嗅球における匂い経験依存的な神経回路再編の分子機構
Molecular mechanisms that regulate the sensory experience-dependent developmentof dendritic spines in newborn olfactory bulb interneurons（日本神経科学学会推薦）

代表研究者 奈良県立医科大学

坪井 昭夫

Nara Medical University

Akio TSUBOI

協同研究者 奈良県立医科大学

吉原 誠一

Nara Medical University

Seiichi YOSHIHARA

奈良県立医科大学

高橋 弘雄

Nara Medical University

Hiroo TAKAHASHI

Sensory experience regulates development in a variety of species and in various brain structures, including thecortex, hippocampus and olfactory bulb (OB). Within the mammalian OB specifically, the development of dendrites in
mitral cells is dependent on odor-evoked neural activity. However, little is known about the developmental role ofsensory experience in the other major OB populations of GABA-releasing inhibitory interneurons, such as granule cells(GCs). In this study, by in situ hybridization (ISH) screenings, we newly identified a transcription factor, neuronal
Per/Arnt/Sim domain protein 4 (Npas4) gene, which is expressed in a subset of OB GCs following sensory experience.
Then, we performed the gain- and loss-of-function experiments for Npas4 in OB GCs, based on lentiviral injection.
Npas4 overexpression in newborn OB GCs increased the spine density even under sensory deprivation. Conversely,
both Npas4 knockdown and knockout resulted in a significant reduction in the spine density of OB GCs. In addition, by
ChIP-seq plus ISH screenings, we identified, as a novel target of Npas4, an oncogenic E3 ubiquitin ligase Mdm2 gene,which is expressed at low levels in the wild-type OB but at higher levels in the Npas4-knockout OB. Proteomics
analysis further revealed that Mdm2 ubiquitinates and degrades a microtubule-associated protein Dcx to reduce thedendritic spine density of OB GCs. Taken together, our findings suggest that Npas4 regulates Mdm2 expression toubiquitinate and degrade Dcx for shaping the dendritic spines of OB GCs after sensory experience.

研究目的
大脳皮質の視覚野や海馬で明らかにされているよ
うに、ニューロンは神経活動に応じて樹状突起の発達やシナプス形成を行うことにより、より精密化された神経回路に成熟する。また、嗅球における顆粒細胞と傍糸球細胞は抑制性の介在ニューロンで、胎生期のみならず成体期においても新生され続け、神経回路に編入されるという可塑性を持っている（図１）。さらに、この成体における嗅球の神経回路再編は神経活動の影響を受けることも知られている。しかしながら、嗅球における匂い刺激に依存的な神経回路再編については不明な点が多い。私共はこれまでに、匂い刺激依存的に発現する転写因子 Npas4

（neuronal Per/Arnt/Sim domain protein 4）を同定し、ロンで過剰発現させると、スパイン密度が増加するそれが嗅球介在ニューロンの樹状突起におけるスパことが判明した。このように本研究において、嗅球イン（棘突起）形成を制御することを示していたが介在ニューロンでは、Npsa4 の発現量に応じて、ス（図２）、その分子機構はわかっていなかった。

パイン形成に関わるダブルコルチンが Mdm2 のユ

そこで、本研究では、“Npas4 がどのようにして嗅球介在ニューロンの樹状突起においてスパイン形成を制御しているのか？”という機構を解明した。

ビキチン化により分解され、スパイン密度が制御されていることが明らかにされた（Yoshihara et al, CellReports, 8, 843-857, 2014）。匂い刺激により神経活動が盛んになった嗅球介在ニューロンでは、Npas4 の発現量が増加し、それに伴ってスパイン密度が増加して、より多くの二次ニューロンと接続できるようになると推測される（図３）。私共は、実際に、嗅球介在ニューロンで特異的に Npas4 を欠損させたマウスが、構造的に類似した２つの匂い分子を弁別学習することができないことを見出しているので、匂い刺激によるスパイン密度の増加は精密な嗅覚情報処理に必須であることが示唆された（Yoshihara et al,Cell Reports, 8, 843-857, 2014）。

