真核生物の起源に関わる新奇光受容型膜タンパク質ロドプシンの機能メカニズム研究
Study on the mechanism of biological function of novel photo-receptive membraneprotein rhodopsins related to the origin of eukaryotes（分子科学会推薦）

代表研究者 東京大学

井上 圭一

The University of Tokyo

Keiichi INOUE

協同研究者 東京大学

永田 崇

The University of Tokyo

Takashi NAGATA

東京大学

八尾 寛

Tohoku University

Hiromu YAWO

In this study, we aimed to reveal the molecular functions and functional expression mechanisms of the transmembrane photoreceptive proteins heliorhodopsin (HeR) and schizorhodopsin (SzR), which were first reported in 2018and 2019, respectively. X-ray crystallography showed that HeR forms a dimer in which two protomers are inter-connected
via their long extracellular loops. A lateral hole structure in HeR to take in retinal from the outside was also found. On theother hand, SzR was found to have a light-driven inward proton pumping function, taking protons into the cell with light.
X-ray crystallography also suggested that SzR has short transmembrane helices, which allow for efficient proton transport.
Although SzR is evolutionarily positioned between conventional microbial rhodopsin and HeR, the protein structure isclose to the former, indicating that it is a member of microbial rhodopsin and not HeR. The photo-functional mechanisms
of HeR and SzR revealed in this study provide new insights into the forms of light utilization acquired by Asgardianarchaea just before they evolved into eukaryotes.

研究目的

知見が得られると期待される。

本研究では代表研究者の井上らがそれぞれ 2018年と 2019 年に報告した光受容膜タンパク質である、研究経過

ヘリオロドプシン（HeR）[1]およびシゾロドプシン

今回、東京大学の濡木理教授らおよび名古屋工業（SzR）[2]について、その分子機能と機能発現メカニ大学・神取秀樹教授らのグループと共に HeR の光反ズムの解明を目的とする。特に分光解析や X 線結晶応メカニズムを明らかにするため、X 線結晶構造解構造解析を行うことで、構造・ダイナミクス情報を析に取り組み、その三次元構造を 2.4 Å の原子分解獲得し、これらの分子機能の発現メカニズムを明ら能で明らかにすることに成功した（Fig. 1）[3]。HeRかにする。特に最近の研究において、真核生物の最の膜貫通領域の構造は代表的な微生物型ロドプシン

終共通祖先に最も近縁な現生原核生物であるとされであるバクテリオロドプシン（BR）と似ており、配る、アスガルドアーキアの一種であるヘイムダール

列相同性が低いにも関わらず両者が共通した構造でアーキアが、従来の微生物ロドプシンに HeR と SzRあることが明らかとなった。さらに、BR とよく似たを加えた三種類のロドプシンを持つことで、新たな形でレチナールが 7 本目の膜貫通ヘリックス（TM7）

光利用戦略を獲得し、真核生物への進化を果たしたのリジンに共有結合していた。一方、細胞外ループと考えられることから、本研究で HeR と SzR の機能は長く伸びたシート構造をとり、隣の分子の表面をを解明することで、真核生物の起源に関わる新たな覆うことで密な二量体を結晶構造中で形成していた。

新たに構築した。そしてその機能を解析したところ
光を照射すると細胞内に水素イオン（H+）を輸送する、内向き H+ポンプ機能を持つことが明らかとなった（Fig. 2）。

Fig. 1. The X-ray crystallographic structure of HeR
また名古屋大学・内橋貴之教授（兼・自然科学研究機構生命創成探究センター（ExCELLS）客員教授）および金沢大学・柴田幹大准教授らとの共同研究により、高速原子間力顕微鏡（AFM）観察によって、この二量体が脂質二重膜中の生理的な条件でも保たれていることを確認し、HeR は基本的に二量体としFig. 2. Experimental results showing the inward H+て機能することを明らかとした。さらに、名古屋工transport of SzR studied in E. coli (left) and mammalian

業大学・神取秀樹教授らのグループとの研究においcells (right). The number of protons transported by SzRsて、細胞に発現させた HeR の N 端、C 端に異なる蛍is larger than that of another group of inward H+ pumps

光タグをつけることで、１細胞のイメージングを行(PoXeR, NsXeR) of bacteria.

