●血管新生の基礎と臨床!!［ I ］血管新生の分子制御機構

4．造血と血管新生の相互作用
高倉伸幸＊

再生医療にとって重要かつ不可欠な点は，移植細胞・臓器の生体内での生着であり，本機構ではこれら移植細胞・臓器への新しい血管の形成，つまり血管新生をいかに誘導するかがポイントとなる．この血管新生は臓器・器官を構築する組織特異的な細胞と血管の重要な構成細胞である血管内皮細胞との相互作用によって誘導されるものと考えられ，器官形成の旺盛な胎仔期における各組織で観察される，血管形成の基本的プログラムの解析が重要と考えられる．
われわれは造血の営まれる胎仔肝臓や成熟個体の骨髄が非常に緻密な血管構造を形成しており，また血液細胞と血管内皮細胞は発生基盤的に共通祖先細胞に由来することから，造血器官特異的な血管形成のプログラムは，この血液細胞と血管内皮細胞の両者のクロストークによって成立すると仮設をたてた．本仮説を支持する表現型を示したのが， 造血幹細胞の完全に欠損する AML1!
RUNX1 遺伝子の欠損マウスであり，本マウスで胎仔肝を観察したところ，血液細胞が存在しないばかりか，通常のマウスでは緻密な血管構築が営まれているのに対し，血管網の形成が損なわれていた．これは血液細胞による血管構築の誘導作用が存在することを示唆する所見であり，この血液細胞による血管網の構築の分子基盤を解析したところ以下の事実が判明した．血液細胞の中でも，造血幹細胞が特異的に血管内皮細胞に発現する TIE2 受容体の結合因子，アンジオポエチン-1 を分泌し，まず造血幹細胞は無血管領域に血管より先に侵入し，このアンジオポエチン-1 を放出することにより，遠隔的に血管内皮細胞の遊走を誘導して血管網を局所に作り上げる．
本解析により造血器官特異的な血管構築のプログラムの一つを解明し得たと考えているが，本機構は胎仔期のみならず成熟個体でも機能し，さらに造血器官のみならず，異所的に移植された造血幹細胞は，そのような現場で血管網の形成を誘導することも判明した．これらは造血幹細胞を用いることによる，血管新生を誘導する血管再生療法への可能性を支持するとともに，臓器の種を超えた，普遍的な基本的プログラムとして本造血幹細胞を臓器移植時の血管誘導に利用できる可能性を示唆した．

Molecular Mechanism of the interaction between Hematopoiesis andAngiogenesis
NOBUYUKI TAKAKURA Department of Stem Cell Biology, Cancer Research Institute of Kanazawa University
たかくら・のぶゆき：金沢大学がん研究所細胞制御研究部門細胞分化研究分野教授．平成９年京都大学大学院医学研究科博士課程修了．平成９年熊本大学医学部助手．
平成11年同講師．平成12年熊本大学発生医学研究センター助教
授．平成13年現職．主研究領域／血液学，血管発生学．
＊

26 第 120 回日本医学会シンポジウム

Key words

血管新生
造血幹細胞
血管内皮細胞アンジオポエチン

成のプログラムから血管形成が進行するのに対し，出生後の成体では主に既存の血管から1．脈管形成と血管新生

新しい血管の分岐が生じる血管新生の過程で胎仔期の血管の形成は未分化内皮前駆細胞発生する．この血管新生の過程の最初のスの発生とその成熟化，管腔形成，そして原始テップである既存の血管からの新しい血管分的な血管叢の形成という脈管形成（vasculo-岐の発芽（sprouting）
は，多少の臓器特異性はgenesis）の過程に始まり，その後，血管壁へのあることも予想されるが，ほぼ全身で TIE2

壁細胞（ペリサイト，平滑筋細胞）動員による（ tyrosine kinase with Ig and EGF homology

血管構造の安定化，原始血管の再構築（血管のdomain-2）-アンジオポエチンという受容体―融合，発芽型および嵌入型血管新生）などの過リガンドのシステムが働いているものと考え

