宮城教育大学環境教育研究紀要

第７巻 (2004)

湖沼の富栄養化状態の把握を目的としたクロロフィルの定量―蛍光光度計の試作とその利用―
村松

隆 *・早坂智恵 **・安達菜央 ***Quantitative Analysis of Chlorophyll Aimed for the Grasp of Lake's Eutrophication- Utilization of Hand-Made Fluorophotometer Takashi MURAMATSU, Chie HAYASAKA and Nao ADACHI
要旨 : 水中の植物性プランクトン量を指標するクロロフィルを定量するための蛍光光度計を試作した。クロロフィルの励起光源として紫外発光ダイオードを、クロロフィル蛍光検出器としてフォトトランジスターを用いた。試作した蛍光光度計は、簡単な操作でクロロフィルを精度よく分析でき、湖沼生態系の活動度や富栄養化状態の理解を目的とした環境教育教材に活用できることが確かめられた。
キーワード : 水質調査

富栄養化

クロロフィル蛍光光度法

幅の狭い光を利用するのが一般的である。以前は適当

１．はじめに湖沼生態系の活動度や水の富栄養化状態を探るためな光源を安価に入手することが困難であったが、最近の水質指標として、溶存酸素、ｐ H、生物化学的酸素になって、強い発光特性を有する青色発光ダイオード

要求量、窒素態、リン態、クロロフィルなどが知られや紫外発光ダイオードなども安価に入手できるようにている。特に、クロロフィルは、水中のらん藻類や緑なった。安価な青色発光ダイオードを用いた化学実験

藻類などに由来することから、学校における水辺の生

１）教材も報告されている。

物調査との関係も深く、環境学習活動にも役立つ水質

著者らは、入手可能な発光ダイオードの中で、クロ指標と考えられる。しかし、湖沼や河川などから抽出ロフィル蛍光が比較的強く現れる紫外発光ダイオード

されるクロロフィル溶液は希薄で、比色分析を行うに（発光ピーク波長 395n）を励起光源に用い、また、蛍は多量の試料水から植物性プランクトンを捕集しなけ光波長領域に高い感度をもったフォトトランジスターればならず能率的でない。一般に、微量なクロロフィを検出器に用いて簡易な蛍光光度計を試作した。ここ

ルの定量には蛍光法が用いられるが、市販の蛍光分析

では、試作した蛍光光度計の性能と、これを用いた環装置は高価であり、学校の生徒実験に利用できる状況

境分析実験への利用について述べる。にはなっていない。
蛍光法では、植物性プランクトンから抽出したクロロフィル溶液に光を照射し、クロロフィルから発する

２．クロロフィル蛍光光度計
１）装置の製作

赤色蛍光を測定し、蛍光強度からクロロフィル濃度を湖沼の植物性プランクトンに含まれる主要な光合成算出する。吸光光度法に比べて高感度であり精度の高色素はクロロフィル a とクロロフィル b であるが、クい定量分析が行えるなどの利点がある。クロロフィ

ロロフィル b の含有率はクロロフィルａの含有率に比ル蛍光を測定するためには、クロロフィルを励起すべて低い。いずれの色素も、近紫外領域から青色可るための光源として、青色可視領域のできるだけ波長視領域の光を吸収し、赤色の蛍光（発光ピーク波長：＊

宮城教育大学環境教育実践研究センター , ＊＊宮城教育大学教育学部 , ＊＊＊宮城県立伊具高等学校－84 －湖沼の富栄養化状態の把握を目的としたクロロフィルの定量

ＥＤA

図１．試作蛍光光度計

ＢＣ660n m ～ 680n m 付近）を発する。通常の蛍光法では、試料水中に含まれる含有率の高いクロロフィル a の励

A:試料室（光源、検出器),B:定電圧回路起に適した 436nm の光を照射光源として用い、クロロ

C:電源（乾電池9V×4個),D:A Cアダプター(12V,1A) E:マイク

フィル a からの蛍光を計測することで、クロロフィル

ロアンメータ（MT-322C）

a の濃度を求めるのが一般的である。しかし、クロロ

図２．試作蛍光光度計の内部

フィル b の含有量の増加に伴って、クロロフィルの定量結果に不確実さが生ずるので注意が必要である。蛍微弱な蛍光を増幅されるためのデバイス等は使用して光光度計の製作に際しては、励起光源として利用すいない。

