Focusing Review

Chromatography, Vol.29 No.1 (2008)

Focusing Review

プロテオミクスにおけるナノ LC-MS システム
石濱泰*

NanoLC-MS systems in proteomics
Yasushi Ishihama*
Institute for Advanced Biosciences, Keio University and PRESTO, Japan Science and Technology Agency,
403-1 Nipponkoku, Daihoji, Tsuruoka, Yamagata 997-0017, Japan
Accepted February 1, 2008.

Abstract
Current proteomics technologies based on mass spectrometry coupled with miniaturized on-line liquid chromatography allow us analyzing
tryptic peptides for protein identificaiton with high throughput. Compared to genome sequencing and microarray-based transcriptomics, however, proteomics is still under development to achieve the complete coverage of whole proteome including protein expression profiles, protein-protein interaction and post-translational modifications. In this review, the current status of proteomic nanoLC-MS/MS systems is addressed.
In addition, the phosphorylation-focused proteome analysis systems consisting of phosphopeptide enrichment methods and nanoLC-MS ispresented as an example of post-translational modification proteome. Furthermore, the future prospects for proteome analysis systems are discussed.
Keywords: nanoLC, LC-MS, proteomics, phosphoproteome, post-translational modification, omics

えるとゲノムやトランスクリプトームは４種の核酸塩基の組

１．はじめにみ合わせからなるため，その物性のバリエーションも限られゲノムに続く第２，第３の「オーム」として，トランスク
リプトーム，プロテオーム，メタボローム，グライコーム，ているし，また PCR による増幅も可能であることから，最リピドーム等の生体関連物質群があり，これらを網羅的に解も扱いやすく，したがって測定法としての完成度も高い。一析し，その全体像を定量的に俯瞰する新しい研究分野「シス方，その翻訳産物であるプロテオームは２０種のアミノ酸の組

テム生物学」が提唱されている。しかし，これらの「オーム」

み合わせであり，物性のバリエーションもより広い。また群をすべて網羅的に，しかも定量的に測定することは現時点

PCR のような増幅も難しく，ダイナミックレンジの問題もでは困難であり，システム生物学といっても，現状では測定考慮しなければいけない。さらに Alternative splicing や翻訳が比較的容易な遺伝子発現解析とインフォマティクスを組み

後修飾を受けるため，その複雑性（対象分子種数）は遺伝子合わせた部分的な研究が多い。しかし，技術の進展により，数の１０倍以上となると言われている。質量分析計（MS）を

例えばトランスクリプトーム，プロテオームおよびメタボ

測定装置に用いる場合には，タンパク質のままでは感度の点ローム解析技術を駆使した大腸菌のシステム生物学研究などで不利であり，トリプシンなどのプロテアーゼによりペプチが報告されるようになってきた[1]。

ドに切断して測定する。このため，ヒト細胞の場合，その測定対象分子種数は優に３００万を越える。しかし，分離の観点

さて，分離分析化学の側面からこれらの測定対象分子を考慶應義塾大学先端生命科学研究所〒９９７―００１７ 山形県鶴岡市大宝寺日本国４０３―１
電話：０２３５―２９―０５７１
FAX：0235-29-0536
E-mail：y-ishi@ttck.keio.ac.jp―２５―

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から眺めると，これらのトリプシン切断ペプチドはある一定ものがもっとも広く用いられている。フリットにはシリカ粒の物性値範囲（特に分子量・脂溶性）に入っており，しかも子を焼結させたもの[12]やケイ酸塩をゾル―ゲル法で固定化

適当に疎水性がばらついているため，単一の逆相クロマトグ

したもの[23, 24]などが用いられている。カラム径も小さく

ラフィー条件でほとんどのものは測定することができる。一流速も遅いので，カラムから下流ではデッドボリュームが生方，極性・イオン性分子が多いメタボローム解析における測じないようにコネクターや接続チューブ断面に細心の注意を

定対象分子数はプロテオーム解析と比べるとはるかに少ない払う必要がある。ESI では，スプレーニードルの先端を細くが，物性の幅が大きく，単一モードのクロマトグラフィーでし，できるだけオリフィスに近づけ，試料を低流量で注入す全てを測定するのは困難である。したがって，メタボローム

