●血管新生の基礎と臨床!!［ I ］血管新生の分子制御機構

3．血管新生の転写調節佐藤靖史＊

成熟個体における血管新生のうち，代表的な様式である発芽型血管新生は，（1）
既存の血管からのペリサイト離脱，（2）内皮細胞による発芽と新生血管の形成，（3）
新生血管へのペリサイトの集積，の 3 つのステップからなる．この血管新生の過程では，内皮細胞にはさまざまな分子が発現することが知られている．これまでの血管新生に関する研究は，それら分子の機能の解析を中心に進められてきたが，それら分子の内皮細胞における遺伝子発現調節機構を解明することは，血管新生の分子機構を理解するうえで重要である．
筆者らは，血管新生における内皮細胞の転写調節について，とくに内皮細胞に発現する転写因子の観点から研究を進めている．これまでの解析から，転写因子 ETS-1が VEGF などの血管新生促進因子や低酸素の刺激によって内皮細胞に発現し，アンジオポエチン 2 の発現誘導によるペリサイト離脱，蛋白分解酵素やインテグリン β3 の発現誘導による発芽，VEGF2 型受容体や neuropilin-1 の発現誘導による VEGF シグナルの増幅など血管新生の（1）および（2）のステップにおいて重要な役割を演じていること，また TGF-β によって ETS-1 の DNA 結合がブロックされ，（3）のステップではその作用が阻止されることを明らかにした．さらに筆者らは，ETS-1 以外にも，内皮細胞にはさまざまな転写因子が発現し，しかも血管新生を促進的に作用する転写因子と抑制的に作用する転写因子とが互いにバランスを取りながら，血管新生をコントロールしていることを明らかにしつつある．
今後は，個々の転写因子の機能を解析するとともに，転写因子間の相互関係についても検討することで，血管新生の全体像について理解を深める必要がある．

Transcriptional regulation of angiogenesis
YASUFUMI SATO Department of Vascular Biology, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University
さとう・やすふみ：東北大学加齢医学研究所腫瘍循環分野教授．昭和53年神戸大学医学部卒業．昭和60年大分医科大学第１内科助手．
昭和62年ニューヨーク大学細胞生物学教室ポスドク．平成元年大分医科大学第１内科助手．平成６年現職．主研究領域／血管生物学．
＊Key words

内皮細胞
遺伝子発現
転写因子
ETS-1

血管新生の基礎と臨床 19はじめにサイトが遊走・増殖して，血管内皮細胞だけの未熟な新生血管の周囲を取り囲み，成熟し生物の発生や組織の構築には，時間的・空た血管を構築するが，この過程も Ang のバラ間的に適切な機能を持つ分子が発現する必要ンスによって調節されている．すなわち TIEがあり，そのためにはその分子をコードする2 受容体のアゴニストである Ang-1 が優勢と遺伝子が適切に転写調節されなければならななり，二次的に PDGF や TGF-β などが作用すい．転写調節因子（以下，転写因子）が，DNAると考えられている（図 1）．

結合ドメインを介して標的遺伝子シスエレメ

このような血管新生の過程では，内皮細胞ントの特異的な塩基配列に結合すると，コアにはさまざまな分子が発現する．これまで血クチベーターによって基本転写因子群と連動

管新生に関する研究は，内皮細胞に発現するし，転写が開始する．基本転写因子群として増殖因子受容体，血管基底膜を消化する蛋白は，まず TATA box 結合因子である TFIID が分解酵素，細胞接着・遊走に必要なインテグ

TATA box に 結 合 し，さ ら に TFIIA，TFIIB,リン，管腔構造の構築に必要な VE-カドヘリ

TFIIF，RNA ポリメラーゼ II，TFIIE などがこンなどの働きを中心に進められてきたが，それに会合して転写開始複合体を形成する．なれら分子の内皮細胞における遺伝子発現調節

