超高感度マルチ酵素活性アッセイの実現に向けたデュアルスウィーピング濃縮法の開発
Development of Dual Sweeping Preconcentration forHighly Sensitive Multiple Enzyme Activity Assay（日本分析化学会推薦）

代表研究者 大阪府立大学

末吉 健志

Osaka Prefecture University

Kenji Sueyoshi

In conventional microfluidic bioassays, short optical pathlength and extremely small quantities of analytes
sometimes can significantly reduce detectability. Various sample preconcentration techniques have been reported forimproving the detectability of bioassays. In the present study, we developed a novel preconcentration technique, ‘doublesweeping’, utilizing cationic and anionic micelles simultaneously. Microscopic observations demonstrated that double
sweeping enabled a sample solution, which initially filled a capillary, to be focused into an extremely narrow band.
Initially, the sample molecules are swept from cathode to anode, or anode to cathode, based on conventional sweepingwith an anionic or cationic micellar solution, respectively. Then, the fronts of the swept bands collide each other in thecapillary, and halt at the interface between the bands. The sample molecules in the micellar solutions continue to movetoward the interface because of the electrophoretic migration of the micelles, which results in further focusing, andsuppression of the band broadening due to molecular diffusion. We demonstrated that higher preconcentration efficiency
was achieved using double sweeping, than using conventional sweeping. In addition, double sweeping was successfully
incorporated into a multiple enzyme activity assay using an arrayed reagent-release capillary, resulting in simple, rapid,
simultaneous, and highly sensitive assays of caspase-3, alkaline phosphatase, and trypsin.

研究目的

活性アッセイに適用してきた [1]。この分析法では、酵素は生体内における様々な化学反応に関与して毛細管力の利用によって 1 L 以下の試料溶液が自いることが知られており、その働きの解明は生命の発的に RRC 内に導入されるため、極微量試料を簡便営みを解き明かす上で非常に重要である。一般に生に分析可能である。その後、RRC 内における酵素反命科学分野で汎用されているマイクロプレートを用

応生成物について蛍光顕微鏡を用いて観察・解析すいた酵素活性アッセイは、操作自体は勘弁である反るだけで、極微量の試料溶液中酵素の活性アッセイ面、複数のウェルへの試料・試薬導入が煩雑、必要が達成される。これまで、RRC の開発によって簡便、試料量・試薬量が多いなどの点から、希少な生体試

短時間、少試料量・試薬量な酵素活性アッセイが実料分析への適用が困難となる場合がある。そこで近現されたものの、100 m と非常に短い光路長に起因

年、ミクロスケール酵素活性アッセイに関する様々する低い濃度感度が大きな課題であった。その改善な研究が進められ、試薬量・試料量の削減や分析ののため、RRC を用いた酵素活性アッセイとミクロス短時間化が実現されてきた。当研究室でも、ガラスケール電気泳動に基づくオンライン試料濃縮法との製毛細管 (キャピラリー) 内表面に分析試薬が物理結合を着想した。その中でも、界面活性剤ミセルを吸着固定された「試薬放出キャピラリー (reagent-

用た疎水性物質の高効率濃縮法であるスウィーピン

release capillary, RRC) 」を開発し、微量試料の酵素グに着目し、これを応用した新手法として、二種類

Figure 1. Schematic illustration of combination of enzyme activity assay using an RRC with double sweeping.の界面活性剤ミセルを同時に用いる「デュアルスドデシルトリメチルアンモニウムブロミド (カチオウィーピング」を提案した。本研究では、その試料

ン性界面活性剤) および硫酸ドデシルナトリウム濃縮機構を解明し、その特徴から「ダブルスウィー(アニオン性界面活性剤) の両方を異なる比率で混ピング」と新たに命名した。また、開発したダブル合・ヒドロゲル化させた、カチオン性およびアニオスウィーピングを酵素活性アッセイデバイスへ応用

ン性混合ミセル含有ヒドロゲル (カチオン性およびし、その高感度化を図った。さらに、アレイ化 RRCアニオン性 RRG) を調製した。RRG を用いたミセルを用いたマルチ酵素活性アッセイへの適用による高の電気的注入について評価するため、ローダミン B

感度一斉分析の実現 (Figure 1) を目的として、その溶液が充填されたキャピラリーの陽極側および陰極検討を行った。

側にカチオン性およびアニオン性 RRG をそれぞれ接続後、各 RRG を介して電圧を印加して、ミセルが研究経過キャピラリー内に導入される様子を観察した。

まず、より簡便な操作で測定可能な酵素活性アッセイデバイスの実現を目指して、(1) 試薬放出ヒドロゲル (reagent-release hydrogel, RRG) を用いた電気(2) ダブルスウィーピングの濃縮機構の解明と濃縮効率の評価的試薬導入について検証した。続いて、RRC を用いダブルスウィーピングは、界面活性剤ミセルの電た酵素活性アッセイの高感度化を目的として、(2)気泳動を利用した試料濃縮法であるスウィーピング

