育成者権の侵害立証における DNA 品種識別技術の現在地《第２弾》

DNA品種識別技術の紹介

農林水産省輸出・国際局知的財産課次席審査官
杉澤武

育成者権の侵害立証への活用が期待されているDNA品種識別技術には様々な方法があるが、それぞれの技術でどのようなことが行われ、どのように植物等１の品種間の異同を判定していくかを理解するに当たっては、一定程度の専門的な知識が必要である。もっとも、技術の内容を専門家が「正確に」伝えようとすると、どうしても専門的な用語が多くなるため、一般の方々にとってなかなか理解しにくくなってしまう。そこで、特集「育成者権の侵害立証におけるDNA品種識別技術の現在地」（知財ぷりずむ2023年３月号30頁以下）では、山本俊哉・平井佑希両氏による「DNA品種識別技術に関する基本的な前提知識（Ｑ＆Ａ）
」において、法律実務家を含む品種登録制度のユーザー向けに、技術面の解説をいただいたところである。本稿では、そこで紹介された具体的なDNA品種識別技術（DNAマーカー）のうち代表的なものをピックアップして、更に解説を行うこととする。DNAマーカーを用いた分析技術に馴染みのない方に大まかな内容をイメージしてもらうことに主眼を置いていることから、以下の説明や図は技術内容を簡略化したものであることを、ご容赦願いたい。
具体的には、SSR（Simple Sequence Repeat）とCAPS（Cleaved Amplified PolymorphicSequence）によるDNAマーカー（ゲノム上の目印）の検出方法と、検出された結果からどのように判定を行っているかについて説明する。

１．PCR（Polymerase Chain Reaction）によるDNAの増幅
SSRとCAPSによるDNAマーカーの説明の前に、どちらのマーカーを利用する際にも共通して使われる技術であるPCRについて、簡単に説明する。新型コロナウイルスの検査方法として一般の方々にもすっかりお馴染みの用語になったPCRであるが、プライマーと呼ばれる短いDNAを２つ使って、その間のDNAを増やす技術のことをいう。PCRでDNAの特定の部分を増やすことで、後述する電気泳動でその部分の長さや数の違いを可視化することができる。
DNAはA（アデニン）、T（チミン）、C（シトシン）、G（グアニン）の４つの塩基で構成されていて、AはTとだけ、CはGとだけくっつく（これを相補性という）。そのため、分析したいDNA（鋳型DNA）の中に２つのプライマーに相補的な塩基配列が両方ともあればDNAは増幅されるが、どちらか一方でも無ければDNAは増幅されない。
１ 種苗法で保護されている農林水産植物には多細胞の藻類や政令で定める32種類（令和４年４月現在）のきのこも含まれている。

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プライマーは、分析対象となる植物等で塩基配列が同じ部分に作る（設定する）ことが多い。
そうすることで、全ての分析対象から増幅されたDNA（増幅産物）を得ることができる。
一方、プライマーとプライマーの間の塩基配列は分析対象間（品種間）で違いがあるということも品種識別においては必須条件である。プライマー間にどのような塩基配列の違いがあるかで使用する分析技術が異なることになる。

PCRのイメージ
プライマー

２つのプライマーとそれに挟まれた部分だけが増える---GATTCGTACG

プライマー---AATGCGTA---CTAAGCATGC-------------------------TTACGCAT--分析したいDNA（鋳型DNA）

分析したいDNAとプライマーの塩基配列が⼀致しないとプライマーがくっつかないのでDNAが増えない。

---AATGCGTA---CTACGCATGC-------------------------TTACGCAT--注：わかりやすくするために鋳型DNAを⼀本鎖で表している

２．DNA マーカーを用いた分析技術

２．DNAマーカーを用いた分析技術（１）SSR（Simple Sequence Repeat）

SSR とは、DNA 配列中にある短い塩基配列の繰返しのことであり、下図における「AGT」が⑴ SSR（Simple Sequence Repeat）それにあたる。
SSRとは、DNA配列中にある短い塩基配列の繰返しのことであり、下図における「AGT」がそれにあたる。

