静水圧作用下における軟骨細胞の DNA 損傷-修復メカニズムの解明
DNA damage response in murine chondrocytes under hydrostatic pressure
東京大学
派遣期間
研究機関
研究指導者

牧 功一郎
2018 年 4 月 1 日～2018 年 11 月 25 日
Helsinki Institute of Life Science, University of Helsinki, Finland
Helsinki, 00290, Finland
Prof. Sara Wickström

Articular cartilage, which is found at the tip of bone joints, not only constitutes the slippery joints but also buffers
mechanical loading due to animal body weight and movement. Chondrocytes in cartilage produces abundant
extracellular matrix, such as collagens, to make the tissue slippery and moisture to manage mechanical forces such as
frictional force, compression force, and hydrostatic pressure. Interestingly, hydrostatic pressure is known to assist thechondrocytic differentiation. It is therefore reasonable to hypothesize that some signaling pathways areactivated/inactivated under hydrostatic pressure to regulate the differentiation genes for chondrogenesis, though there is
still no break-through which clearly explains this phenomenon. In this research, we focus on DNA damage response,
which may remodel chromatin architecture and gene expression. DNA damage is caused by cellular stress such as UV
exposure, and its excessive accumulation in nucleus, which is not affordable for cells to repair, leads to apoptosis. Onthe other hand, at certain extent of DNA damage, a variety of proteins accumulate near the site of damaged DNA andmake a molecular complex that mediate the following signaling pathways, which includes chromatin remodeling.
Chromatin is a high-order architecture, which mainly consists of DNAs and histones, and integrate the overall gene
expression in cells. In this research, we investigated DNA damage response in chondrocytes under hydrostatic pressure.

研究目的

その過剰な蓄積はアポトーシスを引き起こすことが関節軟骨は、関節の骨端表面に存在し、そのスム知られる。その一方で、細胞活動を維持できる程度ーズな可動や荷重の緩衝を担う組織である。関節軟の損傷においては、損傷 DNA の近傍には DNA 損傷

骨に存在する軟骨細胞は、コラーゲンなどの細胞外の感知・修復に関与するタンパク質が複合体を形成

基質を豊富に産生することにより、潤滑な機能的構し、クロマチン構造のダイナミクスにも影響を与え造を維持している。近年の研究によると、生体の荷ることが近年の研究から明らかとなっている。クロ重や運動に由来した静水圧の負荷により、間葉系細マチンは主に DNA とヒストンから構成され、遺伝胞から軟骨細胞への分化が促進されることが知られ子発現を統合的に制御する高次構造体である。ている。このことから、静水圧の作用下において種々以上のことから、本研究では、次の作業仮説を立のシグナル経路が活性化・不活性化され、特定の遺てた：（１）静水圧のもとで軟骨細胞に DNA の損傷伝子の転写が制御されることが想像されるが、このが生じる。
（２）損傷 DNA の感知・修復プロセスをメカノバイオロジー現象を統合的に説明するメカニ介してクロマチン構造が変化する。
（３）クロマチンズムが未だ示されていない。本研究では、静水圧の構造の変化により細胞分化に関わる遺伝子が活性化もとで遺伝子発現が調整される際に生じる上流の経する。この大きな仮説を検証する第一歩として、本路として、DNA の損傷・修復応答に着目した。DNA

