Bioorthogonal	  reac.on	
Staudinger	  liga-on	  &	  Cu-­‐free	  click	  chemistry	  	  2013.11.18	  Hanada	  (M1)	  	1	

1.	  Introduc-on	What	  are	  the	  requirements	  for	  reac.ons	  in	  living	  animals?	
• Stability	  and	  reac.vity	  under	  physiological	  condi.ons	  (water,	  pH,	  temperature)	  • Selec.vity	  and	  bioinertness	  (Lys,	  Cys,	  Tyr,	  etc.	  are	  included	  in	  cells)	  • Low	  toxicity	  • Rapid	  kine.cs	  in	  low	  concentra.on	

2	

1.	  Introduc-on	
The	  concept	  of	  	  “Bioorthogonal	  reac.on”	

Central	  to	  the	  process	  of	  chemical	  cell-­‐surface	  remodelling	  is	  the	  concept	  of	  bio-­‐orthogonality.	  The	  pair	  of	  func.onal	  groups	  chosen	  for	  the	  cell-­‐surface	  transforma.on	  must	  be	  mutually	  reac.ve	  under	  physiological	  condi.ons	  and,	  at	  the	  same	  .me,	  remain	  inert	  to	  the	  biological	  environment.	  	   Prescher,	  J.	  A.;	  Dube,	  D.	  H.,	  Bertozzi,	  C.	  R.	  	  Nature	  2004,	  430,	  873.		

Prof.	  Carolyn	  R.	  Bertozzi	
SleQen,	  E.	  M.;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Acc.	  Chem.	  Res.	  2011,	  44,	  666.	
SleQen,	  E.	  M.;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Angew.	  Chem.	  Int.	  Ed.	  2009,	  48,	  6974.	

3	

1.	  Introduc-on	

Today’s	  contents	◯	  Staudinger	  liga.on	
OMe
ROO

O+

N

N R'
H

OMe

N N R'
R

PPh 2

P
Ph 2

N

R'

R

PPh 2
O

Aza-ylide

Saxon,	  E.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Science.	  2000,	  287,	  2007.	
◯	  Cu-­‐free	  click	  chemistry	
R'N

N

N

strain-promoted+RN

N N R'

room temperatureR

Agard,	  N.	  J.	  ;	  Prescher,	  J.	  A.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2004,	  126,	  15046.	
4	

Index	1.	  Introduc.on	  2.	  Staudinger	  liga.on	  	  2-­‐1.	  Basic	  development	  	  2-­‐2.	  Cell	  surface	  inves.ga.on	  	  2-­‐3.	  Ex	  vivo	  and	  in	  vivo	  	  2-­‐4.	  Kine.cs	  studies	  	  3.	  Cu-­‐free	  click	  chemistry	  	  3-­‐1.	  Precedents	  and	  prototype	  reac.ons	  	  3-­‐2.	  Strain	  promoted	  [3+2]	  cycloaddi.on	  	  3-­‐3.	  DIFO/BARAC	  	  3-­‐4.	  Advanced	  labeling	  with	  DIFO	  in	  vivo	  4.	  Summary	  5	

2-­‐1.	  Basic	  development	

Classical	  Staudinger	  reac.on	
PR' 3
R N N

NR N NH 2O

R N PR' 3
N2

Aza-ylide

N PR' 3

R

δ−N

δ+
PR' 3

NN

R NH 2O PR' 3

key intermediate◯Physiological	  condi.on	  &	  Bioinertness	  	  ・The	  phosphine	  and	  azide	  forms	  Aza-­‐ylide	  in	  the	  presence	  of	  water	  at	  RT.	  	  ・Both	  are	  abio.c	  and	  expected	  to	  be	  bioinert.	  	  Points	  to	  overcome	  ×Aza-­‐ylide	  intermediate	  hydrolyzes	  to	  yield	  amine.	  
△water	  solubility	  of	  Phosphine	  SleQen,	  E.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Acc.	  Chem.	  Res.	  2011,	  44,	  666.	
6	

2-­‐1.	  Basic	  development	

Molecular	  design	  through	  small	  molecule	  inves.ga.on	
・Intramolecular	  reac.on	  was	  designed	  in	  order	  to	  prevent	  amine	  forma.on.	

・The	  model	  reac.on	  gave	  only	  a	  liga.on	  product.	  
(A	  primary	  amine	  was	  not	  observed.)	

