倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1502

内因性リガンドを介した脳標的非ウイルス性遺伝子送達システムの創製木村誠悟

名古屋大学

学際統合物質科学研究機構

特任助教

Developing an endogenous ligand-mediated non-viralgene delivery system targeting the brain
Seigo Kimura,
Integrated Research Consortium on Chemical Sciences, Nagoya University,
Research Assistant Professor

本研究は、治療用遺伝子を脳内で発現可能な LNP の開発を目的とし、①新規 in vivo スクリーニング法の開発と、②遺伝子発現の組織選択性のメカニズム解析を行った。①について、DNA バーコードによって LNP をラベルし、次世代シーケンス（NGS）で測定することで、1 匹のマウスで数百種類の LNP の体内動態を同時に測定可能な系を作成した。②について、タンパク質発現量、組織内／核内 DNA 量・mRNA 量の定量解析の結果、翻訳過程に〜250 倍の差が生じていることが示唆された。
This study aimed to develop LNPs that enable gene expression for therapeutic purposes in the brain. We
conducted（1）the development of a novel in vivo screening method and（2）the analysis of the mechanism
responsible for tissue-selectivity in gene expression. Regarding（1）, we created a system that can measure the invivo dynamics of hundreds of types of LNPs simultaneously in a single mouse by labeling the LNPs with DNA
barcodes and measuring them with NGS. Regarding（2）, the results of quantitative analysis of protein expression
levels and tissue/nuclear DNA and mRNA levels suggest that there is a difference of up to 250-fold in the translation
process.

1．研究内容ングは、大量の実験動物を必要とし、時間とコス1.1. 背景

トがかかる。さらに、治療用遺伝子を発現させる

核酸医薬・遺伝子治療は、スピンラザ ®・オンには、細胞内動態を考慮したキャリア設計が必要

パットロ ®・コラテジェン ® など、既に国内でもとなるが、送達遺伝子の発現に違いを生むメカニ承認され、難治性疾患に対する新たな治療法としズムは未解明の部分が多い。本研究では、遺伝子て期待されている。治療用核酸を、作用部位まで治療用 DDS 開発における上述した課題（①時間いかに送達するかがその薬効を左右するため、核とコストがかかるスクリーニング、②未解明の遺酸医薬・遺伝子治療は最も DDS 技術を必要とす

伝子発現機構）を解決するため、オンパットロ ®

る分野の一つである。肝臓を標的とした DDS 開や COVID-19 の mRNA ワクチンでも利用されてい発が先行しているが、今後は、他の臓器への応用る LNP を対象に研究を行った。また、標的臓器はが課題であり、多くの研究グループが研究開発で開発が渇望されているが標的化が困難である脳を鎬を削っている。しかし、DDS 開発のスクリーニ選択した。

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1.2. 新規スクリーニング法による LNP の in vivo
機能解析

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匹のマウスを使用する従来の試験法では、大量の実験動物、時間・コストがかかる。そこで、DNAこれまでの研究から、標的化リガンドを用いずバーコードと次世代シーケンス（NGS）を用いて、とも、LNP の脂質組成を変えることで組織選択性

in vivo スクリーニングのハイスループット化を試が大きく変化することが分かっている（Kimura

みた（図 1）。DNA バーコードで各 LNP を標識し、S et al, J Control Release. 2021, Kimura S et al, JNGS を用いて体内動態を解析する手法は、1 匹のcontrol Release. 2023, S.T. LoPresti et al, J Control

実験動物で同時に 300 種類以上もの LNP を試験でRelease. 2022, Q. Cheng et al, Nat Nanotechnol.

きる（JE Dahlman et al, PNAS. 2017）。本研究で2020）。これは、LNP が生体に投与された際に、は、バーコード配列を RNA として発現させるこLNP 表面に吸着する内因性物質による影響だと考とで、組織移行性と同時に転写までの遺伝子発現えられる。実際、LNP 製剤のオンパットロ ® はを追うことが可能な、転写型 pDNA バーコードをApoE という内因性タンパク質が粒子表面に吸着設計した（図 2）。脂質組成の異なる 30 種類のすることで肝実質細胞に効率的に取り込まれる

