抗体カラム処理後の血中タンパク質の２Ｄ-ＤＩＧＥを用いた定量比較の再現性評価○前田洋祐・山中秀徳・武吉正博・美濃部安史 財団法人化学物質評価研究機構 安全性評価技術研究所

Ⅱ．カラムの劣化が再現性に与える影響の検証

概要
血液は、試料採取の容易さと多数のタンパク質成分を含有していることから、疾患診断、治療モニタリング、新薬開発に有用なタンパク質マーカーの探索が盛んに行われている。タンパク質マーカー探索研究には、網羅性、定量性、再現性が重要な 要素でありFluorescence 2D-Differential Gel Electrophoresis (2D-DIGE)法は、これらの条件を満たす方法の一つである。
血中にはアルブミン、IgG等の数種のタンパク質が大量に存在し、血中タンパク質解析にはこれらのタンパク質の除去する前処理が必要不可欠である。前処理には抗体カラム処理が汎用されているが、この方法ではわずかに残留したタンパク質が２D-DIGE法による定量比較解析に影響を及ぼすことがある。また、抗体カラムの繰り返し使用による除去※率の低下、非特異的吸着の増加も生じる 。そこで我々は、アジレント社製の抗体スピンカラムを用いて効果的な除去法の検討し、あわせてカラムの劣化が２D-DIGE法の結果に与える影響を調べた。その結果、改良法では２D-DIGE法による検出限界以下まで除去することができ、30回以上繰り返しても同様であった。またカラムの劣化が２D-DIGE法の結果の再現性に多大な影響があることが確認された。抗体カラムを前処理に用いる際はカラムの劣化状況を考えて実験を行わなければ、カラムの劣化による発現量の変動とサンプル間の発現量の変動を誤って検出する可能性があることが分かった。
※:Ichibangase T. et al., Biomed Chromatogr(2008)

Mw
200kpI3

アジレント社製

Mw
200k

10pI
3

Ｂ社製

アルブミンの除去を確認

アルブミン

10IgG heavy chain

IgG light chain

10k10kpI
Mw 3200k

新品カラム使用

Mw
200k10アルブミン
除去すべきタンパク質の検出を確認

新品カラム使用

pI310

アルブミン

10k10kIgG heavy chain

除去すべきタンパク質の検出量の増加を
IgG light chain
確認

使用60回目カラム使用

使用60回目カラム使用

使用回数を重ねると除去すべきタンパク質が検出された･ヒト血液の前処理･画像解析

試料にはヒト血清・ヒト血漿を用いた。
抗体カラムはアジレント社製マルチプルアフィニティ除去LCスピンカート
リッジ Human 6（アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、アンチトリプシンを除去）
Ｂ社製抗体スピンカラム（アルブミン、IgG、フィブリノーゲン、トランスフェリン、IgA、IgM、ハプトグロビン、α2-マクログロブリン、α1酸性糖タンパク、α1-アンチトリプシン、HDL 8{アポA-I，アポA-II}、アポB、補体C3を除去）
標準法ではカラムに付随のプロトコールに従った。
改良法では、素通り画分を再度カラムに通し、他の条件はプロトコールに従った。

Typhoon（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用いてSypro® Rubyの励起波長(480nm)および蛍光波長(620nm)で画像を取得した。画像解析にはDecyder TM BVAソフト(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を用いANOVA解析を行った。質量分析に供する際には染色後に解析用のゲルに対してDecyderTM
BVAソフトを用いてマッチングし、スポットピッカー（GEヘルスケア バイオサイエンス社、Ettan Spot Picker）でピッキングした。

抗体カラムは共通して、使用回数を重ねることによるカラムの劣化の影響が見られる

Ⅲ.カラムの劣化による検出量の変化
表1.検出量の変化したタンパク質の一例･酵素（トリプシン）消化条件

スポット容積の1スポットに対し、0.1μgのトリプシン（プロメガ社）で酵素消化（30℃、一晩）した。

検出量の減少したタンパク質 平均比
Complement C3･二次元目電気泳動
平衡化終了後、Ettan DALT ΙΙシステム（GEヘルスケア バイオサイエンス社）及び12%均一ゲル（自作）を用いて二次元目のSDS－PAGEを行った。泳動は、3Ω（15℃）一定で泳動先端が完全に溶出するまで（約15時間）行った。

