保健科学研究10(1)： 19―24，2019【原著】
X 線照射がラット肺胞線維芽細胞のエラスチンへ及ぼす影響
北山義尚*1

白戸佑貴*2

椎谷賢*1 嵯峨涼*3 寺島真悟*3
敦賀英知*3

細川洋一郎*3（2019 年 6 月 13 日受付，2019 年 8 月 30 日受理）
要旨：弾性線維は全身に広く分布する細胞外基質の 1 つである。これまで肺胞の弾性線維が X 線照射によって分解することは報告されていない。そこで，肺胞の線維芽細胞を用いた細胞培養系により，弾性線維に X 線を 10Gy，20Gy，30Gy 照射した。その結果，X 線照射後 12 時間では弾性線維の分解は観察されなかったが，24 時間後では有意な分解傾向が観察された。本研究により肺胞の弾性線維が X 線により分解することが示唆された。

キ－ワ－ド：放射線肺炎，肺胞，弾性線維I.

はじめに
近年，日本での人口動態統計によるがん死亡デ－タでは，リジルオキシタ－ゼが作用することにより，肺胞線維芽細胞から分泌されるトロポエラスチンが互いに架橋結合を起こしながら微細線維の束に沈着することで弾性線維が形成

男女計のがん部位別において，肺がんによる死亡者が最もされる 8， 9， 10)。肺胞弾性線維の破壊により，肺炎および肺多い 1)。肺がん患者への放射線治療の役割は，根治目的胸気腫様症状が生じることが報告されている 11， 12)。放射線部放射線治療，術前術後照射，再発転移に対する緩和照射治療の際の肺照射体積によって，放射線治療の副作用であなど多岐にわたる。肺がんに対する放射線治療では，直線る放射線肺炎の発生が起こりうる線量が変化する。線量の加速器による 6 ~10MV の X 線を用い，CT シミュレ－ショ変化については，照射体積が全肺の 1/3（%）であると 45Gy

ンによる 3 次元的治療計画にて不均質補正を用いて行い，であるのに対し，2/3（%）であると 30Gy で放射線肺炎が必要に応じて適切な呼吸性移動対策を行う 2， 3)。放射線治生じ得ると日本腫瘍学会ガイドラインで報告されている療に用いられる X 線は，腫瘍だけではなく正常組織におい13)。しかし，肺胞の弾性線維が X 線照射によって分解されても損傷を引き起こす。正常肺組織の放射線障害には，早るか否かを解析した報告はない。そこで，X 線照射後のラ期障害である放射線肺炎と，晩期障害である放射線誘発性ット肺胞線維芽細胞が形成した弾性線維の X 線照射による肺線維症がある。放射線肺炎では多くの病変が限局性だが，変化を，細胞培養系を用いてトロポエラスチンの蛍光免疫患部の範囲が広いときは重篤な症状となり死亡することも染色により解析する。

ある。放射線肺炎の定義はいまだ完全には定義づけされていないが，損傷を受けた肺組織と，感染症を伴う炎症の組み合わせと考えられている 4)。放射線肺炎の原因として，

II. 方法肺組織の肺胞の損傷が挙げられている 4， 5， 6)。

1．培養細胞および X 線照射

肺の末梢にある肺胞は伸縮性と弾性を有し，呼吸運動に培養細胞はラット肺胞線維芽細胞 （RFL－6 ; Healthより肺は膨張する。呼吸は肋間筋や横隔膜が動くことで肺Protection Agency， Salisbury， UK）を培養細胞として用いが受動的に膨らむことで空気を取り入れ，肺自身の弾性にた。培養培地は Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）

よって縮むことで空気を吐き出す。このように肺は呼吸に（SIGMA－ALDRICH， Missouri， USA）とし，仔牛血清より大きく構造が変化するため，呼吸作用には伸縮性と弾（Gibco， Massachusetts， USA）を 10%となるように添加性を生み出す弾性線維が必要となる 7)。肺胞の弾性線維のし，また抗生物質（Penicillin ： 100unit/ml， Streptomycin：形成は，初めに糖タンパク質であるフィブリリン分子が肺100µg/ml）（Roche， Basel， Switzerland）を 1%となるよう胞線維芽細胞から分泌され，分子間でトランスグルタミナに添加した。細胞をインキュベ－タ（MCO－5AC－PJ，－ゼにより架橋結合を起こし微細線維を形成する。その後，SANYO， Osaka， Japan）にて CO2 を 5%とし，37℃環境*1 弘前大学大学院保健学研究科博士前期課程
Master’s Course in Hirosaki University Graduate School of Health Science〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*2 弘前大学大学院保健学研究科博士後期課程
Doctor’s Course in Hirosaki University Graduate School of Health Science〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111

66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*3 弘前大学大学院保健学研究科
Hirosaki University Graduate School of Health Science〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-511166-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japanⓒ2019 Health sciences Research.

