単一菌体の時間的・空間的連続観察から得られた新知見と将来展望

1 分子蛍光顕微鏡による 1 細胞内遺伝子発現の可視化
Visualization of Gene Expression Dynamics in Single Living Cells
Using Single-Molecule Fluorescence Microscopy
谷口雄

一Yuichi Taniguchi
理化学研究所生命システム研究センター
要旨

1 つ 1 つの細胞で行われる遺伝子発現は確率的であるため，各細胞に存在する遺伝子発現産物の量は，例えゲノムが等しくても不均一となり，さらに時々刻々と変動する．しかしながら，低コピー数のタンパク質の発現や，発現量の微小なばらつき・ゆらぎなどを測定することは，一般的な遺伝子発現の測定手法では感度面において難しい．このため筆者らは，1 分子イメージング技術を応用し，1 細胞の遺伝子発現の動態を定量的に解析する方法論の開発を進めている．モデル生物である大腸菌（Escherichia coli）を用いて 1,018 遺伝子に対して網羅的に解析を行ったところ，各細胞のタンパク質発現量の分布はほぼどの遺伝子においてもガンマ分布で記述でき，さらにその形状は転写・翻訳速度による影響を受けて決定されることが分かった．さらに，1 細胞内における mRNA とタンパク質の発現量を同時に測定した結果，両者の量の間には相関性が無いことが分かった．

キーワード：1 分子・1 細胞イメージング，遺伝子発現ノイズ，ゲノムワイド解析，大規模データ解析，微細加工技術

ローブ配列の導入によって可視化し，1 分子蛍光顕微鏡を用

1.

はじめにいて数や局在を捉えることで，各細胞の遺伝子発現の定量化

一つ一つの細胞では，内在するゲノム DNA から無作為にを行う．識別できる蛍光タンパク質の種類の数の関係上，試遺伝子発現が行われ，細胞間の性質の違いが生み出されてい料内で同時に測定できる遺伝子の数は 3 ～ 4 程度に限定され．最近の研究により，こうした細胞毎の遺伝子発現量ているが，細胞株ライブラリ 7）を用いることにより，全遺伝のばらつき，すなわち遺伝子発現ノイズが，表現型変化や環子に対して網羅的に解析を行うことも可能である．本稿では，境適応など，様々な生命プロセスに深く関わることが分かっ

技術の概要，並びに 1 分子レベルでの遺伝子発現ダイナミクてきた 3）．このため，1 つ 1 つの細胞で起こる遺伝子発現をスの特徴的性質について解説する．

る

1,2）

個別に定量化する“1 細胞解析”が近年の生命科学において注目を集めるようになり，次世代シーケンサーや質量分析等

2.

1 分子蛍光顕微鏡法を基盤とした技術の開発が盛んに行われている．しかしなが1 分子蛍光顕微鏡は，蛍光顕微鏡の検出感度を高めること

ら，これらの技術のほとんどは，細胞を破砕し，内容物を抽により，カバーガラス上，もしくは細胞内に存在する蛍光ラ出して解析を行うため，ダイナミックな遺伝子発現量の変化

ベル化された分子を 1 分子のレベルで観察する測定手法であを捉えることは難しい．また，1 細胞内に含まれる内容物のり，近年の生命科学において幅広く応用がなされている．技量は極めて少ないため，低コピー数の遺伝子の発現の検出や，術が開発された当初は，モータータンパク質の運動を in

発現量の微小なばらつき，ゆらぎを捉えることは感度的に厳vitro の環境下で 1 分子レベルで観察する等の用途に用いらしいものとなっている．

れていたが 8），最近では細胞内の分子の可視化にも用いられ

そこで筆者らは，近年開発された超高感度分子検出技術で4）ており，転写因子のゲノム DNA への結合・解離や，膜タンを応用し，各細胞の遺伝パク質の拡散運動などの様子が 1 分子レベルで観察されてい子発現を生きたまま，リアルタイムに，かつ 1 分子の感度でる 9）．また最近では，ゲノムシーケンサーにも技術が応用さ定量化する手法の開発を行ってきた 5,6）．本法では，1 つ 1 つれており，断片化した 1 分子の DNA から非増幅で配列を解の mRNA やタンパク質の発現を，ゲノム DNA 上への蛍光プ析できるようになってきている．

