骨髄微小環境における脂肪細胞の役割
PPAR- γ Antagonists Attenuate Bone Marrow Failure in an Aplastic Anemia Mouse
Model but not in Radiation Marrow Destruction
自治医科大学
派遣期間
研究機関
研究指導者

佐藤 一也
2011 年 4 月 3 日～2013 年 8 月 22 日
National Institutes of Health (NIH), NHLBI, Hematology Branch,
9000 Rockville Pike, Bethesda, MD 20892 USA
Neal S. Young, MD

Aplastic anemia (AA), one of the well-known bone marrow (BM) failure diseases, is characterized by a decrease in thenumber and function of hematopoietic stem cells (HSCs) and progenitors, and by a massive expansion of adipocytes inBM cavities. A functional role of adipocytes in AA is unclear. In this study, we demonstrate that inhibition ofadipogenesis by peroxisome proliferator–activated receptor-gamma (PPAR- γ) inhibitors can improve hematopoiesis ina mouse model of immune-mediated BM failure. Mice in PPAR- γ inhibitor-treated groups showed higher levels ofleukocytes, neutrophils, red blood cells, and platelets in peripheral blood (PB), and higher total nucleated cells and LinSca1+ c-kit+ stem cells in BM than did animals in the control group. In PPAR- γ inhibitor-treated groups, there wassignificantly less CD8+ cell infiltration in BM, suggesting that inhibition of adipogenesis might affect activation ofcytotoxic T cells. Both confocal microscopic imaging and HE staining of BM also showed significantly higher numbersof nucleated cells in the treated groups. This is the first report that reveals a negative role of adipocytes in
immune-mediated BM failure, and this study suggests PPAR- γ can be a novel therapeutic target in AA.

研究目的
再生不良性貧血をはじめとする造血不全疾患は高転写因子である PPAR- γ阻害剤を腹腔内投与しても、同様の結果が確認されたとしている。

度の低形成性骨髄を呈し、骨髄内の殆どは脂肪細胞

われわれは本報告をうけて、原因不明の難治性造で占拠されることが知られている。しかしながら、血不全（厚生労働省特定疾患治療研究対象疾患）で脂肪細胞は造血細胞の広汎な破綻から生じた二次的ある再生不良性貧血の治療に骨髄脂肪細胞が標的とに生じたものにすぎないのか、また造血に何らかのなり得るのではないかと考えた。本疾患は造血幹細正ないし負の影響を与えているのかは長く不明のま胞移植や免疫抑制療法など一定の効果が期待できるまであった。おそらく受動的な役割を担うにすぎな治療法はあるものの、ときとして致死的な合併症をいものとして、これまで大きな問題として捉えられ併発するなど、より安全かつ効果的な治療法が望まることはなかったが、2009 年の Nature 誌に骨髄脂肪れてきた。すでにわれわれの研究室では造血不全の細胞は造血を抑制するという衝撃的な報告がボスト安定したマウスモデルの開発に成功しており、 共焦ンのグループからなされた。 先天的に脂肪が形成で点レーザー顕微鏡の画像を三次元再構築することできない A-ZIP/F1 マウスを用いて、致死量の放射線照骨髄を効率よく可視化することができる。われわれ

射後に骨髄移植を実施すると、正常のマウスに比較

は PPAR- γ阻害剤を造血不全マウスに投与し、いくして明らかに骨髄の生着、及び末梢血の血球回復がつかの分子生物学的手法を組み合わせることで、in促進した。また脂肪分化の制御に中心的役割を担うvivo、in vitro の両方から研究課題をすすめた。

研究経過

遺伝子に着目して PCR array を実施した。これまで

C.B10-H2b/LilMcd マウスに亜致死量の全身放射線の実験結果を支持するように、治療群では殆どの照射（500cGy）を行い、同日に C57BL/6 マウス由来

adipogenesis に関わる遺伝子の発現レベルが 3-20 倍のリンパ球（5x106 cells、MHC マイナー抗原不一致）程度低下していた。PPAR-γの標的遺伝子である Agtを輸注することで、 免疫学的な造血不全を発症する（-11.6 倍）、Nrob2（-19.3 倍）、Sirt1（-15.6 倍）、Ncoa2モデルを作成した。移植片対宿主病は発症すること（-14.9 倍）、Adig（-14.2 倍）、Bmp2（-12.9 倍）、及なく、すべてのマウスは二週間以内に高度の汎血球

び Acacb（-11.7 倍）などは 10 倍以上の発現レベルの減少をきたした。放射線照射及びリンパ球輸注の前低下がみられた。一方で細胞周期関連遺伝子の E2f1

日より PPAR- γ阻害剤（BADGE、あるいは GW9662）（6.1 倍）や Mapk14（3.0 倍)は上昇し、炎症関連遺をレシピエントマウスに腹腔内投与し、day14 まで伝子である Il6（-7.4 倍）、Tnfsf4（-7.7 倍）、Irf4（-15.8継続したところで解析を行った。

