倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1501

血管の新機能を標的とした、白血病に対する革新的治療戦略の創出
木戸屋浩康

福井大学学術研究院 医学系部門 血管統御学分野

教授

Research for leukemia therapy targeting novel
function of blood vessels
Hiroyasu Kidoya,
Department of Integrative Vascular Biology, Faculty of Medical Sciences, University of Fukui,
Professor

本研究では白血病の血管に注目し、新しいコンセプトによる治療薬開発を目指して研究を進めた。血管は、酸素や栄養分の供給路として働くことが知られているが、それに加えてアンジオクラインファクターと呼ばれる分子群を産生することで組織の制御に働くことが明らかになりつつある。解析を進めたところ、白血病では骨髄血管の異常化が誘導されており、この異常化した血管から産生されるアンジオクラインファクターが白血病の進展・再発に働くという「負のスパイラル」が存在する可能性を見出した。
In this study, we focused on the bone marrow microenvironment in the progression of leukemia, and analyzed
tumor blood vessels, which are a common therapeutic target in the treatment of solid tumors. We performed
analysis using Regnase-1 deficient mice that spontaneously develop acute myeloid leukemia. It has been shown thatmice lacking Regnase-1 specifically in the hematopoietic cell lineage exhibit AML-like symptoms. Using these micethat spontaneously develop leukemia, we proceeded to analyze the structural and functional changes in the bonemarrow vasculature in leukemia. The results showed that an increase in the number of blood vessels and abnormal
formation of vascular structures in the bone marrow occurred with the onset of leukemia. These results indicate that
abnormal bone marrow vascularization is associated with leukemia progression.

1．研究内容殖と細胞形質の変化が誘導されることを確認して本研究では、革新的な白血病の進展・再発抑制いる。これらの分子は白血病との関連性がこれま法を開発するため、白血病の骨髄で認められる異で示されておらず、新たな治療標的となる可能性常血管とアンジオクラインファクターを標的としがある。本研究では、これらのアンジオクラインた新規治療法の開発を進めた。申請者は白血病をファクターを標的とすることで「白血病細胞 - 骨促進するアンジオクラインファクターの同定のた髄腫瘍血管の負のスパイラル」を解消する効果的め、正常な骨髄血管内細胞と比較して白血病におな白血病の治療法開発を目指す。

いて高発現する分泌分子をインフォマティクス解析にて探索した。その結果、AF1 と AF2 という 21.1 白血病モデルマウスを用いた骨髄血管の解析つのアンジオクラインファクターの候補を得るこ

急性骨髄性白血病を自然発症する Regnase-1 遺とができた。さらに、in vitro での造血幹細胞の培伝子欠失マウスを用いて解析を進めた。Regnase-1

養系において AF1 と AF2 を添加すると、過剰な増は RNA 分解酵素で、標的とする mRNA の 3′ UTR

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自然科学・工学－健康・医療：1 年助成に存在する Stem-loop 領域を介して mRNA を分解いるかの検討を進めた。一般的に固形がんの進展する働きを持つ分子である。血球細胞系特異的にに伴って形成される腫瘍血管は、がん組織に酸素Cre を発現する Vav1-Cre マウスを用いることで血と栄養を供給することでがんの増殖を支えている球細胞系特異的に Regnase-1 を欠損するマウスが、非固形がんである白血病ではがん組織が拡大（Vav1-Cre: Regnase-1flox/flox）を作成すると、成長化していくことがないため、腫瘍血管が固形がんに伴って徐々に体重の減少が認められ、生後 8 週とは異なる役割を担っていると考えられる。注目から 12 週頃にほぼ全てが死亡する。その死因につしたのはアンジオクラインファクターと呼ばれる

いて解析を進めると、著しいリンパ節腫脹と脾腫血管から産生され周辺組織に作用する分子群であおよび、末梢血中に特徴的な芽球の出現が認めらる。骨髄の血管ニッチでは、血管がアンジオクラれるなど AML 様の症状を呈していることが明らインファクターを産生することで造血幹細胞の分かとなった。また、通常では生体内で増殖するこ化や増殖を制御しており、造血系の恒常性維持にとがない長期造血幹細胞（Lineage 陰性、cKit 陽働くことが知られている。申請者は、白血病細胞性、Sca1 陽性、CD34 陰性、Flt3 陰性）が、著しが骨髄血管の異常化を導き、異常化した血管からく増加していることが明らかとなった。この白血産生されるアンジオクラインファクターが白血病病を自然発症するマウスモデルを用いて、白血病の進展・再発に働くとのではと考え解析を進めた。

における骨髄血管の構造的および機能的な変化の白血病マウスの異常化した骨髄血管から特異的に解析を進めた。マウスが白血病を発症した後に大産生されるアンジオクラインファクターを同定す

腿骨を回収して組織切片を作成し、血管内皮細胞るため、Regnase-1 遺伝子欠失マウスの骨髄からのマーカーである CD31 と Endomucin に対する蛍血管内皮細胞を回収して RNA-seq 解析を進めた。

