倉田奨励金研究報告書｜2018 年度（第 50 回）助成■受領№1376

再生組織の複合立体形成による歯の再生治療技術の開発

代表研究者

大島 正充

国立大学法人 徳島大学大学院医歯薬学研究部 顎機能咬合再建学分野 准教授

1．研究⽬的な⻭周組織再⽣技術の開発を⽬的とした。

⾼齢化社会を迎えた我が国において、⻭の喪失や疾患・機能障害は増加の⼀途をたどっており、その2．研究内容

本質的解決は国⺠の健康⻑寿を⽀えるための重要

2.1 ⾻細胞−⻭根膜細胞の積層構造を有する複合な課題であるとされている。これまでに、健康な⾼細胞シートの作製

齢者を増やすために推進されてきた「8020運動」

天然⻭の⻭周組織構造を再現するために、⾻芽細により、⾼齢者の残存⻭数は⾶躍的に上昇している

胞と⻭根膜細胞の積層化による複合細胞シートのものの、⻭や⻭周組織における「疾患や機能的障害作製を検討した。⻭根膜細胞（PDL細胞）は5週齢を有する残存⻭の増加」という側⾯が指摘されていSD系雄性ラットの⾅⻭から採取・培養し、⾻芽細る。特に、⾼齢化に関連したう蝕や⻭周炎の進⾏に胞はマウス由来MC3T3-E1細胞を⽤いた。これらのよる⻭・⻭周組織の崩壊は、⻭の喪失に⼤きく関わ

細 胞 を 温 度 感 受 性 培 養 ⽫ （ UpCell®, CellSeed,る不可逆的な障害であり、⽣理的かつ機能的な⻭のTokyo, Japan）に段階的に播種し、積層培養により再⽣治療技術の開発が期待されている。

⻭根膜細胞と⾻芽細胞による複合細胞シートを作

再⽣医学は幹細胞と組織⼯学技術を融合させ、⽣製した（図1a）。複合細胞シートの組織学的解析に物学的な発⽣・再⽣の原理に基づく次世代の医療技より、⾻芽細胞と⻭根膜細胞の境界は分離すること術へと発展することが望まれている。実質的な組織なく、複数の細胞が層状に⽴体構築されていること損傷を伴う疾患や外傷に対する治療技術として、吸が⽰された（図1b）。次に、複合細胞シートの積層収性／⾮吸収性の⼈⼯担体と幹細胞との複合体形構造を詳細に解析するために、⾻芽細胞および⻭根成技術や、細胞シート⼯学技術を利⽤した組織再⽣膜細胞の特異的マーカーによる免疫組織化学染⾊、に向けた技術開発と臨床応⽤化が推進されている。

および動物種（ラット）特異的Fluorescent in situ

⻭科領域においても、⻭周組織治療⽤細胞シートのhybridization（FISH）プローブ染⾊にて解析した。

臨床応⽤が進められているものの、単⼀細胞によりマウス特異的Osteocalcin（OCN）の免疫染⾊では、構築された⻭根膜細胞シートでは、複数種の細胞か複合細胞シートにおける⾻芽細胞（MC3T3-E1細胞）ら構成される⻭周組織の広範性損傷に対する再⽣領域のみが陽性として検出された。その⼀⽅で、ラが困難であるとされている。そこで本研究では，⻭

ット特異的FISHプローブ染⾊においては、複合細周組織を構成する⻭槽⾻‐⻭根膜線維の構造を再胞シートにおける⻭根膜（PDL）細胞領域のみが現する複合細胞シートを構築し，三次元的な⻭周組陽性として検出されており、⻭根膜細胞領域と⾻芽織再⽣が可能であるかを検証することにより、新た細胞領域が明確に区画化された⾻‐⻭根膜構造の倉田奨励金研究報告書｜2018 年度（第 50 回）助成⽴体形成なされていることが⽰された（図1c）。

天然⻭と類似した⻭周組織の形成がなされており、複合細胞シートの⾻‐⻭根膜構造の配置を維持した状態で、適切な組織分化がなされていることが⽰された（図2b）。

図1

複合細胞シートの作製と組織学的解析a）骨‐歯根膜構造を有する複合細胞シートの作製手順の模式図。
b）複合細胞シートの実態像と HE 染色像。MC3T3E-1 細胞とPDL 細胞の立体構築により作製した。（Scale bar：左図1mm，右図 200 ㎛）c）複合細胞シートにおける Osteocalsin 免疫染色像（左図）とラット特異的 FISH プローブ染色像（右図）。複合細胞シート内の骨細胞‐歯根膜細胞の領域が明瞭に区分けされている。
（Scale bar：左図 200 ㎛，右図 100 ㎛）

