大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）による水中免疫電顕法：
タンパク質複合体のダイナミックな離合集散と細胞内移動
Immuno Correlative Microscopy in Solution Using Atmospheric Scanning Electron
Microscope (ASEM): Observation of Dynamic Rearrangements of Molecular Complexes
海老原達彦ａ，村井稔幸ｂ，西山英利ｃ，佐藤真理ａ，須賀三雄ｃ，佐藤主税ａ

Tatsuhiko Ebihara, Toshiyuki Murai, Hidetoshi Nishiyama, Mari Sato, Mitsuo Suga and Chikara Satoａ

産業技術総合研究所

バイオメディカル研究部門ｂ

大阪大学大学院医学系研究科
ｃ

日本電子（株）開発本部

要旨

タンパク質の細胞内分布は高度に制御され，刺激に応じてダイナミックに変化する．免疫電顕法はタンパク質の精妙な細胞内配置による機能の解明に貢献してきた．膜タンパク質が，刺激後に細胞内膜から細胞膜へ数秒以内に移動する例などが近年多く見つかってきており，多要素の変化を時間経過とともに解析する必要が増してきている．すなわち，従来よりも迅速な試料作製と観察が可能な，いわゆる高スループットな電子顕微鏡が求められている．大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）は，培養ディッシュ内の水溶液中試料をディッシュ底の電子線透過薄膜越しに倒立走査電顕で観察する新しいタイプの電顕である．試料は脱水処理なしに，蛍光抗体法と同様に手早く作製できる．しかも細胞や組織の抗原分布は薄膜から 2 ～ 3 μm の厚さで観察可能である．さらに上方の光顕による蛍光像との対比によって，タンパク質複合体の形成など多分子相関の詳細な観察を実現している．

キーワード：免疫電子顕微鏡，光・電子相関顕微鏡，F- アクチン，STIM1，CD44識した細胞を脱水，包埋，薄切することなくそのまま観察す
1.

はじめにシグナル制御タンパク質には，ダイナミックに移動するものが多い．その典型である TRPV2 は細胞内膜に控えており，ることにより，高スループットな免疫電顕を実現する．また，光顕との相関観察が可能であり，非常に有用性の高い新型の電子顕微鏡と言える（図 1）．

外的刺激によって数秒以内に細胞表面に表れる 1）．この様に，素早く移動するタンパク質が近年数多く見つかってきてい2.

る．その詳細な挙動と機構を解明するためには迅速な試料作

従来の免疫電顕法は，主に透過電顕を用いて，様々なタン製が可能な，いわゆる高スループットな電子顕微鏡観察法がパク質の分布を高分解能で解明してきた．一般に，電顕では必要と考えられる．

電子線を散乱させないように鏡筒内を真空にする必要があ

従来の免疫電顕法

また，細胞の様々なタンパク質は互いに会合・離散しながる．そのため試料は真空に耐えしかも電子線を透過するようら機能を果たす．会合したタンパク質複合体の多くは，さらに，数時間～数日間かかる複雑な処理を施す必要があった．に細胞骨格とも結合して細胞内で局在する．これまでの複合

試料調整法は，大きく分類すると，Post-embedding 法，Pre-体の研究アプローチでは，構成タンパク質をそれぞれ異なるembedding 法，Replica 法 の 3 種 類 で あ る．Post-embedding

色で標識して相互の局在を解析してきた．電顕は分解能に優法では，有機溶媒による脱水・樹脂包埋などの前処理を抗体れているが単色であるため，異なるサイズの金粒子による染標識前に施すため，脱水処理に弱い試料では抗原性と構造にめ分けにも限界がある．この限界を打ち破るのが光・電子相問題を生じることもある．脱水処理なしに親水性樹脂に試料

関顕微鏡（CLEM: Correlative Light and Electron Microscopy）を直接包埋し薄切することも可能ではあるが難しい．Pre-であり，光顕の色情報と電顕による高分解能情報を統合し，embedding 法では，水溶液中で試料を抗体標識するため抗原複合体の挙動をより詳細に探ることができる．

