本研究は，日本農芸化学会 2020 年度大会（福岡）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のため中止）に応募された研究のうち，本誌編集委員会が優れた研究として選定した６題の発表のうちの一つです．

日本農芸化学会

ハルジオンの抗菌作用
病原体に対する防御と活用技術への可能性
東京都立多摩科学技術高等学校（バイオテクノロジー領域）
齋藤美弥，熊代瑛，吉住真奈（顧問：橋本利彦）

私 た ち は， 雑 草 の 生 命 力 を 調 べ る た め タ ン ポ ポ と ハ ル ジ オ

本研究の目的●ン，万年草の根を無菌培養した．実験としては，無菌培養に
失 敗 し て し ま い タ ン ポ ポ と 万 年 草 は カ ビ が 生 え て し ま っ た．
しかしながらハルジオンだけがカビが生えてない状態で化学と生物あった．この現象から私たちは，ハルジオンには抗菌効果がハルジオンは観賞用として日本にもち込まれ，現在では帰化植物となっている．また，ハルジオンを観察するあるのではないかと考えた．そこで大腸菌や黒麹菌，納豆菌と病気になっていたり，虫に喰われていたりしているもを用いて抗菌効果を調べたところ各微生物の生育を阻害してのが少なかった．そこで私たちは，植物から発散して微いることがわかった．次に，ハルジオンの抗菌効果のメカニ

生物の活動を抑制するフィトンチッドの可能性や昆虫やズムを解明するためモデル生体膜を用いて実験を行った．その結果，ハルジオンの成分は脂質二重層を傷つけることがわ
か っ た． 最 後 に HPLC に て 分 析 し， ハ ル ジ オ ン に は ク ロ ロ ゲン酸が含まれていることがわかった．

イントロダクション
雑草は生命力が強く，草むしりの際も「根から抜かなければ，また生えてくる」と言われる．そこで私たちは，植物の根が何 cm 残っていると再び生えてくるのか疑問に思った．
はじめに，植物の根の再生能力を調べるため 1, 2, 3 cm

微生物から身を守るために生成されるファイトケミカルの可能性などを考慮しながら，ハルジオンの生命力の強さを探るため実験を開始した．

実験方法および結果と考察
1.

抗菌作用の発見（無菌培養）（1）雑草の生命力の強さについて【目的】
私たちは，雑草の生命力の強さについて土に残る根の長さが関係しているのではないかと考えた．そこで試料の根を無菌培養することで植物の再生過程を観察すること長さを変えた試料で実験を開始した．また，土壌で実とにした．

験を行うと，潅水や温度，湿度などの管理を一定条件に【試料】するのは困難であると考えて無菌培養に着目した．実験

タンポポ（1, 2, 3 cm），ハルジオン（1, 2, 3 cm），万年の試料としてタンポポ，ハルジオン，万年草を使用した．

草（1, 2, 3 cm）

無菌培養を行ったことで私たちは偶然ハルジオンだけが【培地】

抗菌効果があるのではないかと思わせる結果を得た．

MS（Murashige and Skoog）培地【方法】
試料を水道でよく洗い，さらに中性洗剤で丁寧に洗っ化学と生物 Vol. 58, No. 12, 2020699

図 1 ■ （A） タ ン ポ ポ，（B） ハ ル ジ オ ン，（C）万年草

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た後，軽くキッチンペーパーで拭いた．次に，70％エタ【方法】

ノールに 1 分間浸け，滅菌水でエタノールを洗い落とし大腸菌を用いた実験では，デソキシコレート寒天培地た後，次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素濃度 0.6％）に 3を溶解し大腸菌を混釈して平板培地を作製した．また，分間浸けて殺菌を行った．塩素消毒後，3 回滅菌水で洗

黒麹菌と納豆菌を用いた実験では，ポテトデキストロー

浄した後，MS 培地に植えて 1 週間様子を観察した．

ス寒天培地を滅菌し，平板培地を作製した後，黒麹菌や【結果】

納豆菌をコンラージ棒で広げた．それぞれの培地の中央

タンポポやハルジオン，万年草のすべての試料においにハルジオンの根を刺したり，横に置いたりして 37 Cて成長がみられなかった．また，タンポポおよび万年草で 48 時間培養した．の試料はすべて無菌操作に失敗してカビが生えてしまっ【結果】
ハルジオンの根の切り口付近の大腸菌や黒麹菌，納豆た．しかし，ハルジオンの試料は 1, 2, 3 cm のすべての試料において根の周辺にはカビが見られなかった（図菌は育成しなかった．

