①

GC/TOF-MSを用いた血液中のPOPs分析
GC/TOF-MS○望月あゆみ, 平井哲也 , 藤峰慶徳
大塚製薬㈱ 大塚ライフサイエンス事業部
EDC分析センター

POPsとはPersistent Organic Pollutants: 残留性有機汚染物質
DDT，アルドリン，ディルドリン，エンドリン，クロルデン，ヘプタクロル→1948〜1975年の間に農薬として使用登録されていたヘキサクロロベンゼン，マイレックス，トキサフェン→日本国内では未登録
PCB，ダイオキシン類（PCDD/Fs）→非意図的生成物・工業原料
合計12種類
主に農薬・殺虫剤・難燃剤として世界中で大量に使用されていたが，2001年，「残留性有機汚染物質に関するストックホルム条約」により地球規模での製造・使用規制

POPsは…
○人や生物に対する毒性が強い○難分解性で生物濃縮が起きる○大気・水・生物環境を通じ地球規模で汚染が移行する

暴露状況や人体影響を調査するために規制物質ならびにその代謝物の血液濃度の測定が必要②

③

POPsの分析法
測定対象：DDT類, ドリン類, クロルデン類, ヘプタクロル, HCB, マイレックス等の有機塩素系化合物とその代謝物21種＋PCBs，PCDDs，PCDFs＋Toxaphene
今後さらに規制される化合物数は増加するものと予想される多成分一斉分析を行うには…
SIM法による測定では，モニターイオンの増加に伴い・感度の低下→必要な感度が得られない・時間軸を細かく区切ってモニターイオンの設定をする→条件設定が困難
また、SIM法では個々のマススペクトルが得られないため，標準物質が入手困難な場合，ピークの同定が困難

スキャン測定④

GCT（GC/TOF-MS）の特徴
・操作が簡易．
・高分解能で測定可能（R≧6000，mDaレベルの質量分析が可）・スキャン速度に優れている．（TOF：最高10スキャン/秒，HRMS：0.3スキャン/秒）

GCTなら…
・スキャン測定に適しており，mDaレベルの信頼性の高いマススペクトルを得ることができる→より精度の高い化合物同定が可能
・スキャン質量範囲内であれば…
測定対象物質の定量と同時に，その他の化合物についても質量数を指定し，検索・同定することができる

目的目的・HRGC/TOF-MSを用いた血液中のPOPsの分析方法の定量性を調べる
・個々のマススペクトルとライブラリを照合し、化合物の同定を行う
・定量対象物質以外の化合物について検索・同定を行う。

測定化合物
測定化合物
HCB, β-HCH, γ-HCH, Heptachlor epoxide, Oxychlordane, t-nonachlor, Dieldrin,
2,4’-DDT, 4,4’-DDT, Mirex and 4,4’-DDE
計11化合物

試薬・試料
試薬・試料
・標準品：Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (USA)製・試薬類：ダイオキシン分析用もしくは残留農薬・PCB試験用を使用
・血液試料：日本の一般健常人ボランティア（25〜62歳）17名より採血分析まで−20℃にて冷凍保管⑤

分析方法概要
分析方法概要全血30 mL
飽和硫酸アンモニウム 12 mL
25% エタノール/ヘキサン 24 mL
振とう 30 min

ヘキサン層

水層

13C -OPs 内部標準12ヘキサン 24 mL振とう 30 min

×2回

ヘキサン層 (3回抽出分)

ヘキサン洗浄水で水洗 20 mL×3回

無水硫酸ナトリウムで脱水

エバポレーターで溶媒留去，真空デシケータで一晩乾燥
脂肪重量測定GPC clean-up
18〜26分を分取 (72-104 mL)
ENVI-CARB/LC-NH2/LC-SI cartridge (20 mL tube, SUPELCO, USA)
25%トルエン/アセトニトリル 20 mL
HRGC/TOF-MS 分析
最終濃縮：ノナン 20μL⑥

⑦

機器分析条件精製 (GPC Clean-up)
Column CLNpak EV-G and CLNpak EV-2000 (Shodex®, Japan)
Solvent 30% acetone/cyclohexane
Flow rate 4 mL/min.