性は保存される．しかし，試料はその後に脱水され樹脂包埋

本稿で解説する大気圧走査電子顕微鏡（ASEM: Atmos-される．これら両方法では薄切が行われるため，連続切片法 2）

pheric Scanning Electron Microscope）は，金粒子や蛍光で標無しには，情報はおよそ 50–150 nm の薄い切片内に限られａ〒 305–8566 茨城県つくば市東 1–1–1
E-mail: ti-sato@aist.go.jp
2013 年 5 月 10 日受付

解説

大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）による水中免疫電顕法るという問題があった．Replica 法では，割断面の微細な凹凸が抗原の局在と共に高分解能で観察できる．しかし，得られる情報は割断面近くに限られてしまう．
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する．最初にディッシュ上部に配した光顕で，培養細胞の変3.

ASEM による水中観察電顕法

化を観察する．目的とする細胞変化が起った瞬間に化学固定

液体・気体中の試料をそのまま高分解能で電顕観察したい

し，ラジカルスカベンジャーである 10 mg/ml グルコース溶という要求から，電子線透過窓を持つ閉鎖カプセルである環液中で，下から SiN 薄膜越しに電子ビームスキャンにより同3）

境セルが電顕開発の早期から開発された ．近年，薄膜窓が一視野を高倍率観察する（図 1A）．また，光・電子相関観察

カーボン膜から，半導体微細加工技術によって開発された強を行う抗原の標識には，蛍光と金が付いた FluoroNanogold 6）

靭な素材へと変わり，環境セルは飛躍的な発展を始めた．しや quantum dots 7）が活用できる．ASEM の分解能は 8 nm で，かし十数 μl と小さな閉鎖系であり，神経細胞などの培養は細胞小器官や細胞骨格の観察も可能である 4,8）．

難しく長期培養や外部からの試薬投与も困難であった．何よ3.1 細胞骨格の ASEM 観察

りも，この小さな容器では抗体標識を行うことは容易でなく，細胞骨格は細胞の形を決定するとともに，能動輸送のレー免疫電顕法への応用を阻んでいた．

ルであり，分子局在の足場となる．微小管はチューブリン重その克服のために，我々は ASEM を開発した（図 1A，B）4,5）．

合により形成され，細胞分裂，鞭毛運動，神経回路形成など

強靭な 100 nm 窒化シリコン（SiN）薄膜をディッシュ底のに重要な役割を果たす．腎線維芽細胞由来の COS7 を化学固素材とし，その中の試料を倒立走査電子顕微鏡を使って底か定し，Triton X-100 処理後に，抗 α- チューブリン抗体で一次ら観察する．この 35 mm 径の ASEM ディッシュは，底面の標識を行って 8），Alexa Fluor 488 Nanogold-Fab’ 抗体 6）によっ

SiN 薄膜以外は通常の培養用プラスチックペトリディッシュて二次標識し，金増感を行った（図 1C）9）．これらの一連のである．そのため，培養細胞に対する一般的な蛍光抗体法の操作はディッシュの液交換で済み，2–3 時間で全ての作業を手技をそのまま応用することが可能である．しかも，水中で終えることができた．ASEM では，微小管は主に細胞の中心観察するため，試料作製の手間は光顕とほとんど同じである．

から辺縁に向かって走る白い線に見えた（図 2A）．拡大する

インキュベーター内へ ASEM ディッシュを移し，そこで細と，約 20 nm の金粒子の連なりが正体であった（図 2B）．

胞を培養した後，ディッシュを試料ステージ上に O リングバックグラウンドは極めて低い．もちろんラベリングは抗体で固定して，倒立 SEM 鏡筒内部を 1 分程度かけて真空排気に限らない．図 2C，D はファロイジン―金で標識したアク

図 1 ASEM の原理と蛍光・金標識法．
（A）倒立型 SEM に対向して光学顕微鏡を配置し，両者の間に，底に電子線透過薄膜を張った ASEM ディッシュをセットする．このディッシュは取り外して CO2 培養器内で培養が可能である．原子 400 個厚の SiN 薄膜は，半導体製造工程から生まれたもので真空を支える強度をもつ．電子線は薄膜を透して液中の細胞を照射し，反射電子は薄膜を通って円盤型の BEI 検出器で検出される．SEM 像は，ディッシュ上から撮影した蛍光像とリンクされる．（B）ASEMディッシュ．中央底にシリコンチップが埋め込まれている．下はディッシュ底から見たチップの拡大像で，中央はエッチングにより凹んでおり SiN 薄膜が張られている．（C）細胞内抗原の蛍光・金抗体標識と金増感処理を示す．文献 8）より改変．

