研究報告
秦野研究所年報
34, 10-17（2011）

バルプロ酸曝露後のラット胎児脳大脳皮質の微細構造
熊谷文明 1，臼見憲司 1，丸茂秀樹 1，斉藤義明 1，永田伴子 2，桑形麻樹子 1
The ultrastructural observation of the cerebral cortex after valproic acid exposurein rat fetuses
Fumiaki KUMAGAI1, Kenji USUMI1, Hideki MARUMO1, Yoshiaki SAITO1,Tomoko NAGATA2, Makiko KUWAGATA1

We examined the fetal cerebral cortex ultrastructure using a transmission electron microscope (TEM).
Valproic acid (VPA, 600 mg/kg) was exposed to pregnant female rats on gestation day (GD) 11, and fetalbrain was obtained on GD16. Epoxy-embedded sections were prepared for TEM examination.
In the ventricular zone (VZ), the VZ consisted of two distinctive cell types, the cells having oval
nucleus with moderate chromatin and cells having invaginated nucleus with electron-dense
cytoplasm. Cells on bottom of the VZ were bound together by desmosome junction, and multiple cell
divisions were also observed. In the VPA group, the sturucture and numbers of organelles such as
ribosome, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and centriole were comparableto those of the control group. In the intermediate zone (IZ), dark cells showing oval nucleus withlong cytoplasmic processes were directed tangentially to the cortical surface, and microtubules
were observed therein. Cell direction in the IZ was unordered in the VPA group as compared to thecontrol group. In the sub-plate (SP), the vacuolar structures surrounded by the unit membrane, inthe extracellular space and extended cell processes into the cortical plate (CP) were observed. In theVPA group, small vacuolar structures, and extracellular space were noticed, resulting in a fuzzy SP.
The CP consisted of cells having large and pale stained nucleus that were lined up radially to thecortical structure mostly. Some dark cells were invaginated into the CP. In the VPA group, morenumbers of this dark cell were observed, and arrangement of cells was disrupted.
From the results, cells constituting each layer showed a distinctive structure by TEM. Althoughorganellar structures and their distribution were similar between the VPA and control groups, VPA
exposure caused disruption of the cell position and symmetry.

緒言

われわれは，ラット胎生期 VPA 曝露自閉症モ

臨床報告から，抗てんかん薬であるバルプロ酸デルを用いて VPA 曝露後の神経発生への影響を（valproic acid；VPA）を妊婦がある時期に服用す調べてきた．800 mg/kg の VPA を妊娠ラットのると，その後生まれてきた子供が自閉症を発症す

11 日に単回経口投与し，妊娠 16 日（= 胎齢 16 日，るリスクが高くなることが知られている．動GD 16）に採取した胎児脳の約 45 µm ゼラチン切物実験においても，ラット胎児の神経管閉鎖前片による組織学検査を実施した結果，VPA 曝露後に相当する母動物の妊娠時期に VPA を曝露し，により大脳皮質皮質板（Cortical plate；CP）のその出生児を用いた自閉症モデルの研究が近年行厚さが対照群よりも薄く，サブプレート層（Sub-われているplate；SP）も不明瞭となることを明らかにした 8）．

．

3 - 7）

1 , 2）

中枢神経系は神経管から発生し，そこに存在す
1

毒性部病理学研究室

2

毒性部長

10

る神経系幹細胞の分裂により神経芽細胞および神経膠芽細胞に分化するとされているが，GD 16

研究報告

写真 1

ラット GD 16 の胎児大脳の超薄切片作製部位（約 1 µm 樹脂切片，トルイジン青染色）

A；大脳前頭面の組織像，B；A の□部の拡大像（超薄切片作製部位）．の発生段階では主に神経芽細胞産生の時期であ2％パラホルムアルデヒド・1 . 25％グルタールア

