原著論文
77（短報）

藻類 Jpn. J. Phycol. (Sôrui) 68: 77-80, July 10, 2020

新しい手法による Spirogyra castanacea（ホシミドロ科）の接合の誘導
岩田和佳 *・池谷仁里・石田一馬・園部誠司・新免輝男
兵庫県立大学大学院生命理学研究科（〒 678-1297 兵庫県赤穂郡上郡町光都 3 丁目 2 番 1 号）
Kazuyoshi Iwata*, Hisato Ikegaya, Kazuma Ishida, Seiji Sonobe and Teruo Shimmen: New method of inducing conjugation of Spirogyra
castanacea (Zygnemataceae). Jpn. J. Phycol. (Sôrui) 68: 77-80 July 10, 2020
Condition inducing conjugation of Spirogyra was investigated. Conjugation of Spirogyra castanacea cells was induced in solution of highpH. In artificial pond water (APW) containing 5 mM Na2SiO3 (pH 10.4), a few cells were observed to be conjugated, while many cells
shrunk (damaged or died). However, when cells were incubated in 0.1 M mannitol solution for 24 h and then in APW containing 5 mM
Na2SiO3 (pH 10.4) with 0–0.15 mM mannitol, damage of cells dramatically decreased and 10–30% of cells were conjugated. Interestingly,
the ratio of cells conjugated to parthenospore-like cells decreased as concentration of mannitol in APW increased. From these results, pHand osmotic stress are suggested to be key factors inducing conjugation in this Spirogyra species.
Key Index Words: conjugation, high pH, Spirogyra, turgor regulation
Graduate School of Life Science, University of Hyogo, Harima Science Park City, Hyogo 678-1297, Japan*Author for correspondence: k-iwata@arion.ocn.ne.jp

淡水藻であるアオミドロ属（Spirogyra）藻類は接合藻綱

ホシミドロ科に属し，その接合過程は古くから興味深い生命現象として知られている。実験室レベルでの接合子形成の誘導は，様々な条件で試みられてきた。例えば，窒素欠乏（Yamashita & Sasaki 1979，Simons et al. 1984），光条件（Yamashita & Sasaki 1979，Simons et al. 1984），C/N 比（Yamashita & Sasaki 1979），pH（Simons et al. 1984）である。
しかし，再現性の低さから，接合子形成の研究はあまり進んでいなかった。

Ikegaya et al.（2012）は，Spirogyra castanacea G.C.Couchの藻体を寒天培地の上で培養することにより，接合子形成を誘導することに成功した。この実験系は約 40% から 50%と誘導率が高く，類似の方法も既に報告されていた（Allen1958）。

著 者らは，様 々なストレス下 で 植 物の成 長阻 害を緩 和

す る こ と が 知 ら れ て い る ケ イ 素（Epstein 2009） の，S.

castanacea に対する影響を調べた。ケイ素（Na2SiO3）濃度を増加させた時，少数の細胞が接合し，その後，高い pH の時に接合が誘導されている事実を見出した。本報では，その経過に加え，高 pH 溶液中で接合子形成を誘導する方法と，観察された現象について報告する。

S. castanacea を兵庫県相生市の小川で採取し（Inoue et al.
1999），Ikegaya et al.（2012）に従い培養した。即ち，蛍光灯を用い，明暗 16:8 時間のサイクルで，C 培地（Closterium用合成培地 Ichimura 1971）中で維持した。

アオミドロの接合子形成誘導は，以下の 2 つの方法で行った。

方 法 1．C 培 地 で 培 養 し た 藻 体 を， 人 工 池 水（0.1mM KCl, 0.1 mM CaCl 2 , 1 mM NaCl, 1 mM N-2hydroxyethylpiperazine-Nʼ-2-ethanesulfonic acid-Na 緩衝液 ,pH 7.0）で 3 回ゆすぎ，24 穴プレート（AGC テクノグラス）に入った 1mM，2.5mM，5 mM Na2SiO3 を含む人工池水（pH10.4）中に移した。
方法 2．C 培地で培養した藻体を，0.1 M マンニトールを含む人工池水中で 24 時間静置し，人工池水で軽くゆすぎ，24 穴プレートに入った 5 mM Na2SiO3 を含む人工池水（pH10.4）中に移した。
アオミドロの接合は，乳状突起の形成から始まる。そこで，

Ikegaya et al.（2012）と同様に，突起が観察された時点を接合の開始と判断した。突起を形成した細胞は，次の 2 タイプがあった。タイプ I は接合管で 2 細胞が接合したもの（Fig.
1a），タイプ II は単独で突起を形成したもの（Fig. 1b）である。タイプ II は，接合藻の一種 Zygnema で報告された単為胞子（Pouličková et al. 2007）に類似の楕円形の外見を有する場合があった。タイプ I では，接合管で接合した 2 つの細胞を，細胞数 2 としてカウントした（tube type）。タイプ IIでは，突起を持っている細胞の数を，そのまま細胞数としてカウントした（single cell type）。

