ゼンマイ類における適応的遺伝子を含むゲノム領域の解析による種分化過程の解明
Genetic architecture of speciation in Subgenus Osmunda（日本植物学会推薦）

角川代表研究者

東京大学

共同研究者

国立科学博物館 堤洋子
千絵

the University of Tokyo

Yoko KAKUGAWA_YATABE

National Museum of Nature and Science

Chie TSUTSUMIIntra-gametophytic selfing is considered to be prevented by lethal or deleterious recessive genes in several
diploid species of ferns. Doubled haploids obtained from intra-gametophytic selfing within isolated gametophytes of aputative F1 hybrid between Osmunda japonica and O. lancea were analyzed with EST_derived molecular markers, andthe distribution pattern of transmission ratio distortion (TRD) along linkage map was clarified. The segregation ofLG_11 was influenced by zygotic lethality or genotypic evaluation, and some deleterious recessive genes exist in LG_11
and reduce the viability of homozygotes with O. japonica alleles. It is very likely that a region of LG_11 wereresponsible for the low frequencies of intra-gametophytic selfing in O. japonica. Osmunda lancea is a rheophilous fern
endemic to Japan, and a locus on LG_10 appeared to be associated with stenophylly in O. lancea. In order to clarify theother adaptive characters in subgenus Osmunda, the phenological analyses and more detailed morphological comparison
were carried out. As the result, the sterile fronds of O. lancea, shorter in length and having thicker petiole, finishedfoliating earlier than those of O. japonica. Mapping of these characters are planned.

研究目的作製したのは 200 個体程度の F2 雑種および早熟性の種分化は生物多様性をうみだす原動力だと考えら

F２雑種個体の胞子由来の 10 個体程度の F3 雑種集団れる。多くの種分化研究がなされているが、陸上植に加え、前葉体（配偶体）を単離し得た 60 個体程度

物のモデル植物を用いる場合、近縁種間において繁の DoubledHaploids 個体である。

殖様式や適応的な形質、野外での生育環境および自初期の陸上植物が多様化を遂げる上で主に働いた然選択圧などを比較するのが困難である場合が多い。

生殖隔離機構についての知見は限られているが、シシダ植物はモデル植物でなくとも、配偶体が独立栄

ダ植物は陸上植物の中でも原始的な繁殖様式をもつ養で単離培養が可能なため、Doubled Haploids 個体

ため、植物が陸上に上がる前から主に生殖的隔離とが作成できるという利点があり、遺伝学的な解析がして働いていたと考えられる交配後隔離、つまり、しやすい。そこで、ゼンマイ科ゼンマイ属のゼンマ配偶体もしくは配偶子同士が互いに認識する際の接イ（Osmunda japonica）とヤシャゼンマイ（Osmunda

合前隔離や受精卵の遺伝子型によって異なる適応度lancea）においては、遺伝地図を基にマップベースをしめすなど、接合後隔離を調べるのに適した材料の研究を可能にすることを目的とした。と考えられる。繁殖様式に関わる遺伝的背景の解析

遺伝地図の作成方法としては、ヤシャゼンマイには、今後種分化研究を行う上で重要だと考えられる。

おいて EST ライブラリーを作成し、CAPS マーカーなヤシャゼンマイには一つの前葉体上で受精し胞子体どの分子マーカーを設計した。解析した人工雑種集形成を行なう自配受精能があるが、姉妹種であるゼ団は、自然 F１雑種から採取した胞子から作製した。

ンマイではほとんどみられない。ヤシャゼンマイに

おいては胞子一つから集団が形成できるため散布力全体的に生存率が低かったので、十分に成長した幼が高いと考えられ、ゼンマイにおいては高い他殖性個体を得ることが難しかった。しかし、Doubledによって集団内の遺伝的多様性が維持されているこ

