本研究は、日本農芸化学会 2021 年度大会（仙台）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のためオンライン形式で実施）に応募された研究のうち、本誌編集委員会

日本農芸化学会が優れた研究として選定した６題の発表のうちの一つです。

バクテリアによるバイオプラスチックの合成と分解
愛媛大学附属高等学校理科部プラガールズ
二宮妃奈多，門屋知里，森
私たちは海洋性細菌に生分解性プラスチックを作らせることで， 海 洋 マ イ ク ロ プ ラ ス チ ッ ク 問 題 を 解 決 し よ う と 考 え た．

化学と生物●

その結果，天日塩から海洋性細菌を単離でき，菌株の最適培養条件下で生分解性プラスチックの合成を確認した．その物
質 は 細 菌 の 貯 蔵 栄 養 分 で あ る PHB（ポ リ ヒ ド ロ キ シ 酪 酸）

美空（顧問：中川和倫）
解される生分解性プラスチックがある．
本研究は SDGs の 17 の目標のうち，「産業と技術革新の基盤をつくろう」，「つくる責任

豊かさを守ろう」，「陸の豊かさも守ろう」等に関係すであると推定された．また，バイオマスプラスチック配合レる．

ジ袋の土壌中での分解性についても調べたところ，ほとんど【方法および結果】分解されないことがわかった．

つかう責任」，「海の1.

天日塩からの海洋性細菌の単離
海洋性細菌を単離する試料として，市販の天日塩を用本研究の目的・方法および結果【目的】
現在，海洋には毎年 1000 万トン以上のプラスチックいた．天日塩は加熱されていないので耐塩性・好塩性細菌が休眠しており，世界中の産地とする試料が入手できるからである．海洋性細菌用のマリンブロス培地（塩分2％含有）に天日塩 5％を溶解させて 37 C で 2 日間（液ごみが流入し，マイクロプラスチックによる汚染が問題体培地が濁るまで），液体培養した．次に寒天 2％添加になっている (1)．私たちは，海洋性細菌に生分解性プラで固化させたマリンブロス平板培地に液体培養で増殖しスチックを効率よく経済的に合成させる方法を考えた．

た細菌を塗布して培養し，形成されたコロニーの形状

すでに存在するマイクロプラスチックを減らすことはで（輪郭の形，立体感，表面の滑らかさなど）や色調（白きないが，海洋性細菌が作る生分解性プラスチックなら色・有色，透明感など）をもとに目視で菌株の単離を海の微生物によって確実に分解されるはずである．今行った．

後，日常生活で利用するプラスチックを海洋性細菌が作

その結果，12 種類の天日塩から 66 種の菌株を得るこる生分解性プラスチックに置き変えることで，上の問題とができた（ゲノム解析ができなかったので同一種を別の解決につながることが期待される．そこで本研究で種に分類している可能性もある）．なお，使用した天日は，生分解性プラスチックを作る海洋性細菌の単離とそ塩の産地は，日本（2 種），中国，オーストラリア（2の産生条件の検討を目的とした．

種），メキシコ，アルゼンチン，南アフリカ，スペイン，

また，2020 年 7 月からのレジ袋有料化に伴って普及しイタリア，フランス（2 種）であり，いずれの天日塩かたバイオマスプラスチック配合レジ袋が本当に環境にやらも種数の差はあるが菌株を得ることができた．

さしいのかを調べることにした．なお，バイオプラス2.

培養条件の検討

チックには，資源循環型だが生分解性があるとは限らな得られた各菌株の最適培養条件を調べるために pH，いバイオマスプラスチックと，二酸化炭素と水に自然分栄養分の C／N 比，塩分濃度を変化させた培地で培養し化学と生物 Vol. 59, No. 10, 2021

