［II］組織・器官幹細胞：臨床応用への基盤開発（1）●幹細胞と細胞療法

4．臓器幹細胞純化の可能性
松崎

有未＊，Richard C. Mulligan＊＊

近年，いくつかのグループから造血幹細胞，あるいは造血器官に由来しない未熟細胞の分化の多能性についての報告がなされている．我々のグループでは最近，骨格筋由来の未熟な細胞を同定し，それらが骨髄移植後，骨格筋ばかりでなく血液細胞にも分化しうること，また逆に骨髄由来の未熟細胞群が血液細胞と骨格筋双方に分化しうることを示した．
このような，幹細胞分化の「可塑性」は骨髄移植の新たな応用の可能性を示し，さらに遺伝子治療などと組み合わせることにより，先天的あるいは後天的遺伝子疾患治療への新たな展開を予想させる．つまり，骨髄移植という治療によって，血液ばかりではなく疾病の原因臓器そのものを再生する可能性がでてきたのである．筋萎縮性疾患のような全身性疾患に対して細胞あるいは欠損遺伝子を組織的に導入する場合など
では，このような治療法が特に効果的であると考えられる．
今回我々は，当研究室で発見し，現在広く使用され始めた Hoechst 33342 という色素を用いた造血および様々な臓器からの幹細胞純化の試みとその可能性について主に報告する．Hoechst 33342 は DNA 結合色素であり，UV レーザーにより励起し，450675（nm）という 2 つの波長の蛍光を発するという際だった特徴を持つ．本研究室ではすでにマウス骨髄細胞を用い， Hoechst 33342 の特徴ある染色パターン中， 特に，両波長を暗く発現している（あるいは全く発現していない）細胞集団が高い幹細胞活性を持つことをあきらかにし，その細胞分画に対し，SP 細胞（side population）と名付けている．また，Lou Kunkel らとの共同研究により骨髄細胞と骨格筋細胞に対するHoechst 染色では，由来の SP 細胞がそれぞれ固有の臓器ばかりでなく，互いの臓器細胞へと分化しうることを示した．
その後の解析により，この SP 細胞は骨髄以外では骨格筋ばかりでなく脳，肝，膵，腎，心臓など，これまでに調べた全ての組織の存在しており，さらにはマウス，ヒト，サル，ブタなど，全てのほ乳類に共通して存在していることがわかってきている．現
在，これらの臓器 SP 細胞がどのような分化能を持つのか，それぞれに対し in vivo，in vitro 両面からの解析を行い，それぞれの臓器固有の幹細胞としての性質を持つか否かはもちろん，あるいはそれ以外の臓器への分化の可能性，つまり分化の可塑性について解析中である．

New approach for organ specific stem cell purification study
YUMI MATSUZAKI Division of Molecular Medicine, Children s Hospital, Harvard Medical School
まつざき・ゆみ：Hervard Medical School, Children s Hospital,
Division of Molecular Medicine
Research Fellow．平成９年筑 波
大学大学院医学研究科修了．平成11年現職．主研究領域／臓器幹細胞分離法の樹立．
＊＊Richard C . Mulligan : Hervard Medical School, Children sHospital, Division of MolecularMedicine.
＊Key words

Hoechst 33342
SP 細胞
造血幹細胞
組織幹細胞

幹細胞と細胞療法 67

幹細胞に関する研究はこれまで主として骨spective な研究が可能となった経緯がある．

髄に存在する造血幹細胞研究を中心に行われ現在最も純化されていると思われている骨てきたが，それらの仕事は主に retrospective

髄幹細胞は，中内ら1）によって報告された c-なものであり，FACS と monoclonal 抗体の開Kit 陽性，Sca-1 陽性，CD 34 陰性，かつ line-発が breakthrough となって，非常に純度の高age marker 陰性という細胞表面抗原の発現い幹細胞を分離することが可能となり，per-パターンを持つものであろう，すでに singlecell レベルでの実験がなされ，1 個の細胞からすべての lineage の血球細胞が分化し，2 年以上にわたり造血系が維持されることが示されている．
その一方，当研究室では Hoechst 33342 とHoechst-Blue（450nm）

いう，DNA に binding する色素を使った stem
cell purification 法を用い，抗体を使用しない新たな幹細胞純化法について研究を行っている．
Hoechst 33342 は，bisbenzimid というクラスに属する蛍光色素で，細胞透過性が非常にHoechst-Red（675nm）

