ISSN 0073 － 8751

NUMBER

33

INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKARESEARCH
COMMUNICATIONS

2019
公益財団法人

発

酵

研

究

所

RESEARCH COMMUNICATIONS

No.

33

2 0 1 9I N S T I T U T E F O R F E R M E N TAT I O N , O S A K A ( I F O )Published by
INSTITUTE FOR FERMENTATION, OSAKA
17 — 85, JUSO — HONMACHI 2 — CHOMEYODOGAWA — KU, OSAKA 532 — 8686, JAPAN公益財団法人発酵研究所

理 事 長

中濱

一雄

常務理事

樽井

直樹

理

事

熊谷
清水
冨田
原島

英彦
昌
房男
俊

左子
鈴木
永井
古川

芳彦
健一朗
和夫
謙介

監

事

下元

高文

藤井

智幸

大島 敏久
笹川 千尋
関 達治
谷 吉樹
藤田 正憲

北本
下田
武田
土屋
吉田

勝ひこ
親
直久
英子
敏臣

評 議 員

目

次

巻頭言………………………………………………………………………………… 熊谷英彦

1

第 13 回助成研究報告会の開催 …………………………………………………… 横田

明

3

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明 ……………………………… 西澤智康

7

超高発酵菌体外多糖産生，新規乳酸菌の探索と次世代シンバイオティック機能性評価…………………………………………… 木村郁夫

23

魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討:
抗生物質を代替する養殖魚類表皮版プロバイオティクスの確立を目指して……………………………………………………………………… 堀克敏

31

酸素発生型光合成により駆動する嫌気発酵プロセス…………………………… 得平

茂樹

47

新

57

高嶺，栗原

新

61

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるポリアミン輸送および生合成の包括的分析:新規ポリアミン代謝および輸送遺伝子の存在の可能性………………………………………………… 杉山 友太，阪中 幹祥，栗原

新79

中性の生育条件下で機能する大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定………………………………… 杉山 友太，阪中 幹祥，片山

高嶺，栗原

新

91

Bacteroides 属細菌におけるポリアミン生合成系遺伝子の機能解析………………………………………………… 阪中 幹祥，片山

高嶺，栗原

新

105

新

113

高嶺

131

■ 平成29年度大型研究助成■ 平成25年度寄付講座助成
腸内シンビオシスの分子機序解明とその高度応用展開………………………… 栗原
Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価………………………………… 後藤 愛那，阪中 幹祥，片山

複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する
新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産……… 栗原
β -ガラクト- N -ビオシド構造を有する globo H，Gb5，およびGA 1 糖鎖に対する 2 種のラクト- N -ビオシダーゼの特異性………………………………………………… 後藤 愛那，栗原新，片山高効率 1,2 - α - L - fucosynthase の作出と様々な複合糖質への H 抗原構造の導入 ……… 杉山

友太，片山

高嶺，栗原

新

139

高効率 1,2 - α - L - fucosynthase の応用展開 …… 杉山

友太，片山

高嶺，栗原

新

153

新，片山

高嶺

161

ビフィズス菌のフコシルラクトーストランスポーターに見られる適応進化が母乳栄養児腸管でのビフィズスフローラ形成に関与する………………………………………………… 阪中 幹祥，栗原 新，片山

高嶺

175

ナス科植物病原性アルタナリア属菌の分類および特性評価…………………… 染谷

信孝

189

冬虫夏草がセミ共生真菌に進化した遺伝的基盤と生物機能の解明−寄生菌から共生菌への進化……………………………………………………… 松浦優

189

土壌環境をモデルにした培養基による難培養放線菌の分離法の開発と微生物資源の獲得…………………………………………………………………… 松本

厚子

190

菌根を分離源とした菌根性きのこの遺伝資源拡充:
分離源菌根の形態学的特徴の解明と分離手法の改良…………………………… 遠藤

直樹

191

地下深部油ガス田におけるメタン生成機構の解明- 共生培養法によるリグニン関連物質分解微生物の網羅的分離培養 ………… 持丸

華子

191

日本産 Alternaria 属菌群および Cercospora 属菌群の分類学的研究 …………… 中島

千晴

192

昭和期に記載された稀産シクエストレート菌の実体解明と保全対策の再検討……………………………………………………… 折原

貴道

193

雪氷環境における好冷性微細藻類の共生細菌 Hymenobacter nivis のゲノム解析及び代謝機構の解明…………………………………………………… 寺島

美亜

193

河川水の自由生活性アメーバ内の非結核性抗酸菌を分離して共生関係の実態を解明する………………………………………………………… 西内由紀子

194

外来雑草エゾノギシギシを摂食するコガタルリハムシの腸内シュウ酸
分解細菌の共生機能の解明………………………………………………………… 大坪和香子

195

酸化還元電位制御下でのコロニー形成「固相電気培養装置:SPECIES 」
で拓く培養可能微生物圏のフロンティア………………………………………… 木村善一郎

196

Bifidobacterium bifidum によるヒト母乳オリゴ糖分解物のクロスフィーディングがビフィズスフローラ形成を促す………………………………… 後藤 愛那，阪中 幹祥，栗原■ 平成29年度 一般研究助成

藍建て発酵に関与するインジゴ還元酵素の機能と構造解析並びに染色への応用……………………………………………… 米田

一成

196

がん幹細胞選択的な細胞毒性を示す植物成分の微生物生産に向けた研究…… 關

光197

高変異性好熱菌を利用した耐熱化変異酵素のハイスループット創出………… 鈴木

宏和

198

クオラムセンシングフェロモンを介した腸内細菌とヒトのクロストーク…… 岡田

正弘

198

基質多様性を有するアデニル化酵素の探索とD -アミノ酸ジペプチド生産法の開発 …………………………………………… 木野

邦器

199

メディエータレス酵素機能電極用素子を志向した
直接電子移動型色素依存性脱水素酵素の探索と機能解析……………………… 里村

武範

200

酵母における S -アデノシルメチオニンの生理機能に関する研究 …………… 水沼

正樹

201

細菌の休眠および覚醒の制御機構の解明………………………………………… 山口

良弘

201

腸内細菌によるビフィズス菌の Fim 線毛のポリマー化誘導因子の探索とその機構解明……………………………………… 西山

啓太

202

アルキルアルコールを配糖化する
微生物由来の新規配糖化酵素反応の開発………………………………………… 上田誠

203「バイオ還元システム」利用拡大のための補酵素再生系
グルコース脱水素酵素の進化工学的改変………………………………………… 片岡

道彦

203

大腸菌エネルギー代謝における解糖系と好気 TCA 経路の使い分け・相互変換スイッチング機構の解明………………………………………………… 田中寛

204

微生物由来ピペリン代謝酵素に関する研究……………………………………… 小林

達彦

205

PET 分解酵素の structure-based designによる高機能化と応用に関する研究……………………………………………… 織田

昌幸

206

藻類のミルキング培養法による省エネ型バイオ燃料生産プロセスの開発…… 大田

昌樹

206

1,3 -ジオール骨格化合物の発酵生産に向けたプラットフォーム経路の構築:
再生可能資源からのロケットプロペラント前駆体生産への挑戦……………… 片岡

尚也

207

電気化学的制御によるセルロースナノファイバーの高効率合成……………… 椎木弘

208

サンゴ共生藻における宿主非依存的な光合成産物の分泌に関わる
環境応答シグナル経路……………………………………………………………… 丸山真一朗

208

嫌気環境での高効率キシロース発酵に向けた
Spathaspora 属酵母のキシロース代謝遺伝子群の機能解析 …………………… 笹野

209佑嫌気的環境汚染物質分解菌の遺伝子導入・破壊系の開発……………………… 野尻

秀昭

210

嫌気性バルキング原因菌の微生物機能情報の解明と高速メタン発酵リアクターのバルキングメカニズムの理解…………………… 山田

剛史

211

鉄還元菌の多環芳香族炭化水素嫌気性分解代謝系の解明……………………… 井上

謙吾

211

陸生カニ消化管より得られた微生物コンソーシアのセルロース・
リグニン分解機序の解明とメタン発酵前処理への応用………………………… 馬場

保徳

212

貴

215

大腸菌表層ストレス応答:
インプットとアウトプットに働くプロテアーゼの機能………………………… 秋山

芳展

217

コロニー形成の遺伝学，その後…………………………………………………… 正木

春彦

221

レアメタル気化微生物の分離・同定と機能解析（その 2 ） …………………… 山下

光雄

223

■ 平成28年度若手研究者助成
環境 DNA メタバーコーディングにより可視化された祖先的な木材腐朽性きのこ類の多様性と見えない未知系統…………………… 白水■ 助成研究のその後

巻

巻

頭

言

頭

言
熊

谷

英

彦＊

今から 50 年以上も前の話であるが，筆者が大学院生のころ，所属する京都大学の醗酵生
理及び醸造学研究室（故緒方浩一先生担当）では，微生物保存株の植え継ぎがほぼ毎年行われていた．酵母，カビ，バクテリア，それぞれ担当があったが，私は自分の研究との関係か
らバクテリアを担当することが多かった．100 株以上の手つかずのバクテリアの斜面培養から各 3 本の新しい斜面培地に，無菌箱の中でガスバーナーと白金耳を使いながら植え替えた．
なぜか夏休みの暑い時が多く，汗をかきながら，綿栓の残り火の部分を手でこするので指先を真っ黒にしながら続けた覚えがある．でも，しんどいとかイヤだとかという感じは全くな
かった．若かったせいもあるが，その作業の大切さが分かっていたからだと思う．菌株をいろいろ実際に触ってみると，菌株の顔（斜面培養上の集落の形状や色つや）が分かり，それとラテン語の面白い属種名が結びついて，なんだか新しい世界が見えるように思った．それとともに保存中にバクテリア集落の形状が変わることや，菌株が変異することさらにはコンタミが起きることも経験した．
私は微生物の酵素について研究してきたが，新しいテーマに入る時は必ずスクリーニングをした．目的とする酵素の活性が高い菌株を選ぶためである．その時に保存株が役に立ち，
保存株中にない場合は，保存機関からとり寄せた．ご指導いただいていた山田秀明先生は，
武田薬品工業㈱の研究所に電話して，IFO から必要な菌株を取り寄せられた．保存株のコンタミに際しても同様に取り寄せるということで，IFO は当時からずーっと頼もしい，ありがたい存在であった．
平成 14 年度をもって，IFO はその微生物の収集，保存，分譲業務を NITE バイオテクノ
ロジーセンター（ NBRC ）に譲渡移管し，平成 15 年度からは，微生物研究者に対する研究助成を行う大きな業務上の方向転換をした．このことは，私達大学の微生物研究者にとっては，IFO をより身近により頼もしくより有難い存在と感じさせるものであった．個人的には，研究助成の審査や寄付講座の審査に関ることで勉強になったし，身近な後輩たちが助成や寄付講座の対象となり，研究の新展開や発展の上で大きな助けになった．日本の微生物研究の進展に直接広く大きな貢献をしていることは言うに及ばないが，特に，助成課題 1「微生物の分離，分類，保存に関する研究」を基本とし，重要視している点が特徴的であり，多くの微生物学研究者が強く共感し高く評価しているところである．IFO の伝統を踏まえていることはもちろん，あらゆる微生物学において基本的に重要な分野でありながらどちらかといえ熊谷英彦
石川県立大学参与，京都大学名誉教授，公益財団法人発酵研究所理事

＊

−1−

熊

谷

英

彦

ば日の当たらない分野を重点対象としているからである．
この巻頭言を書くにあたり，IFO の歴史を IFO Research Communications で勉強した．設立当初からの社会情勢とあいまった関係者の方々のご苦労が読み取れ大変興味深く読んだ．ただ単に社会の変化に対応するだけでなく，学問の進展を世界的な視野でとらえながら日本の微生物学発展に寄与する最適な現実的な目標を持ち，業務の展開を図ってこられたことが読み取れる．このような社会情勢を踏まえた，現場重視の地道な対処の仕方は，IFO の名称の中にある「大阪」の商法の歴史的伝統を踏まえたものではないかと感じる．本財団の成果発表会や懇親会に多くの人が集まり，「微生物をこよなく愛し，微生物を大切にすること」＊1 の精神が広く大きく育っていると強く感じる．
＊1

生物工学会誌93（3）139-148, 中浜一雄. 2015.「微生物株の保存とバックアップ～発酵研究所設立当時の理事会議事録から～」の
中から引用

−2−

第 13 回助成研究報告会の開催
令和元年 6 月 7 日（金）千里ライフサイエンスセンター 山村雄一記念ライフホールにおいて，第 13 回助成研究報告会を開催し，2 年間の助成を受けた大型研究助成 4 件の研究成果の口頭発表，5.5 年間の助成を受けた寄付講座助成 1 件の研究成果の口頭発表，ならびに 2 年間の助成を受けた一般研究助成 34 件と若手研究者助成 1 件の研究成果のポスターによる発表が行われた．本報告会には大学，国公立研究機関，企業の研究者，大学院生を含めた 254 名が参加しました．
中濱一雄理事長から開会の挨拶があり，樽井直樹常務理事の司会で報告会が進行した．大型研究助成 4 件のうち，「糸状菌−内生細菌の微生物間相互作用現象の解明」（西澤智康）の１題は左子芳彦 京都大学名誉教授の座長のもとに，「超高発酵菌体外多糖産生，新規乳酸菌の探索と次世代シンバイオティック機能性評価」（木村郁夫）および「魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討:抗生物質を代替する養殖魚類表皮版プロバイオティクスの確立を目指して」（堀 克敏）の 2 題は西山 真 東京大学生物生産工学研究センター教授の座長のもとに，「酸素発生型光合成により駆動する嫌気発酵プロセス」（得平茂樹）の 1 題は福田雅夫 中部大学応用生物学部教授の座長のもとに口頭発表が行われた．また寄付講座助成の
1 題「腸内シンビオシスの分子機序解明とその高度応用展開」（栗原 新）は永井和夫 東京工業大学名誉教授の座長のもとに口頭発表が行われた．各研究発表に対して活発な討議がなされ，示唆に富んだ意見も出されて実りのある発表会となった．発表会の最後に，本年 3 月で設置期間が終了した石川県立大学腸内細菌共生機構学寄付講座の栗畑 新 准教授から謝辞が述べられ，また本年度開設される京都大学寄付講座の吉見明 准教授から紹介の挨拶があった．発表の内容は全文が本報告集に収録されている．寄付講座助成の報告は総論１報と各論10 報に分けて報告されている．なお，本報告集には過去に大型研究助成を受けた研究者のその後の研究経過についての報告も収載されています．
引き続いて一般研究助成 34 件および若手研究者助成 1 件はポスター展示による発表がなされた．各ポスターの前で参加者と熱心な質疑が交わされた．さらにこの後行われた懇親会の時間にもお酒を片手にポスターの前で討論する姿が見られて，ポスター発表内容について十分に議論されたようであった．一般助成研究および若手研究者助成の研究結果は本報告集
ではページ数の関係で要約のみを掲載した．
懇親会には報告会参加者のほとんどが参加した．先ずは冨田房雄 理事（北海道大学名誉教授）の挨拶があり，次いで鈴木健一朗 理事（東京農業大学教授）のご発声で乾杯を行った．
懇親会では，参加者の間で和やかに歓談が持たれたのに加えて，報告会では十分に出来なかった質疑応答も行われ，また異なる分野の研究者の間で賑やかな交換が見られた．今回の報告
会および懇親会にも若手の研究者が多数参加され，新旧の研究者の交流の場としても十分役だったものと思われます．参加された皆様のご協力に心から感謝致します．
来年の第 14 回助成研究報告会は 2020 年 6 月 5 日（金）に同じ会場で開催致します．
以下に報告会，ポスター展示，懇親会の模様の一部を写真で紹介する．
（文）横田
−3−

明

RESEARCH COMMUNICATIONS

中濱

開会挨拶
一雄 理事長

座長

西澤

智康 氏

座長

福田

左子

芳彦 先生

座長

座長

和夫 先生

雅夫 先生

木村

郁夫 氏

栗原

新 氏

永井

堀

樽井
−4−

克敏 氏

司会
直樹 常務理事

西山

真 先生

得平

茂樹 氏

RESEARCH COMMUNICATIONS

講

演

会

ポスター発表

挨拶

冨田

房男 理事

乾杯

懇

親

会

−5−

鈴木 健一朗 理事

RESEARCH COMMUNICATIONS

平成 21 年度以降の寄付講座教員と選考委員長（永井和夫先生，清水昌先生）−6−平成 29 年度大型研究助成の研究報告
助成期間:平成 29 年 4 月～平成 31 年 3 月

IFO Res.Commun. 33
7-22, 2019

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明
西

澤

智

康

茨城大学農学部〒300-393

茨城県稲敷郡阿見町中央3-21-1

Elucidation of Biological Interactions of Endohyphal Bacteria within Fungal Hyphae
Tomoyasu Nishizawa
Ibaraki University College of Agriculture
3-21-1 Chuou, Ami, Ibaraki 300-0393, Japan
Obligate bacterial endosymbionts are critical to the existence of many eukaryotes and are usually characterized by
reduced genomes and metabolic dependence on the host, which can cause dif ficulties in isolating theseendobacteria as pure cultures. Endofungal symbiotic bacteria are well characterized in the family Burkholderiaceae
within the class Betaproteobacteria, and these frequently occur in the fungal phylum Mucoromycota. The genus
Mortierella is one of the largest genera in the phylum Mucoromycota. In this study, we examined the presence/
absence of endofungal bacteria in diverse species of Mortierella. A total of 305 isolates of Mortierella spp. weresurveyed, which were mainly obtained in Japan. As a result, Burkholderiaceae-related endobacteria (BRE) were
found in 66 isolates of Mor tierella, and the BREs in the Glomeribacter-Mycoavidus clade were separated
phylogenetically into three groups. These groups consisted of a group containing Mycoavidus cysteinexigens, which
is known to be associated with M. elongata, and two other newly distinguishable groups. These results
demonstrated that BREs were harbored by many species of Mortierella, and those associated with isolates of
Mor tierella spp. were more phylogenetically diverse. In addition, a culturable endosymbiotic bacterium,
Mycoavidus sp. strain B2-EB, present in the fungal host Mortierella parvispora E1425, was obtained successfully inthis study, and its complete genomic sequence was newly determined. The results indicated genomic reduction
occurring in the genome of strain B2-EB (chromosome size, 1.88 Mb), in comparison with those of otherBurkholderiaceae-related endohyphal isolates (chromosome size, 2.76 – 2.80 Mb); was equivalent to that of theuncultured endosymbionts ＇ Ca. Glomeribacter gigasporarum＇ (draft genome sequence size, 1.62 – 1.73 Mb)
harbored in the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora margarita. This work allowed us to understand the
genome evolution of the Burkholderiaceae-related endosymbionts. Phylogenetic analysis of concatenatedhousekeeping genes and calculation of the average nucleotide identity showed strain B2-EB was a new species
affiliated with the genus Mycoavidus. Comparing with the massive expansions of transposable elements in otherknown Mycoavidus genomes (7.2 – 11.5％ of total genome length), this proportion only accounted for 2.4％ in thestrain B2-EB genome. In addition, comparing with the genomes of the closest species, M. cysteinexigens, the strain
B2-EB genome was characterized by the loss of genes involved in signal transduction, transcription, energy
production, and conversion, as well as carbohydrate and amino acid metabolism. To the best of our knowledge, thestrain B2-EB genome represents the smallest genome among cultured endofungal bacteria.
Key words: comparative genomics, endohyphal symbiont, isolation, Mortierella, Mycoavidus緒
E-mail: tomoyasu.nishizawa.agr@vc.ibaraki.ac.jp
共同研究者:郭 永（茨城大学農学部）
高島勇介（茨城大学農学部）
成澤才彦（茨城大学農学部）
太田寬行（茨城大学農学部）

言

地球上の生物は共生や寄生など様々な相互関係を持っていることが知られている．環境中の微生物の複雑な生態を考えてみると，微生物学の成立基盤において純粋培養を確立することが重要であるため，環境微生物間でみ
−7−

西

澤

智

康

られる共生現象の理解が遅れたのではないだろうか（太目 7 科 9 属 13 種の AM 菌と，約 9 種の Endogone 属糸状田ら，2016 ）．その典型的な例として，アーバスキュラー

菌から Molicutes 綱の内生細菌が検出された（高島ら，

菌根菌（ AM 菌）がもつ「細菌様構造体（ Bacterium-like2015 ）．M. elongata の内生細菌，菌根菌の内生細菌，そorganelles(BLOs)）」がある（ Mosse, 1970 ）．その報告

して Rhizopus 属菌の内生細菌の 3 例は，いずれも隔壁から 30 年以上が経ち，さらに 2000 年代のゲノム解読技を 持 た な い 菌 糸 構 造 の 糸 状 菌 を 宿 主 と し，術の革新的進歩によって，ようやくこの BLOs の一つが細菌として分類学的に位置づけられ，菌類内生細菌の研Burkholderiaceae 科に属するという共通点があった．
近年の網羅的ゲノム DNA 解読技術の進展は糸状菌−究が始まった（ Bianciotto et al., 2003 ）．

内生細菌間の共生現象の解明に大きく貢献した．内生細微生物間で細胞内共生の関係があることが提起され，菌のゲノム情報からその性質を推定することを目指し，

糸状菌−内生細菌の関係では，アーバスキュラー菌根菌

糸状菌から内生細菌画分を分取してゲノム解読した結Gigaspora margarita と そ の 内 生 細 菌 ＇Candidatus
Glomeribacter gigasporarum＇（ Bianciotto et al., 2003 ），果，システイン生合成系と輸送系に関する遺伝子群を欠イネ苗立枯病の病原糸状菌 Rhizopus microsporus とリゾ

アメーバに共生する Legionella 属細菌はシステイン要求いているという特徴を見出した（ Fujimura et al., 2014 ）．

キ シ ン 産 生 内 生 細 菌 Paraburkholderia rhizoxinica

性を示し，糖の利用性がないため（ Feeley et al., 1979 ），（ Partida-Martinez & Hertweck, 2005; Partida-Martinez et

システイン要求性を満たす専用の分離用培地（例えばal., 2007 ）で研究が進められてきた．我々の先行研究において，畑地土壌から分離した糸状菌 Mortierella elon-

BCYE α 寒天培地）が用いられている．そこで，分画し

gata の複数株で Burkholderiaceae 科に属する内生細菌の存在が明らかとなり，菌糸破砕物からグラム陰性菌のバ認められ，新属新種の Mycoavidus cysteinexigens B1-EBT

イオマーカーとなるエンドトキシンも検出され，菌糸内分離に至っていない ＇Ca. G. gigasporarum＇ も含めてゲノた内生細菌を BCYE α 寒天培地に接種したところ増殖が株の分離培養に成功した（ Ohshima et al., 2016 ）．純粋部の BLOs は糸状菌に内生する Burkholderiaceae 科に属

ムサイズが判明している Burkholderiaceae 科の内生細菌するグラム陰性細菌であることが明らかとなった（ Satoのなかで，そのゲノムサイズから判断すると，宿主糸状et al., 2010 ）．
近年，菌類に内生する細菌の探索が進み，3 門 4 亜門 7菌の代謝に依存する生活様式が推察された．

綱 21 目 36 科 41 属 73 種 148 系統の菌類に内生細菌が存在

Mortierella 属糸状菌における内生細菌の分布とその多様性 を 解 析 し た． さ ら に，Mortierella 属 に 内 生 す る

することが確認され（高島ら，2015），その内生細菌の 16S
rRNA 遺伝子配列の系統分類解析から 5 門（ Proteobacteria，Bacteroidetes ，Tenericutes ，Firmicutes ，Actinobacteria ）と Cyanobacteria 門の糸状性 Nostoc punctiforme が内生することが報告された（太田ら，2016）．Betaproteobacteria

本 研 究 は， 内 生 細 菌 を 保 有 す る M. elongata 以 外 のMycoavidus 属細菌を研究モデルとし，新たに分離培養に成功した Mycoavidus 属の新種内生細菌のゲノム解読と比較ゲノム解析から，糸状菌−内生細菌の共生関係，
特に共生微生物間の相互作用について報告する．

綱 の Burkholderiaceae 科 に は， 植 物 病 原 性 Rhizopus

実験方法

microsporus（ Mucoromycotina 亜門）から純粋分離された内生細菌で，Burkholderia 属の新種として記載された
Paraburkholderia rhizoxinica と Paraburkholderia endofun-

サンプリング，サンプル調製および菌類の単離gorum（ Partida-Martinez et al., 2007 ）や，先に述べた M.

動物遺骸，動物糞，植物組織，植物リター，キノコ（子elongata（ Mortierellomycotina 亜門）から純粋分離された内生細菌であり，同じく Burkholderiaceae 科の新属新実体）および土壌を採集または分譲により入手した．土種として記載された Mycoavidus cysteinexigens が含まれ行い，土壌上に発生した胞子嚢を LC A 培地（三浦・工藤，

壌からの Mortierella 属菌の分離は，主に湿室法によりる（ Ohshima et al., 2016 ）． ま た，M. elongata 以 外 の1970 ）に移植することで菌株を確立した．また，それMortierella 属菌においても Mycoavidus 属細菌に属すると考えられる近縁種が内生していることが確認された以外の基質については，表面洗浄，表面殺菌または未処（ Takashima et al., 2018b ）．未だ純粋分離には成功してたは胞子嚢を新しい LC A 培地に移植することで菌株を確いないが，Gigasporaceae 科に属するアーバスキュラー

理のまま直接平板法を行い，生育してきた菌糸先端部ま立した．分離菌株の培地上に細菌の増殖が確認された場

菌根菌に内生する細菌も Burkholderiaceae 科に属し，新合は，van tighem 法（ Sato et al., 2010 ）により菌糸外に属新種 ＇Candidatus Glomeribacter gigasporarum＇ としてあるバクテリアを排除した．分離菌株は，LC A 培地上で提唱された（ Bianciotto et al., 2003 ）．同様に，分離培養

培養後，菌糸を含む寒天片ごと凍結保存液（ 10％グリセに至ったという報告はまだないが，Glomeromycota 門の 3

ロール（ v/v ）および 5％トレハロース 2 水和物（ w/v ））−8−

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明

1 mL に加え，−80 ℃のディープフリーザーで凍結保存し株を接種し，十分に菌糸が生育するまで室温（約 23 ℃）

た．また，NITE Biological Resource Center（NBRC）およで培養した．培養後の菌糸体をセロファン上から無菌的び CBS-KNAW culture collection（ CBS ）より Mortierellaに 2.0 mL ネ ジ 口 チ ュ ー ブ（ WATSON ） ま た は 1.5 mL属菌をそれぞれ 11 および 12 菌株を入手した．

チューブ（ WATSON ）に移し，Prepman Ultra Sample
Reagent（Applied Biosystems ）を 100 µL 加えた．その後，内生細菌の単離

オートクレーブ滅菌した金属クラッシャー（ TAITEC ）Mortierella parvispora E1425 株を用いて，Ohshima et

ま た は ペ ッ ス ル で 菌 糸 体 を 破 砕 し，DRY BATH

al.（ 2016 ）の方法に従って内生細菌の単離を行った．
滅 菌 セ ロ フ ァ ン を 被 せ た 1/2CMMY 寒 天 培 地（ Corn

INCUBATOR（ Fast Gene ）を用いて 100 ℃，10 分間イ

meal agar, 8.5 g/L ; Malt extract 10.0 g/L ; Yeast extract,

後，上清を新しい 1.5 mL チューブに移した．次に TE 緩ンキュベートした．20,400×g，3 分間（室温）遠心した

1.0 g/L ; Agar, 7.5 g/L ） の 上 に 宿 主 糸 状 菌 を 接 種 し，衝液（ pH 8.0 ）を 100 µL 加えた後，フェノール:クロ

23 ℃で 5 日間培養した．培養後，菌糸体を ACES 緩衝液

ロ ホ ル ム: イ ソ ア ミ ル ア ル コ ー ル（ 25:24:1，v/v/v）（ pH 6.9 ）に回収し，菌糸体の破砕を行った．ホモジナ

を 加 え，2 分 間 ボ ル テ ッ ク ス し た． 遠 心（ 20,400×g,

イザーペッスルで破砕した菌糸懸濁液を遠心分離によっ

15 min, 4 ℃）した後，上層（水層）100 µL を新しいエッて菌糸残渣を除いた後，上清を孔径の異なる 2 種類のメ

ペンドルフチューブに移し，これを DNA 粗抽出液としンブレンフィルター（ 8.0 µm 孔径および 3.0 µm 孔径）た．その後，エタノール沈殿により精製し，TE 緩衝液

で 2 段階のろ過を行い，内生細菌の粗分画液を得た．シ（ pH 8.0 ）を加えてペレットを溶解し，DNA 抽出液としステイン含有培地（ BCYE α 寒天培地）に 1 mL の分画た．DNA 濃 度 は NanoDrop 分 光 光 度 計（ Nanodrop

液を接種し，室温 30 日間で静置培養を行った．さらに，

Technoglogies Inc. ）を用いて計測した．抽出した DNA

生育した細菌コロニーから画線培養を行い，シングルコ

を 鋳 型 に し て，ITS1F-ITS4 ，ITS5-ITS4 ， ま た は
ITS5-LR5 プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 い て， 糸 状 菌 ITS1-

ロニーを得た．

5.8S-ITS2 を含む領域を PCR 増幅し，PCR 産物を精製し内生細菌の顕微鏡観察

た（ Takashima et al., 2018b ）．精製した PCR 断片は ABI

菌 糸 内 生 細 菌 の 蛍 光 顕 微 鏡 観 察 は，Live/Dead™

PRISM 3130xl Genetic Analyzer（ Thermo Fisher Scientific

BacLight™ Bacterial Viability Kit（ Life Technologies
Japan Ltd. ）を用いた．染色は，回収した菌糸に染色液

Inc. ）で塩基配列を決定した．宿主糸状菌の PCR 増幅を直接滴下し，一定時間経過後に染色液をリンスした後，子の増幅に用いたユニバーサルプライマーで PCR 増幅

プレパラートを作成した．蛍光顕微鏡（ BX51, Olympusを行った（ Sato et al., 2010 ）．精製した PCR 増幅断片はCorp. ）下で菌糸内に緑色または赤色に染まった細胞を

ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer（ Thermo Fisher

観察した．

Scientific Inc. ）を用いて塩基配列を決定した．

に用いた DNA 抽出液を鋳型とし，細菌 16S rRNA 遺伝

透過型電子顕微鏡観察（株式会社東海顕微鏡解析，名古屋）は，急速凍結 – 凍結置換法で行った．グリセロー

遺伝子バーコード領域を用いた宿主糸状菌の種同定と内ル寒天培地上で 7 日間培養した菌糸体を二枚の銅ディス

生細菌の分子系統解析

クとサンドイッチするように設置し，液体プロパン

宿主糸状菌の分子同定のために，来歴が明確なカル（−175 ℃）で急速に凍結した．凍結したサンプルは 2％

チャーコレクションまたはハーバリウムに保存されている

四酸化オスミウム含有置換緩衝液（アセトン:蒸留水＝Mortierellomycotina 亜門に属する菌類の ITS1-5.8S-ITS2

98:2 ）中で−80 ℃，48 時間の置換固定を行い，さらに遺伝子領域を NCBI より収集し，ITS1-5.8S-ITS2 遺伝子−20 ℃，14 時間と 4 ℃，2 時間の固定処理を行った後，配列データベースを構築した（ Takashima et al., 2018b ）．

プロピレンオキシドと 100％エタノールを用いて脱水処構築したデータベースを用いて blastn による相同性検索

理し，スパー樹脂で試料を包埋した．その後，ウルトラを行い，宿主糸状菌の分子同定を行った．Takashima et

ミクロトームを用いて厚さ 90 nm の超薄切片を作製し，酢酸ウラニル溶液とクエン酸鉛で電子染色し，透過型電al.（ 2018a ）に従い，MAFFT（ ver. 7.212 ）でアライン
メントし，Gblocks（ ver. 0.91b ）でアラインメントより

子顕微鏡（ JEM-1400Plus, JEOL ）で観察した．

保存領域を抽出したのち，MEGA（ ver. 6.06 ）（ Kumar

DNA 抽出と PCR 法による糸状菌および内生細菌の遺伝et al., 2008 ）でモデル推定を行い，RAxML（ ver. 8.212 ）を用いて ITS1-5.8S-ITS2 遺伝子に基づく宿主糸状菌の子バーコード領域の塩基配列決定

最尤系統樹を作成し，相同性検索および系統解析の結果

1/2CMMY 培地上に敷いた滅菌セロファン上に供試菌を統合することで分子同定を行った．

−9−

西

澤

智

康

ま た， 得 ら れ た 内 生 細 菌 の 16S rRNA 遺 伝 子 は，

結果および考察

MAFFT（ ver. 7.212 ）でアラインメントして MEGA（ ver.
6.06 ）でモデル推定を行い，RAxML（ ver. 8.212 ）を用いて最尤系統樹を作成した（ Takashima et al., 2018b ）．

Mortierella 属菌に内生する細菌の 16S rRNA 遺伝子に基づく系統解析

完全ゲノム配列決定とゲノム解析

分離した 305 菌株およびカルチャーコレクションより入手

分離培養した内生細菌を BCYE α 寒天培地で 7 日間培した 23 菌株の計 328 菌株について，PCR 法により内生細養し，集菌後，リゾチームで溶菌し，フェノール法で全菌の有無を調査した結果，66 菌株より Burkholderiaceae

ゲノム抽出を行った（ Guo et al., 2018 ）．抽出したゲノ科に属する内生細菌が検出された（ Table 1 ）．これら

ム DNA は PacBio RS II と Illumina HiSeq2500 を 用 い てMortierella 属菌 66 菌株は，25 種に分子同定されたことから（Table 1 ），Burkholderiaceae 科に属する内生細菌は，シーケンスした（株式会社ジーンベイ，横浜）．PacBio
RS II では 20-kb のライブラリを作製し，P6-C4 ケミカル

これまで内生細菌が確認されていた Mortierella 属菌 2を用いて 1 個の SMRT cell でシーケンスした．Illumina

種（ M. elongata および M. minutissima ）に加えて，新HiSeq2500 では Truseq DNA PCR-Free Kit で 101-base ラ

たに Mortierella 属菌 23 種が宿主糸状菌となることが確

イブラリを作成し，Paired-end シーケンスした．得られ認された．

た 塩 基 配 列 は SPAdes（ ver. 3.10.1 ）（ Bankevich et al.,

計 66 菌株の宿主糸状菌から検出された内生細菌の2012 ）でハイブリッド・アセンブリし，Pilon（ ver. 1.22 ）16S rRNA 遺伝子に基づく分子系統解析の結果，検出さ（ Walker et al., 2014 ）で塩基補正を行い，マニュアルでれたすべての内生細菌は，Glomeribacter-Mycoavidus ク

環状化して完全ゲノム配列を決定した．アノテーション

レードに位置し，M. cysteinexigens B1-EBT 株が属するサは，Dfast（ Tanizawa et al., 2018 ），BLAST-KOALA

ブクレード（ MorBRE group A ）に加えて，2 つの異な（ Kanehisa et al., 2016 ），NCBI-COG（ Galperin et al.,るサブクレード（ MorBRE group B および group C ）を2015 ）を用いて行った．推定された CDS は Orthofinder

形成することが明らかとなった（ Fig. 1 ）．

（ver. 2.3.3 ）（Emms & Kelly, 2015 ）でオルソログ・グルー

以上の結果から，特定のグループの内生細菌がより広プを作成し，シングルコピーの CDS 数から割合を計算

範囲に Mortierella 属糸状菌に内生することが示され，した．また，Burkholderiaceae 科糸状菌内生細菌（ BRE ）これらの内生細菌は他の Burkholderiaceae の菌種とは独の比較ゲノム解析は，BLASTP 相同性検索を行い，75％

立した系統にあることが明らかとなった．

以上のアライメント・カバレージで 10-5 以下の e-valueとなるアミノ酸配列をホモログ遺伝子とした（ Guo et al.,

単離した Mycoavidus 属内生細菌のゲノム解読

2018 ）． さ ら に，eggNOG（ Huerta-Cepas et al., 2015 ）細菌 16S rRNA 遺伝子に基づく系統解析（Fig. 1 ）から，を用いて Burkholderiaceae 科の自由生活型細菌と内生細本研究で新たに分離した糸状菌 M. parvispora E1425 株

菌ゲノムの機能遺伝子プロファイルを作成し，CheckMに内生する細菌が M. cysteinexigens B1-EBT 株に最も近縁（ Parks et al., 2015 ）を用いて細菌ゲノム間で共通するであることが示され，システイン要求性があることを推

シングルコピー遺伝子の保有率からゲノム完成度（％）

察した．そこで，先に分離したときと同様にシステインを求めた．

含有培地（ BCYE α 寒天培地）を用いて M. parvispora
E1425 株に内生する細菌の分離培養を試みた．内生細菌

内生細菌の MLSA 解析と全ゲノム相同性検索の分画液を BCYE α 寒天培地の上に接種し，室温で 30

内 生 細 菌 分 離 株 の 分 子 系 統 解 析 は，Sharmin et al.

日間の培養後にコロニーを形成し，さらにコロニーから（ 2018 ）の Multilocus sequence analysis（ MLSA ）法に画線して 7 日間の培養を行い，シングルコロニーを得た．

従い，5 個のハウスキーピング遺伝子（ atpD, gyrB, lepA,

細菌 16S rRNA 遺伝子領域の塩基配列が M. parvispora

recA, rpoB ）の塩基配列を用いて MAFFT（ ver. 7.222 ）でアライメントし，Kakusan（ ver. 4 ）でモデル推定をE1425 株に内生する細菌と一致しことから，この内生細行い，RAxML を用いて最尤系統樹を作成した．また，先行研究の M. cysteinexigens B1-EBT 株の完全ゲノム解種の同定のため，最も近縁の Mycoavidus cysteinexigens

読から，ゲノム上に可動遺伝因子領域が多く見出され，菌分離株を B2-EB 株と名付けた．

B1-EB 株と全ゲノム相同性検索を行い，Whole-genome

多数の反復配列が含まれていた．そこで本研究では，ロAverage Nucleotide Identity（ ANI，％）を算出した（Richterングリード法の PacBio RS II およびショートリード法のet al., 2015 ）．

Illumina HiSeq2500 を用いて B2-EB 株ゲノムのシーケンTスを行った．PacBio RS II から約 926 Mb 分のロングリー− 10 −

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明
Table 1Isolates of Mortierella spp. associated with endohyphal bacteria

Continued on the next page.

− 11 −

西澤Table 1

智康

continued
Continued.

− 12 −

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明

Fig. 1.

Maximum likelihood phylogenetic tree of Burkholderiaceae-related endobacteria (BRE) dwelling in the multiple Mortierella
species based on partial 16S rRNA gene sequences (1350 positions) using RAxML with the GTRGAMMAI model and bootstrapping (1000 replicates) with the rapid bootstrap analysis option. Bootstrap values > 70％ were shown at nodes. Wolbachia pipientis
wRi was used as an outgroup. BRE clades associated with Mortierella spp. were classified into MorBRE groups A, B, and C
according to 95％ of nucleotide identity cutoff.

− 13 −

西

澤

智

康

ド（ 1 リード当たりの平均長:9,877 塩基，N50:13,899

細菌様細胞を確認できた（ Fig. 2B ）．細菌様細胞の大き塩基）と Illumina HiSeq2500 から約 1,487 Mb 分のショー

さは約 1.2 μm×0.4 μm であり，中心に核様体の構造が観トリードを得た．これらの塩基配列情報は SPAdes を用察できた．その構造体の周囲にはリボゾーム様の構造もいてハイブリッド・アセンブリ解析した後，Pilon で塩多数見られた（ Fig. 2C ）．先行研究において，M. elon-

基補正と配列環状化を行い，最終的に 1,876,900 塩基のgata FMR23-6 株 の 電 子 顕 微 鏡 観 察 か ら 内 生 細 菌 M.

環状ゲノム配列を得た（Table 2）．Dfast を用いてゲノム・
アノテーションした結果，B2-EB 株ゲノム上には 1,627

cysteinexigens B1-EBT 株が糸状菌菌糸細胞内の液胞中に局在することが観察されている（ Sato et al., 2010 ）．し個のコーディング領域（ CDS ），2 個のリボソーム RNAかし，M. parvispora E1425 株では細菌様細胞は宿主糸オペロン（ rrn ）と 47 個の転移 RNA（ tRNA ）が推定さ

状菌菌糸細胞内の脂質体（ V ）と液胞（ L ）に接触してれた．そのうち，COG-Orthology による検索から 1,157

いた（ Fig. 2B ）．

個の CDS が同定され，KEGG-Orthology では 1,062 個のOrthology 解析の結果，1,319 個のシングルコピー CDS

Mycoavidus 属細菌間の比較ゲノム解析
Uehling et al.（ 2017 ）は，分離培養を経ずに宿主糸状菌

CDS が 同 定 さ れ た． ま た，Orthofinder を 用 い たが推定され，同定された全 CDS の約 81％がシングルコ−内生細菌共生体をメタゲノム解析して，M. cysteinexigens

ピー CDS であり，既知の BRE 内生細菌ゲノムの中で最

AG77 の 完 全 ゲ ノ ム 配 列 を 決 定 し た が（ Table 2 ），も多い割合であった．また，B2-EB 株ゲノムのシングル
コピー遺伝子数の割合は，M. cysteinexigens（ 64 - 66 ％）Mycoavidus 属細菌の分離培養株で完全ゲノム塩基配列情報を得たのは，これまでに M. cysteinexigens B1-EBT 株

を 含 め た 他 の Burkholderiaceae 科 に 属 す る 内 生 細 菌の 一 例 の み で あ っ た（ Sharmin et al., 2018 ）．M. cyste-（ 52 - 74％）より割合が高かった（ Table 2 ）．B2-EB 株

inexigens B1-EBT 株と B2-EB 株の 16S rRNA 遺伝子相同性が 99.1％であったため，MLSA 解析および全ゲノム相同の ゲ ノ ム は， こ れ ま で に 分 離 培 養 さ れ て い る
Burkholderiaceae 科に属する糸状菌内生細菌の中で最小サイズであった．

性検索により塩基配列レベルで種を同定した．内生細菌
B2-EB 株の種の同定のため，5 個のシングルコピー遺伝子（ atpD, gyrB, lepA, recA, rpoB ）を用いて MLSA 法分蛍光顕微鏡および透過型電子顕微鏡による内生細菌の観察

子系統解析を行った．RAxML を用いた最尤系統樹の結LIVE/DEAD BacLight 染色キットを用いた蛍光顕微鏡

果から，B2-EB 株が Mycoavidus 属細菌に属するが，最観察では，M. parvispora E1425 株の菌糸内に緑色に発も近縁の標準株である M. cysteinexigens B1-EBT 株と比較色する生菌の細菌様構造物が見られた（ Fig. 2A ）．さらして 5 つのハウスキーピング遺伝子の平均相同性はに透過型電子顕微鏡観察から，二重細胞膜をもつ桿状の93.2％であり，異なる分岐となった（ Fig. 3A ）．さらに，Table 2

Genomic features of Burkholderiaceae-related endobacteria− 14 −

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明

Fig. 2.

Microscopic observations of Burkholderiaceae-related endobacteria dwelling in the hyphae ofMortierella parvispora E1425. (A) fluorescent microscopic observation of endobacteria within
hyphae stained by a LIVE/DEAD™ BacLight™ bacterial viability kit, and (B) transmission electron microscopic obser vation of endobacteria within rapid-freezing and freeze-substituted
hyphae. Abbreviation: FH, fungal hyphae; EB, endobacterium-like structures; L, lipid bodies; V,vacuoles; M, mitochondria. (C) the enlargement of endobacteria in the red square frame in the(B), arrowheads indicate the nucleoids in the center of endobacterial cells.

全ゲノム相同性検索では，B2-EB 株と B1-EBT 株の ANIが，脂肪酸の生合成，輸送，分解に関わる遺伝子は存在

値が 88.6％であることから，新たに分離した B2-EB 株

することから，宿主糸状菌細胞内の脂肪酸を炭素源としを Mycoavidus 属 の 新 種 と 判 断 し た（ Fig. 3B ）． ま た，て利用していることが推察された（ Fig. 4 ）．一方，アM. cysteinexigens B1-EBT 株 の 宿 主 糸 状 菌 M. elongata
FMR23-6 株は畑土壌から分離されたことから，森林土

ミノ酸生合成では，B2-EB 株は M. cysteinexigens B1-EBT

壌から分離・培養した宿主糸状菌 M. parvispora E1425

要求性に関わる遺伝的根拠が確認できた．さらに B2-EB

株に内生する B2-EB 株は M. cysteinexigens B1-EBT 株と株ではアスパラギン，アルギニン，シトルリン，ヒスチ

は異なる種分化を遂げたと推察される．

ジン，プロリンの生合成経路に関わる遺伝子も欠失して

B2-EB 株において，解糖系遺伝子がほぼ欠失している株と同様にシステイン輸送系の欠失もあり，システイン

いたが，5 -アミノレブリン酸やミクロシン C の膜輸送系− 15 −

西Fig. 3.

澤智康Phylogenetic identification of Mycoavidus sp. strain B2-EB using (A) an unrooted maximum likelihood phylogenetic tree constructed by RAxML based on a concatenated sequence (11,460
positions in total) of the five housekeeping genes (atpD, gyrB, lepA, recA, and rpoB), indicating
the relative placement of the three endofungal bacterial clades (bold) and other genera in thefamily Burkholderiaceae, and (B) a boxplot of whole genome average nucleotide identity between
strain B2-EB and M. cysteinexigens B1-EBT, indicating strain B2-EB as a new species affiliatedwith the genus Mycoavidus. The horizontal lines in (A) show genetic distance, which are support
values estimated with 100 bootstrap replicates.

遺伝子群を保有していたことから，宿主糸状菌の細胞内酵素（ NRPS ），カロテノイド様アリールポリエン色素にあるオリゴペプチドなどの生理活性物質を分解してア体合成系に関与する二次代謝産物生合成系遺伝子が見出

ミノ酸を獲得しているのではないか考えられる．以上のされた．また，II と III 型分泌機構と一部必須酵素が欠ことから，B2-EB 株の宿主糸状菌内での生活様式は，宿失した IV 型分泌機構，sec-SRP，ツイン・アルギニン透

主の栄養に依存していると推定された．

過系（ Tat ）に関与する遺伝子群を保有することから，

B2-EB 株ゲノムから，タイプ I モジュール型ポリケチド合成酵素（ PKS ），リボソーム非依存的ペプチド合成

宿主との相互作用に関与する二次代謝産物を宿主細胞内に分泌することが示唆された（ Fig. 4 ）．

− 16 −

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明

Fig. 4.

Model representing metabolic processes and secretion system assumed from Mycoavidus sp.
strain B2-EB. Purple crosses show the genes responsible for the pathways or proteins deleted inboth B1-EBT and B2-EB genomes, and red crosses show those deleted only in the B2-EB
genome. Blue characters and arrow show the putative genes and pathway present in only strain
B2-EB genome. Abbreviation: POT, polyamine transport system; PST, phosphate-specific transport; DPP, dipeptide permease; MCE, mammalian cell entry; FHU, ferrichrome-uptake; EPSs,
exopolysaccharides; LPSs, lipopolysaccharides; IM, inner membrane; OM, outer membrane;
SEC, general secretion pathway; TAT, twin arginine translocation pathway.

Burkholderiaceae 科内生細菌間の比較ゲノム解析による
微生物間相互作用機序の推定が 起 こ り， 内 生 細 菌 ゲ ノ ム は や が て 崩 壊 し て い く．

宿主細胞内の共生細菌では，トランスポゾンやプロMycoavidus 属細菌ゲノムには 7.2 - 11.5％の可動性遺伝
因子（トランスポゾンやプロファージなど）が同定されファージなどの可動遺伝因子の働きによって遺伝子の挿た（ Fig. 5A ）．特に，B2-EB 株ゲノムではアミノ酸輸送

入・欠失は頻繁に起こり，その後ゲノムサイズが縮小す系の欠失だけではなく，有機物代謝や転写・RNA プロ

ると考えられている．ゲノム縮小過程において，DNA

セシング制御，シグナル伝達などに関わる遺伝子群が欠

複製・修復に関わる機能が欠失すれば，突然変異の蓄積

失 し て い る こ と が 見 出 さ れ た（ Fig. 5B ）． し か し，− 17 −

西Fig. 5.

澤智康Comparative genomic analysis between Mycoavidus sp. strain B2-EB and M. cysteinexigens B1-EBT. A, a synclastic comparison
shown by linking homologous gene with gradient grey lines. B, a bar-plot of reduced orthologous group in the B2-EB genome
comparing to those in the B1-EBT genome. COG category: (1) cellular processes and signaling (D, cell cycle control, cell division,
chromosome partitioning; M, cell wall/membrane/envelope biogenesis; N, cell motility; O, post-translational modification,
protein turnover, and chaperones; T, signal transduction mechanisms; U, intercellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V, defense mechanisms; W, extracellular structures; Y, nuclear structure; Z, cytoskeleton), (2) information storage andprocessing (A, RNA processing and modification; B, chromatin structure and dynamics; J, translation, ribosomal structure andbiogenesis; K, transcription; L, replication, recombination and repair), (3) metabolism (C, energy production and conversion; E,amino acid transport and metabolism; F, nucleotide transport and metabolism; G, carbohydrate transport and metabolism; H,
coenzyme transport and metabolism; I, lipid transport and metabolism; P, inorganic ion transport and metabolism; Q, secondary
metabolites biosynthesis, transport, and catabolism), (4) poorly characterized (R, general function prediction only; S, function
unknown). n, no COG prediction.

− 18 −

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明

Fig. 6.

Genome completeness of Burkholderiaceae bacteria based on the conservation rate of 568 single-copy genes in the complete
genome except for those of Ca. Glomeribacter species and Paraburkholderia endofungorum HKI 456T. Genome completeness ofeach strain was plotted to the genome size (A) and genome GC content (B), respectively. Nine colors show the major genera withsequenced complete genome sequences in the family Burkholderieaceae: red, Mycoavidus; blue, Ca. Glomeribacter; orange,
Parabukholderia; grey, Burkholderia; purple, Cupriavidus; aquamarine, Pandoraea; forest green, Ralstonia; olive, Lautropia; pink,
Polynucleobacter. The closed circles and triangles indicate the bacterial lifestyles of free-living and intracellular, respectively.

B2-EB 株の DNA 修復系遺伝因子はほぼ保存されていた

いる．微生物間共生現象の研究から，自然界での微生物ため，構成するゲノムが崩壊していく過程に至らず非退の生態の実態がより深く理解され，微生物の生理生態的化 的 な ゲ ノ ム 縮 小 化 が 起 き た と 考 え ら れ る． ま た，

特徴の一つの物質循環の理解の深化や微生物間相互作用

Burkholderiaceae 科細菌ゲノムに保存されている 568 個の標的シングルコピー遺伝子の保有率を比較した結果，の応用技術へのさらなる開発が期待される．

要

Mycoavidus 属細菌のゲノムから約 89％が同定され，最も 近 縁 の 属 で あ る 糸 状 菌 内 生 細 菌 ＇Ca. Glomeribacter約

gigasporarum＇（保有率，約 22 - 70％）よりも顕著に多かっ真核生物に細胞内共生する細菌は，一般的に自由生活た（ Fig. 6 ）．よって，B2-EB 株ゲノムは，宿主糸状菌細型の近縁な細菌と比較すると縮小したゲノムを保有する

胞内で内生維持に必要不可欠な特異的機能に関与する遺ことが知られている．しかし，そのゲノム縮小化のメカ伝子が残存したと考えられる．

ニズムについては未だ不明である．土壌に生息する糸状ゲノム解析技術の進展が，微生物の分離・培養，さら菌に Betaproteobacteria 綱 Burkholderiaceae 科に属する細に微生物共生体の相互作用機序の解明に大きく貢献して菌が内生していることが報告され，内生細菌は植物毒素− 19 −西澤

智康2) 郭 永，小沼奈那美，高島勇介，Dilruba Sharmin，佐藤嘉則，成澤才彦，真鍋理一郎，高島昌子，大熊盛也，太田寛行，西澤智康．2017．An EHB Mycoavidus cysteinexigens
enhances in vitro carbon utilization by host Mortierella elongata. 環境微生物系学会合同大会2017，8月29-31日，仙台
3) Guo, Y., Takashima, Y., Sharmin, D., Narisawa, K., Ohta, H.
& Nishizawa, T. 2018. Genomic analysis of a newly-cultured
endohyphal bacterium Mycoavidus strain dwelling in the soil
fungus Mortierella parvispora. 第12回日本ゲノム微生物学会年会，3月5-7日，京都
4) 郭 永, 高島勇介，成澤才彦，太田寛行，西澤智康．2018．
糸状菌に内生するMycoavidus属細菌のゲノム収縮過程．
SATテクノロジー・ショーケース2018，2月8日，つくば
5) 郭 永，Dilruba Sharmin，高島勇介，成澤才彦，太田寛行，西澤智康．2018. 糸状菌内生細菌Mycoavidusの二次代謝産物生合成遺伝子の系統解析．日本土壌微生物学会
2018大会，6月16-17日，東広島
6) 郭 永, 高島勇介, Dilruba Sharmin, 佐藤嘉則, 成澤才彦, 太
田寛行, 西澤智康. 2019．Mortierella属糸状菌に内生する
Mycoavidus属細菌のゲノム縮小化．日本土壌微生物学会
2019大会，6月15-16日，札幌
7) Guo, Y., Takashima, Y., Narisawa, K., Ohta, H. & Nishizawa,T. 2019. Comparative genomics highlights extreme genome
reduction in a newly cultured Mycoavidus-related endofungal bacterium dwelling in Mortierella parvispora. ASM
Microbes 2019, June 20-24, San Francisco, United States ofAmericaの生合成や宿主体内の活性酸素の除去など微生物間相互作用に関わると考えられている．我々の先行研究において，Mortierella 属糸状菌に属する M. elongata に内生する細菌のドラフトゲノム情報からシステイン輸送系が欠失していることを見出し，システイン含有の BCYE α 寒天培地を用いることで Burkholderiaceae 科に属する新属・新種の内生細菌 Mycoavidus cysteinexigens B1-EBT 株を分離培養することに成功した．本研究では，新たなMycoavidus 属細菌の分離に成功し，その全ゲノム解析
および比較ゲノム解析を行った結果について報告する．
こ れ ま で に 計 305 菌 株 の Mortierella 属 菌 を 分 離 し，
そのうち 66 菌株に Burkholderiaceae 科に属する内生細菌 を 検 出 し た． 寄 託 済 み 1 菌 株 を 除 く 内 生 細 菌 保 有
Mortierella 属菌株を新たにカルチャーコレクションに寄託した．検出された内生細菌の 16S rRNA 遺伝子領域に基づく分子系統解析から，内生細菌は，GlomeribacterMycoavidus クレードに位置し，3 つのサブクレードを形成することが明らかになった．また，Mortierella parvispora E1425 株 の 菌 糸 体 か ら 内 生 細 菌 画 分 を 調 製 し，
BCYE α 寒天培地で培養することにより，Mycoavidus 属
細菌の新種と考えられる B2-EB 株の分離培養に成功した．この B2-EB 株から DNA を抽出し，Pacbio RS II と
HiSeq2500 でシーケンスを行い，ハイブリッド・アセン
ブリ解析により全ゲノムを解読した．B2-EB 株のゲノム
サイズは約 1.88 Mb であり，これまでに分離培養されている Burkholderiaceae 科に属する糸状菌内生細菌の中で最小サイズであった．ゲノム解読された Mycoavidus 属
細菌間で比較ゲノム解析を行った結果，B2-EB 株のゲノ
ムは，M. cysteinexigensB1-EBT 株と比較して，システイ
ン輸送系の欠失だけではなく，有機物代謝や転写・RNA
プロセシング制御，シグナル伝達などに関わる遺伝子群が欠失していることが見出された．また，Mycoavidus

原著論文
1) Sharmin, D., Guo, Y., Nishizawa, T., Ohshima, S., Sato, Y.,
Takashima, Y., Narisawa, K. & Ohta, H. 2018. Comparative
genomic insights into endofungal life styles of two bacterial
endosymbionts, Mycoavidus cysteinexigens and Burkholderia
rhizoxinica. Microbes Environ. 33: 66-76.
2) Takashima, Y., Seto, K., Degawa, Y., Guo, Y., Nishizawa, T.,
Ohta, H. & Narisawa, K. 2018. Prevalence and intra-family
phylogenetic divergence of Burkholderiaceae-related endobacteria associated with species of Mortierella. Microbes
Environ. 33: 417-427.

属細菌ゲノムには 7.2 － 11.5％程度のトランスポゾンやプ保存機関に寄託した菌株

ロファージなどの可動遺伝因子領域が見つかっている．
B2-EB 株では DNA 修復系遺伝子のほとんどが保存されていたことから，構成するゲノムが崩壊していく過程にMortierella sp. YTM18 = JCM 33085

至らず非退化的なゲノム縮小化が起きたと考えられる．

Mortierella sp. YTM19 = JCM 33086

よって，B2-EB 株ゲノムには宿主内での内生維持に必要

Mortierella sp. YTM23 = JCM 33087

不可欠な特異的機能に関わる遺伝子のみが残されている

Mortierella sp. YTM25 = JCM 33088と推察された．

Mortierella sp. YTM35 = JCM 33089
Mortierella sp. YTM36 = JCM 33090

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) Sharmin, D., Guo, Y., Nishizawa, T., Narisawa, K. & Ohta, H.
2017. Genome comparison of two endohyphal bacteria from
dif ferent geographic origin. 環境微生物系学会合同大会
2017，8月29-31日，仙台

Mor tierella sugadairana Y TM39 = JCM 33091, NBRC
112366Mortierella sp. YTM40 = JCM 33092
Mortierella sp. YTM49 = JCM 33093, NBRC 112368
Mortierella sp. YTM50 = JCM 33094
Mortierella sp. YTM53 = JCM 33095− 20 −

糸状菌-内生細菌の微生物間相互作用現象の解明

Mortierella sp. YTM78 = JCM 33096

Mortierella sp. M41s = JCM 39038

Mortierella sp. YTM104 = JCM 33097

Mortierella sp. M53 = JCM 39039

Mortierella sp. YTM108 = JCM 33098

Mortierella sp. M54 = JCM 39040

Mortierella sp. YTM110 = JCM 33099

Mortierella sp. M56s = JCM 39041

Mortierella sp. YTM112 = JCM 33100

Mortierella sp. M60 = JCM 39042

Mortierella sp. YTM113 = JCM 33101

Mortierella sp. M64 = JCM 39043

Mortierella sp. YTM115 = JCM 33102

Mortierella sp. M70 = JCM 39044

Mortierella sp. YTM123 = JCM 33103
Mortierella sp. YTM124 = JCM 33104

謝Mortierella sp. YTM127 = JCM 39001

辞Mortierella sp. YTM131 = JCM 39002
本研究を遂行するにあたり，多大なる助成をいただき

Mortierella jenkinii YTM133 = JCM 39003
Mortierella sp. YTM134 = JCM 39004

ました公益財団法人発酵研究所に深く感謝申し上げま

Mortierella sp. YTM135 = NBRC 112369

す．また，Mortierella 属菌株の寄託において多大なるごMortierella sp. YTM138 = JCM 39005

尽力を賜りました国立研究開発法人理化学研究所バイオ

Mortierella sp. YTM139 = JCM 39006

リソース研究センター微生物材料開発室の橋本 陽 博士，

Mortierella sp. YTM160 = JCM 39007

岡 田 元 博 士 に 厚 く お 礼 申 し 上 げ ま す． さ ら に，Mortierella sp. YTM164 = JCM 39008
Mortierella sp. YTM165 = JCM 39009

Mycoavidus 属細菌のゲノム解析においてご尽力をいただ い た 茨 城 大 学 農 学 部 産 学 官 連 携 研 究 員 の Dilruba

Mortierella sp. YTM170 = JCM 39010

Sharmin 博士，独立行政法人製品評価技術基盤機構バイ

Mortierella sp. YTM171 = JCM 39011

オテクノロジーセンターの三浦隆匡 博士に深く感謝いMortierella sp. YTM173 = JCM 39012

たします．

Mortierella sp. YTM174 = JCM 39013

文

Mortierella sp. YTM176s1 = JCM 39014
Mortierella sp. YTM177s = JCM 39015
Mortierella sp. YTM179 = JCM 39016
Mortierella sp. YTM181 = JCM 39017
Mortierella sp. YTM184 = JCM 39018
Mortierella sp. YTM185s1 = JCM 39019
Mortierella sp. YTM186s = JCM 39020
Mortierella sp. YTM187 = JCM 39021
Mortierella sp. YTM190 = JCM 39022
Mortierella sp. YTM210 = JCM 39023
Mortierella sp. YTM212 = JCM 39024
Mortierella sp. YTM214 = JCM 39025
Mortierella sp. YTM223 = JCM 39026
Mortierella sp. YTM225 = JCM 39027
Mortierella parvispora E1425 = JCM 39028
Mortierella chienii E1931 = JCM 39029
Mortierella parvispora E2010s1 = JCM 39030
Mortierella sp. M5 = JCM 39031
Mortierella sp. M8 = JCM 39032
Mortierella sp. M10 = JCM 39033
Mortierella sp. M14 = JCM 39034
Mortierella sp. M26 = JCM 39035
Mortierella sp. M30 = JCM 39036
Mortierella sp. M40 = JCM 39037

献Bankevich, A., Nurk, S., Antipov, D., Gurevich, A., Dvorkin, M.,
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− 22 −

IFO Res.Commun. 33
23-29, 2019

超高発酵菌体外多糖産生，新規乳酸菌の探索と次世代シンバイオティック機能性評価
木

村

郁

夫

東京農工大学大学院 農学研究院〒183-0054

東京都府中市幸町3-5-8

Screening of exopolysaccharide high-producing lactic acid bacteria andsymbiotic functional evaluation
Ikuo Kimura
Graduate School of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology,
Tokyo 183-8509, Japan
Metabolic disorders, such as obesity and diabetes, arise from disrupted energy homeostasis that depends upon
the equilibrium between energy intake and expenditure. Gut microbiota has emerged as a pivotal, multifactorial
mediator in these disorders as it remarkably regulates host energy acquisition and metabolism while being
modified by diet. Short-chain fatty acids (SCFAs) represent an essential subset of gut microbial metabolites
derived from the fermentation of the indigestible dietar y fiber. We previously reported that SCFAs play animportant role in the regulation of energy homeostasis via specific receptors (e.g., GPR41 and GPR43) that arepresent in host tissues. Recent evidence suggests that indigestible polysaccharides such as dietary fiber and thegut microbial-derived SCFAs exert multiple beneficial effects on host energy metabolism. In this study, weinvestigated the roles of the gut microbiota-derived exopolysaccharides (EPS) in host energy metabolism andevaluated several EPS in detail in order to provide insight into the development of new drugs and functional foods
that are effective against the energy-metabolism associated disorders. We isolated and identified several high-EPSproducing bacteria in gut microbes by screening. Moreover, we confirmed that the administration of these purified
EPS to mice markedly increased SCFAs production in the intestine and thereby improving host metabolic
functions. Further study including human trial is needed to apply these novel EPS and EPS-producing bacteria as
the functional foods against the metabolic disorders.
Key words: exopolysaccharide, gut microbiota, dietary fiber, short-chain fatty acids, obesity緒

言のプレバイオティクス摂取を介した予防医学・健康増進
戦略への関心は食品科学の観点からも益々高まってい近年の腸内細菌叢研究により，腸内細菌が宿主のエネる．この中で，食物繊維等の難消化性多糖を腸内細菌がルギー調節や栄養摂取に関与し，肥満や糖尿病等のエネ

発酵することで産生する短鎖脂肪酸が，宿主側の生理機

ルギー代謝疾患に直接的な影響を及ぼすことが判明し，能発現の主要因であると注目され，我々を含む近年の報

我々もこの分野で多数成果を挙げてきた（ Ohue-Kitano

告（ Miyamoto et al., 2018, Nakajima et al., 2017, Kimura

et al., 2019, Watanabe et al., 2018, Nakatani et al., 2018 ）．
したがって，腸内環境を改善するための生菌摂取による

et al., 2013, Kimura et al., 2011 ）により，その重要性が世界的にも認識され始めている．したがって，腸内発酵

プロバイオティクスや，腸内細菌の餌となる食物繊維等応用により食品の機能性を発揮するための戦略として，
如何に腸内において短鎖脂肪酸の質と量を制御するかがE-mail: ikimura@cc.tuat.ac.jp
共同研究者:中島 啓（東京農工大学大学院）
宮本潤基（東京農工大学大学院）重要である．
そこで，我々は食と腸内環境に基づいた生活習慣病予防・治療戦略として，腸内細菌の宿主への有用効果の源− 23 −

木

村を腸内細菌発酵産物，短鎖脂肪酸と捉え，その増幅によ郁夫

ニーをピックアップし，実際に LC/MS/MS を用いて，る機能性発現に着目した研究に焦点をおいた．従来の食高分子多糖を含むコロニーであることを確認した

物繊維−プレバイオティクスの概念を一新し，菌体外多（ Fig. 1A ）．コロニーの形状を指標に，EPS 産生菌を単糖（ Exopolysaccharide:EPS）−プレバイオティクスに離し，16S rRNA 配列による簡易菌種同定を行い，ヒト着目することにより，新規 EPS 産生腸内細菌群の探索

腸内細菌由来 EPS 高産生菌株多数の単離・同定に成功を行う．そして，単一菌によるプロバイオティクスとプした．実際，高 EPS 産生菌は 10 人に 1 人の割合で検出

レバイオティクスの両方の効果を併せ持つ次世代シンバ

できた．また，菌種同定の結果，高 EPS 産生菌は，属

イオティクスという新たな概念の実証と，新規機能性食レベルでも異なった菌が多数存在することがわかった

品素材分野として世に普及させることを目指し，本研究（ Fig. 1B ）．さらに，これらの菌から EPS を大量に精製を行った．

するために液体培養での精製を試みたが，いくつかの菌に関して，液体培養では EPS 産生能の低下が確認され実験方法たため，高収率（ 10 mg/ml 以上）で回収可能な EPS から先ず，精製を行った（ Fig. 1C ）．

EPS 産生菌株の培養と単離
当研究室で保有するヒト糞便サンプルより得られた，
ヒト由来腸内細菌群から高効率 EPS 産生菌について，

精製 EPS の in vivo 投与試験（短鎖脂肪酸産生から代謝機能への影響）嫌気環境下，プレート培養により単離し，ゲノム抽出後，精製した EPS に関して，マウスへの 14 日間投与実験

16S rRNA 配列を指標に菌種同定を行った．更に中規模

により，短鎖脂肪酸産生量を指標に高発酵性 EPS を選

液体培養によりそれらの菌株からそれぞれの EPS の精出した（ Fig. 2A ）．糞便中短鎖脂肪酸（酢酸・プロオピ

製を行った．

オン酸・酪酸）に関して，最も産生量の高い EPS（ strain

マウス実験

A 由来）を用いて，高脂肪食誘導肥満マウスに対するEPS 長期負荷試験を行った．コントロール食には，EPS

精製したそれぞれの EPS を 10 ％の割合で混餌し，マの代わりに腸内細菌によって難発酵性の食物繊維である

ウスに 14 日間摂取させ，マウス糞便中短鎖脂肪酸産生

セルロースを EPS と同量加えた．結果，EPS 摂取により，量を GC/MS を用いて測定することにより腸内短鎖脂肪

セルロース摂取と比較し，高脂肪食による体脂肪重量増

酸高産生 EPS を選抜した．さらに，短鎖脂肪酸高産生加に対する有意な抑制効果が確認できた（ Fig. 2B ）．さEPS を用いて，12 週間の 10 ％ EPS 含有高脂肪食摂取をらに，EPS 単回投与による即時的な代謝機能への影響

行い，肥満誘導マウスへの EPS 投与における代謝機能

として，EPS 摂取は，マウス経口ブドウ糖負荷試験に改善作用について検討を行った（この時の EPS のコン

おける血糖値の上昇を有意に抑制できることがわかった

トロールとして，難発酵性多糖であるセルロースを用い（ Fig. 2C left ）．食物繊維由来短鎖脂肪酸は，短鎖脂肪酸た）．その時の腸内細菌叢変化について，次世代シーク

受容体 GPR41 や GPR43 を介し，腸管ホルモン GLP-1 のエンサーを用いて 16S rRNA を指標に解析し，糞便中短分泌や，直接的な膵臓 β 細胞からのインスリン分泌を促

鎖脂肪酸を GC/MS により定量した．また，その EPS

進することで糖代謝改善に関わっていると報告されていを産生する菌株が生体内で実際に EPS を産生しているる（McNelis et al., 2015; Tolhurst et al., 2012 ）．したがっかを確認するために，無菌アイソレーター内で飼育をて，我々は更に，同様の検討を GPR41 や GPR43 遺伝子行っている無菌マウスへの EPS 産生菌株の移植実験を欠損マウスで行ったところ，EPS 単回投与時に見られ行った．そして，EPS 産生菌移植によるマウス腸内でた血糖上昇抑制効果が消失した（Fig. 2C middle ）．また，の EPS の産生および短鎖脂肪酸の産生量，そして代謝

腸内細菌の全く存在しない無菌マウスにおいても同様の機能改善効果について調べた．

検討を行った結果，こちらも EPS による効果が消失した（ Fig. 2C right ）．このことは，EPS 摂取による血糖結果および考察

上昇抑制が，EPS から腸内細菌によって産生される短鎖脂肪酸がその受容体を介してインスリン分泌を促進す

ヒト糞便より EPS 高産生菌の単離と精製ることにより，発揮されたことを示唆している．以上の先ず初めに，当研究室において保管しているヒト便サ

結果より，我々はマウスにおいて EPS 摂取が代謝機能

ンプルの希釈液を，独自に作製した EPS 産生菌特異的を改善することおよびそのメカニズムが腸内細菌を介し選択寒天培地上に播種し，EPS 産生菌の単離を行った．

た短鎖脂肪酸産生とその受容体を介して発揮されること

EPS を産生していると予想される粘性をもつ巨大コロを証明した．

− 24 −

超高発酵菌体外多糖産生，新規乳酸菌の探索と次世代シンバイオティック機能性評価

Fig. 1.

Isolation and identification of high EPS producing bacteria from human feces.
(A) The cultured plate from human feces. Arrows indicates ropy colony by EPS producing bacteria. (B) Isolation of high EPS
producing bacteria. The bacteria＇s sampling names indicate specific strain. (C) Measurement of EPS products in liquid cultures.

− 25 −

木

Fig. 2.

村郁

夫

Metabolic benefits by EPS administration to mice.
(A) Measurement of short-chain fatty acids (SCFAs; acetate, propionate, butyrate) in mouse feces with EPS supplementation for 2 weeks (n = 8). (B) Body, adipose, and liver weights of high fat diet fed mice with EPS supplementation for 12
weeks (n = 8). WAT, white adipose tissues; epi, epididymal; peri, perirenal; sub, subcutaneous. (C) Oral glucose tolerance
tests in wild-type (left), Gpr41- or Gpr43-deficient (middle), and germ-free (right) mice were analyzed 1 h after EPS
administration (n = 8). **P < 0.01; *P < 0.05 (Student＇s t test). Results are presented as means±SE.

精製 EPS の in vivo, in vitro 投与試験（腸内細菌叢への属の割合の上昇が確認できた（ Fig. 3A ）．また，この時影響）の糞便中短鎖脂肪酸に関しても短期負荷試験（ 14 日間）

12 週間 EPS 長期摂取時の腸内細菌叢の変化をメタと比較して更なる上昇が確認できた（ Fig. 3B ）．以上よ16S 菌叢解析によって検討した．結果，セルロース摂取

り，EPS の摂取は腸内細菌叢を改善し，短鎖脂肪酸の群と比較して，痩せ型に多いとされている Bacteroides

産生を促すことより，生体において有益な効果をもたら− 26 −

超高発酵菌体外多糖産生，新規乳酸菌の探索と次世代シンバイオティック機能性評価

Fig. 3. Change in gut microbial composition by EPS supplementation.
(A) The relative abundance of microbial taxa in mouse feces with 10％ EPS supplementation for 12 weeks(n = 4). (B) Quantitation of short-chain fatty acids (acetate, propionate, butyrate) in mouse feces with 10％
EPS supplementation for 12 weeks (n = 8). **P < 0.01 (Student＇s t test). Results are presented as means±SE.

すと推測される．次に，この EPS を分解（資化）でき

盲腸中に高分子多糖が検出でき（ Fig. 4C ），糞便中短鎖る腸内細菌種の特定を in vitro 腸内細菌培養系により検脂肪酸に関しても EPS 非産生菌ではなく，EPS 産生菌討を行った（元石川県立大学 山本憲二 教授との共同研と EPS 資化菌である B. stercoris の 2 菌種の移植により，究）．59 種の腸内細菌に対し，EPS の資化性を確認した

有意な上昇が確認できた（ Fig. 4D ）．以上，EPS 産生菌

ところ，Bifidobacterium 属，Clostridium 属，Lactobacillus

および EPS 資化菌のノトバイオート実験から，糖質負属や Ruminococcus 属ではなく，Bacteroides 属特異的に荷による EPS 産生→ EPS 資化→短鎖脂肪酸産生→宿主

EPS が資化された．このことは，EPS 負荷によるマウ

代謝機能改善作用が確認された．
このように，一部の腸内細菌は宿主腸内において EPS

ス腸内細菌叢変化の結果とも一致する．

を産生し，その EPS を別の腸内細菌が資化することに
高 EPS 産生菌のノトバイオート実験

よって短鎖脂肪酸が産生され，この短鎖脂肪酸が宿主の最後に，実際に我々の単離した EPS 産生菌が生体内エネルギー代謝機能に影響を及ぼす腸内細菌 ‐ 宿主ので EPS を産生し，この EPS が腸内細菌による発酵をう

作用メカニズムの一端が本研究によって示唆された．しけ，産生する短鎖脂肪酸が宿主の代謝機能を改善させる

かしながら，本研究内では，実際の腸内細菌叢全体が腸かをノトバイオート実験により，検討した．最初に無菌管内で EPS を産生し，それらが宿主側にどのような影マウスに EPS 産生菌と EPS 非産生菌をそれぞれ移植し響を与えているかを証明するには至っていない．EPS

た．14 日間の高脂肪食摂取・高糖質飲水の結果，EPS

産生菌は多種にわたり，産生される EPS も非常に多種

非産生菌を移植したマウスにおいて体脂肪重量の上昇が多様であるため，今後，この複雑共生系の証明を精力的確認されたが，EPS 産生菌の移植では，その効果が無に進める必要がある．

菌マウスと同程度であった（ Fig. 4A ）．また，血糖値に要関しても EPS 産生菌では EPS 非産生菌に比べて低い傾向を示した．この時，in vitro 腸内細菌培養系で確認し

約

た EPS 資化性の高い Bacteroides stercoris も同時に移植

EPS 産生量を指標に 10 株以上のリード EPS 産生菌のしたところ，EPS 産生菌と B. stercoris の 2 菌株移植に関選抜が出来た．うち，3 株以上に関して，EPS の精製をして無菌マウスと比較して有意に血糖値を減少させた

行い，マウスへの投与実験から腸管内での短鎖脂肪酸の（ Fig. 4B ）．この効果は EPS 非産生菌と B. stercoris の 2

高産生が確認できた．また，これら EPS 資化性の高い菌株移植では確認できなかった．また，同様に EPS 非腸内細菌の同定も完了し，EPS 産生菌と EPS 資化菌の産生菌では検出されなかったが，EPS 産生菌移植ではノトバイオート実験から，高糖質食負荷による EPS 産− 27 −

木

Fig. 4.

村郁

夫

Gnotobiotic mice transferred EPS-producing bacteria.
(A) Body weight and adipose weight, and (B) plasma glucose at 10 weeks of age were measured in high fat
diet fed GF and gnotobiotic mice for 1 weeks (n = 8). (C) Measurement of polysaccharides in cecum by LC
and (D) short-chain fatty acids in feces (n = 5 – 8). EPS(+), EPS -producing strain; EPS(-), EPS -non-producing type strain. **P < 0.01; *P < 0.05; #P < 0.05 (Tukey–Kramer test). Results are presented as means±SE.

本助成で得られた研究成果の報告

生→ EPS 資化→短鎖脂肪酸産生→代謝機能改善作用の確認もできた．さらには，実際にマウス実験において，EPS 投与による代謝機能の改善効果も確認できたことから，現在，うち 1 種類に関してはヒト臨床試験への移行の準備を進めている．本研究課題により，数種類のシード EPS 産生菌の抽出ができたので，今後，研究の規模をさらに拡大し，大規模培養の確立・臨床応用に向けて，更なる研究展開が必要である．

口頭発表
1) 木村 郁夫. 2019. 菌体外多糖と肥満・糖尿病「腸内細菌叢
由来代謝物質がもたらす生体恒常性と疾患」, 第19回 日本
抗加齢医学会, 6月14日, 東京
2) 木村 郁夫. 2017. 腸内細菌代謝産物による宿主エネルギー制御機構「代謝異常と腸内細菌」, 第51回糖尿病学の進歩,
2月18日, 京都− 28 −

超高発酵菌体外多糖産生，新規乳酸菌の探索と次世代シンバイオティック機能性評価

謝

辞本研究の遂行にあたり，助成頂きました公益財団法人
発酵研究所に深く感謝致します．また，微生物培養実験で御協力頂きました石川県立大学 元教授 山本 憲二 先生，助教 松崎千秋 先生，EPS の発酵合成・精製で御協力頂きました日東薬品工業株式会社の久 景子様，清水秀憲様に厚く御礼申し上げます．

文

献

Kimura, I., Inoue, D., Maeda, T., Hara, T., Ichimura, A., Miyauchi,
S., Kobayashi, M., Hirasawa, A. & Tsujimoto, G. 2011. Shortchain fatty acids and ketones directly regulate sympathetic
nervous system via GPR41. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108:8030-8035.
Kimura, I., Ozawa, K., Inoue, D., Imamura, T., Kimura, K., Maeda,
T., Terasawa, K., Kashihara, D., Hirano, K., Tani, T., Takahashi,T., Miyauchi, S., Shioi, G., Inoue, H. & Tsujimoto, G. 2013. The
gut microbiota suppresses insulin-mediated fat accumulation
via the short-chain fatty acid receptor GPR43. Nat. Commun. 4:
1829.
McNelis, J.C., Lee, Y.S., Mayoral, R., van, der, Kant, R., Johnson,
A.M., Wollam, J. & Olefsky, J.M. 2015. GPR43 potentiates betacell function in obesity. Diabetes 64: 3203–3217.
Miyamoto, J., Watanabe, K., Taira, S., Kasubuchi, M., Li, X., Irie,
J., Itoh, H. & Kimura, I. 2018. Barley β-glucan improves metabolic condition via short-chain fatty acids produced by gut

microbial fermentation in high fat diet fed mice. PLoS One 13:
e0196579.
Nakajima, A., Nakatani, A., Hasegawa, S., Irie, J., Ozawa, K.,
Tsujimoto, G., Suganami, T., Itoh, H. & Kimura, I. 2017. The
short chain fatty acid receptor GPR43 regulates inflammatory
signals in adipose tissue M2-type macrophages. PLoS One 12:
e0179696.
Nakatani, A., Li, X., Miyamoto, J., Igarashi, M., Watanabe, H.,
Sutou, A., Watanabe, K., Motoyama, T., Tachibana, N., Kohno,
M., Inoue, H. & Kimura, I. 2018. Dietary mung bean protein
reduces high-fat diet-induced weight gain by modulating hostbile acid metabolism in a gut microbiota-dependent manner.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 501: 955-961.
Ohue-Kitano, R., Taira, S., Watanabe, K., Masujima, Y., Kuboshima,T., Miyamoto, J., Nishitani, Y., Kawakami, H., Kuwahara, H. &Kimura I. 2019. 3-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)propionic acidproduced from 4-Hydroxy-3-methoxycinnamic acid by gut
microbiota improves host metabolic condition in diet-Induced
obese mice. Nutrients 11: 1038.
Tolhurst, G., Heffron, H., Lam, Y.S., Parker, H.E., Habib, A.M.,
Diakogiannaki, E., Cameron, J., Grosse, J., Reimann, F. &Gribble, F.M. 2012. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via the G-protein-coupled receptor
FFAR2. Diabetes 61: 364–371.
Watanabe, K., Igarashi, M., Li, X., Nakatani, A., Miyamoto, J.,
Inaba, Y., Sutou, A., Saito, T., Sato, T., Tachibana, N., Inoue, H.
& Kimura, I. 2018. Dietar y soybean protein ameliorates
high-fat diet-induced obesity by modifying the gut microbiota-dependent biotransformation of bile acids. PLoS One 13:
e0202083.