程（血管新生：angiogenesis）を経て，全身細部られる．におよぶ血管網が張りめぐらされていく．胎
仔期では血管の形成はまだ血管の全くない状態からのスタートであるために，この脈管形

アンジオポエチン-1，4（Ang-1，4）

アンジオポエチン-2，3（Ang-2，3）

coiled-coil
TIE-2fibrinogen

血管内皮細胞

on

Ang-1

安定期

図1

壁細胞
接着

リン酸化

off

Ang-2
壁細胞

離解

Ang-1

発芽の開始

血管構造の安定化，不安定化におけるアンジオポエチン-TIE2 のシステムの概念図

血管新生の基礎と臨床 27

な血管の発芽開始が誘導されたのち，いかに新規の血管分岐が虚血部で正確に血管網を形

2．TIE2 とアンジオポエチン成するのかは明らかではない．ここで，われ血管は通常の酸素状況においては，血管内われは非常に緻密な血管網の形成されてい皮細胞とその周囲を裏打ちする壁細胞（平滑る，胎児期の肝臓や成体の骨髄に注目した．

筋細胞やペリサイト）は強固に接着しており，これらの臓器・器官は血液細胞の増殖や分化血管構造が安定に保たれている．
この状況は，が営まれる，いわゆる造血器官である．そも

壁細胞が分泌するアンジオポエチン-1 が血

そも血管内皮細胞は造血幹細胞にも分化する

管内皮細胞上の TIE2 を刺激し，内皮細胞とヘマンジオブラストという共通祖先細胞から壁細胞のマトリックスを介した接着を誘導す分化することや，造血幹細胞は発生初期に，1,2）ることによって支持されている（図 1） ．しマウスでは胎生 9 日目の臍腸間膜動脈内2）あかし，組織で低酸素が生じると壁細胞が内皮

るいは 10 日目以降では背側大動脈内で血管細胞から離脱して，内皮細胞が容易に移動で内皮細胞に接着，増殖すること，また胎児肝きる状況が形成される必要がある．この壁細や骨髄においては血管内皮細胞が造血を支持胞の解離が低酸素で内皮細胞から分泌され，するストロマ細胞的役割を果たすなど，このアンジオポエチン-1 に対して拮抗して働く，両者の細胞は発生的近縁関係にあるといえアンジオポエチン-2 に よ っ て も た ら さ れ る

る．また，発生初期よりこの両者は CD34，CD3）と考えられている（図 1）．しかし，このよう31 などの接着因子，レセプター型チロシンキ

血管内皮細胞の発生

血管内皮細胞
血管内皮細胞の集合

血管網

血管床
血管分枝の発芽図2

P-Sp 培養法に観察される血管内皮細胞の発生

写真の内皮細胞は PECAM-1!
CD 31 に対する抗体で染色されたもの．

28 第 120 回日本医学会シンポジウム

ナーゼである TIE2，VEGFR2!
Flk-1 などの発op マウスより樹立されたスト ロ マ 細 胞4）を現を共有する．このような類似性から，それフィーダー細胞として必要とし，培養初期にはぞれの細胞の発生や分化には互いの細胞間相P-Sp 領域から未分化な血管内皮細胞がまず互作用が重要ではないかと考えられた．そこOP9 細胞上を移動して，円を描くように P-Spで，血管網の形成の基本的プログラムをこのを取り囲む．やがてこの血管内皮細胞は増殖

血管内皮細胞と血液細胞の相互作用を検討すしてシート状の構造（血管床）を呈し，さらにることで解析し，成体の血管形成を制御し得その末梢域で成熟した内皮細胞が微細な血管るメカニズムを検討した．

網を形成する．本培養に可溶性の受容体を添加して行った各受容体の機能抑制の解析か

3．胎児期の造血と血管形成を反映する
試験管内培養法の確立

ら，Flk-1 は血管床および血管網，TIE2 は血管網の形成に必須の役割を果たすことが明らかとなった．ノックアウトマウスの解析では胎仔期に造血幹細胞が発生する領域であFlk-1 が脈管形成に5），そして TIE2 が血管新る P-Sp（ para-aortic splanchnopleural meso-生に2，6）欠損を生じることから，われわれはこderm；傍大動脈臓側板中胚葉）領域の組織片の血管床の形成は，未分化な血管内皮細胞がを用いて，造血においては二次造血（成体型）原始的な血管構造物を形成していく過程であを，血管内皮細胞においては脈管形成，血管る脈管形成を，そして血管網の形成は，既存新生を観察可能な器官培養の確立に成功したの血管から発芽的に血管枝を伸長する過程で2）（図 2）．本培養においては OP9 という op!

