本研究は，日本農芸化学会 2020 年度大会（福岡）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のため中止）に応募された研究のうち，本誌編集委員会が優れた研究とし日本農芸化学会て選定した６題の発表のうちの一つです．

空中胞子 DNA 検出によるキノコの判別と生育域調査
静岡県立掛川西高等学校自然科学部
杉山賢大（指導教員：鈴木拓哉・志茂野千香子）
本 研 究 で は， 空 気 中 に 飛 散 し て い る キ ノ コ の 胞 子 由 来 のDNA を 検 出 す る こ と で キ ノ コ の 生 育 域 と 種 の 特 定 を 行 う こ●とを目的にした．独自に開発した簡易的な空中微粒子採取装置 を 用 い て 胞 子 を 収 集 し ，PCR 法 に よ っ て DNA を 検 出 す ることにした．はじめにシイタケの子実体の DNA 増幅を行い，胞 子 由 来 の DNA を 検 出 で き る の か 検 証 し た と こ ろ， 良 好 な

化学と生物結果が得られた．次に野外調査を行った．静岡県の山麓の空クラゲ，そして中国産マツタケの 9 種類のキノコの子実体を用いて DNA 増幅方法の確立を行った．まずこれらの子実体の内部（図 1a）を切り取り，DNA 抽出試薬として UniversAll Extraction BuﬀerII を 25 µL 加え，95 Cで加熱し，5 C で遠心分離を行った．この上澄み液をDNA 抽出液とした．

気 中 に 飛 散 し て い る 胞 子 由 来 DNA を 分 析 し た 結 果， マ ツ タ
ケと推定できる胞子由来の DNA を検出することに成功した．
さらに採取装置の設置地点周辺にて実際にマツタケを発見できたことから，自然界に生育するキノコの種の特定が簡便に行えることがわかった．静岡県ではこれまでマツタケの生育を確認できていなかったが，県内でマツタケの生育を確認できたことは本研究での新たな発見である．

DNA 抽 出 液 1 µL に DNA ポ リ メ ラ ー ゼ と し て KOD
One® PCR Master Mix 25 µL，滅菌蒸留水 22 µL，プライマー 2 µL を加えて図 1b の温度サイクルで PCR 法による DNA 増幅を行った．今回 PCR 法に使用したプライマーを図 1c に示す．なお，プライマーについては，国立研究開発法人 森林研究・整備機構 森林総合研究所の宮崎和弘先生に情報を提供して頂いた．このプライマー

本研究の目的本校では環境 DNA を用いて，生物の生育域の特定をは IGS1 領域を増幅するもので，シイタケの品種識別に使われており，シイタケの安定した DNA 増幅が確認されているため，使用することとした．
その後 3％アガロースゲルを用いた電気泳動法により目的とし，研究を行っている．そこで，本研究では，空気中に飛散しているキノコの胞子を検出することによっDNA 増幅の確認を行った．て，キノコの生育域と種の特定を行うことを目的にし

2.

空気中からの DNA 検出た．昨年度本校で独自に開発した簡易的な空中微粒子採空中微粒子採取装置は先行研究で作製したものを使用

取装置を用いて，胞子を収穫し，PCR 法によって DNAした．写真と仕組みを図1dに示す．装置内のポンプにを検出することにした．

よってストローを通じて空気中の微粒子をボトル内に吸い込む．ボトル内には DNAの16 時間以上の保持が確認され本研究の研究方法 (1〜5)
シイタケおよび他種キノコからの DNA 増幅

1.ているオスバン溶液が入っており，ここに空気中に浮遊・飛散している微粒子を溶かし込む仕組みとなっている．な
お，使用するボトルやストローは使い捨てである．

市販されている静岡県産シイタケ・シメジ・エリン

この装置を用いて空気中から胞子が検出可能かを調べ

ギ・ヒラタケ・マッシュルーム・マイタケ・エノキ・キるため，静岡県島田市のシイタケ農園内に空中微粒子採156

化学と生物 Vol. 59, No. 3, 2021

図 1 ■ DNA 増幅方法の確立と空気中からのDNA 検出方法

日本農芸化学会

a. 子実体内部の切り取り，b. PCR 法によるDNA 増幅温度サイクル，c. 使用したプライマーセット，d. 空中微粒子採取装置の写真と仕組み．

取装置を設置し，16 時間稼働させた．採取は 2019 年 6月 7 日 17 時から 6 月 8 日 9 時まで行った．その後，微粒子を含んだオスバン溶液 50 µL を試料とし，1 の方法でDNA 増幅を行った．なお，採取装置は農園内の菌床が●置いてある棚に設置した．
3.

