細菌べん毛軸回転メカニズムの解明と回転阻害物質探索
Investigating rotation mechanisms of bacterial flagellar rod and developing inhibitors（日本生物物理学会推薦）

代表研究者

東京工業大学

北尾 彰朗

Tokyo Institute of Technology

Akio KITAO

協同研究者

東京工業大学

Tran Phuoc Duy

Tokyo Institute of Technology

Duy Phuoc TRAN

About half of infant deaths in the world are caused by infectious diseases, which are still a major problem indeveloping countries. If the function of the bacterial flagellum, which is responsible for bacterial motility, can beclarified, it will lead to countermeasures against infectious diseases in the future and contribute to human health.
This study aims to clarify the mechanisms by which the flagellar rod transmits torque supported by the flagellar
bushing, allowing rotation at low energy cost, and to search for compounds that inhibit the rotation of the rod withlarge molecular dynamics simulations. 40 nanosecond molecular dynamics simulations were performed from theinitial states of 140 different rotation angles of rod-hook complex. The free-energy landscape of the rotation and thetime required for the rotation were calculated by the Markov state model. As a result, it was found that the rod-hookcomplex can rotate at ~ 1900 Hz, which is consistent with the time obtained experimentally so far. We are currently
analyzing the interactions between the rod-hook complex and the LP ring that enables rotation at low energy cost.

研究目的

回転力を伝達し、スクリューであるべん毛繊維を回世界の乳幼児死亡原因の約半分はウィルスや細菌転させて細胞運動を行う。更に、走化性シグナルにが引き起こす感染症によるものであり、特に発展途

よって回転を制御し、べん毛繊維のらせん性を変化

上国では未だに大きな問題である。細菌の運動性にさせることで細胞運動を制御している。

かかわる細菌べん毛の機能が分子レベルからマクロ

構造生物学と分子シミュレーションの連携は、２レベルにいたる範囲で明らかになれば、細菌の増殖

１世紀に入って原子解像度・分子レベルでの生命現を抑え病原性に対処することに繋がる科学技術の発象解明を急速に進展させてきており、構造生物学的展が期待される。そして将来的に感染症へのより効に決定されたべん毛の部分構造に基づいて、大規模果的対策に繋がり、人類の健康に寄与する可能性がな分子シミュレーションを実行し、その機能を研究ある。細菌べん毛は多くの病原性細菌、例えば大腸することが可能になってきた。これらの細菌の運動菌やサルモネラ菌などが移動するために用いる巨大性にかかわるべん毛の機能が分子レベルからマクロな分子機械である。また 30 種類以上のタンパク質がレベルにいたる範囲で基礎科学的に明らかになるこ

3 万分子程度集合することで構築され、その長さはとが期待される。本研究では、べん毛の回転を大規10 マイクロメートルにも及ぶ。べん毛をもった細菌模な分子シミュレーションによって観察することで、には、一般によく耳にするものに限っても、上記以べん毛の軸受けが軸を保持しつつ、低エネルギー外に赤痢菌・コレラ菌・ビブリオ菌・ピロリ菌などコストで回転を許してトルク伝達と構造変化を連がある。これらの細菌は、輸送装置を用いて巨大な携するメカニズムを明らかにし、将来的に軸の回分子構造体を構築し、イオン勾配エネルギーを回転転を阻害する化合物探索を目指している。

力へと変換し、自在継手として働くフックを介して研究経過
このような研究には、大規模な分子シミュレーションの実行が必須である。そこで我々は 2020 年、と最初の平衡化には GPU を用いて研究室内の PC を用いたが、その後は「富岳」を用いて、すべてのシミュレーションを行った。

