卵タンパク質酵素分解物抽出物によるインスリン分泌促進および骨格筋糖・脂質代謝亢進作用の検討
愛媛大学大学院連合農学研究科・大学院博士後期課程

落合優

■

緒 言
インスリン（INS）は骨格筋におけるグルコース（GLU）取り込みを増加させ、血糖値の低下および骨格筋グリコーゲン充足を導く。特にアスリートにとって骨格筋グリコーゲンは持久運動（Ex）時の主要エネルギー源であるため、膵臓 β 細胞からの INS 分泌を活性化させ、骨格筋グリコーゲンを充足させることが望ましい。
近年、食品タンパク質由来低分子ペプチドはタンパク質の合成材料としてだけでなく、多種多様な生理活性を有し、その中には INS 分泌を増加させるペプチドも多数報告されている 1-3）。Morifuji ら 1）はヒトにおいて、ホエイタンパク質を摂取した場合、大豆タンパク質を摂取した場合と比べて血中INS 値が約 2 倍に上昇することを報告し、さらに、タンパク質を加水分解処理して低分子化することで、血中 INS 値の上昇はより速やかになることを報告している。このように、食品タンパク質の種類および分子量の違いによっても INS 分泌の応答が異なることが明らかにされている 4, 5）。したがって、卵白タンパク質（EWP）を低分子化したペプチドにも INS 分泌促進作用が期待できるが、EWP およびその加水分解物（EWH）による INS 分泌促進、骨格筋グリコーゲン充足作用、および Ex 後の抗疲労作用についての報告はない。
本研究では、EWH を健常ラットに単回または反復投与し、INS 分泌促進作用および骨格筋グリコーゲン充足作用を検討した（実験①および②）。次に INS 分泌不全モデル（Goto⊖Kakizaki（GK））ラットを用いて EWH の摂取が INS 分泌指標（HOMA⊖β）に及ぼす影響について検討した（実験③）。さらに、健常ラットに EWH を反復摂取させ、肝臓および骨格筋グリコーゲン充足作用と Ex 後の抗疲労作用を検討した（実験④）。
■ 方 法【実験①】EWH の単回投与が GLU 負荷後の血糖値、血漿 INS 値、および骨格筋グリコーゲン蓄積に及ぼす影響
Wistar 系ラット（3 週齢、雄）14 匹を 1 週間の馴化期間後、12 時間絶食させ、対照群（Ct）、またはEWH 群（E）の 2 群に分けた。Ct 群には水を 5mL /kg、E 群には水に懸濁した EWH を 500mg /5mL /kg 経口投与し、その 30 分後に GLU 溶液を 2g/kg 経口投与した。EWH 投与前、GLU 溶液投与前および投与後 120 分までの血液を尾静脈より採取し、遠心分離後に血漿を得た。さらに 1 週間後、同様に EWHおよび GLU 溶液を投与した。EWH 投与前、GLU 溶液投与前および投与 30 分後に同様に採血を行い、GLU 溶液投与 60 分後に断頭屠殺を行い、血清および骨格筋サンプルを得た。血糖値、血漿 INS 値を市販キットを用いて測定した。また、骨格筋グリコーゲン含量を Lo らの方法 6）を参照して測定した。
【実験②】EWH の反復摂取が GLU 負荷後の血糖値、血漿 INS 値、および骨格筋グリコーゲン蓄積に及ぼす影響
Wistar 系ラット（3 週齢、雄）21 匹を 1 週間の馴化期間後、カゼイン食（Ct）群、または EWH 食（E）群に分け、2 週間自由摂取させた。12 時間絶食後、E 群をさらに EWH 非投与群（EC）または EWH 投与群に分け、Ct 群および EC 群には水を 5 mL/kg、E 群には水に懸濁した EWH を 500 mg/5 mL/kg 経口（E）投与し、その 30 分後に GLU 溶液を 2 g /kg 経口投与した。EWH 投与前、GLU 溶液投与前および投与後 120 分までの血液を尾静脈より採取し、血漿を得た。さらに 1 週間後、同様に EWH および GLU 溶液を投与した。EWH 投与前、GLU 溶液投与前および投与 30 分後に同様に採血を行い、GLU 溶液投与
60 分後に断頭屠殺により、血清および骨格筋サンプルを得た。血糖値、血漿 INS 値、および骨格筋グ
リコーゲン含量を実験①と同様に測定した。
【実験③】GK ラットにおける EWH の反復摂取が INS 分泌指標に及ぼす影響
Wistar（W）および GK（G）ラット（各 5 週齢、雄）各 12 匹を 1 週間の馴化期間後、それぞれ、カゼイン（C）食（WC、GC）群、または EWH（E）食（WE、GE）群の計 4 群に分け、6 週間飼育した。飼育終了後、

