LC/MS-TOFによるによるミジンコによるミジンコ飼育水中
ミジンコ飼育水中
カイロモンのカイロモンの高感度分析と高感度分析と同定
横河アナリティカルシステムズ
○内田秀明
徳島大院薬
安元 剛、西上明則、
楠見武徳、大井 高

第9回日本水環境学会シンポジウム
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水中でで解明水中でﾐｼﾞﾐｼﾞﾝｺがﾝｺが放出する放出するｶｲﾛﾓﾝするｶｲﾛﾓﾝをｶｲﾛﾓﾝをLC/TOF-MSで!!
コロニーへとコロニーへと形態へと形態変化し変化し捕食者に捕食者に抵抗
ミジンコ
カイロモン
＝脂肪族硫酸エステル
脂肪族硫酸エステル&エステル
脂肪族硫酸アミド
脂肪族硫酸アミド

Hessen, D. O. and van Donk, E., Hydrobiologia, 127, 129–140 (1993).

ミジンコ飼育水
ミジンコ飼育水から飼育水から直接検出&同定
直接検出 同定できた
同定できた

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1

はじめに
１．植物プランクトンがミジンコに捕食されにくくするため単細胞からコロニーに形態変化することが知られていた。
しかし、微量であるため化合物は未解明であった。
２．我々は冷凍ミジンコメタノール抽出物から24化合物を単離した。化学合成も組み合わせて活性本体が脂肪族硫酸エステル群であることを解明した。
３．今回LC/MS-TOF（飛行時間型LC/MS）を用いてオオミジンコ飼育水中からこれら活性物質の高感度直接検出を試みた。
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水環境中での水環境中でのカイロモンでのカイロモン作用
カイロモン作用魚
カイロモン
変態

動物プランクトン
動物プランクトン
ミジンコ
Daphnia

緑藻Scenedesmus
緑藻植物プランクトン
植物プランクトン
参考図書：．
参考図書：ミジンコ－
ミジンコ－その生態
その生態と生態と湖沼環境問題－、湖沼環境問題－、花里孝幸－、花里孝幸、
花里孝幸、1998．
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2緑藻の緑藻の形態変化
Scenedesmus gutwinskii var. heterospina (NIES-802)

コントロール(10日後コントロール 日後)
日後(捕食者無捕食者無し捕食者無し)

Daphnia カイロモン (10日後日後)
日後(捕食者共存捕食者共存)
捕食者共存
顕微鏡200倍写真倍写真(スケール顕微鏡倍写真 スケールはスケールは50 µm)
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抽出と抽出と単離の単離の概要
Daphnia pulex (10 kg, frozen)
MeOH (20 L x 3)
evaporation to 1/7 volume

Aqueous suspension (9 L)
Hexane (9 L)
CH2Cl2 (9 L)
BuOH (9 L)

Hexane Extract (42 g)
CH2Cl2 Extract (18 g)

BuOH Extract (18 g)
Aqueous Extract (54 g)

ODS column (MeOH/H2O = 1/1)
HPLC (CAPCELLPAK C18 , MeOH/H2O = 1/1)
HPLC (CAPCELL PAK C18,40% Acetonitrile/250 mmol NaClO4)

Active compounds
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3

ミジンコブタノール抽出物
ミジンコブタノール抽出物から抽出物から単離から単離された
単離されたカイロモンされたカイロモン
脂肪族硫酸エステル
脂肪族硫酸エステル
OSO3M

脂肪族硫酸アミド
脂肪族硫酸アミドNHSO3M

OSO3M

1 (88 mg)

9 (3.6 mg)
OSO3M

17 (8.0 mg)
NHSO3M

OSO3M

2 (5.0 mg)
OSO3M

103 (20 mg)

118.9 mg

18 (0.4 mg)

OSO3M

NHSO3M
19 (0.8 mg)

OSO3M

OSO3M
4 (4.8 mg)

NHSO3M

12 (0.3 mg)

OSO3M

20 (0.6 mg)

OSO3M

5 (10 mg)