・Phosphine	  solubility	  was	  improved	  with	  water	  soluble	  linker.	

7	Saxon,	  E.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Science.	  2000,	  287,	  2007.	

2-­‐2.	  cell	  surface	  inves-ga-on	

Reac.on	  on	  the	  cell	  surface	1.	  Azide	  install	  via	  metabolic	  pathway	

2.	  Staudinger	  liga.on	  on	  the	  cell	  surface	3.	  Detec.on	  ・Avidin-­‐	  FITC	  ﬂuorescence	  (Flow	  cytometry)	  ・	  HRP-­‐conjugated	  bio.n	  an.body	  (Western	  blolng)	  …etc.	
8	Saxon,	  E.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Science.	  2000,	  287,	  2007.	

Azide	  install	  Mechanism	2-­‐2.	  cell	  surface	  inves-ga-on	• Modiﬁed	  ManNAc	  deriva.ve	  was	  accepted	  in	  the	  biosynthe.c	  pathway	  of	  the	  Sialoside.	

Saxon,	  E.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  J.	  Am	  Chem.	  Soc.	  2002,	  124,	  14893.	
9	Yarema,	  K.	  J.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  J.	  biol.	  Chem.	  1998,	  273,	  31168.	

2-­‐2.	  cell	  surface	  inves-ga-on	

Liga.on	  step	・Water	  soluble	  phosphin	  reagent	・Reac.on	  procedure	
O

H OH
HOHO

HN O
H

HHOH
ManNAz
20 µM
Jurkat cells

3 daysN3HO
HN
H
Jurkat cells

NHH

PPh OMe
2O
NH

S
1mM
1hO
3O

HNO

Jurkat cells

10	Saxon,	  E.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Science.	  2000,	  287,	  2007.	

2-­‐2.	  cell	  surface	  inves-ga-on	

Detec.on	  step	・Cell	  surface	  labeling	  was	  detected	  by	  ﬂow	  cｙtometry.	  
・Jurkat	  cells	  were	  stained	  with	  Avidin-­‐
FITC	  ,and	  then	  detected	  by	  ﬂow	  cytometry.	  

O

H OH

N3

HN O

HOHOH
H

H

H
3OHO

NH H

HNH

PPh 2OMeONH

S

5OO3HN
O・Stained	  with	  Avidin-­‐FITC,	  Jurkat	  cells	  which	  were	  treated	  with	  ManNAz	  and	  aryl	  phosphine	  showed	  high	  ﬂuorescence.	  	  →But,	  is	  the	  reac.on	  hypothesis	  really	  true?	  
11	Saxon,	  E.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Science.	  2000,	  287,	  2007.	

2-­‐2.	  cell	  surface	  inves-ga-on	Possible	  side	  reac.ons	  	・Classical	  Staudinger	  reac.on	  followed	  by	  nonspeciﬁc	  acyla.on	  of	  amines	
OOMe PPh 2
O

N3

HN O

HOHOH
HO

HNO

H OH

OMe PPh 2O
classical Staudinger reaction

H

H

O

H OH
HOHO

H

H

H

H

OH

NH 2

HN O

O
nonspecific acylation

OHO

H
NO

H OH

HN O

HOHOH
H

Ph 2P
HN
H

H

HN
O

O

OH

・Reduc.on	  of	  disulﬁde	  bonds	
Alkyl	  phosphine	  reduces	  disulﬁde	  bonds	  to	  thiol.	  
→How	  about	  aryl	  phosphines?	
OH

OH

O

O

HO

P

OH+R
S

HOS
R

O

O

P
O

O

OH+

2 R

SH

O

TCEP	
Whitesides,	  G.	  M.	  et	  al.	  J.	  Org.	  Chem.	  1991,	  56,	  2648.	

12	

2-­‐2.	  cell	  surface	  inves-ga-on	Control	  experiments	
It	  is	  conﬁrmed	  	  that	  this	  ﬂuorescence	  was	  not	  generated	  by	  reduc.on	  of	  disulﬁde	  bonds	  or	  non-­‐speciﬁc	  acyla.on	  of	  amines.	  

→This	  reac-on	  is	  a	  genuine	  bioorthogonal	  reac-on!		

