課題番号：２３指３０１
研究課題名：インフルエンザ等の薬剤耐性の迅速診断法の開発
主任研究者名 ：秋山 徹
分担研究者名 ：切替 照雄
キーワード
研究成果

：インフルエンザ、タミフル耐性、迅速診断、病原体ゲノム：

本研究ではタミフル耐性インフルエンザの耐性に寄与する変異を検出する遺伝子解析法を臨
床現場で利用可能とするための基礎研究および開発研究を実施する。また病原体の遺伝学的検査の基盤となる病原体ゲノム情報を収集・解析し、その情報を元に重要感染症病原体の迅
速診断法を開発する。
インフルエンザのタミフル耐性の遺伝子診断法開発
本研究で対象となるインフルエンザのタミフル耐性の遺伝子診断法開発には、耐性および感受性のインフルエンザ遺伝子の準備が必要である。これに加えて、遺伝子診断法の臨床現場への導入を困難にしている１）検体からの病原体遺伝子抽出、２）遺伝子増幅反応実施、３）増幅遺伝子の変異解析法、の各課題を解決する必要があった。以下ではこれらの解決についての成果を順に記述する。
１）検体からの病原体遺伝子抽出操作の簡便化：現在のインフルエンザ遺伝子解析では、検体からのインフルエンザ遺伝子抽出に専用のキットを使用する必要がある。このキットではカラムに病原体遺伝子を吸着後、複数の溶液で遠心機を使用して洗浄し、さらに遺伝子を回収するという複雑な工程が必要となる。しかしながらこの工程を簡略化し、熱処理のみで以降の遺伝子増幅反応を行うことが技術的に可能となっている。この技術は以降の遺伝子増幅
反応を妨害する検体中の物質を抑制する特殊な緩衝液で、１段階のみの前処理を行い直接検体とする方法である。本計画では、この技術をインフルエンザ検体調整用に最適化した。検体からの病原体遺伝子抽出の簡便化：予備的試験を実施し、加熱法による検体処理での遺伝子増幅反応への適用性を検証する。すでに他のＲＮＡウイルスで構築されている類似法を元に、条件の最適化を行った。検体調整時間は、従来の約３０分から、１段階法による抽出で、５分に短縮された。
２）遺伝子増幅反応の簡便化：現在のインフルエンザ遺伝子増幅反応ではＲＮＡをＤＮＡに変換する逆転写反応と、その後のＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に、専用の温度制御装置が必要であり、この反応は通常数時間を要する。これらの装置は比較的高価だったが現在では数十万円程度で入手可能となっており、臨床現場への導入は容易になってきている。本研究では、
増幅反応時間を短縮するため、逆転写反応とＰＣＲ法を連続的に実施し、さらに反応が短時間で終結する高速反応酵素を採用して、数時間だった反応時間を最終的には２０分程度に短縮する。これらの高速反応酵素はいくつかが製品化されており、インフルエンザ遺伝子増幅に最適な酵素の選定とさらなる最適化を実施した。遺伝子増幅反応の簡便化：すでに市販されているいくつかの高速増幅酵素のそれぞれの特性を検証し、インフルエンザの耐性遺伝子
増幅に最適な酵素の選抜を行った。増幅反応に使用するプライマーを通常より長いものに設定することで、反応の頑強性を向上させると共に、増幅反応を従来の、変性・アニーリング・

増幅の３段階法から、変性・アニーリング＆増幅の２段階法に切り替えることで、従来２〜６時間程度を要していた反応時間を３０分程度に短縮できた。
３）増幅遺伝子解析法の簡便化：タミフル耐性などの遺伝子変異の解析にはＤＮＡシーケン
サなどの高度な装置が必要であり、診療室では実施できない。そこで結核の薬剤耐性診断に使用されているラインプローブ法を利用する。ラインプローブ法では複数の変異を一つのスリットで解析できるので、インフルエンザの抗インフルエンザ薬耐性のタイプが変化した場
合でも、容易に対応可能であるという大きな利点がある。ラインプローブ法をさらに簡便化するため、非対称ＰＣＲでのＰＣＲ増幅時の産物標識の一体化、およびスリットにサンプルを滴下するだけで解析可能とするように反応と解析条件の最適化を行った。増幅遺伝子解析
法の簡便化：インフルエンザの抗インフルエンザ薬耐性に寄与する遺伝子変異を検出するためのプローブを実装したラインプローブを作製する。当面タミフル耐性に焦点をあてて必要なプローブの設計とラインプローブへの搭載を行った。本プローブを使用し、国際医療研究センターの小児科との臨床研究により、インフルエンザ亜型とタミフル耐性の有無の検出における、その有用性を検証した。同ラインプローブは３５４株の培養ウイルス株において、特異性は１００％で、タミフル耐性検出感度は９９％だった。また、臨床検体においては、
特異性は１００％で、タミフル耐性非保有の特異性は８８％だった。
４）タミフル耐性インフルエンザの人工遺伝子による評価系の構築：タミフルなどの耐性判定の遺伝子診断には、当該変異を持つ病原体が必要となる。しかしそれらのウイルスをリア
ルタイムで入手することは困難である。そこで本計画ではデータベースに登録される変異情報を活用し、予め構築しておいたタミフル耐性に関与する遺伝子（ノイラミニダーゼ遺伝子）の発現系にて、変異情報を組み込んだ変異体を発現させる系を構築する。これにより、ウイルス本体に頼らない評価系を構築した。タミフル耐性インフルエンザの人工遺伝子による評
価系：タミフル耐性の評価が必要と考えられる季節性のＨ１Ｎ１インフルエンザおよびＨ３
Ｎ２インフルエンザ、さらに新型のＨ１Ｎ１インフルエンザについて、それぞれのノイラミニダーゼ遺伝子をクローニングし、発現系を構築した。本発現系により発現させた人工ノイ
ラミニダーゼの活性を発光基質法を用いて測定したところ、これらの酵素は解析に充分な酵素活性を有していた。また、タミフル耐性に関与する変異を組み込んだ酵素では、期待された通り、タミフルに対する感受性が低下していた。リレンザ、ラピアクタの各抗インフルエ
ンザ薬との交差耐性についての解析では、タミフル耐性はリレンザ耐性とは交差しなかったが、作用点がタミフルと同じラピアクタでは、交差耐性を認め、タミフル耐性変異を持ったウイルスは、ラピアクタにも耐性になることが示唆された。
病原体ゲノム情報の収集・解析
１．

インフルエンザ以外の薬剤耐性が問題となっている新興感染症の病原体および診断が困難な病原体について次世代シーケンサを活用し、ゲノム情報を収集する。新興感染症として、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ

ｃｉｎａｅｄｉの全ゲノム情報を解析し、論文発表した（Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ
ａｇａｒｉ

Ｎ，

Ｋｉｒｉｋａｅ

５６９２、２０１２）。

Ｔ．Ｊ

Ｔ， Ｔａｋｅｓｈｉｔａ

Ｎ， ＯｈｍＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１９４（２０）：２．

国内で流行している高度多剤耐性緑膿菌と結核菌の全ゲノム配列の解析を行った。
劇症型レンサ球菌感染症患者より分類された流行型のＭ１型菌であるＭ１

ＧＡＳ

４

７６株の全ゲノム配列を明らかにし、論文化した。
（Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ Ｔ，
ＷａｔａｎａｂｅＳ，ＫｉｒｉｋａｅＴ．Ｊ

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９４（１９）：５４６６．２０１２）。
３．

昨年度まで実施した高度多剤耐性緑膿菌ゲノム解析の成果を元に、同菌耐性因子を標的としたイムノクロマト法を構築し、研究用試薬として実用化し、論文発表した（Ｋ
ｉｔａｏ

Ｔ，

Ｔａｄａ

Ｔ，

Ｔａｎａｋａｈｉｍｏｊｉｍａ

Ｍ， Ｓｈｉｍａｄａ

Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｊ

Ｔ．Ｉｎｔ

Ｍ，

Ｎａｒａｈａｒａ

Ｋ，Ｓ

Ｋ， Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ Ｔ，

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ

Ａｇｅｎｔｓ．

３

９（６）：５１８−２１、２０１２）。
４．

本イムノクロマト法の有用性を、２０１１年〜２０１２年に大手臨床検査センター
で分離された多剤耐性緑膿菌の疫学研究にて検証し、 ＩＭＰ、ＡＡＣ（６′）−Ｉａｅ
またはＡＡＣ（６′）−Ｉｂを保有する多剤耐性緑膿菌の割合が、多剤耐性緑膿菌の約８０％二相等することを明らかにした（Ｔｏｊｏｉｍａ

Ｍ， Ｔａｎａｋａ

ｙａｍａ

Ｍ，

Ｔａｄａ

Ｍ， Ｎａｒａｈａｒａ

Ｔ， Ｋｉｒｉｋａｅ

ｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０１４

ＳｈｉｍｏｊＫ， Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉ

Ｔ， Ｏｈｍａｇａｒｉ
Ｊｕｎ

Ｔ，

Ｎ．Ｊ

ＩｎｆｅｃｔＣ

５． ｐｉｉ： Ｓ１３４１−３２１Ｘ（１４）００１８０−９． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｉａｃ．２０１４．０４．０１４．）。
５．

これまでほとんど国内では症例が報告されていなかったＩＭＰ型メタロ−β−ラクタ

マーゼを保有したＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅについて、その多発事例を見いだし、全ゲノム解析を元に、多発事例と孤発例の識別を行った（ＨａｙａｋａｗａＫ， Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ

ａｔｓｕ

Ｍ， Ｓｈｉｍａｄａ

ｕｒｏｄａ
Ｓ，

Ｅ，

Ｔｏｊｏ

Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．
６．

Ｋ， Ｍｅｚａｋｉ

Ｋｕｂｏｔａ
Ｍ，

Ｓ，

Ｔ， ＮａｇａｍＫ， Ｓｕｇｉｋｉ

Ｔａｋｅｓｈｉｔａ

Ｏｈｍａｇａｒｉ
２０１４Ｔ， Ｋｉｒｉｋａｅ
Ｎ，

Ｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ

Ｙ， Ｋ

ＫｕｔｓｕｎａＡｇｅｎｔｓＪｕｎ；５８（６）：３４４１−３４５０．）。

劇症型レンサ球菌感染症の原因菌の一つであり、これまで全ゲノム構造が明らかにされていなかったＬａｎｃｅｆｉｅｌｄ血清型Ｃ群のレンサ球菌の全ゲノム配列を世界に先駆けて明らかにした（Ｗａｔａｎａｂｅｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ
１６４４−５１．
７．

Ｔ．Ｇｅｎｏｍｅ

Ｓ，

Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｂｉｏｌ

Ｔ，

Ｍｉｙｏ

Ｅｖｏｌ． ２０１３；５（９）：ｄｏｉ： １０．１０９３／ｇｂｅ／ｅｖｔ１１７．）

Ａ型インフルエンザウイルスの亜型を識別可能なモノクローナル抗体について、それらの反応エピトープを解析し、識別の基盤となっている機構を明らかにした（Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ
ａｒａｈａｒａ
ｉ

Ｓ，

ｈｅｒ

Ｋ，

Ｔ， Ｙａｍａｓｈｉｒｏ

Ｍｉｙａｍｏｔｏ

Ｋｉｔａｊｉｍａ

Ｒｅｓｐｉｒ

Ｈ，Ａ，Ｔ， ＭａｉＳｈｉｎａｇａｗａ

Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｖｉｒｕｓｅｓ． ２０１２

ｌｅ

Ｑ， Ｎ

Ｓ，

Ｔ．ＩｎｆｌｕｅｎｚａＭｏｒＯｔ

Ｎｏｖ；６（６）：４３４−４１．）

Subject No.