Haploids から DNA を抽出し、EST ライブラリーに基とが考えられる。シダ植物においては劣性致死遺伝

づいて開発したマーカーを解析することは可能であ子が自配受精を妨げていると考えられてきたり、この結果に基づいて遺伝地図を作成している。

（Klekowski 1969）ので、このような繁殖様式の違現在までに 120 のマーカーが遺伝地図上にマッピンいに関わるゲノム領域を人工交配集団の解析によっグされている。これらのマーカーの内、４１のマーて明らかにし、ゼンマイにおいて劣性致死遺伝子のカーについては、F２雑種個体の解析も行なっている。

存在するゲノム領域を明らかにすることを目的とし構築された種間の遺伝地図上の分子マーカーの解析た。加えて、野外の雑種混生集団における遺伝子浸および人工交配集団と野外雑種集団の解析をおこな

透の解析を行ない、劣性致死遺伝子を含む領域におうことにより、自配受精能の遺伝的背景および細葉ける種間の遺伝的分化にどのような影響を与えるか形質の遺伝的背景の解析を行なった。

を解析した。

さらに、小石川植物園植栽株および埼玉県飯能市

また、ゼンマイ類には日本固有の渓流沿い植物で入間川沿いの野生集団を用いたフェノロジー調査とあるヤシャゼンマイが含まれる。渓流沿い植物とは、形態観察を行なった。この調査において、適応的な河川が増水すると冠水するところに生育する植物で形質と考えられた形質に関しては、今後遺伝地図上あり、系統的に離れた複数の分類群において葉が細にマッピングする予定である。

くなる細葉形質がみられる。葉が細くなることで、遺伝地図の精緻化のため、ゼンマイ類のゲノムに水流抵抗が軽減され、冠水時の葉のダメージが少なついて次世代シークエンス解析を行ない、新たな分くなる。陸上植物の近縁種間では、適応的な形態形子マーカーの開発も行っている。

質がはっきりしない場合がほとんどだが、渓流沿い植物であるヤシャゼンマイにおいては細葉形質が適考察応的な形質としてあげられる。細葉形質は他の分類人工交配集団の解析により、ヤシャゼンマイとゼ群の渓流沿い植物にもみられることから、冠水時のンマイの実験系における種間遺伝地図として、120水流抵抗という自然選択圧を受けることで平行進化の分子マーカー（CAPS マーカー、SSR マーカー、SNPすることが考えられる。そのため、形態観察などのマーカー）がマッピングされ、23 連鎖群を含む遺伝研究もされ（Van Steenis 1981）、ヤシャゼンマイに地図が作成された（Yatabe-Kakugawa et al. 2013）。

関しても先行研究がある（Imaichi & Kato 1992,

この種間遺伝地図を基に、自配受精能に関わるゲ

Imaichi & Kato 1993）。そこで、細葉形質に関するノム領域の解析を行なった。Doubled Haploids 集団

遺伝的背景の解析を行なった。と F2 雑種集団、配偶体集団における対立遺伝子の頻さらに、細葉形質以外に渓流沿いに生育する上で度の比較により、連鎖群 11 にゼンマイの対立遺伝子適応的な形質があるかどうか、フェノロジー調査おがホモになると生存率が著しく低下する領域がある

よび形態観察をおこない、将来のマッピング対象とことが明らかになった。この領域にゼンマイでは劣なる形質の探索を行なった。これらの総合的な解析

性致死遺伝子が存在すると考えられ、ヤシャゼンマ結果を踏まえて、種分化研究における新しい実験系

イではこの劣性致死遺伝子が失われることにより、としてヤシャゼンマイとゼンマイの実験系を立ち上

自 配 受 精 率 が 高 く な っ てい る こ と が 考 え ら れ るげることを目標とした。

（Yatabe-Kakugawa et al. 2013）。連鎖群 11 には12 の分子マーカーがマッピングされている。しかし、経過これらの多くはゼンマイとヤシャゼンマイでは遺伝

シダ植物では、配偶体を単離することによって自的分化がみられてもゼンマイの集団内には変異がな配受精が可能な場合、全ての遺伝子座がホモであるい。そこで、次世代シークエンス解析をゼンマイにDoubled Haploids を作成することができる。自然雑ついて行い、薄嚢シダ全般で使えるマーカーの開発

