LC-MS/MS によるヒト⾎清中アポリポプロテイン E アイソフォーム定量分析法開発

Method Development of an LC-MS/MS Method to Determine Apolipoprotein E Isoforms in Human Serum〇 星野 雅輝、新⽥ 真⼀郎、若林 弘樹、上⽥ 哲也（株式会社ＬＳＩメディエンス）〇 Masaki Hoshino, Shin-ichiro Nitta, Hiroki Wakabayashi, Tetsuya Ueda (LSI Medience Corporation)

⽬的
APOE遺伝⼦のε4アレルはアルツハイマー病の危険因⼦とされている。既に遺伝⼦検査が⼀般的に⾏われているが、定量的な評価は難しい。今回、LC-MS/MSを⽤いて⽣体試料中でのタンパク質濃度としてのアポリポプロテインE（ApoE）の主要な3アイソフォーム（ApoE2, ApoE3, ApoE4）の分離定量が可能な分析法の構築を⽬的として検討を⾏った。質量分析計
としては⾼分解能精密質量（HRAM）分析が可能な Q Exactive Focus を使⽤し、定量と定性を兼ね備えた分析法を構築することとした。汎⽤試薬を使⽤し、多量のサンプル測定でも効率的に測定できる分析時間とするなど、頑健な分析法を構築するための条件を検討した。

分析法検討

結果

【分析対象ペプチドおよび代替マトリックス選定】【分析法バリデーション】

既報1)をもとに主要アレル箇所を含む4ペプチド断⽚と各アイソフォームに共通の 1 ペプチド断⽚を測定する⼿法とした。
また、リコンビナントタンパク質を標準物質として検量線を作成するために代替マトリックスをIn silico ベースで検討し、イヌの⾎清を検量線作成⽤の代替マトリックスに選定した。
定量⽤の標準物質としては ApoE2 及び ApoE4 のリコンビナントタンパク質を使⽤し、内標準物質としては各ペプチド断⽚の安定同位体標識体を使⽤した。

本分析法は前処理で酵素消化を⾏うタンパク質のLC-MS/MSによる分析法であり、同様に酵素消化を伴う抗体医薬品のLC-MS/MSによる分析法に対して⽂献2)等で提案されている基準を⽤いて分析法バリデーションを実施した。
なお、標準溶液の安定性についてはメーカーの添付⽂書引⽤とし評価対象外とした。マトリックス中の安定性に関しては、⽂献情報3)もあることと、倫理的な観点からもボランティア採⾎による新鮮⾎を⽤いた評価は本バリデーション内では評価対象外とした。
また、前処理ヒト⾎清サンプル60本の分析を⾏いバッチ耐久性を確認した。
すべての測定結果は設定した基準を満たした。

Dog_ApoE
Rat_ApoE
Human_ApoE3
Human_ApoE2
Human_ApoE4

Items

Descriptions

Criteria

Results

Selectivity

6 individual human serum

Matrix Effect

IS: PA in IS-non-spiked sample ≤5.0% of PA in IS-spiked sample-20.0% ≤ RE ≤ 20.0%
CV ≤ 20.0%

6 individual human serum
Intact and spiked (50 µg/mL each for
ApoE2 and ApoE4)
Surrogate matrix (dog serum) blank
Analyte:sample injection after calibration curve PA in blank sample ≤ 20.0% ofinjection
PA in LLOQ sample
3 daysIS:
PA in blank sample ≤ 5.0% of
PA in LLOQ sample
Surrogate matrix (dog serum)-20.0% ≤ RE ≤ 20.0%
1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 µg/mL(LLOQ: -25.0% ≤ RE ≤ 25.0%)
n=1, 3 days
6 points or higher(Including LLOQ/ULOQ)
Surrogate matrix (dog serum)-20.0% ≤ RE ≤ 20.0%(No criterion for 0 µg/mL sample)
1, 3, 20, 160 µg/mL
Human serum(LLOQ: -25.0% ≤ RE ≤ 25.0%)0 (intact), 50 µg/mL
CV ≤ 20.0%
n=5, 3 days
(LLOQ: CV ≤ 25.0%)
Surrogate matrix (dog serum)-20.0% ≤ RE ≤ 20.0%(No criterion for 0 µg/mL sample)
1, 3, 20, 160 µg/mL
Human serum(LLOQ: -25.0% ≤ RE ≤ 25.0%)
CV ≤ 20.0%0 (intact), 50 µg/mL(LLOQ: CV ≤ 25.0%)
n=15 (whole results of intra-batch)
80.0% ≤ RR ≤ 120.0%
Surrogate matrix (dog serum)
3, 160 µg/mL
Human serum
0 (intact), 50 µg/mLn=348 hours in an autosampler set at 4℃
Determined values for each serum
6 individual human serum
CV ≤ 20.0%
Preparation: n=1
Injection: n=10/sample (total 60)
Visual inspection on each peak

