倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1498

脂質ストレスを制御する超分子ポリロタキサンを用いた
NASH 治療戦略の開発
伊藤美智子

東海国立大学機構名古屋大学環境医学研究所

メタボ栄養科学寄附研究部門

特任准教授

Development of therapeutic strategy for NASH using
supramolecular polyrotaxane to regulate lipid stressMichiko Itoh,
Department of Metabolic Syndrome and Nutritional Science, Research Institute of Environmental
Medicine, Nagoya University, Nagoya, Japan, Specially appointed associate professor

非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）は炎症・線維化を特徴とし、肝硬変・肝細胞癌の主要な原因疾患として注目を集めている。NASH の病態形成にはコレステロールをはじめとする細胞障害性を有する脂質の蓄積増加が指摘されているが、コレステロール代謝を標的とする治療戦略は確立していない。本研究ではリソソームのコレステロール蓄積を制御する超分子ポリロタキサンの NASH に対する有効性を検討した。
Non-alcoholic steatohepatitis（NASH）is a chronic liver disease characterized by inflammation and fibrosis, andhas emerged as a leading cause of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The concept of lipotoxicity has pointed
out that cytotoxic lipids, such as cholesterol, may cause liver injur y and promote the development of NASH.
However, therapeutic approaches targeting cholesterol metabolism in NASH have not been established. In this study,
we investigated the effectiveness of a supramolecular polyrotaxane designed to regulate cholesterol accumulation inlysosomes. Our findings offer promising insights into a potential therapeutic strategy for NASH by controlling lipidstress.

1．研究内容限定的である。本研究では肝細胞に蓄積したコレ

1.1 背景ステロールの質的変化とその貪食処理にあたるマ

メタボリックシンドロームの肝臓における表現クロファージの機能変化に注目し、脂質ストレス型と言われる非アルコール性脂肪性肝疾患の中で、による NASH 発症機構の解明および新規治療標的

単純性脂肪肝は一般的に予後良好と言われるが、としての可能性を検証した。

NASH は炎症・線維化と特徴とし、高率に肝硬変・肝細胞癌に進展する重症型として注目されて1.2 研究手法と結果いる。単純性脂肪肝では中性脂肪が中心となって1.2.1 NASH におけるコレステロールの質的変化蓄積するが、NASH ではコレステロールをはじめ著者らが独自に開発した NASH モデルマウスとする細胞障害性を有する脂質の蓄積が増加する（Am. J. Pathol. 179: 2454-2463, 2011）の肝臓を電（脂肪毒性）。コレステロールは肝細胞死を誘導し、子顕微鏡で観察したところ、細胞死に陥った肝細慢性炎症の起点となるが、コレステロール合成酵胞の残余脂質内部にコレステロール結晶化が認め素阻害剤であるスタチンの NASH に対する効果はられ、死細胞を取り囲んで貪食処理をするマクロ倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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ファージ内部に脂肪滴形成が認められた（図 1）。

したところ、肝臓に最も多く分布していた。さらこのような死細胞を取り囲むマクロファージはに、肝臓を分散して FACS 解析を行ったところ、CD11c 陽性であることから（JCI Insight 2: e92902,肝細胞、類洞内皮細胞、マクロファージへの取り2017）、NASH の肝臓を分散し、CD11c 発現レベ込みが多いことが明らかとなった。NASH モデル

ルに応じてマクロファージを採取し、GC-MS にてマウスに対して病態発症後に 6 週間持続皮下投与コレステロール含量を測定した。野生型マウスやを行ったところ（30 mg/kg/day）、体重には変化

NASH の CD11c 陰性マクロファージと比較して、はないものの、肝重量の低下と肝機能改善が認め

CD11c 陽性マクロファージではコレステロール含られ、組織学的に線維化が改善した。このとき肝量の増加が認められた。

コレステロール含量には変化がなく、CD11c 陽性A

Bマクロファージのコレステロール含量が低下した
ことから、βCD ポリロタキサンはマクロファージに作用して肝線維化を改善することが示唆された。
1.2.3 培養マクロファージに対するコレステロー
ル結晶添加
βCD ポリロタキサンによる肝線維化改善効果の分子機構を検討するため、野生型マウスの正常肝図 1．NASH 肝の電⼦顕微鏡像
Ａ．細胞死に陥った肝細胞の周囲をマクロファージが取り込み（⽮印）、残余脂質内部に針状のコレステロール結晶が認められる。
Ｂ．内部の脂質が減少すると、マクロファージ側に脂肪が蓄積する。
Scale bars, 10 μm（論⽂ 1 より引⽤、改変）

