福岡県保健環境研究所年報第29号，96−99，2002

原著論文
眼科疾患から検出されたアデノウイルス血清型の経年変化（1997〜2000年）
梶原淳睦, 濱崎光宏, 江藤良樹, 千々和勝己, 鬼木信乃夫＊１
流行性角結膜炎（EKC）等の眼科疾患の原因ウイルスを PCR 法及び培養細胞を用いたウイルス分離法により検索した. その結果, 培養細胞を用いたウイルス分離では35株のアデノウイルスが分離され,ウイルス分離の陽性率は30.4％（35/115）であった. 一方, PCR 法では73.9％（85/115）が陽性であり,PCR 法はウイルス分離法の約2.4倍高感度にアデノウイルスを検出することができた. PCR 法と制限酵素を用いた RFLP 法により決定したアデノウイルスの血清型は1997及び98年は19型が最も多かったが,1999及び2000年は8型の方が多くなった. 特に, 1999年5月以降は8型が主に検出され, EKC の病原ウイルスの変化が明らかになった. EKC は例年6−9月をピークとする流行を繰り返し, 流行状況は4年間で大きな差はなかった. しかし, 各年の流行を引き起こしているアデノウイルスの血清型は変化していることを明らかにすることができた.
［キーワード :アデノウイルス，血清型，流行性角結膜炎（EKC)），PCR］
１

２

はじめに材料及び方法

EKC 等の眼科疾患の多くはアデノウイルスが原因とウイルス分離には Vero, FL, RD-18 s, HEp-2細胞をなって引き起こされている. ヒトアデノウイルスは使用した. ウイルス分離材料は1997年4月から2000年12DNA の相同性等により A-F の6亜属に分類され, 47の血月までに福岡県筑紫野市内の一眼科医院を受診した流行. 従来より EKC 等の患者から培性角結膜炎, 咽頭結膜熱及び急性結膜炎の患者より採取

養細胞を用いて病因ウイルスの分離同定をしているが,された結膜ぬぐい液115検体を用いた. 疾病ごとの内訳

ウイルスの分離同定には2週間以上の時間がかかり, ウは流行性角結膜炎が113件, 咽頭結膜熱が1件, 急性結膜イルス分離率は約20 -30％であった. これはエンテロウ炎が1件であった.

清型に分類さている１）

イルスによる感染症からのウイルス分離率40 -70％に比べ1 /2以下である. また, 培養細胞を用いたウイルス分

２・１

ウイルス分離離では細胞の種類によりウイルス感受性が異なることもウイルス分離は, 96穴マイクロプレートに培養細胞（5考えられる. 最近, PCR 法と制限酵素を用いた RFLP 法

×10 6 cells/ml） を0.1 ml ずつ分注し, 浮遊状態の細胞により, EKC 等の患者の結膜ぬぐい液よりアデノウイに結膜ぬぐい液25 μlを1検体当たり2 穴接種し, 37

ルスの迅速で, 高感度な検出・血清型別の同定方法が報℃, 1週間 CPE の出現を観察した. 最長4代継代し CPE２）. そこで同法を感染症発生動向調査事業

陰性の場合は分離陰性とした. 分離されたアデノウイルにより採取された検体に適用し, 培養細胞を用いたウイ

スは国立感染症研究所より分与された抗血清, またはデルスの分離同定結果と比較してきた ３）. その結果, EKC

ンカ生研製の抗血清を用い中和試験により同定した.

告されているの原因ウイルスの検出率を向上させ, ウイルス分離法では捉えられなかった病原ウイルスの変化を明らかにした

２・２

PCR法

PCR 法は Saitoh-Inagawa ら の方法により行った２）. 即ので報告する.

福岡県保健環境研究所（〒818‑0135 太宰府市大字向佐野39）＊１鬼木眼科医院（〒818-0051 筑紫野市二日市713-4））- 96 -

表 1 プライマー及び PCR 産物
PrimerNucleotide positions*

Sequence

PCR product length(bp)

AdTU7
AdTU4'20,734 - 20,753
21,718 - 21,737

5' - GCCACCTTCTTCCCCATGGC- 3'5' - GTAGCGTTGCCGGCCGAGAA- 3'1,004

AdnU- S'
AdnU- A

20,743 - 20,762
21,679 - 21,698

5' - TTCCCCATGGCNCACAACAC- 3'5' - GCCTCGATGACGCCGCGGTG- 3'956* : numbered by using Ad2 nucleotide sequence4)

Eco T14I

Hae III

Hinf I

12345M

図１

Ad 3
Ad 8
Ad 11
Ad 19
Ad 37
ψX174-Hind III

PCR 産物の制限酵素切断パターン

ち, 結膜ぬぐい液 200 μlを12000× g で30分間遠心デノウイルスの血清型別を決定した.