− 29 −

IFO Res.Commun. 33
31-45, 2019

魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討：
抗生物質を代替する養殖魚類表皮版プロバイオティクスの確立を目指して堀克敏名古屋大学工学研究科〒464-8603

愛知県名古屋市千種区不老町

Fish skin microbiome analysis for prevention of pathogen:A preliminary study for development of ＇fish skin probiotics＇.
Katsutoshi Hori
Graduated School of Engineering Nagoya University
Furo-cho, Chikusa, Nagoya, Aich 464-8603, Japan
The importance of fish disease control is increasing in order to improve the productivity of aquaculture. As apractical method for fish disease control, we have proposed a concept of ＂fish skin probiotics＂ in aquaculture. In
this study, we analyzed fish skin bacterial microbiota during the percutaneous infection to explore the feasibility ofthis concept. Zebrafish (Dani rerio) was used as a model fish. The fishes were given the combination of stressconditions such as temperature shift, skin injury, and administration of antibiotics during infection experiments,
and then exposed to Yersinia ruckeri, an important trout pathogen. Progress of the infection was diagnosed byobservation of specific symptoms. The changes of skin bacterial flora were analyzed by comprehensive sequencingof 16S rDNA amplicon using a next generation sequencer (NGS). The infection of Y. ruckeri to zebrafish wasobserved among the injured fishes at 20℃, and most of the fishes died in 7 days after the pathogen challenge. The
skin bacterial floras of dead fish were occupied by the pathogen, suggesting that the pathogen infected
percutaneously. In order to investigate the relationship between the skin bacterial flora and Y. ruckeri infection, thefloras at 20℃ were compared with those at 28℃. At 20℃, the replacement of the major bacteria in the floras andthe increase in the abundance of OTUs containing pathogenic and parasitic bacteria were observed. The effects of
the injury and the challenge of Y. ruckeri on the skin bacterial flora were compared among the experimentalgroups at 28℃ and 20℃ except for the dead condition (pathogen challenge after injur y) by volcano plot andβ-diversity analyses. The results suggested that the quantitative change in bacterial floras occurred by thechallenge of Y. ruckeri and injury. Infection experiments were then conducted with the fishes, whose skin bacterial
floras were destroyed by antibiotic treatment. Although most fishes survived after the pathogen challenge, theskin bacterial floras were occupied by Y. ruckeri. These results suggest that the zebrafish skin bacterial flora
usually prevents colonization of Y. ruckeri to the skin, and that physiological stresses such as low temperature,
injury, and antibiotic treatment cause dysbacteriosis of the skin bacterial flora and dysfunction of the skin barrier,
resulting in the increases in the susceptibility to infection. Furthermore, we analyzed the skin bacterial floras ofrainbow trout (Oncorhynchus mykiss), which is known as a natural host of Y. ruckeri, in order to obser ve thechanges of the floras during breeding in a fish farm. The skin bacterial floras depended on the fish growth stage
and breeding water. The data imply that the change of the skin bacterial flora in the process of aquaculture affects
the infection sensitivity against Y. ruckeri.
Key words: microbiome, fish skin, Yersinia ruckeri, probiotics

E-mail: khori@chembio.nagoya-u.ac.jp
共同研究者:中谷 肇（名古屋大学工学研究科）
田丸 浩（三重大学生物資源学研究科）− 31 −

堀

緒

克

言

敏

して研究が進められている（ Shreiner et al., 2015; Giatsis

水産養殖は世界の魚介類消費量の増加とともに急激な

et al., 2016 ）．
一方で，魚類は水中で生活することから，空気中より成長を遂げてきた．1974 年には食用向け魚介類生産量もはるかに多くの活性の高い微生物に体表面がさらされのうちわずか 7％を占めているにすぎなかったが，このることになる．魚類の表皮はこういった微生物から宿主

シェアは 2014 年には 45％まで上昇し，2025 年には 50％

を物理的，免疫的に守る障壁の役割を担っている．特にを超えると予測されている（ FAO, 2018 ）．このように，表皮を覆っている粘膜は水と常に接しているため，環今後も発展が見込まれる水産養殖の生産性や経済性を維

境の変化，栄養状態，共生微生物または病原菌の干渉持するために，魚病対策は大きな課題となっているなど多くの外的な要因に適応しなければならない重要（ Leung & Bates, 2013 ）．

な組織である（ Gomez et al., 2013; Peatman et al., 2013;

魚病対策として抗生物質はその簡便さと適応範囲の広Brinchmann, 2016 ）．

さから世界中の養殖場で利用されてきたが，薬剤耐性菌

水産養殖では生産性をあげるため魚を過密飼育していの出現が問題となった．薬剤耐性菌は抗生物質が使用さることが多く，魚同士の喧嘩や衝突，壁や網との摩擦なれる様々な環境で出現する可能性があり，世界的な関心どにより表皮が傷つくリスクが高まっている．表皮上にを集める大きな環境問題となっている（ Cantas et al.,

できた傷口からは病原菌が粘膜の壁を突破して体内に侵2013; Kelly & Davies, 2017 ）．これらのことから抗生物入しやすく，表皮が傷ついた魚について，病原菌の感染

質 の 使 用 が 世 界 的 に 規 制 さ れ 始 め（ Kelly & Davies,による死亡率が大幅に上昇することが報告されている2017 ），日本でも厚生労働省が 2016 年に「薬剤耐性菌対（ Liu et al., 2015 ）．したがって，養殖魚の病害防除を微策アクションプラン」を発表しその利用が規制されつつ生物によって行うのであれば，これまでのプロバイオ

ある．

ティクス研究のように腸管だけに着目するだけでは十分

このようなことから，抗生物質に代わる魚病対策が模ではなく，表皮にも着目するべきだと考えられる．しか索された結果，水産用ワクチンの開発が盛んに行われ，しながら魚類において表皮を対象としたいわば「表皮版

いくつかの魚病に対しては実用化もされている

プロバイオティクス」については，世界でも全く検討さ（ Sommerset et al., 2005 ）．しかしながらワクチンは特定れていない．

の病原菌にしか効果を示さないことに加え，抗原や添加

魚類表皮版プロバイオティクス技術の実現可能性を探剤を適切にデザインしなければ効果の高いワクチンを得るためには，通常のプロバイオティクスである腸管を対ることができないことから開発までに多くの時間と費用象としたものと同様に，対象となる器官・組織におけるを必要とする．よって様々な病原菌に対抗できるだけの，細菌叢との関係を明らかにしていく必要がある．魚類に有効なワクチンの開発が追い付いていないのが現状であ

おいて表皮細菌叢を解析した例はさまざまな魚種で報告る（ Sommerset et al., 2005 ）．

されているほか，魚種や遺伝的背景が異なる個体間，生抗生物質やワクチンとは異なる魚病対策のアプローチ

育環境の違いにより細菌叢が異なること，水の pH の変として，プロバイオティクスの魚類への利用がある．プ化や，養殖場での魚の取り扱いによって表皮細菌叢が変

ロバイオティクスとは，経口投与によって腸内で一定期

化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る（ Larsen et al., 2013;

間生存し，宿主に有益な効果をもたらす微生物やそれら

Boutin et al., 2014; Sylvain et al., 2016; Minniti et al., 2017;を含む食品のことであり，魚類のプロバイオティクスにUren Webster et al., 2018 ）．しかしながら，その細菌叢ついても，1980 年代から研究が始められ，病原菌に対の違いや変化が養殖において魚病の防除にどのような役する拮抗作用を示すものや，魚類の免疫機能を強化する

割を示すのかは不明である．

もの，魚類の成長を促進するものなど様々な有用微生物

本研究では病害防除における表皮細菌叢の重要性につが す で に 発 見 さ れ て い る（ Zorriehzahra et al., 2016;

いて明らかにするために，主としてサケ・マス類にレッHoseinifar et al., 2018 ）．投与方法は簡便であり，有用微ドマウス病を引き起こすことが知られている Yersinia

生物を餌に混ぜることや飼育水中に播種することで経口投与させる方法が一般的に行われている（ Gatesoupe,

ruckeri（ Kumar et al., 2015 ）をモデル魚類であるゼブ
ラフィッシュに経皮感染させる条件を探索した．また，

1999; Verschuere et al., 2000; Irianto & Austin, 2002;

表皮感染を引き起こす飼育条件において，ゼブラフィッ

Zorriehzahra et al., 2016; Hoseinifar et al., 2018 ）．このよ

シュの表皮細菌叢の変化を解析した．また，養殖場のニ

うなプロバイオティクスの主な作用機序の一つは，腸内ジマスにおける表皮細菌叢の変遷を解析した．

細菌叢の改善によるものであると考えられており，近年
ではプロバイオティクスと腸内細菌叢との関係性に着目− 32 −

魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討

実験方法

菌フローラを，フィルター（ E045A047A，孔径 0.45 μm，
直径 47 mm ; ADVANTEC ）で吸引濾過して回収した．

使用した病原菌株と培養条件抗生物質で魚を処理する場合は 500 mL のフラスコに本 研 究 で 使 用 し た 魚 の 病 原 性 細 菌 Yersinia ruckeri

滅菌飼育水と抗生物質を加え，飼育した．その後滅菌飼

NVH 3758 株はノルウェーにて病気のニジマスより単離育水を新しいものに交換し，20 ℃のインキュベーター

された株であり，オスロ大学の Dirk Linke 教授より分

内で，病原菌を加える条件と加えない条件で最大 7 日間譲していただいた．培養には LB 培地（ Miller ）を用い，飼育した．

感染実験には 28 ℃で 24 時間振盪培養したものを用いた．
ゼブラフィッシュ表皮からの細菌ゲノムの抽出
ゼブラフィッシュの管理

曝露実験終了後，フラスコから回収した個体は過剰量

感染実験に用いたゼブラフィッシュ（ Danio rerio ）のトリカインを含む滅菌飼育水中にて安楽死させると同の成魚は三重大学田丸研究室にて 1 年以上飼育された個

時に，表皮に付着した飼育水を洗い流した．死亡させた体を入手し，感染実験を行うまで三重大学とは異なる飼

ゼブラフィッシュから表皮ごと付着している細菌叢を採育水にて管理した．飼育に用いた水槽は CROSS MINI取した．回収した表皮サンプルは滅菌済み 1.5 ml チュー（ NWC-341 ; NISSO ）を使用した．餌はテトラミンスー

ブに移し，−30 ℃で冷凍保存した．

パ ー（ 17653 ; ス ペ ク ト ラ ム ブ ラ ン ズ ジ ャ パ ン ） を

表皮サンプルからの細菌ゲノム DNA の抽出・精製に

Tetra Auto Feeder（ AF-3 ; スペクトラム ブランズ ジャはキットを用いた（ NucleoSpin Tissue ; タカラバイオ）．

パン）で 1 日 2 回 12 時間おきに与えた．照明には Tetra

その際，グラム陽性細菌などの細胞の破砕が難しい細菌

LED Mini Light（ 73333 ; スペクトラム ブランズ ジャパ

ゲノム DNA を回収するためのプロトコルに従い，リゾン ） を 使 用 し， 簡 単 デ ジ タ ル タ イ マ ー（ PT70DW ;チーム溶液（ 20 mg/ml リゾチーム ; 127- 06724 ; 和光純薬

REVEX ）で 12 時間ごとに点灯と消灯を行った．水温は工業，20 mM Tris-HCl，2 mM EDTA ，1 ％ Triton X-100 ）セーフカバーヒートナビ SH80（ 7775 ; ジェックス）をによって 37 ℃で 1 時間サンプルの前処処理を行った．

使用して 28 ℃に維持した．
次世代シーケンサー iSeq100 による 16S rDNA アンプリ
コンライブラリーのシーケンシング

ゼブラフィッシュへの病原性細菌の感染実験
滅菌水にオートクレーブ滅菌した Instant Ocean Sea

抽出したゲノム DNA から，原核生物のみが持つ 16S

Salt（ NPQO ）の溶液を添加し，海水塩が 3 g/L（海水rDNA の V4 領域を対象として，iSeq100（ illumina ）をの 10％）に調整した滅菌飼育水を作成した．滅菌飼育

用いてシーケンスを行うための 16S rDNA アンプリコンライ

水にトリカイン溶液（ 4.0 mg/mlトリカイン，0.021 M

ブラリーを調製した．ライブラリー作成には以下のプロトコ

Tris ）2 ml を加え麻酔液とした．麻酔をかけた後，1 かル（ 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation ;所刺し傷をつけた．滅菌飼育水 300 ml を 500 ml フラス

15044223 Rev. A ; illumina ）を参考にして行った．ただコに用意し，傷つけた成魚を移し麻酔の影響が切れたこ

し抽出ゲノムからの 16S rDNA V4 領域の増幅には Exとを確認した後，24 時間 20 ℃もしくは 28 ℃で飼育した．

Taq（ RR001A; タカラバイオ株式会社）を用い，アニー

コントロール群として傷をつけない魚も上記の条件で同リング温度を 50.7 ℃に設定した．増幅に用いたプライ時に飼育した．24 時間後，飼育水に病原菌を添加した．

マーは Earth Microbiome Project（ http://www.earthmi-

病 原 菌 を 暴 露 し て か ら 新 し い 滅 菌 飼 育 水 に 交 換 し，

crobiome.org/emp-standard-protocols/16s/ ）Version

20 ℃のインキュベーター内で最長 7 日間飼育した．感染

4_13（ updated April 2016 ）で紹介されたものを使用し，実験に供したゼブラフィッシュは 3 - 12 時間おきに観察

オーバーハング（イルミナアダプター配列）が領域特異し，衰弱しているか，もしくはレッドマウス病が疑われ的配列に追加された配列組成のものを用いた．プライる症状が出ているかによって感染の評価を行った．症状

マーの配列は以下の通りである．

が見られた，もしくは死亡したゼブラフィッシュは随時
フラスコから回収した．その際コントロール群からも，

Forward Primer:

感染群から回収したゼブラフィッシュと同じ匹数のゼブ

TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTG

ラフィッシュを同時に回収した．飼育水の交換から 7 日

YCAGCMGCCGCGGTAA

間経過した時点でも症状が見られなかったゼブラフィッ

Reverse Primer:

シュもすべてフラスコから回収した．

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGG

また，実験が終了した時点での飼育水中に含まれる細ACTACHVGGGTWTCTAAT− 33 −

堀克

敏25 サイクルの PCR を行い増幅が終了したサンプルのうリード）を OTU Clustering ツールを用いて OTU（ opera-

ち 11 サンプルを無作為に選び，増幅産物を含む反応液

tional taxonomic unit ）ごとに分類分けした．リファレの一部を採取し，3 ～ 5 倍に超純水で希釈した後，バインスデータベースに基づく OTU クラスタリングを行

オアナライザー電気泳動システム（ Agilent 2100 ）を用

い，リファレンスのデータベースとして GreenGene を

いて電気泳動し，増幅産物の状態を確認した．残りのサ用い，類似度 97 ％を閾値とした．得られたテーブルデー

ン プ ル に 含 ま れ る 増 幅 産 物 を AMPure XP ビ ー ズ

タを Microsoft Excel 形式のデータとしてエクスポート（ A63881; ベックマン・コールター株式会社）を使用しし，総リード数，OTU 数，サンプル間で重複する OTUて精製した．精製したアンプリコンに，Nextera XT v2の個数，各 OTU が占める割合を計算した．さらに詳細キットを用いて，シーケンサーに必要なアダプター配列な細菌種の同定には得られたリード配列を NCBI Blastとインデックス配列を 8 サイクルの PCR によって付加にて検索することで行った．

した．ポリメラーゼは 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix

各実験群における OTU の存在量に基づくヒートマッ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いた．

プの作成は Create Heat Map for Abundance Table ツー

シーケンスに必要なアダプターを付加したアンプリコン

ルによりおこなった．上記の OTU Clustering ツールにを再び AMPure XP ビーズを使用して精製し解析用ライよって比較したい実験群のシーケンスデータよりブラリーを得た．精製したライブラリーの一部をバイオ

Abundance Table を作成し，これをもとにツールを実行

アナライザーで電気泳動し，ライブラリーの大きさを確した．パラメータとしてサンプル間距離の計算方法とし認した．ライブラリー濃度を Qubit 4 dsDNA BR Assayてユークリッド距離を用い，クラスタリングの方法としKit（ Q32853 ; ThermoFisher SCIENTIFIC ）を用いて測て完全連結法を選択した．サンプル間のユークリッド距

定した．測定した結果に基づき，各サンプルのライブラ

離（E）の計算は以下の式による．

リーを 50 pM 含むライブラリーを作製した．シーケンス
データのクオリティーを高めるために PhiX Control v3（ FC-110-3001 illumina ）をライブラリーに添加した．調製したシーケンスサンプルは，以下のプロトコル（ iSeq
100 Sequencing System Guide ; 1000000036024 v00 JPN ;illumina ）を参考にしてシーケンスを行った．

ここで 𝑛 は OTU の数，𝑋𝑖𝐴 と 𝑋𝑖𝐵 は OTU 𝑖 のサンプル A
および B における abundance である．

16S rDNA アンプリコンシーケンスに基づく In silico 解析

実験条件間での各 OTU の変化量の計算と，有意差のシーケンスによって得られた 16SrDNA 配列情報をも

検定は Differential Abundance Analysis ツールを用いてと に し た 菌 叢 解 析 お よ び 統 計 解 析 に は CLC Genomic

解析した．比較したい実験群のシーケンスデータより

WorkBench（ Filgen ）を用いた．iSeq によって得られ

Abundance Table を作成し，それをもとにしてツールをたペアエンドリードのうち 50％以上がマージできな

実行した．比較方法としてコントロールに対する比較をかったために，ペアエンドの fastq ファイルのうちの選択し，コントロール群となる条件を選択した．得られリード 1（約 150 bp ）を用いて解析を行った．ソフトウ

たテーブルを Microsoft Excel で読み込めるファイル形

エアーにインポートしたシーケンスデータは Trimming

式にエクスポートし，倍率変化，p 値および FDR 補正 p

Sequences ツールにより長さとクオリティースコア，未値から volcano プロットを作成した．

決定塩基の出現回数に基づきトリミングした．トリミン

実験群間の β 多様性解析は次のように行った．比較対グパラメーターとして，Trim using quality score の閾値象の実験群のシーケンスデータより Abundance Table をを 0.05 に，Trim ambiguous nucleotides の最大不確定塩

作成し，Align OTUs with MUSCLE ツールにより OTU

基数を 1 に設定した．トリミング後の配列長の長さを最に分類分けされたリードをアラインメントした．このア

短 140 bp，最長 270 bp とした．トリミング後のリード

ラインメントデータをもとに Create tree ツールによりに対してゼブラフィッシュゲノムのリファレンスゲノム

系統樹を作成した．系統樹の作成方法として近隣結合法

データーと一致する配列を Clean Host DNA ツールを用をもちい，核酸配列のアラインメントデータに基づく距

いて取り除いた．続いて実験条件ごとに配列情報を分類

離の測定方法として K80 モデル（ Kimura, 1980 ）を用するため，サンプル名，曝露実験時の水温，傷の有無，

いた．作成された系統樹から Beta diversity ツールを用

病原菌曝露の有無，サンプル回収時のゼブラフィッシュ

いて，各サンプル間の Unweighted Unifrac 距離およびの生死と飼育水との分類に基づくメタデータを作成しWeighted Unifrac 距離（Lozupone et al., 2011 ）を計算し，た．最終的に得られた 16S rDNA リード（ 20000−1500

このデータから 3 次元主座標プロット（ 3D PCoA plot ）− 34 −

魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討

養殖魚の表皮細菌叢の取得を作成した．

石井養殖（岐阜県大垣市）で養殖しているニジマス

それぞれの UniFrac 距離の計算は以下の式による．

（ Oncorhynchus mykiss ）（ 8 か月齢および 1 年 2 か月齢）を使用した．細菌叢の回収は麻酔を使用せずに，表皮全Unweighted UniFrac:

体を滅菌綿棒で擦り取り，滅菌した飼育水に浸してボルテックスで懸濁した．また飼育場の水も採取し，フィル
ターで吸引濾過して微生物を回収した．
Weighted UniFrac:

結果と考察
ここで 𝑛 は系統樹の枝数．𝑝𝑖𝐴 ，𝑝𝑖𝐵 はそれぞれサンプル
A および B 中の枝 𝑖 に帰属する分類群の個体数．指示関数はそれぞれサンプル A および B

Y. ruckeri の経皮感染条件の検討
Y. ruckeri がモデル魚類となるゼブラフィッシュに対して経皮感染を引き起こす条件を模索した．Fig. 1 は 2
種類の飼育水温と表皮の傷の有無により実験群を構成

中の枝 𝑖 に属する分類群の個体数が 0 以上の時は 1，そし，病原菌を暴露した後の生存個体の数の推移を示した

サンプル間の群集性の判定および群集間の有意差検定が生存した．次に，水温は至適水温のままで，表皮に傷れ以外の時は 0 となる．

にグラフである．ゼブラフィッシュの飼育至適水温である
28 ℃で病原菌に暴露したところ，暴露後すべての個体

は PERMANOVA（ PERmutational Multivariateをつけたのち，病原菌を暴露した．この場合も傷をつけ

ANalysis Of VAriance ）ツールを利用した．β 多様性解ない場合と同様にほぼすべての個体が生存した．これら

析に用いた系統樹を用いてサンプル間の Unweightedのことからゼブラフィッシュの至適水温である 28 ℃で

Unifrac 距離および Weighted Unifrac 距離を計算させた．

は Y. ruckeri はゼブラフィッシュに感染しないことが示

順列（Number of permutations ）は 99, 999 にセットした．

された．次に病原菌を暴露する水温を 20 ℃まで引き下

統計値の計算は Anderson（ 2001）の方法により算出した．

げ実験を行った．傷をつけずに病原菌暴露を行った場合
は 28 ℃の時と同様にほとんどの個体が生存した．一方Fig. 1

The number of survival fishes in infection experiments after pathogen challenge. The number ofsurvival fishes in each experimental condition was counted for 7 days after the challenge of Y. ruckeri.
Non-infection group (without pathogen) and infection group (with pathogen) were compared in eachexperimental condition. Inset image are the dead fishes after the challenge of Y. ruckeri.

− 35 −

堀克

で，傷をつけたのち，病原菌を暴露した場合はほとんど

敏( 31.6％)，Sphingobacteriales 目( 14.1％)，Acinetobacterの個体が暴露後 7 日目以内に斃死した（ Fig. 1 ）．斃死し属( 10.4％)，Yersinia 属( 5.8％)，Pedobacter 属( 3.9％)た個体は鰓付近より出血がみられ，レッドマウス病様のCerasicoccaceae 科( 3.6％)，Acidovorax 属( 2.6％)，症状を呈していた（ Fig. 1 inset image ）．20 ℃で傷をつけた条件のうち，病原菌を暴露しない非感染群の個体はAeromonas 属( 2.2％)，Propionibacterium 属( 2.0％) の占有率が高かった（ Fig. 2A ）．また，28 ℃および 20 ℃

ほぼすべての個体が生存したことから，ゼブラフィッで特異的にみられた OTU はそれぞれ 148，347，両方にシュは Y. ruckeri の感染により斃死したものと考えられ共通してみられた OTU は 137 であった．20 ℃および

た．また，表皮に傷をつけない条件では感染群の個体も28 ℃で存在比率の高い細菌種の変遷を比較したところ，ほぼ生存したことから（ Fig. 1 ），表皮の傷が感染の原

どちらの温度でも共通してみられる OTU にそのほとん因となっていることが示唆された．魚類は変温動物であどが属し，温度により占有率の交替がおこることによりり，水温によって個体の抗体生産能などの免疫機構が影

細菌叢の構成変化を引き起こしていることが示唆された

響 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る（ Bly & Clem, 1992; Le（ Fig. 2B ）．次に，傷をつけたことによる影響を観察す

Morvan-Rocher et al., 1995; Nikoskelainen et al., 2004 ）．

るために，各飼育水温において，病原菌を暴露しなかっ

したがって飼育水温を下げたことで，ゼブラフィッシュ

た非感染群で，傷をつけた個体と付けなかった個体の主の免疫機構が影響を受け，至適水温の時と比べ免疫力が要な細菌叢の変化を比較した．28 ℃の飼育水温におい低下し，Y. ruckeri に感染しやすくなった可能性がある．

ては Cerasicoccaceae 科，Acidovorax 属，Bosea 属の割合

魚の表皮は病原菌の侵入を防ぐためのバリアとして機能が増加し，Stenotrophomonas 属の割合が減少していた．

を有していると考えられ，表皮に分泌される皮膚粘液中

一方 20 ℃では，傷をつけたことによる主要な細菌叢のにはレクチンなどの生体防御因子が含まれている占有率の変化は小さかった（ Fig. 2A ）．次に，病原菌暴（ Nakamura et al., 2001; Tsutsui et al., 2005; Gomez et al.,露の影響を観察するために，各飼育温度において，病原2013; Unajak et al., 2015; Brinchmann, 2016; Tsutsui et al.,菌を暴露した感染群と，何もせずに飼育したコントロー

2016 ）．表皮に傷をつけた魚は病原菌存在下での生存率

ル群を比較した．28 ℃では傷をつけずに病原菌を暴露しが低下することが報告されている（ Liu et al., 2015 ）．した場合は Cerasicoccaceae 科が増加し，Stenotrophomonas

たがって，傷をつけたことでバリア機能が破壊され病原属の割合が減少していた（ Fig. 2A ）．病原菌を暴露する菌が体内に侵入しやすい状況が生まれたほか，生理的なとともに表皮に傷をつけた場合は，Luteolibacter 属の増ストレスによって，生体防御因子の分泌低下など免疫活

加と，傷の付加で増加していた Acidovorax 属の割合が性が低下し，普段は感染しない病原菌に感染しやすい状さらに顕著に増加した．20 ℃の水温においては，傷を態になったと考えられる．

つけない感染群では主要な細菌群の占有率については大きな変化が見られなかった（ Fig. 2A ）．一方で傷をつけ

Y. ruckeri 経皮感染実験における主要な表皮細菌叢の構成の変化て病原菌を暴露した場合は多くの魚が斃死し，斃死魚の感染を引き起こすようなストレスを与えた状態で，表占有していたことから，感染が経皮的に起こったとこと皮の微生物フローラがどのような影響を受けるのかを観

細菌叢は病原菌として暴露した Yersinia 属が 80％以上をが明らかとなった（ Fig. 2A ）．

察するために，主な微生物フローラとして細菌叢に注目

感染実験で用いた飼育水中では病原菌の割合は低いこし解析を行った．飼育水温 28 ℃および 20 ℃の各実験群とから（ Fig. 2A ），Y. ruckeri は固体表面に付着したことより採取した表皮サンプルよりそれぞれ 138339 リードが示唆される．Y. ruckeri は固体表面上にバイオフィルム

および 263519 リードの細菌由来 16S rDNA 配列のシーを形成することが知られ，そのようなバイオフィルムがケンスが得られた．これらの配列をリファレンスデータ

感染源になると考えられている（ Kumar et al.，2015 ）．

ベースと照合し operational taxonomic unit（ OTU ）ごとに一方，感染し斃死した魚の表皮細菌叢が Yersinia 属細菌

分類することで，28 ℃のサンプルからは 285 ，20 ℃のサンに占有されていたことから，今回の実験条件では魚の表

プルからは 484 の OTU に分類された．傷の付加や病原菌

皮上に直接バイオフィルムを形成したことが示唆された．

暴露を行わずに，飼育温度を変化させただけで飼育した個

28 ℃から 20 ℃への温度変化では主要な細菌叢の構成

体の細菌叢解析の結果，28 ℃では主に Enterobacteriacea

が大幅に変化していることが示された（Fig. 2B ）．また，科( 31.2％)，Acinetobacter 属( 17.6％)，Methylobacterium

温度変化による主要細菌叢の交替は，新たな種が表皮を属( 6 . 6 ％)， B o s e a 属( 5 . 3 ％)， D e l f t i a 属( 4 . 2 ％)占有したというよりは，もともとどちらの温度でも表皮

Stenotrophomonas 属( 3.3 ％)，Pseudomonas 属( 1.5％)，に存在した細菌の表皮占有率が増減したことによるもの

Ochrobactrum 属( 1.2％） が，20 ℃ で は Pseudomonas 属であることが示唆された（ Fig. 2B ）．表皮は水温の影響− 36 −

魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討

Fig. 2Bacterial composition on individual fish skin in infection experiments. (A) The stacked bar chart shows the abundance of Operational
Taxonomic Unit (OTU) (top 50) in fish skin samples. The samples were grouped by water temperature (20℃ or 28℃), the status of
injury (Injury + or −), and the status of the pathogen challenge (Y. ruckeri + or −). (B) Comparison of the abundance of the major skinbacteria varied by water temperature. The stacked area chart shows the abundance of respective bacteria from fish skin maintained
at 28℃ and 20℃ . The data from fishes in the uninjured, non-infection group (Injury − Y. ruckeri −) were used for the analysis.

− 37 −

堀克

敏を受けやすいことから，そこに形成されている細菌叢もCorynebacterium 属，Delftia 属，Propionibacterium 属，

水温に影響されると考えられ，細菌種によって異なる生

Staphylococcus 属，Stenotrophomonas 属，Acidovorax soli
であった．

育至適温度が占有率の変化に影響した可能性が高いと考えられる．水温低下や傷の付加といったストレスによる

次に，このような変化が 20 ℃の各実験群の個体の細免疫力の低下に加え，温度変化による表皮細菌叢の変化

菌叢全体に与える影響を解析するために，20 ℃で斃死

よって Y. ruckeri が表皮上にバイオフィルムを形成しやした実験群と飼育水のサンプルを除く実験群に対して，

すい状態になった可能性がある．28 ℃においては傷のUnifrac 距離（ Lozupone et al., 2011 ）を用いた β 多様性

付加や病原菌暴露といったストレスにより Acidovorax

解析を行い，各実験群間の細菌叢の類似性を観測した

属や Luteolibacter 属細菌の占有率がそれぞれ増加したが（ Fig. 5 ）． ま た PERMANOVA 解 析（ Anderson, 2001 ）（ Fig. 2A ），これらの細菌種が魚に対する病原性を示すによる類似度検定を行い，β 多様性解析の結果の相違がという報告は見られない．一方で Acidovorax 属に関し有意なものかを検定した（ Table 1 ）．β 多様性解析の結ては 20 ℃に飼育水温を低下させた場合にも占有率がや果を主座標分析により視覚化したものを Fig. 5 に示しや増加していることから（ Fig. 2A ），ゼブラフィッシュ

た．各個体間について OTU を構成するメンバーの有無

においてストレスを与えると表皮において占有率が増加

のみ考慮に入れた Unweighted UniFrac 距離を計算したする細菌種である可能性がある．

場合は，傷の付加や病原菌の暴露によるそれぞれの実験
群の細菌叢の相違は少なかった．一方でそれぞれのY. ruckeri 経皮感染実験における各 OTU の量的変化
20 ℃および 28 ℃で感染実験を行った各実験群の魚のOTU の存在量（リード数）を考慮した Weighted Unifrac

うちの生存個体について，100 リード以上存在する各

露していない群集に分かれた．PERMANOVA 解析の結OTU のリード当たりの存在量を個体ごとにヒートマッ

果，Unweighted Unifrac 解析による β 多様性比較では傷距離を計算した場合は，病原菌を暴露したグループと暴プで示し，各 OTU の存在パターンによりクラスタリンの有無による各個体の群集性は低く（pseudo-F 値 1.38 ），グした．その結果，20 ℃と 28 ℃の実験群に属する個体

傷の有無により形成された各個体群集間での優位な差ははそれぞれ別のクラスターに分離した（ Fig. 3）．20 ℃で見られなかった．一方で病原菌暴露の有無では弱いなが存在量が多い OTU に関して 20 ℃で大きく占有率が上昇

ら 条 件 の 違 い に よ る 群 集 形 成 が み ら れ（ pseudo-F 値

した主要細菌群（ Fig. 2B）のほか病原性細菌や寄生性細2.70 ），それらの群集間多様性に優位な差がみられた（ P

菌をふくむ OTU が増加している傾向がみられた（ Fig. 3）．

値 < 0.04 ）．一方で，Weighted Unifrac 解析を用いた β 多

主 な OTU と し て は Rickettsiales 目 Cytophagaceae 科様性比較では，傷の有無により各個体の群集性がみられ

Aeromonas 属( Janda & Abbott, 2010)，Chryseobacterium
属( Zamora et al., 2012)，Flavobacterium 属( Loch &（ pseudo-F 値 3.45 ），傷の有無により形成された各個体

Faisal, 2015)，Janthinobacterium 属( Austin et al., 1992)，

さらに病原菌暴露の有無ではより顕著な群集形成がみら

Stenotrophomonas 属( Abraham et al., 2016 ），Yersinia 属れ（ pseudo-F 値 3.88 ），群集間で多様性に優位な差がみ( Kumar et al., 2015)，Acinetobacter johnsonii( Kozińska

群集間で多様性に優位な差がみられた（ P 値 < 0.03 ）．

ら れ た（ P 値 < 0.02 ）（ Table 1 ）． こ れ ら の 結 果 か ら，

et al., 2014 )が み ら れ，Stenotrophomonas 属 と A. john-

20 ℃における傷の付加および病原菌の暴露について，

sonii 以外は 20 ℃での飼育により増加していた（ Fig. 3 ）．
28 ℃と 20 ℃のそれぞれの実験群において，傷の付加

どちらも細菌叢の構成全体に影響を与えていること，傷や病原菌暴露といったストレスを与えた実験群と温度変与える影響が大きいこと，その影響は構成メンバーへの化以外には何もストレスを与えなかったコントロールの影響といった定性的なものよりも，メンバーの量的な変実 験 群 を 比 較 し た 場 合 の 各 OTU の 存 在 量 の 変 化 を化への影響が大きいということが示唆された．

の付加よりも病原菌の暴露の方が，表皮細菌叢の構成に

volcano プロットによって表示した（ Fig. 4 ）．その結果，先に述べたように魚の免疫機能は水温に影響される．

28 ℃での感染実験群では有意に増加，減少の傾向を示

20 ℃では病原性細菌や寄生性細菌を含む OTU の増加がす OTU が同時にみられたのに対し，20 ℃では病原菌暴露みられたが（ Fig. 3 ），20 ℃という水温はゼブラフィッ

や傷の付加により特定の OTU の存在量が有意に減少する

シュにとっての至適温度である 28 ℃から大きく外れる

傾向を示した．傷の付加により，有意に増加している 3

為，免疫機能の低下がおこり，日和見感染している病原つ の OTU は A. johnsonii, Pseudomonas 属 Zoogloea 属 で性細菌や寄生性細菌を含む OTU の増加がみられたのであった．一方，病原菌暴露および傷の付加により有意にはないかと推定される．

減少している OTU は Cytophagaceae 科，Methylobacteriacea

20 ℃では傷の付加や病原菌の暴露によって細菌叢の科，Neisseriaceae 科，Rhizobiaceae 科，Burkholderia 属，

量的な減少を伴う変化が主にみられたが，28 ℃では細− 38 −

魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討

Fig. 3− 39 −

Clustered heatmap of individual fish skin bacterial
floras in infection experiments at 28℃ and 20℃.
The relative abundances of the identified OTUs
(over 100 reads) in individual fish skin samples
were shown by heatmap. Samples were clusteredby the pattern of OTU abundance in each samples
and taxonomy. Dashed frame border represents
sample clusters formed by difference of watertemperature. Circles represent the main groups of
OTUs at each water temperature. OTUs withframe border represent the genera that possibly
include fish pathogen or parasitic bacteria.

堀

克

敏

菌 量 の 増 加 と 減 少 が 共 に み ら れ た（ Fig. 4 ）． こ れ は20 ℃で形成されている細菌叢は 28 ℃のものとは質的に変化しており，傷の付加や Y. ruckeri の暴露によって，細菌叢の構成メンバーが生育阻害を受けやすくなっている可能性を示している．細菌量の減少により空いた場所には Y. ruckeri がバイオフィルムを形成する可能性が考えられる．一方で，水温低下と共に傷を与えなければ Y.
ruckeri の表皮占有率の上昇および斃死に至らないことから，傷の付加と同時に病原菌を暴露したことにより，
よ り 大 き な 表 皮 細 菌 叢 の 変 化 が 起 き， 付 着 し た Y.
ruckeri の表皮上での増殖が促されたのではないかと推測される．また，傷をつけた場合には A. johnsonii のよ
うな魚類にとって病原性を示す可能性がある細菌が増加していたことから，傷の付加は一部の病原性細菌の増殖を促す可能性がある．本研究では 20 ℃で傷を付加した
後に，病原菌を暴露した個体はほとんどが斃死したため，傷の付加と病原菌暴露による相加的・相乗的な細菌叢への影響は解析できなかったが，唯一生き残った個体の細Table 1PERMANOVA analysis for β-diversity.

Fig. 4

Volcano plot showing the degree of differential abundanceof bacteria on the fish skin in infection experiments at
28℃ and 20℃. Log2-transformed fold change in abundance against control group (Injur y−, Y. ruckeri −) isplotted on the x-axis and log10-transformed false discovery
rate-adjusted p-values plotted on the y-axis. The dashedhorizontal line represents the 0.1 p-value cutoff.

Fig. 5

Principal coordinate analysis (PCoA) of beta diversity of fish skin bacterial floras in infection experiments at 20℃. Unweighted orweighted UniFrac distances were analyzed among the samples from alive fish at 20℃ and plotted by PCoA. Dashed circle
represents the group of samples from the fish challenged with Y. ruckeri.

− 40 −

魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討

菌叢の構成や他の斃死個体の細菌叢の構成（ Fig. 2A ）占有について，表皮細菌叢との関係を調べるために，抗から推測すると，主要細菌叢間の存在比には変化がない

生物質処理により細菌叢を破壊したゼブラフィッシュに傾向がみられることから，主要細菌叢以外の変化が引きついて Y. ruckeri の感染実験を行った．20 ℃で抗生物質

金になり，Y. ruckeri の表皮占有が引き起こされたので処理に供した魚は感染群，非感染群ともにほとんど斃死はないかと思われる．

しなかった（ Fig. 6A ）．これらの魚の表皮細菌叢を解析

これらのことから，20 ℃に水温を変化させることで，したところ，20 ℃で抗生物質を 24 時間投与したのち，表皮細菌叢が変化し，それによって細菌叢が質的に変化

水を入れ替え飼育を継続した魚の細菌叢は処理をせずにすることで，表皮細菌叢の Y. ruckeri に対する抵抗性が飼育した魚（ Fig. 2A ）と比較して異なる構成を示した

低下したことに加え，低温と傷の付加によってゼブラ（ Fig. 6B ）．このことは，抗生物質処理により細菌叢がフィッシュ個体の免疫力低下したことにより，病原菌に破壊され，再構成されたことを示唆している．さらに，対する感受性が増したのではないかと推測される．

抗生物質処理後に Y. ruckeri を暴露した場合，Y. ruckeriの表皮占有がみられた（ Fig. 6B ）．

Y. ruckeri の表皮占有における表皮細菌叢破壊の影響
20 ℃における経皮感染で観察された Y. ruckeri の表皮

Fig. 6

Fig. 1 の感染実験では斃死した魚を中心に Y. ruckeri の表皮占有が観察されたが，今回の実験条件では斃死してInfection experiments with zebrafish treated with antibiotics. (A) The skin bacterial flora was destroyed by
antibiotics treatment, and then the number of survival fish was counted for 7 days after the challenge of Y.
ruckeri. Non-infection group (without pathogen) and infection group (with pathogen) were compared. (B)The stacked bar chart showing abundance of OTU (top 50) in antibiotics-treated fish skin samples at a
genus level. The samples were grouped by the status of the pathogen challenge (Y. ruckeri + or −).

− 41 −堀克

敏いない魚でも表皮に Y. ruckeri が多く見られた．このことから，Y. ruckeri による表皮の占有は表皮細菌叢を破壊することで魚の生死に関係なく起こることが示された．
このことから，表皮細菌叢の構成の変化は Y. ruckeri の表皮付着を左右することが示唆された．魚類のウイルスの感染について，表皮細菌叢の破壊が感染を引き起こすという報告例があるが（ Reid et al., 2017 ），細菌の経皮感染についても表皮細菌叢の構成が重要な要因となることが示唆された．
養殖魚における表皮細菌叢の変遷
ゼブラフィッシュでは Y. ruckeri の経皮感染が成立す
る 20 ℃と成立しない 28 ℃で細菌叢の構成が異なっていた．また，20 ℃では病原菌の暴露により表皮細菌叢の量的な変化が観察された．このようなストレスによる表皮細菌叢の変動は Y. ruckeri の感染を左右する可能性が高いが，実験条件とは異なり，特別なストレスを与える
状態ではない養殖の現場でも生育環境の変化により表皮細菌叢の構成が変動しているのかは不明である．そこで，Fig. 7

Y. ruckeri に自然感染することが知られているニジマス
について，生育段階と飼育水の条件が異なる魚から表皮細菌叢を採取し解析を行った．ニジマスの成魚の表皮細菌叢の菌叢解析の結果，合計 77586 リードのシーケンス
データから 2752 の OTU に分類された．実験室環境で飼育しているゼブラフィッシュ表皮細菌叢とは異なり多様な種からなる細菌叢が観察された．主な細菌種は，Massilia

Analysis of the skin bacterial floras of rainbow trout froma fish farm. Skin bacterial flora of rainbow trout wascollected from the 1 year 8 monthes (1y8m) and 8monthes (8m) old fishes, and the composition was
analyzed by NGS. The abundance of the major skinbacteria was compared between 1 year 8 months and 8months fishes by a stacked area chart. Closed and open
triangles represent the bacteria that abundantly exist on
8 months or 1 year 8 months old fish, respectively.

属( 17％)，Sphingomonas 属( 10％)，Deinococcus 属( 7％)，Flavobacterium 属( 3％)，Gemmatirosa 属( 3％)，報告もあり（ Minniti et al., 2017 ），同じ養殖場の池の違

Roseomonas 属( 3％)，Tychonema 属( 3％)，Hymenobacter
属( 2 ％)，Aliterella 属( 2％)であった（ Fig. 7 ）．同じ養いや，生育段階の違いといったより狭いレベルでも，表殖場から採取した 8 か月齢と 1 年 2 か月齢のニジマスのが変化すれば Y. ruckeri のような病原性細菌に対する感

表皮細菌叢では Massilia 属，Tychonema 属，Spirosoma 属，受性も同時に養殖の各段階で変化している可能性がある．

皮細菌叢は影響を受けるものと考えられる．表皮細菌叢

Scytonema 属，Cutibacterium 属，Calothrix 属などが生育段階で異なる占有率を示していた（ Fig. 7 ）．同一の養要殖場の異なる月齢（ 1 年 2 か月齢と 8 か月齢）のニジマ

約スおよびその飼育水の細菌叢について，リード数が 100

水産養殖の生産性の向上のために魚病対策の重要性が以上の OTU に関してヒートマップを作製したところ，増している．本研究では適応範囲が広く簡便な魚病対策

それぞれが異なるプロファイルを示した（ Fig. 8 ）．まの新手法として「魚類表皮版プロバイオティクス」を掲た 8 か月齢の魚の表皮細菌叢の一部は飼育水の細菌叢のげ，その実現可能性を探ることを目的とした．

影響を受けていることが示唆された（ Fig. 8 ）．これら

ゼブラフィッシュをモデル魚類とし，温度変化と傷にのことから，魚の生育段階や，養殖池の水の違いによりよるストレスや，抗生物質の投与による表皮細菌叢の破養殖場のニジマス表皮細菌叢が容易に変化することが示壊を行った後，病原菌（ Yersinia ruckeri ）を暴露し，経唆された．遺伝的に隔絶された環境に生育するサーモン

皮感染が進行するか観察した．また，その際の表皮細菌の個体群間では表皮細菌叢が異なることが報告されてい叢の変化を次世代シーケンサー（ NGS）による 16S rDNA

るが（ Uren Webster et al., 2018 ），養殖魚の表皮細菌叢

アンプリコンの網羅的シーケンスによって解析した．

についての関連する報告として，輸送や網による捕獲と感染実験において，飼育水温を 20 ℃に下げ，さらにいった魚の取り扱いによっても細菌叢が変化するという表皮に傷をつけた後，病原菌を暴露したところ，斃死す− 42 −

魚類体表微生物叢の網羅的解析と感染予防効果の検討

Fig. 8Clustered heatmap of the skin bacterial flora of rainbow trout and their breeding water.
The relative abundances of the identified OTUs (over 100 reads) in individual fish skin samples andbreeding water were shown by heatmap. Samples were clustered by the pattern of OTU abundance andtaxonomy. Solid frame border represents specific bacteria that exist in 1-year 2-moth or 8-month old fish.
Dashed frame border represents OTUs that exist both 8-month old fish and its breeding water.

− 43 −

堀克

敏る個体が観察された．斃死個体と生存個体の表皮細菌叢

Marine Biotechnology Conference and the 12th Asiaを比較したところ，斃死個体の表皮細菌叢は病原菌に占

Pacific Marine Biotechnology Conference,

有されていることが明らかとなった．このことから，病Sep.9-13, Shizuoka, Japan

原菌が表皮に付着し，感染したことが示唆された．この保存機関に寄託した菌株

時 の 表 皮 細 菌 叢 と 病 原 菌 感 染 の 関 係 を 調 べ る た め，
28 ℃と 20 ℃の表皮細菌叢を比較した．その結果，20 ℃
では主要細菌叢の交替と，病原性，寄生性細菌を含む

特願 2019-106436, 発明者:堀 克敏, 出願人:名古屋大学，

OTU の増加がみられた．このことは，飼育水温の低下

発明の名称:「魚類表皮プロバイオティクスに有用な微により，ゼブラフィッシュの免疫系が影響を受けたこと生物」を示唆していた．次に 20 ℃および 28 ℃での各感染条件

Pseudomonas sp. KH-ZF1 株 保存機関 独立行政法人製品
評価技術基盤機構 機関番号 9011005001123

において OTU レベルでの細菌叢の比較を行った．その結果，20 ℃ではコントロール群と比較して，病原菌の謝

暴露や傷の付加によって特定の OTU が減少する傾向がみられた．20 ℃で斃死した条件を除く感染実験の各条

辞件において，傷の付加や病原菌暴露が表皮細菌叢全体に

本研究の遂行にあたり，助成いただきました公益財団

もたらす影響を β 多様性解析によって観測したところ，

法人発酵研究所に深く感謝いたします．本研究の遂行に主として病原菌暴露により細菌叢の量的変化を伴う影響

協力いただいた全国養鱒振興協会会長理事 小堀 彰彦

がもたらされていることが示唆された．表皮細菌叢と病氏，石井養殖 石井 優二 氏，名古屋大学工学研究科 荒川

原菌の感染との関係を調べるために，抗生物質処理によ友子 氏，オスロ大学 Dirk Linke 教授に深く御礼申し上り表皮細菌叢を破壊した個体に病原菌を暴露する感染実げます．

験を行った．抗生物質処理後の病原菌の暴露によりほと

参考文献

んどの魚は生存したが，表皮細菌叢は病原菌に占有されていた．これらの結果から，ゼブラフィッシュ表皮細菌叢が病原菌の表皮への付着を防いでいること，魚に与えたストレスにより表皮細菌叢や魚の免疫系が影響を受け，病原菌に対する感受性が高まることが示唆された．
さらに，養殖場での表皮細菌叢の変遷を観察するために，
Y. ruckeri に自然感染することが知られているニジマスの表皮細菌叢を解析した．その結果，同じ養殖場内で飼育されている個体間でも飼育水や生育段階により表皮細菌叢は変化していた．これらのことから，養殖魚についても養殖の過程での表皮細菌叢の変化が Y. ruckeri の感
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− 45 −

IFO Res.Commun. 33
47-56, 2019

酸素発生型光合成により駆動する嫌気発酵プロセス
得

平

茂

樹

首都大学東京大学院理工学研究科〒192-0397 東京都八王子市南大沢1-1

Anaerobic fermentation driven by oxygen-evolving photosynthesis
Shigeki Ehira
Graduate School of Science and Technology, Tokyo Metropolitan University
1-1 Minami-Osawa, Hachioji, Tokyo 192-0397, Japan
Cyanobacteria, which carry out oxygen-evolving photosynthesis, have attracted attention as hosts for the direct
production of biofuels and valuable chemicals from CO2 using light energy. Various chemical-producing strains
have been generated by introducing engineered metabolic pathways. However, the introduced metabolic pathways
often include oxygen-sensitive enzymes, which are inactivated by oxygen evolved during photosynthesis.
Anabaena sp. strain PCC 7120 is a filamentous cyanobacterium that forms differentiated cells called heterocystswith a semi-regular spacing of 10 to 15 cells along filaments. Heterocysts are specialized for nitrogen fixation, andtheir intracellular environment is maintained micro-oxic to protect oxygen-sensitive nitrogenase, an enzyme fornitrogen fixation. This study aimed to utilize the heterocyst as a host for the production of chemicals with oxygensensitive enzymes under photosynthetic conditions. A genetically engineered strain, expressing within heterocysts
the 1-butanol synthetic pathway that includes a highly oxygen-sensitive Bcd/EtfAB complex from the anaerobe
Clostridium acetobutylicum, was generated. In this strain, 1-butanol production was concomitant with oxygenevolving photosynthesis. This study proved the usefulness of heterocysts as a cell factory for anaerobic production
from carbohydrate provided by photosynthesis in vegetative cells.
Key words: cyanobacteria, anaerobic fermentation, photosynthesis, butanol, heterocyst緒

言て 2,3 −ブタンジオール（ Oliver et al., 2013; Savakis et al.,2013 ）などの様々なアルコールを生産する株が作製さ微細藻類による化学品や燃料の生産は，光合成によりれている．しかし，その生産性は低く，商業生産のため

CO2 を原料として物質生産を行うことができるため，に は 生 産 性 の 更 な る 向 上 が 不 可 欠 で あ る（ Case &CO2 排出削減に大きく貢献すると期待されている．微細Atsumi, 2016 ）．生産性が低い原因の一つとして，光合藻類の中でも原核生物であるシアノバクテリアは，遺伝

成条件下での糖異化活性が低い点が挙げられる．多くの子操作が容易であり，また細胞構造も単純であるため，物質の発酵生産の基質としてピルビン酸やアセチル CoA

代謝工学の宿主として広く利用されている．シアノバクが用いられるが，その供給が制限されている（ Hirokawa

テリアに新規代謝経路が導入され，燃料や化学品の原料

et al., 2015 ）．単細胞性シアノバクテリア Synechococcus

として利用可能な様々な物質を生産する株が作り出されている（ Angermayr et al., 2015 ）．これまでにシアノバ

elongatus PCC 7942 では，アセチル CoA とアセチルリン酸との変換を触媒するリン酸アセチルトランスフェラー

クテリアの代謝工学により，エタノール（ Dexter & Fu,

ゼをコードする pta 遺伝子を導入することで，光合成条

2009 ），イソプロパノール（ Kusakabe et al., 2013 ），1 −件下でのイソプロパノール生産が可能となっている

ブタノール（Lan & Liao, 2011 ），イソブタノール（Atsumi（ Hirokawa et al., 2017 ）．

et al., 2009 ），2 −メチル − 1 − ブタノール（ Shen & Liao,2012 ），1,2 −プロパンジオール（ Li & Liao, 2013 ），そしつの要因は，光合成の副産物として必然的に発生する酸

シアノバクテリアにおける生産性向上を妨げるもう一素である．酸素は，金属を補因子として持つ酵素を始め

E-mail: ehira@tmu.ac.jp

として，非常に多くの酵素を失活させてしまう．発酵は，− 47 −

得

平

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樹

通常酸素が存在しない条件下で行われる反応であるた

いては糖異化活性を高めるために糖異化酵素の発現が増め，その反応には酸素感受性酵素が多く含まれる．実際，加する（ Winkenbach & Wolk, 1973 ）．嫌気的な細胞内偏性嫌気性細菌 Clostridium acetobutylicum の 1 −ブタノー

環境に加え，高い糖異化活性を持つヘテロシストは，発ル合成経路には酸素感受性酵素が含まれるため，この経

酵による物質生産を行わせる細胞として多くの利点を備路を導入した S. elongatus PCC 7942 では，酸素発生を停えている．実際，ヘテロシストにおいてエタノールを生止させた上でさらに嫌気状態にしないと 1 −ブタノール産させるためにピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水の生産が起こらない（ Lan & Liao, 2011 ）．一方で，酸素素酵素を発現させると，一細胞当たりのエタノール生産

感受性酵素を同じ反応を触媒する酸素耐性のある酵素に量は，単細胞性シアノバクテリアの生産量のおよそ 3 倍置き換えることで，酸素による生産阻害を回避することに達することが示されている（ Ehira et al., 2018 ）．

ができる（ Lan et al., 2013 ）．このように酸素を発生す

本研究では，アナベナの分化細胞ヘテロシストを物質る光合成と酸素感受性酵素による発酵をいかに両立させ生産細胞として利用することで，酸素感受性酵素によるるかが，シアノバクテリアを始めとする微細藻類による発酵生産と光合成を同時に行わせることが可能であるか

物質生産の課題の一つとなっている．

を検証した．C. acetobutylicum がもつ 1 -ブタノール合成

シアノバクテリアは，酸素発生と酸素感受性酵素の問経路をヘテロシストにおいて発現させたところ，光合成

題を解決する手段をもともと備えている．多くのシアノ条件下で 1 -ブタノールが生産されることが示された．

バクテリアは窒素固定を行うことができるが，窒素固定

さらにヘテロシスト特異的な遺伝子発現抑制システムを

反応を触媒する酵素ニトロゲナーゼは酸素に非常に弱い構築し，ヘテロシストの代謝改変により生産性を向上さ酵素である．シアノバクテリアは窒素固定を光合成から
時間的，あるいは空間的に分離することでこの二つの反応を両立させている．多くのシアノバクテリアは，光を必要とする光合成を昼間に行い，光合成を行うことができない夜に窒素固定を行っている（ Grobbelaar et al.,1986 ）．一方，一部の糸状性シアノバクテリアは，光合成と窒素固定を空間的に分離することで，昼間に同時にこ の 二 つ の 反 応 を 行 う こ と を 可 能 に し て い る．
Anabaena sp. strain PCC 7120（以下，アナベナ）などの糸状性シアノバクテリアは，数百の栄養細胞が一列につながった糸状体を形成する（ Fig. 1A ）．窒素化合物が培地中に存在するとアナベナの糸状体は栄養細胞のみから構成されているが，窒素化合物が無くなるとヘテロシス
トと呼ばれる細胞がおよそ 10 ～ 15 細胞おきに 1 個の割合で形成される（ Flores & Herrero, 2010 ）．ヘテロシス
トは，窒素固定のみを行う分化細胞である．酸素感受性のニトロゲナーゼを酸素から保護するために，ヘテロシ
スト内は嫌気的な環境に保たれている．酸素を発生する
光合成が停止しているだけでなく，多糖と糖脂質からなる 2 層の外膜を細胞壁の外側に形成し，細胞外からの酸素の流入を防いでいる．さらに，酸素呼吸を活性化する
ことで細胞内の酸素濃度を 600 nM にまで低下させている（ Tomitani et al., 2006 ）．ヘテロシストは光合成を行Fig. 1

うことができないため，窒素固定に必要なエネルギーを隣接した栄養細胞に依存している．栄養細胞が光合成により作り出した糖を主にスクロースとして受け取り，その異化により窒素固定に必要な ATP と還元力を得ている（Cumino et al., 2007; Nurnberg et al., 2015 ）（Fig. 1B ）．
1 分子の N2 を 2 分子の NH4+に還元するためには 16 分子の ATP と 8 個の電子が必要であり，ヘテロシストにお− 48 −

A. The filamentous cyanobacterium Anabaena sp. strain
PCC 7120 grown in the absence of combined nitrogen.
Heterocysts are indicated by arrowheads. B. Centralcarbon metabolic pathways in vegetative cells andheterocysts. Vegetative cells synthesize sucrose fromCO2 by the Calvin cycle of photosynthesis and provide it
for heterocysts. In the heterocysts, sucrose is catabolized
through the oxidative pentose phosphate pathway (OPP)and glycolysis to produce ATP and reductants required
for nitrogen fixation.

酸素発生型光合成により駆動する嫌気発酵プロセス

せることにも成功した．本研究の成果は，ヘテロシストの物質生産細胞としての可能性を提示するものである．

1 ％ CO2 を含む空気を通気しながら 30 ℃で培養した．

必要な時には，スペクチノマイシンとストレプトマイシ
ンをそれぞれ 2 µg/ml ずつ培地に添加した．1 − ブタノー

実験方法

ルおよびエタノールを生産させるときには，OD750 がお

よそ 1 になるまで培養した対数増殖期後期の細胞を集菌使用したアナベナ株と培養条件
アナベナ株の培養には，20 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)を添加した BG-11 培地を用いた（ Rippka et al., 1979 ）．
30 ～ 35 µmol photons/m /s の白色光連続照射条件で，-2-1

Table 1

し，窒素源を含まない BG-11 培地（ BG-110 ）で 2 回洗浄後，OD750 が 0.2 になるように BG-110 に懸濁し，ヘテ
ロシスト形成の誘導およびアルコール生産を開始させた．本研究で使用した株を Table 1 に示す．

Strains and plasmids used in this study− 49 −

得平

プラスミドの構築およびアナベナの形質転換茂樹

析 に 用 い た． ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 解 析 は Higo et al.

全てのプラスミドは hot fusion 法により作製した（ Fu（ 2018a ）の方法に従って行った．GlnA の定量は ImageJ

et al., 2014 ）．プロモーター領域，リボスイッチそして各遺伝子のコード領域を含む DNA 断片を PCR により増（ National Institutes of Health ）を用いて行い，Studentの t 検定により有意差（ p ≤ 0.05 ）を検定した．

幅 し， ゲ ノ ム 組 み 込 み 用 ベ ク タ ー pSU102-cyaA の結

BamHI と KpnI サイトの間にクローニングした（ Table
1 ）．クローニングした DNA 断片は全て，シークエンシ

果ングにより配列を確認した．ldh 遺伝子破壊用プラスミ

1 − ブタノール合成経路の構築

ド pBU11 は，ldh の上流領域，nptII，および ldh の下流
領域を PCR で増幅し，アナベナ遺伝子破壊用プラスミ

C. acetobutylicum では，アセトアセチル CoA から 4 個の 酵 素 の 働 き に よ り 1− ブ タ ノ ー ル が 合 成 さ れ る

ド pRL271（ Cai & Wolk, 1990 ）の PstI サイトにクロー（ Fig. 2A ）．これらの酵素をコードする遺伝子 crt，bcd，

ニングすることで作製した．
アナベナは，大腸菌の接合により形質転換した（ Elhai

etfBA ，hbd そして adhE2 を一つのオペロンとして，アナベナに導入した（ Fig. 2B ）．ブタノール合成経路をヘ& Wolk, 1988 ）．sacB 遺伝子の組換えによりスクロース

テロシストでのみ発現させるために，ヘテロシスト特異感受性になった株から，スクロース耐性株を選抜するこ的な発現誘導系を利用した（ Higo et al., 2018 ）．ヘテロとで二点交叉株を得た（ Cai & Wolk, 1990 ）．全てのゲシスト特異的なプロモーターである nifB プロモーター

ノムコピーで目的の組換えが起こっていることは，PCRから，ブタノール合成オペロンを発現させた（ Wang &により確認した．

Xu, 2005 ）．プロモーターとオペロンの間には，テオフィ
リン応答性のリボスイッチが挿入されており，テオフィ

1 − ブタノールとエタノールの定量

リン非存在下では ρ（ Rho ）非依存的ターミネーターが1 − ブタノールを生産させている培養液を取り，21,500形成されることで転写が終結するため，ブタノール合成

×g で 5 分間の遠心分離により細胞を沈殿させた．99 µl

オペロンは転写されない（ Ma et al., 2014 ）．テオフィリの上清を取り，内部標準として 1 µl の 0.1 ％ (v/v) 2 − ブ

ン存在下では，テオフィリンが mRNA と結合すること

タノールと混ぜた．1 − ブタノールの定量は，水素炎イ

でターミネーター構造が壊れ，ブタノール合成オペロン

オン化型検出器と Gaskuropack 54 60/80 を充填したスが発現する．さらにブタノール合成オペロンと同時に，

テンレスカラム（長さ 2 m，直径 3 mm ）を装備したガブタノール合成の出発物質となるアセトアセチル CoA

スクロマトグラフ（ GC-2014；島津製作所）を用いて行っを マ ロ ニ ル CoA と ア セ チ ル CoA か ら 合 成 す る 酵 素

た． カ ラ ム 温 度 は 190 ℃， 注 入 口 と 検 出 器 の 温 度 は

NphT7 を 導 入 し た（ Okamura et al., 2010 ）（ Fig. 2A ）．

240 ℃に保った．
エ タ ノ ー ル の 定 量 に お い て は， 遠 心 分 離 後 の上清nphT7 はヘテロシスト特異的プロモーターである coxBII
プロモーターから発現し（ Jones & Haselkorn, 2002 ），500 µl に内部標準として 1 mg/ml の 2 − プロパノールを

その転写は 2 -アミノプリン（ 2-AP ）応答性リボスイッ

50 µl 加えた．混合液を 1.5 ml のバイアル瓶に移し，密栓

チによる制御を受ける（ Fig. 2B ）．これら二つの遺伝子した状態で 60 ℃に 20 分間静置した．ヘッドスペースのユニットをもつプラスミド pBU1 をアナベナゲノム中のエタノール濃度を上記のガスクロマトグラフで定量しcyaA 遺伝子内にある中立領域に挿入し（ Katayama &Ohmori, 1997 ），ブタノール生産株 BU1 を作製した．

た． カ ラ ム 温 度 は 140 ℃， 注 入 口 と 検 出 器 の 温 度 は
180 ℃に保った．

ヘテロシストにおける 1 − ブタノール生産
ヘテロシストの単離とウエスタンブロット解析

上記で作製したアナベナ株 BU1 が 1 − ブタノールを生糸状体からのヘテロシストの単離は，Golden et al.

産することができるかを検証した．まず，窒素源を含む（ 1991 ）の方法に従って行った．単離前の糸状体および培地で培養した BU1 を窒素源を含まない培地に移し，単離したヘテロシストを遠心分離により集め，400 µl のヘテロシスト形成を誘導した．ヘテロシスト分化が完了

抽 出 緩 衝 液（ 25 mM HEPES − NaOH（ pH 7.5 ），1 mMする分化誘導後 24 時間で，ブタノール合成経路の発現

EDTA，5 mM 2 -メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル，1× proteaseを誘導するためにテオフィリンと 2-AP を添加した．そinhibitor cocktail (Roche) ）に懸濁した．菌体を Bulletの後，常に光を照射している条件下で 10 日間培養を続

Blender（Next Advance ）を用いてステンレスビーズ（直けたところ，BU1 は 1.14 mg/l の 1 − ブタノールを生産し

径 0.2 mm ）で破砕後，遠心分離により細胞残渣とステた（ Fig. 3A ）．一方，テオフィリンと 2-AP を加えなかっンレスビーズを沈殿させ，上清をウエスタンブロット解た場合には，1 − ブタノールは生産されなかった．Bcd/− 50 −

酸素発生型光合成により駆動する嫌気発酵プロセス

Fig. 2The metabolic pathway for 1-butanol production in heterocysts of engineered Anabaena. A. Vegetative cells fix CO2 by photosynthesis and provide fixed carbon for heterocysts in the form of sucrose. In heterocysts, 1-butnol is produced from sucrose via pyruvate. PDH, pyruvate dehydrogenase; AccABCD, acetyl-CoA carboxylase; NphT7, Acetoacetyl-CoA synthase; Hbd, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase; Crt, crotonase; Bcd/EtfAB, butyryl-CoA dehydrogenase/electron transferring flavoprotein complex; Ter,trans-2-enoyl-CoA reductase; AdhE2, bifunctional aldehyde/alcohol dehydrogenase; LDH, lactate dehydrogenase. B. The schematic representation of artificial operons for butanol synthetic pathways introduced into Anabaena. Bcd/EtfAB complex or Ter
was used as an enzyme that convert crotonyl-CoA to butyryl-CoA in strain BU1 or BU2, respectively.

EtfAB 複合体と AdhE2 は，酸素感受性酵素であると言わ れ て い る（ Inui et al., 2008; Atsumi et al., 2008 ）．E.
coli や Bacillus subtilis のような酸素呼吸を行う細菌においても，1 − ブタノールの生産性は好気的条件下よりも嫌気的条件下での方が高い（ Atsumi et al., 2008; Nielsen
et al., 2009 ）．今回，これらの酵素を嫌気的な細胞内環境をもつヘテロシストで発現させることで，酸素発生型
光合成と酸素感受性のブタノール生産を同時に行わせることができることが示された．
フェレドキシン非依存型酵素 Ter の利用による生産性向上
Bcd/EtfAB 複合体はクロトニル CoA をブチリル CoAに変換する際，電子受容体として酸化型のフェレドキシ

Fig. 3ンを必要とする．フェレドキシンに対する選択性がある
ため，異種の宿主細胞では機能が制限されることが知ら
れ て い る（ Li et al., 2008; Lan & Liao, 2011 ）． そ こ で，
Bcd/EtfAB 複合体を同じ反応を触媒するトランス − 2 −エノイル CoA 還元酵素（ Ter ）に置き換えるため，bcd− 51 −

1-Butanol production by genetically engineered Anabaena.
A. 1-Butanol production by BU1 and BU2 under nitrogen-fixing conditions. 1-Butanol concentration wasmeasured 10 days after induction of the butanol synthetic
pathway by the addition of theophylline and 2-aminopurine (2-AP). B. Time course analysis of 1-butanol production by BU2 in the presence of 1 mM theophylline and
0.1 mM 2-AP.

得

平

茂

樹

と etfBA を Treponema denticola 由来の ter に置き換えたの生成量が増加したとともに，Hbd や Ter が必要とする

株 BU2 を作製した（ Fig. 2B ）（ Lan & Liao, 2011 ）．Ter

NADH の消費が抑えられたことが生産量の増加につなは補因子として NADH のみを必要とする酵素である

がったと考えられる．

（ Fig. 2A ）．BU2 における 1 − ブタノール生産性を評価したところ，生産開始後 5 日目までは直線的に濃度が増加

ヘテロシスト特異的代謝改変による生産性向上

した（ Fig. 3B ）．その後，生産速度は低下したが 15 日

BU11 のようにゲノムから標的遺伝子を削除する遺伝目まで 1 − ブタノール濃度は上昇を続けた．生産 10 日目

子欠失株では，その影響はヘテロシストに限らず栄養細における生産量は，2.17 mg/l であり，BU1 のおよそ 2胞にも及ぶ．そのため，栄養細胞の機能に必須の遺伝子

倍のブタノールを生産した（ Fig. 3A ）．ヘテロシストにを不活性化することはできない．ヘテロシストのみで遺おいては Bcd/EtfAB 複合体が機能することができるが，伝子機能を抑制することができれば，栄養細胞の光合成

その活性は 1 − ブタノール生産の律速となっており，Ter活性を維持したまま，より物質生産に適した代謝経路をに置き換えることで生産性が向上することが示唆された．

も つ 株 を 作 る こ と が で き る． そ こ で 本 研 究 で は，
CRISPR 干 渉 法（ CRISPR interference; CRISPRi ） を 利

ピルビン酸競合経路の不活性化による生産性向上

用してヘテロシスト特異的に遺伝子発現を抑制するシス

BU2 株の 1 − ブタノール生産性をさらに向上させるたテムの開発を行った．

めに，BU2 を親株として乳酸脱水素酵素をコードする

CRISPRi で は， ヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 を 失 っ た Cas9

ldh 遺伝子を破壊した BU11 を作製した（ Fig. 4A ）．乳酸
脱水素酵素は，NADH の酸化にともないピルビン酸か（ dCas9 ）と標的配列に相補的なシングルガイド RNA

ら乳酸を生成する反応を触媒する（Fig. 2A）．1 − ブタノー

制することができる（ Qi et al., 2013 ）．言い換えれば，ルの生産に必要なピルビン酸と NADH を消費するため，

この 2 つの因子が同時に存在しないと機能することがで（ sgRNA ）を発現させることで，標的遺伝子の発現を抑その不活性化は 1 − ブタノール生産性の向上につながる

きない．ヘテロシスト特異的プロモーターから dCas9と期待できる．BU11 における 10 日間までの 1 − ブタノーを発現させることで，ヘテロシストのみで遺伝子発現がル生産性を評価したところ，BU2 に比べて 30％生産性抑制されると期待できる．そこで，nifB プロモーターが向上した（ Fig. 4B ）．乳酸脱水素酵素の不活性化によから dCas9 が発現し，テトラサイクリン誘導性プロモーる生産性向上により，ピルビン酸からのアセチル CoA

ターから sgRNA が発現する株 2e を作製した（ Fig. 5A ）．
さらに，dCas9 の発現タイミングを人為的に制御するためにリボレギュレーターである toehold switch を利用した．このシステムでは dcas9 の上流に挿入した switch
RNA の働きで，リボソームがリボソーム結合サイトに結合することが妨げられている．しかし，trigger RNA
が switch RNA に結合するとリボソームが結合サイトに結合できるようになるため，翻訳が活性化される．本シ
ステムでは trigger RNA はテトラサイクリン誘導性プロモーターから発現するようにデザインされており，テト
ラサイクリン存在下でのみ dCas9 の翻訳が起こる（Higoet al., 2018 ）．ネガティブコントロールとして，sgRNAが発現しない株 2c も作製した（ Table 1 ）．sgRNA の標的遺伝子としては，ヘテロシストにおいて高発現する
glnA を用いた．glnA はグルタミン合成酵素をコードしており，窒素同化に必須の遺伝子である．そのため，シ
アノバクテリアでは glnA を不活性化することはできな
い．2e における GlnA の発現は，栄養細胞ではテトラサ

Fig. 4

1-Butanol production by ldh-disrupted strain BU11. A. ldh
was inactivated by replacing with neomycin-resistantcassette in BU2 to construct BU11. Disruption of ldh in
BU11 was confirmed by PCR using the primer pair F andR. B. 1-Butanol concentration was measured 10 days
after induction of the butanol synthetic pathway.

イクリン存在下でも変化しなかったが，ヘテロシストではテトラサイクリンにより減少した（Fig. 5B, C ）．また，
2c ではテトラサイクリンの添加は GlnA の発現に影響しなかった．以上の結果から，2e ではテトラサイクリン
で dCas9 と sgRNA の発現を誘導することで，ヘテロシ− 52 −

酸素発生型光合成により駆動する嫌気発酵プロセス

Fig. 5

Repression of GlnA in heterocysts by CRISPR interference. A. The schematic representation of CRISPR interference system introduced into Anabaena. dcas9 is expressed from the heterocyst-specific promoter PnifB and sgRNA is expressed from the anhydrotetracycline (aTc)-inducible promoter PL03. Switch RNA, which is located upstream of dcas9, inhibits translation of dcas9 by
preventing ribosome from binding to the ribosome-binding site. Trigger RNA, which is also expressed from PL03, is base-pairingwith switch RNA, resulting in derepression of dcas9 translation. Thus, dCas9 is expressed within heterocysts only in the presenceof aTc. B. Repression of GlnA in heterocysts. Heterocysts were enriched 72 h after induction. Total protein was extracted fromwhole filaments (lane w) and enriched heterocysts (lane H), and western blot analyses using anti-GlnA, anti-RbcL, and anti-NifH
antibodies were conducted. RbcL and NifH were used as marker proteins for vegetative cells and heterocysts, respectively. C.
Quantification of GlnA expression levels in whole filaments and heterocysts. The GlnA level of whole filaments of 2c in theabsence of aTc was taken as 100.

スト特異的に遺伝子発現を抑制できることが示された．

下すると窒素同化が抑制され，ヘテロシストではより窒ヘテロシストでは窒素固定で作られたアンモニウムイ

素固定を行うために糖異化活性が上昇すると考えられる

オンが，グルタミン合成酵素により取り込まれることで（ Higo et al. 2016 ）．GlnA の発現抑制により物質生産性

窒素化合物に変換される．そのため，GlnA の発現が低が向上するかを評価するため，2e にエタノール合成プ− 53 −

得

平

茂

樹

ラスミド pET1 を導入した．pET1 は，エタノール合成

テロシストにおいては C. acetobutylicum のフェレドキシ

に必要なピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコール脱ンを発現させることなく，Bcd/EtfAB 複合体が機能し水素酵素をヘテロシスト特異的に発現させるプラスミド

た．アナベナは複数種類のフェレドキシンを持っており，である（Ehira et al. 2018 ）．pET1 をもつ 2e 株のエタノー

ヘテロシストではニトロゲナーゼへの電子供与体としてル生産量は，pET1 をもつ 2c 株と比べ，30 ％増加してい特別なフェレドキシンも発現している（ Magnuson &た（ Fig. 6 ）．

Cardona, 2015 ）．これらのフェレドキシンのいずれかが考

Bcd/EtfAB 複 合 体 と 共 に 機 能 す る と 考 え ら れ る が，察

Bcd/EtfAB 複合体に対して最適なものであるかは定かではない．C. acetobutylicum のフェレドキシンをヘテロ

本研究では，ヘテロシストにおいて C. acetobutylicum

シストで発現させることで，Bcd/EtfAB 複合体を利用の 1 − ブタノール合成経路を発現させることで，光合成した 1 − ブタノールの生産性をさらに向上させることが条件下で 1 − ブタノールの生産が可能であることを示しできる可能性がある．

た．ヘテロシストでは，元々の生産菌が持っている活性

乳酸脱水素酵素の不活性化により，1 − ブタノールのが高く，生産に適した酵素をそのまま利用することがで生産量は増加した．したがって，ピルビン酸の供給量をき，生産性の向上が期待できる．また，これまで酸素発増加させることが，生産性の向上に重要であることが示

生型光合成との両立が不可能であった代謝経路を利用し唆される．ヘテロシストでのエタノール生産においても，た物質生産を実現することも可能である．本研究の成果

スクロース分解酵素や解糖系の酵素，あるいはアラニン

は，ヘテロシストの物質生産細胞としての有用性を示し，脱水素酵素の発現量を増加させピルビン酸の供給量を増

光合成による物質生産の可能性を大きく広げるものである．

やすことで，生産量が増加することが示されている

ヘテロシストにおいては，酸素感受性の Bcd/EtfAB（ Ehira et al. 2018 ）．ヘテロシスト内の代謝を物質生産複合体が機能することが示された．しかし，Bcd/EtfABに最適化していくことで，更なる生産性の向上が期待で複合体を Ter に置き換えることで 1 − ブタノール生産量

きる．本研究では，CRISPRi によるヘテロシスト特異的は 2 倍に増加し，この酵素が生産の律速となっていたこ

な遺伝子発現抑制システムを開発することにも成功しとが示唆された．フェレドキシンを電子受容体として必た．本システムにより，栄養細胞の増殖や生存に必須の要とする Bcd/EtfAB 複合体は，フェレドキシンに対す遺伝子であっても，ヘテロシストのみでその発現を抑制

る選択性のために異種宿主で機能させることが困難ですることが可能となる．実際，増殖に必須のグルタミン

あった（ Li et al., 2008; Lan & Liao, 2011 ）．しかし，ヘ合成酵素の発現をヘテロシストにおいて抑制し，ヘテロ
シスト代謝を活性化することで物質生産量が増加することが示された．本システムを用いて，ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼをコードする必須遺伝子である ppc などの発現をヘテロシスト特異的に抑制することで，増殖に影響を与えることなく，ヘテロシストでのピルビン酸供給量を増加させることが可能となる（ Lu &Coleman, 1990 ）．今後はヘテロシスト代謝をさらに物質生産に最適化した形に作り換え，生産性をさらに向上させ，実用化へとつなげていく．

要

約

酸素発生型光合成を行うシアノバクテリアを利用した
CO2 からの有用物質生産は，化石燃料に依存しない持続可能な社会システムの構築に大きく貢献すると期待されFig. 6

Ethanol production in the GlnA-repressed strain 2e/
pET1. GlnA expression was repressed in heterocysts by
the addition of aTc, and ethanol concentration wasmeasured 48 h after the GlnA repression. The relative
ethanol level in the presence of aTc to that in the absenceof aTc is shown.

ている．これまでに新たな代謝経路を導入することで，様々な有用物質を生産するシアノバクテリアがつくり出されてきた．しかし，嫌気的な代謝酵素系を用いた物質生産では，光合成の副産物として生成される酸素により導入した酵素が失活してしまうため，期待通りの生産性− 54 −

酸素発生型光合成により駆動する嫌気発酵プロセスを示さないことが多く，新たな物質生産系の開発が求められている．
光合成を行う栄養細胞が数百個一列につながる多細胞性シ ア ノ バ ク テリ ア Anabaena sp. strain PCC 7120 は，
ヘテロシストと呼ばれる分化細胞をおよそ 10 細胞ごとに一個の割合で形成する．ヘテロシストは窒素固定に特殊化した細胞であり，酸素に極めて弱い窒素固定酵素ニ
トロゲナーゼを酸素から保護するために，細胞内環境が嫌気的に維持されている．本研究では，ヘテロシストを物質生産細胞として利用することで，光合成を行いながら同時に嫌気発酵による有用物質生産が可能であるかを検証した．
1 − ブタノールはエタノールよりも優れたバイオ燃料と し て 期 待 さ れ て い る． 偏 性 嫌 気 性 細 菌 Clostridium
acetobutylicum は 1 − ブタノールを合成することができる
が，その合成経路には複数の酸素感受性酵素が含まれる．
我々はヘテロシスト特異的なプロモーターを利用して，
C. acetobutylicum のブタノール合成経路を構成する 7 個の遺伝子をヘテロシストにおいて発現する株を構築した．そしてその株を用いて，光合成条件下で効果的にブ

原著論文
1) Ehira, S., Takeuchi, T. & Higo, A. 2018. Spatial separation ofphotosynthesis and ethanol production by cell type-specificmetabolic engineering of filamentous cyanobacteria. Appl.
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2) Higo, A., Isu, A., Fukaya, Y., Ehira, S. & Hisabori, T. 2018a.
Application of CRISPR inter ference for metabolic engineering of the heterocyst-forming multicellular cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. Plant Cell Physiol. 59: 119-127.
3) Higo, A. & Ehira, S. 2019a. Anaerobic butanol production
driven by oxygen-evolving photosynthesis using the heterocyst-forming multicellular cyanobacterium Anabaena sp.
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4) Higo, A. & Ehira, S. 2019b. Spatiotemporal gene repression
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5) Higo, A., Nishiyama, E., Nakamura, K., Hihara, Y. & Ehira, S.
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201: e00244-19.
その他
1) 得平茂樹．2018．餅は餅屋；分化細胞の転職は実現するか？．生物工学96: 656.

タノールを生産させることに成功した．本研究により，謝

ヘテロシストを物質生産細胞として利用することで，酸素発生型光合成と嫌気発酵という相反する反応を同時に辞行わせることができることが示された．シアノバクテリ

本研究を行うにあたり，多大なる助成をいただきましアではこれまで利用することができなかった酸素感受性た公益財団法人発酵研究所に深く感謝申し上げます．ま酵素を利用した物質生産が可能となり，シアノバクテリ

た，本研究実施に大きく尽力していただいた肥後明佳博アによる CO2 からの有用物質生産の可能性が飛躍的に士（現地球環境産業技術研究機構）に感謝いたします．

広がると期待できる．

文

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) 得平茂樹．2017．酸素発生型光合成で駆動する嫌気発酵
プロセス．第8回日本光合成学会年会，5月27 − 28日，滋賀
2) Ehira, S. 2018. Redox regulation of cellular differentiation incyanobacteria. CLS, Tokyo Tech. International Forum 2018,
4 March, Tokyo, Japan3) 肥田真太朗，得平茂樹．2018．シアノバクテリアにおける多様な分化細胞を生み出す分子機構の解明．第12回日本ゲノム微生物学会年会，3月5 − 7日，京都
4) 得平茂樹，肥後明佳，竹内卓人．2018．糸状性シアノバ
クテリアの細胞種特異的代謝工学による嫌気的バイオ燃料生産．第59回日本植物生理学会年会，3月28 − 30日，札幌
5) 大塚夏海，得平茂樹．2018．窒素･炭素代謝のグローバル
レギュレーターNtcAのレドックス制御．第9回日本光合成学会年会，5月26 − 27日，仙台
6) Kurio, Y., Koike, Y., Kanesaki, Y., Yoshikawa, H. & Ehira, S.
2018. DevH is a global regulator of the heterocyst-specificgenes that are upregulated at the later stage of differentiation. 16th Inter national Symposium on Phototrophic
Prokaryotes, 5-10 August, Vancouver, Canada

献

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− 56 −

平成 25 年度寄付講座助成の研究報告
助成期間:平成 25 年 10 月～平成 31 年 3 月

IFO Res.Commun. 33
57-60, 2019

腸内シンビオシスの分子機序解明とその高度応用展開
栗原新

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Elucidation of molecular mechanism of intestinal symbiosis and its advanced application
Shin Kurihara
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, JapanThe aim of this donation course is to elucidate the symbiotic relationship between the host and intestinal bacteria
from a viewpoint of low-molecular-weight compounds produced by the host or gut microbiota. We defined thosecompounds that affect each physiological function across taxonomic boundaries as ＂symbiogenic factors＂.
In this research, we studied on polyamines that are symbiogenic factors delivered from the gut microbiota tohumans, phenethylamine that is a candidate for a novel symbiogenic factor, and human milk oligosaccharides thatare symbiogenic factors delivered from human to the gut microbiota. Furthermore, we report our development of
culture system that is useful to clarify the symbiotic mechanism between the gut microbiota and the host.
Key words: symbiogenic factor, intestinal bacteria, polyamines, phenethylamine, human milk oligosaccharides,
culture system, symbiosis.

第1章

はじめに

(Turnbaugh et al., 2006)
・糖尿病(Suez et al., 2014)
・自閉症(Hsiao et al., 2013 )などの様々な疾病が密接に関連

本寄付講座は，宿主または腸内細菌が産生する低分子

していることが明らかとなった．この結果，腸内常在菌化合物で，分類学上の界を越えてお互いの生理機能に影叢は「もう一つの臓器」とも呼ばれ始め，その適切な制響を与える因子を「シンビオジェニック因子」と定義

御は人類の健康寿命延伸に最も重要な課題の一つである（ Fig. 1 ）し，この定義にあてはまる化合物を軸としてと考えられている．
腸内常在菌の菌体そのものは大腸の免疫機構に阻まれ宿主と腸内細菌の共生関係を明らかすることを目的として，ごく一部しかヒト組織に接触できない．対照的に，て設立された．
ヒトはその腸管内に重量にして 1 kg，細胞数にしてヒ腸内常在菌により産生される低分子化合物（腸内常在菌

ト細胞とほぼ同数の腸内細菌を有している．ヒト一人のが産生するシンビオジェニック因子）は，腸管上皮を通腸管に存在する腸内細菌種は 150 以上であり，これらの過して体内に取り込まれ，宿主健康に対してより直接的

混合物は「腸内細菌叢」と呼ばれている．近年，爆発的な影響を与える．一方で，宿主はその免疫機構のほかに，に進化した核酸の解析技術により，腸内常在菌叢と肥満

様々な低分子化合物（宿主が産生するシンビオジェニック因子）を用いて「もう一つの臓器」である腸内常在菌

E-mail:栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属:近畿大学生
物理工学部 〒 649-6433 和歌山県紀の川市西三谷930 ）教員
阪中幹祥（現所属:National Food Institute, Technical Universityof Denmark ），片山高嶺（現所属:京都大学大学院生命科学研究科）

叢を適切に制御していると考えられる．
本論では，腸内細菌からヒトへと受け渡されるシンビ
オジェニック因子であるポリアミン及びシンビオジェ
ニック因子候補であるフェネチルアミン，ヒトから腸内細菌に受け渡されるシンビオジェニック因子であるヒト
母乳オリゴ糖についての研究成果を報告する．さらに，
腸内細菌と宿主の共生機構を解明する際に有用な培養シ− 57 −

栗原

新Fig. 1 Symbiogenic factors
The aim of this donation course is to elucidate the symbiotic relationship between the host and intestinal bacteria from a viewpoint of
low-molecular-weight compounds produced by the host or gut microbiota. We defined those compounds that affect each physiological
function across taxonomic boundaries as ＂symbiogenic factors＂

腸内常在菌叢最優勢 56 種のうち入手可能な 44 種についステムの開発についての研究成果を報告する．

第2章て，作成の容易な GAM 培地を用いて 32 種が培養可能

研究概要であることを示した．これはヒト腸内常在菌叢最優勢
56 種の 57 ％，入手可能な 44 種の 73 ％であった(Gotoh1)ヒト腸内常在菌叢最優勢種のハイスループット培養系の開発

et al., 2017)．さらに，GAM で培養可能な 32 菌種を 96
穴マイクロディープウェルプレート上で一斉に培養可能

近年，培養を介さないマイクロビオーム解析によりヒなハイスループット培養系を開発した．

ト 腸 内 常 在 菌 叢 最 優 勢 56 種 が 報 告 さ れ た(Qin et al.,2010)．これら 56 種のうち 44 種についてはその基準株

2)ポリアミンが菌株保存・分譲機関から入手可能であった．我々はヒポリアミンは，動脈硬化等の心血管系疾患の予防作用

ト腸内に実際に最優勢に存在する菌種を用いて生理学的や炎症抑制やオートファジー誘導を介した寿命延伸作用

なアッセイを行う目的で，これら 44 菌種のコレクショが明らかになったことから，近年注目が集まっている物

ンを作成した．この過程で，菌株保存・分譲機関による質であり，腸内常在菌からヒトへ受け渡されるシンビオ

推奨培地は菌種間で様々であるために，ヒト腸内常在菌

ジェニック因子である．

叢最優勢種同士の生理学的な比較が困難であることが明1 )で開発したヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種を GAM

らかとなった．また，推奨培地の多くはその作成法が煩培地での培養系における培養液を用いて，その細胞内お雑で，牛ルーメン液などの入手困難な材料を必要とする

よび培養上清のポリアミン（プトレッシン，スペルミジ

ものも多いため，腸内常在菌叢最優勢種の生菌体を用い

ン，スペルミン）の変動を定量し，この定量結果と各菌た研究に対するハードルは依然として高いことも明らか

種のゲノム上における既知ポリアミン代謝系・輸送系をとなった．我々はこれらの問題を解決するために，腸内構成するタンパクホモログの有無とを突き合わせてみた．

細 菌 培 養 培 地 と し て 知 ら れ る Gifu Anaerobe Medium

この結果，ヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種のうち，新規ポ（ GAM ）
(Yamamoto-Osaki et al., 1994 )における腸内常リアミン取り込み系を持つと推定されるものが少なくと在菌叢最優勢種の生育の可否を調べた．この結果，ヒトも 2 菌種（ Eubacterium siraeum，Collinsella aerofaciens ），− 58 −

腸内シンビオシスの分子機序解明とその高度応用展開

新規ポリアミン放出系を持つと推定されるものが少ながる可能性が考えられた．一方で，セロトニン濃度が不く と も 6 菌 種（ Bacteroides dorei，Bacteroides stercoris，足する場合は腸内細菌のフェネチルアミン産生を促進す

Dorea longicatena，Dorea formicigenerans，Ruminococcus

ることで，セロトニン濃度を適正レベルに保ち，便秘等

torques，Blautia hansenii ），新規ポリアミン合成系を持つと推定されるものが少なくとも 3 菌種（D. longicatena，を抑制できる可能性が考えられた．

Parabacteroides merdae，E. ventriosum ）存在した．以上の見積もりは，一つの菌種が重複した機能を持つ遺伝子

一般に処方されている宿主由来 AADC の阻害剤を用いを持たないと仮定して行われたため（例えば，ポリアミ

ルアミン生成を抑制することを最終的な目的とした．In

ンの取り込みが観察された菌種の染色体にポリアミン取り込み系のホモログが一つでも存在すれば新規のもの

vitro で AADC 阻害剤と共にフェネチルアミン産生ヒト
腸内常在菌叢最優勢種の一種である E. faecalis を培養しはないと仮定して見積もりを行った．），重複した機能たところ，そのフェネチルアミン産生が大きく抑制されを持つ遺伝子の存在の可能性を考慮した場合は，さらた．このことは，腸内代謝産物の遺伝子の特定により，に多くの機能未知遺伝子が存在することが考えられる

目的代謝産物の濃度の最適化を通じた疾病の制御の可能(Sugiyama et al., 2016)．

性を示している．

本研究では宿主に対する安全性が既に確立され，既にて腸内細菌由来 AADC を阻害し，腸管内でのフェネチ

ヒト腸内常在菌叢最優勢種で多くの未同定のポリアミン関連遺伝子が存在したことは，ヒト腸内常在菌叢最優4)ヒト母乳オリゴ糖

勢種の染色体上には，様々なシンビオジェニック因子の

乳児期の腸内細菌叢は成長後も宿主の健康に影響を及生産に関わる多くの全く新規な重要遺伝子が存在するこ

ぼすことが明らかとなってきている．母乳栄養児の腸管とを示唆しており，腸内環境の制御を腸内細菌由来のシではビフィズス菌優勢の細菌叢が形成されるが，この機

ンビオジェニック因子の制御を通じて行うためには，生構にはビフィズス菌が有するヒト母乳オリゴ糖利用経路菌を用いた遺伝学的・生化学的実験により，より多くの（ヒト母乳オリゴ糖代謝関連遺伝子）が重要な役割を果た

腸内細菌遺伝子を新規同定することが必要であると考えしていることを，乳児糞便の遺伝子解析やオリゴ糖解析

られる．

によって明らかとした．また，Bifidobacterium bifidum

また，Enterococcus faecalis と大腸菌を混合して培養すや一部の Bifidobacterium longum が有する細胞表層グリることで，腸内ポリアミンが複数の腸内細菌の代謝経路

コシダーゼによって菌体外で分解された母乳オリゴ糖分を経由して生合成され，その生合成経路はビフィズス菌

解物が，他のビフィズス菌種の生育を促進するという，等が産生する酸により作動することを明らかとした「菌種間クロスフィーディング機構」を明らかとした(Kitada et al., 2018)．

(Gotoh et al., 2018)．さらに，二種のヒト母乳オリゴ糖
トランスポーターを新たに同定し，これらのヒト母乳オ3)フェネチルアミン

リゴ糖に対する基質特異性は少しだけ異なること，その1 )のハイスループット培養系における培養上清を解違いには特定の数アミノ酸残基が関与していることを明析したところ，GAM 培地で培養可能なヒト腸内常在菌

らかにした．より幅広い種類のヒト母乳オリゴ糖を取り叢最優勢 32 種のうち 5 菌種が細胞外に著量のフェネチ

込めるトランスポーターが母乳栄養児の腸内で優占的にルアミンを産生することを見出した．また，このフェネ存在していたことから，トランスポーターのヒト母乳オチルアミン産生が芳香族アミノ酸脱炭酸酵素遺伝子

リゴ糖への適応進化がビフィズスフローラ形成の鍵と（ aadc ）に依存することを E. faecalis の aadc 破壊株・相なっていることが強く示唆された(Sakanaka et al., 2019)．

補株を用いて証明した．フェネチルアミン産生ヒト腸内
常在菌叢最優勢種の一種である E. faecalis の aadc 破壊5)共生モデルの構築（アピカル嫌気培養法）の開発

株・相補株を定着させたマウスを作成し，芳香族アミノ

腸内常在菌の多くは嫌気性である一方で，宿主の上皮酸の一種であるフェニルアラニンを多量に含む餌を与え細胞には血流を介して酸素が供給されている．このようたところ，aadc を大量発現する aadc 相補株を定着したな実際の腸管内環境を模した培養装置の開発に取り組ん

マウスの大腸でセロトニン産生量が有意に増加していだ結果，単層化したヒト上皮細胞培養株の頂端側を少なた．また，ヒト糞便中の aadc 遺伝子量とフェネチルア

くとも 5 日間，溶存酸素濃度 0.5 ％以下に，かつ基底膜

ミン産生能に有意な正の相関があることを示した．末梢側を 60 ％以上に維持することが可能となった．本装置のセロトニンは骨代謝および蠕動運動を促進することがを用いて培養した Caco-2 細胞では通常の CO2 インキュ

知られており，過剰なセロトニン濃度を適正レベルに抑ベーターで培養した細胞と同等のタイトジャンクション

制することで，骨粗鬆症や過敏性腸症候群の治療につなが形成されていた．さらに，頂端膜側において偏性嫌気− 59 −

栗

原性細菌の増殖が観察された．本装置は，腸内細菌と宿主の共生を in vitro で解析可能とするのみならず，食品素
材や医薬品の腸内動態を解析する上で有用なツールとなる可能性が示唆された．

第3章

おわりに

次世代シーケンサーの登場により，21 世紀初頭から糞便中の DNA，RNA の解析が精力的に行われ，腸内常在菌叢の組成・その塩基配列・遺伝子発現が明らかとなった．さらに，様々な質量分析装置の発達に伴い，糞便中のメタボローム解析も精力的に行われている．しかしながらこの中で，腸内常在菌の遺伝子機能の多くは未知のままである．ポリアミンをはじめとした腸内細菌由来シンビオジェニック因子の濃度を制御し人類の健康に資するためには，腸内における生産メカニズムを解明する必要がある．また，ヒト母乳オリゴ糖をはじめとした宿主
由来シンビオジェニック因子の腸内常在菌による資化機構を解明することにより，宿主側からの腸内細菌の適切な制御が可能となる．このような制御を広く行うためにはヒト腸内常在菌を培養し，シンビオジェニック因子の合成・輸送・資化系を構成する遺伝子を同定し，遺伝子の発現制御やその遺伝子がコードする酵素・トランスポーターに対する阻害剤の標的を定める必要がある．今後はより多くの腸内常在菌について遺伝子レベルで解析を行い，腸内常在菌叢の適切な制御によるヒト健康寿命の延伸を目標として研究を展開していきたい．

謝

辞

本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成によって開設された腸内細菌共生機構学寄付講座において行われたものである．本助成を賜った発酵研究所に対してここに厚く御礼申し上げます．本寄付講座世話人である石川県立大学・熊谷英彦参与のご支援とご協力に感謝の意を表し，共同研究でお世話になりました多くの先生方に深く御礼申し上げます．

文

献Gotoh, A., Katoh, T., Sakanaka, M., Ling, Y., Yamada, C.,
Asakuma, S., Urashima, T., Tomabechi, Y., Katayama-Ikegami,A., Kurihara, S., Yamamoto, K., Harata, G., He, F., Hirose, J.,
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Gotoh, A., Nara, M., Sugiyama, Y., Sakanaka, M., Yachi, H.,
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− 60 −

IFO Res.Commun. 33
61-77, 2019

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価
後藤

愛那，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Use of Gifu Anaerobic Medium for culturing 32 dominant species of human gut microbes
and its evaluation based on short-chain fatty acids fermentation profiles.
Aina Gotoh, Mikiyasu Sakanaka, Takane Katayama, Shin Kurihara
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
Recently, a ＂human gut microbial gene catalogue＂, which ranks the dominance of microbe genus/species in human
fecal samples, was published. Most of the bacteria ranked in the catalogue are currently publicly available;
however, the growth media recommended by the distributors var y among species, hampering physiologicalcomparisons among the bacteria. To address this problem, we evaluated Gifu Anaerobic Medium (GAM) as astandard medium. Forty-four publicly available species of the top 56 species listed in the ＂human gut microbial
gene catalogue＂ were cultured in GAM, and out of these, 32 (73％) were successfully cultured. Short-chain fatty
acids from the bacterial culture supernatants were then quantified, and bacterial metabolic pathways werepredicted based on in silico genomic sequence analysis. Our system provides a useful platform for assessing
growth properties and analyzing metabolites of dominant human gut bacteria grown in GAM and supplemented
with compounds of interest.
Key words: gut microbes, standard medium, short-chain fatty acids, dominant human gut bacteria, Gifu
anaerobic medium

E-mail:後藤愛那（ aina.g1985@gmail.com ）（現所属:京都大学大学院生
命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
阪中幹祥（ miksak@dtu.dk ）（ 現 所 属:National Food Institute,
Technical University of Denmark. Kemitorvet 2800
Kgs. Lyngby ），片山高嶺（ takane@lif.kyoto-u.ac.jp ）（現所属:京都大学大学院生
命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属:近畿大学生物
理工学部 〒 649-6433 和歌山県紀の川市西三谷 930 ）
共同研究者
杉山友太（石川県立大学生物資源環境学部），
奈良未沙希（石川県立大学生物資源環境学部），
南 博道（石川県立大学生物資源工学研究所），
谷内寛之（石川県立大学生物資源環境学部），
北方 彩（石川県立大学生物資源環境学部），
中川 明（石川県立大学生物資源工学研究所），
奥田修二郎（新潟大学大学院医歯学総合研究科），
加藤紀彦（京都大学大学院生命科学研究科）

緒

言

過去 10 年間に行われた疫学的研究および複数のオミク
ス研究（ゲノミクス，プロテオミクス，およびメタボロ
ミクス）により，腸内常在菌叢およびその代謝産物が宿主であるヒトの健康に影響を与えることが示唆された．
例えば，腸内常在菌叢は，消化管の発達，食物の消化と変換，宿主の免疫反応，宿主のエネルギー収支に影響を与え，炎症性腸疾患にも関与していることがわかっている(Gevers et al., 2014; Honda & Littman, 2012; Hooper etal., 2002; Peterson et al., 2008; Sommer & Backhed, 2013;
Spor et al., 2011; Turnbaugh et al., 2009)．現在，この分野における研究の焦点は，オミクス研究から代謝産物に基づく研究へと移行しており，腸管内腔における共生において重要な役割を果たす分子（例えばアミノ酸，ペプ− 61 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

チド，ビタミン，ポリアミン，バクテリアによって産生(Yamamoto-Osaki et al., 1994 )が実験的に有用であるこされる短鎖脂肪酸など）について研究が行われ始めていとが知られている．ヒト腸内常在菌叢最優勢種のうちる(Donia & Fischbach, 2015; El Kaoutari et al., 2013;

JCM から分譲される菌種については GAM での生育の可

Flint et al., 2008; Matsumoto et al., 2013; Woyke et al.,

否が調べられているが，ATCC と DSMZ に分譲される

2006)．このうち，短鎖脂肪酸は以下に列挙するように，菌種については GAM による生育の可否が調べられていヒト健康に好影響を与える腸内細菌の代謝産物として期ない．そこで，我々は，GAM が優勢なヒト腸内細菌の待されているために，近年大きな注目を集めている．

ための共通の培地として利用可能かどうかを評価した．

短鎖脂肪酸は腸管粘膜を構成する細胞の主要なエネル

このことは，ヒト腸内常在菌叢最優勢種を培養するためギー源であり，肥満やメタボリックシンドロームを防ぎ，に現在使用されている培地に関連する上記の問題の解決

抗炎症作用や抗結腸直腸癌作用を持つほか，細菌由来のにつながる．

毒素から宿主を保護し，不安行動を調節する(Arora et

ここでは，「ヒト腸内微生物遺伝子カタログ」に掲載

al., 2011; Berni Canani et al., 2012; Csordas, 1996; Fukuda

されている公に入手可能な 44 種のうち 32 種が GAM でet al., 2011; Fukuda et al., 2012; Furusawa et al., 2013;
Hamer et al., 2008; Hosseini et al., 2011; Louis et al., 2014;

培養できることを示す．さらに，我々は，細菌によって

Murphy et al., 2010; Murugesan et al., 2015; Perry et al.,

よび酪酸)の濃度を分析した．次に，それらのゲノム配

2016; Shepherd et al., 2014; Turnbaugh et al., 2006; Vinolo

列の in silico 分析による予測に基づいて，これらの細菌

et al., 2011)．これらの代謝産物の腸内細菌による産生および合成が，どのように制御されているかは，依然との短鎖脂肪酸代謝経路について議論した．

産生された短鎖脂肪酸(乳酸，酢酸，プロピオン酸，お実験方法

して未解明である．
2010 年に 124 人の被験者の糞便中に見いだされた優勢な腸内常在菌の属および種が同定され，「ヒト腸内常溶存酸素を除去した GAM の調製

在菌叢における遺伝子カタログ」として報告された(Qin

日水製薬（ Tokyo, Japan ）から購入した GAM ブイヨ

et al., 2010)．このカタログから決定されるヒト腸内常在細菌最優勢種を再構成すれば，優勢でない菌種を無視しンを脱イオン水に完全に溶解し，115 ℃で 15 分間オートてしまう危険をはらむものの，in vitro で代謝産物の挙動

度が 97 ℃に下がったら，直ちに GAM を嫌気チャンバーを解析することが可能となる．また，2010 年の調査で確(INVIVO2 400, Baker Ruskinn, Sanford, ME, USA )内に移認されたヒト腸内常在菌叢最優勢種の大部分（ 56 種中
44 種）が，Japan Collection of Microorganisms(JCM)，

クレーブ処理することで滅菌した．オートクレーブの温し，37 ℃で一晩放置して溶存酸素を除去した．腸内細菌の培養における全ての操作は嫌気チャンバー内で行った．

American Type Culture Collection(ATCC )，Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)

推奨培地と GAM での腸内細菌の培養を通じて購入可能であった．しかし，これらの菌株保存・

腸内細菌は ATCC，JCM，および DSMZ から入手した分譲機関が推奨する培地（Table 1 ）は種によって異なり，（ Table 1 ）．GAM 以外の菌株保存分譲機関による推奨培

多くの場合，その調製には面倒な手順が必要である．例

地は，菌株保存分譲機関による手法に従い調製した．まえば，ATCC 培地 1016 の作成には，牛ルーメン液といっず，細菌を調製した推奨培地（ Table 1 ）を用いて，37 ℃，

た入手困難な材料が作成に必要である．さらに，ヒト腸嫌気性条件下（ 0 ％ O2 , 5 ％ H2 , 10 ％ CO2 , and 85 ％ N2 ）内常在菌叢最優勢種を構成するそれぞれの細菌種を培養で 1 ～ 5 日間，培養した．次いで，推奨培地中で増殖しするための培地は，その構成成分がそれぞれ異なるためた細菌培養液を，酸素を除去した滅菌済みグリセロールに，各菌種の代謝挙動および増殖について，適切に比較と混合し（グリセロールの終濃度は 15 ％(v/v)），−80 ℃を行うことが不可能である．

で保存したものをグリセロールストックとした．次に，腸内細菌の培養においては，Gifu 嫌気性培地（ GAM;作成したグリセロールストック中の細菌を，滅菌爪楊枝

1.0 ％ (w/v) peptic digest of animal tissue, 0.3 ％ papaic

を用いて GAM に接種した．他の細菌がコンタミネーショ

digest of soybean meal, 1.0 ％ proteose peptone, 1.35 ％ンした可能性については，後述する 16S rDNA 配列解析

digested serum, 0.5 ％ yeast extract, 0.22 ％ beef extract,により排除した．GAM を用いた細菌培養液を，酸素を0.12 ％ liver extract, 0.3 ％ glucose, 0.25 ％ potassium除去した滅菌済みグリセロール（終濃度は 15 ％(v/v)）

dihydrogen phosphate, 0.3 ％ sodium chloride, 0.5 ％と混合し，96 ウェルプレートに等分し，−80 ℃で保存

soluble starch, 0.03 ％ L -cysteine hydrochloride, andした．グリセロールの酸素除去は，GAM の脱酸素化と0.03 ％ sodium thioglycollate, final pH 7.3 ± 0.1 ）同様に行った．

− 62 −

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価

Table 1.

