ノートルダム清心学園清心女子高等学校
中原明日美，福原古都音（指導教諭：田中福人）

日本農芸化学会

油脂分解酵母を求めて

本 研 究 は 日 本 農 芸 化 学 会 2019 年 度 大 会（開 催 地： 東 京 農 業大学）での「ジュニア農芸化学会」において発表されたものである．研究チームは，身近に存在するツツジの花から，近●年社会問題ともなっている，食用油などによる環境汚染に立ち向かえる（かもしれない）力をもつ「酵母」を単離することに成功した．目指すゴールは必ずしも近くはないが，若いパワーでその可能性を手繰り寄せていただきたい．なお，本

化学と生物研 究 は 参 加 者 か ら 高 く 評 価 さ れ， ジ ュ ニ ア 農 芸 化 学 会「銀賞」を受賞した．

泌し，酵母が繁殖しやすいと考えたからである．また，ツツジの花は花期が短く，一定期間に集中して採集できるというメリットもある．なお，酵母の分離および培養については，以下の手順で行った (2〜4)（図 1a）．柱頭，やく，花びらの中心などを滅菌した綿棒で擦り取り，綿棒ごと YPG 液体培地（酵母エキス 1％，ペプトン 2％，グルコース 2％）1 mL に入れて懸濁した．その懸濁液少量（0.3 mL 程度）を，細菌の繁殖を防ぐためクロラム

本研究の目的，方法および結果と考察【目的】

フェニコール 0.01％（細菌の増殖を防ぎ，酵母を分離しやすくするために添加）を含む分離用の YPG 平板培地（粉末寒天 2％添加）に塗抹し，30 C で数日〜10 日間静本校では，花に生息する酵母（花酵母）を材料にし，置培養した．形成されたコロニーの外観から酵母と思わ自然界における生物相互の関係と野生酵母の機能を理解れるコロニーを識別し，分離した．単コロニー分離を繰することを目指して実験を行っている．本研究では，野り返すことで，最終的に独立コロニーとして単離した．

生酵母のもつ能力を明らかにすることを目的として，特2.

野生酵母の油脂分解能力の判定に野生酵母が油脂を分解できるかどうかに注目した．先油脂（菜種油）が入った YPG 平板培地は，蒸留水 1 L

行研究によると，油脂を分解できる酵母を利用した工場に対し，酵母エキス 1％，ペプトン 2％，グルコース 2％，(1)廃水の処理などの試みは行われているものの ，社会一粉末寒天 4％，菜種油 1％，トリトン X 0.1％を添加し，般での実用化には至っておらず，いまだ研究段階にあ120 C で 20 分間滅菌後，少量のエタノールに溶かしたクる．そこで私たちは，微生物を用いた環境改善を最終的ロラムフェニコール 0.01％を添加し，シャーレに分注し，なゴールに定め，過去の研究から，比較的野生酵母がよ一晩静置して作製した．そこにツツジから単離した野生く採集できるツツジの花を分離源とし，そこから得られ酵母を植え，1 週間培養した．

た野生酵母が油脂を分解できるかどうかの検討を行うと平板培地中の油脂の染色にはオイルレッド O を用いともに，油脂分解能力をもつ酵母の種の同定を試みた．

た．オイルレッド O は低極性で，油などの無極性分子【方法】

中で拡散する．オイルレッド O 保存液（オイルレッド O

1.

ツツジからの野生酵母の単離

0.3 g を 99％ 2-プロパノール 100 mL に溶解し飽和溶液と酵母は市街地である岡山大学構内のツツジの花から採したもの）と蒸留水を 6 : 4 の割合で混ぜ，ろ過して染色集した．ツツジを用いた理由は，ラッパのような形をし液とした．酵母を培養した平板培地にプロパノール溶液ていて蜜線が花弁の基部に集まっており，多くの蜜を分を滴下した後，前述した染色液を滴下し，37 C で 15 分

化学と生物 Vol. 58, No. 2, 2020131

日本農芸化学会●

図 1 ■ 実験方法の概略
a）酵母の採取・単離の流れ．b）18S rDNA 配列を利用した種の同定の流れ．

静置して染色した．その後，さらにプロパノール溶液を滴下して 1 分静置し，余分な染色液を除いた後，培地上化学と生物の酵母の周りに油脂が分解された形跡（＝クリアゾーン）が見られるかどうかを観察した．
油脂分解能力のある酵母の種の同定

3.

