熱帯病の地球規模制御戦略
シンポジウム 1『熱帯病制圧にむけた製品開発』
シンポジウム 2『スマトラ沖地震津波による感染症流行対策支援−熱帯医学は何をすべきか・何ができるか−』

第 29 回日本熱帯医学会九州支部大会（2005 年 1 月 21-22 日：長崎）
記録集

長崎大学熱帯医学研究所・疾病生態分野
2007 年発行

●シンポジウム 1『熱帯病制圧にむけた製品開発』

1. Juntra Karbwang：
What is Product Development and why it is important for TDK?
2. 森田公一：
West Nile fever vaccines
3. 坪井敬文：
Malaria transmission-blocking vaccine development:Post-genome approach
4. 平山謙二
Vaccine and Diagnostic tool development for Schistosomiasis control
5. 大原直也
ＢＣＧの抗原性蛋白質と新規結核ワクチンの開発

1. WHO/TDR における医薬品研究開発
Juntra Karbwang
Clinical Coordinator, WHO/TDR, Geneva, Switzerland

J Karbwang MD, PhD
Clinical Coordinator,
WHO/TDR

Activities within R&D at TDR
Research

WHO/TDR 自体はもともと１９７５年に２つの課題を掲げて誕生した。
１．熱帯病の制圧対策に資する新しいあるいは改良された道具を開発する研究を行う。
２．熱帯病の流行地の国々の研究開発能力を強化する。

PreDevelopment

PreClinical

Discoveryz Established in 1975 with 2 objectives:z to undertake R&D of new and improved tools

for the control of major groups of tropicaldiseasesz to strengthen research capabilities in countries
where these diseases are endemic

Development

Planning Activities
Decision points

Unicef/UNDP/World
Unicef/UNDP/World Bank/WHO Special Programme for
Research and Training in Tropical Diseases (TDR)

ClinicalPortfolio Review by R&D Committee

Phase IVREGISTRATION

Product R&D in TDR

製品開発研究の流れ図を示すと図に示すようになる。発見のフェーズから開発フェーズに移る時にかなり厳しい運営委員会が開催され、臨床前期から臨床研究に入るが、この時点ではかなり絞り込まれた
プロジェクトだけが進行してゆく。黒いダイヤの決断の時にも注目。

新薬の開発についてその流れ図を示した。基礎研
究を元に標的となる分子を決めたり、病気と関連する遺伝子の情報から標的となる代謝経路などを絞り込んでゆく。次にいろいろな手法を用いて化学的なデザインや合成経路、生体材料などを発見し治療モデルなどで確かめる。開発のフェーズではまず毒性検査を行いその後臨床治験の４つの相へと入ってゆく。

Find a gene orprotein linked
to a disease

Development of A Drugz Drug development (drug R&D) divides into two parts:z Researchz Developmentz It can be regarded as a bridge between academia and theclinic:z Research is based mostly on work carried out inacademia and published in the scientific literaturez Development aims to satisfy National Drug Regulatory
Authorities that the new product is safe and effective
z Traditionally, it is carried out by the (for profit)
pharmaceutical industry

薬品発見研究は学術機関でなされ、高度に創造的で革新的であり、その成果は薬品の候補物質であり特許を伴うようなものとなるか、あるいはその方法が成功しないことが明らかになるかである。良い発見研究とは上記のいずれかの結果が最短時間でまた最低のコストでできることである。

Find a drug
And improve it

Drug Discovery Research
医薬品研究開発の概観
新規のコンパウンドやリード化合物を発見する研究
部分と薬剤グレードの化学薬品を大量に製造したり
毒性検査を行ったり治験を行う開発部分によって成り立っている。

z Drug discovery research:z Builds on basic research carried out in academiaz Is highly innovativez Is highly speculativez Output is either:z development candidate, back-up and associatedpatents or,z conclusion that the approach is not viable

Overview of Drug R&D

Target Identification
Target Validationin the shortest possible time and with the least cost

Compound Screening
DISCOVERYIn Silico Modeling

Hit/Lead Identification
Lead Optimization

Chemical Development
Preclinical Studies:
Toxicology, ADMEz Successful discovery research delivers one of these outputs

DEVELOPMENT

Human Trials
Regulatory

医薬品開発は研究開発の二つの要素が合体して、あるいはブリッジングして初めて完成するが研究が科学論文を目的とするのに対し、開発は国の基準に適合した安全で効果的な薬品の製造を目指している。開発研究は伝統的に製薬会社の利益追求のために行われてきた。

発見研究をまとめるとこの図のようになる。上段はターゲットの同定、すなわち病気と直接関係する遺伝子やたんぱく質などの物質を発見することである。
従来はたとえば生理活性物質を生き物に振りかけて反応性を測定するような生物学的な方法が使われてきたが、最近ではリバースジェネティックスやプ
ロテオミックスのような物の変異などとの病気との相関などを手がかりにしてターゲットを発見していく手法が広まってきている。上段右はこうして同定された疑わしい物質が確かに病気を引き起こすものであることを確認するステップである。このステップにより開発チームはその物質を抑制するような物質をデザインすることで製品へと結び付けられる可能性をより確心することができる。下段には上段で見つけたターゲットに対する有望な物質を見つけていく
一般的な方法を示している。すなわち、まず最初にやられるのは数百万種に及ぶ化学物質の中からターゲットを修飾出来る数個の物質を選び出す作業である。これをスクリーニングと称する。この候補物
質をさらに下段の右にあるように最適化のプロセスへと進める。このプロセスには化学的な操作に加えて、製剤としての修飾作業が伴うこととなる。

臨床試験、化学薬品の製造基準、臨床試験、そして認可のプロセスが必要である。
Drug Development: Overview
PRE-CLINICALREGULATORY
CLINICAL
(GCP)

(GCP)

(GCP)

CMC

薬理活性を持った化学物質（ＡＰＩ）の合成、製剤としての規格、さらに品質管理を総称して CMC と称する。
薬品開発には以下のような要素が含まれている。
すなはち、
化学、動物、臨床研究から候補となる発見について
アクセス可能な情報網を作り上げる。
研究ほど創造的でも革新的でもない。
その方法は国の薬品承認機関によって決定されている。
次第にこの方法は ICH ガイドラインに集約されてきている。
頻繁で詳細な運営監査を必要としている。
そこから得られるものは-薬品の承認-不適格との結果-科学論文と経過の特許
良い開発プロジェクトは上記 3 つのうちのどれかの結論を可及的速やかにかつ低コストで出すことができるものである。

Drug Developmentz

Drug development:z Builds on the information available about the development candidatefrom discovery research in the areas of chemistry, animal studies andclinical investigationz Less innovative and less speculative than researchz What has to be done, the order in which it is done and the way that it isreported are dictated by National Drug Regulatory Authorities
z Increasingly, such authorities operate to ICH guidelinesz Needs frequent and detailed management review
z Outputs are either:z regulatory approval for the drug candidate, orz conclusion that the candidate drug will not make itz plus scientific publications and process patentsz Successful development projects deliver one of these outputs in the
shortest possible time and with the least cost

図には開発の一連のプロセスを概観して示した。前

Chemistry, Manufacturing, Control (CMC)z Synthesis of active pharmaceutical ingredient(API)z Formulation of APIz Quality assurance/ quality control (QA/QC)

CMC の１．活性物質の合成
薬品合成を専門にする科学研究者は少量のターゲ
ット物質を合成する（30−100mg)ことを第一義的に考えている。
製造化学者は大量の薬品を安価に作ることをまず第一に考えている。そのためには-原材料が安価で簡単に手に入ること。
-化学反応のステップが少ないこと。
-爆発する危険がないこと。
-回収率が高いこと。
-純度が高く不純物が簡単に除けること。
-不純物の中に毒性の高いものが含まれないこと。
-製造過程を破壊するような腐食性の物質を含まないこと-危険なガスを発生しないこと。
-廃液中に環境汚染物質を含まないか、除去しやすい形になっていること。

CMC: Synthesis of API

CMC: QA/QCz Objective is independent analysis of the quality of the API andz

Priority for the synthesising medicinal chemist is to make small
amounts (30-100mg) of the target moleculesz Priority for process chemist is to find a way of making large quantities(tonnes) of the NCE selected for development as cheaply as possible:
z
z
z
z
z
z
z
z
z

Cheap and readily available starting materials
Small number of chemical reactions
No reactions with a risk of explosion
High yields overall
Low impurity level with impurities easily removed
No highly toxic impurities
No corrosive substances which will damage the plant
No dangerous gases (eg CFCs) that might cause problems if they escape
into the air
No toxic by-products that might cause problems if they escape down thedrains and which are costly to get rid of legally

CMC その２ 製剤
その目的は有効成分が疾患の組織に到達して効果を発揮できるような形を作ること。
たとえば以下のようなものである。
-その場に塗るもの。皮膚に塗布する軟膏やクリー
ムがその代表。
-経口できるカプセルや錠剤、粉薬、水薬で、摂取後溶けなければならない。
-注射用の溶剤。注射はいろいろな制約があるために、経口ができないか特別の事情がある場合に限られる。

CMC: Formulation

the finished product against an agreed set of specificationsz Specification cover factors such as:

Percentage by weight of API
Percentage by weight of impurities, both overall and on an individualbasis
z Percentage by weight of waterz Overall weight (finished capsules and tablets only)z Sterility (parenterals only)z Pyrexia (parenterals only)zzz These measurements are made before each batch of API andfinished product are releasedz They are also used to establish the shelf life of the product

CMC その４．法的な規制
もっとも大切な基準は常に一定の品質のものを製造できるかということである。
上記の検査のため、３回のまったく独立した製造を繰り返し、その製品（有効物質）のばらつきを観察す
る。
同様に製剤でも３階の繰り返しを行い確かめる。
もし違うサイズのカプセルや錠剤があればそれぞれ３回ずつ検査を行う。
有効期限の検査は適切な温度と湿度のもとに保存して行い、最短でも６ヶ月の観察を行う。

CMC: Regulatoryz Key requirement is demonstration of ability to consistently

make API and formulated product to specificationz To this end, 3 completely separate production batches of APIz Objective is to develop a means of delivery of the drug

substance to the patient so that it reaches the areas in the bodywhere the infection resides
z Options:z Topicals for local application: usually oils or creams forapplication to skin,z Capsules, tablets or drinking solutions to swallow:
formulation must dissolve readily once ingested;z Parenteral for im, sc or iv injection: only option for treating
patients who cannot take drug by mouth or for drug
substances which are not orally bioavailable; restricted
application otherwise because delivery needs clean
syringes and needles and skilled medical personnel =expensive & potential danger

CMC その３．品質管理
目的は製造者とは独立に有効な薬効成分の質を解析し、検査基準に適合するかを調べることである。
検査基準とは以下のようなものである。
-有効成分の重量パーセント-不純物の含有率-水分の含有量-全体の重量（カプセルや錠剤の場合）-滅菌（注射薬のみ）-発熱性（注射薬のみ）
上記の検査は製剤が出荷される前に行われる。
有効期限についても検査される。

have to be made and shown to be within the set specification
z Similarly, 3 batches of formulated product have to be madeand shown to be within the set specification
z If more than one capsule or tablet size is made, then 3 batchesof each of them must be madez The shelf life of the API and the formulated product must be

determined during real time under appropriate conditions oftemperature and humidity, with a normal minimum
requirement for formulated product of 6 months

前臨床試験
一般的な薬理学
中毒学
吸収拡散代謝排泄（ADME)すなわち薬物動態学

Pre-clinical developmentz General pharmacology
z Toxicology
z Absorption, distribution, metabolism &excretion (ADME) / pharmacokinetics (PK)