List of bacterial species/strains and description of the media used for culture.

− 63 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，片山

GAM を用いた場合の腸内細菌の増殖曲線

高嶺，栗原

新

いて配列決定し，続いて BLAST 分析を行った．検索結GAM に腸内細菌培養液のグリセロールストックを嫌気チャンバー内で完全に融解させ，このうちの 5 μL を果が目的の細菌の 16S rDNA 配列のみであった場合に，培養が成功したと判定した．

96 穴ディープウェルプレート中の 500 μL の GAM に混合し，嫌気条件で 37 ℃で 1 - 2 日間，前培養した．コピー

短鎖脂肪酸の定量

プレートスタンド（ Tokken, Chiba, Japan ）を用いて，短鎖脂肪酸の濃度は高速液体クロマトグラフィー

前培養液を 96 穴ディープウェルプレート中の 500 μL の(HPLC)分析によって測定した．GAM で培養した細胞GAM に接種した．以下のプロトコルにより OD600 を測

を 4 ℃で 40 分間，4,400 rpm で遠心した．得られた培養定することにより各菌種の増殖を経時的に解析した．

上清を水で 300 倍希釈し，そのうちの 10 μL を AC11-HC

96 穴ディープウェルプレートで増殖した培養液をピ(4 by 250 mm)カラムを装備した Dionex ICS-3000 シス

ペッティングにより混合し，一部を取り出して OD600 をテム(Dionex, Sunnyvale, CA, USA )を用いて分析した．

測定した．1 cm の光路長を有するキュベット中で測定

分析に先立って，カラムに 1 mM 水酸化ナトリウム(溶して得られた培養液（適切に希釈済み）の OD600 値を，媒 A )を 1.5 mL/min の流速で流すことで系を平衡化し未知の光路長を有する 96 穴プレート中のマイクロプ

た．サンプル中の各成分は，溶媒 A および 100 mM 水酸

レートリーダーにより測定された同じサンプルの化ナトリウム(溶媒 B )を用いて二成分勾配により溶出

600 n m における吸光度で割った．得られた値を，マイした．1.5 mL/min の流速で，0 ～ 8 min で 0％の溶媒 B，

クロプレートリーダーによって得られた生データから

8 ～ 15 min で 0 ～ 10 ％ の 溶 媒 B， そ の 後 15 ～ 25 min で

OD600 値を計算するための係数として使用した．培養の59％の溶媒 B をそれぞれ溶媒 A に混入させ，グラジエ

終わりに，細胞をペレット化し，培養においてコンタミントを形成させた．

ネーションがなかったことを確認するために後述の 16S
rDNA の配列決定を行った．後に pH および短鎖脂肪酸

Blast を使用した in silico 代謝経路解析
Protein BLAST(Blastp)(Camacho et al., 2009)分析は，を解析する目的で，培養上清を−30 ℃で保存した．

NCBI protein searches データベース中のヒト腸内常在16S rDNA シーケンス

菌叢最優勢種のタンパク質配列に対して，参照タンパク

ゲノム DNA（gDNA ）をビーズショッカー[Shake Masterver. 1.2(#BMS-12, Biomedical Science, Tokyo, Japan)]あ

質配列（ Table 2 ）を検索した．100 および 300 bit を超えるスコアを有するタンパク質を抽出した．

るいはフェノール - クロロホルム抽出により抽出し，16S

結rRNA 遺伝子中(16S rDNA )の V1 - V3 領域の DNA 配列決定に供した．以下に手法の概略を示した．16S rRNA果

（ 1,500 塩基対）をコードする DNA 断片を，プライマー 7f

ヒト腸内常在菌叢最優勢 56 種にランキングされる各細(5＇-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3＇ )およびプライマー

菌種の増殖

1510R(5＇-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3＇ )を用いた「ヒト腸内微生物遺伝子カタログ」のトップ 56 にランPCR によって gDNA から増幅した．精製した DNA 断片を

ク 付 け さ れ た 細 菌 の う ち，44 種（ 79 ％） が ATCC，

プライマー 518R(5＇-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3＇ )をJCM，および DSMZ から入手可能であった（ Table 1 ）．

用いた DNA 配列決定のための鋳型として使用した．得上記の 3 つの菌株・分譲機関によるマニュアルでは，こられた配列をヌクレオチド基本局所アラインメント検索

れらの 44 種のうち，4 種（ 9％）について GAM で培養

ツール(BLAST )プログラム(https://blast.ncbi.nlm.nih.

すること，残り（ 91％）については，Table 1 に記載のgov/Blast.cgi )を用いて分析した．培養物の純度を確認

特定の培地で培養することがそれぞれ推奨されていたするために，サンガー配列決定中のヌクレオチド配列を（購入後の各菌種の回復培養および保存には Table 1 の表す波形を視覚的に検査することで単一のシグナルから下線で示した培地を使用した）．アスタリスク（＊）でなることを確認した．得られた配列について BLAST 解示された 6 菌種は，Table 1 で示した培地で培養可能で析を行い，目的の細菌の 16S rDNA 配列がトップヒット

あることが我々の研究室で以前に確認されていたので，であれば，培養が成功したと判定した．Parabacteroides

推奨培地とは異なる培地で培養を行った．各培地に接種

distasonis お よ び Pseudoflavonifractor capillosus の 2 つ の種については，その 16S rDNA 配列は各種内で多型であした細菌は，37 ℃に保った嫌気チャンバー内で 1 ～ 5 日るために，16S rDNA 配列をプラスミドベクターにクの後，16S rDNA 配列を決定することで，コンタミネー

ローニングし，得られた 10 個のプラスミドを各株につションがないことを確認した．

間培養した．得られた培養液から gDNA を抽出し，そ− 64 −

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価
Table 2.

List of proteins used as the query sequences for Blastp analysis.

推奨培地における前培養の後，前培養液を GAM に接

腸内微生物遺伝子カタログ」でランク付けされている上

種し，37 ℃に保った嫌気チャンバー内で 1 ～ 5 日間培養

位 56 種の半分以上（ 32 種，57％）に相当する（ Table 1 ）．

した．検討した種のうち，推奨培地で培養した 28 種がGAM に お い て も 増 殖 す る こ と が で き た（ Table 1 ）．

GAM で培養可能なヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の増殖

GAM で培養した培養液中に含まれる細菌の 16S rDNA

曲線
GAM で培養した際のヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の配列を解析することで，培養がコンタミネーションなく増殖曲線を Fig. 1 に示した．1 日以内にほぼ全ての種（27

行われたことを確認した．
この結果，「ヒト腸内微生物遺伝子カタログ」で特定種）が定常期に入った．Bacteroides 門に分類される腸内されたヒト腸内常在菌最優勢種のうち公に入手可能なも細菌種は，GAM の生育が特に良好である傾向がみられのは 44 種であるが，この中で合計 32 種（ 73％）が GAMで培養可能であることが明らかとなった．これは，「ヒトた．定常期における最大 OD600 値および増殖曲線の形状

は種ごとに異なった．

− 65 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

Figure 1. Growth curve of dominant human gut bacteria in GAM.
Growth was monitored by measuring OD600 at 37 ℃ for 60 h under anaerobic conditions. The numbers before the name of the species indicate the rank order.
Continued on the next page.

− 66 −

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価

Figure 1.

continued
Continued.
Continued on the next page.

− 67 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，片山

Figure 1.

高嶺，栗原

新

continued
Continued.
Continued on the next page.

− 68 −

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価

Figure 1.

continued
Continued.

− 69 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

GAM で培養可能なヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種によっ

培養 60 時間における培養上清における短鎖脂肪酸（乳て産生された短鎖脂肪酸の分析

酸，酢酸，プロピオン酸，および酪酸）の濃度（ Fig. 2 ）本研究で開発された GAM を用いた培養が物質生産におよび pH（ Fig. 3 ）を測定した．

関わる機能遺伝子の解析に有用であることを示す目的

32 種のうち 6 種（ 18.8％）が 10 mM を超える乳酸を産で，GAM で培養可能なヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の生し，他の 26 種の乳酸産生量は低レベルにとどまった

Figure 2. Concentration of SCFAs in culture supernatants.
SCFAs (lactic acid, acetic acid, propionic acid, and butyric acid) in culture supernatants after 60 h of culture of the dominant human gut
bacteria. The number before the name of the species indicates the rank order listed in the ＂human gut microbial gene catalogue＂. Dashedlines on the panel of lactic acid and acetic acid show the concentration of each acid originally contained in GAM.

− 70 −

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価（ Fig. 2 ）．この中で E. faecalis は，最も高い濃度の乳酸をは，かなりの量の酢酸を産生した（ Fig. 2 ）．試験に供し産生した．試験した全ての種の培養上清中に酢酸が検出た Bacteroides 属と Parabacteroides 属に含まれるすべてされた．GAM で培養した場合 22 種（ 71％）が 10 mM をの菌種はプロピオン酸を産生した（ Fig. 2 ）．Clostridiales

超える濃度の酢酸を産生した．GAM で良好な生育を示し目 に 属 す る Roseburia intestinalis, Coprococcus comes，

たほとんどの Bacteroides 属細菌と Parabacteroides 属細菌

Anaerotruncus colihominis，Eubacterium ventriosum の 4

Figure 3. Summary of growth, pH, and composition of SCFAs in culture supernatants.
The OD600 and pH values of culture supernatants after culture for 60 h in GAM. Total SCFAs indicate the sum of the concentrations oflactic acid, acetic acid, propionic acid, and butyric acid contained in culture supernatant. The number of each column and the number
before the name of the species indicate the rank order.

− 71 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，片山

新

養したが，本研究では，これら 10 種は GAM で培養可

種の培養上清からは酪酸が検出された．

考

高嶺，栗原

能 で あ っ た（ Table 1 ）．26 種 類 の 成 分 を 必 要 と す る察Megamedium 1.0 と比較して，GAM は粉末を水に溶かすことによって簡単に調製することができる．本研究でポストマイクロビオーム時代の研究では，ヒト常在菌は，ヒト腸内常在菌叢最優勢種のかなりの割合に相当す

叢最優勢種の生菌を用いたアッセイが重要であり，このる 32 種を GAM で培養可能なことが示された．GAM にためには網羅的な腸内細菌の培養が必須である．しかしは，他の一般的に利用されている腸内細菌用の培地よりながら，優勢なヒト腸内細菌を培養するために菌株保存・も優れた点がいくつかある．たとえば，多くの腸内細菌分譲機関によって推奨される培地の作成には煩雑な手順用の培地に添加されるウマの血液は，GAM には必要とが要求される上に，各培地にはそれぞれ異なった培地成

されないために，培地は透明であり，OD600 を指標とし分が含まれるため，これらの培地で生育したそれぞれのた増殖を容易に解析できる．また，GAM を標準培地と細菌の代謝産物を種間で比較することは困難である．本して培養することにより，短鎖脂肪酸をはじめとした代研究では，培地の調製の困難さを軽減し，代謝産物分析

謝産物の解析が可能となり，複数の腸内細菌種の培養にを視野に入れた場合の培地を共通化する目的で，ヒト腸用いる培地が共通であることは，細菌代謝や様々な増殖

内常在菌叢最優勢種を培養するための標準培地としての条件に対する応答を培地のバイアスのない条件で比較す

GAM を位置づけ，その有用性を検証した．

ることが可能となる．

Wu et al.(2015)は，ヒト腸内細菌叢モデルのモデル

短鎖脂肪酸はいくつかの経路で産生される．Fig. 4 にを確立するための標準培地として Megamedium 1.0 を開グルコースを炭素源とした場合の乳酸，酢酸，プロピオ

発し，「ヒト腸内微生物遺伝子カタログ」に記載されてン酸，酪酸の合成経路の概要(Louis et al., 2014; Reichardt

いる 10 種のヒト腸内常在菌叢最優勢種を含む 13 種を培

et al., 2014; Rios-Covian et al., 2015 )を 示 し，Fig. 5 に

Figure 4. Pathways responsible for the biosynthesis of SCFAs from glucose in gut microbes.
The key enzymes are indicated: (1, 2) LDH, lactate dehydrogenase; (3) Ack, acetate kinase; (4) ProK, propionate kinase; (5) PCoAT, propionyl CoA:succinate CoA transferase; (6) MmdA, methylmalonyl CoA decarboxylase; (7) LcdA, lactoyl-CoA dehydratase subunit alpha; (8)PduP, CoA-dependent propionaldehyde dehydrogenase; (9) ButK, butyrate kinase; and (10) BCoAT, butyryl CoA:acetyl CoA transferase.

− 72 −

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価

GAM で培養可能であったヒト腸内常在菌叢最優勢種に形成される NAD+ が必要である．したがって，多くの嫌おける，短鎖脂肪酸代謝に関連する重要な酵素あるいは気性細菌が乳酸をあまり生産しなかったことは，驚くべ

そのホモログのゲノム上における存在を示した．

きことである．B. uniformis と B. intestinalis の培養上清

乳酸は，主に乳酸脱水素酵素（ LDH ）によってピルビには高濃度の乳酸が含まれていたが，これら 2 種の増殖

ン酸から産生される（ Fig. 4 ）．本研究で試験した 32 菌は，試験を行った他の Bacteroides 属細菌の増殖と比較

種のうち，25 の種が高度に保存された LDH ホモログをして低レベルであった（Fig. 2 ）．このことは，生育に伴っ有するにもかかわらず（ Fig. 5 ），乳酸産生量は低レベルて放出された高濃度の乳酸が，B. uniformis および B.

にとどまった（ Fig. 2 ）．一般的な嫌気性条件下での効率

intestinalis の生育を阻害した可能性を示唆している．
酢酸は主にピルビン酸からアセチル CoA を介して生的な解糖には，LDH によって触媒される反応においてFigure 5. Occurrence of homologous proteins responsible for SCFA synthesis from glucose in the genomes of dominant human gut
bacteria.
The results shown are based on the Blastp analysis of genomes in the NCBI database. The color of each columns indicates the score fromthe Blastp analysis: (black) > 300 bit, (grey) 100 − 300 bit, and (white) < 100 bit. The number before the name of the species indicates therank order listed in the ＂human gut microbial gene catalogue＂.

− 73 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，片山

産 さ れ る． 酢 酸 キ ナ ー ゼ(AcK)(Fig. 4)(Louis et al.,

高嶺，栗原

新

される種の培養上清中からはプロピオン酸が検出されな

2004 )は，酢酸産生経路の最終段階の化学反応を触媒すかった（ Fig. 2 ）．これらの門に分類されるほとんどする酵素であり，ヒト腸内常在菌叢最優勢種に含まれる各

べての種は AcK/ProK，および MmdA，LcdA，または細菌のゲノムに広く保存されている(Fig. 5)．ビフィズ

PduP ホモログを有したが，それらのすべては PCoAT ホ

ス菌は，プロバイオティクス細菌として用いられる菌種

モログを欠いていた．

であるが，本菌に由来する酢酸はマウスの腸上皮に吸収本研究で R. intestinalis，C. comes，A. colihominis，E.

され，大腸菌 O157:H7(Fukuda et al., 2011 )などの病原菌に対する防御機構を増強することがこれまでに報告さventriosum の培養上清中に検出された酪酸は，2 分子のアセチル CoA から酪酸キナーゼ(ButK )の触媒する反応れている．本研究で試験したヒト腸内常在菌叢最優勢により生成するか，ブチリル CoA:アセチル CoA トラ

32 種のうち，R. intestinalis および E. ventriosum を除く

ンスフェラーゼ(BCoAT )の反応によって生成すると考30 菌種の培養上清中に 5 mM を超える，かなり高濃度のえられる(Duncan et al., 2002)．このうち，ヒト糞便か酢酸が検出された．この結果は，ヒト腸内常在菌叢最優

ら 分 離 さ れ た C. comes，A. colihominis，E. ventriosum

勢種の多くが，ビフィズス菌と同様に腸上皮に酢酸を供については，ButK が酪酸合成に寄与することがこれま給し，腸上皮細胞の防御機構に寄与していることを示唆

でに報告されている(Duncan et al., 2002)．一方で，R.

している．

intestinalis では ButK ではなく BCoAT が酪酸の生合成に関与することが知られている(Duncan et al., 2002)．R.

本研究では，試験した株の 22 ％に相当する 7 菌種のヒト腸内常在菌叢最優勢種が，5 mM 以上のかなり高い
濃度のプロピオン酸を生産した．これら 7 菌種は，プロ

intestinalis の培養上清からは最も高濃度の酪酸が検出され，これに伴い BCoAT 経路で利用される培養上清中のピオン酸の生合成を触媒するメチルマロニル- CoA デカ

酢酸は低濃度であった．一方，E. faecalis, C. aerofaciens,

ルボキシラーゼ（ MmdA ）とプロピオニル CoA:コハ

およびすべての Bacteroides 属細菌の培養上清には，こク酸 CoA トランスフェラーゼ（ PCoAT ）の両方の遺伝

れらの菌種が ButK ホモログを有しているにも関わら子ホモログを有していた（ Fig. 5 ）．MmdA は，グルコー

ず，酪酸が検出されなかった．また，BCoAT ホモログ

スからプロピオン酸を生成するための主要経路であるコを持つ P. capillosus についても酪酸の生成は認められな

ハク酸経路に含まれる酵素であり，コハク酸経路の最終

かった．

段階は，PCoAT に触媒されるプロピオニル CoA からコ

最近，Clostridium 属腸内細菌に由来する酪酸およびプハク酸への CoA の転移反応である（ Fig. 4 ）．他のプロ

ロピオン酸が，結腸調節性 T 細胞の誘導を介してマウス

ピオン酸産生経路としては，ラクトイル- CoA デヒドラの結腸の炎症を抑制するのに重要な役割を果たすことがターゼ（ LcdA ）を用いるアクリル酸経路および CoA 依報告された(Furusawa et al., 2013)．本研究において試験

存型プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ PduP ）された 2 種の Clostridium 属細菌である C. asparagiformeを用いるプロパンジオール経路が知られている（ Fig. 4 ）および C. scindens はプロピオン酸を生成した．また，(Reichardt et al., 2014)．
アクリル酸経路の最終反応では，本研究で対象とした 32 株のうち 7 株はプロピオン酸をリン酸アセチルトランスフェラーゼによってプロピオニ

生産し，4 株は酪酸を生産した．これらの結果は，ヒトル CoA へリン酸が転移され，プロピオニルリン酸が形

腸内常在菌叢最優勢種の一部が，免疫調節機能を有し，成された後に，プロピオン酸キナーゼ（ ProK ）によって宿主と腸内細菌との間の共生関係にとって重要であり得プロピオン酸が生成する（ Fig. 4 ）(Hosseini et al., 2011)．

る短鎖脂肪酸の産生を通して腸内環境を調節することを一方で，プロパンジオール経路では，PCoAT と ProK に示している．

よって触媒される反応が，それぞれ最終ステップになる

本研究における短鎖脂肪酸解析の結果は，先行研究に可能性がある(Reichardt et al., 2014)．ProK を参照配列

おける生化学的解析および本研究におけるヒト腸内常在として使用した Blastp 解析により検索されたタンパク

菌叢最優勢種の染色体に対する in silico 解析の結果と一質配列は，AcK を参照配列として使用した Blastp 解析

致している(Louis et al., 2014)．本研究における短鎖脂により検索されたタンパク質配列と全ての菌種において

肪酸産生細菌は短鎖脂肪酸産生に関与する遺伝子または完全に一致していた．過去の研究においてアセチルリン

それらのホモログを有することから，本研究で得られた酸を脱リン酸化する反応と，プロピオニルリン酸を脱リ

結果は，これまでに行われたヒト腸内細菌における短鎖ン酸化する反応は，同じキナーゼによって触媒されるこ

脂肪酸関連代謝経路が同定された以前の in vitro におけと が 示 さ れ て い る（ AcK/ProK ）(Chittori et al., 2012;

る酵素研究における結果と一致している．しかしながら，Diez-Gonzalez et al., 1996; Hesslinger et al., 1998)．しか短鎖脂肪酸合成に関与する遺伝子またはそれらのホモロ

しながら，Firmicutes 門および Actinobacteria 門に分類

グを有するいくつかの細菌は，本研究では，それぞれの− 74 −

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価

遺伝子に対応する短鎖脂肪酸を産生しなかった．例えば細菌の全てに相当する 14 菌種がプロピオン酸を，4 菌種

Bacteroides 属の細菌はすべて ButK ホモログを持っているが（ Fig. 5 ），酪酸を生成するものはなかった（ Fig. 2 ）．

（ Roseburia intestinalis，Coprococcus comes，Anaerotruncus

これらの結果は，特定の化合物の存在，宿主の免疫系，

colihominis，Eubacterium ventriosum ）が酪酸を生産した．
これらの短鎖脂肪酸が検出された菌種について，その代および他の細菌の存在などの他の要因が，Bacteroides 属

謝経路を in silico 予測したところ，既存の研究結果と合細菌における butK の発現に必要であることを示唆して致していた．本研究で開発した 96 穴プレート上の GAMいる．これらの因子は，本研究で開発されたシステムをを用いた培養システムは，ヒト腸内細菌最優勢種の増殖用いた包括的な in vitro スクリーニングによって同定さの評価や，代謝産物の分析を行う際に再現性の良いプ

れうる．

ラットフォームとして用いることが可能である．

我々のシステムは，標準培地として GAM を使用する

本助成で得られた研究成果の報告ことで，ヒト腸内常在菌叢最優勢種の増殖特性およびその代謝産物を再現性良く分析するための有用なプラットフォームである．この研究で採用されたアプローチは，
ヒト腸内常在菌叢最優勢種の代謝挙動を理解するためのモデルとして使用することが可能である．また，本研究で開発されたシステムが，培養と代謝産物の解析を通じた腸内細菌とヒト宿主間との共生関係を解析する研究において広く用いられることを望む．

要約

近年，培養を介さない手法によりヒト腸内細菌最優勢
56 種が報告された．これらの 56 菌種のうち 44 種についてはその基準株が菌株保存・分譲機関から入手可能である．しかし，菌株保存・分譲機関による推奨培地は菌種間で様々であるためにヒト腸内細菌最優勢種同士の生理学的な比較が困難である．また，推奨培地の多くは作成法が煩雑で，牛ルーメン液などの入手困難な材料を必要とするものも多い．この問題を解決するために本研究で口頭発表
1) 後藤愛那，奈良未沙希，杉山友太，阪中幹祥，谷内寛之，
北方彩，奥田修二郎，片山高嶺，栗原新．2017．GAM培地を用いたヒト腸内細菌最優勢32種の培養及び短鎖脂肪酸の生産能とその代謝経路のin silico予測．日本農芸化学会大会2017年度大会．3月19日．京都．
2) 後藤愛那，奈良未沙希，杉山友太，阪中幹祥，谷内寛之，
北方彩，中川明，南博道，奥田修二郎，加藤紀彦，片山
高嶺，栗原新. 2017. GAMを用いたヒト腸内細菌最優勢32種の培養と短鎖脂肪酸産生プロファイルに基づくその評
価. 第10回北陸合同バイオシンポジウム．11月10日．富山．
原著論文1) Gotoh, A., Nara, M., Sugiyama, Y., Sakanaka, M., Yachi, H.,
Kitakata, A., Nakagawa, A., Minami, H., Okuda, S., Katoh, T.,
Katayama, T. & Kurihara, S. 2017. Use of Gifu Anaerobic
Medium for culturing 32 dominant species of human gut
microbes and its evaluation based on short-chain fatty acids
fermentation profiles. Biosci. Biotechnol. Biochem. 81:20092017.

は，腸内細菌培養培地として知られる Gifu Anaerobe

謝Medium（ GAM ）を標準培地として用い，ヒト腸内細菌最優勢種の生育の可否を調べた．さらに，ヒト腸内細辞

菌最優勢種の生理機能を比較する際の標準培地としての本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成にGAM の実用性を示す目的で，腸内細菌の有用代謝産物

よって開設された腸内細菌共生機構学寄付講座においてとして知られる短鎖脂肪酸についての解析を行った．

行われたものである．本助成を賜った発酵研究所に対し腸内細菌最優勢 56 種のうち，菌株保存・分譲機関かてここに厚く御礼申し上げます．

ら入手可能な 44 種を推奨培地で培養し，グリセロール

文

ストックにて保存した後に GAM 培地での生育の可否を96 穴ディープウェルプレート上で調べた．生育した菌体について 16S rDNA シーケンスにより培養液中の大部分が目的の菌種であることを示した．試験を行った 44
菌種のうち 32 種が GAM で培養可能であり，これは最優勢 56 種の 57 ％，入手可能な 44 種の 79 ％であった．
次に，これらの菌種の培養上清由来の短鎖脂肪酸（乳酸，
酢酸，プロピオン酸，酪酸）を定量した．6 菌種が乳酸を，22 菌種が酢酸をそれぞれ 10 mM 以上の濃度で生産した．
また，試験した Bacteroides 属および Parabacteroides 属

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Kristiansen, K., Pedersen, O., Parkhill, J., Weissenbach, J.,− 76 −

Gifu 嫌気性培地を用いたヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種の培養および短鎖脂肪酸発酵特性に基づくその評価
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− 77 −

IFO Res.Commun. 33
79-90, 2019ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるポリアミン輸送および生合成の包括的分析：新規ポリアミン代謝および輸送遺伝子の存在の可能性
杉山

友太，阪中

幹祥，栗原

新

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Comprehensive analysis of polyamine transport and biosynthesis in the dominant humangut bacteria: Potential presence of novel polyamine metabolism and transport genes.
Yuta Sugiyama, Mikiyasu Sakanaka, Shin Kurihara
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
Recent studies have repor ted that polyamines in the colonic lumen might af fect animal health and thesepolyamines are thought to be produced by gut bacteria. In the present study, we measured the concentrations of
three polyamines (putrescine, spermidine, and spermine) in cells and culture supernatants of 32 dominant humangut bacterial species in their growing and stationar y phases. Combining polyamine concentration analysis inculture supernatant and cells with available genomic information showed that novel polyamine biosynthetic
proteins and transporters were present in dominant human gut bacteria. Based on these findings, we suggested
strategies for optimizing polyamine concentrations in the human colonic lumen via regulation of genes responsible
for polyamine biosynthesis and transport in the dominant human gut bacteria.
Key words: gut bacteria, polyamines, polyamine transport, polyamine biosynthesis, symbiosis緒言1985）．哺乳動物の結腸内腔には，ポリアミンが最大

ポリアミン（プトレッシン，スペルミジン，スペルミ

mM オ ー ダ ー の 濃 度 で 存 在 し(Matsumoto & Benno,

ン）は，2 個以上のアミノ基を有する脂肪族アミンであ2007），これまでの研究でこれらのポリアミンが腸内細る．ポリアミンは真核生物(Pegg, 2009)から原核生物細菌に由来することが報告されている(Matsumoto et al.,

胞 ま で 広 範 な 生 物 に 分 布 し て い る(Tabor & Tabor,

2012; Noack et al., 2000）．結腸内腔内のポリアミンは結腸粘膜を介して血流に移動し(Kibe et al., 2014），身体にE-mail:
杉山友太（ sugiyama.yuta.6s@kyoto-u.ac.jp ）（ 現 所 属: 京 都 大
学大学院農学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
阪中幹祥（ miksak@dtu.dk ）（現所属:National Food Institute,
Technical University of Denmark. Kemitorvet 2800
Kgs. Lyngby, Denmark ），栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属:近畿大学生
物理工学部 〒 649-6433 和歌山県紀の川市西三谷 930）
共同研究者
奈良未沙希（石川県立大学生物資源環境学部），
後藤愛那（石川県立大学生物資源環境学部），
北方 彩（石川県立大学生物資源環境学部），
奥田修二郎（新潟大学大学院医歯学総合研究科）

様々な影響を与える．例えば，ガン細胞では細胞増殖を促進するポリアミンが高濃度で見いだされ，腸内細菌由来のポリアミンががん細胞に供給される可能性が考えられる．そこで，抗生物質の投与により腸内細菌由来のポリアミンの腸管内濃度を低下させ，癌治療を行うための研究が行われている(Johnson et al., 2015）．しかしながら，腸管内腔のポリアミンは，寿命の延長(Kibe et al.,2014; Matsumoto et al., 2011），損傷した粘膜の回復(Luxet al., 1980），認知機能の増強(Kibe et al., 2014)等の，哺乳類の健康にさまざまな有益な効果をもたらすことも報告されている．腸管内腔のポリアミン濃度は，腸管内腔に生息する様々な腸内細菌によるポリアミンの合成と− 79 −

杉山

友太，阪中

幹祥，栗原

新

輸送の結果，決定されている．細菌の既知のポリアミン

ン生合成遺伝子（ speB，adi，および ncpah; Fig. 1 ）のの 生 合 成・ 輸 送 経 路 を Fig. 1 に 要 約 し た(Kurihara &存在量がマウス腸内細菌叢で変化しないことを報告しSuzuki, 2015; Michael, 2015; Michael, 2016; Murray-

た．この結果は，腸内細菌が前述のポリアミン生合成経

Stewart et al., 2016; Sugiyama et al., 2016）． 最 近，Kibe路（ Fig. 1 ）に加えて，プトレッシン生合成を担う新規

et al.（ 2014)は，マウスにおいて，結腸内腔のプトレッ
シン濃度が増加したにもかかわらず，既知のプトレッシ

遺伝子あるいは新規遺伝子群（複数の酵素でプトレッシンが合成される場合）を有していることを示唆している．

Figure 1. P olyamine biosynthetic and transport pathways in bacteria.
Polyamine biosynthetic and transport pathways previously described in bacteria are integrated and illustrated. Gray squares
indicate transporters (importer, antiporter, and exporter) that were previously reported in Escherichia coli or Enterococcus
faecalis. Black squares with white letters show abbreviated names of enzymes experimentally identified in E. coli, En. faecalis,B. thetaiotaomicron, Thermus thermophilus, Vibrio cholerae, or Pseudomonas aeruginosa. The abbreviations used are as
follows: AAT, agmatine aminopropyltransferase (Ohnuma et al., 2005); ADC, arginine decarboxylase (Moore & Boyle, 1990;
Stim & Bennett, 1993); ADI, agmatine deiminase (Llacer et al., 2007); AdoMetDC, S-adenosylmethionine decarboxylase(Tabor & Tabor, 1987); AGM, agmatine; AguD, putrescine-agmatine antiporter (Suarez et al., 2013); APAGM, aminopropylagmatine; APAUH, aminopropylagmatine ureohydrolase (Ohnuma et al., 2005); ARG, arginine; ASA, aspartate-β-semialdehyde;
AUH, agmatine ureohydrolase (Satishchandran & Boyle, 1986); CASDC, carboxyspermidine decarboxylase (Hanfrey et al.,2011; Lee et al., 2009; Sakanaka et al., 2016); CASDH, carboxyspermidine dehydrogenase (Hanfrey et al., 2011; Lee et al.,2009); CSPD, carboxyspermidine; dcSAM, decarboxylated S-adenosylmethionine; MdtJI, spermidine exporter (Higashi et al.,2008); MTA, 5′-deoxy-5′-methylthioadenosine; NCP, N-carbamoylputrescine; NCPAH, N-carbamoylputrescine amidohydrolase(Nakada & Itoh, 2003); ODC, ornithine decarboxylase (Kashiwagi et al., 1991; Morris & Pardee, 1965); ORN, ornithine; PCT,
putrescine carbamoyltransferase (Llacer et al., 2007); PlaP, low-affinity putrescine importer (Kurihara et al., 2011); PotABCD,
ATP-binding cassette type spermidine preferential importer (Furuchi et al., 1991); PotE, putrescine-ornithine antiporter(Kashiwagi et al., 1992; Kashiwagi et al., 1997); PotFGHI, ATP-binding cassette type putrescine specific importer (Pistocchi etal., 1993); PuuP, high-affinity putrescine importer (Kurihara et al., 2009); SAM, S-adenosylmethionine; SapBCDF, putrescine
exporter (Sugiyama et al., 2016); SPD, spermidine; SPDSyn, spermidine synthase (Tabor et al., 1986).

− 80 −

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるポリアミン輸送および生合成の包括的分析：新規ポリアミン代謝および輸送遺伝子の存在の可能性

したがって，ポリアミン生合成および輸送にかかわる新（ Table 1 ）．それぞれの腸内細菌については既報(Gotoh

しい遺伝子の同定ができれば，その遺伝子の発現制御を

et al., 2017)にしたがって培養を行った．

通じて，ヒト結腸内腔におけるポリアミン濃度を最適化
細胞内および培養上清のポリアミン解析できると考えられる．
2010 年に，ヒト腸内の主要な微生物属／種を順位付け

サンプル中のポリアミン濃度は高速液体クロマトグラ

したヒト腸内常在菌叢最優勢種が報告された(Qin et al.,フィー（ HPLC ）を用いて定量した．分析条件は既報

2010）．我々は Gifu anaerobe medium（ GAM ）を用いれ(Sakanaka et al., 2016)に従った．培養上清および細胞ば，これらヒト腸内常在菌叢最優勢 56 種のうち 32 種がを増殖期および定常期でそれぞれサンプリングした培養可能であり，これら 32 種の代謝産物組成を培地のバ(Sugiyama et al., 2017）．培養上清および細胞内の HPLC

イアスを除去して比較可能であることを報告した（ Gotoh etを用いたポリアミン濃度の測定に必要なサンプルの調製

al., 2017）．ヒト腸内常在菌叢最優勢種に含まれる Alistipes（ Hamana et al., 2008），Bacteroides（ Hamana et al.,2008; Hosoya & Hamana, 2004 ） お よ び Parabacteroides（ Hamana et al., 2008 ）属細菌によって生産された定常期におけるポリアミン濃度はこれまでに報告されている．しかしながら，いくつかの細菌では，細胞内および培養上清中のポリアミン濃度はそれらの生育段階によって 異 な る こ と が 報 告 さ れ て い る(Hanfrey et al., 2011;
Sakanaka et al., 2016; Sugiyama et al., 2016）．このことは，
ポリアミンが細胞増殖にとって重要であるためであると考えられる．したがって，細菌によるポリアミンの生合成および輸送についてのより良い洞察を行うためには，
生育段階別の細胞内および培養上清中のポリアミン濃度の測定が必要である．さらに，ヒト腸管腔におけるポリ
アミンホメオスタシスを包括的に理解するためには，これ ま で に 報 告 の あ る Alistipes，Bacteroides お よ び
Parabacteroides 属細菌以外のヒト腸内常在菌叢最優勢種のポリアミン生合成・輸送についても詳細に解析されるべきである（ Table 1 ）．
本研究では，GAM で培養可能なヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種（ Table 1 ）について，GAM で培養した場合の増殖期と定常期における細胞内および培養上清中のポ
in silico 解析を用いて，リアミン濃度を測定した．さらに，
これらのヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種が新規ポリアミン生合成および輸送タンパク質を有する可能性について
議論する．

実験方法
実験材料
GAM ブイヨン，プトレッシン二塩酸塩，スペルミジ
ン三塩酸塩，およびスペルミン四塩酸塩は，それぞれ
日 水 製 薬， 和 光 純 薬， ナ カ ラ イ テ ス ク お よ び MP
Biomedicals から購入した．
菌株およびその培養条件
腸内細菌は ATCC，JCM および DSMZ から入手した− 81 −

Table 1.

Bacterial strains used in this study.

杉山

友太，阪中

幹祥，栗原

新

法は既報に従った(Sakanaka et al., 2016）．細菌細胞を起因すると考えられた．試験を行った 32 種のヒト腸内遠心した際に生じるペレット内に残存した GAM 中に含常在菌最優勢種のうち，22 ％に相当する 7 種（Bacteroides

まれるポリアミンが細胞内ポリアミン濃度に与える影響

dorei, B. finegoldii, P. johnsonii, Dorea formicigenerans,を最小化する目的で，培養上清を細胞ペレットから完全

Clostridium asparagiforme, Ruminococcus lactaris お よ びに除去したが，その際に一部の細胞ペレットが失われた．

Eubacterium ventriosum ）において，増殖期または定常期，あるいは，増殖期・定常期双方で，培養上清中でのプトレッ

このため，細胞内ポリアミンレベルを細胞タンパク質の量に対して標準化（ nmol/mg タンパク質として濃度をシン濃度の減少が観察された（ Fig. 2B）．対照的に，試示した）し，菌種間で比較した．

験を行った 32 種のヒト腸内常在菌最優勢種のうち，13％に 相 当 す る 4 種（ Bacteroides intestinalis, Ruminococcus

BLAST 解析プ ロ テ イ ン BLAST（ BlastP ） 解 析(Camacho et al.,obeum, Clostridium scindens および Enterococcus faecalis ）において，増殖期あるいは定常期の培養上清中のプトレッ

2009)を，全ての腸内細菌種のゲノムに対して実施した．

シン濃度は培養開始時と比較して増加した（ Fig. 2B ）．

実験によって機能が実証されたタンパク質を，BlastP 解

また，試験を行った 32 種のヒト腸内常在菌最優勢種の

析のためのクエリータンパク質として使用した

うち，16 ％に相当する 5 種（ B. dorei, Bacteroides stercoris,（ Sugiyama et al., 2017）．BlastP 解析結果より 100，300，

Ruminococcus torques, Anaerotruncus colihominis お よ び

および 500 bit を超えるスコアを持つタンパク質を抽出し，色分けした（ Fig. 5 ）．

E. faecalis ）において，培養上清中のプトレッシン濃度が増殖期から定常期へかけて増加した（ Fig. 2B ）．

統計

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるスペルミジン生合成

値は平均値 ± 標準偏差（ S.D. ）として示した．SPSS®

と輸送

ソフトウェアバージョン 21（ IBM ）を用いて有意差検定を行った．

結細胞内スペルミジンの存在についてはプトレッシンについて用いたものと同じ基準で判定を行った．試験した
32 種のヒト腸内常在菌叢最優勢種のうち，スペルミジ

果ンが検出されなかった D. formicigenerans と Collinsella

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるプトレッシン生合成と輸送
ヒト腸内常在菌叢最優勢種の細胞中のプトレッシン濃aerofaciens を除き，増殖期あるいは定常期において細胞内にスペルミジンが検出された（ Fig. 3A ）．この中で，C.
nexile の細胞内スペルミジン濃度は非常に低かった（ 7.3± 5.2 nmol/mg タンパク質）（ Fig. 3A ）．

度を細胞タンパク質レベルに対して標準化し，nmol/

培養上清中のスペルミジン濃度の変化は，もともとmg タンパクとして示した．細胞内プトレッシン濃度

GAM に含まれていたスペルミジン濃度（ 24.6 ± 1.0 μM，（ nmol/mg タンパク）の値（平均 - S.D. ）がゼロより大Fig. 3B の灰色の帯として示した）とサンプル中のスペ

きい場合，細菌は細胞内にプトレッシンを有すると判断

ルミジン濃度とを比較することによって計算した．こした．この基準に基づいて，32 の試験したヒト腸内常れまでにスペルミジンが細胞外で分解されることを証

在菌叢最優勢種のうち 5 種（ 16 ％）（ Bacteroides ovatus，

明する報告はないため，培養上清中のスペルミジンレ

Bacteroides xylanisolvens, Bacteroides finegoldii, Clostridium

ベルの減少は，培養した細菌によるスペルミジンの取り

asparagiforme および Ruminococcus lactaris ）では，増殖期または定常期，あるいは，増殖期・定常期双方で，細込みに起因すると考えられた．試験を行った 32 種のヒ

胞内にプトレッシンを有していた．ただし，B. xylanisolvens（ Bacteroides caccae, Bacteroides thetaiotaomicron,の細胞内プトレッシン濃度は非常に低かった（ 0.56 ±Bacteroides vulgatus, Bacteroides ovatus, B. xylanisolvens,

0.39 nmol/mg タンパク質）（ Fig. 2A ）．

B. dorei, B, stercoris, B. finegoldii, Bacteroides fragilis, P.

ト腸内常在菌最優勢種のうち，69 ％に相当する 22 種

培養上清中のプトレッシン濃度の変化は，もともとjohnsonii, Dorea longicatena, Dorea formicigenerans,

GAM に含まれていたプトレッシン濃度（ 73.5 ± 3.7 μM,

Ruminococcus gnvaus, Roseburia intestinalis, Coprococcus

Fig. 2B の灰色の帯として示した）とサンプル中のプト

comes, Clostridium nexile, C. asparagiforme, Clostridium

レッシン濃度とを比較することによって計算した．これ

scindens, R. lactaris, A. colihomihis, Pseudoflavonifractor

までにプトレッシンが細胞外で分解されることを証明す
る報告はないため，培養上清中のプトレッシンレベルの

capillosus および E. faecalis ）において，増殖期または定常期で培養上清中でのスペルミジン濃度の減少が観察さ減少は，培養した細菌によるプトレッシンの取り込みにれた（ Fig. 3B ）．試験を行った 32 種のヒト腸内常在菌− 82 −

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるポリアミン輸送および生合成の包括的分析：新規ポリアミン代謝および輸送遺伝子の存在の可能性

Figure 2. P utrescine concentration in culture supernatants and cells of dominant human gut bacteria.
(A) Intracellular putrescine concentrations in dominant human gut bacteria in growing and stationary phases. The amount of
putrescine in the cell was quantified by HPLC and normalized to the cellular protein concentration. White bars show putrescine
concentrations in the growing phase, black bars show those in the stationary phase. Data are represented as mean±S.D. (n = 3).
(B) Putrescine concentration in culture supernatants of gut bacteria in the growing and stationary phases. Gray bands indicate the maximum and minimum putrescine concentration values in GAM (n = 3). White bars show the putrescine concentrations in growing phase, and black bars show those in the stationary phase. Data are mean±S.D. (n = 3). *p < 0.01 (Dunnett＇s
test in comparison with GAM). †p < 0.01 (two-tailed unpaired t-test). The number shown before the species name indicates theorder of gut bacterial occupancy (Qin et al., 2010).

− 83 −

杉山

Figure 3.

友太，阪中

幹祥，栗原

新

Spermidine concentration in culture supernatants and cells of dominant human gut bacteria.
(A) Intracellular spermidine concentration in the gut bacteria in the growing and stationary phases. The amount of spermidine
in the cell was quantified by HPLC, and normalized to the cellular protein concentration. White bars indicate spermidine concentrations in the growing phase, black bars indicate those in the stationary phase. Data are represented as mean±S.D. (n = 3).
(B) Spermidine concentration in the culture supernatant of the gut bacteria in the growing and stationary phases. The grayband indicates the maximum and minimum spermidine concentrations in GAM (n = 3). White bars show the spermidine
concentrations in the growing phase, black bars show those in the stationary phase. Data are represented mean±S.D. (n = 3).
*p < 0.01 (Dunnett＇s test in comparison with GAM). †p < 0.01 (two-tailed unpaired t-test). The number shown before the speciesname indicates the order of gut bacterial occupancy (Qin et al., 2010).

− 84 −

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるポリアミン輸送および生合成の包括的分析：新規ポリアミン代謝および輸送遺伝子の存在の可能性

最 優 勢 種 の う ち，13 ％ に 相 当 す る 4 種（ B. dorei, D.

込みタンパク質）および PotFGHI（プトレッシン取り

formicigenerans, R. torques および Blautia hansenii ）において，培養上清中のスペルミジン濃度が増殖期から定常

込みタンパク質）が保存されており，CASDC（カルボ期へかけて増加した（ Fig. 3B ）．また，試験を行った 32

ボキシスペルミジンデヒドロゲナーゼ）は，多くのヒト

種のヒト腸内常在菌最優勢種のうち，31 ％に相当する

腸内常時菌叢最優勢種に保存されていた．また，
SpeA（アキシスペルミジンデカルボキシラーゼ），CASDH（カル10 種（ Bacteroides uniformis, B. intestinalis, P. merdae, P.

ルギニンデカルボキシラーゼ），NCPAH（ N -カルバモ

distasonis, R. torques, R. obeum, Bl. hansenii, Eubacterium

イルプトレッシンアミドヒドロラーゼ）は主に

siraeum, Eubacterium ventriosum および Co. aerofaciens ）では，GAM に含まれるスペルミジン濃度と増殖期・定Bacteroides 属および Parabacteroides 属細菌によく保存されていた．一方で，SapBCDF（プトレッシンエクスポー

常期双方のスペルミジン濃度間で有意差は認められなタ ー），SpeB（ ア グ マ チ ン ウ レ オ ハ イ ド ロ ラ ー ゼ ），かった（ Fig. 3B ）．

AAT（アグマチンアミノプロピルトランスフェラーゼ），
APAUH（アミノプロピルアグマチンウレオハイドロラー

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるスペルミン生合成とゼ），SpeE（スペルミジンシンターゼ），AguB（ N -カル

輸送

バモイルプトレッシンアミドヒドロラーゼ）は Bacteroides

細胞内スペルミンの存在についてはプトレッシンについて用いたものと同じ基準で判定を行った．試験し属および Parabacteroides 属細菌以外の腸内細菌によく保存されていた．

た 32 種のヒト腸内常在菌叢最優勢種のうち 41 ％に相当

大腸菌において機能報告のある AdiA（アルギニンデ

する 13 菌種（ B. vulagus, B. xylanisolvens, B. intestinalis,

カルボキシラーゼ），SpeC および SpeF（いずれもオル

B. fragilis, P. merdae, D. longicatena, D. formicigenerans,

ニチンデカルボキシラーゼ），PuuP（プトレッシン取り

R. torques, R. obeum, R. gnavus, Eu. siraeum, Eu. ventriosum
および Ps. capillosus ）で，増殖期あるいは定常期におい込みタンパク質）および MdtJI（スペルミジンエクスポーて ス ペ ル ミ ン が 検 出 さ れ た（ Fig. 4A ）． し か し，B.

そのホモログは殆どあるいは全く見いだされなかった．

ター）についてはヒト腸内常在菌最優勢種のゲノム中にvulgatus, B. xylanisolvens, B. fragilis, P. merdae の細胞内ス
ペルミン濃度は非常に低かった（ ≤ 3.2 nmol/mg タンパ

考ク質）（ Fig. 4A ）．

察

培 養 上 清 中 の ス ペ ル ミ ン 濃 度 の 変 化 は， も ともと本研究で培養を行ったヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種

GAM に 含 ま れ て い た ス ペ ル ミ ン 濃 度（ 8.4±0.4 μM,の細胞内および培養上清のポリアミン解析の結果と，Fig. 4B の灰色の帯として示した）とサンプル中のスペ

BlastP 解析による既知ポリアミン代謝系・輸送系を構成

ルミン濃度とを比較することによって計算した．プト

するタンパクホモログの有無の判定結果を統合し，矛盾

レッシン，スペルミジンと同様，これまでにスペルミン

点を抽出する手法で，未知のポリアミン代謝系・輸送系

が細胞外で分解されることを証明する報告がないため，の存在を推定した．例えば，スペルミジン取り込みが観培養上清中のスペルミンレベルの減少は，培養した細菌

察された菌種において既知のスペルミジン取り込みタンによるスペルミンの取り込みに起因すると考えられた．

パクのホモログが存在しない場合は，この菌が未知のス試験を行った 32 種のヒト腸内常在菌最優勢種のうち，ペルミジン取り込みタンパクを有していると推定した．

P. merdae を除き，増殖期または定常期で培養上清中でのスペルミン濃度の減少が観察された（Fig. 4B ）．また，

この結果，ヒト腸内常在菌叢最優勢 32 種のうち，新規
ポリアミン取り込み系を持つと推定されるものが少なく試験を行った 32 種のヒト腸内常在菌最優勢種のうち，とも 2 菌種（ Eu. siraeum, Col. aerofaciens ），新規ポリア

9 ％に相当する 3 種（ B. stercoris, D. longicatena およびミン放出系を持つと推定されるものが少なくとも 6 菌種

R. torques ）において，培養上清中のスペルミン濃度が増殖期から定常期へかけて増加した（ Fig. 4B ）．

（ B. dorei, B. stercoris，D. longicatena, D. formicigenerans,

ヒト腸内常在菌叢最優勢種における既知のポリアミン生longicatena, P. merdae および Eu. ventriosum ）存在した（ Fig. 6 ）．以上の見積もりは，一つの菌種が重複した機

合成および輸送タンパクの存在

R. torques および Bl. hansenii ），新規ポリアミン合成系
を 持 つ と 推 定 さ れ る も の が 少 な く と も 3 菌 種（ D.

BlastP 解析を用いて，ヒト腸内常在菌叢最優勢種にお能を持つ遺伝子を持たないと仮定して行われたため（例

ける既知のポリアミン生合成または輸送タンパクの有無

えば，ポリアミンの取り込みが観察された菌種のゲノムを判定した（ Fig. 5 ）．ほとんどすべてのヒト腸内常在にポリアミン取り込み系のホモログが一つでも存在すれ

菌叢最優勢種において，PotABCD（スペルミジン取りば新規のものはないと仮定して見積もりを行った．），重− 85 −

杉山

Figure 4.

友太，阪中

幹祥，栗原

新

Spermine concentrations in culture supernatants and cells of the dominant human gut bacteria.
(A) Intracellular spermine concentration in the gut bacteria in the growing and stationary phases. The spermine in the cell
was quantified by HPLC, and normalized to the cellular protein concentration. White bars show spermine concentrations in
the growing phase, black bars show those in the stationary phase. Data are represented as mean±S.D. (n = 3).
(B) Spermine concentration in the culture supernatant of the gut bacteria in growing and stationary phases. The gray band
indicates the maximum and minimum spermine concentrations in GAM (n = 3). White bars show the spermine concentrationsin the growing phase; black bars show those in the stationary phase. Data are represented as mean±S.D. (n = 3). *p < 0.01
(Dunnett＇s test in comparison with GAM). †p < 0.01 (two-tailed unpaired t-test). The number shown before the species nameindicates the order of gut bacterial occupancy (Qin et al., 2010).86− 86 −

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるポリアミン輸送および生合成の包括的分析：新規ポリアミン代謝および輸送遺伝子の存在の可能性

Figure 5.

Occurrence of homologous proteins responsible for synthesis and transport of polyamines in the genomes of dominanthuman gut bacteria.
The BlastP analysis was performed against the genomes of the dominant human gut bacteria using query proteins listed in
Supplementary Table S1. Black, dark gray, light gray, and white boxes indicate the result of homologs with scores > 500 bits,
between 300 and 500 bits, between 100 and 300 bits, and < 100 bits, respectively. The number shown before the species nameindicates the order of gut bacterial occupancy in a ＂human gut microbial gene catalog＂(Qin et al., 2010).

− 87 −

杉山

Figure 6.

友太，阪中

幹祥，栗原

新

Novel polyamine biosynthetic proteins and transporters expected to exist in the tested dominant human gut bacteria.
The presence of novel polyamine biosynthetic proteins and transporters was predicted from the changes in polyamine
concentrations in the culture supernatants and cells and the presence or absence of homologs of known polyamine biosynthetic proteins and transporters. Presence or absence of novel polyamine biosynthetic proteins and transporters is indicatedby the color of boxes; gray boxes indicate presence and white boxes indicate absence. The number shown before the speciesname indicates the order of gut microbial occupancy in a ＂human gut microbial gene catalog＂ (Qin et al., 2010).

要複した機能を持つ遺伝子の存在の可能性を考慮した場合
は，さらに多くの機能未知遺伝子が存在することが考え約られる．これらの機能未知遺伝子を解明し，その機能を近年，結腸内腔のポリアミンが動物の健康に影響を与制御することができれば，ヒト腸管内腔のポリアミン濃える可能性が報告されており，これらのポリアミンは腸度を最適化し，ヒト健康寿命を延伸することが可能とな内細菌によって産生されることが知られている．本研究

ると考えられる．

では，増殖期および定常期におけるヒト腸内常在菌叢最− 88 −

ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるポリアミン輸送および生合成の包括的分析：新規ポリアミン代謝および輸送遺伝子の存在の可能性

優勢 32 種の細胞内および培養上清中のポリアミン（プmetabolism and transport genes. Int. J. Biochem. Cell Biol.
93: 52-61.

トレッシン，スペルミジン，およびスペルミン）の濃度を測定した．これらのポリアミン濃度の定量結果を，ゲ謝

ノム情報から推測される生合成酵素・トランスポーターの有無と組み合わせることにより，多くの未知のポリア

辞ミン生合成酵素およびトランスポーターがヒト腸内常在

本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成に

菌叢最優勢種に存在することが示された．これらの機能

よって開設された腸内細菌共生機構学寄付講座において未知遺伝子を解明し，その機能を制御することができれ行われたものである．本助成を賜った発酵研究所に対しば，ヒト腸管内腔のポリアミン濃度を最適化し，ヒト健てここに厚く御礼申し上げます．本寄附講座世話人であ康寿命を延伸することが可能となると考えられる．

る石川県立大学・熊谷英彦参与のご支援とご協力に感謝の意を表します．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 奈良 未沙希，片山 高嶺，栗原 新. 2015. ヒト腸内細菌優占種の菌体内および培養上清におけるポリアミン解析. 日本
ポリアミン学会第6回年会. 1月19日. 東京.
2) 栗原 新，松本 光晴，鈴木 秀之. 2015.腸内細菌のポリアミン代謝，輸送系同定の重要性. 日本農芸化学会2015年度大会「ポリアミン研究のさらなる発展と新たな展開をめざした農芸化学と医学薬学との融合」シンポジウム. 3月29
日. 岡山.
3) 栗原 新，奈良 未沙希，白石 友香，片山 高嶺. 2015. 腸内細菌の新規ポリアミン合成系，輸送系同定の重要性. 2015年度 日本乳酸菌学会泊まり込みセミナー. 5月14日. 南あわじ.
4) Nara, M, Katayama, T., Kurihara, S. 2015. Analysis of polyamine in the culture supernatant and cells of major humanintestinal bacteria. ポリアミンに関するゴードン研究会議.
6月15日. 米国，ニューハンプシャー州.
5) Kurihara, S., Nara, M., Shiraishi, Y., Katayama, T. 2015.
Construction of screening system for novel polyamine
biosynthetic pathway of major intestinal bacteria. 2015. ポリ
アミンに関するゴードン研究会議. 6月15日. 米国，ニュー
ハンプシャー州.
6) 栗原 新，奈良 未沙希，白石 友香，杉山 友太，片山 高嶺.
2015. ヒト腸内細菌最優勢種のポリアミン輸送能，合成能の網羅的解析. 2015年度日本農芸化学会中部，関西支部合同大会（中部支部第 174 回例会，関西支部第 491 回講演会）. 9月19日. 射水.
7) 奈良 未沙希，杉山 友太，阪中 幹祥，奥田修二郎，片山
高嶺，栗原 新. 2017. ヒト腸内細菌最優勢種の菌体内および培養上清における生育段階別のポリアミン解析と新規
ポリアミン合成，輸送系存在についてのin silico予測. 日本
農芸化学会大会2017年度大会. 3月19日. 京都.
8) 奈良 未沙希，杉山 友太，阪中 幹祥，奥田 修二郎，片山
高嶺，栗原 新. 2017. ヒト腸内細菌最優勢種の菌体内および培養上清における生育段階別のポリアミン解析. 日本ポリアミン学会第8回年会. 1月20日. 習志野.
原著論文
1) Sugiyama, Y., Nara, M., Sakanaka, M., Gotoh, A., Kitakata,A., Okuda, S. & Kurihara, S. 2017. Comprehensive analysisof polyamine transport and biosynthesis in the dominanthuman gut bacteria: potential presence of novel polyamine

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− 89 −

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− 90 −

IFO Res.Commun. 33
91-103, 2019

中性の生育条件下で機能する大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定
杉山

友太，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Identification of SapBCDF as a novel putrescine exporter of Escherichia coli
Yuta Sugiyama, Mikiyasu Sakanaka, Takane Katayama, Shin Kurihara
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
It has been reported that polyamines present in the intestinal tract at a concentration of several hundreds of μM
and have an important influence on host health. Intestinal polyamines are produced and released by gut bacteria.
In Escherichia coli, a model of gut bacteria, PotE which is a polyamine-releasing system that responds to acid stresshas been reported so far. However, even under neutral growth conditions, E. coli extracellularly release putrescine.
In this study, we identified a novel putrescine exporter of E. coli that function under neutral growth conditions. The
screening was performed using a gene knockout collection of E. coli, and sapD and sapF which are components ofsapABCDF operon were estimated to encode putrescine excreted protein or a part of it. Deletion of sapBCDF
significantly decreased putrescine levels in the culture supernatant, and complementation of the deletion mutant
with the sapBCDF genes restored putrescine levels in the culture supernatant. Furthermore, the concentration of
stable isotope labeled putrescine derived from stable isotope labeled arginine added to the media was depended on
sapBCDF presence in E. coli. From these results, we concluded that SapBCDF exported putrescine from E. coli
cells to culture supernatant.
Key words: putrescine, polyamine, Escherichia coli, gut bacteria

E-mail:
杉山友太（ sugiyama.yuta.6s@kyoto-u.ac.jp ）（ 現 所 属: 京 都 大
学大学院農学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
阪中幹祥（ miksak@dtu.dk ）（現所属:National Food Institute,
Technical University of Denmark. Kemitorvet 2800
Kgs. Lyngby, Denmark ），片山高嶺（ takane@lif.kyoto-u.ac.jp ）（現所属:京都大学大学院
生命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属:近畿大学生
物理工学部 〒 649-6493 和歌山県紀の川市西三谷
930 ）
共同研究者
中村篤央（協同乳業株式会社），
松本光晴（協同乳業株式会社），
神戸亜也香（京都工芸繊維大学応用生物学系），
東 恭平（千葉大学大学院薬学研究科，
現 東京理科大学薬学部），
五十嵐一衛（アミンファーマ研究所），
鈴木秀之（京都工芸繊維大学応用生物学系）

緒言

ポリアミンは，構造中に 2 つ以上のアミノ基を有する
脂肪族アミンであり，主なものにプトレッシン , スペル
ミジンおよびスペルミンが存在する．ポリアミンは真核
細 胞 か ら 原 核 細 胞 ま で 広 く 分 布 し（ Tabor & Tabor,
1985; Wortham et al., 2007; Pegg, 2009; Tiburcio et al.,2014 ），細胞内で核酸などのポリアニオンに結合し，タンパク質および核酸の合成を促進し，増殖因子として重要な役割を果たしていると考えられている(Pegg, 2009;
Tiburcio et al., 2014）．実際，活発に増殖している細胞（対数増殖期の細菌など）において，ポリアミンは最大数
10 mM と い う 高 濃 度 で 存 在 し て い る（ Igarashi &Kashiwagi, 2000 ）．
動物の腸管内にもポリアミンは存在しており，これは腸内細菌由来であると報告されている（ Matsumoto et− 91 −

杉山

友太，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

al., 2012 ）．さらに，腸管内のポリアミンが動物の健康に影響を与えることが近年報告されている（ Goodwin et

et al., 2006 ）を用いたゲノムワイドスクリーニングを行い，sapBCDF オペロンが中性の生育条件下でのプトレッ

al., 2011; Matsumoto et al., 2011; Kibe et al., 2014 ）．例えば，腸管病原性の Bacteroides fragilis による結腸腫瘍形

シン排出に寄与していることを遺伝子レベルで実証した．

実験方法

成への寄与（ Goodwin et al., 2011 ）が報告されている一方で，腸管内腔のポリアミンが宿主に好影響を与えることも報告されている．例えば，マウスモデルにおいて大使用菌株および使用プラスミド

腸内腔で腸内細菌によって産生されるポリアミンを増加

本研究で使用した菌株とプラスミドを Table 1 に示しさせることで，老化が遅延することが報告されている

た．ただし，Keio コレクション（ Baba et al., 2006 ）を（ Matsumoto et al., 2011; Kibe et al., 2014 ）．

用いたプトレッシンエクスポーターのスクリーニングにところで，生理的 pH ではポリアミンは正に荷電して使用した株は Sugiyama et al.(2016)にすでに報告した．

おり親水性であることから，拡散により疎水性である細SK623（ MG1655 ΔpuuP::FRT ） は Keio コ レ ク シ ョ ン

胞膜を透過することはできない．したがって，細菌はポ（ Baba et al., 2006 ）の JW1289 をドナーとして用いた P1

リアミンの取り込みと排出を行う際にポリアミントラン

transduction 法（ Miller, 1972 ） に よ り，ΔpuuP::FRT-

スポーターを必要とする．したがって，腸管内のポリア
ミン濃度は腸内細菌のポリアミントランスポーターを介

kan+-FRT を，MG1655 に 導 入 し た 後 に， プ ラ ス ミ ド
pCP20（ Datsenko & Wanner, 2000 ）を用いて kan+ 遺伝

した取り込みと排出のバランスにより決定されるといえる．

子 を 除 去 す る 手 法 で 作 出 し た．speB，speC お よ び

モデル腸内細菌の一つである大腸菌では，これまでに5 つのポリアミントランスポーターが同定されている．

sapBCDF の遺伝子破壊は pKD3 もしくは pKD13 を用いて，Datsenko & Wanner の方法（ 2000 ）に従い行った．

PotFGHI は， プ ト レ ッ シ ン を 取 り 込 む ATP-binding

相補プラスミド（ pACYC184-sapB +C + D+ F + ）は MG1655

cassette（ ABC ）トランスポーターであり（ Pistocchi etのゲノム DNA を鋳型とした PCR により sapB の上流領

al., 1993 ），PotABCD は，スペルミジンに高く，プトレッ
シンに低い親和性を示す ABC トランスポーターである

域 500 bp を含む DNA 断片を増幅し，増幅断片を HindIII（ Furuchi et al., 1991 ）．PuuP は，プロトン駆動型のプ

シークエンス解析によりクローニングした DNA 断片に

トレッシンインポーターであり，大腸菌がプトレッシン

変異がないことを確認した．

および SphI で消化した pACYC184 に挿入し作製した．

を唯一の炭素源あるいは窒素源とした条件下で生育する
際に必須のトランスポーターである（ Kurihara et al.,培地および培養条件

2009 ）．PlaP は，大腸菌が表面運動性を示す際に重要な遺伝子操作時の培養，および，種々のアッセイ時の前培養

プロトン駆動型のプトレッシンインポーターである

は，Luria-Bertani（ LB ）培地（ BD Difco ）を用いて行った．

（ Kurihara et al., 2011 ）．PotE は中性 pH の生育環境下でM9+トリプトン培地（ M9 最少培地の炭素源としてはプロトン駆動型のプトレッシンインポーターとして機グルコースの代わりに 1 ％バクト -トリプトンを使用し能するが，酸性 pH の生育環境下ではオルニチンを取りた培地）（ Kurihara et al., 2005 ）を抗菌ペプチドアッセ

込み，プトレッシンを排出するプトレッシン / オルニチ

イおよび菌株の培養上清のプトレッシン濃度の解析に使

ンアンチポーターとして機能し，PotE は大腸菌の酸性用した．

環境への適応に寄与していると考えられている

puuP はコハク酸によって負に調節される（ Kurihara（ Kashiwagi et al., 1992; Kashiwagi et al., 1997 ）．一方で，大腸菌は中性の生育環境下においても PotE 非依存的にet al., 2010 ）．そこで，染色体上に puuP を有する株の培
養上清中のプトレッシン濃度を解析する際は，培養上清

プトレッシンを培養上清に放出することが報告されてい中に排出されたプトレッシンの取り込みを抑制する目的る（ Schiller et al., 2000 ）．これは，大腸菌が中性の生育で，コハク酸ナトリウムを M9+トリプトン培地に終濃環境下でプトレッシンを排出するプトレッシンエクス

度 0.2 ％となるよう添加して培養した（この培地を M9

ポーターを有していることを示唆している．

+トリプトン+コハク酸培地とした）．培養上清中の安

腸管内のポリアミン濃度を制御する上で，宿主に重要

定同位体標識プトレッシン濃度の分析のために，安定同な影響を与える腸管内のポリアミン源である腸内細菌の位体標識アルギニンを終濃度 1 mM となるよう M9+ト

ポリアミン代謝，特にポリアミンの排出を分子レベルでリプトン培地に添加した．

理解することは，極めて重要であるといえる．本研究で培養上清中のプトレッシン濃度を測定する実験においは，腸内細菌の一種である大腸菌の新規プトレッシンエて，前培養は 100 mL 容の三角フラスコへ 10 mL の適切

クスポーターを同定するため Keio コレクション（ Baba

な抗生物質を含む LB 培地を添加し，37 ℃で 140 rpm で− 92 −

中性の生育条件下で機能する大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定
Table 1

Strains and plasmids used in this study.

振盪培養した．本培養は 300 mL 容の三角フラスコへた 系 を 用 い た．100 μL の LB 培 地 を 6.9 mL の 10 mM リ

60 mL の培地を添加し，初期 OD600 が 0.03 となるよう前ン酸ナトリウム緩衝液（ pH 7.4 ）に添加することでアッ培養液を加え，37 ℃で 140 rpm で振盪培養した．

セイ培地を調製し，37℃に加温し使用した．MG1655 お

Keio コレクションを用いたプトレッシンエクスポー

よび YS40 を，M9+トリプトン培地中で 140 rpm，37 ℃

ターのスクリーニング時は，20 mL 試験管へ 5 mL の M9で 4 時間培養した．培養後，細胞を氷冷 10 mM リン酸+トリプトン + コハク酸培地を添加し，37 ℃，140 rpm

ナトリウム緩衝液（ pH 7.4 ）で洗浄し，5×106 cells/mL

で 6 時間振盪培養を行った．

となるように 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液（ pH 7.4 ）で再懸濁した．10 μL の細胞懸濁液，5 μL の LL-37 溶液，

抗菌ペプチドアッセイ

および 35 μL のアッセイ培地を混合し，37 ℃で 2 時間イ

抗 菌 ペ プ チ ド LL-37 に 対 す る MG1655 お よ び YS40

ンキュベートした．450 μL の氷冷 150 mM 塩化ナトリウ（ MG1655 ΔsapBCDF::FRT-Kan -FRT ）の感受性を評価

ムを添加することで反応を停止した．反応混合物を氷冷するために，Harwig et al.(1994 ）の方法を一部改変し10 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4 ）で段階希釈し，r− 93 −

杉山

友太，阪中

幹祥，片山

LB 寒天培地に塗布した．プレートを 37 ℃で 22 時間イ

高嶺，栗原

新

を 500 μL 分注し，内部標準として 0.01 ％（ w/v ）1,6 - ヘ

ンキュベートし，colony forming unit（ cfu ）を算出した．

キ サ ン ジ ア ミ ン（ Kanto Chemical ） を 10 μL 添 加 し，生存率は，LL-37 で処理した細胞の cfu を LL-37 未処理

5 M NaOH で pH 11 ± 0.5 に調整した．ポリアミンのアの細胞の cfu で割ることで算出した．

ミノ基を N - エトキシカルボニル化する目的で，50 μL のエ チ ル ク ロ ロ ホ ル メ ー ト（ Kanto Chemical ） を 含 む

ポリアミン定量

1 mL のジエチルエーテルをサンプル溶液に添加した．

ポリアミン濃度は高速液体クロマトグラフィー

混 合 物 を 室 温 で 30 分 間 振 と う し た 後，4 ℃ で 5 分 間（HPLC ）により定量した．HPLC 分析および試料調製は，

15,000 ×g で遠心分離した．ポリアミン N - エトキシカ

以前に報告した方法と同様に行った（ Sakanaka et al.,

ルボニル誘導体を含有するジエチルエーテル層をスク2016 ）．

リューキャップ付きのガラス管に移した．この誘導体化

培養上清サンプルの調製について，培養液 500 μL を

反応を，50 μL のエチルクロロホルメートを含有する

遠心分離し（ 18,700 ×g，4 ℃，5 分），上清を回収した．

1 mL のジエチルエーテルを遠心後の水層へ添加し再抽

タ ン パ ク 質 を 除 去 す る た め に， 上 清 の 1/10 容 量 の出することによって繰り返した．2 回の抽出で得られた

100 ％（ w/v ）トリクロロ酢酸を添加し，ボルテックス

ジエチルエーテル層を合一し，そして乾燥窒素流下で乾によりよく混合し，遠心分離した（ 18,700 ×g，4 ℃，5

燥した．乾燥 N - エトキシカルボニルポリアミン誘導体

分）．遠心分離後，上清を回収し，HPLC に供した．細を 100 μL の酢酸エチルで溶解し，ここに 200 μL の無水

胞内ポリアミン測定用サンプルの調製では，OD600 = 0.5（ 2トリフルオロ酢酸（ Sigma-aldrich ）を加えた．密封ガ

時間培養したサンプル）または OD600 = 1（ 4 ～ 24 時間培

ラス管内の混合物を 75 ℃の加熱ブロック上に 1 時間置養したサンプル）あたり 500 μL の培養液を回収，遠心き，トリフルオロアセチル化反応を行い，次いで乾燥窒分離（ 18,700 ×g，4 ℃，5 分）し，ペレットを 1 mL の素流下で完全に乾燥させた．誘導体を 200 μL の酢酸エ

氷冷したグルコース含まない M9 最少培地で洗浄した．

チルで再懸濁し，2 μL を GC-MS に供した．GC-MS 分析

洗浄後，ペレットを 300 μL の 5 ％（ w/v ）トリクロロ酢

は，キャリアガスとしてヘリウムを使用し，Equity-5 キャ

酸で懸濁し，100 ℃で 15 分間煮沸し細胞を破壊した．煮

ピラリーカラム（ 30×0.25 mm，膜厚 0.25 μm，Sigma-

沸後，懸濁液を遠心分離（ 21,500 ×g，4 ℃，15 分）し，

aldrich ）を用いて行った．注入器および供給源の温度

上清を Cosmonice フィルター W（Nacalai Tesque）でフィはそれぞれ 260 および 150 ℃とした．GC のグラジエン

ルターろ過し HPLC 分析に供した．遠心時に沈殿したタ

トは 8 ℃/分で 140 ～ 190 ℃まで加熱し，続いて 4 分間保ンパク質は 300 μL の 0.1 N 水酸化ナトリウム溶液に溶解

持し，次いで 20 ℃/分で 300 ℃まで加熱し，続いて 4 分

し，Protein assay kit（ Bio-Rad ）を用いてタンパク質濃間保持した．最後に，20 ℃/分で 320 ℃まで加熱し，4度を定量した．得られたプトレッシン濃度はタンパク質

分間保持することで洗浄した．フラグメントイオンは濃度で正規化し，nmol/mg of total cell protein として表

selected ion monitoring mode で モ ニ タ ー し，m/z +355

した．

のイオンをプトレッシンの基本フラグメントとして使用した．抽出率および誘導体化率は 1,6 - ヘキサンジアミン

安定同位体標識プトレッシン定量を用いて標準化し，プトレッシン濃度は検量線を用いて安定同位体標識プトレッシンの量は，Chen らの方法定量した．

（ 2009 ）を一部改変しガスクロマトグラフィー - 質量分

結析（ GC-MS ）により行った．大腸菌株を安定同位体標識
L -13C5 , 15N4 アルギニン（ S.I.Arg，Wako Pure Chemicals ）を終濃度 1 mM となるよう添加した M9+トリプトン培

果

プトレッシンエクスポーターのスクリーニング

地 中 で 8 時 間 培養し た． 培養 上 清 に 対し て 1/10 量のプトレッシンエクスポーターをコードする遺伝子の欠100 ％（ w/v ）トリクロロ酢酸と混合してタンパク質を損株は，親株と比較して培養上清中のプトレッシン濃度沈殿させた．次いで，試料を遠心分離（ 18,700 ×g，4 ℃，が低くなる，という仮説を立てスクリーニングを行った．

35 分）し，600 μL の上清に 2 mL のジエチルエーテルをKeio コレクション（ Baba et al., 2006 ）より物質輸送系

添加し，1 分間ボルテックスすることで抽出を行った．

に関連あるいは化合物のトランスポーターとしてアノ

次いで，エマルジョンを遠心分離（ 18,700 ×g，4 ℃，5 分）

テーションが付けられている遺伝子の欠損株 123 株を入により分画し，脂質，炭水化物およびその他の夾雑物を手 し， 培 養 上 清 中 の プ ト レ ッ シ ン 濃 度 を 測 定 し た

含有するジエチルエーテル層を除き，そして水層へ再度（Fig. 1A; Sugiyama et al., 2016 ）．スクリーニングの結果，ジエチルエーテルを添加し，水層を洗浄した．この水層

ΔsapF 株（ JW1283 ）の培養上清のプトレッシン濃度が− 94 −

中性の生育条件下で機能する大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定

Fig. 1.

Putrescine concentrations of culture supernatant of screened strains and depiction of putative sapABCDF operon.
A, Putrescine concentrations of the culture supernatant of the screened strains. Bacterial strains were grown for 6 h at 37 ℃ withreciprocal shaking at 140 rpm in 5 ml of M9 + tr yptone + succinate medium in a 20-ml test tube. Culture supernatant was
harvested and subjected to HPLC analysis. Dots in the box plot indicate putrescine concentration of culture supernatant of tested
mutants. The concentrations of putrescine of culture supernatant of parental strain (BW25113), ΔsapD (JW1284), and ΔsapF(JW1283) are indicated as solid dots.
B, Location of putative sapABCDF operon. Locations and directions of genes are indicated by arrows, and the annotations ofgenes are indicated below the arrows. Locations of puuP encoding putrescine importer (Kurihara et al., 2009) and genes
encoding enzymes for putrescine degradation pathway, the Puu pathway (Kurihara et al., 2005; Kurihara et al., 2006; Kurihara etal., 2008; Kurihara et al., 2009; Kurihara et al., 2010; Nemoto et al., 2012), are indicated by arrows. Locations of predictedpromoters are shown by arrowheads; gray arrowheads indicate σ54, and black arrowheads indicate σ70. This figure is modified
from Figure 1 of Sugiyama et al. (2016).

− 95 −

杉山

友太，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

試 験 株 の 中 で 最 も 低 く（ 18.6 μM ）， 次 い で ΔsapD 株

MG1655 ΔsapBCDF ）を作製した．各株について，培養（ JW1284，25.5 μM ）であった．これらの値は，試験株上清および細胞内のプトレッシン濃度を経時的に定量しの親株（ BW25113，48.8 μM ）またはスクリーニング結た（ Fig. 3 ）．生育による影響を除くため，培養上清中の果の中央値（ 48.7 μM ）よりも低かった（ Fig. 1A ）．こプトレッシン濃度は細胞生育度（OD600 ）で（ μM/OD600 ），れらの結果より，sapD および sapF がプトレッシン排出

細胞内のプトレッシン量はタンパク質量で正規化したに寄与すると予想された．

（ nmol/mg protein ）．YS111 と YS112 の生育に差は認め

sapABCDF オペロン構成遺伝子の培養上清中のプトレッシン濃度への寄与

較してわずかに良かった（ Fig. 3A ）．YS111 と YS113 のin silico 解析により，sapD および sapF は sapA，sapB，大に達し，それぞれ 41.9 および 38.4 μM/OD600 であった

られなかったが，YS113 の生育は YS111 と YS112 と比培養上清のプトレッシン濃度は，培養開始 4 時間後で最

sapC，とともに sapABCDF オペロンを形成すると推測された（ Fig. 1B ）．大腸菌における sapABCDF の機能は（ Fig. 3B ）．その後，培養開始 12 時間後には培養上清中

不明であり，いずれも ABC トランスポーターの構成タ

YS112 の培養上清のプトレッシン濃度も培養開始 4 時間

ンパク質というアノテーションが付けられているのみで後に最大値を示したが，26.2 μM/OD600（親株の 63 ％）あった（ Fig. 1B ）．そこで，sapABCDF が新規プトレッシ
ンエクスポーターをコードすると考え，ΔsapA，ΔsapB おの プ ト レ ッ シ ン 濃 度 は 0 と な っ た（ Fig. 3B ）． 一 方，で あ っ た（ Fig. 3B ）．sapB +C +D+F +（ YS111 と YS113 ）株と sapBCDF 欠損株（ YS112 ）間で培養開始 2 および 4

よび ΔsapC 株の培養上清のプトレッシン濃度を測定した．

時間後の培養上清中のプトレッシン濃度に有意な差

ΔsapA 株の培養上清中のプトレッシン濃度（48.3 μM ）は，親株とほぼ同等であった．一方で，ΔsapB および ΔsapC（ p < 0.01 ）が認められた（ Fig. 3B ）．対照的に，細胞内株 の 培 養 上 清 の プ ト レ ッ シ ン 濃 度 は， 親 株 の 37 ％ら れ な か っ た（ Fig. 3C ）． 以 上 の 結 果 を 総 合 す る と，

（ 18.2 μM ）および 47 ％（ 23.4 μM ）であった（ Sugiyama

sapBCDF の欠損による培養上清のプトレッシン濃度の減少（ Fig. 3B ）がプトレッシン生合成量の減少による

et al., 2016 ）．これらの結果より，培養上清中のプトレッ
シン濃度の減少は，sapB，sapC，sapD，および sapF 遺のプトレッシン量は sapBCDF の有無による変化は認め

伝子の欠損により生じ，sapA は培養上清中のプトレッ
シンの減少に関与していないことが示された．
SapBCDF の抗菌ペプチド耐性への関与
Salmonella enterica sv. Typhimurium および Haemophilus
influenzae において SapABCDF が抗菌ペプチドを取り込
む ABC トランスポーターであり，抗菌ペプチド耐性に寄 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る（ Parra-Lopez et al.,
1993; Mason et al., 2006 ）．そこで，大腸菌においてもSapABCDF が抗菌ペプチド耐性に寄与していることが予測されたため，抗菌ペプチド LL-37 に対する野生型株（ MG1655 ） お よ び ΔsapBCDF 株（ YS40 ，MG1655
ΔsapBCDF ）の感受性を評価した（ Fig. 2 ）．この結果，いずれの株も LL-37 の濃度依存的に生存率が低下したが，MG1655 と YS40 の間で LL-37 に対する感受性に有Fig. 2.

