倉田奨励金研究報告書 第 52 集
2020 年度（第 52 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：2 年助成（最終）奨励金№1461

新規の生体イメージングモデルを駆使した血栓器質化機構の解明
原哲也

神戸薬科大学准教授

Novel in vivo imaging model assessing DVT
organization mechanism
Tetsuya Hara,
Kobe Pharmaceutical University, Associate Professor

蛍光顕微鏡での励起光の照射下に 10-20 秒程度観察すると秒単位でリアルタイムで血栓形成がおこることが再現性をもって確認できた。血栓形成は血流速度が低いほど、おこりやすく、血栓面積が増加することがあきらかになった。次に、マルチカラーイメージングによる、血管内皮の接着因子、各種血球成分と実際の血栓形成の生体下での時空間的制御機構を明らかにするため、フィブリン、白血球、血小板などの複数分子、血球を同時に生体下にイメージングすることに成功した。さらに、我々は本モデルで形成された血栓を二光子顕微鏡で観察することにも挑戦し、より詳細に 4 次元データとして血栓の基質化反応が観察可能であった。この二光子顕微鏡による血栓器質化機構の可視化技術を用いることで、静脈血栓器質化に重要な白血球や血小板の血栓内への浸潤が、一方を除去することで他方が著明に現象することが明らかとなった。
We established new in vivo murine DVT imaging model using conventional fluorescence microscopy. After 10-20
seconds of irradiation of excitation light, we reproducibly observed DVT formation in murine femoral/saphenousvein. Thrombus formation is flow velocity-dependent as seen in clinical situation. We next tried to image multi-color
imaging to explore the mechanism of endothelial cell and several hematological cells using in vivo imaging. We
could image fibrin, leukocyte, and platelets simultaneously in vivo. We also succeeded in imaging DVT using twophoton microscopy in vivo. Using two-photon in vivo DVT imaging system, we observed that invasion of leukocyte
and platelet are required in each other. Depleting neutrophils in mice decreased platelet invasion into DVT, anddepleting platelets decreased leukocyte invasion.

1．研究内容なった。すなわち、本血栓モデルは実臨床と同様1-1．静脈速度と血栓形成の定常状態での関連性に血流速度依存性であることが証明できた。

ex vivo でラベルした赤血球を用いて血流を測定し、静脈結紮後の血流にどの程度の個体差があるのかを明らかにする。そして静脈速度と血栓形成

1-2．マルチカラー生体分子イメージングによる血栓制御機構の解明までの時間の相関を数値化する。これまでの前実蛍光標識した抗好中球抗体や抗血小板抗体、験では静脈血流速度が遅いほど、血栓形成は早く、フィブリンをマウスに経静脈投与することによっ血流依存性であることがわかっている。この関連て、生体下に好中球や血小板と血栓形成時の挙動性を数値化した。

が可視化できる。マルチカラーイメージングによ

結果、血栓形成は血流速度が低いほど、おこりる、血管内皮の接着因子、各種血球成分と実際のやすく、血栓面積が増加することがあきらかに血栓形成の生体下での時空間的制御機構を明らか倉田奨励金研究報告書 第 52 集
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自然科学・工学－健康・医療：2 年助成（最終）にすることが可能である。具体的には白血球と血ス）に静脈血栓を形成し、炎症細胞浸潤や線維化小板は各種抗体以外にもローダミン 6G を用いて形成を経時的に観察し、野生型（WT）マウスと安価に標識可能である。実際にフィブリン、白血比較する。これまでの研究結果では、血管老化マ球、血小板などの複数分子、血球を同時に生体下ウスでは予想に反して、小型の血栓が形成されるにイメージング可能であることを確認した。

ことが想定される。また、器質化が進んだ白色血栓が形成されることが明らかになりつつある。こ1-3．赤血球ラベルによる血栓形成における赤血球の役割の解明
これまでの前実験的な観察により、血栓形成時には赤血球の大きさとほぼ等しい円形の構造物がれらを総合すると、現時点では器質化のスピード亢進が起こっているものと思われる。これはすな
わち CTEPH 病変の形成にも影響を及ぼしている可能性が高く、今後も解析をすすめていく。

