課題番号：23 指 104

研究課題名

：糸球体上皮細胞におけるインスリンシグナル伝達系の腎機能に対する役割の検討

主任研究者名 ：鏑木康志
分担研究者名 ：松本道宏、浜崎辰夫

キーワード：糖尿病腎症、糸球体上皮細胞、インスリンシグナル伝達系

研究成果

：

糖尿病腎症は我が国における腎不全の原疾患の第一位であり、患者数は年々増加している
ものの、糖尿病腎症の発症・進展を防止する十分な治療法は確立されていない。本研究の目
的は、糸球体上皮細胞(podocyte)におけるインスリン(Ins)シグナル伝達系の障害が、蛋白尿を伴う糖尿病腎症の発症・進展に関与するかどうかを遺伝子改変マウスにより検討することにある。そこで本研究は、Ins シグナル伝達系において重要な役割を果たしている分子のpodocyte 特異的なノックアウト(KO)マウスを Cre-loxP システムを用いて作製し、腎症の発症・進展に関する表現型を解析した。Podocyte 特異的 Cre recombinase 発現マウスと TSC2、または PDK1 遺伝子 flox マウスとの交配により、腎糸球体上皮細胞特異的 TSC2(または PDK1)欠損マウスならびに対照としての TSC2-flox(または PDK1-flox)マウスを作製した。磁気ビーズを用いた灌流法により Pod 特異的 KO マウス、対照 PodCre Tg マウス、対照 flox/flox マウ
スより腎糸球体単離を行い、単離腎糸球体における TSC2 mRNA（あるいは Cre mRNA）発現を
real-time PCR 法により検討した。Pod 特異的 TSC2 KO マウス単離糸球体における TSC2 mRNA
発現レベルは対照とした PodCre Tg マウス、TSC2(flox/flox)マウスに比べて有意に減少しており、また、Pod 特異的 PDK1 KO マウス単離糸球体における Cre mRNA 発現レベルは対照とした PDK1(flox/flox)マウスに比べて有意に上昇していた。このことから、作製した Pod 特異
的 KO マウスでは podocyte 特異的に当該遺伝子が発現抑制されていると判断した。
PodTSC2 KO
マウス、PodPDK1 KO マウスともにメンデルの法則に従って生まれ、また外観上顕著な異常は観察されていない。一方、尿中アルブミン量の解析では 3 週齢以降の KO マウスのアルブミン・
クレアチニン比(U-ACR)が flox/flox 対照マウスや PodCre Tg 対照マウスに比べて有意な高値を示した。SDS-PAGE 解析では約 60kDa のアルブミンが PodTSC2 KO や PodPDK1 KO マウスにおいて多量に検出された。PodTSC2 KO マウス、PodTSC2 KO マウスの腎組織を光顕にて病理学的に解析したところ、尿細管における蛋白円柱の存在、ならびにメサンギウム基質の拡大を認めた。これらの解析結果から、podocyte における TSC2, PDK1 は糸球体機能維持に重要な役割を果たしていることが示された。
次に podocyte における Ins シグナル伝達障害に対する後期糖化反応生成物(AGE)の作用と糖尿病腎症発症との関連を解析する目的で podocyte 特異的 AGE 受容体(RAGE)トランスジェニ
ックマウスを作製した。Podocin プロモーターを有するマウス RAGE 遺伝子発現ベクターを構築し、約 400 個の C57BL/6J マウス受精卵に遺伝子コンストラクトを注入し出産させた結果、2 系統(B252 系統, B313 系統)が自然交配可能なマウスとして確立された。磁気ビーズを用いた灌流法により PodRAGE Tg(B252 系統)より腎糸球体を単離し、腎糸球体における RAGE mRNA
発現量を real-time PCR により検討した。PodRAGE Tg 腎糸球体における RAGE mRNA 発現量は
対照 C57BL/6J マウスに比べ有意に上昇していた。なお、PodRAGE Tg マウス(B252 系統)、
PodRAGE Tg マウス(B313 系統)からの単離糸球体における RAGE mRNA レベルは両系統間で発現差異を認めなかった。PodRAGE Tg マウスはメンデルの法則に従って生まれ、外観上顕著な異常は観察されていない。
6, 12 週齢における PodRAGE Tg マウス, 対照 C57BL/6 マウスの体重、随時血糖、絶食時血清インスリンレベル、尿中アルブミン・クレアチニン比に有意差は認められなかった。そこで 8 週齢 PodRAGE Tg マウス、対照 C57BL/6J マウスそれぞれにストレプ
トゾトシンを投与し、ストレプトゾトシン誘発糖尿病における腎機能の変化を解析した。ス
トレプトゾトシン投与 4, 8 週後の PodRAGE Tg マウス、
対照 C57BL/6J マウスにおける血糖値、体重は両群間で差異を認めなかった。一方、PodRAGE Tg マウスの尿中アルブミン・クレアチ
ニン比はストレプトゾトシン投与 4 週後、8 週後のいずれも対照 C57BL/6J マウスに比べ有意な高値を示した。ストレプトゾトシン投与 8 週後の PodRAGE Tg マウス腎臓の病理学的所見では、対照 C57BL/6J マウスに比べて腎糸球体領域における軽度のメサンギウム基質拡大が認められた。これらの解析結果から、podocyte における RAGE 発現上昇は糸球体上皮細胞のバリ
ア機能障害を引き起こし、糖尿病腎症の病態を増悪化に作用することが示された。
最後に、podocyte の補充療法が糖尿病腎症治療に有効かを検証する目的で、Osr1、WT1 をはじめとする podocyte 分化に関与する遺伝子を高発現した脂肪前駆細胞の作製と、さらにこの細胞を糸球体上皮細胞へと培養系で誘導した後に糸球体腎炎モデルマウスに移植すること
で、podocyte 前駆細胞補充の糖尿病腎症治療としての可能性を検討した。脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASC）に Osr1、あるいは WT1 のいずれかを単独導入、および同時導入したのち、DMEM/FBS 培地で一週間培養して細胞の変化を観察したところ、Osr1、ならびに Osr1/WT1 を導入した ASC では一部細胞の形態がより上皮細胞様な形態に変化した。また、遺伝子導入された細胞から腎構成細胞への分化を示す Wnt4、Six2、Foxc2 と Podxl 等の遺伝子発現が検出された。Osr1/WT1 遺伝子導入後の Nephrin、Podxl、Foxc2、Pax2、Lmx1、Wnt4、Six2、CD24、
CD133、CDH11 発現の経時的解析の結果、Osr1/WT1 遺伝子導入 3 日後の ASC が podocyte 前駆細胞の特性にもっとも類似し細胞移植に適していると判断した。そこで、Osr1/WT1 遺伝子を導入した ASC および遺伝子導入を行っていない ASC を adriamycin 投与による糸球体腎炎モデ
ルマウスの尾静脈に注入し、移植された細胞の腎臓への生着率および尿中タンパク質量の変化を検討した。Osr1/WT1-ASC および ASC を移植したマウス群では、非細胞投与マウス群に比べて尿中タンパク濃度の低下が認められた。ところが、細胞を移植したマウス腎臓の組織学的解析では GFP 発現 ASC の局在は腎組織内にはほとんど認められなかった。さらに ASC の腎組織内への生着率を検討するために、Osr1/WT1-ASC および ASC を adriamycin 腎症モデルマ