ることにより，感度を上昇させることができる[19, 25]。こ解析では，LC のようなカラム交換の必要がなく，分離溶液

れはマイクロ ESI またはナノ ESI と呼ばれ（両者の定義の違の交換や印加電圧の極性だけで複数の分離条件が設定できる

いは厳密ではないが，ナノメートル領域の液滴が生じるもキャピラリー電気泳動（CE）が MS との組み合わせで使わの，すなわち先端サイズが１マイクロメートル以下のものがれることが多い。特にメタボロームではイオン性試料が大半

ナノ ESI とされている），ナノ LC と MS のインターフェーを占めるので，電気泳動法は適していると考えられる。最近

スに用いられている。この先端の先細り構造を利用してニー

では，LC でも逆相系だけではなく HILIC モードを用いて極ドル自身にクロマトグラフィー用樹脂を充填したニードル一性分子を LC-MS で測定することも報告されている[2]。

体型カラムでは，ポストカラムデッドボリュームを無視する

さて，LC の高感度化，高性能化を実現させる一般的な手ことができ，カラム前の接続部の影響も受けにくいというメ段として，充填剤およびカラム径のミクロ化がある。前者はリットがあるため，現在多くの研究室で使われている。この

２µm 以下の充填剤と耐圧 HPLC システムの市販化により現

ニードル一体型カラムではフリットなしで充填剤を保持させ

在では UPLC 等の名前で一般的になりつつある[3, 4]。またるため，当初先端径は充填剤径よりも小さめに設定されていモノリス型充填剤の開発により，新しい展開も見せている

たが，充填剤がニードルを完全に塞いでしまうケースがあり[5]。一方，後者については１９７０年代後半から８０年代にかけ

安定なカラム調製が問題となっていた[21, 26]。その後，先て，内径２０〜２５０µm のフューズドシリカキャピラリーを用

端径よりも小さい充填剤を使用しても石橋のアーチの原理でいた充填カラムを用いたキャピラリー LC が開発された[6-

充填剤を保持可能であることがわかり，先端径と充填剤径を13]。このようにミクロ化された LC システムでは吸光度検コントロールしてフリットレスカラムを調製することが可能

出器は十分な光路長を確保するのが難しいため高感度分析にとなった[27]。筆者らの研究室ではこのカラムをフューズド

は向いていない。一方，MS では，試料溶媒を揮発させ，試シリカ管の加工から自作しており，先端径と充填剤径をきち

料分子を気化，イオン化する必要があるため，一般的にはむんとコントロールすることにより，連続運転しても数ヶ月はしろ低流量での試料導入が好ましく，ミクロ化 LC との複合

安定して使えるカラムを３０分ほどで作製している。充填は，化に適している。１
９８５年にキャピラリー LC と高速原子衝撃

窒素ボンベによる圧力を利用して行っており，充填圧はせい法を用いた質量分析計とのオンライン接続システムが初めてぜい１００bar 程度である。カラムを LC システムに取り付けて報告され[14]，直ちにペプチドマッピング等に応用された[15から，流速を上昇させて２００bar の圧をかけてから，測定を-17]。ちょうど同時期に質量分析における新しいイオン化法

開始するようにしている。このように非常に「ラフ」な充填として，エレクトロスプレーイオン化法（ESI）が開発されであるにも関わらず，酢酸・水・アセトニトリル系移動相を[18]，LC とのオンライン接続が比較的容易に行えるように用いた C１８逆相グラジエント分析（アセトニトリル濃度変化

なった。その後，ESI についてもミクロ化による流速５０〜５００

４〜２４％／１０分）で，ピークの半値幅は約５秒と，非常に高nL/min での高感度化が実現し[19, 20]，９０年代後半には充填い分離効率が得られている[28, 29]。筆者らの研究室では，カラムと一体化した ESI ニードルも開発され[21, 22]，ポス

質量分析計の入り口を洗浄するのに合わせて２週間から１ヶトカラムデッドボリュームがゼロになるナノ LC-MS 分析も

月に１回はカラムを交換するようにしている。

可能となった。ポストゲノム研究が盛んになる中で，ナノニードル一体型カラムではモノリスタイプの固定相をニー

LC-MS システムはプロテオミクスを中心に日常的に使われドル中で調製することも可能であり[30, 31]，充填剤タイプ

る分析装置となってきた。ここではすでに確立しているプロでは難しい内径２０µm 以下のものにも適している。一方で，テオミクス分野での適用例を中心にしてナノ LC-MS システ

