昆虫の概「倍」日リズムの形成要因：概日時計の観点から
Roles of the circadian clock in driving circa’bi’dian rhythm in an insect（（公社）日本動物学会推薦）

代表研究者 大阪大学

志賀向子

Osaka University

Sakiko SHIGA

The large black chafer Holotrichia parallela exhibits ~48-h circa'bi'dian rhythm. Although circabidian rhythm isthought to involve the circadian clock, there is no molecular evidence. Because there are no two-day cycles in geophysicalenvironments, nothing is known about ultimate factors for the circabidian rhythm. To discuss the proximate and ultimate
factors of the circabidian rhythm we first examined circadian clock genes expressed in the head or brain with its oscillation
period, then compared life history traits, especially on feeding and reproduction between species exhibiting the circabidianrhythm including H. parallela and Holotrichia species exhibiting the circadian rhythm. We found mRNA abundance ofcircadian clock genes shows daily rhythm in the head and brain. When feeding with certain plant leaves, H. parallela ate
and laid eggs more than one Holotrichia species with the circadian rhythm. Species exhibiting the circabidian rhythm
have a distinct external form of a female reproductive organ compared with those exhibiting circadian rhythm. Theseresults suggest H. parallela have the circadian clock in the brain, supporting an idea that circadian clock is involved in
the circabidian rhythm. H. parallela may have efficient digestive system to eat a large amount of food at one time tocompromise less eating chance.

研究目的

オクロコガネの概日時計遺伝子の発現周期を明らか

概日時計により駆動される概日リズム（約 24 時間にし、オオクロコガネに 24 時間周期の概日時計が存周期の内因性リズム）は、生物の環境周期との調和在するか、そして、概日時計遺伝子の二サイクルでや、社会的同調に重要な性質であり、生物に普遍的概倍日リズムが形成されるという仮説について考察に存在すると言われている。一方、概日リズムの二する。さらに、２）概倍日リズムを持つ種と概日リ倍の周期で活動する動物もいる。私たちはこれまでズムを持つ種の間で繁殖に関わる形質を比較し、概に、潜土性のオオクロコガネ（昆虫綱コウチュウ目

倍日リズムの究極要因を探るヒントを得る。

コガネムシ科クロコガネ属）が野外でほぼ二日に一度夜に活動し、実験室の恒暗条件においても約 48 時

研究経過間の周期で地上に出現する概「倍」日リズムを持つ

１）オオクロコガネの頭部および脳における概日時ことを報告した（Kawasaki et al., 2017）。二日と言う計遺伝子発現リズムの解析

地球物理学的な環境周期は見当たらず、このリズム野外から採集したオオクロコガネオス成虫を実験の究極要因は謎である。また、光パルスに対する行室の 25℃明暗周期（12 時間明期：12 時間暗期ｘ2 サ

動リズムの位相反応から、概倍日リズムは概日時計イクル）で飼育し、明暗周期（2 サイクル：出現日 1により構成されると考えられたが（Kawasaki et al.,サイクル＋非出現日 1 サイクル）および恒暗条件（482017）、直接の証拠はなく至近要因も不明である。

時間暗期：出現日 1 サイクル＋非出現日 1 サイクル）

そこで本研究は、概倍日リズムの至近要因と究極で 4 時間毎に頭部全体の時計遺伝子（period, clock,要因を探るため、以下の 2 点を目的とする。１）オcryptochrome2）の相対発現量を Quantitative real-timereverse transcriptase-PCR（q-rtPCR）により調べた。その結果、これら 3 つの遺伝子の相対発現量は、オオクロコガネが出現する日（出現日）、出現しない日（非出現日）に関わらず明暗周期で弱い日周性がみられた。一方、恒暗条件ではリズムは見られなかった。
これらのサンプルでは、相対発現量を求めるために用いたコントロール遺伝子のmRNA 量に測定時間によるばらつきが見られたので、次に RNA-sequencingを用いて脳内の時計遺伝子mRNA 量を調べることにした。
オオクロコガネオス成虫の野外採集個体を 25℃明Figure 1. Images of a cherry leaf before (upper) and after(lower) eaten. Images were scanned to measure the area.

暗周期で飼育し、6 時間毎に脳の RNA 抽出を行い、96 時間分 16 サンプルについて RNA-sequencing を行

きに、オオクロコガネはマルオクロコガネより有意った。その結果、93 億リード配列をアセンブルし約に摂食量が多かったが(Tukey-Kramer test, P<0.05)、他54 万のコンティグ配列を得た。その中から、9 種類の種間比較では有意な差は見られなかった (Tukey-の時計遺伝子の候補配列を得た。各時計遺伝子のKramer test, P>0.05)。また、クローバーを与えたときTPM (transcripts per million) 値を調べた結果、TPM 値