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12 時間の絶食後に屠殺し、血糖値および血清 INS 値を実験①および②と同様に測定し、INS 抵抗性指数（HOMA⊖R）および HOMA⊖β 値を算出した。
【実験④】EWP および EWH の反復投与が Ex 前後の骨格筋グリコーゲン充足、および Ex 後の筋疲労に及ぼす影響
Wistar ラット（各 3 週齢、雄）47 匹を 1 週間の馴化期間後、カゼイン食（C）群、EWP 食（EWP）群、卵白加水分解物 A 食（EWHA）群、および卵白加水分解物 B 食（EWHB）群に分け、3 週間飼育した。飼育中、毎日全ラットに 2％の錘を胴体に付け、1 時間の Ex（スイミング）を負荷した。飼育 2 週間後、全ラットに 1 時間の Ex を負荷させ、Ex 直前、Ex 後 90 分までの血液を尾静脈より採取し、血糖値、血漿遊離脂肪酸（NEFA）値、および筋疲労指標である血漿クレアチンキナーゼ（CK）活性を市販キットを用いて測定した。全飼育期間終了後、さらに Ex 前屠殺群（R）または 1 時間の Ex 後屠殺群（E）に分けた。血糖値、血清 NEFA 値、血清 CK 活性を上記と同様に測定した。また、肝臓及び骨格筋グリコーゲン含量を上記の方法に従って測定した。
【統計解析】
統計解析は統計ソフト（エクセル統計 2008 for Windows）を用い、結果の数値は平均値 ± 標準誤差で示した。それぞれの結果の比較において、ⓟ <0.05 を統計学的有意水準とした。
■ 結 果【実験①】1 回目の OGTT の血糖値および血漿 INS 値の結果を Fig.1-A に示した。また、グルコース溶液投与 60 分後の足底筋グリコーゲン含量の結果を Fig.1-B に示した。EWH の単回投与は GLU 投与後の血糖値上昇を有意に抑制した。しかしながら、血漿 INS 値および足底筋グリコーゲン含量は Ct 群とE 群間に有意差は見られなかった。
【実験②】1 回目の OGTT の血糖値の結果を Fig.2-A に示した。また、2 回目の OGTT の血糖値、血漿INS 値、および GLU 溶液投与 60 分後の腓腹筋グリコーゲン含量の結果を Fig.2-B に示した。EWH の摂取により、空腹時血糖値が有意に低値となった。また、OGTT における血糖値は GLU 投与後 90 分以降、Ct 群に比べて EWH 摂取群で有意に低値を示した。
【実験③】解剖時の血糖値、血清 INS 値、HOMA⊖R、および HOMA⊖β の結果を Fig.3 に示した。EWHの摂取は血糖値を有意に低下させ、HOMA⊖R を有意に改善したが、HOMA⊖β を改善するには至らなかった。
【実験④】Ex 後の血糖値、血漿 NEFA 値、および血漿 CK 活性の経時変化を Fig.4-A、解剖時の血糖値、血清 NEFA 値、および血清 CK 活性の結果を Fig.4-B、および肝臓および骨格筋のグリコーゲン含量の結果を Fig.4-C に示した。Ex 後の血漿 CK 活性は、C 群と比べて EWP 群で上昇する傾向が示されたが、EWHA および EWHB 群で顕著に抑制され、その程度は EWHB 群でより強く確認された。Ex 後の血糖値は EWHB 群が C 群と比べて高く推移し、血漿 NEFA 濃度は C 群および EWP 群と比較して、EWHA 群および EWHB 群で有意に低値を推移した。また、腓腹筋のグリコーゲン含量は EWP 群において Ex 後に顕著に低下したが、その他の群においては Ex 前後で有意な減少は確認されなかった。
■考 察
実験①および②の結果より、EWH の単回および反復投与による血漿 INS 値の上昇は確認されなかった（Fig.1-A および Fig.2-B）。さらに INS 分泌不全である GK ラットに EWH 食を反復摂取させた場合においても HOMA⊖β は改善されず（Fig.3）、本試験で用いた EWH には INS 分泌促進作用は認められないことが示された。
一方、EWH の単回投与による GLU 溶液投与後の血糖値上昇が有意に抑制され（Fig.1-A, Fig.2-A）、GLU 投与 60 分後の腓腹筋グリコーゲン含量が E および EC 群において Ct 群と比較して有意に高値を示した（Fig.2-C）。本実験結果からは EWH の摂取による骨格筋グリコーゲン充足促進作用の詳細なメカニズムは不明ながら、骨格筋における糖の取り込みが INS 非依存的に促進された可能性やグリコーゲン合成が促進された可能性が考えられる 2, 7）。これまでに膵臓 β 細胞を用いた ⓘⓝ ⓥⓘⓣⓡⓞ 試験におい、フェニルアラニンに強い INS 分泌作用を有すること 8, 9）や、て、アルギニン、分岐鎖アミノ酸（BCAA）

