Press Release2024 年 7 ⽉ 8 ⽇
東京⼯業⼤学
東北⼤学
筑波⼤学
理化学研究所タンパク質結晶に分⼦を閉じ込め反応過程を可視化−X 線⾃由電⼦レーザーと量⼦化学計算による⾼精度解析−【要点】○化学反応中の分⼦の構造変化をリアルタイムかつ原⼦レベルで追跡することに成功。
○タンパク質結晶の中に、反応が起こる「場」を作り出し、溶液中のような状態を再現。
○さまざまな化合物が引き起こす化学反応を可視化し、新しい分⼦の機能を設計するための開発ツールとして期待。
【概要】

東京⼯業⼤学 ⽣命理⼯学院 ⽣命理⼯学系のマイティ・バスデブ特任助教と上野隆史教授（兼 同 科学技術創成研究院 ⾃律システム材料学研究センター）のグループは、東北⼤学 多元物質科学研究所の南後恵理⼦教授（兼 理化学研究所 放射光科学研究センター チームリーダー）、筑波⼤学 計算科学研究センターの庄司光男教授らの研究グループと共同で、化学反応性を持つ⾦属錯体（⽤語 1）をタンパク質結晶（⽤語 2）に固定化し、X 線⾃由電⼦レーザー（XFEL）（⽤語 3）と量⼦古典混合（QM/MM）計算（⽤語 4）を⽤いて化学反応中の⾦属錯体の構造変化をナノ秒レベルで原⼦分解能追跡し、反応機構を解明する技術を開発した。
⼈⼯分⼦反応（⽤語 5）の追跡⼿法は多数報告されているが、反応の際に⽣じる活性種の構造変化を実時間・原⼦レベルで追跡することは困難であった。本研究では、タンパク質結晶の細孔中に⽔分⼦が多く存在することに着⽬し、あたかも溶液中のようなタンパク質環境に⾦属錯体のマンガンカルボニル錯体（Mn(CO)3）を固定化し、結晶を保持しながら光照射で⾦属‒CO 結合の開裂反応を駆動させることに成功した。XFEL を⽤いて、Mn(CO)3 錯体を固定化したリゾチーム結晶（⽤語 6）へ光を照射し、反応開始後のわずかな時間（10 ナノ秒、100 ナノ秒、1 マイクロ秒後）の構造変化を観察した。この結果、
CO 配位⼦が選択的に順次解離していくことが明らかになった。さらに、QM/MM 計算
により、リゾチームのタンパク質環境によって反応が制御されていることを明らかにした。安定なタンパク質結晶の細孔を利⽤したこの⼿法は、さまざまな低分⼦化合物が起こす化学反応を可視化し、反応機構を理解するための基盤技術として、「有⽤な分⼦触媒の設計」や「複雑な分⼦反応メカニズムの理解」へ貢献すると期待される。
本成果は、⾃然科学分野の学術誌「Nature Communications（ネイチャーコミュニケーションズ）」のオンライン版で 6 ⽉ 29 ⽇（現地時間）に公開された。

●背景

化学反応において短寿命の中間構造を決定することは、その反応メカニズムの理解が重要である。しかしながら、分光学的⼿法によって過渡的な活性種の形成を検出する⼿法はあるものの、その中間構造を決定し原⼦レベルで構造変化を追跡することは困難であった。⼀⽅で、近年、X 線⾃由電⼦レーザー（XFEL）による時分割連続フェムト秒結晶構造解析（TR-SFX）法（⽤語 7）を⽤いた三次元⽴体構造解析によって、タンパク質の構造変化をコマ送り動画のように捉える技術が開発されつつある。この⼿法は、これまで天然のタンパク質や酵素の構造変化の観察に適⽤されることが多く、合成⾦属錯体などの低分⼦化合物によって促進される化学反応への応⽤は困難であった。その理由は、低分⼦化合物の場合、反応の際に⼤きな構造変化が起こりにくいこと、また構造データが得られにくいためである。そこで、研究グループは、タンパク質結晶を合成⾦属錯体の反応場として⽤いることにより、化学反応による合成⾦属錯体の構造変化を追跡できると考え、タンパク質結晶内に固定化した⾦属錯体の光励起反応の中間構造を TR-SFX 法で決定することにより、反応過程の構造変化の直接観察を試みた（図 1）。

