出芽酵母で見出した全く新しいタイプの染色体 DNA 複製起点の解析
Analysis on the replication origin, which shows novel characteristics,
in budding yeast（日本遺伝学会推薦）

代表研究者 高知工科大学

田中 誠司

Kochi University of TechnologySeiji TANAKA

Many analyses to date have provided insight on the regulatory mechanisms of DNA replication in eukaryotes.
While the protein factors that act in trans are well conserved throughout eukaryotes, the cis factors on the DNA side, thereplication origins, are surprisingly diverse. Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is the representative organismwith distinct conserved replication origins and has played a pioneering role in elucidating the mechanism of DNA
replication in eukaryotes. In this organism, every replication origin has conserved 13-bp-long ARS consensus sequence(ACS), which is T-rich. Moreover, it is known that there is another less conserved sequence, which is A-rich, in theproximity of the ACS. The replication origin identified in this study has completely new features that have never been
described before. That is, there is no conserved sequence or similar sequence in the replication origin, and thereplication origin usually functions with only one copy, whereas this replication origin requires two or more copies.
Therefore, the identification of this new-type replication origin may lead to a better understanding of the diversity ofeukaryotic replication origins and a more comprehensive understanding of replication origins in general.

研究目的

点から DNA 複製を開始させることで、その問題を本研究では、われわれが最近発見した、出芽酵母解決する。真核生物の良いモデルである単細胞生物

Saccharomyces cerevisiae の全く新しいタイプの染色である出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae からヒトの体 DNA 複製起点(以下 ORI と略)の機能解析を行ような多細胞生物に至るまで、複製起点は、平均しい、その特徴や性質を理解することを第一の目的とて約数十 kb につき１箇所存在するという驚くべきして、解析を行った。さらに、同様の性質を備える保存性を示す。

ような DNA 配列の網羅的同定を試みることで、真核生物 DNA 複製における進化的保存性は上記真核生物の複製起点全般についての包括的な理解がの複製起点の配置だけにとどまらない。真核生物細得られるのではないかと考え解析を進めた。

胞では，１回の細胞周期につき、DNA 複製が１度だけ起きることを保証するために、複製時に DNA研究経過

２本鎖を巻き戻すヘリカーゼの働きを細胞周期の時これまでに知られている全ての生物において DNA期特異的に２段階に制御している。すなわち、1)

複製は、DNA 上の特定の領域（複製起点：

G1 期には、ヘリカーゼを不活性型として複製起点

replication origin）から開始する。原核生物では一般に装着し（ライセンス化反応）、2) DNA 複製が起的に、複製起点はゲノム上に１箇所だけ存在する

きる S 期にヘリカーゼを活性化し、DNA 合成の場が、真核生物では，その巨大なゲノム DNA を過不である複製フォークを形成（ヘリカーゼ活性化）、足なく一定時間内に複製するために、多数の複製起

このとき同時に、ライセンス化反応を抑制し、次のG１期までライセンス化をブロックし続けること

芽酵母のように ACS は存在せず、その配列は A/Tで、１回の細胞周期につき、DNA 複製が１度だけrich であることが示されている。このように、真核起きることが保証される。このヘリカーゼの活性

生物の複製起点 DNA の配列には、進化的な保存性「制御メカニズム」自体のみならず、ヘリカーゼ本は見られず、このことは複製起点の分布や複製制御体である Mcm2-7 複合体を始めとして、ヘリカーゼ因子に見られる進化的保存性とは、極端な対照性をの活性制御機構においてはらたく種々の因子群につ示すということが理解されている。

いても、真核生物間で保存されていることがわかっ

出芽酵母では、ARS アッセイと ACS の存在、さている。このように、生命の根幹をなす DNA 複製らに、近年になって開発された、精製タンパク質をという現象は、様々なレベルで真核生物間で高度に用いた in vitro 再構成系より、複製開始反応の詳細保存されていることが良く理解されるようになっな理解が得られるようになってきた。これまで知らた。

れているいかなる生物においても複製起点からは，一方、ヘリカーゼが装着され、その活性化による両方向に進行する２つの複製フォークが生成する。

DNA２本鎖巻き戻しが最初に起きる場である、複

このことは，DNA２本鎖を巻き戻す活性型ヘリカ

製起点自体は、その塩基配列を含め真核生物間で驚ーゼが「１つ」の複製起点から「２つ」生じるといくほど保存されていないということもわかってきうことを意味する。このために、ヘリカーゼを複製た。出芽酵母 S. cerevisiae は真核生物で最初に複製起点に装着するライセンス化反応の時点で、ヘリカ起点が同定された生物である。その実験では，断片ーゼが「２セット、かつ対称的な配置」で装着され化した染色体 DNA をプラスミドに組み込み、そのていることもわかっていた。一方、真核生物で最もプラスミドが染色体外で自律複製が可能かどうかをよく理解されている複製起点である出芽酵母 ARS調べる（ARS アッセイ）ことで、プラスミドに自にある保存配列である ACS の塩基配列は、方向性律複製能力を与える DNA 配列、すなわちを持つ。すなわちこのことは、複製起点 ACS 配列

