富山県立富山中部高等学校スーパーサイエンス部
瀬口楓，松森友宏，春若純菜（指導教諭：浮田直美）

日本農芸化学会

ナタマメ粉末のウレアーゼ活性高い酵素活性をもつ種子粉末の活用性を探る
本 研 究 は 日 本 農 芸 化 学 会 2019 年 度 大 会（開 催 地： 東 京 農 業大学）での「ジュニア農芸化学会」において発表されたものである．ウレアーゼとは尿素を二酸化炭素とアンモニアに加●水分解する，微生物や植物に広く存在する酵素である．ウレアーゼはナタマメに豊富に存在することが知られている酵素で，アンモニア産生などのバイオリアクター装置に利用できる反応素子として大きく期待されている．本研究は尿素を用化学と生物いたバイオリアクター装置に使用可能で，安定かつ活性の高いウレアーゼの酵素反応条件の詳細な検討を行い，さらにこれまで広く用いられているナタマメ以外のマメ科植物由来ウレアーゼの利用の可能性を検証しており，学会から高く評価された．

るかどうかどうかを，希硫酸による反応停止と逆滴定により測定する方法により詳しく調べ，ナタマメ種子のウレアーゼ活性が長期にわたり保たれる条件を見いだした．また，ほかのマメ科種子でウレアーゼ活性が高いものを探した．
【方法】［ウレアーゼ活性有無の判定方法］
フェノールフタレイン溶液を加えた尿素水溶液にマメ科種子の粉末を加えて，溶液が赤色に呈色した場合（塩基性になった場合）を活性ありとした．

本研究の目的・方法・結果および考察【目的】
ウレアーゼは尿素をアンモニアと二酸化炭素に分解す〔NH4＋の p(NH2)2CO + H2O → 2NH3 + CO2(1)

NH3 + H2O  NH4+ + OH－(2)a は 9.24; H2CO3 の p(6)a は 6.35（25 C） 〕

る酵素で，1926 年に Sumner によって Jack bean（ナタ［種子を粉末にする方法］

マメ）から初めて結晶化された，活性中心にニッケルをマメ科種子をキムタオルに包み，ハンマーでたたいて(1)含む分子量約 48 万のタンパク質である ．近年では，砕き，さらにセラミックミル（京セラ社製：スパイス

アンモニアを燃料とした燃料電池システム (2, 3) や，発生用）で粉末化した．

する二酸化炭素をカルシウムイオンと反応させて土の強（実験 1）白ナタマメ種子のウレアーゼ活性と pH(4)度増加を図る研究 が行われており，バイオリアクター以下の操作を施した白ナタマメ種子の活性を調べた．

で用いることのできる反応素子としてウレアーゼの活用

・表 1 上：種子を異なる pH の水溶液に一週間浸けて，が注目されている．
純度の高いウレアーゼを精製するには多くの工程が必(5)

表面を水で洗浄後細かく砕き，さらに多量の水で洗浄して乾燥させ，乳鉢ですりつぶした．

要であるが ，粉末化したナタマメ種子に含まれるウレ

・表 1 下：種子粉末を異なる pH の水溶液にしばらく浸アーゼ活性が長期にわたって維持されるのであれば，簡けてから，ろ紙を用いてろ過後，水で数回洗浄（ろ便に調整可能な粉末化ナタマメ種子をウレアーゼ供給体

液が中性でなかった場合は中性になるまで洗浄）．

として利用可能であると考えた．われわれはナタマメ種

なお，ろ紙を用いて種子粉末を水で洗浄すると，ウレ子のウレアーゼ活性が，pH や塩の添加によって失活す

アーゼはろ液に流出するが，12 回洗浄した後もろ紙上

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表 1 ■ pH の異なる水溶液に浸けた白ナタマメ種子の酵素活性○生化学用ウレアーゼ（A）100 C で 1〜4 時間 35 分，乾燥器内で加熱（B）−196 C の液体窒素の中で 5 分間冷却（実験 4）ナタマメ粉末の利用に向けた実験
近年，アンモニアを直接燃料とした燃料電池による発電研究が進められている (3)．この発電では，窒素と水のみが生成し，有害物質や二酸化炭素を排出しない．そこで，尿素溶液とウレアーゼを混合して生成するアンモニアを効率良く利用できないかと考えた．
水に溶けやすいアンモニアを気体として多量に発生させること，アンモニアと同時に発生する二酸化炭素を含

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まないようにすることを目指して，陽イオン交換膜を用いた装置（図 1（A））を用いて，以下の①〜③の手順での種子粉末の酵素活性は高かったので，この方法で活性実験を行った．の有無が判定できると考えた．
（実験 2）逆滴定法によるアンモニア生成量の算出
次の①〜③の白ナタマメ種子試料をそれぞれ用いて，温度や濃度を変えて実験した．