ある 1 分子蛍光イメージング技術〒 565–0874 大阪府吹田市古江台 6–2–3
TEL: 06–6155–0114; FAX: 06–6155–0112
E-mail: taniguchi@riken.jp
2015 年 5 月 28 日受付

特集

1 分子蛍光顕微鏡による 1 細胞内遺伝子発現の可視化

1 分子顕微鏡の光学系として代表的なものとしては，エバネッセント照明光学系（図 1A）が挙げられる 10）．この光学系では，試料を載せたカバーガラスの界面でレーザー光を全反射させ，反射面の界面に生じる約二百ナノメートル程度の81【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 1 分子蛍光イメージングの光学系
A，エバネッセント照明光学系．B，広視野照明光学系．C，シート照明光学系．

厚さの染み出し光を用いて試料内の蛍光を励起し，観察を行の発生が同期して行われるようになり，これを 1 分子蛍光顕う．レーザーを試料全体に透過させないため，バックグラウ微鏡で捉えることで 1 分子感度でのタンパク質発現の観察がンドを大幅に下げることが可能であり，非常に明瞭な 1 分子可能になる 5）．一般的に蛍光イメージングでよく用いられる蛍のスポットを観察することができる．この他，最近では広視光抗体を用いてラベル化する方法とは違い，発現したほぼ全野照明光学系（図 1B）やシート照明光学系（図 1C）が 1 分てのタンパク質が蛍光を発する上，非特異結合によるバック子観察に用いられている．広視野照明光学系では，レーザーグラウンドも生じないため，正確にタンパク質発現量の測定を試料内の全深度領域に当てて観察を行う．全焦点面の蛍光を行うことが可能になる．また，蛍光タンパク質が蛍光を発分子が励起されるためバックグラウンドが高くなるが，厚みするまでのタイムラグは，Venus などの成熟時間の短い蛍光の薄い大腸菌などの試料においては十分に 1 分子を観察できタンパク質を利用することにより最小化することができる 12）．

5）

る ．これに対しシート照明光学系では，薄いシート状の光

図 2C–E には，本法を用いて生きた大腸菌におけるタンパを試料の横側から当て，観察焦点面にある蛍光分子だけを選ク質発現の可視化を行った際の画像を示した 6）．C は Adk（ア択的に蛍光励起して観察を行う．試料のいずれの深度で観察デニル酸キナーゼ）遺伝子，D は AtpD（ATP 合成酵素 F1を行う際にもバックグラウンドが低減化されるため，動物培部位 β サブユニット）遺伝子，E は YjiE（推定転写因子の一養細胞などの厚みのある細胞の全領域において 1 分子を観察つ）遺伝子の発現の様子を表しており，E の画像の一つ一つすることができる

9,11）．のスポットが 1 分子のタンパク質発現を表す．各細胞におけ蛍光の励起光源としては，一般的に 1 W/mm2 以上の高いるタンパク質の発現個数は，各細胞で内在する蛍光強度を積強度のレーザー光が用いられる．典型的に蛍光分子は，退色算し，その値を 1 分子の蛍光分子による値で割り算することするまでに合計で数万個から数十万個の光子を放出することにより求めることが可能である．

が知られているが，高い強度のレーザーを用いて 1 回の露光

一方で，生きた細胞内での mRNA の発現数を測定する方時間でかなりの割合の光子を一度に放出させることで，1 分法としては，MS2 ウィルスのキャプシドタンパク質を利用子からでも解析に十分なシグナルを得ることができる．また，する方法がある 13）．この MS2 タンパク質はステムループ構

