DNA 二重鎖切断の修復過程において R-loop 構造を保護する機構の解明
The mechanism protecting R-loops during DNA double-strand break repair（日本分子生物学会推薦）

代表研究者 東京大学

安原崇哲

協同研究者 マサチューセッツ総合病院 Lee ZOU
群馬大学

柴田淳史

The University of Tokyo

Takaaki YASUHARA

Massachusetts General Hospital

Lee ZOU

Gunma University

Atsushi SHIBATA

R-loops, consisting of ssDNA and DNA-RNA hybrids, are potentially vulnerable unless they are appropriatelyprocessed. Recent evidence suggests that R-loops can form in the proximity of DNA double-strand breaks (DSBs) withintranscriptionally active regions. Yet, how the vulnerability of R-loops is overcome during DSB repair remains unclear.
Here, we identify RAP80 as a factor suppressing the vulnerability of ssDNA in R-loops and chromosome translocations
and deletions during DSB repair. Mechanistically, RAP80 prevents unscheduled nucleolytic processing of ssDNA in Rloops by CtIP. This mechanism promotes efficient DSB repair via transcription-associated end-joining dependent on
BRCA1, Polθ, and LIG1/3. Thus, RAP80 suppresses the vulnerability of R-loops during DSB repair, thereby precluding
genomic abnormalities in a critical component of the genome caused by deleterious R-loop processing.

研究目的

見した 6。さらにこの R-loop 構造の処理を起点としDNA 損傷は日々我々のゲノムを脅かしており、損て転写共役型相同組換え修復という未だ知られてい傷の中でも特に DNA 二重鎖切断は重篤なゲノム異なかった修復経路が誘導されることを明らかにした。

常を誘導するため、正確に修復する必要がある。ヒ

これらの修復経路が機能しない場合には重篤なゲノト細胞において DNA 二重鎖切断は、主に非相同末ム異常が発生することも判明した。

端結合と相同組換え修復機構の 2 つで修復されるが、一般に、R-loop 構造の一重鎖 DNA 領域はヌクレ

それらの間の経路選択は長年の議論の的となっていアーゼによる切断の標的となることから、R-loop 構る。経路選択は周辺クロマチンの状況に依存すると造はゲノム不安定性の原因となると考えられている

考えられてきたが、近年では、RNA が相同組換え修7復を推進することなどが明らかとなり 1、二重鎖切断

相同組換え修復においては、R-loop 構造の一重鎖周辺の RNA 転写の活性化度合いが経路選択に影響DNA 領域は何らかの機構によってヌクレアーゼにする可能性が議論されてきた 2。最近では、二重鎖切よる切断から保護されていることが示唆された。

。しかしながら、この度我々の発見した転写共役型断周辺に RNA と DNA のハイブリッド二重鎖構造が

当申請研究においては、それらがどのような分子できること、さらにはそれらが DNA 修復機構に影メカニズムによって保護されているのかを解明し、響を与えることが明らかになりつつある 3-5。申請者

DSB 修復中に R-loop 構造がさらなるゲノム不安定

らは最近、RNA 転写活性化領域において DNA 二重性の原因となることを防ぐメカニズムを解明するこ鎖切断（DSB）が発生した際に、R-loop 構造、すなとを目的とした。RNA 転写活性化領域は我々の広大

わち、DNA/RNA ハイブリッド二重鎖と、一重鎖 DNAなゲノム内で最も重要な部位であるため、そのようからなる構造の蓄積と、その解消が起こることを発な領域におけるゲノム異常の発生を抑制する機構の解明は非常に重要であると考えられる。これらの機

加を、PCR とその後のシークエンスで検出し、RAP80構を解明することで、がんなどに頻繁に見られるよの欠損によって欠失サイズが増加するかを検証した

うなゲノム異常がどのように発生するかについての、ところ、RAP80 の発現を低下させた細胞では有意に根源的なメカニズムの解明につながると考えられた。

欠失サイズが増加することが判明した。
次に、遺伝子融合頻度測定するため、G1 期の細胞研究経過
R-loop 構造の一重鎖 DNA 領域はヌクレアーゼにに放射線を照射して DSB を誘導し、その後の遺伝子融合頻度を M 期細胞の dicentric を指標に検出する系

よる切断の標的となりうることから、ゲノム不安定

13性の原因となると考えられていたが、我々の発見しRAP80 欠損細胞株では遺伝子融合の頻度が有意に増た DSB 修復メカニズムにおいては、R-loop 構造の一加していることが判明した。

