ミトコンドリアのリン脂質恒常性に必要な新規輸送因子の骨格筋形成における役割
A Role of a novel transport factor required for mitochondrial phospholipid
homeostasis in the skeletal myogenesis（日本脂質生化学会推薦）

代表研究者 獨協医科大学堀端 康博

Dokkyo Medical UniversityYasuhiro HORIBATA

Phosphatidylcholine (PC) is the predominant phospholipid (40-50%) in mitochondrial membranes, and isessential for not only compartmentalization of the organelle but also ATP production, thermogenesis, and regulationof apoptosis. Mitochondria lack enzymes to synthesize PC and therefore the lipid must be imported from theendoplasmic reticulum, the site of PC synthesis. StarD7 is a PC-specific lipid transfer protein required for themaintenance of mitochondrial PC level, respiration, and morphogenesis. In this study, we assessed the role of theprotein in skeletal myoblast differentiation using mouse myoblast C2C12 cells and human primary myoblasts.
Immunofluorescence and immuno-electron microscopy demonstrated that StarD7 was distributed in the cytosol,
inner mitochondria space, and outer leaflet of the outer mitochondrial membrane in C2C12 cells. The siRNAmediated knockdown of StarD7 in C2C12 cells and human primary myoblasts significantly impaired myogenic
differentiation and reduced the expression of myomaker, myomerger and PGC-1α. The reduction in mitochondrial
PC levels and oxygen consumption rates, decreased expression of myomaker, myomerger and PGC-1α, as well as
impaired myogenic differentiation, were completely restored when StarD7 was reintroduced into StarD7-knockout
C2C12 cells. These results suggest that StarD7 is essential for the skeletal myogenesis in mammals.

研究目的

Steroidogenic acute regulatory protein-related lipid

ミトコンドリアの膜構造は外部細胞質との仕分け

transfer (START) ドメインは、約 210 のアミノ酸で構に必要なだけでなく、ATP 産生、熱産生、アポトー成され、生体膜を構成するリン脂質、コレステローシスの制御など、ミトコンドリアの多様な機能にもル、セラミドなどの脂質分子と結合し、引き抜き、必須である。ミトコンドリアは内膜も外膜もリン脂輸送する活性を有する機能ドメインである。これま質二重層で構成されており、総リン脂質の 40-50％をで申請者は、このドメインを有するタンパク質の一ホスファチジルコリン（PC）が占めている。ところつである StarD7 に注目して解析してきた。本タンパが、ミトコンドリアには PC を合成する酵素が欠失

ク質は N 末端にミトコンドリア移行配列（MTS）を、している。
従ってミトコンドリアが必要とする PC は

C 末端側に PC 特異的な輸送活性を有する START ド脂質合成器官である小胞体（ER）から供給されていメインを持つ（Horibata, Y. and Sugimoto, H. J. Biol.

ると考えられている。これまで、この ER-ミトコン

Chem. 285, 7358-7365, 2010）。申請者らはこれまでのドリア間の脂質の輸送/移動は、両オルガネラの近接解析で、StarD7 は細胞質、ミトコンドリアの内部おによって形成される膜接触部位を経て行われると考よび外膜外葉に局在していることを明らかにした

えられているが、関与する因子や分子機構の全容は(Horibata, Y.et al. Sci. Rep. 7, 8793, 2017)。さらに StarD7

未だ多くが不明である。

を欠失したマウス肝癌由来細胞株 HEPA-1 では、ミトコンドリアの PC 量が減少するだけでなく、呼吸した。

機能の低下、ミトコンドリア ATP 生産能の低下、クリステ構造の異常、細胞増殖の低下などが生じるこ③

酸素消費速度（OCR）の測定とを見出した (Horibata, Y. et al. J. Biol. Chem. 291,

細胞外フラックスアナライザーXFp とミトコンド

24880-24891, 2016)。以上から StarD7 はミトコンドリ

リアストレスキットを用い、ミトコンドリアにおけアの機能維持に不可欠な因子だと考えられた。

る OCR を測定した。その結果、StarD7-KO の C2C12

ところで、脳、骨格筋、心筋などの組織は他と比細胞ではミトコンドリアの OCR が顕著に低下してべてエネルギー需要が大きく、その多くをミトコンい た 。 OCR の 低 下 は StarD7 を レ ス キ ュ ー し た

ドリアで合成される ATP に依存している。つまり、KO+StarD7 細胞では完全に回復していた。

これらの組織でミトコンドリアの機能が低下すると、強い障害を受けてミトコンドリア関連疾患のような④ミトコンドリアのリン脂質組成の解析病態が現れると考えられる。今回は骨格筋におけるパーコール/ナイコデンツの密度勾配法によりミStarD7 の役割を解明することを目的とし、マウス筋トコンドリアを単離した。リン脂質を Bligh and Dyer

