微生物エンドグリコシダーゼの機能改変とその糖鎖生物学への応用
Improvement of Function of Microbial Endoglycosidase and Its Application forGlycobiology(日本農芸化学会推薦)

代表研究者

石川県立大学山本 憲二

Ishikawa Prefectural UniversityKenji YAMAMOTO

協同研究者

石川県立大学片山 高嶺

Ishikawa Prefectural University

Takane KATAYAMA

The sugar chains of some glycoproteins play key roles in cellular recognition, the immune response, etc.
Glycosidases are useful for elucidating the structure and function of the sugar chains in glycoproteins.
Endo-β-N-acetylglucosaminidase hydrolyzes N,N’-diacetylchitobiose moiety in oligosaccharides bound to theasparagine residue of various glycoproteins through an N-glycosidic linkage. We identified a fungus isolated from soilthat produces novel endo-β-N-acetylglucosaminidase, which can act to release complex oligosaccharides fromglycoproteins. We named the enzyme Endo-M after its source that was identified as Mucor hiemalis. Endo-M has aspecific transglycosylation activity that transfers intact oligosaccharides from glycopeptides to suitable acceptors
containing N-acetylglucosamine during the hydrolysis of glycopeptides. To enhance transglycosylation activity,
site-directed mutagenesis of various residues in the putative catalytic region of Endo-M was performed, and replacementof Tyr-217 with Phe caused enhanced transglycosylation activity over the wild type. This result suggests that removal of
the hydroxyl group at Tyr-217 reduces steric hindrance. Endo-M proceed by a substrate-assisted mechanism which the2-acetamido substituent acts as a nucleophile to form an oxazolinium ion intermediate, since this enzyme is able to use
synthetic sugar oxazolines as donor substrates for transglycosylation. In combination with a sugar oxazoline, various
mutants acted as a glycosynthase for glycosidic bond formation, allowing accumulation of the transglycosylation
product.

研究目的であり、多くの生体内エネルギーが使われ、多くの生体内のほとんどのタンパク質は多様な糖鎖が付酵素が関わる。糖鎖の生合成は細胞内の小胞体やゴ加した糖タンパク質として存在し、その糖鎖構造のルジ体で行われるが、それを巧みにコントロールし違いがタンパク質の機能に大きな影響を及ぼすことて、目的の糖鎖をタンパク質に付加したり改変したも知られている。糖 鎖 は細胞間の認識を初めとして、りする技術はタンパク質工学における技術の域に達発生・分化、疾病の発症など、さまざまな生命現象していない。一方、このような糖タンパク質の糖鎖に深く関与しており、核酸、タンパク質と共に生命をタンパク質との結合部より加水分解して糖鎖を遊における「第三の鎖」と呼ばれている。遺伝子を基離するエンド型のグリコシダーゼが糖鎖の構造や機にして生合成されるタンパク質に糖鎖が付加するこ能の解析技術のツールとして用いられている。とはタンパク質の機能を決定付ける大きなイベント

End o -β -N -ace t yl gl uco sa mi n id a se は 糖 タン パク

質 の N -型 糖 鎖 （ ア ス パラ ギン 結 合 型 糖 鎖 ） の 糖

ロシン残基をフェニールアラニン残基に置換した

鎖 とタン パ ク質 の結 合 部 に存 在 するために、加水分解活性が低下する一方、チロシン

N, N ’ -d iac et yl ch ito b io se 結 合 を 切 断 し 、 糖 鎖 をの水酸基が除かれたことにより、糖転移反応の基遊 離 す る酵 素 で ある 。我々は土壌より単離同定し質が活性中心に入り込み易くなって、糖転移活性た糸状菌Mucor hiemalisよりユニークなが上昇したものと考えられる。本変異酵素の加水

End o -β -N -ace t yl gl uco sa mi n id a se を見出した。本分解活性の基質に対する Km 値はもとの酵素に比酵素は他の微生物起源の酵素とは異なり、酵母やカ較して 1/10 以下に低下していた。しかし、Y217F

