ペプチドアプタマーによるがんマーカー検出技術開発
埼玉大学 大学院 理工学研究科 物質科学部門
教授 松岡 浩司
（先端産業国際ﾗﾎﾞﾗﾄﾘｰ ﾒﾃﾞｨｶﾙｲﾉﾍﾞｰｼｮﾝ研究ﾕﾆｯﾄ）

2020年 1月21日
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先端産業国際ﾗﾎﾞﾗﾄﾘｰ ﾒﾃﾞｨｶﾙｲﾉﾍﾞｰｼｮﾝ研究ﾕﾆｯﾄ(MiU)
cDNAﾃﾞｨｽﾌﾟﾚｲによるVHH抗体の取得
DNA
VHH①次世代抗体スクリーニング技術(標的ﾀﾝﾊﾟｸ)
ﾗｲﾌﾞﾗﾘ（ｃＤＮＡディスプレイ法）
cDNA
cDNA
mRNA
⇒ 次世代抗体の獲得
ﾃﾞｨｽﾌﾟﾚｲ
試験管内
ｾﾚｸｼｮﾝ②AIE(凝集誘発発光)技術
最適化（ウィルス等との結合により）⇒ ウィルスの見える化③機能性微粒子作製技術（種々の微粒子作製法）
TEMｲﾒｰｼﾞ⇒ 検出・診断系に応用④多価化合物によるクラスタ―化技術
Si Si Si
⇒ 多価接着による感度向上
Sialyllactose Dendrimer⑤糖鎖活用技術⇒ オリゴ糖合成、機能化
抗原

多糖

H
VH

HOH
VH

抗原

抗原

H
VH

VH

OH

HO抗原

OOH
O

H

H
VH

OH

HOO

HOGaOH
l1O
OH-4G
al
1-4OROGlcO
1 H-H

VH

表面基板OH
OH

HOAcH
NO
HOCOO
H
HOO

OH
O

N eu

5A c
2-3

OH

Gal
1-4

HOO
OH
Glc
 1-OHO

OR

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本技術の要旨• がんﾏｰｶｰとして知られるﾐｯﾄﾞｶｲﾝ(Midkine; MK)が、ｶﾙｼｳﾑｲｵﾝ非存在条件下にてｶﾙﾓｼﾞｭﾘﾝ結合ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ(Calmodulin-bindingpeptide; CBP)に対して高い親和性を持つことを見出した。
• 表面ﾌﾟﾗｽﾞﾓﾝ共鳴(SPR)法による分子間相互作用解析装置である
BIAcore X100を用い、ﾐｯﾄﾞｶｲﾝ―CBP結合の特異性を確認し、またその解離定数を求めた。
• CBPは、抗MKペプチドアプタマーとして、診断・検査キットへの高い応用可能性が示唆される。

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本技術の背景

PDB: 2LUT

ﾐｯﾄﾞｶｲﾝ(Midkine; MK)
胚性腫瘍細胞の分化初期において一過性に発現する増殖・分化因子
ヒトがんの多くで発現が増大
C-fragment
N-fragment(食道がん, 胃がん, 大腸がん, 肝臓がん等)⇒ｾﾞﾌﾞﾗﾌｨｯｼｭ ﾐｯﾄﾞｶｲﾝの溶液中立体構造

腫瘍マーカーとしての有用性 高
ｶﾙﾓｼﾞｭﾘﾝ結合ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ(Calmodulin-binding peptide; CBP)
ｶﾙｼｳﾑ結合ﾀﾝﾊﾟｸ質で、多種類のﾀﾝﾊﾟｸ質の制御を行い、様々な細胞機能に影響を与える。
Ca2++4 Ca2+
ﾐｵｼﾝ軽鎖ﾘﾝ酸化酵素のｶﾙﾓｼﾞｭﾘﾝ結合ﾄﾞﾒｲﾝ

PDB:
1CFD

PDB:
2BBM

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従来技術とその問題点
先行技術との比較
👉 抗MKﾓﾉｸﾛｰﾅﾙ抗体(mAb)⇒ｳｻｷﾞ由来のIgG
👉 抗MK RNAｱﾌﾟﾀﾏｰ⇒WO2008/059877 &WO2014/080997
抗体の立体構造の一例
デメリット
一般的な抗体の 安定性
ｴﾋﾟﾄｰﾌﾟは 生産性
5～8ｱﾐﾉ酸残基
⇒