例えば、品種αと品種βがあったときに、品種αはAGTの繰返しが７回、品種βは４回だっ
例えば、品種αと品種βがあったときに、品種αは AGT の繰返しが７回、品種βは４回だったたとする。とする。

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DNA品種識別技術の紹介

例えば、品種αと品種βがあったときに、品種αは AGT の繰返しが７回、品種βは４回だったとする。

プライマーは品種αと品種βで塩基配列が同じ部分に作られて（設定されて）いるので、この場合、品種αと品種βから増幅される DNA は、長さが異なる。この長さの違いを PCR することによって可視化することができる。
プライマーは品種αと品種βで塩基配列が同じ部分に作られて（設定されて）いるので、このプライマーは品種αと品種βで塩基配列が同じ部分に作られて（設定されて）いるので、この場合、品種αと品種βから増幅されるDNA は、長さが異なる。この長さの違いを PCR すること

場合、品種αと品種βから増幅されるDNAは、長さが異なる。この長さの違いをPCRすることによって可視化することができる。
- 2 によって可視化することができる。

このように SSR は増幅産物の長さの違いによって、品種を識別するものである。

このようにSSRは増幅産物の長さの違いによって、品種を識別するものである。
このように SSR は増幅産物の長さの違いによって、品種を識別するものである。

（２）CAPS（Cleaved
AmplifiedPolymorphic
Polymorphic Sequence）
Sequence）⑵
CAPS（Cleaved Amplified
例えば下図のように、DNA 配列上で一つの塩基のみが異なる品種αと品種βがあったとする
例えば下図のように、DNA配列上で一つの塩基のみが異なる品種αと品種βがあったとする（枠内の太字の部分）。。Amplified Polymorphic Sequence）（枠内の太字の部分）（２）CAPS（Cleaved
例えば下図のように、DNA 配列上で一つの塩基のみが異なる品種αと品種βがあったとする（枠内の太字の部分）。

プライマーは品種αと品種βで塩基配列が同じ部分に作られて（設定されて）おり、かつこのプライマーは品種αと品種βで塩基配列が同じ部分に作られて（設定されて）おり、かつこの場合、プライマー間の塩基の数も同じなので、PCRをすると同じ長さのDNAが増幅される。
場合、プライマー間の塩基の数も同じなので、PCR をすると同じ長さの DNA が増幅される。
プライマーは品種αと品種βで塩基配列が同じ部分に作られて（設定されて）おり、かつこの場合、プライマー間の塩基の数も同じなので、PCR をすると同じ長さの DNA が増幅される。
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知財ぷりずむ2023年５月ここで、増幅産物を制限酵素で処理する。制限酵素はDNAの特定の塩基配列を認識して切る
ここで、増幅産物を制限酵素で処理する。制限酵素は DNA の特定の塩基配列を認識して切る
ここで、増幅産物を制限酵素で処理する。制限酵素は DNA の特定の塩基配列を認識して切る酵素である。ここでは、Eco酵素である。ここでは、Eco RⅠという制限酵素で処理した場合を示す。下図の例では品種αのRⅠという制限酵素で処理した場合を示す。下図の例では品種αの増酵素である。ここでは、Eco RⅠという制限酵素で処理した場合を示す。下図の例では品種αの増増幅産物は切断されるが、品種βの増幅産物は切断されない。
ここで、増幅産物を制限酵素で処理する。制限酵素は DNA の特定の塩基配列を認識して切る幅産物は切断されるが、品種βの増幅産物は切断されない。
幅産物は切断されるが、品種βの増幅産物は切断されない。
酵素である。ここでは、Eco RⅠという制限酵素で処理した場合を示す。下図の例では品種αの増幅産物は切断されるが、品種βの増幅産物は切断されない。

CAPS では、このような制限酵素の性質を利用して、PCR をしただけでは品種間の塩基配列のCAPS では、このような制限酵素の性質を利用して、PCR をしただけでは品種間の塩基配列の違いを可視化できない場合においても、下図のように増幅産物の長さと数で違いを可視化できる
このようにCAPSでは、PCRをしただけでは品種間の塩基配列の違いを可視化できない場合に違いを可視化できない場合においても、下図のように増幅産物の長さと数で違いを可視化できる
CAPS では、このような制限酵素の性質を利用して、PCR をしただけでは品種間の塩基配列のようになる。
おいても、制限酵素の性質を利用して、下図のように増幅産物の長さと数で違いを可視化できるようになる。
違いを可視化できない場合においても、下図のように増幅産物の長さと数で違いを可視化できるようになる。
ようになる。

