愛知県工業技術センター研究報告第３６号（２０００）

技術資料

簡易型酵素センサの試作
小久保弘樹 ＊１

松生秀正＊２Fabrication of a Simplified Enzyme Sensor
Hiroki KOKUBO and Hidemasa MATSUO

微小電極型酵素センサのプロトタイプとしてグルコースセンサを試作した。回路基板用の製版フィルムをマスクとして用い、リフトオフ法により金電極をガラス基板に形成させたところ、35μｍ程度の線幅を持つ櫛形電極が作製できた。グルコースオキシダーゼをグルタルアルデヒドとの架橋反応により櫛形金電極に固定し、タレビンから試料溶液を電極上に滴下したときの応答特性を評価したところ、３分程度経過したところで、試料溶液濃度に対して正の相関を持つ応答特性が現れることがわかった。

１．はじめには、回路基板用の製版フィルムを用いて作製し、また、近年、急速に発展しつつある生命科学は新たな主要レジストは HPR1183（富士フイルム）を使用した。

産業へ発展していく可能性を秘めており、生命科学と酵素は、次式の反応を触媒するグルコースオキシダ

エレクトロニクスの融合を図るバイオエレクトロニクーゼ（ EC1.1.3.4、和光純薬：Aspergillus niger 由来、スに対しても、多くの関心が寄せられるようになって以下 GOD）を用いた。

いる。特に、酵素や免疫系の持つ高度な分子識別能力を応用するバイオセンサは、バイオエレクトロニクス

β‑D‑Glucose＋O２→D‑Glucono‑δ‑lactone＋H２O２ … (1)の中でも期待されている技術の一つであり、センサの信号変換方式や伝達系の改良、新規の酵素を用いたセまた、微小電極上への酵素の固定化は、牛血清アルブンサの開発等が盛んに行われてきた。最近では、①撹

ミン（和光純薬：和光一級、以下 BSA）とグルタルア

拌を行うことなく定常もしくは準定常電流での測定がルデヒド（和光純薬：生化学用 70wt% 、以下 GA）を用可能であること、②電極反応電流と無関係な充電電流いた架橋法により行った。具体的には、GOD 溶液（ 0.1M、を小さくできること等の理由から、微小電極を用いた

pH6.1 リン酸緩衝液中の GOD 濃度が 4,000U/mL になる

１）

バイオセンサに注目が集まりつつある 。そこで本研ように調整したもの）３μL と BSA 溶液（0.1M 、pH7.5

究では、微小電極による酵素センサを試作し、得られリン酸緩衝液中の BSA 濃度が 110mg/mL になるように調たセンサの特性評価を行った。

整したもの）30μL、GA 溶液（0.1M 、pH7.5 リン酸緩衝液中の GA 濃度が７wt％になるように調整したもの）４２．実験方法

μL を十分に混合し、その混合液 4.5μL（GOD：1.46U）

２．１を基板上に固定した。基板が粗面化されているため、作製方法

微小電極は、リフトオフ法によりガラス基板上に形酵素膜の基板への付着は良好であり、センサの特性評成させた。電極用薄膜の形成では、ＳＥＭ試料調整用価中に酵素膜の剥離は一切なかった。の簡易なスパッタ装置を用い、装置の都合上、電極材２．２

評価方法

料は金とし、金とガ ラスとの間にはクロム等の接着層

微小電極及び酵素センサの評価には、0.1M 塩化カリは設けなかった。
電極の基板への付着力改善法として、ウムを含むリン酸緩衝液（ 0.1M、pH7.5）に、過酸化水

あらかじめガラス基板を表面粗さ Ra＝0.5μｍ程度ま素またはグルコースを所定の量溶かしたものを用いた。

２）で粗面化する方法を用いた 。パターン製作用マスク

微小電極の評価では、試料溶液を入れたビーカに電極を浸し、スタラーにより 一定レベルで撹拌しながら測*1 機械電子部 *2 現)（財）科学技術交流財団定した（図 １ (a)）。酵素センサの評価では、タレビン

