保健科学研究11(1)：7-11，2020【原著】
各種液体培養法における下痢原性大腸菌関連遺伝子の検出状況

藤岡美幸*1 林 稜太*2 月足正辰*3 吉岡 翔*1松下 紬*2 阿部 翼*2 野坂大喜*1（2020 年 7 月 27 日受付，2020 年 8 月 25 日受理）
要旨：ヒトや動物の腸管に常在する大腸菌は通常病原性はないとされるが，特にヒトに下痢症を引き起こす大腸菌は下痢原性大腸菌（DEC）と呼ばれる．DEC はその病原機序から 5 種類に大別され，各病原因子の遺伝子も明らかである．本研究では糞便系大腸菌を選択的に培養する液体培地を用いて，温度等の培養条件別に DEC 関連遺伝子の検出状況を調査した。対象とした全 218 検体から eae 1 株，aggR 2 株，astA 20 株，aggR＋astA 1 株が検出された。通常のEC ブロスの培養温度 44.5℃ではいずれの遺伝子も検出状況が悪く，EC ブロスおよび HI ブイヨンいずれも 40℃培養での検出が良好であった。本研究により，糞便検体を平板培地に塗抹・培養することなく，液体培地を用いることでDEC 関連遺伝子の迅速検出が可能となり，また培養温度を 40℃にすることで，より多くの DEC 関連遺伝子の検出が可能となった。
キーワード：下痢原性大腸菌，遺伝子検索，液体培養，培養温度

Ⅰ．はじめに大腸菌はもともとヒトや動物の腸管内常在菌のひとつでDEC 関連遺伝子検出状況を選択培地や非選択培地を用いて培養温度別に検討した。

ある一方で，病原因子の獲得により下痢を起こす下痢原性大腸菌（Diarrheagenic Escherichia coli: DEC）や，髄膜・尿Ⅱ．対象および方法路などの腸管以外の部位に感染を起こすものがある １）。

１．対象

DEC は腸管出血性大腸菌，腸管病原性大腸菌，腸管毒素原

対象は弘前市医師会健診センターに提出された下痢症性大腸菌，腸管侵入性大腸菌，腸管凝集付着性大腸菌の 5

患者由来便を滅菌生理食塩水に懸濁した 218 検体とした。

種類に大別され，その病原性の特徴から遺伝子検索により各カテゴリーに分類することが可能である ２）。一般に DEC

２．方法の検索は糞便検体を直接平板培地に分離培養し，培地上に１）各種培養法

発育した大腸菌を対象に遺伝子検索が行われるため，手技

滅菌生理食塩水 1 mL に懸濁された検体は同センターにが煩雑であり，検査結果が得られるまでに時間を要する。て糞便検査に供試され，その残り 200~500 µL を翌日まで冷

また，腸内細菌は 25 ~ 40℃で最もよく増殖する３)とされる蔵保存した。これを懸濁液検体とし，弘前大学大学院保健が，糞便系大腸菌を分離するための選択培地として液体培学研究科に搬入後，当日中に各種培養に用いた。残った懸地が知られており４），いくつかの EC 培地（極東製薬，関濁液検体は‐30℃で凍結保存した。懸濁液検体を対象とし

東化学，栄研化学，ニッスイ）は主に 44.5℃の高温で培養た各種液体培地を用いた培養法の流れを図 1 に示す。

される。この温度は大腸菌の発育可能限界温度でもある５）①培養法 1

ため，一部の大腸菌を見逃してしまう可能性が考えられる。

培養法 1 は弘前市医師会健診センターで 44.5℃培養が行

そこで本研究では適切かつ迅速に下痢原性大腸菌を検出すわれた EC ブロス（極東製薬）とした。同センターにおいる方法の確立のため，糞便検体を直接用いた液体培地でのて EC ブロスで一晩選択培養されたものを当日中に弘前大*1 弘前大学大学院保健学研究科
Hirosaki University Graduate School of Health Sciences〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-39-5970
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*2 弘前大学医学部保健学科
Hirosaki University School of Health Sciences〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*3 弘前市医師会健診センター
Hirosaki Medical Association Health Care Center〒036-8045 青森県弘前市野田 2-7-1 TEL:0172-34-6121
2-7-1, Noda, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8045, Japan学に搬入した。
②培養法 2
懸濁液検体 100 µL を EC ブロス（栄研化学）1 mL に添加し，40℃一晩選択培養したものを培養法 2 とした.
③培養法 3
懸濁液検体 100 µL を非選択培地であるハートインヒュージョンブイヨン（HI ブイヨン，ニッスイ）1 mL に添加し，40℃一晩培養したものを培養法 3 とした。

Correspondence Author mfujioka@hirosaki-u.ac.jpⓒ2020 Health sciences Research.