研究経過
私共は、Npas4 が転写因子であることから、その下流にあるスパイン形成に関与する遺伝子の発現を制御していると推測した。本研究においては、先ず、Npas4 蛋白質が結合する DNA 領域を同定するクロマチン免疫沈降‐シークエンシング法（ChIP-Seq:
Chromatin immuno-precipitation-Sequencing）を用いて、その下流遺伝子を探索した。得られた候補遺伝子について、嗅球介在ニューロンでの発現を調べたところ、蛋白質の分解を促進するユビキチンリガーゼの１つである Mdm2（murine double minute 2）遺伝子の発現が、Npas4 ノックアウトマウスでは野生型よりも増加していた（図３）。次に、Mdm2 が分解する標的蛋白質を、プロテオミクスの一つである iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）法を用いて探索した。その結果、Npas4 ノックアウト
マウスの嗅球介在ニューロンでは、Mdm2 蛋白質の増加に伴って、微小管結合蛋白質であるダブルコルチン（doublecortin: Dcx）の分解が促進されていた（図３）。また、ダブルコルチン遺伝子を嗅球介在ニュー考察
今後、嗅球介在ニューロン特異的な Npas4 ノックアウトマウスを用いて、匂い情報処理を詳細に解析することにより、新生ニューロンによる匂い刺激依存的な嗅球神経回路の再編に関する生理的意義が明らかになると期待される。また、脳梗塞モデルマウ
スにおいて嗅球介在ニューロンの一部は、損傷した脳の領域に移動し修復する性質を持つことが知られているので、本研究は脳梗塞などによる神経障害を回復させる再生医療における新たな治療法の開発にもつながると期待される。
研究の発表
口頭発表
1. Takahashi H, Yoshihara S, Nishimura N, Kinoshita
M, Asahina R, Furukawa-Hibi Y, Nagai T, Yamada K,Tsuboi A: Transcription factor Npas4 regulates thesensory experience-dependent development ofdendritic spines in newborn olfactory bulbinterneurons. Cold Spring Harbor Meeting: Axon
Guidance, Synapse Formation & Regeneration, ColdSpring Harbor, USA (Sep. 16-20, 2014).
2. Tsuboi A, Takahashi H, Asahina R, Kinoshita M,Nishimura N, Yoshihara S: 5T4 and Npas4 regulate
the sensory experience-dependent development ofdendrites in newborn olfactory bulb interneurons.
Keystone Symposia: Adult Neurogenesis, Stockholm,
Sweden (May 12-17, 2014).
3. Yoshihara S, Takahashi H, Nishimura N, Kinoshita
M, Asahina R, Furukawa-Hibi Y, Nagai T, Yamada
K, Tsuboi A: Transcription factor Npas4 regulates
the sensory experience-dependent development ofdendritic spines in newborn olfactory bulbinterneurons. Cold Spring Harbor Meeting: Neuronal
Circuits, Cold Spring Harbor, USA (Apr. 2-5, 2014).
4. Takahashi H, Yoshihara S, Nishimura N, Kinoshita
M, Asahina R, Furukawa-Hibi Y, Nagai T, Yamada K,
Tsuboi A: Transcription factor Npas4 regulates thesensory experience-dependent development ofdendritic spines in newborn olfactory bulb
interneurons. The 12th International Symposium on
Molecular and Neural Mechanisms of Taste andOlfactory Perception, Kyushu University, Fukuoka,Japan (Nov. 2-3, 2014).
5. 吉原誠一，高橋弘雄，西村信城，木下雅仁，朝比奈諒，日比陽子，永井拓，山田清文，坪井昭
夫：Transcription factor Npas4 regulates the sensory
experience-dependent development of dendritic
spines in newborn olfactory bulb interneurons. 第 92回日本生理学会大会，神戸コンベンションセンター（2015 年 3 月 21-25 日)．
6. 高橋弘雄，吉原誠一，小川陽一，朝比奈諒，玉田 喜 規 ， 坪 井 昭 夫 ： 5T4 oncofetal trophoblast
glycoprotein regulates the sensory experience-

dependent dendritic development of olfactory bulb
interneurons. 第 92 回日本生理学会大会，神戸コンベンションセンター（2015 年 3 月 21-25 日)．
7. 吉原誠一，高橋弘雄，西村信城，木下雅仁，朝比奈諒，日比陽子，永井拓，山田清文，坪井昭
夫：Transcription factor Npas4 regulates the sensory
experience-dependent development of dendritic
spines in newborn olfactory bulb interneurons. 第 37回日本分子生物学会大会，パシフィコ横浜（2014年 11 月 25-27 日)．
8. 高橋弘雄，吉原誠一，小川陽一，朝比奈諒，玉田 喜 規 ， 坪 井 昭 夫 ： 5T4 oncofetal trophoblast
glycoprotein regulates the sensory experiencedependent dendritic development of olfactory bulbinterneurons. 第 37 回日本分子生物学会大会，パシフィコ横浜（2014 年 11 月 25-27 日).
9. 吉原誠一，高橋弘雄，西村信城，木下雅仁，朝比奈諒，日比陽子，永井拓，山田清文，坪井昭
夫：Transcription factor Npas4 regulates the sensory
experience-dependent development of dendritic
spines in newborn olfactory bulb interneurons. 第 37回日本神経科学会大会，パシフィコ横浜（2014年 9 月 11-13 日)．
10. 高橋弘雄，吉原誠一，小川陽一，西村信城，木下雅 仁 ， 玉田 喜 規 ， 坪 井 昭 夫 ： 5T4 glycoprotein
regulates the sensory experience-dependent dendritic
development of olfactory bulb interneurons. 第 37回日本神経科学会大会，パシフィコ横浜（2014 年 9月 11-13 日)．
誌上発表
1. Takahashi H, Yoshihara S, Asahina R, Tamada Y,
Tsuboi A: Characterization of newborn interneurons
in the mouse olfactory bulb using postnatal
electroporation. In: Electroporation Methods inNeuroscience, Neuromethods 102 (Springer),pp.93-103, 2015.
2. Tsuboi A, Sakano H: Odorant receptor gene
regulation. In: Handbook of Olfaction andGustation, Third Edition (Wiley-Blackwell), inpress, 2015.
3. Yoshihara S, Takahashi H, Nishimura N, Kinoshita
M, Asahina R, Kitsuki M, Tatsumi K,
Furukawa-Hibi Y, Hirai H, Nagai T, Yamada K,
Tsuboi A: Npas4 regulates Mdm2 and thus Dcx inexperience-dependent dendritic spine developmentof newborn olfactory bulb interneurons.
Cell Reports 8, 843-857, 2014.
4. 吉原誠一，高橋弘雄，坪井昭夫：嗅球ニューロンにおける匂い刺激依存的なシナプス形成の分
子 機 構 ． Aroma Research 第 15 巻 第 3 号
pp.248-249, 2014.
5. 高橋弘雄，坪井昭夫：嗅覚系における CO2 セン
シングの分子機構．化学と生物，第 51 巻，pp.437-439, 2013