を用いて RAP80 の影響を解析した。その結果、重鎖 DNA 領域は相同組換え修復の過程で機能的に過去の研究で、RAP80 を欠損させると、ヌクレア利用されており、切断されずに残存していることがーゼ活性化因子 CtIP が DSB 部位に過剰に蓄積する示唆された。このことは、DSB 後に生じた R-loop 構ことが報告されており 14、さらに、R-loop 構造の一造中の一重鎖 DNA 領域は何らかの機構によってヌ重鎖 DNA は不安定で、ヌクレアーゼによって切断クレアーゼによる切断から保護されていることを示を受けやすいことから、RAP80 欠損細胞では R-loop唆する。そこで、当申請研究においては、DSB 後に構造内の一重鎖 DNA 部位が不安定化している、つ発生した R-loop 構造がどのような機構によって保護まり、RAP80 を介した R-loop 構造内の一重鎖 DNAされているのかを、１）レーザーを使用した R-loop部位を保護するメカニズムが DSB 修復中に発生し構造の可視化システム、２）DSB 修復効率、ゲノムうるゲノム異常を抑制しているという仮説を立てた。

不安定性の解析アッセイ、を通じて解明し、DSB 修

この仮説を検証するため、独自のレーザー照射系

復中に R-loop 構造がさらなるゲノム不安定性の原因15となることを防ぐメカニズムを解明することを目的

RNA ハイブリッドを検出するインジケーターを用として研究を進めた。

いて、DSB 誘導後の DNA-RNA ハイブリッドの挙動を用いた R-loop 構造の解析を行った。まず、DNA-申請者は、細胞生物学的な手法とは別のアプローを解析したところ、RAP80 の発現を低下させた細胞

チ と し て が ん ゲ ノ ム デ ー タ ベ ー ス （ The Cancer

では、DNA-RNA ハイブリッドが蓄積していること

Genome Atlas; TCGA）を解析するための独自のプラが判明した。

ットフォームを継続的に開発してきた 8-11。転写共役

次に、R-loop 構造内の一重鎖 DNA 部位を可視化

型 DSB 修復に関連する新たな因子を探索するため、するために、1)一重鎖 DNA を特異的に認識する抗体

申請者が独自に開発したがんゲノムデータベース解を用いた免疫染色、2) BrdU 抗体を用いた免疫染色、析系で、ゲノム上の遺伝子領域、つまり転写活性化3)DNA ミスマッチを認識する GFP-MSH2/3 をインジ領域に発生する欠失や遺伝子融合などのゲノム異常ケーターとしたリアルタイムでの挙動追跡の 3 通りを抑制する因子をスクリーニングしたところ、の方法を用いて検証した。面白いことに、これら 3 つ

RAP80 とよばれるユビキチン鎖を認識して結合するの系によって DSB 誘導後に観察された R-loop 構造分子を同定した。

内の一重鎖 DNA の挙動はすべて、RAP80 が一重鎖上述のデータベースで、RAP80 の発現低下は、a)DNA の安定化に寄与することを示した。これらの結遺伝子領域の欠失サイズの増加、b)遺伝子融合頻度

果から、RAP80 は R-loop 構造の一重鎖 DNA 部位をの増加を誘導することが判明したことから、まず転保護し、DNA-RNA ハイブリッド鎖の解消を促進し写活性化部位における DSB 誘導後の欠失サイズのていると考えられた。

測定系を用いてそれらの結果を検証した。この実験

さらに、DSB 誘導後に DSB 末端の削り込みに関には I-Sce-I と呼ばれる制限酵素を用いてゲノム上の与するヌクレアーゼ活性化因子 CtIP の DSB へのリ特定の部位に DSB を誘導できる細胞株 12 を使用しクルートをレーザー照射系で観察したところ、過去た。この DSB 部位は CMV プロモーターによる転写の研究と同様に、RAP80 の欠損により CtIP が DSBが活発な領域に位置し、転写共役型 DSB 修復を検出部位に過剰に蓄積することが判明した。また、先にすることができる。この DSB 部位で生じる欠失の増述べた R-loop 構造内の一重鎖 DNA は、過剰に蓄積した CtIP を原因として不安定化していることが明らられ、DNA 損傷のような DNA の二重鎖構造を不安かとなった。つまり、RAP80 は CtIP の蓄積を抑制す定化する刺激があると、これらの RNA が DNA と再ることで R-loop 構造の一重鎖 DNA 部位を保護して重合することにより DNA-RNA ハイブリッドを形成いると考えられた。実際、RAP80 欠損細胞で見られする可能性が高まると考えられる。実際、我々を含た遺伝子融合の増加は、CtIP の発現を低下させるこむ複数のグループが、DNA 二重鎖切断誘導後に R-とにより観察されなくなった。すなわち、RAP80 欠loop 構造が形成されることを観察している。

損細胞におけるゲノム異常の発生は、CtIP の過剰な我々は、これらの R-loop 構造の形成が、正確な修蓄積による R-loop 構造の不安定化が原因であること復を誘導する部位を知らせるための、いわばマークが示唆された。

として機能するのではないかと考えて研究を進めて最後に、この機構が最終的にどのような DSB 修復

きた。実際、G1 期細胞、S/G2 期細胞どちらの場合にメカニズムを誘導するかについて調べた。G1 期細胞

おいても、R-loop 構造は正確な修復機構、すなわちの DSB 修復は一般的に非相同末端結合（NHEJ）に転写共役型相同組換え修復または転写共役型末端結よるとされているが、実際にその NHEJ の中にどの合のいずれかを誘導することを見出した。

