光によるシナプス機能マッピング技術の開発
Optical inactivation of synaptic molecules by chromophore-assisted light inactivation（日本神経科学学会推薦）

代表研究者

三重大学

竹本研

Mie UniversityKiwamu Takemoto

Acute inactivation of synaptic molecules in vivo with spatio-temporal precision should be a powerful tool tounderstand their roles in cognitive functions. Among many molecules in synaptic function, AMPA type glutamate receptor
is an especially known as important molecules for memory acquisition which is delivered into synapses in response to
many types of learning and experience. The CALI method is a promising technique to induce the localized and acuteinactivation of target molecules by using photosensitizers that generates reactive oxygen species in a light-dependent
manner. We have developed elemental technologies for the CALI and established methods for molecular analysis atvarious levels from in vitro to in vivo (Takemoto K et al. ACS.Chem.Biol. 2011, Takemoto K et al. Sci. Rep. 2013 etc.). In
addition, we have been analyzing the mechanism of learning and memory through manipulation of GluA1 homomeric
AMPA receptors using the CALI technology (Takemoto K et al. Nat. Biotechnol. 2017, Trusel M et al. Neuron 2019).
Here, we report new CALI method to inactivate other AMPA receptors, GluA2/3. Our optical technology will permit their
physiological roles in memory acquisition and formation to be analyzed with high spatio-temporal resolution, such asindividual spines, and ultimately enable us to map out “the functional synapses” in memory system.

研究目的

プからは、AMPA 受容体の光不活性化化合物 ANQX

動物はいかにして記憶を維持するのだろうか？興が報告されたが (England PM et al. Sci. STKE 2006)、

奮性シナプス活動に重要な AMPA 受容体には、in vivo での使用実績はなく、その他の AMPA 受容体

GluA1~4 サブユニットが存在する。成体の海馬ではにも結合する CNQX を元にした薬剤であるため複合これらが組み合わさり、GluA1/1（GluA1 ホモマー）・体特異性は低いと示唆される。さらにこれまでに多GluA1/2・GluA2/3 複合体が発現する。中でも GluA1数の AMPA 受容体欠損マウスが作製されたが、遺伝を含む複合体は神経活動依存的にシナプスに移行し子相補が原因で表現系の解釈に困る場合が非常に多機能するが、GluA2/3 は恒常的に存在する（Takahashi

い (Jia et al. Neuron 1996 等)。また遺伝子改変技術でT et al. Science 2003 等）。さらに、in vitro では長期増は迅速な機能阻害が難しく、本研究目的の達成には強誘導後に GluA1 ホモマーと GluA1/2 がまずシナプ不向きと考えられた。よって従来法では、そもそもスへ移行し、その後 GluA2/3 に置き換わることから、記憶の獲得が出来ないのか？維持が出来ないのか？

GluA1 ホモマー・GluA1/2 が記憶の獲得、GluA2/3 がという重要なポイントを区別して解析することは極記憶の維持を行うとの仮説が立てられた（Malinow R

めて困難であった。即ち今後の記憶研究には、シナ

et al. Curr Opin Neurobiol. 2000 等）。申請者の所属研

プス～脳領域レベルのマルチスケールにおいて、局究室ではこれまでに、AMPA 受容体の迅速な光不活所かつ迅速に AMPA 受容体を不活性化する操作的手化技術の開発や機能解析を進めてきた。他のグルー法が重要であると考えられた。

CALI 法（chromophore-assisted light inactivation）とないか等の陰性対照実験や、標的分子の変異細胞あは、光でタンパク質分子を局所かつ任意のタイミンるいはそのレスキュー実験などにより確認する必要グで不活性化する、光操作技術の一つである。CALIがある。

法は 30 年以上前に開発された、いわば古典的な手法

申請者は最近、モノクローナル抗体を用いた CALIであるものの、初期の技術は不活性化効率の低さや法を AMPA 受容体に適用し、シナプス性 AMPA 受容技術導入の難しさから普及は進んでいなかった。一体 GluA1/1 ホモマーをエオシン CALI 法により光で方で近年、高効率かつ簡便に CALI 法を利用できる

acute かつ複合体特異的に光不活化する新技術の開様々な要素技術が整備されるとその有用性が見直さ発に成功し、in vivo において海馬恐怖記憶の消去にれ、光操作技術として再び普及しつつある。CALI 法

成功した （Takemoto K et al, Nat. Biotechnol. 2017）。

では、光照射に応じて活性酸素種（ROS）を産生する

さらに in vivo の CALI 解析と行動科学実験により、光増感剤が重要である。例えば、標的タンパク質にGluA1 ホモマーは記憶の獲得に機能することを見出対する抗体をイソチオシアネート等の反応基が付加した。本手法は、AMPA 受容体において複合体特異された光増感剤で化学標識する。次に、標識された的な光不活化操作が可能な新技術であり、次世代の抗体と標的タンパク質を反応後、光を照射し光増感脳機能解析法としても注目された（Humeau Y et al.

