心身科学 第 6 巻第 1 号（119┉124）（2014）

ブレビバチルス発現系によるエンビジン組換えタンパク質の発現と精製
市

原

啓

子＊

エンビジンはタンパク質の構造的な特徴からイムノグロブリン（Ig）スーパーファミリーに分類される細胞表面の 1 回膜貫通型糖タンパク質である．モノカルボン酸トランスポーターのコファクタ
ーと考えられているが，機能に関しては不明な点が多い．著者は，エンビジンの機能を解明する目的
で，エンビジン組換えタンパク質を昆虫細胞やほ乳類培養細胞，大腸菌を用いて発現させたが，いずれも収量が低くて実験に利用することはできなかった．本研究では，ブレビバチルス Brevibacillus
choshinensis において，プロテアーゼ活性をほとんど示さない菌株を利用して培養上清にタンパク質を分泌させる発現系で組換えエンビジンタンパク質の発現を試みた．まず，エンビジンの細胞外領域の I-set ドメインの 158 アミノ酸残基をコードする cDNA を特異的なプライマーを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応で増幅し，アミノ末端（N 末端）に 6 個のヒスチジンペプチドがタグ配列（His タグ）として連結するよう発現ベクターを構築した．このベクター DNA を用いてブレビバチルスを形質転換し，得られたコロニーの菌体を 2 SY 培地で液体培養をおこなったところ，培養上清に組換えエンビ
ジン（以下 rEmb55 と略す）タンパク質が産生されていることがわかった．培養上清を Ni-NTA カラ
ムにアプライした．100mM のイミダゾールで rEmb55 タンパク質は溶出された．溶出液中に 3 種のタンパク質が含まれていたので，それらのアミノ酸配列を同定するために MALDI TOF/TOF による質量分析をおこなった．2 つが rEmb55 タンパク質であったが，1 つは C 末端で分解が起こっていた．ブレビバチルス発現系の収量としては低いものであるが，エンビジンの機能を調べる量としては問題ないと考えられる．
キーワード：エンビジン，ブレビバチルス，組換えタンパク質発現，精製

昆虫細胞やほ乳類の培養細胞でエンビジン組換えタン

Ⅰ．はじめに

パク質を強制発現させた．いずれの場合にも発現量がエンビジンはタンパク質の構造的な特徴からイムノ

大腸菌を利用して細胞外ドメインとグルタチオンー
S-トランスフェラーゼとの融合タンパク質 rEmb_ex-

低く組換えタンパク質を精製するには至らなかった．

グロブリン（Ig）スーパーファミリーに分類される細胞表面の 1 回膜貫通型糖タンパク質である 1 ）．ほ乳類

GST を発現させた．十分な発現量があったので，グや鳥類など脊椎動物で遺伝子が同定されている．マウ

ルタチオンを担体とするカラムにかけたがカラム内でスでは発生初期に発現が高く 2 ），培養細胞で強制発現不溶化してしまった．グルタチオンでは溶出できずドさせるとフィブロネクチンへの接着能が向上すること
2,4），モノカルボン酸トランスポーター MCT 2 と細胞の高い融合タンパク質を得ることは難しかった（市原，

膜表面で複合体を形成すること 3 ），新規の神経筋接合

未発表データ）．

部位で発現上昇すること 5 ）などが報告されているが，グラム陽性細菌であるブレビバチルス Brevibacillus
choshinensis において，プロテアーゼ活性をほとんど機能に関しては不明な点が多い．
筆者は，エンビジンの機能解析に利用する目的で，＊愛知学院大学心身科学部健康栄養学科（連絡先）〒 470┉0195 愛知県日進市岩崎町阿良池 12

デシル硫酸ナトリウム（SDS）で溶出できたが，純度示さない菌株を利用して培養上清にタンパク質を分泌

E-mail: kichi@dpc.agu.ac.jp

─ 119 ─市

原させる発現系が開発され 6 ），様々な酵素やサイトカインが組換えタンパク質としてつくられている

啓子

Biosystems）で塩基配列を確認した．

．

２）ブレビバチルスの形質転換と組換えエンビジン

7 , 8 , 9 ,10）

本研究では，この発現系を利用し，組換えエンビジン
タンパク質の発現を試みた．大腸菌とブレビバチルスとのシャトルベクターにエンビジン cDNA を組込み，アミノ末端（N 末端）に 6 個のヒスチジンペプチドがタグ配列（His タグ）として連結するようデザインした．このベクター DNA を用いてブレビバチルスを形

