開催

京都大学教育研究振興財団助成事業
成 果 報 告 書
平成

28

年

月0708日公益財団法人京都大学教育研究振興財団会

長

辻井昭

雄

様

所 属 部 局 工学研究科マイクロエンジニアリング専攻

助成の種類

職名

D2氏

名

Subramanian Parimalam Sangamithirai

平成年度

・

㊞

研究成果公開支援 ・ 国際会議開催助成

事業内容

2016 International Conference of Microfluidics, Nanofluidics and Lab-on-aChip

開催期間

平成

28

年 06

月

総 数 278 名

参加者

28

年06

月12日

内 訳
6月10日 109 名、6月11日 103 名、 6月12日 66 名

(機関や資金の名称)

経 費 の 内 訳 と費

当財団の助成について

平成

タイトルは「成果の概要／報告者名」として、A４版２０００字程度・和文で作成し、添付して下さい。 「成果の概要」以外に添付する資料 ■ 無有()事業に要した経費総額
150,000 円
うち当財団からの助成
150,000 円
額
その他の資金の出所

会計報告～

中華人民共和国、大連

開催場所

成果の概要

日

10目 金学会参加登録費
ビザ代
航空券チケット代
宿泊費
タクシー代

助 成 金 の 使 途 に つ い て
額
34907
4000
31960
67446
11687

（円）

財団助成充当額

（円）

34907
4000
31960
67446
11687

（今回の助成に対する感想、今後の助成に望むこと等お書き下さい。助成事業の参考にさせていただきます。）
I sincerely thank Kyoto University foundation for providing me travel grant to attend theconference.
このたびは本国際会議に参加するため、助成いただき京都大学教育振興財団の皆さまには大変感謝申し上げます。

成果報告書および成果の概要は、財団に郵送(あるいは持参)するとともに、Excel・Wordファイルでメル送信して下さい。
メール送信分の印鑑は不要です。Grant report
Name of the conference: 2016 International Conference of Microfluidics, Nanofluidics andLab-on-a-Chip, Dalian Maritime University, Dalian, China
Presentation date and time: June 10th, 2016, 12.00 PM - 12.15 PM
Paper title: Massively parallel quantification of miRNA in single cells via duplex-specificnuclease reaction in pico-liter wells
Abstract

Novelty:
We report a one-step assay for the parallel quantification of miRNA in tens of thousands ofsingle cells. Our protocol leverages DSN (duplex-specific nuclease) induced signal amplificationand uses pico-liter sized micro-wells, which confine single cells and the enzymatic reaction. We
demonstrated our assay with triplexed miRNA detection in K562 cells and a detection limit ofmiRNA at 5.7 copies per well.
Background:
Existing techniques in single cell miRNA analyses require labor-intensive sample preparations
and do not have capability to realize massively parallelized single cell measurements withinseveral hours. Here we present a 60 min protocol for detecting miRNAs in tens of thousands ofsingle cells.
Experimental method:
Our protocol uses a PDMS chip consisting of 100,000 wells (20 m diameter and 30 m deep) toconfine the enzymatic reaction triggered via miRNAs from single cells. MiRNA released uponlysis of single cell hybridizes with complementary linear molecular beacon (LMB), which has aquencher and a fluorophore at 3’ and 5’ ends, respectively. DSN enzyme then cleaves only LMB
in the hybrid duplex, releasing a free fluorescence molecule. Because the reaction can recycle themiRNA target, it creates multiple free fluorescence molecules, resulting in increase of thefluorescence signal. We demonstrated our protocol with simultaneously detecting three miRNAtargets: miR200a, miR16, and miR92 in K562 cells. In this demonstration we spread
approximately 100,000 K562 single cells over a chip and then added a reaction mix containing
three kinds of LMBs (100 nM for each), DSN enzyme (0.1 U/L), and Triton X-100 (0.1%). We
sealed the chip with a glass slide and incubated at 50°C for 60 min. Our protocol lysed the single
cells upon application of the reaction mix over the chip and reduced indigenous nuclease activity
while keeping DSN activity. We measured the resulting fluorescence intensity in each well using
an automated epifluorescence microscope (the scanning of the 100,000 wells took for 100 min).

