メラノサイトの多様性とメラノーマの Cell-of-origin の解析
Dissecting heterogeneity in melanocytes to understand cell-of-origin of melanoma
大阪大学
派遣期間
研究機関

研究指導者

野口 史人
2019 年 4 月 15 日～2020 年 4 月 14 日
Cancer Development and Treatment Group, Department of Medicine
Research Laboratories, Alfred Hospital, Monash University
Melbourne, VIC, Australia
Prof. Mark Shackleton

In the skin, melanocytes produce and provide melanin pigment to the skin cells and protect them fromUV-induced DNA-damage. The melanocyte lineage is consisted of multiple distinct subpopulations which serve as theprogenitors/precursors or functional progenies. The developmental hierarchy of the lineage is also distinct depending toanatomical areas where they reside, e.g. the hairy skin or the glabrous skin. Because dysregulation of the lineage causes
melanocytic disorders including melanoma, it is important to understand how its developmental hierarchy is molecularly
regulated and how dysregulation of it leads to the diseases, although it is not yet well determined. Our project broadly
aims to define developmental lineages in normal and malignant melanocytic cells, by means of our newly developedmethod for prospective isolation and fractionation of melanocyte subpopulations directly from the skin andhigh-throughput analysis of them. So far we have succeeded in isolation of melanocytic cells of fresh normal humanbreast skin or several anatomical regions e.g. dorsal, tail, acral or ear skin of wild-type or melanoma-prone mice.
Genetical, phenotypical and functional characterization of them are currently undergoing and a part of achievement inthis approach will be shown here.

研究目的

生すると考えられている。皮膚メラノサイトの細胞ある一つの組織から phenotype の異なる多様な系統は幹細胞や成熟メラノサイトなどの特定の亜集癌 の サ ブ タ イ プ が 発 生 す る (Intertumoral団から構成されており、各々の存在部位や分子制御heterogeneity)。この多様性の背景として cell-of-origin

機構は有毛部あるいは非有毛部により特異的であるモデルが提唱されている（1）。細胞は組織内で幹細（2）。異なるメラノーマのサブタイプ、すなわち表胞を頂点とする細胞系統のヒエラルキー（細胞系譜）

在拡大型、日光黒子型、日本人に多い末端黒子型なを構成しているが、cell-of-origin モデルによると、正どの多様性は、このメラノサイトの多様性を基に形常な細胞系統の中の特定の細胞集団に、特定の形質成されると考えられる。本研究の目的は、①正常メ転換が起こることで、特定の癌のサブタイプが発生ラノサイトの多様性に基づき細胞系統のヒエラルキする。この機序により、一つの細胞系統から複数のーの分子制御機構を解析し、②メラノサイトの悪性サブタイプの癌が発生する。従って、形質転換の際

形 質 転 換 、 す な わ ち メ ラノ ー マ の 発 生 に お け るの遺伝子変異を解析すると共に、正常組織におけるcell-of-origin となる特定のメラノサイト亜集団と特細胞系統のヒエラルキーを解析することが、癌の発定のメラノーマサブタイプおよびこれに関与する特生を理解する上で重要である。メラノーマは極めて定の遺伝子変異を包括的に同定することで、③得ら多様性に富む悪性度の高い皮膚癌であり、紫外線れた結果をメラノーマの予防や早期診断、新規分類、（UV）などによるメラノサイトの形質転換により発予後の予測、および治療に役立てることである。

研究経過
メラノサイト分離法の確立

profiling により統計的に除外した後、ヒト表皮メラノサイトは DEG により 4 つの特異的な亜集団に分類

ヒトあるいは野生型マウスの皮膚メラノサイトの分された。
申請者らは Pseudotime 解析、Cell cycle 解析、離法として従来主として行われてきた手法は、皮膚Protein network 解析などの transcriptome 解析の結果、細胞をメラノサイト特異的培地にて培養し、メラノこの亜集団の中で ALDH1A1 など複数の既知の Stemサイト以外の皮膚細胞の生存を抑制し、かつメラノcell-maker を有意に高く発現しており、比較的分化度サイトを増幅させるというものだが、この方法によが低く、増殖能が高くかつリボゾーム機能が亢進しるとメラノサイトの細胞系統のヒエラルキー、すなている亜集団を見出した。i) ヒトおよびマウスの毛わちメラノサイト内の亜集団の比率やその分子制御

包間表皮にメラノサイト Precursor cell の存在が報告

因子が変化してしまうため、生体内におけるそれをされており、ii）複数の組織の Stem cell/Precursor cell

観察することが出来ない。生体におけるメラノサイにおいてリボソームがその生存、増殖、維持に重要トの細胞系譜の亜集団や分子制御機構を維持したまな役割を果たしており、iii）刺激により Activate さま解析するためには、未固定皮膚からメラノサイトれたメラノサイト Stem cell/Precursor cell がメラノーを直接分離して High-throughput 解析をする必要があ

マの Cell-of-origin である可能性が示唆されており、る。これは従来マウスにおいてはメラノサイト特異iv）メラノーマの UV 関連発癌においてメラノサイ的な蛍光色素標識を発現する遺伝子改変マウスを用

トおよび表皮細胞のリボソーム機能亢進が密接に関いることで可能だが、ヒトおよび野生型マウスを含与していることが報告されている、などのことからむその他のマウス株では難しかった。そこで申請者（3-6 ）、申請者らは UV 関連ヒトメラノーマのらは、メラノサイト特異的細胞表面マーカー、表皮Cell-of-origin の候補としてこの亜集団に着目し、現細 胞 マ ー カ ー お よ び 血液細 胞 マ ー カ ー （ Lineage

