原著論文
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藻類 Jpn. J. Phycol. (Sôrui) 68: 153-156, November 10, 2020

千葉県産の緑藻ボルボックスの 1 種の形態と分類
野崎久義 1*・佐野郷美 2・手塚幸夫 3・大藪健 4
東京大学大学院理学系研究科（〒 113-0033 東京都文京区本郷 7-3-1）
東邦大学理学部教職課程（〒 274-8510 千葉県船橋市三山 2-2-1）
3房総野生生物研究所（〒 298-0004 千葉県いすみ市大原 7952）
4
夷隅郡市自然を守る会（〒 299-4501 千葉県いすみ市岬町椎木 426-5）
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Hisayoshi Nozaki1*, Satomi Sano2, Yukio Tezuka3 and Ken Ooyabu4: Morphology and taxonomy of a species of Volvox (Chlorophyceae) from
Chiba Prefecture, Japan Jpn. J. Phycol. (Sôrui) 68: 153-156, November 10, 2020
A species of Volvox (Chlorophyceae) was studied by using clonal cultures newly established from a paddy field soil collected in Isumi,
Chiba Prefecture, Japan. Thick cytoplasmic bridges between somatic cells in asexual spheroids of this species indicated that the species
belongs to Volvox sect. Volvox. Monoicous sexual spheroid characteristics and zygote spine morphology of this alga were similar to those of
two Japanese species of this section, V. ferrisii and V. kirkiorum. On the other hand, the zygote number in a sexual spheroid and number ofdaughter spheroids in a parental spheroid were different between the present alga and the latter two species previously reported. However, theITS sequence of nuclear rDNA unambiguously resolved that the Volvox species from Chiba Prefecture belongs to V. ferrisii. This is the firsttaxonomic identification at species level on the genus Volvox originating from Chiba Prefecture, Japan.
Key Index Words: asexual spheroid, molecular phylogeny, monoicous species, morphology, sexual spheroid, taxonomy, Volvox, Volvox
ferrisii, Volvox sect. Volvox
Graduate School of Science, The University of Tokyo, Hongo 7-3-1, Bunkyo, Tokyo 113-0033, Japan
Faculty of Science, Toho University, Miyama 2-2-1, Funabashi, Chiba 274-8510, Japan
3
Boso Wildlife Research Association, Ohara 7952, Isumi, Chiba 298-0004, Japan
4Isumigunsi Nature Preserve Association, MisakichouShiigi 426-5, Isumi, Chiba 299-4501, Japan*Author for correspondence: nozaki@bs.s.u-tokyo.ac.jp
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緒言

一 人 手 塚 が 耕 作 す る 無 農 薬 無 肥 料 の 水 田（35º15'46"N,く「コロボックルの研究ですか」と言われる。ボルボック

シャーレ（90 mm x 20 mm）に入れ，蒸留水約 20 mL を的な生物であり，湖や水田等の淡水域に実在する群体性ともh）で培養した結果，10 日後にボルボックスの遊泳球体が発生した。これをピペット洗浄法で分離し，AF-6 培地（加藤1982）で培養株 3 株（2018-1031-VVx1 ～ VVx3）を確立した。そのうちの 1 株（2018-1031-VVx2）を形態観察と塩「ボルボックス」は一般の人にはなじみが薄いようで，よス Volvox は虫眼鏡でみると小さな緑色の妖精のような魅力言われている多細胞球体の緑藻類の 1 属であり，分類学的にはリンネが 1758 年に属として設立している（野崎 2000）。

東京大学の一般公開やオープンラボではボルボックスは女子高生に人気があり，「自分で培養したい。種を調べたい。」という問い合わせがある。日本各地からこれまでに 8 種と，形態的に特異であるが Volvox ferrisii Isaka, Matsuzaki &Nozaki に非常に近縁な Volvox sp. Sagami が報告されている（野崎 1991, Isaka et al. 2012, Nozaki et al. 2015, 2016,
Kimbara et al. 2019）。千葉県からは君津市亀山湖の未同定種が報告されているが（よしさん 2007），ボルボックスの種レベルでの報告は千葉県からはこれまでないようである（野崎 1998）。

今回千葉県いすみ市からボルボックスを採取し，培養条件下で無性群体と有性群体を観察し，分子系統解析と照らし合わせて種同定を実施したのでその結果を報告する。

材料と方法

2018 年 10 月 13 日， 千 葉 県 い す み 市 新 田 の 著 者 の140º22'30"E） か ら 表 土 を 採 取 し た。 乾 燥 後， 約 0.5 g を

