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研究報告
研究報告

秦野研究所年報
38, 9-19（2015）

ラット胎生期ヒ素曝露による胎児脳発達への影響
瀬沼美華 1，森

千里 2，小川哲郎 3，桑形麻樹子 4Prenatal sodium arsenite affects early development of serotonergic neurons
in the fetal rat brain
Mika SENUMA1, Chisato MORI2, Tetsuo OGAWA3, Makiko KUWAGATA4This study assessed effects of sodium (meta) arsenite shortly after exposure on developing fetal rat brains.

Pregnant rats were administered 50 mg/L arsenite in drinking water or 20 mg/kg arsenite orally using agastric tube, on gestational days (GD) 9–15, and fetal brains were examined on GD16. Dams administered
20 mg/kg arsenite showed reductions in body weight gain and food consumption during treatment, but
not with 50 mg/L arsenite. Arsenite did not induce excessive cell death or affect neural cell division in

any region of the fetal neuroepithelium. Tyrosine hydroxylase immunohistochemistry revealed that nodifference in the distribution of catecholaminergic neurons between fetuses of arsenite treated and control
rats. However, reductions in serotonin positive cells in the fetal median and dorsal raphe nuclei wereobserved following maternal treatment with 20 mg/kg arsenite. These results suggest that arsenite-induced
neurodevelopmental toxicity involves defects in the early development of the serotonin nervous system.

緒言た結果，行動異常，脳内のモノアミン濃度の変化

疫学調査や臨床報告から，一部の環境化学物質の等の神経毒性を示し 4），ラットの妊娠期から育成

胎生期曝露によって子どもに脳発達障害が発症する期にヒ素を投与した実験では，出生児に学習行動ことが明らかにされている．ヒ素は国際がん研究機試験における訓練数やエラー数の増加といった発IARC）によってヒトに対する発がん性が認められが認められている 5）．このように胎生期のヒ素曝

関（International Agency for Research on Cancer；

達神経毒性（developmental neurotoxicity；DNT）

る物質に分類され 1），無機および有機態で自然界

露は脳の発達に影響を及ぼす可能性が考えられるに存在することから，食品や飲料水への混入が問が，ヒ素の胎児脳への影響に関する報告はない．

題となっている環境汚染物質である．ヒ素を含む

本実験ではヒ素曝露直後の胎児脳をエンドポイ

地下水の飲用による健康被害は，アルゼンチン，バントとして評価することにより，胎児脳に対する

ングラデシュ，チリ，中国，インドなどで認められ ，

直接的な影響を調べるとともに，ヒ素誘発性の2）

これらの地域における疫学調査から，高濃度汚染
地域における児童の注意力および記憶力の低下，
IQ 低下が報告されている．これらの報告から，ヒDNT 発現の可能性についても考察した．
材料および方法

素の妊娠期あるいは小児期の曝露によって子供にすべての実験操作は「財団法人食品薬品安全セ

脳発達障害を発現する可能性が懸念され始めた ．

ンター秦野研究所動物実験に関する指針」に基づ

3）動物実験では，ラット成熟動物にヒ素を投与しいて実施した．
1．動物および飼育方法1

毒性学研究室3

埼玉医科大学医学部生理学24

千葉大学大学院医学研究院環境生命医学
病理学研究室動物は日本チャールス・リバー株式会社から購入した Sprague Dawley [Crl:CD（SD）] 系の雌雄
ラットを使用した．妊娠動物を得るために雌雄動物を 1 対 1 で終夜同居させ，翌朝，膣垢内に精子
9

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秦野研究所年報 Vol. 38. 2015

あるいは膣栓が認められた動物を交尾成立とし

電撃回避試験において長期記憶の低下が，水迷

温度 21～25℃，湿度 40～75％，換気設定約 15

なお，ラットに 30 mg/kg のヒ素を妊娠 8 日か

19:00）に制御された飼育室内で，ラット用プラス

た実験では，胎児に外脳，無眼等が報告されてて，この交尾確認日を妊娠 0 日（胎齢 0 日）とした．
回 / 時間，明暗サイクル 12 時間（点灯時間 7:00～

チック製繁殖ケージ（350w × 400d × 180h mm）

路試験において訓練数の増加がみられている 5）．
ら 10 日のいずれかの時期に単回腹腔内投与しいる 9）．これらの既報を参考に予備実験を行ったに妊娠ラットを 1 匹ずつ収容し，床敷として紙