2021 年に世界最速を達成したスーパーコンピュータ「富岳」の利用を申請し、2021 年度の利用を認められた。
計算には全原子モデルに基づいた分子動力学シミュレーション（MD）を用いた。計算対象としたタン
パク質複合体は、細菌べん毛の軸に当たるロッドと軸受け（ベアリング）に当たる LP リングなどからなる。これらの巨大な複合体の立体構造は山口らによっ て 近 年 解 明 さ れ た [T. Yamaguchi et al., Nat.
Commun. (2021)]。ロッドは、タンパク質 FliG とタン
パク質 FliF からなるらせん構造体であり、11 本の素繊維がらせん状に束になった構造をしている。この計算では、FliG の 24 量体と FliF の 5 量体でロッドを形成した。ロッドの外側には、スクリューに当たる細菌べん毛繊維とロッドをつなぎ、トルクを様々な方向に伝達する自在継手であるフックがある。しかしべん毛繊維を計算に加えると計算量が膨大になるので、本計算ではフックタンパク質 FliE の 22 量体をモデルに含めたロッド・フック複合体が低エネルギーコストで回転するメカニズムを調べることにした。また LP リングはタンパク質 FlgH の 26 量体からなる L リングと、タンパク質 FlgI の 26 量体からなる P リングが上下に積み重なった構造体である。
この 26 回の回転対称性により、360 度/26＝約 13.8度が回転の基本単位となる。そこで回転による自由エネルギー変化を約 13.8 度の範囲で調べることにした。これらのロッド・フックと LP リングは合計約 44万原子からなる (Fig. 1)。
これをさらに周期境界条件の下で直方体型の箱の中に水分子と約 0.14M の NaCl からなる水溶液の中に配置したところ、初期状態で箱のサイズは 293 ×293 × 383 Å3 となり原子数はおよそ 293 万原子となった。実際の細菌において LP リングはペプチドグリカン層に固定されていると考えられている。しかし、LP リングとペプチドグリカン層の相互作用はどのようになっているのか十分解明されていないので、
LP リングのうちペプチドグリカン層と相互作用していると考えられるアミノ酸残基に弱い位置拘束力を加えることで LP リングの動きを抑制することにした。タンパク質の分子力場には Amber ff14SB、水分子には SPC/Eb モデルを用いた。初期構造の生成

Fig. 1. Overview of the LP-ring and the rod/hookcomplex. The rod region: FliG (red), FliF (orange). Hook:FliE (yellow), L-ring: FlgH (blue), P-ring: FlgI (green).
Solvent molecules included in the simulation were notshown for better visuality.
当初の予定では、まず平衡化の後、Parallel cascade
selection molecular dynamics （ PaCS-MD ） 法 [R.
Harada, and A. Kitao, J. Chem. Phys. (2013)]を用いて、ロッド・フック複合体を LP リングの内部で回転させる予定であった。しかし、試行計算の結果、ロッド・フック複合体の回転拡散が予想より遅いため、PaCS-MD は期待したほど計算効率がよくないことがわかった。そこで、方針を変更し、まず参照構造のロッドを 0.5 度ずつ回転させ、シミュレーション中に位置拘束力を加えることで回転させることにした。実際にこの方法を用いると 100 ピコ秒以内に 0.5度回転させられることがわかった。このことはロッド・フック複合体の回転のエネルギーコストが低いことを示している。そこで時計回り・反時計回りにそれぞれ 5 ナノ秒の MD ごとにロッドを 0.5 度回転させ、最終的に±35 度回転させた。合計の角度変化
70 度は回転単位である 13.8 度のおよそ 5 倍にあたる。これによって異なるロッドの回転角をもつ 140種類の立体構造を得た。またこれらの 140 の立体構

造を初期構造として、独立に 40 ナノ秒の MD シミ

State 1 と 2 は、既にエネルギー地形の大まかな回転ュレーションを実行し、これをマルコフ状態モデル対称性で観たようにほぼ同じような自由エネルギー（MSM）で解析した。MSM 解析にはソフトウエアの値を持っていた。MFPT として得られた反時計回

pyEMMA [M. K. Scherer et al., J. Chem. Theory Comput.

りの回転 State 2 から 3 への遷移時間は 13.3 マイク(2015)]を用い、研究室の PC で実行した。この際、26ロ秒、State 2 から 1 への遷移時間は 6.6 マイクロ秒、回の回転対称性を持つことを用い、回転 1 ステップ

State 1 から 2 へは 0.5 マイクロ秒を要し、1 ステップを 100 個の微視的状態に分割した。

当たりの時間は 21.4 ± 0.6 マイクロ秒であった。一

この結果から、ロッド・フック複合体が LP リング方、時計回りはそれぞれ 3.4, 14.1, 2.7 マイクロ秒を内で回転する際に自由エネルギーがどのように変化要し、1 ステップ当たりでは、20.3 ± 0.6 マイクロ秒するかを示すエネルギー地形を計算した (Fig. 2)。こであった。このことからも反時計回りと時計回りのこでは通常の回転方向である反時計回りをプラス軸回転に要する自由拡散はどちらの回転方向にもほぼ方向として、回転単位 2 ステップ分の地形を示して対象であることが示された。また、ロッド・フックいる。回転の自由エネルギーの障壁は回転の 1 ステ複合体が 1 回転（360 度）するには単純計算で 26 倍ップのほぼ中間にあたる 7 度付近にあり、巨大なロの 520 マイクロ秒程度要することが予測される。こッド・フック複合体が回転するにもかかわらず、障の値は 1900Hz の回転に相当する。これまでの実験

