保健科学研究

7：13―20，2017【原著】
運動負荷に伴う酸化ストレスマーカー8-oxo-dG 及び炎症関連マーカー血清 MMPs の経時的変動～血清・唾液・尿検体の有用性の検討～
福士泰世*1

中村歩美*2 白戸佑貴*3 田中健登*3 伊藤拓也*3 野沢祐貴*3
井瀧千恵子*4 真里谷靖*4,5（2016 年 12 月 8 日受付，2017 年 2 月 20 日受理）

要旨：本研究の目的は，酸化ストレス増大の一因となり得る運動負荷を実施し，血清，唾液，新鮮尿中の酸化ストレスマーカー8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-oxo-dG)及び炎症関連マーカーMatrix metalloproteinases (MMP-9, MMP-2)の経時的変動の観察・解析から生体内の酸化ストレスを鋭敏に反映する検体及び手法について検討することである。対象者は健常な男子学生 7 人，運動負荷として 1km あたり 6 分の設定で 6km 走を実施し，運動強度は 10 メッツ(metabolic
equivalents)とした。各サンプルは運動 1 時間前，運動 1 時間後，運動 24 時間後に採取した。8-oxo-dG の分析は免疫測定法で行い，MMP-9 及び MMP-2 の分析はゼラチンザイモグラフィーで行った。血清及び唾液中 8-oxo-dG では，3時点における有意な変動はなかった。一方，尿中 8-oxo-dG は，運動 1 時間後に有意に増加し，運動 24 時間後には，
運動 1 時間前と同等の値まで有意に減少した。MMP-9 においても尿中 8-oxo-dG と同様の変化が認められた。運動が惹起する生体内の酸化ストレスを鋭敏に反映するサンプルは新鮮尿であることが示唆された。
キーワード：8-ヒドロキシ-2’-デオキシグアノシン，酸化ストレス，運動負荷，尿，マトリックスメタロプロテアーゼ

Ⅰ．はじめに
人間の生命維持には酸素が必要であり，エネルギー産生
系で酸素が利用されている。その過程で数%の酸素は，反には ROS を消去する抗酸化ネットワークが存在しているが 6)，ROS と抗酸化ネットワークのバランスが崩れ，ROS
が上回ることで酸化ストレスの上昇を引き起こし，老化や癌などの様々な疾患の発生，促進の要因となる。

応性が高い活性酸素に変化する 1)。生理的な状態で絶えず

ROS による生体内の影響を反映するマーカーの一つに，

活性酸素種（Reactive Oxygen Species: ROS）が発生する他，8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-oxo-dG)があり，近年注目さ喫煙や激しい運動，放射線，紫外線，大気汚染物質などのれ て い る 。 8-oxo-dG は DNA を 構 成 す る 塩 基 の 一 つ

要因によっても発生する。ROS は，生体内で細菌などの異deoxyguanosine(dG)の 8 位がヒドロキシル化された構造を物除去や殺菌，シグナル伝達物質の役割を担っており 2)，

持つ DNA 酸化ストレスマーカーであり，dG は ROS によ

癌治療にも応用されている。癌治療の一つである放射線療

る酸化を受けやすいことが知られている。そのため，dG の法は，DNA 近傍で ROS を発生させ，がん細胞を殺すもの

主要な酸化生成物である 8-oxo-dG は ROS による生体へのである 3)。ROS は生体防御や抗腫瘍効果をもたらす一方，影響を鋭敏に反映すると考えられており，血清，尿など，DNA，脂質，蛋白質，酵素などの生体高分子と反応し，生多様なサンプルを対象に生体内酸化ストレスを評価するこ

体に障害を与えるという二面性をもっている 4, 5)。生体内とができる 7)。8-oxo-dG は，産生後に酵素によって細胞外へ放出され，血中へ移行する。そのため，血清や尿検体だ*1 弘前大学大学院保健学研究科博士課程
Hirosaki university graduate school of health sciences doctoral course〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*2 弘前大学大学院保健学研究科修士課程
Hirosaki university graduate school of health sciences master’s course〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*3 弘前大学医学部保健学科
Hirosaki university school of health sciences〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*4 弘前大学大学院保健学研究科
Hirosaki university graduate school of health sciences〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*5 むつ総合病院
Mutsu general hospital〒035-8601 青森県むつ市小川町 1-2-8 TEL:0175-22-4439
1-2-8, Kogawamachi, Mutsu-shi, Aomori, 035-8601, Japan

