課題番号：25指202
研究課題名：肝炎の海外連携等に係る研究主任研究者名 ：溝上雅史
分担研究者名 ：是永匡紹
キーワード ：肝がん、FFPE サンプル、ゲノムワイド関連解析（GWAS）、超並列シークエンス、データベース
研究成果 1 （海外施設との連携） ：国立国際医療研究センター・国際医療協力部と連係して、世界各国（インドネシア、タイ、アルゼンチン、ミャンマー、ウズベキスタン、モンゴル、キルギスタン、台湾、香港、韓国）における HBV研究の拠点施設と共同研究体制（MOU の作成）を整えた。うち、6 か国（インドネシア、タイ、ミャン
マー、ウズベキスタン、モンゴル、台湾）の 7 施設との MOU 作成を完了した。
海外施設の研究担当者とはメールでの打ち合わせを行い、検体の収集および臨床情報の収集を開始している。海外サンプル（ゲノム DNA、血清）の収集に向けて、肝炎・免疫研究センター内に設置した検体・臨床情報管理システムの英語版データシートを作成した。
台湾の共同研究施設から B 型肝炎関連肝発癌患者 400 名および慢性肝炎患者 400 名のゲノム DNA を受領して、検体・臨床管理システムへの登録を完了した。

研究成果 2 （国内施設との連携）：

国内の研究協力施設で採血した B 型肝炎患者のゲノム DNA、血清サンプルを SRL 経由で国立国際医療研究センター・国府台病院に収集・保管する検体・臨床情報収集システムを構築した。今年度はこのシステムを利用して 959 例を収集し、合計 1,163 検体のゲノム DNA と血清を収集した（SRL 経由：763検体、施設直送：400 検体）。収集したゲノム DNA すべての濃度測定を実施し、均一濃度への調整を実施した。
簡易版データシートを用いた臨床情報の収集を進め、SRL 経由で収集した 763 検体のうち 700 検体、および施設直送 400 検体のすべてについての臨床情報を収集した。また、詳細版データシートを用いた臨床情報の収集も並行して進め、SRL 経由で収集した 763 検体のうち 181 検体、施設直送 400 検体のうち 162 検体についての臨床情報を収集した。

研究成果 3（肝発癌研究）：
台湾 GWAS（B 型肝炎関連肝発癌患者と慢性肝炎患者の比較）で検出された疾患感受性候補 SNP を対象として、日本人サンプルを用いた Replication 解析を実施した。また、台湾の共同研究施設から受領した B 型肝炎関連肝発癌患者 400 名および慢性肝炎患者 400 名のゲノム DNA を用いて、日本人を対象とした GWAS（B 型肝炎関連肝発癌患者と慢性肝炎患者の比較）で検出された疾患感受性候補 SNPの Replication 解析を実施している。

Subject No.

：25SHI202

Title：Global initiatives for hepatitis researches

Researchers ：Masaaki Korenaga
Key word：Hepatocellular carcinoma, Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded samples,

Genome-wide association studies, next generation sequencer, database
Abstract：

Result1 (Collaboration with foreign countries)

We prepared a memorandum of understanding (MOU) for collaboration of HBV researches,with foreign universities / institutes / hospitals from Indonesia, Thai, Argentina, Myanmar,Uzbekistan, Mongolia, Kyrgyzstan, Taiwan, Hong Kong and Korea. We have alreadycompleted the document for seven institutes from six countries, including Indonesia, Thai,Myanmar, Uzbekistan, Mongolia, and Taiwan.
We had meetings to make study design via e-mail, and have already started tocollect samples (genomic DNA and serum) and clinical information from HBV patients andhealthy controls. To collect clinical information of HBV patients, we prepared an English
version of clinical information form as a template.
A total of 800 Taiwanese genomic DNA samples from HBV patients havealready collected with simplified clinical information.
Result2 (Collaboration with institutions in Japan)

We constructed the “sample and clinical information collecting system” in our own host server.
Using the system, a total of 1,163 Japanese samples from HBV patients and healthy controls
were collected with simplified (n=1,100) and detailed (n=343) clinical information. The
concentration of all genomic DNA samples was measured using spectrophotometer and all thesamples were arranged to have a uniform concentration.
Result3 (Collaboration with institutions in Japan)

We performed a replication study for candidate SNPs which were identified in Taiwan GWAS
(in comparison between patients with HBV-related hepatocellular carcinoma and patientswith chronic hepatitis B), using Japanese samples. We also performed a replication study forcandidate SNPs, which were identified in Japanese GWAS, using Taiwan samples.

