HRAM-LC-MS/MSによるヒト血清中アポリポプロテインEアイソフォーム定量分析法開発

Development of Quantitative Method for Apolipoprotein E Isoforms in Human Serum by HRAM-LC-MS/MS〇 星野 雅輝、新田 真一郎、若林 弘樹、上田 哲也（株式会社ＬＳＩメディエンス メディカルソリューション本部 高度技術分析センター 医薬品分析部）〇 Masaki Hoshino, Shin-ichiro Nitta, Hiroki Wakabayashi, Tetsuya Ueda (Bioanalysis Department, Advanced Technology Center, Medical Solution Segment, LSI Medience Corporation)

目的

アポリポプロテインE（ApoE）とアルツハイマー病の関連性については1993年のCorderの報告1)以降多くの研究がおこなわれており、APOE遺伝子のε4アレルはアルツハイマー病の危険因子と広く理解されている。一方で、ApoE関与のメカニズムに関しては、Amyloid β代謝、Tauリン酸化、脂質代謝、血管の老化などへの関与など様々なメカニズムが提唱されているが確固とした結論は得られていない2)。タンパク質を定量的に評価することでアルツハイマー病におけるApoE関与のメカニズムに関する新たな知見が得られる可能性がある。そこで
我々は、ヒト血清をアフィニティー精製することなく直接トリプシンを用いて消化断片を作成し、生成されたApoE2, ApoE3, ApoE4及びApoE2～4共通の消化断片をHRAM (HighResolution and Accurate Mass)-LC-MS/MSにより測定する血清中アポリポプロテインEアイソフォーム分析法を開発した。また、本分析法は高精度な血清中タンパク質の表現型判定とタンパク質濃度の測定が同時に可能な方法であり、定量分析法としてのバリデーションについても本研究内で実施した。その結果は酵素消化を伴うLC-MS/MS分析法に対して提案されている基準3)を満たすものであった。

前処理及び測定条件

分析法検討【代替マトリックス選定】

LC-MS/MSによるバイオマーカー測定では代替マトリックスの選択がキーとなる。低分子を測定対象とする場合はいくつか標準的な選択肢がある。
一方、トリプシン消化を伴うタンパク質のバイオマーカー測定では常法は存在しない。タンパク質のバイオマーカー測定において、我々はデータベース上のタンパク配列を使用してin silicoベースの検索を行い配列の異なるタンパク質を持つ動物種の生体試料を代替マトリックスとして系の構築を行っている。
測定対象バッファー、水成分除去
マトリックス

他動物種
マトリックス

分析対象欠損マトリックス

低分子〇〇×
種差なし

△
費用対効果

△
分析対象除去は難しい〇△
費用対効果

00.5

1236245003000.5

1Digestion time (h)C(CAM)LAVYQAGAR-2/y8

LAVYQAGAR-2/y6

LGADMEDVR-2/y8

LGADMEDVC(CAM)GR-2/y62362430Digestion Time (h)LGPLVEQGR-2/y6C(CAM)LAVYQAGAR-2/y8

LAVYQAGAR-2/y6

LGADMEDVR-2/y8

LGADMEDVC(CAM)GR-2/y6

LGPLVEQGR-2/y6

事前の検討で E2/E3, E3/E4 の表現型を示していた 2 例の血清をプールし酵素消化時間を評価した。1時間から6時間までピーク面積としては減少、ピーク面積比としては微増の傾向を示した。特性の異なる5ペプチド断片の同時測定が必要であり、すべてのペプチドで安定な条件とすることは困難であることが想定されたので、両者のバランスから消化時間としては1時間とした。

【LC条件検討】

移動相に使用する試薬はピーク形状とMS感度が相反する傾向がある。我々はバランスを見ながら系の構築を行っている。
条件
酸濃度

ピーク挙動
感度：
低濃度（0.005%程度まで）＞高濃度
ピーク形状： 高濃度>低濃度
感度：
酢酸>ぎ酸>>TFA
ピーク形状： TFA>ぎ酸>酢酸※酢酸はバックグラウンド上昇しやすい
感度：
メタノール>アセトニトリル
ピーク形状： アセトニトリル>メタノール※メタノールはバックグラウンド上昇しやすい
感度：
塩なし>塩添加ピーク形状： 塩添加>塩なし※炭酸水素アンモニウムで感度良好なケースも散見
感度不足の場合は検討する。

