イオンチャネルとイオンポンプの本質的違いに迫る、ポンプ型ロドプシン様チャネルロドプシン ChRmine の構造機能解析
Structural and functional analysis of the pump-like cation-conducting
channelrhodopsin ChRmine（日本生物物理学会推薦）

代表研究者 東京大学

加藤 英明

The University of Tokyo

Hideaki KATO

協同研究者 Stanford 大学

Yoon Seok Kim

Stanford University

Yoon Seok KIM

協同研究者 金沢大学

柴田 幹大

Kanazawa University

Mikihiro SHIBATA

ChRmine, a recently discovered pump-like cation-conducting channelrhodopsin, exhibits puzzling properties (large
photocurrents, red-shifted spectrum, and extreme light-sensitivity) that have created new opportunities in optogenetics.
ChRmine and its homologs function as ion channels, but by primary sequence more closely resemble ion pumprhodopsins; mechanisms for passive channel conduction in this family have remained mysterious. Here we present the2.0-Å resolution cryo-EM structure of ChRmine, revealing architectural features never seen before in channelrhodopsins:trimeric assembly, a short transmembrane-helix 3, a twisting extracellular-loop 1, large vestibules within the monomer,
and an unprecedented opening at the trimer interface. We applied this structure to design three proteins (rsChRmine andhsChRmine, conferring further red-shifted and high-speed properties respectively; and frChRmine, combining faster andmore red-shifted performance) suitable for fundamental neuroscience opportunities. These results illuminate conduction
and gating of pump-like channelrhodopsins and point the way toward further structure-guided creation of novel
channelrhodopsins for applications across biology.

研究目的

由し、この光反応サイクルが一周する間にロドプシ

ヒトから微生物まで多くの生物は光からエネルギ

ンはそれぞれの機能を発揮する。微生物型ロドプシ

ーや情報を受け取り、それに応じた行動を取る。こンの分子機能はイオンチャネルやイオンポンプ、グの光受容に用いられる代表的タンパク質がロドプシ

アニル酸シクラーゼ、ホスフォジエステラーゼなどンである。ロドプシンは微生物からヒトまで広く保多岐に渡るが 1、そのうちイオンポンプやイオンチャ存された光受容タンパク質ファミリーであり、微生ネルとして働くロドプシンはイオン輸送型ロドプシ物型（タイプ 1）と動物型（タイプ 2）の 2 つに大別ンとして総称される。このイオン輸送型ロドプシンすることができる。いずれのタイプもオプシンと呼は、光によって特に神経細胞の膜電位を操作するこばれる 7 回膜貫通型（7TM）タンパク質部分と、保とができる分子ツール（光遺伝学ツール）として近存されたシッフ塩基を介してオプシンに共有結合し年注目を集めている。また、初のチャネル型ロドプたレチナール発色団から構成されている。ロドプシシンである CrChR2 を用いて神経細胞の光操作が可ンが光を吸収すると、まず初めにレチナールの異性能となった 2005 年以降 2、様々なチャネル型ロドプ化が起こり、それをきっかけとして光反応サイクルシンが自然界より単離、あるいはヒトの手によってと呼ばれる一連の立体構造変化が起こる。光反応サ開発され、光遺伝学ツールの有用性を向上させていイクルの間、微生物型ロドプシンは分光学的に区別った。
そうした研究の流れの一環として、我々は 2019できる中間体状態（例えば、K、L、M、N、O）を経年に Rhodomonas lens と呼ばれる海洋微生物より新規のチャネル型ロドプシン ChRmine を発見すること
3質急速凍結装置 vitrobot により ChRmine の凍結 gridに成功した 。ChRmine はこれまで発見されてきた調製を行い、東京大学の所有するハイエンドクライ

チャネル型ロドプシンとはアミノ酸配列が大きく異オ電子顕微鏡 Krios を用いて約 3000 枚の micrographなり、その配列は従来のチャネル型ロドプシンよりを撮影した。しかし、RELION3.1 を用いてデータ解も寧ろイオンポンプ型ロドプシンと類似していた。

