical Society, Washing-ton. DC, 1979.
12） Michikawa, K. : Nippon Shokuhinn Kagaku
Kogaku Kaishi, 42（12）, 982～988, 1995.
13） Ninomiya, K.：調理科学，1, No.4, 185～197, 1968.
14） Kitada, Y., Hasuike, A., Sasaki, M., Tanigawa, K.,
Horiuchi, R., Yumiba, H.：日本食品工業学会誌，30,
151～154, 1983.
15） Kuroda, M., Yamanaka, T., Miyamura, N. ： 日 本
味と匂学会誌，11（2）, 175～180, 2004．
16） Nishimura, T.：日本味と匂学会誌，19（2）, 163～
166, 2012.

© The Ito Foundation

61

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価
Intramuscular free fatty acids related to deliciousness of Japanese Black
Wagyu beef and its taste-traits analyzed by an electronic taste sensing system

山之上

稔１・趙 婭楠１・西田 昌弘１・中田 悠介１・
上田 修司１・羽原 正秋２・池崎 秀和２（１神戸大学大学院農学研究科，２株式会社INSENT）

Minoru Yamanoue１, Yanan Zhao１, Masahiro Nishida１, Yusuke Nakada１,
Shuji Ueda１, Masaaki Habara２ and Hidekazu Ikezaki２（１Graduate School of Agricultural Science, Kobe University, ２INSENT, Inc.）

It is well known that sensory evaluation and an electronic taste sensing system are useful
methods to analyze food tastes. The electronic taste sensing system, which employs the similar
mechanism as that of human tongue, converts food tastes into numerical data. Recently, it has
been developed advanced taste sensors as a method to evaluate taste-traits of meat and meatproducts. But the most appropriate and standard method of beef taste-trait evaluation has notbeen established yet, even though related reports by advanced taste sensors are gradually
increasing. The purposes of this study were to develop a method which is suitable to tastetrait analysis of beef and to obtain the basic knowledge of generalizing the method using theelectronic taste sensing system. Therefore, we revealed changes in beef taste-traits by themethod depending on bovine species, postmortem aging days and cooking process. Sample beef
slices were taken from carcass cross-section between the sixth and seventh ribs of JapaneseBlack Wagyu and Holstein cattle and stored at 4℃ antiseptically. At 7-，14- and 21-days
postmortem, beef broths were prepared from raw and cooked samples. Each beef broth sample
was analyzed by the electronic taste sensing system and estimated by sensory evaluation forcomparison. As the results, beef broth from boiled longissimus thoracis muscles of JapaneseBlack Wagyu at 21-days postmortem is probably desirable to consumers. Different taste-trait
patterns of beef broth removed protein or added ethanol in pretreatment procedures were
demonstrated unlike the other methods. In order to establish the optimize pretreatment
method, the results assessed not only by the electronic taste sensing system but also sensory
evaluation of human panels should be needed.

１．目

えて，脂肪交雑として知られる筋内脂肪が風味や的

軟らかさなどの食味性に影響して発現される１～３）。

牛肉のおいしさは，熟成中に増加するペプチ

筋内脂肪では脂肪交雑の多さが高品質の牛肉とし

ド，アミノ酸や核酸関連物質などの呈味物質に加て評価されるが，筋内脂肪量が同程度の牛肉でも© The Ito Foundation

62

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

おいしさに優劣のあることが知られている。近呈味性分析の最適な手法を確立するために，種々

年，筋内脂肪量だけでなく脂肪の質，すなわちトの牛肉サンプルの分析を行い，官能評価との関連

リアシルグリセロールの構成脂肪酸が牛肉の風味を調べた。

要因となることが示されているが，牛肉は長期

１）間の熟成を経て加熱後に食されており，熟成およ２．方法

び加熱で筋内脂肪が変化し，遊離脂肪酸の量や組2.1

試薬および牛肉試料

成に変化が起きている可能性がある。

試薬は特に表記してあるものを除き，ナカライ

上記の観点から，平成23～26年度に伊藤記念財

テスク社もしくは和光純薬工業株式会社の特級試団からの研究助成を受けて，熟成および加熱前後

薬を用いた。牛肉試料は，伊藤ハム（株）食肉事の黒毛和種牛肉とホルスタイン種牛肉の摂取時に業本部から購入した黒毛和種およびホルスタイン

口腔に拡がる肉汁中の遊離脂肪酸の量および組成

種枝肉の第６－７肋骨間のロース部を用いた。

の変動を分析し，加熱牛肉の食味性を官能評価で

2.2

調べた

。それらの結果，食味性の良い黒毛和

ロース部の牛肉を４℃で保存し，と畜後７日

種牛肉では，熟成に伴い肉汁中の遊離脂肪酸量が目，14日目，および21日目にロース芯から牛肉片

筋肉内リパーゼのはたらきにより増加するこを無作為に採取して熟成および未加熱試料としと，遊離脂肪酸組成は筋内脂肪であるトリア

た。一方，同期間熟成した牛肉ロース芯を４cm

シルグリセロールの脂肪酸組成と異なり，パルミ

×５cmの大きさで厚さ１cmの肉片に整形し，チン酸，ステアリン酸およびオレイン酸の３種の120℃に加熱したホットプレートで内部温度が65

みが検出され，飽和脂肪酸であるパルミチン酸お～70℃になるように表裏を各130秒間加熱後に試よびステアリン酸の割合が高く，熟成の進行とと料を採取し，加熱試料とした。またホルスタイン

もにオレイン酸割合が増加することを見出し

種牛の同ロース部の胸最長筋と僧帽筋からと畜後た 。そしてこれら筋内の遊離脂肪酸変化は牛肉

21日目に牛肉片を採取した。

４～７）

５，７）

６）

のおいしさに寄与していることを示唆している。

2.3

熟成および加熱処理

肉汁サンプルの調製

牛肉のおいしさに密接に関連する味要素として

未加熱および加熱牛肉の各４ｇを採取し，過去の遊離脂肪酸の影響を，よく知られているペプチの報告９～11）におけるサンプル調製法を改変した次

ド，アミノ酸や核酸関連物質などの呈味物質と併の前処理法で肉汁サンプルを調製した。方法１：

せて明らかにするうえで，現在のところ，それら破砕・均質化と低温固化による脂肪除去11），方法の物質が総じて知覚される呈味評価にはヒトによ

２：15％EtOH中の破砕・均質化による脂肪除る官能評価以外に有効な方法が見出されていな

去 10），方法３：煮出しと低温固化による脂肪除い。近年，食肉・肉製品の呈味性を客観的に機器

去９），および方法４：破砕・均質化と除タンパク

分析する手法の一つに，味覚センサーを備える味質を行う５）。

認 識 装 置 ８）を 応 用 し た 報 告 例 が 増 え て き て い

2.4

る。しかし味覚センサーによる牛肉の呈味性と畜後７，14および21日目に胸最長筋から牛肉

評価では最適かつ統一された分析方法がいまだ確片を採取した。未加熱または加熱牛肉片から４種立されておらず，評価間の比較検証に課題が残さ類の方法で肉汁サンプルを調製し，６種類のセンれている。本研究では，味覚センサーによる牛肉サーを備える味認識装置（INSENT社，TS-5000

９～11）© The Ito Foundation

味覚センサー分析黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価

ＺまたはSA402B）で呈味性を分析した。
2.5

63

製法の影響を調べた結果をFig.３に示す。加熱し官能評価た牛肉から調製方法４に従って準備したサンプル

12）
食肉の官能評価ガイドライン（2005）に従っを基準にして分析値を解析した結果，他の調製方て，と畜後21日目の加熱牛肉から肉汁サンプルを法による肉汁分析値と異なるパターンを示した。

調製し，平均年齢23歳の男女14名の学生により６すなわち両品種ともに他の３種類の方法に比較し段階の評点法で評価した。

て検出された酸味値が高く，旨味は低値であり，2.6

特に黒毛和種牛肉汁の甘味値が低い結果であっペプチド定量方法４で除タンパク質を行い調製した牛肉汁中のペプチド含量は，BSAを標準としてLowry法

13）た。低pHが旨味センサーや甘味センサーに影響する可能性が考えられる。
牛肉汁の官能評価の結果をFig.４に示す。加熱で定量した。

牛肉から方法４で調製したサンプル値を基準にし３．結果と考察て解析した結果，対象者全員の結果では両品種とホルスタイン種および黒毛和種牛胸最長筋肉汁

もに酸味以外の味要素に関しては，Fig.３に示すの呈味性に及ぼす熟成の影響を味覚センサーで調味覚センサー分析結果にほぼ一致して３種類の方

べ，結果を熟成７日目の未加熱サンプルを基準に法で調製した肉汁サンプルの各味要素がより強くして示す（Fig.１）。両品種の牛肉汁ともに，熟知覚された。特に方法３で調製した肉汁サンプル

成に伴い苦味雑味および旨味は増加し，酸味は減における官能評価とセンサー分析結果の近似か少する傾向であった。しかしそれらの変化の程度

ら，同方法で調製したサンプルが味覚センサー分は両品種間で異なり，苦味雑味はホルスタイン種

析に適していることが示唆された。方法２で調製

牛肉汁で強く，酸味の減少と旨味の増加は黒毛和した肉汁サンプルには15％エタノールが入ってお種牛肉汁で顕著であった。結果は示していない

り，肉汁中でより多量の脂肪の除去が起こり，筋が，加熱処理はホルスタイン牛肉汁の苦味雑味を

内脂肪が多い黒毛和種牛肉では各味要素が高値で軽減し，黒毛和種牛肉汁の旨味と甘味を増強し分析されたのではないかと考えられる。

た。加熱により我々が通常食している調理牛肉の牛肉汁には味覚センサー分析および官能評価に影響する多くの物質が含まれていると考えられ特徴に近くなることが示唆された。
牛肉の部位間での呈味性の違いを調べるためる。その中のペプチド含量を分析した結果をFig.

に，ホルスタイン種牛肉の胸最長筋と僧帽筋を加５に示す。黒毛和種牛とホルスタイン種牛の両肉

熱後に肉汁を調製し，味覚センサーで分析した汁中に熟成に伴いペプチド量が増加し，これまで（Fig.２）。未加熱と加熱した胸最長筋のサンプルの結果と一致した。しかし黒毛和種牛とホルスタを基準にすると，胸最長筋では僧帽筋より甘味とイン種牛間では筋内脂肪量の違いに関わらず，言

酸味が強く検出され，苦味雑味と渋味刺激が弱い

い換えればいわゆる赤身肉量の違いに関わらず，結果であった。筋肉部位間での呈味性の違いが示

両肉汁間のペプチド含量に差を見出せなかった。

唆されたことから，今後の実験では継続してロー

今後，核酸関連物質や遊離アミノ酸等の他の呈味

ス部の胸最長筋を用いた。

物質を定量し，味覚センサー分析および官能評価

牛肉の味覚センサー分析に最適な肉汁サンプルの結果との関連を調べる必要がある。

を見出すために，分析値に及ぼす肉汁サンプル調© The Ito Foundation

64

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Raw-7dSweetness
Richness

Raw-14d

Sourness
2
1
0
-1
-2
-3

Aftertaste fromastringency

Acid bitterness
Astringency

Umami

Bitterness

Raw-21dSourness
2
1
0
-1
-2
-3

Sweetness

Richness

Aftertaste fromastringency

Astringency

Umami

Bitterness

Saltiness

Acid bitterness

Saltiness

A

B

Fig. 1 Effects of postmortem aging on taste-traits of raw beef prepared by the method 4 and analyzed by anelectronic taste sensing system. Beef broth from longissimus thoracis muscle of Holstein（A : n=2）andJapanese Black Wagyu（B : n=4）cattle.

Longissimus thoracis
Sourness2

Sweetness

1

Richness

Acid bitterness

Trapezius
Sourness2

Sweetness

1

0

0

-1

-1

Astringency-2

Aftertaste fromastringency

Umami

Bitterness

Richness

Astringency-2

Aftertaste fromastringency

Umami

Bitterness

Saltiness

Acid
bitterness

A

Saltiness

B

Fig. 2 Taste-traits of Holstein beef broth from longissimus thoracis and trapezius muscles prepared by themethod 4 at 21-days postmortem and analyzed by an electronic taste sensing system. Raw（A : n=2）
and cooked（B : n=2）beef.

Method 4

Sweetness
Richness

Method 1

Sourness
5
2
-1
-4
-7
-10

Aftertaste fromastringency

Acidbitterness
Astringency

Umami

Bitterness

Method 2

Method 3

Sweetness
Richness

Sourness
5
2
-1
-4
-7
-10

Aftertaste fromastringency

Astringency

Umami

Bitterness

Saltiness

Acid bitterness

Saltiness

B

A

Fig. 3 Taste-traits of Holstein and Japanese Black Wagyu beef broth from cooked longissimus thoracis

muscles prepared by various methods at 21-days postmortem and analyzed by an electronic taste
sensing system. Holstein（A : n=4）and Japanese Black Wagyu（B : n=6）beef.

© The Ito Foundation

65

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価
Method 4

Sweetness

Method 1

Sourness2

Acid
bitterness (NA)10Richness

Method 2-1

Aftertaste fromastringency

Sourness2

Acid
bitterness (NA)10Richness-1

Astringency (NA)-2

Aftertaste fromastringency

Umami

Bitterness

Sweetness

Astringency (NA)-2

Method 3

Saltiness

Umami

Bitterness

Saltiness

B

A

Fig. 4 Taste-traits of Holstein and Japanese Black Wagyu beef broth from cooked longissimus thoracis

muscles prepared by various methods at 21-days postmortem and analyzed by sensory evaluation ofhuman panels. Holstein（A : n=4）and Japanese Black Wagyu（B : n=4）beef. NA, Not analyzed.

Peptides contents（mg/100 g of beef）

250

200

150

100

50

0

7

14

21

Postmortem time（days）
Fig. 5 Effect of postmortem aging on the amounts of peptides incooked beef broth prepared by the method 4 fromlongissimus thoracis muscle and measured by the methodin “Materials and Methods”．Holstein（open box : n＝４）andJapanese Black Wagyu（closed box : n＝５）cattle.

４．要

種々の牛肉汁サンプルの呈味性を味覚センサーで約分析し，これらの要件によるセンサー分析値の特

本研究の目的は，味覚センサーで分析するため徴を把握した。次に牛肉汁サンプルの調製方法をの牛肉汁サンプルの最適な調製方法を見出すこと検討した。熟成21日の加熱処理した胸最長筋からと，その方法を標準化することについての基本的

４種類の調製方法を試みた結果，方法３による肉知見を得ることである。黒毛和種とホルスタイン

汁サンプルの味覚センサー分析値と官能評価が近種牛肉，熟成，加熱処理の違いにより得られた似することが明らかになった。

© The Ito Foundation

66

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

文献１） Westerling, D. B., Hedrick, H. B. : J. Anim. Sci., 48,
1343～1348, 1979.
２） Melton, S. L., Amiri, M., Davis, G. W., Backus, W.
R. : J. Anim. Sci., 55, 77～87, 1982.
３） Mandell, I. B., Buchanan-Smith, J. G., Cambell, C.
P. : J. Anim. Sci., 76, 2619～2630, 1998.
４） 山之上稔，矢野恵子，上田修司，井原一高，豊田淨彦：平成23年度食肉に関する助成研究調査成果報
告書，Vol.30, 68～75, 2012.
５） 山之上稔，大和彩弥香，上田修司，井原一高，豊田淨彦：平成24年度食肉に関する助成研究調査成果
報告書，Vol.31 ,42～48, 2013.
６） 山之上稔，西田昌弘，上田修司，井原一高，豊田淨彦：平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報
告書，Vol.32, 27～33, 2014.
７） 山之上稔，西田昌弘，趙婭楠，上田修司，井原一高，
豊田淨彦：平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，Vol.33, 116～120, 2015.
８） Toko, K. : Mat. Sci. Eng. C, 4, 69～82, 1996.
９） Sasaki, K., Tani, F., Sato, K., Ikezaki, H.,
Taniguchi, A., Emori, T., Iwaki, F., Chikuni, K.,
Mitsumoto, M. : Sensor. Mater., 17, 397～404, 2005.
10） Chikuni, K., Oe, M., Sasaki, K., Shibata, M.,
Nakajima, I., Ojima, K., Muroya, S. : Anim. Sci. J., 81,
600～605, 2010.
11） Nodake, K., Numata, M., Kosai, K., Kim, Y. J.,
Nishiumi, T. : Anim. Sci. J., 84, 613～621, 2013.
12） 食肉の官能評価ガイドライン，（独）家畜改良センター編，１～80，日本食肉消費総合センター，東京，
2005.
13） Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L.,
Randall, R. J. : J. Biol. Chem., 193, 265～275, 1951.

© The Ito Foundation

67

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変
Alteration of the substrate specificity of transglutaminase by protein
engineering

滝

田

禎

亮

（京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻）

Teisuke Takita（Graduate School of Agriculture, Division of Food Science and Biotechnology, Kyoto University）

I cloned a transglutaminase（Tgl）gene from Geobacillus stearothermophilus NCA1503.
The Tgl fusion protein with N-terminal His-tag was expressed in soluble form but did not bindto a Ni affinity column. The Tgl with C-terminal His-tag was expressed in insoluble form. The
Tgl with no tag was expressed in soluble form and likely to have transglutaminase activity. I
succeeded in the purification of the Tgl with no tag and generated the 14 mutants. In addition,
I constructed an expression system of a protein substrate for Tgl, the N-terminal domain oflysyl-tRNA synthetase（ANT）. The ANT fusion protein with N-terminal His-tag was
expressed in soluble form, bound to a Ni affinity column, and was specifically digested by
Factor Xa. I generated the ANT mutant in which all Gln residues are replaced with Asn.
Further, I devised a novel assay for transglutaminases, which was based on fluorescenceresonance energy transfer.

１．目

残基の側鎖アミノ基がアシル受容体となる。これ

的までの研究から，トランスグルタミナーゼは，アトランスグルタミナーゼは，タンパク質のグルシル供与体に対する認識は非常に厳密であるのにタミン側鎖とタンパク質のリシン側鎖との反応を対し，アシル受容体に対してはそうではないこと

触媒し，ε-リシン共有結合を形成する。本反応が報告されている。例えば，ある化合物がアシル

によるタンパク質の架橋は，食肉の弾力性や食感受容体として効果的に利用されるには，一級アミの改善に大きな効果をもたらすため，食品産業にンが存在すればよくその周辺のアミノ酸配列に大広く用いられている。現在，放線菌，Streptomyces

きくは依存しない。一方，グルタミン残基の側鎖

mobaraensis由来のトランスグルタミナーゼが，から１つのメチレン基が失われたアスパラギン残

味の素（株）からアクティバとして商品化されて基は，複数のトランスグルタミナーゼにおいてアいる。上記反応においては，グルタミン残基のシル供与体として利用されない。この理由とし

γ-カルボキシアミド基がアシル供与体，リシンて，グルタミン残基の側鎖メチレン基と疎水性残© The Ito Foundation

68

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

基の相互作用が重要であることが結晶構造をもと2.2にした分子モデリングにより示唆されている 。

G.stearothermophilus由来リシル-tRNA合成酵

トランスグルタミナーゼによるタンパク質架橋反素のＮドメインは，145アミノ酸残基からなり分

応により，さらに大きく食肉の弾力性や食感の改

子量16,641で，グルタミン（９残基）とリシン

善をもたらすためには，その加工において未活用（13残基）が多く，溶解度も非常に高い。そこで，のアスパラギン残基をアシル供与体として効率的

このＮドメイン（ANT）を基質としてタンパクに利用できる新規なトランスグルタミナーゼの取質架橋反応を検出することにした。申請者は，得が望まれる。最近，Bacillus subtilis由来トラ

ANT遺伝子もつpET11aを有していた。本プラス

ンスグルタミナーゼ（Tgl）の結晶構造と特性がミ ド を 鋳 型 に ，以 下 の プ ラ イ マ ー と Pyrobest

報告された 。Tglは，最も小さなトランスグル

DNA Polymerase（Takara）を 用 い ，ANT 遺 伝

タミナーゼで，S.mobaraensis由来のトランスグ子を増幅し，SnaBIとBamHIで切断した。この断ルタミナーゼに対し類似性を示さない。本研究で片を，PshAIとBamHIで切断したpET42a（-GST）

は，酵素の安定性が高いと予想されるBacillusに導入した（pET42a（-GST）-ANT）。

（Geobacillus）stearothermophilus由来のTglをク

３：GATATATCTAGATACGTAAGCCATGA

１）

２）タンパク質基質の発現系の構築

ローニングおよび発現し，その基質特異性を調AGAATTGAACGACCAATTG

べ，部位特異的変異導入によりアスパラギン残基

４：CGTGGGATCCTTACGGCAGCGGAをアシル供与体として効率的に利用する変異酵素を取得することを目的とする。
２．方
2.1

Factor Xaによる切断後得られるANTは，145アミノ酸残基からなり分子量16,609である。このプ ラ ス ミ ド を 大 腸 菌 BL21（DE3）に 導 入 し ，法

30℃で培養し，IPTGを添加し，目的タンパク質

発現ベクターの構築の発現を誘導した。

本研究では，GST-tagを除いたpET-42aを用い，

2.3

タンパク質基質変異体の作製

Tglホモログ酵素とタンパク質基質をＮ末端に本研究の目的は，Tglのアシル供与体の基質認

His-Tag を 付 加 し た 形 で 発 現 さ せ （PshAI と識を，Gln残基からAsn残基に変換することであBamHI部位），Niアフィニティカラムで精製後，る。ANTには，９個のGln残基がある。

Factor Xaを用い余分な配列を除く戦略をとっ

VSHEELNDQLRVRREKLKKIEELGVDPFGKR

た。以下の２種のプライマーをアニールさせ，

FERTHKAEELFELYGDLSKEELEEQQIEVAVNdeIとSpeI切断サイトを有するリンカーを作成

AGRIMTKRGMGKAGFAHIQDVTGQIQIYVRQ

し，T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いリン酸

DDVGEQQYELFKISDLGDIVGVRGTMFKTKV化した。このリンカーを，NdeIとSpeIで切断し

GELSIKVSSYEFLTKALRPLP

GST-tagを除去したpET42aに導入した（pET42a

そこで，ANTのすべてのGln残基をAsn残基に（-GST））。以下の実験では，目的タンパク質発現置換した変異体を作成することにした（Q9N/を除くすべての遺伝子実験は，大腸菌DH５αを

Q56N/Q57N/Q81N/Q86N/Q88N/Q93N/Q99N/

用いた。

Q100N）。pET42a（-GST）-ANTを鋳型に，以下

１：TATGGGTTCAGGTTCAGGTTCAAの プ ラ イ マ ー（相 補 鎖 の み 掲 載）と Pyrobest

２：CTAGTTGAACCTGAACCTGAACCCA

DNA Polymeraseを用いQC法により，変異体を© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変

69

作成した。

T）AGC（G/T）G

Q9N（＋）：CATGAAGAATTGAACGAAACAT

2.5

TGCGCGTCCGCAG

増幅したTgl遺伝子の配列はSnaBIサイトを含

Tgl遺伝子からのSnaBIサイトの消去

Q81N（＋）： GGGCTTTGCTCACATCAACGAC

んでいた。そこで，TA-Tglを鋳型に，以下のプ

GTGACGGGACAAA

ライマーとPyrobest DNA Polymeraseを用い，

Q99NQ100（＋）： ACGATGTTGGCGAAAACA

QC法により，上記サイトを消去した（TA-Tgl

ACTACGAGCTGTTTAAA（SnaBIx））。

Q56NQ57N（＋）： GAGGAACTCGAAGAGAAC

7：CCTGAACTATATACCTATCCGAACGAACAAACATCGAAGTCGCCGT

8：TGTTCGTTCGGATAGGTATATAGTTCAGG

Q86NQ88N（＋）： GACGTGACGGGAAACATT

2.6

pET42a（-GST）へのTgl遺伝子の導入。

AACATTTACGTCCGC

TA-Tgl（SnaBIx）を 鋳 型 に ，以 下 の プ ラ イ

Q93N（＋）：TAACATTTACGTCCGCAACGAC

マーとPyrobest DNA Polymeraseを用い，PCRGATGTTGGCGAAAを行った。その際，終止コドンをTAGからTAA

2.4に変更した。

Tgl遺伝子のクローニング

G.stearothermophilus NCA1503 の ゲ ノ ム を 調製した。ゲノム配列が明らかにされている，２種のG.stearothermophilusのTglのアミノ酸配列を比較した。ATCC12980とNUB3621のTglは，それぞれ，273と272アミノ酸残基から構成され，そ

9：TGCAGACTGCAGTACGTAATTCGCATCTTGTCATCTCCGTCCGGT
10：GGAATTGGATCCTTAACGATACAAGAAAGCAGCGGACCCTAACGT
増幅断片をSnaBIとBamHIで切断後，pET42aのＮ末端およびＣ末端の配列は以下であった。

（-GST） に 導 入 し た （pET42a（-GST）-Tgl

ATCC12980：MIRILSSPSGFHVSGSSSLPP ……

（SnaBIx））。 こ の プ ラ ス ミ ド を 大 腸 菌 BL21

PLGRLPWIAGTLGSAAFLYR（DE3）に導入し，30℃で培養し，IPTGを添加し，NUB3621：MIRIQQSAVDSNLFGPSSLSK……

PMN-NKLITGTMGSATFLYW

目的タンパク質の発現を誘導した。本発現系では，TglはＮ末端にHis-tag配列を含む334アミノ

その塩基配列のＮ末端およびＣ末端の配列は，以下であった。

酸残基からなるタンパク質（His6-Tgl：分子量37,079）として発現する。

ATCC12980：TTGATTCGCATCTTGTCATC……TTTCTTGTATCGTTAG

2 . 7 Ｃ末端にHis-tagをもつTglの発現系の構築。

NUB3621：ATGATTCGAATTCAGCAATC……TTTCTTGTATTGGTAG

過去の論文では，B. subtilisのTglのＣ末端にHis-tagを付加していた ３）。pET42a（-GST）-Tgl

以 下 の 混 合 プ ラ イ マ ー と LA Taq DNA（SnaBIx） を 鋳 型 に ， 以 下 の プ ラ イ マ ー とpolymerase（Takara）を用い，上記ゲノムから，

Pyrobest DNA Polymeraseを用い，PCRを行った。

Tgl遺伝子を増幅した。

11：TCCGGTCTGCAGCATATGGTAATTCGC

5：
（A/T）TGATTCG（C/A）AT（C/T）（C/T）（A/T）G（C/T）（C/A）ATC

ATCTTGTCATCTCCGTC
12：TTCGGACTCGAGACGATACAAGAAAG

6：CTA（A/C）C（G/A）ATACAAGAAAG（C/CAGCGGACCCTAACGT© The Ito Foundation

70

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

こ の PCR 断 片 を ，NdeI と XhoI で 切 断 し ，（Boc-EKK-MCA）はペプチド研究所から購入し

pET22b に 導 入 し た （pET22b-Tgl （SnaBIx）

た 。ア シ ル 供 与 体 蛍 光 ペ プ チ ド ，Z-Asp-Gln-

CHis）
。

Met-Asp-AFC （Z-DQMD-AFC） は ， Bachem

このプラスミドを大腸菌BL21（DE3）に形質か ら 購 入 し た 。こ れ ら す べ て の ペ プ チ ド は ，導入した。本発現系では，TglはＣ末端にHis-tag

DMSOに溶解した。上記受容体ペプチドと供与体

配列を含む282アミノ酸残基からなるタンパク質ペプチド（各10μＭ）を，TG（3.9μＭ）存在下に，（Tgl-His6：分子量32,215）として発現する。

37℃で反応させた（100μl）。反応後，900μlの水

2.8tagをもたないTglの発現系の構築。

pET42a（-GST）-Tgl（SnaBIx）を 鋳 型 に ，プを加え，蛍光を測定した。
2 . 11

Tgl変異体の作製

ライマー11と10，とPyrobest DNA Polymerase

pET11a-Tgl（SnaBIx）を鋳型に，以下のプラを 用 い ，PCR を 行 っ た 。増 幅 断 片 を NdeI と

イ マ ー （相 補 鎖 の み 掲 載） と Pyrobest DNA

BamHI切断後，pET11aに導入した（pET11a-Tgl

Polymeraseを用い，QC法により，14種の変異体（SnaBIx））。

を作成した。

2.9

F68A（＋）： GAAAAGCCGGGCGCAGGCGGCC

Tglの精製

pET11a-Tgl（SnaBIx）をもつ大腸菌BL21（DE3）ATTTTCCGTTTTT

を，100μＭアンピシリンと１mM IPTG存在下，F68Y（＋）： GAAAAGCCGGGCGCAGTATGCC

30℃で培養し菌体を得た。菌体を20 mM Tris-HCl

ATTTTCCGTTTTT（pH8.0）に 懸 濁 し 超 音 波 破 砕 し た 。遠 心 上 清F68W（＋）： GAAAAGCCGGGCGCAGTGGGCC（20,000 ｇ × 10 分）を ，MonoQ 5/50 GL カ ラ ム

ATTTTCCGTTTTT（GE Healthcare Life Sciences）に 供 し た 。緩 衝

E114A（＋）：CGAACTGTACGCCTTTGCGTGC

液 は 20 mM Tris-HCl（pH 8.0）を 用 い た 。0.5

GCGACGGCGATCG

ml/minの流速で，以下のプログラムで運転した：

E114D（＋）： CGAACTGTACGCCTTTGATTG

０-60分，０-１M NaCl；60-90 min，1 M NaCl。

CGCGACGGCGATCG

Tgl画分を脱塩濃縮後，再度，MonoQカラムに供W148A（＋）： TTTGCTGCTGTATGACGCGCAした。0.5 ml/minの流速で，以下のプログラムで

TACGGACAAAGACC

運転した：０-20分，０M NaCl；20-80分，0.5 M

W148F（＋）： TTTGCTGCTGTATGACTTTCA

NaCl；80-81分，0.5-1.0 M NaCl；81-121分，1.0

TACGGACAAAGACC

M NaCl。

Y171A（＋）： CCCCGGGGACTGCCTTGCGTTT

2 . 10 蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によAAAAACCCGGACGるトランスグルタミナーゼ活性検出の検Y171F（＋）：CCCCGGGGACTGCCTTTTTTTT討

AAAAACCCGGACG

モルモット肝臓トランスグルタミナーゼ（TG）

E187A（＋）：GCCGCAATGGCAAGGGGCGAAC

はSigma-Aldrichから購入した。アシル受容体蛍

ACGATCTATTTGG

光 ペ プ チ ド ， Lys-MCA （K-MCA）, Lys-Ala-

E187D（＋）： GCCGCAATGGCAAGGGGATAAMCA （KA-MCA）, Boc-Val-Leu-Lys-MCA

CACGATCTATTTGG（Boc-VLK-MCA）, Boc-Glu-Lys-Lys-MCA

N188A（＋）：GCAATGGCAAGGGGAGGCGACG© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変

71

ATCTATTTGGGCG

Q100N ， Q9N/Q56N/Q57N/Q81N/Q86N/Q88N/

N188Q（＋）： GCAATGGCAAGGGGAGCAGAC

Q99N/Q100N ， Q9N/Q56N/Q57N/Q81N/Q86N/GATCTATTTGGGCG

Q88N/Q93N/Q99N/Q100N を 作 成 し ，発 現 を 確

H200A（＋）：TGGCTTGTTTTACGGAGCGGGC

認した（未掲載）。
3.3

ATCGGCATCGAGA

G. stearothermophilus NCA1503 の ゲ ノ ム か

３．結果と考察
3.1

Tgl遺伝子のクローニング

ら，0.8 kbpのDNA断片が増幅された。得られた
Tglのアミノ酸配列は以下のようになった。そのANTの発現と精製

ANT 融 合 タ ン パ ク 質 は ，30 ℃ で 大 量 発 現 し

ORFは273アミノ酸からなり，分子量は31,051で（Fig. 1A），その大部分が可溶性であった（Fig.

あった。

1B）。可溶性画分を，Profinity IMAC Ni-charged

MIRILSSPSGFHVSGSSSLPPNEQRILHALVSSP

resin（Bio-rad）に供した。ANT融合タンパク質

ELYTYPNEQQLLFEIKLRSQIVQASVDLAKSR

は，この担体に結合し，20-50 mMイミダゾール

AQFAIFRFSRCNSQFWLRDERGGFQLRPDVL

で溶出され，高度に精製された（Fig. 1B）。ANT

PSDAINDIFVNSELYAFECATAIVIVFYKAVL

融合タンパク質を，FactorXaで処理すると，目EGIDVSAFNRLFAHLLLYDWHTDKDLGIETK

的の大きさのバンド（分子量17,000）が確認でき

KGEHFLPGDCLYFKNPDVDPLTPQWQGENTIた。

YLGDGLFYGHGIGIETADSIIAALNRRRKQWA

3.2

TKSAYLLPHITQMNFAYLSQFARRFDELRLP

ANT変異体の作製

５ 種 の 変 異 体 ， Q9N/Q81N ， Q9N/Q81N/LGRLPWIAGTLGSAAFLYR

Q99N/Q100N ， Q9N/Q56N/Q57N/Q81N/Q99N/（A）
Mw x 10‒3
200.0
116.3

（B）
Mw x 10‒3
200.0
116.3
66.2

（C）
Mw x 10‒3
200.0
116.3
66.2
45.0

45.0

66.2
45.0

31.0

31.0

21.5

21.5

14.4

14.4
6.5

6.5

31.0
21.5
14.4
6.5

Fig. 1 Expression and purification of ANT.
（A）
Expression of ANT fusion protein ANT at 30℃. Lane 1, marker ; 2, total fraction（E. colipellet）obtained in the presence of 1 mM IPTG.（B）Purification of ANT fusion protein by Niaffinity chromatography. Lane 1, marker; 2, soluble fraction; 3, 4, 5, and 6, eluent at 20, 30, 40,
and 50 mM imidazole, respectively.（C）Digestion of ANT fusion protein at 4℃ by Factor Xa. Lane
1, marker; 2, 0 hr; 3, 12 hr; 4, 24 hr; and 5, 48 hr.

© The Ito Foundation

72

平成28年度（A）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
1

2

3

4

5

（B）

Mw x 10‒3

200.0
116.3

Mw x 10
200.0
116.3

66.2

66.2

1

2

3

4

5

‒3

45.0

45.0

31.0

31.0

21.5

21.5
14.4

14.4

Fig. 2 Expression of His6-Tgl and Tgl-His6．
（A）
Expression of His6-Tgl at 30℃. Lane 1, marker; 2 and 3, total and soluble（the centrifugal
supernatant）fractions obtained in the absence of IPTG, respectively ; 4 and 5, total and soluble
fractions obtained in the presence of 1 mM IPTG.（B）Expression of Tgl-His6 at 17℃. Lane 1,
marker ; 2 and 3, total and soluble fractions obtained in the absence of IPTG, respectively ; 4
and 5, total and soluble fractions obtained in the presence of 1 mM IPTG.

3.4

性であった（Fig. 3A）。可溶性画分をBSAと37℃

His6-Tglの発現

His6-Tglは，30℃で大量発現し，その大部分がでインキュベーションすると，分子量が増加し

可 溶 性 で あ っ た（Fig. 2A）。可 溶 性 画 分 を ，（Fig. 3B）
，活性を有していることが強く示唆さ

Profinity IMAC Ni-charged resin （Bio-rad） にれた。MonoQカラムによる精製では，１回目では，供したが，結合しなかった。変性状態（６Ｍ塩酸

Tglは，35分（0.6 M NaCl）で溶出した。２回目

グアニジン存在下）では，結合した。Tgl-His6は，では，Tglの大部分は44分（0.2 M NaCl）で，一30℃で発現したが不溶性であった（Fig. 2B）。培

部は86分（1.0 M NaCl）で溶出した。それぞれの養温度を，17℃にしても改善されなかった。変性

画分を濃縮すると，ほぼ均一に精製されていた。

状態では，上記担体に結合した。これらの結果は，前者に比べ（Fig. 3C），後者の純度が高かった

Ｃ末端に付加したHis-tagが，タンパク質内部に（Fig. 3D）。

埋もれ，Tglのフォールディングに影響している

3.6

可能性を示唆した。Ｃ末端にHis-tagを付加した

Fig. 4Aは，K-MCA単独，Z-DQMD-AFC単独，

Tglが精製されているB. subtilisのTglと比較する

K-MCAとZ-DQMD-AFCが共存するときの，励と ，G. stearothermophilusのTglのＣ末端には，起波長325 nmでの発光スペクトルを示している。

27 ア ミ ノ 酸 残 基 の 余 分 な 配 列

混合液の結果は，用いた条件下では，上記２種の（RFDELRLPLGRLPWIAGTLGSAAFLYR）が あ

ペプチドが架橋されていないとき，FRETは効果る 。今後は，この領域とHis-tagの間にリンカー的に起きていないことを示している。Fig. 4Bは，を導入する必要が考えられた。

K-MCA, KA-MCA, Boc-VLK-MCA, Boc-Glu-

３）

４）

3.5

FRETによるTG活性検出の検討

Lys-Lys-MCAをアシル受容体として，Z-DQMD-

tagをもたないTglの発現

Tglは，30℃で大量発現し，その大部分が可溶

AFCをアシル供与体として，TG非存在下と存在© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変
（A）

（B）

Mw x 10‒3
200.0
116.3
66.2

Mw x 10‒3
200.0
116.3

73

66.2

45.0

45.0
31.0

31.0

21.5

21.5

14.4
6.5

14.4
6.5
（C）

（D）

Mw x 10‒3
200.0
116.3

Mw x 10‒3
200.0
116.3

66.2

66.2

45.0

45.0

31.0

31.0

21.5

21.5

14.4

14.4

6.5

6.5

Fig. 3 Expression and purification of Tgl.

（A）
Expression of Tgl at 30℃. Lane 1, marker ; 2 and 3, total and soluble fractions obtained in
the presence of 1 mM IPTG, respectively.（B）Incubation of soluble fraction with BSA at 50℃.
Lane 1, marker ; 2 and 5, BSA, 12 hr ; 3 and 5, soluble fraction and BSA, 0 hr; 4 and 6, soluble
fraction and BSA, 12 hr. The buffers used in lanes 2-3 and 4-6 were 20 mM KH2PO4/K2HPO4
0=0.1 mg/ml.（C）and（D）（pH 8.0）and 100 mM Tris-HCl（pH 8.0）
, respectively.［BSA］
Purified Tgl eluted from a Mono Q column at 0.2 and 1.0 M NaCl, respectively.

下に，反応させた溶液の励起波長325 nmでの495

今後Tglの基質特異性の改変において，本測定がnmでの発光スペクトルの強度を示している。

有効な手段となることを示している。

K-MCAとKA-MCAを用いた場合，TG存在下に，3.7

蛍光強度が増加した。Fig. 4Cは，増加の著しい

14種の変異体を作成した。すべて30℃で大量発

前者の反応液の励起波長325 nmでの発光スペク

現し，その大部分が可溶性であることを確認した

トルを示している。TG存在下では，ピーク波長が，（Fig.５）。

450 nm付近に移動し，これは，TGがK-MCAのLys残基とZ-DQMD-AFCのGln残基間で架橋反応を触媒したことを強く示唆した。この結果は，© The Ito Foundation

Tgl変異体の作製

74

平成28年度

10000

5000

（A）

Fluorescence intensity

Fluorescence intensity

12000

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

8000
6000
4000
2000
0
300

400

500
600
Wavelength（nm）

Fluorescence intensity

12000
10000

Acyl donor
Z-DQMD-AFC

（B）

4000
3000
2000
1000
0

700

-TG +TG -TG +TG -TG +TG -TG +TG
K-MCA

250
200
150
100
50
0
300

（C）

8000
6000

KA-MCA

Boc-VLK-MCA Boc-EKK-MCA

Acyl acceptor

400 500 600 700

4000
2000
0
300

400

500
600
Wavelength
（nm）

700

Fig. 4 Measurement of TG activity by FRET.
（A）
Fluorescence emission spectra of K-MCA and Z-DQMD-AFC at λex＝325nm. Dashed line, K-MCA ; dotted

line, Z-DQMD-AFC ; and solid line, K-MCA and Z-DQMD-AFC. The concentration of each fluorescent peptide
was 1.0μM.（B）Fluorescence intensity after reaction by TG. The acyl donor（Z-DQMD-AFC）and an acyl
0＝3.9μM.［acyl acceptor］
0＝10μM.
acceptor were incubated in the presence of TG at 37℃ for 16 hr.［TG］
0＝10μM. The reaction mixture （100μl）was mixed with water（900μl）and, the fluorescence［Z-DQMD-AFC］
intensity at 495 nm was measured. λex＝325 nm.（C）Fluorescence emission spectra of the mixture containing Z-DQMDAFC and K-MCA. Solid line, Tgl-catalyzed mixture; dotted line, the non-catalyzed mixture. Inset shows theemission spectra of the Tgl-catalyzed mixture mixed with 10 times as much water.
（A）

1

2

3

4

5 6

7

（B）

1

2

3

4

5 6

7

8

Mw x 10‒3
200.0
116.3
66.2
45.0

Mw x 10‒3
200.0
116.3
66.2
45.0

31.0

31.0

21.5

21.5

14.4
6.5

14.4
6.5

Fig. 5 Expression of Tgl mutansat 30℃.
（A）
Ala mutants.（B）The other mutants. Total fraction obtained in the presenceof 1 mM IPTG. Lane 1, marker in both（A）and（B）．

© The Ito Foundation

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変

約

４．要

G. stearothermophilus NCA1503のゲノムからTgl遺伝子をクローニングし，３種の発現系を構築した。Ｎ末端にHis-tagを付加したTgl融合タン
パク質は可溶性であったが，Niカラムに結合しなかった。Ｃ末端にHis-tagを付加したTglは不溶性であった。tagをもたないTglは可溶性であり，活性を有していると考えられ，精製に成功した。
ANT融合タンパク質の発現系を構築し，可溶性であり，Niカラムに結合し，Factor Xaで不要な部分を除去できることを確認した。TGを用い，FRETによるトランスグルタミナーゼ活性の検出に成功した。

75文献１） Chica, R. A., Gagnon, P., Keillor, J. W., Pelletier, J.
N. : Tissue transglutaminase acylation : proposedrole of conserved active site Tyr and Trp residues
revealed by molecular modeling of peptide substratebinding, Protein Sci., 13, 979～991, 2004.
２） Fernandes, C. G., Placido, D., Lousa, D., Brito, J. A.,
Isidro, A., Soares, C. M., Pohl, J., Carrondo, M. A.,
Archer, M., Henriques, A. O. : Structural andfunctional characterization of an ancient bacterialtransglutaminase sheds light on the minimal
requirements for protein cross-linking, Biochemistry,
54, 5723～5734, 2015.
３） Plácido, D., Fernandes, C. G., Isidro, A., Carrondo,
M. A., Henriques, A. O., Archer, M. : Auto-induction
and purification of a Bacillus subtilis transglutaminase（Tgl） and its preliminary crystallographic
characterization, Protein Expr. Purif., 59, 1～８, 2008.
４） Zilhão, R., Isticato, R., Martins, L. O., Steil, L.,
Völker, U., Ricca, E., Moran, C. P. Jr., Henriques, A.
O. : Assembly and function of a spore coatassociated transglutaminase of Bacillus subtilis, J
Bacteriol, 187, 7753～7764, 2005.

© The Ito Foundation

76

大規模ゲノム解析による腸管出血性大腸菌の国際的伝播経路の解明
Large scale genome analyses of enterohemorrhagic Escherichia coli for
exploring international transmission routes

李

謙

一

（国立感染症研究所細菌第一部）

Ken-ichi Lee（Department of Bacteriology I, National Institute of Infectious Diseases）

To elucidate the international transmission routes of enterohemorrhagic Escherichia coli
（EHEC）O111, genome analyses on 190 isolates from five countries were performed. In single
nucleotide polymorphism（SNP）analysis, although several domestic cattle isolates showed lessthan 30 SNPs to foreign isolates, there was no isolates that showed close genetic relationship（SNP ≤ 10）. Variation in virulence gene profiles and length of espF suggested that biased
distribution of virulence factors among countries. In conclusion, further investigation using the
EHEC O111 genomes from various countries could reveal more clear international transmission
routes and country specific virulence lineage.

１．目

る。このようにＯ111は広域な集団感染の原因と的なり，また，EHEC感染症の重症化因子である志腸 管 出 血 性 大 腸 菌 （Enterohemorrhagic

賀毒素２型（Shiga toxin 2：Stx2）を保有するこEscherichia coli：EHEC）による感染症は腹痛，とから，全国レベルでの継続的な疫学調査が感染

下痢，血便などを主徴とし，ときに溶血性尿毒症の拡大や防止のために必要とされている。

症候群などの重篤な合併症を認める。日本国内で現在EHECにおいては，パルスフィールドゲル

は，年間2,000名以上の患者が報告されることか

電 気 泳 動 （PFGE） 法 や 反 復 配 列 多 型 解 析ら公衆衛生上の脅威となっている。EHECの主な（MLVA）法が疫学調査に用いられているが，解保菌宿主は牛とされ，牛肉や牛糞に汚染された青析結果は系統を反映しないため，伝播経路の推定

果や水などから人へ伝播する。このうち，血清群には限界がある。近年，全ゲノム配列（whole

Ｏ111は，国内においてＯ157，Ｏ26に次ぐ発生数

genome sequence：WGS）を用いた解析がよりであり，年間50～100例の感染者が報告されてい簡便・安価に行えるようになり，多数の株の関連る。2011年には北陸および関東の焼肉店において性をWGSから明らかにする研究が盛んに行われ同菌を原因とした，大規模な集団感染事例（死者ている。WGSを用いた解析では，従来法よりも５名を含む181名の患者が報告）も報告されてい高い精度で系統を反映した型別が可能となり，病© The Ito Foundation

大規模ゲノム解析による腸管出血性大腸菌の国際的伝播経路の解明

77

原菌の院内感染の経路解明などに利用されていた。抽出したDNAからNextera XT DNA sample

る。EHECにおいても，WGSを用いたより精度

prep kit（Illumina，カリフォルニア，USA）をを高い型別法の開発が進められている。一方，日用いてDNAライブラリーを調整し，プール化し本では大量の輸入牛肉が消費されており，同菌のたサンプルでMiSeq（Illumina）によるペアエン

伝播には輸入食品も大きな役割を果たしていると

ド（300bp×２）のゲノム配列解読を行った。

考えられるが，輸入牛肉や海外の牛由来株との比較はほとんど行われていない。

2 . 3 SNP抽出，系統解析および病原性因子の検索

そこで本研究では，過去数年間に全国でヒトか

MiSeqによって得られたショートリードをA5-

ら分離されたＯ111のWGSデータに，国内外の牛

miseq pipeline １）によってde novo assemblyを行

および食品由来株の情報を加えたWGS解析を行

い ，ド ラ フ ト ゲ ノ ム 配 列 を 作 製 し た 。EHEC

い，国際的な牛および食品の流通と同菌の人への

O111・11128株の完全長配列を参照配列にし，伝播過程との関係を明らかにし，食の安全に寄与

MUMmer version3.2259２）およびPerlスクリプトする知見を得ることを目的とした。さらに，病原に よ っ て 単 一 塩 基 置 換 （single nucleotide

性に関わる遺伝型および表現型を解析すること

polymorphism ： SNP）を 抽 出 し た 。さ ら に ，で，高病原性の株の国際的な伝播過程・経路に関MUMmerによって参照配列中の50bp以上のリわる知見を得ることを目的に研究を行った。

ピート配列を検出し，解析から除いた。系統解析

２．方
2.1

は，MEGA７３）を用いた最尤法によって行った法（ブートストラップ：1,000回）。病原性因子等の供試菌株

保有状況は，BLAST＋を用いた解析によって調国内ヒト由来株としては，2005年から2014年に分離された135株を用いた。国内牛由来株としては，中国地方で分離された１株（LEC001）およべた。
３．結果と考察び九州地方で分離された３株（LEC002-004）を3.1用いた。国外由来の株については，４か国からそ

全株に共通する領域（コアゲノム領域）から，

れぞれ次の株数を供試した（アメリカ合衆国，40

8,138か所のSNPが抽出された。これらのSNPを

株；イギリス，９株；オーストラリア，１株；ポもとに系統解析を行ったところ，分離国ごとに特ルトガル，１株）。これらの国外由来株について

定のクラスターは認められなかった（Fig.１）。

は ， GenBank （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

国内の牛由来株と最も近縁な株はECJ114（中国genbank/）またはEnteroBase（https://enterobase.

地方，ヒト由来）であり，LEC001（中国地方，牛warwick.ac.uk/）からドラフトゲノム配列をダウ由来）間に16か所のSNPが認められた。同株は，ンロードして用いた。

アメリカの飼料由来CDPHFDLB-F15M03602-A4

2.2

SNP解析

DNA抽出および全ゲノム配列の取得

およびCDPHFDLB-F15M03602-A2との間のSNP

供試菌株を，緩衝ペプトン水（日水製薬株式会

もそれぞれ29および30であり比較的近縁であっ社，東京）で一晩37℃で静置培養した培養液かた。この他に，国内由来ECJ023，ECJ0684およら，DNeasy Blood and Tissueキット（QIAGEN，

び ECJ070 と ア メ リ カ の 飼 料 由 来 CDPHFDLB-

カリフォルニア，USA）を用いてDNAを抽出しF15M03602-A2，CDPHFDLB-F15M03602-A4 お© The Ito Foundation

78

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

SourceBovine

Feed

Food

Human

Unknown
Location
Australia

Japan

Portugal

UK

USA

Fig. 1 Maximum likelihood tree of EHEC O111 from Japan and other four countries.
Information of the isolates is shown in the outer column. Black column represents the presence of stx1 or

stx2. The source and isolated location of the isolates were shown in colors as indicated in the legend.

よびCDPHFDLB-F15M03602-A6との間に25～30

3.2

か所のSNPが認められた。EHEC O157の過去の

stx，インチミン遺伝子（eae），エンテロへモ

研究では，同一集団感染内の株間ではSNPは７以

リシン遺伝子（ehxA）などの主要な病原性因子内に収まるとされている４，５）。本研究ではそのよ

および分離地によって保有率が異なっていた病原うなごく近縁な株は検出されなかったが，SNPが性因子について，Table１に示す。ほぼすべての30か所以内の関連性が示唆される株は多数検出さ株がstx1を保有していたのに対して，stx2は一部れた。このことから，国内外のヒト・牛・食品間の株のみが保有していた。stx2の保有率は，国内の伝播経路を明らかにするためには，より多数の由来株で比較的高かった。ehxA，espP，espI，株を解析する必要があると考えられた。

iroN，issおよびkatPについても，分離地別に保© The Ito Foundation

病原性因子の保有状況

79

大規模ゲノム解析による腸管出血性大腸菌の国際的伝播経路の解明
Table 1 Prevalence of virulence factors in EHEC O111 from each country
Virulence factors

Prevalence（％）

Function

Japan

UK

USA

stx1

Shiga toxin 1

98.6

100

97.5

stx2
eae

Shiga toxin 2
Intimin

37.7
100

11.1
100

10.0
100

ehxA

Enterohemolysin

84.1

88.9

62.5

espP

Serine protease

2.2

22.2

0

espI

Non-LEE effector protein

13.0

22.2

32.5

iroN
iss

Siderophore receptor
Increased serum survival

3.6
52.2

11.1
55.6

0
25.0

katP

Catalase-peroxidase

8.0

22.2

0

有率の差が認められた。これら遺伝子は，espIをことが知られている７）。アリール型は病原性に関除き，すべてプラスミド上に存在するとされる。

与するとの示唆もあり８），Ｏ111においても臨床

EHECは，病原性因子を多数有する巨大プラスミ症状との関連性について検討する必要がある。

ドを保有することが知られている６）。ドラフトゲ
ノム配列からは，上記の病原性因子が同一のプラ

４．要

約

スミド上に存在するかを明らかにすることはでき

国内外由来のEHEC O111計190株のドラフトゲ

ないため，抽出プラスミドの配列解析やロング

ノム配列を用いた各種解析を行った。SNP解析でリードシークエンサーの利用によって，プラスミ

は，国内ヒト由来株と関連性の示唆される（SNP

ドの構造や病原性との関わりを明らかにする必要≤ 30）株は複数存在したが，ごく近縁（SNP ≤性があると考えられた。

10）な海外由来株または国内牛由来株は認められ

3 . 3 locus of enterocyte effacement（LEE）

なかった。同菌の国際的な伝播経路を明らかにするためには，より広範囲に輸入食品等から海外由領域の解析
参照株として用いたEHEC O111・11128株が来株を積極的に分離・解析する必要がある。ま

LEE領域に保有する63のタンパク質コード領域

た，プラスミド性病原性因子の分布やespFの多型（CDS）の配列をクエリとして，供試菌株のドラは分離地によって異なっており，ヒトでの臨床症

フトゲノム配列を調べたところ，供試菌株では状との関連性など検討する必要性があると考えら

LEE領域に大きな挿入および欠失は認められなれた。

かった。一方，espFは株間で配列長の多型が認められ，437-945bpの26種のアリールが認められた。
同遺伝子の配列長は，アメリカ合衆国由来株においてより長い傾向が認められた［平均長±標準偏差（bp）： 日 本 ，572 ± 102 ； イ ギ リ ス ，543 ±
54；アメリカ，734±99］。EspFは，宿主細胞へ
エフェクターとして働くタンパク質であり，プロリンリッチなリピート領域の長さが多型性を示す

文献１） Coil, D., Jospin, G., Darling, A. E. : A5-miseq: an
updated pipeline to assemble microbial genomes
from Illumina MiSeq data, Bioinformatics, 31（4）, 587～589, 2015.
２） Kurtz, S., Phillippy, A., Delcher, A. L., Smoot, M.,
Shumway, M., Antonescu, C., Salzberg, S. L. :Versatile and open software for comparing large
genomes, Genome Biol, 5（2）:R12, 2004.
３） Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. : MEGA7 :© The Ito Foundation

80

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

molecular evolutionary genetics analysis version 7.0
for bigger datasets, Mol Biol Evol, 2016.
４） Holmes, A., Allison, L., Ward, M., Dallman, T. J.,
Clark, R., Fawkes, A., Murphy, L., Hanson, M. :Utility of whole-genome sequencing of Escherichia
coli O157 for outbreak detection and epidemiologicalsurveillance, J Clin Microbiol, 53（11）, 3565～3573,
2015.
５） Joensen, K. G., Scheutz, F., Lund, O., Hasman, H.,
Kaas, R. S., Nielsen, E. M., Aarestrup, F. M. : Realtime whole-genome sequencing for routine typing,surveillance, and outbreak detection of
Verotoxigenic Escherichia coli, J Clin Microbiol, 52（5）,1501～1510, 2014.
６） Ogura, Y., Ooka, T., Iguchi, A., Toh, H.,
Asadulghani, M., Oshima, K., Kodama, T., Abe, H.,

Nakayama, K., Kurokawa, K., Tobe, T., Hattori, M.,
Hayashi, T. : Comparative genomics reveal themechanism of the parallel evolution of O157 andnon-O157 enterohemorrhagic Escherichia coli, Proc
Natl Acad Sci USA, 106（42）,17939～17944, 2009.
７） Holmes, A., Muhlen, S., Roe, A. J., Dean, P. : The
EspF effector, a bacterial pathogenʼs Swiss army
knife, Infect Immun, 78（11）,4445～4453, 2010.
８） Tahoun, A., Siszler, G., Spears, K., McAteer, S.,
Tree, J., Paxton, E., Gillespie, T. L., Martinez-Argudo,I., Jepson, M. A., Shaw, D. J., Koegl, M., Haas, J., Gally,
D. L., Mahajan, A. : Comparative analysis of EspF
variants in inhibition of Escherichia coli phagocytosis
by macrophages and inhibition of E. coli translocation
through human-and bovine-derived M cells, InfectImmun, 79（11）,4716～4729, 2011.

© The Ito Foundation

81

新規な発酵食肉製品の機能性について（Ⅱ）
Functional properties of novel fermented meat products（Ⅱ）

六車

三治男・川越

聖人・木本

早紀・川北

久美子・竹之山愼一（南九州大学健康栄養学部）

Michio Muguruma, Masato Kawagoe, Saki Kimoto, Kumiko Kawakita and Shinichi Takenoyama（Faculty of Health and Nutrition, Minami Kyushu University）

This research aimed to study and search the biological and functional properties as well
as physiological effects of hydrolysates of fermented sausage splayed with dried bonito bacteria（Eurotium herbariorum）. The fermentation of sausage was carried out at 20℃ and withhumidity with 85％ for 3 days. After fermenting, the surface of samples was covered by whitemold. The drying and ripening of fermented sausage were carried out at 18℃ and withhumidity with 65％ until the yield of each samples reduced to 60％（8 days storage）and 50％（12 days storage）.The final pH of these fermented sausages were about 6. The water activities
in Experiment 1（60％ yield）and 2（50％ yield）were 0.91 and 0.86, respectively. All samples
separately hydrolyzed with pepsin and trypsin. Angiotensin I converting enzyme（ACE）
inhibitory activity of the hydrolysates was determined by rabbit lung enzyme. The antioxidant
activity of the hydrolysates was determined by the DPPH radical scavenging assay.
Hydrolysates of fermented sausages showed the high ACE inhibitory activity and high DPPH
inhibition activity. Free amino acids increased during ripening. Glutamic acid（Glu）, alanine（Ala）, valine（Val）, leucine（Leu）and isoleucine（Ile）increased especially. This high level ofGlu seemed to be related to Umami of fermented sausage. Val, Leu and Ile were related to asports nutrition.
Based on their remarkable ACE inhibitory activity and antioxidant activity, we suggestthat the hydrolysates from fermented sausage may have potential applications as functional
food. These fermented sausages inoculated with dried bonito bacteria showed the acceptablesensory quality characteristic.

１．目

ドにACE阻害活性があり，動物実験において血的圧降下作用，抗酸化作用やⅡ型糖尿病予防作用を食肉は良質なタンパク質を多く含み健康や長寿示す結果を得ている３～11）。さらに，欧州の発酵ソーには不可欠な食品であり，近年，食肉にも健康にセージ類から乳酸菌の選別を試み，食塩・亜硝酸

寄与する生体調節機能が存在することが明らかに耐性を有する菌株を見出し，それらの菌株を同定なってきた

し，高い食肉タンパク質分解能を持つ乳酸菌株を。我々も，食肉に含まれるペプチ

１，
２）© The Ito Foundation

82

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

用いて，発酵食肉製品の製造を試みた結果，血圧2.2

上昇抑制効果や抗酸化活性を持ち，嗜好性を高め

新鮮な豚肩ロース肉150ｇ，牛赤身肉15ｇおよた製品の開発が可能であることを明らかにしび豚脂35ｇを細切し，これに食塩5.6ｇ，グルコー

た。これからの高齢化社会に向けて，健康維

ス5.6ｇ，亜硝酸ナトリウム0.06ｇを添加してフー持に寄与する機能性を強化した高品質・高機能発

ド プ ロ セ ッ サ ー（Panasonic MK-K61）で ソ ー

酵食肉製品を開発することは重要である。また，セージエマルジョンを作製した。ソーセージエマ

高齢者のみならず健常者にとっても，健康維持にルジョンを天然豚腸（株式会社

寄与する高い機能性を有し，日本人の食味性にも充填し85℃，30分間蒸煮した。冷却後，日本独自

合う発酵食肉製品を開発することは極めて重要での有用菌株であり，日本鰹節協会の鰹節優良カビある。

菌 で あ る「ユ ー ロ テ ィ ウ ム

12，
13）

発酵ソーセージの製造

松永商会製）に

ハーバリオラム

生ハムにはヨーロッパで自然に着生した酵母や（Eurotium herbariorum）」（和名：カワキコウジ

カビで発酵し熟成するもの（発酵型）と燻煙するカビ）を利用して，この鰹節菌液をソーセージのもの（非発酵型）とがある。なお，日本産の生ハ全面に噴霧した。なお，原料の温度や衛生面には

ムは非発酵型である。日本の伝統的発酵食品は麹十分に注意を払い作業した。

や糠を利用したものが多い。鰹節菌を利用した鰹

次いで，カビ菌を噴霧した塩漬肉を温度20℃，

節もカビ菌による発酵食品である。周知のよう

湿度85％に調整した恒湿恒温乾燥機（カビ室）中に，鰹節菌による発酵により，鰹節の中に核酸系に吊り下げ，カビを発生させた。カビ室では，毎旨味成分（イノシン酸）が産生し，代表的な旨味

日１回の割合で，外気を取り入れて空気循環を良調味料としても利用されている。これを応用すれ

くし，酸素の供給を行ってカビの発育を促進させば，生ハム中にもうまみ成分が産生され，熟成由た。

来のアミノ酸やペプチドの呈味成分と相乗効果をカビがソーセージの全面に被覆後，温度18℃，

生じて濃厚な旨味を付与できることが予想される。

湿度65％に調整した恒湿恒温器中で歩留り60％

そこで，日本独自の有用菌株であり，日本鰹節

（試験区１）および50％（試験区２）になるまで

協会の鰹節優良カビ菌「ユーロティウム

ハーバ

熟成，乾燥させた。

リオラム（Eurotium herbariorum）」（和名：カ2.3

ワサキコウジカビ）を利用して塩漬した豚肉を発水分含量は，赤外線加熱乾燥法の原理に基づい酵させ，さらに乾燥・熟成させることで，凝縮さた加熱乾燥式水分計（ANDエー・アンド・ディ

れた濃厚な旨味が付与された生ハムを作製するこ（株），MF-50）により測定した。一方，水分活とを目的に検討を重ねてその成果を報告した 。

性 （Aw） は ポ ー タ ブ ル 水 分 活 性 測 定 装 置

今回はカビ発酵ソーセージの製造について検討し（AxAir 社 ，Novasina-ms1-aw, Switzerland）をた結果を報告する。

用いて測定した。

14）

２．方
2.1

2.4

法

水分含量および水分活性の測定

発酵ソーセージの消化酵素処理

発酵ソーセージに２倍量の蒸留水を添加してフードプロセッサー（Panasonic MK-K61）を用

実験材料

ソーセージの原材料として新鮮な国産豚肩ロー

いて30秒間，２回ホモジナイズした。その後，こス肉，牛赤身肉および豚脂を購入して使用した。

のホモジェネートをHClでpH1.8に調整し，胃粘© The Ito Foundation

新規な発酵食肉製品の機能性について（Ⅱ）

83

膜由来ペプシン（１：10000）（和光純薬工業株式

7.6mM HHL溶液50μlを添加し37℃で30分間反応会社製）をタンパク質量に対して1/1000倍量添加させた。反応は0.1N HCl（和光純薬工業）554μl

し，攪拌しながら37℃で１時間インキュベートしを加えて停止させた。反応後には酢酸エチル（ナた。NaOHを用いてpH6.8に調整し，10分間煮沸

カライテスク）1.5mlを加えてACEの作用によりした後，溶液温度を40℃まで低下させた。さらに遊離した馬尿酸を振とう抽出し，2,500rpm，15

トリプシン（和光純薬工業株式会社）およびパン分間遠心分離を行った。上清の酢酸エチル層を１

クレアチン（同会社）をそれぞれペプシンと同量ml分取し，100℃，10分間の加熱により蒸発乾固

添加し，再び攪拌しながら37℃で１時間インキュさせた。乾固した馬尿酸を回収するために１Ｍのベートした。最後に10分間煮沸した試料を発酵

NaCl溶液を１ml加えボルテックスを行った。溶ソーセージ由来ペプチドとした。

解した馬尿酸吸光度を228nmで測定した。

2.5

タンパク質の定量

タンパク質の定量はBiuret法

阻害率は肝臓水解物の吸光度をＳ，肝臓水解物により行った。

の代わりにMilliQ 水を加えた時の吸光度をＣ，

す な わ ち ，タ ン パ ク 質 溶 液 に 対 し ，４ 倍 量 のあらかじめACEを失活させてから反応させた時Biuret試薬を加えて常温で30分間反応させた。反の吸光度をＢとして次式より求めた。

15）

阻害率（％）＝｛（C-S/C-B）｝×100

応 液 を 島 津 製 作 所 ㈱ 製 UV-VIS
Spectrophotometer 1240型分光光度計（吸光度：2.7

DPPHラジカル消去活性の測定

540nm）にて測定した。また分解物であるペプチ

DPPHラジカル消去活性の測定は，DPPH分光を適用し，測定を行った。

測 定 法 に 準 じ て 行 っ た 18）。す な わ ち ，400 μM

すなわちタンパク質溶液の215nmの吸光度からDPPH，MES（2-morpholino-etanesulphonic acid）

225nmでの吸光度を差し引き，144倍した時の数

buffer，20％エタノールを同量ずつ加え，混液を値をタンパク質濃度とした。測定には上記と同じ作製した。混液を0.9ml分注し，80％エタノール

分光光度計を使用した。

を240μlとサンプルを60μl加え，20分間反応させドについてはUV法

16）

2 . 6 アンギオテンシンⅠ変換酵素（ACE）阻た。その後，サンプルを加えた順に前述の分光光度計にて吸光度520nmで測定した。また，サンプ

害活性の測定に準じて測定した。ACEはルの代わりに，0.2mM Trolox（Sigma社製）をウサギ肺由来アンギオテンシンⅠ変換酵素

使って標準として測定し，検量線からサンプルの（ACE, Peptidyl dipeptidase, EC3.4.15.1 ，シ グ マ

Trolox相当量を算出した。MES BufferはMESを社）を用い，0.25Ｍホウ酸緩衝液で１unit/mlに蒸留水に溶解し，NaOHでpH6に調整したものを調整し，測定時には0.25Ｍホウ酸緩衝液で60unit/

使用した。

Cushumanの方法

17）

mlに希釈し使用した。ACEとの反応基質として2.8は合成基質であるヒプリル-Ｌヒスチジル-Ｌロイ

発酵ソーセージの遊離アミノ酸の分析は，分析

シン（HHL，ナカライテスク社）を使用した。

試料の重量に対し３倍量のスルフォサリチル酸を

このHHLを塩化ナトリウム（和光純薬工業），0.25

加え，ホモジェネート後，冷蔵庫で１時間静置しＭホウ酸緩衝液をそれぞれ0.608Ｍ，0.1Ｍになるて タ ン パ ク 質 を 変 性・沈 殿 さ せ た 。そ の 後 ，ようにMilli Q水を用いて調整した溶液で溶解し3,500xgで15分間遠心分離を行った。上清を0.45た。試料６μlに60unit/mlのACE溶液20μlおよび

μmメンブレンフィルターでろ過し，分析試料と© The Ito Foundation

遊離アミノ酸含量の測定

84

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
100

本電子株式会社，東京）にて測定した。

80

３．結果と考察3 . 1 発酵ソーセージの発酵過程でのカビの発

Yield rate（%）

した。これをアミノ酸自動分析機JIC-500/Ｖ（日生と歩留変化

6040
200

作製したソーセージを，温度20℃，湿度85％に0調整した恒湿恒温乾燥機（カビ室）中に吊り下げ，ユーロティウム

ハーバリオラム（Eurotium

Control
Fermented

3

6

Days

8

10

12

Fig. 1 Yield rate curve of control and fermented sausage.

herbariorum）」を利用して，この鰹節菌液をソー70

室では，毎日１回の割合で，外気を取り入れて空60

気循環を良くし，酸素の供給を行ってカビの発育を促進させた。２日後に白色のカビがソーセージ
表面に発育し，３日後に全面を覆うように増殖した。さらに，カビの発育したソーセージを，温度

Moisture content（%）

セージの全面に噴霧し，カビを発生させた。カビ

18℃，湿度65％に調整した恒湿恒温器中で，歩留

50
40
30
20
10
0

り60％（試験区１），50％（試験区２）になるま
で乾燥および熟成を進行させた。発酵ソーセージの製造過程の歩留の変化について測定した結果をControl

Fermented
60%

Fermented
50%

Fig. 2-a M o i s t u r e c o n t e n t s i n c o n t r o l a n d e a c hfermented sausages.

Fig.１に示した。カビを噴霧していない加熱直後のソーセージを対照区（Control）とした。カビ
区１；Fermented 60％）に低下し，12日経過して歩留りが50％（試験区２；Fermented 50％）にまで低下した。なお，カビを噴霧した試験区の歩留りの低下状態は，対照区と比較してわずかに早い傾向が認められた。
3 . 2 カビ発酵ソーセージの水分含量および水分活性の変化
水分含量の変化は，Fig. 2-aに示したように対

1.0
Water activity（Aw）

を噴霧した試験区は，８日で歩留りが60％（試験

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

Control

Fermented
Fermented
60%
50%Fig. 2-b Water activities in control and fermented

sausages.

照区が61％，試験区１が31％，試験区２が28％を示した。一方，いずれの製品もpHは約６位で，歩留りの減少に伴い同様に減少する傾向を示し

水分活性（Aw）は，対照区が0.96，試験区１がた。食肉製品の規格基準に当てはめると19），これ

0.91および試験区２が0.86を示した（Fig. 2-b）。

ら製品の水分活性値は，非加熱食肉製品の成分規

各試料の水分含量および水分活性の減少状態は，格の水分活性（0.95未満）よりも低い値であり，© The Ito Foundation

85

新規な発酵食肉製品の機能性について（Ⅱ）

試験区２の水分活性値は，乾燥食肉製品の成分規

分子量をSDS-PAGEやHPLC分析により観察した格の水分活性値（0.87未満）より低値を示した。

結果，食肉を構成している筋原線維タンパク質のまた，いずれの製品も食肉製品の衛生規格，保存分解に伴い出現した分子量1,000～6,000Da間の成基準に適合する製品となった。

分の増加が観察された（データ未掲載）。最近の

3 . 3 カビ発酵ソーセージのACE阻害活性の評

Denizらの研究21）でも，牛肉を材料としたトルコ産のパストゥルマから検出されたACE阻害ペプ

価
著者らは，高い食肉タンパク質分解能を持つ乳酸菌を用いて高機能食肉製品の開発を試みた。そチドは，900～1,500Daの分子量域に多く存在することを認めている。

の結果，乳酸菌による筋原線維タンパク質の分解3.4に伴う機能性ペプチドや遊離アミノ酸の増加，高Fig.４に，対照区および２種類の試験区のカビ

い血圧上昇抑制活性と抗酸化作用も有し，しかも発酵ソーセージから得られた酵素消化物の抗酸化官能評価でも高い評価を受ける製品を開発でき

活性を，DPPHラジカル消去法により測定した結た果を示した。対照区に比較して発酵ソーセージの。本研究でも，カビ発酵ソーセージを，ヒ

12，
13）

カビ発酵ソーセージの抗酸化活性の評価

14）

試験区１は約1.26倍，試験区２は約1.8倍近い高いに準じて酵素消化しACE阻害活性の比較を行っ

抗酸化活性を示した。これらの値は，畜種別差異

た（Fig. ３）。そ の 結 果 ，い ず れ の 製 品 も 高 いを比較検討した数値とほぼ同等の数値を示し

ACE阻害活性を示したが，対照区と比較すると，た22）。なお，発酵ソーセージの試験区２は，調理カビを噴霧して発酵させた製品がさらに高い

加工食肉・食肉製品の機能性発現の研究で測定しACE阻害活性を示し，カビ発酵に伴い，ACE阻

た生ハムの値よりも若干低い活性であった20）。こ害活性が高まる傾向が認められた。これらの結果の要因は，それらの製品の発酵・熟成期間に起因は，我々が，一昨年報告した，「調理加工食肉・すると想定された。Fuら 23）は，内因性のプロテ

食肉製品およびその発現に関する研究」から得らアーゼによる牛肉タンパク質やコラーゲンの分解れた結果20）や，昨年報告したカビ発酵ハムで得らが，ACE阻害活性やDPPHラジカル消去活性を発れた結果とほぼ同様の値であった 。カビ発酵食

現することを報告している。また，生ハムやドラ

肉製品の酵素消化物のタンパク質成分の分子種やイキュア―ドハムからACE阻害活性やDPPHラジトが食して消化したことを前提に，前回の報告

14）60
DPPH activity（μM TE）

ACE inhibitory activity (%)

90
85
80
75
70

Control

Fermented
60%

Fermented
50%

Fig. 3 ACE inhibitory activity of control and eachfermented sausages.

50
40
30
20
10
0

Control

Fermented
60%

Fermented
50%

Fig. 4 DPPH radical scavenging activity of control andeach fermented sausages.

© The Ito Foundation

86

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

カル消去活性が発現することが認められていミノ酸の種類では，Gln，Ser，Gly，Ala，Pro，る 。これらの抗酸化活性発現の要因は，それぞVal，Ile，Leuがいずれも２倍以上増加した。発れの製品中に産生された抗酸化ペプチドの効果で酵ソーセージ100ｇ当たり，Glnが52mgと最も多あることが示されている。さらに，トルコ産のパく，次いでAlaが約36mgと高い値を示した。カビストゥルマ由来の遊離アミノ酸と生理活性ペプチ

発酵に伴い，Val，LeuおよびIleの筋肉で代謝さドの発現様式を検討した報告では，DPPH活性はれる分岐鎖アミノ酸や，同じく筋肉で代謝される

分子量700～2000Daくらいのペプチドに依存してAlaの有意な増加が認められ，スポーツ栄養の分いることが報告されている 。著者らの乳酸菌を野にも貢献できる可能性が示唆された。Alaはア

用いた発酵ハムの研究でも，抗酸化活性の発現

ルコールの分解を促進し肝機能を改善する効果をは，製品の製造過程で発現する低分子量のペプチ有している。また，運動時のエネルギー源である

ドに起因することを認めている13）。本研究におけ

グルコースを生成するため長時間の運動時に必要る，カビ発酵ソーセージからも，抗酸化ペプチドで，持続的な運動を支える効果もある。一方，旨の産生により抗酸化活性が発現することが明らか味に貢献するGluは，カビ発酵に伴って約2.2倍にになった。

増加したことから，発酵ソーセージは対照区に比

24）

21）

カビ発酵ソーセージの遊離アミノ酸分析

較して旨味の顕著な増加が推測された。また，甘

歩留り100％のカビを噴霧していない対照区と味を持ち天然の食品添加物として使用されている

歩留り50％の発酵ソーセージの試験区２に含まれAlaの増加もカビ発酵ソーセージの味覚改善に寄る遊離アミノ酸量を測定した（Fig.５）。その結与すると考えられた。前報20）で，鰹節カビ菌を用

果，対照区に比較してカビを噴霧した発酵ソー

いて製造した発酵ハムの官能評価では，熟成風味

セージは総遊離アミノ酸量が約２倍に増加した。

発現と弾力性で高評価を受けることを報告し，日また，カビ発酵させることによって，Asp以外の畜産学会大会でも公表した 25）。今回の発酵ソー17種類のアミノ酸の増加が認められた。各遊離ア

セージの官能評価でも，発酵熟成に伴い弾力性がFree amino acid content（mg/100g Sample）

3.5

60
50

Control
Fermented 50％

40
30
20
10
0
Asp

Glu

Asn

Ser

Gly

Gln

His

Thr

Ala

Pro

Tyr

Val

Fig. 5 Free amino acid contents in control and fermented sausage（50％）.

© The Ito Foundation

Met

Lys

Ile

Leu

Phe

Trp

新規な発酵食肉製品の機能性について（Ⅱ）

87

増加し，ほどよい香りと適度の酸味や塩味有し，能が認められた。また，カビ発酵に伴い，Val,

旨味のある製品となることが認められた 。

LeuおよびIleの筋肉で代謝される分岐鎖アミノ酸

26）

以上，日本独自の有用菌株である鰹節優良カビや，同じく筋肉で代謝されるAlaの有意な増加がハーバリオラム

認められ，スポーツ栄養の分野にも貢献できる可（Eurotium herbariorum）」を利用して，新鮮な能性が示唆された。また，旨味に貢献するGluが豚肩ロース肉，牛赤身肉および豚脂を用いて調製

カビ発酵に伴って顕著に増加し，旨味成分の凝縮

したソーセージをさらに発酵・熟成させることされた発酵ソーセージが製造された。

菌 「ユ ー ロ テ ィ ウ ム

で，高い血圧上昇抑制活性と抗酸化作用を持ち，ほどよい香りと適度の酸味や塩味有し遊離アミノ酸の増加に伴う旨味の付与された発酵ソーセージを作製できることが明らかになった。
４．要

約

本研究は，日本独自の有用菌株の鰹節カビ菌で
あ る 「ユ ー ロ テ ィ ウ ム

ハーバリオラム（Eurotium herbariorum）」を利用して，ソーセー
ジを発酵させ，生理活性機能と旨味が付与された，市場にはまだ存在しない新規な発酵食肉製品を開発する目的で行った。
新鮮な豚肩ロース肉，牛赤身肉および豚脂を細切し，これに食塩，グルコース，亜硝酸ナトリウ
ムを添加しソーセージエマルジョンを作製した。
このソーセージエマルジョンを天然豚腸に充填し，85℃，30分間蒸煮した。加熱処理したソーセー
ジに鰹節菌を噴霧し，20℃，湿度85％の条件下でカビを発生させた。さらに18℃，湿度65％の条件
下で歩留り60％，50％になるまで発酵・熟成させた。それらの水分含量，水分活性，ACE阻害活性，
抗酸化活性および遊離アミノ酸分析等を行った。
鰹節菌の噴霧後２日でカビの発生が認められ，３
日で全面がカビで被覆された。歩留りが60％および50％になるまでに，それぞれ８日間および12日間を要した。いずれの製品もpHは約６位で水分活性は0.91以下を示した。カビ発酵ソーセージには，発酵・乾燥に伴う熟成過程で産生される高い
血圧上昇抑制効果や抗酸化活性などの生理活性機

文献１） 斉藤忠夫，西村敏英，松田幹編著：最新畜産物利
用学，123～124，朝倉書店，東京，2007．
２） Arihara, K., Nakashima, Y., Mukai, T., Ishikawa,T., Itou, M. : Meat. Sci., 57, 319～324, 2001.
３） Katayama, K., Fuchu, H., Sakata, A., Kawahara, S.,
Yamauchi, K., Kawamura, Y., Muguruma, M. : AsianAust. Anim. Sci. J., 16, 417～424, 2003.
４） Katayama, K., Tomatsu, M., Fuchu, H., Sugiyama,M., Kawahara, S., Yamauchi, K., Kawamura, Y.,
Muguruma, M. : Anim. Sci. J., 74, 53～58, 2003.
５） Katayama, K., Tomatsu, M., Kawahara, S.,
Yamauchi, K., Fuchu, H., Sugiyama, M., Kawamura,Y., Muguruma, M. : J. Agric. Food. Chem., 52, 771～
775, 2004.
６） Katayama, K., Jamhar., Mori, T., Kawahara, S.,
Miake, K., Kodama, Y., Sugiyama, M., Kawamura, Y.,
Nakayama, M., Mayuyama, M., Muguruma, M. : J.
Food. Sci., 72, S702～706, 2007.
７） Katayama, K., Anggraeni, H. E., Mori, T.,
Ahhmed, A. M., Kawahara, S., Sugiyama, M.,
Nakashima, T., Mayuyama, M., Muguruma, M. : J.
Agric. Food. Chem., 56, 355～360, 2008.
８） Muguruma, M., Ahhmed, A. M., Katayama, K.,
Kawahara, S., Maruyama, M., Nakamura, T. : Food.
Chem., 114, 516～522, 2009.
９） Ahhmed, A., Muguruma, M. : Meat Sci., 86, 110 ～
118, 2010.
10） 六車三治男：日本暖地畜産学会報, 55（2）,85～91,
2012．
11） 竹田志郎，久保田大樹，竹之山愼一，河原聡，六車 三 治 男：日 本 暖 地 畜 産 学 会 報 ，57（2）,141 ～ 145,2014．
12） 六車三治男：高機能発酵食肉製品の開発，科学研
究費助成事業研究成果報告書，2013．
13） T a k e d a , S . , M a t s u f u j i , H . , N a k a d e , K . ,Takenoyama, S., Ahhmed, A., Sakata, R., Kawahara,S., Muguruma, M. : Anim. Sci. J., 88, 507～516, 2017.
14） 六車三治男，川越聖人，木本早紀，川北久美子，竹之山愼一：平成27年度食肉に関する助成調査成果
報告書，公益財団法人伊藤記念財団，34, 96～103,
2016．

© The Ito Foundation

88

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）15） 岡田雅人，宮崎香：タンパク質実験ノート抽出と分離精製，29，羊土社，東京，1996．
16） Murphy, J. B., Kies, M. W. : Biochim. Biophys.
Acta, 45, 382～384, 1960.
17） Cushman, D. W., Cheung, H. S. : Biochem.
Pharmacol., 20, 1637～1648, 1971.
18） Balyasnikova, I. V. : In Vitro Cell Dev. Biol. Anim.,
34, 545～554, 2001．
19） 斉藤忠夫，西村敏英，松田幹編著：最新畜産物利
用学，146Ｖ152，朝倉書店，東京，2007．
20） 六車三治男，木本早紀，川北久美子，竹之山愼一：
平成26年度食肉に関する助成調査成果報告書，公益財団法人伊藤記念財団，33, 96～38, 2015.
21） Deniz, E., Mora, L., Aristoy, M. C., Candogan, K.,
Toldra, F. : Food Res. Inter., 89, 194～201, 2016.

22） 竹田志郎，久保田大樹，竹之山愼一，河原聡，六車 三 治 男：日 本 暖 地 畜 産 学 会 報 ，58（1）,103 ～ 108,2015．
23） Fu, Y., Young, J. F., Therkildsen, M. : Meat Sci.,
123, 134～142, 2017.
24） Mora, L., Escudero, E., Toldra, F. : Food Res.
Inter., 89, 638～646, 2016.
25） 六車三治男，木本早紀，川越聖人，川北久美子，竹之山愼一，中村豊郎：鰹節菌によるカビ発酵ハムの熟成風味発現について，日本畜産学会第121回大会
講演要旨集，ｐ258，2016.
26） 六車三治男，川越聖人，木本早紀，川北久美子，竹之山愼一，中村豊郎：新規な発酵食肉製品の開発
Ⅱカビ発酵ソーセージの開発と機能性について，日本畜産学会第122回大会講演要旨集，ｐ185, 2017.

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89

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール
代謝改善素材開発のための基礎研究
Basic study of the development of an innovative hypocholesterolemic foodmaterials using cattle heart peptides

長

岡

利

（岐阜大学応用生物科学部）

Satoshi Nagaoka（Faculty of Applied Biological Sciences, Gifu University）

Only a few reports have dealt with the effects of animal protein and animal proteinhydrolysate on cholesterol metabolism. The cattle heart protein hydrolysate ultra-filtrate（HPHU, MW < ca. 1,000 Da peptides fraction） derived from HPH imparts a stronger
hypocholesterolemic activity than HPH in rats. Thus, after purification of HPHU by a reverse
phase chromatography and gel filtration chromatography, we try to identify the active
hypocholesterolic peptide derived from HPHU using in vitro assay related to micellar solubilityof cholesterol in vitro. Micellar solubility of cholesterol was significantly decreased by
HRHUgf3-RPIB2（purified by a gel filtration and a reverse phase chromatography and areverse phase chromatography）-group compared to CTH-group. Mass Spectrometricalanalysis reveal that peptide X contains in HRHUgf3-RPIB2. We identified for the first time thehypocholesterolemic peptide X derived from HRHU gf3-RPIB2 in rats.

がなされていない畜産食品素材のうち，牛肉ペプ

的

１．目

チド，牛レバーペプチドが体内コレステロール低一般に，大豆タンパク質などの植物性タンパク

下作用を有することも見出した６）。さらに，昨年

質は，カゼインなどの動物性タンパク質と比較し度の研究で，動物性食餌タンパク質である牛肉に１）て，抗動脈硬化作用を有すると考えられている 。

再度着目し，畜産資源の高度有効利用という観点

しかし，現在活発に行われている有効成分の検討

から，廃棄部位を含めた各部位である牛肉，牛心により，このような血清コレステロール低下

臓，牛赤血球，牛血漿加水分解物を用いた研究を作用は動物性素材にも見られることが明らかにさ行った結果，特に牛心臓加水分解物（HPH）がれている。実際に，私は，牛乳の乳清タンパク質

強力なコレステロール代謝改善作用を発現するこが，動物性タンパク質でありながら大豆タンパクとを発見した７）。

２～10）

質よりも，強力な血清コレステロール低下作用をさらに，我々の既報８～10）の研究手法を用いて，発現することを発見し検討している２，３）。また，

牛心臓タンパク質加水分解物（HPH）のコレス

主要な食糧資源でありながら，従来ほとんど検討

テロール低下作用機構を明らかにした。コレステ© The Ito Foundation

90

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

ロールミセル溶解性はカゼインよりもHPHで有２．方法，結果，考察意に低下した。Caco-２細胞のコレステロール吸収抑制はカゼインミセルよりもHPHミセルで有実験１

意に高かった。血清コレステロールはカゼインよFig.１に，HRHUgf3-RPIBの逆相クロマトグラ

りもHPHで有意に低かった。放射性コレステロー

フィーによる溶出パターンを示した。

ルで測定したコレステロール吸収はカゼインと比

平成27年度報告書より12），HPHUの逆相クロマ

べてHPHで有意に減少し，HPHのコレステロー

ト グ ラ フ ィ ー に よ る 分 画 物 で あ る HRHUgf3-

ル低下作用は空腸のコレステロール吸収阻害によRPIB2はCTHやHPHUと比較して，コレステロー

るものである。さらに，HPH由来の牛心臓タン

ルミセル溶解性が顕著に有意に低下した。

パク質加水分解物の限外濾過物（HPHU，分子量

実験２約1000ダルトン以下のペプチド分画物）は，ラッ

最大活性を発揮したHRHUgf3-RPIB2の活性ペトにおいてHPHよりも強力なコレステロール低

プチドをTOF/MS分析を実施した。その結果，

下作用を示すことを発見し，報告した 。

HRHUgf3-RPIB2からペプチドＸ（アミノ酸配列11）は特許の関係で非公表）を同定した。

そこで，本研究では，ペプチド混合物である

実験３

HPHUのコレステロール代謝改善作用に寄与する
活性ペプチドを特定するために，HPHU由来ペプ

牛心臓由来ペプチド分画物であるHRHUgf3-

チドの分画精製を実施し，in vitroのコレステロー

RPIB2からペプチドＸ（アミノ酸配列は特許の関ルミセル溶解性試験を行い，活性ペプチドの特定係で非公表）を同定したので，ペプチドＸについを試みた。さらに，特定した活性ペプチド候補のて，高コレステロール血症ラットにおいて，脂質活性をラットによる動物実験で評価した。

代謝に対する影響を評価した。高コレステロール
食の食餌組成は既報に従って調製した。Wistar系
雄ラット４週齢を実験に使用した。ペプチドＸは７日間ゾンデによって経口投与した。解剖前８時

IB2

IB3

ABS 215nm（mAU）

1800

IB4

IB1

1600

100
90
80

1400

70

1200

60

1000

50

800

40

600

30

400

20

200

10

0

0

5

10

15
Elution volume（ml）

Fig.１

© The Ito Foundation

20

25

0
30

Conc（%B）

ABS 215nm

2000牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール代謝改善素材開発のための基礎研究

91

Table 1 Effects of peptide X on lipid metabolism in Wistar rats
Ｃ

300Ｘ

600Ｘ

Body weight gain（g/7days）

21.5±1.7ａ

19.5±1.4ａ

19.0±1.4ａ

Food Intake 4-5days (g）10.8±0.2ａ

10.2±0.3ａ

11.2±0.3ａ

Liver Weight（g/100g Body Weight）

5.45±0.16ａ

5.72±0.21ａ

5.32±0.12ａ

Serum Cholesterol (mg/dl）

452.2±19.1ａ

422.6±37.2ab

359.0±18.1ｂ

Serum Triglyceride (mg/dl）

162.8±18.7ａ

180.9±27.4ａ

115.6±12.8ａ（Exprimental condition）
C（control）：5g/L Carboxymethylcellulose sodium salt
300X：300mg/kg.B.W./day peptide X
600X：600mg/kg.B.W./day peptide X
１．Initial body weight was 70g.
２．The date are shown by Means±SEM of 8 rats.
３．A feeding period was for 7 days and a fasting period was for last 8 hours.
４．Within a row, means with different letters are significantly different (P＜0.05) by Tukeyʼs test.

間絶食後に解剖し，血液を採取し，遠心分離によ特定するために，HPHU由来ペプチドの分画精製

り血漿を得て，マイナス80度で保管した。なお，

を逆相クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグ

実験結果の統計的分析には，Turkeyʼs-testを用い

ラ フ ィ ー に よ り 実 施 し ，分 画 物 に つ い て ，inた。

vitroのコレステロールミセル溶解性試験を行っ

実験の結果（Table１）から，体重増加量，食た。

餌摂取量，肝臓重量には，群間で有意な変化は認本研究では，HRHUgf3-RPIBの逆相クロマト

められなかった。血清コレステロールは対照群

グラフィー分画物（IB1～4）の中で最もコレス（Ｃ）と比較して，300Ｘ群で低下傾向，600Ｘ群

テロールミセル溶解性低下作用を有する画分は，では有意に低下した。血清トリグリセリドは，対IB2であることを明らかにした。IB2に含まれる

照群（Ｃ）と比較して，600Ｘ群で低下傾向を示

ペプチドをMS分析した結果，Ｘペプチドが含ました。今回の結果は，牛肉由来の最初のコレステれることを発見した。さらに，牛心臓由来のＸペロール代謝改善ペプチドの発見を意味するものあ

プチドは高コレステロール血症ラットにおいて，り，大変興味深いと考える。今後は，このペプチ

血清コレステロール濃度低下作用を発揮すること

ドＸの血清コレステロール低下作用機構を解析すを世界で最初に発見した。

る必要がある。
３．要約

私たちはHPH由来の牛心臓タンパク質加水分
解物の限外濾過物（HPHU，分子量約1000ダルト
ン以下のペプチド分画物）は，ラットにおいてHPHよりも強力なコレステロール低下作用を示すことを発見し，報告した。
そこで，ペプチド混合物であるHPHUのコレス
テロール代謝改善作用に寄与する活性ペプチドを文
献１） Carroll, K. K., Hamilton, R. M. G. : J. Food Sci., 40,
18, 1975.
２） Nagaoka, S., Kanamaru. Y., Kuzuya, Y., Kojima, T.,
Kuwata, T. : Biosci. Biotch. Biochem., 56, 1484, 1992.
３） 長岡利：日本栄養・食糧学会誌，49, 303, 1996.
４） Iwami, K., Sakakibara, K., Ibuki, F. : Agric. Biol.
Chem., 50, 1217, 1986.
５） Sugano, M., Goto, S., Yamada, Y., Yosida, K.,
Hashimoto, Y., Matsuo, T., Kimoto, M. : J. Nutr., 120,
977, 1990.
６） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，336, 1998.

© The Ito Foundation

92

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）７） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，
378, 1999.
８） Nagaoka, S., Awano, T., Nagata, N., Masaoka, M.,
Hori, G., Hashimoto, K. : Biosci. Biotech. Biochem.,
61, 354, 1997.
９） Nagaoka, S., Miyazaki, H., Oda, H., Aoyama, Y.,
Yoshida, A. : J. Nutr., 120, 1134, 1990.

10）Nagaoka, S., Miwa, K., Eto, M., Kuzuya, Y., Hori, G.,
Yamamoto, K. : J. Nutr. 129, 1725, 1999.
11） Nakade, K., Kaneko, H., Oka, T., Ahhmed, A.M.,
Muguruma, M., Numata, M., Nagaoka, S. : Biosci.
Biotechnol. Biochem. 73, 607, 2009.
12） 長岡利：食肉に関する助成研究調査成果報告書，91, 2015.

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93

肥満に伴う認知症の発症予防に対する豚肉摂取による腸内環境改善効果の有用性
Efficacy of intestinal flora improvement by the pork intake on theprevention of dementia related with obesity

後藤

孔郎・正木

孝幸・柴田

洋孝

（大分大学医学部内分泌代謝・膠原病・腎臓内科学講座）

Koro Gotoh, Takayuki Masaki and Hirotaka Shibata（Department of Endocrinology, Metabolism, Rheumatology, and Nephrology, Faculty of Medicine, Oita University）

Obesity induces systemic low-grade chronic inflammation. Alzheimerʼs diseaseis deeply
related with amyloid βdeposition although the mechanism is uncertain. The development of
Alzheimerʼs disease is also associated with chronic inflammation by the activation of microglia
cells, and reduction of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）expression in the brain.
BDNF is an important factor to prevent neuronal death which occurs in Alzheimerʼs disease.
In previous study, we observed that carnosine treatment recovered high-fat diet（HF）-induced
reduction of BDNF expression in the brain. However, it is indicated that carnosine could
activate central nervous system not directly through blood-brain barrier, but indirectly. Our
previous study shows that HF-induced obesity decreases portal levels of glucagon-like
peptide-1（GLP-1）secreted from L-cells in the small intestine and the intraportal GLP-1
administration elevates BDNF expression in the brain. The aim of this study is to clarify thatthe intake of carnosine included a lot in pork improves obesity-induced reduction of GLP-1
secretion. Male rats were divided into four groups and kept for 2 months as follows, standard
diet（Standard；20％ fat）-fed group, high-fat diet（HF；60％ fat）
-fed group, Standard-fed
plus carnosine（250 mg/kg body weight）group, and HF-fed plus carnosine group for 2
months. We evaluated 1）portal GLP-1 levels and GLP-1 expression in small intestine, 2）theanalysis of intestinal flora using T-RFLP（terminal restriction fragment length polymorphism）
method. Carnosine treatment inhibited HF-induced reduction of GLP-1 secretion from small
intestine. Moreover, carnosine also suppressed HF-induced decrease of “Genus Ruminococcus”
in intestinal flora. “Genus Ruminococcus” produce short-chain fatty acid which stimulates
L-cells in small intestine directly to promote GLP-1 secretion, indicating that the alteration ofintestinal flora by carnosine treatment increases GLP-1 secretion from small intestine. Thus itis suggested that carnosine intake might be effective to prevent the development of Alzheimerʼsdisease by elevation of GLP-1 secretion which induces BDNF expression in the brain.

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94
１．目

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）が摂食抑制作用，脳内BDNF発現の増加をもたら的すことを明らかにしている。また，小腸から合成

肥満およびそれに関連した糖尿病などのメタボ

さ れ る GLP-1 は 血 糖 降 下 作 用 を 有 し て お り ，リックシンドロームの増加は世界的な問題となっGLP-1関連薬が糖尿病治療に威力を発揮していている。肥満は，全身性炎症性疾患と位置付けらる。これまで，我々は門脈血中のGLP-1濃度が上れており，肝臓や内臓脂肪のみならず小腸にも炎

昇すると脳内BDNF発現が増加することにより，症性変化がみられるとされている。最近の研究に

膵臓への遠心性交感神経が活性化し，その活性がより，腸内細菌叢がこれらの疾患に関与する環境

膵臓の細胞に作用してグルカゴン分泌を抑制させ要因のひとつであることが明らかになってきた。

ることを明らかにしている１，２）。さらに肥満モデ

近年，腸内細菌が宿主の糖脂質・エネルギー代謝

ルでは，GLP-1の発現が低下していることも認めに関与することや，腸内細菌叢とメタボリックシられている。

ンドロームとの間に関連性があることを示す研究

最近，豚肉に含まれる“カルノシン”は脳神経が相次いで発表された。これらのことは，腸内細細胞を保護し，認知症発症を予防する効果がある

菌叢が肥満およびメタボリックシンドローム発症ことが知られている。ラットの実験において，カの環境要因となりうること，いいかえれば腸内細ルノシンは，脳重量減少の抑制効果があることが菌叢がこれらの疾患の予防・治療の標的となりう

明らかになり，これにはカルノシンの強い抗酸化ることを示唆している。アルツハイマー型認知症作用が関連しているのではないかと示唆されていにおいては，かつては危険因子として体重減少にる。しかしながら，豚肉摂取によって取り込まれ関心が寄せられていた。しかしながら，近年ではたカルシノンが小腸内に直接作用して，小腸からむしろ肥満がアルツハイマー型認知症の危険因子

GLP-1合成を促進させる可能性も考えられる。

であるというエビデンスが集積されてきた。中年

今回，食餌誘導性肥満モデル動物を用い，カル期の肥満はアルツハイマー型認知症発症の重大なノシンの摂取により，小腸からのGLP-1分泌が促危険因子であることが明らかにされてきた。さら進されか，さらにその変化には腸内環境が関与しにさかのぼって小児期からの肥満の管理・予防がているかについて検討する。以上より本研究で動脈硬化性心血管疾患のみならず，アルツハイ

は，豚肉の摂取は腸内環境を整えることで小腸かマー型認知症予防にもきわめて重要であると考えらのGLP-1合成能を改善させ，アルツハイマー型

られている。

認知症の進行予防効果をもたらすことを証明する

一 方 ，脳 由 来 神 経 栄 養 因 子（Brain-derived
neurotrophic factor；BDNF）は神経細胞の発生や成長，維持，修復など重要な働きをするタンパことを目的とする。
２．方法

ク質であるが，近年，このBDNFの発現量がうつ雄ラットに通常食（St；餌中の20％が脂肪成病やアルツハイマー病患者の脳で減少しているこ分）または高脂肪食（HF；餌中の60％が脂肪成とが確認されている。これまで，我々は門脈血中分）を摂取させ，通常食群と高脂肪食群に分けのglucagon-like peptide-1（GLP-1）濃度が上昇

る。さらに，各群をカルノシン添加群（250mg/すると，肝臓の門脈領域に存在するGLP-1受容体kg体重）とコントロール群に分ける。したがっを介して求心性迷走神経を活性化させ，その活性て，通常食＋コントロール（St＋control）群，© The Ito Foundation

95

肥満に伴う認知症の発症予防に対する豚肉摂取による腸内環境改善効果の有用性

通常食＋カルノシン（St＋carnosine）添加群，た（Fig.1A, B）。

高脂肪食＋コントロール（HF＋control）群，高3 . 2 高脂肪負荷に伴う腸内環境の変化に対す

脂肪食＋カルノシン添加（HF＋carnosine）群のるカルノシンの効果

４群を作成し，２ヶ月飼育する。その後，以下のような評価項目について検討する。

高脂肪負荷によって腸内細菌叢の中のRuminococcus属が低下するが，その低下はカルａ）下部小腸のGLP-1発現，門脈血GLP-1濃度

ノシンを経口投与により改善した（Fig.２）。

をELISAキットで測定する。

カルノシンはβアラニンとヒスチジンのジペプｂ）T-RFLP（terminal restriction fragment

チドでβアラニン・ヒスチジンであり，特に豚やlength polymorphism）法を用いて，腸内細菌解牛の筋肉中に高濃度に存在する。これらは，ヒス析 を 検 討 す る 。腸 内 細 菌 の 構 成 菌 種 は ，チジンの構成要素であるイミダゾールからイミダ

16SrDNAの塩基配列が異なるため，制限酵素にゾールぺプチドと呼ばれ，内因性抗酸化物質としよる切断部位は菌種固有のものとなる。これらのての役割を果たしている３，４）。カルノシンを摂取処理によって得られるDNA断片に対応したピー

したラットでは筋肉中のカルノシン含有量が装荷クの位置（断片長），面積（菌数）および数（菌するとともに筋肉脂質の過酸化や蛋白の酸化が抑種の多様性）を解析することで糞便中の構成菌種制されることが知られている。また近年，カルノ

およびその割合を推定する方法である。前述の４

シンは加齢と深く関連のある蛋白変性を伴う疾

群の糞便を採取し，上記方法で腸内環境を評価す

患，特にアルツハイマー型認知症や糖尿病合併症る。

の予防に有効であると報告が散見される。事実，カルノシンは，アミロイドβ蛋白（Ａβ）の活性３．結果と考察を抑制していると考えられている５，６）。これまで

3 . 1 高脂肪負荷に伴うGLP-1発現の変化に対申請者は，カルノシンを摂取すると高脂肪負荷による脳内BDNF発現の低下が改善することを認めするカルノシンの効果
および門客内GLP-1濃度が有意に低下したが，そであることから，カルノシンはＡβの沈着とは独

れらの低下はカルノシンを経口投与により改善し立してBDNFによる神経保護作用が発揮されるこA

B
100 （pmol/mg protein）

50

0

*

St +
controlSt +carnosine

HF+
control＊

HF+
carnosineIntestinal GLP-1 levelsている。BDNFは神経細胞の維持をもたらす因子

Intestinal GLP-1 expression

高脂肪負荷によって下部小腸からのGLP-1発現15 （pmol/L）
10
*
5
0

p<0.05 vs. St + control

Fig. 1

© The Ito FoundationSt +controlSt +carnosine

HF+
control＊

HF+
carnosinep<0.05 vs. St + control

96

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

St +controlSt +carnosine
Blautia
Ruminococcus
Lactococcus
Clostridium
Oscillospia
Bacteroides

HF +control

Coprococcus

HF +carnosine

Natronincola
Desulfovibrio
Tindallia
Lactobacillus
Sarcina＊

OthersUnclassiﬁed＊

p<0.05 vs. St + control

Fig. 2

とが推測される。また，加齢とともにカルノシン

低下を回復させることが認められた。さらに，高の組織中濃度が低下するため，カルノシンを多く

脂肪負荷は腸内細菌叢の中のRuminococcus属を含む豚肉の摂取が，アルツハイマー型認知症の発低下させるが，その低下もカルノシンを経口投与症予防に有効であることが示唆される。とこにより改善した。Ruminococcus属は食物繊維をろが興味深いことに，カルノシンのホモログであ醗酵して，短鎖脂肪酸（酢酸，酪酸など）を産生

るホモカルノシンは髄液中に存在するが，カルノすることが知られている12）。さらにこれらの短鎖シン自体はほとんど存在しないことが明らかに

脂 肪 酸 は ，下 部 小 腸 の Ｌ 細 胞 に 直 接 作 用 し てなっている。したがって，カルノシンの一連

GLP-1 分 泌 を 促 進 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て いの作用は，脳以外の部位から間接的にもたらされる13）。以上より，本研究でみられたカルノシン摂ている可能性が高い。その間接的作用の候補とし取 に よ る GLP-1 分 泌 促 進 作 用 に は ，腸 内 で のて，カルノシンによる小腸での腸内環境の改善，

Ruminococcus属の増加が関与していることが示

さらには小腸から分泌されるGLP-1の分泌促進に唆される。今後，カルノシン経口投与後におけるよる可能性が考えられ，本研究を遂行した。これ

門脈血中のアミノ酸濃度などの解析が必要である

まで我々は，小腸から分泌されるGLP-1が門脈を

と考える。

７～９）

10，
11）

経由して肝臓内のGLP-1受容体に作用し，さらに肝臓からの求心性神経を介して脳内BDNF発現を

４．要約

高める，ということを明らかにしている１，２）。本

肥満は，全身性炎症性疾患と位置付けられてお研究において，高脂肪負荷は小腸からのGLP-1分

り，またアルツハイマー型認知症の危険因子であ泌低下をもたらし，カルノシンの経口摂取はそのるとされている。アルツハイマー型認知症の病態© The Ito Foundation

肥満に伴う認知症の発症予防に対する豚肉摂取による腸内環境改善効果の有用性

生理に関しては，神経細胞外のＡβの沈着のみならず，慢性の炎症が大きく関わるとされているが，メカニズムの詳細は不明である。最近，豚肉に多く含まれる“カルノシン”は脳神経細胞を保護し，認知症発症を予防する効果があることが知られている。しかしながら，カルノシンは直接脳に作用していないのではないかという考えが一般的である。以上より本研究では，「豚肉の摂取は腸内環境を整えることで小腸からのGLP-1合成能を改善させ，アルツハイマー型認知症の進行予防効果をもたらす」ことを証明することを目的とする。カルノシンは，肥満による腸内での炎症反応を抑制させ，BDNF発現の低下を回復させた。以上より，カルノシンを多く含む豚肉の摂取は，ア
ルツハイマー型認知症の発症もしくは進展予防に有効であることが示唆される。
文献１） Kohen, R., Yamamoto, Y., Cundy, K. C., Ames, B.
N. : Antioxidant activity of carnosine, homocarnosine,and anserine present in muscle and brain, Proc Natl
Acad Sci U S A, 85, 3175～3159, 1988.
２） Calabrese, V., Colombrita, C., Guagliano, E.,
Sapienza, M., Ravagna, A., Cardile, V., Scapagnini, G.,
Santoro, A. M., Mangiameli, A., Butterfield, D. A.,
Giuffrida, Stella, A. M., Rizzarelli, E. : Protective effectof carnosine during nitrosative stress in astroglial
cell cultures, Neurochem Res, 30, 797～807, 2005.
３） Preston, J. E１., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T.,
Romero, I. A., Abbott, J. N. : Toxic effects of betaamyloid （25-35） on immortalised rat brain
endothelial cell : protection by carnosine,
homocarnosine and beta-alanine, Neurosci Lett, 242,
105～108, 1998.
４） Fu, Q., Dai, H., Hu, W., Fan, Y., Shen, Y., Zhang, W.,

97

Chen, Z. : Carnosine protects against Abeta42induced neurotoxicity in differentiated rat PC12
cells, Cell Mol Neurobiol, 28, 307～316, 2008.
５） Hipkiss, A. R. : Carnosine, a protective, antiageing peptide? Int J Biochem Cell Biol, 30, 863～
868, 1998.
６） Boldyrev, A. A., Gallant, S. C., Sukhich, G. T. :Carnosine, the protective, anti-aging peptide, Biosci
Rep, 19, 581～587, 1999.
７） Hipkiss, A. R. : On the enigma of carnosineʼs antiageing actions, Exp Gerontol, 44, 237～242, 2009.
８） Huang, Y., Duan, J., Jiang, X., Chen, H., Chen, G. :Separation and determination of enkephalin-related
peptides using capillary electrophoresis, J Sep Sci,
28, 2534～2539, 2005.
９） Jansen, E. E., Gibson, K. M., Shigematsu, Y.,
Jakobs, C., Verhoeven, N. M. : A novel, quantitative
assay for homocarnosine in cerebrospinal fluid using
stable-isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry, J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci, 830, 196～200, 2006.
10） Fujiwara, K., Gotoh, K., Chiba, S., Masaki, T.,
Katsuragi, I., Kakuma, T., Yoshimatsu, H. : Intraportal
administration of DPP-IV inhibitor regulates insulin
secretion and food intake mediated by the hepatic
vagal afferent nerve in rats, J Neurochem, 121, 66～
76, 2012.
11） Gotoh, K., Masaki, T., Chiba, S., Ando, H.,
Fujiwara, K., Shimasaki, T., Mitsutomi, K., Katsuragi,I., Kakuma, T., Sakata, T., Yoshimatsu, H. :Hypothalamic brain-derived neurotrophic factor
regulates glucagon secretion mediated by pancreaticefferent nerves, J Neuroendocrinol, 25, 302～311, 2013.
12） Gokarn, R. R., Elterman, M. A., Martin, S. A.,
Erikson, K. E. : Production of succinate from glucose,cellobitose, and various cellular materials by theruminal anaerobic bacteria Fibrobactor succinogenes
and Ruminococcus flavefaciens, Appl Biochem
Biotechnol, 68, 69～80, 1997.
13） Adachi, T., Tanaka, T., Takemoto, K., Koshimizu,
T. A., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. : Free fatty acids
administered into the colon promote the secretion of
glucagon-like peptide-1 and insulin, Biochem Biophys
Res Commun, 340, 332～337, 2006.

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98

畜産物由来サプリメントの新規評価法の開発
Development of new evaluation method for supplement derived fromanimal product

吉

川

豊・糸

井

亜

弥

（神戸女子大学健康福祉学部健康スポーツ栄養学科）

Yutaka Yoshikawa and Aya Itoi
（Department of Health, Sports and Nutrition, Kobe Women’s University）

Stable isotope abundances of most elements are highly constant in nature but they are notinvariant. Element transfer between physical and chemical compartments can alter the isotopic
composition of an element slightly provided that the transfer process is incomplete andsensitive to the isotopeʼs masses. For the lighter elements such as H, C, O, and N are now usedwidely in a number of scientific disciplines such as the earth and environmental sciences, plantscience and food science. Recently, many researchers were reported that stable isotope ratio of
the heavy elements such as Sr and Pb are measured and these data were used to the opinionof production area or human health. In this study, we examined the Fe stable isotope ratio of
the blood powder, heme Fe, and, FeSO4・7H2O in supplied ILS Co. Ltd. or Wako Pure Chemical
Industry Ltd.. We revealed that δ65Fe dissociated among the blood powder, heme Fe, and,FeSO4・7H2O. In the future, we proposed that δ65Fe may be used as opinion of production area.

１．目

は，地球古環境試料に含まれる有機物の同位体組的成が，生物の起源に関する情報や合成・代謝・分分析技術の進歩により，様々な高精度の装置が解などの生物化学的プロセスと密接にリンクして開発されている。その中でも近年安定同位体の測おり，安定同位体比の解析は地球科学や生態学の定に注目が集まっている。同位体とは，同じ元素分野で特に広く使われている１）。さらに，水素同に属していても中性子数が異なるもの，つまり同位体を指標とした動物の行動範囲の環境変動調

じ元素でも質量数が異なるもののことをいう。多査，炭素・窒素同位体比を指標とする覚せい剤な

くの元素はいくつかの同位体の混合物であり，そどの規制薬物合成原料の特定や流通過程の解明，れらの存在比はほぼ一定である。同位体では電子炭素同位体比によるドーピング判定，ストロンチ

配置の最外殻構造が同一のため，化学的性質は良ウムの同位体比を用いての，大麦，米，小麦，そく似ているが，原子核の重さが異なり，わずかにばなどの産地判別など様々な分野で応用されてい物理学的性質に違いが生じる。環境分野においてる２，３）。

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畜産物由来サプリメントの新規評価法の開発

99

より具体的には，同位体比は各元素により，反位体比を測定することで，日常生活における様々

映する要因が異なることが報告されている。例えな現象を評価することが可能になってきている。

ば，炭素の同位体比（13C/12C）は，光合成経路のそこで，本研究では，安定同位体ならびに安定

異なるＣ３植物とＣ４植物ではその同位体比が異同位体比を測定することで，畜産物由来のサプリなり，Ｃ３植物の炭酸固定酵素（リブロース-1，

メントの新たな食品的価値を見出すため，畜産物

5-ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナー

由来サプリメント中の鉄（Fe）（ヘムFe），ヘム

ゼ；RubisCO）はCO2-酵素複合体を生成する際Fe原料である血粉中のFe，および無機Fe中のFeに分子量44のCO2 を選択し，分子量45のCO2 はほなどの安定同位体比の測定を行い，無機Feとヘぼ使用しないため，それぞれの炭素の安定同位体

ムFeの間でFeの同位体比が変わるのか，また，に は わ ず か な 差 が 生 じ る 。窒 素 の 同 位 体 比

血粉のような食品中のFeとヘムFeの間でFeの同（15N/14N）は根から吸収する土壌中の窒素源の同位体比が変わるのかを評価することを目的とした。

位体比を反映するため，有機農法判定に応用でき

本実験の測定には，Agilent Technologies社のる。また，水においても，重水素（ Ｈ
（Ｄ）
）や Ｏ

誘導結合プラズマ質量分析計（ICPMS；7700シ

を 含 む 水 は 低 緯 度 地 域 の ほ う が 高 く ，軽 い 水リーズ）を用い，各種サンプルを，湿式灰化する（H216O）は重い水（H218O）よりも蒸発しやすく，ことで溶液のサンプルとし，NIST認証標準物質

雨水として落ちてくるときには重い水が落ちてきのIron（Fe）Standard Solutionならびに和光純薬

やすい。そのため，海岸部と山間部では水由来の工業製の1000 ppm各種金属標準液を用いてサン同位体比が異なることも明らかになっている。こプル中の微量元素の定量分析ならびに同位体比のれらの背景原則に基づき農作物の産地判別に同位測定を実施した。

４）

2

18

体比分析が多く用いられている。豪州産のコシヒ
カリは国産や米国産のものより18O/16O比が高く，

２．方法

世界の降水中の 18O/16O比の分布傾向とよく一致

産地の異なる（ベルギー産，オランダ産，ス

し，産地判別できる可能性を示している５）。他にウェーデン産，スペイン産）血粉とそれを原料ともアメリカ産の牛肉は， C/ C比の数値が国産やしたヘムFeならびに和光純薬工業が発売してい豪州産より高く，Ｃ４植物であるトウモロコシがる硫酸鉄（Ⅱ）七水和物（以下硫酸鉄）をサンプ

餌に多く含まれていることを意味した結果となる

ルとして用い，実験を実施した。

13

12

2.1

ことも報告されている６）。

サンプル調整一方，生体に対する同位体の影響では，マウス

ILS（株）より提供された，ベルギー産，オラにおいて，血漿中Caの同位体比（ Ca/ Ca比）は

ンダ産，スウェーデン産，スペイン産の家畜豚由

餌中のその比とほぼ同じ値を示すが，骨中Caのそ

来の血粉並びに同血粉から調製したヘムFeと硫の比は，餌中のものより有意に低値であり，軽い酸鉄をサンプルとして使用した。試験に使用した

質量数の Caを骨中に選択的に蓄積していた 。まヘムFeの調整は，まず血粉を温水に溶解させ，た，ヒトの赤血球と血漿中のFeの同位体比を比較

タンパク分解酵素を添加することでグロビン部分

すると，赤血球では Fe/ Fe比が血漿中より低く，を酵素分解し，限外濾過膜処理によって不要成分

赤血球に含まれるFeは軽い質量数の54Feを濃縮しを除き，ヘムFe含量を上昇させ，スプレードラている可能性が認められている 。このように同イにて粉末化したものである。これらのサンプル

44

42

42

７）

56

54

８）

© The Ito Foundation

100

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

を，有害金属測定用グレードの硝酸，過塩素酸，

ICPMSはAgilent社のAgilent7700を使用し，定過酸化水素（すべてキシダ化学株式会社製）を用

量分析はヘリウムモードを使用した。同位体比のい，ホットプレート上で湿式灰化し，サンプル溶

測定には同位体モードを使用し，積分時間を12液の調整を行った。上記操作を要約すると，定量

秒，スイープ回数を100回，繰り返し回数を１サ

評価用のサンプルとしては，ヘムFeに関しては，

ンプルに対して10回とした。

Fujimoto等の方法に基づき，約４mgのサンプル

なお，同位体比は，Fe標準液の同位体比に対を５mLのメスフラスコに入れ，硝酸を３mL加するサンプルのFe同位体比の比率で表し，下記

え，約６時間ホットプレート上で加熱し，サンプの式から求めた。

ルを完全に溶解させたものを９mLにメスアップ
し使用した 。血粉に関しては，Yoshikawa等のFe／トータルFeの場合，

56

９）

方法に基づき，約４mgのサンプルをトールビー－１］×1000（‰）
［Ｒ
Ｒ

56

カーにはかりとり，上記３種の酸を用いて，トー
ルビーカーの底に白い灰が残るまで150℃に設定したホットプレート上で過熱処理（湿式灰化）を行った。その後，室温に戻るまで放置し９mLに

試料

δ Fe＝

Ｒ＝

標準

Fe
トータルFe56

３．結果と考察メスアップした10）。同位体比測定のサンプルに関

3.1

しては，ヘムFe，血粉ともに，約1.5 mgのサン測定に用いた８種のサプリメント用サンプルのプルをトールビーカーにはかりとり，上記三種の元素の定量結果

定量結果を，Table１に示す。

酸を用いて，トールビーカーの底に白い灰が残る測定した元素は，Mg，Ca，Fe，Cu，Zn，Pb

まで150℃に設定したホットプレート上で過熱処の６種で，Feの含有量が最も多い結果となった。

理（湿式灰化）を行い，各種サンプルが約100

また，ヘムFeは血粉を濃縮して製造していること

ppbになるように希釈してサンプルとした。

から，ヘムFe中の鉄の含有量が血粉より上昇して2.2

定量評価ならびに同位体比の測定いることは理にかなっていた。Fe以外の他の元素

2 . 1で調整したサンプルと同位体比測定のために関しては，血粉とヘムFe間で有意な増減は認の認証標準物質としてアメリカ国立標準技術研究

められなかったが，CaとMgはヘムFe中で増加し

所 （NIST） が 製 造 販 売 し て い る Fe 標 準 液ている傾向があった。これは，ヘムFe製造の際（3126a）を用い，
ICPMSを使用して実験を行った。

に濃縮の工程があるため，比較的血粉中に多く含定量評価で用いた検量線は，和光純薬工業が販まれているCaとMgも濃縮されたたためと考察し売し て い る Mg，Ca ，Fe，Cu ，Zn ，Pb の1000た。また，６種の元素の産地による含有量の違い

mg/Lの標準液を用い，０ppb，5 ppb，10 ppb，は，ベルギー産のものでMgが低い傾向にあった。

50 ppb，100 ppb，500 ppbとなるように溶液を3.2希釈し使用した。内標準物質としては，インジウ

Fe同位体比測定用サンプルを，ICPMSを用いムを１ppbになるように添加した。また，Feの同て測定し，δ54Feとδ56Feの相関ならびに，δ56Fe

位体比測定においては，標準液として，NIST製とδ57Feの相関の結果をFig.１に示す。

の認証標準物質を用いて100 ppbの溶液を調整し，同位体標準液とした。

Feの安定同位体比の測定結果

Feには，質量数が54（5.845％），56（91.754％），
57（2.119％），58（0.282％）の４種の同位体が存© The Ito Foundation

101

畜産物由来サプリメントの新規評価法の開発
Table 1 Mineral concentration of the blood powder and heme Fe
mg/g

Ca

Fe

Cu

Zn

Pb

スウェーデン産

0.26

0.17

2.2

0.010

0.07

0.007

オランダ産

0.29

0.16

2.4

0.006

0.02

0.001

スペイン産

0.29

0.15

2.5

0.006

0.11

0.002

血粉

Mg

ヘム鉄

1.00

ベルギー産

0.24

0.13

1.9

0.006

0.02

0.002

スウェーデン産

0.59

0.65

18.9

0.005

0.06

0.001

オランダ産

0.81

0.37

18.9

0.006

0.07

0.001

スペイン産

1.18

0.91

17.3

0.009

0.06

0.001

ベルギー産

0.28

0.20

18.4

0.004

0.03

0.001

1.00

硫酸鉄

0.50

0.00

δ56Fe（‰）

0.50
δ56Fe（‰）

硫酸鉄

ヘムFe

－0.50

0.00

ヘムFe

－0.50
－1.00

－1.00

血粉

血粉
－1.50
－4.0

－2.0

0.0

2.0

4.0

－1.50
－3.0

－2.5

δ54Fe（‰）

－2.0

－1.5

－1.0

－0.5

0.0

δ57Fe（‰）

Fig. 1 The relationship among the blood powder, heme Fe, and, FeSO4・7H2O on isotope ratio of Fe

在し，また，トータルのカウントに対する各同位プチドも存在しているため，それらがFeの配位体の比が計算できるため，それぞれの同位体比の子となり，同位体分別（選択的な取り込み）効果

表し方は４通り存在し，同位体の種類が４つあるが血粉では存在し，天然の存在比から乖離し，血ため，192種類の相関の表し方が存在するが，天粉からヘムFeを濃縮する過程において，天然存然存在比の低い質量数の元素のICPMSを用いた在比に近づいた可能性も考えられた。一方，湿式

同位体比分析は実用的ではないとの報告もあるた

灰化の際にも血粉やヘムFe，硫酸鉄において，め ，本研究における同位体比の評価は Feを除

サンプルの様態が異なることも観察されたため，

く３通りとし，同位体の種類が３つあるため，54

灰化方法の見直しも今後の課題の一つになるかも

種類の相関の表し方が存在する。その中でも，今しれない。一方，産地による違いは，各産地由来

回は，トータルのカウントに対する各同位体の比のサンプルが一種類のみであったので，正確に比を観察した場合，δ Feの値が，硫酸鉄と血粉中較することはできなかったが，ヘムFeと血粉中のFeとヘムFeとの間で乖離していることが明らのFe間で，同じ地域のサンプルが同じような動かとなった。鉄の同位体の存在割合は， Feが最きをしていないため，地域による差は認められなも多いため，その変化が最も顕著に表れた可能性

いと考えられた。

11）

58

56

56

がある。また，血粉中には多くのタンパク質やペ今回の研究によって，四重極型のICPMSを用© The Ito Foundation

102

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

いてのFeの同位体比測定のプロトコール作成はロンチウムや鉛の同位体の測定，並びに微量金属

ほぼ完成したといえる。現状の同位体比測定の分の測定などを組み合わせての評価が進んでいる。

野 で は ，多 く の 場 合 は ，マ ル チ コ レ ク タ ー

このような背景のもと，サプリメント素材として

ICPMS（MC-ICPMS）を用いての測定が多数で使用される家畜豚由来の成分（血粉ならびにヘム

あるが，装置が非常に高額であり，簡単に同位体

Fe）に含まれるFeの同位体を測定することで，比の測定が行える状況ではなかった。今回100含有成分や産地の違いがFeの同位体に現れるか

ppbというある程度濃いサンプル領域においてどうかの検討を行った。その結果，血粉とヘムは，四重極型のICPMSを使用した場合でも，測Fe中の 56Feに関して，トータルのFeに対する比定が可能であることが分かり，また，低濃度からに差が生じていた。今後，再現性や各種詳細な実高濃度領域までの検量線の作成を行うと，10 ppb

験条件の検討を行うことで，家畜豚由来成分の素～200 ppbの範囲においては，再現性良く同位体材の判別やそれらサプリメント素材の代謝ルート比の測定を行うことができることも判明した。

解明に同位体比を使用できる可能性があり，今後

今回の研究結果は，同ロットのサンプルのみの測定であるため，他のロットでも同様の傾向が観察されるのかなど，今後検討しなければならない

この分野のさらなる発展が期待される。
５．謝辞

課題は多数ある。一方で，本申請課題の研究が発同位体比並びに微量金属の定量実験において展していくと，吸収性の良し悪しで多くの場合議は，京都薬科大学のICPMSの使用をさせて頂き論されている無機Feと有機Feの違いにもう一つました。装置の管理分野である代謝分析学分野の同位体比という物性データを付け加えることがで安井裕之教授に深く御礼申し上げます。

き，新たなサプリメント開発のきっかけになる可能性を秘めている。特にサプリメント原料は，諸外国からの輸入に頼っていることが多いため，現在の日本においては，食品やサプリメントの安全性の担保が声高に叫ばれており，サプリメントの原料である血粉と，商品化されたサプリメント（ヘムFe）との間でδ 56Feの同位体比に違いがあることが再現性良く検出できれば，原料の判別に本法を利用することができ，原料の偽装問題が疑われた時に役立つ一つの方法としての同位体比測定の可能性を提案することができる日も遠くはな
いと考えられる。
４．要

約

近年生態系の研究に安定同位体が広く使用されてきている。食品の産地判別には，水素，炭素，

文献１） 大野剛，平田岳史：分析化学，53，631～644，
2004.
２） 有山薫：分析化学，63，205～220，2014.
３） 植木眞琴：分析化学，63，161～169，2014.
４） 伊永隆史：臨床化学，38，257～265，2009.
５） Suzuki, Y., Chikaraishi, Y., Ogawa, N., Ohkouchi,N., Korenaga,T. : Food Chem, 109, 470～475, 2008.
６） Nakashita, R., Suzuki, Y., Akamatsu, F., Iizumi, Y.,
Korenaga, T., Chikaraishi, Y. : Anal Chim Acta, 617,
148～152, 2008.
７） Hirata, T., Tanaoshima, M., Suga, A., Tanaka, Y.,
Nagata, Y., Shinohara, A., Chiba, M. : Anal Sci, 24,
1501～1507, 2008.
８） Friedhelm, von, B., Marcus, O., Dietmar, G. S.,
Kirsten, van, Z., Hans-Peter, G., Alan, J. S., Sylvie, S.,
Daniel, K., Piet, S. : Metallomics, 6, 2052～2061, 2014.
９） Fujimoto, S., Yasui, H., Yoshikawa, Y. : J Inorg
Chem, 121, 10～15, 2013.
10） Yoshikawa,Y., Adachi, Y., Yasui, H., Hattori, M.,
Sakurai, H. : Chem Pharm Bull, 59, 972～977, 2011.
11） 馬淵久夫，宮崎章，山下信義編：同位体環境分析，
pp273-280，丸善出版，東京都，2013.

窒素，酸素の４種類の安定同位体を中心に，スト© The Ito Foundation

103

豚肝臓由来ペプチドが肝線維化に及ぼす影響（Ⅱ）
Effect of dietary peptides derived from porcine liver on hepatic fibrosis（Ⅱ）

實

安

隆

興

（神戸大学大学院農学研究科）

Takaoki Saneyasu（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

Not only edible meat products but also by-products are valuable sources of essential
nutrients such as protein, minerals, and vitamins. For example, liver contains an abundance ofprotein and vitamins. Nevertheless, there is little attention to the biological functions of theseproducts, and consequently they has been wasted. In the present study, we investigated theeffects of peptides from pig liver（liver peptide）on mouse liver after carbon tetrachloride（CCl4）-induced injury. In the liver of mice fed liver peptide, the mRNA levels of collagen α1（Ⅰ），α1（Ⅲ）, and α1（Ⅴ）chain increased 3 day after CCl4 injection. In contrast, collagenα1（Ⅰ）mRNA level increased in the liver of mice fed normal diet 3 day after the injection. It
is therefore possible that type Ⅲ and Ⅴ collagen play an important role during hepatic tissue
repair after CCl4-induced injury in mice fed liver peptide.

１．目

レバーは，タンパク質とビタミンを豊富に含む的食材であるが，嗜好性が悪く，ヒトの食材として世界人口の恒常的な増加や農産物生産量の低は十分に活用されていない。しかしながら，古く

下，さらには穀物のバイオエタノール生産への利から，肝臓ペプチドを主成分とする肝水解物は肝用など，世界の食糧事情は今後もさらに厳しくな疾患用の薬として用いられており，最近では，健ることが予想されている。ここで，我国は家畜の康ドリンク用の食品素材としても利用されつつあ

飼料原料のほとんどを輸入に依存していることかる。しかしながら，意外にもその肝機能改善作用

ら，畜産物は可能な限り無駄なく利用するべきで機構の詳細は明らかにされていない。それゆえ，ある。しかしながら，食用に適さない内臓や血液

肝臓ペプチドの肝機能改善機構の詳細を明らかに

等の畜産副生物は，その高い栄養価にもかかわらすることができれば，機能性食品素材としての需ず廃棄されている。このことは，食物の有効利用

要をさらに増加させることにより，廃棄食材の量の面に加え，環境および廃棄コストの面からも解の減少に寄与できると判断される。

決するべき課題となっているが，いまだ十分な成果はあがっていない。

昨年度，申請者はマウスを用いて肝臓ペプチドの給与が四塩化炭素誘発性の急性肝障害に及ぼす© The Ito Foundation

104

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

影響を調べた。その結果，25mg/kg体重の四塩－80℃で保存した。凍結保存した肝臓からセパ化炭素を腹腔内投与した翌日の肝臓中のコラーゲ

ゾールRNA I（ナカライテスク株式会社）を用いン遺伝子の発現量は肝臓ペプチドの給与により減て総RNAを抽出し，コラーゲンの遺伝子発現量

少した（Ⅰ型コラーゲン，ｐ＜0.1；Ⅴ型コラー

を ABI 7300 Real Time PCR System（ア プ ラ イ

ゲン，ｐ＜0.05）。しかしながら，この量の四塩

ドバイオシステムズジャパン株式会社），プライ

化炭素をマウスに単回投与した場合，投与から１マー（Table ２），お よ び SYBR Premix Ex Taq II

週間程度で損傷した組織は完全に修復されるもの（Tli RNaseH Plus）（タカラバイオ株式会社）をと過去の報告から予想される。したがって，豚肝用いたリアルタイムPCRにより解析した。

臓ペプチドの給与が肝障害に及ぼす影響の詳細を明らかにするためには，投与後の経時的変化を調べる必要がある。

３．結果

投与経過日ごとに対照飼料給与区および試験飼

本研究では，畜産物の有効利用のための一環と料給与区を比較したところ，試験飼料給与区におして，畜産物由来ペプチドの新規機能性開発を目

い て ，Ⅰ ，Ⅲ お よ び Ⅴ 型 コ ラ ー ゲ ン α １ 鎖的として，豚肝臓ペプチドの給与がマウスにおける四塩化炭素誘発性の肝障害に及ぼす影響についTable 1 Composition of experimental dietsて経時的に調べた。
２．方（g/100g diet）

法

昨年度と同様に，カゼインをタンパク質源とす
る対照試料，あるいはタンパク質換算で対照飼料
中のカゼインの1/3量を豚肝臓ペプチドに置換した試験飼料（Table１）を６週齢のICRマウス（日本エスエルシー株式会社）に４週間給与した後，

CaseinPeptides from pig liver
L-CysteinCorn starch
SucroseSoybean oil
Cellulose
Mineral mixture1）

Control

Liver peptide

20
0
0.3
53
10
7
5

13.3
8.7
0.3
53
10
7
5

3.5
1
0.00140.25

3.5
10.00140.25

25mg/kg 体 重 の 四 塩 化 炭 素 を 腹 腔 内 に 投 与 しVitamin mixture2）
tert-Butylhydroquinone
Choline-tartrateた１）。投与前，投与３，５および７日後に麻酔下1） AIN-93G Mineral mixture（Japan SLC, INC., Shizuoka,

で安楽死させ，肝臓を採取した。採取した肝臓は
重 量 を 測 定 後 ，液 体 窒 素 に て 素 早 く 凍 結 し ，Japan）2） AIN-93G Vitamin mixture（Japan SLC, INC., Shizuoka,
Japan）

Table 2 Primer sequences used for real-time PCR analysis
Gene name
Collagen Ⅰ A1
Collagen Ⅲ A1
Collagen Ⅴ A1
Ribosormal protein S17

Forward primer
Reverse primer
Forward primer
Reverse primer
Forward primer
Reverse primer
Forward primer
Reverse primer

5ʼ-ggg cga gtg ctg tgc ttt-3ʼ
5ʼ-ggt ccc tcg act cct aca tct tc-3ʼ
5ʼ-ctg taa cat gga aac tgg gga aa-3ʼ
5ʼ-cca tag ctg aac tga aaa cca cc-3ʼ
5ʼ-gag gac cac aca ggg aag c-3ʼ5ʼ-ctt gta gac act gag agc aat tcg-3ʼ
5ʼ-ccg ggt cat cat cga gaa gt-3ʼ
5ʼ-gcg ctt gtt ggt gtg gaa gt-3ʼ

© The Ito Foundation

豚肝臓由来ペプチドが肝線維化に及ぼす影響（Ⅱ）

105（COL1A1，COL3A1およびCOL5A1）の遺伝子

し，組織や臓器の構造維持に必須の細胞外マト

発現量は，試験飼料給与区において有意に高い値

リックスタンパク質である２）。また，組織損傷後を示した（Fig.１）。また，試験区ごとにそれぞの治癒過程において，コラーゲンは活性化した線れの遺伝子発現量の経日的変化を調べたところ，維芽細胞，あるいは線維芽細胞様に変化した細胞

対照飼料給与区においては，COL1A1 mRNA量により産生・分泌され，損傷部の修復に重要な役のみ投与３日後に投与前に比べて有意に増加した割を果たしている。分泌されたコラーゲンはアッが，試験飼料給与区においては今回調べたすべて

センブリするが，そのアッセンブリは一般的にのコラーゲンのmRNA量が投与３日後に有意にフィブロネクチン依存的とされている。しかしな

増加した。

がら，最近，肝臓フィブロネクチンを特異的に

４．考ノックアウトしたマウスの肝臓においても，四塩

察化炭素投与による肝障害後にコラーゲンのアッセ

コラーゲンは脊椎動物の体内に最も多く存在

ンブリが生じること，およびそのアッセンブリは
TGF-βおよびⅤ型コラーゲン依存的であることが報告されている３）。本研究において，対照飼料

10
8
AU

を給与したマウスでは，投与前に比べて投与３日

Col1a
＊＃

後のCOL1A1 mRNA量のみが有意に増加したが，豚肝臓ペプチドを給与したマウスではCOL1A1に6
4加えてCOL5A1のmRNA量も投与３日後に有意＃2に増加した。これらのことから，四塩化炭素によ0る肝障害後の治癒過程において，豚肝臓ペプチド25

給与マウスではⅤ型コラーゲンが重要な役割を果

Col3a
＊＃

たしている可能性が考えられた。
また，投与３日後において，今回調べたすべて

15のコラーゲン遺伝子のmRNA量は，対照飼料給10

与マウスに比べて豚肝臓ペプチド給与マウスの肝5臓において有意に高い値を示したが，投与前およ0び投与５日目以降において有意な差は認められな

AU

20

2.5
2

かった。これらのことから，豚肝臓ペプチド給与

Col5a
＊＃

による四塩化炭素投与後のコラーゲン遺伝子の発現増加は一時的なものであり，肝線維化を促進す

AU

1.5

るものではないと考えられた。今後，組織標本に1よる評価や，慢性肝障害モデルでの試験によりそ0.5
0の確認を行う必要がある。
Control Liver Control Liver Control Liver Control Liver
Day o
Day 3
Day 5
Day 7

Fig. 1 Effects of peptides from pig liver on collagenmRNA levels in mice liver.

昨 年 度 の 報 告 で は ，四 塩 化 炭 素 投 与 翌 日 のCOL1A1およびCOL5A1のmRNA量は豚肝臓ペプ
チドの給与により低い値を示し，本年度の結果と© The Ito Foundation

106

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）は逆の傾向を示した。投与翌日は主としてフィブ

素投与３日後のⅠ，Ⅲ，およびⅤ型コラーゲンα

ロ ネ ク チ ン と フ ィ ブ リ ン か ら な る provisional

１鎖の遺伝子発現量は，投与前に比べて有意に増matrixが障害を受けた肝臓で形成されていると加したが，対照飼料給与マウスの肝臓ではⅠ型コ

過去の報告から考えられるが，細胞外マトリック

ラーゲンα１鎖の遺伝子発現量のみ投与前に比べスはコラーゲンの遺伝発現を促進するTGF-βのて有意に増加した。これらの結果から，四塩化炭

活性化を調節することが知られている。したがっ素による肝障害後の治癒過程において，豚肝臓ペて，組織障害後に形成されるprovisional matrix

プチド給与マウスではⅢおよびⅤ型コラーゲンがの量あるいは構造が豚肝臓ペプチド給与により変重要な役割を果たしている可能性が考えられた。

化し，その結果，コラーゲンの遺伝子発現量が減少したのかもしれない。今後，再現性の確認も含めて詳細に検討する必要がある。
５．要

約

本研究では，畜産副生物の利用法開発のための一環として，豚肝臓ペプチドの給与がマウスの四塩化炭素誘発性の肝障害に及ぼす影響を調べた。
豚肝臓ペプチド給与マウスの肝臓では，四塩化炭

文献１） A n u t r i e n t m i x t u r e s u p p r e s s e s c a r b o n
tetrachloride-induced acute hepatic toxicity in ICR
mice, Hum Exp Toxicol, 27, 559～566, 2008.
２） Mander, L. N., Liu, H. W. : Comprehensive natural
products II, chemistry and biology, 469～530, Elsevier,Oxford, 2010.
３） Saneyasu, T., Yoshioka, S., Sakai, T. : Mechanismsof collagen network organization in response totissue/organ damage : Composition and Function of
the Extracellular Matrix in the Human Body, 235～
260, INTECH, 2016.

© The Ito Foundation

107

黒毛和種におけるRBP4多型と枝肉形質の関連解析
Association analysis between RBP4 gene polymorphisms and carcass
traits in Japanese black cattle

平

野

貴・原

ひろみ・半

澤

惠

（東京農業大学農学部）

Takashi Hirano, Hiromi Hara and Kei Hanzawa（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture）

Marbling is most characteristic feature in Japanese Black cattle, and it is known that thevitamin A（VA）restriction improves marbling significantly. In addition, it is known that VA
has many physiological functions. RBP4 transports retinol, which is a converted VA in liver, tothe target tissues（cells）from liver. Therefore, it was suggested that polymorphisms on RBP4
gene affects to carcass traits. We searched polymorphisms on RBP4 in Japanese Black cattle,. However,and detected c.237C＞G（exon 3）,c.355＋26C＞T（intron 4）and c. ＊ 50A＞G（exon 6）
for exon 1, 2 and their flanking region, search of polymorphisms had not been sufficiently due
to obtain only a few sequence data. In the fattened population composed of 176 cattle, theanalysis using these 3 SNPs showed that RBP4 significantly associated with carcass weight（P＜ 0.05）. However, it was suggested that the association between RBP4 and carcass weight
was not caused with these SNPs, but other new polymorphism（s）．
In this study, we searched again polymorphisms on exon 1, 2 and their flanking region,and c.-19＋21delG was detected on intron 1. To perform association analysis in the fattened
population composed of 260 cattle, c.-19＋21delG was genotyped these 260 cattle, and the 3
SNPs were genotyped additional 84 cattle. In the analysis using these genotype data, it was
validated that RBP4 might associate with carcass weight. However, it was suggested that c.-19＋21delG was not cause of the association. Furthermore, we searched polymorphisms locating
on a region from 5ʼ end of exon 1 to 1,439 bp upstream, and 10 SNPs were detected. We needto perform an association analysis between these SNPs and carcass weight.

