本日の講演
細胞や食品の冷凍・凍結挙動とその制御物質について

1．細胞における冷凍時の挙動について
２．食品における冷凍時の損傷に いて
２．食品における冷凍時の損傷について

関西大学 化学生命
化学生命工学部
学部
生命・生物工学科
河原秀久

３．氷結晶制御物質とは結 制御物質
４．不凍タンパク質とその機能細胞における冷凍損傷について
完全な細胞
細胞内凍結

細胞外凍結
急速冷凍

超高速冷凍

細胞における冷凍時の挙動について

Microcrystal of
intracellular ice

緩慢凍結

Deadly damage

Packing effects

Solution effects

膜のダメージ

細胞外に氷形成

Salt effects
or
最小ボリューム

緩慢解凍

細胞の形質転換

高生存率

・・
・・・

酵素の失活

再結晶化現象損傷；凍結温度で相違

Fujikawa S.: Trans of the JAR,14,11-25 (1987)

細胞保存方法

ポリリジンコハク酸誘導体を用いたガラス化法
によるiPS細胞の冷凍保存

スロークーリング法；卵細胞の中にある水分を脱水することが必要になり、凍結する前の胚をアルコールなどを含んだ凍結保護剤に浸します。 この際いきなり高濃度の保護剤に浸けるのではなく少しずつ濃度を上げていきます。
げ凍結保 剤
凍結保護剤に浸された胚は細いストローに移された後、プログラムフリーザーで、ゆっくりと凍細後 プ グザ凍結します。 凍結胚は液体窒素を満たしたタンク内で長期にわたる保存が可能です。 解凍する場合は、ストローを取り出して暖め、凍結したときの逆のステップで培養液に戻します。 良好な胚を凍結解凍した場合７５－８０％の胚が生存し、生存胚あたりの妊娠率は新鮮胚と同様です。

ガラス化法；近年、プログラムフリーザーを用いない新たな凍結方法としてVitrification法（ガラス化法）が開発され、現在はスロークーリング法に代わって凍結法の主流になっている。ガラス化法では細胞内に氷を作らないように高濃度の溶液に浸し、一気に凍結します。この方法の利点は今まで凍結が困難であった胚盤胞や未受精卵の凍結が可能になった。

玄丞烋 再生医科学研究所准教授ら
京都大学ホームページ； http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/news_data/h/h1/news6/2010/101201_3.htm

食品の低温保存および解凍方法
低温保存の対象となる食品の分類そのままでは冷凍保存できない。

生鮮食品
植物性食品; 農産物(野菜類, 果実類）

ブランチング（軽く加熱する)。ok果実はシ
果実はシロップ付け。
プ付け

食品における冷凍時の損傷について

脱 凍結
脱水凍結

動物性食品; 水産物(魚介類） 畜産物(食肉類, 食鳥類, 乳, 卵)
短期は冷蔵。長期は-18℃以下の好ましい魚介類の一部は凍結保存できないものもある。

加工食品

植物性加工食品

動物性加工食品

複合調理加工食品

目的とする貯蔵期間によって貯蔵温度を設定する。

凍結食品の解凍
原料形態の凍結食品；
原料形態
凍結食品； 半解凍すなわち中半解凍すなわち中心温度が-5℃で表面はできるだけ0℃
温度
表面きる け調理冷凍食品； 食用可能な状態まで昇温させる。

水の凍結曲線と氷成長速度

冷凍保存中の食品の物理的変化「凍結焼け」凍 焼 」

1.. 食品の乾燥
2. すき間氷
水氷

低温

すき間におびただしい氷

水分が包装材の内面に移動

3. 氷結晶の成長

融解

「油焼け」
焼 」

高温

氷の再結晶化
低温

高温

低温

凝固
凝固

昇華
昇華

凝縮

水蒸気
時間経過に0分
凍結率と濃縮率

凍結率は結合水を除いた凍結しうる水の割りあい

AFP-20℃で90％（凍結直後)-20 ℃で93％（凍結貯蔵時）

50μg/ml

食品冷凍の化学的問題
タンパク質の変化； タンパク質は食品の骨格、タンパク質は食品の骨格高い水和性により食品固有の口ざわり、歯ごたえなど。
変性により、生肉では軟化、スポンジ化が起こり、ドリップ。