倍）及び Tnf（-6.9 倍）などは殆どが低下していた。

上述のマウスモデルを用いて、PPAR-γ阻害剤によPPAR- γ、及びその標的遺伝子かつ代表的なアディポる骨髄内の脂肪新生（adipogenesis）の抑制による効サイトカインのひとつとして知られる Agt の骨髄内果を下記の項目にて評価した。

での発現をウエスタンブロッティングで確認したところ、治療群で明らかに低下していた。Multiplex®

1．共焦点レーザー顕微鏡、ヘマトキシリン・エオジ

を用いた血清サイトカインの解析では、治療群で、ン（H&E）染色（マウス胸骨、大腿骨）炎症性サイトカインである MCP-1、IL-6、Th1 サイ

2.

末梢血血球数、骨髄単核球数

トカインである IFNγ、IP-10、及び TNF-αの低下を認

3.

フローサイトメトリー

めた。以上より、PPAR- γ 阻害剤の投与によって4.

PCR arrayadipogenesis の抑制はもとより、骨髄のみならず、全5.

ウエスタンブロッティング

身性の炎症反応が減弱していることが明らかになっ6.

血清サイトカイン測定（Multiplex®)

た。引き続き共焦点レーザー顕微鏡及びフローサイ
トメトリーを用いて骨髄内に浸潤している CD4、共焦点レーザー顕微鏡を用いて造血不全マウスのCD8 陽性 T 細胞の絶対数を確認したところ、造血不胸骨骨髄の三次元再構築イメージングを実施したと全マウスではドナー由来の T 細胞が輸注後 10 日程

ころ、骨髄内の造血細胞はほぼ消失しており、殆ど度をピークとして骨髄内に広汎に浸潤しているのにが脂肪細胞で占拠されていた。一方で、PPAR- γ阻害

対し、治療群では CD4、CD8 のいずれのサブセット剤投与群（以下、治療群と略す）では骨髄内の細胞においてもその割合は有意に減少していた。すなわ

成分の比率は明らかに高く、脂肪細胞の浸潤はきわち、PPAR- γ阻害剤による造血の回復は、必ずしもめて少なかった。H&E 染色でも同様に、造血不全マadipogenesis の抑制を介したものではなく、薬剤それウスでは骨髄の正常構造が高度に破壊され、脂肪に自体に何らかの直接的な細胞性免疫抑制作用がある置換されているものの、治療群では比較的よく保た可能性が示唆された。

れていることが確認された。末梢血中の白血球数、更に検証をすすめるべく、（１）致死量放射線照射血小板数、及び骨髄内単核球のいずれにおいても治（900cGy）モデル、（２）化学療法による骨髄抑制療群で有意かつ再現性をもって高値であった。更にモデル（5-FU 100ug/g、腹腔内投与）を用いて、PPAR- γフローサイトメトリーを用いた解析によって、骨髄阻害剤の治療効果を確認した。PPAR- γ阻害剤による内の造血幹細胞及び前駆細胞などの造血初期段階のadipogenesis の抑制が造血を支持するのであれば、必集団（Lin-Sca1+c-kit+）は治療群で有意に多いことがずしも造血不全モデルでなくても、効果は期待でき明らかになった。はじめに仮定したように、造血不るはずである。寧ろ放射線被曝や抗がん剤などによ全において PPAR- γ阻害剤による adipogenesis の抑制る造血障害を PPAR- γ阻害剤が軽減するのであれば、が造血を促進する可能性が示唆された。

臨床的にはより大きな恩恵を受けるものと考えた。

次に大腿骨及び脛骨から total RNA を抽出し、しかしながら、仮説に反して、（１）、（２）のいずれadipogenesis、脂肪酸代謝、及び inflammasome（炎症のモデルにおいても PPAR- γ阻害剤による治療効果やアポトーシスに関与する蛋白質の複合体）経路のは確認できなかった。末梢血血球数、骨髄単核球数

に有意差はみられず、共焦点レーザー顕微鏡においてもコントロール群と治療群とに明らかな違いはなかった。

った。
FVB/NJ マウスは高度造血不全かつ脂肪細胞の増加もない（骨髄内は硝子様物質で占められている）

最後に CD4、CD8 陽性 T 細胞を MACS®にて単離状態に至るものの、PCR array では adipogenesis 関連し、PPAR- γ阻害剤を添加して PMA+ionomycin で増遺伝子の発現は明らかに亢進しており、いくつかの殖刺激を与えて in vitro で培養したところ、PPAR- γ中心的役割を担う負の制御因子がオーバーライドし阻害剤の存在下ではいずれのサブセットの増殖もているものと考えられる。すなわち、造血不全におdose dependent に有意に抑制され、また活性化マーカ