このタイプのものでは，カラムのみ，スプレーニードルのみ

ムの現状を紹介するとともに，将来の展望についても述べたを交換することは不可能であり，頻繁にどちらかを交換するい。

必要がある場合にはカラムとスプレーニードルを別々にする必要がある。
ESI を行うためには試料溶液がニードル先端で荷電してい２．ナノ LC カラムと質量分析計とのインターフェース
ナノ LC カラムとしては，内径７５〜１００µm のフューズドシ

る必要があり，当初は先細りガラスキャピラリーの先端を金リカキャピラリーに３〜５µm の C１８シリカゲルを充填した属（白金など）で被覆したものが使われていた[32]。しかし，―２６―

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石濱 泰

電気化学反応により金属コートの寿命が短くなるため，現在いるような数１０nL レベルの試料溶液のミクロ化は容易でははスプレーニードルの背面に電圧をかける液絡法が主流となく，またそのレベルの液を定量的に扱うことは，きわめてなっている。気相と液相では電気抵抗に大きな差があるの難しい。幸いなことに，C１８カラムを用いたペプチドのグラで，印加した電圧はニードル中では先端までほぼ維持される

ジエント分析においては，数１０µL の試料溶液でもカラムのことになり，長さ５０cm 程度のニードル一体型カラムでも安先端で十分にトラップ，濃縮することが可能である。プロテ

定したスプレーを得ることができる[33]。

オミクスでは通常，数 µL から１００µL 程度までの試料体積を注入する必要があるため，プレカラム（トラップカラム）が用いられることも多い。しかし，分析カラムのサイズが小さ

３．頑健性および時間効率を重視したシステム構築
プロテオミクス用ナノ LC-MS システムに供される試料

いので，十分なローディングキャパシティーと分離効率を得は，臨床検体（血液，尿，切除組織）や培養細胞などいわゆるためにはプレカラムのサイズ（内径と長さ）についても注る「きたない」試料も多く，細い配管を用いるナノ LC-MS

意を払う必要がある。特に内径０．
３〜１mm 程度で長さが２システムにとって難易度は高い。またマーカー探索などを行〜３mm のものはロットばらつきが懸念される。また，内径う場合には多数の試料を分析する必要があり，長期間にわたの小さなものをプレカラムに用いた場合，例えば内径１００るシステムの安定性を確保することと同時に測定時間をできµm，長さ２５mm のプレカラムと内径７５µm の C１８分析カラム

るだけ効率的に使うことが要求される。しかし移動相流量がを用いた場合では，プレカラムに用いる C８もしくは C１８の少ないので，グラジエント分析におけるディレイ時間やカラ種類により溶出順が変化したという報告もある[34]。上記のムの洗浄時間，戻り時間なども通常の LC に比べると全体のプレカラムに付随する問題を回避するため，筆者らはピペッ

測定時間に対する影響が大きい。また，複雑性の高い検体でトチップを用いた前処理ミクロカラムであらかじめ試料体積あれば，多次元分離も必要となり，ますます時間がかかるこを数 µL に減らすことにより，分析カラムへ直接注入するシとになる。インジェクターもシステムのデッドボリュームをステムを用いている（図１）[35]。当初は ZipTip に代表され最小にすべく，低流速に対応したものが必要となる。しかるピペットチップ型の使い捨て脱塩濃縮チップを用いていた

し，イソクラティック溶出系で理論的・実験的に要求されてが，組織由来の試料を用いた場合には試料をクリーンアップ

図１ ナノ LC-MS システムを用いるプロテオーム解析システム

 分析フロー図
タンパク質混合物試料はトリプシンなどのプロテアーゼで消化された後，StageTip で脱塩濃縮され，ナノ LC-MS に供される。
ナノ LC-MS システム
オートサンプラー中の注入バルブに注入された試料溶液は，そのままナノ LC カラムの先端で濃縮される。ナノフローポンプによるグラジエント溶出によりペプチドは分離され，カラム先端でエレクトロスプレーイオン化法によりイオン化し，質量分析計に導入される。写真はカラムの先端部を拡大したもの。先端径は約７µm で充填剤（ReproSil C18）の粒径は３µm。