ＭＳ測定はＭasslynxソフトウェア（マイクロマス社）のサーベイモードで行った。

キャピラリー電圧
3300 V
コーン電圧
45 V
Collision-induced dissociation （CID）ガス
コリジョンエネルギー
25-35 eV

アルゴン

3.50

Hemicentin-1-2.19

Ryanodine receptor2-1.99

Gelsolin

2.29

Cytochrome b5-1.54

Fibrinogen γchain

1.58

同じ試料でもカラム劣化によって有意差が生じたように検出
カラム劣化の差による発現の違いとサンプル間の発現の違いを誤る可能性がある

表2.使用履歴が異なるカラム（新品と60回目）を用いてそれぞれ前処理をした同一試料間の２D-DIGE法による検出量の相対比較結果

10

全スポット数1730

アルブミンの除去を確認

アルブミンの除去を確認

1730
10k

改良法
（新品カラム）改良法（使用３０回目カラム使用）

検出量-1.5倍以下のスポット数
血漿血清445320

検出量1.5倍以上のスポット数
血漿
血清180105

表3.使用履歴が近いカラム（60回目と61回目）を用いてそれぞれ前処理をした同一試料間の２D-DIGE法による検出量の相対比較結果

全スポット数標準法

3.75

使用履歴が異なるカラムを用いた相対比較と使用履歴が近いカラムを用いた相対比較の結果の検証

pI
10 3

pI
10 3

アルブミン

Fibrinogen βchain･質量分析の条件

Ⅰ.標準法（メーカープロトコール）と改良法の比較
pI
Mw 3
200k

-3.14

Striated muscle preferentially expressed
protein kinase･一次元目電気泳動
一次元目電気泳動は、Multiphore ΙΙ 及び ΙPG（ImmobilizedpH Gradient）Strips (24cm, pI3-10、GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用い、サンプルはカップローディングホルダーから添加した。フォーカシングは、トータルで40kVh行った。泳動後、平衡化溶液（50mM Tris, pH8.8、6Mウレア、30％グリセロール、2％SDS）に0.25%（w/v）
DTTを添加したA液及び同様に4.5% （w/v） ヨードアセト
アミドを添加したB液に対して各々10分間ずつ平衡化を行った。

スポット容積の検出量の増加したタンパク質 平均比

検出量-1.5倍以下のスポット数
血漿血清5561

検出量1.5倍以上のスポット数
血漿血清2437

検出量に有意差が生じたスポット数は使用履歴が直近のカラムを用いることで減少した

使用履歴が近いカラムを使用すれば、カラムの劣化が相対的な比較に与える影響を回避することができる

標準法でサンプルの処理を行うと、２D-DIGE法を行うと、除去しきれなかったアルブミンのような血中に大量に存在するタンパク質がスポットとして検出されてしまう

再現性は担保可能まとめ
１．素通り画分を再度カラムに通すことで、アルブミン,IgG等の大量に存在するタンパク質を2D-DIGE法の検出限界以下まで除去することができ、使用30回以上までその効果を確

素通り画分を再度カラムに通す改良法で前処理を行った
ところ、検出限界以下まで除去することができた

認することができた。安価で簡便な抗体スピンカラムの特長を活かしつつ、検出限界以下まで除去できるため、前処理として有効であることが分かった。
２．カラムの劣化が再現性に多大な影響を及ぼすことが確認でき、使用履歴の近いカラム

改良法では30回以上で効果の持続を確認したを用いることで、劣化が相対的な比較に与える影響を回避可能であることが分かった。実
験を行う際には、カラムの使用履歴を管理し、カラムの劣化状況を考えて使用する必要があることが分かった。