図2

複合細胞シートの異所性移植による歯周組織形成の評価

2.2 複合細胞シートの異所性移植による⻭周組織形成の評価
次に、⽴体構築された複合細胞シートが、適切にa）細胞シートの異所性移植の手順の模式図。
（Scale bar：1mm）b）異所性移植 4 週後の HE 染色像および Azan 染色像。
（Scale bar：40μm）

⾻‐⻭根膜の組織構造を形成するかを検証するた
めに、⽣体内への異所性移植を⾏った。4週齢のC57BL/6NJcl（CLEA Japan, Osaka, Japan）マウス

2.3 複合細胞シートの同所性移植による⻭周組織再⽣効果

から下顎第⼀⾅⻭を抜⻭し、⻭根膜組織をすべて除最後に、⾻‐⻭根膜構造を有する複合細胞シート去した後に、オートクレーブ処理にて無細胞化した。

が、広範囲に⾄る⻭周組織の損傷を再⽣可能である

その無細胞化したマウス⾅⻭を担体として⽤い、⾻かを検証するために、マウス上顎第⼀⾅⻭の⼝蓋側芽細胞シート、⻭根膜細胞シート、ならびに複合細に近遠⼼幅2mm，頬⾆幅0.5mm，深さ1.5mmの⻭胞シートをそれぞれ⻭根周囲に付与した状態でコ周組織損傷モデルを作製した（図3a）。同損傷モデラーゲンゲル（Cellmatrix® Type I-A，Nitta Gelatin

ルに対して、移植なし（Control）、PDL細胞シート、Inc. Osaka, Japan）に封⼊し、CB17/Icr-scid/scid

ならびに複合細胞シートの同所性移植を⾏ったと免疫不全マウス（CLEA Japan, Osaka, Japan）の腎ころ、移植8週後において、Control群およびPDL臓被膜下に移植した（図2a）。異所性移植4週後に組細胞シート群では⻭周組織の治癒が不完全な部位

織学的解析を⾏ったところ、⾻芽細胞（MC3T3-E1が認められた（図3b）。⼀⽅で、複合細胞シート群細胞）シートを移植した群では、⻭根周囲に直接的

では、Control群およびPDL細胞シート群と⽐較しな⾻組織の形成が認められ、⻭根膜細胞（PDL細て有意な⻭槽⾻再⽣が認められ，組織学的解析では胞）シートを移植した群では、⻭根周囲に線維性組天然⻭と同等の⻭周組織構造を有していることが織が取り囲んでいたものの、⻭根膜組織としての線⽰された（図3b）。

維⾛⾏や、⾻組織の形成は認められなかった。⼀⽅で、複合細胞シートを移植した群では、⻭根周囲に倉田奨励金研究報告書｜2018 年度（第 50 回）助成
2.4 結論と展望
本研究成果から、⾻‐⻭根膜線維の構造を再現する複合細胞シートによる⻭周組織再⽣技術が開発されたとともに、複合組織の⽴体形成による組織⼯学技術の有⽤性が⽰された。本研究では、再⽣治療技術の概念実証モデルとして⾻芽細胞に細胞株を⽤いているため、臨床応⽤に向けた取り組みとして、患者由来の⾻髄間葉系細胞の利⽤や、⻭根膜細胞の図3複合細胞シートの同所性移植による歯周⾻芽細胞分化誘導などを検討する必要がある。

組織再生効果a）天然歯列と歯周組織損傷モデルのマイクロ CT 像。マウス上顎第一臼歯の口蓋側に近遠心幅 2mm，頬舌幅 0.5mm，３．発表（研究成果の発表）深さ 1.5mm の歯周組織損傷モデルを作製した。（ScaleRaju R, Oshima M, Inoue M, Morita T, Huijiao Y, Waskithobar：1mm）b）歯周組織損傷モデルに移植後 8 週間のマイクロ CT 像。矢印：歯周組織の治癒が不完全な部位、矢頭：歯周組織の治癒部位。
（Scale bar：1mm）

A, Baba O, Inoue M, Matsuka Y, Three-dimensional
periodontal tissue regeneration using a bone-ligamentcomplex cell sheet. Scientific Reports, 3;10（1）:1656, 2020.
doi：10.1038/s41598-020-58222-0.