博 士 （ 水 産学 ） 松 村航

学位論文題名Development of the protoplasts isolated from7species of LaminarlaleS（ PhaeophyCeae）（コンブ目植物7種から単離したプロトプラストの発生）

学位論文内容の要旨
植物 細胞 は全能 性を 持って いる 事が証 明さ れてい る。近年、海藻でもこ の特 性を利 用し た新し い育 種を目 的に 組織培 養や細胞培養の研究が行われている。
プ□ トプ ラスト を用 いた細 胞培 養は、 体構 造の比 較的簡単な紅藻アマノ リ類 や、緑 藻ア オサ類 など で行わ れて おり、 完全な植物体に再生す るこ とがで きる 。しか し、 体構造 が複 雑なコ ンブ目植物では単離細 胞か らの再 分化 や形態 形成 に関す る詳 しい知 見はほとんど無い。
北海道には28種のコンブ目植物が生育している。これらの海藻は、生態系 の維 持に重 要な 役割を 果た してい る海 中林や 藻場を形成するだけで なく 、アル ギン 酸の原 料と して利 用さ れ、古 来から食用としてきた 重要 を海洋 資源 である 。本 研究で は、 コンブ 目植物の中で有用 な 4属 7種 、 コ ン ブ 属 の マ コ ン ブ （ Laminaria japonica)、 ホ ソ
メコン ブ（ L. religiosa)、ミツイシコンブ（工．angustata)、ナガコンブ（工．longissima)、ト口口コンブ属のガゴメ（KjeDmaniellacrassむolia)、スジヌ属のスジメ（Costaria cos tata)、ワカヌ属のワカ ヌ （ Undaria pinnatifida)、 計7種 の胞 子体か らプ ロトプ ラス
トを単 離し 、この 細胞 の発生 過程 を詳細 に観 察した 。さらに、プ口
トプラ スト 由来の 幼胞 子体と 受精 卵由来 の幼 胞子体 （対照）を海中培養し 、生 長、成 熟、 外部お よび 内部形 態を 比較す る事によって、プロ ト プ ラ スト を 用 い た種 苗の 可能性 につい て検討 した。
プ ロ ト プ ラ ス ト を 単 離 す る た め に 、 市 販さ れ て い る Abalone
acetone powder（ 2％ ） と Cellulase〇nozuka RS（ 2％ ）の混 合酵
素 を 用 い た 。 酵 素 処 理 2時 間 後 、 胞 子 体 0.5gか ら 0.9〜 2.4Xl07

個の プ ロト プ ラス ト （球 形 、直 径8〜65 11m） を 容易 かっ 安定して単離 す るこ と がで き 、その生存率 は全ての種で 90％ 以上の高い値 であった。
プロトプラストを水温5℃、10℃、15℃、18℃で培養したところ、全て の サイ ズ （8〜65 11m） の プ口 ト プラ スト は 48時 間以内 に基質に着 生 し、 15日 以 内に 厚い細胞壁を再 生する事をCalcofluor試薬で確認 し た。 全 ての 種 において、10℃と 15℃が細胞壁の 再生に適しており 、 また 第 一分 裂 も10℃と15℃で培養 した細胞で最 も早く見られた 。 細 胞 分 裂 は 10〜 30umの プ口 ト プラ スト 由 来の 細 胞の み でお こり、 サ イズ か ら判 断 して、表層と 外皮層由来の 細胞だけが再生 能カを有している事が分かった。
水温による プ口トプラストの生存率を比ベ．ると、マコンブ、ホソヌコンブ、 ミツイシコン ブ、ナガコン ブ、ガゴヌで は低水温（5℃あるい は 10℃ ）、 ス ジメ 、ワカメでは高 水温（15℃ある いは18℃）が生存 に より 適 して い た。 ま た、 コン ブ 目4種で 比較 す ると、暖 流海域に生育す るホソヌコンブが、水温に対し最も広い適応能カを示し、4種の中で最 も寒流域に生 育するナガコ ンブが、高温で 強く制限された。 こ れら の 結果 は 、プロトプラ ストを培養す る際には生育場 所の水温 を 顧慮 す べき で ある事を示し た。また、水 温を一定に保っ た培養と 変 化さ せ た培 養 結果 か ら、 コン ブ 目4種と ガゴ メ では、仮 根の形 成 に お い て も 低 水 温 、 特 に 5℃ が 最 も 適 し て い た 。
10，20一40，100ルmolm−2s−1の光量でそれぞれ培養した場合、低光量は生存に 適していたが、細胞分裂や仮根の形成を抑制した。一方、
高光 量 ほそ の 生長 を 促進した。し かし、低光量 で数ケ月間生長 が抑制さ れ てい た 1〜 数細 胞の 発 生体 を 高光 量 下に 移す と 活発に分 裂し始め 、 仮根 を 形成 し て正常な胞子 体に生長した 事は、低光量下 での保存が可能である事を示した。
プロトプラス トからの発生過程を詳細に観察したところ、コンブ目4種と ガ ゴヌ で は、 これ ら の受 精 卵の 胚 発生 と同 じ 発生様式 を示し、 プ ロト プ ラス ト からの直接発 生によって正 常な胞子体に再 生した。 こ の発 生 過程 で 2〜10細胞 期 に仮 根 を形 成 した 初 期胞子体は 、生長の方向 性が定まり、多層の葉状部、茎状部、付着器を発達させ、完全 な 胞子 体 に再 生 した。しかし 、この数細胞 の時期に仮根を 形成しな い 発生 体 は正 常 な胞子体には 発達せず、数 細胞で発生が停 止す
るも の や、 茎 状部 、 付着器を形成 しない単層あ るいは多層の葉 状部様 の 形 態 を 示 し 、 5 mm以 上 に は 生 長 せ ず 枯 死 し た 。 こ の 現 象 は 7