：23A301

Title：Development of rapid diagnosis methods to detect drug resistance of pathogens

including influenza viruses
Researchers ：Tohru Miyoshi-Akiyama, Teruo Kirikae
Key word：Influenza virus, drug-resistance, rapid diagnosis, genome

Abstract：

1. Development of rapid diagnosis methods to detect drug resistance of influenza viruses:
Adequate treatment of influenza requires identification of viral type as well as detection of
mutation(s) conferring drug resistance. Reverse hybridization-based line probe assay (LiPA) canbe equipped with a number of probes immobilized on nitrocellulose paper strips. Thus, LiPA could
be utilized to determine viral subtypes and detect the presence or absence of the H274Y mutation,
which confers oseltamivir resistance on H1N1 influenza viruses, simultaneously. In this study,
LiPA to identify influenza virus subtypes H1N1 (pandemic 2009 type and seasonal type), H3N2
and B, and to detect the H274Y mutation was developed, and evaluated the diagnostic capability
using cultured virus isolates as well as nasal swabs obtained from patients suspected of being
infected with influenza. In analyzing 354 cultured virus isolates, this LiPA showed 100%
specificity in virus typing and 99% specificity in detecting the H274Y mutation. In analyzing 49
nasal swabs from a clinical study, this assay showed 100% specificity in virus typing and 88%
specificity in absence of the H274Y mutation although H274Y viruses positive swab based on PCR
were not able to obtained in the clinical study. Thus LiPA for influenza viruses may be used tomonitor viral trends during the influenza season.
2. Determination of emerging pathogen, Helicobacter cinaedi: H. cinaedi is an emerging pathogen,which is increasingly reported to cause bacteremia in patients with malignancy. We report thecompletely annotated genome sequence of H. cinaedi The genome sequence will provide new
insights into the diagnosis, pathogenic mechanisms, and drug resistance of H. cinaedi.
3. Complete Annotated Genome Sequence of Mycobacterium tuberculosis Erdman: Mcobacterium

tuberculosis strain Erdman was isolated from human sputum by William H. Feldman in 1945, at
Mayo Clinic, Rochester, MN, and deposited with the Trudeau Mycobacterium Culture Collectionin 1946. There is no description of the naming of “Erdman” in reference 7. Due to its consistently
high virulence, it has been widely used as a standard virulent laboratory strain for virulence andimmunization studies. We report the completely annotated genome sequence of Mycobacterium

tuberculosis Erdman (TMC 107; ATCC 35801), which is a well-known laboratory strain of M.
tuberculosis.
4. Genome Sequence of Streptococcus pyogenes M1 476: S. pyogenes is a causative pathogen
life-threatening Streptococcal toxic shock syndrome (STSS). Lancefield M1 type of S. pyogenes isfrequently isolated from STSS cases. We report the completely annotated genome sequence of M1
476 strain isolated from a STSS patient in Japan.
5. Development of rapid detection kit for multidrug resistance Pseudomonas aeruginosa: Based on
the genome sequence, which was reported previously, we prepared rapid detection kit for the
AAC(6’)-Ib, which is dominant determinant of aminoglycoside resistance in Japan.
Researchers には、分担研究者を記載する。

6. Discrimination of influenza A subtype by antibodies recognizing host-specific amino acids in theviral nucleoprotein.: BACKGROUND:Nucleoprotein (NP) of influenza viruses is utilized todifferentiate between the A, B, and C viral serotypes. The availability of influenza genome
sequence data has allowed us to identify specific amino acids at particular positions in viralproteins, including NP, known as "signature residues," which can be used to discriminate human
influenza A viruses from H5N1 highly pathogenic avian influenza in human cases (HPAI) andpandemic H1N1(2009) (H1N1/2009) viruses. METHODS: Screening and epitope mapping of
monoclonal antibodies (mAb) against NP of influenza A, which reacted differently with NP fromhuman influenza A virus from HPAI and H1N1/2009 A virus. To identify the epitope(s) responsible
for the discrimination of viral NP by mAbs, we prepared mutant NP proteins in the 293 cell
expression system because some of the mAbs reacted with non-linear epitopes. RESULTS AND
CONCLUSIONS: In the present study, we identified 3 mAbs. The results of epitope mapping
showed that the epitopes were located at the signature residues. These results indicated thatsignature residues of NP could discriminate influenza A viruses from different origin.
7. Development of an immunochromatographic assay for rapid detection of AAC(6')-Ib-producing
Pseudomonas

aeruginosa.:

Todetectaminoglycoside

6'-N-acetyltransferase-Ib[AAC(6')-Ib]-producing, Pseudomonas aeruginosa isolates which are a frequent cause of
nosocomial infections in Japan, an immunochromatographic assay was developed using two kindsof monoclonal antibodies (mAbs) recognizing AAC(6')-Ib. The results of the assessment were fully
consistent with those of aac(6')-Ib PCR analyses.
8. IMP-43 and IMP-44 metallo-β-lactamases with increased carbapenemase activities in
multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa.: Two novel IMP-type metallo-β-lactamase variants,
IMP-43 and IMP-44, were identified in multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates
obtained in medical settings in Japan. Analysis of their predicted amino acid sequences revealed
that IMP-43 had an amino acid substitution (Val67Phe) compared with IMP-7 and that IMP-44
had two substitutions (Val67Phe and Phe87Ser) compared with IMP-11. The amino acid residue at
position 67 is located at the end of a loop close to the active site, consisting of residues 60 to 66 in
IMP-1, and the amino acid residue at position 87 forms a hydrophobic patch close to the active sitewith other amino acids. An Escherichia coli strain expressing blaIMP-43 was more resistant todoripenem and meropenem but not to imipenem than one expressing blaIMP-7. An E. coli strain
expressing blaIMP-44 was more resistant to doripenem, imipenem and meropenem than one
expressing blaIMP-11. IMP-43 had more efficient catalytic activities against all threecarbapenems than IMP-7, indicating that the Val67Phe substitution contributed to increased
catalytic activities against carbapenems. IMP-44 had more efficient catalytic activities against all
carbapenems tested than IMP-11, as well as increased activities compared with IMP-43,
indicating that both the Val67Phe and Phe87Ser substitutions contributed to increased catalytic
activities against carbapenems.
9. Complete genome sequence of Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis 167 carrying
Lancefield group C antigen and comparative genomics of S. dysgalactiae subsp. equisimilis
strains.: Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis (SDSE) is an emerging human pathogen
Researchers には、分担研究者を記載する。

that causes life-threatening invasive infections such as streptococcal toxic shock syndrome. Recent
epidemiological studies reveal that invasive SDSE infections have been increasing in Asia, Europe,and the United States. Almost all SDSE carry Lancefield group G or C antigen. We havedetermined the complete genome sequence of a human group C SDSE 167 strain. A comparison ofits sequence with that of four SDSE strains, three in Lancefield group G and one in Lancefieldgroup A, showed approximately 90% coverage. Most regions showing little or no homology werelocated in the prophages. There was no evidence of massive rearrangement in the genome of SDSE
167. Bayesian phylogeny using entire genome sequences showed that the most recent common
ancestor of the five SDSE strains appeared 446 years ago. Interestingly, we found that SDSE 167
harbors sugar metabolizing enzymes in a unique region and streptodornase in the phage region,
which presumably contribute to the degradation of host tissues and the prompted covRS mutation,
respectively. A comparison of these five SDSE strains, which differ in Lancefield group antigens,revealed a gene cluster presumably responsible for the synthesis of the antigenic determinant.
These results may provide the basis for molecular epidemiological research of SDSE.
10. Biochemical Analysis of Metallo-β-Lactamase NDM-3 from a Multidrug-Resistant Escherichia
coli Strain Isolated in Japan: New Delhi metallo-β-lactamase-3 (NDM-3) was identified in a
multidrug-resistant Escherichia coli isolate, NCGM77, obtained from the feces of a patient inJapan. The enzymatic activities of NDM-3 against β-lactams were similar to those of NDM-1,
although NDM-3 showed slightly lower kcat/Km ratios for all the β-lactams tested except for
doripenem.

The

genetic

context

for

blaNDM-3

was

tnpA-blaNDM-3-bleMBL-trpF-dsbC-tnpA-sulI-qacEdeltaI-aadA2-dfrA1, which was present on an
approximately 250-kb plasmid.
11. Molecular and Epidemiological Characterization of IMP-Type Metallo-β-Lactamase-Producing
Enterobacter cloacae in a Large Tertiary Care Hospital in Japan: IMP-type metallo-β-lactamase
enzymes have been reported in different geographical areas and in various Gram-negative
bacteria.

