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酵母 Premium 報告書

シリアル番号XXXXXxx

管理番号 SIID

00000

作業完了日

202x 年 xx 月 xx 日

発

202x 年 xx 月 xx 日

行

日

極秘資料

本報告書の使用にあたっての確認事項
1.

本報告書は株式会社テクノスルガ・ラボ 技術責任者による承認済みです。

2.

研究発表 (論文投稿) や特許明細書への転用を除き、本報告書の一部または全部をそのままあるいは改変して第三者へ転用などされた場合には、株式会社テクノスルガ・ラボは一切の責任を負いかねます。

3.

当社受託サービス等は、試験・研究用途を目的として販売しております。当社受託サービス等を医療や臨床診断などの試験・研究目的以外へご使用される場合、これに起因する損失・損害等については、当社では一切の責任を負いかねます。

技術責任者

印

株式会社テクノスルガ・ラボ 研究センター 技術部〒424-0065

静岡県静岡市清水区長崎 388 番地の 1

TEL：054-349-6211

FAX：054-349-6121

Mail：tsl-contact@tecsrg.co.jp

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検体情報
検体名SAMPLE

SIID

受取日

00000

202x 年 xx 月 xx 日

備考:目的
26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列解析、形態観察および生理・生化学的性状試験 (以下、生理性状試験) の結果から、検体の帰属分類群を推定します。
方法
1. 前培養条件
・ 培地

BD Difco Yeast Mold Broth (YM) (Becton Dickinson, USA) + 寒天(YM agar)

・ 培養温度27°C

・ 培養期間3 日間・ その他条件

好気培養

2. 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列解析
・ DNA 抽出

物理的破砕法・ PCR 増幅

PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio, Japan)・ サイクルシーケンス

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, USA)PCR 増幅: ITS5, NL4
シーケンス: NL1, NL4
ABI PRISM 3500xl Genetic Analyzer System(Applied Biosystems)

・ 使用プライマー1) 2)
・ シーケンス・ 塩基配列決定

ChromasPro 2.1 (Technelysium, AUS)・ BLAST 相同性検索 3)

解析ソフトウェア: ENKI (TechnoSuruga Laboratory, Japan)
データベース
DB-FU15.0 (TechnoSuruga Laboratory, Japan)
国際塩基配列データベース (DDBJ/ENA/GenBank)
検索日: 202x 年 xx 月 xx 日

・ 簡易分子系統解析

系統樹の推定: 近隣結合法 4)
塩基置換モデル: Kimura-2-parameter 5)
樹形の信頼性評価: ブートストラップ法 6) (1,000 反復)＊ 塩基配列決定は、シーケンサーからの生データ (エレクトロフェログラム) を当社技術者が目視により確認し、修正を行った後に決定しています。

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3. 酵母形態観察試験
以下の条件で巨視的観察 (コロニー観察) および微視的観察を行ないました。
・ 培地

BD Difco Yeast Mold Broth (YM) (Becton Dickinson, USA) + 寒天(YM agar)

・ 培養温度

培養温度を選択°C

・ 培養期間

3 日間～2 ヶ月間

・ その他条件

好気培養

・ 顕微鏡

光学顕微鏡 BX51 (Olympus, Japan) (微分干渉観察含む)
実体顕微鏡 SMZ800 (Nikon, Japan)

・ マウント液

滅菌蒸留水

4. 酵母第二段階試験 (生理・生化学的性状試験)
試験方法は Kurtzman et al. 7) に準拠して行いました。
・ 培地

BD Difco Yeast Mold Broth (YM) (Becton Dickinson, USA) + 寒天(YM agar)

・ 培養温度

培養温度を選択°C (温度耐性試験を除く)・ 培養期間

3 日間～2 ヶ月間

・ その他条件

好気培養

・ 試験項目

糖類発酵性試験
炭素源資化性試験
窒素源資化性試験
ビタミン要求性試験
耐性試験 (温度、薬剤耐性、浸透圧耐性)＊方法に記載の会社名、製品名は一般に各社の日本および各国での商標または登録商標です。

