［III］組織・器官幹細胞：臨床応用への基盤開発（2）●幹細胞と細胞療法

4．骨髄間質を用いた臓器再生と細胞治療
梅澤明弘＊

細胞をヒトに移植することで，本来の臓器の機能を補充することができる．このよ
うに臓器の機能を回復するため，細胞を導入することを「細胞移植」と呼ぶ．細胞移
植は従来の臓器移植と異なり，他人の臓器そのものを移植しようという考えではなく，自分の細胞を含めた範囲の中で細胞によって臓器の機能を補することを目指す．ここでは，骨髄中に存在する間質細胞が，細胞移植を行う上で有用であることを示す．
独自に樹立した骨髄間質細胞は，興味深いことに骨細胞，脂肪細胞そして心筋細胞としての表現形質を示し，多分化能を有する間葉系細胞の幹細胞が骨髄中に存在することが予想される．多分化能のうち，特に骨細胞，心筋細胞への分化について注目し，生体内への移植を試みた．
骨髄間質細胞 KUSA-A 1 は，骨細胞へ分化する．驚くべきことに，KUSA―A 1 細胞は生体内において骨を形成する．この骨形成は再現性が高く（骨形成率 100％），他の細胞株ではみられない優れた特徴である．KUSA-A 1 細胞の骨細胞としての特徴は際だっており，報告されている骨芽細胞とは本質的に異なる細胞である．この骨髄間質中に存在する骨細胞ならびに骨芽細胞としての「生物学的・医学的材料」としての可能性に注目している．一方，骨髄間質細胞 CMG は，心筋細胞へ分化する．CMG 細胞は心筋に特徴的な分岐を伴った tube 状を呈し拍動し，この拍動数は 60〜180 分である．この収縮がいかなる刺激も必要とせず自動能によって生じていること，さらに収縮がシンクロナイゼーションを伴っていることを明確にした．分化過程で CMG 細胞の示す活動電位は，心筋に特徴的であった．これらの分化した細胞を心筋，骨格筋ならびに骨欠損部位に移植した，短期ならびに長期の移植後における細胞の意外な分化能についても示したい．

Mesenchymal stem cells derived from marrow stromaAKIHIRO UMEZAWA Department of Pathology, Keio University School of Medicine
うめざわ・あきひろ：慶應義塾大学医学部病理学助教授．平成元年慶應義塾大学大学院修了．平成７年同大学医学部専任講師．平成11年現職． 主研究領域／病理学．
小児腫瘍，発生学，DNA メチル化．
＊Key words

骨髄間質間葉系幹細胞
脱メチル化
細胞移植

幹細胞と細胞療法 107

胎児性幹細胞ならびに胎児性癌細胞は多分1）化能を有している（図 1）．このような多能性を有している細胞が成人の組織に存在しているようであれば，ヒトの組織を再生させることが倫理的な問題もなく可能となる．私は骨髄由来の間質細胞が心筋細胞，骨細胞そして脂肪細胞に分化することが可能であることを報告してきた．骨髄間質細胞は，分化誘導を行うことで，拍動を行う心筋細胞になり，一方，骨形成を生じた．これらの分化誘導は，われわれのグループが世界に先駆け成功した．この興味深い現象をヒトの骨髄間質細胞で用いることで，再現性よく分化する系を確立したい．
これらの細胞を用いることにより，虚血によって傷害された心筋組織の補充に用いることが可能であり，難治性の骨折部位にす自らの骨髄間質細胞より得た骨細胞を補ることができる．このようなヒトの再生医学を，骨髄穿刺により容易に採取可能である骨髄間質細胞を標的として実現したい．

1．間質細胞の「default state（初期値）」と脱メチル化剤による初期化
幹細胞のソースのひとつとして，骨髄間質がある2,3）．骨髄間質は骨髄中に存在し，造血を支持する能力があることが知られている．
液性因子を介した寄与，膜上の分子を介した関与，ならびにギャップ結合を介した連絡に