１．目

QTLの責任遺伝子を特定するための解析が進め的ら れ ，枝 肉 重 量 に 関 す る 責 任 遺 伝 子 と し て

黒毛和種は脂肪交雑に優れた品種である。これ

NCAPG （chromosome condensation protein G）

までに，黒毛和種の父方半きょうだい家系を用いが同定されている４）。また，脂肪交雑の候補遺伝

たQTL（Quantitative trait locus）解析により，子 と し て EDG1 （Endothelial differentiation

脂肪交雑や枝肉重量など枝肉形質と関連する染色sphingolipid G-protein-coupled receptor 1），TTN

体領域が複数箇所検出されている（Titin）やMYBPC1（Myosin binding protein C,

。これら

１～３）

© The Ito Foundation

108

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

slow type）の5’または3’UTRやプロモーター領域に位置するSNPが探索され，これらと脂肪交雑の関連が示されている５～７）。
ビタミンＡ（VA）は，レチノール，レチナー

域に存在する多型も探索した。
２．材料および方法
2.1

共試個体

ル，レチノイン酸などの総称であり、その生理作

RBP4多型を探索するために，2009～2010年の用は視覚維持，成長作用，生殖作用，細胞増殖・期間に耳片組織が収集された生後20日以内に死亡

分化，免疫機構，および転写調節など多岐に渡るした黒毛和種490頭から同一種雄牛の産子が２頭ことが知られている。また，黒毛和種の肥育は血を超えないように選抜した69頭のゲノムDNAを中VAを低レベルにして行われ，肥育牛の血中用いた（多型探索用集団）。また，多型と主要なVA濃度と脂肪交雑に有意な負の相関があること

枝肉形質（枝肉重量，ロース芯面積，バラ厚，皮や，VAが脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を抑制す

下脂肪厚，推定歩留，BMS）の関連を調べるた

ることが示されている

めに，2003～2008年の期間に東京都中央卸売市場

。

８～11）

VAはレチニルエステルとして小腸絨毛から吸食肉市場および大阪市中央卸売市場南港市場で腎収され，リンパ管を経て肝臓に送られて貯蔵され周囲脂肪組織と各種枝肉形質データが収集されたる。このVAはレチノールに変換され，Retinol-

サンプルを用いた。これらから月齢が23～39ヶbinding protein4（RBP4）と結合し，血管を通し

月，枝肉重量が300～700㎏の範囲である肥育去勢て各臓器へ輸送される

12，13）。我々は，このRBP4

牛20,493頭を選抜し，さらに，同一種雄牛の産子

遺伝子の多型が枝肉形質に影響すると考え，黒毛が３頭を超えないように1,234頭を選抜した。こ和種69頭を用いてRBP4のエクソンを中心に多型

れらのうち，2003年に収集した260頭のゲノムを探索し，c.237C＞G（同義置換：エキソン３），

DNAを用いた（関連解析用集団）（Table１）。既c.355＋26C＞T（イントロン４）およびc. 50A＞

存3SNPsについては，この集団のうち同一種雄牛

G （3’UTR ： エ キ ソ ン ６） の 3SNPs を 検 出 しの産子を含まない176頭は解析済みのため，未解た14）。エクソン１と２の多型は検出されていない

析の84頭を追加した。

＊

が，多型探索のシークエンシングで配列データが2.2得られた頭数が少ないため，十分な多型探索の結RBP4のエクソン１，２とその周辺の多型を，果とは言えない 。これまでに検出されている

これらエクソンの外側に各々配置したプライマー

3SNPs（既存3SNPs）と主要な枝肉形質の関連をセット用いて多型探索用集団で得られたPCR産物

肥育去勢牛176頭で解析したところ，RBP4と枝のシーケンシングにより探索した（Table２, Fig.

肉重量の関連が示唆された。しかし，これら３１）14）。遺伝子上流域の多型探索は，エクソン１

SNPsはアミノ酸置換を伴わずRBP4機能に影響の５’端から上流約3.0kbをカバーするように配置しないと思われることから，新規のRBP4多型がしたプライマーのうち，約1.4kbを増幅するup4F

枝肉重量に関係していることが示唆された 。

とup6Rで同様に得られたPCR産物をこれらプラ

14）

15）

多型探索

本研究では，多型が十分に探索されていないエ

イマーとup5F，up6Fの４プライマーでシーケン

クソン１と２の多型を改めて探索し，新規多型をスした（Table２，Fig.１）。エクソン１と２に対含めたRBP4多型と枝肉形質との関連を肥育去勢するPCRは，プレ熱変性（94℃：２分）を行った

牛260頭で解析した。さらに，RBP4遺伝子上流

後，熱変性（94℃：１分），アニーリング（60℃：© The Ito Foundation

109

黒毛和種におけるRBP4多型と枝肉形質の関連解析
Table l Phenotypes in the population（n＝260）
Mean

SE

Minimum

Maximum

CW（kg）

464.072.85

338.00605.60

REA（cm2）

53.69

0.53

33.00

95.00

RT（cm）

7.56

0.05

5.10

10.00

SFT（cm）
YEP（％）

2.62
73.29

0.05
0.09

0.90
69.50

6.00
78.90

BMS

5.15

0.11

2.00

11.00

CW : Carcass weight

REA : Area of rib eye

RT : Rib thickness

SFT : Subcutaneous fat thikness

YEP : Yield estimated percentage
BMS : Beef marbling standard
Table 2 Primers for search of polymorphisms
Primer sequence（5ʼ→3ʼ）
RBP4-ex1
RBP4-ex2

RBP4-upF

GCGCGTTATGCAAGTGCTGG

R

ACACCCACTCCATCTCGCTCF

ATGGGTGTGATGAGGGTCTG

R

GCGACGATGTTGTCTTGCAG

4F

GCTCCTAGTTAGCTGGTAGG

6R

AGACCCTCATCACACCCATC

5F

GACCATTGACGTCACAGACG

6F

GCGGAAACAGTCCCAAACTC

Size（bp）

Usage

427

PCR, Sequencing

447

PCR, Sequencing

1578

PCR, Sequencing
Sequencing

RBP4-ex2（447bp）
RBP4-ex1（427bp）
ATG
6R

RBP4-up4F6R（1,578bp）
up1F

2F

1R

3F

2R

4F

3R

3,094bp

5F

4R 6F

1,439bp

5R
Exon

1

2

3

c.-19+21delG

Fig. 1 Primers for search polymorphisms on exon 1, 2, their flanking region and upstream region.
Laid triangles indicate primers, and filled one indicates used primers in this study. Boxes indicate exons, andvertical triangle indicates c.-19＋21delG position. ATG is initiation codon.

１分），伸長反応（72℃：１分）を35サイクル繰

とによって多型を探索した。また，上流域約1.4kb

り返し，最終伸長反応（72℃：10分）を行った。

の多型探索は，PCR産物から４つのプライマーで上流域約1.4kbに対するPCRは，上記条件の伸長得られた配列データのうちQualityスコアが40以

反応時間を２分に変更して行った。

上の部位を用いてアライメントし，３個体以上でエクソン１，２に対するPCR産物のシーケンシン

カバーされた領域の配列データをUMD3.1と比較

グによって得られた塩基配列をデータベースに登して行った。また，エクソン１，２およびその周録されているウシRBP4塩基配列（NM_001040475）

辺で検出された多型については，関連解析用集団およびウシゲノム配列（UMD3.1）と比較するこ260頭の型判定も行った。

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110

平成28年度2.3

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

あり，del/del型は検出されなかった。各アレル

既存３SNPsの型判定

RBP4c.237C＞G，c.355＋26C＞Tおよびc. 50A

頻度は，Ｇアレルが0.957であり，delアレルが0.043＞Gの型判定を関連解析用集団について，３種のであった（Table４）。このindelと各種枝肉形質とプライマーセットを用いて行った（Table３，Fig.

の関連を調べるために，関連解析用集団260頭を。PCRは，エクソン１と２に対するもの

型判定した。関連解析用集団における各ジェノタと同じ条件で行った。得られたPCR産物をシーケ

イ プ 頻 度 は ，G/G 型 ： 0.896 ，G/del 型 ： 0.10 ，ンスし，決定した塩基配列に基づいて各SNPの型

del/del型：０であり，各アレル頻度はＧアレル：判定を行った。

0.948であり，delアレル：0.052であった。そこで，＊

２）

14，15）

2.4

各種枝肉形質について，G/G型とG/del型間の平統計解析

関連解析用集団の各多型の型判定結果に基づい均値差を検定したところ，G/del型の枝肉重量がてグループ分けした。各ジェノタイプ間の枝肉形

有意に低いことが示された（Ｐ＝0.05）。また，質の平均値差をエクセルの分析プログラムを用い

いずれの集団においてもHardy-Weinberg平衡にて分散分析およびダンカンの多重比較検定を行従っていた（Table４）。このことから，この多型

い，各種枝肉形質とRBP4多型との関連を調べた。

は子牛死亡に関連していないことが示唆された。
次に，関連解析用集団176頭の解析が終了して３．結果と考察

い る RBP4c.237C ＞ G ，c.355 ＋ 26C ＞ T お よ び c.

RBP4のエクソン１と２およびその周辺に位置

50A＞Gについて追加個体84頭の型判定を行い，＊する多型を探索したところ，イントロン１に位置

260頭の解析用集団として各種枝肉形質との関連

す る indel（c.-19＋21delG）が 検 出 さ れ た（Fig.

を解析した。その結果，c.355＋26C＞Tの各ジェ１）。多型探索用集団における各ジェノタイプ頻

ノタイプ間において，枝肉重量の平均値差に有意度は，G/G型とG/del型がそれぞれ0.913と0.087で傾向が見られた（ｐ＝0.08）（Table５）。

Table 3 Primers for SNP genotyping
SNP

Primer sequence（5ʼ→3ʼ）

c.237C＞Gc.355＋26C＞T
c.＊50A＞GRBP4-ex3（438bp）
Exon

1

2
ATG

Size（bp）

F

GAGAACTTCGACAAGGCTCGR

ACACACGTCCCAGTTACTGC

F

TCCGTCTCTTAAAGTCAGTGC

R

AGTTCTGGCTACTTACACACGFTTACAAGTACATCTAGCTGTCCRGCTAGAACAGACCGAAGGTC

RBP4-ex4（407bp）

3
c.237C>G

4

438
407
590

RBP4-ex6（590bp）
5c.355+26C>T6
TAG c.＊50A>G

Fig. 2 Primers for genotyping of c.237C＞G, c355＋26C＞T and c.＊50A＞G.
Boxes indicate exons, and filled triangles indicate each SNP position. ATG is initiation codon, and TAG isstop codon.

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111

黒毛和種におけるRBP4多型と枝肉形質の関連解析
Table 4 Genotype and allele frequency of a new variant
SNP

Populationc.-19＋21delG（5ʼUTR）

Genotype frequency（n）

n

G/G

HWE＊

Allele frequency

G/deldel/delP

G

delVaridation

69

0.913（63）0.087（6）

0（0）

＞0.7

0.957

0.043

Association

260

0.896（233）

0.100（27）

0（0）

＞0.3

0.948

0.052

＊：Hardy-Weinberg equilibrium test

Table 5 Association analysis between RBP4 and carcass traitsc.-19＋21delG

genotypen

CW（㎏）

REA（cm2） RT（cm） SFT（cm） YEP（％）

BMS

G/G

233

466.00±3.04

53.89±0.57

7.58±0.06

2.60±0.05

73.33±0.10

5.18±0.11

G/del

27

447.44±7.63

51.93±1.31

7.37±0.14

2.77±0.20

73.00±0.30

4.96±0.29

del/del

0

－

－

－

－

－

－

0.05

0.26

0.22

0.31

0.29

0.55

P

c.237C＞G

C/C
C/G
G/G
P

81
126
53

469.16±4.82
462.61±4.02459.76±7.10
0.4553.26±0.82
53.37±0.77
55.11±1.37
0.40

7.57±0.09
7.56±0.07
7.54±0.14
0.98

2.65±0.09
2.60±0.07
2.60±0.13
0.91

73.14±0.16
73.29±0.1473.52±0.22
0.37

5.09±0.20
5.14±0.15
5.28±0.23
0.81c.355＋26C＞T

C/C
C/T
T/T
P

34
128
98

479.80±7.01
463.56±3.58459.28±5.37
0.08

53.21±1.1453.64±0.76
53.92±0.93
0.91

7.70±0.13
7.59±0.08
7.47±0.09
0.36

2.64±0.11
2.55±0.07
2.69±0.09
0.46

73.09±0.25
73.37±0.1473.26±0.15
0.60

4.76±0.30
5.05±0.15
5.42±0.17
0.11

A/A
A/G
G/G

80
129
51

469.38±4.88
463.18±4.02
458.00±7.02

53.33±0.83
53.28±0.75
55.29±1.41

7.57±0.09
7.57±0.07
7.51±0.14

2.66±0.09
2.61±0.07
2.58±0.13

73.15±0.16
73.28±0.14
73.57±0.23

5.10±0.20
5.15±0.15
5.25±0.24

0.37

0.33

0.90

0.86

0.30

0.88

G-C-C-A/G-C-C-A
G-C-T-A/G-C-T-A

17
16

471.88±8.64a,xy
487.13±12.55a,x

52.24±1.67

7.72±0.20

2.59±0.14

73.12±0.37

4.59±0.37

G-G-T-G/G-G-T-G
P

35

450.25±9.05c,y
0.04

56.94±2.09
55.11±1.78
0.34

7.76±0.20
7.36±0.17
0.23

2.97±0.21
2.64±0.16
0.36

73.23±0.36
73.49±0.28
0.71

5.69±0.49
5.54±0.29
0.12

c.＊50A＞GP
4 polymorphisms
Homozygous
a-c: p＜0.05
x-y: p＜0.01

c.-19＋21delGのdel/del型個体は検出されていＧ-Ｃ-Ｔ-Ａ型（487.13±12.55㎏）はＧ-Ｇ-Ｔ-Ｇない。そこで，これら４多型の組み合わせによる型（450.25±9.05㎏）よりも有意に高いことが示

RBP4遺伝子型と各種枝肉形質の関連を調べるた

された（Table５）。これらc.355＋26C>Tと多型のめに，c.-19＋21delGがＧアレルホモ型である個組み合わせによる遺伝子型で示された結果は，体のうち，その他3SNPsがホモ型である個体を選176頭の関連解析用集団で得られたものと同様で抜した。c.-19＋21delG-c.237C＞G-c.355＋26C＞

あった。

T-c.＊50A＞Gによる遺伝子型がＧ-Ｃ-Ｃ-Ａホモ

関連解析用集団260頭の平均枝肉重量は464.07（17頭），Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ａホモ（16頭），Ｇ-Ｇ-Ｔ-Ｇ±2.85㎏であり，c.-19＋21delGのdelアレルに負ホモ（35頭）の各種枝肉形質の平均値差を解析しの効果が示唆された（Table１，５）。しかし、c.-19

たところ，枝肉重量に有意差（P＝0.04）が見ら＋21delGがＧアレルを示すRBP4遺伝子型間で枝れた。そこで，ダンカンの多重比較検定を行った

肉重量に差が見られたことから，このindelを含ところ，Ｇ-Ｃ-Ｃ-Ａ型（471.88±8.64㎏）および

む４多型以外にRBP4機能に影響する多型の存在© The Ito Foundation

112

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
Predicted promoter Exon1

Gap-653 G>C-676 G>C-757 T>C-1060 G>T-1097 A>G
-1141 G>A

-1216 G>A
-1235 A>G

-1307 A>G
-1312 G>ATATA box

Fig. 3 Detected SNPs on the upstream region of RBP4 gene.
Triangle indicates indicate SNPs, and each minus number indicate position counted from 5ʼ end of exon1.
：：The region was predicted as promoter by
These regions indicate high homology with human genome.
：These regions were not covered with
Promoter Scan（https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）.
at least three individuals.

質と関連するかを解析する必要がある。

が示唆された。
そこで，RBP4転写に影響する可能性がある遺伝子上流域の多型を探索した。エクソン１の5’末

４．要

約

端から上流域3,094bpをカバーするように配置し黒毛和種は脂肪交雑に優れた品種であり，脂肪た プ ラ イ マ ー の う ち ，エ ク ソ ン １ と そ の 上 流交雑形成をさらに高めるために肥育中期のVA給

1,439bpを含む1,578bpを増幅するup4Fとup6Rに与が制限されている。また，VAは様々な生理作

よって多型探索用集団をPCRし，これらプライ用を持つことが知られている。RBP4は肝臓でレマーとup5Fとup6Fを用いて各PCR産物をシーク

チノールに変換されたVAを標的臓器（細胞）にエンスした（Fig.１）。up4Fとup6RのPCR産物か輸送するタンパクであるため，RBP4遺伝子の多ら得られた配列データとエクソン１領域の多型探型は枝肉形質に影響すると考えられた。我々は，索で得られた配列データのQualityスコアが40以

これまでに黒毛和種のc.237C＞G（エクソン３），上の部位を用いてアライメントしたところ，３個

c.355＋26C＞T（イントロン４）およびc.＊50A＞

体以上でカバーできた領域は1,165bp（81.0％）でG（エ ク ソ ン ６）の 3SNPs を 検 出 し た（既 存 ３あった。これら配列データを用いて多型を探索し

SNPs）。しかし，エクソン１，２とその周辺は配たところ，10種のSNPが検出された（Fig.３）。

列データが得られず十分な多型探索が行えていな

こ れ ら SNPs の う ち ，-653G ＞ C ，-676G ＞ C ，い。関連解析用集団176頭におけるこれら3SNPs-757T＞Cの3SNPsはヒトと相同性が高い領域にによるRBP4遺伝子型の解析でRBP4が枝肉重量位置しているため，RBP4遺伝子発現に影響してと 関 連 す る 可 能 性 が 示 さ れ た 。し か し ，こ のいる可能性が示唆された（Fig.３）。また，エク

RBP4と枝肉重量の関連はこれらSNPsによるもソン１の23bp上流から251bpは，TATA boxを含のではなく，まだ検出されていない新規多型の影むプロモーター配列と予測された。しかし，この響によると思われた。そこで，改めてエクソン領域の67.7％は，３個体以上の配列データでカ１，２およびその周辺の多型を探索したところ，

バーできていないGap部位に含まれるため，多型イントロン１に位置するc.-19＋21delGが検出さが探索できていない（Fig.３）。そのため，このれた。このindelについて関連解析用集団260頭のプロモーター領域を含むGap部位の多型を改めて型判定と既存3SNPsについて追加84頭の型判定を探索するとともに，今回検出された多型が枝肉形

行い，各種枝肉形質との関連を解析したところ，© The Ito Foundation

黒毛和種におけるRBP4多型と枝肉形質の関連解析

RBP4遺伝子が枝肉重量と関連する可能性が改めて示された。しかし，この関連は使用した４種の多型によるものではないと思われた。そこで，遺伝子上流域1,439bp位置する多型を探索したとこ
ろ，10種のSNPsが検出された。今後、これら多型と枝肉形質との関連を調べる必要がある。
文献１） Takasuga, A., Watanabe, T., Mizoguchi, Y.,
Hirano, T., Ihara, N., Takano, A., Yokouchi, K.,
Fujikawa, A., Chiba, K., Kobayashi, N., Tatsuda, K.,
Oe, T., Furukawa-Kuroiwa, M., Nishimura-Abe, A.,
Fujita, T., Mizoshita, K., Ogino, A., Sugimoto, Y. :Identification of bovine QTL for growth and carcass
traits in Japanese Black cattle by replication andidentical-by-descent mapping, Mammalian Genome,
18, 125～136, 2007.
２） Mizoguchi, Y., Watanabe, T., Fujinaka, K.,
Iwamoto, E., Sugimoto, Y. : Mapping of quantitative
trait loci for carcass traits in Japanese Black（Wagyu）cattle population, Animal Genetics, 37, 51～54, 2006.
３） Hirano, T., Watanabe, T., Inoue, K., Sugimoto, Y. :Fine-mapping of a marbling trait to a 2.9-cM region
on bovine chromosome 7 in Japanese Black cattle,
Animal Genetics, 39, 79～83, 2007.
４） Setoguchi, K., Furuta, M., Hirano, T., Nagao, T.,
Watanabe, T., Sugimoto, Y., Takasuga, A. : Crossbreed comparisons identified a critical 591-kb region
for bovine carcass weight QTL （CW-2） on
chromosome 6 and the Ile-442-Met substitution in
NCAPG as a positional candidate, BMC Genetics, 10,
43, 2009.
５） Yamada, T., Itoh, M., Nishimura, S., Taniguchi, Y.,
Miyake, T., Sasaki, S., Yoshioka, S., Fujita, T., Shiga,K., Morita, M., Sasaki, Y. : Association of single
nucleotide polymorphisms in the endothelial

113

differentiation sphingolipid G-protein-coupled
receptor 1 gene with marbling in Japanese Black
beef cattle, Animal Genetics, 40, 209～216, 2008.
６） Sasaki, S., Itoh, T., Ogino, A., Kimura, H. : Effects
of a single nucleotide polymorpism in EDG1 andTTN genes with meat production and carcass traits
in Japanese Black beef cattle, 34th Conference ofInternational Society for Animal genetics abstract
book, 168, 2014．
７） Tong, B., Sasaki, S., Fujita, T., Yamada, T. :Association of the SNP in the MYBPC1 gene withmarbling in Japanese Black beef cattle, 34th
Conference of International Society for Animal
genetics abstract book, 149～150, 2014.
８） 社団法人畜産技術協会：ビタミンＡのコントロー
ルを用いた効率的肥育技術Q&A, Vol.2，29，2005．
９） 肉牛大辞典飼育の基本から最新研究まで，農分協，
2013．
10） 岡章生：黒毛和種肥育牛の肉質・増体に対するビ
タミンＡの影響，動物遺伝研究会誌，24，31～36，
1996．
11） 松井徹，鳥居伸一郎，矢野秀雄：ビタミンＡとウシの脂肪細胞分化，動物遺伝研究会誌，24，37～
44，1996．
12） 渭原博：レチノール結合蛋白-4，生物試料分析，
34，354～358，2011．
13） Sun, H., Kawaguchi, R. : The membrane receptor
for plasma retinol-binding protein, a new type ofcell-surface receptor, International Review of Celland Molecular Biology, 288, 7～9, 2011.
14） 平野貴，原ひろみ，半澤惠：黒毛和種の脂肪交雑形成に影響するビタミンＡを輸送するRBP４のDNA
多型探索，平成26年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，33，210～215，2015．
15） 平野貴，原ひろみ，半澤惠：黒毛和種におけるRBP４多型と枝肉形質の関連解析，平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，34，326～331，
2016．

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114

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚の他慢性呼吸器感染症への抗病性機構に関する研究および肉豚生産における抗病性育種豚の有効性に関する考察
Study of the anti-disease mechanism for chronic respiratory infections in
Landrace pigs selectively bred for Mycoplasmal Pneumonia of Swine（MPS）
resistance and the effectiveness of anti-disease breeding regarding pork
production

佐久間

晶子１，２・吉野

淳良１・高橋伸和１・野地智法２・須田義人３・麻生久２（１宮城県畜産試験場，２東北大学大学院農学研究科，３宮城大学食産業学部）

Akiko Sakuma１，２, Jyunryo Yoshino１, Nobukazu Takahashi１,
Tomonori Nochi２, Yoshihito Suda３ and Hisashi Aso２
（１Miyagi Livestock Experimental Station, Miyagi, Japan, ２Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University,
３Department of Food, Agriculture and Environment, Miyagi University）

Chronic respiratory infectious disease of swine happens in pig farms, causing severe
economic damage. Mycoplasmal Pneumoniae of Swine（MPS）is the most common respiratory
disease seen during slaughtering, and Porcine Plueropneumonia（PP）occasionally makes pigs
die suddenly. In a previous study, we recognized the possibility that our landrace pig breed（LA）, which is resistant to MPS without needing an MPS vaccine, is also resistant to PP. In
this study, we compared growth results, pathological lesions and immunological gene presencein lungs, and intestinal flora of LA vaccinated for MPS and PP（Cont.）, LA unvaccinated forMPS（Non-MPSv）, and LA unvaccinated for PP（Non-PPv）. Additionally, we examined theeconomic viability of MPS resistance breeding method in LA.
Histopathologically, the inflammation in lamina propria scores and total microscopic lesion
scores tended to be higher in Non-MPSv pigs than in Cont. and Non-PPv（p＜0.1）. However,
all lung lesion scores in LA in this study were less than those in the general landrace pig breedin our previous study. Also, every group grew up satisfactorily and had similar intestinal flora.
We also compared pork grading of 4 LA pigs with MPS lesions（MPS positive pigs）with 8 LA
pigs with no MPS lesions（MPS negative pigs）. In the grading results of MPS negative pigs,
only high grade pork and middle grade pork was seen.
In conclusion, these growth and pathological results suggest that the LA breed grows up
well and has less MPS related lesions without needing MPS or PP vaccines. In addition, theeconomic result also suggested that reducing the number of MPS pigs in pig farms increases
the amount of high grade pork, which plays an important role in improving the profitability of
pig farms.

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豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚の他慢性呼吸器感染症への抗病性機構に関する研究および肉豚生産における抗病性育種豚の有効性に関する考察

１．目

115

LAの出生時からの腸内細菌叢安定時期を調査す

的ることは，肺炎病変との関与が示唆された腸内細豚慢性呼吸器感染症は，養豚業に多大な経済的菌との新たな知見につながる９）。さらに，養豚業損失を生んでおり，なかでも豚マイコプラズマ性においては，豚を家畜衛生的側面からだけでな

肺 炎（MPS：mycoplasmal pneumonia of swine）

く，経営的側面からも精査することも重要であは，Mycoplasma hyopneumoniae（M.hp）によりり，抗病性育種豚の導入による収益の増減を検討

引き起こされ，と畜検査で最も多くみられる豚慢することは，とても重要である。

性呼吸器感染症である。豚慢性呼吸器感染症

今回は，MPSおよびPPワクチン未接種状態下は，養豚業に多大な経済的損失を生んでおり，感において，LAを肥育し，LAの呼吸器抗病性につ染症制御策として用いられる抗菌性物質は，薬剤

いて病理学的・免疫学的に検証するとともに，肉耐性菌出現の可能性が懸念されている６）。一方で，豚生産的側面からも，LA抗病性育種方法の有効

我々は，MPS病変面積育種価が低いランドレー

性を確認することを目的とした。

１～５）

ス種系統豚「ミヤギノＬ２」（LA）の造成に成功している７，８）。昨年度の調査で，LAと一般の無選２．方法

抜ランドレース種（Cont.）をMPSワクチン未接

2.1

種下で飼養したところ，LAはMPSワクチン接種

同腹出生のLA（４頭）を用いて，直腸便を出の有無に関わらず，MPS抗病性が発揮されてお生時から離乳時まで採取し（出生時，１週齢時，り，LAとCont.で病変形成に関わる免疫機構が異３週齢時，５週齢時），DNAを抽出後，T-RFLPなる可能性が示唆された９）。さらに，LAは胸膜法（（株）テクノスルガ・ラボ）により腸内細菌性肺炎（Porcine Plueropneumonia：PP）に対し叢の推移を調査する。

ても抗病性をもつ可能性が示唆されている 。PP
９）は ，Actinobacillus pleuropneumoniae（App）に

LAの腸内細菌叢推移調査

2 . 2 MPSおよびPPワクチン未接種下における
LA肥育豚の抗病性調査より引き起こされる感染症であり，罹患した豚のLA計12頭を用いて，MPSワクチン未接種群４

多くは甚急性または急性の経過をたどり，死の転頭（Non-MPSv），PP ワ ク チ ン 未 接 種 群 ４ 頭

帰をとる症例が多く，Appは薬剤耐性菌も出現し（Non-PPv），両ワクチン接種群４頭（Cont.）をやすいとされている 。

作成し，同一豚舎内で，抗菌性物質無添加の指定

10）

LAは，MPS肉眼的特徴病変「両側性赤色肝変配合飼料を飽食させ，通常群飼肥育し，約６ヶ月化病変」の面積を少なくする方向に改良を重ね

齢（約115kg）で出荷した。発育調査として，一た，MPS病変面積育種価が低い，ランドレース

日 平 均 増 体 量 （DG） を 前 期 期 間 （体 重 30～種系統豚であるが，PPおよびMPSワクチン未接70kg），後期期間（体重70～115kg），全期間（30

種状態においても，細菌性呼吸器疾患に対する抗～115kg）で調査し，出荷体重と出荷日齢を比較病性がLAで発揮されていれば，LAで行った，肉した。

眼病変を指標とした抗病性育種方法は，家畜衛生

肥 育 開 始 時（12 週 齢 目 ，Pre）と 終 了 時（約学的側面から，一般養豚農家での実用性が高いだ

149 日 齢 ，Post）で ，採 糞 を 行 い ，直 腸 便 抽 出

けでなく，公衆衛生的側面からも，薬剤耐性出現

DNAからは腸内細菌叢（T-RFLP法）を検査し率の低減につながる可能性が示唆される。また，

た。また，と畜検査時に肺を採取し，その肺を用© The Ito Foundation

116

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

いてMPS肉眼病変スコアを測定した後９，11），右肺
中 葉 か ら ，ホ ル マ リ ン 固 定 材 料 お よ び 生 材 料

３．結果と考察（RNA・DNA）を採取した。組織学的検索とし

3.1て，ホルマリン固定材料からパラフィン切片を作

調査の結果は，Fig.１に記載した。クラスター

成し，HE染色後，組織病変の程度と出現度から解析の結果，出生時（０週齢）から５週齢までのスコア化した。さらに，肺パラフィン切片をＡ群（主に０週齢から３週齢）とＢ群（主に５週用いてM.hp抗原への免疫組織化学染色（IHC）

齢）に大別できたことから，出生時から３週齢時を行い，肺抽出DNAを用いてM.hp p36に対するまでと，離乳後では腸内細菌叢が異なるとこが示

PCRを行い，肺へのM.hp感染の有無を調査した。

された（Fig.１）
。

９，
12）

生材料は使用するまで-80度にて保管し，そこか

3 . 2 MPSおよびPPワクチン未接種下における

らtotal RNA抽出し，cDNA作成後，qRT-PCRにてIL-4，IFN-γのmRNA量を相対定量する（Ｈ遺伝子：βactin）。

LAの腸内細菌叢推移調査

LA肥育豚の抗病性調査
発育成績は，Table１に記載した。Non-MPSv群，Non-PPv群で前期期間（体重30～70kg）では，

2 . 3 LA試験豚のMPS抗病性の肉豚生産成績

一日平均増体量（DG）がCont.と比較して多かったが（ｐ＜0.05），後期期間（体重70～115kg）でに関する考察供試したLA全頭の出荷成績（内臓検査結果，
格付け成績）について，Cont.群，Non-MPSv群，Non-PPv群間で，MPS病変あり群となし群で，は全群差がなく，すべての群で良好な発育となった。
病変調査の結果は，Fig.２に記載した。肉眼検査結果で，PPを疑う所見（胸膜への線維素析出）

それぞれ比較した。

がNon-PPv群の１頭のみにみられたが，MPSを疑う両側性肺の肝変化病変を呈する個体は，全群で散見された。肺内のM.hp抗原は，IHC，PCRb）INF-γa）IL-4
12.00

12.00

10.00

10.00

8.00
6.00
4.00

Cont
Non-MPSｖ
Non-PPｖ

8.00
6.00
4.00

2.00

2.00

0.00

0.00

Fig. 1 Results of relative quantitation of real time PCRa）Amount of IL-4 in lungs,b）Amount of INF-γ in lungs, βactin was used as a housekeeping gene.

© The Ito FoundationCont
Non-MPSｖ
Non-PPｖ

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚の他慢性呼吸器感染症への抗病性機構に関する研究および肉豚生産における抗病性育種豚の有効性に関する考察

117

Table 1 Results of growth, macroscopic and microscopic lesions in this study
GroupsGrowth results

the slaughtering
inspections results

Cont

Non-MPSv

Non-PPv

DG during 30kg to 70kg (kg/day）

0.9±0.1ｂ

1.0±0.1ａ

1.0±0.0ａ

DG during 70kg to a weight of slautering (kg/day）

1.0±0.1

1.1±0.1

1.0±0.1

DG during this study (kg/day）

0.4±0.0

0.5±0.0

0.5±0.1

Age of slaughtering (days）

152.0±5.5

145.5±1.0150.5±5.3

Weight of slautering (kg）107.5±8.6113.0±0.6110.9±5.1

Number of MPS suspected pigs

3/4

2/4

3/4

Number of PP suspected pigs

0/4

0/4

1/4

3.9±3.0

1.8±2.1

2.0±2.4

PCR of M.hp

0/6

0/6

0/6

IHC of M.hp

0/6

0/6

0/6

Alveolar Septal Infiltration

2.3±1.5

5.0±2.4

2.8±1.9

Alveolar Exudate
Peribronchiolar Lymphoid Hyperplasia

0.0±0.0
0.7±0.6

1.3±2.5
1.8±1.3

0.3±0.5
1.0±0.8

Inflammation in Lamina Propria
Total Micscopic Lesion score

0.3±0.5Ａ
3.3±1.9Ａ

4.5±1.7Ｂ
12.5±6.0Ｂ

2.5±3.0Ａ
6.5±3.7Ａ

Macroscopic MPS lesion area in lungs（％）

Microscopic Lung
Lesion score

B

A

0w
5w
5w
5w
5w
3w
1w
0w
0w
0w

b

100

90

80

70

60

a

1w
0w
1w
3w
3w
3w

Fig. 2 Result of cluster analysis of T-RFLP in study
（1）

50

40

30

100

90

80

70

60

50

40

30

20

DG：Dairy gain per a day, a-b：p＜0.05, A-B：p＜0.1

40 Post Non-MPSv
24 Pre Non-PPv
20 Pre Cont.
21 Pre Non-PPv
22 Pre Non-PPv
23 Pre Non-PPv
25 Pre Non-MPSv
28 Pre Non-MPSv
36 Post Non-PPv
19 Pre Cont.
26 Pre Non-MPSv
18 Pre Cont.
27 Pre Non-PPv
30 Post Cont.
17 Pre Cont.
33 Post Non-PPv
34 Post Non-PPv
37 Post Non-MPSv
38 Post Non-MPSv
32 Post Cont.
31 Post Cont.
35 Post Non-PPv
29 Post Cont.
39 Post Non-MPSv

Fig. 3 Result of cluster analysis of T-RFLP in study（3）W: weeks.

共に陰性だった。しかしながら，組織学的には肺少なく，IFN-γ（Th1系サイトカイン）が多い

および気管支関連病変が散見され，Non-MPSv

傾向にあり，対照的に，Non-PPv群では，IL-4群では気管支粘膜固有層への炎症細胞浸潤病変スが多く，IFN-γが少ない傾向がみられたが，有コアや，組織総合病変スコアが多い傾向にあった

意な差は認められなかった（Fig.２）。
腸内細菌叢の結果はFig.３に記載した。調査の（ｐ＜0.1）。
肺のヘルパーＴ細胞１型（Th1）およびヘル

結果，大きくａ群とｂ群に大別することができ，

パーＴ細胞２型（Th2）関連サイトカイン遺伝子

Pre 時 点 で は す べ て の 検 体 は ａ 群 に 集 約 さ れ発現量を比較したところ，Cont.と比較して，（Fisherʼs extract test, p＜0.05），Pre時点では，

Non-MPSv群で，IL-4（Th2系サイトカイン）が全群とも同様の腸内細菌叢を有していた。有意差© The Ito Foundation

118

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
MPS positive pigs

MPS negative pigs
100%

100%

90%

90%

80%

80%

70%

70%

60%

60%

50%

50%

40%

40%

30%

30%

20%

20%

10%

10%

0%

0%
high

middlenormalhigh

middlenormalFig. 4 Result of quality grading results of pork in this study.
There are 4 MPS negative pigs and 8 MPS positive pigs in this study by

the slaughtering inspections.

は な か っ た も の の ，ａ 群 に は ，Post 時 点 の有意差はなかったものの，MPS肉眼病変面積，Cont.1/4頭，Non-MPS群2/4頭，Non-PP3/4頭がIL-4遺伝子発現量が少なく，組織病変，IFN-γ

分類された。

遺伝子発現量が多い傾向となった。Borjigin Lら

3 . 3 LA試験豚のMPS抗病性の肉豚生産成績（2016）は，MPS病変が一般ランドレース種と比較して少ないLAは，MPSワクチン接種により，に関する考察
今回3.2の試験で調査した豚のうち，MPS病変

血中内のIFN-γ量が増加する知見を得ている13）。

があったLAは4/12頭であった。調査したLAのう

これらの結果は，LAはMPSワクチン未接種でも，

ちMPS病変あり群となし群で，背脂肪厚および

LBよりも肺局所で細胞性免疫を活性化させ，肉格付け成績を比較した。背脂肪厚は，なし群で1.9

眼的にMPS病変が確認されないまでにM.hpに対±0.24cm，あり群で2.04±0.78cmとなり，有意差抗できることを示唆している。

がなかったものの，あり群で背脂肪厚い結果とさらに，今回の腸内細菌叢の調査で，調査個体なった。また，格付け成績では，MPS病変なし

が異なるものの，出生時から３週齢目，５週齢目，群はすべて「上」「中」と格付けされ，「並」とさ12週齢目（Pre），出荷時（Post）で，それぞれ腸れた個体はいなかった（Fig.４）。また，Cont.群，

内細菌叢が異なり，腸内細菌叢は，ワクチン接種

Non-MPS群，Non-PP群で格付け成績に有意なの有無に関わらず，経時的に変化し続けることが差はみられなかった。

明らかとなり，慢性疾病と腸内細菌叢の関係を調

MPSおよびPPワクチン未接種下におけるLA肥

査するうえで重要な手がかりを得ることができた。

育豚の抗病性調査の結果から，LAはMPSワクチ

また，肉豚生産成績の結果から，MPS肉眼病

ンおよびPPワクチン未接種条件下においても，変なし群では，背脂肪厚が薄く，格付け成績も上発育成績，病変成績，格付け成績に，両ワクチン物率が多い傾向にあり（有意差なし），農場にお接種条件下と差がなく，良好な成績となった。

けるMPS罹患率を減らすことが，ワクチンや抗今回，Non-MPS群の肺ではCont.と比較して，生物質等の医療費軽減に加えて，肉豚生産成績を© The Ito Foundation

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚の他慢性呼吸器感染症への抗病性機構に関する研究および肉豚生産における抗病性育種豚の有効性に関する考察向上させることにもつながり，農家の収益性を向上させることが示唆された。
４．要

約

LAは，MPSワクチンおよびPPワクチン未接種
条件下においても，発育成績，病変成績，格付け
成績に，両ワクチン接種条件下と差がなく，良好な成績になることが分かった。また，養豚農場においてMPS罹患率を減らすことが，ワクチンや抗生物質等の医療費軽減に加えて，肉豚生産成績を向上させ，農家の収益性を向上させることが示
唆された。
文
献
１） Jubb, K. J. F., et. al., ed. : The respiratory system.
In, Pathology of Domestic Animals, 5th ed. Vol.2, 579～594, Saunders Ltd, 2007.
２） 久保正法，石川弘道，共著：豚病診断カラーアト
ラス―同一症例に迫る臨床と病理―，初版，40～44,
有限会社ベネット，2009.
３） 日本獣医病理学会編：動物病理カラーアトラス，
１版，73，文永堂出版株式会社，2007.
４） Yamamoto, K. : Porcine Respiratory Disease
Complex, Por. Jpn. Pig. Vet. Soc., 43, ７～８, 2003.
５） 宮 城 県 食 肉 衛 生 検 査 所：平 成 26 年 度 事 業 概 要 ,

119

2015.
６） Tamura, Y. : Trends in Antimicrobial agents for
Veterinary Use and Control Measures ofAntimicrobial Resistance, J. Jpn. Vet. Med. Assoc,
56, 685～691, 2003.
７） Kadowaki, H., et. al. : Selection for resistance toswine mycoplasmal pneumonia over 5 generationsin Landrace pigs, Livestock Science, 147, 20～26, 2012.
８） Katayama, M., et. al. : Immunophenotype
Characterization for Swine Selected Line, Which is
Resistant for the Mycoplasma Pneumonia, AsianAust. J. Anim. Sci, 24, 889～897, 2011.
９） Sakuma, A., et. al. : Comparison of innate immune
related molecules and an enteral environment
between landrace pigs that have been selected forgenetical resistance against mycoplasmal pneumoniaof swine（MPS）and normal landrace pigs ， 食 肉 に関する助成研究調査成果報告書, 34, 266～271, 2016.
10） 石井康明，井上勇，小川信雄，鈴木守編：豚病臨床図説，第１版，240，日本畜産振興会，1985.
11） Goodwin, R. F., et al. : Enzootic pneumonia of pigs :immunization attempts inoculating Mycoplasma
suipneumoniae antigen by various routes and withdifferent adjuvants, Br. Vet. J, 129, 456～64, 1973.
12） Opriessnig, T., et al. : Experimental reproductionof postweaning multisystemic wasting syndrome inpigs by dual infection with Mycoplasma
hyopneumoniae and porcine circovirus type 2, Vet
Pathol, 41, 624～40, 2004.
13） Borjigin, L., et al. : Immunogenic properties ofLandrace pigs selected for resistance to mycoplasma
pneumonia of swine, Anim Sci J, 87, 321～9, 2016.

© The Ito Foundation

120

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究（Ⅱ）
Sustainability of genetic diversity in original pig strains used for branding
pork（Ⅱ）

古

川

力・野

村

こ

う・高

橋

幸

水

（東京農業大学農学部）

Tsutomu Furukawa, Koh Nomura and Yukimizu Takahashi（Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture）

Most Japanese pork brands are produced from three-way crossing and few from pure
breeds. Because some original breeds were developed in closed-herd breeding systems, their
genetic diversity should be considered. Therefore, we investigated the genetic diversity andgenetic structure based on polymorphisms in 30 microsatellite loci in Tokyo X and Nakijin
Agu. Tokyo X was developed using Berkshire（obtained from UK and Kagoshima separately）,
Duroc, and Beijing Black in 1997 as the first synthetic pig strain in Japan. In the phylogenetic
tree based on the genetic distance of each pig, Tokyo X was related to Duroc and Berkshire
but formed its own cluster. Even in the phylogenetic trees of each variety, Tokyo X wasclosely related to these two varieties, but independent from Meishan and Jinhua. In thepedigree information of Tokyo X, the ancestry varieties had almost the same contribution toeach pig. However, in the DNA information of the current group, the number of ancestralgroups that contributed to the current group was estimated to be 4, and the contribution ofeach ancestral group was greatly different among pigs. Nakijin Agu was maintained in threelines; although diversity was low in the lines with a small number of heads, overall diversity
was maintained. In Nakijin Agu, because the observed heterozygosity value was higher than
expected, mating to avoid inbreeding was performed. To maintain the original breeds of thepork brand, it was necessary to avoid inbreeding, and utilizing genetic marker information
along with pedigree information was required.

１．目

大ヨークシャー（Ｗ），デュロック（Ｄ）による

的

三元交雑豚であるが，TOKYO-X，かごしま黒豚，

わが国において豚肉は食肉消費の約４割を占め今帰仁アグーなどのブランド豚肉は特定の系統，る重要な食肉である。量販店において通常の国産品種の純粋種によって生産されている１）。ここで，豚肉よりも高価格で販売されているのが銘柄豚肉

TOKYO-X は Ｄ ，英 国 と 鹿 児 島 由 来 の バ ー クである。銘柄豚として，現在約400ブランドが販

シャー（Ｂ）および中国豚の北京黒豚（Ｐ）を基売されており，その多くはランドレース（Ｌ），

礎品種とし，1997年に認定された日本初の合成系© The Ito Foundation

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究（Ⅱ）

121

統トウキョウＸ（TX）を用いて生産された豚肉収集した。TXについては，前年度の解析に用いのブランド名である。また，三元交雑豚であってた，1991年から2014年までの血統情報および2014

も，もとになる純粋種は閉鎖群育種によって造成

年繁殖集団72頭のマイクロサテライト30座位の多された系統豚であるものも多い。

型データを使用した。なお，対照集団として，西系統豚や希少品種は少頭数の繁殖豚で維持され洋系のＬ，Ｗ，Ｄ，Ｂと中国系の梅山豚（Ｍ），ており，年数が経過するに伴い近交度の上昇によ

金華豚（Ｊ）のマイクロサテライト30座位の多型

る遺伝的多様性の減少や繁殖能力の低下が危惧さ

データを用いた。

れている。系統豚では，近交度の上昇を避けるた

2.2

マイクロサテライト多型解析

めに，血統の管理を厳密に行うとともに，種豚間DNAはNAの耳片からフェノール・クロロホルの血縁係数を算出して血縁の遠いもの同士の交配

ム法にて抽出した。抽出したDNAは国際動物遺を行うなどの対策がとられている。しかし，今帰伝学会議および国際連合食糧農業機関において推仁アグーなどの希少品種では血統の情報が不足す

奨されているマイクロサテライトマーカー30座位るため，血統情報に基づく交配管理が十分に行わを用いてPCRにより目的領域を増幅した。PCR反れておらず，近交度の上昇と繁殖能力の低下が危

応 は Veriti96-Well Thermal Cycler（Applied

惧されている。

Biosystems）を用いて，予備変性94℃５分間後，昨年度は，血統が詳細に判明しているTXにつ

熱変性94℃30秒，アニーリング30秒，伸長反応

いて，まず，維持群の血統情報と繁殖記録を用い

72℃45秒を26サイクル行い，次いで最終伸長反応て個体の近交係数を算出するとともに，近交度が72℃７分間とした。目的領域の増幅後，オート繁殖能力に及ぼす影響を検討した２）。ついで，現キャピラリーシークエンサーABI PRISM 3500xL

有集団のDNAマーカーの遺伝子型を分析して，Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて遺伝的多様性の状況を明らかにし，個体間の近縁解析を行い，Gene MapperSoftware 4.0（Applied

係数とマーカーの近縁度との相関を明らかにしBiosystems）により遺伝子型を決定した。

た。その結果，TXの遺伝的多様性を維持するた

決定した遺伝子型をもとに，GenAlEx6.5３）をめには，マーカー情報をもとに遺伝的構造を解析用いて平均アリル数，有効アリル数，へテロ接合

し，マーカー情報を用いた交配計画を検討する必度の期待値および観測値，FIS 値および主座標分

要があることが示された。

析を行い，FSTAT2.9４）を用いてアレリックリッ

今年度は，TXの基礎品種であるＤ，Ｂ，中国

チネスを算出した。Populations1.2５）を用いて個豚などについてDNAマーカーの遺伝子型を解析

体間のDAS遺伝距離および集団間のDA遺伝距離

し，TXの遺伝的構造を明らかにする。一方，血の算出を行い，近隣結合法（NJ法）により系統

統情報が不明な今帰仁アグー（NA）集団につい樹を作製した。Structure2.3６）を用いて，祖先集てDNAマーカーの遺伝子型を解析し，遺伝的多団数Ｋ＝１～15を想定し，各Ｋについて30,000回

様性と遺伝的構造を明らかにする。

の Burn-in 後 ， 50,000 回 の Markov chain Monte

２．方
2.1

Carlo法を独立に20回試行した。得られた結果か

法ら，Structure Harvester0.6 ７）を用いて対数尤度

材料およびΔＫを算出し，Evannoら８）に従い最も妥有限会社今帰仁アグーより繁殖豚79頭の耳片を当な分集団数を推定した。

© The Ito Foundation

122

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

中国系とは異なるクラスターを形成した。系統樹

３．結果と考察3.1

からもTXはＤおよびＢと近縁であることが示さ

TXの遺伝的構造れた。TXの基礎品種の一つＰは，華北型の在来

TX，西洋系および中国系の遺伝子頻度を用い

種とＢ，中ヨークシャーなどを基礎とする育成品て，高次元データを低次元に集約する主座標分析

種であり９），中南地区のＭやＪとは由来が異なるを行ったところ，28.9％の寄与率である第１主座ため，これらとの遺伝的距離が離れていたと考え標で中国系がその他の集団から独立し，9.2％のられた。

第２主座標でＬとＷがその他の集団から分離し，全集団を対象にしたストラクチャー解析では，二次元上にTX，Ｄ，Ｂをまとまりとするグルー

最も妥当な分集団数はＫ＝３のときで，TX，Ｄ，プが形成された。TXがＤとＢと同じグループをＢ集団が同一分集団を形成し，Ｌ，Ｗと中国系に形成したことは，TXがこの２品種を基礎集団に分離した（Fig.２）。ストラクチャー解析におい含んでいたことの反映と考えられた。一方，TXても，系統樹と同様に，TXはＤ，Ｂと同じ分集のみを対象にした同様の分析では，特定のまとま団に属した。

りは認められなかった。これは，系統造成およびTXだけを用いたクラスター解析では，最も妥維持において集団を均質化する交配が行われたた

当な祖先集団数は４であり，これはTXの基礎豚

めと考えられた。

が４品種・系統から造成されているという血統情

個体間のDAS 遺伝距離にもとづくNJ系統樹で報と一致した。このときの個体ごとへの寄与率とは，TXはＤおよびＢと近隣に位置したが，異な血統情報に基づく基礎品種・系統の寄与率はFig.

るクラスターを形成した。品種集団間でのDA 遺３のとおりであった。上段がストラクチャー解析

伝距離にもとづくNJ系統樹はFig.１のとおりであにより算出された遺伝的寄与率，下段が血統情報

り，TXはＤおよびＢと同じクラスターに位置し，をもとに算出された遺伝的寄与率であり，１本の

L
W
D
TX

B

M

J

Fig. 1 Phylogenetic trees of seven populations constructedbased on DA genetic distance（Tokyo X）．
（L：Landrace,
W：Large White, D：Duroc, B：
Barkshire, M：Meishan, J：Jinhua, TX: Tokyo X）

100%
80%
60%
40%
20%
0%

TX

L

W

Fig. 2

D

B

J M

Clustering assignment of seven populations
obtained by structure analysis（Tokyo X）．

© The Ito Foundation

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究（Ⅱ）

123

縦棒は各個体における祖先集団の寄与率である。

3.2

今帰仁アグーの遺伝的多様性

血統情報をもとに算出された遺伝的寄与率は上か供試動物としてTable１の品種，系統を用いた。

らＰ，鹿児島Ｂ，英国Ｂ，Ｄを示しており，Ｄの有限会社今帰仁アグーにおいては沖縄県北部農林寄与率が最も高かったが，現集団の各個体に対す

高校由来のAG（B），AG（R）および八重山由来

る基礎豚の寄与率はほぼ一定であった。一方，想のAG（W）は系統内で維持されており，それら定された基礎集団の現集団に対する寄与率は個体の交雑群をAG（O）とした。アウトグループとによって大きく異なっていた。血統情報では，親して用いた西洋系のＬ，Ｗ，ＤおよびＢは開放型

世代の片親の対立遺伝子のいずれもが半分ずつ子育種集団であり，中国豚のＪとＭは中国から導入世代に寄与するものとして寄与率を算出するが，されて以来閉鎖的に維持された集団であった。

実際には一方の対立遺伝子だけが子世代に伝わるマイクロサテライトを用いた多様性指数はことから，実際の遺伝的構成はストラクチャー解

Table２に示した。全集団を通してマイクロサテ

析結果が示すように個体によって基礎集団の遺伝

ライトマーカー30座位で合計279のアリルが検出

子頻度が異なると考えられる。したがって，交配され，マーカーごとのアリル数は６から17であっ計画の策定にあたっては，血統情報とともに遺伝

た。集団ごとの平均アリル数は西洋系では3.10～

子の多型情報を活用する必要がある。

4.87の範囲の値を示したのに対して，NAでは2.43～4.07であった。個体数に依存しない有効アリル

a. genetic markers
100%
80%
60%
40%
20%
0%
b. pedigree information
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Fig. 3 Genetic contributions of base populations on present pigs in Tokyo X.
Table 1 Number of animals used for analysis of Nakijin Agu.
Breed

Line

Abbreviation

Ｎ

Nakijin Agu

Ｂ
Ｒ
Ｗ
Ｏ

AG（B）
AG（R）
AG（W）
AG（O）
Ｌ
Ｗ
Ｄ
Ｂ
Ｊ
Ｍ

6
27
9
37
30
30
30
23
9
23

Landrace
Large White
Duroc
Barkshire
JinhuaMeishan© The Ito Foundation

124

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 2 Genetic diversity within each population (Nakijin Agu）．
Population

NA

MNA

ENA

AR

Ho

He

FIS

AG（B）

88

2.93

2.21

2.70

0.62

0.51

-0.20

AG（R）

120

4.00

2.66

2.92

0.66

0.61

-0.09

AG（W）

73

2.43

1.82

2.14

0.44

0.40

-0.09

AG（O）

122

4.07

2.93

3.11

0.74

0.65

-0.14

Ｌ

146

4.87

2.80

3.13

0.62

0.60

-0.02

Ｗ
Ｄ

140
102

4.67
3.40

2.82
2.45

3.08
2.67

0.61
0.53

0.60
0.52

-0.01
-0.01

Ｂ

93

3.10

2.19

2.42

0.49

0.47

-0.03

Ｊ

67

2.23

1.75

2.00

0.42

0.33

-0.23

Ｍ

84

2.80

2.09

2.37

0.51

0.47

-0.10

NA：number of alleles, MNA：mean number of alleles, ENA：effective number of allel-0.10es, AR：allelicrichness, Ho：observed heterozygosity, He：expected heterozygosity, FIS : Wrightʼs FIS

数は西洋系では2.19～2.82の範囲の値を示したの

値よりも大きかったのに対して，県内アグーではに対して，NAでは1.82～2.93であった。また，ア小さかったが，これは県内アグーがいくつかの集

リル数をサンプル数によって標準化した数値であ団からのサンプルであり，集団内で交配が行われるアレリックリッチネスは西洋系では2.42～3.13ていたためと推察されていた10）。

の範囲の値であったのに対して，NAでは2.14～

これらのことから，NAは３系統で構成されて3.11であった。NAではAG（W）は頭数も少なくおり，全体として多様性を維持しているものの，多様性が低かったが，集団全体における多様性はAG（W）の多様性がやや低いことから，今後，

西洋系と同程度の値を示した。大城ら10）はマイク

さらに近親交配を避ける交配を継続するように留

ロサテライト23座位を用いて，沖縄県内アグー意する必要がある。

（以下，県内アグー）254頭の平均アリル数は4.35，
その中の沖縄県畜産研究センターで維持されてい４．要約る（以下，畜研アグー）35頭だけでは1.78と報告

わが国のブランド豚肉の多くは三元交雑によりしており，NAは県内アグーと同程度の多様性を作出されているが，それらの原種豚の一部は系統有していると推察された。

豚や希少品種が用いられており，集団の遺伝的多ヘテロ接合度の観測値は，西洋系では0.49～0.62様性の維持が課題となっている。そこで，トウの範囲であり，それぞれ期待値とほぼ同じ値を示

キョウＸ（TX）と今帰仁アグー（NA）についしたが，NAの観測値は0.44～0.66であり，それぞてマクロサテライト30座位の多型情報に基づく遺れ期待値よりやや高い値を示した。ヘテロ接合度

伝的多様性と遺伝的構造を明らかにした。TXはの期待値および観測値から算出される集団の近親デュロック（Ｄ），英国と鹿児島由来のバーク

交配の程度を示すFIS値は西洋系ではほぼ０でシャー（Ｂ）および北京黒豚を基礎品種とするあったが，NAは-0.09～-0.20とすべて負の値を示

1997年に認定された日本初の合成系統である。個した。これは，西洋系では集団内でほぼ無作為交体ごとの遺伝距離に基づく系統樹では，TXはＤ，配が行われていたのに対し，NAでは近親交配をＢと近縁であるが独自のクラスターを形成した。

避ける交配が行われていたためと考えられる。一品種ごとの系統樹でも，TXはこの２品種と近縁

方，畜研アグーではヘテロ接合度の観測値が期待であり，梅山豚，金華豚とは離れていた。TXの© The Ito Foundation

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究（Ⅱ）

125

血統情報では祖先品種は各個体に対してほぼ同じ

より繁殖豚の耳片をDNA抽出用サンプルとして提供寄与率であったが，現集団のDNA情報ではそのいただいた。心より謝意を表する。

祖先集団は４と推定され，祖先集団ごとの寄与は個体により大きく異なっていた。NAは３系統に分類され，頭数が少ない系統では多様性が低いものの，全体では多様性が維持されていた。NAではヘテロ接合度の観測値が期待値よりも高く，近親交配を避ける交配が行われていることが推察された。ブランド豚肉の原種豚の維持にあたっては近親交配を避ける必要があり，血統情報とともに遺伝的マーカー情報を活用することが求められた。

謝

辞

本研究にあたり東京都農林水産振興財団青梅畜産センターよりトウキョウＸの血統，繁殖成績および血液を提供いただいた。また，有限会社今帰仁アグー

文献１） 食肉通信社：銘柄豚ハンドブック，16，食肉通信社，大阪市，2016.
２） 永井健一，兵頭勲，小嶋貞夫，宇杉央，野村こう，
高橋幸水，古川力：日豚会誌，53, 95～104, 2016.
３） Peakall, R., Smouse, P. E. : Bioinformatics, 28,2537～2539, 2012.
４） Goudet, J. : FSTAT, Lausanne University,
Lausanne, Switzerland, 2001.
５） Langella, M. : Populations 1.2.30 : a population
genetic software, CNRS UPR9034., 1999.
６） Pritchard, J. K. : M. Stephens and P. Donnelly,
Genetics, 155, 945～959, 2000.
７） Earl, D. A., vonHoldt, B. M. : Conserv. Genet.
Resour., 4, 359～361, 2012.
８） Evanno, G., Regnaut, S., Goudet, J. : Mol. Ecol., 14,2611～2620, 2005.
９） 丹羽太左衛門：養豚ハンドブック，養賢堂，東京，
1994.
10） 大城まどか，稲嶺修，中村敏，佐藤正寛，石井和雄，
蝦名真澄：沖縄畜研研報，44，39～42，2006.

© The Ito Foundation

126

黒毛和種で致死に関与するゲノムコピー数多型の探索
Reverse genetic screen for copy number variation associated with lethality
in Japanese Black cattle

佐々木

慎

二

（公益社団法人畜産技術協会附属動物遺伝研究所）

Shinji Sasaki（Shirakawa Institute of Animal Genetics, Japan Livestock Technology Association）

Lethal phenotypes, such as embryonic mortality and neonate death, are a major source ofeconomic loss in Japanese Black cattle. To identify copy number variation region（CNVR）
associated with lethal phenotypes in Japanese Black cattle, we performed a reverse genetic
screening. We aimed to identify loss-type CNVRs that included lethality-associated genes from861 CNVRs using Ensembl gene set database and Mouse Genome informatics database. We
identified 11 genes in 10 CNVRs that were associated with the lethal phenotypes between
early embryonic stage and postnatal stage. Among them, the MLLT4 gene in 19,107 bp loss
type CNVR was genotyped in 1871 Japanese Black cattle. The frequency of the CNVR was
0.24％ in the studied population. The results indicate that reverse genetic screening could be auseful procedure in detecting lethal phenotype-associated CNVRs in Japanese Black cattle.

１．目

ピー数多型（CNV）」を取り上げ，致死に関与す

的るCNVの特定を試みた。解析は，１）CNV内に黒毛和種の生産現場では，胚死滅や子牛死亡な遺伝子が存在するか，２）遺伝子機能の注釈が個

ど致死性の疾患による生産性の低下が問題になっ体の生存に関わる遺伝子か，３）マウスオーソロている。原因となる遺伝的要因を特定するためにグの遺伝子改変マウスの表現型が「致死」である

は，致死個体のDNAを採材し，個体の遺伝子型

か検索後，３）黒毛和種集団で頻度調査を行いと致死との関連を調べる必要があるが，致死個体

CNVと致死との関連を検討した。

のDNAの採材は極めて困難である。そこでまず，集団内の多数の個体の変異情報を収集し，変異が２．方法

存在した遺伝子と致死との関連を調査する手法が

黒 毛 和 種 1,481 頭 を BovineHD BeadChip

有効と考えられる。そこで，遺伝子機能に大きな（Illumina社）で型判定をしたSNPデータを用い影響を与える多型の１つとして「１kbから数Mb検出した861個のCNV領域（CNVR）を検索に用のゲノム領域の欠損や重複と定義されるゲノムコ

い た １）。こ の 中 で ，Ensembl の 遺 伝 子 セ ッ ト© The Ito Foundation

127

黒毛和種で致死に関与するゲノムコピー数多型の探索
２）General Transfer format（GTF）
で ，CNVR 内

遺伝子について致死と関連する表現型の注釈が付に遺伝子のエクソン部分が含まれるか検索した。

けられていた（Fig.１）。この内，10個のCNVRに

CNV に 遺 伝 子 の エ ク ソ ン が 存 在 し た 場 合 ，11個の遺伝子が含まれていた（Table１）。

Mouse Genome Informatics（MGI）デ ー タ ベ ー

11個の遺伝子は，マウスでは遺伝子が欠損する

３）

ス（ジャクソン研究所） を用いて，マウスオーと発生初期に致死の遺伝子が３個，発生中期（器ソログの遺伝子改変マウスの表現型として致死と官形成期）に致死の遺伝子が２個，出生直後に致関連する注釈が付けられているか検索した。次死の遺伝子が３個，出生後に致死の遺伝子が３個に，CNVRの中で特に遺伝子機能の障害が想定さ含まれていた（Table１）。このうち，MLLT4遺伝

れる欠損型CNVRを選抜し，BovineHD BeadChip

子は，19,106bpの欠損型CNVR_393に含まれ，発で型判定された1,871頭の黒毛和種集団で頻度調

生期に細胞接着に関わり，遺伝子の欠損によって査を行った。

胎齢10日目で致死となることが報告されていた４，５）。
そこで，CVNR_393についてBovineHD BeadChip

３．結果と考察で型判定された1,871頭の黒毛和種集団で頻度調861個のCNVRのうち，334個のCNVRに593個査を行った結果，0.24％であった。今回検索したの遺伝子のエクソンが含まれていた（Fig.１）。

集団では低頻度で黒毛和種において致死との関連593個の遺伝子のマウスオーソログについて遺伝を検討することができなかった。今後，頻度が高子改変マウスの表現型をMGIデータベースで検索

い集団で頻度調査を行うとともに，授精記録や子した結果，94個のCNVRに含まれる140個の遺伝

牛死亡サンプルを用いて，黒毛和種でCNVR_393

子に表現型の注釈付けがされており（MP IDのと胎子期の致死との関連を調査する予定である。

付加），その内，47個のCNVRに含まれる52個のまた，他のCNVRについても引き続き頻度調査を

861 CNVR
No

Included in GTF（gene sets）of Ensemble ?

Yes

334 CNVR （593 genes）

572 CNVR

No

MP（Mamalian Phenotype）ID assigned in MGI ?

Yes

240 CNVR

94 CNVR
No
47 CNVR（140 genes）
Lethal categories assigned ?

Yes
47 CNVR
No

37 CNVR（52 genes）
loss-type CNVR ?

Yes
10 CNVR（11 genes）

Fig. 1 Results of screening procedure to identify loss-type CNVRs that included lethality-associated genes.
In 861 CNVRs in detected in 1,481 Japanese Black cattle, 344 CNVRs that included 593 genes weredetected using General Transfer format（GTF）of Ensembl database. Among them, 52 genes, orthologous
to those of mice, in 47 CNVRs were categorized into lethal phenotype in Mouse Genome Informatics（MGI）database. Ten CNVRs included, which included 11 genes, were loss type CNVR.

© The Ito Foundation

128

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 1 Results of screening procedure to identify loss-type CNVRs that included lethality-associated genes.
CNVR_ID

Chr: Start-End（bp）

CNVR size（bp） Gene Symbol

MGI description

CNVR_62

chr2:56690495-56744828

54,333

LRP1B

complete embryonic lethality

CNVR_106

chr3:40511241-40567792

56,551

COL11A1

complete neonatal lethality

CNVR_371

chr9:36934604-36951086

16,482HDAC2

complete neonatal lethality

CNVR_393

chr9:103896317-103915423

19,106MLLT4complete embryonic lethaliy duringorganogenesis

CNVR_481

chr12:28400734-28424536

23,802

PDS5B

complete neonatal lethality

CNVR_640

chr17:9952569-9959315

6,746

NR3C2

complete postnatal lethality

CNVR_762

chr22:36315708-37194409

878,701

ADAMTS9complete embryonic lethality between
implantation and somite formation

CNVR_816

chr25:766584-785640

19,056

LMF1

postnatal lethality

CNVR_828

chr25:33321529-33352790

31,261

GTF21

complete embryonic lethality

CNVR_873

chr28:30054567-30556761

502,194

ADK

complete postnatal lethality

CNVR_873

chr28:30054567-30556761

502,194

VCL

complete embryonic lethality duringorganogenesis

CNVR positions are based on the UMD3.1 assembly of the bovine genome

行い，CNVRと致死との関連を調査する計画である。加えて，ウシとマウスでは発生段階が異なる

謝

辞ため，体節形成６～８）や性成熟の直前に迎える増体

本研究は，公益社団法人畜産技術協会附属動物遺量の最高頂点速度期（PHV）９）などを指標とし発伝研究所杉本喜憲博士の協力のもと行われたこと，生段階を比較検討することで，黒毛和種での致死

ここに感謝致します。

時期について考察する予定である。
４．要

約

本研究は，致死に関連するCNVRを明らかにするため，黒毛和種1,481頭で検出された861個のCNVRのうち，マウスオーソログの遺伝子改変マ
ウスの表現型が致死である遺伝子をMGIデータ
ベースで検索した結果，発生初期から生後までの間の致死と関連する10個の欠損型CNVRとこれらのCNVRに含まれる11遺伝子を検出した。今後，頻度調査を行うとともに，授精記録や子牛死亡サ
ンプルを用いてCNVRと致死との関連を調査する
ことで，黒毛和種において致死に関連するCNVRを特定する予定である。致死との関連が認められ
るCNVRについては集団から排除することで生産性の向上が期待される。

文献１） Sasaki, S., Watanabe, T., Nishimur, S., Sugimoto,Y. : BMC Genetics, 17, 26, 2016.
２） Ensembl（［http://asia.ensembl.org/Bos_taurus/
Info/Index］）
３） Mouse Genome Informatics （［（http://www.
informatics.jax.org/）］）４） Zhadanov, A. B., Provance, D. W. Jr., Speer, C. A.,
Coffin, J. D., Goss, D., Blixt, J. A., Reichert, C. M.,
Mercer, J. A. : Curr Biol, ９, 880～888, 1999.
５） Ikeda, W., Nakanishi, H., Miyoshi, J., Mandai, K.,
Ishizaki, H., Tanaka, M., Togawa, A., Takahashi, K.,
Nishioka, H., Yoshida, H., Mizoguchi, A., Nishikawa,S., Takai, Y. : J Cell Biol, 146, 1117～1132, 1999.
６） Kaufman, M. H., Bard, J. B. L. : The Anatomical
Basis of Mouse Development Academic Press, San
Diego, USA, 1999.
７） Haldiman, J. T. : Anat Histol Embryol, 10, 289～309,
1981.
８） Lopez-Rios, J., Duchesne, A., Speziale, D.,
Andrey, G., Peterson, K. A., Germann, P., Unal, E.,
Liu, J., Floriot, S., Barbey, S., Gallard, Y., Muller-© The Ito Foundation

黒毛和種で致死に関与するゲノムコピー数多型の探索
Gerbl, M., Courtney, A. D., Klopp, C., Rodriguez, S.,
Ivanek, R., Beisel, C., Wicking, C., Iber, D., Robert, B.,
Mcmahon, A. P., Duboule, D., Zeller, R. : Nature, 511, 46～51, 2014.
９） 標準生理学，第２版, 医学書院, 1990.

© The Ito Foundation

129

130

黒毛和種牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効果検証
Investigation on the effect of genetic markers for beef quality in JapaneseBlack cattle

笹

﨑

晋

史

（神戸大学大学院農学研究科）

Shinji Sasazaki（Graduate School of Agricultural Science, Kobe University）

Oleic acid percentage（C18:1）is important for beef quality in term of the effect on beef
palatability and our health. In the current study, we investigated the effect of previously
reported DNA markers, SCD and SREBP1, on C18:1 in a Japanese Black population. In addition,
we also investigated the effect of PLAG1 polymorphism（ss319607405）, which is considered asa causative mutation affecting the bovine stature, on C18:1 in Japanese Black cattle.
We genotyped three polymorphisms, including A293V in SCD, 84bp in/del in intron5 of
SREBP1 and ss319607405 in PLAG1 using 441 animals selected from a Prefectural population ofJapanese Black cattle. Genotyping result and statistical analysis revealed that these threepolymorphims had significant effect on C18:1（p ＜ 0.01）and the allele frequencies of favorable
allele for C18:1 were 0.92 in SCD, 0.68 in SREBP1 and 0.53 in PLAG1. Moreover, the proportionof additive genetic variance in each marker were 3.59％ in SCD, 7.54％ in SREBP1 and 6.38％
in PLAG1. These results suggested that these DNA makers would be useful for improvementof beef quality, but additional markers will be need for further breeding.

１目

る需要も増えてきている。農林水産省の「酪農及的び肉用牛生産の近代化を図るための基本方針」の

黒毛和種は，外国産の安価な牛肉との差別化を中でも，適度な脂肪交雑を保ちつつも旨味に着目図るため脂肪交雑の向上が積極的に進められてきした指標研究や改良を進めることが奨励されていており，国際的にもその肉質が高く評価されている。また脂肪酸の種類の中でオレイン酸のようなる。しかし脂肪交雑は，牛肉の多汁性や柔らかさ

モノ不飽和脂肪酸含有率が多い肉では風味・口解などに関与するものの，粗脂肪含量が一定以上にけが良いとされており，美味しさを決める大きななると牛肉の旨味が低下することも報告されてお要因として脂肪酸組成があると言われている。以り，脂肪交雑の向上のみでは肉質の向上には限界

上の理由より近年我が国の黒毛和種牛肉市場ではがある。また近年の健康志向の高まりから，霜降

脂肪の量ではなく質つまり脂肪酸組成に着目されり牛肉だけでなく脂肪交雑の高くない牛肉に対すている。

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黒毛和種牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効果検証

131

脂肪酸はまず，アセチルCoAから炭素鎖の伸長頭のうち，同種雄牛の子が10頭未満である個体を反応が進められ，様々な長さの飽和脂肪酸として除いた黒毛和種肥育牛441頭を供試した。本集団合成される。さらにそれぞれの飽和脂肪酸においにおける平均出荷月齢は31.69ヶ月，オレイン酸て炭素鎖間に二重結合が導入されることで不飽和含有率の平均はそれぞれ54.76％であった。DNA脂肪酸の合成が進められる。我々は以前の研究にの抽出には屠殺後に採取した頸最長筋を使用しおいて，その中の１つで飽和脂肪酸の不飽和化をた。また脂肪酸組成の測定のため，第６－７肋骨

促して不飽和脂肪酸を合成する酵素あるStearoyl-

間の胸最長筋を採取した。

CoA desaturase（SCD）に着目して多型の調査2.2を行った。結果，遺伝子の翻訳領域内にバリンか

脂肪酸組成はクロロフォルム・メタノール法にらアラニンへのアミノ酸置換を検出し，この変異よる定法に従い胸最長筋内脂肪から脂肪酸を抽出と一価不飽和脂肪酸との間に有意な関連が認めらし （Folch ら 1957）， メ チ ル 化 後 （OʼKeefe られることを報告した 。さらに，SCD遺伝子をは1968），ガスクロマトグラフG-3000（HITACHI，

じめとする脂質代謝関連遺伝子に対して転写因子東京）を用いてオレイン酸含有率（Ｃ18：１）をとして働き，脂質代謝に影響を及ぼしていると考

測定した。

１）

脂肪酸組成測定

え ら れ て い る Sterol regulatory element binding

2.3

protein-1（SREBP-1）に着目した。多型探索に

頸部筋肉組織から，フェノールクロロフォルム

よりSREBP-1遺伝子の第５イントロンに84bpの法による定法に従いDNAを抽出した。調査したindel多型を同定し，黒毛和種において，本多型

DNA マ ー カ ー は SCD 遺 伝 子 の A293V １），

が一価不飽和脂肪酸と関連していることを報告し

SREBP-1遺伝子イントロン中における84bpの挿た 。また近年，黒毛和種において枝肉重量に対２）入・欠失（indel），また黒毛和種において枝肉する責任変異であると考えられてきたPLAG1遺重量に対する責任変異だと考えられているPLAG

伝子の変異が脂肪酸組成に対しても関連がみられ１遺伝子の変異ss319607405３）の３つを用いた。

たことが報告された３，４）。

これらのマーカーはPCR法またはPCR-RFLP法に２）

遺伝子型判定以上のように，これまでの先行研究においてより遺伝子型を判別した。方法については各文献

様々な遺伝子内の多型が調査され，脂肪酸組成とに従ったが，用いたプライマーの配列，PCRの反の関連が報告されてきた。そこで本研究では，黒応条件，使用した制限酵素などについてはTable

毛和種における脂肪酸組成の更なる改良のため，

１に示した。

Ａ県集団に焦点を当て，上記の多型の効果を検討

2.4するとともに，遺伝分散を推定することにより，各マーカーのオレイン酸含有率に対する効果を

これらのDNAマーカーを用いた際の育種改良の調査するため，分散分析およびTukey-Kramerの影響について調査した。

honestly significant difference（HSD）検定を行っ

２

方

2.1

供試動物

統計解析

た。解析においては遺伝子型，出荷年，性，種雄

法

牛，月齢を要因とした。月齢は１次および２次回帰係数として考慮した。また，それぞれのマー

DNAマーカーの効果の検証のため，Ａ県におカーの効果により説明される相加的遺伝分散の値

いて2010年12月から2011年８月に出荷された496を計算し，県集団全体の遺伝分散に対する割合を© The Ito Foundation

132

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 1 Oligonucleotide primers and restriction enzymes used for genotyping
Gene
SCD
SREBP-1
PLAG1

Primer（5ʼ→3ʼ）Tm（℃）

Product size（bp）

Restriction enzyme

60

569

Aci I

65

432/348―65

346/340―

F : GTGGAAAATCAGGTAGGTCTCAGCG
R : CAAGCAAGACTACCACCCAGATCAG
F : CCACAACGCCATCGAGAAACGCTAC
R : GGCCTTCCCTGACCACCCAACTTAG
F : AGAACTCACCGCGGGGCTTTAACATR : GGAGGAGCGCGCGGGGAAGG

F：forward primer R：reverse primer

Table 2 Genotypic and allelic frequencies of three markers in Japanese Black population
Gene
SCD

SREBP-1

PLAG1

Genotypic frequency
AA（n＝405）

AV（n＝36）

Allelic frequency
VV（n＝0）

Ａ

Ｖ

0.92

0.08

0

0.96

0.04

LL（n＝210）

LS（n＝180）SS（n＝51）

Ｌ

Ｓ

0.48

0.41

0.11

0.68

0.32

QQ（n＝94）

Qq（n＝276）qq（n＝71）

Ｑ

ｑ

0.21

0.63

0.16

0.47

0.53

Q＝
（CCG）11, q＝（CCG）
9

示した。
３

なり，SCDよりも比較的遺伝子頻度が保たれていることが分かった。

結果と考察

3.2

3 . 1 SCDおよびSREBP1マーカーの遺伝子型

PLAG1マーカーの遺伝子型判定

これまで枝肉重量に対する責任変異であると考えられてきたPLAG1遺伝子多型（マイクロサテ

判定
これら２マーカーについては，これまでに黒毛ライトss19607405）が脂肪酸組成に対しても効果

和種における様々な集団で脂肪酸組成に対する効を有するのかを確認するためSCDやSREBP1と同果が確認されている。本研究ではＡ県集団におけ様に検証マーカーとして実験に加えた。本多型はる効果を確認するため441頭の選抜した個体を対CCGの繰り返し配列であり，11回繰り返しのも象に遺伝子型判定を行った（Table２）。遺伝子型のをＱアリル，９回繰り返しのものをｑアリルと判定の結果，SCDマーカーについてはAA型が表記している。441頭に対して遺伝子型判定を405個体，AV型が36個体であり，VV型の個体は行った結果，QQ型が94個体，Qq型が276個体，

観察されなかった。アリル頻度を計算したところ

qq型が71個体となり，アリル頻度はＱが0.47，ｑ

Ａアリルの頻度が0.96となり，Ａ県においては頻が0.53となった（Table２）。全国の黒毛和種を用度に非常に偏りがみられることが分かった。まいた過去の報告ではＱの頻度は0.754であり，全た，SREBP１マーカーについては，LL型が210個

国的にみるとＡ県ではｑアリルの頻度が比較的高体，LS型が180個体，SS型が51個体であり，アリ

く，Ｑとｑの頻度が同程度であることが明らかと

ル頻度を計算したところ，Ｌが0.68，Ｓが0.32となった。

© The Ito Foundation

133

黒毛和種牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効果検証
Table 3 Effect of DNA markers on oleic acid percentage in Japanese Black population
Oleic acid percentage
SCD
SREBP1
PLAG1

AA

AV

54.97a±0.25

53.64b±0.48

LL

LS

SS

55.13a±0.31

54.44b±0.32

53.34c±0.47

QQ

Qq

qq

53.59a±0.38

54.34ab±0.31

54.98b±0.41

P value（ANOVA）

due to marker％VA

0.00513.59

0.00027.54

0.0085

6.38％VA＝proportion of additive genetic variancea, b, c：Means with different superscript are significantly different between genotypes

3 . 3 ３マーカーのオレイン酸含有率に対するン酸含有率に対するDNAマーカーの検討を行ったところ，SCD，FASN，GHの３つマーカーに効果と遺伝分散の推定
Ａ県における３マーカーのオレイン酸含有率において効果が確認され，これらにより説明される

対する効果を調査するため分散分析を行った

遺伝分散の割合は約23％程度であることが報告さ（Table３）。各マーカーにおけるオレイン酸含有

れている５）。以上を踏まえると，現状として各県

率 に 対 す る Ｐ 値 は SCD で 0.0051 ， SREBP1 で集団において明らかとなっているオレイン酸含有

0.0002，PLAG1で0.0085となり，いずれのマーカー率に対する遺伝的要因はおよそ20％程度であるとも１％水準で有意な効果が確認された。また，推測される。これまでに各集団において効果の認

TukeyのHSD検定により，各遺伝子型間の詳細められたDNAマーカーはより肉質の良い牛肉生

な調査を行ったところ，SCDではAA型-AV型，産に貢献するものであると考えられるが，今後もSREBP1 で は LL 型 -LS 型 -SS 型 ， PLAG1 で はさらなる改良のために残りの遺伝的要因について

QQ-qq型の間において５％水準での有意差が確の解明が期待される。

認された。また，それぞれの最小自乗平均値を比較 す る と ，SCD で は AA 型 が AV 型 に 比 べ て 約

４

要

約

1.33 ％，SREBP1 で は LL 型 が SS 型 に 比 べ て 約

牛肉中脂肪に含まれるオレイン酸の含有率（Ｃ1.79％，PLAG1ではqq型がQQ型に比べて約1.39％

18：１）は肉質や食味性に関わる重要な形質であ

オレイン酸含有率が高いことが推定された。

る。本研究ではこれまでにＣ18：１に関わるとさ次に，各マーカーにおける相加的遺伝遺伝分散

れ て き た ２ つ の 遺 伝 子 マ ー カ ー SCD お よ びの値を算出したところ，SCDで0.137，SREBP1で

SREBP1についてその効果を調査した。さらに本

0.288，PLAG1で0.244となった。Ａ県集団におけ研究では上記に加えて，これまでに牛の体高や体るオレイン酸含有率の遺伝分散は3.824と推定さ長の責任変異として報告されているPLAG1遺伝

れており，すなわち各マーカーにより説明される子の変異についてＣ18：１に対する影響を調査し

遺 伝 分 散 の 割 合 は SCD で 3.59 ％， SREBP1 でた。県集団441頭について遺伝子型判定を行い，7.54％，PLAG1で6.38％であり，３マーカー全体

Ｃ18：１に対する効果について統計解析を行った

では17.51％であると推定された。以前の他県集ところ，３マーカーとも１％水準で有意な効果が団を用いた研究において，本研究と同様にオレイ確認された。また，Ｃ18：１に対して好ましい方© The Ito Foundation

134

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）のアリルにおける頻度はそれぞれSCDで0.96，
SREBP1で0.68，PLAG1で0.53であった。さらに
これらマーカーにおける相加的遺伝分散の割合を計算したところ，SCDで3.59％，SREBP1で7.54％，
PLAG1で6.38％であった。以上により，上記の３多型はオレイン酸割合の向上に向けて選抜マー
カーとしての効果が期待されるが，今後もさらなる改良のために残りの遺伝的要因の解明が重要であることが示唆された。
文献１） Taniguchi, M., Utsugi, T., Oyama, K., Mannen H.,
Kobayashi, M., Tanabe, Y., Ogino, A., Tsuji, S. :Genotype of stearoyl-CoA desaturase is associatedwith fatty acid composition in Japanese Black cattle,
Mammalian Genome, 14, 142～148, 2004.
２） Hoashi, S., Ashiba, N., Ohsaki, H., Utsugi, T.,
Sasazaki, S., Taniguchi, M., Oyama, K., Mukai, F.,
Mannen, H. : Genotype of bovine sterol regulatory

element binding protein-1（SREBP-1）is associatedwith fatty acid composition in JapaneseBlack cattle,
Mammalian Genome, 18, 880～886, 2007.
３） Nishimura, S., Watanabe, T., Mizoshita, K.,
Tatsuda, K., Fujita, T., Watanabe, N., Sugimoto, Y.,
Takasuga, A. : Genome-wide association study
identified three major QTL for carcass weight
including the PLAG1-CHCHD7 QTN for stature in
Japanese Black cattle, BMC Genetics, 13, 40, 2012.
４） Sasago, N., Abe, T., Sakuma, H., Kojima, T.,
Uemoto, Y. : Genome-wide association study forcarcass traits, fatty acid composition, chemicalcomposition, sugar, and the effects of related
candidate genes in Japanese Black cattle, Animal
Science Journal, 88, 33～44, 2016.
５） Matsuhashi, T., Maruyama, S., Uemoto, Y.,
Kobayashi, N., Mannen, H., Abe, T., Sakaguchi, S.,
Kobayashi, E. : Effects of bovine fatty acid synthase,stearoyl-coenzyme A desaturase, sterol regulatory
element-binding protein 1, and growth hormone
gene polymorphisms on fatty acid composition andcarcass traits in Japanese Black cattle, Journal ofAnimal Science, 89, 12～22, 2014.

© The Ito Foundation

135

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別手法の確立
Establishment of a DNA-based discriminating method for Jidori “ChosyuKurokashiwa” genetically derived from “Kuro-Kashiwa”，a National Natural
Treasure of Japan伊藤直弥１，３・関谷

正男１・佐藤慎一２・大竹剛２・都築政起３（１山口県農林総合技術センター，２独立行政法人家畜改良センター，３広島大学大学院生物圏科学研究科）

Naoya Ito１，３, Masao Sekiya１, Shinichi Sato２, Tsuyoshi Ohtake２ and Masaoki Tsudzuki３（１Yamaguchi Prefectural Agriculture and Forestry General Technology Center, Livestock Technology Research Department,
２National Livestock Breeding Center, ３Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University）

The Kuro-Kashiwa（KRK）chicken is a National Natural Treasure of Japan originated in
Yamaguchi and Shimane prefectures. The commercial meat-type brand chicken“ChosyuKurokashiwa（CK）”is produced by the mating of Yamaguchi-Kurodori（YK）males andRhode Island Red（RIR）females. The YK breed has been established based on the four-way
matings of KRK, Japanese Large Game（JLG）, RIR, and White Plymouth Rock（WPR）breeds
and maintained as a closed colony. Nowadays, it is required to distinguish the CK from theother brand chickens using DNA-based techniques. In the current study, we investigatedhaplotypes at the melanocortin-1 receptor（MC1R）gene and genotypes of the SLC45A2 gene,along with the genotyping of 5 microsatellite markers on the Z chromosome, to establish thetechnique for DNA discrimination of CK from the other brand chickens. All in all, we used 414
blood samples collected from five native Japanese chicken breeds（KRK, JLG, Tomaru, TosaJidori, and Yakido）, three foreign breeds（WPR, Black Australorp, and Black Minorca）, andtwo kinds of crossbreds（two-way matings of KRK and three-way matings of KRK）, andinvestigated the differences in haplotypes at the MC1R locus and the genotype of the
SLC45A2 gene. In addition, we compared the allele sizes of 5 microsatellite markers among
two native Japanese chicken breeds（KRK and JLG）, three foreign breeds（WPR, RIR, andWhite Cornish）, and three kinds of crossbreds（two-way matings of KRK, three-way matingsof KRK, and YK）, using 650 blood samples. As a result, we concluded that DNA discriminationof CK would be possible by establishing a parent stock that has the H2 haplotype at the MC1R
locus,“silver”allele at the SLC45A2 locus, and private alleles of KRK at three microsatellite
loci on the Z chromosome.

© The Ito Foundation

136
１．目

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

確認し，このアリルを保有する種鶏「やまぐち黒的鶏」を作出することにより，「長州黒かしわ」の「長州黒かしわ」は，天然記念物「黒柏鶏（くDNA識別技術が確立される可能性を報告していろかしわ）」をもとにロードアイランドレッド

る４）。

（RIR）
，軍鶏，ホワイトプリマスロック（WPR）

なお，羽色に関わる遺伝子のうち，メラノコルを交配した黒柏四元交雑鶏を閉鎖群育種した雄系

チン１受容体（MC1R）およびSLC45A2遺伝子

種鶏「やまぐち黒鶏（くろどり）」をRIRに交配には５～７），品種により多型があることが報告されしたコマーシャル地鶏である１）。また，「国産銘ているが８，９），筆者らはこのような表現型を支配

柄鶏ガイドブック2011」（社団法人日本食鳥協会，する遺伝子についても黒柏鶏に品種特異性がある

2011）に掲載されている地鶏及び銘柄鶏の中で唯ことを確認しており（未発表），黒柏鶏の特徴を

一「黒柏鶏」を交配に利用した地鶏である２）。

有する種鶏を選抜することにより，「長州黒かし

山口県の養鶏専門農協では，「長州黒かしわ」
を最高級ブランドに位置付け，平成21年から生わ」のDNA識別技術の信頼性が向上する可能性が高くなると考えられる。

産・販売を開始している（商標登録5328087号，今回は，「長州黒かしわ」を他の品種と遺伝子

2009）。
「長州黒かしわ」は山口県初のオリジナル

レベルで識別する手法の確立を目的として，黒柏

地鶏として，平成22年度には県内の肉用鶏の生産

鶏 特 有 の マ ー カ ー， MC1R 遺 伝 子 型 及 び

団体，県養鶏協会および県で構成する「黒かしわSLC45A2遺伝子型について，WPR，白色コーニッ

地どり振興協議会」が設立され，平成25年度に山シュ（WC）およびやまぐち黒鶏等における保有

口県初の統一ブランド「やまぐちブランド」とし状況の確認を行った。

て認証され，平成27年度には県産の特産物５銘柄「ぶちうまファイブ」に選出されるなど，県をあ２．方法

げての地鶏振興体制が整備される中で，首都圏や

2.1

供試鶏

県内に販路を広げており，将来は10万羽生産を目

本試験ではWC（商用鶏Ａ雄10羽），WC（商用指して関係者が一丸となって生産から販売まで取鶏Ｂ雄10羽），WPR（商用鶏Ａ雌10羽），WPR（商り組んでいる。

用鶏Ｂ雌10羽），広島大学で保有している蜀鶏

そのような中，比内地鶏や名古屋コーチンのよ（とうまる）（16羽），土佐地鶏（10羽），八木戸鶏

うな有名ブランド地鶏で行われている地鶏肉の（16羽），オーストラロープ（16羽），ミノルカ（16DNA識別は，地鶏肉のブランド力の保持および羽），山口県農林総合技術センター畜産技術部でブランド価値の向上に繋がることから ，「長州保有している黒柏三元交雑鶏の第４世代（雄31

黒かしわ」においても生産羽数の増加に伴い確立羽），やまぐち黒鶏の第２世代（雄143羽，雌112が必要な技術の一つである。

羽）を 用 い た 。ま た ，黒 柏 鶏 特 有 の DNA マ ー

３）

そのため，関谷らは，黒柏鶏，RIRおよび軍鶏カー，MC1R遺伝子型およびSLC45A2遺伝子型の比較によりＺ染色体上の７つのマイクロサテラの比較に際しては，2013年に得られた結果（黒柏

イ ト DNA マ ー カ ー （ABR0608, ABR1002,

鶏（39羽），RIR（29羽），黒柏二元交雑鶏（72羽），

MCW0258, ABR1008, ABR0376, MCW0128,

軍鶏（833系，16羽）ならびに黒柏三元交雑鶏のABR0289）座位において黒柏鶏特有のアリルを第２世代（168羽））を併用した。なお，やまぐち© The Ito Foundation

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別手法の確立

137

黒鶏については，近交退化の抑制を目的とした系用いた。PCR条件は，熱変性94℃10分，次いで統更新のため，2003年，2011年および2015年に３98℃10秒，アニーリング60℃30秒，エクステン

つの系統を作出しているが，2003年および2011年

ション68℃60秒を35サイクルであった。PCR産物に作出した系統は世代更新により黒柏鶏特有の遺を PCR Purification Kit（QIAGEN）を 用 い て 精伝子を保有していなかったことから，本研究では製 し た 後 ， 3130xl Genetic Analyzer （Applied

2015年に作出した系統のみを用いた。

Biosystems）により，両遺伝子の塩基配列を決※黒柏三元交雑鶏：黒柏鶏の雄をRIRの雌に交定 し た 。得 ら れ た 塩 基 配 列 に 対 し ，BioEdit

配させ作出した黒柏二元交雑鶏の雌に軍鶏

version7.1.3ならびにMEGA6 version6.0を用いて（833系）の雄を交配させ作出（Fig.１）

解析を行った10，11）。
ｂ）マイクロサテライトDNA※やまぐち黒鶏：WPR（981系）の雌に黒柏三元交雑鶏の第３世代を交配させ作出（Fig.１）

供試鶏の血液からフェノールクロロホルム法12）2 . 2 MC1R, SLC45A2およびマイクロサテラにより抽出し20ng/μlに調整したDNAをテンプ
レ ー ト に 用 い ，Table １ に 示 し た 10 マ ー カ ー をイトDNAの多型調査

PCR法により増幅した。

ａ）MC1RおよびSLC45A2
血液より抽出したDNAをテンプレートに用い

PCRに際してはforwardおよびreverseプライてPCRを行った。独自に設計したMC1Rおよびマーをそれぞれ6.25pmol，dNTPを0.2mM，MgCl2

SlC45A2遺伝子のforwardおよびreverseプライ

を２mM，BIOTaqTM HS DNApolymerase（Bioline,

マー，ならびにKOD FX NEO酵素（Takara）をTaunton，MA，USA）を0.375Ｕとし，合計15μl

KRK♂

RIR♀

JLG♂
（833 line）

Two-way matings of KRK（F1）♀

Closed ﬂock
breeding
Three‒way matings of KRK（F3） ♂

WPR♀
（981 line）

Closed ﬂock
breeding
Yamaguchi
Kuro‒dori♂

RIR♀

Chosyu‒Kurokashiwa
Fig. 1 Mating scheme of Chosyu-Kurokashiwa※ RK＝Kuro-Kashiwa, RIR＝Rhode Island Red, JLG＝JapaneseK
Large Game, WPR＝White Plymouth Rock,© The Ito Foundation

138

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）で反応させた。PCR反応条件は，熱変性を94℃でし，最後に72℃で５分間保持した。PCR後，自動10分，その後95℃を30秒，アニーリングを55℃でDNA シ ー ク エ ン サ ー （ABI3130, Applied

30秒，伸張反応を72℃で30秒を35サイクル繰り返

Biosystems, Foster City, CA, USA）を 用 い て 各

Table 1 Microsatellite markers used in the current study
MarkerChr.

Position（Mb）

ABR0608

Ｚ

ABR1002

Forward primer（5ʼ→3ʼ）

Reverse primer（3ʼ→5ʼ）

References

8.8

GCAGGAAGGTTCACAGAAAGTTGGCAATAGCTTCAAAACA

Ｚ

13.1

TAGGAAAGATGCCCGATAAAACAAGGGTTGGGAATGTAGTGAABR1008

Ｚ

29.4

GGGCTCTTTAGGACAACTCAC

ATCAATATGAAGGCAGTTACAAGA

Rikimaru andTakahashi（2007）

ABR0376

Ｚ

43.2

AGGGTATGGATGTCTTACTACACAAAGTTCCTGAATAATA

Rikimaru andTakahashi（2007）

ABR0289

Ｚ

64.6

TTCTCAAACTGTTAAGGTCCAC

AACTCCCACTCCACCACAAC

Rikimaru andTakahashi（2007）

Rikimaru andTakahashi（2007）
Rikimaru andTakahashi（2007）

Table 2 Haplotypes at the MC1R locus found in the current study
AlleleHaplotype

e＋＋

Ｈ0-1

e＋

Ｈ0-2

E

Ｈ1

E

Ｈ2

E

Ｈ3

E or ERE or ER

ERf

eb

Ｈ4

Ｈ5

Ｈ6

Ｈ7

―

Ｈ8

ewh

Ｈ9

Nucleotide position
69

212

274

376

398

427

636

637

645

834

Nucleotide

ｃ

ｔ

ｇ

ｇ

ｔ

ａ

ａ

ｃ

ａ

ｃ

Amino
acid

Asn

Met

Glu

Val

Leu

Thr

Ala

Arg

His

Asn

―

―

―

―

―

―

ｇ

ｔ

―

―

＊

＊

＊

＊

＊

＊

＊

Cys

＊

＊

ｔ

ｃ

ａ

―

―

―

―

―

―

―

＊

Thr

Lys

＊

＊

＊

＊

＊

＊

＊

ｔ

ｃ

ａ

―

―

―

ｇ

ｔ

―

―

＊

Thr

Lys

＊

＊

＊

＊

Cys

＊

＊

ｔ

ｃ

ａ

―

―

―

―

ｔ

―

―

＊

Thr

Lys

＊

＊

＊

＊

Cys

＊

＊

―

―

ａ

―

―

―

―

―

―

―

＊

＊

Lys

＊

＊

＊

＊

＊

＊

＊

―

―

ａ

ａ

―

―

―

―

―

ｔ

＊

＊

Lys

Ile

＊

＊

＊

＊

＊

＊

―

―

―

―

ａ

―

―

―

―

ｔ

＊

＊

＊

＊

Gln

＊

＊

＊

＊

＊

―

―

―

―

―

―

―

―

ｃ

―

＊

＊

＊

＊

＊

＊

＊

＊

Pro

＊

ｔ

ｃ

ａ

―

―

―

―

―

ｃ

―

＊

Thr

Lys

＊

＊

＊

＊

＊

Pro

＊

―

―

―

―

―

ｇ

―

―

―

―

＊

＊

＊

＊

＊

Ala

＊

＊

＊

＊

© The Ito Foundation

139

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別手法の確立（8.8Mb）と ABR1002（13.1Mb）の 間 の 10.0Mb

マーカーのタイピングを行った。

に位置し，鶏の銀笹羽装（Silver型）と赤笹羽装

３．結果と考察（野生型）の発現に関与することが報告されてい本試験で区分したMC1R遺伝子型をTable２に，る９）。

黒柏鶏，蜀鶏，八木戸鶏，オーストラロープ，黒本研究では，黒柏鶏におけるMC1R遺伝子のハ色ミノルカ，土佐地鶏およびWPRのMC1R遺伝

プロタイプはＨ１型が0.05，Ｈ２型が0.95であっ子のハプロタイプおよびSLC45A2遺伝子型の結た。黒柏三元交雑鶏におけるMC1R遺伝子のハプ

果をTable３に示した。

ロタイプはＨ２型が0.52，Ｈ３型が0.48であり，MC1R遺伝子座は，11番染色体上に存在する黒SLC45A2遺伝子はすべてSilver型を示した。黒

色拡張遺伝子座（extended black；E遺伝子座）

柏四元交雑鶏におけるMC1R遺伝子のハプロタイと同義である。E遺伝子座における対立遺伝子のプ は Ｈ ２ 型 が 0.56 ， Ｈ ３ 型 が 0.12 で あ り ，

優劣順位は，E（黒色拡張）＞birchen（E ：かば

SLC45A2遺伝子はSilver型が0.62，野生型が0.38色）＞dominant Wheaten（e ：優性コムギ色）＞であった。蜀鶏は，黒柏鶏より大型であり長鳴性Wild type（e ：野生型）＞partridge（e ：褐色）＞を示すものの，両品種ともに黒色羽装をもつため

speckled（eS：頭部斑紋）＞buttercup（ebc：バターに，両者の外観による判別は難しいとされている

カップ）＞recessive wheaten（e ：劣性コムギ色）

が14），蜀鶏のMC1R遺伝子のハプロタイプは，黒となっている13）。さらに，それぞれのアリルには

柏鶏とは異なるＨ１，Ｈ５およびＨ６型を示すと品種特異性があることが報告されている 。また，

ともに，SLC45A2遺伝子も黒柏鶏とは異なる野SLC45A2遺伝子座は，Ｚ染色体上のABR0608

生型を示した。「国産銘柄鶏ガイドブック2011」

R

W

＋

b

y

５）

Table 3 Haplotype frequencies at the MC1R locus and genotype frequencies of the SLC45A2 gene in each chicken

population
BreedTosa-Jidori

Feathercolor

MC1R（E）locus

SLC45A2（S）locus

ｎ

H0-2

Ｈ1

Ｈ2

Ｈ3

Ｈ4

Ｈ5

Ｈ6

Ｈ7

Ｈ8

Ｈ9

ｎ

Silver
type

Wild
type

BBR＊
（Wild type） 10

1.00

―

―

―

―

―

―

―

―

―

4

―

1.00

10

―

1.00

Toumaru

Black

15

―

0.40

―

―

―

0.07

0.53

―

―

―

Yakido

Black

16

―

―

―

0.84

―

―

―

0.13

―

0.03

Black
Australorp

Black

16

―

―

1.00

―

―

―

―

―

―

―

10

1.00

―

Black Minorca

Black

16

―

0.43

―

―

―

―

0.44

―

0.13

―

10

―

1.00

WPR
（981 Line）

White

16

―

―

0.09

―

0.06

―

―

0.84

―

―

10

0.20

0.80

Kuro-Kashiwa

Black

39

―

0.05

0.95

―

―

―

―

―

―

―

30

1.00

―

Yamaguchi
Kuro-dori
（F2）

Black

255

―

―

0.56

0.12

―

―

―

0.32

―

―

255

0.62

0.38

Three-waymatings of KRK
（F4）

Black

31

―

―

0.52

0.48

―

―

―

―

―

―

31

1.00

―

＊BBR＝Black Breasted Red© The Ito Foundation

No data

140

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）に掲載されている「地鶏及び銘柄鶏の交配様式」ていたのは雄２羽，雌15羽であったことから，本の項目に掲載のある黒色を有する鶏種の中で，近研究では７マーカーのうち５マーカー（ABR0608

江黒鶏の交配に活用されているオーストラロープ（220 bp）,ABR1002 （348 bp）,ABR1008 （285は，MC1R遺伝子のハプロタイプにおいて黒柏鶏bp）,ABR0376 （156 bp）,ABR0289 （289 bp））と同じＨ２型を保有していた。なお，オーストラについて調査を進めた。これら５つのマイクロサ

ロープは，SLC45A2遺伝子も黒柏鶏と同じSilver

テライトDNAマーカーをすべて保有するものは型を示した。

黒柏鶏および黒柏二元交雑鶏の雌のみであり，黒黒柏三元交雑鶏の第２世代の雄40羽，雌128羽

柏二元交雑鶏の雄における５マーカーのアリル頻において，Ｚ染色体上にある黒柏鶏特有の７つの度は0.500であった（Table４）。軍鶏を黒柏二元交

マイクロサテライトDNAマーカーすべてを有し雑鶏に交配させた黒柏三元交雑鶏においては，黒Table 4 Allele frequencies at each marker locus on the Z chromosome in each chicken population
Current study
MakersPosition（Alleles, bp） （Mb）

ABR0608
（197）
（203）

Yamaguchi
Kuro-dori（F2）

Yamaguchi
Kuro-dori
（F2）

♂

♀

0.00
0.06

0.00
0.02

Past study（Sekiya et al.，2013）

Three-way
WC WC WPR WPRmatings of（Ａ） （Ｂ） （Ａ） （Ｂ）
KRK
（F4）
♂
♂
♂
♀
♀

♂

Two-waymatingsof KRK（F1）♂

Two-waymatingsof KRK（F1）♀

Three-waymatings of
KRK
（F2）
♂♀

0.00
0.50

0.00
0.00

0.00
0.00

0.00
0.33

KuroKashiwa

RIR

JLG

♂

♀

0.00
0.00

0.00
0.00

8.8
0.00
0.03

0.00
0.75

0.15
0.25

0.00
0.00

0.00
0.00

（213）

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.10

0.00

0.02

0.00

0.00

（214）
（220）
（222）

0.21
0.69
0.03

0.45
0.46
0.07

0.00
0.97
0.00

0.10
0.00
0.15

0.25
0.25
0.05

0.00
0.00
1.00

0.00
0.00
1.00

0.00
1.00
0.00

0.00
0.00
0.90

0.00
0.00
0.50

0.00
0.50
0.48

0.00
1.00
0.00

0.00
0.48
0.18

0.00

0.00

0.00

0.00

0.05

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.68
0.32

0.46
0.55

0.98
0.02

0.90
0.10

0.85
0.15

1.00
0.00

0.00
1.00

1.00
0.00

0.00
1.00

0.00
1.00

0.50
0.50

1.00
0.00

0.45
0.55

（224）
SLC45A2

10.0

Silver type
Wild type
ABR1002
（256）

13.1
0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.02

（348）
（353）
（356）

0.95
0.00
0.05

0.99
0.00
0.01

0.89
0.00
0.11

0.40
0.60
0.00

0.25
0.15
0.00

0.00
1.00
0.00

0.00
0.00
1.00

1.00
0.00
0.00

0.00
1.00
0.00

0.00
0.09
0.78

0.50
0.50
0.00

1.00
0.00
0.00

0.48
0.11
0.24

（358）
（359）
ABR1008

0.00
0.00

0.00
0.00

0.00
0.00

0.00
0.00

0.00
0.60

0.00
0.00

0.00
0.00

0.00
0.00

0.00
0.00

0.00
0.13

0.00
0.00

0.00
0.00

0.13
0.01

（276）

0.24

0.42

0.00

0.50

0.00

1.00

0.30

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

（279）
（280）
（281）
（285）
（289）
（290）
ABR0376
（156）
（158）
（164）
（168）
（169）
ABR0289
（271）
（273）
（276）
（278）
（283）
（287）
（289）

0.00
0.00
0.23
0.53
0.00
0.00

0.00
0.00
0.13
0.45
0.00
0.00

0.00
0.00
0.14
0.86
0.00
0.00

0.00
0.05
0.45
0.00
0.00
0.00

0.00
0.95
0.05
0.00
0.00
0.00

0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00

0.00
0.00
0.00
0.00
0.70
0.00

0.00
0.00
0.00
1.00
0.00
0.00

0.24
0.00
0.76
0.00
0.00
0.00

0.00
0.00
0.52
0.00
0.00
0.48

0.02
0.00
0.48
0.50
0.00
0.00

0.00
0.00
0.00
1.00
0.00
0.00

0.00
0.00
0.45
0.44
0.00
0.12

0.42
0.00
0.40
0.18
0.00

0.29
0.00
0.32
0.39
0.00

0.59
0.02
0.31
0.08
0.00

0.00
0.00
0.00
0.00
1.00

0.00
0.00
0.00
0.00
1.00

0.00
0.00
0.80
0.00
0.20

0.00
0.00
0.00
0.00
1.00

1.00
0.00
0.00
0.00
0.00

0.00
0.00
0.24
0.76
0.00

0.00
0.00
0.40
0.60
0.00

0.50
0.00
0.19
0.31
0.00

1.00
0.00
0.00
0.00
0.00

0.42
0.00
0.27
0.32
0.00

0.22
0.48
0.00
0.00
0.00
0.00
0.30

0.44
0.31
0.01
0.00
0.00
0.00
0.24

0.02
0.44
0.00
0.00
0.16
0.00
0.39

0.05
0.85
0.00
0.05
0.00
0.05
0.00

0.55
0.45
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00

0.10
0.90
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00

1.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00

0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
1.00

0.68
0.17
0.00
0.00
0.00
0.14
0.00

0.40
0.06
0.00
0.00
0.54
0.00
0.00

0.44
0.01
0.00
0.00
0.00
0.04
0.50

0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
1.00

0.21
0.00
0.00
0.00
0.29
0.00
0.36

29.4

48.2

64.6

© The Ito Foundation

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別手法の確立

141

柏鶏特有の５マーカーのアリル頻度は0.361から

３マーカーとSLC45A2遺伝子は品種識別に際し0.484と黒柏二元交雑鶏より低くなっており，５実用性が高いと考えられた。

マーカーの遺伝子間で組み換えが起こっているこ

以上の事実から，MC1R遺伝子はＨ２型を，とがうかがえた。また，WCや一部の鶏種のWPR

SLC45A2遺伝子はSilver型を示し，黒柏特有のにおいて，SLC45A2遺伝子はSilver型を保有し，

３ マ ー カ ー （ABR0608（220 bp）, ABR1002

黒柏鶏特有の２マーカー（ABR0608（220 bp）,（348 bp）, ABR1008（285 bp））を保有する雄系

ABR1002（348 bp））を保有している個体も散見

種鶏「やまぐち黒鶏」の造成を行うことにより，さ れ た が ， ３ マ ー カ ー （ABR0608（220 bp）,「長州黒かしわ」をブロイラーや他の地鶏・銘柄

ABR1002（348 bp）, ABR1008（285 bp））を 保

鶏とDNAレベルで識別できる可能性は高いと考有している個体は見られなかった。今回の調査結

え ら れ た 。そ の た め ，や ま ぐ ち 黒 鶏 に 対 し ，果において，SLC45A2遺伝子がSilver型を示し，

MC1R遺伝子のＨ２型，SLC45A2遺伝子のSilver

黒柏鶏特有の３マーカー（ABR0608（220 bp）,

型，ならびに黒柏特有の３マーカーに関し固定化

ABR1002（348 bp）, ABR1008（285 bp））を 保を図ることにより，本技術を確立できることが示

有する鶏種は，黒柏鶏，黒柏二元交雑鶏，黒柏三唆された。ただし，オーストラロープは，MC1R

元交雑鶏およびやまぐち黒鶏のみであった。

遺伝子はＨ２型，SLC45A2遺伝子はSilver型を

また，黒柏鶏特有の５マーカー（ABR0608,

示していたため，黒柏鶏特有の５つのマイクロサ

ABR1002, ABR1008, ABR0376, ABR0289）は，

テライトDNAマーカーについては引き続き解析

Ｚ染色体上において，それぞれ8.8，13.1，29.4，を実施する必要がある。

43.2および63.4Mbに位置している（Table４）。これらの遺伝子間の距離は54.6Mbと大きいために，

４．要約

やまぐち黒鶏が造成されるまでに遺伝子間で組み天然記念物「黒柏鶏（くろかしわ）」をもとに換えが起こることが予測された。実際にやまぐち

開発された地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別を

黒 鶏 に お い て ，Ｚ 染 色 体 上 の 後 半 に 位 置 す る

可能にするためには，MC1R遺伝子型はＨ２型を，

ABR0376, ABR0289の黒柏鶏特有アリルの頻度

SLC45A2遺伝子型はSilver型を保有し，黒柏鶏は0.42，0.30と低かった（Table４）。一方，Ｚ染特有の３つのマイクロサテライトDNAマーカー

色 体 上 の 前 半 に 位 置 す る ABR0608, ABR1002,（ABR0608, ABR1002およびABR1008）を保有

ABR1008の３マーカーは，遺伝子間の距離がする雄系種鶏「黒柏四元交雑鶏（やまぐち黒鶏）」

20.6Mbと短いために黒柏鶏特有のアリル型が１の固定化が必要と考えられた。

セットで遺伝することが予測された。やまぐち黒鶏におけるこれら３マーカーの黒柏鶏特有アリルの 頻 度 は ，そ れ ぞ れ 0.69 ，0.95 ，0.53 で あ っ た（Table４）。 SLC45A2 遺 伝 子 は ABR0608,
ABR1002の２マーカー間に位置していた。やまぐち黒鶏において黒柏鶏が保有するSilver型の頻度が0.69であることから，黒柏鶏特有の５マーカーのうち，ABR0608, ABR1002, ABR1008の

引用文献
１） 関谷正男，岡崎亮，宮本和之，野村利定，藤本和正，
福坂一利：黒柏を活用した県産オリジナル地どりの開発（第１報）― ―雄系種鶏「やまぐち黒鶏」の造成と実用地どりの開発―，山口県畜産試験場研究報告，第24号，47～60, 2009.
２） 国産銘柄鶏ガイドブック2011，社団法人日本食鳥協会，東京，2011.
３） Rikimaru, K., Takahashi, H. : A Method for
Discriminating a Japanese Brand of Chicken, the© The Ito Foundation

142

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Hinai-jidori, Using Microsatellite Markers, Poultry
Scence, 86, 1881～1886, 2007.
４） 関谷正男，奥村友美，都築政起：天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別の可能性の検討－，平成25年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，103～107, 2014.
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Campo, J. L. : Association between polymorphism inthe melanocortin 1 receptor gene and E locus
plumage color phenotype, Poultry Science, 93, 1089
～1096, 2014.
６） Gunnarsson, U., Hellström, A. R., Tixier-Boichard,M., Minvielle, F., Bedʼhom, B., Ito, S., Jensen, P.,
Rattink, A., Vereijken, A., Andersson, L. : Mutations
in SLC45A2 cause plumage color variation inchicken and Japanese quail, Genetics, 175, 867 ～ 877,
2007.
７） Hall, T. A. : BioEdit: user-friendly biologicalsequence aliment editor and analysis program for
Windows 95/98/NT, Nucleic Acids Symposium
Series, 41, 95～98, 1999.
８） 奥村友美，大竹剛，佐藤慎一，新實竜也，上本吉伸，

小林栄治：黒色羽装の発現を制御するMC1R遺伝子の品種間における多様性，日本家禽学会誌，50, 1～9,2013.
９） 大竹剛，佐藤妙子，國分洋一，上本吉伸，佐藤周史，
奥村友美，小林栄治：会津地鶏の５色羽装とSLC45A
２遺伝子上の変異との関係，日本家禽学会誌，48, 58～62, 2011.
10） Kerje, S., Lind, J., Schütz, K., Jensen, P.,
Andersson, L. : Melanocortin1üreceptor（MC1R）
mutations are associated with plumage colour inchicken, Animal Genetics, 34, 241～248, 2003.
11） Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A.,
Kumar, S. : MEGA6 : molecular evolutionary
genetics analysis version 6.0, Molecular Biology and
Evolution, 30, 2725～2729, 2013.
12） Sambrook, J., Russell, D. W. : Molecular cloning: alaboratory manual. 3 rd ed, Cold Springs Harbor
Laboratory Press, New York, 2001.
13） 若杉昇：遺伝と育種，新編畜産大辞典（田先威和夫 監 修），第 一 版 ，株 式 会 社 養 賢 堂 ，1066 ～ 1067,
1996.
14） カラー版日本鶏外国鶏，家の光協会，2004.

© The Ito Foundation

143

優良肉用家畜増産のための受精卵移植の基盤となる
高品質卵子の選抜
Selection of high quality egg for embryo transplantation to produce highquality meat livestock

眞

鍋

昇

（大阪国際大学人間科学部）

Noboru Manabe（Department of Human Sciences, Osaka International University）

Many primordial ovarian follicles are present in the ovary of farm animals. Part of themgrows at every sexual cycle and more than 99％ of them die during ovulation process. The aimof the present study is to select the high quality oocytes for embryo transplantation of farmanimals with high-quality meat.
Less than 1％ of primordial ovarian follicles are developed and ovulated, and theremainders are eliminated via atresia. The traditional endocrinology-mechanisms involved in
ovarian follicle development and growth have been characterized, but the precise mechanisms
involved in the regulation of ovarian follicle selection remain unknown. Our recent findings
indicate that apoptosis in the granulosa cells of ovarian follicles plays a crucial role in theoocyte and ovarian follicle selection. Notably, cell death ligand and cell death receptor systems
including apoptosis inhibiting receptors and their intracellular signaling are the key
mechanisms regulating granulosa cell apoptosis. In the present study, we revealed detailed
mechanisms of granulosa cell apoptosis regulated by death ligand and receptor systems andtheir signaling pathways. Moreover, the roles of apoptosis inhibitory receptor［decoy receptor
3（DcR3）］and intracellular signaling inhibitors［cellular FLICE-like inhibitory protein（cFLIP）
and X-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP）］, which are useful to assess the damaged
oocytes and ovarian follicles and/or healthy oocytes and ovarian follicles and to produce highquality health embryos for transplantation, were revealed. We develop novel method to pick uphigh quality oocyte in ovarian follicle with the help of the inhibitory system assessment.

１．目

的に解明してきた。その結果，排卵に至る健常な的卵胞と閉鎖されて消滅する卵胞との判別の指標と申請者は，20年以上にわたって哺乳類の卵子がなる可能性が高い分子をあげることができるよう

休眠後減数分裂を再開して発育成熟する過程でになってきた１，２）。本研究は，これまで遂行して99％以上を選択的に死滅させてしまうことで不都きた卵胞とそれに内包される卵子を選択して死滅合な卵子を取り除くことの調節機構を分子生物学させる分子制御機構を解明する研究の成果を活用© The Ito Foundation

144

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

して，肉用家畜として優良な遺伝子資源をもつ雌

タグランディン類，血管新生因子類，一酸化窒素

家畜の高品質な卵子を選抜して受精卵移植するたなどを添加して共培養し，これらのなかから候補

めの技術基盤を確立することを目的とした。すな

因子の絞込を進めた。その結果，ブタやウシなど

わち，死滅すべき卵胞とそれに内包される品質がの完全性周期動物においては，最初に細胞を死滅

劣る卵子を判定して排除し，残りの排卵に至る卵させる作用が発見された腫瘍壊死因子［tumor胞に内包される高品質の卵子を積極的に救命して

necrosis factor（TNF）α］が卵胞顆粒層細胞の受精卵を生産して受精卵移植に供する技術システ

増殖因子・成長因子・生存因子として働いている

ムを開発しようとするもので，学術的に独創的でことが分かった。申請者は，完全性周期動物の卵あり，かつ社会に貢献する意義深いものである。

胞顆粒層細胞においてはTNF２型受容体のみが２．方発現していることを報告している１）。TNF２型受法

容体は，アポトーシス・シグナルを伝達するので家畜の卵巣を食肉処理場にて入手し，実体顕微はなく細胞増殖シグナルを伝達する。しかしなが鏡下に卵胞を個別に切り出した後，個々の卵胞から不完全性周期動物である齧歯類ではアポトーシ

ら顆粒層細胞を調製した。卵胞液中のプロゲステ

ス・シグナルを伝達するTNF１型受容体が発現

ロン濃度とエストラジオール濃度をELISA法にしていることも分かっている１，２）。培養細胞を用て測定し，これらの比が15以下の卵胞を健常としいた実験では，TNFαがアポトーシス・シグナ

た。卵胞別に顆粒層細胞におけるアポトーシス阻害

ル阻害因子のcFLIP-l, XIAPおよびDcR3の発現

因子［decoy receptor 3（DcR3）, cellular FLICE-をup-regulateすること，そしてTNFαの発現はlike inhibitory protein long form（cFLIP-1）およinterleukin-6（IL6）によってup-regulateされてびX-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP）］

いることなどが分かった。

の発現調節因子の探索とそれらを調節する分子機構の解明を進めた。

これらの知見を道標としてアポトーシス・シグ
ナル阻害因子cFLIP-l，XIAPおよびDcR3の発現を健常に発育している卵胞の顆粒層細胞に高発現

支配的に制御しているマスター因子の同定を目指しているcFLIP-l, XIAPおよびDcR3が，急速にし た 。 cFLIP-l と cellular FLICE-like inhibitory

消滅すると卵胞閉鎖が誘導される。これらの消滅

protein short form（cFLIP-s）とがスプライシンを調節している機構は未解明である。cFLIP-l,

グバリアントであることを確認したが，スプライ

XIAPおよびDcR3のmRNAをup-regulateあるい

シング過程がどのような調節を受けて各々のバリはdown-regulateする因子の探索の最初のステッアントが産生されているのか不明である１）。ブタ

プは，不死化培養顆粒層細胞（JC-410細胞）をのゲノムのcFLIP遺伝子の5ʼ-側の転写開始コドン

用いて進めた。これは，ブタの顆粒層細胞が不死から上流にむかって順次核酸配列を読み進め，転化したものであるが，形質転換をしておらず，

写制御ドメインの解析を進め，これまでに予備的

様々な顆粒層細胞の特性を保持している。この細にFOXO3aなどの転写因子が転写制御していると胞と卵胞に対して成長因子・生存因子として働く思われる成績を得ている２）。

因子を探索するためにサイトカイン，性腺刺激ホ

次いで上記のIL6-TNFα-inhibitors軸がアポ

ルモン，ステロイドホルモンおよびアクチビン，

ト ー シ ス ・ シ グ ナ ル 阻 害 因 子 の 転 写 を up-

インヒビン，フォリスタチン，増殖因子，プロス

regulate す る 場 合 ，あ る い は 未 探 索 な 因 子 が© The Ito Foundation

優良肉用家畜増産のための受精卵移植の基盤となる高品質卵子の選抜

145

down-regulateする場合にどのような転写制御因

いて卵胞閉鎖過程を形態学的に精査し，極初期に子およびその複合体が働いているのか解明を進め誘起される顆粒層細胞のアポトーシスが閉鎖の調た。アポトーシス・シグナル阻害因子の発現を人節に深く係わっていることを示し，この分子制御

為的に調節することで卵子の救命が可能か否かを機構の解明を進めてきている。二次卵胞以降の顆

確認することで，阻害因子の生理作用の確認を進

粒層細胞にはtumor necrosis factor（TNF）family

めた。これらは，卵子の品質を評価するマーカーに属するリガンド（TNFα，TRAIL，FasL）ととして役立つのみならず，アポトーシス・シグナ

TNF 受 容 体 （TNFR）family に 属 す る 受 容 体

ル阻害因子の発現を人為的にup-regulateするこ［TNFR-II，TRAIL受容体（DR4，DR5，囮受容とで食肉処理場で日々廃棄されている卵巣内の卵体１），FasL受容体（Fas，囮受容体３，可溶性子（潜在的卵巣内卵子）を救命するのに役立つとFas），リガンド不明受容体（PFG-5）］が発現し考えられる。

ていることを見いだし，併せてTNFα/TNFR-II

食肉処理場で採取した家畜卵巣の卵胞腔をもつ系は細胞増殖の亢進を担っていることを明らかに

３次卵胞において，顆粒層細胞でのアポトーシ

した１，２）。これらの細胞死リガンドと細胞死受容ス・シ グ ナ ル 阻 害 因 子 の cFLIP-l, XIAP お よ び

体は，閉鎖卵胞のみならず，発育し続けている健

DcR3のmRNAとタンパクがともに高発現してい常卵胞の顆粒層細胞でも発現していたので，細胞る卵胞は，プロゲステロン濃度とエストラジオー

死阻害因子が存在すると考えた。細胞死阻害因子

ル濃度の比が15以下であったので健常であると判を探索した結果，卵胞の顆粒層細胞はミトコンド定できた。この３次卵胞から卵子を取り出して体リアを介してシグナルが伝わるⅡ型アポトーシス

外成熟培養に供した。卵核胞崩壊，第一極体の放細胞であることが分かるとともに囮受容体出を指標として成熟した卵子に凍結精子を用いた（DcR3）と２種類の細胞内のアポトーシス・シグ

体外受精を施した。受精した初期胚を体外で培養

ナル阻害因子（cFLIP-ｌとXIAP）が存在するこ

して２細胞，８細胞，桑実胚，胚盤胞までの発生とが判明した３～10）。

と各ステージの胚の形態異常の判別およびハッチ

リガンドと結合した活性化受容体では受容体のング能の有無を確認した。このようにして卵子の細胞内ドメインであるdeath domain（DD）とア

発生能と受精能を調べて初期胚の発生能の正常性

ダプタータンパク（FADDやTRADD）のDDとを評価した。

が互いに介して結合する。このことで，アダプ
タータンパクにdeath effector domain（DED）を

３．結果と考察介してカスパーゼ-８前駆体（カスパーゼは特異

家畜やヒトを含む哺乳類の卵巣においては胎児性の高いタンパク分解酵素で，下流の特定のタン期に第一減数分裂前期のディプロテン期で停止しパクだけを分解してシグナルを伝達する）が結合た卵子が顆粒層細胞に包まれた原始卵胞の状態でし，この前駆体が分解されて活性化する。囮受容

休眠している。性成熟に達した後，性周期毎に一体DcR3は受容体の細胞内ドメインが欠落してい定数が発育を開始する。卵胞内では顆粒層細胞がるのでアポトーシス・シグナルが伝達しない。免

卵子を保育し排卵に至るが，卵胞の発育の過程で疫系等の多くの細胞では活性化カスパーゼ-８が99％以上が閉鎖する１，２）。

直接下流のカスパーゼ-３前駆体を分解するが，重要な家畜であり完全性周期動物である豚を用

卵胞の顆粒層細胞ではカスパーゼ-８がミトコン© The Ito Foundation

146

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

ドリア外膜の透過性を調節するBidを分解するこを阻害する囮受容体を含めてアポトーシス・シグとで活性化してミトコンドリアからチトクローム

ナル阻害因子は卵子の品質を評価する指標としてＣを放出させる。このチトクロームＣがApaf-1

有用であると考えられた。

およびカスパーゼ-９前駆体と結合して複合体

食肉処理場で採取した家畜卵巣の卵胞のうち卵Apoptosomeを形成する。ここでカスパーゼ-９胞腔をもつ３次卵胞において顆粒層細胞でのアポが活性化されてカスパーゼ-３前駆体を分解する。

トーシス・シグナル阻害因子のcFLIP-l，XIAPお

活 性 化 し た カ ス パ ー ゼ - ３ が caspase activated

よびDcR3のmRNAとタンパクがともに高発現しDNAse（CAD）を活性化させることで活性化さている卵胞は，プロゲステロン濃度とエストラジ

れたCADが核内に移行し，遺伝子DNAを分断す

オール濃度の比が15以下であったので健常であるる。このようにしてアポトーシスが実行されること判定できた。この３次卵胞から卵子を取り出しとを明らかにした３，４）。

て体外成熟培養に供した。卵核胞崩壊と第１極体

健常卵胞顆粒層細胞ではFADDと結合してカの放出を卵子の成熟の指標とし，成熟卵子に凍結

スパーゼ-８前駆体との結合を阻害するcFLIPお精子を用いた体外授精を施した。受精した卵子

よびカスパーゼ-９とカスパーゼ-３前駆体間のシ（初期胚）を体外で培養して２細胞，８細胞，桑グナル伝達を妨げるXIAPが発現していることを

実胚，胚盤胞までの発生と各ステージの胚の形態見いだした。これらの細胞内因子がアポトーシ

異常の判別およびハッチング能の有無を指標とし

ス・シグナルの伝達を阻止している（Fig.１）。

て卵子の受精能および初期胚の発生能とその正常

顆粒層細胞由来細胞で阻害因子を過剰発現させた性を評価した。顆粒層細胞においてアポトーシ

場合，受容体依存性アポトーシスが阻害され，逆ス・シグナル阻害因子のcFLIP-l，XIAPおよびにRNA silencing法で発現を停止させると細胞はDcR3が高発現している卵胞から調製した卵子の死滅した。阻害因子は，TNFαとIL-6によって体外成熟能と受精能は高かった。さらにこの卵子

亢進することが分かった。リガンド・受容体結合

由来の初期胚の発生能は高く，発生した胚は正常

Cell deathligandCell death
receptor

FADD
DD

Decoy receptor 3

Procaspase‒3
Mitochondrion
XIAP

cFLIP-lPro‒
caspase‒8
Activated
caspase‒8

Apoptosome:Cytc/Apaf1/Cas‒pase‒9complex
Bid

Nucleus

CAD
Activated
caspase‒3

ICAD
CAD
CAD

Apoptosis

Fig. 1 家畜卵巣の顆粒層細胞におけるアポトーシス・シグナル伝達阻害因子（cFLIP-l, XIAPおよびDcR３）© The Ito Foundation

優良肉用家畜増産のための受精卵移植の基盤となる高品質卵子の選抜であった。
優秀な精子の遺伝子は，凍結保存・人工授精シ
ステムが一般化することで有効に利用されるようになっている。しかし優秀な雌の遺伝子資源の有効利用は発展途上の段階にとどまっている。近年，生体内卵子吸引（経膣採卵）［ovum pick up（OPU）］によって得られた卵子を体外で培養し，授精後，受精卵移植（初期胚移植）によって産仔を得ることによって優秀な雌の遺伝子資源の有効利用が広まってきているが，従来から行われてきた食肉処理場で日々廃棄されている卵巣内の卵子（潜在的卵巣内卵子）を用いた受精卵移植も行われており，優秀な雌家畜の遺伝子資源の有効利用が進んでいる。アポトーシス・シグナル阻害因子の発現を指標として健常な卵子を選抜して体外培
養・体 外 授 精 し た 後 ，受 精 卵 移 植 す る シ ス テ
ム８～10）を普及させることで，優秀な家畜の増産が一層亢進することが期待される。
４．要約

本研究によって卵胞・卵子の死滅を調節しているアポトーシス・シグナル阻害因子を指標として家畜の卵子の品質を評価することで，体外成熟能と受精能の高い卵子の判別，およびその初期胚の発生能が高く正常胚率も高いことが分かった。生体内卵子吸引や食肉処理場にて廃棄される卵巣内卵子を用いた体外培養・体外受精・受精卵移植システムの高品質化と効率化が期待され，農業領域
のみならず医療領域などを介して広く社会に貢献することも期待される。
文献１） Matsuda, F., Inoue, N., Manabe, N., Ohkura, S. :Follicular growth and atresia in mammalian ovaries:
Regulation by survival and death of granulosa cells,
Journal of Reproduction and Development, 58, 44～
50, 2012.
２） Manabe, N., Matsuda-Minehata, F., Goto, Y.,

147

Maeda, A., Cheng, Y., Nakagawa, S., Inoue, N.,
Wongpanit, K., Jin, H., Gonda, H., Li, J. : Role of cell
death ligand and receptor system on regulation offollicular atresia in pig ovaries, Reproduction in
Domestic Animals, 43, 268～272, 2008.
３） Sai, T., Goto, Y., Yoshioka, R., Maeda, A., Matsuda,F., Sugimoto, M., Wongpanit, K., Jin, H., Li, J.,
Manabe, N. : Bid and Bax are involved in granulosa
cell apoptosis during follicular atresia in porcine
ovaries, The Journal of Reproduction andDevelopment, 57, 421～427, 2011.
４） Sai, T., Matsuda, F., Goto, Y., Maeda, A.,
Sugimoto, M., Gao, H., Mohammad, A., Kabir, A., Li,
J., Manabe, N. : Effect of RNA interference of Bid
and Bax mRNAs on apoptosis in granulosa cellderived KGN cells, Journal of Reproduction andDevelopment, 58, 112～116, 2012.
５） Kominami, K., Nakabayashi, J., Nagai, T.,
Tsujimura, Y., Chiba, K., Kimura, H., Miyawaki, A.,
Sawasaki, T., Yokota, H., Manabe, N. : The molecularmechanism of apoptosis upon caspase-8 activation:
Quantitative experimental validation of amathematical model, Biochimica et Biophysica Acta
（Molecular Cell Research）, 1823, 1825～1840, 2012.
６） Kominami, K., Nagai, T., Sawasaki, T., Tsujimura,Y., Yashima, K., Sunaga, Y., Tsuchimochi, M.,
Nishimura, J., Chiba, K., Nakabayashi, J., Koyamada,K., Endo, Y., Yokota, H., Miyawaki, A., Manabe, N. :In vivo imaging of hierarchical spatiotemporal
activation of caspase-8 during apoptosis, PLoS ONE,7（11）: e50218. doi : 10.1371/journal.pone.0050218.
７） Suzuki, C., Yoshioka, K., Yamada, M., Noguchi, M.,
Manabe, N. : Expressions of tumor necrosis factorα, its receptor I, II and receptor-associated factor 2
in the porcine corpus luteum during the estrous
cycle and early pregnancy, Veterinary ResearchCommunications, 38, 1～10, 2014.
８） Nakagawa, S., Maedomari, N., Kikuchi, K., Nagai,T., Miyano, T., Fulka, J. Jr., Manabe, N. : Rescue of
vitrified fully grown and growing porcine oocytes
by germinal vesicle transfer, The Journal of
Reproduction and Development, 57, 335～341, 2011.
９） Việt, Linh, N., Kikuchi, K., Nakai, M., Noguchi, J.,
Kaneko, H., Quangm, Dang-Nguyen, T., Somfai, T.,
Xuan, Nguyen, B., Nagai, T., Manabe, N. :Fertilization ability of porcine oocytes reconstructedfrom ooplasmic fragments produced andcharacterized after serial centrifugations, The
Journal of Reproduction and Development, 59, 549～
556, 2013.
10） Rátky, J., Egerszegi, I., Páble, T., Balogh, E.,
Manabe, N., Keonouchan, S., Brüssow, K. P. :Reproductive physiology in commercial andpremium pig breeds, Archives Animal Breedind, 60,
253～257, 2017.

© The Ito Foundation

148

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発
Development of porcine/bovine germline stem cell technology using novel
growth factor

高

島

誠

司・高

木

優

二・保

地

眞

一

（信州大学繊維学部・農学部）

Seiji Takashima, Yuji Takagi and Shinichi Hochi（Faculty of Textile Science and Technology and Faculty of Agriculture, Shinshu University）

Spermatogonial stem cells are a subpopulation of undifferentiated spermatogonia and thecore of male reproductive system. In 2003, Kanatsu-Shinohara et al. established spermatogonial
stem cell line termed germline stem（GS）cells. GS cells can expand under glial cell linederived neurotrophic factor（GDNF）stimulation. These cells can colonize the infertile testis,
resume spermatogenesis, produce sperm, and restore fertility, even after 5-months of in vitro
culture. Moreover, GS cells are susceptible for genome editing including gene trap mutagenesis,
transfection, gene targeting technology, and CRISPR/Cas9 system. These properties led us toseek establishing GS cells from economic animals.
In this fiscal yearʼs research, we tried to develop a method to purify spermatogonial cells
from porcine testis and cultivation method of purified spermatogonial stem cells. It was
confirmed that PSS-1 antibody selectively label porcine pre-spermatogonia, and that thisantibody can be applied to cell purification by magnetic-activated cell sorting. We also tried tocultivate PSS-1＋ cells from neonatal porcine testes. Although PSS-1＋ cells were defeated bycontaminating testicular somatic cells under standard culture condition for GS cells, serum
reduction and/or MAP2K1 inhibitor PD0325901 permitted the survival and proliferation of
PSS-1＋ cells.

１．目含む）を播種，自己複製促進因子であるGlial cell

的line-derived neurotrophic factor（GDNF） お よ

精子幹細胞は，精巣中で個体の生涯にわたり精

び Fibroblast growth factor 2（FGF2）を 添 加 し子を作り続ける源となる細胞であり，げっ歯類で培養すると，精子幹細胞がぶどうの房状のコロはすでに試験管内培養法が確立されている。胎児

ニーを形成しながら選択的に増殖する。この細胞

線維芽細胞で作成したフィーダー上，あるいは基は試験管内培養後も精子形成能力を維持してお底膜成分であるラミニンコートされたディッシュり，不妊マウス精巣へ移植すると生着し精子形成上に，幼若個体の精巣細胞（体細胞，生殖細胞をを再開，子孫を得られる。この細胞は培養精子幹© The Ito Foundation

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発

149

細 胞（Germline Stem Cell：GS 細 胞）と 命 名 さ

４℃一晩インキュベートした。PBS（-）で洗浄後，れ ，マウスのほかラット，ハムスターで樹立にAlexa Fluor488標識抗マウスIgG抗体（Molecular

成功している２，３）。GS細胞は試験管内で個体の寿Probes） お よ び Cy3 標 識 抗 ウ サ ギ IgG 抗 体

命を超えて培養できるだけでなく，遺伝子導入や（Chemicon）で染色，蛍光観察を行った。

１）

相同組み替えが可能である。最近ではゲノム

４～６）

2.3

磁気分離法による前精原細胞の純化

編集技術の応用も報告されている 。また，横浜得られた精巣の薄膜を除去しハサミで細切した

市立大の小川らは精巣の器官培養により試験管内の ち ，PBS（-）-EDTA の 入 っ た 50ml コ ニ カ ル

で精子形成を誘導する技術を確立しており，GS

チューブに入れボルテックス撹拌を行うことで精細胞を移植された精巣の器官培養によりGS細胞

細管を遊離させ，ステンレスメッシュにより精細の試験管内精子形成も達成している。これら

管を単離した。得られた精細管を４mg/mlのパの技術はマウスで達成されたものであるが，理論パインで消化し分散させ，シングルセルを回収し上はより大型の経済家畜でも可能であると考えらた。得られた細胞を５％FCS添加のPBS（-）にれる。

分散させ，PSS-1抗体（1/1000）と４℃で30分間

７）

８，９）

こうした背景から我々は，豚精巣からのGS細反 応 さ せ た 。PBS（-）で 細 胞 を ３ 回 洗 浄 後 ，胞樹立を試みてきた。これまでに，豚精巣体細胞

Protein G結合フェライトビーズ（多摩川精機）の増殖が激しく生殖細胞が培養過程で淘汰されてと４℃で15分反応させた。細胞を15mlコニカル

しまうこと，および，豚幼若精巣中の精原細胞をチューブに移し，磁気スタンド（多摩川精機）で標識し純化する技術の開発を進めてきた。今年度

15分間静置し，PSS-１陽性細胞をチューブ側面には，精原細胞純化技術とその培養に関して進展が吸着させ，陰性細胞を含む上清を取り除いた。こあったので報告する。

の操作を２回繰り返したのち，PSS-1陽性細胞を

２．方
2.1

回収した。得られた細胞はAlexa Fluor488抗マウ法

スIgGで染色しPSS-1陽性細胞の純度を検証した。
2.4

精巣材料の入手

豚精巣細胞の培養

豚精巣は長野県畜産試験場にて去勢により摘出

基 礎 培 地 は IMDM 培 地 に Knockout Serum

されたものを譲渡していただき研究に供した。三Replacement（Invitrogen；KSR）を終濃度５％

元豚の生後４～10日のものを使用した。譲渡されで添加したものを基本培地とした８）。この培地にた検体は，冷却条件下で研究室まで運搬し，PBS

は，各種栄養因子のほか，増殖因子としてGDNF（-）で血液などを洗浄した後培養に供した。

（10 ng/ml, Peprotech） ， FGF2（10 ng/ml,

2.2

豚精巣組織の免疫染色

Peprotech），牛胎児血清（0/0.1/1％，BioWest），

得られた豚精巣組織をホルマリン固定し，パラおよびMAP2K1/2阻害剤PD0325901（０～３μM,

フィンブロックを作製，４μｍ厚のパラフィン切

Selleck）を添加した。得られた細胞は，マウス片を作成した。脱パラフィン処理後親水化したの

胎児線維芽細胞をフィーダーとして播種した

ち，定法に従って蛍光免疫染色を行った。切片をディッシュ（24well），およびラミニンコートし10％ヤギ血清でブロッキングしたのち，PSS-1抗たカバーグラス（直径15mm，松浪ガラス）に１体（マウスモノクローナル抗体，1/5000），およ×10５cells/wellで播種し37℃５％CO2 条件で培養

びウサギ抗UCHL1抗体（Biogenesis，1/300）でした。

© The Ito Foundation

150

平成28年度３．結

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

のち，磁気スタンドに静置することにより磁気的

果に細胞をトラップした。磁気解放状態で遠心洗浄により細胞を回収し，蛍光免疫染色を行ったとこ

3 . 1 豚におけるPSS-1陽性細胞の局在と性状

ろ，90％以上の細胞がPSS-1陽性細胞であった解析
豚精巣細胞を抗原とするPSS-1抗体は，本研究（Fig.２）。陽性細胞は陰性細胞と比較し，細胞のグループのメンバーである高木優二博士が信州大

サイズがより大型であった。前精原細胞も大型で学農学部で作製したマウスのモノクローナル抗体

あることから，PSS-1抗体による細胞選別が機能である。この抗体の抗原の精巣内局在を蛍光免役

していることが示された。

染色で確認したところ，幼若豚精巣精細管内の細3.3

PSS-1陽性細胞の培養

胞のうち，前精原細胞と思われる大型の細胞の細得られた細胞の培養を試みた。定法に従い，胞表面が特異的に染まっていた。この細胞が前精１％FBS存在下，マウス胎児線維芽細胞フィー

原細胞か否かを確認すべく既知の精原細胞マー

ダー常に播種した場合，PSS-1陽性細胞は接着しカーUCHL1で共染色したところ，UCHL1陽性細しばらく生存したものの，混入したわずかな体細胞の大半がPSS-1で標識されていた（Fig.１）。こ胞の増殖により淘汰されてしまった。そこで，接のことは，PSS-1が豚前精原細胞を選択的に標識

着 基 質 を ラ ミ ニ ン に 変 更 し ，血 清 濃 度 お よ び

可能な抗体であることを強く示唆するものであっ

PD0325901の添加についても検討したところ，無た。

血清条件下ではPSS-1陽性細胞が消失したもの

3 . 2 幼若豚精巣からのPSS-1陽性細胞の純化の，低血清条件（0.1％），あるいは１％FBS・１

PSS-1抗体をもちいた磁気分離が可能かを検証

μM PDO325901条件下では体細胞の増殖が抑制した。酵素処理した幼若豚精巣細胞をPSS-1抗体

され，PSS-1陽性細胞の分裂像が確認できた（Fig.

