分裂酵母のアクチン細胞骨格に関する微細構造学的解析
Ultrastructural Analysis of the Actin Cytoskeleton in Fission Yeast
釜崎とも子ａ，高木智子ｂ，ｃ，馬渕一誠ｃ，大隅正子ｄ，ｅTomoko Kamasaki, Tomoko Takagi, Issei Mabuchi and Masako Osumiａｂ

名古屋大学高等研究院・日本学術振興会特別研究員PD

日本女子大学理学部物質生物科学科・日本女子大学バイオイメージングセンターｃ

学習院大学理学部化学科生命分子科学研究所ｄ

認定特定非営利活動法人綜合画像研究支援ｅ

日本女子大学名誉教授

要旨

アクチン細胞骨格は，細胞の極性成長や細胞質分裂などの生命活動の基盤として重要である．分裂酵母は，アクチン細胞骨格の形成機構や役割を研究するための優れたモデル系である．分裂酵母のアクチン細胞骨格は，主に蛍光顕微鏡によって解析されており，パッチ，ケーブル，リングの 3 種の構造として観察されるが，その微細構造はほとんど可視化されていなかった．最近，我々は加圧凍結固定法および免疫電子顕微鏡法によって，3 種の F- アクチン構造の微細形態を明らかにした．さらに，分裂酵母細胞のアクチン細胞骨格を構成する F- アクチンの方向性を初めて明らかにした．これらの解析から，アクチン細胞骨格に関する基本的な情報や，アクチン細胞骨格の機能を解明するための一助となる知見が得られた．

キーワード：アクチン細胞骨格，加圧凍結固定法，ミオシン S1 修飾，分裂酵母，電子顕微鏡

1.

S1 やヘビーメロミオシンで修飾することにより，アクチンアクチン繊維の性質細胞骨格を構成する F- アクチンの方向性が可視化されてきアクチン細胞骨格は，細胞の生命活動における様々な運動

た5）．例えば，微絨毛や精子の先体に見られる束状の F- アクの基盤として重要である．筋収縮，細胞運動，細胞質分裂なチンは，全て同じ方向性を示し6,7），繊維束自体は収縮能を持

どの運動は，アクチンフィラメント（F- アクチン）によったない．一方，収縮環を構成する F- アクチンは，繊維のプて構築された構造の上をモータータンパク質のミオシンが滑ラス端側で分裂溝の細胞膜と結合し，収縮環には互いに逆の走することによって起こる．アクチンの細胞内動態は，多数方向性を示す，2 種類の F- アクチンが存在する8,9）．これによっのアクチン結合タンパク質によって調節され1,2），さらにアクて，収縮環の F- アクチンは，ミオシンと共に収縮すると考チン結合タンパク質は，上流のシグナルによって制御されてえられている．

いる．F- アクチンは G- アクチンが重合した，太さ 6 ～ 7 nmの二重らせん状の繊維である3）．F- アクチンとミオシン S12.

分裂酵母の細胞周期におけるアクチン細胞骨格の挙動を混合すると，S1 が F- アクチン中の G- アクチンと規則的分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe は，長さが 8 ～ 14 μm，に結合し，F- アクチンの極性を反映した，一方向性の“や太さが 3 ～ 4 μm の円筒形の単細胞真核生物であり，細胞のじり構造”を形成する4）（図 1A）．この時，やじりの先端方極性や細胞分裂を研究するためのモデル生物である．分裂酵

向を“やじり端”あるいはマイナス端といい，その反対の端母のアクチン細胞骨格は，主に蛍光顕微鏡によって解析されを“反やじり端”，あるいはプラス端という．F- アクチンのており10 ～ 13），細胞周期を通じて，パッチ，ケーブル，リンプラス端では，マイナス端よりも速く重合が行われる．

