質量顕微鏡の開発
瀬藤

光利ａ，ｂ，ｃ＊，松本峰男ｂ，細川直史ｂ，ｃ，杉浦

悠毅ｂ，ｃ，早坂孝宏ａａ

大学共同利用機関法人自然科学研究機構生理学研究所，ｂ三菱化学生命科学研究所・分子加齢医学研究グループｃ

東京工業大学大学院生命理工学研究科

キーワード：質量顕微鏡法，イメージング質量分析，マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法，プロテオーム，メタボローム

ぐためには先入観のない確かな観察が必要であると同時に，
1.

はじめに形態学だけに頼らずに生化学等を用いた解析からの知見と統1590 年頃オランダのヤンセン親子が顕微鏡を発明して以合して理解を深めていくことが重要であると考えられる．本来今日まで，肉眼では見えない小さなものを見たいとの思い

稿では物質の生化学情報とその局在情報を同時に知るためのを持つ科学者が，顕微鏡そのものやその周辺の技術に数多く新たなツールとして我々が開発した質量顕微鏡について以下の改良を施してきた．また研究者の欲求がより小さなものをに説明する．

見たいということから，観察対象が何であるか知りたいという思いへと変わっていくにつれて，さらに数多くの観察手法

2.

や同定手法が開発されてきた．これらに携わった先人達の苦2.1 分子を同定しつつイメージングする顕微技術への期

労や業績は偉大なものであり

1,2），筆者もその恩恵を多分に受けてきた．

背景

待の高まり
ヒトゲノムプロジェクトが完了し，ヒトや他の生物を構成しかしこれら従来の手法には未だ多くの問題点が存在すする分子について多くの情報がもたらされた現在において，る．例えば顕微鏡を用いる際に，実は多くの場合我々は知っ

次の課題はそれら分子の生体における分布を分析することでているものしか“見る”ことが出来ない．それを示す良い例ある．こうした欲求は医療現場においても強い 3 ～ 5）．

が，胃潰瘍にまつわるエピソードである．現在では胃潰瘍は2.2

従来の観察手法の問題点ヘリコバクターピロリ菌によって生じると判明しており，胃顕微鏡を用いて生体分子の同定観察を行おうとする場合，の中に細菌がいることは広く知られるようになった．しか現在主に二種類の手法が汎用されている．一つは抗体を用いし，オーストラリア人のバリー・マーシャル氏とロビン・る方法で，免疫反応を利用して観察したい対象に結合する物

ウォレン氏の両名が，ピロリ菌によって胃潰瘍が生じるとい質（抗体）を作製し，その抗体を蛍光で標識することによっうことを発見するまでは，病変組織にピロリ菌が存在し，て対象物質の局在を明らかにする手法である 6）．もう一つ

我々の網膜には映っていたのにもかかわらず，誰もピロリ菌は，遺伝子改変手法を用いて対象遺伝子にオワンクラゲ由来を“見る”ことができなかったのである．これは胃の中は塩の緑色蛍光タンパク質 GFP（green fluorescent protein）を結酸によって強酸性であり，殺菌されているという当時の常識合させることによって観察する手法である．

によるところが大きい．誰もが細菌などいるはずがないと無筆者もこれらの手法を駆使して顕微鏡による生体分子の観条件に信じこんでしまい，そこにいる細菌を見ることが出来察を行ってきた 7）．これまでに，ニューロン樹状突起シナプなくなっていたのである．一方，ひとたび菌が存在するといス部に NMDAR2 サブユニットを輸送するモータータンパク

うことが常識になってからは，見えなかったころとまったく質 KIF17 の解析 6）を行い，最近では微小管を構成するチュー同じ装置と処理を用いているのにもかかわらず，誰にでもそブリンタンパク質に対する翻訳後修飾の一つであるポリグルれを見ることが可能となった．不思議な事実であるが，このタミン酸化を司る酵素を同定し，ポリグルタミン酸化のことは見るということの難しさを端的に示す良い例である．

ニューロン内での機能を明らかにした 8,9）．

このような，見えているのに見えていないといった事態を防しかしこれらの抗体や GFP を利用した手法，さらには，ナノバイオテクノロジーを用いたラベル法 10 ～ 13）も，あくま

