技術ノート

EpiSkinTM を用いた in vitro 皮膚刺激性試験の検討
青木聡子 1，太田亮2

Investigation of the in vitro skin irritation test using the EpiSkinTM model
Satoko AOKI 1 , Ryo OHTA 2

緒言

SIT，SkinEthicTM RHE）の う ち，EpiSkinTM を

Draize 法 に よ る 皮 膚 刺 激 性 試 験 は， 動 物（主用いる試験法を「検証済み標準試験法（Validatedにウサギ）の背部皮膚に被験物質を塗布し，肉眼Reference Method-VRM）」としている．また，上的に紅斑・浮腫を観察してその程度をスコア化

記 3 種のモデルを使用して試験を行う場合には，

1）

し，被験物質の刺激性を判定する方法である ．

操作者の手技の熟練度を証明するために 10 種のOECDテストガイドライン（TG）
404-Acute Dermal

化学物質（Proﬁciency Chemicals）を用いて刺激

Irritation/Corrosion に 従 い，Draize 法 に よ っ て性の判定が一致することが求められている．

2）

多くの化学物質の刺激性 / 腐食性の判定が行われ今回，EpiSkinTM を用いた皮膚刺激性試験代替てきた．しかし，動物愛護上の問題などから，ウ法の手技確立のため，OECD TG 439 の Table 1

サギを用いた皮膚刺激性試験に代わる皮膚刺激に記載の 10 種の化学物質（表 1）を被験物質とし性を評価する in vitro 試験法の開発が進められて試験を行った．て き た．European Centre for the Validationof Alternative Methods（ECVAM）の も と で は，材料と方法

1999 年から 5 種の皮膚刺激性試験代替法のプレ

1．表皮モデルおよび培地

バリデーション試験 が行われ，その後正式に 58

EpiSkinTM small（SkinEthic 社）は ヒ ト ケ ラ チ

種の化学物質を被験物質として，EpiSkinTM を含ノサイト由来の表皮とコラーゲン基板（Type I お

む 3 種のモデルを用いた皮膚刺激性試験代替法のよ び Type IV コ ラ ー ゲ ン）で 構 成 さ れ る 表 皮 モバリデーション試験が行われた．最終的にはデル（表面積 0 . 38 cm 2）である．試験に使用した

EpiSkinTM と EpiDermTM SIT の 2 種の 3 次元培養

EpiSkinTM small は日本用モデル（10 日培養出荷

ヒト表皮モデルを用いた皮膚刺激性試験代替法モデル）をニコダームリサーチ社から購入し，海が，2007 年に ECVAM の科学諮問委員会により外モデルと同様に培養 13 日で試験に用いた．ま

承認された ．

た輸送が遅れたものについては培養 15 日（使用期3）

4 , 5）

6）

このような経過を経て，2010 年 7 月に OECD限：培養 19 日）で用いた．維持培地はキットに付TG 439 - In Vitro skin irritation: Reconstructed属のものをそのまま使用した．アッセイ用培地

Human Epidermis Test Method OECD TG

は，培地中の 3（4- , 5 - ジメチル - 2 - チアゾリル）

404 の代替法として採択された．OECD TG 439- 2 , 5 - ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT，では，本ガイドラインで認められた 3 種の 3 次

Sigma-Aldrich）濃 度 が 0 . 3 mg/mL に な る よ う，

元培養ヒト表皮モデル（EpiSkin ，EpiDerm

使用直前に調製して用いた．

7）

TM

TM

2．対照物質および被験物質
1

毒性部毒性学研究室

2

毒性部副部長26

陰性対照は 10 倍ダルベッコ PBS（+）（SigmaAldrich）を日局注射用水（大塚製薬工場）で希釈し技術ノート

表1

被験物質
（OECD TG 439，Table 1 に記載の Proficiency Chemicals）
被験物質

CAS No.

