本研究は，日本農芸化学会 2022 年度大会（京都）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のためオンライン形式で実施）に応募された研究のうち，本誌編集委員会が優れた研究として選定した 6 題の発表のうちの一つです．

日本農芸化学会

さかなの腸内細菌抗菌物質を探る

学校法人大阪明星学園明星高等学校生物部
中崎宏哉（指導教諭：上野魚 の 病 気 を 治 す 薬 を つ く り， 養 殖 や 飼 育 に 役 立 て る た め に，魚の腸内細菌から病原菌を不活性化させる物質を出す細菌を●発見することを目的として本研究を行った．キダイの消化管る物質を特定することができれば，魚の病気を治す薬をつくることにもつながる．一方，ヒトの腸内細菌が健康から単離した腸内細菌を用いて，細菌間の種間関係を調べるの維持に役立つように，魚の腸内細菌の中にも免疫力を独自の実験のバクテリアバトルを行った．その結果，ブレビ増強するものや抗菌物質を生産するものが含まれているバクテリウム属細菌が他の菌を不活性化する物質を出している可能性が示された．そこで，この細菌の魚の病原菌に対す化学と生物智）る抗菌活性をディスク拡散法で調べたところ，ブレビバクテリウム属細菌が抗菌活性をもつことが示唆された．

本研究の目的・方法および結果ことがわかっている (2)．そこで，本研究では，魚の病原菌を不活性化させる物質（抗菌物質）を出す「さかなの腸内細菌」を発見することを目的として行った．
【実験方法】
1.

キダイの腸内細菌の単離
本研究では，養殖もされ，身近で入手しやすく安価なキダイ（【目的】）を使用した．外部からの細菌混入がないようにクリーンベンチ内で，キダイを解剖大阪明星学園生物部では，2018 年度より「バイオサして消化管を取り出し，消化管内容物を ZoBell 液体培

イエンスで環境問題に挑戦」をテーマとし，微生物の研地で希釈した．次に，消化管内容物の希釈液をディスポ

究を行っている．2018 年，原因不明の病気により養殖

ループ（プラスチック製白金耳）で ZoBell 寒天培地全場で養殖している魚や水族館で飼育している魚が大量に体に均一に塗り，室温・好気性条件で培養した．また，死亡していることがニュースで報じられ，病気の原因に腸内細菌の培養には，杉田らの文献 (2〜5) にある海洋細菌は栄養，細菌，ウイルスなどの関わりがあること，そしの非選択培地である ZoBell 培地が適していると考え，て細菌性の病気が養殖魚に与える損害は甚大であること

ZoBell 2216E の成分を参考にして，水 1000 mL にペプト(1)がわかった ．養殖ハマチやアユなどの病気の原因となン 5.0 g，酵母エキス 1.0 g，人工海水塩分 35.0 g を加えてる細菌としては，病原性のあるビブリオ属細菌が知られZoBell 液体培地を自作した．寒天培地は，液体培地に寒ている(1, 2)．ビブリオ属細菌による感染症をビブリオ病

天 15 g を加えたものを使用した．といい，養殖ハマチでは体表に潰瘍が生じ，アユでは出コロニーが確認できた細菌は，微生物の同定に良く用血や潰瘍の形成が見られ，病原性のあるビブリオ属細菌

いられる 16S rRNA 遺伝子領域を PCR 法で増幅し，配としてが 分 離 さ れ て い る (1)． し たがって，ビブリオ属細菌などの病原菌を抑えることがで列解析した約 300 bp を BLAST 検索した．
2.

バクテリアバトル

きる物質を出す細菌を発見することができれば，魚の病

バクテリアバトルとは，我々が発案した独自の混合培気を防ぐことにつながる．さらに，病原菌を不活性化す養方法で 2 種類の細菌を同じ培地上に植菌し，増殖の仕98

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方から勝ち負けを判定して，細菌間の種間関係を調べる

染み込ませたディスクをピンセットでおいて，30 C でために行った実験である．バクテリアバトルの実験は次数日間培養した．培養後，ろ紙のまわりにビブリオ属細のように行った．

菌が増殖していない部分である阻止円ができているかを

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2 種類の細菌についてZoBell 液体培地を用いて30 Cで振とう培養した培養液を用意し，ZoBell 寒天培地上に図 1【結果】の（a）のように，プレートを上と下に分けて，その両1.

