細胞内蛋白質工学のための革新的プローブラベリングシステムの開発Development of Innovative Probe Labeling System for In-Cell Protein Engineering（日本化学会推薦）代表研究者	 	 長岡技術科学大学築地	  真也Nagaoka University of TechnologyShinya TSUKIJI	 協同研究者	 	
 京都大学浜地	  格Kyoto UniversityItaru HAMACHI	 

京都大学田村	  朋則Kyoto UniversityTomonori TAMURA長岡技術科学大学石田	  学Nagaoka University of TechnologyManabu ISHIDA長岡技術科学大学菊地	  環Nagaoka University of TechnologyTamaki KIKUCHIChemical protein modification (labeling) is a key approach in protein engineering and chemical biology. Inparticular, the ability to modify target proteins with small-molecule chemical probes, such as fluorescent dyes,NMR probes, and cross-linkers, in living cells will provide powerful tools for the study and control of biologicalsystems. To this end, we have recently developed a technique, termed the ligand-directed tosyl (LDT) chemistry,which allows selective chemical labeling of specific (native) proteins in cells and in vivo. However, the LDTchemistry is still at the beginning stage, and thus its full potential has yet to be exploited. In this work, we firstattempted to apply the LDT chemistry as a novel tool for live-cell fluorescence imaging of endogenous proteins.
Using a newly-designed LDT reagent (1), we were able to selectively label endogenous FKBP12 with an organicfluorescent dye, Oregon Green (OG), in living mammalian cells. It was also possible to visualize therapamycin-mediated complexation of the OG-labeled FKBP12 and mCherry-fused FRB inside of the cells byFRET imaging. Furthermore, in this work, we demonstrated that the chemical labeling efficiency could besignificantly improved by combining the LDT chemistry with the site-directed mutagenesis technique.

研究目的	 いることで標的蛋白質を修飾する。このタグラベル近年、生きた細胞内の特定の対象蛋白質に蛍光色化法は、細胞内蛋白質の選択的な合成プローブラベ素、NMR プローブ、光架橋剤などの「合成小分子プリング技術として一早く発展し、最近ではさまざまローブ」を選択的に修飾・ラベル化する手法が求めな細胞生物学研究、特に合成蛍光プローブを用いたられている。このようなプローブラベリング技術は、細胞内蛋白質の蛍光イメージング研究に実践応用さ既存の蛍光蛋白質テクノロジーやその他の分子生物れるようになってきた [1]。一方、この手法には２つ学的手法では実現できないさまざまな“化学的アプの大きな限界がある。一つ目かつ最大の限界は、タローチによる生体機能解析”を可能にするため、生グラベル化法で修飾するのはあくまでも対象蛋白質命科学の次世代基盤技術として大きな注目を集めてとタグ蛋白質の融合蛋白質だということである。す[1]いる 。これまでに細胞内蛋白質へのプローブラベなわち、細胞内にもともと内在する本来の対象蛋白リング法として、SNAP-tag や HaloTag に代表される質ではなく、細胞に人工的に過剰発現させたタグ融[2]「タグ蛋白質」を利用した手法が開発されている 。

合蛋白質をラベル化し、その機能を解析することにこの手法では、任意の対象蛋白質にタグ蛋白質を融なる。タグ融合蛋白質は真の内在性の対象蛋白質と合したものを細胞内に発現させ、そのタグ蛋白質と本当に同じ機能や活性レベルを持っているのだろう特異的に結合するように設計したプローブ分子を用か。タグラベル化法が有するもう一つのテクニカルな限界は、そのプローブ導入部位である。タグラベーブラベリングを実現する世界初の手法である。そル化法では、タグとなる蛋白質を遺伝子レベルで対して、本手法の最大の特徴は、特異的リガンドさえ象蛋白質に融合する必要があるため、その導入部位あれば、細胞内在性の標的蛋白質をラベル化できるは基本的に対象蛋白質の N 末端か C 末端に限定され点にある。これまでに我々は、本手法を用いることる。蛋白質の末端へのプローブラベリングの有用性で、赤血球内の内在性炭酸脱水酵素に 19F NMR プロについて疑う余地はない。しかし、合成プローブラーブを導入し、その細胞内での蛋白質と阻害剤とのベリングのポテンシャルを最大限に発揮するために結合を in-cell 19F NMR によって検出することなどには、明らかに末端修飾法だけでは不十分である。例成功している[3,4]。

