細胞膜剥離法で明らかになる培養破骨細胞の接着側細胞膜面の裏打ち構造
Visualizing Undercoat Structures Associated with the Adherent Membrane of Cultured
Osteoclasts by Unroofing Freeze-Etching Techniques
明坂年隆

Toshitaka Akisaka
朝日大学歯学部口腔解剖学分野
要旨

骨組織のリモデリングを担う破骨細胞の機能・形態的極性を決定する接着側細胞膜面の裏打ち構造について，細胞剥離法を用い三次元可視化による形態解析を行った．細胞―細胞外基質間接着（cell-to-matrix adhesion）の場では，アクチン細胞骨格を主体としたポドゾームが膜の裏打ち構造と一体となって空間的ネットワークを構築していた．また膜面に出現する特異なクラスリン被覆シー
トはタイトな細胞接着と関連して，クラスリン被覆膜がもつ本来のクラスリン依存性エンドサイトーシス以外の機能的役割を示すと考えられる．さらに，最近の接着構造としてのポドゾーム研究展開の現状を紹介するとともに，今後の展望を探る．

キーワード：培養破骨細胞，膜の裏打ち構造，細胞膜剥離，ポドゾーム，クラスリン被覆

豊富なポドゾーム（podosome）とよばれる特有な接着構造
1.

はじめにが出現してくる．ポドゾームはフォーカルアドヒージョンの生体における骨組織は一見すると変化の乏しい静的な組織一変形であると考えられているが，その分子構成や分単位でと思われるが，骨芽細胞と破骨細胞に代表される骨組織の構変動する動的構造を制御するシステムには相違点も多い 2）．

成細胞群によって骨形成と吸収が一定のサイクルで常時進行

破骨細胞に特徴的なポドゾーム構造は接着側細胞膜に付随するリモデリングが絶えず繰り返されているダイナミックにして出現し細胞質に面した基質側細胞膜面に形成される細胞変動する組織である．その動的平衡は 2 種類の細胞による機骨格と密接に関係する．またこの領域の細胞膜は細胞内外の能的カップリングにより，絶妙なバランスで生体内カルシウ双方向の物質の流れ，シグナル伝達など細胞極性を際立たせムのホメオスタシスが維持されている．間葉系幹細胞に由来る場を提供している．このような領域で細胞膜の細胞質表面する骨芽細胞に対して破骨細胞は単球―マクロファージ系のに密着して存在し，細胞骨格や種々のタンパク質からなる膜血液幹細胞に由来する多核，巨細胞で，その機能としての骨の裏打ち構造の空間的広がりを持った構造を超微構造レベル

基質吸収により血清中のカルシウムレベルを上昇させてカルで観察するには従来の超薄切片法，フリーズフラクチュアーシウムホメオスタシスを保つことにある．この骨吸収機能はやディープエッチングなどの電子顕微鏡法では狭い断面，脂骨芽細胞をはじめとする骨髄に存在する細胞群とともにさま質二重層の内面又は極限られた領域でのみ膜面が露出されるざまな局所・全身的因子によって制御されており，一連の骨だけで広範囲な細胞質に面した膜表面の観察には不向きであ

吸収過程では破骨細胞が骨表面に接着して骨面との間に微小り新たなアプローチが必要になる．そこで膜の裏打ち構造を閉鎖環境を成立させることが必須条件となる．この細胞接着

広範囲に観察する手法として細胞膜剥離法（shearing open,については細胞間（cell-to-cell）の関係で成立するデスモゾーlysis-squirting あるいは unroofing と呼ばれている）が開発され，ム，タイト，ギャップの結合などの接着構造が広く知られてこれまで様々な種類の細胞で報告がなされているが，この手いるが，細胞―細胞外基質（cell-to-matrix）間の接着について法は培養条件下の細胞でのみ有効である制約がある．機能的，はその構造・機能について不明な点が数多く残されている 1）．

構造的にも極性をもった in vivo での典型的な破骨細胞とガ細胞―細胞外基質間に成立するフォーカルアドヒージョン

ラスやアパタイト上で培養する in vitro 条件下でもともに接着（focal adhesion）ではよく発達した束状アクチン線維からな構造に関しては共通の事象として再現できる（図 1a，b）3,4）．