前臨床試験 その１．一般の薬理学・まず候補薬品がヒトに薬理学的な影響を与えないことを確かめる必要がある、
Pre-clinical: General Pharmacology
z Need to be certain before drug exposure tohumans that the anti-infective development
candidate is unlikely to have significant
pharmacological effectsz Test in vitro against a range of receptor assays
at concentrations above, around and below
those likely to be required in the plasma oftreated humans to effect cure

前臨床試験 その２．中毒学
遺伝毒性：細菌の変異原活性や動物細胞の染色体変異誘導試験でこれが陽性になる場合発がん性が示唆される。
一回投与による急性毒性：以前は LD50 だったが現
在は最大許容量 MTD で普通マウスを用いる。MTD
は 1g/kg 以上。
慢性の（毎日）繰り返し投与による毒性：通常ラット、犬、霊長類で行われ、致死性、行動変化、病理変化などを指標に評価する。
胎児毒性：ラットかウサギを用いる。
発がん性：通常ラットが用いられる。毎日投与で 2 年間投与される。コントロールでは腫瘍の発生率は
普通３０％程度である。

Pre-clinical: Toxicologyzzz

Genotoxicity – bacterial mutagenesis and mammalian chromosomal aberration
tests – positive result might be an indication of carcinogenicity
Acute single dose toxicity – was dose causing 50% lethality (LD50), now
maximum tolerated dose (MTD) – usually done in mice - looking for MTD >1g/kg
Chronic (daily) repeat-dose toxicity – usually done in rats and dog/primate –looking for both effects on mortality and also non-lethal behavioural andpathological/histopathological effects:
z

z

z
z

Dose-range finding (DRF) – done with small numbers, often over 7 days - seeks toensure regulatory study establishes a no-effect level (NOAEL) as well as dose-limiting
toxicity
Regulatory – for most (short-course) anti-infectives, done for 28 days, but for others, will
go for 90 or even 120 days

Repro-toxicity – usually done in rats and/or rabbits - 3 segments which look at
various aspects of reproductive performance, including health of offspring
Carcinogenicity – usually done in rats – dosed every day for 2 years – look forbehavioural and pathological/histopathological effects and incidences of various
tumours – must be done with a control as latter will show tumours in about
30% of animals – not usually done for short course anti-infectives

・代謝 製剤が吸収された後大抵は門脈から肝臓へ運ばれて肝細胞で代謝され薬理活性物質になるが、この代謝産物の量を測定する必要がある。この検査にもやはり放射性物質をラベルした薬剤を用いるのが理想的である。
・排泄 主に尿や便中に排泄されるのでこの中の投与物質あるいはその代謝産物を測定しなければな
らない。

Pre-clinical: ADMEz

Absorption – studies needed to check that the drug is mobilised from thesite of administration, requires the development of an assay which canmeasure the drug in blood or plasmaz Distribution – studies needed to see the extent of the distribution of the
drug around the body, ideally such studies require radio-labelled drug /whole body radioautographsz Metabolism – studies needed to see if the body can alter the structure of
the API – usually this would be done by the liver, often on drug entering
the liver in the hepatic portal vein (first pass metabolism) – metabolites
must have their chemical structure and biological properties assessed –initial investigation ideally needs radio-labelled drugz Excretion – most likely this will be in the urine and/or faeces – can be
determined by analysis of urine and faecal samples for parent drug (and its
metabolites, if any)

前臨床試験その４ 薬物動態検査
基本的には前項のＡＤＭＥを記載することである。
普通以下のようなパラメターを測定する。
・Ｃマックス 血中最高濃度 これは特に感染症薬の重要なパラメターである。
・Ｃマックス時間 急性の感染症にはこれが数時間以内でなければ意味がない。
・消化管からの吸収率 普通４０％以上だが理想的には７０％以上。
・血管外溶出量 血液外の組織への移行量で、血液外寄生感染生物の治療の際に必要。
・半減期 短すぎれば投与の間隔を非常に短くしなければならず、長すぎれば薬剤抵抗性を生じやすくしてしまう。なぜならば投与中止後不十分な血中濃度で長期間継続することになるからである。

Pre-clinical: Pharmacokineticszz

前臨床試験その３ ＡＤＭＥ
・吸収性 投与された場所から血液あるいは血清中への移行度について測定する検査が必要である。
・体内分布 吸収された生理活性物質が体内をどのように拡散するか検討する必要がある。このための最も理想的な検査は放射性同位元素を用いたトレース法や全身スキャンによるイメージング法などである。

Essentially a description of the dynamics of the absorption, distribution
and excretion of the API (and its metabolites if any)
Normally involves measurement of:
z
z
z
z
z

z

Cmax (maximum blood concentration obtained) - usually a key parameter foran anti-infective
Time to Cmax – important when treating acute infections that this is no morethan a few hours
AUC (area under the curve) – the other key parameter for an anti-infective
Oral bioavailability (only drugs administered by mouth) – must be over
40%, ideally should be over 70%
Volume of distribution (indicates whether or not drug distributes outside
the circulatory system) – large volume of distribution important for treating
infections which are not confined to the blood plasma
Elimination half life – if too short (eg min), too frequent dosing would be
required; if too long (days), danger of development of resistance because
non-therapeutic levels of drug will be present for long periods after last dose
given

臨床試験
・第１相臨床試験 ボランティアを対象に、安全性、寛容性、薬剤動態について検査する。
・第２相前期臨床試験 患者を対象に安全性、寛容
性と効果について検査する。
・第２相後期臨床試験 患者を対象に投与方法の決定
・第３相臨床試験 ある決められた投与方法によるより多数の対象患者を用いた安全性と効果判定試
験。

GCP: Basic Principles
1. Protection of Rights, safety and well-being of trial subjects
2. Credible trial data
'Respect for Person
Beneficence
Justice'

The clinical trial subject's protection is safeguarded through risk/benefit
assessment based on the results of pre-clinical studies prior to any
clinical trial, reviewed by and regulatory authority.

Clinical Developmentz Phase I: uses volunteers – seeks to establish safety,

tolerance and PK
z Phase IIA: in patients – seeks to confirm safety

and tolerance and establish efficacy (and PK)z Phase IIB: in patients - determines dose regimen
z Phase III: in patients – establishes efficacy andsafety of the chosen dosing regimen in larger
number of patients

倫理委員会の役割
・臨床試験参加者や参加するコミュニティーの尊厳、福祉、権利を守り保障するために存在する。
・その存在は社会的な信頼を獲得するためでもある。
・研究者のための助言も行う。

The Role of Ethics Committees
ＧＣＰの概念臨床試験の実施に関する基準（臨床試験の際の理想的な患者取り扱い基準）は国際的な倫理、および科学的な質を保証する基準である。その中には、試験の計画作製、実施、試験の記録、そしてその報告についての細かい基準が盛り込まれている。ここでいう臨床試験とはヒトを対象とするものである。

 To promote and protect the dignity, well-being, and rights of research participants& their communities
 To provide public assurance that research
is appropriately undertaken
 Provide guidance to researchers

Concept of GCP
Good Clinical Practice (GCP) is an international
ethical and scientific quality standard

生物医学研究評価のための倫理委員会の実務的ガイドライン
2,000 年の 1 月にＷＨＯから出版されたガイドライン
は世界の各地の言語に翻訳されて特に途上国での臨床試験参加者の人権や安全の確保のために大きな役割を果たしている。

Trials that involve participation of human subjects
22

Operational Guidelines for Ethics Committees That
Review Biomedical Research

ＧＣＰ 基本的な原理
１．臨床試験参加者の人権、安全、健康を守る。
２．信頼性のある試験結果を保証する。
ヒトをモルモット扱いすることへの社会的な批判に応えるものでなければならない。すなわち参加者への尊敬、利益、正義（公平）の保証である。
参加者の保護は公的機関が監督した前臨床試験のデータに基づくリスク評価を通して保証される。

The aim of these guidelines is to provide guidancefor ethics committees concerning appropriate
operating procedures私の所属する熱帯病対策研究及び人材育成に関する特別プログラム（ＷＨＯ/ＴＤＲ）における医薬品
開発のシステム

MONITORING VISITSPre - Trial Monitoring visit :Ensure feasibility in the centre and interest of the investigator.

Manager: 臨床試験全体の責任者
Clinical Coordinator：臨床試験の計画立案から実施、報告をすべて統括。
Clinical Monitor:臨床試験の実施に当たって実地の研究者のサポートを行う。
Investigator：臨床試験を実施し、データを記録すると同時に、参加者の人権と健康に責任を持つ。
Ethics Committee：臨床試験の倫理的科学的質を保証すると共に、社会に対する説明責任を担う。
DSMB：全体の責任者が用意する臨床試験中の医薬品の安全性に関する専門家外部評価委員会
Data Management：臨床試験のデータの質を管理し、統計処理を行い、データベースの作成管理を行う。

Framework in WHO/TDRManager

Clinical Coordinator

e
te
t
i
DSMB
m
Clinical Monitor
m
o
C
cs
hi
t
E
Investigator

ＷＨＯ/ＴＤＲでは特に途上国の見捨てられた病気に対する医薬品開発を積極的に支援しているが、製薬会社が最も負担と感じている臨床試験の実施について専門家集団を育成して業務を行いつつある。
その中でも最も重視しているのが臨床モニターとデータ管理者の養成である。臨床モニターは臨床試
験の設定時期から完了まで実際の病院サイトに頻繁に出入りして試験実施に当たる医師を助ける。基本的に 4 種類のモニター訪問が行われる。
１．試験前の訪問 実施施設が適切か評価し、また実施責任医師が適切か判断する。
２．試験開始時の訪問 臨床試験に必要な薬剤、記録用紙、などを配達し、病院の実施グループのスタッフがプロトコールを理解しＧＣＰを守ることができる
か最終確認する。
３．試験期間中の訪問 試験が適切に行われているか確認し、実施者のあらゆる問題の解決に協力する。
４．試験終了時の訪問 治験医師が適切にすべての記録を残しているかチェックし、残った医薬品の回収などを監督する。

Trial Initiation visit :Deliver study material, documents, products and make surethe investigational team understands the protocol and GCP requirements.

Monitoring visit :Make sure the study is conducted according to the protocol
and GCP and help the investigational team in solving problems.