13	

2-­‐3.	  Ex	  vivo	  and	  in	  vivo	

Ex	  vivo	  (Ac4ManNAz	  metaboliza.on	  in	  vivo	  )	・Ac4ManAz	  metaboliza.on	  in	  vivo	  (mice)	  and	  Staudinger	  liga.on	  ex	  vivo	  was	  demonstrated.	
14	

Prescher,	  J.	  A.;	  Dube,	  D.	  H.;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Nature.	  2004,	  430,	  8737.	

2-­‐3.	  Ex	  vivo	  and	  in	  vivo	

Cell	  labeling	  completely	  in	  vivo	O
H OAc
HN OAcOAcOH

H

PPh 2 OMe

N3-O C2H

H
OAc
Ac4ManNAz
300 mg kg-1

DYKDDDDKH
NO

O
Phos-Flag
16 µmol in ~ 200 µlPBS

once a day
7 days

Detection

90 minSplenocytes

・Staudinger	  liga.on	  was	  successfully	  achieved	  in	  vivo.	  
But,	  some	  problemes	  s.ll	  remained….	  	  ・Gradual	  phosphine	  air	  oxida.on	  and	  metabolized	  by	  P-­‐450	  	  ・High	  concentra.ons	  of	  phosphine	  occurred	  high	  background	  signal.	  (Washing	  away	  is	  diﬃcult.)		

Next	  :	  kine.cs	  inves.ga.on	  in	  order	  to	  reduce	  the	  concentra.on	  of	  phosphine	  Gray bars

Brack Bars
Ex vivo Staudinger ligation
with Phos-Flag ;Detection

15	

Prescher,	  J.	  A.;	  Dube,	  D.	  H.;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Nature.	  2004,	  430,	  8737.	

Determina.on	  of	  the	  kine.c	  parameters	

2-­‐4.	  kine-cs	  studies	・Analysis	  under	  the	  stoichiometric	  condi.on

・The	  ﬁrst	  step	  is	  presumed	  to	  be	  the	  rate-­‐determining	  step.	  
・No	  intermediate	  was	  observed	  in	  31P	  NMR	  analysis.	
・Measurement	  of	  pseudo-­‐ﬁrst	  order	  kine.cs	  (kobs)	  by	  31P	  NMR	  of	  7	  and	  8	  (1	  :10)	  in	  CD3CN	  with	  5％	  water	  (v	  /	  v)	  	  	  [8]>>[7]	  	v	  =	  k[7][8]≒kobs	  [7]	  	  kobs=k	  [8]	  ∴lnkobs	  =	  ln[8]	  +	  lnk	  ln[7]=kobs	  t	  +	  C	  	  k	  =	  2	  ×	  10-­‐3	  M-­‐1	  s-­‐1	
16	2687.	
Lin.,	  F.	  L.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2005,	  127,	  2-­‐4.	  kine-cs	  studies	Phosphine	  subs.tuents	  eﬀects	

R2=0.91,	  ρ=-­‐0.38	

17	Lin.,	  F.	  L.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2005,	  127,	  2687.	

2-­‐4.	  kine-cs	  studies	Phosphine	  modiﬁca.on	  eﬀects	

・Electron-­‐dona.ng	  groups	  on	  the	  phenyl	  group	  can	  accelerate	  the	  liga.on.	  
・The	  leaving	  group	  doesn’t	  aﬀect	  kine.cs	  though	  it	  determines	  the	  	  byproduct	  (primary	  amine)	  yield.	

18	

Brief	  summary	  of	  Staudinger	  liga.on	
OMe
ROOO

PPh 2+NN R'
HOMe

N N R'
RP
Ph 2N

R'R

PPh 2O

Aza-ylide・The	  intramolecular	  reac.on	  design	  enabled	  Staudinger	  liga.on	  in	  water.	  
・Staudinger	  liga.on	  accomplished	  labeling	  in	  cell	  lines	  and	  mice.	  
・Kine.cs	  was	  not	  enough	  rapid	  to	  reduce	  the	  concentra.on	  of	  phosphine	  reagents	  though	  electron-­‐dona.ng	  group	  might	  improve	  it.	  	
19	

3-­‐1.Precedents	  and	  prototype	  reac-ons	Second	  candidate	  –	  Click	  chemistry	Rostovtsev,	  V.	  V.	  ;	  Sharpless,	  K.	  B.	  et	  al.	  Angew.	  Chem.	  Int.	  Ed.	  2002,	  41,	  2596.	