タンパク質の発現確認

塩基配列を確認した発現用プラスミドの DNA を精製し，ブレビバチルスコンピテントセルを NTP 法
で形質転換した．MTNm プレート（TM 培地，20mM
MgCl 2 ，ネオマイシン 10μg/ml，1.5％ アガー）上で 37

質転換し，得られたコロニーの菌体を液体培養をおこ℃一晩培養した後，コロニーの出現を確認した．コロ
ニー 10 個について，ネオマイシン（終濃度 25μg/ml）

なったところ，培養上清に組換えエンビジン（以下rEmb55 と略す）タンパク質が産生されていることがを含む 3 ml の 2 SY 培地（ 2 SY/Nm）および TM 培地（TM/Nm）にそれぞれ植菌し，30℃，120rpm で培養しわかった．さらに His タグを利用してキレートカラム
クロマトグラフィで培養上清中の rEmb55 タンパク質た．24 時間培養したところで，TM/Nm 培地での菌懸濁液から 0.3ml をとりだし等量の LB/40％グリセローを精製することが可能であった．ブレビバチルス発現系の収量としては低いものであるが，純度の高い組換

ルと混和してグリセロールストックとし，－80℃で保存した．48時間目では，各培養液から0.1ml をとりだし，

えエンビジンタンパク質を得ることができた．

2 x SDS-PAGE サンプルバッファーと混和し，98℃，3分間加熱し電気泳動用試料を作成した．60 時間後に培養を終了し，培養の上清のみを冷凍保存した．
培養上清を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動

Ⅱ．材料と方法
１．材料（SDS-PAGE）で分離し，ゲルからニトロセルロース

ブレビバチルス発現系キット（ベクター DNA，ブ

膜にタンパク質を転写した11）．抗 Penta-His 抗体（マレビバチルスコンピテントセル，形質転換試薬）および His タグ付き発現ベクター pNC-HisT，制限酵素，

ウスモノクローン抗体，キアゲン社），および抗エンライゲーションキット，大腸菌 DH 5αコンピテント
セルは，タカラバイオ社より購入した．ブレビバチル
ス培養用の 2 SY 培地および TM 培地はキットの説明

ビジン抗体（ウサギポリクローン抗体）4 ）を一次抗体としてウェスタンブロットを行い rEmb55 タンパク質を確認した．
３）カラムクロマトグラフィーによるエンビジンタ

書に従って調製した．

ンパク質の精製
組換え rEmb55 タンパク質を高発現するブレビバ

２．方法１）発現ベクターの作成
マウスエンビジン cDNA を鋳型とし，プライマー
moEmb 89F 5 ’- ccacgtggatcccgccctgatccggctgagggc 3 ’ とmoEmb 555R 5 ’-ccgcgaattctcacttcagcacagtagaatcc 3 ’ を用い，Prime Script taq ポリメラーゼにより PCR 反応
を 行 い っ た． 反 応 生 成 物 で あ る 500bp の DNA 断 片を，さらに，Bam HI と Eco RI で切断した後，アガロ
ースゲルを用いて精製した．発現ベクター pNC-HisT
は，Bam HI と Eco RI で切断し，脱リン酸化酵素で処理した．この発現ベクターに，エンビジン DNA 断

チルスのクローンを選び，グリセロールストックを20ml の 2 SY/Nm 培地に植えて 30 ℃，120rpm で 60 時
間培養した．培養液を 5000 x g，4 ℃で 15 分間遠心し，培養上清を得た．Ni-NTA アガロース担体（キアゲン社）0.4ml をカラムに充填し，カラムバッファー（50mM
リン酸ナトリウム緩衝液 pH7.2, 0.3M NaCl, 10mM イ
ミダゾール）で平衡化した．培養上清は 0.45μm フィ
ルターに通した後カラムにかけた．10ml のリン酸緩衝
塩液および 10ml のカラムバッファーで洗浄し，溶出には，カラムバッファーに，それぞれ 50mM，100mM，200mM，300mM のイミダゾール添加した溶出液を用片を挿入し発現ベクター pNC-HEmb55 を得た．これ

いた．溶出画分を一部とって SDS-PAGE を行い，銀を用いて大腸菌を形質転換し，得られたコロニーよりプラスミド DNA を抽出した．インサートサイズの染色によりタンパク質のバンドを確認した．
４）質量分析器によるアミノ酸配列の確認
100mM イミダゾールで溶出された画分より 4μg を正 し い ク ロ ー ン を 3 つ 選 び，BigDye Terminator v3.1
Cycle Sequencing kit で反応させた後，DNA シーケン