高く，そのため生きた細胞に細胞を固定する
図1

Emission of Hoechst 33342 at TwoWavelengths

ことなく取り込まれる．また，単一の色素でありながら UV で excite された時に，405 nm

Sca-1＋VerCD34

図2

68 第 117 回日本医学会シンポジウム

Sca-1 CD 34 Expression in SP Cells

3 weeks

12 weeks

1009080706050
4030
2010010

図3100
R1200100

1000
R2200

2000
R3Engraftment Activity of BM SP Sub-populations

LiverKidney

Pancreas＋Ver

Hoechst-BlueBrain

Hoechst-Red

図4

Organ SP Cells

および 600 nm の蛍光を発し，通常の Cell Cy-

は Linear な細胞集団からやや横にずれて突cle アッセイで見られる G 0 G 1 および S G

き出たパターンを示すことから Side Popula-

2 の分画の他に，G 0 G 1 よりもさらに暗い部

tion（以下 SP 細胞）と名付けられた（図 1）．



分に形態的に特徴のある Hoechst 陰性の 細胞集団を観察することができる．この細胞群

この SP 細胞分画は verapamil などの MDR
幹細胞と細胞療法 69

8 weeks

12 weeks

12 weeks

図5

Detection of Donor Nuclei in Dystrophin-Positive Myofibers after Bone
Marrow Transplantation

分子阻害剤を添加後完全に消失することかされていることが明らかになった（図 2，3）．

ら，MDR 様の分子によって細胞内から色素がすなわち，Hoechst の蛍光強度が低ければ汲み出されることにより，G 0 G 1 よりもさ低いほど未熟な細胞であるということは，「未らに暗い部分を生じせしめるものと考えられ熟な細胞ほど蛍光色素を細胞外に汲み出す能ている．

力がより高い」ことを示唆すると考えられる．



また，SP 細胞はマウス骨髄のみならず，ヒ骨髄中に存在する最も未熟な細胞はこの

ト，サル，ブタ，犬，あるいはゼブラフィッ

2）

SP 細胞中に存在することはすでに報告した

シュなど，これまでに調べた全ての種におけが，その後，CD 34 と Sca-1 抗体とを組み合わる造血組織でほぼ同じ分画が存在しているこ

せ， in vivo での長期骨髄再構築能を調べたとから，未熟幹細胞における「色素の汲み出ところ，最も未熟な細胞は CD 34 陰性，Sca-し」という機能は種を越えた共通の性質であ

1 陽性，かつ Hoechst が最も暗い部分に濃縮ると考えられる．

70 第 117 回日本医学会シンポジウム

その考えをさらに推し進め，「骨髄以外の組織」における幹細胞も同様な性質をもつのではないかという発想のもと，組織細胞を用いて SP 細胞の有無を調べた．その結果，それぞれに独特のプロフィールを持つものの，調べ

low negative hematopoietic stem cell. Science 1996 ;273 : 242―245.
2）Goodell MA, Brose K, Paradis G, et al. : Isolation andfunctional properties of murine hematopoietic stem
cells that are replicating in vivo . J Exp Med 1996 ;
183 : 1797―1806.

た限りにおいて全ての組織で骨髄中の SP 細胞と同等の分画が存在することが明らかになった（図 4）．また，組織中の SP 細胞の頻度質は ほ ぼ 骨 髄 SP 細 胞 と 同 等 の 0.5％ 前 後 で疑応答あった．
（平井） それではご質問をお願いしま座長

機能解析の結果としては，すでに報告した
ように筋肉 SP 細胞を MDX という筋ジストす．
中尾（日本医学会幹事） 珍しくて面白真ロフィーモデルマウスに移植することによい色素のようですが，この Hoechst 33342 のり，1）Dystrofin 陽性の筋細胞を再構築する

構造式と，物理化学的な性質と，細胞のどこことができる，2）致死量放射線照射マウスが染まっているのかを教えていただきたいとへの静脈注射による移植後，血液細胞の再構思います．

築が見られる，の 2 点が観察された（図 5）．

松崎bind す る 場 所 は，DNA の poly ATの部分です．
現在，他の組織（脳，肝，膵，腎）に存在

中尾DNA だけですか．

する SP 細胞が，それぞれ固有の組織細胞へ松崎

そうです．そこに bind して染まると分化することができるか，あるいは他の臓器への分化が可能か否かについて， in vivo，いうことです．
中尾

それは単体というか，monomer の形

in vitro 両面からのアプローチにより解析をで染まっているのか，着いているのか，それ進めている．とも何か aggregation を起こしているのか，polymer の形でそうなっているのか，そのへ

