本研究は，日本農芸化学会 2020 年度大会（福岡）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のため中止）に応募された研究のうち，本誌編集委員会が優れた研究とし日本農芸化学会て選定した６題の発表のうちの一つです．

エメンタールタイプチーズ製造時の牧草添加がチーズアイ形成とプロピオン酸菌の生育に及ぼす影響
北海道岩見沢農業高等学校
大山穂華，霞璃桜，髙杉伊吹，古川そら，松本華成，木口紗弥夏，近藤恋果（指導教諭：渡部哲哉）

本校では，エメンタールタイプチーズの製造においてチーズアイの形成不良が生じている．本実験では牧草粉末の添加量●

が，チーズアイ形成，微細構造，プロピオン酸菌量，ならびに有機酸量に及ぼす影響を，各熟成期間の形態を走査型電子顕微鏡と共焦点レーザー顕微鏡による観察，および有機酸と化学と生物

プ ロ ピ オ ン 酸 菌 量 は HPLC と 定 量 的 PCR に て 測 定 し た． 結いると考えた．
われわれはこれまでに，乳量 90 L あたり，牧草を 2 mg
添加して製造したエメンタールタイプチーズのチーズアイ形成が良好であることを明らかにした (2)．また，牧草添加量を 2 mg/90 L を標準値とした製造実験を実施し，果，牧草粉末の添加はプロピオン酸菌の増殖にはあまり影響

高温熟成の温度を 23‒26 C，あるいは段階的に 26 C に上しないが，チーズアイの形成を促進することが明らかとなっ昇させたチーズの有機酸量，乳酸菌，ならびにプロピオた．また，チーズアイの個数とサイズをコントロールできる可能性が示唆された．

ン酸菌量を測定した．乳酸値は熟成 14 日目まで上昇したが，その後低下が認められた．一方，プロピオン酸値

本研究の目的，方法および結果と考察【目的】

は熟成 35 日目まで上昇を続けた．乳酸菌量は熟成 14 日目をピークに低下し，プロピオン酸菌量は 35 日目以降も上昇した．その後，高温熟成中の過剰なプロピオン酸

エメンタールチーズはスイス原産の特徴的なチーズア発酵を抑制するため，熟成温度を 23‒24.5 C に設定するイと呼ばれる直径 1‒3 cm 程度の穴が存在するチーズで，ことで，均一なチーズアイを形成し，牧草添加の効果をその巨大な外観から『チーズの王様』とも呼ばれてい確認することができた．しかしながら，熟成 0, 14, 35,る．製造時に添加するスターター（乳酸菌など），ある84 日目の走査型電子顕微鏡（SEM）によるチーズ構造

いは乳由来のプロピオン酸菌が，熟成初期に生成されるの顕微観察では熟成に大きな影響を与えると考えていた

乳酸塩を高温熟成時に嫌気的に分解し，プロピオン酸，乳酸菌やプロピオン酸菌は発見できたが，牧草片の存在酢酸，二酸化炭素，水を生成することでチーズアイが形は発見できなかった (3)．

成されるとされている (1)．

本研究では先行実験で発見できていない牧草片に注目

近年，本校農場において，チーズアイの形成不良が目し，仮説を「チーズアイは，添加した牧草を起点に形成立つようになった．原産地スイスにおいても同様の問題される，また熟成に必須であるプロピオン酸菌は組織内が発生し，同国のアグロスコープ研究所では「牛舎内のの牧草が存在することで増殖する」とし，牧草添加量に浮遊物が乳に入るとチーズアイができる」という仮説のよるチーズアイ形成とプロピオン酸菌の生育への影響にもとで研究が進められ，牛舎の近代化によって清潔な環ついて調査を行った．

境となり，牧草の粉が舞わず生乳に混入しなくなったた

【方法】

(1)

めと結論付けていた ．本校においても牛舎の改築や，エメンタールタイプチーズの製造には，本校の農場で牛舎内の清潔化により，チーズアイの形成不良に至って飼養しているホルスタイン種とジャージー種から搾乳し化学と生物 Vol. 58, No. 10, 2020589

た生乳を混合した混合乳を使用した．クリーム分離した

12‒13 C で管理し 84 日目まで熟成した．なお，牧草添加後， 乳 脂 肪 分 を 3.0％ に 調 整 し 65 C，30 分 間 の 殺 菌 を量は 100 L あたりの原料に対し，それぞれ 100, 1, 0.1 g で行った．

製造し，試験区 7, 8, 9 とした (3)．

製造工程は乳を 34 C まで冷却後，クリスチャン・ハンセン製 R-700 シリーズ（ssp.
LH-B02（ssp.

ssp.