SDS-PAGE で分離し，クマジーブリリアントブルー染

サ ー ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer（Applied

色を行いバンドを確認した．ゲルよりバンドを切り出─ 120 ─

ブレビバチルス発現系による組換えエンビジンタンパク質の発現

換えタンパク質を Ni-NTA アガロースを担体とするキ

し，ヨードアセトアミドで還元アルキル化を行った後，ゲル内トリプシン消化を 37℃で一晩行った．アセト

レートカラムクロマトグラフィを行った．カラムに培ニトリルでペプチドを抽出し，時間飛行型質量分析器
Applied Biosystem 社）（4800 MALDI TOF/TOF Analyzer，

養上清をかけ，イミダゾールの濃度を上昇させて溶出を行ったところ，rEmb55 タンパク質は，100mM イミにかけた．ペプチドのアミノ酸配列は，MASCOT デダゾールですべて溶出されることがわかった（図 2 ）．
溶出された画分に含まれる 3 本のタンパク質（図 2 ，ータベース（http://matrixscience.com/）により同定した．

Ⅲ．結矢頭）のうち，バンド 1 とバンド 2 はウェスタンブロ
ットで確認されたものと一致するが，30kDa 付近のバ果ンド 3 については不明なタンパク質であった．
溶出画分の 3 つのタンパク質を同定するため，電気ブレビバチルス組換え体の 3 つのクローンを 48 時
間培養し，培養上清を SDS-PAGE にかけた（図 1 ，A）．

泳動で分離したタンパク質の各バンドを，ゲル内トリ培地（図 1 ，A，レーン 4 ～ 6 ）での方が組換タンパ

プシン消化し，生成したペプチドのアミノ酸配列を時間飛行型質量分析器 MALDI TOF/TOF Analyzer で解析

ク質のバンドがはっきり見えた．rEmb55 タンパク質の発現には TM 培地より 2 SY 培地の方が適している

した．MASCOT データベースより，バンド 1 とバン
ド 2 はマウスエンビジン（EMB_MOUSE，P21995），

ことがわかった．同じ試料を，抗 His タグ抗体でウェ

バンド 3 はカナマイシンヌクレオチジルトランスフ

スタンブロットをおこなったところ，どちらの培地においても 20kDa 付近にバンドを確認することができェラーゼ（KANU_BACSP，P05058）であることが確認できた．バンド 1 ，2 で同定されたアミノ酸配列を，

TM/Nm 培地（図 1 ，A，レーン 1 ～ 3 ）より 2 SY/Nm

cDNA から予想されるアミノ酸配列と比較すると，バた（図 1 ，B）．さらに，2 SY 培地での培養上清を抗エ
ンビジン抗体でウェスタンブロットをおこなう（図 1 ，ンド 2 では C 末端のペプチドが検出されていたがバンド 1 では検出されていなかった（図 3 ）．バンド 1 は，

C）と，2 本のバンドが認められた．今回の実験では，
cDNA から推定されるタンパク質の分子量は 20kDa でC 末端が分解されて 10 から 19 アミノ酸残基分が短くある．His タグは，N 末端に連結されていることから，
18kDa のバンドではカルボキシ末端（C 末端）側のいなった分子であることが確かめられた．
さらに，500ml の組換え体の培養を行い，カラムク

くつかのアミノ酸が欠落していることが予想された．
N 末端に連結した His タグを利用してエンビジン組

ロマトグラフィにより rEmb55 タンパク質を精製した
ところ，200μg の収量があった．

A
kDa

1

ファストグリーン
2

3

4

5

6

B
1

C

エンビジン

Penta-His
2

3

4

5

6

4

5

6

100
75
50
37
25
20

図1

rEmb55 タンパク質の発現と確認

レーン 1 と 4 ，レーン 2 と 5 ，レーン 3 と 6 は同一の組換え体を培養。1 ，2 ，3 は MT/
Nm 培地，4 ，5 ，6 は 2 SY/Nm 培地で培養した培養上清。A：ファストグリーンで全タ
ンパク質を染色，B：抗 Penta-His 抗体，C：抗エンビジン抗体。矢頭と矢印で示した
2 本のバンドが rEmb55 タンパク質である。

─ 121 ─

市

原

50 mM
CM FT M

kDa
250
100
75
50

W 1

2

3

啓

子

100 mM

200 mM 300 mM

4

7

5

6

8

9 10

37

3

25

2
1

15

図2

カラムクロマトグラフィーによる rEmb55 タンパク質の精製

CM，培養上清．FT，素通り．M，マーカー．W，洗浄．1 から 10 は溶出画分の番号．矢頭 1 ，2 ，3 は 100mM で溶出された 3 つのタンパク質の位置を示す。

