保健科学研究11(1)：1-5，2020【原著】
Escherichia albertii における培養温度の検討

藤岡美幸*1

吉岡翔*１

野坂大喜*１（2020 年 7 月 2 日受付，2020 年 7 月 16 日受理）
要旨：新興病原体である Escherichia albertii は 1998 年にバングラデシュの下痢症患者から分離され，現在わが国でも食中毒の原因菌として知られている。E. albertii の生化学的性状は E. coli に類似しており，臨床検査機関では誤同定されている可能性がある。そこで本研究では E. albertii をはじめ，E. coli，Klebsiella pneumoniae，Citrobacter freundii の4 種類の腸内細菌の混合液を作製し，使用培地や培養温度別に E. albertii の検出を検討した。その結果，E. coli の選択培地である EC ブロス 44.5℃で選択培養した EMB 寒天培地上では E. albertii を検出できなかったが，37~42℃では E.
albertii 濃度が高い混合菌液での検出を認めた。一方で BTB 寒天培地での発育はいずれの条件でも E. albertii の検出は可能であったが，BTB 寒天培地の通常の培養温度である 37℃が最も有効であった。E. coli 検出には高温下での選択培養が行われるが，他菌種のみならず一部の E. coli の発育も抑制することから，E. albertii の分離には 37~42℃での選択増菌後に BTB 寒天培地等を用い，E. albertii の特徴である乳糖非分解集落を標的にすることが有効である。
キーワード：Escherichia albertii，食中毒原因菌，誤同定，培養温度

Ⅰ．はじめにファーランド標準濁度（McFarland standard turbidity: McF）

かつて猛威を振るったサルモネラやビブリオは 2001 年

0.5 に調整後に生菌数をカウントし，菌濃度を 1.5×108の食品衛生法施行規則の改正１）)により激減 ２，３）した。まCFU/mL とした。この菌液 2 mL を 0.2 mL ずつ階段希釈した，現在食中毒原因菌第 1 位であるカンピロバクターもそ104 倍まで行い，104 倍希釈液の菌濃度を 1.5×104 CFU/mLの特性が解明されつつあり ４），感染症予防の検討が進めらとした。E. coli，K. pneumoniae，C. freundii の 3 菌種は McFれている５）。

0.5 に調整後，102 倍希釈し，それぞれの 20 µL，すなわち一方で新興病原体の報告もある。Escherichia albertii は生菌数 3.0×104 個を各 E. albertii 菌液に添加し，これを混1998 年にバングラデシュの下痢症患者より分離され，当初合菌液とした。混合菌液における E. albertii の菌濃度を表 1は Hafnia alvei と同定されていた６）。しかし 2003 年に Huysに示す。E. albertii の菌濃度 1.5×108 CFU/mL では混合菌液

ら７）により生物化学的性状やハウスキーピング遺伝子の解に含まれる菌数が E. coli，K. pneumoniae，C. freundii より析等が行われ，E. albertii と命名された。現在、E. albertii

104 倍相当であるため，この混合菌液を E. albertii 濃度 104は質量分析等で E. coli と誤同定されており８），臨床検査機倍液とした。またこれら 3 菌種と E. albertii の生菌数が等関において正しく菌種同定されていない可能性がある。E.

量になるように調整した 104 倍希釈液を E. albertii 濃度等量

albertii の生化学的性状は，乳糖非分解，非運動性，インド液とした。これら混合菌液は 37，40，42，44.5℃で一晩培ール陰性，リジン脱炭酸陽性，D-キシロース非醗酵等９）が養後，培養液の 1 白金耳を E. coli の選択培地である EMB知られているが，当研究室の先行研究ではインドール陽性寒天培地（ニッスイ），グラム陰性菌用の非分離用培地であや D-キシロース発酵等，様々な生物学的な性状を示した。