―２７―

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しきれない場合があったこと，およびローディングキャパシ

分析中に次の試料注入が可能になり，総分析時間を最小にす

ティーや微量試料に対する回収率が悪かったことから，もうることができる。試料注入にはニードル一体型カラム充填で少し樹脂の充填密度が高く，クリーンアップ効果の優れたもも用いた充填器を使ったものが便利である。注入量は先端かのを，ということで，StageTip（stop and go extraction tip）とらの液滴を採取することで概算することも可能である。分析

名付けた使い捨てのミクロ固相抽出チップ（µ-SPE-Tip）を毎にカラムの交換を行わなければいけないが，カラムを使い開発した[36]。これは３M 社のエムポアディスクというテフ捨てにすることで，試料間のキャリーオーバーをまったく考

ロン繊維にクロマトグラフィー用充填剤が高密度に充填され慮する必要がなくなる。このシステムは SCX-C１８オンライた膜を，ピペットチップに埋め込んだもので，従来のもののン二次元分離システムなど一度試料を注入すれば，分画―分ようにピペッターで試料を行き来させてペプチドをトラップ

析で２０時間以上かかるようなシ ス テ ム に 適 し て い る[37,するのではなく，一方向から注入と溶出を行うので，フィル

38]。

ターとしての役割も付加したものである。この StageTip に
４．多次元分離よる前処理と組み合わせることによって，複数の試料溶液を並行処理で数マイクロリットル程度までにあらかじめろ過，タンパク質のトリプシン消化物を試料として用いるショッ

濃縮し，分析カラムに直接注入することが可能となり，これトガンプロテオミクスの場合には，試料の複雑性と広いダイにより，総分析時間の短縮，システムの安定性の著しい向ナミックレンジの問題をある程度解決するために，LC-MS

上，試料間のキャリーオーバーの低減化を一気に実現するこの分析の前に分画することは有効な手段であり，特にダイナとができた。筆者らの研究室で実際に用いているナノ LC-

および図２に示す。オートサンプラはミックレンジの問題を軽減するためのタンパク質レベルでのMS システムを図１

分画は効果的である[28]。タンパク質の分離法は色々ある

インジェクションバルブがむき出しのものを用い，さらに可が，溶解性の悪いものや塩基性・酸性タンパク質にも使える動式の台に設置することにより，MS との接続距離を最小限こと，分離力や回収率に大きな欠点がないこと，パラレルにしている。また MS 側も元のイオン源を取り外し，オリで，しかも低コストで行えること，コンタミネーションの可フィス部分をむき出しにして，x-y-z 調節が可能なカラムホ

能性が低いことなどを考慮して，筆者は SDS-PAGE を多用

ルダーをその直前に配置し，オートサンプラーとの距離を最している[39, 40]。SDS-PAGE で分離後にレーン全体を５〜小限にしている。

２０個に均等にスライス化し，ゲル内消化している。その後の分析カラムへの直接注入システムとしては，上記のようなLC-MS/MS による分析と組み合わせて，筆者らはこの手法

オートサンプラーを用いたシステムだけではなく，LC シス

を Gel-enhanced LC-MS，略して GeLCMS と呼んでいる。余テムとは独立にカラムにあらかじめ試料を注入しておき，そ談だが，２００３年のアメリカ質量分析学会で初めて筆者らがGeLCMSのカラムを LC システムにセットするという方法もある。こという略号を用いた時，全く独立にコロラド大の場合は LC システム中にインジェクターが不必要となり，学のグループも同様の略号を用いていた。現在では論文のタデッドボリュームやグラジエントディレイ時間を最小限にでイトル中にも使われる例も散見され，一般化しつつある。ちなみに方法自体は筆者らが創始したわけではなく，Simpson