けでなく血漿成分を元につくられ，非侵襲的に採取できる
唾液を検体としても測定が可能であると考えた。しかし，
唾液中 8-oxo-dG の酸化ストレスマーカーとしての有用性について検討した報告は現時点では少ない。また，一般的に 8-oxo-dG の測定は尿検体を材料として ELISA 法を用いて行われているが，尿および血清でも測定可能な臨床検査用の測定器が開発され，簡便迅速に結果を得ることが可能となった。これまで尿や血清，唾液の成分の比較やこれらサンプルに含まれる酵素などの比較検討がなされているが，どのようなサンプルが 8-oxo-dG を鋭敏に反映するかについて検討した研究は，ほとんど見られていない。サンプルの種類によるマーカーの動態の違いを把握することは，正Correspondence Author h15gg606@hirosaki-u.ac.jpⓒ2017Health sciences Research.

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運動負荷に伴う酸化ストレスマーカー8-oxo-dG 及び炎症関連マーカー血清 MMPs の経時的変動～血清・唾液・尿検体の有用性の検討～

確な生体内酸化ストレス評価に繋がると考える。
先行研究で白血球の DNA 損傷が運動後に有意に増加したことが報告されていることから

8)，本研究では，酸化ス

通し不純物を除去した。プレート毎に 0.01-10 ng/ml の8-oxo-dG 標準液を用い標準曲線を作成し，マイクロプレー
トリーダー (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)で 450 nm におけ

トレス増大の一因となり得る運動負荷を実施し，血清，唾

る吸光度を測定した。得られた吸光度から検量線を作成し，液，新鮮尿の 8-oxo-dG を経時的に観察，解析した。さらに

血清 8-oxo-dG 濃度を算出した。各サンプル 3 つの平均値と身体影響の評価に対する有用性及び 8-oxo-dG を鋭敏に反標準偏差を求め，この平均値を測定値とした。

映するマーカーの選択についても検討した。また，炎症関2) 唾液サンプルの測定

連マーカーである，Matrix metalloproteinases (MMPs)の検討も併せて行った。

唾液サンプルを採取する際，数回の含嗽実施後にサンプルを採取することを依頼した。合計 21 個のサンプルとした。

MMPs は プ ロ テ ア ー ゼ に 属 し ， 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス

ペプシンを使用して唾液の粘性を処理した。唾液 8-oxo-dG(Extracellular matrix: ECM)の分解が主要な機能とされる。現濃度は，血清 8-oxo-dG 濃度の測定と同様に ELISA キット

在では 28 種類の MMPs が確認されており，皮膚や骨形成，を使用して ELISA 法にて測定し，その後，吸光度を測定し創傷治癒，炎症やがん組織などで，MMPs の作用と ECMた。得られた吸光度から検量線を作成し，唾液 8-oxo-dG 濃の代謝・変化により起こり得る種々の現象の関連が注目さ度を算出した。各サンプル 3 つの平均値と標準偏差を求め，れている。また，MMPs はその機能や構造により大きく 5

この平均値を測定値とした。

群に分類される。MMP-9 と MMP-2 はその中でゼラチナー

3) 尿サンプルの測定

ゼ群に属し，基底膜の構成成分である IV 型コラーゲンの

尿中 8-oxo-dG 値の測定は，尿中酸化ストレスマーカー測分解を行うことにより，骨格筋の筋繊維を活発化させるこ定システムリーダー ICR-001 (Techno Medica)によって行と に 大 き く 関 わ っ てい る 。最 近 の 研 究 で ， 骨 格筋 中 のった。この専用測定システムでは，8-oxo-dG にはイムノク

MMP-9，MMP-2 の活性が運動により変化すると報告され

ロマト法，クレアチニンには Jaffe 法が用いられている。

ているが，十分な検討はなされていない。このため，運動尿サンプルは，随時尿の中間尿を採取することを依頼し，による MMP-9，MMP-2 の活性の変化についての解析も併

