●血管新生の基礎と臨床!!［II］血管新生と腫瘍

6．血管新生とマトリックスメタロプロテアーゼ
杉田憲治＊

マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）
は，種々の疾患と関連が報告されており，これらの中でも最も研究が進んでいるのが腫瘍との関連である．固形腫瘍がある一定以上大きくなるためには，腫瘍に栄養や酸素を供給するための血管新生が必要である．
MMPs は血管周囲の基底膜を分解することにより血管新生を促進することが知られており，腫瘍の増殖への関わりが理解されている．
MMPs にはサブタイプがあり，血管新生には主として基底膜を選択的に分解するゼラチナーゼ群（MMP-2，MMP-9）が関係し，さらにこれらを活性化する MMP-3（ストロメライシン群）や MMP-14（膜型）も関係することが分かってきている．そして生体内の MMP 活性は，産生の制御，プロペプチドの活性化，内在性特異的阻害蛋白である
TIMPs による不活性化などにより制御されている．
MMPs が血管新生や腫瘍の増殖に関係することは，ノックアウトマウスを使った研究や特異的 MMP 阻害薬を使った研究により証明されてきている．そして MMP 活性を阻害することにより，腫瘍の増殖を抑制する目的で MMP 阻害薬の開発研究が精力的に進められてきており，最も進んでいるものが臨床治験第 3 相の段階である．

Matrix Metalloproteases and Tumor Angiogenesis
KENJI SUGITA Diagnostics Department, Shionogi Pharmaceutical Co. & Ltd.
すぎた・けんじ：塩野義製薬株式会社診断薬部部長．昭和47年京都大学理学部卒業．昭和47年塩野義製薬株式会社中央研究所入社．平
成11年現職．主研究領域／腫瘍学．
＊Key words

MMPs の特徴
MMPs の活性制御
MMP ノッ ク ア ウ ト マ
ウス
MMP 阻害薬

血管新生の基礎と臨床 43

置する共通の立体構造を示す．また，亜鉛結合部位のそばに S1’ポケットと呼ばれる部分

1．MMPs の概要が存在し，MMP 阻害薬の酵素特異性に関係する2）．また，MMP 阻害 薬
（BPHA：後 述）が亜

1）MMPs の特徴
MMPs は 4 つの大きなグループとこれらに属するサブタイプがあり，サブタイプは現在鉛と結合し，S1’ポケット部分に入り込んでいる様子を示している．

1）

分かっているだけでも 23 種以上ある ．これらに共通した特徴は，1）活性部位に亜鉛イオンの結合部位がある，2）
活性に 2 価のカルシウムイオンが必要である，3）
共通の一次構2．MMPs の活性制御1）遺伝子レベルでの発現制御造を持っている，4）
潜在型で産生され，自分MMP 遺伝子の発現は，大きく誘導型と恒常自身あるいは他の酵素で切断されることによ型の 2 つに分けられる．誘導型には MMP-1，り活性化される，などである．

3，7，9，
11，12，
13 が属し，TPA や炎症性サイ

2）MMPs の構造

トカイン，増殖因子などで誘導され，主としMMPs はいくつかが X 線解析 に よ り そ のてマクロファージ，好中球，滑膜細胞などで構造が解明されている．図 1 はアミノ酸の主産生される．恒常型には MMP-2，14 の 2 つが鎖で表したMMP-9の立体構造（触媒ドメイン）属し，主として線維芽細胞で産生される．遺である．MMPs は活性中心の亜鉛が中央に位伝子の発現は，そのプロモーター部分に作用する転写因子によって制御されるわけであるが，誘導型のプロモーターには，増殖因子によって誘導される転写因子 ETS の結合部位やこれにより活性化される，転写因子の AP1 の結合部位である TRE が存在するが，恒常型のものにはこれらがない3）．
2）潜在型 MMPs の活性化
MMPs は潜在型 MMPs として産生され，プロペプチド部分が切断されることにより活性化されるわけであるが，その場所が細胞外か，細胞内か，細胞膜上かで 3 つのグループに分類される4）．第 1 のグループは細胞外に放出された後，自分自身あるいは他のプロテアー

