和文 タイ トル
英 文タイ トル :Structure and Function ofc′・4nduced cottratte
3 11m Diameter Blo壼 lament代表研 究者

早稲 田大学浅井博

lVaseda University

Hiro

共同研 究者

官城教育大学

見上一幸

Miyagi Univerttty ofEdu.

Kazupki Mlkami

共同研 究者

早稲 田大学東 中川

徹

Waseda trniversiw

共同研究者

早稲 田大学

板橋岳志

Waseda University

Asai

Toh Higashnakagawa
Takeshi ltabashi

研究 目的
スパズ ミン (20KDa Ca2■ 結合 タンパ ク質)は 、 ツ リガネ ム シの茎 部 にある Ca2・ 誘起収縮性器官 スパ ズモネ ームの主要構成 タンパ ク質である。
脇 (枝 分 かれ ツ リガネ ムシの一種 )の スパ ズ ミン に関 しては、これ まで、あ昴憮 ηノα滋″ において 2種 のスパ ズ ミンの存在 とそれぞれ のア ミノ酸組成が明 らかにされZ.F″ ノ ′ているのみである。 スパズモネ ームの収縮 メカニズム は、 スパズモネ ームの特性 とタンパ
ル strttn Kawa8ooに おいてマク質組成 の点において、Z.″ ″れ わ物 とは異な つた Z″ 肋″πク ロなア プ ロー チによりが研究 されてきた。今後 スパズモネ ームの収縮 メカニズム を分子
ぉα麟 スパズ ミン cDNA塩 基配列 のレベルか らも解明す るため、本研究 では、まず Z.″ ι決定 とスパズ ミン相 互作用 タンパ ク質 の同定 を行 つた。

研 究経過
ス パ ズ ミン遺伝 子 の 同定

Chι Jγ ″ スパ ズ ミンZ″ ろ郷"滋ス パ ズ ミン8DNA塩 基配列 に特異的 なプライマー を用 いた RT‐ PCRに よつてcDNA部 分 配 列 が 、2種 類 得 ら れ た o鰍 躍 加 ′、ψ αS″滋 2)o印α路 滋

ノ遺伝子 について、inversc PCR及 び RACE‐ PCRを 用 いて gDNA、cDNA塩 基配列を決定 した。 このスパズ ミン遺伝子 には、イ ン トロンが存在せず 、531bp(ア ミノ酸 177残 基)で あった。 このスパ ズ ミンは、分子量 19,659Da、 等電点 4.68の カルシ ウム結合タ ンパ ク質であると予測 された。
カル シ ウム結合 タ ンパ ク質 Spasminlに は、 4つ の EF‐ Hand(カ ル シ ウム結合 ドメイ ン)の うち、カルシ ウム結合可能なサイ トは 1つ しか存在 しない と予測 され る。 これは、 これまでに明 らかにな っている ん″ 肋

スパ ズ ミンや Cttι ttrra 18kス パ ズ ミンに存在する EF‐ hand数 とは異なる。そ して、スパズモネ ームの張力実験な どか ら、Z″ 加″″た には、結合能 の違 うカルシ ウム結合 タンパ ク質 が少な くとも 2つ 以 上は存在す ると示唆 されていたが、SPasminlと は異なるスパズ ミンの存在 が cDNA部 分配列鮭忍聯加 2)か らも示唆 された。
ア ミノ酸配列の比較 か ら、 2つ 目、 4つ 目の EF‐ handに は、1ア ミノ酸残基欠失、 4アミノ酸残基挿入がそれぞれある。また、そ の領域 の DNA配 列 を spasmin同 士の比較は、特に変異 の激 しい領域 であることがわか つた。 カルシウム結合 タンパ ク質 がイン トロンの挿入によつて多様化 してきたことを考えると、以上の結果 は、2つ 日、4つ 日の EF‐ handは 、イ ン トロンの挿入 とそ の後 の突然変異に より 0頭 に組み込まれ、カルシ ウム結合能 を欠失した と示唆 して い る。 また、 この領域 は N末 端 ア ミノ酸配列 と同様 に変異が激 しく、カル
シ ウム結合 タンパ ク質 の機能 に重要なN末 端配列 だけでな く、 この領域 も機能に関係 してい ると考えられ る。
スパズ ミン と相同タ ンパ ク質 であるセン トリン とともに、近隣結合法、最尤法に より分ιJFaス パ ズ ミンは、原生動″ spasminlと 乃″″θγ子系統樹 を作成 した。そ の結果、2α加″″ノ
物 のセ ン トリン とともに他セ ン トリン と異なる幹を形成 した。 このことは、スパズ ミンを含む原生動物 のセ ン トリンは、 ヒ トを含む他セ ン トリン との機能多様性 を示唆 した。