剤から活性酸素を発生させる。この時、活性酸素がNat. Neurosci. 2019, Frank JA et al. Nat. Biotechnol. 2019

標的タンパク質を攻撃し、標的タンパク質は酸化に等）。そこでこの特性を生かし、AMPA 受容体の各複より立体構造が破壊され、その結果分子の不活性化合体を特異的に不活性化する技術を揃えることがでが起こる。ここでの活性酸素の拡散半径は非常に短きれば、これまで困難であった記憶解析・シナプスいため（一重項酸素で約 3-4 nm）、標的分子の特異的解析が詳細に可能になると期待される。そこで本研な不活性化が期待できる。従って、光増感剤と標的究ではこれまでの研究を元に、GluA2/3 複合体を分子の間の距離や方向といった、相対的な位置関係

CALI 法により迅速かつ特異的に光不活化する革新

は、CALI の特異性や分子不活性化効率に重要な要素的光操作技術の開発を進める。本技術が実現すれば、と考えられる。このことから CALI 実験を効果的にGluA1 ホモマーCALI 法で操作可能となった活性化行うためには、まずは光増感剤を標的分子の近傍にしたシナプスに加えて、定常状態のシナプス活動を配置することが重要である。もちろん酸化されるとマッピング解析できることになり、シナプス～脳領立体構造が壊れるアミノ酸残基の近傍であれば良い

域レベルのマルチスケールで AMPA 受容体を介したが、そのアミノ酸残基は多くの場合予測不可能であシナプスマッピング解析を行う技術が初めて実現する。従って現状では、次項に示す方法を用いて光増ると期待できる。

感剤を標的分子の近傍に配置し、CALI が可能かを個々に確認する必要がある。

研究経過

光増感剤を標的分子の近傍に配置するには、抗体

我々のこれまでの研究で、あるシナプス分子に対を化学的に光増感剤で標識する方法と、遺伝子的にしてペプチド抗体を取得したが、native な分子を認コード化された「光増感タンパク質」を標的分子と識する特異性の高い抗体は得ることができなかった。

融合・発現させる方法がある。前者の方法は、細胞従って標的分子の配列の一部を免役して得るペプチ内分子への適用はマイクロインジェクションが必要

ド抗体では、標的分子の立体構造を認識する抗体のとなり簡易的な実験は難しいが、内因性の膜表面分取得が難しいことがわかっている。よって CALI 実子をターゲットにできるという大きな利点がある。

験で必要な、native な標的分子を認識する抗体の取後者は、抗体を必要としないため CALI 実験が容易得には、ペプチド抗体は不向きと言える。そこで本であるが、内在性分子に適用するためには光増感タ研究では、native な GluA3 に対する抗体の取得を目ンパクの遺伝子ノックインが必要である。いずれの指し、DNA 免疫法によるモノクローナル抗体の取得場合でも、光増感剤と標的分子の相対的な位置関係を進めた。

を自在に制御することは困難である。
そこで CALI のDNA 免疫法では、標的分子の cDNA をクローニ効率や特異性は、個々の実験において例えば標的分ングした発現ベクターを、ジーンガン等で免疫動物子と局在が同じ他のタンパク質は機能破壊されていの筋細胞や線維芽細胞に標的分子を発現し免疫する。

導入された細胞で発現した標的分子が細胞表面分子2 といったサブユニットが発現している。生体の海の場合、その細胞外領域が液性免疫を惹起する。す馬では、こうした 3 種類のサブユニットが組み合わなわち DNA 免疫法を用いることで、native な標的分さることで、GluA1/1・GluA1/2・GluA2/3 といった 3子の細胞外領域に対する抗体を多数取得できる。

種類の複合体が発現する。本抗体を用いた CALI 法

我々はこのストラテジーにより、抗体価が十分に高が GluA2/3 に特異的かを確認するために、海馬初代

いモノクローナル抗体として 78 種類を取得し、培養ニューロンにおいて miRNA を用いて GluA3 をFACS によるスクリーニングの結果、native な GluA3

ノックダウン後、同様に CALI を行ったところ、ノを認識する候補抗体として 25 種類の陽性抗体を取ックダウン細胞では CALI の効果が消失した。以上得した。今回の抗体のエピトープである GluA3 の細から、本抗体はシナプスにおいても GluA2/3 特異的胞外ドメインは、GluA1 や GluA2 といった他のに光不活性化が可能なことが明らかとなった。

