●がん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ―［II］転移の生物学と実験動物モデル

8．移植モデルを用いた大腸がんの悪性化機構と臨床
国安

弘基＊

がんとその周囲の宿主組織との微小環境における相互作用は，がんの発生・進展，さらには転移に大きな影響を与える因子であり，その研究はがんの機構解明に重要であるのみならず，診断・治療への応用が期待される．マウスを用いた同所性移植大腸がんモデルは，移植がん組織に対する宿主組織の純粋な反応性変化を評価するのに適した系である．
がん細胞が産生・分泌する多種多様の因子が腫瘍に接する正常組織に影響を与えるが，その点ではがん周囲の正常組織はがんの総合的な性質を測る一つの試験紙ということができる．われわれは，ヌードマウスの盲腸にヒト大腸がん細胞株を移植しがん周囲粘膜の変化を検討した．がん移植後，がん周囲粘膜には過形成性形態変化が発生し，PCNA 陽性核の増加を伴っている．この変化に伴い，過形成性粘膜からの VEGF，bFGF といった血管新生因子の発現が亢進し，がんと粘膜との境界部に多数の新生血管が形成される．また，MLH1，MGMT といった DNA 修復遺伝子の発現低下が認められる．これらの変化の一因として，がん細胞から産生される IL-15 が重視される．このような動物モデルにより明らかとなった知見は，ヒト大腸がん手術材料でも確認され，がん周囲粘膜の過形成性変化は血管新生を通じてがんの進展・転移を促進するのみならず，転移能を反映するマーカーでもあることが示された．この結果をもとに，ヒト大腸がん術前内視鏡生検材料を用いてがん周囲粘膜上皮における Ki-67 labeling index を指標として， 切除後の転移の有無を prospective に予測検討した． この結果，転移陽性症例ではがん周囲粘膜の過形成性変化および Ki-67 labeling index は有意に非転移例よりも高く，80％ の症例で転移の有無を正診し得た．このように，がん周囲粘膜はがんの進展に重要であり，生検による転移マーカーとしても有用と考えられた．

A role for disease progression of hyperplastic mucosa adjacent tocolon cancer
HIROKI KUNIYASU Department of Oncological Pathology, Cancer Center, Nara Medical University
くにやす・ひろき：奈良県立医科大学附属がんセンター腫瘍病理学
教授．昭和61年佐賀医科大学卒
業．平 成９年 テ キ サ ス 大 学 MD
アンダーソン癌センター研究員．
平成12年広島大 学 医 学 部 第1病理学講師．平成13年現職．主研究
領域／消化器がんの発生・転移．
＊

50 第 119 回日本医学会シンポジウム

Key words

大腸がん
マウス大腸がんモデル
がん宿主相互作用転移

管腔の拡張が認められる（図 1）．このようなはじめに増殖性変化や血管新生は，高転移株 KM12SM

がん周囲粘膜の過形成性変化は，大腸がんに比較し低転移株 KM12C では程度が弱い．

で は 90％ 以 上 の 症 例 に 種 々 の 程 度 に み ら

この系で腫瘍移植後 5 週での肝転移を検討れ，分化度の低下を伴っている1）．また，膵がすると，高転移株 KM12SM では平均 42 病変ん，乳がんにおいても高頻度に過形成性変化マウスに比較し，低転移株 KM12C では平均 22）が認められるが ，いずれにおいても，この病変 マウスと有意差がみられ，がん周囲粘膜ような過形成性変化をがんに対する反応性変の増殖性変化や血管新生が腫瘍の転移能に相化とみるか，前がん状態と考えるかで議論さ関することが考えられた3）．なお，上記のよれてきた．しかし，がん周囲過形成性組織のうなヌードマウスにヒトがん細胞を移植する

がんの進展に対する役割はこれまで解明され異種移植系ではなく，マウス大腸がん細胞株ることはなかった．われわれは，大腸がんのCT26 を同系のマウス盲腸に同所性移植する周囲に形成される過形成性粘膜に着目し，が高転移系の大腸がんモデルでもがん周囲粘膜

3）

んとその周囲粘膜との相互作用を検討した ．の著明な過形成と血管新生が認められた3）．
3）がん周囲粘膜に影響を与える因子

1．マウス同所移植大腸がんモデルによる検討

このような変化をもたらす因子の一つとして，以前から EGF（epitherial growth factor；上皮細胞増殖因子）や TGF-α（ transforming1）マウス同所移植大腸がんモデルgrowth factor-α；形 質 転 換 増 殖 因 子-α）が知検討には，ま ず Fidler ら の 方 法 に し た がられており，KM12SM でも発現が認められて4）