図 2 微小管・F- アクチンの免疫 ASEM．（A）COS7 細胞の α- チューブリンを蛍光と金（FluoroNanogold）標識した水中免疫電顕像．
（B）高倍像では一本一本の微小管が観察される．（C）HeLa 細胞の F-アクチンをファロイジン―蛍光金で標識．（D）
高倍像．文献 8）より改変．
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顕微鏡 Vol. 48, No. 2（2013）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

チンフィラメントの ASEM 観察像である．より動的な細胞圧が上昇するに伴って，電子線照射深度は深くなり，観察で骨格であるアクチンフィラメント（F- アクチン）は，細胞きる深さも大きくなると考えられた（図 4）．これらの結果は，運動やシナプス形成・可塑性等に重要である．

図 3 ともよく一致した．

3.2

ASEM はどの位の厚さまで見えているか

ASEM 観察を加速電圧 30 kV で行った場合，薄膜からどの

4. 初代培養神経細胞のシナプス形成時における細胞骨格の再構築程度の深さまで観察できるのであろうか？微小管を図 2 と同様に標識し，共焦点蛍光顕微鏡との比較を行った．図 3Bシナプスは，神経ネットワーク形成の基本単位である．その ASEM 像における突起（矢頭）や球状の突起（矢印）は，のサイズは 50–500 nm と小さく，構成する軸索や樹状突起

A の共焦点像では最上段の薄膜底面像には存在しなかった．

も微細なものが多い．そのため，観察には，光顕よりも電顕A の下図より，これらは薄膜から浮いた構造であることがわの分解能が適しているように思われる．しかし，通常透過電8,10）．

顕で培養神経細胞のシナプス結合を全て観察するには，樹脂

加速電圧 10 kV では観察できる深さは 1 μm 程度まで浅く

包埋後に培養面と水平にサンプルを薄切するという実際にはかり，ASEM の観察できる深さは 2–3 μm と推定された
10）．培養神経細胞のシナプスや神経突起はすべて 2 ～困難な作業を行わなければならない．これに対して，ASEM3 μm の観察可能範囲内にあるため，ASEM で十分解析が行

ではシナプスを包埋や薄切なしに観察可能で，50 nm の小さえると考えられる．

なスパインも観察できた．

なった

電子飛跡シミュレーションによる観察できる深さ

図 5A–
A D は神経軸索の成長円錐を観察したものである．ポモンテカルロ法によってビーム中の電子の軌道（飛跡）をリ-L-リジンコートした ASEM ディッシュ上で，マウス海馬確率に基づきシミュレートした．20 kV から 30 kV と加速電神経細胞（錐体細胞）を 4 日間初代培養した 8）．固定・細胞

3.3

膜透過処理後に，F-アクチンを標識し，白枠の成長円錐をASEM で観察すると，先端のラメリポディア（葉状仮足）内の微細な F-アクチンがまるで自転車のスポークのような形状で観察された（図 5C，D）．スポーク構造の内側には，Homer 1c が共在した（図 5B 黄緑）．このことは，Homer 1cが Ca2+ シグナル情報を受け取り，成長円錐の運動をアクチン重合を介して制御するとの考えにも合致する．培養 14 日目ではシナプスが観察された．スパインに局在する Homer1c（図 5F，緑）をガイドに，シナプス部位の精細な形態が観察できた（図 5H）．チューブリンは樹状突起のシャフトに存 在 し て， シ ナ プ ス 部 位 に は ほ と ん ど 存 在 し な か っ た
図 3 ASEM による観察深度．COS7 細胞の α- チューブリンを
図 2A と同様に金・蛍光標識し，Confocal 蛍光顕微鏡との比較により観察できる深さを測定した．（A）共焦点蛍光顕微鏡像．
最上段は SiN 膜面．最下段は膜面より 1.32 μm．（B–E）ASEM像（30 kV）．観察できる深さは 2–3 μm と推定される 8,10）．文献 8）より改変．

（図 5G）．また，これら樹状突起内の微小管は斜め（らせん状）に走行することが判明した（図 5I，J）．
5.