種オオバヤシャゼンマイの胞子から作成したを試みた。その結果、葉緑体ゲノムに関しては変異

Doubled Haploids においても形態形質を計測したが、探索が容易になった。但し、連鎖群 11 に関しては

L246 に相同性がある配列しかみつからず、次世代シどの形質の間にどの程度遺伝的な相関関係があるのークエンス解析によって得られた配列から開発したかを明らかにするため、人工交配集団を作成し形態マーカーを改めてマッピングしなおす必要がある。

形質の解析を行なった。ゼンマイ類では、比較的簡既存のマーカーを用いて京都と飯能のゼンマイと単に配偶体（前葉体）を培養できるので、F１雑種個ヤシャゼンマイの雑種混生集団および日光と飯能の体の胞子から配偶体を寒天培地上で育て、ランダムゼンマイ純群において遺伝子頻度および遺伝子型の交配させれば、F２雑種個体を得ることができる。幼解析を行なった。その結果、雑種混生集団では、連個体は始め単葉だが、頂羽片と 1 対の側羽片が独立鎖群 11 上の遺伝子座 L606 とその近傍の遺伝子座にした段階で、側羽片の基部の角度と下側最下の側脈おいて、ゼンマイとヤシャゼンマイの対立遺伝子のから分岐する支脈の数を含む、計６つの形態形質を共有の度合いが高く、ヤシャゼンマイの対立遺伝子計測した。60 個体について、１から３枚の葉（計 106の頻度が高く、かつ、ヘテロ接合度も有意に高いこ枚）を解析した結果、側羽片の基部の角度と下側最とが明らかになった。このことから、雑種混生集団

下の側脈から分岐する支脈の数の 2 形質について大では、劣性致死の効果がないヤシャゼンマイの対立きな変異がみられ、両形質間の相関係数は 0.520 で遺伝子がゼンマイに浸透しやすいことが示唆された。

あり、かなりばらつきはあるものの無相関ではない

また、日光と飯能のゼンマイ純群にも L606 とその近ことが明らかになった（Yatabe & Tsutsumi 2012）。

傍の遺伝子座において低頻度でヤシャゼンマイの対また、上側最下の側脈から分岐する支脈の数も、側立遺伝子がみられた。しかし、有意にヘテロ接合度羽片の基部の角度との間の相関係数が 0.426 と小さが高くないこととゼンマイにおける自配受精率が０いものの、無相関ではないことが示された。つまり、～２％と非常に低いことと考え合わせると、自配受側羽片の上側最下の側脈や下側最下の側脈から分岐精を妨げる効果のある対立遺伝子を含む複数の遺伝する支脈の数で、側羽片基部の角度が一義的に決ま子座が近接して存在するか、ゼンマイの中に複数のるわけではないが、これらの形質間にはある程度の劣性致死遺伝子として働く対立遺伝子が存在するか、相関があるということになる。一方で、側羽片の基のいずれかであることが考えられる。

部の角度と、葉形指数は葉ごとにみた場合は相関係以上のことから、繁殖様式に関わる劣性致死遺伝数が－0.232、個体ごとに平均した場合は－0.286 と子は近傍の遺伝子座の遺伝子頻度と遺伝子型頻度にい う よ う に 、 相 関 は あ っ て も 小 さ い （ Yatabe &影響を与え、ヘテロ接合度を高く保つだけでなく、

Tsutsumi 2012）。

種間の遺伝子浸透を促進し遺伝的分化を小さくする

L245 という遺伝子座では、F２雑種個体（60 個体）効果もあることが明らかになった。つまり、劣性致において、ゼンマイの対立遺伝子のホモ接合体は側死の効果はゼンマイ内で他殖性を維持する効果もあ羽片の基部の角度が大きく、反対にヤシャゼンマイり、それぞれの相反する効果の結果として集団内のの対立遺伝子のホモ接合体は、側羽片の基部の角度遺伝子頻度と遺伝子型頻度が決まるものと考えられが小さくなっていた。Doubled Haploids（16 個体）

