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機能性高分子を用いた酵素安定化システムの構築
猿田一

平＊・榊秀次郎Constructing of the enzyme stabilization system using functional polymers
Ippei SARUTA ＊ and Shujiro SAKAKI（平成24年12月 3 日受理）
Frozen enzyme at －20℃ can be used over one year. However, the enzyme activity solvedin the buﬀed solutions is no longer available in a day. The pullan which carried out chemical
modiﬁcation of the cholesteryl group forms CHP nanogel. When a mixture enzyme and CHP
nanogel was heated, complexation denatured enzyme and CHP nanogel was carried out.
When cyclodextrin is added to a complex, nanogel collapses and the enzyme will be native byrefolding. The purpose of this research is Constructing of the enzyme stabilization systemusing functional polymers. In order to form the HRP/CHP complex, the mixed solution of
0.09wt% CHP and 0.4μg/ml HRP was heated（95℃・1h）. This complex was preserved at room
temperature. To collapse nanogel, 20mM Methyl-β-CD was added to this complex after eachday, and HRP activity was measured. HRP activity maintained about 100％ for 15 days. Fromthese results, the enzyme stabilization system has been constructed using CHP nanogel.

1.

緒

言

抗体に酵素が化学修飾された酵素標識抗体は，免疫染色や ELISA などに広く用いられており，標識酵素としては，ペルオキシダーゼなどが知られている（表 1）1－2）。
表 1.

酵素標識抗体に用いられる酵素

酵素名

由来

入手性ペルオキシダーゼ

西洋ワサビ

〇

β-D ガラクトシダーゼ

大腸菌△

アルカリフォスファターゼ

ウシ小腸

×

西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（HRP），大腸
菌由来β-D- ガラクトシダーゼ，ウシ小腸由来アルカリフォスファターゼは，粉末・冷凍保存では 1 年以上安定で長期間の保存に耐えるが，溶液・室温保存では 1 日で酵素活性が失活する。
中 で も，HRP は 入 手 が 容 易 で あ り， 測 定 感 度が高いので広く用いられて，その安定化剤としては，ウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin,＊

環境システム工学専攻

秋田高専研究紀要第48号

BSA）が用いられるが，BSE（牛海綿状脳症）などの感染症が懸念され，医療分野では使用が控えられている。
一方，本研究で用いたコレステロール置換基プルラン（CHP）は，多糖であるプルランに糖100ユニッ
トに疎水性のコレステロール基を 1 ～ 4 個化学修飾した機能性高分子であり，溶液中で自己組織化し，直径20－30nm のナノゲル（CHP ナノゲル）を形成することが知られている（図 1）。

図 1.

CHP ナノゲルの構造

更 に， 熱 な ど に よ り 変 性 し た 変 性 タ ン パ ク 質（Denatured protein）は，CHP ナノゲルに内包され（complaxation），タンパク質 /CHP ナノゲル複合体（CHP nanogel protein complex）を形成する。複合化されたタンパク質は，ナノゲル内では機能，あるいは活性を失ってはいるものの，シクロデキストリ

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猿田一平・榊秀次郎

ン（CD）を添加することにより，CD がコレステロール基と結合し，ナノゲルが崩壊しタンパク質放出する（releasing）。その際に，タンパク質がリフォールディング（Refolding）し，その機能と活性が再生することが知られている（図 2）4－6）。

図 2.

2. 実 験
HRP の測定濃度の検討（1）0.1mg/mL HRP 溶液（10mM リン酸緩衝液，pH7.0）（ 以 下，10mM NaPB） を10mM NaPB で 希 釈
し0.005，0.001，0.02，0.025，0.05µg/mL HRP 溶液 を 調 製 し た。 各 HRP 溶 液 を10μL ず つ96ウ ェ ル
ポリスチレン製マイクロプレートに添加し，TMB
peroxidase Substrate（KPL 社 ） を100μL 添 加 し，室温で10分間反応させた。反応後，2N- 硫酸水溶液を100μL 添加し，酵素反応を停止させた。各ウェルの吸光度450nm をマイクロプレートレーダー（680MICROPLATE READER，BIO RAD 社 ） に て 測定し，結果を図 4 に示した。