However,

the

risk

factorsandepidemiology

pertainingtoIMP-type

metallo-β-lactamase-producing Enterobacter cloacae (IMP-producing E. cloacae) have not beensystematically evaluated. We conducted a retrospective, matched case-control study of patientsfrom whom IMP-producing E. cloacae isolates were obtained, in addition to performing thoroughmolecular analyses of the clinically obtained IMP-producing E. cloacae isolates. Unique cases with
IMP-producing E. cloacae isolation were included. Patients with IMP-producing E. cloacae werematched to uninfected controls at a ratio of 1 to 3. Fifteen IMP-producing E. cloacae cases wereidentified, with five of the isolates being obtained from blood, and they were matched to 45
uninfected controls. All (100%) patients from whom IMP-producing E. cloacae isolates wereobtained had indwelling devices at the time of isolation, compared with one (2.2%) uninfected
control. Independent predictors for isolation of IMP-producing E. cloacae were identified as
cephalosporin exposure and invasive procedures within 3 months. Although in-hospital mortality
rates were similar between cases and controls (14.3% versus 13.3%), the in-hospital mortality ofpatients with IMP-producing E. cloacae-caused bacteremia was significantly higher (40%) than
the rate in controls. IMP-producing E. cloacae isolates were frequently positive for other resistance
Researchers には、分担研究者を記載する。

determinants. The MICs of meropenem and imipenem were not elevated; 10 (67%) and 12 (80%) of
the 15 IMP-producing E. cloacae isolates had a MIC of ≤1 μg/ml. A phylogenetic tree showed aclose relationship among the IMP-producing E. cloacae samples. Indwelling devices, exposure to
cephalosporin, and a history of invasive procedures were associated with isolation of
IMP-producing E. cloacae. Screening for carbapenemase production is important in order to apply
appropriate clinical management and infection control measures.

Researchers には、分担研究者を記載する。

2014/06/30	

研究の目的	

感染症診断の現状	  (インフルエンザを例に)	

臨床現場（診療室レベル)での感染症診断への遺伝
子診断の導入による高精度化および新規抗原検査
法の導入	
  

インフルエンザ様疾患患者	

（うがい液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液)	
  

	
  
現状：	
  
・抗原検査法：簡便であるが低感度。	
  ・遺伝子増幅法：高感度だが煩雑。	
  	
  遺伝子診断法の問題点	
  ・病原体遺伝子分離が必要。	
  ・専門家が必要。	
  ・専用装置が必要	
  (地方衛研レベルでしか実施できない)	
  	
  計画：モデルとしてインフルエンザのタミフル耐性の遺伝子増幅による迅速診断法の臨床現場への導入を目指す。また遺伝子診断法の基礎となる重要病原体の全ゲノム情報解析を実施し、その成果を元に重要病原体迅速診断法を開発する。	
  感染症診断における遺伝子増幅法導入の	  障害・問題点	
１．検体からの病原体遺伝子抽出操作の煩雑さ	
  

15分	

血清採取(急性期・回復期)	
  1〜3週間	

迅速診断キット	

6時間〜2日	ウイルス分離	  （培養細胞または	
  
孵化鶏卵使用)	
  

問題点	
  
・低感度	
  
・長い開発期間	

HI試験	
  
中和試験	
専門家と	
  
装置が必要	
遺伝子検出(RT-­‐PCR、LAMP)	
  
利点：高感度・高特異性	  問題点:地方衛研でしか実施できない	  研究計画と進捗(1)	
  検体からの病原体遺伝子抽出操作の簡便化	
従来法	

本計画では	

(インフルエンザのようなRNAゲノムを持つ病原体の場合にはより困難)	
  	
  反応液添加	

２．遺伝子増幅反応の煩雑さ	
  (インフルエンザのようなRNAゲノムの病原体では通常の増幅操作に加えてRNAをDNAに変換する逆転写反応も必要と
なる)	
  
	
  

３．高価な遺伝子増幅装置の必要性	
  	
  ４．増幅遺伝子解析用の装置・器具の必要性	  (地方衛研レベルでしか実施できない)	
  	
  ５．これら全体に由来する低い即時性	
  →遺伝子増幅法に基づく診断法を臨床現場に導入するためには、これら各項目を個別に簡便化・迅速化する必要がある。	
  簡便化	
5段階の手順と遠心機の必要性の	  ため煩雑。診療室レベルでは	  実施できない。	

(最も汎用されているRNA抽出キットの手順)	

加熱処理(5分)	

そのまま以降の反応へ	

進捗状況	
  
基礎検討を終え、1段階化を完了した。次年度以降では抽出効率の改善を行う。	

1	2014/06/30	

研究計画と進捗(2) 遺伝子増幅反応の簡便化	

本計画では	

本計画では	

従来法	

従来法	
1.	
  RNAをDNAに変換する逆転写反応：	
  	
  2時間	  	
  2.	
  得られたDNAのPCR法による増幅	  	
  94℃,	
  2分	
  	
  94℃,	
  20秒	  
	
  55℃,	
  20秒 x30回	
  	
  72℃,	
  2分	
  	
  2時間	  	  	
  合計４時間	
2回の反応が必要な上に反応液の調整が必要で時間もかかる。	

研究計画と進捗(3)	
   増幅遺伝子解析法簡便化	

1.	
  逆転写反応とPCRの一体化	
  2.	
  高速反応PCR酵素の利用	
  3.	
  非対称PCRによるDNA標識	
  ラインプローブ法で変異検出	  PCRで増幅および標識した変異遺伝子の変異をスリットに結合させたプローブとのハイブ
リダイゼーションで検出	

遺伝子変異解析には	
  1.DNAシーケンサ	
  

94℃,	
  4秒	
  
94℃,	
  5秒	
  
55℃,	
  5秒 x30回	
  72℃,	
  10秒	
  簡便化	ラインプローブ法はす
でに結核薬剤耐性検
査で体外診断薬化されており、実績がある。	

:20分	
  
進捗状況	
  
１．ウイルス亜型特異的なプライマーの設計：各亜型ごとに約100株の分離ウイルス株で正確な増幅を確認。	
  ２．遺伝子増幅：反応時間を30分台に短縮完了。	
  次年度以降では標識法の検討を行う。	

簡便化	

2.または電気泳動装置	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
が必要。	
  	
  

進捗状況	
プローブの設計と試作品作製を完了 (国際特許出願済み)。臨床研究による評価を開始した。

どちらも診療室レベルでの実施は事実
上不可能	

	

研究計画と進捗(4)	
  タミフル耐性インフルエンザの人工遺伝子による評価系の構築	
従来は	

• タミフル耐性インフルエンザの迅速診断法の開発。	
  • 同様の手法はアマンタジンやリレンザ、さらにはこれから認可される他の抗インフルエンザ薬に対するインフルエンザの耐性化診断にも応用できる。	
  

8

6

• さらに、最終的には感染症の遺伝子増幅に基づく診断法の臨床現場(診療室レベル)への導入を可能とする。	

予定している判定ストリップの構成	
  
	
  
	
 タミフル耐性判定	
1枚のストリップでイ
ンフルエンザ感染と	  タミフル耐性を判定	
	
  
	
H1N1

Pdm

B	

H3N2

H1N1

インフルエンザ感染判定
Pdm

H275Y_136K

275H_136K

H275Y

4

275H

各阻害剤のIC50値(pM)

分子量マーカー
陰性コントロール1
陰性コントロール2
季節性H1N1
季節性H1N1
新型H1N1	
新型H1N1	

・耐性判定法の評価には
タミフル耐性となった遺伝子を持つインフル
エンザが必要。	
  →しかし実際にはすべての変異ウイルスをリア
ルタイムで入手することは困難。	
  ・そこでデータベースを活用し、予め構築しておいたタミフル耐性に寄与する遺伝子の発現系に耐性変異を導入
して、評価に必要な変異型遺伝子を入手す
る。	
  
	

進捗状況	
  
１．人工遺伝子を利用した季節性、AH1pdm、B型の発現系の構築完了	
  ２．発現蛋白質への変異導入法の確立と活性測定系の確立を完了した	  	
  1 x 10
	
  
タミフル
リレンザ
	
  
1 x 10
ラピアクタ
	
  
	
  
1 x 10
	
  
100
	
  
	
  
1
	
  
	
  
0.01
	
  
	
  
	
  
耐性変異
	

期待される成果	2	

of NPs from H1N1 ⁄ 2009 and H5N1 HPAI had thesequence GGE, while those of seasonal H1N1 and H3N2
were DGE and DGD, respectively. These findings prompted
us to analyze the reactivity of mAbs against NPs of
H1N1 ⁄ 2009, H5N1 HPAI, seasonal H1N1, or seasonal
H3N2 prepared in our laboratory and from commercial
sources.

Signature amino acids found in NPs from
H1N1 ⁄ 2009 and HPAI viruses
Large-scale sequence analyses revealed signature aminoacids at specific positions in viral proteins including NPs
that distinguish human influenza viruses from avian
viruses.9–11 We analyzed the 1182 of NP sequences of
H1N1 ⁄ 2009 viruses in addition to HPAI and humanviruses based on the data from January 1, 2007 to September 11, 2009 registered as human cases at Influenza Virus
Resources in National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/) andfound 5 and 9 signature residues specific for HPAI virusesand H1N1 ⁄ 2009 viruses, respectively (Table 1). These residues may be the keys to distinguish human seasonal viruses

Characterization of mAbs that reacted differently
with NP in an origin-dependent manner
3A4
The mAb 3A4 is one of the mAbs that was generated byimmunization of recombinant NP from H1N1 ⁄ 2009 viruses(A ⁄ California ⁄ 04 ⁄ 2009) and screening of mAbs that reactedwith H1N1 ⁄ 2009 NP but not human or HPAI NPs. The
results indicated that 3A4 reacted with NP from
H1N1 ⁄ 2009 virus only (Figure 1A). To further narrow
down the epitope of 3A4, we prepared 7 overlapping fragments of H1N1 ⁄ 2009 virus NP (Table S1). The mAb 3A4
reacted with fragments containing residues 1 – 56 (Full, F1,
F1-1, and F1-1-1)(Figure 1B). Then, we used a 15-meroverlapping synthetic peptide corresponding to residues
1–71 of H1N1 ⁄ 2009 NP. Although a peptide corresponding
to residues 31–45 reacted with 3A4, it also reacted to thepositive control mAb and negative control IgG indicatingthat this peptide recognition was non-specific and 3A4
reacted specifically with a peptide corresponding to residues 11–25 (Figure 1C). Comparison of the corresponding
sequences in human, HPAI, and H1N1 ⁄ 2009 viruses

研究計画と進捗(5)	
  インフルエンザA型ウイルス亜型を識別可能なモノクローナル抗体	
従来は	

Table 1. Signature amino acids specific for HPAI and H1N1 ⁄ 2009 viruses
A型インフルエンザ亜型に固有のNP蛋白質内アミノ酸残基	

