本研究は，日本農芸化学会 2022 年度大会（京都）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のためオンライン形式で実施）に応募された研究のうち，本誌編集委員会が優れた研究として選定した６題の発表のうちの一つです．

日本農芸化学会

雄と雌のミトコンドリアCO1を用いたカラスガイ族の交雑種の検出
埼玉県立松山高等学校生物部
築根遼，中野律久，菅谷亮介（顧問：比留間葉月，服部明正）

淡水二枚貝であるカラスガイ族のミトコンドリアの両性遺伝を利用し，交雑種が検出できないかを研究した．各地の雄のサ ン プ ル を 用 い て， 精 子 か ら 雄 ミ ト コ ン ド リ ア の DNA を，体 細 胞 か ら 雌 ミ ト コ ン ド リ ア の DNA を 抽 出 し，CO1 領 域 の●塩基配列を決定し雌雄の系統樹を作成した．この系統樹におい て， 雌 雄 で 異 な る 種 と し て 同 定 さ れ た 割 合 は 約 26 ％この遺伝子によりエネルギー産生酵素が合成される）をPCR 法で増幅し塩基配列を調べれば，多くの場合種が同定できる．CO1 領域はバーコード領域として知られており，高等真核生物全体を通して一定に保たれている塩基配列であるため，種を判別するのに最適である．し（5/19） で あ っ た． こ れ ら は 交 雑 種 で あ り， 種 間 や 属 間 で 交

かし，ミトコンドリアの塩基配列だけでは正確な種の同雑が起きていることが実証できた．

定はできない．形態が良く似ている個体では，雌のミト化学と生物コンドリアだけではなく核の塩基配列を調べることが重要となってくる．また，これによって交雑種の存在を指本研究の目的・方法および結果と考察摘できる可能性がある．

【目的】

イシガイ目の交雑種は，中国産のヒレイケチョウガイ

ミヤコタナゴは，国の天然記念物に指定されている．

（）が淡水真珠養殖のために人為

埼玉県のミヤコタナゴは野外には生息しておらず，水族的に移植されたことにより，在来種のイケチョウガイ館等で管理され，増殖が行われている．しかし，この増（殖したミヤコタナゴを野外に放流できない状態となってと霞ヶ浦に生息していることが初めて報告された (5, 6)．

いる．それは，ミヤコタナゴが産卵するイシガイ目の貝この研究では，雌のミトコンドリアの CO1 領域と核に類が生息環境等の劣化により野外に生息していないからおける特定の塩基配列である ITS 領域を調べて，交雑種である．そこで，松山高校生物部では，ミヤコタナゴなの存在を証明している．ITS 領域は真核生物のリボソーどを増殖させるためにはその産卵母貝となるイシガイ目

ム RNA をコードする遺伝子の間に存在する領域であについて研究することが重要だと考え，これをテーマとり，変異とコピー数が多いことから分子系統樹に使われした研究を進めている(1〜4)．その研究成果を，Manuel）と交雑しその交雑種が琵琶湖ることが多い．

Lopes-Lima 教授らとの国際共同研究で，日本のイシガ

多くの生物では，雌のミトコンドリアのみが子孫に引イ目の担当としてその分布状況をまとめてきた (4)．山脈き継がれる母性遺伝をする．しかし，カラスガイ族を含や海による地理的隔離により日本のカラスガイ族も種分

むイシガイ目では，雄のミトコンドリアが雄に遺伝す化が起こり，6 属 13 種が生息していることが明らかにさる．具体的には，雄のミトコンドリアが精巣や雄の体細れた．また，外来種 1 種（胞に存在し，雄では両性遺伝すること (7) が知られている

cf.

