セントロメア・ペリセントロメア反復配列の DNA メチル化維持機構
Maintenance DNA methylation mechanism of centromeric & pericentromeric repeats（分子生物学会推薦）

代表研究者 九州大学

鵜木 元香

Kyushu University

Motoko UNOKI

Immunodeficiency, centromeric instability, facial anomalies (ICF) syndrome is a rare autosomal recessive disorder, thepatients’ chromosomes of which often show multiradial configurations fused via hypomethylated pericentromeric repeats.
Previously, we reported CDCA7 and HELLS as causative genes of the syndrome, and that their encoded proteins make aprotein complex which facilitates non-homologous end-joining repair of DNA double-strand breaks. In this study, wediscovered that the same complex is required for the accumulation of proteins on nascent DNA, including theDNMT1/UHRF1 maintenance DNA methylation complex as well as proteins involved in the resolution or prevention ofR-loops comprising DNA:RNA hybrids and single-stranded DNA. Consistent with the hypomethylation state ofpericentromeric repeats, the transcription and formation of aberrant DNA:RNA hybrids at the repeats were increased in
CDCA7 and HELLS knockout cells. Furthermore, the ectopic expression of RNASEH1, which resolves R-loops, reduced
the accumulation of DNA damages at a broad range of genomic regions including pericentromeric repeats in these cells.
Hence, we propose that hypomethylation due to inefficient DNMT1/UHRF1 recruitment at pericentromeric repeats by
defects in the CDCA7/HELLS complex could induce centromeric/pericentromeric instability via ectopic expression andpathological R-loop formation, which may explain a part of the molecular pathogenesis of ICF syndrome including
multiradial chromosomes.
異常を引き起こすことを明らかにした 2。しかしなが研究目的

免疫不全、染色体の不安定化、顔貌異常を特徴と

ら、ゲノム編集で作製した CDCA7 及び HELLS 欠損

する immunodeficiency, centromeric instability, facial

HEK293 細胞では ICF 患者細胞同様にセントロメア・anomalies (ICF) 症候群は、セントロメア・ペリセンペリセントロメア反復配列の DNA 低メチル化が認

トロメア反復配列の DNA 低メチル化とヘテロクロめられたのに対し、NHEJ に必須の Ku80 変異細胞でマチンの崩壊を伴う常染色体潜性（劣性）の遺伝病は低メチル化は惹起されなかった 2。よって、CDCA7である。患者の活性化 B 細胞では、低メチル化した及び HELLS の変異は、NHEJ の異常以外の機構で、セントロメア・ペリセントロメア領域を介して異な低メチル化を引き起こすと考えられ、本研究ではそる染色体同士が融合した分枝染色体（multiradialの機構を明らかにすることで、当該領域の DNA メchromosome）が高頻度で認められるのも、本症候群チル化維持機構を明らかにすることを目的とした。の特徴である（Fig. 1）。代表研究者らは 2015 年にまた、当該領域の低メチル化がどのように分枝染色CDCA7 と HELLS を本症体の形成に寄与するのかについても検討した。

候群の原因遺伝子として同定し 1、これらの遺伝研究経過

子の変異が、二本鎖 DNA

これまでに代表研究者は、CDCA7 及び HELLS 欠切断（DSB）の非相同末端結合（non-homologous
end joining: NHEJ）型修復

損細胞に野生型タンパク質を再発現させても、一旦Fig. 1 An example of multiradialconfiguration of chromosomes
observed in ICF patients.

低下した DNA メチル化レベルは回復しないことから、これらのタンパク質は de novo DNA メチル化ではなく、維持 DNA メチル化に関与することを明ら

ループ形成阻害に働く SUPT16H 注 3（注 3: ヒストン

かにしている 2。CDCA7 と HELLS はクロマチンリシャペロンである FACT 複合体の構成因子）が含まモデリング複合体を形成することが報告されたことれていることに気がつき、ICF 症候群の分子病態にから、代表研究者は、同複合体がヌクレオソームをR ループ形成が関与している可能性を考えた。線虫

スライディングさせて、DNA メチル化維持機構に関（Caenorhabditis elegans）ではヒストン H3K9 のメチ与するタンパク質の新規合成 DNA 鎖上への集積をル化が反復配列のヘテロクロマチン維持に重要であ促進しているのではないかとの仮説を立て、CDCA7り、線虫が持つ２つのヒストン H3K9 メチル化酵素

