質量分析に基づくP-450タンパク質の多型解析○山中秀徳1)・堀内雅史1)・武吉正博1)・美濃部安史1)
1)化学物質評価研究機構

概要

結果・MSの条件
MS測定はMasslynxソフトウェア(マイクロマス社)のサーベイモードで行った。
キャピラリー電圧
3300 V
コーン電圧
45 V
Collision-induced dissociation （CID）ガス アルゴン
コリジョンエネルギー
25-35 eV

表-1. 各分画で同定されたP450アイソフォームの数
Solubility

Low
Fractoin1

Fractoin229

Fractoin317High
Fractoin440(B)(A)

Fractoin50

Match to: CP2B1_RAT Score: 912

Match to: CP2B1_RAT Score: 418(P00176) Cytochrome P450 2B1 (EC 1.14.14.1)(P00176) Cytochrome P450 2B1 (EC 1.14.14.1)

Sequence Coverage: 44%Sequence Coverage: 27%

1 MEPTILLLLA LLVGFLLLLV RGHPKSRGNF PPGPRPLPLL GNLLQLDRGG1 MEPTILLLLA LLVGFLLLLV RGHPKSRGNF PPGPRPLPLL GNLLQLDRGG

51 LLNSFMQLRE KYGDVFTVHL GPRPVVMLCG TDTIKEALVG QAEDFSGRGT51 LLNSFMQLRE KYGDVFTVHL GPRPVVMLCG TDTIKEALVG QAEDFSGRGT

101 IAVIEPIFKE YGVIFANGER WKALRRFSLA TMRDFGMGKR SVEERIQEEA

101 IAVIEPIFKE YGVIFANGER WKALRRFSLA TMRDFGMGKR SVEERIQEEA151 QCLVEELRKS QGAPLDPTFL FQCITANIIC SIVFGERFDY TDRQFLRLLE151 QCLVEELRKS QGAPLDPTFL FQCITANIIC SIVFGERFDY TDRQFLRLLE201 LFYRTFSLLS SFSSQVFEFF SGFLKYFPGA HRQISKNLQE ILDYIGHIVE201 LFYRTFSLLS SFSSQVFEFF SGFLKYFPGA HRQISKNLQE ILDYIGHIVE251 KHRATLDPSA PRDFIDTYLL RMEKEKSNHH TEFHHENLMI SLLSLFFAGT251 KHRATLDPSA PRDFIDTYLL RMEKEKSNHH TEFHHENLMI SLLSLFFAGT301 ETSSTTLRYG FLLMLKYPHV AEKVQKEIDQ VIGSHRLPTL DDRSKMPYTD301 ETSSTTLRYG FLLMLKYPHV AEKVQKEIDQ VIGSHRLPTL DDRSKMPYTD351 AVIHEIQRFS DLVPIGVPHR VTKDTMFRGY LLPKNTEVYP ILSSALHDPQ

351 AVIHEIQRFS DLVPIGVPHR VTKDTMFRGY LLPKNTEVYP ILSSALHDPQ

401 YFDHPDSFNP EHFLDANGAL KKSEAFMPFS TGKRICLGEG IARNELFLFF

401 YFDHPDSFNP EHFLDANGAL KKSEAFMPFS TGKRICLGEG IARNELFLFF

451 TTILQNFSVS SHLAPKDIDL TPKESGIGKI PPTYQICFSA R

451 TTILQNFSVS SHLAPKDIDL TPKESGIGKI PPTYQICFSA R

図-2. 溶解性に基づく分画前後のCYP2B1のシークエン
スカバー率の比較（赤字がMS/MSで検出されたペプチド）50FractioantedNon-Fractionated

40Sequence Coverage (%)

CYPアイソフォームの解析は、新薬の臨床試験における薬物相互作用の検討、個々の患者に対するオーダーメード医療における診断等の目的に必須であり、CYPアイソフォームの質量分析装置を用いたプロテオーム解析研究が注目されている。CYP
アイソフォームの網羅的解析では、CYPスーパーファミリーの１次構造が非常に類似していることが解析を困難にする要因の１つとして考えられるが、我々はこれまでの研究から、タンパク質の一次構造の類似性に由来する物理化学的特徴を解析に利用することが可能であることを明らかにしている。具体的には、ヒトおよびラット肝ミクロソームを溶解性に基づいて分画した後に、各画分に含まれるタンパク質をMS/MSにより一斉同定することによって膜タンパク質であるCYPは難溶解性画分に濃縮され、分画しない場合に比較して同定されるCYPアイソフォームの種類が飛躍的に増大するとともに、タンパク質同定の精度を示すスコア値、シークエンスカバー率も向上した1)。
今回、我々は質量分析に基づくアミノ酸配列のシークエンシングによってCYPアイソフォームの同定に加えて、タンパク質レベルで一塩基多型解析（SNPs: SingleNucleotide Polymorphisms）に対応する一アミノ酸置換（SAPs:single amino acidpolymorphisms）が検出可能であることを確認した。

302010MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology) 1)
Step1.