グの 3 種類の F- アクチン構造として観察される（図 2）．間非筋細胞のアクチン細胞骨格は，細胞周期や外界からの刺期において，F- アクチンパッチは old end に位置し，単極で激に応じて，形成もしくは消失する，非常に動的な構造であ伸長成長する10）．New end take-off 14） と呼ばれる時期を境にり，その機能は F- アクチンの方向性と深く関係がある．動して，パッチは細胞の両端に分布するようになり，両極で伸物細胞を用いた研究では，細胞内の F- アクチンをミオシン長成長する．また，細胞の長軸方向には，F- アクチンケーブルが走行する10,15）．パッチとケーブルは，小胞の分泌や細ａ〒 464–8601 愛知県名古屋市千種区不老町
TEL & FAX: 052–788–6174
2009 年 5 月 11 日受付

解説

分裂酵母のアクチン細胞骨格に関する微細構造学的解析

胞壁形成に関与すると考えられている11,16,17）．分裂期においては，細胞中央の分裂位置に，動物細胞の収縮環に相当するF- アクチンリングが形成される13）．そして，リングの収縮に179【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 in vitro，in vivo における F- アクチンのミオシン S1 修飾．
（A）in vitro における F- アクチンのミオシン S1 修飾．ウサギ骨格筋ミオシンを酵素処理することによって，ミオシン S1 が得られる．ミオシン S1 と F- アクチンを混合すると，F- アクチンに沿って“やじり構造”が観察される．
（B）分裂酵母細胞内のアクチン細胞骨格に対するミオシン S1 修飾法．透過性にした細胞とミオシン S1 を混合すると，アクチン細胞骨格を構成する F- アクチンに“やじり構造”が形成される．

図 2 分裂酵母の細胞周期に伴うアクチン細胞骨格の挙動 10,13）（A）と蛍光顕微鏡像（B）．ローダミン - ファロイジンによって F- アクチンを，DAPI によって DNA を染色した．Bar，10 μm．

伴い，一次隔壁が形成されることによって，細胞質分裂す

裂酵母のケーブルと類似しているが，F- アクチンの方向性，18,19）

構成成分さらに機能も異なるため，一括して議論することは最近まで，動物細胞において分裂酵母のアクチン細胞骨格できない．

る．と類似した構造は，ケーブルとリング（収縮環）以外に観察

これまで，3 種類の F- アクチン構造に関する分子遺伝学されていなかった．しかし，アフリカツメガエル卵の収縮環的解析や，光学顕微鏡観察が進められてきた．しかし，動物形成端において，複数のパッチが伸長および融合することに細胞に比べて，小さく，細胞壁を持つ分裂酵母は，アクチンよって，ケーブルが形成される様子が観察された20）．このよ

細胞骨格の電子顕微鏡観察が特に難しいため，その微細構造うな構造変化は，アクチン細胞骨格の形成過程を議論する上はほとんど明らかにされていなかった．最近，われわれは加で興味深いことから，注目を集めている．動物細胞のケーブ

圧凍結置換固定法を用いた透過電子顕微鏡（TEM）によるル構造としては，ストレスファイバー，糸状仮足の F- アク

解析から，分裂酵母細胞のアクチン細胞骨格である，パッチ，チン，微絨毛の芯，先体糸などがある．これらの構造は，分ケーブル，リングの微細構造を同定した（高木，投稿準備中）．

180

顕微鏡 Vol. 44, No. 3（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

←

図 3 加圧凍結固定法による分裂酵母のアクチンパッチの TEM 像．（A）フィラソーム（）と，リボソームが排除された領域に見られる，不定形な繊維状構造体（←←）．（B）長さ 0.2 ～ 0.3 μm の短い繊維束（←）．CM，細胞膜．M，ミトコンドリア．

また世界に先駆けて，分裂酵母細胞内における F- アクチン

動物細胞の研究では，1960 年の石川らによる報告以降，のミオシン S1 修飾法を確立し，アクチン細胞骨格を構成す細胞内の F- アクチンをミオシン S1 やヘビーメロミオシン修る F- アクチンの方向性を決定した21,22）．本稿では，分裂酵母飾することにより，F- アクチンを同定し，かつ繊維の極性の F- アクチン構造に関する基本的な情報や，アクチン細胞が可視化されてきた5）．われわれは，この方法を分裂酵母細骨格の機能を解明するための一助となる知見を紹介する．

胞に応用することを試みた．まず，分裂酵母の生細胞をZymolyase100T によって細胞壁を溶解した後，ファロイジン3.

