糖転移酵素群の協調作用による NOTCH 受容体発現調節メカニズムの解明
Elucidation of the regulatory mechanism of NOTCH receptor expression by thecooperative action of glycosyltransferases（生化学学会推薦）

代表研究者 名古屋大学

岡島 徹也

Nagoya University Tetsuya OKAJIMA

協同研究者 名古屋大学

田嶌 優子

Nagoya University Yuko TASHIMA

名古屋大学

竹内 英之

Nagoya University Hideyuki TAKEUCHI

名古屋大学

小川 光貴

Nagoya University Mitsutaka Ogawa

Glycosylation, one of the post-translational modifications of proteins, is vital for regulating protein expression
and function. The NOTCH receptors represent glycoproteins, where glycans are involved in their fine-tuning. Previousstudies have identified several glycosyltransferases that modify approximately a tandem repeat of epidermal growth
factor-like (EGF) domains located in the extracellular region of the NOTCH receptor. Six cysteine residues are present ineach EGF domain, forming three pairs of disulfide bonds. Notably, the glycosyltransferase that modifies the EGF domain
specifically recognizes the EGF domain that has completed folding and then catalyzes the sugar modification. However,
the molecular mechanism by which O-glycans mediate the regulation of NOTCH expression has not been thoroughly
investigated. Our study addressed the novel roles of O-glycans by establishing HEK293T cells triple mutant for
POFUT1/POGLUT1/EOGT. Detailed analysis of Notch glycosylation by mass spectrometry, aggregation assay, andbiochemical analysis of the degradation pathway suggested that lack of O-glycans caused misfolding of Notch EGF
domains, which hampered proteosome-dependent degradation. Isolation of interacting molecules of NOTCH receptors
under the deficiency of major O-glycans further indicated a novel role of O-glycans in promoting NOTCH receptor foldingby suppressing the inappropriate association of chaperon proteins with folded EGF domains.

研究目的る (2,3)。

主要なタンパク質の翻訳後修飾である糖

これまでの研究で、複数の O 型糖鎖の修飾酵素が鎖修飾は、タンパク質の発現や機能の制御同定されている(4)(5)。これらの酵素は、NOTCH 受に重要である。糖鎖修飾の機能的な重要性

容体の細胞外領域に存在する約 30 個の連続した上を端的に示す基質タンパク質として、

皮成長因子様ドメイン（以下、EGF ドメイン）を修

NOTCH 受 容 体 が あ る (1)。こ の NOTCH 受 容飾する。EGF ドメインには６個のシステイン残基が体 は 、発 生 や 恒 常 性 維 持 に 必 須 な NOTCH シ

存在し、3 組のジスルフィド結合を形成している

グナルを伝達するが、O 型糖鎖の異常は(Figure 1)。重要なことに、EGF ドメインを修飾する

NOTCH シ グ ナ ル の 伝 達 不 全 に つ な が る た

O 型糖鎖の修飾酵素は、フォールディングを完了しめ、O 型糖鎖付加の制御は非常に重要であた EGF ドメインを特異的に認識し、糖修飾を触媒する。すなわち、ジスルフィド結合が形成される前のEOGT の共発現による協調作用も観察された。以上

未フォールディング状態の EGF ドメインには作用しの 結 果 よ り 、 ３ 重 変 異 細 胞 はない。
O-フコース転移酵素１(POFUT1)や O-グルコー

POFUT1/POGLUT1/EOGT に依存的な O 型糖鎖付加

ス転移酵素１(POGLUT1)と呼ばれる糖転移酵素は、反応の分泌過程における機能を反映していることがそれぞれ、タンパク質に直接、フコース/グルコース確認できた。

を付加するが、これらの酵素の欠損により、細胞膜表面上への NOTCH 受容体の発現が妨げられる(6)。

（２）糖転移酵素３重変異体における NOTCH 受容したがって、以下のシナリオが考えられている。①体の残留糖鎖の解析

NOTCH 受容体の EGF ドメインが正しくフォールデ３重変異細胞では、O 型糖鎖を完全に欠損するのィングされる。② O 型糖鎖が付加される。③ O 型か、一部、残留する O 型糖鎖が存在するのかを確か糖鎖の作用により、NOTCH 受容体の細胞膜表面へめるために、内在性 Notch 受容体を免疫沈降によりと輸送される。

単離し、プロテアーゼを用いて生じた消化産物をしかしながら、O 型糖鎖がどのような分子メカニ

Orbitrap Fusion を用いた質量分析を行った。その結果、ズムで NOTCH 受容体の発現調節に関わるのかは不予想していた POFUT1/POGLUT1/EOGT が触媒する明であった。我々は、主要な O 型糖鎖の欠損下におO-フコース、O-グルコース、O-GlcNAc による修飾がける NOTCH 受容体の糖鎖修飾、タンパク質代謝、消失した。一方で、POGLUT２や POGLUT３が修飾相互作用分子を詳細に解析することで、従来、考えする O-グルコースの残存が示唆された。

POFUT1(O-fucose)

Ligandtandem EGF repeat(~30)（３）糖転移酵素３重変異体における NOTCH 受容体の細胞内発現分布の解析
３重変異細胞における NOTCH 受容体の局在の異Notch

EOGT(O-GlcNAc)
POGLUT1(O-glucose)
Notch signal transduction

Figure 1. Notch receptor is modified with O-fucose, O-glucose, and EOGT by
POFUT1, POGLUT1, and EOGT, respectively, at a tandem EGF repeat ofNotch receptor.