意な差は認められなかった（ Fig. 2 ）．したがって，大腸菌において SapBCDF は抗菌ペプチド LL -37 に対する耐性に寄与していないことが示された．
sapBCDF の培養上清中のプトレッシン濃度への寄与
sapBCDF が培養上清中のプトレッシン濃度に与える影響を解析するために，親株 YS111（pACYC184/MG1655），
sapBCDF 欠損株 YS112（pACYC184/MG1655 ΔsapBCDF）
および sapBCDF 相補株 YS113（ pACYC184 - sapB +C +D+F +/− 96 −

Effect of the deletion of sapBCDF on resistance against
LL-37, an antimicrobial peptide.
Strains were incubated with different concentrations of
LL-37. After incubation, the cells were plated, and thenumbers of colonies were counted after incubation.
Survival ratios were calculated by dividing the colonyforming units of strains incubated with LL-37 by those
without LL-37. Closed and open squares indicate themean survival ratio of MG1655 (parental strain) and YS40
(sapBCDF deleted strain), respectively. Data are expressedas the mean±S.D. of three separated experiments. This
figure is modified from Figure 2 of Sugiyama et al.
(Sugiyama et al., 2016).

中性の生育条件下で機能する大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定

Fig. 3.

Effect of the deletion of sapBCDF on putrescine concentrations of culture supernatants. YS111 (parental strain), YS112(sapBCDF-deleted strain), and YS113 (sapBCDF-complemented strain) were grown in M9 + tr yptone + succinate medium
supplemented with 30 μg/mL chloramphenicol.
A, Growth curves of strains. Closed, open, and gray squares represent the mean OD600 values of YS111, YS112, and YS113,
respectively. Data are expressed as the mean±S.D. of three separate experiments.
B, Changes of putrescine concentration in the culture supernatant of strains. Cultures were taken at different times after inoculation, and putrescine concentrations of culture supernatant were measured by HPLC. Putrescine concentrations were normalized
by dividing the values of OD600. Closed, open, and gray squares represent the mean of normalized putrescine concentrations ofculture supernatant of YS111, YS112, and YS113, respectively. The means with different or the same letters are significantly
different or not significantly different, respectively (a versus b, p < 0.01; c versus d, p < 0.01 according to Tukey's test).
C, Changes of intracellular putrescine concentration of strains. Cells were harvested at the indicated times, and putrescine
concentrations in the cells were measured by HPLC and normalized to the amounts of protein in the cells. Closed, open, andgray squares represent the mean of normalized putrescine concentrations in the cell of YS111, YS112, and YS113, respectively.
Data are expressed as the mean±S.D. of three separate experiments. This figure is modified from Figure 3 of Sugiyama et al. (2016).

− 97 −

杉山

友太，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

ものではないことが示唆された．培養上清中のプトレッ

た結果，培養上清中のプトレッシン濃度は，や はり

シン濃度はいずれの株においても培養開始 4 時間後から

sapBCDF の存在に依存していた（ Fig. 4C ）．これらの結果は，sapBCDF が培養上清のプトレッシン濃度に対し急速に減少し始めた（ Fig. 3B ）．
我々は以前，培養上清中のプトレッシンの減少はプトて重要な役割を果たすことを示していた．

レッシンインポーター PuuP によるプトレッシンの取り込みにより引き起こされることを報告した(Kurihara etsapBCDF 欠損によるプトレッシンの取り込みへの影響
培養上清中のプトレッシン濃度はプトレッシン取り込al., 2009）．sapBCDF が培養上清中のプトレッシン濃度に与える影響をより明確に示すために，puuP 欠損を遺みの亢進によっても減少する．そこで，sapBCDF の欠伝子バックグラウンドに有する，SK627（ pACYC184/

損によりプトレッシン取り込みが促進した可能性を検証

MG1655 ΔpuuP ），SK628（ pACYC184/ MG1655 ΔpuuP

した．培養上清中のプトレッシンの減少の比較を容易に

ΔsapBCDF ）および SK634（ pACYC184 - sapB C D F /MG1655 ΔpuuP ΔsapBCDF ）を作製した．SK627 と SK634

するために，プトレッシン生合成酵素をコードする

+

+

+

+

の生育はほぼ同等であった．しかし，SK628 の生育度はspeB および speC を破壊することで大腸菌によるプト
レッシン産生を消失させた．すなわち，MG1655 ΔpuuP

SK634 の生育度と比較して減少した（ Fig. 4A ）．SK627

ΔspeB ΔspeC を 親 株 と し，YS233（ pACYC184/MG1655と SK634 の培養上清中のプトレッシン濃度は，培養開始後それぞれ 8 もしくは 10 時間で最大に達し，それぞれ 103.4 お よ び 83.6 μM で あ っ た（ Fig. 4B ）． 一 方 で，ΔpuuP ΔspeB ΔspeC ），YS234（ pACYC184/MG1655
ΔpuuP ΔspeB ΔspeC ΔsapBCDF）および YS235（pACYC184-

SK628 の培養上清中のプトレッシン濃度は，培養開始後

sapB +C +D+F +/MG1655 ΔpuuP ΔspeB ΔspeC ΔsapBCDF ）を作出し，100 μM のプトレッシンを添加した M9+トリ

12 時間で最大に達したが，わずか 33.6 μM（ SK627 のプトン培地で培養し，培養上清中のプトレッシン濃度を32 ％）であった（ Fig. 4B ）．培養上清中のプトレッシン

経時的に測定した．YS234 の生育は，YS233 と比較して濃度を OD600 の値で正規化（ μM/OD600 ）し比較を行っ

強く抑制され，YS234 の生育は回復した（ Fig. 5A ）．試Fig. 4.

Effect of the deletion of sapBCDF in ΔpuuP background on putrescine concentrations of culture supernatant.
SK627 (pACYC184/ΔpuuP, parental strain), SK628 (sapBCDF-deleted strain), and SK634 (sapBCDF-complemented strain) weregrown in M9 + tryptone medium supplemented with 30 μg/mL of chloramphenicol.
A, Growth curves of strains. Closed, open, and grey squares represent the mean of OD600 values of SK627, SK628, and SK634,
respectively. Data are expressed as the mean±S.D. of three separate experiments.
B and C, Changes of putrescine concentration of the culture supernatant of strains.
Cultures were taken at different times after inoculation, and putrescine concentrations of culture supernatant were measured by
HPLC (B). The putrescine concentrations were normalized by dividing the values of OD600 (C). Closed, open, and grey squares
represent the mean of normalized putrescine concentrations of culture supernatant of SK627, SK628, and SK634, respectively.
Data are expressed as the mean±S.D. of three separate experiments. This figure is modified from Supplementary figure S1 of
Sugiyama et al. (2016).

− 98 −

中性の生育条件下で機能する大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定

験菌株の培養上清中のプトレッシン濃度はいずれの株にターによって大腸菌に取り込まれ，SpeA（アルギニン

おいても経時的に減少したが，株間でのプトレッシン減

デカルボキシラーゼ）および SpeB（アグマチンウレオ

少量に有意差は認められなかった（ Fig. 5B ）．OD600 にヒドロラーゼ）により安定同位体標識プトレッシン

よって正規化されたプトレッシン濃度の減少（ μM/（ S.I.Put ）に代謝されると予想される．生じた S.I.Put がOD600 ）に関しても，培養開始 8 時間後で有意な差は認

SapBCDF によって大腸菌細胞内から培地に排出された

められなかった（ Fig. 5C ）．これは，sapBCDF の欠失お場合，培養上清中の S.I.Put の濃度は，sapBCDF の欠損

よび相補が培地からのプトレッシンの取り込みに影響し

お よ び 相 補 に よ り 変 化 す る と 予 想 さ れ る． そ こ で，なかったことを示唆する．まとめると，sapBCDF の欠SK627，SK628 および SK634 の培養上清中の S.I.Put 濃

失による培養上清のプトレッシン濃度の減少（ Figs. 3B,

度を測定した．この結果，SK627 の培養上清中の S.I.Put

4E および 4F ）は，プトレッシン取り込みの促進による濃度は 21.8 μM/OD600 であったのに対し，SK628 の培養結果ではなく，細胞内からのプトレッシン排出の減少によるものであると考えられた．

上清中の S.I.Put 濃度は 8.3 μM/OD600 であり，SK627 と比較して 62 ％減少した（ p < 0.01，Tukey test ）．SK634の 培 養 上 清 中 の S.I.Put 濃 度 は 16.9 μM/OD600 で あ り，

SapBCDF を介したプトレッシンの排出SK628 と比較して有意に高かった（ p < 0.01 ）（ Fig. 6B ）．

培養上清中のプトレッシンの増加が大腸菌細胞内から培養上清中の総プトレッシン濃度（ S.I.Put と未標識プの SapBCDF を介したプトレッシン排出に起因すること

トレッシンの合計）は，S.I.Put 濃度と同様の傾向を示を示すため，安定同位体標識アルギニン（ S.I.Arg ）をした（ Fig. 6B および 6C ）．試験した 3 株において，安用いたアッセイを行った．この実験の概略を Fig. 6A に定同位体標識および非標識プトレッシンの比率に差は認示した．すなわち，S.I.Arg はアルギニントランスポー

められず，sapBCDF の有無によるアルギニン代謝へのFig. 5.

Effect of the deletion of sapBCDF on putrescine uptake from the medium.
YS233 (pACYC184/ΔspeB ΔspeC ΔpuuP parental strain), YS234 (sapBCDF-deleted strain), and YS235 (sapBCDF-complemented
strain) were grown in M9 + tryptone medium supplemented with 30 μg/ml chloramphenicol and 100 μM putrescine, and growthof strains was measured OD600.
A, Growth curves of strains. Closed, open, and gray squares represent the mean of OD600 values of YS233, YS234, and YS235,
respectively. Data are expressed as the mean±S.D. of three separate experiments.
B, Uptake of putrescine from culture by tested strains. Cultures were taken at different times after inoculation, and putrescine
concentration of culture supernatant was measured by HPLC. Closed, open, and gray squares represent the mean of putrescine
concentration of culture supernatant of YS233, YS234, and YS235, respectively.
C, Decreases of putrescine in the culture supernatants of tested strains. First, a decrease of putrescine concentration during theculture was calculated by subtracting putrescine concentration ( μM) of culture supernatant at 8 h after inoculation from 100 μM,
which is the original putrescine concentration of the medium used in this experiment. Then, the decreases ( μM) were normalized
by dividing the values of OD600. Black, white, and gray bars represent the normalized decrease of putrescine concentration ofculture supernatant of YS233, YS234, and YS235, respectively. This figure is modified from Figure 4 of Sugiyama et al. (2016).

− 99 −

杉山

友太，阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

Fig. 6. Effect of the deletion of sapBCDF on the concentration of culture supernatant of stable isotope-labeled putrescine derived fromstable isotope-labeled arginine supplemented to the medium. SK627 (pACYC184/ΔpuuP, parental strain), SK628 (sapBCDFdeleted strain), and SK634 (sapBCDF-complemented strain) were grown in M9 + tryptone medium supplemented with 30 μg/ml
chloramphenicol and 1 mM S.I.Arg. Cultures were harvested at 8 h after inoculation. Analysis of S.I.Put of the culture supernatant
was performed by GC-MS, and putrescine concentration was quantified using a standard curve and internal standard methods.
Data are expressed as the mean±S.D. of three separated experiments.
A, Schematic illustration of the experiment. Gray circles indicate stable isotope-labeled atoms.
B and C, Concentration of S.I.Put (B) and total putrescine, and sum of S.I.Put and native putrescine (C) of culture supernatant of
SK627, SK628, and SK634. The columns with different letters are significantly different (a versus b, p < 0.01; a versus c, p < 0.05; b
versus c, p < 0.01 according to Tukey's test).
D, Ratio of S.I.Put to total putrescine of SK627, SK628, and SK634.
This figure is modified from Figure 5 of Sugiyama et al. (Sugiyama et al., 2016).

影響はなかったことが示唆された（ Fig. 6D ）．これらのる大腸菌のプトレッシンエクスポーターであることを明

結果より，SapBCDF を介したプトレッシン排出が生じらかにした．これまでに，大腸菌の MdtJI（ Higashi etていることが示された．

al., 2008 ） お よ び Bacillus subtilis の Blt（ Woolridge et考al., 1997 ）がスペルミジンエクスポーターとして報告され，さらに，Shigella flexneri では，MdtJI はプトレッシ

察

ンエクスポーターであることが報告されている（ Leuzzi

本研究では，SapBCDF が中性の生育条件下で機能す

et al., 2015 ）．これまでに，大腸菌は酸性の生育条件下− 100 −

中性の生育条件下で機能する大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定

で PotE を介してプトレッシンを培養上清へ排出するこ（ Lopatin et al., 1994; Liu et al., 2000; Vandenberg, 2008 ）．

とが報告されている（ Kashiwagi et al., 1997 ）．しかししたがって，大腸菌において，SapD の ATP アーゼ活性ながら，中性の生育条件下でも大腸菌が PotE 非依存的により駆動される TrkH および TrkG によるカリウム取にプトレッシンを培養上清に排出することが報告されてり込みと SapBCDF によるプトレッシン排出の間に関係おり（ Schiller et al., 2000 ），これは PotE 以外の新規プ性がある可能性が示唆された．

トレッシンエクスポーターが大腸菌に存在することを示

ポリアミンは細胞増殖に重要であるため，細菌の細胞唆していた．本研究により SapBCDF が大腸菌の中性の内のポリアミン濃度は対数増殖期で高く，定常期で低く生育条件下でのプトレッシン排出において主要な役割をなる（ Fig. 3C ）（ Igarashi & Kashiwagi, 2000; Sakanaka

果たすことが明らかとなった．

et al., 2016 ）．また，細胞内のポリアミンは分解と排出により減少する．Puu 経路は，定常期の初期に機能するエ ク ス ポ ー タ ー の 機 能 解 析 で は， 反 転 膜 小 胞（ Kashiwagi et al., 1992 ）またはエクスポーターを含む

プ ト レ ッ シ ン 分 解 経 路 で あ る（ Kurihara et al., 2005;

プロテオリポソームを使用するのが理想的である

Kurihara et al., 2006; Kurihara et al., 2008; Kurihara et al.,（ Sasahara et al., 2011 ）．しかしながら，調製の技術的な2009; Kurihara et al., 2010; Nemoto et al., 2012）．
プトレッ

困難さのためにこれらの方法を使用せずにエクスポー

シン排出を担う sapBCDF とプトレッシン分解に寄与すタ ー と 同 定 し た と い う 報 告 も 存 在 す る（ Pathania &る puu 遺伝子クラスターの制御が協調的に行われた場

Sardesai, 2015 ）．本研究では，反転膜小胞とプロテオリ

合，細胞内のプトレッシンは，対数増殖期から定常期にポソームが利用できなかったため，速度論的パラメータ

かけて大きく減少する．大腸菌の染色体上で sapBCDF

は決定できなかった．しかし，S.I.Arg を用いることで，遺伝子クラスターと puu 遺伝子クラスターは隣接して存

S.I.Arg から大腸菌の代謝により生じた S.I.Put 量を測定

在しているため（ Fig. 1B ），sapBCDF と puu 遺伝子クラすることでプトレッシンが SapBCDF によって細胞内かスターが協調的に機能し，対数増殖期から定常期にかけら培養上清へ排出されることを示した（ Fig. 6 ）．

て細胞内のプトレッシン量を制御していると予想される．

SapABCDF は γ-Proteobacteria 綱内でよく保存されて本研究において，プトレッシンの排出は，sapA の欠いる．これまでに，SapABCDF が LL-37，β -ディフェン

損 に よ り 阻 害 さ れ な か っ た（ Sugiyama et al., 2016 ）．

シンおよびプロタミンといったカチオン性抗菌ペプチド

SapA は ABC トランスポーターのペリプラズム基質結合

に対する細菌の耐性に寄与することが報告されている

タ ン パ ク 質 と し て ア ノ テ ー シ ョ ン さ れ て い る た め，

（ Parra-Lopez et al., 1993; Shelton et al., 2011）．Parra-

SapA が細胞内から培養上清へのプトレッシン排出に関

Lopez et al.,( 1993)は，S. enterica sv. Typhimurium

与していないことは論理的であるといえる．S. enterica

ΔsapABCDF 株が親株よりもプロタミンに対して感受性が高いことを報告し，S. enterica sv. Typhimurium は抗菌

sv. Typhimurium の sapABCDF はポリシストロニックなペプチドを細胞内に取り込みペプチダーゼで分解してい1993 ）．しかしながら，大腸菌 sapABCDF において推定るという仮説を立てた．この仮説は，
LL-37 と β -ディフェ

された sapA のプロモーターは sapBCDF と独立して位置

ンシンを用いて H. influenzae において実験的に証明されしており（ Fig. 1B ），さらに，推定 σ 因子に関してもて い る（ Shelton et al., 2011 ）． 大 腸 菌 と S. enterica sv.

sapA が σ 70 であったのに対し，sapBCDF は σ 54 であった．
これらの結果より sapA と sapBCDF が別々に発現する可Typhimurium の SapABCDF タンパク質は非常に高い相同性を有している（ SapA，90 ％ ; SapB，92 ％ ; SapC，発現をすることが報告されている（ Parra-Lopez et al.,

能性が強く示唆され，SapBCDF と SapA がそれぞれ異95 ％ ; SapD，96 ％ ; SapF，98 ％）．それにもかかわらず，な る 機 能 を 有 す る と 考 え ら れ た． 本 研 究 は，SapB，大腸菌の SapBCDF は抗菌ペプチド LL-37 に対する耐性

SapC および SapF の機能を同定した最初の報告として，に寄与しないことが示された（ Fig. 2 ）．

大腸菌の SapBCDF がプトレッシンを細胞内から培養上

大腸菌 SapABCDF の機能に関して，本研究以前では清に排出することを示した（Fig. 3，4 および 6 ）．さらに，

唯一 SapD（ TrkE としても知られている）がカリウム大腸菌の SapBCDF は抗菌ペプチド LL-37 に対する耐性

トランスポーター TrkH および TrkG の ATP アーゼとしに寄与してないことを示した（ Fig. 2 ）．

て機能しているという報告がされていた（ Harms et al.,

しかし，ΔpuuPΔsapBCDF 株の培養上清中に依然とし2001 ）．H. influenzae において大腸菌と同様に，sapD 欠てプトレッシンが検出され（ Fig. 4B, 6B および 6C ），大損によりカリウムの取り込みが減少することが報告され腸菌が SapBCDF 以外のプトレッシンエクスポーターをている（ Mason et al., 2006 ）．これまでの研究により，有していることが示唆された．今後，腸内細菌のモデル

植物や動物において細胞内ポリアミンが環境中からのカ生物である大腸菌におけるプトレッシン排出のメカニズ

リウムの取り込みを抑制することが報告されている

ムをさらに研究する必要があると考えられる．

− 101 −

杉山

要

友太，阪中

幹祥，片山

約

Keio コレクションを用いたスクリーニングにより，中性の生育条件で機能する大腸菌の新規 プトレッシン
エクスポーターの一つとして SapBCDF を同定した．他

高嶺，栗原

新

原著論文
1) Sugiyama, Y., Nakamura, A., Matsumoto, M., Kanbe, A.,
Sakanaka, M., Higashi, K., Igarashi, K., Katayama, T.,
Suzuki, H. & Kurihara, S. 2017. A novel putrescine exporter
SapBCDF of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 291: 26343 – 26351.

謝の細菌種と異なり，大腸菌では SapBCDF は抗菌ペプチ

辞ド 耐 性 に 寄 与 し て い な い こ と が 示 さ れ た． 今 後，

本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成金（平SapBCDF が腸管内でのプトレッシン産生を制御する上成 25 年 10 月～ 31 年 3 月）により行われたものである．

で標的になることが期待される．

本助成を賜った公益財団法人発酵研究所に厚く御礼申し上げます．また，本研究の一部は生研センター・イノベー

本助成で得られた研究成果の報告

ション創出基礎的研究推進事業の助成により行われまし口頭発表
1) 杉山友太, 中村篤央, 松本光晴, 神戸亜也香, 鈴木秀之, 東恭平, 五十嵐一衛, 片山高嶺, 栗原新．2015．大腸菌の新規プ
トレッシンエクスポーター SapBCDF．ポリアミンと核酸の共進化 第13回合同シンポジウム．9月12日．東京.
2) 杉山友太, 中村篤央, 松本光晴, 神戸亜也香, 鈴木秀之, 東恭平, 五十嵐一衛, 片山高嶺, 栗原新．2015．大腸菌の新規プ
トレッシンエクスポーター SapBCDF．第8回北陸合同バ
イオシンポジウム．10月30-31日．石川.
3) 杉山友太, 中村篤央, 松本光晴, 神戸亜也香, 鈴木秀之, 東恭平, 五十嵐一衛, 片山高嶺, 栗原新．2015．大腸菌の新規プ
トレッシンエクスポーター SapBCDF の同定と抗菌ペプチ
ド耐性への影響の検討．日本ポリアミン学会第7回年会．
11月13-14日．京都.
4) 杉山友太, 中村篤央, 松本光晴, 神戸亜也香, 鈴木秀之, 阪中幹祥, 東恭平, 五十嵐一衛, 片山高嶺, 栗原新．2016．大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定と抗菌ペプチド耐性への影響. 第9回北陸合同バイオシンポ
ジウム．11月4-5日．福井.
5) 杉山友太, 中村篤央, 松本光晴, 神戸亜也香,阪中幹祥, 東恭平, 五十嵐一衛, 片山高嶺, 鈴木秀之, 栗原新．2017．大腸菌の新規プトレッシンABCエクスポーター SapBCDF. 日
本ポリアミン学会第8回年会．1月20-21日．千葉.
6) 杉山友太, 中村篤央, 松本光晴, 神戸亜也香, 阪中幹祥, 東恭平, 五十嵐一衛, 片山高嶺, 鈴木秀之, 栗原新. 2017. 大腸菌の新規プトレッシン排出タンパク SapBCDFの同定. 2017年度日本農芸化学会. 3月17-20日. 京都.
7) Sugiyama, Y., Nakamura, A., Matsumoto, M., Kanbe, A.,
Sakanaka, M., Higashi, K., Igarashi, K., Katayama, T.,
Suzuki, H. & Kurihara, S. 2017. A novel putrescine exporter
SapBCDF of Escherichia coli. The 2017 Gordon research
conference on polyamines. June 25-30. Water ville valley,USA.
8) 杉山友太, 中村篤央, 松本光晴, 神戸亜也香, 鈴木秀之, 阪中幹祥, 東恭平, 五十嵐一衛, 片山高嶺, 栗原新．2017．大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF の同定.
第12回トランスポーター研究会年会．7月8-9日．宮城.
9) 杉山友太, 中村篤央, 松本光晴, 神戸亜也香, 鈴木秀之, 阪中幹祥, 東恭平, 五十嵐一衛, 片山高嶺, 栗原新．2017．大腸菌の新規プトレッシンエクスポーター SapBCDF. 北陸の微生物研究．8月31日．石川.

た．また，Keio コレクションを分譲頂いた NBRP 大腸菌事業（ NIG ）に御礼申し上げます．

文

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− 102 −

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− 103 −

IFO Res.Commun. 33
105-111, 2019

Bacteroides 属細菌におけるポリアミン生合成系遺伝子の機能解析
阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Functional analysis of polyamine biosynthetic genes in genus Bacteroides
Mikiyasu Sakanaka, Takane Katayama, Shin Kurihara
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
Recent studies indicate that polyamines in the gut are produced by hundreds of gut bacterial species and are closely
associated with host health. However, the molecular mechanisms of the polyamine biosynthesis in human gut
bacteria have been poorly understood. In this study, we analyzed the functions of polyamine biosynthetic genes ingenus Bacteroides, human gut symbionts, using gene manipulation tools. Markerless deletion of carboxyspermidine
decarboxylase gene casdc led to depletion of intracellular spermidine in Bacteroides thetaiotaomicron. Disruption ofarginine decarboxylase gene speA in Bacteroides dorei resulted in the decreased concentration of spermidine in thecells and culture supernatant. These two mutants also showed the delayed growth. Collectively, our results indicatethat casdc and speA are the main genes involved in spermidine biosynthesis in genus Bacteroides.
Key words: arginine decarboxylase, carboxyspermidine decarboxylase, gut bacteria, polyamine, spermidine緒

言されており（ Matsumoto et al., 2012），それらは宿主の健康に大きな影響を及ぼしていることが報告されている

ポリアミンは 2 つ以上のアミノ基を含む脂肪族炭化水（ Upp et al., 1988; Matsumoto et al., 2011; Kibe et al.,素の総称であり，代表的なものとしてプトレッシン，ス2014）．このことから，腸内細菌を介した腸内ポリアミ

ペルミジンおよびスペルミンが挙げられる．ポリアミン

ン濃度制御の重要性が近年高まりつつあり，これを達成

は，生物の様々の部位に存在しており，ヒトの大腸腸管

するには腸内細菌による生合成・輸送の理解が不可欠で内 腔 に お い て も 検 出 さ れ る（ Tabor & Tabor, 1985;

あると考えられている．

Michael, 2015）．腸管内腔に存在するポリアミンは腸内バクテリアのポリアミン生合成経路は大腸菌を中心に細菌によって生合成・輸送されたものであることが示唆研究されているものの（ Tabor & Tabor, 1985），この細菌種はヒト腸内においては菌数が極めて少ない．また，

E-mail:阪中幹祥（ miksak@dtu.dk ）（現所属:National Food Institute,
Technical University of Denmark, Kemitorvet, DK2800 Kgs. Lyngby, Denmark ），片山高嶺（ katayama.takane.6s@kyoto-u.ac.jp ）（ 現 所 属: 京 都
大学大学院生命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属:近畿大学生
物理工学部 〒 649-6433 和歌山県紀の川市）
共同研究者
杉山友太（京都大学大学院農学研究科），
奈良未沙希（石川県立大学生物資源環境学部），
北方 彩（石川県立大学生物資源環境学部）

Bacteroides 属細菌のようなヒト腸内常在菌叢最優勢種（ Qin et al., 2010 ）は大腸菌とは異なるポリアミン生合成経路を有すると推測されているが（ Fig. 1 ）（ Hanfrey
et al., 2011; Sugiyama et al., 2017），現在までに当該ポリアミン生合成経路の実験的な証明は行われていない．本研 究 で は 遺 伝 子 操 作 技 術 を 駆 使 し て，Bacteroides
thetaiotaomicron および Bacteroides dorei のポリアミン生合成経路の一端を明らかにすることにより，ヒト腸内常在菌叢最優勢種におけるポリアミン生合成への理解を深めることを目指した．

− 105 −

阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

新

実験方法
菌株，培養方法および培地
大 腸 菌 は， 過 去 の 報 告 の よ う に λpir 株 を 用 い て（ Koropatkin et al., 2008），Luria–Bertani 培 地 に て 37 ℃で培養した．Bacteroides 属細菌は嫌気チャンバー InvivO2400（ 10 ％ CO2 ，10 ％ H2 ，80 ％ N2 ; Ruskinn Technology ）内で，37 ℃で嫌気的に培養した．B. thetaiotaomicron の培養は，主に GAM 培地（ Nissui Pharmaceutical ）または合成培地（ Koropatkin et al., 2008 ）（以後，ポリアミ
ンフリー培地）で行った．B. dorei の培養は，主に GAM培地または 10 ％(v/v)GAM を添加した合成培地[以後，ポリアミン低濃度培地（ 3 μM プトレシン，2 μM スペル
ミジンおよび 1 μM スペルミン）]で行った．また必要に応じて，アンピシリン（ 100 μg/mL），エリスロマイシン（ 25 μg/Ml），ゲンタマイシン（ 200 μg/mL ）および
5 -フ ル オ ロ- 2' -デ オ キ シ ウ リ ジ ン（ FUdR; 200 μg/mL ）を培地に添加した．
接合伝達による Bacteroides 属細菌の形質転換
エリスロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを保持する大腸菌 λpir 株および Bacteroides 属細菌をそれぞれ培 養 し， 培 養 菌 体 を 混 合 し た 後，10 ％ 馬 無 菌 脱 繊 血（ Nippon Bio-Supp. Center ）を含むブレインハートイン
フュージョン寒天培地（ Sigma-Aldrich ）に塗抹した．
24 時間好気条件でインキュベートし接合伝達を行った
後，形成したコロニーを GAM 液体培地（ Nissui ）で懸濁し，エリスロマイシンおよびゲンタマイシンを含む前
述の寒天培地に塗抹した．インキュベート後，寒天培地上で形成したコロニー，すなわちエリスロマイシン耐性
遺伝子を含むプラスミドを保持する Bacteroides 属細菌を取得した．なお，Bacteroides 属細菌はゲンタマイシン
耐性を持つが，大腸菌は当該耐性を有していない．
B. thetaiotaomicron の遺伝子欠損株および遺伝子相補株の作製
Bacteroides 属細菌では，二重相同組換えによるマー
カーレス遺伝子欠損を行うために，カウンターセレク
ションマーカーであるチミジンキナーゼ遺伝子 tdk と宿主株である Δtdk 株がよく用いられている（ Koropatkin
Fig. 1.

Predicted polyamine biosynthetic pathway in genus
Bacteroides. SpeA, arginine decarboxylase; AIH,
agmatine deiminase/iminohydrolase; NCPAH,
N-carbamoylputrescine amidohydrolase; CASDH,
carboxyspermidine dehydrogenase; CASDC,
carboxyspermidine decarboxylase.

et al., 2008; Wexler et al., 2016）．Δtdk 株は FUdR 耐性を有しているが，本株への tdk の導入は FUdR 感受性を付与するので，tdk 遺伝子はカウンタセレクションマーカー
として利用することができる．これにより，2 回目の相同組換え体を容易に選択することが可能となる．
上述のシステムを利用して，B. thetaiotaomicron Δtdk
（ Koropatkin et al., 2008 ）のカルボキシスペルミジンデ− 106 −

Bacteroides 属細菌におけるポリアミン生合成系遺伝子の機能解析

カルボキラーゼ遺伝子 casdc（ Fig. 1 ）を二重相同組換え株を用いて，上述と同様の方法により B. dorei の speA法によって破壊した．プラスミドの構築には，一貫して遺伝子を破壊した．speA 欠損用プラスミドは speA 遺伝

In-Fusion HD クローニングキット（ Clontech Laboratories ）子の上流と下流領域を PstI および SalI 消化したプラスを用いた．casdc 欠損用プラスミドは，casdc 遺伝子の上

ミド pExchange-tdk(Koropatkin et al., 2008 ）に挿入する

流と下流領域を，tdk を含むプラスミド pExchange-tdk

ことで構築した．これらの上流と下流の領域は B. dorei（ Koropatkin et al., 2008 ）の SalI 部位に挿入することで構JCM 13471T ゲノム DNA をテンプレートとして PCR 増

築した．これらの上流と下流の領域は B. thetaiotaomicron

幅した．使用したプライマーは Sakanaka et al.(2018 ）JCM 5827T ゲノム DNA をテンプレートとして PCR 増幅の Table 1 に記載の通りである．構築した speA 欠損用プ

した．使用したプライマーは Sakanaka et al.(2016 ）のラスミドは接合伝達によって B. dorei Δtdk（親株）に導Table 1 に記載の通りである．構築した casdc 欠損用プラ

入し，さらに上述のように二重相同組換えにより speA

スミドは接合伝達によって B. thetaiotaomicron Δtdk に導欠損株（ Δtdk ΔspeA ）を作出した．speA 遺伝子の欠損

入し，プラスミドが casdc の上流また下流のいずれかには PCR によって確認した．

挿入された株（ tdk を染色体上に保持する 1 回目の相同組み換え体）を取得した．その後，1 回目の相同組み換

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

え体の培養液を FUdR 含有寒天培地に塗抹し，2 回目のポリアミン濃度を測定するために，陽イオン交換カラ

相同組み換え体（相同組換えによって tdk が染色体上か

ム（カラム温度 67 ℃，#2619PH，4.6×50 mm; Hitachi ）ら脱落することにより，Bacteroides 属細菌に FUdR 耐性を装着した HPLC システム（ Chromaster, Hitachi ）を使能が付与される）を取得した．casdc 遺伝子欠損変異の用した．ポリアミンの溶出には，移動相 A（ 45.2 mM ク

導入は PCR により確認し，得られた株を casdc 欠損株

エン酸三ナトリウム，63.3 mM 塩化ナトリウム，60.9 mM（ Δtdk Δcasdc ）とした．

クエン酸）および移動相 B（ 200 mM クエン酸三ナトリ

casdc 相補用のプラスミドは，casdc 遺伝子を，PstI お
よ び NotI 消 化 し た プ ラ ス ミ ド pNBU2-bla-ermGb

ウム，2 M 塩化ナトリウム，5 ％エタノール，5 ％ 1 -プ

（ Koropatkin et al., 2008 ）に挿入することにより構築し間に 50 から 85 ％に直線的に上げ，6 - 12 分の間は 85 ％た．casdc 遺 伝 子 は B. thetaiotaomicron JCM 5827 ゲ ノで維持した．12 - 18 分の間に 100 ％にまで上げ，18 - 45

ム DNA をテンプレートとして PCR 増幅した．使用した分の間は 100 ％で維持した．その後，45 - 60 分の間にプライマーは Sakanaka et al.(2016 ）の Table 1 に記載の50 ％にまで下げた．溶出したポリアミンは，ポストカ

通りである．構築した casdc 相補用プラスミドは接合伝ラム法により o -フタルアルデヒドで誘導体化し，蛍光達によって casdc 欠損株（ Δtdk Δcasdc ）に導入し，プラ検出器（ λex 340 nm，λem 435 nm ）を用いて検出した．

スミドが NBU2 att1 部位（ tRNAT

ロパノール）を使用した．移動相 B の濃度は，0 - 6 分の遺伝子 BT_t70 ）に挿

ポリアミンの誘導体化は，反応溶液 1（ 0.4 N 水酸化ナ

入された株を取得した．得られた株を casdc 相補株（Δtdk

トリウム）および反応溶液 2（ 234 mM ホウ酸，0.05 ％Δcasdc att1:casdc ）とした．

Brij-35, 5.96 mM o -フタルアルデヒド，0.2 ％ 2 - メルカプ

B. dorei の遺伝子欠損株の作製た．各ポリアミンの濃度は，既知濃度の標準物質を用いSer+

トエタノール）を 67 ℃で溶出液と混合することで行っ

B. dorei においては Δtdk 株がなかったため，まず B.

て作成した検量線に基づいて計算した．

dorei JCM 13471T の tdk 遺伝子を上述のように二重相同組換え法によって破壊した．tdk 欠損用プラスミドは，

HPLC による細胞内および培養上清中のポリアミン分析

tdk 遺伝子の上流と下流領域を PstI および SalI 消化した
プラスミド pKNOCK-bla-ermGb(Koropatkin et al., 2008 ）B. thetaiotaomicron をポリアミンフリー培地にて，または，B. dorei をポリアミン低濃度培地にて培養した．

に挿入することで構築した．これらの上流と下流の領域

その後，経時的に培養液を回収し，遠心分離により菌体は B. dorei JCM 13471T ゲノム DNA をテンプレートとしおよび培養上清を取得した．

て PCR 増幅した．使用したプライマーは Sakanaka et

細胞内ポリアミンは以下のように分析した．回収したal.(2018 ）の Table 1 に記載の通りである．構築した tdk
欠 損 用 プ ラ ス ミ ド は 接 合 伝 達 に よ っ て B. dorei JCM

菌体をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した（ 18,700×g,

13471 に導入し，さらに上述のように二重相同組換えに再懸濁し，煮沸した水中で 15 分間インキュベートしにより B. dorei Δtdk 株（親株）を作出した．tdk 遺伝子

た．遠心分離（ 18,700×g，4 ℃，5 分）後，上清をコスの欠損は PCR によって確認した．

モナイスフィルター W（Nacalai Tesque ）により濾過し，T

続いて，カウンターセレクションマーカー tdk と Δtdk

4 ℃，5 分）．菌体を 300 μL の 5 ％(w/v)トリクロロ酢酸

HPLC 分析に供した．また，遠心後に得た細胞残渣を− 107 −

阪中

幹祥，片山

300 μL の 0.1 N 水酸化ナトリウムで溶解した．水酸化ナ

高嶺，栗原

新

トリウム溶液中のタンパク質濃度は，Bio-Rad プロテイ

casdc は，細胞内でのスペルミジン生合成に必要なカ
ルボキシスペルミジンデカルボキシラーゼをコードする

ンアッセイキット（ Bio-Rad ）を用いたブラッドフォーと推定されているので（ Fig. 1），次に，casdc 欠損株（ Δtdk

ド法により決定した（標準物質としてウシ血清アルブミ
ンを使用）．細胞内ポリアミン濃度は nmol/mg 細胞タン

Δcasdc ）における細胞内ポリアミン濃度を解析した．親株（ Δtdk ）および casdc 相補株（ Δtdk Δcasdc att1:casdc + ）

パク質で示した．

では，唯一のポリアミンとして細胞内スペルミジンが存

培養上清中のポリアミンの分析は以下のように行っ在していたのとは対照的に，casdc 欠損株（ Δtdk Δcasdc ）た．培養上清にトリクロロ酢酸を終濃度 10 ％(w/v)とでは細胞内スペルミジンが殆ど検出されなかったなるように混合した．その後，遠心（ 18,700×g，4 ℃，（ Fig. 2B）． 以 上 よ り，casdc は B. thetaiotaomicron の 細

15 分）を行い，得られた上清をコスモナイスフィルター

胞内スペルミジンの産生に寄与する遺伝子であることがW（Nacalai Tesque ）により濾過し，HPLC 分析に供した．

示された．

培養上清中のポリアミン濃度は μM で示した．

な お， 培 養 上 清 中 に は，B. thetaiotaomicron の 親 株（ Δtdk ）ですらスペルミジンが検出されなかったことか

結果および考察ら（ data not shown），少なくとも今回の実験条件では，この菌種はスペルミジンを細胞外に放出できないことがcasdc は B. thetaiotaomicron の増殖とスペルミジン生合成に寄与している

示唆された．しかしながら，B. thetaiotaomicron はマウ

casdc 遺伝子が B. thetaiotaomicron の増殖にどの程度寄与しているかを解析する目的で，親株（ Δtdk），casdc

れ て い る の で（ Noack et al., 1998; Noack et al., 2000），欠損株（ Δtdk Δcasdc ）および casdc 相補株（ Δtdk Δcasdc
att1:casdc + ）をポリアミンフリー培地にて培養し，生育度を比較した．この結果，親株（ Δtdk ）および casdc 相補株（ Δtdk Δcasdc att1:casdc + ）と比較して，casdc 欠損

ス腸内のスペルミジン増加に関与していることが報告さ
in vitro とは環境が異なる腸内では本菌はスペルミジンを細胞外に放出できるのかもしれない．
speA は B. dorei の増殖とスペルミジン生合成に寄与している

株（ Δtdk Δcasdc ） に お い て 生 育 の 遅 延 が 観 察 さ れ た

続いて，speA 遺伝子が B. dorei の増殖にどの程度寄与（ Fig. 2A）．同様の結果が別の細菌種の casdc 欠損株におしているかを解析する目的で，野生型株，親株（ Δtdk ），いても観察されてる(Hanfrey et al., 2011）．これらの結果より，casdc は B. thetaiotaomicron の増殖に必須ではspeA 欠損株（ Δtdk ΔspeA ）をポリアミン低濃度培地にて培養し，生育度を比較した．この結果，野生型株およないものの重要な役割を果たしていることが示された．

び親株（ Δtdk ）と比較して，speA 欠損株（ Δtdk ΔspeA ）Fig. 2.

Growth and intracellular spermidine concentration of B. thetaiotaomicron strains in the polyamine-free medium. (A) Growth
cur ve of B. thetaiotaomicron strains. Parental strain (Δtdk): open triangles; casdc mutant (Δtdk Δcasdc): black circles; andcasdc-complemented strain (Δtdk Δcasdc att1::casdc+): white circles. (B) Intracellular spermidine concentration of B. thetaiotaomicron strains. Cells were withdrawn at the indicated times and analyzed by HPLC. The symbols indicate the same strains as
Fig. 2A. Data are the mean±standard deviation of biological triplicates. Reproduced with modifications by permission from
Springer Nature Customer Service Centre GmbH: Sakanaka et al. Amino Acids (Springer Vienna), 48:2443-2451 (2016) (©
Springer-Verlag Wien 2016).

− 108 −

Bacteroides 属細菌におけるポリアミン生合成系遺伝子の機能解析

はポリアミン低濃度培地において生育が大幅に低下する

ペルミジンが観察されなかった（ Fig. 3C）．この結果は，ことが明らかとなった（ Fig. 3A）．この結果は，speA を細胞外環境におけるスペルミジン濃度の上昇には，speA

含むポリアミン生合成系遺伝子の欠損が様々な細菌種にを介した細胞内でのスペルミジン生合成が必須であるこ

おいて増殖の遅延をもたらすという過去の報告と一致すとを示唆している．B. dorei のスペルミジン生合成・輸る（ Patel et al., 2006; Hanfrey et al., 2011）．

送がどの程度腸内ポリアミン濃度に影響を及ぼしている

speA は，細胞内でのスペルミジン生合成に必要なア
ルギニンデカルボキシラーゼをコードすると推定されてのかについて，今後マウスモデル等を用いた研究で解明いるので，次に，speA 欠損株（ Δtdk ΔspeA ）におけるヒトの腸管には数百種類の腸内細菌が生息しており，する必要がある．

細胞内ポリアミン濃度を調べた．野生型株および親株様 々 な 代 謝 産 物 を 産 生 し て い る（ Matsumoto et al.,（ Δtdk ）では，細胞内に唯一のポリアミンとしてスペル

2012）．ポリアミンは，腸内細菌によって産生される主

ミ ジ ン が 存 在 し て い た の と は 対 照 的 に，speA 欠 損 株

要な代謝産物の 1 つであり，それらは宿主の健康に大き（ Δtdk ΔspeA ）では細胞内スペルミジンが殆ど検出されな 影 響 を 及 ぼ す と 考 え ら れ て い る（ Upp et al., 1988;

なかった（ Fig. 3B）．低濃度のスペルミジンが観察されMatsumoto et al., 2011; Kibe et al., 2014）．これまでのとたのは，培地由来のスペルミジンを speA 欠損株（ Δtdk

ころ，ヒト腸内常在菌叢最優勢種のポリアミン生合成のΔspeA ）が細胞内に取り込んだためであると推察される．
以上より，speA が B. dorei のスペルミジン生合成経路に分子機構は殆ど明らかとなっていない．本研究では，我々関与する主な遺伝子であることが示された．

において，ポリアミン生合成系遺伝子がスペルミジン生はヒト腸内常在菌叢最優勢種である Bacteroides 属細菌

最近，我々は，B. dorei が細胞内で生合成したスペル合成に重要であることを明らかにした．Bacteroides 属細ミジンを菌体外に放出することを in vitro の実験におい菌（特に B. dorei ）の細胞外環境へのスペルミジン放出て報告している（ Sugiyama et al., 2017）．この特徴は，に関しては知見がまだ十分ではないものの，今回我々が得ヒト腸内常在菌叢最優勢種の限られた種のみで観察された成果は腸内ポリアミンがどのように腸内細菌によって制（ Sugiyama et al., 2017），宿主の腸におけるスペルミジ

御されているかを理解するうえで重要であると考えられる．

ン濃度の増加に寄与している可能性がある．今回の研究に お い て も 培 養 上 清 中 の ス ペ ル ミ ジ ン の 濃 度 は，B.
dorei 野生型株および親株（ Δtdk ）では培養時間と共に増加したが，speA 欠損株（ Δtdk ΔspeA ）においてはス

要約

腸内に存在するポリアミンは，数百種類の腸内細菌がFig. 3. Growth and spermidine concentration of B. dorei strains in the polyamine-reduced medium. (A) Growth curve of B. dorei strains.
Wild-type strain: shaded squares; parental strain (Δtdk): white circles; speA mutant (Δtdk ΔspeA): black circles. (B) Intracellularspermidine concentration of B. dorei strains. Cells were withdrawn after being cultured for 24 h (Fig. 3A) and were analyzed by
HPLC. (C) Spermidine concentration in the culture supernatant. The culture supernatant was withdrawn at the indicated times
and analyzed by HPLC. The symbols indicate the same strains as Fig. 3A. Data are the mean±standard deviation of biologicaltriplicates. Reproduced by permission of Oxford University Press: Sakanaka et al., FEMS Microbiol. Lett., 365:fny003 (2018).
(© FEMS 2018)− 109 −

阪中

幹祥，片山

高嶺，栗原

産生したものであり，宿主の健康に密接に関与している

新2) Sakanaka, M., Sugiyama, Y., Nara, M., Kitakata, A. & Kurihara.
S. 2018. Functional analysis of arginine decarboxylase gene
speA of Bacteroides dorei by markerless gene deletion.
FEMS Microbiol. Lett. 365: fny003.

と考えられている．しかし，ヒト腸内細菌のポリアミン
生合成の分子機構は十分に解明されていない．本研究では， 遺 伝 子 破 壊 ツ ー ル を 用 い て， ヒ ト 腸 内 で 優 勢な
Bacteroides 属細菌のポリアミン生合成系遺伝子の機能を解析した．Bacteroides thetaiotaomicron のカルボキシス

謝

ペルミジンデカルボキシラーゼ遺伝子 casdc を欠損する

辞と，細胞内のスペルミジンが殆ど検出されなくなった．

本研究は公益財団法人発酵研究所寄附講座助成によりアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子 speA の欠損は，行われたものです．この場を借りて厚く御礼申し上げまBacteroides dorei の細胞内および培養上清中のスペルミ
ジンの濃度の減少をもたらした．また，これらの 2 つのす．本研究の一部は公益財団法人旭硝子財団（栗原新）遺伝子欠損株では，ポリアミンが全くないまたは少ない

します．また，Bacteroides 属細菌の遺伝子操作ツールを培養条件において生育能が低下していた．以上より，casdc

譲 渡 頂 い た Thomas J. Smith 博 士（ Donald Danforthおよび speA は Bacteroides 属細菌のスペルミジン生合成

Plant Science Center, USA ）および Nicole Koropatkin 博に寄与する主要な遺伝子であることが明らかとなった．

士（ University of Michigan Medical School, USA ）に心による研究助成により行われました．ここに深く感謝致

より感謝致します．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 阪 中 幹 祥 ， 杉 山 友 太 ， 北 方 彩 ， 片 山 高 嶺 ， 栗 原 新 ．
2015．ヒト腸内優占種Bacteroides thetaiotaomicronのスペ
ルミジン合成はcarboxyspermidine decarboxylaseによって制御されている．第8回北陸合同バイオシンポジウム
2015．10月30-31日．石川．
2) 阪 中 幹 祥 ， 杉 山 友 太 ， 北 方 彩 ， 片 山 高 嶺 ， 栗 原 新 ．
2 0 1 5 ． ヒ ト 腸 内 細 菌 Bacteroides thetaiotaomicronのcarboxyspermidine decarboxylaseはスペルミジン合成に寄与している．日本ポリアミン学会第7回年会．11月13-14
日．京都．
3) 阪 中 幹 祥 ， 杉 山 友 太 ， 北 方 彩 ， 片 山 高 嶺 ， 栗 原 新 ．
2016．ヒト腸内細菌Bacteroides thetaiotaomicronのスペル
ミジン生合成に関与するカルボキシスペルミジン脱炭酸酵素．日本農芸化学会2016年度大会．3月27-30日．札幌．
4) 阪中幹祥，杉山友太，奈良未沙希，北方彩，栗原新．
2018．マーカーレス遺伝子欠損を利用したヒト腸内細菌
Bacteroides doreiのアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能解析．日本ポリアミン学会第9回年会．1月19-20
日．兵庫．
5) 阪中幹祥，杉山友太，奈良未沙希，北方彩，栗原新．
2018．ヒト腸内常在菌叢最優勢種Bacteroides doreiにおけるマーカーレス遺伝子欠損系の確立およびポリアミン代謝系遺伝子の機能解析．日本農芸化学会2018年度大会．3
月24-27日．名古屋．
6) 阪中幹祥，杉山友太，奈良未沙希，北方彩，栗原新．
2018．ヒト腸内常在菌叢優勢種 Bacteroides dorei のポリア
ミン放出能とアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子の機能解析．第22回腸内細菌学会．5月31日-6月1日．東京．
原著論文
1) Sakanaka, M., Sugiyama, Y., Kitakata, A., Katayama, T. &Kurihara, S. 2016. Carboxyspermidine decarboxylase of theprominent intestinal microbiota species Bacteroides thetaiotaomicron is required for spermidine biosynthesis andcontributes to normal growth. Amino Acids 48: 2443-2451.

文

献Hanfrey, C.C., Pearson, B.M., Hazeldine, S., Lee, J., Gaskin, D.J.,
Woster, P.M., Phillips, M.A. & Michael, A.J. 2011. Alternative
spermidine biosynthetic route is critical for growth ofCampylobacter jejuni and is the dominant polyamine pathway
in human gut microbiota. J Biol Chem 286: 43301-43312.
Kibe, R., Kurihara, S., Sakai, Y., Suzuki, H., Ooga, T., Sawaki, E.,
Muramatsu, K., Nakamura, A., Yamashita, A., Kitada, Y.,
Kakeyama, M., Benno, Y. & Matsumoto, M. 2014. Upregulationof colonic luminal polyamines produced by intestinal microbiota delays senescence in mice. Sci Rep 4: 4548.
Koropatkin, N.M., Martens, E.C., Gordon, J.I. & Smith, T.J. 2008.
Starch catabolism by a prominent human gut symbiont isdirected by the recognition of amylose helices. Structure 16:1105-1115.
Matsumoto, M., Kurihara, S., Kibe, R., Ashida, H. & Benno, Y.
2011. Longevity in mice is promoted by probiotic-induced
suppression of colonic senescence dependent on upregulationof gut bacterial polyamine production. PLoS One 6: e23652.
Matsumoto, M., Kibe, R., Ooga, T., Aiba, Y., Kurihara, S., Sawaki,E., Koga, Y. & Benno, Y. 2012. Impact of intestinal microbiota
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− 110 −

Bacteroides 属細菌におけるポリアミン生合成系遺伝子の機能解析
Qin, J., Li, R., Raes, J., Ar umugam, M., Burgdor f, K.S.,
Manichanh, C., Nielsen, T., Pons, N., Levenez, F., Yamada, T.,
Mende, D.R., Li, J., Xu, J., Li, S., Li, D., Cao, J., Wang, B., Liang,
H., Zheng, H., Xie, Y., Tap, J., Lepage, P., Bertalan, M., Batto,
J.M., Hansen, T., Le Paslier, D., Linneberg, A., Nielsen, H.B.,
Pelletier, E., Renault, P., Sicheritz-Ponten, T., Turner, K., Zhu,
H., Yu, C., Li, S., Jian, M., Zhou, Y., Li, Y., Zhang, X., Li, S., Qin,
N., Yang, H., Wang, J., Brunak, S., Doré, J., Guarner, F.,
Kristiansen, K., Pedersen, O., Parkhill, J., Weissenbach, J.,
Bork, P., Ehrlich, S.D. & Wang, J. 2010. A human gut microbial
gene catalogue established by metagenomic sequencing.
Nature 464: 59-65.
Sakanaka, M., Sugiyama, Y., Kitakata, A., Katayama, T. & Kurihara,
S. 2016. Carboxyspermidine decarboxylase of the prominent
intestinal microbiota species Bacteroides thetaiotaomicron isrequired for spermidine biosynthesis and contributes to normal
growth. Amino Acids 48: 2443-2451.
Sakanaka, M., Sugiyama, Y., Nara, M., Kitakata, A. & Kurihara, S.
2018. Functional analysis of arginine decarboxylase gene speAof Bacteroides dorei by markerless gene deletion. FEMS Microbiol
Lett 365: fny003.
Sugiyama, Y., Nara, M., Sakanaka, M., Gotoh, A., Kitakata, A.,
Okuda, S. & Kurihara, S. 2017. Comprehensive analysis ofpolyamine transport and biosynthesis in the dominant humangut bacteria: Potential presence of novel polyamine metabolism and transport genes. Int J Biochem Cell Biol 93: 52-61.
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Wexler, A.G., Bao, Y., Whitney, J.C., Bobay, L.M., Xavier, J.B.,
Schofield, W.B., Barry, N.A., Russell, A.B., Tran, B.Q., Goo,
Y.A., Goodlett, D.R., Ochman, H., Mougous, J.D. & Goodman,
A.L. 2016. Human symbionts inject and neutralize antibacterial
toxins to persist in the gut. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113:3639-3644.

− 111 −

IFO Res.Commun. 33
113-129, 2019

複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する
新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産
栗原新

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Bioactive polyamine production by a novel hybrid systemcomprising multiple indigenous gut bacterial strategies.
Shin Kurihara
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
We have previously shown that the level of putrescine, a polyamine found abundantly in the human intestinal
lumen, in the colonic lumen putrescine was increased following administration of arginine and the probiotic
Bifidobacterium sp.; however, the underlying mechanism remained poorly understood. Here, we report a novel
pathway for putrescine production from arginine through agmatine by collaboration of two bacterial groups, which
was triggered by environmental acidification (drop in pH to below 6.5 from neutral). This pathway comprises theacid-tolerance system of Escherichia coli, representing bacteria possessing an arginine-dependent acid resistancesystem; the energy production system of Enterococcus faecalis, representing bacteria possessing an agmatine
deiminase system; and the acid production system of the acid-producing bacteria, represented by Bifidobacterium
spp. This pathway is unique because it represents a relationship between the independent survival strategies ofmultiple bacteria.
Key words: metabolites, polyamines, transporter, biosynthesis, hybrid biosynthetic pathway, Bifidobacterium sp.,
Escherichia coli, Enterococcus faecalis

緒

ポリアミン（主なものにプトレッシンおよびスペルミ

言ジンがある）は腸内細菌の重要な代謝産物であり，プト

腸内細菌に由来する様々な代謝産物は宿主の健康状態

レッシンは健康なヒトにおいて腸管内腔に 0.5 - 1 mM

および疾病の発症に関連しており(Sharon et al., 2014），

程 度 の 濃 度 で 存 在 す る(Matsumoto & Benno, 2007;

プロバイオティクス細菌はこれら代謝産物の生産に影響

Matsumoto et al., 2007）．これらの有機カチオンはほとを与えることによって，腸内微細菌叢の代謝産物組成をん ど 全 て の 生 物 に 見 出 だ さ れ(Pegg, 1986; Tabor &最適化すると予想される．

Tabor, 1985），細胞の適切な成長と増殖に必要である．
ポリアミンは，オートファジーの誘導(Eisenberg et al.,E-mail:栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属:近畿大学生
物理工学部 〒 649-6433 和歌山県紀の川市西三谷 930）
共同研究者
北田雄祐（協同乳業株式会社），
村松幸治（協同乳業株式会社），
東樹宏和（京都大学生態学研究センター），木邊量子（日本獣医生命科学大学獣医学部），
辨野義己（国立研究開発法人理化学研究所），
松本光晴（協同乳業株式会社）

2009），炎症の抑制(Soda et al., 2009），認知機能の改善(Gupta et al., 2013），心不全の進行の抑制(Eisenberg etal., 2016)を通じて動物の健康を促進することがこれまでに報告されている．一方で，腫瘍では高濃度のポリア
ミンが観察され(Gerner & Meyskens, 2004），ポリアミン合成における重要な酵素であるオルニチンデカルボキシ
ラーゼを選択的に阻害した場合に，結腸癌を含む悪性腫
瘍が抑制されることが明らかとなっており，現在臨床研究− 113 −

栗

原

新が進められている(Gerner & Meyskens, 2004; Laukaitis

を遺伝子レベルで解明した研究は存在しなかった．また，& Gerner, 2011）．このように，腸管腔内のポリアミンが健

微生物が特定の代謝産物の合成経路を有していることが康に有益であるか有害であるかについては議論の余地がそのゲノム配列から推測されたとしても，必ずしもその代あるが，腸管内でのそれらの濃度を調節し最適化するた

謝産物を放出するわけではないために，特定の細菌から目めの技術開発は，少なくとも実用的な価値を有する．

的の代謝産物の放出を確認するためには，合成経路およ

我々の研究グループでは，ポリアミンの生合成が損な

び標的代謝産物のトランスポーターの双方に関連する遺伝

われた高齢者において，体内のポリアミンレベルを増加

子発現を分析することが必要である．しかしながら，メタさせる目的で，腸内細菌由来のプトレッシンの生産を促

ゲノム解析およびメタトランスクリプトーム解析を用いて，進する新しい食品や技術を創り出すことを最終目的とし特定の代謝産物に対する合成経路を構成する遺伝子の発て，ポリアミンと抗加齢との関連を研究してきた．一方

現と，同じ代謝産物に対するトランスポーターの発現とので，結腸中のポリアミンレベルを減少させる必要がある間の関連を同定することは非常に困難である．そこで，本結腸癌の患者に対しても，大腸腸管内腔におけるポリア

研究では，伝統的な培養と分子生物学的手法を用いて，ミン産生のメカニズムの解明は，有用であると考えられる．

単一の細菌種による代謝産物の合成と放出の経路とは異食物由来のポリアミンは消化管下部に達する前に主に小なる，様々な細菌種が関与する目的の代謝産物を合成・放腸で吸収されるため(Uda et al., 2003），大腸腸管内腔の出する新規なハイブリッド経路の解明を行った．

ポリアミンの大部分は腸内常在菌叢によって生産される

プロバイオティクスは，発酵食品などに含まれ，体内(Matsumoto et al., 2012）．したがって，高齢者に代表されで有益な働きをする善玉菌およびこれが含まれる食品でる腸管腔内ポリアミンのレベルが低いヒトの腸管内腔におあり，ビフィズス菌がその代表例として知られている

いて，健康な個人の正常レベルである 0.5 -1 mM のポリア

(Rijkers et al., 2010）．プロバイオティクスの機能の一つ

ミン濃度を維持するためには，微生物のポリアミン代謝おとして，腸内細菌叢由来の代謝産物の組成に影響を与え

よび輸送の調節が必要である（ Matsumoto et al., 2007）．

ることによる腸内環境の改善を通じた，宿主の健康増進

これまでの研究で，アルギニンとプロバイオティクスを同時への寄与が挙げられる(Fuller, 1989）．これまで我々は，投与した場合に大腸腸管内腔のポリアミン濃度が増加する

マウスへの Bifidobacterium animalis subsp. lactis の経口ことがわかっているが，そのメカニズムは遺伝子レベルで投与が結腸ポリアミン濃度を増加させることを報告してはほとんど解明されておらず（ Kibe et al., 2014; Matsumoto

いる(Matsumoto et al., 2011）．Bifidobacterium 属細菌はet al., 2011），このことは，遺伝子発現の調節を通じた腸管腔内のポリアミン濃度の最適化を困難なものとしている．

ポリアミン生合成に関与する酵素のホモログを持たな

プトレッシンは，アルギニンデカルボキシラーゼ（ SpeA

腸管内腔のポリアミン濃度の増加は，腸内常在菌叢によおよび AdiA ）によるアルギニンの脱炭酸によって産生されるポリアミン生合成の活性化に起因する可能性が高い．

るアグマチンを原料として，細菌細胞内で腸内細菌により

本研究では，伝統的な培養，分子生物学的手法，およ生合成される．このアグマチンをプトレッシンへと変換するび共生細菌代謝経路の組み合わせを用いて，アルギニン

い．したがって，ビフィズス菌投与によるマウスの大腸

代謝経路としては，これまでに 2 つが報告されている．1

を起点としアグマチンを反応中間体とした 2 つの細菌

つ目の経路はアグマチンが直接プトレッシンに変換されるア（大腸菌および Enterococcus faecalis ）にまたがる新規のグマチンウレヒドロラーゼ（SpeB）経路である．2 つ目のハイブリッド・プトレッシン生産経路を遺伝子レベルで経路は，N -カルバモイルプトレッシン経路であり，この経路同定した．この 大腸菌および En. faecalis の共存によっ

ではアグマチンを基質として，アグマチンイミノヒドロラーゼて生合成されるプトレッシンは，Bifidobacterium 属細菌（ AIH ）に触媒される反応によって生成した N -カルバモイル

等の酸を産生する細菌によって形成される酸性環境におプトレッシンが，N -カルバモイルプトレッシンアミドヒドロ

ける，大腸菌による耐酸性機構および En. faecalis による

ラーゼ（ NCPAH ）に触媒される反応によりプトレッシンへ

エネルギー獲得機構という，それぞれの細菌による独立と変換される．ヒト腸内常在菌叢における最優勢 56 菌種した生存戦略の組み合わせの結果生じる副産物であった．

(Qin et al., 2010)の in silico ゲノム分析の結果，多くの腸実験方法

内常在菌叢最優勢種は不完全なプトレッシンの合成経路しか有さないために，多くの細菌種が単独ではアルギニンからプトレッシンを生産することができないことが予測された細菌株およびプラスミド(Burrell et al., 2010; Sugiyama et al., 2017）．このことは，この研究で用いたヒトの腸内細菌叢における主要な

腸内の複数の細菌種で構成される代謝経路の存在を示唆

14 菌種の腸内細菌(Qin et al., 2010)を含む菌株，プラス

するが，これまでに，そのような“ハイブリッド代謝経路”

ミド，およびプライマーを Table 1 に示した．

− 114 −

複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産
Table 1.

Strains, plasmids, and oligonucleotides used in this study

Continued on the next page.

− 115 −

栗原

Table 1

新continued
Continued.

Continued on the next page.

− 116 −

複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産
Table 1

continued
Continued.

Continued on the next page.

− 117 −

栗原

Table 1

新continued
Continued.

ポリアミン生産菌のスクリーニング

上清中のプトレッシン濃度および pH を測定した．

14 種類の腸内細菌のうち，L -アルギニンからプトレッ
シンを生成する腸内細菌種の 2 菌種を組み合わせ，91

ノトバイオートマウスの作成
6 週齢の無菌マウスに，大腸菌のプトレッシン合成酵

通りについて共培養し，その培養上清中のプトレッシン

素 遺 伝 子 破 壊 株（ SK930 ），En. faecalis の 野 生 型 株

濃度を測定した．

（ V583 ），En. faecalis の aguD 遺 伝 子 破 壊 株（ SK948 ），大腸菌と En. faecalis の共培養
大腸菌と En. faecalis を 2 mM の L -アルギニンを含有

En. faecalis の aguD 遺伝子相補株（ SK949 ），B. animalis
subsp. lactis（ LKM512 ），F. varium（ ATCC 27725 ） をする LB 培地中を用いて 37 ℃で 24 時間，嫌気性条件下

それぞれ単独あるいは複数菌種定着させたノトバイオー

で共培養，あるいは単独で培養した．その後，培養上清トマウスを作成した．

中のプトレッシン濃度を HPLC を用いて測定した．
さまざまな pH での人間の糞便の培養
大腸菌または En. faecalis 由来の培養上清を用いた培養

6 人のボランティアからいただいた糞便を，9 倍量（ w/v ）大腸菌または En. faecalis の 24 時間培養後の培養液をの 100 mM MES 緩 衝 液（ pH 4.2，5.0，5.5，6.0，6.5，お回収し遠心によって培養上清を得た後に，フィルター滅よ び 7.0 ）（ Dojindo Laboratories，Kumamoto，Japan ）菌した．次いで，もう一方の株を滅菌培養上清中で 24に懸濁した．懸濁液を嫌気性条件下で 24 時間インキュ時間培養し，最終培養上清中の L -アルギニン，アグマチ

ベートし，培養上清中のポリアミン濃度を測定した．

ン，およびプトレッシン濃度を測定した．
ポリアミン，L -アルギニン，およびアグマチン濃度の測定
大 腸 菌，En. faecalis, Citrobacter youngae, Fusobacterium

培養上清中のポリアミン，L -アルギニンおよびアグマ

varium および Bifidobacterium 属細菌の単独培養
野生型大腸菌（ MG1655 ）は嫌気性条件下で pH4.0 -チン濃度は，FLR 検出器を装備した HPLC（ Acquity，

9.0 に 調 整 し た 培 地 で 培 養 し た． 野 生 型 En. faecalis

定量した(Kibe et al., 2014）．

Waters, Milford, MA, USA ）を用いて以前の方法に従い（ V583 ）は 5 mM アグマチンを含み，pH 4.0 - 9.0 に調整した培地，または 0 - 3 g/L グルコースおよび 5 mM アグ

Blast を使用したインシリコ経路解析

マ チ ン を 含 み pH 6.0 に 調 整 し た 培 地 で 培 養 し た．C.

プロテイン BLAST（ Blastp ）（ Camacho et al., 2009 ）youngae ATCC 29220 および F. varium ATCC 27725 を嫌気性条件下で pH4.0 - 9.0 に調整した培地で培養した．

分析は，ヒト腸内常在菌 126 細菌株のタンパク質配列

Bifidobacterium 属細菌は，嫌気性条件下で pH 6.5 に調整した培地で培養した．
大腸菌，En. faecalis，ビフィズス菌の 3 菌種を用いた共培養

データを用いて行った(Yatsunenko et al., 2012）．
F. varium と C. youngae の共培養
大腸菌と En. faecalis の共培養と同様に，F. varium と C.
youngae を共培養し，培養上清中のプトレッシン濃度を決定した．

大腸菌のプトレッシン合成酵素遺伝子破壊株（ SK930,

統計分析

プトレッシン欠損株）と En. faecalis の野生型株（ V583 ）の 2 菌種の共培養，あるいは大腸菌のプトレッシン合成
酵 素 遺 伝 子 破 壊 株（ SK930 ），En. faecalis の 野 生 型 株

細胞外および糞便中のプトレッシン濃度，pH，およ（ V583 ），ビフィズス菌の 2 菌種の共培養を行い，培養

び生菌数を，スチューデントの t 検定，一元配置分散分− 118 −

複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産

析（ Tukey＇s test に基づく），Steel-Dwass 検定，または量した．大腸菌を培地で培養した際の各物質の濃度変化

Wilcoxon の符号付き順位検定を用いて試験を行ったグはアルギニンで 2.51 から 0.64 mM（初期濃度の 26 ％）ループ間で比較した．0 週目と 12 週目の比較は，対応への減少，アグマチンで 0.35 から 2.51 mM への増加，のある t 検定または Wilcoxon の符号付き順位検定を使

プ ト レ ッ シ ン で 0 か ら 0.71 mM へ の 増 加 で あ っ た

用して検定した．スチューデントの t 検定および一元配（ Fig. 1C，0 - 24 h ）．この大腸菌の培養上清を用いて En.

置 分 散 分 析（ Tukey＇s test に 基 づ く ） は，SPSS ver.22（ IBM，Armonk，NY ）を用いて行い，他の分析は R 統

faecalis を培養した際の各物質の濃度変化は，アグマチ
ンで 2.51 から 0.10 mM（初期濃度の 3.9 ％）への減少，

計 ソ フ ト ウ ェ ア ver.3.4.2 ま た は SPSS ver.22 を 用 い て

プ ト レ ッ シ ン で 0.71 か ら 3.21 mM へ の 増 加 で あ っ た

行った．

（ Fig. 1C，24 - 48 h ）．対照的に，En. faecalis の培養上清結を用いて大腸菌を培養した場合は，最終的な培養上清中

果にはアグマチン，プトレッシンの双方が産生されず，ア
ルギニンはほとんど存在しなかった（ Fig. 1D ）．以上の細菌の共培養によるプトレッシン生産の誘導

結果を統合すると，大腸菌と En. faecalis の共培養時にまず，腸内細菌を単一菌株で培養した場合と複数菌株観察されたアルギニンを原料としたプトレッシン生産のを共培養した場合の培養上清中のプトレッシン濃度を比誘導は，大腸菌から En. faecalis へアグマチン（アルギ較した．アルギニンを含む培地中のヒト腸内の 4 つの主

ニンとプトレッシンの間の反応中間体である）が受け渡要な門に含まれる 14 種を同時に共培養した培養上清中された結果起こったと示唆された．

のプトレッシン濃度は 8.5 mM であり，これら 14 種を単独で培養した場合の濃度（ 0 - 1.02 mM の範囲であり，平均濃度は 0.21 mM ）の 10 倍以上高かった．（ Fig. 1A ）．

大腸菌と En. faecalis による連続的な物質変換によるプ
トレッシン生産

プトレッシンの高生産を誘導した菌種の組み合わせを決

大腸菌はアルギニンデカルボキシラーゼ(AdiA ）とア定する目的で，共培養した 14 菌種から様々な 2 菌種をルギニン - アグマチンアンチポーター（ AdiC ）からなる

組み合わせ，培養上清中のプトレッシン濃度を定量した．

耐酸性システムを有する(Foster, 2004）．En. faecalis に

こ の 結 果， 大 腸 菌 と En. faecalis を 共 培 養 し た 場 合 においては，アグマチンデイミナーゼ（ AguA ）とアグマ

8.0 mM のプトレッシンが培養上清中に蓄積し，これはチン - プトレッシンアンチポーター（ AguD ）に同様の試験を行った全ての組み合わせのうちで最高の濃度で酸耐性システムが存在する（しかし，このシステムは酸あった（ Fig. 1B ）．この濃度は，大腸菌と En. faecalis をで誘導されないことがこれまでに報告されている

個別に培養した場合に観察された濃度よりも 8 倍以上高(Suárez et al., 2013）．我々は，別個の細菌に由来するこかった．大腸菌と En. faecalis の共培養でのプトレッシ

れら 2 つの耐酸性システムが組み合わさって，誘導されン生産は培地の pH が 5.5 のときに最も高かった．これ

たプトレッシン生産をもたらすという仮説を立てた．こはプトレッシン生産の誘導が，バクテリアの酸耐性シスの仮想経路（ Fig. 2 ）では，アルギニンは AdiC によっテムによるものであることを示唆している．大腸菌はアて培地から大腸菌細胞に取り込まれ，AdiA/SpeA によっ

ルギニンを吸収し，アグマチンに変換し，このアグマチてアグマチンに変換される．生成したアグマチンは，そンを細胞外へと放出する機構を有しており，この際に細の後，大腸菌細胞から AdiC を介して培地中に放出され胞内の H+ が消費されるために，この機構は，アグマチ

る．次に，En. faecalis は AguD により培地からアグマチンを利用した耐酸性システムとして知られているンを吸収する．En. faecalis の細胞内で，アグマチンは(Suárez et al., 2013）．一方で En. faecalis は細胞外のア

AguA とプトレッシンカルバモイルトランスフェラーゼ

グマチンを利用して ATP を産生する経路を持っており，（ AguB ）による連続的な反応によってプトレッシンに

この経路の副産物として細胞外にプトレッシンが放出さ変換される．生成したプトレッシンは，AguD を介してれ， さ ら に 細 胞 内 で H+ が 消 費 さ れ る(Suárez et al.,2013）．重要なことは，アグマチンがアルギニンからプ

En. faecalis 細胞から培地中へ放出される．これら 2 つの細菌の代謝および輸送経路の組み合わせにより，プト

トレッシンを生産する際の反応中間体であることである．

レッシンの生産が促進された可能性が考えられた．

大腸菌または En. faecalis が他の細菌によって放出さこの仮説を実証するために，adiA 遺伝子を破壊あるいれた細胞外のアグマチンを利用してアルギニンからプトは相補した大腸菌を作成し，野生型の En. faecalis と共培

レッシンを合成する可能性を評価するために，一方の細養した（ Fig. 3A ）．まず，2 mM L -アルギニン，1.5 g/L

菌の培養上清を用いて他方を培養し，最終的な培養上清D - グルコース，および 0.5 g/L L - システイン- 塩酸塩を含のアルギニン，プトレッシンおよびアグマチン濃度を定む LB 培地（ LB - RGC ）で，野生型大腸菌（ LKM10096 ）− 119 −

栗原

新Figure 1. Induction of putrescine production by mixed microbial cultures. (A) Extracellular putrescine concentrations in cocultures and individual cultures of 14 bacterial strains in GAM medium supplemented with 2 mM of arginine. (B) Extracellular
putrescine concentrations in cocultures of each pair of 14 bacterial strains (total 91 combinations). *N.D. = not detected, i.e.,
the levels fell below the minimum detectable amount. (C) Extracellular concentration of L-arginine, putrescine, and agmatine
in the medium after culture of E. coli for 24 h (0 – 24 h), followed by culture of En. faecalis for another 24 h (24 – 48 h) in thesame medium; E. coli was removed by filtration after 24 h. (D) Extracellular concentrations of L-arginine, putrescine, andagmatine in medium after culture of En. faecalis for 24 h (0 – 24 h), followed by culture of E. coli for another 24 h (24 – 48 h) in
the same medium. En. faecalis was removed by filtration after 24 h.

− 120 −

複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産

Figure 2.

Hypothetical putrescine production pathway consisting of the acid resistance system of E. coli and an ATP
synthesis system of En. faecalis. A putrescine biosynthesis pathway consisting of sequential reactions accomplished by E.
coli and En. faecalis. Details are shown in the text. Abbreviations: Arg, arginine; Agm, agmatine; Put, putrescine; AdiA, arginine decarboxylase; AdiC, arginine/agmatine antiporter; AguA, agmatine deiminase; AguB, putrescine carbamoyltransferase;
AguC, carbamate kinase; AguD, agmatine/putrescine antiporter.

と 野 生 型 En. faecalis（ SK947 ） を 共 培 養 し た と こ ろ，

これらの結果により，培地中のアルギニンが大腸菌おその上清中に 1.82 mM のプトレッシンが生成した．次に，よび En. faecalis の酵素およびトランスポーターからな

大腸菌の adiA 破壊株（ SK914 ）と野生型 En. faecalis をるハイブリッドシステム（ Fig. 2 ）によって，プトレッ

共培養した場合，プトレッシン生産はほぼ消失した．さシンに変換されることが遺伝学的に証明された．

らに大腸菌の adiA 相補株（ SK912 ）と野生型 En. faecalisを共培養したところ，プトレッシン生産は完全に回復し

2 種の細菌によるハイブリッド・プトレッシン生産シス

た．同様に，adiC 欠失大腸菌（ LKM10097 ）を野生型

テムはマウス腸管においても機能する

En. faecalis と共培養した場合，プトレッシン生産は消失し，大腸菌の adiC 相補株（ LKM10100 ）および野生型 En. faecalis を用いた相補実験ではプトレッシン生産
は完全に回復した（ Fig. 3B ）．

プトレッシン生産経路（ Fig. 2 ）がマウスの腸管内においても機能することを示す目的で，大腸菌および En.
faecalis が定着したノトバイオートマウスを用いた実験を行った．野生型大腸菌と aguD 欠失 En. faecalis を共培

さらに我々は，En. faecalis における aguD の役割を調養した場合，プトレッシン生産は完全には消失しなかっべた（ Fig. 3C ）．野生型大腸菌を En. faecalis の aguD 破たので（ Fig. 3C ），プトレッシン欠損大腸菌（ SK930,

壊株（ SK948 ）と共培養した場合，プトレッシン濃度は

pBelobac11/ΔspeBΔspeCΔspeF; 全てのプトレッシン生合

野生型大腸菌と野生型 En. faecalis を共培養した場合の成遺伝子を破壊したために，プトレッシンを合成できな

14 ％（ 0.26 mM ）にまで減少した．一方で野生型大腸菌

いが，その前駆体であるアグマチンについては合成できを En. faecalis の aguD 相補株（ SK949 ）を用いた相補実る）を作製し，この実験に使用した．プトレッシン欠損

験では，プトレッシン濃度は 0.68 mM（野生型大腸菌と大腸菌および野生型 En. faecalis を LB-RGC 培地中で共野生型 En. faecalis を共培養した場合のプトレッシン濃培養した場合，培養上清中のプトレッシン濃度は 2.8 mM

度の 37 ％）に回復した．

に達した（ Fig. 3D ）．対照的に，プトレッシン欠損大腸− 121 −

栗原

新Figure 3. Validation of the hypothesis of sequential reactions in E. coli and En. faecalis using bacteria whose genes
encoding transporters and enzymes were deleted or complemented. (A, B) Extracellular putrescine concentration in
cocultures of wild-type En. faecalis (SK947) and E. coli including gene knockout mutants or complementary transformants of(A) arginine decarboxylase (adiA) of E. coli or (B) arginine-agmatine antiporter (adiC) of E. coli. (C) Extracellular putrescine
concentrations in cocultures of wild-type E. coli (LKM10096) and En. faecalis including the wild type, gene knockout mutants,
or complementary transformants of agmatine-putrescine antiporter (aguD). (D) Extracellular putrescine concentration in
cocultures of putrescine-deficient E. coli (SK930) and wild-type En. faecalis (SK947). Coculture of these bacteria wasconducted under anaerobic conditions at 37 ℃ for 24 h in LB-RGC. (E, F) Putrescine concentrations in the content of (E) cecal
lumen and (F) colonic lumen of gnotobiotic mice colonized with putrescine-deficient E. coli (SK930) and wild-type En. faecalis(SK947). Error bars represent SEs. One-way ANOVA with Tukey＇s test; *p < 0.05; **p < 0.01.

− 122 −

複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産菌および En. faecalis の aguD 破壊株（ SK948 ）を共培養

いことが報告されているが(Suárez et al., 2013），本研究した場合，プトレッシン生産は完全に消失した．プトレッ

で得られた結果はこれらの結果と一致していた．実際に，

シン欠損大腸菌と En. faecalis の aguD 相補株（ SK949 ）5 mM アグマチンを含有する培地中で単独培養された野の 共 培 養 は， プ ト レ ッ シ ン 欠 損 大 腸 菌 と 野 生 型 En.

生型 En. faecalis（ SK947 ）の生菌数は，同じ培地中で

faecalis の共培養の 21 ％のレベルでプトレッシンが生産された（ Fig. 3D ）．次に，それぞれの細菌株の共培養ペ単独培養された En. faecalis の aguD 破壊株の生菌数も有アを無菌マウスに投与して得られたノトバイオートマウとプトレッシン欠損大腸菌（ SK930 ）を共培養におけるスの盲腸および結腸の内容物中のプトレッシン濃度を定En. faecalis の生菌数は，En. faecalis の aguD 遺伝子破壊株（ SK948 ）とプトレッシン欠損大腸菌の共培養よりも量 し た． プ ト レ ッ シ ン 欠 損 大 腸 菌 お よ び 野 生 型 En.
faecalis が定着したノトバイオートマウスでは，盲腸におけるプトレッシン濃度は 100 μM であった（ Fig. 3E ）．

意 に 高 か っ た． さ ら に， 野 生 型 En. faecalis（ SK947 ）

有 意 に 高 か っ た．（ p < 0.05 ）． さ ら に，En. faecalis の対照的に，プトレッシン欠損大腸菌および En. faecalis

aguD 相補株（ SK949 ）をプトレッシン欠損大腸菌と共培養したとき，En. faecalis の生存数は回復した．これの aguD 遺伝子破壊株が定着したマウスでは，盲腸におらの結果は，En. faecalis が，アルギニンから大腸菌にけるプトレッシン濃度は 46 μM まで減少した．一方で，より産生されたアグマチンを用いてより有利に増殖する

プトレッシン欠損大腸菌と En. faecalis の aguD 相補株をことを示している．

定着させたマウスでは盲腸におけるプトレッシン濃度はン濃度についても同様の傾向を示したが，その差は統計

ビフィズス菌によって生産された酸は En. faecalis と大腸菌によるハイブリッド・プトレッシン生産システムを的に有意ではなかった（ p = 0.079 ）（ Fig. 3F ）．これらの誘導する

ほぼ 100％回復した（ Fig. 3E ）．結腸内腔のプトレッシ

結果は，大腸菌と En. faecalis の酵素およびトランスポー

本研究において観察されたプトレッシン生産の誘導

ターからなるプトレッシンのハイブリッド生産システム

は，培地の pH に強く依存していた（ Fig. 1D ）．ビフィ

が，マウス腸管内においても機能することを示した．

ス 菌 は 乳 酸 と 酢 酸 を 生 成 し(de Vries & Stouthamer,1968），腸管内腔の pH を低下さることが知られている大腸菌と En. faecalis によるハイブリッド・プトレッシ
ン生産システムの生理学的重要性(Bullen et al., 1976）．我々はプトレッシン生産を強く誘導するビフィズス菌をスクリーニングする目的で，プトこの研究で観察されたプトレッシン生産の増加は，当レ ッ シ ン 欠 損 大 腸 菌（ SK930 ） と 野 生 型 En. faecalis

初，大腸菌と En. faecalis の耐酸性システムの組み合わ（ V583 ）の共培養系にさらに 9 つのビフィズス菌株をそせに起因すると考えられた．大腸菌は，細胞内のアグマ

れぞれ追加して共培養を行い，それらの培養上清中のプチンを細胞外のアルギニンと交換するアルギニン依存性

トレッシンの濃度を比較した（ Fig. 4A ）．試験を行った酸耐性系（ AR3 ）を有することが知られている(Richard

組み合わせのうち，プトレッシン欠損大腸菌，野生型& Foster, 2004）．野生型の大腸菌（ MG1655 ）をアルギ
ニンを含有する様々な pH（ pH 5 - pH 9 ）の培地中で単En. faecalis，および B. animalis subsp. lactis LKM512 の3 菌種による共培養における培養上清に最も高濃度のプ独培養した場合，培養上清のアグマチン濃度は培地のトレッシンが検出された．さらに，B. animalis subsp.

pH が 5 から 9 へ上昇すると共に減少した（ pH 4 およびlactis に 分 類 さ れ る 2 株（ LKM512 と DSM 10140T ） を

9 では細胞増殖が阻害された）．これは，大腸菌におけるアルギニンからのアグマチンの産生が酸耐性システム

En. faecalis と大腸菌の共培養系に，それぞれ追加して培養した際のプトレッシン濃度は大きく異なっていたこに依存することを示している．しかしながら，野生型とから，ビフィズス菌のプトレッシン生産誘導能は株に

En. faecalis（ V583 ）をアグマチンを含有する様々な pH（ pH 5 - pH 9 ）の培地中で単独培養した場合は，それぞ依存することが示唆された．

れの培地で生産されたプトレッシンの濃度に有意差はな

faecalis と大腸菌の共培養でプトレッシン生産を誘導するメカニズムを調べた．個別に培養したプトレッシン欠

かった（ pH 4 および 9 では細胞増殖が阻害された）．対次 に 我 々 は B. animalis subsp. lactis LKM512 が En.

照的に，野生型 En. faecalis（ SK947 ）によるプトレッ

損大腸菌，野生型 En. faecalis，および B. animalis subsp.

シン生産はグルコースの存在下で阻害されたことから，
この経路がエネルギー産生に関与している可能性が考え

lactis LKM512 を 24 時間培養した際の上清の pH は初期の pH 6.5 からそれぞれ 5.2，5.3，および 4.4 に減少した

られた．これまでに，En. faecalis のプトレッシン産生

が（ Fig. 4B ），これらの培養上清におけるプトレッシン

経路がエネルギーを得るために活性化されること，酸性濃度は非常に低かった（ Fig. 4C ）．しかしながら，これストレスに対する細菌細胞の保護とは強く関係していなら 3 つの株を共培養した後の培養上清における pH は 5.0− 123 −

栗原新

 f fects of acidification by bifidobacteria on putrescine production by E. coli and En. faecalis. (A) Extracellular
Figure 4. E
putrescine concentration in cocultures of putrescine-deficient E. coli (SK930), wild-type En. faecalis (V583), and each
Bifidobacterium sp. (B, C) Extracellular pH (B) and putrescine concentration (C) in cocultures of putrescine-deficient E. coli
(SK930), wild-type En. faecalis (V583), and B. animalis subsp. lactis LKM512. Coculture of these bacteria was conductedunder anaerobic conditions at 37 ℃ for 24 h in LB medium containing 2 mM L-arginine, 1.5 g/L D-glucose, 5 g/L galactooligosaccharide, 2 mM MgSO4, 60 mM NH4Cl, and 0.5 g/L L-cysteine-hydrochloride (pH 6.5). (D, E) Fecal pH (D) and putrescine
concentration (E) in gnotobiotic mice colonized with putrescine-deficient E. coli (SK930), wild-type En. faecalis (V583), and B.
animalis subsp. lactis LKM512. (F, G) Fecal pH (F) and putrescine (G) concentration in gnotobiotic mice inoculated withputrescine-deficient E. coli (SK930), wild-type En. faecalis (V583), and B. adolescentis JCM 1275T. (H) Extracellular putrescine
concentration in human feces incubated at different pHs. Error bars represent SEs. One-way ANOVA with Tukey＇s test,
Student＇s t-tests, and Steel-Dwass test; *p < 0.05; **p < 0.01.

− 124 −

複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産であり，これは B. animalis subsp. lactis LKM512 を追加

1275T をさらに定着させたマウスの糞便の pH およびプト

せずに共培養した場合の pH 5.9 よりも有意に低かった

レッシン濃度には有意差がなかった（ Fig. 4F および 4G ）．

（ Fig. 4B ）．さらに，3 つの株を共培養した場合の培養上

これらの両ビフィズス菌がマウス腸管に定着しているこ

清中のプトレッシン濃度は，LKM512 を追加せずに共培とは確認されたが，B. animalis subsp. lactis LKM512 の養した場合のプトレッシン濃度の 2 倍以上であり生菌数は B. adolescentis JCM 1275T の生菌数より高かっ（ p < 0.01; Fig. 4C ），B. animalis subsp. lactis LKM512 はた．これらの結果は，ビフィズス菌がプトレッシンを増大腸菌と En. faecalis の共培養におけるプトレッシン生加させる能力は種によって異なることを示唆した．

産を促進したと考えられた．しかしながら，細胞外プト

腸管内腔の環境の酸性化がプトレッシン生産に及ぼす

レッシン濃度が大腸菌および En. faecalis の両方の生菌影響をさらに解析する目的で，ヒト糞便（ n = 6 ）を様々

数と正に相関していたので，環境を酸性化させる以外のな pH の緩衝液に懸濁し，24 h インキュベートしたとこ

因子がこのプロセスに関与している可能性は完全には否ろ，pH 5.6 ではすべての糞便サンプルでプトレッシン濃定できなかった．重要なこととして，他のビフィズス菌度が増加した．これは，腸管内腔環境の酸性化がヒト腸と比較してより高濃度のプトレッシン生産が観察された内細菌によるプトレッシン生産を引き起こす可能性があ

B. animalis subsp. lactis LKM512 あるいは B. adolescentis
JCM 1275T を追加した共培養系においては，大腸菌およることを示唆している（ Fig. 4H ）．細菌細胞を強い酸により死滅させるために糞便（ n = 5 ）を 0.1 N HCl に懸濁び En faecalis において，それぞれ 3.2×10 cfu/ml 以上，7.9

した実験では，プトレッシン濃度の増加はわずかにとど×107 cfu/ml 以上といった高い生菌濃度を示した．一方

まったことから，糞便懸濁液を酸性化した際のプトレッ

で，プトレッシン生産に対する誘導能を殆ど有さなかっ

シン生成は酸性条件による腸内細菌の細胞の破裂に由来た B. longum JCM 1217 あ る い は B. pseudocatenulatum

するのではなく，生菌の生理活動によることが強く示唆

JCM 1200 を追加して行った共培養においては，大腸菌

された．

8

および En faecalis の生菌濃度は B. animalis subsp. lactis
LKM512 あるいは B. adolescentis JCM 1275T を追加した
際の 10 分の 1 以下の 6.3×106 cfu/ml に留まった．なお，

En. faecalis と他の腸内細菌種との共同によるプトレッ
シン生産

3 菌種を用いた全ての共培養液において，プトレッシン

本研究で同定されたハイブリッド・プトレッシンシス

生産が最大に達する培養開始 12 時間以内に，培養上清テムの後半に寄与する En. faecalis（ Fig. 2 ）は，ヒト腸内常在菌叢最優勢種であり(Qin et al., 2010），その占有の pH は 5.5 に到達した．

率の高さから，腸管内腔における代謝物のフローに重要
大腸菌および En faecalis を定着させたノトバイオートマな役割を果たすと予想される．しかし，本研究で同定さウスの糞便中のポリアミン生産はビフィズス菌の経口投れたハイブリッド・プトレッシンシステムの前半に寄与

与により増強されるする大腸菌は腸管内腔では比較的菌数が少ない菌種であ

動物生体内でのプトレッシン生産において，ビフィズ

る．したがって，ハイブリッド・プトレッシン生産系にス菌によって生成される酸性環境の影響を解析する目的

おいて大腸菌によって担われる前半部分が他の腸内常在で，ノトバイオートマウスにプトレッシン欠損大腸菌

菌により代替可能なことを示す目的で，AdiA および AdiC

（ SK930 ）および野生型 En. faecalis（ V583 ）2 種にさらを有する種を in silico 分析によって同定した．同定されにビフィズス菌 2 種（ B. animalis subsp. lactis LKM512

た Citrobacter youngae ATCC 29220 および Fusobacterium

あるいは B. adolescentis JCM 1275T ）のうち 1 種を定着

varium ATCC 27725 の 2 種 そ れ ぞ れ を， 野 生 型 En.

