［II］組織・器官幹細胞：臨床応用への基盤開発（1）●幹細胞と細胞療法

1．未分化胚細胞からの神経分化制御と再生医学
笹井芳樹＊

神経系は再生能が低い典型的組織である．一旦受けた疾病・損傷等による神経細胞欠損は人為的に神経細胞・組織を補充する必要が出てくる．当研究室では未分化な胚細胞から神経系細胞が分化する制御機構を詳しく解析することで，試験管内で特定の神経細胞を分化させる系の樹立を試みている．
脊椎動物の神経系は発生初期に外胚葉から分化するが，その際オーガナイザーから分泌される神経誘導因子が分化誘導を促す．最近分子生物学的方法により神経誘導因子が同定されたが，我々の単離した Chordin もその一つである．Chordin は神経分化を抑制する因子 BMP-4 に拮抗して働き，アフリカツメガエルの未分化外胚葉細胞より神経を分化させる．こうした神経誘導因子研究の最新の知見に加え，この演題では我々が最近同定した神経誘導因子 Chordin の下流因子として働く複数の遺伝子について紹介し，神経の初期パターン形成の制御について討論したい．
またマウスの初期胚の外胚葉組織や ES 細胞を用いた試験管内神経分化系のデーターを紹介し，再生医学的展望について討論する．マウスの未分化細胞からの神経分化誘導にはいくつかの方法があるが，特にレチノイン酸を用いるものと用いないものが存在する．これらの培養条件の違いが神経分化パターンに与える影響のデーターを示し，有用神経細胞の分化条件を討論する．またマウスの神経分化への BMP-4 の作用も詳しく紹介し，現在こうしたアプローチがどこまで現実的か討論する．

Regulation of neural differentiation from embryonic cells : prospects for regenerative medicine
YOSHIKI SASAI Iustitute for Frontier Medical Sciences
ささい・よしき：京都大学再生医科学研究所再生誘導研究分野教授．昭和61年京都大学医学部卒
業．平成８年同大学院医学研究科助教授．平成10年現職．主研究領域／神経発生学．
＊

44 第 117 回日本医学会シンポジウム

Key words

神経分化発生ES 細胞
神経誘導因子はじめにた．全核酸配列決定の結果，それらは 3 つの転写因子をコードしていることが明らかと近年遺伝子スクリーニングの結果，脊椎動なった．うち 2 つはマウスでのホモローグが物の神経分化の初期制御因子を単離・解析さ存在するもので Zic-related 1（Zic-r 1）と Sox

れ，どのようなスイッチが入ることで神経分2 であった．もう 1 つは新規の遺伝子で Sox化が開始するのかが分子レベルで明らかにな因子のファミリーに属する SoxD であった．

りつつある．複雑な神経系のパターン形成の発現分布と制御初期の段階に関わる遺伝子も候補が同定され3 つの初期神経特異的転写因子が同定されてきている．現在の最も重要な研究方向は，たが，その詳細な時間・空間的分布にはそれ神経分化の初期制御遺伝子とパターン形成のぞれ特徴があった．Zic-r 1 と Sox 2 は神経誘初期制御因子をいかに有機的に説明するかで導因子 Chordin の発現開始の直後から予定神ある．この数年初期神経発生を制御する数多経領域であるくの因子が単離され，試験管内において神経いた．一方，この時期の SoxD の発現は外胚葉分化を制御することがかなり可能になってき全体に認められたが，原腸胚の中期までに腹た．Chordin や Noggin はシュペーマン・オー側の発現が減弱して神経外胚葉に限局するこ

ガナイザーから分泌される古典的な神経誘導とが明らかになった．Sox 2 と SoxD はその後因子であり，未分化外胚葉細胞に作用させるも神経系に広く分布していたが，Zic-r 1 は腹と中枢神経系細胞を分化誘導する．その作用側正中部での発現が消失し，神経胚期には神機序は神経分化を負に制御する BMP-4 を不経管（中枢神経原基）の背側のみに発現が続活性化することである．こうした神経分化のいていた．