（３）DNA マーカーとは（３）DNA マーカーとは（３）DNA マーカーとはVol. 21

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DNA品種識別技術の紹介⑶

DNAマーカーとは

上記で説明したように、SSRでもCAPSでも、２つのプライマー間に品種間を識別するゲノム
上記で説明したように、SSR でも CAPS でも、２つのプライマー間に品種間を識別するゲノム上の目印（標識）となる特定のDNA配列（塩基配列）があるが、これらの特定のDNA配列（塩上記で説明したように、SSR でも CAPS でも、２つのプライマー間に品種間を識別するゲノム上の目印（標識）となる特定の DNA 配列（塩基配列）があるが、これらの特定の DNA 配列（塩基配列）のことをDNAマーカーという（SSRの場合はSSRマーカー、CAPSの場合はCAPSマー上の目印（標識）となる特定の DNA 配列（塩基配列）があるが、これらの特定の DNA 配列（塩基配列）のことをカーともいう）。 DNA マーカーという（SSR の場合は SSR マーカー、CAPS の場合は CAPS マ基配列）のことを DNA マーカーという（SSR の場合は SSR マーカー、CAPS の場合は CAPS マーカーともいう）。
ーカーともいう）。

３．アガロース電気泳動による長さの可視化

３．アガロース電気泳動による長さの可視化
３．アガロース電気泳動による長さの可視化
ここまで、SSRとCAPSで異なる長さの増幅産物が得られることを説明したが、次に、その長ここまで、SSR と CAPS で異なる長さの増幅産物が得られることを説明したが、次に、その長ここまで、SSR と CAPS で異なる長さの増幅産物が得られることを説明したが、次に、その長さの違いをどのようにして可視化するのかについて説明する。
さの違いをどのようにして可視化するのかについて説明する。
さの違いをどのようにして可視化するのかについて説明する。
可視化する方法はいくつかあるが、ここではアガロース電気泳動の例で説明する。アガロース
可視化する方法はいくつかあるが、ここではアガロース電気泳動の例で説明する。アガロースという言葉は聞きなれないかもしれないが、ゼリー状の寒天のようなものをイメージしてほし可視化する方法はいくつかあるが、ここではアガロース電気泳動の例で説明する。アガロースという言葉は聞きなれないかもしれないが、ゼリー状の寒天のようなものをイメージしてほしい。
い。また、電気泳動は中学の理科の授業で行う電気分解の実験のようなもので、溶液中に電気をという言葉は聞きなれないかもしれないが、ゼリー状の寒天のようなものをイメージしてほしい。
また、電気泳動は中学の理科の授業で行う電気分解の実験のようなもので、溶液中に電気を通す通すことで、陽極（＋）側にマイナスに荷電している物質を、陰極（－）側にプラスに荷電してまた、電気泳動は中学の理科の授業で行う電気分解の実験のようなもので、溶液中に電気を通すことで、陽極（＋）側にマイナスに荷電している物質を、陰極（－）側にプラスに荷電している物いる物質を引き寄せるものである。
DNAはマイナスに荷電しているので、下図のように陰極（－）
ことで、陽極（＋）側にマイナスに荷電している物質を、陰極（－）側にプラスに荷電している物質を引き寄せるものである。DNA はマイナスに荷電しているので、下図のように陰極（－）側か側から陽極（＋）側に移動する。
質を引き寄せるものである。DNA はマイナスに荷電しているので、下図のように陰極（－）側から陽極（＋）側に移動する。
ら陽極（＋）側に移動する。

これをアガロースゲルの中で行うと、DNA はアガロースゲルの中を通って陽極（＋）側に移動
これをアガロースゲルの中で行うと、DNAはアガロースゲルの中を通って陽極（＋）側に移これをアガロースゲルの中で行うと、DNA はアガロースゲルの中を通って陽極（＋）側に移動する。
動する。
する。