ウスの尾静脈および腎皮膜下に注入し、一週間後マウスの腎臓を摘出して GFP 発現細胞の局在を調べたものの、Osr1/WT1-ASC および ASC 投与マウスの腎組織内では GFP の発現はごく僅かしか検出されず、移植された細胞の腎組織内への定着はほとんど認められなかった。以上の検討から、ASC への Osr1/WT1 遺伝子導入により podocyte 分化に関与する遺伝子群の発現と上皮細胞様の形態変化が引き起こされ、podocyte 前駆細胞への誘導が可能となった。しかしながら、Osr1/WT1-ASC を用いた糸球体腎炎モデルマウスへの細胞移植実験の結果からは
podocyte 前駆細胞としての分化は不完全であると考えざるを得ない。遺伝子導入する際にメチル化を抑制し epigenetic な変化を促す方法や、Osr1/WT1 のような podocyte 前駆細胞分化の初期に関与する遺伝子のみならず podocyte 前駆細胞の分化に関与する遺伝子群を追加導入することにより podocyte 前駆細胞への分化誘導効率を高める工夫が必要とされる。また、
糸球体腎炎モデルマウス腎組織における移植細胞のホーミング効果が低いことについては、
adriamycin が投与されたマウスにおいては腎臓以外の部位で炎症が起き、移植された ASC が腎臓以外の部位に誘導されたため、腎臓への定着が相対的に低かった可能性が考えられる。
細胞誘導療法をより確実に評価するためには、腎障害モデルの作製法も今後改善の余地がある。

Subject No.

：23 指 104

Title

：The role of insulin signaling system in podocytes in the development ofdiabetic nephropathy

Researchers：Yasushi Kaburagi, Michihiro Matsumoto, Tatsuo Hamazaki

Key word：Diabetic nephropathy, podocytes, insulin signaling system

Abstract：
In the last decade diabetic nephropathy has become an increasingly important causeof end‐stage renal disease leading to dialysis in Japan. The earliest clinically detectable signof overt diabetic nephropathy is the excretion of high levels of protein in the urine, followedby progressive loss of glomerular filtration rate. Tight glycemic control, control of bloodpressure by the blockade of renin‐angiotensin system, and control of lipid has been shown toslow progression of diabetic nephropathy, but there are no specific therapies for blocking orreversing diabetic nephropathy. Recent papers suggest that impaired insulin signaling in theglomerular podocyte may be another critical mechanism leading to diabetic nephropathy. In
this study, we focus on the insulin signaling molecules in podocytes, and examine the effects
of insulin signaling molecules in podocytes on the development of diabetic nephropathy.
First, we investigated on the role of TSC2, one of the important molecules involvedin the insulin signaling pathway, in the podocytes. We tried to generate podocyte‐specific
TSC2 knockout mice (PodTSC2 KO) by crossing floxed TSC2 mice with podocyte‐specific
Cre recombinase mice (PodCre Tg) driven by the podocin promoter. PodTSC2 KO mice wereborn with normal Mendelian frequency and initially appeared entirely normal. We went on
to prove whether the TSC2 gene was specifically knocked down in the podocytes of the
PodTSC2 KO mice. We isolated the podocytes explanted from the glomeruli of PodTSC2 KO
mice, and analyzed the expression level of TSC2 mRNA by real‐time RT‐PCR analysis. The
level of TSC2 mRNA in the podocytes of PodTSC2 KO mice were at least 90% decreased
compared with those in PodCre Tg and floxed TSC2 mice. Tissue distribution of TSC2mRNA in PodTSC2 KO mice was examined, and the levels of TSC2 mRNA in the examinedtissues (heart, liver, kidney, skeletal muscle, epididymal fat) were comparable with those in
PodCre Tg and floxed TSC2 mice. At 3, 5, 7 weeks of age, PodTSC2 KO showed albuminuria
although the levels of blood glucose and body weight were comparable with those in PodCre
Tg and floxed TSC2 mice. At 7weeks of age, BUN level in PodTSC2 KO mice weresignificantly increased compared with that of PodCre Tg and floxed TSC2 mice. Next, weinvestigated the role of PDK1, another important molecule involved in the insulin signaling
pathway, in podocytes. We tried to generate podocyte‐specific PDK1 knockout mice
Researchers には、分担研究者を記載する。

(PodPDK1 KO) by crossing floxed PDK1 mice with PodCre Tg. PodPDK1 KO mice wereborn with normal Mendelian frequency and initially appeared entirely normal. The
expression of Cre mRNA in the podocytes isolated from the PodPDK1 KO mice weresignificantly increased with that in floxed PDK1 mice, which showed the PDK1 gene wasspecifically knocked down in the podocytes of the PodPDK1 KO mice. At 3 weeks of age,
PodPDK1 KO mice showed albuminuria although the levels of blood glucose and bodyweight were comparable with those in PodCre Tg and floxed PDK1 mice. BUN level in
PodTSC2 KO mice were significantly increased compared with that of PodCre Tg and floxed
TSC2 mice. Significant histological changes were present in PodPDK1 KO mice. These
histological changes included many renal casts in tubules, and increased levels ofglomerulosclerosis. The current findings revealed TSC2 and PDK1 play important roles in
the maintenance of podocyte function, and that the dysregulation of the molecules in the
podocytes may be involved in the pathogenesis of diabetic nephropathy.
Advanced glycation end products (AGEs) are a complex and heterogeneous groupof compounds that are formed when reducing sugars or reactive carbonyls react
non‐enzymatically with free amino groups through the Maillard reaction. AGEs are
spontaneously produced in human tissues and in circulation, and the formation andaccumulation of AGEs have been known to progress in a normal aging process and at anaccelerated rate under diabetes. Recent studies have revealed that AGEs and receptor for
AGEs (RAGE) interaction elicits oxidative stress generation in various types of cells andsubsequently evokes vascular inflammation, macrophage and platelet activation, andthrombosis, thereby playing an important role in the development and progression ofvascular complications in diabetes. Moreover, it has recently been revealed that AGEs could
also play a role in the pathogenesis of insulin resistance by evoking inflammatory reactions.
To determine whether AGEs‐ RAGE system play a role in the pathogenesis of diabetic
nephropathy, we generated the transgenic (Tg) mice overexpressing RAGE gene specificallyin podocytes, and examined the effects of RAGE overexpression in podocytes on thedevelopment of diabetic nephropathy. We constructed RAGE‐containing plasmids under thecontrol of podocin promoter, and successfully established two Tg founders (B252 and B313
lines). RAGE Tg mice were born with normal Mendelian frequency and initially appeared
entirely normal. We isolated the glomeruli from the RAGE Tg mice, and confirmed RAGE
mRNA was significantly induced in the glomeruli of RAGE Tg mice compared with that innon‐Tg control mice. At 6 weeks of age, RAGE Tg mice were comparable in size to theirlittermates, were normoglycemic, and had comparable serum insulin levels. RAGE Tg mice
were not albuminuric and the kidney size of RAGE Tg mice was indistinguishable from their
Researchers には、分担研究者を記載する。

controls. RAGE Tg mice and control littermates were rendered diabetic at 8 weeks of age via
intraperitoneal injection of low‐dose streptozotocin for 5 consecutive days. Fasting blood
glucose concentrations in RAGE Tg and control mice were within diabetic ranges following
injection of streptozotocin, and there were no significant differences between two groups.
Four weeks after the injection of streptozotocin, RAGE Tg mice started to develop
albuminuria. At 8 weeks after the injection of streptozotocin, significant levels ofalbuminuria and histological changes were present in RAGE Tg mice. The current findings
revealed RAGE play important roles in the maintenance of podocyte function, and that theinduction of RAGE in podocytes may be involved in the pathogenesis of diabetic
nephropathy although further deep mechanistic investigation is needed.
Injury to the podocyte results in proteinuria and often leads to progressive kidneydisease. As podocytes have limited ability to repair and/or regenerate, the extent of podocyte
injury is a major prognostic determinant in diabetic nephropathy. In this study, wehypothesized that cells derived from the stromal fraction of adipose tissue (ASC) could
therapeutically rescue early stage glomerulonephropathy features. Introduction of Osr1 and
WT1 gene into ACS lead to the morphological changes in ASC, which resembles theepithelial‐like cells. Gene expression analysis revealed that co‐overexpression of Ors1 and
WT1 in ACS (Ors1/WT1 ACS) increased the podocyte‐related genes such as pax2, lmx1, wnt4,
nephrin, and foxc2. We administered Ors1/WT1 ACS or ACS intravenously into theproteinuric mice with adriamycin‐induced nephropathy and found the level of urinary
protein were reduced in the Ors1/WT1 ACS or ACS treated mice, otherwise the saline treatedmice (served as control) still showed significant proteinuria. Although further study toelucidate the underlying mechanism is required, this study implicated ASC had atherapeutic potential even when administered in a more clinically relevant setting into a
proteinuric glomerulonephropahty mice.

