出芽酵母のオートファゴソーム形成に関わる Atg タンパク質局在の可視化
Visualization of autophagy-related proteins during autophagosome biogenesis in
Saccharomyces cerevisiae（日本細胞生物学会推薦）

代表研究者 東京大学

鈴木邦律

The University of Tokyo

Kuninori SUZUKI

Macroautophagy (autophagy) is a highly conserved cellular recycling process involved in degradation of
eukaryotic cellular components. During autophagy, macromolecules and organelles are sequestered into thedouble-membrane autophagosome and degraded in the vacuole/lysosome. Autophagy-related 8 (Atg8), a core Atg
protein essential for autophagosome formation, is a marker of several autophagic structures: the pre-autophagosomal
structure (PAS), isolation membrane (IM), and autophagosome. Atg8 is conjugated to a phospholipid
phosphatidylethanolamine (PE) through a ubiquitin-like conjugation system to yield Atg8-PE; this reaction is called
Atg8 lipidation. Although the mechanisms of Atg8 lipidation have been well studied in vitro, the cellular locale of Atg8
lipidation remains enigmatic. Atg3 is an E2-like enzyme that catalyzes the conjugation reaction between Atg8 and PE.
Therefore, I hypothesized that the localization of Atg3 would provide insights about the site of the lipidation reaction.
To explore this idea, we constructed functional GFP-tagged Atg3 (Atg3-GFP). During autophagy, Atg3-GFP transiently
formed a single dot per cell on the vacuolar membrane. This Atg3-GFP dot colocalized with 2×mCherry-tagged Atg8,
demonstrating that Atg3 is localized to the IM by fine-localization analysis. The localization of Atg3 suggests that Atg3
plays an important role in autophagosome formation at the IM.

研究目的
真核細胞の中では、細胞周期や環境条件に応じてのような分子機構でオルガネラの膜構造を構築していくのかを解明することを目的とする。

オルガネラが崩壊し、再構成される現象が頻繁に見AP 形成は、細胞質に出現した小さな袋状の膜が伸られる。真核細胞が栄養飢餓にさらされると、生存展して隔離膜（以下 IM）となり、伸展した IM の末維持に必要な栄養分を確保するために細胞質成分を端が閉じることによって被分解物を内包する AP が大規模に分解する、オートファジーと呼ばれるシス形成されるという極めてダイナミックなプロセスでテムが誘導される。オートファジーは分解システムある。これまでに出芽酵母を用いて AP 形成不能のとしての側面に加え、オートファゴソーム（以下 AP）表現型を指標に ATG（autophagy-related）遺伝子が同という二重膜オルガネラを新規に生合成するシステ定・解析されてきたが、どの遺伝子を破壊しても APムとしての側面を持つ。合成と分解の両方を追うこ形成ができないという表現型が出るのみで Atg タンとのできるオルガネラはあまり知られていないが、パク質がどのような作用機序を介して IM を形成しオートファジーによる被分解物の輸送を担うオルガているのかは全く不明であった。

ネラである AP は新規合成から分解までを追跡する

我々は蛍光顕微鏡を用いてオートファジーに関わことのできる数少ないオルガネラである。本研究でる構造体を可視化することによってこのような閉塞は、AP の形成メカニズムを解析することを通じて、状況を打ち破ってきた。Atg タンパク質を緑色蛍光オルガネラの新規合成時に作動するタンパク質がどタンパク質（green fluorescent protein, GFP）と融合することにより可視化することで、Atg タンパク質がり、Atg2-Atg18 複合体が隔離膜の縁において ER exit

液 胞 上 の 限 定 さ れ た pre-autophagosomal structuresite と接していることが明らかとなった（Suzuki et al.