種全てに共通である事から、仮根細胞の分化が胞子体の生長の方向性を決定し、コンブ目植物の形態形成において最も重要な条件である事が初めて明らかになった。しかし、仮根を形成した初期胞子体でも、水温が高くなるにっれて正常な発達をしないものが多数観察され、高水温によって正常な発達が妨げられ、反対に、低水温ほど正常な発生を促した。スジメ、ワカメでは正常な胞子体に再生する次の発生様式が観察された。（1）直接発生、（2）カルス様細胞塊からの発生、（3）コンブ配偶体様の糸状体からの発生。（1）はコンブ属4種とガゴメの発生様式と同じであり、比較的低水温で見られた。（2）のカルス様細胞塊は全ての水温で見られ、特に10℃と15℃でよく発達した。細胞塊の先端細胞から仮根を発出している場
合は葉状部様の発生体が形成され、正常な胞子体に発達した。この発生はワカメでは希であったが、スジヌのプ口トプラスト由来細胞は、ほとんどこの様なカルス様細胞塊に生長した。（3）の糸状体は高水温で2〜3ケ月培養した時に見られ、1〜数細胞で分裂を停止している体上あるいはカルス様の細胞から発出し、雌雄同株の配偶体様の糸状体に発達した。この糸状体から発生する胞子体には、体細胞由来（ワカメのみ）と卵細胞由来の2夕イプが認められた。後者は通常の2nの胞子体 （受精卵）の発生過程と同じであった。以上の結果は、培養水温によってこれらの発生様式を誘導できる事を初めて示した。
スジヌ、ワカメで発生した配偶体様の糸状体と、それから発生した初期の胞子体の染色体数は2n 約60であり、この胞子体は2倍体の糸状体由来の単為発生体である事を確認した。
7種の再生した幼胞子体を海中培養すると、全ての種の再生胞子体と対照の胞子体は成体サイズに生長し、両胞子体はほぼ同じ（有意差なし）かあるいは生長率の高いコンブ属では対照より長くなる傾向を示した。外部、内部形態は両胞子体で同じであり、コンブ目植物に特有の表層、粘液坑道を持つ皮層（スジメを除く）、髄層からなるラミナリア構造を有していた。
マコンブ、ホソメコンブ、スジメ、ワカメでは正常な胞子嚢を形成し成熟した。また、これらの胞子嚢から放出された遊走子は、雌雄異株の配偶体に生長し、正常な胞子体を形成した。
本論文はコンブ目植物でプ口トプラストから完全な成熟藻体を導いた初めての研究であり、この海中培養の結果は、1980年代から提唱されていたカルスあるいはプロトプラストを用いたク口ーンによる種苗が可能である事を証明した。

学位論文審査の要旨
主査
副査
副査
副査

教授
教授
教授
助教授

山本弘敏
山崎文雄
中尾 繁
安井 肇

学位論文題名Development of the protoplasts isolated from7
species of LaminarlaleS（ PhaeophyCeae）（コンブ目植物7種から単離したプロトプラストの発生）

海藻の プ口 トプラ スト を用い た細 胞培養は、体構造の比較的簡単な紅藻 アマノ リ類 や緑藻 アオ サ類な どで 行われており、完全な植物体に再生す ること がで きる。 しか し、体 構造 が複雑なコンブ目植物では単離細胞
か ら の 再 分 化 や 形 態 形 成 に 関 す る 詳 し い 知 見 は ほ と ん ど 無い 。
本 研 究 で は、 コ ン ブ 目 植 物 の中 で 有 用な 4属7種 、コ ンプ属 のマ コンブ （Laminaria japonica)、ホソヌコンブ（工．religiosa)、ミツイシコン ブ（工．angustata)、ナガコンプ（己．10ngissima)、ト口口コンブ属の ガゴヌ （KjeDmaniella crassifolia）、スジメ属のスジメ（Costariacostata)、ワ カメ属 のワ カメ（ Undaria pinnatifida)の胞子体からプ口ト プラス トを 単離し 、こ の細胞 の発 生過程を詳細に観察した。さらに、
プ 口トプ ラス ト由来 の幼 胞子体 と受 精卵由来の幼胞子体（対照）を海中培 養し、 生長 、成熟 、外 部およ び内 部形態を比較する事によって、プ口ト プ ラ ス ト を 用 い た 種 苗 の 可 能 性 に つ いて 検 討し た 。
プロト プラ ストの 単離 にAbalone acetone powder（2％）とCellulase
Onozuka RS（2％ ） の混 合 酵 素 を 用 い た。酵 素処 理2時 間後、 胞子 体から プ 口トプ ラス ト（球 形、 直径8〜 65ロm） を容易 かつ 安定し て単 離す
る こ と が で き、 そ の 生 存 率 は 全て の 種 で90％以上 の高 い値で あっ た。
プ 口トプ ラス トを水 温5℃ 、10℃、15℃、 18℃で 培養 したと ころ 、全て の サ イ ズ （8〜 65ルm） の プ 口ト プ ラ スト は48時 間以 内に基 質に 着生
し 、15日 以内 に厚い 細胞 壁を再 生す る事をCalcofluor試薬で確認した。
全 ての種 の細 胞壁の 再生 に10℃ ある いは15℃が適しており、また第一分裂 も 10℃ と 15℃ で 最 も 早 く 見 ら れ た 。 細 胞 分 裂 は 10〜30umの プ ロ ト
プ ラスト 由来 の細胞 のみ でおこ り、 サイズから判断して、表層と外皮層

