られており 1），近年はこれをシステム化した装置の開発が進んでいる 2）．
ここで，走査型電子顕微鏡（SEM）は低倍から高倍までをTEM 像に迫る，リターディング法を用いた樹脂包埋生物標本の SEM 反射電子観察とFIB/SEM トモグラフィーへの応用
Improved Block Face Imaging and FIB/SEM

連続的に観察できる光学顕微鏡と TEM の中間的な位置に存在する．医学・生物学分野で SEM 観察と言えば，二次電子による凹凸像観察が一般的であった．しかし，近年の低加速
電圧 SEM 観察の進歩により，Block Face Image（BFI）とよばれる二次元構造情報をもつ画像を得ることができるようになった 3）．SEM を用いて平滑な試料表面を低加速電圧条件

Tomography from a Resin-Embedded Biologicalで観察して得られる反射電子像は TEM 像と同様の画像コン

Specimen Using Back-Scattered Electrons

トラストを持つ．この BFI は TEM と SEM の両方の利点をwith a Retarding Method

併せ持ち，全体から詳細に至るまでを連続的に観察でき，ま太

田啓介，中村桂一郎

Keisuke Ohta and Kei-ichiro Nakamura
久留米大学解剖学講座顕微解剖・生体形成部門

た，後述する組織・細胞レベルの 3 次元再構築を可能にする基礎技術となる比較的新しい観察法である 3,4）．
しかしながら，BFI は TEM に比べてコントラストノイズ比が小さく，汎用型（アウトレンズ型）SEM を用いて分解能の高い BFI 像を得ることは容易ではなかった．我々は試料台とビームカラムの間に負電位を掛ける減速法（リター要旨

重金属染色した樹脂包埋生物試料のブロック表面からの SEM 反射電子組成像は超薄切片の TEM 像と同等の構造情報を持つ．この組成像の像質は試料台とカラムの間に負電圧をかけるリターディング法により劇的に向上し，TEM 像に迫る分解能が得られる．FIB/SEM トモグ
ラフィー法に応用すると TEM を用いた電子線トモグラ
フィー法に準ずる分解能でより大きな構造を解析できる．
これらの新しい生物組織観察法は，偶然得られる良い断面図に頼ることのない確実な構造観察を可能にする．

キーワード：減速法，FIB/SEMトモグラフィー，生物試料，組成像ディング法）を用いることで従来の汎用型 FE-SEM を用いて BFI の画像が劇的に改善されることを見いだした 5,6）．減速法は低加速電圧観察技術の一つとして，主に材料分野で用いられてきた技術である 7）．
本稿では医学生物学分野における BFI 観察の利点を紹介した上で，減速法による画像改善，さらに FIB/SEM を用いた三次元再構築法への応用について我々の取り組みを紹介し，リターディング法を用いた低加速電圧・低電流観察による新しい生物組織観察法を解説する．
2.

1.

Block Face Image の利点

BFI は試料ブロックの表面像でありながら，あたかも超薄はじめに切片を透過型電子顕微鏡（TEM）で観察したものと同様のコ

医学・生物分野の主な観察対象は細胞や組織である．近年

ントラストを持つのが特徴である．SEM のビーム照射に伴っの蛍光顕微鏡や超解像技術の発展により，蛍光物質を用いてて得られる反射電子は試料自身の元素分布を反映した情報を描出されるものの微細構造はかなり詳細に観察できる様に含む．特に重金属で en bloc 染色した樹脂包埋試料をウルトラなってきた．一方で，蛍光物質で標識されているものは組織ミクロトームなどで面出しし，その平滑な試料断面に電子線が持つ構造のほんの一部に限られることに注意しなければなを照射した場合，得られる信号は細胞の膜構造やタンパク質らない．目標物とその周囲の構造を含めた組織の特徴を詳細複合体など重金属で染色され易い構造に一致して高いシグナに把握するには構造全体を漏らさず観察できる透過電子顕微

ルが得られる．走査型透過型電子顕微鏡（STEM）と比較する鏡（TEM）との併用が重要になる．細胞や組織は電子顕微とその原理がわかりやすい（図 1）．STEM 像の場合，薄膜切鏡観察レベルで結晶構造のような規則性を持たないことか片内部に存在する重金属に染色された構造に照射された電子ら，これらの特徴を正確に把握するためには数多くの試料をが散乱されることによりコントラストを得る．この時，試料観察し，その全体像を類推していくことが必要である．しか後方に散乱する電子は，照射される相手が切片でもブロックし，光学顕微鏡と TEM の分解能の差は大きく，両者の像解でも，およそ同じ現象が起き，反射電子の量は透過電子の量釈にしばしば乖離をもたらすことがある．これに対する一つと負の相関をする．つまり，反射電子を信号として用いるこの取り組みとして，同一の試料を光学顕微鏡から電子顕微鏡とで切片を作ることなく TEM や STEM と同等の像を取得でへ連続的に観察する Correlative Microscope という手法が知きるのである．これによって得られる利点は大きく 3 つある．

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E-mail: kohta@med.kurume-u.ac.jp
2012 年 6 月 5 日受付
176①薄切の必要が無い：BFI では平滑な断面さえ作れれば観察できるので，薄切が困難な試料を容易に観察できる．腱や昆虫のクチクラ層といった樹脂浸透の悪い組織でも，面を作
顕微鏡 Vol. 47, No. 3（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

3.