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日本農芸化学会●

化学と生物た．まず，生分解性プラスチックの材料になるポリヒド

く，10 倍希釈でも増殖が良好な菌株もあった．多くのロキシ酪酸（PHB）やポリ乳酸（PLA）を菌体内に合海洋性細菌は貧栄養性の環境に生育しているためだと考成・蓄積させる際，アルカリ性の環境だと酸を合成してえられる．さらに，いずれの菌株も耐塩性細菌ばかりで菌体内を中和すると考え，炭酸ナトリウムで培地を pHあり，塩分 15％添加の方が最適となる好塩性細菌も7.5, 9.5, 10.5 に 調 整 し て 比 較 し た． 次 に， 培 地 養 分 のあった．得られた菌株は天日塩 5％添加培養による単離C／N 比改変を行った．これは酸合成の材料になる C をであり，天日塩中（飽和食塩水中）でも死滅していない増やし，タンパク質合成が優先される N を減らすためでことから，これは当然と思われる．最も多くの菌株で最ある．そこで，マリンブロス培地を 5 倍，10 倍に希釈し適であった pH 7.5 の弱アルカリ性，培地 5 倍希釈＋スク（N 減），糖を 5％添加した（C 増）．グルコース添加だとロース 5％添加，塩分 5％添加を基本条件として培養し，滅菌時にメイラード褐変が起こり観察しにくくなったの増殖に優れた 10 株を選抜した．
（表 1）

でスクロース添加とした．なお，マリンブロス培地は希3.

菌体内蓄積物質の抽出と物質の特定

釈後も塩分濃度が 2％になるように調整した．培地を希菌体内の蓄積物質はレフレルメチレンブルー染色，菌釈しても問題がなければ生産の経済性が向上する．さら体外への分泌物は墨汁染色を行った後，顕微鏡観察で確に，食塩を 5％，10％，15％添加した高浸透圧培地でも認した．菌体内蓄積物質の抽出には特許公報で公開され比較した．菌体内の浸透圧を上げるために貯蔵物質を蓄ていた方法（0.5 M 水酸化ナトリウムで溶解後，エタ積しやすくなると考えたからである．

ノールで沈殿）を用いた (2)．その結果，多くの菌株からその結果，弱アルカリ性が最適条件の菌株が多かった

菌体内蓄積物質を抽出できたが，分泌物からの抽出物はが，pH 10.5 を最適とする好アルカリ性細菌も比較的多なかった．ここで上記の選抜 10 株のうち，蓄積物質のかった．これは細菌の細胞膜における耐アルカリ性と耐収量が多かった 3 株（イタリア由来の I3-1 株，I3-3 株，塩性の獲得過程で水素イオンを輸送する Na＋/H＋イオン

南アフリカ由来の SA3-6 株）を最優良株として選抜しポーターの仕組みが似ているからではないだろうか．また．

た，C／N 比改変では糖を添加した方の増殖が良好であ抽出物の特定は本校の設備では不可能だったので，タり，培地の 5 倍希釈まで増殖には影響がない菌株が多ンパク質，セルロース，デンプン等である可能性を除去

表 1 ■ 培養条件の検討①アルカリ性培地における代表的 10 菌株の増殖
pH

I3-3I3-1SA3-6SF3-3C3-14C10-4SA3-1F3-1C3-12C3-137.5
9.5
10.5＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋（＋：増殖速度小，＋＋：増殖速度中，＋＋＋：増殖速度大）＜目視による＞② C／N 比改変培地における代表的 10 菌株の増殖
N 濃度

I3-3I3-1SA3-6SF3-3C3-14C10-4SA3-1F3-1C3-12C3-13

100％
20％
10％＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋−＋＋＋＋＋＋＋＋−＋＋−＋＋＋＋＋＋（＋：増殖速度小，＋＋：増殖速度中，＋＋＋：増殖速度大）＜目視による＞ N 量を減らすために培地を 5 倍および 10 倍希釈し，未希釈の培地を 100％とした相対量（N 濃度）で表記した．C 量を増やすためにスクロースを 5％添加した．
③高浸透圧培地における代表的 10 菌株の増殖
塩分I3-3I3-1SA3-6SF3-3C3-14C10-4SA3-1F3-1C3-12C3-137％
12％17％＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋（＋：増殖速度小，＋＋：増殖速度中，＋＋＋：増殖速度大）＜目視による＞塩分を 2％含有するマリンブロス培地に食塩 5％，10％，15％を添加した．