採取後は速やかに測定を行った。合計 21 個のサンプルとしせて行った。

た。同システムのプロトコールに従い，サンプルは超純水
で 2 倍希釈し，その上で随時尿に対処するため，8-oxo-dG

Ⅱ．方法
1．対象

値はクレアチニン値で補正をした。各サンプルの 3 回の測定値の平均と標準偏差を求め，この平均値を測定値とした。
4) MMP-9，MMP-2 の活性の測定

健常な男子学生 7 人とした。血清 8-oxo-dG 濃度及び血清

MMP 群の検出には，酵素活性検出法であるゼラチンザ

MMPs の対象者は男子学生 6 人であり，平均年齢は 23.2±

イモグラフィー法を用いた。血液サンプルは 400G×30min

1.5 歳であった。唾液中及び尿中 8-oxo-dG 値の対象者は男で遠心，血清分離を行い，－80℃で保存した。凍結融解し子学生 7 人であり，23.0±1.4 歳であった。

た血清は，酵素量が多く反応が大きすぎるため，サンプル

2．運動負荷バッファー(PBS)で 10 倍希釈を行った。ゼラチンを最終濃1km あたり 6 分の設定で 6km 走を実施した。運動強度は
10 メッツ(metabolic equivalents)とした 9)。

度 1mg/ml で含む均一濃度ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動(SDS－PAGE)を行い，蛋白質を分離した。泳動

また，飲食による影響を抑えるため，運動負荷 5 時間前

条件は，泳動装置 1 つ・ゲル 2 枚では 150V，30A，120 分

から運動負荷 1 時間後まで絶食とし，水のみ自由摂取としで行った。泳動後のゲルは，洗浄後に 37℃で 6 時間静置した。運動時は水分摂取も禁止とした。

て，インキュベーションを行った。反応終了後にゲルを染

3．サンプル採取・測定

色し，その後，脱色を行った。ゲルはスキャナでバンドを血液，唾液，尿サンプルは，運動 1 時間前，運動 1 時間

検出し，バンドの濃度はフリーソフトの ImageJ を用いて定後，運動 24 時間後に採取した。

量した。各対象者それぞれ，運動 1 時間前の酵素濃度を基

1) 血液サンプルの測定

準(100％)とした。運動 1 時間前の酵素濃度と運動 1 時間後，

SST 採血管を使用し，各時点で採血をした。合計 18 個の運動 24 時間後の酵素濃度との比を算出し，これをゼラチン

サンプルとした。血液検体は 400G×30min で遠心，血清分

ザイモグラフィーにおける MMP 濃度とした。以下に作成

離し，－80℃で保存した。血清 8-oxo-dG 濃度は，以前に報したゼラチンザイモグラフィーの 1 例を示す(図 1)。

告された手順 10, 11, 12)で ELISA 法にて測定した。ELISA キ

4．統計解析

ット(Health Biomarkers Sweden AB, Stockholm, Sweden)を用

分析には，統計ソフト IBM SPSS Statistics 22 を用いた。

い，以前に報告された手順に則って 13)，800 µl の血清を各サンプルの運動 1 時間前，運動 1 時間後，運動 24 時間後

C18 固相抽出フィルター (Varian, Lake Forest, CA, USA)にの 3 時点の比較は repeated measure ANOVA 及び Tukey-HSDⓒ2017Health sciences Research.

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福

士，中

村，白

戸，田

中，伊

藤，野

沢，井

瀧，真里谷

の有意な変動はなかった。図 3 に対象者別のグラフを示す。
3．唾液中 8-oxo-dG 値
図 4 に各測定ポイントにおける唾液中 8-oxo-dG 値の経時的変動を示す。唾液中 8-oxo-dG 値は，運動 1 時間前 0.39±
0.30 ng/ml，運動 1 時間後 0.47±0.30 ng/ml，運動 24 時間後
0.49±0.31 ng/ml であった。3 時点における，唾液中 8-oxo-dG
図 1

ゼラチンザイモグラフィーの 1 例

値の有意な変動はなかった。図 5 に対象者別のグラフを示

MMP-9(上)及び MMP-2(下)のバンドが各レーンにみられる。

す。

左端のレーンはマーカーである。

4．尿中 8-oxo-dG / CRE 値
図 6 に各測定ポイントにおける尿中 8-oxo-dG / CRE 値の検定を行った。さらに，尿中 8-oxo-dG と炎症関連マーカー