胚期の背側外胚葉に発現してシグナルが細胞内にどのような反応を誘起mRNA 微量注入法によって 3 つの転 写 因し，転写制御を介して神経分化を促進してい子は神経誘導因子の下流に存在することが示るのかはまったく不明であった．私たちの研された．Chordin mRNA をアフリカツメガエ究室での取り組みを中心に，わかりつつあるルの外胚葉全体に強制発現させたところ，原原理とこれから明らかにされねばならない目

腸胚の中期の Zic-r 1，Sox 2，SoxD の発現はと標を討論したい．また，神経分化を試験管内もに強く異所的に誘導され，また神経誘導因で制御することによる再生医学的応用の展望

子 Chordin の拮抗因子である BMP-4 を作用を述べたい．

させたところ，Zic-r 1，Sox 2，SoxD の発現はともに強く抑制された．また SoxD の発現は1．結果と討論
1）神経分化の初期制御に関わる 3 つの転写因子
アフリカツメガエルの系を用い Chordin 下

Zic-r 1 の強制発現によって正に制御され，BMP の下流因子である GATA-1，MSX-1 などにより負に制御されていることも明らかになった（図 1）．

Zic-r 1 の生物学的活性流因子をターゲットとしたデファレンシャmRNA 微量注入法によって片側の外胚葉ル・スクリーニングの結果，複数の候補遺伝全体に Zic-r 1 を強制発現させると，神経マー子が単離された．そのうち 3 つの遺伝子は予カーが異所的に誘導され，同時に表皮マー定神経領域の極めて初期から発現しており，カーであるケラチンが抑制された．神経板・神経誘導現象の下流因子として有望と思われ表皮の境界を染めるマーカーである hairy 2幹細胞と細胞療法 45

BMP-4
Noggin,Chd,Follistatin
神経誘導因子BMPR[初期原腸胚]Sox2 Zic-related＋FGF[中期原腸胚]Xiro

Xlpou2

Gata1

VentralMsx1 homeobox

SoxD
神経分化阻害/
表皮分化

神経分化促進神経分化
外胚葉内の位置情報
一次ニューロンの分化
プロニューラル遺伝子

Xash3

Xngnr1MyT1側方阻害の解除図1

二次ニューロンの発生

Delta
NeuroD

側方阻害を媒介ニューロンの分化と個性付け

胚初期の神経板の形成に関わる因子の関係を用いた解析からも，注入側で神経板が拡大ことが判明した（図 2）．時間軸を詳しく解析していることが明らかになった．アニマル・すると，神経外胚葉は一旦形成され，Zic などキャップ外胚葉を試験管内培養したところ，の初期因子は誘導されるが，その先の分化がZic-r 1 を強制発現した外胚葉外植体は神経できなくなり，N-CAM などの神経マーカーは組織に分化したが，コントロールの外胚葉外発現しないことが明らかになった．さらに誘植体はすべて表皮に分化した．このことは導型ドミナント・ネガティブ変異体を用いた

Zic-r 1 が直接外胚葉に作用して神経に分化実験から Sox 2 は神経分化の 初 発 ス テ ッ プさせる働きを有することを示 し，Zic-r 1 が（いわゆる神経・表皮の binary decision）ではChordin の下流で働く神経化因子の一つであなく，神経へ分化し始めた細胞がその運命付ることを明らかにした．

けを確定させるのに必須であることが示され

Sox 2 の生物学的活性と機能喪失実験
Sox 2 の mRNA 微量注入法による強制発現た．

SoxD の生物学的活性と機能喪失実験

では，神経分化の誘導はほとんど認められな

SoxD の神経分化誘導における作用を解析かった．そこでドミナント・ネガティブ変異したところ，Sox 2 とは異なり SoxD は単独で体を用い Sox 2 について機能喪失実験を行っ神経分化を促進した．Zic-r 1 と同様に，片側た．Sox 2 の機能を阻害すると，外胚葉からはの外胚葉全体に SoxD を強制発現させると，中枢神経系も神経堤細胞も全く形成されない神経マーカーが異所的に誘導された．また