アガロースゲルには分子の網目があり、DNA はその網目を通って移動することになる。このたアガロースゲルには分子の網目があり、DNA はその網目を通って移動することになる。このため、DNA が長いと網目に引っ掛かりやすいので、移動が遅くなる。逆に DNA が短いと網目に引アガロースゲルには分子の網目があり、DNAはその網目を通って移動することになる。このめ、DNAが長いと網目に引っ掛かりやすいので、移動が遅くなる。逆に DNA が短いと網目に引っ掛かりにくいので、早く移動する。その結果、DNAが一定時間にアガロースゲルの中を移動すため、DNAが長いと網目に引っ掛かりやすいので、移動が遅くなる。逆にDNAが短いと網目にっ掛かりにくいので、早く移動する。その結果、DNA が一定時間にアガロースゲルの中を移動する距離によって、DNA の長さ（分子量の大きさ）を見分けることができる。
引っ掛かりにくいので、早く移動する。その結果、DNAが一定時間にアガロースゲルの中を移る距離によって、DNA の長さ（分子量の大きさ）を見分けることができる。
動する距離によって、DNAの長さ（分子量の大きさ）を見分けることができる。

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上図では、DNA が右から左に移動しているが、実際の電気泳動の画像は、通常上が陰極（－）
上図では、DNAが右から左に移動しているが、実際の電気泳動の画像は、通常上が陰極（－）
上図では、DNA が右から左に移動しているが、実際の電気泳動の画像は、通常上が陰極（－）
側、下が陽極（＋）側なので、下に行くほどDNA が短い（分子量が小さい）ことになる。
側、下が陽極（＋）側なので、下に行くほどDNAが短い（分子量が小さい）ことになる。
側、下が陽極（＋）側なので、下に行くほど DNA が短い（分子量が小さい）ことになる。

ここで、2.⑴SSRと⑵CAPSの例で示した品種αと品種βの増幅産物をアガロース電気泳動しここで、2.⑴SSR と⑵CAPS の例で示した品種αと品種βの増幅産物をアガロース電気泳動した場合、それぞれの増幅産物の長さの違いは下図のように可視化される。
ここで、2.⑴SSR と⑵CAPS の例で示した品種αと品種βの増幅産物をアガロース電気泳動した場合、それぞれの増幅産物の長さの違いは下図のように可視化される。
た場合、それぞれの増幅産物の長さの違いは下図のように可視化される。

４．マーカー情報の整理
４．マーカー情報の整理
２．で説明したDNAマーカーで検出されるDNA配列の違いを「多型」という。SSRやCAPS
４．マーカー情報の整理
２．で説明した DNA マーカーで検出される DNA 配列の違いを「多型」という。SSR や CAPS
においては、多型をタイプごとに名前を付けて（記号化して）整理することが多い。
２．で説明した DNA マーカーで検出される DNA 配列の違いを「多型」という。SSR や CAPS
においては、多型をタイプごとに名前を付けて（記号化して）整理することが多い。
下図では、SSRの例で示したDNAマーカーにおいて、品種αのようにAGTを７回繰り返してにおいては、多型をタイプごとに名前を付けて（記号化して）整理することが多い。

いるものを多型タイプA、品種βのようにAGTを４回繰り返しているものを多型タイプBとし
下図では、SSR の例で示した DNA マーカーにおいて、品種αのように AGT を 7 回繰り返した。また、CAPSの例で示したDNAマーカーにおいて、品種αのように増幅産物が制限酵素Eco
下図では、SSR の例で示した
DNA マーカーにおいて、品種αのようにAGT を 7 回繰り返しているものを多型タイプ
A、品種βのようにAGT を 4 回繰り返しているものを多型タイプ
Bと
RⅠで２つに切れるものを多型タイプAB、切れないものを多型タイプHとした。ているものを多型タイプ
A、品種βのようにAGT を 4 回繰り返しているものを多型タイプ B とした。また、CAPS の例で示したDNA マーカーにおいて、品種αのように増幅産物が制限酵素した。また、CAPSの例で示した DNA マーカーにおいて、品種αのように増幅産物が制限酵素
Eco RⅠで 2 つに切れるものを多型タイプ
AB、切れないものを多型タイプ H とした。