シグナル伝達分子のダイナミックな再配置

5.1 脂質ラフトによる糖鎖レセプターの局在制御
細胞膜において外から内へのシグナルを制御するタンパク質には，一般に脂質ラフトと呼ばれる膜ドメインに局在し，そこで複合体構造をつくるものがある．癌転移関連膜レセプ
ター CD44 は，ラフトに局在すると考えられており，細胞外基質の特定の糖鎖を認識して結合し，癌の転移にも密接に関係している．神経膠芽腫 U251MG 細胞を固定後に，細胞外から CD44 を認識する抗体を用いて金標識した．CD44 を示
す白い点は細胞表面の所々に密集していた（図 6A）11）．対照的に，MβCD（methyl-β-cyclodextrin）の投与により，脂質ラフトの構成成分であるコレステロールを細胞から除去してラフトを破壊すると，CD44 を示す金粒子の分散が認められ

図 4 電子軌道（飛跡）シミュレーション．ASEM でのイメージングを，モンテカルロ法によって電子軌道シミュレーションした．20 kV と 30 kV に関して，試料をカーボン層と仮定して行った．この結果は図 3 で観察された深さの結果を支持している．文献 4）より改変．

解説

大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）による水中免疫電顕法た（図 6B）．この結果は，コレステロールの低下が，細胞運動の駆動力を生み出す足場である CD44 複合体を分散させることで，癌の浸潤・転移などに関わる細胞の運動性を抑制する可能性を示唆している．
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5.2 CRAC イオンチャンネルの Ca2+ 感受機構の可視化
小胞体の膜タンパク質である Ca2+ センサー STIM1 は，細胞膜にある CRAC イオンチャネルのセンサーである．STIM1は小胞体内部の Ca2+ 濃度をモニターしており，小胞体内部の Ca2+ 欠 乏 に よ っ て CRAC を 開 け る と 考 え ら れ て い る．
Ca2+ を涸渇させて，STIM1 の小胞体膜上での分布を観察したのが図 7 である 8）．小胞体マーカー PDI を蛍光標識して相関観察したところ（図 7A），小胞体が Ca2+ を貯蔵している定常状態では，STIM1 を表す金は小胞体全体に分散していた（図 7B，C）．ひとたび Ca2+ 枯渇が起こると，STIM1 分子は細胞膜近くに斑点状に集合した（図 7E–G）．拡大すると，分子は一次元的につながって凝集する様子が初めて観察された（図 7G）．STIM1 分子は非対称なので，分子が前後に連結することが示唆された．STIM1 重合体はさらに細胞膜のOrai と結合し，密集したイオンチャネル複合体を形成し活性化すると考えられる．

図 5 初代培養神経細胞の成長円錐．ポリ-L-リジンコートした SiN薄膜上で，Homer1c-EGFP トランスジュニックマウスの海馬錐体細胞を初代培養した．（A）4 日後の位相差光顕像．（B）蛍光像．Fアクチンを赤と金で標識．（C，D）ASEM 像．成長円錐のラメリポディア（葉状仮足）には，自転車のスポーク状に F- アクチンが観察された．
（E）培養 14 日後の位相差像．シナプスが形成されている．
（F）蛍光像．（G–I）ASEM 像．（G）シナプスのチューブリン．
（H）
さらに重金属で細胞の輪郭を染色．
（I，J）樹状突起内の微小管は，長軸に対して斜め（らせん状）に走行している．文献 8）より改変．

図 6 脂質ラフトにおける CD44 の分布と MβCD の影響．神経膠芽腫 U251MG 細胞の細胞膜表面の CD44 を FluoroNanogold 標識した．左は蛍光，中と右は金粒子を ASEM で撮影．（A）糖鎖レセプ
ター CD44 は，通常脂質ラフトと呼ばれる膜ドメインに局在する．
（B）脂質ラフトを MβCD で壊した細胞では，ラフトに集中していた CD44 は分散していた．ラフト集積構造のほうが，細胞運動の足場として優れていると推測される．それぞれ，左側の図の白枠エリアを拡大撮影した．A と B の各図上下は同倍率．文献 11）より改変．