脂肪の変化； 魚や畜肉の冷凍では、異臭発生や油焼けと呼ばれる脂質の変化。
脂肪の変化
品質劣化

10分

30分

食品冷凍の栄養学的問題
タンパク質； タンパク質の一部は保水性を失い、変性する。
起こしやすい例； タラ
起こしにくい例； タコ、イカ

糖質; 単糖や二糖類は問題ない。デンプンの老化が進む。

糖質の変化； 加熱調理済の冷凍食品にとって、デンプンの老化。
急速な冷凍処理。

脂質； 脂質の一部リパーゼの作用で加水分解し、遊離脂肪酸が増加、酸化しやすくなる。

色素の変化； ヘム色素（カツオやマグロの赤色）ミオグロビン 変色
カロチノイド類 退色は酸化
クロロフィルル 緑色 冷凍保存が高い
ポリフェノール類 アントシアニン アルカリ条件下で退色

栄養素の変化； 冷凍時には変化がない。解凍時のドリップに流出してしまう。

ビタミン類； ブランチング処理により水溶性ビタミン(VC)の溶出と加熱酸化
凍結保存中の酸化による変化
酸
解凍時におけるドリップへの溶出、加熱による溶出と酸化

ミネラル； ブランチング処理により一部（カリウム、ナトリウム）が損失
ブランチング処理により 部（カリウム ナトリウム）が損失

高温

冷凍食品の買い求めから持ち帰りまでのポイント-18℃以下のもの; ショウケースの温度計を確認する。
ロードライン以下のもの;
ロドライン以下のもの; ロロードライン以上に積み上げられたものは品質劣化
ドライン以上に積み上げられたものは品質劣化しているかも。
ガッチリと凍っているもの

包装のしっかりしているもの

乾燥がすすん乾燥がすすんでいないもの
な も

包装 内側に霜 少な も包装の内側に霜の少ないもの
昇華が起きて氷形成している。

割れたり、固まりになったりしていないもの
きっちりと表示しているもの; 名称・原材料名・内容量・賞味期限・保存方法・製造者名など

氷結晶制御物質とは認定証マークのついているもの
持ち帰り; 溶けないように工夫する。 例えば、最後に買う。
ドライアイスの利用や断熱性のある容器に入れる

直接に日光をあてないバックの中央に入れる。
包装紙などで二重、三重に厚く包む。

家では;; -18℃以下に保てるフリーザーに入れる（2～3ヶ月が目安）
家
以下 保 る リ ザ入れる（ヶ月 目安）

生物の耐凍戦略

氷形成に関わる化合物

地球上の生物圏の80％近くが低温環境下に晒される
普遍的水
過冷却促進

氷核

タンパク質・多糖タンパク質 促進

氷核
人間-暖かいねぐら、厚着異物

鳥-越冬 移動不凍

哺乳類 体毛を増加 冬眠
哺乳類-体毛を増加、冬眠
昆虫-土中に潜る昆虫
土中に潜る 冬眠
糖・糖アルコール蓄積
氷結晶制御物質阻害

両性類 土中に潜る 冬眠
両性類-土中に潜る
糖・糖アルコール蓄積

微小なタンパク質 阻害
成長阻害
形態変化
再結晶化抑制凍結保護
タンパク質・多糖

植物-タンパク質、糖・糖アルコール蓄積、氷結晶制御物質
微生物-タンパク質・糖アルコール蓄積、氷結晶制御物質

氷

未凍結状態
細胞内外

氷阻害
昇華

細胞内 阻害 細胞内
タンパク質
タンパク質

変性

未変性

氷結晶制御物質の過冷却曲線
AB

C

C l
Cool
Heat

meltingli

meltingli
Time

0℃

熱ヒステレシス (℃)

抗氷核活性 (℃)

freezing

不凍タンパク質とその機能

TH

ANA

A : AgI + 過冷却促進物質溶液
B : AgI + Distilled water (1 atomospheric pressure)
C : AgI + 不凍タンパク質溶液

不凍タンパク質とは魚由来不凍タンパク質(AFP)と不凍糖タ
不凍糖タンパク質(AFGP)ク質()

