長期派遣援助成果報告書
University of Cambridge Centre for Brain Repair
研究指導者
近藤 亨
鹿児島大学大学院

運動機能修復学講座

整形外科学

瀬戸口啓夫
申請者は脊髄損傷治療に神経幹細胞移植を応用する手法の開発のためにケンブリッジ大学に留学した。 まず移植した神経幹細胞のアストロサイト分化を抑制する目的で骨形成因子 （Bone Morphogenetic Protein, BMP） BMPs の作用を阻害する Nogginや抑制型 Smad 等の遺伝子を神経幹細胞に強制発現させた。またこれらの細胞を脊髄損傷モデルマウスに移植して in vivo においてもアストロサイト分化抑制を図りさらに機能回復を目標とする研究を行った。Noggin を強制発現させると in vitro における神経幹細胞のアストロサイトへの分化を抑制してニューロンならびにオリゴデンドロサイトへの分化を優位に誘導することを可能にした。また移植された損傷脊髄内でも noggin
発現細胞はアストロサイトへの分化が一部抑制されニューロン、オリゴデンドロサイトへの分化誘導が行われた。さらに脊髄損傷後に noggin 発現細胞を移植すると、神経幹細胞移植による運動機能回復効果を高めることが確認された。このように細胞系譜の運命付けを制御する遺伝子を導入して細胞系譜を制御した神経幹細胞を利用することにより、幹細胞移植による再生医療の治療効果を高める可能性が示された。
これらの結果は 2004 年に Experimental Neurology 誌に掲載された。
Treatment of spinal cord injury by transplantation of fetal neural precursor cells
engineered to express BMP inhibitor
Takao Setoguchi, Kinichi Nakashima, Takumi Takizawa, Makoto Yanagisawa, WataruOchiai, Masaru Okabe, Kazunori Yone, Setsuro Komiya, Tetsuya Taga
Experimental Neurology. 2004 Sep;189:33-44.
我々は神経幹細胞移植の治療効果を高めるためには神経幹細胞の分化を制御するメカニズムのさらなる解明が必要であることを実感し研究を行った。神経幹細胞のアストロサイト分化には BMP 群の他にも様々な因子が関与していることが知られている。インターロイキン(IL)-6 ファミリーサイトカインである ciliary neurotrophic factor(CNTF)やleukemia inhibitory factor(LIF),は STAT3 のシグナルを活性化することにより神経幹細胞のアストロサイト分化を誘導することが知られている。一方で OLIG2 は Mash1 やneurogenin などと同じく basic helix-loop-helix (bHLH)ファミリーに属する転写因子である。OLIG2 は脊髄の発生においてモーターニューロンやオリゴデンドロサイトを誘導する因子として同定された。発生期の脊髄や脳では特定の領域にしか発現しない

