倉田奨励金研究報告書｜2018 年度（第 50 回）助成■受領№1374

薬剤耐性菌の迅速な定量プロファイリング技術の開発

代表研究者

今西 規

東海大学

医学部医学科基礎医学系分子生命科学

1．研究⽬的教授

精度なゲノム解析システム（図1）を基盤として、細菌感染症の治療にはさまざまな抗菌薬が使⽤

未知の薬剤耐性菌の細菌種と耐性プロファイルをされるが、薬剤の効かない薬剤耐性菌や、複数の迅速に判定することができる新技術を開発する。

抗菌薬に耐性を⽰す多剤耐性菌が蔓延しており、細菌培養検査に依存せず、医療現場内で3時間以内世界的に深刻な事態となっている。耐性菌が出現に耐性菌を正確に判定できるようにすることをめする原因は、主に、抗菌薬の過剰な使⽤によってざす。

感染細菌が耐性を獲得しているためだと考えられこれと並⾏して、16S rRNA遺伝⼦解析にランダている。医療機関において患者サンプルに含まれムDNAバーコードを導⼊し、PCRバイアスを補正る細菌の種とその薬剤耐性プロファイルを決定すして絶対定量を可能にする新技術の開発をめざす。

るには、通常は細菌培養検査が⽤いられる。しかこれらの新技術を開発したら、その実⽤化をめざし、検査結果を得るまでには2⽇以上を要し、難培してゲノム解析システムの更新を進める。これを養性の細菌も存在するため、正確な判定結果を得細菌感染症の診断補助ツールとして東海⼤学医学ることは容易ではない。そのため、迅速かつ正確部付属病院で試験運⽤することにより、感染症にに薬剤耐性菌の耐性プロファイルを決定するため対するゲノム診断システムを医療機器として実⽤の新しい検査技術が必要とされている。そこで本化することが本研究の最終⽬的である。

研究では、われわれが独⾃に開発した迅速かつ⾼図１

感染症診断のためのゲノム解析システム（左）と青色 LED 照射装置（右）。ナノポア・シー
クエンサーMinION と 2 台の高性能ラップトップ型 PC およびソフトウエア群で構成される独自のシステムであり、2 時間以内に細菌種の同定が可能である。青色 LED は PMA の結合反応に使用する。

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2．研究概要培養を⾏わずに迅速に細菌種と薬剤耐性プロファイルを決定する新技術の開発を試みた（図2）。
薬剤耐性菌を含む試料を分注してそれぞれに異なる抗菌薬を投⼊し、⼀定時間後に選択的膜透過性⾊素（PMA）を投⼊してLED光を照射することにより、死菌由来DNAを化学修飾する。これをPCRで増幅すると、薬剤耐性を持つ⽣菌のDNAのみが選択的に増幅される。以上の処理後に、ナノポア

本⼿法の有効性を検証するため、⼤腸菌ATCC

薬剤耐性菌に対する迅速な細菌種判定技術の開発。試料を抗菌薬で処理後、PMA に生菌と死菌を区別して、生菌のみをゲノム解析にかける。

株、緑膿菌PAO1株、多剤耐性緑膿菌MDRPを⽤マイシン処理（GM-1およびGM-2）を⾏い、⽣菌意した。このうちPAO1株はアンピシリン（Amp）の組成をゲノム解析により調べた（図3B）。このに耐性を⽰し、MDRP株はアンピシリンおよびゲ場合も予想通りに、薬剤耐性を持つ菌の割合が増

ンタマイシン（GM）に耐性を⽰す。⼤腸菌ATCC加していることが明らかになった。

DNAシークエンサーMinIONを使った独⾃のゲノム解析システムで細菌の種組成を決定した。

図２

株は耐性がない。まず、⼤腸菌ATCC株と緑膿菌以上の実験により、抗菌薬とPMAによる処理とPAO1株の混合液に対して、抗菌薬なし（No Drug）、ゲノム解析の組合せにより、細菌種とその薬剤耐アンピシリン処理（Amp-1およびAmp-2）、ゲンタ性プロファイルを同時に決定できることが⽰されマイシン処理（GM-1およびGM-2）を⾏い、そのた。この⼿法のアドバンテージは、最短で3時間程後PMAを使って⽣菌の組成をゲノム解析により度で薬剤耐性菌の細菌種を同定できることである。

調べた（図3A）。その結果、薬剤耐性を持つ菌の今後は、安定的にさまざまな薬剤への耐性菌を判割合が予想通りに増加していることが明らかにな別可能なプロトコルを完成させ、実⽤化をめざしった。次に、⼤腸菌ATCC株と多剤耐性緑膿菌

たい。以上の結果について、論⽂発表を準備中でMDRPの混合液に対して、抗菌薬なし（No Drug）、ある。

アンピシリン処理（Amp-1およびAmp-2）、ゲンタ

図３

抗菌薬処理後の生菌の組成。A)は大腸菌 ATCC 株（耐性なし）と緑膿菌 PAO1 株（アンピシリン耐性）の混合液、B)は大腸菌 ATCC 株と多剤耐性緑膿菌 MDRP の混合液に対する実験結果を示す。

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このほか、ランダムDNAバーコードを使った

2. Nakagawa S, Inoue S, Kryukov K, Yamagishi J,

16S rRNA遺伝⼦の絶対定量解析について研究をOhno A, Hayashida K, Nakazwe R, Kalumbi M,

⾏った。本⼿法のProof-of-concept実験には成功しMwenya D, Asami N, Sugimoto C, Mutengo

たが、コスト⾯や実験に要する時間の⾯では著し

MM, and Imanishi T. Rapid sequencing-based

く不利であることが判明し、実験⽅法を再検討しdiagnosis of infectious bacterial species fromた。今後は、濃度が既知の遺伝⼦配列を試料に混

meningitis patients in Zambia. Clinical &⼊させて解析するスパイク・イン⽅法など、相対Translational的な濃度測定の⽅法を開発していく⽅針である。

(2019)

３．発表（研究成果の発表）【学会講演会への発表】
1.

今⻄ 規、「迅速ゲノム解析と⼈⼯知能を⽤いた感染症診断⽀援システムの開発」、第3回感染症診断と治療におけるゲノム解析（東海⼤学伊勢原校舎、2020年）

2.

⼤野 歩、梅澤 和夫、クリュコフ キリル、中川 草、浅井 さとみ、宮地 勇⼈、今⻄ 規、「ナノポアDNAシークエンサーを⽤いた薬剤耐性菌同定技術」第42回⽇本分⼦⽣物学会年会（福岡、2019年）

3.

⼤野 歩、梅澤 和夫、浅井 さとみ、クリュコフ
キリル、中川 草、宮地 勇⼈、今⻄ 規、「Rapidprofiling of drug-resistant bacteria using
propidium monoazide and a nanopore DNA
sequencer.」第93回⽇本細菌学会総会（名古屋、2020年）

4.

Imanishi T, "Bioinformatics for the diagnosis
of infectious diseases", The 17th Asian
Bioinformatics Consortium Symposium 2019
(Guizhou, China, 2020)【学会誌への発表】
1.

Ishihara T, Watanabe N, Inoue S, Aoki H,
Tsuji T, Yamamoto B, Yanagi H, Oki M,
Kryukov K, Nakagawa S, Inokuchi S, Ozawa H,Imanishi T. Usefulness of next-generation
DNA sequencing for the diagnosis of urinary
tract infection. Drug Discov Ther. 14(1):42-49(2019)

Immunology

8(11):

e01087