で標識し，さらにフェライトビーズを結合させた３）。ただし，その増殖速度は遅く，樹立には至

A

B

C

D

Fig. 1 Localization of antigen for PSS-1 mouse monoclonal antibody in neonatal

porcine testis. （A） Hematoxylin/Eosin staining. （B） PSS-1staining
visualized by Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG.（C）UCHL1
staining visualized by Cy3-conjugated anti-rabbit IgG.（D）Merged imageof B and C. Dotted line indicates the perifery of seminiferous tubule. Bar ＝
20μｍ.

© The Ito Foundation

新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養技術の開発

A

151

B

Fig. 2 PSS-1 ＋ pre-spermatogonia purified from newborn porcine testes.

Testicular cells were incubated with PSS-1 antibody followed by magnitic
activated cell sorting. Collected PSS-1＋ cells were further subjected toimmunofluorescence to assess the purity.（A）Bright field image marged
with images of staining with Hoechst 33342（nuclei）and Propidium iodide（PI, nuclear staining specific for dead cells）.（B）PSS-1 staining visualized
by Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG, marged with PI staining
image. Arrow indicate PSS-1－ cell. Bar＝50μｍ.

近京都大の篠原らはより安価な無血清培地の開発らなかった。
４．考について報告している10）。彼らはさらに，GS細胞

察の自己複製に解糖系の活性上昇が必要であること

今年度は豚前精原細胞の純化法の開発を行い，を示し，これを促進する低分子化合物の添加によ

これを培養に応用することを目指した。細胞の純り，GS細胞の樹立が困難なマウス系統からGS細化については，高木博士が作製したPSS-１抗体胞を樹立することにも成功している11）。このこと

が豚前精原細胞を選択的に標識できることが判明は，他のグループによっても検証されており，低し，磁気分離による細胞純化にも応用可能である

酸素濃度条件下で解糖系の活性を亢進させると，ことが確認できた。今後は新生仔豚だけでなく幼やはり幹細胞活性や精子形成能力が上昇すること

若～成獣個体でも応用可能かを検証したい。まが示されている12）。これらの知見を取り込むことた，純化した細胞の培養についても，無血清条件

で，豚GS細胞の培養効率改善が見込まれる。まあるいはPD0325901の添加が体細胞の増殖を抑制

た，移植や試験管内分化誘導法によるPSS-1陽性

するとともに，PSS-1陽性細胞の生存・増殖を容細胞の精子形成能の検証も不可欠であろう。

認することも判明した。これらの条件を基盤として，培養条件を改良することで，豚GS細胞の培養が可能になると考えられる。

５．要約

今年度の研究では，豚精巣から精原細胞を純化

今後の課題としては，PSS-1細胞集団にわずかする方法，および純化した精原細胞の培養法の開に混入する体細胞の除去法の確立，培地や接着条発を行った。純化法に関しては，高木博士が作製

件の最適化があげられる。特に後者においては，したPSS-1抗体が豚前精原細胞を選択的に標識で「PSS-1陽性細胞の増殖を促進する」「体細胞の増きること，この抗体が磁気分離法による細胞純化

殖を阻害する」ような培養条件が求められる。最に応用可能であることを確認した。さらに純化し© The Ito Foundation

152

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

A

B

C

D

E

Fig. 3 Culture of PSS-1＋ pre-spermatogonia purified from newborn porcine

testes. PSS-1＋ cells were cultured on the laminin-coated cover glass.（A）PSS-1＋ cell culture under standard GS medium containing 1％ FBS. In thiscondition, contaminating testicular somatic cells overwhelmed and PSS-1＋
cells were defeated.（B）Under FBS-reduced （0.1 ％ ）condition ， somatic
cell growth were suppressed and PSS-1 ＋ cells were observed. （C）
Although serum-free condition suppressed somatic cell growth, PSS-1＋
cells were not observed.（D）MAP2K1/2 inhibitor PD0325901 permitted
the survival and growth of PSS-1＋ cells even under 1％ FBS condition.（E）High-power magnification image of PSS-1＋ cells under 1％ FBS with
PD0325901. Some cells exhibited cytokinesis.

た 細 胞 の 培 養 を 試 み ，無 血 清 ，あ る い は
MAP2K1/2の活性化阻害剤が豚精巣体細胞の増殖を顕著に抑制することでPSS-1陽性の前精原細胞を選択的に増殖させうることを見出した。
引用文献１） Kanatsu-Shinohara, M., et al. : Biol. Reprod., 69, 612～616, 2003.
２） Kanatsu-Shinohara, M., et al. : Biol. Reprod., 78, 611～617, 2008.
３） Kanatsu-Shinohara, M., et al. : Biol. Reprod., 85, 208～217, 2011.

４） Kanatsu-Shinohara, M., et al. : Development, 132, 4155
～63, 2005.
５） Kanatsu-Shinohara, M., et al. : Biol. Reprod., 72, 236～240, 2005.
６） Kanatsu-Shinohara, M., et al. : Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 103, 8018～8023, 2006.
７） Sato, et al. : Stem Cell Reports, 5, 75～82, 2015.
８） Sato, et al. : Nature, 471, 504～507, 2011.
９） Sato, et al. : Nature Commun., 2, 472, 2011.
10） Kanatsu-Shinohara, M., et al. : Biol. Reprod., 91,
88, 2014.
11） Kanatsu-Shinohara, M., et al. : GenesDev., 30, 2637 ～
2648, 2016.
12） Helsel, et al. : Stem Cell Reports, 2017, in press.

© The Ito Foundation

153

種雄牛における精子メチル化可変部位の特性評価
Characterization of differentially methylated sites in bull spermatozoa DNA

武

田

久美子・小

林

栄

治

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Kumiko Takeda and Eiji Kobayashi（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The aim of this study was to detect changes in DNA methylation status in spermatozoa
and to assess its use for the early evaluation of bulls. We found that genome-wide methylated
DNA modifications of bull spermatozoa can be analyzed using a human DNA methylation
microarray. The methylation levels of some CpG sites were verified by combined bisulfate
restriction analysis（COBRA）. In this study, age-related methylation changes in CpG sites ofbull spermatozoa were confirmed. The region including CpG1 was confirmed as a differentiallymethylated region, which showed age-related increase by both COBRA and bisulfite
sequencing. Frozen semen obtained from three young Japanese Black bulls during sexual
maturation were used for COBRA analysis. Four of the CpG sites showed age-related changes
or individual differences in methylation levels. Furthermore, two of the bulls were analyzed by
improved human DNA methylation microarray, and differentially methylated CpG sites were
newly detected as age-dependent changes during sexual maturation. In conclusion, methylation
profiles of individual and age-related alterations in young bull spermatozoa throughout sexual
maturation can be revealed using a human microarray and COBRA. Such methylation index
might be expected to contribute to the early evaluation of bulls.

１．目

された種雄牛候補の一部には，精液性状が正常で的あるにもかかわらず人工授精に使用してみると受黒毛和種の子牛価格が年々高騰を続けており，胎性の低い精液が存在している。これら低受胎を肥育農家の経営を圧迫している。わが国における示す精液は，精子活力や生存率，精子濃度など精牛の交配はほぼ凍結精液を用いた人工授精で行わ液性状に基づく検査では発見することは困難であれているが，人工授精による受胎率はここ15年間

るため，ある程度の規模で人工授精が行われた後で低下し続けている（家畜改良事業団資料より）。

に低い受胎率が発覚した時には大きな経済的損失

人工授精の受胎率低下には雌雄双方の要因が関与が発生することとなる。低受胎となる凍結精液のしており，雄側からの要因解明の取り組みも必要

事前の検出が可能となれば，空胎雌牛を減らせるである 。優秀な遺伝形質を持つと期待され選抜とともに，種雄牛の早期受胎性評価につながる。

１）© The Ito Foundation

154

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

精子形成過程においてDNAメチル化は全体的変化について検証し，その変化が種雄牛の早期評に進行することが知られる 。精子形成の段階を価への利用性を明らかにすることを目的とした。

２）

経ても未成熟な精子は不妊や活性酸素種発生の要因となることが知られており，精液中に含まれる未成熟精子の割合，すなわちエピゲノムの不完全さを検出することが，新しい牛凍結精液の受胎性

２．方法

2 . 1 バイサルファイトシークエンスによる牛
精子メチル化可変領域の検証評価となりうる。受精可能な精子の射出機能が備

前年度に検出した精子メチル化可変部位のう

わる性成熟は牛では約14ヶ月齢とされるが，精液

ち，COBRA法により加齢変化を示すと考えられ性状が安定しない場合もあるため，性成熟を迎え

たCpG1について，バイサルファイトシークエンても直ちに繁殖供用はできない。黒毛和種の性成スを行った。サンプルとして農研機構畜産研究部

熟はホルスタイン種より約１ヶ月早いとの報告が門で飼養している１頭のホルスタイン種雄牛の性あり，14ヶ月に満たない雄牛から質的，量的に十成熟期から繁殖供用期に採取した精液（Ｈ１；分な精液が得られる場合もある。このように，繁10ヶ月齢，Ｈ２；11ヶ月齢，Ｈ３；15ヶ月齢，Ｈ殖供用期へ達する時期は個体差が激しく，飼養環

４；25ヶ月齢，Ｈ５；35ヶ月齢）および，黒毛和

境にも大きく左右される。ヒトではDNAメチル

種雄牛から採取した精液（Ａ；159ヶ月齢，Ｂ；

化解析用チップの開発により，網羅的なCpGサイ

75ヶ月齢，Ｃ；20ヶ月齢）を用いた。PCR増幅しトのメチル化状態の比較解析が可能となっておた446bpのCpG1を含む断片は，２％アガロース

り ，精子に起因する不妊に関連するDNAメチ

電気泳動を行い，切り出したDNA断片を精製しル化可変領域（differentially methylated regions;

た （illustra GFX PCR DNA and Gel Band

DMRs）が明らかにされている 。また，年齢にPurification Kit, GE Healthcare）。精 製 し た PCR

伴ったDMRsが多数判明し，老化による不妊等へ

断片はpMD18-T vector（タカラバイオ社）によの影響も示唆されている 。我々は，効率的かつり ク ロ ー ニ ン グ を 行 い ， コ ロ ニ ー PCR

より安価にウシゲノムのDNAメチル化プロファ（EmeraldAmp®PCR system，タカラバイオ社）

イルの評価およびDMRsの探索を行うための手法

お よ び PCR 断 片 の 精 製 （FastGene Gel/PCRとして，ヒト用DNAメチル化解析用チップが非Extraction Kit，ニッポンジェネティックス社）

常に有効であることを示し ，この手法を用いて後にシークエンス解析した。

３）

４）

５）

６）

牛凍結精液間のメチル化状態の比較をすることを可能とした。そして平成27年度の本助成により，

2 . 2 COBRA法による牛精子メチル化可変部
位の検出

体外受精後の胚発生率が高い精液と低い精液の比性成熟期から繁殖供用期における凍結精液のメ較により，雄牛，もしくは精液採取時期（性成熟チル化変化を検出するため，前年度にヒト用メチ直後と繁殖供用時期）においてDNAメチル化状

ル 化 解 析 用 チ ッ プ （HumanMethylation450

態が異なることを明らかにした 。

BeadChip，イルミナ社）により可変部位として簡７）

そこで本年度の研究では，凍結精液のDNAメ

易検出可能とした４箇所のCpG部位（CpG１～４）

チル化状態についてヒト用チップによる網羅的解をターゲットとしたCombined Bisulfate Restriction

析データを追加すると同時に，繁殖供用期の採取

Analysis（COBRA）法によるサンプル間のメチ

月齢の異なる雄牛におけるDNAメチル化状態のル化レベルの相違についてスクリーニングを行っ© The Ito Foundation

種雄牛における精子メチル化可変部位の特性評価

155

た。サンプルとして茨城県畜産センター肉用牛研後（Ｓ１-１，Ｓ２-１）と繁殖供用期（Ｓ１-２，

究所より提供いただいた３頭の黒毛和種雄牛から

Ｓ２-２）の試料間でメチル化レベルの比較解析採取した月齢の異なる凍結精液を供した（Ｓ１-を行い，メチル化可変部位を抽出しリストアップ

１；14ヶ月齢，Ｓ１-２；19ヶ月齢，Ｓ１-３；

した６）。リストアップしたメチル化可変部位につ

28ヶ月齢，Ｓ２-１；15ヶ月齢，Ｓ２-２；20ヶ月

いてヒトプローブの牛ゲノム配列に対する

齢，Ｓ２-３；26ヶ月齢，Ｓ３-１；14ヶ月齢，Ｓ

BLAST検索によりヒト―牛間の塩基配列の相同

３-２；18ヶ月齢，Ｓ３-３；21ヶ月齢）。

性を確認し，CpG部位の位置を特定した。

凍結精液は38℃の温湯に15秒浸すことにより融解した。融解した精液はD-PBS（-）にて２回洗３．結果と考察浄した。１mlの精子浮遊液を1.5ml遠心チューブ

3.1に移し，2,300ｇで精子を沈殿させた。精子ペレッ

チル化可変領域の検証

トよりDNA抽出キット（DNeasy Blood & Tissue

CpG１部位（ターゲットID：cg27100471）をKit，キアゲン社）を用いてDNAを精製した。

含む120bpのヒト用プローブ配列のBLAST検索

DTTを添加することで懸濁液は完全に溶解した。

の結果，牛の29番染色体上にあるmitochondrial

精製したDNAは，キット（MethylEasyTM Xceed

glutamate carrier 1 isoform遺伝子の近傍配列とRapid DNA Bisulphite Modification Kit, Human

98％の相同性があった。CpG１部位を含む446bp

Genetic Signatures社）を用いてバイサルファイ

領域のバイサルファイトシークエンス解析の結ト 処 理 を 行 っ た 。バ イ サ ル フ ァ イ ト 処 理 し た果，CpG１部位およびその領域内にある22箇所のDNAを鋳型にPCR増幅し，CpG部位をターゲッ

CpG部位が全体として加齢に伴ってメチル化度がトとする制限酵素処理を行った。DNA断片を３％高くなる傾向がみられたことから，この領域は加アガロースゲルによって電気泳動を行い，メチル

齢変化を示すメチル化可変部位であることが明ら化レベルの相違性の確認を行った。

かとなった（Fig.１）７）。

2 . 3 マイクロアレイによる牛精子のメチル化
可変部位の検出

バイサルファイトシークエンスによるメ

3 . 2 性成熟期から繁殖供用期における牛精子
メチル化変化の簡易検出

2.1で解析した凍結精液のうち２頭の黒毛和種

４箇所のCpG部位（CpG１～４）をターゲット

雄牛の採取月齢の異なる凍結精液４検体（Ｓ１-としたCOBRA法によるサンプル間のメチル化レ

１，Ｓ１-２，Ｓ２-１，Ｓ２-２）について，改

ベルのスクリーニングを行ったところ，性成熟期

良 型 ヒ ト 用 DNA メ チ ル 化 解 析 用 チ ッ プ

から繁殖供用期の間の月齢で差異を示すものやそ（Infinium MethylationEPIC Kit ， イ ル ミ ナ 社）のメチル化レベルに個体間の相違が検出されたによる解析を行った。解析データは，信頼性の指（Fig.２）。

標であるDetection P-val値および総蛍光強度にこれらのメチル化可変部位のメチル化レベル検よりデータが有効であると判断したCpGサイトに出をいくつか組み合わせることにより，雄牛ごとついて，改良型メチル化解析用チップで得られたの繁殖供用以前のメチル化の正常性や特徴をカテ

データと改良前のメチル化解析チップ（Human

ゴリー化することが可能ではないかと考えられMethylation450K BeadChip）のデータとの間でた。そのためには，性成熟期から繁殖供用期にお比較が可能かどうか検討を行った。次に性成熟直ける牛精子のメチル化可変部位の検索を更に進め© The Ito Foundation

156

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Methylation levels（%）

100
80
60
40
20
0

H1

H2

H3

H4

CpG1‒Array

H5C

CpG1‒BiSeq

B

A

TS

CpG1 region‒BiSeq

Fig. 1 Methylation levels（％）in CpG1 site analyzed by microarray（CpG1-Array）or bisulfite sequencing（CpG1-BiSeq）. The methylation levels of 22 CpG sites（CpG1 region-BiSeq）were determined bybisulfite sequencing. H1～H5 ; semen samples were obtained from a Holstein bull at different ages
（10～35months old）. A～C；Japanese Black bulls（A；159 months old, B；75 months old, C；20months old）.TS；bovine testis. H5 and TS did not apply microarray analysis.

S1
1

2

S2
1

S3
2

1

のメチル化可変部位の検索

TS
2

採取時の月齢が異なる凍結精液４検体（Ｓ１１，Ｓ１-２，Ｓ２-１，Ｓ２-２）について，改CpG1

良型ヒト用DNAメチル化解析用チップによる解析を行った。結果を改良前のメチル化解析用チップのデータとの比較が可能かどうか検討を行った

CpG2

ところ，改良前後でクラスターが分かれてしまう
ため全体としての比較は困難であることが判明した。そこで，改良型メチル化解析用チップによる

CpG3

データのみを用いて性成熟直後（Ｓ１-１，Ｓ２１）と繁殖供用期（Ｓ１-２，Ｓ２-２）との比較解析を行った結果，メチル化レベルの異なるCpG

CpG4

部位を315箇所抽出した（Fig.３）。牛のゲノム配列とのホモロジー検索の結果，そのうち44箇所がFig. 2 Different methylation levels of CpG1-4 regionin

bovine spermatozoa revealed by COBRA. S1-1；14months old, S1-2 ； 19 months old, S2-1 ； 15 months
old, S2-2；20 months old, S3-1；14 months old,
S3-2；18 months old, and, TS；testis.

ヒットし，制限酵素部位のあるCpG部位は17箇所であった。
以上の結果から，ヒト用DNAメチル化解析チップの利用で明らかになったDNAメチル化可変部
位は，性成熟期から繁殖供用期において精液を採取した若い雄牛の月齢や個体差を評価することがる必要がある。
3 . 3 性成熟期から繁殖供用期における牛精子可能であると示唆された。今後は，性成熟期から© The Ito Foundation

Methylation level

種雄牛における精子メチル化可変部位の特性評価

157

0.6

状態の差異および個体差が検出された。次に，そ0.5のうち２頭の雄牛について性成熟期および繁殖供
用期の精子DNAを改良型ヒト用DNAメチル化解0.4

析用チップによる比較解析を行ったところ，この0.3

時期におけるメチル化可変部位が検出された。以0.2

上の結果から，精子DNAメチル化レベルは加齢に伴って変化しうること，またメチル化レベルの0.1
0

変化には個体差のあることが判明した。今後，繁
12

14

16

18

20

22

24

とした評価系を構築していくことで，受胎性に着MonthsFig. 3 Methylation levels of one of the CpG sites

detected by human DNA methylation microarray.
The methylation levels in the CpG sites weredifferent before and after the breeding age of bulls（S1-1 & S2-1 vs. S1-2 & S2-2）.

繁殖供用期において，精子の受精能に着目した特徴のあるメチル化可変部位を特定し，精子評価のためのパネルを構築することで，種雄牛の早期受
胎性評価技術としての利用を目指していく予定である。
４．要殖供用期特異的なメチル化可変部位の差異を指標

約

本研究の目的は，繁殖供用期の採取月齢の異なる雄牛におけるDNAメチル化状態の変化についてその利用性を明らかにし，種雄牛および凍結精液の早期評価に資することである。前年度，ヒト
メチル化解析用チップを利用して精子DNAのメチル化可変部位を５箇所同定した（CpG１～５）。
本年度は，CpG１を含む近傍22箇所のCpG部位についてバイサルファイトシークエンス解析による検証を行ったところ，加齢に伴ってメチル化度が高くなる傾向を確認した。また，４箇所のCpGについて３頭の黒毛和種雄牛の性成熟期から繁殖供用期の時期に採取した凍結精液間のメチル化レベ目した雄牛および凍結精液の早期評価へ資すると期待される。
文献１） 渡邊伸也，武田久美子：種雄牛が有する繁殖能力の把握に向けて：精子の受精能力を多面的に評価するための新しい視点，日本胚移植学雑誌，60（3），135～140，2014．
２） 金田正弘：エピジェネティックスと牛精子DNAの メ チ ル 化 ： 獲 得 形 質 の 遺 伝 は 存 在 す る か ？，Japanese Journal of Embryo Transfer, 36（3）, 141～148,
2014.
３） Sandoval, J., Heyn, H., Moran, S., Serra-Musach, J.,
Pujana, M. A., Bibikova, M., Esteller, M. : Validationof a DNA methylation microarray for 450,000 CpG
sites in the human genome, Epigenetics, 6, 692 ～ 702,
2011.
４） Krausz, C., Sandoval, J., Sayols, S., Chianese, C.,
Giachini, C., Heyn, H., Esteller, M. : Novel insights
into DNA methylation features in spermatozoa:
stability and peculiarities, PLoS One, 7, e44479, 2012.
５） Jenkins, T. G., Aston, K. I., Pflueger, C., Cairns, B.
R., Carrell, D. T. : Age-associated sperm DNA
methylation alterations: possible implications inoffspring disease susceptibility, PLoS Genet, 10,e1004458, 2014.
６） Kobayashi, E., Takeda, K. : A data driven
approach to utilizing Human Methylation arrays ingenome-wide study for bovine DNA methylation,
The Journal of Animal Genetics, 44, １～８, 2016.
７） Takeda, K., Kobayashi, E., Akagi, S., Nishino, K.,
Kaneda, M., Watanabe, S. : Differentially methylated
CpG sites in bull spermatozoa revealed by human
DNA methylation arrays and bisulfite analysis, J
Reprod Dev, 63（3）,279～287, 2017.

ルの違いをCOBRA法により解析したところ，
CpG１を含む３箇所において月齢によるメチル化© The Ito Foundation

158

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究
Study of in vitro embryo production using growing oocytes collected fromovaries removed from beef calves before fattening

的

場

理

子・平

尾

雄

二・武

田

久美子

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Satoko Matoba, Yuji Hirao and Kumiko Takeda（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

The production of embryos using both fully grown and growing oocytes collected fromthe ovaries of calves just before fattening（approximately 9.2-month-old）is beneficial for the
rescue of genetic resources. The aim of this study was to investigate the effects of the presenceor absence of the corpus luteum（CL＋ or CL-），an indicator of puberty on developmental
potential both immature （IM） and in vitro grown （IVG） oocytes. Fully grown IM（approximately 120 μm in diameter）oocytes and 14-day IVG（approximately 100 μm in
diameter） oocytes collected at the growing stage were subjected to IVM-IVF-IVC,
respectively. In both types of oocytes, embryo production was compared between those fromovaries with CL＋ or CL-．Higher blastocyst formation and normal cleavage rates wereobtained in IM oocytes with CL＋ than those with CL-（P ＜ 0.05）. However, no significant
difference was found between IVG oocytes either with CL＋ or CL-．Although puberty canaffect the developmental competence and normality of early cleavage in IM oocytes, it may notstrongly affect it in IVG oocytes. Mitochondrial DNA copy numbers were similar between IM
and IVG oocytes irrespective of the presence/ absence of CL and the maturity of the donor（IVG oocytes in calf vs. cow）. In both the IM and IVG groups, conception was achieved after
the transfer resultant frozen-thawed embryos to the recipient cows. Live calves were delivered
after the transfer of fresh embryos and the parentage of oocyte donors and the sire wasverified by genetic test of DNA from the calves, recipient cows, sire and oocyte donors. In
conclusion, we demonstrated the possibility of embryo and live calf production after IVM-IVF
using both fully grown and growing stage oocytes collected from the ovary from calves either
presence or absence of CL before fattening.

１．目

卵巣を利用できれば，血統の明らかな雌牛の後代的を生産することが可能となる。体外受精で用いる

黒毛和種雌牛の肥育において，子牛の段階で肥卵子は，少数で培養すると発生率が低く１），摘出

育前に去勢（卵巣を摘出）され，廃棄されている卵巣からの卵子採取は１回限りであるため，１頭© The Ito Foundation

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究（卵巣は１頭あたり２個）あたりの採取卵子数が少ない場合の発生率の向上が欠かせない。また，

２．方

159

法

性成熟に達していない若齢牛の未熟な卵巣から得2 . 1 若齢雌子牛由来卵子，卵母細胞の体外受られる卵子は既存の体外受精・培養法では発生率

精後の卵割の正常性と黄体の存在の関係のが低いという報告がある 。我々は，少数の卵子

検討

２）においても，体外発生能を最大限引き出せる個別

肥育前の黒毛和種雌子牛（平均9.2か月齢）か

識別可能な個別卵子・胚培養システム３）を用い，ら摘出された卵巣を，約５時間輸送後，直径２～若齢子牛の未熟な卵巣に存在する通常サイズの卵６mmの卵胞から直径約120μmの未成熟卵子（通子（直径約120μｍ）の体外受精胚生産技術や発常サイズの卵子，IM oocytes）を吸引採取した。

育途上の卵母細胞（直径約100μｍ）の長期培養

採取卵子の体外成熟，体外受精および体外発生培によって体外受精に用いることが可能な成熟卵子

養は，既報６）に従って実施した。性成熟の判断基を得る技術４，５）を用いて，胚盤胞期胚への発生が準７）は，卵巣に黄体が存在する個体を性成熟後，可能であることを明らかとした。昨年度の本助成

黄体が存在しない個体を性成熟前とした。発生培により，通常サイズの卵子の胚発生率には雌子牛養には個別識別培養皿８）を用い，卵子の発生能のの性成熟が影響しており，性成熟に達すると胚の検証について，媒精後28時間目と50時間目の初期発生率が向上することが示唆された。さらに，両卵割および７～９日目の胚盤胞期胚への発生成績

区から発生した胚を新鮮状態で受胚牛に移植するにより比較した（黄体あり；CL＋，ｎ＝193，黄と受胎例が得られることが見出された。発育途上

体なし；CL-，ｎ＝60）。直径0.5～0.8mmの卵胞

卵母細胞については，性成熟の影響を受けない可か ら 直 径 約 100μm の 発 育 途 上 卵 母 細 胞（IVG

能性が示唆されたが，胚発生率はバラツキが大き

oocytes）を採取し，体外発育培養および成熟培

く，実験回数を反復する必要性が課題として残っ養を既報４，５）に従って実施した。すなわち，卵巣た。最近，成牛において，初期卵割の正常性が子表面の皮質を薄く切り出し，得られた卵胞を切開牛への高い発生能と相関が高いことが報告されてして発育途上卵母細胞と顆粒膜細胞の複合体を採いることから，子牛から生産した胚においても，取し，これらをセルカルチャーインサート上で，その方法が応用可能か検証する必要があると考え38.5℃，５％CO2，５％Ｏ2および90％Ｎ2の加湿気られる。また，受胎牛が妊娠を継続して子牛が生相下で13～14日間の体外発育培養を実施した。発産されるのか，生産子牛の素性を明らかにできる

育途上卵母細胞は体外発育培養後，通常サイズののかどうかについての検証も必要性である。

卵子と同気相下で同時間，体外成熟培養を行っそこで，本研究では，若齢雌子牛の通常サイズ

た。また，成熟卵子の体外受精・発生培養は，通の卵子および発育途上卵母細胞において，初期卵

常サイズの卵子と同様とした。これらの発育途上割の正常性と性成熟の関係を検討し，国内の大半

卵母細胞の卵子の発生能の検証と胚の生産性，卵で実施される凍結胚移植による受胎性，さらにＨ子の卵割の正常性について，黄体の有無別に検討

27年度に受胎した牛の妊娠の進行や子牛の正常し た（黄 体 あ り；CL ＋ ，ｎ ＝ 95 ，黄 体 な し；性，親子鑑定を検証した。

CL-，ｎ＝57）。
両区とも，卵子を個別識別可能なリアルタイム
細胞培養観察システムにより培養しながら卵割の© The Ito Foundation

160

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

進行を経時的に撮影した。卵子の卵割の正常性に2.3

ついて，既報に従って検証した。すなわち，第昨年度の本助成では，通常サイズの卵子，発育

１卵割においては媒精後28時間目までに細部断片

途上卵母細胞から生産された胚盤胞期胚を，受胚や突出部がなく均等な２細胞に卵割した卵子を正牛へ新鮮状態で移植して，両区ともに受胎が得ら

常卵割，それ以外を異常卵割とし，第２卵割におれている。そこで，本年度は，凍結保存胚の受胎いては第１卵割が正常であり，媒精後50時間目ま性の検討を行った。通常サイズの卵子および発育でに細胞断片や突出部がなく均等な６細胞以上に途上卵母細胞から生産した胚盤胞期胚の一部を，卵割した卵子を正常卵割とした。両区とも黄体の桑山らの報告11）に準じ，1.36Ｍグリセロールと0.25

有無別に，正常な第１卵割，第２卵割パターンを

Ｍショ糖添加修正TCM199を用いて緩慢凍結保存

経た胚盤胞期胚の発生率を比較した。

した。これらの胚を，体外受精日と同日に発情が

2.2

９）

凍結保存胚の受胎性の検討

生産した卵子や胚の品質と遺伝子解析確認された受胚牛の黄体側卵巣の子宮角に移植し黄体の有無別に採取された卵子および体外発育た。受胎の確認は，移植直前の発情から40日以上した発育途上卵母細胞について，ミトコンドリア

を経過しても発情が回帰しなかった個体に超音波

DNA（mtDNA）コピー数からみた正常性を比較

画像診断装置を用いて行った。

検証した。通常サイズの卵子は黄体の有無別に，

2.4

発育途上卵母細胞は黄体の有無別に成牛の体内発

Ｈ27年度に新鮮胚移植によって得られた受胎牛育卵子と同等であるかどうかを比較検証した。通の妊娠の進行を観察し，生存子牛の生産等の子牛

常サイズの卵子区は，体外成熟後の一部の卵子の正常性の検証を行った。また，素性が明らかな（IM oocytes ， 黄 体 あ り ； CL＋ ， ｎ＝４ ， IM

後継牛を生産するために，卵巣摘出雌子牛の卵巣

oocytes，黄体なし；CL-，ｎ＝４）を，卵丘細の一部，生産子牛，体外受精に用いた凍結精液の胞の剥離除去後にPVPを添加したPBS-で洗浄し，

種雄牛および受胚牛の毛根を用い，遺伝子検査に

個 別 の 卵 子 ご と に DNA 抽 出 キ ッ ト（QIAamp

よる親子鑑定を実施した（家畜改良事業団）。

DNA micro Kit, Qiagen）を用いてDNAを抽出した。卵子１個あたりのmtDNAのコピー数の計測

子牛の正常性の検証と親子鑑定

３．結果と考察は ， Cytochrome c oxidase I （COX1） お よ び

本研究において，黄体ありの個体は平均9.2かCytochrome B（CYTB）遺伝子をターゲットと

月齢，黄体なしの個体は平均9.0か月齢であり，したリアルタイムPCR（Light Cycler 1.5, Roche）

両区に有意差は認められなかった（Ｐ＞0.05）
。

により既報

に従って行った。発育途上卵母細胞

胚の発生能に関し，通常サイズの卵子の初期卵割

区は，約２週間の体外発育培養および体外成熟培

率は黄体の有無の別なく高かった（Fig. 1A）。し養 後 の 一 部 の 卵 子（IVG oocytes ，黄 体 あ り；

かし，胚盤胞期への発生率においては，黄体あり

CL＋，ｎ＝４，IM oocytes，黄体なし；CL-，区が黄体なし区に比べて高い値を示した（P＜ｎ＝４）を，通常サイズの卵子の場合と同様に

0.05，Fig. 1A）。黄体の有無による平均月齢に有DNAを抽出し，卵子１個あたりのmtDNAコピー

意差は認められなかったにもかかわらず，これら数の計測を行った。対照区には，食肉処理場からの月齢において性成熟に達しているかどうかが，採 取 し た 成 牛 卵 巣 由 来 の 体 外 成 熟 卵 子（IVM

卵子の発生能に大きな影響を与えていることを示

oocytes）を用いた（ｎ＝５）
。

している。性成熟に達していない個体の通常サイ

10）© The Ito Foundation

161

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究

Embryo development after IVF

（A）
（%）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

IM oocytes, CL＋
IM oocytes, CL－＊

CleavedEmbryo development after IVF

（C）
（%）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Blastocyst formation

（%）

（B）
IM oocytes, CL＋

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

IM oocytes, CL－＊

Normal cleavage

Blastocysts throughnormal cleavage（D）
IVG oocytes, CL＋
IVG oocytes, CL－

CleavedBlastocyst formation

（%）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

IVG oocytes, CL＋
IVG oocytes, CL－

Normal cleavage

Blastocysts throughnormal cleavage

Fig. 1 The effect of the presence or absence of the corpus luteum on in vitro development of bovine embryos

generated from calf oocytes and the normality of the first and second cleavages. Embryos were derived by in vitro
maturation（IVM）and fertilization（IVF）of fully grown immature oocytes of approximately 120 μm in diameter（IM oocytes）after aspiration（A, B）or from growing stage oocytes（approximately 100 μm in diameter at thetime of collection）（C, D）after in vitro growth culture and IVM. Both IM and IVG oocytes were isolated fromovaries either with（CL＋） or without corpus luteum（CL-）. Embryos with normal cleavage patterns finishedtheir first cleavage（two even blastomeres without fragments nor protrusions before 28h IVF）,second cleavage（≥
six even blastomeres without fragments nor protrusions before 50 h）and their development to the blastocyst
stage（B, D）. Cleavage was evaluated at 50 h（Day 2）, blastocyst formation on Day 7-9（Day 0＝IVF）. ＊；Significant
difference（P＜0.05, t-test）．

ズの卵子を用いる場合，発生能を向上する検討が割合は，両区に差は認められなかった（P＞0.05,必要であると考えられる。初期卵割の正常性におFig. 1B）。この結果は，黄体なし区の胚盤胞期胚

いて，黄体あり区は，媒精後28時間目に正常な第の発生率が全実験回次を通じて低かったため，バ１卵割パターンおよび媒精後50時間目に正常な第ラツキが大きくなったと考えられる。発育途上卵

２卵割パターンを示して発生した卵子の割合が，母細胞の初期卵割率，胚盤胞発生率に黄体の有無

黄体なし区に比べて有意に高かった（P＜0.05,

別に有意差は認められなかった（P＞0.05, Fig.

Fig. 1B）。しかし，胚盤胞期に発生した全胚のう

1C）。この結果は，昨年同様，性成熟前の個体にち，正常な初期卵割パターンを経た胚盤胞期胚のおいて，発育途上卵母細胞は性成熟後の個体で示© The Ito Foundation

162

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

唆された卵子の低い発生能の影響を受けることなされている。今後は，卵割パターンの異なる胚盤

く胚生産を可能としたと考えられる。初期卵割の胞期胚の受胎性についても検証する必要があると正常性および正常な初期卵割パターンを経た胚盤考えられる。

胞期胚の割合においても，黄体の有無にかかわら通常サイズの卵子において，黄体の有無別に，ず 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た（P ＞ 0.05, Fig.

CYTBおよびCOXによるmtDNAコピー数には有1D）。成牛においては，初期卵割の正常な胚を移意な差は認められず，黄体の有無が卵細胞質の成植に用いると約70％と受胎率の大幅な向上が報告

熟度に影響を及ぼさないことが明らかとなった

2.00E＋05（A）

2.00E＋05

CYTB

1.50E＋05

1.50E＋05

1.00E＋05

1.00E＋05

5.00E＋04

5.00E＋04

0.00E＋00（B）

COX

0.00E＋00
IM oocytes, CL＋

IVG oocytes, CL－

IM oocytes, CL＋

IM oocytes, CL－

Fig. 2 Mitochondrial DNA（mtDNA）copy numbers in in vitro matured oocytes analyzed by the CYTB（A）and

COX1 genes（B）, respectively. The experimental groups were derived from fully grown immature oocytes ofapproximately 120 μm in diameter after aspiration of calf ovaries with or without corpus luteum（IM oocytes
either CL＋ or CL-）,respectively. No significant difference was found between groups（P＞0.05, t-test）．
（A）
3.0E＋05（B）
3.0E＋05

CYTB

2.5E＋05

2.5E＋05

2.0E＋05

2.0E＋05

1.5E＋05

1.5E＋05

1.0E＋05

1.0E＋05

5.0E＋04

5.0E＋04

0.0E＋00

COX1

0.0E＋00
IVG oocytes,
CL＋

IVG oocytes,
CL－

IVM oocytes

IVG oocytes,
CL＋

IVG oocytes,
CL－

IVM oocytes

Fig. 3 Mitochondrial DNA（mtDNA）copy numbers in growing stage oocytes analyzed by the CYTB（A）and COX1

genes（B）, respectively. In vitro matured oocytes after in vitro growth culture（IVG oocytes, approximately 100 μm
in diameter at the time of collection）were derived from calf ovaries with or without corpus luteum（either CL＋
or CL-）, respectively. The IVM group represents in vitro matured oocytes collected from cow ovaries obtained
from a local abattoir（IVM oocytes）.No significant difference was found among the groups（P＞0.05, t-test）．

© The Ito Foundation

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する研究

163（P＞0.05，Fig.２）。発育途上卵母細胞においても，耐凍性の向上のために，胚移植事例を増やし，胚黄体の有無別にmtDNAコピー数に違いはなく，の状態別や卵割パターン別の受胎性の検証を行う

体内発育した成牛の体外成熟卵子とも同等であっ必要があると考えられる。

た（P＞0.05, Fig.３）。これらの結果は，通常サイズの卵子だけでなく，発育途上卵母細胞において

４．要約

も，性成熟に影響されず，成牛卵子と遜色ない正約9.2か月齢の肥育前若齢雌子牛の通常サイズ

常なmtDNAコピー数の増幅が検証されたことをの卵子は性成熟により，胚の発生能と初期卵割の示している。

正常性に影響を受けるが，発育途上卵母細胞はそ

Ｈ27年度の本助成研究実績 では，通常サイズの影響を受けていない可能性が明らかとなった。

の卵子，発育途上卵母細胞から生産された胚盤胞

mtDNAコピー数は，通常サイズの卵子，発育途

期胚を新鮮な状態で受胚牛へ移植して，両区とも上卵母細胞ともに性成熟の影響を受けず，成牛とに受胎が得られた。国内では胚移植の約70％が凍遜色がなかった。生産胚は凍結状態であっても受結保存胚を用いているため，凍結胚の融解後の受胎例が得られた。新鮮胚移植により生存産子が得胎性を明らかにする必要がある。本年度は，両区られた。卵巣摘出雌子牛，生産産子，体外受精にから生産され，凍結保存した胚の移植後の受胎性用いた種雄牛および受胚牛の遺伝子検査により親を検討し，通常サイズの卵子区から２頭，発育途

子鑑定が可能であった。今後は，発育途上卵母細上卵母細胞区から１頭の受胎を得られた。このこ

胞由来胚の耐凍性の検討を行うために，胚の状態とから，肥育前子牛から生産された胚は，凍結保別や卵割パターン別の受胎性の検証を行う必要が存した状態においても，受胎性に問題がないことあると考えられる。

６）が明らかとなった。成牛由来の体内受精胚においては，凍結胚は新鮮胚に比べて移植後の受胎率が約５％低下すること，体外受精胚は体内受精胚に比べて移植後の受胎率が約10％低下することが知られている12）。本研究で発育途上卵母細胞は，体外成熟・受精・発生培養前に約２週間の体外発育培養が加わっており，より詳細な耐凍性の検証を行う必要があると考えられる。
Ｈ27年度に新鮮胚移植による受胎牛４頭（通常サイズの卵子区２頭，発育途上卵母細胞区２頭）
すべてから生存産子の生産が得られた。生時体重，在胎日数は一般的な成績であった。子牛の母である摘出卵巣の一部，生産子牛および受胚牛の毛 根 ，体 外 受 精 に 用 い た 凍 結 精 液 の 種 雄 牛 のDNA情報から，遺伝子検査により親子鑑定を検証することができた。今後は，通常の体外受精胚に体外発生培養が追加される発育途上卵母細胞の文
献１） Carolan, C., Lonergan, P., Khatir, H., Mermillod,
P. : Mol Reprod Dev, 45, 145～150, 1996.
２） Mulaart, E., Dotinga, F., Flappe,r H., van de
Brink, A., Pietersma, N., Schouten, J. : Reprod Fertil
Dev, 27, 209～210, 2015．
３） Matoba, S., Fair, T., Lonergan, P. : Reprod Fertil
Dev, 22, 839～851, 2010．
４） Hirao, Y., Somafai, T., Naruse, K. : J Reprod Dev,
60, 68～72, 2014.
５） Hirao, Y., Naruse, K., Kaneda, M., Somfai, T., Iga,
K., Shimizu, M., Akagi, S., Cao, F., Kono, T., Nagai, T.,
Takenouchi, N. : Biol Reprod, 89, １～11, 2013．
６） Matoba, S., Yoshioka, H., Matsuda, H., Sugimura,S., Aikawa, Y., Ohtake, M., Hashiyada, Y., Seta, T.,
Nakagawa, K., Lonergan, P., Imai, K. : J Dairy Sci, 97,
743～753, 2014.
７） 的場理子：公益法人伊藤記念財団平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，34，225～230,
2016．
８） Sugimura, S., Akai, T., Somfai, T., Hirayama, M.,
Aikawa, Y., Ohtake, M., Hattori, H., Kobayashi, S.,
Hashiyada, Y., Konishi, K., Imai, K. : Biol Reprod, 83,
970～978, 2010．

© The Ito Foundation

164

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）９） Sugimura, S., Akai, T., Hashiyada, Y., Somafai, T.,
Inaba, Y., Hirayama, M., Yamanouchi, T., Matsuda,
H., Kobayashi, S., Aikawa, Y., Ohtake, M., Kobayashi,E., Imai, K. : Plos ONE, 7, e3627, 2012．
10） Takeda, K., Srirattana, K., Matsukawa, K., Akagi,S., Kaneda, M., Tasai, M., Nirasawa, K., Pinkert, C. A.,
Parnpai, R., Nagai, T. : J Reprod Dev, 58, 323～329,

2012．
11） 桑山正成，濱野晴三：家畜繁殖技術研究会誌，
13，165～171，1991．
12） 農林水産省ホームページ，牛受精卵移植実施状況（平 成 26 年 度）， http://www.maff.go.jp/j/chikusan/
sinko/lin/l_katiku/pdf/h26_gaiyou.pdf, 2017．

© The Ito Foundation

165

牛の超早期妊娠因子（Super-EPF）ELISAによる受精・着床診断
Fertilization and implantation diagnosis by Super-early pregnancy factor（Super-EPF）ELISA of cattle

松

原

和

衛・小

岩

佳夏子・平

田

統

一

（岩手大学農学部）

Kazuei Matsubara, Kanako Koiwa and Toh-ichi Hirata（Faculty of Agriculture, Iwate University）

In this study, a measurement system of Super-EPF ELISA was established and an earlypregnancy diagnosis of cattle（7th day after AI）by established method was carried out. As aresult, it was suggested that the agreement rate of diagnostic results of 40 heads between
pregnancy diagnosis using ultrasonic diagnostic equipment and Super-EPF ELISA was as highas 90％．The fertilization/pregnancy diagnosis of cattle by Super-EPF ELISA was possible on
7th day after AI. In addition, as a result of measuring serum from AI to delivery, in SuperEPF ELISA, the individuals that were positive up to 14 ～ 30 days after AI, after that, declined
to negative. Furthermore, Super-EPF after embryo recovery turned to negative in mostindividuals on day 3 after collection. Therefore, it was suggested that Super-EPF was affectedby the presence of embryos. This result is the first report by Super-EPF ELISA. However, it
was indicated that there was no relevance between embryo number/rank and Super-EPF. By
further examination, Super-EPF ELISA was proved to be usable as cattle early fertilization/
pregnancy diagnosis technology.

１．目

ロン－タウや遺伝子の発現解析を利用することに的

よって，牛の早期の妊娠診断を行う試みがなされ受精卵移植が牛で行われるようになり母方からている。しかし，それらの現象は着床時期から胎の改良が可能となった。しかし，移植した胚の確盤形成以降のものであり，これらの解析によって実な品質評価方法はなく，移植したにも関わらず受精から着床までのシグナルを検出することはで流産するいわゆる早期胚死滅が問題になってい

き て い な い 。 一 方 ， 早 期 妊 娠 因 子 （Early

る。移植した胚が問題なのか，移植された母牛にPregnancy Factor：EPF）は，1974年にMorton問題があるのかは現状では特定できない。また，

ら１）によってマウスの受精12時間以降の血清中に現在の牛の妊娠診断は，一般的には発情開始予定

発見され，妊娠極初期の受精シグナルとして知ら日によるノンリターン（20日）と直腸検査（30～れ，我々も牛で24～48時間以降で検出している２）。

40日目の妊娠鑑定）である。最近，インターフェ

しかし，検出方法（ロゼット抑制試験：RITest）© The Ito Foundation

166

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）の困難さ，研究材料の特殊性（妊娠極初期）およをそれぞれ1,000倍希釈）では，サンプルを100万

び血清中含量が極めて少ないなどの問題があり，倍に希釈する必要があり希釈誤差を生じること，

EPFの産生機序や構造はいまだに不明である。

また，使用するSuper-EPF IgGの濃度を下げる

1994年にMortonら

はEPF＝シャペロニン10とことによって抗体の節約を行う必要があるため，の報告を行ったが，この報告には多くの矛盾があ

本研究ではSuper-EPF測定のための適正な条件

り ，我々は妊娠血清中で検出される活性を超早を検討した。次に，完成した条件によるELISA

期妊娠因子（Super-EPF），その他の材料で検出

でAIの血清サンプルを多数測定し，妊娠鑑定結される活性をEPF様物質とすることを推奨してい果との一致率を検討した。なお，サンプルは当大る。このSuper-EPFは，牛で人工授精後24～

学農学部附属御明神牧場のAIした黒毛和種40頭

48時間以降の母体血液中にRITestで検出され，から，AI当日（Day０）およびAI後７日目（Day

胚を除去すると母体血液中には検出されなくなる

７）の血清を採取した。診断の評価は，Day０とことから，Super-EPFを測定することにより，

Day７の吸光度間の有意差が危険率５％以下で受精・着床．妊娠診断と胚のモニタリングが可能

Day７で高い場合をSuper-EPF陽性とした。各牛となる。RITestが難しいこと，EPF＝シャペ

はAI後42日目に超音波診断装置による妊娠診断

ロニン10という誤解が広がり，この研究を行って（USPD：Pregnancy Diagnosis using Ultra Sonic

いるのは今では我々のみである。我々は長年，牛diagnostic equipment）を行った。

３）

４）

５，
６）

２，
６）

のSuper-EPFの構造を決定すること，抗体を作

2.2

妊娠期間中の血清中Super-EPFの変化

製することを目的に研究を進めてきた。その結RITestでは，Super-EPFは受精後24時間以降

果，最近になって牛のSuper-EPFの精製方法のの血液中で検出され，妊娠期間（280日）の2/3

単純化に成功し，得られた抗原を元にしてウサギ（186日）ころから検出されなくなることが報告さ

抗牛Super-EPF IgGを作出した。昨年，この抗れている２，６）。そこで，福島県畜産研究所のホル

体 を 使 用 し た Super-EPF 酵 素 免 疫 測 定 法ス タ イ ン 種 ６ 頭 に AI を 行 い ，継 時 的 に AI 後

（ELISA）に人工授精（AI）および胚移植（ET）

Day1，3，7，14，21，30，60，120，240，300に後７日目の牛58頭の血清を適用した結果，その受血液を採取した（報告書作成現在240と300日目は

精診断率は80％であった。

未採取）。また，御明神牧場の黒毛和種１頭にET

本研究では，昨年構築したSuper-EPF ELISAを行い，５～７日おきに302日まで採血した。次の詳細な条件検討を行い，測定系の安定化と簡易に，2 . 1 で完成したSuper-EPF ELISAに各サン化をめざし，サンプル数を増加させることによっプルを適用し血清中Super-EPFの推移を検討して牛の受精・妊娠診断に応用できるかを検討した。

た。なお，評価はDay０の吸光度をブランクとし

２．方て，各サンプルの吸光度から差し引いた吸光度の法差をグラフにして考察した。

2 . 1 Super-EPF ELISAの条件確定と妊娠鑑
定結果との関係

2 . 3 過排卵処理後AIを行った牛から回収された胚の数とSuper-EPFの関係

昨年構築した測定条件（ウサギ抗牛Super-EPF

母体の血清中Super-EPFが，回収胚の数とラIgG, Biotin標識Anti-ウサギIgおよびStreptavidin

ンクに関係するかを検討した。福島県畜産研究所

標識ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）の４頭の黒毛和種に過排卵処理（SOV）後AIを© The Ito Foundation

167

牛の超早期妊娠因子（Super-EPF）ELISAによる受精・着床診断

実施し，その後に胚を回収し採卵０，１，２，３日に 血 清 を 採 取 し た 。 こ の 血 清 を Super-EPF

Table 1 Pregnancy diagnosis of cattle by Super-EPF

ELISA
No.

Cattle No.

ELISA

USPD

Agree

１

B1.17

＋

＋



２

B9.5

＋

＋



３

B8.18

＋

＋



４

B0.1

＋

＋



５

B8.28

＋

＋



６

B9.29

＋

＋



７

B7.14

＋

＋



８

B0.26

＋

＋



９

B0.28

＋

＋



（NP：発情０日目）標準血清は，Ｐがロゼット抑

10

B0.15

＋

＋



制力価（RIT）≧４で陽性，NPがRIT＜３で陰性

11

B9.24

＋

＋



12

B2.6

＋

＋



13

B2.1

＋

＋



14

B2.4

＋

＋



15

B2.7

＋

＋



16

B2.8

＋

＋



17

B9.1

＋

＋



18

B2.2

＋

＋



19

B0.23

＋

＋



20

B9.32

＋

＋



21

B2.13

＋

＋



22

B2.4

＋

＋



23

B0.25

＋

＋



24

B1.6

－

－



果と比較した（Table１）。その結果，40頭中36頭

25

B9.5

－

－



で結果が一致し，その確率は90％であった。その

26

B0.15

－

－



27

B9.8

－

－



28

B9.8

－

－



29

B9.9

－

－



30

B9.8

－

－



31

B0.26

－

－



32

B9.31

－

－



33

B9.8

－

－



34

B9.31

－

－



35

B9.28

－

－



36

B0.32

－

－



ELISAに適用し，Super-EPFの結果と胚の数および胚のランクとの関係を検討した。
３．結果と考察3 . 1 Super-EPF ELISAの条件確定と妊娠鑑
定結果
RITest用の妊娠（P：AI後７日目）と非妊娠であり，この血清を使用してSuper-EPF ELISAの測定条件を検討した。その結果，第１抗体としてウサギ抗牛Super-EPF IgGを5,000倍希釈，第２抗体としてBiotin標識ヤギ抗ウサギIgおよび，
Streptavidin標識HRPを1,000倍希釈にしてA450nmで測定した場合，測定サンプルの希釈倍率が10万倍の時，Ｐの吸光度はNPの吸光度より有意（Ｐ＜0.01）に高かった。そこで，この条件で40頭の牛のDay０とDay７の血清を測定し，USPDの結内訳は，ELISAとUSPD両方とも陽性であった牛は23頭，両方とも陰性の牛が13頭，ELISAの結果が陽性でUSPDが陰性の牛が２頭，その逆が２頭であった。また，ELISAとUSPD両方とも陽性の牛のDay０の平均吸光度は0.919，Day７は1.347
であり，危険率0.1％で有意にDay７が高かった（Table２）。なお，両方とも陰性の牛はDay０で1.026，Day７で1.167と有意な差は認められなかっ

37

B8.28

＋

－

Disagreement

た。さらに，すべての測定サンプルの測定値にお

38

B2.13

＋

－

Disagreement

39

B2.19

－

＋

Disagreement

40

B2.20

－

＋

Disagreement

けるSDは0.383から0.454と安定していた。したがって，本測定法ではAI後７日目の血清とAI時の血清の吸光度を比較することによって妊娠診断

Agreement Rate：90％（36/40）が可能であることが証明された。また，ELISAUSPD : Pregnancy Diagnosis using Ultra-Sonic diagnosticの結果が陽性でUSPDの結果が陰性の牛は，AIのequipment© The Ito Foundation

168

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 2 Absorbance of preganancy and nonpregnancy samples by Super-EPF ELISA
NP

Ｐ

After AIDay 0aDay 7aDay 0bDay 7cAbsorbance

1.026

1.167

0.919

1.347

SD

0.383

0.409

0.385

0.454

Number of bovine

15

15

25

T-testＰ＝0.339

25
Ｐ＜0.001

a-a：no significant difference, b-c：significant difference

７日まで胚は存在していたが，42日のUSPDまで

以降でゼロとなった（データは示していない）。

の間に流産したか早期胚死滅した可能性がある。

したがって，本測定方法を妊娠診断に用いるに一方，本研究ではELISAの結果が陰性でUSPDのは ，ホ ル ス タ イ ン 種 と 黒 毛 和 種 と も お お よ そ結果が陽性のケースが存在した。この原因は，そDay20までに実施すべきものと推察された。ホルの個体のDay７の血清中Super-EPFが検出限界以

スタイン種のDay240と300および，黒毛和種の下であり，その後上昇した可能性も考えられる。

Day140から302の測定はまだであるが，これらのさらなる検討が必要である。

サンプルも含めてSuper-EPFの変化をさらに検3.2

妊娠期間中の血清中Super-EPFの変化

ホルスタイン６頭の吸光度はDay３日まで上昇討する必要がある。
3.3

回収胚の数とSuper-EPFの関係

し，No.14以外はDay21から120日までの間にゼロ

４頭の血清中Super-EPF ELISAの吸光度の変近くに低下した（Fig.１）。No.14はDay30がピー化と，胚のランクおよび回収胚数はFig.２に示し

クとなり，その後Day120まで若干低下したが吸た。過去のRITestの結果では，採卵１日後から光度は高いままであった。また，No.40と29はSuper-EPFは陰性に低下することが示唆されてDay21以降，No.17はDay30以降ゼロであった。

いる。本研究では４頭すべてが採卵時は陽性（ＰNo.37はDay21でピークに至り，Day120でゼロ付＜0.05）であり，採卵後１日目では吸光度は0.4か

近 に 低 下 し た 。な お ，No.17 以 外 は 45 日 目 のら0.8程度と高く，その後２から３日目に吸光度

USPDで胎仔を確認している。No.17はAIの30日は減少した。したがって，胚を回収すると血清中

目と60日目の間の45日目にUSPDを行ったところ

Super-EPFは３日以降に陰性に低下することが示

胎仔が確認できず，60日目と120日目の間にAIを唆された。また，受精卵の存在がSuper-EPFに行っているが，その後の妊娠診断（USPD）では必要であることも確認された。一方，Ａランク胚陰性であった。過去のRITestではSuper-EPFはを生産したNo.16と15の採卵時の吸光度は他の個

妊娠期間の2/3期以降陰性に低下することが示唆

体より若干高い傾向があった。しかし，No.23はされているが，本研究で初めてELISAの結果と変性卵のみにも関わらず，吸光度は0.5程度とAʼ一致した。しかし，No.40と29はDay14日以降ゼ

ランク胚を生産したNo.９よりも高く，子宮中のロとなっており，再測定も含めて評価が必要と思胚の数およびランクはSuper-EPFの吸光度に大われる。一方，黒毛和種１頭はET後133日までのきな影響を及ぼさないことが推察された。

吸光度の変化を見ると，ET後Day12からDay33以上のことから，本測定法は牛の生殖系の研究

まで吸光度は上昇し，その後急速に低下しDay47

にとって新たなツールとなり得ることが示唆され© The Ito Foundation

169

牛の超早期妊娠因子（Super-EPF）ELISAによる受精・着床診断
1.6

Absorbance（A450nm）

1.2

0.8

0.4

0.0

0

1

3

7

14

21

30

60

120

Day after artiﬁcial insemination
Fig. 1 Changes of absorbance after artificial insemination by Super-EPF ELISA

Cattle No.：

No.40

No.29

No.37

No.39

No.14

No.17

Rank of Embryo
Cattle No.

A

A’

B

C

Degeneration

Unfertilize

Zona pellucida

Total

9

0

1

0

0

1

1

2

5

15

1

0

1

0

0

0

0

2

16

5

1

0

0

0

0

0

6

23

0

0

0

0

3

0

0

3

1.0

Absorbance（A450nm）

0.8

No.9

No.16

No.15

No.23

0.6

0.4

Embryo collection

0.2

0.0
AI

1

2

3

Day

Fig. 2 Changes of Super-EPF ELISA absorbance in cattle collected embryo and rank of collected embryo© The Ito Foundation

170

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

た。しかし，本研究ではサンプルの採取に時間をた 。し か し ，胚 の 数・ラ ン ク と 血 清 中 Super-

要し，いくつかのサンプルの測定が行えなかっEPFとの間には関連性はないことが推察された。

た。また，血清中のSuper-EPF含量を測定する

さ ら に 検 討 す る こ と に よ っ て ， Super-EPF

ための検量線の作成を検討したが，本研究期間内

ELISAは，牛の早期受精・妊娠診断技術としてでは良好なデータが得られなかった。引き続き検使用可能であることが証明された。

討することで，安定した測定系になると思われる。さらに，庭先で使用出来るようにするためにはモノクローナル抗体の作出が重要である。
４．要

約

本研究はSuper-EPF ELISAの測定系の確立を行い，確立した方法による牛の早期妊娠診断（AI後７日目）を実施した。その結果，40頭の牛のUSPDとSuper-EPF ELISAとの診断結果の一致率は90％と高く，AI後７日目には牛の受精・妊娠診断は可能であることが示唆された。また，
AIから分娩までの血清を測定した結果，SuperEPF ELISAではAI後14日から30日まで陽性で，そ の 後 陰 性 に 低 下 し た 。さ ら に ，胚 回 収 後 のSuper-EPFはほとんどの個体で回収後の３日目
か ら 陰 性 に 転 じ た 。こ れ は ，母 体 の 血 清 中Super-EPF は 胚 の 存 在 に 影 響 を 受 け る こ と がSuper-EPF ELISA を 使 用 し て 初 め て 示 唆 さ れ

文献１） M o r t o n , H . , H e g h , V . , C l u n i e , G . J . A . :Immunosuppression detected in pregnant mice byrosette inhibition test, Nature, 249, 459～460, 1974．
２） 伊藤（松原）和衛：家畜の早期妊娠因子に関する研究，東北畜産学会報，45，80～91, 1996．
３） Cavanagh, A, C., Morton, H. : The purification ofearly pregnancy factor to homogenity from humanplatelets and identi cation as chaperonin 10,
European Journal of Biochemistry, 222, 551～560,
1994．
４） Kawamura, K., Fukuda, F., Itoh, H., Ito, K.,
Kodama, H., Kumagai, J., Kumagai, A., Tanaka, T. :Chaperonin 10 in the rat oocyte and early embryos :its expression and activity for early pregnancy
factor, American Journal of Reproduction and
Immunology, 44, 242～248, 2000．
５） Ito, K., Takahashi, M., Kawahata, K., Goto, T.,
Takahashi, J., Yasuda, Y. : Supplementation effect ofearly pregnancy factor-positive serum into bovine invitro fertilization culture medium, American Journalof Reproduction and Immunology, 39, 356～61, 1998．
６） 徳中紘太，鎌田晴己，松原（伊藤）和衛：超早期妊娠因子の正体を追い求めて，Journal of Reproductive
Immunology and Biology, 25, 14～30, 2010．

© The Ito Foundation

171

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定（Ⅱ）
Novel standard for artificial insemination timing based on different estrous
detection criteria in cattle（Ⅱ）

坂

口

実・菊

池

元

宏・三

浦

弘

（北里大学獣医学部）

Minoru Sakaguchi, Motohiro Kikuchi and Hiroshi Miura（School of Veterinary Medicine, Kitasato University）

Detection of estrus is prerequisite for optimal timing of insemination. Recently, however, it
is becoming difficult to detect standing estrus, which is the primary sign of true estrus. In thisstudy we tried to evaluate the effects of number of cows in estrus on other estrus-related
behaviors and increased activity as estrus signs for the purposes of determining more optimal
timing of insemination. Continuous observation using a video system and activity monitoring
using an automated pedometry system were performed in Japanese beef cows and thefrequency and duration of estrous behaviors of these cows were analyzed. Number of cows in
estrus influences estrous intensity, but not activity amount. When 2 or more cows were in
estrus the onset of estrus was hastened and this should be taken into consideration todetermine optimal insemination timing by the activity increment. Optimal insemination timing
may be delayed in dominant cows under the circumstance that 2 or more cows are in estrus ascompared to in non-dominant cows under circumstance that 1 cow is in estrus. It was indicatedthat both the number of cows in estrus and the dominance of cows in estrus influence the
estrous activity resulting in influencing the optimal timing of insemination to the cows.

１．目

由として，乳牛では高泌乳化に伴う発情行動，特的にスタンディング行動の微弱化と持続期間短縮，

酪農および肉牛繁殖経営において，繁殖効率は

肉牛では多頭化等による発情見逃しの増加があげ

収益性を左右する重要な要因である。我が国でられる１，２）。また両者に共通して，発情発見スキ

は，乳用牛のみならず肉用牛のほぼすべてが人工ルの低下も問題視されている。客観的な手法とし授精によって繁殖されており，経営者が望む時期て，行動量（歩数）の変化による発情の自動検出に，確実に受胎させることが必要である。牛におシステムが開発され，急速に普及しつつあるが，ける人工授精の適期は，従来スタンディング発情

発情から排卵までの時間的関係は，どの基準で発をゴールドスタンダードとして設定されてきた情と判定するかにより異なる３）。また，スタンディ

が，これに代わる指標が求められている。その理

ング行動以外の発情関連行動の発現時期や頻度© The Ito Foundation

172

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）と，排卵時間との関係についてはこれまでほとん
ど検討されていない。さらに牛群内には通常，一定の序列（順位）が存在し行動に影響するため，と比較した。
２．方法

発情関連行動を個体間の相互作用として捉えるこ

2.1

単独発情の誘起とにより，より柔軟かつ実用的な授精適期の設定

北里大学（青森県十和田市）にて飼養されていた肉用繁殖牛14頭を供試し，単独での発情を確実が可能になると考えた。
平成27年度の本研究助成では，目視観察によるに誘起するため，実験開始前に全供試牛について予備的検討と，同時発情条件下でのビデオによる超音波診断装置による卵巣観察を行い，それまで連続観察を実施した 。目視観察結果から，最もの発情周期の経過から退行期黄体を有すると考え早く発現したのは匂い嗅ぎ行動であり，スタン

られる牛には膣内留置型黄体ホルモン製剤

ディング行動か歩数上昇を基準とした場合，発情（CIDR：シダー1900，ゾエティスジャパン）を挿を見逃す可能性のあることが分かった。発情開始

入し，全頭で黄体期を維持した。退行期黄体を有から排卵までの時間間隔はスタンディング行動をする牛から１頭選抜し，CIDRの抜去により発情基準とした場合が最も短く，歩数上昇および匂いを誘起した。当該牛の排卵確認の１～２日後，次嗅ぎとの時間差は７～８時間あり，用いる指標にの対象牛のCIDRを抜去する，という手順を繰りよって人工授精適期が異なることが示された。連返すことによって14回の単独発情を誘起した。

４）

続観察結果から，開始時間が一般的な範囲にあっ

2.2

たのはスタンディング行動のみであり，終了時間

全供試牛の前肢に発情検出用の無線送信歩数計

では，匂い嗅ぎ，舐め行動のみであった。持続時（牛歩，コムテック㈱）を装着した。３台のビデ間で一般的な範囲にあったのはスタンディング行

オカメラ（RD-4402，㈱アルコム）を用いて発情動と発情スコアのみであった。したがって，スタ行動を記録し，CIDR抜去２日後から，１日４回

ンディング行動を確認した場合を除き，他の発情の給餌時に６時間間隔で主席卵胞の存在を確認

行動により授精適期を決定する際には，こうしたし，その消滅の３時間前を排卵時刻とした。Van

時間的なずれを考慮する必要があると考えられ

Eerdenburgら５）の発情スコア表（Table１）にした。同時発情条件下では，スタンディングおよび

たがい，排卵60時間前からの記録映像より各行動

マウンティング行動は容易に発現し，顎のせと匂の開始と終了および頻度を抽出し，30分ごとの発い嗅ぎ行動を発情発見および授精適期推定精度の情スコアを算出した。スコア合計が80点を上回っ

向上に使えることが分かった。また，個体間の社た時点を発情開始と判定し，下回った時点を終了

会的関係に関する情報を授精適期推定の精度向上とした。歩数上昇は，過去７日間の平均からの1.4に利用するためには，相手牛の順位や，発情行動

倍以上への上昇を基準とした。発情スコア表に記

開始のタイミングとの関係についてもより詳細に載された行動に，他の牛への頭突き行動も加え，調べる必要があると考えられた。

それらの特性を，前年度得られた同時発情での結一方，同時発情条件下と異なり，単独発情条件

発情行動の記録と解析

果（13頭，のべ22発情）４）と比較した。

下では行動の開始および持続時間は短縮し，頻度2.3も下がると予測されるため，今年度は同様の観察

近藤の提示した餌槽優先法６）を一部改変し，牛実験を単独発情について実施し，同時発情の結果

群内の順位付けを実施，発情行動とその後の排卵© The Ito Foundation

牛群内順位と発情行動の関係

173

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定（Ⅱ）
Table 1 Scoring scale for estrous behavior: 1 cow in estrous（n = 22）
PointsStanding heat100

Mounting headside of other cows

45

Mounting (or attempting) other cows

35

Resting with chin on other cows

15

Mounted by other cows but not standing

10

Sniffing vagina of other cows
Restlessness

105

Flehmen3

Maximum estrous score

Behavior（A）
1000

を，前年度得られた同時発情での結果（上位・下位各６頭，のべ20発情） と比較した。

＊

800
600

588

400
366
200

時刻への影響を解析した。14頭の14発情について，上位７頭，下位７頭に分けて発情行動の頻度: 2 or more cows in estrous（n = 14）

0
（B）

25

３．結果と考察3.1

発情スコアおよび行動量の比較

発情スコアは，同時発情において単独発情と比較して有意に高かったが（P＜0.05, Fig. 1A），ス

Persistence of estrus (hr)

４）

20
15

までの時間は，どちらも同時発情で長かったが，有意差は検出されなかった（Fig.２）。一方，歩数倍率から見た行動量の上昇については，最大倍50Fig. 1 Effect of the number of cows in estrus on estrousscore. Vertical bar presents SD.
Values differ significantly between two groups（P＜0.05）.

＊

率の平均値（Fig. 3A）および発情持続時間（Fig.

50

3B）に差はなかった。発情開始および終了からかった（Ｐ＜0.05）。これらの結果は，同時発情
では単独発情と比較して，排卵を基準とした発情の開始・終了ともに，数時間早い可能性を示している。また，発情頭数は行動量の上昇には影響せIntervals to ovulation(hr)

排卵までの時間はFig.４に示すように，発情スコ
アと同様，同時発情で延長し前者では10時間長

13.4

10

コアに基づく持続時間については両者間に差はなかった（Fig. 1B）。発情開始および終了から排卵

15.5: 1 cow in estrous（n = 22）: 2 or more cows in estrous（n = 14）

40
30

32.2

29.3

20
17.9

16.9

10

ず，同時発情では発情行動の強度を高め，排卵を0基準とした発情開始時間を早めていると考えられFrom the onset

From the termination

た。したがって，特に行動量の上昇から授精適期

Fig. 2 Intervals from the onset and termination of estrusを判断する場合，同時発情では単独発情よりも発

defined by estrous score to ovulation. Vertical bar
presents SD.

情開始から排卵までの時間は延長する，という点に留意が必要である。

© The Ito Foundation

174

平成28年度（A）

5

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）: 1 cow in estrous（n = 22）

3.2: 2 or more cows in estrous（n = 14）

次に，各行動別に同時・単独間を比較してみる

Maximum activity ratio

4

各発情行動の比較と，排卵との関係では，フレーメン以外の行動で発情開始から排卵までの時間は，同時発情で延長

3

3.1

していることが示された（Fig. 5A）。一方，発情

2.6

2

終了から排卵までの時間は，匂い嗅ぎ，頭突きおよびフレーメンで，同時発情のほうが長かったが1（Ｐ ＜ 0.05）， 他 の 行 動 に 差 は な か っ た （Fig.
5B）。各行動の持続時間については，同時発情で

050

Persistence of estrus (hr)マウンティング行動が長く（Ｐ＜0.05）
，逆にフ

（B）

40

レーメンは短かった（P＜0.05, Fig.6A）。これらを１時間あたりの行動回数で見ると，スタンディ
ング行動は同時発情で単独発情の５倍を超え（Ｐ30＜0.05），マウンティング行動の頻度も高かった

31.6（P＜0.05, Fig. 6B）。一方で，匂い嗅ぎおよび頭突

23.9

20

き行動は単独発情で同時発情の２倍程度の頻度で観察された（Fig. 6B）。フレーメンについては，

10

同時発情で頻度が高かった（Ｐ＜0.05）。したがっ0て，単独発情ではスタンディング行動の相手を見Fig. 3 Effect of the number of cows in estrus on activity.

Vertical bar presents SD.

動や，マウンティング／スタンディング行動が不成立になった結果と推測される頭突き行動が，よ: 1 cow in estrous（n = 22）60: 2 or more cows in estrous（n = 14）

も，それに続くマウンティング行動につながらなIntervals to ovulation (hr)いケースが多いものと推測できる。

4020

これらの結果と，3 . 1で示した両者間に行動量36.7の差はない，ということを考え合わせると，行動量を裏付けている発情行動は，同時・単独発情間

26.5で異なるといえる。
3.3

10
0

り頻繁にみられるものと解釈できる。また，単独
発情では顎のせ行動までは他の牛に許容されて

＊

50

30

つけられないため，他の牛の匂いを嗅いで回る行

5.1
From the onset

牛群内順位の影響

発情スコアについては，同時・単独発情とも

2.7

From the termination

Fig. 4 Intervals from the onset and termination of estrus

defined by activity ratio to ovulation. Vertical bar
presents SD. ＊Values differ significantly between
two groups（P＜0.05）．

に，上位・下位間に差はなかった（Table２）。行
動量の上昇については，終了から排卵までの時間
が，単独発情の下位牛で同時発情の上位牛と比較して極端に短く（Ｐ＜0.05），有意差はないもの© The Ito Foundation

175

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定（Ⅱ）（A）: 1 cow in estrous（n = 22）

Interval from the onset of estrus toovulation（hr）

60: 2 or more cows in estrous（n = 14）
＊

＊
50

40

30

36.7
32.1

＊＊

Standing

Mounting

39.4

40.7

38.2

36.4

33.6

31.4
28.0
＊＊

20

41.9

38.3

20.7
＊＊＊

10

0

Intervals from the termination of estrus toovulation（hr）（B）

Restingwith chinon otherSniﬃngvagina ofother cows

Butting

Flehmen

＊

35
30
25

＊

20
15

20.6
18.0

17.2

17.5 17.7
＊＊

＊＊

15.5

＊＊＊

16.4
14.3

14.1

12.4

10
5
0

Standing

Mounting

Restingwith chinon other

7.6

7.7

Sniﬃngvagina ofother cows

Butting

FlehmenFig. 5 Intervals from the onset（A）and the termination（B）of estrus defined by different estrous-related behaviors toovulation.
 Values differ significantly between two groups（P＜0.05）．
＊

 n＝13，＊＊＊n＝11＊＊の，発情開始から排卵までの時間も単独発情・下スタンディング行動の開始から排卵までの時間

位牛では同時発情・上位牛よりも平均で約13時間

は単独・上位牛で最も短く，同時・上位牛と比較短いことから，行動量上昇による発情開始を指標

して約８時間短かった（P＜0.05, Table 3A）。まとした場合，前者では後者よりも授精適期が半日た，持続時間は，単独・上位牛で７時間と，他の程度早くなる可能性が示された。

３群の半分程度であった。１時間あたりの平均頻© The Ito Foundation

176

Persistence of estrous-related behavior
(hr)

（A）

平成28年度: 1 cow in estrous (n = 22)50: 2 or more cows in estrous (n = 14)
＊

40

30

31.8

＊
27.8

19.2
10

26.5 26.4

24.0

22.8

20

0

（B）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

14.0

17.2
13.7

10.8
＊＊
Standing

＊＊

8.8
＊＊＊

Mounting

10

Resting withchin on othecows

Sniﬃngvagina ofother cows

Butting

Flehmen

The frequency of estrous-related behavior
per hr

9
＊

8
7

＊

6

＊

＊

5
4
3

3.6

3.1

2

2.1
＊＊

1
0

3.4

0.6
＊＊
Standing

2.6

3.2

2.6
1.9

3.5
＊＊＊

1.6
0.7

Mounting

Restingwith chinon otherSniﬃngvagina ofother cows

Butting

FlehmenFig. 6 Persistence of estrus defined by different estrous-related behavior（A）and its frequency per hr.
 Values differ significantly between two groups（P＜0.05）．
＊

＊＊n＝13，＊＊＊n＝８

度は，単独・下位牛と同等であったことから，スた（Table 3A）。

タンディング行動に関しては，上位牛の単独発情

顎のせ行動については，単独・下位牛で開始かで最も見つけにくいと考えられた。マウンティン

ら排卵までの時間および持続時間が最も短く（Pグ行動に関しては，同時・単独それぞれにおい＜0.05, Table 3A），この条件下では顎のせ行動のて，上位・下位牛間の有意な差は認められなかっ発現が抑制されると考えられた。匂い嗅ぎ行動に© The Ito Foundation

177

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定（Ⅱ）

Table 2 Effects of the number of cows in estrus and the order of cows in the herd on the estrous score and activity

ratio
Number of cows in estrus
Detection methodsof estrus

Estrous score

Activity ratio

12 or more

Dominant（ｎ＝8）

Non-dominant（ｎ＝6）

Dominant（ｎ＝11）

Non-dominant（ｎ＝9）

Intervals to ovulation（hr）
From the onset（A）

29.3±4.3

29.3±2.3

32.9±7.832.9±3.1

From the termination（B）

17.9±6.3

15.7±3.017.8±7.4

17.4±3.1

Persistence of estrus（A-B, hr）
Maximum score

12.4±5.3386±164b14.7±3.7

16.1±5.1

16.4±3.9339±142b603±217a603±183a

From the onset（A）
From the termination（B）
Persistence of estrus（A-B, hr）

27.6±15.0
4.1±6.0ab
23.5±10.4

25.1±2.9
0.8±1.0b
24.3±2.838.2±15.1
6.7±4.3a
31.5±15.535.9±11.1
3.5±4.0ab
32.5±13.7

Maximum ratio

2.6±0.7

2.6±0.7

3.0±0.8

3.3±1.2

Intervals to ovulation（hr）

Data are presented as Mean±SD.
abValues with different superscript significantly differ（P＜0.05）．

Table 3A Effects of the number of cows in estrus and the order of cows in the herd on each estrous-related behavior
Number of cows in estrus
Estrous-related
behaviors

Standing

Mounting

Resting with chinon other cows

1

2 or more

Dominant（ｎ＝8）

Non-dominant（ｎ＝6）

Dominant（ｎ＝11）

Non-dominant（ｎ＝9）

Intervals to ovulation（hr）
From the onset（A）

26.5±4.9b

29.7±1.9ab

34.1±7.1a

30.8±5.6ab

From the termination（B）
Persistence of estrus（A-B, hr）
Frequency per hr during estrus

19.5±5.2
7.0±6.2b0.5±0.5b

14.5±2.815.2±3.2a
0.7±0.4b

18.0±7.1
16.1±3.5a
3.1±1.9a

17.6±2.7
13.2±6.1a
3.3±2.1aIntervals to ovulation（hr）
From the onset（A）
From the termination（B）
Persistence of estrus（A-B, hr）
Frequency per hr during estrus

32.8±2.7b
19.0±4.8
13.9±6.0b
1.5±0.8b

29.7±2.0b
16.2±5.6
13.5±6.3b
2.7±1.1ab

39.4±7.6a
19.1±7.8
20.4±4.9ab
3.9±2.0a

35.2±4.4ab
15.7±5.6
19.5±5.0a
3.4±1.2aIntervals to ovulation（hr）
From the onset（A）
From the termination（B）
Persistence of estrus（A-B, hr）

35.5±10.2ab
16.1±5.7
19.4±14.4ab

31.8±4.3b
16.8±8.8
15.0±9.7b

39.9±8.2a
14.0±8.1
25.8±7.5a

37.3±4.2ab
16.8±5.4
20.5±5.4ab

Frequency per hr during estrus

2.6±1.92.5±1.8

2.3±1.7

3.2±1.3

Data are presented as Mean±SD.
abValues with different superscript significantly differ (P＜0.05）．

© The Ito Foundation

178

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 3B Effects of the number of cows in estrus and the order of cows in the herd on each estrous-related behavior
Number of cows in estrus
Estrous-related
behaviors

1

Sniffing vagina ofother cows

Butting

2 or more

Dominant（ｎ＝8）

Non-dominant（ｎ＝6）

Dominant（ｎ＝11）

Non-dominant（ｎ＝9）

From the onset（A）

43.0±6.935.8±4.1

43.1±8.7

41.1±7.3

From the termination（B）

9.1±6.1ab

6.1±6.0b

11.8±7.4ab

16.2±6.1aPersistence of estrus（A-B, hr）

33.9±11.7

29.8±6.6

31.3±11.4

24.9±9.2

Frequency per hr during estrus

3.1±1.8ab

3.7±2.7b

1.7±0.6a

2.3±1.9ab

From the onset（A）
From the termination（B）

40.5±9.4
8.9±7.635.9±9.8
14.5±6.0

39.9±10.2
15.5±7.839.4±10.7
11.3±7.1

Persistence of estrus（A-B, hr）

31.5±13.1

21.5±8.2

24.4±7.3

28.1±13.0

Frequency per hr during estrus

2.7±1.9ab

3.8±4.3b

1.3±0.9a

1.4±1.3ab

Intervals to ovulation（hr）
From the onset（A）
From the termination（B）
Persistence of estrus（A-B, hr）

40.1±6.6a
13.5±6.6b
26.6±11.7a

31.6±3.9ab
11.0±5.3b
20.6±5.1ab

30.0±13.0b＊
19.1±7.7ab＊
10.9±6.3b＊26.0±3.4b＊
22.9±2.5a＊
7.7±4.8b＊＊

Frequency per hr during estrus

0.6±0.3

0.9±0.4

2.0±3.0＊

0.7±0.3＊＊

Intervals to ovulation（hr）

Intervals to ovulation（hr）

Flehmen

Data are presented as Mean±SD.
abcValues with different superscript significantly differ（P＜0.05）．
＊ｎ＝５，＊＊ｎ＝２．

ついては，単独・下位牛で終了から排卵までの時

発情行動の強度は高くなるが，行動量には影響し間が最も短く，かつ頻度は最も高かった（P＜ないこと，および行動量を基準とした発情開始時

0.05, Table 3B）。頭突き行動については，単独・間は早まることが分かった。したがって，特に行下位牛で最も高頻度に発現した（P＜0.05, Table

動量の上昇から授精適期を判断する場合，同時発

3B）。したがって，単独・下位牛では匂い嗅ぎお情では単独発情よりも発情開始から排卵までの時

よび頭突きが最も優勢な発情行動であることが示

間が長い，という点に留意が必要である。また，唆された。フレーメンに関しては，同時・下位牛

行動量の上昇を裏付けている発情行動は，同時・で持続時間が最も短く（Ｐ＜0.05），頻度も低かっ単独発情間で異なると考えられ，行動量上昇によたが，同時発情での欠測値が多かったこともある発情開始を指標とした場合，単独発情の下位牛り，この理由については不明である（Table 3B）。

では，同時発情の上位牛よりも，授精適期が半日

４．要程度早くなる可能性が示された。

約

単独発情ではスタンディング行動の相手を見つビデオによる発情行動の連続観察および歩数計

けられないため，他の牛の匂いを嗅いで回る行動

により，同時発情条件下での発情行動の特徴を明や，マウンティング／スタンディング行動が不成らかにした昨年度に続き，今年度は，これら同時立になった結果と推測される頭突き行動がより頻発情と単独発情での行動を比較し，その違いを解繁に見られ，単独発情では顎のせ行動までは他の析した。

牛に許容されても，それに続くマウンティング行

その結果，同時発情では，単独発情と比較して動につながらないケースが多いものと推測でき© The Ito Foundation

異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定（Ⅱ）

る。スタンディング行動に関しては，上位牛の単独発情で最も見つけにくいと考えられ，単独発情の下位牛では，匂い嗅ぎおよび頭突きが最も優勢な発情行動であることが示唆された。
以上，発情頭数と牛群内順位は発情行動に影響することが示され，その結果授精適期の判断にも影響することが分かった。

179

文
献
１） 坂口実：畜産の研究，61，75～80，2007．
２） 坂口実：農業技術体系，畜産編（追録26号），第２巻，乳ウシ①，基礎編，乳ウシの生理，繁殖生理
pp.基126の８～15，農山漁村文化協会，2007．
３） Sakaguchi, M., et al. : J. Reprod. Dev., 53, 819～
828, 2007．
４） 坂口実，菊池元宏，三浦弘：平成27年度食肉に関する助成研究成果報告書，伊藤記念財団，34，175～
180，2016．
５） Van, Eerdenburg, F. J. C. M., et al. : Vet. Quart.,
18, 52～54, 1996.
６） 近藤誠司：北海道大学農学部紀要，15，192～
233，1987．

© The Ito Foundation

180

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発（Ⅱ）
Development of novel system for quality evaluation of bovine embryos byanalysis of mitochondrial function（Ⅱ）

阿

部

宏

之

（山形大学大学院理工学研究科）

Hiroyuki Abe（Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University）

Respiration is useful parameter for evaluating embryo quality as it provides important
information about metabolic activity. In this study, we have examined a scanningelectrochemical microscopy（SECM）technique that is a non-invasive and sensitive method formeasuring oxygen consumption by individual bovine embryos. SECM is a technique in which
the tip of a microelectrode is used to scan and monitor the local distribution of electro-active
species near the sample surface. We have developed a SECM measuring system, to establish
the accurate method for embryo quality evaluation. With this system, oxygen consumption of
single, identical bovine embryos at different developmental stages has been monitored. Oxygen
consumption rates（F）of the single embryos were low from 2-cell to 8-cell stages. The
increase of oxygen consumption rate was found at the morula stage and blastocysts showedlarge oxygen consumption rate. Staining with JC-10 revealed the increase of mitochondrial
membrane potential in morulae and blastocysts. Cytochrome c oxidase complex（COX）is oneof the respiratory chain enzyme complexes and essential for cell respiration. In this experiment,
Cox mRNAs were detected by RT-PCR. Cox mRNAs encoded by mitochondrial DNA weredetected in all developmental stage. On the other hand, Cox mRNAs encoded by genomic DNA
peaked at blastocyst stage. These results suggest that the mitochondrial respiratory activity inbovine embryos increased in morula and peaked in hatched blastocyst and the development of
mitochondrial function depends on the gene expression of COX subunit encoded by genomic
DNA. This study shows that the SECM technique is able to non-invasively assess the
mitochondrial respiration function of individual bovine embryos and the embryo quality. The
SECM procedure may contribute to improvements in reproductive technologies in domestic
animals.

１．目

受胎率は伸び悩んでいる。この原因の一つとし的て，移植する胚の選別法の精度に問題があると考

体外受精技術は牛の品種改良や増産を可能とすえられている。現在，移植に供する牛受精卵は割る基盤技術として広く普及しているが，移植胚の球などの形態学的特徴を指標に品質判定されてい© The Ito Foundation

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発（Ⅱ）

181

るが，受精卵は発生過程においてリアルタイムで究調査では，SECMをベースとする牛胚の呼吸活形態が変化するために，ワンポイントでの形態学性測定に特化した細胞呼吸測定システムの開発を的評価のみでは厳密な胚の品質評価はできない。

目的に，（１）単一牛受精卵の酸素消費量を測定

そのため，形態観察のみによる評価法では本来移するための高感度センサープローブ電極，（２）植に適さない胚を移植胚として選別している可能

受精卵のミトコンドリア機能と計測感度影響しな性が高い。

い呼吸測定液の開発を行った。その結果，これら

これまで我々は，牛胚の品質とミトコンドリアの要素技術と，既に開発済の多検体測定プレートの呼吸機能が密接に関連していることを明らかにおよび呼吸解析ソフトをシステム化した「受精卵してきた。ミトコンドリアは酸化的リン酸化

呼 吸 測 定 シ ス テ ム」を 構 築 す る こ と が で き た（呼吸）により細胞活動に必須のエネルギーであ（Fig.１）。平成28年度では，この「受精卵呼吸測るアデノシン三リン酸（ATP）を産生し，胚の定システム」の受精卵品質評価における有用性の発生等に深く関与していることから，精度の高い検証を行った。

１，
２）細胞呼吸測定技術は受精卵の品質評価や細胞の呼2.2

吸機能診断に極めて有効な技術となる。そこで注2 . 1で構築した受精卵呼吸測定システムの性能目したのが，生体反応を非侵襲的に検出できる電を評価するために，牛体外受精胚の酸素消費量測

気化学計測技術である。これまでに，電気化学計定を行った。牛卵巣から回収した卵丘細胞－卵子

測技術の基盤となる走査型電気化学顕微鏡をベー複合体（COC）を無血清培地IVMD101（機能性スに，単一の牛受精卵の酸素消費量（呼吸）を無ペプチド研究所）で成熟培養を行い，体外受精に侵襲的に測定できるシステムの開発に成功していより受精卵を得た。受精卵は無血清培地IVD101

る。本研究では，ミトコンドリア呼吸機能を指標

培地（機能性ペプチド研究所）を用いて培養し，とする牛胚品質評価法と受精卵呼吸測定システム

２細胞期胚から孵化胚盤胞のステージの胚を回収の有効性を検証するために，牛受精卵を用いた詳し種々の実験に用いた。

細なミトコンドリア呼吸機能解析を行った。本研2 . 3 ミトコンドリア呼吸機能の細胞生物学的究の最終目標は，ミトコンドリア呼吸という客観解析的基準に基づく新しい家畜優良胚選別法の開発で
ある。

2.1

高感度ミトコンドリア膜電位アッセイキットであ２．方

牛受精卵の培養る

JC-10 （5,5ʼ,6,6ʼ-tetrachloro-1,1ʼ,3,3ʼ-

tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide

法

derivative）を用いて，各発生ステージのウシ胚

高精度受精卵呼吸測定システムの開発を染色し，共焦点レーザー顕微鏡を用いてミトコ

電気化学計測の基盤である走査型電気化学顕微

ンドリア膜電位を検出した。JC-10は，ミトコン

鏡（scanning electrochemical microsocopy；SECM）

ドリアの脂質二重膜に取り込まれ，膜電位を有すは，局所領域における生体反応を高感度・非侵襲るミトコンドリアでは凝集して赤色蛍光（highΔ

的にモニタできる装置である。これまでの研究にΨｍ）を発し，Mt膜電位が消失すると緑色蛍光より，酸素還元電流を検出できる微小電極をプ（lowΔΨｍ）を発する。相対膜電位（highΔΨ

ローブとするSECMを用いて単一受精卵の呼吸活

m/lowΔΨｍ）および色蛍光の強度を測定するこ性測定に成功しているとで，ミトコンドリア電子伝達系呼吸鎖複合体の。平成27年度の助成研

３～５）© The Ito Foundation

182

平成28年度（c）

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

（e）
（g）
Scan

（a）

EmbryoMicro‒
electrode
Embryo

（b）

（h）

（f）

Micro‒
well

Fig. 1 A modified scanning electrochemical microscopy（SECM）measuring system. SECM system includes ameasuring instrument on the inverted optical microscope stage（a）, potentiostat（b）, notebook computer（c）, amicroelectrode（e）, and a plate（f）for measuring respiration activity of embryos. The plate has six cone-shaped
microwells（arrow in b）. Individual bovine embryos are transferred into a microwell filled with medium. The
embryo sinks down to the bottom of the well, remaining at the lowest point（g）. Microelectrode（arrowhead in g）
is scanned along the z-axis from the side point of embryo（h）.

活性を解析した。
ATPは多様なプロセスを通じて作り出される

３．結果と考察が，最も効率的な方法はミトコンドリアの電子伝

3.1

達系を経由した酸化的リン酸化である。電子伝達

単一牛胚の呼吸量計測には，先端径５μm以下

系はミトコンドリア内膜に存在し，それぞれ多重の白金電極が不可欠である。本研究では，マイクのサブユニットによって構成される５つの酵素複

ロ電極の感度を向上させるために，白金電極の電合体（呼吸鎖複合体Ⅰ，呼吸鎖複合体Ⅱ，呼吸鎖解エッチング法，白金電極をガラスキャピラリー

複合体Ⅲ，呼吸鎖複合体Ⅳ，ATP合成酵素）かに封入するための熱封止および封止後の電極研磨らなる。細胞に取り込まれる酸素の90％は，電子のそれぞれの工程を改良した。その結果，酸素還受容体として呼吸鎖複合体Ⅳ（シトクロムｃオキ

元 条 件 下（ ‒ 0.6 Ｖ 荷 電 下）に お い て 還 元 電 流

シダーゼ：COX）により消費されている。哺乳‒1.0nA以下の感度を有する先端径２μmのディス類のCOXは計13のタンパクサブユニットで形成

ク型マイクロ電極を作製することができた。このされている。ミトコンドリアゲノムはCOX1，電極の性能評価を行った結果，単一ウシ胚およびCOX2，COX３の３サブユニットを，一方の核ゲ卵子の呼吸量計測が可能であった。また，感度向ノ ム は COX4 ， COX5a ， COX5b ， COX6a ，上に伴って検出されるノイズの量が増加したが，COX6b ，COX6c ，COX7a ，COX7b ，COX7c ，

計測データには大きく影響しないことが分かった。

COX8の10サブユニットをコードしている６）。本

電気化学計測では感度の向上に伴い，溶液中の研究では，電子伝達の終末酵素であるCOXを構

電解質組成やタンパク質が計測感度に影響を及ぼ成する核ゲノムおよびミトコンドリアゲノム由来

す可能性が高くなる。そこで，昨年度までに開発のCOXサブユニットのmRNAをRT‒PCR法によしたHTF（human tubal fluid）培地をベースとり解析した。

する呼吸測定液の有効性を調べた結果，安定した高感度細胞呼吸測定システムの性能評価

還元電流の検出と酸素消費量の計測が可能であっ© The Ito Foundation

183

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発（Ⅱ）

化胚盤胞において最大になることが明らかになった。
本研究では，新たに開発した高感度マイクロ電ている（Fig.２）。本研究では，呼吸活性の変化

極と呼吸測定液をSECMに組み入れた受精卵呼吸とミトコンドリア呼吸機能との関係を調べるため

測定システムの有用性を検討した。

に，発生過程におけるミトコンドリア膜電位活性3.2の変化を調べた。その結果，呼吸量が増加する桑呼吸測定による牛胚の品質評価

平成27年度の助成研究調査において，HTF培

実胚期から胚盤胞期にかけて，ミトコンドリア膜

地をベースに製作した測定液は胚に対して非侵襲電位活性の顕著な上昇が観察された（Figs.３，

的であり，高感度の電気化学呼吸測定に有効であ４）。さらに，形態良好胚と形態不良胚でミトコることが明らかになった。また，各発生ステージ

ンドリア膜電位活性を比較したところ，形態不良の牛胚の呼吸量を測定した結果，桑実胚から胚盤

胚では，ミトコンドリア膜電位の低下が観察され胞のステージにおいて有意に呼吸量が上昇し，孵た。

Oxygen consumption（x 10‒15mol/sec）

30

d

20

10
a
0

（18）

c
a

a

b

（20）

（15）

（16）

（14）

（19）

2C

4C

8C

M

B

HB

Fig. 2 Oxygen consumption rates of the single embryos were low from 2-cell to 8-cell. An increase in oxygen

consumption rate was found at the morula stage and blastocysts and hatched blastocysts showed aneven higher oxygen consumption rate. 2C：2-cell, 4C：4-cell, 8C：8-cell, M : Molura, B：Blastocyst, HB：
Hatched blastocyst. The numbers in parentheses represent the numbers of embryos examined. Values
are expressed as means±SEM. Means with different subscripts are different.
4C

2C

8C

B

M

HB

High
ΔΨm
（a）

（c）

（e）

（g）

（i）

（k）

（b）

（d）

（f）

（h）

（j）

（l）

Low
ΔΨm

Fig. 3 Mitochondrial membrane potential（MMP）of bovine embryos during embryonic development.（a, c, e,g, i, k）Red fluorescens showing high（active）membrane potential.（b, d, f, h, j, l）Green fluorescensshowing low membrane potential. An increase in MMP was found from the morula stage to blastocyst
stage. 2C：2-cell, 4C：4-cell, 8C：8-cell, M：Molura, B：Blastocyst, HB：Hatched blastocyst. Bars＝100μm.

© The Ito Foundation

184
Relative membrane potential（highΔΨm／lowΔΨm）

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

1

c

0.8
b

0.6
a

a

（16）

（13）

2C

4C

0.4
0.2

c

c

0

（16）
（18）

8C

（20）

M

B

（27）

HB

Fig. 4 Changes in mitochondrial membrane potential （MMP） of bovine embryos during embryonicdevelopment. MMP were low from 2-cell to 4-cell. An increase in MMP was found at the 8-cell stage
and morula, blastocysts, and hatched blastocysts showed an even higher potential. 2C：2-cell, 4C：4-cell,
8C：8-cell, M：Molura, B：Blastocyst, HB：Hatched blastocyst. The numbers in parentheses represent
the numbers of embryos examined. Values are expressed as means ± SEM. Means with different
subscripts are different.
O

1C

2C

4C

8C

M

B

Be

Cox1
Cox2
Cox3
Cox4
Cox5a
Cox5b
Cox6a
Cox6b
Cox6c
Cox7a
Cox7b
Cox7c
Cox8
18S
Fig. 5 COX mRNAs encoded by mitochondrial DNA（mt DNA）werestrongly detected in all developmental stage. On the other hand,
COX mRNAs encoded by genomic DNA（nDNA）increased from
8-cell embryos and peaked in blastocyst. O：oocyte, 1C：1-cell,
2C：2-cell, 4C：4-cell, 8C：8-cell, M：Molura, B：Blastocyst,
Be：beef.

次に，COXサブユニットのmRNAをRT-PCR

ドリアゲノム由来のCOXサブユニットmRNAと法により解析した結果，ミトコンドリアゲノム由比べて発生過程で顕著な発現量の変化を示した。

来のCoxm RNAは，１細胞から胚盤胞のすべて

４細胞期から８細胞期にかけてmRNA量は減少の発生ステージにおいて検出された（Fig.５）。

したが，胚盤胞では核ゲノム由来のCox mRNA

一方，核ゲノム由来のCox mRNAは，ミトコンの発現量は顕著に増加した。以上の結果から，核© The Ito Foundation

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の開発（Ⅱ）

185

ゲノム由来のCox mRNAは，酸素消費量が増加

COX遺伝子発現の上昇と一致していることが示

する胚盤胞において発現量が顕著に増加することされた。これらの結果は，受精卵の品質とミトコが明らかになった。これにより，本研究で開発しンドリア呼吸機能が密接な関係にあることを示した「受精卵呼吸測定システム」は，単一受精卵レているとともに，本研究で開発した受精卵呼吸測

ベルでミトコンドリア呼吸機能の変化を高精度で定システムはミトコンドリア呼吸機能を高精度で検出できることが分子生物学的レベルでも確認で検出し，ミトコンドリア機能に基づく新しい胚品

きた。

質評価法の基盤技術として有効であることが分本研究で開発した「受精卵呼吸測定システム」

かった。今後は，呼吸測定した胚の移植試験を行は，真核細胞に存在するミトコンドリアの呼吸をい，ミトコンドリア機能解析に基づく牛胚品質評

検出することからほとんどの動物細胞に応用でき価技術の有用性と安全性を検証する予定である。

る。また，電気化学計測法を応用した呼吸測定技
術は非侵襲的であることから，医療分野における応用も期待できる。すでに我々は，SECMを用いたヒト余剰胚の呼吸測定に成功し，初期胚や凍結保存胚の品質評価に対する有用性を報告している７，８）。今後は，牛や豚など家畜全体に応用範囲を広げ，家畜受精卵移植分野での実用化を目指す
とともに，現在有効な品質評価法が開発されていない卵母細胞の品質評価や培養幹細胞の機能診断などへの応用を試みる。
４．要

約

本研究では，電気化学計測技術を応用した「受精卵呼吸測定システム」とミトコンドリア呼吸機能を指標とする牛胚品質評価法の有効性を検証した。牛胚の呼吸測定に特化した高精度の受精卵呼吸測定システムを用いて単一牛胚の酸素消費量を測定した結果，牛胚は桑実胚から胚盤胞にかけて文
献１） Abe, H., Yamashita, S., Satoh, T., Hoshi, H. :Molecular Reproduction and Development , 61, 57～
66, 2002.
２） Abe, H., Matsuzaki, S., Hoshi, H. : Theriogenology,
57, 1273～1283, 2002.
３） Shiku, H., Shiraishi, T., Ohya, H., Matsue, T., Abe,
H., Hoshi, H., Kobayashi, M. : Analytical Chemistry,73, 3751～3758, 2001.
４） Shiku, H., Shiraishi, T., Aoyagi, S., Utsumi, Y.,
Matsudaira, M., Abe, H., Hoshi, H., Kasai, S., Ohya, H.,
Matsue, T. : Analytica Chimica Acta, 522, 51～58, 2004.
５） Shiku, H., Torisawa, Y., Takagi, A., Aoyagi, S.,
Abe, H., Hoshi, H., Matsue, T. : Sensors and Actuators
B, 108, 597～602, 2005.
６） Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E.,
Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh, K.,
Nakashima, R., Yaono, R., Yoshikawa, S. : Science,
272, 1136～1144, 1996.
７） Goto, K., Koike, M., Kumasako, Y., Utsunomiya, T.,
Araki, Y., Abe, H. : Journal of Fertilization and
Implatation, 27, 53～58, 2010.
８） Yamanaka, M., Hashimoto, S., Amo, A., Ito-Sasaki,T., Abe, H., Morimoto, Y. : Human Reproduction, 26,
3366～3371, 2011.

呼吸量が増加し，ミトコンドリアの膜電位活性と© The Ito Foundation

186

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の同定と検証
Identification of endometrium cell-derived factors involved in the early
development of bovine embryo

細

江

実

佐・古

澤

軌

（農業・食品産業技術総合研究機構生物機能利用研究部門）

Misa Hosoe and Tadashi Furusawa（Institute of Agrobiological Sciences, NARO）

To establish the embryo culture system for generating transplantable elongated bovine
embryos in vitro, we screened the endometrium cell-derived factors that expression levels
were upregulated in the presence of embryos. Total RNAs were purified from endometrium
cells that cultured with hatched blastocysts and subjected to RNA-seq analysis. We identified
237 genes as being upregulated with a more than 2-fold difference or only detectable incocultured endometrium cells. Among these genes, we selected the genes that expected to beconcerned with the maternal-embryo communications, and focused on two secretory factors,
PDCD1LG2 and BTC. The supernatants of Cos7 cells that transfected expression vectors of
two genes were added to the embryo culture medium from day 3 to day 10 after IVF.
Although there were no significant differences, the hatched rate of blastocysts and expression
levels of ICM marker genes, NANOG, tended to be improved in BTC group. Conversely, theexpression levels of POU5F1 and NANOG were slightly decreased in PDCD1LG2 group.

１．目

る系が開発されていないために，伸長胚を得るに的は体外受精胚をいったん受胚牛に移植し，再び回牛や豚などの家畜の胚は，受精後およそ３週収する必要がある。我々は伸長胚の発育に関わる

間，着床することなく子宮内を浮遊しながら伸長

子宮内膜細胞由来の因子を同定するため，伸長胚する，独特の発生形態をとる。最近，受精後14日と子宮内膜細胞の共培養系とRNA-seqを利用し目前後の伸長胚を子宮から回収してその一部を切たスクリーニングを行った（平成27年度当財団研り取り（伸長胚バイオプシー），遺伝子診断を究助成）。胚と共培養した子宮内膜細胞の遺伝子行ったのちに再び子宮に戻して産子を得る技術が発現を非共培養細胞と比較した結果，非共培養区

開発された 。伸長胚バイオプシーは多くの診断よりも２倍以上発現が高かった遺伝子を140個，用細胞を提供できるため，近年発展が目覚ましい

また，共培養区のみで発現が確認された遺伝子をゲノム育種等の遺伝子診断に有効な方法である。

97個同定した。本年度はこれらの遺伝子について

しかしいまだに移植可能な伸長胚を体外で作成す機能や発現様式を詳細に解析し，伸長胚の生育へ

１）© The Ito Foundation

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の同定と検証

187の関与が期待される液性因子や，細胞表面分子やい て RNA を 採 取 し た（PicoPure RNA Isolation

細胞外マトリクスなど母体－胚間のコミュニケー

Kit, Thermo）。前述の方法に従いcDNAを合成し，ションに関わる分子を選別した。さらに選別した

ICMおよびTEで発現するマーカー遺伝子につい遺伝子の発現ベクターを構築して培養上清を調製て 定 量 的 PCR を 行 っ た 。各 遺 伝 子 発 現 量 はし，伸長胚培養系への効果を調べた。

GAPDH発現量を内部標準として，相対値で示し

２．方
2.1

た。

法

発現ベクターの構築と培養上清の調製

３．結果と考察

胚と共培養した子宮内膜細胞よりRNAを抽出

はじめに前年度に行った胚－子宮内膜細胞共培

し （RNeasy Micro Kit, QIAGEN）， cDNA を 合養 系 の RNA-seq の 結 果 に つ い て 詳 細 な 解 析 を成た （PrimeScriptTM II 1st strand cDNA行った。共培養開始後24時間と48時間目においSynthesis Kit, TaKaRa）。BTCおよびPDCD1LG2て，非共培養区よりも２倍以上発現が高いと判定について，全長を増幅するPCRプライマー用いてされた遺伝子は140個であり，うち胚が産生する

cDNAを増幅し，pBlueScriptKS＋ベクターにサ

サイトカインであるインターフェロンタウ

ブクローニングした。シークエンスを確認した（IFNtau）でも誘導される遺伝子は85個であっ後，pCDNA3.1プラスミドベクターにcDNAを組た。また共培養区のみで発現が検出された遺伝子

み込み発現ベクターを構築した。対照区には同発は97個であり，うちIFNtauでも誘導される遺伝現ベクターにlacZの遺伝子を挿入したものを用い

子は20個であった。それぞれの上位20の遺伝子にた。エレクトロポレーション法によりCos７細胞

ついて，機能と局在部位を調べたリストをChartに プ ラ ス ミ ド を 導 入 し（1.0μg/100μl OPTI-

１に示した。このリストにおいて，共培養区で２MEM, NEPA21，ネッパジーン），10％FCS添加

倍以上発現が高いと判定された遺伝子のうち，細DMEM培地で培養した。２日後に培養上清を回胞外あるいは細胞膜表面に局在すると思われる分

収し，0.22μＭのフィルターを通したものを添加

子はそれぞれ12個および７個であった。また共培

試料とした。

養区のみで発現が認められた遺伝子のうち，細胞し

2.2外あるいは細胞膜表面に局在すると思われる分子培養上清の胚への影響

常法により牛体外受精胚を作成し ，媒精後７はそれぞれ９個および10個であった。これらの分

日まで５％FCS添加SOFaa培地，７‒10日目まで

子のうち，すでに妊娠牛の子宮内膜細胞で発現がは10％FCS, 20ng/ml LIF, 0.5mM MTG，非必須

上昇することが報告されているものを除外し，アミノ酸添加KnockOut-DMEM培地で，38.5℃，

RT-PCRによる検証を行った。発現の上昇が確認

５％CO2 ，5％O2 ，90％N2 の条件下で培養した。

された分子のうち，PDCD1LG2（NM_001292036）

媒精後３日目に培地の半量をCos7細胞の培養上と BTC （NM_173896） は 24 時 間 目 に お い て清に置換し，以降毎日半量を培地交換した。媒精IFNtau添加区よりも共培養区での発現誘導が顕後７日目に胚盤胞への発生率，10日目に胚盤胞の著であった（Fig.１）。PDCD1LG2はPD-1のリガ

孵 化 率 を 調 べ る と と も に ，各 胚 の 内 部 細 胞 塊

ンドであり，Ｔ細胞の増殖等に関わることが報告（inner cell mass, ICM） と 栄 養 膜 細 胞されている３）。またBTCはEGFファミリーに属す（trophectoderm, TE）を分離し，それぞれにつる分子で，EGFレセプター等を介して細胞増殖

２）© The Ito Foundation

188

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Chart 1 T
 op 20 differentially expressed genes in bovine endometrium cells cultured with hatched blastocysts.

制御に関与することが報告されている４）。これら

たものの，BTC添加区において脱出胚盤胞の割

２つの因子の発現ベクターをCos7細胞に導入し，合がやや高かった（Table１）。ICMの指標である

培養上清を体外受精胚の培養系に添加して，発生

POU5F1, NANOGおよびCDH1の発現をRT-PCR

率と分化マーカー遺伝子の発現を調べた。その結で調べたところ，BTC添加区においてNANOGは果，胚盤胞の発生率に有意な差は認められなかっ

やや高い値を示し，逆にPDCD1LG2添加区では© The Ito Foundation

189

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の同定と検証

Fig. 1 Expression analysis of PDCD1LG2 and BTC genes in endometrium cells. Values were showed as relative valuesof GAPDH.

Table 1 Effect of endometrial cell‒derived factors on early development of bovine embryos
expressing genein Cos7 cells

No. of cultured
embryos（8 cells）

No. of blastocysts
at Day7（％）

No. of hatched blastocysts
at Day10（％）

lacZ

57

29（50.9）17（29.8）

PDCD1LG2

57

30（52.6）

21（36.8）BTC

57

26（45.6）24（42.1）

Fig. 2 Expression of ICM and TE marker genes in Day 10 embryos cultured with Cos7 cell-supernatant containing

PDCD1LG2 and BTC. Values were showed as relative values of GAPDH. Asterisk represents significant difference（P＜0.05）.

© The Ito Foundation

190

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

低い傾向を示した（Fig.２）。CDX2については３胞に導入した。導入２日目に培養上清を回収し，区間で顕著な差は認められなかった（Fig.２）。

体外受精胚の培養系に添加して，発生率と分化

今回胚の発育への影響を調べた２つの因子でマーカー遺伝子の発現を調べた。その結果，胚盤は，BTCでやや胚の発育が改善される傾向が認

胞の発生率に有意な差は認められなかったもの

められたものの，体内発生胚と比較し，POU5F1の，BTC添加区において脱出胚盤胞の割合がや

やNANOGなどICMの指標となるマーカー遺伝子や 増 加 し た 。 ICM の 指 標 で あ る POU5F1 ，の発現は有意に低かった（Fig.２）。PDCD1LG2

NANOG お よ び CDH1 の 発 現 を 調 べ た と こ ろ ，においてはICMの発育が悪くなる傾向が認められ

BTC添加区においてNANOGはやや高い値を示たことから，アンタゴニストや阻害剤が効果的でし，逆にPDCD1LG2添加区では低い傾向を示しある可能性がある。今後，RNA-seqで抽出したた。CDX2については３区間で顕著な差は認めら

他の因子や，複数の因子による相乗効果についてれなかった。

検討を行う予定である。
４．要

約

胚の存在下で発現が増加することが確認された
子宮内膜細胞由来因子，PDCD1LG2とBTCについて胚の発生への影響を調べた。RT-PCRにより得た全長cDNAを発現ベクターに挿入し，Cos7細文
献１） Kimura, K., Matsuyama, S. : J Reprod Dev, 60, 210～215, 2014.
２） Hosoe, M., Shioya, Y. : Zygote, 5, 71～376, 1997．
３） Greenwald, R. J., Freeman, G. J., Sharpe, A. H. :Annu. Rev. Immuno, 23, 515～548, 2005.
４） Shing, Y., Christofori, G., Hanahan, D., Ono, Y.,
Sasada, R., Igarashi, K., Folkman, J. : Science, 12, 259（5101）,1604～1607, 1993.

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191

アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響
Effects of adipokine and insulin resistance on the bovine fertility

小

林

仁

（宮城大学食産業学部）

Jin Kobayashi（School of Food, Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

The aim of the present study was to investigate nutritional and metabolic parameters
during the pasture mating of low fertility cows. Blood samples from 8 infertile cattle werecollected at start of pasture and the day after the mating day. Six cows（75％）became
pregnant during the pasture mating. Cattle were keeping with pasture mating, but the deficient
feed was supplemented with rice straw, which is a low protein feed. BCS, BUN and T-cho
decreased significantly after grazing（p＜0.05）, whereas no difference was found in otherparameters. In the steroid hormones, no difference was found in A4 between the start ofpasture and after mating, whereas in E 2 it was recognized to increase significantly aftergrazing（p＜0.05）.There was no significant difference in adiponecin and TNF-α．
In conclusion, it is suggested that feed management with low nutrition（low protein）may
be conducted improving fertility.

１．目

MPTは，牛群から一部の個体を抽出して多項目的の 血 液 生 化 学 検 査 値（BC 値）や ボ デ ィ・コ ン

近年，牛の受胎率低下が続いており，その原因

ディション・スコア（BCS）を調べ，良好な生産の解明が急務となっている。このため，生産現場性が期待できる繁殖ステージごとのBC値の範囲

ではその対策として，不受胎牛を妊娠させる不妊（適正範囲）と比較することで調査牛の栄養状態

牛専門の牧場開設の動きがある。不妊牛専門の牧や繁殖性を推定することができる。最近，良好な場の一つである宮城県のＨ牧場では，受託した不牛群を基にした黒毛和種における繁殖ステージご

妊牛を放牧牧牛繁殖で一定期間繋養することで約とのBC値やBCSの適正範囲が報告され２），黒毛80％が妊娠するとしており，注目を集めている。

和種でもMPTが利用できる状況になった。このもし，不妊牛が入牧して受胎するまでの体調の変ためＨ牧場が受託した不妊牛についてもMPTを化を捉えることができれば，不妊の原因の解明や実施することで，栄養状態や健康状態の推定が可

受胎率改善に役立つ可能性がある。

能である。また，BCSが示す肥満の程度が母体の牛群の栄養状態や健康状態の推定に代謝プロ

繁殖性に関係していることは，経験的に知られてフ ァ イ ル テ ス ト（MPT）が 行 わ れ て い る 。

いる。Ｈ牧場で受託する不妊牛に過肥と判断され

１）© The Ito Foundation

192

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）る牛が多いことから，脂肪細胞が産生するアディスフェラーゼ（AST），アラニンアミノトランス

ポネクチン（Adn），レジスチンおよび腫瘍壊死

フェラーゼ（GPT）とした。血中ステロイドホ

因子α（TNF-α）などのアディポカインと血中

ルモンについてはアンドロステンジオン（Ａ 4）ステロイドホルモンを調べることで脂肪代謝と繁とエストラジオール17β（Ｅ2）について検討し，殖性の関係を明らかにできないかと考えた。

実際の測定は清水 隆博士の好意により帯広畜産

以上のことから，本研究では，Ｈ牧場が受託し大学にて行った。また，アディボカインとしてAdn，た不妊牛が入牧して受胎するまでの体調の変化を

レジスチン，TNF-αは，Adiponectin ELISA Kit，

MPTの血液検査に加え，アディポカインおよび

Bovine（Cloud-clone Corp），Resistin ELISA Kit,

性ホルモンを調べることで，不妊や受胎率改善にBovine（Cloud-clone Corp）， TNFα VetSetTM

関係する要因の検討を行った。

ELISA Development Kit（Kingfisher Biotech）を

２．方用い，マイクロプレートリーダー（SpectraMAX

法

250：Molecular Devices）にて測定した。

宮城県登米市南方町のＨ牧場で不妊牛として預本試験の調査期間は，平成28年10月～平成29年

託された黒毛和種の中から，ボディ・コンディ

２月とし，調査牛の年齢，産次数，空胎日数はション・スコア（BCS：るい痩１～10肥満）が７Table１に示したとおりである。

以上の牛８頭を供試した。供試牛への餌の給与
は，放牧による自由採食と，朝・夕２回の稲わら

３．結果と考察の給与（約５kg／頭）の粗飼料のみとした。調預託された牛の中で，BCSが７以上の牛８頭

査項目は，目視によるBCSの測定と血液生化学検（未経産牛５頭，経産牛３頭）を調査した。調査

査値（BC値），ステロイドホルモン，アディポカ

牛の平均の空胎期間は8.0カ月（3.0カ月～12.2カ

インとした。採血は入牧時と入牧後の発情発見時月）で，入牧前の人工授精回数は4.4回（２回～の夕方，飼料摂取に集まったところを保定して頸７回），入牧後27.2日で発情を示した。このうち静脈から真空採血管を用いて行った。採血管は血妊娠したのは６頭（75％）で，未経産牛が３頭

液分離剤および凝固促進用シリカ微粒子添加（60％），経産牛では３頭すべてが妊娠し，未経産（SST）管およびフッ化名ナトリウム添加（NaF）

牛に比べ経産牛が受胎に至る確率が高かった。ま管の２種類を用いた。採血後は－20℃に冷却した

た，妊娠した牛の半数が入牧後初回の発情で妊娠

保冷剤入りの保冷バッグに入れ，宅配便で冷蔵のしており，放牧牧牛繁殖が不妊牛の妊孕性向上にまま宮城大学に送付した。採血の翌日，研究室に有効であることが示された（Table２）。

搬入された採血管を20分間冷却遠心して血漿の分調査牛の入牧時および入牧後最終発情時（以離を行い，直ちに測定するか，いったん‒30℃で後，入牧後とする）のBCS，血液生化学検査値，

凍結保存した後３日以内に測定を行った。

ステロイドホルモンおよびアディポカインについBC値の測定は，臨床化学分析装置（ドライケてTable３に示した。調査牛の入牧時と入牧後のムNX500：富士フイルム）により行った。測定項

BCSを比較すると，8.0から6.9に有意に減少した

目は，ブドウ糖（Glu），尿素窒素（BUN），総コ（ｐ＜0.01）。また，BUNは10.0 mg/dlから3.4 mg/

レステロール（T-cho），アルブミン（Alb），総

dlに，T-choは153.5 mg/dlから104.3 mg/dlにそタンパク質（TP），アスパラギン酸アミノトラン

れぞれ減少し，有意差が認められた（BUN p＜© The Ito Foundation

アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響

193

Table 1 Various traits of low fertility cows before pasture.
TraitsMean

Number of cows for analysis

Range

8

Age（yr.）4.1

2.4-8.1

Months open#

8.0

3.0-12

Number of AI

4.4

2-7

5
6.8m

3.0-104.3

2-7

Number of first-calf heifers
Months open#
Number of AI
Number of mature cows

3

Number of calving
Months open

2.7
9.9

1-4
7.2-12.2

Number of AI

4.4

2-7

#：In the case of heifer, the age minus 15.

Table 2 Reproductive status of low fertility cows during pasture mating.
Traits

Mean

Range

Number of cattle whose estrus cycle returnedDays to first mating（range）
Number of pregnant cattle（％）
First-calf heifers（％）
Mature cows（％）
Pregnant at first estrus（％）
Pregnant at estrus after second time（％）

8
27.2d
6
3
3
3
3

（11-46）（75.0）（60.0）（100.0）（25）（50）

0.01, T-cho p＜0.05）。一方，Glu, TGおよびTPに時に比べ入牧後の血中濃度が有意に高くなったは入牧時と入牧後の値に差は認められなかった。

（ｐ＜0.05）。受胎牛と非受胎牛に分けると，有意入牧後にBCS，BUNおよびT-choが減少する傾向

ではないものの入牧時よりも入牧後にＥ 2 濃度がは，受胎牛および非受胎牛において共通して認め高くなる傾向を示した。TNF-αは，入牧時と入られた。T-choとBUNは，乾物摂取量と正の相関

牧後に有意な差は認められなかったものの，受胎があるとされ，入牧後の飼料摂取量の減少が血液牛に比べ非受胎牛で高くなる傾向を示した。ま

生化学検査値に反映されたと推察された。肝臓機

た，アディポネクチンでは入牧時と入牧後および能を示すGOT，GPTでは，入牧時の値が受胎牛

受胎牛および非受胎牛で差は認められなかったに比べ非受胎牛において高い傾向を示した（受胎（Table３）。

牛GOT 71.5 IU/l，GPT 29.0 IU/l，非受胎牛

不妊牛として預託された牛の75％が妊娠していGOT 83.5 IU/l ，GPT 36.5 IU/l）。ま た ，受 胎 牛ることから，Ｈ牧場の飼養管理が繁殖牛の妊孕性および非受胎牛ともに入牧時が入牧後よりもの向上に有効であることが明らかになった。

GPTが高い傾向を示し，入牧時に肝機能が低下

BUNおよびT-choについて，渡邉ら（2016）が報していた可能性が示唆された。

告 し た 適 正 範 囲（黒 毛 和 種 BUN ９～13 mg/dl,

入牧時および入牧後の血中Ａ 4 濃度に有意な差

T-cho 71～107 mg/dl）と比較すると，T-choでは認められなかったものの，受胎牛に比べ非受胎は適正範囲よりも過剰であった値が入牧後は適正

牛ではＡ4が低い傾向を示した。Ｅ2濃度では入牧範囲内に減少し，BUNでは適性範囲内または適© The Ito Foundation

194

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 3 BCS, blood biochemical values, steroid hormone and adipokine in low fertility cows during pasture mating

condition.
Blood
sampling#

BCS

Glu（mg/dl）

BUN（mg/dl）

T-cho（mg/dl）

TG（mg/dl）

TP（mg/dl）

Start ofpasture

8.0＊＊

75.4

10.0＊＊

153.5＊

8.3

7.1

After
mating

6.9＊＊

74.0

3.4＊＊

104.3＊

8.5

6.9

Start ofpasture

8.2＊＊

77.8

8.6＊

151.8＊

9.3

7.2

After
mating

7.0＊＊

73.0

3.6＊

102.5＊

8.8

7.0

Start ofpasture

7.5

68.0

13.9

158.5

5.0

6.8

After
mating

6.5

76.5

2.9

109.5

7.5

6.5

Blood
sampling#

Alb（mg/dl）

GOT（IU/l）GPT（IU/l）

Ａ4（pg/ml）

Ｅ2（pg/ml）

TNF-α（ng/ml）

Adn（ng/ml）

Start ofpasture

3.8

74.5

30.9

897.5

32.1＊

1.41

2921.7

After
mating

3.4

74.3

22.3

947.7

41.8＊

3.23

2234.5

Start ofpasture

3.8

71.5

29.0

1079.733.8

1.13

2755.2Aftermating

3.3

75.8

22.8

1023.638.7

1.53

2300.9Start ofpasture

3.7

83.5

36.5

350.8

26.7

2.25

3421.1Aftermating

3.7

69.5

21.0

492.5

49.6

7.48

2068.7ｎTotal

Concived

Nonconceived

Total

Concived

Nonconceived

8

6

2

#：
start of pasture 0-6 days, after mating the day after the last mating, BCS：body condition score, Glu：glucose, BUN：blood urea

nitrogen, T-Cho：blood urea nitrogen, TG：triglyceride, TP：total protein, Alb: albumin, GOT: aspartate aminotransferase, GPT：
alanine aminotransferase, A4：androstenedione, E2：estradiol-17β，TNF-α：Tumor Necrosis Factor-α，And：adiponectin, statisticalsignificance is indicated by an asterisk（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

正範囲よりも高い個体が入牧後は適正範囲以下に示唆された。

減少を示した。BUNは過剰でも不足でも繁殖性

性ステロイドホルモンでは，前駆体であるＡ 4を低下させることが知られており，乾物摂取量の濃度に差が認められないものの，Ｅ 2 濃度は入牧減少によってBUNが適正範囲を下回る場合，エ後に上昇が認められた。Ｅ 2 は発情周期に関与しネルギー不足による受胎率の低下や流産率の上昇ており，分泌量の増加が受胎率向上に働いた可能が指摘されている３）。入牧後のGluが比較的高め性が考えられた。一方，Adnは入牧時に比べ入牧に推移しているのに対しBUNは適正範囲以下に後に減少する傾向が見られた。Adnはインシュリ

減少しており，この状態で妊娠している。このたン感受性を高め，インシュリン非依存性の細胞内め可消化粗タンパク質（DCP）の少ない低タン

へのグルコースの取り込みを促進させることが知

パク粗飼料である稲わらを中心とした飼養管理にられている４）。TNF-αは，入牧後に上昇する傾切り替えたことが受胎率向上に作用した可能性が向が見られ，特に非受胎牛で顕著でTNF-αが増© The Ito Foundation

アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響195加していた。入牧後は全頭でBCSが減少しており繁殖方式により，６頭（75％）が妊娠した。入牧

体脂肪も減少していると考えると，脂肪細胞以外

後はBCS，BUNおよびT-choが有意に減少したのの細胞がTNF-αの産生に関与していると推察さに対し，その他の項目では差は認められなかっれた。TNF-αは，炎症性サイトカインともいわた。ステロイドホルモンでは，Ａ 4 では入牧時とれ脂肪細胞以外からも産生され，アポトーシスの入牧後に差は認められなかったのに対し，Ｅ 2 で誘導やIL-1，IL-6の他の炎症性サイトカインの産は入牧後に有意に上昇することが認められた。入生を促進させる。今回の結果からは，アディポカ

牧時および乳牧後のAdnおよびTNF-αに有意なインが牛の妊孕性に直接関与している結果は得ら

差は認められなかった。

れなかった。しかし，ヒトではアディポカインが以上のことから，不妊牛としてＨ牧場に預託さ母体代謝および妊娠性インシュリン抵抗性を支配れた牛が受胎した要因として，入牧前の高栄養のしていることが報告されており ５），今回測定を飼養管理から入牧後の低タンパク粗飼料の飼養管行っていないアディポカインについても調べる必理に移行させたことが関係し，性ステロイドホル要があると考えられる。

モン産生が亢進することで妊孕性の向上が図られ以上のことから，不妊牛としてＨ牧場に預託さたと推測された。

れた牛が受胎した要因として，入牧前の高栄養の飼養管理から入牧後の低タンパク粗飼料のみの飼養管理に移行させたことが関係している可能性があり，性ステロイドホルモン産生が亢進することで妊孕性の向上が図られたと推測された。
４．要約

不妊牛を専門の牧場で受託した牛８頭の入牧時と 入 牧 後 の 牛 の BCS ，血 液 生 化 学 検 査（Glu ，
BUN, T-cho, Alb, TP, ASTおよびGPT），ステロ
イドホルモン（Ａ4，Ｅ2），アディポカイン（Adn,
TNF-α）を調べた。受託した牛は，低タンパク文献１） 岡田啓司：全国家畜畜産物衛生指導協会，生産獣医療システム乳牛編３，第１部代謝プロファイルテ
ストを基本とした栄養管理 第１章～第Ⅴ章，第Ⅷ章，７～45，（株）農山漁村文化協会，東京．
２） 渡邉貴之，小西一之，熊谷秀一郎，野口浩正，武井直樹：日本畜産学会報，85（3），295～300，2014．
３） 渡邉貴之，小西一之：多頭飼養における黒毛和種
繁殖雌牛生産性向上のための代謝プロファイルテス
トを用いた飼養管理マニュアル，平成28年度版，１～159，独立行政法人家畜改良センター鳥取牧場，鳥取，2016．
４） Kadowaki, T., Yamauch, T. : Endocrine reviews，
26（3）,439～451, 2005.
５） Briana, D. D., Malamitsi-Puchner, A. : Reprod Sci.
16（10）,921～937, 2009.

飼料である稲わらを中心とした粗飼料給与と牧牛© The Ito Foundation

196

雄牛の新たな繁殖機能評価法の開発
Research on novel evaluation of reproductive function in bull

北

原

豪

（宮崎大学農学部獣医学科）

Go Kitahara（Development of Veterinary Science, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Selection of sire takes more than five years, and also requires much labor and cost. Oncesire or bull gets disorder in reproductive function, the livestock industry receives large
influence. Therefore, it is better to provide an evaluation capable of finding abnormality earlier.
For a test for abnormality of testis, there are semen and histological examinations. However,the safety and the suitable marker in histological examination are unknown yet. In the present
study, we examined the effects for testis by multiple needle biopsies and the expression ofanti-Müllerian hormone（AMH）in the collected testicular tissue. In five Japanese Black calves,
the right testis was repeatedly received by needle biopsies on four weeks interval during 4 to
24 weeks of age（total six times）. At the same time, the treated testis was examined bythermographic and ultrasound examination, and also the scrotal circumference was measured.
At 28 weeks of age, both right and left testes were castrated, and compared for the volume ofthe each testis and the diameter of the seminiferous tubule. The collected testicular tissue was
examined by AMH immunohistochemistry. There were not the abnormal observations on thetreated testis in every time. The volume of the each testis and the diameter of the seminiferous
tubule in the treated testis（right testis）did not differ from in the contrast testis（left testis）.
The staining intensity of AMH on 8 to 16 weeks of age was showed stronger than on the otherweeks of age. In conclusion, the multiple needle biopsies in four weeks interval did not affectthe testicular growth during the pre-puberty period. The collected testicular tissue was able tobe stained by AMH immunohistochemistry. Therefore multiple needle biopsies with antiMüllerian hormone immunohistochemistry might be useful to evaluate function of testis
objectively, especially function of Sertoli cells.

１．目

ン種が385頭，肉用種が1,534頭である。種雄牛の的供用開始には５年以上を要し，その選抜および育我が国における最近の牛の飼育頭数は，乳用牛成には多くの労力と経費がかかる。また，種雄牛が137万1,000頭，肉用牛が248万9,000頭で，その１頭から１年間に生産される凍結精液ストローは

うち供用されている種雄牛の頭数は，ホルスタイ

３万本以上となるため，種雄牛に繁殖障害が生じ© The Ito Foundation

197

雄牛の新たな繁殖機能評価法の開発

れば，遺伝資源的観点からだけではなく，経済的

ニードルバイオプシーで採取した精巣組織ににも損失が大きい。よって，種雄牛や種雄牛候補

AMHの免疫組織学的染色（AMH-IHC）を行い，牛の精巣における将来の不可逆的異常が早期に予生後からの精巣におけるAMHの発現の経時的変測できれば，経費軽減が可能となる。

化を明らかにする。

精巣の異常を調べる検査として，精液検査と組織検査がある。しかし，牛では生後40週で初めて

２．方法

成熟した精子が精巣内で認められ，生後８～10カ2.1

月で精細管内に遊離精子が認められるが，精液

宮崎大学農学部附属フィールド科学教育セン

採取が困難な性成熟前では精液検査を行うことはター住吉フィールドで飼養され，ニードルバイオ

できない。組織検査は精巣組織および精子を検査

プシーを行う５頭（処置群）と無処置の12頭（対することが可能なため有用な検査法であるが，牛照群）の計17頭の黒毛和種雄子牛を供した。

１）

供試動物

では血腫や壊死を引き起こすことが報告されてい2.2

る。近年，単回によるバイオプシーニードル

処置群（ｎ＝５）は，生後６日以内を０週齢とによる組織検査（ニードルバイオプシー）は牛精

し，４週齢から28週齢で去勢するまでの４週間隔

巣に対し影響が少なく，繁殖能力の検査に有用で（４，８，12，16，20，24週齢）で，右側精巣に対あったと報告された。しかし，異常状態からしニードルバイオプシーを実施し，精巣組織を採の回復や予後を診断するには，複数回のバイオプ取した。キシラジン0.04ｇ/100㎏（セラクター

シーが必要となるが，その影響に関する報告はほルⓇ，バイエル薬品株式会社）を静脈内注射にて

とんどない。

鎮 痛 お よ び 鎮 静 後 ，サ ー モ グ ラ フ ィ 検 査

２，
３）

４，５）

精巣の計測および組織の採取

抗ミューラー管ホルモン（AMH）は，組織の（testo875-1i型赤外線サーモグラフィ，testo），

成長や分化にかかわるTGF-βスーパーファミ

超音波検査（iMAGO，ECM），陰嚢周囲長の測リーに属する140kDaのホモダイマー糖タンパク定を行った。なお，陰嚢周囲長の対照群として，

で，セルトリ細胞から特異的に合成，分泌される

無処置の黒毛和種雄子牛12頭を供した。検査後，ホルモンである。胎子期では性分化における雄性

陰嚢を剃毛および消毒した後，右側精巣の外側中化に欠かせないホルモンであり ，生後はライ心の部位で14Ｇバイオプシーニードル（自動生検

デッヒ細胞におけるテストステロン合成を抑制す

針エースカット，タスク株式会社）で組織を採取ることなどが分かっているが，いまだはっきりしした。組織採取後，頚部筋肉内にペニシリンプロない。ヒトでは，AMHは，間性，潜在精巣およカイン300万単位（懸濁水性プロカインペニシリ

び無精巣症の診断の一助として有効であることがンＧ明治，明治製菓株式会社）を投与した。

６）

報告されている 。しかし，雄牛で，精巣におけ

2.3

るAMHの発現を調べた報告は少なく，また経時

ニードルバイオプシーにて採取した精巣組織

７）

精巣組織の組織検査

は，10％リン酸緩衝ホルマリン溶液で３日間以上的な変化を明らかにした報告はない。
本研究では，雄牛の新たな繁殖機能評価法の開固定し，パラフィン包埋，４μｍで薄切し，ヘマ発のため，黒毛和種雄子牛の精巣に対し４週間隔

トキシリン・エオジン染色を行い，光学顕微鏡でで複数回のニードルバイオプシーを行い，その後観察した。また，28週齢で去勢した左右精巣は，の精巣の発育に及ぼす影響を調べるとともに，生理食塩水中に水浸させ，その前後の変化量を精© The Ito Foundation

198

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

巣容積とした。その後，10％リン酸緩衝ホルマリ

所見はみられず，精巣容積および精細管直径につン溶液で７日間以上固定後，上述と同様に組織標

いても左右精巣間で有意な差はみられなかった本を作製した。過去の報告８）に従い，400倍視野（Fig.３）。処置群のすべての週齢で陰嚢表面温度で精細管直径を15か所計測し，その平均を精細管に左右非対称性がみられなかったことは，馬にお直径とした。精巣容積および精細管直径は，ニーける報告と同様であった11）。牛精巣におけるバイ

ドルバイオプシーを行った右精巣に対し，行わな

オプシーで陰嚢表面温度の左右非対称性がみられかった左精巣を対照として比較した。ニードルバ

た報告がある５）が，これは精巣上体に傷害を与え

イオプシーで採取した精巣組織はAMH-IHCを行たことによると考えられている。したがって，精い ，同一観測者により各週齢の染色強度の評価

巣上体を避けてニードルバイオプシーを行えば，を行った。染色強度は，既報を参考に ，２視野

陰嚢表面温度の左右非対称性にみるような炎症を中の200個の細胞を観察し，染色強度を０；染色惹起しないと考える。生殖細胞の減少によって精されていないもの，１；弱い染色，２；中等度の細管直径が減少し，最終的には精子形成の低下が染色，３；強い染色の４段階に分類した。

起こるとされている５）。しかし今回，４週間隔で

９）

10）

2.4

統計解析

６回のニードルバイオプシーを行っても精細管直統計解析ソフト（JMPⓇ , SAS institute Japan）

径に差がみられなかったことは，その後の精子形を用いて，陰嚢周囲長の変化率（４週齢に対する成に影響がないことを示唆する。よって，春機発水準）は週齢ごとに処置群と対照群の間で，精巣動前の黒毛和種雄牛において，精巣へのニードル

容積および精細管直径は左右精巣間で，それぞれバイオプシーは，精巣上体を避けて４週間隔で行

Wilcoxon testにより解析した。また，精巣組織

えば，精巣実質に不可逆的な障害を与えず，組織に お け る AMH 染 色 強 度 は ，一 元 配 置 散 分 析（Post hoc testとしてTukey-KramerのHSD検定）
により解析した。なお，有意水準は，Ｐ＜0.05と

4

8

12

16

20

24

した。
３．結果と考察3 . 1 ニードルバイオプシーによる精巣発育への影響
処置群の８，12，16，20，24，28週齢において，
サーモグラフィ検査による陰嚢表面温度の左右非対称性，超音波検査による精巣実質のエコー輝度の変化はみられなかった（Fig.１）。処置群および対照群ともに陰嚢周囲長は週を追うごとに増加

28

し，いずれの週齢においても両群間に有意な差はみられなかった（Fig.２，P＝0.36～0.78）。摘出した右精巣において，処置群すべてで刺入部位の白膜に水腫様の痕跡を認めたが，組織学的な異常Fig. 1 Change of ultrasound image in the treated testis.
These images are from #2816 at 4, 8, 12, 16, 20, 24,

and 28 weeks of age. The white bar shows 10 mm.

© The Ito Foundation

199

雄牛の新たな繁殖機能評価法の開発
（%）
250

200

150

100

50

4

8

12
16
Weeks of age

20

24

Fig. 2 Growth rate of the scrotal circumference.
The solid bars were showed in the treated group, the others（hatched）in the control group.

The data at four weeks of age was defined for 100％. Data represent mean±SD.

を採取できることが分かった。

Volume of testis

（mL）
60

3 . 2 AMH-IHCによるセルトリ細胞の染色性

50

変化

40
30

AMH-IHCによるセルトリ細胞の染色強度は，

2024～28週齢よりも８～16週齢が有意に高かった

10（Ｐ＜0.05，Fig.４）。黒毛和種雄子牛の血中AMH

0Control（L）濃度12）は，出生後から２カ月齢まで有意に上昇しTreated（R）（Ｐ＜0.01），その後５カ月齢にかけて有意に（ＰDiameter of seminiferous tubule

（μm）
150

＜0.01）減少していたことから，本試験で染色強度が高かった８～12週齢時には，正常に陰嚢内に140下降した精巣ではAMHがセルトリ細胞で盛んに130

合成，分泌されていたことが組織学的にも明らか120となった。このことは，馬の正常に陰嚢内に下降

110した精巣におけるAMH-IHCの結果９）とも一致し

100

Control（L）ており，正常に陰嚢内に下降した牛精巣のニード

Treated（R）

ルバイオプシーで採取した組織を用いAMHの染Fig. 3 Differences in the volume of testis and the diameterof seminiferous tubule at 28 weeks of age with orwithout six needle biopsies.
The solid bars were showed in the treated group,
the others（hatched）in the control group. There
were not significance between the groups（P ＝ 0.94
and 0.78, respectively）.Data represent mean±SD.

色強度が評価できることが分かった。
以上より，雄牛における精巣の機能を評価する
うえで，特に性成熟前において，ニードルバイオ
プシーによる組織学的検査は有用であり，精巣上体への穿刺を避けることで，４週間隔で採取しても精巣の発育に影響がないことが分かった。ま© The Ito Foundation

200

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

P < 0.05

P < 0.01

P < 0.05 P < 0.01
3.5

P < 0.05

Scoring of staining intensity

3
2.5
2
1.5
1
0.5
0

4

8

12

16

20

24

28

Weeks of age
Fig. 4 Staining intensity of AMH in the testicle tissue collected by needle biopsies.
0：not stained, 1：weekly stained, 2：mildly stained, 3：strongly stained.
Data represent mean±SD.

