倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2020 年度（第 52 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1456

腎臓病の個別化医療実現に向けた尿中落下細胞を用いた非侵襲的検査法の確立
鈴木教郎

東北大学 大学院医学系研究科

教授

Establishment of a non-invasive diagnosis strategy
for personalized precision medicine against kidneydisease by using urine exfoliated cells
Norio Suzuki,
Tohoku University, Professor

慢性腎臓病（CKD）患者の尿中に含まれる腎細胞（尿中落下細胞）の病態理解における有用性を検証した。まず、尿中落下細胞は 3〜5 世代の継代および凍結融解が可能であることを確認した。次に、フローサイトメトリー
解析から、尿中落下細胞には線維芽細胞や尿細管上皮細胞などが様々な割合で含まれることを示した。さらに、腎性貧血治療薬である HIF-PH 阻害薬が培養尿中落下細胞の EPO 遺伝子発現を誘導することを見出した。尿中落下細胞は CKD 患者の薬剤応答性の個別予測やバイオマーカー探索として有用である。
Urinary exfoliated cells（UECs）are living kidney cells non-invasively isolated from the urine of chronic kidneydisease（CKD）patients. This study aimed to determine whether UECs would help in precise and personalized
medicine for CKD. We discovered that in-vitro cultured UECs, even after freezing-thawing, contained various typesof kidney cells, including fibroblasts and tubular epithelial cells. Additionally, hypoxia-inducible factor-prolylhydroxylase inhibitors stimulated erythropoietin production in cultured UECs. These findings suggest that UECs,
which can be non-invasively isolated from the urine of CKD patients, have the potential to predict drug
responsiveness and screen for CKD biomarkers.

1．研究内容たが、CKD の病状や予後と関連する適切なマー

1.1 目的

カー分子は同定されていない。また、病態把握のCKD 患者数は世界的に増加の一途を辿っている

ために侵襲的な腎生検採取が行われているが、穿が、治療法が確立されておらず、血液透析や腎移刺による腎組織の傷害は病態をさらに増悪させる植などの高額な対症療法に頼らざるを得ない。そことが懸念されている。のため、CKD は世界各国で医療費高騰の主因とCKD は多様な病態を示すが、共通して腎間質になっており、CKD の病態理解を進め、効果的治療筋線維芽細胞が出現し、腎臓が線維化する。研究法を確立することは喫緊の課題である。一方、代表者は遺伝子改変マウスを駆使した腎臓病の分CKD の成因は遺伝背景から生活習慣など多様であ子病態解明に取り組んでおり、線維化腎の筋線維り、病状や予後も様々であることから、患者個別芽細胞は、腎間質線維芽細胞の形質転換により出の精密な医療が求められている。実際に、尿や血現することを明らかにした。また、腎間質線維芽液を対象としたバイオマーカー探索が行われてき細胞は赤血球造血因子エリスロポエチン（EPO）

倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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自然科学・工学－健康・医療：1 年助成を産生する役割を担うが、形質転換によって EPO培養した尿中落下細胞を蛍光標識抗体で染色し、産生能を喪失することが、CKD で頻発する貧血のフローサイトメトリーを行うことにより、培養尿原因となることを見出した。さらに、CKD 患者の中落下細胞に含まれる細胞の種類を解析した。と腎 EPO 産生を誘導する薬剤（hypoxia-inducible

くに、尿細管上皮細胞、間質線維芽細胞、血管

factor-prolyl hydroxylase inhibitor：HIF-PH 阻害

内皮細胞に特異的な細胞表面分子の（それぞれ薬）が貧血治療に使われているが、その効果は病EpCAM、CD73、KDR）発現に着目して解析を進状に大きく依存することから、薬剤の使用に際しめた。また、障害を受けた尿細管上皮細胞で発現て患者個別の効果予測が必要であることを提唱しすることが知られている CD44 についても解析した。

た。

ヒト尿中には腎臓由来の生細胞「尿中落下細胞」

遺伝子発現についても、尿中落下細胞から RNAが含まれており、培養可能であることが知られてを採取し、定量的 reverse-transcription polymeraseいる。尿中落下細胞は患者を傷つけることなく容chain reaction（RT-PCR 法）によって解析した。

易に採取できる生細胞であり、高い増殖能を保持得られたデータとフローサイトメトリーの結果をしている。また、基礎的な細胞培養技術があれば、照合するとともに、患者の病態情報との関連を調あらゆる施設で簡便に培養し、増殖させることがべた。

できるため、検査・診断に用いる生細胞検体のソースとして適している。そこで本研究では、

1.3 成果および考察

CKD 患者の尿中落下細胞の分子特性を解析し、病小児 CKD 患者 9 名（IgA 腎症 2 名、アルポート状や予後と相関する因子（バイオマーカー）の同症候群 5 名、紫斑病性腎炎 2 名）の尿中から遠心定および患者個別の薬剤応答性診断の検査系開発によって細胞を採取し、培養したところ、1 週間における有効性について検証を試みた。