autonomously replicating sequence: ARS が同定されを特異的に認識して結合し、その後ヘリカーゼを装た。ARS は後に染色体上でも複製起点として機能着するという働きを持つ複製起点認識複合体していることが示された。このような実験系で（ORC）が、ARS に「１セットで１方向性」に結ARS を単離可能であったことより、出芽酵母では合するということを意味する。したがって、１分子多数の ARS が単離され、それらの詳細な解析よの ORC が、どの様にして２分子のヘリカーゼを対り、ARS には保存された配列：ARS consensus

称性を持つ形で装着させることができるのかという

sequence（ACS）が存在することが示された。ACS大きな疑問があった。

はもともとは 11 bp の配列であったが、現在では，

一方、ARS 解析の初期の頃より、ARS 内には完その領域が拡張された、17 bp の拡張 ACS 配列

全な ACS に加え、複数の ACS 様配列が、様々な向（extended ACS）と呼ばれることもある。一方、ヒきで存在することが知られていた。この意味するとトなどの脊椎動物では、ARS アッセイが機能しなころは長い間全くの謎であったが、in vitro 再構成い。そのため、複製起点の単離は困難を極めたが、系を用いたヘリカーゼ装着機構の解析より、その意近年の次世代シークエンサー等に代表されるゲノム味するところが明らかとなった。すなわち、まず、ワイド解析技術の進化により、その理解が飛躍的に

ORC 結合の特異性が高い第１の部位（ACS）を用高まった。すなわち、動物細胞の複製起点には保存いて、最初のヘリカーゼを装着したのちに、そのヘ配列は存在しないこと、複製起点は単独では存在せリカーゼを用いて ORC が第２の ACS 様配列（このず、複製起点のポテンシャルを持つ領域が複数集ま配列は A-rich、すなわち、T-rich である ACS とはった複製開始ゾーンとして存在すること、近傍に逆の極性となっている）に結合し、第２のヘリカー

G4 などの特徴的な配列を取りうる領域が存在する

ゼを、対称的な形で装着するというものである

ものの、おそらくはクロマチンの状態と複製起点の（Fig.1）。このメカニズムの解明により、ヘリカー間には密接な関わりがあると考えられるに至った。

ゼ装着に関する疑問が解かれると同時に、長年の疑真核生物の良いもであるであるもう一つの酵母：分問であった複製起点に見られる「ACS 様」配列の裂酵母においては ARS アッセイが機能するが、出謎も解かれることとなった。すなわち、複製起点に

Figure 1. Structure of ARS in S. cerevisiae and the mechanism of helicase loading reaction (licensing).
[Upper panel] Schematic presentation of the structure of ARS1, whose structure and function is best understood. ACS, B1 andB2region is essential for the function of this ARS. Extended ACS (e-ACS) consists of ACS and B1. ACS and B1 sequences are
T-rich, and B2 is A-rich. [Lower panel] The molecular mechanism of helicase loading. MCM is helicase core complex. ORC
binds to the e-ACS and loads the first MCM helicase with Cdc6 and Cdt1 (①~③). ORC then binds to the B2 site, whosepolarity is opposite to the e-ACS, with the help with the first MCM and load the second MCM to assemble head-to-head MCM
double hexamer (④~⑥). (Original figures are in the review by Costa & Diffley (2022) Annu Rev. Biochem. 91:26.1-26.25)は緩やかではあるが、ORC を二度結合させるためして存在し、以前より、リピート内に ARS が存在の「対称構造」がその機能のために必須であることするとされていた。興味深いことに、上述の OriDBが明らかとなった（Fig.1）。と、出芽酵母に関する解析情報を網羅的にまとめた

これまでに、ゲノムワイドな ORC、MCM の結合

Saccharomyces genome database (SGD:部位の同定ならびに新生鎖のマッピング等のテクノ

www.yeastgenome.org) における ARS 位置が異なロジーと、上述の拡張 ACS の存在との組み合わせる。OriDB が指定する領域には、ACS 様の配列がより、出芽酵母ゲノム上の全複製起点の同定が試み見られるが、SGD が指定する領域には ACS 様配列られてきた他、それらの情報をデータベース化し、はない（単なる T-rich な配列は存在する）。本研究