Researchers には、分担研究者を記載する。

研究のマイルストーン
1．検体・臨床情報の収集

検体・臨床情報【平成25年度】検体・臨床情報の収集

肝発癌因子の探索

FFPEのゲノム解析

研究協力
施設とMOU作成

HLA‐DPアリル
タイピング

FFPEサンプルの収集
Omni expressの評価【平成26、27年度】
検体・臨床情報の収集

肝発癌因子の探索

FFPEのゲノム解析

国内外から新規検体の収集

HLA層別化GWASの実施

FFPEサンプル
でのGWAS
パイプライン
構築

HBV由来HCCを対象としたGWAS・Replication解析の実施

国内外の研究協力施設からB型肝炎・C
型肝炎由来肝がん患者群、非B非C型肝がん患者群、慢性肝炎患者群、肝硬変患者群のサンプルを収集し、合わせて詳細な臨床情報を収集してデータベースに蓄積する。なお、肝がん患者群については、肝細胞がん組織のFFPEサンプルも収集する。

検体収集の概要図2．肝発癌因子の探索
肝細胞がん組織から抽出したゲノムDNAやトータルRNAを用いて、高速シークエンスによるWhole transcriptome解析やエピゲノム解析などを実施する。癌組織におけるゲノム構造異常（コピー数異常、転座、逆位など）、後天的ゲノム修飾情報、遺伝子発現変化などのゲノム情報を、患者の詳細な臨床情報と共にデータベースに蓄積する。臨床情報と共に、様々なゲノム情報を統合的に解析することで、癌化や病態進展に関わる関連遺伝子の同定やその遺伝子機能の解明を目指す。

3．FFPEのゲノム解析
FFPEサンプルから抽出したゲノムDNAやトータルRNAを用いたゲノムワイドSNP解析や高速シークエンスの実用性を検証し、ゲノムワイド関連解析（GWAS）やエピゲノム解析、トランスクリプトーム解析といった様々なゲノム解析のパイプラインを構築する。ゲノム解析のパイプラインが構築されることで、本研究のみならず様々な疾患を対象とした臨床ゲノム研究において有用となる。

H25年度成果
国際医療協力部と連係して、国外のHBV研究の拠点施設と国際医療研究センターの間でMOUの作成を実施した（図1）。
台湾の共同研究施設からB型肝炎関連肝発癌患者400名および慢性肝炎患者400名のゲノムDNAを受領し、検体・臨床管理システムへの登録を完了した。
既収集検体に加えて、新たに国内から収集したB型肝炎患者サンプルを対象としてHLA‐DPB1タイピングを実施し、関連解析を実施した（図2）。関連解析の結果、B型肝炎慢性化および肝発癌に関連するDPB1アリルが同定された。
図1．検体集およびデータ取得状況（2014.4.22集計）

JapaneseHBV(2n=2,760)
count%

AlleleHealthy(2n=2,470)
count%X^2OR*(95% CI)

HLA-DPB1
01:01
02:01

10.0

514 18.6

10.0

0.9374602 24.4

4.05E-07

02:02

77

2.8

88

3.6

0.1136

03:01

126

4.6

108

4.4

0.7364

04:01

63

2.3

138

5.6

5.43E-10

04:02

129

4.7

224

9.1

2.54E-1005:01

1294 46.9

948 38.4

5.52E-10

06:01

100.4

130.50.3709

09:01401 14.5

241

9.8

1.52E-07

13:01

61

2.2

39

1.6

0.0961

14:01

47

1.7

42

1.7

0.9944

17:01

8

0.3

00.0

0.0074

19:01

14

0.5

14

0.6

0.7683

21:01

1

0.0

0

0.0

0.3441

29:01

1

0.0

2

0.1

0.4999

36:01

2

0.1

0

0.0

0.1809

38:01

1

0.0

4

0.2

0.1419

41:01

10

0.4

6

0.2

0.43500.89(0.06-14.31)
0.71(0.62-0.81)
0.78(0.57-1.06)
1.05(0.80-1.36)
0.39(0.29-0.53)
0.49(0.39-0.61)
1.42(1.27-1.58)
0.69(0.30-1.57)
1.57(1.33-1.86)
1.41(0.94-2.11)
1.00(0.66-1.52)
0.89(0.43-1.88)
0.45(0.04-4.93)
0.22(0.03-2.00)
1.49(0.54-4.11)a) HBV patients (n=1,380) vs. Healthy control (n=1,235)

