1 分子動態検出に基づく細胞内シグナル伝達量測定法の開発
Single molecule analysis-based quantification of intracellular signal transduction（日本分析化学会推薦）

代表研究者

東京大学

吉村 英哲

The University of Tokyo

Hideaki YOSHIMURA

G protein-coupled receptors (GPCRs) transduce extracellular signals to the inside of the cells through interactingwith downstream signal molecules of G proteins and arrestins. Emerging evidence suggests that GPCRs on the plasma
membrane are in a dynamic equilibrium between among monomers, dimers, and oligomers. Nevertheless, the role of thehigher-order oligomer formation in the GPCR signal transduction remains unclear. Using dual- and triple-color singlemolecule imaging, we investigated a dynamic interconversion between monomer, small and large oligomer states of achemoattractant GPCR, Formyl Peptide Receptor 1 (FPR1), and its signal efficacy through G protein interaction. Fullagonist stimulation increased a fraction of large FPR1 oligomers, which resulted in prolonged FPR1-G protein interaction.
The G protein interaction with FPR1 was most stabilized at the full agonist-binding large FPR1 oligomers, demonstratingthat G protein-mediated signal transduction is regulated synergistically by the ligand-binding and FPR1 oligomerization.
Cooperative signal control induced by receptor oligomerization is anticipated as a target for drug discovery.

研究目的

私は細胞内ならではの機能発現機構を解明する分

本研究は細胞膜受容体を通じて細胞内に導入され析法として、生細胞内 1 分子追跡法に注目した。従るシグナル伝達について、受容体と下流分子の 1 分

来１分子動態追跡法は生細胞への適用は多く見られ子動態検出に基づきシグナル入力量を評価し、シグなかった。しかし近年、生細胞内分子に対しても１ナル伝達機構を解明することを目的としている。

分子動態追跡を行い、その分子の機能発現機構の解細胞は外部からのシグナル入力に適切に応答する明を目指す研究が散見されるようになってきた。

ことで生命を維持している。分子生物学・生化学研

最近の代表体な例として、Calebiro らは GPCR の究により、個々のシグナル伝達に関与する分子の同生細胞１分子イメージングにより GPCR の拡散運動定は進み、同定されたシグナル伝達分子（リン酸化が停止し下流分子が集合する“hot spots”が存在す酵素など）の活性化は単離精製した試験管内でも再ることを提唱している（Nature 550, 543-547, 2017）。

現できる。一方、細胞内のシグナル伝達分子は入力

この報告ではおよそ 100 万個の GPCR について動態の種類によりシグナルを伝える下流分子を選択する解析を行い、分子運動（特に拡散係数）評価を基に特異性を有し、また極めて鋭敏な感度や幅広いダイGPCR の状態変化を検出した。その可逆的な状態変ナミックレンジなど、均一系における単純な分子間化の速度定数を求めることで、刺激入力からシグナ相互作用のみでは説明できない。特徴を有している。

ル伝達に至る、言わば素反応について考察している。

これらシグナル伝達の特徴は試験管内では再現でき

Calebiro らは状態変化というアナログな指標についず、機構も理解されていない。この機構を理解するて、状態数と状態間遷移を評価するために 100 万個ためには、単離精製した系とは異なる、細胞内でのにも及ぶ 1 分子解析を行ったが、これは様々な刺激分子集合・動態を解析する、新たな分析法が必要でに対して各種上流・下流分子へのシグナル伝達を評ある。

価する際には、スループットの観点から不利である。

また 100 万個もの分子を単一細胞で解析はできないーとして HEK293 細胞に遺伝子導入し、細胞が本来ため、複数細胞からの結果を積算することになる。

発現しているのと同等の FPR1 発現量（約 2 分子/μm2）

すなわち細胞間の個性は平均化により失われることを示す安定発現株を選抜した。作成した安定発現株になる。すなわち Calebiro らの報告は、“hot spots”を今後の実験に用いた。これらタグ付き FPR1 およという均一溶液中では生じない特異点の存在を生細び Gα を共焦点蛍光顕微鏡で観察したところ、SNAP-胞内で示したことについて高く評価されるが、一方

FPR1 は細胞膜に、Gα-Halo は細胞膜にも局在しつつで、シグナル伝達そのものの機構について詳細な評細胞質にも分布した。この局在は野生型 FPR1 およ価は十分に成し遂げられていない。一方本申請研究