（PAS）と呼ばれる領域に集積することで、AP 形成(2013) J. Cell Sci.）。

が行われることを明らかにした（Suzuki et al. (2001)

このように IM と小胞体とが機能的に関連していEMBO J.）。また、PAS の遺伝学的階層構造を解析することが明らかとなってきたが、IM と小胞体との橋ることで、Atg タンパク質の機能が、飢餓シグナル渡しをする分子装置の存在は未だ解明されていない。の受容と他のタンパク質の集積に関わる「足場タン本研究では、局在未知の Atg タンパク質を可視化すパク質」と、足場タンパク質の上で AP 形成に直接ることで、IM 伸展に関わる分子装置の実体を解明す関わる「実働タンパク質」に分けられることを示しることを目標とした。

た（Suzuki et al. (2007) Genes Cells）。実働タンパク質は AP 形成に直接関わっていることから、AP 形成の研究経過中間構造体である隔離膜上で働くことが予想された。

IM のマーカータンパク質として一般的に使用さ最近になって、我々は、Atg1 を含めて 8 つの Atg タれるのがユビキチン様タンパク質である Atg8 であンパク質が IM 上に局在することを報告した（Suzukiる。Atg8 は新規に合成されるとプロテアーゼであるet al. (2013) J. Cell Sci.）。

Atg4 による末端のアルギニン残基の切断を受け、116

動物細胞では、IM が小胞体膜と物理的に接続して番目のグリシンが露出する。この切断を受けた Atg8

い る こ と が 示 さ れ て い る （ Hayashi-Nishino et al.

を Atg8(G116)と呼ぶ。続いて Atg8(G116)はユビキチ(2009) Nat. Cell Biol.）。さらに我々は、出芽酵母におン結合系の E1 様酵素である Atg7 によって活性化さいて隔離膜と小胞体の局在を三次元的に可視化するれ、E2 様酵素である Atg3 に渡され、リン脂質ホスことによって、隔離膜が COPII 小胞形成に関わる機ファチジルエタノールアミン（以下 PE）と結合し、能領域である ER exit site を介して小胞体と接していAtg8-PE となる。Atg8-PE 生成不能株は AP 形成も不ることを見いだした（Suzuki et al. (2013) J. Cell Sci.）。

能となることから、Atg8-PE は IM 伸展に重要な役割

これらの事実を組み合わせて考えると、AP 形成時にを果たしていると考えられている。しかしながら、は ER exit site を経由して IM と小胞体膜が接続されAtg8-PE が AP 形成の過程において、いつどの場所でているという結論が導き出される。COP II 小胞は小形成されるのかは全く不明のままであった。本研究

胞体からゴルジ体への物質輸送を担う小胞であるこではまず Atg8-PE 生成の最終段階を担う酵素であるとから、小胞体からの小胞輸送が AP 形成に重要でAtg3 を可視化することにより、AP 形成のメカニズあると想像される。では、ER exit site が COP II 小胞ムに新たな知見を得ることを試みた。

形成を介して AP 形成に関わっているのだろうか？

我々は、C 末端に GFP を融合したときに活性を保それにしてはこれまでの丹念な電子顕微鏡観察の過持している一連の Atg タンパク質を可視化してきた程で隔離膜周辺に COP II 小胞らしきものが観察され（Suzuki et al. (2013) J. Cell Sci.）。Atg3 は N 末端およたことがない。それとも、小胞体膜が ER exit site をび C 末端のどちらに GFP を融合しても活性が見られ介して隔離膜に脂質を供給しているのだろうか？

ないことから、この論文では記載されていない。し我々の研究結果によれば、小胞体に局在するタンパかし、Atg8-PE 化の時空間的制御機構を理解するた

ク質は隔離膜に移行しない（Suzuki et al. (2013) J.

