本研究は，日本農芸化学会 2022 年度大会（京都）における「ジュニア農芸化学会」（発表は新型コロナウイルス感染症対策のためオンライン形式で実施）に応募された研究のうち，本誌編集委員会が優れた研究として選定した６題の発表のうちの一つです．

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日本農芸化学会

カテキン類と抗生物質
アンピシリンの抗菌効果に関与する化学構造
秋田県立秋田高等学校生物部緑茶班

荒井優菜，金子聡，佐藤真美，平川青空（顧問：遠藤金吾）

近年，薬剤耐性菌感染症の拡大が問題となっている中，私たは停滞しているのが現状である (8)．

ちは既存の抗生物質の効果に影響を与える物質をカテキン類

一方で，抗生物質の作用がカテキン類によって増強さや そ の 由 来 物 質 の 中 か ら 探 索 し た い と 考 え た．(-)- エ ピ カ テ

れる例がいくつか報告されている．例えば，緑茶の成分

キ ン，(+)- カ テ キ ン，( - )- エ ピ ガ ロ カ テ キ ン ガ レ ー ト，(+)-

である（-）-エピカテキンガレートがメチシリン耐性黄色

タキシフォリンはアンピシリンの抗菌効果には影響がな

ブドウ球菌（MRSA: methicillin-resistant）に対して β-ラクタム系抗生物質オキサシリンの化学と生物

か っ た が，C 環 が カ ル ボ ニ ル 基 に 置 換 し て い る (+)- タ キ シ）に抗菌効果を増強させる報告がある (9)．また，黄色ブドウ対してアンピシリンの抗菌効果を促進することができる可能

球菌において，カテキン水和物がリンコマイシン系の抗性を見出した．

生物質クリンダマイシンおよびマクロライド系抗生物質

フ ォ リ ン が， 条 件 に よ っ て は 大 腸 菌（エリスロマイシンと相乗効果を示す報告もある (10)．そ本研究の目的・方法および結果と考察【目的】

こで私たちは，薬剤耐性菌による感染症の拡大に対抗するため，既存の抗生物質を効果的に利用する方法を開発することを本研究の目的とした．

近年，薬剤耐性菌の爆発的増加による薬剤耐性菌感染私たちが注目したのは，これらの先行研究で用いられ症への罹患が深刻化している．薬剤耐性菌とは抗菌性物ていたカテキン類である (9, 10)．カテキン類およびカテキ質に抵抗性を示す細菌のことであり，薬剤の作用部位をン由来の化合物の中から抗生物質の抗菌作用を促進する

元々持たない自然耐性と，後天的に作用部位の変異や耐ものの探索を試みた．また，今後のスクリーニングのた性遺伝子の獲得によって耐性となる場合があり (1)，後者めに，抗菌作用の促進をもたらす化合物の構造を特定す(2)の機序として，抗生物質の分解能の獲得 ，抗生物質結ることとした．

合 能を 持 つタン パク質 の 獲 得 ， 菌 体 外 へ の 薬 剤 排【実験方法】

出 (4, 5) などが存在する．カルバペネム耐性腸内細菌科細1.

(3)菌（CRE），多剤耐性アシネトバクター（MDRA），多材料
抗生物質の抗菌力を示す指標菌として大腸菌（剤耐性緑膿菌（MDRP），バンコマイシン耐性腸球菌）AB1157 株，抗生物質としてアンピシリン（VRE）などは日和見感染症を引き起こし，感染防御機（β-ラクタム系）を用いた．また試料として（-）-エピカテ能の低下した患者では尿路感染症や敗血症など様々な感

キン，（+）-カテキン，（-）-エピガ ロカテキンガレート，(6)染症を起こすことがある ．薬剤耐性菌の感染者数は（+）-タキシフォリンを用いた（図 1（A）〜（D））．

2013 年で 70 万人以上に達し，2050 年には 1,000 万人に上指標菌用培地として LB（寒天）培地を用いた．LBると予測されている (7)．しかし，新規の抗生物質の開発（寒天）培地の組成は，NaCl 0.5 g, Yeast Extract 1.0 g,486

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図 1 ■ 本研究で用いた試料化合物の構造式（A）：（-）-エピカテキン，（B）：（+）-カテキン，（C）：（-）-エピガロカテキンガレート，（D）：（+）-タキシフォリンを示しており，図中の A, B，C はそれぞれ一般に A 環，B 環，C 環と呼ばれる部位を示している（5）．

Hipolypepton 2.0 g,（Agar 2.5 g），dH2O 200 mL である．
2.