図1

全能性（totipotency）を有するヒト胎児性癌細胞（上）とヒト絨毛ゴナドトロピンの産生（下）ヒト精巣由来の胎児性癌細胞である NCR―G
3 は，レチノイン酸処理により神経，骨格筋，上皮のマーカーを出現するようになる．位相差顕微鏡下において，胎児性癌細胞は壁付着細胞と浮遊細胞のふたつの形態をとる（上）．
レチノイン酸処理後 10 日にて，ヒト絨毛ゴナドトロピンに対する抗体を用いて行った免疫組織化学の結果である（下）．syncytiotrophoblastic giant cell と同様の形態 を 有 す る
多核巨細胞に陽性像が見られる．胎盤への分化を試験管内にて再現できる幹細胞として，ヒト胎児性癌細胞は特徴的である．

より，間質の細胞は血液細胞の分化・増殖を調節する（図 2）．
「間質細胞の造血に対する貢献」とは全く別に「間質細胞そのものの分化3）．すなわち，何も処理をしなければ，骨髄能」を利用することで，骨髄間質細胞を細胞

間質細胞は脂肪細胞か骨芽細胞に分化する治療ならびに臓器再生の供給源として役立つか，まれに軟骨に分化することになる．形態

ことを紹介する．

学的・生化学的に特徴的な分化傾向がみられ骨髄の中には，骨芽細胞，脂肪細胞，軟骨芽細胞が存在する．培養系に骨髄の細胞をない場合は，骨髄に由来する線維芽細胞として扱う．

もってきて，造血細胞を除くとそこには脂肪

ここでは，骨髄間質細胞の，骨芽細胞や脂細胞および骨芽細胞が単離されてくる（図肪細胞といった本来の能力とともに別の予想

108 第 117 回日本医学会シンポジウム

の極めて低い頻度で間質細胞が心筋細胞，骨格筋細胞，神経細胞に分化することは知られているが，その頻度を極端に上昇させるには脱メチル化剤は極めて有用である．神経系への分化を誘導するには，発生学の知識を利用Á¿

す る つ も り で い る．神 経 幹 細 胞 に 対 し てニューロンへの分化を誘導する系を模倣し，間質細胞に対し無血清状態で bFGF，EGF を使用させ，誘導する際にはレチノイン酸，そして成熟には BDNF，NT 3，NGF，glia 培養

À

上清を処理する予定である．

2．マウス由来骨髄間質細胞とヒト由来
骨髄間質細胞
図2

骨髄間質の本来の造血に対する役割のモデル図
骨髄間質細胞と血液細胞との細胞相互作用を表した．CSF―1 をはじめとする液性因子を介する交流（I），膜状の分子を介した連絡（II），ギャップ結合を介した交流（III）の 3通りが考えられる．ギャップ結合は主にコネキシン 43 を発現しており，脂肪細胞への分化過程ではその交流は消失する．また，脂肪細胞へ分化すると液性因子も発現しなくなる．

マウスの間質細胞を目的の細胞に分化誘導させた後，臓器への移植を試みている．マウスの細胞は分裂が停止して増殖が止まるまではヒトに比較して限られている．しかしながら，容易に不死化させること（spontaneousimmortalization）が可能なため，腫瘍化（transformation）しておらず不死化した細胞を得ることで移植の系を立ち上げ，十分量の細胞を得ることが可能である．この腫瘍化していないということは重要である．
腫瘍化した場合，もしなかった分化能を利用して臓器の機能を分化効率は落ちる．また，移植した場合，腫補瘍となり，宿主にとって不都合となる．不死

軟骨芽細胞はもともとの，骨髄間質の初期値化しているだけであれば，移植先の臓器中でとして設定されていた状態であるので，誘導分化し，増殖を止める．

しようと考える．骨芽細胞・脂肪細胞・剤を用いることで分化させることができる
4）

ヒトの場合は，マウスのように自然に不死（図 4）．一方，心筋細胞 ，骨格筋細胞，神経化することはない，低頻度で不死化するのか細胞，血管内皮を間質細胞より作る場合は，もしれないが，ヒトの細胞が何らかの処理をこの骨髄間質細胞の初期値をリセットする必することなしに不死化することは実験室では要がある．細胞の固有の状態（初期値）は，観察されていない．SV 40 large T 抗原またはその細胞のゲノム上のクロマチンまたはメチ

