特集 世界を救え 〜 SFC バイオの挑戦［研究論文］

腸内代謝物質を標的としたメタボローム
解析のための代謝物質抽出条件の比較
The Comparison of Extraction Methods for the
Analysis of Gut Luminal Metabolites
石井 千晴

慶應義塾大学大学院政策・メディア研究科後期博士課程
Chiharu Ishii
Doctoral Program, Graduate School of Media and Governance, Keio University

中西 裕美子慶應義塾大学大学院政策・メディア研究科研究員
Yumiko Nakanishi
Project Researcher, Graduate School of Media and Governance, Keio University

冨田 勝

慶應義塾大学環境情報学部教授
Masaru Tomita
Professor, Faculty of Environment and Information Studies, Keio University

福田 真嗣

慶應義塾大学大学院政策・メディア研究科特任准教授
Shinji Fukuda
Project Associate Professor, Graduate School of Media and Governance, Keio University

Abstract:

腸管内代謝 物質のメタボロミクス研 究は、宿 主と腸内細菌 叢との相互 作 用を 理 解 す る 上 で 重 要 で あるが、そ の 分 析 手 法 は 一 般 化され てい な い。 本 研 究 で は、ヒト糞 便 から 代 謝 物 質 を 抽 出 す る 際 の 溶 媒 や菌体 破 砕の有無などが、陽イオン性 代謝 物 質プロファイルに及ぼす影響 を 比 較した。 検 出され た 141 物 質 のうち溶 媒 の 違 いによって 29 物
質、菌 体 破 砕の有 無によって 7 物 質の濃 度が有 意に異なった。ヒト糞便の代謝物質プロファイルは抽出条件によって異なることが示唆されたため、目的に応じて適切な抽出手法を選択する必要があると考えられる。
Analyses of gut luminal metabolites are important in revealing therelationships between metabolism of intestinal microbiota and host. However,current extraction methods of fecal metabolites are not standardized. In orderto understand the impact of varying extraction methods on fecal metabolite
composition, we compared metabolome profiles that were obtained from methods414

腸内代謝物質を標的としたメタボローム解析のための代謝物質抽出条件の比較
that are different in fraction, solvent and with or without bacterial cell disruption.
From our results, a total of 141 metabolites was detected. Concentrations of 29
metabolites and 7 metabolites were significantly altered by using different solventsand treatment cell disruption, respectively. Since our results suggested thatmetabolome profiles can be altered by varying extraction methods, it is importantto select an extraction method that is suitable for the purpose.

Keywords: 腸内代謝物質、メタボローム解析、抽出、条件検討、CE-TOFMS
gut luminal metabolite, metabolomics, sample preparation method,
CE-TOFMS

１ 序論
ヒトの腸管内には重さにして約 1.5 kg、数百種類以上にもおよぶ腸内細菌が棲息しており、これら腸内細菌の群衆を腸内細菌叢と呼ぶ。腸内細菌叢は難消化性多糖の分解、必須栄養素であるビタミン等の産生、免疫システムの構築、病原性菌の増殖抑制などの役割を担っており、われわれの恒常性を維持するために重要な存在である。しかし、腸内細菌叢のバランスが崩れることにより、大腸がんなどをはじめとする様々な腸疾患 (Arthur, et al., 2012;
Belcheva, et al., 2014; Garrett, et al., 2007)、2 型糖尿病などのメタボリックシ
ンドローム (Karlsson, et al., 2013; Qin, et al., 2012; Vijay-Kumar, et al., 2010)、
肥満の発症 (Ridaura, et al., 2013; Schulz, et al., 2014; Turnbaugh, et al., 2006)などにつながることが示唆されている。さらに、近年では偽膜性腸炎患者の腸内に健康なヒトの糞便懸濁液を移入することで、従来の抗生物質を用いた治療法よりも高い治療効果を得られたことが報告されており、バランスのよい腸内細菌叢を腸管内へ投与することによる腸内環境の改善が疾患の治療に役立つ可能性も提示されている (van Nood, et al., 2013)。したがって、われわ
れの健康を維持するためには腸内細菌叢全体を包括的に理解し、それらのバ
ランスを保つことが重要である。
このように腸内細菌叢とわれわれの健康との関連が指摘されているが、腸内細菌叢が人体に影響をおよぼすメカニズムについては未だに不明瞭な点が多い。近年、腸内細菌叢のメタゲノム解析やメタトランスクリプトーム解析
により、腸内細菌叢の構成や遺伝子情報を得ることが可能になり、その生理
KEIO SFC JOURNAL Vol.15 No.1 2015415