Researchers には、分担研究者を記載する。

Generation of the mice with specific deletion of TSC2 from their podocytes
(-)

(+)

Podocin-Cre(+/+) (F/+) (F/F) (+/+) (F/+) (F/F)

Floxed TSC2
allele(C)
TSC2/β-actin mRNA

(A)

4.0

Cre(+)

3.0

TSC2(F/F)
TSC2 KO

2.0
1.0
0

Heart

(B)

(D)

Liver

(E)

U-ACR (mg/g Cre)

*

1000

*

SkeletalmuscleKidney*(kDa)

Cre(+)

TSC2/β-actin mRNA

10

1

(F)

0.2

250

*
0
Cre(+)

TSC2(F/F) TSC2 KO

♀

F/F

KO

25

3

5

7 (week-old)(G)

BUN (mg/dL)

3

Albumin (g/dL)

*

200

0.1

♂

TSC2(F/F) 75
TSC2 KO
50

100

0.3

KO

Epididymal
fat

*

2

150
100

1

50

*: p＜0.05 vs corresponding controls00Cre(+)

TSC2(F/F)

TSC2 KO

Cre(+)

TSC2(F/F)

TSC2 KOGeneration of the mice with specific deletion of PDK1 from their podocytes
(-)

(B)

(+)

Cre/β-actin mRNA(A)
Podocin-Cre(+/+) (F/+) (F/F) (+/+) (F/+) (F/F)

Floxed PDK1 allele(C)

Body weight (g)(D) 140

10
1
0.1
0.01
0.001

Glucose (mg/dL)

120

20

p < 0.01

PDK1(F/F)

PDK1 KO

(G)

100
80
60

10

40
20

0

(E)
400

0
PDK1(F/F)

PDK1 KOU-ACR (mg/g Cre)

*

300

(F)

250

PDK1(F/F)

PDK1 KO

BUN (mg/dL)

*

200

(H)

150
200

100

100

50

0

0

PDK1(F/F)

PDK1 KO*
PDK1(F/F)*: p＜0.05 vs corresponding controls

PDK1 KO*Transgenic mice expressing receptor for advanced glycation
endproducts (RAGE) gene under the control of the podocin promoter(A)(B)
RAGE/β-actin mRNA

10,000

*
1,000
100
10
1

C57BL/6J(C)

Body weight (g)

25
20

(D)
200

Glucose (mg/dL)(E)
40

U-ACR (mg/g Cre)

(F)
200

30

150

100

20

100

50

10

50

150

15

RAGE Tg

C57BL/6J
RAGE Tg

*

*

10
5
0

0
C57BL/6J

RAGE Tg

0
C57BL/6J

RAGE Tg

C57BL/6J

RAGE Tg0048(week after STZ injection)*: p＜0.05 vs corresponding controlsOsr1/WT1遺伝子を導入されたマウスASC細胞

Osr1+WT1 introduced ASC Osr1introduced ASC
7 days7 daysFoxc2

WT1 introduced ASC
7days

WT1
Osr1
Podxｌ
(Endogenous) (Endogenous)ASC

1: Osr1+WT1 introduced ASC (3 days)
2: Osr1 introduced ASC (3 days)
3: WT1 introduced ASC (3 days)
4: ASC (3 days)
5: 15 dpc mouse embryos

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：23指104

研究課題名：糸球体上皮細胞におけるインスリンシグナル伝達系の腎機能に対する役割の検討
主任研究者名：鏑木康志
論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Okumura A,
Unoki-Kubota
Increased serum leukocyte cell- derived H, Matsushita
chemotaxin 2 (LECT2) levels in obesity Y, Shiga T,
and fatty liver.
Moriyoshi Y,
Yamagoe S,
Kaburagi Y.

BioScience
Trends.

7(6)

2013年

Yokouchi H,
Angiopoietin-like protein 4 (ANGPTL4) is Eto Koki,
induced by high glucose in retinal
Nishimura W,
pigment epithelial cells and exhibits
Takeda N,
potent angiogenic activity on retinal
Kaburagi Y,
endothelial cells.
Yamamoto S,
Yasuda K.

Actaophthalmologica.

91(4)

2013年

J Proteomics

84

2013年

FEBS Lett.

587(5)

2013年

Genesis50 (9)

2013年

Takahashi E,
Differential proteome analysis of serum Okumura A,
proteins associated with the development Unoki-Kubotayof type 2 diabetes mellitus in the KK-A H, Hirano H,
mouse model using the iTRAQ technique. Kasuga M,
Kaburagi Y.
Okumura A,
Suzuki T,
Miyatake H,
Okabe T,
Hashimoto Y,
Miyakawa T,
Leukocyte cell-derived chemotaxin 2 is a Zheng H,
zinc-binding protein.
Unoki-Kubota
H, Ohno H,
Dohmae N,
Kaburagi Y,
Miyazaki Y,
Tanokura M,
Yamagoe S.
The miR-17/92 cluster is targeted by
STAT5 but dispensable for mammary
Yamaji D 他
development
Histidine Augments the Suppression of
Hepatic Glucose Production by Central
Insulin Action

Kimura K,
Matsumoto M,
Inoue H 他

Diabetes

62 (7)

2013年

Sequential activation of genetic
programs in mouse mammary epithelium
during pregnancy depends on STAT5A/B
concentration

Yamaji D, 他

Nucleic Acids
Research

41 (3)

2013年

Mammary-specific gene activation isdefined by progressive recruitment of
STAT5 during pregnancy and theestablishment of H3K4me3 marks

Yamaji D 他

Mol Cell Biol

34 (3)

2014年

研究発表及び特許取得報告について

Ras-related C3 botulinum toxin substrate
Asahara S,
1 (RAC1) regulates glucose-stimulated
Matsumoto M,
insulin secretion via modulation of FKido Y.
actin.

Diabetologia

56(5)

2013年

Sequential activation of genetic
programs in mouse mammary epithelium
during pregnancy depends on STAT5A/B
concentration.

Yamaji D, 他

Nucleic Acids
Res.

41(3)

2013年

InsP3R-Ca(2+) signaling takes center
stage in the hormonal regulation ofhepatic gluconeogenesis.

Matsumoto M

Cell Res.

22(11)

2012年

Nature Medicine

18（4）

2012年

CITED2 links hormonal signaling to PGC-1 Sakai M,
α acetylation in regulation of
Matsumoto M
gluconeogenesis.
他
Endoplasmic Reticulum Stress Inhibits
STAT3-Dependent Suppression of Hepatic
Gluconeogenesis via Dephosphorylation
and Deacetylation.

Inoue H,
Matsumoto M
他

Diabetes

61(1)

2012年

Identification of tuberculosisassociated proteins in whole bloodsupernatant.