る BTB 寒天培地（ドリガルスキー改良培地，栄研）に塗抹

そこで本研究は E. albertii と腸内細菌科細菌を混合させた混合菌液を作製し，菌液中の E. albertii の検出についてし，37，40，42，44.5℃で一晩培養後，E. albertii の分離状況を検討した。

検討した。

Ⅲ．結果
Ⅱ．対象および方法
対象は腸内細菌科細菌である E. albertii JCM17328 株，E.
coli ATCC25922 株，Klebsiella pneumoniae（臨床由来株），

１．各寒天培地 37℃培養における対象菌株の発育状況
１）EMB 寒天培地における発育状況
E. coli は集落が密集しているところでは金属光沢が認め

Citrobacter freundii（臨床由来株）の 4 菌株とした。
E. albertii は E. coli の選択培地 EC ブロス（栄研）でマク*1 弘前大学大学院保健学研究科
Hirosaki University Graduate School of Health Sciences〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-39-5970
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan
Correspondence Author mfujioka@hirosaki-u.ac.jpⓒ2020 Health sciences Research.

1Escherichia albertii における培養温度の検討

これらの培養菌液をそれぞれ EMB 寒天培地に塗抹し37℃培養した結果を図 4 に示す。EC ブロス 44.5℃選択培養における E. albertii 濃度が等量~102 倍混合菌液では金属光沢集落が認められたが，103，104 倍混合菌液では認められなかった。また EC ブロス 37，40，42℃培養後の EMB寒天培地ではいずれの E. albertii 濃度でも金属光沢は認められず，K. pneumoniae の発育が良好であった。これらの培地上の小集落を釣菌した結果，すべて E. coli であった。
EC ブロス 37，40，42℃選択培養後の EMB 寒天培地でのられたが，単離集落は黒色であった。E. albertii は無色透明

発育は 37，40，42℃培養ともに等量~102 倍混合菌液では金の小集落，K. pneumoniae は赤紫色の大集落，C. freundii は属光沢集落が認められたが，103，104 倍混合菌液では認めやや小さい濃赤紫色集落であった（図 1）。

られなかった。また 44.5℃培養では全濃度の混合菌液で黒２）BTB 寒天培地における発育状況色集落のみ認められた。これらの EMB 寒天培地上の半透

E. coli は黄色集落，E. albertii は無色透明の小集落，K.
pneumoniae は淡黄色の大集落，C. freundii はやや小さい黄色集落であった（図 2）。

明な小集落を釣菌した結果、すべて E. coli であった。
２）混合菌液における BTB 寒天培地での発育状況
EC ブロスを各温度で培養した菌液を BTB 寒天培地に塗２．EC ブロスにおける温度別の発育状況

抹し，37℃培養した結果を図 5 に示す。EMB 寒天培地と同１）混合菌液における EMB 寒天培地での発育状況

様に，EC ブロス 44.5℃培養における E. albertii 濃度が等量

EC ブロス 44.5℃選択培養では E. albertii 濃度 103 倍およ~102 倍混合菌液では黄色集落が認められ，E. coli が優位にび 104 倍混合菌液における培養液の濁度は McF 2~3 であっ発育していた。一方で E. albertii 濃度が 103, 104 倍混合菌液

たが，等量~102 倍混合液および EC ブロス 37, 40, 42℃の選において乳糖非分解の透明集落を釣菌した結果，すべて E.

択培養温度におけるすべての濃度で強い混濁が認められた

albertii であった。

（図 3）。

ⓒ2020 Health sciences Research.