酸の種類
有機溶媒の種類
塩の添加添加剤

 シグナル強度の大きい定量妨害ピーク(MSで十分分離可)→Orbitrapへのイオン注入量が自動制御されるため、分析対象イオンの絶対量が減少しシグナルが消失する場合がある。また、測定対象m/z近傍の定量妨害成分により測定対象のm/zずれが起こる場合もある。
 m/zが10 ppm程度違いの定量妨害ピーク(共溶出の場合MS分離不可)→定量妨害ピークと目的のピークが重なりピークトップのm/zがずれてシグナルが消失する場合がある。
我々はクロマトグラムのみではなく、イオンのOrbitrapへの注入時間やスペクトルも念入りに確認し分析条件の構築を行っている。

01005001.50

m/z = 479.76413
Δ-14.0 ppm
定量妨害ピーク

50010050

定量妨害ピークを分離した
正常なクロマトグラム

01.55

1.60

1.65
Time (min)1.70

Linear Gradient

Acetonitrile / methanol / acetic acid

Run time

12.0 min

Q Exactive Focus(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)MS condition
Ionization mode

ESIAnalysis mode

PRM

Detection mode

PositiveResolution

70,000[M+2H]2+
LGADMEDVC(CAM)GR, LGADMEDVR, LAVYQAGAR,C(CAM)LAVYQAGAR, LGPLVEQGR
And corresponding 5 heavy Isotope labeled peptides for IS

Monitoring ions

2.1

2.2

2.3
Time (min)2.4

Results

Selectivity for IS
Male and female, n=3 each, total n=6
Matrix EffectMale and female, n=3 each, total n=6
Carry-Over
n=1, 3 days
Calibration Curve
1-200 µg/mL, n=1, 3 days
Intra-Batch Accuracy and Precision
4 (surrogate matrix) and 2 (serum) concentrations, n=5, 3 days
Inter-Batch Accuracy and Precision
4 (surrogate matrix) and 2 (serum) concentrations, n=15
Stability in an Autosampler for 48 Hours
2 (surrogate matrix) and 2 (serum) concentrations, n=3Batch Size
60 serum samples (10 samples / individual serum)

No interfering peak

RE:-3.4 to 3.1%
CV: 6.1 to 7.9%
No interfering peak
RE: -10.9 to 13.5%
RE: -18.0 to 7.2%
CV: 0.7 to 11.5%
RE: -11.7 to 5.3%
CV: 2.5 to 9.5%
RR: 87.9 to 110.4%
CV: 1.3 to 3.7%

性別、進行状況などの属性情報付きアルツハイマー病患者の血清35例を購入し測定を行った。既知の情報の通り、アルツハイマー病患者ではApoE4保有者の割合が高い結果であった(Caucasian全体でのε4アレ
ル頻度は15%6))。濃度測定値に関しては、例数が少ないため統計的な評価は実施できなかったが、文献情報6)と同様の濃度範囲が得られた。
頻度(%)

ApoE
N
表現型

ApoE3/E4
LAVYQAGAR

ApoE濃度 (µg/mL)

ApoE2
CLAVYQAGAR

2.5TotalLGPLVEQGR

ApoE4
LGADMEDVR

ApoE2/ApoE3
LGADMEDVCGR

100
RT: 0.00 - 8.00

Total ApoE2 ApoE3 ApoE403.0

100

E2/E350

3.54.04.55.05.5Time (min)

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

100

E2/E4
E3/E3022
140.0
5.7
5.7
40.0

45.3
37.1
37.1

29.8
27.8-

15.4
37.1

6.0-

E3/E4

1542.9

35.4-

27.7

7.7

E4/E42

5.7

23.8-

-

15.6

ヒト血清中ApoE濃度測定結果例

60

4.0

4.5

5.0

5.5
Time (min)

6.0

6.5

7.0

7.5

40
2000.0

E3/E3

500
3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5
Time (min)

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

100

E3/E4

500
3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5
Time (min)6.0

6.57.0

7.5

8.0

0.5

1.0100274.18677
80
60E4/E4
4.0

4.5

2.5

3.0

3.5

4.0
Time (min)20

5.5Time (min)6.0

マスクロマトグラムによる
ヒト血清中ApoE表現型判定結果例

6.5

7.0

7.5

8.0

5.0

5.5

6.0

246.12657

6.5

7.5

8.0

NL: 1.30E5
200215_021#860 RT:
6.56 AV: 1 F: FTMS + p
ESI Full ms2
503.2371@hcd24.00[200.0000-1045.0000]

892.38043

764.32214

835.35895

01000200

7.0

518.25604

389.21338

NL: 1.05E6
200215_021#859 RT:
6.56 AV: 1 F: FTMS + pESI Full ms2508.2413@hcd24.00[200.0000-1055.0000]

902.38971
284.19513

LGADMEDVR(+10)
IS659.30408

405.04.5

LGADMEDVR
ApoE4 Specific Peptide

20

3.5

2.0649.29572

60

50

1.54080

10003.0

NL: 1.17E6m/z= 902.38685-902.39587
F: FTMS + p ESI Full ms2508.2413@hcd24.00[200.0000-1055.0000] MS
ICIS 200215_021