日本農芸化学会●

チーズの中央部を細断し，滅菌生理食塩水 270 mL と細），高温菌スターター

断したチーズ 30 g をサニスペックテストバックに入れ，），ST-36（3 分間ストマッキング処理（粉砕・撹拌装置を用いた均），プロピオン酸菌 PR-1質化）をした．有機酸の測定は紫外検出‒逆相吸着高速）を添液体クロマトグラフィー（HPLC）で行い，ストマッキ加した．また，粉末牧草の添加は，チーズバット全体にン グ 処 理 を し た ろ 液 25 mL を 遠 心 分 離 し（1,000 rpm,行き渡るようにするため，レンネット（凝乳酵素）添加10 min, 25 C），デカンテーションにより得られた上清を直前の撹拌工程で添加し，レンネット添加後カード形成測定試料とした．定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を確認し，カッティングした（カードとはチーズとなる

ではチーズ試料から抽出した DNA を用い，絶対検量線部分のこと）．その後，撹拌しホエーを 1/3 排除し，85 C法によりプロピオン酸菌量を定量した．チーズ沈査からの加湯で 48 C になるように 25 分間で加温した．30 分間抽出した DNA 溶液を 20 倍に希釈し，プロピオン酸菌特48 C でクッキング後，予備圧搾でチーズの形を整え，異的プライマーを使用して DNA 量に基づくプロピオン12 h, 0.1 MPa/cm2 で本圧搾をした．その後の塩漬は pH酸菌の菌量を測定した．

（

化学と生物有機酸，および微生物の菌量定量実験の前処理として

ssp.

5.5, Bh（比重の計量単位）22‒23 のブライン（飽和食塩

各試験区のチーズ断面図を熟成毎にフリーソフトウェ水）を用い，1 kg あたり 80 分の塩漬を行った．塩漬終

アの Image J を用いて画像解析を行い，チーズアイの個了後に乾燥し，熟成中は 1 週間の内，月，水，金曜日の数，あるいはスケール面積を解析した．

3 日間を KONDO ヴィンヤードで製造された地元岩見沢

SEM による観察では，各試験区の熟成 0, 14, 35 ある産ワインの残渣活用ワインと食塩水の混合液を用いて

いは 56, 84 日目でサンプリングし，添加したスターターチーズをウォッシュした（熟成中のチーズの表面に悪影である乳酸菌・プロピオン酸菌や，タンパク質，脂肪球響を与える菌の増殖を防ぐため）．の形態を観察した．

低温熟成は 12‒13 C で 14 日間，高温熟成は先行実験の共焦点レーザー顕微鏡観察では先行研究 (4〜6) を参考

結果から相対温度 23‒24.5 C で 21 日間，再度低温熟成に，タンパク質マトリックスや脂肪球を染色し観察を行なった．チーズ組織中のタンパク質成分（主にカゼイ