めには、Atg3 の可視化解析には大きな意義がある。

Cell Sci.）ことから、後者の可能性を考えた場合、隔出芽酵母の Atg3 は結晶解析の報告がなされてい離膜と小胞体の接続されている領域には、脂質のみることから（Yamada et al. (2007) J. Biol. Chem.）、我々を通過させタンパク質の通過を排除するふるい機能

はその結晶構造に基づき、酵母 Atg3 に特徴的なを備えた脂質の輸送装置が備わっている可能性があ

α-helix である Handle region 直後の領域に注目し、そる。の部位に GFP を導入することで Atg3 の可視化を試

このように、隔離膜と小胞体は近接しており、小みた。我々は Asp265 と Gly266, Asp269 と Trp270、胞体側には ER exit site が存在する。では、隔離膜がAsp276 と IIe277 の三カ所に制限酵素サイトを導入し、小胞体と接する部位には特定のマーカーとなるようGFP を挿入した。こうして作製した Atg3-GFP プラなタンパク質はあるのだろうか？

スミドを atg3 欠損株に導入し、Atg3-GFP の活性を我々の解析によ調べたところ、野生型 Atg3 をプラスミドで導入したの第二反応は PAS 形成以降の IM の伸展に必要であ場合と比べてほぼ同等な活性が見られた（Ngu et al.

ることが示唆された（未発表データ）。現在この(2015) J. Biol. Chem.）。

Atg4-GFP の可視化を進め、Atg4 の局在情報を得た

続いて Atg3-GFP の局在を観察したところ、オートファジーの誘導に伴って液胞近傍に集積してくる（未発表データ）。上記の結果と合わせて Atg4 の機能について詳細な解析を進めている。

ことが分かった。この局在は PAS に類似していることから、PAS マーカーである Atg8 との共局在を観察考察した。すると、Atg3-GFP の局在と Atg8 の局在はよく一致することが分かった。

我々はこれまでオートファジーに関わる構造体の可視化に取り組んできた。そうした解析の過程で、さらに、Atg3 の IM 局在を観察した。我々が開発AP の選択的積荷タンパク質を過剰発現することにし た 手 法 を 用 い て IM を 可 視 化 し た と こ ろ 、より、これまで点状にしか確認できなかった AP 形

Atg3-GFP は IM に局在していることが明らかとなっ成の中間構造体、IM をカップ状構造として蛍光顕微た。この結果から、Atg3 は IM 上で機能している可鏡下に可視化することに成功した（Suzuki et al.

能性が示唆された。これらの結果をまとめて論文と(2013) J. Cell Sci.）。本技術を利用して、Atg タンパクして報告した（Ngu et al. (2015) J. Biol. Chem.）。

質が IM のどの領域に局在するかを調べることで、こうして我々は Atg3 の可視化に成功したが、未だ可 視 化 解 析 の な さ れ て いな い タ ン パ ク 質 と し てそれらのタンパク質の作用している部位を明らかにしている。

Atg4 がある。上述のように Atg4 は Atg8 の C 末端の今回局在を明らかにした Atg3 は Atg8-PE の生成をアルギニンを切断することで Atg8(G116)を形成させ介して AP 形成に関わるタンパク質である。Atg3 はる。この反応は Atg8 が PAS に局在するのに必要でIM に局在し、AP 形成が完了すると膜から遊離してある（Suzuki et al. (2007) Genes Cells）。Atg4 は新規細胞質に戻される。Atg3 の膜結合に関しての情報は合成後の Atg8 を切断するのみならず、Atg8-PE を切ほとんどないことから、Atg3 が AP 膜に結合し、再断する活性も持っている。以後前者の反応を Atg4度外れるメカニズムは大きな謎である。Atg4 は IMの第一反応、後者の反応を第二反応と呼ぶ。これまに結合した Atg8-PE を切断することによって Atg3での研究では、Atg4 の第二反応が AP 形成に重要なの局在制御に関わっている可能性がある。こうした役割を果たしていることが報告されている（Kirisako

視点からも Atg4 の役割は大変に興味深いものであet al. (2000) J. Cell Biol.; Nakatogawa et al. (2012)

る。今後は Atg3 の局在制御に Atg4 がどのように関Autophagy）。しかしながら、Atg4 の第二反応が関わわっているのかに注目して Atg3 と Atg4 の機能的関るステップについては依然不明なままであった。そ連を解析していく予定である。

こで我々は、Atg4 の活性中心に変異を導入することで、Atg4 の第一反応と第二反応が AP 形成にどのよ参考文献

うに関わっているのかを調べた。

1.

