研究報告
研究報告

秦野研究所年報
39, 9-15（2016）

雌ラットの新生児期化学物質曝露による低用量影響－遺伝的要因の関与について－
大向英夫，根倉司，立花滋博，太田亮

Genetic variation in low-dose effects of neonatal chemical exposure in female rats
Hideo OHMUKAI, Tsukasa NEGURA, Shigehiro TACHIBANA, Ryo OHTA

Neonatal diethylstilbestrol (DES) exposure was performed using two inbred strains of rats, which havebeen selectively bred for high-active and low-active avoidance (HAA and LAA, respectively) in a shuttlebox task. Neonatal female rats of both strains were daily administered by oral gavage at doses of 0(vehicle), 0.05 and 0.5 µg/kg for the first 5 days after birth. Sexual maturation (vaginal opening), bodyweight changes (1 to 52 weeks of age), estrous cycles (8 to 37 weeks of age), avoidance learning (49 or 50
weeks of age), and organ weights (52 weeks of age) were examined in the rats. As a result, accelerated
puberty, increase in body weight, and conflicting effect on avoidance learning were observed in the0.05 and 0.5 µg/kg groups of LAA rats. Early onset of abnormal estrous cycles, increase in weights ofpituitary and adrenal glands was observed in the 0.5 µg/kg group of HAA and LAA rats. These results
suggest that effects of neonatal chemical exposure on sexual maturation, body weight changes, andavoidance learning vary in rats depending on the strain used.

緒言

系統に比べて性周期の加齢性変化を早期に発症す

著者らは，新生児期に投与した低用量のジエチることが知られているが 6），成熟後の体重増加もルスチルベストロール（DES）
が，老化過程で起こ他の系統に比べて大きく，個体差が生じやすい．

る性周期異常に類似した変化を早期に発症させる

このことから，新生児期の化学物質曝露による肥ことを Sprague-Dawley 系ラット と C 57 BL/ 6 J

満への影響には系統差があるものと考えられる．

系マウス を用いて報告した．また，低用量のエさらに，新生児期の化学物質曝露は学習行動にもチニルエストラジオール（EE）でも同様の変化が影響を与える可能性が指摘されていることから，

Sprague-Dawley 系ラット と Wistar 系ラット

今回は行動型と生殖機能に差のある 2 種類の近交

1）

2）

3）

4）

で報告されている．ヒトにおいては，40 歳未満系である Hatano ラットを実験に使用した．

で卵巣機能が停止する早発閉経が知られており，

Hatano ラットはシャトルボックス条件回避学不妊の原因の一つとなっているが，早発閉経の原習試験の成績により Sprague-Dawley 系ラットか因はほとんどわかっていない．

ら高回避系（HAA）と低回避系（LAA）に分離され近年，新生児期の内分泌かく乱化学物質曝露にた亜系統 7）であるが，LAA ラットは HAA ラット

より成人の肥満が誘発される可能性が指摘されてに比べて膣開口日が遅く 8）, 加齢に伴う性周期異おり 5），著者らが C 57 BL/ 6 J 系マウスを用いて常を早期に発症することが知られている 9）．そこ実施した新生児期 DES 曝露の実験 2）でも雌マウで本研究では，新生児期に低用量の DES を曝露

スに肥満傾向がみられたが，Sprague-Dawley 系

した HAA と LAA の雌ラットについて性成熟，体ラットを用いた実験 では体重増加はみられてい重推移，性周期，学習能力および握力検査ならびない．Sprague-Dawley 系ラットは毒性試験に汎に内分泌系の器官重量を測定し，新生児期化学物用されているクローズドコロニーの系統で，他の質曝露が及ぼす低用量影響に遺伝的要因が関与す1）るか否かを調べた．
1