・インフルエンザNP蛋白質に対する抗体は、A型、B型インフルエンザの識別において，実績があり、臨床現場で応用されている。しかしこれらの抗体ではA型ウイ
ルス内の亜型の識別はできなかった。	
  	
今回、A型ウイルスの亜型を識別可能な抗体を得ることができたので、その認識エピトープを詳細に解析した。	

Signature amino acids

Human

Position

H1N1

H3N2

HPAI

H1N1 ⁄ 2009

Accessibility
predictionV
0 ⁄ 372R
0 ⁄ 372L0 ⁄ 372R
0 ⁄ 372Q
0 ⁄ 372
Specific for H1N1 ⁄ 20090 ⁄ 252
0 ⁄ 252
0 ⁄ 252
0 ⁄ 252
0 ⁄ 252

14 ⁄ 1414 ⁄ 1414 ⁄ 1414 ⁄ 1414 ⁄ 140 ⁄ 5420 ⁄ 5420 ⁄ 5420 ⁄ 5420 ⁄ 542

Poor
Good
Poor
Good
Good

0 ⁄ 3720 ⁄ 3720 ⁄ 3720 ⁄ 3720 ⁄ 3720 ⁄ 3720 ⁄ 3720 ⁄ 3720 ⁄ 3721 ⁄ 252
0 ⁄ 252
1 ⁄ 252
0 ⁄ 252
0 ⁄ 252
1 ⁄ 252
1 ⁄ 252
1 ⁄ 252
1 ⁄ 252

Residues

Specific for human HPAI
33
100
136
305
357
21
53
190
313
316
350
371
433
456

D
D
A
V
M
K
V
N
L

0 ⁄ 140 ⁄ 140 ⁄ 140 ⁄ 140 ⁄ 140 ⁄ 140 ⁄ 140 ⁄ 140 ⁄ 14542 ⁄ 542
542 ⁄ 542
542 ⁄ 542
542 ⁄ 542
542 ⁄ 542
542 ⁄ 542
542 ⁄ 542
542 ⁄ 542
542 ⁄ 542

Good
Good
Poor
Good
Good
Poor
Good
Good
Poor

A total of 1182 of NP sequence (372, 252, 14, and 542 of human H1N1, H3N2, HPAI in human cases, and H1N1 ⁄ 2001 registered as humancases at Influenza Virus Resources at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/) were analyzed to identify signature amino acids that distinguish human influenza viruses from HPAI and H1N1 ⁄ 2009 viruses. Prediction of the signature residues is based on the quatemary structure of
the NP proteins.

解析したモノクローナル抗体はこれらのアミノ酸を認識していることを組み換え蛋白質やペプチドに対する反応性実験で証明した。	
436ª 2012 Blackwell Publishing Ltd

2014/06/30	
GBE

Watanabe et al.

研究計画と進捗(6)	
  Lanceﬁeld	
  C型抗原を持つレンサ球菌であるStreptococcus	
  PCR Analysis

Conventional PCR to analyze the distribution of genes identified in this study was performed using TAKARA LATaq according to the manufacturer’s instruction (TAKARA BIO Inc.).
Primers used to amplify the corresponding genes are listed
in supplementary table S2, Supplementary Material online.

values ranging from 9.6 ! 105 to 4.5 ! 107 CFU/mouse (supplementary table S1, Supplementary Material online).
The SDSE 167 genome consists of a single circular chromosome of 2,076,397 bp with an average GC content of
39.57% (fig. 1 and table 1). The chromosome
wasGenome
shownSequence of SDSE 167 Strain
Completeto contain a total of 2223 protein-encoding genes, and 56
tRNA genes for all amino acids. In addition, the chromosome
harbors two prophage-like elements (fig. 1 and table 2). To
analyze evolutionary relationship of SDSE 167 with other SDSE
strains, whole genome data of the five SDSE strains listed intable 1, including 167, were compared. Genome coverage
analysis using the Blast algorithm indicated that approximately 90% of genome is shared among the five SDSE strains(supplementary table S3, Supplementary Material online).

dysgalac0ae	
  subsp.	
  equisimilis	
  167の全ゲノム配列	
  

従来は	

Results and Discussion

SDSE 167, carrying Lancefield group C antigen, was isolated
from an invasively infected human patient in 2003. We foundthat it was the most virulent SDSE strain isolated with an LD50
of 9.6 ! 105 CFU/mouse in our SDSE collection having LD50

・S.	
  dysgalac0ae	
  subsp.	
  equisimilis(SDSE)は近年、
ヒト無菌部からの分離が増加し、菌血症などの原因となることが明らかになってきた細菌である。SDSEにはC型とG型の血清型が知られているが、前者保有菌の完全ゲノム配列は明らかになっていなかった。	

	

SDSE167株の全ゲノム構造	

Watanabe et al.

167とG型抗原を持つSDSEのゲノムリアレンジメントマップ	
GBE

FIG. 2.—Genome rearrangement maps of S. dysgalactiae subsp. equisimilis 167 with four other SDSE strains. Genome rearrangement maps wereprepared with entire genomes (a) or after omitting the phage regions (b) using in silico molecular cloning. Sequences were aligned from the predicted
replication origin of each genome. Red and green represent the highest and lowest identity of nucleotide sequences, respectively.

(SDSE167_0813 to 0829). This region shows 65% identity
used in place of serotyping to identify Lancefield groupantigens.
with six genes of Streptococcus mutans (rgpA throughThe other unique region found in SDSE 167 is located at
rgpF), whose disruption results in a loss of serotypeSDSE167_0904 to SDSE167_0915. This region did not show
specific antigenicity, specified by the glucose side chains ofsignificant homology with genome of Streptococcus pyogenes
rhamnose–glucose polysaccharide from the cell wall
except for first 1 kb region, which encodes two hypothetical(Yamashita et al. 1998), suggesting that this region may beproteins only at nucleic acid level. The remaining region shows
involved in the synthesis of Lancefield group C antigen. Blast
weak identity with the PTS system, galactitol-specific IIC
analyses of the cluster as well as the corresponding region ofcomponent of Enterococcus faecium NRRL B-2354 and ributhe other SDSE strains, three in Lancefield group G and one in
lose-phosphate 3-epimerase of Streptococcus agalactiae
FIG. 1.—Circular representation of the genome of Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis strain 167. Circle 1 (outermost Lancefield
circle) indicates
the A, indicated that these clusters showedgroup
09mas018883. This region contains sugar metabolizing endistances from the putative origin of replication. Circles 2 and 3 show annotated CDS encoded by the forward (light blue) and reverse (pink)
chromosomal
identity
with those of bacteria carrying group C, G, and A
zymes, including tagatose-6-phosphate kinase, phosphoenolstrands, respectively. Circle 4 shows the rrs operons. Circle 5 shows prophages (green). Circle 6 shows unique regions found in 167 otherthan inrespectively
phages,antigens,(table 1). PCR analysis using the repyruvate-dependent sugar, the phosphotransferase system,
including regions encoding enzymes involved in sugar transfer and sugar metabolism and the FCT region. Circle 7 (innermost circle) shows the G + C content
gions-specific primers showed that corresponding regions of
the phosphotransferase system protein, the PTS systemwith more and less than average (0.40) in purple and brown, respectively.
each putative group antigen were carried by the SDSE isolates
galactitol-specific IIC component, PTS system galactitol-speci(supplementary table S1, Supplementary Material online).
fic IIC component, predicted protein, class II aldolase/adducin,
Althoughphenotypic
analysisisnecessarytoelucidatetheandwithallulose-6-phosphate
3-epimerase.
recentFIG. 3.—Bayesian phylogenetic trees of SDSE. Phylogenetic trees were prepared
entire genomes (a) or after
omitting theOur
phage
regionsmicroarray(b) using1646 Genome Biol. Evol. 5(9):1644–1651. doi:10.1093/gbe/evt117 Advance Access publication August 5, 2013
functionalroles ofandtheseclusters,
theirvisualized
sequences
may beEstimatedresults
that,
upon
injection
peritoneal
BEAST (DrummondRambaut
2007) andusing FigTree.
ages ofsuggested
subclades areshown
as themedian intovalues.mouse
ESS valuesof all

今回、C型抗原を持つ
SDSE	
  167株の完全ゲノム配列を解明すると共に、C型抗原合成の責任遺伝子と考えられる遺伝子群を同定した。	

parameters in BEAST are more than 200. The posterior probability value for each branch was 1.

ベイス法を用いた系統樹解析では現在のSDSEは約500年前に共通祖先から分岐したものと推定された。	
Genome Biol. Evol. 5(9):1644–1651. doi:10.1093/gbe/evt117 Advance Access publication August 5, 2013
Table 3Distribution of CRISPR and Cas Genes among the SDSE Strains
StrainCRISPR ID

No. ofSpacers

Cas Genes

167

tmp_1_Possible CRISPR_1
tmp_1_Possible CRISPR_2

1
1

No hits
No hits

AC-2713

tmp_1_Probable CRISPR_2
tmp_1_Probable CRISPR_3
tmp_1_Possible CRISPR_1

19
14
1

Csn1
Cas3
Csn1

ATCC12394

tmp_1_Probable CRISPR_2
tmp_1_Probable CRISPR_3
tmp_1_Possible CRISPR_1
tmp_1_Possible CRISPR_4

25
29
2
1

Csn1
Cas3
No hits
No hits

GGS_124

tmp_1_Probable CRISPR_2
tmp_1_Possible CRISPR_1
tmp_1_Possible CRISPR_3

18
1
1

Csn1
No hits
No hitsRE378

tmp_1_Probable CRISPR_2
tmp_1_Probable CRISPR_3
tmp_1_Possible CRISPR_1
tmp_1_Possible CRISPR_4

7
13
1
1

Csn1
Cas3
No hits
No hits

NOTE.—CRISPR and Cas genes among the SDSE strains were identified using
CRISPRfinder (Grissa et al. 2007). Possible CRISPR, probable CRISPR, number of
spacers, and type of Cas are presented.