分泌シグナル切断部位
10

20

30

エンビジン配列4050

MKKRRVVNSV LLLLLLASAL ALTVAPMAFA AGSHHHHHHL VPRGSRPDPA
60

70

80

90

100

EGDPTDPTFT SLPVREEMMA KYSNLSLKSC NISVTEKSNV SVEENVILEK
110

120

130

140

150

PSHVELKCVY TATKDLNLMN VTWKKDDEPL ETTGDFNTTK MGNTLTSQYR
160

170

180

190

200

FIVFNSKQLG KYSCVFGEKE LRGTFNIHVP KAHGKKKSLI AYVGDSTVLK
図3

cDNA から予想される組換えエンビジンタンパク質のアミノ酸配列

太字はバンド 2 から検出されたペプチドの配列，アンダーラインは，バンド 1 から検出されたペプチドの配列を示す。

をつくるのには十分な方法と考えられる．さらに，分Ⅳ．考泌シグナルを変更したり，培養液の組成や培養条件を察調節することにより発現量が増加することも知られてエンビジンは，N 末端側から I-set ドメイン，Ig ド

いる 8 ,10）．エンビジンに関しても，これらの条件を適メイン，膜貫通ドメイン，細胞内ドメインからなる．
rEmb55 タンパク質は 158 アミノ酸残基からなる I-set

正化することにより生産性を向上させることができる

ドメインに対応し，3 個のシステイン残基を含むが，ブレビバチルス発現系によって His タグ付き分泌タン

本研究で用いたブレビバチルス発現系はプロテアー

パク質として産生させることができた．さらに，1 回かもしれない．
ゼ活性が低いことが特徴である．rEmb55 タンパク質のカラムで高純度の標品として精製できることがわかでは，培養上清の段階で完全長のポリペプチドの他にC 末端が分解して短くなった分子が見いだされた．分った．ブレビバチルス発現系では，1 リットルの培養

解が菌体内で起こったのか，培養上清中なのかは不明

液において，組換えタンパク質として数十から数百ミであるが，C 末端側に分解の起こりやすいアミノ酸配リグラム 8 , 9 ）の収量が報告されている．rEmb55 タンパ

列が含まれている可能性が高い．カラム精製の時にク質では，1 リットルあたりでは400μg の収量なので，プロテアーゼ阻害剤を添加する必要があるかもしれな

一般的なブレビバチルス発現系の収量と比較して非常い．

に少ない．しかしながら，ブレビバチルス組換え体のブレビバチルス発現系での問題点は，ブレビバチル

培養およびカラムクロマトグラフィー精製は容易にでスの組換え体のコロニーは常温のプレート上でせいぜ
い 1 週間程度しか保存できず，コロニーをプレートかきるので，エンビジンの機能解析に必要なタンパク質─ 122 ─

ブレビバチルス発現系による組換えエンビジンタンパク質の発現

らプレートへ継代培養を繰り返すと組換えタンパク質

エンビジンによるフィブロネクチン基質への細胞接着能の向上．

の発現が低下することである．本研究では，この問題

5 ）Lain E, Carnejac S, Escher P, Wilson MC, Lomo T, Gajendran点を回避するために，形質転換後のコロニーから液体

N, Brenner HR.（2009）J Biol Chem. 284, 8930┉9. A novel role

培養をおこなったすべてのクローンをグリセロールス

for embigin to promote sprouting of motor nerve terminals at the

トックとして－80℃で保存した．グリセロールストッ

neuromuscular junction.

クを作成することで，プレートによる継代を行う必要

6 ）Takagi H, Kadowaki K, Udaka S.（1989）Agric. Biol. Chem.,

がなくなり，必要な時に組換えタンパク質の発現と精53, 691-699. Screening and Characterization of ProteinHyperproducing Bacteria without Detectable Exoprotease

製を行うことが可能になった．グリセロールストック

Activity.

から培養した場合には，保存期間に関係なく一定の発7 ）Miyauchi A, Ozawa M, Mizukami M, Yashiro K, Ebisu S, Tojo

現をみることができた．
謝T, Fujii T, Takagi H.（1999）Biosci Biotechnol Biochem. 63,
1965-1969. Structural conversion from non-native to native form

辞of recombinant human epidermal growth factor by Brevibacillus

DNA シーケンサー，質量分析器の使用に際して，愛知学院

choshinensis.
8 ）Tanio M, Tanaka R, Tanaka T, Kohno T.（2009）Anal Biochem.

