本研究は、日本農芸化学会 2021 年度大会（仙台）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のためオンライン形式で実施）に応募された研究のうち、本誌編集委員会

日本農芸化学会が優れた研究として選定した６題の発表のうちの一つです。

殺虫活性を示す微生物のスクリーニングとその利用法の提案
私立済美高等学校
高橋真衣（顧問：齋藤和樹）
マラリアはハマダラカが媒介するマラリア原虫が引き起こす
寄 生 虫 病 で， 年 間 死 者 数 は 40 万 人 に 上 る． 私 は マ ラ リ ア の●撲滅に貢献したいと考え，原虫を媒介するハマダラカの制御（ベ ク タ ー コ ン ト ロ ー ル） に 利 用 可 能 な「殺 虫 活 性 を 示 す 微生物」に着目した．本研究では，身の回りから細菌を採取して，蚊の幼虫を用いた殺虫活性評価試験の結果をもとにスク化学と生物リーニングし，活性が認められた菌株の種を同定した．その結 果， 殺 ボ ウ フ ラ 活 性 を 示 す 細 菌 と し てイド系薬剤などが練りこまれた蚊帳である Insecticidetreated net が提供されつつあるが (4)，マラリア伝播地域の全家庭に普及するにはほど遠い．また，ピレスロイド耐性をもった蚊の増加により，高価で環境に負荷を与える化学農薬を使わなければならない場合もある (5)．
Integrated Pest Management（IPM，総合的病害虫管理）とは物理的・化学的・生物的・環境的防除をうまおよびく組み合わせて効果的に病害虫を管理することである．の 4 菌株を単離することができた．

さまざまな防除法を組み合わせることで，ターゲットである病害虫が一部の農薬に対して抵抗性を獲得すること

本研究の目的・方法および結果を阻止するだけでなく，化学農薬の使用量を減らすこと【目的】

で環境負荷が低減され，残留農薬による生態系への影響

世界で最も人を死に至らしめている生物は蚊であを小さくすることが期待できる．化学農薬は適切に使用る (1)．WHO は Global technical strategy for malaria でしなければ生態系に対するリスクが大きい一方，生物農2030 年までに世界のマラリア発生率と死亡率を少なく薬は環境への安全性，標的生物の特異性，有効性，生分(2)とも 90％削減するという目標を設定している ．The

解性，IPM への適合性の観点において高い評価を受けWorld Malaria report 2020 に よ る と，2019 年 に は 2 億ている (6)．そのような特徴がある生物農薬のうち，私は2900 万人がマラリアに感染し，40 万 9000 人が死亡して安価で残留性の低い微生物農薬を用いたベクターコント(3)

いる ．マラリアはマラリア原虫の媒介昆虫であるハマダラカによって感染する熱帯性の寄生虫病である．貧困ロールに着目した．
殺虫活性を示す細菌に関する先行研究としてや食糧問題，雇用問題，そして新型コロナウイルスによ（Bt）がカイコの卒倒病菌として発見さる医療崩壊が負の連鎖となって多くの犠牲を生んでいれ，作物にも応用されている (7)．現在，化学農薬の他る．私はこの負の連鎖を断ち切る必要があると思い，マに，生物農薬の使用が検討されているが，依然として化ラリアの撲滅に貢献したいと考えた．SDGs の第 3 目標

学農薬への依存度が高く (8)，将来生物農薬の利用を推しは「すべての人に健康と福祉を」と設定されている．こ進めるためには，Bt 以外の新しい殺虫活性を示す細菌のように決して他人ごとではないマラリアに私たちは真を探索する必要がある．そこで本研究では，蚊に対する正面から向き合っていかなければならない．現在マラリ殺虫活性を示す細菌を自然界から見いだすことを目的とアに対するベクターコントロールの一環としてピレスロした．

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日本農芸化学会【方法】

り調製した菌株培養液 5 mL に直接アカイエカ（

本研究では自然界から微生物を採取し，蚊の幼虫を用）3 齢幼虫 5 匹（2 月採集分）または 4 匹（3 月採

いた殺虫活性評価試験の結果をもとに，殺虫性微生物を集分）を投入し，経時的に死亡した個体数を記録して殺スクリーニングし，DNA 配列を分析することにより種ボウフラ活性を評価した．なお，本研究では安全性の観を同定した．