測定機器 (GCT)
Hewlett Packard 6890 Series (HRGC) / Micromass GCT mass spectrometer (TOF-MS)
Injection Temp. 280℃
Flow rate 1 mL/min. (constant flow mode)
Column HT8-PCB (Kanto chemical Co.,Ltd. , Japan) 60 m x 0.25 mm i.d.
Oven Temp. 120℃, 0 min; 20℃/min.; 180℃, 0 min.;2℃/min.; 260℃, 11 min.
Interface Temp. 260℃
Source Temp. 260℃
Ionization mode EI mode
Electron Energy 50 eV
Scan range 100-450 m/z
Scan rate 1 scan/sec
Resolution 6500

プール全血30 mLの繰り返し測定時の定量値の変動⑧(n=4)
Range
Compoundso,p’-DDT
p,p’-DDT
p,p’-DDE
β-HCH
γ-HCH

Mean

(ng/g-lipid)(ng/g-lipid)

S.D.

C.V.(%)

N.D.*
11-13
380-500240-280N.D.****
12440270
***

***
1.0
49.2
17.3
***

***
8.1
116.4
***

HCB
Dieldrint-nonachlor
Oxychlordan
Heptachlor epoxide
Mirex

19-23
5.0-6.0
37-48
8.8-11
4.6-5.6
2.4-3.0

21
5.4
44
10
5.2
2.8

2.1
0.6
4.7
0.9
0.5
0.3

9.9
1111
8.9
9.7
9.7

* : N.D. - Not detected⑨日本の一般健常人の血液中有機塩素系化合物濃度(n=17)
Compoundso,p’-DDT
p,p’-DDT

Numbersof N.D.*
7 (41%)
2 (12%)

p,p’-DDE

Mean**

Range**(ng/g-lipid)

1.3
4.7

S.D.**
1.2
3.70 (0%)

180

150

58-680

β-HCH
γ-HCH

0 (0%)
17 (100%)

76
***

120
***

5.5-550***

HCB0 (0%)

14

4.5

5.6-23

Dieldrin

4 (24%)

5.4

3.4

1.5-14t-nonachlor

0 (0%)

16

17

2.4-72Oxychlordan
Heptachlor epoxide

2 (12%)
2 (12%)

5.0
2.2

4.8
2.2

0.98-200.71-9.4

Mirex

8 (47%)

0.92

0.48

0.36-1.7(ng/g-lipid)*N.D. : Not detected (% - percentage of numbers of N.D)** : Except N.D. data

0.35-3.7
1.1-14

⑩

血液分析より得られたTOF マススペクトル245.9997

ライブラリデータ (NIST)

血液分析で得られたTOFマススペクトルとライブラリデータの比較（p,p’-DDE）血液分析より得られたTOF マススペクトルライブラリデータ (NIST)

血液分析で得られたTOFマススペクトルとライブラリデータの比較（β-HCH）⑪

⑫

Total ion chromatogram (TIC)

Select Ion (m/z=359.8415, 361.8385)
Selected ion chromatogram
HxCB [M+2]

Extract mass spectra
TOF mass spectra⑬

HxCB [M+4]

血液分析結果における定量対象外の化合物検索・同定
例① (例： HxCB)TOF mass spectra ⑪

Library data (NIST)

血液分析結果における定量対象外の化合物検索・同定
例② (例： HxCB)

⑬

まとめ

⑭

GC/TOF-MSを用いたPOPs分析では…
・再現性良好 (C.V.=6.4〜11%)
・日本の一般健常人の血液分析結果より, γ-HCHを除くほとんど全ての測定対象化合物の検出が可能であった全ての試料で p,p’-DDE が最も高く (58-680 ng/g-lipid),次いでβ-HCH が高濃度に検出された (5.5-550 ng/g-lipid)
・mDa レベルの精密質量数が得られ，より高精度な化合物同定が可能であった
・有機塩素系農薬類を定量対象とした分析結果より，HxCB（Hexachlorobiphenyl）等の定量対象外の化合物のマススペクトルを検索し，化合物の同定を行うことが可能であった

GC/TOF-MS を用いた分析法はPOPsの定量分析ならびに未知の化合物の検索・同定を行うスクリーニング測定法として有用性が期待される