Mitsutoshi Setou, Mineo Matsumoto, Naofumi Hosokawa, Yuki
Sugiura and Takahiro Hayasaka: Development of mass microscopyａ〒 444―8787 愛知県岡崎市明大寺町字東山 5―1
TEL: 0564―59―5267; FAX: 0564―59―5291＊
E-mail: setou@nips.ac.jp
2007 年 11 月 2 日受付
24で間接的な観察法，つまり実際に観察しているのは抗体やGFP，ナノプローブが発する蛍光であり，意図する観察対象を直接見てはいないのである．そのため真に観察したい分子は，得られた顕微鏡像と違った挙動をしていたという事例には事欠かない．さらに本質的な問題としては，観察のために
顕微鏡 Vol. 43, No. 1（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

は対象分子がすでに同定されていなければならないという制ものである．この構造解析は MS を複数回行うことから MSn

約がある．抗体を作るにせよ，GFP をつけるにせよ，当然解析と呼ばれる．化合物の質量数や構造解析で得られたデーながらこれらは分かっていないモノに対しては行えない．初タとデータベースを参照することで化合物の同定も可能であ

めて見るモノ，あるいは未知のモノに対して，従来の抗体やる．タンパク質のような大きな分子でも断片のペプチドやアGFP を用いた観察手法は一般に無力である．そのため，電ミノ酸の構成から複雑なタンパク質の分子配列の構造を解析

子顕微鏡を用いて“ありのままに”高解像度で物質同定をすることが出来る．これらを行う分析装置の一つで我々が使伴った観察ができないかという試みが期待を集めてき

用 し て い る 装 置 に 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 計（time-of-flight14,15）．無染色試料を高コントラストで観察するヒルベルト（TOF）mass spectrometer，以下 TOF-MS）がある．これは微分コントラスト電子顕微鏡を初めて哺乳類細胞の観察に適高質量範囲測定，精密質量測定の点で他の装置より優れていた

用し，その細胞内ナノ構造をとらえた

16）などの事例もある

る．質量分析技術は，例えば，プロテオミクスと呼ばれるタが，今の段階では生物試料は電子線ダメージの問題から，原ンパク質の網羅的解析において革新的な発展をもたらした．

子分解能には程遠く，微小管のような巨大かつ特徴的な構造

プロテオミクスとはタンパク質をプロテアーゼで消化し，物の同定にとどまっている．また分析電顕は原子同定ができMS で得られた情報をタンパク質・核酸配列データベースでる有効な手段であるが，今のところ有機分子の分子構造の観検索して同定するボトムアップ方式の解析法である．分析精察は困難である．

度の向上とデータベースの発達も相まって，質量分析は生体物質の同定やタンパク質の翻訳後修飾を始め実に様々な目的

3.

質量顕微鏡とは以上の問題を解決する顕微鏡として我々が開発を進める質に用いられるようになった．
3.2

イオン化法

量顕微鏡とは，これまでの光を検出する光学顕微鏡や，電子質量分析法においてはいくつかのイオン化法が用いられるを検出する電子顕微鏡と異なり，質量を検出することで可視が，本項の主題である質量顕微鏡法においては二次イオン化化を行う手法である（図 1）．以下に詳細を説明する．とマトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI; matrix-

質量分析法（Mass Spectrometry; MS）

assisted laser desorption/ionization）による質量分析が一般的

3.1

質量分析法（以下 MS）とは原子・分子・クラスターなどである．二次イオン化質量分析法（SIMS）は解像度の点での粒子を何らかの方法で気体状のイオンとし，それらイオン優れているが原子レベルに分解が起きるため生体分子の解析の質量と電荷の比に応じて分離・検出し，質量数を分析するには不向きであった．ただし，ごく最近クラスター SIMS の手法である．また単純な質量の分析だけでなく分子の構造解登場により改善しつつある．MALDI は観察対象にマトリッ析も可能である．構造解析の原理は質量分析装置内でイオンクスを塗布し結晶を作り，そこにレーザーを照射し短期間に化した分子を分解し，断片イオンの質量数を測定するという急激に熱を発生させ対象分子をイオン化させるという手法である．田中耕一（（株）島津製作所）氏が，MALDI の発見で2002 年のノーベル化学賞を受賞したことは記憶に新しい．
従来のイオン化法では壊れやすかった分子量～ 105 Da 領域のタンパク質などの生体分子までイオン化することが出来る．
3.3 質量顕微鏡法（Mass Microscopy）
質量顕微鏡法とは質量分析の解析の次元を，これまでの一次元から二次元へと上昇させた手法である．通常，質量分析法では前処理として解析対象分子を分離・精製しなければならず，組織細胞内での分布や局在という位置情報が失われてしまうという欠点が残されていた．これを対象分子の位置情報が得られる状態で解析出来るようにしたのがイメージング
質量分析，質量分析イメージング，マスイメージング等と呼ばれる手法である．どれも同じものを指すが，日本語の特性として，後に来る言葉の方に重点が置かれる．イメージング
質量分析は分析法の一種という意味合いが強く，分析化学や質量分析の立場の人が好み，質量分析イメージングはイメージングという意味合いが強く，より画像化技術に力点が置かれている傾向がある．イメージング質量分析では対象分子の同定および局在情報の取得を同時に行うために，薄切片とした生体試料にマトリックスを噴霧して均一な微細結晶を作

