緑藻クラミドモナスの走光性レドックス調節の分子機構
Molecular basis of redox regulation in Chlamydomonas phototaxis（日本動物学会推薦）

代表研究者 東京工業大学

若林 憲一

Tokyo Institute of TechnologyKen-ichi WAKABAYASHIThe unicellular green alga Chlamydomonas shows positive or negative phototaxis depending on the light intensities,
circadian rhythms, etc. Switching of the phototactic sign is important for the cells to stay under proper light conditions
for photosynthesis. However, its mechanism has been unclear. Recently, we showed that the cellular redox poise
determines the phototactic sign: cells show positive phototaxis after treatment with reactive oxygen species (ROS),
whereas they show negative phototaxis after treatment with ROS quenchers. To understand the regulatory mechanism of
this redox-dependent sign-control, we isolated a new mutant that responds to the treatment with redox reagents in an
opposite manner to that of wild type and named it ips1 (inverse phototactic sign 1). Using next-generation sequencing,
we identified a mutation in a gene that functions in a carotenoid biosynthesis pathway. Interestingly, ips1 mutant cells do
not have the eyespot. Currently we are analyzing how eyespot-less mutant cells show opposite sign of phototaxis.
研究目的

行動に関わることを示した初めてのケースである。

細胞には細胞質酸化還元状態を「やや還元的」光合成活性が細胞内レドックス状態を変化させる状態に保つレドックス(reduction-oxidation)恒ことが知られているため、走光性には細胞ごと葉常性が働いている。このことは、タンパク質・脂緑体を動かすことによって受容する光強度を変化質などの不可逆的酸化変性を防ぐなど、生体機能させて細胞内レドックス状態を維持する、「レドッの維持にとって重要な役割を果たしていると考えクス恒常性」のためのフィードバック行動としてられる。一方で、呼吸活性や光合成活性などの理の側面があるのではないかと考えられる。しかし、

由で、細胞内は一過的・局所的に酸化的または過この調節の分子メカニズムは全くわかっていない。

剰に還元的に変化し得る。この変化がシグナルと我々は、細胞のレドックス状態のセンシングかなり、転写因子の活性化など様々な細胞の機能をら始まって鞭毛運動調節を行うまでのシグナリン調節する（レドックス調節と呼ばれる）ことが近グ経路の分子的実態を、新たに単離したクラミド年次々に判明している。

モナスのレドックス感受性突然変異株の解析によ

我々は緑藻クラミドモナスを用いて鞭毛運動の調節機構について研究してきた。クラミドモナスって明らかにすることを目的として研究を行ってきた。

は淡水性単細胞緑藻であり、２本の鞭毛を巧みに操って走光性を示す。しかし、クラミドモナスがどのような条件で正の走光性（光源に向かう）と負の走光性（光源から逃げる）を入れ替えるのか、研究経過（１）クラミドモナスの新奇走光性符号異常株の単離と解析長い間謎であった。我々は以前、細胞質レドッククラミドモナス野生株に紫外線照射による変異導ス状態変化に応じて鞭毛運動が調節を受けること入を行ったのち、「酸化処理をしても負の走光性を示（文献 1）、さらに酸化的に傾くと細胞が正の走光す」という基準で新奇ミュータントのスクリーニン性を、過還元に傾くと負の走光性を示すことを明グを行った。得られた株に対して数度親株との戻しらかにした（文献 2）。これらはレドックスが細胞交配を行ったのち、ips1(inverse phototactic sign 1)と名づけた。ips1 株の走光性を観察したところ、通常はAB野生株と同様に正の走光性を示すが、酸化処理によって負の走光性を、還元処理によって正の走光性を示すという、「レドックス薬剤への応答性が野生株と逆」であることを確かめた。この変異株の原因遺伝子が、細胞内のレドックス状態のセンシングにかかわる可能性が高いと考え、遺伝子解析を行った。

カロテノイド層
10 µm

C（光の反射板）
チャネルロドプシン(光受容タンパク質)

野生株

走光性の定量結果。0°の方向から光を当眼点

ips1

White mutant

10 µmてた際の、各角度に泳いだ細胞の割合をA. クラミドモナスの位相差顕微鏡像。２極型ヒストグラムで示した。ips1 株は酸本の鞭毛、１つの眼点をもつ。B. 眼点の化・還元処理をすると野生株と逆方向に模式図。光受容体チャネルロドプシンを裏泳ぐ。

打ちするようにカロテノイド顆粒層が存在する。C. クラミドモナス細胞の明視野

ips1 株の原因遺伝子を同定するために、まず東京大学大学院理学系研究科・廣野雅文准教授との共同研究により、PCR 多型を用いた遺伝子マッピングを顕微鏡像。野生株に見える眼点（矢じり）が、ips1 と White mutant には見えない。

