生細胞内におけるヒトゲノムのダイナミクス
Dynamics of human genome DNA in living cells（日本細胞生物学会推薦）
代表研究者 国立遺伝学研究所 前島一博 National Institute of Genetics

協同研究者 北海道大学 永井健治
国立遺伝学研究所 花房 朋

Hokkaido UniversityNational Institute of Genetics

国立遺伝学研究所 日原 さえら

Kazuhiro Maeshima

Takeharu Nagai
Tomo Hnafusa

National Institute of Genetics

Saera Hihara

Summary
Genome information, which is three-dimensionally organized within cells as chromatin,
is searched and read out by various proteins for diverse cell functions. Although how
the protein factors find their targets remains unclear, the dynamic nature of chromatin islikely crucial. Based on thisTo pursue this , it is important to know genome dynamics.
To approach this basic dynamics, we tried to investigated the movement of eachnucleosome in the chromatin. However, thisIt had been technically challenging to image
single nucleosome, because of a single cell hasving numerous nucleosomes (≈3 x 107).
To that overcome this problemfluorescently label a small number of nucleosomesend,
we fused using PA-GFP (PhotoActivatable-GFP), ) to histone H4, and stably expressed
the PA-GFP-H4 in the cellswe established the system for a single nucleosome imaging.
From our analysis of the single nucleosome movement, we found a novel
ATP-independent local dynamics of individual nucleosomes. This dynamic local
movement without energy would be a basis of various genome events.
研究目的
全長 2m にもおよぶヒトゲノム DNA は人体の設計図であり、ヒストンに巻かれてヌクレオソーム構造を作り、直径約 10 µm の細胞核のなかに折り畳まれている。教科書などでは、このヌクレオソーム構造は、折り畳まれて 30 nm クロマチン線維になり、さらにらせん状に折り畳まれて階層構造を作るとされてきた。しかしながら、私たちはクライオ電子顕微鏡、X 線散乱を用いた構造解析
から、分裂期染色体には 30 nm クロマチン線維を含む規則的な階層構造は存在せず、このヌクレオソーム構造がとても不規則な形で、核内や染色体内に折り畳まれて収納されていることを見出した。このことは、個々のヌクレオソームが規則的な構造として縛られず、ある範囲でダイナミックに動ける可能性を示唆する。このようなヌクレオソームの「ゆらぎ」に基づく動きが、遺伝子の発1

現、DNA 複製、染色体凝縮などのゲノム機能に重要な役割を果たしているのではないだろうか？本研究では、このことを実証するため、生細胞内のヌクレオソーム 1 分子の動きを直接イメージングする技術を開発し、ヒトゲノムクロマチンの細胞内ダイナミクスを明らかにすることを目的とした。
研究経過と考察
ヒトゲノムは 3x109 塩基から成りたっている。およそ 200bp に 1 つの割合でヌクレオソームが存在すると仮定すると、ヒト細胞の中には ≈3 x 107 個にもおよぶヌクレオソームが存在する。ヌクレオソーム 1 分子をイメージングするためには、まず細胞内のごく少数のヌクレオソームを蛍光ラベルしなければならない。また、蛍光ラベルされたヌクレオソームをどのように観察するのかも問題である。
私たちはこれらの問題を克服するため、PA-GFP (photo-activated GFP)でラベルされたヒストン H4 を、細胞内で極めて少量発現させることにした。通常 PA-GFP
ヌクレオソームは蛍光を持たない（Fig. 1A 左）。そして、405-nm レーザー刺激によって活性化され、蛍光を発するようになる（Fig. 1A 右）。通常の条件では、ほとん Fig. 1 The method of single
nucleosome
imagingusing
どすべての PA-GFP ヌクレオソームが活性化してしまい、多量の PA-GFP ヌクレソーム PA-GFPが塊として観察されるため、1 個 1 個のヌクレオソームを区別できない。しかしながら、非常に微量のレーザーを細胞に照射すると、少数のヌクレオソームだけを蛍光ラベルすることが可能となり（Fig.
1B）、1 個 1 個のヌクレオソームが観察できるようになるなると考えた。具体的な研究手順は以下の通りである。
(1) 低発現 PA-GFP-ヒストン H4 コンストラクトの作製と PA-GFP-H4 安定発現細胞の作製
PA-GFP-H4 の低発現のため、通常用いられる CMV などのウィルスプロモーターではなく、ヒトの内在性の弱いプロモーターを用いる方が望ましい。このため、ヒト Cdk1 プロモーターをもちいて、発現コンストラクトを構築した。また、一過性発現させた細胞での観察はとても簡便である一方、発現量を一定にすることが困難であり、再現性にも乏しい。このため、細胞のゲノムに部位特2