CloseClose-out visit :Make sure the investigator file is archived properly and collect back all unusedmaterial, documents or products.
27

データの質の保証
治験の情報は記録され、まとめられ、保存される。
この作業の正確性や正当性を保証するためにデー
タ管理作業者が働く。

Quality of Data
Trial Information
DATA Management

RecordedHandledStoredAllows its accurate reportinginterpretation & verification

臨床試験 第 1 相・ヒトに対する初めての投与
・妊娠していない成人男女のボランティア 10 名から
20 名
・そのために用意された特別の病院の施設を用いて行われる。
・最初の一人には微量の投与が行われ、常時安全性と寛容性に関するモニターがなされ、薬物動態検査が施行される。
・すべて問題なければ他のボランティアに同様の量で投与され、必要な観察を行う。
・そこで問題がなければ投与量が増量される。
・投与量は最終的には寛容できる最高の量あるいは治療効果を見込まれる量まで増量する。

Clinical: Phase I
z
z
z
z

z
z
z

First time in Human
About 10-20 adult male and female (non-pregnant) volunteers
The study is carried out in a specialised hospital unit
Initially a single very small dose of dug is given to the lead volunteer,safety and tolerance are monitored and plasma samples taken for PK
analysis.
If all is well, other volunteers are given the same small single dose andfollowed in the same way
If all is well, the dose is increased and followed in the same way
Dosage is increased until either the maximum tolerated dose or theplasma levels thought to be required for efficacy are reached臨床試験 第 2 相・患者に対して初めて投与される。
・第 2Ａ相・25 名の妊娠していない男女の患者に対して第 1相で確認した投与量を用いて対照なしの試験を行い、安全性、薬物動態、効果判定を行う。
・第 2Ｂ相・25 名の男女の患者に対して、投与量を調整したプロトコールで試験を行い、第 3 相試験で用いる投与方法を確認する。

Clinical: Phase IIz First time in Patient

Clinical: Phase III

z
z
z
z
z
z
z

“pivotal” study is carried out in male and female (non-pregnant) patients
Study is double-blinded against a placebo or a comparator (usually theexisting standard treatment)
Around 1000 patients are enrolled,
Likely to be multi-centre, but working to a single protocol
Study principally measures efficacy and safety, though some patients may also
be assessed for PK
Study is monitored to ensure compliance with protocol and GCP
All data is collected on to CRFs (case report forms) which must be filled incontemporaneously

臨床試験 第 3 相の続き
○付加的な第 3 相試験 （時に第 4 相となることもある。これは認可後に行われた場合である。）
・成人対象の付加的な臨床試験 特定の国の基準を満たすためであったり、食事、人種、免疫状態などを考慮する場合。
・小児を対象とする場合 特に感染症では小児の場
合免疫状態や薬物動態が異なるため、有用である。
・妊婦を対象にする場合 最も無視される人たちで、催奇形性や訴訟をおそれて臨床試験が実施されない。
・予防的な投与法 マラリアなどワクチンのない感染症などでは重要。

z Phase IIA:z Carried out in a group of about 25 male and female(non-pregnant) patients – un-controlled - seeks to
confirm safety & tolerance, establish the efficacy andconfirm the PK in patients using the projected dosing
regimen from the Phase I
z Phase IIB:z Carried out in groups of about 25 male and female (non-pregnant) patients – un-controlled - investigatesalternative dosing regimens above (to improve efficacy)or below (to improve safety and tolerance) those used in
the Phase IIA in order to establish the dosing regimen
to be used in Phase III

臨床試験 第 3 相
・決定的な臨床試験
・偽薬あるいはすでに存在する標準薬を対照とした
2 重盲検法を用いる。
・約 1000 名を対象とする。
・多施設試験が多いが、プロトコールは統一する。
・基本的には効果と安全性を評価するが一部薬物
動態検査も行われる。
・試験期間はプロトコールとＧＣＰが遵守されるかモニターされる。
・すべてのデータはＣＲＦ臨床試験データ記録用紙に記録される。

Clinical: Phase III (Continued)
z Additional Phase III studies may also be carried out(sometimes referred to as Phase IV studies, especially if they
are carried out after regulatory approval is obtained):
Additional studies in adults to deal with specific country regulatory
requirements, human diet and genetic and diversity, and immune statusof patientsz Paediatric studies – useful in all infectious diseases since the disease
immune status of and the PK of drugs in small children, and especiallyin infants, are not the same as in adults - vital in diseases such as
malaria which particularly affect such populations – may need adifferent formulationz Studies in pregnant women – the most neglected patient population
because of concerns about teratogenicity and litigationz Prophylactic studies – important in diseases such as malaria where no
vaccine availablez

政府機関の承認・ＣＭＣ、前臨床試験、臨床試験の情報が得られると、それは医薬品マスターファイルにすべて収められる。すべての署名付オリジナルの書類が入っている。
・このマスターファイルが完成すると承認機関に提出するための冊子としてまとめられる。この冊子にはオリジナルファイルのほかに専門家報告と称する
この 3 つの領域のまとめが添付される。

・ほとんどの国には国の承認機関が存在する。
・そのうち、世界のビッグ３は、米国ＦＤＡ、ヨーロッパ
ＥＭＥＡ、それに日本のＰＭＤＡ（ＦＤＡ）である。世界の市場に届けるには 150 の機関の承認を受ける必要がある。
・承認機関は提出冊子を検討し適切に効果と安全性が確認されているか評価する役割を担っている。
・承認前に開発会社に質疑応答が行われることがある。また条件付き承認や期限付きで付加的な臨床試験を要求されることもある。
・すべての承認例で、市場でのサーベイランスが義務付けられ、実際の世の中での新薬の安全性と寛容性がモニターされる。

Regulatory

z

z

z

z

z
z

As the information in the CMC, pre-clinical and clinical areas is obtained it is put
into the “Drug Master File”. This contains the original, signed copies of thereports of the work done.
Once this File is complete, it is used to put together a dossier for submission toregulatory authorities. The latter contains copies of all the original files, plus
“Expert Reports” which summarise the information covering the 3 areas.
Most countries have their own National Drug Regulatory Authority,

The 3 big ones are the US FDA, the European EMEA and the Japanese
FDAz To obtain global regulatory approval, over 150 submissions are required
The role of the regulatory authorities is to assess the dossier and decide whether or
not the developers have established sufficient evidence for safety and efficacy for
their candidate anti-infective to be approved for use in the country concerned
A dialogue may be conducted with the developer before approval, and approval
may be conditional on certain further studies being carried out within a given time
In all cases, PMS (post-marketing surveillance) is required to monitor the safety
and tolerance of the new drug in the “real” world

ワクチン開発について
ワクチン開発も基本的なプロセスは通常の医薬品と変わらない。

Vaccine development
Basic
research

Applied Research
PrePre-clinicaldevelopment

Discovery

Exploration

Scientificfoundation
Concept
identification

医薬品の開発過程のまとめ

Safety andtolerability
Animal protection
experiments

Target Identification
Target Validation
In Silico Modeling

Preclinical Studies:
Toxicology, ADMEDEVELOPMENT“Field trials”
trials”

Methods of production
Stability

Consistency batches

GLP

GLP - GMP

GLP - GMP - GCP
Regulatory requirements

Production facilities

Planning Activities

Hit/Lead Identification
Lead Optimization

Chemical Development

GLP
Dose Finding

Human Trials
Regulatory

Find BiologicalTargetsand Identify
VaccineCandidates

一つの医薬品を新しく作り出すには・複雑なプロセスが必要：生物学や化学研究による
たくさんの発見が必要、さらに長く険しい臨床試験
・時間がかかる：8 から 12 年平均
・お金がかかる：発見研究から承認、市場後サベイ
ランスまで含めて 800 億円以上かかる。
・危険：多数の有望と思われた薬品が承認までたどり着かない。成功率は１％未満。

Test
VaccineCandidatein Animal
systems

Effectiveness

Efficacy

Likelihood of protection
in humansCompound Screening
DISCOVERY

SafetyImmunogenicity

Antigens
characterisation
andconfiguration

Summary of Drug R&D

Vaccination strategies
Availability
Post licensing

Clinical Development
Clinical trials Human
Research

Registrationz

Use of the vaccine
for PH purposes
Further safety
and efficacy trial
Pharmacovigilance

GLP - GMP - GCP
Regulatory

ワクチン開発の場合の臨床試験
第 1 相 安全性試験：100 名未満のボランティアに投与し安全性をチェックする。その際抗体反応など効果判定も行う。
第 2 相 実際の対象者：投与量やプロトコールの最適化を行う。安全性のためのデータベースを作成。
第 3 相 多数の対象者：2 万人から 7 万人を用いて安全性と寛容性を確認する。生産部門の信頼性も同時に確認。

承認後の臨床試験
10 万人以上を対象にまれな副作用をチェックする。
自己免疫など起こりうる免疫応答性などを観察。老年層や小児での反応性を確認。他の地域での検討。

一つの新しいワクチンを作るには。
１．複雑な過程が必要：微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、化学の膨大な発見研究が必要。さらに長く複雑な臨床研究が続く。
２．時間がかかる：１５から 20 年の開発期間を要する。
３．お金がかかる：500 億円
４．危険：全体としての成功率は５％以下。発見研究の際の成功率は１３％、その後の開発段階での成功率は３５％。これは医薬品の開発より成功率が高い。

2. West Nile fever vaccines
Kouichi Morita
Department of Virology, Institute of Tropical Medicine, Nagasaki University
Introduction:
West Nile fever is a tropical disease thatused to be known as an acutemosquito-borne virus infection occurring
sporadically in Africa, the Middle East, anda part of West Asia1). The West Nile virus,
which is a West Nile pathogen, was firstreported in New York City in the UnitedStates of America (U.S.A.) in 1999, andcontinues to expand causing a serious
problem across North America. Although,at present, there are no signs that this virus
has affected Japan, a West Nile fever
vaccine for humans should soon be
developed and made available as aprecaution against the disease.
1. Ecology of West Nile virus
The West Nile virus (WNV) is a RNA virus
classified as Flavivirus. Significantly, theWNV belongs to the Japanese Encephalitis
virus antigenic complex which includes
severalmedically
importantviruses
associated with human encephalitis . Inview of this, we need to fully understand therelationship between the WNV and theJapanese encephalitis virus present inJapan.
For
instance,botharemosquito-borne viruses (arbovirus), however,Japanese
encephalitis
ismainlyswine-hosted and is transmitted by theCulextritaeniorhynchus
species
reproducing in paddy fields. On the other
hand, the West Nile virus is bird-hosted andis transmitted by many kinds of mosquitoes
found in houses, islands and even urban
areas. Thus, Japanese encephalitis occurs
in areas relatively close to ruralcommunities, while the West Nile fever
occurs in both rural and urban communities.
In fact, West Nile fever cases occur in big
cities such as New York City, and two
different epidemiological situations are
revealed when these two epidemics occur.
Serological differentiation between these
infections is also essential. However, theHI (hemagglutination-inhibition) test, which

is a commercially provided serodiagnosis
method of Japanese encephalitis, gives a
positive result even to serum from West Nile
fever cases(2) because of the similarity ofthese viruses in the level of virus
antigenecity.
Serodiagnosis can bedifferentiated using IgM-ELISA assay,
however, this is not commercially available
at present.
2. Epidemiology
The West Nile virus spread in the Old
World, that is, in Africa, the Middle East,
the Mediterranean areas, a part of Europe,West Asia, and India until 1998. Some
major outbreaks were recorded in theseareas.
On the other hand, Japanese
encephalitis spread in East Asia, Southeast
Asia, and South Asia, and to date, manycases still occur, annually.
It has been confirmed that the West Nilevirus, which had not existed in the New
World until then, first appeared in the U.S.A.
in 1999. The first West Nile fever caseoccurred in New York City in August 1999.
An infectious disease expert working for a
hospital in New York City examined two
acute viral encephalitis cases, and reported
this to City Health authorities, as well as
requestedforanepidemiologicalinvestigation of encephalitis the area of New
York City. The result was that more thanten acute encephalitis cases of unknown
causes were confirmed in the Queens area,
which was centrally located in New York
City. Tests revealed that the West Nilevirus caused the outbreak of encephalitis.
WNV was isolated from dead birds andpatients’ brains and cerebrospinal fluid.
Results of analytical data of this virus generevealed that the West Nile virus straincame from around the Middle East (3). In the
U.S.A., the West Nile virus spread to fourstates around New York City and sixty-two
cases were reported in the first year of theepidemic. In 2000, the epidemic area spread
up to twelve states; in 2001, up to twenty-six