アクチンパッチの微細構造の同定を添加した TritonX-100 で細胞膜を透過処理した．さらに，分裂酵母の F- アクチンパッチは，蛍光顕微鏡法ではドッ透過性にした細胞とミオシン S1 を混合し，細胞内の F- アクト構造として観察されるが10 ～ 13,15），最近，加圧凍結置換固チンを S1 修飾した（図 1B）．これら一連の処理条件を検討定した試料に免疫電子顕微鏡法（IEM）を適用することによっすることによって，分裂酵母のアクチン細胞骨格を構成するて，パッチの微細構造は三種類に分類されることが明らかに

F- アクチンの“やじり構造”が，初めて TEM によって観察なった（図 3；高木，投稿準備中）．

できるようになった21,22）．

第一の構造は，酵母などの真菌に見られる，フィラソームミオシン S1 で修飾した分裂酵母細胞内の F- アクチンの観である．分裂酵母のフィラソームは，microvesicle の周囲を察には，野生株と細胞周期を同調した，cdc25 温度感受性変繊維性の要素が取り囲んだ，直径 0.1 ～ 0.3 μm の構造であ異株25）を用いた．Cdc25 は M 期への進行に必要な Cdc2 キナー

る15,16,23,24）．第二の構造は，リボソームが排除された領域にゼを活性化するフォスファターゼであり，この変異による見られる，直径約 0.3 μm の不定形な繊維状構造体である．

アクチン細胞骨格の異常は報告されていない．野生型細胞

IEM による解析から，フィラソームの繊維性の要素およびおよび cdc25 細胞の長軸方向に“やじり構造”を呈した F-不定形な繊維状構造体は，F- アクチンパッチのマーカーでアクチンからなるケーブルが見られた（図 4A，B）21）．G2ある，Arp3 からなることが明らかにされている．第三の構期もしくは M 期に同調した cdc25 細胞の，ケーブルを構成造は，細胞内部に見られる長さ 0.2 ～ 0.3 μm の繊維束であり，する F- アクチンの方向性を調べると，それぞれのケーブルそれを構成する繊維の直径は，F- アクチンと同じく，10 nm

中の F- アクチンの方向性は大体揃っているように見られただった．

（図 4C，D）21）．そこで，G2 期および M 期のケーブルを撮影

4. F- アクチンケーブルにおける F- アクチンの方向性の解析した 50 枚の電顕像をそれぞれ用意し，それらを構成する Fアクチンの方向性を決定した．すると，G2 期ではケーブルを構成する 81 ± 19％，M 期では 26 ± 21％の F- アクチンが，分裂酵母の F- アクチンケーブルは，細胞の長軸方向に伸細胞端に対してプラス端を向けていた21）．すなわち，G2 期長する線状の構造として，蛍光顕微鏡によって観察される．

から M 期へ移行する間に，ケーブルの方向性は逆転するこ

その微細構造は，加圧凍結置換固定した細胞の TEM によるとが判明した．この結果から，ケーブルは細胞周期に伴う極解析により，直径約 8 ～ 10 nm の微細繊維からなる，長さ性成長部位に，必要な物質を輸送するためのレールとして機約 1.2 μm の繊維束であると考えられている．