●

キダイの腸内細菌の単離端にそれぞれの細菌をディスポループで植菌し，真ん中培養した結果，数 mm 程度の大きさで色の異なる丸形には×字型に植菌した．真ん中に植菌するときは，先にのコロニーが多数観察され，培養したプレートの中にオ片方の細菌を植菌し，7 分間乾燥したあとにもう片方のレンジ色・丸形，黄色・丸形，白色・丸形の 3 種類のコ細菌を植菌し，2 種の細菌が混ざらないようにした．真ロニーが確認できた．これらの細菌の遺伝子解析で得らん中の交差部分（図 1 の（a）中の赤線の四角内）ではれた塩基配列を BLAST 検索した結果，相同性が 98％以先に植菌した方が培地に近いために増殖しやすいと考上であったことから，オレンジ色・丸形のコロニーの細え，塗る順番による差異を観察するために，プレートの菌はブレビバクテリウム属細菌（上と下では植菌する順番を逆にした．植菌後に 30 C で黄色・丸形のコロニーの細菌はブラキバクテリウム属細数日間培養した後，両端の部分において単独で細菌の増菌（

菌 は マ イ ク ロ バ ク テ リ ウ ム 属 細 菌（ようすを確認し，面積の半分以上を占めた細菌の勝ちとsp．）であることがわかった．

した．

2.

ディスク拡散法（抗菌活性試験）sp.），sp.），白色・丸形のコロニーの細殖が確認できたとき，真ん中の交差部分で細菌の増殖の3.

化学と生物確認した．

バクテリアバトルキダイから単離した 3 種類の細菌をそれぞれ単独で培キダイから単離した腸内細菌を用いて，魚の病原菌で養して 3 日目にコロニーを確認したところ，大きさがほあるビブリオ属細菌に対する抗菌活性をディスク拡散法ぼ同じであった．このことから，増殖速度が同じであるで調べた．まず，ZoBell 液体培地でキダイから単離したと判断し，3 種類の細菌を用いてバクテリアバトルを腸内細菌を 30 C で数日間振とう培養した．この培養液行った．本実験では，キダイから単離した細菌はコロを卓上遠心分離機で 10 分間遠心分離（3200 回転／分）

ニーの色が異なることから，オレンジ色のブレビバクテした上澄み液と沈殿物，オートクレーブで滅菌したもリウム属細菌はオレンジ色，黄色のブラキバクテリウムの，ネガティブコントロールとして ZoBell 液体培地の属細菌は黄色，白色のマイクロバクテリウム属細菌は白みの 4 種類の試料を用意した．次に，ZoBell 液体培地で色とコロニーの色で呼び分けることとした．

ビブリオ属細菌を培養した培養液をつくり，クリーンベバクテリアバトルの実験をした結果，オレンジ色対黄ンチ内で ZoBell 寒天培地のプレートに，コンラージ棒色の対戦が合計 48 回，オレンジ色と白色の対戦が合計で均一になるようにビブリオ属細菌の培養液を塗って乾25 回，黄色対白色の対戦が合計 18 回で成立した．図 1

燥させた．乾燥させたプレートに 4 種類の試料をろ紙にの（b）はバクテリアバトルの結果の例で，プレートの図 1 ■ バクテリアバトルでの植菌の仕方とその結果（a）プレートを上と下に分け，両端にそれぞれの細菌を植菌し，真ん中は×字型に植菌した．上と下では交差部分（赤線の四角内）の植菌の順番を逆にした．（b）オレンジ色と黄色を 3 日間培養したようす．上では黄色が勝ち，下ではオレンジ色が勝っている．（c）オレンジ色が勝ち，そのコロニー付近の赤線内では，黄色が増殖できていない．
オレンジ色；ブレビバクテリウム属細菌，黄色；ブラキバクテリウム属細菌，白色；マイクロバクテリウム属細菌．