方法
大腸菌 AB1157 株を LB 液体培地に入れ，37 C で一晩日本農芸化学会

振とう培養した．その後，LB 液体培地で菌液を 1/10 に希釈し，100 μM の濃度になるようにアンピシリン水溶液を，2.0 mM の濃度になるように（-）-エピカテキン，（+）-カテキン，（-）-エピガロカテキンガレート，（+）-タキシフォリンをそれぞれ加え，37 C で 3 時間振とう培養した．そして各菌液をリン酸緩衝液で適当に希釈し，直図 2 ■ アンピシリン処理時の大腸菌 AB1157 株の生存率
生存率は，アンピシリン非処理時（対照実験区）における菌数を1 として，各実験区の菌数を対照実験区の菌数で除したもので算出しており，エラーバーは各実験区の平均値の標準誤差とした．

径 9 cm のシャーレに作製した LB 寒天培地に 100 μL ずつ●撒き，37 C で 18 時間培養した．培養後，生育したコロニー数を計測し，各々の希釈率に応じて菌数を算出した．対照実験区の菌数を 100％として，各実験区の菌数

化学と生物の相対値を次の式（1）の通り求め，生存率とした．

生存率 [%] = 各実験区の菌数 ×100 式（1）
対照実験区の菌数
3.

検定方法
検定を用いて有意水準 5％で 3 または5 群間の平均値の比較を行い，差が認められた場合，有意水準 5％でマンホイットニーの U 検定による多重比較を行った．
【結果】
1.

実験 1

図 3 ■ 各試料単独処理時の大腸菌 AB1157 株の生存率
DMSO（ジメチルスルホキシド）は各試料の溶媒として用いた対照実験区であり，（-）-Ecは（-）-エピカテキン，（+）-Ct は（+）-カテキン，（-）-EGCg は（-）-エピガロカテキンガレート，（+）-Txは（+）-タキシフォリンを加えた実験区を示す．生存率は，対照実験区における菌数を 1 として，各実験区の菌数を対照実験区の菌数で除したもので算出しており，エラーバーは各実験区の平均値の標準誤差とした．

大腸菌 AB1157 株において，アンピシリンを加えて振と各試料単独での抗菌効果を検証した．その結果，（-）-エ

う培養した実験区のコロニー数を計測し，アンピシリン

ピ カ テ キ ン，（+）-カ テ キ ン，（-）-エ ピ ガ ロ カ テ キ ン ガを加えなかったものを対照実験区として生存率を算出し，レート，（+）-タキシフォリンは，いずれも溶媒であるアンピシリン単独での抗菌効果を検証した．その結果，

DMSO にできるだけ溶解させ，菌液に処理する際の菌

アンピシリン 100 μM で生存率 0.055％（体に対する影響を抑えるために DMSO の占める体積を-10の 検 定： ＝2.0×10 ， ア ン ピ シ リ ン 10 μM‒100 μM 間1/100 程度に抑えた 2.0 mM の濃度では単独での抗菌効のマンホイットニーの U 検定： ＝3.7×10-6 でともに有果は示さなかった（図 3）．

意水準 5％で有意差あり）であり，十分な抗菌効果が見3.

られており，以後，この濃度をアンピシリン処理濃度とするものと決定した（図 2）
．
2.

