技術ノート

セルデスク LF1 が細胞毒性試験における直接接触法用陰性対照材料として適切である根拠データ
山影康次 1，小林美和子 1,2，又吉裕子 2，野田優子 2，蓜島由二 3，宮島敦子 3，
加藤玲子 3，藤巻日出夫 3，坂口圭介 4，武田真紀 4，岡田真幸 4，太田 亮 1
Supporting data that Cell Desk LF1 is suitable as a negative reference material forthe direct contact method in cytotoxicity tests
Kohji YAMAKAGE, Miwako KOBAYASHI, Yuko MATAYOSHI, Yuko NODA, Yuji HAISHIMA, Atsuko MIYAJIMA,Reiko KATO, Hideo FUJIMAKI, Keisuke SAKAGUCHI, Maki TAKEDA, Masayuki OKADA, Ryo OHTA

緒言

共同実験では，セルデスク LF1，対照材料，細「医薬品，医療機器等の品質，有効性及び安全胞および血清を秦野研究所から提供し，国内ガイ性の確保等に関する法律」（薬機法）
で定められていダンスに準拠した共通の試験計画書に従って 3 回る医療機器を製造販売（承認申請，認証申請及び届の繰り返し実験を行った．

出）
する場合，その安全性評価の一環として，生物学的安全性評価を実施する必要がある．すなわち，材料および方法医療機器の接触部位と接触期間に応じた生物学的1．試験施設有害作用（毒性ハザード）を特定するための項目に共同実験は，医療機器，歯科材料，細胞組織医ついて評価することが求められている．評価項目

療機器およびそれらの材料について，有効性・安の一つである細胞毒性は人体と接触するすべての全性・品質担保に関する研究を行っている国立医医療機器で必須の評価項目となっている．細胞毒

薬品食品衛生研究所の医療機器部，そして，医療性試験を実施する場合，基本的には国内ガイダン機器メーカーで実際に細胞毒性試験を実施してい1）

ス に記載されている方法に準拠して実施される．

るテルモ株式会社の湘南センターの協力を得て，国内ガイダンスでは，細胞毒性試験結果の妥当秦野研究所を加えた 3 施設で実施した．

性を示す材料として陰性および陽性の対照材料の2．試験試料使用が推奨されている．しかしながら，直接接触接着細胞用プラスチック製カバースリップと法用の陰性対照材料として推奨されている組織培して販売されているセルデスク LF1（ ロット番

養用プラスチックシートが販売中止となったこと

号：811P9012，製造元製品コード：MS-92132，

から，その代替品が求められている．ここでは，

直 径 13.5 mm， 放 射 線 滅 菌 済， 秋 田 住 友 ベ ー

その候補材料であるセルデスクLF1の直接接触法

ク）を，直接接触法用の新規陰性対照材料候補用陰性対照材料としての適切性を確認するために，として用いた．また，国内ガイダンスで推奨さ3施設による共同実験としてV79細胞を用いるコロ

れ て い る 対 照 材 料 に つ い て は， 直 接 接 触 法 用ニー形成法による細胞毒性試験を実施した．の陰性および陽性の対照材料として，それぞれ123418

一般財団法人 食品薬品安全センター 秦野研究所
公益事業部，対照材料管理室
一般財団法人 食品薬品安全センター 秦野研究所
安全性事業部，品質試験検査 G
国立医薬品食品衛生研究所 医療機器部
テルモ株式会社 湘南センター

組織培養用プラスチックシート（ロット番号：ECR0604， 和 光 純 薬 工 業）お よ び 0.25% Zincdibutyldithiocarbamate（ZDBC）含有ポリウレタンフィルム（RM-B，サイズ：直径14 mm，ロッ
ト番号：B-174K，食品薬品安全センター）を用いた．また，培地抽出法用の陰性対照材料として高技術ノート

密度ポリエチレンフィルム（RM-C，ロット番号：群の相対コロニー形成率（%）
を算出した．

C-161，食品薬品安全センター），陽性対照材料

4.2 培地抽出法と し て 0.1% Zinc diethyldithiocarbamate（ZDEC）

対照材料の重量に対し 0.1 g/mL の割合にな含有ポリウレタンフィルム（RM-A，ロット番号：るように M05 培地を加え，CO2 インキュベー

A-181K，食品薬品安全センター）および0.25% Zinc

ター中に 24 時間静置し，得られた抽出液を抽

dibutyldithiocarbamate（ZDBC）含有ポリウレタン

出濃度 100% の培地抽出原液とした．

フィルム（RM-B，サイズ：約2mm×15mm，ロッ抽出原液（100%）を新鮮な M05 培地で希釈し

ト番号：B-174K，食品薬品安全センター）を用いた．て種々の濃度の試験液（RM-A：0.20，0.50，1.0，

放射線滅菌済みセルデスク LF1 およびエチレン

2.0，5.0，10%，RM-B：20，40，50，60，オキシドガス滅菌した対照材料を秦野研究所が提80，100%，RM-C：25，50，75，100%）を 調供し，それらを試験に用いた．