No interferingpeak
RE:-3.4 to 3.1%
CV: 6.1 to 7.9%∙∙∙RLRADMEDVRNRL∙∙∙RRLAVYKAGVRE∙∙∙RLWPLLEQARE∙∙∙∙∙∙RLGADMEDLRNRL∙∙∙KRLAVYKAGAQE∙∙∙RLGPLVEQGRQ∙∙∙∙∙∙RLGADMEDVCGRL∙∙∙KRLAVYQAGARE∙∙∙RLGPLVEQGRV∙∙∙∙∙∙RLGADMEDVCGRL∙∙∙KCLAVYQAGARE∙∙∙RLGPLVEQGRV∙∙∙∙∙∙RLGADMEDVRGRL∙∙∙KRLAVYQAGARE∙∙∙RLGPLVEQGRV∙∙∙ApoE2 SpecificCommon

Carry-Over【酵素消化時間検討】
50 µg trypsin / sample

50 µg trypsin / sample
100%PAR to max (n=3)%PA to max (n=3)

100500CalibrationCurve

50000.51236243000.51Digestion time (h)C(CAM)LAVYQAGAR‐2/y8

LAVYQAGAR‐2/y6

LGADMEDVR‐2/y8

LGADMEDVC(CAM)GR‐2/y62362430Digestion Time (h)LGPLVEQGR‐2/y6

C(CAM)LAVYQAGAR‐2/y8

LAVYQAGAR‐2/y6

LGADMEDVR‐2/y8

LGADMEDVC(CAM)GR‐2/y6

LGPLVEQGR‐2/y6

事前の検討で E2/E3, E3/E4 の表現型を⽰していた 2 例の⾎清をプールし酵素消化時間を評価した。1時間から6時間までピーク⾯積としては減少、ピーク⾯積⽐としては微増の傾向を⽰した。両者のバランスから消化時間としては 1 時間を採⽤した。

Intra-Batch
Accuracy andPrecisionInter-Batch
Accuracy andPrecision

前処理、測定条件【標準物質および試薬】
ヒト⾎清は Biopredic International (Saint Grégoire, FRANCE)、イヌ⾎清
は北⼭ラベス（⼭⼝、⽇本）、ApoE2 および ApoE4 リコンビナントタン
パク質は PEPROTECH (NJ, USA)、内標準物質⽤の安定同位体ペプチドはBio-Synthesis (TX, USA)、トリプシン(Product Code T8003)は SigmaAldrich (東京、⽇本)のものを購⼊した。その他試薬は各社より特級以上のグレードの試薬を購⼊した。また、Milli-Q⽔を使⽤した。

Stability in anAutosampler
for 48 Hours

Batch Size↓Denaturation (Urea)↓Reduction & alkylation (DTT, IAM)
↓Digestion by trypsin (Sigma-Aldrich T8003, 50 µg / sample, 37℃, 1 hour)↓Termination (10%TFA)

03.0

LC-MS/MS analysis

Human Serum
Sample-1
E2/E3
3.5

4.0

4.5

100

5.0

5.5
Time (min)

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

Human Serum
Sample-2
E3/E3【測定条件】

03.0

LC condition

Nexera X2 system (SHIMADZU CORPORATION, Kyoto, JAPAN)

100Column

Xselect CSH C18 Column, 130Å, 2.5 µm, 2.1 X 50 mm (Waters, MA, USA)

50Run timeAcetonitrile / methanol / acetic acid

MS condition

Q Exactive Focus (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)

Ionization mode

ESIAnalysis mode

PRM

Detection mode

PositiveResolution

70,000

Monitoring ions

[M+2H]2+
LGADMEDVC(CAM)GR, LGADMEDVR, LAVYQAGAR,C(CAM)LAVYQAGAR, LGPLVEQGR
And corresponding 5 heavy Isotope labeled peptides for IS

SoftwareTraceFinder 4.1 & Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)

Product Ions
forquantification

LGADMEDVC(CAM)GR: m/z = 735.30901 (y6+)
LGADMEDVR: m/z = 892.38291 (y8+)
LAVYQAGAR: m/z = 665.33655 (y6+)
C(CAM)LAVYQAGAR: m/z = 835.44208 (y8+)
LGPLVEQGR: m/z = 701.39406 (y6+)
IS: corresponding fragments of heavy isotope labeled peptides±5 ppmMethodInternal standard method