7各種液体培養法における下痢原性大腸菌関連遺伝子の検出状況表1下痢原性大腸菌における標的遺伝子

下痢原性大腸菌

標的遺伝子

腸管出血性大腸菌

stx1 , stx2 , eae

腸管病原性大腸菌(Typical)

eae , bfpA(Atypical) eae
腸管侵入性大腸菌

invE

腸管毒素原性大腸菌

esth , estp , elt

腸管凝集付着性大腸菌

aggR , astA

表する stx1, stx2, eae, bfpA, aggR, elt, esth, estp, invE, astA の④培養法 4
懸濁液検体 100 µL を HI ブイヨン 1 mL に添加し，40℃10 種類を標的遺伝子とした ６）（表 1）。また腸管病原性大腸一晩前培養した。その後，培養液 100 µL を EC ブロス（栄菌が保有する eae を共通遺伝子として保有する E. albertii研化学）1 mL に添加し，さらに 40℃一晩選択培養したもの報告もある 11)ことから，同菌との鑑別には E. albertii 特のを培養法 4 とした。

異遺伝子 mdh, lysP を用いた。今回使用したプライマーを表2 に示す。
各条件で培養した培養液 100 µL を TE 緩衝液（pH8.0，２）PCR による遺伝子検索
DEC の遺伝子検索は 5 種類に分類されるカテゴリーを代

表2
Targetgene

富士フィルム和光純薬工業）900 µL に加え，100℃で 5 分

使用プライマー一覧

Sequence (5' to 3')

Size of PCR
product (bp)

Reference

stx1

AGTTAATGTGGTGGCGAAGGCACCAGACAATGTAACCGC

3476)

stx2

TTCGGTATCCTATTCCCGGCGTCATCGTATACACAGGAG

5896)

eae

CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC
CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG

8817)

bfpAAATGGTGCTTGCGCTTGCTGC
GCCGCTTTATCCAACCTGGTA

3248)

aggR

GTATACACAAAAGAAGGAAGCACAGAATCGTCAGCATCAGC2549)

elt

AACGTTCCGGAGGTCTTATGCAACCTTGTGGTGCATGATG

5116)

esth

TTCACCTTTCCCTCAGGATGATAGCACCCGGTACAAGCAG

1726)

estp

ACTGAATCACTTGACTCTTCATCACAGCAGTAAAATGTGTTGT1206)

invE

GCAGGAGCAGATCTTGAAGGAAAGGCACGAGTGACTTTC

2086)

astA

CCATCAACACAGTATATCCG
ACGGCTTTGTAGTCCTTCCA

1016)

mdh

CTGGAAGGCGCAGATGTGGTACTGATT
CTTGCTGAACCAGATTCTTCACAATACCG11510)

lysP

GGGCGCTGCTTTCATATATTCTTTCCAGATCCAACCGGGAGTATCAGGA

25210)ⓒ2020 Health sciences Research.

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藤岡，林，

月足，吉岡，松下，

阿部，

表３野坂

培養法別DEC関連遺伝子検索結果

培養法

液体培地

培養温度

(n=1)

eae

aggR

(n=3)

(n=21)astA

1ECブロス

2ECブロス

44.5℃
40°C

0103

8193HIブイヨン

40°C

13204

HIブイヨン→ECブロス

40°C

1318

検体および aggR 陽性 3 検体は，培養法 1 では検出できなかったが，培養法２~４ではすべて検出された。astA 陽性
21 検体は，培養法 1 では 8 検体，培養法２~４では 18 ~ 20検体の検出であり，21 検体すべてを検出した方法はなかった。
eae 保有 1 検体は凍結懸濁液から再分離し，E. albertii 特間加熱後，10,000 rpm で 5 分間遠心分離した上清を DNA

異遺伝子を標的とする PCR を行った結果， mdh，lysP 遺テンプレートとした。PCR の反応条件は 1 検体あたり滅菌伝子は検出されなかった。また aggR 保有 3 検体も同様に蒸留水 18.375 µL，10×Ex TaqTM buffer(TaKaRa) 2.5 µL，再分離し，確認試験として Clump 試験を行った。1 検体はdNTP mixture(TaKaRa) 0.125 µL，DNA テンプレート 2.5 µL，検査不能であったが，2 検体のうち 1 検体が Clump 試験陽25 µM プライマー各 0.125 µL とし，全量を 25 µL とした。