行った。この結果、ある染色体上の数百 kb の範囲にまで遺伝子の存在可能性のあるエリアを絞ることができた。次いで、基礎生物学研究所・重信秀治特任准教授との共同研究で、次世代シーケンス法によるips1 株の全ゲノム解読を行った。マッピングで絞った領域について、ips1 株、その親株、公開されているクラミドモナスゲノムデータの相互比較を行った
結果、カロテノイド生合成に関わる遺伝子に１アミノ酸残基の置換が生じていることを見出した。
クラミドモナス細胞には、眼点とよばれる赤い点状の器官のすぐ近傍の細胞膜に、光受容タンパク質「チャネル型ロドプシン」が存在する。眼点はカロテノイド色素を含んだ顆粒が配列した構造であり、これらが光の反射板として機能することで、チャネル型ロドプシンは「細胞の外側から差す光」のみに反応する高指向性を持つと考えられている。ips1 株
を細胞レベルで詳細に観察すると、眼点が存在しないことが明らかになった。

ips1 株はその後解析を続けているが、残念ながら野生型遺伝子導入によるレスキュー実験が成功していない。点変異の遺伝子産物が存在するため、たとえ野生株遺伝子を導入しても、ドミナント・ネガティブな表現型を示している可能性が高い。しかし、基礎生物学研究所の皆川純教授、得津隆太郎助教との共同研究により、ips1 株の細胞内カロテノイド量が野生株と比べて著しく低いことを逆相 UPLC 法によって確認することができた。眼点が存在しないことと合わせて、ips1 株がカロテノイド生合成異常株であるという状況証拠がかたまりつつある。

研究においては、ホワイトミュータントは走光性を（２）クラミドモナスの負の走光性を示す agg1 変異示さないことが発表されていた。本研究で単離・解株の解析

析した新たなカロテノイド生合成変異株 ips1 は、光公開されている変異株ライブラリーに、agg1 と呼の下でも緑色の野生株とほとんど変わらない細胞をばれる「強い負の走光性を示す」株が存在する。
（室形成し、暗闇ではホワイトミュータントにやや似た内照明により、培養液をいれた試験管の底に凝集薄緑の細胞色を示す。そして、レドックス薬剤処理

aggregate することからそう呼ばれる。）この株は通後の符号こそ逆であるものの、はっきりとした走光常は野生株と逆の負の走光性を示すものの、レドッ性を示す。我々の観察から、ホワイトミュータント

クス薬剤処理後は野生株と同じ符号の走光性を示す。

は著しく運動性が低下しているため、走光性を示さ

このことから、agg1 株は走光性符号を入れ替える酸ないように誤認されていた可能性がある。

化還元レベル（電位）の閾値が著しく酸化側に偏っips1 株の走光性符号逆転表現型の原因として、カている、センシング異常の変異株であると考えられロテノイドの量が問題なのか、あるいは眼点の存在る。

が問題なのか。既に単離されている眼点欠失株の走ips1 株と同様にして遺伝子マッピングおよび次世光性符号を調べたところ、予備的な結果では ips1 株

代シーケンスを行ったところ、機能未知の遺伝子にと同じく走光性符号が逆になった。このことから、トランスポゾンが挿入されていることがわかった。

後者の「眼点の欠失」が主な原因である可能性があ

この遺伝子の cDNA を調製し、agg1 株に導入したとる。これまでは、眼点が光の反射板として存在するころ、表現型を相補して正の走光性を示すようになことが走光性の発現に重要な役割を果たすと考えらった。現在、この遺伝子産物の局在などについて詳れてきたため、この知見は藻類の走光性発現のメカ細に調べている。

ニズムの理解に再考を促すものである。
では、なぜ符号が逆になるのだろうか。仮に細胞（３）新奇走光性異常突然変異株の単離自体が凸レンズのような役割を果たすとしたら、細当初より研究計画にあった ips1, agg1 株の原因遺胞がある方向から浴びた光は細胞の反対側に収束す

伝子同定に成功したが、まだこれらの遺伝子が直接る。そのような場合、カロテノイド層の有無によっ細胞内レドックスセンシングおよびシグナリング経て、チャネル型ロドプシンが「光が強い」と感じる路に寄与しているかどうか分からない。これらの研側が細胞の外側と内側で入れ替わるはずである。
（た究を続けることと並行して、新たに変異株を単離す

