植物におけるクローン繁殖の制御機構とその進化
Molecular mechanism and its evolution of vegetative propagation in plants

代表研究者 神戸大学

石崎公庸

Kobe UniversityKimitsune ISHIZAKI

Many plants have an ability to reproduce asexually via vegetative propagation, in which clonal progenies aregenerated directly from vegetative organs. However, little is known about the molecular mechanisms. The liverwort
Marchantia polymorpha propagates asexually via gemmae generated in gemma cup formed on the dorsal side ofgametophyte thallus. To investigate genes involved in the process of gemma and gemma cup development, weperformed RNA-seq analysis comparing gemma-cups contaning gemmae and thallus without any gemma cup. Throughthe comprehensive transcriptome analysis, we identified the gene encoding an R2R3-MYB transcription factor,
designated as GEMMA CUP-ASSOCIATED MYB 1 (GCAM1), which was significantly up-regulated in the developing
gemma cup. Targeted disruption of GCAM1 conferred a complete loss of gemma and gemma cup formation.
Overexpression of GCAM1 resulted in suppression of tissue differentiation in thallus, suggesting the function ofGCAM1 in the maintenance of stem cell like property in the basal epidermis of gemma-cup. Phylogenetic analysis
showed the orthologous relationship of GCAM1 to factors involved in axillary meristem formation of angiosperms. Our
results demonstrated the crucial role of GCAM1 in the vegetative reproduction in the liverwort, and suggested acommon regulatory mechanism of secondary meristem formation shared between gametophyte of liverworts andsporophyte in angiosperms.

研究目的

優占の生活史をもつユニークなモデル植物であり、動物では初期発生の過程で分化能力が強固に限定有性生殖に加えて、栄養繁殖の仕組みをもつ。ゼニされ分化全能性は失われるのに対し、植物では発生ゴケの栄養繁殖では、その本体である葉状体上に杯が進んでも体細胞の分化全能性が維持される。多く状体という器官が形成され、その中に 100 個以上もの植物では、体細胞の分化全能性に基づき、受精をのクローン個体が形成される。ゼニゴケにおける杯介さず根・茎・葉といった栄養器官の体細胞から独状体と無性芽の形成メカニズムについては、100 年立したクローン個体を形成して繁殖することができ以上前に詳細な形態学的観察がある（Barns and Landる。例えば、塊茎から芽が形成されるジャガイモや、

1908, Botanical Gazette 6: 401-6）。杯状体はゼニゴケ

葉の付け根に芽（ムカゴ）が形成されるヤマイモの葉状体の頂端細胞近くからその発生が開始される。

例が挙げられる。また竹林すべて根で繋がった 1 ク

まず、①葉状体の背（上）側の表皮細胞の一部が、ローンである竹もその一例である。この繁殖様式は杯状体底部細胞となり、垂層分裂を繰り返しながら栄養繁殖と呼ばれ、固着性の生活様式をもつ植物に杯状体底部領域が拡大する。次に、②杯状体底部細とって、安定した環境下で迅速に繁殖する際に有利胞から、無性芽始原細胞が分化し、不等分裂の後、であり、また農業や園芸の分野でも重要な繁殖様式

頂端側の細胞が分裂を繰り返して、円盤状の無性芽である。しかしながら、これまで分子遺伝学が利用が形成される。③また、杯状体の外壁となる部分は可能な栄養繁殖のモデル植物がなく、その分子メカ

杯状体底部表皮細胞の外側の組織が、上部方向へ成ニズムについてはほとんど知見がない。

長することで盛り上がりカップ上の形態となると考

ゼニゴケは、陸上植物進化の基部に位置し半数体えられる。①と②、そして③のプロセスは同時に進行する。形成された無性芽は、杯状体の中に存在すーターレポーターアッセイで得られた結果の検証をる限り休眠しているが、雨粒などの物理的刺激によ行う予定である。

り杯状体の外に散布され、吸水すると成長を開始す

次に、GCAM1 の機能を解析するため、相同組み替る。無性芽による栄養繁殖は、有性生殖に水を必要えによるジーンターゲティング法により、GCAM1とし多大なコストを払うゼニゴケにとって、生育範の遺伝子構造が破壊された GCAM1 ノックアウト株