能すると考えられた（図 5）．

解説

分裂酵母のアクチン細胞骨格に関する微細構造学的解析

181【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

5. F- アクチンリングにおける F- アクチンの方向性の三次元的解析
分裂酵母の F- アクチンリングの微細構造は，分裂溝に存在する F- アクチンの束であり15,16），IEM による解析から，リングの構成成分であるトロポミオシンの局在も観察されている15）．S1 修飾した cdc25 細胞の赤道面を観察すると，緩い束状の F- アクチンが細胞膜に沿って走行し，細胞質を囲んでいた（図 6）22）．厚さ 55 nm の超薄切片を作製した場合，このような繊維束は，赤道面周囲の 14 ～ 33 枚の連続切片にわたって認められたことから，F- アクチンリングであると判断した．次に，F- アクチンリングの連続切片を 6 組作製し，収縮環の全構造を解析した．リングを構成する全ての F- アクチンの本数は，1,100 ～ 2,100 本だった22）．6 例の収縮環を構成する全ての F- アクチンの方向性を決定したところ，互いに逆方向の繊維の本数比は，おおよそ 1 対 1 だった22）．リングから無作為に選んだ 100 本の F- アクチンの平均長は，後期 B では 0.59 ± 0.16 μm，細胞質分裂期では 0.45 ± 0.12 μmであった22）．この解析から，リングを構成する F- アクチンの長さは，収縮環の収縮に伴って短くなると推察された．こ

図 4（左） F- アクチンケーブルの微細構造と F- アクチンの方向性．
（A，B）G2 期および M 期に同調した cdc25 変異株における，S1 修飾した F- アクチンケーブルの TEM 像．観察部位は各図の左上に示した．CM，細胞膜．Bar，0.1 μm．（C，D）ケーブルを構成する F- アクチンの方向性をトレースした像．F- アクチンケーブルに最も近い細胞端に対してプラス端を向けた Fアクチンを青色で，一方，細胞端に対してマイナス端を向けたF- アクチンを赤色で示した．
図 5（下） F- アクチンケーブルにおけるアクチン重合とケーブルの機能．間期においては細胞成長端側で，分裂期においては細胞中央部で，ケーブルを構成する F- アクチンが重合することによって，ケーブルは伸長する．その結果として，細胞の極性成長や細胞質分裂に必要な物質を輸送できるようになると考えられる．

図4

図5182

顕微鏡 Vol. 44, No. 3（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 6 分裂期に同調した cdc25 変異株の赤道面における S1 修飾した収縮環の微細構造．
（A）後期 B 後半の収縮環における切片 #10 の電顕像（全切片数 = 19）．矢印，収縮環の F- アクチン．CM，細胞膜．Bar，0.2 μm．（B）A で見られた F- アクチンのトレース像．マイナス端を時計回りに向けた F- アクチンを赤色で，その逆方向性の F- アクチンは青色で示した．それ以外，もしくは未知の方向性の繊維は黄色で示した．白い線，細胞膜．（C）後期 B 前半の収縮環における切片 #10 の拡大像（全切片数 = 20）．Bar，0.2 μm．（D）C で見られた F- アクチンのトレース像．

図 7 収縮環を構成する F- アクチン方向性．（A）後期 B 前半，後期 B 後半，細胞質分裂期の収縮環における F- アクチンの三次元再構築像．Bar，1 μm．（B）収縮環の形成と収縮過程の想定図．（Kamasaki et al., 200722）より，一部改変して転載）のような収縮環の F- アクチンに関する基本的な情報は，動リングの半分ずつを占めており，互いに逆の方向性である物細胞も含めて，われわれの研究によって初めて明らかに2 本の半円形の繊維束によって，リングが構成されているよなった．さらに，われわれは収縮環を構成するほぼ全てのうであった．一方，後期 B 後半以降のリングでは，互いにF- アクチンの方向性を決定し，リングの三次元再構築を行っ逆方向性の F- アクチンが全体的に均一に混在していた．こた（図 7A）22）．後期 B 前半では，同じ方向性の F- アクチンが，れらの結果から，リング形成の初期には細胞中央部の表層の解説

分裂酵母のアクチン細胞骨格に関する微細構造学的解析

183【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

1 箇所からアクチン重合が起こり，繊維束が両方向に向けて伸長する可能性が示唆された（図 7B）．さらに，収縮が開始する前に，収縮環の F- アクチンが，再配列して入り混じることが推察された．
6.