非存在下で新規合成 DNA 鎖上に集積できなくなるの二重変異体では、反復配列のヘテロクロマチン構タンパク質を、野生型と CDCA7 欠損細胞を用いて、造が弛緩して異所性の転写が起こり、これが R ルー

isolation of proteins on nascent DNA (iPOND)-MS/MS 法プを形成して、DSB の原因となることが報告されてにて網羅的に同定した。その結果、CDCA7 欠損細胞いた。そこで代表研究者は、ICF 症候群患者細胞ででは、DNA メチル化の維持に必須である DNMT1 とも同様のことが起きているのではないかと考え、モUHRF1 の新規合成 DNA 鎖上への集積が、野生型細デル細胞である CDCA7 及び HELLS 欠損細胞におい胞と比較して 40〜60%減少していることを見出したて低メチル化が顕著なペリセントロメア領域に R ル3ープが形成されていないか調べたところ、当該領域。最近、ICF 症候群患者で DNA メチル化が低下し注1ている領域は後期 DNA 複製領域であることが報から通常は転写されない RNA が異常に転写され、R告された（注 1：ペリセントロメアを含むヘテロクループが当該領域に蓄積しており、さらに DSB も当ロマチン領域が多く含まれ、UHRF1 によるヒストン該領域に蓄積していることがわかった 3。R ループをH3 のユビキチン化が DNA メチル化の維持に必須で解消する RNASEH1 を外来性に発現させると、ペリある領域であり、DNA 複製非共役的に DNA メチルセントロメア領域の DSB が減少したことから、ペリ化維持に関する一連のプロセスが起こる領域である

セントロメアに生じた異所性の R ループが、DSB のことが昨年報告された）。UHRF1 がユビキチン化す原因であることがわかった（Fig. 2）。本研究成果は、るヒストン H3 が含まれるヌクレオソームに巻き付

2020 年 10 月に Scientific Reports 誌に掲載された 3。

いたヘミメチル化 DNA は DNMT1 の良い基質ではPericentromeric satellite-2 repeatsないことも報告されていることから、

1.0% Input (53BP1-ChIP)

CDCA7/HELLS 複合体は、クロマチンリモデリングを介して、DNMT1/UHRF1 維持 DNA メチル化複合体が後期 DNA 複製領域にアクセスすることで、ヘミメチル化 DNA のメチル化を促進している可能性が強く示唆された。これは、クロマチンリモデリン
グと DNA メチル化維持機構を結びつける重要な知見である。一方昨年、申請者らの発表とほぼ同時期

0.80.60.4
0.20.0V5–RNASEH1 0に、他グループから HELLS が DNA 複製非共役型のCells:

DNA メチル化維持機構に関与していることが報告

P = 0.005
P = 0.031+2–WT–+4

CDCA7 KO

Fig. 2 R-loops cause DNA double-strand breaks at
pericentromeric satellite-2 repeats in CDCA7 KOcells. Chromatin immunoprecipitation assay using
anti-53BP1 antibody was conducted. WT and CDCA7
KO cells with or without transfection of the V5–RNASEH1_WT were served for the assay. p53BP1:
DNA double-strand break marker. RNASEH1: R-loop
digestion enzyme.

され、申請者の仮説が実証された。
また代表研究者は、CDCA7 と複合体を形成し、CDCA7 非存在下で新規合成 DNA 鎖上に集積が減少するタンパク質として、厳しい選択条件を設けて、DNMT1 と UHRF1 以外に６つのタンパク質を同定した 2,3。これらのタンパク質は CDCA7 の直接的な相互作用タンパク質である可能性が高いと考えられた。

考察
ICF 症候群におけるセントロメア・ペリセントロ

2
代表研究者は、この中に R ループ注（注2: DNA:RNA

メア領域の DNA 低メチル化が、染色体不安定性のハイブリッドと１本鎖 DNA からなる 3 重鎖構造）原因であることは以前から示唆されてきたが、今回、の解消に重要な RNA ヘリカーゼである DDX21 と RDNA 低メチル化が異所性の転写を引き起こし、それが異常な R ループ形成を介して DSB の原因となる

2.

M. Unoki, H. Funabiki, G. Velasco, C. Francastel, H.

ことで、染色体の脆弱性につながるという詳細なメ

Sasaki：CDCA7 and HELLS mutations undermine

カニズムを明らかにすることができた。なお、DSB

non-homologousの 主 要 な 修 復 機 構 は 、 NHEJ と 相 同 組 換 え

instability syndrome, J. Clin. Invest., 129, 78-92,（homologous recombination: HR）であることが知ら2019.