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摘出筋および筋芽細胞を用いた試験において、BCAA を有するジペプチドに INS 非依存的な骨格筋糖取込みとグリコーゲン蓄積作用が確認されている 7）。いずれにしても特定のアミノ酸やジペプチドが血中に移行することが INS 分泌や骨格筋における糖取り込みに強く関与することが示唆されている。
EWP に含有される BCAA 量は乳タンパク質と同等であるため 10）、タンパク質分解酵素種や精製時の反応条件等の検討により INS 分泌を促進する EWH を精製することは、本研究テーマにおける今度の重要な研究課題であると考えられる。
実験④の結果より、EWHA および EWHB 群において、Ex 後の血清 CK 活性の上昇が顕著に抑制され、Ex 後の筋損傷が有意に抑制される可能性が示唆された。しかし、EWP 群において同様の結果は得られなかった。このことから、EWP を低分子化することにより、その作用メカニズムは不明ながら、筋損傷を抑制する作用が生じることが示唆された。また EWHB 群において、Ex 後の一過性の血糖値低下が EWP 群と比較して抑制されたこと（Fig.4-A）、EWHA 群および EWHB 群における Ex 後の血漿 NEFA 値の低下が EWP 群と比較して顕著に生じること（Fig.4-A）、さらに Ex 後の腓腹筋グリコーゲン量の減少が EWP 群と比較して抑制されること（Fig.4-C）が示された。これらのことより、EWH の摂取により、Ex 時における筋損傷が抑制されるだけでなく、Ex 中のエネルギー源として糖の利用が制限され、脂質の利用が促進される可能性が示唆された。
以上より、本研究で用いた EWH は INS 分泌を促進する作用は有さないものの、骨格筋グリコーゲン充足を促進する作用を有することが示された。また、EWH は EWP と比較して Ex 中のグリコーゲン利用を節約するだけでなく、Ex 後の筋損傷を著しく抑制することも示唆された。しかしながら、EWH によるこれらの結果の作用メカニズムは不明であり、更なる研究を要すると考えられる。
■要 約
EWH の単回投与および反復摂取による INS 分泌促進作用および骨格筋グリコーゲン充足作用の有無について検討したところ、EWH には INS 分泌促進作用は認められなかったものの、GLU 投与 60 分後の腓腹筋グリコーゲン充足作用を有することを見出した（実験① ⊖ ③）。また、EWH の反復摂取によるEx 後の抗疲労作用の有無について検討し、筋損傷指標である血漿 CK 活性、および腓腹筋グリコーゲン低下が顕著に抑制されることを見出した
（実験④）
。
■ 文 献
（1）Morifuji M, Ishizaka M, Baba S, Fukuda K, Matsumoto H, Koga J, Kanegae M, Higuchi M.（2010）
Comparison of diﬀerent sources and degrees of hydrolysis of dietary protein: eﬀect on plasma aminoacids, dipeptides, and insulin responses in human subjects. Ⓙ． Ⓐɡⓡⓘⓒ． Ⓕⓞⓞⓓ Ⓒʰⓔⓜ． 58, 8788-97.