微細構造学的解析における今後の課題

今後は，ミオシン S1 修飾法と免疫電子顕微鏡法を併用した手法の確立を目指し，その手法を用いて，分子レベルでのアクチン細胞骨格の形成・再編成機構の解明に迫りたいと考えている．さらに，細胞内におけるミオシンフィラメントの微細構造を可視化することにより，細胞の極性成長および細胞質分裂におけるアクチン細胞骨格の機能をさらに追究することを計画している．
謝

辞本研究を遂行するにあたり，理化学研究所学研究室

吉田化学遺伝荒井律子博士に有益なご助言を賜った．RATOC

システムエンジニアリング株式会社

南郷脩史社長，日本女子大学

故佐々木崇寿教授には，松影昭夫元教授，昭和大学多くの便宜を図って頂いた．それらの方々に対して，心からの感謝の意を表する．
文献1）Pollard, T.D. and Cooper, J.A.: Annu. Rev. Biochem., 55, 987–1035(1986)
2）馬渕一誠：Annual Review 細胞生物学 1991（1991）
3）Hanson, J. and Lowy, J.: J. Mol. Biol., 6, 46–60 (1963)4）Nachmias, V.T. and Huxley, H.E.: J. Mol Biol., 50, 83–90 (1970)
5）Ishikawa, H., Bischoff, R. and Holtzer, H.: J. Cell Biol., 43, 312–328(1969)

184

6）Tilney, L.G., Hatano, S., Ishikawa, K. and Mooseker, M.: J. CellBiol., 59, 109–126 (1973)
7）Tilney, L.G.: in Inoue, S. and Stephens, R.E. (Ed.), Molecules andCell Movement, Raven Press, New York, 339–388 (1975)
8）Sanger, J.M. and Sanger, J.W.: J. Cell Biol., 86, 568–575 (1980)
9）Mabuchi, I., Tsukita, S., Tsukita, S. and Sawai, T.: Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 85, 5966–5970 (1988)
10）Marks, J. and Hyams, J.S.: Eur. J. Cell Biol., 39, 27–32 (1985)11）Kobori, H., Yamada, N., Taki, A. and Osumi, M.: J. Cell Sci., 94,635–646 (1989)
12）Kobori, H., Toda, T., Yaguchi, H., Toya, M., Yanagida, M. and Osumi,
M.: J. Cell Sci., 107, 1131–1136 (1994)
13）Arai, R. and Mabuchi, I.: J. Cell Sci., 115, 887–898 (2002)
14）Mitchison, J.M. and Nurse, P.: J. Cell. Sci., 75, 357–376 (1985)
15）Arai, R., Nakano, K. and Mabuchi, I.: Eur. J. Cell Biol., 76, 288–295(1998)
16）Kanbe, T., Kobayashi, I. and Tanaka, K.: J. Cell Sci., 94, 647–665(1989)
17）Katayama, S., Hirata, D., Arellano, M., Perez, P. and Toda, T.: J. Cell
Biol., 144, 1173–1186 (1999)18）Gould, K.L. and Simanis, V.: Genes and Dev., 11, 2939–2951 (1997)19）Rajagopalan, S., Wachtler, V. and Balasubramanian, M.: Trends Genet., 19, 403–408 (2003)
20）Noguchi, T. and Mabuchi, I.: J. Cell. Sci., 114, 401–412 (2001)21）Kamasaki, T., Arai, R., Osumi, M. and Mabuchi, I.: Nat. Cell Biol.,7, 916–917 (2005)22）Kamasaki, T., Osumi, M. and Mabuchi. I.: J. Cell Biol., 178, 765–771 (2007)23）Takagi, T., Ishijima, S.A., Ochi, H. and Osumi, M.: J. ElectronMicrosc., 52, 161–174 (2003)24）Baba, M., Baba, N., Ohsumi, Y., Kanaya, K. and Osumi, M.: J. Cell
Sci., 94, 207–216 (1989)
25）Russell, P. and Nurse, P.: Cell, 45, 145–153 (1986)

顕微鏡 Vol. 44, No. 3（2009）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】