図1

MMPs の立体構造

ゼによって切断さ れ て 活 性 型 に な る．第 2

この構造は，MMP-9 の構造（触媒ドメイン）をアミのグループは細胞内でフリンという蛋白分解ノ酸の主鎖で表している．MMPs は共通の立体構造

酵 素 に よ り 切 断 さ れ，活 性 化 さ れ る．第 3を示しており，3 つの α ヘリックスと 5 つの β シートよりなり，活性中心の球状の亜鉛が中央で 3 つののグループは，細胞上にある MMP-14 によりヒスチジンによって支えられている．また，亜鉛結分解を受けて活性化され，これには MMP-2合部位のそばに，MMP 阻害薬の酵素特異性に関係と MMP-13 が入る．

する S1 ポケットが存在する．阻害薬（BPHA）が亜鉛イオンに結合し，さらに S1 ポケット部分に入り込んでいる様子を示している．

44 第 120 回日本医学会シンポジウム

3）内在性特異的阻害蛋白 TIMPs
内 在 性 の MMP 特 異 的 阻 害 蛋 白 で あ る

TIMPs は，正常状態では MMPs を負に制御し局在していることと，同時に MMP-14 もがんているが，何らかの刺激によりこのバランス細胞の膜状に局在していることが観察されが崩れると，MMP 活性が上昇し病態につながた．そしてさらに，内在性の特異的阻害蛋白

る．TIMPs は現在のところ，分子量の違いとである TIMPs のサブタイプである TIMP-2 が結合蛋白の違いにより 4 つのサブタイプに潜在型 MMP-2 の C 端に結合することが分か

5）り，これらの 3 つが結合してコンプレックス分類される ．

を形成することが推測され，次のようなモデ

3．MMPs と腫瘍血管新生および腫瘍増殖ルが提唱された．MMP-2 の活性化は，まずMMP-14 で一部が切断された後，残りを自分自身同士で切断するという 2 段階で起こる

1）MMPs と腫瘍血管新生ことが分かっており，がん細胞膜上の MMP-血管新生は，腫瘍をはじめ動脈硬化，心不14 に，TIMP-2 を介して潜在型の MMP-2 が結全，関節リウマチ，変形骨関節症，糖尿病性合し，近接し た 別 の MMP-14 に よ り 潜 在 型

網膜症などいろいろな疾患に関わることが分MMP-2 が切断され，さらに自分自身同士で切かっている．この中で最も詳しく研究されて断されることにより活性化されるというわけいるのが腫瘍の血管新生である．つまり，腫である．このモデルから，活性型 MMP-2 がが瘍細胞から VEGF などの血管新生因子が産んの周辺に集まっていることが説明され，が生され，これにより刺激を受けた血管内皮細んとの密接な関連も理解されたわけである．

胞が MMPs をはじめとするプロテアーゼを3）MMP-2 ノックアウトマウスでの血管新生産生し，そしてこの MMPs が血管を裏打ちしと腫瘍増殖ている基底膜を分解し，血管内皮細胞は間質

MMP-2 ノックアウトマウスを使った実験へ遊走していき，そして間質中で増殖し，管で，血管新生の未発達あるいはがんの増殖抑腔を形成し，新生血管を構築していく．そし制が観察された8）．血管新生は背部皮下法，て，この血管ががんに到達して，栄養源と酸つまりメンブレンでシールしたチャンバー内素を供給するようになると腫瘍が大きくなっにがん細胞（B16-BL6 マウスメラノーマ細胞）

6）ていくというわけである ．

を植え込み入れ，それを正常マウスおよび

2）MMPs と腫瘍の増殖

MMP-2 ノックアウトマウス背部に植え込み，MMPs の中で腫瘍の血管新 生 に 関 わ る の経時的に血管新生を観察するという方法で調は，血管を裏打ちしている基底膜を構成してべられた．血管新生の程度は，皮筋層の組織いる IV 型コラーゲンを分解するゼラチナー断面を用意し，皮筋層 1 mm 幅当たりの血管ゼ群（MMP-2，MMP-9）で，これらを活性化す