ける adipogenesis は単に骨髄内の造血細胞の枯渇かーである CD25 の発現が低下することが明らかとなら普遍的に起こるものではなく、ドナーとレシピエった。ICAM-1 の発現も低下しており、T 細胞の骨髄ントとのアロ免疫反応の程度、あるいはその組み合へのトラフィッキングの減弱に寄与しているものとわせによって異なることが明らかとなった。本研究考えられた。

成果はこれまで発表されていないあらたな知見であ以上の実験結果より、骨髄脂肪細胞を標的とした造血不全に対するあらたな治療の確立が期待された

り、マスターレギュレーターを同定すべく、現在なお NIH にて研究を継続している。

ものの、その治療効果は adipogenesis の抑制を介するものではなく、薬剤それ自体に免疫抑制効果があ考察ることが示された。 従って、adipogenesis の抑制が脂肪組織は単に中性脂肪、ひいては余剰なエネル造血を回復させるとの Nature 誌の結論を導くためにギーを貯蔵する役割を担うのみと考えられていたが、は、免疫学的な影響が実験結果を修飾していないか、近年の基礎、臨床研究の進歩によって、 アディポサ再検討する必要があると思われた。

イトカインなどを分泌する重要な内分泌器官である

上述の実験結果からは骨髄脂肪細胞の役割を明らうえに、炎症や免疫反応と密接に関わっていることかにすることができず、また PPAR- γ阻害剤を用いが分かってきた。一方で骨髄内の脂肪の役割についた解析には免疫学的な影響が払拭できないことからては、前述の Nature 誌を除くと殆ど報告されていな限界があることが明らかとなった。そこで FVB/NJ

い。造血不全疾患における骨髄脂肪細胞を検討したマウスを用いたあらたな造血不全モデルを開発し、報告は おそらく本研究がはじめてである。PPAR- γ

従来の造血不全モデル（C.B10）と比較することで、は adipogenesis に関わる中心的な転写因子であるが、あらたな知見を得ることを試みた。レシピエントを現在使用可能な PPAR- γ阻害剤はきわめて不安定なFVB/NJ マウスとして、放射線照射量を 700cGy、DBA薬剤である。本稿で示したように細胞性免疫修飾作マウス由来のリンパ球を 10x106 cells 輸注する、より用があるなど特異的に adipogenesis を抑制している

重症度の高い造血不全モデルを作成した（MHC マイとはいえない。更に in vitro の解析では比較的低濃度ナー抗原不一致）。従来の造血不全モデル（C.B10）であっても cytotoxicity を示すなど、本薬剤を用いたではリンパ球輸注二週間後にマウスは広汎な骨髄不実験結果を以て、脂肪細胞の生体内の役割を議論す全に陥り、骨髄内の殆どが脂肪細胞で占められるこることは困難である。とは前述の通りである。造血不全の機序はドナーリ

前述の Nature 誌の発表後、論文は幅広く引用され、ンパ球による免疫学的な骨髄の破壊であるので、免現在では脂肪細胞は造血の negative regulator である

疫抑制剤であるシクロスポリン（CyA）を投与するとの認識が広まりつつある。われわれが今回あらたことで造血不全から免れることが分かっている。興に開発した FVB/NJ マウスを用いた造血不全モデル

味深いことに上記に示したあらたな造血不全モデル

は非常にユニークであり、adipogenesis がアロ免疫（FVB/NJ）では、リンパ球輸注二週間後に同様に高反応、或いは炎症性サイトカインなどの違いによっ度の汎血球減少、骨髄の広汎な破壊がみられるものて異なる形で惹起されることをはじめて示したものの、脂肪細胞の浸潤は殆ど認められない。更に興味である。造血不全状態でも必ずしも骨髄内に脂肪細深いことに、CyA を投与すると、造血の回復と共に胞が増殖しないことから、少なくとも脂肪細胞が造脂肪細胞が同時に骨髄内に増殖するという、従来と血の負の制御因子であると決定づけることはできなは相反する生体内での変化を示すことが明らかにない。 PCR array などの結果から造血不全における骨髄中の adipogenesis の詳細なシグナル伝達を明らかandにすることで、阻害剤や siRNA などを用いて特異的Proliferator-Activatedにブロックすることが可能となる。本研究を更にす

Antagonists Attenuate Bone Marrow Failiure in an

すめることで、骨髄内脂肪の役割、とくに造血へのAplastic Anemia Mouse Model but Not in Radiation

影響を近く解明できるものと考えている。

Marrow Destruction. ASH Annual Meeting, Atlanta,

AplasticAnemia;
Receptor-g

Peroxisome(PPAR-g)

GA, 2012
研究の発表

2.

Kazuya Sato. PPAR-g in adipocytes plays a negative

口頭発表

regulatory role in immune-mediated bone marrow

1.

Kazuya Sato, Xingmin Feng, Jichun Chen, Marie J.

failure. CHI Symposium: The human immune

Disierto,

system after perturbation and in disease, Bethesda,

KeyvanKeyvanfar,

DanielaMalide,Sachiko Kajigaya, and Neal S. Young. Adipocytes

MD, 2012