HILIC-MS/MS を用いた抗インフルエンザウイルス薬同時分析による河川水中濃度
大阪産業大学工学部○高浪 龍平、谷口 省吾、林 新太郎、尾崎 博明

HILIC-tandem mass spectrometry for quantification of Influenza antivirus drugs in river water
Ryohei TAKANAMI, Shogo TANIGUCHI, Shintarou HAYASHI, Hiroaki OZAKI (Dept. of Civil Eng. /Osaka Sangyo Univ.)

1. はじめに
近年、医薬品や身体ケア製品由来物質（PPCPs）による環境汚染ならびに耐性菌の発生が懸念され、それらの環境動態が注目されている。これらは環境中にごく微量に存在し、前処理におけるクリーンアップや濃縮、高感度な質量分析計による測定が必要となる。特に医薬品の測定では、その多くが塩基性化合物や両性化合物であり、逆相カラムで保持されないか保持された場合でもシャープなピークが得られない問題があるため測定を困難にしている。
本研究では、HILIC（親水性相互作用クロマトグラフィー）－MS/MS による分析方法を用い、抗インフルエンザウイルス薬であるタミフル（OP：Oseltamivir Phosphate）、タミフル代謝物（OC：Oseltamivir Carboxylate）およびリレンザ（ZH：Zanamivir Hydrate）の同時分析により大阪府東部を流域とする寝屋川河川水中濃度を測定した。

2. 試料および分析方法
河川水の採取は 2012 年 1 月 10 日（第 2 週）、1 月 27 日（第4 週）、2 月 10 日（第 6 週）、2 月 22 日（第 8 週）および 3 月28 日（第 13 週）において図 1 に示す 3 地点（St.1：極楽橋、St.2：上萱島橋、St.3：住道大橋）で行った。
試料 100ml をろ過し、ろ過残渣の超音波抽出メタノール液をろ液と混合し、アスコルビン酸で pH3.5 に調整した。標準添加法および内部標準法による測定のため、各試料に適宜 OP、OC、ZH の標準物質およびラベル化体物質を添加後、固相抽出を行った。固相は Oasis MCX（Waters 製、充填剤量 500mg）を用い、メタノールおよび精製水でコンディショニングを行った後、試料を 1ml/min の流速で通水した。通水後、精製水およびメタノールで固相を洗浄し、16%アンモニア水含有メタノール溶液で溶出した。溶出液は 40℃加熱、窒素気流下で0.5ml まで濃縮し、メタノールで 1ml に定容した。
OP、OC および ZH は LC/MS/MS で測定した。LC は Waters
製 ACQUITY UPLC を用い、分析カラムは C18 カラム（Waters製 ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100mm, 1.7μm））、T3 カラム（Waters 製 ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100mm, 1.7μm））、HILIC カラム（Waters 製 ACQUITY UPLC BEH HILIC（2.1×100mm, 1.7μm））の 3 種について分離を検討した。なお、C18 カラムは逆相、T3 カラムは、C18 カラムと同様の逆相で C18 カラムより保持能が高い。HILIC カラムは親水性相互作用クロマトグラフィーであり、逆相系の分離と逆の挙動を示す。移動相は 10mM 酢酸アンモニウムを含有するアセトニトリルおよび精製水を用い、C18 および T3 カラム使用時は、移動相におけるアセトニトリルの割合が 5%から 50%となるようにグラジエントさせた。HILIC カラム使用時は、移動相におけるアセトニトリルの割合が 95%から 50%となるようにグラジエントさせた。試料の注入量は 1μl とし、流量は0.7ml/min（C18 カラムのみ 0.6ml/min）、カラムオーブンの温度は 30℃とした。
MS/MS は Waters 製 ACQUITY TQD を用い、ESI+モードでイオン化させ、MRM モードで測定を行った。MS/MS の測定
条件および OP、OC、ZH の検出下限（S/N 比の 3 倍）、定量下限（S/N 比の 10 倍）を表 1 に示す。

図1

採取地点

表 1 MS/MS の測定条件
イオン化法
ESl positive
測定方法
MRM
注入量1μlOP モニターイオン
313.14 > 225.14（ラベル化体）316.14 > 228.14
OC モニターイオン
285.10 > 197.10（ラベル化体）288.10 > 200.10
ZH モニターイオン
332.96 > 59.96（ラベル化体）335.96 > 62.96
検出・定量下限
検出下限
OP
0.75
OC および ZH(ng/l)
7.5
定量下限
OP
2.5
OC および ZH(ng/l)25.0

図2

分析カラム別のクロマトグラム（A：C18 カラム、B：T3 カラム、C：HILIC カラム、
①ZH のピーク、②OC のピーク、③OP のピーク）

50（定点あたり⼈数）

403020100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15週
図3大阪府下のインフルエンザ患者数