図1

解説

多彩な顕微鏡法の物理的源流．

質量顕微鏡の開発

り，レーザーで二次元走査することによってイオン化を行
25【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

い，レーザーを照射した場所ごとに発生したイオンを TOFMS で検出する手法が一般に用いられる

17）

4.1 装置開発のポイント．1990 代にスター開発した実験機は光学観察系，レーザー照射系，イオン捕集・トした初期のイメージング質量分析の解像度は 0.1 mm ～搬送系，質量分析系およびデータ処理系で構成されている

1 mm 程度と肉眼解像度程度であった．

（図 2）．それぞれの重要な開発項目について概要を紹介する．

それらが 21 世紀に入ってより進化して肉眼解像度を超える

4.1.1

光学観察系ようになり，顕微鏡の定義（肉眼解像度を超える解像度を持試料を置く光学観察系は大気圧も可能なシステムである．

つイメージング手法）を満たすようになった．生体組織の切大気圧下でイオン化が可能な MALDI 法をベースとした質量片上において数千点に及ぶ質量分析を行うことになるため，膨顕微鏡を開発中である．実際に我々は解像度 10 μm 以下のレ大な情報を取り扱うことになる．この手法によりタンパク質・ベルにて，この大気圧型質量顕微鏡のプロトタイプ機を製作

ペプチド・脂質を生体組織上で位置情報を保持したまま解析することができた（原田および瀬藤，2007 年度アメリカ質する事が可能になり，病理組織への応用が報告されるように量分析学会）．

なってきた．質量顕微鏡および質量顕微鏡法の誕生である．

4.1.2

レーザー照射系

質量顕微鏡は現在までに，日本で筆者らのグループ（自然レーザー照射系は，観察で着目した部位を正確に分析する科学研究機構を中核とした島津製作所，癌研究会，理化学研ために微小径のレーザー光を試料に照射し，微小領域のイオ究所，大阪大学，三菱化学生命科学研究所との開発チーン化を行うシステムである．観察光軸とレーザー光軸を別々ム），米国で Caprioli らのグループ

18），欧州で Heeren らのグループ 19）が主導して研究を進めてきた．
ちなみに，筆者はこの装置を名付けるにあたって，以前に使用されていないことを確かめた上で，質量分析顕微鏡，略に制御することにより，レーザー照準精度を 1 μm 以下，照射スポット直径を 5 μm に抑えることが出来た．標準的な市販装置のレーザー照射スポット直径は約 50 μm であり飛躍的に改善した．

して質量顕微鏡と名付けた．ところが科学技術振興機構の予4.1.3

算をいただく際に，分析家の先生から，顕微質量分析装置の本装置では，試料のイオン化は大気圧付近の圧力領域で行方がよいのではないか，との指導が入り一度は顕微質量分析われる．このために質量分析部は高真空中で動作させる必要装置と改名した．その後，日経バイオテクノロジーの宮田氏があり，イオン捕集・搬送系では差動排気システムとなってにこれらの名前をお話したところ，質量顕微鏡が今後使われいる．質量顕微鏡法において生体組織から直接生成される分るでしょう，ということであった．実際，その後数年が経ち，子の情報をより正確に得るためには，従来型よりも広範囲の使用頻度を Google で調べると，たしかに宮田氏の予言どお質量を持つイオンを捕集する必要がある．また，生体組織かり質量顕微鏡が圧倒的に多く，数万件がヒットする．どうすらは多種のイオンが生成するが，これらを分離検出できなけ