図 1. リゾチームの結晶構造と本研究の概略図

●研究成果本研究グループは、光照射により⼀酸化炭素（CO）を放出するマンガンカルボニル（Mn(CO)3）錯体を多孔性のニワトリ卵⽩リゾチーム（HEWL）結晶に固定化し、CO 放出反応中の⾦属錯体の構造変化を TR-SFX 法によって直接リアルタイムで観察することに成功した。
光照射による反応が結晶内で均⼀に起こることや、効率よく XFEL 測定を⾏うことを考慮すると、⻑時間測定のためにサイズが 20μm 未満の微結晶が⼤量に必要となる。本構造解析では、5-10μm サイズのリゾチーム正⽅晶結晶を鋳型結晶とし、合成した結晶を Mn(CO)3 錯体溶液に浸漬させることで Mn(CO)3 と HEWL の複合体を調製することを検討した。正⽅晶はバルクスケールで 10 分以内に結晶を⼤量に合成することができ、内部に 2.2 nm の細孔空間が存在する。合成した Mn(CO)3-HEWL 複合体の X 線構造解
析の結果、Mn(CO)3 錯体は細孔表⾯に位置するアミノ酸 His15 に配位固定化していることが分かった（図 2）。

図 2. Mn(CO)3-HEWL 複合体の結晶構造

次に、Mn 錯体の光励起化学反応の構造変化を直接観察するため、X 線⾃由電⼦レーザー（XFEL）施設 SACLA（⽤語 8）でナノ秒ポンプレーザーを⽤い、365 nm の紫外光を結晶に照射し、Mn(CO)3 錯体から CO を放出させた。光を照射後、10 ナノ秒から 1 マイ
クロ秒後に XFEL による回折実験を⾏い、コマ送り撮影のように Mn(CO)3 錯体から COが放出される過程の中間構造を観察した。Mn(CO)3 錯体は、光照射前はリゾチーム結晶
内で 3 つの CO リガンドと 2 つの⽔分⼦が配位し、⼋⾯体の配位構造を有している（図2）。光照射中の⼀連の構造解析の結果、アキシャル位の CO 配位⼦が最初に放出され、Mn ビスカルボニル種が中間体として観察された。その後、エカトリアル（eq1）に位置する CO 配位⼦が放出され、最終的には、3 つの CO が放出され、Mn 錯体も放出された。
さらに、反応中に起こるタンパク質の側鎖の関与とその構造変化についても可視化することができた（図 3）。
実験的に観測された Mn 錯体の CO 放出の詳細を明らかにするために、量⼦古典混合（QM/MM）計算を⾏った。光照射前のリゾチーム結晶内の Mn(CO)3(H2O)2 の構造を⽤いて QM/MM モデルを構築したところ、Mn に配位している 3 つの CO の周辺にリゾチームのアミノ酸残基があることで、CO と⽔分⼦の交換反応が配位位置によって変わり、選択的反応が起きることを明らかにした。さらに、TR-SFX 法で直接観測した構造が主反応経路上にあることを⽰した。

図 3. リゾチーム結晶に固定化した Mn(CO)3 錯体の CO 放出過程の直接観察●今後の展開化学反応における低分⼦化合物の構造変化追跡のために、安定なタンパク質結晶の細孔空間を利⽤した本研究チームのアプローチは、低分⼦化合物による活性中⼼の構造ダイナミクスを実時間・実空間・原⼦レベルで可視化することができる。今後は、この⼿法を⽤いることで、光照射による化学反応だけでなく、⾦属触媒をタンパク質結晶に固定化した⼈⼯⾦属酵素内部で駆動する触媒反応の中間体構造の追跡など、より複雑な反応過程の直接観察へとつながり、触媒開発や医薬品設計など広範囲な応⽤が期待できる。
●社会的インパクト

化学反応を⾼速で追跡する⼿法は、これまでも開発されてきたが、原⼦レベルの分解能では達成されてこなかった。原⼦レベルでの反応過程の追跡のためには⽴体構造解析が必要不可⽋だが、合成化合物の構造変化を直接観察することは困難であった。本研究は、⾼い結晶性を有するタンパク質結晶に⾦属錯体を固定化することで、⾦属錯体の化学反応過程を⽴体構造変化として観察することに成功した。本⼿法は、合成化合物による触媒反応から、クラスター形成、超分⼦反応まで、これまでの⽅法では不可能とされてきた化学反応追跡も実現できることから⼤きな社会的インパクトを持つと⾔える。
●付記

