LC-MS/MSを用いたゴルフ場農薬の一斉分析法の検討
1○竹峰秀祐 1,2、山本勝也 1、前川真徳 1、宮里正弘 3、松村千里 1、藤森一男 1、近藤明 2
兵庫県環境研究センター，2 大阪大学大学院 工学研究科，3 財団法人 ひょうご環境創造協会

Analysis of Pesticides for Golf Course by using LC-MS/MS. by 1,2Shusuke TAKEMINE, 1Katsuya YAMAMOTO,
1
Msanori MAEKAWA, 3Masahiro MIYAZATO, 1Chisato MATSUMURA, 2Kazuo FUJIMORI, 3Akira KONDO, (1Hyogo
Pref. Inst. of Env. Sci., 2Grad. school of Eng., Osaka Univ., 3Hyogo Env. Advancement Assoc.)
1.

はじめにゴルフ場で使用される農薬等による周辺環境の汚染と動植物への被害の未然防止を図るため、平成 2 年度に「ゴルフ検討で化合物由来のイオンが確認できた化合物とした。標準
試料の濃度は 100ng/mL に設定し、溶媒はアセトニトリルとした。

場で使用される農薬による水質汚濁の防止に係る暫定指導

サンプラーからの試料の注入量は 5μL、移動相には A 液指針」が制定され、ゴルフ場排出水中の農薬の濃度に指針値に 2mM 酢酸アンモニウム水溶液、B 液にアセトニトリルをが設定された。平成 22 年度に暫定指導指針の改正に伴い、

用 い 、 グ ラジ エ ン ト分 析 を行 っ た 。 グラ ジ エ ント 条 件を新たに 29 農薬に指針値が追加された。また、分析法についTable1 に示す。MS の設定として、キャピラリー電圧を 0.5kV、ても大幅な見直しが行われ、LC-MS/MS を用いた一斉分析法

イオン源温度を 150℃とした。脱溶媒温度は 450℃、脱溶媒1)が示された 。

ガス流量は 1000L/hr とした。

LC-MS/MS を用いた一斉分析法は 42 種（代謝物を含めてLC カラムに、ACQUITY UPLC BEH C18（1.7μm 、2.1×44 種）が示されており、その他は LC-MS/MS や HPLC を用150mm、Waters 社製）と ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8μm、いて個別に分析する方法、もしくは GC-MS を用いた分析法

2.1×150mm、Waters 社製)を使用し、結果を比較検討した。

が示されている。しかし、その他の化合物についてもLC-MS/MS を用いた一斉分析法に含めることが出来れば、分Table 1. Gradient condition. The mobile phase is as follows: A is

析作業の省力化を行うことが出来ると考えられる。

2mM ammonium acetate, and B is acetonitrile.

本研究では、指針値が設定されているゴルフ場農薬につい

0.3
Composition of mobile phase
Time[min]
A[%]
B[%]

Flow rate[mL/min]て、LC-MS/MS での一斉分析条件について検討した。
2.

0.0
2.0
3.0
10.0
12.0
17.017.2

実験方法

2.1

分析対象化合物

分析対象化合物は農薬 74 種とした。代謝物であるネライ
ストキシンシュウ酸塩、カルベンダジム、トリフルミゾール
代謝物、カフェンストロール脱カルバモイル体、およびトリ99997030
5599

1130709595
12.4 検量線の作成
2.3 でピークが確認できた化合物について、検量線の直線ネキサパックも分析対象とした。

性の確認を行った。混合標準試料を作成し、1ng/mL、5ng/mL、2.2ESI を用いたイオン化条件の検討

分析対象化合物について、ESI を用いてイオン化が可能か

10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL の濃度に設定し、検量線を作成した。
分析条件は 2.3 と同様のグラジエント条件、MS 条件を用検討するため、インフュージョン分析を行った。併せて、化合物毎の最適なターゲットイオン、コーン電圧、コリジョンい、LC カラムには HSS T3 を用いた。

エナジーを検討した。
LC-MS/MS は 、 XevoTQ MS シ ス テ ム （ ACQUITY

3.

結果と考察

UPLC/Xevo TQ MS、Waters 社製）を用いた。MS の設定とし

3.1

ESI を用いたイオン化条件の検討結果て、キャピラリー電圧を 2.5kV、イオン源温度を 120℃とし66 化合物について、化合物由来のイオンが確認できた

た。脱溶媒温度は 250℃、脱溶媒ガス流量は 500L/hr とした。

（Table2）。今回の条件でイオンが確認できなかった化合物は、各対象化合物を標準原体から順次希釈を行い、1μg/mL～誘導体化しイオン化できる化合物に変化させる、もしくは添50μg/mL の濃度に設定した標準試料をインフュージョン分加剤を使用し特殊な付加イオンを生成する等の措置が必要析に用いた。と考えられる。ただし、ベノミルについては、代謝物のカルベンダジム由来のイオンが確認されたため、標準品中で分解2.3 分析カラムの比較検討していたと考えられる。