特集 世界を救え 〜 SFC バイオの挑戦

学的機能が明らかになりつつある。しかし、腸内細菌叢の機能をより詳細に理解するためには、遺伝子情報だけでなく、腸内に存在する代謝物質の情報を網羅的に取得することが重要である。これらの代謝物質は宿主と腸内細菌叢とのやり取りの結果として生じ、腸内細菌叢と宿主に共通して利用されると考えられる。近年の研究によってこのような腸内代謝物質の重要性は次第に明らかになっており、中でも短鎖脂肪酸や二次胆汁酸が宿主におよぼす影
響が注目されている。腸内細菌が産生する酪酸は宿主の制御性 T 細胞を分化誘導することで腸管の炎症を軽減させることや (Furusawa, et al., 2013)、酢酸を含む短鎖脂肪酸は全身のエネルギー代謝を活性化し、肥満を防止することが報告されている (Kimura, et al., 2013)。しかしその一方で、腸内細菌が一次胆汁酸を代謝して産生する二次胆汁酸は、肝臓がんの発症を促進することが報告されている (Yoshimoto, et al., 2013)。このように腸内細菌叢から産生される代謝物質には正負両面の機能があり、腸内代謝物質についてさらなる知見を得ることは腸内細菌叢—宿主間相互作用メカニズムの解明において重要である。さらに、腸内代謝物質の網羅的な解析を行うことで、腸内細菌が産生する新規機能物質の探索や、腸内代謝物質プロファイルによる腸内環境の評価が可能になると考えられ、将来的には腸炎などの治療に用いる糞便検体の選定など、多岐にわたる用途において有用であり、重要な研究課題である。
われわれはキャピラリー電気泳動 - 飛行時間型質量分析法 (CE-TOFMS：
Capillary Electrophoresis Time-of-Flight Mass Spectrometry) を用いて、腸内代謝物質のメタボローム解析に取り組んでいる。CE-TOFMS はイオン性の低分子化合物の測定に優れており、分離能が高く多様な代謝物質を同時に測定することができ、大腸菌においては主要な代謝物質の約 90% を測定することが可能であった (Ohashi, et al., 2008)。メタボローム解析ではガスクロマト
グラフィー−質量分析法 (GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry)
や液体クロマトグラフィー−質量分析法 (LC-MS: Lipid ChromatographyMass Spectrometry) が一般的に用いられるが、GC-MS は短鎖脂肪酸などの揮発性物質の測定には優れるものの一部のアミノ酸などは測定することがで
きず、LC-MS は多様な代謝物質の測定が可能であるが、対象となる物質ご416

腸内代謝物質を標的としたメタボローム解析のための代謝物質抽出条件の比較とに最適なカラムや測定メソッドを選択する必要があり、一度の測定における網羅性では CE-TOFMS に劣る。CE-TOFMS は中性物質や脂溶性物質の測定には不向きであるものの、腸内の主要な代謝物質である短鎖脂肪酸、アミノ酸、一部のビタミン類、ポリアミンなどを同時に測定することが可能であるため、腸内代謝物質のプロファイリングに適した手法であると考えられる。しかし、CE-TOFMS を用いた腸内代謝物質の研究報告は少なく、腸内代謝物質の抽出手法は未だ確立していない。松本らは、マウスの糞便をPhosphate Buffered Saline (PBS) 溶液に溶解し、その上清を CE-TOFMS で測定しているが (Matsumoto, et al., 2012)、これは糞便中に含まれる腸内細菌の細胞を破砕せず、細胞外の物質のみを分析対象とした手法である。腸内細菌叢のはたらきを包括的に理解するためには、腸内細菌叢のメタゲノム解析
やメタトランスクリプトーム解析から得られる遺伝子情報とメタボロームデータを統合する必要があると考えられるが、そのためには細菌が産生し細胞内に蓄積している代謝物質も含めて代謝物質プロファイルを取得する必要があると考えられる。また、一般的に代謝物質を抽出する際には、代謝酵素を失活させるためにメタノールもしくは水 / メタノールの混合溶媒を用いた手法や (Dietmair, et al., 2010)、クロロホルム / メタノールの混合溶媒を使用した液液分配による抽出法が用いられる (Kuwabara, et al., 2013)。さらに、細菌や植物など細胞壁をもつ細胞から代謝物質を抽出する場合は、ジルコニアビーズなどを用いて細胞を物理的に破砕し、メタノールなどの溶媒で抽出する方法が用いられている (Wang, et al., 2015)。このようにサンプルから代謝物質を抽出する方法には様々な選択肢が存在するため、本研究では糞便中代謝物
質の抽出において、手法の違いが代謝物質プロファイルに与える影響を把握するため、様々な手法を用いて糞便中代謝物質の抽出を試み、それらを CETOFMS で分析した結果を比較した。