るストレスファイバーと膜面との関連で成立しているが，破本稿ではこれまで技術的な制約で困難であった分離，培養骨細胞にはそれらが欠如し代わりに，同様にアクチン線維のした破骨細胞の接着側細胞膜の細胞質面の裏打ち構造について，その空間的解析を主として細胞膜剥離法と急速凍結・デ〒 501–0296 岐阜県瑞穂市穂積 1851–1
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2011 年 11 月 14 日受付
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イープエッチングレプリカ法を用いて得られたデータを紹介するとともに，破骨細胞の接着構造がもつ研究の拡がりについて解説する．
顕微鏡 Vol. 47, No. 1（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 a．アパタイトコーティングガラス上で培養した破骨細胞の走査電子顕微鏡像．緑色で着色した部分はアパタイト基質が分解・吸収されガラス面が露出された吸収窩領域を示す．b．アパタイト基質上で培養した破骨細胞の細胞膜剥離後のレプリカ像のモンタージュ写真．ポドゾームを含むアクチンリングは赤色，吸収窩に面した領域は緑色で示す．a，b：スケールバー
は 10 μm．の局在が明らかにできる．ディープエッチングまたはフリー
2.

細胞膜剥離法の実際

ズドライ処理の後白金を 2 nm 厚になるよう蒸着源から試料細胞を剥離して接着側の細胞膜面を観察しようとする最初

面に 10 ～ 20 度の角度で回転蒸着し，カーボン蒸着でレプリの試みは 1975 年に Mazia らのグループによって報告されてカを補強した（図 2）．レプリカ膜はガラス面に培養させた

いる 5,6）．いずれも接着性を高めた人工基質面に細胞を接着

細胞では比較的容易に剥がれるが，アパタイト上で培養したさせ，低張緩衝液の水流によって細胞膜面を露出させる手法

細胞ではアパタイトを無機酸（0.1 M 塩酸）または EDTA でを用いている．その後，改良が加えられ緩衝液のジェット水溶解させるステップが必須となり，続いて次亜塩素酸による流や超音波によるマイクロキャビテーション効果によって細有機物の除去処理を行い蒸留水による洗浄後，フォルムバー

胞膜面を露出させ，急速凍結・ディープエッチングレプリカ

ル支持膜を張った 75 メッシュのグリッドに回収して透過型法を組み合わせて大幅に分解能を向上させて解析することが電子顕微鏡（TEM）で観察した．観察時にはゴニオメーター可能となった 7）．本稿では検索対象となる細胞はウサギ骨髄装置を用いて± 10 ～ 20 度の傾斜をつけてステレオペア撮影から分離，カバーガラス又は Biocoat（合成リン酸カルシウを行った．三次元可視化にはステレオペア，アナグリフ，電ムアパタイトでカバーガラスをコートしたもの；BD Bio-子線トモグラフィーの手段が利用されるが，2 枚のステレオsciences 社製）上で 1 ～ 2 日間培養したものを用いた．通常

写真から Alicona 社製「Mex ver.5」のソフトを用いてコン細胞膜剥離法を用いるとき，基質面に試料となる細胞をアルピューター上で簡易的に三次元構築（DEM: Digital Elevation

シアンブルーや poly-L-lysin を用いて基質面に結合させる処Model）を行った．

置が必要になることがあるが，破骨細胞は本来基質面に強く結合する性質があるのでこの処理は不必要となる．培養細胞

3. 接着膜面の細胞質側表面の膜の裏打ち構造とポドゾーム

は培養液から人工細胞質緩衝液中に移し，20 ml プラスチッ

接着構造としてのポドゾームは破骨細胞のみならずマクロクシリンジを用いて基質上の細胞にジェット水流を吹き付けファージ，樹状細胞，oncogene で形質転換させた線維芽細胞，るか，または超音波細胞破砕装置に取り付けたホーン型マイ