い ，ヌードマウス盲腸壁にヒト大腸がん細いる．今回の検討で，われわれは新たに IL-15胞株 KM12SM（高転移株）とその親株 KM12C（interleukin-15；インターロイキン-15）に着6（低転移株）を 1×10 個注入し，同所性に大腸目した．
IL-15 は炎症性腸疾患において腸上皮がんを形成させる系を用いた．この系におい細胞の生存因子・増殖因子として作用し，粘て形成される粘膜過形成は，前がん病変では膜再生に重要な役割を担うと考えられていなく腫瘍の移植に伴う反応性変化であること

る5）．この IL-15 を介した腫瘍―宿主相互 作が明らかであることから，がんと宿主との相用を検討した．まず IL-15 の供給源となるが互作用を純粋に検討することが可能である．

ん細胞 KM12SM および KM12C での IL-15 発2）がん周囲粘膜の変化

現を検討すると，高転移株 KM12SM では明瞭高転移株 KM12SM では，腫瘍移植後 3 週以な発現がみられるが，KM12C では発現レベル

降にはがん腫を覆う粘膜上皮に陰窩の延長をは低く両者に差異が認められた．
さらに IL-15

伴 う 肥 厚 と，PCNA（proliferating cell nuclearによりラット腸上皮細胞株 IEC6 を処理する

antigen；増殖細胞核抗原）
陽性細胞の増加がと，p21Waf 1 発現低下・cyclin E 発現亢進に認められる．これに伴い，過形成性となったよる増殖促進作用，bFGF・VEGF の発現亢進

粘 膜 上 皮 か ら は VEGF
（vascular endothelialによる血管増生促進作用，さらに Bax・Bakgrowth factor；血 管 内 皮 増 殖 因 子）
，bFGF

発現低下および AKT リン酸化レベルの亢進（basic fibroblast growth factor；塩 基 性 線 維による抗アポトーシス作用が認められた（図芽細胞増殖因子）の産生が亢進し，その結果，

2）．事実，IL-15 により無血清培養や抗がん剤

粘膜とがん腫との間には多数の新生血管や血処理によるアポトーシス誘導は抑制される．
がん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ― 51

Vascular density
Folddensity
3

KM12SM model
KM12C model
Control

2107142128

Day
CD31

図1

がん周囲粘膜―がん腫境界部における血管新生

Cell cycle

Angiogenesis

Apoptosis

IL-15 treatment

IL-15 treatment

IL-15 treatment

CCC2448（h）

p21Waf1

bFGFCyclin EVEGF

PCNA

TubulinTubulin2448（h）

2448（h）

BAX
BakAKTpAKTTubulin図2

腸上皮細胞株 IEC6 に対する IL-15 の効果

このように，がん周囲粘膜の過形成や血管新生に，がん細胞が産生する IL-15 が関与することが明らかとなった6）．

2．ヒト大腸がん切除症例を用いた検討では，このようながん―宿主相互関係はヒ

52 第 119 回日本医学会シンポジウム

ト大腸がんにも認められるのであろうか．そンターロイキン―8）の産生および腫瘍―腫瘍

こで，漿膜下層（外膜下層）浸潤を示すヒト大周囲粘膜間の血管密度を免疫組織化学により腸がん切除症例 74 例を検討した．がん細胞検討すると，各血管増殖因子の発現，血管密の 増 殖 活 性 を Ki-67 labeling index に よ り 検

度とも Dukes’ C 症例では腫瘍部と同等のレ討すると，リンパ節転移陽性例（Dukes’ C）34ベルにまで上昇していたが，Dukes’ B 症例で例とリンパ 節 転 移 陰 性 例（Dukes’ B）
40 例 とはこれらの因子の増加は著明ではなく，対照の間に有意差は認められないが，がん周囲粘粘膜との間に有意差はみられなかった（図膜 の 形 態 学 的 過 形 成 は Dukes C 32 例
（943）
．このようにがん周囲粘膜の増殖性変化お％），Dukes B 16 例（40％）と転移例で有意によび血管新生は，マウス大腸がんモデルと同高頻度であり，がん周囲粘膜の Ki-67 labeling

様にがんの持つ転移能をよく反映することがindex に よ る 増 殖 活 性 は Dukes C 平 均 19％確認された．また，Dukes’ B，C いずれの症例に対し Dukes’ B 平均 9％ と転移例で有意ににおいても，がん周囲粘膜における血管増殖高値であった．次にがん周囲粘膜での血管増因子の発現および血管密度は腫瘍内部のそれ