states; in 2002, up to forty states; and in
2003, up to forty-six states. The number ofcases also increased tremendousely since
2002, which means that outbreaks havecontinued with 4156 cases (with 264 deaths)
in 2002; 9862 cases (with 264 deaths) in
2003, and 2470 cases (with 88 deaths) in2004. It affects fields of general medical
treatment as well, since although the WNV
is most often spread to humans from the biteof an infected mosquito, the virus may also
be transmitted in other ways – throughorgan transplants and blood transfusions.
3. Characteristics of West Nile virus
infection in the USA
Approximately 80 % of the West Nile virus
human infections cause no symptoms,
however, infected people in the past werereported to have had various symptoms.
The reported symptoms during an epidemic
were: central nervous system damage, as
was evident in cases of Japanese
encephalitis; acute febrile illness associatedwith dengue-like rash; and hepatitis
associated with jaundice and similar toyellow fever in the Central African Republic.
The West Nile virus is endemic in areas such
as Africa and West Asia and the said
infection present in these areas is mostly
febriferous and heals naturally which
explains why the infection is called “WestNile fever”. When infected mosquitoes biteand suck blood from people in these areas,
general symptoms appear as in acute virus
infection such as fever, headache, muscle
ache, skin eruption, enlarged lymph node,
fatigue, and loss of appetite, after an
incubation period of three to fourteen days.
Most will recover within one week without
any aftereffects. Dengue-like rash is foundin the case of nearly half of infected people(nearly 20% in the U.S.A.), and it appears on
the breast, back, and arms, mid-way during
the infection, and will disappear in a week.
In some cases in the elderly, the virus affects
the central nervous system and causes
severe encephalitis and cerebral meningitis.
West Nile virus infection in the U.S.A.,
however,showadifferent
clinicalpresentation from that of the classic West
Nile virus infection, that is, cerebral
meningitis and encephalitis cases occur

more frequently in U.S.A. than in Africa andin West Asia. The infection in the U.S.A. isalmost like “West Nile encephalitis”. It has
been reported that 2866 of 9862 cases in thedata of 2003 (29%) and 900 of 2470 cases inthe data of 2004 (36%) showed symptoms of
cerebral meningitis, encephalitis, muscle
weakness, and polio-like paralysis. The
West Nile virus which emerged in the U.S.A.,
infects and attacks the brain and spinal cordin humans significantly. Moreover, it has
been confirmed that, annually, in the U.S.A.,
many birds infected with West Nile virus
died of encephalitis, while there have been
no reports that in Africa and the Middle
East, many birds infected with West Nilevirus have died. Thus, the West Nile virus,
which appeared in the U.S.A., is consideredhighly-neurotropic and a highly-virulent
virus strain. In view of this, there is anurgent need to develop a vaccine tocounter-attack the effects of WNV infection.
4. Why we do not have the West Nile fever
vaccines?
Over sixty years have passed since theWest Nile virus was first discovered fromhuman blood by an American researcher in
Uganda, Africa, in 1937. But why has
there been no vaccine developed up to thistime?
It is not because developing avaccine is difficult but there are otherreasons for this. Firstly, there has not beena continuous occurrence of WNV outbreaks.
Secondly, researchers and pharmacists inindustrialized
nationswithvaccinedevelopmental
techniques
werenotinterested, as epidemics had occurred indeveloping countries, such as in the tropicalregions. But, given the serious effects of
the WNV when first recognized, a vaccine
needs to be developed soon as it is a virusthat caused severe human meningitis orencephalitis in human elderly patients.
However, when WNV appeared in North
America in 1999, encephalitis was alreadyreported in humans and horses, which was
an important milestone in the evolving
history of the virus. In view of this, thepresent situation has totally progressed
differently from when the virus first cameout due to the emergence of ahighly-neurotropic
andhighly-virulent
strain.

5. Necessity of West Nile fever vaccine
development in Japan
It has been confirmed that the West Nilevirus is related to the Japanese encephalitis
virus.
During experiments using mice
when the WNV was first discovered,analysis showed that both viruses had ahigh cross immunity with each other. (4)During subsequent experiments, Goverdhan
et al. reported that in one of theirexperiments, a chimpanzee, after having
been immunized with the Japanese
encephalitis vaccine, did not develop an
infection to the WNV when exposed to thesaid virus. This led them to believe that
the Japanese encephalitis vaccine could bean effective protection against the WNV
infection.
However, Takasaki et al. also performedexperiments to examine the cross immunity
against WNV (g2266 strain) by inoculating
mice with Japanese encephlalitis vaccines toconfirm the effectivity of the JE vaccine on
WNV virus infection. The results were notconclusive.
Results showed partial
immunity to the virus when the mice were
inoculated with concentrated vaccine (10 to
20 times a normal dose for humans).
Moreover, when Thasan et al. conducted
experiments on whether or not antibodies
produced in human serum vaccinated withJE are able to neutralize the WNV (NewYork cros 394-99 strain), they revealed thatthey could not detect neutralizing antibodies
specific to the WNV. Hence, the need todevelop a specific vaccine for WNV fever, as
the JE vaccine when used against the WNV
fever is not effective.
6. Current situation of vaccine development
Development of a West Nile fever vaccine
has been attempted in a number oflaboratories, i.e., inactivated vaccine using
purified virion, live vaccine produced bygenetic engineering, DNA and RNA vaccines,
replicon vaccine, recombinant vaccine using
live measles vaccine. So far, live vaccine
produced by genetic engineering andinactivated vaccine are the most likely to
become available.
Live attenuated vaccines
The conventional way of producing live

attenuated vaccines is to culture viruses
repeatedly in various cultured cells which
requires a certain amount of time totransform them.
However, at present,
there have been various attempts to produce
safe live vaccines using the newly developed
genetic engineering method which produces
results faster than the conventional way.
Using genetic engineering, the research is
conducted to produce the WN fever live
vaccines by replacing gene segments,
associated with protection from WNV
infection, into other safe flavivirus live
vaccine strains.
The WNV virion presents two kinds ofstructural proteins on the surface, PrM and
E. The E-protein, a very effective antigen,is exposed out of the virion and which
induces neutralizing antibodies.
The
purpose of the vaccine is to extract
immunity against E-protein. Constructionof chimera virus using the moleculartechnological approach assures an efficient
way of development of live attenuatedvaccine for West Nile fever. The chimera
virus can be constructed using thewell-analyzed Flaviviruses as backbone
virus and the PrM-E protein gene of WNV as
an insert gene.
This technique will
drasticallyshortenthe
periodofdevelopment of live attenuated viruses forWest Nile fever compared to that of theconventional way of vaccine development.
A number of West Nile fever live vaccine
candidates have already been produced
using chimera viruses. Monath et al. areattempting to construct a WNV/YFVchimera virus using a yellow fever virus live
attenuated vaccine strain, 17D, as a
backbone virus. Chanock et al. are also
attempting to construct a WNV/DEN
chimera virus using a dengue virus
attenuated strain, containing some deletionin 3’-NTR as a backbone virus. (8) Chimera
virus has also been produced using
tick-borne encephalitis virus genes.
ChimeriVaxTM-West Nile (9), which is achimera virus of yellow fever vaccine strain(17D) by Monath et al., has only reached thehuman clinical trial level.
They also
constructed a number of mutants byperforming
artificial
amino-acidreplacement, which might be associatedwith attenuation, in West Nile E protein
region of chimera virus in order to improve
the safety of their virus. (10)Safety,neurovirulence, antibody production in miceand monkeys, and whether or not their virus
grow in mosquito vectors, have already been
examined, and now, first stage tests arebeing conducted with humans. They havereported that their chimera virus is able to
make favorable immunity induction to West
Nile virus by acquiring the original natureof 17D, which is nonpathogenic and causes
viremia at a low level, when animals
including monkeys are inoculated withchimera virus. It is also reported that theirchimera virus has a low infection rate tomosquitoes although some people areconcerned that the chimera virus might bepassed on and affect our environment if
mosquitoes bite and suck blood fromvaccinated people, as in the case of live
vaccines.
Inactivated vaccines
The present way of producing Japanese
encephalitis vaccines, approved by the
Ministry of Health, Labour and Welfare,Japan, is to, first, inactivate the Japanese
encephalitis virus grown in a mouse’s brain
with
low-concentrated
formalin;andcondense and intensively purify its virus
virions using the ultracentrifugal method.
More than a million doses of this Japanese
encephalitis vaccine are used in Asian
countries every year. Vaccine produced by
the Research Foundation for Microbial
Diseases of Osaka University, is the only
Japanese encephalitis vaccine approved by
the U.S. Food and Drug Administration(FDA) now. Effectiveness and safety of thevaccinehasalready
been
provenscientifically with animal experiments andhumanclinicalandfieldtrials.
Theoretically, the West Nile fever vaccines
can be produced in the same way as that ofJapanese encephalitis vaccines. In Japan,
the Research Foundation for Microbial
Diseases of the Osaka University and the
Chemo-Sero-Therapeutic Research Institutein Kumamoto, in collaboration with theInstitute of Tropical Medicine, Nagasaki
University, have succeeded in culturing
many West Nile viruses (New York strain)using the tissue culture technique, and are
producing inactivated vaccines in the same
way as that of Japanese encephalitis
vaccines. Effectiveness of these vaccine
samples using mice was examined in theInstitute of Tropical Medicine, and enoughneutralizing antibodies produced fromvaccinated mice have been observed.
Protective activity was also confirmed invirus challenge tests using the high-virulent
New York City strain. Preparations are
currently underway for a human clinical
trial, as safety tests with animals have been
performed.
Discussion
Inactivatedvaccinesaremoreadvantageous because of its safety. We
need more safety tests than inactivatedvaccines for live vaccine before using themeven if we succeed in developing it because
live vaccines have disadvantages, too, suchas the possibility to turn attenuated vaccine
virus into the high-virulent one due to backmutation, unexpected side effects, severe
diseasesbyvaccinestrainwith
immunodeficiency, and teratogenesis in theearly stages of pregnancy. Seligman andGold (12) recently pointed out that a virus
gene may be recombined by double infectionof other Flavivirus, and also warned thatrecombinant viruses with new pathogenicity
may be generated between wild viruses andvaccine viruses if people are vaccinated with
Flavivirus live vaccines in epidemic areas
where other wild Flavivirus are present. It
was suggested that chimera live vaccine,including chimera virus with 17D, should bemade available only after approval byinternational organizations has beenobtainedandthatdevelopmentofinactivated vaccines should be promoted,
instead.
The advantages of live vaccines, however,are its affordability compared to inactivatedvaccines and its long-term effectiveness.
We need to develop live vaccines in the eventthat high-virulent West Nile viruses appear
in Latin America and developing countries
in Asia from the U.S.A.. In any case, thetwo aforementioned vaccines are preferredamong several other West Nile fever
vaccines available. When we think of theserious situation of the West Nile fever
epidemic in the U.S.A., we recognize theurgency of developing and making available
in Japan the West Nile fever vaccine.
(Reference)
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Fields Virology Third Edition.
Philadelphia : Lippincott-Raven
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to 1985. in Encephalitis, mosquitoes anda virus in Karachi. Edited by Takasu T.
p89-120,1987
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cross-protection between West Nile andJapanese encephalitis viruses in bonnet
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antibodies to West Nile virus in subjects
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Am.J.Trop.Med.Hyg, 66:115-116, 2002.
8) Pletnev AG, Claire MS, Elkins R, et al.:
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West Nile virus. Virology, 314:190-195,
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development. Trends Mol Med,
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10) Juan Arroyo,Chuck Miller,John
Catalan,Gwendolyn A. Myers,Marion S.

Ratterree, Dennis W. Trent, and Thomas
P. Monath: ChimeriVax-West Nile Virus
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Live flavivirus vaccines: reasons forcaution. Lancet. 363: 2073–75. 2004.