られていなかった NOTCH 受容体のフォールディン
グを促進する O 型糖鎖の新たな役割が示唆された。
研究経過（１）３種類の異なる糖転移酵素による NOTCH 受容体の細胞膜発現の制御
NOTCH 受容体の O 型糖鎖修飾に関する主要な糖転移酵素である POFUT1、POGLUT1 に加えて、EGFドメイン特異的 O-GlcNAc 転移酵素(EOGT)を欠損した HEK293 細胞を樹立した。この３重変異細胞では、Notch1 の細胞膜への発現が完全に消失した。一方、
POFUT1 もしくは POGLUT1 を発現させることにより、Notch1 の細胞膜発現が部分的に回復した。
また、常を明らかにするために免疫染色をしたところ、NOTCH 受容体の細胞内への蓄積が観察された。また、タンパク質凝集アッセイより、３重変異細胞における凝集体の形成が観察された。こうした異常NOTCH 受容体の分解機構を明らかにするために、プロテアソームやオートファジーの阻害剤を用いて解析したが、蓄積した NOTCH 受容体の発現レベルは、これらの阻害剤により大きな変化は認められなかった。一方で、岐阜大学の大橋博士の実験結果か
ら、還元剤を培養細胞に直接添加することで、NOTCH 受容体の細胞内蓄積が解消されることが明らかにされた。また、還元剤依存的な NOTCH 受容体の分解には、プロテアソーム経路に関わる分子の発現が必要であることが示された（大橋ら、未発表データ）。これらの結果より、プロテアソーム経路依存的な NOTCH 受容体の分解経路が存在すること、そして、細胞内に蓄積された NOTCH 受容体は、還元されない限り、プロテアソーム経路で分解を受けないことが示唆された。

胞に還元剤を添加することで、NOTCH 受容体の蓄積が解消された。さらに、プロテアソーム経路を遮(４) O 型糖鎖欠損 NOTCH 受容体と相互作用する分断することで、還元剤存在下でも NOTCH 受容体の子の同定蓄積が観察された。以上のことより、３重変異細胞

NOTCH 受容体発現における O 型糖鎖の役割を分では、ジスルフィド結合の異常を伴う NOTCH 受容子レベルで理解するために、O 型糖鎖欠損 NOTCH体凝集体の形成を通じて、プロテアソーム経路を介受容体との相互作用因子の探索を行った。１つは、した分解抵抗性を獲得したことが示唆された。

BioID 法を用いて糖鎖変異型 NOTCH1 と相互作用す以上の結果は、NOTCH 受容体の O 型糖鎖修飾がる分子を網羅的に同定した。別のアプローチとして、EGF ドメインのフォールディングに間接的に関与す３重変異細胞に発現する内在性 NOTCH に相互作用ることを示唆する。予備的な研究結果より、３重変するタンパク質を免疫沈降法により単離し、質量分異細胞から単離した NOTCH 受容体に残存する O 型析により同定した。複数の分子が両グループに共通糖鎖の付加率が低下することが示された。この残存しており、その中に、ジスルフィド結合の形成に関する糖鎖は POGLUT2/3 が付加するものと考えられ、わる PDI ファミリータンパク質が含まれていた。

他の糖転移酵素と同様に正しくフォールディングを受けた EGF ドメインに特異的に作用することから、考察

EGF ドメインのフォールディングの異常を支持する。

これまでに POFUT1/POGLUT1 を用いた糖転移酵

このことは、O 型糖鎖は、正しいフォールディング素の変異実験より、O 型糖鎖が NOTCH 受容体の細を受けた EGF ドメインに特異的に作用することと一胞表面発現に必要であること、さらには、EGF ドメ見、矛盾する。一方で、３重変異細胞では、NOTCHインの安定性に寄与することが報告されている(6)。

受容体から主要な O 型糖鎖の欠損により、PDI ファ

しかしながら、これら以外にも NOTCH 受容体を修ミリータンパク質との相互作用が認められた。これ

飾酵素が存在し、その中でも特に EOGT による O-らの結果より、EGF ドメインの O 型糖鎖は、フォー

GlcNAc 修飾は、NOTCH 受容体 1 分子あたり、２１ルディングが完了した EGF ドメインが PDI ファミ箇所の予想付加部位が存在している(7)。さらに、リー分子などのシャペロンタンパク質と相互作用す

EOGT の過剰発現より NOTCH 受容体の細胞外領域ることを抑制することで、フォールディング途中のの分泌量が増加することも見出している(8)。そこで、 EGF ドメインに選択的にシャペロンが作用すること
本研究課題では、POFUT1、POGLUT1、EOGT の３を保証する分子機序に関与することが考えられた
重変異により、大部分の O 型糖鎖を欠損させた際の(Figure 2)。この仮説に基づき、酵素活性を持たない

NOTCH 受容体の発現様式について、検討を行った。

糖転移酵素（POFUT1）が EGF ドメインと相互作用

その結果、内在性 NOTCH 受容体の細胞表面への発することで、酵素活性非依存的に NOTCH 受容体の現が消失し、細胞内の蓄積が観察された。さらに、フォールディングを促進するメカニズムの一部を説３重変異細胞において凝集体形成の亢進が観察され明できる可能性がある(9)。

た。これらの結果より、O 型糖鎖欠損により、NOTCH受容体の輸送よりむしろ、フォールディングの異常

O-glycan (+)

O-glycan (-)
chaperone

chaperoneの可能性が示唆された。
O 型糖鎖欠損に伴う異常な NOTCH 受容体の分解経路を理解するために、プロテアソームやオートファジーの阻害実験を行ったが、細胞内の発現量に大きな変化は認められなかった。一方で、３重変異細Notch

Notch

Figure 2. Shematic representation of a potential role of O-glycans on the foldingof Notch EGF domains.

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