殖因子 VEGF，bFGF，IL-8（interleukin-8；イとほぼ相関しており，ヒト大腸がんにおいてbFGF

VEGF
250

p＜0.0001

p＜0.003p＜0.0001

p＜0.048

150
150
10050

Control

Dukes' Dukes' Dukes' Dukes'
BCBC
Adjacent mucosa Tumor

IL-8
150

p＜0.0001

p＜0.0008

50

Control

Dukes' Dukes' Dukes' Dukes'
BCBC
Adjacent mucosa Tumor

Microvessel density
p＜0.000180

p＜0.016660
401002050

図3

Control

Dukes' Dukes' Dukes' Dukes'
BCBC
Adjacent mucosa Tumor

0ControlDukes' Dukes' Dukes' Dukes'BCBC
Adjacent mucosa Tumor

大腸がんおよびがん周囲粘膜における血管増殖因子の発現・血管密度とリンパ節転移の有無

がん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ― 53表がん周囲粘膜過形成を用いた生検標本による大腸がん術前転移能診断

Mean Ki-67 LI

nFalsecases

TrueFalse

Difference
True vs False

Dukes A
Dukes B
Dukes C
Dukes D

1061231230

5.6 ± 3.0
6.3 ± 1.7
25.6 ± 6.8
43.0 ± 2.0

2141.0 ± 5.7
11.0 ± 4.4――
p ＝ 0.1333 ＊p ＝ 0.0091 ＊―Total

316（19%）Difference
Dukes A―D

p ＝ 0.5170 †p ＝ 0.0002 ＃＊Statistical difference was calculated by unpaired Mann-Whitney U test
Statistical difference was calculated by chi-square test＃
Statistical difference was calculated by unpaired Kruskal-Wallis test
†もがん周囲粘膜ががんの性質を反映した変化を示すことが明らかとなった3）．

3．術前転移能マーカーへの応用

がん
TGF-αEGF
IL-15

がん周囲粘膜増殖悪性度
診断

これまでの結果から，大腸がん周囲粘膜の性状はがんの転移能を反映することが明らか

過形成性変化治療？

血管新生となったが，大腸がん周囲粘膜の持つもう一つの臨床的意義は，がん周囲粘膜が内視鏡的転移に採取可能であり，これを利用して転移能を術前に予測することが可能な点である．これ

図4

がん―周囲粘膜相互作用までの多くの報告では，がん悪性度はがんの浸潤先進部における各種マーカーと相関するものの，がん表層部では必ずしも先進部と同off 値を決定したが，先の 74 例のがん周囲粘様の結果を得られない傾向がみられた．切除

膜に お け る Ki-67 labeling index か ら，cutoff

してはじめて解析可能ながん先進部に対し，値により分割される Dukes’ B，C 症例におけ内視鏡的に採取可能ながん周囲粘膜はより臨る偽陽性，偽陰性の頻度が最も低くなるよう床現場に応用可能であると予想された．これに値を設定したところ，15％ となった．このを小規模なプロスペクティブスタディにより結果をもとに，大腸がん生検標本のがん周囲7）検討した ．まず，先の 74 例の大腸がん症例

粘 膜 に お け る Ki-67 labeling index か ら 転 移の検討から，各種マーカーとリンパ節転移のの有無を術前判定し，切除標本によりその真有無との相関を多変量解析にて検討すると，偽を確認するという検討を行った．術前転移検討したがんにおける各種因子の発現に比較判定を行い得た 31 例では，Dukes’ A-B 症例し，がん周囲粘膜における Ki-67 labeling in-

16 例中 13 例で，Dukes’ C-D 症例 15 例 中 12

dex が最も鋭敏なマーカーであるという結果

例で転移の有無を正しく予知し得た（的中率が得られた．次に転移の有無を判定する cut-81％）（表）．この結果から，がん周囲粘膜にお54 第 119 回日本医学会シンポジウム

け る Ki-67 labeling index を 指 標 と す る 転 移質能診断は臨床応用可能であると考えられた．

おわりに疑

応

答

座長
（曽根） 同所性の移植モデル を 使 っ

今回の発表内容を図 4 にまとめた．がんはて，臨床で見られるがん進展の周辺組織の種々の因子を介して宿主に対し自己に都合のhyperplasia あるいは angiogenesis の現象が，よい変化をもたらし，自己の存続・進展のたどういった molecule で起こっているのか，とめ利用していると考えられる．今回の検討で