い、実験的に HeR は通常のロドプシンと逆の膜トポロジーを持つことが示された。
一方、HeR の細胞外側は疎水的なアミノ酸残基で塞がっており、イオンや基質が通る隙間は確認されなかった。こうしたアミノ酸残基は HeR の間で保存性が高く、大部分の HeR は微生物型ロドプシンのような輸送体としては機能できないことが示唆された。
一方、細胞内側はレチナールから細胞内ループにわたって、水分子を介した広範な親水性相互作用が存在しており、光受容に伴う HeR の構造変化に重要であると考えられる。
HeR の構造には、レチナールの上部に既知のロドプシンにはない、大きな横穴構造があることが明らかとなった。そして、この穴を塞ぐように HeR のアミノ酸を変異させると、レチナールの再構成効率が大きく低下したことから、この横穴は HeR が環境中からレチナールを効率的に取り込むために重要な役割を持つと考えられる。
次に、名古屋工業大学・神取秀樹教授ら、イスラエル工科大学・Oded Béjà 教授ら、チェコ科学アカデミ・Rohit Ghai 教授ら、名古屋大学（兼・自然科学研究機構 生命創成探究センター（ExCELLS）客員教授）
・内橋貴之教授らの研究グループと共に、SzR の機能を調べるため、大腸菌やホ乳類の細胞にその遺伝子を導入し、タンパク質を大量に発現させる系をこの様に光で細胞内に H+を輸送するロドプシン
は、近年深海などで見つかった、アーキアとは進化的に遠く離れた一部の細菌でのみ知られていたが[4]、この発見により真核生物に進化する直前のアス
ガルドアーキアも、光を使って細胞内に H+を取り込んでいることが初めて示唆された。またさらに SzRは海洋に広範に棲む未知の微生物グループにもあることが本研究の中で見いだされた[5]。
次に、SzR がどのようにして光エネルギーを使って、細胞内へ H+を運ぶのか、そのメカニズムを明らかにするために、タンパク質を精製してその性質を詳細に調べた。その結果、アスガルドアーキアの SzR
は主に 557 nm の光を、海洋性微生物のものは 542 nmの光を吸収することが示され、棲息する環境や生物種によって利用する光の波長（色）が異なることが示唆された。またさらに分子全体の構造を高速原子間力顕微鏡で観察したところ、同一の 3 つの分子が集まった三量体構造を持つことが明らかとなった。
さらに、光を吸収した際にタンパク質の中で起こる反応や分子構造変化を、ナノ秒レーザーを用いた高速分光計測や高精度の赤外分光計測で解析したところ、SzR はレチナールとタンパク質内外の溶媒との間で、直接 H+をやり取りすることで、細胞内へ一方向的に H+を輸送することが明らかとなった。

さらに X 線結晶構造解析を用いて SzR の立体構胞内側のグルタミン酸が溶媒に露出しやすい構造を造を明らかにした。SzR が既存の微生物ロドプシン取っていることが明らかになった（Fig. 3）。水素イと HeR どちらに近いのか調べるために、構造を比較オンの通り道にあるアミノ酸改変体タンパク質を用したところ、SzR の細胞内や細胞外のループ構造はいた実験によって、溶媒がタンパク質内部に流入しBR に近く、また BR 様の三量体を形成する一方で、やすいことも示された。

HeR とは大きく異なっていた。従って、SzR はタン

こうした結果をもとに、光によって構造変化するパク質を構成するアミノ酸の配列こそ両者の中間でとタンパク質内部に溶媒が入り込み、H+がグルタミあるが、既存の微生物ロドプシンに分類されることン酸に誘引されながら細胞の中へ直接放出されるとがわかった。

