第1 9 回日本再生医療 学 会 総 会
筆頭発表者のCO I 開 示
筆頭発表者指名：林田 尚 之

ラットを用いた膝軟骨全層欠損モデルの評価系の検討

演 題 発 表 に 関 連し，
開示 す べ き C O I 関係にある○ 林田 尚之 1) ，榊原 基嗣 1) , 水町 凉治 1) , 森田 枝美 1) , 吉原 佐江子 1) , 田 代 貴 士 1) , 片 山 誠 一 1) ,廣中 直行 1) , 西 勝英 1) ,2)

企 業 等 は あ り ません．

結的

変形性膝関節症は最も一般的な関節疾患の一つであり，事故やスポーツによる外傷，肥満や骨格，遺伝，加齢に伴う関節への過負担などの様々な要因により徐々に関節軟骨が変性する慢性の進行性疾患である．変形性膝関節症は進行すると膝の痛みが強くなり，歩行時の膝の痛みや膝を曲げ辛いといった QOL を著しく損なう症状となる．
関節の軟骨は硝子軟骨と呼ばれ，高い粘弾性を示し，体重を支えながら関節の滑らかな動きを可能にする．また，血管やリンパ管，神経を欠く組織であり，軟骨細胞自体の修復能や分裂能に限界がある．このため，一度損傷すると自然修復が困難であることから，関節軟骨の再生医療の実現が待ち望まれている．
そこで我々は，ラット膝軟骨全層欠損モデルを作製し，細胞移植および培養液上清の治療効果を検討した．

● 荷重差測定
1.2

1.00.8###0.60.4法

正常（n=3)Control（n=5）
細胞（n=5）
培養上清（n=5）

*

*

###

*###

############

重量負荷比：モデル肢／正常肢

3d

1w

2w

3w

4w

5w

6w

【モデル作製後】● 歩行解析（CatWalk）

実験 1：移植細胞の有効性評価試験

正常（n=3)Control（n=5）

細胞（n=5）

入荷2.5

*
*

#

2.0
1.52w

3w

4w

5w

6w

7w

試験群
正常 bControlb細胞 c
培養上清 d投与量001×106 cells/site
0

投与容量0.1 mL/site
0.1 mL/site
0.1 mL/site
0.1 mL/site

投与経路
膝関節腔内
膝関節腔内
膝関節腔内
膝関節腔内

投与日 a

Day 3Day 3
Day 3Day 3● 評価方法：10% FBS-1% ペニシリン - ストレプトマイシン -DMEM
37℃，5%CO2
胎児由来大腿骨骨頭を採取．0.2% コラゲナーゼを用いて骨頭を分散し，細胞を採取．採取後 9 日間予備培養．

荷重差測定： Incapacitance Tester（メーカー：Linton Instrument）を用いて測定
歩行解析： CatWalk XT（メーカー：Noldus Information Technology）を用いて測定● 膝軟骨全層欠損部位 ● 投与細胞写真（投与日：採取後 9 日目）

3w

4w

5w

6w 【モデル作製後】

左右比：モデル肢／正常肢

3d左右比

1.0

3d#

1w

2w

3w

4w

5w

6w 【モデル作製後】###0.10

3d#

1w

#2w

3w

4w

5w

6w 【モデル作製後】

Print Width

足跡（水平方向）の長さ

足跡（垂直方向）の幅

2.0
1.5

1.5
1.0

1.0

*

#0.5

0.5
左右比：モデル肢／正常肢

0.0

3d1w

2w

3w

4w

5w

6w 【モデル作製後】

Print Area
足跡面積

2.0
1.5

#1.0
***

#0.5
0.0

4w

0.15

Print Length

2.0

3w

0.20

0.05

6w 【モデル作製後】5w

2w

左後肢（モデル肢側）のみ着地している時間

0.25

左右比：モデル肢／正常肢0.01w

Single Stance

0.5

左右比培地：
培養条件：
培養：

2w

0.0

足がガラスプレートから離れている際の速度###

a. モデル作製日を Day 0 とした．
b. 細胞培養に使用していない培地を投与した．
c. SD ラット胎児（妊娠 18 日目）大腿骨骨頭由来初代細胞
d. 予備培養 8 日目から 9 日目に使用した培地● 細胞培養：

1w

1.5

例数

35553d2.0

左右比● 群構成：

1.5

Swing Speed● モデル作製方法：
1. ラットを 2% イソフルラン吸入にて麻酔後，左後肢膝関節内側を切開して軟部組織を剥離後，膝蓋骨をずらして大腿骨膝軟骨をドリルで削り取ることで全層欠損モデルを作製した．
2. 筋肉組織を切開し内側側副靱帯を露出させ，内側半月板の上下の位置で内側側副靱帯を横切した．
3. 関節膜越しに見える半月板を確認し，前十字靭帯および後十字靭帯を切断した．
4. 半月板にメスを用いて数回傷をつけることで損傷させるとともに，大腿骨について脛骨の接触部分を削った．

