倉田奨励金研究報告書｜2016 年度（第 48 回）助成■受領№1311

医療、衛生、学術への応用を志向したウイルス酵素イメージング技術の開発

代表研究者

高橋忠伸

静岡県立大学

大学院薬学研究院

生化学講座

1．研究目的准教授

フルエンザ薬（ザナミビル、オセルタミビル、ラA型・B型インフルエンザウイルスや一部のパニナミビル、ペラミビル）に対する耐性化を同時

ラミクソウイルス、そしてこれらの感染細胞には、に判定できる簡易迅速インフルエンザ検出法を開糖鎖末端に存在するシアル酸（Neu5Ac）を切断す発する。学術研究への応用として、感染細胞内のる酵素「シアリダーゼ」が発現している。研究代

ウイルスシアリダーゼ活性の局在性をイメージン

表者らは、これらのウイルスや感染細胞のシアリグする画期的解析手法を確立する。本研究は、こダーゼ活性を蛍光イメージングするプローブ

れらの目標を達成するためにBTP3-Neu5Acベー『BTP3-Neu5Ac』を開発してきた（Takahashi, Sci.

スの高感度、簡易、迅速なウイルス検出法の開発

Rep. 4, 4877, 2014; Takahashi, Virology 464-465,

や、BTP3-Neu5Acをプロトタイプとするプローブ

206-212, 2014; Takahashi, Biol. Pharm. Bull. 37,

自体の構造改良により、画期的なシアリダーゼ蛍

1668-1673, 2014; Takahashi, J. Virol. Methods

光イメージングの高性能化技術の開発を実施した。

209, 136-142, 2014; Takahashi, Biol. Pharm. Bull.

本研究成果は、シアリダーゼ蛍光プローブの高性

38, 1214-1219, 2015; Takahashi, PLoS One 10,

能化における改良基盤、インフルエンザウイルス

e0144038, 2015）。また、抗インフルエンザ薬（シ検出と共に薬剤耐性を同時判定する画期的検出法、アリダーゼ阻害剤）の存在下でBTP3-Neu5Acを反およびウイルス感染におけるシアリダーゼ機能研応させると、薬剤耐性インフルエンザウイルスや究の「ブレークスルー」技術を提供する。

その感染細胞のシアリダーゼ活性が維持されることを利用して、薬剤耐性ウイルス感染細胞を選択的に蛍光イメージングし、薬剤耐性株を高効率に分離する方法を確立した（Takahashi, PLoS One11, e0156400, 2016）。
感染者数、検査業務の従事者、研究者人口が極めて多いインフルエンザウイルスについて、医療、衛生検査、学術研究をマーケットに見据えて、蛍光イメージングプローブの画期的な応用技術を開発したい。医療・衛生検査への応用として、抗体に依存しないことから抗原性が大きく変化した新型ウイルスを検出可能で、現行の4種類の各抗イン

図 1. BTP3-Neu5Ac ベースの簡易迅速ウイルス検出法

倉田奨励金研究報告書｜2016 年度（第 48 回）助成

2．研究概要2. 1. 薬剤耐性を同時検出するインフルエンザウイ
ルスの簡易迅速検出法の開発

2. 2. シアリダーゼ蛍光イメージングプローブの性能改良基盤の確立
感染細胞内の局所的なシアリダーゼ活性を追跡

現在、薬剤耐性検出の主流であるオセルタミビするため、BTP3-Neu5Acの局所染色性を向上させ

ル耐性H275Y置換の遺伝子検出法は、検査対象外

たい。BTP3-Neu5Acの局所染色性は、BTP3の疎の遺伝子配列や未知の薬剤耐性変異には対応でき水性に大きく影響を受ける。BTP3の疎水性を増大ない。薬剤耐性ウイルスを簡易、迅速、高感度にさせるため、BTP3構造のBr部位に直鎖状炭化水検出できれば、薬剤耐性ウイルスの早期流行情報

素鎖を導入し（広島国際大学薬学部池田潔先生と大の取得、臨床における薬剤選択、未知の薬剤耐性

坪忠宗先生との共同研究）、A型インフルエンザウ変異の発見に貢献する。BTP3-Neu5Acの使用をベイルス感染細胞（感染16時間）に反応させた。炭ースとして、市販のインフルエンザ診断薬と同等

