倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2021 年度（第 53 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：1 年助成

奨励金№1508

ゲノム DNA 上の疾病原因領域を迅速に特定する新規技術の開発
鈴木匠

茨城大学准教授

Developing the novel technology that identifies
rapidly disease-causing regions on the genome
Takumi Suzuki,
Ibaraki University, Associate professor

多くの疾病では、遺伝子間領域などに存在するエンハンサー領域に生じた突然変異が原因となっている。このため、疾病原因領域の特定には、エンハンサー配列の変異を調べることが必要だが、現在、社会に実装可能なエンハンサー解析技術は存在しない。本研究では、すべてのエンハンサーに関与するメディエーター複合体（MED）と呼ばれるタンパク質の挙動を追跡することによって、エンハンサー領域を特定する新規技術を開発した。
It is now widely known that mutations in the enhancer region cause many diseases. Therefore, it is necessary toinvestigate mutations in enhancers to identify disease-causing regions. However, currently there is no enhancer
analysis technology that can be applied clinically. In this study, I have developed a novel technique to identify
enhancer regions by tracking the behavior of proteins called mediator complex（MED）, which interact withtranscription factors bound to enhancers.

1．研究内容胞でのみ突然変異が発生し、その他の大部分の細1.1 研究の背景

胞では正常である場合が多く、変異を正確に検出

遺伝子の突然変異は、先天的な疾病だけでなくするためには細胞タイプ特異的に解析する必要が神経変性症やがんなどの後天的な疾病にも関与すある。しかし、現状では、社会に実装可能なエンることが知られている。従来、これらの疾病では、ハンサー解析技術は存在しない。

それぞれの遺伝子においてタンパク質に翻訳される領域に変異が起こり、異常なタンパク質が合成されることが原因であると考えられてきた。しかし、近年の解析技術の急速な進歩によって、遺伝子本体の異常だけでなく、遺伝子間領域などに存在し遺伝子の発現を調節する領域（エンハンサーと呼ばれる）に生じた突然変異が非常に多くの疾病の原因となっていることが明らかになった［図図 1．研究の概念図1］。このことから、それぞれの疾病の原因を特定するには、遺伝子本体だけでなくエンハンサー領申請者は、従来の方法とは異なる基本原理に立域の配列についても変異の有無を確認しなければ脚したエンハンサー解析法を開発するため、エンならない。また、後天的な疾病の場合、特定の細ハンサーと相互作用するタンパク質の一群である

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転写因子に注目した。転写因子は、エンハンサー所を網羅的に特定し、エンハンサーを同定する方に結合した後、RNA ポリメラーゼなどの転写装置法の開発を目指した。

を引き寄せる、あるいは排除することによって、遺伝子発現を調節する。転写因子が結合する領域

申請者はこれまで、遺伝子発現を制御するタンを同定は、エンハンサーの同定と同義であるため、パク質である転写因子の機能を解析する新規手法

エンハンサー解析法の基本原理として利用できる。

DamID の開発に携わってきた［Tang et al., 2022］。
DamID では、任意のタンパク質の DNA 結合パ

1.2 研究の方針

ターンをアデニンのメチル化頻度という情報に置それぞれの転写因子は RNA ポリメラーゼを含き換えて定量的に解析できる。目的の DNA 結合

む転写装置をプロモーター領域にリクルートし転タ ン パ ク 質 に DNA ア デ ニ ン メ チ ル 基 転 酵 素

写を活性化・抑制する、という普遍的な性質を持（Dam）を融合させる。Dam は 5 -GATC-3 配列をつ［図 2］。エンハンサーに結合している転写因子認識し、アデニンをメチル化するため、Dam 融合は、メディエーターというタンパク質複合体に結タンパクが結合した領域の近傍の 5 -GATC-3 配列合し、このメディエーター複合体がそれぞれの遺はメチル化を受ける。つまり、高度にメチル化さ伝子のプロモーター配列に転写装置を引き寄せる、れた領域は、目的の DNA 結合タンパク質が高頻あるいは結合を阻害する。

度に結合した領域であることを意味する。このため、Dam 融合タンパク質を発現誘導した後、ゲノムワイドな DNA メチル化パターンを解析すれば、目的のタンパク質が結合した領域を特定できる。
これを応用し、任意の細胞において、MED2、MED3、MED15 と Dam の融合タンパク質を発現させ、メチル化された領域を特定することによってエンハンサー領域を同定する技術（MED-Dam）