し, 沈殿 させた 角 結 膜 成 分 に 100 μlの 0.31 mg/ml
Proteinase K, 0.5% Tween20, 1 mM EDTA, 10 mM

３Tris-HCl （ pH8.3） を加え55 ℃, 1時間消化し, 95 ℃,1分間加熱し DNA を抽出した. 10000× g で結果
眼科疾患の患者より採取された115件の検体から, 培

10分間養細胞を用いたウイルス分離では35株のアデノウイルス

遠心した上清 10 μlに表1のプライマーを用い, まずが分離された. アデノウイルスは大半が HEp-2細胞によAdTU7, AdTU4 'で1stPCR を, 次いで AdnU-S', AdnU-Aり分離され, 一部 FL 細胞でも分離された. ウイルス分で nested-PCR で 増幅した. 表1にプライマー及び PCR

離の陽性率は30.4％（35/115）で, 分離されたウイルス産物のアデノウイルスゲノム上の位置を示した. PCRの血清型別は3型（12株），8型（1株），11型(1株), 19型

条件は1st 及び nestd-PCR と もに94 ℃(18株）,分, 72 ℃

1分, 50 ℃

137型(3株）であった.

2分を36サイクル行った後, 72 ℃で7分間加熱した. PCR 産物は3％アガロース電気泳動後, エチジ

表２ウムブロマイドで染色した.

ノウイルスの血清型

２・３

血清型

分離方法

陽性数(%)

ウイルス分離35(30.4)

121118380

PCR85(73.9)

1226

1311530

RFLP法

PCR 法により増幅された DNA のバンドが確認されたウイルス分離及び PCR 法により検出されたアデ

ものは, EcoT14I, HaeIII, HinfI の3種の制限酵素を用いて付属のバッファー中にて37 ℃, 1夜消化した. 酵素消Ad 3Ad 8 Ad 11 Ad 19 Ad 37

陰性化後の DNA フラグメントは1％アガロースゲル電気泳動後エチジウムブロマイド染色し, 切断パターンよりア- 97 -一方, PCR 法では73.9％（85 /115）が陽性であり,RFLP 法 により同定されたウイルスの血清型別は 3型きなかった. この差がウイルス分離に用いた培養細胞の（12株）, 8型（26株）, 11型(1株), 19型(31株）, 37感受性によるものか, 不感染性粒子の形成等のウイルス型(15株）であった. PCR 産物の制限酵素による切断パの側の原因によるものかは不明であるが, 培養細胞を用ターンを図1 に示した. ウイルス分離で決定されたウイ

いた病原体検索では病原ウイルスの流行状況を捉えきれルスの血清型と PCR 法で決められた血清型は全て一致ないことが明らかになった. PCR 法ではウイルス遺伝した. 培養細胞を用いたウイルス分離と PCR-RFLP 法子の特定の一部分だけが増幅され, 抗原性の変化などのとの検出結果の比較を表2に示す. また, 各年の情報が得られない等の問題はあるが, 病原体の検索とし

PCR-RFLP 法 でのアデノウイルスの検出状況を表3に示て高感度であり培養細胞を用いたウイルス分離法と併用した.

することが望ましい. さらにこれらの結果から, PCR法で陽性になった検体からのウイルスの分離培養方法を

表３検出されたアデノウイルス血清型の年次推移検討する必要がある.
また, アデノウイルス19型と37型は標準抗血清による血清型別陽性検体数

分離年

検体数

Ad3Ad8 Ad11 Ad19 Ad37計

199719981999
2000

3640231627125678

合計

1151226４1191651633322331614311585

中和試験では交差が見られたが, PCR-RFLP 法 では明瞭に区別することができた. 従って, PCR-RFLP 法 は検出方法としてばかりでなく同定方法としても有力であり,抗原変化など血清学的方法で型別の同定が出来ない場合にも利用可能である.

