愛媛大学附属高等学校
森本日向，田中千遥（顧問：松本浩司）

日本農芸化学会

酢屋で継代培養されてきた酢酸菌の遺伝子比較

本 研 究 は， 日 本 農 芸 化 学 会 2019 年 度 大 会（開 催 地： 東 京 農業 大 学） の「ジ ュ ニ ア 農 芸 化 学 会」 で 発 表 さ れ た も の で ある．発表者らは，全国で伝統的な静置発酵によるお酢づくり●を 続 け て い る 23 の 企 業 か ら 酢 酸 菌 を 含 む 発 酵 液 サ ン プ ル の提 供 を う け， そ の 菌 叢 解 析， 酢 酸 菌 の 単 離， 同 定 を 行 っ た．
ま た， 最 も 多 く の サ ン プ ル 中 に 確 認 さ れ た 酢 酸 菌を対象に，系統解析を行った．

が行われ，かつ，系統解析でそれを証明できるとすれ
ば，江戸時代から続く静置発酵による酢づくりの文化がどの様に全国に伝播していったのかまで解明できるかもしれない．
【方法】
1.

酢酸菌の収集と 16S rDNA PCR-DGGE 解析

化学と生物

伝統的な静置発酵でお酢を作り続けている全国の 45
本研究の目的，方法および結果【目的】

企業に対し，種酢の提供を依頼した．協力していただけ
る場合は企業を訪問し，50 mL の種酢をサンプリング
し，発泡スチロール箱に保冷剤とともに入れて学校に酸味を感じる調味料の代表である酢は，人類最古の調(1)もって帰るか，郵送した．もち帰ったサンプルは，近隣味料とされる ．造酢技術の一つである伝統的な静置発の企業の発酵液を真似た再現液体培地 (2)（市販の醸造酢酵は，江戸時代後期に確立されて現在まで続いている．

10％＋市販の日本酒 30％＋水 60％）に対してサンプル

静置発酵では，酢酸発酵が終了した発酵液の一部を種酢が 10％容量となるようになるように植え継ぎ，30 C のとして残し，そこに新しいお酒などのアルコールを投入恒温器の中で微生物の培養を行った．その後，各サンプして，発酵が終了するまで静置する．このようにして，ルを植え継いだ各再現培地内の菌叢を調べるため，16S

各企業は自社の酢酸菌を絶やさぬよう大切に培養し続け

rDNA PCR-DGGE 解析 (3)（変性剤濃度勾配ゲル電気泳てきた．これまでの私たちのアンケート調査の結果か動法．60 C，電圧 80V, 15 時間）を行った．

ら，地震や戦災，猛暑などによって酢酸菌を全滅させた

2.

酢酸菌の単離と同定経験をもつ企業があることがわかっている（未発表）．

培養液から菌体を単離するため，1. の再現液体培地でこうした際や，そもそもの創業時には，近隣の同業他培養後の培地を，再現平板培地（再現液体培地に寒天社，あるいは県を超えて，種酢を譲り受けた記録をもつ1.5％と乾燥酵母エキス 0.3％を加えて滅菌後，シャーレ企業もあった．しかしほとんどの企業では，創業時の記で固化したもの）に白金耳でストリークし，数日間培養録や，災害復興時の種酢の授受の記録は残っていなかっした．こうして得られたシングルコロニー（以下 AiTVた．

株）のうち，遺伝的に同じ株を排除するため rep-PCR

そこで私たちは，酢酸菌の DNA 塩基配列を解読し，

DNA フィンガープリンティング法 (4) による比較解析をその系統解析を行うことにした．これによって，各企業行い，得られたバンドパターンが同一の株を排除した．の酢酸菌がどの企業から受け渡されたのかを明らかにでこのようにして得られた AiTV 株だけを対象に，16Sきないかと考えたからである．創業時に必ず種酢の授受

rDNA 領 域 を PCR 法 で 増 幅 し， そ の 産 物 を 精 製 後，

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化学と生物●

図 1 ■ 酢屋の発酵液の 16S rDNA PCR-DGGE 解析結果一つのバンドが一つの株を示している．遺伝子内の GC 含有が高い株ほど長い距離を移動するためバンドが下方に現れ，GC 含有が低い株ほど，短い距離しか移動しないため上方に現れる．ゲルごとのバンド比較のために，DGGE maker（M; ニッポンジーン製 DGGE Maker II,10 fragments）とともに泳動した．四角で囲んだ 4 つの企業の菌叢は，非常によく似ている．