た，ニードルバイオプシーで採取した組織を用織を採取する方法にニードルバイオプシーがある

い，抗ミューラー管ホルモンの免疫組織化学染色

が，複数回の実施が精巣に及ぼす影響を調べた報を行えば，精子の形成に関与するセルトリ細胞の告はほとんどない。

正常性や成熟度を評価でき，雄牛の新たな繁殖機

リ細胞のみから合成・分泌されるホルモンであ能評価法につながる可能性が示唆された。
４．要

抗ミューラー管ホルモン（AMH）は，セルト
り，その成熟度を示す。しかし，経時的に牛精巣約におけるAMHの発現を調べた報告はほとんどな

種雄牛の供用開始には５年以上を要し，その選い。

抜および育成には多くの労力と経費が掛かる。

本実験では，黒毛和種雄子牛の精巣にニードル

よって，種雄牛や種雄牛候補牛の精巣における将バイオプシーを繰り返し行い，精巣の発育に及ぼ来の不可逆的異常が早期に予測できる新たな繁殖す影響を調べ，採取した精巣組織におけるAMH

機能評価法があれば，経費軽減が可能となる。

の発現を免疫組織学的染色で調べた。生後４週か精巣の異常を調べる検査として，精液検査と組

ら24週まで４週間隔で６回，ニードルバイオプ

織検査がある。しかし，精液採取が困難な性成熟

シーを片側精巣に行い，陰嚢周囲長，精巣容積，

前では精液検査を行うことはできず，組織検査も

精細管直径を調べたが，無処置の牛あるいは対側組織を採取することによる傷害が懸念される。組の精巣と比較し，有意な差はみられなかった。ま© The Ito Foundation

雄牛の新たな繁殖機能評価法の開発

た，サーモグラフィ検査による陰嚢表面温度および超音波検査によるエコー輝度も左右精巣間で差はみられなかった。採取した精巣組織におけるAMHの発現は８週から16週齢に染色強度が有意に高くなり，その後低下した。
よって，性成熟前の雄牛における精巣の機能を評価する際に，ニードルバイオプシーは有用であり，精巣上体への穿刺を避けることで，４週間隔で採取しても精巣の発育に影響を及ぼさないことが分かった。また，採取した組織でAMHの免疫
組織化学染色を行えば，精子の形成に関与するセルトリ細胞の正常性や成熟度を評価でき，雄牛の新たな繁殖機能評価法につながる可能性が示唆された。
文
献１） 中尾敏彦，津曲茂久，片桐成二：獣医繁殖学，第４版，111～112，文永堂出版，東京，1995．
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© The Ito Foundation

202

牛の受胎性に関与する排卵後の黄体と主席卵胞の位置関係の人為的制御に関する研究
Study of artificial regulation of locational relationship between corpus luteum
and dominant follicle after ovulation which relate to fertility of dairy cattle

松

井

基

純

（帯広畜産大学畜産学部獣医学科）

Motozumi Matsui（Department of Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Previous study reported that the conception rate after AI in dairy cattle was reduced
when the first-wave dominant follicle（DF）developed in the ovary ipsilateral to the corpus
luteum（CL）. The aim of the present study is to clarify the effect of hormonal treatment for
estrus synchronization on the locational relationship between a DF and CL after ovulation. In
Experiment 1, sixty-seven lactating dairy cows were received GnRH on 7 days after
spontaneous ovulation. Prostaglandin F2α（PGF2α）were administrated on 7 days after GnRH
treatment, then, cows were randomly assigned to two groups, PG groups（n＝33）and PG＋
GnRH group（n＝34）．PG＋GnRH group were received GnRH at 48 hours after PGF2αtreatment. PG group were not received GnRH. In Experiment 2, forty-four lactating dairy cows
were received PGF2 α on mid-luteal phase. Cows were randomly assigned to two groups, PG1
group were received one injection of PGF2α（n＝22），PG2 group were received two
injections of PGF2α with 12 hours interval（n＝22）．All cows were received GnRH at 56
hours after 1st injections of PGF2α．In both experiments, the location of the first-wave DF in
the ovary was confirmed to be ipsilateral or contralateral to the CL on 7 days after ovulation.
Data from cows（n＝269）showed spontaneous estrus and ovulation was used as control group.
The ratio of the cow having the first-wave DF located contralateral to the CL tended to behigh in PG＋GnRH group（61.8％）than that in PG group（39.4％）and control（46.5％）．
There was no effect of number of PGF2α injections on the locational relationship between a
DF and CL after ovulation. At the beginning of hormonal treatment, if the preovulatory follicle
located contralateral to the CL, the ratio of the cow having the first-wave DF located ipsilateral
to the CL was higher in PG group（84.6％）than that in PG＋GnRH group（37.5％）．Hormonal
treatment to induce estrus and ovulation may be involved in the locational relationships
between the first-wave DF and CL.

１．目の発育（卵胞波）がみられ，各卵胞波では，一つ的の 卵 胞（主 席 卵 胞）が 選 抜 さ れ 大 き く 発 育 す

牛では発情周期中に卵巣内で２～３回の卵胞群る１）。発情・排卵から１週間後頃には，最初の卵© The Ito Foundation

牛の受胎性に関与する排卵後の黄体と主席卵胞の203

胞波（第１卵胞波）の主席卵胞が存在する。つま用いた。ホルモン処置時の卵胞動態をそろえるたり，すべての牛で，発情・排卵から１週間後頃にめに，すべての牛は，発情排卵後７日目に性腺刺は，必ず排卵後に形成される黄体と主席卵胞が存

激ホルモン放出ホルモン（GnRH，酢酸フルチレ

在している。主席卵胞は左右の卵巣でランダムにリン100μｇ）を投与し，新規卵胞波を誘導した。

発育するため，発情・排卵から１週間後頃の卵巣

その７日後に発情誘起のために，黄体退行を目的状態は，黄体と主席卵胞が，同じ卵巣に存在するとしたプロスタグランジンＦ２α（PGF２α，ジ場合（共存）とそれぞれが異なる卵巣に存在する

ノプロスト25㎎）を投与した。PGF２α投与後に場合（非共存）の２通りのパターンが存在する。

発情観察および排卵確認を行った試験区をPG区

これまで，受胎成立に不可欠なプロジェステロ（33頭）とした。さらに排卵誘起を目的にPGF２ンを分泌する黄体の発育やその機能と受胎性とのα投与から48時間後にGnRHを投与した試験区を関係について，多くの研究が行われてきたが，そPG＋GnRH区（34頭）とした。両試験区とも排卵の黄体と同時に発育する第１卵胞波主席卵胞が受確認から７日後に，黄体および最大卵胞（第１卵

胎性に及ぼす影響は，ほとんど調べられていな

胞波主席卵胞）の位置を調べた。黄体と最大卵胞い。近年，牛の排卵後の卵巣内での卵胞発育と受が同じ卵巣に位置する場合を共存，それぞれ異な胎性との関係について，人工授精後５日目に主席る卵巣に位置する場合を非共存とした。

卵胞が黄体と非共存であった場合は受胎率がまた，対照試験として，FSC繁殖管理データか

69.3％であるのに対し，共存では40.2％と顕著にら，2008年から2014年までのホルスタイン経産泌低かった 。このことから，人工授精後に黄体と乳牛（のべ269頭）の繁殖状況データを用いて，

主席卵胞が同一卵巣に存在する共存状態が，牛のホルモン処置を行わない場合（無処置区）の排卵受胎性を低下させることが明らかになった。

後の黄体と第１卵胞波主席卵胞との位置関係を調２）

このことは，授精後に共存状態とならない，つべた。発情観察により発情診断を行い，その後，まり，黄体と主席卵胞がそれぞれ異なる卵巣に存

直腸検査により排卵を確認した。排卵確認から７

在する非共存状態となるように卵巣状態を人為的日後に，黄体と最大卵胞の位置関係を調べ，共存に制御することで，受胎率を改善できる可能性をと非共存を判定した。

示している。

2 . 2 試験②

本研究では，人工授精後に非共存状態を誘導す

黄体退行誘起処置が排卵後の共存・非共存の発生に及ぼす影響ることのできる新しい発情誘起プログラム開発の帯広市内の酪農場において，ホルスタイン種経ための基礎的情報の収集を目的に，現在，臨床現産泌乳牛44頭を用い，発情周期の中期にPGF２α

場で用いられているホルモン処置が，排卵後の共投与による黄体退行誘起を行った。PGF２α投与

存・非共存の発生状況に及ぼす影響を調べた。

は１回（PG１回区）あるいは12時間間隔で２回

２．方（PG２回区）実施した。それぞれの群について，

法

2 . 1 試験①

１回目のPGF２α投与から56時間後にGnRHを投ホルモン処置が排卵後の共存・与して排卵誘起を行った。試験①と同様に排卵確
認から７日後に，黄体と最大卵胞の位置関係を調

非共存の発生に及ぼす影響
帯広畜産大学畜産フィールド科学センター

べ，共存と非共存を判定した。

（FSC）繋養のホルスタイン種経産泌乳牛67頭を© The Ito Foundation

204

平成28年度３．結
3.1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

加え排卵誘起処置を行ったPG＋GnRH区では，共果存は38.2％，非共存は61.8％の発生割合であった

試験①（Table１）。

ホルモン処置を行わず自然排卵した無処置区に

統計学的には，無処置区とPG区との間で，共おいて，排卵後の黄体と第１卵胞波主席卵胞との存および非共存の発生状況に差異は認められな位置関係について，共存（53.5％）および非共存かった。一方，PG＋GnRH区では，無処置区およ（46.5％）の発生状況に差異は認められず，それびPG区と比べ，非共存の発生が多い傾向がみら

ぞれ，およそ50％の確率で発生することが示されれた。

た（Table１）。

3.2

試験②

ホルモン処置による排卵後の黄体と第１卵胞波

黄体退行誘起処置の違いによる排卵後の黄体と主席卵胞との位置関係について，黄体退行誘起処

第１卵胞波主席卵胞との位置関係について，PGF

置のみ行ったPG区では，共存は60.6％，非共存は

２ α を １ 回 投 与 し た PG １ 回 区 で は ，共 存 は39.4％の発生割合であった。黄体退行誘起処置に

40.9 ％，非 共 存 は 59.1 ％ の 発 生 割 合 で あ っ た

Table 1 Effects of hormonal treatment on the locational relationship between CL

and 1st wave DF after ovulationa
Locational relationshipc（％）

TreatmentbｎIpsilateral

Contralateral

Control

269

53.5

46.5

PG

33

60.6

39.4

PG＋GnRH

34

38.2

61.8

a）CL : corpus luteum, DF : dominant follicleb）Cows were received GnRH on 7 days after spontaneous ovulation. Prostaglandin F2α（PGF2α）were administrated on 7 days after GnRH treatment, then, cows were randomly
assigned to two groups, PG groups and PG＋GnRH group. PG＋GnRH group were received
GnRH at 48 hours after PGF2α treatment. PG group were not received GnRH.
c）Ipsilateral : DF developed in the ovary ipsilateral to CL
Contralateral : DF developed in the ovary contralateral to CL

Table 2 Effects of PGF2α treatment on the locational relationship between CL and1st wave DF after ovulationa
Treatmentb

ｎ

PG1
PG2

Locational relationshipc（％）
Ipsilateral

Contralateral

22

40.9

59.1

22

54.5

45.5

a）PGF2α: prostaglandin F2α, CL : corpus luteum, DF : dominant follicleb）Cows were received PGF2α on mid-luteal phase. Cows were randomly assigned to twogroups, PG1 group were received one injection of PGF2α, PG2 group were received two
injections of PGF2α with 12 hours interval. All cows were received GnRH at 56 hours
after 1st injections of PGF2α.
c）Ipsilateral : DF developed in the ovary ipsilateral to CL
Contralateral : DF developed in the ovary contralateral to CL© The Ito Foundation

牛の受胎性に関与する排卵後の黄体と主席卵胞の205（Table２）。PGF２αを２回投与したPG２回区でとは，黄体退行の状況によっては，排卵の直前には，共存は54.5％，非共存は45.5％の発生割合で発育を開始する第１卵胞波の卵胞がFSHの作用あった。PG１回区とPG２回区との間で，共存おを受けている可能性を示している。つまり，黄体

よび非共存の発生状況に差異は認められなかった。

退行の状況が，排卵後の共存・非共存の発生を制４．考御している可能性がある。

察

本研究では，試験②において，黄体退行誘起処

本研究の結果から，ホルモン処置を行わない場

置として，PGF２α投与を１回（PG１回区）か合（無処置区），自然発情排卵後の排卵後の黄体ら２回（PG２回区）に増やすことで，黄体退行と第１卵胞波主席卵胞との位置関係は，共存と非の状況に差異をもたらしたが，PG１回区とPG２共存が同じ程度に発生する状況であった。

回区との間で，共存および非共存の発生状況に差

ホルモン処置をした場合，PGF２αを投与し発異は認められなかった。試験①からは黄体退行の情誘起のみを行った場合（PG区），無処置区と比状況が，排卵後の共存および非共存の発生に影響

べ有意差はないが，排卵後におよそ６割で共存とを及ぼすことが示唆されたが，試験②からその影なった。一方，PGF２αを投与し発情誘起を行い，響は大きくないことが示された。しかし，試験①

さ ら に GnRH を 投 与 し 排 卵 誘 起 も 行 っ た 場 合と②では，黄体退行誘起のためのPGF２α投与時（PG＋GnRH区），排卵後の非共存の発生が，無処の卵胞の状態が異なる可能性があり，また，排卵置区やPG区と比べ高くなる傾向が示された。

誘起のためのGnRH投与の時期が異なる。今後，

このようなホルモン処置の違いによって共存と

黄体退行誘起時の卵胞の状態や黄体退行と排卵の非共存との発生状況の差異が起こる理由は，本研時期との関係が，排卵後の共存および非共存の発究からは明らかにされなかった。一般にPGF２α

生に及ぼす影響について詳細に調べる必要がある投与による発情発現は，投与後48時間以降に起こと考えられた。

ることが知られていることから，PG＋GnRH区

最近の研究報告にて，排卵後の黄体と第１卵胞では，発情発現より前にGnRH投与が行われてい波主席卵胞の位置関係が，排卵時の退行黄体と排ると考えられる。これまでの研究報告では，排卵卵卵胞との位置関係と関連していることが示されの直前に第１卵胞波の発育が開始すること が知た５）。そこで，本研究において，それぞれのホルれている。これらのことから，PG区では生理的モン処置において，排卵時の退行黄体と排卵卵胞な卵胞波発育が行われているのに対し，PG＋との位置関係が排卵後の共存および非共存の発生

GnRH区では卵胞波発現より前に小卵胞へGnRH

状況に及ぼす影響について整理し，ホルモン処置

処置による影響が及んでいる可能性があり，その時の黄体と排卵に至った卵胞の位置関係と排卵後ことが，ホルモン処置の違いによる排卵後の黄体の共存および非共存の発生状況との関係を解析しと第１卵胞波主席卵胞の位置関係の差異を生み出たところ（Table３），有意差は認めらなかったが，している可能性が考えられた。

PG区と無処置区では，処置時に非共存の場合，

３）

１）

既報において，黄体退行の差異による血中Ｐ４

高い確率で，排卵後に共存の状態となることが示

濃度推移の違いによって，卵胞発育を刺激するされた。一方，PG＋GnRH区では，処置時の黄体

FSHの小規模な血中濃度上昇が排卵前に観察さと卵胞の位置関係に関わらず，排卵後に非共存とれる個体が存在するなる割合が高くなることが明らかとなった。この

４）ことが報告された。このこ© The Ito Foundation

206

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 3 Effects of the locational relationship between CL and PF at treatment on

the locational relationship between CL and 1st wave DF after ovulationa
Treatmentb

Control

PG

PG＋GnRH

ｎ

269

33

34

Locational relationshipat treatmentc（n）

Locational relationshipafter ovulationd（％）
Ipsilateral

Contralateral

Ipsilateral

138

44.9

55.1

Contralateral

131

62.6

37.4

Ipsilateral

20

45.0

55.0

Contralateral

13

84.6

15.4

Ipsilateral

18

38.9

61.1

Contralateral

16

37.5

62.5

a）CL : corpus luteum, PF : preovulatory follicle DF : dominant follicleb）Cows were received GnRH on 7 days after spontaneous ovulation. Prostaglandin F2（PGF2α）were administrated on 7 days after GnRH treatment, then, cows were randomly
assigned to two groups, PG groups and PG＋GnRH group. PG＋GnRH group were received
GnRH at 48 hours after PGF2α treatment. PG group were not received GnRH.
c）Ipsilateral : PF was located in the ovary ipsilateral to CL
Contralateral : PF was located in the ovary contralateral to CLd）Ipsilateral : DF developed in the ovary ipsilateral to CL
Contralateral : DF developed in the ovary contralateral to CL

ことは，排卵後の共存あるいは非共存の状態を決

卵巣に存在する非共存状態を人為的に誘導するた定する要因として，黄体退行から排卵までの内分めの要件を探ることを目的に，現在，臨床現場で泌の変化とその時間的推移が強く関与している可用いられているホルモン処置が，排卵後の共存・能性を示唆している。今後，より詳細な内分泌状

非共存の発生状況に及ぼす影響を調べた。試験①

況の解析が必要であると考えられた。

では，PGF２αのみを投与して発情・排卵に至っ

本研究の結果から，ホルモン処置をしない場合

た場合とPGF２αに加えてGnRHを投与して排卵には排卵後の黄体と第１卵胞波主席卵胞の位置関

誘起を誘起した場合について，排卵後の共存・非係は共存と非共存がほぼ同じ割合で発生するが，共存の発生状況を比較した。PGF２αとGnRHをホルモン処置による発情誘起および排卵誘起処置

投与した場合，無処置の自然発情およびPGF２α

は，排卵後の共存および非共存の発生状況に影響のみを投与した場合に比べ，非共存の発生が多いを及ぼすことが明らかとなった。今後，様々なホ傾向がみられた。試験②では，黄体退行誘起のたルモン処置について，授精後の黄体と第１卵胞波

めにPGF２αを１回あるいは２回投与した後，主席卵胞の位置関係およびその後の受胎率を調べ

GnRHを投与して排卵誘起を誘起することで，ることで，高い受胎性をもたらす卵巣状態（排卵PGF２αの投与回数が排卵後の共存・非共存の発後の非共存状態）を誘導するホルモン処置を開発

生状況に及ぼす影響を調べた結果，PGF２αの投できることが，本研究の知見から示唆された。

与回数による影響は認められなかった。本研究か

５．要ら，排卵後の黄体と第１卵胞波主席卵胞の位置関

約係について，ホルモン処置による発情誘起および本研究では，排卵後に主席卵胞が黄体と同じ卵

排卵誘起処置が，排卵後の共存および非共存の発巣に存在する共存状態あるいはそれぞれが異なる

生状況に影響を及ぼすことが明らかとなった。今© The Ito Foundation

牛の受胎性に関与する排卵後の黄体と主席卵胞の後，様々なホルモン処置について，授精後の黄体と第１卵胞波主席卵胞の位置関係およびその後の受胎率を調べることで，高い受胎性をもたらす卵巣状態（排卵後の非共存状態）を誘導するホルモン処置を開発できる可能性が考えられた。

207

文
献
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３）Stevenson, J. S., Thompson, K. E., Forbes, W. L.,
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© The Ito Foundation

208

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した牛精液および受精卵の未凍結保存
Preservation of bovine semen and embryo by supercooling using an aminoacid that effectively inhibits ice crystal formation

星

野

由

美

（広島大学大学院生物圏科学研究科）

Yumi Hoshino（Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University）

Cryopreservation is extensively used for preserving reproductive cells such as sperm
cells, oocytes and early embryos. This method offers a major advantage as the frozen material
can be preserved almost indefinitely in liquid nitrogen. However, DMSO and ethylene glycol,
which are used in the preservation solution, are known to be cytotoxic, and freezing-induced
cellular damage can reduce the fertilization and development rates. In this study, the validityof a non-cryopreserve compound and an amino acid expected to have supercooling-promoting
effects was investigated for developing a non-freeze preservation technology for semen andearly embryos. Coffee extract was used as a supercooling-accelerating substance. The coffee
extract comprised caffeine, caffeic acid, ferulic acid, coumaric acid, and chlorogenic acid. Amongthese, the supercooling-facilitating activity was highest for caffeine. The supercoolingpromoting effect was observed for coffee extract and caffeine during the preservation of semen
and oocyte for 7 days. The viability and motility of the sperm were improved when coffee
extract or caffeine was added; this addition also contributed to the maintenance of the oocyte
nuclear membrane structure. In this study, supercooling preservation of semen and oocytes
was achieved using supercooling-accelerating substances such as coffee extract and caffeine.
Thus, under appropriate conditions, semen and early embryo could be preserved whithout
freezing-induced dameges.

１．目のダメージや，保存液に含まれる凍害保護物質に的よる細胞毒性は，現行の凍結保存法では避けるこ

生殖細胞の保存は，優良形質をもつ家畜遺伝資とができない１，２）。また最近の研究によると，保源の活用や希少動物の遺伝子保存に有効であり，存液に含まれる凍害保護物質が受精卵移植後に子重要な技術となっている。細胞の長期保存には，

宮内で炎症を引き起こす原因になることも指摘さ

ガラス化法や緩慢凍結法などの凍結保存法が広くれている。精子や受精卵がダメージを受けると，用いられており，液体窒素中で半永久的な保存が細胞の生存やその後の受精・発生に大きく影響す可能である。しかし，凍結により生じる細胞膜へる。これらの問題を回避するために，未凍結保存© The Ito Foundation

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した牛精液および受精卵の未凍結保存

209の可能性を検討することした。関西大学の河原秀クス）を使用し，20℃から段階的（0.1℃／分）

久教授らは，植物（ヒノキ，大根，エノキダケなに温度を下げ，－６，－８，－10，－12℃の温度ど）や食品廃棄物（コーヒー粕，あん粕，日本酒

下で１，３，７日間保存を行った。温度回復時になど）から氷晶形成抑制物質を発見し，その抽出は，段階的（0.1℃／分）に温度を上げ，20℃でに成功している。氷晶形成抑制物質には，不凍タ回収した。温度制御は，Berendsenらの方法に準ンパク質や過冷却促進物質として分類されるものじて行った３）。保存液に添加する氷晶形成抑制物があり，氷結晶の形成やその成長を抑制する効果

質は，過冷却促進効果が報告されているコーヒーがある。これを適切な濃度で加えると，低温下で粕エキスに基づいて比較検討した。コーヒー粕エ

も氷核形成が抑制されるため，過冷却状態を維持

キスは，熱水抽出した後，分子量１万以上を除去させることができる。一般に液体が凝固点以下でして酢酸エチル分画によって抽出した。各分画のも固体にならない状態を過冷却というが，液体中成分を同定し，それぞれの抗氷核活性値を算出しに異物が存在すると過冷却温度は上昇し凍結しやた。抽出成分に基づいて，本研究では，①生理食すくなる。しかし，氷晶形成抑制物質を添加する

塩水，②UW液，③コーヒー粕エキスを含むUW

ことで過冷却温度を下げることが可能になるた液，④カフェインを含むUW液，を保存液としてめ，細胞や組織の保存に有効であると考えられ用いた。精子の健常性は，HTF培地で培養１時る。ハーバード大学の研究チームは，過冷却を利

間後の生存性と運動性，その後の体外受精によっ用してラットの肝臓を３日間保存することに成功て評価した。卵子については，核および核膜の正した 。本研究では，植物由来の氷晶形成抑制物

常性を評価するため，２％パラホルムアルデヒド

質を用いて，細胞毒性のない保存液で生殖細胞ので固定し，Lamin B１抗体を用いた免疫蛍光染色

過冷却保存の可能性を検証することとした。

を行った。核相の判定にはPropidium iodide（PI）

３）

２．方

を用い，共焦点レーザー顕微鏡で観察した。マウ法

スでの保存条件に基づき，ウシ精液および受精卵

生殖細胞における過冷却保存の条件を検討するため，サイズが小さく，入手が容易なマウスを用いて予備実験を行った。まず，ICR成熟雄マウスの過冷却保存条件の検討を行った。
３．結果と考察の精巣上体尾部より精子塊を採取した。採取したコーヒー粕エキス１㎎/mlに含まれる成分を分精子塊は，37℃に加温したUW液（University of析したところ，カフェイン，カフェ酸，クロロゲ

Wisconsin（ViaSpan），アステラス製薬）100μン酸，クマル酸が含まれていることが明らかに

ｌのドロップに10分間静置し，精子を自然に懸濁なった。それぞれの濃度と抗氷核活性値を比較しさせた。均一に拡散した精子懸濁液10μｌは各保たところ，弱酸性フェノール層にカフェインが多存液100μｌに希釈して，過冷却保存に供した。

く含まれ，抗氷核活性が最も高かった（Table１）。

卵子はPMSG投与46時間後の３週齢ICR雌マウス

カフェインは哺乳動物の卵子や受精卵の活性を維の卵巣から採取した。卵丘細胞を除去した後，持する効果があり，培養液にも添加されることが100μｌの保存液に卵子３個を浸漬し，過冷却保多い４）。このことから，本研究ではコーヒー粕抽存を行った。温度制御と過冷却維持には超低温ア

出液とカフェインを氷晶形成抑制物質（過冷却促

ルミブロック恒温槽（クライオポーター，サイニ

進物質）として使用することとした。それぞれ0.5© The Ito Foundation

210

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 1 Concentration and anti-ice nucleation activity of each coffee component
Concentration（μg/ml）
Caffeine

Caffeic acid

Chlorogenic acid

Coumaric acidAnti-ice nucleation
activity（℃）

coffee extrtact

169.9

0.9

141.2

0

2.50±0.42

carboxylic acid

221.3

6.0

200.9

0

2.03±0.29

strong acidic phenol

435.9

19.2

113.6

0.3

3.03±0.41

mild acidic phenol

655.1

2.7

25.2

0.1

4.40±0.42

neutrality

365.4

3.8

34.3

0.1

3.53±0.24

Table 2 The motility of the sperm after 7-day supercooling preservation
Temperature（℃）
4

－6

－8

－10

－12

Saline

－

－

－

－

－

UW

－

－/＋

－

－

－

UW＋coffee

－

＋

＋

＋

－/＋

UW＋caffeine

＋

＋＋

＋＋

＋＋

＋＋

または1.0㎎/mlの濃度になるようUW液に添加が良好であったことから，過冷却によって代謝をし，氷晶形成抑制効果（過冷却促進効果）を検証抑えられた結果と考えられた。卵子は，精子保存したところ，どちらも－６℃～－12℃の温度条件と同様にコーヒー粕エキスまたはカフェインを含下では過冷却を維持できることを確認した。まむUW液で最大７日間保存を行った。保存後，核た，この温度条件においては，７日間維持しても膜構造を観察するためにLamin B１抗体を用いて保存液の凍結は認められず，生殖細胞の保存に有免疫蛍光染色を行った結果，UW液単独に比べ，効であると判断した。

コーヒー粕エキスとカフェイン添加区において，精子は，コーヒー粕エキスまたはカフェインを核膜が正常に維持されていた。添加濃度によって含むUW液で１，３，７日間，４℃または－６℃

有意な差は認められなかったが，１㎎/ml添加区～－12℃で保存したところ，生存性および運動性

でより高い効果が得られた（Fig.２）。保存温度に効果が認められた（Table２）。すなわち，コンについては，－６℃で細胞形態と核膜構造が最もトロールとして設けた，生理食塩水またはUW液

安定して維持された結果であった。以上の結果か単独の保存液では，保存温度・日数に関わらず，ら，精子や卵子の保存においては，コーヒー粕エ

その運動性は極めて低く不動精子が多数を占めた

キスやカフェインを含むUW液が有効であり－が，カフェイン添加区では４℃，－６℃～－12℃

６℃で未凍結保存が可能であることが示された。

で ，コ ー ヒ ー 粕 エ キ ス 添 加 区 で は ，－ ６ ℃ ～牛の精液や受精卵の保存に展開するため，保存－12℃で精子の運動性を維持できることが明らか

液のスケールアップによる影響を調べたところ，となった。また，顕微鏡下での形態観察において10mlまでは安定して保存できることを確認した。

は，保存後の精子形態に異常は認められなかった

牛精液と受精卵については，条件検討を進めてい（Fig.１）。４℃よりも過冷却条件で精子の運動性

るが，精子濃度によって生存率や運動性にばらつ© The Ito Foundation

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した牛精液および受精卵の未凍結保存
UW

UW + Coﬀee

UW + Caﬀeine

‒6℃

4℃

SalineFig. 1 Evaluation of the sperm after supercooling preservation. The

sperms treated with saline, UW solution, UW with coffee extract, or
UW with caffeine for 7 days at 4 or －6℃．
PI

Merged0.5mg/ml
1.0mg/ml
0.5mg/ml
1.0mg/ml

UW + caffeine

UW + coffee extract

UW onlyLamin B1

Fig. 2 Distributions of Lamin B1 and chromosomes after 7-day

supercooling preservation.

© The Ito Foundation

211

212

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

きがあり，保存液量や希釈方法を含めて，引き続らかになった。そこで，コーヒー粕抽出液とカきの検討が必要である。

フェインを氷晶形成抑制物質（過冷却促進物質）

一般的に生殖細胞の体外操作では酸化ストレス

として保存液に添加し，その効果を検証した。そが生じやすく，それによって生殖細胞はダメージの結果，コーヒー粕エキスとカフェインが，精子を受ける 。コーヒー粕エキスに含まれるクロロや卵子の過冷却保存に有効であり，－６℃の温度

ゲン酸は，抗酸化物質としても知られており，抗条件下で７日間の保存が可能であることを明らか

酸化作用によって細胞が保護されたことも考えらにした。動物種や対象細胞に最適な条件検討を行れる。本研究では，コーヒー粕エキスとその成分

う必要はあるが，適切な条件を構築できれば，新であるカフェインを添加することで，精子や卵子規保存法としての発展が期待される。

５）の過冷却保存に有効であることを示した。動物種や対象細胞に最適な条件検討を行う必要はある
が，適切な条件を構築できれば，新規保存法としての発展が期待される。
４．要

約

生殖細胞の保存には凍結保存法が広く用いられているが，細胞へのダメージは避けられず，融解後の受精や発生に影響を及ぼしている。現状の問題点としては，凍結により生じる細胞膜の損傷，保存液に含まれる凍害保護物質による細胞毒性である。この問題を解決するために，本研究では植物由来の氷晶形成抑制物質を用いて，細胞毒性のない保存液で生殖細胞の過冷却保存（未凍結保存）の可能性を検証することとした。氷晶形成抑制効果が知られているコーヒー粕エキスの有効成分を分析したところ，カフェイン，カフェ酸，ク
ロロゲン酸，クマル酸が含まれ，特にカフェイン

文献１） Saragusty, J., Arav, A. : Current progress inoocyte and embryo cryopreservation by slow
freezing and vitrification, Reproduction ，141（1），１～19，2011．
２） Mandawala, A. A., Harvey, S. C., Roy, T. K.,
Fowler, K. E. : Cryopreservation of animal oocytes
and embryos: Current progress and future
prospects, Theriogenology， 86（7）， 1637 ～ 1644 ，
2016．
３） Berendsen, T. A., Bruinsma, B. G., Puts, C. F.,
Saeidi, N., Usta, O. B., Uygun, B. E., Izamis, M. L.,
Toner, M., Yarmush, M. L., Uygun, K. : Supercoolingenables long-term transplantation survival following
4 days of liver preservation, Nat Med，20（7），790～
793，2014．
４）
Ariu, F., Bogliolo, L., Leoni, G., Falchi, L., Bebbere, D.,
Nieddu, S. M., Zedda, M. T., Pau, S., Ledda, S. : Effectof caffeine treatment before vitrification on MPF
and MAPK activity and spontaneous
parthenogenetic activation of in vitro matured ovine
oocytes, Cryo Letters，35（6），530～536，2014．
５）Agarwal, A., Aponte-Mellado, A., Premkumar, B. J.,
Shaman, A., Gupta, S. : The effects of oxidative
stress on female reproduction: a review, Reprod Biol
Endocrinol，10（49），2012．

で抗氷核活性（過冷却促進効果）が高いことが明© The Ito Foundation

213

お灸は牛の卵巣機能の向上をもたらすか？
Does the Moxibustion have positive effect to ovarian function？

三

浦

亮太朗

（日本獣医生命科学大学獣医学部）

Ryotaro Miura（Department of Veterinary Medicine, Nippon Veterinary and Life Science University）

In the present study, we examined the effect of Moxibustion to the corpus luteum（CL）
function in cows. We used fifteen lactating dairy cows（Holstein : n＝9, Jersey : n＝5, Guernsey :n＝1）and nine non-lactating cow（Holstein : n＝5, Jersey : n＝2, Japanese Black : n＝1, JapanesePolled : n＝1）for the experiment. On day 10 of the estrous cycle（Day 0＝the day of ovulation）,
cows were divided into two groups ;（1）Moxibustion group（Lactating dairy cows : n＝8, Nonlactating cows : n＝5）, in which the cows were treated moxibustion and（2）Control group（Lactating dairy cows : n＝7, Non-lactating cows : n＝4）
. Moxibustion treatment were applied onnine specific points in Moxibustion group. Before moxibustion treatment, we collected the blood
sample（only lactating dairy cows）and examined the size and blood flow area of CL using
color-doppler ultrasonography in Moxibustion group and Control group（Pre）. After the moxa
were burn out（0h）, blood collection（only lactating dairy cows）and ovarian examination weredone at 1h, 4h, 12h, 24h, 36h and 48h in Moxubustion group and Control group. Mean crosssection area of CL were not different between Moxibustion group and Control group during
the experimental period. Mean blood flow area of CL were significantly higher at 24h in
Moxibustion group than in Control group, and mean blood flow area of CL were tended to behigher from Pre to 24h in Moxubustion group. In lactating dairy cows, mean blood flow area of
CL were no difference between Moxibustion group and Control group during the experimental
period, however, mean blood flow area of CL were significantly higher in Moxibustion groupthan in Control group during the experimental period. Mean plasma progesterone
concentration were not different between Moxibustion group and Control group during theexperimental period in lactating dairy cows. From the present study, it was suggested thatmoxibustion treatment may have an effect of improving the CL function in cows.

１．目

い，収益を得ることができる。そのため，受胎率的の低下は畜産農家の経済的損失に直結する。これ

近年，世界中で乳牛の受胎率低下が大きな問題

まで，卵巣静止および卵胞嚢腫などの卵巣疾患にとなっており，日本においてもその例外ではな

対して排卵誘起とその後の授精を目的としたホルい。牛は分娩を経ることで乳生産や肉生産を行

モン治療１）や，人工授精後の受胎率向上を目的に© The Ito Foundation

214

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

プロジェステロン製剤を補充する処置が行われての効果を，卵巣内構造物の発育動態および血中性

きた 。しかしながら，牛本来の生理状態や体調ステロイドホルモン濃度推移を評価することで明が十分に回復していない状態でホルモン処置をらかにすることを目的としたものである。この研行ったとしても，効果を発揮しないのが現状であ究を通してお灸の効果を科学的に評価し，牛の繁る。そのため，牛が本来有する能力を引き出すと殖成績向上および卵巣疾患に対する新たな治療方

いうアプローチで繁殖成績改善を目指していくこ

法や方向性を示すとともに，現在の畜産現場でみとが重要であると考えられる。

られるホルモン処置の乱用を打開するための礎の２）

お灸とは，東洋医学の独特の概念である，気と血がめぐる通路（経絡）に存在する経穴（ツボ）と呼ばれる特定の部位に，温熱刺激を与えること研究となることを目指す。
２．方法

により，生理状態の変調を整え変化させること

日本獣医生命科学大学付属牧場（富士アニマル

で，本来持っている感染に対する免疫力や機能をファーム）にて飼養されていた泌乳乳牛（ホルス

増進させ疾病の治療もしくは予防を目的に行われタイン種：9頭，ジャージー種：5頭，ガーンジー

るものである。中国医学，モンゴル医学およびチ

種：1頭：雌），非泌乳乳牛（ホルスタイン種：5

ベット医学などで行われる代替療法である３）。

頭，ジャージー種：2頭；雌）および肉用繁殖雌

ヒトの領域において鍼灸治療が行われているのはアジアの国々だけではなく，アメリカおよび牛（褐毛和種：1頭，無角和種：1頭；雌）を用いた。

ヨーロッパの国々を含む世界中の国々で治療としお灸の黄体機能に与える影響を調査するためて正式に取り入れられており，疼痛管理，感染症に，開花期黄体を有する泌乳牛に対してお灸を実および不妊治療などに適応されている。また，ヒ

施 し ，黄 体 血 流 お よ び 血 中 プ ロ ジ ェ ス テ ロ ン

トの医療のみならず牛，馬および豚などの動物に（P4）濃度に与える影響とその持続期間を評価す

おいてもツボは開発されており，お灸が実施されるため以下の手順で試験を実施した。

ている。これまで，牛のお灸は発情兆候の明瞭化，

１）試験牛をお灸実施群（泌乳牛：8頭，非泌乳

胎盤の排出および子宮の早期回復に対して効果を

牛：5）とコントロール群（泌乳牛：7頭，非泌持つことが知られてきたが ，この現象に対する

乳牛：4）に分ける。

３）

科学的な証明は十分になされていない。しかしな

２）発情周期の10日目（排卵確認日＝0日目）にがら，人を対象にした研究において，妊娠女性に牛の繁殖に効果のあるとされる９つのツボ１）に対してお灸を実施したところ，施灸前後の子宮動お灸を実施した（Fig.１）。コントロール群に脈および臍帯動脈の血管抵抗値が低下，つまり血対してはお灸を実施しなかった。

流量の増加が起きることが示されている 。また，

 お灸は，牛を保定枠場内に入れ実施した。

卵胞期の女性に対して鍼治療を施したところ，血 お灸はそれぞれのツボに艾（もぐさ）を2.5

中エストラジオール濃度が高値を示した症例が観ｇずつ配置し，９箇所のツボに配置した艾に同察された 。これらのことから，鍼灸治療を施す

時に着火する。艾はおよそ15分で燃え尽き，すことで卵巣および子宮機能に何らかの効果を及ぼ

べての艾が燃え尽きたタイミングを０時間としすことが示唆される。

た。

４）

５）

そこで，本研究は牛に対するお灸の卵巣機能へ３）お灸実施直前（Pre），1.0時間後，4.0時間後，© The Ito Foundation

215

700
600

Control
Moxibustion

500
400
300

Group:NS
Hour:NS
Group×Hour:NS

200
100
0
Pre

8

16

24

32

40

Blood ﬂow area of CL (mm2）

Cross-section area of CL（mm2）

お灸は牛の卵巣機能の向上をもたらすか？
250

Control
Moxibustion

200
150

*

100

Group:P< 0.05
Hour:NS
Group×Hour:P< 0.05*:P < 0.05

50
0
0

48

8

16

24

32

40

48

Hour after treatment（h）

Hour after treatment（h）
Fig. 1 Comparative changes of mean cross-section area

Fig. 2 Comparative changes of mean blood flow area ofof CL in Moxibustion group and Control groupbetween Pre to 48 hours. Data are presented as
the mean±standard error of the mean（SEM）.
CL＝Corpus luteum

CL in Moxibustion group and Control groupbetween Pre to 48 hours. Data are presented as
the mean ± SEM. The asterisk denotes difference
between each points. ＊ : P＜0.05. CL＝Corpus luteum

12.0時間後，24.0時間後，36.0時間後および48.0

推移に差はなかった（Fig.１）。

時間後に卵巣観察および採血（採血は泌乳牛の3.2み）を実施した。

反復測定―分散分析を行ったところ，時間要因

黄体血流推移の結果

卵巣観察は，カラードプラ画像診断装置を用いには有意差はなかったが，群要因および時間×群て黄体画像および黄体血流を捉えた画像を記録し交互作用に有意差があった。交互作用に有意差がた。その後，画像解析ソフトを用いて黄体断面積確認されたので，多群比較検定を行ったところ，

および黄体血流面積を算出し解析に用いた。採血

お灸実施群内においてPreから24時間後に血流がはヘパリン採血管を用いて尾静脈から行った。採増加する傾向（Ｐ＜0.1）が観察された。また，

決後30分以内に遠心分離機にて血漿を分離し，血お灸実施24時間後においてお灸実施群でコント

中P4濃度を測定するまで－30℃冷凍庫にて保管

ロール群と比較して黄体血流面積は有意に高かっした。血中P4濃度は市販の血中P4濃度測定EIAた（Fig.２）。また，泌乳牛のみのデータで解析キットを用いて測定した。データは平均±標準誤したところ，時間要因，群要因および時間×群交差で示した。統計解析においては，Ｐ＜0.05を有互作用に有意差はなかった（Fig.３）。非泌乳牛意差ありとした。

のみのデータで解析したところ，時間要因および

３．結
3.1

時間×群交互作用に有意差はなかったが，群要因

果に有意差があり，試験期間を通じてお灸実施群で黄体断面積推移の結果

高く推移した（Fig.２，Fig.３，Fig.４）。

反復測定－分散分析を行ったところ，黄体断面3.3

血中P4濃度推移の結果

積は試験期間を通じて，お灸実施群とコントロー

泌乳牛のみのデータに関して反復測定－分散分

ル群で有意な差はなかった。また，泌乳牛と非泌析を行ったところ，血中P4濃度は試験期間を通乳牛で区分して，黄体断面積をお灸実施群とコン

じて，お灸実施群とコントロール群で有意な差はトロール群で比較した場合においても黄体断面積なかった（Fig.５）。

© The Ito Foundation

平成28年度

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

250

Control
Moxibustion

200
150
100

Group:NS
Hour:NS
Group×Hour:NS

50
0
0

8

16

24

32

40

48

Plasma P4 concentration（ng/ml）

Blood ﬂow area of CL（mm2）

216

6.0
5.0
4.0
3.0
2.0

0.0
0

CL in Moxibustion group and Control groupbetween Pre to 48 hours in lactating dairy cows.
Data are presented as the mean±SEM. CL＝Corpus
luteumBlood ﬂow area of CL（mm2）

8

16

24

32

40

48

Hour after treatment（h）

Fig. 3 Comparative changes of mean blood flow area ofControl
Moxibustion

250

Group:NS
Hour:NS
Group×Hour:NS

1.0

Hour after treatment（h）

300

Control
Moxibustion

200

Fig. 5 Comparative changes of mean plasma P4

concentration in Moxibustion group and Control
group between Pre to 48 hours in non-lactatingcows. Data are presented as the mean±SEM. P4＝Progesterone

えるかを十分に検証した研究はほとんど存在しない。そこで，本研究はお灸が牛の卵巣機能に対してどのような影響を与えるのかを，発情周期10日

150目の黄体を有する個体に対してお灸を実施する群100とコントロール群を設け，両群間で黄体断面積，

Group:P< 0.05
Hour:NS
Group×Hour:NS

50
0
0

8

16

24

32

40

黄体血流面積および血中P4濃度推移を比較し検48

Hour after treatment（h）
Fig. 4 Comparative changes of mean blood flow area of

CL in Moxibustion group and Control groupbetween Pre to 48 hours in non-lactating cows.
Data are presented as the mean±SEM. CL＝Corpus
luteum

証した。黄体断面積の推移にお灸実施群とコントロール群で差はみられなかったが，黄体血流面積はお灸実施群で増加することが示された。過去の報告から黄体機能を評価する指標として黄体血流量は有効であることが示されている８）。本研究の結果から，お灸実施群でお灸が卵巣機能に対して直接的に影響を与える，黄体機能を向上させたこ

４．考とが推測される。しかしながら，黄体血流面積を察

泌乳牛と非泌乳牛で分けて解析した場合，非泌乳牛におけるお灸の繁殖成績に及ぼす効果を検証

牛ではお灸実施群が期間を通して有意に高く推移した報告では，分娩後の早期にお灸を実施し，そしたが，泌乳牛では有意な上昇は確認されなかっの後の子宮回復および初回授精受胎率を評価してた。これは，お灸に対する反応が泌乳牛と非泌乳

おり，お灸実施をすることで繁殖成績が向上する

牛で異なることが推測される。繁殖障害牛に対す可能性が示されている

６，７）。しかしながら，卵巣る施灸は，１回/日を３日間連続で実施すること

周期を正常に繰り返している経産牛に対して施灸が推奨されており３），泌乳牛では泌乳による代謝することで卵巣機能に対してどのような影響を与亢進などの影響があることが考えられるため，卵© The Ito Foundation

お灸は牛の卵巣機能の向上をもたらすか？

217

巣機能の亢進をはかるためには１回のみではなくとを目的としたものである。発情周期10日目の開数回の施灸が必要であることが推察された。過去

花期黄体を有する泌乳経産牛および非泌乳経産牛の報告から，血中P4濃度は黄体血流面積と正のに対して，牛の繁殖に効果のあるとされる9つの相関関係があることが示されている 。そのため経穴に艾を2.5ｇずつ配置し，着火した。すべて

黄体血流量を増加させることで，血中P4濃度をの艾が燃え尽きたタイミングを0時間とした。黄上昇できる可能性がある。妊娠牛では非妊娠牛に体断面積と黄体血流面積を評価するためにカラー

比較して人工授精後の血中P4濃度が高いこと９），

ドプラ画像診断装置を用いて卵巣観察を行った。

また前発情周期の血中P4濃度が高い牛で受胎率また泌乳経産牛のみ，血中P4濃度を評価するたが高くなることが報告されており，発情周期中

めに尾静脈より採血を行った。卵巣観察と採血はの血中P4濃度を高めることは牛の繁殖成績向上

お 灸 実 施 直 前（Pre），1.0 時 間 後 ，4.0 時 間 後 ，のために重要であることが示されている。そのた

12.0時間後，24.0時間後，36.0時間後および48.0時

め黄体機能を向上させ，血中P4濃度を上昇させ間後に実施した。黄体断面積推移にお灸実施群とる方法が求められる。今回，泌乳牛における血中コントロール群で差はなかった。黄体血流面積推

P4濃度推移にお灸実施群とコントロール群間で移は，お灸実施群内においてPreから24時間後に差はなかったが，黄体血流面積推移に差がなかっ

血流が増加する傾向が観察され，また，お灸実施

たことからこの結果は納得できるものであった。

24時間後においてお灸実施群でコントロール群に今後は，より黄体機能を向上させ血中P4濃度を比較して黄体血流面積は有意に高かった。血中上昇させるお灸の方法やより少ないツボ数でも効P4濃度推移はお灸実施群とコントロール群で差果が得られる組み合わせを探索する必要があるとはなかった。黄体血流の増減は黄体機能を評価す考えられる。

る上で有用な指標となることから，これらの結果

８）

10）

本研究から，お灸を実施することで黄体機能がから，お灸を実施することで黄体機能に直接的に向上する可能性が示唆された。牛に対するお灸

影響を与え機能を向上させる可能性が推察されは，民間療法として実施され効果があることが報た。今後はより黄体機能を向上させるお灸の実施

告されているが，十分な科学的な裏付けがなされ方法やより少ないツボ数でも効果が得られる組みておらず，広範囲に普及しているとは言いがた

合わせを探索する必要があると考えられる。これい。しかしながら，本研究によりお灸の卵巣機能らの研究を進めることで，牛の繁殖成績向上およへ与える影響を科学的に裏付けすることで，一般

び卵巣疾患に対する新たな治療方法や方向性を示の産業動物臨床現場でより広範囲に利用されるこすとともに，牛の生産性向上を目指した取り組みとが期待され，畜産現場での生産性向上に寄与でが可能になると考える。

きると考えられる。
５．要

約

本研究課題では，牛に対するお灸の卵巣機能に対する効果を，発情周期中期の開花期黄体の黄体
断面積，黄体血流面積および血中性ステロイドホ
ルモン濃度推移を評価することで明らかにするこ

文献１）López-Gatius, F., Mirzaei, A., Santolaria, P., BechSàbat, G., Nogareda, C., García-Ispierto, I., Hanzen,
Ch., Yániz, J. L. : Theriogenology，69，1095～1103，
2008．
２）G a r c i a - I s p i e r t o , I . , L ó p e z - G a t i u s , F . :Theriogenology，90，20～24，2017．
３）保坂虎重，白水完児：家畜のお灸と民間療法クス© The Ito Foundation

218

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

リに頼らず経営改善，９～59，農山漁村文化協会，
東京，1997．
４）高橋佳代，相羽早百合，武田佳彦：東京女子医科大学雑誌，65，801～807，1995．
５）麻生武士，本橋亨，村田匡好：産婦科治療，33，
200～205，1976．
６）Korematsu, K., Takagi, E., Kawabe, T., Nakao, T.,
Moriyoshi, M., Kawata, K. : J. Vet. Med. Sci.，55，613～
616，1993．

７）秋 葉 貞 治 ，杉 浦 健 太 郎 ，堂 地 修 ，小 山 久 一：J.
Rakuno Gakuen Univ.，30，235～238，2006．
８）Herzog, K., Brockhan-Lüdemann, M., Kaske, M.,
Beindorff, N., Paul, V., Niemann, H., Bollwein, H. :Theriogenology，73，691～697，2013．
９）Lopes, A. S., Butler, S. T., Gilbert, R. O., Butler, W.
R.: Anim. Reprod. Sci.，99，34～43，2007．
10）Folman, Y., Rosenberg, M., Herz, Z., Davidson, M. :J. Reprod. Fertil.，34，267～278，1973．

© The Ito Foundation

219

日本の養豚場における動物用抗菌剤使用に及ぼす要因の疫学的解析
―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティ
レベルの関係―
Epidemiological analysis of the factors affecting the use of veterinary
antimicrobials at farm level on Japanese pig farms－the relationship between veterinary antimicrobial usage and on-farmbiosecurity level－

杉

浦

勝

明・松

田

真

理・礒

村

れ

ん・ナイジェル CL クワン（東京大学大学院農学生命科学研究科農学国際専攻国際動物資源科学研究室）

Katsuaki Sugiura, Mari Matsuda, Ren Isomura and Nigel CL Kwan
（Laboratory of Global Animal Resource Science, Department of Global Agricultural Sciences，Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Antimicrobial resistance（AMR）is a global health issue, with currently 700,000 people
dying of resistant infections every year. By 2050, 10 million lives a year will be at risk due tothe rise of drug resistant infections if no proactive solutions are taken to slow down the rise of
drug resistance. Improving farm-level biosecurity is a potentially very effective measure which
could facilitate the reduction in veterinary antimicrobial usage while promoting better animalhusbandry and health. This study aimed to analyze the relationship between antimicrobial
usage and biosecurity level at pig farm level since the use of antimicrobials on pig farms
accounts for up to 80％ of veterinary antimicrobial usage in Japan. Data on annual antimicrobial
usage in 2015 based on prescription records was collected from 110 pig fattening farms undercontract with members of the Japanese Association of Swine Veterinarians（JASV）. Of thesefarms 33 farms were selected for assessment of biosecurity（BS）levels using BioAsseT
scoring system developed by the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-Japan
Elimination Team（P-JET）. On these farms, the average annual antimicrobial usage per
fattener produced was 27.47（SD＝23.26）g. The use of oral antimicrobials accounted for morethan 96％ of total usage, and tetracyclines were used most frequently（43.8％），followed bymacrolides（16.9 ％）and penicillins（11 ％）．Within the class of tetracyclines, oxytetracycline
was used most frequently（44.9％），followed by doxycycline（42.5％）and chlortetracycline（12.5％）．In terms of BS level, the overall BioAsseT score averaged 62.5（SD＝12.5）out of100, while the external BS score averaged 174.3（SD＝41.6）out of 290, the internal BS scoreaveraged 161.9（SD＝25.9）out of 259 and the monitoring BS score averaged 78.2（SD＝22.5）
out of 138. Linear regression analysis using BioAsseT scores as independent variables andantimicrobial usage as dependent variables was performed. The results highlighted that alower total antimicrobial usage is associated with a higher external BC score, while a lower critically© The Ito Foundation

220

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

important antimicrobial（CIA）usage of fluoroquinolones is associated with a higher internal
BC score of “pigflows”（e.g. the use of all-in all-out system）．

的

１．目

２．材料と方法

薬 剤 耐 性 菌 に よ る 死 者 は 現 在 世 界 で 70 万 人（2013年）であるが，何も対策をとらない場合に

2 . 1 農場における抗菌剤使用量データなどの収集

は2050年には1000万人に達すると推測され ，薬農場における抗菌剤使用量データは，日本養豚剤耐性菌問題は喫緊の課題である。欧米諸国では開業獣医師協会（JASV）の会員獣医師とコンサ

アクションプランが作成され，畜産分野での抗菌

ルティング契約を結ぶ養豚場（Ｎ＝110）から収剤使用量の削減目標などが定められ，使用量の削集した。2015年１月１日～12月31日の１年間にこ減に取り組んでいる。日本でも昨年４月にアクれらの農場を対象に発行されたすべての抗菌剤処

ションプランが発表され，2020年までに畜産分野

方記録（品目名，販売単位規格，数量）のデータで分離される大腸菌のテトラサイクリンに対するを指示書集計システム（伊藤貢JASV会員獣医師

耐性率を現在の45％から33％に下げるという目標が開発したシステム）を用いて統合抽出した。

が設定された。耐性率を下げるためには，耐性菌

WHOのATCvet分類に基づき，日本での販売がの選択圧を下げることが有用であり，そのために認可されている動物用抗菌剤のうち豚を対象畜種

は抗菌剤の使用量を削減する必要がある。日本にとして含むすべての製品に７桁の抗菌剤コードをおける動物用抗菌剤販売量の８割は豚用に販売さ付与したリストを作成し，13抗菌剤クラス42薬剤れており ，養豚分野での抗菌剤使用量の削減はを投与経路別に有効成分重量をグラムで算出し極めて重要度が高い。しかし抗菌剤使用量の削減た。抗菌剤コードは１桁目に投薬経路，２およびは，感染性疾病の発生リスクを高め，畜産経営に

３桁目に抗菌剤クラス，４から６桁目に製品番

多大な影響を及ぼす可能性がある。現在求められ号，７桁目に包装単位を設定した。2015年の農場ている「治療」から「抗菌剤に依存しない予防」

別の年間出荷頭数値については，PigINFO（JASVへのシフトには，抗菌剤削減の必要性に対する畜および農研機構動物衛生部門により共同開発され産農家および獣医師の理解を醸成するとともに，た生産性に関するベンチマーキングシステム）にその代替となる措置が必要である。

おいて収集されたデータを用いた。これらのデー

１）２）

本研究では，畜産農家における動物用抗菌剤の使用と関連し，かつ畜産農家にとって実現可能な措置として考えられる農場バイオセキュリティ（BS）水準と農場レベルでの動物用抗菌剤使用量との関係について疫学的解析を行い，家畜衛生環

タを用いて，以下の式より2015年における出荷豚
一頭当たりの抗菌剤使用量を算出した。
2015年出荷豚一頭当たりの有効成分重量（ｇ／頭）＝2015年処方の有効成分重量（ｇ）
2015年年間出荷頭数（頭）境の向上による抗菌剤使用量削減策の提案を目的

2.2

とした。

農場BSレベルの評価は，BioAsseT（大竹聡

農場BSレベルの評価

JASV会員獣医師他からなるPRRS撲滅推進チー
３）
ムJAPAN（P-JET）
により開発された農場BS© The Ito Foundation

日本の養豚場における動物用抗菌剤使用に及ぼす要因の疫学的解析―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティレベルの関係―

221

レベルのスコアリングシステム）を用い，その使点満点，重要度「低」は４点満点で評価される用方法に関し事前に研修を受けた各農場の管理獣（Table１）。また，Ｅ評価を受けた項目は飼養衛

医師の査定により行った。BioAsseTはPRRS清浄

生管理基準４）を満たしていないことと同等の評価化を目的として開発されたスコアリングシステムとなる。農場外BSスコアは290点満点，農場内BSである。①農場外BS，②農場内BS，③モニタリ

スコアは259点満点，モニタリングBSスコアはングBSの３大項目からなり，それぞれ①農場へ138点満点で算出した。総合BSスコアは各20小項の病原体の侵入防止，②農場内における病原体の目を合計100点満点換算のうえ，大項目ごとに合伝搬防止，③農家の防疫意識（モニタリング検計100点満点換算し，さらにこれら３大項目の点

査，情報共有，教育，啓蒙）を測定することを目

数を合計100点満点換算して算出した。2015年の的としている。これらの３大項目は合計20の小評

年間抗菌剤使用量データが収集された農場のう

価項目からなり，評価は現場で実践されうる最大ち ， 2016 年 10 月 １ 日 ～ 2017 年 ３ 月 31 日 に限の対策がとられている場合はＡ評価，まったくBioAsseTによる査定が実施された33農場を解析とられていない場合はＥ評価とし，さらに臨床的の対象とした。なお，査定実施期間は使用量調査

重要度を高中低に分けて小項目の重み付けをしの期間とは一致しないが，BSレベルはPRRS等のた。重要度「高」は６点満点，重要度「中」は５

重度の伝染性疾患が流行しないかぎり大きく変化

Table 1 Categories of“BioAsseT”，their number of questions with high, medium and low importanceand their weighted scores in each category.
Categories

1
2
3
4
5
6
7
8
9

# Questions（Total 131）

Weighted ScoresHigh

MediumLow

High（＊6）

External Biosecurity

28

18

8

168

90

32

290

Farm Location
Replacement Glits
Purchase of Semen
Personnels
Transport vehicle
Manure & Carcass
Farm Equipments
Vermin Controls
Visitors

4
5
1
3
5
6
0
2
2

1
3
1
2
7
1
1
2
0

1
1
1
1
2
0
1
0
1

24
30
6
18
30
36
0
12
12

5
15
5
10
35
5
5
10
0

4
4
4
4
8
0
4
0
4

33
49
15
32
73
41
9
22
16

Medium（＊5） Low（＊4） Total

Internal Biosecuriy

26

15

7

156

75

28

259

10 Pen Layouts
11 Pigflows
12 Cleaning & Disinfection
13 Personnels

2
6
9
2

2
2
3
5

1
0
0
0

12
36
54
12

10
10
15

4
0
0

26
46
69

14

Injection Needles

3

1

1

18

25
5

0
4

37
27

15
16

Delivery Stalls
Health Conditions

4
0

1
1

0
5

24
0

5
5

0
20

29
25

Monitoring Biosecurity

5

12

12

30

60

48

138

Monitoring Tests
Pathology Appraisals
Communications
Sociability

4
0
0
1

8
2
0
2

9
0
3
0

24
0
0
6

45
0
15
0

36
0
12
0

100
10
12
16

17
18
19
20

© The Ito Foundation

222

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

することはないと考え，本研究ではこれらの農場

善することにより抗菌剤総使用量およびマクロラで重度伝染性疾患の発生がなかったことを確認し

イド系の使用量の低減につながることが示唆されたうえで査定結果を採用した。

た。小項目４．人に含まれる具体的なBS対策と

2.3

統計分析

しては，衛生管理区域内への人の入場管理や農場

統計分析はすべてSPSS ver24.（IBM）を用いて行った。まず説明変数となる３大項目と従属変関係者のシャワーイン・アウトの徹底があげられる。

数となる抗菌剤使用量との関係性について単変量

また，最重要抗菌剤に定義５）されるフルオロキ

回帰分析モデルを用いて解析を行った。次にこの

ノロン系および第３・第４世代セファロスポリン

結果を踏まえ，３大項目を細分化した20小項目を系（セフチオフル）の合計使用量とBSスコアと説明変数とし，同様の解析を実施した。

の間では有意な関連は認められなかったが，フルオロキノロン系のみの使用量に注目すると，農場３．結果と考察
3.1

内BSの小項目11．ピッグフローのスコアが高い

記述統計

ほど使用量が少なかった（ｐ＜0.002）（Fig.２）。

33 農 場 に お け る 2015 年 出 荷 豚 頭 数 は 平 均

この小項目11．ピッグフローでは，各生産ステー

15,444.3（SD＝26891.3）頭であり，2015年出荷豚

ジの豚舎のオールイン・オールアウトの徹底レベ

一頭当たりの抗菌剤総使用量は平均27.47（SD＝ルや病豚・出荷残り豚の扱いが評価対象となって23.25）ｇであった。そのうち経口抗菌剤が96％いる。オールイン・オールアウトなどの実施によ以上を占めており，使用量が最も多かった抗菌剤

りフルオロキノロン系抗菌剤による治療を必要とはテトラサイクリン系（43.8％）で，次いでマクする感染性下痢症などの発生が減少しているとも

ロライド系（16.9％），ペニシリン系（11.0％）で推測されるが，さらなる情報収集が必要である。

あった。テトラサイクリン系使用量の内訳は，オ

最後に，ペニシリン系および最も多く使用されキシテトラサイクリン44.9％，ドキシサイクリンているテトラサイクリン系の一つであるドキシサ

42.5％，クロルテトラサイクリン12.5％であった。

イクリンの使用量については，農場外BSのうち

BioAsseTによるBSレベル査定結果の総合スコ

小項目１．農場立地条件のスコアが高いほど少な

アは平均62.3（SD＝12.5）点であった。農場外BSかった（ｐ＜0.002）。すなわち，半径３㎞以内にスコアは平均174.3（SD＝41.6）点，農場内BSス

近隣農場，PRRS陽性農場やと畜場がある農場でコアは平均161.9（SD＝25.9）点，モニタリング

は，そうでない農場より多くのペニシリン系およBSスコアは平均78.2（SD＝22.5）点であった。

びドキシサイクリンを使用していることが判明し

3 . 2 養豚場における抗菌剤使用量と農場BSレた。しかし，農場立地条件は農家の努力で改善することが難しい要因であり，立地条件がこれらのベルとの関連養豚場の抗菌剤使用量を目的変数とし，抗菌剤の使用量に影響を及ぼしている原因を明ら

BioAsseTによるBSレベル査定結果を説明変数にかにしたうえで，具体的な対策を検討する必要が用いた単変量解析の結果は表（Table２）のとおある。

りである。抗菌剤総使用量と農場外BSスコア（特本研究の対象養豚場は，JASV会員獣医師によに小項目４．人に関するBS対策）との間に関連るコンサルティングが行われている養豚場であるが認められ（ｐ＜0.001）（Fig.１），BS対策を改ことから，全国の平均的養豚場よりもBSレベル© The Ito Foundation

223

日本の養豚場における動物用抗菌剤使用に及ぼす要因の疫学的解析―動物用抗菌剤使用量と農場バイオセキュリティレベルの関係―

Table 2 Results of univariable general linear regression models（N＝33）．The figure shows the results with p＜0.2．
Dependent Variables
Independent Variables

Total Antimicrobial Critically Important Fluoroquinolones
Usage
Antimicrobial Usage
Usgae

Macrolides
Usage

Penicilins
Usage

Tetracyclines Doxycycline
Usage
Usage

p-value Adjusted R２ p-value Adjusted R２ p-value Adjusted R２ p-value Adjusted R２ p-value Adjusted R２ p-value Adjusted R２ p-value Adjusted R２
Total Biosecurity Scores

0.005

0.201

Internal & External
Biosecurity Scores

0.001

0.274

External Biosecurity Scores
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

0.000

0.336

Farm Location
Replacement Glits
Purchase of Semen
Personnels
Transport vehicle
Manure & Carcass
Farm Equipments
Vermin Controls
Visitors

0.007

0.185

0.002
0.010
0.013
0.006
0.017
0.014

0.249
0.169
0.156
0.194
0.144
0.153

Internal BS Scores

0.022

0.131

Pen Layouts
Pigflows
Cleaning & Disinfection
Personnels
Injection Needles
Delivery Stalls
Health Conditions

0.131

0.041

0.104
0.030
0.052

0.100

0.053
0.116

0.042

0.006

0.196

0.007

0.189

0.001

0.271

0.003

0.221

0.058

0.075

0.070

0.039

0.102

0.155

0.034

0.000

0.351

0.002

0.246

0.040

0.102

0.033

0.111

0.112

0.050

0.006

0.193

0.002

0.237

0.042

0.126

0.002

0.253

0.080

0.067

0.000
0.004
0.009
0.010
0.060
0.060

0.340
0.211
0.172
0.171
0.081
0.191

0.007

0.185

0.004
0.021
0.133

0.217
0.133
0.041

0.099
0.152
0.135
0.090
0.109

0.056
0.065
0.041
0.061
0.051

0.053
0.118
0.086

0.087
0.047
0.063

0.150

0.036

0.064

0.077

0.022

0.131

0.023

0.129

0.096

0.057

0.019

0.137

0.025
0.046

0.124
0.097

0.096
0.035

0.058
0.108

0.039

0.103
0.137

0.040

0.114

0.049

0.036

0.106

0.154
0.002

0.034
0.237

0.088

Monitoring Biosecurity Scores

0.033

0.111

17
18
19
20

0.029

0.117

Monitoring Tests
Pathology Appraisals
Communications
Sociability

80

.20

60

.15

Flouroquinolone Usage
per fattening pig（g）Ｔｏtal AB Usage per fattening pig
（g）

0.178

40
y=85.59-0.33*x

20

.10

.05

y=0.13-3.3E-3*x

.00

0
100

150

200

10

20
30
40
50
Internal Biosecurity Sub-category No.11
Pigﬂows measurement Scores（Max of 46）

250

External BS Scores（Max of 290）
Fig. 1 Linear regression between External Biosecurity

Fig. 2 Linear regression between Internal Biosecurity

Scores and the Total Antimicrobial Usage per
fattening pig（g）（N＝33，y＝85.59－0.33＊x, adjusted
２
R ＝0.336）．

Sub-category No.11. Pigflows Scores and theFluoroquinolones Usage per fattening pig（g）（N ＝33，y＝0.128－0.003＊x, adjusted R２＝0.237）© The Ito Foundation

224

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）が高い養豚場の割合が多いい可能性がある。しかベルと抗菌剤総使用量およびマクロライド系使用

し，本研究では農場レベルでの抗菌剤使用量と農量との間に有意な関連が認められ（ｐ＜0.001），

場BSレベルとの間に関連が認められ，農場外BS

BSの改善がこれらの抗菌剤使用量の低減につなレベルの向上が抗菌剤使用量の低減につながるこがることが示唆された。また，人医療における最とが示唆された。この結果は，農場外BSスコア

も重要な抗菌剤に定義されるフルオロキノロン系

が高いほど肥育豚における使用量が低くなることに関しては，農場外BSに加えて農場内BS，特に（ｐ＜0.01）を示唆するEU諸国での先行研究の結

豚舎のオールイン・オールアウトや病豚・出荷戻果とも整合性がある 。本研究は横断研究であり，り豚を含めた群の再構成との間に有意な関連が認BSレベルと抗菌剤使用量との間の因果関係を明められた。今後は農家における抗菌剤使用量に影らかにするには十分でない（BSレベルが高いた響を与えるBS以外の潜在的要因に関する農場

めに抗菌剤の使用が不要となっている農家だけでデータも収集し，使用量との関係についてプロス

なく，使用量が多いために衛生状態を改善した農ペクティブに追跡する縦断研究を進めることによ家もいるかもしれない）。今後は農家における抗り，抗菌剤使用量削減のために有効な具体的方策

菌剤使用量に影響を与えるBS以外の潜在的要因を特定できると考える。

６）（特にBSレベルが高いにもかかわらず抗菌剤使用量が多い農家やBSレベルが低いにも関わらず抗菌剤使用量が少ない農家における特異的な要因）
に関する農場データも収集し，抗菌剤使用量との関係についてプロスペクティブに追跡する縦断研究を進めることにより，使用量削減のために有効な具体的方策を特定できると考える。
最後に，本研究における抗菌剤使用量データおよびBioAsseTによる査定データの収集に協力くださった，日本養豚開業獣医師協会（JASV）会
員獣医師および農家に深謝する。
４．要

約

本研究では，日本養豚開業獣医師協会（JASV）
会員獣医師とコンサルティング契約を結ぶ33農場について，2015年の出荷肉豚一頭当たりの年間抗菌剤使用量データおよびBioAsseTを用いた2016
年10月～2017年３月に実施されたバイオセキュリ
ティ（BS）レベルの査定結果を収集し，両者間の関連の解析を行った。その結果，農場外BSレ

文献１）OʼNeill, J. : Review of antimicrobial resistance,
AMR Review Organization, May，2016．
 https://amr-review.org/sites/default/files/160518_
Final％20paper_with％20cover.pdf#search＝％
27O ％ 27Neill％2C＋antimicrobial＋resistance％2C＋review％27２）杉浦勝明，松田真理：平成27年度抗菌性物質薬剤
耐性評価情報整備事業④，動物用抗菌剤の使用量に関する情報整備．
３）PRRS撲滅推進チームJAPAN:http://site-pjet.com/
index.html（最終確認日：2017年４月５日）
４）農林水産省：平成23年度飼養衛星管理基準（豚・いの し し 編），http://www.maff.go.jp/j/syouan/douei/
eisei/e_koutei/kaisei_kadenhou/pdf/buta_pam.pdf ，
2013．
５）WHO : Critically important antibacterial agents forhuman medicine for risk management strategies of
non-human use, http://apps.who.int/iris/bitstre
am/10665/43330/1/9241593601_eng.pdf?ua＝1&ua＝1，2005．
６）Postma, M., Backhans, A., Collineau, L., Loesken, S.,
Sjölund, M., Belloc, C., Dewulf, J. : Evaluation of therelationship between the biosecurity status,
production parameters, herd characteristics andantimicrobial usage in farrow-to-finish pig
production in four EU countries, Porcine HealthManagement.，２（1），９，2016．

© The Ito Foundation

225

食鳥と体皮膚に対するカンピロバクターの付着メカニズムの解明
Elucidation of attachment manner of campylobacters on the skin surfaceof chicken carcasses

三

澤

尚

明

（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

Naoaki Misawa（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

Campylobacter jejuni and C. coli are the leading causes of enteric infections in many
developed countries, and the public health burden due to campylobacteriosis is increasing.
Healthy chickens are considered to act as reservoirs of campylobacters, as the organisms
colonize the intestinal tract. Once infected birds enter a processing plant, contamination ofchicken carcasses with C. jejuni and C. coli occurs over the entire skin during defeatheringand evisceration due to leakage of crop and/or intestinal contents. In the present study, weobserved the morphology of the feather follicles of chicken carcasses after defeathering andchilling. Moreover, we examined the presence of adhesion factors in chicken skin that bind to
C. jejuni. A total of 3,133 feather follicles were examined for morphological change before andafter chilling. Shortly after defeathering, most of the follicles were closed, whereas after chilling
they were either closed or open, even though a low proportion of enlarged follicles had become
closed, suggesting that C. jejuni may not be confined to feather follicles as a result of chilling.
The ability of C. jejuni strain 81-176 to adhere to chicken skin was reduced to one-tenth after
treatment of the skin with NaOH（pH 13.0）, but not with HCl（pH 2.0）, suggesting thatadhesion factors present on chicken skin may be extracted or inactivated by treatment withalkali. Binding of skin extracts with the outer membranes of C. jejuni was confirmed by anoverlay assay. These findings strongly suggest that campylobacters may have a specific modeof attachment to the skin surface of chicken carcasses.

１．目

な理由として，鶏肉は皮付きで流通されることが的挙げられる。すなわち，汚染菌は皮膚表面に存在

厚生労働省の食中毒統計で，細菌性食中毒発生する脂質等の膜状物質の内部にも生息し，皮膚表件数が第一位となっているカンピロバクター食中

面から菌が剥離されにくいこと，皮膚表面の傷や毒の原因食品として重要視されているのが鶏肉

羽毛の毛穴に入った微生物の殺菌が困難であるこで，我々が以前行った調査によると，国産市販鶏と，有機物の存在下では殺菌効果が低下すること

生肉の約７割が本菌に汚染されていた 。その主などが考えられる。

１）© The Ito Foundation

226

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

食鳥処理場では，脱羽工程において約60℃の湯に食鳥と体を浸漬しているにもかかわらず，脱羽直後の皮膚の表面に多数のカンピロバクターが付着すること，ブロイラーと地鶏においてカンピロ

秒間ストマッカー処理を行い，最確数（MPN）
法によりCampylobacter属菌数を測定した。
2 . 2 酸およびアルカリ処理した鶏皮膚を用いたカンピロバクターの付着試験

バクターの汚染菌数は同程度であっても，ブロイ

ブロイラーの中抜きと体の背部から25㎝２の皮ラーに対する殺菌効果が低いことなどが報告され膚を採取し，直径３㎝の円筒の底部に貼りつけてている２）。このことは，カンピロバクターの食鳥固定した。0.01M HCl（pH 2.0）または0.1M NaOHと体表面への付着メカニズムは非常に複雑で，細（pH 13.0）を３ml添加し，室温で30分静置した菌側の要因に加えて食鳥や環境中の要因も関与し後，滅菌蒸留水で３回洗浄した。次に，C. jejuniていることを示唆している。カンピロバクターの81-176株を10３ ～10８cfu/mlに調整した菌液３ml

腸管粘膜上皮に対する付着機序については，病原を皮膚表面に添加し，30分静置した。その後滅菌性解明のための研究テーマとして研究が進んでい

リン酸緩衝液（PBS）で洗浄し，鶏皮膚に付着しるが，食鳥と体表面への付着機序についてはほとた菌数を平板希釈法またはMPN法より定量的にんど明らかにされていない。そこで本研究では，測定した。

鶏皮膚に対する本菌の付着メカニズムを明らかに2.3することを目的としている。

ブロイラーの中抜きと体の背部から25㎝２の皮

２．方

オーバーレイアッセイ法

膚を採取し，皮膚上皮面を0.1M NaOHで処理し法

た抽出液（皮膚アルカリ抽出画分）を収集し，ポ2 . 1 食鳥と体冷却前後の羽毛包の形態的変化

リアクリルアミドゲル電気泳動法によりタンパクを分離したのち，ニトロセルロース膜に転写しとカンピロバクターの汚染調査
15体の脱羽直後の地鶏（地頭鶏）と体を用いた。ブロッキングを行った後，これにC. jejuniて，背側頸部（ｎ＝960），腹部（ｎ＝851），大腿81-176株の外膜タンパク画分を添加し，家兎抗C.

部（ｎ ＝ 684）
，背 部（ｎ ＝ 391）
，股（ｎ ＝ 247）

jejuni 81-176株ポリクローナル抗体および酵素標の羽毛包の写真を撮影した。その際，撮影した各

識２次抗体を用いたオーバーレイアッセイ法によ部位の皮膚をマチ針と焼烙により目印を付けたり，菌体外膜タンパクが結合した皮膚アルカリ抽後，と体を氷水が入ったチャンバーに入れて表面

出画分中のタンパクを検出した。陰性コントロー

温度を４℃まで冷却し，浸漬90分後のと体の同一ルとしてC. jejuniの酸抽出抗原を加えずに一次抗部位の羽毛包の写真を同一角度から撮影した。冷体および酵素標識二次抗体を反応させた。

却前後の羽毛包の面積を画像解析ソフト（Image
J 1.47 Wayne Rasband）を用いて測定した。冷
却前後の羽毛包の面積の有意差検定には，ｔ検定を用いた。

３．結果と考察3 . 1 食鳥と体冷却前後の羽毛包の形態的変化とカンピロバクター汚染調査

３体の地鶏から，羽毛包の形態を観察した頸と体を氷水で冷却すると，羽毛包の形態変化に部，背部，胸腹部，大腿部の皮膚を各２検体，10４パターンが認められた。すなわち，冷却の前後

ｇずつ採材した。各検体に９倍量のプレストン培

で羽毛包が閉じていたもの（ｎ＝2679；85.5％），地（Oxoid）を加え10倍乳剤を作製するため，60

冷却前に閉じていた羽毛包が冷却後に拡大したも© The Ito Foundation

227

食鳥と体皮膚に対するカンピロバクターの付着メカニズムの解明の（ｎ＝187；6.0％），冷却前に開いていた羽毛の影響を調べたところ，水酸化ナトリウム水溶液

包 が 冷 却 後 さ ら に 拡 大 し た も の（ｎ ＝ 184 ；を用いた鶏皮膚の前処理によって，鶏皮膚の表面5.9％），冷却後に羽毛包が縮小したもの（ｎ＝に付着するC. jejuniの菌数が約1/10に減少した

83；2.7％）である（Fig.１）。これらのと体の冷（Fig.３）。一方，鶏皮膚の酸処理が本菌の付着能却後のカンピロバクター汚染を部位別に調べた結に及ぼす影響を調べたところ，塩酸のpHに関わ果 ， 頸 部 で の 汚 染 が 最 も 高 く （0.790 log

らずすべての接種菌数において無処理と比較してcfu/10g），次に背部（0.783 log cfu/10g）と続き，付着菌数に有意差は認められなかった（Fig.４）。

大 腿 部 と 腹 部 の 汚 染 度 は 同 程 度 （0.301 log

これらの結果から，宿主側の皮膚にはC. jejuniに

cfu/10g）であった（Fig.２）。これらの結果から，対する付着因子が存在し，それらはアルカリ処理

羽毛包の開閉と汚染菌数の間には関連性は認められなかった。
Berndtsonらは，湯漬け後の脱羽工程で開いた羽毛包の中に本菌が入り，その後の冷却工程で羽毛包が閉じるため，菌が毛包内に封じ込められるという仮説を提唱した

close→open（n=187；6.0%）
small→enlarged（n=184；5.9%）
enlarged→small（n=83；2.7%）
close→close（n=2679；85.5%）

が，今回の結果より，食３）

鳥と体は脱羽の工程でCampylobacterに汚染されるが，その後の冷却の過程で羽毛包が閉じ，菌が毛包内に封じ込められる可能性は低いことが示唆された。
3 . 2 酸およびアルカリ処理した鶏皮膚を用いたカンピロバクターの付着試験と体への付着能に及ぼす鶏皮膚のアルカリ処理

examined after chilling.
M orphological changes in the feather follicles ofchicken carcasses after defeathering and chillingwere evaluated using image analysis software.

No. of campylobacters isolated

1.6% of feather follicles closed
after chilling

1.4
1.2

7.0
6.0
5.0

1.0

4.0

0.8

3.0

0.6

2.0

0.4

1.0

0.2
0.0

% of feather follicles closed after chilling

No. of campylobacters (log cfu /10g)

1.8

Fig. 1 Morphological changes of feather follicles

0.0
Dorsal neckThoracoabdominal

Back

The femur

Fig. 2 Ratio of closed feather follicles and contamination by campylobacters in different

parts of the skin of chicken carcasses after chilling© The Ito Foundation

228

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

No. of recovered C. jejuni（log cfu/100cm2）

7
6
5
4
＊

3

＊

2

● Treated with PBS〇 Treated with NaOH（pH 13.0）

1＊

P<0.05

0
3

4
5
6
7
No. of inoculated bacteria（log cfu/ ml）

8

Fig. 3 Effect of alkaline treatment on adhesion of C. jejuni to the chicken

skinThe counts of C. jejuni adhering to the back skins of broiler chickens

No. of recovered C.jejuni（log cfu/100cm2）

treated with sodium hydroxide （pH 13.0） were compared to those ofcontrols treated with PBS.

8
7
6
5
4
3
● Treated with PBS〇 Treated with HCl（pH 2.0）

2
1
0
3

4

5

6

7

8

No. of inoculated bacteria（log cfu/ ml）
Fig. 4 Effect of acid treatment on adhesion of C. jejuni to the chicken

skinThe counts of C. jejuni adhering to the back skins of broiler

chickens treated with hydrochloric acid （pH 2.0）were comparedto those of controls treated with PBS.

により遊離あるいは不活化された可能性が示唆された。

3 . 3 オーバーレイアッセイ法による鶏皮膚ア
ルカリ抽出画分に存在するC. jejuniの付着因子の検出© The Ito Foundation

食鳥と体皮膚に対するカンピロバクターの付着メカニズムの解明
KDa

M

229

腸内容物が漏出し，と体表面にカンピロバクター

Skinが付着したためと考えられているが，その付着機序を明らかにするまでには至っていない。本研究75

では，C. jejuniがブロイラー皮膚に存在する付着因子を介して特異的に結合しているとの作業仮説
を立て，皮膚に存在する付着因子の存在を確認す
ることを試みた。まず，湯漬け後の脱羽工程で開いた羽毛包の中にカンピロバクターが入り，その後の冷却工程で羽毛包が閉じるため，菌が毛包内25に封じ込められるという汚染機序の仮説を検証す
Fig. 5 Detection of adhesion factors in extracts ofchicken skin binding to the outer membranes ofC. jejuni strain 81-176 using an overlay assay
M; molecular maker, Skin; chicken skin extractions.
Arrows represent positive bands.

るため，脱羽後と冷却後の羽毛包の形状を比較した。その結果，羽毛包の大部分は脱羽後と冷却後においても閉鎖しており，開いた羽毛包が冷却後に閉じる割合は低く，カンピロバクターの汚染菌

鶏皮膚上皮のアルカリ処理画分には，カンピロ

数と羽毛包の開閉には関連が認められなかった。

バクターの付着因子の存在を示唆する結果が得ら

次に，食鳥と体皮膚上皮をアルカリ処理すると本れたため，オーバーレイアッセイ法によるブロイ

菌の皮膚への付着能が低下したが，酸処理では変ラー皮膚アルカリ抽出画分と菌体外膜タンパクと化しなかった。オーバーレイアッセイ法によるブの結合試験を行った。その結果，皮膚上皮のアルロイラー皮膚アルカリ抽出画分と菌体外膜タンパ

カリ処理画分に複数の付着因子が検出された

クとの結合試験では，複数の付着因子が検出さ（Fig.５）。よって，食鳥処理工程で起こる本菌のれ，食鳥処理工程で起こる本菌のと体への汚染と体への汚染は，物理的な付着だけでなく，特異は，物理的な付着だけでなく，特異的な付着機序

的な付着機序の存在が強く示唆された。

の存在が強く示唆された。

４．要

約

Campylobacter jejuni（以 下 ，C. jejuni）は 世
界各国で人の主要な食水系感染症の起因菌として重要視され，疫学調査の結果から鶏肉とその関連調理食品が主な感染源と考えられている。カンピ
ロバクターを保菌した食鳥が処理場に搬入されると，処理場内では容易に交差汚染が起こる。特に，脱羽処理後では，いずれの部位からも高い菌数のカンピロバクターが分離されることから，脱羽処

参考文献１）三澤尚明，近藤房生，後藤公吉，斎藤志保子，川森文彦，小野一晃，重茂克彦，品川邦汎：人および鶏肉由来Campylobacter jejuni HS：２およびHS：19
血清型株のPCR-RFLP法による遺伝子解析，日獣会
誌，56，471～475，2003．
２）三澤尚明：食鳥処理場におけるカンピロバクター
制御法の現状と課題：日獣会誌，65，617～623，
2012．
３）Berndtson, E., Tivemo, M., Engvall, A.: Distribution
and numbers of Campylobacterin newly slaughteredbroiler chickens and hens, Int. J. Food Microbiol.，
15，45～50，1992.

理によると体の物理的な圧迫により総排泄腔から© The Ito Foundation

230

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究２（コンベンショナル豚）
Experimental infection with porcine deltacoronavirus in conventional pigs

鈴

木

亨・大

橋

誠

一・須

田

遊

人

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究部門）

Tohru Suzuki, Seiichi Ohashi and Yuto Suda
（National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research Organization, NARO）

Deltacoronaviruses were first identified in rectal swab samples from several birds andmammals including pigs collected in Hong Kong in 2006-2011．Porcine deltacoronaviruses（PDCoVs）were also detected in United States and Korea in 2014. PDCoV is currently one ofcommon enteric viral pathogen in pigs, because pigs inoculated with only PDCoV show
diarrheas. In recent years, we discovered multiple PDCoVs from fecal samples with PEDV-and
TGEV-specific PCR negative collected around Japan since 2013, when PED re-emerged. In ourprevious study, we characterized clinical signs, virus shedding in feces and sera, and viral
distribution in various tissues of hysterectomy-produced and colostrum-deprived（HPCD）
piglets（3 days old）orally inoculated with PDCoV, YMG/JPN/2014, isolated in ST cell culture.
In this study, we performed experimental infections in conventional piglets（they can suckle
freely colostrum and nature milk from sows）using the inoculums identical with those in
HPCD piglets. In results, conventional piglets inoculated with the PDCoV showed mild
symptoms during the observation period as compared with those of HPCD piglets inoculatedwith the same strain. Our data suggests that suckling milk from sow is important to prevent
piglets from the enteric pathogens exist outside them.

１．目

している最中である2014年に，下痢を呈した個体

的から初めて豚デルタコロナウイルスが検出され，近年，アルファ，ベータ，ガンマコロナウイル

その後の遡り調査によって少なくとも2010年にはス属に次ぐ４番目の新しい属に分類される新型コ

豚デルタコロナウイルスが米国に侵入していたこ

ロナウイルス，すなわちデルタコロナウイルスがとが明らかとなっている３，４）。

多種多様な鳥類および数種の哺乳類で検出され米国での豚デルタコロナウイルスの発見を受けた 。さらに，Wooらの研究グループは2009年かて，我が国でもPEDの発生が後を絶たない状況

ら2010年にかけて香港で採取した豚糞便から新たであった2014年に，当所において，豚伝染性胃腸に豚デルタコロナウイルスを検出した２）。また米炎（TGE）ウイルス陰性かつPEDウイルス陰性

国では，豚流行性下痢（PED）が全国的に流行であり下痢が発生した農場の検体を対象に，豚デ１）© The Ito Foundation

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究２（コンベンショナル豚）

231

ルタコロナウイルスの浸潤状況調査を実施した。

した豚デルタコロナウイルス株（YMG/JPN/2014）

その結果，我が国では少なくとも2014年２月の時を使用した。なお，感染価は10６TCID50/mlであっ点で豚デルタコロナウイルスが国内に侵入していた。

たことが明らかとなった。また，日齢別の陽性数

2.2は哺乳豚が最も高く，次いで肥育豚や繁殖豚など

民間企業から妊娠母豚を購入し，当所動物実験の年齢が進んだ成豚でも比較的高い割合で陽性個施設において自然分娩させ，子豚計12頭を得た。

体が検出されることが明らかとなった。

分娩後，子豚は母乳（初乳，常乳）を自由に摂取

米国ではすでに２つの研究グループによって，子豚を用いた感染実験が実施されている豚への感染実験できる環境で飼育・管理した。子豚は３日齢時で。し

上記ウイルス株を２mlずつ経口投与され，投与かしながら，使用しているウイルス株（野外由来後29日目（約４週間）まで臨床症状および感染動株あるいは細胞分離株）やウイルス接種時の豚の態を観察した。ウイルス投与後から８日間，糞便

日齢が異なるために，少なくとも子豚に対して下は１―２日おきに，血液は２日おきに各個体から痢を引き起こすことは明らかであるが，その他の採取した。８日目以降は，糞便，血液ともに３―

病態に関しては一致した知見が得られていない。

４日間隔で経時的に採取した。また，本ウイルス

そのため，PEDやTGEとの類症鑑別上不可欠で株の体内分布を調べるために，投与後４日目と８ある豚デルタコロナウイルス特有の臨床症状や感日目で，４頭ずつを解剖し，残りの４個体は観察

染動態はいまだに把握できないままである。

終了時に解剖した。解剖時には，主要臓器，消化５，６）

申請者は昨年度感染症に対して感受性が高い子器官（胃，小腸，大腸）ならびに免疫器官（腸管

宮摘出初乳未摂取子豚を用いて，豚デルタコロナ

膜リンパ節，扁桃）を採取し，ウイルス学的解析

ウイルスの感染実験を実施し，本ウイルス特有のに供した。

これら子豚における臨床症状および感染動態を明2.3

らかにした。しかしながら，子宮摘出初乳未摂取

採取した糞便はリン酸緩衝液で希釈して20％乳

子豚は微生物学的に無菌豚であるため，ウイルス剤を作製し，遠心分離（3000×g，10分）により単独さらに特有の病原性を詳細に解析するには適夾雑物を取り除いた上清をRNA抽出に供した。

しているが，実際に生産現場における状況をよりまた，採取した血液は遠心分離（3000×g，10分）

よく反映しているかという点には疑問が残る。そを行い，血清のみを使用した。解剖時に採取したこで，今年度は微生物学的に生産農場と同等のグ

各種臓器はホモジナイザーで粉砕し，リン酸緩衝

レードの子豚（コンベンショナルな子豚）を対象

液で希釈して20％乳剤を作製し，遠心分離（3000に，感染実験を実施し，子宮摘出初乳未摂取子豚×g，10分）により夾雑物を取り除いた上清をの感染実験で得られた結果の再現性を解析・検証

RNA抽出に供した。ウイルスRNAは市販のキッすることを試みた。

ト（QIAmp Viral RNA mini kit）を 用 い て ，手

２．方
2.1

ウイルス学的解析

順書に従って抽出した。抽出したウイルスRNA

法

は豚デルタコロナウイルスのＭ遺伝子をターゲットとしたプライマー・プローブセットならびにスウイルスと細胞昨年度と同様に，山形県内で発生した下痢を発症した豚の小腸内容10％乳剤からST細胞で分離

タンダードを用いてリアルタイムRT-PCRで定量・解析した。

© The Ito Foundation

232

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

3 . 2 糞便中および血中におけるウイルス排泄３．結果と考察3.1

量
糞便中および血中に排泄されるウイルス量の経臨床症状

個体間で程度に差はあるが，いずれの個体も一時的変化をFig.１に示した。なお，本図には参考

過的に元気消失や軽い下痢（軟便）を示した程度

として昨年度の研究成果である子宮摘出初乳未摂

であり，観察期間を通じて顕著な臨床症状は認め

取子豚における糞便中および血中に排泄されるウられなかった。また，すべての個体が観察期間を

イルス量の経時的変化も合わせて表示した。糞便通じて生存した。本結果は本研究に用いたウイル中に排泄されるウイルス量は投与後６日目前後かス株を分離した野外（農場）での結果を反映する

ら上昇し，投与後11日目あるいは14日目でピークものであった。

（糞便１mlあたり10８―10９コピー数）に達し，そPost-infection

29dpi

21dpi

17dpi

14dpi

11dpi

8dpi

6dpi

25dpi

1.00E+03
27dpi

1.00E+03

20dpi

1.00E+05

14dpi

1.00E+05

11dpi

1.00E+07

8dpi

1.00E+07

7dpi

1.00E+09

6dpi

1.00E+09

4dpi

1.00E+11

2dpi

1.00E+11

4dpi

1.00E+13

2dpi

1.00E+13

0dpi

29dpi

25dpi

21dpi

1.00E+03
17dpi

1.00E+03
14dpi

1.00E+05

8dpi

1.00E+05

11dpi

1.00E+07

6dpi

1.00E+07

4dpi

1.00E+09

3dpi

1.00E+09

2dpi

1.00E+11

1dpi

1.00E+11

0dpi
1dpi
2dpi
3dpi
4dpi
5dpi
6dpi
7dpi
8dpi
11dpi
14dpi
17dpi
20dpi
24dpi
29dpi

Ｇｅnomic copies/ml（Ｂ）

Virus shedding in sera
1.00E+130dpi

Virus shedding in feces
1.00E+13

0dpi

Ｇｅnomic copies/ml（Ａ）

Post-infection

Fig. 1 Virus shedding in feces and sera of conventional（A）and gnotobiotic（B）piglets inoculates with YMG/JPN/2014.
Indivisual virus shedding（shown in different colors）was detected by a quantitative porcine deltacoronavirus

membrane（M）gene specific real-time RT-PCR at each time point.

© The Ito Foundation

豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究２（コンベンショナル豚）の後徐々に減少して投与後29日目（観察最終日）
ではほぼ検出限界以下となった。子宮摘出初乳未

４．要

233

約

摂取子豚の糞便中に排泄されるウイルス量の経時

今年度は微生物学的に生産農場と同等のグレー的変化と比べると，排泄開始時に遅れがあるととドの子豚（コンベンショナルな子豚）を対象に，もに，排泄されるウイルス量も少ないことが明ら

昨年度実施した子宮摘出初乳未摂取子豚の感染実かとなった。次に，血中に排泄されるウイルス量

験と同じ条件（ウイルス接種時の日齢，用いたウは一過的に上昇（投与後４日目あるいは６日目でイルス株および接種量など）で感染実験を実施しピーク）を示すが，観察期間を通じてほとんど検た。ウイルスを接種されたコンベンショナルな子

出限界以下であった。また，子宮摘出初乳未摂取

豚は子宮摘出初乳未摂取子豚の場合と比べて，顕子豚の血中に排泄されるウイルス量の経時的変化

著な臨床症状（水様性下痢など）を示さないまと比べると，排泄期間および排泄量ともに著しく

ま，すべての個体が観察期間を通じて生存した。

少ないことが明らかとなった。以上のことから，

また，糞便中および血中のウイルス排泄期間およ

本研究に用いたコンベンショナルな子豚は子宮摘び量に関して，両者で顕著な相違が認められた。

出初乳未摂取豚と比べて，特に感染初期において

すなわち，コンベンショナルな子豚は子宮摘出初ウイルスの増殖が抑えられていることが明らかと

乳未摂取子豚と比べて，ウイルス排泄期間およびなった。コンベンショナルな子豚は母豚の初乳お量が少ないことが明らかとなった。その一方で，よび常乳が自由摂取であったことから，それらにいずれの子豚においても感染から１週間程度は本含まれる免疫成分によりウイルスの増殖が抑えらウイルスは主に空腸～大腸で活発に増殖している

れ，症状が緩和されている可能性が示唆された。

が，時間経過に伴いウイルスが消失していくこと

3.3

豚デルタコロナウイルスの体内分布が示唆された。本研究により，コンベンショナル

投与後４日目，投与後８日目および投与後29日

な子豚は母乳に含まれる免疫成分により本ウイル

目にそれぞれ４頭ずつを解剖し，リアルタイム

スの増殖が効果的に抑えられ，臨床症状が緩和さ

RT-PCRを用いて各種臓器におけるウイルス量をれている可能性が示唆された。したがって，母豚定量・解析した。投与後４日目および８日目での健康状態を良好に保ちつつ，その母乳を子豚には，特に空腸下部から結腸にかけて多数のウイル

しっかりと与えることは感染症を防御するうえでスが存在していることが示された。また，腸間膜重要であることが示唆された。

リンパ節を除く他の免疫器官および主要臓器ではウイルスの存在はほとんど認められなかった。投与後29日目では，回腸以外の臓器でウイルス遺伝
子は検出されなかった。これらの結果は昨年度行った子宮摘出初乳未摂取子豚における解析結果
およびChenらによって報告された結果とほぼ同様の結果であった６）。すなわち，豚デルタコロナ
ウイルスは主に子豚の空腸から大腸にかけて存
在・増殖していることが明らかとなった。

文
献１）Woo, P. C., Huang, Y., Lau, S. K., Yuen, K. Y.:
Coronavirus genomics and bioinformatics analysis,
Viruses，2，1804～1820，2010．
２）Woo, P., Lau, S., Lam, C., Lau, C., Tsang, A., Lau, J.,
Bai, R., Teng, J., Tsang, C., Wang, M., Zheng, B.,
Chan, K., Yuen, K.: Discovery of seven novel
mammalian and avian coronaviruses in the genus
deltacoronavirus supports bat coronaviruses as thegene source of alphacoronavirus andbetacoronavirus and avian coronaviruses as thegene source of gammacoronavirus anddeltacoronavirus, J Virol，86，3995～4008，2012．

© The Ito Foundation

234

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）３）Wang, L., Byrum, B., Zhang, Y.: Detection andgenetic characterization of deltacoronavirus in pigs,
Ohio, USA, 2014, Emerg Infect Dis，20，1227～1230，
2014．
４）Marthaler, D., Raymond, L., Jiang, Y., Collins, J.,
Rossow, K., Rovira, A.: Rapid detection, complete
genome sequencing, and phylogenetic analysis of
porcine deltacoronavirus, Emerg Infect Dis，20，1347～1350，2014．
５）Jung, K., Hu, H., Eyerly, B., Lu, Z., Chepngeno, J.,

Saif, L. J.: Pathogenicity of 2 porcine deltacoronavirus
strains in gnotobiotic pigs, Emerg Infect Dis，21，650～654，2015．
６）Chen, Q., Guger, P., Stafne, M., Thomas, J., Arruda,
P., Burrough, E., Madson, D., Brodie, J., Magstadt, D.,
Derscheid, R., Welch, M., Zhang, J.: Pathogenicity
and pathogenesis of a United States porcinedeltacoronavirus cell culture isolate in 5-day-old
neonatal piglets, Virology，482，51～59，2015.

© The Ito Foundation

235

遺伝子操作技術を駆使した生後感染型アカバネウイルスの病原性決定基の同定と流行ウイルス予測への応用
Identification of pathogenic determinant of Akabane virus by using
reverse genetics and application for endemic prediction of virus

正

谷

達

謄

（鹿児島大学共同獣医学部）

Tatsunori Masatani（Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Akabane virus（AKAV）is an arthropod-borne virus（arbovirus）which causes Akabane
disease when susceptible cattle are infected. The main clinical signs of Akabane disease arecongenital abnormalities in the fetus; however, some AKAV variant strains cause
encephalomyelitis in adult cows. The gene（s）responsible for the pathogenesis and mechanismof encephalomyelitis in adult cows is still unknown. To reveal the mechanism of AKAV
pathogenesis, we tried to establish a reverse genetics system of virulent AKAV strains. To
determine the full-genome RNA sequences of virulent AKAV strains recently isolated inJapan, we utilized KM-2/Br/06, an AKAV strain which has broken out on a large scale insouthern Japan in 2006, and FI-1/Br/08, an AKAV strain which caused neurological symptoms
in adult cattle in Fukui Prefecture in 2008, and then we performed the 5ʼ-rapid amplification of
cDNA ends（RACE）and 3ʼ-RACE, and RT-PCR on the basis of sequences determined by
5ʼ-and 3ʼ-RACEs. Finally, we constructed full genome plasmids containing sequences of sense
RNA segments driven by T7 polymerase, with the 3ʼ ends trimmed by the hepatitis delta virus
ribozyme. Following transfection with the plasmids, we rescued the infectious viruses. Further
studies will be needed to check the biological characteristics of the rescued recombinantviruses.

１．目

ことで感染が拡大する。本ウイルスは，通常は牛的に対する病原性は低く，無症状のまま耐過する。

アカバネ病は，ブニヤウイルス科に属するアカ

しかし，本ウイルスが妊娠牛に感染し子宮内の胎バネウイルス（AKAV）によって引き起こされ仔に到達・増殖した場合，流産・死産および仔牛る牛の疾病である。AKAVは小型吸血昆虫（蚊，の奇形を生じる。このため，本疾病による牛繁殖

ヌカカなど）によって媒介され，夏季―秋季に鹿農家へ対する経済的ダメージは大きい。AKAV

児島・熊本・宮崎県など南日本を中心に毎年流行に対するワクチンは存在するものの，いまだに毎する。AKAVは感染宿主の血中で一過性に増殖

年散発的に発生しており，時として数十戸の農家

し，媒介昆虫がこれを吸血し，他の牛を刺咬するに同時発生して多大な損害を与える。そのため，© The Ito Foundation

236

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

牛繁殖農家にとっては対策を要する疾病の一つででは，これら技術をAKAVに応用することで，ある。特に，流行地である南日本は我が国の重要生後感染AKAVと通常型AKAVの病原性の違い

な肉牛生産基地でもあるため，予防の徹底が求めを決定する遺伝子領域をアミノ酸レベルで同定すられている。

ることを目的とした。

AKAVは，本ウイルスを保有する小型吸血昆虫が季節風に乗って春―夏にアジアから日本へ上

２．方法

陸し，毎年異なるウイルス株が日本南部を中心に

2.1

細胞

各地に流行する。このため越境性動物疾病としてハムスター肺由来HmLu-１細胞及びBHKT７-

も重要な感染症であり，動物衛生研究所や家畜保５）９細胞（岐阜大学・伊藤直人博士より分与）を健衛生所よる媒介昆虫のサーベイランスが定期的用 い た 。こ れ ら 細 胞 は と も に 10 ％ Tryptoseに行われ，その年に流行する株を予測している。

phosphate broth，５％牛胎仔血清およびペニシ

これらAKAV株の中には，上述の胎仔にのみ病

リン・ストレプトマイシンを含むイーグル最小必原性を発揮する「通常型」のAKAVとは異なり，

須培地（EMEM, Wako）で培養した。

成牛に対して致死的な非化膿性脳炎を引き起こす

2.2「生後感染型」と呼ばれるウイルス株が存在し，2006年に熊本県で集団流行した際に分離された我が国でも度々流行している

ウイルス。生後感染型ウ

KM-2/Br/06株２），2008年に福井県で分離された

イルスによる被害は通常型ウイルスに比べて甚大

FI-1/Br/08株３）およびAKAVのプロトタイプでであり，2006年に熊本県・鹿児島県で集団流行しあるJaGAr39株は，動物衛生研究所より供与された際は数百頭を超える被害を出している３）。しかた も の を 使 用 し た 。こ れ ら ウ イ ル ス は す べ てし，その病原性発現メカニズムは不明であり，まHmLu-１細胞で増殖させたのちストックウイル

たどの遺伝子領域の変異が両タイプの病原性の違スとして分注し，使用するまで－80℃にて保存さいを決定しているのかは不明である。我々は，生れた。

後感染型AKAVの病原性を決定する遺伝子領域

2.3

およびそのアミノ酸配列が同定されれば，流行前

ストックウイルス140μｌをもとに，QiaAmpの媒介昆虫サーベイランスの際に当該遺伝子領域

Viral RNA Mini Kit（Qiagen）を 用 い て RNA をを解読することで，生後感染型AKAVの早期摘添付のプロトコールに基づいて抽出した。抽出さ発，流行予測ならびにワクチン接種の徹底を農家れたRNAは濃度・純度を測定後，使用するまでへ周知するうえでの科学的根拠となりうる「ウイ－80℃にて保存された。

１，２）

2.4

ルス予報」の一助になると考えた。

RNA抽出

RACE

我々はこれまでに，狂犬病ウイルスにおいて遺各ウイルスの全ゲノムRNA配列のうち３ʼおよ

伝子組換え技術（リバースジェネティクス）を駆び５’末端の配列は，Liらの方法６）を改変した以使し，強毒株と弱毒株の遺伝子を入れ替えたキメ

下 に 示 す rapid amplification of cDNA ends

ラウイルスを作出しその性状（増殖性，病原性，（RACE）法によって決定した。

免疫回避能力など）を比較することで，どの遺伝

3’-RACE：抽出したウイルスRNA（１μｇ）に子のどのアミノ酸の変異がウイルスの病原性を決DT88アダプター（5ʼ-GAAGA GAAGG TGGAA

めているかを明らかにしてきた 。そこで本研究

ATGGC GTTTT GG-3’：３’末端をcordecypin修４）© The Ito Foundation

遺伝子操作技術を駆使した生後感染型アカバネウイルスの病原性決定基の同定と流行ウイルス予測への応用

237

飾および５’末端をリン酸修飾したもの）を，T4

2.6

フルゲノムプラスミドの構築

RNA ligase 1（New England Biolabs）を用いて

Ｔ７プロモーター配列，２つのEsp3Iサイトお結合させ，さらにDT88と相補的なプライマーであよびデルタ肝炎ウイルス由来リボザイム配列を有る DT89 （5’-CCAAA ACGCC ATTTC CACCTするpT7-riboSM2７）は，Friedemann Weber教授

TCTCT TC-3’）およびPrimescript II first strand（ギーセン大学）より分与された。Esp3Iで消化し

cDNA synthesis kit（タ カ ラ バ イ オ）を 用 い てたpT7-riboSM2に，同じくEsp3Iで消化した各ウ

cDNAを合成した。得られたcDNAをRNaseH（タイ ル ス ゲ ノ ム 配 列 を DNA Ligation Kit Mighty

カ ラ バ イ オ）に よ り 処 理 し た の ち ，InnuPrep

Mix（タカラバイオ）を用いて挿入した。

PCR Pure Light Kit（Analytik Jena）に よ っ て

2.7

トランスフェクション

精製した。

BHKT７-９細胞にTransIT-LT１を使用して，5’-RACE：抽出したウイルスRNA（１μｇ）を各株についてフルゲノムプラスミドを既報に従い用いて，AKAV各分節５’末端特異的プライマーを

トランスフェクションした ８）。トランスフェク

用いてPrimescript II first strand cDNA synthesis

ション後４日目に細胞培養上清を回収し，新たにkitによりcDNAを合成した。RNaseHにより処理

コンフルエントになるよう培養したBHKT７-９

したのち，InnuPrep PCR Pure Light Kitによっ細胞に接種した。４日後に細胞を４％パラホルムて精製し，3’-RACE同様DT88をcDNAに結合さアルデヒドにて固定し，メタノールによって膜透せた。

過処理を行ったのち，抗AKAV Mタンパク質モ

5’-および3’-RACEともに，得られたcDNAを

ノクローナル抗体（東京大・堀本泰介教授より分鋳型とし，Tks Gflex DNA polymerase（タカラ与）にて間接蛍光抗体法を行うことによって感染バイオ），AKAV各分節の３’または５’末端特異的性ウイルスの有無を評価した。

プライマーおよびDT89を使用してSemi-nested
PCRを行った。得られた増幅産物をTOPO Zero

３．結果と考察blunt PCR cloning kit（Invitrogen）によってク

今回，Ｔ７プロモーターをプロモーターとし，ローニングし，得られたプラスミドを４クローン

デルタ肝炎ウイルス由来リボザイムによって転写精製した。シークエンス解析によって各ウイルス

産物の末端を成形し，ウイルスゲノムとして産生の３’および５’末端配列を決定した。

させるようにフルゲノムプラスミドを設計した

2.5（Fig. 1A）。全長ウイルスゲノムRNA分節をPCR

RT-PCR

抽出した各ウイルスRNAより，Primescript IIに よ り 増 幅 す る に あ た り ，KM-2/Br/06 株 ，first strand cDNA synthesis kit に よ り ラ ン ダ ム

FI-1/Br/08株およびJaGAr39株の各３ゲノム分

ヘキサマーを用いてcDNAを合成した。これを鋳節について両末端の配列が不明であったため，5’型とし，後述のpT7-riboSM2ベクターに入るよ-RACEおよび3’-RACEによってそれぞれの末端

うに，制限酵素Esp3Iサイトを各ウイルスゲノム

配列を決定した。その結果，各ウイルスともに，オRNA配列の両端に付くよう設計されたプライ

ルソブニヤウイルス属の３つのゲノム分節すべて

マーを用いて，RT-PCRにより全ゲノム配列を増で保存されているとされる両端７塩基（３’末端：3’幅した。酵素はPrimestar MAX（タカラバイオ）-AGTAGTG-5’および５’末端：3’-CACTACT-5’）を使用した。

は保存されていた。これら塩基は互いに相補的配© The Ito Foundation

238

平成28年度A

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

RNA segment of AKAV strains（S, M or L）

T7

AGTAGTG・・・・・CACTACTHD

pT7ribo-AKAV S/M/L

B
M
S

L

Cell（BHKT7-9）

Full-genome plasmids

Expression ofviral proteins

Viral genomic RNA

Transfection

Recombinant viruses

Nucleocapsid
formation

Nucleus

Replication ofviral genomic RNA

Fig. 1 Reverse genetics system of AKAV.
A: Schematic representation of full-genome plasmids.
T7 promoter（T7）and HDV ribozyme（HD）are shown.
B: Schematic figure of reverse genetics for AKAV.

列であり，感染細胞およびウイルス粒子中で相補ができた。しかし，感染細胞数が少なかったこと，的結合し，ゲノムRNAをヌクレオカプシド化す

トランスフェクション後４日目においてもるのに重要であると考えられた。

AKAV感染時に特徴的な細胞変性効果（CPE）

各ウイルスについて，３つの分節について全塩が認められなかったことから，トランスフェク

基配列を決定したのち，pT7-riboSM2のEsp3Iサ

ション効率およびウイルス培養条件の最適化が必

イトに各配列を挿入した。挿入後，改めて全塩基要であると考えられた。

配列を確認したのち，これらを各ウイルスについ

今後，条件最適化によってウイルスを回収できて３分節分のプラスミドをセットでBHKT７-９

た場合，得られた組換えウイルスの性状（増殖細胞ヘとトランスフェクションした（Fig. 1B）。

性，プラーク形成性，マウスへの病原性など）に

トランスフェクション後，４日間観察を続けた

ついて親株と比較するほか，各分節をウイルス間が，細胞に著変はみられなかった。感染性粒子がで交換した「人工リアソータント株」を作出し，得られていることを確認する目的で，トランス病原性に関与するウイルスゲノム分節およびコー

フェクション後４日目の細胞上清を遠心し，これドされるタンパク質の同定を行っていく予定であを新しく培養したBHKT７-９細胞ヘと接種した。

る。

間接蛍光抗体法によってAKAV感染細胞の有無を評価したところ，いずれの株についても，感染５日目においてわずかに感染細胞を確認すること

４．要約

アカバネウイルス（AKAV）は小型吸血昆虫© The Ito Foundation

遺伝子操作技術を駆使した生後感染型アカバネウイルスの病原性決定基の同定と流行ウイルス予測への応用（蚊，ヌカカなど）によって媒介される牛のウイルスである。AKAV株の中には，妊娠牛に感染
し胎仔に病原性を発揮するタイプの株と，成牛に対しても致死的な非化膿性脳炎を引き起こす「生後感染型」と呼ばれるタイプの株が存在する。しかし，両タイプの病原性の違いを決めるウイルス
遺伝子やそのメカニズムは不明である。そこで本
研究では，生後感染型株の病原性発現機構を明らかにするために，種々の生後感染型株AKAV株の遺伝子操作系を確立することを目的とした。
2006年に熊本県で集団流行した際に分離された
KM-2/Br/06株，2008年に福井県で分離された
FI-1/Br/08株について全ゲノム分節RNA配列を解読する目的で，まず5’-RACE法および3ʼ-RACE
法によって３本のゲノムRNA分節の両末端を解読・決定した。決定された両末端配列に基づいてゲノムRNAをRT-PCRによって増幅し，各ゲノ
ム分節の上流にＴ７プロモーター配列を，下流にデルタ肝炎ウイルス由来リボザイム配列を付した形でフルゲノムプラスミドを両ウイルスの全分節について構築した。
文献１）Miyazato, S., Miura, Y., Hase, M., Kubo, M., Goto, Y.,
Kono, Y.: Encephalitis of cattle caused by Iriki
isolate, a new strain belonging to Akabane virus,

239

Nippon Juigaku Zasshi，51，128～136,1989．
２）Kato, T., Yanase, T., Suzuki, M., Katagiri, Y.,
Ikemiyagi, K., Takayoshi, K., Shirafuji, H., Ohashi, S.,
Yoshida, K., Yamakawa, M., Tsuda, T.: Monitoring
for bovine arboviruses in the most southwesternislands in Japan between 1994 and 2014, BMC Vet
Res，12，125，2016．
３）Kono, R., Hirata, M., Kaji, M., Goto, Y., Ikeda, S.,
Yanase, T., Kato, T., Tanaka, S., Tsutsui, T., Imada,T., Yamakawa, M.: Bovine epizootic
encephalomyelitis caused by Akabanevirus insouthern Japan, BMC Vet Res，4，20，2008．
４）Masatani,T., Ito, N., Shimizu, K., Ito, Y., Nakagawa,
K., Sawaki, Y., Koyama, H., Sugiyama, M.: Rabies
virus nucleoprotein functions to evade activation of
the RIG-I-mediated antiviral response, J Virol，
84，4002～4012，2010．
５）Ito, N., Takayama-Ito, M., Yamada, K., Hosokawa,J., Sugiyama, M., Minamoto, N.: Improved recoveryof rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia
virus-free reverse genetics system, Microbiol
Immunol，47，613～617，2003．
６）Li, Z., Yu, M., Zhang, H., Wang, H. Y., Wang, L. F.:
Improved rapid amplification of cDNA ends（RACE）
for mapping both the 5ʼ and 3ʼ terminal sequences ofparamyxovirus genomes, J Virol Methods，130，154～156，2005．
７）Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F.:
T7RNApolymerase-dependent andindependentsystems for cDNA-basedrescue of
RiftValleyfevervirus, J Gen Virol，89，2157～2166，
2008．
８）Takenaka-Uema, A., Sugiura, K., Bangphoomi, N.,
Shioda, C., Uchida, K., Kato, K., Haga, T., Murakami,S., Akashi, H., Horimoto, T.: Development of an
improved reverse genetics system for Akabanebunyavirus, J Virol Methods，232，16～20，2016．

© The Ito Foundation

240

ジビエとして食される野生動物が保有する食中毒菌の薬剤耐性Drug resistance of food-borne bacteria isolated from game meat animals

安

藤

匡

子

（鹿児島大学農水産獣医学域獣医学系）

Masako Andoh（Research field in Veterinary Medicine, Agriculture, Fishery and Veterinary Medicine Area, Kagoshima University）

Consumption of game meat is becoming popular due to the increasing number of hunted
animals in order to control wildlife population in Japan. However, food hygiene control for gamemeat processing needs to be improved to prevent foodborne illness which include bacterial
infections. To support improvement of food safety management, food borne-bacteria carriage
and drug resistance of isolates in wild deer and boar were investigated. Fresh fecal samples
from 306 deer and 211 boars were collected. Shiga toxin-producing Escherichia coli was
isolated from 50 deer（16.3％）and 3 boars（1.4％）．O serotypes of the isolates included O157
and O26 that may cause serious disease to human. Drug resistant screening against Ampicillin,
Cefazolin, Cefotaxime, Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Oxytetracycline, Colistin,
Nalidixic acid, and Ciprofloxacin was conducted and a Streptomycin and Oxytetracycline
resistant isolate was found. Staphylococcus aureus was also isolated from 57 deer（18.5％）and
3 boars（1.4％）．Methicillin-resistance was not observed in these isolates. In summary, thepresence of antimicrobial resistant isolate in game meat animals was low in this study,
however, sustained monitoring would still be necessary for better public health. Overall,
prevention of fecal contamination during processing is critical for adequate hygiene
management for game meat.

１．目て有効利用するための一案として，捕獲動物をジ

的ビエとして食肉加工することに注目が集まってい日本各地において，野生シカ，イノシシの生息る。従来はジビエの消費は狩猟者や愛好家が中心

数が著しく増加しており，それに伴い様々な被害であったが，地域振興としての利用が増加するなが増大している。畜産業においては，牧草地へのど一般消費者への流通が増加している。しかし，侵入，家畜用飼料の盗食が経済的損失とともに疾家畜と異なり，ジビエとなる野生動物のと殺・解病防疫の観点から深刻である。被害防止の対策と体処理の衛生管理に関しては法律（と畜場法なして，野生鳥獣の狩猟捕獲が促進され捕獲件数はど）の対象にはなっていない。国および自治体に年々増加している。こうした野生動物を資源としよりマニュアルが作成されているが，実際には自© The Ito Foundation

ジビエとして食される野生動物が保有する食中毒菌の薬剤耐性

241

主的な管理で解体処理されているのが実情であン化飛行時間型質量分析法（MALDI TOF-MS），る。国内外でジビエ由来の細菌性食中毒の発生がす な わ ち 質 量 分 析 装 置 autoflex speed TOF/あり，今後，ジビエの普及に伴う食中毒事件の増TOF-KG （Bruker Dalconics） お よ び MALDI

加が懸念される。現行のマニュアル遵守を励行

Biotyperソフトウェアにより同定した。取得した

し，ジビエの適切な衛生管理を普及するために，

マススペクトルをライブラリとのマッチングによリスクを評価させるための基礎的データが必要でり，マッチングスコアが1.7以上で属（Escherichia

ある。

属）同定，2.0以上で種（Escherichia coli）同定

近年，ヒトから薬剤耐性を持つ病原性細菌の検とし，1.7未満であった株を同定不能とした。志

出が増加し，世界的な問題となっている。抗菌薬

賀毒素遺伝子（stx1, stx2）の保有はPCRにより確を投与された家畜に出現した耐性菌がヒトへ伝播

認し１），STECと同定した。Ｏ血清型は，遺伝子することが大きな問題である。食中毒を含む細菌

タイピング２）により決定した。

感染症において，治療のために抗菌薬が使用され

黄 色 ブ ド ウ 球 菌 は ，糞 便 １ ｇ を ７ ％ 食 塩 加る場合も多く，薬剤耐性はその治療効果への影響

ミューラーヒントン培地10mlにて増菌後，卵黄が懸念される。野生動物は，自然に発生した耐性

加マンニット食塩寒天培地にて分離した。卵黄反菌だけでなく，動物薬を投薬した家畜あるいはヒ応が認められたコロニーを釣菌し，非選択培地にトの生活活動により汚染された環境から薬剤耐性て純培養した。グラム染色およびMALDI TOF-

菌を獲得する可能性がある。行動範囲に制限のな

MSにて同定した。

い野生動物は農場や地域を越えて病原性細菌・薬

2.3

剤耐性菌を伝播させる可能性があることから，ヒSTEC は ， 最 小 発 育 阻 止 濃 度 （Minimum

トへの危害防止と家畜の疾病防疫のために野生動

Inhibitory Concentration: MIC）を寒天平板希釈法

物における薬剤耐性菌の情報は重要である。このおよびClinical and Laboratory Standards Instituteような背景から，ジビエとして食される野生動物（CLSI）の基準を用いて測定した。家畜との接触の食中毒菌保有状況とその薬剤耐性を調査する。

の可能性を検討するために，牛または豚への使用

２．方
2.1

薬剤感受性試験が承認されている薬剤，および牛または豚への使法用が承認されている薬剤と耐性機序が類似してい材料

る薬剤として農林水産省の家畜のモニタリングに

2014年６月から2016年５月の毎月，中国および用いられている３），アンピシリン，セファゾリン，

九州地方において捕獲・解体された野生シカ308

セフォタキシム，ストレプトマイシン，ゲンタマ

頭，イノシシ211頭から新鮮直腸便を採集した。

イシン，カナマイシン，オキシテトラサイクリン，

2.2

細菌の分離と同定

コリスチン，ナリジクス酸，シプロフロキサシン

志賀毒素産生性大腸菌（Shiga toxin-producingの10薬剤を試験した。

Escherichia coli : STEC）は，糞便スワブをクロ

黄色ブドウ球菌については，メチシリン耐性を

モアガーSTEC寒天培地（関東化学）に直接塗抹

ディスク拡散法により試験した。オキサシリンおし分離した。本培地においてSTECに特徴的な藤よびセフォキシチンディスクを用い，CLSIの基色コロニーを釣菌し，非選択培地にて純培養し準を用いて判定した。

た。菌種は，マトリックス支援レーザー脱離イオ© The Ito Foundation

242

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

から分離された例もあり，ジビエがヒトの薬剤耐３．結果と考察

性病原性大腸菌感染症に関与する可能性が示され

STECは，シカ306頭中50頭から61株（保有率た。耐性株の検出率は低かったが，その存在が証

16.3％），イノシシ211頭中３頭から４株（保有率

明されたことから，同様の調査を継続する必要性

1.4％）分離された（Table１）。一個体から複数のが示された。また，分離株が保有する耐性遺伝子株が分離されることもあった。保有率はシカが有について解析する必要がある。

意に高かった（オッズ比＝13.44，95％信頼区間：

大型野生動物におけるSTECの保有状況および

4.13～43.70）。分離株のstx遺伝子およびＯ血清型

保有株については，北海道のシカでの詳細な解析（遺伝子型）は，Table２に示した。

報告があるが，その他の地域についての情報は極分離されたSTECの薬剤耐性は，１株においてめて限定的である。同一の地域において通年を通ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンに対しての調査は，国内で初めてであり，食肉としてして認められた。耐性株のMIC（μg/mL）はス加工される野生シカ・イノシシの危害分析のため

トレプトマイシン（耐性限界値：32μg/mL）32に有益な情報である。

（μg/mL），オキシテトラサイクリン（耐性限界

黄 色 ブ ド ウ 球 菌 は ，シ カ か ら 57 株（保 有 率

値：16μg/mL）128（μg/mL）であり，耐性率

18.6％），イノシシから３株（保有率1.4％）分離は両薬剤ともに1.5％であった。耐性株は，シカされた（Table１）。保有率はシカが有意に高かっ

由来の血清型Ｏ113であり，病原因子stx1, stx2,

た （オ ッ ズ 比 ＝ 15.74,95 ％ 信 頼 区 間 ： 4.19 ～eaeAを保有していた。Ｏ113は，ヒトの下痢症例

32.93）。薬剤感受性試験を行った49株はすべて，Table 1 Number of positive animals for Shiga toxin producing Escherichia coli（STEC）

and Staphylococcus aureus
Number of animal

STEC positive

S. aureus positive

Deer

306

50（16.3％）

57（18.6％）

Boar

211

3（1.4％）

3（1.4％）

Table 2 Characterization of Shiga toxin producing Escherichia coli isolated in this study
O serotype（O genotype）

Number ofisolateOrigin animal

stx1 genestx2 gene

eaeA gene

Drug resistance

Ｏ11

11

Deer

－

＋

－

None

Ｏ26

1

Deer

－

＋

＋

None

Ｏ54

9

Deer

－

＋

－

None

Ｏ84

3

Deer

＋

－

＋

None

Ｏ113

1

Deer

＋

＋

－

SM，OTC

Ｏ128

1

Deer

－

＋

－

None

Ｏ146

33

Deer，Boar

－／＋

＋

－

None

Ｏ156

1

Deer

＋

＋

＋

None

Ｏ157

4

Deer, Boar

－

＋

＋

None

SM: Streptomycin, OTC: Oxytetracycline.

© The Ito Foundation

ジビエとして食される野生動物が保有する食中毒菌の薬剤耐性

243

メチシリン耐性の指標となるオキサシリンおよびオキシテトラサイクリン，コリスチン，ナリジク

セフォキシチンに対して感受性であった。

ス酸，シプロフロキサシンに対する感受性試験で野生動物における薬剤耐性ブドウ球菌は，鳥類

は，１株（Ｏ113）がストレプトマイシン・オキ

および齧歯類の調査が多く，大型野生動物についシテトラサイクリン耐性であった。黄色ブドウ球ては報告が少ない。スペインの野生シカおよびイ菌は，シカ18.6％，イノシシ1.4％から分離され，ノシシは，黄色ブドウ球菌の保有率は高いが，耐メチシリン耐性を示す株は認められなかった。今

性菌の保有率は極めて低いことが報告されてい回の研究では分離株の薬剤耐性率は低かったが，る。本研究においてメチシリン耐性株は認め継続したモニタリングが必要である。ジビエとしられなかったが，分離株の遺伝子型を含め，国内て食される野生動物がヒトへ危害を及ぼす可能性の大型野生動物が保有する菌株のモニタリングがのある細菌を保有することが確認された。ジビエ

必要である。

由来の危害を防ぐ一助として，食肉への加工課程

４，５）

本研究は，国内における野生動物由来の食肉でにおける糞便汚染防止が重要である。

あるジビエの安全性を確かめ，適切なリスク回避対策のための基礎的データとなる。増加傾向にある狩猟動物の食肉への有効利用を促進し，農業・畜産業における野生鳥獣による被害軽減を期待したい。これまで知られていない野生動物が保有する食中毒菌の薬剤耐性の把握は，ヒトの健康被害の防止に重要である。
４．要約

日本各地でジビエの加工・消費が増加傾向にあり，適切な衛生管理ための基礎データとして，野生動物が保有する食中毒細菌とその薬剤耐性を調査した。野生シカ306頭およびイノシシ211頭の新鮮糞便を調査した。それぞれ16.3％および1.4％がSTECを保有していた。分離されたSTECのＯ血清型はヒトから検出される型であり，重篤な疾患の原因となるＯ157およびＯ26が含まれた。アン
ピシリン，セファゾリン，セフォタキシム，スト

文献１）Flemming Scheutz, Louise D. Teel, Lothar Beutin,
Denis Piérard, Glenn Buvens, Helge Karch,
Alexander Mellmann, Alfredo Caprioli, Rosangela
Tozzoli, Stefano Morabito, Nancy A. Strockbine,
Angela R. Melton-Celsa, Maria Sanchez, Søren
Persson, Alison D. OʼBrien: Journal of ClinicalMicrobiology，50，2591～63，2012．
２）Atsushi Iguchi, Sunao Iyoda, Kazuko Seto,
Tomoko Morita-Ishihara, Flemming Scheutz,
Makoto Ohnishi, Pathogenic E. coli Working Groupin Japan: Journal of Clinical Micorbiology，53，2427～
32，2015．
３）農林水産省動物医薬品検査所，http://www.maff.
go.jp/nval/tyosa_kenkyu/taiseiki/４）M. Concepción Porrero, Aránzazu Valverde, Pedro
Fernández-Llario, Alberto Díez-Guerrier, Ana
Mateos, Santiago Lavín, Rafael Cantón, JoséFrancisco Fernández-Garayzabal, Lucas Domínguez:
Emerging Infectious Diseases，20，899～901，2014．
５）P o r r e r o M C , M e n t a b e r r e G , S á n c h e z S ,Fernández-Llario P, Casas-Díaz E, Mateos A, Vidal
D, Lavín S, Fernández-Garayzábal JF, Domínguez L:
Applied and Environmental Microbiology，80，4865～
70，2014．

レプトマイシン，ゲンタマイシン，カナマイシン，© The Ito Foundation

244

肉用子牛におけるマイコプラズマ感染症の新たな迅速診断用PCR法の構築と肉用農場におけるマイコプラズマ
感染症予防への応用
A novel PCR methods for rapid screening of Mycoplasma infection of beef
calf and their application for the prevention of Mycoplasma infection in
beef farm

樋

口

豪

紀・岩

野

英

知＊

（酪農学園大学獣医学群獣医学類獣医衛生学ユニット，＊酪農学園大学獣医学群獣医学類獣医生化学ユニット）

Hidetoshi Higuchi and Hidetomo Iwano＊（Animal Health Lab., Faculty of Vet. Med., Rakuno Gakuen Univ.，＊Veterinary Biochem., Faculty of Vet. Med., Rakuno Gakuen Univ.）

A specific polymerase chain reaction（PCR）was developed for fast and easy screening of
mycoplasma infection of beef calves. Major species of Mycoplasma strains（M. bovis）in liquid
cultured swab samples were detected by specific PCR. The minimum limit for detection of
Mycoplasma bovis by the specific PCR was estimated to be about 2.0 x 10３ cfu/ml. Of 37 swab
samples cultured in mycoplasma broth®, simplified PCR detected Mycoplasma DNA in 22 thatwere also positive by culture. Incidence rate of mycoplasma infection of beef calves wereclosely related to nasal infection of Mycoplasma bovis. The results suggest that the specific PCR
is useful for screening of mycoplasma infection of calves on a large-scale beef farm.

１．目

子牛の安定供給において，その最大の阻害要因と的して位置付けられているものが「感染症」であ畜産を取り巻く世界情勢は「競争激化」の様相る。多くの微生物が危険因子として位置付けられを呈し，国内の畜産業にとっても大きな打撃となているが，近年，新興および再興の二面的性質をることが危惧されている。日本政府や北海道はこ有する「マイコプラズマ」が全国の農場に浸潤しれらの状況を受け，畜産農場における経営基盤のつつあることが獣医・畜産領域において，大きな強化を推進しており，限られた生産資源を用いな問題とされている１～４）。人医領域でもマイコプラ

がら，いかに生産効率を向上させるかについて，ズマの周期的発生が疫学的に報告されているが新たな技術開発を進めている。肉用子牛の安定的

2000年代に入り，その発生件数は原因不明のままな供給は，日本における畜産の基盤として位置付増加し続けている。一方，畜産領域でも，これとけられるものであり，我国が世界の畜産大国と伍呼応するように2000年代に入り，牛のマイコプラ

し，さらに将来的な貿易戦略を展開するうえにお

ズマ感染症が全国的に増加傾向を示している。そいて，重要な課題であると認識されている。肉用の原因については疫学的手法を駆使した研究にお© The Ito Foundation

肉用子牛におけるマイコプラズマ感染症の新たな迅速診断用PCR法の構築と肉用農場におけるマイコプラズマ感染症予防への応用

245

Chain Reaction : PCR）を基盤とした検出技術をいても十分に解明されていない。
マイコプラズマは一般細菌の３分の１程度の極構築した。

めて小さな微生物であり，牛の体内に侵入する

2.1.1と，親牛では「乳房炎」を，また，子牛では「肺呼吸器感染症において最も病原性の高い炎」，「中耳炎」および「関節炎」を引き起こす

。

５，
６）

対象マイコプラズマ種

Mycoplasma bovisを対象菌種とした。

通常の微生物は特定の臓器に病原性を発現する

2.1.2

検体処理

が，マイコプラズマは多臓器に同時に定着する能

マイコプラズマ用液体培地に一般細菌の排除を力を発現することで，牛に対し致命的な感染症を目的とした抗菌性物質を添加し鼻腔由来の雑菌の引き起こす。侵入門戸は呼吸器とされるが，体内発育を高度に阻止する。また，高濃度コレステに侵入した後は血液やリンパ液等の体液循環に侵ロールを含有するウマ血清を添加しマイコプラズ

入し，免疫を逃れながら末梢まで到達する。マイマの発育を促進する。本培地で鼻腔サンプルを48

コプラズマ感染症は難治性疾患として淘汰率の極

時間程度処理し効率的な増菌を行った。

めて高い疾患に位置付けられている。近年実施さ

2.1.3

遺伝子サンプルれた調査では，子牛鼻腔内マイコプラズマの農場

多検体処理のためDNA抽出精製を実施せず，増菌試料を直接PCR mixtureに添加することで，浸潤率は85％にまで上昇している。
マイコプラズマ感染症の制圧において，最も重作業時間および検査費用の低減を行う。本技術の要な技術は感染初期の段階において迅速かつ正確構築にあっては，PCRの反応阻害物質を除去するに微生物を摘発することである。その意義は感染性能を持った薬剤をPCR mixtureに導入する。

個体の摘発による感染拡大の阻止と，早期の治療

2.1.4

PCR

開始を可能にし，高い治癒率を実現することであ

Mycoplasma bovis特異的プライマーを新たに設る。しかし，マイコプラズマは通常の培養技術で計 し ， M. bovis （ATCC 25523）, 2. M. arginini

は菌種同定に１ヶ月近くを要し，農場での本病制（ATCC 23838）, 3. M. bovigenitalium（ATCC

圧にあってはその応用が極めて困難であるとされ19852）,4. M. californicum （ATCC 33461）,5. M.

てきた。

bovirhinis（ATCC 27748）, 6. M. alkalescens

そこで本研究ではマイコプラズマ感染症が最も（ATCC 29103）, 7. M. canadense（ATCC29418）

問題となっている肉用子牛について，マイコプラの各標準株において交差性を評価した。また，多ズマの侵入門戸として最上位に位置付けられてい検体処理を目的とし，96穴プレートを用いたリアる鼻腔において，高病原性のマイコプラズマ種のル タ イ ム PCR 系 を 構 築 し た 。培 養 法 に よ る M.

迅速検出技術をPCR法を基盤技術として構築し生

bovisの検出は，2.1.2をマイコプラズマ寒天培地

産農場での疾病制御における応用について検討しに塗布し，５％CO２ 下で２～３週間の観察ののた。

ち，目玉焼状コロニー，フィルムスポットおよびジギトニン試験により同定を行った。

２．材料および方法

2 . 2 肉牛農場に対する新規検査技術の応用と2 . 1 肉牛の鼻腔由来マイコプラズマ種の検出

感染症制圧への有効性評価
2.2.1

技術構築
本申請課題では遺伝子解析技術（Polymerase

供試牛およびサンプリング

４農場（Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ）より得られた© The Ito Foundation

246

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

６ヶ齢未満の子牛100頭を供試した。鼻鏡（鼻先）Table 1 Specifity of M. bovis-specific realtime PCR

を70％アルコール綿花で清拭したのち，滅菌綿棒を鼻腔に挿入し鼻汁を採材し４℃に保存した。
2.2.2

試料処理

鼻汁サンプルをマイコプラズマ用増菌液に接種し48時間培養したものをPCR用試料として解析に用いた。2.1.4の方法に則って実施した。
2.2.3

監視疾病

マイコプラズマ性肺炎，マイコプラズマ性中耳炎，マイコプラズマ性関節炎

M. bovis-specific realtime PCR
M. bovis＋

M. arginini－

M. alkalescens－

M. bovigenitalium－

M. bovirhinis－

M. californicum－

M. canadense－

Acholeplasma－

Table 2 Comparison between culturc and PCR methods

2 . 2 . 4 監視微生物

PCR①Mycoplasma bovis，②Pasteurella multocida，－③H i s t o p h i l s s o m m n i ，④M a n n h e i m i ahaemolytica（②，③および④については既存のCulture

＋

－

5

8

＋

2

22

プライマーを用いたPCR法のよって解析を行った）。

コプラズマ種は，Mycoplasma bovisと同様のコロ
ニー性状を示し，また，Mycoplasma bovigenitaliu

３．結果および考察

はMycoplasma bovisと同様にフィルムスポットを本研究ではMycoplasma bovisの検出において必形成する。このことから，培養法でMycoplasma

要なPCR系の構築を試みた。Mycoplasma属は遺bovis陽性と認めたものの，実際には他種であっ伝子配列の相同性が高く，既報のプライマーにおたものと考えられる。これらのことから，肉眼的

いては，しばしば日特異的な交差反応が検出され所見および生化学検査によるMycoplasma bovisのるが，本研究において構築したリアルタイムPCR

識別には一定の限界があると考えられた（Table２

では，主要なマイコプラズマ種において，非特異

網掛け部分）。

反応は確認されなかった（Table１）。検出感度は本検査系を用い，Ａ～Ｄの農場について各微生

2.0ｘ10 cfu/mlであった。また，野外株を用い，物の陽性個体数を評価した（Table３）。全体とし

従来の培養法との比較を実施したところ，培養法て48頭からMycoplasma bovisが検出された。まで陰性と確認された８検体については，PCRの結た ，23 頭 か ら Pasteurella multocida ，８ 頭 か ら果は陽性であった。Mycoplasma bovisは培養法でHistophils sommni，６ 頭 か ら Mannheimia

は目玉焼き状コロニー，バイオフィルム，ジギト

haemolyticaが分離された。各農場での評価におニン感受性を示すが，生化学検査においてこれら

いて，Ｄ農場ではいずれの病原体も検出されなが不明瞭な株も存在する。そのため，培養検査でかったのに対し，他の農場ではいずれの病原体もMycoplasma bovisと同定されなかったものの，広く分離された。その分離率はＢ，ＣおよびＡのPCRにおいて特定されたものであると考察され順に高く，特にＢ農場では80％（20/25）の個体

た。一方，培養陽性において陽性と確認された２で確認された。Mycoplasma bovisは気管粘膜上皮

検体についてPCRでは陰性を示した。一部のマイにおける線毛運動を強く抑制するとともに，粘膜３© The Ito Foundation

肉用子牛におけるマイコプラズマ感染症の新たな迅速診断用PCR法の構築と肉用農場におけるマイコプラズマ感染症予防への応用

247

Table 3 Pathogens isolated from nasal swab of calves
Farm
Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

Total

Mycoplasma bovis

8

20

15

0

43

Pasteurella multocida

3

18

2

0

23

Histophils sommni

2

1

5

0

8

Mannheimia haemolytica

2

1

3

0

6

（A，B，C and D : each 25 calf，total 100 calves）

Table 4 Incidence of Mycoplasma infction in each farms
Farm
Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

Total

Pneumoniae

3

16

5

0

24

Otitis media

0

4

1

0

5

Arthritis

0

5

1

0

6

免疫をはじめ，関連する免疫担当細胞の機能低下

ることが知られており，本研究でも鼻腔のマイコをもたらすことが報告されているプラズマと全身感染が深く関連している可能性が

。本研究の

７～９）

結 果 よ り Mycoplasma bovis の 感 染 個 体 で は示唆された。

Pasteurella multocida，Histophils sommniおよび

以上，本研究ではターゲットとしたPCR系を確Mannheimia haemolyticaが重複感染しているこ

立し，さらにそれらを農場で活用することで，発とから，Mycoplasma bovisが初期感染の微生物と生しうるマイコプラズマ感染症を予見しうる可能

して粘膜免疫を抑制し，Pasteurella multocida，性が示唆された。今後，さらに多くの農場で本検

Histophils sommniおよびMannheimia haemolytica

査系の有効性を評価し，生産性の向上と高品質ながそれに続いて感染する可能性が示唆された。

牛肉の生産に寄与することが重要であると考えら各農場における主要なマイコプラズマ感染症の発生率についてTable４に示した。鼻腔からいずれの微生物も分離されなかったＤ農場ではマイコ

れる。
４．要

約

プラズマ感染症の発生は認められなかった。一

肉用子牛におけるマイコプラズマ感染症を特異方，最も分離率の高かったＢ農場では，肺炎，中的に検出しうるPCR検査系の構築を試みた。主要耳炎および関節炎のいずれの感染症もすべての農なマイコプラズマ種であるMycoplasma bovisにつ場の中でもっとも高く，重複感染が確認された。

いて鼻腔スワブからの検出を試みた。本検査系に

ＡおよびＣ農場においても肺炎の発生が確認されおける検出感度は2.0ｘ10３cfu/mlであった。37検た。本結果より，鼻腔由来の病原性微生物は，農体の鼻腔スワブについてPCRおよび培養法の比較場におけるマイコプラズマ感染症の発生に深く関を実施したところ，22サンプルにおいて両者が陽わっていることが示された。鼻腔の微生物は扁桃性であることが確認された。一方，培養法で陰性を介して全身循環に入り，生体の各組織に移行すとされた８検体はPCR法で陽性であることが確認© The Ito Foundation

248

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

された。農場での応用を検討した結果，鼻腔スワ
ブ に お け る Mycoplasma bovis の 分 離 率 は ，Mycoplasma bovisによる肺炎，中耳炎および関節炎の発生と深く関与することが明らかになった。
これらの結果よりMycoplasma bovisの特異PCR
は，大型肉牛農場における子牛のマイコプラズマ
感染症スクリーニングに有用である可能性が示唆された。
文献１）Arcangioli, M., Chazel, M., Sellal, E., Botrel, M.,
Bezille, P., Poumarat, F., Calavas, D., Le Grand, D.:
Prevalence of Mycoplasma bovis udder infection indairy cattle: Preliminary field investigation insoutheast France, N Z Vet J，59，75～78，2011．
２）Higuchi, H., Iwano, H., Gondaira, S., Kawai, K.,
Nagahata, H.: Prevalence of Mycoplasma species inbulk tank milk in Japan, Vet Rec，22，169，2011．
３）Bushnell, R. B.: Mycoplasma mastitis, Vet Clin
North Am Exot Anim Pract，６，301～312，1984．

４）Bicknell, S. R., Gunning, R. F., Jackson, G.,
Boughton, E., Wilson, C. D.: Eradication of
Mycoplasma bovis infection from a dairy herd inGreat Britain, Vet Rec，112，294～297，1983．
５）Hewicker-Trautwein, M., Feldmann, M., Kehler,
W., Schmidt, R., Thiede, S., Seeliger, F., Wohlsein, P.,
Ball, H. J., Buchenau, I., Spergser, J., Rosengarten, R.:
Outbreak of pneumonia and arthritis in beef calves
associated with Mycoplasma bovis and Mycoplasma
californicum, Vet Rec，151，699～703，2002．
６）Nicholas, R. A., Ayling, R. D.: Mycoplasma bovis:
disease, diagnosis, and control,Res Vet Sci，74，105～
112，2003．
７）Kauf, A. C., Rosenbusch, R. F., Paape, M. J.,
Bannerman, D. D.: Innate immune response to
intramammary Mycoplasma bovis infection, J Dairy
Sci，90，336～348，2007．
８）Bürki, S., Frey, J., Pilo, P.: Vet Virulence,
persistence and dissemination of Mycoplasma bovis.
Dev Comp Immunol，179，15～22，2015．
９）Wang, Y., Liu, S., Li, Y., Wang, Q., Shao, J., Chen, Y.,
Xin, J.: Mycoplasma bovis-derived lipid-associatedmembrane proteins activate IL-1β production
through the NF-κB pathway via toll-like receptor
2 and MyD88, doi: 10.1016/j.dci.2015.10.017，2016．

© The Ito Foundation

249

肉養鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する感受性
Susceptibility of broiler chicken lines to high pathogenic avian influenza
virus

松

鵜

彩

（鹿児島大学共同獣医学部附属越境性動物疾病制御研究センター）

Aya Matsuu（Transboundary Animal Diseases Research center, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University）

Highly pathogenic avian influenza virus（HPAIV）causes severe clinical symptoms inchickens. The mechanisms underlying the highly pathogenic manifestation of the HPAIV inchickens has not been fully elucidated. The identification of a genetic factor affecting theresistance or susceptibility to HPAIV would aid in the elucidation of the mechanism underlying
pathogenesis. However, there are no studies conducted to evaluate the differences insusceptibility among the breeds of Japan native chickens. The purpose of this study is toelucidate the sensitivities to HPAIV in 4 breeds of broiler chicken including commercial broiler,and 3 different native chickens.
Four breeds of chicken（Broiler, native chicken A, B, and C）were inoculated with two
H5N8 isolates at the dose of 10６EID50. Broiler showed 100％ motility against two H5N8 virus,
and three native chicken showed higher viability. Analysis of the differences in the KaplanMeier survival curves between the various breeds of chicken by log-rank test showedsignificant differences between Broiler and 3 native chickens. The expression of IL-8 andInterferon Regulatory Factor 7（IRF7）RNA in lung 24 hour after inoculation was different
among breed of chicken, but more detail study is needed to elucidate the relationship between
virus multiplication and immune related gene expression.