1）が確認されている．

（図 1）．そこで，雄のミトコンドリアと雌のミトコンド

これらのなかには形態だけでは種の同定が困難なもの

リアの両方の CO1 遺伝子の組み合わせで，交雑種を検が あ る が， 雌 の ミ ト コ ン ド リ ア の CO1 領 域（シ ト ク

出できないかを研究することにした．雄のミトコンドリ

ローム c オキシダーゼ・サブユニット I の遺伝子領域で，アの CO1 の遺伝子データは，NCBI（米国の国立生物科544

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学情報センター）の GenBank にはほとんど登録されて考えている．この交雑種の存在を実証するためには，ミいないため，松山高校生物部で解析 (2) されていた雄ミト

トコンドリアの CO1 領域のみならず，核の ITS 領域のコンドリア CO1 の遺伝子データを基にプライマーを作

データ収集も必要なので，この組み合わせでの予備的検成し，雄の精子から目的の遺伝子を増幅し，塩基配列を討も行った．

調べた．このデータが多く集まれば，日本産ドブガイの【方法】

雄系統と雌系統の組み合わせがどのようになっているか1.

カラスガイ族のサンプルを分析でき，分類学的位置や生息地域の遺伝的多様性を大阪自然史博物館の福原修一・田部雅昭コレクション明確にすることもできる．また，本研究において，現状（イシガイ目）からカラスガイ族の組織標本を分譲して頂では不明瞭な交雑種の存在の有無の評価もできるものといた．この標本の中で MDH（malate dehydrogenase：リンゴ酸脱水素酵素）泳動パターンから標本番号に A があるものは，ヌマガイ（イ（当 時 は），B がタガ，現在の分類では日本農芸化学会属），C が フ ネ ド ブ ガ イ（当 時 は，現在の分類では多くが属）と同定されたサンプルである．また，過去に先輩方が残したサンプルと研究者から分譲して頂いたサンプルや野外から採取した貝も含めて，総計 19 サンプルを使用した．

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図 1 ■ 雌雄のミトコンドリアの構成

図 2 ■ 雄サンプルからの雌と雄の CO1 の系統樹
（上：体細胞の雌 CO1, 下：精子の雄 CO1, 〇：雌雄で同一種，▲：雌雄で異なる種）番号を付したサンプルは本研究のデータであり，それ以外は GenBank のデータである．

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表 1 ■ 雌雄でミトコンドリア CO1 塩基配列が異なる交雑種
番号

サンプル名1359102.

雌 CO1 による種名

Shiga-6
Ibaraki-2
Shizuoka-5
Hokkaido-12
Hokkaido-20

sp. 1

DNA 抽出とシークエンス解析

なわち，2 本鎖 DNA を熱により 1 本鎖にして泳動し，こcf.
sp. 2の 1 本鎖にした DNA の塩基配列を調べる方法 (6) を用い子があるか顕微鏡で観察し，その存在が確認できたら雄て正確に決定し，交雑個体であることの証拠をさらに積とし，卵巣に卵，または鰓（エラ）にグロキディウム幼み上げて実証したい．

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また，sp. 1 がであの組織）の一部を QuickGene DNA tissue kit S（倉敷り，紡 績 株 式 会 社 製） で 処 理 し Quickgene-mini 80（富 士

性が高いので，この地域の雄を多く調べ，証明したい．

フィルム製）を用いて DNA を抽出した．そして，抽出

交雑種の存在を実証するためには，核の ITS 領域のした DNA を PCR 法で増幅し，電気泳動を行った．そのデータを多く収集することも必要である．MDH（リン後，電気泳動にてバンドが確認できたサンプルはシーク

ゴ酸脱水素酵素）泳動パターンから，A 型（エンス解析を業者（ユーロフィンジェノミクス）に依頼した．

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1

生きている貝については，解剖し生殖腺を取り出し精生が確認できた場合は雌とした．精子または体細胞（足化学と生物

雄 CO1 による種名属），B 型（である可能属），C 型（多くは属）と同定されている福原修一・田部雅昭コレクション

雄と雌のミトコンドリア CO1 の系統樹

3.

sp. 2 がを用いて，雌 CO1 と核 ITS の系統樹から同定された属

各地の雄個体の精子から雄ミトコンドリア，体細胞と MDH 泳動パターンから同定されている属との関係を（足 の 組 織） か ら 雌 ミ ト コ ン ド リ ア の DNA を 抽 出 しまとめた（未掲載）．その結果，MDH 泳動パターンか（図 1），CO1 領域の塩基配列を決定した．決定した塩基ら同定された属と ITS の系統樹から同定された属の一致