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化学と生物 Vol. 59, No. 10, 2021

表 2 ■ 培地希釈とスクロース濃度による PHB 収量＜I3-1 株＞

培地へのスクロース添加率＜I3-3 株＞

培地へのスクロース添加率

培地の希釈

0％5％10％15％培地の希釈

0％5％10％15％培地希釈なし
培地 5 倍希釈
培地 10 倍希釈＋＋＋−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋−＋＋＋培地希釈なし
培地 5 倍希釈
培地 10 倍希釈＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋（−：抽出なし，＋：抽出少量，＋＋：抽出多量）＜目視による＞するためにプロテアーゼ，セルラーゼ，アミラーゼ等の●日本農芸化学会

各種分解酵素を作用させた．その後も抽出物が分解されずに残っていたことから，タンパク質，セルロース，デ土壌中

10％

25％

30％

50％

90％

ンプン等ではないことを確認した．ただし，エタノール

1 カ月

̶̶̶

̶

3 カ月

1 mm の穴数個

1 mm の穴数個

4 mm の穴1個数個の穴に増̶̶による抽出物なので核酸の混入が避けられないと思われたため，メチルグリーン・ピロニン染色を行ったところ，I3-1 株の抽出物に DNA の混在が認められた．そこ
で，デオキシリボヌクレアーゼで処理した後に再度染色

レジ袋を 5 cm × 5 cm に切り取ってプラスチックシートに貼り付
け，畑の土壌中に埋めて経過を観察した．

を行うと DNA が混在していない抽出物が得られた．最後に，どの菌株からの抽出物もクロロホルムに完全に溶後には完全に分解されていた．日本における生分解性プ

解 し， メ タ ノ ー ルで析出したことから，この物 質 はラスチックの定義 (3) は「コンポスト中で 3 カ月以内に 6PHB であると推定された．

割以上の分解」（ヨーロッパの基準は 2 年以内に 9 割以上PHB 生産性の向上の分解）なので，抽出した PHB には十分な生分解性が4.

選抜した最優良 3 株について，マリンブロス培地の希釈濃度とスクロース添加量を変えて培養し，菌体内に化学と生物

表 3 ■ 畑の土壌下におけるレジ袋の分解レジ袋のバイオマスプ
ラスチック配合率あると言える．
6.

バイオマスプラスチック配合レジ袋の生分解性

PHB が蓄積されやすい条件を調べた（塩分は培地 2％＋バイオマスプラスチックの配合率が異なるレジ袋を食塩 5％添加に固定した）．その結果，I3-1 株，I3-3 株と5 cm 四方に切ってプラスチックシートに貼り付け，畑も培地を希釈しても菌体の増殖には影響がなかったがの土壌中に埋めて分解速度を調べた．その結果，配合率PHB の収量は低下する傾向が認められた．しかし，培10％，25％，30％の袋には 3 カ月でわずかな分解があ

地希釈時にスクロースを添加すると PHB の収量が回復

り，30％配合の場合の分解性が最も高かったが，50％，し た．I3-1 株，I3-3 株 と も 培 地 10 倍 希 釈＋ス ク ロ ー ス

90％といった高配合率の袋は分解が全く認められなかっ

5％および 10％添加で経済的な PHB 生産が可能になった

た（表 3）．バイオマスプラスチックの配合率が高い（表 2）．それに対して，SA3-6 株は通常の培養での PHB50％，90％の袋は，配合率が 30％以下の袋に比べて手収量は I3-1 株，I3-3 株より多かったが，培地を希釈する

触りがごわごわと分厚く堅かったことから，頑丈に作らと PHB 収量が大幅に低下し，スクロースを添加してもれていることが推察された．

効果がなかった．また，培養時間が I3-1 株，I3-3 株の 1

そのため，私たちは植物材料から 100％バイオマスプ〜2 日に対して SA3-6 株は 3〜4 日と長時間を要するといラスチックを実際に合成するため，デンプンと食酢とグう欠点があった．

リセリンを水に混ぜて加熱処理し，冷暗所で 2 日間静置5.