２ 対象と手法
2.1 抽出条件の設定
抽出条件の検討に際し、抽出に用いる画分、溶媒、およびビーズによる細胞破砕の有無の 3 つの要素を比較する抽出方法について検討した（表 1、図 1）。
KEIO SFC JOURNAL Vol.15 No.1 2015417

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表1
抽出条件
１
２
３
４
5

画分
糞便懸濁液の上清
糞便懸濁液の沈殿
糞便懸濁液
糞便懸濁液
糞便懸濁液

抽出条件

抽出溶媒
0.1 × PBS
50% メタノール / 超純水
0.1 × PBS
0.1 × PBS
50% メタノール / 0.1 × PBS

図１ 代謝物質抽出のフローチャート
図中の「ビーズ」はジルコニアビーズを示す。

418

破砕の有無
無
有
無
有
有

腸内代謝物質を標的としたメタボローム解析のための代謝物質抽出条件の比較

条件 1 では菌体破砕を行わず遠心分離した上清のみを用い、腸内細菌が菌体外に放出する物質や糞便中に含まれる消化された食物由来の物質のみを抽出した。その際、上清画分に菌体は含まれていないと考えられるため、条件 1
ではビーズによる菌体の破砕は行わなかった。条件 2 では、糞便懸濁液を遠心分離して得た沈殿物を対象とした。条件 2 で用いた沈殿物は、洗浄工程を経て菌体外代謝物質は洗い流されていると考えられるため、ジルコニアビー
ズによる破砕を行い、腸内細菌の菌体内に含まれている物質を抽出した。条件 3 と条件 4 ではジルコニアビーズによる腸内細菌細胞の破砕以外の抽出条
件を同一にし、菌体破砕の有無による代謝物質プロファイルの違いを比較した。その際、メタノールよって細菌の細胞膜が壊れることを防ぐため、0.1 ×
PBS を溶媒とした条件で比較を行った。条件 5 は条件 4 の溶媒にメタノー
ルを添加し、抽出溶媒の違いが代謝物質プロファイルにおよぼす影響を分析した。その際、溶媒にメタノールを添加することによって菌体が溶菌されると考えられたため、ビーズによる菌体破砕を行う条件で比較を行った。また、一般的には水 / メタノールの混合溶媒を用いる方法の他に、クロロホルム /メタノールの混合溶媒を使用した液液分配による抽出法も用いられているが、本研究では菌体の破砕を伴わずに代謝物質を抽出することが可能な PBS を溶媒とした場合との比較を行うため、PBS と同様に液液分配を行わずに代謝物質を抽出することが可能な有機溶媒として 50% メタノールを比較対象として選択した。なお、条件 2 と条件 5 で用いている 50% メタノールは、それぞれ 50% メタノール / 超純水と 50% メタノール / 0.1 × PBS である点に違いがあるが、本研究において PBS は菌体の溶菌を防止する目的で使用しており、
条件 2 および条件 5 は共にビーズを用いた菌体の物理的破砕を行っているた
め、超純水と PBS の違いによって差は生じにくいと考え、おおよそ同様の抽
出溶媒として使用した。
2.2 代謝物質の抽出
糞便中代謝物質の抽出条件の比較を行う対象として、3 つの異なる糞便を用い、それぞれの糞便から条件 1 〜 5 の抽出条件で代謝物質を抽出した。糞便は健常な日本人から採取し、採取後直ちに -80°C で保存した。代謝物質のKEIO SFC JOURNAL Vol.15 No.1 2015419

