CutA1を足場とした高度安定型多価化分子認識素子の開発
岡山大学

学術研究院

環境生命自然科学学域（工）
助教

今中 洋行
2023年9月26日

生体分子間相互作用
Biomolecular Interactions（Nucleicacid・Peptide・Protein・Sugarchain・・）

Highly Specific・ Transcriptional Regulation
・ Metabolic Regulation
・ Signal Transduction
・ Immune Response

生命現象は厳密に制御されている
Detection & Use

MedicalDiagnosis

Biologics

EnvironmentalAnalysis

Biosensor

多様な分子を標的とした分子認識素子の創製が必要[1] Wang, J., et al., Small., 1, 1036-1043 (2005)

タンパク質性分子認識素子
Affibody[3]DARPin[4]FN3[6]

Anticalin[5]IgG 抗体VHH 抗体人工抗体様分子

分子量 （Da）

大きい（150k）

小さい（15k）

小さい（6～20k）

宿主

動物細胞

大腸菌，酵母大腸菌，酵母

安定性

低高高分子の改良

困難

容易容易

高い安定性と 特異性 を有する分子認識素子が必要[3] Wahlberg, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100 , 3185-3190, (2003)[4] Binz, H. K., et al., J. Mol. Biol., 332, 489-503(2003)[5] Skerra, A., et al., FEBS J., 275, 2677-2683(2008)[6] Parker, A., et al., Protein Eng. Des. Sel., 18, 435-444(2005)

タンパク質性分子認識素子
Affibody[3]人工抗体様分子の安定性[7,8]変性温度 (°C)

DARPin[4]FN3[6]

Anticalin[5]足場

MW (kDa)
野生型IgG antibody

変異体
VHH
antibody

Affibody
Mw （Da）

6 High（150k）78

42 - 71
Low（15k）

小さい（6～20k）

DARPinHost14-2186
MammalianCell57, S.- cerevisiae
89
E. coli

大腸菌，酵母

Anticalin
Stability

2079

53 High- 73

高Protein
FN3 Eng.

10 Difficult 84

37Easy- 73

容易Low

人工抗体様分子高い安定性と 特異性 を有する分子認識素子が必要
より安定かつ コンパクトな足場分子の開発[3] Wahlberg, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100 , 3185-3190, (2003)[4] Binz, H. K., et al., J. Mol. Biol., 332, 489-503(2003)[7] Vazquez-Lombardi, R., et al., Drug Discovery Today, 20, 1271-1283(2015)[5] Skerra, A., et al., FEBS J., 275, 2677-2683(2008)[6] Parker, A., et al., Protein Eng. Des. Sel., 18, 435-444(2005)[8] Stimple, SD., et al., AIChE J., 66(3), e16814(2020)

従来技術とその問題点
・生体分子認識素子としてはIgG抗体の活用が多いが，調製が困難で，コスト面でも問題が生じることが多い．
・VHH抗体や人工抗体様分子も広く開発が進められてきているが，分子認識素子開発における変異導入の際，構造安定性の低下が避けられない．

[9]タンパク質性足場分子としてのCutA1・From hyperthermophilic archaeon,Pyrococcus furiosus

・Homotrimeric (102 aa x 3)・High thermal stability (Tm = 150 ºC)

Top view

Side view

・Capable of (poly)peptideconjugation or insertion[9] Tanaka, T., et al., FEBS Lett., 580, 4224-4230 (2006)

熱安定性

Thermostability

CutA1

150ºC

〜80ºC

Affibody

Artificial
antibody-like protein
Anticalin

VHH antibody

FN3

・Thecost foranimal immunityishigh

60ºC
IgG antibody

・High Mw (150 kDa)
・Difficult tomodify

40ºC

DARPinEnzyme・Denaturesrapidlyabove40℃

mutation

Maintain high thermalstability

どこに生体分子を挿入・置換するのか

1. Mapping of eachside chain-residue interaction energy

PfCut structure was obtained by AlphaFold2*Galgonek, J., et al., Nucleic Acids Res., 45, W388-392 (2017)
http://bioinfo.uochb.cas.cz/INTAA/どこに生体分子を挿入・置換するのか

2. Ranking of residues
by total interaction energy
3. Picking up lower 25% residues
4．Exclusion of residues located
・at the terminal and vicinity
・in secondary structure・inside the molecule

PfCut structure was obtained by AlphaFold2*Galgonek, J., et al., Nucleic Acids Res., 45, W388-392 (2017)
http://bioinfo.uochb.cas.cz/INTAA/