囲を迅速かつ効率的に拡大するために重要な繁殖様の作出を行った。 ゲノミック PCR によるスクリー式である。

ニングの結果、2 株の独立した GCAM1 ノックアウト

近年、進化的に重要な位置を占めるゼニゴケに注株が単離された。GCAM1 ノックアウト株の表現型を目が集まっている。2008 年には、米国エネルギー省解析したところ、2 株とも、杯状体（そしてもちろJoint Genome Institute によって、全ゲノム解読プロジん無性芽も）を全く形成しない、杯状体形成を完全ェクトがスタートした。さらに、申請者らが中心とに欠損した表現型を示した。さらに我々は、なって簡便かつ効率的なアグロバクテリウムを介しCRISPR/Cas9 系によるゲノム編集により、GCAM1た形質転換系が開発され、相同組換えに基づくジーのタンパク質コード領域に 1〜数塩基の欠失が生じ、ンターゲティング法、CRISPR/Cas9 系による効率的正常な GCAM1 タンパク質が形成されないと考えらなゲノム編集が可能となり、分子遺伝学の基盤が整れる GCAM1 ゲノム編集株を複数株単離した。単離っ た （ Ishizaki et al. 2016, Plant Cell Physiol. 57:

した GCAM1 ゲノム編集株はいずれも GCAM1 ノッ262-70）。本研究では、ゼニゴケをモデルとして、植クアウト株と同様に杯状体形成不全の表現型を示し物に共通するクローン繁殖器官の発生制御の分子メた。得られた GCAM1 機能欠失変異体は、いずれもカニズムを解明することを目的としている。

気室や仮根、生殖器などの形成は野生株と比較して顕著な異常は確認されず、葉状体の分枝にも異常は研究経過
ゼニゴケにおいて、クローン繁殖器官の発生に重要な遺伝子を探索するため、次世代 DNA シーケン見られなかった。以上より、GCAM1 がコードするタンパク質は、ゼニゴケ杯状体の形成に必須の役割を持つことが明らかとなった。

サーを用いて無性芽を含む杯状体組織の網羅的トラ

GCAM1 の機能を更に解析するため、GCAM1 の過ンスクリプトーム解析（RNA-seq）を行った。その剰発現株を作出した。当初、GCAM1 を過剰発現す結果、杯状体組織で特異的に発現が上昇する遺伝子ると、杯状体の形成数が増加するような表現型を期を 500 個以上見出した。その中で、R2R3-MYB 型転待した。実際に GCAM1 を過剰発現した形質転換体写因子をコードする遺伝子の１つについて、qRT−

は、成長が大幅に抑制され、未分化な細胞塊様の組PCR により、その発現が杯状体組織で特異的に上昇織を形成した。さらに、GCAM1 の過剰発現の効果していることが支持された。そこでその R2R3−MYBを検証するため、動物のステロイドホルモン受容体

遺 伝 子 を GEMMA CUP-ASSOCIATED MYB 1ドメイン（GR）を GCAM1 の C 末端に融合し、デキ（GCAM1） と名付け、さらなる機能解析を行うこ

サメタゾン（DEX）処理依存的に GCAM1 の機能をとにした。

誘導できる株を作出した。作出した GCAM1-GR 株

GCAM1 の発現パターンを詳細に解析するため、は、DEX 処理依存的に未分化な細胞塊様の組織が葉GCAM1 の ATG 上流約 5kb の DNA 断片を GUS レポ状体の先端に形成された。次に 2 週間の DEX 処理をーター遺伝子に連結したコンストラクトを作成し、行って、未分化な細胞塊を大きく成長させた後、DEX野生株ゼニゴケに導入した。得られたを洗い流したところ、細胞塊の様々なところから小GCAM1pro::GUS 株では、発生中の杯状体底部と無さな葉状体組織が形成された。以上より GCAM1 は、性芽で顕著な GUS 活性が確認されたことから、組織分化を抑制し未分化な細胞の増殖を促進する機GCAM1 は、発生中の杯状体底部および無性芽で重能をもつことが示唆された。そのような未分化な細要な機能をもつことが示唆された。現在、GCAM1胞集団は、葉状体先端の頂端細胞のような、あらゆの組織レベルの RNA の蓄積状況を直接検出するたる組織・器官の形成中心となる領域を形成するポテ

めゼニゴケ葉状体で in situ RNA ハイブリダイゼーシ

ンシャルを有するという意味で、杯状体底部表皮細ョン法を立ち上げており、系が確立し次第、プロモ胞と似た細胞集団だと考えられる。

現在、GCAM1 下流で制御される遺伝子を解析すリーニングされた am9 変異体は、杯状体形成頻度がるため、GCAM1-GR 株を用いて DEX 処理時と、DEX野生株に著しく低く、さらに低い頻度で杯状体の形を洗い流した後のサンプルから RNA を抽出し、成される葉状体背側中肋部に不完全な杯状体を形成