3. Malaria transmission-blocking vaccine development:
Post-genome approach
坪井敬文

無細胞生命科学工学研究センター

はじめに
マラリアはハマダラカによって伝搬され、熱帯、亜熱帯地域に広く分布する感染症である。
1950 年代後半から DDT 等の殺虫剤による媒介蚊対策やクロロキン等による化学療法によるマラリア撲滅キャンペーンがＷＨＯを中心に取り組まれた。その結果、その後 15 年間にヨーロッパ、北アメリカ、ロシア、オーストラリ
ア及びアジアの一部ではめざましい成果が上げられた。しかし、1960 年頃にはクロロキンに対する耐性熱帯熱マラリア原虫や殺虫剤に抵抗性のハマダラカが急速に拡散してきた。その結果、1970 年代後半からはマラリア患者数も急増している。現在約 20 億人が感染の危険にさらされており、年間約 5 億人が罹患し、熱
帯熱マラリアによる死亡者は 150 から 270 万人にも及ぶと推定されている。そこで、マラリア
ワクチン開発が新しいマラリア対策として注目され、その研究が急がれている。本講演では、
マラリアワクチン、中でも演者らが研究を進めている伝搬阻止ワクチンの意義、実験室とフィールドを結んだ研究の実例、製品開発の状況および我々の新たなポストゲノムアプローチについて紹介した。
マラリアワクチンの標的
マラリアの生活環を基に、マラリアワクチンの標的発育ステージとそれに対するワクチンを分類すると下記の３種に分けてまとめることができる。
１）ヒトへの感染型であるスポロゾイトや肝臓型原虫を標的とする感染阻止ワクチン
２）人体内で増殖する赤血球型マラリア原虫を標的とする発病阻止ワクチン
３）媒介蚊体内のマラリア原虫の発育を阻害す
る伝搬阻止ワクチン
マラリア伝搬阻止ワクチンとは伝搬阻止ワクチンの原理は、蚊の中腸内ステージ（主に生殖体からオーキネートまで）のマ
ラリア原虫に特異的に発現する表面蛋白でヒトを免疫して特異抗体を作らせ、そのヒトからプロテオーム・医薬部門

吸血した蚊の中腸内で、発育した虫体の表面蛋
白とヒトの抗体とが抗原抗体反応を引き起こし、上記の原虫の発育を阻害する。その結果、次のステージのオーシストの形成が阻害され、媒介蚊によるマラリアの伝搬をブロックすることである。伝搬阻止ワクチンの効果としては、
下記のことが期待されている。１）地理的に限局された流行地からマラリアを無くする。２）
その他の流行地においても感染蚊からのスポ
ロゾイト接種数を減少させることにより小児の死亡率を下げる。より重要な効果は、３）現在のマラリア対策にとって最も大きな障害となっている薬剤耐性マラリア原虫の拡散を、伝搬阻止ワクチンによって止めることができることである。そればかりでなく、現在開発中のマラリアワクチンが将来流行地で使われる際には、当然その選択圧によってワクチン耐性株
のみが生き残る可能性がある。そこで、感染阻止ワクチンや発病阻止ワクチンの使用時に伝搬阻止ワクチンを併用すれば、それらに対する耐性原虫の拡散も阻止できる。つまりこのワクチンは現在開発中の全てのマラリア対策に必須のコンポーネントと考えられる
マラリア伝搬阻止ワクチン開発の実例
伝搬阻止ワクチンとして現在研究が最も進んでいるものは，オーキネートに発現する分子量 25kDa の表面タンパク質である。熱帯熱マラリア原虫では Pfs25、三日熱マラリア原虫ではPvs25 と呼ばれている。これらのタンパク質はＮ末端に分泌シグナル配列、Ｃ末端に GPI アン
カーシグナル配列を持ち、それらの間に４つのEGF 様ドメインと呼ばれる配列が存在しており一次構造上いずれも分子内に２２個の保存的なシステイン残基を有している。またそれらのパラログとして熱帯熱マラリア原虫には
Pfs28、三日熱マラリア原虫には Pvs28 と呼ばれる分子量 28kDa のオーキネート表面タンパ
ク質が知られており、Pfs25 および Pvs25 と同様の動態を示すことから伝搬阻止ワクチン候補抗原と考えられている。これらを認識する抗体は抗原を還元すると反応性を失うことから、

これらのタンパク質は複雑な立体構造を取っていることが予測されている。
以下に我々が取り組んできた三日熱マラリ
ア伝搬阻止ワクチンの研究を紹介する。ワクチ
ン開発を進めるためには上記の遺伝子を組換えタンパク質として発現する必要がある。我々は Pvs25 及び Pvs28 遺伝子を三日熱マラリア原
虫 Sal1 株からクローニングし、酵母を用いてそれらの組換えタンパク質を発現することに成功し、アラムアジュバントを用いて誘導したマウスの抗血清は Sal1 株原虫の伝搬を完全に阻止した。次に、この抗血清の伝搬阻止効果を
三日熱マラリア流行地であるタイにおける患者分離株原虫を用いて検討したところ、Pvs25、Pvs28 いずれの標的抗原遺伝子にも変異が存在したにもかかわらず、Sal1 株由来の抗血清はタイ分離株原虫の伝搬を阻止した。以上の結果をふまえて、現在 Pvs25 を用いた第一相臨床試験が米国で実施されている。
ポストゲノムマラリア伝搬阻止ワクチン開発の戦略
ここ 20 年間の世界的なマラリアワクチン開発の努力の結果、伝搬阻止ワクチンを含むいく
つかのマラリアワクチン候補がやっと臨床試
験に突入し始めた段階にあるが、これまで集積された報告によると、必ずしもその有効性は満足できるレベルにはない。
そこで、新しいワクチン候補抗原を探索する
ためここ数年間熱帯熱マラリアゲノム計画が進められ、2002 年に熱帯熱マラリア原虫のゲノム情報が公開された。それによれば、約 5400
個の遺伝子のうち約半数は原虫の各発育ステ
ージ特異的に発現していると予想されており、これらは各種のマラリアワクチン候補抗原としての可能性がある。そこで我々は、愛媛大学
無細胞生命科学工学研究センターにおいて、コ
ムギ胚芽無細胞蛋白質合成法を用いて、熱帯熱
マラリア原虫のゲノム情報を基にゲノムワイドに熱帯熱マラリア原虫の生殖母体ステージに特異的な発現が予想されている遺伝子の組換え蛋白を発現し、その中から新規マラリア伝
搬阻止ワクチン候補抗原を同定することを目的として研究を開始している。
参考文献
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Sequence polymorphism in two novel
Plasmodium vivax ookinete surface

proteins, Pvs25 and Pvs28, that aremalaria transmission-blocking vaccine
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2) Hisaeda H, Stowers AW, Tsuboi T, Collins
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Kaslow DC.
Antibodies to malaria vaccine candidates
Pvs25 and Pvs28 completely block theability of Plasmodium vivax to infectmosquitoes.
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5)Sattabongkot J, Tsuboi T, Hisaeda H,
Tachibana M, Suwanabun N, Rungruang T,
Cao Y-M, Stowers A, Sirichaisinthop J,
Coleman RE, Torii M.
Blocking of transmission to mosquitoes by
antibody to Plasmodium vivax malaria
vaccine candidates Pvs25 and Pvs28
despite antigenic polymorphism in field
isolates. Am J Trop Med Hyg, 2003, 69:
536-541.
6)Sattabongkot J, Tsuboi T, Zollner GE,
Sirichaisinthop J, Cui L.
Plasmodium vivax transmission: chances
for control?
Trends Parasitol. 2004, 20: 192-198.

4.ミニブタ日本住血吸虫感染動物モデルを用いたワクチンおよび診断薬
の開発
平山謙二
長崎大学

熱帯医学研究所

疾病生態分野中国の日本住血吸虫症流行地においては水牛、牛、家豚などが重要な保有宿主となっており、このことが撲滅対策を困難なものにしている。カンボジア、ラオスのメコン住血吸虫症の流行地でもブタが重要な保有宿主であるとの報告がある。またヒト感染後の肝脾疾患特に肝硬変は慢性の合併症として重要である。この住血吸虫症の感染防御免疫あるいは慢性感染による合併症の病態解析のために、マウスに比してより実際のヒト感染系に近いと考えられるクラウン系ミニブタ日本住血吸虫感染モデルについて解析を進めた。これまでの解析から、ミニブタが実験動物モデルとして、感染防御ワクチン開発および住血吸虫感染後の肝線維症予防治療モデルの開発等に応用が可能であることが示された。昨年度には、γ線照射セルカリアワクチンによるワクチン効果を確認することができた。すなわちミニブタでも防御免疫を惹起することが可能であることが明らかとなった。今年度は、家畜に対する、より実践的なワクチンとして、
コレラトキシン（Ｂサブユニット）(CT) と組み換えパラミオシン(PM)の混合経鼻ワクチンを用い粘膜免疫による感染防御効果についての検討を行った。

A. 研究目的

採血し血中特異的抗体価を確認することにミニブタが日本住血吸虫の感染防止ワクチ

よって、免疫の効果判定を行う。その 8 週後ントライアルとしての実験動物モデルの可に全頭にセルカリアを 200 隻感染させ、コン能性について検討し、実際のワクチン開発のトロール郡と免疫群での防御反応の観察を効果判定用のモデル実験動物として応用す行った。感染後直後から 2 週毎に採血を行い、ることを本研究の目的とした。

血清中の特異的抗虫体及び虫卵抗体検出用

B. 研究方法の試料とすると共に、感染４週後からは便中

MHC クラス II 遺伝子型（表１）のほぼ同一の虫卵数（EPG）により、感染の確認を行っ

な生後 5 週令の雄ミニブタ 10 頭（平均体重た。感染後約８週後に解剖、環流実験を行い2.4ｋｇ）を用いた。そのうちの３頭には得ら れた住血吸 虫成虫数の 数によって 、

CT+PM の混合抗原、３等に CT のみ、２頭にPM+CT 経鼻粘膜免疫ワクチンの効果判定をおPM を経鼻粘膜免疫を２週毎に３回施行した。

こなった。全体の実験の流れを図１に示した。

残りの２頭は陰性対照とした。免疫する時に、

図１．ワクチン実験の概要
Four groups, CT+PM (3), CT (2), PM (2), PBS(Control)(2)1. Immunization;
PM (500ug) CTB (250ug)
2. Challenge: 200 S.japonicum Cercaria p.c.
3. Perfusion: Worm recovery, Tissue samples
-6
1

-4
st

-2
nd

2

3

0
rd

2

4

6

8

Challenge

9wks

Perfusion

Immunizationも有意に減少した。このように、経鼻免疫でＣ. 研究結果
免疫群（CT+PM, PM）ではワクチン投与後、ある程度効果が確認されたものの、同時に非血中 PM 特異的 IgG 抗体価は１週間ほどで上常に深刻な副作用が生じることも明らかと昇しその後２週おきに２回追加免疫を行いなった。それは CT＋PM 免疫群で起こった重高い抗体価を維持することができた。３回目

篤な肺臓炎で、おそらく、PM に対する過敏の免疫後２週間で免疫群と非免疫群（CT,

反応が CT により増幅されたものと推測されCONT）にチャレンジ試験（200 隻セルカリア）

た。この副作用で免疫群のうちの１頭は感染を行った。感染から６週後には便に虫卵を認後しばらくして死亡している。解剖後、病理

め、９週後に門脈の還流を行って寄生虫体を標本を作製し鏡検したところ、CT+PM 群にの回収した（表１）。虫体の総数で比較した場

み肺に器質化肺炎と見られる所見が認めら

合、ワクチン群と対照群でれた。また、一部の細気管支では好酸球の浸差はなかったが、雌虫の数で比較すると PM

潤をともなう細気管支炎も観察された。

免疫群では CT を混合した場合もしない場合
表１．Worm recovery rate in each group
ID(T)

Immunaize

Male

Female Total% recover

49

CT+PM

50

CT+PM

88

16

104

52.0

54

CT+PM

95

18

113

56.5

55

CT

80

31

111

55.5

56

CT

108

43

151

75.5

58

CT

86

30

116

58,0

59

PM

87

13

100

50.0

62

PM

117

22

139

69.5

65

Cont.