Correspondence Author tsuru@hirosaki-u.ac.jp

19X 線照射がラット肺胞線維芽細胞のエラスチンへ及ぼす影響下でコンフルエントになるのを観察後，4 週間培養した。4では，すべての線量で，エラスチン陽性部位の減少が観察

週間培養した時点で，X 線発生装置（MBR－1520－R－3，された（図 3）。また，エラスチン陽性部位の面積解析を行HITACHI， Tokyo， Japan）を用いて 10Gy，20Gy またはった結果，線量依存的に陽性部位の面積は減少し，非照射30Gy の X 線照射を行った。X 線の照射条件は管電圧 150kVp，群と照射群にて有意な差が検出された（図 4）。さらに、DAPI

管電流 20mA，線量率 0．99~1．01Gy/min，フィルタを 0．

染色では，X 線照射後 12 時間および 24 時間後においても，5mmAl +0．3mmCu と設定した。

核の変化や細胞の膨潤などの変化は観察されなかった（図1，図 3）。

2．蛍光免疫染
X 線照射後 12 時間および 24 時間の細胞を 5 分間，4%パ
ラホルムアルデヒドりん酸緩衝液（Wako， Osaka， Japan）
を 用 い て 固 定 を 行 っ た 。 1 次 抗 体 (PR393 ; anti － humantropoelastin antibody ， rabbit polyclonal ）（ Elastin ProductCompanies， Missouri， USA）を 2000 倍希釈で添加し，室温にて 12 時間インキュベ－トした。その後，2 次抗体（AlexaFluor® 488－labeled anti－rabbit IgG antibody， goat polyclonal）（Life technology， California， USA）を添加し，アルミホイルにて遮光を行い，室温にて 2 時間インキュベ－トした。
その後，DAPI 染色を行い，蛍光顕微鏡（IX71N－22PH，Olympus， Osaka， Japan）にて観察を行った。

図 1 X 線照射後 12 時間後のエラスチンの免疫染色像および DAPI 染色像
非照射および 10Gy，20Gy，30Gy 照射群でのエラスチンの免疫染色像を上段に示す。非照射および 10Gy，20Gy，30Gy

3．細胞数の計数
X 線照射 24 時間後のラット肺胞線維芽細胞を 0．25%ト

照射群での核の染色像を DAPI 染色にて下段に示す。スケ－ルバ－は 50µm である。

リプシン処理し，60φ培養皿（MS－11600， Sumitomo
Bakelite Co， Tokyo， Japan）に DMEM を 1ml 添加した後，細胞を回収し，遠心分離器（IEC61010－2－020， KUBOTA，Osaka， Japan）を用い，10round/min として，3 分間遠心分離を行った。遠心分離後，上清をアスピレ－トし，DMEMを添加した。その後，生細胞数の計数を行った。
4．面積解析
蛍光免疫染色にて得られた染色像を，Image J にて面積解析を行った。面積解析で得られた値を Turkey–Kramar 法，Scheffe’s F test 法，Bonferroni/Dunn 法を用いて検定を行い，その分散に関して一元配置分散分析法を用いて分析し，グラフを作成した。
図 2 X 線照射後 12 時間後のエラスチンの免疫染色像

III. 結果の面積解析
非照射および 10Gy，20Gy，30Gy 照射群でのエラスチンの1．ラット肺胞線維芽細胞が形成したエラスチンの免疫染免疫染色像の面積解析を行い，X 線照射によるエラスチン色像および DAPI 染色像と X 線照射による変化の免疫染色像の面積の変化を示す。非照射群をコントロ－最初に、ラット肺胞線維芽細胞を培養しコンフルエント

ルとする。コントロ－ル群は n=8，その他の群も n=8 であ後，4 週間培養し， エラスチンの免疫染色により弾性線維る。デ－タはコントロ－ル群を 1 と規格化した後，平均値が形成され連続したエラスチンの染色像を観察した。ラッ±標準偏差で示している。コントロ－ル群と照射群とで有ト肺胞線維芽細胞を 4 週間培養した後，X 線を 10Gy，20Gy，意な差は認められない。

30Gy と照射を行った。照射後 12 時間では、すべての線量で連続したエラスチン陽性像が観察された（図 1）。エラスチン陽性部位の面積解析を行った結果，非照射群と照射群にて有意な差は認められなかった（図 2）。照射後 24 時間ⓒ2019 Health sciences Research.