RNA-seq によるトランスクリプトーム解析を行ってする表現型を示した。サザンブロット解析の結果いる。

T-DNA の挿入数は 1 コピーであり、また TAIL-PCR

杯状体形成に必須の機能をもつことが明らかとなの増幅断片の解析結果から T-DNA の挿入部位近傍

った GCAM1 はどのようなタンパク質をコードするに R2R3-MYB 型転写因子のタンパク質コード領域遺伝子なのか？GCAM1 のアミノ酸配列をクエリーが 存 在 す る こ と が 示 唆 され た 。 さ ら に 杯 状 体 のに陸上植物と、また陸上植物に近縁の車軸藻類のデRNA-seq 解析から、この R2R3-MYB 遺伝子の発現がータベースから、相同性を示すタンパク質を抽出し、杯状体で顕著に上昇することが示唆されたので、分枝系統解析を行った。その結果、GCAM1 がコード

qRT-PCR 解 析 に よ っ て 確 認 し た 。 そ こ で こ のするタンパク質は、陸上植物で多様に機能分化した

R2R3-MYB 遺伝子が、am9 変異体の原因遺伝子と考R2R3-MYB 型転写因子のサブファミリー14 の基部

え、GEMMA CUP-ASSOCIATED MYB 2（GCAM2）とに位置することが明らかとなった。興味深いことに名付け、更なる実験を進めた。まず、プロモーター

R2R3-MYB 型転写因子サブファミリー14 に属する

レポーター解析の結果により、GCAM2 の発現が、葉被子植物の遺伝子は、トマト Blind やシロイヌナズ状体頂端部に加えて発生中の杯状体と無性芽で顕著MERISTEMsであることが示唆された。次に、相同組替えによる（RAXs）など、被子植物の腋芽（茎頂分裂組織と葉ジーンターゲティング法により GCAM2 の遺伝子構の境界領域に形成される芽、側枝をつくる芽となる）造を破壊した GCAM2 ノックアウト変異体を作出し形 成 に 重 要 な 機 能 を も つこ と が 報 告 さ れ て い る

た。独立した 4 系統の変異体が単離され、いずれも（Schmitz et al. 2003, PNAS 99: 1064-69; Müller et al.

am9 と同様、杯状体形成不全の表現型を示した。

2006, Plant Cell 18: 586-597）。

GCAM2 ノックアウト変異体の葉状体は、杯状体形成

ナREGULATOROFAXILLARY

GCAM1 とシロイヌナズナ RAX 遺伝子のオーソロが不全という以外には、その仮根や気室などの器官グ関係を検証するため、GCAM1 をシロイヌナズナ形成に明確な表現型は見つからなかった。しかしなの rax1 rax2 rax3 変異体に導入し機能を相補するかがら生殖器を誘導したところ、野生株では生殖器が検証した。しかしながら、GCAM1 は rax 変異体の腋形成される条件でも GCAM2 ノックアウト変異体で芽形成の表現型を相補することは無かった。GCAM1は生殖器の形成が確認できなかった。以上のことかと RAXs は、もともと共通の祖先遺伝子から派生しら、GCAM2 は、GCAM1 と同様に、杯状体と無性芽た可能性が高いが、それらの N 末端領域の DNA 結形成に必須の機能をもつ制御因子であることが明ら合ドメインに高い相同性は見られるものの、C 末端かとなった。さらに GCAM2 は GCAM1 とは違い、領域の相同性は低く、長い進化の過程で変わっって生殖器の形成にも何らかの役割をもつことが示唆さしまった可能性が考えられる。現在は、RAX 遺伝子れた。

や RAX3 と GCAM1 のキメラ遺伝子をゼニゴケに導GCAM2 の分枝系統解析を行ったところ、GCAM2入し、同様の機能をもつか検証する実験を準備しては GCAM1 とは別の R2R3-MYB サブファミリー21いる。シロイヌナズナ RAX の DNA 結合ドメインがに属することが示唆された。 R2R3-MYB サブファ

ゼニゴケで GCAM1 と同様に機能すれば、GCAM1

ミリー21 には、腋芽や複雑形成に関わるトマトと被子植物の腋芽形成制御因子 Blind や RAX との機

Trifoliate や シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ LATERAL ORGAN能の保存性を補強するデータとなる。