１．目

エンザウイルス（HPAIV）に感染した鶏は急激的な臨床症状の悪化を示し，また強い伝播性を有す

高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）は，家禽ることから，HPAIは畜産界において甚大な被害に対して強力な病原性を有するＨ５あるいはＨ７をもたらす重要疾病の一つである。HPAI制圧の亜型インフルエンザウイルスによって引き起こさためには，本疾患の鶏における病原性発現機構おれる疾患である。国内では2003年に79年ぶりに発よび防御機構を解明し，これに基づいた対策を講生が認められて以降，野鳥や養鶏場において散発じる必要がある。

的な流行が認められている。高病原性鳥インフル

病原性に関わるウイルス因子についての研究は© The Ito Foundation

250

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

進歩しており，ウイルスタンパク質をコードする
遺伝子における複数のアミノ酸置換がウイルス複２．方法

製や宿主サイトカイン応答に影響を与えることが2.1

証明されている。一方，宿主側の要因，例えば鶏本研究では2014年冬季に鹿児島県内の野鳥から

Mx１遺伝子多型や主要組織適合遺伝子複合体

分 離 さ れ た H5N8 亜 型 HPAIV で あ る A/crane/（MHC）ハプロタイプ等がHPAIVに対する感受

Kagoshima/KU-1/2014 （crane-01） お よ び A/

性に関与する可能性も示唆されているものの１，２），

duck/Kagoshima/KU-70/2015 （duck-70） を 用

この分野の研究はあまり進んでいない。過去の研いた。これらのウイルスの遺伝学的解析を行い，究では，イタリアの肉用コマーシャル鶏の一部の

いずれもclade2.3.4.4.に属することを確認した６）。

系統がHPAIVに対して抵抗性を示すこと３），2003

SPF鶏を用いた予備実験によりduck-70の方が―2004年の東南アジアにおける流行の際，タイ在

crane-01に比べて強い病原性を有すること（生存来種鶏が高い生存率を示したことが報告されてい期間の短縮，生存率の低下）を確認した（データる 。このことからHPAIVに対して抵抗性を示

非表示）。

す系統や品種の鶏を用いて宿主側のHPAIV感受2.2

性関連因子を特定できれば，鶏のHPAIVに対す

鶏はブロイラーと３種類の鹿児島県産地鶏る防御機構の解明につながる可能性に着目した。

（Ａ，ＢおよびＣ）計76羽を用いた。いずれの鶏過去の研究において３種類のタイ在来種鶏がも県内の養鶏農場より譲受あるいは購入し，バイ

H5N1亜型HPAIVに対して抵抗性を有することを

オセーフティレベル３実験施設内の鶏用アイソ

感染実験によって証明し，これらの鶏のMx遺伝

レーター内で２日以上馴化した後実験に用いた。

子およびMHCハプロタイプについて解析を行っすべての鶏について感染前に採血を行い赤血球凝たが，HPAIV感受性との明らかな関連性は認め

集抑制（HI）試験によってH5N8亜型HPAIVに対られなかった 。鶏のHPAIV感受性関連因子特する抗体を有さないことを確認した。ウイルス接定のためにはより網羅的な解析が必要であると思

種時の鶏の週齢はすべて４週齢とした。

４）

５）

2.3

われる。

ウイルス株

供試動物

生存性とウイルス排泄一方，日本国内で飼養されている養鶏において４種類の系統群の鶏，各５羽ずつに対して10６

HPAIV感受性を比較した研究は皆無である。国EID50 のcrane-01あるいはduck-70を鼻腔内接種し内で鶏のHPAIV感受性関連因子特定に向けた研た後14日間，24時間ごとに観察を行い，生存性と究を実施するためには，まず日本の養鶏の中で感臨床兆候を評価した。経時的なウイルス排泄を評

受性の異なる系統の抽出を行うことが必要であ価するために，接種から２，４，
６，８，11，14日

る 。そ こ で 本 研 究 で は ，最 近 国 内 に 侵 入 し た

後にクロアカおよび口腔内からスワブ検体を採取

H5N8亜型HPAIVを用いて，国内で飼養されていし，検体中のウイルス力価（logEID50/ml）につる肉養鶏の品種によるHPAIV感受性の違いを明いて発育鶏卵を用いてReedらの方法５）に従い算らかにし，感染初期の免疫応答を比較することを出した。観察時に重度の臨床症状（沈鬱，低体温，目的とした。

神経症状）を示した鶏については人道的エンドポ
イントと判断し安楽殺を行った。14日後に生存している鶏については安楽殺を実施した。すべての© The Ito Foundation

251

肉養鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する感受性

鶏を解剖し，脳および肺からRNAを抽出後，Ａロイラーはいずれも顔面の腫脹，肉冠や脚の皮下型インフルエンザウイルスＭ１遺伝子量をreal-

出血，関節の腫脹など明らかな異常所見を示した

time PCR法によって確認した。２種類のウイルのに対し，３種類の地鶏ではこのような病変はほス接種後の生存性はLog-rank検定により比較し

とんど確認されず，肉眼的な異常は認められないた。スワブ検体のウイルス力価および脳および肺か，あっても軽度であった。

におけるＭ遺伝子Ct値の群間比較は一元配置分

感染後に経時的に採取したクロアカおよび口腔散分析とTurkey法によるpost-hoc検定を実施し内スワブからは，いずれのウイルスにおいてもブた。

ロイラーは接種２日目から死亡時まで高力価のウ

2.4

感染初期の免疫応答解析

イルス排泄が認められた。これに対して３種類の各群３羽の鶏に対して10 EID50 のduck-70を接地鶏のウイルス排泄量は，特に接種２日目および種し，24時間後に解剖を行い，肺を採取した。生

４日目においてはブロイラーと比べて低い傾向が理食塩水を接種した鶏各群３羽ずつを対照とし，認められた。いずれのウイルス接種後においても

６

同様に24時間後に肺を採取した。臓器乳剤を作成
1.0

し発育鶏卵を用いてウイルス力価（logEID50/g）を測定した。臓器中の宿主サイトカインおよび免

crane-1A

0.8

IFN-α，IFN-β，IFN-γ，TLR3, TLR4, IFR-７，
Mx, OAS）の発現についてSYBR Greenを用いた
real-time PCR法（ΔCt法）により解析した 。
５）

Probability

疫関連遺伝子（IL-６，IL-８，IL1b，TNFα，

B

0.6
0.4
C

0.2

群間の比較は一元配置分散分析とTurkey法によるpost-hoc検定を実施した７）。

Broiler

0.0
0３．結果と考察

2

4

6

8

10

12

1.0

3 . 1 ４種類の肉養鶏のH5N8亜型HPAIV接種後の生存性とウイルス排泄

duck-70A

0.8

羽死亡し，観察期間中の生存率は０％であったのに対し，地鶏Ａ，Ｂ，Ｃは14日間の生存率がそれぞれ80％，60％，20％で，地鶏ＡおよびＢはブロイラーと比べて有意に高い生存性を示した（P＜
0.01）
。duck-70を接種後，ブロイラーが４日目まProbability

crane-01を接種後，ブロイラーが７日までに全率が80％，40％，20％で，地鶏Ａ，ＢおよびＣはブロイラーと比べて有意に高い生存性を示した（P＜0.05）（Fig.１）。２種類のHPAIV接種後のブ

B

0.6
0.4

C

0.2
Broiler

0.0

でに全羽死亡，観察期間中の生存率が０％であったのに対し，地鶏Ａ，Ｂ，Ｃは14日後までの生存

14

0

2

4

6

8
Days

10

12

14

Fig. 1 Kaplan-Meier survival curves between the

Broiler and 3 different native chickens（A-C）
inoculated with A/crane/Kagoshima/KU-1/2014（crane-01）or A/duck/Kagoshima/KU-70/2015（duck-70）.

© The Ito Foundation

252

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Viral RNA levels（40-Ct）

40
brain

30

中の持続的なウイルス排泄が認められた（Table

lung

１）
。
２種類のウイルス接種後14日までに死亡した鶏20の肺および脳におけるウイルス遺伝子量（Ct値）

100

をFig.２に示した。HPAIVを接種後死亡した鶏は１羽を除いて，肺および脳におけるウイルス分布

broiler

A

B

C

（n=5）

（n=1）

（n=2）

（n=4）

40
Viral RNA levels（40-Ct）

５羽中４羽の生存が認められた地鶏Ａは生存期間

crane-01が認められ，特に脳でのウイルス増殖が顕著であったが，duck-70接種後に死亡した地鶏ＢおよびＣの肺におけるウイルス遺伝子のCt値はブロ

duck-7030＊＊

イラーに比べて有意な高値を示し，ウイルス増殖＊＊が抑制されている可能性が示唆された。

20

今回用いたH5N8亜型HPAIVは過去に国内に侵入したウイルスに比べて鶏に対する病原性が弱い

100

可能性が指摘されている８）。おそらくこのことがbroilerA

B

C

鶏品種間の感受性の差を顕著にした要因であると

（n=5）

（n=1）

（n=3）

（n=4）

考えられる。本研究に用いた３種類の地鶏の中でFig. 2 Viral RNA is expressed in brain and lung of dead

も特にＡは２種類のHPAIV接種後，８割が不顕

chicken within 14 days after inoculated withcrane-01 or duck-70. Graphs represent mean ±SD
of Ct value for M1 RNA. ＊＊P＜0.01 versus broiler.

性感染となった。より病原性の強いHPAIV感染
時の生存性についても検討する必要があるが，仮Table 1 Viral shedding after inoculation of two H5N8 HPAIV

virus

A/crane/Kagoshima/
KU-01/2014（crane-01）

A/duck/Kagoshima/
KU-70/2015（duck-70）

line

median log EID50/ml in swab samples（range）
n＝tested chicken number
cloaca swab
oropharyngeal swab
4dpi
6dpi
8dpi
11dpi
14dpi
2dpi
4dpi
6dpi
8dpi
11dpi
14dpi
2.9
3.0
4.7
0
6.0
5.0
4 （0-3.7）（3.2, 6.2） ―――（0-2.4）（2.0-6.7）（4.0, 6.0） ―――（4-7） ｎ＝5 （2.7-4.2）
ｎ＝5
ｎ＝2
ｎ＝5
ｎ＝5
ｎ＝2
0
0
0
1.2
0.6
0
0
1.7
0
0
0.7
0
8
（0） （0-2.2） （0-1.2） （0-3.0） （0-1.7）（0-1.2） （0） （0-2.0） （0-1.7）（0-6.4）（0-2.2）（0-3.2）（8） ｎ＝5 ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝5 ｎ＝4ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝5 ｎ＝5 ｎ＝4 ｎ＝4

survival rate
medianwithin 14 days survival（survived/days
inoculated chicken （range）
number）
2dpi

Broiler

0％
（5/5）

Ａ

80％
（4/5）

Ｂ

60％
（3/5）

Ｃ

20％
（1/5）

0
0
0
1.2
0
0
0
0
0
0
1.1
0
11
（0-4.7） （0-3.7） （0-2.7） （0-1.2）（0-2.2） （0-1.5） （0-4.4） （0-5.0）（0-4.2）（0-3.2）（0-3.2）（8,14） （0）ｎ＝5 ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝4 ｎ＝4ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝5 ｎ＝5 ｎ＝4 ｎ＝4
0
0
0
0
0
0
1.7
5.0
1.5
0
0
0
5 （0-3.2）（0-4.4） （0）（0）（0） （0） （0-2.2） （0-6.0） （0,3.0） （0） （0） （0）（4-6） ｎ＝5 ｎ＝5ｎ＝2
ｎ＝1
ｎ＝1 ｎ＝1ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝2 ｎ＝1 ｎ＝1 ｎ＝1

Broiler

0％
（5/5）

3.2
5.4
4
（4.5-6.3）（3-4） （0-3.7）
ｎ＝5 ｎ＝4

Ａ

80％
（4/5）

Ｂ

40％
（2/5）

Ｃ

20％
（1/5）

4.2
6.8
（4.0-4.7）（5.9-8.0） ―
―
―
―
ｎ＝5
ｎ＝4
0
0
3.0
3.2
3.4
0.6
2.7
3.9
2.7
2.2
2.2
0
8
（0-1.9）（2.7-3.4）（3.1-4.9）（3.4-3.5）（0-1.2） （2.0-4.7）（1.7-4.5）（1.7-4.7）（0-3.7）（1.9-3.4）（0-2.7）（8） （0）ｎ＝5 ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝4 ｎ＝4ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝5 ｎ＝4 ｎ＝4 ｎ＝4
0
1.5
2.0
0
0
0
0＊
0
0
0
0
0
14
（0-2.9） （0-2.5） （0-3.7） （0-2.4）（0-4.6） （0） （0-3.0） （0-6.4）（0-2.2）（0-2.2）（0-6.2）（6-14）（0-1.2）
ｎ＝5 ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝4ｎ＝3 ｎ＝3ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝4 ｎ＝4 ｎ＝3 ｎ＝3
1.7
1.7
1.2
0
2.4
1.2
2.2
2.4
1.7
0
1.6
0
9 （0-3.7）（0-2.5） （0-2.7） （0-1.9） （0,4.9） （1.2） （1.7-3.2）（1.7-8.0）（0-5.0）（0-2.2） （0,3.2） （0）（5-13） ｎ＝5 ｎ＝5ｎ＝4
ｎ＝3
ｎ＝2 ｎ＝1ｎ＝5ｎ＝5ｎ＝4 ｎ＝3 ｎ＝2 ｎ＝1―――＊P<0.05（vs. Broiler, A, and C）© The Ito Foundation

―

253

肉養鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する感受性にこのような性質を有する地鶏を飼育する農場に性発現機構および防御機構の解明に有用なモデル

おいて発生があった場合，異常の発見に遅れが生となることが期待される。

じる可能性があることからその防疫には特に注意

3 . 2 ４種類の肉養鶏における感染初期の免疫が必要であると思われる。一方これら地鶏には，

応答
duck-70接種24時間後の肺におけるウイルス力

原性発現抑制機構の存在が疑われる。本研究で得価は，いずれの品種においても低く，ブロイラー

られた結果からこれら地鶏は今後鶏における病原と地鶏Ｃの各１羽ずつでウイルスが検出されたのRelative mRNA expression

感染成立後のウイルス増殖抑制機構，もしくは病

1e+02
5e+01

IL-6

2.0

1e+01
5e+00

1.0

1e+00
5e-01

0.2

Relative mRNA expression

Broiler

A

50.0

B

C

P＜0.01
Vs. C

Broiler

A

B

C

TLR4

10.0
5.0

10.0

2.0

5.0

1.0

2.0

0.5

1.0

0.2

0.5

0.1
Broiler

Relative mRNA expression

0.1

20.0

IFN-α

20.0

2.5

P＜0.05
Vs. C

0.5

1e-01
5e-02

3.0

IL-8

5.0

A

B

BroilerC

Virus titerlogEID50/g

A

B

P=0.05
Vs. Broiler

IRF7

5.0

C

2.0

2.0
1.5

1.0

1.0

P＜0.05
Vs. Broiler

0.5

0.5
0.0
BroilerA

B

C

BroilerA

P=0.01
Vs. Broiler

B

C

Fig. 3 Comparison of the host gene responses and virus titer at 24hr after inoculation with A/

duck/Kagoshima/KU-70/2015 in the lung in 4 different line of chicken.

© The Ito Foundation

254

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

みであった。肺における14種類の遺伝子発現量を在することが指摘されているが，抵抗性形質の品比較したところ，地鶏Ａ（P＜0.05 vs C）および種は，鶏におけるHPAIV病原性発現機構の理解

Ｂ（P＜0.01 vs C）におけるIL-８遺伝子発現抑に有用であると思われる。そこで本研究では，最制が認められた。またIFN遺伝子発現誘導に必須

近日本に侵入したH5N8亜型HPAIVを用いて，国の因子とされるIRF-７遺伝子の発現は地鶏Ａお内で飼養されている３種類の地鶏におけるよびＢにおいて有意に抑制されていた。３種類のHPAIV感受性を明らかにし，感染初期の免疫応

地鶏においてIFNαおよびTLR４は低下傾向に答を比較することを目的とした。

あったが統計学的有意差は認められなかった

２種類のH5N8亜型HPAIVを４種類の鶏（ブロ（Fig.３）。その他の遺伝子発現については群間でイラーおよび地鶏Ａ-Ｃ）に接種し，その後の生明らかな傾向は認められなかった（データ非表

存性について検討を行ったところ，３種類の地鶏

示）。

はブロイラーに比べて有意に高い生存性を示し

最近IRF-７は鶏のＡ型インフルエンザウイル

た。感染24時間後の肺における宿主免疫応答につス感染後のⅠ型IFNの誘導に中心的な役割を果た

いて評価したところ，IL-８およびIRF-７遺伝子

す可能性が報告されている。また他の複数の発現について品種間で差が認められ，品種によっ研究でHPAIV感染後の鶏臓器中におけるIL-８やて感染後の宿主免疫応答が異なる可能性が疑われIL-６の過剰な増加が急激な臨床症状の悪化に関たが，ウイルスの増殖性との関連性についてもよ連している可能性も指摘されている 。今回高いり詳細な検討が必要である。今後この品種の鶏生存性を示した地鶏ＡおよびＢにおいてIL-８とは，鶏のHPAIV感受性関連因子特定に向けた有IRF-７遺伝子の発現抑制が認められたことは，用なモデル動物となる可能性が期待される。

９，10）

11）

HPAIVに対する耐性機構と関連する可能性がある。残念ながら本研究ではウイルス接種24時間後の肺におけるウイルス力価が低く，品種間での臓器中のウイルス増殖性の違いについての検討は困難であった。上記で得られた宿主の免疫関連遺伝
子発現状況の差はウイルス増殖性の違いに起因する可能性もあることから，より詳細な検討を行う
必要がある。またウイルス増殖抑制機構や自然免
疫応答についての細胞レベルでの解析も必要であると思われる。
４．要

約

高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）は，家禽
特に鶏に対して強い病原性と伝播性を有する高病
原 性 鳥 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス（HPAIV）によって発生し，畜産界に多大な被害をもたらす重要疾病の一つである。過去に報告された海外の研究でHPAIVに対して抵抗性を示す鶏の品種が存

文献１）Ewald, S. J., Kapczynski, D. R., Livant, E. J.,
Suarez, D. L., Ralph, J., McLeod, S., et al.：Associationof Mx1 Asn631 variant alleles with reductions inmorbidity, early mortality, viral shedding, andcytokine responses in chickens infected with ahighly pathogenic avian influenza virus,
I m m u n o g e n e t i c s ，2 0 1 1 ；6 3（ 6 ）：3 6 3 - 7 5 ．d o i :10.1007/s00251-010-0509-1. PubMed PMID：
21286706．
２）Sasaki, K., Yoneda, A., Ninomiya, A., Kawahara, M.,
W a t a n a b e , T . ：B o t h a n t i v i r a l a c t i v i t y a n d
intracellular localization of chicken Mx protein
depend on a polymorphism at amino acid position
631, Biochem Biophys Res Commun，2013；430（1）：161-6. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.11.053. PubMed PMID：
23201406．
３）Sironi, L., Williams, J. L., Moreno-Martin, A. M.,
Ramelli, P., Stella, A., Jianlin, H., et al.： Susceptibilityof different chicken lines to H7N1 highly pathogenic
avian influenza virus and the role of Mx gene
polymorphism coding amino acid position 631,
Virology, 2008；380（1）：152-6. doi: 10.1016/j.virol.
2008.07.022. PubMed PMID：18723201．

© The Ito Foundation

肉養鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する感受性４）Boonyanuwat, K., Thummabutra, S., Sookmanee,
N., Vatchavalkhu, V., Siripholvat, V., Mitsuhashi, T.：
Influences of MHC Class II Haplotypes on Avian
Influenza Traits in Thai Indigenous Chicken, The
Journal of Poultry Science，2006；43（2）：120-5. doi:
10.2141/jpsa.43.120．
５）Matsuu, A., Kobayashi, T., Patchimasiri, T., Shiina,
T., Suzuki, S., Chaichoune, K., et al.：Pathogenicityof Genetically Similar, H5N1 Highly Pathogenic
Avian Influenza Virus Strains in Chicken and theDifferences in Sensitivity among Different Chicken
Breeds, PLoS One, 2016;11（4）:e0153649. doi: 10.1371/
journal.pone.0153649. PubMed PMID: 27078641;
PubMed Central PMCID: PMCPMC4841636．
６）Ozawa, M., Matsuu, A., Tokorozaki, K., Horie, M.,
Masatani, T., Nakagawa, H., et al.：Genetic diversityof highly pathogenic H5N8 avian influenza viruses
at a single overwintering site of migratory birds inJapan, 2014/15, Euro Surveill, 2015;20（20）. PubMed
PMID：26027484．
７）Kanda, Y.：Investigation of the freely available
easy-to-use softwareʻEZRʼfor medical statistics,
Bone Marrow Transplant，2013；48（3）：452-8. doi:
10.1038/bmt.2012.244. PubMed PMID: 23208313;
PubMed Central PMCID: PMCPMC3590441．
８）Tanikawa, T., Kanehira, K., Tsunekuni, R., Uchida,Y., Takemae, N., Saito, T.：Pathogenicity of H5N8255

highly pathogenic avian influenza viruses isolated
from a wild bird fecal specimen and a chicken in
Japan in 2014, Microbiol Immunol，2016；60（4）：243-52. doi：10.1111/1348-0421.12369. PubMed
PMID：26916882．
９）Wang, Y., Brahmakshatriya, V., Lupiani, B., Reddy,
S. M., Soibam, B., Benham, A. L., et al.：Integrated
analysis of microRNA expression and mRNAtranscriptome in lungs of avian influenza virus
infected broilers, BMC Genomics, 2012;13: 278. doi：
10.1186/1471-2164-13-278. PubMed PMID: 22726614;
PubMed Central PMCID: PMCPMC3496578．
10）Kim, T. H., Zhou, H.：Functional Analysis of
Chicken IRF7 in Response to dsRNA Analog Poly（I:C）by Integrating Overexpression and Knockdown,
PLoS One, 2015; 10（ 7）: e0133450. doi: 10.1371/
journal.pone.0133450. PubMed PMID: 26186542;
PubMed Central PMCID: PMCPMC4505898．
11）Kuribayashi, S., Sakoda, Y., Kawasaki, T., Tanaka,T., Yamamoto, N., Okamatsu, M., et al.：Excessive
cytokine response to rapid proliferation of highly
pathogenic avian influenza viruses leads to fatalsystemic capillary leakage in chickens, PLoS One,2013; 8（7）: e68375. doi: 10.1371/journal.pone.0068375.
PubMed PMID: 23874602; PubMed Central PMCID:PMCPMC3706397．

© The Ito Foundation

256

リコンビナント抗原を用いたエゾシカにおける肝蛭症の血清診断法の確立と疫学調査による家畜・ヒトに対するリスク分析
Immuno-diagnosis of fasciolosis in ezo deer using recombinant antigens to
examine risk of transmission for livestock and human

関

まどか・福

本

晋

也＊

（岩手大学農学部共同獣医学科，＊帯広畜産大学原虫病研究センター）

Madoka Ichikawa-Seki and Shinya Fukumoto＊（Cooperative Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, Iwate University，＊National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）

Fasciolosis caused by the liver flukes（Fasciola spp.）is one of the major problems inlivestock industry. Fasciolosis is a zoonotic disease, and humans are infected by eating
vegetables or livers which are contaminated with juveniles of the parasite. The number of wildsika deer（Cervus nippon yesoensis）continues to increase in Hokkaido Prefecture, Japan. As aresult, enormous economic damage to agricultural crops by sika deer is observed throughout
Hokkaido prefecture. Therefore, attempts have been made for effective population control byutilizing sika deer as a meat resource（gibier）. Recently, fasciolosis has been recognized as
emerging infectious diseases among sika deer in Hokkaido; however, the lack of epidemiologicalstudy made it hard to paint the precise picture of the disease. The objective of this study was
to obtain the precise seroprevalence of fasciolosis in sika deer from Hokkaido Prefecture byestablishing an Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay（ELISA）. This epidemiological study
enables us to evaluate the risk of sika deer as a meat resource for human as well as the risk ofthem as a source of the liver fluke infection to domestic cattle. The ELISA with recombinant
Cathepsin L1（rCatL1）established in this study was highly reliable. Its sensitivity andspecificity were 90 ％ and 96 ％，respectively. The seroprevalence of 210 sika deer from 12
locations of Tokachi subprefecture revealed that the prevalence of anti-rCatL1 reached 100％in maximum. Therefore, it is very important to pay enough attention for the seroprevalence offasciolosis in sika deer as a source of the liver fluke infection to humans and cattle.

１．目

エゾシカを食肉資源（ジビエ）として有効活用す的る試みがはじまり，産業としての発展が期待され

北 海 道 で は ， エ ゾ シ カ （Cervus nipponている。一方で，エゾシカが保有する人獣共通感

yezoensis）の個体数が増加の一途をたどってお染性の病原体に関する調査はほとんど進んでいな

り，農作物に与える経済被害は甚大である。近年，

い。また，エゾシカは生物学的に家畜牛に極めて効果的な個体数コントロールのために，狩猟した近縁であるため，共通の病原体が数多く存在する１）。

© The Ito Foundation

リコンビナント抗原を用いたエゾシカにおける肝蛭症の血清診断法の確立と疫学調査による家畜・ヒトに対するリスク分析

したがって，エゾシカが保有する病原体を把握することはヒトへの危害分析だけにとどまらず，家

２．方

257

法

畜衛生学的にも必須の課題である。そこで本研究2.1

リコンビナント抗原の作製では，エゾシカ，牛，ヒトのいずれにも感染する

遺伝子組換え技術を用いて大腸菌や酵母に作製

肝臓の寄生虫「肝蛭」のエゾシカにおける感染状

させるリコンビナントタンパク質は，不純物を含況に着目した。北海道では釧路，十勝などでエゾまないために特異性の高い診断用抗原になる。本シカの肝蛭感染率が高いと推定されているが２，３），

研究では，肝蛭が宿主の体内で分泌する10種類の具体的な疫学情報が十分に得られておらず，ヒト

タンパク質群４）の中から，最も分泌量が多いと報ならびに家畜牛への感染源としてのリスクは正確

告 さ れ て い る Cathepsin L1（Cat L1）に 着 目 しに把握されていない。

た。RT-PCR法によって増幅したCatL１のcDNA

肝蛭（Fasciola spp.）は主に牛などの反芻類のをタンパク質発現用ベクター（pHAT10）に組み肝臓に寄生する大型の吸虫で，宿主に重篤な肝障込んだ後，大腸菌（BL21）にトランスフォーメー

害を引き起こす。ヒトは水耕野菜や感染初期の反ションし，リコンビナントCatL1（rCatL1）を発

芻類の肝臓（レバー）に付着した幼虫を生食する

現する大腸菌を得た。得られたrCatL１を６Ｍグ

ことにより感染する。我が国では食肉衛生検査所

アニジンで変性・可溶化した後に，尿素の段階希で獣医師による目視検査が実施されており，肝蛭釈によりリフォールディングし，His-tagカラム症に罹患した家畜牛の肝臓は摘発・廃棄される。

を用いたクロマトグラフィによって精製した。

しかしながら，感染初期の幼虫は非常に小さいた

SDS-PAGEにより精製タンパク質を確認し，ウェめ，獣医師であっても摘発は難しい。また，エゾスタンブロット法により，rCatL１の抗原としてシカなどの野生鳥獣は，と畜場法の対象動物ではの有用性を確認した。

なく獣医師による検査が義務付けられていないた

2.2

め，肝蛭に感染したレバーが見逃されて市場に出剖検時の目視検査で，肝臓に肝蛭の寄生が確認

回るリスクがある。食品衛生法により2012年にはされたエゾシカから得た血清（ｎ＝20）を陽性コ

牛，2015年には豚のレバーを生食用として提供すン ト ロ ー ル と し た 。ま た ，肝 臓 に 槍 形 吸 虫ることが禁止されたため，代用品としてエゾシカ（Dicrocoelium sp.）の感染が確認されたニホンシ

レバーの需要が高まる恐れがあり，今後，ヒトのカの血清（ｎ＝５）と肝臓に寄生虫が見出されな肝蛭症の発生が懸念される。したがって，科学的かったニホンシカの血清（ｎ＝20）を陰性コント

知見に基づく肝蛭保有状況の調査結果を適切に公ロールとした。ELISAでは，得られた血清を100表し，消費者に注意を促すことは急務である。

倍で用いた。また，二次抗体には西洋ワサビペル

ELISA法

本研究では，リコンビナント抗原を用いた特異オキシダーゼ（HRP）で標識されたウサギ由来

性の高いEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

抗 シ カ イ ム ノ グ ロ ブ リ ン（KPL, Milford, MA,（ELISA）法により北海道におけるエゾシカの肝USA） を 600 倍 希 釈 で 用 い た 。 そ の 後 ，

蛭抗体保有率を正確に把握し，ジビエとして供給

o-Phenylenediamine （OPD） 溶 液 （Sigma, St.

する際のヒトへの感染リスク，ならびに家畜牛へLouis, MO, USA）を用いて発色を行い，マイクの感染源としてのリスクを評価することを目的と

ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー（ARVO）（Perkinelmer,

した。

Waltham, MA, USA）で490nmの吸光（OD490）を© The Ito Foundation

258

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

きた（Fig.１）。

測定した。得られた結果の解析では，肝臓に寄生虫が見出されなかった陰性コントロール（ｎ＝3.2

ELISAにおける感度・特異度20）の平均±３S.D.をカットオフ値とし，カット

rCatL１を用いたELISAでは，目視で肝臓に肝オフ値を超えたものを陽性と判定し，感度と特異蛭が確認された陽性コントロールのうち２検体を度を算出した。

除く18検体のOD490 がカットオフ値を上回ったた

さらに，本研究では北海道十勝支庁を中心に12め，感度は90％と算出された。一方，陰性コント地域からエゾシカの血清210検体を得てELISAにロールでは，肝臓に槍形吸虫（Dicrocoelium sp.）

供し（Table１），エゾシカにおけるrCatL１抗体が確認された１検体でOD490 がカットオフ値をわの保有状況を調査した。陽性率の95％信頼区間

ずかに上回ったものの，他の24検体ではすべてが（Confidence intervals : CI）を www.vassarastats.

カットオフ値を下回ったため，特異度は96％と算net.を用いて算出した。

出された。したがって，本研究のELISAは信頼性が非常に高いことが確認された（Fig.２）。

３．結果と考察3.1

3 . 3 北海道十勝支庁のエゾシカにおける疫学

rCatL１の精製調査

SDS-PAGE で rCatL １ を 確 認 し た と こ ろ ，

北海道十勝支庁を中心に，12地域から210検体

HAT-Tag タ ン パ ク 質 の 約 １ kDa を 含 め た 約の血清を得てELISAに供した結果，５検体以上

38kDa付近にバンドが認められた。また，変性・の血清を解析した地域では，陽性率が25―100％

可溶化の影響と考えられるフラグメント化したバと非常に高い数値であることが判明した（Table

ンドも認められた。これらのバンドはいずれも

１，Fig.３）。したがって，地域によりレベルにウェスタンブロット法によりHAT-Tagが陽性で差があるものの，エゾシカ肉をジビエとして供給あると確認され，かつ肝蛭感染牛血清の反応が認する際のヒトへの感染リスク，ならびに家畜牛へめ ら れ た 。し た が っ て ，得 ら れ た rCatL １ はの感染源としてのリスクが非常に高いことが明ら

ELISA用の抗原として有用であることが確認でかになった。

Table1 The seroprevalence of anti-rCatL1 antibody determined by ELISA for 210 sika

deer obtained from 12 locations in Tokachi subprefecture, Hokkaido.
Location ID

No. of tested

No. of positive

Positive rate

95％CI

#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
#8
#9
#10
#11
#12

99
55
17
7
3
2
1
8
8
3
2
5

37
30
9
2
1
0
0
8
2
0
1
2

37.40％
54.60％
52.90％
28.60％
33.30％
0％
0％
100％
25％
0％
50％
40％

28.0-47.7％
40.7-67.8％
28.5-76.1％
5.1-69.7％
1.8-87.5％
0-80.2％0-94.5％59.8-100％
4.5-64.4％
0-69％
2.7-97.3％
7.3-83％

95％CI＝confidence interval© The Ito Foundation

リコンビナント抗原を用いたエゾシカにおける肝蛭症の血清診断法の確立と疫学調査による家畜・ヒトに対するリスク分析
1

kDa

2

3

4

259

5

250▶
１50▶
１00▶
75▶
50▶
37▶

25▶
20▶

Fig. 1 Purification of recombinant Cathepsin L1 of the Fasciola fluke.
１
２
３
４
５

Molecular weight marker
SDS-PAGE and CBB staining
Western blotting to detect HAT tag
Western blotting with positive control serum
Western blotting with negative control serum

個体数が急増したエゾシカは，家畜牛の放牧牧る。また，本研究成果をイムノクロマト法などの野へ日常的に侵入している。エゾシカには駆虫薬

ジビエの供給現場で使用できる簡易診断キットのを投与できないため，今後，肝蛭の感染率は増加

開発に発展させることが望ましい。

の一途をたどると予想される。エゾシカの侵入に今後，北海道全土に解析地域を拡大する必要がより，牧野が肝蛭に汚染されるリスクは非常に高ある。特に，道東地域では家畜牛の肝蛭症が多い

いため，継続的に疫学調査を実施することでリスことが知られており，エゾシカの肝蛭保有率を正クを的確に把握し，家畜牛の感染が起こらないよ

確に把握して，リスクを評価することは緊急の課

うに対策を講じる必要がある。

題であると考える。

また，家畜のレバーの生食が禁止されているため，法的規制のないジビエとしてエゾシカのレ

４．要

約

バーが生食用として提供されるリスクは否定でき

肝 蛭 症 は 大 型 の 吸 虫「肝 蛭（Fasciola spp.）」ない。本研究で明らかになった感染率に基づき，が肝臓に寄生することにより起こる疾患で，主に適切に注意を喚起することで，エゾシカのレバー

家畜牛で問題となってきた。肝蛭症は人獣共通感

がヒトへの感染源になることを防止する必要があ

染症でもあり，ヒトは水耕野菜などに付着した幼© The Ito Foundation

260

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

1.8
1.6

sensitivity：18/20（90％）
speciﬁcity：24/25（96％）

OD value（490nm）

1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2

Cut-oﬀ
0.088

0Fasciola（＋）（n=20）

Dicrocoelium（＋）
Fasciola（－）（n=5）

Fasciola（－）（n=20）

Fig. 2 ELISA with rCatL1 using positive and negative control sera of sika deer. Dotted line

indicates the cut-off value.
3.0

OD value（A490）

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

#1

#2

#3

#4

#5

#6

#7

#8

#9

#10

#11

#12

（37.4%）（54.6%）（52.9%）（28.6%）（33.3%）（0%） （0%） （100%）（25%）（0%） （50%）（40%）

Fig. 3 ELISA with rCatL1 using 210 sera of sika deer from 12 locations in Tokachi subprefecture,

Hokkaido. Dotted and solid lines indicate the cut-off and average values, respectively.

虫や感染動物の肝臓を摂食することにより感染すエゾシカを食肉資源（ジビエ）として有効活用する 。 北 海 道 で は ， エ ゾ シ カ （Cervus nippon

る試みがはじまり，産業としての発展が期待されyezoensis）の個体数が増加の一途をたどっておている。最近，エゾシカにおいて肝蛭症が増加しり，農作物に与える経済被害は甚大である。近年，てきたと認識されてきたが，大規模な疫学調査の効果的な個体数コントロールのために，狩猟した実施例はなく，その実態は不明であった。そこで，© The Ito Foundation

リコンビナント抗原を用いたエゾシカにおける肝蛭症の血清診断法の確立と疫学調査による家畜・ヒトに対するリスク分析

ELISA法を確立して疫学調査を実施することにより，北海道におけるエゾシカの肝蛭抗体保有率
を正確に把握し，ジビエとして供給する際のヒトへの感染リスク，ならびに家畜牛への感染源としてのリスクを評価することを目的とした。
本研究で確立したリコンビナントCathepsinL1（rCatL１）を用いたELISAは感度90％，特異度96％を達成し，信頼性が高いことが確認された。
北海道十勝支庁を中心に，12地域から210検体の血清を得てELISAに供した結果，抗rCatL１抗体の保有率は最も高い地域で100％に達することが判明した。
今後，エゾシカの肝蛭保有率を正確にモニタリングして，家畜牛，ヒトへの感染源として適切な

261

文
献
１）Ichikawa-Seki, M., Shiroma, T., Kariya, T., Nakao,R., Ohari, Y., Hayashi, K., Fukumoto, S.：Molecularcharacterization of Fasciola flukes obtained fromwild sika deer and domestic cattle in Hokkaido,
Japan, Parasitol. Int., in press，2017.
２）尾針由真，押田龍夫：北海道十勝地方のエゾシカ（Cervus nippon yesoensis）における日本産カンテツ（Fasciola sp.）の寄生状況調査，日本野生動物医学会
誌，18，115～120，2013.
３）横井佳寿美，稲原一幸，岡崎ひづる：エゾシカの疾病状況調査―エゾシカの衛生管理技術の構築を目指して，平成19年度北海道家畜保健衛生発表演題（抄録），2007.
４）Robinson, M. W., Menon, R., Donnelly, S. M., Dalton,
J. P., Ranganathan, S.：An integrated transcriptomics
and proteomics analysis of the secretome of thehelminth pathogen Fasciola hepatica: proteinsassociated with invasion and infection of the
mammalian host, Mol Cell Proteomics, 8, 1891～1907，2009.

注意喚起を行う必要がある。

© The Ito Foundation

262

野生獣肉の食肉利用に関する寄生虫性食中毒危害の
科学的分析
Parasitological research for game meat hygiene

山

﨑

朗

子

（岩手大学農学部）

Akiko Yamazaki（Department of Agriculture, Iwate University）

Recently, the population of wild deer have been growing explosively in Japan, resulting in
terrible feeding damage of farm and forest industries. To control number of them, game meatindustry is promoted by Japanese government for the efficient use of resources. Because wild
animals are not hygienically controlled, there is a possibility of contamination by unknown
pathogenic microbes. However, epidemiological information about wild animals is stillinsufficient. Meanwhile, the first Sarcocystic food poisoning was caused by S. fayericontaminated raw horse meat（basashi）.That report made Genus Sarcocystis be widely known
in Japan. Genus Sarcocystis is a protozoa which has two host species in its life cycle. Herbivores
are main intermediate hosts, and Sarcocystis forms sarcocysts in their muscle tissue. Infection
in human occurs by eating the infected cattle meat. And soon after that second Sarcocystic
outbreak was caused by raw venison which also be infected by Sarcocystis spp.. The main
symptom of those cases was vomiting and diarrhea same as reported before, but some people
also shows neurologic manifestation. This is first report of food poisoning case caused by
Sarcocystis spp. in deer. In this study, we tried to clarify the epidemiology of Sarcocystis spp. inwild deer（Cerves Nippon）in Japan. 257 Samples of deer muscle tissue were collected from
Hokkaido, Kanto, and Kyushu area. Sarcocystis specific 18S ribosomal RNA gene was detectedby polymerase chain reaction（PCR）, followed by sequencing analysis of full length of 18Sr
RNA gene to identify species. Genetic screening test revealed that more than 99％ of wild deerin Japan is infected by Sarcocystis spp. regardless of age, area, and sex. From the result ofidentification by sequencing analysis, two species of Sarcocystis are shown as common species
in all areas in Japan, on the other hand, some species are area specific.

１．目

成育環境が管理されないため，より多くの病原微的生物に暴露される可能性が大きい。国内ではすで

近年，多くの地域で獣害対策のため捕獲されたに野生獣肉の喫食による食中毒例が報告されてお野生動物の肉をジビエとして有効活用する地域振り，その病原体は細菌，ウイルス，寄生虫と広範興事業が行われている。家畜に比べ，野生鳥獣は

囲にわたっている１）。最近では，2011年に報告さ© The Ito Foundation

野生獣肉の食肉利用に関する寄生虫性食中毒危害の科学的分析

263

れた馬刺の食中毒事例で新規性食中毒起因微生物

基づいて行う。調査地域は日本全国とし，住肉胞として発見された住肉胞子虫Sarcocystis sp.が野子虫保有率，感染種を同定し，地域，性別，年齢

生ニホンジカにも寄生していることが分かり，などの起因因子を推定することとした。

2014年に馬刺同様シカ肉の生食で食中毒事例を起
こした。

法

２．方

住肉胞子虫については，牛に寄生するS. cruiz，

研究試料は，国内野生ニホンジカの横隔膜，骨ウ マ に 寄 生 す る S. fayeri ， 豚 に 寄 生 す る S.

格筋，季節によっては妊娠個体の胎盤，胎子を採

mniescherianaなどが知られ，ヒトにも感染する取する。試料採取は各県の処理施設や猟師の協力と規定している。野生動物であるニホンジカは，のもと行う。

広範囲を行き来しながら複数の家畜生息域と接触

2 . 1 これまでの調査地域の整理と新たな試料することが考えられる。事実，国内でのシカによ採取地域の決定る被害に，放牧地での牧草の食害があげられてい調査場所は，積極的に野生ジカの駆除と食肉利ることから，すでに牛とも接触していることが考用を行っている地域にサンプリング協力を依頼しえられる。このように，野生ニホンジカに寄生した。また，住肉胞子虫の垂直感染の有無を確認すている住肉胞子虫はジビエ喫食時のリスクに加るため，妊娠個体の胎盤および胎子を採集した。

え，家畜への感染源，伝播源となる可能性も想定

2.2

される。

厚生労働省暫定法：生食用馬肉中のSarcocystis

遺伝子検出法しかし，これまでに報告された疫学研究は，調fayeri検査法２）に準拠し，住肉胞子虫特異的18Ｓ

査地域の偏りや，検体数の数などの点からも十分

リボソームRNAをPCR法によって検出した。ニ

でないうえに，実体顕微鏡および光学顕微鏡によホンジカ筋肉組織10ｇを採取し，PBS 30 mlを加る形態的調査が主であり，詳細な種同定ができてえエクセルオートホモジナイザー（日本精機製作いない。申請者は，北海道からのエゾジカ試料を所）を用いて乳液状になった試料から，DNeasy

用いて遺伝解析を行った結果，一個体に数種の混Blood & Tissue Kits（Quiagen）を用いて核酸を合感染が起こっていることを発見した。家畜にお抽出した。F-primer（18S1F）：5ʼ-GGATAACC

ける住肉胞子虫では固有の優勢種のみが感染して

GTGGTAATTCTATG, R-primer（18S11R）：いることが報告されており，この相違は家畜と野5ʼ-TCCTATGTCTGGACCTGGTGAG を 用 い ，生動物の成育背景の違いが顕著に現れたものと考

Takara EX-Taq の 初 期 変 性 温 度 と 加 熱 時 間 にえられる。さらに，前述のように，野生ニホンジ

従 っ て ，94 ℃，３ 分 間 の 後 ，94 ℃，30 秒 間 ，カの増殖により家畜との接触機会が増大している

60℃，１分間，72℃，１分間を１サイクルとし，ことを考慮すると，ニホンジカが保有している多40サイクルのPCR増幅を行った。増幅産物をアガ

種の住肉胞子虫が家畜にまで伝播していく可能性

ロースゲル電気泳動にて泳動し，1,800bpのバンが高い。

ドを確認した。

そこで本研究では，ジビエ産業の発展，および

2.3

遺伝子配列による種同定法

野生ニホンジカから家畜への感染防御策への寄与

2 . 2の遺伝子検出法のPCRにより得られた18Ｓを目的としてさらに広い範囲での野生ニホンジカ

リボソームRNAの増幅産物を用いて，アガロー

における住肉胞子虫の疫学調査を遺伝子検査法に

ス電気泳動を行い，1,800bpのバンドを確認した© The Ito Foundation

264

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

後，バンド部分のアガロースゲルを切り出し，本研究で行った野生ニホンジカ調査では，国内３

Nucleo spin（TaKaRa）を用いて増幅産物を精製

地域ともSarcocystis属の高率な寄生が確認されした後，in-fusion cloning反応により，遺伝子ク

た。このことから，調査地域においては，野生ニ

ローニング用ベクターであるT-vector pMD20

ホンジカ生息環境中におけるSarcocystis属の生活（TaKaRa）に導入した。大腸菌DH５αを用いて環が十分に保持されていると推察される。また，形質転換を行い，終濃度100μg/mlアンピシリン

全検体の感染率が99％を超えていたことから分か

含有LB寒天培地に形成されたコロニーからプラるように，ニホンジカ種別，性別，年齢による寄スミドを精製し，サンプルDNAとした。Big Dye

生率の偏りは確認されなかった。

v3.1（Applied biosystems）を用いた蛍光ラベリ
ングののち，シークエンサー（ABI3500, Applied

3 . 3 国内野生ニホンジカに寄生するSarcocystis
属の種同定結果

Biosystems）にて塩基配列を取得した。得られた塩

国内３地域の野生ニホンジカ検体から得られた

基配列についてNational Center for Biotechnology

Sarcocystis spp.と，既知のSarcocystis種21種につInformation （NCBI） の Basic Local Alignment

いて18S rRNA遺伝子の塩基配列に基づき，系統樹

Search Tool（BLAST）を 用 い て 相 同 性 検 索 をを作製した。その結果，九州地方ではS. tarandi，行った。既存のSarcocystis属18S rRNA遺伝子塩

S. elongata，S. rangiferi，お よ び S. silva と 相 同

基配列と比較するため，クリスタルＷを用いてマ性が99％のものと，既存種との相同性が97％以下

ルチプルアライメントを行った後，最尤法を用いであるS. spp.が検出された（Fig.１）。関東地方のて系統樹を作製した。

検体から得られたプラスミド群は，S. pilosa，S. tarandiおよびS. elongataと一致するグループ

３．結果と考察3.1が検出された（Fig.２）。北海道の検体から得ら採取された検体数

れたプラスミド群は，S. tarandi，S. elongata，

本研究で採取した野生ニホンジカ筋肉組織検体

S. rangiferi，およびS. silvaと相同性が99％一致

は，北海道114検体，関東地方66検体，九州地方

した（Fig.３）。このように，国内３地域の野生77検体の計257検体であった。ニホンジカ種別でニホンジカにはS. tarandi，S. elongataが共通しはエゾシカ114頭，ホンシュウジカ66頭，キュウて寄生していることが判明した。その一方，各地

シュウジカ77頭であった。性別が分かるものは，域に固有の種も同定された。関東地方のホンシュ

雄77検体，雌51検体であった。年齢は，１歳18検

ウジカ肉検体からはS. pilosaが同定された。これ

体，２歳41検体，３歳37検体，４歳22検体，５歳は，リトアニアの動物園で飼育されていたニホン

以上12検体であった。

ジカから発見された新種で，ニホンジカ固有種の3 . 2 国内野生ニホンジカにおけるSarcocystis

可能性が高いと考えられる３）。九州地方のキュウ
シュウジカ検体からは，現在NCBIに登録されて属の保有率
定性的遺伝子検査法を用いて国内各地から採取いる既存種の18S rRNA遺伝子とは一致しない

した野生ニホンジカ供試験検体を検査した結果，S. spp.が検出された。キュウシュウジカは，ニホ

北海道では100％（114/114：陽性検体数／試験検

ンジカ亜種の中でも，エゾシカおよびホンシュウ

体数），関東地方では98.5％（65/66）九州地方でジカと比較して形態的変異が大きいことが知られは98.7％（76/77）の割合で陽性が確認された。

ており ４），エゾシカおよびホンシュウジカと異© The Ito Foundation

野生獣肉の食肉利用に関する寄生虫性食中毒危害の科学的分析

265

K1-3
K6-2
K6-7
K6-4
K1-9
K1-6
K1-5
K1-4
K1-7
K1-10
K1-2
K6-6
K6-5
K6-3
K6-8
S rangi
S hjorti
S pilosa
S alceslatrans
S cruzis levinei
S tarandivulpes
S alcesS taeniata
s fayeriS grueneri
S scandinavica
K1-1
S tarandi
S rangiferi
S silva
K1-8
S elongata
S fusiformis
S buﬀalonis
S hirsuta
S hominis
S bovifelis
S sinensis
S bovini
S aucheniae
S hardangeris ovalis
S arctica
S wobeseri
S lutrae
S rileyi
0.005

Fig. 1 Phylogenetic relationships between Sarcocystis sp. from wild deer in Kyushu area obtained in this study andother previously published Sarcocystis species.
Isolates from this study are marked in K-No. Nucleotide sequence of the 18S rRNA gene were aligned againstreference sequences retrieved from GenBank using ClustalW program. A phylogenetic tree was constructed byneighbor joining method with the maximum composite likelihood substitution model. The reliability of the tree wasassessed using bootstrap method with 1000 replicates.

© The Ito Foundation

266

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
Kanto3-9
S pilosa
Kanto3-7
Kanto3-5
Kanto3-1
Kanto3-4
Kanto3-6
Kanto3-10
S taeniata
S hjorti
S cruzi
S rangi
S alces
S grueneri
S tarandivulpess levinei
S alceslatrans
S bovifelis
S sinensis
S bovini
S hominis
Kanto3-8
S elongata
S tarandi
S silva
S rangiferi
S truncata is fayeri
S hardangeris ovalis
S arctica
S wobeseri
S lutrae
S rileyi

S fusiformis
S buﬀalonis
S hirsuta
S aucheniae
S scandinavica
0.005

Fig. 2 Phylogenetic relationships between Sarcocystis sp. from wild deer in Kanto area obtained in this study and otherpreviously published Sarcocystis species.
Isolates from this study are marked in Kanto-No. Nucleotide sequence of the 18S rRNA gene were aligned againstreference sequences retrieved from GenBank using ClustalW program. A phylogenetic tree was constructed byneighbor joining method with the maximum composite likelihood substitution model. The reliability of the tree wasassessed using bootstrap method with 1000 replicates.

© The Ito Foundation

野生獣肉の食肉利用に関する寄生虫性食中毒危害の科学的分析

267

H11-1
H11-3
H12-1
H12-9
S tarandi
H11-10
H11-5
H11-9
H12-10
H12-2
H11-2
H12-3
H12-4
H12-6
H12-7
S elongata
S rangiferi
S silva
S bovini
S bovifelis
S sinensis
S hominis
S buﬀalonis
S fusiformis
s fayeri
S hirsuta
S scandinavica
S hardangeris ovalis
S arctica
S rileyi
S lutrae
S wobeseri
S alceslatrans
S cruzi
S grueneri
S hjortis levinei
S pilosa
S rangi
S taeniata
S tarandivulpes
S alces
S aucheniae
0.002

Fig. 3 Phylogenetic relationships between Sarcocystis sp. from wild deer in Hokkaido area obtained in this study andother previously published Sarcocystis species.
Isolates from this study are marked in H-No. Nucleotide sequence of the 18S rRNA gene were aligned againstreference sequences retrieved from GenBank using ClustalW program. A phylogenetic tree was constructed byneighbor joining method with the maximum composite likelihood substitution model. The reliability of the tree wasassessed using bootstrap method with 1000 replicates.

© The Ito Foundation

268

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

（bp）
3000
1000

Fig. 4 Detection of

Sarcocystis sp. 18S ribosomal RNA gene by Polymerase Chain Reaction（PCR）．

Lane 1 : 100bp DNA marker
Lane 2 : muscle tissue（maternal）
Lane 3 : uterus（maternal）
Lane 4 : caruncle（maternal）
Lane 5 : placenta（maternal）
Lane 6 : placenta（fetus）
Lane 7 : umbilical cord
Lane 8 : muscle tissue（fetus）
Lane 9 : diaphragm（fetus）
Lane 10 : heart（fetus）
Lane 11 : tongue（fetus）
Lane 12 : Negative control（PBS）

なったSarcocystis種が寄生している可能性が推測あるため，信頼性向上のために調査検体の増加，される。

かつ妊娠初期，中期，後期の胎子の成長時期に対3 . 4 国内野生ニホンジカにおけるSarcocystis

応した調査を行う必要がある。
今回Sarcocystis種に関して調査を実施した野生属の胎子移行
捕獲時の推定年齢が１歳の検体にも高率にニホンジカは，３地域由来の個体であるが，ニホ

Sarcocystis属が寄生していることが確認されたこ

ンジカに寄生するSarcocystis属の種の多様性およとから，垂直感染の可能性が推測されたため，北び多様な種ごとの毒性，国内に分布するニホンジ

海道で捕獲された妊娠エゾシカ個体から，母体とカの亜種の多様性を鑑みると，さらに多く調査が胎子におけるSarcocystis属の感染の有無を調べ必要である。

た。その結果，エゾシカ妊娠個体では，子宮，胎本研究の疫学的解析から，国内野生ニホンジカ

子側胎盤および胎子の臍帯，骨格筋組織，心臓，にはSarcocystis属感染が避けられないと推察され舌を検査した結果，1,800bpのバンドは認められた。Sarcocystis fayeriによる食中毒性が判明してなかった。一方，母体由来骨格筋組織および母体いるウマ生肉の食肉利用には加熱，冷凍など予防

側胎盤を用いた検査では1,800bpのバンドが確認対策が講じられている５）ことから，シカ肉の食肉された（Fig.４）。このことから，Sarcocystis属の利用の際にも，十分なリスク管理を行うために危

メロゾイトは胎盤関門を通過できないことが示唆

害性予防対策が必要である。

され，胎子移行はできないが，生後１年間の間にスポロシストによる暴露を受ける可能性が示唆された。しかし，本研究では１例のみの調査結果で４．要

約

今回の研究では，これまでに知られていなかっ© The Ito Foundation

269

野生獣肉の食肉利用に関する寄生虫性食中毒危害の科学的分析た野生ニホンジカに寄生するSarcocystis属の種同定を遺伝学的手法で明らかにした。固有宿主に一種のみが感染する家畜での感染形態とは異なり，野生ニホンジカについては，日本国内に広く分布している共通種と，生息地域に特異的に分布する固有種が混合感染している。Sarcocystis属についてはこれまでも食中毒性が指摘されているため，
ニホンジカ寄生性Sarcocystis種についても，食中毒性を明らかにしていく必要がある。

文献１）食品安全委員会ファクトシート：ジビエを介した人獣共通感染症（食品安全委員会HP）https://www.
fsc.go.jp/sonota/factsheets/140805_gibier.pdf２）平 成 23 年 ８ 月 23 日 付 け 食 安 監 発 0823 第 １ 号「Sarcocystis fayeri の 検 査 法 に つ い て （暫 定 版）」
http://www.mhlw.go.jp/file/06-Seisakujouhou11130500-Shokuhinanzenbu/0000125127.pdf３）Prakas, P., Butkauskas, D., Rudaityte, E., Kutkiene,
L., Sruoga, A., Pūraite, I.：J Parasitology Research，
115，3021～3032，2016．
４）大泰司紀之：哺乳類科学，26（2），13～17,1986．
５）斉藤守弘，鉢須桂一，岩崎一弥，中島董，渡辺昭宣，
守屋英樹，板垣博：日本獣医師会雑誌，37
（3）
，158～
162，1984．

© The Ito Foundation

●

●

●

270

カンピロバクターフリーブロイラーの分別出荷を目的とした養鶏場即時検出システムの確立
Establishment of pen side diagnosis system for segregation ofCampylobacter-negative flocks in chicken broiler farms

山崎

渉・イスラム イブラヒム サビック
（宮崎大学農学部獣医学科）

Wataru Yamazaki and Islam Ibrahim Sabike（Department of Veterinary Medicine, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

We established an effective Campylobacter screening system based on loop-mediatedisothermal amplification（LAMP）assay for both boiler chicken farm and slaughterhousesettings. We evaluated a turbidimetric LAMP（T-LAMP）and a fluorescent LAMP（F-LAMP）
assays for the direct screening of naturally contaminated chicken cecal and cloaca samples for
C. jejuni/C. coli to compare these assays with conventional quantitative culture methods.
While a real-time turbidimeter with AC power supply was used for T-LAMP analysis in alaboratory, only 1.75kg weight mobile machine with in-house buttery was used for F-LAMP
analysis. In total of 165 cecal samples, 93 samples（71.0％）were C. jejuni/C. coli-negative and38（29.0％）showed Campylobacter loads of between 6.4 and 9.0 log CFU/g in conventional
culture methods. The performance of T-LAMP and F-LAMP assays were both 100％ accurate
in terms of diagnostic sensitivity（38/38）and specificity（93/93）. Furthermore, in a comparison
study of 165 cloaca samples, both T-LAMP and F-LAMP assays showed 82.8％（48/58）
diagnostic sensitivity, 100％（107/107）diagnostic specificity. In a comparison of 55 flocks, both
LAMP assays showed 90.5％（19/21）diagnostic sensitivity and 100％（34/34）specificity. While
the T-LAMP assay required between 38 and 80 min from the beginning of DNA extraction toresults, the F-LAMP assay required only between 31 and 65 min. Reagent cost for both LAMP
assays were less than 100 JPY for single sample analysis. Theses suggest that the F-LAMP
assay will facilitate the separation of C. jejuni/C. coli-negative and -positive broiler flocks at
the farm level or in slaughterhouses before slaughtering, which would make it an effective toolin preventing the spread of campylobacteriosis to humans.

１．目

明した原因食品のほとんどが鶏肉である。カンピ

的ロバクターによる食中毒低減のためには原材料汚

カンピロバクター・ジェジュニとカンピロバク

染防止が重要なので，市販鶏肉の汚染を低減させ

ター・コリ（以下「カンピロバクター」）は日本る方法が模索されているが，有用な手法はまだ確における細菌性食中毒の原因の第一位であり，判立されていない。カンピロバクターは外部環境か© The Ito Foundation

カンピロバクターフリーブロイラーの分別出荷を目的とした養鶏場即時検出システムの確立

271

ら養鶏場内に侵入し，感染鶏（ブロイラー）腸内かつ正確に鑑別できるシステムを確立し，食中毒で増殖したのちに鶏群全体に急速に広がる。カン

被害低減に貢献することである。

ピロバクターの鶏腸内への定着は移行抗体の低下期あるいは腸内細菌叢構成の急変期である21～28

２．方法

日齢以降におこり，糞食習慣や密閉鶏舎内での多宮崎県内養鶏場の計99鶏群から採取した盲腸内頭飼育，暑熱対策の過換気等の要因を背景に，出容物131ならびにクロアカ（総排泄腔内容物）165荷時である45～55日齢までに同一鶏群全体に広がサンプルを試験に供した（いずれも１鶏群から無

る

１～３）

作為に３サンプルずつ採取）。まず，定法に従い，国内外の調査報告によれば，出荷時における鶏サ ン プ ル の 10 倍 希 釈 系 列 を 作 製 し た う え でのカンピロバクター保菌率は０～100％であり，

mCCDA培地上に各希釈液を塗布した。42℃・２

養鶏場単位で明確な違いが認められる（同一養鶏―３日の条件化で微好気培養を行い，サンプル内

場で飼育されていても飼育鶏舎が異なる別個の鶏

カンピロバクター量を定量した。さらに，サンプ

群では保菌状況が異なることもある）。養鶏場

ル約１ｇをプレストン増菌培地で42℃・１日の微（あるいは鶏群）ごとにカンピロバクター保菌率

好気培養後に，１白金耳量をmCCDAとバツラーが異なる理由は不明だが，これらの知見は適切な培地上に塗布し，42℃・２―３日の条件で微好気

バイオセキュリティ対策を取り，外部環境からの培養を行い，カンピロバクターの定性試験も同時侵入を阻止している養鶏場はカンピロバクターフに行った。培地上のカンピロバクター様コロニー

リー（陰性）の鶏を出荷していることを意味してを各サンプルあたり計４つ釣菌し，菌種を同定しいる。カンピロバクター陰性の鶏は鶏肉汚染を引た。

。

き起こさないので，カンピロバクター食中毒の低減に重要な貢献をすることができる。

さらに，既報に従い４～６），サンプルから総DNA（陽性サンプルはカンピロバクター遺伝子を含む）

しかし，鶏はカンピロバクターの無症状保菌者の直接検出を行った。抽出したDNAに対して，なので，臨床的・肉眼的所見からカンピロバク

濁度LAMP法ならびに蛍光LAMP法を実施した。

ターの陽性・陰性を鑑別することは不可能であ

LAMP法は既報に従い４，６），カンピロバクター・る。それゆえ，現在はカンピロバクター陽性・陰ジェジュニのみを検出するプライマーセット（C.

性鶏群が分別されずに，食鳥処理場に出荷されてjejuni-LAMP），カンピロバクター・コリのみをいる。結果として，陽性鶏群の処理後に陰性鶏群検出するプライマーセット（C. coli-LAMP）なが処理されることにより，食肉加工時に原材料汚らびに２菌種を包括して検出するための２つのプ染が拡大している。養鶏場でカンピロバクター陰ライマーセットの混合（duplex LAMP）の３種性の鶏群を分別したうえで出荷し，食鳥処理場での検出系を評価した。

先行処理するシステムや食鳥処理場内でカンピロ
バクター陽性・陰性鶏群を分別できるシステムを３．結果と考察確立できれば，鶏肉加工時のカンピロバクター汚131サンプルの盲腸内容物に対するカンピロバ

染を合理的に低減させ，食中毒被害を予防でき

クター培養試験の結果，93サンプル（71.0％）はる。本研究の目的は，出荷時および食鳥処理時に陰性，38サンプル（29.0％）が陽性を示した。濁カンピロバクター陽性・陰性の鶏群を簡易・迅速

度LAMP法ならびに蛍光LAMP法を実施した結© The Ito Foundation

272

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

果，いずれも培養試験の結果と完全に一致し，診果，２つのLAMP法の判定結果は一致した。いず

断的感度（陽性サンプル判定の正確度）（38/38）

れも診断的特異度は100％（107/107），診断的感および診断的特異度（陰性サンプル判定の正確度は82.8％（48/58）をそれぞれ示した（Table２度）（93/93）は両法ともに100％を示した（Table

およびTable３）。

１）。

本研究においては，鶏肉の流通・消費前段階で165サンプルのクロアカに対するカンピロバク

ある生産者レベル（養鶏場）でのカンピロバク

ター培養試験の結果，107サンプル（64.8％）はター陽性鶏群の摘発・分別や加工レベル（食鳥処陰性，58サンプル（35.2％）は陽性を示した。陽理場）での二次汚染拡大防止を可能とするため性58サンプルのうち，50サンプルは直接培養におに，日数を要する増菌培養を行うことなく，クロいて陽性を示した。残る８サンプルは直接培養でアカ（出荷直前に養鶏場での使用を想定）およびは陰性を示したが，増菌培養で陽性を示した。濁

盲腸内容物（食肉処理場での使用を想定）からの度LAMP法ならびに蛍光LAMP法を実施した結カンピロバクタースクリーニングを目的としたシTable 1 Results of turbidimetric and fluorescent LAMP assays for 131 broiler chicken cecal samples
Culture results
C. jejunipositive but
C. colinegative（n＝35）

C. colipositive but
C. jejuninegative（n＝０）

C. jejuni
andC. colipositive（n＝３）

C. jejuni
andC. colinegative（n＝93）

Turbidimetric LAMP
C. jejuni-LAMP positive
C. coli-LAMP positive
Duplex LAMP positive

35
0
35

0
0
0

3
3
3

0
0
0

Fluorescent LAMP
C. jejuni-LAMP positive
C. coli-LAMP positive
Duplex LAMP positive

35
0
35

0
0
0

3
3
3

0
0
0

Table 2 Results of turbidimetric and fluorescent LAMP assays for 165 broiler chicken cloaca

samples
Culture results
C. jejunipositive but
C. colinegative（n＝50）

C. colipositive but
C. jejuninegative（n＝６）

C. jejuni
andC. colipositive（n＝２）

C. jejuni
andC. colinegative（n＝107）

Turbidimetric LAMP
C. jejuni-LAMP positive
C. coli-LAMP positive
Duplex LAMP positive

41
0
ND

0
5
ND

2
2
ND

0
0
ND

Fluorescent LAMP
C. jejuni-LAMP positive
C. coli-LAMP positive
Duplex LAMP positive

41
0
43

0
5
5

2
2
2

0
0
0

ND: Not determined.

© The Ito Foundation

カンピロバクターフリーブロイラーの分別出荷を目的とした養鶏場即時検出システムの確立

273

Table 3 Comparison of C. jejuni/C. coli population and LAMP screening results in 58 culture-

positive broiler fecal samples
Culture results
C. jejuni/C. coli
enumeration（log cfu/g）＊Of

C. jejuni/C. coli LAMP
No. of culturepositive（n＝58）

No. of LAMPpositive（n＝48）

No. of LAMPnegative（n＝10）

Concordanceof culture and
LAMP
results（％）

＞9.00

1

1

0

＞8.00

2

2

0

100％
100％

＞7.00
＞6.00

13
15

13
15

0
0

100％
100％

＞5.00

9

8

1

88.9％

＞4.00
 3.00

8

4

4

50.0％

2

0

2

0％

＜3.00

8＊

5

3

62.5％

the eight samples, all tested negative by direct plating, but five tested positives with enrichment

culturing.

ステムを開発し，その性能を評価した。従来から

１ｇあたり4,000から6,000個）を大幅に上回る数

国内で広範に使用されてきた濁度LAMP法に加値を示しており，濁度LAMP法，蛍光LAMP法のえて，より迅速性・視認性・携帯性（現場持込がいずれにおいても培養試験と100％の一致度でカ容易）に優れているモバイル測定機器と自家製比

ンピロバクターのスクリーニングが可能であった

色蛍光試薬を用いる蛍光LAMP法も並行して実（Table１）。それゆえ，１鶏群から無作為抽出し施した。リアルタイム増幅確認による最も早い陽た３羽を食鳥処理場での加工直前に選別し，開発性判定時間と陰性確認時の最終判定所要時間は濁システムを用いてスクリーニングをすれば，カン

度LAMP増幅で18分と60分，蛍光LAMP増幅で11ピロバクター陽性・陰性鶏群の鑑別が可能とな

分と45分であった。両法いずれも肉眼での陽性判る。同定した陰性鶏群を先行処理後に，陽性鶏群定が可能であったが，反応副生物である白濁を確を処理することで食鳥処理場での相互汚染頻度を認する濁度LAMP法よりも，ハイドロキシルナフ

減少させられることが示唆された７）。

トールブルーによる比色変化（深青色から淡青

これに対し，クロアカを対象とした試験では，色）を示す蛍光LAMP法の方が明確に判定でき

陽性サンプルのカンピロバクター菌数は１ｇあたた。先行して実施する20分のDNA抽出ステップ

り3.0log未満から9.0log CFU（1,000未満から10億の時間を加えて，濁度LAMP法は38分から80分，個）であり，盲腸内容物と比較して菌数のばらつ

蛍光LAMP法は31分から65分で迅速に判定が可きが認められた（Table３）。さらに，濁度LAMP

能であることが分かった。１サンプルあたりの試法，蛍光LAMP法のいずれにおいても，培養陽性

薬コストは濁度LAMP法，蛍光LAMP法のいずれの58サンプルのうち，10サンプルを正しく陽性とに お い て も 自 家 製 試 薬 を 用 い て お り ，市 販 品

判定することができなかった（LAMP法の偽陰（200円から400円）よりも安価な100円弱であった。

性判定）。この偽陰性10サンプルは３サンプルの盲腸内容物を対象とした試験では，培養試験のみが低菌量による検出感度不足に起因していた。

結果，陽性サンプルのカンピロバクター菌数は，残る７サンプルはむしろ，検出限界を十分に上回

いずれも１ｇあたり6.0logから9.0log CFU（100万りながら，偽陰性を示した（Table３）。これらの個から10億個）とLAMPの検出限界（サンプル

７サンプル中５サンプルは同一時期に採取した特© The Ito Foundation

274

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

定の１農場に集中しており，クロアカ内に含有さとなり，偽陰性の発生頻度は11.5％まで低下する。

れる遺伝子増幅阻害物質（例えば盲腸内容物にはそれゆえ，１鶏群あたり３羽以上を出荷直前に本ほとんど存在しないが，クロアカ内に高濃度で存LAMP法を用いてスクリーニングをすれば，カン

在する尿酸や特定の飼料に起因する物質）によっ

ピロバクター陽性・陰性鶏群の特定と分別出荷にて，LAMP増幅が阻害されたと推測した。なよる食鳥処理場での相互汚染リスク低減が90％近

お，蛍光LAMP法において，２サンプルのみC.

くの精度で可能となることが示唆された。上述のjejuni-LAMPとC. coli-LAMPが陰性かつdupelx

盲腸内容物を対象としたスクリーニング法と組みLAMPのみが陽性を示す部分的な不一致例が認合わせて，食鳥処理場での鶏肉原材料のカンピロめられた（Table２）。２つのプライマーセットをバクター汚染の低減により，食中毒発生の減少が組み合わせた相乗効果により，検出限界付近のサ実現できる可能性が示唆された８）。

８，９）

ンプルを幸運にも検出できた可能性が示唆された

蛍光LAMP法と濁度LAMP法の診断精度とコが，慎重な判断を期すため，C. jejuni-LAMPとC.

ストは同等であったが，視認性・迅速性・携帯性

coli-LAMPの結果を採用し，最終的に陰性サンプの面で，蛍光LAMP法に利点が多いことが明らか

ルと判定した。

になった。今後は蛍光LAMP法に焦点をあてた改

逆 に ，カ ン ピ ロ バ ク タ ー 菌 数 が １ ｇ あ た り

良を推進する予定である。当初は自家製比色蛍光

3.0log（1,000個）未満でありながら，５サンプル

試薬を常温保存可能な乾燥試薬化し，より現場ではLAMP陽性を示している（Table３）。これらのの使用に即したシステム開発を想定していた。しサンプルはすべて，直接培養（mCCDA培地使用）

かし，予備試験において検出感度の低下が認めら

では雑菌が過剰に発育し，培地上にカンピロバク

れ，実用化には至らなかったので，改良を図る。

ターの発育が確認できなかった。しかし，増菌培今回開発したシステムはDNA抽出ステップに20養（プレストン培地での増菌後，mCCDAとバツ

分，さらに遠心機とヒートブロックの使用を必要

ラー培地に塗沫）では，純培養上にカンピロバクとしている。今後はDNA抽出ステップもさらにターの発育が観察されている。プレストン培地，

使用機材・試薬の簡便化と迅速化を図るととも

mCCDA培地ならびにバツラー培地はそれぞれ，に，サンプル内の遺伝子増幅阻害物質を簡易に除異なる抗菌スペクトラムの抗生物質／抗菌性物質

去できる手法を開発し，陽性・陰性鶏群を100％を含有しているので，増菌培養では雑菌発育を効の正確性で鑑別できるよう，合わせて改良を図っ

果的に抑制できる。それゆえ，元来，サンプル内ていきたい。カンピロバクターのスクリーニングにはLAMP法の検出限界を上回るカンピロバクが養鶏場等の現場で実現できるように，簡易迅速ターが存在していたが，直接培養中の雑菌過剰発かつ高精度なスクリーニングシステムを確立した

育（直接培養の偽陰性）により，見かけ上，菌数い。

が少なく算出されたものと推測された８）。
クロアカサンプルでは鶏個体単位では偽陰性が４．要

約17.2％の頻度で確認されたものの，鶏群単位で解出荷時および食鳥処理時にカンピロバクター陽析した場合（３羽の結果をまとめて１羽でも陽性

性・陰性の鶏群を簡易・迅速かつ正確に鑑別する個体がいれば鶏群を陽性と判定），診断的特異度ためのシステムを開発した。131の鶏盲腸内容物

は100％（34/34），診断的感度は88.5％（17/19）

サンプルに対して，本システムによる迅速スク© The Ito Foundation

カンピロバクターフリーブロイラーの分別出荷を目的とした養鶏場即時検出システムの確立

リーニングの結果は培養試験の結果と完全に一致
し ，診 断 的 特 異 度（93/93）お よ び 診 断 的 感 度（38/38）はともに100％を示した。さらに，165のクロアカサンプルに対して，本システムの診断的特異度は100％（107/107），診断的感度は82.8％（48/58）をそれぞれ示した。判定所要時間は11分から45分であった。開発システムは高感度かつ迅速であり，カンピロバクター陽性・陰性鶏群の特定と分別，食鳥処理場での相互汚染リスク低減に応用できる可能性が示唆された。
文
献１）Rudi, K., Høidal, H. K., Katla, T., Johansen, B. K.,
Nordal, J., Jakobsen, K. S.：Appl Environ Microbiol，70，790～797，2004.
２）Wagenaar, J. A., Jacobs-Reitsma, W., Hofshagen,M., Newell, D.：Campylobacter 3rd edition, pp.667～667，
ASM press, Washigton DC, USA，2008.

275３）Yamazaki, W., Uemura, R., Sekiguchi, S., Dong, J.B.,
Watanabe, S., Kirino, Y., Mekata, H., Nonaka, N.,
Norimine, J., Sueyoshi, M., Goto, Y., Horii, Y., Kurogi,
M., Yoshino, S., Misawa, N.：J Appl Microbiol，120，
1711～1722，2016.
４）Yamazaki, W., Taguchi, M., Ishibashi, M., Kitazato,
M., Nukina, M., Misawa, N., Inoue, K.：J Med
Microbiol，57，444～451，2008.
５）Yamazaki, W., Taguchi, M., Kawai, T., Kawatsu, K.,
Sakata, J., Inoue, K., Misawa, N.：Appl Environ
Microbiol，75，1597～1603，2009.
６）Yamazaki, W.：Methods Mol Biol，943，267～277，
2013.
７）Sabike, I. I., Uemura, R., Kirino, Y., Mekata, H.,
Sekiguchi, Farid, A. S., Goto, Y., Horii, Y., Yamazaki,
W.：Food Control，74，107～111，2017.
８）Sabike, I. I., Uemura, R., Kirino, Y., Mekata, H.,
Sekiguchi, S., Okabayashi, T., Goto, Y., Yamazaki, W.：
Front Microbiol, 7（article number: 1582），2016.
９）Wilson, I. G.：Appl Environ Microbiol，63，3741～
3751，1997.

© The Ito Foundation

276

毒素原性大腸菌易熱性毒素を迅速に検出する
イムノクロマトグラフィーの開発
Development of immunochromatography for rapidly detecting heat-labile
enterotoxin produced by enterotoxigenic Escherichia coli

有

満

秀

幸

（藤田保健衛生大学医学部）

Hideyuki Arimitsu（Fujita Health University School of Medicine）

Enterotoxigenic Escherichia coli（ETEC）causes watery diarrhea both against humans
and swine. ETEC produces heat-labile enterotoxin which is intrinsic each for humans andswine（LTh and LTp, respectively）. Since ETEC causes diarrhea in piglets which affects
growth after weaning, it is important for immediate preventive measures to establish simple
and rapid diagnosis methods to detect ETEC infection in piglets. For this purpose, we
attempted to develop an immunochromatographic detection method for LTp using mousemonoclonal antibodies. From hybridoma clones derived from mice which were intranasallyimmunized with genetically attenuated mutant LTp, we isolated five types of LTp-specificmonoclonal antibody（mAb）producing hybridoma clones; two of which were B subunit specificand three of which were A subunit specific. Among them, one of the B subunit-specific mAb
57B9 was cross-reactive not only with LTh, but also with cholera toxin（CT）produced byVibrio cholerae. Although immunochromatographic test strips using all combinations of mAbs
did not work, the one using a combination of gold colloid-conjugated mAb 57B9 with LTpspecific rabbit polyclonal antibodies on the membrane could rapidly（within 30 minutes）detect
purified LTp at the detection limit of 10 ng/ml. This test strip also cross-detected not only
purified LTh but also purified CT at the same detection limit. This test strip detected not only
LT in the supernatant of LT gene-positive strains cultured in CAYE broth supplemented
lincomycin, but also CT in the supernatant of Vibrio cholerae cultured in Syncase broth. These
results indicate that this test strip is commonly applicable for the diagnosis of both ETEC andV. cholerae infection both in humans and swine.

１．目の摂取による食中毒事例が散発する疾患である。

的

また家畜においては豚の離乳後下痢症の原因菌と毒素原性大腸菌（ETEC）感染症は発展途上国なっており，肥育に影響を与えることから，先進における乳幼児下痢症や旅行者下痢症の主要な原国においても畜産農家に経済的損失を与える疾患因菌であるが，我が国においても汚染生野菜などである。ETECによる下痢の主要な病原因子は，© The Ito Foundation

毒素原性大腸菌易熱性毒素を迅速に検出するイムノクロマトグラフィーの開発

易熱性下痢毒素（LT）と耐熱性下痢毒素（ST）の２種類の下痢毒素である。そのうちのLTはヒ

２．方

277

法

ト下痢症と豚下痢症から分離される菌株で抗原性2.1がわずかに異なり，それぞれLTh，LTpと厳密に抗体の作製およびスクリーニングに使用する区別される。またLTはコレラ菌が産生するコレ

LT（LTh，LTp），mLTおよびCTは既報１～３）にラ毒素（CT）と血清学的に交差し，ペプチドで準じて組換えタンパク質として作製，精製した。

あるSTとは異なり，１分子のＡサブユニットと豚由来の野生株大腸菌は共立製薬株式会社より分５分子のＢサブユニットからなる約86kDaの複合

与された菌株を使用した。LTh産生菌株であるＨ

体タンパクであるため抗原性が高い。

10407 株 ，CT 産 生 株 の コ レ ラ 菌 で あ る Vibrio

LTの検出には分離培養された菌の培養上清を試料とした，ウサギポリクローナル抗体を用いたラテックス凝集反応キットが市販されているが，材料

cholerae 569B株は研究室の保管株を使用した。
2 . 2 モノクローナル抗体およびウサギポリク
ローナル抗体の作製

結果を得るために約18～20時間を要することが難mAb産生ハイブリドーマクローンは既報の志点である。特に獣医畜産領域においては，オンサ

賀毒素（Stx）に対する抗体を作製４，５）する際に，イトでの診断の可否がその後の速やかな防疫対策

Stx抗原とともにアジュバントとしてmLT３）を混につながること，またヒトの公衆衛生分野におい合免疫したBALB/cマウス由来ハイブリドーマかても安価な検出キットを提供できることは，本菌ら分離した。LT特異抗体産生クローンはLTpをの蔓延する途上国の医療への貢献の観点でも重要抗原としたELISAで選別した。限界希釈法を２であると考えられる。

回実施して単一化したクローンをBALB/cマウス

LTによる下痢の発症はCTと同様，小腸上皮細の腹腔内に接種して，腹腔内に滲出する腹水を回胞での持続的なアデニル酸シクラーゼの活性化に収後，ProteinGセファロースを用いてIgGを精製

よるcAMPの上昇で起こるが，一方でLTは高いした。ポリクローナルIgG抗体はmLTをフロイン

粘膜アジュバント活性を示すことが報告されておトアジュバントと乳化後にウサギに皮下免疫し，り ，我 々 の 研 究 室 で は 弱 毒 化 さ せ た 変 異 LTp

採血して得た抗血清からProtein Aセファロース（mLT）を種々のワクチン抗原と経鼻投与するこを用いて精製した。精製抗体のLTやCTに対するとにより，ワクチン効果を強めることを報告して感度はELISA，反応特異性はウェスタンブロッ

きた。さらに我々はmLTをワクチン抗原とともトまたはDynabeads Protein Gを用いた免疫沈降に混合免疫したマウスに由来する，LTに対する法により確認した。

モノクローナル抗体（mAb）産生ハイブリドー
マを数種分離したことから，このmAbがLT，ひ2 . 3 イムノクロマトグラフィーのテストスト
リップの作製

いては交差反応するCTを迅速かつ高感度に検出

テストストリップの作製は既報に準じて行っできる診断薬開発に利用できないかと考えた。

た ４）。作製したmAbは金コロイド粒子（WRGH

そこで本研究では，得られたLTに対するmAb

２；ワインレッドケミカル社）で標識し，１％の性状を詳細に解析し，迅速簡易診断に利用でき

BSAを含むPBSで希釈した溶液をコンジュゲート

る可能性のあるLT検出用のイムノクロマトグラ

パッド（ミリポア社）に染みこませて乾燥させ

フィーのテストストリップの作製を試みた。

た。テストストリップはメンブレンとしてHi-© The Ito Foundation

278

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

FlowPlus135メンブレンカード（ミリポア社）を（59B3，63B7，72D5）がＡサブユニット特異抗使用し，テストライン（検出部）には金コロイド体であることが明らかとなった。LTpを抗原とし標識抗体とは異なる別のmAb，またはウサギポ

たELISAでは抗体間に感度の差はほとんど見ら

リクローナルIgGを画線塗布，コントロールライれなかったが，LThに対しては63B7の感度が低ン（対照部）には抗マウスIgGヤギ抗体を画線塗下し，またＢサブユニット抗体２種についても布し，37℃で２時間乾燥させた。ブロッキング溶ウェスタンブロットでバンドが検出できないなど

液（0.5％カゼイン加50mMホウ酸，pH8.5）に45

反応性に違いが見られた。また，CTに対しては分 間 振 盪 後 ， 安 定 化 溶 液 （0.5 ％ シ ョ 糖 加

Fig.２に示すように，57B9のみがLTp，LThとほ

50mMTris-HCl，pH7.5）に30分置換し，その後ぼ同感度で交差反応することがELISAで明らか

室温で一晩乾燥させた。これに上述の金コロイドとなったが，LThに対してと同様，ウェスタンブ

標識抗体を含むコンジュゲートパッドと試料添加

ロットではバンドとして認められず，免疫沈降にパッド（サンプルパッド），吸収パッドを貼り付

より特異性が確認された。これらの結果から，

け完成品とした。

57B9はLTp，LTh，CTに同等に交差反応する抗2 . 4 試料の作製およびテストストリップでの体であり，残る４抗体はLT特異抗体と判断した。
3.2

毒素の検出

テストストリップの反応性

大腸菌株の培養にはカザミノ酸―酵母エキス

次にイムノクロマトグラフィーに用いる最適な（CAYE）培地，トリプティックソイ（TS）培地，抗体の組み合わせを見いだすため，各mAbを金Syncase培地，ブレインハートインフュージョン

コロイド標識抗体，メンブレン塗布抗体として検（BHI）培地に加え，BHIはカザミノ酸を２％に証を行った。しかしながら予備実験の段階で，なるよう添加したBHI-CA培地も使用した。コレ

mAb同士の組み合わせではどれも１μg/mlのLT

ラ菌培養にはSyncase培地を使用した。いずれのでさえ検出ができなかったため，塗布抗体はウサ培地も毒素産生増強効果があることが報告されてギポリクローナルIgGに切り替え，最適なmAbをいるリンコマイシン（最終濃度90μg/ml）の添加

金コロイド標識抗体として使用することにしたの影響も検討した。37℃で一晩培養した菌液のポ（こ の 抗 LTp ポ リ ク ロ ー ナ ル IgG は ELISA でリミキシンＢ処理遠心上清をフィルターで濾過

LTp>LTh>CTの順の反応感度を示し，またウェ

し，その150μｌをサンプルパッドを通じてテス

スタンブロットでの反応性にも差があるものの，

トストリップに展開し，30分以内にテストライン

３種すべての毒素に交差反応する）。Fig.３に結とコントロールライン上のバンドの出現の有無を果を示すように，作製したテストストリップのう

確認した。

ち，57B9を金コロイド標識抗体としたものが最も感度が高く，10ng/mlまでの精製LTpおよび３．結果と考察3.1

LThを検出できることが明らかとなった。その他のmAbではこの感度に至らなかったことから，得られたmAbの感度と特異性

今回５種類のLTp特異的なmAb産生クローン

57B9 を 金 コ ロ イ ド 標 識 抗 体 と し た テ ス ト ス トが得られた。各抗体の特性をFig.１に示す。LTp

リップを用いて以降の検証を行うことにした。

を抗原としたウェスタンブロットにより，２種類

3.3（57B9，58D3）がＢサブユニット抗体，３種類

豚の臨床材料から分離されたETECからの最適© The Ito Foundation

最適な供試菌培養条件の検討

279

毒素原性大腸菌易熱性毒素を迅速に検出するイムノクロマトグラフィーの開発
（A）

2

（KDa）

57B9
58D3
59B3
63B7
72D5
134

60▶
50▶
40▶
30▶

◀LTA

20▶

1
0
0.01

◀LTB

0.1
1
10
100 1000 10000
Ab concentration（ng/ml）

57
B9
58
D3
59
B3
63
B7
72
D5
13
4

OD415nm3（B）

Reaction for LTp

（C）

（KDa）
60▶
50▶
40▶

4

13

58

0.1
1
10
100 1000 10000
Ab concentration（ng/ml）

D3
59
B3
63
B7
72
D5

20▶

1
0
0.01

◀LTA

30▶

B9

2

57B9
58D3
59B3
63B7
72D5
134

57

OD415nm3（D）

Reaction for LTh
Fig. 1 Immunological properties of the LT-specific mouse mAbs prepared in this study. The reaction of each mAbagainst purified LTp（A）and LTh（C）in ELISA. The data represent the mean of three separate experiments andthe error bars indicate the standard error of the mean.（B）Western blot analysis of each mAb（57B9 and 58D3, 100
ng/ml; 59B3, 63B7, and 72D5, 10 ng/ml；134, 1μg/ml）against the cell extracts of LTp（B）and LTh（D） -expressing
recombinant E. coli MV1184 strains. Each lane was separated after blocking and recombined in the detection step.
mAb 134 was used as a negative control.

なLT産生条件を決定するため，種々の培地で培

CAYE培地，Syncase培地でより明瞭なバンドが養し，テストストリップでのLT検出の可否を検検出できたため，この２種の培地にリンコマイシ

証 し た 。Fig. 4（A）に 結 果 を 示 す 。こ の 中 でンを添加した培養条件が適していると考えた。次CAYE培地とSyncase培地におけるETECの培養に種々の遺伝子型を示す豚由来大腸菌株培養上清上清でLTが検出できた。BHI培地ではカザミノ

中のLT検出の可否を確認したところ，Fig. 4（B）

酸添加の有無に関わらずLTの検出ができず，TSに示すように，ST遺伝子（est），浮腫病の原因因

培地では結果が安定せず良否の判定ができなかっ子である志賀毒素バリアントStx2e遺伝子（stx2e）

た。また，ETECのLT産生は培地中にリンコマの有無に関わらず，LT遺伝子（elt）保有株の培

イシンを添加すると増強することが知られている

養上清中からはLTを検出することができ，非保ことより，各培地に添加して培養したところ，有株においては非特異反応，STやStx2eとの交差© The Ito Foundation

280

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

（A）
57B9
58D3
59B3
63B7
72D5
134

◀Hc

31▶

◀A subunit
◀Lc

21.5▶

1

14.4▶
6.5▶

C
T
C
TB

1
10
100 1000 10000
Ab concentration（ng/ml）

T

0.1◀B subunit

C

0
0.01

134

66.2▶
45▶

TB

2

57B9

（kDa）

C

OD415nm3（B）

Fig. 2 Response of anti-LT mAbs to CT.（A）Sensitivity of each mAb against purified CT. The data represent the

D5
72

B7

B3

63

59

57

58

B9

D3

mean of three separate experiments and the error bars indicate the standard error of the mean. （B）
Immunoprecipitation of mAbs against 150μl of cell extract from recombinant E. coli MV1184 strains expressing
CT or CTB. “Hc” and “Lc” indicate the heavy and light chains of each mAb, respectively. Purified CT（5 μg）was
loaded in the right lane as a reference band. In all experiments, mAb 134（anti-His tag mAb）was used as anegative control antibody.

LTp

100
10
100
10
100
10
100
10

100
10
1
100
10
1

C▶
T▶

LTh

LTp

（ng/ml）
Fig. 3 Immunochromatographic detection limits of the test strip against purified LT. Rabbit anti-LTp polyclonal IgG（1 mg/ml）and goat anti-mouse IgG antibody（1 mg/ml）were applied to the membrane as test（T）and control（C）lines, respectively. Each mAb was used in the form of a gold colloid-conjugated antibody. One hundred andfifty microliters of purified LTp and LTh were loaded onto the test strips.

反応は見られなかった。また本テストストリップに結果を示す。ポリクローナル抗体の交差反応性はLTh産生株であるＨ10407株の培養上清中のがLTに比べると低下する事実にも関わらず，精LThも検出できたことより，豚のみならずヒトの製したCTに対してもLTと同じく10ng/mlまで検ETEC感染症診断にも利用可能であると考えられ出可能であった。また，Syncase培地で培養したV.

た。

cholerae 569B株の培養上清中のCTも同様に検出

3.4

コレラ毒素の検出の可否の検証できた。

用いた金コロイド標識mAb57B9，画線したポ

3.5

総括

リクローナルウサギIgGともにCTとの交差反応

本テストストリップに用いた抗体はLTpを免疫性が確認されていることから，作製したテストス

原として作製したものであるため，当初の目的はトリップのCTの検出の可否を検証した。Fig.５

豚のETEC感染症の診断に特化した迅速診断法の© The Ito Foundation

BH
I-C
A
TS

CA
YE
BH
I

（A）

281

Sy
nc
as
e

毒素原性大腸菌易熱性毒素を迅速に検出するイムノクロマトグラフィーの開発

LCM
C▶
T▶

H10407
（LTh）

（B）
C▶
T▶
eIt
est
stx2e

Fig. 4 Immunochromatographic detection of LT in the culture supernatant of E. coli strains.（A）Effect of culture

media with or without lincomycin（LCM）on the production of LT in the elt-positive strain.（B）Detection of LT invarious genotypes of E. coli strains cultured in CAYE broth containing lincomycin. Rabbit anti-LTP polyclonalIgG（1 mg/ml）and goat anti-mouse IgG antibody（1 mg/ml）were applied to the membrane as the test（T）andcontrol（C）lines, respectively. mAb 57B9 was used in the form of a gold colloid-conjugated antibody. One hundredand fifty microliters of culture supernatant of various genotypes of clinical isolates from swine were loaded onto
the test strips. Culture supernatant of H10407 was used as an LTh-producing strain. The toxin gene profile of eachstrain is shown under the panel.

C▶

Sup.

1

10

100

T▶

CT
（ng/ml）
Fig. 5 Immunochromatographic cross-detection of CT. Rabbit anti-LTP polyclonal IgG（1 mg/ml）and goat anti-mouse

IgG antibody（1 mg/ml）were applied to the membrane as the test（T）and control（C）lines, respectively. Crossreactive mAb 57B9 was used as in the form of a gold colloid-conjugated antibody. One hundred and fifty
microliters of purified CT were loaded onto the test strips. “Sup.” indicates the result of CT detection in the culture
supernatant of V. cholerae strain 569B in syncase broth（without lincomycin）.

開発であった。しかしながら，今回作製したテス

る。血清レベルでもLTとCTが交差することは知トストリップはヒトのETEC感染症，コレラ菌感

られているが，今回のウサギポリクローナルIgG

染症の診断にも拡大して利用できるものであるとの結果でも明らかなように，その反応性の強さは考えられた。これを実現できたのは金コロイド標

免疫抗原との抗原性の類似度に相関するため，通識抗体として用いた抗体（57B9）のLThおよび常は同等の感度は期待できない。そのポリクロー

CTに対する同感度の交差反応性によると思われ

ナル抗体の検出力の差異をmAb57B9が補い，本© The Ito Foundation

282

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

テストストリップにおける同等の検出感度をもたの毒素を検出することができたことから，豚のみらしていると考えられた。豚の大腸菌感染症にはならずヒトのETEC感染症やコレラ感染症の迅速LTやSTが関与する下痢症と，Stx2eが引き起こ

診断に利用できると考えられる。

す浮腫病があり，その分離菌株の遺伝子プロファ
イルはFig.４に示すように多岐にわたる。作製したテストストリップはこれらの他の病原因子への交差反応性や非特異反応を示さなかったことより，豚大腸菌感染症の正確な迅速診断に利用できる可能性がある。また，感染症診断のみならず，
食肉におけるETECの汚染状況のチェッカーとしても利用できる可能性がある。
なお，本研究の成果はJournal of Microbiological
Methods誌にアクセプトされ，掲載された６）。
４．要

約

毒素原性大腸菌（ETEC）の下痢因子である易熱性下痢毒素（LT）に対するmAbを作製し，ウ
サギポリクローナル抗体と組み合わせて，迅速に豚由来菌中のLT（LTp）を検出するイムノクロ
マトグラフィーのテストストリップを作製した。
５種類のmAbから選別したＢサブユニット特異抗体57B9は，ヒト由来ETEC中のLT（LTh）にも，コレラ菌が産生するCTにも同感度の交差反応を認めた。これらを使用したテストストリップは
10ng/mlの感度でLTp，LTh，CTを検出し，野生株のETECやコレラ菌の培養上清中のそれぞれ

文
献１）Arimitsu, H., Tsukamoto, K., Ochi, S., Sasaki, K.,
Kato, M., Taniguchi, K., Oguma, K., Tsuji, T.：
Lincomycin-induced over-expression of mature
recombinant cholera toxin B subunit and theholotoxin in Escherichia coli, Protein Expr Purif，
67，96～103，2009.
２）Tsuji, T., Kato, M., Kato, Y., Kawase, H., Imamura,S., Miyama, A.： Construction of plasmids useful for
production of the B subunit of cholera toxin from
Vibrio cholerae or a heat-labile enterotoxin fromenterotoxigenic Escherichia coli, Eur J Epidemiol，
10，393～398，1994.
３）Tsuji, T., Yokochi, T., Kamiya, H., Kawamoto, Y.,
Miyama, A., Asano, Y.：Relationship between a low
toxicity of the mutant A subunit of enterotoxigenic
Escherichia coli enterotoxin and its strong adjuvant
action, Immunology，90，176～182，1997.
４）Arimitsu, H., Sasaki, K., Tsuji, T.：Development ofa simple and rapid diagnosis method for swine
edema disease to specifically detect Stx2e protein
by immunochromatographic test, Microbiol
Immunol，60，334～342，2016.
５）Arimitsu, H., Sasaki, K., Iba, Y., Kurosawa, Y.,
Shimizu, T., Tsuji, T.：Isolation of B subunit-specificmonoclonal antibody clones that strongly neutralize
the toxicity of Shiga toxin 2, Microbiol Immunol，
59，71～81，2015.
６）A r i m i t s u , H . , S a s a k i , K . , T s u j i , T . :Immunochromatographic detection of the heat-labile
enterotoxin of enterotoxigenic Escherichia coli withcross-detection of cholera toxin, J Microbiol
Methods，132，148～152，2017.

© The Ito Foundation

283

わが国の家畜におけるＤ型インフルエンザウイルス
感染の実態調査
Surveillance on influenza D virus infection in livestock in Japan

堀

本

泰

介・村

上

晋

（東京大学大学院農学生命科学研究科）

Taisuke Horimoto and Shin Murakami（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Influenza（flu）D virus was first isolated as a flu C-like virus from pigs with respiratory
illness in the US in 2011, epidemiological analyses suggested that cattle are the major
reservoirs of this virus and that the virus is potentially involved in the bovine respiratory
disease complex. Flu D viruses were also detected in China, France, Italy, and Mexico,
suggesting their wide global geographic distribution. Here, we report bovine flu D virus
infection in Japan and the isolation and characterization of a Japanese strain. We conducted aserological survey with an HI test for flu D virus, using archived bovine serum samples
collected from several herds of beef or dairy cattle nationwide. Nasal swab samples of cattle
exhibiting respiratory symptoms were screened for viral RNA with real-time RT-PCR. Fullgenome sequences of positive samples were phylogenetically analyzed. For virus isolation,nasal swab samples were inoculated onto HRT-18G and ST cells, followed by CPE. We foundsero-positive cattle in all prefectural regions tested with a total positivity rate of 30.5％．The
flu D genome sequence was detected in a nasal swab sample from a diseased cow. One isolate
was successfully obtained from an RT-PCR-positive sample. Full-genome sequences showed
high similarity among Japanese strains, which form independent clusters from isolates of othercountries. In conclusion, bovine flu D viruses have circulated country-wide in Japan. Horizontaltransmission of the viruses might occur readily within a herd. The virus is possibly related tomild respiratory illness in cattle. The phylogenetic analysis indicates the independent evolutionof flu D viruses in Japan.

１．目

ンフルエンザウイルスと分類された２）。米国にお的けるその後の調査により，Ｄ型インフルエンザウ

2011年，米国オクラホマ州の牧場で飼育されてイルスは，本来は牛の病原体であり，畜産衛生上いた呼吸器疾患のある豚から，新しいインフルエの最重要疾患である牛呼吸器病症候群（BRDC）

ンザウイルスが分離された 。遺伝子・抗原解析の患畜から高頻度でウイルス遺伝子が検出されるによりこのウイルスは既知のインフルエンザウイ

ことから，BRDCの原因ウイルスの一つである可ルス（Ａ～Ｃ型）とは異なる性質を示し，Ｄ型イ

能性が示されている。実際，牛への感染実験によ１）© The Ito Foundation

284

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

り単独で呼吸器疾患を引き起こすことが示された

共通性が高いと推測されるウイルスPB１遺伝子（2016年） 。また，米国以外でも，フランス（2015

特異的なリアルタイムRT-PCR法によりウイルス

４）
５）
６）
年）
，中国（2015年），イタリア（2015年）に遺伝子陽性検体を検索した。さらに，陽性検体において呼吸器疾患の牛や豚からこのウイルスが検関しては，検体を培養細胞に接種しウイルス分離

出されていることから，すでに世界規模で侵淫しを試みた。初めてＤ型インフルエンザウイルスをていると考えられる。一方，米国ではＤ型インフ

分離したHause博士らの方法１）に従い，検体は抗ルエンザウイルスに対する特異抗体がヒツジやヤ

生物質処理した後，ヒト結腸腺癌HRT-18Ｇ細胞

ギでも見つかっており，家畜全般に対する考慮すに接種し，その上清を豚精巣ST細胞で盲継代すべき病原体である可能性が高い 。

るという方法により，CPEおよび上清の赤血球凝３）７）本研究では，わが国の牛や豚などの家畜おける
Ｄ型インフルエンザウイルス感染の実態調査を実集HA活性が観察できるまでトリプシン存在下で継代した。

施し，その呼吸器病との関連性や，日本に存在す

分離ウイルスの各RNA分節をRT-PCR法で増るＤ型インフルエンザウイルスの生物性状を明ら幅し，全長ウイルスゲノム塩基配列を決定し，外かにすることを目的とする。

国株のデータベース配列と共に最尤法により進化

２．方

系統樹解析を行った。

法

３．結果と考察Ｄ型インフルエンザウイルス抗体調査を，北海道，岩手，東京，岐阜，大阪，宮崎，鹿児島の農調査したすべての都道府県の牛で陽性が認めら

場 で 飼 育 さ れ て い る 牛 の 血 清（血 漿）を 用 い

れ た（各 陽 性 率 は 14 ～ 50 ％ ）。全 国 陽 性 率 は（2011―2016年に採血），米国D/OK株 （農林水30.5％を示した（Table１）。陽性率は牛の年齢が産省の許可を得てカンザス大Hause博士より分上がるにつれて高くなっていった。５歳以上の高与）を抗原として七面鳥赤血球を用いた赤血球凝

齢牛では半分近くの個体が抗体陽性を示した。し集抑制HI試験を常法により行った。特異的な反たがって，わが国の牛社会にはＤ型インフルエン

応と判断されるHI価40倍以上を陽性とした。

ザウイルスが広く侵淫していることが明らかに

８）

茨城県の乳牛および山形県のBRDCを発症したなった。乳牛（ホルスタイン）と肉牛（黒毛和肉牛から呼吸器（鼻腔）スワブを採取し，株間の種）間で陽性率に有意な差はなかった。また，

Table 1 Serological survey for influenza D virus infection in Japanese cattle
地域

牛種

検体数

陽性数

陽性率

北海道

ホルスタイン

199

56

28.1

岩手

黒毛和種

50

10

20.0

東京

ホルスタイン

66

30

45.5

岐阜

ホルスタイン

37

5

13.5

大阪

ホルスタイン

24

7

29.2

宮崎

黒毛和種

879

272

30.9

鹿児島

黒毛和種

12

6

50.0

1267

386

30.5

合計

© The Ito Foundation

わが国の家畜におけるＤ型インフルエンザウイルス感染の実態調査

285

2010年に採材した検体からも陽性が検出されたこ

在，日本株のウイルスの性状をさらに解析していとより，ウイルスはそれ以前に日本に侵入している。

た可能性が示された。

今回の調査では，わが国のBRDC牛にＤ型イン

宮崎県の検体における調査結果から，陽性率のフルエンザウイルスが検出されることが明らかに高い農場と低い（もしくは０％）農場が明瞭に区なったものの，果たしてＤ型インフルエンザウイ

別された。この違いは牧場の地域性によるものでルスがBEDCの主要な原因であるかどうかの判断はなかった。したがって，ウイルスの農場内におまでには至っていない。しかし，最近の海外でのける水平伝播性は極めて高いと推測される。

メ タ ゲ ノ ム 解 析 で は ，BRDC 牛 か ら こ れ ま で茨城県の乳牛２頭および山形県の肉牛１頭からBRDCの原因とされる他の既知の病原体（牛RS

ウイルス遺伝子RT-PCR陽性検体が得られた。こウイルス，牛パラインフルエンザウイルス３，牛れらの全ゲノム配列はウイルス間で非常に相同性

ヘルペスウイルス１など）より極めて高頻度でＤが高く（99％以上），Ｄ型インフルエンザウイル

型インフルエンザウイルスが検出されることが示

スのゲノムは他の型のインフルエンザウイルスにされている９，10）。したがって，今回の成果は，現比べ，比較的安定であると考えられた。系統樹解在までその効果的な制御法が見つかっていないわ

析の結果，日本分離株は他国分離株とは異なるクが国のBRDCの発生を予防する（軽減する）ためラスターを形成していることが分かったが，Ｍ分のブレイクスルーとして，Ｄ型インフルエンザウ

節のみはフランスおよび中国株と同じクラスター

イルスに対するワクチン開発や抗ウイルス薬の開に属していた（Fig.１）。日本株と他の外国分離発などの必要性を検討するための礎になると考え

株との進化系統学的な違いは，外国株が最近導入られる。

されたのではなく，日本のＤ型インフルエンザウ
イルスが独自の進化をとげたことを示している。

４．要約

つまり，日本にはかなり以前からＤ型インフルエ

Ｄ型インフルエンザウイルスは，2011年米国のンザウイルスが牛社会に存在していたことを示唆

呼吸器症状のある豚から初めて分離された。そのしている。

後，牛が主要なレゼルボアであり，牛の呼吸器病

山形県のRT-PCR陽性検体から，Ｄ型インフル症候群（BRDC）の病原体であることが示唆され

エンザウイルスの分離に成功した。初めての日本た。また，Ｄ型インフルエンザウイルスは，中国，株の分離である。分離ウイルスのゲノム全塩基配

フランス，イタリアでも見つかり，地球規模で感列は検体中のRT-PCR増幅産物の全塩基配列と同染が広がっていると推測された。本研究では，日一であることから，その正当性が証明された。日本におけるＤ型インフルエンザウイルスの感染実

本株の独立した遺伝学的クラスターから，日本株態を調査した。HI試験を用いた血清調査では，はウイルス学的にも外国株と異なった特性を有し調べたすべての都道府県の牛検体（ホルスタイていることが推測される。例えば，ウイルスの中

ン ，黒 毛 和 種）で 陽 性 が 見 つ か っ た（陽 性 率

和活性に関与するウイルスエンベロープHEFタ

30.5％）。一方，RT-PCRによりウイルス遺伝子

ンパク質の抗原性が日本株と外国株とで相違するが陽性であったBRDC牛の鼻腔スワブ検体からウのであれば，Ｄ型インフルエンザに対するワクチ

イルス分離を試みたところ，初めて日本株の分離

ンは，日本株をベースに開発する必要がある。現に成功した。分離ウイルスゲノムの系統樹解析か© The Ito Foundation

© The Ito Foundation

0.00500.005096

NP
81

D/bovine/Minnesota/729/2013
56
D/bovine/Kansas/13-21/2012
D/bovine/Kansas/1-35/2010
97 D/bovine/Texas/3-13/2011
97
D/bovine/Oklahoma/660/2013
D/bovine/Nebraska/9-5/2012
D/bovine/Kansas/11-8/2012
D/bovine/Mississippi/C00046N/2014
D/swine/Oklahoma/1334/2011100
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68
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D/bovine/Italy/1/2014
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D/bovine/Shandong/Y127/2014
100
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D/bovine/France/2986/2012
D/bovine/Yamagata/10710/2016
D/bovine/Ibaraki/7768/2016
100
89 D/bovine/Ibaraki/7768/2016(2)
77

99

44

M

0.0050P3
94

0.00500.005085

NS89 D/bovine/Nebraska/9-5/2012

D/bovine/Oklahoma/660/2013
D/bovine/Texas/3-13/2011
D/bovine/Kansas/11-8/2012
D/bovine/Kansas/13-21/2012
D/bovine/Minnesota/628/2013
73
99
95 D/bovine/Minnesota/729/2013
D/bovine/Kansas/1-35/2010
D/bovine/Italy/1/2014
D/bovine/Italy/46484/2015
D/swine/Italy/199724-3/2015
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D/swine/Oklahoma/1334/2011
D/bovine/Kansas/14-22/2012
D/bovine/France/2986/2012
D/bovine/Shandong/Y125/2014
D/bovine/Shandong/Y127/2014
100
D/bovine/Shandong/Y217/2014
D/bovine/Ibaraki/7768/2016
D/bovine/Ibaraki/7765/2016
100
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86

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100
63
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38
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33
100
D/bovine/Shandong/Y125/2014
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70
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62
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D/bovine/Kansas/1-35/2010100
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100
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100 D/bovine/Minnesota/628/2013

0.005059

PB1

Fig. 1 Phylogenetic trees of the 7 segments of influenza D virus isolates at the nucleotide level. Japanese viruses are shown as red color.

43

99

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71
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78
99
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95
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100
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100 D/bovine/Shandong/Y125/2014
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99
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100D/bovine/Mississippi/C00013N/2014
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100 D/bovine/Ibaraki/7768/2016
80 D/Bovine/Ibaraki/7765/2016

HEF

62

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99
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100
97 D/bovine/Oklahoma/660/2013
D/bovine/Nebraska/9-5/2012
99
D/bovine/Kansas/11-8/2012
99
D/bovine/Kansas/14-22/2012
D/bovine/Yamagata/10710/2016
100 D/bovine/Ibaraki/7768/2016
85 D/bovine/Ibaraki/7765/2016

64
65
94

平成28年度

0.0050

54

PB2

286
食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

わが国の家畜におけるＤ型インフルエンザウイルス感染の実態調査

ら，日本株は外国株とは異なるクラスターを形成することが示された。これらの成績から，牛のＤ型インフルエンザウイルスはわが国に広く存在し
BRDCに関与する可能性があること，ウイルスは日本で独自に進化してきたことが明らかとなった。
文献１）Hause, B. M., Ducatez, M., Collin, E. A., Ran, Z.,
Liu, R., Sheng, Z., et al.：PLoS Pathog, 9: e1003176，
2013．
２）Hause, B. M., Collin, E. A., Liu, R., Huang, B.,
Sheng, Z., Lu, W., et al.：MBio, 5: e00031-14，2014．
３）Ferguson, L., Olivier, A. K., Genova, S., Epperson,
W.B., Smith, D. R., Schneider, L., et al. : J Virol，90，5636～5642，2016．
４）Ducatez, M. F., Pelletier, C., Meyer, G.：Emerg

287

Infect Dis，21，368～371，2015．
５）Jiang, W. M., Wang, S. C., Peng, C., Yu, J. M.,
Zhuang, Q. Y., Hou, G. Y., et al.：Virus Genes，49，493～496，2014．
６）Chiapponi, C., Faccini, S., De Mattia, A., Baioni, L.,
Barbieri, I., Rosignoli, C., et al.：Emerg Infect Dis，22，352～354，2016．
７）Quast, M., Sreenivasan, C., Sexton, G., Nedland, H.,
Singrey, A., Fawcett, L., et al.：Vet Microbiol，180，281～285，2015．
８）Collin, E. A., Sheng, Z., Lang, Y., Ma, W., Hause, B.
M., Li, F.：J Virol，89，1036～1042，2015．
９）Mitra, N., Cernicchiaro, N., Torres, S., Li, F., Hause,
B. M.：J Gen Virol，97，1771～1784，2016．
10）Ng, T. F. F., Kondov, N. O., Deng, X., Van
Enennaam, A., Neibergs, H. L., Delwart, E.：J Virol，
89，5340～5349，2015．

© The Ito Foundation

288

牛由来黄色ブドウ球菌の増殖阻止を可能にする
牛ポリクローナル抗体の特性解析
Characterization of bovine polyclonal antibodies that are capable of inhibiting
the growth of Staphylococcus aureus isolated from cows

野

地

智

法・米

山

裕

（東北大学大学院農学研究科）

Tomonori Nochi and Hiroshi Yoneyama（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

Staphylococcus aureus（S. aureus）is a pathogen that causes various infectious diseases in
not only humans but also animals. A few vaccines for livestock are currently available and they
are expected to induce production of S. aureus-specific antibodies that prevent bacterial
adherence to host cells or promote opsonization by phagocytes. However, despite thewidespread use of such vaccines, economic losses related to S. aureus infections have not been
reduced. Therefore, further researches focused on seeking an additional mechanism of action of
S. aureus vaccine is required to increase the efficacy of current vaccines. In this study, we
generated S. aureus-specific bovine IgG antibodies（anti-S. aureus）and demonstrated thatanti-S. aureus directly inhibited bacterial growth in vitro in the absence of complement andphagocytes. A further in vitro culture study using a laboratory strain of S. aureus JE2 and its
deletion mutant JE2ΔSrtA, which lacks the gene encoding sortase A, revealed that the effectof anti-S. aureus to inhibit the bacterial growth was in a sortase-A-independent manner.
Sortase A is involved in the synthesis of cell-wall-associated proteins. Thus, other surface
molecules, such as membrane proteins, cell surface polysaccharides, or both, may trigger the
inhibition of bacterial growth by anti-S. aureus. Together, our findings contribute insights intodeveloping new strategies to further improve the available vaccine by designing a novel
antigen on the surface of S. aureus to inhibit bacterial growth in vivo.

１．目

れ，それらを抗原としたワクチン開発を目指した的研究がこれまで数多く行われてきた。しかしなが家畜の生産現場を含む環境中に広く存在する黄ら，黄色ブドウ球菌に対する効果的なワクチンは色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は，食中いまだ開発されておらず，さらなる研究が必要と毒などの感染症の原因菌として広く知られていされている。また，家畜用の黄色ブドウ球菌ワクる。ヒトを対象とした黄色ブドウ球菌に関する微チン開発を目的とした研究は，医学領域でのそれ

生物学的および分子生物学的研究を通して，黄色と比べ著しく遅れており，その進展は，安心安全ブドウ球菌の病原性に関する分子が多数特定さな食肉生産を可能にするためにも非常に重要であ© The Ito Foundation

牛由来黄色ブドウ球菌の増殖阻止を可能にする牛ポリクローナル抗体の特性解析

289

る。本研究では，肉牛を含む家畜生産現場におけのTween-20を用い，室温で１時間ブロッキング

る黄色ブドウ球菌を原因とする疾病制御を可能とした後，抗血清より作製した牛IgG（抗S. aureus

する，新たな予防・治療戦略を構築することを最抗体）または市販の牛IgG（Sigma，コントロー

終目標とし，現在使用されている黄色ブドウ球菌

ルIgGと表記）を２倍ごとに段階希釈し，室温でに対するワクチンの作用機序を明らかにすること２時間反応させた。洗浄後，HRP標識ヒツジ抗を目的とした。

牛IgG重鎖抗体（Bethyl，１：10,000希釈）を室温

2.1

で１時間処理し，最後にTMB microwell peroxidase法

２．方

substrate system（KPL）で発色させた。

供試菌

2.4

Flow cytometry

本研究では供試菌としてStaphylococcus aureus

作製した抗S. aureus抗体とコントロールIgGを（BM1006 １），SA003 ２）およびJE2 ３），JE２由来のそれぞれFITC（Sigma）で標識し，1000μg/ml

ト ラ ン ス ポ ゾ ン ミ ュ ー タ ン ト JE2ΔSrtA ），に調整し，2.3の供試菌とともに４℃で30分間反Staphylococcus epidermidis，ATCC14990） ，応させた。また，未処理の供試菌も対照群としてBacillus atrophaeus（ATCC9372） ，Escherichia

調製した。洗浄後のサンプルは，BD Accuri C6７）coli（JM109）を用いた。

Flow Cytometer（BD Bioscience）を用いて測定

４）

５）

６）

2.2

し，得られたデータをFlowJo（Digital Biology）

抗体精製

ホルスタイン牛（５ヵ月齢，雄）に，ホルマリを用いて分析した。

ン 処 理 し た 黄 色 ブ ド ウ 球 菌（BM1006 ，1.5 ×

2.51010CFU，以後，S. aureus）をアジュバントであ供試菌をSDSサンプルバッファー（62.5μＭのるTiterMax Gold（TiterMax）とともに，２週

Tris-HCl（pH6.8），２％（w/v）SDS，10％（v/v）

間間隔で３回免疫（皮下接種）した。最終免疫からグリセロール，５％（v/v）２-メルカプトエタ

１週間後に抗血清を回収し，Protein G Sepharose

ノール，0.02％（w/v）ブロモフェノールブルー

4 Fast Flow（GE healthcare）を用いて免疫グロを含む）で溶解し，タンパク質を抽出した。そのブリンＧ（IgG）を精製した。

後，抽出物を５―20％のePAGELポリアクリルアⓇ

2.3

SDS-PAGEおよびWestern-blot解析

ミドゲル（ATTO）を用いたSDS-PAGE解析に供

ELISA作製した牛IgGの質量およびS. aureusに対するした。電気泳動後，ゲルをSimplyBlue SafeStain

特異性を解析するために，精製IgGをELISA解析（Invitrogen）で 染 色 し ，ま た は 一 部 の ゲ ル はに供した。抗S. aureus抗体の含量を測定する試

Immobilon-P membrane（Millipore）に転写し，

験では96ウェルプレート（Nunc）に２μg/mlのWestern-blot解析に供した。転写後のメンブレン

精 製 ヒ ツ ジ 抗 牛 IgG 重 鎖 抗 体（Bethyl）を 固 相

は，Tris緩衝液で希釈した0.05％（v/v）Tween-20

し，また，特異性を確認する試験では，ホルマリを用いて４℃で一晩ブロッキングした後，10μg/ン処理したS. aureus（BM1006，SA003，JE2，

ml に 調 整 し た 抗 S. aureus 抗 体 も し く は コ ン ト

JE2ΔSrtA），S. epidermidis（ATCC14990），B.

ロールIgGを，それぞれ室温で１時間処理した。

atrophaeus （ATCC9372）， E. coli （JM109） を洗浄後のメンブレンは，10,000倍希釈したHRP標

５μg/mlに調整し，一晩４℃で固相した。翌日，

識ヒツジ抗牛IgG重鎖抗体（Bethyl）を用いて室トリス緩衝化生理食塩水で希釈した0.05％（v/v）

温 で １ 時 間 処 理 し た 後 ， EzWestLumi plus

© The Ito Foundation

290

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）（ATTO）を用いて抗S. aureus抗体に特異的なバ研究で作製した牛IgGを抗S. aureus抗体と表記す

ンドを検出した。

る。興味深いことに，S. aureusと系統学的に近2.6

in vitroの増殖阻害試験

いS. epidermidisに対しても，抗S. aureus抗体に

S. aureus（BM1006，SA003，JE２およびJE2

よ る 反 応 性 が 確 認 さ れ た 。し か し な が ら ，S.

ΔrtA）およびE. coli（JM109）を，Trypto-Soyaaureusと同じFirmicutes門に属し分類が科から異（TS）培地（Nissui）で，一晩37℃で前培養した。

なるB. atrophaeus，またProteobacteria門に属す

新しいTS液体培地（４ml）に前培養した菌液をるE. coliに対する抗S. aureus抗体の反応性はほ40μｌ加え，作製した抗S. aureus抗体（10，100おとんど認められなかった。Flow cytometryの結よび1000μg/ml）またはコントロールIgG（1000

果からも抗S. aureus抗体が，S. aureusに対してμg/ml）を添加した。培養開始0.5，２，５およ

高い反応性を有し，またS. epidermidisに対して

び24時間後の細菌数を，TS寒天培地上の細菌コもわずかに反応すること，一方で，B. atrophaeus

ロニーの数を測定することで計測した。また，培およびE. coliには反応性を示さないことが確認さ

養開始後0.5，２，５および24時間後に培地を回れた（Fig. 1B）。これらの結果から，抗S. aureus

収し，0.45μｍのシリンジフィルター（Advantec）

抗体は，S. aureus特有の，あるいはS. aureusとS.

を用いて濾過することで，素通り画分中に含まれepidermidisが共通して有する抗原を認識している（培地中に残存する）牛IgG含量と，S. aureus

ることが示唆された。また，Western-blot解析でに対する特異性をELISA法で評価した。

は，抗S. aureus抗体およびコントロールIgGとも

2.7

統計

に反応する自然抗体由来の反応が認められたが，統計分析は，Kruskal-Walllis検定を用いたOne-

抗S. aureus抗体のみに反応する，S. aureus特有

way ANOVAおよびTukey多重検定を用いたtwo-の様々な分子量からなる特異的な反応が存在する

way ANOVAをPrism 7 software（GraphPad）でことが明らかになった（Fig. 1C）
。

行った。

3.2

BM1006およびSA003の培養液中に抗S. aureus

３．結果と考察3.1

in vitroでの増殖阻害試験

抗体もしくはコントロールIgGを添加した結果，S. aureus特異的牛IgGの作製

両株ともに，抗S. aureus抗体を添加することで，ホルスタイン牛（♂）にS. aureus（BM1006株，

濃度依存的に増殖が阻害されることが確認された死菌）を皮下接種し，その後に得られた抗血清よ（Fig. 2A）。また，このような増殖阻害効果は，り精製した牛IgGの特異性をFig.1Aに示した。市コントロールIgGを添加した場合ではまったく認販のコントロールIgGと比較し，免疫したホルス

められなかった（Fig. 2A）。一方で，抗S. aureus

タイン牛から得られたIgG抗体は，濃度依存的に抗体が反応性を示さなかったE. coliの培養液中にBM1006株に反応することが確認された。また，

抗S. aureus抗体を添加しても，E. coliの増殖阻

別株の黄色ブドウ球菌であるSA003に対しても，害効果はまったく認められなかった。これらの結作製した牛IgGは高い反応性を有していた。この果からは，抗S. aureus抗体の有するS. aureusにことから作製した牛IgGは，S. aureusに共通する

対する特異的な反応が，in vitroでの増殖阻害に抗原に反応することが考えられた。S. aureusに必要不可欠であることを示すものであった。しか対して反応することが確認されたため，以後，本しながら，S. aureusの菌数は，抗S. aureus抗体© The Ito Foundation

291

牛由来黄色ブドウ球菌の増殖阻止を可能にする牛ポリクローナル抗体の特性解析

Control IgG
anti-S. aureusA
S. aureus
OD 4503

S. epidermidis

BM1006SA03

B. atrophaeus

ATCC14990

E. coli

ATCC9372

JM109

2
1
0

100

10-1

10-2

100

10-1

10-2

100

10-1

10-2

100

10-1

10-2

100

10-1

10-2

IgG concentration（ug/ml）
None
Control IgG
anti-S. aureus

B

S. aureus

S. epidermidis

BM1006

B. atrophaeus

ATCC14990

SA003

ATCC9372

E. coli
JM109

101 102 103 104 105 101 102 103 104 105 101 102 103 104 105 101 102 103 104 105 101 102 103 104 105

*

*

*

MFI

2000
1500
1000
500
0

ne
gG reus
No trol Iu.an
Co nti-SaC

negG reus
No trol Iu.an
Co nti-S
a

SDS-PAGEkDa

M 1 2 3 4 5negG reus
No trol Iu.an
Co nti-SanegG reus
No trol Iu.an
Co nti-SanegG reus
No trol Iu.an
Co nti-Sa

Western-blot
kDa

250
150
100
75

250
150
100
75

50
37

50
37

25
20

25
20

15
10

15
10

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5anti-S. aureus

Control IgG

Fig. 1 Generation of anti-S. aureus-specific bovine IgG antibodies.
S. aureus, S. epidermidis, B. atrophaeus, and E. coli were used to confirm the specificity of anti-S. aureus generated

by immunization of a Holstein dairy cow with killed S. aureus.（A）ELISA analyses showed that anti-S. aureus was
highly reactive with two strains of S. aureus（BM1006 and SA003）and less reactive with S. epidermidis. In
contrast, almost no reactivity was detected when anti-S. aureus was treated with B. atrophaeus and E. coli.（B）
Flow cytometric analyses confirmed the results obtained by ELISA.（C）SDS-PAGE and western blot analyses
revealed that anti-S. aureus reacted with S. aureus-specific molecules with a broad range of molecular masses. M:
molecular marker, 1: S. aureus（BM1006）, 2: S. aureus（SA003）,3: S. epidermidis, 4: B. atrophaeus, 5: E. coli. Three
separate experiments were performed, and the data represent the mean±standard error of the mean（SEM）. ＊p＜0.05.

© The Ito Foundation

292

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

A

x107 CFU/ml

1000

****
*
**
****
*
***
****
****
##

BM1006anti-S. aureus（10 µg/ml）
anti-S. aureus（100 µg/ml）
anti-S. aureus（1000 µg/ml）
Control IgG（1000 µg/ml）
None

##

100

##
10

S. aureus

1

x107 CFU/ml

1000

**
*** **

SA003

100

#

10

1

JM109

100

10

1

B

E. colix107 CFU/ml

1000

0.5

Total IgG

2
5
Culture time（h）

24

S. aureus-speciﬁc IgG titer
Immobilized:
S. aureus（BM1006）

Concentration（μg/ml）

1000
800
600

NS

400

100

10-1

Concentration (μg/ml)

10-2

0h
0h
0.1h
0.5h
1h
5h
24h

in PBSin Trypto-Soya

2000

0 0 0.1 0.5 2 5 24（h）
Trypto-Soya
PBS**
0 0 0.1 0.5 2 5 24（h）
PBS
Trypto-Soya

Fig. 2 Growth Inhibition of S. aureus in the presence of anti-S. aureus.
（A）
Growth of S. aureus（BM1006 and SA003）was inhibited in the presence of anti-S. aureus, whereas the growthof E. coli（JM109）was not detectably inhibited.（B）The amount of uncoupled total IgG remained was constant in
the culture broth during the overnight culture. In contrast, the titer of residual S. aureus-specific IgG was
decreased during the culture. Three separate experiments were performed, and the data represent mean ± SEM.
The p values calculated using one-way or two-way factorial analyses of variance are #p ＜ 0.05 and ##p ＜ 0.01 or ＊ p＜0.05；＊＊p＜0.01；＊＊＊p＜0.001; and ＊＊＊＊p＜0.0001, respectively.

© The Ito Foundation

牛由来黄色ブドウ球菌の増殖阻止を可能にする牛ポリクローナル抗体の特性解析

293の存在の有無に関わらず，一晩培養すると抗体をの，黄色ブドウ球菌の増殖を阻害する傾向が確認

添加していない試験区と同程度にまで増加し，こされた（Fig. 3B）。これらの結果は，抗S. aureusのことは，増殖阻害効果が培養中，持続されない抗体が認識する多数の抗原の中でも，特に増殖阻ことを意味していた。そのため，培養中の抗S.

害に関わるS. aureus特異的な抗原が存在している

aureus抗体の濃度および特異性の変化を調べるた

ことを示していた。S. epidermidisは，S. aureus

めの経時的な解析を行ったところ，培養液中に残の増殖を抑制していることも報告されており８），存する牛IgG含量は培養時間を通して変化していそのことは，S. aureus特異的な抗原をワクチン

ないのに対し，S. aureusに特異的な牛IgGの力価として用いることが，S. aureusが引き起こす感は，培養中試験を通して経時的に減少しており，染症を予防するためには重要であることを示唆し培養開始24時間後にはほとんど消失していることていた。

が明らかとなった（Fig. 2B）。これらの結果から，

3 . 4 SortaseA依存的細胞壁結合タンパク質

抗S. aureus抗体は多様な抗原を認識するポリクは，抗S. aureus抗体の増殖阻害作用には影

ローナル抗体であり，S. aureusの増殖を直接的響しないに阻害する生理活性を有していること，また，inS. aureus表層のペプチドグリカンに連結する

vitro環境では，S. aureusに特異的に反応する抗細胞壁結合タンパク質は，S. aureusの病原性に体が枯渇することで，S. aureusは増殖を開始す関与していることから，S. aureusワクチンの候ることが明らかになった。

補分子とした研究がこれまで広く行われてき3 . 3 抗S. aureus抗体による増殖阻害効果にはた ９）。そ こ で 細 胞 壁 結 合 タ ン パ ク 質 が ，抗 S.
aureus抗体による増殖阻害に関与するか否かを調S. aureusに特異的な分子が関与する
抗S. aureus抗体がS. epidermidisにもある程度べ る た め ，S. aureus の 野 生 株 で あ る JE2 と ，の 反 応 を 示 し て い た こ と か ら ，S. aureus と S.

SortaseA遺伝子を欠くトランスポゾンミュータ

epidermidisに共通して発現する分子を，あるいン ト で あ る JE2ΔSrtA を 利 用 し ，ELISA と inはS. aureus特異的な分子を抗S. aureus抗体が認

vitroでの増殖阻害試験を行った。ELISAの結果識することが増殖阻害に必須であるか否かを明ら

か ら ，抗 S. aureus 抗 体 の 反 応 性 は JE2 と JE2Δ

か に す べ く ， S. epidermidis と 結 合 し た 抗 S.

SrtAでほぼ同程度であることが確認された（Fig.

aureus抗体を遠心分離によって除去したうえで，4A）。また，増殖阻害試験を行ったところ，多く

増殖阻害試験を実施した。In vitroでの増殖阻害の細胞壁結合タンパク質を欠損しているJE2Δ

試 験 の 前 に 実 施 し た ELISA 解 析 か ら ， S.

SrtAでも野生株のJE2と同程度の増殖阻害効果がepidermidisによる吸収処理を行った抗S. aureus

見 ら れ た（Fig. 4B）。こ れ ら の 結 果 か ら 抗 S.

抗体は，S. epidermidisに対する反応性をほとん

aureus抗体による増殖阻害効果は，細胞壁結合タ

ど失っていること，また，黄色ブドウ球菌に対す

ンパク質が関与するのではなく，膜タンパク質なる反応性は，わずかに減少した程度であることがどのその他の表層抗原が関与する可能性が示唆さ明らかになった（Fig. 3A）。その後，in vitroでのれた。

増 殖 阻 害 試 験 を 行 っ た 結 果 ，無 処 理 の 抗 S.
aureus 抗 体 と 比 較 し ，吸 収 処 理 を 行 っ た 抗 S.
aureus抗体は，その生理活性は若干低下するもの

４．要

約

黄色ブドウ球菌（S. aureus）は，家畜の生産© The Ito Foundation

294

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Aanti-S. aureus
anti-S. aureus absorbed with S. epidermidis
Control IgG

OD 4503
2

Immobilized:
S. epidermidis

1
0

100

10-1

10-2

IgG concentration（μg/ml）
B

anti-S. aureus
anti-S. aureus absorbed with S. epidermidis
Control IgG
None

100

BM1006

S. aureus

x107 CFU/ml

1000

****
****
***
#

#

10

1

0.5

2
5
Culture time（h）

24

Fig. 3 Involvement of S. aureus-specific molecules in anti-S. aureus-induced growth inhibition.
ELISA analyses and in vitro bacterial culture studies confirmed the bacterial specificity of growth inhibition

induced by anti-S. aureus.（A）After absorption of anti-S. aureus with S. epidermidis, the S. aureus-specificantibody titer was slightly decreased compared with that of the original anti-S. aureus. In contrast, little reactivityof anti-S. aureus with S. epidermidis was detected after absorption.（B）Anti-S. aureus absorbed with S.
epidermidis did not inhibit the growth of S. aureus. Three separate experiments were performed, and the data
represent the mean ± SEM. The p values calculated using one-way or two-way factorial analyses of variance are#
p＜0.05 or ＊＊＊p＜0.001 and ＊＊＊＊p＜0.0001, respectively.

現場において様々な感染症を引き起こす病原体でて，今日用いられているワクチンの有効性を高めある。S. aureusによる感染症を防ぐためのワク

るためには，現在行われているワクチンの評価方

チンは牛でも利用可能であり，それらのワクチン法とは別の，新たな観点からの研究に取り組むこの作用機序として，S. aureusの宿主細胞への細とが必要である。本研究では，S. aureusに対す菌接着阻害や，オプソニン作用の亢進等があげらる特異的な抗体（抗S. aureus抗体）を作製し，れている。しかし，S. aureusワクチンの普及に

抗S. aureus抗体が，補体や免疫細胞が存在しなもかかわらず，家畜生産現場でのS. aureusが引い条件であっても，in vitroでの細菌増殖を直接き起こす感染症は減少する傾向にない。したがっ

阻害可能であることを明らかにした。また，S.

© The Ito Foundation

牛由来黄色ブドウ球菌の増殖阻止を可能にする牛ポリクローナル抗体の特性解析

295

A
Control IgG
anti-S. aureus

S. aureus
OD 4503

JE2

JE2ΔSrtA

2
1
0

100

10-1

10-2

100

10-1

10-2

IgG concentration（μg/ml）

Bx107 CFU/ml

1000

***
***

JE2

*
***
***
***

**
***

100

#

10

1000

**
**

JE2ΔSrtA**

S. aureus

1

x107 CFU/ml

anti-S. aureus（10 µg/ml）
anti-S. aureus（100 µg/ml）
anti-S. aureus（1000 µg/ml）
Control IgG（1000 µg/ml）
None

*

#

100

10

1

0.5

2
5
Culture time（h）

24

Fig. 4 Dispensable role of the sortase A-dependent cell-wall-associated proteins in anti-S. aureus-induced growth

inhibition.
The involvement of antibody recognition of sortase-A-dependent cell wall-associated proteins in the growth

inhibition of S. aureus was addressed using S. aureus strains JE2 and JE2ΔSrtA.（A）ELISA analyses revealed
that anti-S. aureus reacted equally with JE2 and JE2ΔSrtA.（B）The growth of JE2 and JE2ΔSrtA was delayed
equally when they were cultured with anti-S. aureus. Three separate experiments were performed, and the data
represent the mean ± SEM. The p values calculated using one-way or two-way factorial analyses of variance are#
p＜0.05 or ＊p＜0.05；＊＊p＜0.01 and ＊＊＊p＜0.001, respectively.

aureusの病原性に関与する細胞壁結合タンパク質

与するか調べた結果，抗S. aureus抗体による増のペプチドグリカンへの連結に関与するプロテ

殖阻害効果はSortaseA非依存的であることが確

アーゼであるSortaseAに着目し，細胞壁結合タ認された。したがって抗S. aureus抗体はその他ンパク質が抗S. aureus抗体による増殖阻害に関の表層抗原（膜タンパク質，細胞表面多糖類，ま© The Ito Foundation

296

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

たはその両方など）に結合することにより増殖阻害を引き起こすことが示唆された。今後，トラン
スポゾンミュータントライブラリーを用いて，本研究で確認された増殖阻害に関与する分子を特定
し，特定した抗原を利用することで，より効果の高いS. aureusに対するワクチンの開発が可能になると期待される。
文
献１）Kiku, Y., Nagasawa, Y., Tanabe, F., Sugawara, K.,
Watanabe, A., Hata, E., Ozawa, T., Nakajima, K. I.,
Arai, T., Hayashi, T.：The cell wall component
lipoteichoic acid of Staphylococcus aureus induces
chemokine gene expression in bovine mammary
epithelial cells, J Vet Med Sci，78，1505～1510，2016.
２）S y n n o t t , A . J . , K u a n g , Y . , K u r i m o t o , M . ,Yamamichi, K., Iwano, H., Tanji, Y.: Isolation fromsewage influent and characterization of novel
Staphylococcus aureus bacteriophages with wide
host ranges and potent lytic capabilities, Appl
Environ Microbiol，75，4483～4490，2009.
３）McCarthy, H., Waters, E. M., Bose, J. L., Foster, S.,
Bayles, K. W., OʼNeill, E., Fey, P. D., OʼGara, J. P.：Themajor autolysin is redundant for Staphylococcus

aureus USA300 LAC JE2 virulence in a murine
device-related infection model, FEMS Microbiol Lett,
363: fnw087，2016.
４）Fey, P. D., Endres, J. L., Yajjala, V. K., Widhelm, T.
J., Boissy, R. J., Bose, J. L., Bayles, K. W.：A genetic
resource for rapid and comprehensive phenotype
screening of nonessential Staphylococcus aureus
genes, MBio, 4: e00537-00512，2013.
５）Jones, D., Deibel, R. H., Niven, C. F. Jr.：Identity of
Staphylococcus epidermidism, J Bacteriol，85，62～
67，1963.
６）Fritze, D., Pukall, R.：Reclassification of bioindicatorstrains Bacillus subtilis DSM 675 and Bacillus
subtilis DSM 2277 as Bacillus atrophaeus, Int J Syst
Evol Microbiol，51，35～37，2001.
７）Phue, J. N., Shiloach, J.：Transcription levels of key
metabolic genes are the cause for different glucose
utilization pathways in E. coli B（BL21）and E. coli
K（JM109）,J Biotechnol，109，21～30，2004.
８）Iwase, T., Uehara, Y., Shinji, H., Tajima, A., Seo, H.,
Takada, K., Agata, T., Mizunoe, Y.：Staphylococcus
epidermidis Esp inhibits Staphylococcus aureus
biofilm formation and nasal colonization, Nature，
465，346～９，2010.
９）Stranger-Jones, Y. K., Bae, T., Schneewind, O.：V a c c i ne a s s e m bl y f r o m s ur f a c e pr o t e i ns o f
Staphylococcus aureus, Proc Natl Acad Sci USA，
103，16942～16947，2006.