もしも組織 SP 細胞がそれぞれの組織を再構築する機能を有しているとするならば，んはいかがでしょうか．
松崎

お恥ずかしい話ですが，そういうメMDR 様の分子による細胞内からの色素の汲

カニズムに関しては全然研究していないとい

み出しは全幹細胞に共通する性質であるというか，調べていないのです．染まればよいとうことが証明でき，それにより組織幹細胞純いうか，あまり物にこだわらない研究室なも化の汎用的な方法を提供するとともに，汲みので．

出しに関与する全幹細胞に共通する機能分子

中尾

細胞膜を通過するわけですから，その同定などを含む今後の幹細胞研究への新たれ程大きいわけはありませんね．しかも水溶なる進展が期待される．

性ですね．
松崎

〔文献〕
1）Osawa M, Hanada K, Hamada H, et al . : Long-term
lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-

molecular weight もそれほど大きく

あ り ま せ ん．完 全 に chemical で molecularweight は確か 120 前後だと思います．
中尾

色素としては最小の方ですね．
幹細胞と細胞療法 71

松崎ですから多分 permeability が高いの

原先生たちがや は り 骨 髄 か ら progenitor をだと思います．molecular weight だけでいえとってきて，血管の再内皮化を見ているのでるかどうかわかりませんが．

すが，実際には，contribution 自体は非常に少中尾

もしよろしかったら構造式を教えていただきたいと思います．
座長

関連しますが，DNA に結合する色素の局在は核ですね．
松崎

DNA の poly（A）と（T）の部分を認識するということしかわかっていません．
座長

簡単なことをいいますと，その結合が弱いものが未熟な細胞であるということでてもなかなか population が上げられな い のですが，先生の今日のデータを見ますと，ずいぶん SP 由来の細胞が行っていますね．これは例えば実験系の違いなのか，それともそういう population を選んでくると，かなり高率に再内皮化を実現できるのか，いかがでしょうか．
松崎

すね．
松崎

ないというデータです．例えば VEGF を入れtotal bone marrow で も あ の 程 度 のというよりは，efflux の問題だと思

repopulation が見られることがあります．たう の で す．immature な 細 胞 ほ ど multi dragだし入れた細胞の数が全然違いますので，やresistors gene というか，MDR 様の分子がた

はり enrich はされていると思います．SP 細

くさん出ている，もしくは汲み出す力が強い胞の中に proliferation 能の非常に高い細胞がと考えた方がよいと思います．

enrich されているというふうに考えてよろし

座長

MDR の発現で細胞を採ってきたという理解でよろしいですか．
浅島

いのではないかと思いますが．
栗原

Isner のところでも，いかに効率を上誠（東京大） そうしますと，例えばげるかということで，多分今一番苦労していnewborn と adult の場合に，大ざっぱにいっると思うので，非常に興味を持って拝見しまて SP は ど の く ら い newborn の 方 に 多 い とした．

か，そういうことはいえますか．
松崎（熊本大） 非常に面白いお話でし須田年生

調べた限りでは，adult の同じ organたが，実際に実験する時に，筋肉にしても腎と比べた場合，newborn の方が大体 10 倍ぐ

臓にしても，バラバラにするのは大変なことらいパーセンテージが高いです．

だと思います．これは何かコツのようなもの

浅島

そ れ か ら 例 え ば heart や liver で 出ていたものを，この場でいえば SP だけの問があるのでしょうか．
松崎

それがそれぞれの collaborator の一題として一応比べていますが，質的に変化し番の腕の見せどころで，実は私自身は全然得る potency は今どのあたりまで調べられてやっていないのです．それぞれの organ についますか．

いてのスペシャリストがいますので，これは松崎

それが一番興味のあるところです始めてから半年以上たつのですが，毎回いろが，これからすべての organ で，SP について，いろ工夫して，どうすれば効率よくばらすこ

それぞれの organ への分化能を調べて行かなとができるか，あと viability をどれだけ保つければならないところですので，まだ何ともかという方法に 関 し て は，そ れ ぞ れ の col-お答えのしようがありません．

laborator の成果と思います．

（熊 本 大） 血 管 の 仕 事 を ず っ と
栗原裕基

須田

切片を切って，それをレーザーでスやってきましたので，血管に非常に興味がキャンして，腎の stem cell はどこにあるといあって見ていましたが，Isner のところで，浅うような出し方は試みられているのですか．