NHSO3M

13 (3.8 mg)

21 (1.5 mg)
NHSO3M

OSO3M

OSO3M
6 (90 mg)

14 (2.0 mg)
OSO3M

22 (0.1 mg)

OSO3M

7 (8.0 mg)

NHSO3M
23 (0.2 mg)

15 (0.8 mg)
OSO3M

OSO3M
8 (0.5 mg)

NHSO3M

16 (0.5 mg)

24 (1.5 mg)※ 色をつけた物は新規化合物
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形態変化活性の形態変化活性の評価方法
活性細胞コロニー(コロニーコロニーあたりのコロニーあたりの細胞数あたりの細胞数)
細胞数
ColonyNumber of Cells

1-cell type1

12-cell type1

24-cell type1

48-cell type18
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Cell per colony

合成化合物との活性合成化合物とSDSの
54

OSO3Na45OSO3Na

321

NHSO3Na

2SDS

1
1000

1001010.1

OSO3NaPositive cont. 3.2(Daphnia water, 10% v/v)
Negative cont. 1.0ng/mL• 4は1 ng/mLで強い活性を示した• 5は1000~10 ng/mLで強い活性を示した• 各化合物は活性の至適濃度を持つ• SDSは中程度の活性を示した
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メチレンブルー法
メチレンブルー法によるカイロモンによるカイロモン濃縮
カイロモン濃縮冷凍ミジンコpulex)本体
本体から冷凍ミジンコ(Daphniaミジンコ
本体から単離から単離した
単離したカイロモン
したカイロモンは
カイロモンは陰イオン界面活性剤イオン界面活性剤
オオミジンコ(Daphniamagna)飼育水中飼育水中にオオミジンコ飼育水中に本当に本当に存在するか存在するか？
するか？
メチレンブルー法
メチレンブルー法で濃縮を濃縮を試みる(環境水中陰イオン界面活性剤の定量分析に使われている)
NR OSO3Na

Cl(H3C)2N

SN(CH3)2N
NaR OSO3(H3C)2N

SClN(CH3)2

参考文献：日本分析化学会北海道支部偏, 水の分析, 化学同人, 1981; pp 374–378.
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5

ミジンコ飼育水中
ミジンコ飼育水中の飼育水中の脂肪族硫酸エステル
脂肪族硫酸エステルのエステルの検出
Sampleオオミジンコ飼育水
オオミジンコ飼育水

Blank

エバポレーターで倍濃縮
エバポレーターで50倍濃縮
ろ過

654 nmでのでの比色法
での比色法

陰イオン界面活性剤総量
イオン界面活性剤総量

8 ng/mL! (ブランクブランク 0.4 ng/mL)

DOWEX 50WX8-100
陽イオン交換樹脂
イオン交換樹脂で交換樹脂でメチレンブルーをメチレンブルーを除去

LC/MS-TOF分析
分析
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LC/MS-TOFのの概要

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精度の精度の高い精密質量測定
ESIイオン
イオン源
イオン源

分析用スプレー
分析用スプレー

正確に正確に測定するための測定するための手順するための手順① 定期的に定期的にチューニング
② 測定前に測定前にキャリブレーション③ 測定中に測定中に内部標準物質による内部標準物質によるマス軸校正
マス軸校正

マス軸校正
マス軸校正用
軸校正用
リファレンススプレー

複数の複数の基準物質を基準物質を用いてマスいてマス軸マス軸を平行移動し平行移動し長さも調整さも調整する
調整する
m/z

m/z

100.0000

1000.0000

m/z

m/z

100.0000

1000.0000

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効率的で測定効率的で選択的な選択的なLC/MS測定
ESI(エレクトロスプレーイオン化法)