び Gα の局在と童謡である。すなわちタグを付加すは、まずは拡散運動には注目せず、1 分子動態によりることで FPR1 および Gα の局在には影響は現れな初めて検出できる分子ごとの共局在形成/解離といかった。タグ付き FPR1 および Gα の活性能についてうデジタルな反応に注目した。すなわち分子数の計は、シグナル伝達の下流で生じる cAMP の検出実験数および共局在イベントの検出という整数で表され（cAMP アッセイ）を行い、いずれも野生型と同様るデジタルな指標をシグナル測定に用いることで、の活性を有していることを確認した。また、SNAP-同じ 1 分子イメージングでありながら圧倒的に簡便

FPR1 の活性については、Gα と Gβγ 間の FRET 測定で、かつ細胞ごとおよび空間的なばらつきも評価でによって、野生型と同様の活性時間変化を示すこときる新たなシグナル測定法を提案する。また、本研も確かめた。

究においてもシグナル伝達の時空間分布は解析可能

続 い て 、 SNAP-FPR1 と Gα-Halo を そ れ ぞ れであるため、hot spots の検出が実現する。その後 hot

Setau647 とテトラメチルローダミン（TMR）で染色

spot 形成の過程と機構を解明するために拡散係数なし、全反射蛍光顕微鏡を用いて生細胞 1 分子蛍光観

どの分子運動について経時変化解析を行うことは有察を行った。観察された動画から、FPR1 蛍光輝点の用である。

蛍光強度の分布を評価した。その結果、Setau647-

これらの背景を踏まえ、本研究では受容体を通じSNAPf-FPR1 はガラス上にまいた 1 分子 Setau647 のて細胞内へとシグナルを入力する現象について、そ蛍光強度分布と比較し、より高輝度側に広い分布をのシグナル量を 1 分子観察により評価することで、示した。この結果は、一部の FPR1 が細胞膜上で集シグナル伝達機構を理解することを試みた。具体的合体を形成していることを示している。また、FPR1な標的分子としては GPCR の 1 つである FPR1 を選と Gα-Halo の 1 分子共局在時間を評価したところ、び、下流の G タンパク質と FPR1 のリガンドの 3 種

単量体、集合体どちらの FPR1 に対しても共局在時の分子を生細胞中で同時に 1 分子観察した。その結間に有意差は見られなかった。この細胞に FPR1 の果を基に、受容体へのリガンド結合および受容体集リガンド fMLP を作用させ、同様の評価を行った。

合他の形成とシグナル伝達についての考察を行った。

その結果、リガンド刺激後には FPR1 集合体の個数が増加した。一方で、FPR1 と Gα-Halo の相互作用

研究経過

時間については、単量体/集合体間および刺激前/刺激

まず、標的分子である FPR1 と G タンパク質を蛍後の間でいずれも有意差は見られなかった。また、

光顕微鏡下で 1 分子可視化するためのプローブを作リガンドの代わりに阻害剤を添加した場合において製した。FPR1 にはベンジルグアニン修飾した有機分も、集合体の割合は増加し、単量体/集合体間で FPR1子を共有結合により標識できるタンパク質タグであと Gα-Halo との共局在時間に有意差は見られなかっる SNAPf タグを N 末端側（細胞外ドメイン）に融合た。

したもの（SNAP-FPR1）の遺伝子を構築した。G タ

FPR1 と Gα-Halo の 2 色のみの観察では、いずれンパク質の標識には、Gα サブユニットを対象として、の FPR1 にリガンド刺激が入力されているのかを判

過去に緑色蛍光タンパク質を挿入しても活性を保持別することができない。そこで、蛍光色素修飾を施したことが報告されている中間部位に春歩かんと共したリガンドを用いて、FPR1、Gα-Halo 、リガンド有結合を形成するタンパク質タグ Halo タグを挿入の 3 色同時生細胞 1 分子観察実験を行った。この観したもの（Gα-Halo）をコードした遺伝子を作成した。

察では、SNAP-FPR1 には Setau647 を、Gα-Halo にはこれら遺伝子を組み込んだ発現プラスミドをベクタ

R110 を、リガンドには TMR を用いてそれぞれ蛍光標識を施した。リガンドとの共局在が検出された（す集合体の形成と受容体の活性化は同値であり、集合なわちリガンドが結合していることが確認できた）体の形成そのものが受容体の活性化を示していると