実験 2

実験 3
大腸菌 AB1157 株において，各試料とともにアンピシリン 100 μM を加えて振とう培養した実験区のコロニー数を計測し，アンピシリン非存在下で各試料を単独で加大腸菌 AB1157 株において，各試料を単独で加えて振えたものを対照実験区として生存率を算出し，アンピシとう培養した実験区のコロニー数を計測し，試料を何もリンの抗菌作用の強さを検証した．その結果，各試料と加えなかったものを対照実験区として生存率を算出し，アンピシリンの同時処理時の生存率の中で，（+）-タキシ

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（+）-タキシフォリン中の C 環のカルボニル基に起因することになる．
実験 2 の結果より，大腸菌 AB1157 株において，（-）-エピ カ テ キ ン，（+）-カ テ キ ン，（-）-エ ピ ガ ロ カ テ キ ン ガ
レートは，それら単独での抗菌効果は示さなかった（図3）．また，実験 3 の結果より，アンピシリンの抗菌効果

化学と生物●

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図 4 ■ アンピシリンと各試料の同時処理時の大腸菌 AB1157 株の生存率
DMSO（ジメチルスルホキシド）は各試料の溶媒として用いた対照実験区であり，（-）-Ec は（-）-エピカテキン，（+）-Ct は（+）-カテキン，（-）-EGCg は（-）-エピガロカテキンガレート，（+）-Tx は（+）-タ
キシフォリンを加えた実験区を示す．生存率は，各試料の単独処理時における菌数を 1 として，各実験区の菌数を各試料単独処理実験区の菌数で除したもので算出しており，エラーバーは各実験区の平均値の標準誤差とした．

に対しては DMSO と比べて（-）-エピカテキン，（+）-カテキン，（-）-エピガロカテキンガレートに差異は認められず，促進も抑制も行わなかった（図 4）．（-）-エピカテキン（図 1（A））と（+）-カテキン（図 1（B））の構造上の違いは，C 環から出る B 環とヒドロキシ基（-OH）の立体的な配座が異なる点であり，これらは立体異性体の一種であるジアステレオマーの関係にある．また，（-）
エ ピ カ テ キ ン（図 1（A）） と（-）-エ ピ ガ ロ カ テ キ ン ガ
レート（図 1（C））の構造上の違いは，（-）-エピガロカテフォリンとアンピシリンの同時処理時の生存率は，アンキンガレートでは B 環にフェノール性ヒドロキシ基が 1ピシリン単独処理時の生存率の約 40％に低下していた個追加されていることと，C 環から出るヒドロキシ基がものの，の検定において ＝0.05 であり，ガレート基（図 1（C）中の B ）に置換されていること

各試料とアンピシリンを同時に加えた実験区間の生存率である．このことから，（-）-エピカテキンと（+）-カテキに有意水準 5％で有意差を確認することはできなかった

ンの構造上の違いである B 環とヒドロキシ基の立体的な（図 4）．

配座や，（-）-エピカテキンと（-）-エピガロカテキンガ【考察】

レートの構造上の違いである C 環から出るヒドロキシ基

今回の実験では，カテキン類およびその代謝産物は単の存在および B 環のフェノール性ヒドロキシ基の数はア独では抗菌効果をもたらさなかった．また，統計的にはンピシリンの抗菌効果には影響がないことが明らかにアンピシリンの抗菌効果に差は生じさせなかったものなった．の，（+）-タキシフォリンはアンピシリンの抗菌効果を促

本研究で用いた（+）-タキシフォリンは，メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対して β-ラクタム系であるアンピ進する可能性を見出すことができた．
カテキン類は 2 個のベンゼン環（図 1 中の一般に A 環，シリン，ニューロキノン系であるレボフロキサシンやセB 環と呼ばれる部位）が，この 3 個の炭素原子と1 個の酸ファロスポリン系のセフタジジム，マクロライド系のア素原子とともに形成している 6 員環（図 1 中の一般に C 環

ジスロマイシンの抗菌効果を高めるという報告があと呼ばれる部位）を形成している化合物である (11)．

る (13)．本研究の成果より，グラム陽性菌である黄色ブ（+）-カテキン（図 1（B））と（+）-タキシフォリン（図ドウ球菌だけでなく，グラム陰性菌である大腸菌におい1（D））の構造上の違いは，C 環の 4 位の炭素がカルボニても，（+）-タキシフォリンがアンピシリンの抗菌効果をル化されていることである．大腸菌 AB1157 株におい促進する可能性はある．（+）-タキシフォリンはシベリアて，（+）-タキシフォリンは，単独での抗菌効果は示さ