72 第 117 回日本医学会シンポジウム

松崎

はい．cortex の方です．medulla の方

matopoiesis を reconstitute させて，それ由来は全部捨てるようにして初めて FACS sortingのものが muscle に出るかどうか，そのようの効率が非常によくなりました．

な形で実験ができるかなと考えて，今その準（筑 波 大） 先 生 の と こ ろ の ラ ボ
中内啓光

も，私どものところも，多分同じようなこと備をしているところです．ですからまだお答えはできません．

をやっていると思うのですが，一番の興味は，（大阪大） 今のご質問に関連する
岡野栄之

各臓器にある SP 細胞が，本当は同一なのか，のですが，いわゆる brain からとった 0.4％ のそれともそれぞれ違うのか，そのあたりが一もののうち，sorting したもので，SP fraction番大事だと思うのです．その点についてはいで，neurosphere をどのくらいの割合で作るかがですか．

かということと，もう一つ，申しわけありま松崎

それは意図的に省いたのですが，せんが，あれは in vivo repopulation でも何でstreight な デ ー タ が 出 て い る の は muscle ともなくて，集めてきた細胞が単に生着していbone marrow との共通点なのです．それぞれるというだけだと思うのですが，in vivo re-muscle の SP 細胞は muscle に行き，かつ he-population だ と い う，何 か 根 拠 は あ る の で

matopoiesis も あ り ま す．bone marrow の 方しょうか．

も，muscle にも行き，血球細胞も出てきます．

松崎

それぞれの population に共通の細胞が あ るかといわれますと実はあるのです．しかも共細胞の数が全然違いますから，少な

くとも proliferation はしています．
岡野

proliferation はしているのですね．

通な CD 45 陽性で，30 は陰性，c-kit 陽性，Sca-

それは in vivo で BrdU を取り込んで，posi-1 陽性で，完全に hematopoietic stem cell と同tive になっているということですか．

じ fraction が muscle の中にあるのです．それ松崎そこまでは確認していません．ただは SP 細胞の中のほんの一部ですが，そこに細胞の数自体が，injection した細胞の 10 倍以

しか activity がないのです．つい最近そこま上に増えています．

でわかってきました．ですから他の organ に岡野

そうであればそうですね．骨髄の方関しても，もしかすると共通のものがあるのの話で glia 系の marker を出すということでではないかと考えて今実験をすすめているとすが，先生は side population で採ってきた細ころです．

胞 の 中 で，い わ ゆ る mesenchymal stem cell

峯石（国立がんセンター） 今のことに真が入っている可能性はあるとお考えですか．

関係した質問ですが，例えば hematopoietic

本当にナイーブな質問で申しわけありません

stem cell などは，非常に微量かもしれません

が．

が，血流に乗ってすべての臓器を回っている松崎

mesenchymal stem の培養系の方 にと思うのです．ですからこのいろいろな臓器向けて，今それを確認しているところです．の SP 細胞というのは，それを切り出してくそれ以外にどのようにすれば detect できる

る途中の血管床に引っかかっている，実は全かという assay 系がな か な か 思 い つ か な く部 hematopoietic stem cell 由来の共通したもて，確認できていません．のだという可能性はありませんでしょうか．
松崎岡野

mesenchymal stem cell であれば，結それは何ともいえないですが，可能局あれは glia になるという有名な論文がたく性は当然あると思います．それを区別するにさんありますから，結局 hematopoietic になは，例えばやはり single cell sorting して，he-るかどうか convince するためには，やはりそ幹細胞と細胞療法 73

こをきっちりやっていただけたら非常に嬉しりについてはどのような議論がされています

いと思います．

か．

松崎

purify してき た も の で こ れ が mes-enchymal stem cell だ と い う definition が なかなかないのですね．
岡野それからもう一つ，最近多くの論文

松崎

私としては単なるマーカーとしてしか考えていないのですが．
岡野そうですか．

松崎

Y probe でもやっていて，同じデーを見て常々不思議に思っているのですが，タが出ています．donor は同じです．雄のマウ

stem cell が trans differentiation し た と い う

スの SP 細胞を雌に移植して，ノーマルで確

論文は，皆 ROSA mouse を使っていますね．

認しています．

あの locus は ES 細胞由来の動物ですし，何かあるのかなと思っているのですが，そのあた

74 第 117 回日本医学会シンポジウム

座長

どうもありがとうございました．