（2）森藤雅史（2012）運動後の筋グリコーゲンの回復に及ぼすアミノ酸 , ペプチド , たんぱく質の影
響 , 臨床スポーツ医学 , 29, 887-92, 文光堂 , 東京
（2010）
Post⊖exercise carbohydrate plus whey（3）Morifuji M, Kanda A, Koga J, Kawanaka K, Higuchi M.
protein hydrolysates supplementation increases skeletal muscle glycogen level in rats. Ⓐⓜⓘⓝⓞ Ⓐⓒⓘⓓⓢ 38,1109⊖15.
（4）Calbet JA, MacLean DA.（2002）Plasma glucagon and insulin responses depend on the rate ofappearance of amino acids after ingestion of diﬀerent protein solutions in humans. Ⓙ． ɴⓤⓣⓡ． 132, 2174⊖
82.
（5）van Loon LJ, Saris WH, Verhagen H, Wagenmakers AJ.
（2000）
Plasma insulin responses after ingestionof diﬀerent amino acid or protein mixtures with carbohydrate. Ⓐⓜ Ⓙ Ⓒˡⓘⓝ ɴⓤⓣⓡ． 72, 96⊖105.
（6）Lo S, Russel JC, Taylor AW.
（1970）Determination of glycogen in small tissue samples. Ⓙ． Ⓐⓟⓟˡ． Ⓟʰⓨⓢⓘⓞˡ．
28, 234⊖6.
（7）Morifuji M, Koga J, Kawanaka K, Higuchi M.
（2009）
Branched-chain amino acid⊖containing dipeptides,identiﬁed from whey protein hydrolysates, stimulate glucose uptake rate in L6 myotubes and isolated
skeletal muscles. Ⓙ． ɴⓤⓣⓡ． Ⓢⓒⓘ． Ⓥⓘⓣⓐⓜⓘⓝⓞˡ．（Tokyo）. 55, 81⊖6.
（8）Hutton JC, Sener A, Malaisse WJ.
（1980）Interaction of branched chain amino acids and keto acids
upon pancreatic islet metabolism and insulin secretion. Ⓙ．ʙⓘⓞˡ． Ⓒʰⓔⓜ． 255, 7340⊖6.
（9）Blachier F, Mourtada A, Sener A, Malaisse WJ.
（1989）Stimulus-secretion coupling of arginine-induced
insulin release. Uptake of metabolized and nonmetabolized cationic amino acids by pancreatic islets.
Ⓔⓝⓓⓞⓒⓡⓘⓝⓞˡⓞɡⓨ 124, 134⊖41.