いう、SzR 独自の内向き H+輸送モデルを提唱した。

次に、H+の輸送メカニズムについて調べた。暗状態では、H+はレチナールのシッフ塩基に結合してお考察り、光刺激が入るとそこから離れて、SzR の細胞内本研究は、世界で初めて HeR と SzR の立体構造を側に存在するグルタミン酸を通して細胞内に放出さ決定した。HeR は BR とはアミノ酸配列が大きく異れる（Fig. 3）。一般的な H+ポンプでは、H+はグルタなり、さらに膜に対する向きでも反転しているにもミン酸などのアミノ酸残基や水分子の間を、玉突き関わらず、 構造やレチナールの結合様式に多くの類のように移動していくことで輸送される。しかし似性が見られた。しかしイオン輸送能がないことか

SzR では、このグルタミン酸は細胞内への H+の輸送ら、HeR が関与する新規の光シグナル伝達システムには必須であるにもかかわらず、H+はこのアミノ酸が存在する可能性が高く、その解明に向け今後さらにトラップされず、直接タンパク質から細胞の中へなる研究が必要である。

放出されることが示唆されており、SzR の H+輸送メ

一方、SzR の研究からはアスガルドアーキアが真カニズムには大きな謎があった。特徴的なことに、核生物への進化の過程において、太陽光と酸素のあSzR の細胞内側に面している部分は他のロドプシンる環境へ進出する際に、独自の光駆動型の内向き H+と比べて短く、特に TM6 は約 13 アミノ酸残基分短ポンプロドプシンを持つようになったことを示唆しいものであった。こうした構造的特徴によって、細ており、今後は、本来のアスガルドアーキアの中で細胞の内向き H+輸送がどのような役割を果たすのか、その解明に向けた研究が必要となる。
また本研究で明らかになった SzR の輸送メカニズ
ムは、ヒトなどの体内に存在するイオン輸送タンパク質が、どのようにして輸送するイオンの種類や方向を決定するのかという、大きな問題に新たな知見を与えるものであり、他のタンパク質の分子メカニズムの理解へつながると期待される。さらに、脳の神経細胞が関連するうつ病などの発病メカニズムの研究や、血液の酸性化に伴う細胞疾患であるアシドーシスなどの機構解明に向けた分子ツールとして、

Fig. 3. Focusing on the intracellular side of the hydrogenion transport pathway of SzR, glutamate 81 (E81) isSzR の医学研究への応用も期待される。
参考文献

separated from the solvent only by two leucines because

1. Pushkarev, A. et al.: Nature, 558, 595-599 (2018).

TM6 is too short to cover the intracellular side like other

2. Bulzu, P. A. et al.: Nat. Microbiol., 4, 1129-1137 (2019).

rhodopsins. Between the Schiff base and E81, a leucine

3. Shihoya, W. et al.: Nature, 574, 132-136 (2019).

(L78) blocks the pathway, and it is thought that during

4. Inoue, K. et al.: Nat. Commun., 7, 13415 (2016).

+photoactivation, H is transferred into the cell with therotational motion of L78.

5. Inoue, K. et al.: Sci. Adv., 6, eaaz2441 (2020).

研究の発表

Rhodopsins

口頭発表○井上 圭一 2019 年度 ExCELLS 若手リトリー[受賞講演]ト 2020 年 2 月 7 日、蒲郡

1.

新奇な微生物型ロドプシンの光機能およびその微生物型ロドプシンの光機能とその分子メカニ

光反応メカニズムズム○井上圭一 第 3 回晝間輝夫光科学賞・令和 2○井上 圭一 第 3 回先端光機能計測研究会 2019年度研究助成金贈呈式 2021 年 3 月 18 日浜松・年 12 月 26 日、東京オンライン
2.

9.