この強度の値は太陽光の値よりも約数千倍高いものであり，造を有する特定の RNA 配列と強く結合する性質を持ってい生体試料へのダメージも懸念されるが，露光時間を数百ミリる．注目する遺伝子の mRNA に MS2 タンパク質結合配列の秒に抑える等の工夫を行うことにより，細胞が生きた状態で繰り返しを挿入し，同時に蛍光タンパク質と MS2 タンパクの連続観察を行うこともできる．一方で蛍光の検出には，高質 の 融 合 体 を 細 胞 内 で 恒 常 的 に 発 現 さ せ て お く こ と で，開口数の対物レンズ，並びに EM-CCD などの超高感度カメラ

mRNA の発現と共役した蛍光スポットを細胞内で観察できが一般的に用いられる．カバーガラスは超音波またはプラズるようになる．また，ダイナミクスの測定を要しない場合にマ洗浄を行ったものが主に用いられ，細胞は自家蛍光が極力は，蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法を用いて，注目少なくなるように最小培地等で培養したものが用いられる．

する遺伝子が発現する mRNA に蛍光オリゴヌクレオチドを3.

プローブする方法が簡便である 14,15）．
遺伝子発現過程の蛍光プローブ法

遺伝子発現の過程においては，遺伝情報をコードしたゲノ

4.

ゲノムワイド解析

ム DNA から，転写の過程を通じて mRNA，翻訳の過程を通先述したように，蛍光イメージング法では一度に識別できじてタンパク質の発現が行われる．タンパク質発現数の正確る色の数が限られており，従って蛍光を利用する本法では，な測定を行う方法としては，注目するタンパク質に蛍光タン

生物の持つ数千から数万オーダーの数の遺伝子のうち，数種パク質を融合させるやり方が一般的である 1）．細胞内のゲノム類の遺伝子しか同時に解析を行うことはできない．筆者らはDNA 内の注目する遺伝子のコード領域に蛍光タンパク質のこれを補う方法として，膨大な数の遺伝子の解析を逐次的に配列を挿入することで，注目遺伝子の発現と蛍光タンパク質行うハイスループット解析プラットフォームを開発した．

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顕微鏡 Vol. 50, No. 2（2015）【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 1 細胞内タンパク質発現量の定量化（文献 6 より転載）
A，蛍光タンパク質（Venus）融合大腸菌株ライブラリ．B，ハイスループット計測用マイクロチップ．C–E．実際に得られる測定データの代表例（Adk，AtpD，YjiE）．左の画像は，細胞の位相差像（グレースケール）に，1 分子蛍光像（黄色）を重ねたもの．右のグラフは，1 細胞に含まれるタンパク質コピー数の分布を示す．

多数の遺伝子の発現を解析するためには，まずゲノム DNA逐次的に蛍光イメージングしていくことで，多数株の測定を上のそれぞれの遺伝子に蛍光タンパク質配列を挿入したもの行う．そして測定したデータは画像処理システムに送られ，を用意する必要がある．筆者らは，過去に報告されたモデル各細胞におけるタンパク質数や局在，分布などの統計情報が生物である大腸菌（E. coli）の各タンパク質の精製のために自動的に生成される．このシステムでは，1 チップ 96 サン開発された細胞株コレクション

7）を利用してこうした細胞株のコレクションを網羅的に構築した（図 2A）．用いたコレクションは，ゲノム上の各遺伝子の C 末端にタンパク質精製タグである SPA（Sequential affinity tag）を挿入したものであり，プルの測定が約 30 分で終了し，この際各サンプル当たり平均約 4,000 細胞の解析を行うことができる．
5.