誘導体化せずに高極性化合物測定可能

Negative ion mode

バックグラウンド低いので簡便な前処理だけで測定可能

フラグメンター電圧調整[M-H]－だけでなく適度なフラグメントも併せて検出する

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7

分析条件
HPLC
Instrument
ColumnMS
Instrument
Ionization: Agilent 1100
: ZORBAX XDB-C18: Agilent TOF: ESI: 3.5 x 105 Pa(N2)i.d. 2.1 x 50 mm, 3.5µm Nebulizer
Mobile phase : A=10mM CH3CO2NH4
B=CH3CN
Gradient (min.): 0 - 3 - 8 - 12(B%)
30 - 30 - 95 - 95Post time
: 5 min. (0.5 mL/min.)Flow rate: 0.3 mL/min.
Column temp. : 40 °C
Injection vol. : 10 µL

Drying gas: 10 L/min, 350 °C (N2)
Polarity: NegativeVcap: 5000 V
Fragmentor: 250 VScan
: m/z 50～～1100
Transients/scan : 10,000
References: m/z 112.9856 &1033.9881

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標品の標品のマスクロマトグラム
各標品[M‐H]－ ﾏｽｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ (22以外100 ng/mL x 10µL注入)
2.0e5

22

Intensity, cps

101.0e554704.0e4

SDS
6m/z 97 ﾏｽｸﾛﾏﾄｸﾞ
ﾏｽｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ⇒ﾗﾑ⇒選択的検出可能R－OSO３H

2.0e4m/z 97

0
1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

Time, minOSO3H
OSO3Hm/z 209
OSO3H

OSO3Hm/z 223m/z 237

NHSO3HOSO3Hm/z 223m/z 237

m/z 250
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2006/9/58標品の標品の精密質量測定結果
No.

[M-H]－m/z理論値m/z測定値

5

C8H17O4S

209.0853

209.0857

10

C9H19O4S

223.1009

223.1011

7

C9H19O4S

223.1009

223.1013

22

C11H24NO3S

250.1482

250.1484

4

C10H21O4S

237.1166

237.1167

6

C10H21O4S

237.1166

237.1164SDS

C12H25O4S265.1479

265.1481

構造式
OSO3H

OSO3H
OSO3H

NHSO3H

OSO3H

OSO3H

OSO3H

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ミジンコ飼育水分析結果
ミジンコ飼育水分析結果(飼育水換算飼育水換算200倍濃縮倍濃縮 x 10µL注入注入)
飼育水換算
注入1.00e6TIC

5.00e5Intensity, cps

0
2.5e4m/z 97 ﾏｽｸﾛﾏﾄｸﾞ
ﾏｽｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ

1.5e4

OSO3H

4SDS

0
6000m/z 237 ﾏｽｸﾛﾏﾄｸﾞ
ﾏｽｸﾛﾏﾄｸﾞﾗﾑ

3000
0
1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

Time, min

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9ミジンコ飼育水
スペクトル
ミジンコ飼育水から飼育水から得から得られた化合物られた化合物の化合物のMSスペクトルm/z 237.1169
フラグメンター電圧フラグメンター電圧を電圧を高めに設定するとすると生設定すると生じるフラグメント
じるフラグメント

m/z 96.9602

m/z 96.9602から計算される実験式(計算条件:C0～20H0～45N0～5O0～5S0～5)
候補1: HO4S (誤差0.1 mAMU)
候補2: C4HOS (誤差-15 mAMU)
候補3: HO2S2 (誤差18 mAMU)

m/z 237.1169から計算される実験式(計算条件:C0～20H0～45N0～5O0～5S0～5)
候補1:
誤差0.3mAMU)
候補 C10H21O4S (誤差
誤差＝化合物4の化合物 の[M-H]－に一致
候補2: C11H17N4S (誤差-1.0 mAMU)
候補3: C14H13S (誤差2.3 mAMU)
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まとめ
１．ミジンコ本体から単離されたカイロモンを、ミジンコ飼育水から簡便な前処理だけでLC/MS-TOFを用いて同定できた。
2. マス軸校正用内部標準物質を同時に測定することで、精度の高い精密質量測定が可能であった。
３．カイロモンの存在が推定されている例はあるが、化学的に直接検出・同定された例は稀である。
４．SDS等が自然界の微生物に及ぼす影響を簡単に迅速に分析できる。
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