結果，50 mg/kg以上の投与量は母動物への最大耐シー）を適宜供給した．固型飼料（CE- 2，日本ク

したがって，20 mg/kg（ 強制経口投与）ある

パルプ製チップ（ペパークリーン，日本エスエル

レア）
および給水瓶に充填した水道水（秦野市水道局給水）を自由摂取させて飼育した．

いは 50 mg/L（飲水投与）を本実験の投与量として設定した．

2．投与物質3. 検査方法

2.1 投与物質および投与方法

3.1 体重，摂餌量および飲水量の測定

リウム（NaAsO 2 , CAS No. 7784-46-5, 純度≧

よび妊娠 16 日（帝王切開日）に測定した．また，投与には 3 価のヒ素である（メタ）亜ヒ酸ナト

体重および摂餌量は妊娠 9 日（投与開始日）お90％ , Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）
を用いた．

妊娠 0 日から 16 日まで毎日，飲水量を算出した．

および神経発生過程を考慮し設定した．すなわ

妊娠 16 日（11: 00 ± 1 h）に母動物をセボフル

投与期間および解剖日については，既報

6- 8）

3.2 帝王切開および母動物の検査

ち，ラットの胎齢 16 日の脳は主要な領域の原ラン（マイラン製薬，大阪）にて吸入麻酔し，深幹細胞の増殖，細胞の移動および蓄積が評価可数および死亡児数を記録した．胎児は 4％パラ評価を行った実績があることから，妊娠 9 日かparaformaldehyde；4％ PFA）で 2 日間低温下

基が形態学的に識別でき，神経上皮層では神経能な時期であり，他の化学物質を用いて DNT

麻酔下で放血により致死させた．剖検後，着床

ホルムアルデヒド 0. 1 mol/L リン酸緩衝液（4％

ら 15 日の 7 日間，20 mg/kg のヒ素を強制経口（約 4℃）にて浸漬固定した．胎児体重は固定後

飲水投与（As 50 mg/L 投与群）し，妊娠 16 日に

3.3 ヒ素含量測定

投与（As 20 mg/kg 投与群）
あるいは 50 mg/L を帝王切開にて胎児を得た．対照群には媒体である注射用水を同様に強制経口投与した．なお，
投与液量（5 mL/kg）は，投与開始日である妊娠
9 日の体重を基に個体別に算出した．

強制経口投与用検体はヒ素を注射用水に溶解させ，飲水投与用検体はヒ素を水道水に溶解させ給水瓶へ充填した．なお，いずれの投与検体
も用時調製した．

対照群は 11 匹，As 20 mg/kg 投与群は 12 匹，

As 50 mg/L 投与群は 6 匹の母動物を用いた．
2.2 投与量の設定

本実験の投与量は，既報

4, 5, 9）および予備実験

10）の結果に基づいて設定した．成熟ラットに 20 mg/kgのヒ素を 15 日間強制経口投与した実験では，に測定した．

帝王切開時に母動物の肝臓（対照群および As

20 mg/kg 投与群；各 3 匹）
，胎盤，胎児全体，

胎児脳（対照群および As 20 mg/kg 投与群；各 3腹）を採取し，誘導結合プラズマ質量分析装置（ICP-MS）により組織中のヒ素含量を測定した（定量下限；肝臓，胎盤，胎児では 0.01 ppm，
胎児脳では 0. 02 ppm）．測定の際，胎盤，胎児および胎児脳においては，一腹をまとめて一試料とした．なお，含量測定は日本食品分析センターに依頼した．
3. 4 免疫組織化学染色
固定した胎児から脳を摘出した後，10％ゼラ

チン水溶液を用いて胎児脳を包埋し，4％ PFA

液にて 2 日間低温下で浸漬固定した．その後，自発運動の低下および中脳のドーパミン（DA）0.01 mol/L リン酸緩衝生理食塩液（0.01 mol/L娠 6 日から生後 42 日に飲水投与した実験では，製したゼラチンブロックは，ビブラトームを用

含 量 の 増 加 が み ら れ ，50 mg/L の ヒ 素 を 妊
4）10量を凌駕する用量であることが推察された 10）．

PBS 液）に移し，薄切時まで低温保管した．作PDF Compressor Pro

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いて 40 µm の厚さで前頭断の連続切片を作製

3.5 胎児脳の計測

原則として 3 本のバイアル瓶に得られたすべて

径
（A）
，横径
（B）お よ び 大 脳 皮 質 の 厚 さ
（C）
，

し，
0.01 mol/L PBS 液に浸漬して冷蔵保存した．
の切片を回収した．なお，セロトニン（5-HT）
染色の画像解析に使用した標本は，すべての胎

胎齢 16 日の胎児脳標本を用いて，大脳の縦前脳と中脳との境界部の縦径（D），中脳の横径（E）を計測した（結果 3. 1 参照）．

児脳切片を 1 本のバイアル瓶に回収した．薄切4．画像解析

いは各種免疫組織染色を実施した． すなわち，て，5-HT 染色標本の画像解析を行った．中脳領POD, Roche），
リン酸化ヒストン H3 染色（rabbit

8 領域に分け
（結果 3. 5 参照），各領域の陽性細胞

Aldrich），
Tyrosine Hydroxylase（TH）染色（sheep線核領域に分け，面積を算出した．

切片は，Crecyl violet 染色（ニッスル染色）ある

TUNEL 染色（in situ cell death detection kit,

anti-phosphorylated-histone H 3 , Sigmaanti-tyrosine hydroxylase, Pel-Freez），5-HT 染色（goat anti-serotonin, ImmunoStar）標本を作