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結果
1. 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列解析
表 1. DB-FU に対する BLAST 検索結果
相同性スコアで上位 30 に検索された 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列解析データ
登録名
株名
Saccharomyces cerevisiae
NRRLY-12632
Saccharomyces cariocanus
NRRLY-27337
Saccharomyces paradoxus
NRRLY-17217
Saccharomyces jurei
NCYC-D5088
Saccharomyces arboricolus
CBS10644
Saccharomyces kudriavzeviiIFO1802
Saccharomyces bayanus var. uvarum NRRLY-17034
Saccharomyces pastorianus
NRRLY-27171
Saccharomyces bayanus var. bayanus NRRLY-12624
Saccharomyces mikatae
IFO1815
Kazachstania unispora
NRRLY-1556
Torulaspora microellipsoides
NRRLY-1549
Kazachstania aquatica
CBS10102
Kazachstania africana
NRRLY-8276
Kazachstania martiniae
NRRLY-409
Kazachstania solicola
CBS6904
Kazachstania servazzii
NRRLY-12661
Kazachstania aerobia
CBS9918
Torulaspora franciscae
NRRLY-17532
Torulaspora delbrueckii
NRRLY-866
Kazachstania yasuniensis
CLQCA20-132
Torulaspora pretoriensis
NRRLY-17251
Kazachstania lodderae
NRRLY-8280
Kazachstania bromeliacearum
CBS7996
Torulaspora maleeae
IFO11061
Naumovozyma dairenensis
NRRLY-12639
Kazachstania siamensis
NBRC101968
Kazachstania zonata
NBRC100504
Kazachstania piceae
NRRLY-17977
Torulaspora globosa
NRRLY-12650

Accession No.
AY048154
AF398478
U68555
HG764813
EF580918
AB040995
AY130339
U68547
U94931
AB040996
U68554
U72160
AY881651
U68550AF398481
AY007895
U68558
AY582127
U73604
U72156
HG934855
U72157U68551
HQ412595
AB087395
U68556
AB258462
AB198187
U84346
U72166

相同率
572/572 (100.0%)567/572 (99.1%)
566/572 (99.0%)565/572 (98.8%)562/572 (98.3%)
563/573 (98.3%)
561/572 (98.1%)
560/572 (97.9%)
560/572 (97.9%)
559/574 (97.4%)
549/572 (96.0%)
549/573 (95.8%)
549/573 (95.8%)
549/572 (96.0%)
548/572 (95.8%)
547/572 (95.6%)
547/572 (95.6%)
547/572 (95.6%)
548/573 (95.6%)
548/573 (95.6%)
546/572 (95.5%)
547/573 (95.5%)
544/572 (95.1%)
541/566 (95.6%)
545/573 (95.1%)
543/571 (95.1%)
546/574 (95.1%)
545/573 (95.1%)
542/572 (94.8%)
543/573 (94.8%)

BSL

注 1) BSL (バイオセーフティレベル) はレベル 2 以上を表記し、空欄はレベル 1 を意味します。
注 2) 網掛けは、簡易分子系統解析に供した配列データを示します。

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表 2. 国際塩基配列データベースに対する BLAST 検索結果
相同性スコアで上位 30 に検索された 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列解析データ
登録名
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae

株名
HBUAS72096
HBUAS72067
HBUAS72029
XS-13
XS-2
CICC 1445
HBUAS61797
HBUAS61795
HBUAS61793
HBUAS61792
HBUAS61791
HBUAS61787
HBUAS61786
HBUAS61784
HBUAS61783
HBUAS61781
HBUAS61779
HBUAS61778
HBUAS61777
HBUAS61776
HBUAS61775
HBUAS61773
HBUAS61771
HBUAS61770
HBUAS61769
HBUAS61768
HBUAS61766
HBUAS61765

5 / 14

Accession No.
OP018321
OP018292
OP018254
OP010083
ON775518
ON680882
ON680872
CP096552
ON306703
ON306701
ON306699
ON306698
ON306697
ON306693
ON306692
ON306690
ON306689
ON306687
ON306685
ON306684
ON306683
ON306682
ON306681
ON306679
ON306677
ON306676
ON306675
ON306674
ON306672
ON306671

相同率
572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)572/572 (100.0%)

R0SIID00000

0.1
NRRLY-27337 T (AF398478)

32

Saccharomyces cariocanus

23

Saccharomyces paradoxus NRRLY-17217 NT (U68555)