Z″腸″"滋 スパズモネームは、 2種 類 のカルシ ウム結合能をもつ。Spasmin lが カル シウム結合能を一つ しか持たない こ とか ら、(1)spasminl、 spasmin2と カル シ ウム結合能 の異なるカルシ ウム結合 タンパ ク質 が存在する、(2)も しくは spasmin同 士が ダイマー形成 を してい る可能性がある。

スパズ ミン相 互作用 タンパ ク質 の同定
認で発見 された。この 200 kDa
スパズモネーム を構成す る 200 kDaタ ンパ ク質が、α ルダ″
タンパ ク質 はスパ ズモネームの伸縮運動に必須 である。 しか し、スパズ ミン との相 互作用については、 これまで確認 されてい なか った。抗 スパズ ミン抗体を用 いた免疫沈降法や、GST融 合 スパズ ミンを用 いた共沈法によ り、200 kDaタ ンパ ク質はカルシ ウム依存的 にス
パ ズ ミン と結合す る ことを確認 した。しか し、遺伝子同定用 のプ ライーマー作成 のために、200 kDaタ ンパ ク質のア ミノ酸解析 を行 い、現在解析 中である。

また、 上記方法 によ り、高分子、低分子 タ ンパ ク質 にい くつ かの カル シ ウム依存的 スパ
ズ ミン相 互作用 タ ンパ ク質 を新たに発見 した。我 々は、このタンパ ク質類 にフィラメン トを架橋す るようなタンパ ク質 が含 まれてい ると予測 してい る。

スパ ズモ ネ ームの赤外顕微分光光度計に よる解析
本研究 に用い られた本研究 に用 い られた スパ ズモネ ーム は、巨大型であ つて、直径が約30‑40μln、 長 さが約 300‑400μmも ある。 したが つて、既存 の赤外顕微分光光度計を用 いて、 スパズモネーム内タ ンパ ク質 のペ プチ ッ ド2次 構造 を調 べ ることができる。我 々の予備的研究に よれば、Ca2+の 不存在下 で、 αヘ リックス構造 の存在 が認 められ、Ca2■ の存在下で、 αヘ リックス構造 の存在 %が 著 しく減少す ること見 出 した。ただし、 β構造 の存在お よび増減 について は、解析 す る ことが出来なか つた。 ところで、Bllの・ の十分量存在下で、スパズ ミンの αヘ リックス量は、スパ
スパズ ミン溶液実験では、C′ズモ ネーム内タンパ ク質全体のそれについ ての結果 とは逆に、 20%増 加す る こと、を・ の添加下で、ランダム確認 してある。 200 kDaタ ンパ ク質 の αヘ リックス構造 が、C♂
コイル構造 (す なわち、 ゴム状無秩序構造 で、エ ン トロピーカ の発現 の源 )に 転位す ると暗示 され る。

