微量がん細胞の簡便で高感度なオンサイト検出を可能とする核酸デバイス
熊本大学大学院先端科学研究部
助教 北村 裕介
2021年8月5日

分析化学
核酸化学
機能性人工核酸を用いた遺伝子解析

人工核酸触媒

DNAサーキット

機能性人工核酸を用いたナノデバイスの構築

核酸アプタマー
高次構造（複雑な立体構造）を形成する
ことでモノクローナル抗体のように標的分子に対して選択的かつ強固に結合できる核酸
SELEX （ Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment）
法により取得↓2013年 - 2015年の期間で約1年間フロリダ大学に留学し、習得

抗トロンビンアプタマーのトロンビンとの結合構造

研究背景
現行の技術において、簡便、迅速、安価かつ確度高くがんを診断可能な技術が存在しない。
CT：レントゲン１００枚分の被曝量、微小がんの検出は困難
腫瘍マーカータンパク（CEA）の検査：初期がんの検出は困難、偽陽性が多い
CTCT

審査腹腔鏡

審査腹腔鏡

腹膜播種転移血管循環腫瘍細胞（CTC）とは...
原発巣のがん組織から剥離して血中を循環しているがん細胞転移に深く関与している
様々な固形がん患者において確認される
微量がん患者、初期かんの患者からも確認される
単位血液量（体積）あたりのCTCの個数が予後や治療奏功の有用な判断材料となる
CTC計数は採血のみで低侵襲かつ頻繁に行うことが可能
健常者

前立腺がん

良性疾患

1 mLの血液中にわずか数個〜数百個程度（血液細胞は10億個〜50億個）

乳がん

肺がん

卵巣がん

大腸がん

その他の癌

膵臓がん

W.-J. Allard, et al. Clin. Cancer Res. (2004)

血管循環腫瘍細胞（CTC）とは...
原発巣のがん組織から剥離して血中を循環しているがん細胞転移に深く関与している
様々な固形がん患者において確認される
微量がん患者、初期かんの患者からも確認される
単位血液量（体積）あたりのCTCの個数が予後や治療奏功の有用な判断材料となる
CTC計数は採血のみで低侵襲かつ頻繁に行うことが可能

提供元：医学部

岩槻政晃助教M. Cristofanilli, et al. N. Engl. J. Med. (2004)

既存のCTC検出技術との比較
既存技術（Cell Search System、米国ベリデックス社)
CTCを用いた唯一のFDA承認診断システム
結果を得るまでに１ヶ月を要する
検査費用は約２５万円
陽性率は３０％程度
大量の夾雑物中に存在する微量な標的の検出を試みる際には、前段階処理として、事前に標的を選択的に濃縮しておくことが鉄則である。Cell Search Systemもその鉄則通り２つの技術要素から構成される。
セルサーチシステムの作業工程
選択的濃縮検出①②③④⑤⑥⑦⑧⑨

バッファーで希釈
血しょう成分を除去
抗EpCAM抗体修飾磁気ビーズの投入
磁力による磁気ビーズの分離
結合しなかった細胞の除去とビーズの洗浄
種々の抗体を用いた免疫染色
Expert Rev. Mol. Diagn., 16, 1291 (2016)
溶液の除去と洗浄
磁気ビーズからの細胞の回収と少量のバッファーへの分散蛍光顕微鏡を用いた観察用のカートリッジに添加既存のCTC検出技術との比較

6人中6人がCTCと分類
6人中５人がCTCと分類
6人中１人がCTCと分類
CTCではないと判断されたものClinical Cancer Research, 10, 2004. 6897–6904

蛍光色素修飾抗体を複数使用し、染色のパターンからがん細胞や血球細胞を特定する。
→ 判定資格を有するオペレーター６人が顕微鏡像から１細胞ずつ確認得られる発光量は、標的量に依存→ 高感度に検出が可能な装置の性能に依存するしかない。
得られる発光は、標的の細胞上に限定される→ 高解像度で撮影可能な蛍光顕微鏡が必須となる。