イムノクロマト法によるAAC(6’)-­‐Iae検出手順	

特別な装置を必要とせず、細菌コロニー１個で検出可能なことが大きな利点である	

GBE

1649

cavities, SDSE degrades host tissue polysaccharides by secreting poly/oligosaccharide lyases, while simultaneously using the
Entner–Doudoroff pathway to metabolize acquired carbohydrates (Watanabe et al. 2013), and this region was found in
167 among the SDSE isolates (supplementary table S1,
Supplementary Material online). Thus, this unique region containing sugar metabolizing enzymes may contribute to thehigher virulence of SDSE 167.
In conclusion, we determined, for the first time, the complete genome sequence of a group C SDSE strain 167 andcompared it with the genome sequences of other SDSE
strains. Our results may provide insight into the pathogenic
mechanism of SDSE and may form the basis of molecularepidemiological research on these highly virulent bacteria.

Supplementary Material
Supplementary tables S1–S4 are available at Genome Biology
and Evolution online (http://www.gbe.oxfordjournals.org/).

Acknowledgments
The authors thank Mrs. Komiya and Mrs. Sakurai for excellent
work in the genome analysis. This work was partly supported

研究成果(論文発表)	

1650 Genome Biol. Evol. 5(9):1644–1651. doi:10.1093/gbe/evt117 Advance Access publication August 5, 2013

1.	
  DisseminaPon	
  in	
  Japan	  of	
  mulPdrug-­‐resistant	
  Pseudomonas	
  aeruginosa	
  isolates	
  producing	  IMP-­‐type	
  metallo-­‐β-­‐lactamases	
  and	  AAC(6')-­‐Iae/AAC(6')-­‐Ib.	
  Tojo	  M,	
  Tada	
  T,	
  Shimojima	
  M,	
  Tanaka	
  M,	
  Narahara	
  K,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Kirikae	
  T,	
  Ohmagari	
  N.	
  J	
  Infect	
  Chemother.	
  	
  S1341-­‐321X(14)00180-­‐9.	
  2014	  2.	
  Molecular	
  and	  Epidemiological	
  CharacterizaPon	
  of	
  IMP-­‐Type	
  Metallo-­‐β-­‐Lactamase-­‐Producing	
  Enterobacter	
  cloacae	
  in	
  a	
  Large	
  TerPary	  Care	  Hospital	
  in	
  Japan.	
  Hayakawa	
  K,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Kirikae	
  T,	
  Nagamatsu	
  M,	
  Shimada	
  K,	
  Mezaki	
  K,	
  Sugiki	
  Y,	
  Kuroda	
  E,	
  Kubota	
  S,	
  Takeshita	
  N,	
  Kutsuna	
  S,	
  Tojo	
  M,	
  Ohmagari	
  N.	
  AnPmicrob	
  Agents	
  Chemother.	
  58(6):3441-­‐3450	
  2014	  3.	
  Biochemical	
  Analysis	
  of	
  Metallo-­‐β-­‐Lactamase	
  NDM-­‐3	
  from	  a	
  MulPdrug-­‐Resistant	
  Escherichia	
  coli	  Strain	
  Isolated	
  in	
  Japan.	
  Tada	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Shimada	
  K,	
  Kirikae	
  T.	
  AnPmicrob	
  Agents	
  Chemother.	
  58(6):3538-­‐3540	
  2014	  4.	
  DisseminaPon	
  of	
  16S	
  rRNA	  methylase	
  ArmA-­‐producing	
  acinetobacter	
  baumannii	  and	
  emergence	
  of	
  OXA-­‐72	
  carbapenemase	
  coproducers	
  in	
  Japan.	
  Tada	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Shimada	
  K,	
  Shimojima	  M,	
  Kirikae	
  T.	
  AnPmicrob	
  Agents	
  Chemother	
  58(5):2916-­‐20	
  2014	  5.	
  DisseminaPon	
  of	
  mulPdrug-­‐resistant	
  Klebsiella	
  pneumoniae	
  clinical	
  isolates	
  with	  various	
  combinaPons	
  of	
  carbapenemases	
  (NDM-­‐1	
  and	  OXA-­‐72)	
  and	
  16S	
  rRNA	  methylases	
  (ArmA,	
  RmtC	  and	
  RmtF)	
  in	
  Nepal.	
  
Tada	
  T,	
  6.	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Dahal	
  RK,	  Mishra	
  SK,	
  Ohara	  H,	
  Shimada	
  K,	
  Kirikae	
  T,	
  Pokhrel	
  BM.	  Int	  J	  AnPmicrob	
  Agents.	
  42(4):372-­‐4	
  2013	  6.	
  Complete	
  genome	
  sequence	
  of	
  Streptococcus	
  dysgalac0ae	
  subsp.	
  equisimilis	
  167	
  carrying	
  Lanceﬁeld	
  group	
  C	
  anPgen,	
  and	
  comparaPve	
  genomics	
  of	
  S.	
  dysgalac0ae	
  subsp.	
  equisimilis	
  strains.	
  Watanabe	
  S,	
  Kirikae	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T.	
  Genome	
  Biol	  Evol.	
  PMID:	
  23918808	
  2013	
  7.	
  Concomitant	
  RegulaPon	
  of	
  Host	  Tissue-­‐Destroying	
  Virulence	  Factors	
  and	  Carbohydrate	  Metabolism	  During	
  Invasive	  Diseases	
  Induced	
  by	
  Group	
  G	
  Streptococci.	
  Watanabe	
  S,	
  Shimomura	
  Y,	
  Ubukata	
  K,	
  Kirikae	  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T.	
  J	
  Infect	  Dis.	
  	
  208(9):1482-­‐1493	
  2013	
  8.	
  IMP-­‐43	
  and	  IMP-­‐44	
  Metallo-­‐β-­‐Lactamases	
  with	  Increased	
  Carbapenemase	
  AcPviPes	
  in	
  MulPdrug-­‐Resistant	
  Pseudomonas	
  aeruginosa.	
  Tada	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Shimada	
  K,	
  Shimojima	
  M,	
  Kirikae	
  T.	
  AnPmicrob	
  Agents	
  Chemother.	
  	
  57(9):4427-­‐32	
  2013	
  9.	
  MulPlocus	
  sequence	
  typing	
  (MLST)	
  for	
  characterizaPon	
  of	
  Enterobacter	
  cloacae.	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Hayakawa	
  K,	
  Ohmagari	
  N,	
  Shimojima	
  M,	
  Kirikae	
  T.	
  PLoS	  One.	
  8(6):e66358	
  2013	
  10.	
  Emergence	
  of	
  16S	
  rRNA	  methylase-­‐producing	
  Acinetobacter	
  baumannii	  and	
  Pseudomonas	
  aeruginosa	
  isolates	
  in	
  hospitals	
  in	
  Vietnam	
  Tada	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Kato	
  Y,	
  Ohmagari	
  N,	
  Takeshita	
  N,	
  Hung	  NV,	
  Phuong	  DM,	
  Thu	
  TA,	
  Binh	  NG,	
  Anh	
  NQ,	
  Nga	
  TT,	
  Truong	  PH,	  Xuan	
  PT,	
  Thu	
  LT,	
  Son	
  NT,	
  Kirikae	
  T.	
  BMC	  Infect	  Dis.	
  	
  13(1):251.	
  2013	
  11.	
  NDM-­‐8	
  metallo-­‐β-­‐lactamase	
  in	
  a	
  mulPdrug-­‐resistant	
  Escherichia	
  coli	  strain	
  isolated	
  in	
  Nepal.	
  Tada	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Dahal	
  RK,	
  Sah	
  MK,	
  Ohara	
  H,	
  Kirikae	
  T,	
  Pokhrel	
  BM.	
  AnPmicrob	
  Agents	
  Chemother	
  57(5):2394-­‐6	
  2013	
  12.	
  Novel	
  6'-­‐n-­‐aminoglycoside	
  acetyltransferase	
  AAC(6')-­‐Iaj	
  from	  a	
  clinical	
  isolate	
  of	
  Pseudomonas	
  aeruginosa.	
  Tada	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Shimada	
  K,	
  Shimojima	
  M,	
  Kirikae	
  T.	
  AnPmicrob	
  Agents	
  Chemother.	
  	
  57(1):96-­‐100	
  2013	
  13.	
  Complete	
  genome	
  sequence	
  of	
  Helicobacter	
  cinaedi	
  type	  strain	  ATCC	  BAA-­‐847.	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Takeshita	
  N,	
  Ohmagari	
  N,	
  Kirikae	
  T.	
  J	
  Bacteriol.	
  194(20):5692	
  2012	
  14.	
  Complete	
  genome	
  sequence	
  of	
  Streptococcus	
  pyogenes	
  M1	
  476,	
  isolated	
  from	
  a	
  paPent	
  with	  streptococcal	
  toxic	
  shock	
  syndrome.	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Watanabe	
  S,	
  Kirikae	
  T.	
  J	
  Bacteriol.	
  194(19):5466.	
  2012	
  15.	
  Monitoring	
  of	
  S	
  protein	
  maturaPon	
  in	
  the	
  endoplasmic	
  rePculum	
  by	
  calnexin	
  is	
  important	
  for	  the	
  infecPvity	
  of	
  severe	
  acute	  respiratory	
  syndrome	
  coronavirus.	
  Fukushi	
  M,	
  Yoshinaka	
  Y,	
  Matsuoka	
  Y,	
  Hatakeyama	
  S,	
  Ishizaka	
  Y,	
  Kirikae	
  T,	
  Sasazuki	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T.	
  J	
  Virol.	
  	
  86(21):11745-­‐53	
  2012	
  16.	
  Laninamivir	
  octanoate	
  and	
  arPﬁcial	
  surfactant	
  combinaPon	
  therapy	
  signiﬁcantly	
  increases	
  survival	
  of	
  mice	  infected	
  with	  lethal	
  inﬂuenza	
  H1N1	
  Virus.	
  Fukushi	
  M,	
  Yamashita	
  M,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Kubo	  S,	
  Yamamoto	
  K,	
  Kudo	
  K.	
  PLoS	  One.	
  7(8):e42419.	
  	
  2012	
  17.	
  Development	
  and	  evaluaPon	
  of	
  a	
  line	  probe	
  assay	
  for	
  rapid	
  typing	
  of	
  inﬂuenza	  viruses	
  and	
  detecPon	
  of	
  the	
  H274Y	
  mutaPon.	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Akasaka	
  Y,	
  Oogane	
  T,	
  Kondo	
  Y,	
  Matsushita	
  T,	
  Funatogawa	  K,	
  Kirikae	  T.	
  J	
  Virol	
  Methods.	
  	