点からマラリアの媒介昆虫であるハマダラカではなく，2020 年 2 月から 3 月にかけて愛媛県松山市ならびに愛購入ができ飼育も簡便なアカイエカを用いることにし，

南 町 の 9 カ 所（地 下 水， 土 壌（土 I-A， 土 I-B， 土 II），同じ蚊であることからハマダラカへの殺虫効果も期待で田，水たまり，川，麦麹，米麴）からサンプルを採取しきると考えた．て，多くの菌種の発育が認められることで知られている

通常蚊の幼虫であるボウフラは，水面あたりに浮遊Soybean Casein Digest（SCD） 寒 天 培 地（ニ ッ ス イ）

し，尾部を水面上にだして呼吸している（図 2A，矢印に塗布し，25 C，1 日間静置培養を行って，コロニーを部分）．そして，刺激を与えると下にもぐる様子が観察形成させた（図 1）．

される，一方，活性評価時に刺激を与えても動きが認め数多く認められたコロニーの色や形状を観察して，それらが互いに異なるものをそれぞれ別種の細菌由来のコられない個体や底に沈み浮き上がってこない個体は死亡個体とみなした（図 2B，矢印部分）．

ロニーと判断して菌株を選別し，白金耳で釣菌して単離さらに，スクリーニングによって選抜した殺虫活性をした．そして，それぞれの菌株を新たに SCD 液体培地

示す菌株の種を同定するために，スクリーニング用のサ5 mL に植菌し，25 C，24 時間振とう培養した．その後，ンプルを培養したときと同様の条件で調製した培養液培養液を終濃度 20％（v/v）グリセロールと混和し，ス

1100 µL から遠心分離により菌体を回収して 500 µL のトック液を作成した．次に，殺虫活性を示す菌株をスクTE buﬀer に 懸 濁 し た 後，10％ SDS 30 µL と 20 µg/mLリーニングするために，各菌株ストック液を植菌したProteinase K 3 µL を加えて 37 C で溶菌した．次にフェSCD 液体培地を 25 C，24 時間振とう培養することによノール／クロロホルム抽出，エタノール沈殿をしたのち
total DNA を 回 収 し た． そ の DNA を 鋳 型 と し て 16SrRNA 遺伝子（細菌に共通な塩基配列）領域を PCR に化学と生物より増幅した．27F, 1492R のユニバーサルプライマーを用いた PCR により，各菌株において約 1470 bp の増幅産物を得た．アガロースゲル電気泳動後に目的 DNA を含むゲル片を切り出して精製し，DNA 抽出を行った後，DNA シークエンサーにより塩基配列を解析した．DNA
シ ー ク エ ン ス 解 析 は Euroﬁns genomics に 依 頼 し，BlastN（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE̲
TYPE=BlastSearch）を用いて相同性の高い塩基配列をもつ細菌種を検索した．

図 1 ■ 採取場所と形成したコロニー

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図 2 ■ 殺ボウフラ活性評価

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【結果と考察】

ターコントロールに活用できる正確なデータが得られる

9 カ所から合計 24 菌株を採取することができ，殺虫活だろう．現在世界中でハマダラカを代表とする蚊がマラ性試験を実施した．表 1 では殺ボウフラ活性を示した菌

リアを媒介することで多くの感染者や死者を出してい株についてボウフラの死亡数（匹）／試験に用いたボウる．本研究では安全性の観点からアカイエカを用いて殺フラ数（匹）を表している．殺虫活性試験の結果，コロ虫活性を評価した．したがってハマダラカに殺虫活性をニーの形状から目視で選別した 24 菌株のうち 24 時間で示すとは言い切れないが，同じ昆虫綱双翅目カ科に属すも殺ボウフラ活性を示さない菌株は 20 株であり，4 菌株る生物（ハマダラカはハマダラカ属，アカイエカはイエが 24 時間以内に殺ボウフラ活性を示し，なかには土 IIカ属）に活性が見られたことの意義は大きいだろう．

から単離した菌株のように 7 時間以内に効果が認められるものもあった（表 1）．

本研究の意義と展望

16S rRNA 遺伝子の解析から，殺虫活性を示した菌

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株を（土 I-A より単離），（土 I-B），ある株に殺ボウフラ活性があることを確認した．今後，活性（田）と同定できた．グラム陽性細菌で成分の同定や他の生物に対する活性評価，環境アセスメおよびントを行うことで，より環境に配慮した生物農薬を開発●