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99

行った．

表 1 ■ バクテリアバトルの勝ち数のまとめ

その結果，上澄み液では図 2 の（a）のような阻止円（a）オレンジ色対黄色
先に植菌した細菌

オレンジ色勝ち

黄色勝ち

勝敗なし

が確認でき，沈殿物においても同様な阻止円が確認でき202343404011た．オートクレーブで滅菌した試料や ZoBell 液体培地

黄色オレンジ色
合計

白色
オレンジ色
合計

オレンジ色勝ち

白色勝ち

勝敗なし

5914325336

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黄色白色
合計

れる場合があった．外側の白色の物質の近くではビブリオ属細菌が増殖できていなかった．
【考察】
バクテリアバトルの結果から，オレンジ色のブレビバ
クテリウム属細菌は他の 2 種の細菌に対して勝ちが多（c）黄色対白色
先に植菌した細菌

また，図 2 の（b）（c）のようにディスクのまわりにオレンジ色のものがあり，その外側に白色のものが見ら（b）オレンジ色対白色
先に植菌した細菌のみの試料では阻止円が確認できなかった．

黄色勝ち

白色勝ち

勝敗なし

8412033123オレンジ色；ブレビバクテリウム属細菌，黄色；ブラキバクテリウム属細菌，白色；マイクロバクテリウム属細菌．

く，黄色のブラキバクテリウム属細菌は白色のマイクロバクテリウム属細菌に対して勝ちが多かったことが明らかとなった．ただし，黄色や白色も先に植菌した場合には勝つ場合もあった．このことは，先に植菌した方が培地に近いために増殖しやすいという考えが正しかった結果であると思われる．それにもかかわらず，先に黄色を化学と生物●植菌した場合にオレンジ色の勝ちが多かったことから，上では面積の半分以上を占めている黄色の細菌の勝ち，オレンジ色が優先して増殖できる条件があったと考えら下ではオレンジ色の細菌の勝ちとした．

れる．また，オレンジ色のコロニーが増殖した近くの部

オレンジ色対黄色の結果を表 1 の（a）にまとめた．

分で黄色のコロニーサイズが小さくなり，増殖できなく合計 48 回中，オレンジ色の勝ちは 43 であった．先に黄なった例があったことから，黄色はオレンジ色の付近で色を植菌した場合に黄色の勝ちもあったが，後に植菌しは増殖しにくいことが考えられる．これらのことから，たオレンジ色の勝ちが多かった．また，先にオレンジ色ブレビバクテリウム属細菌が他の細菌を不活性化する物を植菌した場合は，勝敗なしもあったが，勝ったのはオ質を出していることが考えられた．

レンジ色だけであった．

また，培養液の上澄み液や沈殿物を染み込ませたディ

オレンジ色対白色の結果を表 1 の（b）にまとめた．

スクで阻止円が確認できたことから，本研究で魚の腸内合計 25 回中，オレンジ色の勝ちが 14 と多かったが，白から単離したブレビバクテリウム属細菌は，魚の病原菌色の勝ちや勝敗なしもあった．先に白色を植菌した場合であるビブリオ属細菌に対しても抗菌活性をもつことがはオレンジ色の勝ちが 5 に対し白色の勝ちが 3 で，勝敗わかった．上澄み液と沈殿物を染み込ませたディスクのなしも 3 であった．しかし，先にオレンジ色を植菌した両方から阻止円が確認されたのは，遠心分離機での分離場合は，オレンジ色の勝ちが多かった．

が不十分であったことが原因であると考えられる．ディ

黄色対白色の結果を表 1 の（c）にまとめた．合計 18

スクの周りに見られたオレンジ色のものはブレビバクテ

回中，黄色の勝ちが 12 であった．ただし，その多くはリウム属細菌で，その外側の白色のものは，ビブリオ属

先に黄色を植菌した場合であった．先に白色を植菌した細菌が増殖できていないことから，何らかの物質がでた

場合は黄色の勝ちが 4 で白色の勝ちが 3，勝敗なしは 3ためにできたと考えられる．ディスクの観察から本研究であった．

で魚の腸内から単離したブレビバクテリウム属細菌が菌

オレンジ色が勝ちの場合，図 1 の（c）のように勝つことがあり，図中の赤線内のようにオレンジ色のコロニーが増殖した近くの部分では黄色のコロニーサイズが小さくなり，増殖できないようすが観察できた．
ディスク拡散法（抗菌活性試験）

3.