させたノトバイオートマウスを作成した．同時にプト

faecalis（ V583 ）と共培養した．C. youngae と En. faecalisを共培養した場合のプトレッシン生産は，C. youngae を

レッシン欠損大腸菌および野生型 En. faecalis 2 種のみ（ビフィズス菌を定着させない）を定着させたノトバイ

単独で培養した際と比較して増加する傾向があった

オートマウスも作成した．プトレッシン欠損大腸菌およ（ Fig. 5A ）．一方で，F. varium と En. faecalis を共培養しび野生型 En. faecalis 2 種のみを定着させたノトバイオー

た場合の培養上清中のプトレッシン濃度は，F. varium をトマウスと比較して，B. animalis subsp. lactis LKM512

単独で培養した場合よりも 28 倍以上高かった（Fig. 5A ）．

をさらに定着させたマウスの糞便の pH は有意に低く

さらに，F. varium および野生型 En. faecalis を共定着さ（ p < 0.01 ）（ Fig. 4D ），プトレッシン濃度は有意に高かっせたノトバイオートマウスの糞便中のプトレッシン濃度

た（ p < 0.05 ）（ Fig. 4E ）．しかしながら，プトレッシン

は，野生型 En. faecalis または F. varium を単独定着させ欠損大腸菌および野生型 En. faecalis 2 種のみを定着させたノトバイオートマウスの糞便中のプトレッシン濃度よたノトバイオートマウスの糞便と，B. adolescentis JCM

りも有意に高かった（ p < 0.05 ）（ Fig. 5B ）．これらの結− 125 −

栗原

新Figure 5. General putrescine production pathway from arginine via agmatine in the human intestinal microbiome. (A)Extracellular putrescine concentration in monoculture of C. youngae ATCC 29220 or F. varium ATCC 27725, and coculture of C.
youngae ATCC 29220 or F. varium ATCC 27725 with wild-type En. faecalis (V583). (B) Fecal putrescine concentration in
gnotobiotic mice inoculated with F. varium ATCC 27725 and wild-type En. faecalis (V583). Mono- and cocultures of thesebacteria were conducted under anaerobic conditions at 37 ℃ for 24 h in LB-RGC.

果は，AdiA および AdiC ホモログを有するいくつかの腸細菌種の遺伝子破壊株および相補株を使用して実験的に内常在菌種が，ハイブリッド・プトレッシン生産系に寄証明した．

与していることを示唆した．C. youngae を単独で培養しこの研究では，腸管内腔の生態系におけるポリアミンた際のアグマチン生産は培地の pH が 5.0 のとき最も高の一種であるプトレッシンの代謝に焦点を当て，2 つのかったが，F. varium を単独培養した際は，培地の pH が腸内細菌種（ En. faecalis と E. coli ）の独立した代謝経7.0 の と き 最 も 高 か っ た． こ の 結 果 は C. youngae の路と輸送システムが組み合わさることによりプトレッシ

AdiC/AdiA 経路が，大腸菌のそれと同様に，環境の酸性ンの生産が誘導されることを遺伝子レベル，また，in化によって活性化されるが，F. varium の経路は中性環

vitro と in vivo の双方において証明した．しかしながら境でも機能することを示唆していた．

in vivo 実験においては，結腸内腔中のプトレッシン濃度は in vitro 実験における培養上清中のプトレッシン濃考

察度と比較して著しく低かった．これは，生産されたプトレッシンが宿主によって吸収された可能性を示唆してお腸内細菌の代謝物は，単一の細菌細胞内の反応によっり，この点を明確に実証するためにはさらなる研究が必て，または腸管内の異なる細菌種における連続した反応要である．En. faecalis は大腸菌との共培養に加えて，によって合成されると考えられている．腸内細菌由来のAdiA と AdiC の ホ モ ロ グ を 持 つ C. youngae ま た は F.

代謝産物の合成に関与する酵素の実験的同定を目指した

varium との共培養によっても，プトレッシンを生成するため，この経路によるプトレッシンの生成は，En.

い く つ か の 研 究 が 進 行 中 で あ る(Degnan et al., 2014;
Rogowski et al., 2015; Wu et al., 2015)が，これらの研究は個々の細菌の細胞内経路のみに着目した研究である．

faecalis と E. coli という特定の菌種の組み合わせには依存しない．ヒト腸内には酵素 AdiA，AdiC，AguA，お一方で，2 つ以上の腸内細菌が協同して行う代謝反応をよび / または AguD のホモログを有する多くの種類の細遺伝子レベルで解析した研究はごくわずかである．例え菌が存在するために，この経路を介してプトレッシンをば，腸内細菌による多糖類のクロスフィーディングシス

生産することができる無数の組み合わせがある可能性がテムについて報告した優れた研究(Rakoff-Nahoum et al.,高い．アグマチンを生産するための至適 pH は，単一培

2016)では，細菌間の共生は，このクロスフィーディン

養では C. youngae と F. varium で異なることから，ヒト

グに関与する 2 つの細菌種のうちの 1 種の細菌における腸内においては，酸性条件化で活性化される AdiC/AdiA

遺伝子破壊によって検証されている．これに対し本研究システムと中性条件下でも機能する AdiC/AdiA システ

において我々は，2 つの細菌による新規プトレッシン・ムが共存している可能性が考えられた．

ハイブリッドシステムを，本システムに関与する双方の− 126 −

本研究で観察されたプトレッシン生産の誘導は，酸性複数の腸内常在細菌の生存戦略が組み合わさることによって成立する新規ハイブリッドシステムによる生理活性物質ポリアミンの生産

環境での生存を目的とした大腸菌の耐性システムによっ

短鎖脂肪酸が腸内常在菌に由来する他の代謝産物の産生て引き起こされ，プトレッシン生産は酸性の pH 条件にを誘導するという報告はこれまでにない．本研究では，依存した．大腸菌は，
2 つのアルギニンデカルボキシラー

ビフィズス菌による腸内環境の酸性化が in vitro およびゼ，SpeA(Boyle et al., 1984)お よ び AdiA(Gong et al.,2003)を有し，これらの酵素の触媒する反応によってアin vivo での大腸菌と En. faecalis の共培養によるポリアミンの合成と放出を促進するという全く新しい機構を解グマチンを生合成できる．adiA とオペロンを形成して明した．本研究の知見は，ビフィズス菌が健康増進効果

いる adiC は，細胞内のアグマチンを外部のアルギニン

を直接的にもたらすという既存の考え方から，ビフィズと交換するアルギニン - アグマチンアンチポーターをス菌が腸内細菌叢による代謝産物生成の改変を介した健

コ ー ド す る(Gong et al., 2003）． 大 腸 菌 細 胞 内 で は，

康増進効果を間接的にもたらすという新しい考え方へ

AdiC によって細胞外から取り込まれたアルギニンはの，大きなパラダイムシフトを示している．興味深いこ

AdiA によって脱炭酸され，この際にプロトンを消費すとに，プトレッシン生産は大腸菌および En. faecalis のるとともにアグマチンを生成し，環境の pH を上昇させ増殖を抑制したいくつかのビフィズス菌（ B. longum おる．このシステムは低 pH に反応して引き起こされ，「耐

よび B. pseudocatenulatum ）を含む共培養系では阻害さ

酸 性 シ ス テ ム 3（ AR3 ）」 と し て 広 く 研 究 さ れ て き た

れた．この知見は，腸内常在細菌，特に AdiC/AdiA ま(Foster, 2004）．

たは AguD/AguA を有する細菌の増殖を抑制しない特定

En. faecalis で は， プ ト レ ッ シ ン は ア グ マ チ ン か ら
AguA と AguB によって触媒される連続的な反応によっのビフィズス菌が，このハイブリッドシステムを介したて合成される(Landete et al., 2010; Llacer et al., 2007）．

とを示唆している．

En. faecalis のアグマチン生合成経路はこれまでに報告されておらず，アグマチン生合成酵素のホモログも存在

菌による環境の酸性化によって引き起こされる，アルギ

しないので，この細菌はアグマチンを細胞外から取り込

ニンを原料としアグマチンを経由する 2 つの異なる細菌

み，これをプトレッシンに変換すると考えられる．アグ

種にまたがる新規プトレッシン生産経路を発見した．こ

マチンの取り込みは，細胞内のプトレッシンを細胞外のの経路は，ビフィズス菌による酸の産生，この酸によるプトレッシン生産の誘導に関与している可能性があるこ
結論として，我々は腸管内腔において酸を産生する細アグマチンと交換するアグマチン - プトレッシンアンチ

大腸菌の耐酸性システムの誘導，En. faecalis のエネル

ポーター（ AguD ）によって行われる(Driessen et al.,

ギー生産システムの誘導という，関連する個々の細菌に

1988）．細胞内のアグマチンをプトレッシンに変換する

おける独立した戦略からなる．

アグマチンデイミナーゼを含む経路は，AguA，AguB，

我々は，腸内細菌叢による他の代謝産物の生産においおよび AguD からなり，培地を中和することによってても同様の菌種間の関連が存在する可能性が高く，腸内En. faecalis の増殖に最適な環境を作り出すことができる(Suárez et al., 2013）．しかしながら，この経路は環境

常在菌叢による代謝産物産生を解析する上で，このよう

pH によって影響されない．一方でこの経路は培地中に要であると考えている．

な菌種間にまたがる合成系の可能性を考慮することは重存在するアグマチンに誘導され，グルコースによって完要全に抑制される．以上の結果は，En. faecalis のアグマ
チンデイミナーゼ経路が耐酸性においてだけでなくエネ

約

ルギー生産においても重要な役割を果たすことを示唆しこれまでの研究で我々は，ヒト腸管内腔に豊富に見らた Suarez らの報告を裏付けるものである(Suárez et al.,れるポリアミンの一種であるプトレッシン濃度がアルギ

2013）．

ニンとプロバイオティクスビフィズス菌の投与後に増加

ビフィス菌のよく知られている健康への効能は，これすることを報告したが，そのメカニズムは不明であった．

らの細菌による酢酸および乳酸の生産による腸管内腔の本研究では，生育環境の酸性化（中性から 6.5 未満の環境の酸性化である．例えば便秘は，これらの短鎖脂肪pH の低下）によって引き起こされた 2 つの細菌グルー酸によって刺激された消化管の蠕動運動の活性化によっ

プの物質代謝・輸送経路が組み合わさることで，アルギて軽減することができる(Shi et al., 2016）．これに加え，ニンを原料とし，アグマチンを反応中間体とした新規プビフィズス菌によって産生される有益な代謝産物が直接トレッシン生合成経路を発見し，その機構を遺伝子レベ的に効用を持つことも知られている．例えば，これまで

ルで実証した．この経路は，ビフィズス菌に代表されるの研究で，ビフィズス菌が酢酸産生を介して病原体によ細菌が放出する酸がトリガーとなり発動し，大腸菌に代る感染から大腸腸管を保護することが示された(Fukuda

表される細菌のアルギニン依存性の酸耐性機構および，

et al., 2011）．しかしながら，ビフィズス菌に由来するEnterococcus faecalis に代表される細菌のアグマチンデイ− 127 −

栗原

ミナーゼによるエネルギー獲得機構が組み合わることで成立する．この経路は，複雑な細菌叢を形成する腸管内腔において複数の細菌の独立した生存戦略が偶然に組み合わさった結果，ヒトに大きな影響を与える生理活性物質であるポリアミンが生成されるという点が特徴的である．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 北田 雄祐，村松 幸治，栗原 新，松本 光晴. 2015. 腸内常在菌の異なる環境適応によるプトレッシン産生経路の解明. 日本ポリアミン学会第6回年会. 1月19日. 東京.
2) 北田 雄祐，村松 幸治，栗原 新，松本 光晴. 2015. 腸管内プトレッシンは腸内細菌の異なる環境適応を介して高生産される. 日本農芸化学会2015年度大会3月29日. 岡山.
3) 北田 雄祐，村松 幸治，栗原 新，松本 光晴. 2015. 腸内環
境の酸性化による腸内ポリアミン増加. 日本ポリアミン学会第7回年会. 11月13日. 京都.
4) 北田 雄祐，栗原 新，村松 幸治，松本 光晴. 2016. 腸内環
境の酸性化は腸内細菌由来の生理活性物質であるポリア
ミンを増加させる. 日本農芸化学会大会2016年度大会. 3月28日. 札幌.
5) 北田 雄祐，東樹 宏和，栗原 新，松本 光晴. 2017. 腸内マイクロバイオーム内の異菌種間の独立代謝系を介したプ
トレッシン産生経路. 日本農芸化学会大会2017年度大会. 3
月19日. 京都.
6) 北田 雄祐，東樹 宏和，栗原 新，松本 光晴. 2017. 腸内マイクロバイオーム内の異菌種間の異なる代謝系を介したポリアミン産生. 日本ポリアミン学会第8回年会. 1月20日.
習志野.
原著論文
1) Kitada, Y., Muramatsu, K., Toju, H., Kibe, R., Benno, Y.,
Kurihara, S. & Matsumoto, M. 2018. Bioactive polyamine
production by a novel hybrid system comprising multiple
indigenous gut bacterial strategies. Sci. Adv. 4: eaat0062.

謝辞

本研究は公益財団法人発酵研究所の寄付講座助成によって開設された腸内細菌共生機構学寄付講座において行われたものである．本助成を賜った発酵研究所に対してここに厚く御礼申し上げます．本寄付講座世話人である石川県立大学・熊谷英彦参与のご支援とご協力に感謝の意を表します .

文

献Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M.,
Datsenko, K.A., Tomita, M., Wanner, B.L. & Mori, H. 2006.
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− 129 −

IFO Res.Commun. 33
131-137, 2019

β -ガラクト- N -ビオシド構造を有する globo H，Gb5，およびGA 1 糖鎖に対する 2 種のラクト- N -ビオシダーゼの特異性
後藤

愛那，栗原

新，片山

高嶺

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松

Different specificities of two lacto-N-biosidases towards β-linked
galacto-N-biose-containing sugar chains of globo H, Gb5, and GA1
Aina Gotoh, Shin Kurihara, Takane Katayama
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
Two independently evolved lacto-N-biosidases (LnbX and LnbB) show different specificities towards the sugar
chains of globo- and ganglio-series glycosphingolipids. LnbX, a member of glycoside hydrolase family 136, from
Bifidobacterium longum subsp. longum, liberated galacto-N-biose (GNB: Galβ1-3GalNAc) and fucosyl GNB (a type4 trisaccharide) from Gb5 pentasaccharide and globo H hexasaccharide, respectively. LnbB, a member of theglycoside hydrolase family 20, from Bifidobacterium bifidum, released GNB from Gb5 and GA1 oligosaccharides.
This is the first report demonstrating enzymatic release of β-linked GNB from natural substrates.
Key words: Bifidobacterium, lacto-N-biosidase, glycosphingolipid緒

言

Clostridium 属細菌によって産生される酪酸が制御性 T細胞の分化を誘導することなどが知られている．さらに，

腸内細菌叢は宿主の健康に大きな影響を及ぼす．例え

マウスの不安行動や認知機能障害といった行動異常も，ば，腸内細菌によって産生される短鎖脂肪酸は，マウス

腸内細菌代謝物に関連していることが報告されているの体重，エネルギーバランス，および免疫応答に影響を与(Diaz Heijtz et al., 2011; Goehler et al., 2008; Hsiao et al.,えることや(Kimura et al., 2013; Maslowski et al., 2009)，

2013）．したがって，宿主の健康にとって腸内細菌叢の構成や影響を理解することは不可欠である．

E-mail:後藤愛那（ aina.g1985@gmail.com ）（現所属 : 京都大学大学院生
命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（ 現所属 : 近畿大学生
物理工学部 〒 649-6433 和歌山県紀の川市西三谷 930），
片山高嶺（ takane@lif.kyoto-u.ac.jp ）（現所属 : 京都大学大学院生
命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町）
共同研究者
加藤紀彦（京都大学大学院生命科学研究科），
杉山友太（京都大学大学院農学研究科），
本多裕司（石川県立大学生物資源環境学部），
櫻間晴子（石川県立大学生物資源環境学部），
神戸大朋（京都大学大学院生命科学研究科），
芦田 久（近畿大学生物理工学部），
北岡本光（国立研究開発法人農研機構），
山本憲二（石川県立大学生物資源環境学部）

難消化性多糖（食物繊維）は，腸内細菌叢の組成に影響を与える要因の 1 つであり，有用微生物の増殖を促進するプレバイオティクス（一般的にオリゴ糖）の開発を目指す研究において注目を集めている(Brownawell
et al., 2012）． 成 人 の 腸 管 内 に 生 息 す る Bacteroides
thetaiotaomicron のゲノム上には，多糖類の資化に関与
す る 遺 伝 子 群 が 多 く 存 在 し て い る(Koropatkin et al.,2012）．また，乳児腸管内で優占種となる Bifidobacterium
属細菌には，人乳中で 3 番目に豊富な固形成分であるヒトミルクオリゴ糖（ HMOs ）の代謝に特化した酵素が備わっている(Asakuma et al., 2011; Ashida et al., 2009;
Kiyohara et al., 2011; Martens et al., 2008; Miwa et al.,2010）．これらの腸内細菌は，食餌由来および宿主由来− 131 −

後藤

愛那，栗原

新，片山

高嶺

の糖鎖を分解して増殖することで共生関係を築くため

ラクト- N -ビオシダーゼが，Bifidobacterium という 1 つに，これらのグリコシダーゼを進化させた可能性が高い．

の属で異なる進化を遂げてきたことは大変興味深い．すそのため，正常な腸内細菌叢の形成と維持の基盤を理解

なわち，本酵素は腸内細菌の炭素源獲得の分子基盤を理するためには，グリコシダーゼの特徴を詳細に解明する解するため，また宿主―細菌の共生および共進化の分子ことが必要である．このことは，腸上皮細胞表面での基盤を理解するための重要な研究対象となりえる．

FUT2 による H 抗原（ Fucα1-2Gal ）の発現と，H 抗原から腸内細菌由来の 1,2 - α - L -フコシダーゼによって遊離さ性として，グロボ系およびガングリオ系スフィンゴ糖脂れるフコース（ Fuc ）が，共生の確立と病原性細菌遺伝

質のオリゴ糖に対する活性を調べた．これは，β -ガラク子の発現を減少させるために重要であるという知見から

ト- N -ビオース（ GNB:Galβ1-3GalNAc ）を天然基質かも裏付けられる(Bry et al., 1996）．1,2 - α - L -フコシダー

ら遊離させる活性を見出した最初の報告である．

本論文では，LnbX および LnbB の新規な糖鎖分解活ゼ（ EC 3.2.1.63 ）は，腸管内生態系に影響を与える特

実験方法

異的な細菌グリコシダーゼの代表と考えられる(Katayama et al., 2004）．
HMOs の主成分であるラクト- N -テトラオース（ LNT:

基質および試薬

Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc ）をラクト- N -ビオース I

LNB-β-pNP お よ び ラ ク ト- N -フ コ ペ ン タ オ ー ス I（ LNB:Galβ1-3GlcNAc ）およびラクトース（ Lac ）に（ LNFP I:Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc ）は分解する酵素ラクト- N -ビオシダーゼ（EC 3.2.1.140 ）も，

Sigma-Aldrich（MO, USA ）から，GNB-β-pNP は東京化成

腸内細菌と宿主の共生に重要な酵素であると思われる．

工業株式会社（Tokyo）から，LNT は Dextra Laboratories

これまで 2 つの異なるラクト- N -ビオシダーゼが単離さ（ Reading, UK ）から，globo H，Gb5 および GA1 オリゴ

れているが(Sakurama et al., 2013; Sano et al., 1992; Wada

糖は Elicityl（ Crolles, France ）から購入した．Gb 5 は

et al., 2008），一方はグリコシドヒドロラーゼファミリー（ GH ）20 に属し，他方は最近になって GH136 に分類さAsahipak NH 2 P-90 20 F カラム（ Showa Denko, Tokyo ）れることとなった(Henrissat & Davies 1997）．これらはさらに精製した．

を用い高速液体クロマトグラフィー（ HPLC ）によってそれぞれ Bifidobacterium bifidum 由来のラクト- N -ビオ
シダーゼ（ LnbB ），および Bifidobacterium longum subsp.

酵素の精製

longum 由 来 の（ LnbX ） で あ る． 我 々 は こ れ ま で に，
GH20 LnbB が未修飾 LNB 構造に対して厳密な特異性を加組み換えタンパク質として大腸菌において発現し精製示すのに対し，LnbX は GalNAcβ1-3GlcNAc（ α -ジスト

した(Sakurama et al., 2013; Wada et al., 2008）．タンパク

ログリカンの O -マンノシルグリカンに見られる二糖構質濃度は，ウシ血清アルブミンを基準として BCA タン

造）(Yoshida-Moriguchi et al., 2010），および LNB と 2＇ -パク質アッセイキット（ Thermo Scientific，MA，USA ）フコシル LNB（ Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc ）を遊離するこを使用して測定した．

LnbX および LnbB は，既報の方法に従い，His タグ付と を 報 告 し て い る(Sakurama et al., 2013; Wada et al.,2008）．構造的に考えると，
LnbB は GH20 の主要メンバー

酵素活性測定である β - N - アセチルヘキソサミニダーゼの活性中心に酵素反応は 50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（ pH 6.0 ）おいて非還元末端側にサブサイトを拡大させる（−2 サ中で行った．基質として pNP - 糖およびオリゴ糖を使用

ブサイト）ことで進化したと考えられる．GH 20 ラクト

した．酵素の添加により反応を開始し，30 ℃で適当な- N -ビオシダーゼは，Bifidobacterium 属および Streptomyces

時間インキュベートし，直線的な反応変化が得られる範属が有しているが，これら 2 つの細菌間のアミノ酸配列

囲 に お い て 速 度 を 決 定 し た．LnbX の 濃 度 は，相同性は最大で 38 ％であり，これらの酵素は異なるプ

0.09 - 0.3 μg/mL（ LNB-β-pNP の 場 合 ），4 - 6 μg/mL

ロセスで進化してきた可能性が高い．Streptomyces 属に（ GNB-β-pNP の場合），50 - 60 μg/mL（ Gb5 の場合），まおける進化の原動力が何であったかについて明確な答え

たは 970 μg/mL（ globo H の場合）とした．LnbB の濃はないが，Bifidobacterium 属の場合は，宿主由来グリカ

度 は，0.1 - 0.8 μg/mL（ LNB-β-pNP お よ び GNB-β-pNPン， 特 に HMOs が そ の 要 素 で あ っ た と 考 え ら れ る．

の場合），または 1 - 2 μg/mL（ Gb5 および GA1 の場合）

LnbX ホ モ ロ グ は こ れ ま で 5 つ の 属（ Bifidobacterium，とした．速度論的パラメータ測定では，基質濃度はそれClostridium，Ruminococcus，Roseburia，および Enterococcus）
で同定されている．ラクト- N -ビオシダーゼ活性自体がぞれの K m 値の 0.3 から 2 倍までの範囲で行った．反応

停止は，炭酸ナトリウム添加（ pNP - 糖の場合）または

自然界では稀であることを考えると，2 つの全く異なる

95 ℃で 3 分間加熱（オリゴ糖の場合）で行った．遊離し− 132 −

β -ガラクト- N -ビオシド構造を有する globo H，Gb5，および GA 1 糖鎖に対する 2 種のラクト- N -ビオシダーゼの特異性

た pNP 量は 405 nm の吸光度を測定して決定した．オリを調べた．比較のため GH20 LnbB の活性についても同ゴ糖の加水分解は，Asahipak NH 2 P-50 4 E カラム（昭時に評価した．LNB-β-pNP に対する LnbX および LnbB

和電工）を用いた HPLC システムで，73 ％アセトニトの速度論的パラメータは（ Table 1 ），以前の報告と同程

リル 1 mL/分の流速で溶出を行い，荷電エアロゾル検出度であった(Ito et al., 2013; Sakurama et al., 2013）．予想器（ Thermo Scientific ）を用いてモニターした．Globo

通 り，LnbX は GNB-β-pNP を 加 水 分 解 し， 比 活 性 はH を基質とした場合，遊離した Fucα1-2Galβ1-3GalNAc

LNB-β-pNP の 1/50 程 度 で あ っ た（ 0.51 U/mg 対 25 U/からフコシル基を除去するために，HPLC 分析に先立っmg ）．ただし，阻害反応で得られた結果を反映して，て，反応生成物を 1,2 - α - L -フコシダーゼ(Katayama et al.,LnbX は LNB-β-pNP よ り も GNB-β-pNP に 対 し て 低 い2004)で処理した．検量線は，既知濃度の Lac および
GNB を用いて作製した．GraFit ソフトウェア（Erithacus

K m 値を示した（< 0.05 mM 対 0.12 mM ）．GH20 LnbB は，
LNB-β-pNP と比較して 1/3 程度の効率で GNB-β-pNP を

Software，West Sussex，UK ） を 使 用 し，Michaelis-

加水分解した（ 2.5 U/mg 対 7.7 U/mg ）．LnbB は GH20

Menten 式（競合的阻害を含む）に曲線近似することによりパラメータを算出した．

β - N -アセチルヘキソサミニダーゼから発生したと考えられ，そのほとんどは β - N -アセチルグルコサミニドとマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ MALDI-TOF ）β - N -アセチルガラクトサミニドの両方に等しく作用するため，LnbB が GNB-β-pNP に対して活性を持つこと

質量分析（ MS ）は驚くべきことではない．ムチン型 O -グリカンに存在

アセトン処理によってタンパク質を除去した上清を乾燥させ，マトリックスとして 20 mg/mL の 2,5 - ジヒドロする α 結合型 GNB に対しては，LnbX と LnbB のどちらも作用しなかった．

キシ安息香酸含有 50 ％メタノール（ Sigma-Aldrich ）に

次に，LnbX および LnbB がグロボシドおよびガング

溶 解 し た．MALDI-TOF MS 分 析 は，UltrafleXtreme

リオシド由来の GNB 含有天然オリゴ糖を加水分解でき（ BrukerDaltonics，MA, USA ）を使用し，陽イオンモー

るかどうかを調べた．LNB 含有糖 LNT および LNFP I

ドで行った．

についても参考のために調査した．薄層クロマトグラ

結フィー分析により，LnbX が LNT，LNFP I，Gb 5，お果

よび globo H に作用するのに対し，LnbB は LNT，Gb5，
および GA 1 に作用することが明らかとなった（ Fig. 2 ）．

GalNAc による LnbX 活性の阻害

LnbB は GM1 には作用しなかった．これらの基質の加LnbX は LNT に 対 す る 触 媒 効 率 が 高 い こ と か ら

水分解は，MS 分析によっても確認した（ LNT 加水分解

(Sakurama et al., 2013），LNT を主要基質としていると考えられるが，LnbX ホモログは自然界で非常に稀にしか存在しないため，他の酵素活性を示すかどうかを調べることとした．そのためにまず，宿主由来糖タンパク質，
糖脂質，およびグリコサミノグリカンの糖鎖を構成する単糖である Fuc，Gal，GalNAc，Glc，GlcA，GlcNAc，Man，Neu5Ac，および Xyl による LnbX の活性阻害効
果を調べた．基質として LNB-β-pNP を使用して調べた
結果，GalNAc のみが活性を阻害することを見出した（ Fig. 1）．GalNAc による阻害は，K i 値 6.4 mM の競合阻害であったが，Gal や GlcNAc（ LNB 構成単糖）では阻害効果が見られなかった．LNB-β-pNP および GalNAc
β1-3GlcNAc-β-pNP に対する LnbX の K m 値が同程度である こ と を 考 慮 す る と，LnbX は−1 サ ブ サ イ ト と し て
GlcNAc よりも GalNA をより強く認識すると考えられFig. 1.

る．なお，LnbX は GalNAc-β-pNP に作用しないことが既に分かっている(Sakurama et al., 2013）．
GNB 含有オリゴ糖に対する LnbX と LnbB の活性
まず最初に LnbX による GNB-β-pNP の加水分解活性− 133 −

LNB-β-pNP-hydrolyzing activity of LnbX in the presenceof various monosaccharides. The reaction mixture (total
volume of 50 μL) consisting of 0.23 μg/mL LnbX and
1 mM LNB-β-pNP in 200 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0) was incubated in the absence (control) andpresence of 10 mM monosaccharide (each) for 15 min
at 30 ℃ . This figure is modified from Figure 2 of Gotoh
et al., (2015). Carbohydr. Res., 408:18–24.

後藤Table 1.

愛那，栗原

新，片山

高嶺

Activities of LnbX and LnbB on GNB-containing sugars.

については Lac（計算値 365.1；実測値 365.1 ）およびは，LnbX は globo H を Gb5 の 1/40 程度の効率で加水分

LNB（計算値 406.1；実測値 406.1 または 406.2 ），LNFP

解 し た（ 0.0051 U/mg 対 0.21 U/mg ）．LNT に α1,2 で フ

I に つ い て は Lac（ 実 測 値 365.1 ） お よ び 2＇ -フ コ シ ル

コシル基が付加した LNFP I についても，活性の有意なLNB（ 計 算 値 552.2； 実 測 値 552.3 ），Gb5 に つ い て は低下が観察された．LnbX は GA1 から GNB を遊離しなGNB（計算値 406.1；実測値 406.1 ）および Galα1-4Galβ1-

かったが，Gb5 に対しては作用したことから，LnbX は4Glc（計算値 527.2；実測値 527.3 ），globo H について

−1 および+1 サブサイト間の基質の非平面性には対応

は Galα1-4Galβ1-4Glc（実測値 527.3 ）および 2＇-フコシル

できないと考えられた．

GNB（ 計 算 値 552.2； 実 測 値 552.3 ），GA1 に つ い て は

Gb5 に対する LnbB の活性は非常に低く，比活性はLac（観測値 365.1 ）および GNB（観測値 406.1 ））が検

GNB-β-pNP との間で 170 倍異なり（ 4.9 s−1 対 0.029 s−1 ），出された．

K m 値は少なくとも 60 倍異なった（ 3.3 mM 対 < 0.05 mM ）．
LnbB は明確な+サブサイトを持たず，その触媒ポケッ

Gb 5 に対する Lnb X および Lnb B の速度論的パラメー
タと，Gb5 および globo H に対する LnbX の比活性，なトは溶媒に対して開いているにも関わらず(Ito et al.,

らびに Gb5 および GA1 に対する LnbB の比活性を決定2013），K m 値が脱離基に大きく影響を受けるのは興味深した．LnbX は，GNB-β-pNP に対して LNB-β-pNP より

い．LnbB は LNFP I を加水分解しないのと同様に globo

低い K m 値を示す一方で（ < 0.05 mM 対 0.12 mM ），Gb5

H にも作用しなかった．GA1 に対する LnbB の比活性は対 0.4 mM ）．kcat 値の差は，LNT と Gb5 で 130 倍（ 110 s

0.0094 U/mg ）．この場合も，脱離基の構造の違いが活に対しては LNT よりも 6 倍高い K m 値を示した（ 2.5 mM−1

対 0.84 s−1 ） で あ り， こ れ は LNB-β-pNP と GNB-β-pNP

Gb5 に対するものよりも 5 倍高かった（ 0.049 U/mg 対性に影響を及ぼしたと考えられる．

との差（ 60 倍:83 s−1 対 1.5 s−1 ）よりも 2 倍大きかった．

考

Gb5 は LNT と比較して 1 つ糖が伸長されており，また+1 サブサイトの Gal と+2 サブサイトの Gal との間に
α1,4 結合を有するために，LnbX の+サブサイトで立体障害が生じ得ることを示唆している．基質濃度 5 mM で察

スフィンゴ糖脂質は，スフィンゴイド塩基を含む糖脂質のひとつであり，一般に脂肪酸とアミド結合している．

− 134 −

β -ガラクト- N -ビオシド構造を有する globo H，Gb5，および GA 1 糖鎖に対する 2 種のラクト- N -ビオシダーゼの特異性

Fig. 2.

Specificity analysis of LnbX and LnbB for natural oligosaccharides containing β-linked LNB or GNB disaccharide structures. The
reaction mixture containing 2 mM of each substrate in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) (total volume of 50 μL) was
incubated at 30 ℃ for 12 h in the absence and presence of 2 U/mL or 20 U/mL of the enzyme (LnbX or LnbB). Unit (U) was
determined using LNB-β-pNP as a substrate. The reaction products were analyzed by thin-layer chromatography using a solvent
system of 1-butanol/acetic acid/water (2/1/1). The sugars were visualized with diphenylamine-aniline-phosphoric acid. LNB or
GNB was used as the standard (the right most lane in each image). This figure is modified from Figure 3 of Gotoh et al., (2015).
Carbohydr. Res., 408:18–24.

脊椎動物において 2 糖以上からなる糖鎖構造を有するス

これらの構造に作用するユニークな酵素を見つけたこと

フィンゴ糖脂質は，糖鎖のコア構造に基づいて 4 つのグは，複雑なスフィンゴ糖脂質の生理学的および病理学的ループ（グロボ，ガングリオ，ラクト，ネオラクト系）

機能の分析においても重要と考えられる．

に分類されている．これらの糖脂質は細胞膜の外葉に見腸内細菌によるスフィンゴ糖脂質の糖鎖の分解についられ，いわゆる脂質ラフトを形成し，細胞−細胞間の相て は，1988 年 に Larson et al.(1988)と， そ の 後 Falk et

互作用およびシグナル伝達に重要な役割を果たしている(Schnaar et al., 2009）．ヒトにおけるスフィンゴ糖脂質

al.(1990)が言及している．彼らはラクト系およびネオラクト系スフィンゴ糖脂質を分解するビフィズス菌およ

分解に必要なリソソーム酵素の欠乏はファブリー病およびルミノコッカス属細菌由来の酵素を発見しており，そびテイ・サックス病を引き起こすことが知られている

れらの糖鎖構造は本質的に HMOs と同じである．本研(Patterson 2013; Thomas & Hughes 2014）．さらに，ス

究では，LnbX と LnbB が，HMO に対する活性と比較す

フィンゴ糖脂質の糖鎖は，いくつかの細菌とその毒素のるとかなり低いものの，GNB 含有グロボシリーズ（ Gb5

宿 主 細 胞 へ の 接 着 に 利 用 さ れ る こ と も あ る(Basu &と globo H ）およびアシアロガングリオ糖鎖（ GA1 ）のMukhopadhyay 2014; Krivan et al., 1988）．したがって，糖鎖に作用することを見出した．LnbX は Gb5 および− 135 −

後藤

愛那，栗原

globo H オリゴ糖からそれぞれ GNB および 2＇ -フコシル

新，片山

高嶺

させることが明らかとなった．Bifidobacterium bifidum

GNB（ 4 型糖鎖）を遊離したが GA1 には作用せず，一由来 GH20 メンバーである LnbB は，Gb5 および GA1 か方 LnbB は Gb5 および GA1 から GNB を遊離した．これら GNB を遊離する活性を有していた．これらの結果は，は天然基質から β 結合型 GNB を遊離する活性，また，天然基質から β - GNB を遊離する活性の報告としては初

type-4 三糖の遊離活性のそれぞれ最初の報告である．グ

めてである．これらの特徴的な活性は，腸内細菌叢の形

ロボシドとガングリオシドが消化管上皮細胞の表面に存成においても重要な役割を果たす可能性があり，同時に在し，LnbB と LnbX の両方が細胞壁結合型タンパク質

スフィンゴ糖脂質の糖鎖の機能を解明するための新しいであることを考慮すると，これらの活性は，GNB/LNB

ツールとして応用が可能である．

資化経路を持つビフィズス菌が，腸において炭素源を獲本助成で得られた研究成果の報告

得 す る 際 に 有 利 に 働 く か も し れ な い(Kitaoka et al.,2005）．また，これらの糖鎖は腸内の多くの細菌の受容体としてとも機能するため，腸内の生態系全体に影響を与える可能性もある(Karlsson, 1989）．
近年，発生学，免疫学，および病原性に関する研究において，糖鎖工学の必要性が高まっている．Globo H は，乳癌，前立腺癌，肺癌の腫瘍細胞で高発現している糖鎖マーカーで腫瘍転移に関与していると考えられている(Heimburg-Molinaro et al., 2011）．Gb5，いわゆる SSEA-3a
は，多系統分化ストレス耐性（ muse ）細胞，骨髄間質細胞，胚性幹細胞，および人工多能性幹細胞の細胞表面に発現しているが，これらの細胞における役割は不明な
点 が 残 さ れ て い る(Shevinsky et al., 1982; Takahashi et

口頭発表1) 後藤愛那，阪中幹祥，片山礼子，廣瀬潤子，加藤紀彦，
栗原新，北岡本光，片山高嶺．2016．母乳オリゴ糖分解
酵素LnbXからみるビフィズス菌―ヒトの共生関係．日本
応用糖質科学会平成28年度大会（第65回）．9月．広島．
原著論文1) Gotoh, A., Katoh, T., Sugiyama, Y., Kurihar,a S., Honda, Y.,
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lacto-N-biosidases towards β-linked galacto-N-biosecontaining oligosaccharides of globo H, Gb5, and GA1.
Carbohydr. Res., 408:18−24.

al., 2007; Thomson 1998; Wright & Andrews 2009）．そのため，LnbX と LnbB のユニークな活性は，特異的なエ謝キソグリコシダーゼとエンドグリコセラミダーゼととも辞に使用することにより，生理活性に必要な糖鎖部分を同

この研究は，公益財団法人発酵研究所寄付講座助成，定するための有用なツールとして利用することが可能と

文部科学省ナノテクノロジープラットフォームプログラ思われる(Ito & Yamagata, 1986; Sakurama et al., 2012）．

ムからの助成金を受けて遂行されました．

さらに，我々は GNB の大量合成法（～ 100 g ）を確立

参考文献

しているので，これら酵素のグリコシンターゼ化を行え
ば，GNB 含有複合糖鎖を合成することへも応用可能である．
異なる進化起源を有する 2 つのラクト- N -ビオシダーゼについて，新規な糖鎖分解活性が明らかとなった．これらの発見は，環境中で利用可能な糖鎖を栄養源とする腸内細菌と宿主の共生関係を理解するために重要な知見である．さらに，これらの酵素は様々な複合糖質の糖鎖をトリミングあるいは合成するツールとして応用可能である．

要

約

進 化 起 源 の 異 な る 2 つ の ラ ク ト- N -ビ オ シ ダ ー ゼ（ LnbX と LnbB ）について，グロボ系およびガングリオ
系スフィンゴ糖脂質の糖鎖に対する新規な特異性を見出し た．Bifidobacterium longum subsp. longum 由 来 LnbX
は GH136 に分類されるが，Gb5 および globo H からそれぞれ GNB および 2＇ -フコシル GNB（ 4 型三糖）を遊離

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− 137 −

IFO Res.Commun. 33
139-152, 2019

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の作出と様々な複合糖質への H 抗原構造の導入
杉山

友太，片山

高嶺，栗原

新

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Generation of a highly efficient 1,2-α-L-fucosynthase and its use
for introducing H-antigen structure into various glycoconjugates
Yuta Sugiyama, Takane Katayama, Shin Kurihara
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
Fucα1-2Gal linkages, the so-called H-antigens, constitute histo-blood group antigens and are involved in various
physiological and pathological events. Recent studies have revealed that the H-antigen-containing glycans play animportant role in establishing symbiosis between gut microbes and the host. H-antigen-containing glycans can also
mitigate gut microbiota dysbiosis. Therefore, development of a method for synthesizing H-antigen-containing
sugars is desired as a research tool and for medicinal purposes. In this study, we succeeded in converting an
inverting 1,2-α-L-fucosidase into a highly efficient 1,2-α-L-fucosynthase. The synthase specifically synthesized H
type 1-, type 2-, type 3- and type 4-chain-containing sugars with yields of 57–75 ％ based on acceptor depletion. The
synthase was also able to introduce Fuc residues into Lewis a/x antigens to produce Lewis b/y tetrasaccharides.
Moreover, the enzyme was shown to introduce H-antigens into sugar chains of a glycoprotein (porcine gastricmucin), as revealed by lectin blotting and mass spectroscopy analysis. These results show that the synthasedeveloped in this study could ser ve as an alternative to other H-antigen synthesis methods involving α-1,2fucosyltransferases and retaining α-fucosidase.
Key words: H-antigen, glycosynthase, fucosidase

E-mail:
杉山友太（ sugiyama.yuta.6s@kyoto-u.ac.jp ）（ 現 所 属: 京 都 大
学大学院農学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
片山高嶺（ takane@lif.kyoto-u.ac.jp ）（現所属:京都大学大学院
生命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属:近畿大学生
物理工学部 〒 649-6493 和歌山県紀の川市西三谷
930 ）
共同研究者
後藤愛那（京都大学生命科学研究科），
加藤紀彦（京都大学生命科学研究科），
芦田 久（近畿大学生物理工学部），
本多裕司（石川県立大学生物資源環境学部），
吉田永史奈（石川県立大学生物資源工学研究所），
北岡本光（農業・食品産業技術総合研究機構 現 新潟大学農学部），
熊谷英彦（石川県立大学生物資源環境学部），
山本憲二（石川県立大学生物資源工学研究所）

緒言

H 抗原は血液型抗原決定基を構成する構造の一つであり，ガラクトース（ Gal ）にフコース（ Fuc ）が α -1,2グリコシド結合した二糖構造（ Fucα1-2Gal ）を指す．H
抗原は糖タンパク質，糖脂質およびオリゴ糖といった複合糖質の糖鎖の非還元末端に見られ（ Hakomori, 1999 ），様々な生物学的プロセスで重要な役割を果たしている（ Heimburg-Molinaro et al., 2011; Tateno et al., 2013 ）．ヒトにおいて，H 抗原は α -1,2 - フコシルトランスフェラー
ゼ（FUT1 および FUT2 ）によって合成される（Mollicone
et al., 1994; Rouquier et al., 1995 ）．FUT1 は赤血球および内皮細胞で発現して ABO 式血液型抗原のコア構造を合成する一方，FUT2 は分泌器官で発現している（ Su etal., 2004 ）． 興 味 深 い こ と に， マ ウ ス に お い て 腸 管 の− 139 −

杉山

友太，片山

高嶺，栗原

新

Fut2 の発現が腸内細菌によって亢進されることが報告とラクト- N -テトラオース（ LNT, Galβ1 - 3GlcNAcβ1 -されている（ Bry et al., 1996; Goto et al., 2014; Pickard et

3Galβ1-4Glc ）より，Thermosynechococcus elongates 由来

al., 2014 ）．この現象は，宿主が特定の腸内細菌へ H 抗
原を栄養源の一つとして提供し，定着を促すシステムで

α -1,2 -フコシルトランスフェラーゼおよびフコキナーゼ/GDP-Fuc ピロホスホリラーゼを利用したワンポット酵あると考えられていたが（ Bry et al., 1996 ），最近，腸素反応系を用いて 1 g のラクト- N -フコペンタオースＩ

内細菌の 1,2 - α - L -フコシダーゼにより遊離した Fuc が腸（ LNFP I, Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc ） を 合

管出血性大腸菌の病原性遺伝子の発現を減弱させること成した．このようにグリコシルトランスフェラーゼは，が 示 さ れ た（ Pacheco et al., 2012 ）． ま た，Pham et

特定のオリゴ糖を合成するための有用なツールであると

al.(2014)はマウスに H 抗原を構造に含むオリゴ糖を投与することで，Enterococcus faecalis に対する感染抵抗性

い え る．Osanjo et al.(2007)は Thermotoga maritima 由
来の α -L -フコシダーゼ（アノマー反転型）変異体が，4 -が付与されることを示した．これらの結果は腸管におけニ ト ロ フ ェ ニ ル（pNP）- α - L -フ コ シ ド か ら Galβ-pNP へる H 抗原構造が宿主の健康にとって重要であることをFuc を転移可能であることを報告している．

示唆している．ヒトにおいては，非分泌型個体（FUT2 -/- ）グリコシンターゼとは，グリコシダーゼに変異を導入

は分泌型個体と比較してクローン病や I 型糖尿病のリスすることで，フッ化糖を種々の糖アクセプターへ転移さクが高いことが報告されている（ McGovern et al., 2010;

せることができるようになった酵素を指す．グリコシン

Smyth et al., 2011 ）．

ターゼでは加水分解活性が欠失しているため，形成されH 抗原構造を含む糖質は，母乳によっても腸内へ供給

た グ リ コ シ ド 結 合 は， 加 水 分 解 を 免 れ る（ Shaikh &される．人乳中で 3 番目に豊富な固形成分であるヒトミ

Withers, 2008 ）． グ リ コ シ ン タ ー ゼ は，Hehre et al.

ルクオリゴ糖（Human milk oligosaccharides，HMOs ）は，(1979)による発見に基づいて開発され，最初にアノマー

母親が分泌型である場合，ほとんどの非還元末端に H

保持型のグリコシダーゼに適用された（ Malet & Planas,

抗 原 が 見 ら れ る（ Kunz et al., 2000; Kobata, 2010;

1998; Mackenzie et al., 1998 ）．また最近，アノマー反転

Urashima et al., 2012 ）．HMOs はヒト消化酵素による分型 の グ リ コ シ ダ ー ゼ に も 適 用 さ れ て い る（ Honda &解を受けないため大部分が大腸に到達し（ Brand-Miller

Kitaoka, 2006; Wada et al., 2008b; Ohnuma et al., 2012 ）．

et al., 1998 ），そこで腸内細菌（ビフィズス菌など）の選 択 的 増 殖 を 促 す と 考 え ら れ て い る（ Kitaoka et al.,

アノマー反転型 1,2 - α - L -フコシダーゼ（ BbAfcA ）のフ

2005; Sela et al., 2008; Wada et al., 2008a; Sela et al., 2008;

コシンターゼ化（ 1,2 - α - L -フコシンターゼ）に成功した

我々は以前 , Bifidobacterium bifidum JCM 1254 由来のAsakuma et al., 2011; Sakurama et al., 2012; Sakurama etが，作出した酵素の反応効率は低かった（ Wada et al.,al., 2013; Lewis et al., 2015; Katayama, 2016 ）．また H 抗
原を有する HMOs は，Campylobacter jejuni の感染を防2008b ）．BbAfcA は 1 型，2 型および 3 型 H 抗原を含有するオリゴ糖および糖タンパク質糖鎖に対し高いフコシ

ぐことが報告されている（ Ruiz-Palacios et al., 2003 ）．H

ダーゼ活性と特異性を有することから（ Katayama et al.,抗原を有する HMOs の 1 つである 2' -フコシルラクトー

2004; Gotoh et al., 2015 ），より高いシンターゼ活性を有ス（ 2'-FL, Fucα1-2Galβ1-4Glc: Glc, グルコース）は，腸する変異体が作出できれば，オリゴ糖合成に有用である

管上皮細胞のリポ多糖誘発性炎症反応を減弱させることと考えられた．

が報告されている（ He et al., 2016 ）．これらの結果は，
H 抗原構造が腸内細菌と宿主間の良い共生関係を確立す

BbAfcA の活性中心は，アスパラギン酸残基（ D766 ）によって活性化されたアスパラギン残基（ N423 ）が塩るため，さらには様々な腸関連疾患を予防するために重基触媒として作用するというユニークな反応機構を有し要であることを示唆している．これまでに，H 抗原構造て い る（ Nagae et al., 2007; Liu et al., 2013 ）（ Fig. 1 ）．

の酵素合成は α -1,2 -フコシルトランスフェラーゼまたは

求核攻撃する水分子は，2 つのアスパラギン残基（ N421

α -フコシダーゼによる糖転移反応を用いた例が報告されて い る．Drouillard et al.(2006)は，Helicobacter pyloriのグルタミン酸残基（一般酸触媒）とも水素結合して由来の α -1,2 -フコシルトランスフェラーゼを含むいくつE566 側鎖をグリコシド酸素に対し適切に配向させていかの遺伝子を大腸菌へ導入し，2'-FL およびラクト- N -フる．本研究において，我々は BbAfcA への変異導入によコペンタオース IV（ LNFP IV, Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-るフコシンターゼ反応効率の向上を目指した . 次いで ,3Galβ1-4Glc: GlcNAc, N -アセチルグルコサミン）を合成

単糖，オリゴ糖，および糖タンパク質を用いて反応の特することに成功している．組換え大腸菌を用いた 2'-FL異性を解析した．

および N423 ）によって支持されており，N421 は E566のグラムスケールでの合成は Baumgärtner et al.(2013)
によっても報告されている．Zhao et al.(2016)は，Fuc− 140 −

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の作出と様々な複合糖質への H 抗原構造の導入

2'-FL（ 1 mM ）を用いて BbAfcA 変異体の加水分解活性を測定した．野生型は 0.51 nM，BbAfcAN421D は 1.0 nM，
BbAfcAN423D は 10.2 nM，BbAfcAN423Q は 51 nM，その他の変異体は 102 nM で使用した．遊離した Fuc は，Fucose
dehydrogenase（ Kikkoman ）と Thio-NAD（ Oriental
Yeast ） を 用 い た 方 法 で 定 量 し た（ Katayama et al.,2004 ）．
組換え BbAfcA 変異体のフコシンターゼ活性測定
β -フッ化フコース（ β-FucF ）とラクトース（ Lac ）を用いて BbAfcA 変異体のフコシンターゼ活性を調べた．
10 mM の基質と 4 μM の BbAfcA 変異体を含む 100 mM ク
Fig. 1.

Structure of the catalytic site of 1,2-α-L-fucosidase fromB. bifidum.
The catalytic four residues (N421, N423, E566, andD766) and Gal-recognizing residues (H419, E485, W500,
and E566) are shown with the attacking water molecule
depicted by a sphere (PDB ID: 2EAC) (Nagae et al.
2007). 2'-FL observed in the crystal structure of E566A
mutant (PDB ID: 2EAD) is used to model the complex
structure with WT enzyme. The hydrogen bonds areshown as dashed line. This figure is modified from
Figure 1 of Sugiyama et al. (2016).

エン酸緩衝液（ pH 5.0 ）を 30 ℃で 30 分間インキュベー
ト後，95 ℃で 3 分間処理して反応を停止させた．反応物
は Asahipak NH2P-50 4E（ 4.6×250 mm ）カラム（ Showa
Denko ）を用いて，高速液体クロマトグラフィー（HPLC ）（ Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific ） 分 析 し た．
カラムオーブンは 40 ℃とし，溶出は 73 ％アセトニトリ
ルを使用し，1.0 mL/min で行った．検出はコロナ荷電化粒子検出器（ CAD, Thermo Fisher Scientific ）を用いて行った．2'-FL 量は，標品から作成した検量線から算出した．
反応の至適 pH は，100 mM クエン酸緩衝液（ pH 4.5 6.0），2 -モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（pH 6.0 - 7.0）
および 3 -モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（pH 7.0 -

実験方法8.0 ）を用いて決定した．熱安定性は 100 mM クエン酸
緩 衝 液（ BbAfcAN423H は pH 5.5，BbAfcAN423D/D766N は

BbAfcA 変異体の作製

pH 5.0 ）中で 30 分間インキュベートを行って評価した．

BbAfcA 触媒ドメイン遺伝子を保有する pET23b-afcA（ Katayama et al., 2004 ） を 鋳 型 と し て，QuikChange

アクセプターの特異性解析

site-directed mutagenesis（ Stratagene ）を用いて触媒残単糖とオリゴ糖を用いて BbAfcAN423H のアクセプター

基へアミノ酸置換を導入した．シーケンス解析を行い，特異性を調べた．10 μM の BbAfcAN423H ，10 mM β-FucF

目的以外の変異が無いことを確認した後，得られたプラと 10 mM アクセプターを含む 100 mM クエン酸緩衝液

スミドを大腸菌 BL21ΔlacZ（ DE3 ）（ Ashida et al., 2009 ）（ pH 5.5 ）を 30 ℃で 30 分インキュベートし，95 ℃で 3へ導入した．

分間処理後，反応液を HPLC-CAD を用いて分析した．
反応効率はアクセプター消費量を算出して評価した．

組換え BbAfcA 変異体の発現と精製

HPLC-CAD 分 析 は，HILICpak VG-50 4E カ ラ ム（ 4.6×

His-tag を利用して Ni-NTA スピンカラム（ QIAGEN ）250 mm, Showa Denko ）を用いて行い，カラムオーブンを用いた酵素精製を行い，Slide-A Lyzer G2（ Thermo

は 40 ℃とした．溶出は 73 ％アセトニトリルを使用し

Fisher Scientific ） を 用 い て 10 mM Tris-HCl 緩 衝 液

1.0 mL/min で行った．キシロビオースをアクセプター（ pH 8.0 ）に対して透析した．必要であれば，MonoQ

として使用した場合は，移動相としてアセトニトリル /5/50 カラム（ GE Healthcare Life Science ）を用いてさメタノール / 水（ 75/20/5 ）を使用した．

らに精製した．精製度は SDS- PAGE により確認した．

ブタ胃ムチン（ porcine gastric mucin, PGM ）もアク

タ ン パ ク 質 濃 度 は，280 nm で の モ ル 吸 光 係 数

セプターとして用いた．なお，フコシンターゼ反応の前（ 184,165 M-1cm-1 ）より算出した．

に Fuc 残基を PGM の糖鎖から除去した．脱フコシル化
は，2 mg/mL PGM，1 mM ジチオトレイトールおよび組換え BbAfcA 変異体の加水分解活性測定

10 μM の野生型 BbAfcA を含有する 50 mM リン酸ナトリ− 141 −

杉山

友太，片山

ウム緩衝液（ pH 6.5 ）を 30 ℃で 48 時間インキュベート

高嶺，栗原

新

で溶出した．溶出画分を窒素流下，40 ℃で再度乾燥した．

し行った．反応を 95 ℃で停止させた後，反応液を水に対して透析，凍結乾燥し脱フコシル化 PGM を調製した．

反応産物の精製

1 mg/mL 脱 フ コ シ ル 化 PGM，10 mM β-FucF お よ び

フコシンターゼ反応により生成したオリゴ糖を精製し10 μM BbAfcAN423H を 含 有 す る 50 mM ク エ ン 酸 緩 衝 液

た．反応液（750 ～ 4300 μL ）を Amberlite MB-3 で脱塩し，（ pH 5.5 ）を 30 ℃で 30 分間インキュベートした後，サ

凍 結 乾 燥 後，Sugar-D カ ラ ム（ 20×250 mm，Nacalai

ンプルをメタノール処理した Immobilon-P 膜（Millipore）

Tesque ）に供した．カラムオーブンは 40 ℃で，溶出は上にスポットした．2 ％（ w/v ）ウシ血清アルブミンを

72 ％アセトニトリルで 5.0 mL/min で行い，示差屈折率

含む 0.05 ％（ v/v ）Tween-20 ブロッキング剤含有トリス

検 出 器（ RID-10A，Shimadzu ） に よ り モ ニ タ ー し た．

緩衝食塩水中（ TBS-T ）でブロッキング後，ビオチン結反応産物を含む画分を合一し，凍結乾燥後，さらに合レクチン[ Ulex europeus agglutinin I（ UEA-I ）および

TSK-gel 80Ts（ 20×250 mm，Tosoh ） カ ラ ム を 用 い て

ピーナッツ agglutinin（ PNA ）]（ 0.4 μg/ mL ）およびペル

精 製 し た． 溶 出 は 水 で 7.0 mL/min の 流 速 で 行 い，

オキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ 0.125 μg/ mL ）を

RID-10A でモニターした．

含む TBS -T 中で室温 60 分間インキュベートした．TBS -T
で 洗 浄 後，SuperSignalTM West Pico Chemiluminescent

マトリックス支援レーザー脱離 / イオン化飛行時間型質

Substrate（ Thermo Fischer Scientific ）と LAS-3000

量分析（ MALDI-TOF MS ）および MALDI-TOF/TOF（ Fujifilm ）を使用して結合を検出した．

MS 解析
マトリックスとして 2,5 - ジヒドロキシ安息香酸を用い，ポジティブイオンモードで行った．MALDI-TOF/TOF

O-結合型糖鎖の調製
O-結合型糖鎖は還元的 β - 脱離によって得た（ Aoki et

MS 解析（ Bruker UltrafeXtreme，Bruker Daltonics ）に

al., 2008 ）．凍結乾燥した糖タンパク質（ 100 μg ）を 1 Mの水素化ホウ素ナトリウムを含有する 500 μL の 100 mM

より，MS/MS スペクトルを得て，糖鎖構造の推定を行った．糖鎖の理論質量は，GlycoWorkbench 2.0（ Ceroni et

水酸化ナトリウムに再懸濁し，ガラス管中で 45 ℃で 18

al., 2008 ）を用いて算出した．糖鎖量の半定量的な推定は，全シグナル強度を 100 ％とすることで行った．

時間インキュベートした．その後，氷上で 10 ％（ v/v ）酢酸で中和し，Dowex-50W-X8（ H+ 型，100-200 メッシュ，結Sigma-Aldrich ）カラムで脱塩した．オリゴ糖アルジトー
ルを 5 ％（ v/v ）酢酸で溶出して回収し，凍結乾燥した．

果

0.3 mL の 10 ％酢酸含有メタノールを添加し，40 ℃で窒

高効率 1,2 - α - L -フコシンターゼの選抜

素雰囲気下で乾燥させることでホウ酸をメタノールと共沸させ除去した．この工程を 5 回繰り返した．試料をBbAfcA の 活 性 中 心 は，N421，N423，E566 お よ び
D766 により構成される（ Fig. 1 ）．E566 はフコシンター

0.3 mL の 5 ％酢酸で再溶解し，予め平衡化した Sep-pak

ゼ 反 応 に お い て 塩 基 触 媒 と し て 必 須 で あ る と 考 え，

C18 カートリッジ（ Waters ）に添加した．フロースルー

N421，N423 および D766 にアミノ酸置換を導入した．

および 2 mL の 5 ％酢酸洗浄画分をオリゴ糖アルジトー

2'-FL 加 水 分 解 活 性 を 測 定 し た と こ ろ，BbAfcAN421D ，ル画分として回収し，凍結乾燥した．

BbAfcAN423D および BbAfcAD766E は野生型 BbAfcA の 36 ％，4.9 ％および 25 ％の活性を保持していた（ Sugiyama et

糖鎖およびオリゴ糖の完全メチル化
糖鎖の完全メチル化は，Anumula & Taylor(1992)のal., 2016 ）が，他の変異体では劇的に減少していた．これらの変異体のうち，BbAfcAN423H が，β-FucF と Lac を方法に従った．凍結乾燥オリゴ糖および O-結合型糖鎖基質とした際に最も高いフコシンターゼ活性を示した由来オリゴ糖アルジトールを 200 μL の無水ジメチルス（ Sugiyama et al., 2016 ）．BbAfcAN423D のフコシンターゼ

ルホキシド（ DMSO ）で再溶解した．試料を 250 μL の活性は，以前報告した BbAfcAD766G と同等であった（Wada

塩基（水酸化ナトリウム含有 DMSO ）および 150 μL の

et al., 2008b ）．次に，N423D または N423H 変異をバッ
クグラウンドにして D766 変異体を作出した（ Sugiyama

ヨードメタンと 5 分間激しく混合することにより，メチル化を行った．2 mL の 5 ％酢酸および 2 mL のジクロロメタンを添加した後，完全メチル化サンプルを有機溶媒

et al., 2016 ）．N423D に お け る D766N 変 異 は フ コ シ ン
ターゼ活性の劇的な増加をもたらした一方，N423H に層に抽出し，次いでこれを窒素雰囲気下 40 ℃で乾燥さおける D766 へのアミノ酸置換の導入は活性の減少をもせた．サンプルを予め平衡化した Sep-pak C18 カート

た ら し た（ Sugiyama et al., 2016 ）． こ の 結 果 か ら，

リッジに添加，水で洗浄，85 ％（ v/v ）アセトニトリル

BbAfcAN423H および BbAfcAN423D/D766N をさらなる分析に用− 142 −

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の作出と様々な複合糖質への H 抗原構造の導入いることとした．

グルコース（Glc ）とキシロース（Xyl ）はそれぞれ 8.4 ％BbAfcAN423H は pH 5.5 で，BbAfcAN423D/D766N は pH 5.0 で最も高い活性を示し，その活性は以前の研究で得られたと 7.2 ％がフコシンターゼ反応で消費され，HPAEC-PAD
分 析 で 小 さ な ピ ー ク が 検 出 さ れ た（ Sugiyama et al.,よりも大幅に高かった（ Fig. 2A ）（ Wada et2016 ）．L - ラムノース（ L -Rha ）はわずかに消費された

al., 2008b ）．BbAfcAN423H および BbAfcAN423D/D766N のいずれの場合も，反応は 30 分以内に定常に達した．生成物（ Table 1 ）．これらの反応におけるアクセプター特異性濃度（ 2'-FL ）と酵素濃度との比例関係は反応の初期段（ Fru ），ガラクトサミン，N-アセチルガラクトサミン

階（ < 3 分）でのみ観察されたが（ Fig. 2A ），これは水（ GalNAc ），グルコサミン，GlcNAc およびマンノース

溶液中での β-FucF の半減期が短い（ 20 分）ためである

はいずれもアクセプターとして機能しなかった．

D766G

BbAfcAについては考察で述べる．また，L -Fuc，フルクトースと 考 え ら れ た（ Sakurama et al., 2012 ）． 添 加 し た

3-β-ガラクトビオース，Lac および 6-β-ガラクトビオー

β-FucF および Lac に対する収率は，いずれの基質濃度に お い て も，BbAfcAN423D/D766N（ 83 ～ 94 ％） よ り もスは，二糖の中で最も効率的に（ > 85 ％）フコシル化さ

BbAfcAN423H の 方 が（ 88 ～ 100 ％） わ ず か に 高 か っ た．
ま た，BbAfcAN423D/D766N は BbAfcAN423H と 比 較 し て，Lacス（ GNB, Galβ1-3GalNAc ），3-β-ガラクトシルグルコー

濃度に対する影響を受けやすく，100 mM Lac 存在下でガラクトビオース，ラクチュロース，N-アセチルラクの 収 率 は，BbAfcA

れた（Table 1 ）．また，メリビオース，ガラクト- N -ビオー
ス，ラクト- N -ビオース I（ LNB, Galβ1-3GlcNAc ），4-β-はトサミンもアクセプターとして認識され，45 ～ 79 ％の

80 ％ で あ っ た（ Sugiyama et al., 2016 ）．BbAfcAN423H は基質が消費された（ Table 1，Fig. 3A ）．マルトース，イ

55 ℃ 30 分のインキュベーション後でも 90 ％の活性を維

ソマルトース，セロビオース及びゲンチオビオースは弱持したが，BbAfcAは 40 ℃ 30 分のインキュベー

いアクセプター（ 2.6 ～ 22 ％）として機能したが，トレションで失活した．これらの結果より，BbAfcAN423H が最ハロース，ラミナリビオース及びスクロースはアクセプ

N423D/D766N

N423D/D766N

で 60 ％，BbAfcA

N423H

も効率的な 1,2 - α - L -フコシンターゼであると考えられた．

ターとして機能しなかった．一方で，キシロビオース（ Xylβ1-4Xyl ）を使用した際に 33 ％が消費され，反応産BbAfcAN423H のアクセプター特異性物と予想される新しいピークが出現した（ Table 1 およBbAfcAのアクセプター特異性を，10 mM の種々の単糖およびオリゴ糖を用いて解析した（ Table 1 ）．12

び Fig. 3B ）．フコシル化キシロビオースの化学構造は機N423H

器分析により決定した（後述）．

種の単糖の中で，Gal が最も効率的に消費され（ 83 ％），3 -フコシルラクトース（ 3-FL, Galβ1-4(Fucα1-3 )Glc ）HPAEC-PAD 解析において生成物と予想されるピークがをアクセプターとした際の反応効率は 82 ％であり，ラ認 め ら れ た（ Sugiyama et al., 2016 ）．L -ア ラ ビ ノ ー ス

ク ト ジ フ コ テ ト ラ オ ー ス（ LDFT，Fucα1-2Galβ1-4（ L -Ara ）は 48 ％が消費され，良いアクセプターであった．

(Fucα1-3 )Glc ）標品と同じ保持時間のピークが HPLC

Fig. 2.

Time course of the fucosynthase reaction catalyzed by BbAfcAN423H and BbAfcAN423D/D766N mutants.
The reaction was carried out at 30 ℃ in the presence of 10 mM β-FucF, and Lac, and the samples were taken at the indicated time
points for HPLC analysis. BbAfcAN423H (A) and BbAfcAN423D/D766N (B) were added at the concentrations between 0.25 and 1 mg/mL.
This figure is modified from Figure 2 of Sugiyama et al. (2016).

− 143 −TABLE 1.
Acceptor specificity of 1,2-α-L-fucosynthase (BbAfcA N423H mutant).

Continued on the next page.

杉山
友太，片山
高嶺，栗原

− 144 −

新

Table 1

continued

Continued.

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の作出と様々な複合糖質への H 抗原構造の導入− 145 −

杉山

友太，片山

高嶺，栗原

新

分析で認められた．ルイス a 及びルイス x 三糖からルイしていた（ Angyal & Pickles, 1972 ）．精製産物の量とそ

ス b 及びルイス y 四糖が 43 ％及び 62 ％の効率で生成しの 回 収 率 は，2' -フ コ シ ル GNB は 11.4 mg で 50 ％ mol，ていた（ Table 1; Sugiyama et al., 2016 ）．アクセプター

3 -フ コ シ ル キ シ ロ ビ オ ー ス で は 0.4 mg で 4 ％ mol，としてラクト- N -テトラオース（ LNT, Galβ1-3GlcNAcβ1-

LNFP I は 2.0 mg で 30 ％ mol ，LNFP IV は 2.7 mg で3Galβ1-4Glc ）を用いるとラクト- N -フコペンタオース I

41 ％ mol であった．

に対応するピークが現れ，反応効率は 75 ％であった（ Table 1 および Fig. 3C ）．ラクト- N -ネオテトラオース

糖タンパク質糖鎖への H 抗原導入

（ LNnT, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc ）をアクセプター

モデルタンパク質としてブタ胃ムチン（PGM ）を使用とした際の反応効率は 59 ％であった（ Table 1 およびした．Fig. 4A にUEA-I および PNAを用いたレクチンブロッ

Fig. 3D ）．これらの生成物の構造については後述する．

トにより，H 抗原（左）および T 抗原（ Galβ1-3GalNAc,右）を検出した結果を示した．野生型 BbAfcA による機器分析によるフコシンターゼ反応産物の解析

PGM 処理は UEA-I シグナルの消失をもたらし（レーンフコシンターゼ反応のアクセプター特異性を決定する

1 および 2 ），同時に PNA シグナルを増加させたことかために，GNB，キシロビオース，LNT および LNnT をら（レーン 5 および 6 ），Fuc が除去されて T 抗原が現アクセプターとした反応液より精製した反応産物の構造れたことが示された．脱フコシル化した PGM を β-FucF

を MALDI-TOF-MS 及び NMR により解析した．キシロと共にインキュベートすると，UEA-I シグナルが現れた

ビオースをアクセプターとした際に得られた反応産物の（レーン 3 ）が，BbAfcAN423H 非存在下では UEA-I シグナ

1 次元および 2 次元 NMR スペクトル解析結果より Fuc

ルは認められなかった（レーン 4 ）．PNA シグナルはわ

はキシロビオースの還元末端 Xyl 残基の O3 位置に導入

ずかに減弱していた（レーン 6 ～ 8 ）．

され，3 -フコシルキシロビオース（ Xylβ1-4(Fucα1-3 )次いで，O-型糖鎖をタンパク質から遊離し，完全メチ

Xyl ）を生成することが示された．GNB，LNT およびル化後，MALDI-TOF MS および MALDI-TOF/TOF-MS

LNnT をアクセプターとして用いた時，Fuc は α -1,2 結により解析した（ Fig. 4B; Sugiyama et al., 2016 ）．ピー

合を介して非還元末端の Gal 残基に結合し，それぞれクの相対含有量を，全シグナル強度に対する百分率で表2' -フコシル GNB（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc ），LNFP （I Fuc

し た（ Sugiyama et al., 2016 ）． 野 生 型 BbAfcA に よ る

α1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，1 型 H 抗 原 ） 及 び
LNFP IV（ Fucα1-2Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc ，2 型

PGM 処 理 は，m/z 708.4（ 推 定 Fucα1-2Galβ1-3GalNAc-

H 抗原）を形成することが示された．2' -フコシル GNB

NAc-itol ）の相対量を増加させた（ Fig. 4B; Sugiyama et

中の GalNAc 残基はピラノース形とフラノース形で存在

al., 2016 ）．フコシンターゼ反応後，デオキシヘキソー

Fig. 3.

itol ）の相対量を減少させ，m/z 534.3（推定 Galβ1-3Gal-

HPLC analysis of the fucosynthase reaction products.
The reactions were carried out at 30 ℃ for 30 min in 100 mM sodium citrate buffer (pH 5.5) containing β-FucF (10 mM), acceptors(10 mM) and 10 μM BbAfcAN423H. The mixtures were analyzed by HPLC-CAD. The chromatograms obtained for galacto-N-biose(GNB) (A), xylobiose (Xyl-Xyl) (B), lacto-N-tetraose (LNT) (C), and lacto-N-neotetraose (LNnT) as acceptors (D) are shown. The
peaks of acceptor and product are indicated. This figure is modified from Figure 3 of Sugiyama et al. (2016).

− 146 −

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の作出と様々な複合糖質への H 抗原構造の導入

Fig. 4.

Analysis of the reaction products using porcine gastric mucin (PGM) as an acceptor.
(A) Lectin blot analysis of non-treated PGM (lane 1 and 5), 1,2-α-L-fucosidase (BbAfcAWT)-treated PGM (lane 2 and 6), defucosylated
PGM incubated with β-FucF in the presence of BbAfcAN423H (lane 3 and 7) and in the absence of enzyme (lane 4 and 8). The
samples were spotted with varying amounts (0.125 to 1.0 μg), and the membrane was blotted with UEA-I and PNA for detecting
H- and T-antigens, respectively. (B) MALDI-TOF MS analysis of permethylated O-glycan alditols. O-Glycans released from
non-treated PGM (upper panel), BbAfcAWT-treated PGM (middle panel), and BbAfcAWT- and BbAfcAN423H-treated PGM (BbAfcAWT+ BbAfcAN423H) (lower panel) were used for the analysis. This figure is modified from Figure 4 of Sugiyama et al. (2016).

− 147 −

杉山

友太，片山

高嶺，栗原

新

考

察

ス（ dHex，Fuc は dHex ）含有糖鎖の相対量（ m/z = 708.4 ）は，未処理 PGM と同等レベルまで回復した（ Fig. 4B;
Sugiyama et al., 2016 ）． 同 様 に，m/z が 1157.7（ dHex-

以前の研究で取得した BbAfcAD766G のフコシンターゼ

1Hex2HexNAc2-itol: Hex, ヘキソース ; HexNAc, N -アセ

活性は非常に弱かったため（収率 6 ％未満）（ Wada et

チルヘキソース）および 1331.8（ dHex2Hex2HexNAc2itol ）相対量は，PGM を野生型 BbAfcA で処理すると減al., 2008b ），生成物の精製は困難であったが，本研究では高効率変異体 BbAfcAN423H を作出することが出来たた

少 し， 同 時 に dHex を 含 ま な い 糖 鎖（ m/z = 983.6，

め，アクセプター特異性を詳細に調べることが可能と

Hex2HexNAc-itol ） 含 有 量 が 増 加 し た（ Fig. 4B;なった．BbAfcAN423H は，Gal および非還元末端に Gal を

Sugiyama et al., 2016 ）． フ コ シ ン タ ー ゼ 反 応 後，

含有するオリゴ糖に加え，単糖では L -Ara，Glc，L -Rha

Hex2HexNAc2-itol（ m/z = 983.6 ）の相対量は減少する

および Xyl，さらに二糖類のマルトース，イソマルトー

一 方 で，dHex 含 有 糖 鎖（ m/z = 1157.7 お よ び 1331.8 ）ス，セロビオース，ゲンチオビオースとキシロビオースの 含 有 量 は 増 加 し た． 同 様 の 傾 向 は，m/z 1228.7をアクセプターとして認識した（ Table 1 および Fig. 5 ）．

（ Hex2HexNAc3-itol ） と 1402.8（ dHex1Hex2HexNAc3-

L -Ara の場合， C1 ピラノース型において O4 がアキシャ

itol ）および 1576.9（ dHex2Hex2HexNAc3-itol ）間，さらに m/z 2127.2（ Hex4HexNAc5-itol ）と 2475.4（ dHex
2Hex4HexNAc5-itol ） 間 で も 認 め ら れ た（ Fig. 4B;

4ル 配 座 を と る た め に（ Angyal & Pickles, 1972 ），BbAfcAN423H が認識可能であると予想された（ Table 1 お
よび Fig. 5 ）．L -Rha の場合，糖の 1C4 環を反転させると

Sugiyama et al., 2016 ）．一方で，還元末端に HexNAc 残C2-（ axial ），C3-（ equatorial ），C4-（ equatorial ）-OH基 を 有 す る と 思 わ れ る m/z 1269.8 の 糖 鎖 は（ GlcNAc

基が Gal の C4- ，C3- ，C2 -OH と重なることになる．そ

β1-3Galβ1-3/4GlcNAcβ1-6GalNAc-itol と推定）
（ Karlssonのため，生成物は Fucα1-4Rha と考えられる（ Fig. 5 お

et al., 1997 ），野生型 BbAfcA および BbAfcAN423H 処理の影響が認められなかった（ Fig. 4B; Sugiyama et al., 2016 ）．

よび Table 1 ）．

Fig. 5.

β-FucF とキシロビオースから生じた生成物は，3 -フStructural requirement of acceptor sugars for 1,2-α-L-fucosynthase reaction.
Structures of H-antigen, L-arabinopyranose (L-Ara), L-rhamnose (L-Rha), α-anomer of 3-fucosyllactose, and α-anomer of 3-fucosylxylobiose are shown. The acceptor sugar accommodated in the (-1) subsite of the enzyme is shown by dashed line. This figure
is modified from Figure 5 of Sugiyama et al. (2016).

− 148 −

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の作出と様々な複合糖質への H 抗原構造の導入

コシルオキシビオース（ Xylβ1-4（ Fucα1-3 ）Xyl ）であっトール）の存在下での試料調製中の煮沸の繰り返しによた（ Sugiyama et al., 2016 ）．この結果は，Xyl または Glc

る糖タンパク質の変性から生じたと考えらえる．つまり，の α -アノマー酸素を認識していることを強く示唆してレクチンは PGM 糖鎖に対してより容易にアクセス出来いる（ Fig. 5 ）．キシロビオースの還元末端 α -アノマー

たことで生じたシグナルと思われる．高密度に糖鎖を有O1（ axial ），O2（ equatorial ）および O3（ equatorial ）は，するタンパク質 PGM に対する効率的な Fuc 導入は，本Gal の O4（axial ），O3（equatorial ）および O2（equatorial ）手法が，糖脂質や細胞表面の糖鎖を含む様々な複合糖質に構造的に対応している．ラミナリビオースのような 3に障害を与えずに H 抗原を導入するツールとして使用

位にグリコシド結合を有する二糖は，還元末端 Glc の可能であることを示唆している．

O3 がフリーではないため，アクセプターにならなかっ

Hehre et al.(1979)は，アノマー反転型 β -アミラーゼたと考えられる．α-GalNAc および α-GlcNAc の C3 ヒド

が β -マルトシルフルオリドを 2 段階で β -マルトースとロキシル基は equatorial であるが，BbAfcAN423H は認識し

フ ッ 化 水 素 に 加 水 分 解 す る こ と を 見 出 し た． 後 になかった．このことから，1,2 - α - L -フコシンターゼが認Hehre-resynthesis hydrolysis と命名された反応は，アノ

識 す る ア ク セ プ タ ー の 構 造 要 素 は，2 つ の 連 続 し た

マー反転型酵素をグリコシンターゼに変換するための前equatorial OH に続いた axial OH を 1 つ有する椅子型配提 条 件 で あ る（ Honda & Kitaoka, 2006; Wada et al.,座を有する 6 員環であると推定された（Fig. 5 ）．これは，

2008b ）．すなわち，導入されたアミノ酸置換がフッ化

BbAfcA 結晶構造から推察される Gal 認識様式に良く一致しており（ Nagae et al., 2007 ），また BbAfcA が LNFP

糖からのフッ素イオン遊離活性を保持しつつ，加水分解

II（ Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc ）に対して

ゼ変異体が得られる（ Honda & Kitaoka, 2006; Hidaka etは加水分解活性を示さず，3-FL（ Galβ1-4(Fucα1-3)Glc ）お よ び LNFP V（ Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)al., 2010 ）．酸および塩基触媒として一対のカルボン酸
残基および求核水を保持する一般的なアノマー反転型酵Glc ）中の α（1-3）-フコシル結合に対してわずかな加水素の場合，塩基残基が保存されていれば，単に求核水を分解活性を示すこととよく一致する（ Fig. 5 ）（ Katayama

保持する残基を中性のアミノ酸残基で置き換えること

et al., 2004 ）． 興 味 深 い こ と に，Lac で は Gal 残 基 のC6-OH 基が Glc 残基の C3 の OH に近接して存在しておで，グリコシンターゼ化が起こり得る．例えば，GH8

り，これは 3-FL への酵素の接近を妨げると予想される．

ナーゼ（ Honda & Kitaoka, 2006 ）および GH19 に属す

活性を大幅に減少させる場合に効率的なグリコシンターに属する還元末端キシロース遊離エキソ - オリゴキシラ

セロビオース（ Glcβ1-4Glc ）（ 5.6 ％）とキシロビオース

るキチナーゼ（ Ohnuma et al., 2012 ）が挙げられる．し（ 33 ％）の間に見られる明確な反応効率の差は，非還元

かしながら，いくつかのアノマー反転型酵素は独特な反末端糖から延長してくるヒドロキシメチル基によって引応機構を有しており（ Helland et al., 2009; Honda et al.,

き起こされたと予想される．

2016 ），それらをグリコシンターゼ化するための理論はGNB，LNT および LNnT をアクセプターとして使用

存 在 し て い な い（ Honda & Kitaoka, 2006; Wada et al.,は α -1,2 結合を介して非還元末端

2008b ）．本研究で使用した BbAfcA は，前述の通り独特

Gal 残基に Fuc 残基を特異的に導入していた（ Sugiyama

な反応メカニズムを有している（ Fig. 1 ）．解析した 51

et al., 2016 ）．その他の Gal 含有糖から生じた産物の化
学構造は決定しなかったが，おそらくすべて H 抗原構

種の BbAfcA 変異体のうち，2 種の変異体 BbAfcAN423H お造であろう．従って，フコシンターゼ反応は本質的にはたが，求核水を保持する残基の変異体（ N421 変異体）

非還元末端 Gal で生じると考えられる．アクセプターとはフコシンターゼ活性を示さなかった．BbAfcAN423H おしてメリビオース，3-β-ガラクトビオース，3-β-ガラク

よび BbAfcAN423D/D766N のフッ素遊離活性が何に由来する

トシルグルコース，4-β-ガラクトビオースおよび 6-β-ガ

かは不明である．独特の反応機構を有するアノマー反転

ラクトビオースとした反応液の HPLC プロファイルにお型酵素から効率的なグリコシンターゼを創製するためにいては，副産物ピークは全く認められなかった．

は，経験的なアプローチが必要であると考えられる．

した場合，BbAfcA

N423H

よび BbAfcAN423D/D766N は高いフコシンターゼ活性を示し

MS 分析および UEA-I を用いたレクチンブロッティン

本研究では β-FucF の不安定さのために速度論的パラ

グによって明らかとなったように，野生型 BbAfcA と

メ ー タ ー を 求 め る こ と が 出 来 な か っ た． し か し，

BbAfcAN423H で処理した PGM（脱フコシル化後に再度フコシル化）の H 抗原構造は，未処理 PGM に匹敵するほBbAfcAN423H によって触媒される反応が最初の 3 分間で直線的に進行したと仮定すると（ Fig. 2A ），H 抗原合成にどであった．野生型 BbAfcA と BbAfcAN423H で処理した

対する変異体の比活性は 5 s-1 であると推定され，この値

PGM で見られ，未処理 PGM では見られなかった PNA

は α -1,2 -フコシルトランスフェラーゼの値（ 1 - 20 min-1 ）による T 抗原の検出は，おそらく還元剤（ジチオトレイ

よりもかなり高い．BbAfcAN423H を用いて H 抗原含有糖− 149 −

杉山

友太，片山

高嶺，栗原

質 の 合 成 を ス ケ ー ル ア ッ プ す る た め に は，β-FucF の新using highly efficient 1,2-α-L-fucosynthase. Glycobiology.
26:1235 – 1247.

フィーディングまたは低温反応（ < 4 ℃）が必要である
かもしれない．

謝

本 研 究 で 開 発 さ れ た 1,2 - α - L -フ コ シ ン タ ー ゼ

辞

BbAfcAN423H は，1 型，2 型，3 型および 4 型 H 抗原，ルイス b および y 抗原，および他の非天然型オリゴ糖を合本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成金によ成した．また，糖タンパク質糖鎖に H 抗原を導入可能り行われたものである．本助成を賜った公益財団法人発であることが示された．本酵素は糖鎖生物学の分野にお酵研究所に厚く御礼申し上げます．MALDI-TOF MS 分析

いて有用なツールであるといえる．

は文部科学省のナノテクノロジープラットフォームプロ

要

グラムの支援を受けて北陸先端科学技術大学で行われた．

約

H 抗原（ Fucα1-2Gal ）は，種々の生理現象に関与しているが，最近の研究において腸内細菌と宿主との間の共生を確立するのに重要な役割を果たすことが明らかにされた．したがって，H 抗原含有糖を合成する方法の開発 が 望 ま れ て い る． 本 研 究 で は， ア ノ マ ー 反 転 型
1,2 - α - L -フコシダーゼを高効率の 1,2 - α - L -フコシンター
ゼに変換することに成功した．作出した 1,2 - α - L -フコシンターゼは種々のオリゴ糖のみならず糖タンパク質（ブタ胃ムチン）の O-型糖鎖に H 抗原を導入することが可能 で あ っ た． こ れ ら の 結 果 は， 本 研 究 で 作 出 さ れた
1,2 - α - L -フコシンターゼが糖鎖生物学において有用なツールとして機能することを示している．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表1) 杉山友太, 後藤愛那, 本多裕司, 吉田永史奈, 栗原新, 北岡本
光, 山本憲二, 片山高嶺. 2015. ヒトミルクオリゴ糖の酵素合成に向けた高効率1,2-α-L-fucosynthaseの作出. 2015年度
日本農芸化学会. 3月26-29日. 岡山.
2) 杉山友太, 加藤紀彦, 後藤愛那, 本多裕司, 吉田永史奈, 栗原
新, 北岡本光, 山本憲二, 片山高嶺. 2015. ビフィズス菌由来
1,2-α-L-fucosidaseの高効率フコシンターゼ化-ヒトミルクオ
リゴ糖の酵素合成への応用-. 2015年度日本農芸化学会中部・関西支部合同大会. 9月19-20日. 富山.
3) 杉山友太, 加藤紀彦, 後藤愛那, 本多裕司, 吉田永史奈, 栗原
新, 北岡本光, 山本憲二, 片山高嶺. 2016. 高効率1,2-α-L-fucosynthaseを用いたO-型およびN-型糖鎖のフコシル化. 2016年度日本農芸化学会. 3月27-30日. 北海道.
4) 杉山友太, 加藤紀彦, 後藤愛那, 本多裕司, 吉田永史奈, 栗原
新, 芦田久, 熊谷英彦, 山本憲二, 北岡本光, 片山高嶺. 2017.
高効率1,2-α-L-fucosynthaseの作出とH抗原含有オリゴ糖および糖タンパク質創製への応用. 第10回北陸合同バイオシ
ンポジウム. 11月10-11日. 富山.
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Wada, J., Ando, T., Kiyohara, M., Ashida, H., Kitaoka, M.,
Yamaguchi, M., Kumagai, H., Katayama, T. & Yamamoto, K.
2008a. Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidase, a critical
enzyme for the degradation of human milk oligosaccharides
with a type 1 structure. Appl. Environ. Microbiol. 74:3996-4004.
Wada, J., Honda, Y., Nagae, M., Kato, R., Wakatsuki, S.,
Katayama, T., Taniguchi, H., Kumagai, H., Kitaoka, M. &Yamamoto, K. 2008b. 1,2-α-L-Fucosynthase: a glycosynthasederived from an inverting alpha-glycosidase with an unusual
reaction mechanism. FEBS Lett. 582:3739-3743.
Zhao, C., Wu, Y., Yu, H., Shah, I.M., Li, Y., Zeng, J., Liu, B., Mills,
D.A. & Chen, X. 2016. The one-pot multienzyme (OPME)
synthesis of human blood group H antigens and a human milkoligosaccharide (HMOS) with highly active Thermosynechococcus
elongatus α1-2-fucosyltransferase. Chem. Commun. (Camb)
52:3899-3902.