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抽出は、まず内部標準物質をそれぞれ 200 μM 含む 0.1 × PBS 溶液を糞便 10
mg あたり 100 μl の割合で加え、ハンディーホモジナイザー（SIGMA 社）で全体が均一になるまで撹拌し糞便懸濁液とした。内部標準物質には methionine
sulfone、D-camphor-10-sulfonic acid、2-morpholinoethanesulfonic acid を用いた。糞便懸濁液を 100 μl ずつ 4 本のスクリューキャップチューブ（バイオメディカルサイエンス社）に分注し、図 1 および表 1 に示す条件 1 〜 5 の抽出
条件で代謝物質の抽出を行った。
条件 1） 糞便懸濁液 100 μl を 17,800 g で 10 分間遠心分離し、上清を回収した。その後、分画分子量 5 kDa の限外濾過フィルターを用いてタンパク質の除去を行った。残りの沈殿に再度 100 μl の内部標
準物質入り 0.1 × PBS 溶液を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した後、17,800 g で 10 分間遠心分離し、上清を回収した。
その後、分画分子量 5 kDa の限外濾過フィルターを用いてタンパ
ク質の除去を行った。濾液をそれぞれ超純水で 2 倍に希釈して測定に用いた。測定後、2 つの上清画分から得られた濃度を足しあわせた。
条件 2） 条件 1 において 2 回目の遠心分離で生じた沈殿に対し、内部標準物質を含まない 0.1 × PBS 溶液を 100 μl 加えてボルテックスミ
キサーで撹拌した後、17,800 g で 10 分間遠心分離した。その後、上清を取り除く洗浄工程を 2 度繰り返し、細胞外代謝物質と内部標準物質を除いた。50% メタノール溶液 / 超純水 ( 内部標準物質をそれぞれ 20 μM の濃度で含む ) を 100 μl と 3 mm ジルコニア
ビーズ（TOMY 社）3 個および 0.1 mm ジルコニアビーズ（TOMY社）を約 0.1 g 加え、卓上型破砕機（バイオメディカルサイエンス社）を用いて、1,500 rpm で 10 分間撹拌した。その後、17,800 g
で 5 分間遠心分離し、上清を分画分子量 5 kDa の限外濾過フィ
ルターを用いてタンパク質の除去を行った。濾液は真空乾燥機（LABCONCO 社）で 40°C、3 時間乾固させた後、50 μl の超純水に再溶解したものを測定に用いた。

420

腸内代謝物質を標的としたメタボローム解析のための代謝物質抽出条件の比較

条件 3） 糞便懸濁液 100 μl にジルコニアビーズを加えず、卓上型破砕機を用いて、1,500 rpm で 10 分間撹拌した。その後、17,800 g で 5 分
間遠心分離し、上清を分画分子量 5 kDa の限外濾過フィルターを用いてタンパク質の除去を行った。濾液を超純水で 2 倍に希釈して測定に用いた。
条件 4） 糞便懸濁液 100 μl に 3 mm ジルコニアビーズ 3 個および 0.1 mm
ジルコニアビーズ約 0.1 g を加え、卓上型破砕機を用いて、1,500rpm で 10 分間撹拌した。17,800 g で 5 分間遠心分離し、上清を分画分子量 5 kDa の限外濾過フィルターを用いてタンパク質の除去を行った。濾液を超純水で 2 倍に希釈して測定に用いた。
条件 5) 糞便懸濁液 100 μl に、100% メタノール溶液を 100 μl、3 mm ジル
コニアビーズ 3 個および 0.1 mm ジルコニアビーズ約 0.1 g を加え、卓上型破砕機を用いて、1,500 rpm で 10 分間撹拌した。17,800 g
で 5 分間遠心分離し、上清を分画分子量 5 kDa の限外濾過フィル
ターを用いてタンパク質の除去を行った。濾液は真空乾燥機で40°
C、3 時間乾固させた後、50 μl の超純水に再溶解したものを測定に用いた。
2.3 CE-TOFMS による代謝物質の測定および解析
代謝物質を抽出した溶液は CE-TOFMS（Agilent Technologies 社）の陽
イオンモードで測定を行った。CE-TOFMS の測定条件は平山らにしたがい、測定を行った (Hirayama, et al., 2009)。CE-TOFMS により測定したデータは解析ソフトウェア Master Hands (Sugimoto, et al., 2010) を用いて、代謝物質の同定および濃度の算出を行った。抽出条件による代謝物質濃度の違いを比較するため、同じ糞便から 5 種の抽出条件によって得られた各代謝物質の濃度を Zスコアに変換した。その値を用いて MeV TM4 version 4.8 (Saeed, etal., 2006) を使用してヒートマップを作製し、サンプル間での階層的クラスタ
リングおよび代謝物質の k-means クラスタリングを行った。階層的クラスタ
リングおよび k-means クラスタリングにおいて、クラスタリングにはユーク
リッド距離の群平均法を用いた。k-means クラスタリングのクラスター数としKEIO SFC JOURNAL Vol.15 No.1 2015421