135

25

160

80.0

66

Cont.

87

30

117

58.5

Dead at 7wks after infection

図２．雌虫の虫体数が免疫群で有意にG. 研究発表減少した。

1. 論文発表

30

P<0.0520
10CT CT+PM

(-)

PM

D. 考察
以上の結果からは、パラミオシンのワクチン効果については、雌成虫に対する防御効果があったことが認められたが、粘膜経鼻免疫が1. Kanji Watanabe, Mihoko Kikuchi,
Akio Ohno, Raafat Taha Mohamed,
Takeshi Nara, Ratawan Ubalee,
Masachika Senba, Takuya Iwasaki,
Honggen Chen, Yoshiki Aoki, Kenji
Hirayama. The miniature pig: A
unique experimental model for
Schistosoma japonicum infection.
Parasitology International,
53(4):293-9.2004
2. Kenji Hirayama. Immunogenetic
analysis of post-schitosomal
liver fibrosis. Parasitology
International, 53(2): 193-7, 2004

必ずしも安全ではないということが判明した。
しかしながら、回虫感染防御を目的とした回

2. 学会発表

虫抗原を用いた家豚への粘膜経鼻ワクチンな1. K. Hirayama. The miniature pig as

unique model for human Schistosoma
japonicumv vaccine experiments.
作用についての報告が認められない。粘膜経
Forth world congress on vaccines and鼻ワクチンの手法そのものが、悪いわけでは
immunization. September 30 ‒なく、住血吸虫由来パラミオシンの蛋白とブ
October 3, 2004, Tsukuba Science
タとの相同性が高く、この事が過剰な免疫応
City/ Tokyo, Japan
答が喚起されたのではないかと推測している。
2. Kanji Watanabe, Mihoko Kikuchi,
現在、この免疫応答性について検討している。
Ekhlas Hamed, Takeshi Nara, Takeshi
Arakawa, Kazunari Ishii, Masachika
Ｆ.結語
Senba, Takuya Iwasaki, Yoshiki Aoki,
実際のワクチン開発の効果判定用のモデル実Kenji Hirayama. The miniature pig as
験動物として応用することを本研究の目的とa unique experimental model for
して、本年度の研究を行った。経鼻粘膜ワク
human Schistosomiasis japonica.
チンの安全性については、問題が生じたが、U.S.-JAPAN Cooperative Medical
ミニブタはワクチン効果判定の実験動物としScience Program Parasitic Diseasesて有効であることが確認された。より簡便にPanele Annual Meeting. Kyoto, Japan.
感染虫体数を測定する系を開発する必要性がDecember 7 - 9, 2
どの研究報告結果では、このような重篤な副あると思われた。

Life cycle of schistosome

熱帯医学会九州支部会シンポジウム
ミニブタ日本住血吸虫感染動物モデルを用いたワクチンおよび診
断薬の開発
平山謙二

Somula長崎大学 熱帯医学研究所 疾病生態分野

Lung

Adult
worms

Eggs

Skin

Vaccine and Diagnostic tools development forthe control of Schistosomiasis japonica

Portal vain
Miracidium

K. Hirayama

巻貝

Sporocyst

Institute of Tropical Medicine, Nagasaki University,
Nagasaki, Japan.

Cercaria

Schistosome priority antigens

Why we use pigs
instead of rodents?

S.japonicum

S.mansoni
Identity

Function

Stage

Mouse
Sm28-glutathione
Somula Enzyme
S-transferase(GST) Adult

Sm97paramyosin

Somula Muscle
Adult protein

30-60
30

Sj28-GST
Sj26-GST

Animaltrials–Sj97Animal
trialsparamyosin

Sm62-IrV-5, myosinAll
antigenstagesMuscleprotein

50-70

Sm28-TPI, TrioseAllstagesEnzyme

30-60

Sm23

All
stagesMembrane 40-50
antigen

Sj23

AnimaltrialsSm14-FABP

Somula Membrane 65
antigen (outbred)

Sj14

Research

Phosphate Isomerase

1. The rodents model isdifferent from humanschistosomiasis

Identity Phase

Sj62

Research–

2. The pig is one of the reservoir host of
Schistosoma japonicum.
3. Ethical clearance

Fecal eggs number (EPG)
in miniature pig infected with S.j

CLAWN miniature pigs
F1 (Landrace strain ×
Great Yorkshire strain)

CLAWN miniature pigs
Body weight
1 year after
birth

CLAWN
<40 kgDomestic 150~200
Pigs
kg
Established closed colony

EPG (g feces)• Developed by Y .Nakanish, Kagoshima Univ., in 1980s’
F1 (Göttingen strain ×
Ohmini strain)

The life span of S.japonicum ismuch longer than that of rodents.
(The pigs’ life span is around 40 years.)
One pair infection of Schistosoma in mouse isequivalent to 4000 worms infection in man.
(expected to be less than 100)

800
700
600
500
400
300
200
100
0
0

C-1
C-2

5

10 15 20 25 30 35 40 45

weeks

Eggs excreted into
feces at 7 weeks
postinfection

Vaccine trial 1.

x100

100µm

Miracidium
x400

x200

Attenuated Cercaria

Immunized group (3)0

14 wks6wks

400 Attenuated Challenge*
200 Cercaria
Cercaria

Delayed Type Hypersensitivity after
challenge infection with 200 cercariae

Fecal Eggcount

4 wks old :2.3kg~2.6kg*Attenuated Cercariae
20krad (200Gy at a rate of 33Gy/min)

Control group (3)P-09 (immunized)

P-05 (control)

Non-Immune healthy pigs

Fecal examination
EPG

P<0.004

600

Control400
200
0Immunized

4

5

6

7

8

Vaccine trial 2.
Mucosal Immunization with
Cholera toxin B subunits
and Paramyosin

9

Wks post infection

Cholera toxin B subunits (CTB)
1. No toxicity
2. Specific affinity for GM1-ganglioside located in
GALT (could function as an effective delivery
vehicle for vaccine antigens)ss

GM1-ganglioside

Immunized groups, CT+PM (3), CT (2), PM (2)0

1st

2nd 3rd Challenge

Immunization

2

4

6

8 9wksPerfusion

1. Immunization;
CT+PM: PM (500ug) + CTB (250ug)
2. Challenge: 200 S.japonicum Cercaria p.c.
3. Perfusion: Worm recovery, Tissue samples

Control group (2)No Treatment

-4 -2

0

2

1st

2nd 3rd Challenge

46

8 9wksPerfusion

1. Immunization;
CT+PM: PM (500ug) + CTB (250ug)
2. Challenge: 200 S.japonicum Cercaria p.c.
3. Perfusion: Worm recovery, Tissue samples

Immunization procedure

Vaccination schedules
-4 -2

-6

Control group (2)No Treatment

Cell membrane-6

Immunized groups, CT+PM (3), CT (2), PM (2)Immunization

A subunit

B subunit

Vaccination schedules

Anti-paramyosin antibody inthe intranasally immunized pigs
1.2

Oncomerania hupensis (Jiangsu strain, China)

nasal secretion

0.8

S-IgA
IgG

0.4
0
1.2

Serum

0.8

IgG

0.4
0

Cercaria

PM/CT PMCT

PBS

Challenge infection to Miniature pigs

Fecal egg number (EPG)
EPG
2000

PM+CT
CT
PM
CONT

1500
1000
500
0

5

6

7

8

Weeks after infection

Perfusion 9 weeks after challenge
ID
49*
50
54
55
56
58
59
62
65
66

Vaccine
CT+PM
CT+PM
CT+PM
CT
CT
CT
PM
PM
Cont.
Cont.

Male Female Total % recoverDied at 7wks after infection
52.0
88
16
104
56.5
95
18
113
55.5
80
31
111
75.5
108
43
151
58.0
86
30
116
50.0
87
13
100
69.5
117
22
139
80.0
135
25
160
58.5
87
30
117

Number of Female worm
No. ofFemale3020
100CT CT+PM (-)

Number of Male Worm
No. of
Male
150
100
50
0

CT CT+PM (-)

PM

PM

Serious Adverse Event Due to CT+PM
ID
49*
50
54
55
56
58
59
62
65
66

P<0.05

9

Vaccine
CT+PM
CT+PM
CT+PM
CT
CT
CT
PM
PM
Cont.
Cont.

Lung Pathology
Died with Pneumonitis
Pneumonitis
Pneumonitis
NormalMild Pneumonitis
NormalNornalNormalNormalNormalControl Lung (Normal)

CT+PM Lung

Summary
1.Domestic Pig
PM + titermax: 40% worm reduction.
As well as attenuated cercriae vaccination.
2.Miniature pig
Revealed to be Susceptible host.
Attenuated cercariae vaccine reduced egg
number.
Mucosal immunization decreased female
worm number.
Cholera Toxin plus PM provoked severe
acute pneumonitis after challenge infection
.

LIVER

control

CT

PM

CT+PM

Thank you…

Ryukyu Univ.
T.Arakawa
Juntendo Univ. T.Nara
Nagasaki Univ.
K. Watanabe, M. Kikuchi,
K. Ishii, E. Hamedo,
R. Ubalee M. Senba,
T. Iwasaki, H. Chen Y. Aoki

5. ＢＣＧの抗原性蛋白質と新規結核ワクチンの開発
大原直也

長崎大学大学院医歯薬学総合研究科口腔病原微生物学分野

はじめに
マイコバクテリウム属は好気性の非運動性、無芽胞桿菌であり、また、鞭毛、莢膜をもたない。細胞壁に多量の脂質、特にワックス用の極
めて疎水性の強い成分からなるために、酸、ア
ルカリ、有機溶媒に抵抗性が強く、抗酸菌（acid-fast bacillus）と呼ばれる。その中には多くの病原菌が属する。罹患数および症状の重篤度からみるに抗酸菌の感染による慢性疾患の中でもっとも重要なものは結核菌（Mycobacterium tuberculosis）による結核とらい菌（Mycobacterium leprae）によるハンセン病である。結核は 1999 年 7 月に厚生省が結核緊急事態を宣言したように日本においても相当数の新規患者数があるが、世界レベルではもっと深刻な問題である。WHO の統計によれば、世界人口の３分の１が結核菌に感染しており、全世界で新たに発生する結核患者は年間850 万人で、約 180 万人が結核で死亡している。結核による死亡者の 98％以上は発展途上国であり、特にエイズの合併が拍車をかけている。また多剤耐性結核菌が蔓延しており、その感染者数は約５０００万人にのぼると考えられている。結核菌は呼吸器を介して感染するが、感染後すぐに発症するのは感染者の約 10％であり、ほとんどは持続生残菌（persister）として冬眠状態のまま数十年にわたって潜伏している。その中のまた 5％程度のみが二次結核（内因性再燃）として発症する。そして残りの大半のケースはそのまま発症することもなく、宿主の死とともに死滅する。
一方、ハンセン病の日本における最近の新規患者数は、毎年、日本人は 5 名前後、在日外国人は 10 名前後であり、きわめて少ない。しかし世界的に見れば、現在治療を受けているハンセン病患者は 110 カ国 46 万人であり、また、
新規患者数は 2002 年 1 年間に 62 万人と報告されている。2002 年の国外における新患としては、インド（473,658）、ブラジル（38,365）、
ネパール（13,830）、 タンザニア（6,492）、
モザンビーク（5,830）、マダガスカル（5,482）に多数の発生が見られ、これら 6 カ国で世界の88%を占める。

