本研究は、日本農芸化学会 2021 年度大会（仙台）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のためオンライン形式で実施）に応募された研究のうち、本誌編集委員会

日本農芸化学会が優れた研究として選定した６題の発表のうちの一つです。

地域資源由来のナノファイバーとデジタルモールド技術によるマイクロ流体デバイスの設計と細胞接着制御
一関工業高等専門学校未来創造工学科化学・バイオ系
上野裕太郎，岩渕沙姫，八重樫健成，太田空良，加藤千寛，鈴木麻紘，千葉 泉，山火瑞生，千田洸弥（顧問：戸谷一英，二階堂 望）
各 種 ナ ノ フ ァ イ バ ー（NF） や 細 胞 外 マ ト リ ク ス（ECM） をプ ラ ス チ ッ ク シ ャ ー レ に コ ー ト し た と こ ろ， β - キ チ ン NF の●

み で は 細 胞 接 着 性 が 認 め ら れ な か っ た が，ECM に よ り 接 着性が回復した．機能性食品を評価する臓器チップの製造を念頭 に，3D CAD と 3D プ リ ン タ に よ り マ イ ク ロ 流 路 の 樹 脂 型（モ ー ル ド） を 成 形 し ， ポ リ ジ メ チ ル シ ロ キ サ ン（ PDMS）

化学と生物樹脂を流し込んでマイクロ流路の上部を試作した（デジタルモ ー ル ド 技 術）． マ イ ク ロ 流 路 上 部 を 上 記 シ ャ ー レ に 圧 着 してマイクロ流路を成形し，細胞を灌流培養したところ，上記の ECM/NF 塗 布 シ ャ ー レ で 得 ら れ た 細 胞 接 着 試 験 結 果 に 合
致 し た 細 胞 接 着 性 が， マ イ ク ロ 流 路 内 の ECM/NF 重 層 部 分でも確認できた．

本研究の目的，方法および結果フラッシュメモリサイズのポリマー製チップ上でヒト由来細胞を用いて人体内の臓器機能を正確に再現すること(2, 3)を目指している（図 1）．また，新型コロナウイルス阻害剤の評価にも利用され (4)，ウイルス感染評価系としても注目されている (5, 6)．
動物実験の代替法を模索する世界的な潮流から，機能性食品の評価もいずれ臓器チップで行われる可能性が指摘されている．食品は経口摂取により小腸で吸収されるので，市販の小腸マイクロ流体チップがこの分野に適応できる (7)．一方で市販のチップは，肺や腸，肝臓などの複雑な臓器モデルを作製できるが (8)，粘性のあるゲルや凝集塊でマイクロ流路が目詰まりする可能性がある．し
たがって，自在にチップの流路を成形加工する必要があ

流れがなく拡散培養系である二次元細胞培養は，必ずる．戸谷指導教員らは三陸地域資源のイカの中骨から β-しもミクロ流体系である生体内の環境を模倣しているとキチン NF を製造する方法を確立し (9, 10)，スキンケア化は言いがたく，より生体内に近い環境での細胞評価試験

粧品として商品化している (11, 12)．われわれは，抗ウイ系が望まれてきた．マウスをはじめとした動物実験は医ルス活性や免疫賦活活性を有する機能性食品の評価を臓薬品開発だけでなく化粧品，食品開発などの過程で利用器チップ上で行うことを念頭に，地域資源とデジタルされているが，近年，EU における「動物実験代替法」モールド技術を活用して「機能性食品評価の臓器チップや化粧品分野での規制を受けて諸外国で動物実験が禁止プラットフォーム」を構築することを考えた．

されつつある (1)．また，薬剤評価においては実験動物と【目的】

ヒトとで薬効が異なる場合があり，薬剤がヒトに効能が機能性食品の評価を臓器チップ上で行うことを念頭あるか否か正確には予測できない．その結果，多くの新に，本研究では，β-キチン NF や ECM をコートしたプ