OLIG2 が E14 マウス胎児脳から分離培養した神経幹細胞のほぼ全ての核内でOLIG2 が発現していることが報告されている。さらにこの OLIG2 を神経幹細胞にレトロウイルスベクターを用いて持続的に強制発現させるとアストロサイトの分化を抑制し得ることを報告されている。我々は OLIG2 によるアストロサイト分化抑制作用についてさらに詳細な検討を行ったところ、アストロサイトが分化する際には OLIG2 が核内から細胞質へ移行していることを見い出した。また OLIG2 の細胞質移行は PI3K-AKT のシグナルを介して CRM1 依存的に行われていることも見い出した。さらに OLIG２の核外輸送を阻害することによりアストロサイト分化抑制作用を高めることが可能であることを見出した。これらの結果を総合すると、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトの 2 つの細胞系譜は少なくとも OLIG2 という転写因子を要として相互に牽制しあっていることが示唆される。OLIG2 の核外輸送を誘導するシグナルをウイルスベクター等で制御した神経幹細胞を用いれば移植後のアストロサイトの分化を抑制できる新たな可能性があると推測され、現在研究を行っている。
これらの結果は 2004 年に The Journal of Cell Biology 誌に掲載された。
Nuclear export of OLIG2 in neural stem cells is essential for CNTF-induced astrocyte
differentiation
Takao Setoguchi, Toru Kondo
The Journal of Cell Biology. 2004 sep;27:963-968
同時に我々は癌の幹細胞についての研究を行った。癌組織中には造血幹細胞や神経幹細胞等と同じく自己複製能、多分化能、無制限の分裂能を併せ持つ癌幹細胞が存在していることが知られている。また癌の再発や転移に癌幹細胞が関与していることが示唆されている。癌幹細胞の特質を知り、その維持機構や増殖⋅分化メカニズ
ムを解明することは癌幹細胞をターゲットとした治療法の開発に有用であると考え研究を行った。我々は幾つかのcancer cell linesについて幹細胞の特性のひとつであるSP細胞の存在の有無を調べるためにHoechst 33342 dye 染色とフローサイトメトリーで解析したところ少なくとも4種類のcell line, C6 glioma cell line, MCF7 breastcancer cell line, B104 neuroblastoma cell line, HeLa adenocarcinoma cell line 中にSP細胞が存在することを見出した。これらcancer cell line中のSP細胞の維持に関与する因子や、cancer cell line中のSP細胞が幹細胞特異的性質を持つか否か等について
C6 glioma を用いて解析した。Cancer cell linesは血清入り培地で長年に亘る継代培養を行われてきているので、その間SP細胞を維持するのに必要な因子が血清から供給されていたと考えられる。その因子を明らかにするために我々は無血清培地中でC6gliomaを培養し、様々な因子を補うことでSP細胞の維持に必要な因子を検索した。その結果、増殖因子であるplatelet derived growth factor (PDGF) とbasic fibroblast
growth factor(bFGF) の両方の存在がC6 glioma中のSP 細胞の維持増殖に必要かつ十分であることが明らかになった。次にSP細胞とnon-SP細胞との特質の違いを調べるために、Hoechst 33342 dyeとセルソーターを用いてSP細胞分画とnon-SP細胞分画に分離後、その性質を調べた。各々の分画の細胞をbFGFとPDGFを添加した無血清培
地で二週間培養するとSP細胞分画からはSP細胞とnon-SP細胞の両方の細胞が増殖してくるのに対し、non-SP細胞分画からはnon-SP細胞のみしか生み出されないことが解った。またSP細胞はセルソーターで分離直後は90％以上が未分化神経系細胞のマーカーであるnestin陽性細胞であり、ニューロンマーカーやアストロサイトマーカー陽性細胞は観察されなかった。しかし10日間培養するとSP細胞培養中からニューロンマーカー陽性細胞やアストロサイトマーカー陽性細胞が出現することが解った。これらのデータはC6 glioma中のSP細胞が、神経幹細胞と同様に自己複製能と多分化能を併せ持っていることを示唆している。次にSP細胞とnon-SP細胞の悪性度の違いを検討するためにセルソーターで分離したSP細胞とnon-SP細胞をbFGFとPDGFを添加した無血清培地中で1週間培養した後に、ヌードマウスに腹腔内移植して腫瘍形成能を観察した。移植後18日目に観察したところ、non-SP細胞を移植したマウスでは腹腔内腫瘍形成や転移性腫瘍は確認されなかった。一方、SP細胞を移植した全てのマウスに腹膜や子宮に腫瘍形成を認めた。さらにSP細胞を移植したマウスの６５％以上に肺転移を認めた。腹腔内に形成されたSP細胞由来の腫瘍はnestin陽性細胞、ニューロンマーカー陽性細胞、アストロサイトマーカー陽性細胞の少なくとも三種類の細胞から構成されていることが解った。これらのデータはSP細胞がnon-SP細胞と比較して悪性腫瘍形成能力が著しく高いことを示す。
未だ根治不可能な癌の治療の為には癌幹細胞をターゲットとした治療法の確立が不可欠である。我々は cancer cell line 中には悪性度が有意に高い上に組織幹細胞様の性質を有している癌幹細胞ともいえる SP 細胞が存在することをはじめて明らかにした。
さらに Hoechst 33342 dye とセルソーターを用いればこれら SP 細胞の精製が容易に可能であることも明らかにした。精製した SP 細胞を利用して癌幹細胞に特異的に効果のある薬剤の探索など、我々の知見は癌幹細胞をターゲットとした治療法の開発に非常に有用であると考えられる。
これらの結果は 2004 年に PNAS 誌と Cell Cycle 誌に掲載された。
Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell lineToru Kondo§ Takao Setoguchi§ and Tetsuya Taga§ These two authors contributed equally
Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jan 20;101(3):781-6.
Cancer Stem Cells Persist in Many Cancer Cell Lines.
Takao Setoguchi Tetsuya Taga Toru Kondo
Cell Cycle. 2004 Apr;3(4):414-415.