凝集し、それが徐々に血管内皮に接着し、血栓形成 が 開 始 さ れ る こ と が わ か り つ つ あ る。こ の1-6．好中球―血小板相互作用

FITC-dextran により黒く抜ける円形構造物が赤血野生型マウスに好中球除去抗体を腹腔内投与し、球であることを明らかにするために、赤血球を蛍その一日後に血栓を形成させて二光子顕微鏡で観光ラベルして、生体イメージングを行った。しか察し、ローダミンで蛍光標識した白血球や血小板し、FITC ラベルした赤血球は血栓形成後にすみやの血栓内への浸潤を検討したところ、好中球除去

かに FITC シグナルが減衰するため、また、実際によって、血小板の血栓内への浸潤が著明に抑制の赤血球の中でのラベルされた赤血球の割合が低された。遊走能を持たない血小板であるため、こいために、当初の目的である、黒い円形構造物がれは好中球が血小板の血栓内への浸潤に重要であ赤血球であることを直接的に視覚的に証明するこることが示唆される。すなわち NETs 依存性に好とは不可能であった。

中球―血小板複合体の形成が重要であることが示唆された。今後は DNAse 投与によって同様の現1-4．二光子顕微鏡への応用象が再現できるか否かを検討していく。

本モデルをこの二光子顕微鏡に応用して観察で逆に抗血小板抗体の投与による血小板除去で同きれば、より高い精度で深部まで観察可能となる。

様の検討をしたところ、ローダミンで標識した白そこで、我々は本モデルで形成された血栓を二光血球の血栓内への浸潤が抑制された。すなわち、子顕微鏡で観察した。結果、より詳細に 4 次元

血小板や白血球の浸潤は互いの存在が必須である

データとして血栓の基質化反応が観察可能であっことが示唆された。

た。引き続き、二光子顕微鏡を用いた血栓器質化機構を可視化、解明を進めていく。

2．発表（研究成果の発表）
2-1 Ryanto GRT, Musthafa A, Hara T, Emoto N.

1-5．血管老化マウスにおける血栓器質化反応の解析「高齢者では血栓の器質化反応（炎症細胞浸潤や線維化）が早いために、血栓溶解が不完全となり、Inactivating the Uninhibited: The Tale ofActivins and Inhibins in Pulmonar y Arterial
Hypertension. Int J Mol Sci. 2023; 24: 3332.
2-2 原

哲也、日本血栓止血学会学術推進委員会

器質化血栓として肺動脈に残存して CTEPH とな（SPC）シンポジウム「包括的血栓止血モデルる」という仮説に基づき、血管のみが老化した遺の実践と応用」 Novel murine in vivo imaging

伝子改変マウス（TRF-2DN マウス：血管老化マウ

model of deep venous thrombosis

第 43 回日

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2020 年度（第 52 回）助成

自然科学・工学－健康・医療：2 年助成（最終）本血栓止血学会学術集会（オンライン2021年）
2-3 原哲 也、In Vivo Imaging of Venous

Thrombus and Pulmonar y Embolism Using
Novel Murine Venous Thromboembolism
Model 国際血栓止血学会 2021（オンライン2021 年）
2-4 Takami M, Hara T, Okimoto T, Suga M,Fukuzawa K, Kiuchi K, Suehiro H, Akita T,
Takemoto M, Nakamura T, Sakai J, Yatomi A,
Nakasone K, Sonoda Y, Yamamoto K,
Takahara H, Hirata KI. Electrophysiologicaland Pathological Impact of Medium-Dose
External Carbon Ion and Proton Beam
Radiation on the Left Ventricle in an Animal
Model. J Am Heart Assoc. 2021; 10: e019687.
2-5 Suzuki M, Tanaka H, Yokota S, Hara T,
UedaY,

HirataKI.

Multiplecardiaccomplications associated with collagen disease.
J Echocardiogr. 2020; 10.1007/s12574-02000504-7.
2-6 Yoshikawa S, Hara T, Suzuki M, Fujioka M,
Taniguchi Y, Hirata KI. Imatinib Dramatically
Impr oved

Pulmonar y

Hyper tension

Caused by Pulmonar y Tumor Thrombotic
Microangiopathy （PTTM） Associated with
Metastatic Breast Cancer. Int Heart J. 2020; 61:624-628.
2-7 Hisamatsu E, Nagao M, Toh R, Irino Y, Iino T,Hara T, Tanaka H, Satomi-Kobayashi S,Ishida T, Hirata KI. Fibronectin-containing
High-Density Lipoprotein is Associated withCancer Cell Adhesion and Proliferation. Kobe J
Med Sci. 2020; 66（1）: E40-E48.