配列データと GenBank のデータを基に，最尤法を用い率は，93％（14/15）であり，標本番号 83A-36（MDH：て分子系統樹をフリーソフト MEGA7 で作成した．

属，ITS：【結果】属）だけが一致しなかった．しかし，雌の CO1 の系統樹から同定された属雄サンプルのデータを基に，雌雄の CO1 の系統樹を作成した（図 2）．また，この系統樹において，雌雄のでは，MDH 泳動パターンとの一致率は 0％であった．
この大きな相違の原因は何からくるのだろうか．

CO1 で同定した種が異なるサンプルを表 1 にまとめた．

この点を明らかにするために，まず，MDH 泳動パ調べた 19 個体の中で，雌雄で異なる種として同定さターンと ITS で同定した時にどのような関係があるかをれたのは 5 個体なので，約 26％（5/19）が交雑種の可能調べた．MDH（リンゴ酸脱水素酵素）は TCA サイクル性が高い．Ibaraki-2 の組み合わせは属内の内で還元反応を行う酵素であるが，この酵素の遺伝子は属ミトコンドリアではなく核内に存在する．したがって，に よ る 属 間 雑 種 と 考 え ら れ る． し か し， 田 部 ら は，核に存在する ITS と同じなので両方法で同定した属の一MDH 泳動パターンをもとに分類した属と致率は高い．次に，核の遺伝子である MDH の泳動パ属が混生している場所のサンプルに交雑個体

ターンと雌のミトコンドリアの遺伝子である CO1 の場

種間雑種，残り 4 個体は属との泳動パターンが認められなかったことから，属と属には生殖隔離が起こり，交雑(8)できないとしている ．

合である．これらの方法で同定した属が一致しないならば，交雑種が考えられる．しかし，15 サンプルの全てが一致していないので，全てを交雑種として判定することは難しい．以前の研究でこのコレクションのサンプル

本研究の意義と展望の CO1 を調べたが，MDH 泳動パターンで同定された属とほぼ一致していた（一部の例外有り）．

本研究にて 2 属の交雑種として考えられる 4 サンプル

今後の課題として，このコレクションの一部には雄を検出した．今後の課題として，これらの ITS 領域の塩（ただし，体細胞なので，雄ミトコンドリアが少ない）

基配列を PCR-SSCP 法（一本鎖高次構造多型解析），すもあるので，より感度の良い雄 CO1 プライマーを作成

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し，雌雄で同定された種が異なるかどうかで交雑種であるかを検討したい．また，交雑種になると体細胞に残る雄ミトコンドリアが多くなるのかについても新たな研究テーマとして取り組みたい．
この研究が進展して，なぜイシガイ目では雄のミトコンドリアが排除されずに両性遺伝するのかが解明されると，母性遺伝する生物では，どのような仕組みで雄ミトコンドリアだけを排除できるかの研究の手がかりが見つかる可能性がある．

文献1) 佐久間幹大，鳥屋太志：日本産イシガイ類の分子系統解
析．埼玉県立松山高等学校生物部，2015.
2) 石川春樹，砂村遥平：両性遺伝するドブガイ類の雄ミトコンドリアの分子系統解析．埼玉県立松山高等学校生物部，2016.
3) 草野侑巳，星野直樹，熊木日向：日本産ドブガイ類の種分化．埼玉県立松山高等学校生物部，2017.
4) M. Lopes-Lima, A. Hattori, T. Kondo, J. Hee Lee, S. Ki
Kim, A. Shirai, H. Hayashi, T. Usui, K. Sakuma, T. Toriya:, 146, 106755 (2020).
5) 白井亮久：ちりぼたん，39，25 (2008).
6) A. Shirai, T. Kondo & T. Kajita:, 68, 151 (2010).
7) M. Soroka:, 56, 91 (2008).
8) 田部雅昭，福原修一，長田芳和：貝類学雑誌，53, 29 (1994).

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Copyright © 2022 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.60.544

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