倉田奨励金研究報告書｜2018 年度（第 50 回）助成■受領№1384

DNA ナノテクノロジーを駆使したマイクロ RNA 応答型デコイ核酸医薬の創製

代表研究者

森廣 邦彦

東京大学 大学院工学系研究科 化学生命工学専攻

1．研究目的
核酸医薬はこれまで標的化困難とされてきた生

助教

2．研究内容2.1 DNA プローブの配列および構造の最適化

体分子をターゲットにできることから大きな注目

多くのがん細胞で過剰発現しているmiR-21をを集めており、2010年代に入ってからは複数のアトリガーとしたHCRに用いるヘアピン型DNAプンチセンス医薬やRNA干渉 （RNAi） 医薬が各国ローブセット（HP1とHP2）を3種設計・合成した。

で承認されるなど、その開発競争が世界中で過熱配列の設計には核酸高次構造の安定性予測に広く用化している。これら上市された核酸医薬品の多くいられているオンラインソフトウェアNUPACKをはmRNAを標的としており、その翻訳やスプライ利用した。これらの配列はHCRの進行に最も大きシング過程を制御することで薬効を示す。一方で、な影響を与える一本鎖領域 （toeholdと呼ばれる）細胞内の核酸結合タンパク質を標的とした核酸創の⻑さを種々変更している。また、ヌクレアーゼ

薬研究も精力的に進められている。中でもデコイに対する抵抗性を高めるため、toehold部分をホス核酸は転写因子を捕捉する「おとり」として機能し、ホロチオエート化（リン酸ジエステル結合の酸素病変細胞で異常に働いている遺伝子の発現を調節す原子の1つを硫⻩原子に置換）している。

ることで治療効果を発揮する。転写因子は従来の低

まず、各プローブセットのHCRの進行効率をゲ分子医薬では標的化が困難な”undruggable”なタンル電気泳動によって評価した （図1）。その結果、パク質とされており、デコイ核酸は新しい創薬モ

HP1のtoeholdが8塩基⻑の場合に最も選択的なダリティとして大きく期待されている。デコイ核

HCRの進行が確認された。すなわち、miRNAを加酸医薬の⻑所として、①機能メカニズムが配列依えていない場合や、標的ではないmiR-122を加え存的であるため分子設計が容易 ②標的特異性がた場合はHCRが進行せず、標的のmiR-21を加えた高い ③創薬標的が豊富（例えばヒトには1000種類場合のみHCR生成物が観察された。今後の実験で以上の転写因子が存在すると推測されている）とは全て、toeholdが8塩基⻑のHP1を用いることといった点が考えられる。このように様々な利点をする。また核酸分子を医療応用する場合、体内ヌ有しているデコイ核酸であるが、これまでに「おクレアーゼによる分解が問題となる場合が多い。

とり」メカニズムを基にした核酸医薬は上市に至そこでHP1およびHP2を各種ヌクレアーゼを含むっていない。本研究ではDNAナノテクノロジーをFBSとともに一定時間インキュベートし、酵素分駆使し、病変細胞で特異的に発現しているマイク解の様子をゲル電気泳動によって解析した。そのロRNA（miRNA）に応答して薬効を発揮するデコ結果、それぞれのプローブが少なくとも8時間は安イ核酸の開発を目的とする。

定に存在し得ることが分かった。

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9 mer

HP1 toehold 8 mer
miR-21 miR-122 -- ++ --- ++ -10 mer
-2.3 ヒト生細胞内における HCR の評価- ++ -

培養細胞系でのHCRの評価を共焦点顕微鏡を用いて実施した。生細胞へのプローブの導入法としてまずはリポフェクション法を検討した。また、
HCR生成物HCRの進行は蛍光分子間の蛍光共鳴エネルギー移動 （FRET）によって評価することとした。すHP1 & HP2

なわち、HP1をFluoresceinで、HP2をTAMRAで修 飾 す る こ と で 、 HCR が 進 行 し た 場 合 に の み

図1

ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるFRETが観察されるように各プローブを設計した。

HCR の評価

まず、miR-21を過剰発現していることが知られているヒト子宮頸がん細胞（HeLa）にHP1とHP2

2.2 非培養細胞系における HCR 産物と転写因子をリポフェクションした結果、細胞内からFRETによる蛍光発光が観察された。この結果から、

NF-κB の結合評価
本研究では、HCRによって生成する⻑鎖DNAmiR-21をトリガーとしたHCRが生きた細胞内で二重鎖中に転写因子NF-kB結合配列が生じるようも進行することが分かった。一方、miR-21をほとにプローブの配列を設計している。そこで、HCRんど発現していないことがわかっているヒト胎児

産物とNF-κBとの結合をゲル電気泳動によって腎細胞（HEK293T）に同様にHP1とHP2をトラン評価した（図2）。実験の結果、HCR生成物にNF-kBスフェクションした結果、HeLa細胞と比較してを加えた場合のみNF-kBとHCR産物との複合体FRET効率の低下が見られ、HCRがmiR-21依存的に対応するバンドが確認できたことから、設計通に進行していることが示唆された。

りHCRの生成物である⻑鎖DNA二重鎖がNF-kB続いて、マイクロインジェクション法によるプロ捕捉能を有していることが明らかとなった。今後、ーブ導入を検討した。マイクロインジェクション法

コントロール実験としてNF-kB結合配列をもたなはリポフェクション法と比較して、各プローブの量い⻑鎖DNA二重鎖を用いた実験等を行い、選択性と導入のタイミングを厳密に制御できるメリットが等について詳細に検討していく予定である。

ある。HP1とHP2を細胞内に導入後、同様に共焦点顕微鏡によって解析を行い、FluoresceinとTAMRA

NF-κB

-+

NF-κB /HCR生成物複合体の蛍光強度の比を算出することでHCRの進行を経時的に追跡した （図3）。また、miR-21をほとんど発現していないHEK293Tについても同様に実験を行なった。解析の結果、HeLa細胞では時間HCR生成物経過に伴いTAMRA/Fluorescein比が上昇した一方、HEK293T細胞ではほとんど変化が見られなかった。本実験からも、HCRが細胞内のmiR-21濃度

HP1 & HP2に依存して進行することが分かり、細胞選択的な疾病治療の可能性を見出すことができた。

図2

HCR 生成物による NF-κB の捕捉倉田奨励金研究報告書｜2018 年度（第 50 回）助成

３．発表（研究成果の発表）

1. 2
1.2
HeLa
HeLa

TAMRA / FAM ratio

HEK293T
HEK293TOkamoto

11

A Hybridization Chain Reaction（HCR）Based
0. 8
0.8

MicroRNA Detection System
The 46th International Symposium on Nucleic

0. 6
0.600

15153030

45456060

75759090105105120120

Time from injection (min)

図3(1) Kunihiko Morihiro, Daisuke Fukui, Akimitsu

プローブを各細胞内にマイクロインジェクショ
ンした場合の TAMRA / Fluorescein 比の変化

Acid Chemistry 2019（口頭発表、東京、2019年10月）(2) 福井大介、森廣邦彦、岡本晃充
マイクロRNA応答型低分子多重放出システム
日本化学会第100春季年会2020（口頭発表、千葉、2020年3月）