および脂肪肝から肝マクロファージを採取し、それぞれにコレステロール結晶の添加実験を行った（500 μg/ml）。正常肝・脂肪肝マクロファージともにリソソームへのコレステロール蓄積が認められ、リソソーム生合成を制御する MiT/TFE 転写因子
ファミリーの 1 つである transcription factor E3（TFE3）の核内移行が認められたことから、リソ

1.2.2 NASH モデルマウスに対する超分子ポリロタキサンの投与ソームストレスが加わっていると考えられた。
βCD ポリロタキサンを同時添加すると（1 mM）、β-cyclodextrin（βCD）はコレステロールを捕捉

コレステロール蓄積および TFE3 の核内移行を抑して細胞外に排出する効果を有するが、細胞膜透制した。RNA シークエンス解析によって遺伝子発過性が低く、細胞膜のコレステロール含量に変化

現プロファイルを比較したところ、正常肝・脂肪を与えるため細胞毒性が大きな問題となる。共同肝ともに発現誘導される遺伝子群（図 2、クラス研究者の東京医科歯科大学・田村博士は βCD とター E）と脂肪肝マクロファージのみに発現が誘線状高分子を組み合わせて超分子 βCD ポリロタ導される遺伝子群（図 2、クラスター B、C）が認

キサンを構築し、酸分解性の修飾を行うことによめられた。クラスター E にはリソソームストレス

りリソソームへの指向性を付加した（J. Controlに関与する遺伝子が含まれ、クラスター B、C にRelease 269: 148-158, 2018）。βCD ポリロタキサン

は CD11c の他、線維化を促進する遺伝子が複数認の体内動態を検討するため、蛍光標識 βCD ポリロめられた。Ingenuity Pathway Analysis（QIAGEN）

タキサンをマウスに投与し、血液、心臓、肺、肝にて、脂肪肝マクロファージ特異的に発現が誘導

臓、脾臓、腎臓を採取して各臓器への分布を検討された遺伝子群を制御する転写因子として early倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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growth response 1（Egr1）が抽出された。死細胞

phenotypic changes and promotes liver fibrosis

を取り囲む CD11c 陽性マクロファージは他の散在

in nonalcoholic steatohepatitis. J. Exp. Med. In性マクロファージとは異なる遺伝子発現プロファpress.

イルを有し、疾患特異的マクロファージ亜集団であることを提唱してきた（JCI Insight 2: e92902,【学会発表】

2017）。本研究により、死細胞に由来するコレステ

1. 伊藤美智子、菅波孝祥：NASH 病態形成におけロールが TFE3、Egr1 を介して疾患特異的活性化る脂肪毒性の理解と医学応用．第 9 回肝臓と糖を誘導することが示唆された。

尿病・代謝研究会、鹿児島、2023/5/13
2. Itoh M, Tanaka M, Suganami T. L ysosomal
cholesterol overload triggers macrophage
phenotypic changes and promotes liver fibrosis
in nonalcoholic steatohepatitis. Keystone
Symposia for the meeting on Metabolic
Syndrome and Diabetes as Drivers of NAFLD/NASH, Banff, Canada, 2023/3/21
3. 伊藤美智子、菅波孝祥：The role of cholesterol
overload in macrophages as a novel molecularmechanism of non-alcoholic steatohepatitis. 第100 回日本生理学会大会、京都、2023/3/15
4. 伊藤美智子、金井紗綾香、白川伊吹、田中都、
小川佳宏、菅波孝祥：NASH 発症におけるマク
ロファージのリソソーム機能障害と病態生理的図 2．肝マクロファージに対するコレステロール結晶添加と遺伝⼦発現変化
正常肝（Normal）および脂肪肝（Steatosis）から単離した肝マクロファージに対してコレステロール結晶（CC）を添加した（500 μg/ml, 24 時間）。RNA シーク
エンスデータのクラスタリング解析（k＝5）、各クラスターに含まれる遺伝⼦を右側に記載。
（論⽂ 1 より引⽤）

2．発表（研究成果の発表）【論文】
1. Itoh M, Tamura A, Kanai S, Tanaka M,
Kanamori Y, Shirakawa I, Ito A, Oka Y, Hidaka
I, Takami T, Honda Y, Maeda M, Saito S,
Murata Y, Matozaki T, Nakajima A, Kataoka Y,Ogi T, Ogawa Y, Suganami T. L ysosomal
cholesterol overload triggers macrophage

意義の解明．第 43 回日本肥満学会学術集会、那覇、2022/12/1
5. 伊藤美智子、田村篤志、金井紗綾香、白川伊吹、田中都、金森耀平、小川佳宏、菅波孝祥：
マクロファージの脂質代謝障害に着目したNASH 発症機構の解明．第 95 回日本生化学会
大会、名古屋、2022/11/09