Results and discussion:
We observed significant fluorescence in cell containing wells after the incubation and measured
mean signal to noise ratio (SNR) of single cell containing wells were 4.1, 4.6, and 2.6
respectively for miR200a, miR16, and miR92. We determined as SNR=(fcd-fc)/(fed-fc), where fcd,and fed are fluorescence intensities of wells with and without single cells, respectively. We usedthe background level, fc, of the mean fluorescence intensity of single cell containing wells in acontrol experiment sans DSN. We also determined the limit of detection of our protocol was
1 pM (5.7 copies per well) and the dynamic range was two orders of magnitude ranging from
1 pM to 100 pM with spiking synthetic miRNAs into the reaction mix.
Outcome of attending conference:
I was able to present my research to the scientific community and also received comments. I
could meet international researchers related to my field and had scientific discussions.

報告書
学会名：2016年ナノマイクロ流体，Lab-on-a-Chip国際学会，中国，大連，大連海事大学
発表日時：2016年6月10日

PM12:00-PM12:15

論文名：ピコリットルウェル内における二本鎖特異的ヌクレアーゼを使用した一細胞miRNAの大規模並列定量
概要
新規性：
我々は数万個の一細胞内miRNAの1ステップ並列定量方法について報告する．我々のプロトコルはDSN(二本鎖特異的ヌクレアーゼ)をシグナル増幅に活用し，ピコリットルサイズのマイクロウェルを利用する．マイクロウェルは一細胞と酵素反応をウェル内に制限する．本アッセイを用いたK562細胞株のmiRNA3種類の検出を示し，また検出限界が1ウェルあたり5.7コピーであることを示した．
背景：
現在の一細胞miRNA解析技術はサンプルの準備に非常に大きな労力を割いており，また数時間に及ぶ一細胞大規模並列計測を行うことができない．そこで，本研究では数万個の一細胞のmiRNAを60分で検出する方法を提示する．
実験方法：
本プロトコルでは10万個のウェル (直径20 µm，深さ30 µm) を含むPDMSチップを使用する．一細胞からのmiRNAによる酵素反応はこのウェル内に限定される．一細胞の破壊により放出されたmiRNAは相補的なlinear molecular beacon (LMB)と結合する．
LMBは3’ 末端と5’ 末端にそれぞれクエンチャーと蛍光物質を持つ．DSN酵素はmiRNAに結合し二本鎖を形成しているLMBのみを切断し，LMBの蛍光分子は遊離し蛍光を発する．ターゲットのmiRNAは未反応のLMBと再結合することができるため反応を繰り返すたびに遊離する蛍光分子が増え，結果蛍光シグナルが増大する．我々はK562内の3つのmiRNA，miR200a，miR16，miR92，の同時検出により本プロトコルを示した．本プロトコルではまず約10万個のK562細胞をチップの上にまき，反応溶液を導入した．反応溶液は3種類のLMB (それぞれ100 nM)，DSN酵素 (0.1 U/µL)，Triton X100 (0.1%) を混合した．チップをスライドガラスでシールし，50°Cで60分インキュベートを行った．本プロトコルにより反応溶液をチップに導入することでウェル内の細胞を破壊し，DSNの活性を維持している間生来のヌクレアーゼの活性を抑えた．反応後，10万個のウェルそれぞれの蛍光を自動落射蛍光顕微鏡を用いて100分でスキャンを行い、それぞれの蛍光強度を計測した．

結果と考察：インキュベーション後，細胞を含むウェル内が強い蛍光を発することを観察した．一細胞を含むウェルの平均SN比はmiR200a，miR16，miR92それぞれに対して4.1，4.6，2.6であった．ここでSN比= (fcd-fc)/(fed-fc) と定義した．fcdとfedはそれぞれ一細胞をウェル内に含む場合，含まない場合の蛍光強度である．fcはバックグラウンドの蛍光強度としてDSNを使用しないコントロール実験における一細胞を含むウェルの蛍光強度の平均値を使用した．また，本プロトコルにおける検出限界を1pM (1ウェルあたり5.7コピー) とし，ダイナミックレンジは合成miRNA と反応溶液を混合により1 pMから100 pMの範囲と決定した．
学会参加における成果：
私は科学コミュニティにおいて本研究を発表しまたコメントをいただくことができた．
本分野に関係のある国際的な研究者に会い，彼らと議論をすることができた．