経時的変動を示す。尿中 8-oxo-dG / CRE 値は，運動 1 時間

MMP-9 の変化量の相関をみるため，相関分析を行った。

前 17.9±4.1 ng/mgCRE，運動 1 時間後 43.0±14.1ng/mgCRE，

MMP-9 の活性の変化量は，ImageJ で定量した値から算出

運動 24 時間後 22.1±13.8 ng/mgCRE であった。運動 1 時間した。いずれも有意水準は 5%未満とした。

前に比べ運動 1 時間後に尿中 8-oxo-dG / CRE 値が有意に上

5．倫理的配慮

昇していた(p<0.01)。また，運動 1 時間後に比べ運動 24 時

本研究は，弘前大学大学院保健学研究科倫理委員会の承間後には尿中 8-oxo-dG / CRE 値が有意に減少していた認のもとに実施された(2014-001)。全ての対象者からイン(p<0.01)。運動 1 時間前と運動 24 時間後では，有意な変動

フォームドコンセントにより同意が得られた後，検体採取はなかった。図 7 に対象者別のグラフを示す。

時及び運動負荷前に対象者の体調を確認した。

5．MMP-9 及び MMP-2 の活性
1) MMP-9 の活性
図 8 に各測定ポイントにおける血清 MMP-9 の経時的変Ⅲ．結果

動を示す。データは運動 1 時間前を 100%とした。その結

1．対象者背景

果，運動 1 時間後 338.2%±115.1%，運動 24 時間後 121.8%

喫煙習慣のある学生はいなかった。また，運動習慣のある学生は 1 名であった。表 1 に対象者の背景を示す。
表 1 対象者背景 (n=7)
対象
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7

年齢
25
22
23
21
24
24
22

BMI
34.3
23.2
19.4
22.7
23.4
22.0
24.1

喫煙
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし

運動習慣
なし
なし
有り
なし
なし
なし
なし

±28.7%であった。MMP-9 の 3 時点の比較において，MMP-9の活性は，運動 1 時間前に比べ運動 1 時間後に有意に上昇していた(p<0.01)。また，運動 1 時間後に比べ運動 24 時間

測定サンプル
血液・唾液・尿血液・唾液・尿血液・唾液・尿血液・唾液・尿血液・唾液・尿血液・唾液・尿唾液・尿後には有意に減少していた(p<0.01)。運動 1 時間前と運動
24 時間後において，有意な変動はなかった。図 9 に対象者別のグラフを示す。
2) MMP-2 の活性
図 10 に各測定ポイントにおける血清 MMP-2 の経時的変動を示す。MMP-2 においても運動 1 時間前を 100%とした。

2．血清 8-oxo-dG 値

運動 1 時間後 111.3%±8.2%，運動 24 時間後は 105.1%±

図 2 に各測定ポイントにおける血清 8-oxo-dG 値の経時8.5%であった。3 時点の比較において，MMP-2 の活性は運的変動を示す。血清 8-oxo-dG 値は，運動 1 時間前 0.38±0.13

動 1 時間前に比べ運動 1 時間後に有意に上昇していた

ng/ml，運動 1 時間後 0.35±0.10 ng/ml，運動 24 時間後 0.35

(p<0.01)。しかし，運動 1 時間後と運動 24 時間後及び運動±0.16 ng/ml であった。3 時点における，血清 8-oxo-dG 値(ng/ml)
0.80

0.60

0.60
8-oxo-dG8-oxo-dG(ng/ml)
0.80

0.40

0.20

#1
#2
#3
#4
#5
#6

0.40
0.20

0.00

0.00
運動1時間前図 2

運動1時間後運動24時間後血清 8-oxo-dG の経時的変化ⓒ2017Health sciences Research.

