190517

IContents: 190517
１  N /3GK>JC/)82$#

2 / N N N /8%6#(7'6'R

3  P<GLA<OQ'5%6@MD:!
Garza et al, 19958.#

４   8IAEM;*6PP1F9O=-BKM>H?MTn108+,QGarza et al, 19958.#5 allele specificity-0R
Garza et al, 1995&41"Zhou et al, 19988.#

遺伝子型・表現型の見方
Maloy and Hughes, Methods in Enzymology 421:3-8 (2007)
2EN7KJ>9+-<@5L0lj!f!ePXbYSgA*,;ML(g \b`UdE1>L0lpyr
pyrC: dihydroorotase, pyrD: dihydroorotate dehydrogenasehg\b`Ud867<9DL(l pyr B*,f?F/
fQ]cdgEOA5L3A, B...B:@59gig(80F(DLE'=@5L3allele numberA>L
pyrD1 B pyrD2 G3=pyrDF(DLE(8'=@5L
jg0EZadV^WdDCF
84L
pyrC ETn108
lpyrC::Tn10kg0E#84L
pyrC 8#lΔpyrC*&Ij!f!gA*>fl'%.)g"HO$84L (Pof+) "HO$8D5 fPof-) R[_PTd) (Kmr)論文に書かれているTableの例(Asai et al, 1997) φ80
lacZ DM15 lac a

DH5αの遺伝子型recA1: RecAt|oAb,M.4#Q_TaP
hsdR17:

GE2HsdRb,M%Cl !_TaP

endA1: I*,-endonuclease EndAb,M~sx1>"bDNAS@WkaP

supE44: ptn{(UAG) suppressor tRNADc}mrb?
thi-1: vnc(relA1: nzFJKbgj670cppGppl(gyrA96: DNA gyrasecA subunitb,M+)AyrosFb8`aj
Δ(argF-lacZYA)U169: U169`Uhk[(_MargFRhlac operonS(Φ80d lacZΔM15: u~ }mrΦ80l]SM lacZΔM15`Uhk[(SOiMLacZcC$/}pw(ω)lqxX^Pj;<DH5α&dM.4#QS_TZM GE2HsdRS':l\^Pjc_M
;<c%Clo  X[~sxS39 b\^fM4#Q
lBVWZM !lUaPNendA( bgiM1>"b @lUaPc_5Lb~sxlH_TjNe[MLacZcω}pwlqxYjc_Mα.=S:N

変異体の性質を調べる
7",;,</48,,V

'HNIPGQJAF@L(8?

1<7,V$ 02<47#-=<ST*<?

1<UCMOECRSsuppressorTDPKB#%-3.<U“allele specific”U75!9A>23

suppressormutation

BA-B &:VA6)3.5+

allele specificB6)3.<

細菌べん毛の変異体（輸送装置）

691.4;
'/:3-%'
&'(Minamino et. al, 2000)),'/:3-FliI' 
K188I<ATP=($!*(Minamino et. al, 2008)

FliI(K188I)(), +
'/:3-%# +<05978;/:2' +"*=細菌べん毛の変異体（固定子）
. motB

pGM1: motB %!),&*((Blair et. al,1991)

motB17 .
(R13 stop)
motB6, motB8 .
(A39V) (E205K)
 #.
+-'-" $% #/(Minamino et. al, 2008)

$'"%*/,(#&$ #Mike*/,( MotB !%*/,(&)-.+)0& %
! 2006

べん毛モーターのエネルギー変換素子：固定子

 (*)'MotAMotB!"$ %&*+H+) #"MotA(*)'FliG $"!#"
1993年頃にどこまで分かっていたか？

Irikura et al, 1993

固定子はモーターのどの因子と相互作用するのか？
$+-#*'.G@E;E2

13"F,2;D?9%!