る発光ダイオードの光学特性と、クロロフィル a とク
ロロフィル b の蛍光特性を十分把握しておく必要があ２) クロロフィルの蛍光特性る。

紫外発光ダイオードに加える電圧を変え、定量のた図１に試作した蛍光光度計の外観を、図２に試作めの測定条件を探索した。試験用の試料として、ペー装置の内部構造を示す。クロロフィル励起光源としパークロマトグラフ法（展開溶媒：石油ベンジン・アて２個の紫外発光ダイオード（ピーク波長 395nm, 5セトン

8:1 v / v）で、緑葉から分取したクロロフィ

Φ , SANDER SDL-5N3CUV-A 型）を、蛍光検出器として 570n m 以下の短波長カット硝子フィルター（東芝

ＧV O -57）を取り付けたフォトトランジスター（S H A R P
P T550F 型）を使用した。電源としては、室内測定用ＨＦに AC アダプター（12V 1A）を用い、定電圧回路を経由ＦＩして光源と検出器に電圧を供給した。また、乾電池（９V ４個）を屋外測定用電源として用い、切り替えて使Ｊ用できるようにした。クロロフィル蛍光は、フォトトランジスターに接続したディジタルマイクロアンメータ（MT マザーツールMT-322C 型）で読みとるようにＦ : 紫外発光ダイオード（SDL-5N3CUV-A 型）した。希薄なクロロフィル溶液について、できるだけＧ : フォトトランジスター（PT550F）

強い蛍光を計測する目的で、図３に示すように、セルＨ : 硝子フィルター（VO-57）（内径 10mm の円筒形 Pyrex 製吸光測定管）の両側に２Ｉ : セルホルダー（外径 15mm）個の紫外発光ダイオード (F) をとりつけ、励起光路に

Ｊ : 黒色アクリル板（50mm × 70mm）

対して直角方向のセルの側面にフォトトランジスター

図３．試料室（光源、検出器）の構成（G）を固定した。散乱光を除去するためのスリットや（上部投影図）－85 －宮城教育大学環境教育研究紀要2)
ルａとクロロフィル b の D M F 溶液を用いた。
それぞ200180

れのクロロフィル濃度は、可視吸収スペクトル測定に度の希釈溶液列をつくり、これを標準溶液として試験に用いた。
図 4 と図 5 は、それぞれクロロフィルａとクロロフィ

160
蛍光強度 (μA）

3)
より吸光係数値を用いて算出した。
４段階の既知濃第７巻 (2004)

1401201008060

ル b の蛍光強度の濃度変化を示したものである。いず40れの場合も、発光ダイオード（規格最大電圧 4V）に20加える電圧が規格上限値に近いほど強い蛍光が観測さ00れる。クロロフィルの紫外線分解を避ける目的で検討

204060 80 100 120 140 160 180 200
クロロフィルａ濃度 ( μg/L)

したが、試作装置では数分間光を照射し続けても蛍光強度の変化は認められなかった。高感度測定には、可発光ダイオード加電圧

能な限り紫外発光ダイオードに加える電圧を高くし―■― : 3.3V, ―●― : 3.6V, ―▲― : 3.9V

た方がよいことから、測定条件として許容上限値に近

図４．クロロフィル a 溶液の蛍光強度と濃度との関係

い 3.9V にすることとした。図４，図５から、約 200μg / L 以下の希薄溶液では、クロロフィル蛍光強度が25濃度の増加に伴って直線的に増加していくことが分かる。また、紫外発光ダイオードの加電圧を 3.9V とル b の蛍光強度に比べて 6.7 倍強く観測され、クロロフィルａに対して感度の高い測定が可能であることが分かった。クロロフィル蛍光と濃度との関係は、クロロフィル a とクロロフィル b の蛍光強度（加電圧 3.9V