特集 世界を救え 〜 SFC バイオの挑戦て、k=4 を使用した。2 群間の代謝物質濃度の比較には対応のある t 検定を用
い、Benjamini & Hochberg 法を用いて疑陽性率 (False Discovery Rate, FDR)を算出した。FDR ≦ 0.05 の場合に有意差があると表現した。

３ 結果と議論
3.1 各抽出条件での代謝物質濃度の比較
各抽出条件における代謝物質濃度を比較するため、同一の糞便から 5 種の抽出条件によって得られた各代謝物質の濃度を Zスコアに変換し、その値を可視化した（図 2）。サンプル間の階層的クラスタリングの結果、抽出条件ごとにクラスターが形成された。したがって、得られる代謝物質のプロファイ
ルは抽出手法によって異なり、CE-TOFMS でヒト糞便の測定を行う際には抽出条件に留意する必要があることが示唆された。各抽出条件における代謝物質のプロファイルの特徴をより詳細に調べるため、k-means 法を用いて代謝物質のクラスタリングを行い、抽出条件ごとの特徴を反映したクラスター
I-IV に分類した。
クラスター I に含まれる代謝物質は条件 4 において最も高濃度で検出されたものである。このクラスターには 15 種のアミノ酸や 3 種のジペプチドが含まれていた。また、クラスター I に含まれる代謝物質の多くは条件 3 と比較して条件 4 において高濃度で検出される傾向にあり、これらの代謝物質は菌体外にも存在するが、菌体内にも一定量存在しているためビーズによる菌体破砕を行うことで検出量が増加したと考えられる。さらに、これらの代謝物
質は条件 5 と比較しても、
条件 4 において高濃度で検出される傾向にあるため、メタノールに溶出しにくいことが示唆された。
クラスター II の代謝物質は条件 5 において特に高濃度で検出された。これ
らの代謝物質はビーズ破砕を行い、メタノールを添加した条件で最も高濃度で抽出される傾向にあるため、菌体内の存在量が多く、メタノールに溶解しやすい代謝物質であると考えられる。このクラスターには guanine、cysteine、
adenosine などの核酸の構成要素や、thiamine、pyridoxal などのビタミンが含まれていた。
クラスター III の代謝物質は条件 2 において検出量が少なく、それ以外の422

腸内代謝物質を標的としたメタボローム解析のための代謝物質抽出条件の比較

図 2 各抽出条件によって得られた陽イオン性代謝物質のプロファイル
サンプルの階層的クラスタリングおよび代謝物質の k-means クラスタリングはユー
クリッド距離を用いて行った。ハイフンの前の文字列は条件を表し、ハイフンの後ろの数字は糞便の違いを表す。ヒートマップは各代謝物質の Z スコアを色で表しており、赤は高濃度、青は低濃度、灰色は検出限界以下を表す。