46 第 117 回日本医学会シンポジウム

[原腸胚初期][原腸胚後期][神経胚]

binary decision

神経への運命づけの確定

分化の維持・成熟

未分化外胚葉
BMP

初期
神経外胚葉

後期
神経外胚葉

成熟神経細胞

Zic,Sox2,SoxD

nrp-1

N-CAM

表皮前駆細胞
Sox2-依存的分化
表皮細胞

図2

ドミナント・ネガティブ Sox 2 による神経分化の抑制

ナント・ネガティブ変異体を作成し，発生中の胚の外胚葉全体に発現させて内在性の未分化外胚葉細胞

SoxD の機能を抑制したところ，前脳に特異的な欠損が生じ，それより尾側の神経は正常外胚葉運命づけBMP神経誘導因子であった．このことは in vivo において SoxDは頭側の神経組織の発生に必須であるが，同じく発現している尾側の神経発生では必ずし表皮細胞神経上皮細胞

Zic-関連因子
SoxDも必要ではないことを示している（図 3）．
2）マウス細胞の試験管内神経分化制御

Sox2
SoxD

Sox2

以上，アフリカツメガエルを用いた神経分化の制御遺伝子について述べたが，哺乳類ではどうであろうか？

我々はまず，アニマル

キャップアッセイに対応するマウスの外植体
吻側神経組織尾側神経組織として，epiblast（未分化外胚葉）の培養を試みた．試行錯誤の結果，これより極めて高率

図3

神経分化制御因子の役割に（＞90％）
神経分化をさせる系を樹立した．
これを用いて，BMP-4 の作用を検討したところ，強い神経分化抑制活性を認め，マウスにSoxD を強制発現した外胚葉外植体は神経組

おいても BMP-4 はアフリカツメガエルのそ織に分化した．SoxD で分化誘導される神経れと相同な役割をしていることが示唆されは主として頭側の神経組織であることが，神た．
ES 細胞を試験管内で分化させる系でも同経領域マーカーを用いた解析の結果で明らか様の活性を認めた．このことは両生類でわになった．HMG 領域を欠損させた SoxD ドミ

かってきた多くの知見がマウスでも当てはま幹細胞と細胞療法 47

出てくる皮膚にするのにはいくつものステッる可能性を強く支持する．

プが必要で，その 1 個手前くらいの precursor

展望にするのは比較的簡単にできます．BMP de-

このように両生類のみならず，マウスでも神経分化の初発段階の制御が分子レベルで進

pendent になります．
栗原

例えば reversible に，もう一度ニューんでおり，昨今の幹細胞工学と相まって，神ロンになるポテンシャルを持った状態に戻れ

経難病に対する神経補充療法の技術基盤確立

るのか，あるいはもうすぐに reversible に他に大きく寄与すると思われる．の細胞への lineage に入って行くのか，そのあたりはどうなのでしょうか．
笹井〔文献〕
1）Hemmati-Brivanlou A, Melton DA : Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell 1997 ; 88 : 13―17.
2）Sasai Y, De Robertis EM : Ectodermal patterning invertebrate embryos. Dev Biol 1997 ; 182 : 5―20.
3）Mizuseki K, Kishi M, Matsui M,et al . : Xenopus Zicrelated-1 and Sox-2, two factors induced by Chordin,
have distinct activities in the initiation of neural induction. Development 1998 ; 125 : 579―587.
4）Mizuseki K, Kishi M, Shiota K,et al . : Sox-D is an essential mediator for induction of anterior neural tissues in Xenopus embryos. Neuron 1998 ; 21 : 77―85.
5）Kishi M, Mizuseki K, Sasai N,et al .Requirement of Sox
2-mediated Signaling for Differentiation of Early
Xenopus Neuroectoderm. Development（in press）
6）Sasai Y : Identifying the missing links : genes that connect neural induction and primary neurogenesis invertebrate embryos. Neuron 1998 ; 21 : 455―458.