お，遺伝子発現には，転写因子や基本転写因機構を解明することは，血管新生の分子機構子群だけでなく，ヒストンのアセチル化，を理解するうえで重要な研究課題である．筆DNA の脱メチル化などの修飾が必要であり，者らは，血管新生における内皮細胞の転写調

ヒストンがアセチル化されることによりクロ節について，とくに内皮細胞に発現する転写マチン構造が緩み，DNA が脱メチル化される因子の観点から研究を進めている．

ことにより転写因子が DNA へと結合することが可能となる．

1．血管新生のプロセス

2．転写因子 ETS-1 の構造と発現
ets-1 遺伝子は，鳥類の白血病ウイルスである E26 から v-ets のホモローグとして単離さ成熟個体における血管新生のうち，代表的れたがん原遺伝子であり，その後ヒトを初めな様式である発芽型血管新生は，内皮細胞ととして哺乳類の ets-1 遺伝子がクローニングペリサイトによって構築されている細小血管されており，ヒトの ets-1 遺伝子は 11q23 にから，ペリサイトが離脱するステップで始まコードされている．ETS-1 蛋白は 450 個のアるが，このステップはアンジオポエチン（An-ミノ酸からなり，N 末端側の poin-ted ドメイ

giopoietin : Ang）によって調節されている．すン，中央部付近の転写活性ドメイン，C 末端側

なわち，TIE2 受容体のアンタゴニストであるの ETS ドメインなどに区別される．このうちAng-2 の産生が増すことによってペリサイトETS ドメインは ETS ファミリーの転写因子が離 脱 す る と，同 部 位 の 内 皮 細 胞 が VEGFに 共 通 す る DNA 結 合 領 域 で あ り，通 常 85

（vascular endothelial growth factor）などの血個のアミノ酸からなり，3 つの α ヘリックス

管新生促進因子に反応して血管新生が進行すと 4 つの β シートを有している．また，NMRる．その際，内皮細胞は種々の蛋白分解酵素での解析から ETS ドメインは winged helix-を産生して基底膜を消化し，遊走・増殖にturn-helix 構造を示すことが明らかとなってよって新生血管を増やしてゆく．最後にペリいる．ETS ファミリー転写因子は，ETS ドメ

20 第 120 回日本医学会シンポジウム

血管の不安定化

発芽

血管の安定化

ペリサイト離脱

蛋白分解細胞遊走細胞増殖管腔形成

ペリサイト集積

Ang-2

PDGF
TGF-β

低酸素

VEGF

図1

Ang-1

発芽型血管新生のプロセス

発芽型血管新生は，Ang-2 の産生が増加して細小血管からペリサイトが離脱することで始まる．ペリサイトが離脱すると，同部位の内皮細胞が VEGF などの血管新生促進因子に反応し，蛋白分解酵素産生・遊走・増殖によって新生血管を増やしてゆく．最後に Ang-1 が優勢となり，PDGF や TGF-β などの作用を介してペリサイトが新生血管の周囲を取り囲んで，安定・成熟した血管が構築される．

1NH2330

415 450

ETSドメイン

転写活性ドメイン

COOH

ETS-1
GGAA/T

標的遺伝子

ETS結合モチーフ

図2

転写因子 ETS-1

ETS-1 蛋白は 450 個のアミノ酸からなり，中央部付近の転写活性ドメイン，C 末端側の ETSドメインなどに区別される．このうち ETS ドメインは DNA 結合領域であり，標的遺伝子の転写調節領域に存在する ETS 結合モチーフ（GGAA!
T）に結合する．

インのうち 3 つ目の α ヘリックスを介して，の trophoblast に 発 現 す る．そ の 後，胎 生 8モノマーとして標的遺伝子の転写調節領域に日以降の神経系の後脳，神経管，神経堤，血存在する ETS 結合モチーフ（GGAA!
T）に結管内皮，心臓などに発現する．とくに血管内合する（図 2）．

