倉田奨励金研究報告書｜2016 年度（第 48 回）助成■受領№1313

生活の乱れが誘発する疾患発症機構および治療法開発への新規動体追跡技術の応用

代表研究者

浜田俊幸

国際医療福祉大学

薬学部

年齢軸生命機能解析学分野

1．研究目的

准教授

al., Nature comm, 2016)。

情報処理や通信技術の発達は我々の生活を格段

体内時計の乱れが誘起する疾患は、時差ぼけをに便利にしてくれた一方で、高度情報化は世界中含む睡眠障害・精神疾患・癌（特に乳癌、前立腺で昼夜を問わない時間の融合により24時間体制社癌）・糖尿病を始めとする生活習慣病など発症する会を作り出した。24時間社会は、24時間体制の交までに⻑期を有する。そのためそれらの発症機構

代勤務や深夜勤務などの生活環境の変化を生み、解明に迫るためには少なくとも数週間に及ぶ⻑い生活サイクルが多岐多様になった。ヒトは昼行性連続測定が必要である。本研究では、独自に開発動物で、日中活動し夜間休息するという生活サイした動体追跡技術を改良し、自由行動の生理学的クルを持つ。ある程度⻑い期間、夜間休息の時間

条件下でマウスの各組織の遺伝子発現と行動（睡帯に睡眠を取らないあるいは取れない生活習慣を眠覚醒、飲水、摂食、自由行動）をリアルタイム持つヒトの多くは、規則正しい昼行性の生活習慣で解析可能で体内時計の乱れにより誘発されるを持つヒトに比べて、睡眠障害のみならず様々な様々な疾患の初期症状を検出するシステムを構築

疾患発症リスクが高いことが大きな社会問題となすることを目的とする。っている。その生活様式の変化により誘導される体内時計の乱れと様々な疾患の発症には密接な関２．研究概要係があることが明らかになってきた。体内時計の2.1 遺伝子発現定量と種々の行動解析をリアルタイ

乱れは睡眠障害、癌（特に乳癌）、糖尿病、生活習ムで連係するシステムの開発

慣病等の強力な危険因子として作用し様々な疾患

現在、自由行動下マウスの嗅球辺りに取り付けに及び社会問題になっている。その発症機構は不たシンチレータの３次元空間内の動き（直交座標明であり、その解明は急務である。体内時計の乱の値）を基に、測定飼育ケージ内で1mm単位でマれは生体各組織のリズムを計測することで可能でウスの各組織の３次元空間内での位置を解析してある。これまでの研究では，遺伝子発現を⻑期間いる。シンチレータの直径1.5mmのものを頭に連続計測するには，組織を培養して観察する方法

2mmのものを背中に取り付けることで全身の各しかなく，この方法では，疾患の発症や治療効果組織の遺伝子発現が解析できる。それぞれのシンを個体レベルで検討することはできなかった。そチレータの画像を軸にパターンマッチング技術をこで私は上記問題を解決する動体追跡技術をもちもちいて、マウスケージ内を自由に行動しているいた自由行動する動物の遺伝子発現リズムを⻑期

マウスのシンチレータの３次元座標（X,Y,Z）を計間連続測定する新しい方法を開発した(Hamada et

算し、その位置に基づいて発光量の3次元空間補正

倉田奨励金研究報告書｜2016 年度（第 48 回）助成を行い遺伝子発現量を計算しているが、今回、シの複数マウスのコミニュケーション解析は、自閉ンチレータの位置に基づいて計算されたマウスの症や鬱病などの治療法開発や脳機能解析に大きく嗅球部位を追跡し、特定場所に滞在する時間を解貢献できると思われる。複数マウスの解析にあた析することにより、摂食行動・飲水行動・睡眠・り、シンチレータを装着せずにマウスの動体追跡覚醒行動の３次元行動パターンを自動解析するアができることが理想であるため、本研究ではシンルゴリズムを開発し、既存の電気生理的手法によチレータ無しでマウスの各組織を追跡するシステ

る脳波解析と比較する目的で同時計測を行った。

ムを構築することを行った。今回、時計遺伝子動体追跡による解析は0.5秒毎に３次元空間の嗅Period1 (Per1)プロモーターにルシフェラーゼ遺球の位置をプロットしたプロット図とEM-CCD伝子（luc）を連結したPer1-luc マウス（図1）をカメラで確認し、マウスの特定行動と嗅球の位置もちいて嗅球に発現しているPer1遺伝子発現の発と滞在時間を考慮することで独自の解析システム

光を追跡するシステムを目指した。左右に耳に発を開発した。マウス嗅球部位の動きを0.5秒毎に解現している Per1 遺伝子の発光の位置と嗅球の位

析し１日24時間の⻑さの解析を行った結果、マウ置の関係から嗅球の３次元座標を計算し、Per1 遺スが測定ケージ内で、いつ・どこで・何をしてい伝子発現リズムを検出できた。今後、他の脳部位るか自動解析できるようになった。電気生理学的の遺伝子発現定量も行っていく予定である。

手法はテレメトリーシステムをもちいて、マウスの頭蓋骨に脳波用電極を、マウス首の筋肉に筋電用電極をそれぞれ装着し、それらの電気信号情報

2.2 自由行動下マウスの生体深部の遺伝子発現変化
計測センサーの作製はマウス腹腔内に移植された送信機により計測ケ

本研究では生体深部の⻑期間遺伝子発現変化をージ下に設置した受信機を介してコンピュターへ解析するシステムを構築することを行った。光フ伝達し解析した。脳波解析は10秒を1エポックとしァイバー先端を特殊加工し、小型光電子増倍管にて解析を行った。１日（24時間）を４時間毎に解接続する携帯小型PMTシステムをもちいて肝臓析した結果、マウスの摂食行動・飲水行動・睡眠・および精巣におけるPer1遺伝子発現を自由行動条

覚醒行動リズムの夜高く、昼低い日内リズムが検件下、連続定量解析することに成功した。このセ出できた。光イメージング技術をもちいた動体追ンサーは埋め込み処置は伴うが、組織を傷付ける跡による睡眠・覚醒行動と電気生理学手法によることもなく低侵襲性である。今後、肝臓・腎臓・睡眠・覚醒行動は１日を通して約90%の一致率だ

精巣・腸、腎臓などの様々な末梢組織にセンサーった。１個体マウスで光イメージングのみの技術を密着させ、自由行動下のマウスで生体深部の複で遺伝子発現と行動を同時計測することでリアル

数組織の遺伝子発現を⻑期間リアルタイムで同時タイムに遺伝子発現から行動解析まで連動して解計測することを行う。

析が可能となった。体全体の様々な情報をリアル

以上、開発してきた動体追跡システムとセンサタイムで同時に包括的に解析できるシステムのプーによる計測を連係させて生体機能を解析していロトタイプの開発に成功した。

く予定である。これらの逐次計測システムの完成により、健康状態にある生理活動の基準化ができ

次に動体追跡技術により複数マウスの追跡をし、複数マウスの各組織の遺伝子発現を同時解析することを試みた。マウス間の解析が遺伝子レベルから行動解析まで可能となることが期待できる。こると考えている。

倉田奨励金研究報告書｜2016 年度（第 48 回）助成

図１．Per1-luc トランスジェニックマウスの明視野（左）及び暗視野（右）での撮影例
時計遺伝子 Per1 発現部位が可視化できる（嗅球，耳，尾部位など）。今回はマウスにシンチレータを装着せず、マウスの遺伝子発現部位を追跡し、追跡部位の遺伝子発現を定量するシステムを開発した。

３．発表
３.１

浜田俊幸

動体追跡技術をもちいて睡眠システムを解析する
日本睡眠学会

第22回「睡眠科学研究講座」札

幌 2018年
３.２

浜田俊幸

生体複数部位の遺伝子発現を⻑期間追跡定量する新規光計測システム
第３回可視化マウス研究会
３.３

東京

2018年

浜田俊幸

iPRECIOをもちいた自由行動マウスの全身遺伝子発現の可視化と定量化
第40回日本神経科学大会 ランチョンセミナー
千葉 2017
３.４

尾崎倫孝、芳賀 早苗、小澤岳昌、森田直樹、浜田俊幸「光技術を用いた臓器・細胞機能評価と制御」、
Organ Biology 24 (2): 87-91、2017