分解経路における Rab7 の活性制御機構の FRET センサーを用いた解析
Analysis of regulation-mechanism of Rab7 activity during degradation pathway byusing FRET sensors（日本分子生物学会推薦）

代表研究者 東京理科大学

中村 岳史

Tokyo University of Science Takeshi NAKAMURA

協同研究者 東北大学

福田Tohoku University

Mitsunori FUKUDACancer Research UK

Giampietro SCHIAVO

英国がん研究所

光則J.P. スキャボ

Lysosomes are not only cellular incinerators but also have a much broader function and they are involved infundamental processes such as autophagy and energy metabolism, secretion, plasma membrane repair, and signaling.
Rab7 is a Rab family GTPase that is essential for dynamic regulation of lysosome and late endosome in endosome
maturation. It is generally thought that the replacement of Rab5 by Rab7 “Rab5 to Rab7 conversion “ is a crucial event
during endosome maturation. However, its mechanism is largely unknown in mammalian cells. In this study, wedeveloped a novel FRET sensor for Rab7 and examined Rab7 activity during endosome maturation. At first, we made a
new design for FRET sensors, called MeV linkers, based on the recently-developed EV linker design. By using MeVlinkers, we developed a novel FRET-based sensor for Rab7 (Raichu-A441). The dynamics range of FRET/CFP ratio ofRaichu-A441 is 47%. We confirmed that Raichu-A441 responded to Rab7GAP in 293F cells. GTP loading assay
showed that Raichu-A441 have a comparable GTP loading to that of EGFP-fused Rab7. Co-expression of Raichu-A441
and mRFP-Rab7 showed that Raichu-A441 have the same intracellular localization as Rab7. We are now investigating
the recruitment and activity-change on macropinosomes in EGF-stimulated COS7 cells.

研究目的分子が Rab7 と Rab34 である。そこで、生きた細胞細胞は様々な膜系により構成されており、それらで活性変化を可視化できる FRET センサーを活用しが小胞輸送を介して情報と物質の交換を行なって生て、Rab7 と Rab34 による後期エンドソームとリソソ命活動を維持し、神経や免疫などの高次機能を支えーム動態（形成と細胞内配置）の制御の解析を行うている。従って小胞輸送システムが破綻することでことを目指して研究を行った。

種々の疾患が生じてくる。細胞内消化の場であるリソソームもそうした膜系のひとつであり、その機能研究経過異常により種々の疾患が生じる。中でも、リソソー

2011 年に共同研究者である松田道行教授（京都大ムに存在する分解酵素の欠損による各種の蓄積症が学）のもとで開発された extended variable (EV)リンカ

よく知られており、それぞれに研究が進んでいる。

ーを用いた FRET センサーのデザイン（Komatsu et al.

一方で、リソソーム自体の形成や細胞内配置の異常

Mol. Biol. Cell 22, 4647-4656, 2011）を基に、さらにいもまた、神経変性疾患、がん、感染症等と直接関係くつかの新たな工夫を加えることで、本研究で新たしていることが明らかになっているが、リソソームに Rab7 の FRET センサーを開発した。特に効果があ動態の制御機構についてはまだ多くの部分が不明のったのは、従来の EV リンカーに加えて、FRET センままである。そのリソソームの動態を制御するキーサーの第１コンポーネントと第２コンポーネントの間、及び第３コンポーネントと第４コンポーネント的解析の結果も合わせて、従来の２状態モデル（Rabの 間 の ２ か 所 に １ ５ ア ミ ノ 酸

分子は膜に存在する活性型-GTP 型と細胞質に存在（GGSGGGGSGGGGSGG）のリンカーを挿入するとする不活性型-GDP 型の２つの状態を行き来していいう工夫である。私たちはこの手法を MeV (Modifiedるというモデル）に代わる「Rab 分子の局在‐活性EV) linkers と名付けた。２つの蛍光団の間での共鳴の４状態遷移」モデルを提案したいと考えている。

エネルギー移動の効率はその間の距離と蛍光団のさらにモデル系として、上皮細胞成長因子で刺激dipole の成す角度の２つで決まることが知られていした COS7 細胞を用いて、マクロピノサイトーシスる。もともと EV linker の発想は角度の影響をできるにおける Rab5 と Rab7 の局在と活性の時空間変化のだけ抑えて、蛍光団間の距離のみで FRET 効率が決解析を行った。それにより主に３つの結果が得られまるようにすることでデザインの汎用性を高めるとた。①Rab5 と Rab7 はマクロピノソームの形成の直いうものであった。MeV linkers はその考え方をさら前にその場所にリクルートされる。ただし、Rab5 のに拡張したものであり、現在ほかの複数のセンサー局在が 10-20 分程度と一過性であるのに対して、マについても、このデザインの有効性を検討している。

