倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2020 年度（第 52 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1459

糖タンパク質を標的とした膵がん早期診断技術の開発
舘野浩章

国立研究開発法人産業技術総合研究所

研究グループ長Development of early diagnosis technology ofpancreatic cancer targeting glycoproteins
Hiroaki Tateno,
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Group Leader

膵癌の 5 年生存率は未だ 10％未満であり、治療することが極めて難しい。膵癌を根治する唯一の方法は、膵癌を早期発見し、外科的切除することである。しかし早期膵癌を高感度に検出できる診断薬は存在しない。我々はグライコーム解析の結果、膵癌から血液中に分泌される新たな膵癌関連糖鎖マーカーとして rBC2LCN 陽性SERPINA3（BC2-S3）を発見した。BC2-S3 は健常者や良性疾患患者と比べ膵癌患者で有意に高い値を示した。さらに既存の診断薬である CA19-9 と比べて切除可能な早期膵癌に高い診断能を示すことがわかり、実用化に向けて研究開発を進めてきた。
The five-year survival rate for pancreatic cancer is still less than 10％, making it extremely difficult to treat. The
only way to cure pancreatic cancer is early detection and surgical resection. However, there is no diagnostic agent
that can detect early-stage pancreatic cancer with high sensitivity. We discovered rBC2LCN-positive SERPINA3（BC2-S3）as a novel pancreatic cancer-associated glycan marker secreted into the blood from pancreatic cancer byglycomic analysis. Furthermore, BC2-S3 showed higher diagnostic performance in resectable early-stage pancreaticcancer than CA19-9, an existing diagnostic agent, and we have been conducting research and development forpractical use.

1．膵癌の医療課題

より膵癌の 5 年生存率は 44％にまで向上できるこ癌の治療が格段に進んだ現代では、癌全体としとが報告されている。そのため切除可能な状態でて治る確率（5 年生存率）は約 60％に達している。

発見することが膵癌根治の最大の課題となっていしかし膵管上皮に発生する膵癌は例外で、未だ治る。

る確率が 10％未満の難治癌の代表である。膵癌のある。膵癌を根治できる唯一の方法は早期膵癌を2．新たな膵癌関連糖鎖マーカー・BC2-S3の同定発見し、外科的切除することである。しかし早期正常組織に近い形態をもつ高分化型膵癌に発現（ステージ I-II）に発見できるのは膵癌患者全体のする癌関連糖鎖マーカーは、早期膵癌のマーカー

約 5-10％程度に過ぎない。早期膵癌は腫瘍が小さとして利用できるのではないかと仮説を立てた。

いために画像診断で検出することが難しい。さらそこでまずレクチンマイクロアレイを用いて各種には CA19-9 などの既存の診断薬も早期膵癌の検膵がん細胞株の糖鎖プロファイル解析を行った。

出率は 50％以下と低い。外科的切除と補助療法にその結果、高分化型膵癌細胞株に高い反応性を示

国内患者数は 4.2 万人、世界では約 40-50 万人で

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図1

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BC2-S3 は膵癌から血液中に分泌すものの、低分化型膵癌細胞株や正常膵管細胞株には反応しないレクチン rBC2LCN を発見した（Shimomura et al. Mol Cancer Ther 2018、PCT/JP2016/079577）。rBC2LCN は 69 例の膵癌患者全例に強い反応性を示した（図 1）。rBC2LCN は H

図2BC2-S3 は膵癌で特異的に検出

タイプ 3（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）に極めて特異

SERPINA3（BC2-S3）は健常者では検出されず、的に反応するレクチンである。実際に質量分析と膵癌患者血清でのみ検出された（図 2）。さらに

液体クロマトグラフィーを用いて膵癌患者由来ゼ

BC2-S3 は正常膵癌では発現していないものの、膵ノフラフト腫瘍の定量的糖鎖構造解析を行うと、癌 で 発 現 し て い る こ と が わ か っ た。そ の た め

H タイプ 3（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）が確かに膵

BC2-S3 は膵癌で発現し、血液中に分泌されている癌腫瘍で検出されることがわかった（Hasehira etと考えられた。

al. BBRC 2021）。そのため H タイプ 3 は新たな膵癌関連糖鎖であると結論付けた。

3．BC2-S3 の診断能

rBC2LCN が反応性を示す H タイプ 3 陽性糖タBC2-S3 を測定するために rBC2LCN と SERPINA3ンパク質が膵癌から血中に分泌されているのでは抗体を用いたレクチン ELISA を構築し、健常者、ないかと考え、rBC2LCN を捕捉と検出の両方に用膵癌、その他癌（胆管癌、大腸癌、食道癌、肝いるレクチン-レクチンサンドイッチアッセイで健癌）、その他良性疾患（胆嚢炎、慢性膵炎、他の膵常者と膵癌患者血清の解析を行った。その結果、疾患）を解析した（図 3）。BC2-S3 は健常者と比健常者と比べて膵癌患者血清に有意に高値を示しべて膵癌で有意に高値を示すことがわかった。

