新規ミトコンドリア外膜-内膜接触部位を介したリン脂質輸送
Phospholipid transport via novel contact sites between the outer and inner membraneof mitochondria（日本脂質生化学会推薦）

代表研究者 九州大学

宮田 暖

Kyushu University

Non Miyata

協同研究者 九州大学

久下 理

Kyushu University

Osamu Kuge

Mitochondrial synthesis of cardiolipin and phosphatidylethanolamine requires the transport of their precursors,
phosphatidic acid and phosphatidylserine, respectively, from Endoplasmic reticulum to the mitochondrial inner
membrane via the mitochondrial outer membrane. In yeast, the Ups1-Mdm35 and Ups2-Mdm35 complexes transfer
phosphatidic acid and phosphatidylserine, respectively, between the mitochondrial outer and inner membranes. Inaddition, there is a Ups1-independent cardiolipin synthetic pathway requiring several mitochondrial inner membraneproteins with unknown functions including Mdm31, Mdm32 and Fmp30. In the present study, we identified amitochondrial porin, Por1 as a protein interacting with Mdm31 and Mdm35. Depletion of porins Por1 and Por2 led todestabilization of Ups1 and Ups2, striking decreases in the cardiolipin synthesis via Ups1-dependent andUps1-independent pathways as well as loss of Ups2-dependent phosphatidylethanolamine synthesis but did not affectUps2-independent phosphatidylethanolamine synthesis in mitochondria. Por1 mutations affecting the interactions withMdm31 and Mdm35 led to decreases in CL levels. Thus, yeast porins have specific functions in mitochondrial
phospholipid metabolism. Furthermore, knockdown of the mammalian porins, VDAC1 and VDAC2 in HeLa cells
decreased CL level, suggesting that Porin function in cardiolipin metabolism is conserved among species.

研究目的

ら合成されるが、ミトコンドリアは PA、PS の合成能

ミトコンドリアは外膜、内膜の二つの生体膜に囲まを持たないため、CL、PE 合成のためには PA、PS はれた細胞小器官であり、好気呼吸によるエネルギー小胞体などからミトコンドリア外膜を経てミトコン産生や、アポトーシスによる細胞死、脂質合成など、ドリア内膜まで輸送されなくてはならない。

種々の重要な機能を担っている。ミトコンドリアは酵母において、ミトコンドリア膜間腔に局在する

また、小胞体と並んで主要なリン脂質合成の場でもUps1-Mdm35 複合体が PA の、Ups2-Mdm35 複合体が PSある。リン脂質のうち、カルジオリピン(CL)および、のミトコンドリア外膜-内膜間輸送を媒介し、それぞ細胞内の大部分のフォスファチジルエタノールアミ

れ CL、PE の合成に寄与している。ミトコンドリア外ン(PE)は、ミトコンドリア内膜において合成される。

膜-内膜間 PA 輸送体である Ups1 を欠損すると CL 合

CL、PE は、呼吸鎖複合体やクリステ構造の形成など、成の著しい減少がみられるが、Ups1 と Ups2 を同時

ミトコンドリア機能維持に必須のリン脂質である。に欠損すると、CL 合成が野生型酵母と同程度まで回CL、PE は、ミトコンドリア内膜においてそれぞれホ復することが知られており、Ups1 に依存しない未知スファチジン酸(PA)、ホスファチジルセリン(PS)かの CL 合成経路の存在が示唆されていた。我々は、近年、この Ups1 非依存的 CL 合成経路に必須の因子とがあるのではないかと考えた。
解析の結果、Por1 は、して、ミトコンドリア内膜タンパク質 Mdm31、Mdm32、Mdm35 と結合することを明らかにした。Mdm35 は、Fmp30 を見出した。さらに、この Ups1 非依存的 CLUps1、Ups2 両者のコファクターであり、Mdm35 を合成経路は、Ups2 の欠損などによってミトコンドリ
ア PE 量が低下した際に活性化し、Ups1 の欠損の有欠損すると、Ups1、Ups2 が不安定することが知られている。Porin を発現抑制した酵母では、Mdm35 同様、Ups1、Ups2 の不安定化が見られた。これらのこ無に関わらず、Ups1 依存的な CL 合成経路に替わり、とから、Porin は Mdm35 と結合し、Mdm35 の機能発主要な CL 合成経路となることを明らかにした(参考