− 152 −

IFO Res.Commun. 33
153-159, 2019

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の応用展開
杉山

友太，片山

高嶺，栗原

新

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Versatility evaluation of 1,2-α-L-fucosynthase
Yuta Sugiyama, Takane Katayama, Shin Kurihara
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
A highly efficient 1,2-α-L-fucosynthase (BbAfcAN423H) generated by protein engineering of 1,2-α-L-fucosidase wasfurther examined for its versatility. The enzyme was found to introduce H-antigen into N- and O-glycans in fetuin
glycoproteins, GM1 ganglioside, and a plant-derived xyloglucan nonasaccharide. This study broadens thefeasibility of this novel H-antigen synthesis technique in functional glycomics.
Key words: 1,2-α-L-fucosynthase, H-antigen, N-glycan, glycolipid, xyloglucan緒

言

オリゴ糖やタンパク質糖鎖のフコシル化修飾は，糖鎖

et al., 1995; Hakomori, 1999 ）．H 抗原は病原菌感染の予防などの有益な効果を示し，宿主と腸内微生物叢との共-タンパク質および細胞間相互作用を調節する因子とし

生 を 確 立 す る た め の 構 造 と し て 知 ら れ て い る(Ruiz-て主に複合糖質の糖鎖の非還元末端に見られる（ Lowe,

Palacios et al., 2003; Goto et al., 2014; Pham et al., 2014）．

2002; Pickard & Chervonsky, 2015 ）． ヒ ト に お い て は

例えば，母親は乳中に 2' -フコシルラクトース（ 2'-FL ）α -1,2 -フ コ シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ（ FUT1 お よ び
FUT2）によりフコース（Fuc ）α -1,2 ガラクトース（Gal ）および他のフコシル化ヒト乳糖オリゴ糖（ Human Milk

二糖構造（ Fucα1-2Gal: H 抗原と呼ばれる）が合成され，（ Kunz et al., 2000; Kobata, 2010; Urashima et al., 2012 ）．

糖タンパク質および糖脂質上に血液型抗原決定基が形成高等植物では，α -1,2 -フコシル基により苗の成長が調節される（Kelly et al., 1994; Mollicone et al., 1994; Rouquier

されることも知られている（ Zablackis et al., 1996; Dumont

E-mail:
杉山友太（ sugiyama.yuta.6s@kyoto-u.ac.jp ）（ 現 所 属: 京 都 大
学大学院農学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
片山高嶺（ takane@lif.kyoto-u.ac.jp ）（現所属:京都大学大学院
生命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属:近畿大学生
物理工学部食品安全工学科 〒 649-6493 和歌山県紀の川市西三谷 930 ）
共同研究者
加藤紀彦（京都大学大学院生命科学研究科），
後藤愛那（京都大学大学院生命科学研究科），
本多裕司（石川県立大学生物資源環境学部），
芦田 久（近畿大学生物理工学部食品安全工学科），
山本憲二（石川県立大学生物資源工学研究所）

Oligosaccharide，HMO ）を分泌して児に供給している

et al., 2015 ）．したがって，フコシル化糖の合成は，様々な生物において観察されるフコシル基が介在する細胞応
答の詳細な分子メカニズムの解明に役立つと考えられる．
我々は，
Fucα1-2Gal 結合の形成を触媒するが Fucα1-2Gal結合に対する加水分解活性を失った高効率 1,2 - α - L -フコシンターゼ（ BbAfcAN423H ）を作出することに成功している（ Sugiyama et al., 2016 ）．本研究では，種々の複合糖質を用いて BbAfcAN423H のさらなる応用を試みた．

実験方法
組換えタンパク質の調製
Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 由 来 の 1,3 - 1,4 α - L -フコシダーゼ（ BT_2970 ），野生型 BbAfcA および− 153 −

杉山

友太，片山

高嶺，栗原

新

BbAfcAN423H は以前の報告と同様に調製した（ Sakurama

ピリジルアミノ（ PA ）標識糖鎖を用いたフコシンター

et al., 2012; Sugiyama et al., 2016 ）．

ゼ反応
2 μM PA 標識糖鎖（ TaKaRa ），100 μM β-FucF および

GM1 のフコシル化

10 μM BbAfcAN423H を含有する 60 μL の 100 mM クエン酸

50 μg のガングリオシド GM1（ Sigma-aldrich ）を 2 μL

ナトリウム緩衝液（ pH 5.5 ）を 30 ℃で 60 分間インキュのジメチルスルホキシドで溶解した．1 mg/mL ガング

ベートした．反応液は高速液体クロマトグラフィー

リオシド GM1，10 mM β-FucF および 10 μM BbAfcAN423H（ HPLC ）で分析した．Waters e2695 separation module

を 含 む 50 μL の 100 mM ク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液（Waters ）を用い，カラムは TSKgel Amide-80 カラム（4.6（ pH 5.5 ）を 30 ℃で 60 分間インキュベートした．反応×250 mm，Tosoh ） を 使 用 し た． カ ラ ム オ ー ブ ン は

液はシリカゲル 60 アルミニウムシート（ Merck ）を用

40 ℃とした．溶出は溶媒 A（アセトニトリル / 10 ％アセ

いた薄層クロマトグラフィー（ TLC ）で分析した．展

トニトリル含有 500 mM 酢酸 -トリエチルアミン（pH 7.3 ）開溶媒は，クロロホルム / メタノール / 0.2 ％塩化カルシ= 75/15 ）および溶媒 B（アセトニトリル / 10 ％アセト

ウム（ 60/3/8，v/v/v ）とした．TLC プレートの呈色は，ニトリル含有 500 mM 酢酸 -トリエチルアミン（ pH 7.3 ）ジ フ ェ ニ ル ア ミ ン-ア ニ リ ン-リ ン 酸 試 薬 で 行 っ た= 40/50 ）を用いて 1 mL/min の流速で行った．溶媒 B の（ Anderson et al., 2000 ）．さらに，マトリックス支援レー

グラジエント（100 分間で 0 → 100 ％）とし，20 分間 100 ％ザー脱離イオン化法（MALDI-TOF-MS ）分析を行うため，

で 保 持 し た． 溶 出 液 は Waters 2475 Multi-wavelength

反応産物を Sep-Pak C18 カートリッジカラム（ Waters ）を用いて精製した．まず，アセトン沈殿によって酵素をFluorescence Detector（ Waters ）（ λ ex: 310 nm ，λ em:

380 nm ）でモニターした．

除去し，上清を遠心濃縮によって乾固し，50 ％メタノー
ルで再溶解した．サンプルを蒸留水で予め平衡化した
Sep-Pak C18 カラムにアプライし，クロロホルム - メタ

ノール（ 2/1，v/v ）で溶出し，窒素雰囲気下で乾燥した．

レクチンブロット
アシアロフェツインサンプル（ 2 μg ）を SDS-PAGE
で分離し，次いで PVDF 膜（ Immobilon-P，Millipore ）へ転写した．ブロッキング溶液[ 2 ％（ w/v ）ウシ血清

植物キシログルカンのフコシル化

アルブミンおよび 0.05 ％（ v/v ）Tween-20 含有 Tris 緩

10 mM または 2 mM xyloglucan nonasaccharide（ XLLG，

衝生理食塩水]と共に 1 時間インキュベートし，膜をビオ

Tokyo Chemical Industries ），10 mM β-FucF および 10 μM

チン結合レクチン（ 0.4 μg/mL; Ulex europaeus agglutinin

BbAfcAN423H を含有する 100 μL の 100 mM クエン酸ナト
リウム緩衝液（ pH 5.5 ）を 30 ℃で 30 分間インキュベー

I, UEA-1 ま た は Peanut agglutinin，PNA ）（ J-Oil Mills ）トした．反応液はパルスアンペロメトリック検出器を備（ 0.125 μg/mL ）を含むブロッキング溶液と共に 1 時間

えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ HPAEC-PAD ）インキュベートした．膜を Tris 緩衝生理食塩水で洗浄

およびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ Dionex ） で 分 析 し た．CarboPac PA1 カ ラ ム（ 2×し，SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate

250 mm，Dionex ）を 30 ℃で使用し，溶出は 125 mM 水

（ Thermo Fischer Scientific ）および Luminescent Image

酸化ナトリウムと酢酸ナトリウムの 20 分間のリニアグ

Analyzer LAS-3000（ Fujifilm ）を用いて検出した．

ラジエント（ 0 ～ 330 mM ）で 0.25 mL/min で行った．
N-型糖鎖の調製
糖タンパク質のフコシル化
アシアロフェツイン（ Sigma-aldrich ）はシアリダー

N-型 糖 鎖 は， ペ プ チ ド- N -グ リ カ ナ ー ゼ（ PNGF，Roche ）を用いて調製した．まず糖タンパク質をトリプ

ゼ（コレラ菌由来，Roche ）処理により残留シアル酸残シン処理し，糖ペプチドまで消化した．糖タンパク質サ

基 を 除 去 し た 後， フ コ シ ン タ ー ゼ 反 応 に 使 用 し た．

ン プ ル を 凍 結 乾 燥 し，10 mM 塩 化 カ ル シ ウ ム を 含 む

1 mg/mL ア シ ア ロ フ ェ ツ イ ン，10 mM β-FucF お よ び

100 mM Tris-HCl 緩 衝 液（ pH 8.2 ）200 μL で 再 溶 解 し，を含む 100 mM のクエン酸ナトリウム次いで 5 μL の 20 mg/mL トリプシンを添加し，37 ℃で緩衝液（ pH 5.5 ）250 μL を 30 ℃で 60 分間インキュベー

15.5 時間インキュベートした．その後，サンプルを遠心トし，95 ℃で 3 分間処理することで反応を停止させ，分離（ 15,000 rpm，4 ℃，10 分）し，上清を回収した．

10 mM Tris-HCl 緩衝液（ pH 8.0 ）に対して透析した後，沈殿を水で再懸濁し，再度遠心分離し，上清を回収した．

糖鎖分析に供した．

両方の上清を合一し，遠心濃縮により乾燥させた．乾燥

10 μM BbAfcA

N423H

したトリプシン消化ペプチドを 300 μL の 5 ％（ v/v ）酢
酸で再溶解し，5 ％酢酸で予め平衡化した Sep-Pak C18− 154 −

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の応用展開

カートリッジカラムへ添加し，5 ％酢酸で洗浄した．糖導入フコースの結合様式の決定

ペプチドを，20 ％イソプロパノール含有 5 ％酢酸およびフコシンターゼ反応により導入された Fuc のグリコシ

40 ％イソプロパノール含有 5 ％酢酸で溶出した．糖ペプ

ド結合の様式は，Fuc の結合様式に対して高い特異性をチドから N-型糖鎖を遊離させるために，溶出液を遠心

示 す 1,2 - α - L -フ コ シ ダ ー ゼ（ 野 生 型 BbAfcA ） お よ び

濃縮機で乾燥し，27 μL の蒸留水と 20 μL の 100 mM リン

1,3 - 1,4 - α - L -フコシダーゼ（ BT_2970 ）処理により解析

酸ナトリウム緩衝液（ pH 7.5 ）を添加，再溶解し，次い

し た．1,2 - α - L -フ コ シ ダ ー ゼ 処 理 は，1 μM 野 生 型

で 3 μL の PNGF を加えた．反応溶液を 37 ℃で 16 時間イ
ン キ ュ ベ ー ト し， 乾 燥 さ せ た． 乾 燥 後， サ ン プ ル を

BbAfcA お よ び フ コ シ ン タ ー ゼ 反 応 産 物 を 含 有 す る
150 μL の 100 mM リン酸ナトリウム緩衝液（ pH 6.5 ）を300 μL の 5 ％酢酸で溶解し，予め平衡化した Sep-Pak C18

37 ℃でインキュベートすることで行った．1,3 - 1,4 - α - L -カラムにアプライした．夾雑物を除き，糖ペプチドからフコシダーゼ処理は，1.8 μM BT_2970 およびフコシン遊離した N-型糖鎖を含む 5 ％酢酸溶出画分を回収し，ターゼ反応産物を含有する 150 μL の 100 mM 2 -モルホリ

凍結乾燥後，糖鎖を完全メチル化し，MALDI-TOF-MS

ノエタンスルホン酸緩衝液（ pH 6.0 ）を 37 ℃でインキュ

分 析 に 供 し た． 糖 鎖 の 完 全 メ チ ル 化 は Sugiyama et

ベートすることで行った．処理後，試料を前述のように

al.,(2016)と同様に行った．

MALDI-TOF MS および MALDI-TOF / TOF MS によって分析した．

O-型糖鎖の調製
Sep-Pak C18 カートリッジカラムで糖タンパク質から結果および考察

遊離した N-型糖鎖を回収した後，O-型糖鎖を含有する
糖ペプチドを 20 ％および 40 ％イソプロパノール含有

アシアロフェツインの N-および O-型糖鎖のフコシル化

5 ％酢酸で溶出し，O-型糖鎖の分析に使用した．糖ペプ

1,2 - α - L -フコシンターゼ（ BbAfcAN423H ）が糖タンパク

チドから O-型糖鎖を遊離させるため，還元 β 脱離法を質の N-型糖鎖に Fuc を導入できるかを調べるために，用いた．糖ペプチド（ 80 ～ 100 μg ）を 1 M 水素化ホウ

最初にモデル糖タンパク質としてウシ胎児血清由来のア

素ナトリウムを含む 100 mM 水酸化ナトリウム 500 μL で

シアロフェツイン上の N-型糖鎖のフコシル化を試みた．

溶解し，45℃で 18 時間インキュベートした．インキュ

フェツインは，そのポリペプチド上に 3 本の N-型糖鎖

ベート後，氷上に静置し，10 ％（ v/v ）酢酸を加えて反と 3 本の O-型糖鎖を有する 48 kDa のタンパク質である．

応液を中和した．次にサンプルを Dowex-50W-X8（ H 型，

MALDI-TOF-MS 分析によりアシアロフェツインは N-

100 - 200 m，Sigma-aldrich ）カラムで脱塩し，フロース型糖鎖として主にトリアンテナ型（ m/z 2520.4 ）を，次

ルー画分および 5 ％酢酸での洗浄画分を集めて凍結乾燥

いでバイアンテナ型（ m/z 2071.2 ）とシアリダーゼ耐性+した．10 ％酢酸含有メタノール 0.3 mL を加え，残留ホ

モノシアロトリアンテナ型（ m/z 2881.6 ）を有していた

ウ酸塩をメタノールとの共沸混合物として 40 ℃の窒素

（ Fig. 1Aa ）．一方，BbAfcAN423H 処理アシアロフェツイン

流下で除去した．ホウ酸塩を完全に除去するために，この MS スペクトルは，m/z 2694.5 のシグナルの明瞭な増の工程を 5 回繰り返した．遊離したオリゴ糖アルジトー

加，さらに m/z 2245.2，2868.1，3055.6 のシグナルの出

ルを 0.3 mL の 5 ％酢酸に溶解し，Sep-pak C18 カートリッ

現を示した（Fig. 1Ab ）．これらのシグナルが示す質量は，ジカラムを用いて精製した．遊離したオリゴ糖アルジ

ア シ ア ロ フ ェ ツ イ ン が 元 々 有 し て い る m/z 2071.2，

トールを含有するフロースルー画分を回収，凍結乾燥し，2520.4 および 2881.6 の糖鎖に 1 つ（ m/z +174 ）または 2完全メチル化後，MALDI-TOF-MS 分析に供した．

つ（ m/z +348 ）のデオキシヘキソース（ dHex，Fuc はデオキシヘキソースの一つ）が付加した場合の質量と一MALDI-TOF-MS 分析

致した．実際に，m/z 2694 のシグナルの MS/MS スペク

MALDI-TOF-MS（ UltrafleXtrem，Bruker ）分析にお

トルは，モノフコシル化トリアンテナ型 N-型糖鎖に対いて，完全メチル化糖鎖はポジティブイオンモードで，応するフラグメントパターンを示した（データ未掲載）．

ガングリオシド GM1 およびフコシルガングリオシド

さらに，m/z 433 および 2284 のフラグメントイオンは末GM1 はネガティブイオンモードで使用した．マトリッ

端デオキシヘキソース（ dHex ）構造の存在を示し，こク ス と し て 2,5 -ジ ヒ ド ロ キ シ 安 息 香 酸 を 用 い た．

れは Gal 残基のフコシル化を示唆している．α - L - フコシ

MALDI-TOF/TOF-MS 解析により MS/MS スペクトルをダーゼ処理の結果，Fucα1-2 結合であることが明らかと得た．糖鎖の理論質量はソフトウェア GlycoWorkbench

なった（ Fig. 1Ac および 1Ad ）．

2.0（ Ceroni et al., 2008 ）を用いて計算した．

アシアロフェツインのアシアロバイアンテナ型，アシアロ - およびモノシアロトリアンテナ型 N-型糖鎖への− 155 −

杉山

Fig. 1.

友太，片山

高嶺，栗原

新

MALDI-TOF MS analysis of the permethylated N-glycans released from asialofetuin (A) and fetuin (B) treated with BbAfcAN423H.
(A) MS spectra obtained for the permethylated N-glycans released by PNGF from asialofetuin treated without (a) and with BbAfcAN423H (b). The sample (b) was further treated with 1,2-α-L-fucosidase BbAfcAWT (c) or 1,3–1,4-α-L-fucosidase (BT_2970) (d). (B)The same experiments were conducted using fetuine as an acceptor glycoprotein. The estimated glycan structures are shown.Sugars are depicted as: diamond, N-acetylneuraminic acid; filled circle, galactose; filled square, N-acetylglucosamine; filled
triangle, fucose; open circle, mannose. This figure is modified from Figures 2 and 4 of Sugiyama et al. (2017). Biosci. Biotechnol.
Biochem. 81:283-291.

− 156 −

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の応用展開

Fuc の導入効率は MS のシグナル強度の比較より，それら の ピ ー ク は 野 生 型 BbAfcA 処 理 で 消 失 し た が，

ぞれ 9，26，および 20 ％と算出された．この結果より，

BT_2970 で処理した場合は変化せず，Fuc が α -1,2 結合フコシル化の効率は糖鎖の種類により異なることが示さで糖鎖へ導入されたことが示された（ Fig. 1Bc およびれた．そこで，PA で標識されたバイ - およびトリアン

1Bd ）．これらの結果は，NeuAcα2-6 結合を有する Gal

テナ型 N-型糖鎖を用いて BbAfcAN423H の特異性を解析し残基においても Fuc 導入が可能であることを示していた．バイ - およびトリアンテナ型 N-型糖鎖を基質とした

た．MS シグナルに基づくフコシル化効率はジシアロ -時，BbAfcAN423 処理により，それぞれ 2 つおよび 3 つのバイアンテナ型およびジシアロ - ，トリシアロ - およびピークが HPLC で認められ，Fuc がバイアンテナ型ではテトラシアロ - トリアンテナ型 N-型糖鎖において，それ

1 および 2 個，トリアンテナ型では 1 ～ 3 個導入されてぞれ 12，11，15 および 11 ％であった．

いることが示唆された（データ未掲載）．基質の消費から算出したフコシル化効率は，バイ - およびトリアンテ

BbAfcA と 2'-FL の共結晶構造においては，Gal 残基のO6 が溶媒側に露出している（ Nagae et al., 2007 ）．すな

ナ型 N-型糖鎖においてそれぞれ 80 および 81 ％であっ

わ ち BbAfcA は， 糖 鎖 の 非 還 元 末 端 に 存 在 す る

た．これらの結果は，BbAfcAN423H は遊離のバイ - および

NeuAcα2-6Gal 構造を収容するのに十分な空間を有する

トリアンテナ型 N-型糖鎖を同程度の効率でアクセプといえる．

ターに出来ることを示唆した．したがって，アシアロフェ
ツインにおけるフコシル化の効率の違いは，糖タンパク

糖脂質のフコシル化
次いで GM1（ Fig. 2Aa ）を用いてフコシル化を検証

質上の各糖鎖種への BbAfcAN423H のアクセスのしやすさ

した．モノフコシル GM1 は離乳期間中に哺乳動物の消に起因していると考えられた．
ア シ ア ロ フ ェ ツ イ ン の O-型 糖 鎖 の フ コ シ ル 化 も化管で発現することが示されており，さらに小細胞肺癌

MALDI-TOF MS 分 析 に よ っ て 明 ら か と な っ た．

および肝細胞癌の潜在的マーカーとしても報告されてい

BbAfcA
処理後，フコシル化 O-型糖鎖アルジトール（ナトリウム付加物）の質量と一致するいくつかのシグる（ Wu et al., 2012 ）．

ナル（m/z 708.5，Fuc1Gal1GalNAc-itol および m/z 1157.7，

反応液を TLC 分析により解析した．フコシンターゼ反Fuc1Gal2GlcNAc1GalNAc-itol ）（ GlcNAc; N -アセチルグ

応による生成物と考えられる新たなスポットが GM1 ス

ルコサミン , GalNAc; N-アセチルガラクトサミン）が新

ポットの下に観察された（データ未掲載）．MS 分析にた に 観 察 さ れ た（ デ ー タ 未 掲 載 ）． 以 上 の 結 果 は，より，GM1 由来の m/z 1544.7 および m/z 1572.8 のピー

BbAfcAN423H が糖タンパク質糖鎖に Fucα1-2Gal 構造を導入可能であることを示している．

クに加えて，m/z 1690.8 および m/z 1718.8 の新たなピー

N423H

ウシ脳由来 GM1 を用いてフコシンターゼ反応を行い，クが出現し，モノフコシル GM1 の推定質量と一致した（ Fig. 2Ab および 2Ac ）．これらのピークは BbAfcA 野生

BbAfcAN423H を用いたシアル酸含有 N - 結合型糖鎖へのFuc の導入の α -1,2 - フコシル化が生じたことが示された（Fig. 2Ad ）．

BbAfcAN423H 処理アシアロフェツインで検出された m/z
3055.6 の シ グ ナ ル の MS/MS ス ペ ク ト ル に お い て，

植物キシログルカンのフコシル化

型での処理で消失したことから，GM1 ガングリオシド

NeuAc1dHex1Hex1HexNAc1 の質量に対応する m/z 1022

キシログルカンは，高等植物の細胞壁におけるヘミセ[M+Na]+ のフラグメントイオンが認められた（ NeuAc;

ルロース多糖の主成分である．XLLG は β-1-4 結合グル

N -アセチルノイラミン酸，HexNAc; N-アセチルヘキソサミン）．この結果は，BbAfcAN423H がシアル酸含有 N-合したキシロース（ Xyl ）および Galβ1-2Xyl 残基の側鎖型糖鎖に対しても Fuc を導入できることを示唆していを有する九糖である（ Fig. 2Ba ）．フコシル XLLG は植た．そこで，アクセプターとしてフェツインを用いてフ物体内に存在し，オーキシン刺激成長に対して阻害活性

コシンターゼ反応を実施した．フェツインではシアル酸を示すことが報告されている（ Augur et al., 1992 ）．

コシル骨格を有し，グルコース（ Glc ）の C6 位に α 結を含有する N-結合型糖鎖:ジシアロバイアンテナ（ m/z

10 mM の XLLG を用いてフコシンターゼ反応を行い，2793.4 ），トリシアロ−（ m/z 3603.8 ）およびテトラシ

反応液を HPAEC-PAD へ供したところ，生成物と予想さアロ（ m/z 3966.0 ）トリアンテナ型が主要な糖鎖としてれるピークが BbAfcAN423H 処理サンプルにおいて認めら検出された（ Fig. 1Ba ）．一方で，BbAfcAN423H 処理フェ

れた（データ未掲載）．この条件での反応効率は XLLG

ツインサンプルでは，モノフコシル化を有するシアル酸に対して 57 ％であった．完全メチル化反応生成物の MS

含有 N-型糖鎖に対応するピークがそれぞれ認められた分析によりモノ（- m/z 1948.2 ），ジ（- m/z 2122.3 ）およ（ m/z 2967.5，3778.9 お よ び 4140.1 ）（ Fig. 1Bb ）． こ れびトリフコシル XLLG（m/z 2296.0 ）が BbAfcAN423H によっ− 157 −

杉山

Fig. 2.

友太，片山

高嶺，栗原

新

MALDI-TOF MS analysis of the reaction products using GM1 ganglioside (A) and xyloglucan nonasaccharide (B) as acceptors. (A)The structure of ganglioside GM1 is shown (a). Mass spectra obtained for GA1 without (b) and with BbAfcAN423H (c) treatment.
The sample (c) was digested with 1,2-α-L-fucosidase BbAfcAWT to examine the glycoside linkage (d). Cer, Ceramide. (B) The
structure of xyloglucan nonasaccharide (XLLG) is shown (a). Mass spectra obtained for XLLG without (b) and with BbAfcAN423H(c) treatment. This figure is modified from Figures 5 and 6 of Sugiyama et al. (2017). Biosci. Biotechnol. Biochem. 81:283-291.

て生成されたことが示された（ Fig. 2Bb および 2Bc ）．

研究により BbAfcAN423H の糖鎖生物学ツールとしての有シグナル強度から，トリフコシル XLLG はごく微量の生用性が示された．

成物であると示唆された（ Fig. 2Bc ）．以前の研究にお本助成で得られた研究成果の報告

いて，フコシル基は Gal の C2 位のみならず，還元末端
Glc が α -アノマーの場合に C3 位でも起こり得ることを示 し て い る（ Sugiyama et al., 2016 ）． こ の フ コ シ ル
XLLG の MS/MS 分析を行ったところ，m/z 1175 に相当するフラグメントイオンピークが認められ，3 つ目のフコシル基が還元末端の Glc 残基に付加されている可能性が強く示された（データ未掲載）．ただし，XLLG の還元 末 端 Glc へ の Fuc の 付 加 は，XLLG に 比 べ て 過 剰 な
β-FucF が存在する場合のみ観察された．これらの結果
は BbAfcAN423H がフコシル化キシログルカンの産生に有用であることを示している．

要約

高効率 1,2 - α - L -フコシンターゼ BbAfcAN423H が，フェツイン糖タンパク質の N-および O-結合型糖鎖，GM1
ガングリオシドおよび植物由来のキシログルカンに Fuc

口頭発表1) 杉山友太, 加藤紀彦, 後藤愛那, 本多裕司, 吉田永史奈, 栗原
新, 北岡本光, 山本憲二, 片山高嶺. 2016. 高効率1,2-α- L fucosynthaseを用いたO-型およびN-型糖鎖のフコシル化.
2016年度日本農芸化学会. 3月26-29日. 北海道.
2) 杉山友太, 加藤紀彦, 後藤愛那, 本多裕司, 吉田永史奈, 栗原
新, 芦田久, 熊谷英彦, 山本憲二, 北岡本光, 片山高嶺. 2017.
高効率1,2-α-L-fucosynthaseの作出とH抗原含有オリゴ糖および糖タンパク質創製への応用. 第10回北陸合同バイオシ
ンポジウム. 11月10-11日. 富山.
原著論文
1) Sugiyama, Y., Katoh, T., Honda, Y., Gotoh, A., Ashida, H.,
Kurihara, S., Yamamoto, K. & Katayama, T. 2017.
Application study of 1,2-α-L-fucosynthase: introduction of
Fucα1-2Gal disaccharide structures on N-glycan, ganglioside, and xyloglucan oligosaccharide. Biosci. Biotechnol.
Biochem. 81:283-291.

残基を α1-2 結合で導入可能であることが示された．本− 158 −

高効率 1, 2 - α - L - fucosynthase の応用展開

謝

辞本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成金および一般研究助成（加藤 紀彦）により行われたものである．
本助成を賜った公益財団法人発酵研究所に厚く御礼申し上げます．MALDI-TOF MS 分析は文部科学省のナノテ
クノロジープラットフォームプログラムの支援を受けて北陸先端科学技術大学で行われた．

文

献Anderson, K., Li, S.C. & Li, Y.T. 2000. Diphenylamine-anilinephosphoric acid reagent, a versatile spray reagent for revealing
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− 159 −

IFO Res.Commun. 33
161-174, 2019

Bifidobacterium bifidum によるヒト母乳オリゴ糖分解物のクロスフィーディングがビフィズスフローラ形成を促す
後藤

愛那，阪中

幹祥，栗原

新，片山

高嶺

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Bifidobacterium bifidum enhances bifidus flora formation in fecal culturesby sharing human milk oligosaccharide degradants within bifidobacterial communities
Aina Gotoh, Mikiyasu Sakanaka, Shin Kurihara, Takane Katayama
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
Gut microbiota of breast-fed infants is generally rich in bifidobacteria. Recent in vitro studies have revealed that
infant gut-associated bifidobacteria specifically possess gene and enzyme sets to degrade human milkoligosaccharides (HMOs), which suggests selective growth of the organisms in infant guts. Interestingly, however,
HMO assimilation ability of Bifidobacterium sp. is not related to the dominance of each species in the intestines.
Bifidobacterium longum susbp. longum and Bifidobacterium breve are the dominant species in infant stools;
however, they show ver y limited HMOs assimilation ability in vitro. In contrast, Bifidobacterium bifidum and
Bifidobacterium longum subsp. infantis are less abundant in infant stools despite that their in vitro HMO
degradation ability is very high. In this study, we observed altruistic behavior by B. bifidum when incubated infecal cultures supplemented with HMOs as a carbon source. Four B. bifidum strains, all of which were found topossess complete sets of HMO-degrading genes, left HMOs degradants unconsumed during in vitro growth.
These strains stimulated the growth of other Bifidobacterium species when added to fecal cultures containing
HMOs, thereby increasing the relative abundance of bifidobacteria in fecal communities. HMO consumption was
also enhanced in B. bifidum-supplemented cultures. The addition of deoxyfuconojirimycin, a potent fucosidase
inhibitor, abolished the growth stimulatory effect exerted by B. bifidum. The altruistic behavior by B. bifidum was
not observed in the medium supplemented with glucose as a carbon source. These results suggest B. bifidummediated cross-feeding of HMOs degradants within bifidobacterial communities.
Key words: Bifidobacterium, human milk oligosaccharides, secretory glycosidases, cross-feeding

E-mail:後藤愛那（ aina.g1985@gmail.com ）（現所属 : 京都大学大学院
生命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
阪中幹祥（ miksak@dtu.dk ）（ 現 所 属 : National Food Institute,
Technical University of Denmark, Kemitorvet, 2800
Kgs. Lyngby, Denmark ），片山高嶺（ takane@lif.kyoto-u.ac.jp ）（現所属 : 京都大学大学院
生命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町），
栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属 : 近畿大学生
物理工学部 〒 649-6433 和歌山県紀の川市西三谷
930 ）

共同研究者
加藤紀彦（京都大学大学院生命科学研究科），
Yiwei Ling（新潟大学大学院医歯学総合研究科），
山田千早（東京大学大学院農学生命科学研究科），
朝隈貞樹（国立研究開発法人農研機構），
浦島 匡（帯広畜産大学生命・食料科学研究部門），
苫米地祐輔（東海大学工学部），
片山礼子（石川県立大学生物資源環境学部），
山本憲二（石川県立大学生物資源環境学部），
原田 岳（タカナシ乳業株式会社），
何方（タカナシ乳業株式会社），
廣瀬潤子（滋賀県立大学人間文化学部），
北岡本光（国立研究開発法人農研機構），
奥田修二郎（新潟大学大学院医歯学総合研究科）− 161 −

後藤

緒

愛那，阪中

幹祥，栗原

言

新，片山

高嶺

HMO 分解酵素であるラクト- N -ビオシダーゼ（ LnbX ）をコードする遺伝子が，混合乳栄養児と比較して完全母

哺乳類の腸に棲息する何兆もの細菌は，その代謝産物

乳栄養児の便中で優位に濃縮されていることを明らかにや上皮細胞との直接的な接触を通して，宿主の健康に大した(Yamada et al., 2017）．B. longum における lnbX のきな影響を与える(Kau et al., 2011）．腸内細菌叢の組成

存在は株依存的であり，ゲノム配列が決定された B.

は時間とともに変化するが，最も大きな変化が見られるの は 授 乳 開 始 時 と 終 了 時 で あ る(Yatsunenko et al.,longum 株のうち本遺伝子を持つ株が半分以下であることを考慮すると，この結果は，HMOs が腸内における2012）．最近の研究では，乳児期における腸内細菌叢形

選択圧として作用していることを強く示唆している．

成が宿主の健康に長期的な影響を与えることが指摘され乳児型ビフィズス菌は，HMOs を分解するために 2 つているため(Cox et al., 2014; Olszak et al., 2012），乳児期の異なる戦略を発達させてきた(Katayama 2016）．一つの腸内細菌叢がどのように形成されるかを理解すること

目は細胞外グリコシダーゼ依存的な戦略，二つ目はトラ

は非常に重要である．ビフィズス菌はヒト腸内に最初にンスポーター依存的な戦略である．前者の場合，HMOs

定着する腸内細菌として知られており，一般に母乳で育は細胞壁に結合した分泌型グリコシダーゼによって細胞てられた乳児では総細菌数の 50 ％以上（多くの場合

外で加水分解され，その後，遊離した単糖類および二糖

70 ％以上）を占めている(Matsuki et al., 2016; Tannock

類が細胞内に取り込まれる．後者では，3 糖以上のオリet al., 2013; Yamada et al., 2017）．ビフィズス菌の豊富さ，すなわち占有率の高さは，下痢，アレルギー，およびア

ゴ糖は ATP 結合カセット（ ABC ）トランスポーターに

トピー性皮膚炎の発症率と逆相関することが知られてお

よって細胞内で加水分解される．乳児型ビフィズス菌にり(Di Gioia et al., 2014; Kalliomäki et al., 2001），さらに，おける HMOs 分解経路の理解はまだ完全ではないが，B.

抗腫瘍免疫の活性化(Saavedra et al., 1994），血清コレス

bifidum と LnbX 陽性の B. longum は細胞外グリコシダー
ゼ を 利 用 す る 前 者 に 属 す る の に 対 し，B. breve，B.

テロール値の低下(Beena & Prasad 1997），および葉酸の供給量の増加(Scholz-Ahrens et al., 2001)といった効

よって細胞に直接取り込まれ，エキソグリコシダーゼに果も明らかにされている．したがって，ビフィズスフロー

infantis，および LnbX 陰性の B. longum はトランスポー
ターに依存するタイプである(Odamaki et al., 2015）．以ラの形成は，生涯にわたってヒトの健康に好影響を与え前の研究において我々は，4 種の乳児型ビフィズス菌をることが考えられる．

HMOs 培地で培養した際の上清中の分解物を分析する

ヒト母乳オリゴ糖（ HMO ）は，人乳に含まれる 3 糖

ことで，これらのビフィズス菌がゲノム配列や酵素機能以上のオリゴ糖の総称で，乳糖および脂質に次いで 3 番から予想した通りのグリコシダーゼとトランスポーター

目に豊富な固形成分である．膵消化酵素に対して耐性をを使用して HMOs を資化していることを明らかにした示すために，乳児にとっての栄養にはならないが(Kunz(Asakuma et al., 2011）．この過程で，興味深いことに，

et al., 2000; Urashima et al., 2012），それにもかかわらず
母親は乳腺で多大なエネルギーを消費して HMO を産生

細胞外グルコシダーゼ依存的な HMOs 分解様式を持つする（理論上 1 回のグリコシルトランスフェラーゼ反応

B. bifidum JCM 1254 株 は， 理 論 上 す べ て の タ イ プ のHMOs を資化することが出来るにもかかわらず，増殖途には 1 分子の ATP が必要とされる）．それには何らかの中で HMOs 分解物の一部を消費せずに培地中に残した

生理的意義があって然るべきである．これまでに，我々ままにすることを見出した．具体的には，対数増殖期初を含むいくつかの研究グループが，乳児型ビフィズス菌期の培養上清中に，ラクト- N -テトラオース（ LNT:Gal

で あ る Bifidobacterium breve，Bifidobacterium bifidum，Bifidobacterium longum subsp. longum（ B. longum），B.

β1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，最も豊富な HMO コア構造）
からラクト- N -ビオシダーゼ（ LnbB ）によって産生さ

longum subsp. infantis（ B. infantis ）（ ま れ に B. pseudo-

れるラクト- N -ビオース I（ LNB:Galβ1-3GlcNAc ）およcatenulatum が含まれることもある）が HMOs 分解に必要な酵素をコードする遺伝子群を持つことを報告していびラクトース（ Lac:Galβ1-4Glc ）が大量に検出されるる(Garrido et al., 2016; James et al., 2016; Katayama 2016;

期間全体を通して検出され，定常期の終期においても消Matsuki et al., 2016; Sela et al., 2008）．腸内細菌種におい費されないまま残されていた．LnbX 陽性の B. longumて，これらの HMOs 分解酵素の存在は基本的に上記ビ

JCM 1217 株も Lac を一時的に培養液中に放出していた．

ことを見出した．加えて，ガラクトース（ Gal ）は培養

フ ィ ズ ス 菌 種 に 限 定 さ れ て い る た め(Katayama 2016;

これらの結果は，HMOs 分解物である LNB，Lac，およRuiz-Moyano et al., 2013; Thomson et al., 2017），HMOs

び Gal が，他種ビフィズス菌に共有される可能性を示しはこれらの細菌にとっての選択的栄養源になっている可て い た(Asakuma et al., 2011; Katayama 2016）． 特 に，能性が高い．実際，我々は最近，B. longum の重要な

LNB 資 化 に は ガ ラ ク ト- N -ビ オ ー ス（ GNB ）/ ラ ク ト− 162 −

Bifidobacterium bifidum によるヒト母乳オリゴ糖分解物のクロスフィーディングがビフィズスフローラ形成を促す- N -ビオース I（ LNB ）トランスポーターと細胞質ホスもしくは Glycom（ Denmark ）から恵与，ラクト- N -フコホリラーゼ（ GNB / LNB ホスホリラーゼ）が必要であ

シルペンタオース II（ LNFP II:Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc

るが(Kitaoka et al., 2005; Xiao et al., 2010），これらの遺伝子は 4 種の乳児型ビフィズス菌 B. longum，B. breve，B.

β1-3Galβ1-4Glc ）およびラクト- N -ジフコシルヘキサオー
ス I（ LDFH I:Fucα1 - 2Galβ1 - 3(Fucα1 - 4)GlcNAc

bifidum，および B. infantis が特異的に有していることが知られている(Xiao et al., 2010）．

β1-3Galβ1-4Glc ）は Carbosynth（ Berkshire, UK ）から，デオキシフコノジリマイシン（ DFJ ）は Sigma-Aldrich

Tannock et al.,(2013)は母乳栄養児の腸内細菌叢中で（ MO, USA ）から，イソマルトペンタオース（ IMP ）は

B. bifidum がある程度以上検出される場合は，ビフィズ
スフローラ形成率が高くなることを報告した．興味深い

生化学工業（ Tokyo ）から購入した．LNB は以前の報告に従って合成した(Nishimoto and Kitaoka 2007b）．2 -ことに，これは母乳栄養児の糞便にのみ見られる現象で，アミノアントラニル酸（ 2-AA ）およびシアノ水素化ホ

人工乳栄養児の糞便においては見られなかった．これら

ウ素ナトリウムは，ナカライテスク（ Kyoto ）から入手しの結果も，やはり，ビフィズス菌群集内で B. bifidum にた．他の全ての試薬は分析用グレードのものを使用した．

よって産生された HMOs 分解物のクロスフィーディン
菌株と培養条件

グが起こっている可能性を示唆していた．

本 研 究 で 使 用 し た 菌 株 は，B. bifidum JCM 1254 株，

そこで本研究では，乳児糞便から単離した B. bifidumの 4 株を用いて，ビフィズス菌コミュニティー内のクロJCM 7004 株，TMC 3108 株，および TMC 3115 株と，B.

スフィーディングの可能性を検討することとした．まず，これらの株を HMOs 培地で培養し，その上清中に遊離

longum 105-A 株およびそのラクト- N -ビオシダーゼ遺伝
子欠損株 ΔlnbX である．B. bifidum JCM 1254 株と JCMする HMOs 分解物を分析することによって，それぞれ

7004 株は理研バイオリソースセンター（JCM ）から購入，の株の HMOs 資化能を分析した．次に，B. bifidum によ

TMC 3108 株と TMC 3115 株は幼児糞便から以前に単離る B. longum への HMOs 分解物の供給（クロスフィー

されたものである(Harata et al., 2010）．B. longum 105-A 株ディング）について，共培養実験を行うことで検証した．

は京 都 薬 科大の加 納 康 正先 生から頂いた（ Matsumura

さらに，HMOs を炭素源として糞便懸濁液を培養し，その際に 4 株の B. bifidum の添加が他種ビフィズス菌のet al., 1997; Kanesaki et al., 2014）．AnaeroPack シ ス テ ム（ Mitsubishi Gas Chemical，Tokyo ）を用いて嫌気性条増殖を促進する可能性について検討した．B. bifidum の件下，GAM 培地（ Nissui，Tokyo ）で培養した．特定

2 株については全ゲノム配列も決定した．その結果，B.

の糖を添加した培地での増殖を調べる場合，基本培地

bifidum は HMOs 分解物のクロスフィーダーとして利他的な性質を有していることを見出した．本研究の成果は，（ 0.2 ％酵母エキス，1.0 ％ペプトン，0.5 ％酢酸ナトリウ

母乳栄養児の腸内でどのようにしてビフィズスフローラ

シウム，0.2 ％リン酸水素二カリウム，および 0.1 ％シスが形成されるかを考える上で，また，ビフィズスフロー

テイン塩酸塩）を用いた．植菌前に 4 ％還元剤（ 2 ％シ

ラ形成を促すためのヒト介入試験を行う上で重要な情報

ステイン塩酸塩および 11 ％炭酸ナトリウム）および 1 ％を提供することにつながる．

の糖を添加した．増殖は OD600 を測定することによって，

ム，0.2 ％クエン酸二アンモニウム，0.02 ％硫酸マグネ

または CFU を測定することによってモニターした．デー

実験方法

タは平均値 ± 標準偏差（ SD ）として示した．
全ゲノム配列決定

試薬
2' -フコシルラクトース（ 2'-FL:Fucα1-2Galβ1-4Glc ），3 -フコシルラクトース（ 3-FL:Galβ1-4(Fucα1-3)Glc ），B. bifidum JCM 7004 株 お よ び TMC 3115 株 よ り，Wizard DNA ゲノム精製キット（ Promega，WI, USA ）ラクト- N -ネオテトラオース（ LNnT:Galβ1-4GlcNAcβ1-を用いてゲノム DNA を抽出し，PacBio RS II シークエ

3Galβ1-4Glc ），ラクト- N -フコシルペンタオース I（ LNFP

ンサー（ Pacific Biosciences，CA, USA ）を用いてそれ

I:Fucα1-2Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc ），およびラクぞれ 540 倍および 260 倍のカバレージで配列を決定し，

ト- N -ジフコシルヘキサオース II（ LNDFH II:Galβ1-3

SMART 分析ソフトウェア v2.3.0 を用いて配列を再構築(Fucα1-4)GlcNAcβ1-3Galβ1-4(Fucα1-3)Glc ） は Dextra

し た． さ ら に，HiSeq に よ り 追 加 の 配 列 決 定 を 行 い，Laboratory（ Reading, UK ）から，ラクト - ジフコテト

ギ ャ ッ プ 部 分 を 修 復 し た． 配 列 決 定 お よ び 分 析 は，

ラオース（ LDFT:Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)Glc ）およ

TaKaRa Bio の Dragon Genomic Center（ Shida ），び ラ ク ト- N -テ ト ラ オ ー ス（ LNT:Galβ1-3GlcNAcβ1-

Eurofins Genomics（ Tokyo ），および Beijing Genomics

3Galβ1-4Glc ）は Isoprep（ Tullinge, Sweden ）から購入，

Institute（ Guangdong, China ） に て 行 っ た．Glimmer3− 163 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，栗原

新，片山

高嶺

(Delcher et al., 2007)を使用してオープンリーディング

基本培地中で培養した．経時的に培養液をサンプリング，

フレームを予測し，KAAS(Moriya et al., 2007)によって希釈して，抗生物質含有（2.5 µg/mL クロラムフェニコー

KEGG データベース(Kanehisa et al., 2017)に基づいた

ル）もしくは非含有 GAM プレート上に塗布した．クロ

アノテーションを行った．

ラムフェニコール含有プレート上に形成されたコロニー
は B. longum， 非 含 有 プ レ ー ト 上 の コ ロ ニ ー は B.

PCR 産物の直接シークエンシング
B. bifidum TMC 3108 株のゲノム DNA をテンプレートとし，HMO 分解酵素をコードする遺伝子を PrimeSTAR

longum と B. bifidum 由来の合計として計算した．HMO
培地中における B. bifidum 存在下で，B. longum 105-A

Max（ TaKaRa Bio ） を 用 い た ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応

ΔlnbX 株 を，WT 株 と 競 合 さ せ る 場 合 は，pBFS38 と
pBFO2（ Sakanaka et al. 2014 ） を そ れ ぞ れ ΔlnbX 株 と（ PCR ）で増幅した．増幅断片を精製した後，Eurofins

WT 株に導入して区別した．経時的にサンプリング，希Genomics に依頼してプライマーウォーキング法により釈して抗生物質含有 GAM 寒天プレート（ 30 µg/mL ス
ペクチノマイシンあるいは 2.5 µg/mL クロラムフェニ

配列決定を行った．

コール）上に塗布し，CFU を算出した．
人乳からの HMOs の調製
HMO は， 以 前 の 報 告 に 従 い 人 乳 か ら 精 製 し た

糞便試料培養(Asakuma et al., 2011）．人乳は，長尾助産院（ Kyoto ）糞便試料は，1 人の健康な日本人乳児（乳児 C:4 ヵにおいて，採取前の 1 ヶ月間に抗生物質を服用していな

月齢／帝王切開分娩／女児）と 2 人の健康な日本人幼児

い 14 人の健康な日本人の母親から回収した．インフォー（幼児 A:4 歳／女児，幼児 B ／ 5 歳／男児）から両親の同意を得たうえで採取した．2 人の健康な日本人の成人

ムド・コンセントはすべての母親から得られている．

（成人 D:30 歳／男性，成人 E:39 歳／男性）も本人の培養上清中の糖濃度分析

同意を得て採取を行った．採取した試料は嫌気性条件下

培養上清中の単糖およびオリゴ糖は，蛍光標識後に高で 保 存 し， 嫌 気 性 チ ャ ン バ ー（ InvivO2 400; Baker

速液体クロマトグラフィー（ HPLC ）によって分析した．

Ruskinn，Bridgend，UK ）中で 20 ％グリセロールに懸HMO 存在下でインキュベートした培養液から 50 µl を採濁し，使用するまで−80 ℃で保存した．解凍した糞便

取し，遠心分離により上清を回収して−20 ℃で保管し試料 A ～ E を，炭素源として 1 ％ HMOs またはグルコー

た．ラベル化の際は，上清を解凍して直ちに 30 µl の水ス（ Glc ）を含む基本培地 1 mL に接種して培養した．

および 20 µl の 0.1 ％ IMP（内部標準）と混合した．次い

接種後 0 時間の幼児 A，幼児 B，乳児 C，成人 D，およで，試料中の糖を以前の報告に従い 2-AA で標識した

び成人 E の試料中の総菌数は 16S rRNA 遺伝子コピー数(Asakuma et al., 2011）．種々の糖のうち LNB は熱によで推定し，それぞれ 7.9×108 ，3.2×109 ，4.4×109 ，1.7

り自発分解するため，本論文中に結果として記載されて×1010 ，および 1.7×1010 copies/mL であった．DFJ を添いる濃度は本来の濃度の半分以下になっている．TSKgel

加する場合は終濃度 500 μM とした．24 時間インキュベー

Amide-80 HR カラム（ 4.6×250 mm，φ = 5 µm ）（ Tosoh，

トした後，培養液を遠心分離し回収した菌体を 1 mL のTokyo ）を用いて，65 ℃で分析を実施した．カラムをTE 緩衝液（ 1 mM EDTA 含有 10 mM Tris-HCl，pH 8.0 ）85 ％溶媒 A（アセトニトリル）／ 15 ％溶媒 B（ 100 mMに再懸濁した．懸濁液をステンレスビーズ（φ = 5.0 mm ）ギ酸アンモニウム緩衝液，pH4.3 ）で平衡化し，溶出はおよびジルコニアビーズ（φ = 0.1 mm，100 μL 容量に相当）

流速 1 mL/分で 90 分間，溶媒 B のグラジエント（ 15 ％を入れた 2 mL のスクリューキャップ付チューブに移しから 45 ％）にて行った．標識した糖は Waters 2475 蛍光

た 後， シ ェ イ ク マ ス タ ー ネ オ（ Biomedical Science，

検出器を用いて，励起 330 nm および蛍光 420 nm で検出Tokyo ）にて，1,500 rpm で 10 分間振盪破砕した．次いで，した．糖濃度は，同様に標識した標準糖を用いて作成し破砕液からフェノール／クロロホルム法により全 DNAた検量線で決定した．得られたデータを内部標準によりを抽出した．SYBR Green システム（ TaKaRa Bio ）を用補正し，平均値 ± 標準偏差（ SD ）として示した．

い，各試料中の B. bifidum（種レベル）と Bifidobacterium（属レベル）の量を，
16S rRNA 遺伝子の qPCR 分析によっ

B. longum と B. bifidum の in vitro 共培養
クロラムフェニコール耐性遺伝子が組み込まれたプラ（ SD ）として示した．ビフィズス菌の占優率は，ビフィ

スミド（ pBFS38 ）(Sakanaka et al. 2014)を 保 持 す る B.

ズス菌の 16S rRNA 遺伝子数（ B. bifidum を除く）を総

longum 105-A WT 株 を，B. bifidum JCM 1254 の 存 在 下および非存在下で，炭素源として 1 ％ HMO を添加した

細菌 16S rRNA 遺伝子数で割ることによって算出した．

て 定 量 し た．結 果 は 3 回 の 実 験 の 平 均 値 ± 標 準 偏 差

プ ラ イ マ ー は，B. bifidum 種 レ ベ ル(Tannock et al.,

− 164 −

Bifidobacterium bifidum によるヒト母乳オリゴ糖分解物のクロスフィーディングがビフィズスフローラ形成を促す

2013)と Bifidobacterium 属 レ ベ ル(Yamada et al., 2017)を決定した（ Fig. 1）．これら 2 株を選択したのは，ムチのものを使用した．培養上清の pH は，マイクロ pH メー

ン糖鎖を資化する株であることが報告されているためでター（ HORIBA，Kyoto ）で測定した．また，TLC 分析

ある(未発表データ）．JCM 7004 株の染色体の長さはで は， シ リ カ ゲ ル 60 ア ル ミ ニ ウ ム シ ー ト（ Merck,

2,261,666 bp で，2,106 の コ ー ド 領 域（ CDS ），57 のDarmstadt, Germany ） を 用 い，1 -ブ タ ノ ー ル: 酢 酸:

tRNA 遺伝子，および 3 つの rRNA オペロンを含むと予水（ 2:1:1 ）溶液にて展開後，呈色試薬（ Anderson et

測された．TMC 3115 株の染色体は 2,178,894 bp で，1,876の CDS，53 の tRNA 遺伝子，および 3 つの rRNA オペロ

al., 2000 ）を用いて可視化した．

ンを含むと予測された．ゲノムの平均 GC 含量はそれぞ
統計分析

れ 62.6 ％と 62.8 ％であった．すでに明らかにされてい統計分析は，BellCurve バージョン 2.00（ SSRI，Tokyo ）る 7 株の B. bifidum ゲノム配列の中で，JCM 7004 株のおよび Excel 2013（ Microsoft ）ソフトウェアを用い，

ゲノムサイズが最大である一方，TMC 3115 株のものはDunnett 検定（多重検定）を行った．この際，p 値が 0.05

最小であった．

未満の場合に有意な差であると見なした．

Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes（ KEGG ）における解析では，JCM 7004 株の 2,106 の CDS のうち

画像作成

932 遺伝子に，TMC 3115 株の 1,876 の CDS のうち 905

ゲノム構造は R パッケージの“ circlize ”ライブラリー
を用いて作図した．

遺伝子に機能が割り当てられた．これら遺伝子のうち10 ％以上が炭水化物代謝に関与していると予測された．
糖 質 関 連 酵 素 デ ー タ ベ ー ス(http://www.cazy.org/ ）倫理的配慮(Lombard et al., 2014)に基づく分析によると(Yin et al.,

本研究は，京都大学（ R0046），滋賀県立大学（ 71-3），

2012），JCM 7004 株 お よ び TMC 3115 株 は， そ れ ぞ れ

石川県立大学（ 2016-2 ）の倫理委員会の審査・承認を40 個および 39 個のグリコシダーゼファミリードメイン

受け，ヘルシンキ宣言に基づいて実施した．乳児糞便はを含んでいた．B. bifidum ゲノム中に宿主由来糖鎖に作

母親の同意を得て，それ以外は全ての被験者からイン用するグリコシダーゼが豊富に含まれることは，以前にフォームド・コンセントを得た上で解析に使用した．

も指摘されている(Turroni et al., 2010）．

データ登録

B. bifidum における HMOs 分解酵素の保存性
これまでの研究で JCM 1254 株における HMO 資化に

B. bifidum JCM 7004 株および TMC 3115 株の全ゲノ
ム配列は，accession number AP018131 および AP018132
で DDBJ より入手可能である．

結は，6 つの細胞外酵素，1 つのトランスポーター，および 1 つの細胞内ホスホリラーゼが関わることを明らかとしている．1,2 - α - L -フコシダーゼ（ AfcA ）（ Katayama et

果al., 2004），1,3-1,4 - α - L -フ コ シ ダ ー ゼ（ AfcB ）（ Ashida
et al., 2009），ラクト- N -ビオシダーゼ（ LnbB ）（ Wada

HMOs 存在下における B. bifidum の増殖

et al., 2008），β-1,4-ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ III（ BbgIII ），乳児糞便から単離された 4 株の B. bifidum を，HMOs
を炭素源として含む培地中で培養した．比較のために

β-1,3 - N -アセチルグルコサミニダーゼ I（ BbhI ）（ Miwa

Lac 含有培地でも同様に培養した．その結果，4 株とも

et al., 2010）， お よ び シ ア リ ダ ー ゼ II（ Kiyohara et al.,2011)は，HMOs に見られる全てのグリコシド結合を単HMOs と Lac を良好に資化することが分かった（ 15 時糖（ Fuc，Gal，Glc，N -アセチルグルコサミン（ GlcNAc ），間以内に OD600 > 0.5）．なお，
HMOs 含有培地においては，および N-アセチルノイラミン酸（ Neu5Ac ））および二JCM 1254 株，TMC 3108 株， お よ び TMC 3115 株 が糖（ Lac および LNB ）に分解する分泌型酵素である．

JCM 7004 株よりも高い増殖能を示した．

LnbB によって遊離した LNB は，GNG/LNB トランス
ポ ー タ ー に よ っ て 細 胞 に 取 り 込 ま れ(Asakuma et al.,B. bifidum JCM 7004 株および TMC 3115 株の全ゲノム
配列決定2011）， そ の 後 GNB/LNB ホ ス ホ リ ラ ー ゼ（ GLNBP ）によってガラクトース- 1 -リン酸と GlcNAc/GalNAc に加B. bifidum JCM 1254 株 の ド ラ フ ト ゲ ノ ム 配 列
は，GeneBank デ ー タ ベ ー ス（ accession number

リン酸分解され(Nishimoto & Kitaoka 2007a），ビフィズ

BBBT00000000 ）から入手可能である．本研究においてて加水分解されるか，または Lac パーミアーゼによっては，JCM 7004 株および TMC 3115 株の完全ゲノム配列

輸送される(Miwa et al., 2010; Parche et al., 2006）．これ

ス経路に入る(Suzuki et al., 2010）．Lac は BbgIII によっ− 165 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，栗原

新，片山

高嶺

Fig. 1. T he genomic structure and gene functions (KEGG Orthology) of B. bifidum JCM 7004. The genome structures were depictedusing the R package ＂circlize＂. This figure is modified from Figure 2 of Gotoh et al., (2018). Sci. Rep., 8:13958.

ら の ６ つ の 酵 素 AfcA，AfcB，LnbB，BbgIII，BbhI，

これはこの株が HMOs 培地で増殖能が低い要因である

GLNBP， お よ び GNB/LNB ト ラ ン ス ポ ー タ ー は， 全と推察される．B. bifidum 種レベルにおける HMOs 分解

HMOs で 90 ％以上を占める中性 HMOs(Urashima et al.,

酵素の高い保存性は，他の乳児型ビフィズス菌種とは大2012 ）を完全消化するために必要な最小セットである．

きく異なる点であり，B. longum，B. infantis，および B.

ゲノム解析から，JCM 7004 株および TMC 3115 株が，HMO 分解酵素の最小セット全てを含むことが明らかと

breve では，HMO 分解酵素をコードする遺伝子の保存性は，GNB/LNB トランスポーターおよび GLNBP を除なった．TMC 3108 株についても，PCR 産物の配列決定

いて多くの場合，株依存的である(Garrido et al., 2016;から，これらの遺伝子を有することが分かった．

Matsuki et al., 2016; Odamaki et al., 2015; Ruiz-Moyano et

4 株間の 7 つの酵素のアミノ酸配列の同一性は非常にal., 2013; Thomson et al., 2017; Yamada et al., 2017）．

高く（ 97.3 ～ 100 ％），結晶構造が解明されている酵素（ AfcA，AfcB，LnbB，GNB/LNB トランスポーター基B. bifidum の HMOs 資化様式

質結合タンパク質（ GL-BP ），および GLNBP ）において，
基質認識および触媒作用に関与するアミノ酸残基は完全

B. bifidum における上記 7 遺伝子の役割を検証するために，HMOs 培地中で培養した 4 株の上清中の糖組成おに保存されていた．ゲノム配列が報告されている他の 5

よび濃度変化を分析した（ Fig. 2）．その結果，HMOs のつの B. bifidum 株も，これら酵素セットを 98.1 ％以上の消費様式は 4 つの株で非常に類似していることが明らか同一性で保有していた．唯一の例外は JCM 1255 株のになった．また，その消費様式は我々の以前の報告とも

GL-BP であり，フレームシフト変異が導入されていた．

類似していた(Asakuma et al., 2011）．すなわち，HMOs− 166 −

Bifidobacterium bifidum によるヒト母乳オリゴ糖分解物のクロスフィーディングがビフィズスフローラ形成を促す

Fig. 2. I n vitro HMO consumption behavior of four B. bifidum strains. Each strain was cultured in HMO-supplemented basal medium,and the samples were collected at the indicated time points. The sugars in the culture supernatants were labelled with 2-AA andanalyzed by normal phase HPLC. LNB concentration was not accurately determined due to its heat lability. Concentrations of (a)penta- and hexasaccharides (LNFP I, LNFP II/III, LNDFH I, and LNDFH II), (b) tetrasaccharides (LNT, LNnT, and LDFT), (c)di- and trisaccharides (2′-FL, 3-FL, Lac, and LNB), and (d) monosaccharides (Fuc, Gal, Glc, and GlcNAc) are shown.

− 167 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，栗原

の主成分である LNT および 2'-FL の分解は細胞が対数増

新，片山

高嶺

殖期に入る前に始まり，また，これらの 2 つの基質の大longum 105-A 株および B. bifidum JCM 1254 株の共培養試験を行った．B. longum 105-A（ lnbX 陽性）の野生型

部分は対数増殖期初期でほぼ全て分解され，結果として株（ WT ）は，単独培養では HMOs 培地中での増殖能

LNB および Lac の一時的な増加（それぞれ少なくともは低かったが，B. bifidum と共培養すると増殖が著しく

0.3 mM，1.9 mM ） が 観 察 さ れた． こ の こ と は，LnbB促進された（Fig. 3）．次に，B. bifidum 共存下において B.

と AfcA が速やかに機能していることを示唆している

longum 105-A WT と ΔlnbX 株の増殖競合実験に行ったところ，両者の増殖には差が見られなかった．このことか(Ashida et al., 2009; Katayama et al., 2004; Sakurama etら，lnbX 遺伝子は B. longum が B. bifidum によって産生

al., 2013; Wada et al., 2008）．Gal は LNnT および Lac から BbgIII によって遊離され，増殖期間を通して培地中された HMOs 分解物を利用するのに必要ないことが明で検出された．Glc 濃度は JCM 7004 株を除いて低いまらかとなった．B. longum ΔlnbX 株は単独培養では LNTまであった．JCM 7004 株で Glc 消費能が低いのは，他を資化することができなかったが，B. longum WT（ LnbXの 3 株に比べて増殖能が低かったことと関連していると陽性）との共培養条件下ではよく増殖した(Yamada et

思われる．GlcNAc は検出されなかった．3-FL，LDFT，
LNFP II/III，および LNDFH I/II の α-(1 → 3/4)-フコシ

al., 2017）．このような種間・種内レベルのクロスフィー
ディングは，実際の腸内細菌叢群集内においても起こり

ル結合は AfcB によって加水分解されるが，3-FL および得ることが示唆された．

LNDFH I の分解速度が遅いのは，AfcA と比較して AfcBの触媒活性が低いことに起因すると考えられる

HMOs を添加した糞便懸濁液中における B. bifidum の他(Sakurama et al., 2012）．これらの結果は，培養上清中のビフィズス菌の増殖への影響への HMOs 分解物（ LNB，Lac，Gal，および Fuc ）の

B. bifidum によって産生された HMOs 分解物が，実際の複雑な生態系において他種ビフィズス菌に共有される

放出が，B. bifidum 固有の性質であることを示している．

かどうかを調べるために，1 名の乳児（ C ），2 名の幼児
B. bifidum による B. longum への HMOs 分解物のクロス
フィーディング（ A および B ），および 2 名の大人（ D および E ）から回収した糞便試料を用いて共培養実験を行った．幼児 A，

HMOs 分解物のクロスフィーディングの可能性を調

幼児 B，乳児 C，成人 D，および成人 E の糞便試料中のべるために，B. bifidum の afcA または lnbB 遺伝子を破壊することを試みたが，遺伝子欠損株の取得には至らな

Bifidobacterium 属細菌 16S rRNA 遺伝子の初期（培養 0時間）コピー数は，それぞれ 1.0×108 ，4.7×108 ，3.1×

か っ た． そ こ で，HMOs 添 加 培 地 中 に お い て，B.

104 ，1.1×109 ，および 3.9×109 copies/mL であった．B.

Fig. 3. I nter-species cross-feeding of HMO degradants. The wild-type strain of B. longum 105-A with pBFS38 (CamR) was grown in basal
medium supplemented with 1 ％ HMOs in the absence (left panel) and presence (right panel) of B. bifidum JCM 1254. The
samples were taken at the indicated time points, and CFUs were determined by spreading the cultures on Cam-containing (for B.
longum cells) and not containing (for B. longum + B. bifidum cells) plates. This figure is modified from Figure 4 of Gotoh et al.,(2018). Sci. Rep., 8:13958.

− 168 −

Bifidobacterium bifidum によるヒト母乳オリゴ糖分解物のクロスフィーディングがビフィズスフローラ形成を促す

bifidum の 16S rRNA 遺伝子のコピー数については，成人 D を除いて検出限界未満（ < 4.0×104 copies/mL ）でび 9.3 倍増加したが，他の試料や他の添加条件では変化しないかむしろ減少した．

あった．糞便懸濁液を 4 種の B. bifidum の存在下または添加した B. bifidum 自身は，使用した炭素源（ HMOs

非存在下で，1 ％ HMO を添加した培地中で 24 時間培養

または Glc ）にかかわらずよく増殖していた．糞便試料した後，16S rRNA 遺伝子数を測定した（ Fig. 4）．そのを HMOs 培地で培養した場合の最終 pH は中性（ 6.4 ～結果，B. bifidum の添加は，成人 E および TMC 3115 株

7.7 ）であったが，Glc の場合は 5.1 ～ 6.1 に低下した．

を添加した幼児 B の場合を除いて，B. bifidum 以外の他

以上の結果より，B. bifidum によって産生された HMOs

種ビフィズス菌の増殖を促進していた．この増殖促進効

分解物が，B. bifidum 自身だけでなく他種ビフィズス菌

果は，15 例中 10 例で統計的に有意（ p < 0.05，Dunnettにも供給され，それによってビフィズス菌全体の占有率検定）であった．幼児 A の試料において観察された他を上昇させたことが強く示唆された．

種ビフィズス菌増殖促進効果は，B. bifidum を添加しな

考

か っ た コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て，JCM 1254 株，JCM
7004 株，TMC 3108 株，および TMC 3115 株それぞれで察

60，130，290，および 990 倍であった．幼児 B 試料では，

腸内細菌叢の組成は，宿主―細菌間の相互作用だけでJCM 1254 株，JCM 7004 株，および TMC 3108 株それぞなく，細菌―細菌間の相互作用によっても影響を受ける．

れで 2.5，1.6，および 1.7 倍であった．特に，幼児 C 試

腸内における細菌間の競合としては，侵入した病原菌が料の場合は，B. bifidum を添加することにより 1,700 倍

増殖あるいは定着するのを防ぐ効果が良く知られているから 10,000 倍の増加が見られたが，成人 D 由来試料でが(Sekirov et al., 2008），最近の研究ではクロスフィー

は 1.4 倍から 14 倍の増加であった．他種ビフィズス菌

ディングを含む相互作用が明らかにされ始めている．ク

の増殖促進効果は特に幼児 A および乳児 C の試料におロスフィーディングは，双方向と単方向のいずれの形でいて顕著であったが，両試料を B. bifidum 非添加条件でも起こり得るが，双方向クロスフィーディングとしてはイ

24 時間培養した際は B. bifidum の 16S rRNA 遺伝子は検ヌリンを介した Bacteroides ovatus と Bacteroides vulgatus

出されなかった（すなわち，元々に試料に B. bifidum がとの作用(Rakoff-Nahoum et al., 2016)や O -グリカン分含まれていなかった）．一方で，幼児 B，成人 D，成人 E

解 物 と シ ュ ー ド ビ タ ミ ン B12 を 介 し た Akkermansiaの糞便試料では 24 時間培養後に B. bifidum が検出された（それぞれ 1.8×10 ，3.1×10 ，および 1.5×10 copies/mL．
6

97

こ の 結 果 は， 後 者 3 つ の 糞 便 試 料 に は， 元 々 の B.
bifidum が含まれていたことを示している．培養上清を
TLC 分析したところ，幼児 A および乳児 C の試料の B.
bifidum 非添加条件では，2＇-FL，LNFP I，LNDFH I，および長鎖 HMOs のスポットが 24 時間培養後も残っていmuciniphila と Eubacterium hallii と の 作 用 な ど が 報 告
さ れ て い る(Belzer et al., 2017）．A. muciniphila とAnaerostipes caccae 間には単方向クロスフィーディングが見られ，A. muciniphila によって産生された酢酸がAn. caccae の 増 殖 を 促 す(Belzer et al., 2017）． ま た，
Faecalibacterium prausnitii の 増 殖 に 必 要 な 酢 酸 をたが，B. bifidum を添加して培養した場合ほぼ完全に消Bifidobacterium adolescentis が供給する例も知られている(Rios-Covian et al., 2015）．このような細菌間での分解費された．幼児 B 試料では，B. bifidum 非添加条件にお物や代謝物の共有は，腸内細菌叢の多様性を増加させ，

いて LNDFH I に対応するスポットが検出されたが，B.

柔軟で健康な腸環境を形成するために重要であると考え

bifidum 添加により消失した．成人 D および成人 E の培
養上清においては，B. bifidum 非添加および添加いずれられている(Bokulich et al., 2016）．

においても，明らかなスポットは検出されなかった．

フィズス菌による HMOs 資化メカニズムの解明に取り

B. bifidum の添加は，HMOs 消費を促して他種ビフィズス菌の菌数を増加させるのみならず，全菌数中におけ組 ん で き た． そ の 結 果，B. infantis，B. longum，B.

これまでに，我々を含むいくつかの研究グループがビるビフィズス菌占有率も同様に上昇させていたことは特breve，および B. bifidum に代表される乳児型ビフィズ
ス菌が HMOs 資化能を有することが明らかとなった．

筆に値する(Fig. 4）．

興味深いことに，4 種は近縁種であるにもかかわらず，

同 様 の 培 養 を Glc 含 有 培 地 で 行 っ た と こ ろ，B.

HMOs を分解するために異なる戦略（ B. bifidum およびbifidum 添加による他種ビフィズス菌の増殖促進効果は全くと言って良いほど見られなかった．すなわち，B.

LnbX 陽性 B. longum は細胞外グリコシダーゼ依存的，B.
breve，B. infantis，および LnbX 陰性 B. longum はトランスポーター依存的）をとっており，HMOs 消費様式

bifidum JCM 1254 株および TMC 3108 株をそれぞれ幼児
A および乳児 C 由来の試料に添加した場合にのみ，他種も異なっている．LoCascio et al.（2010)は，B. infantis

ビフィズス菌の 16S rRNA 遺伝子コピー数が 5.6 倍およが ABC トランスポーターと細胞内エキソグリコシダー− 169 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，栗原

新，片山

高嶺

Fig. 4. E xogenous addition of B. bifidum to fecal suspensions increases the relative abundance of Bifidobacterium (species other than B.
bifidum) in the culture supplemented with HMOs. Stool suspensions from two children (Child A and B), one infant (Infant C),
and two adults (Adult D and E) were cultured in basal medium containing 1 ％ HMOs with and without the addition of four B.
bifidum strains for 24 h. The abundance of 16S rRNA gene attributable to Bifidobacterium species other than B. bifidum were
determined by qPCR at 0 h (white bars) and 24 h (striped bars: without the addition of B. bifidum, and grey bars: with the additionof B. bifidum) post-inoculation. The data are means±SD of three independents assays. Dunnett＇s test was used to examine thestatistical significance. Relative abundance (％) of Bifidobacterium sp. other than B. bifidum in total bacterial cells is also shown.
This figure is modified from Figure 5 of Gotoh et al., (2018). Sci. Rep., 8:13958.

− 170 −

Bifidobacterium bifidum によるヒト母乳オリゴ糖分解物のクロスフィーディングがビフィズスフローラ形成を促す

ゼをコードする 40 kb の遺伝子クラスターを獲得したこ

加条件では消費されずに残っていた HMO 分子種が消失とで，ほとんどの HMOs 分子を消費可能となったと報していた．B. bifidum による他種ビフィズス菌の増殖促告している．B. bifidum も HMOs 資化能が高く，本研究

進効果は，HMOs 培地においては見られたが，Glc 培地

ではこの表現型が B. bifidum おいて高度に保存されたで は ほ と ん ど 観 察 さ れ な か っ た． 興 味 深 い こ と に，

HMOs 分解酵素に起因していることを明らかとした．B.

HMOs 培地中で 24 時間培養した後の試料 B，D，およinfantis お よ び B. bifidum と は 対 照 的 に，B. breve と B.

び E においては，B. bifidum 非添加条件であっても B.

longum は限られた HMOs 分子種のみしか資化できない．
すなわちこれら 2 種は，LNT を資化することができるが，bifidum が検出され，一方試料 A と C では検出されなかった．B. bifidum による他種ビフィズス菌の増殖促進効果

他の HMO 分子種の資化能は極めて限定的であることがが，試料 B，D，および E よりも試料 A および C におい

知られている(Ruiz-Moyano et al., 2013; Thomson et al.,て顕著であったことを考慮すると，元々の糞便中に B.

2017）．B. breve 株 に お い て は LNnT，2'-FL， お よ び /
ま た は 3-FL を 分 解 す る こ と が で き る 株(James et al.,bifidum が存在していた B，D，および E では，培養時に外部から添加した B. bifidum の効果が表れにくかった

2016; Matsuki et al., 2016），B. longum 株では LNT に加と推察される．帝王切開分娩で生まれた離乳前乳児であえて 2'-FL および LNFP I を利用することができる株がる乳児 C では，B. bifidum を添加した HMOs 培地での培いくつか報告されているが，このような例は極めてまれ

養によって，ビフィズス菌数と占有率が大幅に増加したである（ Garrido et al., 2016; Thomson et al., 2017）．つ

ことも注目すべき点である．

ま り， 種 レ ベ ル で み る と B. breve お よ び B. longum のHMOs 分解物のクロスフィーディングにおける α -フHMOs 資化能は，B. infantis および B. bifidum と比較しコシダーゼ阻害剤 DFJ(Sakurama et al., 2012)の影響をてかなり限定的である．それにもかかわらず，乳児の腸

幼児 A の試料を使用して調べたところ，DFJ 添加によっ

内細菌叢内では，B. breve や B. longum が優占種であるて B. bifidum による他種ビフィズス菌の増殖促進効果が場合が多い(Matsuki et al., 2016）．つまり，母乳栄養児消失した．また，その際の培養上清には，2'-FL，LNFPの腸におけるビフィズスフローラ形成は，種や株ごとのI，および LNDFH I が消費されずに残っていた．この結

HMOs 資化能によってのみ単純に説明することは出来

果は，フコシル化 HMOs の分解が DFJ によって阻害さない．

れたために引き起こされたと考えられる．したがって，B.

上述した通り，以前の研究において我々は B. bifidum
JCM 1254 株が HMOs 分解物の一部を消費しないまま培

bifidum の細胞外グリコシダーゼによる HMOs 分解は，
少なくとも他種ビフィズス菌への単方向クロスフィー

地中に残したままにすることを明らかとした．一方，ディングに関与していると結論付けて間違いではないと

Tannock らは，母乳栄養児の糞便における B. bifidum の思われる．もちろん，B. bifidum による未知の代謝産物

存在とビフィズスフローラ形成率の間に正の相関があるが関与している可能性を排除することはできないが，本ことを報告している(Tannock et al., 2013）．これらの知研究の結果は，母乳栄養児の腸内におけるビフィズスフ

見は，B. bifidum による他種ビフィズス菌への HMOs 分

ロ ー ラ 形 成 に は，B. bifidum（ お そ ら く LnbX 陽 性 B.

解物のクロスフィーディングの可能性を示唆していた．
我々は本研究において，4 株の B. bifidum すべてが培

longum も）による HMOs 分解物を介した他種ビフィズ
ス菌の増殖促進効果が大きく関与していると推察され養中に HMOs 分解物を残したままにすることをまず示る．B. bifidum の利他的な性質は，成人の腸においてもし，次にビフィズス菌の種間および種内において HMOs

機能している可能性がある．Egan らは B. bifidum によ

分解物のクロスフィーディングが起こっていることを明るムチン糖鎖分解物が B. breve にクロスフィーディング

らかとした．すなわち，B. longum は B. bifidum と共培されている可能性を報告している(Egan, et al., 2014a;

養した場合にのみ HMOs 培地中で高い増殖能を示した．

Egan, et al., 2014b）．ムチンは，ヒトの大腸において高また，ラクト- N -ビオシダーゼ遺伝子を欠損させた B.

発現している糖タンパク質であり，B. bifidum はその糖

longum ΔlnbX 株は LNT を資化できなかったが，WT 株と共培養した場合は，LNT 培地中で良好に増殖した．

鎖を分解する分泌型グリコシダーゼを有している(Gotoh et al., 2015; Katayama 2016; Katoh et al., 2017）．

これらの結果を基として，より複雑な生態系，すなわち興味深いことに，ムチン糖鎖と HMOs 分子のグリコシ

糞便試料を用いた実験を行った．その結果，B. bifidum

ド結合は類似しており，本研究で紹介した HMOs 分解

を HMOs を含む糞便懸濁液に加えると，他種ビフィズに関わる多くのグリコシダーゼがムチン分解にも利用さ

ス菌の生育が促進されることが明らかとなった（成人 E

れている(Katayama 2016）．

試料を除く）．また，幼児 A，幼児 B，および乳児 C 由

以上をまとめると，本研究においては，B. bifidum に来試料を B. bifidum と共培養した場合，B. bifidum 非添

よる HMO 分解様式が種内で良く保存されていることを− 171 −

後藤

愛那，阪中

幹祥，栗原

明らかにすると共に，生じた HMOs 分解物が他種ビフィ
は，乳児用調製乳を含むプレバイオティクスやプロバイ
オティクスの発展，および乳児腸管におけるビフィズス
フローラ形成を促す介入試験を考える上で重要な知見を謝提供するものである．

約

高嶺

J., Kitaoka, M., Okuda, S. & Katayama, T. 2018. Sharing of
human milk oligosaccharides degradants within bifidobacterial communities in faecal cultures supplemented with
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ズス菌の増殖を促進することを見出した．これらの成果

要

新，片山

辞

本研究は，財団法人発酵研究所寄付講座助成および学術振興会特別研究員奨励費からの助成金を受けて遂行さ

母乳栄養児の腸管においては一般にビフィズスフロー

れました．

ラが形成される．近年の研究によって，乳児型ビフィズ

母乳と糞便試料の採取にご協力頂いた長尾助産院（京ス菌がヒト母乳オリゴ糖（ HMOs ）の特異的資化経路

都）の長尾早枝子先生，B. longum 105-A 株を提供してを有することが明らかとなったが，ビフィズスフローラ

頂いた加納康正博士，LNT を提供して頂いた Glycomがどのように形成されているかについては解明されていA/S 社，TMC 3115 株について議論して頂いた遠藤明仁

ない．興味深いことに，各ビフィズス菌種の HMOs 資博士に感謝申し上げます．

化能は，実際の腸内における優占性と相関していない．

参考文献

すなわち，B. longum と B. breve は乳児腸内の優占種であるが，in vitro 培養における HMOs 資化能は高くない．
一方で，in vitro 培養において HMOs 資化能が高い B.
bifidum および B. infantis は，実際の乳児腸管内では占有 率 が 低 い． こ の よ う な 背 景 か ら， 本 研 究 で は B.
bifidum の利他的性質について検討を加えた．まず，B.
bifidum JCM 7004 株および TMC 3115 株の全ゲノム配列を決定すると共に，B. bifidum 種内において HMOs 資化に必要な遺伝子セットが高度に保存されていること，また，B. bifidum が HMOs を炭素源として増殖中にその分解物を培地中に残したままにする性質を共通して有することを見出した．次に，HMOs を添加した糞便懸濁液を B. bifidum の存在下で培養することで他種ビフィズス菌の増殖が促進され，それによりビフィズス菌全体の占有率が上昇することを見出した．同時に，B. bifidum 添加による HMOs 消費の促進も観察された．これらの結果は，乳児腸管内でビフィズスフローラが形成される過程で，B. bifidum による HMOs 分解物を介したクロス
フィーディングが起こっていることを強く示唆している．

本助成で得られた研究成果の報告
1) 後藤愛那，山田千早，苫米地祐輔，廣瀬潤子，朝隈貞樹，浦島匡，北岡本光，栗原新，山本憲二，原田岳，何方，加藤紀彦，片山高嶺．Bifidobacterium bifidum 菌株間におけるヒトミルクオリゴ糖資化様式および関連酵素の保存性．2017．日本農芸化学会2017年度大会．3月．京都．
原著論文1) Gotoh, A., Katoh, T., Sakanaka, M., Ling, Y., Yamada, C.,
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175-187, 2019

ビフィズス菌のフコシルラクトーストランスポーターに見られる適応進化が母乳栄養児腸管でのビフィズスフローラ形成に関与する
阪中

幹祥，栗原

新，片山

高嶺

石川県立大学生物資源環境学部寄付講座腸内細菌共生機構学〒921-8836

石川県野々市市末松1-308

Evolutionary traits found in fucosyllactose transporters support symbiosis
between bifidobacteria and breast-fed infants
Mikiyasu Sakanaka, Shin Kurihara, Takane Katayama
Host-Microbe Interaction Research Laboratory
Faculty of Bioresources and Environmental Sciences
Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan
Recent studies indicate that the human gut microbiota established during infancy has persistent effects on healthin later life. Breast-feeding promotes the formation of a bifidobacteria-rich microbiota (bifidus flora) in infant guts,
which has been attributed to the ability of infant gut-associated bifidobacteria to catabolize human milkoligosaccharides (HMOs) that are non-digestible sugars contained in breast milk. However, the in vivo molecularand physiological basis underlying bifidus flora formation in infant guts remains unclear. Here, we report acomprehensive characterization of two functionally distinct, but overlapping fucosyllactose transporters (FLtransporter-1 and -2) from Bifidobacterium longum subspecies infantis. Faecal DNA and HMO consumption patternanalyses revealed the association of both FL transporters (primarily FL transporter 2) with bifidus flora formation
in infant guts. Structural analyses of the solute-binding protein (SBP) of FL transporter-2 complexed with
2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose as well as phylogenetic analysis of homologous SBPs revealed the molecularbasis of ligand binding, which highlights the expansion of HMO uptake preferences by the gain-of-function
mutations in the SBP as a key adaptation strategy of Bifidobacterium to the infant gut niche. Our results provide amolecular insight into the HMOs-mediated symbiosis and co-evolution between bifidobacteria and humans.
Key words: ATP-binding cassette transporter, bifidus flora, ecological niche adaptation, human milkoligosaccharides, oligosaccharide uptake

E-mail:阪中幹祥（ miksak@dtu.dk ）（ 現 所 属 : National Food Institute,
Technical University of Denmark, Kemitorvet, DK2800 Kgs. Lyngby, Denmark ），栗原 新（ skurihara@waka.kindai.ac.jp ）（現所属 : 近畿大学生
物理工学部 〒 649-6433 和歌山県紀の川市）
片山高嶺（ katayama.takane.6s@kyoto-u.ac.jp ）（現所属 : 京都大学大学院生命科学研究科 〒 606-8502 京都市左京区
北白川追分町）共同研究者:Mor ten Ejby Hansen（ Depar tment of Biotechnology andBioengineering, Technical University of Denmark ）後藤愛那（京都大学大学院生命科学研究科）
加藤紀彦（京都大学大学院生命科学研究科）

吉田圭佑（森永乳業株式会社基礎研究所）
小田巻俊孝（森永乳業株式会社基礎研究所）
杉山友太（京都大学農学研究科）
廣瀬潤子（滋賀県立大学人間文化学部）
浦島 匡（帯広畜産大学畜産学部）
清水（肖）金忠（森永乳業株式会社基礎研究所）
北岡本光（農研機構食品研究部門）
吹谷 智（北海道大学大学院農学研究院）
横田 篤（北海道大学大学院農学研究院）
Leila Lo Leggio（ Depar tment of Chemistr y, University of
Copenhagen ）Maher Abou Hachem（ Depar tment of Biotechnology andBioengineering, Technical University of Denmark ）− 175 −

阪中

緒

幹祥，栗原

言

新，片山

高嶺

トース（ FL ）トランスポーターを包括的に解析すると共に，それらが母乳栄養児腸内での HMOs の利用およ

母乳栄養児の腸内では，ビフィズス菌優勢な細菌叢（ビびビフィズスフローラ形成にどのように関わっているの

フィズスフローラ）が形成される．これは，ビフィズス

かを明らかにした．また，2 つのトランスポーターの菌 が 母 乳 に 含 ま れ る オ リ ゴ 糖[ HMOs（ human milk

SBP による 2'-FL および 3-FL の結合様式を構造学的に

oligosaccharides ）]を他の腸内細菌と比較して効率よく明らかにした．これらの結果を基に，ビフィズス菌が資 化 で き る か ら と 考 え ら れ て い る（ Katayama, 2016;

FL トランスポーターを適応進化させることで乳児とのThomson et al., 2018）．HMOs は母乳中の固形成分の中共生を成立させてきたことについて議論する．

で ラ ク ト ー ス（ Lac）， 脂 質 に 次 い で 三 番 目 に 多 く

実験方法（ 10 - 20 g/L），2' -フコシルラクトース（ 2'-FL ）および
3 -フコシルラクトース（ 3-FL ）に代表されるようなフコシル化オリゴ糖を豊富に含んでいる（ Fig. 1C 参照）

使用菌株と培養条件（ Kunz et al., 2000; Urashima et al., 2012）．
これまで，Bifidobacterium longum subsp. longum（ B.

B. longum 105-A（ = JCM 31944 ）は京都薬科大学の加納 康 正 元 教 授 よ り 分 譲 頂 い た．B. infantis JCM 1222T

longum ），Bifidobacterium longum subsp. infantis（ B.

（ = ATCC 15697T ）および Bifidobacterium kashiwanohense

infantis ），Bifidobacterium breve お よ び Bifidobacterium

JCM 15439T は理研バイオリソースセンターより入手しbifidum に代表される乳児型ビフィズス菌の HMO 分解酵素がよく研究されてきた(Katayama, 2016; Thomson etた．B. infantis JCM 1222T の遺伝子番号は GenBank アクal., 2018）．B. bifidum および B. longum のいくつかの株
は，細胞表層に提示された糖質分解酵素を利用して細胞ズス菌の培養は，GAM 培地（Nissui ）もしくは 0.34 ％(w/

外で HMOs を分解して利用すると共に，他のビフィズ

ン塩酸塩および 2 ％(w/v ）グルコース（ Glc ）を添加しセッション番号 CP001095.1 に基づいて記載した．ビフィv ）アスコルビン酸ナトリウム，0.2 ％(w/v ）システイ

ス菌種にクロスフィードしている(Gotoh et al., 2018）．

た MRS 培地（ Becton Dickinson; MRS-CS 培地）を用い

一方で，他のビフィズス菌は HMOs を直接に細胞内にて行った．糖資化性試験では，0.5 ％(w/v ）の糖を唯一取込み，その後，細胞内でそれらを分解する(Katayama,の炭素源として MRS-CS 培地に添加した．培養は嫌気

2016; Thomson et al., 2018）．いずれの場合においても，

チャンバー内で 37 ℃で行った．

HMOs または HMO 分解産物を取込むことはビフィズス

通常の遺伝子組換え操作には大腸菌 DH5α 株を用い菌の乳児腸内での増殖に重要であると考えられるが，ビた．必要に応じてクロラムフェニコール（ Cm; ビフィ

フィズス菌の HMO 取込み機構に関する報告は現在のとズス菌は 2.5 μg/mL，大腸菌は 10 μg/mL），スペクチノ

ころ非常に限られている(Suzuki et al., 2008; Garrido et

マ イ シ ン（ Sp; B. longum は 30 μg/mL，B. infantis はal., 2016; James et al., 2016; Matsuki et al., 2016; Zúñiga et

10 μg/mL，大腸菌は 75 μg/mL），カナマイシン（ 50 μg/al., 2018）．当該研究分野の草分け的存在である David
Mills らの研究グループは，ゲノム解析および ABC トラ

mL ）を添加した．特に記載がない限り，菌の増殖はン ス ポ ー タ ー の 基 質 結 合 タ ン パ ク 質（ SBP: solutebinding protein ）の糖鎖アレイ解析によって，ATP 結合

OD600 で測定した．
HMOトランスポーター解析用のビフィズス菌宿主の構築

カ セ ッ ト（ ABC ） ト ラ ン ス ポ ー タ ー が B. infantis のHMO トランスポーターの生理的な基質特異性は，細HMOs の取込みに重要であることを約 10 年前に明らか

胞内 HMO 分解酵素遺伝子（プラスミド pMSK65 ）を保にしている（ Sela et al., 2008; Garrido et al., 2011）．しか持する B. longum 105-A ΔlnbX ΔgltA 株（後述）において，しながら，これらの技術で得られた知見や情報は，個々

トランスポーターを異種発現することによって解析したのトランスポーターの特異性や腸内細菌叢形成における（ Fig. 1A および 1B）．菌株およびプラスミド作製の詳細

生理的役割を理解するのに十分とはいえなかった．または，Sakanaka et al.(2019 ）の Materials and Methods に

最 近，B. longum(Garrido et al., 2016 ） お よ び B. breve

記した通りである．

(Matsuki et al., 2016 ）における 2'-FL や他のフコシル化

B. infantis JCM 1222T 由来のトランスポーター遺伝子
Blon_0341–0343 と Blon_2202–2204 な ら び に B. kashi-

HMOs を取込むトランスポーターがゲノム解析を中心とした解析により同定されているものの，やはり基質特
異性や in vivo での生理的役割はまだ不明な部分が多く

wanohense JCM 15439T 由来のトランスポーター遺伝子
BBKW_1838-1840 は PCR 増幅した後，xfp プロモーター

残されていた．

下流に位置するように pJW241(Yamamoto et al., 2010 ）本研究では，B. infantis 由来の二種類のフコシルラクの NdeI 部 位 に 挿 入 し た． 構 築 し た プ ラ ス ミ ド を，

− 176 −

ビフィズス菌のフコシルラクトーストランスポーターに見られる適応進化が母乳栄養児腸管でのビフィズスフローラ形成に関与する

pMSK65 を保持する B. longum 105-A ΔlnbX ΔgltA に導入

Blon_2202 の結晶化と構造決定し た．PCR に 使 用 し た プ ラ イ マ ー は，Sakanaka et al.

