倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1499

脳内オキシトシン絶対濃度変化の実時間測定法の開発
稲生大輔

大阪大学大学院医学系研究科特任講師（常勤）Development of a fluorescent sensor for real-timequantitative recording of oxytocin dynamics
in the brain
Daisuke Ino
Osaka University Graduate School of Medicine, Lecturer

脳の細胞外では数百種類にわたる分子が情報伝達を介在すると想定されているが、生きた脳内における局所動態は未だ不明な点が多く、その計測法の開発は強く求められている。本研究では、 幸せホルモン と呼ばれる神経ペプチド オキシトシンに対する蛍光センサー MTRIAOT の開発を行った。オキシトシン受容体と蛍光タンパク質のキメラ分子に対して指向性分子進化をほどこし、超高感度センサーの開発に成功した。本センサーを生きたマウスの脳に導入し、生体内におけるオキシトシンの脳内動態をリアルタイムで捉えることを試みた。興味深いことに、刺激の種類や動物の行動パターンに依存して、脳内のオキシトシンシグナルは多用な動態を示すことが明らかとなった。
Oxytocin（OT）, a hypothalamic neuropeptide that acts as a neuromodulator in the brain, orchestrates a variety ofanimal behaviors. However, the relationship between brain OT dynamics and complex animal behaviors remains
largely elusive, partly because of the lack of a suitable technique for its real-time recording in vivo. Here, we
describe MTRIAOT, a G-protein-coupled receptor-based green fluorescent OT sensor that has a large dynamic range,
suitable affinity, ligand specificity for OT orthologs, minimal effects on downstream signaling and long-term
fluorescence stability. By combining viral gene delivery and fiber photometry-mediated fluorescence measurements,
we demonstrate the utility of MTRIAOT for real-time detection of brain OT dynamics in living mice. MTRIAOTmediated measurements indicate variability of OT dynamics depending on the behavioral context and physicalcondition of an animal. MTRIAOT will likely enable the analysis of OT dynamics in a variety of physiological andpathological processes.

1．研究内容胞膜への強い局在が重要となってくる。まず 6 種

1-1．超高感度蛍光オキシトシンセンサー MTRIAOTの脊椎動物（ヒト、マウス、ニワトリ、ヘビ、カの開発（図 1）

エル、メダカ）のオキシトシン受容体の細胞膜へ細胞外オキシトシンの結合により、明るさが大の局在を解析した。広く生物実験に用いられる培きく変化する蛍光センサーの開発を行った。セン養細胞である HEK293T 細胞に発現させたところ、サーのデザインとしては、オキシトシン受容体のメダカのオキシトシン受容体がもっとも強い細胞細胞内ループに cpGFP が挿入されたキメラタンパ膜局在を示すことが明らかとなった。そこでメダク質を採用することにした。高感度なオキシトシ

カのオキシトシン受容体をセンサーの骨格として、ン感知を達成するには、センサータンパク質の細蛍光センサーの開発を進めることにした。まず最倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

図 1：超高感度蛍光オキシトシンセンサー MTRIAOTの開発
a – c、細胞膜に強く局在するオキシトシン受容体のスクリーニング。 メダカ由来のオキシトシン受容体が最も強い細胞膜への局在を示した。
d – e、3 段階の変異導入によるセンサースクリーニング。
リンカー部位、膜貫通ヘリックス、cpGFP 内部配列にそれぞれランダム変異を加え、作製した変異体センサーのスクリーニングを行った。最終産物を MTRIAOT と名付けた。

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

図 2：食事と関連したマウス脳内におけるオキシトシン応答測定a – c、MTRIAOT を用いた in vivo 脳内オキシトシン動態測定。脳内でオキシトシンが約 2 時間周期で振動していること（オキシトシン振動）を発見した。
d – e、絶食による脳内オキシトシン動態の変動。絶食中にオキシトシン振動の波形が乱れること（オキシトシン乱流）を発見した。

応答を測定した。成体マウスを給餌・給水条件下でケージ内を自由行動させたところ、オキシトシンの一過性情報が約 2 時間周期で振動様に発生す適な cpGFP 挿入部位の決定を行った。メダカのオることが判明した。われわれはこの現象をキシトシン受容体の K240-I268 の間への cpGFP をシトシン振動（oxytocin oscillation） と名付けた。

挿入時に細胞膜局在を保持しつつオキシトシン応興味深いことにオキシトシン振動は、マウスが食答を示すことがわかった。本タンパク質をプロト事を行うタイミングと同期していることが明らか

タイプセンサーとし、ランダム変異を加えることとなった。では、オキシトシン振動の発生に食事でセンサー感度の進化を試みた。HEK293T 細胞をは必要なのであろうか？ 本命題を検証するため用いた顕微鏡下でのスクリーニングにより、本スに、絶食時にオキシトシン振動への影響が観察さクリーニングを通じ、オキシトシンに対し、最大れるか否かを解析した。驚くべきことに、絶食後約 8 倍もの蛍光強度変化を示す超高感度蛍光オキ