250

St.2St.3濃度（ng/l）

200
15010050023

図4456 7 8 9測定週（週）

10 11 12 13

St.2 および St.3 における OP 濃度

750

St.2St.3濃度（ng/l）

600
450
300
150023図545

6 7 8 9測定週（週）

10 11 12 13

St.2 および St.3 における OC 濃度

75

St.2

St.360濃度（ng/l）

OP、OC、ZH 標準物質混合溶液（200ng/l）を 1μl 注入した際の分析カラム別のクロマトグラムを図 2 に示す。また、同じ条件を用いてメタノールを 5μl 注入し、カラム通水時間（t0）を測定した。C18、T3 および HILIC カラムにおける t0はそれぞれ、0.46、0.39 および 0.47min であった。C18 およびT3 カラムでは、ZH のピークがそれぞれの t0 付近にあり、ZHがカラムによって分離されずに溶出していることがわかる。
一方、HILIC カラムでは C18 および T3 カラムと溶出順が逆になり、OP のピークが最初であった。このピークが測定された時間は 1.56min であり、HILIC カラムの t0 である 0.47minから十分な時間差があり、HILIC カラムにおいて OP、OC、ZH 全ての分離が可能であった。このことより、河川水試料の測定には HILIC カラムを用いることとした。
大阪府下における 2012 年 1 月 2 日（第 1 週）からのイン
フルエンザ患者数の経時変化を図 3 に示す。なお、インフル
エンザ患者数は、週ごとに定点（医療機関）で集計されたイ
ンフルエンザ患者発生数を定点数で割った、定点あたりの人数で示した。この情報は大阪府感染症情報センターより提供を受けたものである。第 2 週から急激に患者数が増大し、第4 週から第 5 週にかけて最大となった。よってこの時期においてインフルエンザが流行していたといえる。また、最大時の定点あたり人数は約 45 であり、これは過去 10 年で最も高い値であった。
寝屋川河川水中の OP、OC、ZH 濃度をそれぞれ図 4、図 5、
図 6 に示す。なお、St.1 の全試料からは OP、OC、ZH が検出されなかったため図から除外した。また、各試料の OP、OC、ZH ラベル化体物質回収率の平均値はそれぞれ、75.1、73.1、74.3%となり十分な回収が得られた。河川水中の OP、OC、ZH 濃度は、インフルエンザが流行している 2012 年 1 月 27日（第 4 週）から高くなり、2012 年 2 月 10 日（第 6 週）のSt.2 においてそれぞれの最大値 239、620、54ng/l を検出した。
その後、インフルエンザの流行が収束するにつれて、河川水中濃度は低下した。
抗インフルエンザウイルス薬が St.1 において検出されず、St.2 において高濃度に検出されたのは、St.1 と St.2 の間に下水処理施設からの処理水が流入していることに起因している。
下水処理過程においてこれらの薬品が十分に処理されないことはこれまでの研究で明らかとなっている 1）。また、St.3 におけるこれらの濃度が St.2 に比べ減少しているのは、支川の流入による希釈や底質への吸着によるものと考えられ、OCにおいては底質への吸着も確認されている 2）。OC は、下流になるにつれて濃度の減少がみられるものの、OP および ZHと比べ河川中に高濃度で存在し、耐性菌の発生が懸念される。
以上より、抗インフルエンザウイルス薬 OP、OC、ZH の測定には、HILIC カラムによる分離が有効であり、これにより高回収率の同時分析が可能である。寝屋川河川水中のこれらの濃度とインフルエンザ患者数の推移は類似し、河川中の抗インフルエンザウイルス薬はヒト由来であり、体外に排出されたこれらの薬品が十分に処理されず、環境中に放出されているといえる。

インフルエンザ患者数

3. 測定結果および考察

453015参考文献
1) Takanami, R., Ozaki, H., Giri, R.R., Taniguchi, S. & Hayashi,
S. : Antiviral drugs zanamivir and oseltamivir found inwastewater and surface water in Osaka, Japan. J. Water
Environ. Technol., Vol.10 No.1, pp.57-68, 2012.
2) 高浪龍平，谷口省吾，尾崎博明，林新太郎，上田淳；寝屋川表流水および底質における抗インフルエンザウイル
ス薬の挙動，日本水環境学会年会講演集，46，p535，2012．

02

図63456 7 8 9
測定週（週）

10 11 12 13

St.2 および St.3 における ZH 濃度

なお、本研究の一部は文部科学省私立大学学術研究高度化推進事業「社会連携推進事業」（平成 19 年度～平成 23 年度）の一環として行ったものである。