り，幼若な神経系の細胞の分裂，移動および集ルデヒド混合固定液を用いて浸漬固定した胎児頭積が観察可能な時期である．すなわち，脳室帯部より，頭蓋骨を除去して採取した．その後，胎（Ventricular zone；VZ）で細胞分裂を終えた神児脳を大脳の前額側から 1 / 3 の部位を前頭断で細経芽細胞が中間帯（Intermediate zone；IZ）を移切し，固定液の浸透性を高めるために 70 kPa 程動した後，脳膜側に集積し，SP および CP を形度の圧力で引き続き吸引浸漬固定した．さらに，成する時期である．

細切片を 0 . 1 M リン酸緩衝液で洗浄後，0 . 1 M リ

本研究では，透過電子顕微鏡（TEM）を用いてン酸緩衝 2％四酸化オスミウムで後固定したの

VPA 曝露後のラット GD 16 胎児脳における VZ，ち，エタノール上昇系列で脱水してエポキシ系樹IZ，SP および CP の微細構造を観察し，VPA 曝脂に包埋・重合した．

露による脳初期発生への影響を調べた．

重合が終了した樹脂ブロックから，光学顕微鏡による観察および超薄部位の確認のために約 1 µm

材料および方法の厚さのトルイジン青染色標本を作製した（写真

実験には，日本チャールス・リバーより購入し1）．その後，トリミングが終了した樹脂ブロック

た Fischer 妊 娠 ラ ッ ト（F 344 /DuCrlCrlj）を 8 匹

から 65～70 nm 程度の厚さ（干渉色：シルバー～（対照群 4 匹，VPA 曝露群 4 匹）用いた．動物は，シルバーゴールド）の超薄切片を作製し，酢酸ウ

室 温 21.0～25.0℃， 湿 度 40 . 0～75 . 0％， 照 明

ラニル染色液および佐藤の鉛染色液を用いた二重12 時間明暗周期（7 時～19 時点灯）に設定された染色を施した．染色後の超薄切片は，HT7700 形

動物室で，固型飼料（CE- 2，日本クレア）およびTEM（日立ハイテクノロジーズ）を用いて観察した．
なお，すべての動物実験操作は，「財団法人食飲料水を自由摂取させて飼育した．
投与量は，われわれのSDラットを用いた既報

8）に基づき実施した結果，全胚吸収が認められた品薬品安全センター秦野研究所動物実験に関する指針」に基づいて実施した．

ために，600 mg/kg の VPA（Sigma-Aldrich，St.
Louis，MO，USA）
を GD 11（膣栓確認日 = GD0）

結果および考察の F344 ラットに 5 mL/kg の容量で経口投与し，1．光学顕微鏡による観察

GD16 に帝王切開した．対照群には，生理食塩液エポキシ系樹脂包埋による約 1 µm の厚さのを同様に投与した．胎児脳は，0 . 1 M リン酸緩衝

トルイジン青染色切片観察において，対照群と11

秦野研究所年報…Vol.…34.…2011

写真 2

VPA 曝露後のラットの胎児脳組織像（トルイジン青染色）

A；対照群，B；VPA 曝露群．

VPA 曝露群を比較すると，VPA 曝露群では CP（写真 3 -G）も認められ，脳室内との物質輸送を示が薄く，その内側の SP が不明瞭であった（写真唆する所見と考えられた．その他，単位膜に囲2）．これは，SD ラットを用いて実施した 45 µmまれた小胞の集合体（写真 3 -H）が細胞間隙および8）

ゼラチン切片観察の結果と同様であった ．皮質細胞突起の先端部に認められた．VZ における細の厚さも対照群と比較して菲薄であった．

胞配列，細胞分裂の頻度，脳室面構造物の微細形態ならびに細胞内小器官の量および分布には，対2．TEM による観察

照群と VPA 曝露群とを比較して差は認められなラット GD16 胎児脳（大脳皮質領域）の TEM 観かった．これらのことから，VZ における神経系

察では，対照群および VPA 曝露群ともに，幼弱幹細胞の分裂には，VPA 曝露による影響はないな神経系細胞がみられ，細胞分裂像，細胞突起像と考えられた．

あるいは集積により層形成を示す像などが認められた．

IZ は，VZ の外側（脳膜側）に位置する層であり，VZ において分裂を終えた細胞が突起を伸ばしな

VZ は，脳室に面する位置にある層であり，神がら移動している領域である 9）．さらに IZ は，幼経系幹細胞が VZ 層内を放射方向に移動しながら若 な 神 経 細 胞 マ ー カ ー で あ る TuJ- 1（Neuronal