南極ノトセニア
不凍糖タンパク質発見。
20 mg/mlタンパク質で、-1.9℃凍結点
タ パク質
℃凍結点

Characteristic AFGP TypeⅠAFP
T peⅠAFPTypeⅡA
T peⅡA TypeⅢAFP
T peⅢAFPTypeⅣA
T peⅣAFPFP 12000
2600-33000
3300-4500
11000-24000
6500
Mass (Da)Key Properties
Disaccharide

Alanine-rich
α-helix

Disulfide bonded

β-sandwich
βsandwich

Alanine richherical bundle

Representat
ive
AntarcticStructure
Natural Source
nototheniods

Right-eyed,
flouders

Sea raven,
Smelt, herringg

Ocean pout,
Wolfish, eel ppout

Longhorn,
sculpinp

AAT repeat

Pleugramma antarcticum

海水温度の凍結点より体液のComp. Biochem. Physiol. B., 76, 545-548 (1983)
Comp Biochem.
Comp.
Biochem Physiol.
Physiol C,C 111,111 121-129
121 129 (1995)

凍結温度を低下させる

存在する生物種

不凍糖タンパク質

魚類、植物、甲虫の幼虫、昆虫、キノコ、カビ、地衣類、酵母、細菌など（Antifreeze glycoprotein)

昆虫の幼虫由来熱ヒステレシスタンパク質

植物由来不凍タンパク質の存在と構造存在が明らかにされている植物
アブラナ科

イネ科

ガーリックマスタード
フユガラシ
菜の花
芽キャベツ・キャベツ
芽キャ
ツ キャ ツオオバコ科

ブナ科

ハラオオバコ
オニオオバコ

セリ科

ズルカマラ
ジャガイモ

ユリ科

キク科

ヤナギ科

ヤブカンゾウ

コントンウッド
ントンウッドシオン属
セイヨウタンポポ

Thecodiplosis japonensis

Tenebrio molitor (②)

Choristoneura fumiferana (③)

マツバノタマバエ

ゴミムシダマシ

トウヒシントメハマキガ

幼虫

Cucujus clavipes

Oncopeltus fasciatus

ヒラタムシ

ナガカメムシ

幼虫

キョウチクトウ科
ヒメツルニチニチソウ

スミレ科
スミレ

起源

タイプ

Mealworm (②)

8.7

8.4

9.0

Th + Cys
Thr
C richi hTh + Cys
Thr
C richi h

S +CSerCys richi h

12 or 13 AA 繰り返し

12 AA 繰り返し

（活性化因子）

二次構造

β-シート？

β-シート？

β-シート + コイル

相同タンパク質

Trypsin inhibitor ?

Trypsin inhibitor ?

Trypsin inhibitor ?

不凍タンパク質の３つの基本活性

分子量

他の機能

熱ヒステレシス値(TH ℃)

局在10

水Arctic rhizosphereLipoglycoprotein

164,000

INA

Marinomonas

Antarctic saline lakeProtein

60,000RIA

Primoryensis*外
内Aタイプ
cooling

Moraxella sp.
Flavobacterium

Antarctic soil
Antarctic soil

Lipoprotein
Protein

80,00052,00060,000RIA

xanthum

Colwellia spp **.

Antarctic seaProtein* ; Garnham CP et al, Bichem J., 411, 171-180 (2008).
** ; Raymond JA et al, FEMS Microbiol. Ecol., 61, 214-221 (2007).
赤字は、関西大学微生物工学研究室で研究開発したもの。

26,000,RIA

外外

1℃/ min

熱ヒス
テレシス値
（℃)

5

Teemperature (℃℃)

Pseudomonas putida

ProteinSpruce budworm (③)一次構造次構造

氷結晶の形態変化

fluorescens

Rhagium inquisitor
ハナカマキリ幼虫

分子量(kDa)

細菌由来の不凍タンパク質

Antarctic soil

ビロウドムシキチナーゼタイプ
β-1,3-グルカナーゼタイプ
β1 3 グルカナーゼタイプ
ソーマチン様タンパク質タイプ
ポリガラクチポリガラクチュロナーゼインヒビタータイプ
ナ ゼイン
タ タイプ

Pseudomonas

幼虫

Dendroides canadensis (①)