正常マウス

AML1ノックアウトマウス

血管網ある血管新生を反映するものと定義づけた．

AML1ノックアウトマウス＋造血幹細胞AML1ノックアウトマウス＋アンジオポエチン-1欠損マウス由来造血幹細胞

血管内皮細胞
血液細胞

血管床

図3

血液細胞の血管網に対する影響を P-Sp 培養法によって観察したもの

血液細胞のないマウスの培養では血管網が形成されず，本条件に正常マウスの造血幹細胞を添加すると血管網は回復する．
しかしアンジオポエチン-1 の発現しない（アンジオポエチン-1ノックアウトマウス由来）
造血幹細胞では血管網を誘導できない．

血管新生の基礎と臨床 29一方，造血幹細胞はまずこの血管床を形成す仮説がたてられている．このように血管内皮る未分化血管内皮細胞上でクラスターを形成細胞にも AML1 遺伝子が発現するというこしたあと，血管網領域に移動して，接着，増とは，AML1 ノックアウトマウスの血管網の殖する．このことから，この血管網領域にお形成異常は，血液細胞が存在しないからではいて造血と血管新生の相互作用を解析可能でなく，内皮細胞そのものの一次的な機能異常あると考えた．の関与も示唆される．しかし正常マウスの造血幹細胞を AML1 ノックアウトマウス由来

4．造血幹細胞の欠損するマウスでの血管新生の解析の P-Sp 培養に添加すると，血液細胞がコロニーを形成する領域に一致して，血管網の回復が観察された．そして詳細な検討の結果，造血幹細胞の発生を欠損する AML1 遺伝
7，8）

血液細胞の中では造血幹細胞分画にほぼ限局の血管構造を胎して，TIE2 の結合因子であるアンジオポエチ

仔において観察したところ，局所（頭部，心外

ン-1 の産生が観察され，本因子を分泌する造膜，腹膜など）にて血管網の形成が不十分であ血幹細胞に向かって血管内皮細胞は遊走が誘ることが判明し，またこのノックアウトマウ導されることが判明した9）．アンジオポエチ

スを用いて P-Sp 培養を行ったところ，野生ン-1 のノックアウトマウス由来の造血幹細型の胎仔由来のものに比較して，血管網の形胞では，上述した AML1 の血管異常を回復さ成が非常に疎であることが判明した．AML1せることはできなかった．このことは，造血は臍腸間膜動脈，背側大動脈といった発生初幹細胞由来のアンジオポエチン-1 が血管新期造血幹細胞がクラスターを形成して接着，生に重要な分子であることが想像された（図3）．

増殖する動脈の一部の血管内皮細胞に発現を以上から，造血幹細胞は自己のコピーを作認め，AML1 を発現する本動脈内の内皮細胞るという自己複製能，そしてさまざまな系統が造血幹細胞に分化するのではないかというの成熟した血液細胞を産生するという多分化子のノックアウトマウス

造血幹細胞（矢印）を入れたマトリゲル＋可溶性TIE2受容体

遊走

Ang-1
造血幹細胞

図4

造血幹細胞による血管遊走の概念図（左）と生体内で観察された異所性に移植された造血幹細胞による血管網の形成（右）（右）マトリゲルに造血幹細胞（矢印）を添加し，成体マウスの皮下に移植すると，ゲルの中に血管網が形成された．しかし，本機構は可溶性の TIE2 受容体を添加してアンジオポエチンを中和すると生じない．