このように結核およびハンセン病は今なお重要な感染症であり、新たな治療法の開発とともに予防法の確立、特に新規ワクチンの開発が強く望まれている。結核に対しては生菌ワクチンであるＢＣＧが広く使用されている。これはパスツール研究所の Albert Calmette とCarnille Guérin によって強毒菌である牛型結核菌（Mycobacterium bovis）を 15 年間、231
代にわたってグリセリン胆汁馬鈴薯培地に継代培養して得られた、病原性のない弱毒菌である。これまでに３０億人以上に接種され、持続性が長く、安全性についても十分に証明されている、しかも安価なワクチンである。当初は経口投与であったが、すぐに経皮投与に切り替えられ現在に至っている。また、結核だけでなく、他のマイコバクテリアによる感染症に対しても有効と考えられている。 しかし、さまざまな疫学調査の結果等からすると、その効果について疑問視されており、乳幼児に対しては有効であるが、成人の肺結核に対しては効果があまり無いというのが一般的な見解となっている。
ところで、ＢＣＧの効果を左右する要因として、用量、接種スケジュール、被接種者の遺伝的背景、環境中のマイコバクテリアとの接触頻度がある。また使用する亜株の種類によっても効果が異なることが示唆されている。ＢＣＧはもと
もと Pasteur 研究所で作成されたが、これが株分けされ、各国で使用されている。結核菌のゲノム配列が決定されたあと、各国で使用されている亜株のゲノムについて検討され、それぞ
れ亜株で様々な領域が脱落していることが明らかになった（Behr MA et al., 1999）。現在
WHO でどの株を世界の標準株とすべきかの検討がされている。
このような状況の中で著効な結核ワクチンの開発が求められている。結核ワクチンが保持すべき性状は、１回の接種で、長期の免疫効果（メモリー）が得られること、乳幼児に使用されている他のワクチンと併用できること、世界的使用できること、ツベルクリン反応を引き起こさないこと、そして安全、安定でかつ安価であることである。様々なタイプの結核ワクチン

の開発が世界中で進行しており、主要なものとして、DNA ワクチン、菌体蛋白質あるいは細胞壁脂質等を使用したサブユニットワクチン、免疫惹起能の強い蛋白質あるいはサイトカインを産生する組換えＢＣＧワクチン、弱毒（栄養要求株）化したマイコバクテリア、非定型抗酸菌がある。
結核ワクチンの開発ではマウス、モルモット、
カニクイサルが動物モデルとしてよく使用されている。マウスは結核菌に対して比較的抵抗性であり、重篤な病理像が見られない。しかし、細胞レベル、分子レベルでの解析が容易である。
これに対してモルモットは結核菌に対する感受性が高く、病変部位も人のものに近い。完全密封可能なチャンバー内にモルモットをおき、結核菌を含むエアロゾルを暴露する噴霧感染が推奨されている。しかし、サイトカインについてもまだまだ不明なものが多く、解析が困難である。カニクイサルはヒトに最も近い動物モデルであることから理想的であるが、使用できる数、施設ともに限られている。

らの結論であった。その後 1980 年代までリボ
ゾームワクチンの研究は様々な病原細菌に対しておこなわれた（Gregory RL, 1986）。その結果、免疫活性の本体については RNA にあるとするもの、蛋白質に由来するというもの、どちらにもあるというもの等いろいろであった。ところで、結核菌のリボゾームは 16S rRNA を中
心に 19 種類 22 個のリボゾーム蛋白質が集合した 30S サブユニットと、23S rRNA と 5S rRNAを中心に 34 種類 34 個のリボゾーム蛋白質が集合した 50S サブユニットが合わさった 70S
リボゾームである。我々はリボゾーム中の免疫活性の強い物質を探し、ワクチンとすることを企てた。リボゾーム画分は粗精製であり、さらに種々の蛋白質が含まれる。日本で使用されているＢＣＧ日本株からリボゾームを精製し、マウスを免疫するとフットパッド中に接種したらい菌の増殖を抑制した（Matsuoka et al.,1997, 図１）。

ところでマイコバクテリアではMycobacterium ulcerans が産生する
mycolactone 以外には毒素は知られておらず、
マイコバクテリアの感染によって生じる病態
は主に感染宿主の免疫反応によって生じる。一般に細胞性免疫優勢に傾けば、感染した菌を排除する方向に働くと考えられている。したがってサブユニットワクチン、DNA ワクチンあるいは組換えＢＣＧワクチンを作成においてはＴ細胞を強く活性化する抗原を標的とする場合が多い。これまでにマイコバクテリアのさまざ
まな抗原蛋白質が調べられているが、抗原性の強い蛋白質の主要なものに・抗原群(Ag85,
MPT/MPB51)、ESAT6、CFP10、ストレス蛋白質(HSP65, ・-crystallin)、Mtb8.4、Mtb9.8、Mtb32、Mtb39、Mtb40、Mtb41、19kDa lipoprotein、
PE-PGRS、PEE-MPTR ファミリーが知られている。
ＢＣＧのリボゾームの免疫活性とリボゾーム
ワクチン
我々はリボゾームと分泌蛋白質について着目し、研究を進めてきた。Youmans 夫妻は 1960
年代に、結核菌弱毒株 H37Ra 株のリボゾーム画
分で免疫することにより結核菌強毒株 H37Rv
株の感染を予防できることを示した（Youmans
AS and Youmans GP, 1965）。そして、その本体はリボゾーム中の RNA であるというのが彼

しかし、リボゾームを RNA 画分と蛋白質画分に分画するとその効果は著しく減少した。遅延型
過敏反応（DTH 反応）と T 細胞の増殖反応についても 70S リボゾームの場合には精製ツベル
クリン（PPD；purified protein derivative）と同程度の活性を示したが、RNA 画分と蛋白質
画分に分画した場合にはいずれの画分もその活性が著しく減少した。次に蛋白質画分から精製した各リボゾーム蛋白質について T 細胞の増殖反応を調べたが、強い活性を示すものは認められなかった（Miyazaki et al., 1999）。
さらに一度分画した RNA 成分と蛋白質成分を同時に接種しても活性が戻らなかった。以上のことからリボゾームの免疫活性は RNA 成分と蛋白質成分が複雑な構造をとることにより生じるものであるとの結論に至った。
分泌蛋白質の抗原性ＢＣＧによる感染防御免疫は生菌の接種によって得られるが、死菌では得られないことがよく知られている。生菌と死菌の違いとして、菌体外へ産生分泌される成分の有無があげられる。すなわち、生菌では分泌蛋白質と総称される種々の蛋白質が持続的に菌体外に産生・分泌されるが、死菌ではそれらの分泌はほとんど無い。Pal と Horwitz は結核菌の分泌蛋白質で免疫することによりある程度の結核菌の感染
防 御 が で きた こ と を 報告 し て い る（ Pal &Horwitz, 1992）。分泌蛋白質によって誘導される感染防御免疫はらい菌の感染に対しても有効である（Matsuoka et al., 1997）。結核菌、ＢＣＧの培養上清中にはさまざまな蛋白質が含まれる（図２）。

この中で 抗原を含む Ag85 complex という蛋
白質群が感染防御抗原であることが最初に示された（Horwitz et al., 1995）。 抗原が始めて精製、同定されたのは約 40 年前であり、阪大微研の米田博士と福井博士によってなされた（Yoneda & Fukui, 1965）。両博士によりこの蛋白質抗原は高度な純度にまで精製され、結核菌の主要蛋白質抗原であることが明確に示された。1989 年に当時阪大微研にいた山田毅
博士と味の素株式会社中央研究所によってＢ
Ｃ Ｇ の 抗 原 遺 伝 子 がク ロ ー ニ ング さ れ た（Matsuo et al., 1988）。この遺伝子レベルの解析がきっかけとなり、その後海外のグループにより構造の類似した蛋白質抗原が複数ある
ことがわかり、Ag85 complex と総称されている。Ag85 complex は 85A、85B= 抗原、85Cの３種類の蛋白質からなり、結核菌では全分泌蛋白質の約 30％を占める。その後同じく産生量の多い分泌蛋白質である MPT/MPB51 蛋白質が部分的に類似の配列を持つことが明らかとなった（Ohara et al., 1995）。 抗原はフィブロネクチンと結合すること、また、ミコール酸の合成に関与する酵素であることが明らかとなった。Ag85 complex は IFN- の産生を誘導し、感染を予防する防御抗原であることもわかってきた。Ag85 complex の感染防御免疫
誘導能は高く、C57BL/6 マウスを用いた実験では 2mg の免疫でらい菌の増殖を抑制することができた（Naito, 2000, 図３）。

組換えＢＣＧワクチン
1980 年後半、抗酸菌に遺伝子組み換え技術が導入されたことによってＢＣＧに新たな展開がおこった。組換えＢＣＧワクチンの開発である。まず米国 Bloom のグループがＢＣＧに形質転換可能な抗酸菌−大腸菌シャトルベクターを開発した（Snapper et al., 1988）。ほぼ同時にフランスパスツール研究所でも同様のベクターが開発された。またバクテリオファー
ジを利用した系も開発されている。1991 年、
Bloom のグループ（Stover ら）と Young のグループによって、これらのベクターを利用して外来遺伝子を導入したＢＣＧを作成し、宿主に免疫応答を誘導させた報告がなされた(Stover
et al., 1991; Aldovini & Young, 1991)。前述の山田毅博士と味の素株式会社中央研究所のグループは・抗原の分泌シグナルを応用し、外来抗原をＢＣＧ菌体外に分泌する系を開発した（Matsuo et al., 1990, 図４）。

Stover らは 1993 年に Borrelia burgdorferi

の表層リポ蛋白質を発現するＢＣＧを動物に投与し、感染を防御できたと報告したが、これが組換えＢＣＧによる感染防御の最初の報告である（Stover et al., 1993）。これまでにさまざまな病原体および疾患を対象に組換え
ＢＣＧの作製が行われている（Ohara et al.,2001a）。ところで、我々は分泌系をベースとして組換えＢＣＧの研究を行ってきた。まず味の素中央研究所および北大免疫研の生田和良
博士のグループとの共同研究で、HIV-1 の V3
領域の 15 アミノ酸をコードする DNA 断片を・
抗原遺伝子に挿入し、このキメラ蛋白質を発現する組換えＢＣＧを作製した。この研究はこの組換えＢＣＧを接種されたマウスではこのエ
ピトープ特異的な CD8 陽性 CTL が誘導された（Kameoka et al., 1994）。また HIV-1 の gag
p17 の B 細胞エピトープと・抗原のキメラ蛋白質を発現する組換えＢＣＧを接種したマウス
では最終免疫後このエピトープを認識する交代の産生が 14 ヵ月以上持続した（Wada et al.,1996）。ところで、菌体成分の中で感染防御抗原が明らかとなれば、それを多く産生させることで、ＢＣＧのワクチンとしての効果を上昇できる可能性がある。Ag85 complex の遺伝子をプラスミドにつなぎ、そのプラスミドでＢＣＧ
を形質転換することによって Ag85 complex 過剰産生株を作製し、感染研松岡博士、野間口博
士との共同研究で感染防御実験をおこなった。
Ag85A 過剰発現株 rBCG/85A あるいは Ag85A、・
抗原(=85B)および MPB51 の 3 抗原を過剰発現す
る rBCG/BA51 で免疫したマウスでは、その後感染させたらい菌の増殖が顕著に抑制された（Ohara et al., 2000, 2001b）。その効果は親株であるＢＣＧ日本株よりも顕著であり、BALB/c マウスにおいては５匹中４匹において検出限界以下であった（図５）。