芽細胞株 C2C12 細胞およびヒト初代筋芽細胞の法で抽出後、QTRAP5500 を用いた液体クロマトグラ

StarD7 を欠失すると筋分化がどのような影響を受けフィータンデムマススペクトリー（LC-MS/MS）で定るかを解析した。

量した。その結果、StarD7-KO 細胞では野生型細胞と比べ有意に PC 量が低下していた。ミトコンドリ

研究経過

アの PC 量の低下は KO+StarD7 細胞では野生型細胞① 免疫染色法を用いたトポロジー解析と同じ量にまで回復していた。

StarD7 の C 末端に myc タグを付加した発現ベク
ターを C2C12 細胞に発現し、固定後、ジギトニンま⑤

骨格筋分化誘導と筋分化の評価

たは Triton X-100 で膜透過処理を行った。前者は細C2C12 細胞あるいは初代ヒト筋芽細胞を、2%ウマ胞膜のみ透過し、後者はミトコンドリアを含めすべ血清を含む DMEM 培地で 2〜10 日間培養することての生体膜を透過する。ミトコンドリア膜に対するで筋分化を誘導した。筋分化の評価は、分化マーカ

透過効果は、内在性の TOM70（ミトコンドリア外膜）、ーである Myogenin や MHC6（Myosin Heavy Chain6）

YME1L1（ミトコンドリア膜間腔）、SDHA（マトリの発現量をウェスタンブロット、定量的 PCR、およクス）の染色によって評価した。その結果、StarD7 はび免疫細胞染色法で解析することで行った。さらに細胞質、ミトコンドリア内部および外膜外葉に局在細 胞 融 合 の 活 性 化 因 子 で あ る Myomaker やすることがわかった。さらに岡山大学・坂本浩隆先

Myomerger、ミトコンドリアの合成を促進する PGC-生との共同研究で金コロイド標識２次抗体を用いた1αの mRNA の発現量を定量的 PCR によって解析し免疫電顕を行い、ミトコンドリアにおける局在を詳た。

しく調べた。その結果、StarD7 はミトコンドリア内まず、野生型 C2C12 細胞の筋分化を 2〜10 日間誘部と外膜外葉に局在することが免疫電顕による解析導し、StarD7 の発現の経時変化を調べた。分化マーでも確認された。

カーである Myogenin や MHC6 は分化誘導の日数に従って発現量が増加したが、StarD7 は誘導前後でほ② StarD7 の欠失細胞の樹立とレスキュー実験

ぼ一定のままであることがウェスタンブロットと定CRISPR/Cas9 の 変 異 酵 素 を 用 い た DOUBLE

量的 PCR により明らかになった。

NICKASE DESIGN 法を使用し、StarD7 をノックアウ

続いて C2C12 細胞を 5 日間分化誘導し、筋分化のト（KO）した C2C12 細胞（StarD7-KO）を樹立した。

程度を MHC6 の免疫細胞染色で評価した。野生型細レスキュー実験は、StarD7-KO 細胞にヒト StarD7 を

胞では MHC6 で染色される多核の筋管繊維が観察さトランスフェクトし、G418 薬剤耐性セレクションにれた。一方、StarD7-KO 細胞は MHC6 でほとんど染より安定的に StarD7 を再発現する細胞（KO+StarD7）

色されず、筋管繊維の形成も著しく阻害されていた。

を単離した。ヒト初代筋芽細胞を用いた実験では、KO+StarD7 細胞では筋管繊維の形成が野生型細胞とsiRNA を用いて StarD7 をノックダウンする系を確立同程度にまで回復していた（Fig.1）。また StarD7-KO

細胞では Myogenin、MHC4、MHC6 がほとんど発現ていた。さらに、StarD7 が欠失した筋芽細胞ではマしておらず、Myomaker や Myomerger および PGC-1α

ウスでもヒトでも筋分化が顕著に阻害されたことかの発現も野生型細胞と比べて顕著に低下していた。

ら、本タンパク質は正常な筋形成に必須であることが実証された。
ミトコンドリアの機能が低下すると、なぜ筋分化が阻害されるのであろうか？その理由については以下のように考えられる。増殖期にある未分化の筋芽細胞では、活動に必要な ATP は主に解糖系によって賄われていると考えられている。しかし、筋管細胞に分化する際、エネルギー需要が増大し、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化による ATP 生産へと代謝系がシフトされる。今回、StarD7 の欠失によりミトコンドリアの機能が低下することがわかったが、これにより代謝シフトが阻害されていると考えられる。
その結果、筋特異的遺伝子の転写因子であるMyogenin の低下、細胞融合を促進する Myomaker やMyomerger の低下、さらにミトコンドリア新生を促す転写コアクチベーターPGC-1αの発現抑制が生じ、筋分化が強く阻害されたと思われる（Fig.2）。この考察は、例えばクロラムフェニコール、CCCP、ロテノンなどのミトコンドリア機能阻害剤で筋芽細胞を処理すると筋分化が強く阻害されるという過去の報告