2.2 の検討で得られた化合物毎の最適な MS 条件を用い、LC-MS/MS で標準試料の分析を行った。対象化合物は 2.2 の3.2

分析カラムの比較検討結果

Table 2. Ion modes, target ions, retention times (RTs), and linearity of calibration curves. If the ions of target compound were notdetected in the infusion analysis, “N.D.” is described in the column of “Target ion”. The values in the column of “RT” indicate
the retention times of peak using HSS T3. If the standard solution of 100ng/mL was not detected, “N.D” is described in thecolumn of “RT”. If the standard solution of 1ng/mL was not detected, the value of “Linearity of calibration curve” is marked with“*”. If the standard solution of 5ng/mL was not detected, “**” is described.
Compound nameAcetamiprid
Asephate
Isoxathion
Imidacloprid
Etofenprox
Clothianidin
Chlorpyrifos
DiazinonThiamethoxam
Thiodicarb
Tebufenozide
Trichlorfon
Pyridapfenthion
Fenitrothion
Permethrin
Bensultap
Nereistoxin oxalate
Azoxystrobin
Isoprothiolane
Iprodione
Iminoctadine triacetateEtridiazole
Oxine-copper
CaptanChlorothalonil
Chloroneb
Difenoconazole
Cyproconazole
Simeconazole
ThiuramThiophanate-methyl
Carbendazim
Thifluzamide
Tetaconazole
Tebuconazole
Triflumizole
Triflumizole MetaboliteIon
mode++++++++++++++++++++++++++++-

Target ion (Pre./Pro.) [m/z]
Quantification

Confirmation

222.9 / 89.9
184.0 / 142.9
184.0 / 113.0
314.0 / 105.0
314.0 / 126.0
256.0 / 175.0
256.0 / 208.9
394.3 / 359.3
394.3 / 177.1
250.0 / 168.9
250.0 / 131.7
351.8 / 277.9
351.8 / 197.9
304.9 / 168.9
304.9 / 114.9
292.1 / 210.9
292.1 / 131.8
355.0 / 88.0
355.0 / 108.0
351.2 / 149.0
351.2 / 105.0
257.0 / 127.0
257.0 / 78.8
341.0 / 189.0
341.0 / 205.0
278.0 / 109.0
N.D.
432.0 / 102.9
432.0 / 119.0
149.9 / 104.9
404.0 / 329.0
404.0 / 344.0
291.0 / 231.0
291.0 / 189.0
328.0 / 243.0
330.0 / 245.0
178.5 / 69.0
178.5 / 55.0
N.D.
146.0 / 91.2
146.0 / 118.0N.D.
245.0 / 182.0
245.0 / 175.0
N.D.
406.0 / 250.9
408.0 / 253.0
292.3 / 70.0
292.3 / 124.7
294.0 / 73.0
294.0 / 69.9
241.0 / 87.9
241.0 / 119.9
343.1 / 150.6
365.1 / 130.8
192.0 / 160.0
192.0 / 132.0
526.9 / 165.9
526.9 / 129.9
372.0 / 159.0
308.0 / 70.0
310.0 / 70.0
278.0 / 73.0
293.0 / 223.0
293.0 / 194.0

RT
[min]

Linearity ofcalibration
curve [r 2 ]

5.75
4.30
12.37
5.58
N.D.
5.37
N.D.
12.18
5.00
8.3611.35
5.12
10.25
N.D.

0.998
0.999
0.990
0.990

11.43
6.06
10.00
10.86
10.79
N.D.

**
0.996*
0.999
0.999
0.999*

0.995
0.999
0.999
0.996
0.996
0.995
0.997

N.D.
6.16

0.946

11.63
9.54
9.85
8.25
7.27
5.43
11.38
10.06
10.50
10.53
10.50

0.999
0.999
0.998
0.997
0.977*
0.999
0.999
0.996
0.995
**
0.991*

Compound name
Tolclofos-methyl
Validamycin
Hymexazol
Flutolanil
Propiconazole
BenomylPencycuron
Boscalid
Fosetyl
Polycarbamate
Metalaxyl
Mepronil
AsulamEthoxysulfuronOxadiargyl
Oxaziclomefone
Cafenstrole
Cafenstrole metabolite
Cyclosulfamuron
Dithiopyr
Siduron
Simazine
Terbucarb
Triclopyr
Napropamide
Halosulfuron
Pyributicarb
Butamifos
Flazasulfuron
Propyzamide
Bensulide
Pendimethalin
Benfluralin
MCPP
MCPA
Trinexapac-ethyl
Trinexapac