由 来の 細 胞だ け が 再生 能 カ を有 し てい る事 が分かっ た。
水温に よる プロト プラ ストの 生存 率をコ ンブ属4種で比べると、暖流
海 域 に 生育 す る ホ ソ メ コ ンブ が 水 温 に 対 し最 も広い 適応 能カを 示し 、4
種 の 中 で最も 寒流 域に生 育す るナガ コン ブが高 温で 強く制 限さ れた。 この 結 果 は、プ 口ト プラス トを 培養す る際 には生 育場 所の水 温を 顧慮す ぺきである事を示した。
10，20―40，100ルmo
lm―2S−1の各光量で培養した場合、低光量は生存に適 し て いたが 、細 胞分裂 や仮 根の形 成を 抑制し 、高 光量は その 生長を 促進した。
コンブ 属4種 とガ ゴヌの プ口 トプラ スト の発生過程はこれらの受精卵の 胚 発 生と同 じで 、プ口 トプ ラス卜 から の直接 発生 によっ て正 常な胞 子体 に 再 生し た 。 こ の 発 生 過程 で 2〜 10細 胞 期に 仮根 を形成 した 初期胞 子体 は 、 生長の 方向 性が定 まり 、多層 の葉 状部、 茎状 部、付 着器 を発達 させ た 。 しかし 、こ の数細 胞の 時期に 仮根 を形成 しな い発生 体は 正常な 胞
子 体 に は発達 せず 、茎状 部、 付着器 を形 成しな い単 層ある いは 多層の 葉状 部 様 の形 態 を 示 し 、 5 mm以 上 に は 生 長 せず 枯死し た。 この現 象は 7種
全 て に 共通で ある 事から 、仮 根細胞 の分 化が胞 子体 の生長 の方 向性を 決
定 し 、 コンブ 目植 物の形 態形 成にお いて 最も重 要な 条件で ある 事を初 めて 明 ら かにし た。 ただし 、仮 根を形 成し た初期 胞子 体でも 、水 温が高 くな る に っれて 正常 な発達 をし ないも のが 多数観 察さ れ、高 水温 によっ て正 常 な 発達が 妨げ られ、 反対 に、低 水温 ほど正 常な 発生を 促し た。ス ジ
ヌ、ワカメでは正常な胞子体に再生する次の発生様式が観察された：（1）
直 接 発 生、（ 2）カ ルス 様細胞 塊か らの発 生、 （3） コンブ 配偶 体様の 糸状体 からの 発生。（1）はコンプ属4種とガゴヌの発生様式と同じであり、比較的低水温で見られた。（2）のカルス様細胞塊は全ての水温で見られ、
特 に 10℃と15℃で よく発 達し た。細 胞塊 の先端 細胞 から仮 根を 発出し ている場合は葉状部様の発生体が形成され、正常な胞子体に発達した。（3）の 糸 状 体は 高 水 温 で 2 ‑3ケ月 培 養 し た 時 に見 られ、 1〜数 細胞 で分裂 を停止 してい る体上あるいはカルス様の細胞から発出し、、雌雄同株の配偶体様の糸状体に発達した。
プ 口 トプラ スト から再 生し た幼胞 子体 を海中 培養 すると 成体 サイズ に生 長 し 、対照 の胞 子体と ほば 同じ（ 有意 差なし ）か あるい は生 長率の 高
いコンブ属では対照より長くなる傾向を示した。
マ コ ンプ、 ホソ メコン プ、 スジメ 、ワ カメで は正 常な胞 子嚢 を形成 し成 熟 し た。ま た、 これら の胞 子嚢か ら放 出され た遊 走子は 雌雄 異株の 配偶体に生長し、正常な胞子体を形成した。
こ の 結果は コン ブ目植 物で プロト プラ ストか ら完 全な成 熟藻 体を導 いた 初 め ての知 見で あり、 海藻 の育種 に多 大な貢 献を なすも ので ある。 審査 員 は これを 評価 し、博 士（ 水産学 ）の 学位に ふさ わしい と認 定した 。