DNA シーケンス解析サービスに依頼して塩基配列を決Joining 法）で解析し系統樹を描いた．なお解析サンプ定した．その結果を BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.

ルについては，企業の譲渡（提供）サンプルから単離しgov/Blast.cgi）で検索し，種を同定した．

た株だけではなく，ゲノム情報が公開されている 3 株

3.

ADH による系統解析（SKU1108, NBRC3283, NBRC3191）も含めて行った．

2. で単離・同定できた菌のうち，最も多くの企業に存在していた酢酸菌 1 種を選んだ．その種の全塩基配列を【結果と考察】1.

酢酸菌の収集と DGGE 解析

解析する予算はないため，特定の遺伝子領域だけを比較

福島県，千葉県，中部地方，石川県，福井県，三重することにした．一般に酢酸菌は易変異性が報告されて県，和歌山県，兵庫県，岡山県，広島県，山口県，香川

おり，実験室での 10 回程度の植え継ぎによって高温へ

県，愛媛県，徳島県，高知県，福岡県，佐賀県，長野県(5, 6)．そのたにある合計 23 の企業からサンプルを提供していただけ

め，解析対象とする遺伝子領域は，適度に共通性を保った．16S rDNA PCR-DGGE 解析の結果，発酵液中にはた領域でなければならない．私たちは，以下の理由から

さ ま ざ ま な 菌 が み ら れ た が（図 1），の適応能力が現れることが報告されている属やアルコール脱水素酵素（ADH）解析をすることにした．

属といった酢酸菌のほか，乳酸菌も酢酸菌の ADH の一部を用いた系統解析結果において，多く存在していた．ほとんどのサンプルで，複数の酢酸

16S rDNA 配列に基づいた系統分析と高い類似性が見ら菌が確認された．また各サンプル間で菌叢は異なっていれるという報告がある (7)．ADH はエタノールから酢酸たが，似ているバンドのパターンも複数あった．しかしを生成する中心的な役割をもち，酢酸菌が自身の生命活

この結果から，地域における菌叢の特徴や，種酢の授受動のエネルギーを得るためにも重要な酵素である．まの歴史を判断することなどはできなかった．

た，食酢製造の工程で最も機能するこの酵素の遺伝領域

2.

酢酸菌の単離と同定が大きく損なわれると，企業はその変異株を仕込み桶ご提供されたすべての発酵液から単離した 81 株のうち，と排除する．したがって，ADH は保存性が高いと考え同定を試みた結果，74 株の酢酸菌を同定することがでられる．

きた．16S rDNA 配列から酢酸菌と同定されたもののう得られた塩基配列の情報は，近隣結合法（Neighbor‒

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ち，属が 44 株と最も多く，そのうちの 35 株713

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図 2 ■ ADH 遺伝子領域の分子系統樹
AiTV からはじまる株が，本研究で単離した株．現在，解析対象の株数を増やしている．同じ企業でも原料が異なれば系統的に近くなく，地理的に離れた企業同士でも，原料が同じであれば系統が近かった．8 年前に発酵液の提供を受けた記録のある企業の株は，提供元の企業の 2 株のどちらとも近くなかった．

はで あ っ た． ま た

化学と生物

属 が 15 株，属 が 12 株，属が 2 株，属が 1 株であった．

いう 2 つのグループに大別されると考えられた．この解釈が本当に正しいのか，なぜ ADH が原料の影響を強く受けるのかについては，今後さらなる研究が必要である

これらのことから，酢屋の発酵液中ではが，少なくとも同じ種酢を由来とする企業をグループ分とが優占していると考えられた．

けしたり，お酢づくりのルーツを探ったりする研究対象

3.

