ウルトラディアンリズムを制御する神経基盤および分子基盤の解明
Neuronal and Molecular Basis underlying Ultradian Rhythms in Planarian（日本動物学会推薦）

代表研究者 鳥取大学

井上 武

Tottori University

Takeshi INOUE

Biological rhythms are prevalent in the organisms, with the underlying mechanisms being widely conserved. However,
the mechanisms regulating ultradian rhythms, which are periodic movements that occur on a timescale of several hours
and play a role in various physiological functions such as, homeostasis, cardiovascular system, and metabolism, remain
largely unexplored. Planarians belong to an early branching bilateral group of organisms with a simple, neverthelesssophisticated brain and exhibit ultradian rhythms through spontaneous activity and rest cycles without external stimuli. In
this study, we investigated the neural basis and molecular mechanisms regulating the ultradian rhythm of spontaneous
movement in the planarian Dugesia japonica. Results showed that their locomotion does not adhere to a circadian rhythm
but displays multiple cycles in ultradian rhythms (approximately 30, 60, 90, and 120 minutes). In addition, our results
suggest that integrating ultradian rhythm periodicity and environmental information in the brain leads to doubling, tripling,or quadrupling the basic 30-minute ultradian cycle, resulting in a longer cycle. Our RNA-seq data showed that planarians
lack conventional clock genes; instead, they rely on novel factors to regulate the ultradian rhythm. These findings suggestthat phase synchronization of circadian rhythms may be achieved through mechanisms that extend ultradian rhythms via
environmental factors.

研究目的

振動子によって生成されていることが示唆されてい

概日リズムをはじめとする生物リズムは、ほぼする。さらに、ウルトラディアンリズムはタンパク質

べての生物に存在し、その基本的なメカニズムも広の合成、酵素の活性、体温、酸素消費量、血圧、ホルく保持されている。概日リズムの周期は 24 時間であモン分泌、消化、睡眠の位相などでウルトラディア

り、概月リズムは１ヶ月、概年リズムは１年である。

ンリズムが発現しており、これら多くの生理的サイ

このような長周期の生体リズムは、全て地球環境にクルと個体の休止・活動サイクルが同様の周期性で適応したものである。では、どのようにして地球環発生している。これらの事実は、体内システム全体

境に適応したのだろうか？

にわたってウルトラディアンリズムを調節する新たウルトラディアンリズムは、数十分から数時間単な振動子が存在することを意味している。しかし、位で生じる短期的な生物リズムである。かつては概その振動子の実体や調節機構についてはまだ明らか

日リズムにおけるノイズと考えられていたが、現在になっていない。内因性のリズムが地球環境に適応

では、真核微生物から哺乳類まで、ほとんどの生物するための鍵は、脳の獲得にあると考えた。つまり、のあらゆるレベルの生命プロセスで見られる現象と進化の過程で脳が獲得されたことによって、環境情して認識されている。ウルトラディアンリズムは、報を脳に集約し、全身の調節が可能になったと推測

環境情報を遮断しても、中枢時計である視交叉上核した。

の時計遺伝子を阻害しても持続するため、行動や環

プラナリアは、動物進化の初期に脳を獲得した種境によって生成されるのではなく、自律的に生成さと密接に関連していると考えられており、その脳は、れることや概日リズムに関連する中枢時計とは別の動物の脳のプロトタイプとされている。したがって、

プラナリアの解析により、内因性リズムを駆動する

48 時間 1 分毎にその動きを追跡した。その結果、プ機構が地球環境の周期にどのように適応したのか、

ラナリアは外部からの刺激がないにも関わらず、活またウルトラディアンリズムを駆動する普遍的な機動と休止の期間が交互に現れることが確認された構が何であるのかを明らかにすることが可能である（図 1A）。