In vivo

刺激性score

分類性状純度製造者

1 ナフタレン酢酸

86 - 87 - 30NI

固体

＞ 98 . 0 %東京化成工業2 イソプロパノール

67 - 63 - 00.3NI液体≧ 99 . 9

和光純薬工業

3 ステアリン酸メチル

112 - 61 - 81NI

固体    99 %Alfa Aeser

4 ヘプチルブチレート

5870 - 93 - 91.7NI

液体≧ 98 %

Sigma-Aldrich

5 サリチル酸ヘキシル

6259 - 76 - 32NI液体≧ 99 . 0 %Sigma-Aldrich

6 シクラメンアルデヒド

103 - 95 - 72.3I

液体＞ 92 . 0 %東京化成工業7 1 ‐ ブロモヘキサン

111 - 25 - 12.7I

液体≧ 97 . 0 %和光純薬工業8 水酸化カリウム ( 5 % 水溶液 )1310 - 58 - 33I

液体

−

関東化学

9 1 - メチル - 3 - フェニル - 1 - ピペラジン

5271 - 27 - 23.3

I固体    97 %Sigma-Aldrich

10 ヘプタナール

111 - 71 - 73.4I

液体≧ 95 . 0 %和光純薬工業

NI：刺激性なし（GHS 分類：区分外）
I：刺激性あり（GHS 分類：区分 2）たもの（以下，PBS（+））を用いた．陽性対照は，含有イソプロパノール）に浸漬，攪拌して生成ホ5 w/v％ ラ ウ リ ル 硫 酸 ナ ト リ ウ ム（SLS, Sigma-ルマザンを抽出した．抽出は室温（22 - 24℃），遮Aldrich，純度：99％）
水溶液を用いた．

光下で約 4 時間行った．次いで，96 ウェルプレー

被験物質は，表 1 に示した化学物質 10 種を用

トを用い，各抽出液を 200 µL ずつ 2 ウェルに分いた．

注し，プレートリーダーを用いて測定波長 570 ±3．試験方法

5 nm で光学濃度（OD）値を測定した．なお，ブラ試験プロトコールは ECVAM のホームページで
公 開 さ れ て い る Standard Operating Procedure

ンクの OD 値は，酸性イソプロパノール液を 200µL ずつ 6 ウェルに分注して測定した．

（SOP，Version：1.8，February 2009） に従った．

陰性対照については，3個の表皮モデルそれぞれ試験には陰性対照，陽性対照および各被験物のOD値から6ウェルのブランクOD値の平均値を質につき各 3 個の表皮モデルを使用した．受領し差し引き，得られた3個の表皮モデルの各OD値のた表皮モデルは，12 ウェルプレートに移し，24平均値（ODNC）を細胞生存率100％とした．陽性対時間以上維持培地で培養（37℃，5％ CO 2，湿度照および被験物質の細胞生存率は，各表皮モデル95％以上）した．被験物質が液体の場合はピペッのOD値からブランクのOD平均値を差し引いたもトで 10 µL を表皮モデル表面に塗布した．固体ののをODNC で除し，100を乗じて細胞生存率を算出

場合は 5 µL の日局注射用水をピペットで塗布しした後，3個の表皮モデルの平均をとった．

8）

た後，被験物質 10 ± 2 mg を秤量皿ロートで適用

なお，SOP に記載の「適用 7 分後の陽性対照のし，スパチュラで広げた．陰性対照，陽性対照お再塗布（一度塗布した検体をスパチュラで塗り広よび被験物質は 15 ± 0 . 5 分間（室温：22 - 24℃）げる作業）」は，陰性対照および被験物質の塗布適用した後，各表皮モデルにつき 25 mL の PBS方法と合わせるため行わなかった．また，刺激（+）で洗浄した．洗浄後の表皮モデルは新たな維性判定の補助としての培地中 IL- 1 αの測定は，持培地に移した後，42 ± 1 時間培養した．42 時

ECVAM のバリデーションスタディ時には行われ間培養後の表皮モデルは，アッセイ用培地（0 . 3たが，OECD TG 439 には記載がないため本試験

mg/mL MTT）に移し，3 時間± 5 分間培養後，表では行わなかった．

皮をコラーゲン基板ごと専用パンチでくり抜き，4．判定基準ピンセットで表皮とコラーゲン基板をはがした．

OECD TG 439 に従い，陰性対照の OD 値の平表皮とコラーゲン基板は，各表皮モデルにつき均が 0 . 6 以上 1 . 5（ 小数第 2 位四捨五入）以下，陽500 µL の酸性イソプロパノール液（0 . 04 N HCl