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藤岡，吉岡，野坂EC ブロス 37，40，42℃選択培養後の BTB 寒天培地でのは他菌種のみならず，一部の E. coli も発育を抑制される可

発育は 37，40，42℃培養ともに乳糖分解菌の発育が良好で能性が示唆された 12)。また EMB 寒天培地の培養温度も必あったが，44.5℃培養では EC ブロスの培養温度に関わら要以上に高温にせず，添付書による 37℃培養が有効であるず，対象菌株の発育が抑制されていた。また E. albertii 全ことを再確認した。

濃度の混合菌液において，各培養温度から乳糖非分解集落今回，EC ブロスで増菌培養後，EMB 寒天培地と同様にBTB 寒天培地での混合菌液の分離状況も検討した。BTB 寒を釣菌した結果，すべて E. albertii であった。

天培地は 37℃で 24 時間培養をすると，乳糖分解菌は黄色

Ⅳ．考察集落となり、一方で乳糖非分解菌は透明な集落となる。本

近年，新興病原体である E. albertii による食中毒事例がいくつか報告 10,11)されている。しかしながら E.

研究の対象菌株は E. albertii のみ乳糖非分解であるため，albertii はいずれの培養条件でも分離が困難ではなく，E. albertii の濃臨床検査機関における質量分析等では E. coli 等と誤同定さ度が高ければ容易に分離が可能であった。また EMB 寒天

れており８)，同定には PCR による E. albertii 特異遺伝子の培地と同様に高温下での培養は対象菌種も発育抑制される検索等が必要であるため，通常の臨床検査では下痢症原因可能性があり，添付書による 37℃の培養温度が有効であっ菌として分離しても菌種同定が正しくできていない現状がた。

ある。そこで本研究では大腸菌群である E. coli，E. albertii，食中毒の原因菌である赤痢菌や腸管出血性大腸菌，カンK. pneumoniae，C. freundii の 4 菌種を対象に混合菌液を作

ピロバクター等は 100 個程度でも感染・発症が可能である

製し，大腸菌群を選択的に分離・培養する EC ブロスや EMBとされるが，一般には 106~108 個の原因菌の摂取により食寒天培地，グラム陰性桿菌や腸内細菌を分離する BTB 寒天中毒を起こす 13)。よって E. albertii が原因となる食中毒で培地を用いて E. albertii の分離を検証した。

は，患者便中には相当数が含有されていることが想定され

EC ブロスは添付書により，37℃で 48 時間培養後にガスるため，増菌培養を行わずに E. albertii の検出が可能であの産生があれば大腸菌群陽性，44.5℃で 24 時間培養後にガると考える。一般に便培養には BTB 寒天培地は使用されなスの産生があれば E. coli 陽性と判定されるが，実際に菌種いが，同様に乳糖を含有する SS 寒天培地ではサルモネラ同定するためには集落の分離が必要である。今回対象としや赤痢菌以外の発育は強く抑制される 14)。また SS 寒天培

た 4 菌種は大腸菌群に含まれ，また E. albertii は E. coli と地より選択性が強くない腸内細菌分離培地である DHL 寒

同じ Escherichia 属であることから，本研究では各培地上の天培地は乳糖と白糖が含まれている 15)。E. albertii は乳糖お集落の様子を詳細に確認した。EC ブロス 37, 40, 42, 44.5℃

よび白糖非分解との報告が多い 16, 17) が，白糖分解 E.の温度で一晩選択培養後，EMB 寒天培地に塗抹し，その様albertii の報告 18) もあることから，DHL 寒天培地の 2 種類子を観察した。EMB 寒天培地は大腸菌群の確定試験に使用の糖非分解の集落を対象とすることは見落としの可能性をされ，添付書に準じた 37℃培養により，E. coli は中心部黒否定できない。さらに BTB 寒天培地は非選択培地であるた色で黄金色の金属光沢を示し，サルモネラや赤痢菌は透明め，便を塗抹・培養した際には様々な菌種が発育することな小集落を形成するとされる。今回，E. albertii はうすいピが予想される。そこで EC ブロス 44.5℃で選択培養するこ

ンク色の透明なやや小さな集落を形成しており，サルモネとで，非目的菌の発育を抑制することが可能となる。菌量

ラや赤痢菌と類似した透明な小集落を形成した。一方，E.