皮における ETS-1 の発現は，第 1 イントロン

ETS-1 は，マウスの胚発生において着床時に存在する血管内皮選択的な発現調節領域で血管新生の基礎と臨床 21制御されており，血管形成が完了すると ETS-1を誘導して血管新生を惹起する重要な刺激での発現は著しく減弱することが明らかとなっあるが，低酸素が ETS-1 の発現を誘導するこている．これに対して，成熟個体においてと，さらにその機序として，ets-1 遺伝子の転ETS-1 は，通常の血管内皮細胞には発現して写調節領域には低酸素反応領域（hypoxia re-いないが，血管新生部位や内皮再生部位の内sponsive element ; HRE）が存在し，転写因子皮細胞に発現する．

HIF-1（hypoxia inducible factor-1）が同部位に結合することで ETS-1 の発現を直接的に誘導することを見いだした4）．

3．血管新生における ETS-1 の機能（図 3）2）ETS-1 の機能

1）ETS-1 発現の機序

ETS-1 の発現を増強すると内皮細胞の血管通常（細 胞 周 期 G0 期）の内皮細胞には新生能（細胞浸潤能）が亢進し，逆に発現を抑ETS-1 は発現していないが，血管新生や内皮制すると血管新生能は低下したが，これは1,2）．

ETS-1 が 内 皮 細 胞 に お い て 蛋 白 分 解 酵 素

このうち，VEGF や塩基性線維芽細胞成長因（uPA，MMP-1，MMP-3，MMP-9）とインテグリ子（basic fibroblast growth factor ; bFGF）など

ン β3 サブユニットの発現を誘導することに代表的な血管新生促進因子により，ERK 1!
2よると考えられた1,5）．

再生に際し，ETS-1 の発現が誘導されるの活性化を介して誘導されることが判明しさらに ETS-1 の機能を詳細に解析するた3）

た ．一方，低酸素はさまざまな細胞に VEGF

め，野生型 ETS-1 と ETS-1 の機能を阻害する

血管の不安定化

発芽

Ang-2

蛋白分解酵素インテグリンβ3内皮細胞血管の安定化

潜在型TGF-β活性型TGF-β

ETS-1

HIF-1
ERK
VEGF受容体
低酸素

VEGF

図3

血管新生における転写因子 ETS-1 の役割

ETS-1 は VEGF などの血管新生促進因子や低酸素の刺激によって内皮細胞に発現し，アンジオポエチン 2 の発現誘導よりペリサイト離脱，蛋白分解酵素やインテグリン β3 の発現誘導による発芽，VEGF 2 型受容体や neuropilin-1 の発現誘導による VEGF シグナルの増幅など血管新生を促進する重要な役割を演じている．一方，血管新生の最後のステップで活性型 TGF-βが生成されると，ETS-1 の DNA 結合がブロックされ，ETS-1 の作用は阻止される．

22 第 120 回日本医学会シンポジウム

ドミナントネガティブ型ETS-1（DNETS-1）を非増殖性アデノウイルスベクターに組み込み，AdETS-1 と AdDNETS-1 を作成した6,7）．

血管新生を終息させるものと考えられる．

おわりにAdETS-1 を用いて ETS-1 を内皮細胞に過剰以上，ETS-1 の機能を中心にして，血管新生発現させると，VEGF2 型受容体（KDR!
Flk-1）における転写因子の重要性について述べた．

および VEGF 結合能を有する neuropilin-1 の筆者らは，今回の ETS-1 以外にも，血管新発現が著明に増強し，逆に AdDNETS-1 を用生の過程では内皮細胞にはさまざまな転写因いて内因性 ETS-1 の機能を阻害すると 2 型子が発現し10），しかも促進的に作用する転写受容体（KDR!
Flk-1）
お よ び neuropilin-1 の 発因子と抑制的に作用する転写因子とが互いに現が著明に低下したことから，ETS-1 はこれバランスを取りながら血管新生をコントロー

