Instructions for use

GABA ELISABA E-2500

GABA ELISAEnglish1.

Introduction

1.1

Intended use and principle of the test
Enzyme Immunoassay for the quantitative determination of Gamma-aminobutyric acid (GABA) in humanplasma, serum and urine.
After extraction and derivatization Gamma-aminobutyric acid (GABA) is quantitatively determined by
ELISA.
The competitive ELISA uses the microtiter plate format. The antigen is bound to the solid phase of the
microtiter plate. The acylated analyte concentrations of the standards, controls and samples and the solid
phase bound analyte compete for a fixed number of antiserum binding sites. When the system is inequilibrium, free antigen and free antigen-antibody complexes are removed by washing. The antibody
bound to the solid phase is detected by an anti-rabbit IgG-peroxidase conjugate using TMB as a
substrate. The reaction is monitored at 450 nm.
Quantification of unknown samples is achieved by comparing their absorbance with a standard curve
prepared with known standards.

2.

Procedural cautions, guidelines, warnings and limitations

2.1 Procedural cautions, guidelines and warnings(1) This kit is intended for professional use only. Users should have a thorough understanding of this protocol
for the successful use of this kit. Only the test instruction provided with the kit is valid and has to be used
to run the assay. Reliable performance will only be attained by strict and careful adherence to the
instructions provided.
(2) This assay was validated for a certain type of sample as indicated in Intended Use (please refer to
Chapter 1). Any off-label use of this kit is in the responsibility of the user and the manufacturer cannot beheld liable.
(3) The principles of Good Laboratory Practice (GLP) have to be followed.
(4) In order to reduce exposure to potentially harmful substances, wear lab coats, disposable protective
gloves and protective glasses where necessary.
(5) All kit reagents and specimens should be brought to room temperature and mixed gently but thoroughly
before use. Avoid repeated freezing and thawing of reagents and specimens.
(6) For dilution or reconstitution purposes, use deionized, distilled, or ultra-pure water.
(7) The microplate contains snap-off strips. Unused wells must be stored at 2 °C to 8 °C in the sealed foil
pouch with desiccant and used in the frame provided.
(8) Duplicate determination of sample is highly recommended to be able to identify potential pipetting errors.
(9) Once the test has been started, all steps should be completed without interruption. Make sure that therequired reagents, materials and devices are prepared ready at the appropriate time.
(10) Incubation times do influence the results. All wells should be handled in the same order and timeintervals.
(11) To avoid cross-contamination of reagents, use new disposable pipette tips for dispensing each reagent,
sample, standard and control.
(12) A standard curve must be established for each run.
(13) The controls should be included in each run and fall within established confidence limits. The confidence
limits are listed in the QC-Report provided with the kit.
(14) Do not mix kit components with different lot numbers within a test and do not use reagents beyond
expiry date as shown on the kit labels.
(15) Avoid contact with Stop Solution containing 0.25 M H2SO4. It may cause skin irritation and burns. In caseof contact with eyes or skin, rinse off immediately with water.
(16) TMB substrate has an irritant effect on skin and mucosa. In case of possible contact, wash eyes with anabundant volume of water and skin with soap and abundant water. Wash contaminated objects before
reusing them.
(17) For information on hazardous substances included in the kit please refer to Material Safety Data Sheet(MSDS). The Material Safety Data Sheet for this product is made available directly on the website of the
manufacturer or upon request.
(18) The expected reference values reported in this test instruction are only indicative. It is recommended thateach laboratory establishes its own reference intervals.
(19) Kit reagents must be regarded as hazardous waste and disposed of according to national regulations.

Version: 12.0

Effective: 2015-07-07

2/19

2.2

Limitations
Any inappropriate handling of samples or modification of this test might influence the results.

2.2.1 Interfering substances
Serum/Plasma
Samples containing precipitates or fibrin strands or which are haemolytic or lipemic might cause
inaccurate results.
24-hour urine
Please note the sample preparation! If the percentage of the final concentration of acid is too high, thebuffer capacity of the Diluent is insufficient. As a consequence GABA will not be extracted quantitatively.
2.2.2 Drug interferences
There are no known substances (drugs) which ingestion interferes with the measurement of GABA level inthe sample.
2.2.3 High-Dose-Hook effectNo hook effect was observed in this test.
3.

Storage and stability
Store the unopened reagents at 2 - 8 °C until expiration date. Do not use components beyond the expiry
date indicated on the kit labels. Once opened the reagents are stable for 1 month when stored at
2 – 8 °C. Once the resealable pouch has been opened, care should be taken to close it tightly withdesiccant again.

4.

Materials

4.1

Contents of the kit
BA D-0090

Adhesive Foil - Ready to use

Contents:

Adhesive Foils in a resealable pouch

Volume:3 x 4 foils

BA D-0033
Contents:
BA E-2442
Contents:
BA E-0030

Macrotiter Plate - Ready to use
2 x 48 well plate, empty in a resealable pouch
Extraction Plate - Ready to use
2 x 48 well plate, precoated with cation exchanger in a resealable pouch
Wash Buffer Concentrate - Concentrated 50x

Contents:

Buffer with a non-ionic detergent and physiological pH

Volume:1 x 20 ml/vial, light purple cap

BA E-0040

Enzyme Conjugate - Ready to use

Contents:

Goat anti-rabbit immunoglobulins conjugated with peroxidase

Volume:1 x 12 ml/vial, red cap

BA E-0055

Substrate - Ready to use

Contents:

Chromogenic substrate containing tetramethylbenzidine, substrate buffer and hydrogen
peroxide

Volume:1 x 12 ml/black vial, black cap

BA E-0080

Stop Solution - Ready to use

Contents:

0.25 M sulfuric acid

Volume:1 x 12 ml/vial, light grey cap

BA E-2531
Contents:

BA E-2510

GABA Microtiter Strips - Ready to use
1 x 96 well (12x8) antigen precoated microwell plate in a resealable foil pouch withdesiccant
GABA Antiserum - Ready to use

Contents:

Rabbit anti- GABA antibody, blue coloured

Volume:1 x 6 ml/vial, blue cap

Version: 12.0

Effective: 2015-07-07

3/19

Standards and Controls - Ready to use
Cat. no.

Component

Colour/Cap

Concentration
ng/mlConcentration
nmol/lVolume/Vial

BA E-2501

white

0

0

4 ml

BA E-2502

light yellow

75

727

4 ml

BA E-2503

orange

250

2 425

4 ml

BA E-2504

dark blue

750

7 275

4 ml

BA E-2505

light grey

2 500

24 2504 ml

BA E-2506

7 500

72 7504 ml

BA E-2551

black
light green

BA E-2552

dark red

Conversion:

GABA (ng/ml) x 9.7 = GABA (nmol/l)Contents:

Acidic buffer with non-mercury preservative, spiked with defined quantity of GABABA E-2513

Refer to QC-Report for expected value andacceptable range!