製し，試験に用いた．なお，培地抽出液は抽出3．使用した細胞終了後すみやかに試験に用いた．

チャイニーズ・ハムスター肺由来の V79 細胞抽出開始日に V79 細胞をウェルあたり 100 個（ヒューマンサイエンス振興財団 研究資源バンク播種した．ウェルあたりの M05 培地量は約 2より入手）を用いた．秦野研究所が提供した V79mL とし，各群 3 ウェル用いた．

細胞の凍結アンプル（マイコプラズマの汚染なし）

播種翌日，培地を除き，各濃度の試験液（試を解凍し，解凍後継代 10 代以内の細胞を使用した．

験液濃度 0% の陰性対照群については新鮮な継代および直接接触法による細胞毒性試験

M05 培地）2 mL とそれぞれ交換し，6 日間培養に は， ウ シ 胎 児 血 清（ ロ ッ ト 番 号 : 014BS815，した．

Biosera，秦野研究所提供）を 10 vol% 含む Eagle's

培養終了後，メタノールで固定し，ギムザ液

MEM 培地（MEM10 培地）を用いた．培地抽出法で染色した．各ウェルのコロニー数を，目視まによる細胞毒性試験では，ピルビン酸ナトリウたは多目的高速画像解析装置（型式 : PCA-11，ム（1 mmol/L）およびウシ胎児血清を 5 vol% 含むシステムサイエンス）を用いて計測した．コロ

Eagle's MEM 培地（M05 培地）を用いた．

ニー数の平均値から陰性対照群のコロニー形成細胞は，CO2 インキュベーター
（37°C，5%CO2）内で培養した．

能および陰性対照群に対する各処理群の相対コロニー形成率（%）
を算出した．

4．細胞毒性試験

RM-A および RM-B については，50% を挟む

各試験施設は，直接接触法および培地抽出法に2 点の試験液濃度と相対コロニー形成率から回よるコロニー形成試験をそれぞれ 3 回，異なる日帰直線式を用いて IC50 値（コロニー形成を 50%に実施した．

阻害する濃度）を算出した．

4.1 直接接触法

5．実験成立条件

24 ウェルプレートのウェル底面に陰性対照材以下を満たした実験データのみを採用すること

料（組織培養用プラスチックシート），セルデスとした．

ク LF1 および陽性対照材料（RM-B）をそれぞれ

1）
無材料対照群 / 陰性対照群のコロニー形成能が密着させ，MEM10 培地に懸濁した V79 細胞（1020.8～1.2 である．

個 /mL）
を各ウェルに 0.5 mL（50 個 / ウェル）加え2）
陰性対照材料（培地抽出法の場合は 100% 濃度た．なお，陰性対照として何も置かないウェルの試験液）の相対コロニー形成率が 80～120%を無材料対照群とした．各群 3 ウェル用いた．

である．

6 日間培養後，細胞をメタノールで固定し，3）
直接接触法の陽性対照材料 RM-B の相対コロギムザ液で染色した．各ウェルのコロニー数をニー形成率が 0% で，培地抽出法の陽性対照材目視により計数し，コロニー数の平均値から無料 RM-A および RM-B の IC50 値がそれぞれ 7%

材料対照群のコロニー形成能（コロニー数 / 播未満および 80% 未満である．

種細胞数）および無材料対照群に対する各処理
19秦野研究所年報 Vol. 43. 2020

表1

セルデスク LF1 および 対照材料の直接接触法による V79 細胞を用いるコロニー形成試験結果

試験施設 実験 No.
A

123B

123C

123コロニー/ ウェル
123

平均±S.D.