ら分子の内皮細胞における発現誘導を介しルしていることを明らかにしつつある．今後

6）て，VEGF 刺激を増幅すると考えられた ．まは個々の転写因子の機能を解析するとともた，AdETS-1 により Ang-2 の発現が著しく増に，転写因子間の相互関係についても合わせ強することも判明し，ペリサイトの離脱にもて検討することで，血管新生の全体像につい関 与 す る と 考 え ら れ た8）．以 上 の よ う に，て理解を深める必要があると考えている．

ETS-1 は血管新生の開始と進行のステップで内皮細胞の機能を調節し，血管新生を促進的に調節する中心的な転写因子であり，ETS-1の機能を阻害することによって血管新生は抑制される6）．
3）TGF-β と ETS-1ペリサイトが集積し，成熟した血管が構築されることによって血管新生のプロセスは終了するが，このときには ETS-1 の機能が制御されなければならない．以前より筆者は，内皮細胞とペリサイトが接触することで潜在型として産生・分泌された TGF-β が活性型に変換されることを明らかにしており，活性型TGF-β が血管の成熟化に重要な役割を果たしていると考えられている．そこで TGF-βが ETS-1 の機能にどのように影響するかを検討したところ，TGF-β は mRNA，蛋白いずれのレベルにおいても ETS-1 の発現を促進したが，ETS 結合モチーフへの結合は著明に抑制し，ETS によってドライブされるプロモーターアッセイにおいて ETS-1 転写活性を 阻 止 す る こ と が 確 認 さ れ た9）．こ の こ とは，ペリサイトの集積によって潜在型 TGF-βが活性化されると，ETS-1 の働きを阻害して，〔文献〕
1）Iwasaka C, Tanaka K, Abe M, et al. : Ets-1 regulates
angiogenesis by inducing the expression of urokinasetype plasminogen activator and matrix metalloproteinase-1 and the migration of vascular endothelial cells.
J Cell Physiol 1996 ; 169 : 522―531.
2）Tanaka K, Oda N, Iwasaka C, et al. : Induction of Ets-1
in endothelial cells during re-endothelialization after
denuding injury. J Cell Physiol 1998 ; 176 : 235―244.
3）Kanno S, Oda N, Abe M, et al. : Roles of two VEGF receptors, Flt-1 and KDR, in the signal transduction ofVEGF effects in human vascular endothelial cells. Oncogene 2000 ; 19 : 2138―2146.
4）Oikawa M, Abe M, Kurosawa H, et al. : Hypoxia induces transcription factor ETS-1 via the activity of hypoxia inducible factor-1. Biochem Biophys Res Commun 2001 ; 289 : 39―43.
5）Oda N, Abe M, Sato Y : ETS-1 converts endothelial
cells to the angiogenic phenotype by inducing the expression of matrix metalloproteinases and integrin β3.
J Cell Physiol 1999 ; 178 : 121―132.
6）Nakano T, Abe M, Tanaka K, et al. : Angiogenesis Inhibition by Transdominant Mutant Ets-1. J Cell Physiol
2000 ; 184 : 255―262.
7）Teruyama K, Abe M Iwasaka-Yagi C, et al. : Role oftranscription factor Ets-1 in the apoptosis of humanvascular endothelial cells. J Cell Physiol 2001 ; 188 :243―252.
8）Teruyama K, Abe M, Nakano T, et al. : Neuropilin-1 isa downstream target of transcription factor Ets-1 in

血管新生の基礎と臨床 23human umbilical vein endothelial cells . FEBS Lett2001 ; 504 : 1―4.
9）Iwasaka-Yagi C, Abe M, Sato Y : TGF-β attenuates thetransactivation activity of Ets-1 despite its induction
via the inhibition of DNA binding. Tohoku J Exp Med
2001 ; 193 : 311―318.
10）Namba K, Abe M, Saito S, et al. : Indispensable role ofthe transcription factor PEBP 2!
CBF in angiogenic activity of a murine endothelial cell MSS 31. Oncogene
2000 ; 19 : 173―179.

