技術ノート
技術ノート

LabCyte EPI-MODEL 24 を用いた
JIS L 1918
「繊維製品の皮膚一次刺激性試験」
渡辺美香，小林美和子，生悦住茉友，山影康次
Primary skin irritation test of textile products according to JIS L 1918
using LabCyte EPI-MODEL 24
Mika WATANABE, Miwako KOBAYASHI, Mayu IKEZUMI, Kohji YAMAKAGE

緒言
欧州連合（EU）では，1986 年以降，動物実験の規制が段階的に強化され，2013 年 3 月 11 日から
は，EU 内で動物実験を用いて開発された化粧品の販売が全面禁止となっている．その禁止措置には，製造元が EU 加盟国以外の製品も含まれており，すべての化粧品に適用されている．昨今，こうした海外の動きの影響によって，日本でも動物実験廃止を求める声が少しずつ広がりを見せてきたことから，動物を用いない動物実験代替法による安全性評価が強く求められている．

図1

LabCyte EPI-MODEL 24 模式図

ヒト正常表皮細胞を重層培養したヒト 3 次元培養表皮モデルである．ヒト皮膚構造に類似し，高度に分化，重層化した 3 次元構造をとっている．

こ の 様 な 状 況 の 中 で， 日 本 工 業 規 格 JIS L19181）においても，2005年に繊維製品の皮膚への一次刺激性を予測・予知するための培養ヒト3次材料および方法

元皮膚(Reconstructed human Epidermis, RhE)

RhE モデルモデルによる in vitro 試験方法が制定されていLabCyte EPI-MODEL 24 はヒト正常表皮細胞る． し か し， こ の JIS 規 格 制 定 時 に RhE モ デを重層培養した RhE モデルであり（図 1），2013

ルとして皮膚貼付試験との対比試験が行われた

年 7 月 26 日に経済協力開発機構（OECD）のテスの は EpiDerm EPI- 200，Testskin LSE お よ び

トガイドライン 439 3）（in vitro 皮膚刺激性再生ヒVitrolife のみで，これら以外の RhE モデルを使ト表皮試験法）にも掲載されている．この試験に用 す る 場 合 に は，JIS L 1918 に 規 定 さ れ た 試は LabCyte EPI-MODEL 24 と キ ッ ト に 付 属 の験成立条件を満たす必要がある．そこで著者ら

アッセイ培地［EPI-MODEL］とともに株式会社

は 日 本 国 内 で 入 手 が 容 易 な RhE モ デ ル で あ る

ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング（愛知）

LabCyte EPI-MODEL に つ い て，JIS L 1918

より購入して使用した．に規定される試料を用いて試験成立条件を満たす基準布2）ための条件検討を行った．

試験に用いる基準布を作製するために，JIS L0803 4）で規定された染色堅ろう度用添付白布の綿を，60 ˚C に保持して 10 分間湯洗いし，5 分間のすすぎを 2 回行い，これを 10 回繰り返したものを沸騰水中で 30 分間処理し，精製水で 3 回の代替法試験部細胞毒性学研究室すすぎを行い，風乾した．この基準布を RhE モ
9

秦野36.indb 914/02/06 11:20

秦野研究所年報 Vol. 36. 2013

表1

コントロール試料の分類

コントロール試料の分類

しみ込ませる溶液人工汗液 1）

コントロール試料 O（24 / 48 時間貼付用）
コントロール試料 A（24 時間貼付用）

SLS 2）（10 g/L）

コントロール試料 B（24 時間貼付用）

SLS（1 g/L）

コントロール試料 C（48 時間貼付用）

SLS（5 g/L）

コントロール試料 D（48 時間貼付用）

SLS（0 . 1 g/L）1）

人 工汗液 : L- ヒスチジン塩酸塩一水和物（0 . 5 g/L），塩化ナトリウム（5.0 g/L），リン酸二水素ナトリウム二水和物（2 . 2 g/L）を含む水溶液［pH 5 . 5 ± 0 . 2（25 ℃）］．JIS L 08485）で規定された
酸性人工汗液．
2）
SLS: SLS 原液（10 g/L）を調製し，基準布の貼付時間によって異なる濃度に希釈した．