は種の間で摂食量に有意な差は見られなかった。餌に 24 時間あるいは 48 時間の周期性がみられるもの、を限定すると、概倍日リズムを持つオオクロコガネ

周期性が見られないものに分類された。今後、q-は、１回の摂食で概日リズムを持つマルオクロコガ

rtPCR を用いて明暗周期、恒暗条件での脳におけるネの２日分以上食べていることがわかった。また、

時計遺伝子の相対発現量を調べるとともに、これら

サクラ、クローバーいずれを与えた場合でもメスの時計遺伝子の RNA 干渉を実施し、概倍日リズムに対摂食量がオスよりも多かった。

する影響を調べる予定である。

次に産卵数を比較した。種（4 種）と餌（サクラ、２）概倍日リズムを持つ種と概日リズムを持つ種にクローバー）の二要因で分散分析を行った結果、種おける摂食量、産卵数、メス生殖器形態の比較と餌の間に交互効果が見られた（Two way ANOVA, P

概倍日リズムを持つ種は、概日リズムを持つ種に＜0.05）。そこで餌ごとに産卵数を比較したところ、比べ二日あたりの活動時間が短くなる分、効率的なクローバーを与えた際は産卵数の種による違いは見摂食・繁殖方法を持つという仮説を立て、これらのられなかったが、サクラではオオクロコガネの産卵形質を比較した。準自然条件（自然日長・室温）で、数は他種より有意に大きかった（Tukey-Kramer test ,野外から採集した概倍日リズムを持つオオクロコガ

P<0.05）。

ネとコクロコガネ、概日リズムを持つマルオクロコ

さらに、メスの内部生殖器官の形態を 4 種で比較

ガネとクロコガネ 4 種を個別飼育し、餌としてサクした。これまでに Holotrichia 属と同じコガネ科のケ

ラ Cerasus yedoensis あるいはクローバーTrifolium

ブカアカチャコガネ Dasylepida ishigakiensis におい

repens の葉を二日ごと与えた。摂食前と摂食後の葉て交尾嚢（bursa copulatrix）、受精嚢（spermatheca）、をスキャンして面積差分を求め（Figure 1）、これを受精嚢腺（spermathecal gland）の形態が調べられてい体長ｘ前胸背板の幅で補正したものを food intake

る（Harano et al. 2012）。交尾嚢は交尾時に雄から受index (FII)として計算し、摂食量とした。

け取る精子以外のオス由来物質を貯蔵、分解、吸収摂食量（FII）について種（オオクロコガネ、コクする器官、 受精嚢は精子の貯蔵、受精嚢腺はオス由

ロコガネ、マルオクロコガネ、クロコガネ）、性（オ来物質を分解する酵素を分泌する器官として知られス、メス）、餌（サクラ、クローバー）の 3 要因で分ている。オオクロコガネ、コクロコガネ、マルオク散分析を行った結果、これら 3 要因はすべて摂食量

ロコガネ、クロコガネにおいても、形態学的特徴かに影響を与え、種と餌、餌と性で交互作用がみられ

らこれら 3 つの器官を分類し（Figure 2）、外部形態た（Three way ANOVA, P＜0.05）。サクラを与えたととパラフィン切片を作製し内部構造を調べた。

野外採集個体の受精嚢内部には細い繊維状のものれない。

が存在していたが、未交尾のオオクロコガネではこれは観察されなかったことから、受精嚢は考察

Holotrichia 属においても精子の貯蔵器官であると考

概倍日リズムの存在は古くから知られており、ヒえられる。受精嚢腺の管はヘマトキシリンで強染さトが環境からの時間信号のない部屋で長期間隔離される細胞からなり、内部にはエオシンで染まる物質れると、その睡眠周期が二日になる（Aschoff et al.

で満たされていた。

1967; Homma and Homma 1988）、蚊においても、長期間の恒常条件で概日リズムが概倍日リズムに変わると報告されている（Clopton 1984）。これらのリズムはいずれも通常の 24 時間周期の明暗条件では起こらず、恒常条件下で体内の複数の概日時計が互いに同調しない「内的脱同調」を起こすことが原因だと考えられている。
オオクロコガネの概倍日リズムは、野外を含めた24 時間の明暗周期２サイクルごとに同調して観察されること（Kawasaki et al. 2017）、メスのフェロモン腺も二日周期で発達を繰り返すことから（Leal et al.