析した結果、GDN の detergent micelle 中にタンパク

しかし、ChRmine は従来のチャネル型ロドプシンと質の大部分が埋もれてしまっており、このままでは比較しても光電流が非常に大きく、高い光感度や長高分解能の 3D map 再構成は困難であることがわか

波長シフトした励起波長スペクトルを併せ持っていった。

たことから、様々な新規の光遺伝学実験を可能にしてきた4,5。近年では網膜色素変性症の遺伝子治療に6そこで、京都大学岩田研究室との共同研究のもと、ChRmine に対して強固に結合する抗体の作成を試みも利用可能ではないかと期待されており 、革新的光た。Liposome に再構成した ChRmine 精製タンパク質遺伝学ツールとしての地位を築きつつある。しかしをマウスに打ち込み、得られた抗体を ELISA, 蛍光

ながら、前述の通り ChRmine はそのアミノ酸配列がクロマトグラフィー法によりスクリーニングするこ

従来のイオンチャネルよりもむしろイオンポンプととで、最終的に ChRmine の立体構造を特異的に認識類似しており、なぜ ChRmine がこれだけ強力なイオする抗体「Fab02」を得ることに成功した。

ンチャネルとして機能することが可能なのか、その次に、得られた Fab02 を用いて ChRmine のクライ構造基盤は全くの謎であった。そこで、「ChRmine はオ電子顕微鏡構造解析を試みた。今度は Au grid より（アミノ酸配列以上に）一体どこまでポンプ型ロド3,528 枚の micrograph を撮影し、これを RELION3.1.1プシンと類似しているのか」、「ChRmine が単なるアでデータ処理することにより最終的に 2.02Å というミノ酸配列以上にポンプ型ロドプシンとの類似性を高分解能の cryo-EM map を再構成することに成功し有しているのであれば、なぜ ChRmine はイオンチャた。これは、チャネル型ロドプシンとしては初の高ネルとして機能することができるのか」、「そもそも分解能 cryo-EM 構造であるとともに、結晶構造を含イオンポンプとイオンチャネルの本質的違いは一体めても、これまででもっとも高分解能のチャネルロどこに存在しているのか」、そして「ChRmine が持つドプシン構造の 1 つとなった。

高い光電流や長波長シフトした励起波長スペクトル得られた ChRmine の構造は二量体を形成する従来といった特徴はどのような分子基盤によって支えらのチャネルロドプシンとは異なり「3 量体構造」を形れているのか」、それらの問いに対する答えを得るた成していたため、この量体数が生理的なものである

め、我々は本研究において ChRmine の構造機能解析かを検証するため、金沢大学柴田研究室との共同研を試みることにした。また、得られた構造情報を用究のもと、高速 AFM を用いて脂質中の ChRmine のいることで、ChRmine のツールとしての性質をさら量体数検証を行った。その結果、ChRmine は確かにに向上させた発展的光遺伝学ツールの開発を目指し脂質中でも 3 量体構造を形成していることが判明した。

た。これは ChRmine が、アミノ酸配列のみならず、量体数までもが従来のチャネル型ロドプシンよりもbacteriorhodopsin(BR)のようなポンプ型ロドプシン研究経過

Rhodomonas lens 由来 ChRmine について、まず小と類似していることを意味していた。

スケールで条件検討を行い、Sf9 昆虫細胞を用いた発

次に我々は、ChRmine がポンプ型ロドプシンとど現精製系を確立することに成功した。次に、Sf9 細胞こまで類似の構造的特徴を有しているか検証するたでの発現スケールを 10ml から 6L へと上げ、得られめに、モノマー状態での構造比較を行った。その結2+た細胞ペレットから膜画分を素精製し、さらに Ni

果、ChRmine と C1C2(従来型チャネルロドプシンのアフィニティーカラムクロマトグラフィーやゲル濾例)7 の構造を重ね合わせた際、その r.m.s.d.は 2.14Å