Polyoma middle T 抗原を導入すると不死化すル化という修飾状態または高次情報として決る細胞が出現してくる．しかし，そのようなめられているので，その細胞の固有の状態を方法で不死化された細胞は，同時に腫瘍化し解除するために脱メチル化剤として 5―aza-ており，分化形質を失っているばかりか，移cytidine を使用する．正確に言えば，ある一定植先で腫瘍を形成した．
幹細胞と細胞療法 109

図 3 骨髄の初期培養骨髄の初期培養を行い，血液細胞を除去した．骨芽細胞ならびに脂肪細胞が見られる．骨芽細胞は，隣接する細胞とギャップ結合を介する連絡を有する．星印で示した細胞に Lucifer Yellow CH を注入し， その色素が隣接する細胞に移動し， ギャップ結合の存在を示している（a，b）．これらの細胞はコネキシン 43 を発現している．一方，脂肪細胞は，隣接する細胞との間にギャップ結合はなく，注入した細胞からの色素の移動はない（c，d）．
a，c : 蛍光像．b，d：位相差顕微鏡像．

ヒトの骨髄間質細胞を用いて細胞移植・臓命の延長はみられなかった．線維芽細胞の寿器再生を試みるには，マウス同様に相当数の命をテロメレースは延長するとされているの細胞を用意しなければならない．10 名以上ので，骨髄間質細胞の寿命が延長することが予方からの骨髄間質細胞を用いて初期培養を作想される．私の場合，増殖が止まろうとして製したところ，数代で細胞は増殖を停止した．

いるときにテロメレースを導入したために，細胞は単離した方の年齢に依存して細胞寿命細胞寿命を延ばすことができなかった可能性が決められているため，年齢の異なる方々かがあった．

ら細胞を単離したが，分化誘導する実験系をヒト間質細胞の分化誘導・未分化性の維行う場合ではあまり年齢に関係して細胞寿命持・細胞増殖には，液性因子は重要な役割をが長いとは限らなかった．脱メチル化処理しはたした．未分化の状態を保つことと増殖のてから分化誘導するまでは何回か増殖させる維持に，bFGF は有効であった．細胞寿命を延ので，ヒトの細胞移植を試みる上で細胞寿命長させるわけではないので，明らかに増殖をを延ばすことは必要である．そのためにテロ促進し，短時間で必要な細胞数をえることをメレースを導入して細胞寿命の延長を試み可能とした．

た．残念ながら，細胞転換に必要なほどの寿110 第 117 回日本医学会シンポジウム

3．どのような細胞が細胞移植にとってベストであり，事実上の標準となりえるか？―骨髄間質細胞と他の幹細胞を比較して―胎児性幹（ES）細胞は全能性を有しており，基本的に胎盤を除く全ての細胞を供与することが可能である．また，マウスならびにヒトでも ES 細胞は基本的に不死化していると考えられる．言い方をかえれば，不死化した細胞のみが報告され，多くの研究者に利用可能となっている．また，皮下移植した場合，ES細胞の種類にもよるが，神経組織，気管，軟骨，消化管組織を含む奇形腫をつくり，悪性腫瘍としての性格は有していない．その問題を解決すれば，不死化していることにより細胞移植に十分に足り得る細胞数を簡単に得られる点は他の細胞にはない特徴がある．核移植技術とともに ES 細胞を利用すれば拒絶の問題も解決される．ただし，一般に言われているように簡単に ES 細胞をそれぞれの個人で樹立できるかどうか（または必要量の細胞を得られるかどうか）に関しては，私は疑問をもっている．また，特定の細胞に分化させ，移植先で目的の細胞のみを利用するのも難し
い可能性を否定できない．
図 4 骨髄間質細胞の分化形質
骨髄間質細胞中には，骨芽細胞，脂肪細胞が含まれる．通常の培養状態において，骨芽細胞，脂肪細胞を単離してくることが可能である（default state）．
酵素組織化学法によって，アルカリ・フォスファターゼが強陽性になり，骨芽細胞であることがわかる（上）．別の条件下では，骨芽細胞は脂肪細胞へ分化する（中）．これらの細胞中には，Oil Red O 陽性の脂肪滴を認める．さらにこれらの間質細胞に対して，5―azacytidine を処理することで，心筋細胞への分化を誘導することが可能となる（下）．

