〔生物工学会誌

第 94 巻

第 5 号 230–236．2016〕2015 年度 生物工学功績賞 受賞

メタボロミクス技術開発と精密表現型解析への応用
福﨑英一郎

Development of Metabolomics Technology andits application to high resolution phenotype analysis
Eiichiro FUKUSAKI (Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka
University, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japan) Seibutsu-kogaku 94: 230–236, 2016.

はじめにらに下流には代謝物の総体情報であるメタボロームが位置する．メタボロームはいわゆるゲノム情報実行の結果

前世紀末に多くのモデル実験生物のゲノム配列が決定であり，精密な定量的表現型と考えることができ，後天された．ゲノム情報を通じて有益な新知見が数多く得ら

的獲得形質理解に特に貢献すると期待されている（図れ，世界中が解く価値のある新問題に直面した．ゲノム

1）．

解読前後で，生命科学研究やバイオテクノロジー研究に

メタボロームを観測する方法に特に制限はないが，質対する考え方も大きく変わった．各人が色々な所感を量分析は，感度，解像度にすぐれ，代謝物の定性・定量もったのであろうが，筆者がもっとも感じたことは「ゲ分析の手法としてもっとも頻用されている手法である．

ノム情報が分かっても意外に生命の不思議はわからない

特に種々の化合物分離手段，たとえばガスクロマトグラものだ」という印象である．というのも，筆者自身，ゲ

フィー，液体クロマトグラフィー，キャピラリー電気泳

ノム解読が進行している中で，生命体の設計図であるゲ

動，超臨界流体クロマトグラフィーなどと組み合わせる

ノム配列が解読されれば，生命体の仕組みが相当わかるであろうという雰囲気に期待に胸を膨らませていた一人だったからである．当然のことながら，生命体はその設計図であるゲノム情報によって定められる遺伝形質により多くの運命が決定づけられる．しかしながらゲノム情報だけで生き物のすべてが規定されるわけではない．遺伝形質の貢献は高等生物になるに従い低くなり，後天的獲得形質の影響が大きくなる．一卵性双生児であっても生活環境が異なれば時として大きく異なる健康状態になるのである．後天的獲得形質理解にはゲノムの下流のオーム情報解析が重要である．トランスクリプトームおよびプロテオームは，ゲノム情報が実行される過程のメ
ディアの流れを表現する動的情報であり遺伝子間の発現
ネットワークの理解には必須のオーム情報である．
ただ，後天的獲得形質の直接理解には至らないことが多い．さ
著者紹介

230

図 1．ポストゲノムオーム科学におけるメタボロミクスの位置
づけ

大阪大学大学院工学研究科生命先端工学専攻（教授） E-mail: fukusaki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

生物工学

第94巻

ことにより，
威力を発揮する．近年は，質量分析計（MS）

述した論文を発表した 3)．本問題については現在に至るの感度が劇的に向上するとともに，種々のハイブリッドまで完全解決策は得られていないが，メタボロミクスの型質量分析計の出現により，以前には考えられなかった

安易な運用に警鐘を鳴らす重要な意味をもつ提案論文で情報が得られるようになった．メタボロミクス研究は，あると自負している．メタボロミクスはノンターゲット

観測代謝物対象を特定しないノンターゲット解析と，あ解析を半定量的に実施した上で，ターゲットを絞り定量る程度観測対象を特定したターゲット解析の両方の運用性を高めて解析することにより詳細な知見が得られる．

が行われるが，筆者は，定量性を重視したターゲットプ

そのためには，タンデム四重極 MS を用いた multiple

ロファイリングを実施し，得られたメタボロームと表現型の相関関係を詳細に解析することにより，表現型発現

reaction monitoring（MRM）モードでの解析が必要となる．できる限りユーザーフレンドリーな MRM モード

機構解明に資する代謝情報を得ることを主眼として研究

でのターゲット解析プラットフォームを開発した 4,5)．さを行ってきた．できるだけ網羅的に代謝物をとらえるたらに，質量分析スペクトルから代謝物を推定していく過めに，通常の質量分析とはかなり異なる分析を実施する

