Cbln1－デルタ２グルタミン酸受容体シグナリングはいかにシナプス形成・維持とシナプス可塑性を制御しているか？

幸田 和久
聖マリアンナ医科大学生理学教室

デルタ２グルタミン酸受容体とは？
グルタミン酸受容体
イオンチャンネル型(ionotropic)

AMPA・KA型
NMDA型
δ型 （GluD)

GluR1-4 / GluR5,6 KA1,2
NR1, NR2A-D, NR3A,B
δ1, δ2代謝型(metabotropic)

Group IGroup IIGroup III

mGluR1, 5
mGluR2, 3mGluR4, 6, 7, 8

GluD2は・・・

calbindin

GluD2・ 小脳プルキンエ細胞にほぼ特異的に発現。
・ グルタミン酸や類似アミノ酸でイオンチャネル活性が見られない。

ML・ グルタミン酸や類似アミノ酸が結合しない。
PCL

GluD2はorphan receptorであるGL

Cbln1とは？
C1qファミリー分子

Cbln1
顆粒細胞に発現する機能不明の分泌タンパク質
Cbln1 (ISH)ML

Cbln1PCLGLどこが異常でしょう？
正常

Neurology 2005

A 17-year-old boy
Moderate ataxia, mild dysmetria, no nystagmus, mild mental retardation
Attends a normal school, to which he gets by bicycle

小脳の解剖
小葉（lobule）

プルキンエ細胞

顆粒細胞

A Color Atlas of the Brain & Spinal Cord

小脳皮質の神経回路
平行線維
小脳皮質

プルキンエ細胞

入力

苔状線維
登上線維

顆粒細胞

登上線維
小脳髄質

苔状線維

深部小脳核

プルキンエ線維↓深部小脳核 深部小脳核↓
橋、脊髄、前庭核、視床などへ

下オリーブ核下オリーブ核橋、脊髄、前庭核など

大脳出力

脊髄

感覚、運動情報（脊髄、大脳など）
誤差情報Marr-Albus-Ito （MAIT） モデル
Marr (1969), Albus (1971）がモデルを提唱

David Marr入力
苔状線
維James Albus

小脳前ニューロン

平行線
維
顆粒細胞

可塑性（depression）
プルキンエ細胞

登上線維

教師信号

下オリーブ核伊藤正男（伊藤正男 脳の設計図）

LTDの誘導平行線維と登上線維の同時入力

平行線維(parallel fiber; PF)

プルキンエ細胞(Purkinje cell ; PC)
登上線維(climbing fiber; CF)

平行線維－プルキンエ細胞シナプスの伝達効率が低下

LTDの実体はシナプス表面のAMPA受容体の数の減少
平行線維

JNC ’99, EMBO J ’00

AMPA受容体

mGluR1
受容体

P

GRIP
Ca2+

PKC

プルキンエ細胞樹状突起

プルキンエ細胞の応答

S880

P

エンドサイトーシス

LTDの実体はAMPA受容体の数の減少(2)視運動反応（optokinetic response）のadaptationによって、平行線維－プルキンエ細胞シナプスのAMPARの数が減少する
OKR（－）

OKR（＋）

GluD2

AMPAR

100 nmWang et al. PNAS ’14

GluD2はシナプス形成とシナプス可塑性に関与
δ2 plays roles in functional and structural plasticity.
GluD2をノックアウトすると・・・

F1. no LTD(Kashiwabuchi et al. Cell ‘95)

PF

機能的異常
F1. 平行線維(PF)-プルキンエ細胞（PC)間シナプスのLTDの障害

M1. Naked spines

形態的異常M1. シナプス前成分を伴わないPCの神経棘（spine）
naked spines (free spines)

PC

行動学的異常B1. 運動失調
B2. 小脳依存性学習の障害（瞬目条件付け、前庭動眼反射など）

Cbln1KOの表現型もほぼ同じ
GluD2, Cbln1はどのように機能するか？

M1. Naked spines表現型回復実験
グルタミン酸受容体の機能的モジュール

GluD2KOマウスのPC
X

N-terminal
domainGluD2mutant のトランスジーン（トランスジェニックマウス、ウイルスベクター）

Ligand binding
Channel poreProtein-protein
interaction

GluD2KOマウスの異常表現型(1) LTDの障害(2) シナプス形成の障害(3) 運動失調、運動学習の障害回復するか？

表現型回復実験(2)トランスジェニックマウスの作成
KOバックグラウンド
WT vs mutant

GluD2wt or mutant
L7 (pcp2)