ダブルスウィーピングにおける試料濃縮機構の解明を基盤技術として開発した新規試料濃縮法である。と濃縮効率の評価を行った。また、最終的には (3)

測定対象となる試料分子が含まれるキャピラリー末

アレイ化 RRC と RRG、そしてダブルスウィーピン端の陽極側からカチオン性ミセルを、陰極側からアグを組み合わせた超高感度マルチ酵素活性アッセイ

ニオン性ミセルを、それぞれ同時に電気泳動によっの実現に向けて検討を行った。て導入する。このとき、ミセル内の疎水性空間に取り込まれた試料分子は、各ミセルと同程度の泳動速(1) 試薬放出ヒドロゲルを用いた電気的試薬導入度で共に移動することとなる。その結果、各ミセル

一般的なキャピラリー電気泳動分析では、キャピによってかき集められるようにして濃縮されながら、ラリー両端に緩衝液が満たされた溶液リザーバーをキャピラリー中央部に向かって移動する。各ミセル接続する。その際、わずかな液面高さの差異によっゾーンがキャピラリー中央部に到達し、異なる電荷てキャピラリー内に溶液が流入し、分析結果や再現を有するミセル同士が衝突すると、電気的に中性な性に影響を与えることが知られている。この問題点ミセルが形成され、その電気泳動が停止する。そのを解消し、簡便なアッセイを実現するため、溶液リ際、ミセルに取り込まれていた試料分子も衝突界面ザーバーが「試薬放出ヒドロゲル (RRG)」に置換さ近傍において泳動停止し、細いバンド状に濃縮されれた電気泳動操作を新たに着想した。本研究では、る。その結果、キャピラリー内試料分子の高効率なFigure 2. Fluorescence imaging of sample migration during double sweeping. (a) Images obtained using digital microscope at 13, 27, and 42 s after applying voltage. (b) Fluorescence intensity profiles extracted from fluorescent images.
試料濃縮が達成され、超高感度検出が実現される。

された (Figure 2a)。この結果から、煩雑かつ実験結試料濃縮機構解明のためのモデル試料として、果に悪影響を与える可能性がある溶液操作を排除す

ローダミン B 溶液をキャピラリー内に充填後、(1) とるために溶液リザーバーを RRG に置換することで、同様の手順で各ミセルを電気泳動によって導入した。

RRC 後のスウィーピングによる試料濃縮を簡便な電気泳動および試料濃縮の様子は蛍光顕微鏡を用い手順で実現可能であることが示された。て観察した。得られた蛍光画像から、未濃縮時と濃縮時の蛍光強度を比較し、ダブルスウィーピングの濃縮効率を評価した。また、多様な蛍光基質への対(2) ダブルスウィーピングの濃縮機構の解明と濃縮効率の評価

応を目標として、酵素活性アッセイ用基質の蛍光部

各 RRG をローダミン B 溶液充填キャピラリーに位として使用されているフルオレセイン、アミノメ接続して電圧印加し、各ミセルを電気泳動導入し続チルクマリン、ローダミン 110 について、それぞれけた。その結果、それぞれのミセルによって濃縮さの濃縮効率を同様に評価した。

れた試料バンドがキャピラリー中央付近へと移動し、最終的には 50 m 程度の非常に狭いバンド状に収束(3) 超高感度マルチ酵素活性アッセイの実現されて停止する様子が観察された (Figure 2a)。また、酵素反応モデル試料として、カスパーゼ 3 用蛍光

電圧印加中は濃縮完了後のバンド幅の増加が確認さ基質が固定化された RRC を作製した。
作製した RRCれず、試料分子の濃度拡散による希釈が抑制されてにカスパーゼ 3 溶液を毛細管力にて導入し、酵素反いる様子が確認された。このとき、未濃縮時との蛍応を行った。その後、蛍光生成物をダブルスウィー

光強度比較から、本実験系におけるダブルスウィーピングによって濃縮し、酵素活性アッセイの高感度ピングの濃縮効率は約 200 倍と算出された (Figure化を試みた。さらに、トリプシンおよびアルカリフォ2b)。この値は、キャピラリー全長 (10 mm) に充填

スファターゼ用蛍光基質が固定化された RRC をそされていた試料バンドが約 1/200 (50 m) に収束されぞれ作製し、各酵素活性アッセイの高感度化を同れたことに対応しており、キャピラリー内の蛍光分様に試みた。また三種類の RRC が並列的に配置され子ほぼすべてが一点に濃縮されていることを示唆したアレイ化 RRC を用いて同様の実験を行い、超高感ている。また、従来の界面活性剤を一種類のみしか度マルチ酵素活性アッセイの実現を目指した。