© The Ito Foundation

297

食肉により媒介されるトキソプラズマ原虫感染症
に対する新規血清診断法の確立
Establishment of new sero-diagnostic method against food-borne
toxoplasmosis

玄

学南・高

洋・郭 焕平・Adjou Moumouni PF・
白藤 梨可・菅沼 啓輔・相馬 武久＊（帯広畜産大学原虫病研究センター，＊マルピー・ライフテック株式会社臨床検査部）

Xuenan Xuan, Yang Gao, Huanping Guo, Paul Franck Adjou Moumouni,
Rika Umemiya-Shirafuji, Keisuke Suganuma and Takehisa Soma＊（National Research Center for Protozoan Diseases, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine,
Veterinary Diagnostic Laboratory，＊Marupi Lifetech Co., Ltd. Ikeda, Osaka, Japan）

Two antigens（TgSRS2, TgGRA9）of Toxoplasma gondii were expressed in Escherichia
coli as fusion proteins with glutathione S-transferase tags. Enzyme-linked immunosorbent
assays（ELISAs）using rTgSRS2 and rTgGRA9 were established, and the antibody responses
in experimentally infected mice were detected by these two methods. The former（rTgSRS2ELISA）could detect the specific antibodies in both acute and chronic stages, while the latter（rTgGRA9-ELISA）could detect the specific antibodies only in acute stage. To evaluate theusefulness of the ELISAs in the field, feline serum samples were used for detecting the specificantibodies and compared with commercialized latex agglutination test（LAT）. rTgSRS2ELISA and rTgGRA9-ELISA detected 31（88.6％）and 19（54.3％）samples as positive from 35
LAT-positive samples, respectively. These results suggested that rTgSRS2-ELISA could be
useful to detect the infected animals in the field.

１．目

た，トキソプラズマ原虫性脳炎はエイズ患者や免的

疫抑制剤の投与を受けている患者の主要な死因のトキソプラズマ原虫とは，猫科動物を終宿主と一つでもある。ヒトへの主な感染源として猫糞便し，ヒトや他の動物を中間宿主とする病原体であ中に排泄されるオーシストと感染動物の食肉とさる。トキソプラズマ原虫感染症は世界的に広がっれる。したがって，トキソプラズマ原虫感染動物ている重要な人獣共通感染症であり，豚・羊などを的確に診断し，その対策をとることは公衆衛生

産業動物のトキソプラズマ原虫感染症は日本では上きわめて重要である。

届出伝染病に指定されている。ヒトでは特に妊婦

トキソプラズマ原虫感染症に対する診断法は，が初感染した場合，流・死産や新生児の水頭症・血清診断法とDNA診断法に大別される。トキソ

脈絡網膜炎などの先天性感染症を惹き起こす。まプラズマ原虫は動物やヒトに一旦感染すると宿主© The Ito Foundation

298

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

が生涯を終えるまで寄生するので，血清診断法にンＳトランスフェラーゼ（GST）融合タンパク

より特異抗体が検出されれば，体内に原虫が寄生質として大腸菌で発現した。大腸菌の可溶化分画していると確定診断を下すことができる。現在，からグルタチオンカラムを用いて組換えタンパク

世界中でもっともよく使われている血清診断法と質rTgSRS2とrTgGRA9を精製した。

して虫体凝集反応とラテックス凝集反応がある。

2 . 2 rTgSRS2とrTgGRA9に対する特異抗体

日本では，長年栄研のラテックス凝集反応キットの作製（商品名：猫・豚用「トキソチェック-MT」，ヒ

精製したrTgSRS2とrTgGRA9をそれぞれフロ

ト用「トキソテスト-MT」）が動物（猫・豚）おインドアジュバントと混合し，ICRマウスに２週

よびヒトの血清診断法として主流であった。しか間間隔で３回ずつ免疫した後，特異抗体を採集しし，これらの商品が2015年に製造中止となり，現た。得られた抗体を用いて虫体におけるTgSRS2

場で混乱を招いている。

とTgGRA9の分子局在を調べた。

近年，我々の研究グループではトキソプラズマ

2.3

ELISA法原虫の抗原分子の特定と診断・予防法の開発に関

陽性抗原としてrTgSRS2またはrTgGRA9を，する研究を精力的に行ってきた。これまでにトキ陰性抗原としてrGSTをそれぞれ10mM炭酸緩衝

ソ プ ラ ズ マ 原 虫 由 来 の 組 換 え TgSAG1 １），液（pH9.6）で１μg/mlに調製し，50μｌ／ウェ

TgSAG2 ，TgAMA1 ，TgGRA4 ，TgGRA7 ，

ルで96穴ELISAプレート（Nunc，デンマーク）

TgROP2などを作製し，これらの組換えタンパに分注した。４℃で一晩固相化後，抗体希釈液

ク質を抗原とした酵素免疫測定法（ELISA法）（３％スキムミルク加PBS液）を100μｌ／ウェルやクロマトグラフィックテスト法（ICT法）はそ

で分注し，37℃１時間反応させた。洗浄液（0.05％

れぞれマウス感染モデルや感染猫において特異抗Tween-20加PBS液）でプレートを６回洗浄後，体を検出可能であることを明らかにした。しかし

抗体希釈液で100倍希釈した被検血清を50μｌ／

ながら，トキソプラズマ原虫は多くの抗原分子をウェル分注した。37℃で１時間反応後，洗浄液で保持し，より理想的な抗原分子の探索が望まれる。

プレートを６回洗浄し，抗体希釈液で2000倍希釈

そこで，本研究ではいままで解析されなかった

したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ネコIgG抗体

トキソプラズマ原虫の２種類の抗原分子の特定と（Bethyl ，米 国）を 50μｌ ／ ウ ェ ル 分 注 し た 。

診断抗原としての有用性を検討した。

37℃で１時間反応後，洗浄液でプレートを６回洗

２）

６）

２．方

３）

４）

５）

浄した。基質溶液（0.05％ABTSと0.003％H２O２

法

加クエン酸緩衝液）を100μｌ／ウェルに分注し，

2 . 1 抗原分子TgSRS2とTgGRA9をコードす

室温で１時間反応後，415nmの吸光度を測定し，それぞれの陽性抗原と陰性抗原の吸光度の差をる遺伝子のクローニングと発現
トキソプラズマRH株よりmRNAを抽出し，

ELISA値とした。また，SPF猫血清30検体から求RT-PCR 法 に よ り TgSRS2 の 全 長 遺 伝 子

めた平均値＋３ｘ標準偏差をカットオフ値とした。

（1,119bp，372aa）とTgGRA9のＣ末端の膜貫通2.4領域を除いた遺伝子断片（897bp，298aa）を増

ラテックス凝集反応キット（トキソチェック

幅した。PCR産物をそれぞれ大腸菌発現用ベク-MT，栄研）により，被検血清中のトキソプラ

ターpGEX-4T-１にクローニングし，グルタチオ

ズマ抗体保有率を調べた。

© The Ito Foundation

ラテックス凝集反応

食肉により媒介されるトキソプラズマ原虫感染症に対する新規血清診断法の確立

2.5

マウスの実験感染

2.6

299

被検血清

ICRマウス一匹あたりトキソプラズマPLK株

マルピー・ライフテック株式会社臨床検査部に

1,000虫体ずつ腹腔内に接種し，１週間間隔で血保有している猫血清をELISA法の評価に供した。

清を採集し，トキソプラズマに対する抗体の検査
に供した。

kDa

1

M

2

3

100
70
55
4
0
35
25
A）

B）

C）

D）

Fig. 1 Reactivity of recombinat antigen rTgSRS2（A）, and localization of its native protein（B-C）.
A）Lane 1, purified rTgSRS2; line 2, rTgSRS2 reacted with T. gondii-infected mouse serum; line 3, rTgSRS2 reacted with
SPF mouse serum; line M, molecular marker. B）T. gondii tachizoites reacted with anti-rTgSRS2 mouse serum（green
fluorescence）. C）T. gondii tachizoites reacted with anti-rTgSAG1 rabbit serum（red fluorescence）. D）Merged form ofpanels B and C.

kDa

1

M

2

3

100
70

55

40

35
A）

B）

C）

D）

Fig. 2 Reactivity of recombinat antigen rTgGRA9（A）, and localization of its native protein（B-C）.
A）Lane 1, purified rTgGRA9; line 2, rTgGRA9 reacted with T. gondii-infected mouse serum; line 3, rTgGRA9 reacted with
SPF mouse serum; line M, molecular marker. B）T. gondii tachizoites reacted with anti-rTgGRA9 mouse serum（green
fluorescence）. C）T. gondii tachizoites reacted with anti-rTgSAG1 rabbit serum（red fluorescence）. D）Merged form ofpanels B and C.

© The Ito Foundation

300

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
0.8

TgSRS2とTgGRA9をクローニングし，組換えGST融合タンパク質として大腸菌で発現したと
こ ろ ，分 子 量 は そ れ ぞ れ 予 想 通 り の 66kDa と

ELISA OD 415nm

３．結果と考察

60kDa で あ っ た （Fig. １，
２）。両 組 換 え 抗 原（rTgSRS2とrTgGRA9）は，トキソプラズマ実
験感染マウス血清とは反応したが，SPFマウス血rTgSRS2rTgSRS9

0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
Weeks P.I.

Fig. 3 Antibody responses to TgSRS2 and TgGRA9 inexperimentally infected mice. Antibody titers weredetected by the ELISAs using rTgSRS2 andrTgGRA9.

清とは反応しなかった（Fig.１，
２）。両組換え抗原をマウスに免疫し，得られた特異抗体を用いて ，虫 体 に お け る 分 子 局 在 を 調 べ た と こ ろ ，

LAT titer

終了する12週目まで慢性感染期においても高い抗体価を維持した。一方，TgGRA9に対する抗体は，

24

2

10

16

した。その後，TgSRS2に対する抗体は，実験が

6

0.0

51

体が上昇し始め，４週目には抗体価がピークに達Cut-oﬀ

8

た（Fig.３）。感染後２週目に両抗原に対する抗

0.5
0.376

25

確立し，実験感染マウスにおける抗体応答を調べ

12

rTgSRS2とrTgGRA9を抗原としたELISA法を

1.0

64

１，
２）。

1.5

32

小器官に局在していることが示唆された（Fig.

rTgSRS2 ELISA OD 415nm

TgSRS2は細胞表面に，また，TgGRA9は細胞内Fig. 4 Detection of specific antibodies to T. gondii incats by ELISA using rTgSRS2 and LAT. The
ELISA values over cut-off were judged as positive.
The titers of LAT over 1: 64 were judged as
positive.

５週目以降は下降し始め，慢性感染期には低値を示した。この結果より，rTgSRS2を抗原とした
ELISA法は，急性感染期と慢性感染期の両方の感染動物の検出に有効である可能性が示唆され断キットと比較検討した（Fig.４，
５）。rTgSRS2を抗原としたELISA法においては，LAT陽性血
清35例中31例（88.6％）が陽性と判定された。また，LAT陰性41例中10例（24.4％）が陽性と判定

4

6

LAT titer

10
2

-0.5

51
2

用いて，両ELISA法の診断効果を市販のLAT診

Cut-oﬀ

0.0

25

次に，終宿主である猫から採集した被検血清を

0.5
0.242

12
8

定も可能かも知れない。

64

法の組み合わせにより，被検動物の感染時期の推

1.0

32

能性が示唆された。両組換え抗原を用いたELISA

1.5

16

急性感染期の感染動物の検出のみに有効である可rTgGRA9 ELISA OD 415nm

た。一方，rTgGRA9を抗原としたELISA法は，Fig. 5 Detection of specific antibodies to T. gondii incats by ELISA using rTgGRA9 and LAT. The
ELISA values over cut-off were judged as positive.
The titers of LAT over 1: 64 were judged as
positive.

© The Ito Foundation食肉により媒介されるトキソプラズマ原虫感染症に対する新規血清診断法の確立された。一方，rTgGRA9を抗原としたELISA法

301

いては，さらなる詳細な検討が必要である。

においては，LAT陽性血清35例中19例（54.3％）が陽性と判定された。また，LAT陰性41例中５例（12.2％）が陽性と判定された。これらの結果
より，rTgSRS2を抗原としたELISA法は，比較的に優れた診断効果があることが示唆された。今後，LATとの不一致例については，さらなる詳細な検討が必要である。
４．要

約

本研究では，これまでに解析されなかったトキ
ソプラズマ原虫の２種類の抗原分子の特性解明と診断抗原としての有用性を検討した。TgSRS2とTgGRA9遺伝子を大腸菌発現用ベクターpGEX4T-１にクローニングし，GST融合タンパク質として発現した。rTgSRS2とrTgGRA9を抗原としたELISA法を確立し，実験感染マウスにおける抗体応答を調べたところ，前者は急性感染期と慢性感染期の両方の感染動物の検出に有効であり，
後者は急性感染期の感染動物の検出のみに有効である可能性が示唆された。次に，終宿主である猫から採集した被検血清を用いて，両ELISA法の診断効果を市販のLAT診断キットと比較検討した と こ ろ ，LAT 陽 性 血 清 35 例 中 そ れ ぞ れ 31 例
（88.6％）と19例（54.3％）が陽性と判定された。
こ れ ら の 結 果 よ り ，rTgSRS2 を 抗 原 と し た
ELISA法は，比較的に優れた診断効果があることが示唆された。今後，LATとの不一致例につ文
献１）Kimbita, E. N., Xuan, X., Huang, X., Miyazawa, T.,
Fukumoto, S., Mishima, M., Suzuki, H., Sugimoto, C.,
Nagasawa, H., Fujisaki, K., Suzuki, N., Mikami, T.,
Igarashi, I.：Serodiagnosis of Toxoplasma gondii
infection in cats by enzyme-linked immunosorbent
assay using recombinant SAG1, Vet Parasitol., 102，35～44，2001.
２）Huang, X., Xuan, X., Kimbita, E. N., Battur, B.,
Miyazawa, T., Fukumoto, S., Mishima, M., Makala,L. H., Suzuki, H., Sugimoto, C., Nagasawa, H., Fujisaki,K., Mikami, T., Igarashi, I.: Development andevaluation of an enzyme-linked immunosorbent
assay with recombinant SAG2 for diagnosis of
Toxoplasma gondii infection in cats, J Parasitol., 88，
804～807，2002.
３）Zhang, H., Compaore, M., Lee, E. G., Liao, M.,
Zhang, G., Sugimoto, C., Nishikawa, Y., Xuan, X.：
Apical membrane antigen 1 is a cross-reactive
antigen between Neospora caninum and Toxoplasma
gondii, and anti-NcAMA1 antibody inhibit host cell
invasion by both parasites, Mol Biochem Paarasitol.,
151，205～212，2007.
４）Zhang, G., Huong, T., Battur, J., Zhou, J., Zhang, H.,
Liao, M., Kawase, O., Lee, E. G., Dautu, G., Igarashi,M., Nishikawa, Y., Xuan, X.：A heterologous primeboost vaccination regime using DNA and a vaccinia
virus, both expressing GRA4, induced protective
immunity against Toxoplasma gondii infection in
mice, Parasitology，134，1339～1346，2007.
５）Huang, P., Liao, M., Zhang, H., Lee, E. G., Nishikawa,Y., Xuan, X.：The dense granule protein NcGRA7, a
new marker for the serodiagnosis of Neospora
infection in aborting cows, Clin. Vaccine Immunol.,
14，1640～1643，2007.
６）Mishima, M., Xuan, X., Yokoyama, N., Igarashi, I.,
Fujisaki, K., Nagasawa, H., Mikami, T.：Recombinantfeline herpesvirus type 1 expressing Toxoplasma
gondii ROP2 antigen inducible protective immunity
in cats, Parasitol Res., 88，144～149，2002.

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302

ゲノム疫学的アプローチによる豚抗酸菌症の実態解明
Research on actual insights into transmission routes of Mycobacterium
avium in pigs by genomic ecological approach

大屋

賢司・丸山

史人＊・岩本朋忠＊＊・西内由紀子＊＊＊（岐阜大学応用生物科学部，＊京都大学大学院医学研究科，＊＊神戸市環境保健研究所，＊＊＊大阪市立大学医学部）

Kenji Ohya, Fumito Maruyama＊，Tomotada Iwamoto＊＊ and Yukiko Nishiuchi＊＊＊（Department of Applied Biological Sciences, Gifu University，＊Graduate School of Medicine, Kyoto University，＊＊Kobe Institute of Health，＊＊＊Osaka City University Medical School）

Swine mycobacteriosis, caused by Mycobacterium avium subsp. hominissuis（MAH）,
represents chronic proliferative lymphadenitis in pigs. It doesnʼt display apparent symptom,
but is usually found as miliary tubercles during inspection at a slaughterhouse. Detected
tubercles should be discarded, leads economical loss, especially at farms where MAH is highly
prevalent in pigs and surrounding environments. In this study, we attempted to isolate MAH
from discarded lymph nodes of pigs, reared pigs and surrounding environment in Tokai area inJapan. Isolated MAH strains were applied to the SNPs analysis of hsp65 gene, the variable
number of tandem repeat（VNTR）analysis and whole genome sequencing. We succeeded inrevealing a part of transmission route of MAH between pigs and surrounding environment by
genomic epidemiological approach. Currently extensive genome analysis of isolated MAH
strains is on-going.

１．目

済的損害は大きい。

的

MAHは，豚をはじめとした感染動物の糞便中

豚抗酸菌症は，非結核性抗酸菌群のうち，特にに排泄され，それに汚染された土壌，水，おがく

Mycobacterium avium subsp. Hominissuis

ずなどが豚への感染源となることが知られてい（MAH）を原因とする，慢性増殖性のリンパ節炎る２）。そのため，豚抗酸菌症が蔓延した環境におである。通常，感染豚の臨床症状は認められず不いては，豚や周りの環境におけるMAHの分布状

顕性感染となり，食肉検査場での内臓検査にて粟況，豚への伝播経路を把握することにより，豚舎状の結節性病変として発見される 。本症による衛生環境の改善など本症の蔓延を防ぐための対策

臓器の廃棄率は全国平均約１％である（平成９年を講じることが可能となる。

１）

全国食肉衛生検査協議会資料）。この廃棄にMAHを分子疫学的に型別するための方法としてよる損害は１ヶ所あたり数百円であるが，全廃棄は，hsp65遺伝子の一塩基多型（single nucleotideとなった場合や，蔓延している生産者における経polymorphism: SNP）解析，多重反復数多型配列

度© The Ito Foundation

ゲノム疫学的アプローチによる豚抗酸菌症の実態解明

303（variable number of tandem repeat: VNTR） 解

Mycobacterial interspersed repetitive units析がある 。またこのような特定の遺伝子，領域（MIRU）-VNTRとMycobacterium avium Tandem

を対象とした型別に加え，近年，全ゲノム上の違

Repeats（MATR）-VNTRの計19領域の反復配列

いを型別することも可能になってきた。本研究で領域を対象とした３，５）。決定した塩基配列情報よりは，これら手法を組み合わせたゲノム疫学的アプ

Tandem Repeat Finder（https://tandem.bu.edu/

ローチにより，MAHの伝播経路，宿主や地域特

trf/trf.html）
を用いて，
M. avium subsp. hominissuis

性を明らかにすることを目的として研究を行った。

MAH104株６）を標準株として反復配列，反復数を

３）

２．方
2.1

算出した。反復数が小数値となった場合は，小数法

点以下第一位で四捨五入して整数値とした。最小

抗酸菌の分離全 域 木 （minimum spanning tree: MST） は ，

東海地方の食肉検査場で廃棄された豚内蔵（腸Bionumerics ver.7（Applide Maths）を用いて作間膜リンパ節）および東海地方の養豚場で飼育さ成した。全ゲノム配列は，150bp paired endでれている豚の糞便，養豚場のおがくず，土壌を分Illumina Hiseqに供しデータを得た。

離材料とした。腸間膜リンパ節は，20㎎を400μｌの２％NaOHとともに，卓上破砕機（シェイク

３．結果と考察マン３；バイオメディカルサイエンス）を用いて

本研究では，豚の病変部，糞便，飼育環境より

2,800rpm，30秒間処理し接種用乳剤とした。豚

MAHを分離し，それらの疫学的関連を検証した。

の糞便，おがくず，土壌は10倍量のPBSで懸濁し豚の抗酸菌症においては，Fig.1Aに示すような明た後，等量の２％NaOHを加え接種材料とした。

らかな腸間膜リンパ節の壊死様病変を示す場合でいずれも室温で一晩放置し，100μｌを２％小川

も，顕微鏡下で菌を検出できない場合も多い。ま

PS培地（日水製薬株式会社）およびミジット分

た，抗酸菌の細胞壁はワックスＤ，ミコール酸な離培養剤（日本BD）に接種し37℃で３週間からど多量の脂質を含むためDNA抽出効率が悪く，４週間培養した。生育したコロニーは，２％小川

ゲノムDNAはGC含量が高い１）。そのため，このPS培地もしくはMiddlebrook 7H11寒天培地（日ような病変部から核酸を抽出し通常のPCRに供し本BD）を用いて３回クローニングを行い供試菌ても菌の検出感度は悪く，その後の解析には菌の株とした。

分離を行うことが重要である。試料をアルカリで2.2分離した抗酸菌の菌種・亜種同定

一晩処理した後に，小川培地に接種することによ

菌種の同定は遅発育性抗酸菌14菌種と豚抗酸菌

り抗酸菌を分離することができ（Fig.1B），その症の原因菌M. avium，M. intracellulareの各16S

後の解析に供した。

rRNA領域の配列解析により行った 。亜種に関まず，食肉検査場で腸抗酸菌症として廃棄されしては，挿入配列（insertion sequence: IS）保有

た腸間膜リンパ節より分離される抗酸菌についてパターンによりまず検討した 。その後，hsp65

検討した。分離された13株について詳細な遺伝学

遺伝子３’側領域の塩基配列解析を行い，コード的解析を行った。分離された13株は，16S rRNA

分類と亜種の決定を行った 。

配列解析の結果，すべてM. aviumであった。M.

４）

５）

３）

2.3

aviumには４亜種が存在するが，hsp65配列解析

抗酸菌のゲノム疫学的解析

VNTR 解 析 は ， 反 復 配 列 領 域 と し ての 結 果 ， す べ て M. avium subsp. hominissuis© The Ito Foundation

304

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

A

B

Fig. 1 Isolation of acid-fast bacteria. A. A mesenteric lymph node that was inspected as swine mycobacteriosis in aslaughterhouse. Necrotic legions are shown（arrowheads）. B. Colonies of acid-fast bacteria appeared on a slant of
Ogawa-agar.

（MAH）であった。M. aviumの亜種は，ISの保る MAH と 環 境 か ら 分 離 さ れ る MAH の 比 較 も有パターンにより鑑別が可能とされている 。た

行った。この農場から出荷された豚において，腸とえば，ヨーネ病の原因菌であるM. avium subsp.

抗酸菌症として廃棄された腸間膜リンパ節から分

paratuberculosisはIS900を保有するが，他の亜種

離された株と，豚舎の床に敷いているオガ粉からには存在しない。日本の豚から分離されるMAH分離された株のVNTRパターンが完全に一致したは ，ほ と ん ど が IS1245 を 保 有 す る と さ れ て い（Table２）。このことから，同農場においてはオる 。しかしながら，本研究で豚から分離したガ粉がMAHの温床となり，豚へ感染しているこ

MAHは，13株中８株がIS1245を保有していなとが強く示唆された。また，土から分離された株

かった（Table１）。これら８株のVNTR解析を行のVNTRパターンも非常に近かった（データ示さ

い，MSTを作成し既報のMAH株と比較したとこ

ず）
。

５）

２）

ろ，ヒトの非結核性抗酸菌症患者由来株，国内・本研究では，特徴的なIS保有パターンを示す

国外の豚から分離された株いずれからも離れた距

MAH株，および同一農場内の生体・周辺の環境

離に配置された（データ示さず）。Hibiyaらは，から分離されたMAH株の詳細な解析を行った。

国内の豚由来MAHにおけるIS1245の保有率は特にオガ粉と腸間膜リンパ節から分離された株の90％以上であると報告している 。この報告では，

VNTRパターンが完全に一致していたことは，本IS1245陽性のMAHは外部から種豚を導入してい症の蔓延にオガ粉が重要であることを分子疫学的る農場で分離され，IS1245陰性のMAHは，種豚に改めて示した点で意義深い。これらの株はすべを自家繁殖している農場より分離されていた 。

てゲノム解析に供し，詳細な解析が進行中である。

IS1245陽性のMAHは豚の間で伝播され，IS1245

本研究のように，MAHを豚および周辺の環境

陰性のMAHは特定の農場の環境および豚の間でから分離し，ゲノム疫学的観点から家畜～環境の循環しているのではないかと考察されている。

間での“循環動態”を解析することにより，感染２）２）

また，特定の農場において，生体から分離され源の同定やその後の衛生対策を講じることが可能© The Ito Foundation

305

ゲノム疫学的アプローチによる豚抗酸菌症の実態解明
Table 1 Classification of M. avium subspiecies by the IS sequences distribution
Species

Subspecies

IS900

IS901

IS1245

M. avium
M. avium

avium

－

＋

＋

silvaticum

－

＋

＋

M. avium

hominissuis

－

－

＋

M. avium

paratuberculosis

＋

－

－

－

－

－

8 strains isolated in this study.
M. avium

hominissuis

Table 2 Genetic profile of MAH isolated in a pig farmID

Source of MAH strains

VNTR locus
Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

Ｅ

Ｆ

Ｇ

1

mesenteric lymph node

2

3

3

1

2

8

2

2
3
4

mesenteric lymph node
mesenteric lymph node
saw dust

2
2
2

3
3
3

3
3
3

1
1
1

2
2
2

8
8
8

2
2
2

となる。MAHを含む，非結核性抗酸菌群のうち，廃棄となるが，複数の臓器に発見された場合は全

M. avium，M. intracellulare，M. kansasii，M.

廃棄となる。本研究では，東海地方で抗酸菌症疑abscessは，ヒトの非結核性抗酸菌症の主要な原因とないで廃棄される豚内蔵，飼育される豚および周辺る。これら４菌種のうち，M. aviumとM. intracellulareの環境からMAHの分離を試みた。分離したMAHは生化学的性状も非常に似かよっているため，MAC

は，hsp65遺伝子のSNPs解析，多重反復数多型配（Mycobacterium avium-intracellulare complex）

列 （variable number of tandem repeat: VNTR）

菌と総称されている。MAC菌は，ヒトや動物だ

解析，ゲノム解読を行った。このようなゲノム疫

けでなく環境中にも広く存在することが知られて学的アプローチにより，本菌の生体，環境におけいる。豚の抗酸菌症の原因菌であるMAHは，ヒる分布状況の一端を明らかにすることができた。

トの非結核性抗酸菌症との関連も示唆されてい現在，詳細なゲノム解析が進行中である。

る。本研究で得られた知見は，家畜衛生のみならず，ヒトも含めた公衆衛生学的点からも意義深いと思われる。
４．要

約

豚抗酸菌症は，非結核性抗酸菌群のうち，特にMycobacterium avium subsp. hominissuis（MAH）を原因とする，慢性増殖性のリンパ節炎である。通常，感染豚の臨床症状は認められず不顕性感染となり，食肉検査場での内臓検査にて粟状の結節性病変として発見される。病変部は部分

文献１）後藤義孝：マイコバクテリウム族（抗酸菌）と感染症，獣医微生物学（見上彪監修），第三版，文英堂
出版（東京），117～120，1995.
２）Hibiya, K., Kazumi, Y., Nishiuchi, Y., Sugawara, I.,
Miyagi, K., Oda, Y., Oda, E., Fujita, J.：Descriptive
analysis of the prevalence and the molecularepidemiology of Mycobacterium avium complexinfected pigs that were slaughtered on the mainisland of Okinawa, Comp Immunol Microbiol InfectDis，33，401～21，2010.
３）Iwamoto, T., Nakajima, C., Nishiuchi, Y., Kato, T.,
Yoshida, S., Nakanishi, N., Tamaru, A., Tamura, Y.,
S u z u k i , Y . , N a s u , M . ：G e n e t i c d i v e r s i t y o f
Mycobacterium avium subsp. hominissuis strains© The Ito Foundation

306

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

isolated from humans, pigs, and human living
environment, Infect Genet Evol ， 12 ， 846 ～ 252 ，
2012.
４）Chen, Z. H., Butler, W. R., Baumstark, B. R.,
Ahearn, D. G.：Identification and differentiation of
Mycobacterium avium and M. intracellulare by PCR,J Clin Microbiol，34，1267～9，1996.
５）Inagaki, T., Nishimori, K., Yagi, T., Ichikawa, K.,
Moriyama, M., Nakagawa, T., Shibayama, T., Uchiya,K., Nikai, T., Ogawa, K.：Comparison of a variablenumber tandem-repeat（VNTR）method for typing

Mycobacterium avium with mycobacterialinterspersed repetitive-unit-VNTR and IS1245
restriction fragment length polymorphism typing, J
Clin Microbiol，47，2156～64，2009.
６）Uchiya, K., Takahashi, H., Nakagawa, T., Yagi, T.,
Moriyama, M., Inagaki, T., Ichikawa, K., Nikai, T.,
Ogawa, K.：Characterization of a novel plasmid,
pMAH135, from Mycobacterium avium subsp.
hominissuis, PLoS One, 10, e0117797．2015.

© The Ito Foundation

307

データマイニング技術を用いた牛白血病ウイルス
感染の免疫動態解明に関する研究
Study of immune dynamics in bovine leukemia virus infection using data
minig techniques

関

口

敏・乗

峰

潤

三

（宮崎大学農学部）

Satoshi Sekiguchi and Junzo Norimine（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

The bovine MHC class II DRB3 alleles are associated with polyclonal expansion oflymphocytes caused by bovine leukemia virus（BLV）infection in cattle. To confirm the genetic
resistance, we measured BLV proviral load of BLV-infected cattle to examine whether the
DRB3＊0902 allele, one of the resistance-associated alleles, is associated with the proviral load.
Fifty-seven animals with DRB3＊0902 were identified out of 835 BLV-infected cattle and hadsignificantly lower proviral load（P＜0.000001）compared with the rest of the infected animals,
in both Japanese Black and Holstein cattle. This result strongly indicates that the bovine MHC
class II DRA/DRB3＊0902 molecule plays an important immunological role in suppressing viral
replication, resulting in resistance to the disease progression.

１．目し，子牛を素畜として購入する肥育経営の収益性的の悪化を招いている。肥育経営の安定をはかるた

我が国の畜産・酪農経営は，高齢化や離農の増め，一刻も早い肉用牛繁殖基盤の回復が求められ加による生産基盤の縮小に歯止めがかからず，子ている。これらの課題に追い打ちをかけるよう牛価格の高騰による肥育経営の悪化や，国内乳製に，我が国における牛白血病の感染拡大は増加の品需給のひっ迫のため生乳換算18万トンを超える

一途をたどっている。牛白血病は，牛白血病ウイ

乳製品の追加輸入を余儀なくされるなど，過去例

ルス（BLV）の感染を原因とし，リンパ球の異のない危機的な状況となっている。肉用牛繁殖経常増加や全身性のリンパ肉腫を主徴とする疾病で営では，戸数が年々減少するなか，離農による子ある。本疾病に対するワクチンや治療法はない。

取り用めす牛の飼養頭数の減少を規模拡大により

またBLV持続感染牛は免疫能の低下による易感補ってきたものの，平成22年度から子取り用めす

染性を示し，様々な複合感染症を発症する危険性

牛の頭数は継続して減少している。また，子取りがある。さらに，肉質の低下や繁殖成績への影響

用めす牛の飼養頭数の減少により子牛価格が高騰も懸念されていることから，肉用牛生産にとって© The Ito Foundation

308

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

も深刻な問題となっている。本疾病はすべての感には「WizardⓇ Genomic DNA Purification Kit

染牛が発症することはなく，一部のBLV感染牛（Promega）」を使用した。

は発症に対して抵抗性を示す。1993年に，ある特2.2

定のMHC classⅡを持つことで抵抗性を獲得する

分離した血漿について，抗BLV抗体を検出すことが示された（Mirsky et al.，1993） 。抵抗性る検査法（ELISA）を用いてBLV感染の有無をを持つBLV感染牛の血中ウイルス量は感受性牛診断した。ELISAは「牛白血病エライザキットに比べて極めて低く，発症のリスクも低い。レト（JNC）」を用いた。

１）

BLV感染の診断

ロウイルス感染症では，感染後の病気の進行が宿

2.3

BLV感染プロウイルスの定量

主の持つ遺伝形質によって著しく異なる場合があELISAで陽性を示した感染牛から抽出したゲ

ることは知られている。しかしながら，抵抗性をノムを用いて，Real-Time PCR法を用いてBLV感示す遺伝形質の発見から20年以上が経った今で染牛の血中のウイルス量を測定した。Real-Time

も，そのメカニズムは明らかにされていない。こPCR に は「ウ シ 白 血 病 ウ イ ル ス 検 出 用 Probe/

れは解析に必要なツールがなかっただけでなく，Primer/Positive control （TaKaRa）」および病原体に対する宿主の様々な因子が複雑に絡み「Cycleave PCR Starter Kit（TaKaRa）」を 使 用合っているため，免疫応答を単純化して解析するした。

ことが困難であることなどが考えられる。免疫反2.4

応では外部からの抗原刺激を受けて，多くの遺伝生物のゲノム中に存在する制限酵素認識部位の子やタンパク質の発現が変化し，その最終結果と配列には個体差があり，制限酵素切断後に生じるして体内代謝物質の変化が現れる。さらに，様々特異配列の長さは個体ごとで差が現れる。RFLP

なサイトカインや免疫構築を担う受容体の抑制あ法とは，制限酵素によって切断されたDNA断片

るいは活性化が促進される。このような複雑な免の長さの違いを利用して，個体間で異なる多型を疫機構を解析するためには，無数の宿主因子から識 別 す る 方 法 で あ る 。こ の こ と を 利 用 し て ，

免疫応答に関連する重要な因子を抽出し，同定す

RFLP法で感染牛の抵抗性遺伝子を決定した。

RFLP法による抵抗性遺伝子の決定る必要がある。そこで本研究では，BLV感染の2.5

疫学調査を行い，BLVに感染した抵抗性牛を同感染牛の血液から抽出したBLVについて，ウ

定した。次に，抵抗性の遺伝子型とプロウイルス

イルスエンベロープの部分塩基配列440bpを決定量との関係を調べた。

し，MEGA６ソフトウェアを用いて多重アライ

２．方
2.1

BLVの系統樹解析

メント解析および遺伝子系統樹の作成を行ったウ法

イルス遺伝子の系統樹解析を行った。
2.6

血液の採材

統計処理

臨床獣医師らと連携しながら，九州県内にあるデータは各群の平均値，中央値および標準偏差

複数の研究協力農場から835頭のBLV感染牛の血を算出し，両群間でウィルコクスンの順位和検定

液を採取した。採血後は速やかに遠心分離し，血を行い，統計学的有意差検定を行った。なお，有漿と血球成分を分離した。分離後の血漿はマイナ

意水準は５％とした。

ス20度で冷凍保存し，血球成分からはゲノムを抽2.7

出し，マイナス20度で冷凍保存した。ゲノム抽出

本研究で取り扱う農場情報や試料は生産者を含© The Ito Foundation

人権の保護および法令等の遵守への対応

データマイニング技術を用いた牛白血病ウイルス感染の免疫動態解明に関する研究309

む畜産関係者の同意の下，実施しているものであ

牛と非抵抗性牛の感染プロウイルス量を比較した

り，「国立大学法人宮崎大学個人情報保護規則」

結果，和牛，乳用牛ともに抵抗性遺伝子を持つ牛および「国立大学法人宮崎大学保有個人情報管理のプロウイルス量が持たない牛のそれより有意に規定」を遵守するものである。

低かった（Fig.１）。この結果は，和牛も乳用牛も抵抗性遺伝子を持つ牛ではBLVの増殖が抑え

３．結果と考察られていることを示す重要な知見である（論文投

835頭（和牛：653頭，乳用牛：182頭）のうち，稿中）。次に，感染牛から抽出したBLVの遺伝子

抵抗性遺伝子（DRB3 0902）を保有していたのについて系統樹解析を行ったところ，20種の異なは57頭（和牛：44頭，乳用牛：13頭）で，BLVる遺伝子サブタイプが検出された（Fig.２）。こ感染牛全体の約6.8％であった（Table１）。抵抗性

れらの多くは遺伝子サブタイプ１型に分類され＊Table 1 Proportion of BoLA-DRB3＊0902 allele in animals giving with E band in PCR-RFLP
The number of animals
Japanese Black（ｎ＝653）（allele count＝1,306）

Holstein（ｎ＝182）（allele count＝364）

Total（ｎ＝835）（allele count＝1,670）

Percentage of eachallele（％）（allele count＝1,670）

DRB3＊0901

1

2

3

a）
0.18（0.05－0.57）

DRB3＊0902

44

13

57

a）
3.41（2.62－4.43）

DRB3＊0903

0

0

0

a）
0.00（0.00－0.29）

Total

45

15

60

a）
indicates 95％ confidence interbal for the percentage of each allele. There was no animal with homozygous DRB3＊0901

nor DRB＊0902 allele.

P＜0.000001

8000
6000
4000
0

2000

Proviral load
（copies/50ng）

10000

12000

P＜0.000001

W

W/O

W

Holstein

W/O
Japanese Black

Fig. 1 Association between the DRB3＊0902 allele and proviral load. Proviral load is indicated as the number of copies

per 50ng DNA. Holstein cattle with DRB3＊0902：W; without DRB3＊0902：W/O. Japanese Black cattle with DRB3
0902：W; without DRB3＊0902：W/O）.

＊© The Ito Foundation

310

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Fig. 2 Phylogenetic tree of the BLV genotypes. The phylogenetic tree was based on partial sequences（423 nt）of theenv gene. The sequences from this study labeled with black circle and from Genbank labeled with white square（Japanese strain）or circle（foreign strain）. The BLV genotypes are indicated on the right（G I and G III）or inparentheses（G II, G III and G IV-G X）.The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining methodwith bootstrap probability more than 70％．The bootstrap values, more than 70％，are shown next to branches. The
tree is drawn to scale, with branch lengths in the same units as those of the evolutionary distances used to infer
the phylogenetic tree.

た。また，地域によって遺伝子サブタイプの分布および乳用牛）を用いて，抵抗性遺伝子（DRB3＊が異なることが明らかとなった（Fig.３）。この0902）の有無と末梢血プロウイルス量との関連

ような遺伝子サブタイプと地理的な分布の関係を性を解析する事を目的とした。その結果，DRB3＊示した研究成果は初めての報告であり，感染経路

0902保有牛は，和牛および乳用牛のどちらにおやウイルスの感染拡大パターンの解明に有用な知いても保有していない牛と比較してプロウイルス

見となりうる（Marawan et al.，2017） 。今後は，量が有意に低かった。プロウイルス量の低い感染抵抗性遺伝子を持つ牛を用いて網羅的なタンパク

牛は，水平および垂直伝播経路において感染源と質の比較定量解析を実施し，データマイニングのなるリスクが低いことから，DRB3＊0902を保有

手法を用いてBLV感染に重要な因子を抽出・同する牛は，BLVに感染しても感染拡大源となり定する予定である。

難いことが示唆される。このことから，全国で牛

２）

４．要

白血病が蔓延している現状から，DRB3＊0902を約保有する牛の白血病清浄化対策への有効活用が期

本研究は，BLVに感染したフィールド牛（和牛待される。今後は，ウイルス増殖を抑制する免疫© The Ito Foundation

データマイニング技術を用いた牛白血病ウイルス感染の免疫動態解明に関する研究

311

Fig. 3 Prevalence and distribution of different subgenotypes in 3 different localities of the Miyazaki prefecture.

学的機序の解明していく予定である。
文献１）Mirsky, M. L., Da, Y., Lewin, H. A.：Detection ofbovine leukemia virus proviral DNA in individual
cells, PCR Methods Appl，２（4）：333～340，1993．

２）Marawan, M. A., Mekata, H., Hayashi, T.,
Sekiguchi, S., Kirino, Y., Horii, Y., Moustafa, A. M.,
A r na o ut , F. K ., Ga l i l a , E. S., N o r i m i ne , J .：Phylogenetic analysis of env gene of bovine
leukemia virus strains spread in Miyazaki
prefecture, Japan, J Vet Med Sci, in press，2017．

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312

肉用牛の出血性腸炎で認められる腸管病原性微生物の混合感染と病態との関連
Co-infection of Eimaria and enteropathogenic microbes and its role in
the pathophysiology of haemorrhagic enteritis in beef cattle

桐

野

有

美・目

堅

博

久＊・野

中

成

晃

（宮崎大学農学部， 宮崎大学テニュアトラック推進機構）＊

Yumi Kirino, Hirohisa Mekata＊ and Nariaki Nonaka（Faculty of Agriculture, University of Miyazaki，＊Organization for Promotion of Tenure Track）

Bovine Eimeria species are found nationwide in Japan and the vast majority of calves are
exposed to them. Most cases of haemorrhagic enteritis（HE）in cattle are related to theinfection of these causal protozoa, which is responsible for severe economic losses in farms. It
has been recently demonstrated that such HE cases are caused by co-infection of Eimeria andother pathogens. This study explored potential microorganisms which are associatively
involved in the pathophysiology of HE in cattle by coprological molecular diagnosis. A total of
27 cases and their respectively matched controls in 20 farms were sampled. Fecal samples
were collected on the onset of disease, the third day since the onset, and the cure phase.
Realtime PCR was performed targeting ten viral species and six bacterial species consideredenteropathogenic to cattle. Eimeria oocysts were quantitatively examined by McMastermethod. Severe infection of Eimeria（OPG>10,000）was found in 70％ of the cases and 4％ of
the controls. Clostridium perfringens was detected in 30％ of the cases while in 4％ of thecontrols. Bovine enterovirus was detected in 67％ of the cases and 71％ of the controls. Group
A rotavirus, Bovine torovirus, and bovine coronavirus were also detected in a few cases.
According to matched-pairs analysis, the existence（“severe infection”instead, in the case ofEimeria）of C. perfringens, E. zuernii, E. bovis, and other Eimeria species were verified tohave a significant association to the disease. These pathogens showed significant decrease ortendency of decrease along toward the cure phase. These results indicate that infection ofEimeria and C. perfringens is likely to play an important role in HE pathophysiology. On theother hand, Bovine enterovirus was not considered to associate to the disease as it was
detected frequently in both cases and controls and the proportion of the test-positive animals
didnʼt decrease during the cure phase. Eimeria-associated HE seems to have several patternsof pathophysiology, which can be one of the reasons for the different outcomes of treatments inthe field. The information on such patterns and the factors involved will contribute to theestablishment of effective treatment methods.

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肉用牛の出血性腸炎で認められる腸管病原性微生物の混合感染と病態との関連

１．目

313

（最終治療日）の３時点で採材を行った。対照と的して発症牛と飼養条件をそろえた臨床上健康な同牛，特に肉用牛の出血性腸炎は，増体率の低下，

居牛（以下「健康牛」）からも，マッチド・ペア

時には死亡を招くこともあり，畜産農家における方式で同時に採材した。健康牛24頭のうち３頭

経済損失の重大要因のひとつとして定着していは，それぞれ同居する複数の発症牛の対照としてる。主な原因とされるコクシジウム（Eimeria属

採材されたため，のべ27組の発症牛－健康牛のペ原虫）はわが国に広く分布し，若齢牛を中心に高アを解析に供した。検査材料は冷蔵にて運搬し，率に感染しているが，発症や重症化のメカニズム

遺伝子抽出および検査を行うまでPBS10％乳剤とについては未解明の部分が多い。臨床現場では抗して－80℃にて保管した。採材と同時に，牛の個

コクシジウム剤（サルファ剤）の投与を中心とし

体情報，臨床症状，治療内容などの臨床情報を記た治療が行われるが，これによりコクシジウムの録し，解析に用いた。

オーシスト排出が認められなくなっても，しばし

2.2

ば重症化を抑えることができない 。

土赤らが開発した牛下痢関連病原体の網羅的診１）

病原体の検出

近年，ニワトリやブタにおいては，コクシジウ

断系Dembo-PCR５）を一部改変し，牛の腸管に病

ム単独ではなく他の消化管病原性微生物との混合

原性を示すとされる10種のウイルスと６種の細菌感染が重要な発症因子であることが示唆されていの遺伝子をターゲットにTaqManリアルタイム

る。申請者が行った先行研究においても，コ

PCRを行った（Table１）。細菌DNAとウイルス

クシジウムが関与する出血性腸炎の約半数におい

RNA/DNAは，それぞれQIAamp Fast DNA StoolてClostridium perfringensの著しい増殖が観察されMini Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）およびHighた 。しかし残りの半数においては，C. perfringens

pure viral nucleic acid kit（Roche Diagnostics

以外の病原体が，コクシジウムとの混合感染によGmbH, Mannheim, Germany）を用いて製品の指り出血性腸炎を引き起こしている可能性を示唆し示書に従って抽出した。RNAウイルスの遺伝子増ている。

幅はOne Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa２，
３）

４）

そこで本研究では，牛の出血性腸炎の病態形成

Bio, Otsu, Japan）で，またDNAウイルスと細菌に複合的に関与している病原体を明らかにするこの遺伝子増幅はPremix Ex TaqTM（TaKaRa Bio,とを目的に，発症牛の糞便に排出される病原性ウ

Otsu, Japan）で行った。これらの製品の指示書

イルスおよび細菌の消長をリアルタイムPCRを用に従い，核酸抽出産物，Table１に示す各プライ

いて経時的に観察した。

マーとプローブ（いずれも最終濃度0.2μＭ）を加

２．方
2.1

え，超純水で全量20μｌに調整したものをター

法

ゲット病原体ごとに反応チューブに入れ，検査材料の採取

LightCycler Ⓡ 96 （Roche Diagnostics GmbH,平成28年７月から平成29年１月，宮崎県およびMannheim, Germany）を使用して遺伝子増幅反

鹿児島県の計20農場において，臨床獣医師により応を行った。なお，抽出工程における核酸損失を出血性腸炎と診断された牛（以下「発症牛」）27

監視するため，β-actinをインターナルコント

頭を対象に調査を行った。直腸便を検査材料とロールとして検出した。すべての反応温度条件はし，発症１日目（初診時），第３病日目，寛解時

45℃５分，95℃30秒ののち，95℃10秒，55℃20秒，© The Ito Foundation

314

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 1 Primer-probe sets used for TaqMan realtime PCR
PathogenTarget gene

Forward primer（5ʼ-3ʼ）
Reverse primer（5ʼ-3ʼ）Probe（5ʼ-3ʼ）

Reference
No.

Bovine viral diarrheal
virus

5ʼUTR

GGGNAGTCGTCARTGGTTCG
GTGCCATGTACAGCAGAGWTTTT
FAM-CCAYGTGGACGAGGGCAYGC-TAMRA

5）

Bovine enterovirus

5ʼUTR

GCCGTGAATGCTGCTAATCCGTAGTCTGTTCCGCCTCCACCTFAM-CGCACAATCCAGTGTTGCTACGTCGTAAC-TAMRA

7）

Bovine coronavirus

M protein

CTGGAAGTTGGTGGAGTT
ATTATCGGCCTAACATACATC
FAM-CCTTCATATCTATACACATCAAGTTGTT-ZEN/IBFQ＊

8）Group A rotavirus

VP6

ACTCCAATGTAAGTGATCTAATTCGAGTTGTTCCAAGTAATCCAAA
FAM-ACCAATTCCTCCAGTTTGGAAYTCATTYCC-ZEN/IBFQ＊

5）Group B rotavirus

VP6

TGGCAGGTGGTCAGGTAATAAACACCACACGTTCTAGCTTTCAG
FAM-GTCACATGTGTCTCAGGCATGGAAGC-ZEN/IBFQ＊

5）Group C rotavirus

VP6

GCCAATACGAGAAGGGATTC
TCTTCACGGATGCAACTAGC
FAM-CCAGGATTTCCATGGGAACAGACGT-TAMRA

5）

Bovine torovirus

Nucleocapsid

CGTATTCAAAACCAAAGACGTG
GTGCAGTCTCATTTGCCATC
FAM-CCAGCAGTCACTATCTTTGCCATTTGA-ZEN/IBFQ＊

5）

Mammalianorthoreovirus

λ3

TCGATATCGGGAATGCAGCTGACGGGAAAGTGGTRGTCA
FAM-ATGATCCAGCATCTATCGAAACTRTATAAACG-ZEN/IBFQ＊

5）

Bovine herpes virus-1

gE

CAATAACAGCGTAGACCTGGTCGCTGTAGTCCCAAGCTTCCAC
FAM-TGCGGCCTCCGGGCTTTACGTCT-TAMRA

9）Bovine adenovirus

Hexon

CRAGGGAATAYYTGTCTGAAAATCAAGGATCTCTAAATTTYTCTCCAAGA
FAM-TTCATCWCTGCCACWCAAAGCTTTTTT-TAMRA

10）

Salmonella Dublin

VagC

GGGTGAGCGAGCTGGAAACGCCATAAAGTCCGGGTCA
FAM-TTTTTCGAGCTGCGCGAACGAGC-TAMRA

11）

Salmonella Enteritidis

sefA

GGTAAAGGGGCTTCGGTATCTATTGGCTCCCTGAATACGC
FAM-TGGTGGTGTAGCCACTGTCCCGT-TAMRA

12）

Salmonella
Typhimurium

fliC

TGCAGAAAATTGATGCTGCT
TTGCCCAGGTTGGTAATAGC
FAM-ACCTGGGTGCGGTACAGAACCGT-ZEN/IBFQ＊

12）

Mycobacterium avium
sub. Paratuberculosis

IS900

CAGCGGCTGCTTTATATTCCGCAGAGGCTGCAAGTCGTFAM-AAGACCGACGCCAAAGACGCTGCGA-ZEN/IBFQ＊

13）

Clostridium perfringens（α-tixin）

Cpa＊

TGCACTATTTTGGAGATATAGATAC＊
CTGCTGTGTTTATTTTATACTGTTC＊FAM-TCCTGCTAATGTTACTGCCGTTGA-ZEN/IBFQ＊

14）Enterotoxigenic
Escherichia coli

K99

GCTATTAGTGGTCATGGCACTGTAG
TTTGTTTTCGCTAGGCAGTCATTA
FAM-ATTTTAAACTAAAACCAGCGCCCGGCA-ZEN/IBFQ＊

15）

β-actinActin

AGCGCAAGTACTCCGTGTGCGGACTCATCGTACTCCTGCTTFAM-TCGCTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-TAMRA

9）＊Modified from the primer-probe sets which are listed in Dembo-PCR５）© The Ito Foundation

肉用牛の出血性腸炎で認められる腸管病原性微生物の混合感染と病態との関連

72℃20秒を40サイクルとした。

315

そ し て そ の 他 の Eimeria 属 原 虫（P ＝ 0.045）でEimeria属原虫と線虫類の検出は，McMaster

あった（Table２）。このうち病状の寛解に向かっ法により糞便中のオーシストあるいは虫卵を種別て保有率が有意に低下したのはE. zuernii（P＝に定量した。Eimeria属原虫については，糞便１0.004）のみであったが，C. perfringens，E. bovis，ｇあたりのオーシスト数（OPG）が10,000を超え

およびその他のEimeria属原虫においても低下傾るものを重度感染とした。

向が認められた（それぞれP＝0.268，P＝0.198，

2.3

統計解析

P＝0.265）（Fig.１）。なお，本調査では経過中に検出された病原体と病態発生との関連を以下の保有率が有意に上昇した病原体はなかった。

方法で解析した。まず，McNemar検定により，以上の結果は，Eimeria属原虫とC. perfringens

病原体の保有と疾病との関連をマッチド・ペア方の存在が，病態形成に関与していることを示して式で解析した。次いで，発症牛において，各病原いる。著者らは先行研究において，Eimeria属原体の検出率を経時的に多重比較検定した。すべて

虫の重度感染が，腸管内におけるC. perfringensの解析は統計プログラムＲ（www.r-project.org）の増殖に重要な役割を果たす可能性を指摘していを用いて行い，P＜0.05の時に有意と判断した。

る４）。今回のマッチド・ペアによる解析および病
原体保有率の経時的観察のいずれもこれを支持す

３．結果と考察る結果となった。一方で，牛エンテロウイルスは

今回，調査対象とした症例は，子牛（８カ月齢

発症牛・健康牛ともに高頻度で検出され，その保未満）15頭，肥育牛９頭，種雄牛１頭，肉用繁殖

有率は治癒経過においても低下しなかった。本ウ

母牛１頭，不明１頭の計27症例であった。

イルスの自然感染による病原性については未だ不

初診時の検査結果から，Eimeria属原虫の重度明であり６），牛群によっては無症候的に定着して感 染（OPG ＞ 10,000）が 発 症 牛 の 70 ％（19/27）

いるとされる７）。これらのことから，本ウイルスで認められ，そのうち79％はE. zuerniiによるもの存在と病態との関連は弱いと推測されるが，経のであった。健康牛の４％（1/24）で認められた時的定量解析で確認する必要がある。

重度感染はE. bovisによるものであった。また，今回，病態との関連は証明されなかったもの

C. perfringensは発症牛の30％（8/27）から検出の，Eimeria属原虫とC. perfringens以外の病原体された一方で，健康牛からの検出は４％（1/24）との組み合わせも検出されたことから，コクシジにとどまった。牛エンテロウイルスは発症牛のウムが関与する出血性腸炎には複数の病態がある

67％（18/27）および健康牛の71％（17/24）で検ことが示唆された。この違いが，実際の臨床現場出された。Ａ群ロタウイルス，牛トロウイルス，における治療への反応に影響を与えているものと牛コロナウイルスが検出された症例も少数（それ推察される。したがって，どのような病態パター

ぞれ１例，１例，３例）認められた。

ンが存在し，それぞれにどのような病原因子が関発症牛と健康牛のマッチド・ペアで解析した結与しているかを明らかにできれば，各病態に対応

果，病原体の保有（Eimeria属原虫の場合は重度する適切な治療法の提案につなげることができ

感染，以下同様）と発症との間に有意な関連が認る。そのためには，症例の検査結果をさらに蓄積められた病原体は，C. perfringens（P＝0.019），

し，ロジスティック回帰分析により各病原体の関E. zuernii（P ＝ 0.0001），E. bovis（P ＝ 0.025），

与の程度を詳細に評価する必要がある。また，デ© The Ito Foundation

316

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 2 Test results for the targeted pathogens on the matched case-control in each disease stage examined
No. of pairs（Case/Control）
Onset
Pathogen

Day 3

Cured

＋/＋

＋/－

－/＋

－/－

＋/＋

＋/－

－/＋

－/－

＋/＋

＋/－

－/＋

－/－

Bovine viral diarrheal virus

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Bovine enterovirus

16

2

4

5

11

4

3

5

6

2

0

6

Bovine coronavirus

0

1

0

26

0

0

0

23

0

0

0

14

Group A rotavirus

0

1

0

26

0

1

0

22

1

0

1

12

Group B rotavirus

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Group C rotavirus

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Bovine torovirus

1

2

0

24

0

1

1

21

1

1

1

11

Mammalian orthoreovirus

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Bovine herpes virus-1

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Bovine adenovirus

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Salmonella Dublin

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Salmonella Enteritidis

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Salmonella Typhimurium

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Mycobacterium avium sub.
paratuberculosis

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Clostridium perfringens

0

8

1

18＊

0

4

0

19＊

0

1

1

12

Enterotoxigenic Escherichia coli

0

0

0

27

0

0

0

23

0

0

0

14

Eimeria zuernii

0

15

0

12＊

0

6

2

15

0

1

0

13

Eimeria bovis

2

5

0

20＊

0

2

0

21

0

1

0

13

Eimeria spp.（Except E. zuernii
and E. bovis）

0

4

0

23＊

0

1

2

20

0

0

0

14

Nematodes

1

1

3

22

1

0

2

20

0

1

0

13

NB: The counts represent pairs containing 1 case and 1 control rather than individual cases.
NA, all cases and controls tested were negative for the pathogen.
＋/＋，both case and control were test positive. ＋/－，case was test positive while control was test negative. －/＋，case was test
negative while control was test positive. －/－，both case and control were test negative.
＊An association was verified between case status and the presence of the pathogen by McNemar test.

ジタルPCRによる絶対定量解析や次世代シークエの経済損失の原因となっている。近年この病態のンサによる網羅的遺伝子解析により，今回検査対形成において，Eimeria属原虫と他の病原性微生象としなかった他の微生物の関与について追及す

物の混合感染が重要であることがわかってきた。

ることも重要である。

本研究では，牛の出血性腸炎の病態形成に複合的

４．要に関与する病原体を明らかにするために，臨床症

約例の糞便中に排出される病原体遺伝子を経時的に牛に感染するEimeria属原虫はわが国に広く分検査した。計20農場において出血性腸炎発症牛27

布し，若齢牛を中心に高率に感染している。牛の頭とそれぞれに対応する健康同居牛から，マッチ

出血性腸炎の多くにこの原虫が関与し，畜産農家

ド・ペア方式で採材した。初診時，３病日目，そ© The Ito Foundation

肉用牛の出血性腸炎で認められる腸管病原性微生物の混合感染と病態との関連
A

317

100
Onset

80

Day 3

Cured

*

60
40
20
0

BEV

RVA

BCoV

BToV

C. p

E. z

E. b

E. spp

Nematodes

C. p

E. z

E. b

E. spp

Nematodes

B
100
Onset

80

Day 3

Cured

60
40
20
0

BEV

RVA

BCoV

BToV

Fig. 1 Proportion of individuals with positive test result for each pathogen in each disease stage（A）Haemorrhagic
enteritis cases.（B）Healthy animals for matched controls.＊，P＜0.05.
BEV, Bovine enterovirus. RVA, Group A rotavirus. BCoV, Bovine coronavirus. BToV, Bovine torovirus. C. p,
Clostridium perfringens. E. z, Eimeria zuernii. E. b, Eimeria bovis. E. spp, Eimeria species except E. zuernii andE. bovis.

して寛解時の３時点で糞便を採取し，牛の腸管にス，牛トロウイルス，牛コロナウイルスが検出され病原性を示すとされる10種のウイルスと６種の細た症例も少数認められた。マッチド・ペアで解析

菌の遺伝子をターゲットにリアルタイムPCRをした結果，C. perfringens, E. zuernii, E. bovis，

行った。またMcMaster法によりEimeria属原虫

そしてその他のEimeria属原虫において，病原体の オ ー シ ス ト を 種 別 に 定 量 し た 。そ の 結 果 ，の保有（Eimeria属原虫の場合は重度感染）と病

Eimeria属原虫の重度感染（OPG＞10,000）が発態発生との関連が示唆された。これらの病原体の症牛の70％および健康牛の４％で認められた。ま

保有率は病状の寛解に伴って有意に低下，あるい

た，Clostridium perfringensが発症牛の30％からは低下傾向を示した。以上の結果は，Eimeria属

検出された一方で，健康牛からの検出は４％にと原虫とC. perfringensの感染が病態形成の一部をどまった。牛エンテロウイルスは発症牛の67％お成す可能性が高いことを示している。一方で，牛

よび健康牛の71％で検出された。Ａ群ロタウイル

エンテロウイルスは発症牛・健康牛ともに高頻度© The Ito Foundation

318

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

で検出され，その保有率は治癒経過においても維持されたことから，病態との関連は弱いと推測される。Eimeria属原虫が関与する出血性腸炎には複数の病態があり，この違いが臨床現場における治療への反応に影響を与えているものと推察される。どのような病態パターンが存在し，それぞれにどのような病原因子が関与しているかを明らかにできれば，各病態に対応する適切な治療法の提案につなげることができる。
文献１）Kano, S., Yoshida, Y., Takahashi, T., et al. : J Livest
Med，58，679～84，2011.
２）Collier, C. T., Hofacre, C. L., Payne, A. M., et al. :Vet Immunol Immunopathol，122，104～15，2008.
３）Mengel, H., Kruger, M., Kruger, M. U., et al. :Parasitol Res，110，1347～55，2012.
４）Kirino, Y., Tanida, M., Hasunuma, H., et al. : Vet
Rec，177，202～202，2015.

５）Tsuchiaka, S., Masuda, T., Sugimura, S., et al. : J
Vet Med Sci，78，383～9，2016.
６）Blas-Machado, U., Saliki, J. T., Sánchez, S., et al. :Vet Parasitol，48，1075～84，2011.
７）Jiménez-Clavero, M. A., Escribano-Romero, E.,
Mansilla, C., et al. : Appl Environ Microbiol，71，3536～43，2005.
８）Decaro, N., Elia, G., Campolo, M., et al. : J Virol
Methods，151，167～71，2008.
９）Wernike, K., Hoffmann, B., Kalthoff, D., et al. : J
Virol Methods，174，77～84，2011.
10）Wong, K., Xagoraraki, I. : J Appl Microbiol， 109，605～12，2010.
11）Persson, S., Jacobsen, T., Olsen, J. E., et al. : J Appl
Microbiol，113，615～21，2012.
12）Lee, S. H., Jung, B. Y., Rayamahji, N., et al. : J Vet
Sci，10，43～51，2009.
13）Bull, T. J., Gilbert, S. C., Sridhar, S., et al. : PLoS
One, 2: e1229，2007.
14）Gurjar, A. A., Hegde, N. V., Love, B. C., et al. : Mol
Cell Probes，22，90～5，2008.
15）West, D. M., Sprigings, K. A., Cassar, C., et al. :Veterinary Microbiology，122，323～31，2007．

© The Ito Foundation

319

ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成促進：
筋成長期での制御による食肉特性の向上を目指して
Slow-myofiber generation induced by dietary polyphenol feeding to
growing animals, toward enhancing meat quality

川口

舞・柴田 歩実・大宅 俊平・松吉 祐児・
水野谷 航・中村 真子・辰巳 隆一（九州大学大学院農学研究院）

Mai Kawaguchi, Ayumi Shibata, Shunpei Ohya, Yuji Matsuyoshi,
Wataru Mizunoya, Mako Nakamura and Ryuichi Tatsumi（Graduate School of Agriculture, Kyushu University）

Muscle fiber-type proportions are responsible for skeletal muscle properties including
contractility（fast-and slow-twitch）, metabolism（glycolytic and oxidative）, fatigue resistance（low and high）, and meat quality（differential tasting-component contents and fat deposition）.
The mechanisms that regulate such properties are therefore, important targets of research on
meat-animal production and human sports and health sciences. We very recently found that
resident myogenic stem satellite cells produce and secrete semaphorin 3A（Sema3A）protein
exclusively to impact the formation of slow-twitch fibers through a cell-membrane receptor/
myogenin/MEF2D/slow-myosin heavy chain（MyHC）signaling, during muscle regeneration.
Here we report that the Sema3A ligand-dependent pathway may also work during postnatal
muscle growth. In vivo experiments were conducted using satellite cell-specific Sema3A
conditional knockout（cKO）mice which received Sema3A-cKO treatment at 3 wks after birthand evaluation of the effect on fiber-type proportions at 15 wks by quadrupleimmunofluorescence microscopy. Results demonstrated that Sema3A-cKO mice had adrastically diminished proportion of slow fibers and a corresponding increase in the proportionof fast IIb fibers in areas originally rich in slow fibers, the medial head of gastrocnemius muscle
examined here（at 15 wks）. At the cKO starting time-point（3 wks）
, there was no significant
difference in the fiber-type proportion between control and Sema3A-cKO mice, indicating thatthe particular phenotype observed results from Sema3A deletion during postnatal muscle
growth from 3 wks to 15 wks. These features of the postnatal phenotype were supported byresults from primary cultures of satellite cells prepared from 3-wks-old control and Sema3AcKO mice. There were significant decreases in the expression of slow MyHC, myogenin, andMEF2D, and a complementary increase in fast MyHC type IIb message and total fast-MyHC
protein（IIa＋IIx＋IIb）observed at 72 h post-differentiation by RT-qPCR and/or Western
blotting of cell lysates. These emerging results directly support our finding that myoblastsecreted Sema3A ligand plays an essential role in slow-fiber “commitment” during myofiber
formation period in postnatal muscle growth. Therefore, the present study provides a possible© The Ito Foundation

320

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

contribution of dietary agonist of Sema3A cell-membrane receptor（including polyphenols
described in a previous research report）to increasing slow-fiber population and may help indeveloping a novel strategy for application in meat production technologies and human sports
and age-related health sciences.

る 。ま た ，こ の 分 子 機 構 の 最 も 重 要 な 点 は ，的

１．目「Sema3Aが細胞膜受容体に結合するとシグナル

骨格筋の主体である筋細胞（細長く巨大な細胞伝達が開始する」ことにあり，このことは細胞膜なので“筋線維”と呼ばれる）はその収縮特性や受容体のアゴニストにより遅筋型筋線維の形成をエネルギー代謝特性の違いから「遅筋型（Ⅰ型）」

促進できることを示唆している。

と「速筋型（Ⅱ型）」に分類される。遅筋型筋線

一方，一昨年度の助成研究により，リンゴ幼果

維は速筋型に比べて直径が小さく（“キメ”が細皮（未利用食品資源）から調製したポリフェノー

かく軟らかい），脂肪が沈着しやすい他，旨味成ルを10週齢程度のラット（ヤングアダルト期）に分やヘム鉄・タウリン・カルニチンなどの機能性

８週間給餌すると遅筋型筋線維の割合が増加し筋栄養成分の含量が高いことが知られている。また

持久力が格段に向上することを明らかにするとと遅筋型筋線維の収縮タンパク質である遅筋型ミオ

もに10，11），このリンゴポリフェノール中のある単シンは速筋型ミオシンに比べ加熱ゲル強度や保水

一成分がその有効成分であることを見出した。こ性も高い。したがって筋線維型は食肉および加熱のような特性を持つ食品成分はこれまでに報告が食肉製品の品質および栄養機能性を決める重要ななく，上記のSema3A細胞膜受容体のアゴニスト

要素であり，これを制御している分子機構を明らであることを実証する必要がある。

かにする意義は極めて大きいと言える。

したがって本研究ではまず，動物の出生後の筋

私達は，筋肥大・再生に関わる筋幹細胞（衛星

成長過程でもSema3A・細胞膜受容体依存的な自細胞）が活性化・増殖し分化・融合期に至ると，律制御機構が遅筋型筋線維の形成を制御するかど

多機能性細胞制御因子semaphorin 3A（Sema3A）

うかを検証した。これは，先の「筋幹細胞の分泌を合成・分泌し遅筋型筋線維の形成を誘導するこ因子Sema3Aによる遅筋型筋線維の形成誘導」のとを見出した。すなわち，「筋損傷により活性化・生理学的重要性と新規性を傍証することにもな

増殖・分化した筋幹細胞が互いに融合して新しいる。この目的を高い精度で達成するため，成長期

筋線維を形成する際にSema3Aを合成・分泌し，の筋幹細胞特異的Sema3Aコンディショナルノッ

細胞膜受容体neuropilin2-plexinA３複合体→筋

クアウトマウス（Sema3A-cKOマウス）を用い

特異的転写制御因子群myogenin/MEF2D→遅筋

たin vivo・in vitro実験を実施した。それらの実型myosinからなるシグナル伝達軸により遅筋型

験結果をここに報告する。なお，現在，リンゴポ

筋線維の形成を誘導する」という新規の分子機構

リフェノールのアゴニスト活性の実証試験を進めであるており，研究成果は次の機会に報告する。

。動物の出生後の筋成長過程でも同様

１～９）に新しい筋線維を形成することで筋が肥大・伸長するので，上記のSema3A依存的な自律制御機構
が遅筋型筋線維の形成を誘導していると予想され© The Ito Foundation

ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成促進：筋成長期での制御による食肉特性の向上を目指して

2.1

血清を含むDMEM基礎培地にて３日間培養した

法

２．方

321

後，５％ウマ血清-DMEMで３日間分化誘導し筋管を調製し，遅筋型・速筋型MyHCアイソフォー

実験動物

出生後３週目の雄性Pax7CreER -Sema3A マム，myogenin，MEF2Dなどの発現をリアルタイ

ウスにER のアゴニストであるタモキシフェンをム RT-qPCR （TaqMan Probe 法 ； 内 部 標 準 は

腹 腔 内 投 与 し（Sigma-Aldrich

HPRT）およびWestern blotting（内部標準はβ

T2

flox

T2

社 製 Ｔ 5648；

200μg/g体重を１日１回，計３回），衛星細胞特-actin）により調べた。

異的にSema3A遺伝子をcKOした。マウスの後肢

これらの遺伝子組み換え実験および動物実験は

大腿部および背部の筋から単離・培養した衛星細すべて，日本学術会議が定める動物実験実施ガイ胞に対してゲノムPCRを行い，cKOされた個体をドラインに従い九州大学動物実験審査委員会の承選 別 し 実 験 に 供 し た 。対 照 区 と し て 同 週 齢 の認の下実施した（許可番号：No. Ａ26-091，Ａ

Sema3A-loxPマウスにタモキシフェンを同様に

26-081，Ａ28-091，Ａ28-092）。

投与した。各群３匹のマウスを配置した。15週齢まで通常餌（Oriental Yeast社製CRF-１）にて

３．結果と考察

自由摂食・飲水条件下で飼育し（室温22±２℃，

3 . 1 筋成長期のSema3A-cKOが遅筋型筋線維

湿度55±10％，12：12明暗サイクル），後肢下腿形成に及ぼす影響：in vivo実験（Fig.１）

部ふくらはぎの筋を採取・解析した。初期体重，

筋の成長期にある３週齢で衛星細胞特異的に

総摂食量および体重増加量はいずれも対照区と

Sema3AをcKOすると，成熟期（15週齢）のヒフ

Sema3A-cKO区間で有意な差がないことを確認

ク筋の遅筋型筋線維割合（％）が有意に減少し，した。

超速筋型であるIIb型筋線維の割合が代替的に増2.2

筋線維型組成解析

加した（Fig. 1A，1B，および1Ｃの右側のグラ

３週齢および15週齢でそれぞれふくらはぎの筋

フ；p＜0.01）。cKOを開始した３週齢では，筋線を回収し，その凍結切片に対して抗myosin重鎖

維型組成にコントロール区とSema3A-cKO区間（MyHC）アイソフォームモノクローナル抗体をで有意な差は認められなかったことから（Fig.

用いた４重蛍光免疫染色を行った 。ヒフク筋の1Cの左側のグラフ），上記の筋線維型組成変化は，

う ち ，遅 筋 型 筋 線 維 が 豊 富 な 骨 側 の 内 側 部筋成長期のSema3A発現のcKOに起因することが（medial head部）の遅筋型・速筋型筋線維の数を明確になった。したがって，衛星細胞が合成・分それぞれ測定し（各個体，合計500―1000本の筋泌するSema3Aは，筋成長期の遅筋型筋線維の形

線維），それらの相対的割合（％）を算出した。

成に重要な因子であることが明らかになった。

12）

有意差の検定はStudentʼs-tテストにて行った。
2.3

衛星細胞初代培養系での解析

3 . 2 Sema3A-cKO が 遅 筋 型 myosin 発 現 に 及ぼす影響：in vitro実験（Fig.２）

３週齢のコントロールマウスおよびSema3A-

上記のin vivo実験結果をさらに検証するため，

cKO マ ウ ス の 後 肢 大 腿 部 お よ び 背 部 の 筋 か ら

３週齢のコントロールマウス（タモキシフェン非

Allenらの方法に従い衛星細胞を単離し（純度

投 与 の Pax7CreERT2-Sema3Aflox マ ウ ス）お よ び

95％以上），poly-L-lysineとfibronectinで２重コー

Sema3A-cKO マ ウ ス（タ モ キ シ フ ェ ン 投 与 のトした培養用プレートに播種した。10％正常ウマ

Pax7CreERT2-Sema3Afloxマウス）から単離した衛13）© The Ito Foundation

322

平成28年度
control

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
control

Sema3A-cKO

3-wk
after birth（cKO-startingtime-point）

Sema3A-cKO

slow

merge

A

medial head

Gas

Gas
Pla

Pla
lateral head

Sol

Sol

Gas

500µm

500µm

500µm

500µm

Gas

15-wk
Pla
Sol

Pla

C

Gas
Sol

Pla
Sol

merge

merge
200µm

slow

100

200µm

!

**

80

60

40
**

20

Sema3A cKO

CNT

Sema3A cKO

!

CNT

0
fast IIb

Gastrocnemius medial head, posterior side
3 wk
15 wk
n=3
n=3

fast IIb

Gas

fast IIx

15-wk
HE

fast IIa

B

Sol

Sema3A-cKO

slow

control

Fiber-Type Composition (%)

PlaGray/white: slow I; black: fast IIa;green: fast IIx;red: fast IIb
Fig. 1 Sema3A-cKO abolishes slow-fiber generation during postnatal muscle growth.（A）Demonstration of quadruple MyHC-immunofluorescence. Merged and slow-MyHC views photographed under the

Tile-Scan program at 3 wks and 15 wks after birth（calf muscles of Sema3A-loxP controls and Pax7CreERT2Sema3Aflox Sema3A-cKO mice）.Gas, gastrocnemius; Pla, plantaris; Sol, soleus muscles.（B）MyHC-immunofluorescence of calf muscle（posterior side）at 15 wks. First and second rows display representative
low-magnification views of HE-staining and merged immunofluorescence, respectively; lower micrographs show
magnified views of boxed areas（medial head region of the muscle）.（C）Slow fibers（type I）and fast fibers（types IIa, IIx, and IIb）were counted for medial head region of gastrocnemius
and expressed as relative ratios（percentages）. Bars depict the mean±SEM for three mice in each group andsignificant differences from control at p ＜0.01 are indicated by（＊＊）．

© The Ito Foundation

ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成促進：筋成長期での制御による食肉特性の向上を目指してA

323

real-time RT-qPCR <72h>

2.5* TaqMan Probe assay

control（n = 3）
Sema3A cKO（n = 3）

(relative unit)

Target Genes / HPRT

2.0
1.5

p=0.87p=0.47p=0.14p=0.79p=0.80p=0.94p=0.27p=0.29

1.0

*

0.5

*
*

0
plexinA3

plexinA2

plexinA1

neuropiin2

neuropiin1

MEF2D

MEF2C

fast MyHC Ib

fast MyHC IIx

fast MyHC IIa

slow MyHC

myogenin

Sema3A-dependent signaling elementsB（mouse #）1

Western blotting <72h>
3
1

2

2

3

slow MyHC

fast MyHC
IIa+IIx+IIb

total MyHC
MF20-positive

β-actininternal STD
control

Sema3A cKO

Fig. 2 Evaluation of Sema3A-cKO effect in primary cultures of satellite cells. Satellite cells were prepared from control（Pax7CreERT2-Sema3Aflox without tamoxifen-i.p. injection）and Sema3A-cKO mice（Pax7CreERT2-Sema3Aflox withtamoxifen i.p.）, and maintained in proliferation medium（DMEM-10％HS）for 72 h and in differentiation medium（DMEM-5％HS）for the next72-h period. Cultures were evaluated by RT-qPCR for mRNA expression levels of
myogenin, slow MyHC, fast MyHC types IIa, IIx, and IIb, MEF2C, MEF2D, neuropilin1, neuropilin2, and plexinA1-3（A）and by Western blotting for protein expression of slow MyHC, total fast MyHC（IIa, IIx, IIb）, total MyHC
（pan MyHC, MF20 antibody-positive）（B）. Bars depict the mean and SEM（3 mice per group）as arbitrary units
relative to the mean of the control. Significant differences from the control（open bars）at p ＜ 0.05 are indicated by（＊）．

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324

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

星細胞の初代培養系にて，筋線維型のマーカー分

有効性に着目し，そのサプリメント給餌によって子である遅筋型・速筋型MyHCの発現変化を調べ

遅筋型筋線維の割合を増やし食肉特性を向上させた。幼若な筋線維の形成期にあたる分化誘導後３ることを指向した。これを実現するため，まず，日目の細胞試料に対してRT-qPCR解析を行った「筋の成長期における遅筋型筋線維の形成機構」と こ ろ ，遅 筋 型 MyHC 発 現 の 減 少 と 超 速 筋 型を明らかにすることを目的とした。筋成長期にあMyHC（IIb）の発現増加が認められた（Fig. 2A；

る生後３週齢のマウスを用いて，筋幹細胞（衛星p ＜ 0.05）。こ れ ら の 結 果 は ，Fig. 2B に 示 し た細胞）特異的にSema3Aの合成・分泌をノックア

Western blottingの結果，すなわち，遅筋型MyHC

ウト（cKO）すると，成熟期（15週齢）のヒフク

タンパク質の減少と速筋型myosin重鎖タンパク

筋の遅筋型筋線維割合が有意に減少し，速筋型筋質の代替的増加（IIa，IIx，IIbの合成量）と一致

線 維（IIb 型）が 代 替 的 に 増 加 し た 。３ 週 齢 のするとともに，先のFig.１の結果ともよく符合しSema3A-cKOマウスから単離した衛星細胞の初た。また，Sema3A-cKOによってもSema3A細胞代培養系においても，遅筋型筋線維のマーカーで膜受容体であるneuropilinとplexinAの発現量はある遅筋型myosin重鎖の発現低下および速筋型

変化しない一方，転写制御因子群myogeninおよmyosin重鎖（IIb型）の増加が認められた。また，びMEF2DのmRNA発現が有意に減少したことか

転写制御因子群myogeninおよびMEF2Dの発現がら（Fig. 2A；p＜0.05），筋再生と同様に筋成長に有意に減少したことから，筋再生と同様に筋成長

お い て も Sema3A リ ガ ン ド → 細 胞 膜 受 容 体 →に お い て も Sema3A リ ガ ン ド → 細 胞 膜 受 容 体

myogenin/MEF2D→遅筋型MyHCのシグナリン→myogenin/MEF2D→遅筋型myosin重鎖のシググ軸により遅筋型筋線維の形成が誘導されている

ナリング軸により遅筋型筋線維の形成が誘導されと考えられた。

ていると考えられた。したがって，Sema3A細胞以上の結果から，筋の成長期において，衛星細膜受容体のアゴニストによって遅筋型筋線維の形胞が合成．分泌するSema3Aによって遅筋型筋線成を促進できると期待されるので，前述の食品成維の形成が誘導されていることが明らかになっ分（リンゴポリフェノール）のアゴニスト活性おた。また，細胞内シグナリングには細胞膜受容体

よびその摂餌効果を早急に検証する予定である。

とその下流因子であるmyogeninおよびMEF2Dが研究成果は食肉生産科学の他，加齢筋医科学・関与すると考えられた。したがって，Sema3A細健康科学・スポーツ科学への食品機能学的貢献が胞膜受容体のアゴニストによって遅筋型筋線維の強く期待される。すなわち，本研究は加齢や不活形成を促進できると期待され，前述の食品成分

動（寝たきりや無重力環境暴露）に伴う筋持久力（ポリフェノール）のアゴニスト活性およびそのの低下を抑制することやアスリートの持久運動能

摂餌効果を早急に実証する必要がある。

力を向上させる技術開発に資すると期待される。

４．要

また，脂肪酸をβ酸化しエネルギー源として代謝

約する遅筋型筋線維の増加は体脂肪を減少させ，生遅筋型筋線維は速筋型に比べて直径が小さく，脂肪が沈着しやすい他，旨味成分や機能性栄養成

活習慣病の予防ひいては健康寿命の延長やQOLの改善に寄与すると考えられる。

分の含量が高いことが知られている。本研究では，先行研究で見出したリンゴポリフェノールの© The Ito Foundation

ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成促進：筋成長期での制御による食肉特性の向上を目指して
文
献１）Tatsumi, R., Sankoda, Y., Anderson, J. E., Sato, Y.,
Mizunoya, W., Shimizu, N., Suzuki, T., Yamada, M.,
Rhoads, R. P. Jr., Ikeuchi, Y., Allen, R. E. : Am. J.
Physiol. Cell Physiol., 297, C238-C252，2009.
２）Do, M.-K. Q., Sato, Y., Shimizu, N., Suzuki, T.,
Shono, J., Mizunoya, W., Nakamura, M., Ikeuchi, Y.,
Anderson, J. E., Tatsumi, R. : Am. J. Physiol. Cell
Physiol., 301, C1270-C1279，2011.
３）Do, M.-K. Q., Suzuki, T., Gerelt, B., Sato, Y.,
Mizunoya, W., Nakamura, M., Ikeuchi, Y., Anderson,
J. E., Tatsumi, R. : Anim. Sci. J.，83，712～717，2012.
４）Sato, Y., Do, M.-K. Q., Suzuki, T., Ohtsubo, H.,
Mizunoya, W., Nakamura, M., Furuse, M., Ikeuchi, Y.,
Tatsumi, R. : Anim. Sci. J.，84，185～189，2013.
５）Suzuki, T., Do, M.-K, Q., Sato, Y., Ojima, K., Hara,
M., Mizunoya, W., Nakamura, M., Furuse, M.,
Ikeuchi, Y., Anderson, J. E., Tatsumi, R. : Int. J.
Biochem. Cell Biol.，45，476～482，2013.
６）Suzuki, T., Ojima, K., Do, M.-K. Q., Hara, M.,
Mizunoya, W., Nakamura, M., Ikeuchi, Y., Anderson,
J. E., Tatsumi, R. : In: abstract of the EMBO
Workshop on Semaphorin Function and Mechanismin Action, Cemay-la-Ville, France，2013.
７）Sakaguchi, S., Shono, J., Suzuki, T., Sawano, S.,
Anderson, J. E., Do, M.-K. Q., Ohtsubo, H., Mizunoya,W., Sato, Y., Nakamura, M., Furuse, M., Yamada, K.,
Ikeuchi, Y., Tatsumi, R. : Int. J. Biochem. Cell
Biol.，54，272～285，2014.
８）Do, M.-K. Q., Shimizu, N., Suzuki, T., Ohtsubo, H.,

325

Mizunoya, W., Nakamura, M., Sawano, S., Furuse, M.,
Ikeuchi, Y., Anderson, J. E., Tatsumi, R. : Physiol.
Rep., 3, e12553, 2015. Available from: http://dx.
doi.10.14814/phy2.12553
９）Tatsumi, R., Suzuki, T., Do, M.-K. Q., Ohya, Y.,
Anderson, J. E., Sibata, A., Kawaguchi, M., Ohya, S.,
Ohtsubo, H., Mizunoya, W., Sawano, S., Komiya, Y.,
Ichitsubo, R., Shibata, A., Ojima, K., Nishimatsu, S.,
Nohno, T., Ohsawa, Y., Sunada, Y., Nakamura, M.,
Furuse, M., Ikeuchi, Y., Nishimura, T., Yagi, T.,
Allen, R. E. : Stem Cells，35，1815～1834，2017.
10）Mizunoya, W., Miyahara, H., Okamoto, S.,
Akahoshi, M., Suzuki, T., Do, M.-K. Q., Ohtsubo, H.,
Komiya, Y., Mu, L., Waga, T., Iwata, A., Nakazato, K.,
Ikeuchi, Y., Anderson, J. E., Tatsumi, R. : PLoS One,
10: e0134303, 2015. Available from: http://dx.doi.10.1371/journal.pone.0134303
11）Mizunoya, W., Okamoto, S., Miyahara, H.,
Akahoshi, M., Suzuki, T., Do, M.-K. Q., Ohtsubo, H.,
Komiya, Y., Qahar, M., Waga, T., Nakazato, K.,
Ikeuchi, Y., Anderson, J. E., Tatsumi, R. : Anim. Sci.
J.，88，489～499，2017.
12）Sawano, S., Komiya, Y., Ichitsubo, R., Ohkawa, Y.,
Nakamura, M., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y., Mizunoya,
W. : PLoS One, 11, e0166080, 2016. Available from:http://dx.doi.10.1371/journal.pone.0166080
13）Allen, R. E., Temm-Grove, C. J., Sheehan, S. M.,
Rice, G. M. : Methods in Cell Biol. ，52 ，155 ～ 176 ，
1997.

© The Ito Foundation

326

粗飼料サイレージの発酵品質改善のためのサイレージ密度計測手法の開発
Development of silage density measurement method for improving
fermentation quality of forage silage

大

越

安

吾

（地方独立行政法人北海道立総合研究機構農業研究本部根釧農業試験場）

Ango Ohkoshi（Hokkaido Research Organization, Agricultural Research Department Konsen
Agricultural Experiment Station）

In order to improve fermentation quality of forage silage, it is important to increase thedensity of forage material during filling into silo. As a method of checking silage filling degree,
there is a method of measuring the silage density after opening the silo. It is said that the mostaccurate density measurement method is based on weighing after sample collection using acore sampler and drying treatment. However, preparation of instrument and complicated work
are necessary, so it is a problem that it can not be used frequently.
In this research, the frictional resistance measurement method was studied as a newdensity measurement method instead of the core sampler method. In the frictional resistancemeasurement method, each frictional resistance is measured with respect to a silage crosssection in three ways. The first is the penetration resistance when stabbing the shaft in thesilage, the second is the torque resistance generated by twisting the shaft, and the third is thepulling resistance generated when pulling out the shaft. Firstly, a total of 25 types of shaftswith 5 type diameters and 5 type tip angles were manufactured, and a test for determining theshaft specification was conducted. A shaft standard with a diameter of 12 mm, a tip angle of
15°，and an effective length of 250 mm ＋ tip length was selected.
Measurement of frictional resistance on silage samples of pasture and feed corn withvariable moisture content revealed that there were no correlations, although approximation
formulas of linear functions with gentle slope were obtained with respect to the wet matter
density. In dry matter density, all three methods obtained approximate expressions on the
exponential function and the correlation was very high. Especially, the accuracy of the torqueresistance was higher than the penetration resistance and the pulling resistance. Although thecorrelation with the wet density was high with the core sampler method, it was found that thecorrelation was low and the measurement error was large in the dry matter density.
From the above, it was found that the frictional resistance measurement method has avery high correlation with dry matter density of silage, and the measurement accuracy is inorder of torque resistance＞penetration resistance, drawing resistance＞core sampler method.

© The Ito Foundation

粗飼料サイレージの発酵品質改善のためのサイレージ密度計測手法の開発

１．目

327

普及センターなどの営農指導組織は，サイレージ

的

調製時に粗飼料の充填程度を計測することで踏圧

牧草や飼料トウモロコシなど粗飼料は国内で自作業の過不足を検証し営農指導を行っている。し給可能な飼料であり，近年の飼料穀物相場の高騰

かし最近では，作業を効率化するためにサイロでにより，国策として飼料自給率の向上が掲げられの調製作業の中盤までは収穫作業速度を優先し，ている。これら粗飼料の大半はサイレージとして踏圧不足な状態で粗飼料をサイロに充填し，終盤給与されている。営農規模の拡大によりサイレーに踏圧作業を念入りに行うことで所定の踏圧指標

ジの品質低下の件数割合が10年前から倍増していを達成させる不適切な事例が多発し，再びサイることからも，サイレージの品質改善は急務の課

レージの発酵品質が低下し始めている。このた題である。湿潤な気候である日本では，十分な予め，サイロ開封後のサイレージ密度を計測するこ乾が行えないことでサイレージ調製が困難であるとで，踏圧状況を把握し，営農指導することが行ことが意外に知られていない。サイレージの発酵

われ始めている。

品質に影響する要因には，「原料草の品質」「適正

細切サイレージの密度計測法には，所定の部位

水分での収穫」「異物混入の抑制」「十分な踏圧」を掘削し，重量／容量を計量する手法４）や取り出「迅速な密封」「添加剤の適切な利用」などが挙げ

し機械による大まかな密度計測法５）がある。ロー

られるが，中でも粗飼料の踏圧不足による粗飼料

ルベールサイレージの密度計測法として，先端部の低密度が引き起こす発酵不良が挙げられる。粗をナイフ状に加工したシャフトをフォースゲージ

飼料サイレージは，収穫した粗飼料をサイロ内でに接続した器具で現物密度の高・低を定性的に表十分に踏圧し密度を高めることで，嫌気性細菌で現する手法も示されている６）が，直径５～10㎝のある乳酸菌の働きにより良質なサイレージとな

コアサンプラーによる部分掘削・重量／容量計量る。十分な乳酸発酵をさせたサイレージは，サイ手法７）が広く利用されている。コアサンプラー法

ロの開封以降もサイレージ品質が安定的に確保さには，手動方式と，電動ドリルによる電動方式がれる１）。しかし，近年では収穫作業機が大型化・あるが，双方とも取扱いが煩雑で計測に時間がか

高能率化し，コントラクターなどの外部支援組織

かることや，発電機等の備品が必要であることによる作業代行が進んだことで収穫作業能率は向（手動式は平成27年に販売終了）など利用上の制上したが，踏圧作業などの調製作業能率が停滞し約が多いため，一部の研究機関や営農指導組織がていることで，両者の作業能率にずれが生じてい限定的に利用するに留まっている。これら営農指る。このため，サイロ内では踏圧不足により粗飼導組織からは現行のコアサンプラー法に替わる新料が低密度化し乳酸菌以外の菌の増殖を助長し，機軸の密度計測手法の開発が要望されている。

発酵不良の原因となっている。踏圧の重要性が軽本研究で新たな密度計測法として検討する摩擦視されており，かつ具体的な基準が存在していな

抵抗計測法は，サイレージに対して検出器である

かった状況に対し，本研究の担当者はサイロ内のシャフトの貫入時，引抜時，シャフトのねじり時適正な踏圧程度の指標として，サイロ容積に対しの各種抵抗力からサイレージ密度を推定する手法て充填すべき粗飼料容量を指数化した踏圧指標であり，サイレージ密度との関連性を明らかにす「圧縮係数」を制定し２），サイレージの発酵品質ることで，簡易かつ精度の高い非破壊型サイレーの向上に大きく寄与した 。これを基に農業改良

ジ密度計測手法を検討する。

３）© The Ito Foundation

328

平成28年度２．方
2.1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

2 . 3 サイレージ密度（現物・乾物）およびコ法

アサンプラー法との比較検証

計測方法および計測機の選定

前項で決定した検出用シャフトを用いて，バン

粗飼料サイレージの乾物密度（または現物密

カーサイロから採取したチモシー主体・１番草サ度）を推定するための手法開発として，シャフト

イレージおよび飼料用とうもろこしサイレージ

を対象物に「貫入」「貫入状態でのねじり（以降，（CS）を，30～35℃の中低温で段階的に風乾処理

トルクとする）」「引抜」時の最大応力を計測する

し，異なる水分のサイレージサンプルを調製した

ため，貫入・引抜の抵抗計測には高荷重用デジタ（GS1の水分23.9％，45.3％，63.3％，70.4％，80.3％。

ルフォースゲージ（IMADA製ZPH-5000N）を使

CSの水分16.2％，44.8％，59.2％，66.1％，70.0％）。

用した。トルク抵抗計測にはトルクドライバー

内寸法102×103×400㎜，有効内容量4202mlの筐（東日製FTD200CN2-S）とシャフトを接続するた体に，重量を可変したサイレージサンプルを段階

めのドリルチャックを使用した。

的に充填し，筐体側面部に施した開口部からシャ

2.2

検出用シャフトの製作および選定試験＜検出用シャフトの製作＞

フトを貫入し，貫入・引抜・トルクの各抵抗値を各々３反復ずつ計測した。併せて，内寸法66㎜，

検出用シャフトは，貫入・引抜・トルク計測を

外寸法69㎜，有効深200㎜の電動式コアサンプ

兼用とし，高強度で軽量，かつ切削性に優れる

ラーを用いたコアサンプラー法による密度計測を

ジェラルミン製丸棒を採用した。シャフトの規格

３反復ずつ行った。筐体充填物の状態を現物密度選定のため，直径５㎜，8㎜，10㎜，12㎜，15㎜

および乾物密度の真値として，摩擦抵抗計測３手の丸棒を350㎜ごとに切断し，先端部の円錐角を法と３種のサイレージの現物密度および乾物密度

15°，30°
，60°
，90°
，120°
に調整加工したシャフとの相関性および検量線の精度，計測手法自体のト25種を製作した。円錐部末端を起点としてシャ計測精度の比較・検証を行った。併せて，コアサ

フト円柱部に対し50㎜ごとに目印用の切削加工をンプラー法についても同様の処理を行い計測精度施した。

の比較・検証を行った。

＜検出用シャフトの選定＞
チモシー主体・１番草サイレージ（GS1）が貯３．結果と考察

蔵されているバンカーサイロにおいて，乱されて3.1

いないサイレージ断面のうち，低密度（サイロ上

まず，高密度のサイレージ断面に検出用シャフ部）および高密度（サイロ中央下部）の２カ所にト候補25種類を貫入したところ，直径５㎜と８㎜

対して，検出用シャフト各種を先端円錐部の貫入では，貫入時に検出用シャフトが座屈もしくは曲抵抗計測から以降50㎜ごとに貫入抵抗およびトル

がる可能性が確認された。直径15㎜では先端角全ク抵抗を計測，シャフト円柱部を250㎜まで貫入域において貫入抵抗が500Ｎ以上に達した。直径

した後，引抜抵抗を段階的に計測した。各種計測

10㎜の先端角が60°以上，直径12㎜の先端角が90°値の範囲と抵抗値が描く線形形状，計測時の状況

以上においても同様に貫入抵抗が500Ｎ以上に達から，検出用シャフトの規格および貫入深を決定

し，貫入作業が困難であった。また，貫入時の抵した。

抗値は，先端角が鋭角上であれば直線上の形状を検出用シャフトの選定

示すが，鈍角上では対数関数上の線形形状を示す© The Ito Foundation

329

粗飼料サイレージの発酵品質改善のためのサイレージ密度計測手法の開発

ことから，先端部が貫入部分を乱している可能性

端円錐角15°，直径12㎜，有効貫入深250㎜＋先端が確認された。先端角30°以下では貫入時の反復部長が適当と判断した（Table１）。

計測による誤差が比較的小さく，先端角15°で最3 . 2 サイレージ密度（現物・乾物）および慣小となった。検出用シャフトの貫入長が深くなる

行法との比較検証

に連動して貫入抵抗，引抜抵抗，トルク抵抗とも

原料水分を可変させたチモシー主体・１番草サ

抵抗値が増加した。土質力学分野では，軟弱地盤

イレージおよび飼料用とうもろこしサイレージをへの貫入抵抗時の挙動研究において土壌の固さを所定の筐体に充填して，任意の密度条件のもと示すコーン指数が存在し，先端角に対し補正係数

で，摩擦抵抗３種の検量線を作成した。筐体中の８）を乗じることで対応できることが示されているが ，

サイレージ密度を真値と設定した場合，サイレー

粗飼料では土壌以上に貫入部分の乱れが生じるたジの現物密度と摩擦抵抗３手法には一定の傾向がめ，検出用シャフトの規格を決定した方が効率的見られたが，相関の高い近似式は存在しなかったと判断した。

（図表省略）。筐体中のGS1およびCSの乾物密度と以上の結果から，検出用シャフトの形状は，先摩擦抵抗３計測法との関係を精査したところ，３

Table 1 Shape selection test of detection shaft
maximum friction resistancevalue

shaft form
diameter tip angle
（mm）
（°
）

15

12

penetration
penetration pull
torquelengthpenetration（N）（N） （cN・ｍ）
（mm）

8

5

pull

by penetration

torquemeasurement
magnification

possibility
bend or liner form
buckling

15

732

443

333

26

31

6

6.0

Ｎ

30

622

386

288

64

17

10

3.5

Ｎ

straight

818

286

207

146

31

12

16.0

Ｎ

logarithm

60

250＋tip

straight

90

859

225

200

44

65

0

3.2

Ｎ

logistic

120

981

239

195

134

40

5

8.3

Ｎ

logarithm

15

494

346

192

21

6

8

8.2

Ｎ

straight

30

494

300

173

34

14

6

6.1

Ｎ

straight

628

243

138

102

14

6

6.5

Ｎ

straight

696

199

117

130

47

6

9.3

Ｎ

logarithm

60

250＋tip

90

10standard deviation

120

745

192

120

99

15

10

6.1

Ｎ

logarithm

15

415

278

117

27

33

3

8.4

Ｎ

straight

30

402

242

125

56

27

9

3.7

Ｎ

straight

469

239

112

53

4

8

3.4

Ｎ

logarithm

60

250＋tip

90

504

180

81

61

4

1

5.8

Ｎ

logarithm

120

518

156

100

39

31

4

4.8

Ｎ

logarithm

15

279

204

69

6

3

2

6.2

Ｙ

straight

30

201

149

55

12

7

1

5.6

Ｙ

straight

279

135

60

48

12

0

1.8

Ｙ

logarithm

60

250＋tip

90

355

118

41

97

27

1

7.1

Ｙ

straight

120

400

110

35

49

17

0

5.8

Ｙ

logarithm

15

151

121

25

10

9

1

4.8

Ｙ

straight

30

138

114

41

7

2

3

3.9

Ｙ

logistic

128

97

30

33

12

1

1.1

Ｙ

logistic

164

78

13

6

7

1

5.1

Ｙ

logarithm

120

152

66

20

21

16

2

3.4

Ｙ

logarithm

passing grade

＜500

－

－

＜50

＜50

＜50

＜8

Ｎ

straight

60

250＋tip90© The Ito Foundation

330

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Friction resistance value penetration & pulling（N），torque（cN･m）500△penetration
R² = 0.92

400

300

◇pulling
R² = 0.95●torque
R² = 0.97

200

100

0
50

100

150

Dry matter density for grass silage（kg/m³）

200

250

n=75

Fig. 1 Dry matter density of grass silage by three types of frictional resistance method.
500

Friction resistance value penetration & pulling（N），
torque（cN･m）△penetration
R² = 0.95

400◇pulling
R² = 0.93300●torque
R² = 0.96
200

100

0
100

150

200

Dry matter density for corn silage（kg/m³）

250
n=75

Fig. 2 Dry matter density of corn silage by three types of frictional resistance method.

© The Ito Foundation

300

331

粗飼料サイレージの発酵品質改善のためのサイレージ密度計測手法の開発
900▲wet density
for corn silage
R² = 0.96

800

Silage density for core sampler value（kg/m³）

700

600
●wet density
for grass silage
R² = 0.92

500

400△ dry matter density
for corn silage
R² = 0.83

300

200

100

〇dry matter density
for grass silage
R² = 0.76

0
0

100

200

300

400

500

Silage density in mold（kg/m）

600

700

800

900

n=75

Fig. 3 Density measurement by core sampler method for grass and corn silage.

種とも非常に高い相関が確認された（Fig.１，

乱されるため，引抜抵抗においてもその乱れによFig.２）。また，GS1とCSでは検量線の幅がずれる誤差が影響したものと考えられる。

ることも判明したが，各々単体での検量線は，非筐体中のサイレージの現物密度と摩擦抵抗法３

常に精度の高い二次曲線が得られた。コアサンプ

手法にはゆるやかな関係を見出すことはできる

ラー法による筐体中のサイレージ密度計測では，が，精度面からは実用性がない水準であった。反双方の現物密度との相関が非常に高いことが確認

面，乾物密度と摩擦抵抗法３手法には，非常に高されたが，乾物密度においては，相関が低く，特い相関と精度を見出すことができることから，サにgrassでは低く推移しており，材料の弾力性がイレージに対する摩擦抵抗計測法はサイレージの影響しているものと考えられた（Fig.３）。

繊維部分との関連が大きく，水分の影響は受けな

各計測法の計測誤差は，各地点に対する３反復

いと判断された。

計測から算出した変動係数において，トルク抵抗

以上の結果から，摩擦抵抗計測手法はサイレー法が最も精度が高いことが判明した（Fig.４）。

ジの乾物密度と非常に高い相関があり，その計測

貫入抵抗の変動係数が大きくなる理由として，先精度はトルク抵抗＞貫入抵抗・引抜抵抗＞コアサ端部の抵抗が影響しているものと考えられる。まンプラー法の順序となることが判明した。

た鋭角状の先端であっても貫入経路が少なからず© The Ito Foundation

332

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

50

Coeﬃcient of variation（%）

40

30

20

10

0

GS1
CS
penetration

GS1

pullingCS

GS1

torqueCS

GS1
CS
core sampler

Dry matter density measurement in each method

Fig. 4 Measurement error of dry matter density in each method

４．要

まず，直径５種類×先端角５種類で合計25種類

約のシャフトを製作し，シャフト規格を決定するた

粗飼料サイレージの発酵品質の改善のためにめの試験を行った結果，直径12㎜，先端角15°，は，サイロへ充填する粗飼料の密度を高めること

有効長250㎜＋先端長のシャフト形状を選定した。

が重要である。サイレージの充填程度を把握する

水分含量の異なる牧草と飼料トウモロコシのサイ方法として，開封後にサイレージ密度を計測する

レージ試料の摩擦抵抗を測定したところ，３手法方法がある。最も精度の高い密度計測法は，コアとも現物密度に対して緩やかな傾斜を有する線形

サンプラーを用いたサンプル採取と乾燥処理後の関数の近似式が得られたが相関はなかった。乾物

秤量によると言われている。しかし機材の用意と密度においては，３手法すべてが指数関数上の近煩雑な作業が必要となるため，頻繁に利用できな似式が得られ，相関も非常に高かった。特に，トいことが問題である。

ルク抵抗は貫入抵抗や引抜抵抗よりも反復時の計本研究では，コアサンプラー法に替わる新たな測精度も高かった。また，コアサンプラー法では

密度計測手法として，摩擦抵抗計測法を検討し現物密度との相関は高いが，乾物密度においてはた。摩擦抵抗計測法は，サイレージ断面に対して相関も低く計測誤差も大きいことが判明した。

３手法の摩擦抵抗を計測する。一つ目は，サイ以上のことから，摩擦抵抗計測手法はサイレー

レージにシャフトを突き刺した時の貫入抵抗，二ジの乾物密度と非常に高い相関があり，その計測

つ目はシャフトをねじることで生じるトルク抵

精度はトルク抵抗＞貫入抵抗・引抜抵抗＞コアサ

抗，三つ目はシャフトを引き抜く時に生じる引抜

ンプラー法の順序となることが判明した。

抵抗である。

© The Ito Foundation

粗飼料サイレージの発酵品質改善のためのサイレージ密度計測手法の開発
文献１）坂本登他：梱包サイレージの密度に関する研究，
三重県農業技術センター研究報告，８号，91～96，
1976.
２）大越安吾：大型バンカーサイロの踏圧法，北海道
農業試験成績会議資料，１～29，2005.
３）三浦康雄他：グラスサイレージ調製技術の実証的調査研究・普及とTMRセンター支援，北海道草地研
究会報43，５～８，2009.
４）Latsch, R. : Density determination of grass silageComparison of five measurement methods,
Landtechnik, 66, no.6，418～421，2011.

333５）高木正季：サイレージ容積量の実態とその推定法，
北海道草地研究会報30，ｐ110，1996.
６）名久井忠他：ドリル式コアサンプラーによるバン
カーサイロの簡易密度計測，農研機構新しい研究成果，40～43，1997.
７）服部育男他：ロールベールサイレージの流通促進のための迅速な水分測定手法，日本草地学会誌60（4），268～274，2015.
８）室町忠彦：静的コーンペネトロメーターの軟弱地盤調査への適用に関する実験的研究，鉄道技術研究
報告，No.757，1971.

© The Ito Foundation

334

籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の実規模での開発（Ⅱ）
Development of commercial based animal welfare friendly broiler
production system by unhusked rice feeding in Japan（Ⅱ）

有

賀

小百合・佐

藤

衆

介

（帝京科学大学生命環境学部）

Sayuri Ariga and Shusuke Sato
（Teikyo University of Science, Faculty of Life and Environmental Sciences）

This study aimed to investigate the effect of feeding corn-based diet containing 20％
unhusked rice（20％-UR）on behaviour and physical and psychological health of broiler
chicken. 45 male and 45 female chickens were fed 20％-UR. Their behaviour, fear response tonovel object, chronic stress, incidences of dermatitis and dirty body, and quality of litter intheir pens were compared with those of chickens fed corn-based diet containing 0％ unhusked
rice（CORN）．
The nitrogen content rates of litter in the pen of male and female chickens fed 20％-UR（％）were lower than that of chickens fed CORN（p ＜ 0.01; male: CORN; 2.91 ± 0.12 vs. 20％-UR: 2.50 ± 0.08; Female: 2.77 ± 0.10 vs. 2.46 ± 0.15）．Male chickens fed 20％-UR had lower
incidences of severe hock dermatitis and mid-level dirty body, compared with those of malechickens fed CORN（p ＜ 0.05）.The rate of number of chickens that rested at standing posture
was more in male chickens fed 20％-UR than in male chickens fed CORN（p ＜ 0.05）. Smaller
numbers of female chickens fed 20％-UR attempted to contact to novel object（p ＜ 0.05; CORN:
5.4 ± 4.3 vs. 20％-UR: 0.0 ± 0.0）and vocalized discomfort（p ＝ 0.08; 29.3 ± 4.4 vs. 20.7 ± 4.5），
compared with those of female chickens fed CORN. Female chickens fed 20 ％-UR tended tohave lower plasma corticosterone concentrates（ng/ml）than chickens fed CORN（p＝0.08;
CORN: 1.12 ± 0.70 vs. 20％-UR: 0.55 ± 0.18）．
In conclusion, it seems that feeding corn-based diet containing 20％ unhusked rice haveeffects to reduce incidences of hock dermatitis and dirty body, promote activity, and reducefear response to novel object and chronic stress in the broiler chicken.

１．目

際流通が加速する中，日本の畜産も国際規約との的整合性を保つ必要がある。日本の肉用鶏生産にお近年，家畜福祉（AW）の国際規約化が進んでける主な福祉問題は「接触性皮膚炎の重症化」

おり，2013年にはOIE（世界動物保健機構）がブ「正常行動（砂浴び行動等）の発現制限」「敷料のロイラーのAW世界基準を作成した。畜産物の国

質の悪さ」である１）。

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籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の実規模での開発（Ⅱ）

335

小原の報告１）では，肉用鶏に全飼料中重量比

料給与区（籾米区）の２区に45羽ずつ配分し，4230％の籾米配合飼料を給与した結果，コーン配合

ｄまで平飼いした（4.65㎡/45羽／区）。７～27ｄ

飼料給与鶏より，活動性（立位休息行動等）が向に は 前 期 飼 料（両 区 と も CP ： 20.70 ％，ME ：上，慰安行動（羽繕い）が増加，慢性ストレス指3100kcal/㎏），28～42ｄには後期飼料（両区とも

標（偽好酸球／リンパ球比）が低下，趾蹠接触性

CP：19.00％，ME：3150kcal/㎏）を給餌した。

皮膚炎の発症が軽減，モモ肉，ササミ，筋胃重量

敷料にはオガクズを用い，２週に１度撹拌した。

が増加した。肉用鶏への籾米配合飼料の給与は，

2.2

生産性調査

正常行動の発現や心理的および身体的健康性を改

７ｄ以降１週間おきに体重を計測し（ｎ＝45×

善し，生産性の向上にも効果があることから，有２×２），雌雄ごとに区間でｔ検定を行った。飼

効な福祉改善技術となり得る。

料摂食量（ｇ／羽）は，前期・後期飼料の合計飼

しかし，籾米配合飼料はその代謝エネルギーの料製造量から，前期・後期飼料の給与期間終了時

低さから，油脂をより多く添加する必要がある。

の合計飼料残量を引き，羽数／区で除し算出した多量の油脂添加は，飼料タンク内でのブリッジ現（ｎ＝１×２×２）。日増体重（ｇ／羽／day）は，象の原因となるため，籾米配合飼料の実用化に対７～42ｄの増体重（ｇ／羽）を経過日数で除し算しては生産現場を中心に懸念が生じている。籾米

出した（ｎ＝１×２×２）。飼料要求率は，７～

配合飼料の実用化には，籾米配合率の低率化が鍵42ｄの飼料摂食量を増体重（ｇ／羽）で除し算出となる。低率な籾米配合飼料が肉用鶏の生産性にした（ｎ＝１×２×２）。

与える影響に関してはいくつか報告があり，籾米

2.3

19.5％配合飼料では籾米０％飼料と比較して体重30ｄの1200ｈ～2100ｈにビデオカメラで各区をが重く，モモ肉中総アミノ酸含量と筋胃重量割合撮影した。撮影期間を２時間ごとの５期間（1200が多く，飼料要求率を改善するなど ，生産性を

ｈ～，1400ｈ～，1600ｈ～，1800ｈ～，2000ｈ～）

向上する効果がある。しかし，低率な籾米配合飼に分け，各期間の初めの30分間を５分間隔の瞬間

料が肉用鶏の福祉性に与える影響は不明である。

サンプリングにより観察し，維持行動（摂食，立そこで，本研究では，肉用鶏に籾米20％配合飼料

位休息，伏臥位休息，移動）の発現羽数割合（％）

を給与し，行動発現，心理的および身体的健康性を記録した。各期間の平均値（７データ／期間）に与える影響を解明することを目的とした。

を１データとし，統計分析に用いた（ｎ＝５×２

２）

２．方
2.1

行動発現調査×２）。５期間の初めの10分間で連続観察を行い，法

計50分間の慰安行動（砂浴び，羽繕い）および敷料つつき行動の発現回数を算出した（ｎ＝５×２

飼養方法

日本農産工業株式会社畜産技術センター（茨× ２）。維 持 行 動 は 雌 雄 ご と に 区 間 で Mann-

城）にて，2016年６月28日～８月10日に，チャン

Whitneyʼs U検定を，快適性行動はχ２検定を行っ

キー種肉用鶏，雌雄各120羽を飼養した。０～６た。

日齢（６ｄ）まで，雌雄別にペン（155×118㎝）

2.4で群飼し，幼雛用飼料と籾米を不断給餌した。７42ｄに敷料サンプル約100ｇを５ヵ所／区で採ｄに雌雄ともコーン60％・籾米０％配合飼料給与取した（ｎ＝５×２×２）。60℃で２日間敷料を区（コーン区）と，コーン40％・籾米20％配合飼

乾燥させ，敷料中水分含有率（％）を算出した。

© The Ito Foundation

敷料の質の調査

336

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

その後，燃焼法により，全窒素含有率（％；NR）

た。NO設置直後から２分間，10秒間隔の１-０サを算出した。各項目にて雌雄ごとに区間でｔ検定

ンプリングにより，NOから30㎝内にいる個体のを行った。

うち，NOへの接触を試みた羽数割合（％）を計

2.5

身体的健康性調査

測し，Mann-Whitneyʼs U検定を行った（ｎ＝３

アニマルウェルフェア技術研修会テキスト～ブロイラー～×２）。雄の映像に不具合があったため，雌のみを基に，40～42ｄに跛行，羽毛の汚調査した。また，映像内の音声を音声分析ソフト

れ，接触性皮膚炎の発生状況を目視で観察した。

ウェア（WaveSurfer，KTH，Sweden）により全個体にて，跛行は「歩行不可能」「明らかに異解析し，NO試験時２分間の発声回数とその音圧

常」「正 常」に ，羽 毛 の 汚 れ は「中 度」「軽 度」を観測した。聴覚で認識できた47dB以上52dB未「汚染なし」に，胸部皮膚炎は「炎症あり」「炎症

満の発声と，不快性や興奮性を示す52dB以上のなし」に分類し，各評価の羽数を算出した（ｎ＝高音圧な発声の回数および持続時間（秒）を計測

45×２×２）。膝節および趾蹠皮膚炎は，脚２本し，高音圧発声の回数割合（％）と持続時間割合／羽を「重度」「軽度」「炎症なし」に分類し，各（％）を算出し，区間でｔ検定を行った（ｎ＝３

評価区分の脚数を算出した（ｎ＝90×２×２）。

×２）。

３）

各項目にて雌雄ごとに区間でχ２検定を行った。

慢性ストレス指標である血漿中コルチコステロ

肝・腎機能や代謝機能評価のため，42ｄに雌雄ン（CORT）濃度分析のため，42ｄに雌雄各６羽

各６羽／区にてEDTA-２Ｋ採血管を用いて採血／区にてEDTA-２Ｋ採血管を用いて採血した。

した。1500ｇ，４℃，10分間の遠心分離後，血漿1500ｇ，４℃，10分間で遠心分離後，血漿を採取し，を 採 取 し ，TP ，BUN ，CRE ，UA ，Na ，iP ，

ジエチルエーテルにより抽出し，Corticosterone

AST，LDH，AMY，CK，γ-GT，T-CHO，TG，

ELISA Kit （K014-H1, Arbor Assays, USA） に

NEFA，TBA，GLUを測定した。各項目にて雌よりCORT濃度（pg/ml）を計測した。雌雄ごと

雄ごとに区間でｔ検定を行った。

に区間でｔ検定を行った（ｎ＝６×２×２）。

2.6

心理的健康性調査

ストレス条件下での反応性評価のため，３．結果と考察

Welfare Quality Ⓡ Assessment protocol for

3.1

poultryを基に，40ｄに新奇物への恐怖反応性

体重（ｇ）の結果，雄では42ｄ（コーン区：を調査した。鶏群内に新奇物（NO：黄，青，赤

3394 ± 269 vs. 籾 米 区 ： 3515 ± 305），雌 は 35 ｄのビニルテープを巻いた50㎝長の棒）を置き，設（2300 ± 151 vs. 2365 ± 134）と 42 ｄ（2833 ± 190

置直後から２分間，10秒間隔の瞬間サンプリング

vs. 2911±172）に籾米区でコーン区より有意ににより，NOから30㎝内にいる羽数を計測した。

重かった（ｐ＜0.05）。飼料摂食量（ｇ／羽；雄：３ヵ所／区で反復測定した。30㎝内の羽数の結果

コーン区：5146 vs. 籾米区：5152；雌：4380 vs.

から，平常時との個体密度比（30㎝内の個体密度4470），増体重（ｇ／羽；雄：3169 vs. 3290；雌：（㎏/㎡）／40ｄでの飼養密度（㎏/㎡））を算出し2625 vs. 2702），日増体（ｇ／羽／day；雄：91

た（ｎ＝３×２×２）。雌雄ごとに時間と区間をvs. 94；雌：75 vs. 77）は，雌雄ともに籾米区で要因とした二元配置分散分析を行った。また，多かった。飼料要求率は雌雄ともに籾米区で少な

NO試験時の鶏群の様子をビデオカメラで撮影しかった（雄：1.62 vs. 1.57；雌：1.67 vs. 1.65）。籾

４）© The Ito Foundation

生産性籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の実規模での開発（Ⅱ）

337

米20％配合飼料の給与により生産性が向上する可かった。これは雌雄間の体重と飼育密度の差，雄能性が示唆された。

の籾米区での活動性の向上が要因であると考えら

3.2

行動発現

れる。体重と膝の皮膚炎には正の相関があり５），維持行動発現羽数割合の結果，雄の籾米区では高飼育密度は低密度よりも膝や胸の皮膚炎が多コーン区より立位休息行動が有意に多く発現したい ６）。本試験では，42ｄでの雌雄間の体重差は（ｐ＜0.05）。他の項目では有意差はなかった。雌600ｇ，飼育密度差は６㎏/㎡に及んでいた。雌は雄ともに籾米区では羽繕い行動発現回数（雄：雄より体重が軽く，飼育密度が低く，コーン区，

コ ー ン 区 ： 316 vs. 籾 米 区 ： 342 ； 雌 ： 345 vs.

籾米区ともに行動が制限されていなかったため，

397）と敷料つつき行動回数（雄：231 vs. 261；

飼料の効果が表れなかった可能性がある。雄の籾

雌：248 vs. 280）が多かったが，有意ではなかっ

米区では活動性が増え，敷料との接触時間が短た。雄の籾米区では砂浴び行動回数がコーン区よ

かったことから，皮膚炎が軽減したと推察される。

りわずかに多かったが（コーン区：54 vs. 籾米

血液生化学分析の結果，雄の籾米区ではコーン区：72），有意ではなかった。籾米20％配合飼料

区より血漿中NEFA濃度（μEq/L）が高かったの給与は，羽繕いや砂浴び等の慰安行動，敷料つ（ｐ＜0.05；コーン区：156.2±28.5 vs. 籾米区：

つき行動の発現には大きな影響はないが，活動性

204.7±43.7）。有意ではなかったが，雌の籾米区を向上させる効果があった。

でもコーン区より高い値となった（ｐ＝0.15；

3.3

敷料の質

117.0±21.5 vs. 141.7±33.0）。他の項目に有意差

NR（％）は，雌雄ともに籾米区でコーン区よはなかった。血漿中NEFA濃度は脂質代謝の指標

り有意に低かった（ｐ＜0.01；雄：コーン区：とされ，高脂肪飼料の給与や飼料摂食量の増加に

2.91±0.12 vs. 籾米区：2.50±0.08；雌：2.77±0.10より増加するとされている７）。本試験の飼料中粗vs. 2.46±0.15）。敷料中の水分含有率は雌雄とも脂肪（％）は，コーン区（前期3.6；後期3.9）よに差がなかった。籾米20％配合飼料の給与は，敷り籾米区（5.9；6.3）で多かった。籾米区での血料の質を改善する効果があった。

漿中NEFA濃度の上昇は，飼料中脂肪分の増加が3.4

身体的健康性

一因と考えられる。

膝節の接触性皮膚炎の結果，雄の籾米区では

3.5

心理的健康性コーン区より「重度」羽数が少なく，「炎症なし」

NO試験の結果，雌の籾米区ではコーン区より

羽数が多かった（ｐ＜0.05；重度：コーン区：７NO周辺の個体密度比が有意に少なく（ｐ＜ 0.01），

羽 vs. 籾米区：１羽，炎症なし：43 vs. 56）。羽30㎝内滞在時のNOへの接触試み行動の発現羽数

毛の汚れの結果，雄の籾米区ではコーン区より割合（％）が有意に少なく（ｐ＜0.05；コーン「中度」羽数が少なく，「汚染なし」羽数が有意に

区：5.4±4.3 vs. 籾米区：0.0±0.0），試験期間中

多 か っ た（ｐ ＜ 0.05；中 度：６ vs. ３ ，汚 染 なの高音圧発声回数割合（％；29.3±4.4 vs. 20.7±

し：１ vs. ９）。他の項目に有意差はなかった。

4.5）と持続時間割合（％；62.6±12.5 vs. 44.8±

籾米20％配合飼料の給与は，肉用鶏の膝節接触性4.2）が少ない傾向があった（ｐ＝0.08）。血漿中

皮膚炎や羽毛の汚れの軽減に効果があると示唆し

CORT 濃 度（ng/ml）の 結 果 ，雌 の 籾 米 区 で はた。前項のとおり，雌の籾米区では雄同様に敷料

コーン区より低い傾向があり（ｐ＝0.08；コーンの質が改善したが，接触性皮膚炎への影響はな

区：1.12±0.70 vs. 籾米区：0.55±0.18），雄では© The Ito Foundation

338

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

個体差が大きく有意ではなかったが，籾米区で低ン区より立位休息行動が有意に多く発現したｐ＜

かった（1.24±1.57 vs. 0.62±0.43）。籾米は嗜好0.05）。新奇物への反応性では，雌の籾米区はコー性が高く１），選り分け行動などの欲求行動（正常ン区より新奇物への接触を試みる羽数割合が有意行動の一つ）の発現を促進する効果がある 。まに少なく（ｐ＜0.05），不快性を示す発声の回数

た，本研究でも，籾米配合飼料の給与は活動性を割合が少ない傾向があった（ｐ＝0.08）。慢性ス向上させ，わずかながら慰安行動の発現も促進しトレス指標である血漿中コルチコステロン濃度た。動物の嗜好性や正常行動発現への欲求を満た（ng/ml）の結果，雌の籾米区ではコーン区よりす飼育環境（エンリッチメント環境）では，慢性低い傾向があった（ｐ＝0.08）。籾米20％配合飼

ストレスを軽減し，新奇刺激に対する恐怖反応性

料は，膝節の接触性皮膚炎や羽毛の汚れを軽減を緩和させることが明らかとなっている 。籾米

し，活動性を高め，新奇物への恐怖反応性や慢性20％配合飼料の給与は，肉用鶏の新奇刺激に対す

ストレスを軽減する効果がある。

８）９）る恐怖反応性や慢性ストレスを軽減する効果があり，環境エンリッチメント技術として有効であると考えられた。
3.6

総括

全飼料重量比20％の籾米配合飼料は，膝節の接触性皮膚炎や羽毛の汚れの軽減，活動性の向上，新奇刺激に対する恐怖反応性や慢性ストレスの軽減などの効果があり，籾米30％配合飼料の報告１）と同様に，肉用鶏の福祉改善技術として有効であ
る。
４．要

約

本研究では，籾米20％配合飼料の給与が肉用鶏の行動発現，心理的および身体的健康性に与える影響を解明するため，肉用鶏，雌雄各45羽に籾米０％配合飼料（コーン区）と籾米20％配合飼料（籾米区）を給与した。敷料の質の悪さの指標である敷料中全窒素含有率は，雌雄ともに籾米区でコーン区より有意に低かった（ｐ＜0.01）。健康性評価では，雄の籾米区ではコーン区より「重度の膝節皮膚炎」「中度の羽毛汚れ」が少なかった文
献１）小原愛：日本のブロイラー生産における福祉的飼育法の提案，東北大学大学院農学研究科博士論文，
2015．http://hdl.handle.net／10097/61423．
２）龍田健，石川翔：飼料用全粒籾の給与割合がブロイラーの生産性に及ぼす影響，兵庫農技総セ研報（畜産）50：９～14，2014．
３）公益社団法人畜産技術協会：アニマルウェルフェ
ア専門家養成事業アニマルウェルフェア技術研修会
テキスト～ブロイラー，2015．
４）W e l f a r e Q u a l i t y Ⓡ. 2 0 0 9 . W e l f a r e Q u a l i t y Ⓡ
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Consortium, Lelystad, Netherlands.
５）Broom, D. M., Reefmann, N. : Chicken welfare as
indicated by lesions on carcases in supermarkets,
British Poultry Science, 46（4），407～414，2005．
６）Shepherd, E. M., Fairchild, B. D. : Footpad
dermatitis in poultry, Poultry Science, 89（10），2043～
2051，2010.
７）秋葉征夫：鶏における脂質代謝の制御，日本畜産学
会報，53
（7）
，449～461，1982.
８）有賀小百合，佐藤衆介：籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の開発，平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，34，338～342，
公益社団法人伊藤記念財団，東京，2016．
９）Reed, H. J., Wilkins, L. J., Austin, S. D., Gregory, N.
G. : The effect of environmental enrichment during
rearing on fear reactions and depopulation trauma
in adult caged hens, Applied Animal Behaviour
Science，36（1），39～46，1993．

（ｐ＜0.05）。行動調査の結果，雄の籾米区ではコー© The Ito Foundation

339

代謝性疾患と関連病態の発症におけるスカトール
および胆汁酸の役割
Role of skatole and bile acids in development of metabolic diseases

石

塚

敏・清

水

英

寿＊

（北海道大学大学院農学研究院，＊島根大学生物資源科学部）

Satoshi Ishizuka and Hidehisa Shimizu＊（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University,＊Faculty of Life and Environmental Science, Shimane University）

We previously found that an increase in the concentration of skatole originated from highprotein diet in the gastrointestinal tract induces bile acid secretion in rats. A high-fat dietconsumption during aging enhances secretion of a primary bile acid, cholic acid. A cholic acidsupplementation without disturbance of bile acid metabolism by intestinal bacteria isconsidered to mimic bile acid environment under high-fat diet during aging. Such condition
successfully induces some aspects of metabolic disorders in our previous observation.
Therefore, we investigated the role of skatole on the host health condition. Male SpragueDawley rats were fed a diet supplemented with or without skatole for four weeks. The dietaryintervention did not affect the food intake and body weight gain. However, the skatole diet
induced increased liver weight and enhanced glycogen accumulation. Also, the skatole dietraised proportion of deoxycholic acid in the feces. In contrast, there was a tendency to reduceω-muricholic acid in the feces of the rats fed the skatole diet. These results suggest that anincrease of skatole concentration in the digestive tract provokes some disease phenotypes in
the host via promotion of 12α-hydroxylated bile acid proportion.

１．目なる。近年，スカトールが核内受容体farnesoid

的X receptor（FXR）の活性を抑制するのみならず

糞便臭や豚肉の臭みの原因となる３-メチルイ

逆向きに亢進するインバースアゴニストであるこンドールはスカトールとも呼ばれ，タンパク質にとが報告された２）。FXRは体内での胆汁酸生合成

含まれるトリプトファンに由来し，高タンパク質を負に制御し，胆汁酸が過剰となった場合のネガ

食摂取では消化管内でのスカトールの産生量が増

ティブフィードバック機構に寄与している。我々

加することが知られている。また，男性ホルモン

はこれまでに，飼料中へのスカトール添加が胆汁の一つであるアンドロステロンが肝臓におけるス酸分泌増加を引き起こすことを見出した３）。胆汁

カトール代謝を抑制するため１），スカトールが蓄酸は，肝臓においてコレステロールから合成され積することが結果として豚肉の臭みを増す原因とて脂質吸収に寄与し，その消化管内への分泌は高© The Ito Foundation

340

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

脂肪食の摂取により増大する４）。

胆汁酸であるCAを食餌に添加することで，この胆汁酸はステロイド骨格に水酸基やカルボキシ時の胆汁酸環境のみを模倣する系ができると推察

基等の親水性の官能基が付与された構造であり，した。飼料中のCAの添加濃度を変えて消化管内

胆汁酸が界面活性剤として作用することが食品成

容物や糞便中の胆汁酸濃度を測定し，腸内細菌叢

分からの脂質吸収に一役買っている。また，加齢による胆汁酸代謝を阻害しない添加量を確定し，により一次胆汁酸組成はコール酸（CA）に偏る

その条件で長期間飼育することで宿主の状態を評ことが報告されている５）。腸内細菌により胆汁酸価したところ，CA摂取で腸内細菌叢の多様性減自体が代謝，すなわち脱抱合化や脱水酸化等を受少が観察される以外にも，脂肪肝や消化管粘膜のけることが知られている。CAは腸内細菌によりバリア機能の脆弱化などの異常が観察された（投７α脱水酸化を受け二次胆汁酸であるデオキシ

稿中）。このことは高脂肪食で生じる程度の消化

コール酸（DCA）に変換され，肝臓や大腸にお管への胆汁酸分泌増加が結果として一種の未病状

けるガンの発症を促進することが知られている態を作り出すことを示している。そこで本研究で６）。加齢に伴う高脂肪食摂取により分泌が増加しは，消化管内でのスカトール濃度の増加が，胆汁た場合でも，脱抱合化や７α脱水酸化は問題なく酸負荷で観察される未病状態を誘導し得るか否か進行する。また，消化管内での胆汁酸濃度は最大を検証した。

で数十mMにも昇るため腸内細菌への影響も考えられる。実際，加齢や高脂肪食で生じる胆汁酸代
謝を模倣するために胆汁酸を添加した飼料をラッ

２．方法

2 . 1 ラットを用いたスカトール添加食摂取実

トに摂取させると，腸内細菌叢が劇的に影響を受験

け高脂肪食摂取時の菌叢と極めて類似した状態にSprague-Dawley 系 ラ ッ ト（５ 週 齢 雄 性）になることを見出した 。これは肥満における腸内AIN-93Ｇに準拠した基本飼料を与え５日間の予細菌叢撹乱の一部が胆汁酸によることを示唆する

備飼育後，基本飼料または0.025％スカトールを結果と考えられる。このように胆汁酸と腸内細菌含む飼料（Table１）を摂取させた群（各ｎ＝11）

叢は互いに影響を受けつつ，それぞれが宿主に対として４週間の試験期間を設定した。試料を自由して少なからず影響を及ぼすと推察される。

摂取として，試験期間終了時に一晩採糞を行っ

７）

胆汁酸は多様な分子種からなり，動物種によりた。解剖時に麻酔下で採血した後，放血致死させ

代謝が異なる。したがって，胆汁酸代謝の全貌をた。各種臓器を採取して重量測定をした。血漿を正確に把握するためには体内に存在する胆汁酸分

分離してトリグリセリドおよびコレステロールを子種を精密に測定し，それぞれの分子種の挙動を測定した。また，肝臓サンプルについて，クロロ

評価することが必要となる。我々は，臓器や血液，

ホルム：メタノール（２：１）で抽出して溶媒を糞便等の生体試料からの胆汁酸を測定するための除去した後にトリグリセリドおよびコレステロー

抽出法を最適化し，約30種類の胆汁酸分子種をルを測定した。また，フェノール硫酸法を用いてLC/MSを用いて一斉分析する方法を確立した 。

肝臓グリコーゲンを測定した。

８）

この方法を用いれば，生体内の胆汁酸代謝の網羅

2.2

的解析が可能である。

採取した糞便を凍結乾燥粉末とした後に加齢に伴う高脂肪食摂取で分泌が増加する一次

糞便中胆汁酸の分析

nordeoxycholic acid（23-nor-5β-cholanic acid-3© The Ito Foundation

代謝性疾患と関連病態の発症におけるスカトールおよび胆汁酸の役割

341

Table 1 Diet composition
Control diet

Skatole dietg/kg dietCorn starch

397.5

397.5

Casein１

200.0
132.0
100.0

200.0
132.0
99.75

70.0

70.0

50.0
35.0

50.0
35.0

Dextrin２
Sucrose３
Soybean oil４
Cellulose５
Mineral Mixture６
Vitamin mixture７

１

10.0

10.0

Choline bitartrate

2.5

2.5

L-Cystine
Skatole

3.0
―

3.0
0.25

NZMP Acid Casein（Fonterra Co-Operative Group Limited, Auckland,
New Zealand）

２

TK-16（Matsutani Chemical Industry Co., Ltd., Hyogo, Japan）

３

Nippon Beet Sugar Manufacturing Co.,Ltd., Tokyo, Japan

４

J-Oil Mills, Inc., Tokyo, Japan５

C rystalline cellulose（Ceolus PH-102，Asahi Kasei Chemicals Corp.,
Tokyo, Japan）

６

AIN-93G Mineral Mix（MP Biomedicals, USA）

７

AIN-93VX Vitamin Mix（CLEA Japan, Inc., Tokyo, Japan）

α，12α-diol）を内部標準として添加し，エタacid（5β-cholanic acid-3α-ol-12-one, 12oLCA）

ノール抽出したものをさらに固相抽出した。各胆and 3-oxo-12α-5β-cholanic acid（5β-cholanic

汁酸組成の分析にはAquity UPLC BEH column

acid-12α-ol-3-one, 3o12α）であったため，こ（100 x 2.0mm i.d., 1.7μm thickness, Waters）およ

れらをモル百分率として示した。

び

LC/MS （Acquity UPLC System, Quattro

2.3

統計解析

Premier XE, Waters）を用い，30種の胆汁酸分

数値は平均値および標準誤差として示した。有子種を分析した 。検出定量された分子種はCA

意水準を５％としてStudentʼs t-test（JMP ver.

（5 β -cholanic acid-3 α ，7 α ，12 α -triol），α12.2.0，SAS institute）を用いて群間比較を実施-muricholic acid（5β-cholanic acid-3α，6β，

した。

８）

7 α -triol ，α MCA）
，β -muricholic acid（5 β-cholanic acid-3α，6β，7β-triol，βMCA），

３．結果と考察ω-muricholic acid（5β-cholanic acid-3α，6α，

スカトール添加食の摂取実験では，摂食量およ

7 β -triol ，ω MCA）
, ursodeoxycholic acid（5 βび体重に群間差は見られなかった（Table２）。興-cholanic acid-3α，7β-diol, UDCA）, DCA（5

味深いことに，スカトール摂取により肝臓重量に

β -cholanic acid-3α，12α-diol）, lithocholic acid増加が見られた一方，腎臓と精巣上体脂肪の重量（5β-cholanic acid-3α-ol, LCA）, ursocholic acidに群間差は見られなかった（Table３）。別途実施（5β-cholanic acid-3α，7β，12α-triol, UCA），

したCA負荷実験では，トリグリセリドとコレス

7-oxo-deoxycholic acid（5β-cholanic acid-3α，テロール蓄積を伴う脂肪肝が観察されたことか

12α-diol-7-one, 7oDCA），12-oxo-lithocholic

ら，本研究でもこれらの測定を行うとともに，肝© The Ito Foundation

342

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 2 Growth parameters of the rats fed control diet or the skatole-supplemented diet for

four weeks
Initial body weight（g）

Total food intake（g）

Final body weight（g）

Control diet161.2±2.0361.5±5.3

577.3±6.5

Skatole diet162.7±1.6368.4±5.5565.2±9.9

Values are shown as mean±SEM（n＝11）.
Table 3 Organ weights of the rats fed control diet or the skatole-supplemented diet for fourweeks
Liver（g/100 g BW）

Kidney（g/100 g BW）

Control diet

4.11±0.09

0.65±0.01

Epididymal fat（g/100 g BW）
1.71±0.09

Skatole diet

4.71±0.14＊

0.64±0.02

1.83±0.13

Values are shown as mean±SEM（n＝11）．
＊Significant difference versus the values in control diet（Studentʼs t-test, P＜0.05）.

Table 4 Accumulation of triglycerides, cholesterol, and glycogen in the liver of the rats fed

control diet or the skatole-supplemented diet for four weeks

Control diet
Skatole diet

Triglycerides（mg/liver）

Cholesterol（mg/liver）

Glycogen（mg/liver）

330.0±34.3
293.0±41.3

39.9±1.6
56.1±9.5

829.5±73.8
1079.0±70.4＊

Values are shown as mean±SEM（n＝11）．
＊Significant difference versus the values in control diet（Studentʼs t-test, P＜0.05）.

40

Mole percentage

35
30

＊

25
20
15
10
5
0

＊

CA

αMCA

βMCA

ωMCA UDCA

DCA

LCA

UCA

7oDCA 12oLCA 3o12α

Fig. 1 Composition of fecal bile acids in the rats fed control diet and the skatole-supplemented diet.