約半日において、脳内オキシトシン応答は消失せシトシンセンサー MTRIAOT の開発に成功した。

ず、振動の振幅が大きく変動した。この乱れたオキシトシン応答をわれわれはオキオキシトシン乱流

1-2．MTRIAOT を用いた食事と関連したマウス（oxytocin turbulence） と名付けた。オキシトシ

脳内におけるオキシトシン応答測定（図 2）

ン乱流は、再び給餌を行うことで消失し、再び正アデノ随伴ウイルスを用いてマウス脳内に常なオキシトシン振動が発生することから、オキMTRIAOT を導入し、ファイバーフォトメトリー法

シトシン乱流は絶食時特異的な脳内信号であるこにより行動化のマウスにおける脳内オキシトシンとが確認された。興味深いことにオキシトシン乱倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

流発生中のマウスの行動は、心が乱されたように変化を示すかを解析した。MTRIAOT を 293T 細胞ケージ内を暴れまわることも明らかとなった。すに発現させ、100 nM のオキシトシンを作用させなわち、脳内のオキシトシン振動の乱れは、空腹たところ約 0.7 ns の蛍光寿命変化が観察された。

による心の乱れをコードする信号となっている可すなわち、MTRIAOT 自体にオキシトシン結合依存能性が推測される。

的な蛍光寿命変化能が存在することが判明した。
そこで、様々な領域を改変した変異体を作製した

1-3．MTRIAOT を用いた老化と関連したマウス

ところ、ある変異体において、野生型よりも蛍光脳内におけるオキシトシン応答測定（図 3）寿命変化幅が大きくなることが明らかとなった。

ホルモンの動態は加齢により変動する可能性が示唆されているが、脳内のオキシトシン動態がどのように変化するかについては、まだ知見が限られている。そこで、様々な週令のマウス（2 カ月、6 カ月、1 年、2.5 年）からの脳内オキシトシン応答の測定を fiber photometry により行った。すると 2 カ月齢において、約 2 時間周期であったオキシトシン振動が、加齢とともに頻度が減少していき、2.5 年齢では約 1 日周期まで減少することが明らかとなった。すなわち、オキシトシン振動の減少は脳の加齢と何らかの形でリンクしている可能性が推測される。
図 4：定量的蛍光オキシトシンセンサーの開発
a – b、MTRIAOT（左）と変異型 MTRIAOT（右）の蛍光寿命変化計測結果

1-5．考察
今回われわれは、生きた動物の脳内からオキシトシン動態をリアルタイムで計測することを実現する世界初の手法開発に成功した。本手法を用い
図 3：老化と関連したマウス脳内におけるオキシトシン応答測定a – b、様々な週令・月齢のマウス脳からのオキシトシン動態測定を行うことで、老化により脳内のオキシトシン振動の周期が減少していくことを発見した。

た計測により、脳内のオキシトシン信号は FM ラジオのように振動していることが明らかとなった。
また詳細な解析から、脳内の振動様のオキシトシン信号は食と深くかかわる可能性が示唆された。
すなわち、正常な給餌状態では脳内では、オキシトシンは一定（2 時間周期）の規則的な信号を刻

1-4．定量的蛍光オキシトシンセンサーの開発（図4）
まず、がオキシトシンの結合依存的に蛍光寿命んでいるのに対し、飢餓状態では信号の波形が大きく乱れる という新規現象が見えてきた。また、
われわれは加齢によりオキシトシン振動の周期が倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成減少していくことも明らかにした。これは脳の老measurement of extracellular oxytocin dynamics in化となんらかの関連が推測される。詳細の解明は

the brain、Neuro2022（第 45 回 日本神経科学大これからというところである。なお、これらの結会）、2022 年 6 月 30 日－7 月 3 日、沖縄コンベン

果をまとめた論文は、学会等で公表を得ているほションセンター・宜野湾市立体育館・ラグナガー

か、昨年 Nature Methods 誌に採択される1）など、デンホテル、沖縄

生命科学分野に大きな反響を与えている。さらに最近では、蛍光寿命変化型のオキシトシンセンサーについても開発に成功しつつある。蛍光寿命型センサーによる定量的な計測が in vivo で可能となれば、脳内オキシトシン濃度変化の定量的な理解がさらに進むであろう。

2．発表（研究成果の発表）
1）論文発表（査読あり）
Daisuke Ino*, Yudai Tanaka, Hiroshi Hibino, andMasaaki Nishiyama: A fluorescent sensor for realtime measurement of extracellular oxytocin
dynamics in the brain, Nature Methods, 19, 12861294, 2022 *Corresponding author2）学会発表
稲生大輔、可視化により探る 多様な細胞外シグナ
ル動態、生理研研究会、シナプス研究会 2022、2022 年 12 月 8 日－9 日、生理学研究所、岡崎、招待講演
稲生大輔、Development of Fluorescent Sensors for
Real-Time Measurement of Oxytocin and the other
Neuromodulators、JPW2022（第 96 回 日本薬理学会 年 会）、2022 年 11 月 30 日－12 月 3 日、パ シフィコ横浜、横浜
稲生大輔、可視化により見えてきた複雑な脳内オ
キシトシン動態、生理研研究会、細胞システム理解のためのシグナル応答原理解明の最前線、2022
年 9 月 15 日－16 日、生理学研究所、岡崎
稲 生 大 輔、A fluorescent sensor for real-time