カラマツなどごく一部の樹木からしか抽出できなかったず，むしろ大腸菌の増加に寄与しており（図 3），これが， 近 年， カ テ キ ン 分 解 菌は（+）-タキシフォリンの持つ抗酸化作用(12)によって酸OX-01 株によって（+）-カテキンと（-）-エピカテキンか化ストレスが低減されたことに起因した可能性がある．

ら容易かつ安定的に（+）-タキシフォリンに変換できる

一方で，（+）-タキシフォリンは，アンピシリンと併用しことが発見されており (14)，（+）-タキシフォリンを用いた場合は，カテキン類を用いた場合と同程度の生存率まて，安価に効果的に抗生物質を使用する方法が開発できで低下したことから，（+）-タキシフォリンは，より低濃る可能性がある．

度のアンピシリンを用いるなど，条件によってはアンピシリンの抗菌効果を促進できる可能性が示唆された（図4）．（+）-カテキンではこのような可能性は見出せなかったことから，今後このような効果が確認できた場合，488

本研究の意義と展望
本研究で得られた成果をもとに，今後は（+）-タキシ

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フォリンとアンピシリンを同時処理する際の条件をさらに検討していくとともに，C 環にカルボニル基を持つ化合物に着目して，アンピシリンの抗菌効果を促進させる化合物を探索していきたい．また，アンピシリン以外の抗生物質への影響や大腸菌以外の細菌に対する効果も検証していきたい．そして，これらの知見をもとに，抗生物質の抗菌効果を促進する化合物をさらに効率良く探索していきたい．
これらの実験を進めていくことで，既存の抗生物質を効果的に利用するための基礎的なデータを集めることができると考えられる．そのデータを活用することによっ日本農芸化学会て，既存の抗生物質を用いて薬剤耐性菌感染症の拡大に対抗できる有効な手段を開発できる可能性がある．今後，集めたデータを発信し，人類の健康や福祉に貢献していきたい．
謝辞：本研究は JST グローバルサイエンスキャンパス東北大学探求型「科学者の卵養成講座」，公益財団法人斎藤憲三・山﨑貞一顕彰会，公益財団法人武田科学振興財団の支援のもとで実施されました．

1) 農林水産省：動物医薬品検査所検査第二部抗生物質製剤
検査室：薬剤耐性菌についての Q&A，2010．
2) E. P. Abraham & E. Chain:, 146, 837 (1940).

Copyright © 2022 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.60.486

化学と生物●文献

3) M. P. Jevons:, 1, 124 (1961).
4) S. S. Pao, I. T. Paulsen & M. H. Saier Jr.:
, 62, 1 (1998).
5) M. Putman, H. W. van Veen & W. N. Konings:, 64, 672 (2000).
6) 柴 山 恵 吾： 一 般 社 団 法 人 日 本 感 染 症 学 会 web サ イ ト，
https://www.kansensho.or.jp/ref/d71.html, 2019.
7) M. Cecchini, J. Langer & L. Slawomirski:(2015).
8) T. F. Schäberle & I. M. Hack:, 22, 165(2014).
9) S. Shiota, M. Shimizu, T. Mizushima, H. Ito, T. Hatano, T.
Yoshida & T. Tsuchiya:, 22, 1388
(1999).
10) M. Miklasińska, M. Kępa, R. D. Wojtyczka, D. Idzik, A.
Dziedzic & T. J. Wąsik:, 21, 244 (2016).
11) 堤 広之：
, 132, 925 (2012)．
12) F. Topal, M. Nar, H. Gocer, P. Kalin, U. M. Kocyigit, İ.
Gülçin & S. H. Alwasel:,31, 674 (2016).
13) J. An, G. Y. Zuo, X. Y. Hao, G. C. Wang & Z. S. Li:, 18, 990 (2011).
14) Y. Otsuka, M. Matsuda, T. Sonoki, K. Sato-Izawa, B.
Goodell, J. Jelison, R. R. Navarro, H. Murata & M.
Nakamura:, 80, 2473 (2016).

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