と考えられる。さらに、プラナリアは外部刺激に依次に、観察された運動が環境のサイクルとどのよ

存せず、自律的に活動と休止を繰り返すウルトラデうに関連しているかを調べるため、12 時間毎の明暗ィアンリズムを示すが、その詳細な運動の特性や制サイクル条件下での活動量を明期と暗期で比較した。

御機構はまだ明らかにされていない。

しかし、明期と暗期での活動量には差が認められな

本研究では、プラナリア（Dugesia japonica）のかった（図 1B）
。恒暗条件下において、昼時間帯と夜自発運動におけるウルトラディアンリズムの特性と、 時間帯とを仮定して比較した場合にも、活動量には
その制御機構を明らかにすることを目的としている。 違いが見られなかった（図 1C）。明暗サイクル条件下
具体的には、まずウルトラディアンリズムにおけるおよび恒暗条件下でのプラナリアの運動について

活動と休止の繰り返しパターンと環境刺激との関連

様々な比較を行ったが、いずれのケースでも差異はを詳細に調査した。次に、活動期と休息期にある個認められなかった。これらの結果から、プラナリア

体の脳から RNA を抽出し、RNA-Seq 解析を実施した。

の自発運動は環境の光刺激や周期とは独立し、概日

これにより、活動期と休息期における発現変動するリズムとは別の内因性のメカニズムによって制御さ遺伝子を解析した。

れていることが示唆された。

研究経過

2. 脳がウルトラディアンリズムを駆動している

1.プラナリアにおけるウルトラディアンリズムは内

プラナリアの卓越した再生能力を利用して、脳と因性の振動子により駆動される

ウルトラディアンリズムにおける自発運動との関連

まず、本研究ではプラナリアのウルトラディアン

性について解析した。頭部を切断した個体が、再生

リズムの運動を詳細に解析した。解析に際しては、過程において、どのように自発運動を回復していく

12 時間毎の明暗サイクル（12L/12D）に同調させた個のかを検討した。その結果、再生後 1 日目から 5 日

体を用い、恒暗（24D）条件下で 1 個体ずつに分けて目までは活動はほぼ消失していたが、再生 7 日目からは数分間程度の周期性を持つ自発運動の回復が始まり、観察することができた。再生 9 日目には、個体の約 9 割で数十分から 1 時間程度の断続的な活動と休息を繰り返す周期性自発運動が観察された。頭部の再生日数と周期性自発運動の回復を、1 分当たりの移動距離の頻度と活動量で比較した。頭部再生
後 1 日目から 5 日目までは 1 分間に長距離を移動す
る活動はほとんど見られず、頻度は低かった。しかし、長距離の活動が検出されるようになるのは 7 日
目からであり、全体として長距離の活動の頻度の回
復は再生 9 日目から見られた。活動量については、
頭部再生後 9 日目には正常個体と有意な差が見られなくなった。これらの結果から、プラナリアの周期性自発運動は頭部再生後 9 日目以降に回復することが示唆された（図 2A）。
さらに、RNAi 法を用いて、シナプス小胞の放出に必要なシナプトタグミンをコードする遺伝子の発現

図 1.プラナリアのウルトラディアンリズムの自発運動.(A)恒暗条件下での周期運動. (B)昼時間帯と夜時間帯の運動量の差.
(C)明暗サイクル条件下での明期と暗期の運動量の差.

を脳特異的に阻害した個体を作成し、その個体を用いてウルトラディアンリズムの自発運動を解析した。

その結果、コントロール個体は正常個体と同様の周期性自発運動を示したが、脳機能を阻害した個体では、周期性自発運動の頻度が低下し、また長距離移動の頻度も低下した（図 2B）。以上の結果から、ウル
トラディアンリズムの自発運動が脳によって制御されていること、そしてその振動子が脳内に存在する可能性が示唆された。

図 3.環境刺激を脳が統合して自発運動を倍数化する.(A)明暗サ
イクル（LD）飼育と恒暗飼育(DD)による周期時間の出現頻度.
(B)syt(RNAi)による脳の活動抑制個体における周期時間の出現
頻度.

