倉田奨励金研究報告書｜2017 年度（第 49 回）助成■受領№1351

CRISPR/Cas9 を使った高精度網羅的非コード RNA
ノックアウトスクリーニング法

代表研究者

関 元昭

千葉大学医学部附属病院がんゲノムセンター

1．研究⽬的近年、超並列シークエンサーを⽤いたRNAシー特任助教

2．研究内容2.1 2 本のガイド RNA によってプロモーター⽋損

クエンス技術の進歩とトランスクリプトームデーを誘導する lncRNA ノックアウト法

タの蓄積によって、ヒトでは60,000種類近くの⻑ORFを持たないlncRNAのノックアウトを実現

鎖⾮コードRNA（以下lncRNA）が存在し、組織するために、lncRNAのプロモーター領域を⽋損さ特異的あるいは腫瘍特異的な発現パターンを⽰すせることでlncRNAの転写を抑制することを⽬指ことが明らかになってきたが、機能の判明したした。本研究ではまず、⼤腸癌細胞株にて発現亢

lncRNAはごく⼀部分に過ぎない。従来lncRNAの進がみられたlncRNA（BNCRとする）について、機能解析に⽤いられてきたsiRNAやアンチセンス転写開始点を含むプロモーター領域に約300bp隔

DNA は 、 ス ル ー プ ッ ト が 低 い た め 多 種 類 のてて2種類のガイドRNAを設計し、Cas9と共に⼤lncRNAを網羅的に解析できなかった。また、コー

腸癌細胞株SW480にて強制発現させた。遺伝⼦発ディング遺伝⼦の網羅的な機能解析に⽤いられる現解析からプロモーター⽋損株におけるBNCRのshRNAライブラリーは、細胞核内で転写調節に関ノックアウトが確認され、さらに通常の培養条件与するlncRNAなどは抑制効果が低かった。近年登およびマウスゼノグラフトモデルにおいてBNCR場したCRISPR/Cas9システムはORFに数塩基のノックアウトによる増殖抑制効果が観察された。

挿⼊・⽋失を⽣じさせることでフレームシフトをこのことから、lncRNAのノックアウト細胞の樹⽴誘導し、タンパク質の機能⽋損を実現している。

やその細胞の機能解析において、プロモーター領全遺伝⼦に対応するガイドRNA（Cas9をゲノム上域の⽋損が有効な⼿段であると確認された。の標的領域へ誘導するためのRNA）をプールし、レンチウイルスによって⼀挙に細胞へと導⼊する

2.2 2 本のガイド RNA を発現するレンチウイルス

遺伝⼦ノックアウトライブラリーが開発されてい⽤プラスミドベクターの開発るが、ORFを持たないlncRNAについては機能を阻プロモーター⽋損によるlncRNAのノックアウ害できる可能性が低い。以上のように、これまでトスクリーニングをゲノムワイドに⾏うためには、に効率的かつゲノムワイドにlncRNAの機能を解2種類の配列からなるガイドRNAペアを⼤規模に析する技術は確⽴されていないことから、本研究合成し、ペアの組み合わせを維持したまま単⼀のでは、効率的かつゲノムワイドにlncRNAをノックレンチウイルスベクターにクローニングする必要アウトする技術の確⽴を⽬指した。

がある。本研究では、DNAマイクロチップ技術に倉田奨励金研究報告書｜2017 年度（第 49 回）助成よるDNA合成⻑の上限を考慮し、200塩基以下のリを⽤いてノックアウトスクリーニングにおける合成DNAからガイドRNAペアを発現するプラス解析パイプラインの構築を⾏った。膵臓癌細胞株

ミドを構築するクローニング⽅法およびそのためであるPanc1へ、18,053遺伝⼦に対する71,090種のベクター設計を⾏った。評価のためにガイド類のガイドRNAライブラリ（Toronto Knock-Out

RNAはAzamiGreenとmCherryのORFを標的としlibrary version 3; TKO-v3）をレンチウイルス感染たペアとし、AzamiGreenおよびmCherryを恒常的によって導⼊した。これらを薬剤選択によってノに発現するHEK293細胞をノックアウト効率測定

ックアウト細胞群を樹⽴し、低酸素、低栄養、低⽤の細胞株とした。まず、先⾏研究であるZhuら

pHのそれぞれの条件下で培養した。各培養条件下と同様の設計でガイドRNAペアおよびCas9を発で最⼤38⽇間に渡って経時的に細胞を回収し、細現させ、フローサイトメトリーによって蛍光タン胞集団に含まれるガイドRNA群について超並列パク質の消失を観察したところ、63~71%のダブシークエンサーを⽤いて解析した。まずスクリー

ルノックアウト効率を⽰した。次に、Dexitらあるニング系の確認として無処理群の細胞、0⽇⽬（刺いはDatlingerらによってCRISPRによるノックア

激開始⽇）と34⽇⽬を⽐較した。5%FDRを基準とウトとシングルセルトランスクリプトームを同時すると、428遺伝⼦あるいは4遺伝⼦に対するガイに解析する技術Perturb-seqあるいはCROP-seqなドRNAが培養後34⽇でそれぞれ減少あるいは増どが報告されたことから、このCROP-seqで使わ加しており、オントロジー解析からミトコンドリれたベクターにガイドRNAペアをエンコードし、ア遺伝⼦の発現調節に関わる遺伝⼦群が濃縮されノックアウト効率を測定した。その結果、ダブルていた。さらに428遺伝⼦のうち29遺伝⼦がHartノックアウト効率は30~31%と低く、直列に配しらの報告によるCore Essential Genes 2.0に該当したガイドRNAペアのうち、特に5ʼ側のガイドRNAており、⽣存必須遺伝⼦とされる遺伝⼦群を抽出の標的蛍光タンパク質がノックアウトされていなすることができた。次に、無処理群と各刺激処理いことが明らかとなった。細胞からゲノムDNAを群とを⽐較したところ、それぞれの刺激特異的な回収し、レンチウイルスによって挿⼊された配列パスウェイが抽出されこれらの詳細については現をPCRによって確認したところ、5ʼ側のガイド在解析中である。以上より、ノックアウトスクリRNA領域が⽋失しており、ガイドRNAペアの両プーニングのための解析パイプラインが構築され、ロモーター間での組換えによって脱落したものとlncRNAのノックアウトスクリーニングにおいて考えられた。そこで、さらにガイドRNAの配置、も適⽤できると考えられる。

あるいはウイルスベクターの構成要素である末端反復配列（LTR）や薬剤耐性マーカー遺伝⼦の配以上より、CRISPRを⽤いた⾮コードRNA ノッ置について検討を⾏い、最終的に71~75%のダブクアウトスクリーニング法の各要素技術についてルノックアウト効率を⽰すガイドRNAペア発現構築することができた。今後、ゲノムのアノテー⽤レンチウイルスベクターを開発した。

ション情報を元にガイドRNAペアを設計し、本研究で開発した技術群に適⽤することで、⾮コード

2.3 ガイド RNA ライブラリスクリーニングのための解析パイプラインの構築

RNAの⾼精度かつ網羅的な機能解析が実現すると考えられる。

ガイドRNAペアライブラリを⽤いてゲノムワイドなlncRNAのノックアウトスクリーニングを３．発表（研究成果の発表）

⾏うにあたり、まず従来型のガイドRNAライブラ

Masoudy M, Seki M, Yazdanparast R, Yachie N,

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Aburatani H. A genome-scale CRISPR/Cas9
knockout screening reveals SH3D21 as a sensitizer
for gemcitabine. (2019) Scientific Reports 9,19188,
https://doi.org/10.1038/s41598-019-55893-2