細胞分裂を繰り返している領域であると言われてClass Ⅲ β -Tubulin）免疫染色陽性領域であるこいる ．VZ（写真 3，4）は，対照群および VPA 曝とから IZ を構成する多くの細胞は神経芽細胞で露群ともに，核小体が明瞭な楕円形の核を持つ構成されていることが明らかになっている 8）．IZ

明調細胞および形態的にこの明調細胞と同等の（写真 5，6）
は，対照群および VPA 曝露群ともに，特徴を持つ暗調細胞で構成されていた（写真 3 -A，核小体が明瞭な紡錘形の核を持ち，核および細胞3-B，4-A，4-B）．いずれの細胞にも，リボソー質ともに暗調な細胞で構成されていた．また，こム，ミトコンドリア，小胞体，ゴルジ装置，細線の暗調な細胞は，接線方向に伸長し，細胞体の維状構造物および中心小体等の細胞内小器官（写間には同方向に伸長した細胞突起と考えられる真 3-C，4-C，4-D）がみられた．脳室面を構成す細胞質が豊富に認められた（写真 5 -A，6 -A）．細

る細胞は，デスモソーム様の細胞結合（写真 3 -D）

胞突起内には細線維状構造物がみられ（写真 5 -C，により結合しており，細胞分裂像（写真 3 -E）も多6 -C），VZ に認められた単位膜に囲まれた小胞の数認められた．また，微絨毛（写真 3 -F）ならびに集合体（写真 6 -D）も観察された．VZ および IZ に細胞膜の一部が陥入あるいは単一膜で囲まれた像みられた単位膜に囲まれた小胞の集合体は，細胞9）

12

研究報告

写真 3

対照群のラットの胎児脳 VZ の TEM 像（電子二重染色）

A；VZ 弱拡像，B；明調細胞および暗調細胞，C；細胞内小器官（リボソーム，ミトコンドリア，小胞体），D；デスモソーム様細胞接着，E；細胞分裂像，F；微絨毛，G；細胞膜の一部が陥入あるいは単一膜で囲まれた像，H；小胞の集合体．

写真 4

VPA 曝露群のラットの胎児脳 VZ の TEM 像（電子二重染色）

A；VZ 弱拡像，B；明調細胞および暗調細胞，C；細胞内小器官（リボソーム，ミトコンドリア，小胞体），D；中心小体．
13

秦野研究所年報…Vol.…34.…2011

写真 5

対照群のラットの胎児脳 IZ の TEM 像（電子二重染色）

A；IZ 弱拡像，B；細胞内小器官（リボソーム，ミトコンドリア，小胞体），C；細胞突起（細線維状構造物）．

写真 6

VPA 曝露群のラットの胎児脳 IZ の TEM 像（電子二重染色）

A；IZ 弱拡像，B；細胞内小器官（リボソーム，ミトコンドリア，小胞体），C；細胞突起（細線維状構造物），D；小胞の集合体．

間隙または細胞突起の先端部に観察されたことか

は，対照群および VPA 曝露群ともに，明瞭な細胞ら，細胞移動時の方向性に関連する構造物ではな間隙がみられ，その間を無秩序な方向性で走行すいかと考えられた．IZ を構成する細胞の細胞内る細胞突起（写真 7-C，8-C）および核小体が明瞭な小器官（写真 5-B，6 -B）の量および分布は，対照暗調細胞（写真 7-B，8-B）で構成されていた．ま群および VPA 曝露群ともに VZ に観察される細胞た，細胞突起の一部が袋状に膨らんでいる像も観の細胞内小器官の量および分布とほぼ同等であっ察された（写真 7-D，8-D）．その他，SP においてたが，VPA 曝露群では，細胞および突起の方向も，VZ および IZ でみられた小胞の集合体が認め性に一部乱れ（写真 6 -A）が認められたことから，られた（写真 8-E）．細胞内小器官は，その量およ

