<<ま えがき>>
アカバ ンカ ビにお ける活性酸素を介 した光信号伝達 の遺伝学的解析
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代表研究者 横浜市立大学 蓮沼仰嗣 Yokohma Ciけ UniVersiり Ko呻 Hasuntlma<<英文サマ リー>>As tt Gttly eVent dung light dgmi tl枷 sd∝ on we hⅣ e pl叩 ∝ed nllcleoside diph∝ phte nm鵬 ̲1(RIDK‑1)will be a tltansducer of tlle sig劇 .Uponinumimdon

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<<本文>>ワ形礼目白勺
をアカバ ンカ ビはその生活環 のなかで,多 くの形態形成 が光 によって市晰卸されている。光市確‖受ける主要 な発生過程 をまとめてみると,以 下 のよ うになる。

1)光 による菌糸のカロテノイ ドの誘導合成, 2)菌糸からの気菌糸および分生子 (コ ニーディア)形 成の光による誘導, 3)概 日性リズム (お よそ 1日 のリズム)を 示す分生子形成リズムの1光 による位相応答, 4)窒 素源枯渇下 の培地で,光 は原子嚢殻形成 を促進する, 5)債 J面 か らの光照射 による子嚢殻 の極性 の誘導 (子 嚢胞子放出 口, ビー クを上方 に形成す る), 6)ビ ー クの正の屈光性 ,等 である。
アカバ ンカ ビでは最近 の研究 によ り,少 な くとも 3つ の光受容体 が存在す るとされている。

i)WC‑1,WC‑2は 複合体 ,WC∞mメ ∝ (WcC)を 形成 し,光 を受容す ると共 に,核 内に移行 し,転写因子 として作用する。 )VIVID(VVD)は WCCの 機能を抑制する因子 として働 き,光 受容も行なう。iii)New opdn‑1(NOP‑1)は バ クテ リオ ロ ドプシンに相似 したタンパ ク質で,NOP̲1は光照射 によ リプロ トンを放 出するが,そ の機能は判明 していない。WCCは 多数 の機能 をもち,その変異,К ―f,お よび К ̲2は 上記 の 1),2), 4), 5), 6)の 過程 において光照射 の作用 がプ 変異 は菌糸におけるカ ロテノイ ドの光誘導が促進 される。
見 られない。また ソ
これ らの光受容体以降 の過程 を分子 レベルで明 らかにす るために,ア カバ ンカ ビ菌糸 か ら調製した粗抽出液 を用 いて,試 験管内光信号伝 達解析系を立てた。青色光照射は 15 kDaタ ンパク質の リン酸化 を増大 させた (小 田,蓮 沼 1994)。

15 Daタ ンパク質 は精製 され ,ヌ ク レオシ ド2リン酸キナーゼであることが 同定され,N× Hと 命名 された (小 倉 ら 1999)。 31DK lの リン酸化がほとん どない変異株 ,rtt f物 が単離された(小 田,蓮 沼 19977。 変異株,J′ Jい ノ囲 は光 による子嚢殻極性 の誘導が欠失 していた (小 倉 ら2∞ 1)。
以上の研究結果 をもとにして,光 を感 じる酵素,plDK lが どのような分子機構 をもって,光を感 じ,光 に対応 してカ ロテノイ ド合成および形態形成 をしているかを決定す ることを研究 目的とした。

研究経過
アカバ ンカ ビの野生機 スーパー オキシ ドジスムターゼ(SOD)変 異株 ,鍛月 ,″ 湖いf″胃菌糸 の表面培養 に光 を照射すると,野 生株 はカロテ ノイ ドを誘導合成 した。soι■ 変異株は野生株よ り
早 く,お よそ 2倍 の速度でカ ロテノイ ドを合成 した。 この系 にアンチオキシダン トを加えるとカ ロテ ノイ ド合成 の速度が低下 した。Mけ ″2り 変異株は野生株 のお よそ 1/2の 速度でカ ロテノイドを合成 した。殿何 変異株,お よび ″滋̲fP列 変異株は子嚢殻 の極J性 の光誘導が共に欠失 してい,た。w′ f変 異株はスーパー オキシ ド(02・ つを過酸化水素 (H2の に変換す る速度が低 いため,細胞内スーパー オキシ ド(o2・ つは高 いが,H2Qレ ベルは低 いと考 えられる。H2° 2レ ベルは時間 をかけて高 くなる考え られ る。Jtt f″ 変異株はカタラーゼ との機能的な相互作用が野生株 に比べ低 ・く,カ タラーゼの作用 が弱 く,細 胞内スーパー オキシ ド(02・ つはそのレベルが低いが細胞内t02
ベレ ルは高いと考え られる。カ ロテノイ ド合成系遺伝子 ,α月 ,2‑3の 発現が野生株は一過的になるのにたい して,鍬灯 変異株は長 くつず く。カロテノイ ド合成 と,ス ーパーオキシ ド(02・ つ'および過酸化水 素 (H2°Dの 濃度 の消長 との関係は明解 には解 けて いな い。アンチオキシダン トが明 らかにカロテノイ ド合成 を抑制す るので,活 性酸素分子種が関与する ことは強 く示唆されるつ(吉 田,蓮 沼 η餌)。