  185(2):276-­‐80.	
  2012	
  18.	
  Development	
  of	
  an	
  immunochromatographic	
  assay	
  for	
  rapid	
  detecPon	
  of	
  AAC(6')-­‐Ib-­‐producing	
  Pseudomonas	
  aeruginosa.	
  Tada	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Tanaka	
  M,	
  Narahara	
  K,	
  Shimojima	
  M,	
  Kitao	
  T,	
  Shimada	
  K,	
  Kirikae	
  T.	
  J	
  Microbiol	
  Methods.	
  	
  91(1):114-­‐6	
  2012	
  19.	
  Complete	
  annotated	
  genome	
  sequence	  of	
  Mycobacterium	
  tuberculosis	
  Erdman.	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Matsumura	
  K,	
  Iwai	
  H,	
  Funatogawa	
  K,	
  Kirikae	
  T.	
  J	
  Bacteriol.	
  	
  194(10):2770	
  2012	
  20.	
  Emergence	
  of	
  a	
  novel	  mulPdrug-­‐resistant	
  Pseudomonas	
  aeruginosa	
  strain	
  producing	  IMP-­‐type	
  metallo-­‐β-­‐lactamases	
  and	  AAC(6')-­‐Iae	
  in	
  Japan.	
  Kitao	
  T,	
  Tada	
  T,	
  Tanaka	
  M,	
  Narahara	
  K,	
  Shimojima	
  M,	
  Shimada	
  K,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Kirikae	
  T.	
  Int	  J	  AnPmicrob	
  Agents.	
  	
  39(6):518-­‐21	
  2012	
  21.	
  DiscriminaPon	
  of	
  inﬂuenza	  A	
  subtype	
  by	
  anPbodies	  recognizing	  host-­‐speciﬁc	
  amino	  acids	
  in	
  the	
  viral	
  nucleoprotein.	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Yamashiro	
  T,	
  Mai	  le	  Q,	  Narahara	
  K,	
  Miyamoto	  A,	
  Shinagawa	
  S,	
  Mori	  S,	
  Kitajima	
  H,	
  Kirikae	
  T.	
  Inﬂuenza	  Other	  Respi	  Viruses	
  6(6):434-­‐41	
  2012	

3	

2014/06/30	

研究成果(学会発表・特許出願)	
学会発表	
1.
切替 照雄,多田 達哉,秋山 徹：日本の医療施設で分離される多剤耐性アシネトバクターバウマ ニーの分子疫学解析.第87回日本細菌学会総会、2014年3月26日〜28日	
2.
多田 達哉,秋山 徹,切替 照雄：日本の医療施設で分離された IMP-­‐43	
  および IMP-­‐44	
  産生多剤耐性緑膿菌 .第87回日本細菌学会総会、2014年3月26日〜28日	
3.
安藤 弘樹,秋山 徹,渡邊 真弥,切替 照雄：A	
  silent	
  mutaPon	
  in	
  mabA	  confers	
  isoniazid	
  resistance	
  on	
  Mycobacterium	
  tuberculosis.第87回日本細菌学会総会、2014年3月26日〜28日	
4.
加藤 雅子,秋山 徹,小林 信之,切替 照雄：Whole	
  genome	
  sequencing	
  analysis	
  of	
  Mycobacterium	
  tuberculosis	
  isolates	
  from	  residents	
  in	
  Tokyo.第87回日本細菌学会総会、2014年3月26日〜28日	
  5.
渡邊 真弥,切替 照雄,	  秋山 徹:	  	
  Lanceﬁeld	
  C	
  群抗原を保有する Streptococcus	
  dysgalacPae	
  subsp.	
  equisimilis	
  167	
  株の完全ゲノム配列.第87回日本細菌学会総会、2014年3月26日〜28日	
  6.
久保田 寛顕,奥野 ルミ,貞升 健志,秋山 徹,甲斐 明美:	  都内において分離された多剤耐性緑膿菌(院内感染由来株)の分 子疫学解析.第87回日本細菌学会総会、2014年3月26日〜28日	
  7.
渡邊真弥，切替照雄，秋山徹：G群レンサ球菌による劇症型レンサ球菌感染症発症機構の解明.	
  第7回細菌学若手コロッセウム,	  2013年8月7日～9日,	
  広島県三原市.	
8.
渡邊真弥，切替照雄，秋山徹：マウス感染モデルを用いたG群レンサ球菌の二成分制御因子CsrRSの解析.	
  第22回Lanceﬁeldレンサ球菌研究会，2013年6月28日～29日,東京.	
9.
Watanabe	
  S,	
  Kirikae	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T.	
  Transcriptomic	
  proﬁling	
  of	
  group	
  G	
  Streptococci	
  using	  a	
  murine	
  infecPon	
  model.	
  113th	  General	
  MeePng	
  of	
  American	
  Society	
  for	
  Microbiology.	
  Denver,	
  Colorado,	
  USA.	
  May	
  18-­‐21,	
  2013.	
10.
渡邊真弥，祝弘樹，舩渡川圭次，蓜島由二，奥村香世，加藤雅子，橋本雅仁，切替富美子，秋山徹，切替照雄：A	
  mutaPon	
  in	
  the	
  decoding	  region	
  of	
  16S	
  rRNA	  amenuates	
  the	
  virulence	  of	
  Mycobacterium	
  tuberculosis.	
  第86回日本細菌学会総会，2013年3月18日～20日,	
  千葉市.	
11.
秋山徹，多田達哉，切替照雄：緑膿菌における高度多剤耐性遺伝子の出現と伝播.	
  第86回日本細菌学会総会，2013年3月18日～20日,	
  千葉市.	
12.
多田達哉，秋山徹，切替照雄:	
  日本の医療施設で分離される多剤耐性緑膿菌株の分子疫学解析.	
  第86回日本細菌学会総会，PB-­‐178，2013年3月18日～20日,	
  千葉市.	
13.
切替照雄、安藤弘樹、加藤正子、秋山徹：イソニアジド耐性に関与する遺伝子変異に関する実験解析. 第83回実験結核研究会総会.	
  2013年	
  3月27日,	
  千葉市.	
14.
Ohmagari	
  N,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Tada	
  T,	
  Kato	  Y,	
  Takeshita	
  N,	
  Kirikae	
  T,	
  Mung	
  N	
  V,	
  Phuong	
  D	
  M,	
  Thu	  T	  A,	  Binh	  N	
  G,	
  Binh	  N	
  G,	
  Anh	  N	  Q,	  Nga	
  T	
  T	
  T,	
  Truong	
  P	
  H,	
  Xuan	  P	
  T,	
  Thu	  T	  A,	  Son	  N	  T:	  Emergence	
  of	
  16S	  rRNA	
  methylase-­‐producing	
  gram-­‐negaPve	
  pathogens	
  in	
  medical	
  senng	
  in	
  Vietnam.	
  Asian-­‐African	
  Resarch	
  Forum	
  on	
  Emerging	
  and	
  Reemerging	  InfecPons	
  2013.	
  January	
  23,	  Tokyo,	  Japan,	
  2013.	
15.
Kirikae	
  T,	
  Tada	
  T,	
  Miyoshi-­‐Akiyama	
  T,	
  Dahal	
  R	
  K,	
  Sah	  M	  K,	  Ohara	  H,	
  Pokhel	  B	
  M.:	
  Emergence	
  of	
  16S	
  rRNA	  methallo-­‐beta-­‐lactamase	
  producing	
  nosocomial	
  pathogens	
  in	
  a	
  hospital	
  in	
  Nepal.	
  Joint	  Conference	
  on	
  InfecPous	
  Diseases	
  with	  Growing	
  Concern	
  in	
  Recent	  Years	
  in	
  Nepal.	
  Kathmandu,	
  Nepal,	
  January	
  18,	  2013.	
16.
多田達哉、秋山徹、島田佳世、切替照雄：医療施設で分離される多剤耐性緑膿菌株の解析.	
  第41回薬剤耐性菌研究会,	
  2012年10月25日,	
  下呂市.抄録集P.17.	
17.
霜島正浩、小川美保、坂入和宏、田中雅士、楢原謙次、秋山徹、切替照雄：クイックチェイサー	  Iae・IMPを用いた腸内細菌におけるIMP型metallo-­‐β-­‐lactamaseの迅速測定.	
  第24回臨床微生物迅速診断研究会総会,	
  2012年5月19日,	
  仙台.	
18.
秋山徹、生方公子、切替照雄：劇症型連鎖球菌感染症のマウスモデルにおける宿主因子の発現解析.	
  第83回日本細菌学会総会,	
  2012年3月28-­‐29日.長崎.	
19.
霜島政弘、秋山徹、切替照雄：全国レベルにおける多剤耐性緑膿菌検出状況.	
  第27回日本環境感染学会総会,	
  2012年2月3日,	
  福岡.	
20.
T.	
  Kitao-­‐Ando,	
  T.	
  Miyoshi-­‐Akiyama,	
  M.	
  Tanaka,	
  K.	
  Narahara,	
  M.	
  Shimojima,	
  T.	
  Kirikae:	
  Immunological	
  detecPon	
  system	
  for	
  bacteria	
  producing	
  metallo-­‐β-­‐lactamase	
  IMP.	
  InternaPonal	
  Union	  of	
  Microbiological	
  SociePes	
  2011	
  Congress.	
  September	
  6-­‐10,	
  2011.	
  Sapporo,	
  JAPAN	21.
T.	
  Miyoshi-­‐Akiyama:	
  Rapid	
  diagnosis	
  test	  for	
  mulP-­‐drug	
  resistant	
  Pseudomonas	
  aeruginosa	
  producing	  AAC(6’)-­‐Iae,	
  AAC(6’)-­‐Ib	
  and	  IMPs.	
  The	
  7th	  InternaPonal	
  Conference	
  on	
  Noscomial	  InfecPon	
  Control.	
  December	
  23,	  2011.	
  Hanoi,	
  Vietnam.	
  	