48
13

Saccharomyces jurei NCYC-D5088 T (HG764813)
Saccharomyces mikatae IFO1815 T (AB040996)

21589897 76

Saccharomyces arboricolus

CBS10644 T (EF580918)

Saccharomyces kudriavzevii

IFO1802 T (AB040995)

Saccharomyces bayanus var. uvarum NRRLY-17034 T (AY130339)
Saccharomyces pastorianus NRRLY-27171 T (U68547)
Saccharomyces bayanus var. bayanus NRRLY-12624 T (U94931)

653399SIID00000-26S
Saccharomyces cerevisiae

NRRLY-12632 NT (AY048154)

Torulaspora microellipsoides NRRLY-1549 T (U72160)
Kazachstania africana NRRLY-8276 T (U68550)
54

Kazachstania unispora NRRLY-1556 T (U68554)
Kazachstania aquatica CBS10102 T (AY881651)
Kazachstania lodderae NRRLY-8280 T (U68551)

図 1. 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列に基づく簡易分子系統樹
左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、株名の末尾のT はその種の基準株 (Type strain)、NT はその種の新基準株 (Neotype strain) を示します。

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2. 酵母形態観察試験
2-1. 巨視的観察
・周縁の形状全縁・隆起状態

周縁部は扁平で、中央部はクッション形

・表面の形状

平滑・光沢および性状

バター様、湿性・色調

白色～クリーム色

図 2. YM 平板培地上の巨視的観察像(3 日間培養、上段 全体像、下段 コロニー拡大像)

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2-2. 微視的観察（形態観察）
YM 平板培地上で培養開始 3 日目に、栄養細胞は亜球形から楕円形、卵形であり、増殖は多極出芽によることが確認されました (図 3)。培養開始 4 週間を経過した平板で有性生殖器官の形成は認められませんでした。

図 3. 微視的観察像 (スケールバーは 10µm)

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3. 酵母第二段階試験 (生理・生化学的性状試験)
表 3. 生理性状試験の結果
糖類発酵性試験
Glucose
Galactose
Maltose＋＋L

Me α-D-glucoside
SucroseTrehalose＋＋－Glucose＋

Cellobiose－Galactose
L-Sorbose
D-Glucosamine
D-Ribose
D-Xylose
L-Arabinose
D-Arabinose
L-RhamnoseSucrose＋－－－－－－－＋Salicin
Melibiose
LactoseRaffinose
InulinSoluble starch
Glycerol
Erythritol
Ribitol (Adonitol)－－－＋＋W－－－Maltose＋Xylitol－Trehalose
α-Methyl-D-glucoside＋＋

D-Glucitol(Sorbitol)
D-Mannitol－－

Growth at 37 °C
50% (w/v) D-Glucose＋＋

Melibiose
LactoseRaffinose－－＋

炭素源資化性試験
Galactitol(Dulcitol)
Inositol
2-Keto-D-gluconate
5-Keto-D-gluconate
D-Glucuronate
DL-Lactate
Succinate
CitrateMethanol
Ethanol
N-Acetyl-Dglucosamine
Hexadecane－－－－－
W－－－W－－

窒素源資化性試験
Nitrate－耐性試験
Growth at 30 °C
0.01% Cycloheximide＋－

Growth at 40 °C
10% NaCl / 5% Glucose＋－

ビタミン要求性試験
Vitamin-free mediumW＋: 反応が陽性－: 反応が陰性
W (weak): 弱い陽性反応が認められたことを示します。
L (latent): 試験開始 2 週間以降に急速に陽性反応が認められたことを示します。
D (delay): 試験開始後 1 週間以上の時間をかけて徐々に陽性反応が認められたことを示します。

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表 4. 検体と帰属が推定される Saccharomyces cerevisiae との生理性状データの比較*
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The Yeasts 5th a)

Yeast database b)

糖類発酵性試験
GlucoseGalactoseMaltose
Me α-D-glucosideSucrose
Trehalose
Melibiose
LactoseRaffinose＋＋L＋＋－－－＋＋v＋＋＋－－－＋＋－/＋＋
ND＋－
ND－＋