BFI の像形成とリターディング法による像改善

高い分解能を持つ BFI 観察を行うためには低加速電圧・低プローブ電流という条件下の観察を行う必要がある．SEMでブロックの表面を走査する場合，入射ビームが試料と相互作用する領域を情報源サイズと呼び，これが分解能を規定する大きな要素となる．情報源サイズは入射電子の加速電圧に依存するため，加速電圧を下げることで分解能向上につながる．一方プローブ電流が大きくなればプローブサイズ・情報
図 1 STEM 像とブロック表面からの SEM 組成コントラスト像（BFI）の比較（文献 6）

源サイズも大きくなり分解能向上は望めない．これらのことから BFI では出来るだけ低加速電圧で，それに見合う低プローブ電流を用いることが重要となる．ブースティングレン
ズ方式を用いた高分解能 SEM 10）を用いれば，極低加速電圧・低プローブ電流の観察条件において高分解能・高コントラス
ト BFI 像を得ることはできる．しかしながら汎用型 SEM を用いてこのような条件下で高いコントラストを得ることは難しい．低加速電圧・低プローブ電流では情報源サイズは小さくなるが，コントラストノイズ比も急激に小さくなり画像を

図 2 BFI 観察では臓器の全体から高拡大までを連続的に観察できる．標本はラット網膜（文献 6）取得できないのである．従って，これらの条件がかみ合う部分が最適な動作条件となる．汎用型 SEM でも，高い分解能を必要としない場合は大きなプローブ電流を用いることでコントラストノイズ比を得ることができる 11）．我々が使用してる事はそれほど難しくはない．さらに未脱灰骨断面などの硬いる汎用型 FE-SEM（Quanta 3D FEG, FEI）の情報源サイズ組織や，セラミックとの界面などは FIB を用いた試料面作が最も小さくなる現実的な条件は加速電圧 1.5 kV，プローブ製を行うことで，詳細に観察することが出来る．

電流 10 pA 程度であるが，通常この条件で十分なシグナルを②広範囲観察：生物組織観察では全体像の把握は重要であもつ BFI 観察を行うことは難しい．

る．臓器全体を俯瞰的に観察することで，人為的なセレクショ低電圧観察法の一つとして知られているリターディング法

ンエラーを起こしにくくすることができる．BFI は SEM では試料とカラム間に負の電圧を掛けることで，一次電子を試取得するため原理的には cm オーダーの標本を nm オーダー

料直前で減速させる方法である．このリターディング法は，まで連続的に観察することが可能である．図 2 にラット網電子の減速という効果以外に，カラムと試料の間にカソード膜の全層を BFI で撮影したものを示す．このような範囲をレンズを形成し，これが球面収差と色収差を大きく軽減，像TEM で観察する場合，単孔メッシュを使わない限りグリッ質の改善につながることが知られている 12）．我々は，このリドに視野を邪魔されることが多く，広範囲の観察は努力が必

ターディングを BFI に応用し，その像質改善について検討要であった．

した．

③三次元再構築：SEM 内に FIB 4,5,8） や小型のミクロトー
3）

試料はラット肝臓をフェロシアン化カリ - 四酸化オスミウ

ムを組み込むことで ，試料を連続的に切削し，切削ごとにム，酢酸ウラン，アスパラギン酸鉛で en bloc 染色し，型どBFI を取得すると，TEM を用いた電子線トモグラフィー

おりに EPON 812 樹脂に包埋，ミクロトームにて面出しをし（TEM トモグラフィー）よりも大きな領域を 3 次元再構築すたものである 5,13）．リターディングの有無を除いて各画像はる こ と が で き る． 前 者 は FIB/SEM Tomography も し く は同条件で取得し，同じ画像処理をしている．リターディング

6,9）

ISAR（Serial Ion Ablation and Reconstruction）などとよば法を適応したものでは，図 3 に示すように明らかにコントれ，5 μm 角～ 100 μm 角の領域を完全に再構築して解析する