Eco RⅠで 2 つに切れるものを多型タイプ AB、切れないものを多型タイプ H とした。

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DNA品種識別技術の紹介

これらの情報は表のようにして整理されることが多い。例えば、上記の DNA マーカー①と②
これらの情報は表のようにして整理されることが多い。例えば、上記のDNAマーカー①と②
これらの情報は表のようにして整理されることが多い。例えば、上記のDNA マーカー①と②を含め、３種類の DNA マーカーを用いて 5 つの品種の多型タイプの情報を記号で整理したときを含め、３種類のDNAマーカーを用いて５つの品種の多型タイプの情報を記号で整理したときを含め、３種類の DNA マーカーを用いて 5 つの品種の多型タイプの情報を記号で整理したときに、下表のようになったとする。に、下表のようになったとする。に、下表のようになったとする。

この場合、マーカー①は品種Ⅰ、Ⅱ、Ⅲと品種Ⅳ、Ⅴとを識別することはできるが、品種Ⅰと
この場合、マーカー①は品種Ⅰ、Ⅱ、Ⅲと品種Ⅳ、Ⅴとを識別することはできるが、品種ⅠとⅡや、品種ⅣとⅤを、識別することはできない。しかし、マーカー①、②及び③の３つのマーカ
この場合、マーカー①は品種Ⅰ、Ⅱ、Ⅲと品種Ⅳ、Ⅴとを識別することはできるが、品種ⅠとⅡや、品種ⅣとⅤを、識別することはできない。しかし、マーカー①、②及び③の３つのマーカ
ーを使えば、品種Ⅰ～Ⅴを全て識別できることが、表中の記号から読み取れる。
Ⅱや、品種ⅣとⅤを、識別することはできない。しかし、マーカー①、②及び③の３つのマーカ
ーを使えば、品種Ⅰ～Ⅴを全て識別できることが、表中の記号から読み取れる。
ーを使えば、品種Ⅰ～Ⅴを全て識別できることが、表中の記号から読み取れる。
このように、DNA マーカーは特定の DNA 配列（又は塩基配列）によって供試品種を２～数種
このように、DNA マーカーは特定の DNA 配列（又は塩基配列）によって供試品種を２～数種
このように、DNAマーカーは特定のDNA配列（又は塩基配列）によって供試品種を２～数種類の多型タイプに分けることができるが、供試品種が多くなると、1 つの DNA マーカーでは識別類の多型タイプに分けることができるが、供試品種が多くなると、1 つの DNA マーカーでは識別類の多型タイプに分けることができるが、供試品種が多くなると、１つのDNAマーカーでは識できなくなることが多い。そのため、いくつかの DNA マーカーを組み合わせることで、多くのできなくなることが多い。そのため、いくつかの DNA マーカーを組み合わせることで、多くの別できなくなることが多い。そのため、いくつかのDNAマーカーを組み合わせることで、多く品種を識別できるようにしたものがマーカーセットである。
品種を識別できるようにしたものがマーカーセットである。の品種を識別できるようにしたものがマーカーセットである。
また、マーカーセットにおけるマーカーの組合せは必ずしも固定されているわけではない。例
また、マーカーセットにおけるマーカーの組合せは必ずしも固定されているわけではない。例
また、マーカーセットにおけるマーカーの組合せは必ずしも固定されているわけではない。例
えば、新たに別の品種を追加して識別しようとしたときに、それまでのマーカーセットでは識別えば、新たに別の品種を追加して識別しようとしたときに、それまでのマーカーセットでは識別えば、新たに別の品種を追加して識別しようとしたときに、それまでのマーカーセットでは識別できないことがある。
できないことがある。
できないことがある。
下表の例では、先の例に品種Ⅵを追加した場合を示している。この場合、マーカー①、②及び下表の例では、先の例に品種Ⅵを追加した場合を示している。この場合、マーカー①、②及び下表の例では、先の例に品種Ⅵを追加した場合を示している。この場合、マーカー①、②及び③だけでは、品種ⅤとⅥを識別することができないが、マーカー④を追加すれば識別ができるこ③だけでは、品種ⅤとⅥを識別することができないが、マーカー④を追加すれば識別ができるこ③だけでは、品種ⅤとⅥを識別することができないが、マーカー④を追加すれば識別ができることが、表中の記号から読み取れる。とが、表中の記号から読み取れる。とが、表中の記号から読み取れる。