CHP ナノゲルによるタンパク質のリフォールディング

そこで本研究では，CHP ナノゲルのタンパク質リフォールディング能に注目し，酵素を室温・溶液状態で安定化することを目的とした。
具体的には「2 液（2 ステップ）での安定化システム」として，タンパク質を熱変性させることにより CHP ナノゲルと複合化さて（図 3 ⊖①），タン
パク質 /CHP ナノゲル複合体の状態で長期保存し（図 3 ⊖②），必要時毎に CD を添加し（図 3 ⊖③），リフォールディングさせ，活性を安定的に維持させるシステムの構築を目指した（図 3）。

図 3.

図 4.

HRP 活性の濃度依存性

以上の結果より，以下の実験では，HRP の終農度を0.5μg/mL に決定した。
HRP/CHP ナノゲル複合体形成時の加熱条件の最適化
0.5μg/mL HRP 1000μL をブロックヒーターにて85，90，95℃で10，20，30，40，50，60分間加熱した。加熱終了後，「HRP の測定濃度の検討（1）」と同様に，TMB Peroxidase Substrate を用いて吸光度450nm を測定し，結果を図 5 に示した。

2 液での安定化システム

図 5.

HRP 活性の温度・加熱時間依存性
平成25年２月

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機能性高分子を用いた酵素安定化システムの構築

以上の結果より，以下の実験では，95℃・1h で熱体に 4，8，16，20mM の Methyl-β-CD あるいはヒド変性させることをした。
ロキシプロピル -β- シクロデキストリン（HP-β-CD）
CHP ナノゲル濃度の最適化（1）（東京化成工業株式会社）溶液（10mM NaPB）を0.1mg/mL HRP溶液（10mM NaPB）300μLと0.0009， 600μL をそれぞれ添加し，4℃・24h インキュベート
0.009，0.09，0.9wt% CHP ナノゲル溶液（10mM NaPB）
し，リフォールディングを行なった。インキュベー
300μL を混合させ，95℃・1h インキュベート HRP/ション後，10mM NaPB にて 8 倍希釈した。希釈後，CHP ナノゲル複合体を形成させた。各 HRP/CHP
TMB Peroxidase Substrate を用いて吸光度450nm
ナノゲル複合体に20mM Methyl-β-CD 東京化成工を測定した。CHP ナノゲル，各 CD 未添加の HRP業株式会社）溶液（10mM NaPB）を600μL 添加し，活性を100％とした時の比活性を図 7 に示した。
4℃・24h インキュベートし，リフォールディングを行なった。インキュベーション後，10mM NaPBにて 8 倍希釈した。希釈終了後，TMB peroxidase
Substrate を用いて吸光度450nm を測定した。CHP
ナノゲル及び CD 未添加（Native HRP）の HRP 活性を100％とした時の比活性を図 6 に示した。

図 7.

図 6.

残存 HRP 活性の CHP ナノゲル濃度依存

リフォールディング効率は CHP ナノゲル濃度が0.09wt%の時，58.6％となり最大効率となった。
以上の結果より，0.1mg/mL HRP に対して，HRP/CHP ナノゲル複合体形成に必要な CHP ナノゲル量（CHP ナノゲル濃度）は0.09wt%であることがわかった。
CD 濃度の最適化（1）シクロデキストリンの特徴を表 2 に示した。
表 2.

シクロデキストリンの特徴

種類

置換度（個／グルコース）

分子量Methyl-β-CD

1.7－1.9

1380－1500

HP-β-CD

0.6－0.91310

0.1mg/mL HRP 溶 液（10mM NaPB） と0.09wt%
CHP ナノゲル溶液（10mM NaPB）をそれぞれ300μL混合し，95℃・1h インキュベートし，HRP/CHP ナノゲル複合体を形成させた。HRP/CHP ナノゲル複合
秋田高専研究紀要第48号残存 HRP 活性の CD 濃度依存