過クロマトグラフィー法を用いることで、最終的にであったのに対し、ChRmine と BR 間での r.m.s.d.は1L あたり 0.3-0.5mg の精製タンパク質標品を得るこ

1.83Å であることが判明した。これは、ChRmine がとに成功した。

量体数のみならず、モノマー単位での全体構造もまさらに、得られたタンパク質を用いて、タンパクた BR と類似であることを示唆していた。

このように ChRmine は BR と多くの類似性を有しな影響が現れたため、ChRmine においてもこの空隙ていた一方で、数多くのユニークな構造的特徴も有がイオン透過経路の一部として働いていることが強していた。もっとも特筆すべき点は TM3 と細胞外ルく示唆された。ChRmine、C1C2 は共に BR と比較しープ 1 番(ECL1)であり、ChRmine の TM3 は従来のて単量体内部に大きな空隙を有していたため、この微生物型ロドプシンと比較して顕著に短くなってお特徴がチャネル型ロドプシン全般において保存されり、その結果 ECL1 は非常に長く、また曲がりくねたものであるか検証するため、構造既知のチャネル+った構造をとっていた。BR において外向き H ポン

ロドプシン全て（C1C2, CrChR2, C1Chrimson, GtACR1,

プ機能に重要な 3 アミノ酸残基、D85, T89, D96 はいiC++, ChRmine）について、空隙のサイズを計算しこずれも TM3 上に存在しており、これは DTD モチーれを BR と比較した。その結果、我々の仮説通りチフと呼ばれる。DTD モチーフは ChRmine にも保存

ャネル型ロドプシンは例外なく BR よりも顕著に大されているが、そのうち D85 に相当する D115 は TM3きな空隙を単量体内部に有しており、これがチャネがほどけたことによりシッフ塩基と 6.9Å も離れたルとポンプを切り分ける本質的な構造的特徴の一つ場所に位置していた。この位置の Asp 残基は微生物であることが強く示唆された。

型ロドプシンにおいて高度に保存されているが、こまた、イオン輸送型ロドプシンにおいて高度に保こまで両者の距離が離れたロドプシンは ChRmine が存されている TM3 上の Arg 残基（R82 in BR, R159 in初であった。また、プロトン化シッフ塩基の窒素原C1C2, R112 in ChRmine）に着目したところ、BR を含子と D115 の間には 3 個の結合水が観測された。

むポンプ型ロドプシンと ChRmine を含むチャネル型

これらの結果を踏まえ、東京大学井上研究室とのロドプシンでは Arg 残基の配向が大きく異なってい共同研究で野生型 ChRmine と D115N 変異体の過渡ることが判明した。具体的には、ポンプ型ロドプシ吸収分光解析を行ったところ、D115N 変異体では、ンでは単量体内部の空隙を塞ぐように Arg 残基の側野生型 ChRmine では観測されなかった K 様中間体鎖が経路中心に向かって突き出していた一方、チャの顕著な蓄積が観測された。D115 と同様にシッフ塩

ネル型ロドプシンでは Arg 残基の側鎖が経路を塞が基の近傍に位置している D253 についてその D-to-Nないよう細胞外側に向いていることが分かった。

変異体の過渡吸収を測定した際には、野生型と同様我々は、現在この Arg 残基の配向についてもチャネの光反応サイクルしか観測されなかったため、これルとポンプを切り分ける重要な一要因であると考えらの観測結果より D115 が M 中間体においてシッフている。

塩基プロトンのアクセプターとして機能する可能性

さらに我々は、ChRmine が 3 量体を形成する生理が強く示唆された。シッフ塩基と D115 までは 7Å 近的意義をより深く理解するため、ChRmine の単量体

い距離が離れているが、その間には複数の水分子が間で相互作用しているアミノ酸残基に変異を導入し、観測されたことから、現在我々は、M 中間体におい蛍光ゲル濾過クロマトグラフィー法により量体数をてシッフ塩基から D115 まで複数の水分子を介して調べながら、パッチクランプ法によりチャネル活性プロトンがリレー的に受け渡されるモデルを考えてを測定した。その結果、ChRmine の量体数が 3 量体いる。

