小胞体品質管理に関わる蛋白質ジスルフィド結合形成・開裂因子の構造的基盤
Structural basis of protein disulfide bond formation/cleavage factors
involved in ER quality control（日本生物物理学会推薦）
代表研究者：九州大学

稲葉謙次

Kyushu University Kenji Inaba

協同研究者：大阪大学

鈴木守

Osaka University Mamoru Suzuki

Endoplasmic reticulum (ER) is the organelle where membrane and secretory proteins are newlysynthesized. The Ero1-PDI system catalyzes protein disulfide bond formation in this organelle, thereby
sustaining oxidative protein folding. In some cases, however, proteins are terminally misfolded due toaberrantly formed disulfide bonds and eliminated by the mechanism called ER-associated degradation(ERAD). In this process, incorrect disulfide bonds of misfolded proteins are reduced by ERdj5, a memberof the PDI-family, resulting in the acceleration of their ERAD. Recently, we have succeeded in solving
crystal structures of mammalian Ero1 and ERdj5 at atomic resolution. Crystal structure of Ero1 revealed
how this enzyme generates protein disulfide bonds de novo in conjunction with a FAD cofactor andtransfers them to PDI specifically and effectively. Detailed structural and biochemical analyses of ERdj5
elucidated how this reductase facilitates the ERAD process in concert with EDEM1, an ERAD-enhancing
lectin that recognizes misfolded glycoproteins, and BiP, an ER-resident molecular chaperone thattransports reduced substrates to a retrotranslocation channel. These results provide structural andmechanistic basis of ER quality control ensured by Ero1 and ERdj5 in mammalian cells.

研究目的と背景結合の形成・異性化・開裂を触媒する酵素も近年、細胞の中で合成される蛋白質は必ずし含まれる。ジスルフィド結合は二つのシステも自発的に正しい立体構造を形成するわけでインのチオール基が二電子酸化を受けることはなく、幾つかの補助因子の助けを借りて正により形成される硫黄原子間の共有結合であしくフォールドし独自の機能を発揮するといり、蛋白質の立体構造形成ならびにその安定う概念が確立されつつある。それら補助因子化に深く寄与する。さらに最近の研究では、の代表的なものが分子シャペロンと呼ばれる

このジスルフィド結合の形成・開裂が様々な蛋白質群であり、その中には、ジスルフィド転写因子やシグナル伝達因子の活性制御にも関与しており、細胞の恒常性維持において重形に変換し）、ここで創りだされたジスルフィ要な役割を担うことが分かりつつある。

ド結合は PDI (Protein Disulfide Isomerase)に受小胞体は、細胞内で産生される全蛋白質け渡され、PDI がフォールディング途上の多の約３０％を占める分泌蛋白質や膜蛋白質がくの蛋白質にジスルフィド結合を導入する。

合成される重要な小器官である。小胞体内でこれと類似した酸化システムは広く生物界には、新生ポリペプチド鎖に糖鎖を付加する酵見られ、特に大腸菌における DsbB-DsbA 酸化素に加え、ジスルフィド結合を効率よく導入システムは、細胞生物学的にも構造生化学的することで蛋白質の高次構造形成を促す因子にも深く研究されている。

や誤ったジスルフィド結合の形成により誘起

我々は本研究期間中、ヒト細胞内での蛋されたミスフォールド蛋白質を還元すること白質ジスルフィド結合形成において中心的役で分解除去を促す因子が存在する。これら一割を担うフラビン酵素 Ero1 の結晶構造解析

連の酵素が正常に機能することにより、小胞に成功した。これにより、同酵素がαヘリッ体中の蛋白質の品質が管理される。一方でこ

クスに富んだ球状構造をもち、FAD 分子と共れらシステムの破綻はミスフォールド蛋白質役してジスルフィド結合を創りだすための反の過剰な蓄積につながり、アルツハイマー病応中心の構造と化学スキームを原子レベルでなどの神経変性疾患を誘起することが報告さ明らかにした (Fig. 1)。

れている。我々は最近、小胞体における蛋白質の高次構造形成とミスフォールド蛋白質の分解に関わる主要因子 Ero1 と ERdj5 の結晶構造を解くことに成功した。そして、構造情報に基づく系統的な in vitro および in vivo 解析により、小胞体品質管理を支えるジスルフィド結合形成・開裂因子の分子基盤を確立したので、以下報告する。

