第36回日本毒性病理学会学術集会 ワークショップ 「毒性病理の最前線」

神経細胞壊死を評価するために知っておきたいこと

山田 直明
2020年2月13日（配布資料用に一部改変）

ＣＯＩ （利益相反）

本演題に関連して開示すべき利益相反はありません．
In connection with the presentation, there is no COI tobe described with any companies.

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Neuron–Cell Bodyの用語（goRENI, 2019年）• Cellularity, decreased, neuron（Cell loss, neuronal ）• Chromatolysis• Heterotopia, neuronal• Necrosis, neuron (neuronal)
https://www.goreni.org/• Neuronophagia• Vacuolation, neuron (neuronal)
Common Artifact• Artifact, dark neuron (Dark neuron artifact)3

神経細胞壊死評価時の留意点• Cellularity, decreased, neuron（神経細胞の消失によるもの）③評価時期（When)• Necrosis, neuron①観察部位（Where）②鑑別方法（How）• Artifact, dark neuron (Dark neuron artifact)4

観察部位について：STP position paper
ラット

サル

5Bolon B, et al. Toxicol Pathol. 2013;41(7):1028-48.

STP position paperに準じたイヌの脳の切り出し位置の検討
第32回本学会（2016年）ポスター発表より抜粋

イヌのSTP position paper準拠③②④⑤①

イヌやマウスでは，各施設で独自に検査部位を検討
マウスはラットのような検査は，小さいため困難

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Table 4 の記載事項
このリストは、この論文に記載されている推奨事項に基づいた例であり、研究開発のニーズに合わせて機関が容易に変更できます。

あくまでも例示であり，フレキシブルに考える↓
なぜ検査部位を画一化できないのか？
↓領域特異性があるから！！
Bolon B, et al.
Toxicol Pathol. 2013;41(7):1028-48.

7神経毒性物質の領域特異性の例

MPTP

2’-amino-MPTP

Dopaminergic system

Serotonergic system

構造が少し違うだけで，影響を受ける部位が全く異なる
SWITZER III RC, et al. Toxicol Pathol. 39: 73-84, 20118

MK-801の領域特異性

今回の発表では，この部位を評価しています

SWITZER III RC, et al. Toxicol Pathol. 39: 73-84, 20119

DARK NEURON ARTIFACTとの鑑別
類義語：
Basophilic neurons; Dark ‘spiky’ nerve cells;
Neuronal hyperchromatosis.

一方，神経細胞壊死は…
・暗く濃い核と明るい好酸性の細胞質を有する１・グリアの反応が見られる１・壊死像に時間的バリエーションがみられる2・毒性変化であれば領域特異性があることも指標．
1. Kaufmann W, et al. Toxicol Pathol. 2012. 40(4 Suppl):87S-157S.
2. SWITZER III RC, et al. Toxicol Pathol. 39: 73-84, 2011

DARK NEURON ARTIFACT（ ）と Necrosis（ ）MK-801, 帯状皮質

DARK NEURON ARTIFACT（ ）と Necrosis（ ）この程度の変化なら十分ＨＥ染色でも鑑別できる

微妙な例はどうしたらよいか？
アーティファクト

カイニン酸による神経細胞壊死

Pritt ML. et al., Toxicol Sci. 2014 . 141: 398–408.
When neuronal necrosis is subtle, the thoroughness of evaluation can be greatly enhancedby the use of a stain that is specific for this change.
Toxicologic Pathology Ninclinical Safty Assessment.
特殊染色を使う！！
In: Sahota PS, et al. editors. CRC Press. 2013. P909.

Fluoro-Jade C について

染色手技は極めて簡単
ただし試薬の値段は高い…

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Fluoro-Jade C の染色例

緑色に光るのでわかりやすい！！
Dark neuron artifactは染まらない！！
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Fluoro-Jade Stainで染色されるもの• カイニン酸受容体興奮毒性：カイニン酸，ドウモイ酸• 酸化的フリーラジカル：鉄やマンガン化合物• NMDA受容体拮抗作用：MK-801，フェンサイクリジン• 下オリーブ核活性化興奮毒性：イボガイン• ミトコンドリア阻害：MPTP
神経細胞が死ぬメカニズムに関係なくラベリングされるが，未知のメカニズムによる神経細胞死への親和性については検討が必要
変性細胞のポリアミンに結合（？）
Schmued LC, et al. Brain Res. 1997 Mar 14;751(1):37-46.
Schmued LC, et al. Brain Res. 2005 Feb 21;1035(1):24-31. 16FJ染色の灌流固定の必要性
浸漬固定