HLA-DPB1
AlleleHCC(2n=1,148)
count%
0.0

Japanese
IC + CH(2n=1,356)X^2count%
1
0.1
0.357401:01

002:01

171

14.9

291

21.5

2.45E-05

02:02

34

3.0

37

2.7

0.7263

03:01

58

5.161

4.5

0.5164

04:01

34

3.024

1.8

0.0482

04:02

52

4.562

4.6

0.9593

05:01

571

49.7

614

45.3

0.0260

06:01

4

0.3

6

0.4

0.7100

09:01

169

14.7

195

14.4

0.8095

13:01

29

2.5

26

1.9

0.3004

14:01

20

1.7

22

1.6

0.8162

17:01

4

0.3

2

0.1

0.3055

19:01

7

0.6

5

0.4

0.3842

21:01
29:01
36:01
38:01

11
0
1

0.1
0.1
0.0
0.1

00
2
0

0.0
0.0
0.1
0.0

0.27700.27700.19300.2770

41:01

2

0.2

8

0.6

0.1003

OR*(95% CI)

0.64(0.52-0.79)
1.09(0.38-1.75)
1.13(0.78-1.63)
1.70(1.00-2.87)
0.99(0.68-1.44)
1.20(1.02-1.40)
0.79(0.22-2.79)
1.03(0.82-1.28)
1.33(0.78-2.26)
1.08(0.58-1.98)
2.37(0.43-12.94)
1.66(0.52-5.24)

0.29(0.06-1.39)b) HCC (n=574) vs. IC + CH (n=678)

図2．HLA関連解析結果
a) B型肝炎慢性化とHLA‐DPB1の関連
b) b) 肝発癌とHLA‐DPB1の関連課題番号：２５指２０２
研究課題名：代謝異常と肝発癌に関する研究主任研究者名 ：溝上雅史
分担研究者名 ：是永匡紹
キーワード ：
研究成果
：肝細胞癌は高齢者、肥満・糖尿病患者に圧倒的に多いという臨床的事実は長く認識されていながら、どのように発癌機構に影響するのかは不明のままであった。この原因としては、肝細胞癌の原因として約 70%が HCV 感染しており、これまでに研究は HCV を排除することに費やされていたと推測している。近年、HCV に対しては新薬の開発が進み、2-3 年内に HCV を高率かつ副作用なく、排除可能になる。ポスト肝炎ウイルス時代の肝発癌は、前述した加齢と代謝異常のクロストークを解明することが必要不可欠である。
肥満・脂肪性肝疾患では、糖・脂質代謝異常のみならず、肝内鉄過剰状態が存在するが報告されているが、脂肪肝における鉄代謝異常の意義や臨床的な長期予後は未だに明らかにされていない。
そこで、本年度では、8 週齢の C57BL/6N と C57BL/6J に対して AIN 食又は通常餌（CE2）を与える4 群（6NAIN,6NCE,6JNAINe,6JCE）を設定する。飼育開始 6,12 ヶ月目 sacrifice し肝内の脂肪化の程度、酸化ストレスの程度、肝ミトコンドリア単離し、その機能解析を行った。
C57BL/6N では、C57BL/6J と比較して軽度の体重増加を認めていたが、AIN 食でその差顕著化し、肝内脂肪や鉄濃度の増加を認めた。また、脾臓内での鉄濃度の低下を認め、6N では網内系で鉄保持が充分できず、肝蔵内へ蓄積されていると推測された。鉄吸収機構の状態を把握するため、hepcidin を測定したから、発現低下が確認され、その原因として IL6/STAT3 や BMP6/Smad3 は否定され、酸化ストレスが関与することが確認された。
マイクロアレイ解析で、ミトコンドリアによる脂肪酸分解抑制、及び呼吸鎖複合体 IV 機能異常が抽出されたため、CPT1/2 の western blot や複合体 IV 酵素活性や subunits を real time PCR にて確認したとこ
ろ CPT1/2 の発現低下によるβ酸化抑制、及び複合体 IV 活性低下、更に複合体 IV の subunit である
CoX7a2 発現低下が確認された。
遺伝子に変化がないとされる C57BL/6J と C57BL/6N においても、加齢とともに肝脂肪蓄積と脾臓内鉄に対する感受性が異なる。同量の鉄置換食にて更に肝機能が上昇したことは脾臓による鉄処理機構低下が肝脂肪肝増強の一因となることを示唆する。また CoX7a は骨格筋では CoX7a1 としてエピゲノム修飾を受け糖尿病発症に関与すると報告され、肝臓での Cox7a も加齢と鉄代謝異常により同様な変化を受ける可能性が示唆された。今後は、Cox7a2 のエピゲノム解析を行うとともに、別モデルや Knockout マウスを作製し、肝発癌機構にともなう Complex IV の意義を明らかにする。今後は、Cox7a2 のエピゲノム解析を行うとともに、別モデルや Knock out マウスを作製し、肝発癌機構にともなう ComplexIV の意義を明らかにする。

