●血管新生の基礎と臨床!!［ I ］血管新生の分子制御機構

1．血管リモデリングの細胞生物学
西川伸一＊

血管は比較的単純な細胞構成よりなる組織であるが，毛細管から徐々に大きな血管へと移行しながら全体として完全な閉鎖系を形成している独立に組織化された臓器である．この組織化の過程については，他の臓器の発生と同じで分子遺伝学的アプロー
チを中心に現在は進んでいる．血管形成については特に階層性の成立について研究が進んでいるが，関与が明らかにされる分子のリストが増えれば増えるほど，実際の過程について理解が困難になるという逆説的な状況に陥っている．われわれは，血管形成細胞の挙動をデザインして一定の形態へと発展させるという，一種の synthetic biology を目指して研究を行っている．この研究過程で，これを達成するために必要な正常血管の細胞レベルでの挙動がほとんどわかっていないことに気付き，現在は正常血管細胞の細胞生物学を構築すべく，2 つの方向での研究を行ってきた．
1）リモデリングの過程では，血管内皮!
周囲細胞間の相互作用の重要性が指摘されている．ただ，周囲細胞の血管内皮への直接作用を知ろうとするとき，内皮のみからなる血管構築を作成しない以上，ある分子が内皮の形態形成運動への直接作用を調べることはできない．われわれは，網膜血管発生系を用いて，周囲細胞が全く形成されてこない血管網の構築に成功した．予想通り，このような血管はリモデリングせず，また leaky であり，最終的に出血をきたす．そこで周囲細胞由来の分子をこの系に加えることで，周囲細胞の機能を代償する分子があるかを検討し，この系への Angiopoietin 1 の添加によって，血管のリモデリングのかなりの部分とともに，出血や浮腫を完全に抑制できることを示した．この結果は，Angiopoietin 1 が周囲細胞自体の作用のうちかなりの部分を占めていること初めて明らかにしたものである．
2）これと平行して，十分量の正常血管内皮を ES 細胞の分化系から作成し，試験管内で血管内細胞集団へのさまざまな分子の作用を調べる，いわば血管の細胞生物学の確立を試みている．現在様々な分化段階の各細胞の機能を検討してきたが，本シンポジウムでは，この研究から生まれてきた最も新しい成果についてお話したいと考えている．

Cell Biology of Vascular Remodeling
SHIN-ICHI NISHIKAWA Department of Molecular Genetics, Graduate School of Medicine Kyoto Universityにしかわ・しんいち：京都大学大学院医学研究科分子遺伝学教授．
昭和48年京都大学医学部卒業．昭和55年ケルン大学遺伝学研究所
留学．昭和62年熊本大学医学部教授．平成５年京都大学医学部教授．
平成13年現職．主研究領域／血液学，発生学．
＊

6 第 120 回日本医学会シンポジウム

Key words

Vascular remodelingES cell
Mural Cell
Endothelial Cellはじめに心臓を起点としてみたとき，血管系は太い

1．血管の細胞生物学の必要性

幹から順次細くなる分枝が伸びる樹木のイ

血管形成についての研究は，血管新生に関メージで見られることが多いのではないだろ

わる分子の同定に向けた分子生物学と，それうか．実際，血管新生という言葉を使うとき，ぞれの機能の in vivo での検証を二つの柱と血管の専門家でさえ木が伸びるイメージを完して進んできた．とくに遺伝子ノックアウト全に払拭することは難しい．しかし，血管の技術の進歩は，個々の分子の機能を個体や組初期発生過程を見ると，このイメージがあま織といった高次レベルで理解するための大きりに単純であることがわかる．実際には，中な原動力となっている．しかし，当然分子と胚葉から分化してきた血管内皮細胞の集団組織の間には細胞が介在し，組織レベルの表が，まず単純な原始血管層と呼ばれる管腔の現形は個々の構成細胞に表現された分子の機ネットワークを作り，この単純な構造から能が統合された結果であると言える．ところ