LGADMEDVR(+10)
IS8.0

100

RT: 6.57

2060

3.5

NL: 1.33E5m/z= 892.37786-892.38678
F: FTMS + p ESI Full ms2503.2371@hcd24.00[200.0000-1045.0000] MS
ICIS 200215_021

408003.0

RT: 6.56

LGADMEDVR
ApoE4 Specific Peptide

800100E2/E450528.26434

399.22168
250300350400450500

550774.33051

845.36737

596.35010
600

650700750800850

90095010001050m/z

ヒト血清中ApoE消化断片ペプチドスペクトル例

考察
我々は、ApoE2およびApoE4のリコンビナントタンパク質を標準品に使用したヒト血清中のアポリポプロテインEの各アイソフォームの分離定量可能な分析法を開発し、バリデーションを行い定量分析法として頑健な分析法であることを確認した。また、HRAM-LC-MS/MS法は定性的な評価にも有用なことが確認された。トリプシン消化を伴う複雑なマトリクス中のバイオマーカー測定においても非常に高精度なターゲット同定が可能な点は有用であると考えられる。今後、CSF中のApoE測定に向けた高感度化検討および、アルツハイマー病患者血清サンプルの測定を進めたい。ApoE濃度について、属性情報(進行度/性別/年齢など)との相関の有無を統計的に評価しバイオマーカーとしての有用性を検証したい。

参考文献

RT: 2.05 - 2.50
100

Relative AbundanceRelative Abundance

50

Mobile phase BItems

E2/E3

通常の四重極MSによる分析条件では定量妨害ピークの存在はバックグラウ
ンド上昇により容易に認識できる。一方、Q Exactive Focusの測定データをThermo Fisher Scientificのソフトウェア（TraceFinder、QuanBrowser等）で定量解析する場合、定量妨害ピークの影響によりシグナル消失が起こる。クロマトグラムのみの確認では原因がわかりにくいケースが多いので注意が必要となる。

定量妨害ピークによるシグナル消失

Water / acetic acid

本分析法は前処理で酵素消化を行うタンパク質のLC-MS/MSによる分析法であり、同様に酵素消化を伴う抗体医薬品のLC-MS/MSによる分析法に対して文献3)等で提案されている基準を用いて分析法バリデーションを実施した。
なお、標準溶液の安定性についてはメーカーの添付文書引用とし評価対象外とした。マトリックス中の安定性に関しては、文献情報5)もあることと、倫理的な観点からもボランティア採血による新鮮血を用いた評価は本バリデーション内では評価対象外とした。
また、前処理ヒト血清サンプル60本の分析を行いバッチ耐久性を確認した。
すべての測定結果は設定した基準を満たした。

E2/E2【Q Exactive Focusの条件検討における留意点】

m/z = 479.77084
分析対象

Mobile phase A【アルツハイマー病患者血清の測定】

今回の分析条件では高選択性のPRM法を採用し、バックグラウンド上昇の影響は抑制できるため、感度を優先し低濃度酢酸、水とアセトニトリル/メタノールによるグラジエント条件、添加剤無しの条件とした。

RT: 1.50 - 1.75
10060℃

Relative Abundance%PAR to max (n=3)%PA to max (n=3)

0Column temp.

【分析法バリデーション】

10050

Human serum or dog serum sample (10 µL)↓Denaturation (Urea)↓Reduction & alkylation (DTT, IAM)
↓Digestion by trypsin(Sigma-Aldrich T8003, 50 µg / sample, 37℃, 1 hour)↓Termination (10%TFA)↓LC-MS/MS analysis

Xselect CSH C18 Column, 130Å, 2.5 µm, 2.1 X 50 mm

結果

50 µg trypsin / sample

100Column

今回の検討では測定対象の5ペプチドは文献情報4)から選択した。

【酵素消化時間検討】
50 µg trypsin / sample

Sample Treatment Procedure

Relative Abundance

タンパク質 △
条件設定が難しい

Nexera X2 system(SHIMADZU CORPORATION, Kyoto, JAPAN)

LC condition

1): EH Corder et al, Science, 1993, 261, 921-923
2): Safieh et al. BMC Medicine, 2019, 17:64
3): 橋井則貴ら, Chromatography 2018, 39, 7-19
4): Eduardo Martínez-Morillo et. al., J. Proteome Res. 2014, 13, 2, 1077−10875): Irene van den Broek et. al., Clinical Chemistry 2016, 62:1, 188-197
6): Amy L. Heffernan et al, J Mol Neurosci. 2016, 60(3), 316–324.