炭素源資化性Glucose
Galactose
L-Sorbose
D-Glucosamine
D-Ribose
D-Xylose
L-Arabinose
D-Arabinose
L-Rhamnose
SucroseMaltoseTrehalose
α-Methyl-D-glucoside
Cellobiose
Salicin
Melibiose
LactoseRaffinose
InulinSoluble starch
Glycerol
Erythritol
Ribitol (Adonitol)
Xylitol
D-Glucitol (Sorbitol)
D-Mannitol
Galactitol (Dulcitol)
Inositol
2-Keto-D-gluconate
5-Keto-D-gluconate
D-Glucuronate
DL-Lactate
SuccinateCitrate
Methanol
Ethanol
N -Acetyl-D-glucosamine
Hexadecane＋＋－－－－－－－＋＋＋＋－－－－＋＋W－－－－－－－－－－－W－－－W－－＋v－－－－－－－＋＋＋－－－－－＋－－vv－－－－－－－－－v－－－＋－－＋－/＋－－－－－－－＋＋＋－－－－－＋－－－/＋－－－－－－－－－－/＋－/＋－－－＋－－

窒素源資化性試験
Nitrate－－－耐性試験
Growth at 30°C
Growth at 37°C
Growth at 40°C
0.01% cycloheximide
50% (w/v) D-glucose
10% NaCl/5 % glucose＋＋＋－＋－＋v
v＋－＋v
v
?
＋－

ビタミン要求性試験
Vitamin-freeW－－* 表中の「＋」は反応が陽性、「－」は反応が陰性、「W」は弱い陽性反応、「D (delay)」は試験開始後 1 週間以上の時間をかけて徐々に陽性反応が認められたことを、「L (latent)」は試験開始 2 週間以降に急速に陽性反応が認められたこと、「V」は株による相違が認められることを、「ND」はデータが記載されていなかったことを示します。
a The Yeasts, a taxonomic study, 第 5 版 (Kurtzman et al., 2011) より引用。
b Yeast Database<http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/defaultinfo.aspx?Page=YeastsHome>より引用。

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考察
微生物同定システム「ENKI」を用いた DB-FU および国際塩基配列データベースに対する BLAST 相同性検索の結果、検体の 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列は子嚢菌系酵母の一種である Saccharomyces cerevisiae の複数の塩基配列に対し相同率 100%の相同性を示しました (表 1, 2)。
DB-FU に対する相同性検索で得られた塩基配列を基に解析した分子系統樹 (図 1) において、検体は Saccharomyces 属で構成される系統群に含まれ、その中でも Saccharomyces
cerevisiae NRRL Y-12632NT (アクセッション番号 AY048154) と同一の分子系統学的位置を示しました。
コロニー性状および形態観察の結果、検体は YM 培地で白色～クリーム色、表面が平滑でバター様光沢で湿性のコロニー性状を示し (図 2)、栄養細胞は亜球形から楕円形、卵形であり、増殖は多極出芽によることが確認されました (図 3)。検体で観察された特徴は、有性生殖器官の形成は認められませんでしたが 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列解析で検体の帰属が推定される Saccharomyces cerevisiae の形態学的特徴 7) にほぼ一致していました。
また、検体 (表 3) と検体の帰属が推定される Saccharomyces cerevisiae との生理性状データを比較した結果、ほぼ類似した生理性状を示しました。
以上のことから、今回の 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列解析、簡易形態観察および生理性状試験の結果において、検体を Saccharomyces cerevisiae と同定いたします。

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R0

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まとめ検体名SIID

帰属分類群

バイオセーフティ
レベル

SAMPLE00000

Saccharomyces cerevisiae (Desm.) Meyen

レベル 1GRASバイオセーフティレベルについて

菌類についてのバイオセーフティレベルの分類指針は、微生物株保存機関や文献により若干異なりますので、本報告書においては Atlas of clinical Fungi 8) を参考に示します。
レベル
GRAS

内容
食品にひろく応用利用されている危険性の少ない生物。

1

無脊椎動物に棲息、共生する腐生菌または植物病原菌。ヒト（動物）への感染は、偶発的、表在性であり、非深部性あるいは軽症である。

2

基本的には無脊椎動物に棲息するが、ヒト（動物）組織内においても比較的生育性を示す菌種。
重度の免疫不全患者では、深部性かつ日和見感染性の真菌症を引き起こす。また、表在性の感染を引き起こす病原菌も、本レベルに分類される。