が少ないことが予想される検体では直接あるいは濃縮してcoli は集落が密集しているところでは金属光沢が認められBTB 寒天培地に塗抹・培養し，乳糖非分解菌を標的にするたが単離集落は黒色集落，K. pneumoniae はピンク色の大集ことで，E. albertii を見逃す可能性を減少させることができ落，C. freundii は黒色小集落であった。よって EMB 培地にると考える。他にマッコンキー寒天培地 19) が乳糖を含有おける E. albertii の分離は透明集落を標的にすることが有するが，当研究室の先行研究では BTB 寒天培地と同様の発効であると考える。

育状況であった。しかしながらマッコンキー寒天培地は

EC ブロス 37, 40, 42℃で選択培養後の EMB 寒天培地におNaCl を含有するグラム陰性桿菌の選択培地であり，一部のける各培養温度別の分離状況では， E. albertii の菌濃度にグラム陽性球菌が発育可能な BTB 寒天培地より選択性が関わらず K. pneumoniae が優位に発育し，他の 3 菌種は発強いことから，検体の種類により使用培地の選択は慎重に育があまり良くなかった。一方で EC ブロス 44.5℃で選択行う必要がある。

培養後の EMB 寒天培地 37, 40, 42℃培養した培地での発育臨床検体等から検出した乳糖非分解菌が E. coli に類似しは，E. albertii の菌濃度 103，104 倍混合菌液では E. albertii

た生化学的性状であり，自施設で E. albertii との詳細な鑑の発育を認めた。しかしながら 44.5℃での培養ではいずれ別が難しい場合は，現段階では PCR 等を用いた鑑別が可能の選択培養温度でも E. albertii や K. pneumoniae，C. freundiiな施設へ同定依頼が必要になると思われる。よって今後はは検出できず，また E. coli も黒色集落のみで金属光沢集落

生化学的性状の解析や検出技術の検討等を進め，一般の施を形成しなかった。このことから 44.5℃の高温下での培養設でも実施可能な E. albertii 簡易同定法の開発に努めたい。

ⓒ2020 Health sciences Research.

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Escherichia albertii における培養温度の検討

利益相反

開示すべき利益相反はありません。

11)
12)

引用文献
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2） 国立感染症研究所. 細菌性食中毒 1998~2007 年. IASR, 29(8):213-215, 2008.
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10) 深田真美，福原亜美，他：集団感染事例から検出されたⓒ2020 Health sciences Research.

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17)

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19)

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藤岡，

吉岡，

野坂

【Original article】
Study on culture temperature in Escherichia albertii
MIYUKI FUJIOKA*1 SHO YOSHIOKA*1
HIROYUKI NOZAKA*1（Received July 2, 2020 ; Accepted July 16, 2020）

Abstract: Escherichia albertii, an emerging pathogen, was isolated from a patient with diarrhea in Bangladesh in 1998, andis now a known cause of food poisoning in Japan. E. albertii is similar to E. coli and has been misidentified by clinicallaboratories. We prepared a mixture of E. albertii with three other types of enterobacteria and assessed the ability to detect E.
albertii on various different culture media and at various culture temperatures. E. albertii was not detected on EMB agar
plates, which were cultured at 44.5°C after inoculation with mixed culture in EC broth, a selective medium for E. coli. E.
albertii was detected in mixed bacterial cultures with high E. albertii concentrations after culturing at 37, 40, and 42°C in EC
broth. In contrast, growth of E. albertii on BTB agar plates was detectable under all conditions, although 37°C (the mostcommon incubation temperature for BTB agar plates) was most effective for detection of E. coli. Selective culturing at hightemperatures inhibits growth not only of other bacterial species, but also of E. coli to some extent. We suggest that bacterial
culture in selective media at 37, 40, and 42°C, followed by plating on nonselective media such as BTB agar, for non
lactose-degrading colonies, is an effective method for detecting E. albertii.
Keywords: Escherichia albertii，Food poisoning bacteria，Misidentification，Culture temperatureⓒ2020 Health sciences Research.

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