た。そのため膵癌患者血清では H タイプ 3 陽性糖

BC2-S3 は良性疾患では低値を示した一方で、肝癌タンパク質が増加していることがわかった。次にや胆管癌でも増加した。また BC2-S3 は術後に有LC-MS/MS 解析により rBC2LCN の糖タンパク質意に低下したことから、腫瘍依存的であることをリガンドを一斉解析すると、そのうちの 1 種が確認できた。CA19-9 は後期（ステージ III/IV）にSERPINA3 と呼ばれるセリンプロテアーゼ阻害剤血中量が顕著に高くなる一方で、BC2-S3 値はスであることがわかった。SERPINA3 は主に肝臓でテージが進むにつれて徐々に血中量が増加する傾発現していることから、免疫沈降とウエスタンブ向があることがわかった。

ロット解析において、健常者でも膵癌患者でも同BC2-S3 の膵癌全体に対する判別能（AUC: 0.822）定度血清中に検出された。一方、rBC2LCN 陽性は CA19-9（AUC: 0.790）と同等であった。重要倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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図3

BC2-S3 は健常者と比べて膵癌で高い値を示す

図5

BC2-S3 の早期膵癌（IA-IIA）の検出率

4．BC2-S3 のキット化と品質規格設定
キ ッ ト の 安 定 供 給 体 制 を 構 築 す る た め に、
図4

BC2-S3 の早期膵癌（IA-IIA）の診断能

SERPINA3 に対するマウスモノクローナル抗体を3 種作製し、レクチン ELISA を構築した。そして、なことに、早期膵癌（ステージ IA-IIA）におい年齢をマッチさせた健常者（n＝39）と膵癌患者ては BC2-S3 の判別能（AUC: 0.899）は CA19-9

血清（n＝36）を用いてこれら 3 種のモノクロー（AUC: 0.754）より顕著に高い判別能を示した

ナル抗体の膵癌（I-IV）に対する識別能を ROC 曲（図 4）。一方、後期膵癌（ステージ IIB-IV）にお線下面積（AUC）で比較した。その結果、1 種のいては BC2-S3 の判別能（AUC: 0.784）は CA19-9

モノクローナル抗体が最も高い膵癌識別能（AUC:（AUC: 0.807）と同等であった。さらに BC2-S3 の0.8711）を 示 し、ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体（AUC:早期膵癌の検出率（89.7％）は CA19-9 の検出率0.8761）と同等であった。そして、CA19-9（AUC:（62.1％）を圧倒的に凌駕していた（図 5）。その0.7742）と比べて高い膵癌識別能を示した。最終ため BC2-S3 は早期膵癌を検出できる新たな糖鎖的にレクチン ELISA に用いる SERPINA3 モノクマーカーとして期待される。

ローナル抗体の作製と安定供給体制の構築を完了

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自然科学・工学－健康・医療：1 年助成した。BC2-S3 を産生する膵癌細胞株の培養上清か（依頼講演）

ら抗 SERPINA3 モノクローナル抗体アフィニティ

早期膵癌の診断を実現する新規糖タンパク質マーカラムにより精製することで、ELISA の標準物質カーの開発の作製を完了した。SERPINA3 糖タンパク質の発第 41 回日本糖質学会

現プラスミドを膵癌細胞株にトランスフェクトし、2022/9/30

組換え BC2-S3 を一過性発現させ、得られた培養上清から組換え BC2-S3 を精製し、値付けを行った。rBC2LCN レクチンの固相化法、SERPINA3 抗体を用いた検出法（POD 標識、ビオチン-アビジン、ABC 法）の検討を行った。さらにブロッキング剤や非特異反応防止剤の検討を行い、バックグラウンドやバラつきの低減を検討し、最適化を完了した。最終的に BC2-S3 測定キットを完成させ、計 215 例の患者検体を用いて予備試験を行った。
早期膵癌（IA-IIA）と異常がない患者の識別能を解析した結果、CA19-9 の AUC が 0.6952 であるのに対し、BC2-S3 の AUC が 0.8116 であることがわかり、切除可能早期膵癌（IA-IIA）に対して高い識別能を示すことがわかった。
さらに、標準物質の値付け、キャリブレーター、試薬性能（感度、正確性、同時再現性、測定範囲）、分析における妨害物質、妨害薬剤、カットオ
フ値の参考値、測定試料の性質、採取法を設定した。以上から、BC2-S3 測定キット（モノクロナル抗体使用）の仕様・規格の設定を完了した。

5．薬事相談PMDA と計 4 回の相談を行い、臨床的意義、及び臨床性能試験プロトコールの合意に至った。

6．発表（研究成果の発表）（論文発表）
rBC2LCN-reactive SERPINA3 is a glycobiomarker
candidate for pancreatic ductal adenocarcinoma.
Mawaribuchi S, Shimomura O, Oda T, Hiemori K,
Shimizu K, Yamase K, Date M, Tateno H.
Glycobiology. 2023 Feb 2:cwad009. doi: 10.1093/
glycob/cwad009.