固定子
MotA: ;D?9
MotB: ;D?9"

4MotA8 

回転子
FliG: =C915 
FliM:  8)621!
FliN: CBD:20
MotA.MotB3 10+-"H+8)<A>C.(-&"2/7$.)6H
MotA.MotB3)62$H
MotA.MotB3 2FliG, FliM, FliN.)62$H
遺伝学的に調べたい

motB 変異体から、運動能を回復するサプレッサーを取るサプレッサー単離実験のデザイン
David Blair FN@B3motA, motB %7
%G#8D7E:QB5P

2:Q3

K=H motB %( _F(&;39G%6O. *R<PUY[XU]R
2<P4UY[XU]%1R<QI3MotB F'$<P +7,A
6P4H motA, fliG, fliM, fliN JG%F(&<P`_AG64 (motA+ DmotB uvrC279::Tn10)
a_AG64"R EMS C mutagenesis
b_pMB plasmid (motB missense mutation)R
c_-C.

*R)<LG^Mot+, UY[XU]_R/

d_UY[XU]FP1virR!:>P
e_P1virRRP6647 (motA+ DmotB )/pMBF!:>3Tetr6AMot+C/
f_%7ZXY:Q?0^motA, fliG, fliM, fliN_RPCRCM;3V]TS\Wサプレッサー単離に用いた motB 変異
. motB

pGM1: motB %!),&*((Blair et. al,1991)

motB17 .
(R13 stop)
motB6, motB8 .
(A39V) (E205K)

David Blair #.
+-'-" $% #/(Garza et al, 1995)

サプレッサー単離に用いた菌株の説明

RP437 (wild type)motA

motBcheA

motA DmotB cheA

RP6647 (DmotB )motA DmotB cheA

AG64 (DmotB uvrC279::Tn10)

Tn10 (Tetr)
uvrC

pGM1 (PlacUV5 -motB, Ampr)pMB plasmids (PlacUV5 -motB*, Ampr): pGM1motB 

極性効果（Polar effect)',&+mRNA'+2%0"(!0@39=>A

*"+*7<>4:5>!
BA

z,

*-/

CA

y, a,%0(D#10
! .%0D$)!0"+"(2*-/+mRNA!

(#1)@6?;8?6?A

サプレッサー単離に用いた菌株の説明

RP437 (wild type)

motAmotBcheA

motA DmotB cheA

RP6647 (DmotB )motA DmotB cheA

AG64 (DmotB uvrC279::Tn10)

Tn10 (Tetr)
uvrC

pGM1 (PlacUV5 -motB, Ampr)pMB plasmids (PlacUV5 -motB*, Ampr): pGM1motB 変異の抑圧（suppression)
AG646 motB %)0#: pMBCF@DB= +<7AG64=EMS+;2 4FIAE4

 motB 5%;!-5%9<;

% pMBCF@DB$9(<;MotB 5 J%3"K= (,; /8:%
+<7 EMS1*. % motB =J?CH@K+;'243;!
motA DmotB cheAx

相補相補できないmotB

motB*pMB

&(uvrCxpGM1

GI>5Tn10 (Tetr)

抑圧するx gene X

トランスポゾンを使ってマッピング
82$AG64 (DmotB uvrC279::Tn10)B(:)R


;FLNIFOB motA, fliG, fliM, fliN 903=:9?3'%-:P5:#:",9&@ uvrC 9 Tn10 *43* AG64 6&@%=/$
P5:#9 *038>$P1vir6 Tn10 79!6+@%:EJM)>

22 kb
P1vir*KIDOG1@DNA:FCHQ110 kb

17 kbTetr)5Mot+98@ B <@motA 7 uvrC *9P16!.A@ Q75%
fliG, fliM, fliN 7 uvrC *9P16!.A@ Q20 - 25%:トランスポゾンTn10(Benjamin and Kleckner, 1989)(Harring et. al., 1982)

IS: insertion sequence3(Tn10 12!&110>BD:A9E;F16G$8E?'5-#4"*+(!IS10 right$02 6 ,"

<E7=>$ '5-)4022 /%!$IS101.Tn1063)"<E7=>11C@E>

P１ファージによる形質導入

1/$< ;E
PFSL%$:OMISLJNQ;$-2DC

0;PFSL<!;JNQDNA
E@59+5?(&'7.9+-"T&()#'U;