ラストが上昇しており，分解能も向上がみられた．しかし，ことができる．これは従来の連続超薄切片法と同様の結果をFIB で作為的に作製した試料面の凹凸（カーテニング）はリもたらすが，画像取得が自動化されるという点と，ブロックターディングにより過度に強調されており，この観察法ではの表面観察であるため歪みがなく，得られたデータに定量性試料表面の平滑性が重要であることがわかる（図 3c，f）．一が有るという点で特徴がある．また切削幅を数 nm に設定す方，加速電圧との関係を見ると，通常状態ではほとんどシグることで，高い空間分解能を得ることも可能となる．

ナルを検出できない低加速電圧条件（1.5 keV）であっても，このように BFI は従来の観察法を補完する多くの利点をリターディングにより明瞭に観察できることが判る（図 4）．

もっているが，高分解能な像を取得するという点で未だ問題

これは，リターディングにより反射電子が加速され，検出器が残る．の検出効率が高くなったこと，また，低角度散乱電子の軌道

最近の研究と技術リターディング法を用いた樹脂包埋生物標本の SEM 反射電子観察と FIB/SEM トモグラフィー

177【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

ちカソードレンズを作る事で像質を改善するため，試料の大きな凹凸や傾斜が像に影響する．実際，樹脂包埋標本を試料台ごと傾斜させると，強い非点が生じて良好な像を得ることは出来なかった（図 5a，b）．
我々は FIB/SEM トモグラフィーにリターディング法を応用するため，図 5c に示す新しい試料台を開発した．試料台中央には直径 2 mm の斜めのピットが作られている．試料台を SEM に対し水平に設置したときこのピットは FIB 軸と同角度（38°）の傾斜を持つ．このピットにロッド状の試料を挿入すると，試料台の上面を SEM に対して水平に維持した
図 3 ラット肝臓を包埋した樹脂ブロック表面を SEM にて観察（照射電子エネルギー 5 keV）．上段は通常の反射電子像，下段はリダーディング（2 kV）を掛けている．平滑面の低倍（a，d）
像と拡大像（b，e）ではいずれも組成コントラストが高くなり，リターディングにより像質が改善している．一方，凹凸のある断面（c，e）ではリターディングにより，凹凸が強調されて内部構造が確認できない．（文献 5，一部改変）

まま，試料面のみ 52° 傾斜し FIB 軸に直交した状態となる．
この状態で FIB で切削した断面は SEM 軸に対し 38° 傾斜する．この試料台を用いた場合リターディングモード下であっても傾斜した FIB 切削面からの BFI 像に強い非点は現れず，水平設置した時と同様，高い分解能で撮影することができた．
この試料台上で試料は±0.8 mm の凹凸を持つためカソードレンズへの影響がゼロではない．しかし，その影響は，分解能に影響する他の様々なファクターよりも小さいところまでがカラム方向に曲げられることにより，より多くのシグナルに押さえ込むことが出来ていると考えられ，リターディングを検出できたことがコントラストを増加させた要因と考えらモードでの FIB/SEM 観察が可能であることが判る．

れる．これらの複合的な効果により汎用型 FE-SEM でも分解能 5 ～ 4 nm の BFI 観察像を得ることができた．

実際にラット肝臓の細胞質の一部分をリターディングモードを用いて FIB/SEM で観察し，3 次元再構築したのが図 6とはいえ，SEM により得られる像コントラストの成因，である．提示した例では照射電圧 3 KeV 負電圧 1.5 kV，プロー分解能の解釈はいまだ定まっていない．詳しくは成書を参照

ブ電流 10 pA の条件にて反射電子像を取得した（検出器：していただきたい 14）．この点は本学会においても「SEM のvCD, FEI）．FIB に よ る 一 回 の 切 削 厚 は 10 nm で， 切 削 と物理学」研究部会において活発な議論が行われている最中でBFI 観察を 650 回繰り返して得られたデータである．およそある 15）．

6 μm 角の領域をボクセルサイズ 6 nm×6 nm×10 nm，空間4.

ガネラの分布はもちろん，ミトコンドリアに注目するとそのリターディングと FIB/SEM トモグラフィー

FIB/SEM での試料加工と観察は，試料面が FIB 軸に直交分解能 20 nm 程度で再構築している．核膜孔や様々なオルクリステ構造を詳細に観察できる．

した状態，すなわち SEM 軸に対して傾斜した状態で行われミトコンドリアの膜は外膜と内膜の 2 枚からなり，クリスる．一方，リターディング法は試料表面に強い電界，すなわ

テはこの内膜が内腔に棚状に突出した構造だと理解されてい図 4 樹脂包埋生物サンプルの SEM 組成コントラスト像における照射電圧（Landing energy）とリターディング（2 kV）による像形成．（a）通常の観察では，2 keV 以下の照射電圧では画像が得られなかったが，リターディングを行ったものでは 1.5 keV で十分な像が得られる．一方，高い照射電圧ではいずれも像は得られるものの，鮮明さに欠ける．輝度分布を比較すると，この標本をこの倍率で観察したときには照射電圧 2 keV，リターリング 2 kV で最もコントラスト比の高い画像が得られている（b）．（文献 5，一部改変）
178