Ion
mode++++-++++++++++++++++-

Target ion (Pre./Pro.) [m/z]
Quantification

Confirmation

301.0 / 143.0
301.0 / 125.0
498.3 / 178.1
498.3 / 142.0
100.0
322.2 / 145.0
323.3 / 146.0
342.0 / 158.8
342.0 / 68.9
N.D.
327.2 / 111.0
327.2 / 92.0
341.0 / 112.0
343.0 / 114.0
N.D.
N.D.
280.0 / 220.0
280.0 / 192.0
270.0 / 118.9
270.0 / 90.9
229.0 / 197.0
229.0 / 133.0
399.4 / 182.0
399.4 / 156.0
358.1 / 341.0
358.1 / 223.0
376.0 / 190.0
376.0 / 161.0
351.1 / 100.0
351.1 / 72.0
250.0 / 186.0
250.0/131.0
420.3 / 265.3
420.3 / 77.9
400.2 / 352.2
400.2 / 304.2
231.2 / 92.0
232.2 / 93.0
202.0 / 95.9
202.0 / 103.8278.0 / 165.9
278.0 / 108.9
254.0 / 195.9
254.0 / 218.0
272.2 / 129.0
272.2 / 74.0
433.2 / 252.1
433.2 / 154.0
331.1 / 181.0
331.1 / 165.0
333.0 / 180.0
333.0 / 152.0
408.0 / 182.0
256.0 / 190.0
256.0 / 173.0
398.0 / 158.0
398.0 / 218.0
282.0 / 212.0
282.0 / 71.0
N.D.
213.0 / 141.0
215.0 / 143.0
199.0 / 141.0
201.0 / 143.0
253.1 / 68.9
253.1 / 207.1
223.2 / 135.0
223.2 / 179.1

Linearity ofRTcalibration[min]2curve [r ]

N.D.
N.D.
N.D.
10.85
11.15

0.999
0.999

12.24
10.34

0.996
0.989

8.53
10.74
1.55
4.70
N.D.
13.02
10.98
5.75
N.D.
12.74
9.35
7.05
12.42
4.82
10.57
5.04
13.23
12.51
4.75
10.38
11.82
13.27

0.999
0.998
0.998

4.83
4.71
4.86
N.D.

0.999
0.999
0.999
0.990*
0.999
0.997
0.997
**
0.999
0.999*
0.981
0.992
0.995
0.816*
0.999
0.999
0.992
0.991*
0.995

LC-MS/MS の分析で、55 化合物のピークが確認できた。

今回の検量線の範囲で、46 化合物が 0.99 以上の r2 を示し

BEH C18 と HSS T3 に確認できた化合物の違いは無かった。

た。クロロタロニル、チオファネートメチル、およびプロピ

しかし、HSS T3 のほうが全化合物とも保持時間が長かった

ザミドは、検量線の直線性が低かった。これらの化合物は標ため、対象とした化合物の保持性能が高いと考えられる。

準試料中での安定性、他化合物とのイオン化の競合等、確認

Table2 に HSS T3 を使用した場合のピークの保持時間を示す。 する必要があると考えられる。
ピークが確認できなかった化合物は、「N.D.」と表記した。

対象化合物毎に感度が大きく違うため、1ng/mL および新たに指針値が設定された農薬のなかで、LC-MS/MS を使5ng/mL（もしくはそれ以上の濃度）のピークが確認できず、用した個別分析法が示されているベンスルタップと代謝物、検量線が 5 点検出できない化合物があった。検量線が 5 点検

チオファネートメチルと代謝物、トリネキサパックエチル、出できなかった化合物は「**」と記載している。

および MCPA は、今回の分析条件でピークを確認できた。た

実試料を分析する場合、設定された指針値と一斉分析の対だし、LC-MS/MS を用いた一斉分析法の対象となっているフ象とする化合物の感度について勘案し、検量線の設定や濃縮ェニトロチオン、およびシクロスルファムロンは、ピークが倍率を十分に検討する必要があると考えられる。また、移動検出されなかった。

相の緩衝液の条件を変更することで、イオン化効率が改善し、今回の分析条件でピークが確認できなかった化合物につ感度が向上する化合物もあると考えられる。

いては、感度が低い、LC カラムが適していない、移動相が謝辞適していない等、様々な理由が考えられる。更なる検証が必していただきました。また、日本ウォーターズ株式会社の山要である。

本氏には LC カラムを提供していただきました。ここに記し、京都府保健環境研究所の近藤氏には、標準試薬を提供謝意を表します。
3.3

検量線の作成結果

各対象化合物の検量線の直線性を Table 2 に示す。なお、
エトキシスルフロンは、標準試料中での安定性が低いため、直線性の確認が出来なかった。

参考文献
1)

環境省、2010、ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁の防止に係る暫定指導指針、http://www.env.go.jp/water