蛍光強度（μA）

した場合、クロロフィル a の蛍光強度は、クロロフィ

2015105の場合）をそれぞれ Fa、Fb とすると、（１）式と（２）0式で与えられる。

0204060 80 100 120 140 160 180 200
クロロフィルｂの濃度（μg/L）

クロロフィルａ ( μg/L) =1.01 × Fa（１）

光ダイオード加電圧

クロロフィルｂ ( μg/L) =0.15 × Fb（２）―■― : 3.3V, ―●― : 3.6V, ―▲― : 3.9V
図５．クロロフィル b 溶液の蛍光強度と濃度との関係

３）蛍光強度に及ぼすクロロフィル b の影響
湖沼の植物性プランクトンから抽出した試料溶液に仮に、緑葉の平均的な重量含有率（クロロフィル a :ついて蛍光を測定しクロロフフィル濃度を算出する場

クロロフィル b ～ 3 : 1）を試料水にあてはめてみ合は、（１）式を用いることになる。従って、試料溶

ると、（１）式と（２）式から、定量値に含まれるク液にクロロフィルｂが含有する場合には、クロロフィロロフィルｂに由来する不確実さはおよそ 5% と見積ルの定量結果に不確実さが生じるので、クロロフィル bもれる。環境水のクロロフィルの混合比が変化する場に由来する定量誤差を見積もっておく必要がある。淡合を想定し、クロロフィル定量誤差を 10% としても、水性の植物性プランクトンには、らん藻類、緑藻類、（１）式を用いて算出したクロロフィル濃度を富栄養紅藻類など種類も多く、水域の違いや季節によって化等の実態把握に利用することは十分可能である。

その存在量も異なる。しかし、クロロフィル全量に占めるクロロフィル b の割合はそれほど大きくはない。

－86 －湖沼の富栄養化状態の把握を目的としたクロロフィルの定量

４）フェオ色素の蛍光特性

200180湖沼や河川には、クロロフィルが一部酸化分解した160も含まれる。フェオ色素はクロロフィルと同様に紫外光を吸収し赤色蛍光を発する。フェオ色素とクロロ
フィルの固有蛍光強度（１μg あたりの蛍光強度に相当）

蛍光強度(μA)

フェオ色素（フェオフィチンとして報告されている）は、用いる励起光の波長によって異なる。通常の蛍光140120100806040法（例えば海洋法）では、436ｎｍの励起光を用いて20試料水の蛍光強度（F c h）を測定する。その後、セル

00に１滴程度の塩酸を加えて溶液中のクロロフィルを全204060 80 100 120 140 160 180 200
クロロフィルa濃度（μg/L)てフェオ色素に酸化分解し、再度、蛍光強度 (Fph) を―▲―：クロロフィルａ ,測定する。予め、クロロフィルとフェオ色素の固有蛍

図６．クロロフィルａとその酸化体（フェオ色素）の蛍光強度と濃度との関係

光強度を求め、F c h > > F p h の条件が成立すれば、それ―△―：フェオ色素ぞれの蛍光強度から、試料水中に含まれるフェオ色素30をクロロフィルと区別して定量することができる。
著者らは、クロロフィルａとクロロフィル b に由来すいてフェオ色素の濃度と蛍光強度との関係を調べた。
図６と図７に測定結果を示す。フェオ色素の蛍光強度はクロロフィルの種類と無関係に、それぞれのクロロ蛍光強度（μA）

るフェオ色素溶液をつくり、試作した蛍光光度計を用

25201510フィルの蛍光強度にほぼ一致していることが分かる。
5試作した蛍光光度計では、クロロフィルとそのフェオ色素の固有蛍光強度比（R）は、クロロフィルａとク00

ロロフィル b いずれも、R ～１ と近似できる。つまり、20406080100 120
クロロフィルb濃度（μg/L)