10. Spectroscopic and structural studies on new types ofDiscovery and functional analysis of novel retinal

rhodopsins: Heliorhodopsin and schizorhodopsin

proteins○ K. Inoue Indo-Japan workshop Frontiers in○Keiichi Inoue ミレニアムサイエンスフォーラ

Molecular Spectroscopy_From Fundamentals toム（サー・マーティン・ウッド賞受賞講演）2019

Applications in Chemistry and Biology November 1,年 11 月 22 日 東京

2019, Kobe, Japan
11. 光受容膜タンパク質微生物型ロドプシンの新地[招待講演]

平：ヘリオロドプシンの発見と展開

1.

光駆動タンパク質ロドプシンのもたらす生物と○井上 圭一 日本生物物理学会北海道支部講演

光の新たな関係会 2019 年 10 月 29 日、札幌

○井上 圭一 日本バイオインダストリー協会・2.

未来へのバイオ技術勉強会 2021 年 4 月 21 日、

ンパク質ロドプシンのデザイン

オンライン○井上 圭一 筑波大プレ戦略研究会「生命からPhotobiology of new microbial rhodopsins学ぶ」 2019 年 10 月 10 日、つくば○K. Inoue BPS - Biophysical Society 65th Annual
3.

5.

6.

13. 急速に拡大する微生物型ロドプシンワールド

Meeting February 22-26, 2021, Online○井上 圭一 第 57 回日本生物物理学会年会・カSir Martin Wood Prize Lecture: The emerging world

レントトピック・セッション「タンパク質の構of microbial rhodopsins in photobiology

造・機能・デザイン」2019 年 9 月 24 日、宮崎

○K. Inoue MRC LMB Seminar November 26, 2020,
4.

12. 分子の構造とメカニズムから学ぶ、光受容膜タ

14. 微生物の持つ光機能性膜タンパク質ロドプシン

Onlineの多様性とオプトジェネティクスの拡がり

Sir Martin Wood Prize Lecture: The emerging world○井上 圭一 超スマート社会の構築に繋がる革of microbial rhodopsins in photobiology

新的材料創出に向けた光・量子ビーム応用技術○K. Inoue MPI-FKF Seminar November 11, 2020,

調査専門委員会第１回委員会 2019 年 9 月 14 日、Online

大阪

微生物ロドプシンの機能と色の制御

15. 細菌や古細菌の持つ微生物型ロドプシンの光駆○井上 圭一 第 58 回日本生物物理学会年会・シ動プロトン輸送機構の多様性

ンポジウム「Biomolecular Design to Control Their○井上 圭一 第 92 回生化学会大会 2019 年 9 月

Functions」2020 年 9 月 17 日、オンライン

18 日、横浜

The diversity of photobiological functions of

16. 光受容型膜タンパク質微生物型ロドプシンの多microbial rhodopsins

様な機能メカニズムと内部結合水○ K. Inoue 2020 World Conference on Protein○井上 圭一 第 1 回新世代研究所（ATI）水和ナ

Science July 6-10, 2020, Sapporo, Japan（※コロナノ構造研究会 2019 年 9 月 10 日、水上禍により開催中止）
7.

8.

加速する光機能性タンパク質研究の潮流[一般講演]○井上 圭一 第 41 回光化学若手の会 2020 年 6

1.

アスガルドアーキア由来の新奇光駆動型内向き

月 20 日、京都（※コロナ禍により開催中止）

プロトンポンプ：シゾロドプシンの機能・分光・Photobiology and Photochemistry of Microbial

構造研究

○井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、村 出、神取 秀樹、濡木 理 第 43 回日本分子但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八生物学会年会 2020 年 12 月 4 日、オンライン

尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理 第 47 回

1.

ヘリオロドプシンとシゾロドプシン：２つの新生体分子科学討論会 2021 年 6 月 4 日、オンラ

奇光受容膜タンパク質ファミリーの発見とそのイン機能、光反応

アスガルド古細菌の持つ新奇光駆動型内向きプ○井上 圭一、O. Béjà、神取 秀樹 第 42 回日本

ロトンポンプ、シゾロドプシンの輸送メカニズ

分子生物学会年会 2019 年 12 月 3 日、博多
9.