程度の経路の多様性があるかは詳しく分かっていな

今回の研究で、RAP80 が R-loop 構造の保護、およい。最近、G1 期細胞に放射線を照射した後に、非常び転写共役型末端結合の誘導において重要な役割をに長い時間（16 時間から 24 時間）かかって修復さ果たしていることが明らかとなった。RAP80 を欠損れる経路は、BRCA1/CtIP などの修復因子によってすると、R-loop 構造のうち一重鎖 DNA 部位が過剰DSB 末端が削られることで修復が完了することが示に蓄積した CtIP によって不安定化し、逆に一重鎖唆された 16。この論文で用いられた系を参考に、G1DNA を失った R-loop 構造の DNA-RNA ハイブリッ期 RPE 細胞に放射線を照射し、その後の γH2AX foci

ドは、正常な解消のメカニズムが機能せず、DNA-の数を指標にして、未修復の DSB 量を定量した。そRNA ハイブリッドは蓄積してしまうと考えられた。の結果、RAP80 は G1 期細胞において、未だ知られこれらの R-loop 構造の制御異常は、転写共役型末端ていない新たな修復経路である、転写共役型末端結結合によって守られるべき領域において DSB 誘導合（TA-EJ）を開始していることが判明した。この経後の欠失サイズや、遺伝子融合頻度を増加させると路は DSB 誘導後 30 分以内に迅速に完了し、RAP80考えられることから、RAP80 を介した R-loop 構造のおよび R-loop 構造を起点として開始されていること制御は、先に解明した転写共役型相同組換え修復とが示唆された。また、この修復経路に関与する因子並んで、我々のゲノムの転写活性化部位、すなわちとして、BRCA1、CtIP、POLQ、LIG1/3 を同定し、転最も重要な部位の遺伝子情報を守っているメカニズ

写活性化部位においては、この非定型的な末端結合ムであると考えられた (Figure 1)。

を介して DSB が迅速に修復されていることが明らかとなった。転写共役型末端結合が阻害されると、
DNA-PK、Artemis による、欠失・変異を伴った DSB修復が行われることも示唆されたことから、G1 期細胞においては、RAP80 と R-loop を起点とする転写共役型末端結合によってゲノムの安定性が維持されていることが明らかとなった。
考察
ゲノムは広大であるが、どの部位に DNA 損傷が生じたかによってその修復方法を変化させる機構が存在すると考えられてきた。その一つの因子として、
DNA 損傷が生じた部位の転写の活性化度合が関与していることが示唆されてきた。転写が活性化していれば、その部位には豊富に RNA が存在すると考え

Figure 1. The Model for TA-EJ

今回の研究で R-loop 構造の保護機構、さらにその12 Ogiwara, H. et al. Oncogene 30, 2135-2146 (2011).

下流の修復経路が明らかとなったが、そもそも R-13 Yamauchi, M. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.

loop 構造がどのように形成されるのか、また RAP80416, 111-118 (2011).

が何を目印として DNA 二重鎖切断部位に誘導されるのかは未だ分かっていない。今後の研究ではそれらの分子メカニズムをさらに深く追求することで、14 Coleman, K. A. et al. J. Biol. Chem. 286, 13669-13680(2011).

転写と DNA 修復機構がいかに共役し、我々のゲノ

15 Kato, R. et al. Mol Cell Oncol 6, 1542244 (2019).

ムを守っているかを明らかにしていきたい。

16 Biehs, R. et al. Mol. Cell 65, 671-684 e675 (2017).

参考文献
1 Keskin, H. et al. Nature 515, 436-439 (2014).

研究の発表

2 Marnef, A. et al. J. Mol. Biol. 429, 1277-1288 (2017).

口頭発表

3 Ohle, C. et al. Cell 167, 1001-1013 e1007 (2016).

1.

安原崇哲

「RNA 転写と DNA 二重鎖切断修復のクロストーク」第 42 回日本分子生物学会年会

4 Cohen, S. et al. Nat. Commun. 9, 533 (2018).

福岡県

5 Lu, W.-T. et al. Nat. Commun. 9, 532 (2018).
6 Yasuhara, T. et al. Cell 175, 558-570 (2018).

誌上発表

7 Aguilera, A. et al. Mol. Cell 46, 115-124 (2012).

1.

2019 年 12 月

Yasuhara, T.*,#, Kato, R.#, Yamauchi, M., Uchihara,

8 Yasuhara, T. et al. Nat. Commun. 5, 5426 (2014).

Y., Zou, L., Miyagawa, K., and Shibata, A. RAP80

9 Sato, H. et al. Nat. Commun. 8, 1751 (2017).

recognizes RNAPII to protect vulnerable R-loops

10 Permata, T. B. M. et al. Oncogene 38, 4452-4466

during DNA double-strand break repair. bioRxiv(2019).
11 Kakoti, S. et al. Front Mol Biosci 7, 205-205 (2020).

2021.04.23.440542; doi:10.1101/2021.04.23.440542(*co-corresponding, #co-first)