福岡県保健環境研究所年報第39号, 76－80, 2012

短報
患者及び浴場施設検体から複数血清群のLegionella pneumophila が分離された事例について
市原祥子・江藤良樹・濱﨑光宏・村上光一・竹中重幸・堀川和美・
荒牧明世＊1・前川純子＊2
浴槽内で溺水し、レジオネラ肺炎を発症した患者の喀痰 1 検体と、当該患者が利用した浴場施設検体 3 検体について、レジオネラ属菌の検査を実施した。その結果、喀痰からは血清群（以下、SG）
1 と 6 が、浴場施設検体からは SG 1、3、5、6 及び型別不能の Legionella pneumophila が分離された。また、浴場施設検体中のレジオネラ属菌数は、3,900 － 13,800 CFU/100 mL であった。さらに、
パルスフィールドゲル電気泳動による分子疫学的解析の結果、患者由来株と浴場施設由来株の遺伝子型は、各血清群で一致した。また、sequence-based typing でも、血清群 1 では sequence type（ST）
1212、血清群 6 では ST 537 を示し、両由来株は互いに一致した。これらの結果から、患者由来株と浴場施設由来株は、同一菌株あるいは相互に関係する菌株である可能性が高いと考えられた。本事例は、浴場施設検体のみならず、患者からも複数の血清群が分離された珍しい事例であった。
［キーワード：浴場施設、Legionella pneumophila、血清群 1、血清群 6、
パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）、sequence-based typing（SBT）］である。今回、我々は浴槽内で溺水後にレジオネラ症を発症

１ はじめにレジオネラ症において、臨床検体から分離されたレジオネした患者と、当該患者が利用した浴場施設検体から、関連性ラ属菌は、Legionella pneumophila （以下、L. pneumophila）が疑われた複数血清群の L. pneumophila が分離された事例

が 9 割以上を占め、そのうちの 8 割が血清群（以下、SG）を経験したので、その概要を報告する。

1)

1 であるとされる 。
レジオネラ属菌は本来土壌など自然界に存在する細菌で２ 事件の経緯あるが、循環浴槽水や空調設備の冷却塔などに入ると、そこ当該患者は、72 歳、男性、糖尿病の治療中であった。平

でアメーバを宿主として増殖する。そのため、レジオネラ症

成 24 年 2 月、循環式の A 浴場施設大浴場利用中に、浴の感染源の一つとして、浴場施設が指摘されており、厚生労槽の中で溺れた状態で発見され、医療機関へ搬送された。入働省により、公衆浴場における衛生管理要領や、循環式浴槽

院 5 日目に尿中抗原が検出されたため、同日、医療機関かにおけるレジオネラ症防止対策マニュアル等が示されていら所轄保健福祉環境事務所へレジオネラ症（肺炎型）の患者

2),3)るところであるとして届出があり、当該患者が利用した A 浴場施設検体の。

レジオネラ症は、患者尿中に排泄される可溶性抗原（以下、レジオネラ属菌検査を実施することとなった。

尿中抗原）の検出による診断で届出が可能であるが、感染源を解明するためには、尿中抗原陽性の診断にとどまらず、患３ 検体と方法者検体から菌を分離し、患者周辺の環境から分離された菌株

３・１ 検体との関連性を確認することが重要である。しかし、検体採取

患者検体は、医療機関にて喀痰 1 検体が採取された。まが困難などの理由で臨床検体からの菌分離は稀なのが現状た、浴場施設検体は、A 浴場施設から 3 検体を採取した（検体番号 1：患者が利用した大浴場の湯、2：ろ過器に入る直福岡県保健環境研究所 （〒818-0135 太宰府市大字向佐野 39）*1 福岡県保健医療介護部保健衛生課（〒812-8577 福岡市博多区東公園 7-7）
*2 国立感染症研究所細菌第一部（〒162-8640 東京都新宿区戸山 1-23-1）

前の湯、3：ヘアキャッチャーのたまり湯）。
３・２－76－

浴場施設検体の検査法

浴場施設検体は、pH を測定し、それぞれ 500 mL を 0.2μm 径ポリカーボネート製滅菌メンブランフィルター（アド渣を GVPC 培地又は BCYEα 培地接種するグループ（それバンテック）を用いて濃縮した。このメンブランフィルター

ぞれ C-2、D-2）に分け、シングルコロニーを形成するようを 50 mL 遠心チューブに移し、5 mLの滅菌精製水を加えてに塗抹した。培養条件及び分離菌株の性状検査は、浴場施設激しく混和した（以下、濃縮検体）。濃縮検体及び非濃縮検検体と同様に実施した。