キノコ栽培実験による胞子検出範囲の検証
胞子が検出されるときのキノコの生育状態と，本校で用いる方法の検出感度の把握のために，本校で菌床栽培化学と生物しているシイタケを，閉め切った教室内に 1 日置き，その後同教室に採取装置を 1 日設置し，胞子由来の DNAが検出できるか確認した．これを 2 週間ごとに行い，キノコの状態と胞子検出の確認をした．
4.

野外調査
今回の調査方法でマツタケ（（S.ItoImai）Sing.）の新たな生育域を特定することを目的とし，野外調査を行うこととした．マツタケの生育が確認されている，山梨県南都留郡鳴沢村の山内 2 地点と，マツタケの生育が確認されていない静岡県西部の山 A の 10 地点，山 B の 4 地点の計 16 地点で空中微粒子採取装置を 16 時間設置した．
山梨県南都留郡鳴沢村はマツタケの生育が確認されており，実際に装置を設置した際にマツタケを発見した．

図 2 ■ シイタケおよび他種キノコからの DNA 増幅結果と胞子検出範囲の検証
a. シイタケの子実体から増幅された PCR 産物の電気泳動結果，b.
8 種類のキノコの子実体から増幅された PCR 産物の電気泳動結果，
c. シイタケ農園の空気中から採取した試料の電気泳動結果，d. 教室内（190 m3）で栽培中の空気を試料とした電気泳動結果．

そのため，試料に加えて，発見したマツタケの子実体かから 25 C，日本では 8 月末から 11 月下旬に発生する．

らも DNA を検出することにした．

そこで私たちは生育条件を満たす範囲に絞り調査を行っ静岡県の山の場所の詳細については，今回ご協力いたた．

だいた山主さんの意向の元伏せさせてもらう．静岡県では，マツタケの生育域について公表されていないが，地本研究の結果元の人から過去の目撃情報を得られたため，調査することにした．マツタケは樹齢 20 から 30 年になるアカマツ

1.

シイタケおよび他種キノコからの DNA 増幅から発生し，アカマツとは共生関係である．腐植質の少シイタケの子実体の電気泳動結果を図 2a に示す．目ない乾燥した土壌を好み，菌糸体の生育最適温度は 22的の増幅長である 1,000 bp のバンドが確認でき，今回の化学と生物 Vol. 59, No. 3, 2021

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DNA 増幅方法は有効であることがわかった．
次にシイタケ以外の 8 種類のキノコの子実体の電気泳動結果を図 2b に示す．キノコの種類によって，バンド

たはキクラゲに近い種のキノコが生育していることが考えられる．の位置がそれぞれ異なることが確認できた．これは今回マツタケの胞子が検出されなかったことについて，前使用したプライマーがキノコの種によって，異なる増幅日までの降雨の影響が考えられた．一方，他のキノコの長をもつことを示している．キノコの種類ごとの DNA胞子は検出されたことから，野外調査では風などの気象増幅長を表 1 にまとめた．

条件だけでなく，胞子量や飛散範囲がキノコの種によっ

空気中からの DNA 検出

2.

