未知の膜タンパク質挿入装置の解明
Elucidation of a novel membrane insertion system（日本生化学会推薦）

代表研究者 神戸大学

匂坂 敏朗

Kobe University

Toshiaki SAKISAKA

協同研究者 神戸大学

山本 泰憲

Kobe UniversityYasunori YAMAMOTO

Transmembrane proteins are cotranslationally or posttranslationally inserted into the endoplasmic reticulumn (ER)membrane. We have identified calcium-modulating cyclophilin ligand (CAML) as a mammal-specific membrane
insertion receptor for the transmembrane protein having a transmembrane domain close to the C-terminus. After orsimultaneously with the membrane insertion into the ER, sorting of the transmembrane proteins occurs at the ER andallows transport of the transmembrane proteins to the destined organelle. Here, we have found that the number oftransmembrane domains is involved in determining its ER or cis-golgi localization. A transmembrane protein containing
four transmembrane domains at the C-terminus mainly localizes at the cis-golgi, while a transmembrane protein containing
less than four transmembrane domains at the C-terminus mainly localizes at the ER. We generated a truncated protein
containing only four transmembrane domains and found that the truncated protein mainly localized at the cis-golgi. We
purified and identified a small G protein as a four transmembrane domains-binding protein using the cell line stably
expressing the truncated protein containing only four transmembrane domains. These results suggest that the number oftransmembrane domains at the C-terminus is important for determining the transmembrane protein localization at the ERand cis-golgi interface.

研究目的

輸送を介し、目的の場所へと輸送される。しかし、

す べ て の 生 物 は 総 タ ン パ ク 質 の 約 3 0 %に

トランスロコンは、大多数の膜タンパク質の膜挿入

及 ぶ 膜 タ ン パ ク 質 を 有 し 、物質輸送、細胞内シを担う優れたシステムであるが、トランスロコンだ

グナル伝達、生体防御などの生体に必須な機能を担けでは小胞体への膜挿入を説明できない膜タンパクっている。疎水性ドメインを持つ膜タンパク質がど質も存在する。その一つとして、C 末端側に膜貫通のようにして脂質二重層へ正確にターゲティングさ領域がある膜タンパク質がある。C 末端側に膜貫通れ、挿入されるのかを理解することは、生化学の重領域がある膜タンパク質は、膜貫通領域がリボソー要な課題の一つである。膜タンパク質の生合成メカムの外へ出てくる前に翻訳が終了するため、トランニズムとして膜透過装置トランスロコンによる翻訳スロコンによる翻訳と共役した膜挿入が物理的に不と共役した経路がある。リボソームで合成された膜可能である。小胞体に膜挿入された C 末端側に膜貫タンパク質は、各々適切な膜へ輸送される必要があ

通領域がある膜タンパク質は、他の膜タンパク質とり、小胞体に存在する膜透過装置であるトランスロ同様に、小胞輸送を介し、目的の場所へと輸送されコンを介して、小胞体膜に挿入される。そして小胞る。その輸送の選別は小胞体で行われることが知られているが、膜貫通領域が輸送選別に関与しているかは十分に明らかにされていない。そこで、C 末端側の膜貫通領域の個数を変えることにより、小胞体への膜挿入、その後の輸送に影響があるかを調べた。

研究経過
C 末端側に膜貫通領域がある膜タンパク質の細胞内局在を調べた。この膜タンパク質には 3 種のスプライシングバリアントがあり、それぞれ膜貫通領域バリアント１のシスゴルジへの局在に必要な領域の個数が 4 個（バリアント 1）、2 個（バリアント 2）、が C 末４つの膜貫通領域で十分であるか調べるため1 個（バリアント 3）であった（Figure 1）。に、strep タグを付けたバリアント１の 4 つの膜貫通領 域 (strep- バ リ ア ン ト １ 膜 貫 通 領 域 ) を 作 製 し た（Figure 3）。

これを安定に発現する HeLa 細胞を樹立し(strep-バ
リアント１膜貫通領域-HeLa 細胞)、抗 strep 抗体、抗GM130 抗体で免疫染色を行った。strep-バリアント１膜貫通領域は GM130 と共局在した。このことから、
HeLa 細胞に HA（ヘマグルチニンのペプチド配列）バリアント１のシスゴルジへの局在には 4 つの膜貫タグのついたバリアント 3 種（HA-バリアント 1、通領域のみで十分であることが分かった。C 末端側HA-バリアント 2、 HA-バリアント 3）をそれぞれ発にある膜貫通領域の個数を変えることにより、その現させ、抗 HA 抗体と抗細胞内小器官のマーカータ長さに依存して細胞内局在が異なっていた。膜貫通ンパク質抗体を用いて免疫染色した。HA-バリアン領域の長さによる疎水性の変化が、小胞体膜の脂質

ト 1 はシスゴルジのマーカータンパク質である二重層との相互作用を介して、小胞体での選別輸送

GM130(シスゴルジマトリックスタンパク質 130)とに関与していると考えられた。

共局在した。HA-バリアント２と HA-バリアント３

バリアント１をシスゴルジへ局在化させる分子メは小胞体のマーカータンパク質である PDI(タンパクカニズムを明らかにするために、C 末４つの膜貫通質ジスルフィドイソメラーゼ)と共局在した。これら領域に結合するタンパク質の探索を行った。strep-バのことから、膜貫通領域が 4 つ存在するバリアント