ぜひ教えていただきたいと思います．先生のデ ー タ で は，in vitro で hypoxia が induce
されるという系は非常にクリアに理解できたのですが，よく放射線治療あるいは抗がん薬
治 療 で，in vivo の 環 境 の 中 で VEGF が upregulate されるなどということが，がんの悪性度あるいは抗がん薬治療に対する抵抗性と非常にリンクしているということが報告されています．検討されているかどうかちょっとわかりませんが，in vivo の環境の中で，たとえばこの ETS-1 あるいは HEX といった転写質

疑応

答

因子が，radiation や抗がん薬などのストレスに対してどのように挙動するか，というよう座長（須田） 佐藤先生，どうもありがとうな情報はありますでしょうか．といいますのございました．それではご質問がありましたは，非常にクリアな機能を持っているようでらお願いいたします．

すので，とくに ETS-1 の decoy，それから HEX

北村幸彦（大阪大） 低酸素状態と血管新生

それ自体が，抗がん薬として使えるのではなについて伺いたいと思います．マラソンで高いかという印象を持ったのですが，いかがで地トレーニングをしますね．あのような時，しょうか．

血管新生は高まっているのでしょうか．
佐藤佐藤

最後のほうのご質問から先に述べまHypoxia で drive される遺伝子にはすと，そのような考え方が成り立つのではな

たくさんのものがありますが，代表的なものいかと思って，私どもの教室では臨床の方々は，一つは erythropoietin で，高地トレーニンとの共同で，がんの時にどうかというようなグをしますと血球が非常に増えてくるということで見ようとしています．

ことはあります．もう一つ，それでは VEGF

それから，たとえば radiation や抗がん薬治がたくさんできると血管新生が増えるかとい療で，実際にこういう転写因子がどうかという話ですが，高地トレーニングとの関連につうことですが，そのへんも私どもは直接見ていては私はそういうデータを知りません．

はおりませんが，ETS-1 についてはさまざま

血管新生の場合にはバランスが非常に大切な刺激で誘導がかかってくるということもわですし，むやみやたらにできるわけではなくかってきました．今日お示しした以外にも，て，できて欲しいような現象があるわけです．

TNF-α のような炎症性 cytokine とか，あるいですから，大人の場合であれば子宮や卵胞，は 過 酸 化 水 素 の よ う な oxygen radical が 加あるいは創傷治癒など，そういうきっかけがわっても内皮に誘導がかかってきます．です

必要なわけです．何もない状況で VEGF が非から，radiation とか cytotoxic な agent で誘導常に増える病気がありますが，そのような場がかかる可能性はあるのではないか，という合でもむやみやたらと血管が新生されるわけようには予想されます．

ではありません．

島田

私は今食道がんの遺伝子治療を担当

島田英昭（千葉大） 私は一貫してがんの治していまして，こういう形で，局所投与で行療という観点で非常に興味を持ちましたのでえばおそらく副作用の点はクリアできると思24 第 120 回日本医学会シンポジウム

いますので，よいデータがございましたらま佐藤

その可能性はあると思います．完全たよろしくお願いしたいと思います．ありがになくなってしまうわけではなくて，有意にとうございました．

誘導は抑えられますが，完全に hypoxia によ谷本圭司（広島大） 細かい質問になるかもる誘導がゼロになるわけではありませんのしれませんが，ETS-1 の promoter 解析についで，一部先生がおっしゃられたように他のメて教えていただきたいと思います．非常にクカニズムも作動しているかと思います．

リ ア な functional HRE の 存 在 を 見 せ て い た谷本

そのような cis-element や結合するだきましたが，HRE を delete した construct

転写因子などについて検討されてないのででも hypoxic response が見られたように思いしょうか．

ます．それは，たとえば VEGF や ERK などの佐藤

signal が 入 っ て く る よ う な cis-element が 存ません．

在するということなのでしょうか．

座長

そちらについてはまだ検討しておりどうもありがとうございました．

血管新生の基礎と臨床 25