日本農芸化学会

幅長のみ確認できた．このことから，シメジとエノキまて異なることが考えられる．

シイタケ農園の空気中から採取した試料の電気泳動結

次に，静岡県西部の山 A・B の電気泳動結果を図 3b果を図 2c に示す．シイタケの特異的な増幅長であるに示す．A・B どちらの山でもマツタケの DNA 増幅長1,000 bp 前後のバンドが確認できた．このことから，空である 400 bp の DNA 増幅長が確認できた．さらに，装気中から胞子由来 DNA は検出が可能であることを示す

置設置の後，生育するキノコの調査を目視で行ったとこことができた．

ろ，山 B の採取地点周辺でマツタケを発見した．山 B でキノコ栽培実験による胞子検出範囲の検証

3.

栽培中のシイタケを教室内に置き，その空気を試料とは目視での発見と胞子検出結果が一致したことから，今回の調査方法はマツタケにも有効であると考えられる．

した電気泳動結果を図 2d に示す．栽培を始めて 2 週間

また，山 B では DNA 検出を利用した本研究の調査方法の子実体の放出する胞子を空気中から検出することがでによって，マツタケの新たな生育場所を発見することがきた．また，今回空気を採取した教室の広さは約 190 m3できた．

●であったため，キノコが子実体を形成し始めた段階で，この範囲の空気中から胞子由来 DNA は検出可能であることがわかった．
野外調査

化学と生物4.

本研究の意義と展望
私たちが確立した調査方法は，空気中から単に胞子を山梨の電気泳動結果を図 3a に示す．子実体からは採取するのではなく，キノコの DNA を採取・検出する

400 bp の DNA 増幅長が確認できたが，空気中試料からことによって，生育するキノコの種や生育範囲の特定まはマツタケの増幅長とは異なる 500 と 800 bp の DNA 増で簡易的に行うことにつながる．

表 1 ■ キノコの種類ごとの DNA 増幅長

な DNA 増幅長を示したことから，増幅領域内に，種ご今回使用したプライマーがキノコの種によって特異的キノコの種類DNA 増幅幅（bp）とに増幅長の差を生じさせる塩基配列があることが考え

シイタケ
キクラゲ
エノキ
マイタケ
マッシュルーム
ヒラタケ
エリンギ
シメジ
マツタケ

約 1,000
約 850
約 800
700〜750
約 600
約 600
約 600
約 500
約 400

られる．今後はシーケンス解析や制限酵素による切断の有無を確認し，この部位に見られる塩基配列の特徴を把握していきたい．また，空気中から検出された DNA の増幅長を種の判断に用いているが，検出した DNA の領域について特定し，有効性を確認していく．
マツタケの生育域調査では，静岡県では目視による生育域調査の結果と DNA 検出結果が一致した．一方，山図 3 ■ 野外調査結果
a. 採取したマツタケの子実体（左写真）ならびに空気中から増幅された PCR 産物の電気泳動結果，b. 空気中から増幅された PCR 産物の電気泳動結果，ならびに発見したマツタケ（右写真）．マツタケの DNA 増幅長だと思われる 400 bp のバンドの位置を矢印で示す．

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梨県では子実体は確認できたが胞子は検出されなかった．この原因として，山梨県ではマツタケの胞子飛散量の少なさや前日までの降雨の影響等が考えられた．
マツタケの胞子由来 DNA を野外にて検出できたことから，今後はマツタケ以外にもトリュフなどの希少なキノコの生育域特定を目指していく．また，今回の調査方法について胞子検出範囲やキノコの成長過程の関係性について調査を進め，より簡易的で実用可能な方法へと発展させていく．さらに，宿主となる動植物に寄生する菌類の DNA を検出することで，宿主の生育範囲の特定に文献
1) 宜寿次盛生：林産試だより，2014(3), 4 (2014).
2) 藤田 徹，藤田博美：「胞子採取法の改良の検討」，京都府林業試験場
3) 猪俣 衛：北日本病原中研録，1980(31), 98 (1980).
4) 静岡県立掛川西高等学校：空中環境 DNA を使った鳥類調査方法の確立．
（2018 年度の本校の研究）
5) 宮崎和弘：「IGS1 領域の塩基配列データを利用したシイタケ品種の識別について」，平成 24 年度森林総合研究所九州支所年報，24 (2012).
Copyright © 2021 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.59.156

化学と生物

●

日本農芸化学会も応用していく．

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