２５指２０２ 分担研究：

代謝異常と肝発癌に関する研究MK

２５指２０２ 分担研究：

代謝異常と肝発癌に関する研究MK

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：25指202
研究課題名：肝炎の海外連携等に係る研究主任研究者名：溝上雅史

論文発表
論文タイトル著者掲載誌

Khudayberganova D,Sugiyama M, Masaki
N, Nishida N, Mukaide
M, Sekler D, Latipov R,
IL28B polymorphisms and clinical implications Nataliya K, Dildora S,PLoS One
for hepatitis C virus infection in Uzbekistan. Sharapov S,
Usmanova G,
Raxmanov M,
Musabaev E,
Mizokami M.
Nishida N, Sawai H,
Kashiwase K, Minami
M, Sugiyama M, Seto
WK, Yuen MF,
Posuwan N,
Poovorawan Y, Ahn
SH, Han KH, Matsuura
K, Tanaka Y, Kurosaki
M, Asahina Y, Izumi N,
Kang JH, Hige S, Ide
T, Yamamoto K,
New susceptibility and resistance HLA-DP
Sakaida I, Murawaki Y,
alleles to HBV-related diseases identified by aPLoS One.
Itoh Y, Tamori A, Orito
trans-ethnic association study in Asia.
E, Hiasa Y, Honda M,
Kaneko S, Mita E,
Suzuki K, Hino K,
Tanaka E, Mochida S,
Watanabe M, Eguchi
Y, Masaki N, Murata K,
Korenaga M, Mawatari
Y, Ohashi J,
Kawashima M,
Tokunaga K,
Mizokami M.

掲載号

年

24;9(3):e93011

2014

10;9(2):e86449

2014

Strategy for preventing hepatitis B reactivation Kusumoto S, Tanakain patients with resolved HBV infection
Y, Mizokami M, Ueda Hepatology.
following rituximab-containing chemotherapy. R.

in press

2013

Is antiviral prophylaxis necessary to prevent
Kusumoto S, Tanaka
hepatitis B virus (HBV) reactivation in patients
Y, Mizokami M, Ueda J Clin Oncol.
with HBV-resolved infection receivingR.
rituximab-containing chemotherapy?

31(35):4480

2013

Trinks J, Sugiyama M,
In vitro replication competence of a hepatitis B Tanaka Y, Kurbanov F,Benetucci J, Giménezgenotype D/A recombinant virus: dissimilarJ Gen Virol.
E, Weissenbacher MC,biological behaviour regarding its parentalgenotypes.
Mizokami M, Oubiña
JR94(Pt 12):27248

2013

研究発表及び特許取得報告について

Risk factors for long-term persistence ofserum hepatitis B surface antigen following
acute hepatitis B virus infection in Japaneseadults.

Ito K, Yotsuyanagi H,
Yatsuhashi H, KarinoY, Takikawa Y, Saito
T, Arase Y, Imazeki F,
Kurosaki M, Umemura
T, Ichida T, Toyoda H,Yoneda M, Mita E,Yamamoto K,
Hepatology.
Michitaka K, Maeshiro
T, Tanuma J, TanakaY, Sugiyama M,
Murata K, Masaki N,Mizokami M;
Japanese AHB Study
Group.

59(1):89-97

2014

Novel point mutations and mutational
complexes in the enhancer II, core promoter
and precore regions of hepatitis B virus
genotype D1 associated with hepatocellular
carcinoma in Saudi Arabia.