製し，細胞死の発現，神経幹細胞の分裂能，モノアミン系神経核（カテコールアミン系神経核，5-HT 神経核）の発生について観察した．

免疫組織染色は浮遊法によりdiaminobenzidine（DAB，和光純薬工業）発色による ABC 法を用いて実施した．いずれの免疫染色の場合においても，内因性ペルオキシダーゼ活性を賦活化するために 3％過酸化水素・0.01 mol/L PBS 液中にて室温下で 15 分間インキュベーションを行っ

画像解析ソフト（Image J 1. 45 , NIH）を用い

域での 5-HT の分布領域を吻側から尾側にかけての面積を算出した．さらに，背側縫線核，正中縫
5. 統計解析方法
統計処理には統計ソフト（統計解析ソフトウェ

ア SAS®）
を用いた．帝王切開所見（胎児死亡数，胎児死亡率，胎児体重，胎盤重量）
は一腹単位に集計

し，その他の所見は得られた値を評価対象として各群の平均値を求めた．対照群とヒ素投与群を比較し Student の t 検定を実施した（有意水準 5％）．
結果
1．母動物所見および曝露量
ヒ素曝露後の母動物および帝王切開所見を表 1

た．0.01 mol/L PBS 液にて洗浄後，0.5％正常に，投与期間中の飲水量を図 1 に示した．

下で 60 分間非特異性反応を抑制させ，一次抗体

ヒ素の総曝露量（平均値）
は，As 20 mg/kg 投与群

0.01 mol/L PBS 液にて洗浄後，ビオチン化二であった．As 50 mg/L 投与群は As 20 mg/kg 投

血清・0.3％ TritonX-100 含 PBS 液中にて室温を 1 日から 2 日間低温下（約 4℃）
で反応させた．

次抗体を室温下で 90 分間反応させた．洗浄後，7 日間の投与の結果，母動物の体重で換算したで 44. 3 mg/ 匹，As 50 mg/L 投与群で 8. 8 mg/ 匹

与群よりも曝露量が低い結果となったことから，

アビジンビオチン複合体を形成させた（室温 60

本実験における低用量群と位置付けられた．

ス塩酸緩衝液で洗浄後，氷上で 0.03％過酸化水の低下がみられた．As 20 mg/kg 投与群でも，投液中で反応させ抗原の可視化を行った．

目には回復傾向を示した．

分）．0.01 mol/L PBS 液および 0.05 mol/L トリ
素 0.1％ DAB 含 50 mmol/L トリス・リン酸緩衝
染色後，胎児脳の各領域 [ 大脳皮質前頭部（脳室帯，中間帯，皮質板および辺縁帯）
，大脳皮

質中央部
（脳室帯，中間帯，皮質板および辺縁帯），大脳皮質後部（脳室帯，中間帯，皮質板および辺縁帯），線条体，隔壁，海馬，扁桃体，視床前部，視床後部，視床下部前部，視床下部

As 50 mg/L 投与群では，投与翌日から飲水量

与翌日に飲水量の低下が観察されたが，投与 2 日
As 20 mg/kg 投与群，As 50 mg/L 投与群ともに体重増加抑制がみられた．As 20 mg/kg 投与群

では体重増加量および摂餌量の有意な低下がみられたことから，As 50 mg/L 投与群よりも毒性が強く発現したと考えられた．

帝王切開の結果，胎児死亡率，胎児体重に群間後部，中脳（乳頭体，視蓋前域，中脳被蓋，黒の顕著な差はみられなかった．

質緻密部および腹側被蓋領域，前丘，後丘，中2．母動物および胎児組織中のヒ素含量測定

心灰白質），峡部，小脳，延髄 ] について観察した．

As 20 mg/kg投与群では，母動物の肝臓，胎盤，11

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表 1 ヒ素曝露（妊娠 9 日から 15 日）
後の母動物所見および妊娠 16 日の帝王切開所見
GroupControl