薬候補が臨床試験で薬効なしと判定され，研究開発費のラスチックシャーレ（ディッシュ）とデジタルモールド莫大な損失となってきた．これらの問題点を解決するた技術により，3D プリンタを用いて試作したマイクロ流めに，二次元培養や動物実験と，ヒト生体内の中間的な路を組み合わせて，新たな細胞接着制御系の開発を目指モデルとして，Organs-on-a-Chip（臓器チップ）が考案

す．

された (1)．臓器チップは，マイクロ流路を有する USB

44

化学と生物 Vol. 60, No. 1, 2022

日本農芸化学会●

化学と生物図 1 ■ Organs-on-a-Chip の製造概念図（左）と実際のマイクロ流路の構築（右）左：ナノファイバーと ECM を使用した細胞接着制御デバイスの製造工程のフロー（概念図）右：PDMS 樹脂をシャーレに圧着して構築し：細胞が足場とするフィブロネクチンやコラーゲン，ラミニン，プロテたマイクロ流路と潅流培養システム * 細胞外マトリクス（ECM）
オグライカンなどの生体高分子【材料および方法】
1.

原材料

理食塩水（PBS）でリンス後にトリプシン処理して剥がした細胞を「接着細胞」とした．細胞数は，細胞をトリβ-キチン NF は地域資源のイカ中骨から調製した．そパンブルーおよび蛍光（AO-PI）染色し，蛍光明視野全の他の NF はスギノマシン社製「BiNFi-s」を使用した．

自動セルカウンター LUNA-FL（Logos Biosystems 社）

2.

NF のディッシュへのコート
各種 NF（β-キチン，α-キチン，キトサン，セルロース，CMC（カルボキシメチルセルロース））をマイクロにより計測した．
4.

デジタルモールド技術によるマイクロ流路の試作と灌流培養

スプレーガンにより細胞培養用ポリスチレンディッシュ

マイクロ流路の鋳型として高価で手間のかかる金型の（AGC テクノグラス，IWAKI 製 35 mm dish）へ均一に代わりに，デジタルモールド技術で成形した樹脂型を用スプレーコートした．必要に応じて市販の ECM（アテいた．すなわち，3D CAD（Fusion 360）でマイクロ流ロコラーゲン（ニッピ製），ヒトフィブロネクチン（富路の体積を何通りかに変えたモールド（樹脂型）を設計

士フィルム和光））を推奨法にしたがって重層した．

し，光硬化性のポリジェット 3D プリンタ（Stratasys 社

3.

細胞接着試験製）で樹脂型を試作した．この樹脂型に PDMS 樹脂を塗布シャーレは使用直前に UV 照射処理 15 min を行い

流 し 込 み，PDMS が 硬 化 し た ら 剥 が し て 細 胞 培 養 用殺菌した．D-MEM（Dulbleccoʼs Modeﬁed Eagle Medi-

35 mm ポリスチレンディッシュに圧着しマイクロ流路をum）2 mL お よ び HeLa 細 胞 懸 濁 液 200 µL を 播 種 し，形成させた．バブルトラップも試作した．図 1 のようCO2 インキュベータ内で 37 C，3 日間から 4 日間培養しに，培養液（リザーバ）→専用マイクロチューブポンプた．細胞の様子は位相差顕微鏡（総合倍率 20 倍）で観（アイカムス・ラボ社製）→バブルトラップ（試作）→三察した．培養後に培地をピペットで回収し，遠心分離で方活栓→マイクロ流路（試作）→廃液チップの順につな沈殿した細胞を「浮遊細胞」，シャーレをリン酸緩衝生

い で 流 体 回 路 を 構 築 し た．CO2 イ ン キ ュ ベ ー タ 内 で化学と生物 Vol. 60, No. 1, 202245

日本農芸化学会
β-キチンナノファイバー（NF）だけが細胞非接着性であり，コラーゲンなどを重層した場合，細胞接着性が回復する．

化学と生物

●

図 2 ■ 各種 NF と ECM によるシャーレの細胞接着性回復試験

図 3 ■ マイクロ流体デバイス上での細胞接着試験
画像：位相差顕微鏡観察写真画像．原画像を 300％に拡大して一部をトリミングしたもの．右下の画像：原画像を縮小したもの．原画像は総合倍率 20倍（対物 4×，接眼 10×，モニター 0.5×）にて撮
影．

HeLa 細胞などを灌流培養し，接着増殖した細胞を位相【結果および考察】

差顕微鏡で観察した．

1.