れており、NHEJ は DNA 断端を結合するだけなので3.

endjoining

incentromeric

M. Unoki, J. Sharif, Y. Saito, G. Velasco, C.

注 4（注 4：ペリセントロメFrancastel, H. Koseki, H. Sasaki ： CDCA7 andア反復配列を含む遺伝子非コード領域の修復には通HELLS suppress DNA:RNA hybrid-associated DNA

常は大きな問題はないと考えられる）、HR は姉妹染

damage at pericentromeric repeats, Sci. Rep., 10,

色分体を鋳型として修復に使用するため、塩基変異

17865, 2020.

塩基変異が生じやすいが注5が生じにくい （注 5: 例外的に反復配列を修復する

4.

M. Unoki: Chromatin remodeling in replication-

場合には、相同配列が並んでいるために間違いが生

uncoupled maintenance DNA methylation andじ得る）という特徴がある。なお、ヒトにおいてペchromosome stability: Insights from ICF studies.

リセントロメアを構成するサテライト 2 反復配列はGenes Cells, 2021, in press.

5 塩基対を１単位とし、これが染色体によっては数100 万塩基対にわたって繰り返しており、特筆すべきこととして、異なる染色体のペリセントロメア反復配列も高い相同性を有している。また、NHEJ は細Healthy persons
CDCA7ZBTB24

CDCA7HELLS

胞周期に関係なく使用される修復経路であるのに対CDCA7Nucleosome sliding

し、HR は姉妹染色分体上の相同配列が必要である
ことから、S 期から G2 期に使用される修復機構であChromatin remodelingる。R ループを伴う DSB は HR で主に修復されることが報告されており、また CDCA7 及び HELLS の変?
DNMT1

UHRF1

異は NHEJ の効率を低下させて HR 優位な状況を作り出すことが予測される 2。よって、CDCA7 及びHELLS 欠損細胞では、姉妹染色分体が存在しない G1期においてペリセントロメア反復配列に DSB が起Maintenance DNAmethylation（Replication-uncoupledregions）

こった場合に、異なる染色体のペリセントロメア反DDX21 and FACT
complex

NHEJ related
proteins

Resolution &prevention of R-loops

Non-homologous end
joining（NHEJ）

Chromosome stability

復配列を鋳型として修復が試みられ、中間体（ホリデイジャンクション）が上手く解離できないために、ペリセントロメア領域を介した染色体融合が生じる

ICF patients

Type-1 patients

Type-2, 3, 4 patients(DNMT3B mutation)(ZBTB24, CDCA7, or HELLS mutation)

Defects in de novo
DNA methylation

Defects in replication-uncoupled
maintenance DNA methylation

可能性が考えられる（Fig. 3）。分枝染色体の生成機序は長いこと不明であったが、本研究により、DNA損傷修復異常が絡んだ現象であることが見えてきた
ことは、ICF 症候群の分子病態機序の全貌解明に向Hypomethylation of pericentromere

Ectopic transcription ↑Formation of pathological R-loops ↑DNA replication fork

2nd structure
ssDNA

けた大きな前進であると考える。申請者はここまで

R-loopHypomethylationの研究成果と考察を総説としてまとめ、Genes toCells 誌に発表した 4。

PolCollision

DNA:RNA hybrids

RNADNA damages ↑

参考文献
1.

P. E. Thijssen, Y., …, M. Unoki, et al.： Mutations
in CDCA7 and HELLS cause immunodeficiencycentromeric instability-facial anomalies syndrome,Nat. Commun., 6, 7870, 2015.

Repair by transcription-associated homologous recombination?
(Defects in NHEJ backup system）?
Fusion of chromosomes via pericentromeric repeats
Multiradial chromosomes
Fig. 3 Potential mechanisms underlying the protection of chromosome stability inhealthy persons and the molecular pathogenesis of ICF syndrome.

研究の発表6.

鵜木元香：染色体の安定性はどのように維持さ誌上発表

れているのか？〜ICF 症候群の原因遺伝子の機1.

M. Unoki, J. Sharif, Y. Saito, G. Velasco, C.

能解析から見えてきたこと〜、ダイバーシティ

Francastel, H. Koseki, H. Sasaki: CDCA7 andCHIBA 研究環境促進コンソーシアム「スキルアHELLS suppress DNA:RNA hybrid-associated DNAップセミナー」、千葉、2020 年 2 月.

damage at pericentromeric repeats, Sci. Rep., 10,
2.