えば、環境応答性蛍光色素を用いてバイオセンサー	  一方、LDT 化学はまだ誕生して間もなく、その応を構築したり、対象蛋白質に光架橋剤を導入してそ用についてはまだ十分検討されていない[3–6]。そこでの相互作用の相手を光クロスリンクしようとする場本研究では、LDT 化学をより実用的かつ革新的な細合、プローブ分子は対象蛋白質の末端よりもむしろ胞内蛋白質ラベリング・エンジニアリングツールと蛋白質“本体”の特定部位へ修飾することが望ましして飛躍的に発展させることを目的とした。具体的い。しかし、生細胞内で使用でき、対象蛋白質の機にはまず、「① LDT 化学の蛍光イメージングへの応能を損なわずにその蛋白質の本体の特定部位へ合成用」を検討した。
（上述のように）現在の蛍光イメープローブをラベル化可能な手法というのはこれまでジングでは、対象蛋白質に蛍光蛋白質もしくはタグ存在しなかった。

蛋白質を融合したものを観察するしかなく、内在性	  我々は、有機化学的アプローチをもとにこの難題蛋白質を蛍光可視化することのできる技術というのに取り組み、「リガンド指向型トシル（LDT）化学」はまだほとんど開発されていない。そこで本研究でと命名した新規の蛋白質ラベル化技術を考案・開発は、内在性蛋白質の選択的化学修飾が可能な LDT 化[3]することに成功した 。LDT 化学では、標的蛋白質学を応用し、生細胞“内在性”蛋白質の蛍光ラベリに特異的に結合するリガンドと任意の合成プローブングと live-cell 蛍光イメージングに挑戦した。

を求電子性フェニルスルホン酸エステル基（通称ト	  更に本研究では、「② LDT 化学と遺伝子工学を融シル基）によって連結した化合物をラベル化剤とし合した新しい細胞内蛋白質ラベリング法の開発」にて用いる（図 1）。このラベル化剤は、標的蛋白質に取り組んだ。プロトタイプの（内在性蛋白質を対象選択的に結合し、そのリガンド結合部位近傍の求核とした）LDT 化学では、ラベル化の成否や効率が標性アミノ酸とトシル基が（近接効果を利用して）反的蛋白質に大きく依存し、ラベル化速度も遅い（多応することでプローブ分子が標的蛋白質に転移する。

くの場合、10 時間以上）という大きな欠点がある。

この SN2 型反応と同時に、リガンド部位はラベル化例えば、高親和性リガンドをもとにラベル化剤を作剤骨格から切り離される。そのため、標的蛋白質のっても、標的蛋白質によってはラベル化がほとんど活性・機能は保持される（標的蛋白質は不活性化し進行しないという場合もある。これは、標的蛋白質ない）。すなわち、LDT 化学は、標的蛋白質の機能のリガンド結合ポケット周辺の求核性アミノ酸の有を損なわず、その蛋白質本体への部位特異的なプロ無、種類、またその空間分布が標的蛋白質によって	 Fig. 1 Principle of the LDT chemistry異なるためである。したがって、遺伝子工学的手法行し、反応 18 時間後には 56%、24 時間後には 70%を用いて対象蛋白質のリガンド結合ポケットの周辺の収率で OG ラベル化 FKBP12 が得られることが確に高求核性アミノ酸を導入すれば、さまざまな標的認された。一方、リガンド部位を持たない化合物 2蛋白質を高効率かつ高速にラベル化できるようにな（図 2）では FKBP12 のラベル化は全く進行せず、1る可能性がある。そこで本研究では、遺伝子工学的による FKBP12 のラベル化は“蛋白質—リガンド相互に改変した蛋白質に対する LDT 化学を展開し、汎用作用”（FKBP12 とラベル化剤 1 との相互作用）によ的かつ高効率な細胞内蛋白質ラベリング法の開発にって駆動されていることが示された。また、ペプチ