血管平滑筋細胞や血管内皮細胞など多様な細胞に出現してく

クロチップによる低出力超音波マイクロキャビテーション効ることが知られている．アクチン染色で見たポドゾームの蛍果によって背側細胞膜，細胞質の大部分を吹き飛ばし，細胞光像は，単独のものではドット状を呈しクラスターからリン膜の試料を調製した．このような細胞膜剥離処理にかかる時グ，ベルト状へと細胞機能に応じて変化し，これらの変化は間は 10 数秒で終わらせることができる．その後のディープ細胞の分化・成熟と骨吸収活動を反映したものとなっていエッチングまたはフリーズドライ時の緩衝液の塩の析出を防る 8）．ポドゾームの形成は全く新規にアクチンの重合から de

ぐため，蒸留水による短時間の洗浄後に液体窒素温度に冷却novo 形成されるほか，既存のものから分裂して形成される 2した純銅ブロックに圧着させる急速凍結固定を行った．免疫つの経路がある．ポドゾームの half-life は分単位のダイナミッ標識を行う場合には，剥離後 0.1％ glutaraldehyde による短クに変貌する構造である．ポドゾームはアクチン線維を主体

時間の化学固定が必要となり，抗体と金コロイド標識をすれとした構造でその中心（コア）部と周辺（リング）部の 2 つば金コロイドが白金レプリカ上でも高コントラストを示しその異なったアクチン細胞骨格の配列を伴うサブドメインから

講座

細胞膜剥離法で明らかになる培養破骨細胞の接着側細胞膜面の裏打ち構造

39【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 Unroofing 法による細胞膜剥離の手順
a：基質上での分離破骨細胞の培養．b：緩衝液のジェット水流，または超音波によるマイクロキャビテーション効果による核，細胞質の除去と接着側細胞膜面の裏打ち構造と膜面の露出．
c：露出した細胞膜面上の裏打ち構造とアクチン細胞骨格の急速・凍結固定とその後のディープエッチング又はフリーズドラ
イ．d：白金とカーボンの回転蒸着によるレプリカ膜の作製．e：
酸・有機溶剤による基質成分と細胞成分の除去とレプリカ膜の回収．

図 3 ポドゾームの共焦点レーザー顕微鏡像
a：ファロイジンによる F- アクチン単染色では破骨細胞ラメリポデイウム領域のポドゾームコア部（赤色のドット）のみが染色される．サイズが異なる単独のものからクラスター状となりポドゾームの融合像も観察される．b：ファロイジンによるF- アクチン（赤色）と G- アクチンに特異的に結合する DBP（Vitamin D Binding Protein）抗体による二重染色（緑色）ではコアとリング部が識別される．共存する部位は黄色になる．図b は XY- 軸のオプティカル切片像．c：図 b で観察されるポドゾー
ムの Z- 軸オプティカル切片像．円錐形の底辺を基質側に向けたポドゾームから同様にコアとリング部から構成されているのがわかる．スケールバーは 5 μm．

た 11）．通常の細胞膜面に密着する裏打ち構造としてのアクチン線維はトモグラフィーによる解析から膜面との間隔が 1 ～2 nm であると報告されている 12）．ジェット水流または超音波マイクロキャビテーションによる細胞膜剥離法ではポドゾームコア部やポドゾームが集合してシーリングベルトを構構成されている 9）．ポドゾームコアでは密に集中した分岐ア成するアクチン線維に結合するいろいろな関連蛋白質を取りクチン線維から成るが，そのリング部（アクチンクラウドと除くことが困難で，クリアーな線維構造として殆ど見られなも呼ばれる）では密度も疎で比較的長いケーブル状のアクチい．逆に強固に結合している成分がポドゾーム構造と一体とン線維が分布している（図 3）．典型的なフォーカルアドヒなって重要な役割を演じていると考えられる（図 4，5a）．こジョンの構成アクチン関連蛋白は 50 種類以上のものが報告のことは triton X-100 などの界面活性剤処理で取り除くことされているが，ポドゾームにおいてもコアとその周辺リングができることから明らかである．それに対して周辺の裏打ち部とは明らかに異なりコア部には WASP, Arp 2/3, dynamin 2,骨格では G- アクチンからなるおおよそ 5 nm 周期の明瞭なcortactin, vimentin, fimbrin, Pyk 2 等 が， ま た リ ン グ 部 に は線維構造を呈した．またポドゾームを構成する細胞骨格は膜