抽出した PHB の性能と生分解性して固化させた (4)．この 100％バイオマスプラスチック

菌体から抽出した PHB をビニールの表面に薄く塗りの薄膜は土壌中で分解した．このことから，バイオマス広げ，乾燥してから曲げ伸ばしを行ったところ，プラスプラスチック配合レジ袋の生分解性は，バイオマスプラチックと同様の可塑性や伸縮性があった．また，抽出しスチック以外の部分を占める「分解されにくいプラスた沈殿状の PHB を寒天培地上に塗り広げ，その中央にチック成分」に左右されると推定された．バイオマスプ

堆肥中から単離した細菌を接種して培養したところ，数ラスチックはそのままではもろく，強度や耐久性を向上

日後にコロニー周囲の PHB が分解されていた．さらに，させる必要がある．配合率を高くするほど製品を頑丈に抽出した PHB をプラスチックシート上に塗り広げて乾作る必要があり，配合率の高さが生分解性に反映されに燥させた後に畑の土壌中に埋めておいたところ，3 カ月くいのではないだろうか．実際，最も分解が速かった配化学と生物 Vol. 59, No. 10, 2021529

合率 30％のレジ袋でも，土壌中で分解されない製品もに応用したい．現在は徐放性肥料カプセルへの利用を考あった．

えている．これはポリエチレンで肥料をコーティングしバイオマスプラスチックは二酸化炭素削減に効果があた直径 2〜3 mm の農業製品で，水田に散布されて肥料ると宣伝されているが，実際にデンプンから自作してみが溶出した後に河川・海洋に流出する．愛媛県の海浜にると，安価に大量生産ができるが，製造過程に膨大なエ漂着するマイクロプラスチックの約 4 割（重量比）が本ネルギー（電力）が必要なことから，実際にどれだけのカプセル由来であり，水田面積が広い地域ほど多い (5)．

二酸化炭素削減につながるのか疑問に思った．その点，今後，本カプセルの製造企業に対して生分解性プラス細菌による PHB 合成は多量の電力消費や加熱処理が不チック化の提案を行う予定である．

要なので環境負荷が少ないと感じた．また，最近では謝辞：
・本研究は（株）リバネスの「サイエンスキャッスル研究費 2020 アサヒ飲料賞」に採択され，2020 年 6 月〜12 月にアサヒ飲料（株）商品開発研究所の竹内曜様からリモートで定期的にアドバイスをいただきました．
・（株）日立ハイテクノロジーズの「理科教育支援プログラム」により，2020 年 6 月〜8 月に卓上小型電子顕微鏡の無償貸与を受けました．
・本研究のメンバーは，愛媛大学 GSC（グローバルサイエンスキャンパス）で研究指導を受けています．

PHB を医薬品や飼料に利用する特許も多数出願されて日本農芸化学会おり，バイオプラスチック以外の用途も多い．

本研究の意義と展望
細菌による PHB の合成・蓄積は以前から知られていたが，海洋性細菌を利用した PHB の産業的な生産の前例はなかった．本研究では，世界中を産地とする市販の天日塩から優良な菌株を得られたこと，最適な培養・生●産条件を検討できた．また，培地を希釈して培養しても糖の添加で PHB 産生が良好になることから，経済的な生産が可能になる．さらに，レジ袋の土壌中における生分解性には，バイオマスプラスチックの配合率の高さが化学と生物必ずしも反映されないという意外な結果も得られた．
今後は，菌株の種の同定や PHB と推定された抽出物質の分子量の測定を行いたい．また，プラスチックの生分解性の高さは，製品の強度や耐久性とは相反するので，早期の分解が望まれる使い捨ての小型プラスチック

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文献1) 中嶋亮太： 海洋プラスチック汚染−『プラなし』博士，
ごみを語る ，岩波書店，2019.
2) 海洋研究開発機構，信州大学，東京海洋大学：「特許公報（B2）第 5887062 号」(2016).
3) 日本化学会編： 持続可能社会をつくるバイオプラスチッ
ク−バイオマス材料と生分解性機能の応用化と普及に向けて ，化学同人，2020.
4) wikiHow 編集チーム： バイオプラスチックを作る 3 つの方法 ，https://www.wikihow.jp
5) 愛媛県立東温高等学校 曽根 伸： 愛媛高校理科 愛媛
県の海岸におけるマイクロプラスチックの汚染調査 ，愛媛県高等学校教育研究会・理科部会，57, 2020.
Copyright © 2021 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.59.527

化学と生物 Vol. 59, No. 10, 2021