加 え て 25 ℃ 明 暗 条 件 下（80–130 μ mol m − 2 s − 1，14:10

基配列決定に用いた。ボルボックスの性誘導は有機物を多く含む培地で培養する必要があるため，培養した親球体から遊泳する直前の娘球体をピペットで放出させて再分離してバクテリアを排除し（Isaka et al. 2012），VTAC 培地（Kawachiet al. 2013）を用いて上記明暗条件で培養した。2018-1031VVx2 株は国立環境研究所微生物系統保存施設（Kawachi etal. 2013）に寄託し，NIES-4465 として公開した。光学顕微鏡観察には BX60 microscope（Olympus, Tokyo, Japan）を用いた。観察にはビニールテープ法（野崎 1999）を使用し，運動を止めて写真撮影した。球体の細胞数は表面積（S = 4π R2）に相当するので，球体の正中断面周囲の細胞数（L =2 π R）を計数して概算（S = L2/ π）した（Nozaki 1988）。
分子系統解析には核 rDNA ITS 領域（ITS-1, 5.8S rDNAand ITS-2）を用いた。方法は Kimbara et al. (2019) に準じ て， 細 胞 破 砕 液 を DNA サ ン プ ル と し，Coleman et al.

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野崎らFigs 1–3. Asexual spheroids of Volvox ferrisii from Chiba, Japan. 1. Semi-optical section of spheroid. 2. Surface view of somatic cells interconnected with one another by
thick cytoplasmic bridges (asterisks). 3. Side view of anterior somatic cells. Note that the cells are ellipsoidal or ovoid.

(1994) のプライマー，KOD One PCR Master Mix（Toyobo,Osaka, Japan）で PCR 増幅した DNA フラグメントをダイ色で厚い細胞壁を持ち，細胞壁は鋭い棘で覆われていた。受精卵の棘を除いた直径は 33–38 μ m であった。棘は先が尖レクトシーケンスで配列決定した。決定した配列は既知のり，径 7–10 μ m の長さであった（Fig. 5）。

ルボックス節［Volvox sect. Volvox (= section “Euvolvox” ,し，球体表面から見ると星形からアメーバ状の形状であった

DDBJ アクセッション番号 LC575050）は，埼玉県の池，神奈川県と茨城県の水田から分離培養された 4 株の雌雄同体
種 V. ferrisii の 配 列（AB663330, AB663333, AB663336,AB663339; Isaka et al. 2012） と 100% 一 致 し た。 ボ ル
ボックス節全体の系統樹では，日本産の雌雄同体の 2 種 1
モ ル フ ォ タ イ プ（V. ferrisii, V. kirkiorum Nozaki, KawaiToyooka & Isaka, Volvox sp. Sagami） が 雌 雄 異 体 種 V.
rousseletii G.S.West と単系統群を構成し，これらがタイプ種 V. globator Linnaeus とは系統的に異なることが明らかであった（Fig. 7）。

胞は，やや縦長で楕円形から卵形であった（Fig. 3）。

考察

VTAC 培地で培養すると有性球体が誘導された。有性球体
は複数の卵と 2–4 個の精子束を同時にもつ雌雄同体であった（Fig. 4）。未成熟の有性球体では卵は同時に分化しないが，成熟した球体では 46–95 個の同じように成熟した卵，または受精卵が認められた（Figs 5, 6）。成熟した受精卵は赤褐う細胞同士が太い細胞質連絡で連結する特徴をもつボルボッ

種 V. ferrisii のものと完全一致したので，同配列を用いてボSmith 1944)］で最も多くの種数を解析した Nozaki et al.
(2020) の系統解析結果をそのまま系統樹に使用した。

結果

無性球体は卵形で 5,800–9,600 細胞から構成されていて，発達中の次世代の胚または娘球体を 4–17 個持っていた（Fig.

1）。成熟したものは径 370–680 μ m であった。非生殖細胞は鞭毛を 2 本ずつ持ち，鞭毛よりも太い細胞質連絡で連結（Fig. 2）。娘球体が反転する時期の親球体の前方の非生殖細培養株からバクテリアを除去し，酢酸ナトリウムを含む

千 葉 県 産 2018-1031-VVx2 株 の ITS 配 列（585 塩 基 対，光学顕微鏡で観察した結果，千葉県産株は球体の表面を覆クス節に含まれることが明らかになった。本節の種レベルの同定は無性球体の形態だけでは不可能である（Isaka et al.

2012, Nozaki et al. 2020）。このために有性生殖の誘導と核rDNA ITS 配列決定を実施した。

千葉県の緑藻ボルボックス

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Figs 4–6. Sexual spheroids of Volvox ferrisii from Chiba, Japan. 4. Immature sexual spheroid showing sperm packet (s) and eggs (e). 5. Part of mature sexual spheroid
showing zygotes with spiny walls. 6. Sexual spheroid with many matured zygotes.

