仙台市立仙台青陵中等教育学校科学部
大江信太郎，田村真和，渡邉汐音（顧問：塗田永美）

酵素ルシフェラーゼの性質について
本 研 究 は 日 本 農 芸 化 学 会 2013 年 度 大 会（開 催 地： 東 北 大 学）での「ジュニア農芸化学会」において発表された．ルシフェ
ラ ー ゼ と ル シ フ ェ リ ン の 酵 素 反 応 に つ い て 温 度 と pH の 変 化との関係を調べ，ルシフェラーゼの熱安定性を明らかにした
ほか，発光色の変化について，文献をあたって詳細な考察を行っている．

変化を別々に調べる場合は，どちらかの液を 0.5 mL ず
つ採り，HCl 水溶液（0.1 mol/L）を 25 〜 75 μL, NaOH水溶液（0.1 mol/L）を 25 〜 75 μL まで 25 μL の幅で加えた後，0.5 mL のもう一方の液を加えた．各試験管の発光の有無・程度を確認した後，各試験管に入れた薬品を中和させるため等量の HCl または NaOH 水溶液を加え，各試験管の発光の有無・程度を確認した．

本研究の目的，方法および結果【結果と考察】実験 1：A 液と B 液を 1 mL ずつ混合し，10 〜 60℃まで【目的】ホタルのルシフェラーゼとルシフェリンによる10℃間隔で 5 分間保温し，発光の有無・程度を確認した．

発光反応は，酵素反応の例として広く用いられている．

その結果，40℃で最も強い発光が観察された．また，高高校の夏休みの理科講座でホタルルシフェラーゼを用い温で保温すると発光色が暖色系になり，60℃では発光はた実験を行った際，発光色などが反応条件によって変化観察されなかった（図 1A）．その後各試験管に A 液を加することを知り，それらがなぜ起こるのかなどいくつかえたところ，発光が弱かった 50℃ , 60℃ のサンプルに疑問点が生じた．そこでさまざまな反応条件を整えて詳おいて再び発光が観察された（図 1B）．これは，高温下しく調べてみることにした．

でルシフェラーゼが失活し，残存していたルシフェリン【方法】ホタルルシフェリンとルシフェラーゼとして，と新たに加えたルシフェラーゼが反応したためと考えらホタライト（キッコーマンバイオケミファ）を用いた．

れた．これを確認するため，A 液を各温度で 5 分間保温

A 液がルシフェラーゼ，B 液がルシフェリンと ATP を後，常温にして B 液を加えた．その結果，60℃ , 5 分で含んでいる．

ルシフェラーゼが失活することが確認された（図 2A）．

実験 1：温度による発光の変化．A液とB 液を1 mL ずつ

またこのとき 50℃で保温後の発光色の変化が見られな混合し，10 〜 60℃まで10℃間隔で5 分間保温し発光の有かったことから，ルシフェラーゼは 50℃では不可逆的に無・程度を確認した．その後各試験管にA液を追加し，常変化せず，常温に戻すことで元どおりに反応することが温で発光を再度確認した．酵素と基質それぞれの温度に対示唆された．一方，B 液を各温度で 5 分間保温後，常温する変化を観察するときは，混合前に上記と同様に保温しにして A 液を加えたところ発光の変化は見られなかった

た後に常温に戻し，もう一方の液を加え，発光を観察した．

ことから，ルシフェリンは 60℃では不活化しないことが実験 2：pH による発光の変化．A 液と B 液を 1 mL ずつ示された（図 2B）．以上のことから，50℃ではタンパク混合し，40℃に保温して，発光を確認した後，HCl また質分子の構造が可逆的に変化していると考えられた．

は NaOH 水 溶 液（0.1 mol/L） で pH を 3 〜 12 に 調 整 し，実験 2：反応の至適 pH を調べるため，A 液と B 液を混発光の有無・程度を観察した．酵素と基質の pH による合した後に pH を調整して発光を観察した．その結果，化学と生物 Vol. 52, No. 1, 201459

①ルシフェリル AMP 中間体が生成され，その酸化により励起状態のオキシルシフェリンが生成される．
②励起状態のオキシルシフェリンが，基底状態に戻るときに光エネルギーを放出し，発光する．
図 1 ■ 温度変化による発光反応の変化（A）異なる温度下での発光，（B）（A）の後に酵素を添加したときの反応．