Web サイトとして公開した OriDB

では、それぞれが ARS とする領域（ARSOriDB、（cerevisiae.oridb.org）が作られ、広く一般に提供さARSSGD）を取り出し、それぞれ ARS アッセイに供れている。複製起点とされた全ての領域について、したが、いずれの領域も ARS 活性を示さなかっARS アッセイによる機能測定が行われたわけではた。また、２kb のリピートユニット全長を用いてないため、なかにはその機能が疑わしいものも存在

ARS アッセイを行なったが、ARS 活性は示さなかするが、これまでに機能があるとされたものについった。以前の解析で、顕著な ARS 活性の提示のたては、例外なく上記の「ACS の存在」ならびにめにはリピートユニットが２つ以上必要であること「ACS 様配列を持つことによる対称構造」を持を突き止めていたため、 ARSOriDB、あるいはつ。 一方、本研究で対象とした複製起点は、ARSSGD のみをタンデムに２コピー以上含むものを・明確な ACS 配列を持たない作製し、その活性を調べたが、いずれも ARS 活性・２コピー以上存在して初めて ARS 活性を示すは示さなかった。また、リピートユニットからという、これまでの複製起点にはない特徴を示す。

ARSOriDB と ARSSGD を同時に除いた領域をタンデム

本領域は、メタロチオネイン Cup1 をコードするに２コピー持つものを作製したが、これも ARS 活

タンデムリピート領域内に存在する。このリピート性を示さなかった。

ユニットはその長さが２kb であり、実験室酵母株

これらの結果より、２コピーのリピートユニットにおいては、数個から十数個のタンデムリピートと全長を含むものを出発点とし、両側から削り込んで長さを短くした多数のコンストラクトを作製し、ムに２コピー持つものは ARS 活性を示さないと

ARS 活性を調べたところ、リピートユニット左端いう結果と矛盾しない。

付近の約 90 bp 内に ARS 活性に大きく影響を与え新型エレメント内には ACS に似た配列は存在しる領域が存在することがわかった。一方、本領域内

ないものの、T 塩基が 4-5 個連続する領域があるたには ACS 様配列もなく、本領域が複数あったとしめ、それらを GC-rich な配列に置き換えたものにつても ARS 活性は見られない。上述したように、出いても解析を行ったが、ARS 活性促進効果への影

芽酵母複製起点が機能するためには、その内部に向響は見られなかった。

かい合って存在する２つの ORC 結合部位があることが必要である。あそこで、この短い領域を予め考察

ACS を組み込んだ、ARS 活性を示さないプラスミ

今回、我々が出芽酵母 CUP1 リピート領域から新ドに挿入し、ARS として機能させることができる

規に発見した ARS は、これまでに記述例がないよようになるか否かを調べることとした。

うな全く新しい特徴を備えていた。即ち、解析の結果、上記の新規に同定した約 90 bp の領域（以下の解析結果より、「新型エレメント」と呼称する）は、ACS を配置したプラスミドの・ACS の上流に配置しても ARS 活性に影響はない（Fig.２の 7 と 8）が、・出芽酵母の既知複製起点にある保存配列 ACS およびその類似配列が無い.
・複製起点は通常１コピーで機能を示すが、本領域は２コピー以上必要.
今回行った解析より、・ACS の下流に配置すると、ARS 活性を誘導でき・該当領域に、複製起点があるとされていたが（根る（Fig.２の 5 と 6）。しかも、この活性には、拠不明）データベースに記述されている場所は、・既存 ACS との位置関係が重要であり、データベースにより異なり、また、それらを取り・新型エレメント自体の向きは重要ではないこと出してタンデムな２コピー以上の形にしても顕著がわかった（Fig.２の 5〜8）。一方、単純に、な ARS 活性は示さないこと、・新型エレメントを複数重ねただけでは ARS 活性・データベース上で複製起点とされている場所を取を示さない ことがわかった（Fig.２、11）。こり除いたリピートユニットをタンデムな２コピーの結果は、上述の、リピートユニットから以上の形にしても顕著な ARS 活性は示さないこARSOriDB と ARSSGD を同時に除いた領域をタンデと、・２コピー以上のタンデムなリピートユニット（ARS 活性あり）から出発すると、完全な１ユニットに加え、部分的な重複があれば、顕著なARS 活性が見られ、・この重複部分はどこでも良いわけではなく、ARS活性に顕著な影響を及ぼす領域（新型エレメントと呼称）があること、・新型エレメントは、複製ライセンス化反応において第２の ORC 結合部位として機能可能なものであるが、・通常の ARS の B2 エレメントで見られるような、A-rich 配列はなく、さらにその方向特異性も示さ

Figure 2. Newly identified element has unique features in
the function of ARS.
Conserved ACS sequence placed on the plasmid isshown in filled arrows and the newly identified ʻthe newtype elementʼ is shown in open arrows. The direction ofarrows indicates the polarity of the sequence. +/indicates the ARS activity of the construct shown in left.