ノックアウ ト変異株,J2認卜fRffり ,′ ′″ f躍 2が 単離され,そ の菌糸のカロテノイ ド合成が調査された。菌糸は黄色,ヵ 形質となり,野 生株とははっきり相違が見られた。このようにして NIDK‑1は光信号伝達に関与すること力鴻虫く示唆された。更 にこれ らの変異株,′ ′〃いf服 ノf膠 2は 気,rr教 ―の形質を示す。
菌糸および分生子が形成されず,ま た原子嚢殻も形成されない。そのため雌嚇
また菌糸の寒天培地上の初期の成育が台風のような,渦 巻状の形態を示 した。,湖 卜f服 ノ,,湖←IPIP
2は前者は mRNAを 蓄積 しない。また後者は mRNAを 蓄積するが NDK‑1タ ンパク質は途中でち・ぎれ,不 完全な活性の無いタンパク質が産生される (李 ら投稿中)。
菌糸のカロテノイ ドの産生については更に詳細 に調査された。震盪培養 した菌糸をろ紙の上に集め,気 湘中で光照射 した。暗黒対照に比べ,光 照射は明らかにカロテノイ ド合成を上昇させた。
この実験を酸素ガス,窒 素ガスで空気を置換 して,同 様の光照射を行なった。酸素ガスは有意にカロテノイ ドの生成を促進 したが,窒 素ガスは促進 しなかった。液体培地中で同様の実験をすると,気湘中に比べて,光 によるカロテノイ ドの合成誘導は有意に減少 した。さらに液体培地に過酸化水素 (比 の を加えると,光 照射は液体培地中のカロテノイ ド合成を促進 した (飯 草ら,投稿準備中)。 このようにして,活 性酸素がカロテノイ ド合成速度を制御していること力測K示 唆された。
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さらにアカバンカビ野生株及び 〃ノ租変異株から,メ チルビオロゲン耐性株をそれぞれ,%株および 40株 単離 した。 これらを 2回 シングルセルをして核の単一化をした後, 3回 野生株に交配 した 2株 について,そ のスーパーオキシ ドジスムターゼ (SOD)活 性,カ タラーゼ活性を測

SOD活 性は野生株との変化はないが,カ タラーゼ活性は 3種類のカタラーゼ,C■ 1,Cが 2,定 した。

Ca6に 付いて活性測定 している。これらの変異株は菌糸のカロテノイ ド合成が低下 し,光 照射・下で菌糸は自かった。これらの変異株の形質からも,活 性酸素がカロテノイ ドの光誘導 に関与 していること力溺K示 唆された (王 ら,投 稿準備中)。
考察
光信号伝達の研究は 1950年 代から研究がなされたが,長 い間その難解さから,解 かれざる難問として取 り残されてきた。わたし供は 1990年 代初頭からその研究結果を出し始め,plDK‑1が光信号伝達の初期過程に重要な機能を持つことをアカバンカビおよびアラスカエンドウを用いて示してきた。アカバンカビの菌糸におけるカロテノイ ド合成の光誘導は,光信号伝達の研究にとり,非常によい系をあたえる。この系を用いて,活 性酸素が光信号伝達に重要な機能を持つことを強く示唆 してきた。活性酸素はその寿命 も短 く,そ の分子種の正確な測定 も,あ まり容易では無い。
そのため研究が取 り残されて来た可育旨性がある。それはまた光信号伝達の研究が容易にヤ渤翠明されなかった理由の 1つ でもある。アカバンカビは遺伝子変異を用いた遺伝学が可能である為に厳格な解析が可能であり,困 難な問題を解く良い研究材料ヽを与えた。さらに推論になるが,31DK・,

3

は NmttH… 1と して,が ん転移 をする悪 性がん細胞ではその発現が低下 してお り,が んの悪性化に関与す ることが示唆されてきた。 しか しその遺伝子 をがん細胞で発現 してもがん転移が改善されないな ど,疑 問点 も多数あ り,議 論は残 されたままになってきた。AIDKが カタラーゼ と複合体 を形成 し,過 酸化水素 の消去 に機能があるとするな ら,Nm2H‑1の mRNAが 無 くなった良性腫瘍は,活 性酸素 の除去能力が低 いゆえに,更 に悪 性化す る変異を受け易 く成 るだろ う。 このような推論 も可能 となる。更 に最近 の分類学では菌類は動物 と極 めて近縁である ことが 明 らか となつてきた。両者 を共通点 のある生物 として推論する ことはそれほど妥 当性 を欠 くものでは無 い。
け回頭発表