paxillin, talin, vinculin, myosin 等が局在することが明らかにの裏打ち構造とともに剥離によるシアストレスに抵抗し，強10）．そのうちリング部に存在する G-actin がポド固に膜面に結合していることを示している．または剥離の程ゾームのアクチンネットワーク形成のための供給源となって度を強くすると殆ど膜面構造は消失するが，弱いと細胞質のいる 3）．中間径フィラメントや微小管はポドゾーム本体構造構造が多く残り接着側細胞膜が露出されないなど現在の技術の構成要素とはならずポドゾーム形成後に近傍に位置して相では定量的に調節することは不可能である．私たちのこれま互にポドゾームの離散・集合に影響を与えると考えられていでの検索ではアクチン線維の極性はコア部では膜面に重合端る．F- アクチン染色蛍光像では大小サイズの混在したポドのプラスエンドが向くが，クラウド部では中心に向かっていゾームの一つ一つがドット状を呈するが，アクチン関連蛋白る．このことはアクトミオシン系のもとでポドゾーム領域のとの二重染色ではポドゾームは円錐形の底辺を細胞膜面に向

膜面ではトレッドミル機構が働いて機械的な力が膜面に伝達なっている

けた形状を示し底辺のサイズはおおよそ直径 0.5 ～ 3 μm，されることになる．その結果，効率的にポドゾーム領域膜に高さも同等な二重構造が識別できる（図 4）．細胞膜剥離後存在する膜貫通性のインテグリンを介した接着メカニズムがの電子顕微鏡観察からはポドゾームのアクチン細胞骨格は膜働くことが考えられる．の裏打ち構造としてのアクチン線維と連結しそれぞれの線維通常培養条件を 2 次元ではなく 3 次元的に培養基質と接触は膜面顆粒を介して膜面に繋ぎ止めらフォーカルアドヒーするようにすると細胞形態に大きな変化が現れることが判っ

ジョンの膜面とのコンタクト部で観察されるのと同様であっている．2 次元培養ではラメリポデイウムを伴い基質上で広40顕微鏡 Vol. 47, No. 1（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 4 破骨細胞ラメリポディウム領域に相当する接着側膜面上に出現するクラスター状ポドゾームの DEM 像．それぞれのポドゾーム（矢頭）はアクチン線維で繋がれ膜の裏打ち骨格と連結している．矢印は膜剥離されずに残った背側細胞膜（D）と露出した接着側細胞膜面との境界を示す．スケールバーは 10 μm．

図 5 a．アクチンベルト内のポドゾーム相互は図 4 に比較してクラスターとなったものよりさらにアクチン細胞骨格の密なネットワークを作っている．膜の裏打ち骨格とも一体化されて膜面に結合し三次元的なネットワークを構築している．ポドゾー
ムのリングに相当する領域にクラスリン被覆ピット・小胞が観察されクラスリン依存性エンドサイトーシスが生じている．この図では 7 つのポドゾームが識別できる（P1 ～ P6）．b．白線四角で囲んだポドゾームのリング（アクチンクラウド）部に相当する領域を拡大したもの．数個のクラスリン被覆ピット・小胞が観察されこの領域で膜の輸送がおこなわれていることを示している．a スケールバーは 2 μm，b は 0.1 μm．

く伸展する線維芽細胞が 3 次元培養ではラメリポデイウムを

2 つのタイプのクラスリン被覆，ピットとシート，が出現し欠如し，発達の悪いストレスファイバーをもつ細長い紡錘型てくる．接着側膜面にはカベオラは観察されなかった．破骨の本来の in vivo にある形に近い細胞形態へと変化する．ま細胞をカバーガラスまたはアパタイト上で培養しても同様にた破骨細胞と同様なポドゾームを形成するマクロファージは広範囲にクラスリン被覆シートが出現したがクラスリンピッ

3 次元培養下では単独のポドゾームではなく細胞の突出部にトはポドゾーム近傍の限られた場所に出現するのみであっ．しかし破骨細胞

た 3,4）（図 5b）．ポドゾーム領域に出現するクラスリン被覆ピッでは接着する相手となる骨基質とは in vivo においても 2 次

トはポドゾーム膜に存在するインテグリンのリサイクリング

元 in vitro で再現される状態と同様に，cell-to-matrix の関係に関わるのか，またシグナル伝達の一環であるのか想像の域が成立するので 2 次元培養でもより in vivo 状態に近い環境を出ない．大部分のクラスリン被覆がピットや小胞形成に至で解析できる利点をもっている．