運動1時間前図 3

運動1時間後 運動24時間後

血清 8-oxo-dG の経時的変化(対象者別)

15

運動負荷に伴う酸化ストレスマーカー8-oxo-dG 及び炎症関連マーカー血清 MMPs の経時的変動～血清・唾液・尿検体の有用性の検討～(ng/ml)(ng/ml)
1.20

1.00

1.00

0.80

0.80

8-oxo-dG8-oxo-dG

1.20

0.60
0.40

0.20

0.00
運動1時間前図 4

運動1時間後図 5**

運動1時間後 運動24時間後

唾液中 8-oxo-dG の経時的変化(対象者別)(ng/mgCRE)

**

70.0

** p＜0.01

40.0
30.0

8-oxo-dG

60.0
50.0

30.0
20.0

10.0

10.0

0.0

0.0
運動1時間前

運動1時間前 運動1時間後 運動24時間後

運動24時間後尿中 8-oxo-dG の経時的変化

**

500.0
450.0
400.0
350.0
300.0
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0

図7

**

** p＜0.01

運動1時間前図8

運動1時間後MMP-9 activity (% of control)

図6

運動1時間後尿中 8-oxo-dG の経時的変化(対象者別)

500.0
450.0
400.0
350.0
300.0
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0

#1
#2
#3
#4
#5
#6

運動1時間前

運動24時間後MMP-9 の経時的変化

図9

運動1時間後運動24時間後MMP-9 の経時的変化(対象者別)

150.0

**

150.0

#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7

40.0

20.0

100.0

50.0
** p＜0.01

0.0

MMP-2 activity (% of control)8-oxo-dG

運動1時間前(ng/mgCRE)

50.0

MMP-9 activity (% of control)

0.00

運動24時間後

唾液中 8-oxo-dG の経時的変化

60.0

MMP-2 activity (% of control)

0.60
0.40

0.20

70.0

#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7

#1
#2
#3
#4
#5
#6

100.0

50.0

0.0
運動1時間前図 10

運動1時間後運動24時間後MMP-2 の経時的変化ⓒ2017Health sciences Research.

運動1時間前図 11

運動1時間後運動24時間後MMP-2 の経時的変化(対象者別)

16

福

士，中

村，白

戸，田

中，伊

藤，野

沢，井

瀧，真里谷

1 時間前と運動 24 時間後において，有意な変動はなかった。

中では血清中の 8-oxo-dG 値が濃縮されている可能性が考

図 11 に対象者別のグラフを示す。

えられる。このことは，酸化ストレスマーカーとして唾液

6．尿中 8-oxo-dG と MMP-9 の相関は，血清に比べて酸化ストレスをより反映している可能性

尿中 8-oxo-dG と MMP-9 の運動前から運動 1 時間後の変を示す。血清の経時的変化とは異なり，運動 1 時間後及び化量の相関は，相関係数 r=0.20 であり，有意の相関はみら

24 時間後にも唾液中 8-oxo-dG 値が上昇する傾向が認められなかった。また，運動 1 時間後から 24 時間後の変化量はれた。

相関係数 r=－0.198 であり，有意の相関はみられなかった。

中島らは，Hartmann らが行った，非鍛錬者を対象にした
疲労困憊までの運動の実施による DNA 損傷の変化につい

Ⅳ．考察て，DNA 損傷がピークに達するには，一過性の運動後かなりの時間が必要と考えている。また，一過性の運動負荷後健常な男子学生を対象に 6km 走の運動負荷を加え，運動にみられる酸化ストレスの程度とその回復に要する時間は，

前後及び運動 24 間後に血清，唾液，尿を採取し，各サンプ

運動負荷の強度と深く関わっていることが示唆された事をル中の 8-oxo-dG 値の経時的変動を観察した。また，炎症関報告している 16)。今回実施した 6km 走では，DNA 損傷が連マーカーとして，MMP-9 及び MMP-2 の変動を観察した。

ピ ー ク に な る ま で に 時 間 を 要 し ， 24 時 間 後 の 唾 液 中

1．血清サンプル

8-oxo-dG 値上昇に関連した可能性はある。対象者別で見た

血清 8-oxo-dG 値は，運動 1 時間前，運動 1 時間後，運動場合，血清と同様に個人間のばらつきが目立った。

24 時間後で明らかな経時的変化は認められなかった。対象

一部の対象者には，運動後に唾液中 8-oxo-dG 値が上昇

者別で血清 8-oxo-dG 値の経時的変化をみると，ほとんどのし，24 時間後には唾液中 8-oxo-dG 値が減少する傾向が認

対象者は運動前後で変化が認められず，一部の対象者は，められた。これは，酸素消費量の増加に伴い，活性酸素の運動 24 時間後に血清 8-oxo-dG 濃度が上昇，又は運動直後生成が促進され，DNA の酸化的損傷が促進されたこと，及に減少しており，個人間のばらつきが目立った。8-oxo-dG