毒性部 毒性学研究室
9

秦野研究所年報 Vol. 39. 2016

材料と方法

性成熟の指標として，生後 25 日から全例につ実験には，妊娠雌ラット（HAA 14 匹，LAA 16いて膣開口の有無を毎日観察し，完成日に体重を匹）を用い，各系統とも 4 匹以上 / 群の 3 群に分け測定した．さらに 8 週齢から 37 週齢まで 2 週間おた．動物は，床敷としてペパークリーン（日本エきに毎日，全例について膣垢を採取し，性周期をスエルシー，静岡）を入れたラット用繁殖ケージ観察した．膣垢像を発情前期，発情期，発情休止（350W × 400D × 180H mm）に 1 匹ずつ収容し，期に分類し，渡辺らの方法 6）に従って性周期の型

温度 21～25℃，湿度 40～75％，照明 12 時間（7 時を分類した． すなわち，4 日から 5 日の間隔で発～19 時点灯）に調節された飼育室で，固型飼料（CE-情期の認められた動物を正常周期とみなし，それ2，日本クレア，東京）と水道水を自由摂取させて以外のものは異常周期と分類した．

飼育した．これらの実験条件は，全て以前実施し各群とも4腹から10匹を無作為に選び，49またた Sprague-Dawly 系ラットを用いたもの と同は50週齢時にシャトルボックス条件回避反応装置じとした．全ての実験操作は，「一般財団法人食（TK-401L，ユニコム，神奈川）を用いて能動的回品薬品安全センター秦野研究所 動物実験に関す避学習試験（10試行を1セットとして連続6回，1る指針（機関内規程）」に基づいて実施した．

日6セットを連続3日間）を実施した．また，50週

1）

DES の 投 与 経 路 は，Sprague-Dawley 系 ラ ッ

齢時にラット・マウス用握力測定装置（MK-380CM/

トを用いた実験 と同様に強制経口投与を選択しR，室町機器，東京）を用いて握力測定を行った．

た． 投 与 量 は，Sprague-Dawley 系 ラ ッ ト を 用

52 週齢時に全例をペントバルビタールナトリ

いた実験 で性周期異常を早期に発症させた 0 . 5

ウム麻酔下で安楽死させ，剖検した．その際，下µg/kg/day と， 性 周 期 異 常 の 早 期 化 を 起 こ さ な

垂体，副腎および卵巣の重量を測定した．

1）

1）

かった 0.05 µg/kg/day とした．投与には，シグ離乳前の児に関するデータは腹単位，離乳以降

マ・アルドリッチ社（St. Louis, MO）製の DES をのデータは個体を標本単位として，系統ごとに一20 mg 秤量し，1 mL のエタノール（和光純薬，大元配置型の分散分析あるいは繰り返しのある二元阪）に溶解後，トウモロコシ油（ナカライテスク，配置の分散分析を行い，群間に有意性が認められ京都）で段階希釈して調製した 0 . 05 および 0 . 005

た場合は Dunnett 法による多重比較検定を行っµg/mL 液を使用した．なお，対照群の児動物には，た．性周期異常の頻度と剖検時に認められた異常トウモロコシ油のみを投与した．

所見については，Fisher の直接確率検定を行っ新生児は，生後 1 日（分娩日を生後 0 日とした）た．有意水準はいずれも 5 % および 1 % とした．に外表異常がなく，体重値にも顕著な差がない雌児を優先的に選び，雌児数は 4～8 匹 / 腹とし，残結果

りは雄児で 10 匹 / 腹に調整した．投与液量は 10性成熟（図 1）：LAA ラットでは膣開口日が DESmL/kg 体重とし，マイクロシリンジおよび栄養カの用量に依存して早まる傾向がみられ，0 . 5 µg/kg

テーテル（アトム栄養カテーテル，外径 1 . 0 mm，投与群の膣開口日（平均±標準偏差：34 . 8 ± 1 . 9）

アトムメディカル，東京）を応用して作製した新は同系統の対照群（37 . 0 ± 1 . 5）と比較して有意生児用胃管を用いて，生後 1 日から生後 5 日まに短縮した．一方，HAA ラットでは，膣開口日で 1 日 1 回投与した．なお，同腹児は全て同じ投に DES 投与の影響は認められなかった．完成日