徐々に動静脈・毛細管，大血管，小血管の区が，これまで血管構成に関わることが明らか

別が存在する組織化された血管が形成されてになったそれぞれの分子が，個々の細胞でどいく．すなわち，樹木が伸びるのではなく，のように機能しているかは意外なほど明らか

単純な構造が階層化し複雑化するのが血管のになっていない．したがって，細胞レベルのリモデリングである（図 1）．最 近 の 遺 伝 子

解析を進めたうえで，それを基礎に組織レベノックアウトマウスの研究から，リモデリンルでの表現系を解釈しなおすことが今最も重グとはさまざまな分子が同時に関与する複雑要な課題と考えられる．これが血管形成の細な過程であることがわかっている．

胞生物学である．
もちろん，これまでも血管の細胞生物学がなかったわけではない．VEGF のクローニン
グは，VEGF 依存性の血管内皮細胞株を用いた細胞生理学的研究を基礎として生まれたもaAngioblast developmentangioblastのであり，また，内皮同士の接着に重要な機能を有する VE-cadherin についても細胞生化学的研究が行われてきた．しかし，血管のリb

Vasculogenesis
primary capillary plexus

モデリング過程とは血管構造の多様化と階層化が始まることであり，多様化能力を失った細胞株を用いて研究を進めることはほとんど

cAngiogenesis
sproutingintussusception

不可能に近い．この認識に立って，われわれは血管内皮細胞の多様化に基づく血管リモデリングの分子機構について，より直接的に研dRemodelling & Maturation
pruningarteriogenesis

究できる実験システムの開発をめざした．

mature vascular system

図1

血管発生過程の各段階血管新生の基礎と臨床 7

うと判断した（図 2）．

2．ES 細胞から血管内皮細胞分化を誘導する

ES 細胞とは，マウス胞胚期の内部細胞塊より樹立された，生殖細胞を含むほぼすべての細胞へ分化する能力（全能性）を保ったまま試発生過程で見られる血管内皮の多様化のプ験管内で維持できるという画期的な細胞株でロセスを実現するためには，多様化能を有すある．ES 細胞の樹立は，内部細胞塊細胞を分る血管内皮，あるいはその前の段階の細胞を化しないまま増殖させる条件が発見されたこ用いて実験を行う必要がある．これを実現でとにより可能になったもので，現在ではこれきる細胞のソースとしては，1）
胎児より調整に白血病阻害因子（LIF）とその受容体が重要した fresh な血管内皮とその前駆細胞，2）多な役割を演じていることが明らかにされてい様化できる血管内皮細胞株，そして 3）
ほぼする．この細胞はその全能性ゆえに，試験管内べての体細胞へと分化できる（全能性）
ES 細でさまざまな組織細胞を調整することを可能

胞から試験管内で誘導した血管内皮とその前にする重要な技術と期待されている．

駆細胞，を挙げることができる．それぞれの方法には長所も短所も存在する．ただ，現在利用可能な技術や材料として考えるとき，胎児期の血管内皮を大量に調整することは可能ではあるが難しく，また多様化できる細胞株

3．ES 細胞から血管細胞を作成するための培養法
われわれが研究を始めた当初はそれを確かは残念ながら報告されていないことから，わめるための方法が開発されておらず，
ES 細胞

れわれは 3）の ES 細胞からさまざまな血管内培養が血管の研究に利用されることはまださ

皮細胞を分化させる方法が最も現実的であろかんでなかった．われわれは，できるだけ単type Â collagencoated dishtype Â collagencoated dishSort Flk1+
mesodermal cells

Endothelial cells
Smooth muscle cells

Induction ofdifferentiationfrom ES cells
Sort VE-cadherin+
endothelial cells

Vascularformation

Endothelial cellcolony formation

type ¿ collagen gel

OP9 stromal cell layer

・ES細胞の in vitro 分化誘導系

図2

8 第 120 回日本医学会シンポジウム

ES 細胞からの血管内皮細胞の調整

純な ES 細胞分化培養方法の開発，および血化にもかかわらず，内皮より構成される単層管内皮までの分化の中間段階を定義し純化す構造は比較的安定に維持されていることも明るための細胞表面マーカーを開発を行った．

