倉田奨励金研究報告書｜2018 年度（第 50 回）助成■受領№1377

インフルエンザウイルス感染超初期過程のナノスケールライブイメージング

代表研究者

大場 雄介

北海道大学大学院医学研究院教授

1．研究目的医学が大幅に進歩した現在でもウイルス感染症に取り込まれる最初のステップに関わる宿主細胞膜動態と分子基盤を明らかにすることを目指した。

は未だ多くの課題が残された研究分野であり、実際に多大な研究開発費が新興・再興感染症に支出

2．研究内容されている。中でもインフルエンザ感染症は、毎2-1 インフルエンザウイルス侵入に伴う膜ナノ動態

年の季節性流行に加え、新型の出現によるパンデライブセル高速AFMは生きた細胞観察用に開ミック、高病原性鳥インフルエンザウイルスのヒ発されたものであり、細胞表面の微細構造（膜陥トへの感染、さらには現行治療薬に対する耐性株入、膜隆起など）の動態をxyz軸方向に10nmの空の蔓延など、社会的、経済的に対策を要する。し間分解能と秒単位の時間分解能で画像化できる

かし、これら対策の多くは感染症が成立した後の（Suzuki et al., Sci. Rep., 2013, Yoshida, et al.,治療法開発、あるいは感染拡大を防ぐための二次PLOS Biol., 2018）。この高速AFMは倒立型光学顕的対策に限定されている。一方で、ウイルスが宿微鏡へ搭載可能なユニット構成である。ここで主細胞に侵入する感染超初期過程については、イはz方向の光学顕微鏡の空間分解能を上げるため

ンフルエンザウイルスのような変異頻度の高いウ共焦点顕微鏡とのハイブリッドイメージングシス

イルスの獲得変異株出現を食い止める唯一のステテムを構築した。

ップにもかかわらず、未だ多くが謎のままである。

次に、ライブセル高速AFMを用いてウイルス侵

近年、我々は、インフルエンザウイルス感染にお入に伴う宿主細胞膜の振る舞いをナノスケール、ける細胞内カルシウムの重要性を見出し（Fujioka,

秒オーダーで可視化することを試みた。共焦点顕et al., Nat. Commun., 2013）、カルシウムチャネル

微鏡とのハイブリッドシステムでは、同一細胞のがカルシウム動員の鍵となる宿主受容体であるこ

同一場所を同時刻にAFMと蛍光の観察することとを報告した（Fujioka et al., Cell Host Microbe,により、生きた細胞の細胞膜の形状像とタンパク2018）。受容体が同定された現在、次なる問いはウ質・分子の局在像の相関イメージングが可能であイルス粒子が細胞に吸着してからダイナミックなる（図１）。ウイルス粒子として蛍光ラベルしたも膜動態を伴いエンドサイトーシスにより取り込まのを用いた。大部分のウイルス粒子は直径100–れるまでの「感染超初期過程」の宿主細胞機構で300nmの球状であり、細胞膜に結合したウイルスある。この課題に対して我々は、ナノスケールバ粒子を高い分解能で可視化することに成功した

イオイメージング手法によってこのプロセスを可（図２）。この観察系では、細胞表面のウイルス粒視化し、インフルエンザウイルス粒子が宿主細胞子はAFM像に白い輝点として検出され、細胞内部

倉田奨励金研究報告書｜2018 年度（第 50 回）助成の粒子は検出されない。この情報と、ウイルスの関係を調べることが有用である。ここでは、相関蛍光シグナルの位置情報を統合することで、ウイイメージングによりクラスリンの局在とともにウルス粒子が細胞表面か内部に位置するかを空間的イルスが細胞内部へと取り込まれていく様子を観に切り分けることができた。10秒毎の経時観察に察した（図２）。結果、前述の膜の窪みと膜隆起をよって、ウイルス侵入に付随する膜動態が多様で伴う取り込み様式はクラスリン依存性であり、窪あることを見出した。中でも高頻度でみられた取みを伴わない様式はクラスリン非依存性の経路でり込み様式は、ウイルス粒子の周りの膜が徐々にあることが明らかとなった。このことは、インフ窪むことから始まり、取り込みの最終段階で窪み

ルエンザウイルスの侵入経路にはクラスリン依存の片側から隆起した膜の構造体がウイルスを覆い性と非依存性があるという従来の知見と合致する。

細胞内部へと取り込むものであった。他に低い頻さらなるエンドサイトーシス関連タンパク質群の度であったが、ウイルス周囲の膜が窪むことなく相関イメージングと阻害薬を用いた実験により、膜隆起によって取り込まれる場合もあった。これ

クラスリン依存性経路での膜隆起の形成およびウらの結果は、インフルエンザウイルスの侵入経路イルス粒子の取り込みにコータクチンとArp2/3が複数あることに合致する。

複合体を起点としたアクチン重合が関わっていることを突き止めた。したがって、従来考えられてAFM探針きたダイナミンによる「膜の括り切り」に加えて、高アクチン依存的なプロセスが膜の窪みの閉鎖に関