から単量体へとシフトする変異体については、その次に我々は、ChRmine の TM2 の細胞内側、細胞外チャネル活性も顕著に減衰することが明らかとなっ側が BR と比較してそれぞれ外向きに kink している

た。我々が導入した変異はイオン透過経路やレチナという構造的特徴に着目した。この TM2 の傾きと、ールの結合部位からは大きく離れていることから、前述した特徴的な ECL1 の構造により、ChRmine は

この結果は ChRmine の 3 量体形成自体がチャネル活BR と比較して単量体内部に大きな空隙を有してい性の機能発現に重要であることを示していると考えた。そのため、単量体内部の空隙のサイズで比較すられる。これはチャネルロドプシンによる多量体形ると ChRmine は BR よりも明らかに C1C2 と類似し成がチャネル活性に重要であることを実験的に示していた。単量体内部の空隙は他のチャネルロドプシた初の例である。

ンの持つイオン透過経路と類似の位置に存在してお次に、我々は今回得られた ChRmine の構造情報をり、経路を形成するアミノ酸に変異を導入したとこ

用いて、ChRmine の持つパフォーマンスをより向上

ろ、（発現量には影響がないが）チャネル活性に顕著させた新規の光遺伝学ツールを開発できないか考えた。ChRmine は既に高い光電流、高い光感度、長波ニューロンの活性化とともに Pyr ニューロンと接続長側にシフトした励起波長スペクトルという 3 つのしている PV ニューロンの活性化を捉えることに、長所を併せ持つ光遺伝学ツールだが、励起波長スペPV ニューロンを光刺激した際には PV ニューロンのクトルやキネティクスの面で改良の余地が大いに残活性化とともに PV ニューロンと接続している Pyrされていた。そこで我々は、イオン透過経路内部のニューロンの興奮抑制を捉えることに成功した。こ荷電アミノ酸残基とレチナール結合ポケット周辺のれは世界で初めての「3 色の可視光を組み合わせたアミノ酸残基に着目し、複数の変異を導入することin vivo 光遺伝学実験」であり、今後同技術を用いたで、そのキネティクスや励起波長スペクトルの改良

all-optical physiology 実験により、神経科学研究が加を目指した。イオン透過経路内部の荷電アミノ酸残速すると期待される。

基として 6 種のアミノ酸、レチナール結合ポケット

また、我々は rsChRmine が 740 nm 超の近赤外光に周辺のアミノ酸残基として 2 種のアミノ酸に着目し、 よって活性化可能な唯一のチャネルロドプシンであそれぞれに変異を導入したところ、H33R 変異体、ることを示しており、この点からも rsChRmine が今I146M/G174S 二重変異体において、それぞれオフキ

後神経科学をはじめとする幅広い生命科学分野におネティクス値の減少、励起スペクトルのさらなる長いて必須の光遺伝学ツールとして活躍する可能性は波長シフトが観測された。そこで、我々はこの H33R高いと考えている。

変 異 体 を high speed ChRmine (hsChRmine) 、

上記の結果は、代表研究者である加藤を最終著者

I146M/G174S 二 重 変 異 体 を red-shifted ChRmine

及び責任著者の一人として学術誌 Cell に掲載された。

(rsChRmine)と名付け、両変異を掛け合わせた三重変異 体 を faster and further red-shifted ChRmine

参考文献(frChRmine) と名付けた。

1.

このうち、特に rsChRmine は 1 光子での全光光遺HE.

Structure-Function

RelationshipofChannelrhodopsins. Adv. Exp. Med. Biol., 1293, 35-

伝学実験(all-optical physiology 実験)に適していると考えられたため、
米国 Stanford 大学 Karl Deisseroth 研

Kato

53 (2021)
2.

究室の Yoon Seok Kim 研究員らとの共同研究のもと、Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, Nagel G,
Deisseroth K. Millisecond-timescale, genetically2+

緑色光によって励起される Ca イメージングツール

targeted optical control of neural activity. Nat.