び生体内に備わる抗酸化システムによる修復の影響である

は年齢，運動習慣，代謝機能，喫煙，肥満，ストレスや生と考えられる。また，全体の結果と同様，運動 1 時間後よ活習慣などによって個人差が生じるとされるが，今回の結り運動 24 時間後に唾液中 8-oxo-dG 値が上昇する傾向が認

果は，これらを反映していた可能性がある。Mats ら 10)は，められた。これは，前述のように DNA 損傷がピークにな

最大心拍数 80%の高強度の運動負荷を 20 分間実施し，そるまでに時間がかかった可能性があり，また，修復レベルの結果，血清 8-oxo-dG レベルが有意に上昇したことを報告の個人差により，回復が間に合わず，減少しなかった可能している。しかし，本研究で同様の変化が認められたのは，性もあると考えられる。

6 例中 4 例(#1, #2, #4, #6)であった。残り 2 例のうち 1 例に一方，運動 1 時間前に比べて運動 1 時間後に唾液中関しては，8-oxo-dG の産生増大，代謝機能低下などの可能

8-oxo-dG 値が減少した理由として，運動誘発性発汗による性があるが，運動直後に大きな低下をみた 1 例にはこの考汗への排泄の可能性がある。唾液は耳下腺・顎下腺・舌下えが適合せず，解釈が難しい。本研究で実施した運動負荷

腺と多数の小唾液腺から漿液と粘液が分泌され，交感神経において，対象者の中には途中歩いてしまった学生もいた。

と副交感神経の二重支配を受けており，副交感神経が優位

そのため，十分な運動負荷ではなかった可能性がある。血に働くと，水やイオンが多い唾液が分泌される 14)。汗も唾

清 8-oxo-dG 値による酸化ストレスを評価する場合，高強度

液 同 様 ， 血 漿 を 元 に作 ら れて い る た め ， 運 動 中の 汗 にの運動負荷を十分かつ出来るだけ均等に行うことが必要と8-oxo-dG が排泄されたことで血中 8-oxo-dG 値が減少し，考えられた。

その血液から唾液中 8-oxo-dG 値が作られた可能性がある

2．唾液サンプルと考える。さらに，発汗量に水分摂取量の違いが影響を与唾液中 8-oxo-dG 値も，血清と同様に運動 1 時間前，運えた可能性もある。運動時の水分摂取と発汗に関する先行

動 1 時間後，運動 24 時間後の 3 時点における明らかな経時研究では，運動時に水分を摂取した群は非摂取群に比較し，的変化は認められなかった。しかし，血清に比べ唾液中発汗量が多かったことを報告している 17)。今回，運動時の8-oxo-dG 値は高値を示した。

水分摂取は禁止としたため，運動時の水分摂取による発汗

唾液は主に腺房細胞で産生される。一部の唾液成分は，量への影響は少ないと考えられる。しかしながら，運動負副交感神経終末から分泌されるアセチルコリンが唾液腺細

荷前の水分摂取は自由であったため，少なからず発汗量に胞の基底側膜のムスカリン性受容体に結合することで，血影響を与えた可能性が考えられる。運動後の水分摂取につ漿中の水が唾液として分泌される 14, 15)。人体は交感神経といては，水分を多く摂取した対象者は，体液量が増加し，副交感神経の二重支配を受けているが，採血が実施された

尿量の増加に繋がった可能性がある。そのため，運動 1 時

1 時間後では，交感神経支配が次第に減弱し副交感神経優間後の唾液採取までに尿排泄量が多かった対象者は，尿中位となり，その影響により，血漿成分を元に作られる唾液

に 8-oxo-dG が排泄されたことも考えられる。

ⓒ2017Health sciences Research.