4 ml
4 ml

Assay Buffer - Ready to use

Contents:

Buffer with non-mercury preservative

Volume:1 x 20 ml/vial, yellow cap

BA E-2428

Equalizing Reagent - Lyophilized

Contents:

Lyophilized protein

Volume:1 vial, brown cap

BA E-2446

D-Reagent - Ready to use

Contents:

Crosslinking agent in dimethylsulfoxide

Volume:1 x 4 ml/vial, white cap

Hazards
identification:
H318 Causes serious eye damage.
H334 May cause allergy or asthma symptoms or breathing difficulties if inhaled.
H332 Harmful if inhaled.
H315 Causes skin irritation.
H317 May cause an allergic skin reaction.
BA E-2458

Q-Buffer - Ready to use

Contents:

TRIS buffer

Volume:1 x 20 ml/vial, white cap

BA E-2561

I-Buffer - Konzentriert

Contents:

Buffer with non-ionic detergent and non-mercury preservative

Volume:1 x 4 ml/vial, light red cap

BA E-2541

Elution-Buffer - Ready to use

Contents:

Buffer with citric acid

Volume:1 x 50 ml/vial, dark green cap

BA E-2560

Diluent - Ready to use

Contents:

Buffer with acidic pH

Volume:2 x 20 ml/vial, blue cap

Version: 12.0

Effective: 2015-07-07

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BA E-2787

NaOH - Ready to use

Contents:

Sodium hydroxide solution

Volume:1 x 2 ml/vial, purple cap

Hazards
identification:
H314 Causes severe skin burns and eye damage.
* For the determination of serum and plasma, standards and controls should always be diluted 1:3[e.g. 100 µl standard + 200 µl water (deionized, distilled, or ultra-pure)]. Do not forget to correct theresult afterwards for the dilution. Urine values of GABA are higher than for serum and plasma. Dilution of
the standards is to make sure sample is measured in linear part of standard curve.
4.2

5.

Additional materials and equipment required but not provided in the kit− Calibrated precision pipettes to dispense volumes between 10 – 400 µl; 1 ml; 10 ml− Microtiter plate washing device (manual, semi-automated or automated)− ELISA reader capable of reading absorbance at 450 nm and if possible 620 - 650 nm− Microtiter plate shaker (shaking amplitude 3 mm; approx. 600 rpm)
− Vortex mixer− Absorbent material (paper towel)− Water (deionized, distilled, or ultra-pure)Sample collection and storage
PlasmaWhole blood should be collected into centrifuge tubes containing EDTA as anti-coagulant (Monovette™ or
Vacuette™ for plasma) and centrifuged at room temperature immediately after collection.
Fasting specimens or pre-feed specimens for children (2 - 3 hours after last meal) are advised.
Haemolytic and especially lipemic samples should not be used for the assay.
Storage: up to 24 hours at 2 - 8 °C, for longer period (up to 6 month) at -20 °C.
Repeated freezing and thawing should be avoided.
Serum
Collect blood by venipuncture (Monovette™ or Vacuette™ for serum), allow to clot, and separate serumby centrifugation at room temperature. Do not centrifuge before complete clotting has occurred. Patients
receiving anticoagulant therapy may require increased clotting time.
Fasting specimens or pre-feed specimens for children (2 - 3 hours after last meal) are advised.
Haemolytic and especially lipemic samples should not be used for the assay.
Storage: up to 24 hours at 2 - 8 °C, for longer period (up to 6 month) at -20 °C.
Repeated freezing and thawing should be avoided.
Urine
Spontaneous urine or 24-hour urine, collected in a bottle containing 10 - 15 ml of 6 M HCl, can be used.
If 24-hour urine is used please record the total volume of the collected urine. If the percentage of the
final concentration of acid is too high, the buffer capacity of the Diluent is insufficient. As a consequence
GABA will not be extracted quantitatively.
Storage: for longer periods (up to 6 month) at -20 °C.
Repeated freezing and thawing should be avoided. Avoid exposure to direct sunlight!

6.

Test procedure
Allow all reagents and samples to reach room temperature and mix thoroughly by gentle inversion before
use. Duplicate determinations are recommended.
The binding of the antisera and of the enzyme conjugate and the activity of the enzyme are temperaturedependent, and the absorption values may vary if a thermostat is not used. The higher the temperature,
the higher the absoption values will be. Varying incubation times will have similar influences on theabsorbance. The optimal temperature during the Enzyme Immunoassay is between 20 – 25 °C.
In case of overflow, read the absorbance of the solution in the wells within 10 minutes, using a
microplate reader set to 405 nm

6.1

Preparation of reagents
Wash Buffer
Dilute the 20 ml Wash Buffer Concentrate with water (deionized, distilled, or ultra-pure) to a final volumeof 1000 ml.
Storage: 1 month at 2 – 8 °C

Version: 12.0

Effective: 2015-07-07

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Equalizing Reagent
Reconstitute the Equalizing Reagent with 10 ml of Assay Buffer.
Reconstituted Equalizing Reagent which is not used immediately has to be stored in aliquots for max
1 month at -20 °C and may be thawed only once.
I-Buffer
Dilute the 4 ml I-Buffer Concentrate with water (deionized, distilled, or ultra-pure) to a final volume of
400 ml.
Storage: 1 month at 2 – 8 °C
D-Reagent
The D-Reagent has a freezing point of 18.5 °C. Make sure that the D-Reagent has reached room
temperature and forms a homogeneous, crystal-free solution.
6.2

Preparation of samples
The GABA ELISA is a flexible test system for various biological sample types and samples. It is notpossible to give a general advice how to prepare the samples. However, the following basics should help
the researcher to fit the protocol to his specific needs:
For the determination of samples in a range between 25 – 2500 ng/ml, standards and controls should
always be diluted 1:3 with water [e.g. 100 µl standard + 200 µl water (deionized, distilled, or ultrapure)]. This predilution of the standards has to be taken into account in the calculation of results.
The standards are diluted to make sure that the samples fall into the linear part of the standard curve.
Do not dilute samples!
For the determination of samples in a range between 75 – 7 500 ng/ml, do not dilute standards,
controls or samples.
• Avoid excess of acid: excess of acid might exceed the buffer capacity of the dilution buffer.
A pH of 3.0 during the extraction is mandatory.
• It is advisable to perform a Proof of Principle to determine the recovery of GABA from the samples.
Prepare a stock solution of GABA. Add small amounts (to change the native sample matrix as less as
possible) of the stock solutions to the sample matrix and check the recovery.
• The sample volume determines the sensitivity of this test. Determine the sample volume needed todetermine GABA in your sample by testing different amounts of sample volumes.
If you need any support in establishing a protocol for your specific purposes, do not hesitate to contact
the manufacturer directly!