「GCaMP6」と rsChRmine を組み合わせ、培養細胞

Neurosci., 8, 1263-8 (2005)

2+および脳スライスを用いた Ca イメージング実験を

3.

Marshel JH, Kim YS, Machado TA, Quirin S, Benson

行った。その結果、野生型 ChRmine と比較してB,rsChRmine は GCaMP6 と励起スペクトルの被りが顕

Ramakrishnan C, Inoue M, Shane JC, McKnight DJ,

著に小さく、GCaMP6 の励起光による ChRmine の活

Yoshizawa S, Kato HE, Ganguli S, Deisseroth K.

性化という”optical cross-talk”を最小限に抑えること

Cortical layer-specific critical dynamics triggeringが可能であることが分かった。そこで我々はさらに、

perception. Science, 365, eaaw5202 (2019)

この rsChRmine と GCaMP6 を、青色光によって励起

4.

2+KadmonJ,RajaC,Chibukhchyan

A,Chen R, Gore F, Nguyen QA, Ramakrishnan C, Patel

される Ca イメージングツール「XCaMP-B」と組み

S, Kim SH, Raffiee M, Kim YS, Hsueh B, Krook-

合わせることで、3 色の可視光を用いた in vivo 光遺Magnusson E, Soltesz I, Deisseroth K. Deep brain

伝学実験という世界初の試みを行った。具体的には、

optogenetics without intracranial surgery. Nat.

マ ウ ス の medial prefrontal cortex (mPFC) 内 のBiotechnol., 39, 161-164 (2021)

pyramidal neuron (Pyr ニ ュ ー ロ ン ) と paralbumin-5.

Matsubara T, Yanagida T, Kawaguchi N, Nakano T,expressing interneuron (PV ニューロン)にそれぞれ

Yoshimoto J, Sezaki M, Takizawa H, Tsunoda SP,XCaMP-B と GCaMP6 を発現させ、さらにはいずれHorigane SI, Ueda S, Takemoto-Kimura S, Kandori H,か一方の細胞に rsChRmine を発現させた状態で、光刺激により rsChRmine 発現細胞を活性化させるという 1 光子でのファイバーフォトメトリー実験を行った。
その結果、Pyr ニューロンを光刺激した際には Pyr

Yamanaka A, Yamashita T. Remote control of neuralfunctionby

X-ray-induced

Commun., 12, 4478 (2021)

scintillation.

Nat.

6.

Bansal H, Gupta N, Roy S. Theoretical analysis of2.

Kato,

"Structuralbasisforchanneloptogenetic spiking with ChRmine, bReaChES andconduction in the pump-like channelrhodopsin

CsChrimson-expressing

ChRmine" SFB 1078 Colloquium, Berlin, Germany

neuronsfor

retinalprostheses. J Neural Eng., 18 (2021)
7.

Hideaki(Zoom) (January 24, 2022)

Kato HE, Zhang F, Yizhar O, Ramakrishnan C,
Nishizawa T, Hirata K, Ito J, Aita Y, Tsukazaki T,
Hayashi S, Hegemann P, Maturana AD, Ishitani R,
Deisseroth K, Nureki O. Crystal structure of the誌上発表
1.

Kishi KE, Kim YS, Fukuda M, Inoue M, Kusakizakochannelrhodopsin light-gated cation channel. Nature,T, Wang PY, Ramakrishnan C, Byrne EFX, Thadhani

482, 369-74 (2012)

E, Paggi JM, Matsui TE, Yamashita K, Nagata T,Konno M, Quirin S, Lo M, Benster T, Uemura T, Liu

研究の発表

K, Shibata M, Nomura N, Iwata S, Nureki O, Dror RO,

口頭発表

Inoue K, Deisseroth K, Kato HE. Structural basis for1.

加藤英明：Structural basis for channel conduction in
the pump-like channelrhodopsin ChRmine, 第 44 回
日本分子生物学会年会, 横浜, 2021 年 12 月 2 日channelconduction

inthepump-likechannelrhodopsin ChRmine. Cell, in press (2022)