FUSION1/2（ LOF1/2）が属す る（ Lee et al. 2009,

また GCAM1 の他に、杯状体形成に必須の機能をDevelopment 136: 2423-32; Ahmad Naz et al. 2013,

もつ、R2R3-MYB 型転写因子の単離に成功した。あPNAS 110: 2401-6）。GCAM2 とオーソログの関係にグロバクテリウムを介した形質転換では、T-DNA 断

ある Triforiate や LOF と、GCAM1 のオーソログであ片がゲノム中にランダムに挿入され、挿入場所に遺る RAXs や Blind とは、遺伝学的な関係は示唆されて伝子が存在した場合は、その構造が破壊される。こいるものの、どのような相互作用が存在するのかにの T-DNA タギング法による変異体作出法からスクついては、明らかになっていない。今後、GCAM1

と GCAM2 の遺伝学的関係や相互作用について、詳恒常活性型やドミナントネガティブ型など様々な細に解析する予定である。

RopGTPase を発現させ、細胞骨格や細胞分裂の進行

また順遺伝学解析から GCAM1，GCAM2 とは別のをライブイメージングすることで、低分子量 G タンメカニズムで栄養繁殖プロセスに関わる制御因子のパク質による無性芽発生の初期プロセス制御機構を同定に成功した。これまでに杯状体は正常に形成さ解明しようと実験を準備している。

れるが、その中に無性芽を形成しない変異体が 2 株
単 離 さ れ て お り 、 そ れ ぞ れ karappo-1(kar-1) と考察karappo-2(kar-2)と名付けていた。kar-1 および kar-2

本研究では、ゼニゴケの栄養繁殖について、分子の表現型をプラスチック包埋ブロックの切片像解析遺伝学的に解析をすすめ、杯状体形成に必須の転写などにより詳細に解析したところ、kar-1、kar-2 変異因子 GCAM1、GCAM2 を同定することに成功した。

体はいずれも、発生初期の無性芽が全く確認できず、さらに杯状体底部からの無性芽発生開始に重要な機

無性芽発生の初期プロセスである不等分裂などに異能をもつ KAR を同定し、低分子量 G タンパク質シ常があることが示唆された。kar-1、kar-2 ともに外来グナリングが、無性芽発生開始の鍵となっているこ遺伝子がランダム挿入された集団から選抜された変とが示唆された。本研究は、植物の自然発生的な栄異体であるが、遺伝学的解析を進めたものの、表現養繁殖プロセスの制御因子を同定に成功した世界初型と連鎖する外来 DNA は同定できなかった。変異の成果である。

原因遺伝子の同定は困難と考えられたが、ゼニゴケ

さらに杯状体形成の制御因子 GCAM1、GCAM2 がのゲノム解析がほぼ完了してきたので、変異体ゲノいずれも被子植物の腋芽形成の制御因子のオーソロムのリシーケンス解析を行うことにした。その結果、グであったことは極めて興味深い。無性芽発生の場独立して単利された kar-1、kar-2 であるが１つの共となる杯状体底部細胞は、葉状体の頂端細胞近傍で通した遺伝子に変異が確認された。その遺伝子の野形成が開始される未分化な幹細胞群である。一方で、生型 DNA 断片を、kar-1 と kar-2 に導入したところ、腋芽の元となる腋芽メリステムは、茎頂分裂組織と杯状体の中の無性芽形成が回復したことから、この葉の境界領域で形成される幹細胞群である。両者と遺伝子を KARAPPO（KAR）と名付けた。相同性検索

も新たな芽を生み出す幹細胞群が増えるメカニズムの結果、KAR 遺伝子は、植物の低分子量 G タンパクと言う点で機能的に共通と考えられる。本研究の結質の一種である Rop の活性化を担うグアニルヌクレ果は、コケ植物と被子植物という４億年以上も前にオチド交換因子(GEF)をコードするこが示唆された。

分岐した系統間で、幹細胞の増殖に関与する共通のKAR により活性化されると考えられる Rop 遺伝子

遺伝子制御ネットワークが保存されていることを示をゼニゴケで探索したところ、１つの遺伝子唆するものである。今後、GCAM1、GCAM2 のお互（MpRop）を見出した。そこで、KAR と MpRop タいの制御関係、および上流、下流の制御メカニズムンパク質を大腸菌で発現・精製し、KAR によるを詳細に解析することにより、植物における幹細胞