らずシート状になったままの “frustrated endocytosis” の状態

クラスター状に現れる特徴があるという

13）

細胞膜剥離により表される破骨細胞の接着側細胞膜には講座にあり，強固に基質に接着した細胞膜ではクラスリン依存性細胞膜剥離法で明らかになる培養破骨細胞の接着側細胞膜面の裏打ち構造

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図 6 a．破骨細胞ラメリポディウム領域に出現するシート状を呈するクラスリン被覆（赤色で着色）部．相互に数珠繋ぎ連結するクラスリンシート領域は多様な形態を呈する．これらの領域では膜骨格が欠如するとともにクラスリン被覆ピット・小胞は殆ど観察されない．スケールバーは 1 μm．b．吸収窩に面した膜面．部分的に脱灰されたアパタイト結晶表面（緑色で着色）部にはクラスリン被覆は観察されないが，平滑を呈する無傷のアパタイト結晶上では数珠状に繋がったフラットなクラスリン被覆膜（赤色で着色）が強固に接着している．スケールバーは 1 μm．

エンドサイトーシスのプロセスが抑制されることを示している（図 6a）．アクチンベルトで囲まれた吸収窩領域では分解4.

破骨細胞の接着構造研究の拡がり産物取り込みのためにクラスリン被覆介在エンドサイトーシ

ポドゾームの機能的役割について破骨細胞ではまず骨吸収スの頻度が高まることなく，アパタイトにクラスリン被覆が考えられるがそれ以外の細胞については血管内皮細胞によシートが残存していた．アパタイト表面と密着するクラスリる血管新生（angiogenesis），血管平滑筋細胞におけるアテローン被覆部ではアパタイト表面の分解が及ばず，その結果平滑ム性動脈硬化（atherosclerosis），がん細胞での組織浸潤・転面を呈したままの無傷のアパタイトが保存されていた移に関与することが解明されつつある 17）．破骨細胞では骨面（図 6b）．このことは吸収窩内でもクラスリン依存性エンドへの接着構造として注目されるようになったポドゾーム研究

サイトーシスによって分解された細胞外基質を細胞内に取りが端緒となり 18）Rous sarcoma virus（RSV）形質転換した線込むメカニズムが働いていないことを示している．また破骨維芽細胞 19），単球性白血病細胞，悪性リンパ腫における B細胞で観察されるようにクラスリン被覆シートの存在は細胞型リンパ球 20）に類似な接着構造インベドポディア（invadopo-骨格の関与しない基質面との接着機能が働いていることを示dia，浸潤突起）として区別され，細胞の遊走・転移に接着しており，同様な報告が培養上皮細胞における cell-to-matrix

構造が密接な関係があることが想定されるようになった 21）．

adhesion でなされている14）．クラスリン依存性エンドサイ

ポドゾームは接着構造としての機能のみならずそれらの膜トーシスに必須の AP-2 を欠如させてクラスリン被覆シートに MT 1 (membrane-type 1)-MMP や MMP-9 な ど の metallo-を形成させなくすると細胞運動が活発化するとの報告 15）もproteinase の局在が証明されるに至り，細胞外基質の分解にありクラスリン被覆シートの出現は基質間との接着の強固さもかかわることが判ってきた 22,23）．アクチンが豊富に局在すと結びついているといえる．少なくとも細胞内に取り込みる接着構造のうち破骨細胞をはじめ単球―マクロファージやピット形成が起こるポドゾーム領域にはクラスリン，ダイナ

樹状細胞由来の細胞に見出されるものをポドゾームと，蛋白ミン，アクチン，ARP2/3 の局在が示されているが，クラス分解性活性を有する浸潤性がん細胞やがん遺伝子で形質転換リン被覆シートが出現する領域にはそれらの裏づけが欠けてした細胞を基質上で増殖させたときに細胞外基質に突出したいる．これらのクラスリン被覆シートは破骨細胞に特異的にポドゾームに類似した構造をインベドポディアと呼び区別さ出現するわけでも無く他の細胞でも報告されている