As 20 mg/kg

As 50 mg/L

11

12

6

Number of dams
Amount of As exposure（mg/dam）

0

44 .3 ± 4 .2

8 .8 ± 1 .3

Body weight gain（g）GD9 - 16

40 .2 ± 8 .8

18 .2 ± 14 .9 **29 .5 ± 15 .0

Food intake（g）GD9 - 16

149 . 9 ± 36 .8

112 .7 ± 30 .1 *146 .4 ± 13 .4

Water intake（g）GD9 - 16

281 .6 ± 55 .3

257 .2 ± 52 .6

176 .1 ± 26 .3 **Implantations（total）

16 .0 ±

13 .2 ± 4 .4
（158）

13 .5 ± 4 .3
（81）

Intrauterine deaths（total）

0 .9 ± 0 .5
（10）

0 .6 ± 1 .0
（7）

0 .5 ± 0 .5
（3）Intrauterine mortality（%）

5 .7 ± 3 .2

3 .9 ± 6 .6

3 .4 ± 3 .7

Mean fetal body weight（g）

0 .4354 ± 0 .0479

0 .4273 ± 0 .0352

0 .4218 ± 0 .0173

a

1 .8
（176）

a Intrauterine mortality（%）=（Number of intrauterine deaths / Number of implantations）
× 100
値は平均値±標準偏差を示す．GD は Gestational day を示す．
* 対照群と比較した有意差（P<0 .05）を示す .
** 対照群と比較した有意差（P<0 .01）を示す .

50

表2

45

Group

40

Number of dams

35
#

(g)

30
25
20

15
10

##

Control
As 20 mg/kg
As 50 mg/L

**

**
**
**

ヒ素曝露後の母動物および胎児組織中のヒ素含量
Control

As 20 mg/kg

3

3

Liver

1 .02 ± 0 .27

35.25 ± 11.75 **Placenta

3 .26 ± 0 .71

39.76 ±

9.07 **

Fetuses

0 .13 ± 0 .05

13.11 ±

2.84 **

Brain (fetuses)

0 .01 ± 0 .00

1.43 ±

0.13 **

値は平均値（µg/g tissue）±標準偏差を示す．
胎盤，胎児および胎児脳は腹単位で集計した．
** 対照群と比較した有意差（P<0 .01）を示す .

50Dosing period

図1

ヒ素曝露（妊娠 9 日から 15 日）における母動物の飲水量# 対照群と比較した有意差（P < 0 .05）を示す．
**, ## 対照群と比較した有意差（P < 0 .01）を示す．

胎児全体，胎児脳のいずれの組織でもヒ素が検出られなかった（表 3）．

され，母動物の肝臓および胎盤では，ほぼ同じ濃3.2 細胞死度で検出された．胎盤と胎児のヒ素含有濃度を比較すると胎盤よりも胎児の方が低濃度であったが，胎児および胎児脳にもヒ素が検出された．また，対照群でもごく微量のヒ素が検出された（表2）．
3．胎児脳の形態学的検討

一腹から 2～3 匹の胎児を無作為に選出して，胎児脳のニッスル染色および TUNEL 染色像を図 3A～C に，細胞死数を図 4 に示した．胎

齢 16 日の脳をニッスル染色し，図 4 に示した

各領域
（27 領域）での神経上皮層における死細胞数を光学顕微鏡の 400 倍視野下で観察した．

観察の結果，脳の各領域で細胞死数が異なっ

脳の計測
（3.1）
，細胞死
（3.2）
，分裂能
（3.3）のていたが，対照群とヒ素投与群との間では顕評価を行った．

著な差はみられなかった．なお，細胞死像は3.1 脳の計測

胎齢 16 日の脳の 5 領域
（図 2A～E）を計測した結果，対照群と As 20 mg/kg 投与群の間に顕著な差はみられず，ヒ素投与による影響は認め
12

TUNEL 陽性を示し，アポトーシスであることを確認した（図 3A～C）．

3.3 リン酸化ヒストン H 3 陽性細胞

リン酸化ヒストン H3 染色像を図 3D～F に

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図 2 胎児脳の計測部位（胎齢 16 日）
A. 大脳の縦径，B. 大脳の横径，C. 大脳皮質の厚さ，D. 前脳と中脳との境界部の縦径，E. 中脳の横径表 3 ヒ素曝露後の胎児脳の計測（胎齢 16 日）GroupControl

As 20 mg/kg

16

14

A: Longitudinal diameter of cerebrum（mm）

3 .0 ± 0 .1

3 .1 ± 0 .1

B: Lateral diameter of cerebrum（mm）

4 .0 ± 0 .1

3 .9 ± 0 .1

C: Thickness of cerebral cortex（µm）

Number of fetuses

220 ± 34

221 ± 23

D: Longitudinal diameter of boundary area
3 .4 ± 0 .2
of fore- and mid-brain（mm）

3 .5 ± 0 .2

E: Lateral diameter of midbrain（mm）

2 .3 ± 0 .1

2 .4 ± 0 .1

値は平均値±標準偏差を示す．対照群との有意差はみられなかった．

図 3 ヒ素曝露後の胎児脳の大脳皮質前頭部（胎齢 16 日，上段はニッスル染色および TUNEL 染色 , 下段はリン酸化ヒストン H3 染色）（A，D）対照群，（B，E）As 20 mg/kg 投与群，（C，F）As 50 mg/L 投与群
写真は枠領域の拡大像を示す．矢印は TUNEL 陽性細胞を示す．