程で当該推定の確からしさを BLAST の統計理論を用い必要がある．解析方法も通常の解析では対処できないたて表す方法論を開発した 6)．このように GC-MS メタボ

め，われわれは種々の解析方法を開発してきた．受賞研

ロミクスプラットフォームを開発するとともに，その有究はメタボロミクス研究において普遍的に必要な方法論

GC-MS以外の手法，
用性を示すことができた．もちろん，の開発とそれらの一般性と拡張性の検証について与えら

たとえば液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）

れたものであると自覚している．本稿では開発した方法

やフーリエ変換核磁気共鳴スペクトラム（FT-NMR）な論について言及した上で，種々のアプリケーションを紹どの解析戦術も駆使して総合的にメタボロミクス研究を介し，今後の展望についても考察したい．

推進している．他にも近年，さまざまな解析方法が考案

メタボロミクス研究に必要な基本的解析方法の開発されている．メタボロミクス技術の進展については，総説を参照されたい 7)．メタボローム情報を説明変数としメタボロミクスにおいて通常，質量分析は何らかの分た表現型解析は，実験材料に制限はほとんどない．動植

離手段との組合せで運用される場合が多いと前述した．

物微生物のすべてが研究対象になりうる．近年の応用研

種々の分離モードの中で，特にガスクロマトグラフィー

究については，総説を参照されたい 8)．本論文では，筆（GC）がもっともよく用いられる．GC は誘導体化が必者のいくつかのトピックスを中心として，メタボロミク

要である上にガス化の際の高熱でサンプルが熱分解など

スの表現型解析への応用について議論したい．

により変動することが危惧される手法であり，バイオ分
野では，液体クロマトグラフィー（LC）の方がなじみ

メタボリックフィンガープリンティングの原理と応用のある方法である．しかしながら，メタボロミクスにおメタボロミクスがポストゲノムオーム科学に登場した

いては GC の高いピークキャパシティとイオン化サプ

当初は，メタボローム情報を上流のオーム情報，すなわ

レッションを受けにくい電子イオン化（EI）法によるイ

ち，ゲノム，トランスクリプトーム，プロテオームといっオン化による高い定量性は欠点を補っても余りある長所

た情報理解のための一助と考える運用が主流だった．こである．しかしながら，網羅性を優先するために，必要れは，一定レベルの成果を上げてきたが，どちらかとい

最小限の前処理しか行わないために，生体サンプル由来

うとメタボロミクスは主役ではなく，補助的な戦術としの膨大な代謝物情報が GC-MS 分析の生データには含まてとらえられてきた．一方，メタボローム情報を説明変れている．バイオロジストが理解可能な代謝物データ行数として定量的表現型のレベルを解析するメタボリック

列を組織化するためには新しい手法の開発が必要であっフィンガープリンティングは，遺伝型の差異を解析できた．上記の背景を踏まえて，いくつかの重要な基本技術

るだけでなく，生体のダイナミックな変動の表現方法とを考案・開発した．まずは，スキャンデータから代謝物して期待できる．メタボリックフィンガープリンティン

ピークを抽出し，できうる限り正確に代謝物推定する汎グ解析は他のオーム情報（ゲノム，トランスクリプトー

1)

用性の高い解析方法を開発した ．当該方法を種々の生

ム，プロテオーム他）を必要としないことも大きな特長

体サンプルに適用しその一般性の高さを検証した 2)．同．
である（図 2）

じ分析を行っても分析バッチが異なれば微妙な差異を生メタボリックフィンガープリンティングの運用の例を

むことは一般に知られている．解析変数が膨大であるメ

あげる．実験動物であるゼブラフィッシュは，発生段階

タボロミクスでは特に重要な問題となる．筆者は，当該をメタボロームを説明変数として正確に予測することが問題点を指摘し，将来解決すべき重要課題である旨を記できる 9)．人工授精により調整したゼブラフィッシュの2016年 第5号

231

図 3．メタボリックフィンガープリンティングによるゼブラ
フィッシュの発生ステージの予測
図 2．メタボロリックフィンガープリンティングの概念おけるメタボロームを観測して得られたメタボローム
初期発生胚を経時的にサンプリングし，水溶性代謝物を行列を説明変数として分裂寿命を応答変数とする OPLS

