その他の
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報文

藻類 Jpn. J. Phycol. (Sôrui) 68: 157-160, November 10, 2020

微細藻類への遺伝子組換え最前線
松田向平 1・平川泰久 2

はじめにやインジェクション法などの物理的な手法，そしてアグロバ

昨今のシークエンス技術の発展により，ゲノム解読やトラ

クテリウム法などの生物的な手法である。それぞれの手法に

ンスクリプトーム解析はとても身近なものになった。藻類でメリット・デメリットがあり，オールマイティーなものは存も広範な種で配列情報が公開されており，誰でも簡単に手に在しない。そのため，それぞれの細胞に合った手法を選ぶ必することができる。核ゲノムにおいても，ドラフトゲノムを要がある。化学的手法は壁をもつ細胞には不向きであるが条含めれば，全ての主要な藻類群 ( 緑藻，紅藻，灰色藻，渦鞭件が合えば非常に高い導入効率を示し，物理的手法は壁をも毛藻，不等毛藻，ハプト藻，クリプト藻，ユーグレナ藻，クつものにも適用できるが細胞へのダメージが大きい。生物学

る遺伝子情報とは裏腹に，遺伝子組換え技術の確立は一部のるのに適している。もう一つの要素である発現プロモーター

ロララクニオン藻 ) で利用可能である。しかし，日々蓄積す種に限られてきた。遺伝子組換えは，遺伝子機能解析などの的手法は高等植物で広く使われており，長鎖 DNA を導入すには 2 種類あり，内在性プロモーターと外来性プロモーター

基礎研究から有用物質を細胞内で生産させる応用研究まで幅である。内在性のものは遺伝子導入を行う生物から単離した広く用いることができる。そのため，多様な藻類での遺伝

プロモーターで，一般的に発現量の高い遺伝子の上流領域を子組換え技術の需要が高まっており，近年その開発が急速使用する。藻類の場合は，集光性タンパク質遺伝子やルビスに進められている。アメリカの Moore 財団の支援を受けた

Experimental Model Systems (EMS) プロジェクトでは，世界中の研究グループにより，微細藻類を含む多様な原生生物への遺伝子導入系の開発が 2015 年から進められてきた。その成果は最近報告され，約 20 種で遺伝子組換えに成功していコ遺伝子のプロモーターが使用されることが多い (Doron etal. 2016)。一方，外来性プロモーターには，近縁生物に由来するものやウイルス由来のものがある。ウイルス由来のプロモーターには広範な生物に使用できるものもあり，カリフラ

ワーモザイクウイルス由来の CaMV35S プロモーターは，陸る (Faktorová et al. 2020)。

上植物はもちろん，複数の藻類でも機能することが報告されに導入して発現させること」である。そのため，遺伝子ノッ

核酸導入法と発現プロモーターのどちらか一方に問題がある

遺伝子組換えとは一般的に「外来遺伝子 (DNA) を細胞内

クダウン技術である RNAi や，近年のゲノム編集技術である

TALEN や CRISPR/Cas9 は，遺伝子組換えとは異なる場合がある。例えば RNAi では，二本鎖 RNA を直接細胞へ導入した場合は遺伝子組換えの定義から外れるが，二本鎖 RNAを発現する DNA ベクターを細胞に導入した場合は遺伝子組換えとなる。同様に CRISPR/Cas9 でも，Cas9 タンパク質と単鎖ガイド RNA の複合体を細胞内に導入した場合は遺伝子組換えではないが，それらを発現する DNA ベクターを細胞に導入した場合は遺伝子組換えとなる。本稿では，近年報告されている微細藻類への遺伝子組換え技術を中心に，ゲノム編集技術に関しても一部紹介する。

遺伝子組換えに必要な要素

外来遺伝子を細胞内に導入し，タンパク質として発現させるためには二つの重要な要素がある。一つは核酸導入法で，もう一つは発現プロモーターである。核酸導入法はその名の通り，DNA を細胞膜や細胞壁などの物理的障壁を突破して細胞内へと導入する手法のことである。それには大きく分けて 3 つあり，リポフェクション法やリン酸カルシウム法，ポリエチレングリコール (PEG) 法などの化学的な手法，ガラスビーズ法やエレクトロポレーション法，パーティクルガン法ている (Doron et al. 2016)。新たな遺伝子導入系の開発は，と成功しないし，どちらに問題があるかは成功するまで分からない。まずは，確実に核酸導入できる手法・条件を見つけることが重要である。EMS プロジェクトでは直鎖多糖に蛍光物質を結合した FITC-dextran などを用いて細胞への核酸導入
条件を検討しており，著者らもこの方法でクロララクニオン
藻への新たな遺伝子導入系の開発に成功している（これに関しては後程述べる）。