Tornøe,	  C.	  W.	  ;	  Christensen,	  C.;	  Meldal,	  M.	  J.	  Org.	  Chem.	  2002,	  67,	  3057. 	

20	

3-­‐1.Precedents	  and	  prototype	  reac-ons	

Cu(I)	  toxicity	※	  Detailed	  data	  was	  not	  published.	
Reagents	

concentra.on	 Survive	  .me	

Mammalian	  cells	Cu	  (Ⅰ)	

<500	  μM	1	  h	Zebraﬁsh	  embryo	CuSO4	

1	  mM	

15	  min	Sodium	  ascorbate	  (Reductant)	

1.5	  mM	Tris(benzyltriazo 0.1	  mM	-­‐lylmethyl)	  amine	  ligand	・Cu	  (Ⅰ)	  showed	  high	  toxicity	  in	  the	  low	  concentra.on.	  
→	  They	  intended	  to	  avoid	  using	  Cu.	

SleQen,	  E.	  M.;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Angew.	  Chem.	  Int.	  Ed.	  2009,	  48,	  6974.	

21	

3-­‐2.	  Strain-­‐promoted	  [3+2]	  cycloaddi-on	Strain-­‐promoted	  [3+2]	  cycloaddi.on	
N+NNN

N NWilg,	  G.	  ;	  Krebs,	  A.	  Chem.	  Ber.	  1961,	  94,	  3260.	  

Described	  as	  “explosionsar-g”	

Design	  of	  bio.nylated	  cyclooctyne	  compound	

Agard,	  N.	  J.	  ;	  Prescher,	  J.	  A.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2004,	  126,	  15046.	
22	

Glycoprotein	  labeling	3-­‐2.	  Strain-­‐promoted	  [3+2]	  cycloaddi-on	

Cell	  surface	  labeling	

・Applica.on	  for	  covalent	  labeling	  of	  biomolecules	  and	  living	  cells	  succeeded.	  	  ・No	  apparent	  toxicity	  was	  exhibited.	
Agard,	  N.	  J.	  ;	  Prescher,	  J.	  A.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2004,	  126,	  15046.	

23	

3-­‐2.	  Strain-­‐promoted	  [3+2]	  cycloaddi-on	Kine.cs	
Modiﬁca.on	

OCT	  k	  =	  0.0024	  M-­‐1	  s-­‐1	

・The	  ﬁrst	  Cu-­‐free	  click	  chemistry	  reagent	  was	  only	  a	  liQle	  faster	  than	  Staudinger	  liga.on.	  
→	  Improvement	  was	  achieved	  by	  modiﬁca.on.	  
I’ll	  take	  up	  DIFO	  and	  BARAC.	  

DIBO	  :	  Boons	  and	  co-­‐wokers	  DIBAC	  ,	  19:	  the	  Van	  Del~	  and	  Popik	  groups	  TMDIBO:	  Leeper	  and	  co-­‐wakers	  Others:	  Bertozzi	  group	  	24	3-­‐3.	  DIFO	  /	  BARAC	DIFO	  :	  The	  reac.vity	  is	  the	  same	  as	  Cu(Ⅰ).	

・DIFO	  showed	  more	  rapid	  kine.cs	  than	  the	  	  precedents	  and	  	  good	  reac.vity	  in	  the	  low	  concentra.on.	
Baskin,	  J.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  Proc.	  Natl.	  Acad.	  Sci.	  U.S.A.	  2007,	  104,	  16793.	
25	

3-­‐3.	  DIFO	  /	  BARAC	

Kine.cs	  of	  DIFO	
・Second-­‐order	  rate	  constants	  of	  the	  reac.on	  against	  benzyl	  azide.	  
cf)	  Staudinger	  liga.on	  :	  2.0	  ×	  10-­‐3	  M-­‐1	  s-­‐1	  (in	  CD3CN)	
CD3CN	  7:3	  CD3CN	  :	  25mM	  potassium	  phosphate	  (D2O,	  pH=7)	  	1	7.6	  ×	  10-­‐2	  M-­‐1	  s-­‐1	2	(4.2±0.1)	  ×	  10-­‐2	  M-­‐1	  s-­‐1	(9.0±0.3)	  ×	  10-­‐2	  M-­‐1	  s-­‐1		3	(5.2±0.2)	  × 10-­‐2	  M-­‐1	  s-­‐1		(8.6±0.9)	  ×	  10-­‐2	  M-­‐1	  s-­‐1		

Baskin,	  J.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  Proc.	  Natl.	  Acad.	  Sci.	  U.S.A.	  2007,	  104,	  16793.	
Codelli,	  J.	  A.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2008,	  130,	  11486.	