らかになった．この結果は，VEGF が細胞の形これに基づき，
図 2 に示す実験系を確立し，血態変化，とくに伸張反応を誘導する一方，細管内皮前駆細胞や，血管内皮そのものを比較

胞同士が接着した単層構造は比較的安定に維的大量に試験管内で調整することに成功した．

持されるということがわかる．
このような実験手法はようやく利用できる

4．単一細胞の反応性についての研究ようになったばかりであり，個々の細胞の動態が観察できるようになったからといって最近の細胞生物学は，個々の細胞レベルでVEGF によって誘導される細胞伸張反応の生のさまざまな活性をモニターするというさま化学的基礎が解明されているわけではない．

ざまな画像技術を基礎に大きく進展を遂げてしかし，この動態観察は生化学的研究の糸口きた．われわれの実験系でも，これら進歩をになることは明らかである．
この確信のもと，導入して個々の細胞のさまざまな反応を調べ同じような実験をさまざまな増殖因子や分化ることは，最も重要な課題として現在行って因 子 に つ い て 現 在 進 め て い る．こ れ ま でいる．
ES 細胞の特色は遺伝子導入が比較的容VEGF に加えて，VEGF-c，Angiopoietin 1 等に易に行える こ と で，こ れ を 利 用 し て Actin-

ついて研究を行い，VEGF-c が内皮細胞の接GFP 遺伝子を導入した ES 細胞を作成した．

着を高めるシグナルであること，Angiopoietin

この操作により導入した GFP 遺伝子により，が細胞内アクチンの形成の様式に大きな影響

導入細胞を他の細胞から区別できるようになをもつシグナルであることなどが明らかにり，フィーダー細胞上でも目的の細胞の振るなってきた．
もちろん，これまで明らかになっ舞いを調べることが可能になる．さらに，こたことがすぐにリモデリングという形態形成の 場 合 GFP が actin に 結 合 し て い る た め，過程の理解に直結できるわけではない．しかGFP は actin の動態を反映する．これにより，し，こうして得られる一個一個の細胞の反応

たとえば上皮構造の場合 GFP が細胞接着部についての情報をもとに，もう一度高次構築位に濃縮するため，細胞接着部位の動態をリ形成と対応させることが将来可能になると期アルタイムでモニターすることも可能である．

待している．

さて，Actin-GFP を導入した ES 細胞の分化を誘導し，VE-cadherin を発現した血管内皮細胞を純化し，その細胞を OP 9 上で培養することで，個々の血管内皮細胞の振る舞いを調べることが可能である．その際，顕微鏡にセットできる培養装置とビデオ記録装置を用いると，血管内皮がさまざまな培養条件の変化にどのように反応するかを調べることができる．この方法を用いて VEGF に対する血管内皮の反応を調べてみると，個々の内皮細胞が紡錘状の細胞へ形態変化を遂げ，かつ伸張するのが観察できる．しかし，このような変〔文献〕
1）Nishikawa SI, Nishikawa S, Kataoka H, et al. : Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies Flk 1+VE-cadherin+ cells as the diverging point ofendothelial and hematopoietic lineages. Development
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2）Tachibana K, Hirota S, Iizasa H, et al . : A chemokine
receptor CXCR 4 is essential for the vascularization of
the gastrointestinal tract. Nature 1998 ; 393 : 591―594.
3）Nishikawa SI, Nishikawa S, Kawamoto H, et al . : In vitro generation of lymphohematopoietic cells from endothelial cells purified from murine embryos. Immunity 1998 ; 8 : 761―769.