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4 つの条件では同程度に検出された。条件 2 は主に菌体内のみに存在する代謝物質を得る手法であり、この条件で検出量が少ないことから、これらの代謝物質は菌体内よりも菌体外の存在量が多いと考えられる。また、ビーズ破砕の有無のみが異なる条件 3 と条件 4 において検出量の違いが少ないことか
らも、これらの代謝物質は菌体内の存在量が少ないことが示唆された。また、抽出溶媒のみが異なる条件 4 と条件 5 を比較しても検出濃度に大きな差がないことから、0.1 × PBS 溶液および 50% メタノールに対して同程度に溶出する代謝物質であると考えられる。
クラスター IV の代謝物質は、いくつかの抽出条件で検出されなかったものである。したがって、これらの代謝物質に注目する際は抽出条件を慎重に検討する必要があると考えられる。
以上の結果を踏まえ、各抽出条件の特徴をサンプル間の階層的クラスタリ
ングから比較すると、条件 2 ではほぼ全ての代謝物質濃度が他の抽出方法と比較して低いことが示された。これは、糞便中代謝物質の多くが菌体外に存在していることを示唆している。腸管内では常に腸内細菌の増殖や溶菌（死滅）が起こるため、腸管内や糞便中には溶菌した腸内細菌由来の代謝物質も多量に存在していると考えられる。条件 2 では、糞便中に存在はするが溶菌していない細菌細胞に含有されている代謝物質を検出しているが、条件 2 で検出される代謝物質濃度が全体的に低濃度であったことから、このような細胞に含まれる代謝物質は全体から比べると微量であると考えられる。他の抽出条件については、階層的クラスタリングの結果から条件 1 と条件 3 が類似していることが示唆された。条件 1 と条件 3 の抽出手法の違いは、条件 3 では撹拌を行ったのに対し、条件 1 は撹拌を行わなかった点のみであり、抽出溶媒などの条件は同一である。また、条件 3 の撹拌ではビーズを用いていな
いため、菌体の破砕は起こらなかったと考えられる。本研究の結果から、糞
便中代謝物質は主に菌体外に存在することが示唆されているため、結果として条件 1 と条件 3 はほぼ同一の抽出条件になっていたと考えられる。条件 1と条件 3 に次いで、類似した代謝物質プロファイルが得られた手法は条件 4であった。条件 3 と条件 4 ではビーズ破砕の有無に差があるにも関わらず、クラスター I に属するアミノ酸などを除いて代謝物質プロファイルは類似し

424

腸内代謝物質を標的としたメタボローム解析のための代謝物質抽出条件の比較ていた。条件 5 は条件 1、条件 3、条件 4 とは異なるクラスターに分類された。
条件 1、条件 3、条件 4 は溶媒にメタノールを含まないが、条件 5 は溶媒にメタノールが含まれているため、溶媒の違いが得られる代謝物質プロファイ
ルに影響を及ぼすことが示唆された。また、条件 3 と条件 4 はビーズによる破砕の有無が異なり、条件 4 と条件 5 はメタノール添加の有無が異なるが、
条件 3 と条件 4 の差よりも条件 4 と条件 5 の差の方が大きいことを示しており、メタノール添加の有無はビーズ破砕の有無よりも大きな影響をおよぼすことが示唆された。
次に、個別の代謝物質に注目し、溶媒の違いや菌体の破砕の有無によって有意に濃度が異なる代謝物質を調べた。溶媒の違いによる影響の分析には条件 4 と条件 5 の比較を、菌体破砕の有無による影響の分析には条件 3 と条件4 の比較を行った。
溶媒の違いの比較から、検出された 141 物質のうち 29 物質の代謝物質の濃度に有意差が認められた（表 2）。そのうち 14 物質はアミノ酸で、いずれも 0.1 × PBS 溶液のみを用いた条件 4 において有意に高濃度で検出された。
アミノ酸は水溶液中では双性イオンとなり、有機溶媒よりも水に溶解しやすい性質があるため、このような結果が得られたと考えられる。また、メタノールを添加した条件 5 において有意に高濃度であった物質には adenine や
2’-deoxyguanosine など核酸の構成要素が含まれていた。
ビーズによる菌体破砕の有無の比較では 4 種のアミノ酸を含む 7 物質の代
謝物質の濃度に有意差が認められた（表 3）。これらすべての代謝物質が菌体破砕を行った条件 4 において高濃度であった。
溶媒の差異やビーズによる菌体破砕の有無によって有意に濃度が異なる代謝物質の中には多数のアミノ酸が含まれていたため、条件 3 〜 5 における各種アミノ酸の濃度を図 3 に示した。有意差がなかったアミノ酸についてもその多くが条件 4 で最も高濃度で検出される傾向にあった。
3.2 各抽出条件で検出された代謝物質数の比較
次に、各条件で検出された代謝物質の数を示す（図 4）。条件 5 において検出された代謝物質の数は平均 131 種であり、最も多かった。これは条件 1 とKEIO SFC JOURNAL Vol.15 No.1 2015425