素10個以上の鎖導入はイメージング性能自体が減な感度をめざす簡易迅速検出法を確立することに少した。炭素8個の鎖導入が、シアリダーゼの局在した。

する感染細胞表面を最も明確にイメージングした

ウイルス検出感度の向上と検出時間の短縮のた（図3）。

め、タンパク質遠心濃縮膜フィルターを使用した

BTP3構造に不飽和三重結合鎖を導入して蛍光ウイルスの濃縮と、シアリダーゼ反応におけるカ性に影響する共役構造を改良し、蛍光強度の増大

ルシウムイオン濃度、pH、温度の最適化を行った。と蛍光検出の高感度化を試みた。炭素8個の三重結

最終的に、ウイルス遠心濃縮に1分間、BTP3-Neu合鎖の導入は、蛍光強度が増大し、感染細胞の蛍5Acを添加後のシアリダーゼ反応に15分間の計16光像が鮮明になった（図4）。感染4〜6時間後、シ分間で、携帯型UVライトの照射によりフィルター

アリダーゼは細胞内ゴルジ体に局在している。炭膜上のウイルスが蛍光検出された（図1）。

素鎖導入プローブでは、感染細胞内のゴルジ体とBTP3-Neu5Acベースの簡易迅速検出法により、思われる部位が蛍光化された。BTP3-Neu5Acの生薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出を試みた。

細胞内移行性は十分ではなかったが、炭素鎖導入10 µM抗インフルエンザ薬（ザナミビル、オセルタによるBTP3構造の疎水性増大は生細胞内移行性

ミビル、ラニナミビル、ペラミビル）の存在下での向上をもたらした。

BTP3-Neu5Acを反応させると、通常の薬剤感受性ウイルスのシアリダーゼ活性は阻害されて蛍光化しないが、薬剤耐性ウイルスのシアリダーゼ活性は阻害されずに蛍光化できる。BTP3-Neu5Acベースの簡易迅速検出法は、オセルタミビル耐性ウイルスのオセルタミビル耐性と新たにペラミビル耐性を蛍光検出できた（図2）。

図 3. 直鎖状炭素鎖

図 4. 不飽和炭素鎖導入

図 2. BTP3-Neu5Ac ベースの簡易迅速検出

導入プローブのプローブの局所染色性と法による薬剤耐性ウイルスの蛍光検出

局所染色性の向上

蛍光強度の向上（図中の赤枠内が薬剤耐性の蛍光検出）倉田奨励金研究報告書｜2016 年度（第 48 回）助成

3. 発表（研究成果の発表）
１．高橋忠伸、紅林佑希、大坪忠宗、池田
南彰、鈴木潔、隆：薬剤耐性インフルエンザの蛍光検出単離法、BIO Clinica 33 (3), 38-44(2018)
２．高橋忠伸、大坪忠宗、池田
紅林佑希、南彰、鈴木潔、和田裕久、隆：薬剤耐性インフ

ルエンザウイルスの簡易検出分離法の開発、USフォーラム2017（静岡）、2017年4月20日
３．高橋忠伸：インフルエンザウイルス感染とシアル酸分子種、第31回インフルエンザ研究者交流の会シンポジウム

シンポジウムI「糖鎖とウイルス」セッション（静岡）（招待講演）、2017
年6月8日
４．加藤大介、紅林佑希、高橋忠伸、鈴木隆：シアリダーゼ蛍光イメージング剤「BTP3-Neu5Ac」を用いた簡易・迅速・高感度ウイルス検出系の確立、第65回日本ウイルス学会学術集会（大阪）、2017年10月24日
５．高橋忠伸：インフルエンザウイルス形成を制御するスルファチド結合機構の解明と感染細胞を蛍光イメージングするシアリダーゼ蛍光化剤の紹介、薬力学研究会

講演会（東京）（招待講演）、2018年2月8日
6. Daisuke Kato*, Yuuki Kurebayashi*,
Tadanobu Takahashi* (*These authors
contributed equally to this work), Tadamune
Otsubo, Hitomi Otake, Mika Yamazaki,
Chihiro Tamoto, Akira Minami, Kiyoshi Ikeda,
Takashi Suzuki. An easy, rapid, and sensitive
method for detection of drug-resistantinfluenza virus by using a sialidase fluorescentimaging probe, BTP3-Neu5Ac. PLoS One
13(7), e0200761 (2018)
7. 高橋忠伸、紅林佑希、加藤大介、大坪忠宗、池田潔、南彰、鈴木隆：薬剤耐性インフル

エンザの単離法と簡易高感度検出法、BIO
Clinica 33 (9), 98-103 (2018)7