示した．胎齢 16 日の脳をリン酸化ヒストン H3

野下で観察した．観察の結果，脳の各領域で陽染色し，図 5 に示した各領域（16 領域）におけ

性細胞数は異なっていたが，対照群とヒ素投与

る脳室帯の脳室に接している最も内側の層のリ群との間では顕著な差はみられなかった．

ン酸化ヒストン H3 陽性細胞，すなわち細胞分

裂中期にある細胞像を光学顕微鏡の 400 倍視

3.4 カテコールアミン系神経の分布

胎齢 16 日の脳を TH 染色し，中脳の腹側被13

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秦野研究所年報 Vol. 38. 201530

Control
As 20 mg/kg
As 50 mg/L

count /area

25
20
15
10
5
0

図4

100

count /area

80

ヒ素曝露後の胎児脳における細胞死数（胎齢 16 日）

Control
As 20 mg/kg
As 50 mg/L

60
40
20
0

図 5 ヒ素曝露後の胎児脳におけるリン酸化ヒストン H3 陽性細胞数（胎齢 16 日）

14PDF Compressor Pro

研究報告

図 6 ヒ素曝露後の胎児脳におけるカテコールアミン系神経核の分布（胎齢 16 日，Tyrosine Hydroxylase 染色）（A，D）対照群，（B，E）As 20 mg/kg 投与群，（C，F）As 50 mg/L 投与群
写真は枠領域の拡大像を示す．

図 7 ヒ素曝露後の胎児脳における 5-HT 神経核の分布（胎齢 16 日，5-HT 染色）（A，D）対照群，（B，E）As 20 mg/kg 投与群，（C，F）As 50 mg/L 投与群
写真は枠領域の拡大像を示す．

蓋野および黒質緻密部（図 6A～C），投射先である線条体（図 6D～F）における TH 陽性細胞および神経線維の分布を観察した（対照群；14 胎投与群；13 胎児 / 7 腹）を 5-HT 染色し，中脳の背側縫線核（図 7A～C），正中縫線核（図 7D～

F）領域における 5-HT 陽性細胞の分布を観察し児 / 6 腹，As 20 mg/kg 投 与 群；18 胎 児 / 6 腹，た．その結果，As 50 mg/L 投与群では対照群

神経核および投射先ともにカテコールアミン系

投与群では背側縫線核，正中縫線核は確認され神経核の分布に対照群との顕著な差はみられな

たが，5-HT 陽性細胞の分布に対照群との差異

かった．

（減少）
が認められた．そのため，背側縫線核おAs 50 mg/L 投与群；12 胎児 / 5 腹）．観察の結果，3.5 5-HT 神経核の分布

胎齢16日の脳（対照群；15胎児/8腹，As 20 mg/kgとの顕著な差はみられなかった．As 20 mg/kg

よび正中縫線核における 5-HT 陽性細胞を数えた結果，対照群と比較して As 20 mg/kg 投与群
15

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秦野研究所年報 Vol. 38. 2015

表 4 ヒ素曝露後の胎児脳における 5-HT 陽性細胞数（胎齢 16 日）GroupControl

As 20 mg/kg

87

Number of dams
Number of fetuses

15

Dorsal raphe（count/area）

218 .0 ±Median raphe（count/area）
Total（count/area）

13
120 .3169 .6 ± 49 .7

156 .0 ±70 .0

115 .0 ± 31 .7

374 .0 ±136 .5284 .6 ± 55 .7 *値は平均値±標準偏差を示す．
* 対照群と比較した有意差（P<0 .05）を示す .

図 8 5-HT 神経核の分布領域（胎齢 16 日，正常胎児）

160000700000140000600000500000*400000*80000

200000100000

40000

*

20000

0

ControlB

As 20 mg/kg

160000

**

80000

B

C

D

E

F

G

As 20 mg/kg

100000
80000
60000

60000
40000

40000

*

20000

A

B

C

D

E

F

20000

G

H

D

0

A

B

C

D

E

F

G

図 9 ヒ素曝露後の胎児脳における 5-HT 陽性細胞の分布（胎齢 16 日）* 対照群と比較した有意差（P < 0 .05）を示す．
** 対照群と比較した有意差（P < 0 .01）を示す．
A．総面積
B．8 領域における背側および正中縫線核の面積
C．8 領域における背側縫線核の面積
D．8 領域における正中縫線核の面積