Tanaka T,
Sakurada S,
Kano K,
Takahashi E,
Yasuda K,
Hirano H,
Kaburagi Y,
Kobayashi N,
Le Hang NT,
Lien LT,
Matsushita I,
Hijikata M,
Uchida T,
Keicho N

BMC Infect Dis

11

2011年

Role of the podocyte signal-transduction

Kaburagi Y,
Unoki-Kubota H

Diabetol Int

2

2011年

J Biol Chem

286(43)

2011年

PLoS One

6(8)

2011年

J. Biotechnol.

Vol. 154, No.
4

2011年

場所

年月

Overexpression of KLF15 in adipocytes ofmice results in down-regulation of SCD1 Nagare T,
expression in adipocytes and consequent Matsumpoto M
enhancement of glucose-induced insulin 他
secretion.
Ablation of TSC2 Enhances Insulin
Secretion by Increasing the Number ofMitochondria through Activation ofmTORC1.

Inoue H,
Matsumoto M他

Konno, M.
Intracellular reactivation of
Masui, S.
transcription factors fused with protein
Hamazaki, T.S.
transductiondomain
Okochi, H.
学会発表
タイトル

発表者

学会名

研究発表及び特許取得報告について

Okumura A,
Suzuki T,
Miyatake H,
Leukocyte cell-derived chemotaxin 2 Miyakawa T,
is a zinc-binding protein: theZheng H,monomeric forms are stabilized by
Unoki-Kubota
the zinc ion.
H, Dohmae N,
Kaburagi Y,
Tanokura M,
Yamagoe S.

第36回日本分子生物学会年会神戸

2013.12.3

奥村 彰規、久
保田 浩之、松血中LECT2濃度は肥満と脂肪肝の予測因 下 由実、志賀 第34回日本肥満子となりうるか
智子、森吉 百学会合子、鏑木 康志東京

2013.10.11

久保田 浩之、定量的プロテオミクスを用いた2型糖尿 高橋 枝里、奥 第28回日本糖尿病関連因子の探索
村 彰規、平野 病合併症学会
久、鏑木 康志

旭川

2013.9.13

Electrostatic Repulsion-Hydrophilic
Interaction Chromatography for
Profiling of Human Urine Shotgun
Proteome

Takakura M,
Unoki-Kubota
H, Kaburagi
Y.

HUPO 12th
Annual World
Congress横浜

2013.9.14

iTRAQ-Based Quantitation andValidation by Multiple Reaction
Monitoring to Identify DiabetesRelated Biomarkers in Sera from KKy
A Diabetes Mice

Takahashi E,
Unoki-Kubota
H, Okumura A,
Hirano H,
Kaburagi Y

HUPO 12th
Annual World
Congress横浜

2013.9.14

奥村 彰規、久
保田 浩之、松
第56回日本糖尿Leukocyte cell-derived chemotaxin 2 下 由実、志賀病学会年次学術は新規の肥満関連因子である
智子、森吉 百集会合子、鏑木 康志熊本

2013.5.16

鏑木 康志、山下 亮、本間蛍光ディファレンシャル二次元電気泳動
第56回日本糖尿
綾香、梶尾による糖尿病腎症患者のプロテオーム解病学会年次学術
裕、野田 光析集会彦、久保田 浩之熊本

2013.5.16

The transcripional coregulator CITED2
regulates adipocyte differentiation by 松本
interacting with retinoblastoma protein
CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節機構
松本の解明

The histone acetyltransferase GCN5
regulates hepatic gluconeogenesis
through a CITED2-dependent substrate
switch

松本

道宏

他

12th
International
Congress on
Obesity

クアラルンプー
2014年3月17日
ル・マレーシア

第28回日本糖尿病・肥満動物学会
道宏 他
宮崎
2014年2月15日
年次学術集会シン
ポジウム２
Keystone
Symposia,
Challenges and バンクーバー・
道宏 他
2014年1月14日
Opportunities in
カナダ
Diabetes Research
and Treatment

研究発表及び特許取得報告について

The histone acetyltransferase GCN5 is an酒井essential regulator of hepatic他
gluconeogenesis
The Transcriptional Coregulator CITED2
regulates adipocyte differentiation and 山地
lipid accumulation

International
Symposium on
淡路夢舞台国際他
2013年11月12日
Transcription and会議場
Metabolism

大介

Central Role of Fasting Inducible
CITED2-GCN5 Interaction in Hepatic
Gluconeogenesis

松本

道宏Central Role of Fasting Inducible
CITED2-GCN5 Interaction in Hepatic
Gluconeogenesis

松本

道宏

ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝糖代謝 酒井調節機構の解明他

International
Symposium on
淡路夢舞台国際
2013年11月12日
Transcription and会議場
Metabolism

真志人International
Symposium on
淡路夢舞台国際他
2013年11月11日
Transcription and会議場
Metabolism 2013
Asia-PacificDiabetes and他
Obesity (APDO)
東京
2013年10月12日
Study Groupsymposium 2013

真志人

第34回日本肥満学会・若手研究奨励賞審査口演

東京

2013年10月11日

東京

2013年10月11日

転写調節分子CITED2は癌抑制遺伝子産物Rbの山地
機能調節を介して脂肪細胞分化を制御する

大介

他 第34回日本肥満学会

転写調節分子CITED2による代謝制御機構

道宏

他

松本

国立健康・栄養研 国立健康・栄養
2013年10月10日
究所 所内セミナー 研究所・東京

CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節機構 酒井真志人

The 7th Kobe
Diabetes Night
Seminar

肝臓における２型糖尿病治療標的の同定への
松本
試み―肝糖産生亢進と脂肪肝を中心に―

道宏

日本医科大学老
日本医科大学老人人病研究所・川 2013年9月26日
病研究所セミナー崎

The Histone Acetyltransferase GCN5 is an
酒井Essential Regulator of hepatic
他
Gluconeogenesis
転写調節分子CITED2は癌抑制遺伝子産物Rbの山地
機能調節を介して脂肪細胞分化を制御する

他

真志人

大介

他

神戸

1st Annual
Helmholtz-Nature ミュンヘン・ド
Medicine Diabetes
イツ
Conference

2013年10月4日

2013年9月

第18回アディポサ
イエンスシンポジ
ウム

東京

2013年8月24日

大阪

2013年8月22日

転写調節分子CITED2による代謝制御機構の解
松本
明

道宏

第34回 Osaka
Diabetes Forum －Paradigm
Conversion for
Diabetes－

肝インスリン抵抗性による病態の分子機構–
松本
肝糖産生亢進と脂肪肝を中心に–

道宏

第6回 MetabolicHepatology 研究会

仙台2013年7月30日

CITED2: a new player in hormonal
regulation of hepatic gluconeogenesis

道宏他

2nd Annual World
Congress of
Diabetes-2013

西安・中国

2013年5月20日

ヒスチジンは、中枢神経を介してインスリン 木村 久美，松作用による肝糖産生抑制を増強する
本 道宏 他

第56回日本糖尿病
学会年次学術集会熊本

2013年5月18日

CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節機構
松本の解明

第56回日本糖尿病
学会年次学術集会
特別シンポジウム
３; インスリン作
用研究の進化と展
望熊本

2013年5月17日

松本

道宏

他

研究発表及び特許取得報告について

転写調節分子CITED2は癌抑制遺伝子産物Rbの山地
機能調節を介して脂肪細胞分化を制御する

第56回日本糖尿病
学会年次学術集会熊本

2013年5月17日

第56回日本糖尿病
学会年次学術集会・若手研究奨励賞審査口演

熊本

2013年5月16日

1st Korea-Japan
Diabetes Forum,
26th Spring
Congress of
Korean Diabetes
Association