性対照の細胞生存率の平均が 40％（小数第 1 位四27秦野研究所年報 Vol. 34. 2011

表2

陰性対照と陽性対照の OD 値，細胞生存率および SD 値
陰性対照OD 平均値

陽性対照

SD（%）

細胞生存率（%）

SD（%）

平均値 *

0.86124

最小値

0.6430

最大値

0.98188*：5 回実施【試験成立基準】
陰性対照の OD 値の平均：0.6 以上 1 . 5（小数第 2 位四捨五入）以下
陽性対照の細胞生存率の平均が 40（小数第 1 位四捨五入）% 以下
かつ陰性対照および陽性対照の細胞生存率の SD 値が 18（小数第 1 位四捨五入）% 以下

表3

被験物質の細胞生存率の実施結果と既報との比較
Validation phase II b）

実施結果
被験物質

MeanSD（%）（%）

ナフタレン酢酸

1066

イソプロパノール

948

ステアリン酸メチル

109

ヘプチルブチレート

99

サリチル酸ヘキシル
シクラメンアルデヒド

判定a）Mean（%）

Cotovio et al.c）
施設間

MeanSDSD

Lab 1Lab 2Lab 3NI9689924--

NI100828211--

7NI1049010179697NI1041021125--

1084NI100102

954-

-

185I

2494217--

1- ブロモヘキサン

3310I

261947142611

水酸化カリウム（5 % 水溶液）

113I----

2617

1-メチル-3-フェニル-1-ピペラジン

4114I

91711--

ヘプタナール

70I---

634-

Lab 1

Mean：細胞生存率の平均値（%）
SD：細胞生存率の SD 値（%）
NI：刺激性なし / I：刺激性あり
Lab 1～3はそれぞれECVAMバリデーション試験の試験施設（Lab 1：L’Oreal，Lab 2：Unilever，Lab3：Sanofi aventis）
a）：OECD TG 439 による判定b）：引用文献 Spielmann H, Hoffmann S, Liebsch M, et al.（2007）：引用文献 Cotovio J, Grandider MH, Portes P, et al.（2005）c）      引用した文献値は小数第 1 位を四捨五入して表示した．

捨五入）以下で，かつ陰性対照および陽性対照の細胞生存率の標準偏差（SD）
値が 18％（小数第 1 位

2．陽性対照（表 2）
陽 性 対 照 の 細 胞 生 存 率 は 3～18％（ 平 均：四捨五入）以下の場合，試験成立とした．被験物

12％）,SD 値は 0～8％（平均：4％）であった．

質の刺激性の有無の判定においては，被験物質適3．被験物質（表 3）

用表皮モデルの細胞生存率の SD 値が 18％以下で刺激性の判定結果は，被験物質 10 種全て OECD試験成立とし，細胞生存率が 50％（小数第 1 位四TG 439 の記載と一致した．以下に，各被験物質捨五入）以下の場合に「刺激性あり」，50％を上回の細胞生存率の平均値および SD 値を示す．

る場合に「刺激性なし」と判定した．

1）
ナフタレン酢酸
細胞生存率の平均値は 106％，SD 値は 6％

結果となり，刺激性なしと判定した．

1．陰性対照（表 2）2）イソプロパノール

陰性対照の OD 値は 0 . 6～0 . 9（ 平均：0 . 8），細胞生存率の SD 値は 4～8％（平均：6％）であった．
28

細胞生存率の平均値は 94％，SD 値は 8％となり，刺激性なしと判定した．

技術ノート3）ステアリン酸メチル
細胞生存率の平均値は 109％，SD 値は 7％となり，刺激性なしと判定した．
4）ヘプチルブチレート
細胞生存率の平均値は 99％，SD 値は 7％となり，刺激性なしと判定した．
5）サリチル酸ヘキシル
細胞生存率の平均値は 108％，SD 値は 4％ン 試 験 4）， バ リ デ ー シ ョ ン 試 験 前 に 行 わ れ た
Cotovio らの報告 9）との比較を表 3 に示した．
表皮モデルを用いた in vitro 皮膚刺激性試験法
で被験物質を評価する場合，結果のばらつきの原因として，被験物質の特性によるもの以外に手技的な要因（塗布および洗浄の手技）が挙げられる．
塗布の作業については，熟練すれば問題はないと考えられるが，被験物質と表皮モデルとの接触となり，刺激性なしと判定した．