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実施例
BIAcore X100 を用いた分子間相互作用測定
ｱﾅﾗｲﾄ: ﾋﾄﾐｯﾄﾞｶｲﾝ(hMK), ｳｼ血清ｱﾙﾌﾞﾐﾝ(BSA), 緑色蛍光ﾀﾝﾊﾟｸ質(GFP), ｳｻｷﾞ
血清由来免疫ｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝG(IgG), ｻﾊﾞｲﾋﾞﾝ(Suv):変異型ｶﾙﾓｼﾞｭﾘﾝ結合ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ(mtCBP);
Biotin-AAARWKKAFIAVSAANRFKKIS
野生型ｶﾙﾓｼﾞｭﾘﾝ結合ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ(wtCBP);
Biotin-AAARWKKNFIAVSAANRFKKIS
NM23ﾀﾝﾊﾟｸ質結合性ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ(anti-NM23 pep.);
Biotin-IRNGPSSP
MKとmtCBPが分子間相互作用を示すことを確認
結合速度定数 (ka) = 7.113 x 104 (1/Ms)
解離速度定数 (kd) = 5.785 x 10-4 (1/s)
解離定数 (KD = kd/ka) = 8.132 x 10-9 (M)Response / RU

反応速度論解析(Evaluation software)Time / sec

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実施例
BIAcore X100 を用いた分子間相互作用測定
ｱﾅﾗｲﾄ: ﾋﾄﾐｯﾄﾞｶｲﾝ(hMK), ｳｼ血清ｱﾙﾌﾞﾐﾝ(BSA), 緑色蛍光ﾀﾝﾊﾟｸ質(GFP), ｳｻｷﾞ
血清由来免疫ｸﾞﾛﾌﾞﾘﾝG(IgG), ｻﾊﾞｲﾋﾞﾝ(Suv):変異型ｶﾙﾓｼﾞｭﾘﾝ結合ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ(mtCBP);
Biotin-AAARWKKAFIAVSAANRFKKIS
野生型ｶﾙﾓｼﾞｭﾘﾝ結合ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ(wtCBP);
Biotin-AAARWKKNFIAVSAANRFKKIS
NM23ﾀﾝﾊﾟｸ質結合性ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞ(anti-NM23 pep.);
Biotin-IRNGPSSP
Midkine

BSA

GFP

IgG

Survivin

mtCBP(変異型)◎××××

wtCBP(天然型)〇----

Anti-NM23 pep.

×---7

新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術の問題点であった、安定性を改良することに成功した。
• 従来は大量合成の点で極微量の使用に限られていたが、グラムオーダーで合成することが可能となった。
• 本技術の適用により、抗体がペプチドで置換できるため、製造コストが1/10～1/100程度まで削減されることが期待される。
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想定される用途
がんﾏｰｶｰ検査ｷｯﾄへの応用ｲﾒｰｼﾞ抗原
血液：がんﾏｰｶｰ
検体

がん罹患の判別検出ﾗｲﾝ

金ナノ 抗体A粒子

特定の抗原に対して親和性を持つ次世代抗体（ペプチドアプタマー）

ｺｽﾓﾊﾞｲｵ株式会社HPより抜粋
9実用化に向けた課題• 現在、親和性についてﾋﾞｱｺｱを用いた解離定数の決定まで開発済み。しかし、基盤等への固定化の点が未解決である。
• 今後、活性の向上について多価化データを取得し、体外診断薬に適用していく場合の条件設定を行っていく。
• 実用化に向けて、nMの精度を10倍向上できるよう技術を確立する必要もあり。
10実用化に向けた課題解決案
・多価化による感度の飛躍的な向上⇒有機化学とﾀﾝﾊﾟｸ質工学のｺﾗﾎﾞﾚｰｼｮﾝ
多糖
抗原

抗原
VHH

VHH
VHH
抗原

UUU

VHH
U
U

UUU

UUU

strong iteraction!!!

biological ev aluationStxU

多価抗体の例
特願2017-008331

UU

基板表面

homopolymer

UUVHH

UU

VHH

copolymerU
U抗原

Bioorg. Med. Chem. 26, pp. 5792-5803, 2018.
11企業への期待• 未解決の基盤等への固定化技術については、我々の先行技術により克服できると考えている。
• 体外診断薬の技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、簡易キットを開発中の企業、がん検出分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：ﾐｯﾄﾞｶｲﾝ結合性ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞｱﾌﾟﾀﾏｰおよびその使用• 出願番号 ：特願2016-14248
• 出願人
：埼玉大学
• 発明者
：松岡浩司、新井秀直、根本直人

13産学連携の経歴• 2014年-2016年 埼玉県先端産業創造ﾌﾟﾛｼﾞｪｸﾄに採択• 2016年 本件特許出願 (2016年1月28日)• 2019年 JSTイノベーションジャパンに採択

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お問い合わせ先
埼玉大学 研究機構
オープンイノベーションセンター
ＴＥＬ 048－858 －3849
ＦＡＸ 048－858 －9419
e-mail coic-sangaku＠ml.saitama-u.ac.jp

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