図2

LabCyte EPI-MODEL 24 を用いた試験操作の流れ

デルのサイズに合わせて打抜きポンチで直径 6試験方法mm 以上（6 または 7 mm）の円形に打抜き，使用試験の流れを図 2 に示した．入手した LabCyte

前にオートクレーブ滅菌した（121 ˚C，15 分）．

EPI-MODEL 24 の培養カップを，アッセイ培地コントロール試料

0 . 5 mL を入れた 24 ウェルアッセイプレートに移JIS L 1918 に従い，人工汗液および濃度の異し，37˚C，5％ CO 2 条件下で前培養した．前培なるラウリル硫酸ナトリウム水溶液（以下，SLS）

養後，基準布による処理を行うが，処理方法と処4 種類を，それぞれ別々の基準布に基準布質量の理時間の検討を行った．処理方法については，前3 倍量しみ込ませたものをコントロール試料とし培養を約 24 時間行った後，培養表皮表面にコンた．試験成立の判定に用いた 5 種類のコントロー

トロール試料を貼付（実験 1 および実験 2）するか，ル試料を表 1 に示した．

もしくは，培養表皮表面に基準布を貼付して人工10

秦野36.indb 10

14/02/06 11:20

技術ノート表2

評価基準
細胞生存率（%）
24 時間貼付試験

48 時間貼付試験

皮膚一次刺激性の分類

50 . 0 未満―

陽性50 . 0 以上，80 . 0 未満

50 . 0 未満

弱陽性50 . 0 以上，80 . 0 未満

50 . 0 以上

陰性80 . 0 以上―陰性

24 時間貼付試験で，細胞生存率が 80 . 0 % 以上を示した場合は，被験試料の皮膚への一次刺激性は陰性に分類し，50 . 0 % 未満を示した場合は陽性に分類する．24 時
間貼付試験で，細胞生存率が 50 . 0 % 以上，80 . 0 % 未満を示した場合は，さらに 48時間貼付試験を実施し，細胞生存率が 50 . 0 % 未満の場合は弱陽性に分類し，50 . 0% 以上の場合は陰性に分類する（JIS L 1918 : 2011 より転記）．

汗液または SLS を滴下（実験 3）させた．このとき，

記条件にいずれも適合する場合，試験が成立した試料を貼付しない培養表皮を未貼付試料として用ものとした．

意した．いずれも n=3 で行った．新たにアッセ

未貼付試料の生細胞数≧ 0. 7 注

イ培地をそれぞれ 0 .5 mL（24 時間）または 1 mL

コントロール試料 O の細胞生存率≧ 80 . 0 ％（48 時間）を加えたウェルに培養カップを移して，コントロール試料 A およびコントロール試料 C24 時間または 48 時間貼付試験を実施した．の細胞生存率＜ 20. 0％

24 時間または 48 時間培養した後，基準布を除

コントロール試料 B およびコントロール試料 D去して培養表皮表面を PBS で洗浄し，培養表皮の細胞生存率≧ 80 . 0 ％を 0.5 mg/mL MTT 含有アッセイ培地 0. 5 mL が

注：LabCyte EPI-MODEL 24を用いたin vitro皮入ったウェルに入れ，3 時間培養した．その後，

膚刺激性試験における陰性対照の判定基準

培養表皮をチューブに移し，イソプロパノールを未貼付試料への判定基準として採用した．

300 µL に浸漬した．チューブを冷蔵庫で 24 時間以上静置して，MTT 反応生成物（ホルマザン）を抽出（MTT 抽出液）した．

結果および考察ヒト3次元培養表皮モデルLabCyte EPI-MODELMTT 抽出液を 200 µL ずつ 96 ウェルプレート

24がJIS L 1918に適合するモデルであるか検討すに移し，マイクロプレートリーダーで測定波長るため，JIS L 1918に規定されるコントロール試570 nm，参照波長 650 nm における吸光度を測料を用いてin vitro皮膚刺激性試験を実施した．