1̲蓮 沼仰嗣,吉 田雄介 ,李 範揆 ;「 アカバ ンカ ビにお ける活性酸素を経 由す る光信号伝達の解枷
日本遺伝学会(仙 台,2003)

2.蓮 沼仰嗣 ;ILttl■t stnal trallsductioll via ROS in Netlrosora cras釧 基礎生物学研究所研究会 ,光 生物学実験系 としての藻類 の展望 ,基 礎生物学研究所(岡 崎,2003)

3.蓮 沼仰嗣 ,吉 田雄 介 ,矢 部 尚登 ;llttllt嗅 狙al tra■ sducion via ROIs il■ 入り玉帆 ρc塑
αttsa l第 10回 日本光生物学協会講演会 (奈 良,2003∠ り

4.蓮 沼仰嗣 ,吉 田雄介 ,李 範揆 ,矢部 尚登 ;￨ア カバ ンカ ビの光信号伝達 とパ ラコー ト耐性株の晰 l日 本植物学会第 67回 大会 体b幌 ,20030
5.吉 田雄介 ,李範揆 ,蓮 沼仰嗣 ;1活 性酸素分子種がアカバ ンカ ビ光形態形成 に与える錮 第26回 日本分子生物学会 (ネ 中戸 , 20034つ
6.李 範揆 ,吉 田雄介,蓮 沼仰嗣 ;旺 solatiOl■ ofNDI← l muta■ ts by ttPing ald genetic a誂 ″dsoftheNDK fllllction in Aむ tFospο口 cras開 1第 26回 日本分子生物学会 ,(神 戸 ,2003ビ リ
7.Iく ol」 i]Hhsun呻 ;ILight sttl

trallsduction via reactive oxygen il■ tenllediates ill

Receptors and Sttnd■ lransduction;Gordon Researcl■
Conference Q7entllra,USA,2004)
Netlrosora crassal PhOtosenso15ァ

8.蓮 沼仰嗣 ,吉 田雄介 ,李 範揆 ;IA出弓is dttht霙 狙d tral■ sductiol■ via ROS ill Aり ι の 能α郷釧

日本植物生理 学会 2004年 年会 (東 京,2004̀り9.Kotti■ Iastntlllla,YusdぐYosl■ ida,ald

BШ lJb■ l lee;ILigllt sigrlal tral■ sduction

cotlpled 、
ith reactive o、ygen species il■ Nし こ、″て不pο 慶2 0燿 sSa lCol■

ference;聴 ht Sensing alld Su

Trそ rlsductiol■ ill il■The 58th ■1枷 ada

Plant Photomorphogenesis(01く 認dd,2004)

10. Iく o町 l IIasunШ mは , alld Yusl」 (e Yosllida;「 Fbacti17e ttgen species coupb in tl■

process of photolllorphogenesis in Netlrosora crassa1 14tll lntenatiol■Photobiologye■al Collference on(CIIゴ u,Iく orea,2004)

11̲Bull■ 9電 Lee,Y■ lsl」ぐ Yosllida,al■ dIく 01ji Hasuntuna;「 Morollogenetic cllaracteristics4.

of knock― out mu撤 1ぉ of nucleog

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diphosphate kinase CNDK‑1)in NeuFOSpOra‐m割珀おКnce.on Photobiology(N.u,Korea,‐ 2004D‐
12.吉 田は 、李範揆,蓮 沼仰嗣 :￨ア カバンカビにおける NDKと カタラーゼの相互作用の遺伝生化学的解枷 日相 碑審導(大 阪 2004り13.李範揆:吉 田雄介,蓮沼仰嗣 ;￨アカノヽンカビNllcl∝ 燎坐 ‐diphosphate km∞ 41NDK―1)欠 損株の形態的特徴 日本遺伝学会 伏 阪 20040
14山,‐誌上発表

1.Yusuke Yoshida,andく は Hasun― ,2004,Reactive oxygen species atta
phcは agK】T止 〔SiS in‐ Nerospα a.cFaSu(■Ю建

2.Ktt HЫmば餞,YtlsukeMasa⌒

工BbL Chem.279,6986‑6993.
m,and B¨ k焙 ;Light sensing in Pmts,IEd.

u wada, SpFirlger VerLg TOky03 2005:;Light signal廿 榔 d¨

血 reactive oxygenコ eciesin Nerospα aC淘 簸 。 in pres鶴cOupled.

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