一次共生藻類への遺伝子導入

一次共生藻類はシアノバクテリアを取り込み葉緑体を獲得したグループで，緑藻，紅藻，灰色藻，ポーリネラ (Paulinella

chromatophora) が含まれる。このうち緑藻と紅藻では，いくつかの種で遺伝子導入系が開発されているが，灰色藻とポー

リネラにおいては報告がない。大型藻でも緑藻のアオサ属(Ulva) や紅藻のアマノリ属 (Pyropia) などで遺伝子導入系が報告されているが (Mikami 2013)，ここでは微細藻類を中心に見て行こう。

モ デ ル 緑 藻 と 言 え ば Chlamydomonas reinhardtii で あ るが，2007 年に核ゲノムが解読された本種では (Merchant etal. 2007)，1990 年代にはパーティクルガン法やガラスビーズ
法，エレクトロポレーション法による遺伝子導入系が開発さ

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松田・平川

表 1. 主要な高次共生藻類への遺伝子導入系

藻類群・種名

遺伝子導入法プロモーター

引用文献

アグロバクテリウム / パーティクルガン / エ
レクトロポレーション

CaMV35S

Khatiwada et al. (2019)

Amorphochlora amoebiformis

パーティクルガン / エレクトロポレーション

RbcS

Hirakawa et al. (2008), Fukuda et al.
(2020)

不等毛藻
Phaeodactylum tricornutum

パーティクルガン / エレクトロポレーション

Fcp

Apt et al. (1996), Miyahara et al. (2013)
Kilian et al. (2011)ユーグレナ藻Euglena gracilis
クロララクニオン藻

Nannochloropsis sp.

エレクトロポレーション

Vcp

渦鞭毛藻
Amphidinium sp.

SiCa+PEG

CaMV35S, nos

ten Lohuis & Miller (1998)

Symbiodinium microadriaticum

SiCa+PEG

CaMV35S, nos

ten Lohuis & Miller (1998)

Symbiodinium spp.

アグロバクテリウム

CaMV35S, nos

Ortiz-Matamoros et al. (2015)

ハプト藻
Pleurochrysis carterae

PEG

Fcp

Endo et al. (2016)

Tisochrysis lutea

PEG

Lhc

Endo et al. (2018)

CaMV35S, cauliflower mosaic virus 35S; Fcp, fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein; Lhc, Light-harvesting complex protein; nos, nopaline synthase; PEG,
polyethylene glycol; RbcS, rubisCO small subunit; SiCa, silicon carbide; Vcp, violaxanthin/chlorophyll a-binding protein

れている (Jinkerson & Jonikas 2015)。C. reinhardtii への遺れ (Bhattacharya et al. 2013)，パーティクルガン法による遺られることが多いが，複数回の矩形波を採用したエレクトロ

常の真核生物の遺伝子組換えでは，導入した外来遺伝子は染ポレーション法が細胞壁をもつ細胞にも有効であることが報色体に組み込まれ，ゲノム複製により娘細胞へと引き継が

高い導入効率を示す条件なども報告され (Wang et al. 2019)，

ド DNA は染色体に組み込まれることなく，核の中で自己複その他の緑藻を見てみると，緑藻綱の Dunaliella salina やVolvox carteri，マミエラ藻綱の Ostreococcus lucimarinus やMicromonas commoda などで，C. reinhardtii と同様な手法
で遺伝子導入に成功している (Doron et al. 2016, Faktorová etal. 2020)。一方，最近報告された Acutodesmus obliquus とNeochloris oleoabundans への遺伝子導入系は一風変わっている (Muñoz et al. 2019)。これは生物学的手法で，プラスミド
DNA をもつ大腸菌と藻類細胞を混合し，2 時間程度インキュ

purpureum の核にはバクテリア型の DNA 複製機構があることが示唆されている (Li & Bock 2018)。

ものである。しかし，どのように DNA の移動が起こるのか類群において遺伝子導入系の報告があり ( 表 1)，それぞれに伝子導入には細胞壁をもたない変異株や除去した細胞が用い告されている (Yamano et al. 2013)。さらに，少量の DNA でより簡便で効率の良い遺伝子導入系の開発が行われている。

伝子導入系は最近になって報告された (Li & Bock 2018)。通れる。しかし P. purpureum の場合，導入した環状プラスミ

製することが報告された。詳しいメカニズムは不明だが，P.