体に、塩酸‐塩化カリウム混合溶液（pH 2.2）を等量加え、雑菌処理後に 100 μL を 2 枚のレジオネラ GVPC 選択寒３・４天培地（以下、GVPC 培地）（Oxoid）に接種し、37±1ºC、解析

パルスフィールドゲル電気泳動による分子疫学的湿潤下で 7 日目まで培養した。なお、濃縮検体を滅菌精製

患者喀痰 1 検体及び浴場施設検体 3 検体から分離され水で 1000 倍まで 10 倍段階希釈したものについても、同様

た L. pneumophila SG 1 及び SG 6（各 3 株）及び無関係に培養した。2 枚 の GVPC 培地に発育したレジオネラ属

事例患者由来 L. pneumophila SG 1（1 株）について、パル菌を疑う集落数を合計し、検体原液 100 mL 中の推定レジスフィールドゲル電気泳動（以下、PFGE）による分子疫学オネラ属菌数を算出した。GVPC 培地上に発育した集落に的解析を実施した。PFGE の方法は、レジオネラ属菌のパ4)

光をあて実体顕微鏡で観察する方法 により、レジオネラ属

ルスフィールドゲル電気泳動法

菌を疑う集落を釣菌し、レジオネラ BCYEα 寒天培地（以ュアルに従い実施した（使用した制限酵素はSfiI、泳動条件

下、BCYEα 培地）及び羊血液寒天培地に接種し、システイは 200 V、5－50秒、14ºC、21時間）。

九州ブロック統一マニン要求性を確認した。BCYEα 培地にのみ発育した集落について、スライド凝集反応（デンカ生研）及びラテックス凝集

３・５

Sequence-based typing による分子疫学的解析

反応（Oxoid）による血清型別試験及びグラム染色を実施しPFGEを実施した喀痰由来株 2 株（SG1：1 株、SG6：1た。また、polymerase chain reaction（PCR）法により、genus株）及び浴場施設検体由来株 7 株（検体番号 1 は SG1：1

Legionella 16S rRNA gene （ LEG ） 及 び L. pneumophila

株、SG6：1 株、検体番号 2 は SG1：1 株、SG6：2 株、macrophage infectivity potentiator gene（mip）の探索を行った

検体 番号 3 は SG1 ：1 株、SG6 ：1 株）について、

5)。さらに、血清型別不能であった株は、DDH レジオネラ‘極sequence-based typing（以下、SBT）による分子疫学的解析を東’（極東製薬工業）を用いて、取扱説明書に従い DNA-DNA

国 立 感 染 症 研 究 所 に お い て 実 施 し た 。 SBT は 、 The

ハイブリダイゼーションを実施した。

European Working Group for Legionella Infections（EWGLI;
http://www.ewgli.org/）の方法（Sequence-Based Typing (SBT)

３・３

protocol for epidemiological typing of Legionella pneumophila

患者検体の検査方法

患者喀痰は、安全キャビネット内で喀痰溶解試薬（スプタVersion 3.1）に従って、flaA、pilE、asd、mip、mompS、proA

ザイム、極東製薬工業）により溶解処理した（以下、溶解処

及び neuA 遺伝子の一部の領域の塩基配列に基づく型別理液）。図 1 に患者検体の検査の流れを示す。溶解処理液を行い、遺伝子型を決定した。

は、そのまま GVPC 培地又は BCYEα 培地に接種するグループ（それぞれ A-1、B-1）、溶解処理液を 3000 rpm、20 分４

遠心後に沈渣を GVPC 培地又は BCYEα 培地に接種する

４・１

結果
浴場施設検体の理化学性状及び培養検査結果

グループ（それぞれ A-2、B-2）、溶解処理液を塩酸 - 塩化

浴場施設検体の残留塩素濃度は、いずれも 0.05 mg/L 未カリウム混合溶液（pH 2.2）で 5 分酸処理後に GVPC 培地

満で、厚生労働省健康局長通知2)で定められている遊離残留又は BCYEα 培地接種するグループ（それぞれ C-1、D-1）、塩素濃度の基準（0.2 ないし 0.4 mg/L 程度を保ち、かつ最溶解処理液を 5 分酸処理後に 3000 rpm、20 分遠心し、沈大 1.0 mg/L を超えないよう努めること）を満たしていなか

喀痰溶解処理液
未処理液
未処理液

グループ

酸処理液
遠心沈渣GVPC BCYEα GVPC BCYEαA-1
B-1A-2B-2
図1

未処理液

GVPC BCYEα GVPC BCYEα
C-1
D-1
C-2
D-2

患者検体の検査の流れ－77－遠心沈渣表1
検体番号

浴場施設検体の培養検査結果

検体名

レジオネラ属菌数（CFU／100mL）

分離された
Legionella pneumophila の血清群

1

大浴場の湯3,900

血清群1、3、6

2

ろ過器に入る直前の湯5,700

血清群1、3、5、6、型別不能 ＊1

3

ヘアキャッチャーのたまり湯

13,800

血清群1、6、型別不能 ＊1*1 DNA-DNAハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 結 果 か ら 、 L. pneumophila で あ る と 判 定 し た 。