定した．ブランクはイソプロパノールとし，測定値

実験 1 では，直径 6 mm のコントロール試料をから生細胞数（吸光度平均値）および細胞生存率

培養表皮表面に貼付し，24 時間または 48 時間培｛（各群の吸光度平均値 / 各対照群の吸光度平均値）養した結果（表 3），コントロール試料 O の細胞生× 100｝を算出した．なお，コントロール試料 O存率は 94 . 0％
（24 時間）および 105％
（48 時間）での場合は未貼付試料，コントロール試料 A～D のあった．コントロール試料 A およびコントロール場合はコントロール試料 O をそれぞれの対照群

試料 C の細胞生存率は 43. 8％および 61 . 8％，コとした．

ントロール試料 B およびコントロール試料 D の細なお，実際に被験試料（繊維製品）を試験する際

胞生存率は 92 . 0％および 97. 9％であった．には，被験試料をコントロール試料と同じサイズ

コ ン ト ロ ー ル 試 料 O， コ ン ト ロ ー ル 試 料 Bに打ち抜き，人工汗液を滴下したものについて同およびコントロール試料 D は試験成立条件（≧

様な操作を実施し，表 2 の評価基準より刺激性に80 . 0％）を満たしたが，コントロール試料 A おついて分類することになる．

よ び コ ン ト ロ ー ル 試 料 C は い ず れ も 条 件（ ＜試験成立条件20. 0％）を満たさなかった．コントロール試料 AJIS L 1918 に従い，コントロール試料群が下およびコントロール試料 C は MTT 含有培地で培
11

秦野36.indb 11

14/02/06 11:20

秦野研究所年報 Vol. 36. 2013

表3

直径 6 mm のコントロール試料を培養表皮表面に 24 時間または 48 時間貼付した結果

試料名培養 24 時間

培養 48 時間

生細胞数（OD 570 - 650）

生細胞数
（OD 570 - 650）

細胞生存率（％）

123平均

1 . 208 ± 0 . 214

1000 . 955

0 . 946−

0 . 951 ± 0.006

123平均

未貼付試料

1 . 359

1 . 056−

コントロール試料 O

S.D.

S.D.

細胞生存率（％）
100

1 . 056

1 . 203

1 . 149

1 . 136 ± 0 . 074

94 . 00 . 989

0 . 967

1 . 029

0 . 995 ± 0.031

105

コントロール試料 A/C 0 . 476

0 . 615

0 . 401

0 . 497 ± 0 . 109

43 . 80 . 639

0 . 552

0 . 655

0 . 615 ± 0.055

61.8

コントロール試料 B/D 1 . 093

1 . 024

1 . 017

1 . 045 ± 0 . 042

92 . 00 . 976

0 . 974

0 . 971

0 . 974 ± 0.003

97.9■ 網掛け部： 試験成立条件を満たさなかった．

表4

直径 6 または 7 mm のコントロール試料を培養表皮表面に 24 時間貼付した結果
培養 24 時間

試料名

生細胞数
（OD 570 - 650）
123

平均細胞生存率（％）

S.D.

未貼付試料

1 . 018

0 . 925

0 . 970

0 . 971±0 . 047

100

コントロール試料 O0 . 901

1 . 013

1 . 014

0 . 976±0 . 065

101

コントロール試料 A（直径 6 mm）

0 . 176

0 . 3140 . 2120 . 234±0 . 07224 . 0

コントロール試料 A（直径 7 mm）

0 . 198

0 . 260

0 . 348

0 . 269±0 . 075

27 . 6■ 網掛け部 : 試験成立条件を満たさなかった．

表5

直径 6 mm の基準布を培養表皮に貼付後，人工汗液または SLS を基準布にしみ込ませた結果
培養 24 時間

培養 48 時間

生細胞数（OD 570 - 650）

試料名
123

平均

S.D.

細胞生存率
（％）

生細胞数
（OD 570 - 650）
平均

S.D.