きるというメリットがある。さらに複数のカラムを用いればらが２０００年にすでに膜タンパクデータベース用に用いている[41]。
ペプチドレベルでの分画の場合は，例えばオンライン二次
元 LC-MS/MS システムで全自動で行うことができるが，分画操作は直列処理でしか行えないので，全体として効率が落ちてしまわないよう，分画数にも注意する必要がある。筆者
らは前述の StageTip を用いて並列処理で分画することで効率を上げている[42]。使い捨てなのでコンタミネーションを考慮する必要がないのも実用的であり，９６well フォーマット
で並列処理するので，LC-MS 用注入プレートに直接適用できる。４分画程度であれば，分画間の重なりは１５％程度である。SCX 以外の StageTip を用いることも可能であり，Tip 作

図２ ナノ LC-MS システム
筆者らの研究室で実際に用いているシステム。装置構成は，
ポンプ：Dionex Ultimate 3000， オートサンプラー：CTC
Analytics 社 HTC-PAL， カラム：自作， インターフェース（x-y-z ステージを含む）：日京テクノス㈱によるカスタム
品， 質量分析計：Thermo Fisher Scientific 社 LTQ-Orbitrap。







製法も含めて詳細なプロトコールを公開しているので，参考にされたい[36]。そのほかには，移動相に少量のイオンペア



試薬（トリフルオロ酢酸やヘプタフルオロ酪酸を０．
００５〜



０．
０２％程度）を加え，ペプチドの溶出パターンを変化させたり[39]，繰り返し分析の際に前に同定されたものを排除しな―２
８―

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石濱 泰

がら分析を繰り返す方法[43]などがあり，これらは分画法とヒトタンパク質の２０〜３０％はリン酸化を受けているといわれいうわけではないが，より多くのペプチドを同定するというているが，その全体像は未だ不明である。２１世紀に入って，目的には有用である[39]。

プロテオームレベルでのリン酸化ペプチド濃縮法開発が積極的に展開され，特にこの２，３年で飛躍的な進歩を見せてい数回繰り返し分析ができるくらいの試料量がある場合に，同定の効率をあげる最も効率的な手段は，筆者の経験では違る。その一例を図３に示す。UniProt（Release５４．
１，２１-Aug-う質量分析計を使うことである。例えばアプライドバイオシ

２００７）には２
００６年１２月までに発表されたすべてのリン酸化プ

ステム社の QSTAR（ハイブリッド四重極―飛行時間型）とロテオミクス論文の結果がインプットされている。筆者らがサーモフィッシャー社の LTQ（リニアイオントラップ型）

開発したヒロドキシ酸修飾酸化金属クロマトグ ラフィー

では，得意とする m/z 領域が違うだけではなく[44]，衝突誘（HAMMOC）によるヒト由来培養細胞のリン酸化ペプチド

起解離パターンも違うことから，同じ試料で，同じ LC 条件

同定結果（２００７年６月以降，２００８年１月３１日まで，筆者らのを用いても，異なるペプチドをより多く同定することが可能

研究室のみでの結果）を UniProt データと照合してみた（図である。

３）。その結果，たった１つの研究室の７ヶ月間のみの結果

プロテオミクスだけではなく，メタボロミクスでもイオンにも関わらず，時間の経過とともに，直線的に同定数が増し

交換クロマトグラフィーや親水性相互作用クロ マ トグラており，しかも数だけを見れば，UniProt 登録数をすでに上フィー（HILIC）などが逆相クロマトグラフィーと組み合わ回っている。データのオーバーラップが非常に少ない理由

せた二次元 LC の一次元目として用いられている[45]。特には，用いた試料の処理方法の違いだと考えている。すなわ

HILIC は逆相系では保持できない極性成分の分析に対して有ち，通常のリン酸化プロテオーム解析の試料は，より多くの効である。プロテオミクスでは SCX と WAX を混合させる
ことにより生じるドナー効果を使って，より幅の広い化合物を分画することができることも報告されている[46]。
５．リン酸化プロテオミクス
特定の官能基のみにアフィニティーをもつ樹脂を用いることでその官能基を有する化合物群を選択的に濃縮することも可能であり，例えばプロテオミクスでは鉄イオンやガリウム
イオンを固定化した金属固定化クロマトグラフィー（IMAC）を用いてリン酸化ペプチドの濃縮が行われている[47]。筆者らは，IMAC の代わりにチタニアやジルコニアな
どの金属酸化物を乳酸などの親水性ヒドロキシ酸で修飾した担体を用いて，リン酸化ペプチドの濃縮を行っている[36, 48,
49]。このような濃縮ステップなしで，細胞抽出物試料のナ
ノ LC-MS 分析を行っても，リン酸化ペプチドを同定することはできない。これは，一般的にリン酸化を受けるタンパク質の存在量は，いわゆるハウスキーピングタンパク質の存在量よりもはるかに少なく，しかもその中でリン酸化を受けている割合はさらに少ないからである。また，リン酸化ペプチ