数および血管断面積を計測することにより数る MMP-3（ス ト ロ メ ラ イ シ ン 群）
や MMP-14値化された．
野生型（n=6）に比べ，MMP-2 ノッ（膜型）も関係する．

クアウトマウス（n=7）
では，血管新生についそして，ゼラチナーゼ群の MMP-2 と腫瘍との関連について，以下のことが解明されてて，平均で血管断面積で 56％，血管数で 69％と，有意に減少していた（表 1）．

きている7）．MMP-2 は主としてがん組織より

B16-BL6 マウスメラノーマの背部皮内移植は間質の線維芽細胞で産生されることから，実験（n=9）に お い て，野 生 型 お よ び MMP-2

当初，がんとの関連については疑問視されてノックアウトマウスでの増殖を時間経過でいたが，活性型の MMP-2 はがん細胞周辺に追ったところ，腫瘍の増殖も血管新生と相関
血管新生の基礎と臨床 45して，ノックアウトマウスに移植したほうがているだけである．そして，BPHA はがんに関移植後 3 週間目の測定で 39％ 減少と有意に係 す る MMP-2，MMP-9，
そ し て MMP-14 を 選その増殖が減少していた．

択的に阻害するが，（−）
BPHA はどの酵素も4）特異的 MMP 阻害薬による腫瘍の血管新阻害しなかった．

生阻害や増殖阻害

血管新生は，前述の背部皮下法でチャン

特異的 MMP 阻害薬を使った実験により，

バ ー を マ ウ ス 背 部 に 植 え 込 ん だ あ と，200

MMPs の活性と腫瘍の血管新生および増殖のmg !kg の BPHA および（ − ）BPHA を連日経9）関係がきれいに証明された ．図 2 に，用い口投与し，4 日目の血管数および血管断面積

た BPHA とこれの光学異性体で不活性型のを測定することにより定量化された．がん細（−）BPHA の構造式と酵素阻害のパターンを胞をチャンバーに入れた場合は，入れない場示すが，これらは 1 ヵ所の部位の向きが違っ合に比べ顕著な血管数および血管断面の増加が認められ，そして BPHA 投与により，血管数でも血管断面積でも有意にその増加が抑制

表１MMP-2 ノックアウトマウスにおける血管新生されたが，（−）
BPHA 投与による抑制は認め

血管数 a

血管断面積 a次に BPHA および（−）
BPHA の抗腫瘍活性

58 ± 17

17,750 ± 6,170bc

野生型マウス（n ＝ 6）
ノックアウトマウス（n ＝ 7）40 ± 9られなかった（表 2）．
が調べられた．用いたのはマウスの B16-BL6
メラノーマを背部皮内接種の系で，200 mg!

10,020 ± 2,990

kg の BPHA お よ び（−）
BPHA の 経 口 投 与 にa

チャンバー移植後 4 日目の背部裏側皮膚の皮筋層 1 mm
幅あたりの血管数および血管断面積（µm2）
b野生マウス群に対し有意差ありc
野生マウス群に対し有意差なし

よる影響を調べ，BPHA の連日経口投与（18日間）により有意に腫瘍の増殖の抑制が認められたが，（−）
BPHA では抑制されなかった．

BPHA

SO2NH

IC50

MMP-1
MMP-2
MMP-3
MMP-7
MMP-9
MMP-14

図2（−）BPHACONHOH

97412＞1000795
1617nM
nM
nM
nM
nM
nM

SO2NH

CONHOH＞1000＞1000＞1000＞1000＞1000＞1000

nM
nM
nM
nM
nM
nM

BPHA と（−）BPHA の構造と酵素阻害活性

表の数値は IC50 値（最高酵素活性を 50％ 阻害する化合物の濃度）を nM で示している．
BPHA とその光学異性体（−）BPHA は，その構造が分子 1 ヵ所の向きの違いだけである．これが酵素阻害活性の有無に対応している．さらに BPHA はがんと関連する，
MMP-2，9，14 を選択的に阻害している．