野生型もしくはセレノメチオニン（ SeMet ）置換型

(2019 ）の Materials and Methods に記した通りである．

Blon_2202 の 結 晶 化 は 10 mM 2'-FL ま た は 3-FL の 存 在
下，蒸気拡散法で行った．リザーバーには，100 mM

組換えタンパク質の発現と精製

MES（ pH 6.5），25 ％ PEG-500MME ， お よ び 10 mM

B. infantis JCM 1222 由 来 の SBP（ Blon_343 お よ び
Blon_2202 ）は，ヒスチジン（ His ）タグを付加もしく

ZnSO4 を用いた．SeMet 置換体については 2.1 Å，2'-FLは 付 加 せ ず 発 現 さ せ た． 付 加 し て い な い 場 合 は，分解能で回折データを収集した．セレンによる異常散乱T

複合体については 1.3 Å，3-FL 複合体については 1.4 Å の

Blon_0343（アミノ酸残基 32–469 ）および Blon_2202（ア（ SAD ） を 用 い て 位 相 決 定 を 行 い， 得 ら れ た 構 造 を

ミノ酸残基 26–460 ）に対応する遺伝子を Sakanaka et

2'-FL および 3-FL 複合体構造を決定する際の分子置換モal.(2019） の Supplementary Table S3 に 記 載 の プ ラ イ
マ ー を 用 い て PCR 増 幅 し，pCDF23(Nakagawa et al.,デ ル と し て 使 用 し た．Phenix.AutoSol（ McCoy et al.,2016 ）の NdeI および XhoI の部位に挿入した．構築し2004），Coot（ Emsley & Cowtan, 2004 ）および phenix.

たプラスミドを，pRARE2 を保持する大腸菌 BL21（DE3 ）refine（ Afonine et al., 2012 ）を使用して精密化した後，

ΔlacZ 株(Sakurama et al., 2013 ）に導入し，終濃度 0.1 mM
イソプロピル β - D - チオガラクトピラノシド（ IPTG ）の

MolProbity（ Adams et al., 2010 ）を使って妥当性を確認存在下で 18 ℃で一晩培養した．菌体を超音波処理によって破砕し，終濃度 80 ％となるよう硫酸アンモニウムを

al.(2019 ）の Supplementary Table S1 に記した通りである． 図 の 表 記 に は PyMOL Molecular Graphics System

添 加 し た． 上 清 画 分 を Mono Q 5/50 GL（ GE

v1.7.2.2（ Schrodinger ）を使用した．

2007; Adams et al., 2010），Phenix.AutoBuild（ Terwilliger,

した．データ回収・解析の詳細については Sakanaka et

Healthcare）および Superdex 200 increase 10/300 GL（ GE
Healthcare ）でさらに精製し，等温滴定型熱量測定（ITC ）Blon_0343 および Blon_2202 ホモログの保存性および系

に供した．

統学的解析

His タ グ を 付 加 し た Blon_0343（ ア ミ ノ 酸 残 基

Blon_0343 お よ び Blon_2202 ホ モ ロ グ の 保 存 性 は，

29 – 469 ）および Blon_2202（アミノ酸残基 24 – 460 ）のNCBI ゲノムデータベースに対する BlastP 解析によってタンパク質をコードする遺伝子は Sakanaka et al.(2019 ）B. longum SC596 のゲノム配列(Garrido
調べた．その際，の Supplementary Table S3 に記載のプライマーを用いてPCR 増幅し，pETM11 の NcoI および EcoRI 部位に挿入

et al., 2016 ）も解析に含めた．系統学的解析には，アミノ酸配列が 60 ％以上一致する配列を用いた（ Blon_0343

した．構築したプラスミドは大腸菌 BL21（ DE3 ）に導と Blon_2202 が 60 ％一致であるため）．18 種類の異なる

入し，同様に誘導発現させた．細胞破砕液を HisTrap HP

配 列 を MAFFT（ https://mafft.cbrc.jp/alignment/soft-

カラム（ GE Healthcare ）に供した後，HiLoad Superdex

ware/ ）にてアラインメントし，近隣結合法により系統

G75 26/60（ GE Healthcare ）によってさらに精製した．

樹 を 作 成 し た． ま た， ア ミ ノ 酸 残 基 の 保 存 性 は，His タグは TEV プロテアーゼを用いて除去し，得られた

WebLogo（ https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi ） をタンパク質を結晶化に用いた．タンパク質濃度は 280 nm

使用して解析した．

での吸光度を測定することにより決定した（ Blon_0343
は 77,810 M−1cm−1 ，Blon_2202 は 81,820 M−1cm−1）．

ヒト試料の収集

ITC 分析

月齢，平均 2.9±1.2 月齢）は長尾助産医院（京都府）に36 名の母乳栄養児糞便（男児 18 名，女児 18 名，1.4 – 5.7
Blon_0343 および Blon_2202 の糖リガンドに対する結て回収した．また，母乳は，乳児糞便を収集した日に合 は，ITC（ MicroCal iTC200; GE Healthcare ） に よ っ

32 名の母親から提供して頂いた．成人サンプルは，31て熱力学的に解析した．タンパク質を 10 mM リン酸ナ

名（男性 16 名，女性 15 名，21–75 歳，平均 42.3 ± 16.8 歳）

トリウム緩衝液（ pH 6.5 ）で透析し，リガンドを同じ透を石川県立大学（石川県）にて回収した．これらのサン析 緩 衝 液 に 溶 解 し た．204 μL の 反 応 セ ル 中 で，

プルは盲検下で解析に使用した．

45 – 250 μM のタンパク質を 25 ℃，750 rpm で攪拌した．
リガンド（2 – 10 mM ）の滴定は 180 秒の間隔で 20 回行っ

HMO 分析
母乳，乳児糞便および培養上清中の糖は，既報に従った．データを希釈熱で補正した後，One-Set-of-Sites 結合
モデルによりフィッティングを行った．

て高速液体クロマトグラフィー（ HPLC ）で解析した（ Gotoh et al., 2018）．内部標準物質はマルトヘプタオー− 177 −

阪中

幹祥，栗原

ス（母乳および培養上清）またはメリビオース（乳児糞

新，片山

高嶺

0343 と Blon_2202–2204 の評価便）を用いた．

HMO 取込み系を欠損させると同時に細胞内 HMO 分
解 酵 素 を 発 現 さ せ た 株 B. longum 105-A ΔlnbX ΔgltA/

糞便 DNA 中の 16S rRNA 遺伝子および FL トランスポー

pMSK65（ HMO 分解酵素遺伝子+）を作出した（ Fig. 1Aター遺伝子の定量

お よ び 1B; 以 後， 本 宿 主 株 を MS554 株 と 表 記 す る）．

糞 便 DNA は 既 報 に 従 っ て 抽 出 し た（ Yamada et al.,MS554 株は，HMOs を炭素源として利用することがで

2017）．Blon_0343 遺伝子，Blon_2202 遺伝子，全バクテ

きなかったが，この菌株に B. infantis JCM 1222T 由来のリアおよび Bifidobacterium 属細菌の 16S rRNA 遺伝子の2 つの ABC トランスポーターパラログ Blon_0341–0343

コピー数決定には，定量 PCR（ TB グリーンプレミック

および Blon_2202–2204（ SBP のアミノ酸配列の一致度

ス Ex Taq II; TaKaRa Bio ） を 用 い た． 存 在 率( ％)は，は 60 ％）（Garrido et al., 2011 ）を異種発現させたところ，

FL トランスポーター遺伝子または Bifidobacterium 属細精製 HMO 混合物存在下において非発現株よりも生育能菌の 16S rRNA 遺伝子のコピー数を全バクテリアの 16Sが上昇した（データ未掲載）．Lac 存在下では発現株とrRNA 遺伝子コピー数で割ることで算出した．定量 PCR

非発現株との間に差は見られなかった．HMO 混合物存で 使 用 し た プ ラ イ マ ー は Sakanaka et al.(2019）の在下で培養した際の上清を HPLC 分析に供したところ，

Supplementary Table S3 に記した通りである．検量線は，いずれのトランスポーター発現株も 2'-FL と 3-FL を速B. infantis JCM 1222 ま た は B. kashiwanohense JCM
15439T のゲノム DNA を鋳型として作成した．

やかに消費することが明らかとなった（ Fig. 1C）．さらTに，Blon_2202–2204 発現株は，培養の後期においてラクトジフコテトラオース（ LDFT ）およびラクト- N -フメタゲノムデータセット解析

コペンタオース（ LNFP ）I も利用することが示された．

糞便 DNA メタゲノムデータ（アクセッション番号

他の HMO 分子種 [LNT，ラクト- N -ネオテトラオース

qiime:621 ）は，MG-RAST v4.0.3（ http://metagenomics.

（ LNnT），LNFP II/ III およびラクト- N -ジフルコヘキサ

anl.gov/ ）から取得した(Yatsunenko et al., 2012）．Perl

オース（ LNDFH ）I/II] の濃度は株間で差がなかったおよび Python スクリプトおよび公的に入手可能なソフ（ Fig. 1C およびデータ未掲載）．以上より，Blon_0341–

トウェアを用いてクオリティチェック後(Li & Durbin,0343 と Blon_2202–2204 は，基質特異性が僅かに異なる

2009; Niu et al., 2010），132,556±76,952 リード / サンプ

FL トランスポーターであることが明らかとなった．以ル（平均 ± SD; 計 83 名）のシークエンスデータを得て，後，Blon_0341–0343 を FL トランスポーター 1（ SBP は

Blon_0343 および Blon_2202 ホモログにマッピングした．

FL1-BP），Blon_2202–2204 を FL トランスポーター 2（ SBP

各遺伝子の相対量(％)は，当該遺伝子にマッピングさは FL2-BP ）と表記する．

れ た リ ー ド 数 を 全 リ ー ド 数 で 割 る こ と で 算 出 し た．
Bifidobacterium 属細菌の存在率(％)は，上述のアクセッ
ション番号から取得した．解析したデータセットは，米B. infantis JCM 1222T の生育における FL トランスポー
ター 1 および 2 の重要性

国（n = 50），マラウイ（n = 18 ）およびベネズエラ（n = 15 ）

次に，2 つのトランスポーターの片方または両方を欠に居住する 83 名から構成されており，母乳栄養児（ 1

損させた B. infantis JCM 1222T 株を作製した．FL トラ歳以下）が 34 名，人工乳栄養児（ 1 歳以下）が 27 名でンスポーター 1（ ΔBlon_0341–0343 ）または FL トラン

あり，成人は（ 18 歳以上）は 22 名であった．

スポーター 2（ ΔBlon_2202–2204 ）の単独マーカーレス
欠損株は得られたが，二重マーカーレス欠損株は得られ倫理的配慮なかった．そこで代わりに，FL トランスポーター 1 欠

本研究は，京都大学（ R0046），滋賀県立大学（ 71-3），

損株（ ΔBlon_0341–0343 ）の FL2-BP 遺伝子に挿入変異

石川県立大学（ 2016-2 ）の倫理委員会の審査・承認を（ Blon_2202::pMSK101 ）を導入することで二重欠損株を受け，ヘルシンキ宣言に基づいて実施した．乳児糞便は取得した．結果として，4 種の遺伝子欠損株，すなわち母親の同意を得て，それ以外は全ての被験者からインΔBlon_0341–0343（ ΔFL1 株），ΔBlon_2202–2204（ ΔFL2株），Blon_2202::pMSK101（ FL2-BPINS 株）および ΔBlon_

フォームド・コンセントを得た上で解析に使用した．

結0341–0343 Blon_2202::pMSK101（ ΔFL1 FL2-BPINS ， 二

果重欠損株）を以降の実験に用いた．
これらの菌株はガラクトース（ Gal ）の存在下では生育に差が見られなかった．2'-FL または 3-FL 存在下ではHMO トランスポーター評価系の構築および Blon_0341–

FL ト ラ ン ス ポ ー タ ー 2 単 独 欠 損 株（ ΔFL2 株 お よ び− 178 −

ビフィズス菌のフコシルラクトーストランスポーターに見られる適応進化が母乳栄養児腸管でのビフィズスフローラ形成に関与するFig. 1. A platform for evaluating in vivo substrate specificity of HMO transporters. Specificity of the two candidate HMO transporters from B. infantis was analysed by their heterologous expression in the pMSK65-harboring B. longum 105-A ΔlnbX ΔgltA,
the strain expressing intracellular HMO-degrading enzymes but deficient in growth on purified HMO mixture. (A) The E. coli–
Bifidobacterium shuttle vector pMSK65 carrying the genes encoding intracellular HMO-degrading exo-glycosidases from B.
infantis. (B) B. longum 105-A ΔlnbX ΔgltA strain with pMSK65 as a host for evaluating in vivo specificity of HMO transporters.
The candidate gene cluster is introduced into the host using a compatible plasmid. (C) Changes in the concentration of each
HMO in culture supernatant during growth on 0.5 ％ (w/v) purified HMO mixture. The strains carrying the following plasmids
were used for the analysis: an empty vector (open diamonds); the plasmid expressing FL transporter-1 (locus tags Blon_0341−
0343, gray diamonds); and the plasmid expressing FL transporter-2 (locus tags Blon_2202–2204, black diamonds). Experiments
were technical triplicates, and data are the means±SD. Reproduced with modifications from Sakanaka et al. (Sci. Adv. (2019)5:eaaw7696) [© 2019 American Association for the Advancement of Science (Licensed under CC BY-NC; https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/)].

FL2-BPINS 株）の増殖は野生型株とほぼ同様であったの

株 以 外 は ど の 株 も 生 育 に 差 が 見 ら れ な か っ た．

に対し，FL トランスポーター 1 単独欠損株（ ΔFL1 ）で

FL2-BPINS 株および ΔFL1 FL2-BPINS 株の生育が LNFP I

は生育に遅延が見られ，二重欠損株（ ΔFL1 FL2-BPINS ）存在下で見られたのは予想外であったが，この株ではでは大幅な生育能の低下が観察された（データ未掲載）．

FL トランスポーター 2 の膜貫通ドメイン遺伝子がゲノ

LDFT 存在下では野生型株と FL トランスポーター 1 単

ム上に残っているため，別の SBP が FL2-BP の代わりに独欠損株（ΔFL1 ）の間で生育に大きな差は見られなかっ

LNFP I 取込みに関与した可能性が考えられた．いずれ

たが，FL トランスポーター 2 単独欠損株（ ΔFL2 またはにせよ FL トランスポーター 2 が B. infantis の LNFP I の）はほとん

利用に重要な役割を果たしていることは間違いなさそう

ど生育できなくなっていた．LNFP I 存在下では，ΔFL2である．以上より，B. infantis において FL トランスポー

FL2-BP

INS）と二重欠損株（ ΔFL1 FL2-BP

INS− 179 −

阪中

幹祥，栗原

新，片山

高嶺

ター 1 は 2′-FL と 3-FL の取込みに，FL トランスポーターかとなった．他の糖を滴加した際には熱量変化は見られ

2 はそれらに加えて LDFT と LNFP I の取込みに寄与すなかった（データ未掲載）．

るトランスポーターであることが明らかとなった（デーFL2-BP の構造解析

タ未掲載）．
精 製 HMO 混 合 物 は FL ト ラ ン ス ポ ー タ ー の 基 質

X 線結晶構造解析の結果，FL2-BP は SCOP データベー（ 2'-FL，3-FL，LDFT および LNFP I ）を約 50 ％程度のス（ Andreeva et al., 2004 ）上のクラスター B に分類さ濃度で含んでいるが，B. infantis 野生型株と 4 種の欠損れる典型的な SBP 構造を有していることが分かった．

株を HMO 混合物を炭素源として培養した場合には生育

すなわち，サイズが異なる二つのドメインがリガンド結の差は見られなかった（データ未掲載）．しかしながら，合サイトを構成するヒンジ領域で繋がっていた（データ

野生型株と二重欠損株（ ΔFL1 FL2-BPINS ）間で競合培

未掲載）．2'-FL および 3-FL との FL2-BP 複合体の結合養を行ったところ，2'-FL または精製 HMO 混合物存在

サイトを比較したところ，Fuc-[Gal/Glc]（ Fuc: フコース ;下において野生型株は二重欠損株よりもそれぞれ 1000

Glc: グルコース）で形成される 2 糖構造モチーフを厳密倍および 100 倍程度優勢に生育した（それぞれ p = 8.14×に認識していることが明らかとなり，FL2-BP が 2'-FL

および 3.30×10 ，スチューデントの t 検定）（デーおよび 3-FL に対して同等の親和性（ Table 1 ）を有する

タ未掲載）．ガラクトオリゴ糖（ GOS ）存在下で競合培構造基盤であることが明らかとなった(Fig. 2A）．すな

-10

10

-6

養を行った場合には，両株の間には差が見られなかった

わ ち，Fuc 部 分 と Fuc に 連 結 し た 糖 部 分（ 2'-FL で は（ p = 0.18）．以上の結果から，FL トランスポーター 1 おGal，3-FL では Glc ）は，どちらの複合体でも同じ箇所

よび 2 は，B. infantis が HMOs 豊富な環境で優勢になるに位置していた（ Fig. 2A および 2B）．2'-FL の還元末端
Glc と 3-FL の非還元末端 Gal を認識する部位は結合サイための重要な因子であることが示された．

トの溶媒側に位置しており，これらの糖は約 50 度傾い
FL1-BP および FL2-BP の糖リガンドへの結合て結合していた．

FL1-BP および FL2-BP の糖リガンドへの結合を ITC

Fuc の 3 つ の OH 基 は，G321，S212，E284，S112，を使用して解析したところ，エンタルピー駆動型である

N114 および K115（本残基は 2'-FL 複合体のみ）との間で，ことが分かった（ Table 1 ）．FL1-BP の 2'-FL に対する

また環内酸素（O5 ）は Y59 の OH 基と水素結合していた．

Kd 値（ ≈ 10 μM ）は，2'-FL および 3-FL に対する FL2-BPの Kd 値（ 5−6 μM ）とほぼ同じであった一方で，LDFT

Y59，F 92 および K115 は疎水環境を形成して Fuc のメ
チ ル 基 を 包 み 込 ん で い た．2'-FL に お け る Gal お よ びに対する FL2-BP の親和性は低かった（ ≈ 200 μM）．すな

3-FL における Glc は，水素結合および W286 によるス

わち，FL1-BP は 2'-FL に特異性が高い一方で FL2-BP はタッキングで認識されており（ Fig. 2A），FL2-BP が両

2'-FL，3-FL そして弱いながらも LDFT にも親和性を有

基質を同程度に認識可能であるのは Q63 側鎖の柔軟性しており，基質特異性が異なる SBP であることが明らによるものであることが示唆された．Fuc-[Gal/Glc] 構

Table 1.

Isothermal titration calorimetr y analysis of the binding of FL1-BP and FL2-BP to mono- and difucosyllactose.a− 180 −

ビフィズス菌のフコシルラクトーストランスポーターに見られる適応進化が母乳栄養児腸管でのビフィズスフローラ形成に関与するFig. 2. Structural basis of the dual recognition of 2′-FL and 3-FL by FL2-BP from B. infantis JCM 1222T (A and B) andconser vation of FL-recognizing residues in the ligand binding site of FL-BPs (C and D) (A) Conformations of 2′-FL and
3-FL in the ligand binding site of FL2-BP. Sugars are depicted by stick models. The sugar rings of Fuc and Gal of 2′-FL and thoseof Fuc and Glc of 3-FL well overlap, while the Glc of 2′-FL and the Gal of 3-FL shifts about 50˚. (B) Structural mimicry between 2′-FL and 3-FL (α-anomer). Axial O4 of Gal moiety of 2′-FL corresponds to α-anomeric oxygen (O1) of 3-FL, when Lac moiety isinverted each other. (C) Conservation of residues interacting with 2′-FL and/or 3-FL visualized by sequence Logos. (D) Phylogenetic tree constructed using the FL-BP homologs that share ≥ 60 ％ identity. The signatures associated with the four identified
clusters show significant changes in distinct binding residues between the homologs of FL1-BP (cluster IV) (gray pentagon) andFL2-BP (cluster I−III) (black pentagon). Reproduced with modifications from Sakanaka et al. (Sci. Adv. (2019) 5:eaaw7696) [©
2019 American Association for the Advancement of Science (Licensed under CC BY-NC; https://creativecommons.org/
licenses/by-nc/4.0/)].

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阪中

幹祥，栗原

新，片山

高嶺

造の厳密な認識とは対照的に 2'-FL における Glc およびの FL1-BP および FL2 -BP はそれぞれクラスター IV および

3 -FL における Gal とタンパク質間の相互作用は多くなく，クラスター II に分類されるが，その基質特異性の違いはこ

この結合部位は溶媒に向かって開いていた．このことがれらのアミノ酸残基の違いに起因していると推察された．

LDFT および LNFP I の結合に重要であると推察された．
次に FL1-BP および FL2-BP ホモログの結合サイトのFL-BP ホモログのビフィズス菌ゲノムにおける保存性

アミノ酸残基を比較した（Fig. 2C および 2D）．その結果，BlastP 解 析 を 行 っ た 結 果（ ア ミ ノ 酸 配 列 の 一 致 度

Lac 部分を認識する部位と Fuc 部分を認識する部位で保60 ％以上で評価），FL1-BP ホモログ（クラスター IV ）存性が大きく異なっていた．Lac 部分を認識する 6 種のおよび FL2-BP ホモログ（クラスター I から III ）は B.

アミノ酸残基（ S60，Q63，A88，D161，W286，S322 ）infantis，B. longum，B. longum subsp. suis（ B. suis），B.

は全てのホモログにおいて保存されていたが，Fuc 部分

breve ，Bifidobacterium pseudocatenulatum お よ び B.

を認識するアミノ酸残基は，S112 および G321 を除く 5
種 の 残 基（ Y59，N114，K115，S212 お よ び E284 ） にkashiwanohense にのみ見出され（ Fig. 3），他の細菌種には全く検出されなかった．B. infantis では 19 株のうち

おいて多様性を示した．すなわち系統樹解析によると

16 株がいずれかの FL トランスポーターを有し，11 株はFL-BP ホモログは 4 つのクラスター（ I–IV ）に分類され両ホモログを有していた．B. longum は 39 株のうち 3 株

たが，これらのクラスター間で Fuc 認識残基に大きな多しか FL2-BP ホモログを有しておらず，それらのうちの様性が見られた（ Fig. 2D）．B. infantis JCM 1222 由来

2 つは B. infantis のそれと 71 ％程度の一致（クラスター

T

Fig. 3. Distribution of FL-BP homologs within Bifidobacterium. Distribution of FL1-BP and FL2-BP homologs ( > 61 ％ identity)
among Bifidobacterium species/subspecies. FL1-BP and FL2-BP from B. infantis JCM 1222T were used as queries for BlastP analysis. The cluster numbers (I to IV) are indicated based on the phylogenetic analysis shown in Fig. 2D. The sequences of B.
longum without subspecies identification in the NCBI database were excluded from the analysis. No close homologs ( ≥ 60 ％identity) were found in the genomes of other bacterial taxa in the NCBI database. Reproduced with modifications from Sakanaka
et al. (Sci. Adv. (2019) 5:eaaw7696) [© 2019 American Association for the Advancement of Science (Licensed under CC BY-NC;
https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/)].

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ビフィズス菌のフコシルラクトーストランスポーターに見られる適応進化が母乳栄養児腸管でのビフィズスフローラ形成に関与するIII ）であった．B. breve のゲノムでは，FL-BP のどちら連性を評価した．本データセットには米国（ n = 50），マ

か一方のホモログが 89 株のうち 10 株に見いだされた．B.

ラウイ（ n = 18 ）およびベネズエラ（ n = 15 ）に居住す

pseudocatenulatum は 14 株のうち 6 株に FL2-BP が存在していた．B. kashiwanohense および B. suis では，それる 83 名の糞便メタゲノムデータが含まれており，母乳

ぞれ 2 株および 1 株が FL2-BP ホモログを有していた．B.

以下）および成人（ n = 22，18 歳以上）から構成されてkashiwanohense JCM 15439T 由来の FL2-BP ホモログ（クラスター III ）は B. infantis のそれと 71 ％程度の同一性

いる．解析の結果，Bifidobacterium 属細菌および両方のを示したが，当該遺伝子クラスター BBKW_1838–1840

や成人群と比較して母乳栄養児群において有意に濃縮さを MS554 株で異種発現した結果，B. infantis の FL トラ

れていることが明らかとなった（ Fig. 4E）．興味深いこンスポーター 2 と同じ基質特異性を有することが明らかとに，マラウイとベネズエラの群では，両方の FL-BPとなった(データ未掲載）．

遺伝子が米国の群よりも豊富に存在しており（ Fig. 4F），

ビフィズスフローラ形成における FL トランスポーター

Bifidobacterium 属細菌の存在率の間には，強い正の相関が観察された（ Fig. 4G; スピアマンの順位相関係数）．

栄養児（ n = 34，1 歳以下），人工乳栄養児（ n = 27，1 歳

FL-BP 遺伝子，特に FL2-BP 遺伝子が，人工乳栄養児群

か つ 両 方 の FL-BP 遺 伝 子（ 特 に FL2-BP 遺 伝 子 ） と遺伝子の役割日本人（ 36 名の母乳栄養児と 32 名の成人）の糞便

以上の結果から，FL トランスポーター（特に FL トラン

DNA を 定 量 PCR 解 析 に 供 し た． そ の 結 果，

スポーター 2 ）は，フコシル化 HMOs を取込むことで，

Bifidobacterium 属細菌および FL2-BP ホモログの存在率
が成人に比べて母乳栄養児の糞便で有意に多いことが明

母乳栄養児の腸内におけるビフィズスフローラ形成に関与していることが強く示唆された．

らかとなった（ Fig. 4A, p < 0.001, マンホイットニーの U

考検定）．
興味深いことに，母乳栄養児群では，Bifidobacterium

察属細菌と FL2-BP ホモログ遺伝子または FL1/2-BP ホモ

日本人の腸内には海苔由来のポルフィランの分解およログ遺伝子の占有率との間に有意な正の相関が観察されび輸送に関わる遺伝子が特異的に検出されるように，腸た（ FL2-BP 遺 伝 子 は ρ = 0.512，p = 0.001，FL1/2-BP 遺内細菌は宿主の食事に適応しながら進化を遂げている

伝子は ρ = 0.501，p = 0.002; スピアマンの順位相関係数 ;（Hehemann et al., 2010）．また，腸内細菌のトランスポー

Fig. 4B）．FL1-BP ホ モ ロ グ 遺 伝 子 と Bifidobacterium 属

ターは，他の細菌との競争に打ち勝ち，腸内で安定に定細 菌 で は 弱 い 正 の 相 関 が 観 察 さ れ た（ ρ = 0.370，

着するための重要な因子であることが最近報告されていp = 0.026）．一方で，成人群では，相関がわずかにしか検出 さ れ な か っ た（ FL1/2-BP 遺 伝 子 に お い て の みる（ Maldonado-Gómez et al., 2016; Leth et al., 2018）．本
研究では，B. infantis の二種類の FL トランスポーター

ρ = 0.386，p = 0.032）．次に，母乳および乳児糞便中（ 32
母子ペア）の HMO 濃度を比較したところ，糞便中におを解析し，これらの基質特異性の僅かな違いがビフィズ

ける FL-BP 遺伝子の存在が，腸管内におけるフコシル

び，母乳栄養児における腸内細菌叢の形成にどのように化 HMOs の消費挙動と一致していた．すなわち FL-BP

寄与しているのかについて理解を得ることを試みた．

ス菌にどのような進化的な利点を与えているのか，およ遺伝子が検出された糞便群（ n = 25 ）では，FL トランス

これまで，B. infantis JCM 1222T の FL トランスポー

ポーターの基質（ 2'-FL，3-FL，LDFT，および LNFP I ）ター 1 および 2 は基質特異性が同じであると推測されての濃度が FL-BP 遺伝子の非検出群（ n = 7 ）よりも有意いたが（ Garrido et al., 2011），今回の結果からその基質に低い一方で（ Fig. 4C，p = 0.0098，マンホイットニー

特異性は重複しているものの僅かに異なっていることがの U 検定），母乳中の FL トランスポーター基質の濃度

示 さ れ た（ Fig. 1C お よ び Table 1）．FL1-BP お よ び

は両群間で差はなかった（ p = 0.2944）．また，FL2-BP

FL2-BP は系統的に離れており，FL 結合に関わるアミノ

遺 伝 子 の 占 有 率 は 乳 児 糞 便 中 3-FL 濃 度（ ρ = −0.416，

酸残基も異なっていた（ Fig. 2C および 2D）．特に Fuc

p = 0.018 ） お よ び LNFP I 濃 度（ ρ = −0.551，p = 0.001 ）と有意な負の相関関係にあった（ Fig. 4D; スピアマンの認識に関わるアミノ酸残基 N114，K115 および E284 は，

順位相関係数）．

たが，FL1-BP ホモログ（クラスター IV ）においてはそ

FL2-BP ホモログ（クラスター I–III ）では保存されてい上記の解析とは別に，データベースに登録されたメタ

れぞれセリン，グルタミン酸，グリシンに置換されておゲノムデータセット（ MG-RAST，アクセッション番号

り，これが FL1-BP および FL2-BP 間の基質親和性の違

qiime:621 ）（ Yatsunenko et al., 2012 ） を 利 用 し て，いを生み出している可能性が示唆された．さらに，糞便

Bifidobacterium 属細菌の存在量と FL-BP 遺伝子量の関DNA 解析より，二種の FL トランスポーターのうち特に− 183 −

阪中

幹祥，栗原

新，片山

高嶺

Fig. 4. The abundance of Bifidobacterium in breast-fed infant guts is associated with FL transporter genes. The resultspresented are obtained by analysing Japanese subjects recruited in this study (A–D) and by data mining of a deposited metagenome dataset (MG-RAST, accession number qiime:621) (Yatsunenko et al., 2012) (E–G). (A) Relative abundance (％) of genus
Bifidobacterium and two FL-BP homologs in stool DNA of breast-fed infants (n = 36) and adults (n = 31). The copy number of thegenes attributable to Bifidobacterium 16S rRNA, FL1-BP, and FL2-BP, which was determined by qPCR analysis, was divided by
the copies of 16S rRNA gene attributable to total bacteria. Mann-Whitney U-test was used for evaluating the statistical significance. The data are shown by box plot, in which the middle bar indicates the median while the top and bottom of the box indicate− 184 −

ビフィズス菌のフコシルラクトーストランスポーターに見られる適応進化が母乳栄養児腸管でのビフィズスフローラ形成に関与する

the third and first quartiles, respectively. Whiskers represent the lowest and highest values within 1.5-times the interquartile
range from the first and third quartiles, respectively. (B) Spearman＇s rank correlation coefficient analysis between the relative
abundances of genus Bifidobacterium and either (left and middle panels) or both (right panel) of FL-BP genes in the breast-fed
infant (black diamonds) and adult (open diamonds) groups. The data obtained in (A) were used for the analysis. (C) The concentrations of 2'-FL, 3-FL, LDFT, and LNFP I (substrates for FL transporter-1 and -2) in breast milk and infant stools (32 mother-infant pairs) were compared between FL-BP gene-detected (positive, n = 25) and undetected (negative, n = 7) groups. Mann-Whitney
U-test was used for evaluating the statistical significance. (D) Spearman＇s rank correlation coefficient analysis between the relative abundance of the FL1-BP or FL2-BP gene and the faecal concentration of each substrate HMO. The data obtained in (C) wereused for the analysis, and the results are shown as a heatmap. * and ** indicate p < 0.05 and p < 0.01, respectively. (E and F) The
deposited metagenome data of 83 individuals from USA (n = 50), Malawi (n = 18), and Venezuela (n = 15) were used for the analysis(132,556±76,952 reads/sample) (Yatsunenko et al., 2012). The abundances (％) of genus Bifidobacterium and two FL-BP homologs in the faecal samples obtained from breast-fed (n = 34) and formula-fed (n = 27) infants ( ≤ 1 year old) and adults (n = 22, ≥ 18
years old) are shown in (E), and those in the faecal samples of breast-fed infants living in USA (n = 10), Malawi (n = 14), and Venezuela (n = 10) are shown in (F). See Materials and Methods for read count and abundance calculation for FL-BP genes. Different
letters (a, b, and c) indicate statistically significant differences among the three groups (p < 0.05, Mann-Whitney U-test with
Bonferroni correction). (G) Spearman＇s rank correlation coefficient analysis between the relative abundances of genus Bifidobacterium and either or both of two FL-BP genes in the breast-fed infant group. The data obtained in (F) were used for the analysis,
and the results are shown as a heatmap. *, **, and *** indicate p < 0.05, p < 0.01, and p < 0.001, respectively. Reproduced with modifications from Sakanaka et al. (Sci. Adv. (2019) 5:eaaw7696) [© 2019 American Association for the Advancement of Science(Licensed under CC BY-NC; https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/)].

FL トランスポーター 2 が，母乳栄養児腸内でのビフィ

な か っ た こ と か ら も 裏 付 け ら れ る（ Fig. 4D）． ま た，

ズスフローラ形成に重要であることが示唆された

FL2-BP 遺伝子の存在率と LNFP I 濃度との間にも有意（ Fig. 4A–D）．FL トランスポーターの重要性は，既報のな負の相関が検出されている．従って，この FL トラン

メタゲノムデータの解析からも裏付けられた（ Fig. 4E–

スポーター遺伝子の適応進化が HMOs を介したビフィG）．興味深いことに，マラウイとベネズエラに在住しズス菌とヒトの共進化戦略において重要な役割を担ってている母乳栄養児の腸内における Bifidobacterium 属細いると考えられる．また，2'-FL だけでなく 3-FL も強く

菌と FL-BP 遺伝子の存在量には強い正の相関が検出さ認識できるということは，FL トランスポーター 2 を有れたが，このような相関は米国在住の母乳栄養児では観するビフィズス菌が非分泌型個体（ FUT2 −/−）によって察されなかった．

産生される HMOs（ 2'-FL の代わりに 3-FL が大量に存

ビフィズス菌は，哺乳動物，特にヒトの腸管内での増在する（ Urashima et al., 2012 ））に関しても効率よく利殖に関わる遺伝子を獲得することによって宿主との共進用できることを示唆している．したがって，FL トラン化を遂げてきたと考えられており（ Milani et al., 2014），

スポーター 2 は HMO 主要成分の資化に極めて重要な因

特にビフィズス菌は多数の糖質 ABC トランスポーター子であると考えられる．

を獲得してきたと推察されている（ Milani et al., 2016）．

本研究の成果とこれまで蓄積されてきた知見（ Sela et

最近の報告において，FL トランスポーター 2 のホモロal., 2008; Katayama, 2016; Thomson et al., 2018; Zúñiga et

グが FL の資化に関与していることが既に示されていたが（ Garrido et al., 2016; Matsuki et al., 2016），本研究でal., 2018 ）を合わせることで，ビフィズス菌のフコシル
化 HMOs の利用戦略について統合的に理解することがはビフィズス菌が如何にして二種の FL トランスポー可能となった．「どの HMO トランスポーターがビフィ

ターを適応進化させてきたのかを詳細に解明すると共ズスフローラの形成に最も重要であるのか」といった課に，その生理的意義を明らかにすることができた．FL

題はまだ残っているものの，今回得た成果から HMOs

トランスポーター 2 の広い基質特異性は，SBP のアミノを介したビフィズス菌と乳児の共進化機構の一端を垣間

酸残基の置換による機能獲得に起因しており，それに見ることに成功したといえる．

よって FL2-BP は 2'-FL および 3-FL の両方を同様の親和要性で認識し，さらに LDFT および LNFP I も微弱ながらも認識するように適応進化してきたと推測される．この

約

適応進化の重要性は，母乳栄養児糞便中の FL2-BP 遺伝

乳児期の腸内細菌叢がヒトの健康に長期的な影響を及子の存在量と 3-FL 濃度の間で有意な負の相関が観察さぼすことが明らかとなってきた．母乳栄養児の腸内では，れ，一方で FL1-BP 遺伝子ではそのような相関が見られビフィズスフローラが形成されることが古くから知られ− 185 −

阪中

幹祥，栗原

ており，これは乳児腸内に生息するビフィズス菌が母乳

新，片山

高嶺

に含まれる HMOs を資化可能であるためと考えられて

B. longum 105-A を分譲頂いた京都薬科大学 加納康正元教授，技術的なサポートを行って頂いた京都大学 辺シ

きたが，現在までビフィズスフローラ形成の分子機構はオン大学院生，尾島望美 大学院生，デンマーク工科大

十分に明らかとされていない．本研究では，B. infantis

学 河口礼佳研究員，本研究内容に関して有益な御助言

由来の二種類のフコシルラクトーストランスポーターを提供頂いた森永乳業株式会社 菅原宏祐研究員に心よ（FL トランスポーター 1 および 2 ）を包括的に解析した．

り感謝致します．

また，ヒト糞便試料における DNA 分析および HMO 消文

費様式の解析から，母乳栄養児腸内でのビフィズスフ
ローラ形成には，二種類の FL トランスポーター（特にFL トランスポーター 2 ）が関与していることを明らかとした．さらに，FL トランスポーター 2 の SBP の構造解析および当該 SBP のホモログの系統解析から，ビフィ
ズス菌の HMO 分子種における適応進化戦略，すなわち
如何にしてトランスポーターが幅広い種類の HMOs を取込めるように進化を遂げてきたのかについて理解を深めることができた．以上の成果より，ビフィズスフロー
ラの形成機構，および，HMOs を介したビフィズス菌と乳児の共生・共進化の分子的基盤の一端が明らかとなった．

本助成で得られた研究成果の報告
口頭発表
1) Sakanaka, M., Yachi, H., Kurihara, S., Fukiya, S., Yokota, A.,& Katayama, T. 2016. Physiological characterization of 2′-fucosyllactose transpor t systems from Bifidobacterium
longum subsp. infantis. The 4th International Propionibacteria
and Bifidobacteria symposium. 20–23 September. Ireland.
2) 谷内寛之，阪中幹祥，後藤愛那，栗原新，吹谷智，横田篤，片山高嶺．2016．ビフィズス菌Bifidobacterium
longum subsp. infantisのフコシルラクトーストランスポー
ターに関する研究．第9回北陸合同バイオシンポジウム．
11月4–5日．福井．
原著論文
1) Sakanaka, M., Hansen, M. E., Gotoh, A., Katoh, T., Yoshida,K., Odamaki, T., Yachi, H., Sugiyama, Y., Kurihara, S.,
Hirose, J., Urashima, T., Xiao, J. z., Kitaoka, M., Fukiya, S.,
Yokota, A., Leggio, L. L., Hachem, M. A., & Katayama, T.
2019. Evolutionar y adaptation in fucosyllactose uptake
systems supports bifidobacteria-infant symbiosis. Sci. Adv.
5:eaaw7696.

謝辞

本研究は公益財団法人発酵研究所寄付講座助成により行われたものです．この場を借りて厚く御礼申し上げます．
また，ヒト試料の収集にご協力頂いた長尾早枝子博士，
2′-FL，3-FL，LDFT を譲渡頂いた Glycom A/S，発現ベ
クター pCDF23 を分譲頂いた石川県立大学 中川明講師，

献

Adams, P.D., Afonine, P.V., Bunkóczi, G., Chen, V.B., Davis, I.W.,
Echols, N., Headd, J.J., Hung, L.W., Kapral, G.J., GrosseKunstleve, R.W., McCoy, A.J., Moriarty, N.W., Oeffner, R.,
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− 187 −

平成 29 年度一般研究助成の研究報告
助成期間:平成 29 年 4 月～平成 31 年 3 月

IFO Res.Commun. 33
2019

A. solani-nigri と近縁のクレードに分かれた．この結果，

ナス科植物病原性アルタナリア属菌の分類および特性評価
染谷信

ハリナスビ分離株の一部はジャガイモ分離株と同一種である可能性が高いと考えられ，緑肥作物としてのハリナ

孝

スビが病原体宿主となる可能性が推測された．また，ジャ農業・食品産業技術総合研究機構野菜花き研究部門
someyan@affrc.go.jp

ガイモ品種の夏疫病抵抗性を調査した結果，28 品種に目的：ジャガイモの重要病害は疫病，次いで Alternaria

疫病抵抗性が高いにもかかわらず，夏疫病感受性が高い

solani による夏疫病があげられる．現在，疫病抵抗性品

品種が複数確認された．

おける抵抗性程度を判定することができた．その中には種の育成は進められているが，夏疫病抵抗性品種育成は進んでいない．そのため，疫病抵抗性品種が普及して殺冬虫夏草がセミ共生真菌に進化した
遺伝的基盤と生物機能の解明−寄生菌から共生菌への進化

菌剤使用を低減した場合，夏疫病被害が増大する可能性がある．本課題では，ジャガイモ夏疫病発生圃場および周辺のナス科植物における夏疫病様病徴から病原糸状菌

松を単離，同定することを試みた．

浦優

琉球大学熱帯生物圏研究センター
yumatsu@comb.u-ryukyu.ac.jp

方法：ジャガイモ（ Solanum tuberosum:St ），ミニトマト（ S. lycopersicum:Sl ），ハリナスビ（ S. sisymbriifolium:
Ssi ），イヌホオズキ（ S. nigrum:Sni ），テリミノイヌ

目的：多くの昆虫が共生微生物を体内に保持することでホオズキ（ S. americanum:Sam ），ケイヌホオズキ（ S.

新規な代謝機能を獲得することが知られており，セミ類

sarrachoides:Ssa ）の病葉から，各 50 菌株，計 300 株

は必須アミノ酸を合成する 2 種の必須共生細菌と共生しの 糸 状 菌 を 分 離 し，ITS 領 域 塩 基 配 列 を 決 定 後，て貧栄養な植物導管液に適応している．しかし，セミ共

Alternaria 属菌株についてクラスタ解析を行った．代表

生細菌 Hodgkinia cicadicola（ホジキニア）のゲノムは株について gapdh，alt1a，tef1 および rpb2 配列を決定し，極端に断片化しており，いつ滅ぶかわからない状況にあMLST による系統解析を実施した．北海道十勝地域の殺る．一方，我々の予備調査により，日本のセミ類には冬菌剤無処理圃場においてジャガイモ品種の夏疫病罹病程

虫夏草に近縁な真菌類が広く感染していることがわかっ

度を調査し，夏疫病抵抗性を評価した．

ていた．本研究では，セミの共生系の実態を把握するた結果・考察：6 種のナス科植物から単離した糸状菌 300

め，セミ宿主と冬虫夏草を収集し，感染動態，系統，ゲ株のうち，ITS 配列および分生子形態から約 3 分の 2 がノムや生物機能を網羅的に調査して，寄生から共生へのAlternaria 属菌と簡易同定された．クラスタ解析した結進化を解明する．

果，大きく 2 分され，一方は小型分生子，もう片方は大方法：日本各地からセミを採集し，共生器官の顕微鏡観型分生子を形成する菌株群であった．大型分生子形成ク

察，DNA 抽出を行い，PCR と Illumina シーケンサーに

ラ ス タ の MLST 解 析 結 果 か ら， ト マ ト 分 離 株 は

よ る Multilocus sequence typing（ MLST ） と メ タ ゲ ノ

Alternaria linariae と同じクレードに位置し，ジャガイ

ム解析により共生微生物の感染や系統学的位置を解明す

モ分離株とハリナスビ分離株は A. linariae と近縁の別クる．また，セミの共生真菌株の単離培養を試み，PacBio

レードに位置した．ケイヌホオズキ分離株の一部はRSII を用いたゲノム解析により共生真菌とセミ生冬虫

A. grandis，ハリナスビ分離株の一部は A. protenta と同

夏草の数株を比較解析してそれらの遺伝的基盤や相違点

じクレードにそれぞれ分かれた．イヌホオズキ，テリミを同定する．さらに，イワサキクサゼミの飼育系を立ち

ノイヌホオズキおよびケイヌホオズキの一部菌株は上げ，共生真菌の除去と感染実験によってセミタケ類の− 189 −

IFO Res.Commun. 33
2019

感染機構や機能を解明する．

優占種菌との共培養による難培養土壌放線菌の分離法を結果・考察：全国のセミ 24 種 73 集団 219 個体の調査で開発し，微生物資源の拡大を試みる．

は，共生細菌 Sulcia muelleri（サルシア）が全種全個体

方法：土壌希釈液をベンレート（ 25 µg/mL ）およびナから検出された．一方，ホジキニアは 15 種のセミに検

リジキシン酸（ 25 µg/mL ）を含む WPA 培地（ 1.0％プ

出されず，他 9 種のホジキニアはゲノム断片化に伴い不ロ リ ン，1.5 ％ 寒 天， 水 道 水，pH 無 調 整 ） に 混 釈 し，

安定な状態にあることが示唆された．次に，セミの共生

27 ℃にて 1 週間培養後，出現するコロニーを釣菌した（分真菌を MLST 解析に供した結果，共生真菌はオフィオ

離 1 ）．分離株は YD 培地（ 1.0％酵母エキス，1.0％デキ

コルジセプス属（ Ophiocordyceps ）のセミタケ類から派

ストロース）にて各々培養後，集菌，洗浄後，リン酸緩生し，ホジキニアと最低 3 回以上置換したと推定された．

衝生理食塩水に懸濁し，各菌株を混合し菌体混合液を作

また，セミ 10 種 25 集団 81 個体から共生真菌の単離培養製した．この混合液を加えた WA 培地（ 1.5％寒天，水を試みたが，ツクツクボウシ 3 集団（つくば，和泉，京道水，pH 無調整）を大型シャーレの中で固化した．そ都）のみ成功した．一方で多数のセミ生冬虫夏草試料もの上にメンブレンフィルター（ Ø 0.45 µm ）を置き，底培養と分子系統解析に供したが，共生真菌に近縁な新規面に穴を開けたガラスシャーレを重ねた．これを培養基

寄生菌株は得られていない．共生真菌のゲノム解読では，として分離 1 に用いたのと同一土壌および同一分離培地

培養，高分子 DNA の抽出とアセンブルに時間を要したを用い，27 ℃で 1 - 2 週間培養し放線菌を分離した（分が，ツクツクボウシ共生真菌とセミタケ（ O. sobolifera ），離 2 ）．分離株は 16S rRNA 遺伝子の部分塩基配列に基づ

エゾハルゼミタケ（ O. longissima ）の NBRC 寄託株にき分類した．分離に用いた土壌はメタゲノム解析により，

つ い て， ゲ ノ ム 全 長 25.1 ～ 26.7 Mb，7013 ～ 7524 個 の土壌中の細菌叢を調べ分離株と比較した．

遺伝子（ complete BUSCO 98.97 - 99.3％）を同定し，共結果・考察：2 種の土壌（ A，B ）を用い，22 株および生真菌が共生細菌と同じ必須アミノ酸合成能を有し，ま18 株の放線菌を分離（分離 1 ）後，土壌ごとに各々菌体た寄生性に関わる多くの遺伝子もつことを確認した．今混合液を加えた WA 培地上で再度分離を行なった（分離後，詳細な比較解析により共生真菌と寄生菌の遺伝的な2）． 土 壌 A か ら は 51 株 の 放 線 菌 を 分 離 し，25 種

違いを明らかにする．セミの飼育実験は 2 年間の試行錯（ Streptomyces 属 20 種，希少放線菌 3 属 5 種）に分類さ誤の結果，卵採集と短期的な維持は可能となったが，長れた．同時に，菌体混合液無添加から分離した 30 株は，期的な維持にはさらに条件検討が必要である．

21 種（ Streptomyces 属 19 種， 希 少 放 線 菌 1 属 2 種 ） に分類された．そのうち重複しているのは Streptomyces 属
7 種のみであった．土壌 B からは添加群から 100 株，24

土壌環境をモデルにした培養基による難培養放線菌の分離法の開発と微生物資源の獲得
松本

厚種（ Streptomyces 属 22 種，希少放線菌 1 属 2 種），無添加群からは 62 株，20 種（ Streptomyces 属 20 種）が分離され，重複種は Streptomyces 属 15 種であり，共培養に子よる効果があったと推測された．

北里大学北里生命科学研究所
amatsu@lisci.kitasato-u.ac.jp

一方，土壌 A および B をメタゲノム解析し細菌叢を調査した結果，放線菌（ Actinomycetales 目）の中に占め

目的：環境微生物にとって個々に取り出された実験室環

る Streptomyces 属の割合は約 5％および 1％に過ぎず，境と土壌環境では生育条件が劇的に変化する．未利用な分離株として得られたのはほんの一部であることは明ら

放線菌資源を分離し活用する目的で，自然環境に近づけかであった．

た培養条件すなわち土壌中で共存する細菌叢に注目した− 190 −

共培養により土壌 A より分離した希少放線菌 KV-967

IFO Res.Commun. 33
2019

は Jiangella 属と近縁であるものの 16S rRNA 遺伝子の相ターンを示した．また塩基配列解析の結果，いずれの菌同性が低く新規放線菌と推定される．また，土壌 B から株も目的とする菌種であることが示された．また，菌根は共培養のみで希少放線菌が分離され，本方法は実験室

分離と組織分離の両方を行った 10 属 18 種のうち，キハと土壌との環境の違いを少なからず埋めるものであり，

ツダケ（ Lactarius tottoriensis ）は菌根分離でのみ分離

土壌中の未培養放線菌の分離に寄与できると考えている．

株を得ることができた．一方，これら 18 種には組織分離でのみ培養できた試料が 3 属 3 種，いずれの方法でも培養できた試料が 3 属 6 種，培養できなかった試料が 6

菌根を分離源とした菌根性きのこの遺伝資源拡充：分離源菌根の形態学的特徴の解明と分離手法の改良
遠藤直属 8 種あった．以上より，菌根分離法は従来の子実体分離と併用することで菌根性きのこ種の菌株拡充に寄与できると考えられた．分離源の菌根形態を観察した結果，

樹

Amanita 属は節や種によって菌鞘構造が異なったのに対鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源研究センター
endo_nao@tottori-u.ac.jp

し，Hydnum 属は属内で菌根形態が共通する傾向にあっ
た．Tricholoma 属も同様の傾向を示したが，全体の色

目的：菌根性きのこ種は樹木と外生菌根を形成し，共生

調や根外菌糸体の頻度，菌糸のクランプ結合の有無に種するきのこ種である．本菌群は腐生性きのこ種と比べて間で差異が見られた．ゆえに，菌根形態は分類群によっ生殖器官である子実体からの分離培養が困難であり，基ては節以下の分類形質となることが示唆された．

礎研究や応用研究の材料となる菌株が殆ど得られていな
いのが現状である．本研究では菌根性きのこの栄養器官

地下深部油ガス田におけるメタン
生成機構の解明 - 共生培養法によるリグニン関連物質分解微生物の網羅的分離培養である菌根からの分離培養法（菌根分離法）により本菌群の菌株拡充を試みた．また，菌根を分離源として利用するため，種同定の基準となる菌根の形態情報を集積した．

持

方法：国内より菌根性きのこ種の子実体とその直下の土

丸

華

子

産業技術総合研究所地圏資源環境研究部門
h-mochimaru@aist.go.jp

壌 61 試料を採集した．菌根は実体顕微鏡下で外部形態を，微分干渉顕微鏡下で微細形態をそれぞれ観察し，同定した．同定した菌根は 0.01％ Tween 80 水溶液で洗浄

目的：世界の天然ガス資源に含まれるメタンの約 20％したのちに 1％次亜塩素酸カルシウム水溶液で表面殺菌

は微生物により生産されたと推定されている．地上からし，テトラサイクリンおよびストレプトマイシンを隔絶された研究対象の地下深部天然ガス貯留層中には50 mg/L および 100 mg/L 添加した MNC または MA 平

100 万年以前に堆積した有機物が存在している . 堆積物

板培地に接種し培養した．18 種 20 試料では組織分離も中で有機物は重縮合を繰り返し巨大な分子量を持つ難分併せて行った．培養は 20 ℃暗所にて 2 か月以上行い，解性の有機物に変化していると考えられており，メタン

分離株は rDNA ITS 領域の PCR-RFLP 解析および塩基配生成へと続く根源有機物の種類やそれを分解する微生物

列解析によって同定した．

については明らかではない．そこで本研究では，地下深結果・考察：菌根性きのこ 18 属 49 種 61 試料で菌根分離部油ガス田におけるメタン生成機構を解明することを目を行った結果，7 属（ Amanita，Boletus，Cantharellus，的とし，国内の様々な油ガス田の試料から，リグニン関Lactarius ，Rhizopogon ，Sarcodon ，Tricholoma ）18 種

連物質であるメトキシ芳香族化合物を分解する微生物をに由来する 19 菌株を確立できた．いずれの菌株も，分網羅的に分離・同定し，その生態を解明する．

離 源 の 菌 根 や 地 上 部 の 子 実 体 と 同 一 の PCR-RFLP パ

方法：国内油ガス田から地層水を採取し，リグニン関連− 191 −

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2019

物質として，メトキシ芳香族化合物を基質として培養を用いて作成し，それらの結果と形態，宿主範囲といった行った．このメトキシ化合物の分解産物と考えられる水

複数の要素を組み合わせることにより，統合的に種概念

素や酢酸をメタンに変えるメタン生成菌との絶対共生関を再検討する．これにより分類学上の成果を得るととも係がメトキシ化合物分解微生物にとって必須であるといに，種バーコーディングや迅速検出技術の開発等の実用う仮説を立て，水素利用または酢酸利用のメタン生成菌

場面においてそれらの成果を応用することを目的としてを添加する共生培養法を用いてメトキシ化合物分解微生開始した．

物の集積培養を行った．試験管に水素利用または酢酸利方法：重要な植物病原菌で宿主特異的毒素産生能を有する

用メタン生成菌を共生菌として基質と共にあらかじめ添

Alternaria alternata strawberry pathotype および Japanese

加し，油ガス田試料の希釈培養を行った．この共生を用

pear pathotype を中心に形態と多遺伝子座（ITS ，gapdh，

いた希釈培養を繰り返した後，集積された細菌の 16S

rpb2，tef-1a，alt a1，endoPG ）の分子系統，接種試験

rRNA 遺伝子塩基配列を解析した．

による宿主範囲，および毒素産生菌による病変形成の有結果・考察：メタン生成菌を添加せずに希釈培養を行っ

無を統合した種概念を検討した．また，毒素産生遺伝子た系では，ほとんど高希釈率の培地ではメトキシ化合物の一部塩基配列を参考に LAMP 法用特異的プライマーの分解が見られなかったのに対し，メタン生成菌を共生を設計した．Pseudocercospora 属菌については 4 遺伝子菌として添加した系では，高稀釈率の培地においても良座（ ITS ，act，tef-1a，rpb2 ）による解析を行った．

好なメトキシ化合物の分解が見られた．この結果はメト

結果・考察：日本産広義 Alternaria 属菌 110 株 32 種の 6

キシ基の分解とメタン生成が密接な共生関係により成り領域を解析して分子系統樹を得た．A. alternata は同一

立 つ こ と を 示 唆 す る． 集 積 さ れ た 細 菌 に つ い て 16S

種内で宿主植物に対して特異的毒素（ HST ）産生能をrRNA 遺伝子塩基配列を解析したところ，採取地や培養有する系統と欠く系統が存在する等，多様性に富むが，温度などが異なる複数の試料から，既知種との相同性が形態，宿主範囲，毒素産生能を統合して解析した結果，90％以下の細菌が 40 - 100％の存在率で検出された．こ

宿主特異的毒素産生系統と非産生系統の間には種レベルの中で既知種との相同性がそれぞれ 88 - 90％と離れていでの分化が見られ．このことから，毒素産生系統をる新規微生物は 5 種類以上確認され，共生培養法が未知

Alternaria gaisen Nagano ex Bokura とすることを提案しのメトキシ化合物分解微生物の培養に有効であることがた．加えて，この A. gaisen の宿主特異的毒素産生系統確認できた．本研究により，深部地下油ガス田においてを非産生系統から明瞭に区別することが実用上重要であ

メトキシ芳香族化合物がメタン生成菌との強固な共生にることから，毒素産生遺伝子の部分配列を用いて LAMP

より分解されメタンへと変換されているという新しい生法用プライマーセットを設計し，毒素産生菌の特異的識態が示された .

別に成功した．この手法を更に発展させ，LAMP-FLP 法
によるコムギ赤かび病（ Fusarium graminearum ）の薬
剤抵抗性系統を特異的に検出可能なシステムを開発し公日本産 Alternaria 属菌群およびCercospora 属菌群の分類学的研究
中島千表した．一方，植物病原菌である Pseudocercospora 属菌はやはり多様性に富み，分子系統関係も明らかになりつ晴つある．本研究では，従来用いられてきた多遺伝子座に三重大学大学院生物資源学研究科
chiharu@bio.mie-u.ac.jp

変えて新たな組み合わせ（ ITS ，act，tef-1a，rpb2 ）による分子系統解析により，東・東南アジア産（日本，台湾，

目的：日本産広義 Alternaria 属菌と Pseudocercospora 属

韓国，マレーシア，タイ）の数多くの Pseudocercospora 種菌の包括的分子系統樹を分類学上，信頼に足る分離株をの分子系統関係を明らかにし，あらたな種バーコード領域− 192 −

IFO Res.Commun. 33
2019を提案した．さらには，これらの種分化が，宿主植物のていたが，今回，菌蕈研究所（鳥取市）にて探索を行っ

分化や地理的な分化と密接に関連することが示唆された．

た結果，この国内唯一の標本を再発見することができた．
ハハシマアコウショウロ（ Circulocolumella hahashimensis ）は，1936 年 11 月に小笠原諸島母島で採集され，昭和期に記載された稀産シクエストレート菌の実体解明と保全対策の再検討
折原貴

C. agaricoides 同様，
翌年記載されて以降再発見例は無く，
環境省レッドリストで絶滅種に指定されている．今回，道

現地での子実体探索調査やハーバリウム収蔵資料の調査

神奈川県立生命の星・地球博物館学芸部
t_orihara@nh.kanagawa-museum.jpを実施した結果，本種の実体解明に繋がる有力な形態学的知見が得られた．

目的：トリュフ類やショウロのように，子実体（きのこ）ニカワショウロ（ Protuberella borealis ）は 1938 年のが外皮に覆われたまま成熟し，自力での胞子散布ができ

記載以降，長らく記録が無く，実体が明確でなかった．

ないシクエストレート菌（地下生菌）は，担子菌類や子本種は 1990 年代以降に再び発見されるようになったが，嚢菌類の多岐にわたる系統から平行進化してきたことがこれらは元来のニカワショウロと形態的に大きく異なっ

知られている．日本におけるこれらの菌の基礎的研究はている．この「通称ニカワショウロ」の系統解析を行っ

近年急速に進展しており，その高い多様性は世界的にもた結果，既知種とは属レベルで異なる，未知系統の菌で注目を集めている．しかし，昭和期に今井三子（ 1900 -あることが示された．

1976 ），小林義雄（ 1907 - 1993 ），吉見昭一（ 1928 - 2003 ）1930 年代に小笠原産の標本を基に記載されたオオショ

らの菌学者により散発的に記載された種については，実ウロ（ムニンショウロ）の学名と和名を再検討するとと体が不明なままであるものが多い．本研究では，これらもに，レクトタイプ指定を行った．さらに，本種が日本過去に記載された「幻」の菌の実体を明らかにし，国内

本土や南西諸島，中国大陸に広く分布することを示した．

のシクエストレート菌の分類学的基盤を構築することを

南方熊楠が遺したシクエストレート菌の原画・標本資目的とした．さらに，実体が明確でないまま希少種・絶料計 11 点を直接観察し，分類学的検討を行った．その滅種とされてきた菌について，保全に資する基礎的知見

結果，ショウロ属菌や，2016 年に著者により記載されを集積することを目指した．

た Rossbeevera paracyanea などに同定された．

方法：昭和期に活躍した菌類研究者により記載もしくは記録されたシクエストレート菌について，タイプローカ

雪氷環境における好冷性微細藻類の共生細菌 Hymenobacter nivis のゲノム解析及び代謝機構の解明

リティを含む過去の記録産地での野外調査や国内各地のハーバリウムにおける標本調査を実施した．得られた標本の分類学的再検討を行うとともに，一部については核寺

リボソーム RNA 遺伝子等の領域に基づく分子系統解析

島

美

亜

北海道大学低温科学研究所
m.terashima@lowtem.hokudai.ac.jp

も行った．
結果・考察：本研究により得られた主要な結果は以下の目的：氷河や高山雪原では雪解けが進む春，雪の表面を通りである．
スナタマゴタケ（Chlorophyllum agaricoides）は 1930 年

ピンクに染める赤雪現象が起こる．この現象は藻類増殖に小樽市の海岸で一度採集されて以降，国内では記録がによるものであり，低温，強光，高紫外線，低栄養，凍無く，環境省レッドリストでは「絶滅」に指定されている．

結による乾燥などのストレス下においても藻類が生育しこの国内唯一の標本はおよそ 20 年前から所在不明となっている．赤雪には微細藻類のほか，細菌も検出されてお− 193 −

IFO Res.Commun. 33
2019

り，藻類が生産した有機物を消費していると思われる．

河川水の自由生活性アメーバ内の非結核性抗酸菌を分離して共生関係の実態を解明する

南極の赤雪からは真核緑藻と一緒に従属栄養性細菌のHymenobacter nivis が特異的に検出されている．本研究では，H. nivis における南極赤雪の厳しい環境への適応

西メカニズムの解明を目的とした．

内由紀子

大阪市立大学医学部附属刀根山結核研究所
nishiuchi@med.osaka-cu.ac.jp

方 法： 南 極 の 微 細 藻 類 に よ る 赤 雪 か ら 単 離 さ れ た
H. nivis P3 株について次世代シーケンサー PacBio でゲ
ノ ム 配 列 解 析 を 行 っ た．H. nivis P3 株 を 5 ℃ お よ び

目的：肺非結核性抗酸菌感染症は世界中，特に日本で著

15 ℃で R2A 培地上で培養し，明暗状況下での生育を比しく増加している．環境から感染する抗酸菌感染症が世較した．フローサイトメトリーにより，2 日おきに培養界中で増えている事実は，環境中の抗酸菌が生存域を拡

液内の細胞数を正確に測定し，成長曲線を作成した．明大している可能性を示唆している．生存域の拡大には，暗状況（ 5 ℃）で培養した H. nivis の細胞外高分子物質

単独で浮遊する以外にバイオフィルム形成や自由生活性の総炭水化物をフェノール硫酸法で定量した．同様に，

アメーバ（アメーバ）内共生が寄与していると考えられ

総タンパク質を BCA 法で定量した . 次に，ゲノム上確るが，その実態は不明な点が多い．本研究では河川表層認された遺伝子の発現を調べる為，明暗状況（ 5 ℃）で水中の浮遊菌とアメーバ内の抗酸菌について，培養法と培養した H. nivis P3 株のプロテオームをオービトラッ

抗酸菌現存量，および菌叢を比較解析して共生関係の実

プ型質量分析装置で測定した．

態を調べた．

結果・考察：H. nivis P3 株の約 500 万塩基ゲノム配列に方法：淀川，猪名川，石川の 3 ～ 6 ポイントから毎年夏は 4604 の遺伝子が予測され，光に反応するタンパク質

季と冬季の 2 回表層水を 1 L 採取して，0.8 µm 孔径のフィ（プロテオロドプシン，フィトクロム，フォトリアーゼ，

ルター上に残った試料をアメーバ試料，0.8 µm 孔径のクリプトクロム）の遺伝子が含まれていることが明らか

フィルターを通過し 0.2 µm 孔径のフィルター上に残った試になった．さらに，明暗環境下で本菌の増殖を比較をす

料を浮遊菌試料とした．試料を 2 分し，培養と DNA 抽出

ると，5 ℃及び 15 ℃共に明環境下の方が速く，静止期のに供与した．培養試料はアルカリ処理後に Middlebrook

細胞数も明環境下の方が多かった．H. nivis P3 株がプロ

7H11 寒天培地で 4 週間培養し，得られた分離株の rpoB

テオロドプシンなどのタンパク質により光エネルギーをの配列を基に 97％相同以上で菌種同定した．得られた利用し，成長を促進させていると考えられる．また，明Mycobacterium avium subsp. hominissuis（ MAH ）株で暗環境下の細胞外高分子物質の分析を行った結果，総炭は 縦 列 反 復 配 列 多 型 解 析 を 行 っ た．DNA は DNeasy

水化物と総タンパク質は共に暗環境下の方が多いことがPowerWater kit を用いて抽出し，atpE を指標とした定わかった．次に，H. nivis P3 株のプロテオームを解析し量 PCR 法，および 16S rRNA 遺伝子の V3 - V4 領域を対たところ，光反応タンパク質が発現されていることが明象とした菌叢解析を行い QIIME で解析した．

らかになった．プロテオロドプシン，フィトクロム，フォ

結果・考察：浮遊菌試料を培養すると MAH，M. intra-

トリアーゼ，クリプトクロムの発現が明暗環境下で確認

cellulare，M. colombiense，M. arupense，M. shigaense なできた．光反応タンパク質が暗環境でも発現されている

どの病原性および非病原性の多様な抗酸菌を 20 種以上のは，常に光を認識し利用できる状態を保つためだと思分離した．河川や採水ポイント，季節による特徴は認めわれる．こうしたタンパク質を発現することによって，られなかった．分離した MAH 17 株を縦列反復配列多型

H. nivis は南極赤雪の低温・強光環境に適応し，優占し解析したところ，患者や浴室由来株が多いクラスターにていると考えられる .

11 株，豚由来株が多いクラスターに 6 株分布した．河− 194 −

IFO Res.Commun. 33
2019

川表層水中の MAH は多様性を示し満遍なく分布する特の栄養培地を用いて行った．ハムシ腸管・体液および単徴を示した．アメーバ試料からは，Naegleria koreanum，

離菌株 DNA は，SK ミルによる破砕後 DNeasy キットを

Naegleria neojejuensis，Stenamoeba limacine，Vermamoeba

用いて抽出し，16S rRNA 遺伝子の配列決定による菌種

vermiformis を分離した．分離アメーバから生きた抗酸同定および菌叢解析（ V3 -V4 領域）に使用した．単離菌は分離できなかったが，抗酸性染色をするとアメーバ菌 株 ML5 お よ び R102 の ゲ ノ ム 配 列 決 定 は，Illumina

内に抗酸性染色陽性菌が認められた．定量 PCR 法で抗MiSeq を用いて受託解析により実施した．. ハムシ腸管

酸菌数を定量したところ，浮遊菌およびアメーバ試料のに共生する細菌の蛍光 in situ ハイブリダイゼーション

いずれも菌が認められ，最大 3.8×105 コピー/500 mL では，whole-mount FISH 法を用いて行った．

あった．検体間の菌叢の違いを主座標分析したところ，

結果・考察：野外環境および飼育環境由来のコガタルリ

浮遊菌試料とアメーバ試料間，および採取した季節によ

ハムシ腸管内容物および体液を塗布したシュウ酸含有培

りクラスターを形成した．また，菌叢解析結果より細胞

地および栄養培地に生育したコロニーを 70 個単離した．

内寄生菌を抽出してその分布をアメーバ試料と浮遊菌試

その結果，シュウ酸を含む培地では，16S rRNA 遺伝子

料間で比較したところ，Mycobacterium はアメーバ試料による細菌叢解析においても優勢的であった Rahnella

で多く認められた．定量 PCR による結果と合わせて河属および Pantoea 属の近縁細菌がそれぞれ優勢的に見出川表層水において抗酸菌は浮遊するだけでなく，表層水

され，シュウ酸分解能も有していた．このことから，コ中のアメーバとも関わりあって生存していることが示唆

ガタルリハムシには生育環境に由来するシュウ酸分解細された．今後アメーバ試料から抗酸菌を分離して浮遊菌菌が優勢的に共生していることが知られた．優勢種の代由来抗酸菌との違いを検討したい．

表菌株である Pantoea sp. R102 株のドラフトゲノム解析の結果，シュウ酸脱炭酸酵素遺伝子の配列が見出されたが，Rahnella 属に近縁（未培養グループ）の ML5 株の外来雑草エゾノギシギシを摂食する
コガタルリハムシの腸内シュウ酸
分解細菌の共生機能の解明
大坪

ドラフトゲノム配列からは既知のシュウ酸分解遺伝子は見出されなかった．興味深いことに，16S rRNA 遺伝子の BLASTn 検索および系統解析の結果，本研究におい和香子てコガタルリハムシから単離されたシュウ酸分解細菌株

東北大学大学院農学研究科
wakako.ohtsubo@tohoku.ac.jpの 30％以上が，カメムシとの共生能力を持つことが報告されている環境細菌と最も高い相同性を示し，特に目的：外来雑草エゾノギシギシは高濃度のシュウ酸を含R102 株については，ゲノムの各遺伝子の配列の多くがむことから，多くの動物や昆虫にとって有害である．しカメムシ共生細菌である Symbiont C ゲノムの相当遺伝

かし，日本の在来昆虫であるコガタルリハムシは，幼虫

子配列と 99 ～ 100％の相同性を示した．今回単離した細および成虫共にエゾノギシギシを旺盛に摂食し，さらに菌の獲得・共生と宿主の生存との関連性については，単体内にはシュウ酸が蓄積していないことが知られてい離菌の感染・除去実験により検討中であるが，本研究のる．本研究では，ハムシ腸管に共生する細菌のシュウ酸

これまでの結果は，コガタルリハムシに共生するシュウ分解能力に着目し，その特徴や共生機能について明らか

酸分解細菌が，カメムシにおいて報告されているようなにすることを目的とした．

「環境中から獲得され宿主の生存に寄与する」共生機能

方法：コガタルリハムシ幼虫腸管および体液からの細菌を有する可能性を示唆している．

の単離およびシュウ酸資化性試験は，10 または 20 mMのシュウ酸を添加した 2 種類の半合成培地および 6 種類
− 195 −

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2019

た属が 20 以上存在したのに対し，非印加系では 11 属にと酸化還元電位制御下でのコロニー形成「固相電気培養装置：SPECIES 」で拓く
培養可能微生物圏のフロンティア
木村

どまった．また印加系から得られたコロニーには種レベ
ルで新規と考えられる Proteobacteria 門に属する株が含まれており，当該株群については現在電子資化性調査及善一郎

びゲノム解読を実施中である．またこのことは電極印加

呉工業高等専門学校環境都市工学分野
z-kimura@kure-nct.ac.jp

による培養化の可能性を示唆した．すなわち，SPCEIES
は培養可能微生物圏を拡大し得る培養技術であることが目的：廃棄物系バイオマスは現在主としてメタン・水素判明した．またコロニー菌叢の優占種は，電子資化性細等の燃料用途としてリサイクルが検討されているが，今菌であることが示唆されている Thermoanaerobacter 属

後の再生可能資源の利活用の拡大のためには，より高付だった．従って本研究により SPECIES の持つ電子資化

加価値な炭化水素を生産するプロセスを開発していく必性細菌培養装置及び菌体細胞培養化装置という性質が明要がある．筆者は細胞外に存在する電子を直接的にエネ

らかとなった．以上の成果について現在論文執筆中であルギー源とする細菌（電子資化性細菌）を物質生産触媒

る．一方で，現状として本技法は，電子資化性細菌を除として用いる高付加価値物質の生産系の構築に取り組ん

く一般的な細菌の培養可能性をも拡大する可能性があでいる．電子資化性細菌は様々な物質生産系を構成し得り，今後の課題として「培養性の拡大」及び「電子資化る有用な細菌群であるが特異的培養法が確立されておら性細菌培養の特異性向上」の 2 つの指向性を切り分け，ず，その確立は当該細菌分離のスループットを向上させ

新規微生物培養装置，電子資化性細菌特異分離装置，そ得る．筆者は，自身の独自技術である固相電気培養装置

れぞれの方向性に合致する装置運用条件を検討する必要（ Solid-Phase Electrichemical Colonization and Isolationがある．

Equipment System; SPECIES ）が，当該細菌群の分離装置として使用できると着想し，嫌気環境試料を植種源と藍建て発酵に関与するインジゴ還元酵素の機能と構造解析並びに染色への応用

する電子資化性細菌の分離培養可能性，および実際の分離培養により得られた細菌群の系統分類に取り組んだ．

米

方 法：SPECIES は 培 地 に 対 し カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ

田

一

成

東海大学農学部
kyoneda@agri.u-tokai.ac.jp（ CNT ）を添加した導電性固体培地による培養装置である．無機栄養培地に水ガラス（ケイ酸ナトリウム）10％
及び CNT 分散水溶液（終濃度 0.01％）を添加し塩酸滴

目的：日本の伝統産業である藍染めは藍と呼ばれるタデ

定によるゲル化で固体培地とし，ここに－400 mV（ vs科植物の葉を発酵させたスクモを原料に用いて，常温高Ag/AgCl 2 ）陽極を作用極としてポテンショスタット を

アルカリ条件下での発酵還元により作られる．微生物に用いて電圧印加した．培地は電圧印加系と非印加対照系

よるスクモ還元は古来より行われていたが，その実態はを作成し，両者に環境試料（八橋油田油層水）を滴下し，ほとんど不明であり，職人らの経験と勘に基づいて作業嫌気状態で 1 ヵ月培養した．培養後のコロニー菌叢は次が続けられてきた．そのため同一原料・同一操作に因り

世代シーケンサにより解析・比較した．

ながら還元力の異なる染色液ができ，その品質管理が困

結果・考察：SPECIES 装置内に形成された菌叢は植種難な事が報告されている．これまでに藍染め染色液より源と明確に異なった．電極印加による大きな影響として，

インジゴ還元酵素を生産する常温性の好アルカリ性菌の培地上に形成されるコロニーの多様性が高まることが判

単離や部分精製酵素の機能解析例はあるものの，酵素の明した．電圧印加系においては，0.5％超の検出頻度となっ不安定性の問題からインジゴ還元酵素の詳細な機能は未− 196 −

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だに不明である．そこで，本研究ではインジゴ還元活性

がん幹細胞選択的な細胞毒性を示す
植物成分の微生物生産に向けた研究を有する好熱性 Bacillus 属細菌である，Bacillus smithiiに着目し，日本の伝統産業である藍建てにおけるインジ關

ゴの還元過程を生化学的視点から解明することを目的と

光

大阪大学大学院工学研究科
hseki@bio.eng.osaka-u.ac.jp

している．
方法：B. smithii のゲノム情報からインジゴ還元酵素遺伝子を同定し，遺伝子合成を行った．遺伝子合成後，

目 的： グ ア イ ア ノ ラ イ ド セ ス キ テ ル ペ ン ラ ク ト ン

pET15b ベクターにクローニングした．その後，大腸菌（ GSLs ）は 5 員環 - 7 員環 -ラクトン環が縮合した基本

BL21 コドンプラスを用いて IPTG による遺伝子発現を構造を持つ植物セスキテルペノイドの一グループであ行った．補酵素の同定には TLC を用い，UV によって補り，抗ガン活性を示すアルグラビンやミケリオリドなど酵素の検出を行った．酵素活性は窒素ガス存在下におけの化合物を含む．幾つかの GSL は急性骨髄性白血病幹る 610 nm の減少を測定した．結晶化は 42 mg/ml に濃縮細胞に対する選択的細胞毒性を発揮することから注目さした酵素を用いシッティングドロップ蒸気拡散法を用いれている．本研究では，組換え酵母を用いた GSL 生産て，20 ℃で結晶化を行った．また，藍染め染色実験にに向けた基盤研究として，GSL 生合成に関わる酵素遺は田中直染料店のインジゴ還元顆粒を使用した．

伝子の探索と組換え酵母における GSLs 生合成経路の再結果・考察：遺伝子発現産物はコバルト親和性カラムで構築を目的とした．

精製を行い，嫌気条件下においてインジゴカルミン（水方法：ジンチョウゲ科シャムジンコウ由来のセスキテル

溶性インジゴ）の還元活性（ 30 U/mg ）を有しているこ

ペン環化酵素（ δ - guaiene 合成酵素），レタス由来シトとを明らかにした．補酵素の同定を行った結果，本酵素

クロム P450 モノオキシゲナーゼ（ CYP71AV3 ），クソニ

は FMN を補酵素としていた．酵素化学的性質を決定しンジン由来アルコールデヒドロゲナーゼ（ ADH1 ）およ

た結果，本酵素の最適 pH は 7，最適温度は 70 ℃以上で

びアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ ALDH1 ）をコードする

あり，pH 5 ～ 11 の広い範囲で安定であり，100 ℃でも遺伝子を単離し，セスキテルペノイドの共通前駆物質で失活しない高度耐熱性の新規なインジゴ還元酵素であるあるファルネシル二リン酸を高生産する Saccharomyces

ことがわかった．インジゴカルミンに対する K m 値はcerevisiae（ EPY300 株）に導入した．導入遺伝子の発現

6.9 μM，NADH に対する Km 値は 157 μM であった．また，を同時に誘導することで，組換え酵母内で GSL 基本骨

わずかではあるが本来の基質であるインジゴに対する反格の前駆体となりうる δ - guaianoic acid を de novo 合成

応性も 280 - 700 nm のスペクトル測定を行うことで確認した．次に，δ - guaianoic acid を基質としてラクトン環することができた．しかし，本来の基質であるインジゴ形成を誘導し GSL 基本骨格を生成しうる酵素遺伝子のに対する還元活性は非常に低かった．インジゴ還元顆粒

候補として，シナジンコウの GSL 産生部位である agar-とインジゴ還元酵素を使用した藍染め染色実験で綿布のwood part における発現量が著しく高い 6 種の CYP71

染色を比較したところ，0.1％のインジゴ還元顆粒の使ファミリー P450（ AsCYP-1～ 6 とする），また，Thapsia

用条件で，還元剤の有無による染色の差が確認できた．

garganica の根において発現する 3 種の P450 を選抜した．

また，PEG600 を沈殿剤として FMN-酵素複合体の単結

こ れ ら の 遺 伝 子 を 人 工 合 成 し，δ - guaiene な ら び に晶が得られたため，X 線回折実験を行い，1.9 Å 分解能

δ - guaianoic acid 生産酵母に導入した．酵母培養液抽出

で立体構造を決定した．

物をガスクロマトグラフィー質量分析（ GC-MS ）に供するとともに，生成物の一部については単離およびNMR による構造決定を行った．
− 197 −

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結果・考察：AsCYP-1～ 6 のそれぞれを導入した酵母培合も解析した．2 つ目の手法として，熱変性タンパク質

養液抽出物の GC-MS の結果，3 種の P450 が δ - guaieneの蓄積が好熱菌の生育を阻害する可能性を検証した．モ

に対する酸化活性を示した．生成物の構造解析の結果，デル酵素遺伝子を好熱菌内で高発現させ，増殖曲線を解

AsCYP-1 は 13 - hydroxy - δ - guaiene を，AsCYP-2 は 新 規

析することで，細胞内で産生される酵素の安定性と増殖化合物である 11,12 - epox y - 7 -hydroxy - δ - guaiene を生成速度の関係性を評価した．

物 と し て 与 え る こ と が 判 明 し た．AsCYP-3 な ら び に

結果・考察：熱変性タンパク質の蓄積により発現量を上T. garganica 由来の 3 種の P450 については，いずれも上昇させるプロモーターを 2 つ見出した．これらの下流に記と異なる δ - guaiene 酸化物を生成物として与えること

黄 色 蛍 光 タ ン パ ク 質 遺 伝 子 を 配 置 し，BSPryFA とが判明したため，単離と構造決定を進めている．一方，BSPryF V の遺伝子と共に好熱菌中で発現させたが，明いずれの酵素についても目的とするラクトン環形成誘導

確な差異は見られなかった．黄色蛍光タンパク質が高温活性については検出されなかったため，さらなる候補酵

培養下において熱変性したため，プロモーターの応答が素遺伝子の探索が必要である．

複雑化した可能性を考慮し，レポーターを耐熱性の高い
BgaB に変更した．BgaB は蛍光タンパク質よりも高感度に検出できるため，プロモーターと bgaB 遺伝子から高変異性好熱菌を利用した耐熱化
変異酵素のハイスループット創出鈴木宏なるレポーターカセットを好熱菌染色体に導入した．得られた株中で BSPryFA と BSPryF V を高産生させたとこ

和ろ，いずれのレポーター株においても期待通りの bagB

鳥取大学大学院工学研究科
hirokazusuzuki@tottori-u.ac.jp

発現変動（ BSPryFA 生産株で高く，BSPryF V 生産株で低い）が見られた．2 つ目の手法は，BSPryFA 生産株と目的：実用的な耐熱化変異（安定化）酵素を得るには，

BSPryF V 生産株の増殖曲線を用いて評価した．これら

その遺伝子のランダム変異ライブラリーを構築し，耐熱両株は同様な倍加時間を示したが，増殖開始時間（準備化変異に成功した遺伝子をスクリーニングする手法が古期）において差異があり，BSPryF V 生産株は BSPryFA

くから用いられてきた．しかし，スクリーニングについ生産株よりも早く増殖を開始した．熱変性タンパク質のては簡便な方法が確立されておらず，耐熱化変異酵素の蓄積が負荷となり，増殖開始を遅らせた可能性が考えら創出は決して容易な作業ではない．耐熱化変異酵素創出

れる．いずれの手法も酵素活性に依存することなく耐熱のハイスループット化を目的とし，本研究では耐熱化変化変異酵素を選別できる汎用的スクリーニング法に発展

異酵素遺伝子を好熱菌（ Geobacillus kaustophilus ）中ですると期待できる．

簡単にスクリーニングする手法の開発を目的とした．
方法：1 つ目の手法は，好熱菌中で熱変性タンパク質がクオラムセンシングフェロモンを介した腸内細菌とヒトのクロストーク

蓄積した際に発現が変動する遺伝子をレポーティングする方法で，そのような遺伝子をトランスクリプトーム解

岡析により見出した．これら遺伝子のプロモーター領域下流に黄色蛍光タンパク質の遺伝子を連結し，モデル酵素

田

正

弘

東京大学大学院薬学系研究科，
現 神奈川大学工学部
okada ＠ kanagawa-u.ac.jp

遺 伝 子（ 非 耐 熱 性 酵 素 BSPryFA や 耐 熱 性 変 異 酵 素
BSPryF V など）と共に好熱菌中で発現させ，その際の酵素耐熱性とレポーター発現量の相関性を評価した．ま目的：翻訳後修飾によりトリプトファン残基がイソプレた β - ガラクトシダーゼ（ BgaB ）をレポーターとした場

ニル化されたオリゴペプチド型クオラムセンシングフェ− 198 −

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2019

ロモン（ ComX フェロモン）を初めて発見したが，今の草菌が属するフィルミクテス門やクロロフレクサス門にところ，存在を確認できているのは枯草菌 7 菌株のみで加え，放線菌門，シアノバクテリア門細菌からも，トリある．そこで，腸内細菌を含めた様々な細菌にも同種のプトファンイソプレニル化酵素のホモログが見つかっフェロモンが分泌されていること，宿主（ヒト）に対した．以上の結果から，翻訳後修飾によるトリプトファンても何らかの生理活性を示すことを明らかにする目的で残基のイソプレニル化は様々な細菌に広く見られる翻訳研究を行った．

後修飾の一つである可能性が極めて高いと考えられた．

方法：ペプチドフェロモンを直接探索することは困難であるため，生合成遺伝子に着目したゲノムマイニングを

基質多様性を有するアデニル化酵素の探索とD -アミノ酸ジペプチド生産法の開発行った．ComX のイソプレニル化酵素 ComQ を指標にした相同性検索により，クロロフレクサス門の細菌

木Sphaerobacter thermophilus 由来の sthQ 遺伝子が検出さ

野

邦

器

早稲田大学理工学術院先進理工学部
kkino@waseda.jp

れ，すぐ隣には C 末端から 2，3 番目にトリプトファン
残基を有する短鎖ペプチドをコードする sthX 遺伝子が存在した．そこで，sthQX 遺伝子クラスターのクローニ

目的：ジペプチドは，構成するアミノ酸単体には見られン グ を 行 い，SthQ，SthX を 得 た 後 に，SthQ お よ びない生理活性や物理化学的特性を有し，医薬品原料，健Mg 2+イオン存在下，ドナー基質であるファルネシル二

康食品，化成品原料などとしてその用途は拡大している．

リン酸と SthX との反応を行った．さらに，SthQ の X 線

一方，乳酸発酵製品や醸造食品の中に遊離の D -アミノ

結晶構造解析を行った．

酸の存在と呈味性などが報告されており，キラリティの結果・考察：反応液を LC-MS/MS を用いて分析した結異なる D -アミノ酸から成るジペプチドにも新たな機能

果，SthX の C 末端から 10 残基に相当し，C 末端から 2や特性が存在する可能性が期待できる．本研究では，我々番目のトリプトファン残基がファルネシル化された修飾が開発したユニークな反応システムを利用した D -アミ

デカペプチドが検出されたことから，SthQ がトリプト

ノ酸含有ジペプチドの合成法の高度化を目指し，合成可ファン残基のファルネシル化酵素であることが証明され能な D -アミノ酸ジペプチドの拡張を検討した．

た．続いて，SthQ 単独であるアポ体の結晶と，ドナー方法：これまでに，非リボソーム型ペプチド合成酵素の基質のミミックであるファルネシルチオ二リン酸との複アデニル化ドメイン（ A ドメイン）による基質アミノ酸

合体の結晶について構造解析を行った結果，両者の構造のカルボキシ基のアデニル化と，一方の基質アミノ酸のはほぼ一致した．これは，二箇所の基質結合部位付近にアミノ基による非酵素的な求核置換反応を組み合わせる

通常なら存在するループ構造が短い，もしくは存在しなことで，アミド結合形成が起こり，ジペプチドが生成す

いためであると考えられた．この特徴は SthQ が構造的ることを見出している．後段の求核置換反応は非酵素的に大きなペプチドを基質として受け入れること，ComQ

であるがゆえに D -アミノ酸を含む多様なアミンとアミが基質許容性の極めて高い酵素であることを合理的に説

ド結合を形成し，広範な D -アミノ酸を含むアミド化合明できるため，トリプトファン残基のイソプレニル化酵物が合成可能である．一方，前段の D -アミノ酸をアデ素の特徴と言える．ComQ と相同性のある約 30,000 種

ニル化し得る A ドメインの基質特異性が広がることで類のタンパク質のうち，SthQ と同じ特徴を有するもの

合成可能な D -アミノ酸ジペプチドが拡張できるため，を選別した結果，300 種類程度のホモログが検出された．

D -アミノ酸をアデニル化可能な新規 A ドメインの探索

興味深いことに，その中に ComQ や SthQ は含まれていを行った．

たが，既知の酵素は全く含まれていなかった．また，枯結果・考察：D -アミノ酸をアデニル化可能な A ドメイン

− 199 −

IFO Res.Commun. 33
2019はほとんど報告されていない．そこで，二次代謝産物生Dye-DH が見出され注目されている．DET 型 Dye-DH は，合成機構において基質アミノ酸の立体反転を担うエピメ

酵素内に基質の酸化反応を行う触媒部位と電極へ電子授

リ化ドメインの存在を手がかりとして，新たに取得した受が可能な鉄などを含む酸化還元部位の二つの反応部位

5 つの A ドメインと研究室で保有していたものを含め計から構成されている．この DET 型 Dye-DH は，酵素−

6 つの A ドメインの評価を行った．その結果，Tyrocidine

電極間での電子授受を介するメディエータを必要とせsynthetase の Aドメイン TycA-A が D -Trp，D -Tyr，D -Phe，ず，直接電子の授受を行うことが可能であるため，生体