異なる荷電性・長さを有するペプチドの挿入X2/X4 + FL (total 8aa)
G2 GSGGSG

E2 GSEESG

G4 GSGGGGSG E4 GSEEEESG

Cut_G4_G4_PS
Cut_E4_E4_PS
Cut_G2_G2_G4_PS
Cut_E2_E2_E4_PS

2 sites insertion

3 sites insertion

発現タンパク質の可溶化率と熱安定性
60～99: Temp. of Heat Treatment [ºC]

2 sites Insertion

28-

M W S IS 60 70 80 90 99 W S IS 60 70 80 90 99

1710-

CutG4_G4_PS 15.6 kDa

3 sites Insertion

CutE4_E4_PS 16.1 kDa

W S IS 60 70 80 90 99 W S IS 60 70 80 90 99
281710-

CutG2_G2_G4_PS 15.8 kDa

CutE2_E2_E4_PS 16.8 kDa

M:マーカー W:全菌体画分 S:可溶性画分 IS:不溶性画分 60～99:熱処理温度 [℃]新技術の特徴・従来技術との比較•CutA1の改良設計により，複数箇所への生体分子の同時挿入・置換後においても安定な基盤足場分子を開発した。
→ 多価化分子認識素子としての利用•本技術の適用により、分子の構造安定性が高レベルで担保されるため，調製コストが大幅に削減されることが期待される。

ELA(Enzyme-linked assay)による分子間相互作用検出
On hydrophilic PS microwell
Substrate: p-NPA

Analyte Molecule：Peptide conjugated EstAf

FL-EstAf R6-EstAf E6-EstAf

Abs. at
405 nmEstAf[4]Protein Immobilization(Conc.: 100 pmol/well)Cut_2E
Cut_3E

Cut_2G
Cut_3G

Cut_PS(N.C)

Ligand molecule：Peptide Inserted CutA1

部位特異的な相互作用を再現

EstAfによるCutA1への非特異的な相互作用は生じない

ペプチド挿入/置換部位における部位特異的な相互作用を検出

低分子化合物の捕捉も可能
RX-EstAf(X:1-6)：1から6残基のアルギニンを連結

Cut_3E8 Kd(app)* [nM]
R4-Est515.6

R5-Est

414.9
154.1

R6-Est*4パラメーターロジスティック回帰分析
により見かけの解離定数Kd(app)を算出

類似の特性をもつペプチドとの相互作用の相違
K6-EstAf

R6-EstAf

Side chain tip sites

Side chain tip sites
H 2N

Peptide frame

ONHNHOH 2NOHOH
NH 2

Peptide frame

NH 2

The estimated amount of R6-Est remined[pmol/well]側鎖配置の差異が相互作用検出感度に影響
5R6-EstAf

4

全て可溶化発現＋耐熱性あり(99ºC以上)
Cut_41-43GE2_48GE2_75-77GE3 _PS

3

Cut_41-43EG2_48GE2_75-77GE3 _PS
Cut_41-43GE2_48EG2_75-77GE3 _PS

2

Cut_41-43GE2_48GE2_75-77EG3 _PS
Cut_41-43EG2_48EG2_75-77GE3 _PS

1

Cut_41-43GE2_48EG2_75-77EG3 _PS

0

Cut_41-43EG2_48EG2_75-77EG3 _PS

Cut_41-43EG2_48GE2_75-77EG3 _PS

1101001000
The amount of R6-Est added [pmol/well]想定される用途•環境分野におけるバイオセンサーの開発（環境リスク因子測定）•食品分析における測定キットや高感度バイオセンサーの開発•体外診断用医薬品の開発
標的分子に応じた多様な分子設計が可能実用化に向けた課題•凍結乾燥等による長期保存条件の確立•分子認識素子取得のためのライブラリー調製（CutA1表層提示系の確立）•挿入分子サイズの限界が不明

企業への期待• 診断・分析キット開発の基盤技術を有する企業との共同研究を希望• 微細加工技術を有する企業とのバイオセンサー開発に向けた共同研究を希望• 具体的な標的分子シーズ・ニーズの提示• 低分子化合物から細胞まで幅広い標的物質の捕捉を可能とする独自ライブラリー開発のサポート

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：高度に安定でフレキシブルなタンパク質性分子認識素子• 出願番号 ：特願2023-139127
• 出願人
：岡山大学
• 発明者
：今中洋行、今村維克

お問い合わせ先
岡山大学
研究推進機構 知的財産本部
ＴＥＬ：086-251-8417
e-mail：chizai@okayama-u.ac.jp
URL：https://www.orsd.okayama-u.ac.jp/