VPA 曝露は IZ における幼弱な神経系細胞の移動

び分布に両群の間に差は認められなかった．光学に影響を及ぼしている可能性が考えられた．

顕微鏡観察において不明瞭であった VPA 曝露群のSP は，IZ の外側に位置する層であり，IZ と CP

SP では細胞間隙が少なかった（写真 7-A，8-A）．の間隙としてみられる領域である．SP（写真 7，8）

SP はその大部分が細胞間隙であることが明らか

14

研究報告

写真 7

対照群のラットの胎児脳 SP の TEM 像（電子二重染色）

A；SP 弱拡像，B；暗調細胞，C；細胞突起，D；細胞突起が袋状に膨らんでいる像．

写真 8

VPA 曝露群のラットの胎児脳 SP の TEM 像（電子二重染色）

A；SP 弱拡像，B；暗調細胞，C；細胞突起，D；細胞突起が袋状に膨らんでいる像，E；小胞の集合体．になったことから，IZ および CP の乱れの影響に前に到達した神経芽細胞を超えて脳膜側に配置

よりその境界が不明瞭になったと考えられた．

し CP を構築していくことが知られている 9）．CPCP は SP の外側に位置する層であり，移動し（写真 9，10）は，核小体が明瞭な大型の核を有すてきた神経芽細胞が放射方向に集積する領域である明調な細胞（写真 9 -B，10 -B）および暗調な細る．CP まで移動してきた神経芽細胞は，それ以胞で構成されていた．対照群では，SP との境界
15秦野研究所年報…Vol.…34.…2011

写真 9

対照群のラットの胎児脳 CP の TEM 像（電子二重染色）

A；CP 弱拡像，B；明調細胞および暗調細胞，C；細胞内小器官（リボソーム，ミトコンドリア，小胞体），D；核内に細胞質が陥入している像，E，F；小胞の集合体．

写真 10

VPA 曝露群ラットの胎児脳 CP の TEM 像（電子二重染色）

A；CP 弱拡像，B；明調細胞および暗調細胞，C；細胞内小器官（リボソーム，ミトコンドリア，小胞体）において明調な細胞が並んで配列し，暗調な細10 -B）が認められた．さらに，細胞の移動方向を胞がそこに入り込む様に存在していた．VPA 曝

示す構造物と推察された単位膜に囲まれた小胞の露群では，SP との境界において対照群と比較し集合体（写真 9 -E，9 -F）が CP においても観察さて暗調細胞の混在が多くみられ，配列に乱れ（写れた．

真 9-A，10-A）が認められたことから，VPA 曝露

今回の結果から，GD 16 胎児脳の各層にみられは CP への細胞の集積に影響を及ぼしている可能る細胞の細胞内小器官の分布に差はみられなかっ性が考えられた．CP を構成する細胞の細胞内小たが，層毎に特徴的な細胞配列がみられた．ま器官（写真 9-C，10 -C）は，他の層に観察された

た，VPA 曝露群では，IZ の細胞および細胞突起細胞の細胞内小器官と比較して豊富に認められの方向性の乱れ，不明瞭な SP ならびに CP の細たが，それらの量および分布ともに両群の間に胞配列の乱れが認められたことから，脳発生初期差は認められなかった．その他，一部の大型核の VPA 曝露が神経細胞の移動および集積に影響を有する明調細胞では，核内の陥入像（写真 9 -D，を及ぼしている可能性が考えられた．

16研究報告文献1） Moore SJ, Turnpenny P, Quinn A, et al.:by maternal conditions including shipping
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