Open and closed bars represent the values in the rats fed control diet and the skatolesupplemented diet, respectively. The values are means±SEM （n＝11）．Asterisks show
significant difference from control（Studentʼs t-test, P＜0.05）．

臓に蓄積し得るエネルギー源としてグリコーゲン

トリグリセリドとコレステロールについても差はを測定した。その結果，トリグリセリドおよびコ

見られなかった。これらのことから，スカトール

レステロールには差が見られなかったにもかかわは肝臓へのグリコーゲンの蓄積を増加させた結らず，グリコーゲンについてはスカトール摂取群

果，肝臓重量の増加を引き起こしたことが推察さで有意な増加が観察された（Table４）
。血漿中の

れた。

© The Ito Foundation

代謝性疾患と関連病態の発症におけるスカトールおよび胆汁酸の役割

343

糞中の胆汁酸組成を見ると，スカトール添加食を健全に保つことは衛生上の問題だけとして重要

群 で は DCA と UDCA の 比 率 が 有 意 に 増 加 し た

なだけではなく，それを食する側の健康維持のリ（Fig.１）。中でもDCAの増加は著明であり，スカ

スクにもなり得ることを改めて示す結果と考えら

トール摂取によりCAの分泌増加により，結果とれる。

して大腸内でのDCA生成比率が増加したと推察された。ラットにおける一次胆汁酸としてはCA

４．要

約以外にケノデオキシコール酸から合成される複数

食餌タンパク質の過剰摂取により消化管内で生のミュリコール酸（MCA）分子種が知られてい成するスカトールが，胆汁酸の分泌増加を引き起る。スカトールの摂取ではこれらのミュリコール

こすことをこれまでに見出した。加齢に伴う高脂酸分子種の濃度に有意な群間差は観察されなかっ肪食摂取で分泌が増加する胆汁酸はコール酸であたが，ωMCA比率が低下する傾向にあった。以る。したがって，腸内細菌による胆汁酸代謝を撹前の研究でスカトール摂取ラットの肝臓における乱しない程度のコール酸胆汁酸の摂取は，加齢・胆汁酸生合成関連因子の発現解析を行ったとこ

高脂肪食摂取での生体内での胆汁酸環境のみを模

ろ，胆汁酸合成の律速酵素であるCyp7a1の発現倣した状態と考えることができる。この条件が肝が0.025％スカトール摂取で有意に増加したもの

脂質蓄積増加等の代謝疾患に至る未病状態を誘導の，CA等12αに水酸基を持つ胆汁酸の合成に関することから，スカトールの負荷が宿主の状態にわるCyp8b1発現に有意差は見られなかった 。

及ぼす作用を検証した。Sprague-Dawley系雄性

したがって，スカトール摂取による糞中DCA比ラットを，対照群とスカトール摂取群に分け，４率の増加に，必ずしもCyp8b1の発現制御は関与週間の試験飼育後に解剖を行った。結果として，しないと考えられる。血漿中の12α水酸化胆汁酸

スカトール摂取は肝臓重量の増加を引き起こすとレベルはヒトでのインスリン耐性と相関があるこ

ともに，肝臓グリコーゲン蓄積の有意な増加を引とが報告されている 。もとよりDCAは12α水酸

き起こした。糞中胆汁酸の組成をLC/MSで解析

化胆汁酸であることを考慮すると，ガンや各種代したところ，スカトール摂取はデオキシコール酸

謝疾患等の予防を目指すうえで，この12α水酸化比率が著しく増加した一方で，ωミュリコール酸

胆汁酸の生成を減らすという取り組みが重要であ比率が低下する傾向を示した。結果として，消化ると考えられる。

管内におけるスカトール濃度の増加は12α胆汁酸

３）９）スカトールの生成は食事タンパク質中のトリプ
トファンに由来することから，食肉をヒトが摂取比率の増加を引き起こすことで未病状態の形成に関与する可能性が示された。

した結果，体内でのスカトール生成が増加する可能性が考えられる。また，食肉供給のための家畜の管理環境次第では，不必要なスカトールをあらかじめ家畜の体内で増やしてしまうリスクも考えられる。このような食肉を摂取した状況を模倣したスカトールの負荷が，結果としてCAやDCAに代表される12α胆汁酸の体内での増加に関わる可能性が重ねて示された。このことは，家畜の健康文献１）Gray, M. A., Squires, E. J. : Effects of nuclear
receptor transactivation on boar taint metabolism
and gene expression in porcine hepatocytes, J
Steroid Biochem Mol Biol，133，110～119，2013．
２）Gray, M. A., Pollock, C. B., Schook, L. B., Squires, E.
J. : Characterization of porcine pregnane X receptor,
farnesoid X receptor and their splice variants, Exp
Biol Med（Maywood），235，718～736，2010．
３）石塚敏，清水英寿：スカトールによる胆汁酸代謝© The Ito Foundation

344

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）の撹乱：ヒト・家畜の健康維持を目指したその制御，公益財団法人伊藤記念財団平成26年度食肉に関する
女性研究調査成果報告書vol.33，139～142，2015．
４）Reddy, B. S., Hanson, D., Mangat, S., Mathews, L.,
Sbaschnig, M., Sharma, C., Simi, B. : Effect of highfat, high-beef diet and of mode of cooking of beef inthe diet on fecal bacterial enzymes and fecal bile
acids and neutral sterols, J Nutr，110，1880～1887，
1980．
５）Uchida, K., Chikai, T., Takase, H., Nomura, Y., Seo,
S., Nakao, H., Takeuchi, N. : Age-related changes ofbile acid metabolism in rats, Arch Gerontol Geriatr，
10，37～48，1990．
６）Yoshimoto, S., Loo, T. M., Atarashi, K., Kanda, H.,
Sato, S., Oyadomari, S., Iwakura, Y.,Oshima, K.,
Morita, H., Hattori, M., Honda, K., Ishikawa, Y., Hara,

E., Ohtani, N. : Nature，499，97～101，2013．
７）Islam, K. B., Fukiya, S., Hagio, M., Fujii, N.,
Ishizuka, S., Ooka, T., Ogura, Y., Hayashi, T., Yokota,
A. : Bile acid is a host factor that regulates thecomposition of the cecal microbiota in rats,
Gastroenterology，141，1773～1781，2011．
８）Hagio, M., Matsumoto, M., Fukushima, M., Hara, H.,
Ishizuka, S. : Improved analysis ofbile acids in tissues
and intestinal contents of rats using LC/ESI-MS, J
Lipid Res，50，173～180，2009．
９）Haeusler, R. A., Astiarraga, B., Camastra, S., Accili,D., Ferrannini, E. : Human insulin resistance isassociated with increased plasma levels of 12α-hydroxylated bile acids, Diabetes，62，4184～4191，
2013．

© The Ito Foundation

345

Lactococcus属乳酸菌で調製した発酵乳給与による離乳子豚の免疫機能の改善と生産性の向上
Feeding milk fermented with a Lactococcus strain to weaning piglets
ameliorates growth performance, but not immune function

守谷

直子・兼松

伸枝・田島

清・成田

卓美・木元

広実

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構畜産研究部門）

Naoko Moriya, Nobue Kanematsu, Kiyoshi Tajima, Takumi Narita and Hiromi Kimoto-Nira（Institute of Livestock and Grassland Science, NARO）

Fermented milk by lactic acid bacteria is expected to have a beneficial effect on not only
growth performance but also immune response for weaning piglets. In this study, the effects offermented milk feeding for 4 weeks on the performance from weaning period to growing
period and on the immune function during weaning period were examined. For the preparationof fermented milk, Lactococcus lactis subsp. cremoris strain J50 was selected from lactic acidbacteria collection of our institute. This strain indicated some probiotic properties, such as
tolerance to low pH and bile. Additionally, strain J50 was able to survive in fermented milk at
4℃ for 1 week. During weaning period, although dry matter intake of fermented milk fed
group（n＝6）was significantly increased than that of milk fed group（n＝6），there is no
significant difference in average daily gain of both groups. Consequently, feed efficiency offermented milk fed group was significantly lower than that of milk fed group. The piglets offermented milk fed group were assumed to take 9 ～13 log10 cfu of live microorganism everyday. White blood cell differentiation and lymphocyte subset of piglets in both groups weresimilar. IgA and IgG levels in the fecal samples were not different between milk and fermented
milk fed piglets. During growing period, dry matter intake and average daily gain of fermented
milk fed group was significantly increased than those of milk fed group. It was suggested thatfermented milk feeding to weaning piglets stimulated the feed intake during growing period aswell as weaning period. The fermented milk may therefore improve the growth performance
during growing period.

１．目

取った移行免疫の抗体値が低下することも知られ的ており，感染性疾病の増加も問題となっている。

離乳直後の移行期の子豚は，母豚からの分離やこの時期の発育停滞は生産性を低下させる一因で母乳から粉末飼料への摂取飼料の切り替わりなどあるが，離乳時期の子豚の飼養管理として液状飼の生育環境の急激な変化により，しばしば一時的料を給与することは増体の改善に効果があること

な発育停滞が観察される。また母乳を通して受けが知られている１）。大塚らは，離乳期の子豚を用© The Ito Foundation

346

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

いた試験を行ったところ，粉状の人工乳を給与すた牛乳に１％（wt/wt）添加し，30℃で一晩発酵る場合と比較して，人工乳と発酵乳を混合した液させることで調製した。牛乳および発酵乳は４℃状飼料の給与が飼養成績の改善に有益であったとで保管し，１週間ごとに必要量を調製した。

報告している 。離乳子豚への液状飼料の給与は

2.2

乾物摂取量を増大させることから，その結果とし試験には母豚２頭の産子であるLWD三元交雑て，腸管絨毛が伸長するなど消化管が健全な状態

種の雌の離乳子豚12頭を用いた。供試子豚は３週に保たれ，子豚の成長につながると考えられてい齢で離乳し，28℃に温度制御された動物飼育室のる 。さらに，発酵乳には乳酸菌が多く含まれる

単飼用ケージに収容して４週間の飼養試験を行っことから，乳酸菌が子豚の消化管内でプロバイオ

た。単飼用ケージの上部には子豚の保温のためにティクスとして働くことによる腸内環境の改善や赤外線ランプを設置した。試験区は牛乳給与区

免疫賦活などの効果が期待される。

（牛乳区）と発酵乳給与区（発酵乳区）の２区と２）

３）

発酵乳給与試験

Lactococcus lactisは牛乳中でよく生育することし，供試子豚を腹，体重が等しくなるように６頭から，昔から乳業用乳酸菌として広く利用されてずつ割り当てた。給与する基礎飼料には抗菌性飼きた。Lactococcus属乳酸菌が，培養細胞系にお料添加物および生菌剤を含まない市販の人工乳後

いて免疫賦活効果を有することが木元ら５，６）によ

期用（SDS No.２，フィード・ワン株式会社）をり報告されているが，豚の免疫機能に及ぼす影響用いた。牛乳区の子豚には，基礎飼料と牛乳を現について調べた報告はない。そこで本試験では，物比で１：２の割合で混合した飼料を，発酵乳区

離乳直後の子豚にLactococcus属乳酸菌を用いての子豚には，基礎飼料と発酵乳を現物比で１：２調製した発酵乳を給与する試験を行い，離乳期のの割合で混合した飼料を，それぞれ９：00と15：

子豚の成長と免疫機能に及ぼす効果について検討

00に飽食となるように給与した。
2.3

した。
２．方

育成試験

発酵乳給与試験終了後の７週齢の雌子豚12頭

法（牛乳区６頭，発酵乳区６頭）を，引き続き育成

2 . 1 Lactococcus属乳酸菌株の選抜および発酵試験に供試した。コンクリート平床式の豚房に１頭ずつ収容して，上部には子豚の保温のために赤乳の調製
畜産研究部門の乳酸菌ライブラリーに分離，保

外線ランプを設置した。牛乳区，発酵乳区ともに存されているLactococcus属乳酸菌４）より，乳発

市販の配合飼料を用いた。発酵乳給与試験終了

酵能を示す９株を選抜した。低pH耐性および胆後，各試験区の平均体重が30㎏となるまでパー

汁酸耐性試験を実施し，消化管内で生残性が高

ティクル後期（豊橋飼料株式会社）を飽食となる

く ，プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス 効 果 が 期 待 さ れ る

ように給与した。

Lactococcus lactis subsp. cremoris J50株を，本試

2.4

験で発酵乳調製に用いる乳酸菌株として選定し飼料摂取量は，発酵乳給与試験中は毎日，育成

た。牛乳は畜産研究部門で搾乳された生乳を80℃

試験中は毎週測定した。体重は両試験期間を通じで30分間殺菌することで調製した。発酵乳は，あて毎週測定した。発酵乳給与試験前（３週齢）とらかじめ８％スキムミルクに接種して30℃で24時

試験終了後（７週齢）に頸静脈より採血するとと間培養しておいたＪ50株を，殺菌後30℃に冷却しもに新鮮糞を採取した。血液については生化学性© The Ito Foundation

測定項目

Lactococcus属乳酸菌で調製した発酵乳給与による離乳子豚の免疫機能の改善と生産性の向上

347

状と血液像（江東微生物研究所）を測定した。ま発酵乳の給与によって飼料効率が低下したことをた 単 核 球 を 分 離 し た 後 ，CD3 ，CD4 ，CD8 ，

報告している７）。本試験の結果は，この大塚らのCD21，CD335に対する蛍光標識抗体を用いて細結果と一致している。発酵飼料の給与により，飼胞表面の抗原マーカーを染色し，フローサイト

料効率が低下することはよく知られている。このメーター（Gallios，ベックマンコールター株式会

原因としては，発酵過程において乾物やエネル社）を用いてリンパ球サブセット割合を測定しギーの損失が起きている可能性や微生物が産生すた。糞便については，免疫グロブリン（IgAおよる有機酸の基質となる糖の損失が影響を及ぼしてび IgG） 濃 度 に つ い て ELISA キ ッ ト （Bethylいる可能性などが指摘されている１）。本試験ではLaboratories）を用いて測定した。

Lactococcus属乳酸菌を用いて牛乳の発酵調製を

2.5

統計解析

行ったが，発酵過程においてこれらの損失が起統計解析には，SAS（バージョン9.4）プログ

こっていたかどうかは不明である。しかし，血中ラムのGLMプロシージャを用いた。結果は平均の総タンパク質，アルブミン含量やA/G比に両試値±標準誤差で表した。

験区で差が認められず，栄養状態に問題はなかったと考えられることから，発酵乳給与区において

３．結果と考察

飼料効率が低下した原因については今後，さらに発酵乳給与試験期間中の飼養成績をTable１に

詳細な検討が必要である。

示した。乾物摂取量（DMI）は，牛乳区に対し本試験で給与した発酵乳は，MRS培地中で低て発酵乳区で有意に（ｐ＜0.01）増加した。平均

pH，胆汁酸に耐性を示し，低温保管後の生菌数

日増体重量（ADG）は牛乳区と発酵乳区で差がが高かったLactococcus lactis subsp. cremoris J50

認められず，その結果を受けて，飼料効率は発酵株を用いて調製した。発酵乳のpHは4.2まで低下

乳区において有意に（ｐ＜0.01）低下した。また，し，発酵乳中のＪ50株の菌数は調製直後において血液生化学性状をTable２およびTable３に示した。

10.6±0.5log10cfu/g，１週間貯蔵後において8.7±

３週齢から７週齢へ成長するに伴って，血漿中の0.4log10cfu/gであった。これを給与した発酵乳区

カルシウムおよびリン濃度がそれぞれ有意に（ｐの子豚における乳酸菌摂取量は，成長による摂食＜0.01）変動したが，発酵乳の給与による影響は量の増加に伴って増加し，９～13log10cfu/dayで認められなかった。また，血漿中の総タンパク質，あった。ヒトでは発酵乳の摂取によって血中コレ

アルブミン含量，アルブミン／グロブリン（A/ステロール濃度が低下する保健効果が報告されてG）比についても，両試験区に有意な差は認めらいる。本試験では，血中脂質性状に発酵乳の給与れず，発酵乳給与の影響はなかった。血中の中性による有意な差は認められなかった。発酵飼料中

脂肪，総コレステロール，HDL-コレステロールに含まれる乳酸菌の摂取は，消化管内において大およびLDL-コレステロール濃度は，いずれも３腸菌群の競合阻害に有効で，宿主の消化管環境を

週齢から７週齢へ成長するに伴って有意に（p＜健全に保つ効果があると考えられている。

0.05，p＜0.01，p＜0.01，p＜0.01）低下したが，

Mizumachiらは，乳酸菌の摂取が離乳子豚の免

発酵乳給与による影響は認められなかった。大塚

疫機能の賦活に効果を示したと報告している８）。

らは，脱脂粉乳または脱脂発酵乳を人工乳に混合

そこで，発酵乳の給与が全身免疫に及ぼす影響をして離乳子豚へ給与する試験を行った結果，脱脂明らかにするために，末梢血中の白血球像と単核© The Ito Foundation

348

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 1 Growth performance of piglets during milk and fermented milk feeding experimentmilkfermented milk

P-value

Average daily gain（g/day）

432±17450±13ns

Dry matter intake（g/day）

666±25798±17ｐ＜0.01

Feed efficiency（weight gain/feed intake）

0.65±0.02

0.56±0.02

ｐ＜0.01

Values are means based on 6 piglets±SEM. Piglets were fed basal diet with milk or fermented milk for
4 weeks.

Table 2 Plasma biochemical parameters of experimental piglets
Total protein（g/dL）

Albumin（g/dL）

Albumin/globulin

Calcium（mg/dL）

Phosphorus（mg/dL）

3weeks old
7weeks old

5.4±0.2
5.3±0.1

3.6±0.2
3.6±0.1

2.0±0.2
2.2±0.1

10.8±0.2
10.2±0.1＊＊

11.2±0.2＊＊

fermented milk
3weeks old
7weeks old

5.5±0.1
5.5±0.1

3.8±0.1
3.8±0.1

2.3±0.1
2.3±0.1

10.9±0.1
10.3±0.1＊＊

10.5±0.4＊＊

milk
9.6±0.1

9.7±0.2

Values are means based on 6 piglets±SEM. milk, milk fed group from weaning at 3 weeks old for four weeks;fermented milk, fermented milk fed group during weaning period. The statistical comparisons were made in＊＊；ｐ＜0.01
same colum within each group．

Table 3 Plasma lipid profiles of experimental piglets
Triglycerides（mg/dL）

Total cholesterol（mg/dL）

HDL cholesterol（mg/dL）

LDL cholesterol（mg/dL）

3weeks old
7weeks old

58±9
33±5＊

174±17

80±3

92±14

99±3＊＊

46±1＊＊

49±2＊＊

fermented milk
3weeks old
7weeks old

53±8
35±5＊

148±1192±7＊＊

74±3
43±2＊＊

71±9
44±5＊＊

milk

Values are means based on 6 piglets±SEM. milk, milk fed group from weaning at 3 weeks old for four weeks;fermented milk, fermented milk fed group during weaning period. The statistical comparisons were made in＊；ｐ＜0.05，＊＊；ｐ＜0.01
same colum within each group．

球中のリンパ球サブセット比率を測定した。白血の状態であることが明らかとなった。末梢血単核球像を測定した結果をTable４に示した。発酵乳

球中のリンパ球サブセット比率を測定した結果をの給与による影響や試験期間中の成長に伴う有意Table５に示した。Ｔ細胞を示すCD３抗体陽性細な変化は認められなかった。出生直後の子豚の白胞の割合が３週齢から７週齢へ成長するに伴っ血球像は好中球優位であるが，生後８日目と生後て，両試験区において有意に（ｐ＜0.05）増加し15日目にはリンパ球優位に変化することが報告さた。発酵乳の給与は，Ｔ細胞，Ｂ細胞（CD21抗

れている 。本試験においても３週齢および７週

体陽性細胞），NK細胞（CD335抗体陽性細胞），

齢の子豚の白血球像ではリンパ球が70％程度を占

すべてのサブセットの比率に影響しなかった。次

めており，離乳後の時期においてもリンパ球優位に腸管免疫に及ぼす影響を明らかにするために，

９）© The Ito Foundation

Lactococcus属乳酸菌で調製した発酵乳給与による離乳子豚の免疫機能の改善と生産性の向上

349

Table 4 White blood cell differentiation of piglets during milk and fermented milk feeding

experimentneutrophil

eosinophil

basophillymphocyte

monocyte（％）
milk
3weeks old
7weeks old

25±5
21±5

0.7±0.3
1.3±0.5

0.0±0.0
0.3±0.271±575±5

3.3±0.6
2.5±0.7

3weeks old

24±3

0.3±0.2

0.0±0.0

73±4

2.7±0.7

7weeks old

27±2

1.8±1.1

0.0±0.0

69±2

2.2±0.5

fermented milk

Values are means based on 6 piglets±SEM. Piglets were fed basal diet with milk or fermented milk fromweaning at 3 weeks old for four weeks.

Table 5 Lymphocyte subset of piglets during milk and fermented milk feeding experiment
CD3＋

CD4＋

CD8＋

CD21＋

CD335＋（％）
milk
3weeks old
7weeks old

40±4
50±3＊

25±2
25±2

28±2
37±2

18±3
20±3

13±1
11±2

fermented milk
3weeks old
7weeks old

45±6
54±4＊

25±3

28±2

21±2

11±1

26±1

35±3

20±2

11±2

Values are means based on 6 piglets±SEM. milk, milk fed group from weaning at 3 weeks old for four weeks;fermented milk, fermented milk fed group during weaning period. The statistical comparisons were made in＊；ｐ＜0.05
same colum within each group．

糞便中の免疫グロブリン（IgAおよびIgG）含量影響が認められなかったが，乾物摂取量が増加しを測定したが，発酵乳給与による影響は認められて，育成期の増体成績が改善する可能性が示唆さなかった（data not shown）。

れた。

発酵乳給与試験終了後，引き続き育成試験を行った。この期間中のDMIは，牛乳区に対して

４．要約

発酵乳区で有意に（ｐ＜0.001）増加し，ADGも離乳期の子豚の成長と免疫機能の改善を期待し発酵乳区で有意に（ｐ＜0.05）高い値となったて発酵乳を給与する試験を行った。発酵乳調製の（data not shown）。育成試験期間中，両試験区のために，農研機構畜産研究部門で所有する乳酸菌

豚は同じ飼料を給与されていたことから，DMIライブラリーから乳発酵能を示し，低pH，胆汁の増加が増体成績の改善につながったと考えられ

酸および低温耐性が高いLactococcus lactis subsp.

る。育成期以降の飼養成績に及ぼす影響について

cremoris J50株を選抜した。発酵乳区の子豚では，も ，さ ら に 検 討 中 で あ る 。以 上 の 結 果 か ら ，

発酵乳給与試験期間中の乳酸菌摂取量が９～Lactococcus lactis subsp. cremoris J50株を用いて13log10cfu/dayであった。発酵乳区では牛乳区と調製した発酵乳を離乳期の子豚へ４週間給与する

比較してDMIが有意に増加したが，ADGは両試ことによって，離乳期の増体成績と免疫機能には験区で差が認められず，飼料効率は発酵乳区にお© The Ito Foundation

350

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

いて有意に低下した。Ｊ50株を含む発酵乳の給与は，離乳子豚の末梢血中の白血球像とリンパ球サブセットに影響を及ぼさず，糞便中のIgAおよびIgG含量も両試験区で差が認められなかった。発
酵乳給与試験終了後の育成試験では，発酵乳区のDMIおよびADGが牛乳区に対して有意に高い値となった。離乳期に発酵乳を給与することでDMIが高まり，育成期間の増体成績が改善される可能性が示唆された。
文
献１）Missotten, J. A. M., Michiels, J., Ovyn, A., Smet, S.
D., Dierick, N. A. : Arch. Anim. Nutr.，64，437～466，
2010．
２）Otsuka, M., Ishida, A., Murakami, H., Narita, T.,

Minato, H., Takada, R. : Jpn. J. Swine Sci.，42，54～
60，2005．
３）Lawlor, P. G., Lynch, P. B., Gardiner, G. E., Caffery,P. J., OʼDoherty, J. V. : J. Anim. Sci.，80，1725～1735，
2002．
４）Nomura, M., Kobayashi, M., Narita, T., KimotoNira, H., Okamoto, T. : J. Appl. Microbiol.，101，396～
405，2006．
５）Kimoto, H., Mizumachi, K., Okamoto, T., Kurisaki,
J. : Microbiol. Immunol.，48，75～82，2004．
６）Kimoto-Nira, H., Suzuki, C., Kobayashi, M.,
Mizumachi, K. : J. Food Prot. ， 71 ， 2124 ～ 2128 ，
2007.
７）Otsuka, M., Ejiri, D., Katsumata, M., Takada, R.,
Kanto. : J. Anim. Sci.，55，54～60，2005．
８）Mizumachi, K., Aoki, R., Ohmori, H., Saeki, M.,
Kawashima, T. : Animal.，3：5，670～676，2009．
９）Gardiner, M. R., Sippel, W. L., McCormick, W. C. :Am. J. Vet. Res.，14，68～71，1953．

© The Ito Foundation

351

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系
による飼料用ダイズ生産技術の開発
Development of soybean production technique by living multi methodwith tropical grasses in southwestern Japan

石

垣

元

気・福

山

喜

一

（宮崎大学農学部附属フィールド科学教育研究センター住吉フィールド）Genki Ishigaki and Kiichi Fukuyama（Sumiyoshi Livestock Science Station, Field Science Education Research Center,
Faculty of Agriculture, University of Miyazaki）

Tropical grasses mainly utilized in southwestern Japan have exhibited that the dry matteryield is increased as the growth stage developed. However, the nutritive value such as crude
protein（CP）and non fibrous carbohydrate（NFC）tends to be decreased strikingly as thegrowth stage developed. Therefore, the introduction or breeding the new grass or crops whichhave high potential as high protein source will be urgent problem. However, the practical
success cases have not been reported in southern-western region of Japan. The aim of study
were i）to investigate the dry matter yield of soybean（‘Miyakonojoʼ and ‘Williams 82ʼ）undercultivation method that rhodes grass have been used as multi-living plant after 1st cutting andii）to investigate the nutritive value of the silage and the digestibility for pig. Rhodes grassgrew vigorously after 1st cutting and started to generate the head at around the end of
October. The development growth of the rhodes grass hampered the growth of soybean at theinitial growth stage and the subsequent stages. As a result, the dry matter yield of soybean
ranged from 9.8 kg/10a to 26.6 kg/10a, correspond to about 3％ and 10％ among the total dry
matter yield. However, the nutritive value of EE, CA and CP tended to be higher than those ofrhodes grass silage. The digestibility of rhodes grass-soybean mixed silage was significantly
lower than that of concentrate. The low digestibility value was derived from the increase offiber accompanied with development growth in rhodes grass.

１．目

ら輸入している。また，配合飼料価格は年々高騰的する傾向にあり，生産農家の負担が増加している

農業算出額における畜産部門のうち，九州はことから，輸入配合飼料に代替する新しい飼料を24％を占めており，我が国の主要な畜産生産地帯

自給生産することが喫緊の課題となっている。

となっている。特に南九州（宮崎県，熊本県，鹿国内の西南暖地（主に西日本）において主に栽児島県）は九州全体の５割以上を占める畜産県で培されている暖地型イネ科牧草は，生育段階が進あるが，生産農家は配合飼料のほとんどを海外かむにつれて，乾物収量は増加するものの，タンパ© The Ito Foundation

352

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

ク質や消化性が著しく低下し，家畜における繁殖

フィールド科学教育研究センター住吉フィールド

障害や増体・発育の遅延が認められるケースがあの圃場（北緯39°59′，東経131°28′，海抜12ｍ）

る。このことから，今後，高タンパク粗飼料となにて，2016年５月から2016年12月に行った。供試るような作物を新たに探索，導入することが望ま

土壌は，礫が比較的少なく，有機物に乏しい砂質れる。最近，国内の寒冷地では，新しい高タンパ土壌である。2016年５月にローズグラス種子を3.0

ク質供給源として，ダイズサイレージが注目され㎏/10ａの播種量で散播した。ローズグラスの１ており，寒地型イネ科牧草イタリアンライグラス

番草刈取りは2016年８月22日に行い，地際15㎝でをリビングマルチとして利用することでダイズを刈り取った。１番草刈取り後，耕起区はロータ

栽培する技術を確立している（内野ら2014） 。

リー（クボタ社）を用いて40㎝幅で一部耕起し

一方，南九州を含む西南暖地での牧草を利用したた 。ダ イ ズ 播 種 は ，ダ イ ズ 種 子（都 城 お よ び

飼料用ダイズ生産の技術開発はいまだ行われていWilliams 82）を株間20㎝で１点２粒播きの条件ない。西南暖地の牧草生産において特徴的な問題で点播した。各供試植物の草丈（㎝）および乾物

点として，①暖地型イネ科牧草の土壌窒素に対す収量（㎏/10ａ）を2016年11月23日に調査した。

る低い窒素利用性，②暖地型イネ科牧草の生育段

施肥は，10ａ当たり換算量で基肥として発酵牛糞

階の推移に伴う栄養成分の急激な低下があげられ

１ｔ（N2.5％，P ２ O ５ 4.0％，K ２ O2.1％），化成肥る。このような問題点を解決し，西南暖地におけ料でＮを４㎏，P２O５を3.4㎏，K２Oを2.9㎏施用し，る高タンパク飼料生産を技術開発できれば，西南追肥として１番草刈取り後に，化成肥料でＮを４暖地における家畜生産（肉用牛生産，乳生産な㎏施用した。2016年11月23日に，地際15㎝で刈りど）の生産コストを大きく縮小することが可能と取ったローズグラスおよびダイズは，同圃場で約なる。

１日予乾処理した。予乾処理後，刈取りサンプル

１）

本課題は，九州で採草用としてよく用いられるは，約１㎝幅に細断し，ポリエチレン製バックに

暖地型イネ科牧草ローズグラスの１番草刈取り後約1500ｇずつ詰め，室温で貯蔵した。また乳酸発の刈り株をマルチリビングとして用いて，ダイズ

酵を促進させるために，乳酸菌（サイマスター

２系統（都城およびWilliams 82）を栽培し，そLP，雪印種苗株式会社）を添加した。サイレーの収量性を調査した。さらに，採草したローズグ

ジは，調製から30日目に各処理３袋ずつ開封し，

ラス－ダイズでサイレージを調製し，豚における粗タンパク質（CP），粗脂肪（EE），粗灰分（CA），

消化性について調査した。

を調査した。

２．方
2.1

2.3

法

豚における消化率の推定

サイレージの粗タンパク質（CP），粗脂肪（EE），

供試材料

粗繊維（CF）および可溶性無窒素物（NFE）の

暖地型イネ科牧草ローズグラス品種カタンボラ

消化率を全糞採取法により行った（独立行政法人（雪印種苗）をマルチリビングとして供試した。

３）
農業・食品産業技術総合研究機構2009）。供試

ダイズ系統として都城およびWilliams 82を供試

動物は繁殖豚２頭を用いて，ラテン方格に濃厚飼した。

料（繁殖豚用）およびサイレージを各々７日間給2.2

ダイズ栽培試験およびサイレージ調製

与し，後の３日間を本試験とした。本試験期間に

試 験 は ，国 立 大 学 法 人 宮 崎 大 学 農 学 部 附 属

おいて排泄された糞を全量採取し，一部を消化率© The Ito Foundation

353

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発の推定に供試した。

は，ローズグラスでは，いずれのダイズ系統および処理区においても300㎏/10ａ程度であったのに

３．結果と考察
3.1

対し，ダイズ系統は9.8㎏/10ａから26.8㎏/10ａとローズグラスおよびダイズ系統の収量性低い値であった（Table１）。しかしながら，ダイ

ダイズ系統ʻ都城ʼおよびʻWilliams 82ʼは，いズ 系 統 Williams 82 の 耕 起 区 で は ，全 体 収 量 のずれも播種後５日目から出芽し，旺盛に伸長した

10.1％を占めていたことから，耕起処理によって，ものの，ローズグラスの１番草刈取り後の再生がダイズ系統Williams 82の個体数が不耕起区よりさらに旺盛であったため，ダイズ播種後３週間目も高く維持されたと推察される。

には，ローズグラスの草高がダイズよりも高く

以上の結果から，西南暖地の秋季における暖地なった（Fig.１）。収穫前では，耕起区における型イネ科牧草ローズグラスをマルチリビングとしダイズの草丈は，有意ではないものの，いずれのて用いたダイズ栽培では，ローズグラスの高い再系統も不耕起よりも高い傾向が認められた。さら生性および生殖成長に伴う出穂茎の伸長により，にローズグラスの草丈は，耕起区，不耕起区のいダイズ植物体の初期生育およびその後の生育に負ずれの処理においてもダイズの草丈よりも有意にの影響を及ぼすことが明らかとなった。本試験で高い値であったことから，ダイズ播種前の耕起処

は，ダイズの収穫時期に合わせて収穫したため，

理がダイズの初期生育およびその後の生育に与えローズグラスの生育段階が過度に進んだ状態とる効果は認められなかった（Table１）。乾物収量なった。このことから，西南暖地での粗飼料生産

a

b

c

Fig. 1 Experimental field（Figure 1a）of rhodes grass and two soybean plants（“Miyakonojo”, Figure 1b; “Williams 82”,

Figure 1c）at pre-harvest time（23th November 2016）．
Table 1 Plant length and dry matter yield of rhodes grass and two soybean strains.
‘Miyakonojo’
Parameter‘Williams82’

Non tillage

TillageP

Non tillage

TillageP

Rhodes grass156.1ａ137.3ａ0.011

156.2ａ131.7ａ0.001

Soybean

57.3ｂ

54.7ｂ

0.227

52.0ｂ

47.7ｂ

0.055

Rhodes grass318.1ａ337.0ａ0.784

318.6ａ266.5ａ0.358

Soybean

9.8ｂ

15.2ｂ

0.343

16.8ｂ

26.8ｂ

0.254

Soybean mixing（％）

3.1

4.5

0.496

5.3

10.1

0.240

Plant length（cm）

Dry matter yield（kg/10a）

Values followed by different letters between rhodes grass and soybean differ significantly（P＜0.05）by t-test.

© The Ito Foundation

354

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

体系において，ダイズ生産を組み入れられるようこれまでにマメ科作物およびマメ科牧草の栽培さな時期を，秋季以外で新たに検討する必要があれていないため，ハスモンヨトウなどの害虫の発る。南九州をはじめとする西南暖地の多くの地域

生数が顕著ではなかったと考えられる。

では，寒地型イネ科牧草イタリアンライグラスの3 . 3 ローズグラス・ダイズ混合サイレージの

２番草の刈取りが５月上旬頃には行われ，その栄養成分および消化性後，トウモロコシなどの長大作物や暖地型イネ科

ローズグラス単体およびローズグラスとダイズ

牧草が作付けされる。今後，イタリアンライグラ

を混合したサイレージでは，サイレージ調製前のスの２番草刈取り株をリビングマルチとして利用

予乾により，いずれも水分含量（％）が60％までする技術や，ローズグラスとの混播によるダイズ低下した。各サイレージの栄養成分は，粗脂肪生産技術を検討する必要がある。

（EE），粗灰分（CA），粗タンパク質（CP）のい

3.2

ハスモンヨトウの発生数

ずれにおいてもダイズを混合したサイレージが高ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）は，鱗翅い傾向を示した（Table２）。

目ヤガ科に属し，多くのマメ科作物やマメ科牧草

濃厚飼料の粗タンパク質（CP），粗脂肪（EE），

を対象とする広食性の害虫であり，多くの作物で被粗繊維（CF）および可溶性無窒素物（NFE）に２，
４）
害が報告されている（山口1968；遠藤ら2002）。

おける消化率は，各々80.6％，86.0％，38.7％お本試験期間中では，調査開始時からヨトウガの成よび88.6％であったのに対し，ローズグラス・ダ虫（雄）が確認された。確認個体数は８月４日にイズ混合サイレージの消化率は15.3％，11.0％，

最も多くなり（約160匹），その後，急激に低下し5.1％および17.1％となり，濃厚飼料よりも有意にた（Fig.２）。播種後１週間目の９月７日にはヨ

低い値であった。サイレージの低い消化性は，サトウガ成虫は確認されなかった。本試験地では，イレージのほとんどを占めているローズグラスのNumber of S.litura adults

200
160
120
80
40
0

7/19

7/21

7/28

8/2

8/7

8/14

8/21

9/1

Fig. 2 The transition of number of Spodoptera litura male adults during experimental period.

Table 2 Chemical compositions of rhodes grass（RG）and RG＋Soybean silage（‘Miyakonojo’）．
Moisture

EE

CA

CP

-％DMRhodes grass（RG）

60.5

2.2

10.2

10.5

RG＋Soybean

61.9

2.5

10.5

12.0

There was no significant differences in two silages for each nutritive values.

© The Ito Foundation

9/7

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発

355

Table 3 Digestibility of concentrate and RG＋Soybean silage.

Concentrate

RG＋Soybean silage

Pig A

CP

EE

CF

NFE

79.4

85.9

39.9

88.9

Pig B

81.8

86.1

37.6

88.3

Mean

80.6ａ

86.0ａ

38.7ａ

88.6ａ

PigA

17.7

14.2

5.2

16.5

PigB

13.0

7.8

5.1

17.7

Mean

15.3ｂ

11.0ｂ

5.1ｂ

17.1ｂ

Means followed by different letters between concentrate and RG＋Soybean silage differ significantly（P＜0.001）
by t-test.

高い繊維含量が起因していると考えられる

その収量性を調査した。さらに，採草したローズ（Table３）。しかながら，肥育豚の肥育後期におグラス－ダイズでサイレージを調製し，サイレー

ける成長速度は低下し，脂肪が蓄積しやすくなる

ジの栄養成分および豚における消化性について調ことから，飼養管理では厚脂を防ぎ，良好な筋肉査した。ローズグラスの高い再生性および生殖成増加を図る工夫が必要である。本試験で調製され長に伴う出穂茎の伸長は，ダイズ植物体の初期生たサイレージが示した高い繊維性および低い消化育およびその後の生育を抑制した。その結果，ダ性は，このような飼養管理に対して一つの打開策

イズの乾物収量は，全体収量のうち，数パーセンになるかもしれない。今後，このような高い繊維

トから10％程度しか占めなかった。しかしなが性および低い消化性を示したローズグラス・ダイ

ら，調製したローズグラス・ダイズ混合サイレー

ズ混合サイレージの肥育後期豚への給与が筋肉のジの栄養成分は，粗脂肪（EE），粗灰分（CA），

発育や肉質，または脂肪の蓄積にどのような影響

粗タンパク質（CP）のいずれにおいてもローズを及ぼすのか調査する必要がある。

グラスサイレージよりも高い傾向を示した。ま４．要

た，ローズグラス・ダイズ混合サイレージの消化約率は，濃厚飼料よりも有意に低い値であったこと

国内の西南暖地において主に栽培されている暖地型イネ科牧草は，生育段階が進むにつれて，乾から，ローズグラスの生育段階の進行に伴う繊維含量の増加が起因していると考えられる。

物収量は増加するものの，タンパク質や消化性が著しく低下し，家畜の繁殖障害や増体・発育の遅延が認められるケースがある。このことから，今後，高タンパク粗飼料となるような作物を新たに探索，導入することが望まれている。しかしながら，これまでこのような高タンパク粗飼料となるような作物が西南暖地において導入された例はない。本課題は，九州で採草用としてよく用いられる暖地型イネ科牧草ローズグラスの１番草刈取り後の刈り株をマルチリビングとして用いて，ダイズ２系統（都城およびWilliams 82）を栽培し，

文献１）内野宙，魚住順，嶝野英子，河本英憲，出口新：イタリアンライグラスをリビングマルチとして導入した飼料用大豆生産体系―大豆の播種時期が収量性に及ぼす影響について―，第237回日本作物学会講演
要旨，2014．
２）遠藤信幸，和田節，水谷信夫，高橋将一：ダイズ
育成系統九系279のハスモンヨトウと大豆カメムシ類に対する品種特性，九州病害虫研究会報48巻，262～
263，2002．
３）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構：
消化試験法（豚），262～263，2009．
４）山口福男：ハスモンヨトウとその防除，農業および園芸43巻，681～684，1968．

© The Ito Foundation

356

哺乳期の長日処理による黒毛和種の代謝調節
Control of metabolism in Japanese black cattle by postnatal exposure
to long photoperiod

安

尾

しのぶ

（九州大学大学院農学研究院）

Shinobu Yasuo（Faculty of Agriculture, Kyushu University）

Seasons or photoperiod during lactation period affects growth and metabolism of theskeletal muscle in animals. Thus, photoperiodic control during lactation period in livestock may
increase productivity and modulate meat quality. This study analyzed the effect of longphotoperiod during lactation period on body weight and metabolism-related parameters using
Japanese Black cows. The cows were exposed to long or short photoperiod during 3-months
lactation period. The body weight at 3 months old, as well as milk intake during 3 months andplasma insulin levels at 3 months old, was higher in the cows exposed to long photoperiod thanthose exposed to short photoperiod. Expression of several genes including myostatin in theskeletal muscle at 2 months old were not changed by photoperiod, but the effect may appear
after weaning. Analysis of long-term effect, including wide range of analysis of gene expression
and meat quality, is needed in future studies.

１．目

すると，成熟後に至るまで体重増加が促進される

的ことを見出した５）。さらに，成熟後の骨格筋を用動物の成長や代謝は哺乳期における環境要因にいてメタボローム解析を行ったところ，インスリ

多大な影響を受ける。例えば，哺乳期における栄ン感受性の向上機能があるパルミトレイン酸が増養状態やストレス，免疫活性が様々な生理機能に加することや，TCA回路が活発化すること，ま影響を及ぼし，肥満や糖尿病などの病気に関わるた 脂 肪 酸 代 謝 に 関 わ る peroxidome proliferator-

ことが広く知られている１）。哺乳期における季節

activated receptorの発現が変化することが明らや日長も，動物の生理機能に影響を及ぼす重要なかとなった。これを牛に応用すれば，哺乳期の長要因である。ハムスターにおいて，哺乳期の日長

日処理により生産性を高める技術や，付加価値のが性線の発達や性成熟，また成長に影響すること高い新たな食肉の生産技術の開発が期待できる。

が報告されている２～４）。

牛は周年繁殖動物であるが，乳牛を長日条件で飼我々は最近，マウスの哺乳期を長日条件で飼育育すると，体重や乳量が有意に増加する６）。この© The Ito Foundation

357

哺乳期の長日処理による黒毛和種の代謝調節ことから，体重や代謝関連の指標に関しては，牛血漿を用いて，ELISA測定キットによりイン

でも長日処理の効果が得られることが予想される。

スリン濃度を測定した。骨格筋バイオプシー試料

そこで本研究では，黒毛和種の牛を長日条件でを用いてcDNAを合成し，リアルタイムPCRにより，飼育すると体重増加や代謝にどのような変化が見

PPAR-delta（PPARd）および-gamma（PPARg），

られるかを明らかにすることを目的として，哺乳また骨格筋形成抑制因子であるマイオスタチンの期の長日処理が体重増加やホルモン分泌に及ぼす発現を解析した。各発現量はGAPDHの発現量で影響，また骨格筋代謝関連遺伝子の発現に及ぼす補正した。

影響を調査した。
２．方

３．結果および考察法

3.1

体重・体格・摂食量

牛の日長調節を行うため，飼育舎内で光コント出生後から哺乳期にかけて日長処理を３カ月間

ロールを行う小屋を２つ準備して，長日区と短日行ったところ，３カ月齢の体重は短日区で96㎏お区を設定した。牛を一日中小屋に閉じ込めると多よび78㎏，長日区で129.5㎏および108㎏となり，大なストレスがかかるため，日中は屋外で適度に

長日区では短日区に比べて約1.36倍の体重増加が運動しながら自然日光を利用し，明期終了時刻を見られた（Table１）。体高，体長，胸囲のいずれ

小屋内で調節するシステムとした。長日区は日のについても，長日区の牛では短日区の牛よりも大出から16時間の光を浴び，短日区は日の出から10

きい値を示した（それぞれ1.06倍，1.13倍，1.09倍，

時間の光を浴びるように設定し，日長調節が終了

Table１）。また，３カ月間におけるミルク摂取量した夜間には扉が自動で開くように設定した。

は，短日区で102.4㎏および85.1㎏，長日区で119.8

５月に出生した牛を用いて，当該システムにて㎏および111.5㎏であり，長日区では短日区の約飼育を開始した（長日区：オス２頭，短日区：オ

1.23倍であった（Table１）。ミルク摂取量に粗飼ス１頭およびメス１頭）。日長調節は離乳（３カ料やスターター給与量を加えて，飼料効率を計算

月齢）までとし，離乳後は自然日長下において粗した結果，長日区では0.45および0.42，短日区で飼料で飼育した。約10日ごとに体重や体格の調査

は0.57および0.43であった。

を行い，３カ月齢までの採食量や飼料効率を測定

本研究で用いた牛は５月に出生したため，哺乳した。２カ月齢において血漿および骨格筋バイオ期は春から夏にあたる。離乳直後（夏）の被毛状

プシーを採取した。

態を観察すると，短日区では冬毛が，長日区で夏Table 1 Various measurements in cows maintained under short or long day conditions
Birth3-month old

0-3 month old

BW

BW（kg） WH（cm） BL（cm） CW（cm）

Milk intake（kg）

Photoperiod

No.

Sex

Short day

1

Ｍ

28

96

92.2

85.4

105

102.4

2

Ｆ

30

78

86.2

83.2

99

85.1

1

Ｍ

31

129.5

98

95

115

119.8

2

Ｍ

34.5

108

92.6

95.6

108

111.5

Long day

BW: Body weight, WH: Withers hight, BL: Body length, CW: Chest width© The Ito Foundation

358

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

毛が見られた。そこで，毛量を計測したところ，区のほうが高濃度であった。長日区でインスリン２

短日区では9.67および6.42ｇ/100㎝ ，長日区では濃度が高いという結果は，長日区で摂食量が多く

1.98および1.88ｇ/100㎝２であった。

体重が重いという結果と一致する。しかし，摂食

本研究の結果から，黒毛和種の哺乳期を長日条

量の違い（約1.23倍）に比べて，インスリン濃度

件で飼育すると，短日飼育に比べてより多く摂食の違いは4.76倍と大きいことから，摂食量を介さし，体重増加が促進されることが示唆される。長ない経路に対する日長の影響が示唆される。ハム

日条件では短日条件に比べて明期が長いため，本スターでも同様に，長日条件では短日条件より血研究の結果は，単に摂食の機会が多くなった結果

漿インスリン濃度が高い12）。さらに，長日条件のとも考えられる。しかし，夜行性であるハムス

ハムスターでは，脳におけるインスリン受容体のターにおいても，長日条件では活動時間が短いに

発 現 や ，イ ン ス リ ン シ グ ナ ル 伝 達 に 関 わ るもかかわらず，摂食や体重が増加する７）。このメ

PTP1Bの発現やリン酸化AKTの濃度が高く 13），

カニズムとして，松果体から分泌されるメラトニ

インスリン作用機構の全体が日長の影響を受けてンの分泌パターンが日長によって変化し，その分いることが分かる。マウスでは，骨格筋や脂肪組

泌パターンにより視床下部における摂食・エネル

織においても，糖の取り込みを制御するGlucose

ギー恒常性関連遺伝子の発現が変化することが解transporter４の発現は長日条件のほうが高く，明されている 。牛においても，メラトニンの分インスリンの高感受性と相関している14）。以上よ泌パターンは季節や日長により異なることかり，黒毛和種のインスリン分泌およびインスリンら，視床下部における摂食・エネルギー恒常作用機構が日長の影響を受けていることが示唆さ性機構が日長の影響を受けた可能性が考えられれる。しかし，血漿インスリン濃度は摂食タイミる。しかし，本研究では，出生体重が長日区で若ングにより変動するため，直前の摂食状態に影響

干高いことや，短日区でメスが含まれることなどを受けた可能性は否定できない。今後は，摂食のの区間の違いがあり，その影響が反映された可能タイミングを合わせたうえで，濃度を比較する必性が否めない。個体数を増やして条件を整えた上要がある。また，糖負荷試験によりインスリン分で，より正確な解析をしていく予定である。

泌の反応性を比較することも重要である。

８）

９，10）

本研究では，短日区と長日区でそれぞれ冬毛と２カ月齢の骨格筋におけるPPARd，PPARg，

夏毛が観察された。ハムスターでも被毛状態が日およびマイオスタチンの発現には日長の明確な影長の影響を受けるが，これは日長によって変化す

響は見られなかった。しかし，我々が行ったマウるプロラクチンの分泌により制御されている 。

スにおける予備実験では，哺乳期の日長による牛でもプロラクチンの分泌は日長により変化する

PPARdの発現変化は離乳以降に現れ始めたことことから ，同様のメカニズムが考えられる。

から，引き続き牛を飼育していくことで，離乳の

11）

10）

3.2

３カ月齢以降に発現変化が現れる可能性がある。

ホルモン濃度および遺伝子発現

代謝状態の指標として，糖の取り込みによりタ

また，血漿インスリン濃度が変化していたことか

ンパク質および脂肪酸の合成を促進するインスリ

ら，インスリン伝達シグナルの下流にある遺伝子

ンの血漿中濃度を測定した。２カ月齢における血群の発現が変化している可能性が考えられる。本漿中のインスリン濃度は，長日区で2.61および1.59

研究では限られた遺伝子の発現のみ調査したが，μg/l，短日区で0.55および0.34μg/lであり，長日網羅的な遺伝子発現解析などにより，より広範な© The Ito Foundation

哺乳期の長日処理による黒毛和種の代謝調節

発現プロファイルを明らかにし，骨格筋の日長反応機構を明らかにする必要がある。
４．要約

哺乳期の季節や日長条件は動物の成長や骨格筋
代謝に影響を及ぼす。この性質を畜産に応用すれば，哺乳期の日長コントロールによる生産性の向上や肉質の制御などが期待できる。本研究では，
黒毛和種の牛において，哺乳期の長日処理が体重増加や代謝関連指標に及ぼす影響を解析した。３カ月間の哺乳期を長日区と短日区に分けて飼育した結果，３カ月齢時の体重は長日区で短日区より重く，ミルク摂取量も多かった。また，血漿イン
スリン濃度は長日区で短日区より高い傾向が見られた。２カ月齢の骨格筋におけるマイオスタチンなどの発現に変化は見られなかったが，離乳後に影響が現れる可能性がある。今後は，実験個体数を増やした上で，長期的な影響の調査や，広範な遺伝子発現の解析および肉質の解析をしていく予
定である。
文
献
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© The Ito Foundation

360

耕作放棄地を利用しためん羊生産体系の確立の試み
Attempt to establish a new sheep production system in abandoned
farmland

田

中

智

夫

（麻布大学獣医学部）

Toshio Tanaka（School of Veterinary Medicine, Azabu University）

This study was conducted aimed to establish the sheep production system in abandoned
farmland. The grazing areas were in Toyooka, Suzaka, Nagano prefecture, Japan. Suffolk ewes
were grazed after weaning their lambs. Some wheat bran was fed as supplement feed. The
body weight and body condition score of them were recorded every 2 months. Improvement ofboth measurements was relatively slow. The quality of grasses on abandoned farmland wasvariously, so the supplement feed might be very important for recovering their body condition.
The feeder size of supplement was needed for all ewes in the group could eat simultaneously.
The ability of successful mating was different in each ram, especially the youngest ram could
not success to copulate. Therefore, the selection of ram also might be very important.

１．目

り，その方策の１つとして耕作放棄地の有効活用的が期待されている。筆者は，約20年前から耕作放近年，わが国における耕作放棄地面積は年々増棄地を利用しためん羊の放牧に関する研究に着目加しており，とくに最近20年間で倍増して約40万

し，（社）日本緬羊協会（現（公社）
畜産技術協会

haにもなっている。その原因として，農業者の

緬山羊振興部）のめん羊振興対策事業の一員とし高齢化と後継者不足が主なものとしてあげられるて，全国各地の休耕田や果樹園跡地等でのめん羊が，放棄された土地が野生動物の隠れ家として利放牧の実態調査を実施し，取り組みの背景や問題

用され，それら野生動物が周辺の耕作地を荒らす点を明らかにした。その後，一部は貴財団およびことで放棄される農地がさらに増えるといった悪

文科省科学研究費の助成金を受けて，岐阜県郡上循環も見られる。実際，イノシシやシカ，サルな市や島根県美郷町，および本研究実施地である長どの野生動物による農作物被害額も増加の一途を野県須坂市の耕作放棄地にめん羊を導入して，行たどっている。

動研究や草生変化などの研究に取り組んできてお一方，わが国は，飼料自給率および食糧自給率

り，その成果を日本畜産学会や日本緬羊研究会でともに低く，これらの向上が強く求められてお報告するとともに論文発表してきた。これらの中© The Ito Foundation

耕作放棄地を利用しためん羊生産体系の確立の試み

361

で，めん羊は短草ばかりでなくセイタカアワダチ

種成雌羊４頭を使用し予備実験を行った。予備実

ソウやススキなど草高のあるものもよく摂取し，

験ではプランターを利用した飼槽を分割や連結に放棄地がほぼ裸地化するまで摂取すること，補助よって長さの調節を行って４つのパターンで配置

飼料として野菜くずを給与することでコストをかし，それぞれ６回ずつ実験を行った。飼料は，ヘ

けずに維持管理が可能なことなどを明らかにしイキューブとスーダン乾草を細断したものを給餌

た

１～５）

した。その結果，飼槽を２つ用いて飼槽の幅の合本研究は，耕作放棄地を利用しためん羊の放牧

計が羊の体幅の合計より１頭分大きくすることにについて，これまで数年間にわたって試験的に取より，群れの最優位個体と最劣位個体の間で採食り組んできた長野県須坂市における基礎的知見を時間に有意差が認められなくなった。

。

踏まえ，めん羊による除草効果とそれに伴う景観

この結果を元に前述の耕作放棄地を利用した放保全だけでなく，子めん羊や羊肉の販売を見すえ

牧場Ａ，Ｂの２箇所で本実験を行った。実験１にためん羊生産体系の確立を目指し，耕作放棄地を示したように，Ａにはサフォーク種成雌羊９頭，農地として再生し，食糧自給率の向上も期待でき

Ｂには成雌羊４頭が放牧されていた。飼槽は予備る技術の開発を目的とした。

実験と同様のプランター２つを配置し，その合計

２．方

幅を体幅の合計と同じまたは体幅の合計より１頭法分大きくした。飼料は日常的に給餌されているふ長野県須坂市豊丘の「信州豊丘めん羊飼育協議会」の協力の下に，同地域に散在する耕作放棄地

すまを使用した。
実験３：耕作放棄地における放牧羊の性行動解にサフォーク種めん羊を放牧して，以下の実験を実施した。

析
実験２の終了後，８月20日に耕作放棄地ＡとＢ

実験１：耕作放棄地へ放牧した離乳後の繁殖羊に雄羊を１頭ずつ導入し，雌雄混飼直後から２日間，午前と午後に各２時間ずつ性行動を連続観察の体重変化
サフォーク種成雌羊13頭（２～５歳）を供試しした。以下，２頭の雄を雄Ａ，雄Ｂとよぶ。９月た。2016年５月に離乳し，９頭と４頭に分けて耕12日に両区の雄を入れ替えて，再度２日間，午前

作放棄地ＡとＢに導入した。なお，放棄地Ａに導と午後に各２時間ずつ性行動を連続観察した。加

入したうちの３頭は，協力団体（信州豊丘めん羊

えて，11月21日に畜舎において，実験１で受胎し飼育協議会）の都合により，繁殖開始前に出荷さなかった２頭に対し，新たな雄（当歳：以下雄れ，データは６頭となった。放牧開始後1.5～２ヵＣ）を混飼して，その後２日間，午前と午後に各

月ごとに各個体の体重とボディーコンディション

２時間ずつ性行動を連続観察した。

スコア（BCS）を測定した。
実験２：耕作放棄地における放牧時の補助飼料

３．結果と考察
実験１：耕作放棄地Ａの６頭と，放棄地Ｂの４

給与法の検討
耕作放棄地での放牧ではスペースや労力が限ら頭の体重およびBCSの推移をTable１に示した。

れていることが多く，設置する飼槽は可能な限り

放牧開始1.5ヵ月後においても，BCSは2.0―3.0（平少なく，コンパクトであることが望まれる。そこ

均2.5）と十分な回復はみられず，その後は補助で，まず麻布大学の羊舎内で大学産のサフォーク

飼料として１日１頭100ｇのふすまを給与したが，© The Ito Foundation

362

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 1 Changes in body weight and body condition score（BCS）of ewes（Exp.1）
Individual
numberBody weight: kg（BCS）
June 23 aAug. 20 b

Oct. 7 c

Nov. 14 d3194

79.0（3.0）

84.0（3.5）

79.5（3.0）

87.5（4.0）

0004

74.0（2.5）

70.5（2.0）

72.5（3.0）

74.5（4.0）

Ｗ6

72.5（2.0）

73.0（2.0）

73.5（2.5）

67.5（2.5）＊

Ｒ7

66.0（2.0）

67.0（3.0）

72.5（3.0）

77.5（4.0）

Ｇ5

73.5（3.0）

76.5（3.0）

86.5（4.0）

90.5（4.0）

Ｙ56

71.5（2.0）70.5（2.0）

72.5（3.0）

73.0（3.0）

Mean

72.8（2.4）

73.6（2.6）

76.2（3.1）

78.5（3.6）1311

68.0（3.0）

70.0（3.0）

69.5（2.5）

71.5（3.0）＊

1422

78.5（3.0）

78.0（3.0）

79.5（3.5）

87.5（4.0）

Ｙ7

63.5（2.0）

59.5（2.0）

61.0（2.5）70.0（3.0）

Ｂ168.5（2.0）

74.0（2.0）

73.0（3.0）

81.0（4.0）

Area A

Area BMean

69.6（2.5）

70.4（2.5）

70.8（2.9）

77.5（3.5）

Total mean

71.5±5.1（2.5）

72.3±6.6（2.5）

74.0±6.8（2.9）

78.1±8.2（3.5）

a : 1.5 mo. after grazing，b : introducing a ram，c : 1.5 mo. after b，d : after mating＊: non pregnancy

その２ヵ月後においても平均体重は0.8㎏の増加

その合計幅を体幅の合計と同じにしたところＡ，に留まり，BCSも一部の個体でわずかに改善されＢ共に個体間の採食時間に有意差がみられ，最上た程度であったが，その日（８月20日）から雄を位個体が最下位個体の２倍以上であった（Ｐ＜

導入して交配を開始した。交配開始後も補助飼料

0.001）。飼槽を体幅の合計より１頭分大きくしたを同量給与し，1.5ヵ月後には，すべての個体にところ，Ａでは有意差はみられなくなったが，Ｂおいて交尾が確認され，その時点での体重は交配ではなおも有意差がみられた（Ｐ＜0.01）。予備開始時に比べて平均で2.7㎏，BCSは0.5改善され調査を行った麻布大学の羊群と本調査の羊群それていた。そのひと月後には，さらに体重が4.1㎏

ぞれのLandauの直線性指数６）を求めたところ，増加し，BCSも0.5改善したが，ほとんど増体し予備調査群の0.3に対し，本調査のＡ群は0.6，Ｂていなかった２頭は，受胎しなかった。耕作放棄群は0.7と，いずれも値が大きく，より強い順位

地を利用した放牧においては，草生状態が不均一社会であったことと，Ｂでは飼槽が周囲の壁に近でその栄養価にもばらつきが大きい。そのようない場所に配置したことで羊が体を使って飼槽を専なかでの補助飼料の種類や量の検討を意図した

有できたことが原因だと考えられた。したがっが，現地管理者の協力に頼らざるをえない部分がて，耕作放棄地を利用した４～５頭の少頭数の放大きく，十分な検討はできなかった。

牧では，羊の体幅の合計より１頭分大きい飼槽を実験２：耕作放棄地ＡとＢにおける最上位個体

２つに分け，飼槽は周りの壁と羊の体で飼槽が囲と最下位個体の採食時間をTable２に示した。放われない位置に配置する，という条件が目安とな

棄地それぞれに補助飼料用の飼槽を２つ用意し，ることが示唆された。今後は飼料や放牧場所の多© The Ito Foundation

耕作放棄地を利用しためん羊生産体系の確立の試み

363

Table 2 Eating time （min.） of the highest and lowest social ranked ewes

from supplement feeders（Exp.2）
Eating time（min.）Area

Social rank

Feed trough 1 a

Feed trough 2 b

ＡHighest

4.2X

4.5

Lowest2.1Y

3.9

Highest

3.7X

4.4x

Lowest

1.5Y

2.3y

Ｂ

a : equal width of total width of ewes in the groupb : equal width of total width of ewes in the group plus one ewe
X-Y : P＜0.001, x-y : P＜0.01

様な様式に対応できる飼槽の設置方法の検討が課く，また，サフォーク種だけでなくより活動的な題となろう。

品種（ポールドーセット種など）を混飼すること

実験３：雄Ａ，雄Ｂおよび雄Ｃの総観察時間ににより，サフォーク種の行動も活性化されうるこ

占める性行動の発現割合は，それぞれ3.60％，と，２）めん羊放牧により，近隣農地への野生動

1.69％，1.83％であった。雄Ａは５回の乗駕が観物の出現が抑制され，その効果は長期に持続され察され，そのうち２回は交尾に成功した。雄Ｂはること，３）牛の放牧に用いられるイヤータッグ

４回の乗駕のすべてで交尾に成功したのに対し型殺虫剤を装着することにより，羊においても有て，雄Ｃは交尾に至る乗駕は観察されなかった。

害昆虫の飛着だけでなく飛来そのものも抑制でき交尾の成功率が低い雄Ａと高い雄Ｂでは，性行動ること，４）羊肉の加工には，サフォーク種純粋の各要素の発現割合に有意な差（Ｐ＜0.05）がみよりもポールドーセット種とのＦ１のほうが適しられ，交尾が成功した日には雄Ａではツイスト，ている可能性が示唆されるものの，さらなるデー

尿嗅ぎ，フレーメン，前蹴りが発現しやすく，雄タの蓄積が必要なこと，に加えて，本研究により，

Ｂは陰部嗅ぎ，擦り付け，前蹴り，顎のせが発現

５）耕作放棄地の草資源は多様であり，一律に評しやすかった。ガーディングからツイスト，前蹴価はできないものの，適切に補助飼料を給与する

り，顎のせ，乗駕と続き，交尾に至る連鎖が多くことで有効に活用できること，６）補助飼料用の観察され（Ｐ＜0.05），顎のせが乗駕から交尾に飼槽は，全個体が同時に摂食可能な幅を確保する

至るポイントとなる行動と考えられた。

必要があること，および７）繁殖時には，雄の交以上をまとめると，目的に掲げた「めん羊による除草効果とそれに伴う景観保全だけでなく，補尾成功率の個体差が大きく，雄の選択が重要であること，などが明らかとなった。

助飼料の給与も行いながら子めん羊や羊肉の販売

また，耕作放棄地を利用した小規模のめん羊生を見すえためん羊生産体系の確立」までには至ら

産においては，下牧後に飼い直して肥育しても，なかったものの，先に得られていた以下の知見，

肉の出荷先の確保が容易ではない。一方で，子羊

すなわち，１）耕作放棄地でのめん羊放牧には，の需要は大きいものの供給可能頭数は少ないの舎飼いから直接導入するよりも，過去に放牧経験

で，手間をかけて肥育するよりは，子羊で出荷すのある何頭かの個体を混飼することで，馴化が促

るほうが生産者の負担が小さく，収入も安定す

進され，入牧当初から放牧地全体が利用されやする。本研究地においても，大規模に肉生産してい© The Ito Foundation

364

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

る農家や，種雄羊候補を求めている各地の農家か交尾成功率の個体差が大きく，雄の選択が重要でらの譲渡希望が多く，子羊の生産販売という体系あること，などが明らかとなった。以上の結果かができつつある。今後もこのような体系を確立しら，「めん羊による除草効果とそれに伴う景観保ていくことが，中山間地域における耕作放棄地利全だけでなく，補助飼料の給与も行いながら子め

用のめん羊生産が目指すひとつの方向と考えられ

ん羊や羊肉の販売を見すえためん羊生産体系の確る。

立」までには至らなかったものの，本研究以前に４．要得られていた知見とあわせ，中山間地域における約

耕作放棄地の有効利用のひとつの方向性を示した。

耕作放棄地を利用してめん羊を放牧し，食草による除草効果とそれに伴う景観保全だけでなく，子めん羊や羊肉の販売を見据えためん羊生産体系の確立を試みた。まず，離乳後の繁殖用雌羊を放牧し，ふすまを補助飼料として給与しつつ定期的に体重とBCSを測定した。耕作放棄地の草資源は多様であり，一律に評価はできないものの，適切に補助飼料を給与することで有効に活用できる可能性が示唆された。また，補助飼料用の飼槽は，全個体が同時に摂食可能な幅を確保することで，社会的順位の優劣にかかわらず摂食が可能であった。さらに，繁殖時に自由交配させた場合，雄の文献１）田中智夫，内藤範剛，赤堀友紀，植竹勝治，江口
祐輔：（財）伊藤記念財団平成15年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，22，161～167，2004．
２）田中智夫，田井斐子，植竹勝治，江口祐輔：（財）
伊藤記念財団平成17年度食肉に関する助成研究調査
成果報告書，24，180～185，2006．
３）田井斐子，江口祐輔，植竹勝治，田中智夫：日緬
研会誌，43，13～18，2006．
４）渡邉祐輔，小林麻由，田嶋美穂，植竹勝治，田中
智夫：日緬研会誌，51，１～８，2014．
５）渡邉祐輔，植竹勝治，田中智夫：日緬研会誌，
53，１～６，2016．
６）Martin, P., Bateson, P.（粕谷英一，近雅博，細馬宏
通 訳）：行動研究入門，初版，94～101，東海大学出版会，東京，1990．

© The Ito Foundation

365

竹笹サイレージの肉用鶏への給餌による食中毒菌の制御とプロバイオティクスの開発
Control of foodborne bacteria in poultry by feeding of bamboo silage anddevelopment of probiotics from the silage

谷

口

喬

子・三

澤

尚

明

（宮崎大学産業動物防疫リサーチセンター）

Takako Taniguchi and Naoaki Misawa（Center for Animal Disease Control, University of Miyazaki）

As “bamboo silage” has strong antibacterial activity, it may be used not only as roughage
but also as a functional feed to inhibit colonization by bacteria that can cause foodborne
infections from the intestinal tracts of food animals. In the present study, we evaluated whether
bamboo silage or Lactobacillus species isolated from the silage might have efficacy as feed
additives to reduce Campylobacter jejuni contamination in free range chickens, as poultry are
considered to be a major source of human campylobacteriosis. Lactobacillus species wereisolated from bamboo silage, and nine strains including L. brevis, L. plantarum, L. buchneri,and L. acetotolerans showed antibacterial activity against C. jejuni. However, bamboo silage asa feed additive had no inhibitory effect on intestinal colonization by C. jejuni in free range
chickens. Similarly, addition of heat-killed L. brevis, L. plantarum, and L. buchneri isolated
from bamboo silage to drinking water had no inhibitory of intestinal colonization by C. jejuni.

１．目いる１）。我々は，“竹笹サイレージ”の経産肥育

的

牛への給餌により食中毒菌として重要視されてい宮崎県畜産試験場は，飼料自給率向上および地る腸管出血性大腸菌の保菌率を低下させるデータ

域未利用資源の飼料化を目的として，竹の主軸を得るとともに，飼料抽出物中に強い抗菌活性物（棹）部分だけではなく，高い栄養価が期待され質を含んでいることを明らかにした（未発表デー

る竹葉（笹）部分を原料とした“竹笹サイレータ）。これらの試験結果から，“竹笹サイレージ”ジ”を考案し，栄養成分の分析ならびに牛への給は単に粗飼料としてではなく，食中毒細菌の排除

与試験の結果から，“竹笹サイレージ”が粗飼料や肉質改善などの効果を有する機能性飼料であるとして利用可能であることを確認した 。さらに，可能性が高いと考えられた。

１）

本飼料を給与することにより，ロース，筋間脂肪，

カンピロバクターによる食中毒は国内で最も発

皮下脂肪中のオレイン酸含量が非給与牛に比べ有生件数の高い細菌性食中毒として重要視されてお意に高く，食味も良好であることを明らかにしてり，その主要な感染源の一つに食鳥が挙げられ© The Ito Foundation

366

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）る２）。本菌による食中毒を防ぐには，養鶏場にお培養した培養上清を試験液とした。直径10㎜のペー

いて防除対策を講じることが最も重要であるが，パーディスクを試験液に浸漬し，Campylobacter

現時点では有効な手段はまだ確立されていな

jejuniを塗布した５％馬脱繊維血を含む血液寒天

い

３，
４）

基礎培地（Oxsoid）上に置き，37℃，48時間微そこで本研究では，“竹笹サイレージ”の肉用好気培養（75％Ｎ２，10％CO２，５％Ｈ２，10％Ｏ２）

鶏への給餌による腸管からのカンピロバクター排後，発育阻止円の直径を測定した。すべての試験

除の効果を明らかにし，プロバイオティクスとなにおいて発育阻止円の直径が12㎜を超えるものをる有用菌の検索を行うことを目的とした。最終的陽性と判定した。

。

なゴールは国内外の未利用資源である竹の飼料化

2.4による粗飼料自給率の向上と食鳥肉の安全かつ肉2.4.1

質向上を目指した取り組みにつなげることである。

実験動物として，宮崎県畜産試験場で交雑種開

２．方
2.1

C. jejuniの鶏腸管定着阻害効果試験
実験動物

発したみやざき地頭鶏を使用した。感染実験は，法

宮崎大学動物実験委員会の承認（承認番号2015-

竹破砕物および竹笹サイレージの調製002）を得た後，Ｐ２仕様のアイソレーター内で孟宗竹を樹木粉砕機で10㎜程度に細断し，竹破１ケージにつき２～３羽を飼育して行った。これ

砕物を調製した。竹破砕物１ｔあたり廃糖蜜50㎏

らの鶏については実験開始前に，後述するクロアを混ぜたものをロールベールに成型した。成型後カ内容物検査法でC. jejuni陰性であることを確認のロールベールは，１ロールにつき約300㎏でした。

ラッピングを行い，60日以上経過したものを開封2.4.2

して竹笹サイレージとして用いた。

供試菌株には，ブロイラー盲腸内容物由来C.

2.2

供試菌株と経口投与

乳酸菌分離および優勢乳酸菌種の同定

jejuni T2A-5A-１株を用いた。５％馬脱繊維血

竹破砕物・竹笹サイレージともに，10ｇを秤量を含む血液寒天基礎培地上において，37℃，48時

し，これに滅菌リン酸緩衝液（PBS）90mlを加え

間，微好気条件下で培養したものをPBSに懸濁て10倍希釈乳剤とした。この乳剤を階段希釈してし，550nmにおける吸光度を1.0±0.1に調製した。

MRS寒天培地（Difco）に接種し，嫌気培養条件

マウス用プラスチックゾンデを使用し，嗉嚢内にで30℃，約５日間培養した。優勢乳酸菌は，最も１羽につき１ml投与した。陰性対照群には，PBS

高い希釈倍率の乳剤を接種した培地に生育した集を１羽につき１ml投与した。

落の中から無作為に８個釣菌した。

2 . 4 . 3 クロアカ内容物および盲腸内容物中の分 離 さ れ た 乳 酸 菌 は ，Genetic Analyzer3130

C. jejuniの定量的検出（Applied Biosystems）に よ り 16S rRNA 遺 伝 子

滅菌綿棒を用いて採材したクロアカ内容物およの塩基配列を決定し，BLAST（http://blast.ncbi.

び安楽殺時に採材した盲腸内容物をPBSで階段希

nlm.nih.gov/）のホモロジー検索により同定した。

釈し，mCCDA培地（Oxsoid）に塗布後，37℃，

2.3

抗菌活性の検出48時間，微好気条件下で培養した。

竹破砕物および竹笹サイレージから分離した乳

2.4.4

竹破砕物および竹笹サイレージの給餌

酸菌64株を，MRS寒天培地で５日間，嫌気条件試験区として，通常飼料給餌区，竹破砕物20％下で培養後，GYP液体培地でさらに４～５日間

添加飼料給餌区，および竹笹サイレージ20％添加© The Ito Foundation

竹笹サイレージの肉用鶏への給餌による食中毒菌の制御とプロバイオティクスの開発

飼 料 給 餌 区 の ３ 区 と し ，各 試 験 区 に PBS と C.
jejuniをそれぞれ４羽ずつ投与し，計24羽の鶏を用いた。４週齢時にC. jejuni 6.4×10８cfuまたは
PBSを経口投与した後，５週齢から竹破砕物また

367

３．結果と考察3 . 1 竹破砕物および竹笹サイレージ中の乳酸菌数および優勢乳酸菌種

は竹笹サイレージの添加飼料の給餌を開始した。

竹破砕物中の乳酸菌数は5.2×10６cfu/gで，優竹破砕物および竹笹サイレージ添加飼料は，それ勢乳酸菌種はWeissella cibariaであった。竹笹サ

ぞれ通常飼料（パワーチックZK）に，竹破砕物

イレージ中の乳酸菌数は1.5×10５cfu/gで，優勢あるいは竹笹サイレージを20％添加し，よく混合

乳酸菌種はL. buchneri，L. plantarum，L. brevis

したものを用いた。C. jejuniまたはPBSを嗉嚢内であった。高品質サイレージを調製するためにに投与した後，３日～４週でクロアカ内容物中のは，乳酸菌は材料草に共存する酢酸菌などの微生

C. jejuni数を測定した。PBS投与鶏を13週齢で，C.

物と競合し増殖するため，材料草１ｇあたり10５

jejuni投与鶏を16週齢（C. jejuni投与後12週）で

cfu/g以上の菌数が必要だといわれており５），孟安楽殺し，盲腸内容物中のC. jejuni数を測定した。

宗竹はサイレージ調製のための十分な乳酸菌数を

2 . 4 . 5 竹笹サイレージ由来乳酸菌の鶏への飲保持していることが確認できた。また竹笹サイ
レージの優勢乳酸菌であるL. plantarumは，サイ

水投与試験
竹笹サイレージから分離されたLactobacillus

レージの乳酸発酵を促進するスターターとして，

brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus

L. buchneriおよびL. brevisは，好気的変敗を抑

buchneriをMRS寒天培地上において30℃で１週制するスターターとして広く利用されている。こ間，嫌気条件下で培養した。これらを滅菌蒸留水

れらが優勢乳酸菌種として分離されたことは非常に懸濁したものを，乳酸菌懸濁液（L. brevis 2.8に興味深く，竹笹サイレージの発酵品質へ影響を

×10 cfu/ml, L. plantarum 4.0×10 cfu/ml, L.

及ぼしている可能性が高い。

８７buchneri 2.6×10 cfu/ml）とし，60℃で40分加熱９した。これを，５週齢から１羽につき１日１ml
を飲水に添加した。６週齢でC. jejuni 5.4×10

3 . 2 竹破砕物および竹笹サイレージから分離した乳酸菌の抗菌活性

９68 株 中 ９ 株（L. brevis，L. plantarum，L.

cfuまたはPBSの嗉嚢内投与を行い，投与１週～

buchneri，L. acetotolerans）がC. jejuniに対して５週後にクロアカ内容物中のC. jejuni数を測定し抗 菌 活 性 を 示 し た （Table １）。 中 で も L.

た。PBS投与鶏を12週齢で，C. jejuni投与鶏を15plantarumの活性が最も強く，カンピロバクター

週齢（C. jejuni投与後９週）で安楽殺し，盲腸内排除のためのプロバイオティクスとなりうる可能

容物中のC. jejuni数および乳酸菌数を測定した。

性が示唆された。

乳酸菌の優勢菌種については，16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定し，BLASTのホモロジー検索
により同定した。

3 . 3 竹 破 砕 物 お よ び 竹 笹 サ イ レ ー ジ の C.
jejuni鶏腸管定着阻害効果
C. jejuni投与後のクロアカ内容物および盲腸内試験区は，滅菌蒸留の飲水投与区および竹笹サ

容物のC. jejuni菌数は，通常飼料給餌群，竹破砕

イレージ由来乳酸菌懸濁液の飲水投与区であり，物20％添加飼料給餌群，竹笹サイレージ20％添加

各試験区にPBSとC. jejuniをそれぞれ４羽ずつ投飼料給餌群において有意な差はなく，実験期間中与し，計16羽の鶏を用いた。

安 定 し て 10 ４ か ら 10 ６ cfu/g が 検 出 さ れ た（Fig.

© The Ito Foundation

368

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）１）。しかしながら，竹破砕物および竹笹サイレー

して10４ から10６cfu/g程度のC. jejuniが検出されジの給餌によるC. jejuniの腸管定着阻害効果は認た（Fig.２）。PBS投与群においてC. jejuniは検出められなかった。

されなかった。盲腸内容物の乳酸菌数は，PBSお
よびC. jejuni投与群ともに，滅菌蒸留の飲水対照

3 . 4 竹笹サイレージ由来乳酸菌投与鶏におけ群に比べ，乳酸菌懸濁液の飲水添加群において有るC. jejuniの腸管定着阻害効果
C. jejuni投与後のクロアカ内容物および盲腸内

意に高い値を示した（Fig.３）。その優勢菌種は，容物のC. jejuni菌数は，対照群および乳酸菌懸濁

乳 酸 菌 懸 濁 液 の 投 与 に よ り ，L. reuteri ，L.

液添加群において有意な差はなく，実験期間を通johnsoniiの占める割合が増加したものの，両者Table 1 Antibacterial effect of Lactbacillus isolated frombamboo and bamboo silage on Campylobacter jejuni
antibacterial activity

Species＋－

Lactobacillus plantarum2＊Lactobacillus buchneri
Lactobacillus brevis
Lactobacillus acetotolerans
Weissella cibaria
Lactobacillus casei, paracasei
Lactobacillus coryniformis
Pediococcus cellicola
Burkholderia sp.

3
3
1
0
0
0
0
0

11
11
11
5
8
5
1
2
1

＋Positive，－Negative＊No. of strains.

8

C. jejuni（log₁₀ cfu/g）

7
6
5
4
3
2
1
0
3

ys

da

k

ee

1w

ks

ee

2w

ks

ee

3w

ks

ee

4w

s

ek

we

12

post infection
ControlBambooBamboo silage

Fig. 1 Counts of C. jejuni recovered from the cloaca or cecal contents of chickens fed bamboo tips or bamboo silage.
Viable C. jejuni cells were recovered from the cloaca at 3 days, and 1, 2, 3, and 4 weeks, and from the cecal contents at

12 weeks post-infection, respectively. Bars, standard errors.

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369

竹笹サイレージの肉用鶏への給餌による食中毒菌の制御とプロバイオティクスの開発
8

C. jejuni（log₁₀ cfu/g）

7
6
5
4
3
2
1
0

k

ee

1w

ks

ee

2w

ks

ee

3w

ks

ee

4w

ks

ee

5w

ks

ee

9w

post infection
ControlLaｃ
ｔobacillus

Fig. 2 Counts of C. jejuni recovered from the cloaca and cecal contents of chickens given lactobacilli post-infection
Viable C. jejuni cells were recovered from the cloaca at 1, 2, 3, and 4 weeks, and from the cecal contents at 9 weeks

post-infection, respectively. Bars, standard errors.

14＊

lactobacillus（log₁₀ cfu/g）

12
＊

10
8
6
4
2
0
PBS

ControlC. jejuni
Lactobacillus

Fig. 3 Counts of lactobacilli recovered from cecal contents of chickens given three Lactobacillus species and a control

after administration of C. jejuni or PBS
Viable lactobacilli were recovered from the cloaca of chickens after 6 and 9 weeks of PBS or C. jejuni administration,

respectively. Bars, standard errors.＊, P＜0.05.

の構成菌種には大きな違いは認められなかった製した“竹笹サイレージ”の抽出物中に，強い抗（Fig.４）。

菌活性物質を含んでいることを明らかにし，“竹４．要笹サイレージ”は単に粗飼料としてではなく，食約

中毒細菌の排除や肉質改善などの効果を有する機

我々は，地域未利用資源である竹を活用して作能性飼料である可能性を示した。そこで主要な食© The Ito Foundation

370

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）（A）
Control

Lactbacillus

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

（B）
Control

Lactbacillus

Lactobacillus reuteri
Lactobacillus johnsonii
Lactobacillus saerimneri
Lactobacillus amylovorus

Lactobacillus crispatus
Lactobacillus vaginalis
Lactobacillus taiwanensis
Pediococeus pentosaceus

Fig. 4 Composition of dominant Lactobacillus species in cecum contents.
（Ａ）Chickens
administrated with PBS（Ｂ）Chickens
administrated with C. jejuni

中毒の原因菌であるカンピロバクターに対するプ
ロバイオティクスとなる有用菌の検索を“竹笹サイレージ”より行ったところ，本菌に抗菌活性を保持する乳酸菌数株が分離された。一方，肉用鶏であるみやざき地頭鶏を用いて“竹笹サイレージ”の給餌によるカンピロバクターの腸管定着阻害を調べたところ，その効果は認められなかった。さら に“竹 笹 サ イ レ ー ジ”由 来 乳 酸 菌 で あ る L.
buchneri，L. plantarum，L. brevisの死菌の飲水投与を行ったところ，盲腸内容物中の乳酸菌数は

文
献１）鍋西久：平成24年度宮崎県畜産関係学術研究委託
調査報告書，2012．
２）Corry, J. E., Atabay, H. I. : Symp Ser Soc Appl.
Microbiol, 30，96S-114Ｓ，2001．
３）Stern, N. J., Svetoch, E. A., Eruslanov, B. V.,
Perelygin, V. V., Mitsevich, E. V., Mitsevich, I. P.,
Pokhilenko, V. D., Levchuk, V. P., Svetoch, O. E.,
Seal, B. S. : Antimicrob Agents Chemother，９，3111～
６，2006．
４）de Zoete, M. R., van Putten, J. P., Wagenaar, J. A. :Vaccine, 30，5548～57，2007．
５）Hellings, P., Bertin, G. : Proceedings 15th
International Grassland Congress，932 ～ 933，
Kyotosyuppan, Kyoto, Japan，1985.

増加したが，カンピロバクターの腸管定着阻害効
果は認められなかった。

© The Ito Foundation

371

牛由来肝臓細胞における薬物代謝関連遺伝子の解析
Cytochrome P450 expression in SV40 large T antigen-immortalizes bovine
liver cell lines

吉

岡

都

（国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構・動物衛生研究部門）

Miyako Yoshioka（National Institute of Animal Health, NARO）

In the livestock industry, development of easy and reliable screening methods for
detection of harmful substances in the cattle feed is essential. In this study, to establish an invitro model for evaluation of effects of xenobiotics in livestock, we characterized drugmetabolizing cytochrome P450（CYP）induction in primary bovine hepatocyte and SV40 large
T antigen-immortalizes bovine liver cell lines（parenchymal hepatocyte-like BH4, BH5 cells,
and myofibroblast-like A26 cells）. Primary bovine hepatocytes were highly responsive to
3-methylcholanthrene（3MC）, showing increased levels of CYP1A1, CYP1A2, and CYP1B1mRNA 48 h after stimulation, while no changes were observed for CYP3A4, CYP2C9,CYP2C18, and CYP2B6 mRNA. In contrast, primary bovine hepatocytes were exhibited
upregulation of CYP3A4, CYP2C9, CYP2C18, and CYP2B6 mRNA 48 h after stimulation byphenobarbital（PB）, and there were no changes of CYP1A1, CYP1A2, and CYP1B1 mRNA.
Among the immortalized bovine liver cells, the parenchymal hepatocyte-like BH4 cells werehighly responsive to 3MC for CYP1A1 expression. The myofibroblast-like A26 cells had
relatively high CYP1B1 response to 3MC. There were no differences for CYP1A2 regulation
among the immortalized bovine liver cells. This study showed that mRNA levels of CYPs in
the immortalized bovine liver cells were significantly lower than primary bovine hepatocytes,
however, BH4, BH5 and A26 cells had measurable response to CYP induction. These
immortalized bovine liver cells can be employed as a useful tool to study the effects ofxenobiotics in bovine.

に代わる新規抗菌成分の添加など，新規の飼料添

１．研究の目的および背景加物の開発が進められている。しかし，新規の飼

近年，牛の飼料は，飼料の高騰による未利用資料・飼料添加物やエコフィード等には未知の危害源の有効利用や環境負荷を軽減するためエコ要因が含まれる可能性がある。家畜の健康を保フィードの利用など，経済性追求のために多様化

ち，安全な畜産物を消費者に提供するためには，している。また，薬剤耐性菌の問題から抗生物質

このような家畜の飼料，飼料添加物の安全性を迅© The Ito Foundation

372

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

速，適切に評価することが重要である。しかし，な毒性評価法が確立されれば，畜産物の安全性確

牛は大動物であるため，牛を用いた飼養試験は経保技術に大きく貢献する。

済的にも環境負荷の点でも負担が大きい。一方，
牛は反芻動物であるため，マウスやラット等とは

２．材料および方法

代謝機能が大きく異なっている。牛特有の薬物代

2.1

謝機能を評価可能で，かつ迅速・簡便，経済的な生後７～10日齢のホルスタイン新生子牛を動物

安全性評価試験法としては，細胞を用いた代替手

衛生部門実験動物委員会のガイドラインに従って法が非常に有用である。

実験に供した。ペントバルビタール麻酔下での放肝実質細胞の分離と初代培養

我々はこれまでに，家畜由来の初代培養肝細胞

血による安楽死後，肝尾状葉を採取し，二段階潅を用いた研究で，ダイオキシンやかび毒などの有流法により肝実質細胞を含む肝臓細胞を得た４）。

害物質に対し，生体に近い応答性が得られること

肝実質細胞は，10％牛胎児血清，100U/mlストレを確かめている 。しかし，初代培養細胞を用いプトマイシン，100g/mlペニシリンを添加した

た評価は試験のたびに動物から臓器を採取して細Williamʼs E mediumに再浮遊させ，５×10５cells/

胞分離する必要があるため，株化細胞（不死化細mlの細胞密度で６穴の培養プラスチックシャー胞）を用いた簡便で安定した条件での毒性評価法

レに播種，培養した。

１）の開発が望まれる。生体の代謝の中枢である肝臓

2.2

は，代謝の場である肝実質細胞のほかクッパー細培養２日目の初代培養肝実質細胞に，Fugene

胞，類洞内皮細胞，星細胞等の非実質細胞から構HD transfection reagent を 用 い て SV40LT gene

成されている。これらの非実質細胞のパラクライ

をエンコードしたpSVneoを導入した５）。導入細ンによる肝実質細胞とのクロストークは，毒性発

胞はＧ418を用いて選択を行い，クローニングを

現を含めた薬物代謝のほか，肝再生や脂肪肝など

繰り返し，BH４およびBH５細胞株を得た。同様の病態にも関与していることが知られている 。

に，肝臓分離後の非実質細胞分画の培養から，類

我々は，肝実質細胞，類洞内皮細胞，筋線維芽細

洞内皮細胞株（Ｂ46細胞）および筋線維芽細胞株

胞など，牛の肝臓由来の複数の不死化細胞を作出（Ａ26細胞）を得た３）。継代の際にはacutaseを用してきているが３），薬物代謝に関連する酵素群，

いて分散させ，５×10５cellsの細胞を35㎜ディッ受容体等の遺伝子群の発現動態に関する知見が不シュに播き，３～４日ごとに継代した。培養に用足している。これらの細胞の薬物代謝学的特性がいた培地は，BH４およびBH５細胞は，初代培養

明らかになれば，これらを単独，または組み合わ

肝実質細胞と同様に，Williamʼs E mediumで，Ｂせて使用することで，また培養条件を調整して生

46細胞およびＡ26細胞は，Dulbeccoʼs modified

体の状態に近づけることで，より有効な毒性評価

Eagleʼs mediumで行い，継代には10％の牛胎児手法を開発することができる。そこで，本課題で血清を添加するが，薬物添加実験の際には，血清は，これら牛肝臓由来不死化細胞の薬物代謝関連

中の生理活性物質の影響を除くため，無血清培地

遺伝子の発現動態を解析し，種としての特性およに交換して実施した。

２）

不死化細胞株の樹立と培養方法

び不死化による変動を解明し，牛の飼料汚染物質

2.3の簡便な毒性評価系確立のための基礎的知見を得

培 養 細 胞 の total RNA 抽 出 は QuickGene-810

ることを目的とする。このような牛の飼料の簡便

Nuclear Acid isolation System（KURABO）を用© The Ito Foundation

RNA抽出とReal-time PCR

373

牛由来肝臓細胞における薬物代謝関連遺伝子の解析

い て 抽 出 し ， Brilliant II SYBR QRT-PCR kit

CYP1A1，１Ａ２および１Ｂ１のmRNAが著しく（Agilent Technologies）を用いたリアルタイム

誘導されたが，３Ａ４，２Ｃ９，２Ｃ18および２Ｂ

PCRにより解析した。プライマーはSigma社の市

６はほとんど誘導されなかった（Fig.１）。以前にも，

販牛用プライマーセットを用いた。解析法は内在

牛初代培養肝実質細胞において，AhRのアゴニス

性コントロールとしてグリセルアルデヒド３-リ

ト で あ る TCDD （2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-ン酸脱水素酵素（GAPDH）を用いた⊿⊿ct法にdioxin）や PBDD/Fs （polybrominated dibenzo-

より実施した３）。

pdioxins, dibenzofurans）によってCYP1A１および１Ｂ１が誘導されることが報告されており１），

３．結果と考察

今回の結果と一致した。

牛初代培養肝実質細胞の薬物代謝機能を定量的

一方，PBはCYP2A，２Ｂ，２Ｃ，３Ａといっかつ数値的に評価可能なアッセイ系を確立するた

た複数のCYPを，AhRとは別の核内レセプター

め，外来性異物代謝酵素を誘導する代表的な薬物を介して誘導する。とくに，CYP2Bサブファミである３-メチルコラントレン（3MC：1μM）まリ ー に 対 す る 誘 導 が 強 く ，CAR（Constitutive

たはフェノバルビタール（PB：1mM）を牛初代

androstane receptor）を介してCYP2Bを誘導す

培養肝実質細胞に添加し，48時間後にチトクローる。牛初代培養肝実質細胞のPB刺激に対する応ムＰ450（CYP）の薬物代謝酵素遺伝子の発現を答は，３Ａ４，２Ｃ９，２Ｃ18および２Ｂ６が上昇

解析した。

し，１Ａ１，
１Ａ２および１Ｂ１は変化しなかっ３MCはAhR（Aryl hydrocarbon receptor）のた（Fig.１）。これらのことから，我々の牛初代

リガンドの一つであり，CYP1Aファミリーを誘培養肝実質細胞が，多くの動物種の肝臓および肝導することが知られている。我々の牛初代培養肝細胞で報告されているのと同様に，薬剤に対応し

実 質 細 胞 に お い て も ，３ MC 刺 激 に 対 し て ，た高いCYP誘導能を有しており，その薬物代謝

10000

1A1
1A2

Relative expression

1000

1B1
3A4

100

2C9
2C18

10

2B6
1
0.1
3MC

PB

Fig. 1 Comparison of CYP mRNA expression in bovine primary hepatocytes after

stimulation with 3-methylcholanthrene（3MC）or phenobarbital（PB）of 48 h. Data
are expressed as fold increase in CYP mRNA content compared with control samples（means±SD）．

© The Ito Foundation

mRNA level(fold induction)374

平成28年度120

1A1

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

5

100

4

80

3

60

1B1

2

40

1

20
0

1A2

BH5

BH4

A26

0

BH5

BH4

A26

7
6
5
4
3
2
1
0

BH5

3MC
DMSO

BH4

A26

Fig. 2 Comparison of CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1 mRNA expression by 3-methylcholanthrene （3MC） inimmortalized bovine liver cells（BH5, BH4 and A26 cells）. Data are expressed as fold increase in CYP mRNA
content compared with control samples（means±SD）．

機能をリアルタイムPCRで評価することが可能でて低いことは知られているが，細胞分離の煩雑さあることが明らかとなった。

や個体差・培養条件による結果のバラつきが少な

初代培養肝実質細胞と同様の方法で，BH4，

く，細胞株による毒性試験等の有効性が認められ

BH５およびＡ26細胞の不死化細胞株における３ており８），ヒトの毒性研究に広く用いられている。

MCによるCYP誘導の比較検討を行った。その結報告されているHepG２細胞の３MCによる１Ａ果，１Ａ１の誘導はBH４細胞で最も高く，１Ｂ

２発現が10倍程度であることを考慮すると９），今

１はＡ26細胞で高かった。１Ａ２は細胞間で差が回の不死化細胞によるCYP誘導も，今後の培養認められなかった（Fig.２）。CYP1A１は，主に条件の改善によって向上する可能性がある。ま肝臓以外の臓器で発現し，ラットやヒトでは肝臓た，１Ａ１については高い誘導能が認められるたでの発現は低いとされている 。しかし，牛ではめ，AhRを介する薬物代謝についての解析に十肝臓を含む多くの臓器でCYP1A１の発現が報告分対応できる。３Ａ４などAhR以外の核内レセされており，とくに肝臓と腎臓で高発現していプターを介する薬物代謝酵素の誘導については，る７）。我々の不死化細胞株においても，肝実質細今後さらに検討が必要である。

６）

胞様のBH４およびBH５細胞および筋線維芽細胞

これまで，牛の薬物代謝動態を検討しうる肝臓様のＡ26細胞において，３MC刺激により，１Ａ由来細胞株は報告されてこなかったが，最近，い１，１Ａ２，および１Ｂ１の誘導が認められた。

くつか牛由来の不死化細胞株が報告されていとくに，１Ａ１の誘導は50～100倍と高く，そのる 10，11）。我々のBH４およびBH５細胞は３MCに

うちBH４細胞による誘導が最も高いことが明ら対してCYP1A1，１Ａ２，１Ｂ１の発現能を有しかとなった。一方，１Ａ２と１Ｂ１の誘導は認めており，リアルタイムPCRで発現量を数値化するられるものの，２～５倍であった。１Ｂ１の誘導ことによって，新しい牛の実験動物代替法への応はＡ26細胞で高かったが，１Ａ２の誘導では細胞用が可能である。また，肝臓は肝実質細胞だけで間で差は認められなかった。これらのCYP誘導

なく非実質細胞との複合的な組織であり，様々なは，初代培養肝実質細胞と比べると著しく低かっ

代謝調節を共同で行っている。このため，肝実質た。

細胞株のみの単独培養系よりも，非実質細胞とのヒト肝ガン由来であるHepG２細胞などの細胞複合培養系の方が，薬物代謝においても高い機能株では，CYP発現が初代培養肝実質細胞に比べを保持する可能性が考えられる。今回，筋線維芽© The Ito Foundation

牛由来肝臓細胞における薬物代謝関連遺伝子の解析

細胞様のＡ26細胞は１Ｂ１の発現は最も高く，これらの細胞を組み合わせた複合培養系を構築する
ことで，さらなる薬物代謝発現の高度化が期待さ
れる。
４．要

約

本研究では，牛の飼料汚染物質の簡便な毒性評
価系確立のため，牛初代培養肝実質細胞の薬物代
謝機能を定量的かつ数値的に評価可能なアッセイ系を確立し，牛肝臓由来不死化細胞の薬物代謝関連遺伝子の発現動態を解析した。牛初代培養肝実質細胞は外来性異物代謝酵素を誘導する代表的な薬物である３-メチルコラントレン（3MC）刺激に 対 し て ，CYP1A1 ，１ Ａ ２ お よ び １ Ｂ １ のmRNAが著しく誘導されたが，３Ａ４，
２Ｃ９，
２Ｃ18および２Ｂ６はほとんど誘導されなかった。一方，フェノバルビタール（PB）刺激に対しては，３Ａ４，
２Ｃ９，
２Ｃ18および２Ｂ６が上昇し，１Ａ１，１Ａ２および１Ｂ１は変化しなかった。不死化細胞株である，牛肝実質細胞様の
BH4，BH５および筋線維芽細胞様のＡ26細胞における３MCによるCYP誘導を比較したところ，
１Ａ１の誘導はBH４細胞で最も高く，１Ｂ１はＡ26細胞で高かった。１Ａ２は細胞間で差が認められなかった。これらの牛肝臓由来不死化細胞株の単培養系は，初代培養細胞と同水準ではないものの，一定のCYP誘導能を有し，毒性評価系への利用が可能であることを見出した。
文
献１）Crispe, I. N. : The liver as a lymphoid organ, Annual
Review of Immunology，27，147～163，2009．
２）Guruge, K. S., Yamanaka, N., Hasegawa, J.,
Miyazaki, S. : Differential induction of cytochrome
P450 1A1 and 1B1 mRNA in primary cultured
bovine hepatocytes treated with TCDD, PBDD/Fs

375

and feed ingredients, Toxicology Letter，185（3），193～196，2009．
３）Yoshioka, M., Takenouchi, T., Kitani, H., Okada, H.,
Yamanaka, N. : Establishment of SV40 large T
antigen-immortalized bovine liver sinusouidal celllines and their immunological responses todeoxynivalenol and lipopolysaccharide, Cell Biology
International，40（12），1372～1379，2016．
４）Yoshioka, M., Watanabe, A., Shimada, N., Murata,
H., Yokomizo, Y., Nakajima, Y. : Regulation of
haptoglobin secretion by recombinant bovine
cytokines in primary cultured bovine hepatocytes,
Domestic Animal Endocrinology，23（3），425～433，
2002．
５）Takenouchi, T., Yoshioka, M., Yamanaka, N.,
Kitani, H. : Reversible conversion of epithelial andmesenchymal phenotypes in SV40 large T antigenimmortalized rat liver cell lines, Cell Biology
International Reports, 17（1），e00001，2010．
６）Ioannides, C. : Cytochrome P450 expression in theliver of food-producing animals, Current Drug
Metabolism，７，335～348，2006．
７）Darwish, W. S., Ikenaka, Y., Ghareeb, W. R.,
Ishizuka, M. : High expression of the mRNA ofcytochrome P450 and phase II enzymes in the lungand kidney tissues of cattle, Animal，４（12），2023～
2029，2010．
８）Westerink, W. M. A., Schoonen, W. G. E. J. :Cytochrome P450 enzyme levels in HepG2 cells andcryopreserved primary human hepatocytes andtheir induction in HepG2 cells, Toxicology in Vitro ，21，1581～1591，2007．
９）Choi, J. M., Oh, S. J., Lee, S. Y., Im, J. H., Oh, J. M.,
Ryu, C. S., Kwak, H. C., Lee, J. Y., Kang, K. W., Kim,
S. K. : HepG2 cells as an in vitro model forevaluation of cytochrome P450 induction byxenobiotics, Archives ofPharmacal Research，38（5），691～704，2015．
10）Donai, K., Kiyono, T., Eitsuka, T., Guo, Y., Kuroda,
K., Sone, H., Isogai, E., Fukuda, T. : Bovine andporcine fibroblasts can be immortalized with intact
karyotype by the expression of mutant cyclin
dependent kinase 4, cyclin D, and telomerase,
Journal of Biotechnology，176，50～57，2014．
11）Gleich, A., Kaiser, B., Schumann, J., Fuhrmann, H. :Establishment and characterization of a novel
bovine SV40 large T-antigen-transduced foetal
hepatocyte-derived cell line, In Vitro Cellular &Developmental Biology-Animal，52 ， 662 ～ 672 ，
2016．

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376

山間地耕作放棄地内野草放牧と畜舎内濃厚飼料多給で生産されたサフォーク種ラム肉の食味および呈味
成分の比較
Comparison of the taste and the taste components in the meat between
Suffolk lambs fattened by grazing on wild grass in abandoned fields inhilly area and those fattened by high concentrates diet in feeding barns

石田元彦・西村 苑夏・矢地 彩加・吉田 彩乃・
浅野 桂吾・長井
誠・小西 康子（石川県立大学生物資源環境学部）

Motohiko Ishida, Sonoka Nishimura, Ayaka Yachi, Ayano Yoshida,
Keigo Asano, Makoto Nagai and Yasuko Konishi（Faculty of Bioresources and Environmental Sciences, Ishikawa Prefectural University）

Nutrients intake, blood metabolites, carcass traits, the taste and the taste components ofthe meat in lambs fattened by grazing on wild grass grown in abandoned farm lands of hilly
area were compared with those in lambs fattened by feeding high concentrates diets at feedingbarns. Ten Suffolk lambs were used. Five of the lambs were allotted to either indoor treatment
where lambs were fed the diet composed of 30％ barley hay and 70％ concentrate on a dry
matte basis or grazing treatment where lambs were grazed on wild grass grown in abandoned
farm lands of hilly area, and the feeding trials were conducted for 133 days from July to
November. After feeding trials, the lambs were slaughtered to determine carcass traits. The
eating quality tests of the meat were conducted by four chefs and the principal component
analysis on the taste components in the meat determined by the metabolome analysis werealso carried out. The intake of crude protein and total digestible nutrients were notsignificantly different between the treatments except August when the intake were higher in
the indoor treatment than in grazing treatment. As the trials proceeded after August, theintake increased in the grazing treatment and decreased in the indoor treatment. The blood
metabolites analysis suggested the improvement of nutrition and immune in the grazing
treatment and disorders in lever in the indoor treatment. The daily gain and carcass weighttended to be lower in the grazing treatment than in indoor treatment. The dressing percentage
was significantly lower in the grazing treatment than in indoor treatment（P＜0.05）. Although
the factor 1 of the principal component analysis showed the remarkable difference in the taste
components between the treatments, there was no significant difference in the R-index value ofthe eating quality tests between the treatments. The results suggested a possibility to makebrand meat by using lambs fattened by grazing on wild grasses grown in abandoned farmlands of hilly areas because they were healthier than those fattened by feeding highconcentrate diets in feeding barns and the taste of the meat might be different between them.

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山間地耕作放棄地内野草放牧と畜舎内濃厚飼料多給で生産されたサフォーク種ラム肉の食味および呈味成分の比較

１．目

377

うとした試みはない。

的

そこで，本研究では山間部耕作放棄地において

国産ヒツジ肉の商品価値は高い。著者らが行っ放牧肥育したヒツジと畜舎で濃厚飼料多給肥育した北海道と長野県の調査においては，枝肉１㎏あたヒツジとの養分摂取量，血液性状，枝肉性状，

たり2,900円で生産者が販売していた。この価格

肉の呈味成分と食味を比較，検討した。

は平成28年５月東京市場での和牛去勢Ａ-４の価
格，2,709円と比べても高かった。
著者らは，平成25年度に石川県立大学附属実験

２．方
2.1

法

飼養試験

農場で生産したラム肉を用いて石川の農林漁業まａ）供試動物と処理区：サフォーク種去勢ヒツ

つりにおいて試食・アンケート調査を行うととも

ジ10頭（平均体重31.6㎏，平均日齢147日）を供に，金沢市内のレストランにラム肉を用いた料理

試し，平均体重と日齢が等しくなるように畜舎区試作を依頼，検討した結果から，県内産ラム肉をと放牧区の各処理区に５頭ずつ割り当てた。

求める消費者，飲食店，食肉卸売業者が多く存在

ｂ）寄生虫予防対策：試験前に駆虫剤（イベルすることを見出した。また，平成27年度に山間部

メクチン１％）注射を行い，１ヶ月に１回糞便検耕作放棄地において野草を用いた放牧試験を実施

査を実施して寄生虫が認められた場合に駆虫した。

し，子ヒツジを放牧肥育することによって放牧終ｃ）飼養管理：畜舎区の試験は石川県立大学実。

験農場畜舎において平成28年７月20日から133日

一方，山間部には狭小で機械化のできない圃場

間実施した。ヒツジを木製スノコ床ペンに１頭ずが多く，効率的な農業生産ができないことから，つ収容し，１日あたり200ｇ増体するのに必要な過疎化，高齢化が進行している。このような耕作

可消化養分総量（TDN）を満たすようにエンバ

放棄地において放牧によるヒツジ生産を行えば生ク乾草と濃厚飼料（規格外大麦と大豆粕を95：５

産物をブランド化でき大きな付加価値を付けるこの割合で混合したもの）を３：７の割合で給与しとができるものと期待できる。

た。水は自由飲水とした。

了時生体重50㎏を達成できる可能性を得た

１，２）

ブランド化する場合，イメージだけでなく，生放牧区の試験は石川県白山市木滑区の耕作放棄

産物の食味に特徴があり，その理由を科学的に証地において平成28年７月20日から132日間実施し明できれば，さらに付加価値を高めることができた。耕作放棄地に２ａの牧区を８区画設け，約４る。従来，ラム肉は畜舎内でエネルギー価の高い

日おきに転牧を行った。１日あたり50ｇ増体する穀類を主体とした飼料を与えて生産されている。

のに必要なTDNを満たすように規格外大麦と市

これに対して，山間部放棄地での放牧では草主体

販大豆粕を混合した補足飼料を給与した。水は自の飼養で肥育される。牧草を栽培した人工草地で

由飲水とした。飼料摂取量を測定するために補足の放牧で肥育されたラム肉は，畜舎において穀類

飼料にはDoveらの方法４）に従ってミツロウを塗多給で肥育されたものよりも肉は赤身の多いもの布した。10月，11月は放牧地の野草では十分な飼となり，より消費者に好まれると報告されてい料を摂取することができなくなったため，エンバ

る 。しかしながら，著者らの知る限り，放牧とク乾草と稲ホールクロップサイレージを給与した。

濃厚飼料多給肥育ヒツジ肉との間の食味の違いとｄ）測定項目と方法：放牧区，舎飼区ともに２その差異をもたらす呈味成分を科学的に解明しよ

週間ごとに体重測定を行った。畜舎区では毎日残３）© The Ito Foundation

378

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

飼を回収し，その重量を測定した。残飼は１週間

畜舎区と放牧区の各１頭の枝肉の左半丸から部分ごとに混合して採取し，給与した飼料原料を飼料肉としたロース部分を－20℃で冷凍保存してお秤量時に採取した。放牧区では採食状況調査におき，食味試験前日に室温にて約12時間かけて半解ける上位10種の野草を，転牧直後に採取するとと凍し，５㎜厚，20ｇ程度にスライスしたものを供

もに，ミツロウ標識補足飼料，11月に与えたエン試した。

バク乾草と稲ホールクロップサイレージを飼料秤
量時に採取した。また，転牧時の朝の飼料給与前ｂ）パネリスト：金沢市内飲食店のシェフ，料理長など４名であった。

にひとつかみ程度の直腸糞を全頭から採取した。

ｃ）食味試験の実施方法：２試料間に差がある採取した試料は60℃で24時間乾燥後，粉砕して分かどうかを明らかにするために，Ｒ-インデック

析に供した。各飼料の乾物，粗灰分，総繊維，高ス法を採用し，クローズドパネルで実施した。テ

消化性繊維，低消化性繊維を測定し，出口らの式５）

スト時間は午後１時～３時頃とし，それぞれの食で TDN 含 量 を 算 出 し た 。ア ル カ ン の 分 析 は肉を同一条件で焼いた調理試料を調製し同一形状

Narvaez et alの方法を参考にして行った。飼の容器に入れ，パネリストに提供した。パネリス

料摂取量の算出は，畜舎区においては乾物給与量

トは予備ラウンドで試料のかたさや味などで２試と残飼乾物量の差から算出し，それにTDN含量料間の違いについて自己の判断基準を設定し，そを乗じてTDN摂取量を算出した。放牧区では野の基準をもとに，本評価では12試料について６段

草，エンバク乾草，稲ホールクロップサイレージ，階で評価した。得られた評点結果を統計解析してミツロウ標識補足飼料の採食割合を計算ソフト

２試料間の差の検定を行った。さらにGC/MS分

EATWHAT ７）（Dove et al 1995）を 用 い て 算 出

析によるメタボローム解析を実施，主成分分析をした。この値を用いて野草と各飼料の乾物摂取量

実施して２試料間の差を化学的見地からも検証しを以下の式を用いて算出した。各野草と飼料の乾た。

６）

物摂取量にそれぞれのCPとTDNの含量を乗じてCPとTDNの摂取量を算出した。
IT＝IS/PS
IF＝IT×PF

３．結果と考察
3.1

・・・
（１）

養分摂取量

CPとTDNの摂取量をFig.１に示す。８月では

・・・
（２）

こ こで，IT：総摂取量（ｇ），IS：補足飼

CP，TDNともに放牧区の方が畜舎区よりも有意

料摂取量（ｇ），PS：補足飼料割合（％），に低かった（Ｐ＜0.05）。しかし，８月から11月

IF：各野草摂取量（ｇ），PF：各野草摂取にかけての摂取量は試験の進行とともに放牧区で割合（％）

増加，畜舎区で低下したために，９月以降の摂取試験終了後と殺解体し，枝肉重量を測定して枝量は両区で差は認められなかった。畜舎区では濃肉歩留を算出し，第12-13肋骨間切開面の背脂肪

厚飼料多給の影響でアシドーシスとなったために厚を測定した。

飼料摂取量が低下したと考えられた。一方，放牧ｅ）得られたデータを分散分析して両区の差を

７時までの放牧を控えたため，８月はヒツジが暑

検定した。
2.2

区では寄生虫対策として午後５時から翌日の午前
熱の影響で昼間に放牧地へ出る時間が少なくな

食味試験と呈味成分分析ａ）供試試料：飼養試験終了後にと殺解体したり，草の摂取量が低下したが，９月以降気温が低© The Ito Foundation

379

山間地耕作放棄地内野草放牧と畜舎内濃厚飼料多給で生産されたサフォーク種ラム肉の食味および呈味成分の比較
(a)

1.5

1.75 x1.50a＊1.31a 1.35

y1.20 b
0.89 b 0.91

1.0y

0.58 y0.5

0.0

AugustSeptember(b)

IndoorGrazing

OctoberIndoorGrazing

60
TDN intake, g/MBS/day

Crude protein intake, g/MBS/day

2.0

50

43.7 a40

40.6 a34.4

42.5 x40.1x

x30.3 b30
17.7 y20
100November

50.4 a＊AugustSeptember

OctoberNovemberFig. 1 Comparison of crude protein（a）and total digestible nutrients（b）intakes between indoor and grazing treatments.
TDN: Total digestible nutrients, MBS: Metabolizable body weight
＊indicates that means are significantly different between indoor and garzing（P＜0.05）.
 indicate that means are significantly different among months within indoor treatments（P＜0.05）.
a, b indicate that means are significantly different among months within grazing treatments（P＜0.05）
.
x, y

＊

110
100

＊

90
80
70
60

Indoor50

Grazing

75
70
65
60
55
50
45

Indoor40

Grazing
7/22

8/26
9/23
month/day

10/17

＊
＊

100
90
80
70
60

Indoor

50

16

(c)

(b)

110

40

7/22 8/10 8/26 9/8 9/23 10/5 10/17
month/day

80

35

γ-Glutamyl transpeptidase
（μl）

120

40

Glucose（mg/dl）

120

＊

(a)

130

Blood urea-nitrogen（mg/dl）

White blood cell（×102/μl）

140

15Grazing
7/22

8/26
9/23
month/day

＊

10/17

(d)

14
13
12

＊

11
10
9
8

Indoor7
6

Grazing
7/22

8/26
9/23
month/day

10/17

Fig. 2 Changes in white blood cell（a）, γ-glutamyl transpeptidase（b）, glucose（c）and urea-nitrogen（d）in blood of lambs.
Gray area fills show the range of the normal values of each metabolites.
 indicates that means are significantly different between indoor and grazing treatments within the same day（P＜0.05）.
＊© The Ito Foundation

380

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

下するとともに採食時間が長くなって草の摂取量

月を除いて差は認められなかった（Fig.１）が，が高まったと考えられた。放牧区のCP摂取量が放牧区では放牧地を移動するためのエネルギーが11月に低下したのは，冬季となり粗タンパク質の必要で増体に利用できるエネルギーが畜舎区より高い野草の摂取をできなくなったためであった。

も少なかったために増体量が低くなったと考えら

3.2

血液性状

れた。枝肉重量は終了時体重の高かった畜舎区の血液成分の測定結果をFig.２に示す。白血球数ほうが高い傾向にあり，枝肉歩留は畜舎区が有意は畜舎区では試験の進行とともに低下し，９月とに高かった（Ｐ＜0.05）。放牧ヒツジは草主体の10月においては放牧区の方が有意に高かった（Ｐ

飼料摂取となるために繊維の摂取量が多く，消化＜0.05）。白血球数は免疫と関係することから，

管内容物の重量が重くなったために枝肉歩留が畜畜舎飼養では養分摂取量の低下とともに免疫が低

舎飼養ヒツジよりも低くなると考えられた。ま下するが，放牧においては摂取量の増加とともにた，放牧区では増体に向けられるエネルギーが少免疫が高まることが示唆された。γグルタミルト

なく，背脂肪が畜舎区に比べて薄くなったと考え

ランスペプチダーゼは畜舎区において試験の進行られた。

とともに高まったが，放牧区においては低下傾向

3.4にあり，９月と10月において畜舎区は放牧区より

呈味成分の主成分分析結果をFig.３に示す。第も有意に高く（Ｐ＜0.05），正常値を上回った。

一主成分において大きな差が認められた。食味試

これより，濃厚飼料多給によって肝機能障害が発験の結果をTable２に示す。２試料の違いを識別生する可能性が示唆された。グルコースは畜舎区

できない場合のR-indexは0.500，識別した場合はで低下傾向にあったが，放牧区では増加傾向に

1.000 で あ る 。４ 番 の パ ネ リ ス ト の み が 高 いあった。畜舎区においては，TDN（エネルギー）

R-index値を示し，両区のラム肉の違いを識別で摂取量の低下に伴いグルコースが低下し，放牧区

きたが，残りの３名のパネリストの値は低く食味ではその逆の現象が生じたものと考えられた。血の違いを識別できなかった。差を分かりにくくし

液中尿素態窒素（BUN）濃度は第一胃内の粗タた原因として，塩の味付けが強過ぎたこと，また，ンパク質とエネルギーの過不足を示唆する。

コショウの使用がラム肉の香りの違いを分かりにBUNが高いとエネルギー摂取不足を示し，低い

くくしたことが考えられた。

呈味成分と食味と粗タンパク質不足を意味する。畜舎区において本試験の結果，放牧肥育されたヒツジは畜舎肥は試験期間中正常値の下限に近く，粗タンパク質

育ヒツジに比べて発育は遅いものの，健康であが不足気味であったことが示唆された。一方，放り，ラム肉の呈味成分が異なることが示唆された

牧区では８月，９月とは正常値範囲内にあった（Fig.３）ことから，放牧仕上げによって従来のが，10月に低下した。野草の生育が停滞する秋にラム肉と食味の異なるラム肉のブランド化の可能は草摂取量が低下するために粗タンパク質不足に性が示唆された。今後は，放牧ヒツジの発育の改陥ることが示唆された。

善とラム肉への味付けを控えた食味試験を実施す

3.3

増体量，枝肉性状ることが望まれる。

体重，日増体量，枝肉性状の結果をTable１に示す。終了時体重と日増体量は畜舎区のほうが高い傾向が認められた。養分摂取量は両区の間で８４．要

約

野草が自生する山間部耕作放棄地において放牧© The Ito Foundation

山間地耕作放棄地内野草放牧と畜舎内濃厚飼料多給で生産されたサフォーク種ラム肉の食味および呈味成分の比較

381

Table 1 Live body weight, daily gain, carcass weight, dressing percentage

and thickness of back fat.
Treatment

Items
Number of lamb（head）
Initial body weight（kg）

P value

IndoorGrazing432.2±2.7１）5－31.1±2.4

0.77

Final body weight（kg）

42.0±3.437.7±3.0

0.38

Daily gain（g/day）

76.8±12.0

50.8±10.8

0.15

Carcass weigt（kg）
Dressing percentage（％）

19.7±1.646.9±1.1

16.1±1.442.7±1.0

0.14
＜0.05

Thickness of back fat（mm）

3.2±0.6

1.3±0.5

0.05

１）Mean±standard error

30

Factor 2（1.76％）

No.10②20

10

No.10④

－150

No.9①

－100

－50

0

No.9④

0

50

－10
No.10①

100

150
No.9 ②

No.10③
－20

No.9③

－30
Factor 1（97.75％）
Fig. 3 Result of the principal component analysis on taste components obtained by metabolome analysis.

乾草と濃厚飼料を３対７の割合で与える畜舎区とTable 2 R-index of the panellists
Panellist

R-index

自然草地に８区画の放牧地を設け４日ごとに転牧

1

0.736

する放牧区に割り当てて飼養試験を実施した。飼

2

0.583

3

0.458

養試験の終了後，と殺解体して枝肉性状を調査

4

0.847

Total

0.63

し，メタボローム解析による呈味成分の主成分分析を実施するとともに，調理専門家をパネラーとした食味試験を実施した。その結果，粗タンパク

肥育したヒツジの養分摂取量，血液性状，枝肉性質と可消化養分総量の摂取量は８月を除いて両区状，肉の食味と呈味成分を畜舎において濃厚飼料に差は認められなかったが，試験の進行に伴って多給で肥育したヒツジと比較した。サフォーク種

畜舎区においては低下，放牧区では増加した。血去勢ヒツジ10頭を５頭ずつ２群に分け，エンバク液検査の結果から放牧区では栄養状態と免疫の向© The Ito Foundation

382

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

上が示唆されたが，畜舎区においては肝機能障害が認められた。日増体量と枝肉重量は，放牧区で畜舎区よりも低い傾向にあり，枝肉歩留は放牧区
が畜舎区よりも有意に低かった（Ｐ＜0.05）。呈
味成分の主成分分析の第一主成分において，両区のラム肉には明らかな違いが認められたが，食味試験のR-index値は両区の間で有意な差は認められなかった。以上の結果から，放牧肥育されたヒ
ツジは畜舎肥育ヒツジに比べて発育は遅いものの，健康であり，ラム肉の呈味成分が異なることが示唆されたので，野草地放牧肥育で生産される
ラム肉をブランド化できる可能性が示唆された。
文献１）中谷晏子，伊藤愛莉，長井千恵，浅野桂吾，石田元彦：山間部耕作放棄地でのヒツジ放牧における野草地の植生，採食草種の変化，日本草地学会誌，62（別号），ｐ51，2016．

２）伊藤愛莉，長井千恵，中谷晏子，浅野桂吾，石田元彦：耕作放棄地に放牧したヒツジのアルカン法による採食草の構成と採食量の推定，日本草地学会誌，
62（別号），ｐ52，2016．
３）Zervasa, G., Hadjigeorgioub, I., Zabelic, G.,
Koutsotolisc, K., Tzialac, C. : Comparison of agrazing-with an indoor-system of lamb fattening in
Greece, Livestock Production Science，61 245～251，
1999．
４）Dove, H., Scharch, C., Olivan M., Mates, R. W. :Using n-alkanes and known supplement intake toestimate roughage intake in sheep, Animal. Prod.
Aust.，24，57～60，2002．
５）出口健三郎，甘利雅拡，柾木茂彦，阿部亮：寒地型イネ科牧草数種を込みにしたTDN含量の推定および推定精度の草種間差異，日本草地学会誌，43（別号），290～291，1997．
６）Narvaez, N., Brosh A., Pittroff, W. : Use of n-alkane
to estimate seasonal diet composition and intake ofsheep and goats grazing in California chaparral,
Small Ruminant Research，104，129～138，2011．
７）Dove, H., Moore, D. : Using a least-squares
optimization procedure to estimate botanicalcomposition based on the alkanes of plant cuticularwax, Aust. J. Agric. Res.，46，1535～1544，1995．

© The Ito Foundation

383

黒毛和種肥育牛への穀物飼料増給に対するルーメン微生物相の応答に関する研究
Response of rumen microbiota to grain-diet level during fattening period
in Japanese Black cattle

小

池

聡

（北海道大学大学院農学研究院）

Satoshi Koike（Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University）

Japanese Black（JB）is the most popular beef breed and accounts for 60％ of beef cattle inJapan. In order to produce marbling meat, JB cattle are fed concentrate-based diet for over
one year. It can be assumed that rumen microbiota of this breed is adapted to long-term
feeding of concentrate diet. In this study, we aimed to identify the core microbiome and its
compositional changes during fattening period in the rumen of JB cattle. Thirty-two fattening
JB cattle were employed in the present study. Ruminal content was collected at different
fattening stages（17-month-old as early fattening stage, 19- to 21-month-old as mid fatteningstage and 26-month-old as finishing stage）using the stomach tube. Total DNA was extracted
from the individual rumen samples and employed for real-time PCR quantification ofrepresentative bacterial species/groups. Butyrivibrio group, Lachnospiraceae OTU 8, Prevotella
genus, Ruminococcus bromii-related group C1 and novel group U4 had higher population size
compared to the other bacterial species, and sum of these five bacterial groups occupied morethan 30％ of total bacteria, irrespective of fattening stages. Therefore, these five bacterialgroups were considered to be a core member of rumen microbiota（i.e., core microbiome）of JB
cattle. However, the composition of core microbiome fluctuated during fattening periods; rumen
microbiome of JB cattle was dominated by either Prevotella genus or R. bromii-related group
C1. Prevotella genus-dominated microbiome seemed to be more common in early-and finishingstage of fattening cattle, while R. bromii C1-dominated microbiome tended to be common in
mid fattening stage. These findings indicate that key bacterial species in the rumen of JB cattle
differ during fattening period.

１．目

黒毛和種は脂肪の蓄積，特に筋繊維間脂肪の増加

的率が高く２），肉質の良さ（霜降り肉）が世界的に黒毛和種は日本国内で約177万頭が飼育され，有名である。本品種は霜降り肉を生産するため

国内肉用牛飼養頭数の約65％を占める１），日本にに，１年半以上の長期間にわたって濃厚飼料を多おける重要な肉用牛である。他の牛品種に比べて給する特徴的な条件で飼養される。一方，濃厚飼© The Ito Foundation

384

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

料多給条件下においては澱粉分解性の乳酸菌群飼養された黒毛和種肥育牛32頭（すべて去勢）を（Streptococcus bovisなど）の過増殖に起因する用いた。供試牛の出荷月齢は28ヶ月齢で，17，

ルーメン発酵停滞が起こりやすく，長時間にわた

19，21および26ヶ月齢の時点で給餌４時間後のりルーメン内pHが5.5を下回る亜急性アシドーシ

ルーメン内容物を経口採取した。給与飼料は乾ス，場合によってはpH５を下回る急性アシドー

草，麦稈および肥育用配合飼料による慣行飼料

シスに発展する 。これにより，消化不良や食欲（ｎ＝16），一部をコーンサイレージに置換した飼減退が引き起こされ，回復が遅れた場合には肉生料（ｎ＝８）もしくは一部をコーンサイレージと産に大きなダメージを与える。このように濃厚飼

飼料用米に置換した飼料（ｎ＝８）とした。採取料多給時にはルーメン内での発酵代謝障害の発生したルーメン内容物は液相と固相を分離せずに分４）

リスクが増加するため ，黒毛和種においても析まで－80℃で凍結保存した。採取したルーメン

ルーメン発酵の安定維持に貢献するコア菌群を特内容物からRepeated Bead Beating Plus Column

定し，それらを破綻させない飼養管理が重要とな

法５）により各個体のルーメン内容物サンプル中のる。

総DNAを抽出した。黒毛和種ルーメン内で重要

３）

当研究グループでは黒毛和種肥育牛のルーメンな働きをするコア微生物群を特定するために，慣細菌叢の解析に着手しており，これまでにいくつ

行飼料で育成および肥育を実施した７個体についか の 基 礎 的 知 見 を 得 て い る 。す な わ ち ，16Sて次世代シーケンサー（MiSeq）による網羅的微rRNA遺伝子クローンライブラリ解析により黒毛生物相解析を実施した。これにより特定されたコ

和種牛ルーメン微生物相を構成する主要微生物群

ア微生物群のうちデンプン分解菌と類推された23群がルーメン全体の約40％を占めることを突き

Prevotella 属 細 菌 ， Butyrivibrio グ ル ー プ ，

止めている（未発表データ）。これら23群には既Lachnospiraceae OTU8 ， Ruminococcus bromii

知 の デ ン プ ン 分 解 性 細 菌 で あ る Ruminococcus

近縁グループＣ１および新規細菌群Ｕ４について

bromiiやButyrivibrio属細菌などが含まれること

real-time PCR定量を行い，これら菌群の肥育期から，黒毛和種ルーメン内において濃厚飼料の分間を通した活性変動をモニタリングした。

解発酵に貢献している可能性が高いものと考えられる。一方，それらの分布量は肥育ステージによ３．結果と考察り変動することも判明している。したがって，肥次世代シーケンシングによる網羅的菌叢解析の育の進行に伴う濃厚飼料増給によってルーメン微結果をFig.１に示す。先行研究にて高頻度で検出

生物相が変動すると推察されるが，詳細についてさ れ た Prevotellaceae 科 ，Lachnospiraceae 科 ，は不明な点が多い。そこで本研究では肥育期間をRuminococcaceae科およびUnclassified Clostridiales

通してルーメン微生物相の変動をモニタリングすが本研究でも主要菌群として認められた。これらることで，黒毛和種において安定的なルーメン発

４分類群の個体ごとの分布量は，Prevotellaceae

酵を支える重要微生物を明確にすることを目的と科が8.96から31.88％，Lachnospiraceae科が5.88かした。

ら11.72％，Ruminococcaceae科が15.49から34.41％

２．方およびunclassified Clostridialesが7.17から27.41％

法であり，いずれの個体においても他の菌群に比べ供試動物は北海道立総合研究機構畜産試験場でて 検 出 割 合 が 高 か っ た 。こ れ ら ４ 分 類 群 に は© The Ito Foundation

黒毛和種肥育牛への穀物飼料増給に対するルーメン微生物相の応答に関する研究

385

100

% of total reads

80

others60

UnclassiﬁedClostridiales
Ruminococcaceae

40

Lachnospiraceae

20
Prevotellaceae
423Z

420Z

417Z

416Z

407Z

405Z

403Z

0

Animal ID
Fig. 1 Determination of core rumen microbes in Japanese Black cattle by MiSeq

100
80
60

% of total bacteria

40
20
10
8
6
4
2
0.5
0.0
la

el

ot

s

u
en

g

v
re

P

ib

riv

y
ut

rio

p

ou

gr

ii

R.

B

m
ro

1

C

b

el

ov

N

p

u
ro

g

4

U

sp
no
h
c 8
La TU
O

ae

ce

ira

Fig. 2 Quantification of core starch degraders in the rumen of Japanese Black cattle

Prevotella属細菌（Prevotellaceae科），Butyrivibrio

た，未培養ではあるものの，分子系統位置からグループ（Lachnospiraceae科），R. bromii近縁

Lachnospiraceae OTU８についてもデンプン分

グループＣ１（Ruminococcaceae科）または新規解能を有する可能性が極めて高いことが当研究グ

細 菌 群 Ｕ ４（Unclassified Clostridiales）と い っ

ループの先行研究において示唆されている（未発たデンプン分解能をもつ分離株が属している。ま表データ）。そこで，デンプン分解に貢献すると© The Ito Foundation

386

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

一方，重要５菌群の分布量はサンプルの間の変ルを対象にreal-time PCRによる定量的モニタリ

動が大きく，分布量は個体もしくは肥育ステージ

ングを行った（Fig.２）。定量した５菌群のうち，の影響を強く受けることが示唆された。そこで，

Prevotella属細菌およびR. bromii近縁グループＣ各菌群の分布量の相関解析を実施したところ，

１の分布量が多く，個体ごとの分布量はそれぞれ

Prevotella属細菌は他４菌群のいずれとも分布量

総細菌の2.79から27.41％および0.12から86.55％をに 負 の 相 関 が あ る こ と が 判 明 し た 。一 方 ，R.

占めたPrevotella属細菌およびR. bromii近縁グ

bromii近縁グループＣ１，Butyrivibrioグループ，

ループＣ１の分布量の中央値はそれぞれ11.00％

Lachnospiraceae OTU８および新規細菌群Ｕ４および15.60％であり，半数以上のサンプルにおいの４菌群はいずれも分布量に正の相関が認められて総細菌の10％以上を占めていた。Butyrivibrio

た。そこでPrevotella属細菌の分布量を他の４菌グループ，Lachnospiraceae OTU８および新規群の合計分布量と比較したところ，給与飼料を問

細菌群Ｕ４の総細菌に占める割合はそれぞれ1.45

わず負の相関が確認され（Fig.３），両者が競合から9.86％，OTU８が0.06から8.44％，Ｕ４が0.03

関係もしくは補完関係にあることが示唆された。

か ら 6.87 ％ で あ っ た 。Butyrivibrio グ ル ー プ ，

この可能性について確認するために，肥育前期，

Lachnospiraceae OTU８および新規細菌群Ｕ４の中 期 ，後 期 に お け る 両 者 の 分 布 量 を 比 較 し た

分布量の中央値はそれぞれ3.25％，3.32％および（Fig.４）。慣行肥育では肥育ステージを通じて

2.74％だった。これら５菌群の分布量の合計値は，Prevotella属細菌および４菌群の分布量に有意な総細菌の11.73から107.0％であった。以上の結果

変動は見られなかったが，コーンサイレージや飼から，黒毛和種ルーメン内ではPrevotella属細菌，

料用米を給与すると肥育中期にPrevotella属細菌

R. bromii近縁グループＣ１，Butyrivibrioグルーの 減 少 も し く は R. bromii 近 縁 グ ル ー プ Ｃ １ ，プ，Lachnospiraceae OTU８および新規 細菌群

Butyrivibrioグループ，Lachnospiraceae OTU８

Ｕ４が主要な構成メンバーであり，いずれもデン

および新規細菌群Ｕ４の増加が認められた。これ

プン分解性細菌であることから，これらが濃厚飼

らの結果は濃厚飼料が増給される肥育中期に料の分解，発酵において重要な役割を担っている

Prevotella属細菌が減少し，それをR. bromii近縁グ可能性が高い。

ループＣ１，Butyrivibrioグループ，Lachnospiraceae

Sum of four core starch degraders*（% of total bacteria）

考えられる上記５菌群について全個体・全サンプ

Conventional diet
80

R²=0.130
P<0.001

60
40
20
0

0

10

20

30

Conventional + corn silage
50

Conventional + corn silage + rice100

40

R²=0.289
P=0.002 80

30

60

20

40

10

20

40

0

0

10

20

30

40

0

R²=0.219
P=0.007

0

10

20

30

genus Prevotella（% of total bacteria）

Fig. 3 Correlation between genus Prevotella and the other four core starch degraders determined by real-time PCR＊

sum of population sizes of R. bromii C1, Butyrivibrio group, Lachnospiraceae OTU 8 and novel group U4© The Ito Foundation

40

387

黒毛和種肥育牛への穀物飼料増給に対するルーメン微生物相の応答に関する研究
Conventional diet% of total bacteria

60

Conventional + corn silage
abc

17mo
19mo
21mo
26mo

40

ab

20

b

a

P<0.05ba aaConventional + corn silage + rice

b

b

b

b

ab

0
genus
Prevotella

Sum of four core
starch degraders*Fig. 4 Population changes of genus Prevotella and the other four core starch degraders during fattening periods＊

sum of population sizes of R. bromii C1, Butyrivibrio group, Lachnospiraceae OTU 8 and novel group U4

OTU８および新規細菌群Ｕ４が補完する形でのと考えられた。一方，５菌群の分布量は個体もルーメン発酵が維持されることを示唆している。

しくは肥育ステージによって変動し，Prevotella

４．要

属細菌とその他の４菌群の分布量に負の相関が認約められた。特に飼料条件によっては肥育中期に黒毛和種牛の安定生産において健全なルーメン

Prevotella属細菌の減少とR. bromii近縁グループ，

発酵は極めて重要である。肥育期間を通してルー

Butyrivibrioグループ，Lachnospiraceae OTU８メン微生物相の変動をモニタリングすることで，および新規細菌群Ｕ４の増加が認められた。これ

黒毛和種において安定的なルーメン発酵を支えるらの結果から，濃厚飼料が増給される肥育中期に重要微生物を明確にすることを目的とした。黒毛Prevotella属細菌が減少し，それをR. bromii近縁グ

和種肥育牛32頭から肥育前期，中期および後期のループＣ１，Butyrivibrioグループ，Lachnospiraceae

時点でルーメン内容物を経口採取し，MiSeqおよ

OTU８および新規細菌群Ｕ４が補完する形で

びreal-time PCRによる菌叢解析に供した。黒毛和種

ルーメン発酵が維持されることが示唆された。

牛ルーメン内ではLachnospiraceae, Prevotellaceae,
Ruminococcaceae お よ び unclassified Clostridialesに属する細菌が総細菌の半数以上を占めた。なかでもデンプン分解菌と類推される５つの細菌群（Butyrivibrioグループ，Lachnospiraceae OTU8，
Prevotella 属 ，Ruminococcus bromii 近 縁 グ ル ープおよび新規細菌群Ｕ４）はいずれも総細菌の１％以上の割合で検出され，合計で総細菌の30％以上を占めていた。したがって，この５細菌群が文
献１）農林水産省：平成25年度畜産統計調査，東京，
2014．
２）Gotoh, T., Albrecht, E., Teuscher, F., Kawabata, K.,
Sakashita, K., Iwamoto, H., Wegner, J. : Meat Sci.,
82，300～308，2009．
３）Nagaraja, T. G., Titgemeyer, E. C. : J. Dairy Sci.,
90 : E17～38，2007．
４）Khafipour, E., Li, S., Plaizier, J. C., Krause D. O. :Appl. Environ. Microbiol.，75，7115～7124，2009．
５）Yu, Z., Morrison, M. : Appl. Environ. Microbiol.,70，4800～4806，2004．

黒毛和種牛ルーメン内の重要細菌群であり，これ
らの安定分布が健全なルーメン発酵の鍵を握るも© The Ito Foundation

388

糖代謝産物および終末糖化産物がブロイラーの生産性に与える影響の解明
Studies on the effect of sugar metabolite and advanced glycation
endproducts on broiler production

橘

哲

也・牧

野

良

輔

（愛媛大学大学院農学研究科）

Tetsuya Tachibana and Ryosuke Makino（Graduate School of Agriculture, Ehime University）

The aim of this study was to investigate the presence of methylglyoxal（MG）andadvanced glycation endproducts（AGEs）in broilers, and further investigate the relationshipbetween MG and metabolic diseases including ascites syndrome. First, we established theanalytical technique for MG and AGE using liquid chromatography-mass spectrometry.
Although MG was detected in the plasma, heart, liver and muscle of several ages of broilers,
aging did not affect MG levels in any tissues. It was indicated that heart has high MG level per,protein compared with liver and muscle. The plasma level of Nε-carboxymethyl lysine（CML）
which is an AGE, was decreased with aging. Secondary, we investigated the relationshipbetween MG and ascites, because MG is thought to disrupt the cardiovascular system andascites is induced by the malfunction of the cardiovascular system. In broilers, it is known thatcold stress and hypoxia induce malfunction of the cardiovascular system and thereby cause
ascites syndrome. We therefore exposed broilers to acute or chronic cold stress to produce
ascites model and measured plasma MG level. Although we could not observe remarkable
ascites symptoms in broilers, MG level in the plasma tended to increase after chronic cold
stress. We therefore investigated the effect of repeated intraperitoneal administration of MG on
the incidence of ascites. As a result, ascites was observed in more than half of the broilers
administrated with MG. The injection of MG increased the plasma level of triacylglycerol but
not glucose and insulin. Finally, oral glucose tolerance test was performed to investigate theeffect of MG on glucose metabolism. Intraperitoneal injection of MG lowered plasma glucose
level after loading glucose, suggesting that MG suppressed glucose absorption in the small
intestine. In summary, these results suggest that MG might suppress glucose absorption, alter
lipid metabolism, and induce ascites syndrome in broilers.

１．目

効率的に利用することで他の鶏品種にはない成長的速度を実現している。しかし，ブロイラーは急激

肉用鶏として普及しているブロイラーは，よりに成長するため，過剰な脂肪蓄積や腹水症，突然多くの飼料を摂取するとともに飼料中の栄養素を死などの代謝性疾患をも引き起こすことが知られ© The Ito Foundation

糖代謝産物および終末糖化産物がブロイラーの生産性に与える影響の解明

389ている。これらの問題の解決が安定した鶏肉生産

みた。最後に，MGをブロイラーに投与した後のにつながると考えられているが，ブロイラーの代

腹水症の発生と血液性状等を調べ，MGと代謝性

謝性疾患に対する根本的な解決策はいまだ確立さ疾患の関係性を検証した。

れていない。
ヒトの代謝性疾患の代表的なものの一つに糖尿病がある。糖尿病によりインスリンの作用が低下

２．方
2.1

法

飼養試験

して高血糖になるとグルコースからメチルグリオ［実験１］１，２，４および６週齢のブロイラー雌

キサール（MG）が生成される。MGは反応性がから血液および組織を採取した（各６羽）。各週

高い物質であり，酸化ストレスを増加させて血管齢のブロイラーから採血し，5,000 xg，10分間，を傷害する。さらにレニン―アンジオテンシン系

４℃条件下で遠心分離し血漿を得た。さらに心を活性化させ，酸化ストレスを増加させるととも臓，肝臓および浅胸筋を採取し，液体窒素で凍結に血圧を上昇させてしまう 。これらに加え，した。いずれのサンプルも分析まで－80℃で保存

MGはインスリン抵抗性をもたらすことで糖尿病した。

をさらに進行させる。また，MGは糖化反応［実験２］６週齢のブロイラー雌を対照区と寒冷により非酵素的にタンパク質と結合することでストレス区に分け，対照区は26℃，寒冷ストレス

N -carboxymethyl lysine（CML）などの終末糖区は18℃で７時間飼育した（各６羽）。その後，化産物（AGEs）となり，タンパク質の機能を損

直腸温を測定し，さらに採血して血漿を得た。

失させてしまう 。MGはタンパク質や脂質から［実験３］３および５週齢のブロイラー雌を対照も生成するため，体内の栄養状態が過多になると区と寒冷ストレス区に分け（各６羽），対照区はMGが大量に生産され様々な悪影響をもたらすと24℃，寒冷ストレス区は17℃で３日間飼育した。

考えられている。

その後，直腸温を測定するとともに，血液を採取

１）

２，３）

ε

４）

鶏は哺乳類よりも２倍ほど高い血糖値を示す高し血漿を得た。

血糖動物である。その中でもブロイラーは多くの［実験４］５週齢のブロイラー雌を対照区，MG

飼料を摂取するため栄養状態が過剰であると言え60 ㎎投与区およびMG 120 ㎎投与区の３群に分る。したがって，ブロイラーではMGやAGEsがけて単飼した（各６羽）。その翌日から７日間，より多く生産されていると予想され，その結果と１日１回ずつ，超純水（対照区），60 ㎎MG水溶して様々な代謝性疾患が発生している恐れがあ

液または120 ㎎MG水溶液を腹腔内投与した。試る。しかしながら，鶏ではMGやAGEsと代謝性験終了後に血液を採取し血漿を得た。

疾患の関係性が未解明であるだけではなく，体内［実験５］実験４と同様に５週齢のブロイラー雌でどれくらい生産されているのかさえ明らかにさをそれぞれ６羽ずつ３群に分けて超純水またはれていない。

MG水溶液を７日間，１日１回ずつ投与した。そ本研究では，ブロイラーの代謝性疾患にMGやの後に16時間絶食した後にグルコースを体重１㎏

AGEsが関わっているかを明らかにすることを目

当たり２ｇ経口投与した。投与０，15，30，60お的 と し た 。ま ず ，鶏 を 対 象 と し た MG お よ び

よび120分後に採血して血漿を得た。

AGEsの測定系の確立を行った。次いで腹水症を2.2

代謝性疾患モデルとし，腹水症発生鶏の作出を試

組織サンプルにDPBSを加えて，ビーズ式ホモ© The Ito Foundation

血漿中および組織中MGの測定390

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

ジナイザー（QIAGEN GmbH，ドイツ）で破砕

2.4した。破砕したサンプルを10,000 xg，２分間，血漿中グルコース，トリグリセライド（TG）

４℃で遠心分離し上清を回収した。回収した上清およびインスリン濃度はそれぞれグルコースCII-

中のタンパク質濃度をWarburg-Christianの式を

テストワコー，トリグリセライドＥ-テストワ

用いて測定した。血漿または組織抽出サンプルに

コー（和光純薬工業株式会社，大阪）およびマウ

５ Ｍ 過 塩 素 酸 を 加 え て 氷 上 で 10 分 間 静 置 し ，スインスリン測定キット（森永生科学研究所，神10,000 xg，10分間，４℃で遠心分離して除タン奈川）を用いて測定した。

血漿中成分の分析パク質した。この上清にｏ-フェニレンジアミン

2.5を添加し，30℃で３時間反応させてMGから２-

統 計 解 析 は 統 計 解 析 ソ フ ト SAS を 用 い た 。

メチルキノキサリンに誘導体化させた。Ｃ18固相GLMプロシージャを用いて分散分析を行い，さ抽出カラム（InertSep C18，ジーエルサイエンス

らにｔ検定またはTukeyの多重検定を実施した。

株 式 会 社 ，東 京）と バ キ ュ ー ム マ ニ ホ ー ル ド

有意水準は５％とした。また，経口糖負荷試験で（Visiprep，シグマアルドリッチジャパン，東京）

は曲線下面積（AUC）を算出した。

で精製した後に，液体クロマトグラフ三連四重極
質量分析装置（LC/MS, Waters Corporation, USA）
で定量分析した。
2.3

統計解析

３．結果と考察3 . 1 ブロイラーの各週齢におけるMGおよび血漿中AGEsの測定

CML濃度

上記2.2と同様に組織抽出サンプルを得た。血上記の方法によりMGおよびCMLの定量に成功

漿および組織抽出サンプルに0.4Ｍ過塩素酸を加した。血漿中MG濃度および組織中MG濃度をFig.