6.3 Test procedure (75 – 7 500 ng/ml)
6.3.1 Extraction
1.

Pipette 100 µl of the standards, controls and samples into the appropriate wells of the Extraction
Plate.

2.

Add 100 µl of the Diluent to all wells. Cover plate with Adhesive Foil and incubate for 15 min at RT(20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

3.

Discard and blot dry by tapping the inverted plate on absorbent material. Wash each well with 500 µlof water (deionized, distilled, or ultra-pure) and incubate for 5 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker(approx. 600 rpm).

4.

Discard the wash and blot dry by tapping the inverted plate on absorbent material.

5.

Pipette 400 µl of Elution Buffer into the appropriate wells of the Extraction Plate. Cover plate with
Adhesive Foil and incubate for 10 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

6.

Use 100 µl for the subsequent derivatization!

6.3.2 Derivatization
1.

Pipette 100 µl of the extracted standards, controls and samples into the appropriate wells of theMacrotiter Plate.

2.

Pipette 10 µl of the NaOH into all wells.

3.

Add 50 µl of the Equalizing Reagent (fresh prepared before assay) to all wells and incubate for 1 min on a
shaker (approx. 600 rpm).

4.

Pipette 10 µl of the D-Reagent into all wells.

5.

Cover plate with Adhesive Foil and incubate for 2 h at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

6.

Pipette 200 µl Q-Buffer into all wells.

7.

Shake for 10 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

8.

Use 50 µl for the subsequent ELISA!

Version: 12.0

Effective: 2015-07-07

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6.3.3 GABA ELISA
1.

Pipette 50 µl of the derivatized standards, controls and samples into the appropriate wells of the
GABA Microtiter Strips.

2.

Pipette 50 µl of the GABA Antiserum into all wells and mix shortly.

3.

Cover plate with Adhesive Foil and incubate for 15 - 20 h (overnight) at 2 – 8 °C.
Alternatively incubate 2 h at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

4.

Remove the foil. Discard or aspirate the content of the wells. Wash the plate 3 x by adding 300 µl of
Wash Buffer, discarding the content and blotting dry each time by tapping the inverted plate on
absorbent material.

5.

Pipette 100 µl of the Enzyme Conjugate into all wells.

6.

Incubate for 30 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

7.

Discard or aspirate the content of the wells. Wash the plate 3 x by adding 300 µl of Wash Buffer,discarding the content and blotting dry each time by tapping the inverted plate on absorbent
material.

8.

Pipette 100 µl of the Substrate into all wells and incubate for 20 - 30 min at RT (20 – 25 °C) on a
shaker (approx. 600 rpm). Avoid exposure to direct sunlight!

9.

Add 100 µl of the Stop Solution to each well and shake the microtiter plate to ensure a homogeneous
distribution of the solution.
Read the absorbance of the solution in the wells within 10 minutes, using a microplate reader set to
450 nm (if available a reference wavelength between 620 nm and 650 nm is recommended).

10.

6.4 Test procedure (25 – 2 500 ng/ml)
6.4.1 Extraction
1.

Pipette 300 µl of the diluted standards, controls and undiluted samples into the appropriate wellsof the Extraction Plate.

2.

Add 300 µl of the Diluent to all wells. Cover plate with Adhesive Foil and incubate for 30 min at RT(20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

3.

Washing step (2 cycles):Discard and blot dry by tapping the inverted plate on absorbent material. Add 1ml of I-Buffer to eachwell and incubate the plate for 5 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).
Discard and blot dry by tapping the inverted plate on absorbent material. Add 1ml of I-Buffer to eachwell and incubate the plate for 5 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

4.

Discard and blot dry by tapping the inverted plate on absorbent material.

5.

Pipette 250 µl of Elution Buffer into the appropriate wells of the Extraction Plate. Cover plate with
Adhesive Foil and incubate for 10 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

6.

Use 100 µl for the subsequent derivatization!

6.4.2 Derivatization
1.

Pipette 100 µl of the extracted standards, controls and samples into the appropriate wells of theMacrotiter Plate.

2.

Pipette 10 µl of the NaOH into all wells.

3.

Add 50 µl of the Equalizing Reagent (fresh prepared before assay) to all wells and incubate for 1 min on a
shaker (600 rpm).

4.

Pipette 10 µl of the D-Reagent into all wells.

5.

Cover plate with Adhesive Foil and incubate for 2 h at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

6.

Pipette 150 µl Q-Buffer into all wells.

7.

Incubate for 10 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

8.

Use 25 µl for the subsequent ELISA!

Version: 12.0

Effective: 2015-07-07

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6.4.3 GABA ELISA
1.

Pipette 25 µl of the derivatized standards, controls and samples into the appropriate wells of the
GABA Microtiter Strips.

2.

Pipette 50 µl of the GABA Antiserum into all wells and mix shortly.

3.

Cover plate with Adhesive Foil and incubate for 15 - 20 h (overnight) at 2 – 8 °C.
Alternatively incubate 2 h at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

4.

Remove the foil. Discard or aspirate the content of the wells. Wash the plate 3 x by adding 300 µl of
Wash Buffer, discarding the content and blotting dry each time by tapping the inverted plate on
absorbent material.

5.

Pipette 100 µl of the Enzyme Conjugate into all wells.

6.

Cover plate with Adhesive Foil. Incubate for 30 min at RT (20 – 25 °C) on a shaker (approx. 600 rpm).

7.

Remove the foil. Discard or aspirate the content of the wells. Wash the plate 3 x by adding 300 µl of
Wash Buffer, discarding the content and blotting dry each time by tapping the inverted plate on
absorbent material.

8.

Pipette 100 µl of the Substrate into all wells and incubate for 20 - 30 min at RT (20 – 25 °C) on a
shaker (approx. 600 rpm). Avoid exposure to direct sunlight!

9.

Add 100 µl of the Stop Solution to each well and shake the microtiter plate to ensure a homogeneous
distribution of the solution.
Read the absorbance of the solution in the wells within 10 minutes, using a microplate reader set to
450 nm (if available a reference wavelength between 620 nm and 650 nm is recommended).

10.

7.