大学歯学部吉村文信教授，佐藤美紀枝技術員の協力と支援をう

386, 156-60. Amino acid-selective isotope labeling of proteins

けたことに深く謝意を表する．

for nuclear magnetic resonance study: proteins secreted by

文

Brevibacillus choshinensis.

献9 ）Teramura N, Tanaka K, Iijima K, Hayashida O, Suzuki K,

1 ）Huang RP, Ozawa M, Kadomatsu K, Muramatsu T.（1990）

Hattori S, Irie S.（2011）J Bacteriol. 193, 3049┉56. Cloning

Differentiation. 45, 76┉83. Developmentally regulated expressionof a novel collagenase gene from the gram-negative bacteriumof embigin, a member of the immunoglobulin superfamily foundGrimontia（Vibrio）hollisae 1706B and its efﬁcient expression in
Brevibacillus choshinensis.

in embryonal carcinoma cells.
2 ）Huang RP, Ozawa M, Kadomatsu K, Muramatsu T.（1993）Dev

10）Onishi H, Mizukami M, Hanagata H, Tokunaga M, Arakawa T,

Biol. 155, 307┉14. Embigin, a member of the immunoglobulin

Miyauchi A.（2013）Protein Expression and Puriﬁcation 91, 184

superfamily expressed in embryonic cells, enhances cell-┉191. Efﬁcient production of anti-ﬂuorescein and anti-lysozyme
as single-chain anti-body fragments（scFv）by Brevibacillus

substratum adhesion.
3 ）Wilson MC, Meredith D, Fox JE, Manoharan C, Davies AJ,

expression system.

Halestrap AP.（2005）J Biol Chem. 280, 27213┉21. Basigin11）Ichihara-Tanaka K, Oohira A, Rumsby M, Muramatsu T.（2006）（CD147）is the target for organomercurial inhibition of

J Biol Chem. 281, 30857┉64. Neuroglycan C is a novel midkine

monocarboxylate transporter isoforms 1 and 4 : the ancillary

receptor involved in process elongation of oligodendroglial

protein for the insensitive MCT 2 is EMBIGIN（gp70）.

precursor-like cells.

4 ）市原啓子，村松喬（2009）．第 82 回日本生化学会大会抄録集．
（最終版平成 26 年 1 月 7 日受理）

─ 123 ─

Journal of the Institute for Psychological and Physical Science, Vol. 6 , No. 1 , 119┉124, 2014

Production and Puriﬁcation of Recombinant Embigin Protein Secreted
by Brevibacillus Choshinensis.
Keiko Ichihara-tanaka
Abstract
Embigin is a cell surface transmembrane protein whichi is classified as the immunoglobulin (Ig)superfamily. Embigin is thought to be the cofactor of monocarbonate transporter 2 , but its function is not fully
understood yet. In the previous studies, I produced the recombinant embigin proteins in insect cells, mammaliancells, and E. coli cells. In any case the yield was too low to use for the research. In this paper, I designated therecombinant embigin protein, rEmb55, to be produced as a secreting form in speciﬁc strain of Brevibacillus
choshiensis characterized as lacking protease activity. First, the mouse embigin cDNA fragment encoding158
amino acid residues corresponding to the I-set domain of embigin extracellular region was amplified witha set of specific primers by polymerase chain reaction, then the fragment was ligated to the brevibacillus
expression vector pNC-HisT in frame to the cloning site, obtained the pNC-HEmb55. After the conﬁrmationof insert sequence, Brevibacillus choshiensis was transformed, and many colonied developed. Several colonis
innoculated in the 2 SY medium cultured for 48 hours, and successively secreted the rEmb55 protein, which
was able to detected by both anti-Penta His antibodies and anti-embigin antibodis by westernblotting. Next, therEmb55 protein containing culture medium was applied to the Ni-NTA column. 100 mM imidasole effectively
eluted the the rEmb55 protein. As the eluate contained three proeins, I confirmed their peptide sequence
using MALDI TOF/TOF analyzer. Two proteins were the rEmb55 protein; one was the full size, and the otherwas deleted at carboxy-terminal end. Finally I obtained 200μg of the rEmb55 protein from 500 ml of culture
medium. This yield is low as compared to the Brevibacillus expression studies, but this amount seems to begood for examining embigin function.
Keywords: embigin, Brevibacillus choshinensis, recombinant, expression, puriﬁcation

─ 124 ─