相対コロニー
形成率（%）

無材料対照（MEM10 培地のみ）

3750

3841.7±7.2

100.0

陰性対照材料

43464645.0±1.7107.9

セルデスク LF13938

4340.0±2.695.9

陽性対照材料（RM-B）

0000.0±0.00.0

無（陰性対照、MEM10 培地のみ）
陰性対照材料4749444348
4246.344.7±±2.1
3.8

100.096.5

セルデスク LF147454646.0±1.099.4

陽性対照材料（RM-B）

0000.0±0.0

0.0

無（陰性対照、MEM10 培地のみ）

57

575656.7

±0.6

100.0

陰性対照材料47545351.3±3.890.5

セルデスク LF1

53565153.3±2.594.0

陽性対照材料（RM-B）
無材料対照（MEM10 培地のみ）

047

0420
46

0.0
45.0

±±0.0
2.60.0100.0

陰性対照材料

52

46

51

49.7

±3.2110.4

セルデスク LF1

4754

47

49.3

±4.0

109.6

陽性対照材料（RM-B）

0000.0±0.00.0

無（陰性対照、MEM10 培地のみ）

5151

52

51.3

±0.6

100.0

陰性対照材料47394644.0±4.485.8

セルデスク LF146485349.0±3.695.5

陽性対照材料（RM-B）

0000.0±0.00.0

無（陰性対照、MEM10 培地のみ）

4348

4645.7±2.5100.0

陰性対照材料

4046

47

44.3

±3.896.9

セルデスク LF1

4649

53

49.3

±3.5107.9

陽性対照材料（RM-B）

0000.0±0.00.0

無材料対照（MEM10 培地のみ）

48

46

50

48.0

±2.0100.0

陰性対照材料

49

46

47

47.3

±1.598.5

セルデスク LF1

4750

4647.7±2.1

99.4

陽性対照材料（RM-B）

0000.0±0.00.0

無（陰性対照、MEM10 培地のみ）

54495151.3±2.5100.0

陰性対照材料5050

4749.0±1.795.5

セルデスク LF147515149.7±2.396.9

陽性対照材料（RM-B）

0000.0±0.0

0.0

無（陰性対照、MEM10 培地のみ）
陰性対照材料

50494750484848.349.0±±1.5
1.0100.0101.4

セルデスク LF151504950.0±1.0103.5

陽性対照材料（RM-B）

0000.0±0.00.0

材料名

陰性対照材料：組織培養用プラスチックシート
陽性対照材料（RM-B）：0.25% ZDBC 含有ポリウレタンフィルム
S.D.：標準偏差結果および考察3 試験施設による直接接触法の 3 回の実験結果を表 1 に示した．
新規陰性対照材料候補であるセルデスク LF120の相対コロニー形成率は，3 試験施設ともに陰性対照材料の実験成立条件である 80～120% の範囲内の値を示し，各試験施設における 3 実験の平均値±標準偏差は，試験施設 A では 96.4 ± 2.7%，

技術ノート
表2対照材料の培地抽出法による V79 細胞を用いるコロニー形成試験結果

試験施設A群

実験成立の指標（基準）1
陰性対照（M05 培地） PE（0.8～1.2）0.9
陰性対照材料（RM-C） RPE at 100%（80～120%） 103.9
陽性対照材料（RM-A） IC50
（7% 未満）1.5
陽性対照材料（RM-B） IC50（80% 未満）
54

実験 No.
23
1.0
1.092.6
85.3
1.71.25245

平均± S.D.

1.0
93.9
1.5
50.3

±±±±0.1
9.4
0.34.7B

陰性対照（M05 培地） PE（0.8～1.2）
1.0
陰性対照材料（RM-C） RPE at 100%（80～120%） 102.2
陽性対照材料（RM-A） IC50（7% 未満）
3.3
陽性対照材料（RM-B） IC50（80% 未満）
551.094.0
3.0541.094.4
3.156

1.096.9
3.155.0±±±±0.04.60.21.0C

陰性対照（M05 培地） PE（0.8～1.2）0.9
陰性対照材料（RM-C） RPE at 100%（80～120%） 111.4
陽性対照材料（RM-A） IC50（7% 未満）
1.5
陽性対照材料（RM-B） IC50（80% 未満）
540.9
108.0
1.545

1.095.80.7450.9
105.1
1.2
48.0

±±±±0.08.2
0.55.2

陰性対照材料（RM-C）：高密度ポリエチレンフィルム
陽性対照材料（RM-A）：0.1% ZDEC 含有ポリウレタンフィルム
陽性対照材料（RM-B）：0.25% ZDBC 含有ポリウレタンフィルム
PE：コロニー形成能
RPE at 100%：100% 試験液での相対コロニー形成率
S.D.：標準偏差

試 験 施 設 B で は 104.3 ± 7.7%， 試 験 施 設 C で はのIC50 値は，それぞれ0.7～3.3%および45～56%

99.9 ± 3.3% であった．

であり，いずれも実験成立条件（RM-A：7%未満，また，各施設ともにすべての実験において，陰RM-B：80%未満），すなわち国内ガイダンスの性対照材料である RM-C はコロニー形成を阻害せ基準を満たした．また，国内ガイダンスの参考情

ず，陽性対照材料である RM-B のコロニー形成率

報に記載されているIC50 値の幅（RM-A：1～3%，は 0% となり，いずれも実験成立条件を満たした．

RM-B：50～60%）と同程度の結果であった．

国内ガイダンスでは，直接接触法による細胞毒以上の結果から，3 試験施設による 3 回の繰り性試験は，抽出時に失活することが予想される材

返し実験は，国内ガイダンスで要求されている試料および眼粘膜に接触する材料について，抽出法

験精度・感度で行われ，それらの試験施設で行わによる細胞毒性試験に加えて実施すると記載されれたすべての実験でセルデスク LF1 は直接接触ている．そこで，直接接触法に加え，抽出法によ法で V79 細胞のコロニー形成を阻害しなかった．

る細胞毒性試験も実施した．

したがって，セルデスク LF1 は直接接触法の陰培地抽出法による対照材料の結果を表 2 にまと性対照材料として適切であることが示された．

めた．
陰性対照材料であるRM-Cは85.3～111.4%の相文献対コロニー形成率を示し，3試験施設のいずれの実1)験においてもコロニー形成阻害作用は認められなかった．陽性対照材料であるRM-AおよびRM-B

厚生労働省医薬食品局：「医療機器の製造販売承認申請等に必要な生物学的安全性評価の基本的考え方について」, 201221