血管新生の基礎と臨床 94）Hirashima M, Kataoka M, Nishikawa S, et al . : Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in
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5）Ogawa M, Kizumoto M, Nishikawa S, et al . : Expression of a 4-integrin defines the earliest percursor ofhematopoietic cell lineage diverged from endothelial
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7）Yamashita J, Itoh H, Hirashima M, et al . : Embryonicstem cell derived Flk 1-positive cells serve as vascularprogenitors. Nature 2000 ; 408 : 92―96.
8）Stacker SA, Caesar C, Baldwin ME, et al . : Vascularendothelial growth factor-D promotes tumor growthand spread via the lymphatics. Nature Med 2001 ; 7 :186―191.

西川

私もまったくわかりません．実際にリモデリングというのは極めて形態的な概念ですから，それで終わってしまえば簡単なのです．すなわちリモデリングができないということで終わりますから．私どもが示した
かったのは，このリモデリングのプロセスは，決して周りの細胞が複雑になるから起こるのではなくて，内皮そのものの動きとしてリモデリングが起こり得るということをまず示しているわけです．そうすると内皮だけをターゲットにしてリモデリングを研究できるということなのです．内皮だけでリモデリングが研究できるとすると，どうしたら内皮だけをあのような形に持って行けるかということが，細胞生物学を形態形成に結びつける一番重要なテーマになりますから，それをこれから行わなければならないのではないかという

質

疑

応

答

ことで，先生が言われるように，まだまだまったくわからなくて，それをどうしたらできる座長（須田） 西川先生，どうもありがとうございました．それではご質問，コメントがありましたらお願いいたします．

ようになるかということをしてみたいと思っているわけです．
磯貝行秀（衣笠病 院） 先 生 の お 話 で は，

最 初 に 私 か ら 伺 い た い の で す が，Angio-Angiopoietin-1 で裸の細胞ができるというこ

poietin-1 が pericyte などから出ていて，そのとですが，その内皮細胞というのは，基底膜と安定化に関わるということは，今の先生のビはどのような関係になっているのでしょうか．

デオでも非常によくわかりました．
西川

Actin の活性化は起こるのですが，安定化かどうかはまったくわかりません．
座長

西川

今論文を準備中ですが，電子顕微鏡ももちろんとってありますし，基底膜はキチンとできています．ただ周りの細胞がついてですが内皮細胞は結構動きが鈍くいませんと，先ほども申しましたように，どなって stabilize されるような感じがしました．

うしても浮腫などが起こってきますので，基西川

動き全体はそうですが，ただ細胞レベルでの動きは，逆に活性化されているだろうと思っています．
座長

底膜全体も電顕的に何となく粗になってくるという感じは受けます．
磯貝

先生は糖尿病の網膜症のモデルとしそういう細胞レベルのことと，一番てお話しいただいたと思いますが，普通糖尿最 初 の retina で 示 さ れ た 裸 の 血 管 内 皮 に病の網膜症の場合は，先生のおっしゃる周囲Angiopoietin-1 を加えるとリモデリングが進細胞，pericyte が減って行くわけですが，pe-むというのがどのように関連するのか，あのricyte と endothelial cell の間の interaction が図からは私にはよくわからなかったのです

ありまして，おそらく pericyte が内皮細胞にが，いかがでしょうか．

いろいろな影響を与えているであろう，それ10 第 120 回日本医学会シンポジウム

から内皮細胞そのものは basement membra-は急速に起こせますので，実際に 5 日間のプne の生成に関係していて，普通糖尿病の場

ロ セ ス で pericyte が な く て basement mem-合は，pericyte がなくなると basement mem-brane だけという状況が作れますから，電顕brane は肥厚するわけですね．

的にも basement membrane をもう少し詳し西川それは多分浮腫ではないかと私は思っています．
磯貝や は り basement membrane の 構 造そのものが，たとえば collagen IV が増えるとか，その他いろいろ変わってくるわけですね．
西川く調べられます．そうすると，多分水の content が上がってなっているのではないかというように私どもは解釈していますが，ぜひまた電顕を見ていただきたいと思います．
座長

どうもありがとうございました．

これで同じことが起こります．これ

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