光免疫染色を行うと、白血病の発症に伴って骨髄その結果、多くの遺伝子発現が有意に変化してい中の血管数の増加や血管構造の異常が起きており、ることが明らかとなり、その中でも細胞外に分泌いわゆる「腫瘍血管化」が起きていることが確認される、もしくは細胞膜に発現する分子を選定しできた。特に活性化した血管内皮細胞に特異的にた。得られた候補遺伝子について、骨髄血管内皮発現する Endomucin が大多数の血管において高発細胞に対する RT-PCR による遺伝子発現解析や、現しており、血管内皮細胞に大きな特性変化が起骨髄組織切片に対する特異的抗体による免疫染色きていることが明らかとなった。このような白血を行うことで 2 つの候補分子（AF1 と AF2）を選病に伴う骨髄血管の変化は、Regnase-1 遺伝子欠定した。これらのアンジオクラインファクターの失マウスにおいて特異的に起きる現象ではなく、白血病進展への影響を検討するため flox マウスを

MML-AF9 細胞もしくは H9M1 細胞を C57BL/6 マ作成し（AF1flox/flox および AF2flox/flox）、血管内皮細ウスへ移植することによって作成した白血病モデ胞にて特異的に Cre 組換え酵素を発現するマウス

ルマウスにおいても同様に確認さらた。これらの（VEcadherin-Cre）をかけ合わせて血管内皮細胞に結果から、白血病の発症・進展により、骨髄微小て特異的に遺伝子を欠損するマウスを作成した環境の変化が誘導され、その結果として骨髄血管（VEcadherin-Cre; AF1flox/flox お よ び VEcadherin-も異常化していることが示された。

Cre; AF2flox/flox）。このアンジオクラインファク
ター欠損マウスに、Regnase-1 遺伝子欠失マウス

1.2 白血病の進展における異常骨髄血管の役割の造血細胞を移植することで白血病を誘導したと白血病の進展に伴って構造的に異常化した骨髄ころ、造血細胞の異常増殖やリンパ節腫脹および血管が、機能的にも白血病の進展に影響を与えて脾腫の抑制が認められた（図 1）。さらに、生存期

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図 1．AF1 の欠損マウスでは白血病の進展を抑制される。
a）Reg1KO 白血病細胞の移植では移植した造血幹細胞の異常増殖と脾腫が認められるが（Reg1KO → Control 群）、血管内皮細胞にて AF1 を欠損するマウス（Reg1KO → AF1KO 群）ではそれが抑制されている。得られた結果はstudent’s t-test によって検定した。*p＜0.05。
b）白血病の進展による脾臓の肥大化も同様に抑制される。（スケールバー：1 cm）

間も有意に延長することが確認された。

2．発表（研究成果の発表）
本研究は、公益財団法人日立財団からの助成を

1.3 考察と展望賜りましたことで大きく進展させることができま

かつては「不治の病」とされていた白血病は、した。研究へのご理解とご協力に厚く感謝申し上

抗がん剤や分子標的療法の発達に伴い、今では治げます。なお、本研究成果は現在投稿準備中です。

療可能な病となりつつある。しかしながら、寛解状態へ治療した後に生じる高い再発率のリスクは、

2. 1 論文発表

依然、白血病患者に不安と恐怖を与えている。そInukai K, Kise K, Hayashi Y, Jia W, Muramatsu F,のため、再発のメカニズムを明らかにし、根治をOkamoto N, Konishi H, Akuta K, Kidoya H,

達成することが、白血病治療の現場から強く望ま

Takakura N. Cancer apelin receptor suppresses

れている。本研究の結果から、がん細胞自身を標

vascular mimicr y in malignant melanoma. Pathol

的とした治療に加え、進展や再発の要因として潜Oncol Res. 29: 1610867. 2023.

在する骨髄腫瘍血管やアンジオクラインファク

Takara K, Hayashi-Okada Y, Kidoya H.

ターを制御することによる白血病の治療法の可能

Neurovascular Interactions in the Development of性が示された。しかしながら、本研究ではマウス

the Vasculature. Life（Basel）. 13（1）: 42. 2022.

白血病モデルを主に用いて解析を行っており、白Morita M, Yoneda A, Tokunoh N, Masaki T,血病の骨髄における血管の変化や異常なアンジオ

Shirakura K, Kinoshita M, Hashimoto R, Shigesada

クラインファクターの産生がヒト白血病でも同様

N, Takahashi J, Tachibana M, Tanaka S, Obana M,に起こるのか検証を進める必要がある。今後、さHino N, Ikawa M, Tsujikawa K, Ono C, Matsuuraらなる解析が進むことで、骨髄腫瘍血管やアンジY, Kidoya H, Takakura N, Kubota Y, Doi T,

オクラインファクターを標的とした治療薬の開発

Takayama K, Yoshioka Y, Fujio Y, Okada Y.

へと繋がることを期待する。

Upregulation of Robo4 expression by SMAD
signaling suppresses vascular permeability and倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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mortality in endotoxemia and COVID-19 models.
Proc Natl Acad Sci U S A. 120（3）: e2213317120.
2023.
2. 2 学会発表
木戸屋 浩康．造血系の正常と異常を制御するアンジオクラインシステム．第 44 回日本分子生物学会
年会．幕張メッセ．12 月 2 日、2022 年
木戸屋 浩康．アンジオクラインシステムによる正常と異常の制御．第 6 回 Neuro-Vascular 研究会．
まつや千千．2 月 20-21 日、2023 年

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