Calculation of results

Measuring range

Urine
Plasma/Serum

GABA
49 – 7 500 ng/ml
25 – 2 500 ng/ml

The standard curve is obtained by plotting the absorbance readings (calculate the mean absorbance) of
the standards (linear, y-axis) against the corresponding standard concentrations (logarithmic, x-axis).
Use non-linear regression for curve fitting (e.g. spline, 4- parameter, akima).
This assay is a competitive assay. This means: the OD-values are decreasing with increasing
concentrations of the analyte. OD-values found below the standard curve correspond to highconcentrations of the analyte in the sample and have to be reported as being positive.
Serum/plasma
The read concentrations of plasma samples have to be divided by 3.
Urine samples and controls
The concentrations of the samples and controls can be read directly from the standard curve.
The total amount of GABA excreted in urine during 24 h is calculated as following:µg/24h = µg/l x l/24h
Conversion
GABA (ng/ml) x 9.7 = GABA (nmol/l)
Expected reference value
It is strongly recommended that each laboratory should determine its own reference value.
Expected Reference
Value
7.1

Spontaneous urine

230 - 1 290 µg/g creatinine

Quality control
The confidence limits of the kit controls are indicated on the QC-Report.

Version: 12.0

Effective: 2015-07-07

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7.2

Typical standard curve
Example, do not use for calculation!
GABA
2

OD

1,5

1

0,5

0
10

100

1000

10000

ng/ml
8.

Assay characteristics
Sensitivity(lower limit of detection)

Urine (spontaneous)
49 ng/ml

Recovery

Mean (%)
104%

Range (%)
96 – 116%% Recovery after spiking

Linearity

Range (ng/ml)

Range (%)

Mean (%)

35 – 4048

74-11993

Analytical Specificity(Cross Reactivity)

Cross Reactivity (%)

Substance

GABA
GABA

100

ß-Alanine

1.6α-Aminobutyric acid

< 0.09Glycine< 0.09L-Glutamine< 0.09β-Aminobutyric acid

< 0.09Precision
Intra-Assay
Sample1
2
3Version: 12.0

Inter-Assay
Range (ng/ml)
318 ± 32723 ± 942457 ± 110

CV (%)
1013
4.9

Effective: 2015-07-07

Sample123Range (ng/ml)
279 ± 35661 ± 731492 ± 117

CV (%)
12
11
7.8

9/19

9.

References/Literature(1) Shmais et al. Mechanism of nitrogen metabolism-related parameters and enzyme activities in thepathophysiology of autism. Journal of Neurodevelopmental Disorders 4(1):4 (2012)(2) El-Ansary et al. Relationship between chronic lead toxicity and plasma neurotransmitters in autistic
patients from Saudi Arabia. Clinical Biochemistry, 44(23):1116-1120 (2011)(3) Lee et al. Astrocytes Are GABAergic Cells That Modulate Microglial Activity. Glia 59:152-165 (2011)For updated literature or any other information please contact your local supplier.
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Version: 12.0

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for useContent

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10/19

GABA ELISA

Deutsch1.

Einleitung

1.1

Verwendungszweck und Testprinzip
Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Gamma-Aminobuttersäure (GABA) in humanem
Plasma, Serum und Urin.
Gamma-Aminobuttersäure (GABA) wird extrahiert und derivatisiert und anschließend quantitativ im
ELISA bestimmt.
Der sich anschließende kompetetive ELISA basiert auf dem Mikrotiterplattenformat. Das Antigen ist aneine feste Phase gebunden. Die Analytkonzentrationen der Standards, Kontrollen und Proben und die ander festen Phase gebundenen Analytkonzentrationen, konkurrieren um die vorhandenen Bindungsstellender Antikörper. Wenn das System im Gleichgewicht ist, werden die freien Antigene und die freien
Antigen-Antikörper-Komplexe durch Waschen entfernt. Der an der festen Phase gebundene AntigenAntikörper-Komplex wird mit einem enzymmarkierten Antikörper bestimmt und mit einem Substrat durcheine Farbreaktion nachgewiesen. Die Reaktion wird bei 450 nm gemessen.
Die Konzentrationen in den Proben werden mit Hilfe einer Standardkurve ermittelt.

2.

Verfahrenshinweise, Richtlinien, Warnungen und Anwendungsgrenzen

2.1 Verfahrenshinweise, Richtlinien und Warnungen(1) Dieses Kit ist nur für den gewerblichen Gebrauch bestimmt. Für eine erfolgreiche Anwendung dieses Kits
benötigen die Anwender ein umfassendes Verständnis dieses Protokolls. Einzig die im Kit enthaltene
Testanleitung ist gültig und bei der Durchführung des Assays zu verwenden. Für eine zuverlässige
Leistung müssen die mitgelieferten Anweisungen genau und sorgfältig befolgt werden.
(2) Dieser Assay wurde für die unter Verwendungszweck (siehe Kapitel 1) angegebene Probenart validiert.
Jede nicht zugelassene Anwendung dieses Kits obliegt der Verantwortung des Anwenders und entbindetden Hersteller von jeglicher Haftung.
(3) Die Grundsätze der Guten Laborpraxis (GLP) sind zu befolgen.
(4) Bei Bedarf Laborkittel, geeignete Einweghandschuhe und Schutzbrille tragen, um die Exposition
gegenüber potenziell gesundheitsgefährdenden Stoffen zu reduzieren.
(5) Alle Reagenzien des Kits sowie die Proben sollten vor der Verwendung auf Raumtemperatur gebracht undvorsichtig aber gründlich gemischt werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Reagenzien und
Proben vermeiden.
(6) Wenn die Verdünnung oder Rekonstitution mit Wasser erfolgen soll, hierfür deionisiertes, destilliertes
oder ultra-pures Wasser verwenden.
(7) Die Mikrotiterplatte verfügt über abbrechbare Streifen. Ungenutzte Kavitäten müssen bei 2 °C bis 8 °C
mit Trockenmittelbeutel im verschlossenen Folienbeutel gelagert und im mitgelieferten Rahmen
verwendet werden.
(8) Es ist sehr empfehlenswert, eine Doppelbestimmung der Proben durchzuführen, um mögliche
Pipettierfehler erkennen zu können.
(9) Sobald der Test begonnen wurde, sollten alle Schritte ohne Unterbrechung ausgeführt werden. Es muss
dafür gesorgt werden, dass die erforderlichen Reagenzien, Materialien und Geräte zur vorgesehenen Zeiteinsatzbereit sind.
(10) Die Inkubationszeiten haben Einfluss auf die Ergebnisse. Alle Kavitäten sollten in der gleichen Reihenfolge
und zeitlichen Abfolge behandelt werden.
(11) Zur Vermeidung einer Kontamination der Reagenzien ist bei jeder Abgabe eines Reagenzes, einer Probe,
eines Standards und einer Kontrolle eine neue Einwegpipettenspitze zu verwenden.
(12) Bei jeder Testanwendung muss eine Standardkurve erstellt werden.
(13) Bei jeder Testanwendung sollten Kontrollen mitgetestet werden, deren Werte innerhalb der bekannten
Vertrauensgrenzen liegen müssen. Die gültigen Vertrauensgrenzen der Kitkontrollen können dem QCReport entnommen werden, der dem Kit beiliegt.
(14) Komponenten von Kits mit unterschiedlichen Chargenbezeichnungen nicht im selben Test verwenden.
Reagenzien nach dem auf dem Kitetikett angegebenen Verfalldatum nicht mehr benutzen.
(15) Kontakt mit der Stopplösung vermeiden, da sie 0,25 M H2SO4 enthält. Die Lösung kann Hautreizungen
und Verbrennungen verursachen. Bei Berührung mit den Augen oder der Haut sofort mit Wasser ausbzw. abspülen.
(16) Das TMB-Substrat reizt die Haut und Schleimhäute. Bei möglichem Kontakt Augen mit reichlich Wasser
und Haut mit Seife und reichlich Wasser aus- bzw. abspülen. Kontaminierte Gegenstände vor dererneuten Verwendung abspülen.
(17) Für Informationen zu den im Kit enthaltenen gesundheitsgefährdenden Stoffen siehe die
Sicherheitsdatenblatt (MSDS). Das Sicherheitsdatenblatt dieses Produkts ist direkt auf der Webseite desHerstellers abrufbar oder auf Anfrage erhältlich.
(18) Die in dieser Testanleitung angegebenen erwarteten Referenzwerte dienen nur als Hinweis. Es wird
empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Referenzbereiche erstellt.