●①水とともにすりつぶした「大根おろし状」のナタマメ
種子 0.3 g, 35 C，尿素水溶液 0.17 mol/L 3.0 mL② ナ タ マ メ 粉 末 0.06 g, 5 C， 尿 素 水 溶 液 0.017 mol/L
3.0 mL（低温・低基質濃度）

化学と生物③ ナ タ マ メ 粉 末 0.001 g を 含 む 0.10 g 混 合 粉 末 ※，22 C（常温），尿素水溶液 0.17 mol/L 3.0 mL※ごく微量の酵素を使用するために，生分解性プラスチックのポリブチレンサクシネート粉末を混ぜて約 100 倍に希釈

図 1 ■ （A）
：アンモニア発生装置（B）：イオンの移動の模式図①〜③の各条件の溶液をそれぞれ複数個用意し，一定時間ごとに希硫酸を加えて反応を停止し，NaOH 水溶液で逆滴定して NH3 生成速度を求めた．
（実験 3）ナタマメ由来のウレアーゼの熱安定性①ダニエル・ボルタ電池装置（ケニス社）の中央に陽イ
オ ン 交 換 膜 を 挟 み， 仕 切 ら れ た 片 側 に 0.1 mol/L
NaOH 水溶液を入れる

白ナタマメ粉末と，生化学用ウレアーゼ（ナタ豆由来②逆側に白ナタマメ粉末と 1.6 mol/L 尿素溶液を入れる

ウレアーゼ：富士フイルム和光純薬）を加熱もしくは冷③ NaOH 側から気体の NH3 が発生したかどうかを，湿ら却後に，ウレアーゼ活性の有無を調べた．

せた赤色リトマス紙，pH 試験紙，臭いで確かめた．

〇白ナタマメ種子：（a）〜（d）は粉末状（実験 5）ナタマメの栽培と成長過程での種子の酵素活性（a）100 C で 1 時間〜4 時間 35 分，乾燥器内で加熱

本校の屋上で，植木鉢やプランターに白ナタマメと赤（b）−196 C の液体窒素の中で 5 分間冷却

ナタマメの種子を園芸培養土に植えて，施肥せずに水だ（c）フライパンで 1 分 30 秒炒ったけ与えて育てた．莢の中で結実していく過程での，種子（d）沸騰水中で 1 時間煮てろ過のウレアーゼ活性を調べた．

（d-1）ろ液（d-2）ろ紙に残ったもの（e）水とともにすりつぶした「大根おろし状」のナタマメ種子を冷蔵庫（5 C）や冷凍庫（−20 C）で保存（f）種子のまま水に浸けて，1 年間冷蔵庫（5 C）で保存（実験 6）マメ科植物種子のウレアーゼ活性
ナタマメ以外の身近なマメ科植物種子にもウレアーゼ活性があるかどうか調べた．
【結果と考察】（実験 1）表 1 に示したように pH 3 以下の強酸性下でウレアーゼは失活した．高濃度の NaCl 水溶液に長期間浸けても失活しなかったので，pH の低下がウレアーゼ

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化学と生物 Vol. 57, No. 10, 2019表 2 ■ マメ科植物種子の粉末のウレアーゼ活性の変性の大きな要因であるとわかった．
（実験 2）①では 1 分間に 2.5×10−4mol のアンモニアが発生した．②の低温，低基質濃度では反応開始 30 秒後には尿素の 1/10 が分解された．③では 20 分で尿素の1/10 が分解された．マメ粉末 1g, 1 分間あたり発生するアンモニア量に換算すると，②は 3×10 − 4 mol，③は 5×10 − 3 mol となり，極微量のマメ粉末で反応が進むことがわかった．
（実験 3）水で煮た（d）は酵素活性が見られなかった．低温の水に浸した（e），（f）は長期間酵素活性があったので，高温になると水中でウレアーゼの高次構造●

日本農芸化学会が変化して，熱変性が進むと考えられる．一方，乾燥粉末状の（a），（b），（c）はいずれも酵素活性があったので，乾燥状態では高い温度でも熱変性は進みにくいと考えられる．数カ月間，サンプル瓶に常温で保存していたナタマメ粉末も高い活性があり，乾燥粉末は常温で長期保存ができることがわかった．また，純度の高い生化学用ウレアーゼ（A）（B）も酵素活性は高いままだった．の種子のウレアーゼ活性を調べた．小さな未熟な種子にこれらの結果から，100 C でも水分がなければ，ウレは酵素活性はなかったが，成熟種子の大きさに成長するアーゼは熱変性しにくい安定な酵素であることがわかっと，柔らかい緑色の未熟な状態でもウレアーゼ活性がた．