FPR1 とリガンドの共局在が検出できなかった FPR1考えられていた。一方、本研究の結果からは集合体とで、集合状態や Gα-Halo との共局在時間について形成自体が高い活性能を示すために十分なものでは比較した。その結果、リガンドが結合した FPR1 の無いことを示している。一方で、リガンドが結合し方が集合体の割合が有意に多かった。また、リガンた単量体も、リガンド刺激前と比較して Gα との共ドの結合が確認されなかった単量体、リガンドの結局在時間に有意な変化は見られなかった。すなわち、合が確認されなかった集合体、リガンドの結合が確リガンドが結合することも FPR1 の活性化に対して認された単量体、リガンドの結合が確認された集合十分条件とはいえない。唯一 Gα との共局在時間に体の 4 状態において Gα-Halo との共局在時間を評価有意な変化を示したものはリガンドが結合しているした。その結果、リガンドの結合が確認されなかっFPR1 集合体であった。この結果はすなわち、リガンたものでは共局在の時定数は 45.6 ± 0.9 msec（単量ドが結合することと集合体を形成することの 2 つが体）と 49.4 ± 1.3 msec（集合体）であったのに対し、揃って初めて FPR1 が十分な活性状態を示すことをリガンドの結合が確認されたものでは 53.0 ± 3.5表している。

msec（単量体）と 67.2 ± 5.2 msec（集合体）であった。
これらの中で、リガンド結合が検出された集合体のみが、他の 3 状態と比較して有意差が認められた。
すなわち、リガンドが結合した集合体のみが有意に共局在時間が延長していることが明らかとなった。

考察
本研究では 2 色および 3 色同時生細胞 1 分子イメージング実験を行い、FPR1 と Gα、およびリガンドの生細胞上での集合と共局在について可視化解析をFigure. Schematic of the 2 step activation model of

行った。その結果、刺激前から FPR1 は単量体と集FPR1 proposed from the present single-molecule合体が共存しており、リガンドを加えた際には集合imaging study.

体の割合が増加した。集合体の割合の増加はリガンドのみならず、阻害剤を加えた際にも検出された。

FPR1 は免疫系における走化性センサーとして機また、刺激入力前と刺激入力後の集合体との間で Gα能することが知られている。一方で、表皮細胞などとの共局在時間には有意差は検出されなかった。

で FPR1 の過剰発現が生じその活性が暴走すると、この結果を基に、FPR1 の活性化様式について考察

スティーブンジョンソン症候群による重要躍進の原する。一般に GPCR の G タンパク質へとシグナルを因となる。すなわち FPR1 は非常に微弱なリガンド伝える機構としては２つのモデルが考えられていた、濃度勾配を検知する高い感度を有しつつ、その活性１つは非活性状態で GPCR と三量体 G タンパク質がを厳密に抑制するという、相反する性質を持つ必要結合している複合体モデル、もう１つは活性・非活がある。本研究で行った 1 分子イメージングから得性状態共に GPCR と G タンパク質が確率論的な衝突られた 2 段階活性化モデルによって活性が制御されを繰り返すとされるランダムコリジョンモデルであることで、感度と安定性という相反する性質が実現る。本研究で行った生細胞１分子観察の結果からは、されていると考えられる。

FPR1 と Gα との間に、数 10 msec 程度の共局在が観察された。この結果はすなわち相互作用は安定な複合体形成とは異なるもので、すなわちランダムコリ研究の発表ジョンモデルを支持する結果となった。

口頭発表（いずれも招待講演）

次に FPR1 の活性状態について考察する。従来は、

1.

"The roles of receptor oligomerization for signal

transduction- A study through single-molecule live-cell imaging-",

2.

4.

5.

名古屋

"A single molecule imaging approach to understand13th International Symposium on Nanomedicine,signal transduction on the plasma membrane in living2019.12.5, Kobe, Japan.

cells",「分子動態からメカニズムを探る -生細胞 1 分

12th International Symposium on Nanomedicine,子イメージングを用いたアプローチ-」,2018.12.7, Yamaguchi, Japan.

第 11 回光塾,
3.

第 95 回創薬科学セミナー, 2019.2.22,

2019.11.13, 神戸"Novel optical techniques to explore biological

誌上発表

function in single cells",

1.

Synergetic roles of Formyl Peptide Receptor 1

The 4th STEPS Symposium on Photon Science,oligomerization in ligand-induced signal transduction,

2019.3.21, Tokyo, Japan.

Tomoki Nishiguchi, Hideaki Yoshimura, Rinshi S.

「1 分子動態解析による細胞内分子作動機構のKasai, Takahiro K. Fujiwara, Takeaki Ozawa, ACS.

解明-生細胞 1 分子イメージングによるアプロー

Chem. Biol., under minor revision.

チ-」,