誘導後 7 日経過した細胞は，スライドグラスに載せ，顕微鏡（Axioskop2, Zeiss, Tokyo, Japan）で観察した。Ikegayaet al.（2012）は，誘導後 4 日経過してから寒天上で観察した。

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岩田ら

Fig. 1. Induction of conjugation of Spirogyra castanacea cell incubated in 5 mM Na2SiO3 with mannitol after turgor was regulated. a: Two cells forming
conjugation tube and zygote (arrowheads). b: Single cells forming papilla (arrowheads). Bars = 100 μm.

しかし，溶液中での接合は同調率が低く，4 日間は静置時間としては十分ではなかったため，7 日後の細胞を観察した。

細 胞 は，CCD カ メ ラ（VB-7010, Keyence, Osaka, Japan）

で撮影した。突起を持つ細胞は，タイプ I とタイプ II を別々にカウントし，結果は全細胞数に対する，突起を持つ細胞数の比率で表した。

また，タイプ I と II を合計すると 35–39% 程度になった（Fig.

3）。また，マンニトールの濃度が増加すると，タイプ I の細胞が減少し，タイプ II の細胞が増加した（Fig. 3）。
今回用いたアオミドロ S. castanacea と同じく仮根を形成す
る Spirogyra fluviatilis では，マンニトールを用いて細胞に浸透ストレスを与えると，膨圧調節を行うことが報告されてい細胞の浸透圧は限界原形質分離法（Iwata et al. 2001）でる（Iwata et al. 2001）。 今 回 の S. castanacea も，0.1 M マ

置し，半数以上の細胞が原形質分離した最低のマンニトール

節（外液の浸透圧上昇により細胞の浸透圧が 0.41 M から 0.44調べた。細胞を，様々な濃度のマンニトール溶液中で 15 分静濃度を細胞の浸透圧とした。

アオミドロ藻体を，1 mM または 2.5 mM Na2SiO3 を含む人工池水中で静置する（方法 1）と，細胞に状態の変化は見

ンニトールを含む人工池水中で 24 時間静置すると，膨圧調M に増加）が観察された。従って，膨圧調節に伴う代謝の変化が生じていると考えられる。このことが，今回観察された，浸透ストレスが付与した高 pH 溶液に対する抵抗性に関係しられず，接合した細胞も見られなかった。その後，藻体を 5ている可能性がある。

が見られたが，多くの細胞にダメージが見られたり，あるい生じることを報告している。寒天上の藻体は，周囲の水を失mM Na2SiO3 を含む人工池水中で静置すると，接合した細胞

Ikegaya et al.（2012）は，接合が寒天上で静置された時には死細胞であったりした（Fig. 2）。この時 5 mM Na2SiO3 はうことにより浸透ストレス下にあると考えられる。従って，浸た。Simons et al.（1984）は，アオミドロの多くの種で，pHがある。

人工池水の持つ緩衝作用を打消し，溶液の pH は 10.4 に達し7–9 で接合した事実を報告している。著者らが知る限りでは，
pH 10.4 という高い pH で，接合子形成が誘導された例は初めてである。従って，誘導に適した pH は種によって異なる可能性も考えられた。いずれにしても pH 10.4 という条件は細胞へのダメージが大きく，実験系としては不適であった。

次に，藻体を 0.1 M マンニトールを含む人工池水（pH 7.0）

透ストレスが S. castanacea の接合に重要な因子である可能性

Ikegaya et al.（2012）は，アオミドロ S. castanacea の接合には光が必要なことを報告している。藻類を取り巻く水のpH は，光合成により上昇することが知られている（衛生環境研究所水質・赤土研究室 2006）。寒天上では，細胞周囲の水は大きく減少するため，水の pH は大きく上昇することが考えられる。従って，高 pH もこの種の接合に重要な因子で中で 24 時間静置し，5 mM Na2SiO3 と 0–0.15 M マンニトーある可能性がある。本報の溶液での誘導系と寒天上での誘導細胞のダメージが劇的に減り，約 10–30% の細胞が接合し，乾燥状態であり表面的には正反対に見えるが，原理的には類ルを含む人工池水（pH 10.4）中に移したところ（方法 2），系は，細胞の置かれた環境で見ると，前者が溶液中，後者が79