ム

２つの新奇ロドプシン、ヘリオロドプシンとシ○井上 圭一、志甫谷 渉、今野雅恵、樋口 晶光、ゾロドプシンについて

但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八○井上 圭一、O. Béjà、神取 秀樹 基生研研究会

尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理 日本化学

「異分野融合による次世代光生物学研究会」

会 第 101 春季年会 (2021) 2021 年 3 月 21 日、オ2019 年 11 月 7 日、岡崎
10. Schizorhodopsin の光駆動内向きプロトン輸送とンライン
2.

8.

光駆動型内向き H+ポンプ型シゾロドプシンのその分子メカニズム

H+輸送メカニズムの分光及び構造研究○井上 圭一、角田 聡、M. Singh、今野雅恵、富○井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、田紗 穂子、細島 頌子、中村 良子、渡辺 大輝、

但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八内橋 貴之、R. Ghai、O. Béjà、神取 秀樹 ISSP

尾 寛、川村 出、神取秀 樹、濡木 理 日本生体ワークショップ「レチナールタンパク質の光機エネルギー研究会第 46 回討論会 2020 金沢 2020

能発現の物理と化学」019 年 9 月 6 日、柏

年 12 月 11 日、金沢、オンライン
3.

ヘリオロドプシンとシゾロドプシン：２つの新誌上発表

奇光受容膜タンパク質ファミリーの光反応ダイ

1.

ナミクス

Hososhima, K. Yamashita, K. Ikeda, A. Higuchi, T.

○井上圭一、O. Béjà、神取 秀樹 第 13 回分子Izume, S. Okazaki, M. Hashimoto, R. Mizutori, S.

科学討論会 2019 年 9 月 17 日、名古屋
4.

Tomida, Y. Yamauchi, R. Abe-Yoshizumi, K.

光エネルギーで働く微生物型ロドプシンの新世

Katayama, S. P. Tsunoda, M. Shibata, Y. Furutani, A.

界○井上 圭一5.

Pushkarev, O. Béjà, T. Uchihashi, H. Kandori & O.

群馬大学理工学研究院大学院セミナー 2019 年 9 月 10 日、桐生

Nureki. Crystal structure of heliorhodopsin. Nature

新奇ロドプシンファミリーSchizorhodopsin (SzR)(2019) 574, 132-136.

による光駆動内向きプロトン輸送

2.

○井上 圭一、角田 聡、M. Singh、今野 雅恵、

P. A. Bulzu, H. L. Banciu, A. Andrei, T. Uchihashi, R.

R. Ghai、O. Béjà、神取秀樹 第 46 回生体分子科

Ghai, O. Béjà & H. Kandori. Schizorhodopsins: A学討論会 2019 年 6 月 21 日、つくば
Methanoculleus 属アーキア由来シゾロドプシン

family of rhodopsins from Asgard archaea thatの熱安定性研究

function as light-driven inward H+ pumps. Sci. Adv.

○川﨑 佑真、今野 雅恵、井上 圭一 第 47 回(2020) 6, eaaz2441.

生体分子科学討論会 2021 年 6 月 4 日、オンラ7.

K. Inoue, S. P. Tsunoda, M. Singh, S. Tomida, S.
Hososhima, M. Konno, R. Nakamura, H. Watanabe,

富田 紗穂子、中村 良子、渡辺 大輝、内橋 貴之、

6.

W. Shihoya, K. Inoue, M. Singh, M. Konno, S.

3.

A. Higuchi, W. Shihoya, M. Konno, T. Ikuta, H.

イン

Kandori, K. Inoue & O. Nureki. Crystal structure of

光駆動型内向きプロトンポンプ、シゾロドプシ

schizorhodopsin reveals mechanism of inward proton

ンのプロトン輸送メカニズム

pumping. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2021) 118,

○井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、e201632811.

但馬聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、八尾 寛、川