研究経過
1. 小胞体におけるジスルフィド結合形成
因子 Ero1 の分子基盤
小胞体における蛋白質ジスルフィド結合の導入は、主として Ero1-PDI 酸化経路に沿っ

Fig. 1 Crystal structure of human Ero1 (top) andて行われる。Ero1 は補酵素である FAD と共役

the close-up view of its FAD-containing reaction

してジスルフィド結合を創りだし（正確にはcenter (bottom)

酸素分子の酸化力をジスルフィド結合という興味深いことに、Ero1 はジスルフィド結制御に関わるだけでなく、PDI から直接電子合を創るに伴い活性酸素種の源である過酸化を受け取り、FAD を含む活性中心へ電子を伝水素を産出し、その量が細胞の許容範囲を超達する機能も兼ねている。したがって上述のえた場合に酸化ストレスを誘起することが知ジスルフィド結合の組換えによるループ領域られている。したがって Ero1 は、小胞体内のの可動性の制御は Ero1 分子内の電子移動反応レドックス環境を鋭敏にセンスし、自身の活の制御に直結し、これにより Ero1 の酸化活性性を制御する巧妙な機構を有する。このフィが厳密にコントロールされていることが明らードバック制御は Ero1 中に存在する四つのシかとなった。

ステイン（Cys94, Cys99, Cys104, Cys131）の間のジスルフィド結合形成パターンに依存す

2. 小胞体関連分解を促進するジスルフィド結る。すなわち、高活性状態では Cys94-Cys99合開裂因子 ERdj5 の分子基盤間で、不活性状態では Cys94-Cys131 間で（お小胞体は蛋白質ジスルフィド結合の形

そらく Cys99-Cys104 間も）それぞれジスルフ成に適した比較的酸化的な環境であるが、ィド結合は形成される。しかしながら、この

最近永田教授（京都産業大学）らのグルー

ジスルフィド結合の組換えによる活性制御のプは、小胞体中で生じたミスフォールド蛋分子機構の詳細は不明であった。そこで我々

白質のジスルフィド結合を特異的に還元は Ero1 の高活性状態および不活性状態両方のする酵素 ERdj5 を発見した。小胞体中で生結晶構造を解き、比較検討を行った。その結じたミスフォールド蛋白質は、小胞体関連

果、機能制御に関わる四つのシステインは全分解（ER associated degradation：ERAD）とて一つのループ領域に集中して存在し、Ero1呼ばれる機構によりサイトゾルへ逆輸送の全体構造はこれら二つの状態で大きな差異され、ユビキチンープロテアソームによるはなかった。しかしながら、二つの状態間の分解を受ける。この過程において、ERdj5

決定的な差はこれらシステインを含むループはミスフォールド蛋白質中の誤ったジスの flexibility の違いにあった。一次構造上近接ルフィド結合を還元し高次構造を解きほする Cys94-Cys99 間でジスルフィド結合が架ぐすことで膜透過しやすい形に変換し、小かる高活性状態の場合、このループ領域の電胞体関連分解を促進すると考えられてい子密度は全く観察されず、可動性が極めて高る。ERdj5 は、PDI ファミリーの因子の中いことが示唆された。これに対し、で最も大きい（~90 kDa）マルチドメイン蛋

Cys94-Cys131 間の long range のジスルフィド白質であり、一次配列情報から小胞体の代結合が架かる不活性状態の場合、このループ表的な分子シャペロン BiP との結合能を有領域の電子密度がはっきりと現れ、高活性状する DnaJ ドメインと、レドックス活性部態に比べ、より rigid になっていることが示唆

位（Cys-X-X-Cys motif）を有する四つのチされた。実はこのループ領域は、Ero1 の活性オレドキシンドメインからなると予想された。また ERAD 経路において、ミスフォと結合する。

ールド蛋白質の糖鎖を認識する因子ii) ERAD を促進するのに必須な ERdj5 の主EDEM1 と結合能を有することも知られてな還元活性ドメインは C 末端側クラスタいた。

ー中の Trx3 と Trx4 であり、これら二つ

そこで我々は、ERdj5 が促進する ERADの活性部位は非常に高い還元力を有する。

経路の作用機序を解明するため、ERdj5 全iii) ERdj5 により還元された基質は ATP 依長の結晶構造解析と系統的な生化学実験

存的に DnaJ ドメインに結合した BiP に受および細胞生物学実験に取り組んだ。

け渡され、BiP が還元された基質を逆輸

ERdj5 は、大腸菌中での発現効率が低く、送チャネルに運ぶ。

また高い凝集性をもつため、結晶化には多これら知見を統合し、EDEM1 によりリクルー

くの困難を伴ったが、徹底したサンプル調トされた基質は ERdj5 の C 末端側クラスター

整条件および結晶化条件の検討の結果、2.4により還元され、次に ATP 依存的に BiP へ受Å 分解能でその構造を解くに至った (Fig.