MpRop の GDP 結合型から GTP 結合型への変換活性の増殖制御の基本メカニズムを明らかにできると考を生化学的に解析し、KAR が MpRop の GEF としてえられる。

機能しうることを確認した。さらに酵母２ハイブリ

一方、無性芽発生開始の制御因子 KAR は、細胞ッド実験によって、KAR と MpRop の相互作用を検骨格の制御を介して植物細胞の形や極性を制御する証した。その結果、KAR がホモ二量体を形成すること考えられている低分子量 G タンパク質 Rop の活性と、KAR と MpRop が相互作用することが明らかと化因子であった。被子植物における Rop シグナリンなった。

グは、根毛の伸長制御や、表皮細胞やトライコーム

以上の結果より、低分子量 G タンパク質の活性化などの細胞形態形成に関与することが知られているを担う KAR が、杯状体内における無性芽発生の初が、栄養繁殖プロセスへの関与は報告されていない。

期プロセスに必須の役割をもつことが明らかとなっ

今後、KAR による Rop の活性化メカニズムや、Ropた。すなわち低分子量 G タンパク質の活性化が、無による無性芽始原細胞の不等分裂などについて、詳性芽始原細胞の極性形成や不等分裂に重要な役割を細に解析することにより、被子植物では、冗長性のもっていることが考えられる。現在、杯状体底部で、ために解析が進んでいない Rop による発生制御の基

形成に重要な GEMMA CUP-ASSOCIATED MYB

本メカニズムが明らかになる可能性がある。

2 の機能、第 58 回日本植物生理学会年会、鹿児今後、本研究により同定された栄養繁殖の制御因島、2017 年 3 月

子について更なる解析をすすめ、論文にまとめるとともに、植物におけるクローン繁殖制御の基本メカ

6.

樋渡琢真、山口勝司、重信秀治、澤進一郎、桐ニズムから、陸上植物における発生制御の原型と進田啓如、深城英弘、三村徹郎、河内孝之、石崎化について新たな知見や概念を発見し、発信してい公庸、第 58 回日本植物生理学会年会、鹿児島、きたい。

2017 年 3 月
7.

吉川未樺子、塚本成幸、深城英弘、三村徹郎、竹澤大輔、坂田洋一、石崎公庸、ゼニゴケ無性研究の発表

芽の休眠に関連する bHLH 遺伝子の機能解析、口頭発表

第 58 回日本植物生理学会年会、鹿児島、20171.

年 3 月-

Ishizaki, K. Molecular genetics of gemma andgemma-cup

development

in

theliverwort

Marchantia polymorpha. EMBO workshop “New2.

3.

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Vienna Austria, 2016 年 6 月

Biotechnol. Biochem. 81: 73-80.

石崎公庸、ゼニゴケ配偶体の幹細胞増殖を制御

2.

Ishizaki, K., Nishihama, R., Yamato, K.T. andするメカニズム、日本植物学会第 80 回大会、沖Kohchi, T. (2016) Molecular genetic tools and縄、2016 年 9 月

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宇野真里奈、塚本成幸、深城英弘、三村徹郎、Plant Cell Physiol. 57: 262-270.
3.

Proust, H., Honkanen, S., Jones, V.A., Morieri, G.,

LATERAL SUPPRESSOR 相同遺伝子の機能、日Prescott, H., Kelly, S., Ishizaki, K., Kohchi, T. and本植物学会第 80 回大会、沖縄、2016 年 9 月

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塚本成幸、大和勝幸、山口勝司、重信秀治、深development of epidermal structures in the common

城英弘、三村徹郎、河内孝之、石崎公庸、ゼニ

ancestor of land plants. Curr. Biol. 26: 93-99.

ゴケの栄養繁殖器官におけるトランスクリプト

5.

1.

model systems for early land plant evolution”

石崎公庸、ゼニゴケ無性芽形成における4.

誌上発表

4.

石崎公庸、榊原恵子（2016）巻頭言：古い酒をーム解析、日本植物学会第 80 回大会、沖縄、2016

新 し い 革 袋 に 〜 preexisting gene regulatory

年9月

network の転用による陸上植物のボディプラン

高見英幸、塚本成幸、増田晃秀、深城英弘、三革新〜−、BSJ-review 7: 37−44.

村徹郎、河内孝之、石崎公庸、ゼニゴケ杯状体