胎児組織から得る間葉系細胞は不死化していない．不死化はしていないが，胎児から単離し て く る た め に 増 殖 が 停 止 す る（senescence）
までの細胞寿命は長く，十分な細胞数を得ることが可能となる．腫瘍化もしていないため，分化誘導も比較的安易であると考えられる．問題は，倫理的な側面と中胚葉系の細胞のみへの分 化 能（limited differentiationcapability）である．間葉系の細胞を増殖させるので，中胚葉以外の細胞は得にくいといった欠点がある．
成人組織の細胞は，分化しきった細胞であ幹細胞と細胞療法 111

り，その組織の形成能ならびに分化は最も優質れている．軟骨より得られた軟骨芽細胞は軟疑応

答骨を形成する．ただし，成人組織より得られた成熟細胞は，骨髄間質以上に細胞寿命が短く，ほとんど増殖しない．ゆえに目的の細胞数を得ることはむずかしいことになる．

座長（秦） ありがとうございました．それではディスカッションをお願いします．
宮園浩平（癌研究会） たいへん面白いお話「どんな細胞が細胞治療に利用できるか」とをありがとうございました．骨ができた細胞いう根元的な疑問が存在する．骨髄間質細胞と，軟骨ができた細胞と，脂肪ができた細胞は，骨髄中に存在し骨髄穿刺で容易に採取では，全部異なるのでしょうか．

き，培養技術も確立している．私がここでく

梅澤

まったく違う細胞でして，不死化，り返したいことは，臨床再生医学に用いるこ腫瘍化はしていません．ですから，腫瘍がでとができる最も現実的な細胞のひとつとしてきたことは 1 度もありません．腫瘤ができた

骨髄間質細胞があることである．

ことも 1 度もありません．注入された細胞は必ず元の生体内の組織の中にバラバラに存在

謝しています．細胞の注入は外科の先生にお願辞

この研究は，慶應義塾大学医学部・秦順一教授の研究室で行われました．阿部仁さんの発見と草刈悟いしています．
宮園

骨になる細胞に軟骨ができたとか，さんの魅力的な骨髄間質細胞の樹立は，この研究の分化の方向性が変わるという感じがありましスタートです．岡野栄之教授，桜田一洋博士，福田恵

たが，何か刺激をすることで，骨の細胞が脂一博士から，多くの世界的な潮流について up-date肪細胞になるとか，あるいは逆の方向になるな情報の提供を受け，最新情報の供与を受けました．

ようなことはないのでしょうか．

牧野伸司博士および神山淳君は，以前，私の自主学習

梅澤

まず骨にしかならない細胞が得られのプログラムに参加してくれた学生でしたが，彼らています．それから骨と脂肪になる細胞は結の多くの実験結果は必要不可欠でした．

構得られます．ただし軟骨と骨になる細胞は絶対に得られないと思っています．実際に私は成体から細胞を得る過程で，発生学のある〔文献〕
1）Hata J-I, Fujimoto J, Ishii E, et al. : Differentiation ofhuman germ cell tumor cells in vivo and in vitro. Acta
Histochem Cytochem 1992 ; 25 : 563―576.
2）Umezawa A, Maruyama T, Segawa K, et al. : Multipotent marrow stromal cell line is able to induce hematopoiesis in vivo. J Cell Physiol 1992 ; 151 : 197―205.
3）Umezawa A, Tachibana K, Harigaya K, et al. : Colonystimulating factor 1 expression is down-regulated during the adipocyte differentiation of H ― 1 A marrowstromal cells and induced by cachectin Tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1991 ; 11 : 920―927.
4）Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, et al. : Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells invitro. J Clin Invest 1999 ; 103 : 697―705.