これらの過剰発現株接種マウスにおいてはマ
イコバクテリアの感染防御に重要な IFN-・及び NO 産生量は増加していた。ほぼ同時に
Horwitz らは異なる作製法により Ag85A 過剰発
現する組換えＢＣＧを作製し、結核菌に対する感染防御効果が強いことを報告している（Horwitz et al., 2000）。Ag85 complex はDNA ワクチンの対象にもなっており、有効であるとの報告が複数のグループによってなされている。我々もマウス及びモルモットを用いて、結核菌の感染に対して Ag85 過剰発現株およびAg85 DNA ワクチンの効果を調べ、著効であることをモルモットおよびマウスを用いて確認した。現在近畿中央胸部疾患センターの岡田全司博士との共同研究で、感染防御に有効な他の抗原についても組換えＢＣＧを作製し、動物実験を進めているところである。
おわりに
この約 15 年あるいはその基礎研究からすると 20 年の間に様々なタイプの抗結核ワクチン
候補が作製され、その数は 350 種類以上にも及ぶ。動物実験では効果の著しいものが多く報告されているものの現行のＢＣＧワクチンを凌駕するものは少ない。その中にあっても幾つかについては有望とされ、phase I の臨床試験に入っている。しかし、結核という病気そのものが長い経過を経る慢性疾患であり、感染後すぐに発症する割合も低いことから、実際にそのワクチン候補が有効であるかの判定が難しく、しかも判定まで長期の時間がかかる。現在開発中のワクチン候補の判定が下されるのは数十年後とみられている。組換えＢＣＧワクチンについてもその真の評価が下されるまでに長期間かかるであろうが、動物実験だけでなく、実際にヒトに対しても有効なワクチンの開発をめざしたい。
謝辞
ＢＣＧの抗原とＢＣＧの宿主―ベクター系
については味の素株式会社中央研究所松尾和浩博士ら、リボゾームの研究は九州大学大学院
農学研究院の木村誠博士のグループ、HIV-1 については北海道大学免疫科学研究所の生田和良博士（現大阪大学微生物学研究所）のグルー
プ、らい菌の感染実験は感染症研究所ハンセン病センターの松岡正典博士と野間口博子博士、結核菌の感染実験はモルモットについては感染症研究所の山本三郎博士と Texas A&M のDavid McMurray 博士のグループ、マウスについては国立病院機構近畿中央胸部疾患センターの岡田全司博士のグループとの共同研究である。共同研究を推進してくださいました皆様にお礼申し上げます。また、全体を通じてほとんどの研究は長崎大学名誉教授山田毅博士のリーダーシップのもとにおこなわれた。この場を借りて感謝の意を表します。
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thanconventional
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アンパラ県カルムナイ地区

スリランカ先遣隊現地報告••

國井 修 熱帯感染症研究センター・教授
錦織信幸 熱帯感染症研究センター・助手
冨尾 淳 東京都立墨東病院・救急医
鈴木 基 井上病院・感染症医（熱研・内科）
阿部朋子 熱帯感染症研究センター・大学院生•

津波の影響を受けたのは海岸から１キロまでの帯状の住宅密集地（ピンク色の地域）
アンパラ市内への道は左手に続く
ここで主に紹介するのは地図の中心あたり、サイナマルドゥとカラティブの二つの小行政区域の様子である

第29回日本熱帯医学会九州支部大会（2005年1月、長崎）
アンパラ市内には津波による被害はない

Ampara県Kalmunai地区の被災状況• 椰子の木の並ぶ砂
浜沿いに幅１kmの住宅密集地域が約10kmにわたって続く• 周辺は海抜２ｍの
水田・湿原地帯

Ampara県Kalmunai地区の被災状況
海岸線に沿って帯状に分けられる被災レベル– 海岸から200m：severely affected area
– 200~500m：moderately affected area
– 500~1000m: slightly affected area
– 1000m: non-affected area

• 主な産業は漁業

Ampara県Kalmunai地区の被災状況• 被災後４８時間はほぼ全域で電力供給停止– その後はseverely affected area以外では復旧

Sainthamaruthu区域の場合• 幅１ｋｍの帯状の住宅密集地域• 1.5kmの海岸線• Kalmunai地域には80の避難所に101980人の被災者（現在はもっと少ない）←Sainthamaruthuの地図• 地域内のSainthamaruthu地区の避難所で日本の国際緊急援助隊（JMTDR）が活動

右側が海岸線
中心の青い線の右側（500m）が津波が直接及んだ地域

Sainthamaruthu地区の場合
海岸から200m：severely affected area (1)Sainthamaruthu地区の場合
海岸から200m：severely affected area (2)• 全面的に津波に覆われた• 大部分の建築物が倒壊• 倒壊を免れた建築物も内部の破損が著明

水道、電気などライフラインの長期的な途絶
浸水による井戸の汚染

Sainthamaruthu地区の場合
海岸から200m：severely affected area (3)海岸から約100mにあったDistrict Hospitalと、海岸周辺の様子

Sainthamaruthu地区の場合
200~500m: moderately affected area

• 波が押し寄せたが、浸水は軽度• 一部の建築物の倒壊• 水道供給の停止• 井戸への影響

Sainthamaruthu地区の場合
500~1000m: slightly affected area
• 建築物の倒壊なし• 浸水はあってもごく軽度• ライフラインの途絶なし• 現在は通常の生活が営まれているアンパラ県はスリ
ランカ最大の被災地である
SAINTHAMARUTHUは、住人
18,000人のうち、1,500人が死亡し、14,000人が避難生活を送っている。

Al-HilalVidiyalayaキャン
プは、3階建ての小学校校舎に、3200人が生活していた。
訪問すると、たくさんの子供たちが集まってくる。

全部で8つの避難民キャンプが設置され、多くは小学校を利用している。

概して元気な様子
だが、家族を失った子供も少なくな
い。

避難民登録をする家族。

新学年が1月25
日にはじまるた
め、スリランカ政
府は仮設住宅を建設中である。

ローカルNGOのUNITEDFRIENDSHIPWELFAREORGANIZATIONが難民キャンプを統括
し、政府組織、
国内外NGOの調整を行っている。

しかし、まだ着工したばかりで、
開校には間に合わない可能性が高い。

ひとつの教室に40人以上が寄り添うように眠る。
教室内で寝るのは女性と子供
だけで、男性は外で寝る。
「こんなところに40人も寝られるわけがない」と言うと、「じゃあ
夜来てみろ」と言われた。

食事はスリランカ政府から、１日３回配給される。不足分は、UFWOが提供している。配給は各キャンプを巡回するため、このキャンプでの配給時間は、昼０時、夕方４時、夜１１時である。

日本の災害医療援助
団体HuMAとアメリカのNGOが共同で医療を提供している。各支援団体
は、スリランカ保健省が開催する調整会議で意見交換する。

診察を待つ人たち。津波にともなう外傷は徐々に減少している。感染症のアウトブレイクは報告されていない。一方、現場ではメンタルヘルスケアの需要が高まっている。

手前にも2つのトイレがあったが、現在は埋められている。黒いタンクの水は雑用水である。

廊下のつきあたりにトイレがある。簡易水洗式
が4つ、この他に仮設トイレが2つある。

トイレの5m程度手前にある水道（雑用水）

水道で顔や手足を洗う子どもたち

小学校の給水塔は機能しており、敷地内の水道水はここから出ている。

黒いボトルに配給された飲料水が入っている。飲料水
はこの避難所に対し、毎日6000L政府から配給される。

小学校の教室で、一世帯概ね160×270cm程度の空間に暮らしている。

教室の一角で食事の準備をする女性。ロッティーを焼き、カレーがないので砂糖をかけて食べると話す。

どの世帯も荷物は少なく、せまい空間を整理して暮らしている。

みんなで水浴びに出かけている。一教室には5〜7世帯が生活している。

世帯間は、机で区切られただけである。

生後1ヵ月半の乳児とその母親。この教室には7世帯が生活している。

はじめに• 津波後の感染症流行により15万人死亡の恐れ（WHO）• 今後の感染症流行予測は容易ではない• 現状の記述・分析も不十分• 信頼できるEvidence（data）がない• 被災地域によって状況が異なる

生後3ヶ月の乳児とその母親

生後1ヵ月半の乳児とその姉

洪水災害での健康影響• 直接的– 溺死、外傷• 間接的– 消化器系疾患（下痢症、肝炎など）、呼吸器系疾患（肺炎、喘息など）、皮膚疾患、眼疾患、精神疾患など

感染症流行の可能性

現況

2004年12月26日スマトラ島沖で発生– 汚染飲料水・食事による• 下痢症（コレラ、赤痢、大腸菌、ロタ、ジアルジア）、A型[E型]肝炎

死者＞16万人（旅行者＞5000– 汚染水との接触人）• レプトスピラ症、野兎病、[サルモネラ症、破傷風] 、アメー
バ角膜炎、[トラコーマ、皮膚感染症]

被災者＞300万人– 媒介動物との接触

被災医療機関• マラリア、デング熱、 [回帰熱、発疹チフス、フィラリア症]– 人口の密集

（1月5日時点）• [ポリオ、麻疹、結核][ ]内は論文発表としてはないが危険性あり

わが国の対応2

世界と我国の対応• アナン国連事務総長の9.77億ドル緊急ア
ピール• 各国は２０億ドル以上の支援を表明• 日本は2位の5億ドルの無償支援– ２億５千万ドル：国際機関を通じた支援– ２億５千万ドル：二国間無償支援– 資金、人的貢献、知見の３点での支援

各国の感染症流行状況（1/6現在）• インドネシア： 流行なし
• タイ

： 流行なし（散発的な下痢症、食中毒、マラリア、デング熱報告あり）• インド• 人的貢献： JICA国際緊急援助隊（JMTDR） 、自衛隊、NGO (Japan Platform等)– タイ、インドネシア、モルディブ、スリランカ– 医療、衛生、物資の輸送等• 物資援助： テント、毛布、浄水器、発電機、医薬品など

流行危険因子
宿主

病原体
病原体

低栄養＋摂取↓予防接種率↓
免疫力↓
生活・予防行動↓増殖↑
接触・伝播↑：流行なし（散発的な下痢症、麻疹）• スリランカ： 流行なし（下痢症報告↓）• モルディブ： 流行なし（散発的な下痢症、肺炎）

環境上下水↓、ベクター↑、医療施設↓、アクセス↓、遺体腐敗↑ 、
廃棄物↑、人口密集・移動↑

各国の対策

感染症対策１ー緊急的• インドネシア：• 早期診断・早期治療– 詳細不明、WHO/UNICEF支援– 高危険集団（子供、妊婦、高齢者、障害者）のケア• タイ– 予防接種、ベクターコントロール• 安全な水・食料の確保、微量栄養素• インド– 政府の1348医療チームが派遣・活動– 80%のポンプ井戸が回復、塩素（ハロゲン）剤が配布• スリランカ– Batticaloa県80キャンプの対策が遅れている– 2~15 lit、2100 Kcal人・日、Vit A, 鉄、ヨード• 居住空間と衛生– 3.5（45）m2/人、トイレ（20人に1つ）– 衛生動物・害虫の駆除– 急性期は過ぎ、中長期的対策の必要性を認識• モルディブ
– 感染症流行サーベイランス、麻疹予防接種済

Banda Ache

対策２ー中期的

Before• ベクター回避・コントロール– 殺虫剤浸漬蚊帳、残留噴霧– 寝具・衣類の清潔保持、排水• 遺体・廃棄物処理– 墓地は水源から30m以上、地下水面から1.5m
上にする• 健康教育・行動変容

After– 文化・習慣による

2005年1月7日

2004年5月18日

インドネシア