い っ た ん BMP を 入 れ て，BMP に

sensitive な時間というのは非常に短くて 2 日
なら 2 日くらいの間ですが，それを過ぎた後BMP を除いても fate は固定されています．それを無理矢理に，例えば ectopic な，おかしなところに移植したら戻るかということに関してはやっていませんが，今のところ in vitro
ではそれはできていません．
峯石（国立がんセンター） 一番最後に
真

パーキンソン病に対する細胞補充療法のお話をなさいましたが，先程の浅島先生のお話にもありましたように，臓器などを戻して，それがきちんとした臓器になるということは，今までは胚など，非常に幼弱な個体に対して実験されていたわけです．それをサルの実験にしても何にしても，すでに成熟した個体に戻すというのは，環境が全く違うのではない

質疑

応

答

かと思うのですが，そのあたりに関してはどのようにお考えでしょうか．

（平井） どうもありがとうございまし座長

た．ご質問はございませんか．

笹井

まさにその通りでありまして，マウスの ES 細胞から神経分化させたようなもの（熊本大） 本論とずれるかもしれ栗原裕基

は，世界中でマウスに関しては adult にどんませんが，BMP-4 の neural cell に行ったといどん移植していますし，それは明らかに生着うものは，具体的にどういう細胞になってゆもしますし，survive もします．例えばそこのくのでしょうか．

部分に入っている何％かの dopamine neuron

笹井

これは条件によってかなり違いますは dopamine neuron になりますし，dopamine

し，BMP-4 を加えるタイミングによっても違も 作 れ ば tyrosine hydroxylase も positive でいます．これはカエルの発想からいいますとあり，シナプスも作ります．今それが治療レ皮膚になる筈です．皮膚になるには条件があベルくらいまで pure になったようであって，ります．正確にいいますと，ケラチンなどが実際に phenotypical に rescue で き る か と い48 第 117 回日本医学会シンポジウム

うところが，多分この 1 年くらいで終わってのヒトというのは「他人」と書いて「ヒト」としまうだろうと思います．これは今までの他呼ぶというもので，例えば今まで 10 年間スの実験からいって，まず確実にどの程度きれウェーデンで行われていた移植は親族のものいに出るかというのが勝負で，きれいに出まを使っていませんので，HLA は random だとしても誰も驚きはしませんね．

思われますが，これで 10 年生存はかなりよ

今大事なポイントは二つで，一つは長期的い成績です．といいますのは，パーキンソンな安全性をマウスで見ていてよいだろうかと病の場合，PET でドパミン系のものを visual-いうことです．4〜5 週間くらいで phenotypi-ise することができますので，1 年おきにどんcal に rescue することはできますが，その後どん follow up しているものがあるのですが，のことがわかりません．

10 年でも結構 activity が残っていますので，それからパーキンソン病モデルに関しては，マウスは確かにアッセイ系として存在す

それを考えますと，HLA を合わせる必要は絶対条件ではないだろうと思っています．

るのですが，手が震えるとか，すくみ足が出（慶 應 大） 先 程，ES 細 胞 で em梅澤明弘

るかといいますとそれは出ませんで，極めてbryo body を作って，高濃度のレチノイン酸いい加減な錐体外路症状が少し出るだけでで lecithin promoter が active な細胞が出てくす．ですからこれはサルでやらなければいけるということでしたが，大体どのくらいの濃ません．サルは見事に tremor も出ますし，す度の時に何％くらい，そしてどのくらい低濃くみ足をしているかどうかは知りませんが，度になってしまうと，何％くらいの lecithin

ほとんどのパーキンソン病症状は出ます．

promoter が activate されるような GAP 陽性

MPTP 処理したものに関して申しますと，あの細胞が出てくるのか，教えていただきたい

れできちんとしたものが出るということと，のですが．

4〜5 年のレベルでの安全性を見なければ，本笹井

大 体 必 要 な half effective な dose と当のルーチンの医療にはならないのではないいうのが 0.2 mmol 程度ではないかと思いまかと思います．ただそれを待たずにヒトでやす．ですから 10―4 くらいで half dose ではないる人はきっといると思います．

かと思います．

座長

一つ教えていただきたいのですが，座長

まだご質問はあると思いますが，時こ の よ う な CNS の 場 合 の HLA の redun-間になりましたのでこれで終わります．笹井dancy はどのあたりまで許されるのですか．

先生，ありがとうございました．

笹井

ヒトの fetal brain の移植の場合，こ幹細胞と細胞療法 49