140160試作装置では、クロロフィルとフェオ色を区別できず、―▲―：混合比を求めることできない。試作装置を用いる場合

図７．クロロフィル b とその酸化体（フェオ色素）の蛍光強度と濃度との関係

は、フェオ色素を定量するための実験操作は不必要でクロロフィルｂ ,―△―：フェオ色素あり、試料水についてのみ蛍光測定を行うだけで、(1)式を用いてクロロフィル総量（クロロフィルとフェオランクトン量に相関（正の相関）し、水の富栄養化状色素の合計量）が算出されることになる。実際に、湖態の実態を表す指標として使用できるものである。③

沼の富栄養化状態を把握するのに、クロロフィルの酸淡水性の植物性プランクトンを対象とした測定では、化分解がどの程度進行しているかはあまり重要ではな

クロロフィル b の存在は、クロロフィル総量値に約く、クロロフィル総量が有効な指標値となる。

10% 以下の誤差を与える程度である。

以上の検討から、試作した蛍光光度計の特性として次のことが確かめられた。①クロロフィル励起用の光源として紫外発光ダイオード（発光ピーク波長395nm）を利用すれば、数μg/L 程度の希薄なクロロフィル溶液に対しても、赤色蛍光強度を感度よく計測できる。②試作した蛍光光度計では、クロロフィル総量を迅速に求めることができる。この総量値は、植物性プ－87 －宮城教育大学環境教育研究紀要

３．環境教育への利用

第７巻 (2004)

8１）水の富栄養化状態の分析

7

著者らはこれまで、河川やため池の水質調査を行い、

6

ここでは、試作した蛍光光度計のため池水質調査への利用について述べる。調査対象は丸田沢ため池（仙台市泉区上谷刈）で、平成１6 年７月から同年 11 月まBOD（mg/L)

４）５)
富栄養化に伴う水質変動現象の解析を進めている。

で定期的に採水し、硝酸性窒素、生物化学的酸素要求5432量およびクロロフィル総量を調べた。図８に測定結果1を示す。
丸田沢ため池の７月から１１月までの時期は、

0

生物化学的酸素要求量が９月中旬に最も高くなり、そ789採水時期（月）101189採水時期（月）1011の後低値化が進む。この変化に対して、硝酸性窒素は９月頃に減少し、１０月にかけて増加傾向を示す。試0.7

作した蛍光光度計を用いて求めたクロロフィル総量は0.6

汚濁の進行が水の富栄養化を促し、藻類発生による窒素固定が進行していることをよく表している。

２）蛍光光度計の生徒実験への導入
試作した蛍光光度計は、小学校における水質調査（気硝酸性窒素 (mg/L)

生物化学的酸素要求量の変化の傾向と似ており、有機
0.50.40.30.2

仙沼面瀬小学校６年の取り組み）と、高等学校での実0.1

験実習（宮城県第一女子高等学校スーパーサイエンス

07実験など）で利用した。図９は、学校で行った植物性プランクトンの捕集と蛍光測定に関する実験操作を示したものである。ひとつの試料水について生徒実験の200

植物性プランクトンの捕集は、注射器を用いて、環境水 250 ｍL を硝子フィルター（GF/F）を通してろ過し、硝子フィルターに植物性プランクトンを捕集する。
次に、硝子フィルターに付着した水分を抜き取った後、硝子フィルターを DMF 10mL の入った共栓付試験管に入れ、約 5 分間振り混ぜる。D M F 溶媒に植物性プラン

クロロフィル総量(μg/L)

所用時間は約 20 分である。

●160●
●

120

8040

●
●

●

●

クトンからクロロフィルが抽出されるので、ろ紙フィルターでろ過し、ろ液（25 倍濃縮液）を蛍光測定管に入れる。
試作した蛍光光度計を用いて蛍光を測定し、

0789
採水時期（月）10（１）式を使って試料溶液に含まれるクロロフィル総量（μ g / L）を求め、環境水 1L あたりのクロロフィａ : 生物化学的酸素要求量 ,ル総量値に換算する。