はゴキブリやカメムシに対する殺虫活性を示すことが知られている(9, 10)．

できる可能性がある．課題として挙げられるのは，生物が生産する殺アカイエカ成分として surface

農薬として実用化する際に，ハマダラカの幼虫のみを選(11)．しかし，私が調べ択的に駆除し，生態系への影響が少ない農薬にすることが生産する殺アカイエカ成分の報ができるかどうかである．ハマダラカの幼虫はマラリア

layer protein が報告されている
た限り告はない．一方，原虫のベクターであるが，ほかの種のボウフラの中には真菌によって引き起こされるは，水を浄化したり，魚の餌になったりすることで生態トマトの根腐れを防除することやコウチュウ目昆虫に対系に大きく貢献しているものもあるであろう．ハマダラ

f. sp.

(12, 13)．また，カのみに着目して生物農薬をはじめとする農薬を開発すはその代謝物を使用して開発された液体ることは困難であろう．そして農薬により駆除される昆製剤に，蚊の幼虫に殺虫活性があることが報告されてい虫種に十分配慮することが必要である．その地域の食事して殺虫活性を示すことが報告されている

化学と生物本研究では，土壌（土 I・II）や田から単離された 4 菌（土 II） な ら び にる(14)．したがって，およびのアカイエカに対する殺虫活性は世界初の報告とな情や文化を深く調査して知り，生態系が大きく崩れないようにしなければならない．マラリアの被害に苦しむ現地から発信される情報を受け取った個人ないし団体が協る．
本研究では殺ボウフラ活性を示す 4 種類の細菌を土壌力しながら解決策を生み出すべきだと考える．私はおよび田から単離できた．これらの菌株が生産する殺ボCOVID-19 のパンデミック前にタイでの現地調査を考えウフラ活性成分をさらに詳しく調べることにより，ベクていた．現在もマラリア伝播地域でのフィールドワーク

表 1 ■ 殺虫活性評価試験結果ができない状況が続くが，タイなどから発信される情報の種類や量が増加すれば，関心をもつ人々が増え，よりIPM を重視し，地域に密着した蚊の防除について活発な議論が交わされることが期待できるだろう．
謝辞：本研究を行うにあたり，ご指導いただきました愛媛大学大学院農学研究科西脇寿先生に感謝申し上げます．この研究は JST 人材育成事業
グローバルサイエンスキャンパスのサポートによって実施しました．

文献「土 I-A」と「土 I-B」は松山市の同一の土壌から単離したものを示す．「培地のみ」は未植菌の SCD 液体培地を示す．

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1) B. Duarte & A. C. Vivarini: Just a little bite? Meet themost dangerous of animals.
, p. 65 (2021). DOI:
10.22533/at.ed.0522102029
2) WHO: “Global technical strategy for malaria 2016-2030
Overview” (2015).
3) WHO: “World malaria report 2019,” (2019).
4) G. G. Yang, D. Kim, A. Pham & C. J. Paul:, 15, 546 (2018).

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, 184, 1094 (2018).
12) T. F. Chin-A-Woeng, G. V. Bloemberg, I. H. Mulders, L.
C. Dekkers & B. J. Lugtenberg:, 13, 1340 (2000).
13) 染 谷 信 孝， 竹 内 香 純， 諸 星 知 広： 化 学 と 生 物，57, 541(2019).
14) V. Padmanabhan, G. Prabakaran, K. P. Paily & K. Balaraman:, 121, 116 (2004).
Copyright © 2021 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.59.577

化学と生物●

日本農芸化学会

5) 認定 NPO 法人 Malaria No More Japan: 2019 年世界マラリア報告書概要， (2020).
6) S. Kumar & A. Singh:, 6, e129 (2015).
7) 飯塚敏彦：日本蚕糸学雑誌，66, 311 (1997).
8) B. Manachini:, (2013)9) H. Nishiwaki, K. Ito, K. Otsuki, H. Yamamoto, K. Komai& K. Matsuda:, 271, 601 (2004).
10) H. M. Aksoy, C. Tuncer, I. Saruhan, I. Erper, M. Öztürk& I. Akca:, 7, 21 (2018).
11) C. Mani, J. Selvakumari, Y. Han, Y. Jo, K. Thirugnanasambantham, S. Sundarapandian & S. Poopathi:580

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