抽出し，シリル化などの誘導体化の後，GC-MS 分析に（orthogonal projection to latent structure）回帰解析を実供した．得られた分析結果から代謝物テーブル行列を組施することで，メタボローム情報を予測変数として寿命織化し，主成分分析に供した．主成分スコアプロットかを予測することに成功した．さらに，前述のメタボロー

ら第 1 主成分が発生段階と強い相関を示していることがム行列を主成分分析に供することにより，得られた主成わかった．次に，メタボローム情報を説明変数，受精後分ベクトル負荷量の情報から寿命の長短に相関のある代時間を応答変数として PLS（partial least square projection
to latent structure）により回帰モデルを作成した．結果

謝物情報を得た．たとえば長寿命株はプロリン，グルタ

として，高い相関係数を有する予測モデルの構築に成功

酸のプールサイズの顕著な増加が認められた．そこで，．
した（図 3）

それらのアミノ酸のプールサイズを増やすために，グルミン，ヒスチジンなどのグルタミン酸グループのアミノ同様の実験は他のモデル動物でも可能であり，これま

タミン酸分解を正に制御する転写調節因子である Uga3で，線虫やショウジョウバエで同様の実験に成功していをノックアウトしたところ，寿命がコントロールと比較

る 10)．本手法は，さらに発生段階に重要な役割を担うバ

して 75％伸びた．結果として Uga3 が寿命延長遺伝子でイオマーカー探索への可能性を提示している．生体のダあることが確認された．同様に，長寿命株では，アスパ

イナミックな状況をモニタリングできるという性能は，ラギン酸やメチオニンの蓄積量が大きい傾向がメタボ

臨床検体（血液，尿など）をサンプルとして疾患の種類

ローム解析からわかったので，二つのアミノ酸のプールと病状レベルを推定することにもつながる．当該技術はサイズを上昇させるために，S03 のアウトフラックスを疾患バイオマーカー探索や，疾患の早期診断システム開正に制御する転写調節因子である Fzf1 をノックアウト

発への応用も期待できる．これまでに筆者らは，種々のした．結果として Fzf1 ノックアウト株は寿命がコント

がんの初期段階に特異的なメタボリックフィンガープリ

ロールと比較して 66％向上した．同様の戦術で，種々ントの発見に成功しており，原理的には早期診断への応なレベルの寿命延長株，寿命短縮株を戦略的に作製する用が可能であることを示している

11–13)．

メタボロミクスを用いた酵母の寿命遺伝子の探索ことに成功した 14)．当該研究の概念を図 4 に記す．
寿命は完全な定量的表現型であるが，さまざまな定量的レベルで変異株をそろえることは古典的な遺伝学の手

メタボリックフィンガープリンティングの技術の応用

法ではきわめて難しい．メタボロームを精密表現型とみ範囲は広く，複数の遺伝子が関与する複雑な定量的表現なした方法を用いることにより，従来困難だった定量的型の解析にも応用可能である．我々は出芽酵母の分裂寿

表現型のラインアップが容易となった．最近，筆者は出命を複数遺伝子関与の定量的な表現型と見做し，メタボ

芽酵母の変異株ライブラリーを用いて転写調節因子関連

リックフィンガープリンティングによる寿命関連遺伝子

変異株と推定される一群の変異株をメタボローム解析

探索を試みた．まず，長寿命変異株と短寿命変異株を通し，ミトコンドリアの retro grade pathway に関わる遺伝

常寿命株とを完全培地でそれぞれ培養し対数増殖期に子を特定することに成功した 15,16)．これらの成功体験を

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図 4．メタボロミクスを用いた半合理的戦略による寿命関連遺伝子の探索

図 5．メタボリックフィンガープリンティング手法を用いた緑茶の品質予測拡大解釈すれば，メタボロームにより複数遺伝子が関与における順位を応答変数として PLS 法により緑茶の製する複雑な定量的表現型が表現可能である．また，複数．
品品質予測モデルの構築に成功してきた 17–21)（図 5）