16H

Control

120000μm2100000A

140000As 20 mg/kg

1200000160000Control

140000C

As 20 mg/kg

10000060000

0Control

120000300000

A

μm2

μm2

μm2

180000800000HPDF Compressor Pro

研究報告の陽性細胞数は減少していた（表 4）．

As 20 mg/kg 投与群において，橋の 5-HT 神経

報告は胎生期のヒ素曝露が胎児脳における細胞死を誘発し，胎児脳における神経幹細胞の分裂能に核領域での分布を詳細に確認するために，5-HT

影響を及ぼす可能性があることを示唆している．

陽性細胞の面積を画像解析にて算出した（対照

このように胎児脳における細胞死の誘発はヒ素曝

群；16 胎 児 /5 腹，As 20 mg/kg 投 与 群；14 胎児 /6 腹）．画像解析の結果，As 20 mg/kg 投与群

では 5-HT 陽性細胞の総面積が有意に減少していた（図 9A）．さらに，吻側から尾側へ 8 領域

（図 8A～H）に分けて解析した結果，5-HT 神経細胞の分布様式に差はない（吻側あるいは尾側へ分布のピークが移動している訳ではない）が，露による初期反応であると考えられたが，本実験の胎生期曝露では細胞死数は増加せず，胎児脳での神経上皮細胞の増殖にも影響は認められなかった．この原因としては，in vitro，in vivo 条件による用量，曝露期間，胎児発生時期，胎児脳における抗酸化能の違いによるものと考えられた．
神経発生の初期に発生するモノアミン神経系の面積が全領域で対照群より減少し，C および F

発生異常は後期の神経発生へ影響を及ぼす可能性

領域では有意差がみられた（図 9B）．また，背があることから，胎生期の脳で化学物質の影響を

側縫線核（図 9C）および正中縫線核（図 9D）に評価するためには大脳の神経上皮と同様にモノア

分けて 5-HT 陽性細胞の面積を解析した結果，

ミン神経系の発生も重要なエンドポイントの一よりも減少し，背側縫線核（C および F 領域）でから 4 か月齢まで飲水投与した実験 19）では，13両神経核ともに As 20 mg/kg 投与群では対照群は有意差がみられた．

つと考えられる 7, 16- 18）． SD 系ラットに胎生 15 日

週および 17 週（投与終了後 1 か月）に自発運動の亢進が観察され，これは線条体（DA 投射先）での考察

本実験では，ヒ素をラットの妊娠 9 日から 15（20 mg/kg）または飲水日の 7 日間 , 強制経口投与

DA 代謝回転の低下に起因した行動変化であると考察している．DA 神経の発生が盛んな胎生期にヒ素を投与した本実験では，DA 神経核および投投与（50 mg/L）し，胎齢 16 日の脳への影響につ

射先ともに TH 陽性細胞の分布に顕著な差はみら

As 20 mg/kg 投与群では体重および摂餌量の減

経の初期発生には影響を及ぼさないと考えられ

いて検討した．

少といった母動物毒性がみられたが，胎児死亡率，
胎児体重，胎児脳の大きさには影響はみられず，れなかったことから，胎生期のヒ素曝露は DA 神
た．ヒ素投与による自発運動亢進の臨界期は胎生
15 日以降であり，胎生期のヒ素曝露による DA 神

5-HT 神経系の発生に影響を及ぼす結果が得られ経系の機能障害が生後に発現する可能性も考えら制がみられたが，胎児脳では細胞死の過剰発現，期から生後にわたる長期のヒ素曝露が必要なのか

神経幹細胞の分裂能，カテコールアミン系神経おもしれない．

た．As 50 mg/L 投与群では母動物に体重増加抑よび 5-HT 神経核の分布に対照群との差はみられなかったことから，As 20 mg/kg 投与群よりも低用量の曝露では胎児脳の発達に影響を及ぼさないと考えられた．

In vitro 試験ではヒ素曝露により神経細胞に細胞死が誘発されることが報告されている

11- 14）．

れた．ただし，行動異常を誘発するためには胎生

本実験における胎生期のヒ素曝露により，胎児脳の 5-HT 神経細胞が減少した．背側縫線核の神経細胞は本実験のヒ素曝露時期に相当する

胎齢 11 日から 15 日に最後の細胞分裂をする 20）．
5-HT は神経伝達物質としての役割だけではな
く，胎生期においてはニューロン新生，樹状突起

また，ラット新生児の大脳の初代細胞培養ではヒの伸長，シナプス形成，大脳皮質の形成に関与し，

素曝露により細胞死の原因となる酸化ストレスが胎生期の脳発達において重要な役割を果たしてい誘発され，成熟ラットへの 20 mg/kg（28 日間）12）

または 1 mg/kg（6 か月間）の経口投与により発現る 21- 24）．すなわち，われわれの結果はヒ素曝露による 5-HT 神経系機能障害が中枢神経系の発生した酸化ストレスが大脳および海馬の神経細胞数にも影響する可能性を示唆している．
アルコール，を減少させたバルプロ酸，チメロサール，有機水銀化合物を含12, 15）と報告されている．これらの17