幼虫Fire beetle (①）

なっているタイプ

ナデシコ科

種

幼虫

構造として明らかに

レンギョウ

ハコベ

ナス科

ハツユキソウ

ケシ科

コマクサ属

モクセイ科

ホワイトオーク
ホワイトオ
ク

トウダイグサ科

ニンジン

カラス麦
冬ライ麦
四条大麦
条大麦
冬小麦
スズメノカタビラ
ライ小麦
ナガハグサ
ホソムギ
コスズメノチャヒキ

融解温度 － 凍結温度 (℃)

0-510μm径の氷結晶; 蒸留水; 不凍タンパク質

Bタイプ

溶液-1010

内051015Time (min)外
氷の再結晶化抑制‐6℃で維持0 min
buffer0 min

30 minAFP
溶液

30 min幼虫

不凍タンパク質の氷結晶への結合状態

不凍タンパク質の名称と関連物質

c 軸
c-軸

氷への結合

不凍タンパク質
不凍タンパク質

水が凍らないというイメージになる

基盤面

形態変化

a-軸
軸

-9℃まで 溶液中の氷結晶が成長しない-9℃まで、溶液中の氷結晶が成長しない。

凍結温度低下氷形態を変化させる能力

Ice structuring protein

再結晶化抑制熱ヒステレシスが強いもの

Thermal hysteresis protein

氷に結合する能力

Ice active protein

再結晶化活性 み 能力
再結晶化活性のみの能力

Ice recrystallization-inhibiting protei(不凍タンパク質ではない？）

a-軸

不凍タンパク質の機能とその応用

冷凍技術の現状
生産ラインなど

AFPによる最大熱ヒステレシス値；9℃水分子の氷結晶への結合阻止の結合阻止

プリズム面

a-軸

不凍タンパク質 Antifreeze
不凍タンパク質；A tifproteint i (AFP)

急速冷凍機ですばやく冷凍（最大氷結晶生成帯-1～-5℃）

機能

冷凍保存 80℃以下
冷凍保存；-80℃以下
氷結晶の形態制御

流通ライン
店頭販売

冷凍庫 ２０℃以上
冷凍庫；-２０℃以上,-10℃以上（一般家庭）
鮮肉など100％凍結していない

家庭冷凍庫
再結晶化発生（解凍時におきやすい）

解凍後、大量のドリップ

組織破壊期待できる応用
ドリップの減少、冷菓の食感、細胞・食品などの冷凍保存

氷結晶の再結晶化抑制

食材・冷凍食品の高品質保存
細胞の長期保存凍結温度の低下

霜発生阻害効果細胞などのチルド状態での保存

低温下での膜の安定化

食品などのチルド状態での保存北米地域で販売されている不凍タンパク質入りアイスクリーム

不凍タンパク質の市場性の予測（北米地域）
潜在的年収入全市場（百万ドル）（百万ドル）

遺伝子導入発現魚

40020

大豆

500

30～50

2,000

100

植物

コーヒー
フルーツ

20010

柑橘類

360

18

細胞・組織・臓器の低温、凍結保存

4,000

150～200

血小板凍結保存

1 000
1,000

75～100凍結外科手術-ユニリーバ

魚由来タイプIII不凍タンパク質の遺伝子を酵母に導入し、発現させて得られた組み換えタンパク質をアイスクリームに添加50

アイスクリーム

30,00090～100

サケの成長

2,500

125

植物油脂を半減し、氷再結晶化を添加した不凍タン
パク質 制御しパク質で制御している。
る

GL. Fletcher et al., CHEMTECH, 29,17 (1999).

