倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1507

体液性因子による内臓脂肪-副腎連関に着目したアルドステロン
過剰分泌機構の解明と治療標的の探索小林洋輝

日本大学医学部 内科学系 腎臓高血圧内分泌内科学分野

助教

Investigation of pathophysiology of aldosterone
overproduction based on visceral fat– adrenal
linkage through humoral factor
Hiroki Kobayashi,
Division of Nephrology, Hypertension, and Endocrinology, Department of Internal Medicine,
Nihon University School of Medicine, Assistant Professor

原発性アルドステロン症（PA）は、手術が適応となるアルドステロン産生腺腫（APA）と、内科治療が行われる両側性副腎皮質過形成（IHA）に分けられる。しかしながら、IHA の原因は明らかではない。本研究では、APAと IHA 患者の血液を用いて網羅的に蛋白を測定し、IHA 特異的な蛋白プロファイルを明らかにした。さらに、これらの蛋白が内臓脂肪量と血漿アルドステロン濃度（PAC）との有意な相関を示すことを確認し、IHA の発症に関与している可能性を示した。今後は、これらの蛋白について細胞実験を行い、アルドステロン過剰分泌における役割を検討する。
Primary Aldosteronism（PA）is classified into Aldosterone-Producing Adenomas（APA）, usually treated surgically,and Idiopathic Hyperaldosteronism（IHA）, typically managed with medication. The cause of IHA remains unknown.
This research comprehensively measured proteins in blood from APA and IHA patients, identifying an IHA-specificprotein profile. Further, we found a significant correlation between these proteins, visceral fat mass, and Plasma
Aldosterone Concentrations（PAC）, suggesting potential involvement in IHA onset. Future work will involve cellularexperiments with these proteins to explore their role in excess aldosterone secretion.

1．研究内容比して肥満を含めた生活習慣病の罹患率が高く、緒

IHA 発症に肥満が関与している可能性を報告した

言
二次性高血圧の代表疾患である原発性アルドス（JCEM. 2018）。さらに IHA 患者では血漿アルドテロン症（PA）は、外科手術の適応となる片側性ステロン濃度（PAC）と内臓脂肪量に有意な相関

アルドステロン産生腺腫：APA と、内科治療が一関係があることを明らかにした（未発表）。我々

般的な特発性アルドステロン症（両側性副腎皮質の研究結果を裏付けるものとして、脂肪細胞由来

過形成 : IHA）に大別されるが、KCNJ5 遺伝子等の体液性因子と副腎アルドステロン過剰分泌とのの体細胞変異が原因とされる APA に対し、IHA の関連が報告されている（PNAS. 2003）が、その詳病因は未解明であり、治療方針決定のための両者細は未解明である。そこで本研究では、血中生理の鑑別法も確立されていない。申請者は各病型の活性物質としてマイクロ RNA（miRNA）（Nature.

臨床所見の違いに着目し、IHA 患者では APA に2017）と蛋白に着目し、「IHA では脂肪細胞由来の倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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血中生理活性物質が副腎アルドステロン分泌制御解析を行う。同定された体液性因子のうち、PAC機構に関与する」という仮説を立て、PA 患者の血および内臓脂肪量と正の相関があるものをリスク

液検体を用いた網羅的 miRNA および蛋白の測定

因子、負の相関があるものを防御因子の候補としを通じて、IHA に特徴的な体液性因子を明らかにた。

し、① IHA の病態解明と治療標的の同定、② IHAの診断のための新たな血中バイオマーカーの同定

Pathway 解析、媒介解析による、候補 miRNA、を目的とする。

蛋白の統合解析（1-2 年目）
同定された蛋白群については、DAVID を用いた

方法

KEGG 解析を行い、IHA の病態に重要な Pathway

本研究の目的は、IHA に特徴的な血中 miRNA、を明らかにした。また媒介解析による因果解析を及び蛋白を同定し、IHA の病態を明らかにするこ行い、内臓脂肪量と PAC の関連性について同定しとである。再現性を検証するため、本研究は申請た候補蛋白がどの程度媒介するのかを明らかにし者の所属施設と共同研究施設である Monash 大学た。

（豪州）のコホートを用いて実施予定である。これら 2 施設での研究計画については、すでに申請者

2-3 年目

所属施設における研究倫理審査委員会から受理さ候補 miRNA、蛋白の H295R 細胞（ヒト副腎皮質れている（RK-20071-406）。今後計画している具細胞セルライン）に対する作用の評価（2-3 年目）