済州島・韓国2013年5月11日

第86回日本内分泌学会学術総会仙台

2013年4月27日

他

第86回日本内分泌学会学術総会仙台

2013年4月26日

ヒスチジンは中枢作用を介して肝糖新生を抑 木村 久美，松制する
本 道宏 他

第86回日本内分泌学会学術総会仙台

2013年4月25日

ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝臓の糖 酒井
新生調節機構の解明
他

第50回日本臨床分
子医学会学術集会東京

2013年4月12日

第50回日本臨床分
子医学会学術集会東京

2013年4月12日

第27回日本糖尿病
合併症学会

福岡

2012年11月

9th IDF WPRCongress& 4th
AASD Scientific
Meeting京都

2012年11月

日本プロテオーム
学会2012年大会

東京

2012年7月

第55回日本糖尿病
学会年次学術集会横浜

2012年5月

第55回日本糖尿病
学会年次学術集会横浜

2012年5月

ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝臓の糖 酒井
新生調節機構の解明
他

CITED2: a new player in hormonal
regulation of hepatic gluconeogenesis

松本

ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝糖代謝 酒井
調節機構
他
転写調節因子CITED2の脂肪細胞分化における
松本
役割の解析

転写調節分子CITED2は癌抑制遺伝子産物Rbの山地
機能調節を介して脂肪細胞分化を制御する

大介

他

真志人

道宏

他

真志人

道宏

真志人

大介

他

鏑木康志、山下尿プロテオーム解析による糖尿病腎症関連因 亮、本間綾香、
佐藤（三城）恵子の探索美、久保田浩之
Unoki-Kubota
Identification of Differential Proteomes
H, Takahashi
Associated with the Development of TypeE, Okumura A,y
2 Diabetes in the KK-A Mice Using iTRAQ Hirano H,
Technique
Kaburagi Y
高橋枝里、久保2DICALを用いた糖尿病性細小血管症関連蛋白 田浩之、本間綾
質の探索
香、平野久、鏑
木康志
佐藤 恵美、加納 圭子、本間尿プロテオーム解析による糖尿病性腎症のバ 綾香、高橋枝
イオマーカー探索里、奥村彰規、
久保田 浩之、
鏑木 康志
奥村彰規、佐藤糖尿病性網膜症の発症プロセスに関与する血 恵美、久保田
中タンパク質浩之、鏑木 康志

研究発表及び特許取得報告について

鏑木康志、佐藤
恵美、本間綾香、加納圭子、
高橋枝里、奥村
糖尿病性細小血管症バイオマーカー探索の試
彰規、中村直み子、佐伯久美子、湯尾明、平野久、久保田浩之第55回日本糖尿病
学会年次学術集会横浜

2012年5月

高橋枝里、久保田浩之、奥村彰
KK-A マウス血清を用いた2型糖尿病関連因子 規、佐藤恵美、の探索
平野久、鏑木康志

第55回日本糖尿病
学会年次学術集会横浜

2012年5月

第55回日本糖尿病
学会年次学術集会横浜

2012年5月

第49回日本臨床分
子医学会学術集会

京都

2012年4月

第7回炎症・脂質代
ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝糖代謝 酒井真志人, 松謝/メタボリサーチ
調節機構.
本道宏 他
フォーラム

東京

2013年1月

ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝糖代謝 酒井真志人, 松
調節機構.
本道宏 他

第24回分子糖尿病
学シンポジウム東京

2012年12月

ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝糖代謝 酒井真志人, 松
調節機構.
本道宏 他

第35回日本分子生
物学会年会

福岡

2012年12月

転写調節因子CITED2はRb蛋白との相互作用を 辻村 知子, 松介して脂肪細胞分化を制御する.
本 道宏 他

第35回日本分子生
物学会年会

福岡

2012年12月

The Role of CITED2 in the Hormonal
Regulation of Hepatic Gluconeogenesis.

第85回日本生化学会

福岡2012年12月

Matsumoto M.

2012
International
Conference on
Diabetes andMetabolism

Seoul, Korea

2012年11月

CITED2 links hormonal signaling to PGC-1 3. Sakai M,
α acetylation in regulation of
Matsumoto M,
gluconeogenesis.
他

9th IDF-WPR
Congress / 4th
AASD Scientific
Meeting

Koyto, Japan2012年11月

転写調節因子CITED2の脂肪細胞分化における 松本道宏，辻村
役割の解析.
知子 他

第33回日本肥満学会

京都2012年10月

ヒスチジンは中枢作用を介して肝糖新生を抑 松本道宏，井上
制する.
啓 他

第33回日本肥満学会

京都2012年10月

転写調節因子CITED2の脂肪細胞の分化調節に
松本道宏
おける役割の解析.

第55回糖尿病学会
年次学術集会横浜

2012年5月

第55回糖尿病学会
年次学術集会横浜

2012年5月y

久保田浩之、岩
糖尿病腎症の進展に対する低分子量ヘパリン 田和希子、山本の効果の検討
靖彦、岡本宏、
山本博
高橋枝里、久保田浩之、奥村彰yKK-A マウス血清を用いた2型糖尿病関連因子 規、佐藤恵美、の探索
平野久、鏑木康志

CITED2: a new player in hormonal
regulation of hepatic gluconeogenesis.

松本道宏

他

他

CITED2はホルモン応答性にPGC-1αのアセチ 酒井真志人, 松
ル化を調節し肝糖新生を制御する.
本道宏 他

研究発表及び特許取得報告について

2012 Asia-PacificDiabetes andObesity (APDO)
Seoul, Korea
Study Group
Symposium

2012年4月

CITED2はホルモン応答性にPGC-1αのアセチ 酒井真志人, 松
ル化を調節し肝糖新生を制御する.
本道宏 他

第49回日本臨床分
子医学会

京都2012年4月

転写調節因子CITED2の脂肪細胞の分化調節に
松本道宏
おける役割の解析.

第85回日本内分泌学会学術総会名古屋

2012年4月

第85回日本内分泌学会学術総会名古屋

2012年4月

CITED2: a new player in hormonal
regulation of hepatic gluconeogenesis.

Matsumoto M.

他

転写共役因子CITED2によるNFκB活性調節を 酒井真志人, 松介した炎症制御機構.
本道宏 他

佐藤 恵美、加尿プロテオーム解析による糖尿病性腎症のバ 納 圭子、久保第23回糖尿病性腎東京
イオマーカー探索
田 浩之、鏑木
症研究会康志
高橋枝里、奥村彰規、加納圭血清プロテオーム解析による２型糖尿病関連 子、久保田浩
第34回日本分子生
横浜
因子の探索
之、岡村匡史、物学会年会
平野久、鏑木康志奥村彰規、高橋枝里、久保田浩
２型糖尿病関連血清タンパク質が網膜血管内第34回日本分子生之、平野久、岡横浜
皮細胞に及ぼす影響の解析
物学会年会
村匡史、鏑木康志田中 崇裕、櫻田紳策、加納圭
結核患者における血漿ペプチドーム解析によ第34回日本分子生子、佐藤恵美、
横浜
るバイオマーカー探索
物学会年会
鏑木康志、小林
信之、慶長直人
本間綾香、加納圭子、佐藤恵美、高橋枝里、MRM法を用いた糖尿病性細小血管症バイオ日本プロテオーム
奥村彰規、佐伯新潟
マーカーの探索
機構第９回大会
久美子、湯尾明、久保田浩之、鏑木康志
加納圭子、本間
綾香、佐藤恵美、高橋枝里、
糖尿病性細小血管症バイオマーカー探索の試第54回日本糖尿病
奥村彰規、佐伯札幌
み学会年次学術集
久美子、湯尾明、久保田浩之、鏑木康志高橋枝里、岡村
匡史、加納圭子、奥村彰規、 第54回日本糖尿病
札幌
糖尿病モデルLEA/Sendaiラット血清のプロテオ
久保田浩之、平
学会年次学術集
野久、安田和樹、鏑木康志CITED2 links hormonal signals to PGC-1α
Matsumoto M,
Santa Fe, New
acetylation for regulating fasting
Keystone Symposia
Sakai M 他
Mexico, USA
gluconeogenesis.
Kimura T.
Hamazaki, T.S.
Effect of cilostazol on lymphatic
Sugaya, M.
第36回研究皮膚科
endothelial cells in vitro and lymph
京都
Fukuda, S.
学会
flow in vivo.
Sato, S.
Okochi, H.