時間が 15 分間と短いので，塗布を正確に行わな

6）シクラメンアルデヒド

いと正しい結果が得られない可能性がある．な

細胞生存率の平均値は 18％，SD 値は 5％とお，SOP に記載の「適用 7 分後の陽性対照の再塗なり，刺激性ありと判定した．

布」については，塗布の作業をより確実にするた

7）1- ブロモヘキサンめと推察される．被験物質が固体の場合は，可能細胞生存率の平均値は 33％，SD 値は 10％

な限り粉砕して細かい粉末にすることが OECDとなり，刺激性ありと判定した．

TG 439 および SOP に記載されている．今回行っ

8）水酸化カリウム（5％水溶液）た 1 - メチル - 3 - フェニル - 1 - ピペラジンの結果は細胞生存率の平均値は 11％，SD 値は 3％と既報よりも細胞生存率の平均値，SD 値ともにやなり，刺激性ありと判定した．

や高い傾向にあった．この原因として，今回の検9）1- メチル -3 - フェニル - 1 - ピペラジン

討では 1 - メチル - 3 - フェニル - 1 - ピペラジンは結細胞生存率の平均値は 41％，SD 値は 14％晶性の粉末をそのまま塗布に用いたために，被験となり，刺激性ありと判定した．

物質の刺激性が弱く，ばらついた結果となったこ10）ヘプタナールとが推察された．これは，検体を乳鉢等で細かい細胞生存率の平均値は 7％，SD 値は 0％となり，刺激性ありと判定した．

粉末にすることによって，より既報に近い結果が得られる可能性が高いと考えられる．
洗浄作業については，SOP では，検体塗布後考察

1 個の表皮モデルにつき PBS（+）25 mL で洗浄す

1．陰性対照および陽性対照ることとなっている．このことから，PBS（+）に陰性対照では，ホルマザン抽出時の攪拌操作溶解しない非水溶性物質や粘性のある物質などの良否が OD 値に影響することがわかった．この洗浄しにくいものについては，洗浄むらがない

OD 値については，試験成立基準の上限値（1 . 5）よう特に注意する必要がある．今回検討した 10に近づくことはほぼ無く，攪拌が足りないと下限物質中，イソプロパノール，1 - メチル - 3 - フェニ値（0.6）に近づく傾向にあった．このことから，

ル - 1 - ピペラジンおよび水酸化カリウム水溶液を4 時間の抽出時間中は攪拌を充分に行い，かつ各除く 7 物質が水に不溶もしくは難溶な物質である表皮モデルの抽出操作を均等に行うことが必要でが，結果のばらつき等の問題は生じなかった．

あると考えられた．

なお，1 - ブロモヘキサンについて試験を繰り陽性対照では，各回の試験で細胞生存率の平均返した結果，細胞生存率の SD 値が 18％を超えた

値および SD 値ともに試験成立基準を満たし，検（細胞生存率の平均値 36％，SD 値 24％，参考デー

体の塗布および洗浄が正しく行われたことが確認タ）．1 - ブロモヘキサンは ECVAM のバリデーできた．なお，ニコダームリサーチ社の方法に従ション試験時に，EpiSkinTM のあるロット使用時

い，SOP に記載の適用 7 分後に陽性対照検体を再に細胞生存率がばらついたこと，EpiDermTM で度塗布する作業を省略したが，問題はなかった．

は偽陰性となり正しく判定できなかったことが報

2．被験物質告 さ れ て い る．ECVAM の Chemicals Selection

今回の結果と ECVAM で行ったバリデーショ

Sub-Committee に よ り misclassiﬁcation が あ っ29

秦野研究所年報 Vol. 34. 2011

た被験物質と物理化学的性状等との関係が調査されたが，1- ブロモヘキサンについては原因は不Vitro. 2001;15:57-93.