体的な研究項目を以下に示す。

同 定 し た リ ス ク、お よ び 防 御 因 子 と し て のmiRNA、蛋白について、ヒト副腎皮質細胞株で1-2 年目ある H295R 細胞に対する作用を評価する。具体

Discovery cohort における蛋白の測定、解析（1的には miRNA の mimic、inhibitor による miRNA年目）の発現制御、及び recombinant 蛋白の刺激によ

申請者所属施設を受診し、副腎静脈サンプリンる H295R 細胞のアルドステロン合成能に対するグ、臨床所見、病理所見から診断された APA40

作用をアルドステロン合成酵素である CYP11B2、人、IHA40 人、本態性高血圧（EH）患者 40 人を

HSD3B1 の 発 現 量（quantitative PCR、Western

対象に、保存血清 100 ul を用いた網羅的蛋白測定blotting）、及び細胞培養液中へのアルドステロン（SomaScan platform を用いた 1,129 種類の蛋白測分泌量（化学発光酵素免疫測定法）で評価する。

定）を行い、① IHA 群に特徴的な miRNA、蛋白群を明らかにした。また②候補蛋白の発現量と結果PAC、及び 3 次元画像解析システムで計測した内IHA 患者における血漿アルドステロン濃度と臓脂肪量との相関解析を行った。統計処理には、内臓脂肪量の相関関係を Spearman 順位相関係数

SAS 9.4 を用いた。

で検討した。その結果、有意な相関関係を認めた（r＝0.40, P＝0.0069）。

Validation cohort を用いた蛋白の検証（1-2 年目）
1）で同定された蛋白の検証のため、Monash 大学（Dr. Jun Yang）の PA 患者 70 人（APA 35 人、IHA 35 人）と EH 患者 30 人について同様の測定、

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図 1．血漿アルドステロン濃度と内臓脂肪の相関関係

上記の研究結果は、脂肪細胞由来の体液性因子

Quality check を 行 い、SOMAscan proteomics（microRNA、蛋白）と副腎アルドステロン過剰分

platform による約 7500 の蛋白測定を行った。その泌との関連の既報（PNAS. 2003, Nature. 2017）を結果、表 1 のように、APA と IHA、PA と EH で裏付けるものである。

異なる蛋白プロファイルを明らかにした。尚、
miRNA の測定については世界的物価高、円安の影

次 に、PA 患 者 と EH 患 者 の 血 清 サ ン プ ル の

表 1．Fold change analysis
APA vs IHA（Fold change analysis）
蛋白IHAAPAFC（Median） （Median）

P

PA vs EH（Fold change analysis）
EH
PAFC（Median） （Median）

P

蛋白 A

484

594

1.23

1.30E-05

434

539

1.24

5.60E-07

蛋白 B

1270

1529

1.20

1.70E-04

1123

1353

1.20

2.10E-05

蛋白 C

711

804

1.13

3.10E-04

658

757

1.15

3.90E-04

蛋白 D

1375

1507

1.10

4.60E-04

1278

1462

1.14

7.10E-07

蛋白 E

538

602

1.12

4.60E-04

492

563

1.14

1.50E-05

蛋白 F

1470

1625

1.11

4.80E-04

1419

1518

1.07

7.90E-04

蛋白 G

1336

1499

1.12

4.90E-04

1202

1419

1.18

7.10E-08

蛋白 H

1299

1497

1.15

5.00E-04

1167

1351

1.16

3.40E-05

蛋白 I

1636

1995

1.22

5.30E-04

1422

1812

1.27

1.80E-08

蛋白 J

1026

1123

1.10

5.30E-04

1007

1094

1.09

3.20E-04

蛋白 K

702

784

1.12

5.40E-04

643

760

1.18

2.80E-07

蛋白 L

539

625

1.16

6.60E-04

450

568

1.26

1.70E-07

蛋白 M

1903

2151

1.13

7.10E-04

1595

2044

1.28

6.50E-08

蛋白 N

1967

2643

1.34

9.40E-04

1671

2415

1.45

6.90E-05

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表 2．Spearman rank correlation
皮下脂肪

