第十八改正日本薬局方（令和3年6月7日 厚生労働省告示）〈蛍光染色による細菌数の迅速測定法〉

参考情報

(ⅲ)

TE緩衝液：pH 8.0の1 mol/Lトリス緩衝液1.0 mLに0.5( )mol/Lエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム試液0.2 mL
被検菌処理液：ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニ

ルエーテルを1 vol％含むTE緩衝液を小分けし，凍結保存する．
(ⅴ)

PCR反応液10倍緩衝液*dNTP溶液**(各2.5 mmol/L)

5 μL

10 μmol/Lセンスプライマー

1 μL

4 μL

10 μmol/Lアンチセンスプライマー

1 μL

耐熱性DNAポリメラーゼ(1 U/μL)

1 μL

水

36 μL

微生物関連

2601 .

PCR用プライマー

微生物 プライマー 塩基配列
5′-GTTTGATCCTGGCTCA-3′
細菌
10F
800R
5′-TACCAGGGTATCTAATCC-3′800F5′-GGATTAGATACCCTGGTA-3′
1500R
5′-TACCTTGTTACGACTT-3′
真菌 ITS1F
5′-GTAACAAGGT(T/C)TCCGT-3′
ITS1R
5′-CGTTCTTCATCGATG-3′を加えた後，水を加えて100 mLとする．
(ⅳ)

G4.

( )

ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル

本品は微黄色の粘性の液体である．

蛍光染色による細菌数の迅速測定法〈G4-8-*10倍緩衝液152〉

2－アミノ－2－ヒドロキシメチル－1,3－プロパンジオール・塩酸(pH 8.4)

100 mmol/L

塩化カリウム500 mmol/L

塩化マグネシウム

20 mmol/L

ゼラチン

0.1 g/L

本法は，蛍光染色を基本として，生理活性を持つ細菌を迅速に計数する手法を示す．生菌数の測定には，カンテン培地上で培養する方法が広く用いられている．しかし，環境中には増殖能を有しながらも通常の手法では培養困難な細菌が多く存在す**dNTP溶液(dGTP，dATP，dCTP，dTTPの等モル混合液)ることから，蛍光又は発光などにより細菌を捉える新たな細菌

dGTP(2′ －デオキシグアノシン5′ －ト検出法が開発されている．蛍光染色法では，蛍光色素で染色しリフォスフェート，ナトリウム塩)
dATP(2′ －デオキシアデノシン5′ －ト

2.5 mmol/L

リフォスフェート，ナトリウム塩)
dCTP(2′－デオキシシチジン5′－トリ2.5 mmol/L

フォスフェート，ナトリウム塩)
dTTP(2′－デオキシチミジン5′－トリ2.5 mmol/L

フォスフェート，ナトリウム塩)

2.5 mmol/L

なお，これらの成分を有する適当な製品を記載に従って(ⅵ)

た細菌を，蛍光顕微鏡やフローサイトメーターなど，蛍光シグナルを検出する種々の装置により計数する．また，染色剤を選択することにより，死菌を含めた全細菌から種々の生理活性を有する細菌まで，計数することができる．DNAやRNAに結合する核酸染色剤を用いて細菌を計数する方法は，蛍光染色法の中でも最も基本となるものであり，細菌の生死にかかわらず核酸を持つ全ての細胞を対象とする．蛍光活性染色法は，細菌の呼吸活性や細菌細胞内に普遍的に存在するエステラーゼの活性用いてもよい．などを指標とする．マイクロコロニー法ではコロニー形成の初シークエンシング試薬期段階であるマイクロコロニーを計数する．以下に，CFDA-シークエンシング方式には，プライマーを標識するダイプラ

DAPI二重染色法とマイクロコロニー法を示す．なおここに示イマー(dye-primer)法，dNTPターミネーターを標識するダイした方法は，迅速・高精度に生理活性を持つ細菌数を測定するターミネーター(dye-terminator)法など，種々の方法がある．

ための手法であり，生菌とする基準がほかの方法と異なるため，DNA自動解析装置やプログラムに合った適切な試薬キットを測定値はほかの生菌数測定法よりも高くなることが多い．本法使用する．に示した方法は，実施者の経験などによって変更可能である．

(ⅶ)

すなわち，本法に示した以外の試薬，器具，装置も合理性があTAE緩衝液，50倍濃縮

2－アミノ－2－ヒドロキシメチル－1,3－プロパンジオール
242 gに酢酸(100) 57.1 mL，0.5 mol/Lエチレンジアミン四酢
酸二水素二ナトリウム試液100 mL及び水を加えて溶かし，れば使用可能である．
1.