った。pH はそれぞれ 8.25、8.06 及び 7.69 であった。表 1５考察に培養検査の結果を示す。GVPC 培地上に発育したレジオレジオネラ肺炎を発症した患者の喀痰と、患者が利用したネラ属菌数は、3,900 － 13,800 CFU/100 mL であり、厚生労浴場施設の浴槽水等について調査した結果、喀痰及び浴場施働省健康局長通知2)で定められている菌数（10 CFU/100 mL

設検体から SG 1 や 6 など複数の血清群の L. pneumophila未満）を超えていた。各種性状検査の結果、分離菌株はいずが分離され、PFGE 及び SBT による分子疫学的解析により、れも L. pneumophila であった。血清群（SG）は、1、3、5、それらは同一菌株あるいは相互に関係する菌株である可能

6 及び型別不能であったが、このうち、SG 1 及び 6 の L.

性があることが確認された。
1人の患者から複数の血清群の L. pneumophila が分離さ

pneumophila は全検体から分離された。

れた例は少なく、2011年度にレジオネラレファレンスセンタ
４・２ーで収集された 38 名分の臨床分離株の中で、複数の血清群

患者喀痰のレジオネラ属菌検査結果

喀痰溶解処理液を、酸処理の有無、遠心の有無、使用培地が分離されたのは 2 名であった（本事例を含む）6）。他の 1の違いにより 8 群に分けて検査した結果、喀痰溶解処理液

名は浴場施設以外で溺水した患者で、血清群は SG 1、6、9 及をそのまま GVPC 培地に接種した群（A-1）と喀痰溶解処び型別不能であった。また、複数血清群ではないが、溺水歴理液を酸処理したものを GVPC 培地に接種した群（C-1）のある他の患者 1 名からは、異なる ST の SG 1 が分離さでレジオネラ属菌の発育を認め、L. pneumophila SG 1 及び 6れた。このように、溺水事例ではエアロゾルによる感染事例が分離された。

よりも複数の血清群あるいは同じ血清群でも複数の ST のL. pneumophila に感染する可能性があると考えられる。

４・３

今回の調査では、SG 6 の 1 株が PFGE では他の株と異パルスフィールドゲル電気泳動による分子疫学的解析結果なる泳動パターンを示したが、SBT による解析では他の株

患者喀痰 1 検体と浴場施設検体 3 検体から分離されたと同一の ST 537 を示した。Amemura-Maekawa ら7) は、疫

L. pneumophila SG 1（各検体 3 株の計 12 株）及び SG 6（各学的に無関係の分離株について PFGE と SBT を実施した検体 3 株の計 12 株）について、PFGE を実施した（図 2）。

結果、PFGE で異なるパターンを示した株が SBT では同じ

その結果、SG 1 については、全検体同一の泳動パターンをST を示したことから、SBT は PFGE に比べ discriminatory示し、SG 6 については、検体番号 2 の 1 株（図2、Lane 25）

power が低いと報告しており、本事例における PFGE とを除き、全て同一の泳動パターンを示した。

SBT のパターンの不一致はこれを支持する結果となった。

４・４

Sequence-based typing による分子疫学的解析結果

SG 6 は全て ST 537 であった。国内の臨床分離株によく見患者喀痰 1 検体と浴場施設検体 3 検体から分離されたられる ST は、ST 138、ST 23、ST 1 などである8）。ST 1212

L. pneumophila SG 1（各検体 1 株の計 4 株）及び SG 6（各は著者らが調べた範囲ではこれまで国内外の報告例はなく、また、本事例では SBT の結果、SG 1 は全て ST 1212、検体 1 株、ただし、検体番号 2 は PFGE パターンが異なST 537 も極めて少ないことから、本事例は稀なケースであった株も加えたため 2 株の計 5 株）について、SBT を実ることがわかった。浴場施設検体から、稀な ST 1212 と ST施した（表 2）。その結果、得られた sequence type（以下、537 が同時に検出された理由は定かではないが、ST などのST）は、SG 1 は全て ST 1212、SG 6 は全て ST 537 であっ遺伝子型は、生息環境を反映すると考えられることから、当た。

該浴場施設固有の L. pneumophila が生息していたことが示唆された。また、患者喀痰から ST 1212 と ST 537 が同時に検出された理由としては、患者が溺水により、これらの－78－

ST の L. pneumophila を含む浴槽水を誤嚥したためと考えける水質基準等に関する指針, 別添 2られた。

る 衛生等管理要領.