挑戦した。

ドマッピングの結果、FKBP12 のリガンド結合ポケ	 ットの入り口に存在する 55 番目のグルタミン酸研究経過	 （Glu55）が部位特異的に修飾されていることが明ら① LDT 化学を用いた細胞内在性蛋白質の蛍光ラベかとなった。

リングと live-cell 蛍光イメージング	  続いて、細胞内在性 FKBP12 のラベル化に取り組	  本研究では、LDT 化学を用いて細胞内在性の蛋白んだ。実験には、FKBP12 の内在発現が確認されて質に小分子蛍光色素をラベル化し、その蛍光ラベルいるヒト肺胞基底上皮腺がん細胞 A549 を用いた。

化内在性蛋白質と他の蛋白質との相互作用を生細胞細胞培養液に 1（4 µM）を加え、37℃で 18 時間静置内でそのまま蛍光イメージングにより可視化するこした。その後、細胞をライセートにし、SDS-PAGEとに挑戦した。具体的には、本研究では概念実証をによる分離後、FKBP12 抗体およびフルオレセイン目指し、イムノフィリンの一種である「FKBP12」を抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ったモデル標的蛋白質とした。FKBP12 に特異的に結合（フルオレセイン抗体は OG も認識する）。その結果、する小分子 SLF をリガンドとし、緑色蛍光色素であ他の蛋白質への非特異反応が若干あるものの、内在る Oregon Green（OG）をプローブとして持つ LDT性 FKBP12 に高選択的に OG 色素がラベル化されてラベル化剤 1（図 2）を設計・合成した。なお、1 のいることが確認された。

設計の際には、我々が以前に見出したピペラジン骨	  上記の結果を踏まえ、我々は次に、細胞内に構築格をリガンドとトシル基間のスペーサーとして採用した OG ラベル化内在性 FKBP12（OG-FKBP12）とした（FKBP12 のラベル化においては、ピペラジン他の蛋白質との相互作用を FRET イメージングによスペーサーを持つ LDT ラベル化剤が最も高いラベって可視化することを試みた。FKBP12 は免疫抑制[6]ル化効率を示すことを以前報告している） 。

剤である小分子ラパマイシンの存在下、FRB という	  まず in vitro 系において、1 による天然 FKBP12 の蛋白質ドメインとヘテロ二量体を形成することが知ラベル化を評価した。pH 8.0 のバッファー水溶液中、られている[7]。そこで本研究では、FRB に赤色蛍光FKBP12 と 1（いずれも 11 µM）を混合し、37℃でラ蛋白質 DsRed を融合した蛋白質（FRB-DsRed）をあベル化反応を行った。MALDI-TOF-MS による解析のらかじめ発現させた A549 細胞を用いることにした。

結果、FKBP12 のラベル化（OG 修飾）が経時的に進なお、DsRed は OG 色素に対する FRET アクセプターとなる。先と同様の条件下、FRB-DsRed 発現細胞

O
SNR

O

O

O

OHNHO中の内在性 FKBP12 を 1 により蛍光ラベル化（OGFOO標識）した。その後、ラパマイシン添加前後での蛍光イメージングを行い、OG 励起時における OG 由