30 第 120 回日本医学会シンポジウム能をもつ以外に，血管内皮細胞を無血管野へと導き，血管網形成を誘導する機能をもつこ

まとめとが明らかとなった．これらの実験結果に基造血幹細胞は，自己複製能（コピー能力）とづいて，造血幹細胞は胎児肝あるいは成体の成熟した全ての血球成分に分化できる多分化

骨髄に共通して見られる毛血管に富む構造を能を持つことから，最も先がけて骨髄移植と呈する造血組織の形成そのものに関わるといいう再生医療に用いられてきた細胞である．

うことが示唆されたのである．

今回の結果から，造血幹細胞は血管新生を促進するという第 3 番目の機能があることが5．成体における造血幹細胞の血管新生誘導作用明らかになった．この概念を応用して，血管再生，血管新生抑制に向けた新しい治療概念，治療の方法論が萌芽することを期待する．

このような，胎児期に観察された造血幹細胞の機能が，成体の血管新生で利用できるならば，虚血性疾患の再生血管の治療に応用可能であると考えられ，逆に，もし種々の病態の悪化に関与する血管形成にも関与するならば，この幹細胞機能を抑制することによる血管治療が可能である．そこでまず，成体における造血幹細胞の血管新生に対する機能を解析したところ，図 4 に示すごとく，造血幹細胞は効率良く，成体マウスに移植された造血幹細胞を含むマトリゲルの中に緻密な血管網を形成させることが判明した．
最近，造血幹細胞だけでなく，他の血球成分であるマクロファージや肥満細胞，あるいは赤芽球は種々のサイトカインやケモカインを分泌して，血管新生を促進することが知られるようになってきている．腫瘍の中にも，われわれの観察した限り多くの血液細胞が血管外に漏出しており，これら血液細胞が腫瘍の栄養血管形成を促進して，腫瘍の増大に寄与している可能性がある．そこで，担がんマウスのモデルに造血幹細胞の増殖に重要な役割を果たす，c-Kit 受容体の機能阻害抗体を投与すると，全血球細胞の減少とともに腫瘍血管の形成が抑制され，腫瘍の増大が抑制されることが判明した（論文投稿中）．

〔文献〕
1）Suri C, Jones PF, Patan S, et al. : Requisite role ofangiopoietin-1, a ligand for the TIE 2 receptor, during
embryonic angiogenesis. Cell 1996 ; 87 : 1171―1180.
2）Takakura N, Huang XL, Naruse T, et al. : Critical roleof the TIE2 endothlelial cell receptor in the development of definitive hematopoiesis. Immunity 1998 ; 9 :677―686.
3） Maisonpierre PC , Suri C , Jones PF , et al. :Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. Science 1997 ; 277 : 55―60.
4）Takakura N, Kodama H, Nishikawa S, et al. : Preferential proliferation of murine colony-forming units in culture in a chemically defined condition with a macrophage colony-stimulating factor-negative stromal cellclone. J Exp Med 1996 ; 184 : 2301―2309.
5）Shalaby F, Ho J, Stanford WL, et al. : A requirementfor F1k-1 in primitive and definitive hematopoiesis andvasculogenesis. Cell 1997 ; 89 : 981―990.
6）Dumont DJ, Gradwohl G, Fong GH, et al. : Dominantnegative and targeted null mutations in the endothelial receptor tyrosine kinase, tek, reveal a critical rolein vasculogenesis of the embryo. Genes Dev 1994 ; 8 :1897―1909.
7）Okuda T, van Deursen J, Hiebert SW, et al. : AML1,
the target of multiple chromosomal translocations inhuman leukemia, is essential for normal fetal liver hematopoiesis. Cell 1996 ; 84 : 321―330.
8）Okada H, Watanabe T, Niki M, et al. : AML1（−!−）
embryos do not express certain hematopoiesis-relatedgene transcripts including those of the PU. 1 gene .
Oncogene 1998 ; 17 : 2287―2293.
9）Takakura N, Watanabe T, Suenobu S, et al. : A role forhematopoietic stem cells in promoting angiogenesis .
Cell 2000 ; 102 : 199―209.