与量を投与した．投与した児動物は，生後 10 日の体重には，両系とも群間に有意差はみられなに母動物とともに金属製金網床ケージ（220 W ×かった．なお，両系統の対照群を比較すると，270D × 190H mm）に収容し，生後 22 日に雌児

LAA ラットは HAA ラット（33 . 4 ± 1 . 0）に比べてのみ離乳させ，同ケージに 2～3 匹ずつ収容した．

膣開口日が 4 日ほど遅かった．

児動物の体重を，生後 1～5 日までは毎日測定し，体重推移（図 2）：LAA ラットでは 0 . 05 および 0 . 5

以降 10 週齢までは週 1 回，10 週齢以降は 2 週間µg/kg 投与群の体重が 4 週齢以降，同系統の対照に 1 回，28 週齢以降は 4 週間に 1 回，52 週齢まで群と比較して有意に増加した．HAA ラットでは測定した．

0 . 05 µg/kg 投与群の体重が 3 および 4 週齢で同系

10

研究報告

図1

新生児期に DES を投与した HAA および LAA ラットの膣開口日（各日齢における膣開口が完成した動物の割合）

図2

新生児期に DES を投与した HAA および LAA ラットの体重推移** は対照群と比較して有意差（5％および 1 ％）があることを示す．

統の対照群と比べて有意に増加したが，それ以対照群を比較すると，LAA ラットの方が HAA ラッ降，DES 投与群と対照群との間で有意差は認め

トより性周期異常が早期に発現した．

られなかった．なお，両系の対照群を比較すると，

シャトルボックス条件回避学習試験（図 4）： LAA

LAA ラットの体重は HAA ラットより低値で推移

ラットでは試行 1 日目の回避率が 0 . 5 µg/kg 投与した．

群で上昇し，試行2日目以降の回避率が0 . 05 µg/kg

性周期（図 3）：0.5 µg/kg 投与群では，HAA ラッ投与群で低下した．一方，HAA ラットでは回避

ト，LAA ラットともに性周期異常が早期に観察さ率に DES 投与の影響は認められなかった．両系

れ，20 週齢までに 90% 以上の動物が性周期異常の対照群を比較すると，HAA ラットは LAA ラッを示した．この間の主な異常周期の型は，両系とトに比べて明らかに高い回避率を示した．

も前半は不規則周期であったが，HAA ラットでは握力測定（表 1）：両系統とも前肢，後肢ともに16 週齢以降，LAA ラットでは 20 週齢以降に連続DES 投与の影響は認められなかった．また，両発情となった．0.05 µg/kg 投与群では，HAA ラッ系の対照群を比較しても握力に系統差は認められ

ト，LAA ラットともに性周期異常の割合はそれぞなかった．

れの対照群と同様の推移を示した．なお，両系の器官重量（図 5）：0 . 5 µg/kg 投与群では，下垂体11秦野研究所年報…Vol.…39.…2016

図3

新生児期に DES を投与した HAA および LAA ラットの性周期（各週齢における性周期異常を示す動物の割合）*，** は対照群と比較して有意差（5 ％および 1 ％）があることを示す．

図 4 新生児期に DES を投与した HAA および LAA ラットのシャトルボックス条件回避学習試験** は HAA ラットの対照群と比較して有意差（1 ％）があることを示す．
# は LAA ラットの対照群と比較して有意差（5 ％）があることを示す．

表1

新生児に DES を投与した HAA および LAA ラットの握力測定
0…µg/kg0 . 05…µg/kg

0 . 5…µg/kg

101010Forelimb0 . 919 ± 0 . 094

0 . 945 ± 0 . 090

1 . 008 ± 0 . 108

Hindlimb

0 . 418 ± 0 . 086

0 . 411 ± 0 . 088

0 . 414 ± 0 . 082

Forelimb

1 . 009 ± 0 . 110

1 . 039 ± 0 . 094

1 . 043 ± 0 . 099…

Hindlimb

0 . 391 ± 0 . 079

0 . 462 ± 0 . 086

0 . 392 ± 0 . 075…

Group
Number…of…animals
HAA…rats

LAA…rats

Each value shows mean（kg）± S.D.