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秦野研究所年報 Vol. 38. 2015

む他の化学物質により誘発される DNT は，初期の 5-HT 神経系の発生に影響を及ぼすことが報告されている 7, 16- 18）．したがって，ヒ素により誘発された 5-HT 神経系の初期発生における異常は，
DNT 発現に関連する重要な機序の一つであると考えられた．

4)

した．母動物の低栄養は神経発達障害をもたらす
胎生期ストレスを誘発する可能性がある 25, 26）．母5)化が観察されることも報告されている 27- 29）．したがって，胎児脳における 5-HT 陽性細胞数の減6)7)5-HT 神経系の変化は母動物のストレスによるものではないことを確認している 10）．

ヒ素は胎盤を通じて未熟な血液脳関門から新生児脳に移行するが

31），本実験結果では胎児脳のヒ素含量は胎児に移行したうちの約 10％であったことから，ヒ素は水銀 32）のように選択的に胎児脳に蓄積しないと考えられた．

Ogawa T, Kuwagata M, Muneoka KT:

Neuropathological examination of fetal rat

Anom (Kyoto). 2005; 45 : 14- 20

Kuwagata M, Ogawa T, Shioda S, et al.:Observation of fetal brain in a rat valproate-induced autism model; a developmental
neurotoxicity study. Int J Dev Neurosci. 2009 ;．しかし，われわれ

5-HT 陽性細胞の分布を確認し，本実験におけるToxicol. 2009; 83 : 549- 556

neurodevelopmental disorder model. Congenit

30）

は母動物にストレスを負荷した胎児脳におけるXi S, Sun W, Wang F, et al.: Transplacental andearly life exposure to inorganic arsenic affected

brain in the 5 -bromo- 2’-deoxyuridine-induced

少は，ヒ素投与によるストレスに起因した変化であることも否定できない

Brain Res Bull. 2001; 55 : 301- 308

development and behavior in offspring rats. Arch動物の低栄養ラットモデルでは，生後に学習・記
憶障害や情動性（不安）の亢進，モノアミン量の変ME, et al.: The effects of sodium arsenite
exposure on behavioral parameters in the rat.

5-HT 陽性細胞数の減少がみられた As 20 mg/kg

投与群の母動物は，体重および摂餌量の減少を示

Science 2011; 79- 86

Rodríguez VM, Carrizales L, Jiménez-Capdeville8)

27 : 399- 405

Senuma M., Takashima H., Ohta R., et al.: The
effect of phenytoin on early development of the

fetal rat brain. Congenit Anom(Kyoto). 2012 ; 5 :9)A20 [abstract].

Beaudoin AR: Teratogenicity of sodium arsenate
in rats. Teratology 1974; 10: 153- 157

10) Senuma M, Mori C, Ogawa T, et al.: Prenatal

sodium arsenite affects early development ofserotonergic neurons in the fetal rat brain. Int J

Dev Neurosci 2014; 38: 204-212

本実験により胎生期に 20 mg/kg のヒ素を曝露

11) Aung KH, Kurihara R, Nakashima S, et al.:

明らかとなった．また，生後に発現するヒ素誘発

cytoskeletal gene expression by sodium arsenite.

すると 5-HT 神経系の発生に影響を及ぼすことが性の DNT には 5-HT 神経系の異常が関与している可能性が示唆された．
文献

1)

3)

18

Neurotoxicology 2013; 34 : 226- 235

12) Flora SJ, Bhatt K, Mehta A: Arsenic moiety ingallium arsenide is responsible for neuronal

apoptosis and behavioral alterations in rats.

Toxicol Appl Pharmacol. 2009; 240 : 236- 244

International Agency for Research on Cancer13) K e i m A , R ö s s l e r O G , R o t h h a a r T L , e t

updating of IARC monographs volumes 1 to 42 .

neuroblastoma cells requires p 53 but occurs

the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans,

25- 38(IPCS) Overall evaluations of carcinogenicity: an
Lyons, 1987 ; 100 - 106 (IARC Monographs on

2)

Inhibition of neurite outgrowth and alteration of

Suppl. 7)

Ng JC, Wang J, Shraim A: A global healthproblem caused by arsenic from natural sources.
Chemosphere 2003; 52 : 1353–1359

al.: Arsenite-induced apoptosis of humanindependently of c-Jun. Neuroscience 2012; 206:
14) Koike-Kuroda Y, Kakeyama M, Fujimaki H, etal.: Use of live imaging analysis for evaluationof cytotoxic chemicals that induce apoptotic cell
death. Toxicol In Vitro. 2010; 24 : 2012- 2020

Rice DC: Neurodevelopmental Toxicants.