タンパク質発現量の分布性

筆者らは相同組換え法 16） を用いて，このタグを蛍光タンパ

筆者らはこのプラットフォームを用いて，まず各細胞に存ク質配列に置き換える作業を各細胞株に対して行うことでコ在するタンパク質の個数が細胞集団内でどのように分布してレクションの構築を行った．現在筆者らは，大腸菌全遺伝子いるか，ライブラリの構築を行った 1,018 遺伝子に対して解の約 1/4 に相当する 1,018 遺伝子に対応する細胞株の構築に析を行った．その結果，Adk や AtpD などの高コピー数タン成功しており，構築した細胞株は Coli Genetic Stock Center

パク質においては典型的にピークを持った分布，YjiE などの（http://cgsc.biology.yale.edu）において提供を行っている．

低コピー数タンパク質においては典型的に単調減少型の分布

しかし，これらの細胞株を一つ一つ顕微鏡で計っていくのが観察された（図 2）．筆者らは，これらの分布を一様に記

では，全ゲノムレベルでの網羅的な解析を行うのに非常に手述できる関数があるのではないかと考え，様々な関数を用い間がかかる．このため筆者らは，膨大な数の細胞株に対しててフィッティングを行ったところ，測定した 1,018 遺伝子の一挙に自動解析を行うハイスループット測定システムを開発

分布のうち，1,009 遺伝子の分布がガンマ分布した（図 2B）．本システムでは，多数の細胞株をマイクロデバイス上に集約して搭載し，自動ステージを用いてこれらを特集

1 分子蛍光顕微鏡による 1 細胞内遺伝子発現の可視化

a−1 − x / bp( x) =x e
Γ ( a) b a83【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

図 3 タンパク質発現ノイズの性質（文献 6 より転載）
A，ノイズ量と平均発現量の関係性．ポアソンノイズによる極限を赤色の線で，全遺伝子に共通して働くノイズによる極限を青色の線で表す．B，タンパク質発現量の時間的推移．上図，各時刻におけるタンパク質発現量の変化．下図，発現量の時系列変化．異なる細胞のデータを異なる色で表している．丸印は細胞分裂が行われたことを表す．

により記述できることを見つけた．ここで x はタンパク質のをとることが分かった．全ての遺伝子が一様にこのノイズの個数，Γ(.) はガンマ関数，a，b はガンマ分布の 2 つの可変パ影響を受けていることから，全遺伝子に一様に影響を与えるラメータを表す．

因子，例えば，RNA ポリメラーゼやリボソームの数の，細このガンマ分布は，mRNA・タンパク質の合成・分解がそれぞれランダムに起こることを仮定したキネティックスキーム：k2
k1
DNA → mRNA → Protein
γ1 ↓Ø

γ2 ↓

Ø

胞毎のばらつきなどが，このノイズの決定因子になっていることが示唆される．
6.

タンパク質発現量の時間変化

次に筆者らは，タンパク質の発現量の時間変化に注目した．
これを調べるため，筆者らは十数個の遺伝子をランダムに選択し，一定の時間間隔をおきながら発現量をタイムラプス観と等価の関係にあることが，過去の理論的研究により示唆さ測することにより，発現量の時間変化の測定を行った．結果，れている 17）．この等価性が成り立つ場合，a の値は mRNA の合低発現のタンパク質では，mRNA の発現・分解と共役する成速度からタンパク質の分解速度を割り算したものに等しく形で，複数のタンパク質が突発的に発現される様子が観察さなり，b の値はタンパク質の合成速度から mRNA の分解速度れた．一方で高発現のタンパク質では，こうした急激な変化を割り算したものに等しくなるはずである．筆者らは実際にはさほどみられず，一定量のタンパク質発現が常に行われてこれらの値を測定したところ，そこで得られる値は実際に a，いる様子が観測された（図 3B）．これは，1 つ 1 つのタンパb の値と等しくなることを見つけた．これはつまり，細胞集ク質発現イベントが数的に積算されているためであると考え団レベルでのタンパク質のコピー数分布が，遺伝子発現の各られる．さらに，細胞毎の発現量のばらつきにも注目したと過程の速度定数により決定づけられていることを表している．

ころ，時間的なゆらぎよりもむしろ，細胞間のばらつきの方

さらに筆者らは，分布の広がり具合がプロテオーム全体にが優勢を占めることが分かった．これはつまり，何世代にもおいてどのような傾向をもっているかを調べた．筆者らは，わたって記憶されるようなエピジェネティックな細胞状態が（分布の標準偏差を 2 乗
分布の広がり具合であるノイズ量 1）