細胞生存率（％）

123

未貼付試料

0 . 849   0 . 791

0 . 832

0 . 824 ± 0 . 030

1000 . 801

0 . 899

0 . 745

0 . 815 ± 0.078

100

コントロール試料 O0 . 765

0 . 716

0 . 764

0 . 748 ± 0 . 028

90 . 80 . 840

0 . 789

0 . 760

0 . 796 ± 0.041

97.7

コントロール試料 A/C 0 . 041

0 . 026

0 . 1290 . 065 ± 0 . 056

8 . 690 . 0540 . 057

0 . 297

0 . 136 ± 0.139

17.1

コントロール試料 B/D 0 . 720

0 . 745

0 . 783

0 . 749 ± 0 . 032

1000 . 810

0 . 768

0 . 725

0 . 768 ± 0.043

96.5

養後，培養表皮のふちが紫色となって吸光度が高が 6. 4 mm であるため，基準布が 6 mm の場合はくなり，細胞生存率が成立条件を上回った可能性

全体を覆わず，7 mm の場合は培養カップの縁でが考えられたことから，基準布のサイズが小さ布が捲れ上がり，培養表皮の端に基準布が接触しかったことが原因と考えられた．

なかったと考えられた．基準布のサイズを調節す実験 2 では，直径 6 mm または 7 mm のコント
ロール試料 O およびコントロール試料 A を，培養るのは困難であるため，試料の貼付方法を変更することを考えた．

表皮表面に貼付して 24 時間培養した結果（表 4），

実験 3 では，あらかじめ直径 6 mm の基準布をコントロール試料 O の細胞生存率は 101％
（24 時

培養表皮に貼付後，人工汗液または SLS を基準間），コントロール試料 A の細胞生存率は 24.0％

布に基準布質量の 3 倍量滴下し，24 時間または（直径 6 mm）および 27.6％（直径 7 mm）であった．

48 時間培養した．その結果（表 5），コントロー

コ ン ト ロ ー ル 試 料Oは 試 験 成 立 条 件（≧

ル 試 料 O の 細 胞 生 存 率 は 90 . 8％（24 時 間）お よ80.0％）を満たしたが，コントロール試料 A はいび 97. 7％（48 時 間）で あ っ た． コ ン ト ロ ー ル 試

ずれも条件を満たさなかった．MTT 含有培地で料 A およびコントロール試料 C の細胞生存率は培養後，実験 1 と同様に，培養表皮は基準布の直8 . 69％および 17. 1％，コントロール試料 B およ

径に関わらずふちが円形状に紫色であった．これびコントロール試料 D の細胞生存率は 100％およは，LabCyte EPI-MODEL 24 の培養表皮の直径

び 96 . 5％であった．いずれのコントロール試料

12

秦野36.indb 12

14/02/06 11:20

技術ノートとも試験成立条件を満たした．
あらかじめ基準布に試料をしみ込ませた後に培

文献1)の皮膚一次刺激性試験方法−培養ヒト皮膚モデル

養表皮に貼付する方法では，基準布が培養表皮の全体を覆わず，コントロール試料 A およびコント
ロール試料 C は試験成立条件を満たさなかった．

法」，日本規格協会 , 20112)

Adaptation to the Requirements of OECD Test

滴下することで，試料を培養表皮の全体に処理す

Guideline 439 . AATEX. 2011 ; 16 : 111- 122
3)

更することで，培養表皮に試料がより適切に接触するようになり，コントロール試料 A およびコントロール試料 C も条件を満たしたと考えられた．
以上の結果から，適切な実験条件を設定すること
でヒト3次元培養表皮モデルLabCyte EPI-MODEL
24はJIS L 1918に適合すると判断された．

Katoh M, Hata K: Refinement of LabCyte EPIMODEL 2 4 Skin Irritation Test Method for

しかし，基準布を培養表皮に貼付してから試料をることができた．この様に，試料貼付の方法を変

日本工業標準調査会審議 : JIS L 1918「 繊維製品OECD: Guideline for the Testing of Chemicals,
Guideline 439: In Vitro Skin Irritation: Reconstructed
Human Epidermis Test Method. 20104)

日本工業標準調査会審議 : JIS L 0803
「染色堅ろう5)

日本工業標準調査会審議 : JIS L 0848
「汗に対する度試験用添付白布」，日本規格協会 , 2011
染色堅ろう度試験方法」，日本規格協会 , 200413

秦野36.indb 13

14/02/06 11:20