Model

Y=aX+b, 1/X2 weighting

3.5

100

Linear Gradient

4.0

4.5

CV: 1.3 to 3.7%
No issueson each peak

5.0

5.5
Time (min)

6.0

6.5

7.0

7.5

4.5

3.5

4.0

LAVYQAGAR

4.540

5.5
Time (min)

6.0

6.5

7.0

7.5

RT: 6.47

NL: 1.39E6m/z= 902.38685-902.39587
F: FTMS + p ESI Full ms2
508.2413@hcd24.00[200.0000-1055.0000] MS
ICIS 190723_151

Heavy Isotope Labeled
LGADMEDVR(+10)

208.08.0

NL: 1.57E5m/z= 892.37786-892.38678
F: FTMS + p ESI Full ms2
503.2371@hcd24.00[200.0000-1045.0000] MS
ICIS 190723_151

2000.0100

5.0

RT: 6.46

ApoE4 Specific Peptide
LGADMEDVR

4080

0.5

1.0

2.0

2.5

3.0274.18728

y3+
Δ=-0.3 ppm

4020801.5y2+Δ=-0.3 ppm

60

0100

CalibrationSample50 µg/mL

5003.04.060

Human Serum Sample
E3/E4 Phenotype60

Human Serum
Sample-3
E3/E403.012.0 min

Window3.580

80

Relative Abundance

50

Mobile phase B

RR: 87.9 to 110.4%

0100

100

Water / acetic acid

RE: -11.7 to 5.3%
CV: 2.5 to 9.5%

RT: 0.00 - 8.00

50↓

Mobile phase A

RE: -18.0 to 7.2%
CV: 0.7 to 11.5%

各アイソフォーム定量と同様に表現型判定もApoE分析法に要求される事項の⼀つである。クロマトグラムによる表現型判定は既報1)などと同様に問題なく実施可能である。また、Q Exactive Focusを⽤いているため各ペプチド断⽚のMS/MSスペクトルでの同定が可能である。特にApoE4の有無は機微な情報であるため、より⾼精度な同定が可能なことは本分析法の⼤きな利点である。
10060℃

RE: -10.9 to 13.5%【定性分析法としての評価】

Human serum or dog serum sample (10 µL)

Column temp.

No interferingpeak

PA: Peak area

【前処理条件】

Relative Abundance

ApoE4 Specific389.21421+10y4+
Δ=0.9 ppm

3.5

4.0
Time (min)

4.5

5.0

6.0

6.5

7.0

7.5

y7+
892.38209
y6+
Δ=-0.9 ppm
y8+
Δ=-0.5 ppm
y5+
Δ=-0.9 ppm
Δ=-0.2 ppm
649.29724

764.32391+10NL: 7.19E5
190723_151#829-848 RT:
6.42-6.50 AV: 10 F: FTMS
+ p ESI Full ms2
508.2413@hcd24.00[200.0000-1055.0000]

902.39177+10+10+10+10284.19567
659.30544

40

5.5Time (min)6.0

C(CAM)LAVYQAGAR LGPLVEQGR

6.5

LGADMEDVR

7.0

7.5

8.0

LGADMEDVC(CAM)GR

200200399.22243
300

400

NL: 7.86E4
190723_151#829-848 RT:
6.42-6.51 AV: 10 F: FTMS
+ p ESI Full ms2
503.2371@hcd24.00[200.0000-1045.0000]

835.36067

60

5.0

8.0

794.34922

518.25739+105.5774.33207

845.36902

528.26543

500

600

700

8009001000m/z考察
我々は、ApoE2およびApoE4のリコンビナントタンパク質を標準品に使⽤したヒト⾎清中のアポリポプロテインEの各アイソフォームの分離定量可能な分析法を開発した。本分析法はペプチド断⽚を標準品とした場合と⽐べて酵素消化の影響についても補正が可能となる利点がある。また、ヒト⾎清⾃体を標準品に使⽤する場合はロットごとに各ApoEの濃度差が⽣じうるが、リコンビナントタンパク質を標準品に使⽤することで常に⼀定の濃度の標準品の使⽤が可能となる。分析法には汎⽤的な試薬のみで実施可能な前処理法を採⽤し、得られた結果は設定した基準を満たした。定性分析法としても問題ない分析法である。以上、⽬的であった頑健な分析法の開発に成功した。
今後、アルツハイマー病研究における⻑期の経時的なApoE濃度評価などの応⽤に活⽤したい。

参考⽂献1): Eduardo Martínez-Morillo et. al., J. Proteome Res. 2014, 13, 2, 1077−1087
2): 橋井則貴ら, Chromatography 2018, 39, 7-193): Irene van den Broek et. al., Clinical Chemistry 2016, 62:1 188-197