顕微鏡 Vol. 47, No. 3（2012）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

る．隣接するクリステ同士の距離は 30 nm 程度であり，これまでミトコンドリア全体のクリステ構造を把握することは困難な課題であった．TEM トモグラフィー法により，クリステが外側の境界膜と連結する部分に「クリステジャンクション」と呼ばれるチューブ状の構造を持つことが示唆されていたが 16），直径数ミクロンあるミトコンドリア全体の膜構造をこの方法で解析することは容易ではなかった．一方，今回の FIB/SEM トモグラフィー像の Z 分解能は，TEM 連続切片法に比べて 1 桁小さく，水平分解能もクリステ構造を観察するには十分であり，また TEM トモグラフィー法に比べて圧倒的に大きなボリュームを観察することが可能である．この観察により，クリステジャンクションがミトコンドリア全体に存在していることが明らかとなった．
このように新しい試料台を用いることで，リターディング
条件下においても傾斜したサンプルから高解像度な BFI 像を取得することが可能であり，リターディング法を FIB/SEM トモグラフィーへ応用できることが実証された．
5. まとめ図 5 リターディングが傾斜試料の画像に与える影響，傾斜することで傾斜軸に対し，修正困難な非点が生じる（a，b）．試料傾斜が必要な FIB/SEM に対応する新型試料台の構造とその写真（c）．試料台を SEM に水平に設置すると，試料面のみFIB 軸に直交する．試料の大きさを直径 2 mm にすることで，凹凸を極力少なくした．実際に（c）の試料台に試料を設置し（d），組成像を取得，非点のない精細な画像が得られた（e）．（文献 5，一部改変）

今回紹介した低加速電圧下の BFI 観察や FIB/SEM トモグ
ラフィー法は，“By chance” に依存しない確実性の高い顕微鏡観察法として生物分野において有効な手段となり得る．現在の医学生物学分野の研究における電子顕微鏡の位置づけ
は，様々な生化学的実験結果を形態学的側面から裏付けるツールとして用いられることが多い．つまり多くの場合，期待される事前情報がある．一方，通常の TEM を用いた研究では，多くの場合，試料全体のほんの一部しか観察することはできない．細胞や組織といった生物学標本の TEM 像は一つとして同じ構造が出現することのない極めて雑多なものであるにもかかわらず，このような状況で，都合のよい画像が見つかると，どんなに批判的な目をもって観察していても時としてミスリードされた解釈が引き起こされやすい．従って，今後の電子顕微鏡観察にはこのようなヒューマンエラーによるリスクを極力低下させる，確実性の高い観察手法が求められる．前述の Correlative 顕微鏡はその一つの流れであると言える．それに加えて，注目する構造を広範囲に俯瞰的に観察すること，そして，注目領域については 3 次元的再構築を行い，像解釈の確度を高めることがより重要になると考えられる．低加速観察条件を用いた BFI そして FIB/SEM トモグ
ラフィーはこれらを実現する十分なポテンシャルを持っているといえる．特に後者はこれまでの手法に比べて高い定量性図 6 図 5 の試料台を用いてえられた肝細胞の FIB/SEM トモグラフィー像．約 6 μm 角の領域を再構築した（a）．一つのミトコンドリアに対して作製した連続スライス像（b）では，ミトコンドリア外膜に接線方向に得られた断面ではクリステの断面がチューブ状を呈する．一方，垂直方向に得られた断面で見られるクリステが外側の膜と連結は，その前後の面で観察できず，この連結がチューブ状であることを示唆している．セグメ
ンテーションを行ったミトコンドリア全体の膜構造（c）とそこから抽出した 3 枚のミトコンドリア（d）．外側の膜との接点はいずれもチューブ状を呈する（矢印）．（文献 5，一部改変）

最近の研究と技術を持っており，生物分野の形態観察に統計解析的手法を導入して比較検討できる点で画期的な手法である．
今回我々が用いたリターディング法は，その機構が単純であり，また汎用型 SEM に導入してその効果が得られる点で，導入の垣根が比較的低い手法である．一方，BFI 観察は研究者にとっても超薄切片作製という技能を必要としない点，また広範囲を簡単に観察できる点で，大きなメリットがある．
電子顕微鏡観察法は，現在も日進月歩で新しい手法の開発

リターディング法を用いた樹脂包埋生物標本の SEM 反射電子観察と FIB/SEM トモグラフィー

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がすすめられている．近い将来，生物観察においても，さらに確実性の高い観察法が登場する可能性もある．今後これらの観察法がより一般的に生物組織観察に用いられるようになることで，形態学的側面から生命現象をより正確に理解することにつながると確信している．
文

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