LNP について、動的光散乱法を用いて（ゼータサ（Akinc et al, Mol Ther. 2010）。現在、脳移行性のイザー）、各 LNP の物性（粒子径、多分散指数、内因性リガンドについてはよく知られていないが、ゼータ電位）と、30 種類の LNP を混合した LNP

LNP 表面の化学構造や物性を変化させることで、プールの粒度分布を測定した（図 3）。良好な自己表面に結合する内因性リガンドを制御できると考相関曲線と単一ピークの粒度分布が確認され、えられる。本研究では、脂質ライブラリーを用いプールされた LNP は安定であることが示唆されたて作成した多様な表面物性を持つ LNP の中から、（図 3B, C）。また、FRET を用いた検証実験で、血中で内因性リガンドと吸着し脳内へ移行する

LNP 同士の融合は生じていないことを確認した

LNP の探索を試みた。しかし、1 種類の LNP に 1（data not shown）。pDNA バーコード法を用いて、

図 1．DNA バーコードによる LNP の in vivo スクリーニング

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図 2．転写型 pDNA バーコード

1.3. 組織選択的な遺伝子発現機構の解析
図 5 のように、全身投与された薬物は、組織移行、細胞内移行、オルガネラ移行の 3 つの障壁をクリアする必要があり、その各過程で非特異的な分布や分解が起こりえる。さらに、pDNA による遺伝子導入の場合、核移行後に、転写・翻訳の過程が存在する。1.2. の結果から、送達遺伝子の発現量の差は、組織・細胞内移行後、特に翻訳過程で大きな差が生じていることが示唆された。そこで、より詳細な解析を行うため、発現の組織選択性が異なる 2 種類の LNP（図 6）について、組織内タンパク質発現量、組織内・核内 pDNA 量・mRNA 量を定量することで、細胞内移行から翻訳までの各過程の効率を比較した（図 7）。その結果、遺伝子発現における組織間及び LNP 間の差は、翻訳過程に〜250 倍の差が生じていることが図 3．各 LNP の物性（粒子径、PDI、ゼータ電位）（A）と LNP プールの自己相関曲線（B）及び粒度分布（C）、（ゼータサイザーによる測定）示唆された。LNP 導入による細胞の状態（エンドサイトーシス機構、代謝等）の変化が翻訳効率、タンパク質発現量に影響しているという仮説の基、発現細胞種についてトランスクリプトーム解析を

30 種類の LNP について、各組織中の pDNA 移行行った結果、RNA プロセシングやリボソーム生合量、RNA 発現量を測定し、さらに、発光タンパク成といった転写・翻訳に関わるパスウェイが遺伝質であるルシフェラーゼをレポーターとして、タ子送達効率の高い細胞で有意に変動していた。

ンパク質発現量を測定した。各組織（肝臓、肺、脾臓、心臓、腎臓、脳）における pDNA 量、RNA1.4. まとめと展望量、タンパク質量をそれぞれプロットした結果、

本研究では、LNP を用いた遺伝子送達におけるタンパク質発現量に 10〜100 倍の差があるにも関新たな in vivo スクリーニング系の開発と、遺伝子わらず、pDNA 量・RNA 量に大きな差は見られな発現機構の解析を行った。現時点で、脳へ効率的かった（図 4、表 1）。に（投与量の 1％以上）送達可能な LNP は見出されていないが、本スクリーニング系を用いた解析から、移行と発現の組織選択性に関して、pDNA

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図 4．30 種類の LNP デリバリーの各組織（肝臓、肺、脾臓、心臓、腎臓、脳）における pDNA 移行量、RNA 発現量、タンパク質発現量の関係。各プロットはそれぞれの LNP の値（平均値、N＝3）を示し、用いたイオン化脂質によって色分けしてある（青：F6、オレンジ：H6、グレー：DODAP）。pDNA 量（DNA（arb. unit））、RNA量（RNA（arb. unit））、タンパク質量（Luciferase activity）をそれぞれの組み合わせで 2 軸プロットした。

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表 1．各組織における pDNA 量、RNA 量、タンパク質量の相関性
TissueRNA-DNA