このことは、有名 な ファイ マンの運動性生体高分子 の ラチ ェ ッ トメカニズ

ム (マ ックス ウエルの魔、彼 の力学教科書 に記載)の モデ ル その もの と成 り得 る、 と我 々は信 じている。

蛍光相関 スペ ク トロス コ ピーの理論的研究
蛍光相関スペ ク トロス コ ピーの方法は、タ ンパ ク質お よび生体器 官 の動的機能 の研究に将来有望 な研究手法である、 と予てか ら本研究代表者 は考 えていた。 この方法 (蛍 光 自己相関 スペ ク トロスコピーお よび蛍 光相 互相関 スペ ク トロス コ ピー)は 、Ca2+誘 起収縮性器官 スパ ズモ ネームの主要構成 タンパ ク質 の ダイナ ミックスのみな らず筋原繊維内 タ ンパ ク質 のダイナ ミックスな どの研究に、使用可能 である。
す でに、過去 二十数年 の間 に、第一 、第 二お よび第四論文 を欧文科学雑誌 に発表 した。
第二論文 は、Biophydcd Chemittryに 誘 いにより日本人編集者 に投稿 したが、査読者 に送付
す るこ とな く、無視 されて しま つた。その論文 は、 レーザー光 の定常干渉下における蛍光相関スペ ク トロス コピーの理論的基礎 を展開 したものであ つた。

実は、 2002年 度米国生物物理学会年会 において、 レーザー光 の 定常干渉下における生物物理学的研究 の新手法 (上 に述べ た方法 とは異なる)の 発表 があった。
そ こで 、本研 究代表者は第四論文を改 めて発表準備 中である。 さらに、第五論文 となる研究を本研究室 の学部 4年 生 と協同で完成 させたので 、それ も欧文科学雑誌に投稿準備 中である。
さて、本研究助成金 の一部 をカール ツアイ ス製蛍光 自己/相 互相関 スペ ク トロス コピー
購入 の 自己負担金 として賄 うこ とができた ので、巨大 スパズモネ ームお よびタガメ飛 翔筋に適用研究す る予定である。

考察以 上述 べ たよ うに、巨大 ツ リガネ ムシを用 いて、我 々は Cが +誘 越ll■ 縮性器官 スパズモネ ームの収縮 の メカニズム をほぼ解明 した。 ここで、注意すべ き ことは、スパズモネームの収縮 が純物理学的現象であると共に、また生物学的現象・ 純生理学的現象 である、 とい うこ とである。 さらに、 この収縮性器官 の運動性 主要構成 タンパ ク質 の一次構造 の解明 は、この一年以内にほぼ完了 し得 る、 と予想 してい る。
結語以上述 べ てきた よ うに、単細胞繊毛虫類 ツ リガネ ムシの 3ナ ノメー ター巾フ ィラメ ン トの Ca2+励 起収縮 のメカニズム を、ほぼ明 らかに した と、本発表者 は考えてい る。実は、1930年 代 か ら 1950年 代 にかけて、筋肉の運動 メカニズムは、 ゴム弾性的すなわちエ ン トロピー的 であると、多 くの著名 な高分子学者や 生物物理学者 は、素朴 にまた期待 をこめて、考 えてきた。その夢 が、ま つた く異 なる運動器官 の 3ナ ノメーター巾バ イオ フ ィラメン トで、実現 された。

将来 の研 究発展 へ の意義
今後 の問題 は、 3ナ ノメータ ー巾バ イオ フィラメン ト (多 細胞生物 にも有 るとして)の生物学的役割 を解明す る ことで あろ う。多分、Ca2+シ グナ リングを伴 う細胞分裂 の問題が、中心的課題 となろ う。
以下に少 し長 くなるが、その発想 の根源 を述 べ る。
すなわち、我 々は、核 内に存在す るナ ノフ ィラメ ン ト、特 に動原体 (キ ネ トコア)に 存在す る コロナ状 フ ァイバーに注 目 している。特 に動原体外側部 を構成す る コロナ・ フ ァイバー または ■brous coronaと 呼ばれ始 めた もや もや とした構造タ ンパ ク質類 は、微小管 の捕獲な どに重要であると、我 々は予測す る。 このフィラメ ン トの機能・構造 を明 らかにすることは、有糸分裂時 の Ca2+、 染色体 と微小管FH5の 動的メカニズムの研究 (主 に欧米でのみ)に 新たな知見を与 え、全ての生物はどの よ うに有糸分裂す るか ?と い う謎 の解明 に重要であると考 えてい る。 しか し、細胞分裂 の動的 メカニズ ムは、 主に微小管 による分裂課
程 の進行 に関す る研究 のみが盛んである。細胞生物学(翻 訳書)の 本 の第 18章 差 う棒分裂 の仕組み の 918ペ ージによれば「中心体およびこれに含まれる中心小体について (本 研究代表者 によれば、動原体も含む筈 )、 細胞生物学者は百年以 上もの間、悩み続 けているが、何から出来ているのか 、複製 の仕方 はどうか 、進化 の過程 でどのように生じてきたのかなどの基本的問題はまだ解明されていない」と記 されてい る。