酢酸菌の単離と同定としては，ADH は適していないと考えられた．現在はを対象に，ADH 全

野外の酢酸菌を集め，その ADH を調べること，また，）を解析し，系統解析を行った結果がADH 以外の領域を対象として比較することを目的に，最も多く得られた塩基配列（

図 2 である．解析結果の中でも注目したのは，アンケー研究を進めている．

ト調査によって，8 年前に福岡県の企業から長崎県の企【まとめ】業へ種酢が渡されたことがわかっているサンプル同士の伝統的な静置発酵によってお酢を生産する企業の種酢関係であった．これらは遺伝的に同一，もしくは極めての菌叢は企業ごとに異なっており，多くの企業では近い株としてグループ分けされると考えていたが，予想が，次いで属の酢酸に反して系統は近くなかった（図 2）．また，距離的に菌 が 優 占 し て い る こ と が わ か っ た． ま た，酢 酸 菌 の近い企業は系統も近くなるのではないか，そして同じ企

ADH 遺伝子の突然変異は，原料の影響を受けているか業から単離されたであれば，遺伝的にもしれないことが示唆された．過去の種酢の受け渡し記同一か，極めて近い株として分けられると予想していた録の分子生物学的証明や，同手法による日本のお酢づくが，どちらも予想とは異なっていた（図 2，福井県，福り手法の伝播経路の解明などは不可能と考えられた．

岡県の例など）．今回の解析結果では原料によって系統が分かれる傾向があり（図 2），米酢や純米酢といった商品名で販売されている日本酒（醸造用アルコール使用

本研究の意義と展望を含む）を原料に含む，アルコール濃度が高い中で生育何となく酢酸菌を題材として始まった先輩の研究と，している系統と，ブドウ酢やビールなどのアルコールに

1 軒のお酢屋さん (2) との出会いがきっかけで，研究仲間加えて比較的糖分の多い原料の中で生育している系統とと解明したい研究テーマが増えました．日本全国のお酢

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屋さんに連絡をとり，気がつけば，貴重で多様な酢酸菌を保有するに至ると同時に，江戸時代から続く醸造文化を守りたいという活動にまで発展しています．酢酸菌を対象として研究するために大学に進学した先輩たち，地域のお酢屋さんをテーマとした地域振興を目的に大学進学した先輩とともに，今後も研究を進めていく予定です．
謝辞：本研究に協力していただいた日本全国 23 の酢蔵の皆様，終始ご指導ご助言をいただきました愛媛大学大学院農学研究科生命機能学専攻応用生命化学コース発酵化学教育分野の阿野嘉孝先生をはじめとする研究室の方々に，この場を借りて深く御礼申し上げます．この研究は，2018年度武田科学振興財団研究助成を受けて行われました．

リーズ 酢の機能と科学 ，朝倉書店，2012.
2) 實好琴葉，小山絵凪：化学と生物，56, 59（2018）．
3) L. De Vero & P. Giudici:, 125, 96(2008).
4) A. E. Yetiman & Z. Kesmen:, 204,9 (2015).
5) Y. Azuma, A. Hosoyama, M. Matsutani, N. Furuya, H.
Horikawa, T. Harada, H. Hirakawa, S. Kuhara, K. Matsushita, N. Fujita:, 37, 5768 (2009).
6) M. Matsutani, M. Nishikura, N. Saichana, T. Hatano, U.
Masud-Tippayasak, G. Theergool, T. Yakushi & K. Matsushita:, 65, 109 (2013).
7) J. Trcek:, 28, 735 (2005).
Copyright © 2019 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.57.712

1) 酢酸菌研究会（外内尚人代表編）： 食物と健康の科学シ

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文献

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