血管新生の基礎と臨床 31

は，今後ヒトでも試せるかどうかわかりませ質

疑応

答んが，まずマウスの実験などで研究を行って行きたいと考えています．

座長（須田） 高倉先生，どうもありがとう

矢崎義雄（日本医学会幹事） 今のお話で，ございました．それではご質問，コメントを血液細胞と血管内皮細胞は共通の祖先で，おお願いいたします．

互いにクロストークして血管新生に促進して小室広昭（筑波大） 大変面白いお話をあり働くということですが，今のご質問と関連しがとうございました．先生のお話を伺っておますが，造血幹細胞と血管前駆細胞は，そのりますと，最近はやっている骨髄の細胞を注レベルでも分化の転換ができるのではない

入すると血管新生ができるという作用です

か，そういう可能性が高いのではないかといが，血管内皮前駆細胞を注入しているから血う報告が最近ありますね．ですから，血管内管新生が起こると考えていたのですが，あの皮細胞に限っては，造血幹細胞から分化でき中に造血幹細胞が入っているということが重る可能性はいかがでしょうか．それから分化要だというように考えてよろしいのでしょうか．

するメカニズムが非常に興味深いと思うので

高倉

造血幹細胞分画を除いて血液細胞をすが．

局所に打つというような実験は，実際に関西高倉

西川先生がご紹介されていたよう医科大学の松原先生が行っておられると聞いに，胎児期ではまず VE カドヘリンという，内ております．先ほど紹介したように，血液細皮細胞の機能的なマーカーを持った細胞から胞はさまざまな cytokine を分泌しています

造血幹細胞が出てくる，分化するということので，そういった cytokine によっても，造血から，胎児期ではまず血管内皮細胞様の細胞幹細胞が存在しなくても，血管形成は促進すから造血幹細胞が発生してくるということはるというようなことが言われています．造血すでに報告されています．これまで本当に造幹細胞単独でというものはこれまで行われて血幹細胞，つまり造血幹細胞に commitmentおりませんが，九州大学で CD34 陽性細胞だした，つまり血球系だけにしかなれないようけを用いて移植をしてどうなるかといった実な細胞と考えられていた細胞が血管内皮細胞験が行われているようですので，その結果をになったかというようなデータは，まだ一つ見てそれは回答できるのではないかと考えても証明されていないわけです．もしかしたらいます．

形質転換ということが起こり得る可能性もあ小室

CD34 positive の 細 胞 と い う の は，ると思いますが，それがどのような DNA のhemangioblast もあるということではないの脱メチル化などによって起こっているのかとでしょうか．

いったことは，そしてその脱分化を起こすよ高倉

い わ ゆ る CD34 陽 性 細 胞 と い う のうな factor がもし同定されれば，それの分子は，造血幹細胞のマーカーにもなりますし，機序というようなものが明らかになって行く血管内皮細胞にもなりますので，CD34 だけと思うのですが，現在現象としては，造血幹の場合，内皮と造血幹細胞の両方を使ってい細胞が血管内皮細胞になるということはありることになります．
そこで CD45 陽性で CD34ませんので，いちおう細胞表面マーカーとし陽性と，あるいは CD45 陽性で Lin 陰性，c-kitては造血幹細胞の顔をしている細胞が血管内陽性といった本当の造血幹細胞のマーカーだ皮細胞になるということは，私どももすでにけで移植した時にどうなるかといったこと見ておりますので確かだと思います．それが32 第 120 回日本医学会シンポジウム

本当に内在的には造血幹細胞にしかならない

座長

造血幹細胞と血管幹細胞の共通性ようなものだったものが，血管内皮細胞にが，ど の く ら い 今 知 ら れ て い る phenotype

なったかどうか，といったことに関しては，だけで語れるかということはむずかしいとこ

現在解析しづらいと言いますか，非常にむずろがあると思いますが，それは総合討論の時かしい困難なところだと思います．にお願いいたします．

血管新生の基礎と臨床 33