3

健常人でさえも、重篤な深在性真菌症を引き起こす可能性のある病原菌。

推定帰属菌種の分離源情報
推定菌種

分離源

引用文献
備考

Saccharomyces cerevisiae (Desm.) Meyen

BSL

レベル 1、GRAS

ブドウ園の土壌、洞窟内の土壌、ブドウ果汁、ワイン、ジンジャーワイン、ビール、サトウキビジュース、シェリー酒、醸造所などブドウ果汁やフルーツジュースの発酵、醸造、パン製造の多くは本菌種の選抜系統が利用されている。
Kurtzman CP, Fell JW, Boekhout T. The Yeasts, a taxonomic study, 5th edition.
Amsterdam: Elsevier; 2011.
簡易分子系統解析において、検体とクラスターを形成した種の情報です。

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R0

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本報告書に付随する電子データ一覧
データ内容
塩基配列テキストファイル
エレクトロフェログラム
画像形式
txt
ab1jpg補足
1. 本報告書における学名表記は Dictionary of the fungi 第 10 版 9) のウェブ版である Index
Fungorum に基づいています。
2. 酵母の同定では 26S rDNA の D1/D2 領域塩基配列をもちいた解析において、相同率100%で一致する基準株由来の塩基配列が検索された場合においても、分類学に基づく同定 (最終的な種の異同の決定) には、形態観察や生理・生化学性状試験、DNA 塩基配列に基づく分子系統解析、化学的性状試験、DNA-DNA ハイブリッド形成試験などの試験結果から総合的に判断することが重要です 7)。
3. データベース DB-FU は、当社と国立遺伝学研究所との共同開発品です。当データベー
スの塩基配列データは、GenBank、DDBJ、ENA などの国際塩基配列データベースに登録されている膨大なデータを吟味した上で、「菌種の絞り込み」に有効と考えられる塩基配列データを選抜し、収録したものです。
4. 国際塩基配列データベース (DDBJ/ENA/GenBank) に対する相同性検索の結果は、検索を実施した時点の情報です。国際塩基配列データベースの登録情報は常に更新されており、論文などを投稿する前には再度相同性検索することをお勧めします。
5. 今回の解析結果のうち、簡易分子系統樹はアライメント結果の編集は行っておらず、論文等の投稿を前提としたものではありません。
6. バイオセーフティレベル (BSL) は、当該種に対し定められています。従って、本報告書で示す検体の BSL はあくまでも目安であり、お預かりした検体の帰属分類群の推定が困難な場合には BSL が示せないこともあります。BSL は最低でもレベル 1 となりますが、レベル 1 であっても日和見感染が報告されている種もあり、その安全性を保障するものではありません。また、検体の近縁菌種の BSL が 2 以上である場合 (本報告の解析結果参照)、その検体は同等の取扱いをされることをお勧めいたします。本報告書でお知らせした BSL は、微生物株保存機関である ATCC (American Type CultureCollection)、CBS (Westerdijk Fungal Biodiversity Institute) および Atlas of clinical Fungi 8)によります。また、当該菌種の BSL に関する情報が見当たらない種については「不明」と表記しています。
「不明」の場合も微生物同定用 DNA データベース DB-FU の BLAST
検索結果の表では出力されていません。
7. 本報告書に関するご質問等につきましては、株式会社テクノスルガ・ラボ 技術部までお問合わせください。

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引用文献1)White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal
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2)

O’Donnell K. Fusarium and its near relatives. In: Reynolds DR and Taylor J (editors). The
Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics.
Wallingford: CAB International; 1993. pp. 225–233.

3)

Altschul SF, Madden TF, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z et al. Gapped BLAST and PSIBLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res
1997;25:3389–3402.

4)

Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetictrees. Mol Biol Evol 1987;4:406–425.

5)

Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions throughcomparative studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 1980;16:111–120.

6)

Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution
1985;39:783–791.

7)

Kurtzman CP, Fell JW, Boekhout T. The Yeasts, a taxonomic study, 5th edition. Amsterdam:Elsevier; 2011.

8)de Hoog GS, Guarro J, Gene J, Figueras MJ. Atlas of clinical fungi, 2nd edition. Utrecht:
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9)

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Wallingford: CAB International; 2008.

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