現に関与している可能性が示唆された。

文献 1)。酵母は Ups1 依存的経路と Ups1 非依存的経Porin が Mdm35 の機能に必要であるならば、Porin路を使い分けることにより、様々な環境下におけるの発現抑制は、Ups2-Mdm35 による PS 輸送依存的なCL 合成を保証していると考えられる。

PE 合成にも影響するはずである。そこで、Porin のさらに我々は、Ups1 非依存的 CL 合成経路の分子機構の解明を目的とし、Mdm31、Mdm32 の結合因子の発現抑制した酵母における Ups2 依存的な PE 合成を観察した結果、予想通り、Porin の発現抑制によってUps2 依存的 PE 合成を低下させた。重要なことに、同定を試みた。結果、Mdm31 の結合因子として、ミPorin の発現抑制は、Ups2 非依存的な PE 合成に影響

トコンドリア外膜 Porin タンパク質である Por1 を同を及ぼさなかった。これらのことより、Porin は、定した。本研究では、Porin のミトコンドリア内リMdm35 との結合を介して Ups1 依存的 CL 合成およン脂質合成・輸送に関する機能解明を目的として解び Ups2 依存的 PE 合成に、そして Mdm31 との結合析を行った。

を介して Ups1 非依存的 CL 合成経路に、それぞれ重要な役割を果たしていることが示唆された。

研究経過
まず、Porin がミトコンドリアにおける CL 合成に関与するかを検証した。酵母には、Por1、Por2 二つの Porin が存在するため、Por1 欠損し、Por2 をDoxycycline によって発現抑制が可能な TetO7 プロモーター存在下で発現する酵母株を樹立し、Porin の発現抑制時の CL 量を観察したところ、CL 量が野生型の約 10%にまで低下していた。この事から、Porinは CL 合成に重要な役割を担っていることが明らかとなった。
定常状態の酵母においてにおいて、大部分の CLは、Ups1-Mdm35 によって媒介される PA 輸送依存的に合成されている。次に、CL が Ups1 非依存的に合成されている Ups1Ups2 二重欠損酵母において Porinを発現抑制すると、やはり CL 量の著しい減少が見られた。これらのことより、Porin は Ups1 依存的、非依存的 CL 合成経路両者に関与していることが示唆された。また、Porin のチャネル活性を低下させる変異を持つ Por1 変異体を発現する酵母では、正常量の CL が観察された。このことより、Porin の CL 合成に関する機能は、そのチャネル活性とは独立したものであることが示唆された。
Porin が Ups1 依存的な CL 合成に関与していることから、Porin は、Ups1-Mdm35 複合体とも相互作用

Porin はミトコンドリア外膜のβバレルタンパク質であり膜間部に露出する 9 つのループ領域を持っており、ミトコンドリア内膜に局在する Mdm31 および膜間部に局在する Mdm35 は、これらループのいずれかに結合する可能性がある。Porin の Mdm31、Mdm35 結合部位を同定するため、Por1 の各ループ領域に点変異を導入し、Mdm31、Mdsm35 との結合への影響を観察した。結果、Por1 の N 末端から 1 番目のループに変異を持つ Por1 変異体は、Mdm31、Mdm35 両者との結合が低下していた。また、このPor1 変異体を発現する酵母では、CL 量の低下が見られた。このことから、Mdm31、Mdm35 と Porin の結合は CL 量維持重要であることが示唆された。また、興味深いことに、N 末端から 6 番目のループに変異を導入した Por1 変異体は、Mdm31、Mdm35 との結合が著しく上昇していた。このことから、Por1と Mdm31、Mdm35 の結合はなんらかの機構で制御されている可能性が考えられる。
Porin は、酵母からヒトまで広く保存されている。
哺乳動物には、VDAC1、VDAC2、VDAC3 の 3 つのPorin が存在する。次に Porin のミトコンドリアリン脂質合成に関する機能が種間で保存されているかを検証した。まず、酵母にマウス由来 VDAC1 を導入した上で、内在性 Porin の発現を抑制すると、CL の減少が救済された。また、ヒト由来培養細胞である