特許出願	
1.出願番号：PCT/JP2011/067761A	
発明の名称：新型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビルリン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法および試験片	
出願日：2012/2/26	
2. 出願番号：特願2013-181767	
発明の名称：抗16SｒRNAメチラーゼ抗体、並びに、アミノグリコシド系抗生剤耐 性菌検出方法及びキット	
出願日：2013/9/3	
3. 出願番号：特願2013-136645	
発明の名称：結核菌の菌株の同定方法及び遺伝子変異の検出方法	
出願日：2013/6/28	

4	

課題番号
：２３指３０１
研究課題名：インフルエンザ等の薬剤耐性の迅速診断法の開発
主任研究者名 ：秋山 徹
分担研究者名 ：秋山 徹
キーワード
研究成果

：インフルエンザ、タミフル耐性、迅速診断、病原体ゲノム：

本研究ではタミフル耐性インフルエンザの耐性に寄与する変異を検出する遺伝子解析法を臨
床現場で利用可能とするための基礎研究および開発研究を実施する。また病原体の遺伝学的検査の基盤となる病原体ゲノム情報を収集・解析する。
インフルエンザのタミフル耐性の遺伝子診断法開発
増幅遺伝子解析法の簡便化：タミフル耐性などの遺伝子変異の解析にはＤＮＡシーケンサな
どの高度な装置が必要であり、診療室では実施できない。そこで結核の薬剤耐性診断に使用されているラインプローブ法を利用する。ラインプローブ法では複数の変異を一つのスリットで解析できるので、インフルエンザの抗インフルエンザ薬耐性のタイプが変化した場合でも、容易に対応可能であるという大きな利点がある。ラインプローブ法をさらに簡便化する
ため、非対称ＰＣＲでのＰＣＲ増幅時の産物標識の一体化、およびスリットにサンプルを滴下するだけで解析可能とするように反応と解析条件の最適化を行った。増幅遺伝子解析法の簡便化：インフルエンザの抗インフルエンザ薬耐性に寄与する遺伝子変異を検出するためのプローブを実装したラインプローブを作製する。当面タミフル耐性に焦点をあてて必要なプ
ローブの設計とラインプローブへの搭載を行った。本プローブを使用し、国際医療研究セン
ターの小児科との臨床研究により、インフルエンザ亜型とタミフル耐性の有無の検出における、その有用性を検証した（Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ
ＯｏｇａｎｅＴ，

Ｋｏｎｄｏ

ｗａ Ｋ， Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｙ，

Ｔ．Ｊ

Ｔ，

Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ

Ｖｉｒｏｌ

ＡｋａｓａｋａＴ，

Ｙ，

Ｆｕｎａｔｏｇａ

Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２

Ｎｏｖ；

１８５（２）：２７６−８０）。
２）タミフル耐性インフルエンザの人工遺伝子による評価系の構築：タミフルなどの耐性判定の遺伝子診断には、当該変異を持つ病原体が必要となる。しかしそれらのウイルスをリア
ルタイムで入手することは困難である。そこで本計画ではデータベースに登録される変異情報を活用し、予め構築しておいたタミフル耐性に関与する遺伝子（ノイラミニダーゼ遺伝子）の発現系にて、変異情報を組み込んだ変異体を発現させる系を構築する。これにより、ウイルス本体に頼らない評価系を構築した。タミフル耐性インフルエンザの人工遺伝子による評
価系：タミフル耐性の評価が必要と考えられる季節性のＨ１Ｎ１インフルエンザおよびＨ３
Ｎ２インフルエンザ、さらに新型のＨ１Ｎ１インフルエンザについて、それぞれのノイラミニダーゼ遺伝子をクローニングし、発現系を構築した。
病原体ゲノム情報の収集・解析
１． インフルエンザ以外の薬剤耐性が問題となっている新興感染症の病原体および診断が困難な病原体について次世代シーケンサを活用し、ゲノム情報を収集する。新興感染症として、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ

ｃｉｎａｅｄｉの全ゲノム情報を解析し、論文発表した（Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ
ＯｈｍａｇａｒｉＮ， Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｔ．Ｊ

Ｔ，

Ｔａｋｅｓｈｉｔａ

Ｎ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９４（２０）：５６９２、２０１２）。
２． 国内で流行している高度多剤耐性緑膿菌と結核菌の全ゲノム配列の解析を行った。
劇症型レンサ球菌感染症患者より分類された流行型のＭ１型菌であるＭ１

ＧＡＳ

４７６株の全ゲノム配列を明らかにし、論文化した。（Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａ
ｍａ

Ｔ， Ｗａｔａｎａｂｅ

Ｓ， Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｔ．Ｊ

Ｂａｃｔｅｒｉｏ

ｌ．１９４（１９）：５４６６．２０１２）。
３． これまでほとんど国内では症例が報告されていなかったＩＭＰ型メタロ−β−ラクタ
マーゼを保有したＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅについて、その多発事例を見いだし、全ゲノム解析を元に、多発事例と孤発例の識別を行った（Ｈａｙａｋ
ａｗａ

Ｋ，

Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ

ａｇａｍａｔｓｕｉＹ， Ｋｕｒｏｄａ

ｕｔｓｕｎａｂ

Ｍ， Ｓｈｉｍａｄａ

ＡｇｅｎｔｓＫｉｒｉｋａｅ

Ｋ， Ｍｅｚａｋｉ

Ｅ， Ｋｕｂｏｔａ

Ｓ， Ｔｏｊｏ

Ｔ，Ｔ，Ｋ， Ｓｕｇｉｋ

Ｓ， Ｔａｋｅｓｈｉｔａ

Ｍ， Ｏｈｍａｇａｒｉ

Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０１４

Ｎ

Ｎ， Ｋ

Ｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ

Ｊｕｎ；５８（６）：３４４

１−３４５０．）。
４． 劇症型レンサ球菌感染症の原因菌の一つであり、これまで全ゲノム構造が明らかにされていなかったＬａｎｃｅｆｉｅｌｄ血清型Ｃ群のレンサ球菌の全ゲノム配列を世界に先駆けて明らかにした（Ｗａｔａｎａｂｅｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ

Ｔ．Ｇｅｎｏｍｅ

３；５（９）：１６４４−５１．

ｄｏｉ：

Ｓ， Ｋｉｒｉｋａｅ
Ｂｉｏｌ

Ｅｖｏｌ．

Ｔ， Ｍ
２０１

１０．１０９３／ｇｂｅ／ｅｖｔ１１

７．）５． Ａ型インフルエンザウイルスの亜型を識別可能なモノクローナル抗体について、それらの反応エピトープを解析し、識別の基盤となっている機構を明らかにした（Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ Ｔ， Ｙａｍａｓｈｉｒｏ
Ｎａｒａｈａｒａｏｒｉ

Ｋ， Ｍｉｙａｍｏｔｏ

Ｓ， Ｋｉｔａｊｉｍａ

Ｏｔｈｅｒ
４−４１．）

ＲｅｓｐｉｒＴ， Ｍａｉｌｅ

Ａ， Ｓｈｉｎａｇａｗａ

Ｑ，

Ｓ， Ｍ

Ｈ， Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｔ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ

Ｖｉｒｕｓｅｓ． ２０１２

Ｎｏｖ；６（６）：４３

課題番号：２３指３０１
研究課題名：インフルエンザ等の薬剤耐性の迅速診断法の開発
主任研究者名 ：秋山 徹
分担研究者名 ：切替 照雄
キーワード
研究成果

：インフルエンザ、タミフル耐性、迅速診断、病原体ゲノム：

本研究ではタミフル耐性インフルエンザの耐性に寄与する変異を検出する遺伝子解析法を臨
床現場で利用可能とするための基礎研究および開発研究を実施する。また病原体の遺伝学的検査の基盤となる病原体ゲノム情報を収集・解析する。同知見を元に重要感染症病原体の迅
速診断法を開発する。
インフルエンザのタミフル耐性の遺伝子診断法開発
本研究で対象となるインフルエンザのタミフル耐性の遺伝子診断法開発には、耐性および感受性のインフルエンザ遺伝子の準備が必要である。これに加えて、遺伝子診断法の臨床現場への導入を困難にしている１）検体からの病原体遺伝子抽出、２）遺伝子増幅反応実施の各
課題を解決する必要があった。以下ではこれらの解決についての成果を順に記述する。
１）検体からの病原体遺伝子抽出操作の簡便化：現在のインフルエンザ遺伝子解析では、検体からのインフルエンザ遺伝子抽出に専用のキットを使用する必要がある。このキットではカラムに病原体遺伝子を吸着後、複数の溶液で遠心機を使用して洗浄し、さらに遺伝子を回収するという複雑な工程が必要となる。しかしながらこの工程を簡略化し、熱処理のみで以降の遺伝子増幅反応を行うことが技術的に可能となっている。この技術は以降の遺伝子増幅
反応を妨害する検体中の物質を抑制する特殊な緩衝液で、１段階のみの前処理を行い直接検体とする方法である。本計画では、この技術をインフルエンザ検体調整用に最適化した。検体からの病原体遺伝子抽出の簡便化：予備的試験を実施し、加熱法による検体処理での遺伝子増幅反応への適用性を検証する。すでに他の RNA ウイルスで構築されている類似法を元に、条件の最適化を行い、1 段階法での抽出が可能なことを確認した。
２）遺伝子増幅反応の簡便化：現在のインフルエンザ遺伝子増幅反応では RNA を DNA に変換
する逆転写反応と、その後の PCR 法による DNA 増幅に、専用の温度制御装置が必要であり、この反応は通常数時間を要する。これらの装置は比較的高価だったが現在では数十万円程度で入手可能となっており、臨床現場への導入は容易になってきている。本研究では、増幅反応時間を短縮するため、逆転写反応と PCR 法を連続的に実施し、さらに反応が短時間で終結する高速反応酵素を採用して、数時間だった反応時間を最終的には 20 分程度に短縮する。これらの高速反応酵素はいくつかが製品化されており、インフルエンザ遺伝子増幅に最適な酵素の選定とさらなる最適化を実施した。遺伝子増幅反応の簡便化：すでに市販されているいくつかの高速増幅酵素のそれぞれの特性を検証し、インフルエンザの耐性遺伝子増幅に最適な酵素の選抜を行った。本手法により従来 2〜6 時間程度を要していた反応時間を 30 分未満に短縮できた。
重要感染症病原体の迅速診断法の開発

１． 昨年度まで実施した高度多剤耐性緑膿菌ゲノム解析の成果を元に、同菌耐性因子を標的としたイムノクロマト法を構築し、研究用試薬として実用化し、論文発表した（Ｋｉｔａｏ