2011年12月

2011年12月

2011年12月

2011年12月

2011年7月

2011年5月

2011年5月

2012年1月

2011年12月

研究発表及び特許取得報告について

Do adipose tissue derived stem cells(ASCS) promote tumor growth?

Tokuhara, M.
Ishiguro, M.
Fukuda, S.
Hamazaki, T.S.
Okochi, H.

IFATS 2011

Miami Beach,
U.S.A.

2011年11月

脂肪細胞における転写因子KLF15の過剰発現
永礼智基、松本はSCD1発現を抑制し、インスリン分泌を増加
道宏 他
させる

第32回日本肥満学会

淡路2011年9月

CITED2はホルモン応答性にPGC-1αのアセチ 酒井真志人、松ル化を調節し、肝糖産生を制御する
本道宏 他

第32回日本肥満学会

淡路2011年9月

CITED2 links hormonal signals to PGC-1α Sakai M,
acetylation for regulating fasting
Matsumoto M
gluconeogenesis.
他

47th EASD Annual
Meeting

Lisbon,Portugal

2011年9月

転写共役因子CITED2による肝臓の糖代謝制御
松本道宏
機構の解明

第84回日本内分泌学会学術総会神戸

2011年4月

転写共役因子CITED2はPGC-1αの活性調節を 酒井真志人、松介して肝糖代謝を制御する
本道宏 他

第84回日本内分泌学会学術総会神戸

2011年4月

小胞体ストレスは、アセチル化抑制を介し 木村久美、松本て、STAT3依存性の肝糖新生系酵素遺伝子発 道宏、井上啓
現抑制を阻害する他

第84回日本内分泌学会学術総会神戸

2011年4月

発表先

場所

年月日

熊本

2013年5月18日

熊本

2013年5月17日

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

特別シンポジウム3 インスリン作用研究の進
松本
歩と展望

道宏

ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝糖代謝酒井調節機構の解明真志人

血糖上げるたんぱく

第56回日本糖尿病
学会年次学術集会
Official News
Flash No. 3
Report
第56回日本糖尿病
学会年次学術集会
Official News
Flash No. 2
Report

松本道宏

他

読売新聞

Cbp/p300-interactingTransactivator with
Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain 2 松本道宏
(CITED2)

他

Science-BusinesseXchange(BioCwntury)

高血糖 肝臓たんぱく質関与

他

朝日新聞

特許取得状況について

松本道宏※出願申請中のものは(

夕刊7面

科学

5(14)

朝刊31面

2012年5月10日

2012年4月5日

科学 2012年3月26日)記載のこと。

発明名称

登録番号

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国(糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法及びキット)(特願2013173382)(鏑木康志、久保田 (2013年8月23
浩之、高倉美智子)
日)（日本）(2012年11月27
日)

（日本）

（糖尿病治療用医薬組成物及びその有効成分（特願のスクリーニング方法）
2012-258468）※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこ（松本道宏）

課題番号：23指104

研究課題名：腎糸球体上皮細胞特異的PDK1, TSC2遺伝子改変マウスの作製と表現型解析

主任研究者名 ：鏑木 康志
分担研究者名 ：鏑木 康志

キーワード：糖尿病腎症、糸球体上皮細胞

研究成果

：

糖尿病の大部分を占める 2 型糖尿病ではインスリン(Ins)分泌障害と Ins 抵抗性が病態の基礎にあり、近年、内臓脂肪蓄積と Ins 抵抗性との関連が注目されている。Welsh らは、腎糸球体上皮細胞(podocyte)特異的に Ins 受容体を欠損するノックアウト(KO)マウスを用いて、糖尿病腎症の発症・進展に Ins 受容体シグナルが関与することを初めて報告した(Welsh G. etal., Cell Metabolism, 2010)。そこで本研究は、Ins シグナル伝達系において重要な役割を果たしている分子の podocyte 特異的な KO マウスを Cre-loxP システムを用いて作製し、腎症の発症・進展に関する表現型を解析することを目的とした。
まず、podocyte 特異的 Cre recombinase (Cre)発現マウスと TSC2 遺伝子 flox マウスとの交配により、podocyte 特異的 TSC2 欠損マウス(PodTSC2KO)ならびに対照としての TSC2-flox
マウスの作製を試みた。Podocyte 特異的 Cre 発現マウスには podocin プロモーターを有するCre トランスジェニックマウス(PodCre Tg)を用い、TSC2 遺伝子 flox マウスとの交配により産まれたマウス尻尾よりゲノム DNA を抽出し Cre、ならびに flox 配列の導入を PCR 法により検討した。複数回の交配を繰り返した後、Cre 遺伝子を有しホモ接合型で TSC2 遺伝子領域に
flox 配列が挿入された PodTSC2KO マウス(Cre(+),TSC2(flox/flox))が産出された(スライド
１(A))。対照マウスとして PodCre Tg マウス(Cre(+), TSC2(+/+))、ならびにホモ接合型 TSC2
遺伝子 flox マウス(Cre(-), TSC2(flox/flox))も併せて作製した。PodCre Tg マウス、
TSC2(flox/flox)マウス、PodTSC2KO マウスより糸球体を単離し TSC2 mRNA 発現量を解析した
ところ、
PodCre Tg マウス、TSC2(flox/flox)マウスに比べ PodTSC2KO マウスにおいて TSC2 mRNAの有意な発現減少が認められた(スライド１(B))。一方、PodTSC2KO マウス心臓、肝臓、腎臓(皮質部)、骨格筋、傍精巣上体脂肪における TSC2 mRNA レベルは対照 PodCre Tg マウス、
TSC2(flox/flox)マウスと比べて有意差を認めなかった（ スライド１(C))。PodTSC2KO マウ
スはメンデルの法則に従って生まれ、また外観上顕著な異常は観察されなかった。3, 5, 7
週齢において、PodPDK1KO マウス, PDK1(flox/flox)マウス、PodCre Tg マウスの体重、ならびに血糖レベルに有意差は認められなかった。一方、PodTSC2KO マウスの尿中アルブミン・
クレアチニン比は PodCre Tg マウス、TSC2(flox/flox)マウスに比べて有意な高値を示し(スライド１(D))、SDS-PAGE 解析により尿中に多量のアルブミンが排泄されていることが明らかとなった(スライド１(E))。また、7 週齢 PodTSC2KO マウスでは、PodCre Tg マウス、