性であった。

PCR の条件は前熱変性を 94℃1 分間行い，熱変性 94℃1 分間，アニーリング 60℃1 分間，伸長反応 72℃1 分間を 25

Ⅳ．考察サイクル，最終伸長反応を 72℃10 分間行った。PCR 産物

糞便汚染指標菌として大腸菌や大腸菌群等が知られてはエチジウムブロマイド添加 2.5%アガロースゲルにて 100いるが，この大腸菌群には腸内細菌ではないエロモナス属

V，30 分間電気泳動（Mupid-21，コスモバイオ社）を行い，等も含まれ，すべてが糞便由来ではない問題があるとされ

UV 照射にて遺伝子の確認を行った。

る。そのため温血動物の糞便由来大腸菌群を高温で増菌・遺伝子陽性検体は凍結懸濁液から再分離したコロニー培養することで，糞便系大腸菌群として通常の大腸菌群とを対象に，PCR にて DEC 関連遺伝子の確認を行った。再区別する 13)。一般に大半の細菌は 30℃以上の温度で増殖可

分離は凍結した懸濁液検体を HI ブイヨンに 1 白金耳接種能であり，増殖の温度域により低温菌，中温菌，高温菌にし，37℃一晩培養後，HI 寒天培地（栄研化学）に塗抹・培分類される。腸内細菌は中温菌に分類されるが，糞便系大養し，対象コロニーを分離した。

腸菌を分離するためのいくつかの EC 培地は主に 44.5℃のさらに aggR 陽性検体は簡易同定法である Clump 試験 12)高温で培養される。この温度は大腸菌の発育可能限界温度を行った。再分離したコロニーはガラス試験管を用いて HIでもあるため５），大腸菌の発育も抑制している可能性があブイヨン 3 mL に接種後，100 rpm で 37℃ 20 時間振盪培養る。本研究では糞便由来検体を対象とし，液体培地を用いし，菅壁の凝集を観察した。

た 4 種類の培養法別に選択増菌・培養し，DEC 関連遺伝子

なお，本研究は弘前大学大学院保健学研究科倫理委員会（整理番号：2020-011）により承認され実施した。の保有状況を検討した。
DEC 関連遺伝子検索の結果，対象 218 検体中，eae 1 検体，aggR 3 検体，astA 21 検体が検出された。遺伝子陽性検Ⅲ．結果

体を再分離し遺伝子検索した結果，eae 1 株，aggR 2 株，下痢症患者由来 218 検体を対象に，4 種の液体培養法をastA 20 株，aggR + astA 1 株であった。これら 3 種類の DEC用いて DEC カテゴリーを代表する 10 種類の遺伝子を検索

関連遺伝子は培養法 1 での検出数が低く，他の方法では大した。その結果，eae 1 検体，aggR 3 検体，astA 21 検体がきな差はなかった。このことから，検体中の大腸菌量が多検出された。stx1, stx2, bfpA, elt, esth, estp, invE は検出されなくなかったことや 44.5℃の高温下での発育に適していなかかった。これら遺伝子陽性検体は凍結懸濁液から再分離しった可能性が考えられた。この高温下における大腸菌の選たコロニーを対象に DEC 遺伝子を確認した結果,24 株が択培養は，菌量が多くない場合には少なからず増菌・発育DEC 関連遺伝子 3 種類を保有しており，eae 1 株，aggR 2に影響を受けるものと考える。PCR は数個の菌数で遺伝子株，astA 20 株，aggR + astA 1 株であった。PCR による検出検出が可能である 14)ことから，増幅された DEC 関連遺伝例を図 2 に示した。

子は必ずしも下痢症の原因に関係していない可能性が示唆

DEC 関連遺伝子陽性の eae 1 検体，aggR 3 検体，astA 21
検体における培養法別の検索結果を表 3 に示す。eae 陽性 1ⓒ2020 Health sciences Research.

され，今後は菌量による培養条件別の検出感度の検討が必要である。

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各種液体培養法における下痢原性大腸菌関連遺伝子の検出状況

eae 保有 1 株は bfpA を保有していなかったことから，
Atypical 腸管病原性大腸菌に分類された。腸管病原性大腸

伝子検索と同時に生菌数あるいは菌量の評価をあわせた下痢症原因菌迅速検出法を検討したい。

菌は EAF プラスミドを保有する Typical と保有しないAtypical に分類され，このプラスミド上にある集束形成線利益相反

開示すべき利益相反はありません。

毛関連遺伝子である bfpA により分類する８）。bfpA を持たない eae 保有大腸菌は健常人からの分離報告 15)もあることか

引用文献

ら，その病原性の診断は慎重に判断する必要がある。また

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20) 桶嶋三津子，王 麗麗，他：非定型下痢原性大腸菌について
１―腸管凝集接着性大腸菌耐熱性償還毒素（EAST1）遺伝子保有大腸菌―．生活衛生，54(4): 271-284, 2010.