油脂分解能力が見られた野生酵母に対し，18S リボ
ソーム DNA（rDNA）領域の塩基配列を解析し，種の同定を試みた．実験は図 1b の流れで行った．Gen とるくん ™（酵母用）High Recovery（タカラバイオ社）を用

図 2 ■ 酵母の油脂分解能力の評価と PCR 産物の確認a）油脂分解能力をもつ酵母（A 株）の周りにできた油脂分解の形跡（クリアゾーン）．b）18S rDNA を標的とした PCR 産物の電気泳動．A と B は単離した酵母（A 株，B 株），は対照のの結果を示している．

いて酵母から DNA を抽出し，その DNA を鋳型として，
18S rDNA 増幅用のプライマー（18-F: 5′-ATC TGG TTGを行ったところ，3 株において酵母の周りにクリアゾーン

ATC CTG CCA GT-3′ ; 18-R: 5′-GAT CCT TCC GCA GGTが確認された（図 2a）．また，酵母自身は染色されな

TCA CC-3 ′）および EmeraldAmp® MAX PCR Master

かったことから，酵母が油脂をそのまま取り込んだのでMix（タカラバイオ社）を用いて PCR（ポリメラーゼ連はなく，酵母の周囲に油脂分解酵素が分泌され，油脂が鎖反応）を行った（98 C 10 秒；55 C 30 秒；72 C 1 分，分解されたと考えられた．

30 サイクル）．得られた PCR 産物についてアガロースゲ

油脂分解能力が見られたツツジ由来の野生酵母 3 株のうル電気泳動を行い，目的のバンドの有無を確認した．バ

ち，2 株（A 株，B 株）については DNA が抽出できたのンドが見られた PCR 産物について，シグマアルドリッ

で，18S rDNA 領域を PCR で増幅し，電気泳動を行った．

チ社にシーケンスを依頼し，得られた塩基配列データを図 2bに示すとおり，対照としたパン酵母（DDBJ（日本 DNA データバンク）のデータベースと照）と同じ長さのバンドが見られたことから，合し，BLAST 解析（既知の種の塩基配列とどれくらい得られた PCR 産物は酵母の 18S rDNA である可能性が高一致するかの解析）により近縁種を検索した．

いと考えられた．

【結果と考察】本研究において，ツツジの花から 44 株の野生酵母が単離できた．そのうち 7 株について油脂分解能力の確認132得られた 2 株の PCR 産物について，シークエンスを行い，BLAST 解 析 し た 結 果 を 表 1 に 示 し た．2 株 と も，属や属などの既知の酵母の塩基化学と生物 Vol. 58, No. 2, 2020

表 1 ■ ツツジ由来の野生酵母の 18S rDNA の塩基配列におけるBLAST 解析結果ることは難しい．環境中に流出した油は，水質を汚染

PCR サンプル名

近縁種

Identities

私たちは，微生物の力を借りて，この問題の解決を目指

A株

sp.

1016/1024（99％）
1016/1024（99％）
1016/1024（99％）
1017/1032（98％）
1017/1032（98％）
1017/1032（98％）

したいと考え，本研究を実施し，ツツジの花から油脂分

sp.

B株

し，固有種の減少など，さまざまな問題を引き起こす．

解能力をもつ酵母を複数単離した．今後，単離した酵母の種の同定，油脂分解メカニズムの解析，同酵母の大量培養法の確立，油脂分解能力の強化など，実用化までには，越えなければならない課題が多数存在する．これら●

日本農芸化学会の課題を一つずつ解決することで，環境問題の改善や新配列と相同性が高いことがわかった．一方，酵母においたな産業の創出につながるのではないかと考えている．ては近縁種間で 18S rDNA 領域の塩基配列の相同性が高本校の過去の研究においては，ツツジの花から，セルいことから，今回のデータだけでは種の同定には至らなロースやキシロースなどの多糖を分解する野生酵母も単かった．ITS（Internal Transcribed Spacer）領域の塩離されている．野生酵母がもつ能力の多彩さには感心さ

基配列は菌種間で差があることが知られていることから，せられるばかりである．

今後その解析も行い，近縁種をより細かく絞り込んでいきたいと考えている．

本研究の意義と展望
油脂は，産業界のみならず，一般家庭でも広く使用されている．産業界においては，適切な規制を行うことで環境中への流出をコントロールできると考えられるが，

1) 千種 薫他：環境技術，26，190（1997）．
2) 西山隆造： 図解応用微生物の基礎知識 ，オーム社，1981.
3) 杉村幸子： やさしい微生物実験 ，ニュー・サイエンス社，
1986.
4) 山里一英他監修：微生物の分離法，R&D プランニング，
2001.
Copyright © 2020 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.58.131

化学と生物

一般家庭で使用される食用油まで厳密にコントロールす文献

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