15) Yadav RS 1 , Shukla RK, Sankhwar ML, et al.:Edition, eBook (Edited in Nriagu J.), Elsevier

induced neurotoxicity in rats. Neurotoxicology

Encyclopedia of Environmental Health. 1 st

Neuroprotective effect of curcumin in arsenic-

PDF Compressor Pro

研究報告

2010; 31 : 533-539

16) Dufour-Rainfray D, Vourc'h P, Le Guisquet AM,
et al.: Behavior and serotonergic disorders in24) V i t a l i s T , C a s e s O , P a s s e m a r d S , e t a l . :Embryonic depletion of serotonin affects corticaldevelopment. Eur J Neurosci. 2007; 26: 331-344

rats exposed prenatally to valproate: a model for25) C o x B M , A l s a w a h F , M c N e i l l P C , e t a l . :17) Ida-Eto M, Oyabu A, Ohkawara T, et al.:of chronic unpredictable stress in the rat. Behav

organomercury compound, causes abnormal early26) Wojciak RW: Alterations of selected iron

autism. Neurosci Lett. 2010; 470 : 55- 59

Embryonic exposure to thimerosal, andevelopment of serotonergic neurons. Neurosci
Lett. 2011; 505 : 61-64

18) Zhou FC, Fang Y, Goodlett C: Peptidergic
agonists of activity- dependent neurotrophic

factor protect against prenatal alcohol- induced

neural tube defects and serotonin neuron loss.
Alcohol Clin Exp Res. 2008; 32 : 1361- 1371

Neurochemical, hormonal, and behavioral effects
Brain Res. 2011; 220 : 106- 111

management parameters and activity in food-restricted female Wistar rats (animal anorexia

models). Eat Weight Disord. 2014; 19 : 61- 68

27) Pallarés ME, Scacchi Bernasconi PA, Feleder

C. et al.: Effects of prenatal stress on motor
performance and anxiety behavior in Swiss mice.

Physiol Behav. 2007; 92 : 951- 956

19) Rodríguez VM, Carrizales L, Mendoza MS, et28) Zuena AR, Mairesse J, Casolini P, et al.: Prenatalo n de ve l o pme n t an d be h avi o r i n th e r at.

and neurochemical profiles in male and female20) Altman J, Bayer SA: Development of the brain29) van den Hove DL, Kenis G, Steinbusch HW, etof the time of origin of neurons in the midbrain

weight as a marker for adult affective state.

al.: Effects of sodium arsenite exposure
Neurotoxicol Teratol. 2002; 24 : 743- 750

stem in the rat. V. Thymidine-radiographic study
tegmentum. J Comp Neurol. 1981; 198: 677-716

restraint stress generates two distinct behavioral
rats. PLOS One 2008; 3 : e 2170

al.: Maternal stress-induced reduction in birth
Front Biosci(Elite Ed.) 2010; 2 : 43- 4621) Alenina N, Kikic D, Todiras M, et al.: Growth30) van den Hove DL, Jakob SB, Schraut KG, et al.:mice lacking brain serotonin. Proc Natl Acad Sci

Deﬁcient Mice: Towards Molecular Mechanisms

retardation and altered autonomic control in

U S A. 2009; 106 : 10332-10337

22) Kriegebaum C, Song NN, Gutknecht L, et al.:Differential Effects of Prenatal Stress in 5 -Httof Gene × Environment Interactions. PLOS One

2011; 6 : e 22715

Brain-specific conditional and time-specific31) Jin Y, Xi S, Li X,, et al.: Arsenic speciation

serotonergic gene expression in the absence ofmice to their newborn pups. Environ Res. 2006 ;inducible Tph 2 knockout mice possess normal

serotonin during adult life. Neurochem Int. 2010;57 : 512-517

23) Mazer C, Muneyyirci J, Taheny K, et al.:Serotonin depletion during synaptogenesis leads
to decreased synaptic density and learning
deficits in the adult rat: a possible model ofneurodevelopmental disorders with cognitivedeﬁcits. Brain Res. 1997; 760 : 68- 73

transported through the placenta from mother

101: 349- 355

32) Sakamoto M, Kakita A, Wakabayashi K, etal.: Evaluation of changes in methylmercury

accumulation in the developing rat brain and its
effects: a study with consecutive and moderate

dose exposure throughout gestation and lactation

periods. Brain Res. 2002; 949 : 51- 59

19