1）．

【考察】

化学と生物

●

【考察】

ハルジオンの切り口付近には，微生物が生えなかっタンポポと万年草は，コンタミネーションが起きてした．このことからハルジオンには抗菌効果があるのではまったため無菌培養ができなかった．考えられる理由とないかと考えられる．また，切り口からワサビに含まれしては，植物の根は土壌中にあり，空気中より多くの微るイソチオシアネートのような揮発性の物質が放出され生物が存在した結果，葉片培養のための殺菌方法では微ていたのならば，培地全体の微生物に対して効果的であ生物を殺菌しきれずにコンタミネーションが起きやする．しかし，今回は切り口付近しか微生物の育成を抑制かったのではないかと思われる．しかし，同じ操作をしする効果がなかった．よって，ハルジオンに含まれていたはずのハルジオンだけコンタミネーションが起きなる抗菌物質は，揮発性でないと判断した (1)．

かった．これは，偶然コンタミネーションが起きなかっ2.

たのか，または抗菌物質があるのか，どちらかの可能性（1）ハルジオンが及ぼす生体膜への影響が考えられる．

【目的】（2）ハルジオンの抗菌効果

抗菌効果のメカニズム

ハルジオンに抗菌効果があることがわかった．そこ【目的】

で，ハルジオンの成分は細胞膜に対してどのように影響

タンポポとハルジオン，万年草の根を無菌培養しようがあるのか調べることにした．としたところ，タンポポと万年草にはカビが生えたにも細菌の細胞膜は，リン脂質二重層から構成され多くのかかわらず，ハルジオンだけはコンタミネーションが起分子の透過障壁となったり，細胞への分子の輸送の場所きなかった．そこで，ハルジオンの抗菌効果について調となったりする．しかしながら，実際の生物の細胞膜をべた．

利用して実験を行おうとすると膜以外の不純物も多【菌株】

い (2)．そこで，純粋にリン脂質二重層への影響を調べる

使用菌株は，大腸菌（）， 納 豆 菌（），黒麹菌（var.

）の 3 種類を用いた．大腸菌は土壌や腸内など広範ためモデル生体膜を利用することにした (3, 4)．
【試料】
ハルジオンの根，茎，葉の各部位を中性洗剤で洗い，囲に分布している単細胞生物で，培地はデソキシコレー

乾 燥 さ せ て か ら 1 mm の 幅 に 刻 ん だ． 各 部 位 を PBS

ト寒天培地を用いた．黒麹菌は多細胞生物で，培地はポ（phosphate-buﬀered saline, pH 7.4）に浸して 0.1 g/mL

テトデキストロース寒天培地を用いた．また，納豆菌のになるようにし，24 時間静置した．ろ紙およびメンブ

実験では，黒麹菌と同じポテトデキストロース寒天培地

レンフィルター（0.45 µm）を通してろ過したものを試を用いた．

料溶液とした．なお，有機溶媒で抽出しなかった理由と700

化学と生物 Vol. 58, No. 12, 2020

化学と生物●

日本農芸化学会

図 2 ■ ハルジオン抽出液が及ぼす脂質二重層への影響

して，有機溶媒が試料溶液内に残ってしまうとモデル生の成分は，脂質二重層を傷つけている働きがあると考え体膜を壊してしまうため PBS を使用した．

られる (5)．

【方法】

3.

ナス型フラスコに eggPC（卵黄由来ホスファチジルコリン）を入れ，クロロホルムに溶かした状態からエバ抗菌物質の特定（1）抗菌ペプチドの可能性【目的】

ポレーターと真空デシケーターを用いてクロロホルムを抗菌作用がある物質の一つとして抗菌ペプチドがあ蒸発させると共に内壁に均一に伸ばした．eggPC の濃る (6)．ハルジオンに含まれる抗菌物質が抗菌ペプチドで度 が 10 mg/mL に な る よ う に 0.001 mol/L カ ル セ イ

ある可能性を検討するため，ハルジオンに熱を加えて抗ン-0.3 mol/L グルコース溶液をナス型フラスコに加えて菌効果を調べる実験を行った．

超音波洗浄機にかけた．さらに遠沈管に移しカップホー【方法】

ン型超音波発生装置（OUTPUT Control 10, DUTY 40）

ハルジオンの根と茎を 180 C で 20 分間乾熱滅菌機を用に 15 分間かけて SUV（small uni-lamellar vesicle）を作いて熱を加えた後，冷却した．デソキシコレート寒天培製した．PBS を加えて SUV 内部溶液と濃度勾配をつけ地を溶解し大腸菌を混釈して平板培地を作製した．培地