壁の高さは 3.4 kcal/mol 程度と低いことが明らかにでは、モーター固定子がない状態での回転は最大でなった。時計回り、反時計回りのそれぞれに関して、6000Hz、ピークで 1000Hz 程度と考えらえれている

完全ではないが自由エネルギー地形は回転に関してことから、今回 MSM で得られた回転速度の結果もほぼ対象であることも示された。

妥当だと考えられる。
それでは実際にべん毛の軸受け（LP リング）がどのように軸（ロッド）を保持しているのであろうか。
これについてはまだ解析中であるが、LP リングとロッドの間には直接の相互作用は少なく、ほとんどが水を介して相互作用している。このことがロッドのスムーズな回転を可能にするカギだと考えられる。

Fig. 2. Free energy landscape of the rod/hook rotation
within the LP-ring. The landscape for the two rotationalunits (±13.8°) are shown. States 1, 2 and 3 indicate theregions of three macrostates assigned to 100 microstatesin MSM analysis.
次に、回転に要する時間を求めるために、mean firstpassage time（MFPT）を計算した。そのために、100Fig. 3. A close-up view of the interface between the LP-の微視的状態を 3 つの巨視的状態（Step 1‒3）に分割

ring and rod/hook complex. Indirect water-mediatedした。Step2 は最も自由エネルギーが低く存在確率interactions mainly maintain the whole structure. Blue, redが高い状態である。従って、阻害剤を結合させるに

and cyan shows basic, acidic and polar residues,はこの状態の立体構造をターゲットとするのが最もrespectively.

適していると考えられる。またエネルギーより高いKitao, Symposium on Computer Simulations and考察

Cryo-ET/EM of Complex Biomolecular Systems, オ

このように妥当と思われる自由エネルギー地形とンライン発表, 2021/11/19.

遷移時間が得られたので、現在はこのような巨大なシステムがスムーズに回転することを可能にする分4.

蛋白質結合解離ダイナミクスの分子動画. 北尾子的なメカニズムの解明を進めている。具体的には

彰朗, 第 59 回日本生物物理学会年会シンポジウ

LP リングとその内部を貫通するロッド・フック複合

ム, 1 原子レベルの動的構造解析が拓く生体分子体の界面で、アミノ酸残基や溶媒の相互作用が回転機能の理解, 2021/11/25.

によってどのように変化するかを調べることで、低5.

柔らかな分子の複合体形成と解離. 北尾彰朗,

エネルギーコストの回転を可能にする機構を調べてシンポジウム「柔らかな分子系研究の発展」, 名いる。さらに得られた情報に基づいて、逆に軸の回

古屋工業大学, 2022/6/2.

転を阻害する最も効果的な方法を考案する。特に LP

6.

Conformational

ChangeofandBiologicalDissociation/

リングとロッドの周辺のどこが最も阻害部位としてAssociation

Macromolecules

適しているかを検討し、これに基づいて軸の回転をInvestigated by Parallel Cascade Selection Molecular阻害する化合物探索を進める。

Dynamics and Markov State Model. Akio Kitao, ABA,APPA &TBS Joint Congress, online, 2022/6/24.

研究の発表

7.

高速分子動画を補完する構造変化の自由エネル

口頭発表

ギー地形と経路・流量の解析, 北尾彰朗, -新学術1.

インシリコシミュレーションで探るタンパク質領域「高速分子動画」シンポジウム, オンライン

複合体の結合親和性とキネティックス. 北尾彰

発表、2022/11/22.

朗, 構造活性フォーラム 2021「次期スーパーコ8.

LP リング中のロッドの回転シミュレーション,北尾彰朗, 2022 年度べん⽑研究交流会, 2023/3/10.

ンピュータ「富岳」時代の計算創薬」, オンライン発表, 2021/6/4.
2.

3.

Simulated dissociation/association dynamics between

ポスター発表proteins and other molecules. Akio Kitao, TSRC

1.

細菌べん毛回転メカニズムの解明と回転阻害に

Virtual Workshop on Protein Dynamics, オンライン

よる新規抗菌物質開発. 北尾彰朗, 第９回 HPCI発表, 2021/7/13.

システム利用研究課題成果報告会, オンライン

PaCS-MD/MSM to investigate protein motions and発表, 2021/10/28.

association/dissociation of protein complexes. Akio