えて氷上で10分間静置し，14,000 xg，５分間，１に示す。いずれのMG濃度も週齢による変化は４℃条件下で遠心分離してタンパク質を沈殿させ認められなかった。また，心臓におけるタンパクた。上清を0.45μｍフィルターでろ過した後に，質重量当たりのMG濃度は肝臓および浅胸筋より

LC/MSで定量分析した。

も有意に多かった。

1.5
1.0
0.5
0.0

2 wk

4 wk

6 wk
（C）

Week
P=0.37
TissueP<0.01
Week x Tissue P=0.43

0.8

0.6
0.4
0.2

Plasma CML（ng/ml）

2.0

P=0.10MG（nmol/mg protein）

Plasma MG（µM）

2.5

1 wk
（B）

（A）

0.0
Heart

Liver

Skeletal muscle

300

200

100

P<0.01

a

b
b b

0

Fig. 1 MG level in plasma（A）and heart, liver and muscle（B）and plasma CML level（C）

in broilers. Data are expressed as mean ± S.E.M. n ＝ 6 ． The result of ANOVA is
indicated within each graph. a, b Means with different superscript letters are
significantly different at p＜0.05．

© The Ito Foundation

（A）

（B）

0.6

0.6

P=0.88Plasma MG（µM）

Plasma MG（µM）

糖代謝産物および終末糖化産物がブロイラーの生産性に与える影響の解明

0.4

0.2

391

P=0.27Week
P=0.05
Cold stressWeek x Cold stress P=0.14

0.4

0.2

0

0
Cont

Cold

Cont

Cold

Cont

Cold

6 wk

6 wk

3wk

3wk

5wk

5wk

Fig. 2 Plasma MG level in broilers exposed to acute（A）or

chronic cold stress（B）. Data are expressed as mean±S.E.M.
n＝6. The result of t-test or ANOVA is indicated withineach graph.

Fig.２に血漿中CML濃度を示す。血漿中CML

慢性寒冷ストレスを負荷した３および５週齢の濃度は１週齢で最も高く，２週齢以降に有意な差

ブ ロ イ ラ ー の 体 重 ，組 織 重 量 お よ び 直 腸 温 をは認められなかった。通常，AGEsは加齢に伴っTable１に示す。３週齢時では，終体重，増体量，て蓄積することが知られている。しかしなが浅胸筋重量および直腸温において有意差が認めら

ら，若齢のブロイラーの血漿中CML濃度が高い

れたものの，５週齢時では寒冷ストレスの影響はことが示された。これは，ブロイラーの加齢に伴認められなかった。また，どちらの週齢においていCMLの産生が減少する，または産生されたも腹水の貯留は認められなかった。Fig.２に慢性CMLの除去反応が発達したことを示唆している。

寒冷ストレスを負荷したブロイラーの血漿中MG

ただし，今回の測定系は遊離体CML量を測定す濃度を示す。慢性寒冷ストレス負荷により血漿中るものであるため，タンパク質修飾体のAGEsを

MG濃度が上昇する傾向が見られたが（Ｐ＝0.05），

測定する必要がある。

週齢による違いはなかった。

５，６）

3 . 2 急性および慢性寒冷ストレス負荷による

急性寒冷ストレスによるMG濃度の変化は見られなかったが，これはMGの体内半減期が短いこ

腹水症作出の試み
急性寒冷ストレスを負荷した６週齢のブロイとが原因であると考えられる７）。一方で慢性寒冷

ラ ー の 試 験 終 了 時 の 直 腸 温 は 対 照 区 が 39.8 ±ストレスにより血漿中MG濃度上昇の傾向が示さ

0.2℃，寒冷ストレス負荷区が38.9±0.2℃であり，れたことから，MG濃度は寒冷ストレスの影響を寒冷ストレス負荷区が対照区と比べて有意に低下受けることが示唆された。鶏へのMG単回投与がした（Ｐ＜0.01）。また，寒冷ストレス負荷区６

血圧を上昇させ，腹水症へのMGの関与が示唆さ羽中１羽で心膜腔に黄色透明の液体が貯留していれていることから８，９），寒冷環境下ではMGが腹ることを確認した。Fig.２に急冷寒冷ストレスを水症に関与している可能性が考えられた。

負荷したブロイラーの血漿中MG濃度を示す。血漿中MG濃度は両区で有意な差は認められなかった。

3 . 3 MG反復腹腔内投与によるブロイラー生
理機能の変化
MGの反復投与により実験終了時の体重が用量© The Ito Foundation

392

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 1 Body weight, tissue weight, and rectal temperature of broilers exposed to chronic

cold stress.
ControlCold stress

Probability

Initial body weight（g）

1008.8±16.7

1009.2±18.90.99

Final body weight（g）

1200.8±30.8ａ

1057.2±29.3ｂ＜0.01

Body weight gain（g）

192.0±26.2ａ

48.0±11.7ｂ＜0.01

8.0±0.8

6.6±0.3

0.11

3 weeks oldHeart（g）
Heart/BW（g/kg）

6.7±0.6

6.2±0.2

0.48

Liver（g）

30.1±0.927.9±1.4

0.21

Liver/BW（g/kg）

25.1±0.4

26.4±1.0

0.25

P. major（g）

97.9±3.2ａ

82.1±4.3ｂ＜0.05

P. major/BW（g/kg）

81.6±2.377.7±3.4

0.36

Rectal temperature（℃）

39.1±0.1ａ

38.6±0.2ｂ＜0.05

Initial body weight（g）

2053.7±32.4

2053.0±24.8

0.99

Final body weight（g）

2345.2±45.3

2296.5±39.4

0.44

Body weight gain（g）

291.5±15.3

243.5±17.50.06Heart（g）

11.9±0.7

10.3±0.3

0.08

5 weeks oldHeart/BW（g/kg）

5.1±0.3

4.5±0.1

0.07

Liver（g）

49.6±3.3

46.3±2.2

0.42

Liver/BW（g/kg）

21.1±1.1

20.2±1.0

0.56

P. major（g）

471.0±20.0

475.7±14.2

0.85

P. major/BW（g/kg）

200.6±5.8207.7±8.50.50

Rectal temperature（℃）

39.4±0.1

39.4±0.2

0.86

Data are expressed as mean±S.E.M.
a, bMeans with different superscript letters are significantly different.

依存的に低下する傾向が見られた（Ｐ＝0.09，対糖値の経時的変化およびAUCをFig.４に示す。

照区，2167±26ｇ；60 ㎎，2140±50ｇ；120 ㎎，

AUCには有意差が見られなかったものの，経口

1882±124ｇ）。また，MG 60 ㎎投与区では６羽

投与15分後のMG投与区の血糖値が対照区よりも中４羽，MG 120 ㎎投与区では６羽中３羽で腹腔有意に低いことが示された。

内に黄色透明の液体の貯留が認められた。血漿中MGの反復投与によりいくつかのブロイラーでグルコース，TGおよびインスリン濃度をFig.３

腹水症が確認されたことから，MGがブロイラーに示す。MG反復投与は血糖値およびインスリンの腹水症発生に関わっている可能性が示唆され濃度に影響を与えなかったものの，血漿中TG濃た。また，MGが血漿中TG濃度を増加させるこ

度は用量依存的に増加した。

とが明らかとなった。MGをラットに４週間投与

MGが耐糖能に及ぼす影響を調査するため，すると血漿中TG濃度が上昇することが報告されMGを反復腹腔内に投与したブロイラーを用いてており10），本研究でも同様の現象が確認されたこ

経口糖負荷試験を実施した。糖負荷試験による血とから，MGの作用は齧歯類とブロイラーで類似© The Ito Foundation

糖代謝産物および終末糖化産物がブロイラーの生産性に与える影響の解明

Plasma glucose（mg/dl）

800

ら 11），MGの作用は投与経路によって異なる可能

P=0.16（A）性がある。糖負荷試験ではMG投与区の血糖値が600

対照区のように上昇しなかった。これは糖が即座に代謝されている可能性も考えられるが，血糖値

400

および血漿中インスリン濃度が対照区と同等であったため，むしろ消化管からの糖吸収能が低下

200している可能性が考えられた。
以上の結果から，本研究によりMGがブロイ

0

Plasma TG（mg/dl）

300

ラーにおける腹水症発生に関与しており，さらに脂質代謝に影響を与えること，糖の吸収能を低下

P<0.05（B）させることが示唆された。

a
200

４．要

ab
100

約

本研究の目的は高血糖動物である鶏において，b

糖代謝産物であるMGおよびAGEが生体内でどれだけ存在しているかを調査するとともに，腹水症

0をはじめとする代謝性疾患とMGの関係性を調査

0.08
Plasma Insulin（ng/ml）

393

することを目的とした。まず，LC/MSを用いた，

P=0.75（C）

ブロイラーの血漿，心臓，肝臓および筋肉中の0.06

MGおよびAGEの定量分析法を確立した。また，
ブロイラーにおいて，週齢の変化が血漿中および0.04

組織中MG濃度に与える影響は認められなかった。心臓は肝臓および浅胸筋と比較してタンパク0.02

質重量当たりのMG量が多い組織であることが示0060された。一方で，血漿中AGE濃度は加齢に伴っ120て低下することが示された。哺乳類では，MGはMG IP injection（mg/bird）

血圧を上昇させる働きがあり，血管系を障害する

Fig. 3 Plasma glucose（A）, TG（B）, and insulin（C）

ことが知られている。腹水症は寒冷条件下や低酸

levels of broilers administered with MG for 7 days.
Data are expressed as mean±S.E.M. n＝6．The resultof ANOVA is indicated within each graph. a, bMeanswith different superscript letters are significantly
different at p＜0.05.

素条件下などの心臓を中心とした循環器への負荷が高まることが発祥の一因とされている。これらのことから，MGはブロイラーの腹水症発生に関わっていると考えられる。そこで，急性および慢していることが示された。このことから，MGは性寒冷ストレス処理を行うことで腹水症モデルのブロイラーの脂質代謝に影響を与えると考えられブロイラーの作出を試み，腹水症とMGの関係性る。一方で，飲水によってMGをラットに８週間を調査した。その結果，慢性寒冷ストレス処理に

与 え て も 血 漿 中 TG 濃 度 が 上 昇 し な い こ と か

よって明確な腹水症を発症しなかったものの，血© The Ito Foundation

394

平成28年度MG 0 mg

食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

MG 60 mg

MG 120 mg
40000

P=0.13

a
300

30000

b
b

200

MG
Time
MG x Time100

P=0.12
P<0.01
P<0.05AUC（a.u.）

Plasma glucose（mg/dL）

400

20000

10000

0

0
0

50

100

0

Time after oral administration
（min）

60

120

MG IP injection（mg/bird）

Fig. 4 Oral glucose tolerance test in the broilers administrated MG. Data are expressed as mean±S.E.M. n＝6. The

result of ANOVA is indicated within each graph. a, bMeans with different superscript letters are significantly
different at p＜0.05.

漿中MG濃度が上昇する傾向が認められた。次にMGを７日間反復腹腔内投与したところ，MG投与を実施した半分以上の鶏において腹水の貯留が認められた。また，MGを投与した鶏において，血漿中TG濃度の上昇が示されるとともに，消化管における糖吸収能の低下が示唆された。これらの結果から，MGはブロイラーにおける腹水症の発生に関わっている可能性が示されたとともに，脂質代謝や糖の吸収に影響を与えることが示唆された。
文献１）D h a r , I . , D h a r , A . , W U , L . , D e s a i , K . M . :Methylglyoxal, a reactive glucose metabolite,
increases renin angiotensin aldosterone and bloodpressure in male Sprague-Dawley rats, Am. J.
Hypertens.，27，308～316，2014．
２）Riboulet-Chavey, A., Pierron, A., Durand, I.,
Murdaca, J., Giudicelli, J., Van Obberghen, E. :Methylglyoxal impairs the insulin signaling
pathways independently of the formation of
intracellular reactive oxygen species, Diabetes, 55 ，1289～1299，2006．
３）Oliveira, L. M. A., Lages, A., Gomes, R. A., et al. :Insulin glycation by methylglyoxal results in nativelike aggregation and inhibition of fibril formation,
BMC Biochem.，12，41，2011．

４）Matafome, P., Sena, C., Seiça, R. : Methylglyoxal,
obesity, and diabetes, Endocrine, 43，472～484，2013.
５）Nagai, R., Shirakawa, J., Fujiwara, Y., Ohno, R. :Detection of AGEs as markers for carbohydrate
metabolism and protein denaturation, J. Clin.
Biochem. Nutr.，55，１～６，2014．
６）Wagner, K-H., Cameron-Smith, D., Wessner, B.,
Franzke, B. : Biomarkers of aging: from function tomolecular biology, Nutrients，８，338，2016．
７）Dhar, A., Desai, K. M., Wu, L. : Alagebrium
attenuates acute methylglyoxal-induced glucose
intolerance in Sprague-Dawley rats, Br. J.
Pharmacol.，159，166～175，2009．
８）Khajali, F., Liyanage, R., Wideman, R. F. :Methylglyoxal and pulmonary hypertension in
broiler chickens, Poult. Sci.，90，1287～1294，2011．
９）Khajali, F., Fahimi, S. : Influence of dietary fat
source and supplementary α-tocopheryl acetate on
pulmonary hypertension and lipid peroxidation in
broilers, J. Anim. Physiol. Anim. Nutr., 94，767～772，
2010．
10）Dhar, A., Dhar, I., Jiang, B., Desai, K. M., WU, L. :Chronic methylglyoxal infusion by minipump causes
pancreatic β-cell dysfunction and induces type 2
diabetes in Sprague-Dawley rats, Diabetes，60，899～908，2011．
11）R o d r i g u e s , T . , M a t a f o m e , P . , S e i ç a , R . :Methylglyoxal further impairs adipose tissue
metabolism after partial decrease of blood supply,
Arch. Physiol. Biochem.，119，209～218，2013.

© The Ito Foundation395

動―静脈差でみる，発育不良豚の成長に必要なアミノ酸および他の栄養成分の推定
Use of venous-to-arterial difference for the determination of amino acidand other metabolites that can complement the growth of runt piglets

塚

原

隆

充

（京都府立大学大学院生命環境科学研究科）

Takamitsu Tsukahara（Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University）[Introduction] “Venous-to-arterial difference” is one of the useful methods to determine therequirement of nutrients in mammals. In this study, I examined the usefulness of “thedifference between the various vessel segments” to apply the porcine industry. Therefore, theblood was collected from five blood vessel segments in healthy and infection piglets, and aminoacid concentration in plasma was measured. Furthermore, I also consider the correlation
between daily weight gain and amino acid concentration including “the difference between thevarious vessel segments”．
[Method] Twenty-four piglets were divided to healthy growing（n＝19）and PRRSV infection（n＝5）piglets at 35-day-old. All piglets were fed the commercial diet（SDS No.2）ad libitum
throughout this study. All piglets were slaughtered at 56- to 60-day-old. The blood in cecal
vein, ileal vein, portal vein, ventral aorta and abdominal vein was collected, and plasma wasisolated by centrifugation. Quantitative assay of amino acids was used ultra-performance liquid
chromatography tandem mass spectrometry.
[Results] Comparison from peripheral blood as the blood of abdominal vein, the amino acidcomposition in the blood of ileal- and cecal-vein was affected remarkably. Particularly, theconcentrations of aspartic acid and glutamic acid were higher but those of arginine were lower
in the ileal- and cecal-vein blood than that in peripheral blood. Aspartic acid and asparagine
concentration was correlated with daily weight gain in peripheral blood, whereas tryptophan
concentration was correlated with daily weight gain in “portal- to abdominal vein difference”．
[Conclusion] According to the results, it is beneficial to determine the amino acid and othernutrients concentrations in five vessel segments to consider the requirement and absorption in
pigs. I also suggested the correlation effect between daily weight gain and amino acidconcentration in blood, the parameter of “portal- to abdominal vein difference” was suitable toconsider the requirement of amino acid in pigs.

© The Ito Foundation

396
１．目

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

長を示す仔豚とは異なる代謝特性を示し，栄養要的求が異なる可能性をうかがわせた。一方この成果

養豚経営における支出の大半は飼料代であるこでは，代謝成分とくにアミノ酸の変動は明確でとから，肉豚１頭当たりの飼料効率を少しでも改あったものの，特定の成分が不足しているのか，

善できれば，飼養頭数が多い農家ほど経営は大きそれとも不要なのかを特定するには至らなかった。

く改善する。この問題を解決するために，これま

栄養成分の生体への利用を推定するために，動で多くの研究が行われてきた。その研究成果の多―静脈差で検討する手法がある。この方法を用い

くは，飼料組成を改変する，もしくは飼料中に生て，肉豚でのタンパク質―アミノ酸要求２）や，糖菌剤や成長促進用抗菌剤などを添加する，など養要求３）についての検討がすでに行われている。本

豚場の経営システム自体を改変する必要があった

研究課題では，平成27年度伊藤記念財団研究助成ため，養豚農家がこれらの研究成果を応用する場で得られた成果をさらに発展させ，健常豚および合，よほどの思い切りがないと成功事例までたど感染豚を剖検し，血管各部位から採血を行い，血り着けないというジレンマがあった。

管部位ごとにアミノ酸濃度解析を行い，血管部位改善率は小幅でも，もう少し農家が手軽に着手同士の差を検討することで，栄養成分の過不足をできるような飼料効率改善策はないかを，平成27

詳細に検討可能か調査した。また，それらのアミ

年度伊藤記念財団助成金の研究資金を得て「同腹ノ酸濃度と日増体量の相関を検討することで，増産仔間で成長が異なる仔豚の代謝特性比較」とい

体改善とアミノ酸要求との関連性についても検討うテーマで研究を行った。これは，一般的な養豚を行った。

農家は，肉豚の成長による豚舎移動ごとに体重を目安に豚房を分けて飼育するが，給与する飼料は２．方法同じであることに着目したことが研究の発端であ

2.1

る。日本飼養標準ならびに飼料会社が販売する飼一般的な一貫経営の養豚場で飼育されている，料は，発育が良好である豚にあわせて設計してい健康な妊娠母豚４頭の産仔を試験に用いた。すべるため，発育不良豚では栄養成分がマッチしていての仔豚（計24頭）は21日齢で離乳させ，その後ない可能性がある。これら発育不良豚の栄養成分

35日齢までは市販試験用人工乳前期飼料（SDS

過不足を特定できれば，発育不良豚の豚房のみの

No.１，フィードワン）を，それ以降は市販試験

飼料組成介入で手軽に養豚経営が改善する可能性

用人工乳後期飼料（SDS No.２，フィードワン）を考えた。課題検討の結果，発育が良好な豚と，を飽食で給与した。なお，飼料成分は既報のとお

元々の生時体重が小さくその後の発育も不良でありである４，５）。35日齢で，そのうち５頭に豚繁殖るいわゆる「ヒネ豚」や，もしくはその後の疾病

障害・呼吸障害症候群ウイルスを感染させた。感などの要因で発育が不良になった豚とでは，末梢染の手法は既報のとおりとした６）。56～60日齢で血および筋肉中の代謝が大きく変動しており，と全頭剖検した。剖検はすべて午前中に行い，ペン

くにアミノ酸の変動が顕著であった 。このこと

トバルビタールを用いた深麻酔後，開腹し，盲腸から，疾病に罹患した仔豚だけではなく，疾病に静脈血，回腸静脈血，門脈血，腹部大動脈血，腹罹患はしていないが生時体重が極端に小さく，そ部大静脈血の順に採血を行った。すべてヘパリンの後も発育不良である「ヒネ豚」でも，健康な成血として採取し，速やかに氷冷した。遠心分離後，

１）© The Ito Foundation

動物の飼育

動―静脈差でみる，発育不良豚の成長に必要なアミノ酸および他の栄養成分の推定

血漿を分取し，分析まで凍結保存した。

397あった。腹部大動脈血中のアミノ酸組成比較でなお，21，35および剖検時に体重を測定した。

は，アスパラギン酸およびグルタミン酸濃度が高2.2値を示す傾向にあった。

アミノ酸分析

血漿に等量の0.4Ｍ過塩素酸を添加しボルテッ

感染豚における血管各部位のアミノ酸濃度と，クス後，暗所，４℃で30分間静置した。その後，末梢血との濃度比較を行った結果をFig.２に示

０℃，20,000×ｇの条件で15分間遠心分離を行っす。腸管から吸収された直後のアミノ酸組成は一た。得られた上清100μＬに対しタンパク質構成

部健常豚とは異なっており，末梢血と比較してアアミノ酸の安定同位体混合液を５μＬ添加し分析

スパラギン酸およびグルタミン酸濃度が高い傾向を行った。

は同様であったが，リジンやアルギニン濃度も高分 析 に は ACQUITY UPLC-MS/MS （TQD,

値を示す傾向にあった。一方で門脈血中のアミノ

Waters）およびIntradaカラム（Imtakt）を用い酸組成は，アスパラギン酸およびリジン濃度に加た。カラム温度は35℃に設定した。グラジェント

えて，アスパラギン，ヒスチジン濃度が高い傾向

条件はバッファーＡ（アセトニトリル：テトラヒにあった。腹部大動脈血中のアミノ酸組成比較でドロフルラン：25mMギ酸アンモニウム：ギ酸＝は，アスパラギン酸およびグルタミン酸濃度が高90：750：160：３）およびバッファーＢ（アセト

値を示す傾向にあった。

ニトリル：100mMギ酸アンモニウム＝１：４）

3 . 2 回腸静脈血中アミノ酸と日増体量との相関を ，Ａ 液 100 ％（0-3min），Ａ 液 100 ― 83 ％（3-回腸静脈血中アミノ酸濃度は，小腸から吸収さ

9min），Ａ液０％（9-16min）に設定した。
2.3

統計解析

れたアミノ酸の代表とする。健常豚の日増体量と正の有意な相関を示したアミノ酸は認められず，

体重測定結果から日増体量を算出し，日増体量負の有意な相関を示したアミノ酸はトレオニン，と各アミノ酸濃度，血管部位差についてピアソン

アスパラギン酸，アルギニンであった。健常豚のの相関解析を行った。Ｐ＜0.05を有意差あり，ｐ日増体量と正の相関傾向を示したアミノ酸は認め＜0.1を有意傾向ありと判断した。

られず，負の相関傾向を示したアミノ酸はロイシン，メチオニン，バリン，グルタミン酸，グリシ

３．結果と考察
3.1

ン，アスパラギン，リジンであった。

血管各部位のアミノ酸濃度

一方で，感染豚の日増体量と有意な相関を示し

健常豚における血管各部位のアミノ酸濃度と，たアミノ酸は認められなかった。感染豚の日増体

末梢血（腹部大静脈血）との濃度比較を行った結量と正の相関傾向を示したアミノ酸はイソロイシ

果をFig.１に示す。腸管から吸収された直後のアン，バリンであった。負の相関傾向を示したアミミノ酸組成は（回腸静脈血および盲腸静脈血），ノ酸は認められなかった。

末梢血と比較してアスパラギン酸およびグルタミ

3 . 3 盲腸静脈血中アミノ酸と日増体量との相関

ン酸濃度が高い傾向にあり，アルギニン濃度が低

盲腸静脈血中アミノ酸濃度は，大腸から吸収さい傾向にあった。一方で，腸管で吸収されたアミ

れたアミノ酸の代表とする。健常豚の日増体量とノ酸が集められて，肝臓へ入る直前である門脈血

正の有意な相関を示したアミノ酸は認められず，

中のアミノ酸組成は，アスパラギン酸およびグル負の有意な相関を示したアミノ酸はアスパラギン

タミン酸濃度に加えてリジン濃度が高い傾向に酸であった。健常豚の日増体量と正の相関傾向を© The Ito Foundation

398

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Ileal vein
Trp
Arg 2.0
Lys
1.5
His
Asn

Cecal vein

Phe

Lys

Tyr
Leu

0.5

Ile

Asn

Met

Gly

Val

Gln

Gln
Ser

Ala

Asp

Thr

Pro

1.5

His

1.0
0.0

Gly

Trp
Arg 2.0

Glu

Lys
His
Asn

Leu

0.5

Ile

Asn

Met

Gly

Val

Gln

Asp

Trp
Arg 1.50

Met

Pro

Thr

Phe

1.00

His

Glu

Ser
Thr

Ile

Glu

Lys

1.0

Asp

0.5

Val

Tyr

Gln
Ala

Leu

Ser
Ala

0.0

Gly

1.0

Ventral aorta

Phe

1.5

Tyr

0.0

Potal vein
Trp
Arg 2.0

Phe

Tyr
Leu

0.50

Ile

0.00

Met
Val
Glu

Ser

Pro

Ala

Asp

Thr

Pro

Fig. 1 Relative concentration against abdominal vein in healthy piglets（n＝19）（/abdominal

vein concentration）

Ileal vein
Trp
Arg 2.00
Lys
1.50
1.00
His

Cecal vein

Phe

Trp
Arg1.50
Lys
1.00

Tyr

0.50

Asn

Ile

Asn

Met

Gly

Val

Gln

0.00

Gly

His

Leu

Gln
Ser
Asp

Thr

Lys
His

Val
Glu
Ala

Lys

Tyr

Gln

Ile

Asn

Met

Gly

Val

Gln

Asp

Thr

Pro

Thr

Phe

1.00

Tyr
Leu

0.50

Ile

0.00

Met
Val

Ser

Glu

Ser
Ala

Asp

Trp
Arg1.50

His

Leu

0.00

Gly

Met

Ventral aorta

0.50

Asn

Ile

0.00

Pro

Phe

1.00

Leu

0.50

Potal vein
Trp
Arg1.50

Tyr

Ser

Glu
Ala

Phe

Pro

Glu
Ala

Fig. 2

Asp

Thr

Pro

Relative concentration against abdominal vein in infection piglets（n＝5）（/abdominal
vein concentration）© The Ito Foundation

動―静脈差でみる，発育不良豚の成長に必要なアミノ酸および他の栄養成分の推定399

示したアミノ酸は認められず，負の相関傾向を示る。健常豚の日増体量と正の有意な相関を示した

したアミノ酸はメチオニン，バリン，トレオニン，

アミノ酸は認められず，負の有意な相関を示した

アルギニンであった。

アミノ酸はアスパラギン酸であった。健常豚の日

一方で，感染豚の日増体量と有意な相関を示し増体量と正の相関傾向を示したアミノ酸は認めらたアミノ酸は認められなかった。感染豚の日増体れず，負の相関傾向を示したアミノ酸はアスパラ量と相関傾向を示したアミノ酸は認められなかっギンであった。
一方で，感染豚の日増体量と正の有意な相関をた。
3 . 4 アミノ酸門脈―静脈差と日増体量との相関示したアミノ酸はイソロイシンであった。負の有アミノ酸門脈―静脈差は，肝臓および全身で利意な相関を示したアミノ酸は認められなかった。

用されたアミノ酸の推定値である。健常豚の日増

感染豚の日増体量と相関傾向を示したアミノ酸は体量と有意な相関を示したアミノ酸は認められな

認められなかった。

かった。健常豚の日増体量と正の相関傾向を示し

3.7たアミノ酸はトリプトファンであった。負の相関

以上の結果から，末梢血中と腸管から吸収され傾向を示したアミノ酸は認められなかった。

まとめた直後のアミノ酸が含まれていると考えられる回

一方で，感染豚の日増体量と正の有意な相関を

腸静脈血および盲腸静脈血ではアミノ酸組成が大示したアミノ酸は認められず，負の有意な相関をきく変化することが分かった。また，それらの血示したアミノ酸はトリプトファン，グルタミン酸液が集められる門脈血でも同様の傾向が示されであった。感染豚の日増体量と相関傾向を示した

た。これらのことから，アミノ酸吸収を詳細に検

アミノ酸は認められなかった。

討する場合は，これらの部位での採血を行う方が3 . 5 アミノ酸動脈―静脈差と日増体量との相関

良い可能性が示唆された。一方で，疾病に感染す

アミノ酸動脈―静脈差は，全身で利用されたアることで変化するアミノ酸組成は変化することがミノ酸の推定値である。健常豚の日増体量と正の確認できた。とくに，感染豚では回腸静脈血や盲有意な相関を示したアミノ酸はチロシンであっ

腸静脈血中のアミノ酸組成が顕著に変化していたた。負の有意な相関を示したアミノ酸は認められことから，疾病に感染することでアミノ酸吸収やなかった。健常豚の日増体量と正の相関傾向を示

生体での利用が変化する可能性が示唆された。

したアミノ酸はプロリンであった。負の相関傾向

通常の末梢血（今回は腹部大静脈血が該当）を用いた場合，日増体量と関連すると考えられたアを示したアミノ酸は認められなかった。
一方で，感染豚の日増体量と有意な相関を示し

ミノ酸はアスパラギン酸およびアスパラギンのみたアミノ酸は認められなかった。感染豚の日増体であった。一方で，例えば，門脈―静脈差をとる

量と正の相関傾向を示したアミノ酸は認められことで，必須アミノ酸であるトリプトファンとのず，負の相関傾向を示したアミノ酸はイソロイシ

関連性が確認できるようになった。とくに，既報ンであった。

では，PRRSV感染によってトリプトファンおよ

3 . 6 腹部大静脈血（末梢血）と日増体量とのびグルタミン酸濃度が変化することが知られており６），これらのアミノ酸は門脈―静脈差で変化が相関
腹部大静脈血中アミノ酸濃度は，一般的なアミ認められていたことから，部位ごとの差をとるこノ酸濃度解析に用いられているアミノ酸値であとで鋭敏にアミノ酸要求を検討できる可能性がう© The Ito Foundation

400

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

かがえた。
４．要

プトファンとの関連性が確認できた。
【まとめ】血管部位でアミノ酸濃度が顕著に変化

約していたことから，アミノ酸吸収・要求を詳細に【目的】栄養成分の生体への利用を推定するため検討する場合には，血管部位での採血を行い，そに，動―静脈差で検討する手法がある。この方法

れらの濃度を総合的に検討する方が良い可能性がを用いて，健常豚および感染豚を剖検し，血管各示唆された。また，日増体量との相関を検討する部位から採血を行い，血管部位ごとにアミノ酸濃場合は，門脈―静脈差で検討するとより生体のア

度解析を行い，血管部位同士の差を検討すること

ミノ酸要求に合致している可能性が示唆された。

で，栄養成分の過不足を詳細に検討可能か調査した。また，それらのアミノ酸濃度と日増体量の相関を検討することで，増体改善とアミノ酸要求との関連性についても検討を行った。
【方法】離乳豚24頭を35日齢で，健常豚（ｎ＝19），PRRSV感染豚（ｎ＝５）に分けた。試験用
離乳後期飼料（SDS No.２）で飼育後，56～60日
齢で剖検した。盲腸静脈血，回腸静脈血，門脈血，腹部大動脈血，腹部大静脈血の順に採血した。血液からは血漿を分取した。血漿中のアミノ酸濃度を定量解析した。解析はUPLC-MS/MSおよびIntradaカラムを用いて行った。
【結果】末梢血（腹部大静脈血）と比較して，腸管から吸収された直後のアミノ酸組成を反映していると思われる回腸静脈血や盲腸静脈血中のアミノ酸の一部が大きく変化していることが分かった。また，部位ごとのアミノ酸濃度および部位毎の差と日増体量との相関を検討したところ，末梢血中ではアスパラギン酸およびアスパラギンと日文献１）塚原隆充：同腹産仔間で成長が異なる仔豚の代謝特性比較，平成27年度食肉に関する助成研究調査成果報告書，2016２）Guan,X., Pettigrew, J. E., Ku, P. K., Ames, N. K.,
Bequette, B, J,, Trottier, N. L. : Dietary protein
c o nc e nt r a t i o n a f f e c t s pl a s m a a r t e r i o ve no us
difference of amino acids across the porcine
mammary gland, J. Anim. Sci., 82，2953～2963，2004.
３）Noah, L., Krempf, M., Lecannu, G., Maugere, P.,
Champ, M. : Bioavailability of starch and postprandialchanges in splanchnic glucose metabolism in pigs,
Am. J. Endocrinol. Metab., 278, E181～E188，2010．
４）Tsukahara, T., Ushida, K. : Organic acid profiles infeces of pigs with pathogenic or non-pathogenic
diarrhea, J. Vet. Med. Sci.，63，1351～1354，2001．
５）Tsukahara, T., Kishino, E., Inoue, R., Nakanishi, N.,
Nakayama, K., Ito, T., Ushida, K. : Correlation
between villous height and the disaccaridase
activity in the small intestine of piglets from nursing
to growing, Anim. Sci. J., 84, 54～59，2013．
６）Oota, Y., Tsukahara, T., Fujieda, T. : Unique aminoacid composition in plasma during porcine
reproductive and respiratory syndrome virus
viremia. Proceedings of“The 7th International
Symposium on Emerging and Re-emerging Pig
Diseases”：Kyoto, Japan，2015．

増体量が関連していたが，門脈―静脈差ではトリ© The Ito Foundation

401

肉質向上に資するアミノ酸栄養の基礎研究
Basic studies on the improvement of meat quality by amino acidsupplementation

佐

藤

祐

介・二

瓶

直

浩・佐

藤

より子

（宇都宮大学農学部）

Yusuke Sato, Naohiro Nihei and Yoriko Sato
（Utsunomiya University, School of Agriculture）

Amino acids have the ability to change metabolism by regulation of gene expression
through mTOR pathway in skeletal muscle. MicroRNAs（miRs）are known to regulate gene
expression by post-transcriptional repression or degradation of target mRNA. However,signaling pathways for miR expression remains unknown. In this study, we investigated theeffects of L-leucine administration on miR expression in skeletal muscle. Food-deprived
C57Bl/6 mice were administrated saline and L-leucine（135mg/100g B.W.）by oral gavage.
Five hours after administration of saline or L-leucine, total RNA was isolated from soleus and
EDL muscles of mice. Poly-A was added to total RNA before reverse transcription to detect
miRs. The expression levels of muscle-specific miRs（1, 133a/b, 206, 208b and 499b）were
measured by qPCR. Skeletal muscle-specific mTOR knockout mice（Mlc1-mTOR -/-）weregenerated by crossing mTORflox/flox mice with Mlc1-Cre mice to determine the signaling
pathway in the regulation of miR expression. The expressions of miR-1, 133a/b were increased
in soleus muscle, and miR-206, 208b and 499b were increased in EDL muscle after L-leucine
administration. To determine whether miRs expression were regulated by mTOR signaling,miRs of soleus and EDL muscles from Mlc1-mTOR-/- were measured by qPCR. In the Mlc1mTOR-/- mice, miR-133a expression was decreased in both soleus and EDL muscles comparedwith mTORflox/flox. These results demonstrated that L-leucine administration induced miR-133a
expression through mTOR signaling in skeletal muscle. Previous report demonstrated thatmiR-133a deficiency caused mitochondrial dysfunction and myopathy in skeletal muscle. We
conclude that L-leucine regulates the mitochondrial function and skeletal muscle homeostasisby expressing miR-133a through mTOR signaling pathway.

１．目（肉類，穀類など）の安定供給策を考えなければ的ならない。現在，我が国の肉類自給率は50％程度

近い将来，地球の人口は100億人に達する見込であるが，家畜の飼料自給率は20％程度とさらにみであり，我々は世界的食料不足の時代を迎え

低く大きな問題となっている。国産米などを家畜る。この問題の解決策として，様々な食料資源

飼料に用いる代替飼料の研究も行われているが，© The Ito Foundation

402

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

コスト等の問題は解決できていない。そのため，研究代表者らのこれまで研究から，分岐鎖アミ

家畜への給餌量を維持（あるいは減少）しながらノ酸の１つであるロイシンは，筋細胞のmTOR

も，「肉質の維持・向上」が可能かどうかについ

経路を介して骨格筋の筋線維型や代謝特性に関連て ，調 査 す る 基 礎 的 研 究 が 必 要 で あ る 。肉 質する遺伝子の発現を制御することが分かった。近（味・テクスチャー）と骨格筋の筋線維型・代謝

年，mTOR経路はタンパク質代謝やmRNA発現特性などには密接な関係があることから，飼料中制御だけでなく，遺伝子の転写後発現調節を担うへの特定の成分添加により，骨格筋の特性を変化

短鎖非コードRNA（microRNA，以下miR）の発させることが可能かどうか，まずは実験動物レベ

現・成熟をも制御していることが報告された６，７）。

ルで精査することが重要である。

すでに，筋特異的なmiRが骨格筋の発生・肥大・

これまでに多くのポリフェノール等の抗酸化物特性を制御する重要な因子であることが明らかに質による骨格筋の代謝特性の制御に関する研究がなっているが８），一方で，特にアミノ酸などの栄報告されている。マウスを用いた実験動物レベル

養シグナルによるにmiRの発現制御についての報

では，赤ブドウのレスベラトロルによる骨格筋の

告はほとんどない。そこで，本研究では，ロイシ代謝特性の変化やザクロのウロリチンＡによる筋ン摂取がmTOR経路を介してmiR発現を制御して機能の向上作用が報告されている１，２）。これらをいるか検討することにした。

家畜飼料へ添加すれば肉質の変化を誘導できる可能性もあるが，一方で，抗酸化物質の一部には

２．方法

DNAを損傷させうる可能性が報告されており，

18時間絶食させた18週齢のC57Bl/6マウス（ｎ生体への未確認の有害性が危惧されている３）。ま＝ ５）に ，ロ イ シ ン を 強 制 的 に 胃 内 投 与 し た

た，実際に抗酸化物質等を生産レベルで家畜飼料（135㎎/100g B.W.）。コントロールマウスには生へ応用するには，大量に必要となることから現実

理食塩水を投与した。投与５時間後に遅筋型のヒ的とは言い難い。

ラメ筋および速筋型の長趾伸筋を摘出し，Trizol

そこで，研究代表者は抗酸化物質以外の既存の法により全RNAを抽出した。ロイシン投与によ飼料添加物であるアミノ酸に着目し，骨格筋の特るTOR経路の活性化を確認するため，qPCR法に性を変化させうるかどうか確認した。準備研究のよりActbを内部標準として18s rRNAの発現量をマイクロアレイ解析の結果，生理的濃度の一部の測定した。miR検出のため，逆転写前に全RNA

アミノ酸（特にロイシン）投与が，ラット骨格筋にpoly-Aを付加した。M-MLV逆転写酵素を用いの特性に関連する遺伝子の発現を上昇させることて逆転写し，qPCR法によりmiRを定量した。まを見出した。これまで，アミノ酸摂取による骨格

た，mTORflox/flox マウスとMlc1-Creマウスを交配

筋タンパク質代謝については多くの研究がなされさ せ る こ と で 骨 格 筋 特 異 的 mTOR 欠 損 マ ウ スているが４，５），骨格筋の特性に及ぼす影響につい（Mlc1-mTOR-/-）を作製し，そのヒラメ筋およびての報告はほとんどない。研究代表者は，一部の長肢伸筋におけるmiRの発現量をqPCR法によりアミノ酸には骨格筋の特性を変化させる作用があ定量した（マウス実験の一部は，海外の共同研究

ると仮説を立て，将来の食肉生産技術へ貢献する機関にて実施した）。本研究では，すでに骨格筋「肉質向上に資するアミノ酸栄養の調査とその作に骨格筋における機能の一部が明らかになってい用機序の解明」を目指している。

るmiR（1, 133a/b，206，208b，499）に着目して© The Ito Foundation

403

肉質向上に資するアミノ酸栄養の基礎研究解析を行った。内部標準として核内small RNAで

mTOR経路活性化が確認できたため，miR発現があるＵ６を用いた。student t-testによりｐ＜0.05

変化しているかqPCRにより調べた。ロイシン投で有意差ありとした。

与５時間後，遅筋型のヒラメ筋では，投与前と比べmiR（1，133a/b）の発現量が有意に増加して３．結果と考察いた（Fig.２）。一方，速筋である長趾伸筋では

ロイシン摂取は骨格筋のmTOR経路を活性化

miR（206，208b，499b）の発現量が有意に増加させることが分かっている５）。マウスへのロイシしており，miR-133ａは増加傾向を示した（Fig.

ンの強制胃内投与は，骨格筋の18srRNA発現を

２）。これらから，ロイシン摂取がmiRの発現に増加させた（Fig.１）。これは，ロイシン投与が与える影響は遅筋と速筋で異なると考えられる。

骨格筋のmTOR経路を活性化させたことを間接生体においてもmTOR経路がmiR発現を制御して的に示している。ロイシン投与による骨格筋のいるか確認するため，骨格筋特異的mTOR欠損

soleus
＊＊

2

Ctrl
1

Leu

0

Relative expression
to Actb (Fold change)

2
Relative expression
to Actb (Fold change)EDL

p = 0.057
Ctrl
1

Leu

0

18S

18S

Fig. 1 Expression of 18s gene in soleus and EDL muscles after oral administration of L-leucine. Expression levels were

calculated relative to Actb and the data are expressed as fold-increase. Graphs represent mean±SEM. All（n＝5）．
assessment of significance was performed with studentʼs t-test（＊＊p＜0.01）

soleus＊＊2＊

Relative expression
to U6 (Fold Change)

Ctrl
Leu

3
Relative expression
to U6 (Fold Change)

EDL

＊

1
0

a

1

m

b

3
13

iR

m

iR

3
13

m

iR

b

6

m

iR

0
-2

R-

i

m

b

8
20

3

＊
＊

p = 0.062

2
1
0

9
49

R-

i

m

＊

Ctrl
Leu

-1

a

33

iR

m

m

-1
iR

b

06

33

m

-1
iR

m

-2
iR

b

08

m

i

2
R-

b

99

-4
iR

m

Fig. 2 Expression of miRs（1, 133a/b, 206, 208b and 499b）in soleus and EDL muscles after oral administration of

L-leucine. Expression levels were calculated relative to small RNA U6 and the data are expressed as fold-increase.
Graphs represent mean±SEM. All assessment of significance was performed with studentʼs t-test（＊p＜0.05，＊＊p＜0.01）（n＝5）．

© The Ito Foundation

404

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）
EDL

soleus□ mTOR ﬂox/ﬂox■ mTOR -/＊＊

2
＊＊＊

1

0

i

m

＊＊

2
＊＊

1

0

3a

3

1
R-

□ mTOR ﬂox/ﬂox■ mTOR -/-3
Relative expression
to U6 (Fold Change)

Relative expression
to U6 (Fold Change)

3

3b

3

m

i

1
R-

06

9

2

iR

m

9b

4
R-

i

m

8b

i

m

a

33

0

2
R-

1
R-

i

m

b

33

1
R-

i

m

6

m

b

99

20

iR

m

-4
iR

b

08

-2
iR

m

Fig. 3 Expression of miRs（133a/b, 206, 499b and 208b）in soleus and EDL muscles of mTORflox/flox and mTOR-/- mice.

Expression levels were calculated relative to small RNA U6 and the data are expressed as fold-increase. Graphs
represent mean ± SEM. All assessment of significance was performed with studentʼs t-test（＊ ＊ p ＜ 0.01 ， ＊ ＊ ＊ p ＜0.001，）（n＝5）.

マウス（Mlc1-mTOR-/-）を作製した。先行研究

ミノ酸栄養が，筋細胞の特性をmiRにより制御すで作製された筋特異的mTOR欠損マウス（HSA-

る可能性を示すものである。一方で，本研究で調mTOR ）では，筋萎縮や遅筋に関連する遺伝子査したmiRは，すでに骨格筋における機能が明ら群の発現低下が報告されている 。本研究で作製かとなっているものに限局しており，実際には他したMlc1-mTOR-/- マウスは，先行研究とほぼ同にもアミノ酸栄養により発現するmiRが存在する様の表現型（形態・遺伝子発現など）を示していと考えられる。今後は，アミノ酸により制御された。このマウスを用いて，生体レベルでmTOR

るmiRをRNA-seq等により網羅的に探索する必経路がmiRの発現に及ぼす影響について調べるこ

要がある。

-/-

９）

とにした。qPCRの結果，Mlc1-mTOR-/- マウスのヒラメ筋および長趾伸筋ではmiR-133ａの発現

４．要

約

量が野生型（mTORflox/flox）に比べて有意に減少しアミノ酸は骨格筋のmTORシグナル伝達経路てした（Fig.３）。これらの結果から，骨格筋でを介して，タンパク質代謝やmRNA発現を制御

はmTOR経路がmiR-133ａの発現を制御しているしている。本研究では，分岐鎖アミノ酸の１つでと考えられる。MiR-133ａを欠損したマウスでは，あるロイシン投与が，骨格筋のmicroRNA（以下，

骨格筋のミトコンドリアの機能不全や筋疾患が引miR）発現に与える影響について検証した。ロイ

き起こされると報告がある。すなわち，ロイシン投与は，遅筋であるヒラメ筋では，投与前とシン摂取によるmTOR経路の活性化がmiR-133ａ

比べmiR（1，133a/b）の発現量を有意に増加さの発現を介して，骨格筋中のミトコンドリアの恒せた。一方，速筋である長趾伸筋では，ロイシン

常性を維持している可能性が示唆された。

投与によりmiR（206，208b，499b）の発現量が10，11）

本研究により，これまで不明な点が多かった

有意に増加されており，miR-133ａは増加傾向を

miRの発現制御について，ロイシンが骨格筋中の示した。また，骨格筋特異的mTOR欠損マウス

miR発現に関与する知見が得られた。これは，ア（Mlc1-mTOR-/-）のヒラメ筋および長趾伸筋で© The Ito Foundation

肉質向上に資するアミノ酸栄養の基礎研究

は，miR-133ａの発現量が有意に減少していた。
これらの結果から，骨格筋においては，ロイシンによるmTOR経路の活性化がmiR-133ａの発現を制御していると考えられる。
文献１）Lagouge, M., Argmann, C., Gerhart-Hines, Z.,
Meziane, H., Lerin, C., Daussin, F., Messadeq, N.,
Milne, J., Lambert, P., Elliott, P., et al. : Resveratrol
improves mitochondrial function and protects
against metabolic disease by activating SIRT1 and
PGC-1alpha, Cell, 127，1109～1122，2006.
２）Ryu, D., Mouchiroud, L., Andreux, P. A., Katsyuba,E., Moullan, N., Nicolet-Dit-Felix, A. A., Williams, E.
G., Jha, P., Lo Sasso, G., Huzard, D., et al. : Urolithin
A induces mitophagy and prolongs lifespan in C.
elegans and increases muscle function in rodents,
Nature Medicine, 22，879～888，2016.
３）Fox, J. T., Sakamuru, S., Huang, R., Teneva, N.,
Simmons, S. O., Xia, M., Tice, R. R., Austin, C. P.,
Myung, K. : High-throughput genotoxicity assay
identifies antioxidants as inducers of DNA damage
response and cell death, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America,
109，5423～5428，2012.
４）Shimomura, Y., Yamamoto, Y., Bajotto, G., Sato, J.,
Murakami, T., Shimomura, N., Kobayashi, H.,
Mawatari, K. : Nutraceutical effects of branchedchain amino acids on skeletal muscle, The Journal of
Nutrition, 136, 529S～532S，2006.
５）Anthony, J. C., Yoshizawa, F., Anthony, T. G., Vary,
T. C., Jefferson, L. S., Kimball, S. R. : Leucine stimulates

405

translation initiation in skeletal muscle of
postabsorptive rats via a rapamycin-sensitive
pathway, The Journal of Nutrition, 130，2413～2419，
2000.
６）Sun, Y., Ge, Y., Drnevich, J., Zhao, Y., Band, M.,
Chen, J. : Mammalian target of rapamycin regulates
miRNA-1 and follistatin in skeletal myogenesis, The
Journal of Cell Biology, 189，1157～1169，2010.
７）Ye, P., Liu, Y., Chen, C., Tang, F., Wu, Q., Wang, X.,
Liu, C. G., Liu, X., Liu, R., Liu, Y., et al. : An mTORC1Mdm2-Drosha axis for miRNA biogenesis in
response to glucose-and amino acid-deprivation,
Molecular Cell，57，708～720，2015.
８）Guller, I., Russell, A. P. : MicroRNAs in skeletal
muscle: their role and regulation in development,disease and function, The Journal of Physiology,
588，4075～4087，2010.
９）Risson, V., Mazelin, L., Roceri, M., Sanchez, H.,
Moncollin, V., Corneloup, C., Richard-Bulteau, H.,
Vignaud, A., Baas, D., Defour, A., et al. : Muscle
inactivation of mTOR causes metabolic anddystrophin defects leading to severe myopathy, The
Journal of Cell Biology, 187，859～874，2009.
10）Liu, N., Bezprozvannaya, S., Shelton, J. M., Frisard,
M. I., Hulver, M. W., McMillan, R. P., Wu, Y., Voelker,
K. A., Grange, R. W., Richardson, J. A., et al. : Micelacking microRNA 133a develop dynamin
2-dependent centronuclear myopathy, The Journalof Clinical Investigation, 121，3258～3268，2011.
11）Nie, Y., Sato, Y., Wang, C., Yue, F., Kuang, S.,
Gavin, T. P. : Impaired exercise tolerance,
mitochondrial biogenesis, and muscle fiber
maintenance in miR-133a-deficient mice, The FASEBJournal, 30，3745～3758，2016.

© The Ito Foundation

406

中鎖脂肪酸に着目した人工乳改良による離乳期子牛の発育改善
The effect of medium-chain fatty acids supplementation with calf starteron growth in calves during the weaning period

福

森

理

加１，２・増

田

洋

史２・長

尾

慶

和１，２

（１宇都宮大学農学部附属農場，２東京農工大学大学院連合農学研究科）

Rika Fukumori１，２, Yoji Masuda２ and Yoshikazu Nagao１，２（１University Farm, Department of Agriculture, Utsunomiya University,
２

The United Graduate School of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology）

Our objective was to determine the effects of calcium salts of medium-chain fatty acids（MCFA-Ca）on growth and metabolic profiles in calves during the weaning transition period.
In exp.1, Sixteen Holstein × Japanese Black crossbred（F1）bull calves weaned at 4 months ofage and 6 Holstein calves weaned at 7 weeks of age were used in this study. In bothexperiments, calves were randomly assigned to 2 dietary treatments（MCFA and control）.
Calves were fed milk replacer（MR）and treatment supplements including MCFA-Ca（MCFA）
or not（control）with concentrate or calf starter and timothy hay. Jugular blood samples weretaken and body weight（BW）were measured temporally related to the weaning. In exp. 1, BW
and average daily gain did not differ between treatments. However, plasma insulin-like growth
factor-1（IGF-1）concentrations were higher and plasma insulin concentrations were lower in
MCFA calves compared with those in control calves. In exp. 2, BW during the post weaning
period was greater in MCFA calves than control calves. MCFA calves showed the higher
plasma concentrations of total cholesterol and beta hydroxy-butyrate after weaning comparedwith control calves. Our results suggest that feedinga solid feed including MCFA-Ca improves
daily gain in early weaning calves and may contribute the future productivity through theendocrine changes.

１．目

高く，また，この時期は将来の生産性に大きく関的わることから高度な栄養管理が必要とされるが，酪農場から生産されるホルスタイン種雄子牛や標準的な管理法が確立されていないのが現状であ

Ｆ１子牛（ホルスタイン×黒毛和種）は，国内牛る。慣行の哺育プログラムでは，省力・省コスト

肉生産を支える重要な存在であるが，その栄養管や早期に反芻胃発育を促す目的で代用乳の給与制

理は省力的かつ早熟であることが望まれ，栄養水限が行われてきたが，最近では哺乳量の増加や代準や飼養基準は明確でない。特に，子牛の哺育期用乳組成の見直しに関する多くの研究がなされ，の飼養管理は，下痢や肺炎などの疾病，事故率が自然な牛の哺乳量に近づける高栄養での哺乳管理© The Ito Foundation

中鎖脂肪酸に着目した人工乳改良による離乳期子牛の発育改善

407が推奨されるようになってきた。一方で，代用乳れている。しかしながら，このような低デンプンから固形飼料へと切り替わる離乳移行期の栄養管

飼料は，子牛のエネルギー供給には不十分である理法に関する調査研究は少ない。離乳移行期にお可能性がある。そこで本研究では，離乳移行期のいて，子牛は単胃動物から反芻動物へと消化吸収

子牛への油脂，特に中鎖脂肪酸の給与効果に着目

機構が劇的に変化する。この時期の子牛においてした。中鎖脂肪酸は，炭素数８～12の脂肪酸であは，デンプンのような易発酵性の栄養素がルーメ

り，長鎖脂肪酸と比較して消化吸収スピードが速ンの絨毛発育に極めて重要であることから，代用

く，速やかに代謝，エネルギーとして利用される。

乳給与を制限あるいは停止することで，人工乳

牛乳中にも含まれ，哺乳期のエネルギー補給に適（カーフスターター）や育成期配合飼料などの固していることから代用乳にも添加されるが，固形形濃厚飼料の摂取量を増加させ，反芻胃発酵に依

飼料への添加効果については詳細な検討がなされ存した栄養摂取への切り替えを促している。このていない。泌乳牛への中鎖脂肪酸カルシウム添加

とき，子牛が吸収するエネルギー栄養素は，代用試験では，成長ホルモン分泌促進因子である血中乳中に豊富に含まれる糖や脂肪から固形飼料の発グレリン濃度が高まる３）など，エネルギー補給効

酵によって得られる揮発性脂肪酸（VFA）へと果に加えて内分泌機能活性化による成長促進効果

急速に変化する。ルーメンの発達と人工乳摂取量も期待でき，離乳移行期の子牛の発育に好適であのバランスを崩すと，デンプン発酵によるVFAる可能性がある。そこで本研究では，離乳移行期

産生速度に吸収速度が追い付かず，ルーメンアシの子牛にエネルギー補給および内分泌賦活化効果

ドーシスの危険性が高まり，食欲停滞による発育を目的として中鎖脂肪酸を脂肪酸カルシウムとし停滞，離乳の遅れなど深刻な影響をもたらす。まて離乳期の固形飼料に添加し，成長および内分泌

た早期離乳法では発酵機能が十分に発達していな機能に及ぼす影響を，離乳時期の異なる条件下でいことが多く，糞中に未消化のデンプンが多く含検討した。

まれる等，栄養素の利用効率が低くなるリスクを伴う１）。これらの現状は，ルーメンアシドーシス

２．方法

や消化不良（下痢）等による損耗率の増加に直結2.1

している。また，デンプンの急速な発酵による

民間牧場および宇都宮大学農学部附属農場で飼

VFA吸収量の増加は，血中成長ホルモン（GH）

養されるＦ１（ホルスタイン×黒毛和種）および濃度を減少，ならびにインスリン濃度を増加させホルスタイン種子牛を供試した。民間牧場における 。GHは肝インスリン様成長因子-１（IGF-

るＦ１子牛の飼養試験を《試験１》，宇都宮大学

１）合成を介した筋肉・骨成長の促進作用を有す

農学部附属農場におけるホルスタイン種子牛の飼るのに対し，インスリンは体脂肪蓄積に代謝をシ養試験を《試験２》として実施した。

フトさせる傾向があることが示されていることか

《試験１》

２）

飼養試験

ら，これらホルモンの代謝機能や栄養素分配調節

１か月齢時に市場導入したＦ１雄子牛を16頭供機能を介して子牛の増体や体組成の発育パターン

試した。離乳を４か月齢とし，離乳10日前（Day-は影響をうけるかもしれない。

10）から離乳後85日後（Day85）までを試験期間

このようなことから，最近では，離乳移行期のとした。試験開始まで，供試牛は代用乳を1.0㎏/

人工乳の繊維含量増加や粗飼料給与の推奨が行わ

d給与され，カーフスターター，チモシー乾草お© The Ito Foundation

408

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

よび水は不断給与された。その後，Day-10か-１

び代謝ホルモン（IGF-１およびインスリン）濃まで，代用乳給与量を0.5㎏/dに減量し，育成期度を測定した。

配合飼料（上限7.5㎏/d），試験用飼料（270g/d）
およびチモシー乾草（不断給与）を給与した。供試牛はMCFA区と対照区の２区に配置され，試３．結果と考察《試験１》

験区ごとにフリーバーンで飼養された。MCFA

子牛の体重，日増体量，配合飼料摂取量の成績

区ではMCFA-Caを10％含む試験用ペレット飼をTable１に示した。試験期間を通じて，体重，料，対照区ではMCFA-Caを含まない試験用ペ

日増体量，配合飼料摂取量に処理区間の差は認め

レット飼料を試験期間を通して一律270g/d／頭られなかった。血液性状の結果をFig.１に示した。

が配合飼料にトップドレスで給与された。使用し血漿総コレステロール濃度は，離乳後に低下し，た中鎖脂肪酸カルシウムの組成は脂肪酸75％［脂その後回復した。血漿ケトン体濃度は，離乳後に肪酸としてＣ８：０，Ｃ10：０，Ｃ12：０を含増加した。血漿総コレステロールおよびケトン体

む］，カルシウム25％であった。採血および配合

濃度は，処理区間で差が認められなかった。血漿飼料＋試験用飼料の摂取量，体重の測定をDay-

グ ル コ ー ス 濃 度 は ，離 乳 前 後 の 変 動 は な く ，

10，Day 0, Day 13, Day 22, Day 50, Day84に行っ

MCFA区の試験開始時濃度が対照区と比べて高た。

値を示した。血漿インスリン濃度は，離乳後に増《試験２》加したが，MCFA区では，対照区と比較して離ホルスタイン種子牛を６頭供試した。出生時に乳後の増加が小さく，低い値を示していた。一方，子牛をMCFA区または対照区に配置し，出生時

血漿IGF-１濃度は試験期間を通して，MCFA区

から14週齢までを試験期間とし，個別ペンで飼養で高値を示した。

した。出生後５日間は初乳を出生時体重の10％量《試験２》

給与し，その後は代用乳を0.6㎏/d（５日齢～），0.8

供試牛の体重をTable２に示した。離乳前およ㎏/d（１週齢～），1.0㎏/d（２週齢～），0.8㎏/d（５び11週齢までの体重は両区間で差がなかったが，

週齢～），0.6㎏/d（６週齢～）で給与したのち７

12および13週齢では，MCFA区で対照区と比較

週齢で完全離乳した。試験用人工乳を，５日齢かして高値を示す傾向にあり，試験終了時の14週齢ら試験期間終了まで2.5㎏/dを上限として給与しでは有意に高かった。本試験において，離乳時のた。試験用人工乳は，市販人工乳と試験１と同様

人工乳摂取量は量処理区ともに１㎏/dを上回っの試験用ペレット飼料を９：１で混合したものでており，離乳可能なレベルに達していた。また，ある。すなわち，MCFA区ではMCFA-Caを１％

人工乳の給与上限である2.5㎏/dを摂取するよう含んでいた。チモシー乾草および水は不断給与とになったのは８～９週齢であり，処理区間に違いした。体重，飼料摂取量の計測および採血を毎週はなかった（データ未掲載）。出生時体重に差が

齢始めの給飼前に実施した。

なく，人工乳摂取量が急速に増加する離乳後から

2.2

評価項目

体重の差が認められたことから，人工乳組成の違

体重，日増体量および飼料摂取量を測定した。

いによる効果であると推察された。

また，採取した血液から，血漿代謝産物（総ケト

血液性状の結果をFig.２に示した。血漿グル

ン体，グルコース，総コレステロール）濃度およコース濃度は両区間に差がなかったが，血漿総コ© The Ito Foundation

409

中鎖脂肪酸に着目した人工乳改良による離乳期子牛の発育改善
Table 1 Body weight and average daily gain for calves fed treatment diets
Treatment１
Item

Control

MCFA

SEM

Treatment
P-value

Initial BW, kg

160.88181.38

20.24

0.64

Weaning BW, kg

178.38190.56

7.84

0.29

Final BW, kg

307.38322.38

11.51

0.37

ADG, kg

1.58

1.52

0.06

0.53

Concentrate,kg/d

5.88

6.04

Supplement,kg/d

0.24

0.24

3.92

4.19

Intake２FCR

１ Treatment：Control＝no MCFA ; MCFA＝MCFA at 24 gDM/d（4.8 gDM/d C8:0, 4.8 gDM/d C10:0,

14.4 gDM/d C12:0）
２FCR：Total Concentrate and supplement DMI（kgDM）/Total gain（kg）

200
180
160

Totalcholesterol（mg/dl）

Day:P<0.01
Treat:P=0.60
Day×Treat:P=0.30

140

80
40

0

Day Day Day Day Day Day-10 0 13 22 50 84

Insulin（ng/ml）

Day:P<0.01
Treat:P<0.01
Day×Treat:P<0.01

a

a

12
10

a

a

8
6
4

b
b

b
b

2
0

60
40

100

20

Day Day Day Day Day Day-10 0
13 22 50 84

200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

Glucose（mg/dl）

Day:P=0.08
Treat:P=0.42
Day×Treat:P<0.01

a

80

200

60

14

100

300

100

16

500

Day:P<0.01 140
Keton bodies
Treat:P=0.82（µmol/L） Day×Treat:P<0.01 120

400

120

0

600

b

20
Day Day Day Day Day Day-10 0 13 22 50 84

IGF-1（ng/ml）

0
control
MCFA

Day Day Day Day Day Day-10 0 13 22 50 84※a,b ; p<0.01

Day:P=0.13
Treat:P<0.05
Day×Treat:P=0.25

Day Day Day Day Day Day-10 0
13 22 50 84

Fig. 1 Plasma concentrations of total cholesterol, ketone bodies, glucose, insulin, and IGF-1 for calves weaned at 4

months of age in MCFA and control.

© The Ito Foundation

410

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 2 Body weight for calves weaned at 7 wk of age in MCFA and control
wk of age１

Control

MCFA

mean

SE

mean

SE

0

44.2

0.81

45.3

1.44

1

45.2

0.96

46.0

1.32

2

48.4

1.48

49.3

1.04

3

53.0

1.72

54.9

1.67

4

58.7

1.61

60.5

1.51

5

65.1

2.00

66.0

1.50

6

69.0

3.12

71.5

2.51

7

73.3

3.69

77.0

2.29

8

76.0

4.82

84.0

2.18

9

85.0

5.77

92.0

3.12

10

91.7

5.92

99.1

3.41

11

96.7

6.05

105

3.06

12

100＊

5.80

112

2.65

13

109＊

5.01

121

2.29

14

115＊＊

5.69

129

3.55

１Calves were weaned at 7 wk of age.
＊Weekly means between MCFA and control tend to be different（P＜0.1）＊＊Weekly means between MCFA and control are different（P＜0.05）

Total cholesterol（mg/dL）

Glucose（mg/dL）

160
140
120
100
80
60
40
20
0

weaning
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14

160
140
120
100
80

MCFA

60

control

40
weaning20
0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314
Weeks of age

Ketone bodies（µmol/L）

Weeks of age
400
350
300
250
200
150
100
50
0

weaning
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14
Weeks of age

Fig. 2 Plasma concentrations of glucose, total cholesterol, and ketone bodies for calves weaned at 7 wk of age in MCFA

and control. ＊：shows the tendency of differences（P＜0.1）and ＊＊：shows the differences（P＜0.05）between MCFA
and control.

© The Ito Foundation

中鎖脂肪酸に着目した人工乳改良による離乳期子牛の発育改善

411

レステロールおよびケトン体濃度は，離乳後にら骨格や筋肉を成長させることが望まれる。したMCFA区で高値を示した。

がって，MCFA-Ca給与は，子牛期において好適試験１および試験２の結果から，MCFA-Ca給な代謝ホルモンの変化をもたらした可能性があ与による増体効果は離乳時期によって異なることる。本試験で供試した子牛の追跡調査を引き続きが示唆された。４か月離乳の子牛は，離乳前の行う予定である。

Day-10から離乳時のDay０において，反芻胃発酵の指標となる血漿ケトン体濃度が既に高く，反４．要約芻胃発酵に依存した栄養摂取が十分可能になって本研究では，子牛の発育改善を目的として，離おり，日増体量も試験期間を通じて1.5㎏/d以上

乳移行期に与える固形飼料に中鎖脂肪酸カルシウと量処理区とも良好であったことから，MCFA-ム（MCFA-Ca）を添加して，その効果を検討しCaの補給効果が明瞭に現れなかったかもしれな

た。結果として，MCFA-Caは早期離乳子牛（７い。一方，７週齢離乳の子牛では，離乳時に１㎏

週齢離乳）において，増体改善効果が認められ/d以上の人工乳を摂取できていたものの，反芻

た。４か月離乳子牛において，増体促進効果は認

胃や代謝の機能は不十分であったことが推察されめられなかったが，インスリン分泌を抑制し，骨る。このような時期において，MCFAは有効な格や筋肉成長を促進するIGF-１の血漿中濃度を栄養素として，増体に寄与した可能性がある。７増加させたことから，将来の生産性に寄与する可週齢離乳子牛において，MCFA-Caの給与は，離能性が示唆された。

乳後の血漿ケトン体濃度を増加させ，血漿コレス
テロール濃度の低下を抑制した。MCFAは，小腸で吸収され，肝門脈を経由して肝臓で速やかに代謝される。このとき，MCFAの一部はケトン体やコレステロールの合成に利用され，全身で利用される。MCFA-Ca給与によって増加したケトン体およびコレステロールは，エネルギーや生体成分の材料として，子牛の発育に寄与した可能性がある。また，試験１では，MCFA-Caの給与によって，血漿インスリン濃度増加が抑制され，血漿IGF-１濃度が増加した。MCFAによる血漿イ
ンスリン濃度の降下作用については，その機序はあきらかでないが泌乳牛への給与試験においても同様の結果が得られている。インスリンは，細胞文献１）Eckert, E., Brown, H. E., Leslie, K. E., DeVries, T. J.,
Steele, M. A. : Weaning age affects growth, feedintake, gastrointestinaldevelopment, and behavior in
Holstein calves fed an elevatedplane of nutrition
during the preweaning stage, Journal of Dairy
Science, 98，6315～6326，2015．
２）Matsunaga, N., Arakawa, T., Goka, T., Nam, K.
T.,Ohneda, A., Sasaki, Y., Katoh, K. : Effects ofruminal infusion of volatile fatty acids on plasma
concentration of growth hormone and insulin in
sheep, Domestic Animal Endocrinology, 17，17～27，
1999．
３）Fukumori, R., Sugino, T., Shingu, H., Moriya, N.,
Kobayashi, H., Hasegawa, Y., Kojima, M., Kangawa,
K., Obitsu, T., Kushibiki, S.,Taniguchi, K. : Ingestionof medium chain fatty acids by lactating dairy cows
increases concentrations of plasma ghrelin, Domestic
Animal Endocrinology, 45，216～223，2013．

増殖作用を持つが，若齢牛におけるインスリン分
泌の過剰は過肥を招くことが指摘されている。一方で，IGF-１は筋肉や骨格の成長を促す成長因子であり，GHの刺激によって産生される。哺育期および育成期には，過剰な脂肪蓄積を防ぎなが© The Ito Foundation

412

ストレスホルモンによる日本短角種牛由来筋芽細胞の増殖と筋線維型への影響
The effect of stress hormone on the myoblast derived from Japanese
shorthorn cattle proliferation and exchanges the muscle fiber type

佐

藤

勝

祥

（秋田県立大学生物資源科学部）

Katsuyoshi Sato
（Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University）

In recent years, the idea of animal welfare is widespread in animal husbandry field. In
addition, stress adversely affects on productivity and the quality of animal product. So, it isvery important to reduce the stress of livestock. We have studied with attention to stressrelated hormones in animal husbandry field. The aim of this study, therefore, 1）to investigate
the correlation coefficients among the stress related hormones（apelin, oxytocin and serotonin）,
insulin like growth factor-I（IGF-I）and cortisol, 2）the effect of these stress related
hormonesto myoblast cell growth and differentiation. In Experiment 1 with Japanese shorthorn cattle, plasma IGF-I concentrations positively correlated with apelin, yet negatively
correlated with serotonin. In Experiment 2 with mouse myoblast cell line C2C12 from RIKEN,
apelin stimulated cell growth, but serotonin inhibited cell proliferation. In addition, MyHC 2xmRNA expression levels with serotonin were lower than that of control group, and MyHC 1（slow type）mRNA expression levels with apelin group were lower than that of with oxytocingroup. These results demonstrate that apelin, oxytocin and serotonin play important role ofmuscle growth and the quality of meat.

１．目

た，安全安心な食肉資源として魅力的である。ま的た，ストレスは家畜の成長や畜産物の質に悪影響

近年，輸入飼料に依存した我が国の牛肉生産はを及ぼす可能性があることから，ストレスの少な

BSE等の発生に見られる食の安全性に関する問題

い飼育環境の構築は畜産現場において重要な課題

や，集約的な飼養形態における家畜福祉に関するである。筆者らは，ストレス応答ホルモンを指標問題等多くの問題を抱えている。秋田県立大学附としてストレスの少ない飼育環境の構築を目指し

属フィールド教育研究センター（FC）で飼育さており，特に，アペリン，オキシトシンおよびセ

れている日本短角種牛は，粗飼料の利用効率に優

ロトニンの３つのホルモンに着目して研究を行っれており，放牧飼育に適していることから，地元ている。アペリンは，ヤギやヒツジの水分代謝にの飼料資源を有効に活用してのびのびと飼養し関するストレス反応によって分泌が促進されるこ© The Ito Foundation

ストレスホルモンによる日本短角種牛由来筋芽細胞の増殖と筋線維型への影響

413とが明らかとなっており，反芻動物におけるストン様成長因子Ⅰ（IGF-Ｉ）濃度を測定した。アレス応答において重要な役割を担っていることがペリンおよびセロトニンの測定は，ユーロピウム

報告されている１）。また，オキシトシンには母性を用いた時間分解蛍光法と２抗体法による競合法

行動や攻撃性をコントロールする働きがあり，セを利用して測定方法を確立した。他のホルモンにロトニン不足はストレス耐性の低下や睡眠障害をついては市販のキット（オキシトシンおよびコル引き起こすことが知られている。ところで，筋肉チ ゾ ー ル ； Enzo Life Sciences ， IGF-I ； R&Dの質（筋線維型）は，運動負荷などの物理的な刺systems）を使用した。

激によって調節されていると考えられていたが，最近の報告では内分泌ホルモンによる調節機構の存在が明らかになってきている。Elabらは老齢マ

2.2

筋芽細胞の増殖および分化誘導におけるストレス応答ホルモン刺激の影響
2 . 2 . 1 筋芽細胞の増殖におけるストレス応答

ウスへのオキシトシン投与によって骨格筋の再生ホルモン刺激の影響能が回復することを報告し ，渡邉らは高脂肪食

本研究では，理化学研究所から購入したマウス

由来の肥満マウスへのセロトニン投与がⅠ型筋線

由来筋芽細胞株（C2C12細胞株）を用いた。ダル

維割合を増加させることを報告している 。これベッコ変性イーグル培地（DMEM, high-glucose）

らの報告から，ストレス応答ホルモンが筋肉の成に，牛胎児由来血清（FBS）を10％，抗生物質

長と肉質へ影響を与える可能性が示唆されてい（ペニシリン―ストレプトマイシン）を１％添加る。そこで，本研究ではアペリン，オキシトシン

して増殖用培地とした。ストレス応答ホルモンとおよびセロトニンによる骨格筋への影響を検討す

し て Pyr-1 apelin-13 ，oxytocin ，serotonin（ペることを目的とした。

プチド研究所，大阪）を用い，増殖用培地に各ホ

２）

３）

２．方

ルモンを1.0μＭの濃度で添加して刺激用培地を法作成した。６wellプレートを用いて，１wellあた

ストレス応答ホルモンと産肉性の検討

り９×10４個（1.0×10４個／㎝２）程度になるようストレス応答ホルモンと産肉性の関連を検討すに細胞を播種し，２日おきに培地を交換しながるため，FCで飼育されている肉用牛から採血をら，７日間培養を行った。培養条件は，37℃，５％行い，各種ホルモン濃度の相関を検討した。FC

CO２ ，95％空気とした。刺激区ごとに４枚のプで飼育されている日本短角種牛９頭（繁殖雌牛，

レートを用意し，培養開始１，３，５および７日目

月齢：78.0±12.2カ月齢，体重：568.8±33.3kg）に１枚のプレート（６well分）の細胞を回収し，と黒毛和種牛３頭（繁殖雌牛，月齢：72.0±18.0

トリパンブルー染色後，血球計算盤を用いて細胞

カ月齢，体重：497.7±11.9kg）を試供牛とした。

数を測定した。

2.1

１日２回（９時と16時）の給餌を行い，水と鉱塩

2 . 2 . 2 分化誘導におけるストレス応答ホルモは自由摂取とした。13時にヘパリン入真空採血管

ン刺激の影響を 用 い て 頸 静 脈 か ら 血 液 を 採 取 し ，遠 心 分 離

２％ウマ血清を加えたダルベッコ変性イーグル（3,000rpm，10min）後の血漿サンプルを回収し培地（DMEM，low-glucose）を分化誘導培地とて，本研究で着目しているアペリン，オキシトシ

した。６wellプレートを用いて，細胞がウェルのンおよびセロトニンと，ストレスの指標としてコ８割程度を占めるまで培養を続けた後，培地を分ルチゾール濃度を，産肉性の指標としてインスリ化誘導培地に変え，分化誘導刺激を行った。細胞© The Ito Foundation

414

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

は10日程度の分化誘導刺激によって，筋管を形成

関（－0.356）が見られた。この結果から，アペした（データ未掲載）。この時，2.2.1と同様にしリンが筋肉の成長を促進し，セロトニンは成長をて分化誘導培地に各ホルモンを1.0μＭの濃度で添抑制する可能性が示唆され，これらのホルモンが加し，分化誘導時におけるストレス応答ホルモン

産肉性の指標となり得る可能性が示された。

の影響を検討した。２日おきに培地交換を行いな

筋芽細胞の増殖におけるストレス応答ホルモン

がら10日間培養した後，各ウェルにRNAiso Plus

刺激試験の結果をTable２に示した。ここでは，（タカラバイオ）を700μｌずつ加えて細胞を回収

１日目の細胞数を100とした細胞増殖率を示してした。回収したRNAiso Plusにクロロホルムをいる。アペリン刺激区では，３日目の細胞増殖率

200μｌずつ加えて10秒間混和した後，室温で５が対照区と比較して有意に低くなったが，５日目

分間静置し，12,000×Ｇ，４℃で15分間遠心分離には有意に高くなるという結果が得られた（いずした。その後，上清のみを回収し，イソプロパノー

れもP＜0.05）。また，オキシトシン刺激区では対ルを500μｌずつ加えて数回転倒混和した後，室照区に対して有意な差は見られなかったが，セロ温で10分間静置し，12,000×Ｇ，４℃で10分間遠

トニン刺激区では３日目と７日目の細胞増殖率が心分離した。上清をアスピレートした後，70％エ

対照区に比べて有意に低い値となった（いずれもタノールを加え，同様にして遠心分離した。上清P＜0.05）。以上の結果から，アペリンは筋芽細胞

をアスピレートした後，回収したRNAをRNase-の増殖を促進し，セロトニンは抑制する可能性がfree-H2O に 溶 解 さ せ た 。 逆 転 写 キ ッ ト

示唆された。この結果は，血中ホルモン濃度の相（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA関を検討した結果とも一致する。アペリン濃度はEraser；タカラバイオ）を用いてcDNAを作成し筋芽細胞の増殖を促進する作用が知られている

た 後 ，リ ア ル タ イ ム PCR 法（LightCycler 96

IGF-Ｉ濃度と強い正の相関があり，セロトニン

System，Roche）を用いてＩ型筋線維に発現す濃度はIGF-Ｉ濃度と弱い負の相関が見られた。

るMyHCⅠmRNAおよびⅡ型筋線維に発現する以上の結果から，アペリンによる成長促進作用おMyHCⅡa，MyHCⅡb，MyHCⅡx mRNAの発現

よびセロトニンによる成長抑制作用の可能性が示

量を解析した。用いたプライマーとPCR条件は，

唆された。

Ⓡ

Shenらの報告

４）

に従い，18s rRNAを内部標準と筋芽細胞の分化刺激におけるストレス応答ホル
モン刺激試験の結果をTable３に示す。分散分析

して相対定量解析を行った。

およびTukeyの多重比較検定を用いて，遺伝子別

３．結果と考察に各ホルモン刺激区の影響を解析した結果，対照

肉用牛の各種ホルモン濃度の相関をTable１に

区 と 比 較 し て セ ロ ト ニ ン 刺 激 区 の MyHC Ⅱ x示す。この結果，ストレスの指標であるコルチ

mRNA発現が有意に低くなった。また，MyHC

ゾール濃度と産肉生の指標であるIGF-Ｉ濃度のⅡａおよびMyHCⅡbmRNA発現には有意な差が間には，弱い負の相関（－0.409）が見られ，牛見られなかったが，MyHCImRNA発現を見ると，の成長においてストレスが負の影響を与えること

アペリン刺激区の値がオキシトシン刺激区よりもが示唆された。また，アペリン濃度とIGF-Ｉ濃有意に低い値となった（いずれもP＜0.05）。これ

度の間には強い正の相関（0.827）が見られ，セらの結果から，セロトニンがⅡ型筋線維への分化

ロトニン濃度とIGF-Ｉ濃度の間には弱い負の相を，アペリンがⅠ型筋線維への分化をそれぞれ抑© The Ito Foundation

415

ストレスホルモンによる日本短角種牛由来筋芽細胞の増殖と筋線維型への影響
Table 1 Correlation coefficients among plasma apelin, oxytocin,

serotonin, cortisol and IGF-I concentrations, in cattle（n＝15）．
oxytocin

serotonin

cortisol

0.049－0.140－0.283

0.827

0.044

0.140

－0.0550.115－0.356apelinoxytocin
serotonin
cortisol

IGF-Ｉ－0.409

Table 2 Cell proliferation rate of C2C12 with apelin, oxytocin and serotonin.
day1

day3

day5

day7

control100±6699±104

1274±551446±58

apelin100±9315±34＊1548±73＊1680±89

control100±8855±301461±88

1889±98

oxytocin100±10705±431247±61

1861±111

control

100±141294±802347±783836±111

serotonin100±13987±64＊2484±149

2937±170＊

All values were presented as the mean±SEM and analyzed by ANOVA and t-test. ＊P＜0.05 vs. control group.

Table 3 MyHC Ⅰ ，MyHC Ⅱ a, MyHC Ⅱ b, MyHC Ⅱ x mRNA expression in differentiated C2C12

with apelin, oxytocin and serotonin.
MyHC Ⅰ

MyHC ⅡaMyHC Ⅱx

MyHC Ⅱb

control

100±19.95ab

100±17.62

100±16.23ａ

100±7.40

apelin73.21±4.76ｂ

114.19±21.47

83.89±11.99ab

122.59±8.68

oxytocin148.67±11.05ａ

97.24±11.16

90.03±15.65ab

129.76±12.14

serotonin

109.97±19.01ab

48.60±12.09

43.45±5.96ｂ

132.49±38.34

The mRNA expression levels were normalized to 18s rRNA levels. The data are expressed as mean±

SEM. The values labeled with different letters are significantly different（P＜0.05）．

制する可能性が示唆された。今後はミオシン重鎖として，肉用牛における血中ホルモン濃度動態のタンパク質の発現解析を行い，実際に分化した筋

検討と，筋芽細胞の増殖と筋管への分化における線維型をさらに詳しく解析することで，これらのストレス応答ホルモン刺激の影響を検討した。結作用について検討を続ける必要がある。

果，肉用牛の血中アペリン濃度は成長因子の指標４．

要として用いた血中インスリン様成長因子Ⅰ

約（IGF-Ⅰ）濃度との間に強い正の相関が見られ本研究では，アペリン，オキシトシンおよびセ

た。さらに，筋芽細胞の増殖においてもアペリン

ロトニンの三種類のストレス応答ホルモンに着目

刺激によって有意に細胞増殖が促進される結果がし，産肉生と肉質への影響を検討することを目的得られ，アペリンが筋肉の成長を促進する可能性© The Ito Foundation

416

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）が示唆された。また，血中のセロトニン濃度と血中IGF-Ⅰ濃度の間には弱い負の相関が見られ，筋芽細胞の増殖においてもセロトニン刺激によって有意に細胞増殖が抑制されるという結果が得られた。この結果から，セロトニンは筋肉の成長において抑制的な作用を持つ可能性が示唆された。
筋芽細胞から筋管への分化におけるストレス応答
ホルモンの影響では，アペリンがⅠ型筋線維への分化を，セロトニンがⅡ型筋線維への分化をそれ
ぞれ抑制する可能性が示唆された。この結果は今後，発現しているタンパク質を解析することで実際に分化した筋線維型を分析し，詳細を検討していく必要があると考えられる。以上の結果から，本研究で着目したストレス応答ホルモンが牛においても産肉性と肉質に影響を与える可能性が示唆され，ストレスの少ない飼育環境と，産肉性と肉質の向上に向けてこれらのホルモンを指標として

文献１）Sato, K., Takahashi, T., Kobayashi, K., Hagino, A.,
Roh, S. G., Katoh, K. : Apelin is involved in
postprandial responses and stimulates secretion ofarginine-vasopressin, adrenocorticotropic hormone
and growth hormone in the ruminant, Domestic
Animal Endocrinology, 42（3），165～72，2012.
２）Elabd, C., Cousin, W., Upadhyayula, P., Chen, R. Y.,
Chooljian, M. S., Li, J., Kung, S., Jiang, K. P., Conboy,
I. M. : Oxytocin is an age-specific circulating
hormone that is necessary for muscle maintenanceand regeneration, Nature communications, ５，4082，
2014.
３）Watanabe, H., Nakano, T., Saito, R., Akasaka, D.,
Saito, K., Ogasawara, H., Minashima, T., Miyazawa,
K., Kanaya, T., Takakura, I., Inoue, N., Ikeda, I.,
Chen, X., Miyake, M., Kitazawa, H., Shirakawa, H.,
Sato, K., Tahara, K., Nagasawa, Y., Rose, M. T.,
Ohwada, S., Watanabe, K., Aso, H. : Serotonin
Improves High Fat Diet Induced Obesity in Mice,
PLoS One, 11（1）：e0147143，2016.
４）Shen, L., Chen, L., Zhang, S., Du, J., Bai, L., Zhang,Y., Jiang, Y., Li, X., Wang, J., Zhu, L. : MicroRNA27b Regulates Mitochondria Biogenesis in Myocytes,
PLoS One, 5；11（2）：e0148532，2016.

用いることの可能性が示された。今後は，実際の牛の生体内，細胞への影響を検討していく。

© The Ito Foundation

417

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発
Bactericidal effect of multi-drug resistance bacteria using lactic acidbacteria and development of functional domestic animal fodder

木

下

英

樹・石

川

潤

一＊

（東海大学農学部バイオサイエンス学科，＊宮城大学大学院食産業学研究科）

Hideki Kinoshita and Junichi Ishikawa＊（Department of Bioscience, School of Agriculture, Tokai University,＊Graduate School of Food, Agricultural and Environmental Sciences, Miyagi University）

Recently, many multidrug-resistant bacteria have appeared due to the use of a large
amount of antibiotics, which have been feared the spread of infection to humans. Therefore, inthis study, we examined whether the bacteriocins produced by LAB can suppress drug
resistance bacteria effectively. First, the characterization of bacteriocin, Bac916, produced by
Lactococcus lactis MBR916 was performed. The culture supernatant of MBR916 strain showedvery high antibacterial activity as 939 A.U./100μl. The culture supernatant showed
antibacterial activity in a wide pH range（pH 2-11）, although it became unstable at pH 5 ormore after autoclaved. In the protease resistibility test, the culture supernatant showed highresistance to proteinase K, actinase E, and chymotrypsin, but the resistibility decreased by aneutralization treatment. In the cross test, when the MBR916 strain was used as an indicator
bacterium, it was sensitive to all the supernatants excluding Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus JCM 1002T. The tendency of antibacterial activity of MBR 916 showed a similarity to
Lb. gasseri JCM11657 which is a gassericin A producer. In the antibacterial activities at thedifferent culture condition, the activity value of MBR916 strain was as high as 2,048（211）
A.U./100μl at 30 °C, but the value disappeared at 37 °C. Further, the bacteriocin productivities
also decreased at cyclic culture and stirring condition. Finally, MBR916 strain and Bac916 wereadded to porcine feces and the number of resistant bacteria was measured after 7 days. The
number of multidrug-resistant bacteria significantly decreased in Bac916-added group ascompared with the control（P＜0.01）. In the microflora analysis by Terminal-Restriction
Fragment Length Polymorphism（T-RFLP）, when MBR916 strain and Bac916 were added to
porcine feces, Bacteroides order decreased compared with the control and bacitracin-addedgroups whereas Lactobacillales order was increased compared with bacitracin-added group. In
this study, the possibility of reduction of multidrug-resistant bacteria using bacteriocin of lactic
acid bacteria was shown, and it is expected to develop functional feed for livestock suppressing
multidrug-resistant bacteria.

© The Ito Foundation

418

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

2.2

的

１．目

抗菌活性値測定

抗菌活性値の測定は，ペニシリンカップ法７）ま現在，病院での抗菌薬の過度の処方や不適切なたはSpot on Lawn法 ８）により行った。JCM1002

使用により多剤耐性菌が出現し，ヒトへの感染と株を混合した寒天平板上にペニシリンカップを静

その拡大が問題となっている。また，動物用

置し，２ｎ倍ずつ希釈した培養上清100μｌを添加

抗菌剤や抗菌性飼料添加物の使用も耐性菌を生みし，37℃で一晩培養後，生育阻止円の直径（㎜）

出す要因となっている。そのため厚生労働省は薬を測定した。阻止円が形成される最大希釈倍率を剤耐性対策のためのアクションプランを作成し，上清100μｌ当たりの抗菌活性値（A.U./100μｌ）

抗生物質の適正使用を呼びかけている 。我々は，とした。Spot on Lawn法では，寒天平板上にサ

昨年までの研究で900菌株以上の乳酸菌からバク

ンプル３μｌを直接滴下し試験した。なお，Spot

テリオシン産生株をスクリーニングし，バクテリon Lawn法もペニシリンカップ法とほぼ同等の結

オシンによる多剤耐性菌の殺菌が可能であること果が得られたため，単位を（A.U./100μｌ）としを明らかにした。特にLactococcus lactis MBR916

た。プロテアーゼ耐性試験の抗菌活性値は，指標のバクテリオシン（以下，Bac916）は多くの多菌を混合した寒天平板上を120μｌずつ96ウェル剤耐性菌に有効で，耐熱性に優れ，中性領域でもマ イ ク ロ プ レ ー ト（Sigma-Aldorich, St. Louis,

抗菌活性を示し，プロテアーゼ（アクチナーゼ

MO, USA）に分注し，サンプルを20μｌずつ上Ｅ）に対して高い耐性を有することを明らかにな層して37℃，24ｈ培養後，生育状況を観察した。

り，非常に有用なバクテリオシンであることが示

また，それぞれの菌株同士のクロステストは，ペされた４）。そこで，Bac916のさらなる特徴付けと，

ニシリンカップ法にて行った。

１，２）

３）

豚糞便中での多剤耐性菌の殺菌効果について検討

2 . 3 培地の調製と粗精製バクテリオシンおよした。

び凍結乾燥粉末の調製

2.1

MRS培地から肉エキス，Tween80，およびグ法

２．方ルコースを除いたMRS-BT溶液を調製し透析後，使用菌株と培養条件

透析外液を取得した。この透析外液にグルコース

本研究では，MBR916株 ，ナイシンＡ産生株でを添加して（終濃度２％）フィルター滅菌し，あるLc. lactis subsp. lactis NBRC12007，ナイシン

MBR916株を植菌し，30℃，18時間培養した。遠Ｚ産生株であるLc. lactis subsp. lactis JCM7638５），

心分離（3,000 rpm，15 min）後，上清を一晩透

ガセリシンＡ産生株であるLactobacillus gasseri析 し ，透 析 内 液 を フ ィ ル タ ー 滅 菌 し て 粗 精 製

JCM11657 ，ガセリシンT/X産生株であるLb.

Bac916溶液を取得した。また，一部を凍結乾燥

gasseri JCM11064と，バクテリオシン非産生株として粗精製Bac916凍結乾燥粉末（Bac916FD）をさ れ る Lc. lactis JCM5805 お よ び Lb. delbrueckii

取得した。

４）

６）

subsp. bulgaricus JCM1002 を用いた。各菌株は2.4

MRS broth（Difco Laboratories, Detroit, MI,

純水に１㎎/ml Bac916FDを溶解し，pHを2.0

USA）を用い，30℃または37℃で24時間，静置～12.0に調整し，室温で１時間程度放置した後，培養した。

Spot on Lawn法で抗菌活性の有無を判定した。

T

Bac916のpH特性と耐熱性の評価

また，pH調整後のサンプルをオートクレーブ© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発（121℃，15 min）し，同様に抗菌活性試験を行った。
2.5

419

水製薬株式会社，日本）を基とし，３種類の抗生Bac916のプロテアーゼ耐性の評価

物質（AMK 12μg/ml，IPM 12μg/ml，CPFX 1

MBR916株の培養上清，pH７に調整した培養

μg/ml）添加，256μg/ml BC添加，無添加培地

上清，１㎎/mlのナイシンＡ（Sigma-Aldorich,を用い，定法に従い生菌数を測定した。

St. Louis, MO, USA）およびJCM11657株の培養

2.8

上清をそれぞれ１mlずつ分注し，Proteinase K（和上記菌数変化測定サンプルの１日目，３日目，

光純薬工業株式会社，大阪），トリプシン（和光

７日目の対照区，BC添加区，Bac916FD添加区，

純薬工業株式会社），アクチナーゼＥ（科研製薬，

MBR916株添加区のサンプルをそれぞれ１ｇ程度

東京），キモトリプシン（Sigma-Aldorich），ペ

採取し，ただちに－80℃にて凍結した。凍結したプシン（和光純薬工業株式会社）を各々適切な緩サンプルを株式会社テクノスルガラボ（静岡市，

衝液を用いて，終濃度が0.5～32 ㎎/mlになるよ日 本）に 依 頼 し ，Nagashima 法 に て Terminal-

うに等量混合し，37℃，24ｈインキュベートし，

Restriction Fragment Length Polymorphism（以マイクロプレート法により活性が完全に消失した

下，T-RFLP）解析に供した。

プロテアーゼ濃度を調べた。
2 . 6 培養条件の違いによるバクテリオシン産

豚糞便の菌叢解析

３．結果と考察
最初にBac916の特徴付けを試みた。抗菌活性

生の消長比較
各種菌株を24時間培養し，培養液を遠心分離試験を行ったところ，MBR916株の上清はナイシ（3,000 rpm, 15 min）後，ろ過滅菌した上清を抗ンＡ産生株であるNBRC12007株上清とほぼ同値

菌試験に用いた。異なる培養温度条件における試の活性を有していることが明らかになった。ま験では，培養温度を30℃と37℃に設定し試験した，Bac916は，室温条件において，pH２-12までた。サイクル培養試験では，至適温度で培養し，安定した活性を示し，加熱条件では，pH５以上

集菌後，新しい培地を入れて培養する作業を３回で阻止円直径の縮小が観察された。Daviesら ９）繰り返した。それぞれの培養上清を回収しサンプ

は，ナイシンの場合，pH２-４の酸性条件で安定

ルとした。また，培養中，30℃における攪拌操作

な活性を保持するが，それ以上のpH条件では不も行い，上清の活性値を静置培養と比較した。

溶化により活性を減少させ，加熱した場合でもほ2.7

豚糞便における菌数の経時変化

ぼ同様の結果となると報告している。

凍結保存していた豚の糞便６サンプルから各10

Table１には，各種プロテアーゼへの耐性試験

ｇずつ計60ｇのサンプルを混合し，同重量の滅菌の結果を示した。pH未調整のMBR916株の上清水を添加し，室温でよく攪拌した。攪拌後，30ｇ

は，トリプシン以外のプロテアーゼでは32 ㎎/ml

ずつチューブに分注し，４区分のサンプルを作製と非常に高い濃度でないと活性の消失は見られなした。区分ごとに，Bac916FD添加区分（終濃度かった。特にアクチナーゼＥおよびキモトリプシ

１㎎/g），バシトラシン（BC）添加区分（終濃度ン に お い て は ，ガ セ リ シ ン Ａ 産 生 株 で あ る

256 μg/g），MBR916 株 添 加 区 分（終 濃 度 10

７

JCM11657株の培養上清よりも数倍高い耐性を示

CFU/g），無添加区分とし，25℃，１週間静置しした。一方，中性化処理した場合，活性が大きくた。菌数の測定は，０日目および７日後の２回低下したことからBac916の酸性領域での構造的行った。サンプルごとに，変法GAM寒天培地（日安定性が，プロテアーゼ耐性に寄与している可能© The Ito Foundation

420

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

Table 1 The concentrations of the proteases showing complete disappearance of the antimicrobialactivity of the bacteriocins
Protease（mg/mL）
Proteinase K

TrypsinActinase E

Chymotrypsin

MBR916 Sup.

32

1

32

32

MBR916 Sup.（pH7.0）

1

0.5

8

0.5

Nisin

8

0

1

0.5

JCM11657 Sup.

32

0.5

2

8

Table 2 Inhibition circle of culture supernatant against each indicator bacteria（unit: mm）
Indicator bacteria

Supernatant

JCM1002

JCM5805

JCM1002

12.3

0.0

JCM5805

14.3

0.0

NBRC12007

34.0

16.8

JCM7638

33.3

14.0

JCM11657

24.5

JCM11064
MBR916NBRC12007

JCM7638

JCM11657

JCM11064

MBR916

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

14.3

11.8

2.0

4.2

15.3

4.0

0.0

12.8

9.7

18.3

7.2

10.3

8.5

4.7

15.7

0.0

12.0

9.3

0.0

9.2

14.0

21.5

0.0

12.2

6.8

6.5

0.0

12.7

28.2

0.0

10.3

9.5

0.0

10.0

13.3

性が示唆された。ナイシンはトリプシンで０㎎/

Fig.１には，培養条件の違いによる活性値の比mlで活性が失われた。これは緩衝液のpHの影響較を示した。MBR916株は，30℃においては，活だと考えられたため，使用する緩衝液を再検討す

性値が2,048 A.U./100μｌと高い活性を示したが，る必要がある。

37 ℃ に お い て は ，活 性 が 消 失 し た（Fig.1a）。

Table２には，バクテリオシン産生株同士のクMBR916株は37℃でも目視でも十分に確認できる

ロステストの結果を示した。MBR916株を指標菌

ほど菌は増殖していたため，菌株の生育不良ではとして使用した場合，JCM1002株の上清を除く，なかった。次に，培養ごとに上清のみを交換する

すべての上清の抗菌活性に感受性であった。まサイクル培養において，サイクルを繰り返すと，た，抗菌の傾向を比較するとJCM11657株と類似

JCM11064株を除くすべての株で活性値の低下傾

性の高い傾向を示した。JCM11657株が産生する向が示された（Fig.1b）。また，静置条件下と撹

ガセリシンＡは，標的受容体を持たないバクテリ

拌条件下における抗菌活性を比較したところ，

オ シ ン で あ り ，抗 菌 ス ペ ク ト ル が 類 似 す る

MBR916株では撹拌条件下で著しく活性が減少しBac916も同様のタイプである可能性が示された。

た（Fig.1c）。以上の結果からBac916産生にかか

また，バクテリオシン産生性でないとされているわる遺伝子群が温度感受性プラスミド上に存在す

JCM5805株も抗菌活性を示したが上清のpHは試る可能性が考えられた10）。タンパク質複製遺伝子験に供した乳酸菌株が生育を阻害されるpHではrepAを有する温度感受性プラスミドpVE6002は，ないため，何らかの抗菌物質を産生している可能37.5℃培養で複製数が著しく低下することが知ら性が示唆された。

れており11），Bac916も同様である可能性が考えら© The Ito Foundation

421

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発（a）

MBR916NBRC12007
JCM11657
JCM11064

1024
256
64
16
4
1
30℃

（b）

37℃
MBR916NBRC12007
JCM11657
JCM11064

4096
Antibacterial activity（A.U./100µL）

JCM7638←no activity

Antibacterial activity（A.U./100µL）

4096

JCM7638

1024

256
64
16
4
1
1cycle（c）2cycle
MBR916

Antibacterial activity（A.U./100µL）

4096

3cycleNBRC12007

JCM7638

1024
256
64
16
4
1
StaticAgitateFig. 1 Antibacterial activities comparison by differential cultural condition,（a）temperature,（b）exchanging new

supernatant,（c）static or agitated condition（30℃）．
Control

Viable cell count（CFU/g）

1.0E+101.0E+09
1.0E+08
1.0E+07

a

a
a

a

a b

a

a

a

b

1.0E+05c

1.0E+04
1.0E+02

Three-mixed antibioticsa1.0E+06

1.0E+03

Bacitracin

d

c

a

1.0E+01
1.0E+00
Control（0 day）Control（7 days）Bacitracin

Bac916

MBR916After 7 days
Fig. 2 Changes in the number of porcine fecal bacteria after adding bacitracin, Bac916, and MBR916.

© The Ito Foundation

422

平成28年度食肉に関する助成研究調査成果報告書（Vol.35）

れた。また，Jiangら 12）は，Lc. lactisのナイシン

用機序は，バクテリオシンの作用機序と一部類似の産生が酸素の影響で増加したと報告しており，しているが，バクテリオシンはもう一つ，細胞膜撹拌による酸素の影響がバクテリオシンの産生にへの孔形成能力があるため，これにより耐性菌を影響している可能性も考えられた。

減少させたと推察できる。もしBac916に孔形成能があるならば，静菌的にではなく殺菌的に作用株を添加した際の一般生菌数および耐性菌数を示すると考えられ，殺菌的に作用することで，自身した。一般生菌数は，各試験区分で変化がなかっの耐性菌を生み出すことなく豚糞便中の多剤耐性

たが，BC耐性菌数は，BC添加区で有意に高かっ菌の増殖を抑えることができる可能性がある。した（Ｐ＜0.01）。これはBC感受性菌が抗菌された

かしながら，本試験ではBac916耐性菌数を測定ため耐性菌数が大幅に増えたか，耐性遺伝子の水していないため，今後検討する必要があるだろう。

平伝播や変異により感受性菌がBC耐性を獲得しFig.３には，各糞便サンプルの菌叢変化を示した可能性が考えられた。また，すべての試験区で，た。コントロールとBC添加区分において，７日

３種混合抗生物質の耐性菌菌数が有意に増加した目ではBacteroides目細菌が増加した。Bacteroides

が，Bac916FD添加区では７日目において，他の目の主構成種であるBacteroides属細菌は，日和試験区よりも有意に少なかった（Ｐ＜0.01）。こ見感染症の原因菌であることが報告され，耐性遺れは，Bac916の抗菌スペクトルの広さと，抗生伝子を受け取り，プールする役割を担うとされて物質との作用機序の違いが関係していると考えらいる。一方，MBR916株添加区分においては，れた。BCは，環状ポリペプチドであり，その作

Lactobacillales目，Clostridium subcluster XIVaの用機序は，細菌の細胞壁合成阻害である。この作増加が観察されたが，他のClostridium subcluster

CntrolRelative abundances
（%）

100%
80%
60%
40%
20%
0%

1

3
Bac916

100%
80%
60%
40%
20%
0%

1

3

BC

100%
80%
60%

Aﬃliations

40%
20%

7 day
（s）
Relative abundances（%）

Relative abundances（%）

Relative abundances（%）

Fig.２には，豚糞便にBC，Bac916FD，MBR916

0%

1

3

7 day
（s）

MBR916

100%
80%
60%
40%

None
Betaproteobacteria class
Deltaproteobacteria class
Lactobacillales order, Clostridium subcluster XIVa
Firmicutes division
Lactobacillales order, Clostridium cluster IV
Clostridium cluster IV, Bacteroides
Clostridium cluster IV, Spirochaetes division
Clostridium cluster（plural）
Clostridium subcluster XIVa
Clostridium cluster IX
Clostridium cluster IV
Bacteroids order
Actinobacteria division
Streptococcus genus

20%

（s）
7 day

0%

1

3

（s）
7 day

Fig. 3 Changes in the dominant bacteria in porcine feces after adding bacitracin, Bac916, and MBR916 by T-RFLP

analysis.

© The Ito Foundation

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性家畜飼料の開発

423

XIVaのOTUが増加していないことを考慮する

定したところ，Bac916添加区では，コントローと，これらの増加は，Lactobacillales目の増加に

ルに比べ有意に多剤耐性菌数が減少した（Ｐ＜よるものと考えられた。Lactobacillales目の主構0.01）。T-RFLPによる菌叢解析では，MBR916株

成菌種は，Carnobacteriaceae（カルノバクテリウ

添加区およびBac916添加区では，コントロール

ム科），Enterococcaceae（エンテロコッカス科），

区およびバシトラシン添加区に比べBacteroides

Lactobacillaceae（乳酸桿菌科），Leuconostocaceae

目 細 菌 が 減 少 し ，バ シ ト ラ シ ン 添 加 区 に 比 べ（ロイコノストック科），Streptococcaceae（レンLactobacillales目の増加が観察された。

サ球菌科）等の乳酸菌でありこれらの乳酸菌が増えた可能性が考えられた。

本研究において，乳酸菌のバクテリオシンを用いた多剤耐性菌の殺菌の可能性が示され，多剤耐以上のことから，堆肥化の前処理として豚の糞便にMBR916株を添加することで，耐性遺伝子を性菌を抑える家畜用の機能性飼料開発が期待される。

プールするBacteroides目の増加を抑え，乳酸菌を増加させることが期待できる。今後，実際に豚に投与し実証研究を行い，糞便中の耐性菌減少に寄与するプロセスの構築を目指していきたい。
４．要

約

本試験では乳酸菌バクテリオシンによる多剤耐性菌の殺菌効果を試験した。まず，Bac916の特徴付けを行った。MBR916の培養上清は，非常に高い活性を示し，広いpHレンジで有効であるが，オートクレーブ処理をするとpH５以上では不安
定 に な る こ と が 明 ら か に な っ た 。ま た ，Proteinase K，アクチナーゼ，およびキモトリプ
シンに高い耐性を示したが，中性化処理によりプ
ロテアーゼ耐性耐性は減少した。クロステストでは，ガセリシンＡ産生株であるJCM11657株と類似性の高い傾向を示した。また，MBR916株は，30℃においては，高い活性を示したが，37℃においては，活性値が消失した。また，サイクル培養
および撹拌によってもバクテリオシン産生能は減少することが明らかになった。最後に豚糞便中にMBR916株およびBac916を添加して耐性菌数を測

文
献１）Tsuji, A., Kobayashi, I., Oguri, T., Inoue, M.,
Yabuuchi, E., Goto, S. : J Infect Chemother, 11 ，64 ～
70，2005．
２）H i r a k a t a , Y . , Y a m a g u c h i , T . , N a k a n o , M . ,Izumikawa, K., Mine, M., Aoki, S., Kondoh, A.,
Matsuda, J., Hirayama, M., Yanagihara, K., Miyazaki,Y., Tomono, K., Yamada, Y., Kamihira, S., Kohno, S. :Clin Infect Dis, 37，26～32，2003．
３）厚生労働省，薬剤耐性（AMR）対策アクションプ
ラン，2016～2020，2016．
４）石川潤一，木下英樹，菰田俊一，須田義人，石田
光晴：Milk Sci., 65，179～190，2016．
５）Matsusaki, H., Endo, N., Sonomoto, K., Ishizaki, A. :Appl. Microbiol. Biotechnol., 45，36～40，1996．
６）Kawai, Y., Saito, T., Kitazawa, H., Itoh, T. : Biosci
Biotechnol Biochem, 62，2438～2440，1998．
７）Cholden, L. S. : J. Bacteriol., 47，402～403，1944．
８）Mayr-Harting, A., Hedges, A. J., Berkeley, R. C. W. :Methods in Microbiology, 7A，315～422，1972．
９）Davies, E. A., Bevis, H. E., Potter, R., Harris, J.,
Williams, G. C. : J. Delves-Broughton, Lett. Appl.
Microbiol., 27，186～188，1998．
10）Muth, G., Nußbaumer, B., Wohlleben, W., Pühler, A. :GG Molecular & General Genetics, 219 ，341 ～ 348 ，
1989．
11）Maguin, E., Duwat, P., Hege, T., Ehrlich, D., Gruss,
A. : J. Bacteriol., 174，5633～5638，1992．
12）Jiang, L., Liu, Y., Yan, G., Cui, Y., Cheng, Q., Zhang,Z., Meng, Q., Teng, L., Ren, X. : Biotechnol. Lett, 37，2039～2045，2015．

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平成28年度助成研究調査一覧

本年度の対象とする研究または調査：
食肉に関する研究または調査（製造加工，食品的価値，家畜生産，飼料，疾病，食肉・食肉製品の流
通など）
単位：千円
研
Ⅰ

究

課

継続
年数

題

代

表

代表者名

研

究

者

所属機関

助成金額

食肉の品質，加工分野

食肉製品製造に使用される各種リン酸塩によるアクト
ミオシンのアクチンとミオシンへの解離に関する研究松石昌典

日本獣医生命科学
大 学 応 用 生 命
科
学
部

1,000

食肉加工品添加物，亜硝酸塩によるメタボリックシン
ドローム改善作用の解明

宮本理人

徳島大学大学院
医歯薬学研究部

1,100

トリプトファン添加による有害細菌の増殖抑制ならびに不活化：食肉および加工品製造工程における活用と作用メカニズムの解明

小関成樹

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,000

新規アクチン結合タンパク質から豚肉の柔らかさの要
因に迫る

灘野

大太

名古屋大学大学院
生命農学研究科

900

筋タンパク質の死後分解に与えるオートファジーの影
響（Ⅱ）：オートファジーと食肉の肉質の関連性

H.27～

仲西

友紀

宮崎大学農学部

1,100

ポークソーセージの「こく」とその寄与因子の解明
（その３）

H.26～

西村

敏英

日本獣医生命科学
大 学 応 用 生 命
科
学
部

1,100

ミオシンの水溶化現象に関連するミオシン尾部領域の
特定

H.26～

早川

徹

帯 広 畜 産 大 学
畜 産 衛 生 学
研 究 部 門1,000

乳業用乳酸菌カルチャーを接種した発酵乾燥食肉製品の加工技術と特徴に関する研究（Ⅱ）

H.27～

根岸

晴夫

中 部 大 学応 用 生 物 学 部

1,100

食肉の熟成に伴う味の改善に対するヒポキサンチンの
影響

服部

昭仁

食 肉 科 学 技 術
研
究
所

1,000

黒毛和種牛肉の筋内遊離脂肪酸とおいしさ，および味認識装置による呈味性評価

山之上稔

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,100

タンパク質工学によるトランスグルタミナーゼの基質認識機構の改変滝田禎亮

京都大学大学院
農 学 研 究 科

900

大規模ゲノム解析による腸管出血性大腸菌の国際的伝播経路の解明李謙一

国立感染症研究所
細 菌 第 一 部

1,000

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Ⅱ

食肉の食品的価値

新規な発酵食肉製品の機能性について（Ⅱ）

H.27～

六車三治男

南 九 州 大 学
健 康 栄 養 学 部

1,000

牛心臓由来ペプチドを活用した革新的コレステロール
代謝改善素材開発のための基礎研究

H.26～

長岡

利

岐 阜 大 学
応用生物科学部

1,000

肥満に伴う認知症の発症予防に対する豚肉摂取による腸内環境改善効果の有用性

後藤孔郎

大分大学医学部
内分泌代謝・膠原病 ・ 腎 臓 内科 学 講 座800

畜産物由来サプリメントの新規評価法の開発

吉川

豊神 戸 女 子 大 学
健 康 福 祉 学 部

800

H.27～

實安

隆興

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

800

黒毛和種におけるRBP4 多型と枝肉形質の関連解析

H.26～

平野

貴

東 京 農 業 大 学
農
学
部

900

豚マイコプラズマ性肺炎抗病性育種ランドレース豚の他慢性呼吸器感染症への抗病性機構に関する研究および肉豚生産における抗病性育種豚の有効性に関する考
察

H.27～

佐久間晶子

宮城県畜産試験場

1,000

ブランド豚肉生産用原種豚の遺伝的多様性の維持に関する研究（Ⅱ）

H.27～

古川

力

東 京 農 業 大 学
農
学
部

700

黒毛和種で致死に関与するゲノムコピー数多型の探索

佐々木慎二

畜産技術協会附属
動物遺伝研究所

1,000

黒毛和種牛肉の美味しさに関わる遺伝子マーカーの効
果検証

笹﨑

晋史

神戸大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

天然記念物「黒柏鶏」の遺伝的特徴を活用した地鶏「長州黒かしわ」のDNA識別手法の確立

伊藤直弥

山口県農林総合技 術 セ ン タ ー

1,000

眞鍋

昇

大 阪 国 際 大 学
人 間 科 学 部

1,000

豚肝臓由来ペプチドが肝線維化に及ぼす影響（Ⅱ）Ⅲ

Ⅳ

遺伝育種分野

繁殖分野

優良肉用家畜増産のための受精卵移植の基盤となる高品質卵子の選抜
新規増殖因子を用いた牛・豚精子幹細胞の純化・培養
技術の開発

H.26～

高島

誠司

信州大学繊維学部

1,000

種雄牛における精子メチル化可変部位の特性評価

H.27～

武田久美子

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,000

肥育前の和牛雌子牛の摘出卵巣からの胚生産に関する
研究

H.26～

的場

理子

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

900

松原

和衛

岩手大学農学部

1,000

牛の超早期妊娠因子（Super－EPF）ELISAによる受精・着床診断異なる発情判定基準による牛人工授精適期の再設定
（Ⅱ）

H.27～

坂口

実

北里大学獣医学部

1,000

ミトコンドリア機能解析に基づく家畜優良胚選別法の
開発（Ⅱ）

H.27～

阿部

宏之

山形大学大学院
理 工 学 研 究 科

1,000

実佐

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
生 物 機 能 利 用
研 究 部 門800

牛伸長胚の生育に関わる子宮内膜細胞因子の同定と検
証

H.27～

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細江アディポカインおよびインシュリン抵抗性が繁殖牛の妊孕性に及ぼす影響小林仁

宮 城 大 学
食 産 業 学 部

1,000

雄牛の新たな繁殖機能評価法の開発

北原豪

宮崎大学農学部

1,100

牛の受胎性に関与する排卵後の黄体と主席卵胞の位置関係の人為的制御に関する研究松井基純

帯 広 畜 産 大 学
畜産学部獣医学科

1,000

氷晶形成抑制効果の高いアミノ酸を利用した牛精液および受精卵の未凍結保存

星野由美

広島大学大学院
生物圏科学研究科

1,000

お灸は牛の卵巣機能の向上をもたらすか？

三浦亮太朗

日 本 獣 医 生 命科 学 大 学
獣 医 学 部

800

日本の養豚場における動物用抗菌剤使用に及ぼす要因の疫学的解析

杉浦勝明

東京大学大学院
農 学 生 命 科 学
研
究
科

1,000

食鳥と体皮膚に対するカンピロバクターの付着メカニ
ズムの解明

三澤

尚明

宮 崎 大 学 産 業
動物防疫リサーチ
セ ン タ ー

1,100

鈴木

亨

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
動物衛生研究部門

1,200

遺伝子操作技術を駆使した生後感染型アカバネウイル
スの病原性決定基の同定と流行ウイルス予測への応用

正谷達謄

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,000

ジビエとして食される野生動物が保有する食中毒菌の
薬剤耐性

安藤

匡子

鹿 児 島 大 学
農水産獣医学域
獣 医 学 系

1,000

肉用子牛におけるマイコプラズマ感染症の新たな迅速診断用PCR法の構築と肉用農場におけるマイコプラズ
マ感染症予防への応用樋口豪紀

酪 農 学 園 大 学
獣医学群獣医学類

1,100

肉養鶏における高病原性鳥インフルエンザウイルスに対する感受性松鵜彩

鹿 児 島 大 学
共 同 獣 医 学 部

1,000

リコンビナント抗原を用いたエゾシカにおける肝蛭症の血清診断法の確立と疫学調査による家畜・ヒトに対するリスク分析関まどか

岩手大学農学部
共 同 獣 医 学 科

1,100

野生獣肉の食肉利用に関する寄生虫性食中毒危害の科
学的分析

山﨑

朗子

岩手大学農学部

1,000

カンピロバクターフリーブロイラーの分別出荷を目的とした養鶏場即時検出システムの確立

山崎渉

宮崎大学農学部
獣 医 学 科1,000

毒素原性大腸菌易熱性毒素を迅速に検出するイムノク
ロマトグラフィーの開発

有満

秀幸

藤田保健衛生大学
医
学
部

800

わが国の家畜におけるＤ型インフルエンザウイルス感
染の実態調査堀本泰介

東京大学大学院
農 学 生 命 科 学
研
究
科

1,000

牛由来黄色ブドウ球菌の増殖阻止を可能にする牛ポリ
クローナル抗体の特性解析

野地

智法

東北大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

食肉により媒介されるトキソプラズマ原虫感染症に対する新規血清診断法の確立

玄学南

帯 広 畜 産 大 学
原 虫 病 研 究
セ ン タ ー

1,000

ゲノム疫学的アプローチによる豚抗酸菌症の実態解明

大屋賢司

岐阜大学応用生物
科
学
部

800

Ⅴ

動物衛生分野豚デルタコロナウイルスの感染動態に関する研究２（コンベンショナル豚）

H.27～© The Ito Foundation

データマイニング技術を用いた牛白血病ウイルス感染の免疫動態解明に関する研究関口敏

宮崎大学農学部

800

肉用牛の出血性腸炎で認められる腸管病原性微生物の混合感染と病態との関連

桐野有美

宮崎大学農学部

1,000

ポリフェノール給餌による遅筋型筋線維の形成促進：
筋成長期での制御による食肉特性の向上を目指して

辰巳

隆一

九州大学大学院
農 学 研 究 院

1,200

粗飼料サイレージの発酵品質改善のためのサイレージ
密度計測手法の開発

大越安吾

北海道立総合研究機構農業研究本部
根釧農業試験場

600

佐藤

衆介

帝 京 科 学 大 学
生 命 環 境 学 部

1,000

代謝性疾患と関連病態の発症におけるスカトールおよび胆汁酸の役割

石塚敏

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,200

Lactococcus属乳酸菌で調製した発酵乳給与による離乳子豚の免疫機能の改善と生産性の向上

守谷

直子

農 業・食 品 産 業
技術総合研究機構
畜 産 研 究 部 門

1,000

西南暖地におけるイネ科牧草リビングマルチ体系による飼料用ダイズ生産技術の開発

石垣元気

宮崎大学農学部
附属フィールド
科 学 教 育 研 究
セ ン タ ー

1,000

哺乳期の長日処理による黒毛和種の代謝調節

安尾しのぶ

九州大学大学院
農 学 研 究 院

700

耕作放棄地を利用しためん羊生産体系の確立の試み田中智夫

麻布大学獣医学部

800

竹笹サイレージの肉用鶏への給餌による食中毒菌の制
御とプロバイオティクスの開発

谷口喬子

宮 崎 大 学 産 業
動物防疫リサーチ
セ ン タ ー800

牛由来肝臓細胞における薬物代謝関連遺伝子の解析

吉岡都

農業・食品産業技術総合研究機構・
動物衛生研究部門

1,000

山間地耕作放棄地内野草放牧と畜舎内濃厚飼料多給で生産されたサフォーク種ラム肉の食味および呈味成分
の比較

石田

元彦

石 川 県 立 大 学
生物資源環境学部

850

黒毛和種肥育牛への穀物飼料増給に対するルーメン微生物相の応答に関する研究小池聡

北海道大学大学院
農 学 研 究 院

1,000

糖代謝産物および終末糖化産物がブロイラーの生産性に与える影響の解明

橘哲也

愛媛大学大学院
農 学 研 究 科

1,000

塚原

隆充

京 都 府 立 大 学
大学院生命環境科 学 研 究 科

1,000

肉質向上に資するアミノ酸栄養の基礎研究佐藤祐介

宇都宮大学農学部

1,000

中鎖脂肪酸に着目した人工乳改良による離乳期子牛の
発育改善

福森

理加

宇都宮大学農学部
附 属 農 場

1,200

ストレスホルモンによる日本短角種牛由来筋芽細胞の増殖と筋線維型への影響

佐藤勝祥

秋 田 県 立 大 学
生物資源科学部

850

木下

英樹

東海大学農学部
バイオサイエンス
学
科

1,000

Ⅵ

家畜飼養，飼料分野

籾米の給与を軸とした日本型動物福祉鶏肉生産技術の実規模での開発（Ⅱ）

動－静脈差でみる，発育不良豚の成長に必要なアミノ酸および他の栄養成分の推定

乳酸菌を用いた多剤耐性菌の殺菌効果の検討と機能性
家畜飼料の開発
合

計

H.27～

H.27～

H.26～

７１件

69,000© The Ito Foundation

伊藤記念財団賞© The Ito Foundation

© The Ito Foundation

431

江草（雜賀） 愛
日本獣医生命科学大学応用生命科学部

食品科学科食品機能化学教室

講師〔業績の課題名〕

食肉ならびにその副生物を由来とする機能性ペプチドに関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
食肉は栄養価が高く，呈味性の良い食糧資源である。さらに，食肉は栄養素の供給源としてのみならず，豊富に存在するタンパク質を活用して，生体調節作用を有する機能性成分を新たに作製することが可能である。そこで「抗酸化作用」や「血圧上昇抑制作用」に着目し，畜産資源を由来とする機能性ペプチドの作出と，その作用機序の解明について研究を進めてきた。
１．抗酸化作用を有する機能性ペプチドに関する研究
豚筋原線維タンパク質の酵素分解物から，脂質の過酸化を抑制するペプチドを単離同定し，その作用機序が金属キレート作用によることを明らかにした。この内容は食肉由来ペプチドの機能性を示したものとして先駆的であり，現在までに 350 報以上の論文に被引用されている。この他，ローヤルゼリー加
水分解物の抗酸化作用についても，２報分の研究に関わってきた。
２．血管機能を改善するための機能性ペプチドに関する研究
生活習慣病は，血管の機能不全から心筋梗塞や脳卒中などを引き起こす。チキンエキスは循環器疾患の改善を目的として，
古来より薬膳や伝承療法として使われてきた。この背景をもとに鶏卵抽出物から，昇圧因子であるアンジオテンシン変換酵素の阻害活性を有する血圧上昇抑制ペプチドを単離した。さらに，その構造を明らかにするとともに，生体（高血圧自然発症ラット）での降圧作用を見出してきた。
このペプチドはコラーゲン由来であったため，コラーゲンを豊富に含む鶏足を原料として，新たに血圧上昇抑制ペプチドを単離した。コラーゲン由来のペプチドは血管内皮細胞の一酸化窒素合成酵素を活性化して血管の保護作用に働いたり，SHR において動脈硬化マーカーを改善することが明らかとなった。
また，ヒトを対象とした臨床試験では，血圧の上昇を抑えるだけでなく，血管内皮前駆細胞を活性化して血管を守る働きが示唆された。
３．内因性機能性ペプチド「カルノシン」に関する研究
タンパク質の酵素分解物だけでなく，内因性のペプチドであるカルノシンについても，研究を進めている。カルノシンは，抗疲労効果や抗酸化作用の改善が示されている。鶏やウズラを用いてカルノシンが増加する飼養条件を検討したり，カルノシン合成酵素の遺伝子情報をもとに，その生理作用に関する研究を進めている。これらの研究を通して，食肉ならびに畜産業が，ヒトの健康維持・増進に重要であることを明らかにしてきた。

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432

岡 村

雅 史

北里大学獣医学部

准教授〔業績の課題名〕

養鶏場および食鳥処理現場における鶏肉の食中毒菌汚染の実態とその対策〔業績の概要（受賞理由）〕
大学院在学時に Salmonella enterica serovar Enteritidis の血清型特異的な鶏卵汚染メカニズムの一端を明らかにし，さらに米国農務省 Beltsville 農学研究センター（USDA-BARC）において客員研究員
として，このメカニズムにおける宿主マクロファージの血清型特異的反応の潜在的関与を明らかにした。
こ れ ら の 成 果 を 投 稿 論 文 と し て ま と め， 学 位 論 文「Salmonella Enteritidis Infection in Chickens:
Differential Mechanisms of Ovarian and Oviductal Colonization and Macrophage Activation among
Salmonella serovars．
」を作成，大阪府立大学大学院にて博士（獣医学）の学位を取得した。その後，
USDA-BARC で博士研究員として勤務し，米国食品医薬品局（FDA）およびメリーランド大学獣医学部の研究グループと共同で，鶏の Salmonella enterica serovar Enteritidis 感染予防のためのワクチンの開発・評価を実施した。また，その過程で特に鶏における細胞性免疫反応に関する基礎研究も行い，優れた成果を得た。
北里大学獣医学部赴任後は，製薬企業との共同研究により，鶏用サルモネラワクチンの開発・評価，
感染鶏の早期摘発を目的とした新規検査法の開発に携わった。一方，これらの研究と並行して，サルモ
ネラ／カンピロバクター汚染鶏肉に由来するヒトの食中毒事例数の減少を目的として，農場と食鳥処理場における両菌の制御を軸としたリスク管理法の確立に関する研究を開始した。この研究は，ブロイラー
生産会社数社とコンサルタント獣医師の協力を得て行い，農場における両菌によるブロイラーの汚染が市販鶏肉の汚染に結びついていることを明らかにした。本研究はその後，内閣府食品安全委員会「食品健康影響評価技術研究」（2008―2009 年）および農林水産省「レギュラトリーサイエンス事業」（2010―2012 年）に採択され，両菌による鶏の汚染が孵卵場ではなくブロイラー農場で起こること，および農場内外のヒト・モノの移動が農場間伝播の原因となる可能性を示した。現在は，農場や処理場，関連業者を含めた鶏肉供給全体における従事者に対する教育・啓発が必須と考え，近隣の食肉衛生検査所等と連携してその具現化を目指している。

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433

宮 口

右 二

茨城大学農学部

教授〔業績の課題名〕

筋漿タンパク質による筋原線維加熱ゲル化促進作用に関する研究〔業績の概要（受賞理由）〕
筋肉内に含まれる水溶性画分には，ミオグロビンをはじめとする約 100 種類ほどの解糖系酵素を含んでおり，その量は食肉タンパク質のうち 30％程を占めている。これら筋漿タンパク質は，食肉の色調には関与していることが知られているが，食肉加工，とくに加熱食肉製品の物性に及ぼす筋漿タンパク質の役割については，十分な知見が得られていなかった。そこで本研究では，ブタ由来の筋漿タンパク質がモデルソーセージの物性に及ぼす影響および作用機序を解明することを目的に実施した。
その結果，まず筋漿タンパク質は乳清や卵白など異種タンパク質に匹敵するほどの乳化力を有することを明らかにした。さらに，ミートエマルションゲルのゲル強度が筋漿タンパク質の添加により高くなることが明らかとなった。この効果は，鶏肉由来の筋漿タンパク質にもあることが示された。
そこで，筋漿画分による食肉ゲルの物性改変効果の作用機序を明らかにするため，筋漿タンパク質を塩析処理したところ，硫酸アンモニウム 75％飽和可溶性画分に食肉のゲル強度を高める効果のあることを明らかにした。なお，その画分の主要成分は 35kDa 付近であり，アミノ酸配列の解析から，同タンパク質がグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）を明らかにした。さらに，食肉中から簡便で，高効率に GAPDH を回収する方法を見出し，精製された GAPDH で筋原線維の加熱ゲ
ル化促進効果を確認した。
また，0.2M NaCl の低塩濃度下でミオシンＢに GAPDH を添加したところ，ミオシンの一部が可溶化していることが確認され，同効果は GAPDH をサクシニル化すると失われることから，GAPDH の正の帯電（塩基性）がゲル化促進では重要であることが示された。また，免疫組織化学的手法および
ATP アーゼの活性測定法を用いて，GAPDH とアクトミオシンとの相互作用を解析し，GAPDH はア
クチンと結合していることが示唆された。以上のとおり，筋原線維加熱ゲル化促進作用は，筋漿タンパ
ク質中の GAPDH によりもたらされ，同タンパク質がアクトミオシンとの分子間相互作用を示すことで発現されることを初めて明らかにした。

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学会等事業助成© The Ito Foundation

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437

第 17 回アジア・大洋州畜産学会議開催報告
公益社団法人日本畜産学会

理事長

小泉聖一

平成 28 年８月 22 日（月）から 25 日（木）まで，
古瀬充宏九州大学大学院農学研究院教授を大会長とし，「環境と人類・家畜の福祉に寄与する持続的家畜生産の進展を目指して」をメインテーマに，第 17 回ア
ジア・大洋州畜産学会議（英文名：ⅩⅤⅡ The Asia-Australasian Association of Animal Production
Societies（AAAP）Animal Science Congress）を福岡県九州産業大学にて開催いたしました。本会議の日本開催は平成８年 10 月に千葉県幕張市で行われた第８回 AAAP 会議以来，実に 20 年ぶりであります。
本会議を日本で開催することは，我が国の畜産学の発展に大きく寄与するだけでなく，経済成長に伴って家畜飼養が急速に進展しているアジア・大洋州地域に対して我が国の畜産技術を移転・支援する機会
や，次世代の畜産学の発展を担う多くの国の若手研究者の交流の場となることが期待されます。そこで，
平成 23 年度の日本畜産学会総会において，我が国に本会議を招致することを決定し，翌 24 年度にタイで開催された第 15 回 AAAP カウンシルミーティングにて日本開催を提案したところ満場一致の賛成を得ることができました。それを受けて，平成 27 年度の日本畜産学会総会にて，第 17 回 AAAP 組織委員会を発足し，学術・出版・プログラム部会，財務・経理部会，募金・広報・登録部会，宿泊・旅行
部会，会場・接遇・展示部会の５つの部会を中心とし，有識者 67 名からなる顧問の助言を適宜受けながら，会議開催に向けたさまざまな活動を展開して参りました。
本会議では，畜産における多様化・高度化した研究の利用，医学との連携，新産業の創成，アジアを中心とした畜産物需要への対応，家畜伝染病の阻止，地球環境に配慮した畜産の発展などを主要題目として，19 の分野にわたる一般演題発表 819 題（口頭発表 41 セッション 377 題，ポスター発表５セッショ
ン 442 題）に加えて，４つの基調講演，10 のシンポジウム，６つのワークショップが行われ，連日多くの国からの参加者で賑わいました。また，会期中には，地元福岡県の獣医師会主催（後援：福岡県・福岡県教育委員会，福岡市）による公開シンポジウム「～いのちを考えるシンポジウム～人と家畜，そしてウイルス，現在＆未来」を開催し，一般の方々への畜産学に対する啓蒙活動を同時に行いました。
本会議への参加者総数は 1,160 名で，そのうち海外からの参加者は 25 ヶ国から 730 名でありました。
本会議の開催にあたっては，各国の若手研究者の積極的な参加を促すために参加費を極力低く設定するとともに，一般演題発表のうち優れたものに対しては，厳正なる審査により若手研究者優秀発表賞を授与しました（口頭発表 30 題，ポスター発表 15 題）。また，アジア・大洋州からの参加者が多く，その宗教的背景がさまざまであることを考慮し，会場にて提供される食事についても格段の配慮を行いました。
本会議開催により，我が国独自の畜産学研究とアジア・大洋州諸国における実践的研究が融合することによる新たな研究の発想，応用研究の進展，新規市場への展開の可能性などの成果が得られ，次回平成 30 年にマレ－シアで行われる第 18 回 AAAP 会議での再会を約束し，無事に最終日の閉会式を迎えることができました。
以上，本会議が成功裡に終了するにあたっては公益財団法人伊藤記念財団平成 28 年度学会等事業助成に多大な協力を賜りましたこと，ここに深く感謝いたします。

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日本食肉研究会の助成事業実施報告
日本食肉研究会会長

根岸晴夫（中部大学応用生物学部）

１．海外派遣事業
国際食肉科学技術会議派遣助成として，第 62 回会議に日本食肉研究会から会員２名が参加した。この会議は毎年８月中旬に交互に開催され，本研究会からは，会長，副会長あるいは常任幹事の中から１名を派遣し，代表者会議に出席し，会議報告を研究会機関誌の「食肉の科学」に掲載し内容を全員に周知することが研究会の中で義務づけられている。今年は８月 14 ～ 19 日にタイ（バンコク）で開催され，本助成（各人 20 万円の補助）により，西海理之会員（新潟大学農学部）と坂田亮一会員（麻布大学獣医学部）が参加した。
2022 年には日本での開催が予定されており，開催準備のための情報収集，ならびに情宣活動を行う
ために，当会では準備委員会を立ち上げ準備に入り，開催地は神戸国際会議場に決定している。その日
本開催を成功させるために，現時点から 2022 年開催時に中心となって活躍する会員を一人でも多く派遣することが重要である。この８月期はアジア圏内であっても飛行機代等の旅費が高額であり，また大会派遣では会議参加費，宿泊費と合わせると負担が大きいが，今回の伊藤記念財団からの助成により参加者は積極的に海外の研究者との学術交流を行い，日本での会議参加のアピールを大いに実施できた。
この会議の詳細は，本研究会会長である筆者，ならびに ICoMST2022 準備委員会の坂田・本山らが，食肉の科学（2016 年２号）および日本食肉加工情報（2016 年 12 月号）でそれぞれ報告している。
２．国内における研究会でのセミナー「国際的な食肉研究のトップランナー（現時点ではドイツあるいはフランスの食肉研究者１名を想定）
を海外から招聘し，討論重視型の食肉ワークショップを開催するために，旅費として 50 万円，会場費と交流費用として 30 万円が必要であるが，旅費の 50 万円は貴財団からの助成をもって充当し，後者の30 万円は食肉研究会の負担とする。本セミナーは食肉研究会大会（平成 29 年３月，神戸大学開催）とジョ
イントすることで，より多くの研究者，技術者および学生の参加を見込むとともに，会場費節減等を行い，本予算内で効率的に開催・運営する」との申請内容で，本年３月 30 日に神戸大学国際文化学部で開催された第 58 回日本食肉研究会大会の中で特別講演としてセミナーを実行した。
今回招聘したのは，ドイツから Prof. Schwägele（Director, Max-Rubner Institute, Kulmbach）で，「Recent Developments in Meat Science in Europe : Analytical Approaches for Tracking andTracing」の演題で約１時間，所属する研究所の紹介からスタートし，次に最近の研究として，食肉における有害物質のトレサビリテイ分析について以下の４項目を分かりやすい英語で説明し，活発な質疑応答がなされた。
１）Analysis of organic residues and contaminants，
２）Heat-induced contaminants，
３）Animal species and quantitation by real-time PCR．
４）Allergens in meat products by HPLC-MS/MS© The Ito Foundation

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この講演で，欧州の中心としてドイツが発信する研究情報の影響力と指導力を，日本の研究者にも知らせる機会ともなった。
３．全日本大学対抗ミートジャッジング競技会
食肉産業界の次代を担うリーダーの育成に努めるために，平成 21 年から全国の畜産系大学生を対象として食肉評価の技術競技会が毎年開催されており，日本食肉研究会はこの競技会を積極的に支援している。これまで８回の競技会に参加した学生は 300 名を超え，その９割近くが畜産・食肉産業界に就職し活躍しており，産学における貢献度は非常に高い。
今回の第９回全日本学生対抗ミートジャッジング競技会では，３月１日（水）～３日（金）に開催され，59 名の大学生（13 大学）が東京食肉市場（港区港南）内の格付現場で，牛豚の枝肉とカット肉を前にして日頃の学習成果を競い合った。
また宿泊先の代々木オリンピックセンターで，食肉産業セミナーなど豊富に組まれたプログラムに全員が参加し，我が国の食肉における産官学の最前線に勤める講師の話を熱心に聴講した。なお，個人総合成績優秀者５名は，今年６月に開催されるオーストラリア大学対抗ミートジャッジング競技会に日本代表チームのメンバーとして参加が決まっている。
この競技会の運営にあたっては，これまで畜産・食肉関連企業・団体からの協賛金で賄ってきたが，競技会内容の充実に伴う経費増加と協賛金の漸減によって適正な運営に支障をきたしている。今回の財団からの助成は，競技会を運営する上で極めて有効であった。その使用内訳として，大会中の宿舎の代々木オリンピックセンターから品川の東京食肉市場までの移動用バス代および競技会会期中に用いる施設
利用の補助費とした。

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食肉の安全・安心および安定的生活を脅かす家畜感染症に関する国際研究集会開催報告
岩手大学農学部附属動物医学食品安全教育研究センター

センター長

鎌田洋一

〔講演会演題〕
東北から One World One Health を実現する：家畜感染症制御と食品安全を結ぶ架け橋〔日時〕平成 28 年９月 26 日（月）〔場所〕岩手大学総合教育研究棟（教育系）北桐ホール（岩手大学農学部附属動物医学食品安全教育研究センター第 13 回全体研修会として）〔事業報告〕
実施した事業では，中国農業科学院蘭州獣医研究所

劉光亮

教授を招き，家畜感染症の制御と食品安全に関する講演を実施した。講演の構成を以下に示す。
・「日本における家畜感染症の制御戦略」武久智之

農林水産省消費・安全局動物衛生課課長補佐（岩手大学客員教授）
・「中国における豚流行性下痢：何を知り，何をすべきか？（PEDV in China : What we know & what
to do ？）
」劉光亮

教授

中国農業科学院蘭州獣医研究所

・「FAMS が展開する牛白血病清浄化モデル開発事業」彦野弘一

准教授・村上賢二

教授

FAMS（岩手大学農学部）・「広まる農場 HACCP 普及活動：HACCP の現状および東北における活動」酒井淳一

会長

東北農

場 HACCP 研究会
講演では，まず，農林水産省

武久講師から，日本における家畜感染症の現状と，その対策についての基本的な戦略が示された。
次に，海外研究者として招聘した劉講師からは，直近で我が国において大流行がみられた豚流行性下痢症に関してその疾病の概要と近年の中国の状況と蘭州獣医研究所の研究状況について講演があった。
以下その内容について詳述する。豚流行性下痢（以下 PED）は 1970 年代初期に英国で初めてその発生が報告された。数年後，PED の病原体である豚流行性下痢ウイルス（PEDV）がベルギーで分離され，その後，東アジアに広がっていった。中国における PED の発生は 1980 年代初期以来散発的かつ地域的であった。しかし，過去５年の間に PEDV はアジアだけでなく北米やヨーロッパのいくつかの国においては，養豚産業にとって重要な経済損耗の原因となっている。講演では PEDV 病原体，病理発生，診断法，免疫，感染伝播，ワクチン開発について示された。さらに，中国における PED の歴史，現在の PEDV 感染状況，ワクチン開発ならびに，劉講師が所属する研究所で展開している研究プロジェク
トが紹介された。
さらに，招聘機関である FAMS が独自展開している牛白血病清浄化モデル開発事業について，© The Ito Foundation

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FAMS 研究員である彦野講師および村上講師による解説があった。
最後に，酒井講師から，FAMS が事務局となっている東北農場 HACCP 研究会の事業の進捗について講演があった。
本事業において，中国より招聘した劉教授による講演によって，中国や東アジアにおける豚流行性下痢症の現状やその制御について最新情報が提供され，また FAMS 側から東北地域の家畜感染症の現状
や牛白血病に関する情報が交換されたとともに，岩手大学および東北地区における畜産・獣医学関係の研究者間で有意義な交流が生まれ，今後の国際的な食肉の安全・安心に関する研究事業の発展などに大いに期待できるものとなった。

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Final Reports for Research Grants for Meat and Meat Products

平成28年度（Vol. 35）
2017年11月

発行

編集・発行 ― 公益財団法人伊藤記念財団
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