* 1A2* 2A1* 2A2* 2A32B12B22B3* 2B12* 2B152C62C72C11* 2C122C132C232C24* 2C702D1* 2D32D42D10* 2D262E13A13A2* 3A94A2* 4A14
* 4F1
* 4X1
* b5
* 27
* 51A10

図-3. 溶解性に基づく分画前後のシークエンスカバー率の比較（*分画後にのみ検出されたアイソフォーム）

Step2. SCX (Strong Cation eXchange)
Step3. RP (Reverse Phase) + ESI-MS/MS

表-2. 同定されたラットP450の一覧

1) Washburn MP, Wolters D, Yates JR 3rd. Large-scale analysis of the yeast proteome bymultidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 2001, 19, 242-247.

CERIの選択的ショットガンプロテオミクス
Step1.タンパク質を液相等電点、溶解性などに基づく分画↓
Step2. SCX (Strong Cation eXchange)
SCXをスキップし直接LCで分析するか若しくは、再現性の高い分画手法（溶解性に基づく分画、液相等電点など）を使用する。

↓1A1, 1A2
2A1, 2A2, 2A3
2B1, 2B2, 2B3, 2B12, 2B15
2C6, 2C7, 2C1 1, 2C12, 2C13
2C23, 2C24, 2C70
2D1, 2D3, 2D4, 2D10, 2D26
2E12J33A1, 3A2, 3A9, 3A18
4A1, 4A2, 4A10, 4A144F14X12751A1

表-3. 同定されたヒトP450の一覧
1A22A6, 2A132C8, 2C9, 2C19
2D62E1
3A3, 3A44A1 14F2, 4F1 151A1
8B1
ヒトの薬物代謝において主要な4つのアイソフォーム（1A2, 2D6,2E1, 3A4）を含む15種類を同定。

これまで報告されている中で最も多い
35 種類のラット P450 アイソフォームを同定

Step3. RP (Reverse Phase) + ESI-MS/MS

MS/MSデータに基づく多型解析

MS/MS

CYP2C19の以下の２つのSAPが、MS/MSデータ解析から直接検出された。

表-4. タンパク質多型の解析結果
prot_acc

prot_desc

prot_score

Isoform Displayed; Variant allele CYP2C19*11;
P33261-00-18-00

溶解性に基づく前分画

多型情報DBの検索

Conflict Displayed; of P33261 - Homo sapiens

102

Isoform Displayed; Variant allele CYP2C19*18;
P33261-00-04-00

Conflict Displayed; of P33261 - Homo sapiens81

ラット肝ミクロソームの分画
UniProt - Swiss-Prot Protein Knowledgebase
Fraction 5

Fraction 4

Fraction 3

Fraction 2

KDa

Fraction 1

以下のデータベースを使用してMS/MSデータから97.0
66.0
45.0

多型を解析。
Description:
Human polymorphisms and disease mutations:Name:humsavar.txt

Statistics for single amino acid variants:Disease variants: 18949
Unclassified variants: 2062

14.4

図-1. 溶解性に基づく分画後の各フラクションのSDS-PAGEゲルイメージ

CYP2C19*18

index

Polymorphisms: 21193
30.0

CYP2C19*11

Total: 42204

まとめ
今回、我々は肝ミクロソームタンパク質の溶解性に基づく分画を実施した後、難溶解性フラクションのLC-MS/MS解析による一斉同定を実施し、CYP2C19の2種類のSNPsを直接的に同定した。
肝臓中に発現しているP-450は、多くの医薬品の代謝に重要な役割を果たしているが、その発現量および活性には大きな個人差が存在する。定量プロテオーム解析が、SNPs、マイクロサテライトの解析に加えてオーダーメイド医療の実現へのキーテクロジーに発展すると期待される。
参考文献：
1) Yamanaka, H., Takeyoshi, M., Minobe, Y., Yakabe, Y., Takatsuki, M., Sato, H., Drug Metabolism Letters, 1, 281-286 (2007)