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領域特異的な新規遺伝子改変技術の開発
水谷 健（基礎生物学研究所技術課）

MIZUTANI Takeshi : Development of a new method for region-specific gene modification
1. 目的

特定遺伝子の DNA に変異を導入するノックアウ

近年次世代シーケンス技術の急速な発展により、網ト法を開発するにあたり、明確な表現型を示すマーカ

羅的な比較トランスクリプトーム解析があらゆる生物

ー遺伝子の選出が必須である。所属研究室では、領域で可能となった。その結果、特定の生命現象を制御す特異的 RNAi 法の開発過程で、外骨格の着色に重要なる遺伝子の推定 (候補遺伝子) が格段に容易になった。

機能を有する遺伝子 (RNAi により体色が黒から赤茶さらに、全身性 RNAi や CRISPR/Cas9 を利用したゲ色に変化) が有用なマーカー遺伝子であることを見出

ノム編集等の遺伝子機能解析法を活用することで、従した。この遺伝子を活用して技術開発を進めた。また来の非モデル昆虫において、次々と候補遺伝子の機能ネガティブコントロールには GFP 遺伝子を選択した。

解明が進められてきている。しかし、これらの機能解析法では、発生過程で致死となる遺伝子の機能解析が(2) 領域特異的なゲノム編集できないことが問題となっている。これを克服するた

カブトムシ終齢幼虫に、ゲル化することで体内でのめに昨年度は、非モデル昆虫であるカブトムシ拡散を防ぎ、その濃縮状態を保つことが可能なトラン

Trypoxylus dichotomus において、局所組織におけるスフェクション試薬に内包された RNP (リボヌクレ

RNAi 法 (領域特異的 RNAi 法) を開発し、致死性回避オタンパク質) をインジェクションし、成虫での表現につながる基盤技術を整えた。本年度は、本技術を応型を解析することで遺伝子ノックアウトの成否を評価用した新たな領域特異的ゲノム編集技術の開発に取りした。トランスフェクション試薬は、株式会社高研よ組んだ。

り提供を受けた。Cas9 タンパク質は、Cas9 (IDT 社) および細胞透過性ペプチド (CPP) を付加した CPP-Cas9

2. 方法(所属研究室の安藤助教が作製) を使用した。ガイド

昨年度開発した領域特異的 RNAi 法では、注入試薬RNA (gRNA) の デ ザ イ ン は 、 Web ツ ー ル のの体内での拡散を防ぐと同時に、試薬の濃縮状態を保CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) を 用 い た 。

つ働きを持つトランスフェクション試薬を用いて二本gRNA を合成するために、遺伝子特異的な標的配列に鎖 RNA (dsRNA) の局所導入に成功した。本年度は、

T7 プロモーター配列を付加した dsDNA を鋳型とし、この手法を応用した、領域特異的ゲノム編集技術 (ノAmpliScribe T7-Flash Transcription Kit (Lucigen) を用いックアウト法) の開発に取り組んだ。ゲノム編集ツーて RNA への転写を行うことで gRNA を調製した。

ルとして CRISPR/Cas9 に着目し、ゲノム編集に必要それぞれ終濃度を Cas9 が 1 µg/µl、gRNA が 0.5な RNA/タンパク質複合体 (RNP) の局所組織への導µg/µl となるよう混合し、室温で 10〜20 分インキュベ入を目指した。この手法は、転写・翻訳が不要なため、ートすることで RNP を得た。RNP は比較的安定して短時間で効率よくゲノム編集ができる。また RNP はいる為、数日なら 4 ℃、長期なら -80 ℃保管可能であ細胞内で迅速に分解されるため、オフターゲット変異る。
氷上のエッペンチューブに、トランスフェクションの減少が期待できる。