17

運動負荷に伴う酸化ストレスマーカー8-oxo-dG 及び炎症関連マーカー血清 MMPs の経時的変動～血清・唾液・尿検体の有用性の検討～

田中らは，唾液分泌量，粘度，組成などの変動や個人差たい。

が大きく，唾液採取前のうがいによっても唾液を希釈してMMP-2 の経時的変動については，MMP-9 と比較すると濃度変化が生じる点，それらを補正する成分が確立されてやや目立たなかったものの，運動前後の活性の変動につい

18)

。これらの

ては，同様の結果が得られた。MMP-2 の発現は，主に由来

留意点に加え，発汗による唾液中 8-oxo-dG 値の排泄の可する線維芽細胞が運動刺激により活性化されたためと考え

能性を踏まえると，酸化ストレス増大の一因となり得る運

られるが，これについては増加をみないとする報告もあり

動負荷の身体影響評価における唾液検体の利用に関しては，

26)

未だ検討すべき因子が多いといえる。

5．運動習慣と 8-oxo-dG の関係

いない点に留意する必要があると述べている，今後さらに詳しい検討が必要と考えられた。
運動習慣のある学生 1 名は，その他の学生よりも，尿中3．尿サンプル
尿中 8-oxo-dG / CRE 値は運動 1 時間前に比べ運動１時間

8-oxo-dG の変動が小さかった。適度な運動や日常的にトレ後で有意に上昇し，運動 24 時間後には運動 1 時間前と同程ーニングをしている者は，抗酸化能力の働きが高くなると度まで有意に減少していた。尿中 8-oxo-dG 値は運動負荷にいうことが明らかにされつつある。また，異なる強度の持より増加することが知られており 16, 19, 20, 21, 22)，今回の結久的運動における生理的応答と酸化ストレス度及び抗酸化

果は，先行研究と同様の結果であった。この変動は，唾液

力との関係を調べた研究では，運動強度の増加に伴い，抗中 8-oxo-dG 値で述べたように，運動による酸化ストレス

酸化力が高まり酸化ストレス度の増加を軽減していることの上昇と考える。また，運動 24 時間後に尿中 8-oxo-dG / CREが示唆されている 27)。したがって，運動習慣のある学生は，値が減少したことも，前述の通り，生体内に備わる抗酸化抗酸化能力が高かったため，8-oxo-dG の増加が軽減され，システムによる修復の影響と考える。

また修復能も強かったため，変動が小さかったと考えられ

対象者別で見た場合，対象者の中には運動前後の尿中8-oxo-dG / CRE 値の変動がほとんど認められない人や運る。
6．尿中 8-oxo-dG と MMP-9 の関係

動 1 時間後から運動 24 時間後の変動が小さい人がいた。し

尿中 8-oxo-dG と MMP-9 では何れも運動負荷後に有意なかし，血清や唾液サンプルで認められたような，運動負荷増加を示し，24 時間後には有意な減少を示したが，運動負後の 8-oxo-dG の低下は尿サンプルで認められなかった。尿荷前後の変化量に対して行った Spearman の順位相関分析，

中 8-oxo-dG 排泄量は男性では年齢による差がないとされ及び運動 1 時間後から 24 時間後の変化量に対して行ったていることから 16, 23)，個人差が生じた要因として運動習慣

Pearson の相関分析では，有意の相関はなかった。相関が示

や食生活，運動による消費カロリー，抗酸化システムによされなかったことは，対象者数が少なかったことが要因とる修復レベルの低下などが関係していると考えられ，今回してあげられる。しかしながら，よく合致した経時的変化の結果はこれらに矛盾しないものであった。今回，尿中を示したことから，好中球由来の酵素である MMP-9 の活

8-oxo-dG 値を測定するにあたり，新鮮尿を採取後，速やか性の変化は，同様に好中球から発生する活性酸素などによに測定を行った。運動前後で有意な変動が見られた理由とり誘発される酸化ストレスと関連する可能性が高いと考えしては，測定した尿検体は凍結保存していないため，検体られた。

の保存状態が与える測定結果への影響が少なかったこと，

7．本研究の限界と課題

値の安定性が得られたことが考えられる。また，8-oxo-dG

本研究では血清，唾液，尿サンプルを用いて，運動負荷

は修復酵素系異物として切り出され，代謝されずに血液をに伴う酸化ストレスマーカー，8-oxo-dG の経時的変動及び経て尿に排泄される 2,16)ことも，安定性の要因の一つと考

MMP の変動を観察し，身体的影響の評価に有用なサンプえられる。以上のことから，新鮮尿は血清及び唾液に比較

ルの検討を行った。6km 走の運動負荷を加えた際，最後まし，酸化ストレスの程度を鋭敏に反映することが示唆されで走りきった学生も居れば，途中で歩いてしまった学生もた。