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Effective: 2015-07-07

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(19) Die Reagenzien des Kits sind als gesundheitsgefährdende Abfälle zu betrachten und gemäß den
nationalen Vorschriften zu entsorgen.
2.2

Grenzen des Tests
Jede unsachgemäße Behandlung der Proben oder Modifikationen dieses Tests können die Ergebnisse
beeinflussen.

2.2.1 Interferenzen
Serum/Plasma
Proben, die ein Präzipitat oder die Fibrinfäden enthalten oder die hämolytisch oder lipämisch sind, können
zu ungenauen Ergebnissen führen.
Sammelurin
Probenvorbereitung beachten! Ist der Säuregehalt des 24 Stunden-Sammelurins zu hoch, reicht die
Pufferkapazität des Diluent nicht aus. In der Folge wird GABA nicht mehr quantitativ extrahiert.
2.2.2 Beeinflussung durch Medikamente
Bislang sind uns keine Stoffe (Medikamente) bekannt, deren Einnahme die Bestimmung des GABAGehaltes in der Probe beeinflusst.
2.2.3 High-Dose-Hook Effekt
Ein Hook-Effekt tritt in diesem Test nicht auf.
3.

Lagerung und Haltbarkeit
Die ungeöffneten Reagenzien sind bei 2 - 8 °C bis zum Verfallsdatum aufzubewahren. Die Reagenzien
dürfen nach Überschreiten des Verfallsdatums nicht mehr verwendet werden. Einmal geöffnet sind die
Reagenzien 1 Monat stabil, wenn sie bei 2 – 8 °C gelagert werden. Der einmal geöffnete Folienbeutel
sollte stets mit Trockenmittelbeutel sehr sorgfältig wieder verschlossen werden.

4.

Materialien

4.1

Reagenzien im Kit
BA D-0090

Adhesive Foil - Gebrauchsfertig

Inhalt:4 Klebefolien in einem wiederverschließbaren Beutel

Volumen:3 x 4 Folien

BA D-0033
Contents:
BA E-2442
Inhalt:BA E-0030

Macrotiter Plate - Gebrauchsfertig
2 x 48 Well Platte, leer in einem wiederverschließbaren Beutel
Extraction Plate - Gebrauchsfertig
2 x 48 Well Platte, beschichtet mit Kationenaustauscher in einem
wiederverschließbaren Beutel
Wash Buffer Concentrate - 50x konzentriert

Inhalt:Puffer mit einem nicht-ionischen Detergenz und physiologischem pH

Volumen:1 x 20 ml/Fläschchen, Deckel helllila

BA E-0040

Enzyme Conjugate - Gebrauchsfertig

Inhalt:Ziege Anti-Kaninchen Immunglobulin konjugiert mit Peroxidase

Volumen:1 x 12 ml/ Fläschchen, Deckel rot

BA E-0055

Substrate - Gebrauchsfertig

Inhalt:

Chromogenes Substrat mit Tetramethylbenzidin, Substratpuffer und Wasserstoffperoxid

Volumen:1 x 12 ml/ Fläschchen schwarz, Deckel schwarz

BA E-0080

Stop Solution - Gebrauchsfertig

Inhalt:0,25 M Schwefelsäure

Volumen:1 x 12 ml/ Fläschchen, Deckel hellgrau

BA E-2531
Inhalt:Version: 12.0

GABA Microtiter Strips - Gebrauchsfertig
1 x 96 Well (12x8) Antigen beschichtete Mikrotiterstreifen mit Trockenmittelbeutel ineinem widerverschließbaren Folienbeutel
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BA E-2510

GABA Antiserum - Gebrauchsfertig

Inhalt:Kaninchen Anti- GABA Antikörper, blau gefärbt

Volumen:1 x 6 ml/Fläschchen, Deckel blau

Standards und Controls - Gebrauchsfertig
Artikelnr.

Komponente Deckelfarbe

Konzentration
ng/ml

Konzentration
nmol/lVolumen/
Fläschchen

BA E-2501

weiß

0

0

4 ml

BA E-2502

hellgelb

75

727

4 ml

BA E-2503

orange

250

2425

4 ml

BA E-2504

dunkelblau

750

7275

4 ml

BA E-2505

hellgrau

2500

24250

4 ml

BA E-2506

7500

72750

4 ml

BA E-2551

schwarz
hellgrün

BA E-2552

dunkelrot

Die zu erwartenden Konzentrationen und
Akzeptanzbereiche sind auf dem QCReport angegeben

Umrechnung:

GABA (ng/ml) x 9,7 = GABA (nmol/l)Inhalt:Saurer Puffer aufgestockt mit einer definierten Menge GABABA E-2513

4 ml
4 ml

Assay Buffer - Gebrauchsfertig

Inhalt:Puffer mit quecksilberfreiem Konservierungsmittel

Volumen:1 x 20 ml/Fläschchen, Deckel gelb
Equalizing Reagent - Lyophilisiert

BA E-2428
Inhalt:Lyophilisiertes Protein

Volumen:

1 Fläschchen, Deckel braun

BA E-2446

D-Reagent - Gebrauchsfertig

Inhalt:Crosslinker in Dimethylsulfoxid

Volumen:1 x 4 ml/Fläschchen, Deckel weiß

MöglicheGefahren:
H318 Verursacht schwere Augenschäden.
H334 Kann bei Einatmen Allergie, asthmaartige Symptome oder Atembeschwerden
verursachen.
H332 Gesundheitsschädlich bei Einatmen.
H315 Verursacht Hautreizungen.
H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen.
BA E-2458

Q-Buffer - Gebrauchsfertig

Inhalt:TRIS Puffer

Volumen:1 x 20 ml/Fläschchen, Deckel weißBA E-2561

I-Buffer - Konzentriert

Inhalt:Puffer mit nicht-ionischem Detergenz und quecksilberfreiem Konservierungsmittel

Volumen:1 x 4 ml/Fläschchen, Deckel hellrot

BA E-2541

Elution-Buffer - Gebrauchsfertig

Inhalt:Puffer mit Zitronensäure

Volumen:1 x 50 ml/Fläschchen, Deckel dunkelgrün

BA E-2560

Diluent - Gebrauchsfertig

Inhalt:Puffer mit saurem pH

Volumen:2 x 20 ml/Fläschchen, Deckel blau

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BA E-2787

NaOH - Gebrauchsfertig

Inhalt:Verdünnte Natronlauge

Volumen:1 x 2 ml/Fläschchen, Deckel lila

MöglicheGefahren:
H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden.
* Für die Bestimmung von Plasma und Serum sollten die Standards und Kontrollen immer 1:3 verdünnt
werden [z.B. 100 µl Standard + 200 µl Wasser (deionisiert, destilliert oder ultra-pur)]. Die Ergebnisse
danach um den Faktor der Verdünnung korrigieren. Die GABA- Urinwerte sind höher als für Serum undPlasma. Die Verdünnung stellt sicher, dass die Probe im linearen Bereich der Standardkurve gemessen
wird.
4.2

5.

Nicht im Kit enthaltene aber zur Durchführung erforderliche Geräte und Reagenzien− Kalibrierte Präzisionspipetten zum Pipettieren von 10 – 400 µl; 1 ml; 10 ml− Waschvorrichtung für Mikrotiterplatten (manuell, halbautomatisch oder automatisch)− Photometer zur Auswertung von Mikrotiterplatten mit 450 nm- und, wenn möglich, 620 - 650 nm-Filter− Mikrotiterplattenschüttler (ca. 600 rpm mit Amplitude 3 mm)− Vortex-Mischer− Wasser (deionisiert, destilliert oder ultra-pur)− saugfähige Unterlage
Probenmaterial und Lagerung
PlasmaDas durch Venenpunktion entnommene Vollblut in einem für EDTA-Plasma vorgesehenen
Blutentnahmeröhrchen (Plasma Monovette™ oder Vacuette®) sammeln und das Plasma direkt durch
Zentrifugation (nach Angaben des Herstellers) von den übrigen Blutbestandteilen trennen.
Es wird dazu geraten, Blutproben im nüchternen Zustand - bei Kindern 2 -3 Stunden nach der letzten
Mahlzeit - zu verwenden. Hämolytische und insbesondere lipämische Proben sollten nicht verwendet
werden.
Lagerung: bis zu 24 Stunden bei 2 - 8 °C, für längere Zeit (bis zu 6 Monate) bei -20 °C
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden.
Serum
Blut durch Venenpunktion entnehmen (Serum Monovette™ oder Vacuette®), gerinnen lassen und das
Serum durch Zentrifugation (nach Angabe des Herstellers) abtrennen. Vor der Zentrifugation muss die
Gerinnung vollständig abgeschlossen sein. Bei Patienten, die Antikoagulantien erhalten, kann die
Gerinnungszeit länger dauern.
Es wird dazu geraten, Blutproben im nüchternen Zustand - bei Kindern 2 -3 Stunden nach der letzten
Mahlzeit - zu verwenden. Hämolytische und insbesondere lipämische Proben sollten nicht eingesetzt
werden.
Lagerung: bis zu 24 Stunden bei 2 - 8 °C, für längere Zeit (bis zu 6 Monate) bei -20 °C
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden.
Urin
Es kann Spontanurin oder 24 Stunden-Sammelurin verwendet werden (im Sammelbehälter werden zur
Stabilisierung des Sammelurins 10 - 15 ml 6 M HCl vorgelegt). Wird 24 Stunden-Sammelurin verwendet,
ist es notwendig, das Volumen zu bestimmen und für die spätere Auswertung der Ergebnisse zu notieren.
Ist der Säuregehalt des 24 Stunden-Sammelurins zu hoch, reicht die Pufferkapazität des Diluent nicht
aus. In der Folge wird GABA nicht mehr quantitativ extrahiert.
Lagerung: für längere Zeit (bis zu 6 Monate) bei -20 °C.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden.
Direktes Sonnenlicht vermeiden!

6.

Testdurchführung
Vor dem Gebrauch müssen alle Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht und vorsichtig durchmischt
werden. Die Durchführung von Doppelbestimmungen wird empfohlen.
Die Reaktion des Antiserums, Enzymkonjugats und die Aktivität des Enzyms sind temperaturabhängig.
Die optimale Temperatur während des Enzymimmunoassay ist zwischen 20 – 25°C. Es wird empfohlen,
dies mit einem Thermometer zu überprüfen.
Liegt die gemessene Absorption außerhalb des Messbereichs, so muss diese innerhalb von 10 Minuten nochmals bei
405 nm gemessen werden.

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6.1

Vorbereitung der Reagenzien
Waschpuffer
20 ml WASH-CONC 50X mit Wasser (deionisiert, destilliert oder ultra-pur) auf ein Endvolumen von 1000 ml
verdünnen.
Lagerung: 1 Monat bei 2 – 8 ° C
Ausgleichsreagenz
Den Inhalt eines Fläschchen EQUA-REAG (BA E-2428) mit 10 ml ASSAY-BUFF (BA E-2513) lösen.
Rekonstituiertes Ausgleichsreagenz, welches nicht benötigt wird, sollte umgehend in Aliquots für max.
1 Monat bei -20 °C gelagert werden (nur einmal auftauen).
I-Puffer
4 ml I-BUFFER mit Wasser (deionisiert, destilliert oder ultra-pur) auf ein Endvolumen von 400 ml
verdünnen.
Lagerung: 1 Monat bei 2 – 8 °C
D-Reagent D-REAGENT
Das D-REAGENT hat einen Gefrierpunkt von 18,5 °C. Es muss sichergestellt sein, dass es vor der
Verwendung Raumtemperatur angenommen hat und eine homogene, kristallfreie Lösung bildet.