クロピノソームでの Rab7 量は徐々に増大し、30 分

次に、複数の手法でこのセンサーが Rab7 の活性程度でプラトーに達したのちもそのレベルを維持しをモニターできることを確認した。まず、センサー続ける。②Rab7 は不活性型でマクロピノソームにリ（野生型、恒常活性型、優勢劣性型）を発現させたクルートされ、その後 10-30 分程度たってから活性293F 細胞の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計で計が上がってくる。③マクロピノサイトーシスにおい測した。その結果、この FRET センサーは 47%といては、Rab5 の局所活性（より正確には活性化因子とう十分大きなダイナミックレンジを持つことがわか不活性化因子のバランス）と Rab5 のリクルートがった。経験的に、このダイナミックレンジが 30%をずれている。

超えることがイメージングに使用できる目安であり、その目標値を達成できた。また、この FRET センサ

考察

ーの FRET/CFP 比が Rab7 の不活性化因子の量依存

従来の２状態モデルは広く受け入られているが、的に低下することを確認した。さらに、細胞中でのその考え方がどこまで妥当かについては実はこのFRET センサー内の Rab7 の GTP/GDP 比を求めて、10 年以上にわたって議論が続けられている。特に、単に蛍光蛋白質をつけただけの Rab7 の GTP/GDP 比

いくつかの Rab（Rab9 など）を RabGDI から乖離さと比較するために、正リン酸を使った GTP loading

せて Rab を膜へと持ってくる GDF (GDI dissociation

assay を行ったまた。EGFP と融合させた Rab7 の野factor)についてはいくつか具体的な候補も単離され生型/恒常活性型/優勢劣性型の GTP/GDP 比がそれぞており(Dirac-Svejstrup et al. EMBO J 16, 465-472,

れ 36.6%、57.3%、0.5%であったのに対し、野生型/1997)、膜上にはある程度の GDP 型-Rab が存在する

恒常活性型/優勢劣性型の Rab7 センサーの GTP/GDPという見方は根強く存在してきた。しかしながら、比は 37.1%、54.0%、1.6%であり、このセンサーの動そのデータは主に生化学的な再構成系を用いて得ら作を生化学的手法で示すことができた。次に、このれたものであり、実際に細胞内でどういう状況になセンサーは Rab7 と同じ細胞内局在を示すことをっているかについてはほとんど情報が存在しなかっ

FRET センサーと mRFP-Rab7 を COS7 細胞に同時にた。本研究で開発された Rab7 センサーの意義はこ発現させて顕微鏡観察することにより確認した。どこにある。細胞内で空間的な Rab7 の活性分布を詳

ちらも後期エンドソーム及びリソソームと思われる細に検討することにより、「膜上にはある程度の核周辺から細胞外縁部に広がって存在する小胞、おGDP 型-Rab7 が存在すること」と「細胞質にも GTPよび細胞質に存在した。

型-Rab7 が存在すること」を支持するかなり信頼性

このセンサーを使った COS7 細胞での解析により、の高い実験結果を得ることができた。今後はまず、不活性型の Rab7 が膜上に相当数存在する、つまり今回の解析を行った COS7 細胞以外での解析を進め「Rab7 の膜‐細胞質間の局在変化はその活性変化て、どの程度この見方が一般化できるかを確認するを必ずしも反映しない」という、定説を覆す結果を必要がある。また、２状態モデルから４状態遷移モ得た。さらに RabGDI との結合能の比較など生化学デルへと移行することにより、少なくとも２つの新たな制御因子が存在することが示唆される。実はそのうちのひとつは GDF やその類似分子である可能研究の発表性が高いが、もうひとつの過程を制御する因子につ口頭発表

いては現時点で全く手がかりが存在しない。この分

1.

大西悠希、川崎司人 安田さや香、新井孝夫、中子的実体を明らかにすることが今後の大きな課題で

村岳史: マクロピノサイトーシスにおける Rab5ある。また、今回は主にマクロピノサイトーシスでの活性制御の解析、日本バイオイメージング学の解析を行ったが、この系で形成されるマクロピノ会第 21 回大会、2012

ソームはリソソームへと成熟することが知られてお2.

安田さや香、川崎司人、大西悠希、中村岳史: マり、その成熟過程での Rab7 活性の検討や、その活クロピノサイトーシスにおける Rab5 の活性制性変化が成熟過程にどう影響するかなどは今後の重御の解析、第 35 回日本分子生物学会年会、2012

要な課題である。すでに得られたいくつかの知見についても、これらの知見が従来の説と大きく異なっ

3.

中村岳史: 膜輸送を制御するシグナルの動態を可視化する、第 8 回スフィンゴテラピィ研究会ているため、これがマクロピノサイトーシスに限られた特性であるのかについて調べることは細胞生物

誌上発表

学一般の問題として興味深いと考えられる。

なし