け渡され、最終的に逆輸送チャネルに運ばれ2)。構造解析の結果、ERdj5 は予測されたるという一連の小胞体関連分解経路の分子機

四つ の チオ レ ドキ シ ンド メ イン

構を解明するに至った。

（Trx1-Trx4）に加え、Trx1 と Trx2 の間に二つのチオレドキシンドメイン様ドメイン（ただし Cys-X-X-Cys モチーフをもたない）を含み、計６つのタンデムに並んだチオレドキシン様ドメインから成ることが分かった。しかもこれら６つのチオレドキシンドメインは全て一つの平面上にきれいに並び、４つのレドックス活性部位が全て DnaJ ドメイン側に位置するというユニFig. 2 Crystal structure of mouse ERdj5ークな構造をとっていた。さらに、ERdj5の全体構造が Trx2 と Trx3 を境に N 末端側クラスターと C 末端側クラスターの二つに分断されることも明らかとなった。

考察
以上解説した二つの研究成果は、小胞体中の蛋白質品質管理に関わる二つの重要な経これら構造情報を基に ERdj5 に関する路（高次構造形成の促進とミスフォールドタ

系統的な機能解析を進め、以下の重要な知ンパク質の分解）の作用機序を分子構造レベ見が得られた。

ルで解明するものであり、国内外で活発に研i) ミスフォールド蛋白質をリクルートした究が進められている小胞体品質管理の学問分

EDEM1 は ERdj5 の C 末端側クラスター野において大きく貢献するものと期待している。さらに本研究で得られた知見は、細胞内Asian Crystallographic Association, Busan,の蛋白質恒常性維持機構の破綻に起因する

Korea, 2010

種々の疾病の分子レベルでの成因解明さらには治療戦略の開発にも将来的にはつながり得

誌上発表

るものであろう。

1. Inaba, K.*, Murakami, S., Nakagawa, A., Iida,

現在、ほ乳類細胞の小胞体中には、PDI

H., Kinjo, H., Ito, K. and Suzuki, M. Dynamic

ファミリーの因子が 20 種類近く同定されてnature of disulfide bond formation catalysts

いるが、その多くについて具体的な機能は依

revealed by crystal structures of DsbB.

然未解明である。また何故これほど多くのEMBO J 28, 779-791, 2009

PDI ファミリー因子が存在する必要があるの

2. Inaba, K.* Disulfide bond formation system inか、その理由も全く不明である。今後、これ

Eschericia coli. J. Biochem. 146, 591-597,

ら因子の具体的な生理的機能、機能発現制御

2009

メカニズム、さらには因子間の相互作用ネッ

3. Inaba, K.*, Masui, S., Iida, H. Vavassori, S.,

トワークを深く究明することにより、細胞がSitia, R. and Suzuki, M. Crystal structures of

長い進化の過程で確立した蛋白質品質管理の

human Ero1a reveal the mechanisms of仕組みをさらに深く理解していきたい。

regulated and targeted oxidation of PDI.
EMBO J 29, 3330-3343, 2010

研究発表

4. Inaba, K.* Structural basis of protein disulfide

口頭発表bond generation in the cell. Genes to Cells, 15,

1. Inaba, K. Crystal structures of mammalian935-943, 2010humanEro1a andERdj5, the enzymes

5. Hagiwara, M., Maegawa, K., Suzuki, M.,involved in ER quality control. Gordon

Ushioda, R., Araki, K., Matsimoto, Y., Hoseki,

Research Conference on thiol-based redox

J., Nagata, K.* and Inaba, K.* Structural basis

regulation & signaling, Lucca, Italy, 2010of an ERAD pathway mediated by the

2. Inaba, K. Structural basis of regulated protein

ER-resident disulfide reductasse ERdj5. Mol.

disulfide bond formation in human cells. The
3rdinternational

symposiumon

proteincommunity, Nara, Japan, 2010
3. Inaba, K. Structural basis of an ERAD pathway
mediated by the ER-resident protein disulfide
reductase ERdj5. The 10th conference of theCell 41, 432-444, 2011