NF のスプレーコートと細胞接着性

β-キチン NF は剪断応力により粘性が低下し液状化す
46

化学と生物 Vol. 60, No. 1, 2022

るチキソトロピー性を有しており，プラスチック器材へる市販の臓器チップでは対応できないことも予想されのスプレーコートが可能であった．各種 NF をスプレーる．本研究では，デジタルモールド技術により誰でもコートしたシャーレを使用して，HeLa 細胞において，3D プリンタを活用して流路の拡張やオーダーメイドのキチン NF のみが細胞接着性が極めて低いことを明らか

臓器チップを迅速に造形できることを示した．にした（図 2A）．これにより β-キチン NF でマイクロ流以上により本研究は，新型コロナウイルス（COV-体デバイスをコートすることで，マイクロ流路におけるID-19）に対する免疫や抗ウイルス活性を高める機能性細胞の目つまりを防止できると予測した (13,14)．

食品を評価する系の構築に寄与する．機能性食品は疾病

2.

ECM による細胞接着性回復試験

予防や健康寿命の延伸により医療費の抑制や国民のECM としてコラーゲンを β-キチン NF 塗布シャーレに(14)重層したところ，細胞の接着性が回復した（図 2B） ．

化学と生物

●

日本農芸化学会

3.

マイクロ流路の試作と灌流培養

QOL を高めることが期待されている（SDGs 目標 3：すべての人に健康と福祉を）．さらに，水産有機廃棄物からキチンを回収し，ナノテクノロジーにより新たな機能デジタルモールド技術によりマイクロ流路を成形し，を付加して，臓器チップへ応用することで環境負荷を低図 1（右側）のように流体回路を構築した．これを CO2減しつつ水産業へ寄与する（SDGs 目標 14：海の豊かさ

インキュベータ内で HeLa 細胞を潅流培養し，位相差顕を守ろう）．本研究は Society 5.0 を意識した異分野融合微鏡観察した（図 3）．無塗布シャーレ（A）と同様に無型（デジタル技術＋臓器チップ）の取り組みであり，再塗布マイクロ流路（B）では細胞が敷石状に接着し増殖利用可能な生物資源を有効活用して，国民の健康と地球した．一方で，β-キチン NF 塗布マイクロ流路（C）で環境にやさしいバイオファーストな未来を目指すものでは 細 胞 は 接 着 せ ず 流 れ 去 っ た．ECM の コ ラ ー ゲ ンある．

（D），フィブロネクチン（E）により細胞接着性が回復【展望】し，試作したマイクロ流路内で ECM/NF 塗布シャーレに合致した細胞接着性が確認できた

(14)

．

日本は欧米に比べて臓器チップの分野で出遅れており，国産の臓器チップは皆無である．本研究はデジタル【結語】

モールド技術により国産の臓器チッププラットフォーム

1.

2.

プラスチックディッシュにおける細胞接着試験で，の開発を目指す．本研究のゴールは，デジタルモールド

β-キチン NF のみ細胞接着性がなかったが，ECM に技術で成形したマイクロ流体デバイスに細胞を接着さより接着性が回復した．

せ，機能性食品の免疫活性を評価して，with コロナ時

デジタルモールド技術によりマイクロ流路を成形し代の免疫アップとイノベーションに貢献することであ細 胞 を 灌 流 培 養 し た と こ ろ，ECM/NF 塗 布 デ ィ ッる．粘性や凝集のある機能性食品や素材を流路の目詰まシュに合致した細胞接着性が確認できた．

りなく導入できる臓器チップをデザインし，流れのある灌流細胞培養系で，粘膜上皮細胞や免疫細胞に与える機本研究の意義と展望【意義】
1959 年に Russell と Burch 氏によって提唱された動物能を評価する．将来的には，臓器チップ上にウイルス標的細胞を配置し，抗ウイルス活性を有する機能性食品の評価系の構築を目指す．また，臓器チップに人工血管を組み込んで血管を介した評価モデルの開発にも本技術を実験の基準理念である「3R の原則」
（Replacement（代応用したいと考えている．

