倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1514

ゲノム編集法と一細胞 RNA-seq 解析を融合した疾患関連 SNP
スクリーニング法の開発
北條宏徳

東京大学・大学院医学系研究科疾患生命工学センター臨床医工学部門

准教授

Development of a screening method for disease-related
SNPs by combining genome editing methods withsingle-cell RNA-seq analysis
Hironori Hojo,
Laboratory of Clinical Biotechnology, Center for Disease Biology and Integrative Medicine,
Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, Associate Professor

本研究では、ゲノムワイド関連解析（Genome Wide Association Study；GWAS）により骨疾患と関連が示唆される一塩基多型（SNP）に対して、ゲノム編集と一細胞 RNA-seq を統合したエンハンサースクリーニング法を用いて、表現型に寄与する SNP の選別を行った。本解析により、有望な候補としてエンハンサー Enh1 を同定した。
今後 Enh1 の骨疾患疾患の寄与を解析する予定である。
To identify single nucleotide polymorphisms（SNPs）that cause bone diseases, we focused on the Genome WideAssociation Study（GWAS）and performed enhancer screening that integrates genome editing and single cell RNAseq. This analysis identified enhancer Enh1 as a promising candidate. In vitro luciferase assay showed that reporter
activity driven by Enh1 was specifically activated in osteoblasts, not in fibroblasts. We plan to further analyze thecontribution of Enh1 to bone diseases in the future.

1．研究内容てきた（Nat Genet. 49（12）: 1664, 2017）。そこで

1.1 背景本研究では、研究代表者がこれまでに取り組んで近年、人の遺伝病や生活習慣病を対象としたゲ

きた、ゲノム編集と一細胞 RNA-seq を統合したエノムワイド関連解析（Genome Wide Association

ンハンサースクリーニング法を用いて、GWAS-Study；GWAS）により、疾患との関連が示唆されSNP データから表現型に寄与する SNP を効率的る一塩基多型（SNP）に関するビックデータが蓄に選別する手法の開発を行った。さらに、その積している。これらのデータの多くは一般公開さ

proof of concept を示すため、骨格系疾患に関するれ、情報を自由に使えるものの、GWAS-SNP デー

GWAS-SNP データベースから病因となる SNP のタベースから、病気の原因となる SNP を選別する同定を目指した。

手法はほとんど開発されていない。最近の研究で、これら疾患と関連する SNP（GWAS-SNP）の多く

1.2 方法が遺伝子制御領域であるエンハンサー領域に集積

1.2.1. ヒト SNP 関連骨発生エンハンサー候補選定していることから、SNP によるエンハンサー活性

ヒト GWAS-SNP データとヒト骨芽細胞エンハンの変化が疾患と深く関連することが明らかになっサーデータセットの統合解析により、骨関連疾患

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2021 年度（第 53 回）助成への関与が疑われる SNP の中で、エンハンサー領域に位置する候補を選定した。

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ヒト骨芽細胞エンハンサープロファイルとして、研究代表者らが開発したヒト骨発生モデルを用いた。オープンクロマチンと遺伝子発現解析を一細1.2.2. ガイド RNA（gRNA）レンチウイルスラ胞レベルで同時に解析可能なシングルセル多層解

イブラリーと CRISPR レポーター細胞の析（scMultiome）を行った。オープンクロマチン作製領域には複数の転写因子が作用し、エンハンサー各エンハンサー候補領域を標的とするガイド活性と正の相関を有することが知られている。本RNA ウ イ ル ス ラ イ ブ ラ リ ー の 作 製 の た め、解析を通して骨芽細胞におけるエンハンサー群をCROPseq ベ ク タ ー（Nature Methods 14: 297 –同定した。本データセットと SNP データセット301, 2017）を用いた。Cas9 が恒常的に発現する骨を、BEDTools（https://bedtools.readthedocs.io/芽細胞株を用いた。骨芽細胞の分化過程を蛍光タen/latest/）により intersection を行い、SNP を有ンパク質で可視化しるため、骨芽細胞特異的レするエンハンサー群を同定した。

ポーター活性を有する Col2.3Ob の利用を検討した。

1.3 2. ガイド RNA（gRNA）レンチウイルスラ
イブラリーと CRISPR レポーター細胞の1.2.3. エンハンサースクリーニングおよび機能検証作製樹立した CRISPR 細胞に gRNA ウイルスライ

ヒト間葉系細胞の safe harbor 領域に Col2.3Ob-ブラリーを感染させた後、骨芽細胞への分化誘導

GFP 細胞をノックインした細胞を作成した。しかを行い、細胞を単離した。CROPseq ベクターにし、骨芽細胞分化誘導前から GFP 陽性細胞が認めはピューロマイシン耐性遺伝子がコードされていられ、スクリーニングに用いることは不適切である。そのため、ウイルス感染細胞をピューロマイると判断した。そのため、本研究では、既にスクシンにより選別した。その後、リコンビナントヒ