表 1 ■ SEM および共焦点レーザー顕微鏡による計測結果（nm）［a］SEMによるタンパク質マトリックス線維の幅の計測結果（nm）

試験区 8
試験区 90 日目

14 日目

35 日目

84 日目

5.45
5.29

5.07
4.47

2.85
3.30

2.53
1.63

［b］SEM による脂肪球の直径の計測結果（nm）

試験区 8試験区 90 日目

14 日目

35 日目

84 日目

2.55
2.47

2.51
2.43

2.52
2.38

2.41
2.42

［c］共焦点レーザー顕微鏡によるタンパク質マトリックス線維の幅の計測結果（nm）

試験区 8試験区 9590

ルレッドにて染色して検鏡した．
【結果】
SEM 像にあるタンパク質マトリックス部分をランダムに 20 箇所選択し，マトリックス線維の幅を測定した．
熟成に伴いマトリックス線維の幅は狭くなり，脂肪球が存在したと考えられる組織上の球状の凹みに大きな変化はなかった（表 1［a］,［b］）．さらに，試験区 7 の試料，ならびに試験区 8 の熟成 35 日目の試料に，粉末牧草とプロピオン酸菌群が共存している領域を確認した（図 1）．
共焦点レーザー顕微鏡での観察では，SEM 同様，画

0 日目

14 日目

35 日目

84 日目

面上でフルオレセインイソチオシアネートにより緑色に

5.26
4.69

5.24
4.01

3.98
2.50

1.42
1.60

染色されたタンパク質マトリックス線維の幅を測定した［d］共焦点レーザー顕微鏡による脂肪球の直径の計測結果（nm）

試験区 8
試験区 9ン）はフルオレセインイソチオシアネート，脂肪はナイ

ところ熟成初期に比べ，熟成が進むほど幅は小さくなった．
（表 1［c］，図 2）ナイルレッドで赤色に染色された

0 日目

14 日目

35 日目

84 日目

脂 肪 球 は 熟 成 に 伴 い 大 き く な っ た（表 1［d］， 図 2）．

2.90
2.76

3.03
2.87

3.10
2.99

2.76
2.40

チーズ組織の構成成分であるタンパク質マトリックス線
維は熟成とともに減少した．試験区 8 は 35 日目でいった

化学と生物 Vol. 58, No. 10, 2020

日本農芸化学会

図 1 ■ SEM で観察した各試験区の牧草片とプロピオン酸菌の画像［a］試験区 7 の牧草片とプロピオン酸菌．［b］試験区 8 の牧草片とプロピオン酸菌．

ん減少し 84 日目では増加した．試験区 9 は熟成とともに増加減少を繰り返した．
脂肪球の構造については，14 日目でいったん増加後●に減少した．HPLC による有機酸含有量の測定では，熟成 84 日目において，酪酸値は先行実験と同様に Controlより大きく減少した．同様に，乳酸量は減少，プロピオン酸は増加した（図 3［b］,［c］）
．

化学と生物

熟成 84 日目のチーズにおいては，牧草添加量が多い方が単位面積当たりのチーズアイの個数が多かったが，そのサイズは小さくなる傾向にあった（図 4［a］）．
菌叢解析の結果，ssp.のプロピオン酸菌量は熟成 35 と 56 日目から急激に増加したが，84 日目には大きな変動は見られなかった．試験区 7 の菌量が最も高かったが，プロピオン酸菌の増殖には大きな影響は与えないようである（図 3［d］）．
【考察】
SEM の観察より，試験区 7 と 8 でチーズ組織内に牧草片が発見され，その周囲にプロピオン酸菌の細菌群が存在するのが確認された．このことから牧草片が存在することでプロピオン酸菌がより多く生育し，乳酸菌により生成された乳酸をより多く代謝したことで二酸化炭素の放出量が多くなり，チーズアイが形成されると考えられた（図 1）．

図 2 ■ 各熟成日数の共焦点レーザー顕微鏡の画像［左］フルオレセインイソチオシアネート染色．
［右］ナイルレッド染色．

るため美味しくなると推察された (7)（表 1，図 2）．

タンパク質マトリックス線維の構造が熟成とともに小HPLC の有機酸含有量の測定では，酪酸値は先行実験さくなっていたことが共焦点レーザー顕微鏡による観察と同様に Control 値より大きく下回っていることから，から明らかになったが，このことは熟成によって乳中のワインと混合した食塩水でウォッシュすることで，その水分が抜け細くなったためとが考えられた．風味として生成を抑制できたと考えられた（図 3［a］）．熟成が進むは，水分の蒸散とともに，タンパク質の濃度は高くなとともに，乳酸は減少し，プロピオン酸は増加している