AMPA 受容体と一部の領域で一定の相同性があり、CALI 法では、光照射により初めて分子活性が低下取得した抗体が GluA3 以外も認識する可能性もある。

することが重要である。一方で、抗体の中には標的そこで各抗体を用いて、GluA1-3 をそれぞれ発現す分子との結合により分子活性を抑制する、いわゆるる CHO 細胞を生細胞染色したところ、25 種類中 11「機能中和抗体」も存在する。そこで本抗体がそれ種類が GluA3 を特異的に認識できることが分かった。に該当しないか確認するために、抗体の添加前後に次にこれら 11 種類の中で、抗体産生量が十分高くおいて GluA2/3 の活性が変化するかを電気生理学的今後の実験に支障がないと示唆された 9 種類のモノに確認した。その結果、AMPA 電流値は抗体添加にクローナル抗体を対象に、CALI 効率を検討した。まより変化しなかった。従って、本抗体には中和活性ず各抗体をエオシンイソチオシアネートにて標識し、 はないと考えられた。
GluA2/3 発現 CHO 細胞において CALI が可能なモノ

本研究では、シナプス活動を光制御することを目クローナル抗体の同定を行った。ここではグルタミ指し、GluA2/3 分子の CALI 法の開発を進め、モノクン酸を添加して検出される GluA2/3 由来の AMPA 電ローナル抗体のスクリーニングから、十分な特異性流に関し、光照射前後での AMPA 電流を比較し、を有する抗体の同定に成功した。現在は、in vivo にCALI 効率を算出した。その結果、11 種類の抗体候

おいて CALI を行う準備を進めており、GluA2/3 の機補の中から CALI 効率が最も高い 2 種類のモノクロ能、特に記憶の貯蔵や維持における生理機能の解明ーナル抗体の取得に成功した。以下では、この内一を目指したいと考えている。

種類について実験を進めた。
CALI 法の技術開発においては、機能破壊の分子特考察異性を示すことが重要である。今回の標的分子であ以上のように多数のモノクローナル抗体からる GluA3（GluA2/3）は、シナプス膜表面に発現し機CALI 効率の高い抗体をスクリーニングすることで、能する。また一般的に抗体は細胞内に透過しないこ

in vivo でも効率よく受容体機能を操作し、記憶へのとから、今回の場合 CALI の標的となるのはシナプ介入が可能になった。光操作技術は光を用いるため、ス表面に提示された GluA2/3 であると期待できる。

光学イメージングと同時に使用することができる。

そこでまず、海馬初代培養ニューロンのシナプスによって例えば pH 感受性 GFP である SEP（Super-おいて、同じくシナプス表面で機能する NMDA 受容ecliptic pHluorin)を用いて AMPA 受容体のシナプス移体を陰性対照に CALI の分子特異性を電気生理学的行を指標にシナプス可塑性を可視化することも可能に評価した。ここでは CALI が可能なモノクローナである。よって今後の研究では記憶時のシナプス機

ル抗体のスクリーニングと同様に、光照射の前後に能をイメージングしつつ、因果的な解析を行うといおいてグルタミン酸電流を比較解析することで本抗った、シナプス機能のマッピングが可能になると期体の CALI 効率を算出した。その結果、本抗体は陰待できる。これにより原理上、脳領域レベルから最性対照の NMDA 受容体を機能破壊することなく小 1 シナプスにいたるまで、詳細な記憶解析が技術

GluA2/3 を分子特異的に機能破壊できることを見出的に初めて可能になると期待できる。

した。
他方 AMPA 受容体には、GluA3 以外にも GluA1・一方本項で記したような、モノクローナル抗体の開発からスクリーニング・特異性解析に至るまでには、我々の研究の経験上約 1 年を要する。従って、多数のシナプス機能分子に対し、網羅的に CALI 法研究の発表を開発することは、現在のところ極めて困難である。

口頭発表

従って CALI 法における今後の課題として、開発ス

1.

竹本研「光によるシナプス分子不活性化技術のピードの短縮化を可能にする、要素技術の開発が重開発とその応用」（第 94 回日本薬理学会シンポ

要と考えられるた。モノクローナル抗体の作製とジウム「分子機能の操作とイメージングによるCALI が可能な抗体のスクリーニングは、多くの時間を要するが、これは CALI 効率の最適化を行っているに等しい。従って、分子ごとに抗体を作製するこ脳機能研究の新展開」、2021 年 3 月 9 日）
2.

竹本研「光による分子操作技術の開発と記憶研となく CALI 効率を迅速に最適化できる全く新しい究への応用」（東京医科歯科大学 CBIR セミナ概念の手法が開発できれば、原理上ゲノムワイドなー、2021 年 2 月 18 日）

分子の光操作が実現すると期待できる。例えば現在一年を要する CALI 法の開発時間を、原理上２週間誌上発表程度に短縮できれば、CALI 法はより広く使用される、

1. Takemoto K "Optical manipulation of

神経科学や細胞生物学領域における標準技術になる

molecular function by chromophore-assistedと期待できる。我々のグループでは今後はこうした

light inactivation." Proc Jpn Acad Ser B Phys

ハイスループットな技術開発を可能にする、CALI 法の要素技術の確立も進めていきたいと考えている。

Biol Sci., 97(4):197-209, 2021