37愛知県工業技術センター研究報告第３６号（２０００）から試料溶液を酵素膜上に２滴垂らし、その応答特性

写真１を測定した（図 １ (b)）。なお、試料溶液１滴当たりの質量は 53.5±3.8ｍg であり、その分布はきれいな正規

センサホルダ

10 kR th分布であった（ 図 ２ ）。微小電極の評価は、ビーカとスタラーを低温恒温水槽に設置することにより、また、酵素センサの評価は作製したセンサホルダ（写 真 １ ）1k

To Monit or
1 0k

1 00 k1k1k1k2 5k
10 01 0k50k
1 6.6 μ1k2M

10 k

10k
10 k

10 k+V ccと温度コントローラ（図 ３ ）を用いることにより、温5 .1 k
1.6 k

度を 35℃に保った状態で行った。微小電極及び酵素センサの電流応答特性はディジタルエ レ ク ト ロ メ ー タ

1 0k

5 .1k

15k

7 .5k

ンサの特性評価ではノイズ除去のため、ディジタルフTo Hea t er
11 5k+V cc（アドバンテスト製 TR8652）を用いて測定し、酵素セ115k

1.6 k- V cc1 5k50k

リード線
エポキシ樹脂図３ＰＩ温度コントローラ‑15‑10櫛型金電極

0.2(a)

ｈ（ｎＴ）

0.15

微小電極の測定系

0.10.05
0‑0.05(a)
(b)

測定系

Ｇ（ω）

4035

個数（滴）

302520151015フィルタのインパルス応答

1.210.80.60.40.2
0‑0.2

10012
角周波数（rad/sec）(b)フィルタの伝達関数50

図２05時間（秒）酵素センサの測定系
図１30‑5405060
質量（ｍｇ）

7080

図４3

ディジタルフィルタ（ fc=1/12 Hz）

タレビン１滴当たりの質量分布
ィルタも挿入した。ディジタルフィルタは、位相が周波数と関係なく一定になるように、最小自乗設計法により設計した ３ ）（図 ４ ）。

３．実験結果及び考察
写 真 ２ に今回試作した微小電極を、また、図 ５ にその電気的特性を示す。回路基板用製版フィルムをマスクとして用いる本方法では、最小線幅 35μｍ程度まで作製可能であった。
電気的特性において電極のアノード及びカソードで38愛知県工業技術センター研究報告第３６号（２０００）∆G 0f (308K ) = ∆H 0f ( 298K ) − 308 × ∆S 0f (298 K ) L ( 6)00
∆Gsol
( 308K ) = ∆Gsol( 298K ) L (7 )ここで、∆S 0f (T ) は反応に伴う標準生成エント ロピーである。表 １ の値を用いて計算すると、電極反応におけるギブスの自由エネルギー変化は 80.9kJ/mol であり、これは eV 換算で 0.84eV となる。従って、反応に伴うギブスの自由エネルギー変化は電極電圧で 0.42V に相当することになり、それ以上の電圧で電流が流れ得ることになる。本実験でも 0.5Ｖ前後から急激に電流が50μ ｍ流れ始め、その値が過酸化水素濃度の増加に伴って単電流（μＡ）

写真２80706050403020100

櫛形微小電極調に増加することから、観測された電流が過酸化水素の分解反応に伴うものであることがわかる。

H2O2： 0.0mM
H2O2： 6.7mM
H2O2：13.3mM
H2O2：26.7mM
H2O2：53.3mM

表１

反応に関わる物質の熱力学的な諸量 ４ ）（）内の g 、 l はそれぞれ気体、液体を表す。
物 質

0.00.20.40.60.8

S 0 ( 298K )kJ mol −1

J K −1 mol −1∆G 0sol (298 K )kJ mol −1181.0

印加電圧（Ｖ）(a)∆H 0f ( 298K )H 2 (g)0130.575

H 2 O (l )‑285.8369.91

H 2 O 2 (l )‑187.78

109.6

‑28.5

O2 ( g )0205.02916微小電極の電圧電流特性−電流（μＡ）

10.08.06.04.02.00.00204060

過酸化水素濃度（ｍＭ）(b)