くに今日は IL-15 を中心に大変明快にお話しはその一端を明らかにすることができたが，いただきましたが，どなたかご質問，あるい

その結果，術前転移診断の可能性が示唆されはコメントをお願いいたします．

た．
また，がん周囲粘膜が hyperplasia-derived

矢野聖二（徳島大） 2 点ほど教えていただ

angiogenesis（過形成由来血管新生） とも呼びきたいと思います．最初の質問は，大腸がん

得る血管新生を通じてがんの進展・転移を促患者さんの組織を biopsy して，Ki-67 の label-進していると考えられることから，今後はがing index でリンパ節転移の有無を予測する

ん周囲粘膜あるいはがん―粘膜相互作用を標という study のところですが，biopsy をした的とした治療の開発も視野に入れた研究が望場合には，その biopsy をする箇所によって結まれる．

果がかなり異なるのではないかと思うのです．それで，だいたい何個ぐらいサンプリン〔文献〕
1）Shamsuddin AK, Weiss L, Phelps PC, et al . : Colonepithelium. IV. Human colon carcinogenesis. Changes
in human colon mucosa adjacent to and remote fromcarcinomas of the colon. J Natl Cancer Inst 1981 ;66 : 413―419.
2）Kuniyasu H, Abbruzzese JL, Clearly KR, et al . : Induction of ductal and stromal hyperplasia by pancreaticcarcinoma. Int J Oncol 2001, in press.
3）Kuniyasu H, Yasui W, Shinohara H, et al . : Inductionof angiogenesis by hyperplastic colonic mucosa adjacent to colon cancer. Am J Pathol 2000 ; 157 : 1523―1535.
4）Morikawa K, Walker SM, Nakajima M, et al . : Influenceof organ environment on the growth, selection, andmetastasis of human colon carcinoma cells in nude
mice. Cancer Res 1988 ; 48 : 6863―6871.
5）Podolsky, D.K. : Healing the epithelium : solving theproblem from two sides. J Gastroentoerol 1997 ; 32 :122―126.
6）Kuniyasu H, Oue N, Nakae D, et al . : Interleukin-15
expression is associated with malignant potential incolon cancer cells. Pathobiol 2001, in press.
7）Kuniyasu H, Oue N, Shigeishi H, et al . : Prospective
study of Ki-67 labeling index in the mucosa adjacent
to cancer as a marker for colorectal cancer metastasis.
J Exp Clin Cancer Res 2001, in press .

グするとデータが安定してくるのかということを教えて下さい．
国安

この study は広島鉄道病院の外科，内科の先生と共同で行いましたが，がんの周囲のところ，先ほどお示ししたようにがんとその周囲の粘膜が一度に取れるような標本を，場所を狙って最低 4 個取ってくるというような方法で行いました．今回，結果の方は31 例お示ししていますが，実際には 38 例検索しておりまして，そのうち 7 例はがんしか取れていないという状態でした．そういうことで，この方法の一番の問題点は，同じ標本の中でがんとその周辺粘膜がきれいに取れてくるかどうかということです．ターゲットとしているがん周囲粘膜ですが，周囲粘膜の過形成性変化はがんごとに範囲が違うのですが，共通して見られるミニマムな領域としては 2 mm で あ り ま す．が ん の pushing edgeになっているそのちょうど裏側のあたりになりますので，採取する時にむずかしいこともありますが，この部分をターゲットとしてがん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ― 55

取ってほしいということでやっています．
矢野

時には起こらないのですか．もう一つは，大もう 1 点伺いたいと思います．IL-15

腸から転移した他の臓器でも，クロストークのことですが，講演中にお話しになりましたが起こって，先程のような病変を起こしてくが，IL-15 はもともと NK リンパ球の活性化因るかどうかということはいかがでしょうか．

子で，私どものところでも IL-15 が肺がん患

国安

まず皮下に植えた時ですが，皮下に者さんのリンパ球を活性化することによっ植えた KM12 SM では，IL-15 の発現はむしろて，肺がんに対するキラー活性を誘導できる下がっています．大腸に植えた時に比べて下ということ，また IL-12 などと共存することがっていて，皮膚にも過形成性の変化は起きによって，そのキラー活性が上がるというこてきません．それから転移巣については，肝とを報告しています．今回はがんと上皮との転移だけを検討していますが，肝転移巣にお関係で お 出 し に な り ま し た が，hyperplasia