冬野菜に存在する不凍タンパク質
不凍タンパク質の応用の可能性

青色以外に存在する

アブラナ科

白菜 大根 ブロッコリー キャベツ 小松菜
チンゲン菜 シロナ 蕪改善

キク科

春菊

セリ科

ニンジン

ユリ科
リ科

ネギ

アカザ科

ほうれん草

ハス科

レンコン

ゴボウ

ミブナ

野沢菜 ミズナ カリフラワ
カリフラワー大根葉・カイワレエキスの使用方法
根葉使法

食品品質における不凍タンパク質の応用性の展開
フリーズドライ食品の品質改善；使用が期待させれる商品

凍み込ませた後、FD

澱粉製品、餃子、中華まん、フリーズドライ用食品、かまぼこ、中華ポテト、魚卵（数の子）、釜揚げチリメンジャコ、ハム、和菓子（餅、団子類、餡）、漬物、野菜、豆乳、湯葉、にこごり、ゆで卵、パン、アイスクリ ム、じゃがいも、野菜、豆乳、湯葉、にこごり、ゆで卵、パン、アイスクリーム、じゃがいも、柚子皮、大根、液体調味料、生麩、米飯、豆腐、ゼリー、ソーセージ、アボガド、畜肉食品、ドレッシング、寒天、血液、血清、血小版など

キュウリ＋AFP

鮮肉・鮮魚の品質改善-AFP

2μg/ml溶液

浸漬方法 インジェクション法
浸漬方法、インジェクション法

家畜の場合、屠殺前に静脈注射

大根葉エキス
1 mgで2.5kgの仕込み量
ムチムチ感
加工肉製品の場合

うどんの場合100 mg/kg

冷凍パン生地、冷凍麺、冷凍ご飯の品質改善

大根葉エキス

100 mgで肉1kg

冷凍パン生地 水分量増加できる できあがり軟らかくなる
AFPによってはデンプン老化抑制あり

鶏肉の場合 ドリップ量58％に冷凍解凍後、軟らかい

冷凍すし飯に対するカイワレ大根エキスの効果
米

450 g

水540 g

水540 gエキス
キス 600μg(a) 根菜大豆
13.5 g
オリゴ糖

すし酢溶液

エキス
600μg
すし飯

すし酢
溶液

Protein (μgPg/g)

炊く10％
トレハロース

すし飯

エキス

トレハロース、大豆オリゴ糖

一粒、一粒が 粒同士が分かれている 接着している-20℃、3ヶ月間保存(b) 葉

500 .2 0400 .1 5300 .1 0200 .0 51000 .0 0012345670 .2 030

Protein (μg/g)

450 g

Thermal hysteeresis (℃)

米

大根の葉および根菜の低温馴化によるAFPの生産

8Cold acclimation time (week)●; タンパク質 ○; 熱ヒステレシス

0 .1 5200 .1 01000 .0 5012345C ld acclimation
Coldlii timei (week)(k)

60 .0 0Therm
mal hystereesis (℃)

養殖魚の場合、？

冬ライ麦由来不凍タンパク質抗体を用いたウエスタンブロッティング
ウスタンブ ッティング(a)

TH (℃)(c) グルカナーゼ(b) キチナーゼ

MWMW

94,00067,000104,000
80,00043,000,46,90030,00033,50020,10014,400

各タ パク質抽出物 不凍活性
各タンパク質抽出物の不凍活性

MW

0.15

67 ｋD
glucanase104,000
80,0000.1442 ｋD
glucanase

0.14

36 ｋD
chitinase46,90028,30033,50028,30019,80019,800SDS-PAGE-

30 ｋD

or
0.13 glucanasechitinase

0.14

27 ｋD
unknown+

複数の不凍タンパク質をアポプラスト画分に蓄積している

これからの研究展開
不凍タンパク質； 氷再結晶化抑制能のみ持ったタンパク質を発見。同じ機能を持った多糖を検索し、すでに発見。構造解析中。
植物不凍タンパク質‘クリスタ・キープ’としてカネカより販売開始
抗氷核活性物質(過冷却促進物質）； 過冷却水を形成するのに最適。
過冷却水を形成するのに最適

ご清聴どうもありがとうございました。

食品成分（日本酒・餡粕など）からの物質生産
高冷凍耐性水分保持高分子ゲル；
食品素材多糖による冷凍耐性ゲルの開発
物産フ ドサイ ンスで販売開始
物産フードサイエンスで販売開始
高冷凍耐性を有する天然乳化剤；
食品から冷凍耐性を合わせ持った乳化剤の開発

これら化合物を組み合わせて、細胞や臓器保存液の開発へ連絡先； 関西大学 生命・生物工学科 河原秀久
℡06 6368 0832
℡06-6368-0832
kawahara@ksnsai-u.ac.jp