細胞内のシグナル伝達を光操作する分子プローブの創製
Molecular probes for optical control of cellular signaling processes（日本化学会推薦）

代表研究者

東京大学

佐藤守俊

The University of TokyoMoritoshi SATO

Alpha subunits of heterotrimeric G proteins (Gα) are involved in a variety of cellular functions. Here wedevelop an optogenetic strategy to spatially and temporally manipulate Gα in living cells. More specifically, weapplied the blue light-induced dimerization system, known as the Magnet system, and an alternative red lightinduced dimerization system consisting of Arabidopsis thaliana phytochrome B (phyB) and phytochromeinteracting factor 6 (PIF6) to optically control the activation of two different classes of Gα (Gαq and Gαs). By utilizing
this strategy, we demonstrate successful regulation of Ca2+ and cAMP using light in mammalian cells. The present
strategy is generally applicable to different kinds of Gα and could contribute to expanding possibilities ofspatiotemporal regulation of Gα in mammalian cells.

研究目的

グを施し，任意のタンパク質の結合解離を青色光照

様々な酵素の光操作を実現するための基盤技術と射で自由自在にコントロールできる光スイッチタンして，研究代表者は最近，アカパンカビ由来の青色パク質（“Magnet”と呼ぶ）を開発した（参考文献 1）．

光受容体に対して様々なプロテインエンジニアリン

本研究では，この光スイッチタンパク質を用いて，

図 1 Gαq の活性を青色光で操作し細胞内のカルシウムイオンの濃度を自由自在に制御するための技術を開発．（A）Gαq の光操作技術の原理図．青色光を照射すると光スイッチタンパク質と融合した Gαq が細胞膜に移行して PLCβ を活性化．このとき生成した IP3 が小胞体膜上の IP3R に結合し，細胞質のカルシウムイオン濃度上昇が誘起される．（B）Gαq の光操作を実現するプローブの設計．

図 2 既存技術との比較と本技術の検証．（A）本技術の anchor プローブ（図 1B）の細胞膜への局在を検証．（B-E）本技術では青色光依存的に細胞質内のカルシウムイオン濃度が上昇するが（B, C），既存技術（opto-α1AR）は，青色光のみならず，蛍光プローブ（R-GECO1）のイメージングを行うための励起光（543nm）にも応答してしまうため，蛍光プローブで細胞の応答をモニターしながら Gαq の光操作を行うことが困難である（D, E）．（F）青色光を照射するたびに細胞質内のカルシウムイオン濃度が上昇することを R-GECO1によるカルシウムイオンの蛍光イメージングにより検証．（G）図 2F の実験の蛍光イメージング画像．青色光照射を与えるたびに R-GECO1 の赤色蛍光が上昇する様子を観察できる．
細胞内のカルシウムイオン（Ca2+）の動態制御に関与

研究経過する酵素（三量体 G タンパク質の Gαq サブユニッGαq は G タンパク質連結型受容体の活性化に伴っト）を自由自在に光照射でコントロール（光操作）て細胞膜で活性され，Ca2+の濃度上昇を誘起する酵

す る こ と を 目 的 と し て ， 分 子 プ ロ ー ブ

素である．本研究のアイディアは，細胞膜近傍にお（“photoactivatable（PA）-Gαq”と呼ぶ）（図 1）の開発研究を行った（結果の発表，誌上発表，文献 1）．