とえばチャネルロドプシン側に光源がある場合、カることとした。これまでに「走光性」と「レドックロテノイド層があれば光源側にチャネルロドプシンス」を組み合わせた変異株スクリーニングを行ったがあるときのみ光受容されるが、眼点がないと細胞研究例はないため、これまでに見つからなかった新が回転して反対側にチャネルドロプシンが存在するしい変異株が得られると考えられる。

ときに「より強い光」を受容することになる。
）そのクラミドモナス野生株に、抗生物質パロモマイシようなメカニズムで眼点欠失が走光性符号を入れ替ン耐性遺伝子である aphVIII の発現ベクターをもちえている可能性がある。ただ、実際には走光性符号いて形質転換した。aphVIII 配列が挿入された部位にが逆転するのは「レドックス薬剤を投入したときの存在する遺伝子が破壊され、その株はパロモマイシみ」であり、薬剤なしでは野生株も他の眼点欠失株ン耐性を獲得する。現在、耐性獲得株ライブラリーも正の走光性を示す。眼点に存在するカロテノイドに対して走光性観察を行い、符号異常株のスクリーがレドックス制御に直接関わる可能性も残っている。

ニングが進行中である。

今後、ips1 や他の眼点欠失ミュータント細胞の詳細な運動解析によって、光を感じて遊泳方向を変化さ考察せる際の細胞の挙動を明らかにしていきたい。さら

これまでに見つかったカロテノイド生合成経路変に新奇の変異株も解析して、細胞内レドックス状態

異株は、通称ホワイトミュータントと呼ばれる(文献

センシングと運動方向変化までの機序を分子レベル3)。これらは明所で培養すると致死であり、暗所でで記述することに挑戦していきたい。

培養すると緑色色素を欠いた白い細胞をもつ。先行生体運動研究合同班会議 千葉（千葉大学）
参考文献

2014 年 1 月 10-12 日

1. Wakabayashi, K., and King, S.M. (2006)

3. 持地翔太、井手隆広、山口勝司、重信秀治、

Modulation of Chlamydomonas reinhardtii

神谷律、廣野雅文、◯若林憲一

Flagellar Motility by Redox Poise

クラミドモナス走光性符号異常ミュータン

Journal of Cell Biology 173:743-54

トの次世代シークエンスによる解析

2. Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., and第 10 回クラミドモナス研究会 岡崎（基礎Kamiya, R. (2011)

生物学研究所） 2013 年 11 月 29-30 日

Reduction-oxidation poise regulates the sign of

4. Ken-ichi Wakabayashi（招待講演）

phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii

Redox Regulation of Cell Motility in the Green

Proceedings of the National Academy of Sciences ofAlga Chlamydomonas reinhardtii.

the United States of America 108:11280-4

The 25the CDB meeting “Cilia and3. McCarthy, S.S., Kobayashi, M.C., Niyogi, K.K.

(2004)

Centrosomes: from Fertilization to Cancer”
June 17-18 2013 RIKEN CDB, Kobe, JapanWhite mutants of Chlamydomonas reinhardtii are5. 若林憲一（招待講演）

defective in phytoene synthase.

緑藻クラミドモナスの走光性符号調節

Genetics 168:1249-57

第３回微細藻類研究会

岡崎（岡崎カンファレンスセンター）2013 年 6 月 13-14 日
研究の発表

6. 若林憲一（招待講演）

口頭発表

緑藻クラミドモナスの運動とレドックス制

1. Ken-ichi Wakabayashi （招待講演）
Regulation of flagellar beating studied using theunicellular

green

alga

Chlamydomonas

reinhardtii
The 17th SANKEN International Symposium
2014

JoinedwithThe

2ndInternational

Symposium of Nano-Macro Materials, Devices,andSystemResearchAlliance

Project“HUMAN SENSING” considering from thebehavior of substances ranging from molecules
to organisms Jan. 21-22 2014 Icho-kaikan, Suita,Japan
2. 持地翔太、井手隆広、山口勝司、重信秀治、神谷律、廣野雅文、◯若林憲一
クラミドモナス走光性符号異常ミュータン
トの解析

御第 54 回日本植物生理学会年会（招待講演）
岡山（岡山大学）2013 年 3 月 21 日
7. 若林憲一
クラミドモナスの鞭毛運動マシナリー
第 85 回日本生化学会大会 福岡（福岡国際会議場）2012 年 12 月 15 日
誌上発表
1. 荒井 祐介, 若林 憲一, 吉川 雅英, 奥 寛雅,
石川 正俊 暗視野顕微鏡法におけるクラミドモナスの三次元トラッキング 日本ロボッ ト 学 会 誌 Vol. 31 (2013) No. 10 p.
1028-1035