オキシルシフェリンの蛍光は赤色であるが，ルシフェラーゼが②の段階においてオキシルシフェリンと結合することで波長の短い黄緑色の光が放出される（1, 2）．②の段階においてルシフェラーゼのイソロイシン 288 がオキシルシフェリンのほうに動き，オキシルシフェリンとルシフェラーゼとの間に疎水的な構造をとる．これによってオキシルシフェリンのもつ化学エネルギーが保持さ

図 2 ■ 温度による反応の変化

れ，光エネルギーへの変換の際に振動（熱）として放出さ（A）A 液（ルシフェラーゼ）を各温度で保温後，B 液（ルシフェリン）と混合した際の反応の様子．
（B）B 液（ルシフェリン）を各温度で保温後，A 液（ルシフェラーゼ）と混合した際の反応の様子．の光が放出される．このイソロイシン 288 を分子量の小れにくくなり，エネルギーの高い（波長の短い）黄緑色
さいアミノ酸に置換すると，エネルギーの保持力が弱くなりエネルギーの低い（波長の長い）暖色系の光が放出される（1）．つまり，ルシフェラーゼのルシフェリン結合部位の微細な構造の変化によって発光色が決定される．

図 3 ■ pH の変化による発光の様子

図 2B において発光色の変化がなかったことから，ルシフェリン自体は 60℃程度の熱では変性しないものと考えられる．本実験で見られた発光色の変化は熱の変化（図 1, 2）や pH の変化（図 3, 4）によってルシフェラー
ゼの全体的な立体構造が変性しない程度にわずかに変化し化学エネルギーの変換効率が悪くなることで，波長の長い光が放出されるようになるためだと考えられる．また，オキシルシフェリン自体の発光色が赤色であることから，発光色の変化は酵素を構成するタンパク質が変性したことによって，オキシルシフェリンとの関係が弱く

図 4 ■ A 液（ルシフェラーゼ）および B 液（ルシフェリン）のpH の変化による発光の様子（A）A 液の pH を変化させた後，B 液と混合した．それぞれのサンプ ル で 最 初 に 加 え た 試 薬 と 量，pH の 測 定 値 は 以 下 の と お り．
1 ; 0.1 M HCl 75 μL（pH 6.5）,2 ; 0.1 M HCl 50 μL（pH 7.0）,3 ; 0.1 M
HCl 25 μL（pH 7.1）, 4 ; 添 加 な し（pH 7.8）, 5 ; 0.1 M NaOH 25 μL（pH 7.8）, 6 ; 0.1 M NaOH 50 μL（pH 8.2）, 7 ; 0.1 M NaOH 75 μL（pH 9.8）.（B）（A）の反応液を中和させた後の発光．（C）B 液のpH を変化させた後，A 液と混合した．それぞれのサンプルで最初に加えた試薬と量，pH の測定値は以下のとおり．1 ; 0.1 M HCl75 μL（pH 7.1）, 2 ; 0.1 M HCl 50 μL（pH 7.0）, 3 ; 0.1 M HCl 25 μL（pH 7.1）, 4 ; 何も加えず（pH 7.8）, 5 ; 0.1 M NaOH 25 μL（pH 8.1）,
6 ; 0.1 M NaOH 50 μL（pH 8.4）, 7 ; 0.1 M NaOH 75 μL（pH 9.0）.
（D）（C）の反応液を中和させた後の発光．

発光反応の至適 pH が 8 付近であることが明らかとなった（図 3）．酵素と基質それぞれの至適 pH を調べるた
め，A 液または B 液の pH を変化させた後にもう一方の液と混合し，発光を観察した，その結果，酵素は pH 8.2と 9.8 の間で失活することが明らかとなった（図 4）．
ホタルのルシフェリンの発光は以下の二段階から成り立っている（1, 2）．

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なり，より本来の発光色に近づいた可能性も考えられる．

本研究の意義と展望
ホタルルシフェリンとルシフェラーゼを用いた発光の観察実験を端緒とし，酵素の至適温度，至適 pH といった酵素反応の基礎的なデータについて，実験系を丁寧に設計し，調べている．設備の関係もあり，発光色の発光スペクトル変化については詳細に調べることは困難であるが，インターネットを用いて文献などの情報を探し出して調べ考察するなど，興味をもった題材に対して真剣に向き合っている姿勢に感銘を受けた発表であった．
文献
1） SPring-8 が 明 か す ホ タ ル が 発 光 す る し く み，http://www.
spring8.or.jp/ja/news̲publications/research̲highlights/no̲26/2） 加藤博章，中津 亨，京都大学低温物質科学研究セン
ター誌，11, 44（2007）.

（文責「化学と生物」編集委員）

化学と生物 Vol. 52, No. 1, 2014