46 第 120 回日本医学会シンポジウム

以 上 の 結 果，特 異 的 MMP 阻 害 薬 で あ る

そして MMP 阻害薬の問題点として，（i）殺BPHA とその不活性型の（−）
BPHA を用いる

細胞作用を持たないので急速ながんの退縮はことにより，MMP 阻害と血管新生阻害および望めない，（ii）効果の判断基準の生存率，ある抗腫瘍作用が関連づけられた9）．

いは無病期間の延長は有効性の判定に多数の治験数と時間（3〜5 年）が必要である，などである．

4．MMP 阻害薬の開発状況
表 3 は，現在腫瘍をターゲットにした臨床おわりに

開 発 中 の MMP 阻 害 薬 を ま と め た も の で あ

MMP 阻害薬は血管新生に関わる MMPs をる．
British Biotechnology 社のマリマスタット

阻害することにより，腫瘍の増殖を抑制する（Marimastat）と AE terna Lab. のネオバスタッと い う 根 拠 に 基 づ く 治 療（Evidence-basedト（Neovastat : AE941）
が 臨 床 治 験 第3相medicine）に沿った薬剤である．

（Phase 3）の段階で，他の 4 つの化合物がこれらに続いている．

そして，多くの血管新生阻害薬の中でも，開発の進んでいる MMP 阻害薬に対する期待

MMP 阻害薬の特徴は，1）ほとんどの固形は大きく，精力的に開発研究が進められてき腫瘍が対象で，広範囲の抗腫瘍スペクトラムており，進んでいるも の は す で に 臨 床 第 3を示す，2）従来の抗がん薬に見られるよう相の段階であり，一刻も早く臨床開発が進んな体重減少，あるいは血球系の減少という毒で，病棟での制がん薬としての位置づけが確性は認められない，ということである．

立されることを期待したい．

表２

MMP 阻害薬による血管新生阻害

血管新生誘導薬剤 a

血管数 b

血管断面積 b

HBSS
HT-1080
HT-1080
HT-1080なし
コントロールBPHA（−）BPHA

2.6 ± 3.2
25.6 ± 7.4
6.5 ± 4.9c
20.8 ± 7.9d

368.3 ± 354.5
6,375.2 ± 1,911.6
1,350.2 ± 1,088.9
5,259.0 ± 2,185.2

a

BPHA あるいは（−）BPHA を 200 mg/kg で 1 日 2 回経口投与した．
チャンバー移植後 4 日目の背部裏側皮膚の皮筋層 1 mm 幅あたりの血管数および血管断面積（µm2）
c
コントロール群に対し有意差あり
d
コントロール群に対し有意差なしb

表３化合物
マリマスタット
ネオバスタットBMS-275291
プリノマスタット
メタスタット
S-3304

臨床開発中の MMP 阻害薬

段階
臨床治験第 3 相
臨床治験第 3 相
臨床治験第 2/3 相
臨床治験第 2 相
臨床治験第 1/2 相
臨床治験第 1 相

開発者
British Biotechnology 社
AE terna/Medac/Ferrer 社
Bristol-Meyers Squibb 社
Agouron 社
CollaGenex 社 /NC¿
塩野義製薬株式会社

血管新生の基礎と臨床 47

は，関節リウマチと変形骨関節症に今 phase〔文献〕
1）中島元夫：マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬．蛋白核酸酵素 2000 ; 45 : 1083―1089.
2）Kiyama R, Tamura Y, Watanabe F, et al. : Homology
modeling of gelatinase catalytic domains and docking
stimulations of novel sulfonamide inhibitors . J Med
Chem 1999 ; 42 : 1723―1738.
3）佐藤 博：MMP 遺伝子発現制御機構．現代医療
2000 ; 32 : 879―884.
4）Nagase H : Activation Mechanisms of Matrix Metalloproteinases. Biol Chem 1997 ; 378 : 151―160.
5） Cawston T : Matrix Metallproteinases and TIMPs :properties and implications for the rheumatic diseases . Molecular Medicine Today （. Review ） 1998
（March）; 130―137.
6）Liotta LA, Tryggvason Km Moor WGI, et al. : Metastatic potential correlates with enzymatic degradationof basement membrane collagen. Nature 1980 ; 284 :67―68.
7）清水元治：細胞外基質分解酵素．膜型マトリックス
メタロプロテアーゼと癌．実験医学（増刊）1998 ; 16（16）: 64―69.
8）Itoh T, Tanioka M, Yoshida H, et al. : Reduced angiogenesis and tumor progression in gelatinase A-deficient mice. Cancer Res, 1998 ; 58 : 1048―1051.
9）Maekawa R, Maki H, Yoshida H, et al. : Correlation ofantiangiogenic and antitumor efficacy of N-biphenyl
sulfonylphenylalanine hydroxamic acid （ BPHA ）, an
orally-active , selective matrix metalloproteinase inhibitor. Cancer Res 1999 ; 59 : 1231―1235.