CFDA-DAPI二重染色法

エ ス テ ラ ー ゼ 活 性 を 持 つ 細 菌 の 検 出 に は fluorescein

1000 mLとする．

diacetate (FDA)系試薬が一般的に用いられる．FDA系試薬は(ⅷ)

細胞内のエステラーゼによって加水分解され，波長490 nm付

1倍TAE緩衝液

用時，50倍濃縮TAE緩衝液を水で50倍に希釈する．
(ⅸ)

アガロースゲルアガロース1.5 gに50倍濃縮TAE緩衝液2.0 mL，臭化エチジ

近の青色励起光下で緑色蛍光を発する．なおFDAはグラム陰性菌に対する染色性が低いため，その修飾体である

ウム(3,8-diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide)carboxyfluorescein diacetate (CFDA)などが利用されている．
核酸染色剤4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)を併用した溶液(1→100) 10 μL，及び水100 mLを加えて加熱して溶かし

CFDA-DAPI二重染色法の原理は以下のとおりである．無極性た後，60℃に冷却する．のCFDAは細胞内に浸透し，細胞内のエステラーゼにより蛍光(ⅹ)

性 の carboxyfluorescein に 加 水 分 解 さ れ る ． こ のローディング緩衝液，6倍濃縮

ブロモフェノールブルー0.25 g，キシレンシアノールFF

carboxyfluoresceinは極性を持つために生細胞内に蓄積される．

0.25 g及びエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和

したがって，エステラーゼ活性を持つ細胞に青色励起光を照射物1.63 gを水50 mLに溶かし，グリセリン30 mLを加え，水をした場合，carboxyfluorescein由来の緑色蛍光を発する．死細加えて100 mLとする．

胞 で は CFDA は 加 水 分 解 さ れ な い た め に ， 蛍 光 性 のcarboxyfluoresceinは生じない．一方DAPIは生菌・死菌の両2602 参考情報 G4. 微生物関連

細胞内に浸透し，DNAのアデニン及びチミンが豊富な部分にロメーターで測定しておく．また，計数にあたっては1視野当特異的に結合するために，DNAを持つ全ての細菌が染色され，たり10 ～ 100細胞程度になるようにろ過量を調節する．した

紫外線励起光下で青色蛍光を発する．したがって，本二重染色がって，1視野当たりの細胞数が多すぎる，又は少なすぎる場法により，青色励起光下ではエステラーゼ活性を持つ細菌のみ

合は試料の再調製を行う．(1視野当たりの平均細胞数が2個以を特異的に計数でき，また紫外線励起光下では全菌数(生菌数下の場合，又は1視野当たりの細胞数が0個の視野が5視野以上＋死菌数)を測定できるので，エステラーゼ活性を持つ細菌及ある場合は，検出限界以下とする．)

びDNAを持つ全ての細菌を計数することが可能となる．
1.1. 装置1.1.1.

蛍光顕微鏡又はこれに準ずる蛍光観察装置

菌数(cells/mL)＝{(1視野当たりの細菌数の平均値) × (ろ過面積)}／{(ろ過量) × (検鏡面積)}

蛍光染色した細菌を計数するための装置で，種々の機種がある．使用する蛍光染色剤に応じた適切なフィルター系を用意す

1.4. 試薬・試液

る．蛍光顕微鏡，レーザー顕微鏡，フローサイトメーターなど，(ⅰ)

各種の蛍光観察装置がある．

した後，121℃で15分間高圧蒸気滅菌する．注射用水を用いて1.2. 器具も良い．

(ⅰ)

ろ過装置(ファンネル，吸引フラスコ，吸引ポンプ)

(ⅱ)

(ⅱ )

ポ リ カ ー ボ ネ ー ト 製メン ブ ラ ン フィル タ ー (孔 径 0.2

ホキシドに溶かし，5 mLとする．遮光下，－20℃で保存する．

無菌水：水を孔径0.2 μmのメンブランフィルターでろ過

CFDA溶液，10 mg/mL：CFDA 50 mgをジメチルスルμm)：粒子を表面で捕集できるフィルターであればポリカーボ(ⅲ)

ネート製でなくても良い．

チレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム試液0.5 mL及び薄CFDA染色用緩衝液：塩化ナトリウム5 gに0.1 mol/Lエ(ⅲ)

スライドガラス

めたリン酸水素二ナトリウム試液(1→3)を加えて溶かし，100(ⅳ)

カバーガラスmLとする．この液にリン酸二水素ナトリウム二水和物溶液(ⅴ)

計数用接眼マイクロメーター(10×10のマス目を区切っ(1→64)を加えてpH 8.5に調整する．孔径0.2 μmのメンブランたもの)

フィルターでろ過する．

1.3. 操作法(ⅳ)

以下に，蛍光顕微鏡による測定法の一例を示す．
1.3.1.