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（10）文部科学省科学技術学術審議会資源調査分科会（編集）,（2010）日本食品標準成分表準拠アミノ酸
成分表〈2010〉, 全国官報販売協同組合 , 東京

Fig.1-A Effects of single administration of EWH on plasma glucose (left) and insulin (right) levels inOGTT.
All results are expressed as mean ± SE(n=7). The differences were evaluated using Student’s t test.
A difference of p <0.05 was considered statistically significant.
*p <0.05,vs. Ct group. ↓ 1,Sample administration；↓ 2,Glucose administration

Plantaris muscle glycogen contents
0.70.6

mg/g

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Ct

E1-B Effects of singleof
administrationof EWHon plantaris
muscle glycogenFig.1-B Effects of singleFig.administration
EWH onplantaris
muscleglycogen contents at 60 minutes
contents at 60 minutes after glucose administration.
after glucose administration.
All results are expressed as mean ± SE (n=7). The differences were evaluated using
All results are expressed
as meanSE (n=7).Thewereevaluated using Student’s t test.
t test. A±differenceof p <0.05 was differences
considered statisticallysignificant.
Student's
p <0.05,vs. Ct group. statistically significant.
considered
A difference of p<0.05 wasFig.2-A Effects of dietary feeding of EWH on plasma glucose levels in OGTT-1.
All results are expressed as mean ± SE(n=7-9). The differences were evaluated using 1-way
ANOVA, and Fischer PLSD test. A difference of p<0.05 was considered statistically significant.
*p <0.05;**p <0.01,vs. Ct group. ↓ 1,Sample administration；↓ 2,Glucose administration

44

Fig.2-B Effects of dietary feeding of EWH on plasma glucose (left) and insulin (right) levels in OGTT-2.
All results are expressed as mean ± SE(n=7-9). The differences were evaluated using 1-way ANOVA,
and Fischer PLSD test. A difference of p <0.05 was considered statistically significant.*p <0.05,vs. Ctgroup. ↓ 1,Sample administration；↓ 2,Glucose administration

Fig.2-C Effects of single administration of EWH on plantaris muscle glycogen contents at 60 minutes
after glucose administration.
All results are expressed as mean ± SE(n=7-9). The differences were evaluated using 1-way ANOVA,
and Fischer PLSD test. A difference of p <0.05 was considered statistically significant. **p <0.01;***p <0.001, vs. Ct group.#p <0.05, vs. EC group.

45

Fig.3 Effects of dietary EWH on fasting serum glucose and insulin levels, HOMA-R, and HOMA-β in
Wister and GK rats.
All results are expressed as mean ± SE(n=6).The differences were evaluated using 2-way ANOVA,and Tukey-Kramer test.A difference of p <0.05 was considered statistically significant. **p <0.01;***p <0.001, vs. corresponding W group.##p <0.01; ###p <0.001, vs. GC group. W, Wistar; G,GK; C, Casein;
E, EWH

Fig.4-A Effects of dietary EWP and EWH on serum glucose, NEFA levels, and serum CK activity
before and after Ex.
All results are expressed as mean ± SE(n=11-12). The differences were evaluated using 1-way
ANOVA, and Tukey-Kramer test. A difference of p<0.05 was considered statistically significant.
*p <0.05,**p <0.01,***p <0.001 vs. C group; #p <0.05,##p <0.01,###p <0.001 vs. EWP group;$$p <0.01 vs. EWHAgroup46

Fig.4-B Effects of dietary EWP and EWH on serum glucose and NEFA levels, and serum CK activity.
All results are expressed as mean ± SE(n=5 - 6). The differences were evaluated using 2 - way
ANOVA, and Tukey-Kramer test. A difference of p <0.05 was considered statistically significant.
*p <0.05; ***p <0.001

F i g . 4- C E f f e c t s o f d i e t a r y E W P a n d E W H o n g l y c o g e n c o n t e n t s i n l i v e r ( l e f t ) a n dgastrocnemius muscle (right).
All results are expressed as mean ± SE(n = 5 - 6). The differences were evaluated using 2-way
ANOVA, and Tukey - Kramer test. A difference of p <0.05 was considered statistically significant.
*p <0.05,vs. corresponding R group.

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