Khan A, Al Balwi MA,
Tanaka Y, Hajeer A,
Sanai FM, Al
Abdulkarim I, Al Ayyar Int J Cancer
L, Badri M, Saudi D,
Tamimi W, Mizokami
M, Al Knawy B.

133(12):2864-71

2013

Yotsuyanagi H, Ito K,Yamada N, Takahashi
High levels of hepatitis B virus after the onset
H, Okuse C, Yasudaof disease lead to chronic infection in patients
Clin Infect Dis.
K, Suzuki M, Moriya K,
with acute hepatitis B.
Mizokami M,
Miyakawa Y, Koike K.

57(7):935-42

2013

Nakano N, Kusumoto
Reactivation of hepatitis B virus in a patient S, Tanaka Y, Ishida T,with adult T-cell leukemia-lymphoma receiving Takeuchi S, Takatsuka
Hepatol Res.
Y, Akinaga S,
the anti-CC chemokine receptor 4 antibody
mogamulizumab.
Mizokami M, Ueda R,
Utsunomiya A

44(3):354-7

2014

高密度マイクロアレイによるゲノムワイド関連解 西田奈央、徳永勝士、析（GWAS)の実際
溝上雅史

67(1): 7-14

2013

肝胆膵学会発表
タイトル

発表者

IL28B遺伝子によるC型肝炎の治療効果予測と、第二の関連遺伝子の探索

西田奈央、徳永勝士、
溝上雅史

学会名場所

年月

第17回日本肝臓学
品川会大会

2013年10月9日-12日

西田奈央、澤井裕美、
B型肝炎慢性化および病態進展に関わるHLA- 馬渡頼子、杉山真也、川嶋実苗、大橋順、田DP遺伝子のアジア人集団における横断的解析
中靖人、徳永勝士、溝上雅史

日本人類遺伝学会
第58回大会仙台

2013年11月20日-23日

西田奈央，田中靖人、
C 型慢性肝炎の治療効果に関連する第二遺伝 杉山真也、馬渡頼子、石井真由美、徳永勝
要因の探索
士、溝上雅史

第49回 日本肝臓学会総会

新宿2013年6月6日7日

研究発表及び特許取得報告について

Trans-ethnic analyses of HLA-DPA1, DPB1
haplotypes to be associated with hepatitis B
virus infection

Nao Nishida, Hiromi
Sawai, Kouichi
Kashiwase, Mutsuhiko
Minami, Masaya
Sugiyama, Wai-Kay
Seto, Man-Fung Yuen,
Yong Poovorawan,
Sang Hoon Ahn,
Kwang-Hyub Han,
Kentaro Matsuura,
Yasuhito Tanaka,
Masayuki Kurosaki,
Yasuhiro Asahina,
Namiki Izumi, JongAmerican
Hon Kang, Shuhei
Association for theHige, Tatsuya Ide,2013年11月1日
Washington DC
Kazuhide Yamamoto, study of Liver-5日
Diseases The Liver
Isao Sakaida,Yoshikazu Murawaki, Meeting 2013
Yoshito Itoh, Akihiro
Tamori, Etsuro Orito,
Yoichi Hiasa, Masao
Honda, Shuichi
Kaneko, Eiji Mita,
Kazuyuki Suzuki,
Keisuke Hino, Eiji
Tanaka, Satoshi
Mochida, Masaaki
Watanabe, Yuichiro
Eguchi, Masaaki
Korenaga, Yoriko
Mawatari, Minae
Kawashima, Katsushi

Nao Nishida, Yasuhito
Tanaka, Masaya
Sugiyama, Yoriko
Understanding of IL28B gene associated with
61th Annual ASHG
Mawatari, Mayumi Ishii,
Bostontreatment response for HCV patients
Meeting
Chieko Haga, Katsushi
Tokunaga, MasashiMizokami

アジア人集団におけるB型肝炎患者を対象としたHLA-DP遺伝子の横断的解析

西田奈央、澤井裕美、馬渡頼子、杉山真也、川嶋実苗、大橋順、田中靖人、徳永勝士、溝上雅史

第36回日本分子生
神戸物学会年

2013年10月22日-26日

2013年12月3日-6日

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
該当なし
特許取得状況について※出願申請中のものは(

発明名称

B型肝炎の慢性化の素因の検出方法)記載のこと。
登録番号特願2013-179634※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）
徳永勝士、澤井裕美、溝上雅史、西田 2013年8月30日 日本奈央

出願国