た後，遠心管に 1 mL ずつ入れて超遠心分離機（130,000の中央に熱を加えたハルジオンの根や茎を刺して 37 C×g, 20 分間）をかけることで蛍光剤入りの SUV を沈殿で 48 時間培養した．

させた．上澄み液を捨てた後，試料溶液を 1 mL 加えて，

【結果】

再び遠心分離（130,000×g, 20 分間）にかけ上澄み液を回収した．カルセインは酸性で蛍光を発するため，回収した上澄み液 0.5 mL に対して 2.0 mL の 0.1 mol/L HCl 溶

大腸菌の生育に対して抑制効果が見られた．
【考察】
ハルジオンに熱を加えても抗菌効果を失わないことか液を加えた後，励起波長 494 nm，蛍光波長 517 nm の条ら，抗菌ペプチドの可能性が低くなった．

件で，SUV から漏出したカルセインの蛍光光度を測定（2）総ポリフェノール量の測定した．また，総カルセイン量は，試料溶液を加える前の【目的】

蛍光剤入り SUV を遠心分離で沈殿させてから回収し，抗菌作用がある物質に関して，1（2）ハルジオンの抗エタノールで SUV を壊すことによって SUV 内部に封入

菌効果において，植物の切り口付近のみ抗菌効果が現れしたカルセインの蛍光光度を測定した．

た た め， 揮 発 性 物 質 の 可 能 性 が 低 く な っ た． ま た，【結果】

3（1）抗菌ペプチドの可能性を調べた実験では，抗菌ペSUV から漏出したカルセインの割合は，葉＞茎≒根

プチドの可能性も低くなった．そこで，抗菌作用があるの順であった（図 2）．

物質にポリフェノールが関与しているのではないかと考【考察】

え，フォーリンチオカルト法を用いてハルジオンに含ま蛍光剤封入モデル生体膜は，流動性があるため時間と共に内部の蛍光剤が少しずつ漏出する特性がある．カテれる総ポリフェノール量を測定した (7)．
【方法】

キン類などでは蛍光剤の漏出を抑える効果があるのに対10％（v/v）フェノール試薬希釈液 5 mL と試料 1 mL

して，今回の実験試料であるハルジオンの成分は，根，を混合して 5 分間放置した．7.5％（w/v）炭酸ナトリウ

茎，葉ともにモデル生体膜から漏出するカルセインの量

ム溶液 4 mL を加えて混合し，60 分間放置した．分光光が自然の漏出より多かった．このことから，ハルジオン度計（吸光波長 765 nm）で測定した．また，基準とし化学と生物 Vol. 58, No. 12, 2020701

図 3 ■ ハルジオンに含まれる総ポリフェノール量と HPLC による分析て没食子酸を用いた．

●

日本農芸化学会【結果】
ハルジオンの総ポリフェノール量は，葉＞茎＞根の順

ハルジオンを HPLC にかけると多数のピークが検出された．しかしながら，24 分ごろを目途にピークが現れであった（図 3）．

なかった．このピークと最も近い溶出時間の物質がクロ【考察】

ロゲン酸だったため，クロロゲン酸の溶出時間と再び照ハルジオンには，ポリフェノールが含まれていることらし合わせた結果一致した．また，クロロゲン酸以外にが 確 認 で き た． さらに，総ポリフェノール量お よ び

比較した物質については，ハルジオンの抽出液の保持時2-（1）のモデル生体膜を用いた実験では両実験結果とも間と一致するものが見当たらなかったり，保持時間が葉の値が高かった．これらのことからハルジオンは，光16 分以内であったりしたため判別できなかった．

合成で重要な葉を病気や昆虫から守る働きがあるのでは【考察】ないかと考えた．
（3）HPLC による成分分析
【目的】

化学と生物

【結果】

ハルジオンの抽出液を HPLC にて分析した．
【試料】
ハルジオンを中性洗剤で洗い，乾燥させてから 1 mm

クロロゲン酸と溶出時間が一致したことから，ハルジオンの成分にはクロロゲン酸が含まれている可能性が高くなった．
（4）抽出液の抗菌効果の確認【目的】
HPLC で 23 から 24 分の間に溶出してきた抽出物を回の幅に刻んだ．花を除く葉，茎，根のすべての部位を収し，抗菌効果があるか確認した．