れているのか？〜ICF 症候群の原因遺伝子の機G. Velasco, D. Ulveling, S. Rondeau, P. Marzin, M.

能解析から見えてきたこと〜、浜松医科大学セUnoki, V. Cormier-Daire, C. Francastel: Interplay

ミナー、浜松、2020 年 2 月.
8.

鵜木元香：染色体の安定性はどのように維持さ

comparative methylomes in rare mendelian disorders.

れているのか？〜ICF 症候群の原因遺伝子の機Int. J. Mol. Sci., 22, 3735, 2021.

能解析から見えてきたこと〜、加齢研研究員会

M. Unoki: Molecular pathogenesis of ICF syndrome.

セミナー、仙台、2020 年 2 月.

IMPACT (Science Impact Ltd), 2021, in press.
4.

鵜木元香：染色体の安定性はどのように維持さ17865, 2020.

between histone and DNA methylation seen through

3.

7.

9.

M. Unoki, H. Sasaki：CDCA7 and HELLS suppress

M. Unoki: Chromatin remodeling in replication-

DNA:RNA hybrid-associated DNA damage at

uncoupled maintenance DNA methylation andpericentromeric repeats、
日本人類遺伝学会第 65 回

chromosome stability: Insights from ICF studies.

大会、オンライン、2020 年 11 月.

Genes Cells, 2021, in press.

10. 鵜木元香：CDCA7 と HELLS はペリセントロメ
ア反復配列の DNA:RNA ハイブリッドに起因す

口頭発表

る DNA 損傷を抑制する、
日本環境変異学会第 49

1.

回大会、沼津、2020 年 11 月.

2.

鵜木元香：セントロメア・ペリセントロメア特異的維持メチル化機構の解明を目指して、新学術11. 鵜木元香：クロマチンリモデリングと染色体安領域研究「多様かつ堅牢な細胞形質を支える非定性、蛋白研セミナー「多角的な視点によるタン

ゲノム情報複製機構」 第 1 回領域会議、札幌、

パク質修飾の機能解明」、オンライン、2021 年

2019 年 9 月.

2 月.

M. Unoki, H. Funabiki, H. Sasaki ： Relationship12. 鵜木元香：クロマチンリモデリングと維持 DNA

between the CDCA7/HELLS chromatin remodeling

メチル化そして染色体安定性、新学術領域研究

complex and NHEJ in molecular pathogenesis of ICF「全能性&非ゲノム複製」領域合同若手研究会

syndrome、第 14 回生命医科学研究所ネットワー

2021、オンライン、2021 年 4 月.

ク国際シンポジウム、大阪、2019 年 10 月.
3.

4.

5.

鵜木元香、船引宏則、佐々木裕之：CDCA7/HELLS

ポスター発表クロマチンリモデリング因子と NHEJ〜ICF 症候

1.

M. Unoki, J. Sharif, Y. Saito, H. Sasaki：CDCA7 and群の分子病態の解明に向けて〜、第 25 回 DNAHELLS suppress DNA:RNA hybrid-associated DNA

複製・組換え・修復ワークショップ、奈良、2019

damage at pericentromeric repeats、第 43 回日本分

年 11 月.

子生物学会年会、オンライン、2020 年 12 月.

M. Unoki, H. Funabiki, H. Sasaki ： Role of the2.

鵜木元香：CDCA7 と HELLS はペリセントロメ

CDCA7/HELLS chromatin remodeling complex in

ア反復配列の DNA:RNA ハイブリッドに起因す

genome stability、第 42 回日本分子生物学会、福る DNA 損傷を抑制する、第 38 回染色体ワーク

岡、2019 年 12 月.

ショップ・第 19 回核ダイナミクス研究会、オン

鵜木元香、船引宏則、佐々木裕之：ICF 症候群のライン、2021 年 1 月.

分子病態における CDCA7/HELLS 複合体と非相3.

鵜木元香：クロマチンリモデリングと染色体の同末端修復の関係性、第 37 回染色体ワークショ

安定性〜ICF 症候群の原因遺伝子の機能解析かップ・第 18 回核ダイナミクス研究会、新潟、2019

ら見えてきたこと〜、第 14 回エピジェネティク

年 12 月.

ス研究会、オンライン、2021 年 3 月.