有用形質の同時向上戦略においてメタボロームが有益なナビゲータになることを示唆している．
食品の二次機能の定量的解析への応用
食品は多成分からなる多機能コモディティであり，ど結果として，
前述のいずれの測定機器を用いた場合も，説明変数の変数抽出を丁寧に実施するとともに，オーバーフィッティングを回避するための工夫をこらすことにより，満足いくレベルでの官能品質予測モデルが構築可能であることが示された．

の成分がどの機能に関与しているのかの完全解明は容易

種々の食品品質解析への応用ではない．特に食品の二次機能（おいしさ）については機能性に基づく解析が困難である．食品の三次機能（生

本手法の適用範囲は広く，筆者らのグループではこれ

理活性機能）にしても，活性本体とおぼしき生理活性物

までに，種々の食品，たとえば，チーズ，しょうゆ，日質を標的とする要素還元研究では食品の機能を説明でき

本酒などの食品の二次機能の定量的解析に成功しているない場合が多い．一方，我が国を取り巻く最近の状況か

（図 6）
．

ら日本食は高性能ブランドを伴った輸出コモディティと日本においてチーズはプロセスチーズとして食される

して外貨獲得の手段として強く期待されつつある．そのことが多い．プロセスチーズはチェダーチーズやゴーダ

ためには，日本の食品品質管理システムの秀逸性を担保

チーズなどのナチュラルチーズを原材料として，食塩存するとともに，管理システムの堅牢性，拡張性，経済性

在下，乳酸菌などによる醗酵を伴う熟成プロセスを経てを向上することが必要となる．しかしながら，日本にお製造される．ナチュラルチーズは季節変動に伴い，大きける食品品質管理は食品企業が個別のスペックを独自ノ

く風味や価格が変動する．ゆえに，チーズ製造企業は世ウハウで運用しているため，一般性に欠ける．また，二界中から適当なナチュラルチーズを調達し，適切な製造

次機能（嗜好性，おいしさ）の定量化の標準化技術は普プロセスで同一ブランド，同一風味という困難な目標に及が遅れている．メタボロミクス技術は食品二次機能解チャレンジしている．原料品質が変動するため，製造プ

析にきわめて有用であると考えられる．食品成分と食品

ロセス，特に熟成プロセスが重要となるが，その工程管

二次機能の関係は，前述のメタボロームと定量的表現型

理は熟練者の経験と勘に依存するところが多い．筆者らの関係に似ている．すなわち，メタボロミクス技術を用は，GC-MS を用いてチーズの含有成分を分析し，得ら

いて，食品成分を分析し得られたメタボロームデータをれたメタボロームを説明変数として，チーズ製造管理に

説明変数として，食品二次機能の定量的レベルを応答変重要な二次機能であるリッチフレーバーやサワーフレー

数とした回帰予測モデルは原理的には構築可能である．

バーなどを応答変数として予測モデルを構築した．モデ

我々は日本の代表的な飲料である緑茶を研究材料としてルの情報からリッチフレーバーを追跡するために有用な緑茶に含まれる成分を種々の分析手法，すなわち，GC-

少数のバイオマーカーの発見に成功した 22,23)．また，

MS，LC-MS，FT-NMR，FT-IR などを用いて観測してGC-MS のかわりに GC-FID（ÀDPHLRQL]DWLRQGHWHFWRU）

得られたメタボロームを説明変数として，緑茶の鑑評会を用いても同様の性能のモデル構築が可能であることを2016年 第5号

233

図 6．食品・生薬の官能評価へのメタボロミクス技術の応用示した 24)．今後，製造現場での品質管理に応用されるこ図 7．OPLS 回帰による呈味の差と成分の相関性解析とが期待される．
しょうゆの風味は食塩とグルタミン酸ナトリウム，そテルとして投薬される．しかしながら，生薬に含まれる