この eae 保有 1 検体は E. albertii 特異遺伝子 lysP および mdhを保有していなかったことから，大腸菌と同定された。E.
albertii は 2003 年に新興病原体として命名され 16），わが国でも食中毒の原因菌としてしばしば報告されている 11)。しかしながら，その性状は大腸菌と類似していることから臨床検査機関では多くが誤同定されており，また近年多くの臨床検査機関で導入が進んでいる質量分析でも正しい同定ができていない現状である 17)。現在，これらの鑑別は PCRによる特異遺伝子の検索が有効とされている 11)ことから，今後 eae 保有大腸菌検出の際には，これらの特異遺伝子の検索も併せて行うことが重要である。
aggR は腸管凝集付着性大腸菌の凝集付着に関する活性因子であり，腸管凝集付着性大腸菌と同定するためには細胞付着試験 18)等が必要となる。しかしながら細胞を用いた付着試験は手技が煩雑で実用的ではないことから，aggR 保有株にはガラス付着特性を活かした Clump 試験 12)を行った。
aggR 保有 3 検体のうち，1 検体は生菌が得られず判定不能であったが，1 検体は Clump 試験陽性，もう１検体は陰性であった。aggR は eae と同様に健常人からの検出報告 16)があり，特に aggR 保有にも関わらず凝集付着特性を示さない株は下痢症の直接の原因ではない可能性も考えられた。
今回最も多く検出された遺伝子は astA であり，218 検体
中 21 検体から検出された。astA は腸管凝集付着性大腸菌
耐熱性エンテロトキシン 1(EAST-1）をコードする遺伝子であり，DEC では aggR と同様に腸管凝集付着性大腸菌に分類される 2)。しかしながら腸管凝集付着性大腸菌において凝集付着に関与する遺伝子は aggR であり，astA の病原性は未だに明らかになっていない 6)。astA は単独保有による集団食中毒の報告 19)がある一方で，健常人での保有例 15)も報告されている。桶嶋ら 20)は，astA 保有大腸菌が他の菌と相互作用することで病原性を発揮している可能性を否定できないとしていることから，astA 保有大腸菌の病原性の判定は eae と同様に慎重に行われることが望まれる。
本研究では下痢症患者由来便の懸濁液を対象に平板培地による分離培養をせず，液体培養にて DEC 関連遺伝子を検索した。44.5℃の高温下での液体培養では大腸菌の発育抑制が考えられたが，40℃の中温下では遺伝子の検出が良好であった。今回検出された 3 種類の DEC 関連遺伝子は健常人保有の報告もあることから，病原性の判断は慎重に行うことが必要である。今後は他の検査材料にも応用し，遺ⓒ2020 Health sciences Research.

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藤岡，林，月足，吉岡，松下，阿部，

野坂【Original article】
Detection of Diarrheagenic Escherichia coli-related genes on variousliquid culture methods
MIYUKI FUJIOKA*1 RYOTA HAYASHI*2 SEISHIN TSUKIASHI*3
SHO YOSHIOKA*1 TSUMUGI MATSUSHITA*2 TSUBASA ABE*2
HIROYUKI NOZAKA*1（Received July 27, 2020 ; Accepted August 25, 2020）

Abstract: Some Escherichia coli strains have acquired virulence genes that confer pathogenicity and are referred to as
diarrheagenic E. coli (DEC) and has been categorized into the five groups. In this study, we used some selective liquid culture
methods to detect DEC-relation genes. As the results, we detected 24 DEC-related gene harboring strains (one eae, two aggR,20 astA, and one aggR+astA) from 218 samples. The detection status of all genes was not good at the normal EC brothincubation at temperature of 44.5°C, and the detection of genes were good at 40°C culture of both EC broth and HI bouillon.
This study enabled the rapid detection of DEC-related genes on liquid culture instead of smearing and culturing fecal
specimens on agar plate, and more DEC-related genes could be detected by incubating the specimens at 40°C.
Keywords: Diarrheagenic Escherichia coli, Gene detection, Liquid culture, Culture temperatureⓒ2020 Health sciences Research.

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