試薬：トランスフェクションバッファー：RNP 溶液＝4.5：4.5：1 の比率で溶液を入れタッピングで混和、ロ(1) モデル昆虫とマーカー遺伝子モデル昆虫には入手が容易であり、低温飼育法によータリーミキサーで 12 rpm, 10 min, 4 ℃ でさらに混り一年中実験に使用可能で、体サイズが大きく領域特和後、10,000 rpm, 1 min, 4 ℃ でスピンダウンし、50 µl異的な解析が容易に行えると考えられる、カブトムシ(RNP 量は、100 pmol または 50 pmol) を標的領域にTrypoxylus dichotomus を使用した。

インジェクションした。

生物学・生理学技研報 202246

CRISPR/Cas9、CPP-CRISPR/Cas9 のいずれでも標的領
3. 結果

域での欠失があり、CPP-CRISPR/Cas9 ではフレームシ羽化したカブトムシ成虫の表現型を確認した。

フトが生じていた (図 2)。

CRISPR/Cas9 を用いた個体では、やや赤茶色に見えるが明瞭な表現型は見られなかった。これに対し CPPCRISPR/Cas9 を用いた個体では、明確に標的領域を含む領域が赤茶色となる表現型があらわれた (図 1)。

CPP-CRISPR/Cas9
CPP-CRISPR/Cas9
CRISPER/Cas9

CRISPR/Cas9

図 2. Amplicon-Seq による欠失の確認

4. 考察
領域特異的な RNAi 技術を応用することにより、
GFP

マーカー

CRISPR/Cas9 法を利用した領域特異的な遺伝子ノックアウト法の開発を試みた結果、目的とする表現型を持つ個体を得ることに成功した。細胞透過性ペプチドを付加した Cas9 (CPP-Cas9) を使用することで、ノッCPP-CRISPR/Cas9クアウト効率が上昇した。これにより、これまで遺伝子機能解析が困難であった、発生過程で致死となる遺伝子に対しても、領域特異的なノックアウトによって致死を回避して機能解析が可能になった。領域特異的GFP

マーカー

RNAi と同様に、この手法は、特殊な技術を必要としないため、他の生物への応用も期待される。今後はこの技術を応用して、CRISPR/Cas9 法による領域特異的なノックインの技術開発を行うことを予定している。

図 1. 成虫外骨格の表現型

謝辞
カブトムシ幼虫に対する領域特異的 RNAi では、本研究を行うに当たり基礎生物学研究所進化発生研

dsRNA をインジェクションした場合、43 匹中 24 匹究部門の皆様にご指導いただきましたことを感謝申しが、明確に領域特異的に外骨格が赤茶色になった。今上げます。本研究は JSPS 科研費 21H04157 の助成を受

回カブトムシ幼虫 2 匹に 50 pmol または 100 pmol

けて行いました。

RNP をインジェクションしたが、CPP-CRISPR/Cas9で、50 pmol、100 pmol ともに 1 匹に明確な領域特異

参考文献的な効果が確認できた。
（表 1）。

1) 水谷 健 (2021） 領域特異的な新規遺伝子機能解析法の開発． 生物学技術研究会報告 第 32 号 生理学

CRISPR/Cas9(50 pmol, 100 pmol)

標的遺伝子

GFP

マーカー

n24

領域特異的な効果
00(わずかに効果を示した)

CPP-CRISPR/Cas9(50 pmol, 100 pmol)

GFP

2402dsRNA (5 µg)

GFP

1543024マーカーマーカー(50 pmol, 100 pmol 各1個体)

技術研究会報告 第 43 号 ：58-592) Gagnon JA, et al. (2014) Efficient Mutagenesis by Cas9Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale
Assessment of Single-Guide RNAs. PLOS ONE 9: e98186.

(残り19 個体は全身に効果が及んだ)

表 1 成虫外骨格の表現型

3) Ramakrishna S, et al. (2014) Gene disruption by cellpenetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein andguide RNA. Genome Res. 24:1020–1027.

インジェクションした幼虫を解剖し、標的領域からゲノム抽出を行って Amplicon-Seq によって標的領域の欠失を確認した。予備的なデータではあるが、47

生物学・生理学技研報 2022