生物物理 58（5），251-254（2018）
DOI: 10.2142/biophys.58.251
受理日：2018 年 7 月 4 日

トピックス

分子動力学シミュレーションとNMR法で迫る
べん毛モーターの回転制御機構
宮ノ入洋平1,2，土方敦司3，本間道夫2,4

1.

1

大阪大学蛋白質研究所

2

名古屋大学大学院理学研究科附属構造生物学研究センター

3

長浜バイオ大学バイオサイエンス学部

4

名古屋大学大学院理学研究科生命理学専攻

はじめに

2.

細菌のべん毛生体高分子の機能を詳細に解明するためには，その大腸菌やサルモネラ菌などの運動性細菌は，べん毛立体構造を動的な観点から理解することが必要となと呼ばれる独自の運動器官を用いて，自身の運動を精る．特に，蛋白質が有するは，生命機能の密に制御している．べん毛は体長の数倍にも及ぶらせ発現と密接に関連することが示唆されており，盛ん揺らぎん状の繊維部分と，細胞表面に埋め込まれたモーターに研究されている．蛋白質の動態構造を原子分解能で部分で構成されている．モーター部分は，50 nm 程度明らかにする手法は，クライオ電子顕微鏡，X 線結晶の小さな器官であるが，秒速 300 回転以上の速さで回構造解析等が挙げられるが，その中でも核磁気共鳴転し，かつ，回転方向を瞬時に変換することができ（nuclear magnetic resonances：NMR）法は，幅広い時間域る，極めて高い性能を有している．べん毛モーターのの動態を捉えることができるユニークな手法である．

回転制御機構の解明は，細菌の生命活動や病原性細菌

近 年 で は， 立 体 整 列 同 位 体 標 識（stereo array isotopeによる感染経路の解明といった，生物学や医学的な観

labeling: SAIL）法をはじめ，高度な安定同位体標識技点のみならず，生体ナノマシンへの応用といった工学術が確立され，40 kDa 以上の高分子量蛋白質におい的側面からも注目されている．べん毛モーターは，約ても精密な立体構造解析が可能となった．また，アミ20 種の蛋白質によって構成され，各々が動的な相互ノ酸残基側鎖が関与する交換運動を定量的に捉える手作用をすることで，上述のような優れたモーター特性法も開発されている 1)．現在，1.2 GHz 超高磁場 NMRを生み出している．特に，回転力を生み出すモーター装置の稼働が見据えられており，今後，様々な蛋白質の主要部分は，固定子や回転子の役割を担う蛋白質複の構造動態研究が展開されることが予想される．特合体が集合した超分子構造体である．この超分子モーに，分子間相互作用に伴う動態変化は，蛋白質の分子ターを介した H+ や Na+ の流入が，細胞内外での電気認識機構の解明のみならず，創薬研究においても，新化学的ポテンシャル差を力学エネルギーに変換し，べたな知見を与えることが期待される．このような背景

ん毛モーターを回転することになる 3)．これまで多くから，実験により得られた構造動態を，精密かつ妥当の研究者が，様々な細菌を対象に，べん毛モーター全性の高い描像として表現することが重要となる．近体の構造解析や各種構成因子の機能解析を進めてき年，分子動力学（molecular dynamics: MD）シミュレーた．我々は，海洋性ビブリオ菌のべん毛モーターを対ションを用いた動態モデルの解析と NMR 法の活用に

象に，回転子リング構造の一つである C リングに注より，様々な生命現象が明らかにされている 2)．本稿

目してきた．C リングは FliG，FliM および FliN 蛋白

では，細菌の運動装置であるべん毛の回転メカニズム質によって構成され，互いが相互作用することで，回の解明に向けた NMR 法と MD シミュレーションを用転運動を制御することが示唆されてきた．特に，FliG

いた研究について紹介する．

は FliM や固定子との相互作用を介して，回転方向の切り替え（スイッチング）を制御していると考えられDynamic Structure of C-terminal Domain of FliG Revealed by NMR and MD Simulation Analysis
Yohei MIYANOIRI1,2, Atsushi HIJIKATA3 and Michio HOMMA2,41
Institute for Protein Research, Osaka University
2
Structural Biology Research Center, Graduate School of Science, Nagoya University
3
Department of Bioscience, Nagahama Institute of Bio-Science and Technology
4
Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University251

べん毛モーター蛋白質の構造動態解析ている．そこで，FliG の構造動態を解析し，スイッチの結果とよく一致していた．一方，A282T 変異体のング機構の解明に迫った ．

NMR スペクトルは，野生型と比較して大きく変化し4)3.ていることが分かった．両者の 1H-15N HSQC スペク

FliG の NMR 解析

トルを比較すると，アミノ酸変異が施された A282 付

FliG は N 末側より，N 末端ドメイン，中間ドメイ近（α3 の C 末端）だけでなく，α1，α5 および α6 にン，C 末端ドメインから構成されている．これまでのおいても NMR 信号の変化が観測された（図 1）．特研究から，各ドメイン間の相互作用が回転方向の変換に α1 に由来する NMR 信号は，A282T 変異体では感制御やトルク発生に関与していることが示唆されてい度の大幅な低下，線幅の広幅化が顕著となり，帰属するが，C 末端ドメイン（FliGc）は固定子蛋白質とのることができなかった．さらに，両者についてアミド相互作用など，特に重要な役割を担っていると考えら