1 の段階ということです．他に心不全とか糖尿病性網膜症に応用しようと研究が行われていると聞いています．
片桐

動脈硬化などはまだですか．

杉田

申しわけありませんが，動脈硬化のことは知りません．私どもの研究所でも動物実験で行いましたが，残念ながらよいものが見つからなかったというのが結果です．しかし多くのところで行っていると思います．
吉澤穣治（慈恵医大） 血管新生阻害薬の副作用のことですが，腫瘍血管の血管細胞の新生を抑制すると同時に，正常血管細胞の抑制ということが問題になると思うのです．MMPの阻害剤の副作用についてはいかがでしょうか．
杉田

理屈からいいまして，当然サリドマイドに見られたように，胎児期に投与しますと危険だと思います．他のものについては今のところわかっていませんが，たとえば創傷治癒と申しますか，怪我をした人が治りにくいとかということがあるかもしれません．今のところ副作用までは詳しく見ていないのです．
中村敏一（大阪大） 今制がん効果を見られた の は tumor mass が moderate に 抑 制 さ れると い う effect で す ね．Moderate と い う のは，MMP の阻害ということから見れば，論理質

疑応

答

的 に そ う だ と 思 う の で す．問 題 は，tumormass が moderate であっても，浸潤，転移が強座長（澁谷） どうもありがとうございましくブロックされたら，それは制がん薬としてた．それではご質問，ご討論をお願いいたし大変優れていると思うのです．問題の浸潤，ます．

転移を見られた成果がありましたら教えてい片桐秀樹（東北大） MMP については，今回は基本的には血管新生のお話をなさったと思

ただきたいと思います．
杉田

臨床治験で転移を見るのは非常に大います．一方，先ほどのスライドにもありま変で，残念ながら治験ができていないというしたように，RA や動脈硬化などにも影響がのが現状と思います．

あると思いますが，MMP の阻害薬によるそち中村

動物レベルではいかがですか．

らのほうの治療はどの程度進んでいるものな杉田

動物レベルでは十分によく効きます．のでしょうか．

中村

がん腫はどのような種類を使われて杉田

今のところ，私の知っている限りで48 第 120 回日本医学会シンポジウム

いますか．どこへの転移ですか杉田

それは今のところ実験的な転移しかまっていると考えてよろしいのでしょうか．

見ておりません．あるいは大腸がんの肝転移

それでも実際に細かく見ますとまた違った像など，あまり通常で行われているよりは，マが見えるなど，そういうところはいかがでウスレベルの話でしか行っていませんので．

しょうか．

中村

それでよいのですが，そういう成果が見られますか．

杉田

細かく見たわけではないので，今の先生のご質問にお答えできないかと思います杉田十分に見られます．

が，行った実験はやはり最初から増えてくる

座長

私から一つだけ短い質問をいたしま

ところから阻害薬が働いているということにすが，chamber で血管新生が MMP 阻害でかなりますので，かなり初期から効かせている

なり抑えられているときは，いちおう今までと申しますか，そのようなものを見たというのモデルでは既存の血管から最初に protein-ように考えていただけるとよいかと思います．

ase で周りが消化されて，血管の出芽が生じ

座長

どうもありがとうございました．

ると言われていますが，そこのところは止血管新生の基礎と臨床 49