れと火入れによって生じるメイラード反応生成物の組合

どの成分が真の薬効成分であるかは大半の場合わかってせで大まかなところは説明できる．しかしながら，原料

おらず，その品質保証は，善意の生薬流通業者の長年のや製造方法に基づく微妙な差異については，何が起因す

経験と勘に基づく官能的判別に依存している．官能試験

るかはわかっていない．筆者は観測範囲をジペプチドに者が熟練の域に達するには通常数十年が必要であり，今広げてメタボローム解析を行ったところ，しょうゆに含後の技術の伝承がきわめて重要であるが，熟練試験者はまれるジペプチドが旨味の差異に大きく相関することを高齢であり後継者不足も相まって，将来に大きな不安を．今後，精密な製造工程管理への貢発見した 25–27)（図 7）残している．筆者らは，婦人科系の慢性疾患によく処方献が期待できる．日本酒は糖化と醗酵を並行して行う複されるが主たる薬効成分がよくわかっていないトウキ

雑なプロセスで製造される．結果として種々の風味を有（Angelica acutiloba）を実験材料として，親水性代謝物にする日本酒が製造され国内外に流通している．筆者らは，注目し，GC-MS，LC-MS，FT-NMR を観測手法として

日本酒に含まれる水溶性成分と揮発性成分とを GC-MS

得たメタボローム行列を説明変数として，生薬流通業者で分析し得られたメタボローム情報を予測変数として日の官能得点を予測することを試みた．結果として PLS に

本酒の官能評価（QDA）を予測することに成功しており，

より満足いく精度で品質を予測することに成功した 32–35)．

28)．メタボリックフィンガープセンキュウ（&QLGLXP RI¿FLQDOH）も前述のトウキ同様，

リンティングの手法は，産地判別，品種判別などにも応

婦人科系不定愁訴に頻用される生薬であるが，その薬効用可能であり，種々の偽装に対する抑止力としての効果成分は不明である．筆者はメタボローム解析の手法によが期待できる．インドネシアではコーヒー果実を好んでり，センキュウの官能品質の推定に成功するとともに，食するジャコウネコの排泄物から回収したコーヒー豆

栽培品種，栽培地，収穫後処理なども判別可能であるこを洗ってローストしたジャコウネココーヒー（Kopiとを示した 8,36)．このようにメタボロミクスは生薬品質

Luwak）が生産されており，世界中のコーヒー愛好家

解析にきわめて有用であり，将来的には生薬流通の際にが世界でもっとも高価なコーヒーとしてその価値を認めもメタボロミクスによる管理が行われることが期待さ

ている．
ところが，
偽装品が多く流通しており問題となっれる．

今後の発展が期待できるている．筆者はインドネシア珈琲カカオ研究所との共同研究を実施し，メタボロミクス技術で偽装判別技術を開発した 29–31)．偽装抑止に貢献できると期待している．
生薬の品質解析への応用

代謝変動の動的解析システムの考案
代謝の微細な差異を定量的に表現できるという特長を利用して，メタボロミクスをバイオプロダクションの効率向上に適用する試みが近年成功を得ている．微生物で日本国内では，生薬は主として漢方方剤のエキス製剤

有用物質生産を試みる場合，通常，有用形質発現のためとして保険適用され，処方されている．漢方方剤は中国に複数の外来遺伝子を導入して形質転換することが一般の古典に起源を有し，通常，複数の生薬の抽出物のカク的である．しかしながら当初の期待どおりの形質を得る

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生物工学

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ことは一般的に困難であり，その多くが代謝のインバラおわりにンスに起因すると言われている．メタボロミクスを用いることにより複数の不都合箇所の発見，菌株改良戦略立

メタボロームを説明変数とした多変量解析により種々案への寄与が期待できる．そのためには，代謝変動の動の生体情報が明らかになる．また，食品や生薬の品質解的解析が必要になる場合がある．

析にも本方法が有用であることは自明である．本論文で前述のアプリケーションは，静的観測条件における代は筆者の近年の研究成果を中心としてメタボロミクスの謝物の相対量を観測して得たスナップショットをメタボ