特集 世界を救え 〜 SFC バイオの挑戦
表 2 抽出溶媒の違いによって有意（FDR ≦ 0.05）に濃度が異なる代謝物質
高濃度で検出された溶媒の種類
0.1 × PBS（条件 4）

代謝物質名
Met
lle

FDR
0.009
0.009

Val

0.009

Thr
N-Acetylglucosamine
Gly-Leu
Urocanate
Pro
Putrescine(1,4-Butanediamine)
Ala
Gly
Lys
Gln
Trp
Phe
UracilTyr
Dihydrouracil
Glu
Asp
Cadaverine
ThymineHypoxanthine
Gly-Gly
Ornithine
50% メタノール /0.1 × PBS（条件 5）
AdeninePipecolate
2'-Deoxyguanosine
3-Aminopropane-1,2-diol

0.009
0.014
0.015
0.015
0.016
0.017
0.019
0.019
0.021
0.024
0.024
0.024
0.024
0.024
0.025
0.026
0.035
0.036
0.037
0.038
0.042
0.042
0.021
0.037
0.042
0.044

表 3 菌体破砕の有無によって有意（FDR ≦ 0.05）に濃度が異なる代謝物質
高濃度で検出された条件
ビーズによる菌体破砕あり（条件 4）

426

代謝物質名
Met
Asn

FDR
0.037
0.037

Val

0.037

Phe
CholineCitrulline
Gly-Leu

0.037
0.037
0.037
0.050

腸内代謝物質を標的としたメタボローム解析のための代謝物質抽出条件の比較

図 3 条件 3、条件 4、条件 5 において検出されたアミノ酸濃度の比較
グラフは各抽出条件における各アミノ酸の濃度の平均値を示した。エラーバーは標準偏差を用いた。アミノ酸の名前は 3 文字表記の略号を用いた。* は FDR ≦ 0.05、** は FDR ≦ 0.01 を表す。

図 4 各抽出条件で検出された代謝物質数
縦軸は各抽出条件で検出された代謝物質の種類数の平均値を示し、横軸は各抽出条件を表す。エラーバーは標準偏差を用いた。

KEIO SFC JOURNAL Vol.15 No.1 2015427

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条件 2 のように菌体と上清を分離していないことに加え、有機溶媒を用いることで PBS 溶液には溶解しにくい代謝物質も抽出できたことに起因すると考えられる。また、条件 2 では検出された代謝物質が平均 83 種と最も少なかった。本研究によって菌体内の代謝物質の存在量は菌体外に比べて少ないことが示唆されているが、この結果は菌体内のみから代謝物質を得ても検出限界に満たない物質が 30 〜 40％程度存在していることを示唆している。

４ 結論
本研究の結果より、CE-TOFMS によって得られる糞便中の陽イオン代謝
物質プロファイルは、抽出に用いる溶媒やビーズによる菌体破砕の有無による影響を受けることが示唆された。上清画分、沈殿画分、および糞便懸濁液
全体の代謝物質プロファイルの比較から、多様な代謝物質が上清画分に含有されていることが明らかとなった。本研究で比較した抽出条件では特にアミノ酸の濃度が抽出条件の影響を受けやすく、菌体破砕を行い、メタノールを添加しない条件において最も高濃度で検出される傾向にあった。また、検出可能な代謝物質の数の比較では、メタノールを添加し、ビーズを用いて菌体破砕を行った条件において最も多くの種類の代謝物質が検出された。これらの結果から、より多くの代謝物質を測定することを重要視する際には条件 5、アミノ酸等に特に着目する際には条件 4、菌体外に存在し、腸管内で宿主細胞と相互作用する可能性が高いような代謝物質を重要視する場合は条件 1 や条件 3 など、各々の目的に沿った抽出条件を選択することが重要であると考
えられる。

謝辞
本論文を執筆するにあたりご協力頂いた村上慎之介さん（慶應義塾大学大学院政策・
メディア研究科）、Aw Wanping 博士（慶應義塾大学大学院政策・メディア研究科）に感謝の意を表する。また、本研究は、山形研究費および笹川科学研究助成による支援を受けて行われた。

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腸内代謝物質を標的としたメタボローム解析のための代謝物質抽出条件の比較

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KEIO SFC JOURNAL Vol.15 No.1 2015429

特集 世界を救え 〜 SFC バイオの挑戦
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〔受付日 2015. 2. 26〕〔採録日 2015. 7. 27〕430