ｃ : クロロフィル総量

b : 硝酸性窒素

図８．丸田沢ため池の水質（平成 16 年度）－88 －11湖沼の富栄養化状態の把握を目的としたクロロフィルの定量

図９．植物性プランクトンの捕集と蛍光測定

４．さいごに光源として用いる発光ダイオードの光学特性と使用上

湖沼の植物性プランクトンは、調査場所や季節にの注意点（特に紫外発光ダイオードを利用する場合）、よって種類と量が異なる。特に、淡水性の植物性プラおよびクロロフィルの蛍光特性を十分に調べておく必

ンクトンはらん藻類以外に緑藻類や紅藻類など種類も要がある。試作した蛍光光度計では、クロロフィル a多い。ここではクロロフィルａとクロロフィル b のみ

はクロロフィル b に比べ約７倍の感度をもち、クロロに着目し考察を試みたが、今後、クロロフィル c に由フィル総量はクロロフィルａについての検量線データ来する定量誤差についても検討が必要であろう。

を用いて算出できる。

これまで著者らが調査して得たクロロフィル総量②蛍光光度計を簡単に製作するためには、できるだけは、広瀬川で 5 μ g / L ～ 10 μ g / L、青葉山に点在す発光輝度の高い光源を用いるとよい。試作した蛍光光るため池では、5 μ g/L ～ 50 μ g/L、また、仙台住宅

度計では、微弱な蛍光の光電流をマイクロアンメータ

地内のため池（丸田沢ため池）では 20 μ g / L ～ 300で直読できるように、光源として２個の紫外発光ダイμ g/L であった。河川のような流水では、概してクロオードを用いた。5μg/L の希薄溶液で、クロロフィルロフィル濃度は低い。試作した蛍光光度計は、希薄な蛍光の光電流値は 4.9μA である。その時のバックグクロロフィル溶液の蛍光を高感度で検出でき、測定操ラウンド（溶媒セル）は 0.2μA 程度で蛍光計測に障作が簡単なことから、環境水の実態や水中生態系の仕害とはならない。バックグランドを低値化する目的で、組みの理解など、学校における環境学習の取り組みにフォトトランジスター受光部に 570nm 短波長カット硝も有効に活用できると思われる。蛍光光度計を製作す子フィルターを装着させたことによる。

る場合の留意点を以下にまとめた。

③蛍光光度計の製作費用は約 15,000 円である。簡易①環境水を対象として蛍光光度計を製作する場合は、な構成を重視し、スリットなどをもうけなくとも、ク－89 －宮城教育大学環境教育研究紀要

ロロフィル濃度に比例した再現性のよい蛍光強度を計測できる。

第７巻 (2004)

50, p.326．
２）村松 隆・花屋 馨 ,1987 緑葉中の色素の分離と④蛍光光度計の定量限界に併せて、植物性プランクト

定量．宮城教育大学理科教育研究施設年報 , 23,ンの捕集方法も工夫できる。
試作した蛍光光度計では、

p81．

試料水 250 ｍL 中に含まれる植物性プランクトンを捕集し、10 ｍL クロロフィル DMF 溶液として蛍光強度を

３）花屋 馨・村松 隆 ,1989．宮城教育大学理科教育施設年報 , 25, p.93．

計測している。クロロフィル抽出と測定は簡単かつ短

４）村松 隆・早坂智恵他 , 2003 ため池の富栄養化に時間に行うことができ、小学生による水質調査でも十伴う水質変動現象の分析．宮城教育大学環境教育研分活用できることが確かめられた。

究紀要 , 6, p.15．
５）村松 隆・森田衣子 ,2000．環境教育のための河参考文献

川利用 - 広瀬川本流と支流の学習 -．宮城教育大学

１）本田数博・有薗秀敏他 ,2001．青色 L E D を光源に

環境教育研究紀要 ,3, p.45．

用いる緑茶クロロフィルの蛍光測定．化学と教育 ,－90 －