それぞれの大腸菌細胞に存在しており，そのばらつきが高発したものから平均値の 2 乗を割り算したものとして定義され現タンパク質におけるノイズの決定因子になっていることをる）を各遺伝子に対して求め，横軸にタンパク質の平均発現表している．

量を取ってプロットを行った（図 3A）．その結果，タンパク質数のノイズには，発現数の大小に応じた 2 種類の下限値が7.

mRNA・タンパク質発現の同時測定存在することが確認された．平均発現量が 10 コピー / 細胞

さらに筆者らは，各細胞内における mRNA とタンパク質以下の低発現の領域では，下限値の値は発現量に反比例してのコピー数を同時に計測し，両者の量の相関性について解析おり，その値はポアソンノイズ，すなわち遺伝子発現ノイズを行った．筆者らは，蛍光 in situ ハイブリダイゼーションが純粋にランダムに行われた場合のノイズ量と等しくなるこ法を用いて，赤色蛍光オリゴヌクレオチドを mRNA 上のとが分かった．一方，10 コピー / 細胞以上の高発現の領域でVenus コード領域にハイブリダイゼーションし，1 分子顕微は，下限値の値は発現量に依存せず，30％のところで一定値鏡を用いて同一細胞内の黄色蛍光，並びに赤色蛍光の数を数

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顕微鏡 Vol. 50, No. 2（2015）【著作権者：公益社団法人 日本顕微鏡学会】

えることによって，mRNA 数，タンパク質数の決定をそれぞれ行った（図 4）．

8.

おわりに各細胞における mRNA 数とタンパク質数の相関プロット

蛍光 1 分子イメージング法を応用した本技術は，一つ一つを解析したところ，面白いことに，測定した 137 の遺伝子のの細胞における遺伝子発現の微小なゆらぎやばらつきを 1 分どれにおいても，両者の数の間には相関性が無いという結果子レベルで定量的に評価することを可能にするものである．

が得られた．遺伝子発現の上流と下流の関係に相当する

筆者らは，モデル生物である大腸菌の持つ千を超える遺伝子

mRNA とタンパク質のコピー数の間に相関性がないことをに対して発現量のばらつきを評価し，全ゲノムレベルでの共示す今回の結果は，一見奇妙に思えるかもしれない．しかし通性・一般法則を探索することにより，遺伝子発現ノイズの実は今回の結果は，mRNA とタンパク質の分解時間の違い素反応モデルを導くことに成功した．今回の解説では大腸菌を考慮することによりうまく説明することができる．大腸菌の測定結果について述べてきたが，筆者らは現在，出芽酵母における mRNA の分解時間は，mRNA シーケンシングを用やヒト培養細胞などといった真核細胞についても同様の測定いて調べると数分程度であったのに対し，タンパク質の分解を行うためのシステムの開発を行っており，実際にこれらの時間は数時間から数日のオーダーであることが知られてい細胞の計測も可能になりつつある．この結果については，近る．これはつまり，観察された mRNA の数は過去数分以内

い将来にどこかの機会で報告したいと考えている．に起こった遺伝子発現の量を反映するのに対し，タンパク質の数は，細胞分裂の長い時間スケールの間に積算された遺伝子発現の量を反映することになる．このように考えると，mRNA とタンパク質のコピー数の間に相関性が無いことはある意味当然の帰結であるということができるかもしれない
が，一方で今回の結果は，将来行われるであろう 1 細胞レベ
ルでのトランスクリプトーム解析に対してひとつの警告を与えるものであり，同時に，プロテオーム解析の必要性を表しているということができる．

図 4 mRNA・タンパク質発現量の相関性（文献 6 より転載）
上図，同一細胞におけるタンパク質（左）と mRNA（右）の発現の可視化．下図，1 細胞内における tufA 遺伝子の mRNAとタンパク質の発現量の相関プロット．

特集

1 分子蛍光顕微鏡による 1 細胞内遺伝子発現の可視化

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