替），Reduction（削 減），Reﬁnement（改 善））の厳格

謝辞：本研究は「一般財団法人東熱科学技術奨学財団」の研究助成により行われた．マイクロチューブポンプおよび灌流培養システムをサポートしてくださった株式会社アイカムス・ラボの小此木孝仁様，β-キチンナノファイバーを提供してくださったヤヱガキ醗酵技研株式会社の山下和彦様に深く感謝申し上げます．

化が進んでいる．EU での動物実験代替法の成立を受け，2009 年から化粧品開発における実験動物の使用は禁止されている（SDGs 目標 15：陸の豊かさも守ろう，目標 12：つくる責任つかう責任）．これは化粧品分野以外にも波及することが想定され，われわれはこの潮流に沿い，臓器チップを用いた機能性食品の評価を目指している．本研究では，β-キチン NF や ECM の簡単なスプレー塗布によりマイクロ流路での細胞の目詰まりを防ぎつつ，同時に細胞接着の制御が行える可能性を示した．
また，粘性や凝集性のある食品の評価には流路が細すぎ

化学と生物 Vol. 60, No. 1, 2022

文献1) 宮崎博之，吉山友二：日薬理誌，151, 48 (2018).
2) 研究開発の俯瞰報告書：3.2 創薬基盤技術，医薬品 3.2.2 生体再現技術 I（臓器チップ），ライフサイエンス・臨床医学分野，2017.
3) K. Ronaldson-Bouchard & G. Vunjak-Novakovic:, 22, 311 (2018).
4) J. Theobald, A. Ghanem, P. Wallisch, A. A. Banaeiyan, M.

47

5)

6)
7)

8)

10) S. Suenaga, N. Nikaido, K. Totani, K. Kawasaki, Y. Ito, K.
Yamashita & M. Osada:, 91, 987
(2016).
11) 戸谷一英，長田光正：キチン・キトサンの最新科学技術̶機能性ファイバーと先端医療材料̶第 5 章イカ中骨由
来 β-キチンナノファイバーの製造と物性，技報堂出版，
2016.
12) S. Suenaga, K. Totani, Y. Nomura, K. Yamashita, I. Shimada, H. Fukunaga, N. Takahashi & M. Osada:, 102, 358 (2017).
13) 特願 2020-034215:「細胞非接着性材料および細胞接着制御性材料」，戸谷一英ら他 5 名
14) 千田洸弥，山火瑞生，千葉泉，二階堂望，小此木孝仁，
山下和彦，戸谷一英：応用糖質科学，11, 34 B-06 (2021).
Copyright © 2022 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.60.44

化学と生物

●

日本農芸化学会

9)

A. Andrade-Navarro, K. Taškova, M. Haltmeier, A.
Kurtz, H. Becker, S. Reuter:, 4, 78 (2018). doi: org/10.1021/acsbiomaterials.7b00
417
H. Tang, Y. Abouleila, L. Si, A. M. Ortega-Prieto, C. L.
Mummery, D. E. Ingber & A. Mashaghi:, 28, 934 (2020).
L. Si:, (2020). doi: org/10.1101/2020.04.13.039
917
M. J. Workman, J. P. Gleeson, E. J. Troisi, H. Q. Estrada,
S. J. Kerns, C. D. Hinojosa, G. A. Hamilton, S. R. Targan,
C. N. Svendsen & R. J. Barrett:, 5, 669 (2018). doi: org/10.1016/j.jcmgh.2017.12.008
M. Kasendra, A. Tovaglieri, A. Sontheimer-Phelps, S.
Jalili-Firoozinezhad, A. Bein, A. Chalkiadaki, W. Scholl, C.
Zhang, H. Rickner, C. A. Richmond:, 8,2871 (2018). doi: org/10.1038/s41598-018-21201-7
特許第 6497740 号：「β-キチンナノファイバーおよびその製造方法」，戸谷一英ら他 11 名48

化学と生物 Vol. 60, No. 1, 2022