時点のところのある細胞が不死化しているのではないか，ということを予想しています．
骨芽細胞を生体内に注入すると，2 日で生体 内 で 骨 を 作 り ま す．し か し 5-azacytidineを処理してトリックを使いますと，神経に転換できると考えています．
杉岡洋一（日本医学会幹事） 私は整形外科医ですので先生のお話に非常に興味を持ちました．骨髄の間葉系幹細胞そのものは，環境によって，例えば骨になったり，軟骨になったり，腱になったりということは前からいわれていますが，先生は，細胞そのものの分化の方向は決まっているとおっしゃったような

112 第 117 回日本医学会シンポジウム

気がしたのですが，そうなのでしょうか．
梅澤

いたりとか短縮しています．これは全部整形

私どもは実は 10 種類以上の細胞を外科の先生にやっていただいていますが，例使っています．その中には私が間葉系幹細胞

えばラットぐらいの大きさになれば外固定でだと思っている細胞がありまして，その細胞きるということですので，解決できる問題だ

は完全にコントロールしているわけではありと思っています．

ません．例えば心臓に打った例では，心臓の杉岡

マウスでも針を使えば，髄内固定は中に骨ができたものは 1 例もありません．心

簡単にできると思います．それから carrier

臓の中に別の神経ができたということもありを使って BMP でも同じような骨ができるのませんが，脾臓に注入して肝臓を作ろうとですが，それとのスピードの違いはどうで思った時には，脾臓の中が骨だらけになったしょうか．

ことはあります．その骨は肝臓に移動して，

梅澤

これは私どもの一番強調したい点で肝臓が骨だらけになったこともありますのあると思っています．BMP で collagen gel 等

で，完全にコントロールしているわけではあは非常によく行われていまして，臨床応用がりません．

できるということですが，治療ということをそれから，もうすでに虚血筋肉に注入する考えた場合，現実的に BMP-2 だけではむずか研究をやっています．虚血に陥らせた筋肉のしいということは知られています．一方細胞中に間葉系幹細胞を入れて骨格筋細胞を作ろを使いますと，本当に速くて，10 日以内どこうと思って実験しました．そして今週の水曜

ろか，生体内で 2〜3 日で，少なくとも骨の塊日に私が解剖していましたら，見事に硬いもは出てきますので，スピードという面からものができていました．もう骨か軟骨かどちら細胞の方が有効であると信じています．

かができてしまって，筋肉などはできていな

中尾真（日本医学会幹事） demethylation

かったのだと思います．まだまだうまく行かは非常に安定な状態でお使いだろうと思いまないこともあるということです．ただうまくすが，その程度を変えるというようなことで，行かない理由もわかっていて，骨格筋再生をいろいろな組織が出てくる可能性はないので完全に成功させた時には，myosin light chain

しょうか．

promoter の後ろに蛍光色素をつけて，筋肉に梅澤

5-azacytidine ですが，3 µM，10 µM，なるだけの細胞を集めてきて注入していま50 µM といろいろな濃度でやっています．いす．今回は 5-azacytidine だけを処理して注入

くつかやっていますが，レチノイン酸などは，していますので，ちょっといい加減過ぎたか

濃度に応じていろいろな臓器ができるというなと思っています．

ことをお聞きしましたが，骨髄間質に関して杉岡

もう一つ，大腿骨を 2 3 欠損させては，濃度に応じて組織の方向性が変わるとい骨をつなげたとおっしゃいましたが，それだうことは認められていません．それから 5-け欠損させれば短縮しますね．何かその間に

azacytidine はあくまでもランダムな脱メチ

スペースを保つような，外固定といいますか，ル化剤ですので，ただ細胞の固有の状態をリそういうものをなさったのでしょうか．

セットしているというようにご理解いただい梅澤

マウスですのでまったくできなくて，目的の細胞を得るためには，サイトカイて，ブラブラの状態です．今日はまったく短ンやマトリックスとか，いくつかの細工が必縮のないものをお見せしました．しかしマウ要と考えています．

スは動きますので，大部分は V 字型にくっつ

座長

ありがとうございました．
幹細胞と細胞療法 113