造血器腫瘍原因遺伝子NPM1c の腫瘍制御機構の解明およびNPM1c を直接標的とした新規治療薬の開発
Analysis of NPM1-mutanted (NPM1c) cells gene regulation andDevelopment of NPM1c inhibitor for NPM1c-dependent leukemia
所属機関： ベイラー医科大学
代表研究者氏名：米澤 大志
研究期間： 2021 年 4 月１日～2022 年 3 月 31 日
区分：個人 A
研究分担者：（個人 A の方は、以下の表を空白、あるいは、削除してください。
）
滞在研究機関： Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, One
Baylor Plaza, Houston TX 77030, the U.S.
Nucleophosmin1 (NPM1) localizes mainly nucleolus and plays important roles in ribosome synthesis and chromatinremodeling. NPM1 mutation, NPM1c, is small insertion in the terminal exon that result in getting nucleolar export
signal (NES). NPM1c interacts XPO1 and change its localization toward cytoplasm. NPM1c is also a promisingtherapeutic target in many hematopoietic malignancies. However, the precise mechanisms of NPM1c leukemia have notbeen fully understood and targeted NPM1c to treat leukemia has not established. In this study I have been trying tounderstand the molecular mechanisms of NPM1c leukemia and to develop MPM1c direct inhibitor.
海外研究活動概要

認められる為、NPM1cはNPM1c白血病において有望

Nucleophosmin (NPM1) は、主に核小体に局在するタな 治 療 標 的 で あ る (Brunetti .L., et al., Cancer

ンパク質で、リボソーム生合成やクロマチン形成なCell.2018) 。加えてXPO1阻害剤は存在するが、XPO1ど、多くの細胞内機構に関与している。また、NPM1が生体内に恒常的に発現している為、細胞内の多様の変異体であるNPM1cは、急性骨髄性白血病の主ななタンパク質の核外移行も阻害し、正常細胞にも一原因遺伝子として知られている。NPM1cはNPM1の定の毒性を示す。一方、NPM1c は、腫瘍細胞や前癌フレームシフト型変異体で、核外移行シグナル状態の造血系細胞のみに変異が認められる為、(NES) を 獲 得 し 、 核 外 移 行 タ ン パ ク 質 Exportin1

NPM1c を直接標的にする阻害剤の方がより、他の細(XPO1) と結合する。そして、NPM1cは核及び多く胞への影響が少なく、腫瘍を抑制できると考えられは細胞質へと移行する。その結果、NPM1c 保有細胞る。よって、NPM1cを直接標的とした阻害剤は、では、多くの腫瘍で異常な亢進を認めるhomeobox

NPM1c白血病に対して副作用軽減、併用及び根治療

cluster (HOX) 遺伝子の発現が上昇し、腫瘍化を引き法の可能性を含め、より良い治療法となる可能性が( 当 該 腫 瘍 を NPM1c 白 血 病 と 呼 ぶ )ある (Fig 1B) 。そこで申請者は、(A): NPM1c 白血(Uckelmann.J .H., et al., Science. 2020)。しかし、NPM1c病 に お け る HOX 遺 伝 子 の 制 御 機 構 の 解 明 (B):

白血病においてなぜHOX遺伝子の発現上昇が起こ

NPM1cを直接標的とした阻害剤の開発 を研究内容

るか、詳細な分子機構は不明である (Fig1 A)。また、及び目的とし、質量分析器 /低温電子顕微鏡

NPM1c白血病においてNPM1cの活性を下げること(Cryo-EM)/次世代シーケンサー/バーチャルスクリーや、XPO1の機能を阻害することで、腫瘍細胞の増殖ニング/などを駆使して研究を遂行している。

起こす抑制や腫瘍モデルマウスにおける生存の延長などが(B): NPM1c を直接標的とした阻害剤の開発
NPM1c自体が、NPM1cを起因とした白血病の良い治療薬となることから、NPM1cを直接標的とした阻害剤の開発に取り組んでいる。現在、NPM1c阻害剤を探索するために、NPM1c-XPO1の立体構造の同定をCryo-EM試みている。立体構造が同定され次第、NPM1cのXPO1ドッキングサイトに結合する化合物を、バーチャルスククリーニング及びサーマルシフトアッセイを用いて同定する。
今後の展望
米国滞在一年間の間で、本研究における実験系の準備および確立を行なってきた。現状としては、
NPM1c がもたらす NPM1c 白血病の、作用機序の手成果(A): NPM1c 白血病における HOX 遺伝子の制御機構の解明がかりが掴めた。また、NPM1c を直接標的とした阻害剤の開発のために NPM1c-XPO1 の立体構造の同定にも取り組んでいる。今後は、より詳細に分子レ

本研究では、NPM1c に相互作用するタンパク質

ベルで NPM1c の白血病制御機構を探索したいと考複合体の検出のために、Bio-ID と質量分析を組み合えている。具体的には、NPM1-XPO1 がどのようにわせることで取り組んだ。Bio-ID とは、ビオチンリして、HOX 遺伝子発現制御に関わるタンパク質と複ガーゼを用いて、リガーゼ近傍のタンパク質をビオ合体を形成して、さらに HOX 遺伝子領域に与える影チン化させる手法である。実際には、ビオチンリガ

響を検討したい。おそらく、HOX 遺伝子が上昇するーゼと NPM1c の融合タンパク質を急性骨髄性白血ことから、HOX 遺伝子転写領域において、HOX 遺病細胞株である OCI-AML3 細胞株に発現させた。さ伝子発現制御に関わるタンパク質と複合体を形成しらに、それら細胞株を核と細胞質画分に分けた。そた後、エピジェネティクス等の変化をもたらしていの結果ビオチン化タンパク質を核と細胞質画分両方ると推測される。なので、CHIP-seq や WGBS を用いに認めた。それらタンパク質を質量分析器にかけ、て、HOX 遺伝子転写領域のヒストンや DNA のメチ

NPM1c によりビオチン化されるタンパク質を複数レーションレベルを検討していきたいと考えている。

同定した。核と細胞質画分両方に既知の NPM1c のまた、NPM1c を直接標的とした阻害剤に関しては、結合タンパク質および核外移行誘導タンパク質であNPM1c に直接結合する化合物が同定され次第、る、XPO1 のビオチン化を確認した。さらに、核分

NPM1-XPO1 の結合を阻害するかどうか、さらに、画において、HOX 遺伝子発現制御に関わるビオチン

NPM1-XPO1 の結合を阻害する化合物に関しては、化タンパク質の同定に成功した。現在、CRISPR

OCI-AML3 細胞株の増殖能力に影響を与えるかなど

activation and interference システムを用いて、これらタンパク質の素となる遺伝子の転写を負又は正に制を検討していきたい。そして、ゆくゆくは、前臨床試験や臨床試験に臨める薬にと成長させて行きたい。

御し、HOX 遺伝子郡の発現レベルを検討するとともに、NPM1c 保有造血器腫瘍細胞株である OCI-AML3

研究の発表

細胞株の増殖能力を検討している。NPM1c は XPO1

口頭発表と結合することで、細胞質に局在を変化することが1.

白血病の発症に大きく関わると予想されていたが、誌上発表

今回の研究で興味深いことに、核内から細胞質に移1.

行する前の NPM1c が、HOX 遺伝子の発現上昇直接関与している可能性が示唆された。

なし- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - なし- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -