個々の中枢概日時計ニューロンの生体内での活動リズムの解析
In vivo analysis of neural activity rhythms of individual central circadian clockneurons（日本生理学会推薦）

代表研究者 金沢大学

三枝 理博

Kanazawa University

Michihiro MIEDA

協同研究者 金沢大学

前島 隆司

Kanazawa University

Takashi MAEJIMA

金沢大学

津野 祐輔

Kanazawa University

Yusuke TSUNO

The suprachiasmatic nucleus (SCN) functions as the central circadian pacemaker in mammals and entrains to theenvironmental light/dark cycle. It is composed of multiple types of GABAergic neurons, and interneuronalcommunications among these neurons are essential for the circadian pacemaking of the SCN. To understand the principles
underlying the SCN network, we took an approach of neuron type-specific genetic manipulations within the SCN anddemonstrated that arginine vasopressin (AVP)-producing GABA neurons, which form one of the major neuron types in
the SCN, play a critical role in the generation of circadian behavior rhythm and the determination of the circadian periodby the SCN network. In the current study, as the next step, we aimed to record the activities of SCN neurons in vivo in aneuron-type-specific manner from both normal and mutant mice with impaired circadian rhythms. By doing so, weexpected to uncover the linkage between the abnormalities of the SCN neural network and behavior rhythms. An outcomeof such efforts is the finding that GABAergic transmission from AVP neurons regulates the timing of SCN output fromthe SCN cellular clocks to control when to wake and locomote.

研究目的

視交叉上核は約 2 万の神経細胞よりなる神経ネッ

哺乳類の概日（サーカディアン）リズム制御中枢

トワークである。哺乳類の概日リズム制御中枢・視は視床下部・視交叉上核である。視交叉上核は中枢

交叉上核（SCN）は約 2 万のニューロンにより構成

概日時計として機能して全身に時刻の情報を送り、される。単離された個々のニューロンは位相もばら様々な生体機能を調節する。概日時計システムは、ばらで不安定な概日振動を示す点で、線維芽細胞な地球の自転に伴う 24 時間周期の昼夜変化を予測しどの末梢細胞と何ら変わりない。多種・多数の時計て行動や体内環境を最適化するために進化した。一ニューロンから成る、強固で安定な概日振動を発振

方現代社会では、時差や夜間勤務、生活習慣の乱れする神経ネットワークの構築こそ、SCN のみに見らにより、概日リズムの変調は誰にでも起こりうる問れる特異な性質であるが、その動作原理は殆ど分か題である。これは睡眠障害のみならず、気分障害、っていない。

肥満・メタボリックシンドローム、がん等、様々な本研究では、SCN の主要なニューロンタイプ、AVP疾患・健康障害のリスクを増大する。したがって、(arginine vasopressin) 産 生 ニ ュ ー ロ ン と VIP

概日リズム発振のメカニズムを理解し、概日リズム(vasoactive intestinal peptide) 産生ニューロンについ変調の効果的な予防方法・対処方法を見つけることて、各々を特異的に、その神経活動の概日リズムをは、大変重要である。

in vivo で測定する。正常マウスだけでなく、代表研究者がこれまでに作成した、概日リズム異常を示す発現マウスを用いて、Ca2+センサー蛋白質 jGCaMP7s遺伝子操作マウスについても測定を行う。このアプを SCN の AVP ニューロンや VIP ニューロンに特異ローチにより神経ネットワークの異常と行動リズ的に発現させた。これらのマウスからファイバーフ

ムの異常を結びつけることができれば、SCN 神経ォトメトリーを用いて、各ニューロンタイプの細胞ネットワークの原理解明に向け、重要な手がかりが内 Ca2+変動（[Ca2+]i）を in vivo で長期間測定するこ得られる。とに成功した。どちらのニューロンも、明暗条件下、恒常暗条件下共に、明瞭な[Ca2+]i 概日リズムを示した（図１）（未発表）。しかし興味深いことに、[Ca2+]i
リズムのピーク時刻は両タイプのニューロンで明ら研究経過かに異なった。ファイバーフォトメトリーは個々の① SCN ニューロンのニューロンタイプ特異的な in vivo

ニューロンの活動ではなく、蛍光センサータンパクマルチニューロン記録質（ここでは jGCaMP7s）を発現するニューロン集団

当初の計画は以下の通りであった。Cre 発現細胞のの活動しか計測できないが、十分に有用な情報を得みでチャネルロドプシン２（ChR2）を発現するトラることができる。in vivo マルチニューロン記録に比ンスジェニックマウスと、ニューロンタイプ特異的べれば比較的簡便ではあるが、自由行動下マウスのCre 発現マウス）を交配し、AVP ニューロン、あるいSCN などの脳深部の微小な神経核から長期的に計測は VIP ニューロンに特異的に ChR2 を発現させる。

を行うのは容易ではない。

このマウスに麻酔を施し、脳定位固定装置に固定した上で、SCN にシリコンプローブ電極（多点電極）・光ファイバーアセンブリを挿入、短時間青色光照射による発火頻度上昇を指標として AVP/VIP ニューロン（=ChR2 発現ニューロン）を同定した上で、神経活動の多チャンネル記録を行い、記録したデータはスパイク・ソーティングにより個々のニューロンの活動に分離する。
記録装置を導入し、シリコンプローブ電極を用いた麻酔下での in vivo 神経活動記録を試みた。神経活動記録自体は上手く行うことに成功した。しかしながら、SCN からの記録は、多くの試行を行ったが、未だ成功していない。SCN は長径 1mm にも満たない微小な神経核であり、脳定位固定装置を用いても、
in vivo で SCN に電極を挿入することが非常に難しいためである。様々な細かい工夫を行い、現在も粘図１

SCN AVP ニューロンの細胞内 Ca2+の in vivo

長期計測

り強くチャレンジし続けている。
③概日リズム異常マウスでの SCN ニューロン[Ca2+]i リ② ファイバーフォトメトリーを用いた SCN ニューロンのニューロンタイプ特異的な細胞内 Ca2+の in vivo 計測①の方法では、個々の SCN ニューロンの発火を記録できる点が魅力あるが、技術的に難易度が高いので、他のアプローチも平行して行った。ファイバーフォトメトリーは、脳内に挿入した光ファイバーを介し励起光照射・蛍光測定する手法である。Cre 依存的発現 AAV ベクターとニューロンタイプ特異的 Cre

ズムの in vivo 計測②で立ち上げたファイバーフォトメトリーの系を、我々がこれまでに作成してきた概日リズム異常マウスに適用し、行動リズム異常の神経基盤を明らかにすることを目指した。様々な系統で計測を行ったが、ここでは一例を挙げる。
AVP ニューロンを含め、SCN のほぼ全てのニューロンは GABA を含有するが、SCN 神経ネットワークにおける GABA の機能については、未だ明らかになっていない。そこで AVP ニューロンの伝達物質としに電極を挿入するか」であり、今後も様々な工夫をての GABA の役割を明らかにするために、AVP ニュ重ね、粘り強く取り組んでいきたい。一般的には、ー ロ ン 特 異 的 に 小 胞 GABA ト ラ ン ス ポ ー タ ー

神経の発火頻度と[Ca2+]i 相関するとされ、Ca2+センサ（VGAT：GABA のシナプス小胞放出に必要）を欠損

ーを用いて神経活動の計測がしばしば行われている。

したマウス（Avp-Cre;Vgatflox/flox）を作成し、解析を進

しかしながら SCN ニューロンでは、発火に伴う細胞めてきていた。Avp-Cre;Vgatflox/flox マウスの概日行動

外からの Ca2+流入だけではなく、細胞内 Ca2+ストア

リズムは、活動時間（活動期の長さ）が５時間以上由来の Ca2+が[Ca2+]i に大きく寄与することが知られ延長し、リズム分割様の表現型を示した。このようており、発火頻度と[Ca2+]i は必ずしも相関しない。

な行動リズム異常にもかかわらず、スライスでの時[Ca2+]i 概日リズムは発火頻度リズムに先行しさえす

計遺伝子レポーターPER2::LUC 発光リズムなど、時る。したがって、両者を別の細胞活動指標として測計遺伝子を基盤とした概日時計の分子機構（細胞時定する必要があるので、in vivo マルチニューロン記計）は、SCN においてほぼ正常であった。しかし、録を成功させたいと考えている。

SCN の細胞時計に対し、行動リズムの活動期開始の一方で、ファイバーフォトメトリにより、ニュー位相は前進し、終了位相は後退していた。そこで、ロンタイプ特異的な in vivo [Ca2+]i リズム計測に成功

ファイバーフォトメトリーを用いて SCN AVP ニュした意義は大きい。
「研究経過」で述べたように、概ー ロ ン の [Ca2+]i リ ズ ム を 計 測 し た と こ ろ 、 Avp-

日リズム異常を示すマウスの SCN の活動を in vivo

Cre;Vgatflox/flox マウスでは AVP ニューロンの[Ca2+]i リで解析するのに力を発揮しており、今後も様々なマズムと行動リズムの位相関係が、in vivo でも明らかウス系統に適用していく。また、Ca2+だけでなく、時に異常になっていることを明らかにすることができ

計遺伝子発現、膜電位、GABA、ドーパミンなど、さた。したがって、AVP ニューロンによる GABA 作動

まざまな蛍光センサータンパク質が開発されている。

性神経伝達は、SCN 中枢概日時計から行動への出力多様なセンサータンパク質を SCN にニューロンタのタイミングを制御し、マウスがいつ起きて動き回イプ特異的に発現させ、ファイバーフォトメトリーるかを調節すると考えられた（図２）。以上の結果は、で生体内でその日内変動を計測することで、中枢時計・SCN 神経ネットワークの動態を多層的に解析することが可能であり、今後行っていきたい。
将来的には、
本研究で確立した in vivo 計測技術を、概日リズム異常を示すことが知られている様々な疾患モデルマウス（肥満、老化、アルツハイマー、うつ、等など）にも適用し、これらのモデルで中枢体内時計 SCN がどのような異常を来しているのか、明らかにしていきたい。

他のデータと共に論文にまとめ、現在投稿中である。
図２ AVP ニューロンによる GABA 作動性神経伝達研究の発表

は、SCN 中枢概日時計から行動への出力のタイミン

口頭発表

グを制御し、マウスがいつ起きて行動するかをコン

1.

三枝理博. 中枢概日時計神経ネットワークの遺伝学的解析. 第 26 回日本時間生物学会学術大会,トロールする

金沢,
2.

2019.10.

三枝理博、長谷川恵美、津野祐輔、前島隆司.
GABAergic transmission of AVP neurons regulates

考察
SCN からの in vivo マルチニューロン記録は想像以上に難しいことが分かった。問題は、「以下に SCN

correctly timed output of the central circadianpacemaker of the SCN. 第 42 回日本神経科学大会,
新潟, 2019.8.

3.

4.
5.

6.

三枝理博. 哺乳類中枢概日時計の神経メカニズ
ム. 明治大学現象数理学共同研究集会, 東京,

誌上発表

2019.3.

1.

三枝理博. サーカディアンペースメーカーの神

suprachiasmatic nucleus as an ensemble of multiple

経機構. 第 41 回日本神経科学大会, 神戸, 2018.8.

oscillatory neurons. Neurosci Res, in press.

三枝理博. 中枢概日時計におけるバソプレシン

2.

Mieda M. The Network Mechanism of the Central

ニューロンの機能. 第 43 回日本睡眠学会定期学

Circadian Pacemaker of the SCN: Do AVP Neurons

術集会, 札幌, 2018.7.

Play a More Critical Role Than Expected? Front

Mieda M. Genetic dissection of neural mechanisms

Neurosci 13, 139 (2019).

underlying the central circadian pacemaker, Sapporo

3.

2018.7.

三枝理博. 概日時計と睡眠. 生体の科学 71, 1822 (2020)

Symposium on Biological Rhythm in 2018, Sapporo,
7.

Mieda M. The central circadian clock of the4.

三枝理博. 中枢概日時計の神経生理学的基盤の三枝理博. 視交叉上核の中枢概日時計における解明. ブレインサイエンスレビュー2018, 307-

AVP ニューロンの役割. 第 95 回日本生理学会,

326 (2018).

高松, 2018.3.