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フローサイトメーターを利用した、高品質モノクローナル抗体を短期間で効率よく取得する作製法の開発
坂口 敦美（東京工業大学オープンファシリティセンターバイオ部門）

SAKAGUCHI Atsumi : Rapid and high efficient methods for productions of high quality monoclonal antibodies
using flow cytometer.
Monoclonal antibodies (mAbs) are useful tools in antibody medicine, experimental medicine, and life science research. However, theconventional methods for the production have low acquisition efficiency, require a lot of time and labor for screening, and are expensive.
Therefore, the aim of this research is to solve the problems of these screening methods and establish a system that can produce and provide
high-quality monoclonal antibodies inexpensively and easily on campus.

3. 結果

1. 目的
医薬品・検査薬開発やライフサイエンス研究におい（1）ハイブリドーマの蛍光標識条件の検討てモノクローナル抗体（mAb）は非常に有用である。

ハイブリドーマ培養液に、EGFP 組換えタンパク質多くの mAb が販売されているが、高価で、目的の用途抗原を 4 nmol 添加し、2 時間培養したところ、抗 EGFPに使用できない、標的分子との結合特異性が低い等のハイブリドーマの細胞表面には蛍光抗原が結合してお課題がある。mAb 作製技術は確立されているが、通常り、一方、抗 Tubulin ハイブリドーマの細胞表面には結は用途に適う抗体の取得効率が低い上に、スクリーニ合は見られず、ハイブリドーマを特異的に蛍光標識でングに多くの時間、手間、コストがかかる。そこで、きていることを確認できた（図 1）。次に、標識の詳細スクリーニング法におけるこれらの課題を解決するこな条件を決定するため、抗原の添加量を 0、0.5、1、2、とを本研究の目的とし、学内で高品質なモノクローナ

3、4、5、10 nmol、暴露時間を 0、0.5、1、2、6 時間でル抗体を安価で、簡単に作製・提供できる環境の構築解析し、検討した。これらの検討結果より、抗原を 2を目指す。

nmol 添加、2 時間暴露を再現性の高い至適標識条件と決定した。

2. 方法
ハイブリドーマのスクリーニング法として、MIHS法を開発した。本法は、ハイブリドーマが、産生する抗体と同じ結合特異性を持つ膜型免疫グロブリンを細胞膜上に発現していることを利用する。蛍光標識した組換えタンパク質抗原を、融合後の細胞培養液に添加すると、目的抗体を産生するハイブリドーマを特異的に標識でき、これをフローサイトメーター（FCM）で分画し、1 細胞ずつウェルにソーティングすることで従来法では 6～10 週間かかっていたスクリーニングとクローニングを、1 日で完了できる。本法の確立のために、蛍光標識条件、FCM によるソーティング条件を検討し、決定した条件で抗 EGFP mAb を作製し、実証実験を行った。

図 1. ハイブリドーマの蛍光標識画像

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（2）FCM によるソーティング条件の検討

表 1. 抗 EGFPmAb 作製結果

細胞が大きく、ダメージを受けやすい融合細胞のうち、わずか 1％程度の陽性集団を、FCM を用いて 96
well プレートに 1 細胞ずつソーティングすると、通常のセットアップでは生細胞を回収できなかったため、ソーティング条件を検討した。主に、次の二点を改良した。一点目として、細胞の流路であるサンプルライン内を綿密に洗浄した。ライン内が汚れていると、細かなゴミでも細胞がぶつかった際に融合細胞がダメー

4. 考察

ジを受けるため、通常のセットアップの洗浄工程に加開発した MIHS 法で抗 EGFP mAb を作製したとこ

え、自作したシリンジ式の洗浄具を用いて、使用の度、ろ、スクリーニングとクローニングを 1 日に短縮でき、ラインを取り外し十分に洗浄した。二点目として、ウ免疫開始から約 1.5 か月で mAb を樹立できることが実

ェルの底の形に留意し、プレートを選択した。一般的証された。さらに、従来法と比較し、約 20 倍の効率でに使用される平底は、細胞がウェル底に衝突した衝撃

mAb を取得でき、免疫沈降できる割合は従来法の約 2.5により損傷することが懸念されるため、丸底を選択し、倍高いことから、高品質 mAb を取得できることも示す

ウェル底への物理的な衝撃を回避した。これらの工夫ことができた。したがって、本法は従来の mAb 作製技により、安定して 80～90 ％の効率で生細胞を回収す術の課題であった時間、手間、コストを削減することることに成功した。

が可能であり、今後学内に導入することで、高品質なmAb を安価で、簡単に作製・提供できる環境を構築で（3）抗 EGFPmAb 作製による本法の実証実験きると期待される。

決定した至適条件で、実証実験として抗 EGFP mAbを作製した。融合後の細胞を EGFP 組換えタンパク質

謝辞

抗原で標識し、FCM で解析し、非標識の融合細胞のサ本研究を行うにあたり、研究における心構え、実験ンプルの最頻値（M）より 3 倍以上の蛍光強度を示し操作や結果の考察の議論のみならず、物事の考え方にた細胞集団約 1％を陽性細胞と判断し、プレートにソいたるまで親身にご指導いただいた横浜国立大学栗原ーティングした。ソーティング後の各 well 培養上清を靖之教授に深く感謝いたします。本研究の要として利用いて、ウエスタンブロッティング法により各 mAb を用させていただいた横浜国立大学 RI センター共用機評価したところ、EGFP に反応する mAb を 15.2 ％取器の使用に際し、機器の使用方法やトラブル時の対応、得できた。他にも、ウエスタンブロッティング法陽性研究への助言をしていただき、共に研究をつくり上げの mAb について、特性を評価したところ、90.3 ％のてくださった田中陽一郎博士に深く感謝いたします。

アイソタイプが IgG、85.7 ％が免疫沈降可能な mAb で本研究にかかわってくださったみなさま、ありがとうあることが分かった（図 2、表 1）。

ございました。
参考文献
Sakaguchi A., Nakajima C., Sawano A., Tanaka Y., andKurihara Y.: Rapid and reliable hybridoma screening methodthat is suitable for production of functional structurerecognizing monoclonal antibody., J. Biosci. Bioeng.
131(6)696–702(2021)

図 2. EGFP 組換えタンパク質抗原を用いた取得 mAb の免疫沈降特許
特願 2022-008917 抗体を製造するための方法及び抗体を評価するための方法並びにこれらに関連するキット
栗原靖之、坂口敦美

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