異的組み換えを用いて、コンストラクトを組み込むことで、安定発現細胞株を作製した。
(2) 固定した PA-GFP-H4 安定発現細胞での 1 分子観察
1 分子観察には、徳永らが考案した細胞核内の 1 分子観察に適した斜光照明のシステム (Tokunaga et al., Nat. Methods, 2008)を用いた。はじめに固定した PA-GFP-H4 安定発現細胞株を利用して、1 分子の観察のための測定検討を行った。幸運なことに、我々の私たちは 1 分子照射システム下では、405 nm のレーザー刺激を行わなくても、PAGFP-H4 の輝点を観察できFig.
2Singlenucleosomeることを見出したすることができた（Fig.
particles in a fixed nucleus2）。おそらく、多数の PA-GFP-H4 のうち、ごく少数は偶発的に PA-GFP が活性化したと考えられる。このようにして、固定した細胞を用いて、観察条件を決定した。
(3) PA-GFP-H4 安定発現細胞のライブ観察
固定細胞で決定した測定条件に基づき、生きた細胞で 1 分子観察を行った。1 個 1 個のヌクレオソームの動きをトラッキングし、データを集める(Fig. 3)。この際、毎秒 30 枚フレームのビデオレートで撮影し、可能な限りヌクレオソームの速い動きに対応させる。この方法で得られた
Fig.
3
Singleparticle
核内および分裂期染色体内のヌクレオソーム 1tracking
分子の動きを、計算機ソフトである MatLab を用いてトラッキングし、動いた距離を算出し、てその分布図を作製した(Fig. 4)。
PAGFP-H4 を利用することで、細胞内に多く≈3 x 107 個に存在するヌクレオソームのふるまいを、個別にトラッキングすることが可能となった。生細胞の間期クロマチン核と染色体でのヌクレオソームの平均移動距離は(を Fig. 4 に示した。)、グルタルアルデヒドで強力にヌクレオソームを固定架橋した細胞場合(Fig.
5 上)と比較して、ヌクレオソームの移動距離は非常に大きかった active な動きがみられる。このことから、検出した生細胞におけるヌクレオソームの動きは、顕微鏡の検出系の揺らぎや測定誤差によるものではないと確認できた。また、生細胞の 30 ミリ秒間 msec でのヌクレオソームの平均移動距離は、50nm 以上であり、30 nm 以上でありよりも大きかった。、このことからこれらの結果は、分裂期染色体や核内に存在すると言われていた、規則的な 30 nm クロマチン繊維
3線維が細胞内でほとんど存在しないことを、生細胞でも証明したことになる。
支持するものと考えている。
また、興味深いことに、グルタルアルデヒドよりも弱い固定架橋であるホルムアルデヒド固定では、生細胞と変わらない比べても遜色ないほどの移動距離の分布がみられた(Fig. 5 下)。このことは、個々ヌクレオソームの個々の動きは、ATP に依存せず、ブラウン運動による「ゆ Fig. 4 Movement single nucleosomesin living cells
らぎ」ものであると考えられる。
このヌクレオソームのゆらぎ（はLocal movement）は、非エネルギーに依存しない的な動きであるため、細胞生物にの様々な機能にとって非常に有効に働くであろう重要であると考えられる(Fig. 6)。例えば、私たちはこの動きを我々は、新しい概念であるヌクレオソー
ムの Local movement と提唱している(Fig.
6)。このゆらぎ Local movement を抑制す
Fig. 5 Movement single nucleosomes
るとが存在しないことは、タンパク質なinglutaraldehyde-fixedandどのクロマチンへのアクセスビリティや
formaldehyde fixed cells
ターゲットが、低下することを我々は別の実験により、示している。このようなクロマチンへのアクセスビリティやターゲットは細胞の基本反応を支えるものであるため、よって、このヌクレオソームのゆらぎ動きは、染色体の形成、さまざまなタンパク質がクロマチンにアクセスすることが要求される、DNA の修復や複製、遺伝子発現の点において、原動力となっていると考えられるで有利になる。
また、分裂期においては、このヌクレオソームのゆらぎが、コンデンシンなどの染色体の軸となるタンパク質の出入りに重要であるため、構造維持、そして染色体凝縮の原動力と考えられる。
私たちは今後もこのブラウン運動によるヌクレオソームの動きゆらぎの重要性を、さらに突き詰め追求していく予定である。
Fig. 6 Local nucleosome movement
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研究発表
口頭発表
1. Kazuhiro Maeshima”Mitotic chromosome structure: irregular folding of nucleosome fibers without the30-nm chromatin fiber” Bauer Forum, FAS Center for Systems Biology, Harvard
University , Cambridge, MA, USA, 6/8, 2011
Kazuhiro Maeshima “How is a Long Strand of DNA Compacted into a Chromosome?”
Albany 2011: 17th Conversation, Albany, SUNY, NY, USA, 6/14-6/19, 2011
2. Kazuhiro Maeshima”Mitotic chromosome structure: irregular folding of nucleosome fibers without the30-nm chromatin fiber” Seminar at The Rockefeller University, NY, USA, 6/20, 2011
3. Kazuhiro Maeshima”Mitotic chromosome structure: irregular folding of nucleosome fibers without the30-nm chromatin fiber” Gordon Research Conference: Chromosome Dynamics, Mount
Snow Resort, VT, USA, 7/10-7/15, 2011
4. Kazuhiro Maeshima, Yoshinori Nishino, Yasumasa Joti, Kazuki Ito, Mikhail Eltsov,
Tetsuya Ishikawa”How is a long strand of genomic DNA organized into chromosome?” “第 49 回日本生物物理学会年会 姫路 9/16-9/18, 2011
5. 前島一博「生きた細胞の動的クロマチン構造」第 1 回細胞環境の測定とモデリングワー
クショップ(第 4 回 JSBi 応用システムバイオロジー研究会) 神戸 11/7, 2011
誌上発表
1.
Maeshima, K. Hihara, S. and Eltsov, M.
Chromatin structure : does the 30-nm fibre exist in vivo? Current Opinion in Cell
Biology (2010), 22, 291-297.
2. Maeshima, K. Hihara, S. Takata, H. New insight into the mitotic chromosome
structure: irregular folding of nucleosome fibers? Cold Spring Harbor Symposia on
Quantitative Biology (2010) 75, 439-444
3.1. Takata, H. and Maeshima, K. Irregular folding of nucleosomes in the cell(Commentary)

5Physics of Life Reviews (2011) 8, 51-52
42. Nishino, Y, Eltsov, M, Joti, Y, Ito, K, Takata, H, Takahashi, Y, Hihara, S, Frangakis,AS, Imamoto, N, Ishikawa, T, Maeshima, K.
EMBO J. (2012) in press.

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