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このように、十分な識別力があり、かつ効率的といえるためのマーカーの組合せは、識別した
このように、十分な識別力があり、かつ効率的といえるためのマーカーの組合せは、識別したい品種の数や種類等によって変わることが多い。なお、上の例では、理論上識別可能となる最低い品種の数や種類等によって変わることが多い。なお、上の例では、理論上識別可能となる最低限のマーカー数を示したが、実際にマーカーセットを開発する際には、より多くの数のマーカー限のマーカー数を示したが、実際にマーカーセットを開発する際には、より多くの数のマーカーを開発することで識別の精度を上げることができる。
を開発することで識別の精度を上げることができる。
５．終わりに５．終わりに

以上、SSR と CAPS を例に、DNA マーカーの検出方法と検出された結果による判定方法を説明した。上記からもわかる通り、１つ１つのSSR マーカーや CAPS マーカーだけでは識別できる
以上、SSRとCAPSを例に、DNAマーカーの検出方法と検出された結果による判定方法を説明
品種の数に限りがあることなどから、多くの品種が存在する植物種等の品種識別を行うためには、した。上記からもわかる通り、１つ１つのSSRマーカーやCAPSマーカーだけでは識別できる品種の数に限りがあることなどから、多くの品種が存在する植物種等の品種識別を行うためには、まずは対象とする植物種等に含まれる多くの品種を分析し、得られた多型情報（SSRの例でいえまずは対象とする植物種等に含まれる多くの品種を分析し、得られた多型情報（SSRの例でいえば、品種αと品種βそれぞれにおける「AGT」配列の繰返しの回数。CAPSの例でいえば、DNAば、品種αと品種βそれぞれにおける「AGT」配列の繰返しの回数。CAPSの例でいえば、配列のうち一部の塩基のみが異なる部分）から、それらを効率的に識別するのに十分な数のマーDNA配列のうち一部の塩基のみが異なる部分）から、それらを効率的に識別するのに十分な数カーを開発することが必要である。その際、いくつかの注意すべき点がある。のマーカーを開発することが必要である。その際、いくつかの注意すべき点がある。
まずは、多型情報を得るために供試する品種のサンプルが品種を代表するものとして適切であ
まずは、多型情報を得るために供試する品種のサンプルが品種を代表するものとして適切であるかである。栄養繁殖性の品種であれば原木や元株、種子繁殖性の品種であれば、育成者や第三るかである。栄養繁殖性の品種であれば原木や元株、種子繁殖性の品種であれば、育成者や第三者機関で適切に保存・管理している等、由来が明確で、後々検証可能なサンプルであることが望者機関で適切に保存・管理している等、由来が明確で、後々検証可能なサンプルであることが望ましいが、入手が簡単ではないことも多い。
ましいが、入手が簡単ではないことも多い。
次にマーカー性能の検証である。多型を検出できるマーカーであっても、実際に使ってみると次にマーカー性能の検証である。多型を検出できるマーカーであっても、実際に使ってみると増幅効率が良くないものや多型の識別がしにくいものもある。このようなマーカーはマーカーセ増幅効率が良くないものや多型の識別がしにくいものもある。このようなマーカーはマーカーセットからは除外しなければならない。
ットからは除外しなければならない。
そして、適切なサンプルとマーカーから得られた多型情報は上述したように表（データベース）
そして、適切なサンプルとマーカーから得られた多型情報は上述したように表（データベース）にしてまとめるが、新たに流通するようになった品種等の多型情報も適宜追加し、かつ適宜マーにしてまとめるが、新たに流通するようになった品種等の多型情報も適宜追加し、かつ適宜マーカーを追加することが有益である。このため、データベースは継続的にアップデートされることカーを追加することが有益である。このため、データベースは継続的にアップデートされることが必要である。
が必要である。
以 上Vol. 21

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