図 7 小胞体（ER）内 Ca2+ 減少による STIM1 の複合体形成．CRAC チャネルの Ca2+ センサーである STIM1 サブユニットは細胞内の小胞体に分布するが（A–C），Ca2+ 枯渇を感知し細胞膜近くに斑点状に集合する（D–G）．白黒像は ASEM 像で，白枠をそれぞれ拡大撮影したのが右側の図である．集合した STIM1 の最拡大像では金粒子が線状に繋がって見え，分子が一次元的に結合していることが推測される（G）．
STIM1 は，さらに細胞膜の Orai1 と超複合体イオンチャネルを形成すると考えられる．（A，D）ER マーカーの PDI に対する蛍光抗体標識であり小胞体の分布を表す．COS7 発現系での結果を示した．免疫系 T 細胞の内在性 STIM1 でも同様の分子会合が観察された．文献 8）より改変．
110

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6.

細菌の構造解析

8. ASEM によるイメージングのコツ：加速電圧とコントラスト

細胞サイズが非常に小さい細菌は液中でどう見えるのであろうか？近年肺炎の流行などで特に注目を集めるマイコプラ

電子顕微鏡で微細な構造を視認できるかは，一般的に装置

ズ マ は， 細 胞 体 積 が 大 腸 菌 の お よ そ 1/25 し か な い．の分解能だけでは決まらない．ASEM でより微細な構造を観

Mycoplasma mobile 種は魚のエラから発見され，水中で極め察するにはどうしたら良いのであろうか？これは，以下の 3て高速で運動できる．それは，タンパク質複合体の足を多数要因により決まる．

持つからである．Triton X-100 で細胞膜に透過処理をした後，重金属で染色して ASEM 撮影を行った．尖った先端にはCap 構造，球状の細胞後方部には核酸，中間部分には変化に富んだ構造が観察された（図 8A）12）．また，移動を支える足複合体を金で免疫標識すると，細胞表面に腹帯状に分布しているのが認められた（図 8B 下）．

1）試料位置におけるビームの広がり
2）コントラスト3）信号量1）は小さいほど良い．加速電圧が高いほど，電子ビーム電流が小さい（スポットサイズが小さい）ほど，また薄膜が薄くて，試料の位置が薄膜に近いほどビームは小さくなる．

7.

細胞培養・固定・金標識・染色の方法

2）は，観察ターゲット（例えば標識の金粒子）とマトリSiN 薄膜は一般に細胞培養に適している．COS7・HeLa 等

クス（例えば水）の原子番号差や密度差が大きいほど高くなの細胞は，基質への接着性が良いため，ASEM ディッシュのる．また，信号発生領域を小さくする方が高くなる．加速電SiN 薄膜上で直接培養した（10％ウシ胎児血清加ダルベッコ

圧を低くすることにより，信号発生領域を小さくできる．

改変イーグル培地，5％ CO2，37°C）．神経細胞の初代培養で3）は，電子ビーム電流が大きいほうが多くなる．

は， あ ら か じ め ポ リ-L-リ ジ ン 等 で 表 面 コ ー ト を 行 っ た．

全体として，生体試料に標識した金粒子などでは原子番号ASEM 観察用の試料作製方法は以下のとおりである．①細胞と密度が高いため，高い加速電圧で観察しやすい．また，薄を 4％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液（pH 7.4）

膜から近く薄い構造のコントラストは，低加速電圧のほうが等で室温にて 10 分間固定，②必要に応じて 0.1％ –0.5％の高く，可視化に優れると言える．

Triton X-100 で細胞膜透過処理，③ 1％スキムミルク等でブロッキング，④一次抗体付加，⑤洗浄後に FluoroNanogold

9.