在機能解析を行っている。

marker）を用いた Flow cytometry（FACS）にて、酵素処理したヒトおよびマウスの皮膚より、メラノサイトを高純度で予期的に分離、精製する新規手法を開発した (Figure 1)。

ヒト表皮メラノサイトの多様性解析
上記の手法によりヒト正常胸部皮膚の表皮よりメラノサイトを分離精製し、メラノサイト亜集団とその分子制御機構を解析する目的で Single cell RNA-seq

野生型マウスメラノサイトの多様性解析

analysis を行った（Figure 2）。サンプル中に混入した

申請者らは上記手法により野生型マウスの体幹、尻表 皮 細 胞 を Differentially expressed gene （ DEG ）尾、掌蹠、耳介皮膚のメラノサイトを分離精製し、その表現型および機能解析を行っている。メラノサ

皮膚における変異メラノサイトを分離し形質、機能イト Stem cell/Precursor cell は成熟メラノサイトのよの解析を行っている。特に、 Tyr::N-rasQ61K において、うにメラニン産生をせず無色素性である（2）。そこ同月齢（5 か月齢）のヘテロ Tyr::N-rasQ61K+/-の毛が黒で申請者らは近赤外線（Near-infrared，NIR）による色を呈するのに対しホモ Tyr::N-rasQ61K+/+ は白髪化励起によりメラニンが蛍光を発する性質およびメラ（体幹、尻尾）を呈することを見出した。FACS にニン顆粒が細胞内構造として Side scatter（SSC）をよるメラノサイト分離解析の結果、ヘテロ散乱する性質を利用して、FACS によりマウスメラ

Tyr::N-rasQ61K+/- と比較してホモ Tyr::N-rasQ61K+/+ のメ

ノサイトを色素性（NIR-high/SSC-high）と無色素性

ラ ノ サ イ ト 系 細 胞 は 色 素 含 有 が 低 下（Figure 3）。野生型（NIR-low/SSC-low)していた。また体幹、尻尾、掌マウスにおいて、休止期（7 週齢）の背部皮膚から蹠、耳介に共通して、組織学的にホモ Tyr::N-rasQ61K+/+

分離メラノサイトはほぼ全て NIR-low/SSC-low 分画

皮膚においては真皮網状層に色素産生のやや低下しであり in vitro のコロニー形成アッセイにおいて高たメラノサイト系細胞が密な胞巣を形成し増殖するいコロニー形成能を認めた。一方で成長期（2 週齢、像を認めたが、ヘテロ Tyr::N-rasQ61K+/-においては主5 週齢あるいは 10 週齢）背部皮膚より分離されたメに真皮乳頭層に色素産生の亢進したメラノサイト系

ラノサイト中には NIR-high/SSC-high 分画が多く細胞の比較的に粗な増殖を認めた。つまり Nras 変異(50％～) 含まれ、この色素性細胞は in vitro にてほぼの burden によりメラノサイト系細胞の形質（メラニコロニー形成を認めなかった。これは休止期毛包にン産生、浸潤）が決定されることが示唆された。今存在するメラノサイトが Stem cell/Precursor cell であ

後この Phenotype の決定に関与する DEG を RNA-seqり、成長期毛包には多くの成熟メラノサイトが存在により解析していく方針である。

(NIR-low/SSC-low)に分画したすることと合致すると考えられ、この手法により形質、機能の異なる野生型マウスのメラノサイト亜集考察団を分離可能であることが示唆された。野生型マウ申請者らが開発したメラノサイト分離/亜集団分

スの尻尾、掌蹠、耳介のメラノサイトについても同画の手法は①ヒトおよび野生型マウスを含む遺伝子様に形質、機能の異なる亜集団の分画化が可能であ

改変による標識のないメラノサイトを予期的に分離り、今後 RNA-seq などによる野生型マウスメラノサすることが可能で、②皮膚細胞中で 0.5％程度とマイイト亜集団の解剖学的部位、毛包周期、週齢毎の包ナーな細胞種であるメラノサイトの精製度が高く、括的遺伝子解析、機能解析の施行を検討している。

Single cell RNA-seq による亜集団解析において更にマイナーなメラノサイト亜集団を見出すことが可能であり、③無標識の野生型マウスやメラノーマモデルマウスのメラノサイト亜集団を分離して機能解析や包括的遺伝子解析をすることが可能である、などの従来手法では得られなかった利点があり画期的であると考えられる。これに基づき今後さらにメラノサイトの多様性とその制御機構の研究を進めていく方針である。
参考文献
１．doi: 10.1038/nature09781
２．doi: 10.1038/416854a
３．doi: 10.1002/med.21426

メラノーマモデルマウスにおける変異メラノサイト

４．doi: 10.1084/jem.20122019の多様性解析

５．doi: 10.1016/j.stem.2017.09.001

申請者らは野生型マウスと同様にメラノーマモデル

６．doi: 10.7554/eLife.42424

マウス（Tyr::N-rasQ61K）の体幹、尻尾、掌蹠、耳介研究の発表口頭発表
1.

Researcher Presentation of Monash Animal Research
Platform: Identifying a novel functional surface
markerofmelanocyte

progenitors.

Fumihito

Noguchi, et.al. 2020. 2. 5, Melbourne
2.

Morning Seminar, the Dept of Dermatology, Alfred
Health:Developingmethods

toprospectively

fractionate melanocytic subpopulation. Fumihito
Noguchi, et.al. 2019. 8. 7, Melbourne
誌上発表無し