Kirisako T, Ichimura Y, Okada H, Kabeya Y,

まず、Western blotting により、Atg8-PE の生成を

Mizushima N, Yoshimori T, Ohsumi M, Takao T,

確認し、GFP-Atg8 の局在の結果と突き合わせること

Noda T, Ohsumi Y. The reversible modification

で第一反応の役割を調べた。その結果、先行研究とregulates the membrane-binding state of Apg8/Aut7

同様に、第一反応は Atg8-PE の生成を介して Atg8

essential for autophagy and the cytoplasm to vacuoleの PAS 局在化に必要であることが分かった。

targeting pathway. J. Cell Biol., 151, 263-276 (2000)

続いて、Atg8(G116)を発現させることにより第一2.

Hayashi-Nishino M, Fujita N, Noda T, Yamaguchi A,

反応を迂回させた株において変異 Atg4 を発現させYoshimori T, Yamamoto A. A subdomain of theた。Atg8-PE が蓄積している株は Atg8-PE の切断活

endoplasmic性が低下している株である。Atg8-PE の蓄積を調べ

autophagosome formation. Nat. Cell Biol., 11,たところ、Atg4 変異体の中には第二反応特異的な欠1433-1437 (2009)

損を示す株の存在が示唆された（未発表データ）。また、GFP-Atg8(G116)の局在を観察したところ、Atg4

3.

reticulum

forms

acradlefor

Nakatogawa H, Ishii J, Asai E, Ohsumi Y. Atg4
recycles inappropriately lipidated Atg8 to promote

autophagosome biogenesis. Autophagy, 8, 177-186
4.

5.

6.

(2012)

研究の発表Suzuki K, Kirisako T, Kamada Y, Mizushima N,

口頭発表

Noda T, Ohsumi Y. The pre-autophagosomal1.

鈴木邦律・オートファゴソーム積荷タンパク質

structure organized by concerted functions of APGの網羅的解析・第 66 回日本細胞生物学会大会・

genes is essential for autophagosome formation.

2014 年 6 月 11 日（水）・東大寺総合文化センタ

EMBO J., 20, 5971-5981 (2001)

ー

Suzuki K, Kubota Y, Sekito T, Ohsumi Y. Hierarchy2.

鈴木邦律・可視化によるオートファゴソーム形of Atg proteins in pre-autophagosomal structure

成分子機構の解析・第 14 回日本タンパク質科学

organization. Genes Cells, 12, 209-218 (2007)

会年会・2014 年 6 月 25 日（水）・ワークピア横Suzuki K, Akioka M, Kondo-Kakuta C, Yamamoto

浜（招待講演）H, Ohsumi Y. Fine mapping of autophagy-related
proteins

duringautophagosome

Saccharomyces cerevisiae.

J.

formation

Cell Sci.,

in126,

誌上発表（下線は報告者、*は責任著者）
1.

during autophagosome formation in Saccharomyces

2534-2544 (2013)

cerevisiae. J. Biol. Chem. 290, 8146-8153 (2015)

7. Yamada Y, Suzuki NN, Hanada T, Ichimura Y,
Kumeta H, Fujioka Y, Ohsumi Y, Inagaki F. TheNgu M, Hirata E, Suzuki K*. Visualization of Atg3

2.

Suzuki K*, Nakamura S, Morimoto M, Fujii K,

crystal structure of Atg3, an autophagy-related

Noda NN, Inagaki F, Ohsumi Y. Proteomic profiling

ubiquitin carrier protein (E2) enzyme that mediates

ofAtg8 lipidation. J. Biol. Chem., 282, 8036-8043

cerevisiae. PLoS One, 9, e91651 (2014)(2007)

autophagosome

cargoin

Saccharomyces