Figure 2

Schematic illustration of adult female

reproductive tracts of Holotrichia species.
交尾嚢は先端と基部で外部形態、内部構造ともに違いが見られ、先端部で嚢胞を作っており、中央部から基部にかけて内部にはひだ構造が観察された。
これら 3 つの器官を 4 種で比較したところ、受精嚢と 受精嚢腺には種による違いは見られなかった。一方、交尾嚢の外部形態に違いが見ら、概日リズムを持つマルオクロコガネとクロコガネでは交尾嚢の管部分の中央部と基部の太さに差がないのに対し、概倍日リズムを示すオオクロコガネとコクロコガネでは交尾嚢の基部が中央部よりも細くなっていた。
交尾嚢基部の太さは何を意味しているのだろうか？松本（2010）はクロコガネ属の交尾行動と交尾器形態の観察から、交尾時にメス交尾嚢の基部にオスの外部生殖器が位置すると記述している。そこで、オオクロコガネ交尾時のオスの外部生殖器のメス体内の位置を調べた。交尾時にメスとオスの腹部末端が接続している状態でオスの腹部末端をハサミで切り取り、メスを酢酸エチルで殺し、メスの腹部を丁寧に解剖した。3 ペアの観察を行った結果、オスの生殖器（temones）は、2 個体では交尾嚢と輸卵管が開口している広い領域にあったが、１個体では交尾嚢の基部に位置していた。このことから、オオクロコガネでは交尾嚢基部の細い管に temones がうまくはまり込み効率的な交尾が可能となっているのかもし1993）、この概倍日リズムは野外で機能する周期現象であり、そのしくみや生態学的意義は興味深い。本
研究により、オオクロコガネの脳にも 24 時間周期で発現量の増減が見られる概日時計遺伝子が存在することがわかった。これより、概倍日リズムを示すオオクロコガネにも概日時計が存在すると考えられる。
そして、オオクロコガネの概倍日リズムは、概日時計と二日を数えるカウンター機構により成立するのではないか。このようなリズムの形成機構は、概日リズム、概潮汐リズム、概年リズムといった時計の周期と行動や生理現象のリズムの周期が一致するメカニズムとは大きく異なる。今後、概日時計遺伝子を用いてどのように二日リズムを形成するか探りたい。
概倍日リズムの究極要因を探るヒントを得るため、繁殖に関わる形質として摂食量、産卵数、メス内部生殖器を、概倍日リズム、概日リズムを示す種で比較した。その結果、概倍日リズムをもつオオクロコガネとコクロコガネに共通してメスの交尾嚢の基部が細くなっており、交尾時ここに雄の棒状骨片が位置する 1 例が観察された。松本（2010）によると、
オオクロコガネメスの交尾嚢の入り口付近で棒状骨片の先端が届き、骨片内の内嚢が反転し交尾嚢の導管に達すること、そして、この構造は交尾時に雄が雌と生殖器のみで結合し反り返るような姿勢を取ることから、ぶら下がったままメスの交尾器から抜け落ちにくくする構造を作り上げている可能性がある（松本, 2010）。このような構造が概倍日リズムを持

appearance and disappearance in association with a

つ種に共通して観察された。この形質は単に系統学

bright light pulse. Experientia 44:981–983.

的な制約である可能性もあるが、何らかの形で交尾6.

効率と関連しているのかもしれない。

dian flight rhythms: a twooscillator model. Journal of

本研究により、サクラを餌とした場合、オオクロコガネの摂食量がマルオクロコガネよりも大きく、

Clopton JR (1984) Mosquito circadian and circa-biComparative Physiology A 155:1-12.

7.

Leal WS, Sawada M, Matsuyama S, Kuwahara Y,

また産卵数も大きいことがわかった。一般には、出Hasegawa M (1993) Unusual periodicity of sex

現日が減ると摂食や交尾の機会が減り不利であると

pheromone production in the large black chafer

考えられる。しかし、オオクロコガネに限って考え

Holotrichia parallela. Journal of Chemical Ecology

れば、2 日に一度の出現で十分量を摂食し、産卵する

19: 1381-1391.

ことがわかった。これらより、オオクロコガネは摂食機会の低減をカバーするだけの摂食量と繁殖方法を獲得することにより二日リズムでも問題なくやっ研究の発表ていけるのではないか。

口頭発表
8.

澤田功司, 志賀向子「オオクロコガネとマルオク
ロコガネにおける摂食と生殖の比較」第 64 回日

参考文献
1.

Kawasaki Y, Nishimura H, Shiga S (2017) Plausible

9.

渡邊耕平, 志賀向子「オオクロコガネの概倍日リlink between circa'bi'dian activity rhythms andズムに関わる脳領域の解析」第 27 回日本時間circadian clock systems in the large black chafer

生物学会学術大会（2020 年 9 月）

Holotrichia parallela. Journal of Experimental
2.

本応用動物昆虫学会（2019 年 3 月）

10. Kohei Watanabe, Sakiko Shiga「Analysis of brain

Biology, 220(21): 4024 – 4034.

regions involved in circa'bi'dian rhythm in the large

Harano K, Tokuda M, Kotaki T, Yukuhiro F, Tanaka S,

black chafer Holotrichia parallela」日本比較生理生

Fujiwara-Tsujii N, Yasui H, Wakamura S, Nagayama

化学会 第 42 回山形大会（2020 年 11 月）

A, Hokama Y, Arakaki N. (2012) The significance of3.
4.

multiple mating and male substance transferred to誌上発表

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