PBS に浸して 24 時間静置した．ろ紙およびメンブレン【方法】

フィルター（0.45 µm）を通してろ過したものを試料溶

溶媒に PBS を使用し，HPLC で 23 から 24 分の間に漏液とした．なお，有機溶媒で抽出しなかった理由とし出してきた抽出物を回収した．次に大腸菌とデソキシコて，有機溶媒が試料溶液内に残ってしまうと 3（4）抽出

レート寒天培地を混合してシャーレにまき，回収した抽液の抗菌効果の確認で微生物に影響があるため PBS を出液を染み込ませた直径 8 mm のペーパーディスクを使用した．

シャーレの中央に置いた．37 C で 48 時間培養した．

【方法】

【結果】

HPLC（Column ODS3, Mobile phase Phosphate buf-

直径 8 mm のペーパーディスクの周りに幅が約 4 mm

fer, Flow velocity 1.5 mL/min, Temperature 40 C, De-の阻止円を確認することができた．

tector UV 280 nm）にかけ，いくつかの純物質とハルジ【考察】オンに含まれている成分とを比較検討した．
【比較】

クロロゲン酸と溶出時間が同じであった物質は，抗菌効果を確認することができた．一方，1 mol/L クロロゲ

抗菌効果があると言われているポリフェノールと比較

ン酸も抗菌効果があり直径 8 mm のペーパーディスクのするため，お茶やココアに含まれるエピガロカテキンガ

まわりに幅が約 5 mm の阻止円を確認した．クロロゲン

レートやエピカテキンガレート，コーヒーに含まれるク酸は，微生物の膜を壊すことによって抗菌効果を発揮す

ロロゲン酸やカフェイン酸，カフェイン，フェルラ酸をる特徴がある．今回の実験においては，HPLC での溶出使用した．

時間がクロロゲン酸と同じであったことと，モデル生体膜を用いた実験において脂質二重層を壊していたことか

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化学と生物 Vol. 58, No. 12, 2020

らクロロゲン酸の可能性が高いと考えられる (8)．
4.

まとめ（1）ハルジオンには抗菌効果があることを発見した．また，そのメカニズムは脂質二重層を壊す働きがある．
（2）抗菌物質の一つとしてクロロゲン酸が考えられる．
5.

本研究の意義と展望
ハルジオンは，1920 年代に観賞用として日本にもち込まれた．しかしながら，1980 年代には，除草剤に耐性のある個体が出現し，雑草として関東地方を中心に全国への分布が拡大していった．現在では花屋に置かれることもなく，庭や街路樹の花壇，空き地などさまざまな日本農芸化学会

ところに生えている．そこで，ハルジオンの生命力の強さはフィトンチッドやファイトケミカル，抗菌物質の可能性等があるのではないかと考えた (9)．
今回，私たちは実験により，ハルジオンには抗菌効果があることを発見した．この結果は，観賞用から雑草として広がっているハルジオンの存在が，私たちの生活にとって活用できる植物へと価値観を変えることができた

1) 一色賢司，徳岡敬子：食品と微生物，10, 1‒6 (1993).
2) S. V. Albers, J. L. van de Vossenberg, A. J. Driessen &W. N. Konings:, 5, 813 (2000).
3) T. Nakayama, K. Ono & K. Hashimoto:, 62, 1005 (1998).
4) K. Kajiya, H. Hojo, M. Suzuki, F. Nanjo, S. Kumazawa &T. Nakayama:, 52, 1514 (2004).
5) T. Hashimoto, S. Kumazawa, F. Nanjo, Y. Hara & T. Nakayama:, 63, 2252 (1999).
6) F. Willem: Broekaert, Bruno P. A. Cammue, Miguel F. C.
De Bolle, Karin Thevissen, Genoveva W. De Samblanx,Rupert W. Osborn & Dr. K. Nielson,., 16, 297-323 (1997).
7) Determination of substances characteristic of green andblack tea-Part 1: Content of total polyphenols in tea-Colorimetric method using Folin‒Ciocalteu reagent, ISO.,
14502-1 (2005).
8) Z. Lou, H. Wang, S. Zhu, C. Ma & Z. Wang:,76, M398 (2011).
9) 多紀保彦監修，財団法人自然環境研究センター編著： 決
定版日本の外来生物 ，平凡社，2008, pp. 364‒365
Copyright © 2020 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.58.699

ジオンの抗菌性が見直され，活用できる可能性を見いだ
した研究内容であると考えられる．

化学と生物●のではないかと思う．そして，今後の研究や開発にハル

文献

化学と生物 Vol. 58, No. 12, 2020703