千葉県産株の受精卵の数（46–95 個）および受精卵の棘の形態（径 7–10 μ m で先が尖る）は，ボルボックス節の雌雄同体種で日本産の V. ferrisii および V. kirkiorum と最も良く一致した（Nozaki et al. 2020; Table 1）。受精卵の数は本節で種レベルの分類に重要とされていたが（Isaka et al.

2012），千葉県産株は両種の中間的な値を示した（Table 1）。
V. kirkiorum で観察されたような小さな有性球体（Isaka一方，et al. 2012）は千葉県産株からは確認されなかった。また，千葉県産株は，無性球体の次世代の球体の数が 10 以上になる点で V. ferrisii および V. kirkiorum と異なった（Table 1）。
従って，千葉県産株は形態的には新種の可能性もあると考えられた。

一方，千葉県産株の ITS 配列は V. ferrisii のものと完全にFig. 7. Phylogenetic position of Volvox ferrisii from Chiba, Japan within Volvox
sect. Volvox. Asterisks indicate dioicous species. Other species are monoicous. The
phylogenetic analyses were carried out previously (Nozaki et al. 2020) based on
maximum likelihood (ML) method of the internal transcribed spacer (ITS) regionsof nuclear rDNA (ITS-1, 5.8S rDNA and ITS-2). Branch lengths are proportionalto the evolutionary distances that are indicated by the scale bar. Numbers in left
and right sides at branches represent bootstrap values (50% or more) based on
1,000 replications of ML and posterior probabilities (0.90 or more) by Bayesianinference, respectively.

一 致 し た。V. ferrisii の ITS 配 列 に は，Isaka et al. (2012)
が形態観察して新種として報告した関東地方産の 4 株が含まれる。群体性緑藻ボルボックス目では ITS 配列の進化速度が高いので，種またはそれ以下の系統解析に用いられ，ボルボックス節の種によっては ITS 配列の種内多型が認められる（Nozaki et al. 2020）。従って，今回の千葉県産のボルボックス節は V. ferrisii に同定すべきと結論され，観察された形態は V. ferrisii の種内変異と解釈される。また，分子情報は本節の種レベルの分類には不可欠であることが今回再認識さ

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野崎ら

Table 1. Comparison of four morphological types of Volvox sect. Volvox from Japan.

Size of asexual spheroid (µm)

Volvox sp. from Chiba Pref.

V. kirkiorum

V. ferrisii

Volvox sp. Sagami

370–680

400–790 × 430–930

630–1,000 × 650–1,000up to 590

Number of cells in asexual spheroid

5,800–9,600

3,000–6,000

5,000–8,000

2,000–10,000(usually 2,000–5,000)

Number of gonidia in asexual spheroid

4–17

2–8 (usually 4–6)

2–8 (usually 3–5)

4–8

Size of sexual colony (µm)

400–650

430–440 × 510–540

600–800 × 650–900

up to 500

Number of cells in sexual spheroid

5,200–7,600

1,000–6,000

5,000–13,000

4,000–8,000

Number of zygotes (eggs) in sexual spheroid

46–95

20–80 (usually 30–50)

70–250 (usually 100–150)

5–25 (usually 10–20)

Number of sperm packets in sexual spheroid

2–4

4–8

3–5

1–5

Shape of anterior somatic cells

ellipsoidal to ovoid

pear-shaped to ovoid

ellipsoidal to ovoid

elongate- ovoid or elongateellipsoidal

Diameter of zygotes without spines (µm)

33–38

32–3835–40

37–48

Shape of spines of zygotestraight with acute apices

straight with acute apices

straight with acute apices

straight with acute apices

Length of spines of zygotes (µm)

7–10

5.5–8

6–8.5

up to 3Distribution

paddy field, Chiba

paddy field, Gifu

paddy fields, Kanagawa
and Ibaraki, ana a pond,Saitama, Japanlarge lakes, Kanagawa, anda pond, Shiga

References

the present study

Isaka et al. (2012)

Isaka et al. (2012)

Nozaki et al. (2016)

れた。

V. ferrisii は関東地方の水田に主に生育し，非常に近縁であるが有性球体の形態が大きく異なる Volvox sp. Sagami（Table 1）が関東地方の大型湖沼に分布するので，両者は生態的種分化の初期であると考えられている（Nozaki et al.

2016）。しかし，今回の千葉県産の V. ferrisii は水田の泥から分離したという以外は生態的な情報がなく，その水田も特に際だった環境特性があるとは思われない。また，千葉県産株には ITS 配列以外の分子情報はない。従って，千葉県産のV. ferrisii の形態的特徴のもつ生態的・進化生物学的意義は今後の研究で明らかになることが期待される。

謝辞

これまで長い間千葉県のボルボックスに関して現地情報を提供して下さった千葉県立中央博物館分館 海の博物館の菊地則雄博士に厚く御礼申しあげる。

引用文献

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