次に、ヒト初代筋芽細胞の内在性 StarD7 を siRNAからも支持されると思われる。

を用いて発現抑制し、筋分化を誘導した。その結果、ミトコンドリアの PC 量の維持と筋形成阻害とのノックダウンした細胞ではコントロールと比較して関係については、以前に興味深い報告がなされていMHC6 で染色される筋管繊維の形成が顕著に阻害さる。骨格筋における PC の新規合成は、主に CDP-コれた。また C2C12 細胞の結果と同様に MHC4、MHC6、リン経路によって行われる。この経路ではコリンキ

Myomaker、Myomerger および PGC-1αの発現量が顕ナーゼによるコリンリン酸の合成によって開始され著に低下していた。

る。ヒトやマウスの骨格筋では、主にコリンキナー以上の結果から、StarD7 は筋芽細胞のミトコンドゼβが発現しているが、この酵素に遺伝的な変異があリア PC の保持ならびにミトコンドリアの機能に重ると、先天性筋ジストロフィーが発症することが知要で、本タンパク質が欠失すると筋分化が著しく阻られている。興味深いことに、このマウスの骨格筋害されることが明らかになった。

ではミトコンドリアの PC 量が顕著に低下し、ミトコンドリアの機能低下や形態異常が見られる。つま考察
ミトコンドリアは PC を自足できないため、必要な PC は脂質合成器官である ER からの供給に完全り、ミトコンドリアの PC 量の減少と筋形成不全についての結果は、この報告と今回の研究で一致している。に依存している。申請者はこれまでの研究から、ミトコンドリアミオパシーはミトコンドリア関連

StarD7 は ER-ミトコンドリア間において PC を輸送疾患の一つで、筋力低下や心機能の喪失などの症状する因子であると考えている。今回、筋芽細胞のを特徴とし、ミトコンドリア恒常性に必須な遺伝子StarD7 を欠失させると、ミトコンドリアの PC 量がの変異によって引き起こされる。近年、ミトコンド低下したことからも、この仮説は支持されたと思わ

リアミオパシーの原因となる遺伝子変異についてのれる。またこの細胞ではミトコンドリアの酸素消費報告数は増加しているものの、未だ多くは不明のまが顕著に低下し、ミトコンドリアの機能障害が生じまである。また現在、ミトコンドリアミオパシーに対する治療法はなく、対症療法で緩和するしかない。
これまでのところ、StarD7 の遺伝子変異によって発症するミトコンドリアミオパシーの症例報告はまだないが、本研究は StarD7 の変異が筋分化を阻害し、ミオパシーの病因になりうることを初めて実証した。
本研究は骨格筋形成のさらなる理解やミトコンドリアミオパシーの診断と治療の開発に貢献出来ると考えられる。

研究の発表
誌上発表
1.

Horibata, Y., Mitsuhashi, S., Shimizu, H., Maejima,

ポスター発表S., Sakamoto, H., Aoyama, C.,

1.

Ando, H., andHoribata, Y. and Sugimoto, H.: Identification,Sugimoto, H. : The phosphatidylcholine transfer

characterization, and functional analysis of a novel

proteinmyogenic

phospholipid carrier protein to mitochondria indifferentiation in mouse myoblast C2C12 cells andmammalian cells. [Best Poster Prize] 27th FAOBMB

human primary skeletal myoblasts. Sci. Rep. 10, 2845

& 44th MSBMB Conference IUBMB Special(2020)

Symposia (Kuala Lumpur, Malaysia) 2019.8.

StarD7

isimportantfor2.

堀端康博, 三橋里美, 清水裕晶, 青山智英子, 杉

口頭発表

本博之; 「ミトコンドリアのリン脂質恒常性に1.

堀端康博, 杉本博之； 「リン脂質輸送タンパク関わる輸送タンパク質 STARD7 は骨格筋分化に質 StarD7 がミトコンドリアにおいて果たす役必須である」第９２回日本生化学会大会,（横浜）

割」
第 62 回日本脂質生化学会プレシンポジウム,2019.9.

（東京）2020.5.
2.

堀端康博, 三橋里美, 青山智英子, 清水裕晶, 杉
本博之; 「筋分化におけるホスファチジルコリ
ン輸送タンパク質 STARD7 の役割の解析」第 61回日本脂質生化学会,（札幌）2019.7.