Methyl-β-CD を用いた場合がいずれの濃度でも有為にリフォールディング効率が高かった。これはCD の化学修飾の置換度により，コレステロール基との親和性が異なるため，リフォールディング効率に差が見られたと考えられる。
以 上 の 結 果 よ り，0.1mg/mL HRP 溶 液（10mMNaPB），0.09wt% CHP ナノゲル溶液（10mM NaPB）に 対 し て，HRP/CHP ナ ノ ゲ ル 複 合 体 崩 壊 に は，20mM Methyl-β-CD 溶液（10mM NaPB）を用いることとした。
HRP の測定濃度の検討（2）基 質 と し て TMB を 用 い る と，CD を 添 加 し リフォールディングをさせた後に，更に希釈が必要となり，希釈時に更なるリフォールディングが起きていることが懸念される。そこで，より低感度な基質を用いて希釈操作を行わない実験系の確立を目指し，基質として ABTS を用いて測定に適した HRP濃度決定を行なった。
0.1mg/mL HRP 溶 液（10mM NaPB） を10mM
NaPB で 希 釈 し，0.02，0.025，0.033，0.05，0.1μg/mL
HRP 溶液（10mM NaPB）を調製し，各溶液を10μLずつポリスチレン製造マイクロプレートに添加し，― 62 ―
猿田一平・榊秀次郎

ABTS Peroxidase Substrate（KPL 社 ） を100μL入れ，室温で10分間反応させた。反応後，1.0wt%
SDS 水溶液100μL を入れ反応を停止させた。マイクロプレートレーダーにて，吸光度405nm を測定した。
実験結果を図 8 に示した。

図 8.

HRP 活性の濃度依存性

以上の結果より，以下の実験では，HRP の終農度を0.1μg/mL に決定した。
CHP ナノゲル濃度の最適化（2）0.4μg/mL HRP 溶 液（10mM NaPB）300μL と0.0009，0.009，0.09，0.9wt% CHP ナノゲル溶液（10mMNaPB）300μL を混合させ，95℃・1h インキュベートし複合体を形成させた。各 HRP/CHP ナノゲル複合体に20mM Methyl-β-CD 溶液（10mM NaPB）を600μL 添加し，4℃・24h インキュベートし，リフォールディングを行なった。リフォールディング後，
ABTS Peroxidase Substrate を用いて吸光度405nmを測定した。
CHP ナノゲル，CD 未添加の HRP 活性を100％とした時の比活性を図 9 に示した。

リフォールディング効率は CHP ナノゲル濃度が0.09wt%の時，42.1％となり最大効率となった。
以 上 の 結 果 よ り，0.4μg/mL HRP 溶 液（10mMNaPB）に対して，HRP/CHP ナノゲル複合体形成に必要な CHP ナノゲル量（CHP ナノゲル濃度）は0.09wt%であることがわかった。
尚，TMB と ABTS を比較すると，必要な CHP ナノゲル量（CHP ナノゲル濃度）は同一であったが，リフォールディング効率は，TMB が16.5％高く，希釈時に更なるリフォールディングが起きていたと思われる。
CD 濃度の最適化（2）0.4μg/mL HRP 溶 液（10mM NaPB） と0.09wt%
CHP ナノゲル溶液（10mM NaPB）をそれぞれ300μL混合し，95℃・1h インキュベートし，HRP/CHP ナノゲル複合体を形成させた。HRP/CHP ナノゲル複合体に4，8，16，20mM の Methyl-β-CD 溶液（10mMNaPB）あるいは HP-β-CD 溶液（10mM NaPB）を600μL をそれぞれ添加し，4℃・24h インキュベートし，リフォールディングを行なった。リフォールディ
ング後，ABTS Peroxidase Substrate を用いて吸光度405nm を測定した。
CHP ナノゲル，各 CD 未添加の HRP 活性を100％とした時の比活性を図10に示した。

図10.

CD の最適化

以 上 の 結 果 よ り，0.4μg/mL HRP 溶 液（10mMNaPB），0.09wt% CHP ナノゲル溶液（10mM NaPB）に 対 し て，HRP/CHP ナ ノ ゲ ル 複 合 体 崩 壊 に は，20mM Methyl-β-CD 溶液（10mM NaPB）を用いることとした。

図 9.