Ｔ， Ｔａｄａｈｉｍｏｊｉｍａ
Ｔ，

Ｍ，

Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｔ， Ｔａｎａｋａ
Ｓｈｉｍａｄａ

Ｔ．Ｉｎｔ

Ｊ

Ｋ，

Ｔ， ＴａｎａｋａＭ， Ｋｉｔａｏ
ｒｏｂｉｏｌＫ， Ｓ

Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ

３９（６）：５１８−２１、２０１２，Ｔａｄａ
ａｍａ

Ｍ， Ｎａｒａｈａｒａ

Ａｇｅｎｔｓ．

Ｔ，

Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙ

Ｍ， Ｎａｒａｈａｒａ

Ｋ， Ｓｈｉｍｏｊｉｍａ

Ｔ， Ｓｈｉｍａｄａ

Ｋ， Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２

Ｔ．Ｊ

Ｍｉｃ

Ｏｃｔ；９１（１）：１１４−６．）。

２． 本イムノクロマト法の有用性を、２０１１年〜２０１２年に大手臨床検査センター
で分離された多剤耐性緑膿菌の疫学研究にて検証し、ＩＭＰ、ＡＡＣ（６′）−ＩａｅまたはＡＡＣ（６′）−Ｉｂを保有する多剤耐性緑膿菌の割合が、多剤耐性緑膿菌の約８０％二相等することを明らかにした（Ｔｏｊｏｈｉｍｏｊｉｍａ

Ｍ， Ｔａｎａｋａｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ
ＩｎｆｅｃｔＴ，Ｍ， Ｔａｄａ

Ｍ， Ｎａｒａｈａｒａ

Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０１４

Ｔ，Ｋ， ＭｉｙｏＯｈｍａｇａｒｉ

Ｊｕｎ

Ｔ， Ｓ
Ｎ．Ｊ

５． ｐｉｉ： Ｓ１３

４１−３２１Ｘ（１４）００１８０−９． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｉａｃ．
２０１４．０４．０１４．）。
３． これまで国内でほとんど発生例が報告されていないニューデリー型メタロβラクタ
マーゼ（ＮＤＭ）のうちＮＤＭ‐３型を保有する大腸菌を臨床現場で分離し、全ゲノム解析などを用いて、その特徴付けを行った（Ｔａｄａｋｉｙａｍａｒｏｂ

Ｔ， Ｓｈｉｍａｄａ

ＡｇｅｎｔｓＴ，

Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａ

Ｋ， Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｔ．Ａｎｔｉｍｉｃ

Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０１４

Ｊｕｎ；５８（６）：３

５３８−３５４０．）。
４． 多剤耐性緑膿菌の疫学解析中に、カルバペネムへの耐性度が上昇した、新型のＩＭ
Ｐ型メタロβラクタマーゼを保有する菌株を同定し、同酵素の酵素学的解析を実施した（ＴａｄａＴ， Ｍｉｙｏｓｈｉ−Ａｋｉｙａｍａ

ＳｈｉｍｏｊｉｍａｔｓＭ， Ｋｉｒｉｋａｅ

Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．

２０１３

Ｔ， Ｓｈｉｍａｄａ

Ｔ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ

Ｋ，

Ａｇｅｎ

Ｓｅｐ；５７（９）：４４２７−３２）。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：23指301
研究課題名：インフルエンザ等の薬剤耐性の迅速診断法の開発
主任研究者名：秋山徹

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Dissemination in Japan of multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa isolates producing IMP-type
metallo-β-lactamases and AAC(6')-Iae/AAC(6')-Ib.

Tojo M, Tada T, Shimojima M, Tanaka M,
Narahara K, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae
T, Ohmagari N.

J Infect
Chemother.

S1341-321X(14)001809.

2014

Molecular and Epidemiological Characterization of IMPType Metallo-β-Lactamase-Producing Enterobactercloacae in a Large Tertiary Care Hospital in Japan.

Hayakawa K, Miyoshi-Akiyama T, Kirikae
T, Nagamatsu M, Shimada K, Mezaki K,
Sugiki Y, Kuroda E, Kubota S, Takeshita
N, Kutsuna S, Tojo M, Ohmagari N.

Antimicrob
AgentsChemother.

58(6):3441-3450

2014

Biochemical Analysis of Metallo-β-Lactamase NDM-3
from a Multidrug-Resistant Escherichia coli Strain
Isolated in Japan.

Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Shimada K,
Kirikae T.

Antimicrob
AgentsChemother.

58(6):3538-3540

2014

Dissemination of 16S rRNA methylase ArmA-producing
acinetobacter baumannii and emergence of OXA-72
carbapenemase coproducers in Japan.

Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Shimada K,
Shimojima M, Kirikae T.

Antimicrob
58(5):2916-20
Agents Chemother2014

Dissemination of multidrug-resistant Klebsiellapneumoniae clinical isolates with various combinationsof carbapenemases (NDM-1 and OXA-72) and 16S rRNA
methylases (ArmA, RmtC and RmtF) in Nepal.

Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Dahal RK,
Mishra SK, Ohara H, Shimada K, Kirikae
T, Pokhrel BM.

Int J Antimicrob
42(4):372-4
Agents.

2013

Complete genome sequence of Streptococcus dysgalactiae
subsp. equisimilis 167 carrying Lancefield group C
antigen, and comparative genomics of S. dysgalactiae
subsp. equisimilis strains.

Watanabe S, Kirikae T, Miyoshi-Akiyama
T.

Genome Biol
Evol.

PMID: 23918808

2013

Concomitant Regulation of Host Tissue-Destroying
Virulence Factors and Carbohydrate Metabolism During
Invasive Diseases Induced by Group G Streptococci.

Watanabe S, Shimomura Y, Ubukata K,
Kirikae T, Miyoshi-Akiyama T.

J Infect Dis.

208(9):1482-1493

2013

IMP-43 and IMP-44 Metallo-β-Lactamases with Increased
Carbapenemase Activities in Multidrug-ResistantPseudomonas aeruginosa.

Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Shimada K,
Shimojima M, Kirikae T.

Antimicrob
AgentsChemother.

57(9):4427-32

2013

Multilocus sequence typing (MLST) for characterizationof Enterobacter cloacae.

Miyoshi-Akiyama T, Hayakawa K, Ohmagari
N, Shimojima M, Kirikae T.

PLoS One.

8(6):e66358

2013

Emergence of 16S rRNA methylase-producing
Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa
isolates in hospitals in Vietnam

Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Kato Y,
Ohmagari N, Takeshita N, Hung NV,
Phuong DM, Thu TA, Binh NG, Anh NQ, Nga
TT, Truong PH, Xuan PT, Thu LT, Son NT,
Kirikae T.

BMC Infect Dis.

13(1):251.

2013

NDM-8 metallo-β-lactamase in a multidrug-resistantEscherichia coli strain isolated in Nepal.

Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Dahal RK,
Sah MK, Ohara H, Kirikae T, Pokhrel BM.

Antimicrob
57(5):2394-6
Agents Chemother2013

novel 6'-n-aminoglycoside acetyltransferase AAC(6')Iaj from a clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa.

Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Shimada K,
Shimojima M, Kirikae T.

Antimicrob
AgentsChemother.

57(1):96-100

2013

Complete genome sequence of Helicobacter cinaedi typestrain ATCC BAA-847.

Miyoshi-Akiyama T, Takeshita N,
Ohmagari N, Kirikae T.

J Bacteriol.

194(20):5692

2012

Complete genome sequence of Streptococcus pyogenes M1
476, isolated from a patient with streptococcal toxic
shock syndrome.

Miyoshi-Akiyama T, Watanabe S, Kirikae
T.

J Bacteriol.

194(19):5466.

2012

Monitoring of S protein maturation in the endoplasmic
reticulum by calnexin is important for the infectivityof severe acute respiratory syndrome coronavirus.

Fukushi M, Yoshinaka Y, Matsuoka Y,
Hatakeyama S, Ishizaka Y, Kirikae T,
Sasazuki T, Miyoshi-Akiyama T.

J Virol.

86(21):11745-53

2012

Laninamivir octanoate and artificial surfactant
combination therapy significantly increases survivalof mice infected with lethal influenza H1N1 Virus.

Fukushi M, Yamashita M, Miyoshi-Akiyama
T, Kubo S, Yamamoto K, Kudo K.

PLoS One.

7(8):e42419.

2012

Development and evaluation of a line probe assay for
rapid typing of influenza viruses and detection of the
H274Y mutation.

Miyoshi-Akiyama T, Akasaka Y, Oogane T,
Kondo Y, Matsushita T, Funatogawa K,
Kirikae T.

J Virol Methods. 185(2):276-80.

2012

研究発表及び特許取得報告について

Development of an immunochromatographic assay for
rapid detection of AAC(6')-Ib-producing Pseudomonas
aeruginosa.

Tada T, Miyoshi-Akiyama T, Tanaka M,
Narahara K, Shimojima M, Kitao T,
Shimada K, Kirikae T.

J Microbiol
Methods.

91(1):114-6

2012

Complete annotated genome sequence of Mycobacterium
tuberculosis Erdman.

Miyoshi-Akiyama T, Matsumura K, Iwai H,
Funatogawa K, Kirikae T.

J Bacteriol.

194(10):2770

2012

Emergence of a novel multidrug-resistant Pseudomonas
aeruginosa strain producing IMP-type metallo-βlactamases and AAC(6')-Iae in Japan.

Kitao T, Tada T, Tanaka M, Narahara K,
Shimojima M, Shimada K, Miyoshi-Akiyama
T, Kirikae T.

Int J Antimicrob
39(6):518-21
Agents.

2012

Discrimination of influenza A subtype by antibodies
recognizing host-specific amino acids in the viralnucleoprotein.

Miyoshi-Akiyama T, Yamashiro T, Mai le
Q, Narahara K, Miyamoto A, Shinagawa S,
Mori S, Kitajima H, Kirikae T.

Influenza Other
Respi Viruses

2012

発表者

学会名

場所

年月

発表者

発表先

場所

年月日

6(6):434-41

学会発表
タイトル
該当無し

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

特許取得状況について※出願申請中のものは()記載のこと。

発明名称

登録番号

新型インフルエンザウイルスのタイピングとオセルタミビル
リン酸塩耐性変異の検出とを同時に行うための方法および試 PCT/JP2011/067761A
験片

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）
独立行政法人・国立国際医療研究セ
2012年2月26日
ンター、株式会社
ニプロ

出願国

未定

抗16SｒRNAメチラーゼ抗体、並びに、アミノグリコシド系抗特願2013-181767
生剤耐 性菌検出方法及びキット

独立行政法人・国立国際医療研究セ 2013年9月3日
ンター

日本

結核菌の菌株の同定方法及び遺伝子変異の検出方法

独立行政法人・国立国際医療研究セ
2013年6月28日
ンター、株式会社
ニプロ

日本※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特願2013-136645