試料の調製

細菌が，液体(水又は緩衝液)に均一に分散した状態となるよ
うに試料を調製する．
1.3.2.

ろ過

DAPI溶液，10 μg/mL：DAPI 10 mgを無菌水100 mLに溶かす．無菌水で10倍希釈して，孔径0.2 μmのメンブランフィルターでろ過する．遮光下，4℃で保存する．
(ⅴ)

蛍光顕微鏡用イマージョンオイル

2.

マイクロコロニー法

コロニー形成の初期段階であるマイクロコロニーを蛍光染色

ろ過装置のファンネルにポリカーボネート製メンブランフィし，蛍光顕微鏡などで観察・計数することにより，増殖能を持ルター(孔径0.2 μm)をセットする．適当量の試料をろ過し，試つ細菌数を短時間の培養で測定することができる．本法ではメ料中の細菌をフィルター上に捕集する．

ンブランフィルター上に細菌を捕集し，そのメンブランフィル

1.3.3.

ターを培地上に静置し短時間培養した後，マイクロコロニーを染色

CFDAを終濃度150 μg/mL及びDAPIを終濃度1 μg/mLとな計数する．肉眼で確認できる前段階のコロニーを検出するため，るように混合したCFDA染色用緩衝液適量を，ろ過装置のファ増殖能力を持つ細菌を迅速かつ高精度に計数することができる．

ンネルに注ぎ，約3分間，室温で染色した後，吸引ろ過する．

マイクロコロニーの染色には，種々の核酸染色剤を用いること

ファンネルに無菌水を適量注ぎ，吸引ろ過し，フィルターに残ができる．

った余分な蛍光染色剤を除く．フィルターを十分に乾燥させる．

2.1. 装置

1.3.4.

2.1.1.

プレパラートの作製

蛍光顕微鏡又はこれに準ずる蛍光観察装置

スライドガラスに蛍光顕微鏡用イマージョンオイルを1滴落蛍光染色した細菌を計数するための装置で，種々の機種があとす．その上に風乾したフィルターをろ過面を上にして置く．

る．使用する蛍光染色剤に応じた適切なフィルター系を用意す

その上に蛍光顕微鏡用イマージョンオイルを1滴滴下し，カバる．蛍光顕微鏡，レーザー顕微鏡など，各種の蛍光観察装置がーガラスを被せてフィルターを封入する．油浸対物レンズを用ある．

いる場合は，カバーガラスの上に更に蛍光顕微鏡用イマージョ

2.2. 器具

ンオイルを1滴滴下する．

(ⅰ)

ろ過装置(ファンネル，吸引フラスコ，吸引ポンプ)

1.3.5.

(ⅱ)

ポリカーボネート製メンブランフィルター(孔径0.2 μm計数

蛍光顕微鏡下で1000倍の倍率で観察・計数する．CFDA-以下)：粒子を表面で捕集できるフィルターであればポリカーDAPI二重染色の場合は，紫外線励起光による退色を防ぐためボネート製でなくても良い．に，まず青色励起光下で緑色蛍光を発する(エステラーゼ活性(ⅲ)

スライドガラスを持つ)細菌を計数した後，同一視野について紫外線励起光下(ⅳ)

カバーガラスで青色蛍光を発する(DNAを持つ)細菌を計数する．蛍光顕微鏡(ⅴ)

ろ紙(No.2)の接眼マイクロメーターの計100マス内に観察される蛍光染色(ⅵ)

計数用接眼マイクロメーター(10×10のマス目を区切っ剤由来の蛍光を発する細菌について，無作為に視野を選んでたもの)

20視野以上計数し，以下の式に従って細菌数を算出する．な2.3. 操作法

お，検鏡面積はあらかじめ接眼マイクロメーターと対物マイク

以下に，蛍光顕微鏡による測定法の一例を示す．