体外に抗菌物質を出している可能性が高いことが考えられた．
これまでに，オカダンゴムシから発見されたブレビバクテリウム属細菌が抗カビ物質を出していること (6)，ムラサキカイメンや海水から単離したブレビバクテリウムバクテリアバトルの結果から，オレンジ色のブレビバ属細菌が抗菌活性をもつこと (7, 8)，チーズから単離した

クテリウム属細菌を用いて，ディスク拡散法の実験を

ブレビバクテリウム属細菌で抗菌ペプチドが確認されて100

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図 2 ■ ブレビバクテリウム属細菌のディスク拡散法の結果

日本農芸化学会（a）ディスクのまわり（青い点線内）でビブリオ属細菌の増殖が減り阻止円が見られた．
（b）ディスクのまわりにオレンジ色が見られ，そのまわりが白くなり，ビブリオ属細菌の増殖も減っている． （c）（b）を裏側から見たもの．
ディスクのまわりのオレンジ色がよくわかる．

いる (9)．このようにブレビバクテリウム属細菌は他の細た物質が魚にとって安全であることを確認し，どの病原菌に対する抗菌活性をもつ物質を生産することが報告さ菌に対して作用があるかを調べたい．また，本研究のよれている．今後，本研究で魚から単離したブレビバクテ

うに抗菌物質に関する研究は，魚の薬の開発に貢献できリウム属細菌からも，抗菌物質が確認できる可能性が高るものであり，さらには，魚のプロバイオティクスとしいと考えられた．て，人における乳酸菌のような働きをもつ可能性も考えられる．

本研究の意義と展望
本研究で単離したブレビバクテリウム属細菌は，バクテリアバトルやディスク拡散法により抗菌活性をもつこ●とがわかった．さらには，抗菌物質を産生し，産生した抗菌物質は菌体外へ放出され，魚の病原菌に作用することが期待できる．この抗菌物質は，魚の腸内から単離した細菌でつくられたものであることから，魚には安全で化学と生物ある可能性が高く，本研究の目的である魚の病気を治す薬をつくり，養殖や飼育に役立てることができる可能性が高い．
また，本研究において行われたバクテリアバトルの実
験方法は，高校の実験室で行うことが可能であり，結果も得やすいことから，他の研究においても細菌の抗菌物質の有無を調べる実験として活用することができると思われる．
今後，本研究で単離したブレビバクテリウム属細菌がつくり出す抗菌物質を特定することができれば，同定し化学と生物 Vol. 61, No. 2, 2023

謝辞：本研究を行うにあたり，長浜バイオ大学の長谷川慎先生と谷口祐一さん，大阪大学の飯田哲也先生にお世話になりました．公益財団法人
武田科学振興財団の支援のもとで実施されました．お世話になった方々にお礼を申し上げます．

文献1) 江草周三：日本獣医師学会誌，21，143（1968）．
2) 杉田治男（編），佐藤秀一（著）： 増補改訂版 養殖の餌と水̶陰の主役たち ，恒星社厚生閣，2014.
3) 石田祐三郎，杉田治男（編）： 海洋環境アセスメントのための微生物実験法 ，恒星社厚生閣，2006.
4) 石田祐三郎，杉田治男（編）： 海の環境微生物学 ，恒星社厚生閣，2011.
5) 亀井勇統：，19，33（2012）．
6) 片岡柾人： オカダンゴムシの共生菌による抗カビ物質生産 ，筑波大学 第 14 回「科学の芽」賞，2019.
7) E. J. Choi, H. C. Kwon, J. Ham & H. O. Yang:,62, 621 (2009).
8) V. Srilekha, G. Krishna, V. Seshasrinivas & M. A. S.
Charya:, 12, 283 (2017).
9) A. S. Motta & A. Brandelliet:, 92, 63
(2002).
Copyright © 2023 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.61.98101