リアント１膜貫通領域-HeLa 細胞の細胞抽出液からはシスゴルジに局在し、膜貫通領域が 4 つ有しない

Strep-Tactin Sepharose を用いて strep-バリアント１膜ものは小胞体に局在することが分かった。膜貫通領貫通領域をプルダウンしたサンプルを電気泳動し、域のスプライシングが、シスゴルジと小胞体への選銀染色した。Strep-バリアント１膜貫通領域と共に 2別を行っていることが考えられた（Figure 2）。

つのタンパク質がプルダウンされた。そのうちの１つがシスゴルジに局在することが知られている低分子量 G タンパク質であった。この低分子量 G タンパク質が膜貫通領域に結合することにより、バリアン

ト１のシスゴルジへの局在に関与していると考えらがあり、局在化シグナル配列として機能しているとれた。

考えられる。今後は C 末端の 4 つの膜貫通領域と低分子量 G タンパク質の結合をより詳細に解析して認考察
本研究で解析した C 末端側に膜貫通領域がある膜タンパク質は、スプライシングにより膜貫通領域の識配列を明らかにし、その配列とこれまで報告されているシスゴルジ局在配列と比較、検討する予定である。

数を変化させることにより、細胞内局在（小胞体あ本研究で解析した C 末端側に膜貫通領域がある膜るいはシスゴルジ）を変化させることができる膜タタンパク質の機能、特に細胞質領域の機能を明らかンパク質であることが明らかになった。にする必要があると考えている。細胞、組織によっバリアント１がシスゴルジへ局在化するには、バて各スプライシングバリアントの発現パターンに違リアント１が小胞体から輸送され、その後シスゴルいがあるのか、スプライシングによるシスゴルジとジに到達したバリアント１がゴルジ中間嚢へ輸送さ小胞体の局在変化の意味は何かを追求していきたいれない、またシスゴルジに到達したバリアント１がと考えている。
本研究成果は、膜貫通領域の数による膜タンパク小胞体へ返送されない、の少なくともこれら 3 つの条件が同時に起こることが必要であると考えられる。 質の局在化機構の一つを発見し、低分子量 G タンパ
これらのどの過程にバリアント１の 4 つの膜貫通領ク質が関与する新しい膜タンパク質のシスゴルジへ域に結合する低分子量 G タンパク質が関与しているの局在化機構の存在を示唆しており、現代生化学、かは不明である。低分子量 G タンパク質がシスゴル細胞生物学の中心的課題の一つである膜タンパク質ジに局在していることが知られており、そこでバリの局在化機構の分子メカニズムの解明に寄与するとアント１と結合していると考えられる。低分子量 G考えている。

タンパク質とバリアント１の結合が、バリアント１をシスゴルジからゴルジ中間嚢へ輸送あるいはシス研究の発表

ゴルジから小胞体へ返送を止めている可能性が高い

口頭発表と考えられる。

1.

匂坂敏朗、寺島俊雄：髄鞘低形成と皮質形成異常を示す新規突然変異マウス laggard 、第 121 回日

今回発見した低分子量 G タンパク質は供与膜から本解剖学会総会・全国学術集会、福島、の輸送小胞の形成と標的膜への輸送を制御し、小胞2016 年 3 月 29 日

体―ゴルジ体間、ゴルジ体―エンドソーム間、エンドソーム―細胞膜間の小胞輸送を制御していること

誌上発表が知られている。今回の結果は、低分子量 G タンパ

1.

Calcium-modulating Cyclophilin Ligand(CAML) in

ク質がシスゴルジからの小胞輸送ではなく、シスゴPosttranslational Insertion of Tail-anchored Proteins

ルジでの膜タンパク質の局在化を制御していること

into the Endoplasmic Reticulum Membrane.

を強く示唆している。低分子量 G タンパク質はシスゴルジに局在する全ての膜タンパク質の局在化を制Y. Yamamoto, and T. Sakisaka: The Emerging Role ofJ. Biochem., 157(6): 419-429, 2015.
2.

Y. Fujiwara, N. Goda, T. Tamashiro, H. Narita, K.

御しているのか、あるいは特定の配列を持つ膜タン

Satomura, T. Tenno, A. Nakagawa, M. Oda, M.

パク質の局在を特異的に制御しているのかは不明で

Suzuki, T. Sakisaka, Y. Takai, and H.Hiroaki:ある。本研究で解析した C 末端側に膜貫通領域があCrystal structure of afadin PDZ domain-nectin-3る膜タンパク質のシスゴルジへの局在化には C 末端の 4 つの膜貫通領域で十分であることから、この領域内に低分子量 G タンパク質が認識する特異的配列

complex shows the structural plasticity of theligand-binding site.
Protein Sci., 224: 376-385, 2015.

3.

T. Urade, Y. Yamamoto, X. Zhang, Y. Ku, and T.
Sakisaka: Identification and Characterization ofTMEM33 as a Reticulon-binding Protein. Kobe J.
Med. Sci., 60:57-65, 2014.