以内に目視可能な細胞コロニーが多数形成された。
これらの細胞は、3〜5 世代の継代が可能であり、1.2 方法凍結融解を経ても培養可能であった。

尿中落下細胞は、提供者の同意を得たうえで、次に、培養尿中落下細胞のフローサイトメト

東北大学病院において、東北大学の承認のもと収リー解析を行い、CD73（線維芽細胞）と EpCAM集した。尿中落下細胞は尿中濃度が非常に薄いた（CD326、上皮細胞）の発現を解析した。その結め、遠心によって尿から採取した直後であっても、果、尿中落下細胞の各サンプルには、様々な割合顕微鏡下で検出することは難しいが、高い増殖能で線維芽細胞と尿細管上皮細胞が含まれることがを有しているため、1 週間ほどの培養によって細確認された。また、一部の検体において、損傷し胞コロニーを形成することが知られている。本研

た尿細管上皮細胞で高発現する CD44 の強陽性分究期間では、9 名の CKD 患者の尿中落下細胞の培画が含まれることを確認した。一方、血管内皮養に成功した。

（KDR）と血球系（CD45）のマーカーは検出され培養ディッシュの底面に接着している尿中落下なかった。

細胞を回収し、継代を繰り返すことにより、尿中培養尿中落下細胞の遺伝子発現を RT-PCR 法に落下細胞の増殖能と培養可能期間を調べた。また、

よって解析したところ、線維芽細胞と尿細管上皮

継代後に凍結および融解し、再培養を行うことに細胞の遺伝子発現は検出されたが、血管内皮と血より、尿中落下細胞の凍結保存の可否についても球系の遺伝子の発現は検出されなかった。これら検討した。の結果は、前述のフローサイトメトリー解析の結倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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果と一致する。また、一部の検体は筋線維芽細胞

levels via renal EPO induction in mice. Blood

で発現する遺伝子群を高発現していたことから、

Adv 7: 3793-3805（2023）

尿中落下細胞の遺伝子発現が腎線維化の指標となることが考えられた。

［2］Nakai T, Saigusa D, Iwamura Y, Matsumoto Y,
Umeda K, Kato K, Yamaki H, Tomioka Y,

さらに、尿中落下細胞が生細胞であることを利Hirano I, Koshiba S, Yamamoto M, Suzuki N.

用し、HIF-PH 阻害薬に対する応答性を検討した。

Esterification promotes the intracellular

その結果、すべてのサンプルにおいて、HIF-PH 阻

accumulation of roxadustat, an activator of

害薬添加から 24 時間後に、低酸素誘導性転写因子

hypoxia-inducible factors, to extend its

HIF1α の蓄積と HIF1α 標的遺伝子群の発現誘導がeffective duration. Biochem Pharmacol 197:検出された。また、その誘導性はサンプル間で大114939（2022）きく異なっていた。HIF1α タンパク質は HIF-PH［3］宮内健一郎、山本多恵、鈴木教郎．腎性貧血阻害薬によって安定化し、活性化することが知らの 発 症 機 序 と 診 断．臨 牀 透 析 38: 111 – 118

れていることから、尿中落下細胞は HIF-PH 阻害（2022）

薬応答性を備えており、患者個別の HIF-PH 阻害［4］Miyauchi K, Nakai T, Saito S, Yamamoto T,

薬応答性を調べるために尿中落下細胞が有効であSato K, Kato K, Nezu M. Miyazaki M, Ito S,ることが示唆された。一方、一部のサンプルではYamamoto M, Suzuki N. Renal interstitial

EPO 遺伝子の発現誘導も検出された。EPO 遺伝子

fibroblasts coproduce erythropoietin and renin

発現は HIF2α によって誘導されることが知られてunder anaemic conditions. EBioMedicine 64:いるため、HIF-PH 阻害薬は尿中落下細胞の HIF2α103209（2021）も安定化・活性化することが示された。また、尿［5］Nakai T, Iwamura Y, Suzuki N. Efficient

中落下細胞には EPO 産生能を有する線維芽細胞もisolation of interstitial fibroblasts directly from

しくは筋線維芽細胞が含まれていることが明らか

mouse kidneys or indirectly after ex vivoとなった。

expansion. STAR Protoc 2: 100826（2021）

以上の結果から、尿中落下細胞は CKD 患者か［6］岩村悠真、内田奈生、熊谷直憲、鈴木教郎 .

ら完全非侵襲的に採取できる生細胞リソースであ慢性腎臓病患者の尿中落下細胞を用いた低酸り、患者個別のバイオマーカー探索および薬剤応素誘導性因子プロリン水酸化酵素の阻害剤に答性診断の解析対象としてとして有用であること対する応答性評価．日本生化学会東北支部例がわかった。尿中落下細胞は体内からのメッセー会 ．（口 頭 発 表、Web 開 催、2021 年 5 月 29

ジを届ける貴重な生細胞であり、尿中落下細胞の日）解析系を発展させることにより、患者数の多いCKD に対する精密な個別化医療を非侵襲的検査法により実現することにつながると期待される。

2．発表（研究成果の発表）［1］Nakai T, Iwamura Y, Kato K, Hirano I,
Matsumoto Y, Tomioka Y, Yamamoto M,Suzuki N. Drugs activating hypoxia-inducible
factors correct er ythropoiesis and hepcidin