ない.という、解析を進めれば進めるほど驚きの結果が得られた。
これらの特徴は、本 ARS が全く新しいタイプの複製起点であることを示しており、その発見自体がDNA 複製研究において大きなターニングポイント

3.

芽酵母 CUP1 領域のコピー数変化のメカニズとなる可能性がある。
真核生物における DNA 複製の研究では、1979 年

ム. 第 38 回 Yeast Workshop. 2021 年 11 月 26に出芽酵母で ARS が初めて真核生物の複製起点として発見され、その領域が 100~200 bp というごく

鳥山竜暉、池澤一希、小川志帆、田中誠司. 出日, Online.
4.

西谷 悠、小川志帆、田中誠司. RSC クロマチ

狭い領域に限定でき、保存配列も存在していたこ

ンリモデラーと DNA 複製・チェックポイントと、その後見出された出芽酵母の他の複製起点も例

因子 Dpb11 の相互作用. 第 38 回 Yeast

外なく同様の性質を備えていたことから、そこに結Workshop. 2021 年 11 月 26 日, Online.

合する因子の同定をはじめ、出芽酵母で得た概念を5.

渡邊加菜、小川志帆、田中誠司. 出芽酵母 S 期拡張する形で真核生物の DNA 複製を理解するといサイクリン Clb5 の機能を再考する. 第 38 回う大きな流れがあった。これまでに蓄積された概念

Yeast Workshop. 2021 年 11 月 26 日, Online.とは異なる性質を持つ本 ARS の発見とその機能解6.

小川志帆、二宮沙絵、田中誠司. 複製因子 Sld3 の明は、真核生物の DNA 複製起点に対する概念を次分裂酵母に特異的な N 末端ドメインの役割. 日のレベルへと導くものかもしれない。また、新型エ

本遺伝学会第 93 回大会. 2021 年 9 月 8〜10 日,

レメントとリピートユニットの複製活性に対するさOnline.

らなる理解が、ヒト細胞のように複製起点に保存配7.

小野 凛之助、宮田 侑香、大迫 泰輝、小川 志帆、列がなく、潜在的な複製起点が多数集合して染色体田中 誠司．出芽酵母 S 期サイクリン Clb6 の高上で複製開始「ゾーン」を形成しているような生物発現が引き起こす致死性の解析. 日本分子生物の複製起点を理解する上で大きな助けとなることも学会 第 44 回 年会. 2021 年 12 月 1～3 日. 横浜

期待できる。

市/Online.

次々に新たな予期しない性質が現れたことによ

8.

岡本愛加、田中 誠司．過剰複製に対する細胞り、本研究期間中にその性質を完全に明らかにする応答とゲノム不安定化. 酵母遺伝学フォーラム

ことはできなかったが、山田科学振興財団の研究援第 53 回研究報告会. 2020.09.09. Online.

助により、研究を発展させ、思いもよらなかった発

9.

他４件.

見をすることができた。最後になりましたが、本研究を援助していただいたことに対し、深く感謝いた

誌上発表

します。

1.

Seiji Tanaka, Shiho Ogawa (2022) Dimerization offiring factors for replication origin activationin eukaryotes: a crucial process for simultaneous

研究の発表

assembly of bidirectional replication forks? Biology

口頭発表

in press.

1.

Shiho Ogawa1, Sae Ninomiya1, Seiji Tanaka.

Seiji Tanaka (2021) Interaction of replication factor

Unique function of the N-terminal domain of Sld3 in

Sld3 and histone acetyl transferase Esa1 alleviates

Schizosaccharomyces pombe. ICY15 (The 15thgene silencing and promotes the activation of lateInternational Congress on Yeasts) meetsand dormant replication origins. Genetics，

ICYGMB30 (the 30th International Conference onVol.217，iyaa001.

Yeast Genetics and Molecular Biology) Aug 23-27,

https://doi.org/10.1093/genetics/iyaa001

2021. Online.
2.

2.

3.

Seiji Tanaka (2020) Construction of Tight

Sae Ninomiya, Shiho Ogawa, Seiji Tanaka. Role(s)Conditional Mutants Using the Improved Auxin-of Schizosaccharomyces specific N-terminal domain

Inducible Degron (iAID) Method in the Buddingof Sld3. Cold Spring Harbor Laboratory Meetings on

Yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in

EUKARYOTIC DNA REPLICATION & GENOME

Molecular Biology, Yeast Protocols，Vol.2196，

MAINTENANCE September 8-12, 2021. Online.

ISBN: 978-1-0716-0868-5，pp.15-26.