考察

５まとめ

アデノウイルスの流行状況は, 1997及び1998年は19型

1. 眼科疾患からのアデノウイルスの検出率は培養細胞が最も多かったが, 1999及び2000年は8型の方が多くなを用いた際には30.4％であったが, PCR 法を用いるとった. また, 1997年は37型が, 1998年は3型も比較的多73.9％と迅速, 高感度に検出でき, 2つの方法で決定さ数検出された. 3型は咽頭結膜熱（プール熱）の原因ウれた血清型は一致した.

イルスとしても知られ, 1998年は夏季に同病の流行があ

2. アデノウイルスの血清型別では B 亜属の検出率はほったため EKC からも分離が多くなっている. 各月のアぼ同等であったが, D 亜属特に8型では分離率は PCR 法

デノウイルス検出状況は, 1997 -98年は19型が年間を通の3.8％と, 培養細胞を用いた方法では流行ウイルスをじて検出され, 3, 8, 37型は散発的に検出されていた

とらえられていないことがわかった.

が, 1999年以降, 19型の検出数が減少し, 9月より8型の

3. アデノウイルスの検出に PCR 法を導入することによ検出数が増加した. 特に, 2000年5月以降は8型が主に検り, 1999年以降の EKC の病原ウイルスの変化（19型→出され, EKC の病原ウイルスの変化が明らかになった.

８型）を明らかにできた.

EKC は例年6 -9月をピークとする流行を繰り返し, 流行状況は4年間で大きな差はなかった. しかし, 各年の文献

流行を引き起こしているアデノウイルスの血清型は変化

1) D. Schnurr & M. E.Dondero : Intervirol., 36, 79 -していることを明らかにすることができた.

83, 1993.

感染症発生動向調査では感染症流行の実態を監視する

2) W. Saitoh-Inagawa et al. : J. Clin. Microbiol. , 34,目的で, 培養細胞によるウイルス分離を中心に病原体を2113-2116, 1996.

特定している. 一方, PCR 法が広く用いられるように

3) J.Kajiwara et al. : Jpn.J.Infect. Dis., 52, 18-19,なり, 迅速で高感度な病原体検索が可能になってきてい1999.

る. 今回用いた PCR 法では約3日で結果の判定が可能で4) K.Chroboczek et al. : Virology, 186, 280-285, 1992.

あり, ウイルス分離法の約2.4倍高感度であった. また,アデノウイルスの亜属や血清型による分離率の違いが明らかになった. 即ち, B 亜属のアデノウイルス（ 3,11型）では検出率は培養細胞法と PCR 法でほぼ同程度であったが, D 亜属（アデノウイルス8, 19, 37型）では培養細胞法によるウイルス分離率は低く, 特にアデノウイルス8型では PCR 法の3.8 %しか分離することがで- 98 -Trend of adenovirus serotypes detected from patientswith ophthalmological diseses （1997−2000）
Jumboku KAJIWARA, Mitsuhiro HAMASAKI, Yoshiki ETO, Katsumi CHIJIWAand Shinobu ONIKI ＊１
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences and Oniki Eye Clinic ＊１
Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135 , Japan
Futsukaichi 713-4, Chikusino, Fukuoka 818-0051 , Japan ＊１
In this study ,we used polymerase chain reaction (PCR) and virus isolation using cell culture to detect adenovirus(Ad) onswabs from patients with conjunctivitis including epidemic kerato-conjunctivitises (EKC), who visited an eye clinic inChikushino City in Fukuoka Prefecture. Virus isolation in culture and serotyping identified Ads from 35 specimens out of 115(30.4%), whereas PCR identified 85 specimens out of 115 (73.9%), the PCR positivity being about 2.4 fold higher thanvirus isolation. In1997 and 1998, Ad serotypes idetified by PCR coupled with restriction fragment length polymorphism(RFLP) was mostly Ad 19, while in 1999 and 2000, Ad 8 was the most frequent serotype. Especialy after September 1999,Ad 8 was mainly detected from EKC patients. The study revealed that the serotye of Ad causing EKC has changed in thecourse of time.
[Key words : Adenovirus, Sero type, Epidemic kerato-conjunctivitises, Polymerase chain reaction]- 99 -