り，かつ微生物，あるいは微生物由来のタンパク質分解ことから，プロピオン酸菌に代謝された乳酸が減少し，酵素により，分解が進みペプチドとなり，アミノ酸になプロピオン酸菌がプロピオン酸を生成したためであろう

化学と生物 Vol. 58, No. 10, 2020591

日本農芸化学会

化学と生物●

図 3 ■［a］HPLC による熟成 84 日目の酪酸値，［b］HPLC による各試験区の熟成期間中の乳酸値，［c］各試験区の熟成期間中プロピオン酸値，［d］qPCR によるssp.の菌量

図 4 ■ 各試験区のチーズアイの個数・面積・割合（図 3［b］,［c］）．
qPCR で はssp.

は高温熟成の終了時，あるいは低温熟成に移行した 35 と 56 日目に増加したことから，先行実験(2, 3)

本研究の意義と展望
本研究においてチーズアイ中に牧草片とプロピオン酸同様，プロピオン酸菌を観察することができたことから，スイスのアグロス菌が，乳酸を代謝しプロピオン酸産生が増大したと考え

コープ研究所の報告にあるように (1)，牧草片由来のセルられる（図 3［d］）．

ロースがプロピオン酸菌の増殖，およびチーズアイ形成

熟成 84 日目のチーズアイは，牧草添加量が多いと個に重要な役割を果たしている可能性が強く示唆された．

数が多くなり，そのサイズは小さかったことから，牧草

チーズ構造中のタンパク質マトリックスについては熟成があるところにプロピオン酸菌が増殖したためと推察しが進むとともに細くなるが，脂肪球のサイズは大きくなた（図 4［a］）．

る可能性がある．本実験の結果は，本校でチーズアイが美しく形成されたエメンタールタイプチーズの製造が永劫的に標準化され，品質の高いチーズの製造を行っていくための重要な基礎データとなる．また，食塩水と混合592

化学と生物 Vol. 58, No. 10, 2020

した残渣ワインによるウォッシュによって，酪酸生成を抑制できたことも，地域の産物を活用した他製品も含めた特色あるチーズ製造に貢献できうる基礎データであると考える（図 4［b］）．
謝辞：この研究について御助言いただきました酪農学園大学・岩﨑智仁教授，山口昭弘教授，長谷川靖洋助教に深く感謝いたします．

1) D. Guggisberg, P. Schuetz, H. Winkler, R. Amrein, E. Jakob, M. Fröhlich-Wyder, S. Irmler, W. Bisig, I. Jerjen, M.
Plamondon:, 47, 118 (2015).
2) 渡部哲哉，山口昭弘，近藤良介，山﨑昭宏，川本あすか，菅井理央，壽﨑未由生，小川恵人，佐藤礼奈，山田智子：
平成 25 年度指定スーパーサイエンスハイスクール研究収
録【第 5 年次】平成 30 年 3 月北海道岩見沢農業高等学校，
pp. 18‒21, pp. 23‒28.

Copyright © 2020 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.58.589

化学と生物●

日本農芸化学会

文献3) 渡部哲哉，山口昭弘，岩﨑智仁，近藤良介，手塚 圭，
山﨑昭宏，小川恵人，佐藤礼奈，山田智子，大山穂華，
霞 璃桜，髙杉伊吹，古川そら，松本華成：平成 25 年度
指定スーパーサイエンスハイスクール研究収録【経過措置第 1 年次】平成 30 年 3 月北海道岩見沢農業高等学校，
pp. 18‒23, pp. 25‒304) C. Lopez, B. Camier & J.-Y. Gassi:, 17, 240(2007).
5) C. D. Hickey, J. J. Sheehan, M. G. Wilkinson & M. A. E.
Auty:, 6, 99 (2015).
6) C. Lopez, M. Maillard, V. Briard-Bion, B. Camier & J.
Hannon:, 54, 5861 (2006).
7) NPO 法人チーズプロフェッショナル協会： チーズを科学する， 初版第 1 刷，幸工房，pp. 38‒39, pp. 97‒114, 2016.

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