→ 高額な機器、高い専門的スキルを要する

既存のCTC検出技術との比較

溶液を吸って入れて混ぜるだけの単純操作
がん細胞を検知すると発光シグナルが増幅され続ける→ 微量のがん細胞からも強い光が得られる。溶液全体が発光する。

→ 目視による簡便で安価な検出が実現

CTC検出実験の全工程図
選択的濃縮工程

細胞捕捉の所要時間：３０分

特許第６７８１８７６号
特許第６７８１８７７号

検出工程
特願２０２０ー０９４４９７

株式会社 オジックテクノロジーズ
マイクロフィルターの製造

中島雄太 准教授（工程１）

熊本大学大学院先端化学研究部
細胞のタグ付け：３０分
流体デバイスの設計

岩槻政晃 診療講師（工程２）

熊本大学大学院生命科学研究部
トリガーの特異的な放出：１時間
消化器外科の医師、CTCに精通

（工程３）
株式会社
若林精機工業
発光シグナル増幅：３０分

樹脂部材の製造、コーティング

CTC検出実験の全工程図
選択的濃縮工程

細胞捕捉の所要時間：３０分

特許第６７８１８７６号
特許第６７８１８７７号

検出工程
特願２０２０ー０９４４９７（工程１）
細胞のタグ付け：３０分（工程２）
トリガーの特異的な放出：１時間（工程３）
発光シグナル増幅：３０分

標的タンパク質：EpCAM (CD326)

上皮細胞接着分子40kDaの膜貫通型タンパク
固形腫瘍に高発現している。
（一細胞あたり約40万個以上）
メラノーマ、神経芽細胞腫、肉腫、リンパ腫細、白血病細胞には発現しない

Nat. Commun., 5, 4764 (2014)

標的認識素子：抗EpCAM核酸アプタマー
明視野像蛍光画像（ヒト胎児腎細胞）

Kd = 22.8 ± 6.0 nM（ヒト乳癌細胞）（ヒト胃癌細胞）FITC（蛍光色素）修飾抗EpCAMアプタマーのがん細胞膜への結合

Anal. Chem. 85, 4141 (2013)がん細胞の検出原理（工程１）
がん細胞のラベル化と情報変換
がん細胞
↓
EpCAM
↓
任意のタグ配列

がん細胞の検出原理（工程２）
タグに応答して、特異的にトリガー（＝ 続く発光増幅機構の開始スイッチ）が遊離する。

がん細胞の検出原理（工程３）
トリガーに応答してDNAサーキットを開始し、発光シグナルを増幅
自発的に進行核酸複合体が消失するまで進行核酸複合体が１つ消失する毎に発光強度が増加

少量のトリガーからでも自動で強い発光が得られる

トリガーの選択的放出
1.0 × 106 cells/mL 100 μM
1 μM Cy5修飾タグ付きアプタマー 100 μM
4°C, 30min

1 μM FAM修飾マスク/トリガー 50 μM
4°C, 30min

洗浄

溶媒：D-PBS(-)中に5.0 mM MgCl2と4.5 mg/mL グルコースを含む

アプタマーの結合率 ＝（Cy5による染色細胞数／Hoechst33342の染色細胞数）× 100
マスクDNAの結合率 ＝（FAMによる染色細胞数／Hoechst33342の染色細胞数）× 100

試験管内におけるDNAサーキットの動作確認
2 nM トリガー もしくは 2 nM トリガー/マスク
20 nM FAM修飾DNA/BHQ修飾DNA/プラットフォーム
200 nM 燃料DNA

溶媒：10 mM Tris-HCl緩衝液中に1 mM EDTA、12.25 mM MgCl2を含む
反応温度：25°C

乳癌培養細胞（MDA-MB-453）を用いたDNAサーキットの動作確認膵臓癌培養細胞（MIR Paca2）を用いたDNAサーキット実験結果
DNAサーキットON

DNAサーキットOFF

DNAサーキットON

DNAサーキットOFF

患者の血液中からのCTCの検出
60代 男性
食道胃接合部癌 異時性右副腎再発
201X

内視鏡下食道亜全摘

202X+3 血液1 mLをフィルターに通液
CEA: 48.4６個のがん細胞を確認

201X+1 右副腎再発
CEA: 142

cellcellcell

10 μm

DAPI

10 μm

CK

10 μm

10 μm

CD45

Marge

化学療法①開始
202X+2

DNAサーキットON
CEA: 9.4

DNAサーキットOFF
DNAサーキットON

DNAサーキットOFF

患者の血液中からのCTCの検出
化学療法②開始
202X+4 (化学療法② 開始２ヶ月後)
血液1 mLをフィルターに通液
CEA: 10.8
2個のがん細胞を確認

