嫌気的環境汚染物質分解菌の遺伝子導入・破壊系の開発

P-31

野尻 秀昭（東京大学生物生産工学研究センター）
背景と目的
従来の方法

嫌気性細菌の環境汚染物質分解能力を利用したバイオレメディエーション技術の開発の重要性は高い

今回実行する方法

形質転換

形質転換

(1) FCMを利用するための環境整備① 嫌気環境の汚染が頻発している② 他の物理化学的手法より浄化コストが低い

evoglow(evocatal)

分解能を利用・制御するため、遺伝子レベルでの解析が求められている

529 nm488 nm① 遺伝子組換え体の検出システムの開発が不十分② 有用嫌気性細菌の単離・培養が困難③ 嫌気性菌の培養にはで時間がかかることが多い＋抗生物質

1～3 週間遺伝子機能の解析に大きな後れ
有用嫌気性細菌の遺伝子組換え法（遺伝子導入や破壊）は確立されていないものが多い

培養を行わずに一細胞レベルで改変の目的 起こった細胞を検出できるシステムの構築

形質転換体が得られるかわからない…

control

酸素濃度 (%)

102040 60 80 100 120 140 160
ガス注入時間 (min)3rd

FCM による蛍光強度測定

嫌気チャンバー内
2～3 日, 30°C

k100,000 イベント分取

2.0 G

CFU/ml

電圧パルスの幅

2～5 倍

1400分取した
イベント

1.0 G

fluorescence

E. coli DH5α
10 μm

[O2] 5.0%[O2] 20.8%（好気）Evoglow

800
600

4.0 K

■E. coli DH5α■pGLOW-Bs1■pGLOW-Bs2■pGLOW-Pp1

10 倍

3.0 K

02

34[O2] 20.8%

5[O2] 5.0%

6

 混合ガスと触媒を用いれば酸素濃度を下げることができた(20.8→1.6%、FCM非稼動時)
 嫌気条件をさらに向上させる方策の確立
 FCMを嫌気的に使う手法確立が重要

count1

4.0 K
3.0 K

2.0 K

pGLOW-Bs2

2.0 K

1.0 K

1.0 K

00100101102103104105100

fluorescence intensity

101 102103 104
fluorescence intensity

Geobacter sulfurreducens PCA

Evoglow-Bs1やBs2で蛍光が確認できないのはレーザーの波長の問題ではない

タンパク質発現量の確認―デルタプロテオバクテリア綱に属する偏性嫌気性細菌―炭化水素の分解、金属の還元が可能[Caccavo FJ et al., 1994; Rooney-Varga JN et al., 1999; Snoeyenbos-West OL et al., 2000]

可溶性画分(kDa)

Bs1
(33)

Bs2
(19)

Pp1
(19) (kDa)

不溶性画分 Bs1(33)

遠心懸濁5037

コンピテントセル
30°C
30°C 1～3 週間

k18 時間NBAF 培地
pBBR1MCS-5
pBBR1MCS-5-Bs2
pBBR1MCS-5-Pp1

嫌気チャンバー内での操作

NBAF+抗生物質
プレート
Evoglow

3.0 K■pBBR1MCS-5■pBBR1MCS-5_Bs2■pBBR1MCS-5_Pp1

Pp1(19) (kDa) Evoglow-Pp1のみで明確なバンドが確認された50

 プラスミドのコンストラクトはほぼ同じ

37

2525202015151010

タンパク質の安定性の問題？

 pGLOW-Pp1 でのみ強い蛍光が見られた
 タンパク質の発現量（細胞内の存在量）が重要
 ターゲットの細菌ごとに最適な高発現プロモーターを選択し、同時にタンパク質の安定性も高める必要がある

count

2.0 K

Bs2(19)(kDa)[Coppi MV et al., 2001]（lacプロモーター下流で発現）

pGLOW-Pp1

105

Evoglow-Pp1のみで蛍光が確認されたレーザーの波長が最適ではない？

有用嫌気性菌での実証試験

G. sulfurreducens
PCA
NBAF 培地

pGLOW-Bs1

Evoglow

count

0 0 1
10 10 102 103 104 105
電圧パルスの高さ

FCMによる測定では蛍光が確認できなかった

Pseudomonas putida 由来

1000

200

エレクトロポレーション

Pp1

merge

488 nmのレーザーを使用

400―遺伝子組換え系が既に確立

B. subtilis 由来
大腸菌のコドンに最適化

467 nmのレーザーを使用

OD600=0.03
LB
E. coli DH5α 懸濁

1200

3.0 G

Bs2

顕微鏡観察による蛍光強度の確認

14 h, 37°C

1600

4.0 G

Bacillus subtilis 由来[evoglow basic kit]

酸素が無くても発光できる

NBAF固体培地

NBAF
液体培地

Bs1

anaerobic

キャタリストボックス

100 µlevoglow

1500[O2] 20.8% or 5.0% 分取後溶液YFP

使用した3種類のevoglow

蛍光スペクトル

aerobic

5

G. sulfurreducens
PCA

1～3 週間効率良く形質転換体が得られる

evoglow (evocatal , Monheim am Rhein, Germany)

20

嫌気チャンバーに入ったFCM

 プラスミド保持株の作製
 染色体挿入株の作製＋抗生物質

蛍光タンパク質の選択

25

サーキュレーター

 発現用大腸菌の作製
 好気条件下 FCM での蛍光測定
 嫌気条件下 FCM での蛍光測定
 タンパク質発現量の確認

 Geobacter sulfurreducens PCA

1st & 2nd

N2+H2(2) 蛍光タンパク質の選択(3) 有用嫌気性菌での実証試験

嫌気FCM測定環境の整備
N2(Beckman Coulter)or フローサイトメーターの利用
 嫌気条件でも蛍光を発するタンパク質の利用

ガス排出

フローサイトメーター(FCM)
MoFloTM XDP

 FCM用ビニールチャンバーの設置
 嫌気化手法の確立
 嫌気化の評価
 改良点の洗い出し

参考文献

1.0 K

 発現量が不十分だった可能性
 プロモーターの問題？

0100 101 102 103 104 105

fluorescence intensity

Caccavo FJ et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol., 60:3752–3759 Murphy KC et al., 2000, Gene, 246:321-330
Coppi MV et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol., 67(7):3180-3187 Park I and Kim BC, 2011, Biotechnol. Lett., 33(10):2043-2048
Rooney-Varga JN et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol., 65:3056–3063
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Snoeyenbos-West OL et al., 2000, Microb. Ecol., 39:153–167Kasai Y et al., 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72(5):3586-3592
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