26	

3-­‐3.	  DIFO	  /	  BARAC	DIFO	  has	  realized	  live	  cell	  labeling.	

Baskin,	  J.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  Proc.	  Natl.	  Acad.	  Sci.	  U.S.A.	  2007,	  104,	  16793.	

27	

3-­‐3.	  DIFO	  /	  BARAC	

Superior	  to	  DIFO	  :	  BARAC	k	  =	  	  0.96	  M-­‐1	  s-­‐1	・BARAC	  was	  more	  reac.ve	  than	  DIFO.	

JeweQ,	  J.	  C.	  ;	  SleQen,	  E.	  M.;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2010,	  132,	  3688.	

28	

3-­‐3.	  DIFO	  /	  BARAC	

Washless	  labeling	  with	  BARAC	

・ BARAC’s	  superior	  sensi.vity	  allowed	  for	  use	  of	  washless	  labeling.	  
（rapid	  kine.cs,	  low	  nonspeciﬁc	  background	  labeling)	
JeweQ,	  J.	  C.	  ;	  SleQen,	  E.	  M.;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2010,	  132,	  3688.	
29	

Advanced	  labeling	  with	  DIFO	  in	  vivo	  	3-­‐4.	

・High	  reac.ve	  cycrooctyne	  DIFO	  realized	  mul.-­‐color	  imaging	  of	  the	  zebraﬁsh	  embryo	  growth	  between	  60	  and	  72	  hpf.	  	  (hpf	  =	  hours	  post	  fer.liza.on)	

Laughlin,	  S.	  T.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  Science	  2008,	  320,	  664.	
30	

Summary	

・Staudinger	  liga.on	  and	  Strain-­‐promoted	  click	  chemistry	  are	  highly	  applicable	  bioorthogonal	  reac.on.	  
・In	  my	  opinion,	  the	  process	  of	  developing	  these	  reac.ons	  is	  full	  of	  sugges.ons	  for	  those	  who	  are	  interested	  in	  bio-­‐applicable	  reac.ons.	  	  	  Thank	  you	  for	  your	  kind	  a\en-on.	
31	

32	

Appendix	

Appendix	• Synthesis	  of	  biotynilated	  phosphine	

33	

Saxon,	  E.	  M.	  Bertozzi,	  C.	  R.	  Science.	  2000,	  287,	  2007.	

Appendix	Mechanism	  of	  Cu	  (Ⅰ)	  catalyzed	  click	  chemistry	  	Rostovtsev,	  V.	  V.	  ;	  Sharpless,	  K.	  B.	  et	  al.	  Angew.	  Chem.	  Int.	  Ed.	  2002,	  41,	  2596.	
34	Appendix	

Synthesis	  of	  bio.n	  conjugate	  OCT	Agard,	  N.	  J.	  ;	  Prescher,	  J.	  A.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2004,	  126,	  15046.	 35	Appendix	Metabolic	  labeling	  of	  cell-­‐surface	  glycans	  with	  Ac4GalNAz	

36	

Laughlin,	  S.	  T.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  Science	  2008,	  320,	  664.	

The	  transi.on	  structure	  energy	  of	  DIFO	  is	  the	  lower	  than	  OCT.	

Appendix	Ess,D.	  H.	  ;Jones,	  G.	  O.	  ;	  	  Houk,	  K.	  N.	  Org.	  Le\.,	  2008,	  10,	  1633.	
37	

Appendix	

The	  reac.vity	  enhancement	  of	  DIFO	  is	  caused	  by	  higher	  HOMO	  and	  lower	  LUMO.	

Ess,D.	  H.	  ;Jones,	  G.	  O.	  ;	  	  Houk,	  K.	  N.	  Org.	  Le\.,	  2008,	  10,	  1633.	
38	

Appendix	BARAC’s	  high	  reac.vity	  is	  due	  to	  the	  alkyne	  bond	  angle.	

Gordon,	  C.	  G.	  ;	  Bertozzi,	  C.	  R.	  et	  al.	  J.	  Am.	  Chem.	  Soc.	  2012,	  134,	  9199.	

39	

40