16）．しかれる．当初，RSV 形質転換線維芽細胞で見られた接着構造し破骨細胞はもとより一般的にクラスリン被覆ピット・小胞をポドゾームと見なしたが今となってはインベドポディアとを作らないシートの機能的役割については解明すべき点が数すべきであったかもしれない．しかしポドゾームがインベド多く残されている．

ポディアの前駆体であるのかどうかはまだ明確ではなく，ポドゾームとインベドポディアは構造・機能上も共通性も多く2 つを明確に区別することは困難な状況となっている．元来，

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顕微鏡 Vol. 47, No. 1（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

細胞はこの 2 つの類似したポドゾーム／インベドポディア両方を形成する能力が備わっており，周囲の環境からのシグナ謝ル伝達の違いによってどちらを形成するのか作り分けている

本稿で紹介した研究の一部は平成 23 年度日本学術振興会科のかもしれない．ガラス面上で培養した破骨細胞のポドゾー学研究費補助金（基盤研究 C（21592350））の助成下で行った．

ムと，アパタイトなどの石灰化基質上で培養したときに出現文してくるシーリングゾーンとの互換性がこのことを示唆している．
破骨細胞が血液幹細胞に由来する前駆破骨細胞として血管から脱け出て組織中を移動し骨表面に到達するまでの経路をたどり，成熟破骨細胞となって骨の分解・吸収に携わる過程とがん細胞の組織浸潤・転移の間で起こる cell-to-matrix の相互作用に共通性を見出すことができる．別の側面からがんの増殖は血管新生に依存することから血管内皮細胞に形成されるポドゾームを抗体療法のターゲットとしてピンポイントで働かなくして，内皮細胞の遊走能を喪失させ血管新生を妨げることが in vitro で明らかにされている 24）．また逆に，X染 色 体 連 鎖 性 劣 性 原 発 性 免 疫 不 全 症 と 知 ら れ る WiskottAldrich 症候群（WAS）は WAS 遺伝子の突然変異で，その結果コードされる WAS 蛋白によってマクロファージや樹状細胞のポドゾーム形成が障害されることに原因がある 25）．事実
マクロファージや破骨細胞のポドゾームにも局在が証明されており，細胞が持つポドゾームの役割には功罪両面を併せもっている．
5. おわりに破骨細胞の接着側細胞膜の裏打ち構造を unroofing 法によって超微構造レベルで空間構造解析することが可能となった．アクチン細胞骨格を主体とするポドゾーム構造と膜の裏打ち構造との関連を明らかにすることができた．また膜面にはクラスリン被覆領域がピット形成するものとシート状に残るものが出現した．クラスリンピット・小胞の存在はすべての真核細胞に備わったクラスリン依存性エンドサイトーシスのプロセスで細胞外からの物質の取り込み，細胞表面の受容体の取り込みによるダウンレギュレーションなどさまざまな細胞機能の発現の場となっている．しかし接着側膜面に出現する “frustrated endocytosis” 状態にあるクラスリン被覆シー
トが何らかの形で細胞接着にかかわり細胞運動を妨げる働きが考えられるが，その正確な機能と回収メカニズムについては不明である．
単に生理学的現象としての骨のリモデリングにおける破骨細胞に出現するポドゾーム／インベドポディアがもつ接着，基質分解能メカニズム解明のための研究が予想を越えた拡がりで展開されてきた．さらにそれらが持つ cell-type-specificvariation によって新たなカテゴリーの拡大が予想される．細胞と細胞外マトリックスとの生物学的現象の理解は生理的側面のみならず病理的側面も併せ持ち，ポドゾーム／インベドポディアをモデルにアクチン細胞骨格のダイナミズムを解き辞献1）Berrier, A.L. and Yamada, K.M.: J. Cell Physiol., 213, 565–573(2007)
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明かす一手段として高い空間・時間分解能を持つ顕微鏡的手法で更なる解析を目指したい．
講座

細胞膜剥離法で明らかになる培養破骨細胞の接着側細胞膜面の裏打ち構造

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