*ABUJNQ~4,600 kb
P1%$ ~110 kbC35;DNA;$Eランダム:8B0>( =84
Generalized transduction (λPFSL<Specialized transduction)
:36<C;7(:KGHR:C P1vir E,P1ファージとトランスポゾンを使って変異をマッピング

8957+Tn10 3&1P1+Tn1030 467,!$21
co-transduction

+P13 $'&1(Jeffrey H. Miller, 1992)#,3%*x

Tn1020%

x

50%

x

100%

(/(/ ,"+Tn10 !$2)( !$21

+

$'3.1: -100%;

トランスポゾンを使ってマッピング;:158319'P1vir0 ".
<:P1vir0RP6647 (motA+ DmotB )/pMB' "Tetr#Mot+$
(pMB57264.%'(+.,(0!.

 158319'P1vir0 "RP6647/pMB' ".
Tetr#Mot+'&.0*.
(75%

&-=motA % uvrC 'P1$(20 - 25%)motA% /.
 /.=75%&-=)fliG, fliM, fliN% /.

fliG, fliM, fliN % uvrC 'P1$

 /.=20 - 25%

これらの抑圧変異体を選択し、PCRで各遺伝子を増幅してシークエンスする

抑圧変異の殆どは motA に発見された
RP6647(DmotB)pGM1 or pMB (motB*)
WT/WT
WT/G164DWT/P159I

L211F/G164D

A191V/P159I

allele specific suppression
AsuppressormutationB

A-B A#$(

allele specificB&)"$

!.+1302,'%!*/- &

変異部位
MotB MotA

FliG E108K
FliG R190H

FliGとMotAの間の相互作用++-Zhou et al., PNAS (1998); Blair, FEBS lett. (2003)

glfjgkd3ee 5 11 m
a]^mRP6647 (ΔmotB )`c]b_>WmotB, motA [#abcd

a: MotB (WT), MotA (WT)b: MotB (G164D), MotA (WT)c: MotB (G164D), MotA (L211F)
d: MotB (G164D), MotA (G199S)

Q LR6motB [C0'[HO;RP6647P6`c]b_>W
motA, motB Q1[#BF6. Q0'[,SK;Y7WTR2(wild type)[$CK;Y7ge MotBRG164D"PVX'[;6)R0EYAM?L@O;7C>C6MotAPL211FTHRG199S"? DYM6G164D"?:IKU)R0EYAM?L@Y7OG>n 8 9M;<+[!;K&=V7A191V
A39V

he MotBQ(-/4 PA39V"? DYM)R0'[<7C>C6AQ"RMotAQ%i(-/4 P DHA191V"PVX BZ6)R0'[CH7A
QAM>W6MotA, MotBPJ;K6N\OAM?*=Y>ny~x|y}vDww F

sop&RP6647 (ΔmotB )ruotqOimotB, motA m.*abB1 #cd

a: MotB (WT), MotA (WT)b: MotB (G164D), MotA (WT)c: MotB (G164D), MotA (L211F)
d: MotB (G164D), MotA (G199S)

b]cGmotB m)TA 5m$Y`LRP6647&aGruotqOi
motA, motB bBm.*SWG=bA 5m;d\LkH
WTcC+(wild type)m0T\LkH
yw MotBcG164D-ahj(5mLG7cA VkR^P]Q`LH
TOTGMotAaL211FeYcG199S-P+Uk^GG164D-PKZ\g7cA VkR^P]QkH`XO I"J^LM :m,L\2NhH

MotBa+UYG164D-mGMotAa+UYL211FeYcG199S-P"TYYfH"-ahZ\MotAb'@P TGG164D-ahkMotBb'@ PgYiTY(5)%m VkR^P]QY^4NilkH

A191V
A39V

zw MotBb6<?EaA39V-P+Uk^7cA 5mMHTOTGRb-c
MotAb1{6<?Ea+UYA191Vahj"SlG7cA 5m TYHRbR^OiGMotA, MotBa[L\G_n`R^
P9NkO

MotA^MotBc6<?Eb/,mT\8 m!T\LkH
MotAb1{6<?EcMotBb6<?Ea>L3aKk^4NilkH