研究では、静水圧作用下における軟骨細胞の DNA損傷は紫外線などの種々の外的ストレスにより生じ、損傷プロセスを明らかにすることを目的とした。

研究経過（１） マウスからの軟骨細胞の単離および不死化およびインキュベーター外での培養環境の影響、および、静水圧負荷の効果を明らかにするため、以下の３つの条件を検討した：（Ａ）封入なし・インキュSara Wickström 先生とのディスカッションにおいて、軟骨細胞様のセルライン（ATDC5 細胞）ではな
く、動物から単離した軟骨細胞に対して検討を行う方が生物学としての重要性が高まるのではないかとの示唆を受けた。そこで、マウスの股関節から軟骨細胞の単離を行い、取得した初代培養細胞に対して、
SV-40 large T antigen をレトロウイルスにより導入することにより、軟骨細胞の不死化を行った。その結果、ノンコートのペトリディッシュ上で均一に増殖 す る 不 死 化 軟 骨 細 胞 を樹 立 し た 。 本 細 胞 は 、
ATDC5 セルラインと比較して極めて高い軟骨細胞マーカー（Collagen 2、 Sox 6、 Aggrecan 1）の遺伝子発現を示しており、より生体内の軟骨細胞に近い特徴を有しているものと判断した。一方で、継代にしたがって脱分化が生じることも見出したため、ATDC5 細胞に比して高い軟骨細胞マーカーの発現量を示す継代数の細胞に対して検討を行った。
（２） 静水圧負荷装置のセットアップ

ベーター内で６時間静置、（Ｂ）封入あり・圧力チャンバー内で６時間静置、（Ｃ）封入あり・圧力チャンバー内で６時間静水圧負荷。
図１ａにH2AX 染色の結果を示す。まず、染色画像において極めて高い蛍光輝度を示している細胞は、複製期の細胞と考えられる。DNA の複製本研究ではDNA の DAPI 染色画像を二値化し、細胞核の領域内におけるH2AX 染色の輝度を評価した（図１ｂ）。
条件ＡとＢを比較することにより、プラスチックバッグへの封入およびインキュベーター外での培養環境の影響により、複製期の細胞の割合が増加することが明らかとなった。本結果に関しては、細胞が産生する各種の増殖因子がプラスチックバッグ内で直ちに拡散することが原因の一つと考察した。一方で、静水圧を負荷した条件 C においては、条件 B と同様に DNA 複製が促進される環境にもかかわらず複製期の細胞の割合が少なくなっている、つまり、DNAの複製が抑制されていることが明らかとなった。

東京大学牛田研究室で開発していた小型の静水圧静水圧のもとで DNA 複製の抑制が生じる機構を負荷装置をヘルシンキ大学にてセットアップした

明らかとするため、顕著な DNA 複製を示していな（持ち出し申請済み）。静水圧負荷実験の概要は以下

い細胞に対して核内におけるH2AX のフォーサイのとおりである。はじめに、軟骨細胞をガラスボトの数を評価した（図１ｃ）。その結果、静水圧の作用ムディッシュに播種した。次に、細胞播種の２４時下における DNA の損傷が、DNA 複製の抑制を誘導

間後に、ディッシュ内の培地を取り除き、ディッシするシグナルを活性化している可能性が示唆された。

ュを新しい培地で満たしたプラスチックバッグに封入した。さらに、ディッシュを封入したプラスチックバッグを圧力チャンバー内に設置した。そして、高圧ポンプを稼働し、圧力チャンバー内に送液を行った。圧力チャンバー下流の電磁バルブは、流路内の静水圧が閾値を超えると開くよう制御し、これにより、周期的な静水圧を実現した。
（３） 静水圧作用下における損傷 DNA の評価
静水圧作用下における軟骨細胞の DNA 損傷を評価するため、リン酸化ヒストンH2AX の免疫染色および共焦点顕微鏡観察を行った。ディッシュの封入

図１．H2AX の免疫染色及び解析結果

（４） 核ラミナ構造のリモデリングに関する考察
近年の研究において、細胞核の外骨格として機能研究の発表
1.