左右比：モデル肢／正常肢0.0

着地時間（秒）

1w

#0.5

左右比0w
3d2.01.0###

1.00.5-1w

足がガラスプレートから離れている時間

3.02.5左右比

投与
荷重差測定，歩行解析
膝関節採取

培養上清（n=5）

Swing

足がガラスプレートから離れる速度の指標

3.5
3.0

モデル作製

平均値±標準誤差###: p<0.001, 正常群と比較して有意差あり（Student's t-test ）*: p<0.05, Control群と比較して有意差あり（Student's t-test ）Stand Index● 動物：ラット，Crl:CD(SD)，♂，8 ヵ月齢以上（モデル作製時）● 実験スケジュール：

荷重差測定において，・ Control 群では，正常群と比較していずれの時点においても有意な低値を示し，モデルの特徴的な変化（モデル肢の荷重値が正常肢より低い）を捉えることができた．
・ 細胞群では，モデル作製後 4 週および 5 週の荷重差測定で有意な改善効果が認められた．
・ 培養上清群では，モデル作製後 5 週以降の重量負荷比で高値を示したが，いずれの測定時点においても有意差は認められなかった．

左右比方果

実験 1：移植細胞の有効性評価試験

重量負荷比目1) 株式会社ＬＳＩメディエンス，2) 熊本大学名誉教授

左右比：モデル肢／正常肢

3d1w

2w

3w

4w

5w

6w

【モデル作製後】● 膝関節採取時の膝写真（代表例）0.0

左右比：モデル肢／正常肢

3d1w

2w

3w

4w

Control6w 【モデル作製後】歩行解析において，・ Control 群では，正常群と比較して Stand Index（⇧），
Swing（⇧），Swing Speed（⇩），Single Stance（⇩）でモデル作製後 2 週までの時点で痛みに起因したと考えられる変化を捉えることができた．
しかし，モデル作製後 3 週以降では，正常群と同程度であった．
・ Control 群の Print Length，Print Width，Print Area については，正常群と比較して大きな変化は認められなかった．
・ 細胞群および培養上清群ともに，Control 群と比較していずれの項目においても明らかな改善効果は認められなかった．
平均値±標準誤差#: p<0.05, ###: p<0.001, 正常群と比較して有意差あり（Student's t-test）*: p<0.05, ***: p<0.001, Control群と比較して有意差あり（Student's t-test）

損傷部位（脛骨の接触部）

正常5w

細胞全層欠損部位

培養上清実験 2：移植細胞の局在確認検討● 動物：ラット，Crl:CD(SD)，♂，8 ヵ月齢以上（モデル作製時）● モデル作製および細胞移植方法：
1. ラットを 2% イソフルラン吸入にて麻酔後，左後肢膝関節内側を切開して軟部組織を実験 2：移植細胞の局在確認検討
滑車溝低倍写真（×4）

滑車溝拡大写真（×20）

剥離後，膝蓋骨をずらして大腿骨膝軟骨をドリルで削り取ることで全層欠損モデルを作製した．
2. 全層欠損直後，損傷部位に PKH26 で蛍光標識した足場素材および細胞の混合物（SD ラット胎児［妊娠 18 日目］大腿骨骨頭由来初代細胞）を移植した．

● 膝関節採取：モデル作製後 7 週

まとめ・ 実験 1 において，荷重差測定では Control 群（膝軟骨全層欠損モデル）の特徴的な変化（モデル肢の荷重値が正常肢より低い）を捉えることができた．また，歩行解析ではモデル作製後 2 週までの時点で本モデルの痛みに起因したと考えられる変化を捉えることができた．
これは，歩行解析が四肢歩行であることから後肢への負荷が軽減されたことに対し，荷重差測定は，より後肢に荷重負荷がかかっていることから，本モデルの変化を鋭敏に捉えることができたことが示唆された．
・ 実験 1 の荷重差測定において，細胞群ではモデル作製後 4 週および 5 週で有意な改善効果が認められた．また，培養上清群では，有意差は認められなかったもののモデル作製後 5 週以降で高値を示したことから，細胞または培養上清を投与したことにより，モデル作製に起因した痛みを軽減できた可能性が示唆された．
・ 実験 2 の移植細胞の局在確認検討では，PKH26 でラベルした移植細胞が損傷部位の底部に局在しており，細胞移植により損傷個所が軟骨細胞の増殖で補填されていたことが確認できた．
これらの結果から，本実験条件下において，荷重差測定ではモデル作製6 週まで本モデルの特徴的な変化を捉えることができ，歩行解析でもモデル作製後 2 週まで痛みに起因したと考えられる変化を捉えることができた．
また，細胞または培養上清を投与したことでモデル作製に起因した痛みを軽減できた可能性があることから，今後，実験 2 で採取した膝関節の病理組織学的検査を実施し，損傷した軟骨の修復の程度を確認予定である．

細胞移植：モデル作製直後に膝軟骨全層欠損部分に移植，膝軟骨採取：モデル作製後 7 週
A, B：HE 写真，C, D：PKH26 蛍光写真，E, F：DAPI 染色（青色）および PKH26（赤色）Merge 写真
A, B 黒線：損傷領域，C ～ F 白矢印：PKH26 陽性細胞

A, B: 損傷個所は軟骨細胞の増殖で補填されていた．
C, D: 損傷部位の底部で PKH26 陽性反応が確認された．
E, F: PKH26 の陽性反応と DAPI の Merge 写真より PKH26 でラベルした移植細胞が局在していることが確認された．