202X+3 血液1 mLをフィルターに通液
CEA: 48.4６個のがん細胞を確認

DNAサーキットON

cellcellcell
DNAサーキットOFF

DNAサーキットON
DNAサーキットOFF

10 μm

DAPI

10 μm

CK

10 μm

10 μm

CD45

Marge

DNAサーキットON
DNAサーキットOFF

202X+4 (化学療法② 開始3ヶ月後)

CEA: 8.5

DNAサーキットON

DNAサーキットOFF

患者の血液中からのCTCの検出
60代 男性胃癌 術後腹膜播種再発疑い
CT画像 → 画像上再発確認困難

201X 幽門側胃切除
201X 抗がん剤治療
202X 閉塞生黄疸が出現
諸精査の結果、播種性再発の疑い

CEA: 1.6 → 陰性
202X+1 (閉塞生黄疸が出現1ヶ月後）

DNAサーキットON

血液1 mLをフィルターに通液６個のがん細胞を確認

DNAサーキットOFF
DNAサーキットON

cellcell

cell

10 μm

DAPI

10 μm

CK

10 μm

CD45

10 μm

Marge

DNAサーキットOFF

指数関数的増幅スキーム

指数関数的増幅：核酸配列

指数関数的増幅結果

核酸アンプに添加するトリガー量を変化させて実験を行なった

20 nM FAM修飾DNA/BHQ修飾DNA/プラットフォーム
200 nM 燃料DNA本手法が現在までに達成している事項とビジネスプラン
簡便：患者負担は採血のみ。UVライトを溶液に照射し目視で判定
迅速：前処理に２時間、測定３０分
安価：費用は１０００円程度
高確度：現在のところ６名のがん患者の血液の提供を受け、全員陽性検出に成功。うち１名は腫瘍マーカー検査で陰性、CTでも腫瘍が確認されなかったが、医師の所見ではがんの再発と診断された患者。

本手法が現在までに達成している事項とビジネスプラン
既存製品
本技術
CellSearch®

MRI、CT◎ 100%

×

装置費用

◎×

1億～2億円

検診費用
個人負担額○2万～4万円

検診時間

×

30分以上

判定時間

◎ 2～3時間陽性率
Q(機能)微量がん細胞
患部特定C
(コスト)

D(納期)
S(安全性)

××

画像診断

被爆25%

実施回数は少ないが100%◎ CTC検出×◎ CTC検出△ 4千2百万円◎ 1千万円以下◎ 採血のみ1ヶ月◎ 採血のみ◎ 採血のみ◎ 採血のみ××約40万円

×◎ 千円程度◎ 2～3時間

今後予定している開発事項複数の標的タンパク（EcCAMに加え、がん種特異的な標的タンパク）を同時に異なる色で検出（複数色のアンプを併用）→ 発光色によって、ニーズが非常に高いがん種特定の実現へ達成された場合、CTCの簡易検査でのがん腫の特定は世界初の成功例となるため、社会的インパクトは非常に大きい。

企業への期待
基礎技術の開発は終わっておりますので、実証例を増やして範囲を拡大していくというフェーズに来ていると考えております。
この開発を加速していく上での課題としましては、当面の研究費とマンパワーの確保であると考えております。ご支援、ご協力頂けるパートナー、一緒に伴奏頂ける製版企業様などを探しておりますのでどうぞよろしくお願い致します。

がんマーカー検査やCTを補完する患者のリアルタイムモニタリング
個人病院やクリニック規模での簡易診断の実現へ
受診率は平均40%に満たない

男女別検診受診率(40～69歳)

がん検診を受けない理由（内閣府大臣官房政府広報室）

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ： 細胞検出方法及びキット• 出願番号 ： 特願2021-090562• 出願人： 熊本大学
• 発明者： 北村裕介、井原敏博、中島雄太、勝田陽介

産学連携の経歴• 2014年- 株式会社オジックテクノロジーズ社と共同研究実施• 2020年- 株式会社若林精機工業と共同研究実施• 2017年-2019年 戦略的基盤技術高度化支援事業（サポイン事業）に採択

問い合わせ先
熊本大学
熊本創生推進機構・イノベーション推進部門・研究コーディネーター・有田 健一

ＴＥＬ 096－342－3246
ＦＡＸ 096－342－3300
e-mail liaison@jimu.kumamoto-u.ac.jp