この問題 の解決 の糸 日またはキー ワー ドは、

C a2+励 越収縮性 の 3 ナ ノメー ター 直径バイオ フィラメン トであると、本研究代表者 は信 じる。コロナ 。ファイバー または ibrous corona とい う言葉 があるこ とを知 つたの は、2001年 2月 のボス トンにおける米国生物物理学年会 の総説講演 を聴 いた ときである。
聴覚の Hair C(通 の論文 (Hudspeth,Nature Vo1341,1989年 )に 3nm直 系 フ ィラメン ト

が電顕 で観察 された とい う報告 と役割 の記事 が一つのみ見つ か つた。
一般 にCa2+励 起収縮性繊維は、原 生動物 ツ リガネ ムシの茎部に存在す るスパズモネーム と呼ばれる器官 に、また ゾ ウリム シな どでは、原形質膜 に裏打ち構 造 に顕著 に見られ る。スパズモネ ームは、アクチ ン繊維 (太 さ約 8 n l12)な どと比べ て非常に細 く、太 さ 3nmの Ca2+励 起収縮性 フ ィラメ ン ト束 で構成 され、構成 タンパ ク質類 についても、我 々のみ が盛んに研究 している。Ca2+結 合 タンパ ク質 (Centrin/CaltFaCttnノ spasmin)の みは、我 々 も含 めて世界の数 ヶ所 で研究 されている。Ca2+が 細胞分裂 を制御「キネ トコア・ コロナ・フ ァイバー は、していることや、他 に類 のない繊維 の細 さか ら、ツ リガネ ムシのCa2+励 起収縮性ナノフィラメン トに類似 したフィラメ ン トである」 とい う確信 を持 つている。 この確信 を証明する本研究は、Ca2+励 起収縮性ナノフ ィラメン トの分子 とい うミク ロな世界か ら、 マ ク ロな有糸分裂 メカニズ ムまでの一連 の解明
へ とつ なが り、他種 バイオ フ ィラメン トも複雑 に関与す る様 々な生命現象 の研究分野において、極 めて大 きな意義があると考 えてい る。現在 までに明 らかに してい る原生動物 のCa2+励 起収縮性 フ ィラメ ン ト構成 タンパ ク質類 の知見を基に して、今 までに類の ないアプ ローチをす る こ とで、分子 レベルか らキネ トコア・ コロナ・ フ ァイバーの構成 タンパ ク質類、それ らの機能 ・局在性 を明 らかに し、 さらに有糸分裂時 におけるこのナ ノファイバー の機能を解明 したい。
また核は、Ca2+依 存的ATP非 依存的な収縮・ 弛緩運動 が可能であ り、そ の運動 メ
カニズムはアクチ ン・ミオシン系やチ ューブ リン・ダイニ ン系に よるものでな く、Ca2+励超収縮性雛 によると予測 され る。その機能や構成 タンパ ク質類 つい てはまだ分かっていない。細IIt分 裂時の ダイナ ミックな核の変化 を考えれば、核内のCa2+励 起収縮性繊維 の解明 は極 めて大 きな意義 があると考 えてい る。 これまで、細lla分 裂 メカニ
ズム をCa24励 起収縮性繊維 に注 目した研究はな く、先行研 究では見 えていないCa2+とCa2+励 起収縮性繊維 による細胞分裂の動的 メカニズムが、本研究によって独創的なこれが成功すれば、モデル を新たに提案できる ことはFHl違 い ない と考 えてい る。
2001年 度 の3人 のノーベ ル 医学 ・生理学 賞受 賞者 の仕 事 に勝 る とも劣 ないかな
あ !! 生 きて い る限 り、知的遺産 の創 生に貢献 していきた い、 と本研究代表者等は考 えている。