イオン捕集・搬送系

べきか日本質量分析学会および国際質量分析学会の用語委員

ればならない．もしも選択分離能（= 質量分解能）が十分でである内藤先生と相談するが，科学的にどれも正しい場合，ない場合には，得られた質量スペクトル内で隣接するピーク皆が一番使っている用語が正しい言葉ではないか，というのが一体化してしまい，分析精度が低下してしまう．本装置でが今のところの我々の結論である．先日のイメージング質量は，この問題への対応としてデジタルイオントラップ装置を分析と質量顕微鏡法に関する初の国際会議，第一回サニベル
カンファランスでも同様の結論であった．英語圏では Mass
Microscopy という単語が我々とほぼ同時にオランダ，オーストリアで使われ始めている．Imaging Mass Spectrometry，Mass Spectrometry Imaging の 両 者 で は Imaging Mass Spectrometry の方が良く使われているが，Ionmobility Mass Spectrometry と同じ IMS と略されるために嫌がる研究者も多く，結論には達していない．いずれにせよ，日本語圏，特に顕微鏡学会の諸兄には質量顕微鏡で良さそうである．
4. 質量顕微鏡法の実際細胞内の生体分子の分布を測定しようとした場合，一つの細胞内にある生体分子の量はきわめて微量である．当然ながら，このような超微量分子を検出するためには高感度検出技術が必要となる．そのためにはイオンを高効率で発生させ，そのイオンを高効率で捕集し，さらに高効率で質量分析計に搬送しなくてはならない．これらを達成するために，装置の高感度化と試料の適切な前処理法の開発を行った．
26

図 2 質量顕微鏡プロトタイプ機の概観．①顕微鏡部 ②試料チャンバー（以上，大気圧） ③イオン搬送系 ④デジタルイ
オントラップ ⑤リフレクター型飛行時間質量分析計．

顕微鏡 Vol. 43, No. 1（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

開発，搭載した．これは印加電圧の周波数をデジタルに変化ることも可能となった 21）．

させ，高電圧にせずにイオンをトラップすることができる装4.2.3 MSn 解析の感度上昇のための，生体試料処理法

置で，従来のイオントラップの問題点であった高電圧下の放さ ら に，on-tissue digestion 法 を 適 用 す る 対 象 と し て，電によるイオン収率の低下を防ぎ，高効率でイオンを集めらPVDF（ポリビニリデンフロライド）膜上の組織切片を，変れるようになった．

性・還元作用を持つ緩衝液を用いて新たな PVDF 膜へ転写

4.1.4

質量分析系する手法も考案した 22）．この手法では，組織内タンパク質

さらに 2008 年完成予定の次世代の質量顕微鏡においては，を変性させ還元することで酵素消化効率が向上し，さらに組質量分解能を向上させるために，新開発の高分解能マルチ織内の塩を除くことができる．これにより組織内での MSn

ターン飛行時間型（multi-turn TOF; mTOF）質量分析器を用解析をより効率よく行えるようになった．

いることを計画している．通常の TOF では質量分解能が飛行時間に比例するため分解能の向上には装置を大型化する必要

4.2.4

顕微鏡観察をするために，透明かつ電気導電性を有する膜の探索があるが，mTOF ではイオンを周回飛行させることにより装続いて我々は特殊フィルムの使用に着手した 23）．PVDF 膜置を大型化せずに高い分解能を得られることが期待される．

は確かに観察したその場所での物質同定を可能にしたもの

4.1.5

データ処理系の，光の透過性がないことから試料観察が困難であった．

試料のイメージングの際には顕微鏡で取得した試料画像内

我々は生体試料を観察しながら MSn 解析を行えるように透で，任意の測定領域を指定し，任意の解像度で自動 2 次元ス

明導電性シートを使用し，そのシート上における試料前処理キャンを行える．一回の測定で得られる質量分析スペクトル法を開発した 23）．これには非常に薄い PET（ポリエチレンの数は数万に達しその情報量は膨大なものとなるため，効率テレフタレート）基板上に金属酸化物薄膜を形成した素材を的かつ高速に解析する必要がある．このため，データ処理系新規試料支持材として採用した．この素材は 75 ～ 125 μm のでは得られた情報から有効なデータだけを効率良く抽出する

PET 基板に，酸化インジウムスズ（ITO）を 5 ～ 15 nm 程度技術開発を行った．

蒸着したものである（ITO フィルム）．試料前処理法の適用

4.2

試料の適切な前処理法

高効率イオン化のためのサンプル処理などの手法開発を，既存の質量分析装置を用いることで行っている．以下に我々がここ数年取り組んできた手法の開発の歩みについて説明す
る．
4.2.1

後に組織上で MS2 解析を行い，得られたスペクトルよりタンパク質同定に成功した 23）．
4.2.5

高効率イオン化とノイズの低減をするための，マトリックス塗布法の開発
一方，スプレードロップレット法と命名したマトリックス高効率イオン化のための，試料切片厚みの最適化の塗布方法も新たに開発した．元来はスプレーコーティング

まず我々は高効率イオン化を狙って生体組織切片の厚さの法および滴下法といった別個に採用されていたマトリックス最適化を行った．特に高分子量タンパクの計測においては，塗布法を，二段階連続で行うというものである 24）．すなわ