Protein-RNA

Protein-DNA

Liver

R2 CL4F6: 0.0018
R2 CL4H6: 0.3119
R2 DODAP: 0.7737

R2 CL4F6: 0.044
R2 CL4H6: 0.348
R2 DODAP: 0.0203

R2 CL4F6: 0.0712
R2 CL4H6: 0.0379
R2 DODAP: 0.0002

Lung

R2 CL4F6: 0.1536
R2 CL4H6: 0.0241
R2 DODAP: 0.0009

R2 CL4F6: 0.238
R2 CL4H6: 0.0023
R2 DODAP: 0.2458

R2 CL4F6: 0.2382
R2 CL4H6: 0.0103
R2 DODAP: 0.0235

SpleenR2 CL4F6: 0.0047
R2 CL4H6: 0.8062
R2 DODAP: 0.5521

R2 CL4F6: 0.3055
R2 CL4H6: 0.001
R2 DODAP: 0.4145

R2 CL4F6: 0.0652
R2 CL4H6: 0.00001
R2 DODAP: 0.096

Heart

R2 CL4F6: 0.0372
R2 CL4H6: 0.1265
R2 DODAP: 0.5517

R2 CL4F6: 0.3419
R2 CL4H6: 0.0723
R2 DODAP: 0.3692

R2 CL4F6: 0.0976
R2 CL4H6: 0.1739
R2 DODAP: 0.0249

KidneyR2 CL4F6: 0.0059
R2 CL4H6: 0.0052
R2 DODAP: 0.6157

R2 CL4F6: 0.000002
R2 CL4H6: 0.0046
R2 DODAP: 0.0413

R2 CL4F6: 0.0112
R2 CL4H6: 0.0445
R2 DODAP: 0.0731

Brain

R2 CL4F6: 0.0043
R2 CL4H6: 0.0057
R2 DODAP: 0.1757

R2 CL4F6: 0.2975
R2 CL4H6: 0.000006
R2 DODAP: 0.4626

R2 CL4F6: 0.0567
R2 CL4H6: 0.5361
R2 DODAP: 0.0455* 図 4 の各グラフから R 二乗値（R2）を計算した。

図 5．薬物送達プロセスのフレームワーク（模式図）

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図 6．ルシフェラーゼをコードした pDNA 封入 LNP（DOPE-LNP、DOPC-LNP）の体内分布（蛍光）とレポーター活性（ルシフェラーゼ発光）の Ex vivo イメージング。LNP をマウスに尾静脈内投与し、6 時間後に各臓器を摘出後、IVIS で観察。

図 7．2 種類の LNP-pDNA 送達における、各細胞内過程（核移行、転写、核外輸送、翻訳）効率の比較

移行量、mRNA 発現量、タンパク質発現量の相関るという知見は、これまでの核移行前の過程（エが低く、特に翻訳過程に大きな差が生じている可ンドソーム脱出や核移行）に着目した DDS 設計能性が示唆された。in vivo 遺伝子送達における組に一石を投じるものである。今後は、動態解析だ織選択性の違いに、翻訳過程が大きく関わっていけでなく、キャリアが細胞にどう認識され、それ倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成が遺伝子発現に関与するどのような生物学的プロセスに影響しているのかを検証していく必要がある。

2．発表（研究成果の発表）
1. Kimura S, Khalil IA, Elewa YHA, Harashima H.
“Novel lipid combination for delivery of plasmid
DNA to immune cells in the spleen”, J Control
Release, 330: 753-764, 2021
2. Shimosakai R, Khalil IA, Kimura S, Harashima
H. “mRNA-Loaded Lipid Nanopar ticles
Targeting Immune Cells in the Spleen for Useas Cancer Vaccines”, Pharmaceuticals, 15: 1017,2022
3. Kimura S, Harashima H. “On the mechanismof tissue-selective gene deliver y by lipidnanoparticles”, J Control Release, 2023 in press
4. The 7th Annual Meeting of the Nucleic Acids
Therapeutics Society of Japan, Tokyo, Japan,“Different cellular responses to lipid-based
car riers af fect tissue/cell-selective genedelivery”, Seigo Kimura, Hideyoshi Harashima,
August 2022 *川原賞受賞
5. Liposome Research Days 2022, Vancouver,
Canada, “On the mechanism of tissue-selectivegene transfection by lipid-based carriers”, Seigo
Kimura, Hideyoshi Harashima, June 2022

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