ビの糖タンパク質が有する比較的単純な構造の糖鎖は未だ加水分解活性が残存しており、そのために（high-mannose type）のみならず、ヒトや動物由来

長時間反応すると糖転移生成物は加水分解されての糖タンパク質が持つ複雑な構造の糖鎖（complex消失する（Fig.1）。

type）にも作用する新奇な酵素であり、Endo-Mと名糖転移活性をも有し、水酸基を持つ化合物に供与体から糖鎖を転移付加できることを見出した。すなわ
ち、細胞内で数十にも及ぶ反応を経て行われる糖鎖の付加反応をひとつの酵素のみによって行うことができる。この糖転移活性を利用することによって、これまでにさまざまな生理活性ペプチドに糖鎖を付加した糖ペプチドを化学-酵素合成した。
そこで、本酵素の糖転移活性を促進するために部位特異的変異を行い、さらに本酵素の反応中間体であるオキサゾリン糖鎖を基質として、糖鎖をタンパク質やペプチドに効率的に付加する方法を確立し、糖鎖生物学における技法として応用することを本研究の目的とした。

1.2Man9GlcNAc2-pentapeptide (mM)

付けた。また、本酵素は加水分解活性のみならず、

0.8Y217F
0.4
Wild type032024080160
Incubation time（min）
Fig.1 Enhanced transglycosylation activity of Endo-M
mutant Y217F
0Transglycosylation reaction using GlcNAc-pentapeptide as
an acceptor, and Man9GlcNAc2-Asn as a donor

Endo-M の酵素反応はオキサゾリン中間体を経由する substrate-assisted catalytic mechanism と呼ばれるユニークな機構によって進行することが見出

研究経過
Endo-M は本来、加水分解酵素であるため、その糖転移活性によって反応生成物を得ようとする
際に問題となるのは、糖鎖を有する糖転移生成物が Endo-M の加水分解活性の基質となって分解されるためにその生成収率が低下することである。
そこで、加水分解活性が抑制され、糖転移活性が促進されるような Endo-M の変異酵素を作成することを試みた。Endo-M の活性中心（グルタミン酸-177）付近のさまざまなアミノ酸残基を部位特異的変異させた酵素を作成して調べたところ、加水分解活性が抑制され、糖転移活性が促進されるような変異酵素 Y217F を得た。この変異酵素はチされている。すなわち、酵素タンパク質にはAcid/Base として機能する酸塩基触媒残基のみが存在し、基質の N-アセチルグルコサミン残基の部分の 2-アセトアミド基が Nucleophile として機能する求核残基となる。すなわち、糖-酵素反応中間体の代わりにオキサゾリン化合物の中間体が形成され、この中間体が水と結合すれば加水分解物が生成し、アクセプターと結合すれば糖転移反応産物が生成する（Fig.2）。同様に Substrate-assisted
catalytic mechanism によって反応が進行することが知られているβ-ヘキソサミニダーゼ（Glycosidehydrolase (GH) family 20）、キチナーゼ（GH family18）は触媒残基であるグルタミン酸残基の周辺に存在するアスパラギン酸残基が高度に保存され、

2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium chloride（DMC）

E177 (Acid/Base)HOHOMan 3HOO

OHNOによって処理して調製した N-型糖鎖のオキサゾO
HO

リン化合物を供与体基質として用いて、N175A 変

HO
Ac HN

O

As n異酵素により糖転移反応を行ったところ、糖転移(Nucleophile)生成物が加水分解されずに蓄積されることが見出

E177O

HOMan3
HO

Transglycosylation

OOxazolinium ion
intermediateOHON +Oされた（Fig.3）。さらに、アスパラギン残基をグHydrolysis

OHNOOHOO
HOAcHN

Asn

E177の高い収率で得ることができ、本酵素が機能性糖O鎖複合体の合成に実用的な酵素となり得る可能性

HOHOMan3HOO

HOては糖鎖が付加された糖転移生成物を 70％以上

R

E177HO
Man3
HO

ルタミン残基に置換した変異酵素 N175Q についOOHが示された。

HNHydrolysis

O

また、N175Q は N-型糖鎖のオキサゾリン化合物

Transglycosylation productのみならず N-型糖鎖をも糖鎖供与体基質となる

Fig.2 Substrate-assisted catalytic mechanism of Endo-M

ことを見出し、さらに N175H は N175Q よりも効

オキサゾリン化合物中間体の形成とその安定化を率的に機能性糖鎖複合体を酵素合成することを明担うことが示唆されている。一方、Endo-M と同らかにした。

じファミリーに属する酵素（GH family 85）の触媒残基付近のアミノ酸配列を比較したところ、相同性があることが見出され、いずれの酵素も考察化合物への糖や糖鎖の付加反応に糖加水分解酵