図３

ドの MS 装置中の衝突誘起解離によるフラグメント化過程に

おいても，リン酸基の存在により，アミノ酸配列に関する十分な情報が取れないことがしばしばあり，さらにリン酸基を有するペプチドは ESI におけるイオン化効率も一般的に低い。データベース検索による同定の過程でも，「セリン，スレオニン，チロシンの一部はリン酸基で修飾されているかもしれない」という条件で検索するので，検索対象が拡大し，同定精度が低下する。これらの理由から，リン酸化タンパク質，ペプチドに対する濃縮はリン酸化プロテオーム解析にとって必須のステップとなっている。
タンパク質リン酸化は細胞内情報伝達経路において重要な役割を担うなど，様々な細胞機能をコントロールしている。

―２９―

リン酸化プロテオミクスによるタンパク質リン酸化の同定
分析フロー図C８―StageTip にチタニアを充填したリン酸化ペプチド濃縮カラム（写真）でリン酸化ペプチドを選択的に濃縮した
後，ナノ LC-MS システムで分析する。
UniProt データベースに登録されているヒトタンパク質のリン酸化サイトと HAMMOC 法で筆者の研究室で検出されたリン酸化サイトの比較
UniProt データが公開された２００７年８月以降，HAMMOC法によるリン酸化サイトは１ヶ月当たり約２０００サイトのペースで増加している（HAMMOC 法は２００７年６月以降のデータを採用）。オーバーラップは飽和傾向にあるが，
HAMMOC ユニークなリン酸化サイトは直線的に増加している。

Chromatography, Vol.29 No.1 (2008)[3]

リン酸化サイトを検出するために，リン酸化反応を活性化さ

Mellors, J. S.; Jorgenson, J. W. Anal Chem. 2004, 76, 5441
−5450.

せるべく，前もって細胞を成長因子や脱リン酸化酵素阻害剤[4]で処理しているため，定常状態では発現していないリン酸化

Churchwell, M. I.; Twaddle, N. C.; Meeker, L. R.; Doerge,
D. R. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.

サイトが多数存在すると考えられる。一方，筆者らは，試料

2005, 825, 134−143.

の定常状態でのリン酸化（より少ない量のリン酸化）を測定[5]しているために，UniProt に登録されていないユニークなリ

Ishizuka, N.; Minakuchi, H.; Nakanishi, K.; Soga, N.;

ン酸化サイトが同定されているものと考えている。HAM-

Nagayama, H.; Hosoya, K.; Tanaka, N. Anal Chem. 2000,

MOC 法の現状の性能は，前分画なしに細胞抽出液のトリプ

72, 1275−1280.

シン消化物（５０µg 程度）からそのまま直接リン酸化ペプチ[6]Takeuchi, T.; Ishii, D. J Chromatogr. 1980, 190, 150−155.

ド濃縮を行い，１回のナノ LC-MS 測定で１０００個程度のリン[7]

Takeuchi, T.; Ishii, D. J Chromatogr. 1981, 218, 199−208.

酸化サイトを同定することが可能であり，図３にも示すよう[8]

Takeuchi, T.; Ishii, D. J Chromatogr. 1981, 213, 25−32.

に従来法よりも格段に進歩していると考えられる。しかし，[9]

Takeuchi, T.; Ishii, D. J Chromatogr. 1982, 238, 409−418.

一方で現状の HAMMOC 法では同定できない一群のリン酸[10] Yang, F. J. J Chromatogr. 1982, 236, 265−277.

化ペプチドがあることもわかってきた[49]。これらのリン酸[11] Shelly, D. C.; Gluckman, J. C.; Novotny, M. Anal Chem.
1984, 56, 2990−2992.