高次共生藻類への遺伝子導入

真核藻類には緑藻や紅藻に由来する葉緑体をもつ者がいる。

緑藻や紅藻を直接取り込むイベントは二次共生だが，紅藻由来の葉緑体をもつ二次共生藻類を他の真核生物が細胞内共生
した場合は三次共生となる。これらをまとめて高次共生と呼ベートすると，プラスミドが藻類細胞へ取り込まれるというぶことにする。高次共生藻類の中で，クリプト藻を除く各藻は明らかにされていない。

ついて見ていこう。

Cyanidioschyzon merolae で，DNA と細胞と PEG を混合しどで近年注目を集めており，遺伝子導入系の開発も進められ

子導入系が開発されている (Matsuzaki et al. 2004, Ohnuma
et al. 2008)。また，アンチセンス鎖を利用した遺伝子発現
抑制 (Ohnuma et al. 2009) や相同組換えによる遺伝子ノッ
クダウン (Fujiwara et al. 2017) が利用可能であることに加されている (Ebenezer et al. 2019)。2001 年にパーティクルガ

紅 藻 で は，2004 年 に 全 ゲ ノ ム 配 列 が 報 告 さ れ たて数分インキュベートするだけという非常にシンプルな遺伝

え，同調培養系や葉緑体単離法なども確立しており，モデル
紅藻としての地位は揺るぎない。他の紅藻では，チノリモ属の Porphyridium purpureum で非常に面白い報告があるので紹介したい。P. purpureum は 2013 年にゲノム配列が報告さユーグレナ藻の Euglena gracilis は，健康食品への利用なている。ドラフトではあるが，2019 年に核ゲノム配列も報告

ン法による E. gracilis の葉緑体への遺伝子導入系が報告されているが (Doetsch et al. 2001)，核への遺伝子導入は長らく成功していなかった。そして近年，本種において CaMV35S プ

ロモーターを含むベクターを用いた遺伝子導入系が報告された (Khatiwada et al. 2019)。驚くことに，アグロバクテリウ

ム法，パーティクルガン法，及びエレクトロポレーション法の 3 つの異なる方法で遺伝子導入に成功したと報告している。

微細藻類への遺伝子組換え最前線

しかし，導入遺伝子が核ゲノムに組み込まれた証拠は示されておらず，第三者による再現実験が待たれる。また遺伝子組

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は光合成色素を失い増殖できていない。Chen et al. (2019) は，

既存の様々な方法を Symbiodinium microadriaticum に試した

換えではないが，Cas9 タンパク質複合体をエレクトロポレー

が，遺伝子組換えに成功しなかったと報告している。つまり，入・欠失を確認したという報告もある (Nomura et al. 2019)。

用可能な遺伝子導入系の確立には至っていない。

ション法により E. gracilis に導入し，目的遺伝子への塩基挿

今後もユーグレナ藻は E. gracilis を中心に開発が進みそうである。

未だ渦鞭毛藻では生理学的・遺伝学的な解析ツールとして利最後はハプト藻だが，円石藻の Pleurochrysis carterae で遺伝子導入系が報告されている (Endo et al. 2016)。円石藻

クロララクニオン藻では，2012 年に Bigelowiella natansの細胞表面は炭酸カルシウムからなる殻に覆われており，こかし，遺伝子導入系は本種ではなく他種の Amorphochlora

胞から円石を除いたプロトプラストを用いて PEG 法によりにおいてゲノム配列が解読されている (Curtis et al. 2012)。しれが核酸導入する際の一つの障壁になっている。彼等らは細amoebiformis で開発されている。著者らは，2008 年にパーティクルガン法による A. amoebiformis への遺伝子導入系を遺伝子導入に成功している。ここで興味深いのはプロトプラ