NHO2CO来の蛍光強度（FOG）と DsRed 由来の蛍光強度（FDsRed）Fの比（FDsRed/FOG：R 値とする）に基づいたレシオ画OMeO像を取得した。その結果、ラパマイシンの添加によMeOって R 値が顕著に増加し、OG から DsRed への FRETOR=ONOO効率が増加していることが明らかとなった（図 3 上OO1段）。また、FKBP12 と FRB の二量化を誘導しない2	 Fig. 2 Structures of LDT reagents 1 and 2	 FK506 や DMSO を添加した場合、R 値の増加は見られなかった（図 3 下段）。以上の結果より、ラパマイこの結果は、天然蛋白質を標的とした LDT 化学では、R valueラベル化の成否および効率がリガンドとトシル基間highのスペーサー構造に大きく依存することを示している。したがって、このプロトタイプの LDT 化学だけでは限界がある。そこで本研究では、標的蛋白質のlowリガンド結合部位の周辺に人為的に高求核性アミノ酸「システイン（Cys）」を変異導入し、その Cys 導入蛋白質に対する LDT 化学を展開するという新し	 Fig. 3 FRET imaging of the rapamycin-mediatedinteraction of OG-FKBP12 and FRB-mCherry inliving A549 cells. Scale bar, 10 µm.	 

いアプローチを検討することにした。このように標的蛋白質に Cys を導入することで、１）天然蛋白質に対してはラベル化効率の低いラベル化剤でも高効率なラベル化が可能になること（ラベル化剤の最適化のための試行錯誤の必要がなくなること）、２）よシンによる OG-FKBP12 と FRB-DsRed との複合体形り高速なラベル化が実現できること、３）Cys の導成（相互作用）を生細胞 FRET イメージングにより入位置を選ぶことで、蛋白質へのプローブ導入部位可視化することに成功した。

も人為的に選べるようになること、などを期待した。	  上記の Cys 導入アプローチの有用性を検討するた② LDT 化学と遺伝子工学を融合した新しい細胞内めに、FKBP12 のさまざまな部位のアミノ酸を Cys蛋白質ラベリング法の開発に置換することにした。具体的には、FKBP12 と SLF	  本研究では、LDT 化学と遺伝子工学（部位特異的リガンドの複合体の結晶構造（PDB code: 1FKG）をアミノ酸変異法）を融合することで、より汎用的か基に、リガンド結合ポケット周辺の Lys48、Glu55、つ高速・高効率な細胞内蛋白質ラベリング法の開発Tyr83、Thr86、Gly87、His88、Gly90、Ile91、およびを目指した。まず、この背景となる実験結果についこれらよりも離れた位置にあるアミノ酸を含め、計て説明する。

30 種類の変異体を作成した。pH 8.0 のバッファー水	  我々は以前に、FKBP12 に対するラベル化剤とし溶液中、それぞれの変異体と 3（いずれも 15 µM）て化合物 3（図@）を設計・合成した。3 は、リガンを混合し、37℃でラベル化反応を行った。ゲル電気ドとトシル基間のスペーサーとしてエチレンジアミ泳動と in-gel 蛍光検出によるラベル化の評価を行い、ンを持ち、それ以外の部分は上記のラベル化剤 1 と天然型 FKBP12 に対するそれぞれの変異体の相対的ほぼ同一である。まず、3 を用いた天然 FKBP12 のなラベル化効率を比較検討した。その結果、ほとんラベル化を評価した（以下、全て in vitro 系での実験）。

どの変異体は天然型と同程度もしくはそれよりも低pH 8.0 のバッファー水溶液中、FKBP12 と 3（いずれいラベル化効率しか示さなかった。一方、Thr86 をも 15 µM）を混合し、37℃でラベル化反応を行った。

Cys に置換した FKBP12 だけは天然型よりも顕著にMALDI-TOF-MS による解析を行った結果、FKBP12高いラベル化効率を示すことが明らかとなった。そのラベル化が経時的に進行し、反応 24 時間後にはおこで、MALDI-TOF-MS を用いてより定量的な解析をよそ 20%の収率でラベル化 FKBP12 が得られること行ったところ、T86C 変異体は天然型よりもおよそ 6が確認された。このラベル化収率は、FKBP12 を 1倍大きなラベル化反応初速度を示し、反応 12 時間後でラベル化したとき（①参照）と比べて顕著に低い。