居り，また 1km あたり 6 分のペースから遅れ，6 分半～7

4．MMP-9 及び MMP-2

分のペースになった学生もいた。運動負荷におけるばらつ

MMP-9 の経時的変化について，運動前と運動 1 時間後のきがみられたことは本研究における限界と言え，運動負荷

間で MMP-9 の活性は有意な増加を示した。これは，運動の内容については今後検討する必要がある。また対象者数

負荷により血液中の好中球が増加，活性化され，それに伴も十分とは言えず，より多くの対象を用いての研究を検討

い MMP-9 の活性も増大した可能性があると考えられる
25)

24,

すべきであろう。

。運動 24 時間後には，ほぼ運動前のレベルまで回復し，一方，放射線被ばくによって実験動物の生体内 ROS 産生

その増加は一過性であった。MMP-9 は一過性の運動負荷にが過剰となり，それに伴う酸化ストレスの増大がみられる

よる生体内の現象を反映することが確認された。しかし本ことが報告されている 28)。8-oxo-dG を指標とした酸化的実験では，血液中の好中球数やその機能の変化を確認して損傷量評価やリアルタイム PCR 法を用いた DNA 損傷の定いない。MMP-9 増加の機序については今後の検討課題とし量化などが試みられていることから 29)，今後は放射線治療ⓒ2017Health sciences Research.

18

福

士，中

村，白

戸，田

中，伊

患者など臨床例における 8-oxo-dG の変動についても検討

藤，野

12)

していきたい。
13)

Ⅴ．おわりに複数の手法による酸化ストレスマーカー8-oxo-dG の測14)定を行った結果，新鮮尿サンプルを用いて測定し，CRE 補15)正を加えた尿中 8-oxo-dG の経時的変動が炎症関連マーカ
ー血清 MMP-9 の変動とよく合致していた。運動に伴う身16)

体的影響の評価におけるサンプルとして，新鮮尿の有用性が示唆された。

17)
18)

謝辞
本研究を行うにあたり，ご協力いただきました本学医学

19)

部保健学科学生の皆さんに深く感謝いたします。
利益相反

20)

本論文について他者との利益相反はありません。
21)

引用文献
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19運動負荷に伴う酸化ストレスマーカー8-oxo-dG 及び炎症関連マーカー血清 MMPs の経時的変動～血清・唾液・尿検体の有用性の検討～【Original article】
Serial changes of oxidative stress marker
8-hydroxy-2’-deoxyguanosine and inflammation-related markers
matrix metalloproteinases induced by exercise load
~A usability study on serum, saliva and urine samples~
YASUYO FUKUSHI*1 AYUMI NAKAMURA*2 YUKI SHIROTO*3KENTO
TANAKA*3 TAKUYA ITO*3 YUKI NOZAWA*3 CHIEKO ITAKI*4
YASUSHI MARIYA*4,5（Received December 8, 2016 ; Accepted February 20, 2017）

Abstract ： The purpose of this study was to analyze serial changes of an oxidative stress marker
8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-oxo-dG) employing serum, saliva and urine and serum matrix metalloproteinases (MMP-2
and MMP-9) related to inflammation, which were induced by exercise load, and to determine appropriate samples and tools
reflecting oxidative stress in vivo based on the results. Seven healthy male volunteers ran 6 km at a rate of pace with 1 km insix minutes, of which the exercise intensity was corresponded to 10 metabolic equivalents. All samples were collected at 1hour before, 1 hour after and 24 hours after the exercise and analyzed by immunoassay for 8-oxo-dG or gelatin zymography
for MMP-2 and -9. No significant changes in the values of serum and salivary 8-oxo-dG were observed at the three points.
However, the value of urinary 8-oxo-dG significantly increased 1 hour after exercise, and then significantly decreased 24
hours after exercise to the same level 1 hour before exercise. The level of MMP-9 activity showed the similar serial changewith that for urinary 8-oxo-dG. It appeared that exercise-induced oxidative stress in vivo could be detected by urinary
8-oxo-dG.
Keywords: 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-oxo-dG), oxidative stress, exercise load, urine, matrix metalloproteinaseⓒ2017Health sciences Research.

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