基 15N 窒素に対して，横緩和速度定数の解析を行っれている．実際，FliGc 中の一部アミノ酸を置換するた．その結果，野生型と比較して A282T 変異体では，と，回転方向に異常を示す表現型が確認された ．野

変異箇所に対応する α3-α4 領域で，ミリ秒オーダーの5)生型では，べん毛モーターの回転方向を，時計回り遅い交換運動が存在することが示唆された．これらの（CW）と反時計回り（CCW）に変換することが可能

結果から，A282T 変異に伴い，特に α1 領域を中心にであるが，282 番目のアラニン残基をスレオニン残基FliGc に構造変化が起こり，α3-α4 領域で，新たに遅いに置換した A282T 変異体では，回転方向が CW に固揺らぎが生じることが示唆された．

定 さ れ て し ま う こ と が 明 ら か と な っ た． そ こ で，

4.

FliGc および FliGcA282T について NMR 測定を行い，FliG の MD シミュレーション解析

NMR 解析より，FliGc と FliGcA282T 変異体の間で，両者の動態構造を比較した．
C，15N で安定同位体標識した FliGc および FliGc

構造動態に違いがみられることが示唆された．そこ

A282T 変異体を調製し，NMR 信号の帰属を行った．

で，両者についての MD シミュレーションを行い，各原子の化学シフトの解析から，FliGc の 253 番目の動的構造の違いについて解析した．

13

メチオニン残基（M253）から C 末端の Leu 残基（L351）ビブリオ菌 FliG の立体構造はまだ実験的に決定さまでの領域に，6 本の α ヘリックスが存在することがれていないため，まず T. maritima FliG の結晶構造 6) を分 か っ た（図 1；α1：F256-V260，α2：D264-R272，α3：

テンプレートとして，ビブリオ菌 FliG の G214-L351

Q276-L283，α4：D288-K296，α5：K300-E311，α6：領域を対象に MODELLER を用いて立体構造モデルを

V318-D337）．これは，他の細菌由来の FliG 結晶構造 6)構築した．両者のアミノ酸配列は，独自の手法である

図1
FliGc および FliGcA282T の NMR 解析．（a）FliGc［黒］，FliGcA282T［赤］の 1H-15N HSQC スペクトルの重ね合わせ図．変異に伴い化学シフトの変化［矢印］やシグナルの消失［破線部］がみられる．（b）A282T 変異に伴い大きな化学シフトした領域を青色，シグナルが消失した領域を赤色で構造モデル上にマップした．

252

べん毛モーター蛋白質の構造動態解析

ALAdeGAP を用いてアラインメントした 7)．得られた

相 対 配 置 が 異 な っ て い る こ と が 明 ら か と な っ た．

モデル構造は，テンプレート構造や NMR スペクトル

FliGc においては，両者間の距離が 9.5-10.4 Å であるの解析でみられたように，M253-L351 の領域は 6 つののに対し，FliGcA282T はそれよりも大きく約 11 Å にα ヘリックス構造をとり，また G214-L252 の領域は，

ピ ー ク を 持 っ て い た． こ の 差 異 は，α1 に 存 在 す る

ARMc と 呼 ば れ る armadillo 様 構 造 を と る（図 2）．

F256 と α3 末端の A282 との間にある疎水性相互作用

FliGcA282T 変異体の構造モデルについては，FliGc のが，T282 への置換によって立体障害を受けることに構 造 モ デ ル を も と に 構 築 し た．FliGc お よ び

起 因 す る と 考 え ら れ た． こ の MD の 解 析 結 果 は，

FliGcA282T の 立 体 構 造 モ デ ル を GROMACS に 供

NMR 解析においてみられた α1 領域の構造変化と対し，MD シミュレーション（各 500 ナノ秒× 3 回）を応していると考えられる．先行研究において，F256行った結果，両者間で興味深い差異が見いだされた．

が存在する MFXF モチーフ

まず，MD トラジェクトリ中の FliGc 構造のクラス制御することが示唆されており 8)，今回の解析結果よター解析をすると，少なくとも 3 つのコンフォメーり得られた相互作用をサポートするものと考えられションが存在していることが明らかとなった．一方，る．さらに，FliGcA282T のシミュレーションにおい

FliGcA282T に お い て は， 主 に 単 一 の コ ン フ ォ メ ーては，アミノ酸変異箇所である 282 番目のスレオニンションをとっており，構造変化が制限されていること残基（T282）の側鎖 OH 基が，近接する α3 に存在すが示唆された（図 2）．両者の構造分布の違いが，立る V278 の主鎖カルボニル基と新たに水素結合を形成体構造のどの領域に起因するかについてシミュレーしていた．この水素結合の形成が，α3-α4 領域の構造ションデータを解析したところ，α1 領域と α4 領域の動態に影響を与えていると考えられる．先述の NMRは FliGc の相対配置を