化ペプチドは，例えば結晶形の異なる高温処理チタニアを用[12] Kennedy, R. T.; Jorgenson, J. W. Anal Chem. 1989, 61,

いた場合に数百サイトがまとめて同定されており，まだまだ1128.

改良する必要がある。今のところ，リン酸化プロテオームの[13] Karlsson, K. -E.; Novotny, M. Anal Chem. 1988, 60, 1662−

全体像が一体どのくらいであるのかまだ不明であるが，更な1665.

る技術開発とともに，この分野が発展していき，ライフサイ[14] Ito, Y.; Takeuchi, T.; Ishii, D.; Goto, M. J Chromatogr.

エンスへのより大きな貢献へつながることは間違いないと考1985, 346, 161−166.

える。

[15] Caprioli, R. M.; DaGue, B.; Fan, T.; Moore, W. T. Biochem
Biophys Res Commun. 1987, 146, 291−299.

６．今後の展望[16] Deterding, L. J.; Moseley, M. A.; Tomer, K. B.; Jorgenson,

ここ数年様々なタイプのハイブリッド型質量分析計が開発

J. W. Anal Chem. 1989, 61.

され，質量分析計の性能は大きく向上し，高速スキャンやよ[17] Henzel, W. J.; Bourell, J. H.; Stults, J. T. Anal Biochem.

り広いダイナミックレンジ，高い質量精度などが実現されている。一方，LC 側では UPLC やモノリス型のカラムなど新1990, 187.
[18] Yamashita, M.; Fenn, J. B. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4451−

しい技術がでてきているものの，その性能はまだまだ質量分4459.

析計に追いついていない。充填剤タイプの HPLC 用カラム

[19] Emmett, M. R.; Caprioli, R. M. J Am Soc Mass Spectrom.

のミクロ化は限界にきており，サブミクロン充填剤相当の骨1994, 5, 605−613.

格をもったモノリスでの分離の向上に期待したい。いずれに[20] Wilm, M.; Mann, M. Int J Mass Spectrom Ion Processes.

せよ，翻訳後修飾なども含めた全プロテオームの解析という1994, 136, 167−180.

目的にはまだまだあらゆる部分での技術開発が必要とされて[21] Davis, M. T.; Lee, T. D. J Am Soc Mass Spectrom. 1998, 9,

いるが，その一方ですでに現状の技術を用いた生命科学への194−201.

応用研究もどんどんされている。今後もこの分野は技術革新[22] Gatlin, C. L.; Kleemann, G. R.; Hays, L. G.; Link, A. J.;と生命科学への応用という両輪でバランスをとりながら，

Yates, J. R., 3rd Anal Biochem. 1998, 263, 93−101.

益々発展していくと思われる。

[23] Piraino, S. M.; Dorsey, J. G. Anal Chem. 2000, 75, 4292−
4296.

参照文献
[1]

[24] Behnke, B.; Bayer, E. J. Chromatogr. A 1995, 716, 207−

Ishii, N.; Nakahigashi, K.; Baba, T.; Robert, M.; Soga, T.;

213.

Kanai, A.; Hirasawa, T.; Naba, M.; Hirai, K.; Hoque, A.;
Ho, P. Y.; Kakazu, Y.; Sugawara, K.; Igarashi, S.; Harada,[25] Wilm, M.; Mann, M. Anal Chem. 1996, 68, 1−8.

S.; Masuda, T.; Sugiyama, N.; Togashi, T.; Hasegawa, M.;[26] McGinley, M. D.; Davis, M. T.; Robinson, J. H.; Spahr, C.

Takai, Y.; Yugi, K.; Arakawa, K.; Iwata, N.; Toya, Y.;

S.; Bures, E. J.; Beierle, J.; Mort, J.; Patterson, S. D. Elec-Nakayama, Y.; Nishioka, T.; Shimizu, K.; Mori, H.; Tomita,

trophoresis. 2000, 21, 1678−1684.
[27] Ishihama, Y.; Rappsilber, J.; Andersen, J. S.; Mann, M. J

M. Science 2007, 316, 593−597.
[2]

Chromatogr A 2002, 979, 233−239.

Tolstikov, V. V.; Fiehn, O.; Tanaka, N. Methods Mol Biol.

[28] Ishihama, Y. J. Chromatogr. A 2005, 1067, 73−83.