AFM

蛍光標識ウイルス

低高11µmµm

低わることを示唆された。今後はインフルエンザウ
イルスが利用する宿主膜動態を特異的に阻害するような条件を見出したい。

共焦点顕微鏡2-3 展望これまでのインフルエンザウイルス研究はウイ
図 1 高速 AFM と共焦点顕微鏡による生きた細胞表面の微細構造（膜の凹凸、ウイルス粒子構造）と分子局在の相関イメージ
ング。AFM による細胞表面の形状像では、高い構造は白く低い構造は暗く表示される（画像右上）。ウイルス粒子（赤）の蛍光画像（左下）。重ね合わせ画像（右下）。赤と黄色の矢頭はそれぞれ細胞表面と細胞内のウイルス粒子を示す。

ルス側に着目したものが主であり、宿主細胞への侵入機構に関しては議論の余地があった。インフ
ルエンザウイルスの宿主細胞への侵入経路がエンドサイトーシスであることは40年以上前に見出され、2011年にはクラスリン依存性に加えて、クラスリン非依存性経路で取り込まれることが明らかになった（Erik et al., PLOS Pathog., 2011; Fujioka
et al., PLOS ONE, 2011）。インフルエンザウイル
スとシアル酸との結合が明らかにされてから半世紀を経て、ついに機能的宿主受容体が同定されたのは2年前のことである（Fujioka et al., Cell Host

2-2 ウイルス取り込みにおける膜ナノ動態の分子基盤

Microbe, 2018）。しかしながら、これらの分子機ウイルス侵入における膜ナノ動態の分子機構を構の解明と比べて、ウイルスの侵入に伴う膜動態理解するには、膜形状と膜を裏打ちするタンパクについてはまだ未解明な点が多い。その原因とし質群（クラスリンやAP2など）の局在の時空間的て、これまでウイルス侵入時の膜形態の研究を牽

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引してきた電子顕微鏡では静止画像しか得ること間分解能には一桁以上の差があり、そのナノスケができず、侵入の全過程を経時的に観察することールでの位置関係を明らかにする事は困難である。

が困難であったことが挙げられる。本研究で確立したがって膜ナノ動態を支える宿主機構の解明へしたウイルス侵入時の膜ナノ動態のライブイメー

向けては光学顕微鏡のさらなる高分解能化が必須

ジング技術により、我々は世界に先駆けてこの課で あ ろ う 。 全 反 射 蛍 光 照 明 （ total internal

題を克服することに成功した。現在のところ本技

fluorescence reflection, TIRF）顕微鏡を組み合わ術は、膜ナノ動態を決定する宿主細胞機構の解明せれば、１分子レベルの解像度かつ秒オーダーのに資する唯一の技術といえる。実際の観察事例か時間分解能で宿主因子の動態の可視化でき、膜ナら、ウイルスの取り込み過程における周囲の膜のノ動態と宿主因子の関係が見えてくる。将来的に、動きはナノ動態は必ずしも対称的ではなく、非対ウイルス侵入の宿主機構を解明し、ウイルス感染称的かつ局所的な構造変化を伴うことがらかとな

超初期過程を標的とした新しい治療法・予防法をった。これは、ウイルス周辺の宿主因子が不均一確立することで、人々がウイルスのパンデミックに局在化することを示唆するものであるが、共焦に恐れることなく安心・安全に暮らせる社会の実

点顕微鏡を高速AFMと組み合わせでは、両者の空現に貢献したい。

a（秒）020406080100120140150

ウイルス/膜形状クラスリンb

膜キャッピングモデル（AFM）

クラスリン

アクチン・Arp2/3複合体

膜切断モデル（電子顕微鏡）

図 2 （a）ウイルス・膜の形状像（AFM）とクラスリンの局在（蛍光）の相関イメージング。クラスリン依存性経路でのウイルス侵入では、ウイルス粒子の周囲の膜の窪みと、一過性の膜隆起が見られる。イメージサイズ：650nm×650nm。（b）アクチン依存的な隆起により、膜小胞の切り離しが行われる（模式図上）。ダイナミンによって膜が括り切られ、膜小胞が形成される従来のモデルと少し異なる（模式図下）。

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３．発表（研究成果の発表）

3.

国内外の学会誌、学会講演会等における発表を５件程度記載。
1.

2.

大場雄介．細胞膜動態のcorrelative imaging．
第57回日本生物物理学会年会（宮崎、2019年）

4.

Aiko Yoshida, Nobuaki Sakai, Naoki Takahashi,Yusuke Ohba. Fluorescence Imaging of membrane

Shige H. Yoshimura, Yusuke Ohba.Live-cell imaging

dynamics and intracellular signaling. 9th FAOPS

and analysis of the plasma membrane during

Congress (Kobe, 2019)

clathrin-mediated endocytosis by high-speed atomic

吉田藍子、酒井信明、吉村成弘、大場雄介．

force microscopy. ASCB|EMBO 2019 meeting

クラスリン依存性エンドサイトーシスに伴う（Washington D.C., 2019）

細胞膜動態のライブセル可視化解析．第92回日本生化学会大会（横浜、2019年）