図 2．メディエーター複合体の開発を最終的な目標とした［図 3］。

メディエーター複合体は、3 つの領域に分けられ、このうちテール領域と呼ばれる箇所で転写因子と結合している。テール領域は、MED2、MED3、MED15 と呼ばれるサブユニットから構成されている。これらの構成因子は非常に多くの転写因子と結合するため、ゲノム DNA 上で MED2、MED3、MED15 が高頻度に接近した領域には転写

図 3．MED-Dam の原理因子が結合している、つまりエンハンサー領域である可能性が非常に高い。

1.3 研究成果

以上のことから、本研究では、メディエーター

ま ず、テ ー ル 領 域 構 成 因 子 で あ る MED2、複合体のテール領域構成因子に着目し、ゲノム

MED3、MED15 と Dam の融合タンパク質［図 3］

DNA 上における MED2、MED3、MED15 の存在を発現する遺伝子組換え系統の作出を行った。

箇所を特定することによって、転写因子の結合箇本研究では、細胞タイプ特異的な解析を行うた倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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めに、Gal4/UAS システム［図 4］を用いた。この

エンハンサー領域が同定されている遺伝子に注目システムでは、転写因子 Gal4 が UAS 配列を認識したところ、sloppy-paired1（slp1）と dacapo（dap）し、そ の 下 流 の 遺 伝 子 を 強 力 に 発 現 誘 導 す るがこのリストに含まれていたため［図 5］、この 2［Brand and Perrimon, 1993］。UAS 配列の下流に遺伝子を MED-Dam の解析対象とした。

それぞれの MED と Dam をコードする配列が挿入

dacapo の遺伝子座における MED2 の接近パターされた系統を作出すれば、Gal4 によって MED 融ンを解析したところ、転写開始点の上流約 2 kbp

合 Dam タンパク質の発現を制御できる。

ほどの領域に強いシグナルが検出された［図 5］。
この領域では、胚発生期における中枢神経系のエンハンサーに含まれていることが知られている［Liu et al., 2002］。この領域が、実際に幼虫期の視覚中枢でエンハンサーとして機能しているかどうかは、今後の解析において検証する必要がある。

図 4．Gal4/UAS システム

sloppy-paired1 の遺伝子座にでは、転写開始点の上流約 6.2 kbp ほどの領域に強いシグナルがMED2、MED3 については Dam 融合タンパク検出された［図 5］。この領域には、今回用いた質を発現する遺伝子組換え系統の作出に成功した。

R35H02 系統の作出に用いられた調節領域が含ま

MED15 に関しては、PCR 法による増幅が困難でれており［Janet et al., 2013］、MED-Dam の結果あったため、発現コンストラクトの構築には至らと一致している。以上のことから、今回開発したなかった。MED15 については、今後、人工遺伝

MED-Dam によって、実際にエンハンサーとして子合成等の手法によって、配列を取得し、pUAS-機能している領域を検出することが可能であるこLT3-Dam ベクターに挿入する予定である。とがわかった。

当初の計画では、MED-Dam の発現誘導実験にeve-Gal4 と bsh-Gal4 を使用する予定であったが、いずれを用いて MED-Dam の発現を誘導した場合においても胚性致死となった。このため、新たにMED2-Dam、MED3-Dam の誘導に適した Gal4 系統を探索した。その結果、MED-Dam を誘導可能な 26 系統を特定した。このうち、R35H02 系統は、脳神経系の一部の神経幹細胞で特異的に発現しており、比較的少数の細胞での解析が必要な本研究に非常に適していた。そこで、以降の解析では R35H02 系統を用いた。

図 5．slp1, dap 遺伝子近傍の MED-Dam 結合パターン

MED-Dam 解析に先立ち、解析対象の遺伝子を絞り込むために R35H02 を発現している神経幹細胞において Dam 融合 RNA ポリメラーゼ II（RNApolII-Dam）を発現させてトランスクリプトーム解析を行なった。この結果、有意に発現している約5000 の遺伝子を同定した。このうち、1 つ以上の2．発表（研究成果の発表）なし