あった．収穫した硬い成熟種子には高い酵素活性があっ（実験 4）赤色リトマス紙は青色に変化し，pH 試験紙た．

化学と生物は pH 10 を示し，明らかなアンモニア臭があった．

（実験 6）マメ科植物は栽培しやすいので，ほかのマアンモニアの溶解によって溶液が塩基性に変化していくと，生じた CO2 は HCO−3 や CO23 −になる．

メ科種子もウレアーゼとして使用できないか，ウレアーゼ活性を調べた結果を表 2 に示す．

CO2 + OH－  HCO3−(3)

HCO3− + OH－  CO32− + H2O(4)

ナタマメ属とダイズ属の種子粉末に高いウレアーゼ活性があった．野生種のツルマメは栽培種のダイズの原種と考えられている (7)．また，「枝豆」として販売されているダイズの未成熟種子（未加熱）にも活性があった．

陽イオン交換膜を半透膜として用いたのは，NH4 はSumner はナタマメ由来のウレアーゼを研究する以前

陽イオン交換膜を通って反対側の NaOH 水溶液中で気に，脱脂ダイズのウレアーゼを用いた研究を行ってい2−体の NH3 として発生し，HCO−3 や CO3 は膜を通れないた (1)．ナタマメはダイズよりもウレアーゼ活性が高いため（図 1（B）），CO2 成分と分離できると考えたからでが (1)，ダイズには多くの品種があり世界で広く栽培されある．イオンでない CO2 分子は膜を通過する可能性がている．野生種のツルマメも含めてダイズ属の種子粉末あるので，純粋な NH3 ガスを回収するには，発生したは，身近で利用しやすいという点から，酵素ウレアーゼ

NH3 に対してソーダ石灰を用いることにより，CO2 と水として活用できる．

＋の除去ができると考えられた．
（実験 5）校舎屋上の施肥しないプランターで栽培したが，ナタマメは結実するまで成長した．マメ科植物は根粒菌と共生するので，肥料は少なくて済む．ナタマメ

まとめ
ナタマメ種子の粉末はウレアーゼ活性が非常に高い．

は夏の暑さに強く，水を十分に与えていれば結実する栽

ナタマメ粉末は水で煮たり，強酸性水溶液に浸けたりす培しやすいマメであることがわかった．

ると直ちに失活するが，5 C 以下の水に浸けたり，乾燥マメ科種子は無胚乳種子であり，発芽したナタマメの状態で 100 C の高温に置いたりしてもすぐには失活しな

子葉にはウレアーゼ活性は残っていたが，落下した子葉い．長期間常温保存が可能なこの粉末は，酵素ウレアーには酵素活性はなかった．成長して開花した後，莢の中ゼとして利用しやすい．ナタマメ属およびダイズ属の多化学と生物 Vol. 57, No. 10, 2019655

くの品種の種子にも同様なウレアーゼ活性がある．尿素

あったマメに存在するウレアーゼの比活性測定や性質のから生じるアンモニアと二酸化炭素の有用性から，ナタ検証による酵素の選別や，酵素粉末の固相化法を検討す

マメとダイズの種子粉末には，バイオリアクターで用いることにより，高機能化バイオリアクター装置の作製がることのできる反応素子として活用できる可能性がある．

可能となり，有用なアンモニアと二酸化炭素のさらなる活用が期待される．

本研究の意義と展望
安価で入手しやすいナタマメやダイズ種子粉末に含まれるウレアーゼは，粉末のまま常温で長期保存可能であること，いつでもどこでも尿素溶液にその粉末を加えれば，アンモニアを発生させることができること，反応は日本農芸化学会

溶液をやや強い酸性にするだけで容易に停止できることが本研究により明らかになった．また発生したアンモニ
アは燃料電池の燃料として注目されているため，これらのマメ粉末を膜に吸着することでバイオリアクターの反応素子として活用することも可能である．加えてアンモニアと同時に生成する二酸化炭素はカルシウムイオンと反応させると炭酸カルシウムに変えることができるた

1) James B. Sumner: “The chemical nature of enzymes”
Nobel Lecture, 1946 年 12 月2) 雑賀 高，浜野友紀：尿素を燃料とする水素エネルギーシステム，2011.
3) 京都大学，ノリタケカンパニー，三井化学，トクヤマ，
日本触媒，豊田自動織機：「アンモニア燃料電池」SIP 委
託研究 2017 年 7 月共同発表
4) 鹿渡洸一，林 和幸，木下尚樹，安原英明：生体触媒反応を介したセメンテーションによる改良砂の力学特性，
第 40 回岩盤力学に関するシンポジウム講演集，2011.
5) 小橋恭一：博士論文「ウレアーゼの結晶化法ならびにウレアーゼ阻害剤について」学位論文 1963 年 6 月
6) 国立天文台：理科年表，2009.
7) 杉山信太郎：日本醸造協会誌，87(12), 890 (1992).
Copyright © 2019 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.57.653

化学と生物

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め，土壌の改良に役立てることができる．今後，活性の文献

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