6.2

Probenvorbereitung
Der GABA ELISA ist ein flexibles Testsystem für verschiedene biologische Probentypen und Volumina. Es
ist nicht möglich, eine pauschale Empfehlung zur Probenvorbereitung zu geben. Allerdings können die
folgenden Grundlagen dazu beitragen, das Protokoll an die spezifischen Anforderungen anzupassen:
Für die Bestimmung von Proben in einem Bereich zwischen 25 – 2500 ng/ml, sollten die Standards
und Kontrollen immer 1:3 mit Wasser verdünnt werden [z.B. 100 µl Standard + 200 µl Wasser(deionisiert, destilliert oder ultra-pur)]. Diese Vorverdünnung der Standards muss bei der Berechnung
der Ergebnisse berücksichtigt werden.
Die Standards werden vorverdünnt, um sicherzustellen, dass die Proben im linearen Bereich der Kurve
gefunden werden.
Keinesfalls die Proben verdünnen!
Für die Bestimmung von Proben in einem Bereich zwischen 75 – 7 500 ng/ml, keinesfalls
Standards, Kontrollen oder Proben verdünnen.
•••

Säureüberschuss vermeiden: Ein Säureüberschuss könnte die Pufferleistung des Verdünnungspuffersüberschreiten. Ein pH 3,0 während der Extraktion ist zwingend notwendig.
Es ist ratsam, ein Proof of Principle zu erstellen, um die Wiederfindung von GABA in den Proben
bestimmen zu können. Dazu eine GABA-Stocklösung herstellen. Von der hergestellten Stocklösung
kleine Mengen (um die native Probenmatrix so wenig, wie möglich zu ändern) zur Probenmatrix
hinzugeben und die Wiederfindung prüfen.
Die Probenvolumina bestimmen die Sensitivität des Tests. Zur Bestimmung von GABA in der Probe,muss vorher das Probenvolumen durch Austestung verschiedener Mengen an Probenvolumina
bestimmt werden.

Falls Sie Unterstützung bei der Erstellung eines Protokolls für Ihre spezifischen Zwecke benötigen,wenden Sie sich vertrauensvoll direkt an den Hersteller!
6.3 Testdurchführung (75 – 7 500 ng/ml)
6.3.1 Extraktion
1.

Jeweils 100 µl der Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Kavitäten der
EXTRACT-PLATE 48 pipettieren.

2.

Jeweils 100 µl DILUENT in alle Kavitäten pipettieren. Platte mit FOIL abdecken und 15 Min bei RT(20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

3.

Den Inhalt der Kavitäten ausleeren und die Restflüssigkeit durch Ausklopfen auf einer saugfähigen
Unterlage entfernen. Jede Kavität mit 500 µl Wasser (deionisiert, destilliert oder ultra-pur) waschen
und für 5 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

4.

Die EXTRACT-PLATE 48 ausleeren und Restflüssigkeit durch Ausklopfen auf einer saugfähigen Unterlage
entfernen.

5.

400 µl ELUTION-BUFF in die entsprechenden Kavitäten der EXTRACT-PLATE 48 pipettieren. Platte mit FOIL
abdecken und 10 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

6.

Jeweils 100 µl für die Derivatisierung verwenden!

Version: 12.0

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6.3.2 Derivatisierung1.

Jeweils 100 µl der extrahierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Kavitätender Ш 48 pipettieren.

2.

Jeweils 10 µl NAOH in alle Kavitäten pipettieren.

3.

Jeweils 50 µl Ausgleichsreagenz (siehe 6.1) in alle Kavitäten pipettieren und 1 Min auf einem
Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

4.

Jeweils 10 µl D-REAGENT in alle Kavitäten pipettieren.

5.

Platte mit FOIL abdecken und 2 Stunden bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm)
inkubieren.

6.

Jeweils 200 µl Q-BUFFER in alle Kavitäten pipettieren.

7.

Für 10 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

8.

Jeweils 50 µl für den ELISA verwenden!

6.3.3 GABA ELISA
1.

50 µl der derivatisierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Kavitäten derШ GABA pipettieren.

2.

50 µl AS GABA in alle Kavitäten hinzugeben und kurz schütteln.

3.
4.

Platte mit FOIL abdecken und für 15 - 20 Stunden (über Nacht) bei 2 – 8 °C inkubieren.
Alternativ für 2 Stunden bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.
FOIL entfernen und den Inhalt der Kavitäten ausleeren oder absaugen. Die Kavitäten 3 mal gründlich
mit 300 µl Waschpuffer waschen, ausleeren und die Restflüssigkeit jedes Mal durch Ausklopfen
auf einer saugfähigen Unterlage entfernen.

5.

100 µl CONJUGATE in alle Kavitäten pipettieren.

6.

Für 30 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

7.

Den Inhalt der Kavitäten ausleeren oder absaugen. Die Kavitäten 3 mal gründlich mit 300 µl
Waschpuffer waschen, ausleeren und die Restflüssigkeit jedes Mal durch Ausklopfen auf einersaugfähigen Unterlage entfernen.

8.

100 µl SUBSTRATE in alle Kavitäten pipettieren und für 20 - 30 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem
Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. Direktes Sonnenlicht vermeiden!

9.

100 µl der STOP-SOLN in alle Kavitäten pipettieren und die Miktrotiterplatte kurz schütteln.

10.

Absorption mit einem Mikrotiterplatten-Photometer bei 450 nm (falls vorhanden gegen eine Referenzwellenlänge von 620 - 650 nm) innerhalb von 10 Minuten messen.

6.4

Testdurchführung (25 – 2 500 ng/ml)

6.4.1 Extraktion
1.

Jeweils 300 µl der verdünnten Standards, Kontrollen und unverdünnten Proben in die
entsprechenden Kavitäten der EXTRACT-PLATE 48 pipettieren.

2.

Jeweils 300 µl DILUENT in alle Kavitäten pipettieren. Platte mit FOIL abdecken und 30 Min bei RT(20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

3.

Waschschritt (2 Durchgänge)Den Inhalt der Kavitäten ausleeren und die Restflüssigkeit durch Ausklopfen auf einer saugfähigen
Unterlage entfernen. 1 ml I-Puffer (siehe 6.1) hinzufügen und für 5 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem
Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.
Den Inhalt der Kavitäten ausleeren und die Restflüssigkeit durch Ausklopfen auf einer saugfähigen
Unterlage entfernen. 1 ml I-Puffer (siehe 6.1) hinzufügen und für 5 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem
Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

4.