シンドビスウイルスベクターを用いた遺伝子の導入
GluD2wt or mutant
SG1

nYFP
SG2

GluD2欠損マウスのプルキンエ細胞へ
GluD2の変異体を導入
nYFP

24 hrs after injection

チャネルポア変異体はLTDを回復させた
GluD2

チャネルポア変異体

GluD2欠損マウスのプルキンエ細胞へ
GluD2のチャネルポア変異体を導入

nYFP
GluD2

シナプス伝達効率

ベクターのみ野生型
GluD2
チャネルポア変異体
LTD誘導刺激

Kakegawa et al. ’07

チャネルポア変異体は失調歩行を回復させた・チャネルポア変異体
・nYFPのみ

GluD2のチャネルポア変異体は、LTDを回復
運動障害を回復

GluD2はチャネルとして機能していない

GluD2∆CT7 の導入によって、LTDは回復しなかった
GluD2∆CT7

トランスジェニックマウス
GluD2KO
GluD2∆CT7
GluD2WT
LTD誘導刺激X
GluD2WTGluD2∆CT7

GluD2∆CT7

GluD2KO

GluD2WT

・・・

delphilin
PTPMEG
PSD93
S-SCAMnPIST

GluD2KOPDZタンパク質

Kohda et al, ’07, Kakegawa et al. ’08

GluD2∆CT7 の導入によって、LTDは回復しなかった
瞬目条件付け：小脳依存性の学習
条件刺激（音）無条件刺激（電気ショック）音
電気ショックWT

条件反応(%)

GluD2WTGluD2KO
GluD2∆CT7

Kohda et al, ’07, Kakegawa et al. ’08

GluA2の2つのリン酸化部位
GluA2

1. S880のPKCによるリン酸化
平行線維－プルキンエ細胞シナプスのLTDに必須
平行線維

mGluR1
受容体
Y876
S880

Ca2+GRIPP

AMPA受容体
S880

PKC

プルキンエ細胞樹状突起

2. Y876 phosphorylation
海馬におけるLTDではY876のリン酸化？ 脱リン酸化？

チロシンリン酸化とGluD2
GluD2
・ DelphilinはSrcに結合する(Miyagi et al. JNS ’02)

・ Delphilin-KOマウスは LTDが増強(Takeuchi et al. PloS One ’08)

・ PTPMEG-KO マウスはLTDが減弱
delphilin
PTPMEG
PSD93S-SCAM
nPIST(Kina et al. EJN ’07)

PTPMEGによるGluA2-Y876の脱リン酸化がLTD誘導に必要ではないか？

PTPMEGの活性とそのGluD2への結合がLTD誘導に必要
PTPMEG

Ferm domain

PDZ

PTP

PTPMEGDAPTPMEGDA-∆PDZ*(脱リン酸化活性を失った変異体)*

Sindbisvirus vector

Kohda et al. PNAS ’13

GluA2はPTPMEGの基質である
Substrate trapping

869

Pulled down:
GST-PTPWT

873 876

GluA2-CT･･･NFATYKEGYNVYGIESVKI

pep-3pY

YKEGYNVYGP
P P+-++p880

DA

VCP
NSF

GST

phosphorylationlevel of pep-3pY

GluA2*p876*GST

10The lysates of HEK293 cells
expressing GluA2Kohda et al. PNAS ’13

Src
boiled Src
PKC

PTP:

WTDA

CS

“phosphatase-inactive”

S880 phosphorylation level

input

GST-GluA2-CT

in vitro dephosphorylation assay

*10.8
0.6
0.4
0.20+-++

GluA2-Y876の脱リン酸化がLTD誘導の十分条件
Sindbisvirus vector

869

873 876

GluA2WT･･･NFATYKEGYNVYGIESVKI

GluA2Y876F･･･NFATYKEGYNVFGIESVKI

GluA2Y869F, Y873F ･･･NFATFKEGFNVYGIESVKI

Kohda et al. PNAS ’13

GluD2-PTPMEGはLTDの扉を開くWT
GluD2

GluD2-KO, PTPMEG-KO

GluA2

mGluR1

Y876 P
S880

PTPMEG

GluA2

Y876 P
S880

LTD誘導刺激

GRIP

Y876
S880P

PKC

Endocytosis （LTD）

Y876 P
S880

mGluR1

Nrx-Cbln1-GluD2の複合体がシナプス形成を促す
Cbln1とGluD2
Cbln1とneurexin
GluD2
GFP

HEK293 cells

GFP + Syn

Syn
Matsuda et al. Science ’10
Matsuda et al. EJN ’11

Nrx-Cbln1-GluD2の複合体がシナプス形成を促す(2)Neurexin, Cbln1, GluD2の3者
コンプレックス

初代培養プルキンエ細胞

Matsuda et al. EJN ’11

Nrx-Cbln1-GluD2系によるシナプス形成シナプス・オーガナイザー

シナプス前部

GluD2

GluD2 : Cbln1 : Neurexin = 1 : 2 : 2
（4量体）

（6量体）

シナプス後部
シナプス可塑性

Cbln1-KOマウスでは、なぜLTDが起きないのか？

Elegheert et al. Science ’16