12

研究報告

図5

新生児期に DES を投与した HAA および LAA ラットの 52 週齢における内分泌系器官の重量各群の平均±標準偏差を表す．
*，** は対照群と比較して有意差（5％および 1％）があることを示す．

表2

新生児にDESを投与したHAAおよびLAAラットの52週齢における剖検所見

HAA…rats

Group0…µg/kg

0 . 05…µg/kg

0 . 5…µg/kg

Findings

Grade－P－

P－

P

Dark…reddish…spot

1901312011Mass

1911302001901302010

Pituitary…gland**

Mammary…gland
Galactocele
LAA…rats

Group0…µg/kg

0 . 05…µg/kg

0 . 5…µg/kg

Findings

Grade－

－－

PP

**

P

Pituitary…gland
Dark…reddish…spot

190201191

Mass

190200190190200192

Mammary…gland
Galactocele

Notes）－ : No abnormal changes P : Non-graded change
Numerals represent the number of animals.
Signiﬁcantly diﬀerent from the respective 0 µg/kg group（**: P< 0 . 01）.

および副腎の重量が HAA ラット，LAA ラットと考察

もに，それぞれの対照群と比較して有意に増加し

HAAラットと LAAラットを用いた新生児期 DESた．さらに LAA ラットでは，0 . 5 µg/kg 投与群の曝露の実験においても，Sprague-Dawley 系ラッ卵巣重量が対照群と比較して有意に低下した．

ト 1）と C 57 BL/ 6 J 系 マ ウ ス 2）を 用 い た 新 生 児 期

剖検所見（表 2）：HAA ラットでは，0 . 5 µg/kg 投DES 曝露の実験と同様に，0 . 5 µg/kg 投与群で性与群の下垂体の腫大および暗赤色点と乳腺におけ周期異常が早期に発症した．このことから，新生る乳汁貯留がそれぞれ約半数に認められた．これ

児期 DES 曝露により誘発される性周期異常は，遺に対し LAA ラットでは，0 . 5 µg/kg 投与群の下垂伝的要因に関係なく発現する変化と推察された．

体の暗赤色点が 1 例，乳腺における乳汁貯留が 2

一方，LAA ラットの 0 . 05 µg/kg 以上の投与群例のみであった．

では，対照群に比べて体重が有意に増加した．
HAA ラットではいずれの DES 投与群も対照群
13

秦野研究所年報 Vol. 39. 2016と同様の体重推移を示したことから，新生児期は，内分泌かく乱物質の低用量影響を評価する上DES 曝露の体重への影響には遺伝的要因が関与で遺伝的要因に左右されにくい有用な指標の一つするものと推察された．両系の対照群を比較するとなると考えられた．と LAA ラットの体重は HAA ラットより低値を示したことから，新生児期 DES 曝露の体重への影
響は，成熟後の体重増加が少ない系統にて検出されやすいと考えられる．

結論
本研究ではエストロゲン活性を有する DES を行動型と生殖機能に差のある 2 種類の近交系ラッ

性成熟観察結果から，LAA ラットでは，膣開トである Hatano ラットの雌の新生児期に投与

口日の早期化が 0 . 5 µg/kg 投与群でみられたのにし，発達から老化に至る段階において，生殖器系対し，HAA ラットでは DES 投与の影響が認めらおよび学習行動への影響に対する遺伝的要因の関れなかった．これまでの新生児期 DES 曝露の実

与について検索した．その結果，性周期異常と内験においては，C 57 BL/ 6 J 系マウス で膣開口日分泌系の器官重量の増加は系統に関係なく発現すの遅れが，Sprague-Dawley 系ラット で膣開口るが，体重，性成熟および学習行動への影響は使日の早期化がいずれも 5 µg/kg 投与群で認められ用する系統によって異なることが示された．