切片の厚さが 10 μm 以下となった時に高効率イオン化と低ノちマトリックス溶液をスプレーコーティングした後，より高イズを示す測定結果が得られることを明らかにした 20）．

濃度の同種マトリックス溶液の液滴をそこに滴下し微細結晶

4.2.2

生体分子の位置情報を保持した上で高分子同定のための，試料処理法
さらに生体組織上で，通常ではイオン化が困難な巨大タンパク質の解析を行うため（<100 kDa），組織上において試料で覆われたマトリックススポットを作製するものである．
ラット脳切片に対する処理を例にとれば，この方法によりそこから検出され得るピークのシグナル強度は従来法に比べ約30 倍となりシグナル／ノイズ比が飛躍的に向上した 24）．の拡散を最小限に抑えるタンパク質変性法，酵素消化法を考さらに我々はこのスプレードロップレット法によるマト案し，これを on-tissue digestion 法と名付けた 21）．これは組リックス塗布を，培養細胞を用いた実験系に対しても適用し織内タンパク質を変性させた後に，微小量のトリプシン溶液た．ITO フィルム上に直接 HEK293T 細胞の培養を行い，こをケミカルインクジェットプリンター（島津製作所）を用いれらにスプレードロップレット法を用いることで生体試料のて分注し，タンパク質を消化するというものである．我々は直接質量分析用試料として調整できることを示した 25）．ま既存の四重極イオントラップ飛行時間型質量分析計 AXIMA-た HEK293T 細胞に対して on-tissue digestion 法を行い，得QIT（島津製作所，MALDI-QIT-TOF MS）によりこの方法のられた細胞由来タンパク質のトリプシン消化産物の中で特に評価を行った．ケミカルインクジェットプリンターとはピコ強いピークを示す二つのものに対して MS2 解析を行ったとリットルレベルの微量溶液分注機能を備えた装置で，酵素消ころ，これらはそれぞれ histone H2A.2，nucleophosmin のト化やマトリックス添加等の処理を微細なスケールで実施できリプシン消化産物と同定された 25）．今回取り上げた培養細るものである．on-tissue digestion 法により，分子量が大き胞の測定系においては，簡便かつ迅速なタンパク質分子種のくそのままではイオンとして検出されにくいタンパク質もト同定を伴った解析が十分可能であると示された．このようなリプシン消化産物として検出できるようになった．さらにこアプローチは，遺伝子発現などの形質転換した培養細胞の発れらの消化産物を生体組織上で直接 MS2 解析により同定す

現タンパク質や培養細胞の系を用いた細胞間シグナルにおい解説

質量顕微鏡の開発

27【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図3

癌組織に対するイメージング質量分析の例．て，新たな視点からの解析法を提供するものであり，質量顕微鏡の応用範囲を拡張する．
5. 展望
まず，メタボロームのマッピングがすぐにでも可能である．またプロテオーム領域，すなわちタンパク質においても，ユビキチン化 26 ～ 28）やグルタミン酸付加 9）などのタンパク質の翻訳後修飾の様相を解析するには，今のところ質量分析以外に方法がなく，位置情報の取得が困難であるが，今後質量顕微鏡ではこうした翻訳後修飾を受けたタンパク質の細胞内分布の違いをも検出できることが期待される．
病理学的な試料を用いた分析に質量顕微鏡を用いることで，その病理に対して大きな影響を及ぼしているマーカーを探索することも可能である．胃がんの背景にヘリコバクターが，肝癌の背景に肝ウイルスが，進行麻痺の背景に梅毒がいたように，思わぬ微生物由来物質が探索され，病原菌が同定され，それまで不治と思われていた病気に治療法や予防法が出来るかもしれない．我々は様々な腫瘍組織 29,30）（図 3），あるいは実際に糖尿病などの生活習慣病に罹患した患者組織や，統合失調症の死後脳において構成物質や物質的変化を解明し，異常部位の物質的背景が何であるかを明確にしたいと考えている．
また，一度に数千から数万の分子の量的・位置的な挙動を，ターゲットを絞らずにモニターできる革命的な手法であることから，薬物動態，さらに薬物投与などの操作を加えたときの反応等，創薬の面でもすでに必須の技術として各製薬メーカーで使用されている．今後はさらに質量顕微鏡による疾患の解析から得られた知見に基づいて新薬も開発されるだろう．
謝辞

この研究は科学技術振興機構の先端計測分析技術・機器開発事業の支援を得て行ったものです．澤田研究総括，島津製作所基盤研究所吉田所長をはじめとする共同研究者の皆様に感謝いたします．
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顕微鏡 Vol. 43, No. 1（2008）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】