リーニングで機能することを確認していた、マウト Bone morphogenetic protein（rhBMP2）を 含ス骨芽前駆細胞に Cas9 が恒常的に発現している、

む骨芽細胞分化誘導培地で一週間培養し、骨芽細Cas9-MC3T3E1 細胞を用いることにした。1.3.1

胞分化誘導を行った。次に、10x Genomics 社ので同定した骨格系疾患に関連する SNP を有する骨Chromium システムによる一細胞 RNA-seq 解析を芽細胞エンハンサー候補領域の中で、マウスにお行った。有望エンハンサーについては、機能検証

いても配列が保存された有望領域 50 領域選定し、としてルシフェラーゼアッセイを行った。

50 領域に対するガイド RNA を設計した。各 gRNA配列を CROPseq ベクターにクローニングした。

1.3 結果1.3.1 ヒト SNP 関連骨発生エンハンサー候補選定

1.3.3. エンハンサースクリーニングおよび機能検証

ヒト GWAS-SNP データとして、GWAS catalog

Cas9-MC3T3E1 細 胞 に CROPseq ベ ク タ ー 由（https://www.ebi.ac.uk/gwas/）データベースから

来 レ ン チ ウ イ ル ス を 感 染 さ せ た。薬 剤 セ レ ク

骨関連疾患との関与が疑われる SNP プロファイル

ションおよび骨芽細胞分化誘導を行った後、10xを取得した。“bone density”, “bone disease”, “boneGenomics 社の Chromium システムによる一細胞mineral content measurement”, “bone fracture” をRNA-seq 解析を行った。本解析では、一細胞ごと含む 10 個のカテゴリー中で報告があった SNPに Chromium システムによる一細胞分子バーコーセットを用いた。

ド付与を行った後、遺伝子発現解析を行うことで、

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各分子バーコードに対する遺伝子発現プロファイ

2.2. Shoichiro Tani, Hiroyuki Okada, Masahide

ルと gRNA プロファイルを取得可能である。バSeki, Yutaka Suzuki, Taku Saito, Sakae

イオインフォマティクスの手法を用いて、各細胞

Tanaka, Ung-il Chung, Hironori Hojo andにおける Genotype（エンハンサー欠損部位）と、Shinsuke Ohba: Elucidating Gene RegulatoryPhenotype（遺伝子発現プロファイル）を対応付Networks

けることで、どのエンハンサー候補群が、骨芽細Development by Integrating a Model of胞の分化に寄与するか絞り込んだ。その結果、有Human Endochondral Bones and Single-cell

望な候補としてエンハンサー Enh1 を同定した。

Multiomics, ASBMR 2022, 2022/9/9, Austin,

Enh1 の機能検証を行うため、Enh1 配列を有する

USA.

Underlying

HumanSkeletal

ルシフェラーゼレポーター DNA を構築した。線

2.3. Shoichiro Tani, Hiroyuki Okada, Masahide

維芽細胞と骨芽細胞を用いてレポーターアッセイ

Seki, Yutaka Suzuki, Ung-il Chung, Hironoriを行ったところ、線維芽細胞および分化誘導前のHojo and Shinsuke Ohba: Elucidating Gene

骨芽細胞に比べて、分化誘導後の骨芽細胞ではレRegulator y Networks Underlying Human

ポーター活性が顕著に促進することが確認された。

Skeletal Development by Integrating SingleCell Dynamics of Chromatin Accessibility andGene Expression, ISSCR 2022, 2022/6/17,

1.4 考察本研究により、骨格系疾患 SNP と関連するヒト骨芽細胞エンハンサーを同定した。今後、上述のルシフェラーゼアッセイにおいて、SNP の 1 塩基置換を導入し、SNP によりレポーター活性が変化するか検討する予定である。有望な結果が得られた場合は、レポータトランスジェニックマウスを作出し、同定したエンハンサー活性の組織特異性の検討に進む予定である。また、同定したエンハンサー内で、どのような転写因子が作用するか明らかにするため、JASPAR を用いたモチーフ解析を検討する。今回樹立できなかったヒト間葉系細胞の CRISPR レポーター細胞については、異なるレポーター遺伝子や、PiggyBac システムの利用を検討する予定である。

2．発表（研究成果の発表）
2.1. HironoriHojo: Modeling of skeletal

development using human pluripotent stem
cells and exploring the gene regulator ynetworks,

TheKoreanSocietyfor

Biotechnology and Bioengineering（KSBB）
2023, 2023/4/14, Jeju, Korea.

San Francisco, USA