浴場施設の利用が原因と思われるレジオネラ症患者が発公衆浴場におけ3) 平成13年9月11日付 健衛発第95号 循環式浴槽におけるレジオネラ症防止対策マニュアルについて.

生しても、その患者の検体採取が困難なことから、浴場施設と患者の直接的な関連性を示したデータは少ない。そのため、

4）森本

本事例のような浴場施設の環境調査と、患者及び浴場施設検5）病原体検出マニュアル4類感染症, レジオネラ症（平成23年10月7日改訂）.

体由来の分離株に関する調査のデータは、患者発生防止のための浴場施設の衛生管理の重要性を示す上でも有用な知見

洋：環境感染誌, 25 (1), 8-14, 2010.

6）平成24年度衛生微生物技術協議会レファレンスセンタ
ー関連会議資料.

であると考えられる。

7） J. Amemura-Maekawa et al. : Microbiol. Immunol., 49 (12),1027-1033, 2005.

文献1)8）平成23年度生活衛生関係技術担当者研修会資料.

病原微生物検出情報：29, 332-333, 2008.

2) 平成15年2月14日付 健発第0214004号 公衆浴場における衛生管理要領等の改正について. 別添 1 公衆浴場におLane 123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

図2 患者及び浴場施設検体から分離された血清群 1 及び 6 の Legionella pneumophilaのパルスフィールドゲル電気泳動像
Lane 1, 8, 16, 23及び30：Salmonella Braenderup
Lane 2－4：患者由来株（SG1）
Lane 5－7：浴場施設検体1由来株（SG1）
Lane 9－11：浴場施設検体2由来株（SG1）
Lane 12－14：浴場施設検体3由来株（SG1）
Lane 15：無関係事例株（SG1）
Lane 17－19：患者由来株（SG6）
Lane 20－22：浴場施設検体1由来株（SG6）
Lane24－26：浴場施設検体2由来株（SG6）
Lane27－29：浴場施設検体3由来株（SG6）表2

患者及び浴場施設から分離された Legionella pneumophila の sequence-based typing

検体（図2 Lane番号）
（2）
患者由来株
浴場施設検体1由来株 （5）
浴場施設検体2由来株 （9）
浴場施設検体3由来株 （12）
（17）
患者由来株
浴場施設検体1由来株 （20）
浴場施設検体2由来株 （24）
浴場施設検体2由来株 （25）
浴場施設検体3由来株 （27）

血清群
1
1
1
1
66666－79－

遺伝子型
2,10,17,14,21,14,2,10,17,14,21,14,
2,10,17,14,21,14,
2,10,17,14,21,14,
3,13,1,28,12,9,3
3,13,1,28,12,9,3
3,13,1,28,12,9,3
3,13,1,28,12,9,3
3,13,1,28,12,9,3

ST No.
1212
1212
1212
1212
537
537
537
537
537

Multiple serogroups of Legionella pneumophila isolated from a patient and a public bath
Sachiko ICHIHARA, Yoshiki ETOH, Mitsuhiro HAMASAKI, Koichi MURAKAMI, Shigeyuki TAKENAKA,Kazumi HORIKAWA, Akiyo ARAMAKI*1, and Junko AMEMURA-MAEKAWA*2Fukuoka Institute of Health and Environmetnal Sciences, Mukaizano 39, Dazaifu, Fukuoka 818-0135, Japan*1 Department of Public Health and Medical Affairs, Division of Public Health, Higashikouen 7-7,Hakata-ku, Fukuoka 812-8577, Japan*2 Department of Bacteriology, National Institute of Infectious Diseases, Toyama 1-23-1, Shinjyuku-ku, Tokyo 162-8640, JapanThe sputum of a patient that nearly drowned in a public bath and was subsequently diagnosed with Legionellosis, and three spa water
samples from the public bath were analyzed. Legionella pneumophila serogroup (SG) 1 and 6 were isolated from the patient and L.
pneumophila SG 1, 3, 5, 6 and untypable strains were isolated from the spa samples. The concentrations of Legionella spp. ranged
from 3,900 to 13,800 CFU/100 mL in the spa samples. Molecular epidemiological analyses of the isolates conducted using pulsed-field
gel electrophoresis (PFGE) and sequence-based typing (SBT) revealed that the types of isolates from the patient and the bath wereindistinguishable at the DNA level, indicating that the patient may have been infected with the pathogen at the bath facility. This is arare case in which multiple serogroups of L. pneumophila were isolated from both a public bath and a patient.
[Key words; public bath, Legionella pneumophila, serogroup 1, serogroup 6, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE),
sequence-based typing (SBT)]－80－