る。シダ植物は様々な遺伝学的な解析における利点

でも、同じ遺伝子座において遺伝子型と側羽片の基があるにもかかわらず、ゲノムワイドな解析はほと部の角度の間に相関がみられた。但し、この遺伝子んどされてこなかった。他殖性は集団内の多様性を座における遺伝子型と、側羽片の下側最下の側脈か維持する機構として重要であり、生物多様性を理解

ら分岐する支脈の数などを含む他の計測した形質とする上で重要な知見を得ることができた。

は相関がなかった。つまり、側羽片の基部の角度にまた、人工交配集団における解析結果から、細葉影響を与える遺伝子の１つは L245 と連鎖していて、形質は複数の遺伝子座に支配されていることが明ら

現在までに L245 を含む５つのマーカーがマッピンかになったが、特に大きな効果がある遺伝子座を含グされている連鎖群上にあると考えられる。しかし、むゲノム領域が特定された。他の適応的な形態形質

この遺伝子を含むゲノム領域が側羽片の下側最下のについても相関解析や QTL マッピングを試みている。

側脈から分岐する支脈の数や葉形指数に影響を与え渓流沿い植物において一般的に適応的な形質だとているという証拠は得られておらず、ヤシャゼンマ

考えられている細葉形質の遺伝学的な解析を行なっ

イの細葉形質は複数の遺伝子によって決まるものだた。まず、小羽片基部の角度と下側最下の支脈数なと考えられる。

さらに、ゼンマイ亜属には南北アメリカとヨーロする過程で、栄養葉が短くなり、栄養葉の早期に萌ッパ、アフリカに分布するレガリスゼンマイと、カ芽・展葉する性質が進化したのではないかと考えら

ラフトから北インドに分布するゼンマイ、日本固有れる。ヤシャゼンマイとゼンマイの萌芽や展葉の性種のヤシャゼンマイが含まれるので、3 種を対象と質は埼玉県飯能市入間川沿いでも比較観察され、ヤしたフェノロジー観察と形態観察を行なった。ゼンシャゼンマイに栄養葉の早期展葉の性質があること

マイ属では胞子嚢をつける部分とつけない部分の羽が支持された。晩秋に落葉した後の根茎の観察を行片形態は完全に異なっている。レガリスゼンマイはなったところ、同じ葉長の栄養葉で比較すると、ヤ一部の葉の先端部に胞子嚢群をつける（部分的に二シャゼンマイの葉柄が一番太く、次いでゼンマイの形になる）のに対して、ゼンマイとヤシャゼンマイ葉柄が太いことが明らかになった。レガリスゼンマ

では完全に二形になる。分子系統解析の結果と併せイの葉柄が一番細く、その分、株ごとの葉の数が多て考えると、レガリスゼンマイからゼンマイとヤシいことが明らかになった。葉柄の太さは攪乱環境へャゼンマイが分岐した時に完全二形が進化したと考の適応と考えられ、この形質もレガリスゼンマイかえられる。ヤシャゼンマイは渓流沿い植物であり、らゼンマイ、ゼンマイからヤシャゼンマイというよ渓流帯で冠水時に水流抵抗に耐えるために羽片や小うに徐々に強い攪乱を受ける環境に侵出する過程で羽片が細くなっている。しかし、その他にも渓流帯獲得したのではないかと考えられた。このように、の生育環境に進出・適応する過程で獲得した形質や、ヤシャゼンマイの渓流帯への適応を考える上でも、ゼンマイの時点で前適応していた形質があると考え葉柄形質や根茎形質、フェノロジー形質は細葉形質られる。そこで、本研究ではゼンマイ類の展葉フェと同等に重要だと考えられ、今後さらに詳細な研究ノロジーや葉柄形態を調べた。と遺伝地図上へのマッピングが必要である。