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北山，白戸，椎谷，嵯峨，寺島，細川，敦賀

図 3 X 線照射後 24 時間後のエラスチンの免疫染色像
および核染色像
非照射および 10Gy，20Gy，30Gy 照射群でのエラスチンの免疫染色像を上段に示す。非照射および 10Gy，20Gy，30Gy
照射群での核の染色を DAPI 染色にて下段に示す。スケ－ルバ－は 50µm である。

図 5 X 線照射後 24 時間後の RLF の細胞数
非照射および 10Gy，20Gy，30Gy 照射群でのラット肺胞線維芽細胞の細胞数を示す。非照射群をコントロ－ルとする。
コントロ－ル群は n=8，その他の群も n=8 である。デ－タはコントロ－ル群を 1 と規格化した後，平均値±標準偏差で示す。コントロ－ル群と照射群とで有意な差は認められない。

IV. 考察本研究では，ラット肺胞線維芽細胞の形成した弾性線維を対象として，X 線照射が弾性線維の分解に与える影響に関して解析することを目的とした。コンフルエント後のラット肺胞線維芽細胞をさらに 4 週間培養すると連続した弾性線維が形成される。その弾性線維に X 線を 10Gy，20Gy，
図 4 X 線照射後 24 時間後のエラスチンの免疫染色像の面積解析

30Gy と照射を行い，その 12 時間および 24 時間後と時間経過による線維の分解について，エラスチンの免疫染色像から面積解析を行った。弾性線維の形成過程で、細胞が分非照射および 10Gy，20Gy，30Gy 照射群でのエラスチンの泌するトロポエラスチンは微細線維上で互いに架橋結合す

免疫染色像から，面積解析を行い，X 線照射によるエラスることによりエラスチンとなり弾性線維が成長する。免疫チンの免疫染色像の面積の変化を示す。非照射群をコント染色に使用した 1 次抗体である抗トロポエラスチン抗体は，

ロ－ルとした。コントロ－ル群は n=8，その他の群も n=8弾性線維のエラスチンに反応することが知られている 14)。

である。デ－タはコントロ－ル群を 1 と規格化した後，平その結果，エラスチンの 24 時間後の免疫染色像から，エラ均値±標準偏差で示している。**は非照射群（0Gy）と照射スチンの減少が確認された（図 3）。また，面積解析を行っ群（10Gy，20Gy，30Gy）に対して P 値を 0．01 と定め，有た結果，非照射群と照射群にて，有意な差を検出した（図意差がみられたことを示す。

4）。この結果から，X 線照射後 24 時間では，X 線照射により有意に弾性線維の分解がなされることが明らかとなった。

2．X 線照射後の細胞数の変化

これまで，弾性線維のタ－ンオ－バ－は非常に遅いと考

ラット肺胞線維芽細胞を培養しコンフルエント後，4 週

えられてきた 15)。弾性線維の分解機構として，X 線照射に間培養した後，X 線を 10Gy，20Gy，30Gy と照射を行った。

よ っ て 培 養 シ ャ － レ 中 に 生 じ た Reactive oxygen species

24 時間後の生細胞数を計数した（図 5）。全ての照射群にお（ROS）や Matrix metalloproteinase （MMP）の関与が考えいて対照群（0Gy）に対して細胞数に有意な差は見られなかられる。酸化ストレスにより生成された酸化剤が，新たにった。

合成されたトロポエラスチンを修飾し，トロポエラスチンのフィブリリン 2 分子や MAGP－1 分子への凝集を阻害したという報告がある 16)。そのため，X 線照射により生じたⓒ2019 Health sciences Research.