研究発表

口頭発 表1.Zθ θittt"″ げみfJ5r わ のスパ ズ ミン遺伝 子 の単離、第 34回 日本原生動物学会、2001,11、金沢

2.Ca2+励 起収縮性 巨大 スパ ズモネ ー ム を構成す るタ ンパ ク質類 の pNA、 cDNAの 解析 、
2002年 生 体運動研究合 同班会議 、2000,1、 千葉
3.Evidence that hydrophobic 50 kDa protein and its putative tetramer are essential forspas■oneme contraction、 6th Asian Conference on Ciliate Blolology、

2002,7、 Tsukuba、Japan

4.Ca2■ 励 起収縮性繊維 を構成す る新規 タンパ ク質、第 73回 日本動物学会、2002,9、 金沢

5.3ナ ノメター 直径 バ イオ フ ィラ メン トの Ca2+結 合 シグナル変換 機構 、第 35回 日本原生動物学会 2002,11、 高知
6. Hypothesis toward the evolution of calcium‐ binding protein, spasmin in Zoo″ 加 ″J″″″ろ%sc″ わ 離rain Kawagoe erotozoa ciliOphoral、

The American Society ofCell BIology 42nd

A―ual Mceting、 2002,12、 San Francisco、 USA
誌 上発 表頓懸 àθ θ 19:
and Other Spedes lnfered iom Small Subunit rRN‐ A Gene Sequences,あ 』oぎ ′胸ノ1.T habashi,K Mikamiand H As滅 :Phylogenetic Relationships betweenめ Fric・ g肋

931‐ 937(2002)″嘔″″′力
2.T Itabashi,K.NIlikami and H Asai;Characterization ofthe 17η w滋 ′gene in Zθ θ″α″うzsc″ ′α strain Kawagoc(protOZO亀Rθ 髭解 hノε 夕θ′ルウり

In press

CiliOphora)and■ S relation to other spasmins and crentrins,

Abstract
勧″″′解 ″ろ需θ 議 stttin Katva30e is a giant sessile peritFiCh Clliated protozoa that possesses àたcontractile organelle called a spasmoneme We report here on the molecular characterlzation andpЮ vide an opportunity to discuss the evolutionary relationShips of the Z

み sc聯 麟 spasmini
α″spasmins belon3 tO the calmodulin superfamily and are the mttor COmpOnents of spasmoneme
rliaments. We analysed and obtained the whole sequence of the ,pαs″sequcnce of the」 μtts″ 滋 2 8ene lt is surprising that the sequellce of ttη

″″ノgene and a partials″ 滋 f does not∞ ntainintrons and encodes an open reading frame of 531‐ bp.It predicts a product of 177 amino acids witha calculated molecular mass of 19,659 Da and a〆 of 4.68.The amino acid sequencc has two
putative cttcium‐ binttng domains,One ofthem is a Lnctlonal domain,as deflned by the EF‐

handconsensus.The varieties ofspasmins were revealed by comparison wtth amino acid components andmolecular relationships of spasmin l protein and other spasmins.A comparison ofthe amino霧id

みIs盤 ′a spasnlin and k■ own centrins indicates that spasmins have a one
sequence between the Z α″
residue deletion in the EF… hand domain… 2 and four residuc insertions in domain‐ 4, as does theわ spasmin Howevet there are large variations in the amino acid sequence at domain,4b″ たι′

within spasmln l,spasnun 2 and the rろ /″̀θ =la spasnlln.