Fab’二次抗体付加，⑥蛍光観察，⑦ 1％グルタルアルデヒ

水中での光顕・電顕による相関観察が一つの装置にてでき

ド で 抗 体 を 固 定， ⑧ 水 洗 後 に， 室 温 で 5 分 間 金 増 感， ⑨ることは，ASEM の大きな特徴である．観察の迅速さは，多10 mg/ml グルコース溶液などのラジカルスカベンジャー中条件での実験を可能にした．光顕とのリンクは，遺伝子導入

考察で ASEM 観察を行う．標識以外の構造を見るためには，⑩実験でも威力を発揮する．培養細胞への遺伝子導入は，時と金属塩溶液（例えば 1％リンタングステン（PTA）水溶液やして数％の効率でしか成功しない．mCherry などの蛍光タ10 倍希釈白金ブルー液）などで 10 分間染色する 4,8）．

ンパクの遺伝子を導入マーカーとして使用すれば，発色する導入細胞を選別してその影響を電顕観察できる．
新開発の開放型 ASEM ディッシュは，特に二つの利点をもたらした．一つは，培養が難しい様々な細胞を薄膜上で培養できるようになったこと．もう一つは標識や洗いの効率が上がったことである．ASEM ディッシュでは，3 ml の大きな培養体積で CO2 インキュベーター内で培養できるため，培養液の塩濃度が安定である．さらに，広い液面でのガス交換により酸素・二酸化炭素濃度が安定である．SiN 膜は，ガラス用の表面コート剤で表面処理することで細胞接着が向上
する 12）．それは，SiN 膜表面は恐らく製造過程で酸化されてSiO となっており，ガラス様の性質を持つからと思われる．
標識・洗浄の容易さは，本免疫電顕法をほぼ光顕並に高スループットなものにした．そのため，多検体解析やスクリーニン

図 8 マイコプラズマ Mycoplasma mobile の ASEM 像．
（A）重金属染色．下は拡大図．（B）足タンパク複合体 Gli349 の水中免疫電顕像．金標識の後で，重金属で細胞の輪郭をカウンター染色．上は模式図であり，細胞は矢印方向に移動する．マイコ
プラズマは一般に大腸菌の 1/25 の体積しかない．文献 12）より改変．

解説

大気圧走査電子顕微鏡（ASEM）による水中免疫電顕法

グが容易であり，1 日に 40 ディッシュを観察した例もある．
試料の調整はすべて水溶液中で行われるため，抗原性の保存は極めて良い．100 種類ほどの細胞標識用の抗体を試したところ，100％の抗体で ASEM 観察することができた．その内半数はマウスモノクローナル抗体である．重金属による染め111【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

分けを追加することで，特定の細胞構造を強調することができる．酢酸ウラン，リンタングステンは主にタンパク質・核酸 を， 四 酸 化 オ ス ミ ウ ム は 油 滴 や 膜 構 造 を 強 調 す る 4）．
ASEM の加速電圧を変えることで，目的物の薄膜からの距離を推定することができる．この辺りは，機能的には共焦点顕微鏡と少し似ているが，原理は異なる．
10.

おわりに高スループットな ASEM は，多様な試料を短い前処理により高分解能で観察することが可能である．ASEM の操作は，電顕としては極めて習得が簡単である．常に薄膜が同じ高さにセットされるため，フォーカス位置が同じ場所にくることも簡便さの一因となっている．今回ご覧いただいた結果以外に ASEM は，光顕分解能以下のタンパク質微結晶を無染色で結晶化溶液中で観察可能である 13）．また，基礎生物学のみならず，癌の術中迅速診断 4）や病原菌の特定，食品化学，ポリマー化学などにも応用できる．さらに，開放系の気体・液体中で高分解能観察できる能力は，材料科学や電気化学 14），ナノ科学など様々な物理・物性研究にも広く応用できる．
謝

辞

産総研の小椋俊彦博士に ASEM（ClairScope）開発での貢献に，ASEM 製作では日本電子テクニクス（株）の露木誠氏，佐藤猛氏，石森能夫氏，小泉充氏，小川康司氏に，薄膜の製作では，山形県工業技術センターの渡部善幸博士と日本電子の小入羽祐治氏の御協力に感謝いたします．ASEM 開発の一部は，産業技術総合研究所と日本電子のマッチングファンドの支援を受けて行われました．

112

文献

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顕微鏡 Vol. 48, No. 2（2013）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】