いという課題があった (Hirakawa et al. 2008)。最近になっ藻ではタンパク質分解酵素 (proteinase K) で処理することでストを作成するレシピである。植物細胞のプロトプラスト化報告したが，導入効率は低く，一過的な発現しか確認できなではセルラーゼなどの細胞壁消化酵素が用いられるが，円石て，蛍光物質 (FITC-dextran) が細胞内に導入される条件をエ

効率的に円石を除去できると報告している。さらにこの手法

レクトロポレーションを用いて検討したところ，ヒトの培養細胞で使用されている条件が適していることが解った。これを基に，著者らはエレクトロポレーション法による高効率な遺伝子導入系の開発に成功した (Faktorová et al. 2020)。また，
安定的な遺伝子導入株の作出には薬剤耐性遺伝子などの選抜

マーカーを用いるのが一般的だが，著者らは蛍光タンパク質

GFP を発現する細胞をマイクロピペット法により単離することで遺伝子導入株の確立に成功している (Fukuda et al. 2020)。
現在は，効率的な薬剤選抜法の開発と A. amoebiformis のゲ
ノム解読を進めている。

は，他の円石藻 Tisochrysis lutea でも試され，遺伝子組換えに成功している (Endo et al. 2018)。円石を持たないハプト藻

では，Isochrysis galbana にアグロバクテリウム法 (Prasad etal. 2014) とパーティクルガン法 (Faktorová et al. 2020) で遺伝子導入した報告がある。一方，ゲノム解読の終わっている

Emiliania huxleyi では未だ遺伝子組換えの成功例は報告され

ていない。

まとめ

本稿では藻類への遺伝子組換え技術の近年の進展状況をま

不等毛藻は，高次共生藻類の中で最も遺伝子導入系の開とめた。著者らが見落としている報告もあると思うが，藻類発が進んでいる藻類群である。複数種の珪藻で遺伝子組換への遺伝子組換え技術は着々と進んでいると言える。遺伝子

え が 可 能 で，Nannochloropsis 属 で も 報 告 が あ る (Kilian
et al. 2011)。 そ の 中 で モ デ ル と な る の は， 羽 状 珪 藻 のPhaeodactylum tricornutum で あ る。 本 種 で は，1996 年 にパーティクルガン法による遺伝子導入系が開発され (Apt et al.
1996)，その後エレクトロポレーション法 も開発されている(Miyahara et al. 2013)。さらに，RNAi による遺伝子ノック
ダウン (De Riso et al. 2009)，TALEN (Daboussi et al. 2014)
や CRISPR/Cas9 (Nymark et al. 2016) を用いたゲノム編集技術も開発されている。P. tricornutum は高次共生藻類の中でも数歩進んだ存在であり，他の藻類で遺伝子組換えを行う上での良い見本となっている。
遺伝子組換えに関していえば，渦鞭毛藻が最も厄介な藻類である。EMS プロジェクトでも，多くのグループが渦鞭毛藻への遺伝子導入系の開発に取り組んだが成功例は無かった (Faktorová et al. 2020)。渦鞭毛藻への遺伝子組換えの最初 の 報 告 は 1998 年 で，Amphidinium と Symbiodinium に

CaMV35S プロモーターを含むベクターを炭化ケイ素と PEGを用いた手法で導入したものであった (ten Lohuis & Miller
1998)。しかし著者らの知る限り，この 20 年でこの手法を用いた研究論文は発表されていない。Ortiz-Matamoros et al.
(2015) は，Symbiodinium にシロイヌナズナ用のベクターを

アグロバクテリウム法で導入できると報告したが，その細胞導入系の開発はあくまで一つのスタートであり，この技術を用いて分子細胞生物学的な基礎研究や産業応用に繋げていくことが重要である。その際，報告されている遺伝子導入系が信頼できるものかを十分吟味する必要がある。実際，報告の中には十年以上，再現性が示されていないものもある。また，研究技術の開発における問題の一つが，成功したものしか論
文として世の中に出てこないことである。つまり，失敗を知らない研究者が同じ失敗を繰り返してしまう可能性がある。

Faktorová et al. (2020) は，成功しなかった遺伝子導入系の開発に関するデータも補足情報として公開しており，ネガティ
ブデータの共有を行っている。今後もこのような取り組みが増えていくことで，遺伝子導入系の開発は益々進展していく
だろう。

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松田・平川

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(1 筑波大学生命環境科学研究科，2 筑波大学生命環境系 )