図2
FliGc および FliGcA282T のシミュレーション解析．（a）FliGc ではサブマイクロ秒オーダーで 3 つのコンフォメーションが存在しており，MFXF-α1 領域（赤色）および ARM 領域（茶色：一部表示）が大きく変動している．（b）FliGcA282T では，主に単一のコンフォメーションをとる．F256 と T282 の側鎖が立体障害となるため，コンフォメーションが限定されることが示唆された．

253

べん毛モーター蛋白質の構造動態解析

解析の結果でも，α3-α4 の領域は FliGc と FliGcA282T

6)

Brown, P. N. et al. (2002) EMBO J. 21, 3225-3234. DOI: 10.1093/
emboj/cdf332.とを比較した際に，化学シフト変化がみられていた．

7)

同時に，FliGcA282T においては，同領域で，ミリ秒Hijikata, A. et al. (2011) Proteins 79, 1868-1877. DOI: 10.1002/
prot.23011.

オーダーの遅い運動が存在することが示唆されてお

8)

り，MD シミュレーションの結果は，これらの実験結Lee, L. K. et al. (2010) Nature 466, 996-1000. DOI: 10.1038/
nature09300.

果と矛盾しないと考えられる．
以上の解析より，FliGc においては，MFXF モチー
フを含む α1 領域を蝶番として，α ヘリックス間の分子内相互作用が回転方向のスイッチングに関与していることが示唆された 4)．
おわりに

5.

NMR 法による主鎖アミド基の化学シフト変化ならびに横緩和速度定数の解析と MD シミュレーションを活用することで，FliGc の構造動態解明に迫った．

宮ノ入洋平

FliGc では α1 領域を介した分子内相互作用により構造変換が引き起こされており，このことが回転方向のスイッチングに寄与していると考えられた．今後は，FliG と FliM の間の相互作用や C リング構造を対象とした NMR 解析ならびに MD シミュレーションを進め，モーター構成蛋白質の局所的な構造動態が，べん毛超分子モーターならびに細菌の運動を如何にして制御しているのか明らかにしていきたい．

土方敦司

文 献1)

Miyanoiri, Y. et al. (2018) Mod. Magn. Res. 2, 1-18. DOI:
10.1007/978-3-319-28275-6_48-1.

2)

Nygaard, R. et al. (2013) Cell 152, 532-542. DOI: 10.1016/
j.cell.2013.01.008.

3)

Li, N. et al. (2011) Genes Cells 16, 985-999. DOI: 10.1111/j.13652443.2011.01545.x.

4)

本間道夫

Miyanoiri, Y. et al. (2017) Structure 25, 1540-1548.e3. DOI:
10.1016/j.str.2017.08.010.

5)

Kojima, S. et al. (2011) J. Mol. Biol. 414, 62-74. DOI: 10.1016/
j.jmb.2011.09.0919.

トピックス

254

宮ノ入洋平（みやのいり ようへい）
大阪大学蛋白質研究所准教授
2004 年日本学術振興会特別研究員，05 年横浜国立大学大学院環境情報学府修了（博士（工学）），06 年香港科技大学生化学科博士研究員，08 年名
古屋大学大学院理学研究科博士研究員，11 年同・特任助教を経て，17 年より現職．
研究内容：NMR 法を用いた蛋白質の動態解析
連絡先：〒 565-0871 大阪府吹田市山田丘 3-2
E-mail: y-miyanoiri@protein.osaka-u.ac.jp
URL: http://www.protein.osaka-u.ac.jp/rcsfp/apc/nmr/
土方敦司（ひじかた あつし）
長浜バイオ大学バイオサイエンス学部特任講師
2002 年日本学術振興会特別研究員，04 年名古屋大学大学院理学研究科単位取得退学（13 年博士（理学）），04 年理化学研究所リサーチアソシエイ
トを経て，12 年 11 月より現職．
研究内容：構造バイオインフォマティクスを用いたゲノム変異解析
連絡先：〒 526-0829 滋賀県長浜市田村町 1266
E-mail: a_hijikata@nagahama-i-bio.ac.jp
本間道夫（ほんま みちお）
名古屋大学大学院理学研究科教授
1985 年東京大学大学院理学研究科博士課程修了．
理学博士．85 年米国エール大学分子生物物理生
化学科博士研究員，88 年名古屋大学付属病態制御研究施設講師，92 年名古屋大学大学院理学研究科助教授，97 年より現職．
研究内容：細菌べん毛超分子回転モーターのエネ
ルギー変換機構の解明
連絡先：〒464-8602 愛知県名古屋市千種区不老町
E-mail: g44416a@cc.nagoya-u.ac.jp
URL: http://133.6.129.176/~bunshi4/fourth.html