のラベル化収率は 80%（天然型の 4 倍）にも及ぶことが明らかとなった。すなわち、MeO
MeO

H
N

O
O

NO

OO変異導入部位の最適化が必要

O

O

O
S

N
H

OO

OOCys 変異導入を融合するといHO2C

OOうアプローチによってたしか3OFig. 4 Structure of LDT reagent 3ではあるものの、LDT 化学と

OHNH	 にラベル化の効率や速度を向上させられることを実証した。現在、得られた T86C 変異型 FKBP12 と 3 との細胞内でのラベル化特性について評価する準備を進めて

press.
2.

2010, 21, 766–776.

いる。
3.
4.

Y. Takaoka, Y. Sun, S. Tsukiji, I. Hamachi, Chem.
Sci., 2011, 2, 511–520.

実用的かつ革新的な細胞内蛋白質ラベリング・エンジニアリングツールとして発展させることを目的とS. Tsukiji, M. Miyagawa, Y. Takaoka, T. Tamura, I.
Hamachi, Nat. Chem. Biol., 2009, 5, 341–343.

考察	 	  本研究では、申請者オリジナルの LDT 化学をよりM. J. Hinner, K. Johnsson, Curr. Opin. Biotechnol.,5.

S. Tsukiji, H. Wang, M. Miyagawa, T. Tamura, Y.

した。プロジェクト①では、LDT 化学を用いて細胞Takaoka, I. Hamachi, J. Am. Chem. Soc., 2009, 131,内在性の蛋白質（FKBP12）に小分子蛍光色素をラベ9046–9054.

ル化し、その蛍光ラベル化内在性蛋白質と他の蛋白6.

Soc., 2012, 134, 2216–2226.

質（FRB-mCherry）との相互作用を生細胞内でそのまま蛍光 FRET イメージングにより可視化することT. Tamura, S. Tsukiji, I. Hamachi, J. Am. Chem.

7.

A. Fegan, B. White, J. C. T. Carlson, C. R. Wagner,Chem. Rev., 2010, 110, 3315–3336.

に成功した。この成果は、LDT 化学が内在性蛋白質の live-cell 蛍光イメージングに適用できることを実証したものであり、今後、さまざまな内在性蛋白質研究の発表	 の機能解析への道が開かれたことになる。また、プ

口頭発表ロジェクト②では、LDT 化学と遺伝子工学（標的蛋1.

築地真也「リガンド分子細工による新しいケミ白質への Cys 変異導入）を融合することで、より汎カルバイオロジー方法論の開拓」（若い世代の特用的かつ高速・高効率な細胞内蛋白質ラベリング法別講演会）、日本化学会第 93 春季年会、2013 年の開発を目指した。多くの変異体（FKBP12）を試し3 月 23 日、立命館大学た結果、単に Cys を導入するだけではラベル化の高2.

築地真也「細胞システムを解析・制御する新し効率化が実現できるわけではなく、その導入部位もいリガンド分子テクノロジー」、九州工業大学第適切に選ばなければならないということが明らかと29 回歯工学連携講演会、2014 年 5 月 9 日、九州なった。一方、Cys の導入部位さえ適切であれば、工業大学同一のラベル化剤で天然型よりも高効率かつ高速なラベル化が達成できることを実証した。したがって、

誌上発表LDT 化学と遺伝子工学を融合したアプローチは、1.

T. Tamura, Y. Kioi, T. Miki, S. Tsukiji, I. Hamachi:LDT 化学の有用性と適用範囲を確実に拡張するものFluorophorelabelingofnativeFKBP12byである。今後更なる発展が期待される。

ligand-directed tosyl chemistry allows detection ofits molecular interactions in vitro and in living cells,

参考文献	 1.

S. Tsukiji, I. Hamachi, Curr. Opin. Chem. Biol. inJ. Am. Chem. Soc., 135, 6782–6785, 2013.