2007, 358, 141−155.

―３０―Chromatography, Vol.29 No.1 (2008)[29] 石濱泰

石濱 泰

Waters, A. P.; Stunnenberg, H. G.; Mann, M. Nature 2002,

J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 2007, 55, 157−164.

419, 537−542.

[30] Moore, R. E.; Licklider, L.; Schumann, D.; Lee, T. D. Anal[41] Simpson, R. J.; Connolly, L. M.; Eddes, J. S.; Pereira, J. J.;

Chem. 1998, 70, 4879−4884.

Moritz, R. L.; Reid, G. E. Electrophoresis 2000, 21, 1707−[31] Luo, Q.; Tang, K.; Yang, F.; Elias, A.; Shen, Y.; Moore, R.

32.

J.; Zhao, R.; Hixson, K. K.; Rossie, S. S.; Smith, R. D. J

[42] Ishihama, Y.; Rappsilber, J.; Mann, M. J. Proteome Res.

Proteome Res. 2006, 5, 1091−1097.

2006, 5, 988−994.

[32] Valaskovic, G. A.; Kelleher, N. L.; McLafferty, F. W. Sci-[43] Kristensen, D. B.; Brond, J. C.; Nielsen, P. A.; Andersen, J.

ence 1996, 273, 1199−1202.
[33] Mazereeuw, M.; Hofte, A. J. P.; Tjaden, U. R.; van derR.; Sorensen, O. T.; Jorgensen, V.; Budin, K.; Matthiesen,

Greef, J. Rapid Commun Mass Spectrom. 1997, 11, 981−

J.; Veno, P.; Jespersen, H. M.; Ahrens, C. H.; Schandorff,

986.

S.; Ruhoff, P. T.; Wisniewski, J. R.; Bennett, K. L.; Podtelejnikov, A. V. Mol Cell Proteomics 2004, 3, 1023−1038.

[34] Murphy III, J. P.; Valaskovic, G. A. In Proceeding of 51st

[44] 石濱泰 In できマス！プロテオミクス

ASMS conference Montral, Canada, 2003, p TPP293.
[35] Rappsilber, J.; Ishihama, Y.; Mann, M. Anal Chem. 2003,

質量分析によるタンパク質解析のコツ ；小田吉哉，夏目徹，Eds.；

75, 663−670.

中山書店：東京，２００４，p９３−１０３．

[36] Rappsilber, J.; Mann, M.; Ishihama, Y. Nat Protoc 2007, 2,[45] Tolstikov, V. V.; Fiehn, O. Anal Biochem. 2002, 301, 298−

1896−1906.

307.

[37] Link, A. J.; Eng, J.; Schieltz, D. M.; Carmack, E.; Mize, G.

[46] Motoyama, A.; Xu, T.; Ruse, C. I.; Wohlschlegel, J. A.;

J.; Morris, D. R.; Garvik, B. M.; Yates, J. R., 3rd Nat

Yates, J. R., 3rd Anal Chem. 2007, 79, 3623−3634.

Biotechnol. 1999, 17, 676−682.

[47] Stensballe, A.; Andersen, S.; Jensen, O. N. Proteomics.

[38] Washburn, M. P.; Wolters, D.; Yates, J. R., 3rd Nat Biotech-

2001, 1, 207−222.

nol. 2001, 19, 242−247.

[48] Sugiyama, N.; Masuda, T.; Shinoda, K.; Nakamura, A.;[39] Kerner, M. J.; Naylor, D. J.; Ishihama, Y.; Maier, T.; Chang,

Tomita, M.; Ishihama, Y. Mol Cell Proteomics 2007, 6,

H. C.; Stines, A. P.; Georgopoulos, C.; Frishman, D.; Hayer-

1103−1109.

Hartl, M.; Mann, M.; Hartl, F. U. Cell. 2005, 122, 209−220.

[49] Imami, K.; Sugiyama, N.; Kyono, Y.; Tomita, M.; Ishihama,[40] Lasonder, E.; Ishihama, Y.; Andersen, J. S.; Vermunt, A.

Y. Anal Sci. 2008, 24, 161−166.

M.; Pain, A.; Sauerwein, R. W.; Eling, W. M.; Hall, N.;―３１―