4)The ECVAM international validation study on

明としている 10）．同じく 3 次元培養ヒト表皮モデ

in vitro tests for acute skin irritation: report on

ルである LabCyte EPI-MODEL のバリデーショ

the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays

ン試験においても，1 - ブロモヘキサンでは 3 回のand on the Skin Integrity Function Test. Altern試験で刺激性 / 非刺激性の判定にばらつきがでている 11）．一方，ヒトの皮膚刺激性試験（4 時間パッチテスト）では，ウサギでは刺激性と判定される

Lab Anim. 2007 ; 35: 559 -601
5)

激性 / 非刺激性の境界であったことが報告されている 12）．よって，この結果のばらつきは 1 - ブロモヘキサン特有のものであり，1 - ブロモヘキサ

acute skin irritation: selection of test chemicals.
Altern Lab Anim. 2007 ; 35: 603-619
6)7)

以上のことより，EpiSkin

Reconstructed Human Epidermis Test Method.
20108)

min-42 hours for the prediction of acute skin

皮 膚 刺 激 性 試 験 を 実 施 し た と こ ろ，10 種 の 化

irritation of chemicals. EpiSkin TM skin

学物質の刺激性判定はすべて OECD TG 439 のirritation test method 15 min - 42 hours

Table 1 の記載と一致し，OECD TG 439 に基づStandard Operating Procedure, Version : 1. 8.

いた EpiSkinTM を用いた同試験法は，当研究所にお，今回は検討を行っていないが，被験物質が組織に着色する場合や MTT に干渉する場合は，別途適切なコントロールをおく事が SOP に記載されており，そのような物質については更に背景データの収集が必要であると考えられる．

Draize JH, Woodard G, Calvery HO: Methods

in vitro skin irritation of chemicals: optimisationof the EPISKIN prediction model within theframework of the ECVAM validation process.
Altern Lab Anim. 2005 ; 33: 329-34910) Zuang V, Eskes C, Worth A, et al.: Report fromthe Chemicals Selection Sub-Committee to theand EpiDermTM Assays11) Katoh M, Hamajima F, Ogasawara T, et al.:substances applied topically to the skin andAssessment of human epidermal model LabCyte

mucous membranes. J. Pharmacol. And Exp.

EPI-MODEL for in vitro skin irritation testing

Therapeutics.1944; 82: 377-390.

according to European Centre for the Validation

OECD: Guideline for the Testing of Chemicals,of Alternative Methods (ECVAM)-validated

Guideline 4 0 4 :Acute Dermal Irritation/protocol. J. Toxicol. Sci. 2009; 34: 327-334

Corrosion.2002
3)

Cotovio J, Grandidier MH, Portes P, et al.: The

misclassification of chemicals in the EpiSkinTM
for the study of irritation and toxicity of2)

20099)

management team on potential reasons for the文献
1)

ECVAM: Skin irritation validation studyvalidation of the EpiSkinTM test method 15を用いて in vitro

おいて問題なく実施できることが確認できた．な

OECD: Guideline for the Testing of Chemicals,
Guideline 439: In Vitro Skin Irritation:とも細胞生存率にばらつきがでる一因ではないか
TM

ECVAM: Statement on the validity of in vitro
tests for skin irritation.2007

ンが刺激性 / 非刺激性の境界にある物質であること推察された．

Eskes C, Cole T, Hoffmann S, et al.: The ECVAM
international validation study on in vitro tests for1- ブロモヘキサンが刺激性と判定されたのはヒト 30 例中 16 例と約半数にとどまり，ヒトでは刺Spielmann H, Hoffmann S, Liebsch M, et al.:12) Jirova D, Liebsch M, Basketter D, et al.:Fentem JH, Briggs D, Chesne C, et al.: A prevalidation

Comparison of human skin irritation and photo-study on in vitro tests for acute skin irritation. results

irritation patch test data with cellular in vitroand evaluation by the management team. Toxicol Inassays and animal in vivo data. AATEX 2008 ;14: 359-36530