TSC2(flox/flox)マウスに比べて有意な BUN 値の上昇、ならびに有意な血中アルブミン値の低下を認め、腎機能の低下が示唆された(スライド１(F)-(G))。
次に、podocyte 特異的 Cre recombinase (Cre)発現マウスと PDK1 遺伝子 flox マウスとの交配により、podocyte 特異的 PDK1 欠損マウス(PodPDK1KO)ならびに対照としての PDK1-flox
マウスの作製にも取り組んだ。Podocyte 特異的 Cre 発現マウスには podocin プロモーターを有する Cre トランスジェニックマウス(PodCre Tg)を用い、PDK1 遺伝子 flox マウスとの交配により産まれたマウス尻尾よりゲノム DNA を抽出し Cre、ならびに flox 配列の導入を PCR 法により検討した。複数回の交配を繰り返した後、Cre 遺伝子を有し ホモ接合型で PDK1 遺伝
子領域に flox 配列が挿入された PodPDK1KO マウス(Cre(+), PDK1(flox/flox))が産出された(スライド２(A))。対照マウスとして PodCre Tg マウス(Cre(+), PDK1(+/+))、ならびにホモ接合型 PDK1 遺伝子 flox マウス(Cre(-), PDK1(flox/flox))も併せて作製した。PodPDK1KO マ
ウス、ホモ接合型 PDK1 遺伝子 flox マウスより糸球体を単離し Cre mRNA 発現量を解析したところ、PodPDK1KO マウスにおいて Cre mRNA の有意な発現上昇が認められた(スライド２(B))。
PodPDK1KO マウスはメンデルの法則に従って生まれ、また外観上顕著な異常は観察されなかった。3 週齢において、PodPDK1KO マウス, PDK1(flox/flox)マウス、PodCre Tg マウスの体重、ならびに血糖レベルに有意差は認められなかった(スライド２(C)-(D))ものの、PodPDK1KO
マウスの尿中アルブミン比は PDK1(flox/flox)マウスに比べて有意な高値を示した(スライド２(E))。また、3 週齢 PodPDK1KO マウスでは、PodCre Tg マウス、PDK1(flox/flox)マウスに比べて有意な BUN 値の上昇(スライド２(F))、ならびに有意な血中アルブミン値の低下が認められ、腎機能の低下が示唆された。PDK1(flox/flox)マウス腎臓の光顕による病理学的所見では明らかな異常を認めないのに対し(スライド２(G))、PodPDK1KO マウス腎臓では尿細管腔内での蛋白円柱の存在、ならびにメサンギウム基質の拡大が認められた(スライド２(H)) 。
本研究により podocyte における TSC2, PDK1 は糸球体機能維持に重要な役割を果たしていることが示唆された。今後、TSC2, PDK1 による糸球体機能破綻のより詳細な分子機序が解明されれば、糖尿病腎症の病態把握のみならず糖尿病腎症の新規治療法開発に結び付くことが期待される。

課題番号：23指104

研究課題名：腎糸球体におけるインスリンシグナル伝達系、ならびに糖尿病腎症の発症・進展に及ぼすAGE-AGE受容体(RAGE)の作用の検討

主任研究者名 ：鏑木康志
分担研究者名 ：松本道宏

キーワード：糖尿病腎症、後期糖化反応生成物(Advanced Glycation Endproducts: AGE),
AGE 受容体(receptor for AGE: RAGE)

研究成果

：

糖尿病腎症は我が国における腎不全の原疾患の第一位であり、患者数は年々増加している
ものの、糖尿病腎症の発症・進展を防止する十分な治療法は確立されていない。近年、糖尿病における持続的な高血糖状態において促進的に形成される後期糖化反応生成物(AGE)は、骨格筋脂肪や脂肪細胞におけるインスリン(Ins)シグナル伝達系の障害を引き起こし、Ins 抵抗性の発症に関与することが明らかになりつつある(Unoki H et al., Curr Pharm Des, 2008)。
そこで糸球体上皮細胞(podocyte)における Ins シグナル伝達障害に対する AGE の作用、ならびに腎症発症との関連を in vivo の系で解析することを目的に podocyte 特異的 AGE 受容体(RAGE)トランスジェニックマウスを作製し、糖尿病腎症の発症、進展に関連する病理学的、生化学的解析を行った。
Podocyte 特異的に RAGE を発現するトランスジェニックマウスを作製する目的で podocin
プロモーターを有するマウス RAGE 遺伝子発現ベクターを構築し、podocyte 特異的に RAGE を過剰発現するトランスジェニック(PodRAGE Tg)マウスの作製を行った(スライド３(A))。約400 個の C57BL/6J マウス受精卵に遺伝子コンストラクトを注入し、それらを仮親マウスの卵管内に移植して出産させた結果、雄 2 匹、雌 2 匹の founder4 系統が得られた。このうち 2 系
統(B252 系統, B313 系統)が自然交配可能であったため繁殖し解析を行った。磁気ビーズを用いた灌流法により PodRAGE Tg(B252 系統)より腎糸球体を単離し、腎糸球体における RAGE mRNA
発現量を real-time PCR により検討した。PodRAGE Tg 腎糸球体における RAGE mRNA 発現量は
対照 C57BL/6J マウスに比べ有意に上昇していた(スライド３(B))。なお、PodRAGE Tg マウス(B252 系統)、PodRAGE Tg マウス(B313 系統)からの単離糸球体における RAGE mRNA レベルは両系統間で発現差異を認めなかった。
PodRAGE Tg マウスはメンデルの法則に従って生まれ、外観上顕著な異常は観察されていな
い。6 週齢における PodRAGE Tg マウス, 対照 C57BL/6J マウスの体重、随時血糖、絶食時血清インスリン値は両群間で有意差を認めなかった(スライド３(C)-(E))。また、PodRAGE Tg
マウス、対照 C57BL/6J マウスの尿中アルブミン・クレアチニン比も両群間で有意差を認めず、
これは、PodRAGE Tg マウスの血糖値、ならびに血中後期糖化産物(AGE)濃度が対照マウスと同程度であるため、AGE 受容体である RAGE が podocyte で過剰発現していても podocyte や腎臓の機能には大きな影響を及ぼさないためであると考えられた。そこで 8 週齢 PodRAGE Tg マ
ウス、対照 C57BL/6J マウスそれぞれにストレプトゾトシンを投与し、ストレプトゾトシン誘発糖尿病における腎機能の変化を解析した。ストレプトゾトシン投与 4 週後の PodRAGE Tg マ
ウス、対照 C57BL/6J マウス血糖値はそれぞれ 417±71 mg/dL、390±153 mg/dL、ストレプト
ゾトシン投与 8 週後の PodRAGE Tg マウス、対照 C57BL/6J マウス血糖値はそれぞれ 420±84
mg/dL、448±32mg/dL であり、いずれの週齢でも両群間での有意な差は認められなかった。
また、ストレプトゾトシン投与 4～8 週後の PodRAGE Tg マウス、対照 C57BL/6J マウス体重も両群間で有意な差は認められなかった。一方、PodRAGE Tg マウスの尿中アルブミン・クレア
チニン比はストレプトゾトシン投与 4 週後、8 週後のいずれも対照 C57BL/6J マウスに比べ有意な高値を示した(スライド３(F))。PodRAGE Tg マウスの光顕による病理学的所見では、対照 C57BL/6J マウスに比べて腎糸球体領域における軽度のメサンギウム基質の拡大が認められた。
本研究により podocyte における RAGE の発現上昇は糸球体上皮細胞のバリア機能障害を引き起こし、糖尿病腎症の病態を増悪化させることが示唆された。今後、RAGE 発現上昇による糸球体機能破綻のより詳細な分子機序が解明されれば、糖尿病腎症の病態把握のみならず糖尿病腎症の新規治療法開発に結び付くことが期待される。

課題番号：23指104
研究課題名：Podocyte前駆細胞補充療法による糖尿病性腎症治療の試み
主任研究者名 ：鏑木 康志
分担研究者名 ：浜崎 辰夫
キーワード
研究成果
１.研究目的：糸球体上皮細胞、 脂肪前駆細胞、移植、糸球体腎炎モデルマウス：