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X 線照射がラット肺胞線維芽細胞のエラスチンへ及ぼす影響

ROS がトロポエラスチンの微細線維への凝集を阻害したと考えられる。また，MMP に関して，MMP－1，2，7，9，12 がコラ－ゲンとエラスチンを含む様々な細胞外マトリックスを分解するプロテア－ゼであるという仮説がある17)。
これまでの報告では，エラスチンを基質とする MMP はV. おわりに本研究では，ラット肺胞線維芽細胞が形成した弾性線維を蛍光免疫染色にて観察し，X 線照射により弾性線維の陽性像の減少が確認された。このことから，X 線照射により肺胞の弾性線維が分解されることが示唆された。

MMP－3，9，10，12 である 18)。更に，トロポエラスチンが沈着する足場である微細線維を構成するさまざまな分子もMMP の基質となっている 16， 17， 19)。このことから，エラ利益相反
開示すべき利益相反はありません。

スチンの沈着の足場である微細線維が分解されることによりエラスチンの沈着が抑制されたということも一因として考えられる。さらに，本実験と同一細胞のラット肺胞線維芽細胞を用いた実験において，MMP－9 の発現が観察されProMMP－9 の活性化がザイモグラフィ－にて観察されたという報告がある 20)。また，ヒト血管平滑筋細胞が発現した ProMMP－2，ProMMP－9 が，マクロファ－ジ由来の泡沫細胞から生じた ROS により活性化されたという報告もある 21)。この二つの報告から，X 線照射により生じる ROSが，ラット肺胞線維芽細胞の産出した MMP－9 に作用することにより，MMP－9 が活性化し弾性線維の分解に至ったとも考えられる。
エラスチンの 12 時間後の免疫染色像から，エラスチンの減少が確認されなかった（図 1）。また，面積解析を行った結果，非照射群と照射群にて，有意な差は検出されなかった（図 2）。以上の結果から，X 線照射後 12 時間の時点
ではエラスチンの分解が観察されないことが明らかとなった。このことから X 線照射から，12 時間以降にエラスチンの分解がなされると考えられる。ここで，ヒト皮膚線維芽細胞において，X 線照射によって生じる ROS は，X 線照射後 6 時間にて有意な増加がみられないという報告がある 22)。
このことにより，X 線照射によりエラスチンの分解に関して ROS の関与は少ないと考えられる。MMP に関しては，活性化までの時間が必要であり，さらに，一度架橋結合したエラスチンは可溶化されにくいことから 22)，12 時間以内には分解が確認されなかった可能性がある。
X 線照射 12 時間および 24 時間後の DAPI 染色像の結果から，X 線照射後による核の変化はみられなかった。二本鎖切断修復能が正常なヒト線維芽細胞では，X 線 10Gy を照射後 24 時間では生存率に有意差がなかったという報告がある 23)。そのため，核の膨潤等が観察されなかったと考えられる。また，X 線照射後 24 時間において，ラット肺胞線維芽細胞の照射群と非照射群とで有意な細胞数の差が認められなかったことは，ヒトおよびラット線維芽細胞は X
線に対して，この条件下では高い感受性を示さなかったと考えられる（図 5）。

ⓒ2019 Health sciences Research.

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ⓒ2019 Health sciences Research.

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X 線照射がラット肺胞線維芽細胞のエラスチンへ及ぼす影響【Original article】
The effect of X－ray irradiation on elastic fibers formed by rat lungfibroblasts in vitro
YOSHITAKA KITAYAMA*1 YUKI SHIROTO*2
SUGURU SHIIYA*1
RYO SAGA*3 SHINGO TERASHIMA*3 YOICHIRO HOSOKAWA*3EICHI TSURUGA*3（Received June 13，2019 ; Accepted August 30，2019）

Abstract： Elastic fibers are one of the extracellular matrices， which distribute throughout human organizations． It had
not been reported that the elastic fibers in the lung alveoli are degraded by X－ray irradiation． Therefore， in this study，
we performed to examine whether the elastic fibers are degraded by X－ray irradiation or not． We cultured lung fibroblastsfor 4 weeks and examine the degradation of elastin after X－ray irradiation using immunofluorescence． Elastic fibers wereirradiated with X－rays at 10， 20， and 30 Gy． As a result， the elastic fibers were not degraded by 12 hours after X－
ray irradiation． However， at 24 hours after X－ray irradiation， we observed the tendency that elastic fibers were degradedby X－ray irradiation． These results suggest that the elastic fibers in lung alveoli were degraded by X－rays．
Keywords： radiation pneumonia， alveoli， elastic fiberⓒ2019 Health sciences Research.

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