いては，その周辺の，たとえば胆管上皮の過が起きている部分に活性化リンパ球などが浸形成性の変化は認められていません．そうい

潤してきていなかったかどうか，もし見られうことで，やはり大腸の粘膜上皮という，もていたら教えて下さい．

ともと同じところから出ているものが必要な

国安

マウスのモデルにおいて，リンパ球，マクロファージの浸潤はみているのですが，のではないかというふうに考えています．
座長

そうですね．同所性移植モデルの利

この場合，がんのほうで，KM12 SM のほうで用は，そういう意味で解析上重要ですね．もIL-15 の発現が高かったわけですが，リンパう一つお聞きしたいのは，午前中のセッショ球，マクロファージの浸潤ともに IL-15 の発ンにありましたように，血管新生は COX-2現の高い KM12 SM ではほとんど認められまの関与があるということで，大腸がん治療にせんでした．それに対して，逆に KM12 C のほ

COX-2 inhibitor が非 常 に 注 目 さ れ て い ま す

うでマクロファージ，リンパ球の浸潤は，数が，このモデルで実際にどういうことが起こにして約 5 倍程度ありました．そういうことるかというような解析はされていますか．

で，IL-15 は，この場合にはホストの免疫系に対してはハッキリ作用していません．これは国安

それはまだやっておりません．ぜひやってみたいと思っています．

IL-15 の場合，もしかしたら種がヒトかマウス

中津川重一（名古屋大） 聞き漏らしたのかかということで違いがあるのかもしれません

もしれませんが，IL-15 の study は臨床材料をが，syngeneic のモデルでも同じであります使ったものでもやられたのでしょうか．

ので，このモデルにおいては，IL-15 の発現がホストの免疫を賦活していないと思われます．あるいはこの IL-15 とは別に，免疫細胞が国安

前半でお見せしました生検材料を用いたのは，もちろん臨床材料です．
中津川

移植腫瘍の場合と，自然発生のががんの中に浸潤して行く過程で何らかの障壁んとの場合に，何か違いがあるのではないかとなるものが別にあるのではないかというふというふうに思ったのですが，そのへんは感うに感じています．

じられていないのでしょうか．
国安

矢野

ありがとうございました．

座長

ほかにどなたかございませんか．先性の変化，あるいは血管増殖性の変化が見ら

生，臓器微小環境の重要性を，同所性のモデれました．それから IL-15 については，ヒトのルで示されたわけですが，同じような現象が，大腸がんではDukes C 症例では 67％，Dukes

IL-15 を発現するような腫瘍を皮下に植えたB 症例では 8％ に陽性でありまして，ここで56 第 119 回日本医学会シンポジウム

今回の系ではほぼ同じような過形成

も IL-15 の関与は転移の方にリンクしているで効果が違うと思いますが，もう一つの問題というふうに見ています．

は，第 3 相は survival period を見るわけで，生座長

どうもありがとうございました．こ

存期間の延長は，一つの臓器だけではなく，のセッションでは，臨床がんを理解するうえいろいろな臓器への転移によって影響されるでがん転移モデルの重要性についてお話しいという問題があります．先ほど肺がんの多臓ただきました．いろいろな臓器の微小環境の器転移モデルで，MMP 阻害剤がすべての転移特性と申しますか，がんが進展，転移して行に 効 か な け れ ば も ち ろ ん survival prolonga-

く場合に，すべてが一様ではないということtion には貢献しないということを考えます

は，お話の中でご理解いただけたと思います．と，皮下腫瘍系とか，あるいは単純な転移系

現在開発中のがん転移薬の中でも MMP 阻だけで抗腫瘍効果があるからといって，臨床害剤は臨床治験が一番進んでおります．ブリ的な効果を保証するものではないということ

ティッシュバイオテクというイギリスのベンがいえるかもしれません．

チャー企業が第 3 相試験で，肺がん，胃がん，MMP 阻害剤については，残念ながら今世界膵臓がん，脳腫瘍を初めいろいろながん腫で，的にほとんどが開発をストップしている状況

10 近い protocol を大規模で行いました．膵がです．しかしながら，先ほどみなさんから話んでは標準的な治験薬であるジェムスタビン

題提供がありましたように，もう少しわれわと同じくらいの効果がみられ，最初は非常にれ自身ががんの転移の分子機構を，それぞれ注目されたわけです．その後胆がん状態の少がんの特性とか，あるいは臓器レベルでもっない胃がんに関して少し効果があるという結とくわしく解明して行けば，また新しい，さ果でした．最近肺がんに対する非常に大規模らなる道が開けるのではないかというふうにな報告がありましたが，これはまったく効果私は思っています．

はないという結果でありました．
MMP 阻害剤はもちろんがん種によって，これでこのセッションを終わらせていただ
きます．ご静聴ありがとうございました．

MMP がどれだけ関与しているかということ

がん転移研究の新しい展開―分子研究から臨床へ― 57