本成果は、⽂部科学省 科学研究費助成事業（JP19H05781、JP19H05776、JP23H04879、JP20H05438、JP22H04744、JP23K04928、JP18H05421、JP22H00347）、国⽴研究開発
法⼈⽇本医療研究開発機構（AMED）創薬等ライフサイエンス研究⽀援基盤事業 創薬等
先端技術⽀援基盤プラットフォーム（BINDS）（JP21am0101070）、JST 戦略的創造研究推進事業 CREST（JPMJCR20B3）の⽀援によるものである。
【⽤語説明】（1） ⾦属錯体：⾦属イオンが有機分⼦と結合した構造を持つ化合物。
（2） タンパク質結晶：タンパク質分⼦が規則正しく 3 次元に配列した固体の集合体。
タンパク質結晶の X 線回折の強度を解析することにより、タンパク質の 3 次元⽴体構造を決定することができる。
（3） X 線⾃由電⼦レーザー（XFEL）：X 線領域の波⻑を持つレーザーであり、フェムト秒（1,000 兆分の 1 秒）レベルの⾮常に短いパルス幅を持つ。XFEL は X-ray Free
Electron Laser の略。
（4） 量⼦古典混合（QM/MM）計算：化学反応が起こる領域は精度の⾼い量⼦⼒学（QM）計算で扱い、それ以外の部分は分⼦⼒学（MM）計算を適⽤する計算⼿法。
（5） ⼈⼯分⼦反応：⼈⼯合成分⼦によって設計された化学反応、⽣体内では不可能な化学反応を⾏うことができる。
（6） リゾチーム結晶：加⽔分解酵素であるリゾチームが 3 次元に集積した結晶状集合体。結晶化条件により、正⽅晶、斜⽅晶、単斜晶など異なる空間群の結晶をつくりわけ、微⼩結晶を⼤量に合成することができる。
（7） 時分割連続フェムト秒結晶構造解析（TR-SFX）法：結晶中の分⼦の微細な動きを⾼い時間分解能で観察する⼿法。構造変化を引き起こすレーザー光を結晶に与え、⼀定の遅延時間で X 線⾃由レーザーによる測定を⾏うことで、結晶内のタンパク質構造変化を追跡できる。TR-SFX は、Time-Resolved Serial Femtosecond Xray crystallography の略。
（8） X 線⾃由電⼦レーザー（XFEL）施設 SACLA：理化学研究所と⾼輝度光科学研究センターが共同で建設した⽇本の XFEL 施設。SACLA（サクラ）は、SPring-8
Angstrom Compact free electron LAser に由来する施設の愛称。SPring-8 の 10 億倍明るい X 線を、10 フェムト秒未満のパルス時間内で提供する。照射時間が短いため、試料の損傷によるタンパク質の構造変化が起こる前に回折像を撮影することができる。

【論⽂情報】

掲載誌：Nature Communications
論⽂タイトル：Real-time observation of a metal complex-driven reaction intermediateusing a porous protein crystal and serial femtosecond crystallography
著者：Basudev Maity, Mitsuo Shoji, Fangjia Luo, Takanori Nakane, Satoshi Abe, ShigekiOwada, Jungmin Kang, Kensuke Tono, Rie Tanaka, Thuc Toan Pham, MarikoKojima, Yuki Hishikawa, Junko Tanaka, Jiaxin Tian, Misaki Nagama, Taiga Suzuki,Hiroki Noya, Yuto Nakasuji, Asuka Asanuma, Xinchen Yao, So Iwata, Yasuteru
Shigeta, Eriko Nango, Takafumi Ueno
DOI：10.1038/s41467-024-49814-9【問い合わせ先】

東京⼯業⼤学 ⽣命理⼯学院 ⽣命理⼯学系／同 科学技術創成研究院 ⾃律システム材料学研究センター

教授

上野隆史
〒226-8501 神奈川県横浜市緑区⻑津⽥町 4259
Email: tueno@bio.titech.ac.jp
TEL: 045-924-5844【取材申し込み先】

東京⼯業⼤学 総務部 広報課
Email: media@jim.titech.ac.jp
TEL: 03-5734-2975

FAX: 03-5734-3661

東北⼤学 多元物質科学研究所 広報情報室
Email: press.tagen@grp.tohoku.ac.jp
筑波⼤学 計算科学研究センター 広報・戦略室
E-mail: pr@ccs.tsukuba.ac.jp
TEL: 029-853-6260
理化学研究所 広報室 報道担当
Email: ex-press@ml.riken.jp
TEL: 050-3495-0247