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ハエトリソウの効率的な形質転換体作製方法の構築
大井 祥子（基礎生物学研究所技術課）

OHI Shoko : Construction of the efficient method for producing the transformants of Venus flytrap
The molecular mechanism of long-distance intercellular signaling transduction with action potentials in plants has not yet been elucidated(1). Division of Evolutionary Biology in National Institute for Basic Biology investigates the molecular mechanism of the generation andtransmission of the action potential of plants by using Venus flytrap and some other plants with rapid movement. For the purpose, weanalyze loss-of and gain-of function mutants of candidate channel molecules. However, with the current Agrobacterium transformation
method, only 2% of the shoots were regenerated as transformants after about 10 months. Therefore, we improved the following threepoints and succeeded to increase the regeneration efficiency to approximately 20% with about 4 months: 1) An antioxidant was added tothe medium to increase viable rates of explants. 2) Concentrations of culture medium was optimized. 3) Transformed tissue was surgicallyseparated from surrounding non-transformed tissue. Here, I report the three improvements in details.

1. はじめにすることが課題であった。これは、傷害ストレスによ植物の活動電位を介した長距離シグナル伝達の分子る活性酸素の影響と考え、活性酸素の量を抑制する抗機構は、いまだ明らかになっていない 。私が所属し酸化剤を培地に添加することにした。抗酸化剤を培地ている基礎生物学研究所生物進化研究部門では刺激受に添加することで、褐変する外植片数を 2％に抑える

容、伝播、応答に関わる細胞が分化している食虫植物とともに、形質転換により GFP 蛍光を検出できる外植のハエトリソウを用いて、植物の活動電位の発生と伝片を増加させた（表１）。

1)播の分子機構解明に挑んでいる。2020 年、須田氏らによって活動電位発生伝播と関連していると考えられている Ca2+イオンの細胞内濃度動態を可視化したハエト
リソウの形質転換体の作製に成功した 2)。今後は活動電位発生伝播と関連した候補チャンネル分子の過剰発現体や機能喪失変異体の形質転換体の作製を計画している。しかし、従来のアグロバクテリウム形質転換法は、感染に用いた外植片の約 2％のみ形質転換体とな

図 1. ハエトリソウ形質転換法（従来法）

り、また 10 ヶ月ほどの長期間を要し、その形質転換効
表 1. 抗酸化剤不添加・添加による感染率の比較率の低さが課題であった。
そこで、従来の形質転換法に、3 点の改善を行うことで、ハエトリソウの効率的な形質転換体作製方法を構築したので報告する。
2. 改善 1; 感染体の抗酸化剤添加処理
従来の形質転換法では、2 ヶ月間、25℃、暗所で培養

3. 改善 2; 形質転換に適する培地濃度の検討した黄化葉を感染体として用いていた（図１）。黄化葉

感染後、外植片を 2 ヶ月以上培養していると、50%を感染体として用いるのは、感染率が高く、また褐変が褐変化し、植物体地上先端部が増殖しなかった。ハ化しにくいためである。今回は、形質転換の準備期間

エトリソウは低栄養土壌で繁殖していることから、培を短縮するために黄化葉ではなく緑葉を感染体に用い地の窒素含有率が高いことが原因として考えられたたるように試みた。しかし、緑葉を感染体に用いると切め、適した培地濃度を検討することにした。まず、30断面の大部分の細胞が褐変し、35%の外植片が褐変化枚外植片を 1/2, 1/4, 1/8, 1/12 希釈の Murashige and生物学・生理学技研報 202236

Shoog 培地 3)で 25℃、暗所で培養し、２ヶ月後の褐変

5. まとめ化した外植片、植物体地上部先端部の増殖を確認した。

効率的な形質転換体作製方法の構築にあたって、ハその結果、ハエトリソウには 1/8 倍に希釈した MS 培

エトリソウの特性に適した条件を形質転換方法に取り地がハエトリソウの増殖に適すると判断した（図 2）。

入れた。改善１では、切断したハエトリソウの外植片の組織は活性酸素に影響されやすいことを考慮し、抗酸化剤を添加した。改善 2 では、貧栄養地で繁殖するハエトリソウに適した希釈培地で培養をすることで、栄養過多のストレスをなくした。改善 3 は、植物の頂芽優勢の性質とハエトリソウの強い繁殖力を生かし、形質転換組織を切り出すことで形質転換体を効率的に誘導した。今回、構築した効率的な形質転換体作製方

図 2. MS 培地 各希釈倍率における外植片の増殖

法では、外植片に対して約 20%の形質転換体作製に成かんさ功し、また形質転換体を 4 ヶ月程度で作出することがさらに培地の改良を行い、MS 培地の窒素のみ 1/8 希可能になった。

釈、窒素以外の化合物は 1/2 希釈した 1/2 MS_1/8 N 培

今後は構築した形質転換体作製方法を活用し、植物地を使用することで、外植片の褐変化率を 50%からの活動電位発生伝播機能に関連する因子の形質転換体20%以下に抑制した。の作製を計画している。

4. 改善 3; 形質転換組織の切り出し謝辞

感染に用いた外植片のうち 2%は形質転換個体を形

本研究をご指導いただきました基礎生物学研究所生

成するが、外植片の 30%は植物体地上部先端部の一部

物進化研究部門の長谷部光泰教授、瀬上紹嗣助教、真組織のみが形質転換され、増殖しなかった(図 3 上）。

野弘明特任助教、モデル植物研究支援室、埼玉大学の須田啓研究員に感謝申し上げます。
参考文献
1) Hiroaki Mano, Mitsuyasu Hasebe. (2021) Rapidmovements in plants. Journal of Plant Research 134, 3-17.
2) Hiraku Suda, Hiroatimeski Mano, Masatsugu Toyota,Kenji Fukushima, Tetsuro Mimura, Izuo Tsutsui, RainerHedrich, Yosuke Tamada and Mitsuyasu Hasebe . (2020)
Calcium dynamics during trap closure visualized intransgenic Venus flytrap. Nature Plants 6: 1219, 1219-1224.
3) Toshio Murashige and Folke Skoog. (1962) A Revised

図 3. 上；植物体地上部先端部の一部組織のみ形質転換さMedium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco
Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15, 473-497.

れている（矢印）。
下；切り出した形質転換組織の植物体地上部先端部の経過観察。

そこで、形質転換した組織を切り出し、1/2 MS_1/8 N培地で培養した。切り出した形質転換組織は１ヵ月程度で形質転換個体を形成した（図 3 下）。形質転換組織を切り出すことで、外植片の 19％が形質転換個体となり、効率的な形質転換個体の作製を可能にした。

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生物学・生理学技研報 2022