内臓脂肪PAC蛋白CCPCCPCCP

蛋白 O

0.51

2.30E-05

0.55

3.30E-06-0.46

2.90E-04

蛋白 P

0.33

8.70E-03

0.46

1.30E-04-0.48

1.10E-04

蛋白 Q

0.47

1.00E-04

0.34

5.80E-03-0.45

4.10E-04

蛋白 R

-0.04

7.80E-01-0.35

5.10E-03

0.47

1.60E-04

蛋白 S

-0.29

2.40E-02-0.41

7.90E-04

0.42

8.80E-04

蛋白 T

-0.30

1.70E-02-0.47

9.70E-05

0.43

6.70E-04

蛋白 U

-0.28

2.50E-02-0.49

4.90E-05

0.42

9.00E-04

蛋白 V

-0.38

1.90E-03-0.65

1.00E-08

0.429.90E-04

表 3．Pathway 解析
TermCount％

List Total

Pop Hits

Pop Total

Fold Enrichment

P value

Pathway 1186.34

1742518205

3.38

2.0E-5

Pathway 2

124.231741598205

3.56

5.2E-4

響を大きく受けており当初の価格が大幅に高騰し者の鑑別法も確立されていない。ているため測定の見込みが立たない状況である。

その中で申請者は本研究で PA 患者の血液検体

さらに、PAC と内臓脂肪のいずれにも優位に相を用いて、網羅的に蛋白の測定を行い IHA に特徴関関係を認める蛋白プロファイルを明らかにした的な血中蛋白プロファイルを同定した。同定した（表 2）。

蛋白のうちの複数で内臓脂肪量と PAC との優位な今後は、上記の結果について他施設のコホート相関関係を認め、IHA の発症に寄与している可能を用いて Validation し、最終的に同定した蛋白に性が示唆された。今回同定した蛋白はいずれもついて細胞実験を進める予定である。

IHA や APA との関連を報告した論文はなく新規性

続いて、PA と EH について有意に差のあったは極めて高い。

300 種類の蛋白について Pathway 解析を行った。

我々は以前の研究で IHA 患者では APA に比してPathway 解析を行った。その結果を表 3 に示す。

肥満の頻度が高く、IHA 発症に肥満が関与している可能性を報告した（1）。さらに IHA 患者では血考察

漿アルドステロン濃度（PAC）と内臓脂肪量に有意二次性高血圧の代表疾患である原発性アルドスな相関関係を認めることを明らかにした（未発表）。

テロン症（PA）は、外科手術の適応となる片側性

さらに、脂肪細胞由来の体液性因子と副腎皮質アアルドステロン産生腺腫：APA と、内科治療がルドステロン過剰分泌との関連が報告されている

一般的な特発性アルドステロン症（両側性副腎皮（2）。本研究の結果はこれらの関係を媒介する蛋白質過形成 : IHA）に大別されるが、KCNJ5 遺伝子群を明らかにしたものであり、今後は同定した蛋等の体細胞変異が原因とされる APA に対し、IHA白について細胞実験を行い、実際にアルドステロの病因は未解明であり、治療方針決定のための両ン分泌との因果関係を明らかにする必要がある。

倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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文献1）Ohno Y, Naruse M, Beuschlein F, Schreiner F,
Parasiliti-Caprino M, Deinum J, Drake WM, FalloF, Fuss CT, Gr ytaas MA, Ichijo T, Inagaki N,
Kakutani M, Kastelan D, Kraljevic I, Katabami T,Kocjan T, Monticone S, Mulatero P, OʼToole S,Kobayashi H, Sone M, Tsuiki M, Wada N,Williams TA, Reincke M, Tanabe A. Adrenal
Venous Sampling-Guided Adrenalectomy Rates
in Primar y Aldosteronism: Results of anInter national Cohor t （AVSTAT）. J Clin
Endocrinol Metab. 2021 Mar 8; 106（3）:e1400-e1407. doi: 10.1210/clinem/dgaa706.
PMID: 33031550.
2）Ehrhart-Bornstein M, Lamounier-Zepter V,
Schraven A, Langenbach J, Willenberg HS,
Barthel A, Hauner H, McCann SM, Scherbaum
WA, Bornstein SR. Human adipocytes secretemineralocorticoid-releasing factors. Proc NatlAcad Sci U S A. 2003 Nov 25; 100（24）: 142116. doi: 10.1073/pnas.2336140100. Epub 2003
Nov 12 . PMID: 14614137 ; PMCID:PMC283571.

2．発表（研究成果の発表）
・原発性アルドステロン症における血中プロテオーム解析による新規バイオ マーカー、及び治療標的候補の探索 小林洋輝、中村吉宏、阿部雅紀 第 96 回日本内分泌学会学術総会 2023 年 6 月

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