Mdm35 の結合を促進するなら、Ups1-Mdm35 の PA

HeLa 細胞において、VDAC1、VDAC2 を siRNA にへの結合(積み込み)がミトコンドリア外膜に限定さより発現抑制すると、やはり CL 量の減少が観察され、PA のミトコンドリア外膜から内膜への一方向性れた。これらの結果より、Porin の CL 合成に関するの輸送の保証に寄与しているのではないかと考えた。

機能は、種間で保存されていることが示唆された。

この仮説を検証するためには、今後、Porin を再構成したリポソームを用いた試験管内アッセイ系を用い考察
本研究により、ミトコンドリア外膜タンパク質て Ups1-Mdm35 による PA 輸送活性に Porin がどのように影響するかを検証する必要がある。

Porin のミトコンドリアリン脂質輸送・合成に関する

一方、ミトコンドリア内膜タンパク質 Mdm31 は、新規の機能が明らかになった。ミトコンドリアにおPorin と結合し、Ups1 非依存的 CL 合成経路に関与しける CL、PE の合成は、それぞれの前駆体リン脂質ている。よって、Porin と Mdm31 は、もう一つのミである PA、PS のミトコンドリア外膜-内膜間輸送にトコンドリア内膜接触部位を形成し、PA のミトコン依存している。膜間部において Ups1-Mdm35 が PA

ドリア外膜-内膜間リン脂質輸送に関与している可の、Ups2-Mdm35 が PS のミトコンドリア外膜-内膜能性が考えられる。Mdm31 は現在立体構造に関する間輸送を担い、それぞれ CL、PE の合成に寄与して情報がなく、既知のドメインも有していないため、いる。一方、ミトコンドリア内膜タンパク質である

Mdm31 が直接リン脂質を輸送するかは不明である。

Mdm31、Mdm32、Fmp30 が Ups1 非依存的な CL 合

今後、Mdm31 リコンビナントタンパク質を用いた脂成に関与している。Porin は、Mdm35、Mdm31 と結質結合アッセイや、脂質輸送アッセイによって、合することで、Ups1 依存的 CL 合成、Ups2 依存的Mdm31 が PA を直接輸送するかを検証する必要があ

PE 合成および Ups1 非依存的 CL 合成に関与している。また、この Ups1 非依存的経路は、Ups2 欠損酵ることが強く示唆された。

母のような、ミトコンドリアにおける PE 合成が低脂質輸送は、リン脂質を供給する膜と受容する膜下した酵母において活性化され、Ups1 依存的 CL 合が近接した膜接触部位において行われていると考え成経路にかわり、主要な CL 合成経路となる。一方、られる。Ups1-Mdm35 はミトコンドリア内膜に豊富ミトコンドリア膜接触部位を形成する MICOS 複合に存在する CL と結合することが知られていた。本体の欠損は、クリステ構造の異常と非発酵性条件に研究において、ミトコンドリア外膜タンパク質であおける酵母の生育が低下するが、Ups2 欠損は、Ups1る Porin が Mdm35 と結合することを見出した。この