2）1）ているが，今回の実験で LAA ラットにおいてより低用量の 0.5 µg/kg 投与群で膣開口日に明らか謝辞な影響が認められたことは大変興味深い．すなわ

本研究は，平成 23 年度厚生労働省厚生労働科

ち，新生児期 DES 曝露の性成熟への影響も遺伝学研究費の補助事業（化学物質リスク研究事業，的要因に左右され，膣開口日の遅い系統にて早熟H 23 －化学－一般－ 002）により実施した．

が検出されやすいと考えられた．
条件回避学習試験については，LAA ラットの文献0.5 µg/kg 投与群で回避率が上昇し，試行 2 日目

1)験としてのラット一生涯試験の試み．秦野研究所

以降の 0.05 µg/kg 投与群の回避率が抑制された．
HAA ラットでは DES 投与の影響が認められなかったことから，新生児期 DES 曝露の学習行動

年報，2007 ; 30 : 17 - 242)

もに DES 投与の影響は認められなかったことか

大向英夫，太田 亮，豊泉友康ら：マウス新生児期の化学物質曝露による生殖器系の発達および老化に及への影響にも遺伝的要因が関与しているものと推察された．なお，握力測定については，両系統と太田 亮，宮原 敬，又吉 健ら：内分泌攪乱性確定試

ぼす影響の研究．秦野研究所年報，2010; 33: 9-153)

Shirota M, Kawashima J, Nakamura T, et al.:Delayed effects of single neonatal subcutaneous

ら，今回実施した DES の投与量では，握力へのexposure of low-dose 17 α -ethynylestradiol on

影響はないものと考えられた．

reproductive function in female rats. J Toxicol

52 週齢の剖検時に乳汁の貯留および下垂体の腫大に伴う暗赤色点が，HAA ラットの半数にみSci. 2012 ; 37 : 681 - 6904)

Delayed effects of neonatal exposure to 17alpha-られたが，LAA ラットではほとんど観察されな

ethynylestradiol on the estrous cycle and uterine

かった．したがって，これらの所見にも遺伝的

carcinogenesis in Wistar Hannover GALAS rats.

要因が関与しているものと推察される．なお，
Sprague-Dawley 系ラットを用いた新生児期DES

Reprod Toxicol. 2013 ; 40 : 16 - 235)

量 が HAA お よ び LAA ラット と も に 0 . 5 µg/kg 投

obesity. Hormones. 2010 ; 9 : 206 - 176)

渡辺千朗，代田眞理子，長尾哲二：SD 系雌ラットの性周期の加齢性変化に関する研究．秦野研究所

与群において有意に増加し，Sprague-Dawley 系ラットを用いた一生涯試験 4）においても下垂体とNewbold RR: Impact of environmental endocrine
disrupting chemicals on the development of

曝露の実験 においても用量に依存して乳汁の貯留1）が観察されている．しかし，下垂体および副腎の重Takahashi M, Inoue K, Morikawa T, et al.:

年報，1994 ; 17 : 37 - 407)

Ohta R, Matsumoto A, Hashimoto Y, et al.:

副腎の重量増加が 0 . 5 µg/kg 以上の投与群においBehavioral characteristics of rats selectively bredて認められていることから，内分泌系の器官重量

for high and low avoidance shuttlebox response.

14

研究報告

Congenital Anomaiesl. 1995; 35: 223-2298)

Shirota M, Sato M, Kojima K, et al.: Minor
involvement of somatic growth in the onset ofpuberty of Hatano high- and low-avoidance rats.
Reproduction. 2004; 127: 389-3959)

太田 亮，熊谷文明，臼見憲司ら：ストレス高感受性（高回避系）
ラットは低感受性（低回避系）
ラットより寿命が短い．秦野研究所年報，2012; 35: 9-13

15