電極電流の過酸化水素濃度依存性
図５

電流の増加する割合は、高濃度側において、やや飽和傾向を示す結果になった。一般に、電極表面での反応が十分速い場合、十分に撹拌していても電極近傍の（印加電圧:0.7V）

一定領域では拡散のみによって物質の移動が行われる

微小電極の電気的特性

こと、また、拡散方程式は線形方程式であることを考慮すれば、電流値は過酸化水素濃度に比例するはずで

H 2 O2 (aq)→ O2 (aq) + 2H + + 2e − L ( 2)1O (aq ) + 2H + + 2e −2 2→ある。従って、本実験で電流に飽和傾向が現れた原因として、電極表面上での反応速度が十分でなかったこ

H 2 O(l ) L (3)の反応が起きているとした場合の電流の流れ始める電圧を見積もると次のようになる。但し、(2)、(3)式の括弧内の aq は、その物質が水溶液中に存在していることを表し、 l は液体状態にあることを表している。標準生成エンタルピーを ∆H 0f (T ) 、標準エント
ロ ピ ー を S 0 (T ) 、 標 準 生 成 ギ ブ ス エ ネ ル ギ ー を0
∆G 0f (T ) 、標準溶解ギブスエネルギーを ∆Gsol(T ) として、(4)〜(8)式の近似を用いる。
∆H 0f (308 K ) = ∆ H 0f (298K ) L ( 4)とが考えられる。
微小電極の櫛 形部分に GOD を固定し、残りの部分をエポキシ樹脂で覆った酵素センサと、そのグルコース溶液に対する応答特性を 写 真 ３ 及び図 ６ に示す。試料
溶液滴下後３分程度で、電流値とグルコース濃度が単調増加の関係になったが、実験時間内に定常電流は観測できなかった。これは、電極材料の触媒能の問題に加えて、電極のサイズが微小電極の特性を引き出せると考えられている値（数十μm 程度 ５ ））と同程度であり、微小化の効果が顕著に現れにくい状況になっていたためであると思われる。

∆S 0 (308K ) = ∆S 0 ( 298K ) L (5)39愛知県工業技術センター研究報告第３６号（２０００）

４．まとめ
本研究では、新規酵素によるバイオセンサ作製の前段階として、GOD による酵素センサを試作し、その特性評価を行った。今回は実験に用いることのできる電極材料に制限があったため、問題点の原因を断定するに至らなかったが、今後は電極材料の変更や作製方法の改良について検討していく予定である。また、酵素膜の膜厚が応答特性に与える影響や、マイコン等によ酵素る実測値からの推定方法についても検討していく予定
写真３である。
酵素センサ参考文献1) 青木ほか：微小電極を用いる電気化学測定法, 電子
100電流（ｎＡ）

情報通信学会(1998).

グルコース： 0mM
グルコース：0.4mM
グルコース：1.6mMグルコース：3.2mM

80602) 小久保 , 松生, 室田 :愛知県工業技術センター報告,3 5 ,39(1999).
3) P.Bloomfield :Fourier Analysis of Time Series;

40

An Introduction, John Wiley & Sons(1976).

204) 日本化学会編：化学便覧 基礎編, 丸善(1984).

0‑50050

100 150 200 250 300 350
時間（秒）

(a)

試料溶液滴下後の電流変化

δＩ（ｎＡ）

252015105001234

グルコース濃度（ｍＭ）(b)

電流増加量の過酸化水素濃度依存性（試料溶液滴下して３分後）

図６40酵素センサの応答特性（印加電圧： 0.7V）5) 北村房男：Electrochemistry, 68(1), 63(2000).