非依存的 CL 合成経路を活性化させるだけでなく、ことから、Ups1-Mdm35 は、Porin を介してミトコン

MICOS 複合体の欠損による障害をも救済すること

ドリア外膜と、CL を介してミトコンドリア内膜と結が報告されている(参考文献 4)。このことから、ミト合し、自身が膜接触部位を形成し、リン脂質輸送をコンドリア PE 低下時に Mdm31-Porin を介して形成促進しているのではないかと考えられる。また、されるミトコンドリア膜接触部位は、MICOS 複合体

Porin の発現抑制は、Ups1 の不安定化を引き起こしの欠損を相補する可能性がある。今後、Mdm31-Porinた。これに類似して Mdm35 欠損酵母では、Ups1 がの形成するミトコンドリア内膜接触部位がミトコン不安定化し、ミトコンドリア内のプロテアーゼによドリア構造に与える影響について、電子顕微鏡などり分解を受けることが報告されている(参考文献 2)。

による解析を行う必要がある。

これらのことより、Porin は Mdm35 と結合すること

上述のように、Ups1 依存的 CL 合成経路と Ups1で Mdm35 の構造変化を引き起こし、Ups1 との結合非依存的 CL 合成経路は、ミトコンドリア PE 量によを促進する可能性が考えられる。さらに、って相反的に制御されている。Porin は、Mdm35 お

Ups1-Mdm35 はリン脂質輸送過程においてダイナミ

よび Mdm31 両者と結合し、両 CL 合成経路に重要なックに結合と解離を繰り返しており、複合体状態で、役割を担っていることから、Porin は、ミトコンドリ

リン脂質と結合し、逆にサブユニット状態でリン脂ア PE 量に応じた CL 合成経路の切り替えに重要な質を放出することで、リン脂質の膜間輸送を媒介し役割を担っている可能性が考えられる。今後、Porinていると考えられている(参考文献 3)。よって、我々がミトコンドリア外膜-内膜間リン脂質をどの様には Porin がミトコンドリア外膜において Ups1 と制御しているか、その分子機構の解析を進めることで、トコンドリアリン脂質恒常性とミトコンドリア機能維持に関し重要な知見を得ることができると期研究の発表待している。また、このような Porin の機能は酵母

口頭発表

からヒトまで高度に保存されているものと考えられ1.

る。

宮田暖、久下理ミトコンドリアにおけるリン脂質の合成・輸送制御機構の解析

参考文献
1.

第 41 回日本分子生物学会 2018 年 11 月 横浜

Miyata N, Goda N, Matsuo K, Hoketsu T and Kuge

フォーラム オルガネラ・ゾーン討論会「オルガO.

ネラ研究から、オルガネラ・ゾーン研究へ」

Cooperative function of Fmp30, Mdm31, andMdm32

inUps1-independentaccumulation in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
2.

4.

2.

imports

Upsproteins

into

宮田暖
ミトコンドリア形成過程におけるタンパク質とTamura Y, Iijima M, and Sesaki H.
Mdm35p3.

招待講演

cardiolipin

リン脂質輸送機構の解明

themitochondrial intermembrane space by functional

平成 30 年度日本生化学会九州支部例会

complex formation.

2018 年 7 月 福岡

EMBO Journal Vol. 29(17):2875-2887 (2010)

日本生化学会九州支部学術奨励賞・受賞講演

Watanabe Y, Tamura Y, Kawano S and Endo T
Structural and mechanistic insights into phospholipid

誌上発表

transfer by Ups1-Mdm35 in mitochondria.

1.

Miyata N, Satoru Fujii and Osamu Kuge

Nature Communications Vol. 6:7922 (2015)

Porin

Aaltonen MJ, Friedman JR, Osman C, Salin B, dimitochondrial phospholipid metabolism in yeast.

Rago JP, Nunnari J, Langer T, Tatsuta T.

Journal of Biological Chemistry

MICOS and phospholipid transfer by Ups2-Mdm35

Vol. 293(45):17593-17605 (2018)

organize membrane lipid synthesis in mitochondria.
Journal of Cell Biology Vol. 213(5):525-534 (2016)

proteins

have

crucialfunctionsin