動を倍数化し、より長期化させる可能性があることが示された。さらに、周期時間に焦点を当てて、RNAi法を用いてシナプトタグミン遺伝子を脳特異的に阻
図 2.脳が自発運動を駆動する.(A)頭部再生過程における自発運動の回復過程. (B)syt(RNAi)による脳の活動抑制個体における自発運動.

害した個体の解析を行った。その結果、神経活動が阻害された個体では約 30 分の運動が見られた一方で、長時間の運動の頻度は低下していた（図 3B）。こ3.環境刺激を脳で統合して内因性のウルトラディア
ンリズムを長期化する

ウルトラディアンリズムの周期時間を解析したところ、複数の時間（約 30 分、60 分、90 分、120 分）を示し、特に、30 分を基本とした倍数の時間が確認された。周期時間と環境刺激の関連を解明するため、長期間（2 ヶ月以上）恒暗条件で飼育されたプラナリ
アを用いて、再度、明暗サイクル（12L/12D）条件下
あるいは恒暗（24D）条件下で 48 時間観察した。その結果、恒暗条件下で飼育・観察したプラナリアでは、約 30 分の周期が残る一方で、60 分以上の周期は徐々に消失することが観察された（図 3A）。しかし、恒暗条件で飼育した個体を明暗サイクル下で観察した場合、長周期の運動が再現することが確認された。この結果は、長期間光刺激が無い状態では、長周期の運動が低下するものの、一度光刺激が入るとその活動が再び活性化することを示唆している。
このことから、環境刺激が基本周期である 30 分の運

れらの結果から、自律的な周期と環境情報が脳内で統合され、基本的な約 30 分の周期が倍数化して長周期化するメカニズムが存在することが示唆された。
4.ウルトラディアンリズムを駆動する分子の探索
活動期と休止期のプラナリアの脳から RNA を抽出し、周期性自発運動を制御する遺伝子を網羅的に探索した。まず、1 時間以上休止状態にあった個体が活動を開始し、その 10 分後を活動初期と定義した。同様に、1 時間以上活動した後、休止状態に移行し、その 10 分後を休止初期と定義した。それぞれの時点で個体を回収し、氷冷麻酔を速やかに施した後、脳を含む頭部と脳を含まない体幹部に分割した。頭部断片から RNA を抽出し、それを元に RNA-Seq 解析を行った。活動初期、休止初期のそれぞれから 10 個体ずつを回収し、切断片を 1 つのサンプルとした。これにより、各状態で独立に 3 つのサンプルを得た。各
サンプル間の遺伝子発現を比較し、体幹部よりも頭部で高発現している分子の中から、活動初期と休止

体リズムが存在する。だが、その生体リズムの起源は何であったのだろうか？
脳を持たないヒドラ（刺胞動物）は、20〜30 分間
隔のウルトラディアンリズムで行動の休止・活動を繰り返すことが報告されている。また、ヒドラのゲ
ノム中には主要な時計遺伝子が見つかっていない。
これらの事実から、進化の初期段階における生体リ
ズムはウルトラディアンリズムであったのではないかと考えられる。例えば、多くの動物が概日リズムを示すよりも前の個体発生の段階では、ウルトラディアンリズムを示すことが分かっている。さらに、ヒトでも胎児期や乳児期には覚醒・睡眠周期や摂食周期が 2〜4 時間であるという事実がよく知られている。これらのことから、生体リズムの起源はウル
トラディアンリズムであり、そこから概日リズムな
どの長周期リズムが派生した可能性が考えられる。
この仮説が正しいと仮定するならば、長周期リズムの位相応答の機構も説明することが可能になる。つまり、長周期リズムを構成する各ウルトラディアン
リズムを調節することにより、全体を素早く調整することが可能になる。このコンセプトは、哺乳類の視交叉上核の中枢時計の神経細胞が電気的にサイレ
図 4.RNA-seq 解析.(A)活動初期(△)と休止初期(□)の MA プロッ
ト. (B)RNA-seq 解析と qPCR 解析の再現性検証.