HRP リフォールディングの CHP 濃度依存性

2 液（2 ステップ）安定化システム構築（4℃）
0.4μg/mL HRP 溶 液（10mM NaPB），0.09wt%
平成25年２月

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機能性高分子を用いた酵素安定化システムの構築

CHP ナノゲル溶液（10mM NaPB），20mM Methylβ-CD 溶液（10mM NaPB）を用い，本研究の目的である 2 液（2 ステップ）HRP の安定化システム構築（4℃保存）を試みた。
具 体 的 に は，HRP を 熱 変 性 さ せ る こ と に よ り
CHP ナノゲルと複合化さて，HRP/CHP ナノゲル複合体の状態で長期保存し，必要時毎に CD を添加し，リフォールディングさせ，活性を安定的に維持させるシステムの構築を目指した（図11）。

図11.

2 液（2 ステップ）安定化システム

0.4μg/mL HRP 溶 液（10mM NaPB）300μL，0.09wt% CHP ナノゲル溶液（10mM NaPB）300μLを混合させ，95℃・1h インキュベートし，HRP/CHPナノゲル複合体を形成させた。HRP/CHP ナノゲル複合体を 4℃で15日間保存し，各日後（0，1，2，5，8，9，13，14，15日後）20mM Methyl-β-CD 溶液（10mMNaPB）を600μL 添加して HRP のリフォールディングを行なった。リフォールディング終了後，各溶液を10μL ずつポリスチレン製造マイクロプレートに添加し，ABTS Peroxidase Substrate を100μL 入れ，室温で10分間反応させた。反応後，1.0wt% SDS 水溶液100μL を入れ反応を停止させた。マイクロプ
レートレーダーにて，吸光度405nm を測定した。

0 日目の酵素活性を100％としたときの比活性を
図12に示した。
CHP，CD 未添加（HRP only）の残存 HRP 活性は，1 日後に10％未満となった。一方，CHP，CD 添加（HRP/CHP/CD）では，15日後でも100.2％の酵素活性を維持した。以上より，4℃における 2 液での酵素安定化システムが構築出来た。
2 液（2 ステップ）の安定化システム構築（25℃）
4℃における 2 液（2 ステップ）での安定化システムの構築が出来たので，保存温度を25℃に変えて同様の検討を行なった。
0.4μg/mL HRP 溶 液（10mM NaPB）300μL，0.09wt% CHP ナノゲル溶液（10mM NaPB）300μLを混合させ，95℃・1h インキュベートし，HRP/CHPナノゲル複合体を形成させた。HRP/CHP ナノゲル複合体を25℃で15日間保存し，各日後（0，1，2，5，8，9，13，14，15日後）20mM Methyl-β-CD 溶液（10mMNaPB）を600μL 添加して HRP のリフォールディングを行なった。リフォールディング終了後，各溶液を10μL ずつポリスチレン製造マイクロプレートに添加し，ABTS Peroxidase Substrate を100μL 入れ，室温で10分間反応させた。反応後，1.0wt% SDS 水溶液100μL を入れ反応を停止させた。マイクロプレートレーダーにて吸光度405nm を測定した。
0 日目の酵素活性を100％としたときの比活性を
図13に示した。

図13.

図12.

2液での安定化システム（4℃）

秋田高専研究紀要第48号

2 液での安定化システム（25℃）

保存温度を25℃にしても，4℃同様に CHP，CD未添加（HRP only）の残存 HRP 活性は，1 日後に10％未満となった。一方，CHP，CD 添加（HRP/CHP/CD）では，15日後でも約101.7％の酵素活性を維持した。以上より，25℃における 2 液での酵素安定化システムが構築出来た。

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猿田一平・榊秀次郎

3.

参考文献

1．石川榮治（著），生化学実験法27 酵素標識法，学会出版センター，1991
2．石川榮治，河合 忠，宮井 潔（編），酵素免疫測定法（第 3 版），医学書院，1987
3．N. Karuppiah, C. Hedgepeth and D. I Wang : J.

boil. Chem., 211, 60
4．K. Akiyoshi, E-C. kang, S. Kurumada, J. Sunamoto,T. Principi and F. M. Winnik : Macromolecules,33, 3244（2000）
5．K. Akiyoshi, A. Ueminami，S. Kurumada, and
Y. Nomura : Macromolecules, 33, 6752（2000）

平成25年２月