D -Met ，D -Leu，D -Ala を，Bacitracin synthetase の A ド

成分を起電力とするバイオ電池やバイオセンサなどの酵

メイン BacB2-A と Paenibacterin synthetase の A ドメイン

素機能電極用素子としての応用利用が期待されている．

PbtA1-A および PbtB2-A の 3 つの A ドメインが D -Lys を

しかしながら，DET 型 Dye-DH は，これまで常温性生基質とすることを見出した．次に，TycA-A と BacB2-A

物由来酵素の報告例しか無く，酵素自体も不安定であるをモデルにジペプチド合成を検討した．その結果，DD - ，ため酵素機能電極用素子としての利用は困難である．本DL -，L D - 体といった多様なキラリティのジペプチド，研究では，安定性の高い酵素の報告例が多い超好熱菌か

さらには C 末端に任意の D -アミノ酸を有する 40 種類以

ら DET 型 Dye-DH を探索し，超好熱性アーキアを宿主上のジペプチドの合成が可能であることを明らかにしとした組換えタンパク質発現系を用いて DET 型 Dye-DH

た．組換え大腸菌によるジペプチド合成を検討した結果，の発現と酵素の機能解析を進めることを目的とした．

10 mM の D -Trp から最大 4.67 mM の D -Trp - D -Pro の合成

方法：超好熱性アーキアのゲノム情報より基質を酸化すを達成した．

る触媒活性部位とヘムや鉄硫黄クラスターなどの第二の以上，D -アミノ酸を基質とする A ドメイン探索に対酸化還元部位特有のモチーフを持つ遺伝子を検索しする作業仮説の妥当性を示すことができ，その結果，多DET 型 Dye-DH 候補の抽出を行った．DET 型 Dye-DH

様な D -アミノ酸ジペプチドの効率的合成も可能となり，候補遺伝子について好熱性アーキアタンパク質発現系を我々が開発した新規アミド結合反応システムの有効性を用いて，組換えタンパク質の発現，精製を行いタンパク

実証することができた．

質の同定を行った．
結果・考察：KEGG ゲノムデータベースより DET 型
Dye-DH 候補遺伝子を探索したところ 4 種の超好熱菌か

メディエータレス酵素機能電極用素子を志向した直接電子移動型色素依存性
脱水素酵素の探索と機能解析
里

村武ら 6 つの DET 型 Dye-DH 候補遺伝子を見出すことができた．これら DET 型酵素候補遺伝子について，アーキアを宿主とする組換えタンパク質発現ベクターにそれぞ範

れ導入し Sulfolobus acidocaldarius 内で組換えタンパク福井大学学術研究院工学系部門
satomura@u-fukui.ac.jp

質の発現を行った．これら候補遺伝子の発現産物の酵素活性を測定したところ L -プロリン，D - 乳酸，L - 乳酸を目的：色素依存性脱水素酵素（ Dye-DH ）は人工酸化還基質とする Dye-DH 活性が確認できた．そこで，酵素を元色素存在下でアミノ酸，有機酸，糖などの各種生体成

電極上に修飾しメディエータを添加せずに電極反応の測分の酸化反応を触媒する一群の酵素である．本酵素は，定を行ったところ，電極触媒反応を確認することができ

人工の酸化還元色素をメディエータとすることで基質のた．このことから，今回見出した超好熱菌由来酵素は電電子を電極へ導入することが可能である．近年，この極上で DET 反応を行えることが明らかになった．今後

Dye-DH の中に，メディエータを必要とせず酵素−電極は，この DET 型酵素を用いてバイオエレクトロニクス

間で直接電子授受が可能な直接電子移動（ DET ）型

デバイスを構築していく予定である．

− 200 −

IFO Res.Commun. 33
2019

異株で SAM 高蓄積が観察されたことと一致した．

酵母における S -アデノシルメチオニンの生理機能に関する研究
水沼正

Ssg1 タ ン パ ク 質 は， 薬 剤 排 出 ト ラ ン ス ポ ー タ ー
MATE ファミリーと相同性を有したことから，Ssg1 は樹

SAM 濃度調節に関わることが予想された．まず，Ssg1

広島大学大学院統合生命科学研究科
mmizu49120@hiroshima-u.ac.jpの細胞内局在を調べた結果，Ssg1 は液胞膜に局在した．
興味深いことに，その局在は対数増殖期初期では液胞膜

目的：老化は遺伝的・時間的・環境因子など様々な要因に局在したが，その後定常期以降になるとその局在が消が関係しており多様複雑であると考えられてきたため，失した．さらに，同時に Ssg1 タンパク質量もウエスタ

科学的理解は不十分であった．ところが，カロリー制限

ン解析により調べたが，対数増殖期初期では多く観察さに代表されるように食餌制限が老化・寿命制御の一要因れたが，その後減少していった．現在，Ssg1 は SAM/として見出され，それらが関わるシグナル伝達経路が同SAH の生合成や液胞輸送に関与するタンパク質と予想定され，老化・寿命におけるカロリー制限の効果は世界

し，SAM/SAHトランスポーターとして機能を有するの中で最も解析・理解が進んでいる．我々は，新規寿命延か検討している．

長メカニズムを明らかにするため，酵母を使って野生型
株よりも顕著に寿命が延長した変異株の取得に成功した

細菌の休眠および覚醒の制御機構の解明（変異を SSG1 と命名）．SSG1 変異株はメチオニン代謝産物である S -アデノシルメチオニン（ SAM ）を高蓄積

山

することが分かった．野生型株では SAM の蓄積は殆ど

口

良

弘

大阪市立大学複合先端研究機構
yamaguchi@ocarina.osaka-cu.ac.jp

観察されないことから，SSG1 変異株を用いて，SAM の
生理機能を明らかにすることを目的とした．
方 法：SAM の 細 胞 に お け る 生 理 機 能 を 調 べ る た め，

目的：細菌集団には増殖をしない休眠状態の細菌が存在

SAM 高蓄積株である SSG1 変異株を用いて，マイクロし，定常期やバイオフィルム内のおよそ 1％を占めるとアレイ解析およびメタボローム解析を行った．次に，考えられている．休眠状態の細菌は薬剤などの様々なス

Ssg1 タンパク質自身の機能を明らかにするため，GFP

トレスに強い耐性を示すため，食中毒や感染症などの原を付加させた株を構築し，Ssg1 の細胞内局在などの観因となっている．しかし，その出現頻度の低さから休眠察を行った．

および増殖再開機構の研究は停滞している．近年，細菌結果・考察：まず，マイクロアレイの解析から，野生型

は自身の生育を抑制する toxin およびその毒性を中和す

株よりも SSG1 変異株で 2 倍以上増加した転写産物としる antitoxin の二つのタンパク質から構成される toxin-an-て，メチオニン代謝系の遺伝子群以外にグルコース代謝

titoxin（ TA ）system を有し，この TA system が休眠誘導に関与する遺伝子が多数含まれていた．しかも，グルコーに関与していることが示唆されてきた．既に，大腸菌でス代謝に関わる遺伝子群はカロリー制限で高発現するとは HipA-HipB TA system が休眠誘導に重要であると報告報告されていた遺伝子との重複が認められた．このことされた．しかし，hipA 欠損株は野生株と同等の休眠能から，SSG1 変異株ではカロリー制限模倣株になっていを示すことから，休眠へおよび休眠からの増殖再開にはることが示唆された．さらに，メタボローム解析を行っ

hipBA 以外の因子の関与が示唆されている．我々は，たところ，SSG1 変異株では SAM および S -アデノシル

HipA toxin と相同性を持つ YjjJ を同定し，さらに YjjJ はホモシステイン（SAH ）の増加が認められた．一方，ATP

DNA お よ び RNA 合 成 を 阻 害 し，YjjJ-HipB TA system

およびメチオニンの減少が観察され，これらは SSG1 変を構成することを報告した．HipB-HipA に加えて YjjJ

− 201 −

IFO Res.Commun. 33
2019

が休眠に関与すると推測されたことから，YjjJ toxin の互いに共生関係を保ちながら細菌叢を形成している．ビ

標的，さらには HipB，YjjJ および HipA 間の相互作用

フィズス菌はヒトに優勢な腸内細菌の一種であり，腸内を明らかにし，YjjJ，HipA による休眠および増殖再開

環境の恒常性維持と密接に関連することから重要な研究

機構を解明することを目的とした．

対象である．しかし，ビフィズス菌が腸内でどのように

方 法：Escherichia coli MG1655 ∆yjjJ，hipA お よ び hipB定着するのか，その分子機構は十分に明らかにされていの multiple deletion mutant を作成し実験に用いた．精製ない．我々は，ヒトの便から分離されたビフィズス菌に

His-PrS-tagged YjjJ，His-tagged HipA および His-tagged

Fim 線毛をコードする遺伝子が広く保存されている点に

HipB は Ni-agarose カラムを用いて調製した．DNA 結合着目した．興味深いことに，ビフィズス菌の線毛は，糞便

実験は 0.8％アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル

培養液中で培養した際にのみ，菌体表層に線毛ポリマーを 用 い た EMSA で 解 析 し，YjjJ の DNA 結 合 配 列 は構造を形成した．すなわち，ある種の腸内細菌に由来す

SELEX 法およびゲルシフト法を用いて探索した．

る代謝産物が，ビフィズス菌の線毛を誘導したとの仮説

結果・考察：YjjJ が DNA に結合したことから，YjjJ はを立て，線毛誘導因子の探索と機構解明を目的とした．

DNA 結 合 タ ン パ ク 質 で あ る こ と が 示 さ れ た． ま た，

方法：糞便培養液を遠心分離後フィルター濾過し，活性DNA 結合能を欠失した YjjJ 変異体は生育を阻害しなカラム及び HPLC により分画・精製した．得られた各画

かった．よって，DNA 結合が YjjJ による生育阻害に重分 を GAM 培 地 に 添 加 し，Bifidobacterium longum と 共要であることが明らかとなった．そこで，YjjJ の DNAに培養した．線毛の誘導活性は，ウエスタンブロッティ

結合配列を探索し，25 bp および 26 bp のコンセンサス配ングおよび電子顕微鏡により評価した．標的物質の構造列を得た．興味深いことに，25 bp のコンセンサス配列

決定は，質量分析および NMR 解析により行なった．さには CRISPR のリピート配列の一部が含まれていた．まらに，次世代シーケンサーによる遺伝子発現解析と，た，YjjJ はこれらの配列を含む dsDNA，dsRNA および

Caco-2 や HT29-MTX 培養細胞に対する接着試験を実施

ssRNA と結合することを明らかにした．次に，欠損株した．

を用いて YjjJ の生理的役割を解析した．その結果，yjjJ

結果・考察：糞便培養液から線毛の誘導活性をもつピー

および hipA の二重欠損はアンピシリンに対する感受性

クを分取し，構造解析を行った結果，芳香族アミノ酸のを 6.2 倍増加させたが，yjjJ および hipA 遺伝子の単独欠一種（物質 A ）を同定することに成功した．物質 A を

損は薬剤耐性に影響しなかった．よって，休眠を介した

GAM 培地に添加し B. longum を培養したところ，容量

薬剤耐性には，yjjJ および hipA 両遺伝子が重要であるこ

依存的な線毛のポリマー化を確認することができた．以とが示された．現在，HipB，HipA および YjjJ の 3 者によっ

上より，物質 A は，B. longum の線毛誘導物質であるとてどのように休眠が制御されているか解析中である．

結論づけた．また，物質 A 存在下において，B. longumの線毛関連遺伝子（ fimA ，fimB，srtC ）の発現は顕著に上方制御されたことから，物質 A は，転写レベルで腸内細菌によるビフィズス菌の Fim 線毛のポリマー化誘導因子の探索とその機構解明
西山啓

線毛のポリマー化を誘導したことが確認された．さらに，ヒト腸上皮細胞に対する接着性は，物質 A 存在下

太で顕著に増加した．すなわち，線毛のポリマー化は，
B. longum の接着を促進する重要なプロセスであると考北里大学薬学部，
現 慶應義塾大学医学部
keita.nishiyama@keio.jp

えられた．以上より，概ね実験計画を達成することができた．現在，物質 A の代謝酵素を標的として，物質 A

目的：膨大な数の細菌が生息する腸内において，細菌は産生菌を複数見出している．ビフィズス菌がこれらの腸− 202 −

IFO Res.Commun. 33
2019

内細菌と物質 A を介して相互作用し，腸内での生存を

濃度 100 g/L が至適であった．また，マルトースを主炭有利にするという，新たな共生関係の証明について取り素源とする培地でのジャー培養では培養 25 時間目の菌組んでいる．

体で最大活性が得られた．この洗浄菌体を用いてネロー
ル 1 g/L を含む反応液中（ 20 mM リン酸緩衝液，pH 7.0 ）でネロール配糖体の合成を行った．40 ℃で 72 時間反応

アルキルアルコールを配糖化する
微生物由来の新規配糖化酵素反応の開発
上田を行った結果，1.8 g/L の配糖体が蓄積した．モル収率
は 87.6 ％ で あ っ た．E. adhaerens NBRC100388T の α -グ

誠

ルコシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体は所望の配糖

小山工業高等専門学校物質工学科
mueda@oyama-ct.ac.jp

化活性を示した．精製した酵素の至適 pH は 7.5 付近であり，マルトース以外にスクロースやトレハロース，マ

目的：配糖化は化合物の安定性向上や物性改善に有用でルツロースを加水分解した．配糖化活性の基質特異性をあり，配糖体が有用な生理機能を持つ場合もある．微生

確認した結果，3 級アルコールのリナロールでの配糖体

物酵素の糖転移反応は実用的で，ハイドロキノンやビタ合成を確認した．α - および β - グルコシダーゼによる配ミン C 配糖体合成などに実用化されている．我々は土糖化は 3 級アルコールでは困難であり，CGTase では

壌細菌の α -グルコシダーゼに着目し，アルキルアルコー

tert -ブタノールでの配糖化例が報告されるのみであった

ル配糖化酵素の探索と配糖体の合成検討を行い，生姜活が，本酵素はビールの芳香主成分であり生理機能の報告

性成分 6 -ジンゲロールの配糖化を報告してきた．本研もあるリナロールに対する配糖化が可能であることが明

究は芳香性や生理機能を持つテルペンアルコールを基質

らかとなった．今後は，さらに多様な酵素を取得し，アとし，1 級アルコールのネロールの配糖化検討および 3

クセプターの水酸基の立体選択性や位置選択性等につい

級アルコールのリナロールの配糖化等について検討し，て検討を進める予定である．

有用配糖体合成基盤の確立と酵素の性質解明を進めることを目的とする．

「バイオ還元システム」利用拡大のための補酵素再生系グルコース脱水素酵素の進化工学的改変

方法：ネロールの配糖化は土壌分離細菌 Agrobacterium
sp. M-12 株の洗浄菌体を用い，マルトースをドナーとする糖転移反応により行った．培養は 1 L -ジャーファーメ

片ンターで行い活性菌体を得た．配糖化反応は温度，pH

岡

道

彦

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科
kataoka@biochem.osakafu-u.ac.jpなどの至適条件を決定後，コニカルチューブ中（反応液15 mL ）で行った．形質転換体の作製は，ゲノム公開株
で配糖化活性を有する Ensifer adhaerens NBRC100388T

目的：グルコース脱水素酵素（GDH ）を様々な NAD（P）Hから α -グルコシダーゼ遺伝子（ GH family 13 ）のクロー依存性の酸化還元酵素と組み合わせることにより，効率

ニングを行い，対象遺伝子を pET-19b ベクターに組み込的な還元システムが構築されており，多くの化合物の実

み，大腸菌（ BL21（DE3 ））に導入した．得られた形質

生産プロセスへの応用が期待されている．一方，種々の転換体を超音波破砕し，イオン交換とゲルろ過により酵

酸化還元酵素が存在し，その基質/生成物の物性も含め素精製を行った．酵素活性の測定は TLC と HPLC を用て最適反応条件は様々であるため，還元システムの汎用

い，生成物の同定は NMR により行った．

性を高めるためには幅広い条件下で高い活性を示す

結果・考察：Agrobacterium sp. M-12 株の洗浄菌体によ

GDH の 創 出 が 必 要 と な る．Bacillus megaterium 由 来るネロール配糖体の合成は，40 ℃，pH 7.0，マルトース

GDH は反応性に優れた酵素であるが，酸性領域におい− 203 −

IFO Res.Commun. 33
2019て酵素活性が著しく低下することが確認されている．そ大腸菌エネルギー代謝における解糖系と好気 TCA 経路の使い分け・相互変換スイッチング機構の解明

こで，本研究では，GDH の物質生産における補酵素再生系としての汎用性の向上を目的とし，酸性条件における反応性をはじめとする諸性質が改善された GDH の創田出を試みた．

中寛

東京工業大学科学技術創成研究院
kntanaka@res.titech.ac.jp

方法：ランダム変異導入により，野生型 GDH より酸性領域における活性が高い K179 変異 GDH が見出されことから，K179 飽和変異体を作製し酸性条件下での酵素

目的：グルコースを含む培地で大腸菌を培養すると，グ活性を検討した．さらに，K179 飽和変異体の中で温度

ルコースは他の炭素源の利用を抑制して優先的に消費さ安定性の上昇が見られた K179R 変異体について pH 依存

れるが，これは Inducer exclusion によるグルコース抑性，pH 安定性，温度依存性，熱安定性についても検討

制や cAMP を介した Catabolite repression により説明さした．また，GDH の安定性向上へのアプローチの一例

れてきた．ここで取り込まれたグルコースは解糖系によとして，四量体を構成するサブユニット同士の相互作用

りピルビン酸まで分解され，その大部分はアセチル CoAの強化が挙げられる．そこで，255 番目のセリン残基をを経て酢酸として細胞外に捨てられる．これを酢酸オー

システインに置換することによる B. megaterium 由来

バーフロー代謝と呼ぶ．本助成対象者は以前の研究で，GDH への影響を検討した．

この酢酸オーバーフロー代謝の欠損によりグルコース枯

結果・考察：K179 飽和変異体の pH 5.0 における活性を

渇後に一過的な数時間の増殖停止が起こることを見出し測定した結果，野生型と比較して有意に活性が上昇する

た．cAMP に関わる発現調節はここには関与しておらず，ような変異体は見られなかった．次に，0 ℃及び 37 ℃で新規制御系の存在が示唆されたことから，本研究ではその静置における残存活性測定を行った結果，K179R 変異の分子機構の研究を行なった．

体について，0 ℃，37 ℃静置共に著しい比活性の上昇が方法：本研究では，限定量のグルコースと過剰量のアミ見られた．K179R 変異体について詳細に検討した結果，ノ酸を含む M9 最小培地でのバッチ培養系を用いた．こ

熱安定性については 0 ～ 40 ℃の範囲で残存活性の上昇

こでは最初にグルコースが消費され，順次アミノ酸，一が見られたが，他の性質については野生型と同程度であ旦排出された酢酸の順に炭素源の切り替えが起こる．大ることが明らかとなった．

腸菌の変異株としては KO ライン，遺伝子の過剰発現に一方，S255C 変異 GDH について，野生型 GDH と比は ASK A ラインを用いた．SWATH 法によるプロテオー

較すると全体的な pH 安定性の向上が確認された．しかム解析は東工大・田口英樹教授，丹羽達也助教のご協力

し，酸性領域においても pH 安定性の向上が見られたににより行なった．

もかかわらず，アルカリ領域と異なり酸性 pH 領域での結果・考察：グルコース枯渇前後のタイミングで大腸菌活性上昇は見られなかった．次に，熱安定性については

野生型株，および酢酸オーバーフロー経路を欠く pta 変

37 ℃以上の温度でその安定性の向上が確認された．野異株を回収し，中央代謝経路の酵素タンパク質群を対象

生型 GDH が 37 ℃で大きく残存活性が低下し 50 ℃で完に定量的プロテオーム解析を行なった．その結果，ほと全に失活するのに対し，S255C 変異体は 37 ℃静置後もんどの酵素量に違いが見られなかった一方で，pta 株で0 ℃と同程度の活性を維持しており，50 ℃静置後も約は AceA/AceB タンパク質量（グリオキシル酸経路酵素）

79％の活性を維持していた．温度依存性については，の減少，AceE/AceF タンパク質量（ピルビン酸デヒド

60 ℃以下においては温度依存的に活性が増加すること

ロゲナーゼ:PDH ）の増加が観察された．これらはそが確認された．

れぞれ IclR，PdhR をレプレッサーとするオペロンに含− 204 −

IFO Res.Commun. 33
2019

まれており，共通の調節因子であるピルビン酸濃度の上リン分解酵素の精製を行った．精製した酵素の諸性質の昇を示唆する結果となっていた．さらに，pta 変異株の解析および，酵素の異種発現を検討した．

中で PdhR を過剰発現させる実験を行なったところ，実結果・考察：当研究室ではピペリン資化微生物のスク際にグルコース枯渇時の増殖停止が解消した．従って，リーニングにより，ピペリンをピペリン酸へと分解する

酢酸オーバーフロー代謝の欠損により細胞内にピルビン

No.14 株を単離していた．本研究ではまず，ピペリン酸酸が蓄積し，これにより PdhR の負の制御下にある PDHとともに生じるであろうもう一つの反応産物の同定をの発現が増加することで，グルコース枯渇時の増殖が阻行った．反応溶液にアミン修飾試薬である NBDF を作害されたことが示唆された．

用させ質量分析を行い，もう一つの反応産物はピペリジ

これまでの研究で我々は，PDH と 2 -オキソグルタル

ンであることを同定した．次に，ピペリンをピペリン酸酸デヒドロゲナーゼ（ OGDH ）の活性が競合的に制御とピペリジンに代謝する酵素の精製を試みた．No.14 株

される証拠を得てきた．その一方で，OGDH の欠損株のピペリン分解活性は培養上清に見られたため，培養上ではグルコース枯渇後の増殖が完全に阻害されることも

清より SDS-PAGE 上で単一になるまでピペリン代謝酵

観察している．これらを考え合わせると，酢酸オーバー

素の精製を行い，約 35 kDa の酵素を同定した．本酵素

フロー代謝系の欠損による PDH 発現の上昇は，OGDHのピペリンに対する Km は極めて低いことがわかり，菌の活性化阻害を介してグルコース枯渇後の増殖を阻害し体外酵素である本酵素が環境中の低濃度のピペリンともていることが示唆される．その先で，OGDH がどのよ十分反応できることが示唆された．また，低分子化合物

うにしてこの増殖を制御しているかについては，現在さの酵素活性への影響についてはシステイン修飾試薬や一らなる解析が進行中である．

部のキレート剤が酵素活性を阻害することがわかった．
また，本酵素の N 末端部分アミノ酸配列の情報をもとに No.14 株から本酵素遺伝子を同定した．大腸菌およ微生物由来ピペリン代謝酵素に関する研究
小林

達

び放線菌を宿主として異種発現を試みたが本酵素の発現および活性は菌体内，培養上清ともに検出されなかった．

彦

本研究で同定したピペリン代謝の初発反応を担う酵素

筑波大学大学院生命環境科学研究科
sec.mmb.tsukuba@gmail.com

はピペリンの 3 級アミド結合を加水分解する酵素であった．3 級アミド結合は窒素原子に水素が付加していない

目的：コショウは 16 世紀の大航海時代にインドからアミド結合であり，プロリンのアミノ末端がペプチド結ヨーロッパにもたらされ，現在では香辛料として世界中合を形成する場合にも見られる．プロリンのアミノ末端で用いられている．コショウの辛味成分はピペリンといに見られる 3 級アミド結合は Xaa-Proアミノペプチダー

うアルカロイドである．長期にわたり世界中の人々に食ゼにより加水分解されることが報告されているが，今回され，また，栽培されてきたにも関わらずピペリンがど

我々が発見した酵素は Xaa-Proアミノペプチダーゼとはのように代謝（分解）されるのかを酵素レベルで解明しアミノ酸配列の相同性がない酵素であった．天然低分子

た研究はない．そこで我々はピペリンを資化（分解）す化合物の 3 級アミド結合を分解する酵素はこれまでに報る微生物を探索し，その代謝酵素を同定し機能を解明す

告がなく，天然においてピペリンがどのように代謝されることを目的とした．

ているのかは不明であったが，本研究により初めて解明

方法：ピペリンを単一窒素源とする合成培地で生育する

することができた．

微生物（ No.14 株）から，硫酸アンモニウム沈殿および各種カラムを用いたクロマトグラフィー操作によりピペ− 205 −

IFO Res.Commun. 33
2019の触媒反応機構を提唱した．さらに Cut190 各種変異体

PET 分解酵素の structure-based designによる高機能化と応用に関する研究
織田昌を用いた研究を通じて，Cut190 * 以上に高機能化した変異体を取得するとともに，結晶構造で明らかにした複数

幸の Ca2+結合部位の個々の役割を解明した．また Ca2+結

京都府立大学大学院生命環境科学研究科
oda@kpu.ac.jp

合に伴う安定化の DSC 解析と MD 計算から，安定化が目的：本研究対象の polyethylene terephthalate（ PET ）なったことに起因することを明らかにした．さらに Ca2+

分 解 酵 素 Saccharomonospora viridis AHK190 由 来 ク チ

結合は，他の二価金属イオン結合よりも弱く，この弱いナーゼ（ Cut190 ）について，本研究開始前に解明して結合が，Cut190 蛋白質の運動性を極端に低下させるこ

いた基質複合体以外の基本的な結晶構造情報を利用してとなく，一定の柔らかさを維持し，この柔らかさが活性

structure-based design（ SBD）により高機能化を行い，発現に重要であることが示唆された．

Cut190 蛋白質の運動性低下により，分子内結合が強く

PET 加工や廃 PET リサイクルへの応用を目指した．本
研究では，主に以下の各項目の解明を目的とした．Cut190

藻類のミルキング培養法による省エネ型
バイオ燃料生産プロセスの開発の高機能化変異体の 1 つ S226P/R228S 変異体（Cut190 *）について，基質との複合体の結晶構造を解明する．得ら

大れる構造情報に基づき，活性と安定性をさらに向上させた変異体を創製し，その高機能化要因を解明するととも

田

昌

樹

東北大学大学院工学研究科
附属超臨界溶媒工学研究センター
otam@tohoku.ac.jpに，PET の分解活性を検証する．Cut190 が Ca により2+活性化，安定化することに着目して，その要因を他の金属イオンの影響評価結果も踏まえて解明する．

目的：本研究では，牛からの搾乳のように藻類細胞外産方法：Cut190 各種変異体を，大腸菌発現系を用いて調生オイル（炭化水素）を搾油するミルキング培養法と呼製した．Cut190 * の不活性型 S176A 変異体と各種基質ア

ば れ る 方 法 論 よ り 連 続 式 湿 式 抽 出 法 を 開 発 し た．

ナログの複合体を結晶化し，X 線構造解析を行った．得

Botryococcus braunii は細胞外にボトリオコッセンなどをられた立体構造情報に基づき，分子動力学（ MD ）計算

分泌生産する緑藻であり，生産されたオイルはコロニーに よ り 基 質 結 合 に 伴 う 構 造 変 化 を 解 析 し た．

内に主に蓄積される．顕微鏡観察の際にスライドガラス

Cut190 *S176A の Ca 添加に伴う安定化機構を解明すべを押して圧力をかけるとオイルが外部に浸出する様子をく，示差走査熱量計（ DSC）による解析を行うとともに，観察できる．このように何らかの外力を加えてオイルをCa2+ 以 外 の 二 価 金 属 イ オ ン（ Zn2+，Mn2+，Mg 2+ ） が浸出しやすくさせることで，細胞を生存させた状態でオ

Cut190 * の活性化に及ぼす影響を評価し，等温滴定熱量

イルのみを簡便に抽出できる可能性があり，これを実証

計（ ITC）で得られる各金属イオンの結合熱力学量や，することを目的とした．

円二色性分散（ CD ）測定で得られる熱安定性への影響

方 法： 実 験 は， 筑 波 大 学 よ り 分 譲 さ れ た B. brauniiと比較，検討した．

BOT-22 株（オイル含有率 0.189 g/g-dry algae，藻体平

結 果・ 考 察：Cut190 *S176A と Ca2+ ま た は Zn2+， 及 び

均径 13.5 μm ）を試料として用いた．コロニー径が一般

monoethyl succinate または monoethyl adipate との各複に 50 μm 程度であることを考慮し，さらにコロニーに対合体の結晶構造解析を行った．得られた情報から触媒反して高い剪断力を与えつつライン閉塞がない条件とし応前後と考えられる立体構造を高分解能で決定し，MDて，内径 175 μm，長さ 3 cm のキャピラリーチューブに計算結果とあわせて，金属イオンにより制御される新規培養液を 5 ～ 120 cm3/min で流通させた際の剪断応力を2+− 206 −

IFO Res.Commun. 33
2019

利用してコロニーを解砕した．なお，コロニー解砕の評

リー研究が世界中で推進されている．こういった背景の価はコロニー解砕前後の藻体の円相当径を測定する他，

もと我々は以前，産業的に利用価値の高い“非天然化合

細胞毒性が低いとされる n-heptane を培養液に対して体物”1,3 -ブタンジオールを生成しうる合成代謝経路の設積基準で 5 倍量添加し，20 min，300 rpm にて回分抽出

計・大腸菌内での構築を報告した．本研究では，構築しした後に GC-FID 分析によりオイルを定量して行った．

た 1,3 -ブタンジオール合成代謝経路を拡張することでその際，オイル成分は BOT-22 株の代表的な産生物であ様々な 1,3 -ジオール骨格化合物の発酵生産に活用できる

る炭化水素 C34H58 とし，オイル回収率を用いてコロニー

プラットフォーム経路を開発するとともに，その経路を外に滲出したオイルの抽出を評価した．なお，定量分析

応用し，ロケットプロペラント前駆体として有望なには GC-FID を用いた．

1,2,4 -ブタントリオールを再生可能資源から発酵生産す

結果・考察：高 Reynolds（Re ）数領域ではオイル回収率ることを目的とした．

が著しく向上する一方で，平均円相当径は減少した．こ

方法：大腸菌 BW25113 F ＇ を生産宿主として用いた．生れは藻体に作用する剪断応力によりコロニーが解砕され産培地は，グルコース含む改変 M9 培地を用いた．生産

ることでコロニーに内包されていたオイルが滲出されたは対数増殖期中期に IPTG を添加することにより開始しためと考える．実際，120 cm /min 時に低粒径への明確

た．各有機酸は IPTG 添加時に加えた．培養は 30 ℃で行っな遷移が確認された．以上より，本法の連続式コロニー

た．代謝産物及び出発基質濃度は HPLC により定量した．

解砕法としての有用性が示唆された．本プロセスの将来菌体増殖は 600 nm の吸光度を測定することにより確認

的なスケールアップに向けて，オイル回収率の Re 数依した．

存性の一般化を試みた．流量などの実験条件を変化させ，結果・考察：我々が以前に大腸菌内で構築した 1,3 -ブタ

各 Re 数に対してオイル回収率をプロットすると，オイン ジ オ ー ル 合 成 代 謝 経 路 は，Ralstonia eutropha 由 来

ル回収率は Re 数に対しておよそシグモイド型の曲線でPhaAB，Clostridium saccharoperbutylacetonicum 由来 Bld

表現できることがわかった．以上より，オイル抽出挙動

及び内在性アルコール脱水素酵素で構成されていた．本が本モデルにより予測できる可能性が示唆された．その経路を基盤に，PhaA を幅広いアシル CoA への活性を有

一方で，有機溶剤を用いた接触抽出工程においては，フする R. eutropha 由来 BktB へ変換し，有機酸の CoA 誘

ラッフ層（中間層）を生じない流量比の調整が必要であ

導体化を触媒する Megasphaera elsdenii 由来 Pct を付加

ることがわかった．これより，B. braunii 炭化水素の連する二つの改変を施すことで，目的の 1,3 -ジオール類プ

続式湿式抽出の可能性が示唆された．

ラットフォーム経路を設計した．bktB，phaB，bld，pct

3

を IPTG 誘導型プロモーター支配下に配置した発現用プ
ラスミドを構築し，大腸菌に導入した．まず初めに，

1,3 -ジオール骨格化合物の発酵生産に向けたプラットフォーム経路の構築：
再生可能資源からのロケットプロペラント
前駆体生産への挑戦
片岡尚

Pct の本来の基質であるプロピオン酸とグルコースから生成される 1,3 - ペンタンジオールの生産を試みた．組換
え大腸菌をグルコースとプロピオン酸を基質とした培地
で好気的に培養した．両基質は同時に消費され，48 時

也

間の培養で完全に枯渇した．一方で，生成物として

山口大学大学院創成科学研究科
nkataoka@yamaguchi-u.ac.jp

1,3 - ペンタンジオールが確認された．これは，設計した
1,3 -ジオール類プラットフォーム経路が大腸菌内で機能目的：近年，低炭素社会実現のため，化石資源から産出的に構築されたことを示している．次に，本プラットされる化成品を発酵により生産するバイオリファイナ

フォーム経路の汎用性を実証するべく，プロピオン酸の− 207 −

IFO Res.Commun. 33
2019

代わりにイソ酪酸又はグリコール酸を用いて，同様の方

シュ電極を対極，銀／塩化銀電極を参照極として電圧印法で生産試験を行った．その結果，イソ酪酸を用いた場

加した．その際，アノード室には酸素ガスを導入し，合に 4 -メチル - 1,3 - ペンタンジオール，グリコール酸を

30 ℃の恒温槽内で 12 時間培養を行った．培養後，アノー用いた場合に 1,2,4 -ブタントリオールの生成を確認しド室から液体培地の一部を取り出し，菌数計測した．

た．以上の結果は，構築した合成代謝経路が様々な化学

結果・考察：好気性細菌は酸素を電子受容体として電子骨格を有する 1,3 -ジオール類の発酵生産のためのプラッを体外へ放出する．したがって，アノード反応により，トフォーム経路として活用できることを明確に示してい細菌の代謝が促進されることが予測される．酢酸菌はエた．今後，再生可能資源からグリコール酸を効率的に生タノールを消費して電子を生成し，酸素を水に還元する．

成する経路を加えて付与することで，本研究の目的が達

そこで，H 型電解セルのアノード室に酢酸菌を添加し，成できると期待される．

電気培養を行った．+400 mV 印加して 24 時間培養した
ところ，通常培養（電圧印加無）の 60 倍以上の増殖が見られたが，Bacillus cereus によるコンタミネーション

電気化学的制御によるセルロース
ナノファイバーの高効率合成
椎木が認められた．Bacillus 属の細菌は低 pH での生育が困難であることから，液体培地の pH を 4.3 に調整し，再弘度電気培養を行った．その結果，コンタミネーションは大阪府立大学工学研究科
shii@chem.osakafu-u.ac.jp

見られず，12 時間培養では培養前の 2.5 倍，24 時間培
養では 8.0 倍の増殖が見られた．一方，通常培養では，1.1

目的：バイオリファイナリの観点から，セルロースナノ～ 1.3 倍の増殖にとどまった．このように，電圧印加のファイバーを用いた新しい材料の開発が注目されてい有効性が見られたことから，印加電圧について検討をる．セルロースナノファイバーは，植物や微生物などの行った．+800 mV 印加したところ，12 時間後には培養

バイオマスから取得され，軽量でありながら高い機械強

前の 3.5 倍に増殖した．一方，－400 mV 印加した場合，度や耐熱性など優れた特性を有する．しかしながら，植通常培養と同程度であった．これらのことから，アノー

物由来のナノファイバーは加工性に乏しく，成形の際，ド反応により，酢酸菌の増殖が促進されることが分かっ

機械的粉砕による微細化を要するため，本来の優れた特た．本研究により，酢酸菌によるセルロースナノファイ性とのトレードオフとなる．一方，酢酸菌（ Acetobacter

バー合成の効率化が期待される．

xylinum ）はグルコースを摂取して酵素複合体からセルロースを排出し，ボトムアップ的にナノファイバー構造

サンゴ共生藻における宿主非依存的な光合成産物の分泌に関わる
環境応答シグナル経路

体を形成する．したがって，培地形状に則した構造体の取得が可能であり，ナノファイバーの特性を損なうことなく活用できる点で優位である．本研究では，酢酸菌の丸

代謝系を電気化学的に解釈し，電位制御によるセルロー

山真一朗

東北大学大学院生命科学研究科
maruyama@tohoku.ac.jp

スナノファイバーの高効率合成を目的とした．また，金属ナノ構造体との複合化について検討し，新しいセル
ロースナノファイバーの応用の探索も目的とした．

目的：褐虫藻は，Symbiodiniaceae 科に属する単細胞渦

方法：酢酸菌を含む液体培地（ pH 6.5 ）を H 型電解セ

鞭毛藻で，造礁サンゴ等の刺胞動物に細胞内共生し，特ルのアノード室に，リン酸緩衝生理食塩水をカソード室に貧栄養の熱帯海洋環境において生物多様性を支える重に充填した．グラッシーカーボン電極を作用極，白金メッ

要な生態的ニッチを占める．こうした共生成立機構を解− 208 −

IFO Res.Commun. 33
2019

明するためには，褐虫藻が刺胞動物細胞内に共生していに行っていると一般的には考えられていたが，本研究にる時としていない時での生理的変化，共生の不安定化とより，一種の酸性ストレス環境下で生理機能が低下する崩壊（「白化」現象とも呼ばれる）を引き起こす環境スのを補う補償機構として働く可能性が示された．今後は，トレスに対する微細藻類側の環境応答などを理解する必pH と糖輸送活性との関係を生化学的に検証することに要があるが，未解明な点が多く残されている．本研究でより，宿主動物とは独立した，シンプルな微細藻類の環は，褐虫藻を擬似的に共生状態を模した条件で培養し，境応答としての糖代謝制御機構が明らかになると期待さそれに応答して起こる生理的・代謝的・遺伝子発現的変れる．

化を通して，共生において微細藻類が果たす役割を分析することを目的とした．
方法：褐虫藻の代表的な無菌培養株 Breviolum sp. SSB01

嫌気環境での高効率キシロース発酵に向けた
Spathaspora 属酵母のキシロース代謝
遺伝子群の機能解析

株を，宿主刺胞動物の細胞内の食胞環境を模した酸性条件で培養し，宿主動物が共在しない単独培養の「共生ミ笹ミック」褐虫藻を生育させる系を構築し，微小酸素発生量
測定法を用いた光合成活性解析や Illumina NovaSeq6000

野佑

大阪大学大学院工学研究科，
現 崇城大学生物生命学部
sasano@bio.sojo-u.ac.jp

シーケンサを用いた RNAseq 法による遺伝子発現変動解析などを行った．
結果・考察：過去の研究で，酸性条件（ pH 5.5 ）で単独

目的：食料と競合しないバイオマス原料として草本木質培養した場合にグルコース分泌の亢進が検出されたこと系原料からのバイオエタノール生産が望まれている．こから，これを元に，環境の酸性化に応答した糖分泌シグのためキシロースの効率的な発酵が重要である．しかし，ナル経路を解析するため，褐虫藻を単独培養し，通常条

従来知られているキシロース発酵性酵母は，キシロース

件と酸性条件の IMK 培地にてそれぞれ培養した後，グを代謝するために酸素が必要であるという特徴があり，

ルコース分泌に差が見られた 24 時間後に藻体を回収し，発酵液中の酸素濃度を厳密に制御する必要から培養制御

RNAseq による遺伝子発現解析を行なった．通常培地への困難さ及び設備コスト増につながるという問題があっの置換では少数の遺伝子が発現変動するに留まったのにた． 近 年 単 離 さ れ た 子 嚢 菌 酵 母 Spathaspora passali-

対し，酸性培地に交換した場合には 200 遺伝子ほどにおdarum は，嫌気条件においてもキシロースを効率的にいて有意な発現レベルの変動が見られ，これらの遺伝子

発酵することが出来るという大きな特徴がある．本酵母

群を Gene Ontology 解析により機能的比較分類を行なっは真菌類にみられるキシロース代謝経路の酵素遺伝子のたところ，光合成やリボソーム（翻訳機能）に関わる遺パラログが 2 コピーずつ（ XYL1.1，XYL1.2 ，XYL2.1，

伝子群が顕著に発現変動していることが分かった．また，

XYL2.2 ）ゲノム上に存在するユニークな特徴があるが，細胞外からの炭酸イオンの取り込みに関わるトランス

それぞれの遺伝子の役割は分かっていない．そこで，本ポーターや，葉緑体膜に局在し，葉緑体内から細胞質へ酵母が嫌気条件においても効率的に発酵出来るメカニズの糖（三炭糖または六炭糖）の輸送に関わるトランスポー

ムを，キシロース代謝経路の重複遺伝子の機能に着目しターなどが発現量変動を示していた．一方，微小酸素発て解明することを目的とした．

生量測定を基にした光合成活性の計測を行ったところ，

方法：2％グルコースまたは 2％キシロースを単一の炭酸性条件では活性が有意に減少することが示された．こ素源として含む培地において，通気条件を好気と嫌気のれまでグルコース分泌は，共生体が宿主とのコミュニ両条件で XYL 遺伝子の転写量を解析した．転写量の解ケーションの一環，あるいはは栄養分供給として能動的

析方法は各培地において培養した菌体を回収，RNA を− 209 −

IFO Res.Commun. 33
2019

抽出した後，各 XYL 遺伝子の転写量をリアルタイムが頓挫することも少なくない．特に遺伝子組換え体の取PCR により測定した．また，XYL 遺伝子の破壊株の作得には，遺伝子導入操作の後，導入効率が不明のまま数

製は著者らが以前に確立した，エレクトロポレーション

週間培養を行うため非常に時間がかかる．本研究ではこ法による方法を用いた．

の問題を解決するため，酸素を必要としない蛍光タンパ

結果・考察：炭素源がグルコースの培地においてはどのク質をマーカーとし，フローサイトメーター（ FCM ）XYL 遺伝子も転写が誘導されなかったのに対して，キにより遺伝子導入に成功した細胞を検出・分画するシス

シロースの培地ではどの遺伝子も転写が増加した．特に，テムの開発を目的とした．

グルコース培地条件と比較して XYL1.1 は好気条件で約方法：通性嫌気性細菌である大腸菌と，偏性嫌気性細菌

27 倍，XYL1.2 は嫌気条件で約 65 倍転写量が増加した．

である Geobacter sulfurreducens PCA 株をモデルとして実

このことから，好気条件では主に XYL1.1，嫌気条件で験を行った．マーカーには flavin mononucleotide-based

は主に XYL1.2 を発現することで，どちらの環境においfluorescent proteins の 一 種 で あ る Evoglow（ evocatal ）ても迅速なキシロース資化が可能になっていると考えらを使用した．FCM には MoFlo XDP（ Beckman Coulter ）れた．

を使用したが，FCM での分取中に細胞が酸素に曝露ささらに，4 つの XYL 遺伝子の単一破壊株を構築した．

れるのを極力抑えるため，FCM 全体を覆うことのでき作製した破壊株をグルコースまたはキシロース培地で好るビニールチャンバーを作製し，内部を窒素ガスで置換

気と嫌気の両条件において生育を測定した．その結果，して使用した．

好気的条件下においても嫌気的条件下においても結果・考察：本研究で作製したビニールチャンバーを使

XYL1.2 と XYL2.1 遺伝子破壊株の生育は野生型株より用したところ，FCM 使用時にチャンバー内の酸素濃度も弱いことが分かった．また，本酵母の XYL 遺伝子をを 5 ％ 程 度 ま で 下 げ る こ と が で き た． こ の 条 件 で様 々 な 組 み 合 わ せ で 出 芽 酵 母 に 発 現 さ せ た と こ ろ，G. sulfurreducens PCA 株の細胞画分を分取し，培養後にXYL1.2 と XYL2.1 遺伝子を導入した株が嫌気条件での生育したコロニー数から生残数を算出したところ，好気

キシロースからのエタノール発酵の能力が最も高かっ

条件下で分取した場合と比べて 2 ～ 5 倍程度の改善が見た．以上の結果より，4 つの XYL 遺伝子の中でも，少られた．この結果から，本研究で整備した装置は偏性嫌

なくとも嫌気条件においては，XYL1.2 と XYL2.1 が主気性細菌の細胞分取に適していると考えられた．次に，3 種

要な働きをしている遺伝子であると考えられた．本研究の Evoglow（ Evoglow-Bs1，Evoglow-Bs2，Evoglow-Pp1 ）の成果は，嫌気条件での効率的なキシロース発酵技術のを 大 腸 菌 と G. sulfurreducens PCA 株 内 で 発 現 さ せ，開発に繋がるものと期待される．

FCM で蛍光強度を測定した．大腸菌において lac プロ
モーター下で発現させたところ，Evoglow-Pp1 のみで細胞分取の指標として用いることができる程度の蛍光強度

嫌気的環境汚染物質分解菌の遺伝子導入・破壊系の開発
野尻秀が確認された．SDS-PAGE の結果からは，Evoglow-Pp1の発現量が他に比べて多いことが確認された．一方，昭

G. sulfurreducens PCA 株では Evoglow の蛍光を検出する

東京大学生物生産工学研究センター
anojiri@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

ことができなかった．大腸菌の結果と併せて考えると，細胞内の発現量が不十分であったと推察される．

目的：一部の嫌気性細菌は地下水や土壌などの汚染浄化

今後，本システムを様々な嫌気性細菌に適用するためにおいて重要な役割を果たすが，遺伝子工学ツールの開には，FCM 分取時のチャンバー内の酸素濃度をさらに発や遺伝子機能解析が遅れているため，研究開発の試み

下げること，対象とする細菌種に適したプロモーターと− 210 −

IFO Res.Commun. 33
2019組み合わせた遺伝子カセットを作製し，Evoglow の発現した後，16S rRNA 遺伝子アンプリコン解析を行った．

量を十分確保することが重要であると考えられる．特にその後，微生物群の存在比を基に，スピアマンの順位相チャンバー内の酸素濃度については，FCM 用のシース

関係数を算出した．バルキング原因微生物の形態観察は，液を脱気した後に数週間嫌気条件下で静置するなど，方16S rRNA に 特 異 的 な DNA プ ロ ー ブ を 用 い た in situ

法論を確立していく必要がある．将来的には，未だ遺伝

DNA-hybridization chain reaction（HCR ）法によって行っ

子組換え手法が確立されていない嫌気性細菌にも上述のた．健全なグラニュール汚泥切片におけるバルキング原

実験系を適用し，遺伝子組換え体の効率的な取得が可能

因菌の空間分布は，Fluorescence in situ hybridization 法になるか評価を行うことで，嫌気的環境汚染物質分解菌により評価した．バルキング原因菌の分離・培養は，希の遺伝子機能解析を加速することが可能になると期待さ釈培養法やロールチューブ法を用いて行った．

れる．

結果・考察：健全なグラニュール汚泥と比較して，1 種の嫌気性バルキング汚泥では，ユリアーキオータ門（ 2種），クロロフレキシ門（ 2 種）およびプロテオバクテ

嫌気性バルキング原因菌の微生物機能情報の解明と高速メタン発酵リアクターのバルキングメカニズムの理解
山田剛

リア門（ 3 種）に属する微生物種が統計的に有意に増加
したが，他方では，クロロフレキシ門（ 3 種）のみであった．嫌気性バルキング汚泥に対して in situ DNA-HCR 法史を適用した結果，メタノサエタ属アーキア（ユリアーキ

豊橋技術科学大学大学院工学研究科
tyamada@chem.tut.ac.jp

オータ門）とアナエロリネア綱細菌（クロロフレキシ門）
は糸状性であることがわかった．スピアマン順位相関係

目 的： 高 負 荷・ 高 速 運 転 が 可 能 な Expanded granular数に基づき，バルキング原因菌の異常増殖の要因は，運

sludge bed（ EGSB）リアクターの普及や適用廃水種の転条件や環境要因の同一の変化であることも示唆され拡大に伴い，未だ認知されてない問題が確認されてきてた．バルキング原因菌の空間分布調査の結果，アナエロいる．とくに深刻な問題は，糸状性微生物の異常増殖にリネア綱細菌は，糖のような発酵過程の比較的初期の有よるグラニュール汚泥が突発的に浮上・流出する嫌気性機物を利用することが示唆された．さらに，バルキング

バルキングである．ひとたび，嫌気性バルキングが発生

汚泥を植種源とした集積培養では，グルコースと酵母抽すると，リアクターを停止せざるえない事態になる．し出液を用いることで，当該アナエロリネア綱細菌を優占かしながら，その発生メカニズムはおろか原因菌すら不させることにも成功した．

明であり，即効性の高い対策が立てられずにいる．先行研究では，EGSB リアクター外に流出したフロック状汚鉄還元菌の多環芳香族炭化水素
嫌気性分解代謝系の解明

泥の大部分を構成する糸状性微生物が，嫌気性バルキン
グに関与することを明らかにした．嫌気性バルキングの井

発生メカニズムを推定するため，本研究では，バルキン

上

謙

吾

宮崎大学農学部
kinoue@cc.miyazaki-u.ac.jp

グ原因菌を同定するとともに，微生物機能情報を明らかにすることを目的とした．
方法：高濃度食品系有機性廃水を処理する実規模の中温

目的：多環芳香族炭化水素は毒性，難分解性を持つ．こ（ 37 ℃）EGSB リアクターより，採取時期の異なる嫌気れまでの多環芳香族炭化水素の微生物分解に関する研究

性バルキング汚泥（ 2 種）と健全なグラニュール汚泥（ 2は主に好気的分解について進められており，嫌気的に分種）をそれぞれ採取した．4 種の汚泥より DNA を抽出解する微生物，嫌気性分解代謝経路に関する知見は極め− 211 −

IFO Res.Commun. 33
2019て少ない．そこで，本研究では，鉄還元菌による嫌気的な pH を検討したところ，YPY02 株，YPY03 株，YPY04

な多環芳香族炭化水素分解代謝経路を明らかにすること

株ではアルカリ性の培地（pH 11 ）でも生育が可能であっを目的とした．

たことから，これらの株が耐アルカリ性菌でもあること

方法：代表的な多環芳香族炭化水素であるフェナントレ

が示唆された．これらのピレン分解菌のうち，YPY02

ンとピレン，それぞれが唯一の電子供与体，不溶性の酸株と YPY04 株は酸化鉄（III）だけでなくフマル酸も電子化鉄（III）
が電子受容体となる嫌気的培地を用い，自然界受容体として生育可能であることが明らかになった．

から採取したサンプルを植種源として集積培養を行った．集積培養液からそれぞれの基質を含む寒天プレート

陸生カニ消化管より得られた
微生物コンソーシアのセルロース・
リグニン分解機序の解明とメタン発酵前処理への応用（基質の不溶性によって白濁）を用いて単離を試みた．
基質の分解能力はコロニーの周りに基質の分解を示すク
リアゾーンが形成されるかどうかで判定した．得られた分解菌については，市販の培地や最少培地を用いて生育

馬

可能な条件を探索した．液体培地での生育が観察できた

場

保

徳

石川県立大学生物資源工学研究所
ybaba@ishikawa-pu.ac.jp

株については，ゲノム抽出後，16S rDNA 配列の決定による属種の同定を行った．分離した株の鉄還元能力は，酸化鉄（III）
を含む培地で培養後，フェロジン法を用いて目的：セルロースおよびリグニンは，地球上に最も多く

経時的に生成 Fe 濃度を測定することで評価した．また，存在する天然高分子であり，難分解性である．とくに，単離株が利用できる電子受容体などについても検討を嫌気下では分解され難く，これらを含む紙類や野菜残さ行った．

の可溶化が，メタン発酵の課題として残されており，リ

結果・考察：集積培養とそれに続く単離操作により，2

グノセルロースを分解する前処理法の開発が求められて株のフェナントレン分解菌と 4 株のピレン分解菌の取得いる．そこで私たちは，落ち葉・木片を食べるアカテガに成功した．フェナントレン分解菌のうち 1 株（ YPH02

ニの消化管には，セルロースやリグニンを分解する微生株と命名）は Clostridium 属，ピレン分解菌（ YPY02 株，

物が存在することを期待し，紙入りの液体培地を使用し

YPY03 株，YPY04 株，YPY05 株と命名）は Clostridium

た集積培養を試みたところ，紙を解繊する微生物群集を属，あるいは Sporomusa 属に分類される細菌であった．

得た．本研究では，メタン発酵前処理への応用を目ざし

フェナントレン分解菌 YPH02 株は市販の栄養培地で旺て，アカテガニ消化管微生物群集がどのような機序で紙盛に生育することができ，その生育速度も早く，嫌気条を解繊するのか明らかにすることを目的とした．

件下，約 24 時間でプラトーに達した．酸化鉄（III）の還方法：微生物群集構造解析は，カニの消化管内容物から元能力を調べたところ，フェナントレンを電子供与体，DNA を抽出し，16S rDNA および ITS 領域を増幅した後，酸化鉄（III）を電子受容体として，酸化鉄の還元を示す

次世代シーケンサー MiSeq に供した．得られた配列情Fe が生成されたことから，YPH02 株は鉄還元能力を持

報は QIIME software により解析した．RNA-seq はカニ

つ フ ェ ナ ン ト レ ン 分 解 菌 で あ る こ と が 確 認 で き た．

の消化管から RNA を抽出し，北海道システムサイエン

YPH02 株はフェナントレン以外にも，ベンゼン，乳酸スに外注した．セルロースおよびリグニン分解微生物のを電子供与体とする培地で生育したが，トルエン，酢酸

分離は，好気もしくは嫌気条件下にて，CMC–congo

を電子供与体とする培地での生育は芳しくなかった．

red およびリグニン試薬を寒天培地に添加し，これらに

2+2+ピレン分解菌 4 株のうち，3 株のみ 5 倍希釈した変法
GAM 培地で嫌気的条件で生育が確認できた．生育可能

ハロが形成されることを指標に実施した．
結果・考察：得られた集積培養物は植え継ぎとともに紙− 212 −

IFO Res.Commun. 33
2019の分解能を失った．培養条件検討の一助とするため，接種源であるカニ消化管内容物の微生物群集構造解析を実施するとともに，宿主（カニ）由来酵素がリグノセルロー
ス分解に寄与している可能性を考え，宿主の RNA-seqを実施した．その結果，Penicillium や Aspergillus などのリグニンおよびセルロース分解性好気性真菌と，セロビ
オース，単糖および芳香族化合物を利用する好気性細菌が検出され，嫌気性微生物はほとんど検出されなかった．
一方，宿主の RNA-seq の結果，宿主自身もリグノセル
ロース分解に関与することが示唆された．以上より，カ
ニ消化管内では，宿主自身の酵素および好気性真菌によりリグノセルロースの分解がおき，細菌はその分解物を利用しているものと考えられた．また，菌叢解析の情報に基づき，好気性真菌用の培地を用いることで，本研究で検出された好気性リグノセルロース分解真菌を実際に分離することにも成功した．一方，分離源が消化管にもかかわらず，嫌気性リグノセルロース分解微生物はまったく分離されず，この結果は次世代シーケンスで得た菌叢解析結果と矛盾しなかった．今後は，本研究で得られた集積培養物および分離株を，メタン発酵前処理に利用
し，リグノセルロースからのメタン発酵効率化を目ざす．

− 213 −

平成 28 年度若手研究者助成の研究報告
助成期間:平成 28 年 4 月～平成 31 年 3 月

IFO Res.Commun. 33
2019

結果・考察：合計 28 OTU が認められ，子実体採集，分環境 DNA メタバーコーディングにより可視化された祖先的な木材腐朽性
きのこ類の多様性と見えない未知系統
白水離培養，環境 DNA 解析でそれぞれ 10，10，27 OTU を検出した．このうち，環境 DNA 解析が子実体のみで検出された 1 OTU を除くすべての OTU を検出した．系統

貴推定の結果，環境 DNA 解析が最も多様な系統を検出し

国立科学博物館植物研究部，
現 三重大学大学院生物資源学研究科
shirouzy@gmail.comていることが分かった．これらの結果から，今回比較した 3 つの方法の中では環境 DNA 解析が最も包括的な多様性検出法であることが確認された．また，子実体では目的：真菌類は陸上生態系における寄生者や共生者とし検出されず分離培養や環境 DNA 解析でのみ検出されるて様々な動植物と相互作用ネットワークを構築するとと未知系統が複数確認され，一部は系統樹上で初期に分岐もに，強力な分解者として物質循環の要を担う生物群でする進化研究上重要な系統であることが示唆された．こある．一方，150 万種とも 1000 万種ともいわれる多様の結果から，子実体の目視による多様性探索では大型の性の大部分が未知の状態にあり，この情報不足が進化生

子実体を形成しない重要系統を見落としてきた可能性が態学的研究の障壁となっている．真菌類の多様性探索は，指摘される．得られた結果に基づき，各検出方法のバイ

古くは子実体採集に始まり，人工培地を用いた分離培養，アスを考慮した効率的多様性探索，見えない未知系統を

DNA メタバーコーディングに代表される環境 DNA 解析

加えたアカキクラゲ類の系統仮説，記載分類的アプローと，技術の進歩とともに発展してきた．これらの方法に

チと環境 DNA 解析的アプローチの両方の視点から見たはそれぞれ一長一短があり，研究目的に合った方法を選

菌類多様性について考察した．

択する必要がある．しかし，これら 3 つの方法の比較や効率的併用についてはほとんど検討されていない．本研
究では，祖先的な木材腐朽性きのこ類であるアカキクラ
ゲ類の包括的な多様性探索と系統仮説の補強を目的とし，子実体採集，分離培養，環境 DNA 解析を併用した調査を行った．
方法：調査地は筑波大学山岳科学センター菅平実験所（長野県菅平高原）のアカマツ林とした．林内にプロット 1（林齢約 45 年）とプロット 2（林齢約 70 年）を設定し，2016 年～ 2018 年の 3 年間毎年 5 月，7 月，9 月，
11 月にアカキクラゲ子実体とアカマツ枯死枝を採集した．子実体から DNA 抽出を行い，PCR 後サンガー法にて LSU rDNA 配列を得た．アカマツ枯死枝は粉砕後，改変 Dilution-to-Extinction 法による分離培養に供試した．アカマツ枯死枝から DNA を抽出し，アカキクラゲ用プライマーにて PCR 後 MiSeq にて LSU rDNA 配列を得た．配列データは類似度 97％でクラスタリングし
OTU（ Operational Taxonomic Unit ）とした．系統推定には RAxML ，群集解析には R を用いた．
− 215 −

助成研究のその後

IFO Res.Commun. 33
217-220, 2019

大腸菌表層ストレス応答：
インプットとアウトプットに働くプロテアーゼの機能秋

山

大腸菌を含むグラム陰性細菌の細胞は，細胞質を囲む内膜（細胞質膜）とその外側の外膜という二重の膜構造

芳展の研究をおこなった3．本稿では，助成研究の成果とその後の研究経過について概略を紹介する．

により覆われている．これら二つの膜に挟まれた領域をE

ペリプラズム空間と呼び，ここにはペプチドグリカン層

σ 表層ストレス応答経路の誘導に関わる
RseP の基質認識・選別機構が存在する．これら細胞表層構造は，単細胞生物である大腸菌にとって「個」と外界を分ける境界であり，生息環境に存在する有害物質に対する障壁として働く一方，
外界と細胞との間で様々な物質や情報を選択的にやり取σ E 表層ストレス応答に関わる転写因子（ σ 因子）である σ E は，通常は 1 回膜貫通型タンパク質 RseA の N 末りする場として重要な役割を持つ．細胞外環境の大きな端側細胞質ドメインに結合して「不活性」状態に保たれ変化や表層構成因子の生合成過程の異常は，細胞表層のているが，細胞が異常外膜タンパク質の蓄積などの表層構造や機能にダメージを与え，それが，細胞機能，ひいストレスにさらされると，まずペリプラズム側に活性部ては細胞の生存自体に深刻な影響及ぼすこともある．細位をもつ膜プロテアーゼ DegS が活性化されて RseA を

胞はこのような，細胞表層の異常（ストレス）に対応す

ペリプラズム側領域で切断し，これを引き金としてるために，複数の「表層ストレス応答システム」を備え

RseP が RseA の膜貫通領域を切断する4,5,6,7．RseP は膜ている1,2．その中で，σ E 表層ストレス応答経路は，主内切断プロテアーゼの一つで，疎水的な膜内部で基質ポとして外膜の機能・構造の維持に関わっており，高温なリペプチドを加水分解するという特徴を持つ．RseP にどに起因する外膜の異常に応答して，外膜タンパク質のよる切断を受けると RseA 細胞質ドメインと σ E の複合体合成を抑制し，また，プロテアーゼや分子シャペロンをは膜から離れ，最終的に RseA 細胞質ドメインが細胞質含む細胞表層機能や構造の維持に関わる様々な遺伝子のプロテアーゼにより分解されて，σ E がストレス応答遺発現を誘導する．我々は，σ E 表層ストレス応答経路に伝子の転写に働く8．RseP は，DegS による切断で生じおけるプロテアーゼの関与に注目して研究を進めておた「 RseA 分解中間体」を切断するが，DegS による切り，2012 年度発酵研究所の大型研究助成を受けて，ス

断をスキップして全長の RseA を直接切断することは出トレスシグナルの細胞内への伝達（インプット）に関わ来ない4,5,6．DegS は表層ストレスのセンサーとして働る S2P ファミリー膜内切断プロテアーゼ RseP と，スト

くため，これは，ストレスに応じた σ E の活性化を保証

レス応答により誘導されて外膜タンパク質の品質管理するための重要な性質である．我々は本助成研究におい（アウトプット）に関わるプロテアーゼ BepA に関してて，RseP の PDZ ドメインに焦点を当ててその機能・構造の解析を行い，全長 RseA は，そのペリプラズムドメ

著者紹介:京都大学 ウイルス・再生医科学研究所教授
E-mail:yakiyama@infront.kyoto-u.ac.jp
共同研究者（順不同）:秋山光市郎1，岩間（舛井）千草1，大門
康志1，檜作洋平1，水野慎也1，宮﨑亮次1，森博幸1，
禾晃和2，塩田拓也3，Trevor Lithgow 3，鈴木健裕4，
堂 前 直 4 ， 岩 木 薫 大 5 ， 桜 田 洋 人 5 ， Mohammad
Shahrizal 5，田中良樹 5，塚崎智也 5，中山慎太郎 5，
成田新一郎6，上久保裕生7，林有吾71（ 京都大学 ウイルス・再生医科学研究所，2 横浜市立大学大学
院 生 命 医 科 学 研 究 科，3 Department of Microbiology, Monash
University，4 理化学研究所環境資源科学研究センター，5 奈良
先端科学技術大学院大学先端科学技術研究科，6 盛岡大学栄養科学部，7 奈良先端科学技術大学院大学物質創成科学研究科）

インが RseP のペリプラズム PDZ ドメインと立体障害を起こすため，RseP 膜ドメイン内部に存在するプロテアー
ゼ活性部位にアクセスできないが，DegS によりペリプ
ラズムドメインを切断された RseA は RseP 活性部に到達し切断され得るようになること，即ち，PDZ ドメイ
ンが基質ペリプラズム領域に対する「サイズ排除フィル
ター」として働くことで基質の選別をおこなうことを提唱した9,10（ Fig. 1,(1)）．しかしながら，RseP の基質認識・選別がこの機構のみで説明できるのかは不明であった．
【最近の進展】RseP を含む S2P ファミリープロテアー
ゼは，一般に 2 型膜タンパク質（ N 末端を細胞質に，C− 217 −

秋

山

芳

展

末端をペリプラズムに配向する 1 回膜貫通型タンパク

基質膜貫通領域の特異的な認識にも関わる事が示唆され質）を基質とする．我々はこの性質を踏まえてスクリーた（ Fig. 1,(2)）11．膜タンパク質の膜貫通領域が通常とニングを行い，新たな基質を見出しその解析を進めている α ヘリックス構造はプロテアーゼによる切断を受けにるが，その過程でペリプラズム領域を殆ど持たない 2 型

くい．我々の結果は，基質の膜貫通領域は伸びた状態で，膜タンパク質であっても，RseP による切断を受けない

恐らくは β ストランド付加機構により MRE β-loop の βものが存在すること見出した．即ち，上述のサイズ排除

ストランドと相互作用し，活性部位へと提示されて切断フィルター機構以外に，基質を認識・選別するための機をうけることを示唆するものである．さらに，MRE構が存在することが示唆された11．RseP の全体構造は未だ不明だが，古細菌のホモログ mjS2P はその構造が明β-loop に隣接し，RseP を含む S2P ファミリー膜内切断
プロテアーゼで保存された領域（ C1N 領域と名付けた）らかになっている12．mjS2P では，膜平面内部に位置すも部分的に膜に埋もれた配置を取り，直接基質膜貫通領る活性部位に隣接して，2 本の β ストランドからなるルー域と相互作用すること，その変異により基質の切断が阻プ構造（ MRE β - loop と命名）が存在しており，RseP に害されることもわかった（ Fig. 1,(3)）13．MRE β-loop の

おいてもこの構造が保存されているものと予測された．

変異と C1N 領域の変異を組み合わせた実験等から，基我々は，この領域が基質認識に関与する可能性を考えて質はまず C1N と相互作用し，その後に MRE β-loop に受解析を進めた．その結果，MRE β - loop は，基質の切断

け 渡 さ れ る も の と 考 え ら れ る． こ れ ら の 結 果 か ら，に必須であり，この領域が直接基質の膜貫通領域と相互RseP の基質は，PDZ ドメイン，C1N 領域，MRE β-loop

作 用 す る こ と， ま た 種 々 の 基 質 膜 貫 通 領 域 や MREにおける複数のチェックポイントを順次経て認識・選別

β - loop の変異を組み合わせた解析から，MRE β -loop がされ，切断されるものと考えている（ Fig. 1 ）．これら

Fig. 1.

Selective substrate recognition by RseP

− 218 −

大腸菌表層ストレス応答：インプットとアウトプットに働くプロテアーゼの機能の領域が実際にどのようにして基質を認識するのか，如示した14．しかしながら，BepA が如何にして LptD や

何にして基質切断のキネティクスに寄与しているかを理BAM 複合体と相互作用し，その分子シャペロン様機能

解するために，さらに詳細な構造学的及び速度論的解析とプロテアーゼ機能が如何にして使い分けられるのか等

等を進める予定である．

の詳細は不明であった．
【最近の進展】アミノ酸配列の特徴から，BepA は N

ペリプラズムプロテアーゼ BepA の構造と機能

末端側にプロテアーゼドメイン，C 末端側に TPR ドメ

σ E 表層ストレス応答により複数の細胞表層プロテアーゼの発現が誘導されるが，そのうち BepA（旧名タンパク質間相互作用に関わる事からこの領域に注目

YfgC）の具体的機能については不明であった．我々は，るために，TPR ドメイン全体を標的として，部位特異本助成による研究で，BepA が外膜タンパク質 LptD の的 in vivo 光架橋実験を行った17．部位特異的 in vivo 光

成熟化と分解の両方に関わる多機能タンパク質であるこ架橋法では，生細胞内でタンパク質間相互作用をアミノとを明らかにした14．LptD は外膜の β バレル型タンパク

酸残基レベルの分解能で解析することができる．この解質であり，リポタンパク質 LptE と複合体をつくって，

析から，TPR ドメインは LptD や BAM 複合体と架橋さリポ多糖（ LPS ）の外膜表層（外葉）へのアセンブリー

れることが示され，これらとの相互作用に働くことが示過程に働く ．LptD は，その生合成の途上では，LptE

唆された．また，架橋部位の変異解析などから，この相と複合体を形成した「成熟型 LptD 」とは異なるジスル互作用が BepA の分子シャペロン様機能，プロテアーゼ

フィド結合を持つ「中間体構造」をとり，ジスルフィド

機能いずれにも重要であることも示された17．BAM 複結合の架け替えを伴って成熟化する14,16．我々は，BepA

合体は，「シルクハット型」の構造をもち（ Fig. 2 ），外がこの LptD 成熟化の促進に働く一方，LptE の枯渇など

膜ペリプラズム側でシルクハットのつばに当たる部分がにより LptD のアセンブリーが停滞した結果上記中間体

リング状の構造を取る18．我々は，BepA の TPR ドメイ

15

インを持つものと推測された．TPR ドメインは一般にし，TPR ドメインと相互作用するタンパク質を同定すが蓄積すると，これを分解・除去することを見出した ．

ンを発現・精製してその結晶構造を明らかに(PDB ID

このことから，BepA は分子シャペロン様機能（ LptD

5X18)し，BAM 複合体構成因子との架橋部位を TPR ド

アセンブリー促進）とプロテアーゼ機能（アセンブリー

メイン構造上にマッピングした．その結果，TPR ドメ

不全 LptD の分解）の二つの機能を持つものと考えられインが上記 BAM 複合体のリング構造の中に挿入した配る．また，BepA が，外膜に存在する「外膜タンパク質置をとるものと推定された．その後，さらに BepA 全体

組み込み装置（ BAM 複合体）」と相互作用することも構造の解明にも成功し(PDB ID 6AIT )，BepA は分子内14Fig. 2.

Structure of BepA

− 219 −

秋

山

芳

展

文

でプロテアーゼドメインと TPR ドメインが会合したコン
パクトな構造を持つこと，このコンパクトな構造はBepA が機能する時にも維持されていること等を示した．我々の解明した BepA 構造では，プロテアーゼ活性19

部位は BepA 分子内部に埋もれており，さらに，「不活性型」構造をとっていた．BepA がプロテアーゼ機能を発揮するためには，基質が活性部位にアクセス可能となると同時に，活性部位も「活性型」構造へと変化する必要がある．そのような大きな構造変化は，分子シャペロ
ン様機能，プロテアーゼ機能という BepA の持つ 2 つの機能の使い分けにも関わることが推測される．これらの点を明らかにするべくさらなる解析を行っている．
RseP，BepA いずれにおいても，その作用機序の分子的理解とともに，新たな基質の探索と生理機能の解明を進めていく必要があるだろう．

1.

献Mitchell, A. M., and Silhavy, T. J.: Nat. Rev. Microbiol., 17, 417(2019).
2. Grabowicz, M., and Silhavy, T. J.: Trends Biochem. Sci., 42,
232 (2017).
3. 秋山芳展: IFO Res. Commun., 28, 51 (2014).
4. Kanehara, K. et al.: Genes Dev., 16, 2147 (2002).
5. Alba, B. M. et al.: Genes Dev., 16, 2156 (2002).
6. Kanehara, K. et al.: EMBO J., 22, 6389 (2003).
7. Akiyama, Y. et al.: EMBO J., 23, 4434 (2004).
8. Flynn, J. M. et al.: Genes Dev., 18, 2292 (2004).
9. Hizukuri, Y., and Akiyama, Y.: Mol. Microbiol., 86, 1232 (2012).
10. Hizukuri, Y. et al.: Structure, 22, 326 (2014).
11. Akiyama, K. et al.: eLife, 4, e08928 (2015).
12. Feng, L. et al.: Science, 318, 1608 (2007).
13. Akiyama, K. et al.: Mol. Microbiol., 104, 737 (2017).
14. Narita, S. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 110, E3612(2013).
15. Sperandeo, P. et al.: J. Biol. Chem., 292, 17981 (2017).
16. Chng, S. S. et al.: Science, 337, 1665 (2012).
17. Daimon, Y. et al.: Mol. Microbiol., 106, 760 (2017).
18. Ranava, D. et al.: FEMS Microbiol. Lett., 365, 1 (2018).
19. Shahrizal, M et al.: J. Mol. Biol., 431, 625 (2019).

− 220 −

IFO Res.Commun. 33
221-222, 2019

コロニー形成の遺伝学，その後正

木

微生物，特にバクテリアではコロニーを純粋分離してその研究や利用が始まる．試料中の生菌数はコロニー形
成数 cfu から求めるのが常法であり，細菌学で「生きている」とはコロニー形成と同義であった．しかし近年，自然環境で生きているバクテリアのほとんどはコロニーを作らないことが知られるようになった．明らかにコロ
ニー形成は，｢生きている」 こととは違うのに長年の常識のためか生物現象として研究されてこなかった．公衆衛生や食品衛生でも菌の生死は cfu で定義されるので，背後には 100 倍の菌が眠っている可能性があるが，｢損傷菌」 として例外視されることが多く，低コロニー現象
が正常な菌の挙動とは必ずしも認識されていない．我々はコロニー形成を普遍的な遺伝子発現の問題として捉え，コロニーを作れない変異株の分離を糸口にコロニー形成の制限因子を求めた．また低温飢餓時のコロニー形
成能低下が，積極的なストレス応答である証拠を得た．

コロニーを作れない大腸菌変異
コロニー形成にとって広く重要な遺伝子が生存と別にあるならば，コロニーを作れない変異株が大腸菌にもみつかるはずである．しかし一般に変異株はコロニーとして分離するので分離法が問題であった．環境試料では液体培地限界希釈法でコロニー法より多くの菌が得られる
ので，液体培養を基準にしてコロニーを作らない変異体を求めた．試行錯誤の末，大腸菌の温度感受性変異（ ts ）株の cfu と液体培養での mpn（ most probable number ）に着目した．この ts 株集団は高温でコロニーを作らない
1,2)ので，同じ温度の液体培地でなら増える株を探索した．
ts
約 2600 株から期待した表現型の fabB 株を独立に 2株分離した．FabB は脂肪酸合成系の縮合酵素で，とくに不飽和脂肪酸合成には必須である．しかし ts 株は形
質が leaky でありゲノム中には化学変異剤による不特定
多数の変異を持つので，改めて野生株から fabB のみ欠失した ∆ fabB 株を，オレイン酸含有培地上で作製した．
これはオレイン酸を加えない L-broth 寒天培地でコロニーを作らないが，同液体培地ではわずかに生えた．
L-broth 中の酵母エキスに微量の脂肪酸が含まれ，その春

彦

分だけ液体培養では増えると解釈した．
そこでカザミノ酸グルコース合成培地を使い，微量のオレイン酸添加時の固体培養と液体培養における増殖度を追跡したところ，液体培養では増えるのに，アガロース培地ではコロニーどころか増殖そのものが見られなかった(Fig. 1)．これにより大腸菌は，不飽和脂肪酸の供給不足により，特に固体培養での増殖が抑えられることが判明した．2)

コロニー変異からの拡張

2)

変異株は得られたが，問題は野生株である．野生型大腸菌は脂肪酸を合成できるので合成培地でもよく生える．しかし，もし脂肪酸供給が不足すればどうなるか？
そして他のバクテリアでは？
(1) 野生型でもし fabB 発現が落ちると：発現調節可能にした fabB 遺伝子を miniF プラスミドで ∆ fabB 株に導入した．fabB を高発現させるとコロニー形成頻度は液体培養と同等だが，fabB 発現を落とすと液体培養に比べてコロニー形成頻度が大きく落ちた．野生株
でも，もし脂肪酸供給が不足すればコロニー形成しにくくなると推定できる．
(2) 自然環境では脂肪酸欠乏状態か：大腸菌を低温飢餓に保つと cfu が経日的に低下していく．その cfu 測定

Fig. 1

著者紹介:東京大学大学院新領域創成科学研究科特任研究員
E-mail:amasaki@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp− 221 −

Cell proliferation of strain ∆ fabB in M9-Casamino acidsglucose-based solid and liquid media containing 0.01,
0.075, 1.0, or 20 µg/mL oleic acid. After incubation at
37 ℃ as indicated, cells were collected from each plate or
liquid medium for counting of colony-forming cells.

正木

用の平板合成培地にオレイン酸を添加すると，コロ
ニー数が有意に上昇した．大腸菌は野生株でも，飢餓状態の自然環境では実際に脂肪酸欠乏状態にあると推定できる．
(3) 薬剤での脂肪酸合成阻害では：FabB を阻害する抗生物質セルレニンを大腸菌に加えると，液体培養の生育頻度に比べコロニー形成頻度が大きく下回った．
この方法は大腸菌以外に拡張できる．枯草菌にセル
レニンを与えてもコロニー形成が特異的に抑えられた（枯草菌での標的は FabB でなく FabF ）．脂肪酸
合成系の別酵素 FabI を阻害する抗菌剤トリクロサン
でも，大腸菌だけでなく(Fig. 2 )枯草菌やコリネバ
クテリウムでもコロニー形成が特異的に抑えられ，
その抑制はオレイン酸添加で解消された．
(4) 応 用 例 と し て： 森 林 土 壌 抽 出 液 か ら 1/10 濃 度
L-broth アガロース平板培地を使ってコロニー形成させる際，20 µg/ml のオレイン酸とパルミトレイン酸を加えると，コロニー数が 8 倍に上昇した．生じたコロニーの多様度は脂肪酸の添加で低下しておらず，脂肪酸を好む特殊な菌が生えたのではなく，コロニー数全体が底上げされたと考えられる．
以上から，バクテリアは一般に脂肪酸欠乏になるとコロニーを作りにくくなり，飢餓環境では脂肪酸欠乏がコ
ロニー数低下の一因であると推定された．液体増殖に比べて固体増殖が抑えられる理由や，直接の作用因子は未詳である．作用する不飽和脂肪酸の作用域は 20 µg/mL以下の低濃度なので，実際の結果は使用する培地等に依存するであろう．

Fig. 2Comparison of culturability of E. coli MG1655 in solidand liquid media with reduced activity of enoyl-ACP
reductase by the addition of triclosan. cfu and mpn were
determined after incubation at 37 ℃ for four days in
M9CAGlc-based solid and liquid media containing
various concentrations of triclosan as indicated.

春彦

コロニーを作らなくなる現象の遺伝子関与

3)

環境下でコロニー頻度が低下する原因を，コロニー変異とは逆のアプローチから探った．仮説として，コロニー形成能の維持には増殖とは別の特定の遺伝子が必要で，低温飢餓に曝すとその遺伝子の機能／産物が減衰するためコロニー頻度が低下していくであろう，その発現を強化すれば，低温飢餓にしてもコロニー形成能が維持されるのではないかと考えた．そういう遺伝子を得るため，大腸菌の全遺伝子をベクターで高発現できる ASKA ライ
ブラリーを用いた．
全クローンを混合培養したのち低温飢餓に曝すと，集団のコロニー形成率が低下していくに従って，コロニー形成能を保つ目的遺伝子を高発現する細胞が集団中で濃縮される．様々な程度の効果を示す株が得られ，定常期や飢餓ストレス時に働く転写因子 RpoS の発現株も含まれていたが，一番効果が高かったのは cAMP の分解酵
素 CpdA の発現株であった．
これはコロニー形成能の維持に，cAMP はマイナス要因ということだろうか？ cAMP は受容体 CRP と結合して各種の糖代謝を調節する多機能転写因子となるが，コロニー形成にも関与しているのか？そこで cAMP の合成酵素欠損株 ∆cyaA と CRP 欠損株 ∆crp を調べると，いずれを低温飢餓に長く曝してもコロニー形成能が全く低下しなかった．また ∆cyaA 株の前培養液に cAMP を加えると，その濃度に応じて低温飢餓によってコロニー形
成が低下するようになった．
仮説通り，ストレス下でもコロニー形成能の維持に働く rpoS のような遺伝子は取れてきたが，cpdA は意味が違う．ストレス時にコロニー形成能を積極的に落とす仕組みが隠れていて，そのスイッチである cAMP を高発
現の CpdA が壊したらしい．一般に低温飢餓時にコロ
ニー形成能がなくなっていくのは，必要な能力が失われていく面とは別に，最終的な生存のため cAMP が「冬眠」
を積極的に誘導しているようだ．脂肪酸の必要性とはおそらく独立の，その下流の仕組みに興味が持たれる．
麓に辿り着いただけで遺伝学と称するのはおこがまし
いが，その前の努力段階にあった私どもに対して研究助成を給わったことに心より感謝致します．本研究は，東京大学農学生命科学研究科の当時の多くの学生諸君のリ
レーで進めることができました．本文の範囲に限り敬称略で紹介し謝意を表します．変異株は安原幸司，池端佑仁，三井智玄，納庄一樹；cAMP 関係は髙丸玲子，福嶋
凡子；納庄一樹が再実験を含めまとめました．
1) 正木春彦: コロニー形成の遺伝学, IFO Res. Coomun.,28, 15(2014).
2) Nosho, K. et al.: Microbiol.164, 1122 (2018).
3) Nosho, K. et al.: Microbiol.164, 164 (2018).

− 222 −

IFO Res.Commun. 33
223-224, 2019

レアメタル気化微生物の分離・同定と機能解析（その 2 ）
山

下

光

雄

可能性がある．

はじめに

気化セレン生合成の培養工学的解析

レアメタルはデジタル家電や電気自動車のモーターの材料として重要な元素であり，需要が伸びている．レア

セレン酸模擬廃水を用いて，セレン気化物生成におけ

メタルは特定国に偏在し，囲い込みがされるために，レる NT-I の培養最適化試験を行った．その結果培養温度

アメタル消費国である日本では安定供給に向けた対策が38 ℃，pH 9.0，通気量 1 L-1min-1 ，撹拌速度 250 rpm であっ

望まれている．

た．実廃水を用いて最適化条件で Se 気化回収試験を行っ廃水や廃棄物からのレアメタル回収を可能とする戦略

た結果，処理 120 時間で初期セレン濃度の約 39 ％に当として，微生物による金属代謝（メタルバイオテクノロ

たる DMDSe を回収した．模擬廃水での回収率約 71 ％ジー）の活用を提案している．生物のもつ高選択性を活と比較すると，実廃水での回収率は約半分まで減少した．

かすことで，メタルバイオテクノロジーは廃水や廃棄物処理後の実廃水中のセレン量から推定すると，気体回収

から金属を浄化・回収する技術であると考えている．メ率の低下は DMDSe が可溶性セレンとして培養液に残存

タルバイオテクノロジーの中でも生物気化（バイオボラ

していたからであると考えられる．この可溶性画分に含タリゼーション）は，回収技術の活用が期待されている

まれる DMDSe がすべて気体セレンとして回収できる機能の一つである．バイオボラタリゼーション能を有すと，回収率は初期セレン濃度の約 65 ％になり，模擬廃る微生物の分離やその応用に成功すれば，既存技術では水使用時の回収率と同等である．本実験の模擬廃水には困難とされている廃水や廃棄物からのレアメタルの再利

存在しないで実廃水に存在する揮発化阻害要因を解明で用が可能となる．

きれば，セレン気化回収率が高くなると思われる．回収した Se を再資源化するために，硝酸中で溶解し不揮発性

セレン酸還元微生物のメチルセレニン酸に変化した Se 資源化の検討を行った．脱硝酸化，アルカリ化，酸化還元によって，回収率

セレン（ Se ）は，主にガラス染色や太陽電池の半導25 ％，純度 99.7 ％の元素態セレンの精錬に成功した．

体材料として重要なレアメタル資源である．有毒な可溶

気化セレン生合成の遺伝子工学的解析性の Se 酸化物イオンを含む廃水が発生しているため，
物理化学処理により浄化されている．この処理は大量の薬剤の投入と汚泥が発生するという欠点がある．本汚泥

DMDSe は Se にメチル基が結合した構造から，NT-I

は Se 含量が低いため，Se を回収・資源として再利用す

ゲノム DNA からメチル基転移に関与する遺伝子を探索る事は難しく，廃棄されている．

し，DMDSe の合成に関与する遺伝子 menG を発見した．

セレン浄化を目的にセレン酸還元細菌 Pseudomonas
stutzeri NT-I を単離した．NT-I は水溶性セレン酸や亜セレン酸を不溶性の無毒な元素態セレンに還元し，その元

menG を PCR 増幅後，TA ベクターに連結したプラスミ
ド pGEM-MemG を作製した．次にラクトースプロモー
タ ー の 下 流 に DMDSe 合 成 酵 素 の カ ル ボ キ シ 末 端 に素態セレンを揮発性ジメチルジセレニド（ DMDSe ）に

His-Tag を 化 学 修 飾 し た 遺 伝 子 ME-His を 組 換 え た

還元する．NT-I 株の保有する元素態セレンから DMDSe
へのバイオボラタリゼーション反応を利用すれば，廃水

Escherichia coli DH5α（ lac-ME-His ）を構築した．NT-Iと E. coli DH5α（ lac-ME-His ）を亜セレン酸を含む TSB

や廃棄物中に存在する Se を容易に高純度に回収できる培地にて培養し，経時的に培養液の上清と沈殿のセレン濃度を分析した．初発可溶性セレン濃度が 37.8 mg/L で

著者紹介:芝浦工業大学工学部教授
E-mail:yamashi@sic.shibaura-it.ac.jp

あり，NT-I も E. coli DH5α（ lac-ME-His ）も経時的にセレン濃度が減少し，168 時間においては可溶性セレン濃− 223 −

山

下度が各々 11.9 mg/L と 12.0 mg/L に減少した．両株とも

光

雄

不溶性セレンは 24 時間でピークに達し，その後 168 時

Shewanella 属，Idiomarina 属，Vibrio 属 の 9 属 13 種 の細菌の 16S rRNA 遺伝子配列と 98 ％以上の相同性を示し

間では 6.0 mg/L まで減少した．以上の結果から，組換た．このうち Sulfitobacter 属，Ruegeria 属，Alteromonas

え大腸菌は 168 時間後に約 50 ％の DMDSe を合成した

属，Marinobacter 属，Idiomarina 属，Vibrio 属の 6 属には，と示唆された．

調べた限りではテルル酸や亜テルル酸を還元する微生物の報告はなかった．分離株の内 Sulfitobacter sp. strain

テルル酸還元微生物のスクリーニング

TK39B は 4 ％塩化ナトリウム存在下で最も高い溶存テ
ルル除去率 82 ％を示し，X 線解析より元素態テルルをテルル(Te)は電子材料に用いられるレアメタルの一固化物として合成していることが分かった．以上の結果鉱種であり，産業利用量が増えるとともに，環境中へのから，海洋環境の至る所に Te の浄化回収に利用できる排出も増加している．廃水中から水溶性の Te（テルル

耐塩性テルル酸還元能を持つ多様な細菌が存在している酸（Ⅵ），亜テルル酸（Ⅳ））の浄化回収技術開発が望まことを明らかした．

れている．高塩濃度工場廃液からの技術開発を目指し，

おわりに耐塩性テルル代謝微生物に注目し，海洋環境試料から網羅的に分離し，属種の同定と特徴解析を目的とした．微生物の分離源として，東京湾，遠州灘金の瀬，新潟沖のメタルバイオテクノロジーは現在鉱業におけるバイオ

総計 14 ヶ所から海水および海底堆積物を採取した．そのリーチングや金属含有廃水・廃棄物処理といった一部分

結果，東京湾から 24 株，遠州灘金の瀬から 22 株，新潟沖に用いられているに過ぎない．新酵素や遺伝子が発見さから 6 株計 52 株のテルル酸還元微生物を分離した．このれ，それらに基づいた新規な金属代謝反応が多数見出さ

うち，18 株は 0.4 mM テルル酸含有マリン培地で 72 時れている．バイオボラタリゼーションなどレアメタル浄間培養後の溶存テルル除去率が 50 ％以上であった．分離化回収技術は廃水や廃棄物から有価資源を回収資源化す株のうち 18 株は Sulfitobacter 属，Ruegeria 属，Hoeflea 属，る特色のある手法であり，「循環型社会」形成の一助とAlteromonas 属，Marinobacter 属，Pseudoalteromonas 属，なると期待できる．

− 224 −

発酵研究所助成研究報告集

第 33 号【非売品】

令和元年 12 月 10 日 印刷
令和元年 12 月 20 日 発行
編集委員長
編集委員
発行人
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横田 明
金子嘉信，左子芳彦，永井和夫
西山 真，福田雅夫
樽井直樹
公益財団法人発酵研究所
大阪市淀川区十三本町 2 丁目 17 番 85 号
TEL. 06 − 6300 − 6555
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