初期で発現変動が大きく、活動期と休止期で相反する発現変動を示す分子を探索した。詳細にスクリーニングした結果、活動初期の方が休止初期より発現量が高かった遺伝子が 15 遺伝子、休止初期の方が活動初期より発現量の方が高かった遺伝子は 3 遺伝子を得た（図 4A）。
発現量の再現性を検証するために、得られた 33 遺伝子について、リアルタイム PCR による解析を行った。その結果、活動初期の方が休止初期より発現量が高かった遺伝子について 9 遺伝子、休止初期の方が活動初期より発現量の方が高かった遺伝子について 2 遺伝子が RNA-Seq 解析と高い再現性のある発現パターンを示した（図 4B）。現在、11 遺伝子の詳細な時空間的発現パターンを解明するための解析を進めている。同時に、これら遺伝子の機能解析も行っている。
考察

すべての生物には、概日リズム（サーカディアン
リズム）を始めとするさまざまな時間スケールの生ンシングされたり、細胞が個々に分離されたりした
場合でも分子時計活動は維持するが同期性が失われるという報告、また視交叉上核での時計遺伝子（Per1、
Per2、Bmal1）の発現が概日リズムに重なる約 3 時間のウルトラディアンリズムとして変動するという報告など、多くの研究結果からも支持されている。
本研究では、プラナリアにおいて、複数の周期時間（約 30 分、60 分、90 分、120 分）のウルトラディ
アンリズムを示すことが分かった。さらに、環境同調因子を除去したり、RNAi 法を用いて脳の神経活動を阻害したりすると、約 30 分の最も短い周期だけが残り、60 分以上の長い周期は消失することが観察された。これは、ウルトラディアンリズムの周期情報と環境情報を脳で統合することで、約 30 分の基本周
期を倍数化して長周期化していることを示唆している。また、プラナリアのゲノムには Period や Clockといった時計遺伝子が存在しないため、周期の長周期化は概日リズムとは異なる機構によって調節されている可能性が示唆される。加えて、本研究で実施した RNA-Seq 解析においても、Bmal1 など、プラナ
リアのゲノムに存在する遺伝子の発現変動は認められなかったこととも一致する。

以上のことに基づいて、高等動物においては視研究の発表

交叉上核に位置する中枢時計単独で概日リズムを維口頭発表持しているわけではなく、ウルトラディアン型の新1. 澤本美香, 梅園良彦, 井上武, "プラナリア咽規脳内振動子からの信号入力を得ている可能性が推頭における摂食調節に関わる神経細胞種同定",測される。さらに、環境因子によるウルトラディア

日本動物学会第 92 回大会, 2021 年 9 月

ンリズムの長周期化メカニズムにより、生体リズム

2. 宇島金太郎，能登翔大， 青沼春花，阿形清和，の位相同期が達成され、このことにより生体の各種

松尾聡，井上武, "プラナリアの匂い定位行動に生理機能が最適化されると推測される。将来的に、関する定量的解析", 日本動物学会第 93 回大会,

プラナリアにおけるウルトラディアンリズムを制御

2022 年 9 月する神経基盤及び分子基盤が明確になれば、生物リ

3.

Takeshi Inoue, Kiyokazu Agata, Satoshi Matsuo,

ズムの進化過程を理解する可能性が高まるとともに、"The integrated understanding of the brain function -生体時計の異常に起因する疾患の治療にも寄与する

Lesson from the planarian possessing the basic design

ことが可能になると期待される。

of the brain-", 日本生理学会第 100 回記念大会,
2023 年 3 月
誌上発表
1.

Inoue T, Agata K (2022) Quantification of planarian
behaviors. Dev. Growth Differ. 64: 16-37