Substrate-assisted catalytic mechanism によって反応素の糖転移活性を利用することに対しては克服しが進行すると推察される。さらに、触媒残基であなければならない大きな問題点がある。それは糖るグルタミン酸残基の N-末端へ２残基前にアス転移反応により生成した糖転移生成物が糖加水分パラギン残基が完全に保存されており、その解酵素自身の基質にもなって分解され、目的の生Endo-M におけるアラニン置換体 N175A は著しく成物の収率が大きく減少することである。そこで、加水分解活性が低下することから、このアスパラ酵素の触媒残基を改変し、酵素反応中間体をミミギン残基が反応中間体形成のカギ残基である可能

ックした基質を用いて糖転移反応を行うことによ性が示唆された。そこで、ニワトリ卵黄より抽出り、加水分解活性が抑制され、一度生成された糖単離して得られた N-型糖鎖を転移産物は加水分解されずに蓄積される “グライコシンターゼ化”の技法が開発された。すなわち、多くの糖加水分解酵素は触媒反応に関わる酸塩基

Yield of M9GN2-EPO (%)

6050

Y217FY217Fmutant

触媒残基（Acid/Base）と求核残基（Nucleophile）
N175A40を有するが、その求核残基を部位特異的変異によ

N175A mutant

30って不活性化し、反応中間体をミミックしたフッ20化糖を基質として用いて糖転移反応を行うことに10Wildtype
Wildtype

より、生成した糖転移産物は加水分解されずに蓄積され、効率的に糖転移生成物を得ることができ

0120406080100
Incubation time (min)Fig.3 Transglycosylation reactions using sugar oxazolines as thedonor substrate by the wild-type and two mutant Endo-M
020The reaction were carried out using Man9GlcNAc-oxazoline
as donor substrate and GlcNAc-pentapeptide as an acceptor

る。Endo-M はユニークな substrate-assisted catalytic
mechanism によって反応が進行し、求核残基が存在せず、オキサゾリン化合物が反応中間体である。

従って、上記のようなグライコシンターゼ化を行うことはできない。そこで、酸塩基触媒残基周辺のアミノ酸残基について網羅的に部位特異的変異を行い、糖転移活性は上昇し、加水分解活性は低下するような変異酵素を探索した。その結果、
Y217F を見出したが、本変異酵素は加水分解活性を完全に消失していない。そこで、反応中間体であるオキサゾリン化合物に着目し、これを基質として糖転移反応を行うことを検討した結果、N175残基が重要な残基であることを見出し、その部位特異的変異酵素がグライコシンターゼ様の酵素になることを見出した。なかでも N175Q およびN175H は非常に有用なグライコシンターゼ様に働く酵素であることが明らかになり、生理活性糖ペプチドやバイオ医薬品などの実用的な機能性糖鎖複合体の合成に利用できる可能性が示された。

研究の発表
口頭発表
１． 山本憲二：エンド-Ｍ酵素を用いた糖鎖の付加技術、研究産業・産業技術協会第５回先導技術交流会「次世代バイオ医薬品への挑戦」
2012 年 1 月
２． 梅川碧里、芦田久、L.-X. Wang、山本憲二：
糸状菌由来エンドグリコシダーゼ（Endo-M）のグライコシンターゼ様変異体酵素を活用したシアロ糖タンパク質の化学-酵素合成、日本応用糖質科学会大会、2012 年 9 月
紙上発表

１．梅川碧里、芦田久、山本憲二. 2011. エンド
Ｍ酵素による糖鎖の効率的な転移付加と均一化. バイオ医薬品開発における糖鎖技術(早川堯夫、掛樋一晃、平林淳
エムシー出版. 68-76 頁.

監修). シー