ける Gαq の動態を光でコントロールすることにより，当該酵素の活性と細胞内 Ca2+濃度の光操作を実現するというものである（図 1）．上述のように作製した

図 3 Gαq の活性を赤色光で操作し細胞内のカルシウムイオンの濃度を制御するための技術．（A）赤色光での Gαq の光操作技術の原理図．光スイッチタンパク質として，シロイヌナズナ由来の PhyB—PIF6 システムを用いる．赤色光を照射すると光スイッチタンパク質と融合した Gαq が細胞膜に移行して PLCβ を活性化．このとき生成した IP3 が小胞体膜上の IP3R に結合し，細胞質のカルシウムイオン濃度上昇が誘起される．（B）
赤色光で Gαq を操作できるプローブの設計．（C）暗所における本技術の activator プローブ（上図，緑色蛍光）の細胞質への局在と anchor プローブ（下図，赤い蛍光）の細胞膜への局在を検証．（D）赤色光を照射するたびに細胞質内のカルシウムイオン濃度が上昇することを G-CaMP3 による蛍光イメージングにより検証．
（E, F）図 3D のコントロール実験．Anchor プローブがない場合（E），および activator プローブがない場合には（F），赤色光を照射してもカルシウムイオンの濃度上昇は観察されない．
PA-Gαq は青色光に応答して活性化し，細胞内の Ca2+細胞内 Ca2+濃度の光操作を実現できるツールである．

濃度を上昇させることがわかった（図 2）．しかも，本研究ではさらに，Magnet の部分を赤色光スイッチ

PA-Gαq の反応は可逆的であり，青色光の ON/OFF にタンパク質で置き換えることにより，赤色光でコン2+よって，自由自在に Ca 濃度を増減させることがでトロールできる PA-Gαq を開発した．赤色光スイッきるようになった．

チタンパク質として，シロイヌナズナの光受容シス

上述の PA-Gαq は青色光に応答する Magnet を用いテム（PhyB-PIF システム）を用いた（図 3）．開発して開発されているため，青色光で Gαq の酵素活性とた PA-Gαq は赤色光照射に応答して細胞内の Ca2+濃図 4 Gαs の活性を赤色光で操作し cAMP の濃度を制御するための技術．（A）赤色光での Gαs の光操作技
術の原理図．赤色光を照射すると光スイッチタンパク質と融合した Gαs が細胞膜に移行して AC を活性化．これにより cAMP が生成する．（B）赤色光で Gαq を操作できるプローブの設計．（C）赤色光の照射時間依存的に cAMP が生成されることを cAMP 応答エレメント（CRE）を導入したルシフェラーゼ遺伝子の発現を指標として検証．（D）赤色光依存的な cAMP の生成には光スイッチタンパク質 PhyB の補因子（PCB）が必須であることを検証．（E）赤色光強度依存に cAMP が生成されることを検証．（F）本技術では赤色光で Gαs が活性化して cAMP が生成し，暗所もしくは近赤外光により Gαs が不活性化し cAMP の生成が停止する．

度を上昇させることがわかった．さらに，赤色光の色化を実現した．さらに，cAMP の動態に関する酵ON/OFF によって，可逆的に Ca2+濃度を増減できる素（Gαs）の光操作にも当該技術を拡張できることをことも示した．

示した．Ca2+と cAMP はいずれも細胞内での主要なさらに本研究では，PA-Gαq を改変して，Ca2+とは全く異なるセカンドメッセンジャーの環状アデノシセカンドメッセンジャーである．本研究で開発した技術は様々な生命現象を明らかにするための強力なツールを提供すると期待できる．

ン一リン酸（cAMP）を生成する酵素（三量体 G タン
パク質の Gαs サブユニット）の光操作を試みた（図参考文献4）．具体的には，上述の赤色光に応答する PA-Gαq の

1.

F. Kawano, H. Suzuki, A. Furuya and M. Sato,Gαq ドメインを Gαs で置き換えることにより PA-Gαs“Engineered Pairs of Distinct Photoswitches forを設計・開発した．cAMP 応答エレメント（CRE）を

Optogenetic Control of Cellular Proteins” Nat.
Commun., 6, 6256 (2015).

導入したレポーター遺伝子アッセイを利用して評価を行ったところ，PA-Gαs は赤色光照射に応答して活研究の発表

性化し，cAMP を生成することがわかった．さらに

誌上発表

そのレベルは CRE を介した遺伝子発現に十分であ1.

ることも明らかになった．

G. Yu, H. Onodera, Y. Aono, F. Kawano, Y. Ueda, A.
Furuya,H.

Suzuki

andM.

Sato,

“OpticalManipulation of the Alpha Subunits of Heterotrimeric考察

上述のように，本研究では Ca2+の動態に関与する酵素（Gαq）の光操作技術を開発すると共に，その赤G Proteins Using Photoswitchable Dimerization
Systems” Sci. Rep., 6, 35777 (2016).