Die EXTRACT-PLATE 48 ausleeren und Restflüssigkeit durch Ausklopfen auf einer saugfähigen Unterlage
entfernen.

5.

250 µl ELUTION-BUFF in die entsprechenden Kavitäten der EXTRACT-PLATE 48 pipettieren. Platte mit FOIL
abdecken und 10 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

6.

Jeweils 100 µl für die Derivatisierung verwenden!

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6.4.2 Derivatisierung1.

Jeweils 100 µl der extrahierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Kavitätender Ш 48 pipettieren.

2.

Jeweils 10 µl NAOH in alle Kavitäten pipettieren.

3.

Jeweils 50 µl Ausgleichsreagenz (siehe 6.1) in alle Kavitäten pipettieren und 1 Min auf einem
Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

4.

Jeweils 10 µl D-REAGENT in alle Kavitäten pipettieren.

5.

Platte mit FOIL abdecken und 2 Stunden bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm)
inkubieren.

6.

Jeweils 150 µl Q-BUFFER in alle Kavitäten pipettieren.

7.

Für 10 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

8.

Jeweils 25 µl für den ELISA verwenden!

6.4.3 GABA ELISA
1.

25 µl der derivatisierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Kavitäten derШ GABA pipettieren.

2.

50 µl AS GABA in alle Kavitäten hinzugeben und kurz schütteln.

3.
4.

Platte mit FOIL abdecken und für 15 - 20 Stunden (über Nacht) bei 2 – 8 °C inkubieren.
Alternativ für 2 Stunden bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.
FOIL entfernen und den Inhalt der Kavitäten ausleeren oder absaugen. Die Kavitäten 3 mal gründlich
mit 300 µl Waschpuffer waschen, ausleeren und die Restflüssigkeit jedes Mal durch Ausklopfen
auf einer saugfähigen Unterlage entfernen.

5.

100 µl CONJUGATE in alle Kavitäten pipettieren.

6.

Platte mit FOIL abdecken. Für 30 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren.

7.

FOIL entfernen und den Inhalt der Kavitäten ausleeren oder absaugen. Die Kavitäten 3 mal gründlich
mit 300 µl Waschpuffer waschen, ausleeren und die Restflüssigkeit jedes Mal durch Ausklopfen
auf einer saugfähigen Unterlage entfernen.

8.

100 µl SUBSTRATE in alle Kavitäten pipettieren und für 20 - 30 Min bei RT (20 – 25 °C) auf einem
Schüttler (ca. 600 rpm) inkubieren. Direktes Sonnenlicht vermeiden!

9.

100 µl der STOP-SOLN in alle Kavitäten pipettieren und die Miktrotiterplatte kurz schütteln.

10.

Absorption mit einem Mikrotiterplatten-Photometer bei 450 nm (falls vorhanden gegen eine Referenzwellenlänge von 620 - 650 nm) innerhalb von 10 Minuten messen.

7.

Berechnung der Ergebnisse

Messbereich

Urin
Plasma/Serum

GABA
49 – 7 500 ng/ml
25 – 2 500 ng/ml

Eine Standardkurve, mit deren Hilfe die Konzentration der unbekannten Proben ermittelt werden kann,wird durch Auftragen der gemessenen Standard-Extinktionen (linearer Maßstab auf der y-Achse) gegen
die entsprechenden Standardkonzentrationen (logarithmischer Maßstab auf der x-Achse) erstellt.
Für die Auswertung wird eine nicht-lineare Regression (z.B.: spline, 4- parameter, akima) verwendet.
Dieser Assay ist ein kompetitiver Assay. Das bedeutet, dass die OD-Werte mit zunehmender
Konzentration des Analyten sinken. OD Signale, die unterhalb der Standardkurve liegen, entsprechen
einer sehr hohen Konzentration des Analyten in der gemessenen Probe und müssen als positiv gewertet
werden.
Serum/ Plasma
Die Konzentrationen der Plasmaproben müssen durch den Faktor 3 dividiert werden.
Urinproben und Kontrollen:
Die Konzentrationen der Proben und Kontrollen können direkt von der Standardkurve abgelesen werden.
Die Tagesmenge GABA, die innerhalb von 24 Stunden im Urin ausgeschieden wird, errechnet sich wie
folgt:µg/24 Stunden = µg/l x l/24 Stunden
Version: 12.0

Effective: 2015-07-07

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Umrechnung
GABA (ng/ml) x 9,7 = GABA (nmol/l)Erwarteter Referenzbereich
Es wird empfohlen, dass jedes Labor seinen eigenen Referenzwert ermittelt.
Erwarteter Referenzwert

Spontanurin

230 - 1 290 µg/g Kreatinin

7.1

Qualitätskontrolle
Die Vertrauensbereiche der Kitkontrollen sind im QC-Report aufgeführt.

7.2

Typische Standardkurve
Beispiel: bitte nicht für die Auswertung verwenden!
GABA
2

OD

1,5

1

0,5

0
10

100

1000

10000

ng/ml
8.

Testcharakteristika
Sensitivität(Limit of Detection)

Spontanurin
49 ng/ml

Wiederfindung

Mittelwert (%)
104%

Bereich (%)
96 – 116%% Wiederfindung nach
AufstockungLinearität

Bereich (ng/ml)

Bereich (%)

Mittelwert (%)

35 – 4048

74-11993

Substanz

Kreuzreaktion (%)
GABA

Analytische Spezifität(Kreuzreaktion)

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GABA
ß-Alaninα-Aminobuttersäure
GlycinL-Glutaminß-Aminobuttersäure

Effective: 2015-07-07

100
1,6< 0,09< 0,09< 0,09< 0,0918/19

Präzision
Intra-Assay
Probe
1
2
3
9.

Inter-Assay
Bereich (ng/ml)
318 ± 32723 ± 942457 ± 110

CV (%)
10
13
4,9

Probe
1
2
3

Bereich (ng/ml)
279 ± 35661 ± 731492 ± 117

CV (%)
12
11
7,8

Referenzen/Literatur(1) Shmais et al. Mechanism of nitrogen metabolism-related parameters and enzyme activities in thepathophysiology of autism. Journal of Neurodevelopmental Disorders 4(1):4 (2012)(2) El-Ansary et al. Relationship between chronic lead toxicity and plasma neurotransmitters in autistic
patients from Saudi Arabia. Clinical Biochemistry, 44(23):1116-1120 (2011)(3) Lee et al. Astrocytes Are GABAergic Cells That Modulate Microglial Activity. Glia 59:152-165 (2011)

Aktuelle Literatur oder weitere Informationen zum Test werden Ihnen auf Anforderung vonIhrem Anbieter gerne zu Verfügung gestellt.
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