“Hydrostatic pressure-induced DNA breaks in

する核ラミナ構造が注目を浴びている。核ラミナは、

chondrocytes and its relationship with chromatin

中間系フィラメントであるラミンと膜タンパク質か

architecture”,

ら構成されており、核の構造の安定化、および、クDNA 損傷と DNA 複製を調節する構造体として核ラミナ構造に着目し、初期検討として、Lamin A/C の免疫染色を行った。その結果、Lamin A/C の蛍光輝
度は、静水圧の作用下で顕著に下がっていることが観察された。このことから、DNA 複製の抑制は、核ラミナ構造が不安定化することで生じていることが示唆された。核ラミナ構造の不安定化を誘導する分子メカニズムについては引き続き検討を続けるが、特に、損傷 DNA の感知・修復を介したクロマチン構造の変化に着目する予定である。核内のクロマチン構造の変化が核ラミナ構造に与える効果は未だ不明な点が多く、核内で生じる各種反応が核ラミナ構造に伝達され、核と細胞質の間に生じるシグナルを介して核内にフィードバックされる新規のメカニズムの解明が期待される。
考察
本研究においては、マウス関節軟骨から単離した軟骨細胞に対して、周期的な静水圧作用下におけるDNA の損傷メカニズムを検討した。その結果、静水圧の作用下で軟骨細胞に DNA 損傷応答が生じること、および、DNA 複製の抑制が生じることが明らかとなった。今後は、DNA 損傷を起因としたクロマチン 構 造 の 変 化 に 着 目 し 、ク ロ マ チ ン 免 疫 沈 降 法（ChIP）などのテクノロジーを駆使し、遺伝子発現への影響を検討する。さらに、静水圧の作用下でDNA 損傷が誘導されるメカニズムに関しても、検討を進める予定である。静水圧に対する細胞の応答はこれまでにも報告されているが、その最上流のシグナルに関しては未知である。静水圧は、胎生期から老年期まで、軟骨細胞にとどまらず、すべての体細胞に作用する重要な力学的因子であることから、細胞による静水圧の感知・応答機構を理解することは、ライフサイエンス・生体医工学分野において革新的知見をもたらすことが大いに期待される。

TheJoint

MeetingofESCHM-ISB-ISCH, July 2nd-6th, 2018, Krakow,

ロマチンの組織化や遺伝子転写、DNA 複製にも役割を担っている。本研究では静水圧の作用下で生じる

Koichiro Maki, Katsuko Furukawa, Takashi Ushida、Poland2.

Koichiro Maki, Katsuko Furukawa, Takashi Ushida,“DNA breaks in chondrocyte progenitor cells undercyclic hydrostatic pressure”, The World Congress ofBiomechanics 2018, July 8th-12nd, 2018, Dublin,Ireland

謝辞
この度は、本長期間派遣におきまして、貴財団より多大なるご援助を賜りましたことに心からの御礼を申し上げます。Sara Wickström 研究室は、2017 年12 月に発足した新しい研究室であり、私が 2018 年 4月にヘルシンキに到着してからも研究室の立ち上げ作業が残っておりました。はじめは単純な実験に支障が出るなど厳しい期間もございましたが、メンバーが課題を共有し、チームワークが形成されていく過程に加わることができ、そのおかげでチームの輪に馴染むことができたように存じます。ワークスタ
イルに関しては、Sara 先生のもと、“研究者としてのプロフェッショナルな行動とは何か“ということを自分に問いかける機会を数多く持ちました。実験室の使い方、時間の使い方、周りの人たちとのコミュニケーション、データの解析・解釈、研究室会の準備・発表、すべてにおいて、自分の在り方を見つめなおす必要がございました。また、本研究では、日本から持ち込んだ静水圧負荷装置が研究のオリジナリティ・クオリティを担保する重要な役割を担っておりましたが、ヘルシンキ到着後に様々なトラブルが生じてしまい、いつ日本に帰らねばならなくなるかとの不安・無力感で一睡もできなかった夜もございました。そのような状況下で、貴財団の助成金より、装置の修理費の一部や工場への移動費を支出させていただき、最終的に研究を伸展させることが出来ました。あらためまして、ご援助に深謝いたします。今後、いかにライフサイエンス・医工学研究に貢献するかということを使命感とともに強く念頭に置き、歩んでゆく所存であります。この度は、誠に有難うございました。