用いないスウィーピングに基づく試料濃縮と比較しても、約 3~5 倍高効率な試料濃縮が達成されていた。

考察

以上の結果から、本法は従来のスウィーピングには(1) 試薬放出ヒドロゲルを用いた電気的試薬導入無い試料濃縮機構を有しており、より高効率な試料電圧印加直後から、ローダミン B で満たされた濃縮が可能であることが示された。

キ ャ ピ ラ リ ー 内 に カ チ オン 性 お よ び ア ニ オ ン 性

一方、骨格や疎水性、電荷などの性質が大きく異RRG から各ミセルが導入され、スウィーピングの原なるフルオレセイン、アミノメチルクマリン、ロー理に基づく試料濃縮バンドが形成される様子が観察

ダミン 110 についても、それぞれ同様に 200 倍程度

研究の発表口頭発表
1.

讃岐僚太，安倉直希，末吉健志，遠藤達郎，久(FS – FB) / FB

本秀明，"試薬放出ヒドロゲルを用いたダブルスウィーピングに基づく高感度酵素活性アッセイ"，日本分析化学会第 64 年会（福岡），2015.9.9-11.
2.

末吉健志，"ミクロスケール電気泳動のバイオアッセイへの応用"，日本分析化学会近畿支部，
異分野融合による新規分離分析法の創成のため

Figure 3. Multiple enzyme cross-reactivity assay usingarrayed RRCs with double sweeping. FS and FB
represent the fluorescence intensities of the assays insample and buffer solutions, respectively.の若手後援会，口頭発表（依頼講演）（大阪），2015.11.7.
3.

末吉健志，"ミクロスケール電気泳動を駆使した新規バイオアッセイ法の開発"，第 26 回クロマの高効率濃縮が可能であることが確認された。このトグラフィー科学会議，口頭発表（依頼講演）（福ことから、本法は高い汎用性を有しており、多様な岡），2015.11.11-13.

酵素活性アッセイに適用可能であることが示された。

4.

讃岐僚太, 末吉健志, 遠藤達郎, 久本秀明, "ダブルスウィーピングに基づく高感度電気泳動酵素
活性アッセイ", 第 76 回分析化学討論会, 口頭発(3) 超高感度マルチ酵素活性アッセイの実現

表（岐阜）, 2016.5.28-29.

カスパーゼ 3、トリプシンおよびアルカリフォスファターゼの酵素活性アッセイに RRC およびダブ

5.

Kenji Sueyoshi, (Invited talk) "Rapid and sensitive

ルスウィーピングを適用した。その結果、各 RRC 内bioassay based on microscale electrophoresis", 8thで酵素反応によって生じたそれぞれの蛍光性生成物

International Symposium on Microchemistry andが、どれも細いバンド状に濃縮される様子が観察さMicrosystems (ISMM 2016), (Hon Kong University,

れた。また、酵素濃度・反応時間に応じて蛍光強度

Hong Kong), 2016.5.30-6.1.

が増加する様子も確認されたことから、各 RRC とダ

6.

Kenji Sueyoshi, (Invited talk) "Rapid and Sensitive

ブルスウィーピングを組み合わせた高感度酵素活性

Bioassay Using Online Sample Preconcentration

アッセイが可能であることが示された。さらに、三Techniques in Microscale Electrophoresis", 16th

種の酵素活性アッセイ用 RRC が並列に設置された

Asia-Pacific International Symposium on Microscale

アレイ化 RRC を用いて、混合試料溶液のマルチアッ

Separations and Analysis (APCE2016), November

セイを行った結果、各キャピラリーにおいて対応す

7-10, 2016, Malaysia.

る酵素との反応によって生じた蛍光生成物を濃縮・7.

讃岐僚太，末吉健志，遠藤達郎，久本秀明"ダブ検出することが可能であった (Figure 3)。以上の結果

ルスウィーピングに基づく簡便・迅速・高感度から、本法に基づく簡便かつ高感度なマルチ酵素活

酵素活性マルチアッセイ"，日本化学会第 97 春性アッセイが可能であることが示された。

季年会（東京），2017.3.16-19.

参考文献

誌上発表

[1] Henares, T. G.; et al, Anal. Chem. 2007, 79, 908-915.

1.

Ryota Sanuki, Kenji Sueyoshi*, Tatsuro Endo,
Hideaki Hisamoto，"DOUBLE SWEEPING USINGREAGENT-RELEASE HYDROGELS FOR A
HIGHLY SENSITIVE ELECTROPHORETICBIOASSAY MICRODEVICE"，The Proceedings ofMicroTAS 2015 Conference, 1080-1082, 2015.