小石川植物園では、レガリスゼンマイ（北米産）

最後に、本研究では、今後の種分化研究のため、とゼンマイ、ヤシャゼンマイの 3 種類が同じ場所にゼンマイ類における遺伝地図の精緻化と野外集団を植えられている。この 3 株を使って展葉フェノロジ対象としても解析可能な分子マーカーの開発を試みーを調べた。その結果、レガリスゼンマイの胞子葉た。ヤシャゼンマイとゼンマイのゲノムの次世代シは 3 週間ほどかけて 5 月初旬に展葉が終わるが、展ークエンス解析を行ない、混合アセンブルの結果、葉後 1 週間ほどしないと胞子が散り始めなかった。

いままでのところ、10830 配列についてマーカー作

その後、2 週間ほど時期をずらして栄養葉が展葉し成が可能であることが明らかになった。

た。ゼンマイの胞子葉は 4 月中旬から 4 月末にかけて展葉し、展葉中に胞子が散布された。やはり、2研究の発表

週間ほど時期をずらして栄養葉が展葉した。ヤシャ口頭発表

ゼンマイの胞子葉は 3 月下旬には展葉が始まり、4１．角川洋子：渓流沿い植物ヤシャゼンマイにみら

月中旬に展葉が終わると、胞子が散布された。このれる適応的形質の遺伝的背景の解析、日本植物ころには、一部の栄養葉は展葉がおわり、すべての学会第 76 回大会

2012

9

栄養葉の萌芽と展葉が 4 月末には終わった。レガリ

２．角川洋子：渓流沿い植物ヤシャゼンマイにおけスゼンマイとゼンマイを比べると、胞子葉の展葉がる細葉形質の遺伝学的解析、日本生態学会第 60始まる時期に大きな差はないが、ゼンマイの胞子葉回大会

2012

3は栄養葉の半分程度しかなく、胞子散布の始まるま３．水谷有希、角川洋子、邑田仁：ゼンマイ類の野でにかかる期間が 3 週間ほど短い。このことから、外集団における遺伝子型多型の解析、日本植物

ゼンマイは、主に湿地に生育するレガリスゼンマイ

分類学会第 12 回大会

2012

3から、林床の撹乱環境で繁殖できるように適応して４．角川（谷田辺）洋子：渓流沿い植物ヤシャゼ

完全二形を獲得し種分化した可能性がある。一方で、ンマイにおける適応的形質の遺伝的背景、日ヤシャゼンマイでは、胞子葉の展葉や胞子の散布が本植物学会第 75 回大会 2011 9

終了する時期はゼンマイとほとんど変わらないが、胞子葉と栄養葉の長さにあまり差がなく、栄養葉の展葉も胞子葉とほぼ同時期に終わる。渓流帯に進出

５．角川（谷田辺）洋子：シダ植物を材料とした種分化研究 (奨励賞受賞講演)、日本植物学会
第 75 回大会 2011 9６．角川（谷田辺）洋子、堤千絵、加藤雅啓：ゼンマイ類における展葉フェノロジーと種分化、日本植物分類学会第 11 回大会 2012 3
誌上発表
1.

Y. Yatabe-Kakugawa, C. Tsutsumi, Y. Hirayama,
S.

Tsuneki,N.

MurakamiandM.

Kato:

Transmission ratio distortion of molecularmarkers in a doubled haploid population
originated from a natural hybrid between

Osmunda japonica and O. lancea. J. Plant Res.
126, 469-482, 20132.

角 川 洋 子 :シ ダ 植 物 に お け る 種 分 化 , 新 しい 植物 分類 学 II 94－ 105, 20123.

角川 (谷田辺) 洋子:渓流沿い植物ヤシャゼン
マイにおける適応的形質の遺伝的背景, Plant
Morphology 24, 51-55, 2012

4.

C. Tsutsumi, Y. Hirayama, M. Kato, Y.
Yatabe_Kakugawa and S.-Z Shang: Molecularevidence on the origin of Osmunda Xmildei(Osmundaceae) Amer. Fern J. 102, 55-68, 2012

5.

C. Tsutsumi, S. Matsumoto, Y.
Yatabe-Kakugawa, Y. Hirayama and M. Kato: A
new allotetraploid species of Osmunda(Osmundaceae). Syst. Bot. 36, 836-844, 2011