灌流固定

対照群

赤血球が染色されるため神経細胞と判別が困難なことがありうる

対照群

FJ染色の灌流固定の必要性
浸漬固定

MK-801, Day 3

灌流固定

MK-801, Day 3

神経細胞壊死の染色性に違いはなかった
ただし・・・
浸漬固定は赤血球が染色されるため，軸索かどうかの判別は困難

ラット以外でのFJ染色例
カニクイザル，MPTP投与

Tyrosine hydroxylase

・今回のサルの例では染色性は弱かった．
・マウスにカイニン酸を投与した例で染色されなかった経験あり→ ラット以外では検討が必要かもしれない．
FJ-C19

いつ評価するか？ 神経細胞死のタイミング
MK-801
Percent of peak cell death visible

100MPTP
Kainic AcidPCP

種々の神経毒性物質の神経細胞死のピークは投与後１～４日と短期間のうちに見られることが多い

500012345678910Days post-administration
Fundamental Neuropathology for Pathologists and Toxicologists. In: Bolon B. and 20
Butt MT editors. John Wiley & Sons, Inc. 2011. P153. より改変

MK-801の経時的変化
Rat，Crｌ:CD(SD)

解剖

Day 3(n=4)

5 mg/kg 皮下投与
（Day 1）

Day 8(n=4)

Day 15(n=4)

Day 29(n=4)

2匹は10%リン酸緩衝ホルマリンにて浸漬固定．
2匹は4%パラホルムアルデヒドで灌流固定．
いずれも定法に従ってHE染色スライド標本を作製．
併せて，免疫染色（Iba-1，GFAP，CNPase），FJ-C染色を実施．
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MK-801 皮下投与 90分後の様子

神経症状・活動性の低下はDay 3～5程度で消失

Day 3(n=4)

Day 8(n=4)

Day 15(n=4)

Day 29(n=4)22

Vacuoleは分からない

HEDay 3Day 15

Day 8

Day 29神経細胞壊死は認められない 23

HEDay 3

Day 15Day 8

Day 29神経細胞壊死は認められない 24

HEIba-1, Day 3，ミクログリアが目立つ

Day 8，対照群と変わらない

Day 15，対照群と変わらない

Day 29，対照群と変わらない

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HEGFAP, Day 3，アストロサイトが目立つ

Day 8，対照群と変わらない

Day 15，対照群と変わらない

Day 29，対照群と変わらない

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HECNPase, Day 3，対照群と変わらない

Day 8，対照群と変わらない

Day 15，対照群と変わらない

Day 29，対照群と変わらない27

Cellularity, decreased, neuron は分かるか？
神経細胞数を数えてみると…

12.4 ± 2.3（個 / 100 µm2）

Control
見分けるのは困難！！

14.1 ± 3.8（個 / 100 µm2）

Day 29

各n=428

Cellularity, decreased, neuron
海馬や小脳プルキンエ細胞など• 配置に特徴的な神経細胞でない限り，微妙な神経細胞の消失を区別することは困難．

Toxicologic Pathology Ninclinical Safty Assessment.
In: Sahota PS, et al. editors. CRC Press. 2013. P910-911. 29

まとめ
神経細胞壊死を評価するうえで重要なことを3つ紹介した．

・ Where: どこを評価するか？
神経毒性物質には独特の領域特異性が存在することが多い
STPポジションペーパーは例示，フレキシブルに対応すべき・ How： どのような手法を用いて評価するか？
HE染色だけでも明らかなものは評価が可能である鑑別が必要なものや見落としのリスクがあるものに対してはFluoro-Jade染色やIba-1免疫染色など他の手法も考慮する

・ When: どのタイミングで評価するか？
神経細胞壊死と評価のタイミングは考慮しなければならない
神経細胞の減少は評価が難しいことがある
投与一週間以内の検査が必須になることもある
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