糸球体上皮細胞(podocyte)の補充療法が糖尿病腎症治療に有効かを検証する目的で、Osr1、WT1 をはじめとする podocyte 分化に関与する遺伝子を高発現した脂肪前駆細胞を作製する。
さらにこの細胞を糸球体上皮細胞へと培養系で誘導し、これを糖尿病腎症モデルマウスに移植することで、podocyte 前駆細胞補充の糖尿病腎症治療としての可能性を検討する。
２．研究方法脂肪組織由来間葉系幹細胞（ASC）から podocyte 前駆細胞へ分化誘導する方法の確立
Podocyte 前駆細胞を作製するために、podocyte 前駆細胞の分化に必要な遺伝子を有しMultipotency な細胞である ASC を用いた。GFP 遺伝子を導入した成体 BALB/c トランスジェニ
ックマウスから皮下脂肪を採取し、コラゲナーゼ処理により得られた ASC 細胞に、腎臓の初期発生過程において重要な遺伝子である Osr1 および糸球体、podocyte 等の発生に重要な遺伝子である WT1 を導入した。10 日間培養し、細胞の形態変化および腎構成細胞への分化を示す Wnt4、Six2、Foxc2 と Podxl 等の遺伝子発現変化を調べた。
Adriamycin による糸球体腎炎モデルマウスの作製
糖尿病腎症モデル動物の作製にあたり現在までに報告されている種々のモデル動物を検討した結果、adriamycin 投与による糸球体腎炎モデルマウスが安価かつ簡単に作成できると考え、BALB/c マウスへの adriamycin 投与による糸球体腎炎モデルマウスの作製を試みた。
BALB/c マウスに対して一匹当たりに 5mg/ kg body weight、10mg/ kg body weight および 20mg/
kg body weight の adriamycin を尾静脈に注射したのち、マウスの体重、ならびに Bradford
Assay にて尿タンパク質量の経時変化を観察した。さらに adriamycin 投与後のマウスより腎臓を採取し、光顕による病理学的評価を行った。対照マウス群には PBS 投与を行った。
糸球体腎炎マウスへの間葉系幹細胞移植効果の検討
GFP 遺伝子トランスジェニックマウスより調製した ASC に Osr1/WT1 遺伝子を導入後、adriamycin 投与した糸球体腎炎モデルマウスに ASC を尾静脈より投与した。対照マウス群には尾静脈より PBS 投与を行った。細胞移植後、両群のマウスの体重と尿タンパク量の推移を計測するとともに、マウス腎臓の組織学的解析を行い、ASC 投与の影響を検討した。
３．研究結果脂肪組織由来間葉系幹細胞から podocyte 前駆細胞へ分化誘導する方法の確立
ASC に Osr1、あるいは WT1 のいずれかを単独導入、および同時導入したのち、DMEM/FBS 培
地で一週間培養して細胞の変化を観察したところ、Osr1、ならびに Osr1/WT1 を導入した ASC
では一部細胞の形態がより上皮細胞様な形態に変化した(スライド４、上段)。また、遺伝子導入された細胞から腎構成細胞への分化を示す Wnt4、Six2、Foxc2 と Podxl 等の遺伝子発現が検出された(スライド 4、下段)。
遺伝子導入された ASC を細胞移植に用いるタイミングを検討するために、Osr1 または
Osr1/WT1 を導入した ASC の状態と性質をより詳しく解析した。ASC に遺伝子を導入した 30 分、
24 時間、72 時間、7 日、14 日後に Nephrin、Podxl、Foxc2、Pax2、Lmx1、Wnt4、Six2、CD24、
CD133、CDH11 発現を解析したところ、Pax2 と Lmx1、Wnt4、Nephrin、Foxc2 は Osr1 またはOsr1/WT1 導入 24 時間以降から発現が検出され、3～7 日目までに発現がピークに達した後に14 日目で発現が低下した。CD133 の発現は遺伝子導入後 3 日目でピークに達したあと 7 日目から低下した。CD24 および CDH11 は採取したいずれの時期でも発現が検出された。また、Pax2と Lmx1、Wnt4、Nephrin、Foxc2 の発現は Osr1/WT1 導入細胞に比べ Osr1 導入細胞で発現が強かった。これらの結果から、Osr1/WT1 遺伝子導入 3 日後の ASC が podocyte 前駆細胞の特性にもっとも類似し細胞移植に適していると判断した。
Adriamycin による糸球体腎炎モデルマウスの作製
BALB/c マウスに対して一匹当たりに 5 mg/kg body weight、10mg/kg body weight および20mg/kg body weight の adriamycin を尾静脈に注射したのち、マウスの体重及び尿タンパク
質量を経時的に計測した。5mg/kg body weight および 10mg/kg body weight adriamycin を投与した BALB/c マウス群では、対照 BALB/c マウス群に比べて体重の減少、および尿中タン
パク質量の増加が認められた。また、腎臓の病理学的解析から adriamycin 投与 BALB/c マウ
ス群では腎糸球体のメサンギウム領域の拡大が認められた。なお、20mg/kg body weigh のadriamycin 投与群では一部のマウスが死亡した。
糸球体腎炎マウスへの間葉系幹細胞移植効果の検討
Osr1/WT1 遺伝子導入による ASC から podocyte 前駆細胞への誘導と糸球体腎炎モデルマウスの確立に成功したため、Osr1/WT1 遺伝子を導入した ASC および遺伝子導入を行っていない
ASC を 10mg/ kg body weight の adriamycin 投与マウスの尾静脈に注入し、移植された細胞の腎臓への生着率および尿中タンパク質量の変化を検討した。Osr1/WT1-ASC および ASC を移植したマウス群では、非細胞投与マウス群に比べて尿中タンパク量の低下が認められた。ところが、細胞を移植したマウス腎臓の組織学的解析では GFP 発現 ASC の局在は腎組織内にはほとんど認められなかった。さらに ASC の腎組織内への生着率を検討するために、
Osr1/WT1-ASC および ASC を adriamycin 腎症モデルマウスの尾静脈および腎皮膜下に注入し、一週間後マウスの腎臓を摘出して GFP 発現細胞の局在を検討した。Osr1/WT1-ASC および ASC
投与マウスの腎組織内では GFP の発現はごく僅かしか検出されず、移植された細胞の腎組織内への定着はほとんど認められなかった。また、より重症度の高い糸球体腎炎マウスとして15mg/ kg body weight の adriamycin を投与した BALB/c マウス群を作製し、Osr1/WT1-ASC
および ASC を投与しても腎組織内への定着はほとんど観察されなかった。
４．考察とまとめASC への Osr1/WT1 遺伝子導入により podocyte 分化に関与する遺伝子群の発現と上皮細胞様の形態変化が引き起こされ、podocyte 前駆細胞への誘導が可能となった。しかしながら、
Osr1/WT1-ASC を用いた糸球体腎炎モデルマウスへの細胞移植実験の結果からは podocyte 前駆細胞としての分化は不完全であった。遺伝子導入する際にメチル化を抑制し epigenetic な変化を促す方法や、Osr1/WT1 のような podocyte 前駆細胞分化の初期に関与する遺伝子のみ
ならず podocyte 前駆細胞の分化に関与する遺伝子群を追加導入することにより podocyte 前駆細胞への分化誘導効率を高める工夫が必要とされる。
糸球体腎炎モデルマウス腎組織における移植細胞のホーミング効果が低いことについては、
adriamycin が投与されたマウスにおいては腎臓以外の部位で炎症が起き、移植された ASC が腎臓以外の部位に誘導されたため、腎臓への定着が相対的に低かった可能性が考えられる。
また、作製した adriamycin 腎症モデルマウスでは尿タンパクの出現が認められるものの腎障害の程度が低いため、移植した細胞に対するホーミング誘導効果が十分ではなかった可能性も考えられる。細胞誘導療法をより確実に評価するためには、腎障害モデルの作製法も今後改善する余地がある。