アオミドロ接合子形成の誘導

れらの細胞の中には，乳状突起が一度結合した後に分離した細胞が含まれる可能性があるが，明らかに乳状突起が 2 つ。これは，Ikegaya et形成されている細胞もある（Fig. 1b）al.（2012）で報告された現象に似ているが，寒天上で誘導される場合は，乳状突起が 2 つ形成された後，細胞質が単為胞子様の構造に変化しなかった。その理由については不明であるが，溶液での誘導系に含まれている単為胞子様構造の誘導因子が寒天上での誘導系に含まれていない，あるいは寒天上での誘導系に含まれている阻害因子が溶液での誘導系に含まれていない可能性が考えられる。例えば，溶液のみに含まれている Na2SiO3 などが候補に挙がる。

浸透ストレスが強いほど，単為胞子様構造を持つタイプ IIの割合が増加する現象は，次のように考えると合理的であることが理解できる。即ち，ストレスが強い場合は，接合して接合子を形成するより，単独で単為胞子様構造を形成する方Fig. 2. Induction of conjugation of Spirogyra castanacea cell incubatedin 5 mM Na2SiO3. Damaged cell around conjugated cells is indicated byarrowhead. Bar = 100 μm.

似点があるのかもしれない。Takano et al.（2019）は，寒天が，短時間で対応できるため，生存できる確率が増加するということである。
本論文で報告した，溶液中での誘導系は，大量に誘導することが可能で，阻害剤処理なども容易である。一方で，Ikegaya et al.（2012）による寒天上での誘導系は，接合像を上での誘導系を改良し，明期時間と光量を増加させ，13 種の一平面で観察でき，形態学的研究に適している。溶液中では，性化を介して pH が上昇している可能性がある。従って，こる場合がある。従って，目的により実験系を選択することが，るのかもしれない。

が，アオミドロ属藻類の接合現象の更なる理解につながるこSpirogyra で接合子形成を誘導した。この条件は，光合成の活の報告は，高 pH による接合子形成誘導の促進を示唆していタイプ II は，単為胞子に類似の構造を形成している。こtube

藻体がねじれながら接合する場合が多く，観察に問題が生じ研究を進める上で重要であると考えられる。これらの実験系とが期待される。

single celltotal60
Ratio of cells (%)

50403020
10000.05
0.1
Concentration of mannitol (M)0.15

Fig. 3. Ratio of Spirogyra castanacea cells of tube type and single cell type to all cells. Cells were incubated in 5 mM Na2SiO3 with mannitol after turgor wasregulated. Experiments were repeated five times and average values are shown with standard error.

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引用文献

岩田ら

Allen, M. A. 1958. The biology of a species complex in Spirogyra.
Ph.D. thesis, Indiana University, Bloomington, Indiana, USA.
衛生環境研究所水質・赤土研究室 2006. 藻類と pH の関係について . 衛
環研ニュース 第 12 号 p3.
Epstein, E. 2009. Silicon: its manifold role in plants. Ann. Appl. Biol.
155: 155–160.
Ichimura, T. 1971. Sexual cell division and conjugation-papillaformation in sexual reproduction of Closterium strigosum. In:
Nishizawa K. (ed), Proceedings of the 7th International Seaweed
Symposium. pp 208–214. University of Tokyo Press, Tokyo.
Ikegaya, H., Nakase, T., Iwata, K., Tsuchida, H., Sonobe, S. &Shimmen, T. 2012. Studies on conjugation of Spirogyra using
monoclonal culture. J. Plant Res. 125: 457–464.
Inoue, N., Sonobe, S., Nagata, Y. & Shimmen, T. 1999. Secretion oflectin-binding material in rhizoid differentiation of Spirogyra.
Plant Cell Physiol. 43: 479–483.
Iwata, K., Tazawa, M. & Itoh, T. 2001. Turgor pressure regulation andthe orientation of cortical microtubules in Spirogyra cells. Plant
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Poulíčková, A., Žižka, Z., Hašler, P. & Benada, O. 2007. Zygnemataleanzygospores: Morphological features and use in species
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Simons, J., Van Beem, A. P. & de Vries, P. J. R. 1984. Inductionof conjugation and spore formation in species of Spirogyra(Chlorophyceae, Zygnematales) Acta Bot. Neerl. 33: 323–334.
Takano, T., Higuchi, S., Ikegaya, H., Matsuzaki, R., Kawachi, M.,
Takahashi, F. & Nozaki, H. 2019. Identification of 13 Spirogyra
species (Zygnemataceae) by traits of sexual reproduction induced
under laboratory culture conditions. Sci. Rep. https://www.nature.
com/articles/s41598-019-43454-6.
Yamashita, T. & Sasaki, K. 1979. Conditions for the induction of themating process and changes in contents of carbohydrates andnitrogen compounds during the mating process of Spirogyra. J.
Fac. Sci. Hokkaido Univ. Ser. Bot. 11: 279–287.

(Received Feb. 12, 2020; Accepted March 10, 2020)