表現型解析への応用について解説した．実験条件や観測

ローム情報としている．適当な応答変数がある場合は，方法，解析方法を工夫することにより，現状でも相当役

きわめて有効な戦術である．しかしながら，場合によっに立つことが証明できたと思う．メタボロミクスの分析ては代謝の動的情報が求められる場合がある．微生物醗

には感度や定性性能から質量分析が用いられることが多酵制御のための確立された手法として代謝フラックス解い．しかしながら，網羅性を優先するために大量注入な

析（MFA）がある．MFA は微生物醗酵条件の最適化な

どの無茶をするために，質量分析計を最高状態に保つた

どにはきわめて有用な研究戦術であるが，その運用にはめの技術とノウハウが必要となる．今後，メタボロミク

さまざまな制約が存在する．まず，正確な代謝マップ情スの発展は疑う余地がない．しかしながら，観測装置の報が必ず必要である．さらに少なくとも二種類以上の異さらなる発展に加えて，ユーザーフレンドリーな技術のなる標識パターンを有する部分標識化合物を標識基質と開発は引き続き求められる．筆者には幸いながら定年退して用意することが必要となる．さらに，細胞の定常状職まであと 10 年あまりが残されている．今後もメタボ

態が正確な解析には求められる．ゆえに．当該戦術を直ロミクスが一般的な技術になるべく努力邁進する所存で接，非定常状態の高等生物系や疾患研究に適用することある．

は一般にきわめて困難である．何より，MFA を用いる
限り，新しい代謝経路に関わる情報を得ることは，よほ
どの僥倖に恵まれない限りほとんど期待できない．そこで我々は，簡便な半定量的代謝動的情報解析方法として安定同位体希釈に基づく同位体標識分布の経時変動を情報とした解析戦術を考案した．原理は単純である．基質となる代謝物をある時点で安定同位体標識化合物に交換し，その後の経時的にサンプリングして GC-MS，LC-

MS，CE-MS などに供する．アイソトポマーは多くの場合，同一リテンションタイム付近に溶出するのでイオン化サプレッションの影響は軽減される．また，質量分析によって得られた同位体元素の分布の経時的変動情報から，半定量で代謝動態を推察することができる．筆者
は本方法を metabolic turnover analysis（MTA）と呼ぶ．

MTA は定常状態を必要とせず，標識基質にも制限はな
い．ゆえに，CO2 を基質とする植物体の解析に有用である．筆者らはタバコの葉における光合成暗反応の代謝変動を 13C 標識二酸化炭素を標識源とした本法により追跡することに成功している 37)．また，筆者らは，15N 安定同位体を用いた窒素化合物の動的変動解析システムも開発している 38)．
また，筆者らは代謝ターンオーバー解析（MTA）で得られたアイソトープの分配率の時間変動をベクトルとした主成分分析を行い，スコアプロットのトポロジーから代謝距離を推定することに成功している．また，当該原理をノンターゲット分析に広げ，重要未知代謝物関連
情報解析への有用性を示している 39,40)．

2016年 第5号

謝辞

本稿の研究成果は，多くの方々のご指導，ご援助によって達成されたものである．小職が助教授時代の教授であった小林昭雄先生（現大阪大学名誉教授），同僚だった梶山慎一郎先生（現近畿大学教授），岡澤敦司先生（現大阪府立大学准教授）にまずは感謝したい．多くの共同研究者に支えられてきたが，なかでも，10 年ほど前，メタボローム情報で酵母の寿命を予測するという荒唐無稽なアイデアに快く付き合っていただいて以来，酵母の研究をずっと一緒に行ってきた共同研究者である向由起夫先生（現長浜バイオ大学准教授）には特別の感謝の意を示したい．また，奈良先端科学技術大学院大学の金谷重彦教授，国立遺伝学研究所の有田正規教授，大阪大学の
松田史生准教授には，大変お世話になった．この場をお借りして謝意を示したい．本研究の実験のほとんどは小職が主宰する研究室のスタッフ，学生各位との共同研究である．支えていただいた各位に謹んで謝意を示したい．特に，筆者が研究室を立ち上げる当時から二人三脚で頑張ってきた馬場健史
先生（現九州大学教授），小野比佐好先生（元大阪大学助教），
津川裕司先生（現理化学研究所研究員），中山泰宗先生（現崇城大学准教授），和泉自泰先生（現九州大学准教授）には特別の謝意を示したい．

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生物工学

第94巻