Phyco.l (Sorui) 55 : 177‑180 ，Novem ber 10 ，2007

ワークショップ B177

D N A を用いた藻類の集団解析ー海藻・アオコ・赤潮研究の最前線ー

上井進也: ミトコンドリアマーカーによる日本産褐藻アカモク
集団における遺伝的・系統地理的構造の解析「種」の 内部に存在する遺伝的多様性といってもいろいろな種類のものがある 。例えば形態的分類が十分に吟味されておらず形態的には同種とみなされていても実は多系統的である場合もある 。本稿はそういった多系統性に由来する遺伝的多型ではなく，分子系統学的にも単系統とみなされる種の内部に存在している遺伝的多型についての話である。褐藻アカモ

クにおける遺伝的多様性の大きさと 地理的分布にもとづく系統地理的解析について解説したい。

アカモク( 図 1) は褐藻; t ; ンダワラ科の仲間で，九州から 北

海道まで黒潮や親潮の影響の強い地域を除き広く分布している。一年生の褐藻で，ホンダワラの仲間の中では長い茎と長楕円形の気胞，羽状の冠葉などの特徴で比較的簡単に同定できる 。類似種としてシダモクがあり，両種は気胞 の形態( 長楕円形と球形，図 2 ，3) と雌雄性 で区 別 されてきた( 沢田1955 ，奥田 1977 ，Yoshida 1983)0 Sti 巴g 巴r et al. (2003) のと母親由来のミ卜コンドリアマーカ ー とではデータ収集 (シ ーケンスやジェノタイピングなど) の際の方法も違えば，その後の解析も異なる 。 ミ 卜コ ンドリアマ ーカーは片親由来であるため基本的に組み換えがなく， このため全ミトコンド リアゲノムは一つの遺伝子座として扱う 。 この特徴には一長一短( 例

えば短所として はいくつもの遺伝子について多型を調べても結局一つのマ ーカーにおける 多型 として 扱うことになる点が挙 げられる) があるが，種内で、ハプロタイプ聞の系統関係を推定するような場合には大きな利点となる 。なおミトコンドリ

アゲノムは核ゲノムにくらべて遺伝的浮動の影響を受けやす
く，地域差がでやすいことも留意しておいていただきたい。

この解析ではアカモク 3 1:集団，シダモ ク 6 集団から計 305

個体 を日本沿岸から採集 した (図 4) 。 これら 305 個体からがみつかった。ハプ ロタイプ聞の系統関係
は 33 ハ プロタイプ。とおおまかな地理的分布を図 5 に示す。 これらハプロタイプ

ITS 領域に基づく分子系統学的解析によるとアカモクとシダの地理的分布( 各集団における出現頻度) とハプロタイプ聞ITS 領域では両種の区別 は明を行うため S A M O V A 解析 (Spatial Analysis of MOlecular

モクは 他のホンダワラ科の仲間からは明 ￨僚に区別することができる単系統群となるものの瞭ではない。 このような理由から我々の研究では便宜的にアカモクとシダモクを種群としてまとめて扱い，系統地理的解析ばかりではなく両種の遺伝的関係も調べた 。

マーカーとしてはミトコ ン ド
リ アの cox3 遺伝子の部分配列(470 塩基) を用いた。両親由来の核ゲノムコ ード のマ ーカー

図 1‑3の遺伝 的距離をもとに日本沿岸の集団についてグル ー ピング

VAriance，Dupanloup et al.2002) を行なった結果が図 4 である 。

S A M O V A は A M O V A を利用したグ、ル ー ピングの一手法

で，最も大きな遺伝的分化を示すようなク守ループを検出する 。

S A M O V A では 事前に遺伝的構造を仮定する必要がなく，持iアカモクとシダモク 。l. アカモクの藻体。2 アカモクの気J包。3 . シダモクの気J包。スケ ールは図 l は JO c m ，図 2，3 は I cm 。

17 8

図 4 サンプリングポイントと S A M O V A クループの地耳目的分;{fio . はアカモク， ・はシダモクをがす。円グラフは各 S A M O V A グループのハプロタイプ組成を表す。パタ ーンは￨玄15 に対応。前一弧内 はザンプル数。1m 日本クーループ (k=3) は円本海，瀬戸 内海アカモ ，ク 北九州 シダ
ψ果から対象と した集問問に存在する遺伝子流動の障壁を検出することもできる 。 ただ しグル ー プの数を設定 してやる必要があり，通常'は ある程度の範四 (今回の場合 k=2‑9 ，k はグ、ループ数) で解析を 繰り返す。

区14 に示したクゃルーピングは k= 3 (Fct= 0 .852) と k=5 (Fct=0.87 1) の場合のものである 。 k= 3 のときは九州 から 北 海 道までの日本海沿岸と i狐戸内海沿岸のアカモク ・シダモク集団

ダモ クは k= 8 まで分離することはなかった 。
以上 のように 日本 列島沿岸のアカモク ・シダモク集問に は明確な地理的分化 (地理 的 な遺伝 的構造 ) がみられたが， このような地理的分化 がどのような要因によって形成されてきた か を 知 る た め に は 系 統地 理 学 的 解 析 が 必 要 と な る 。 以前は系統地理的 な考察はハプ ロタイプの地 理 的分布とハプロタを含む四日本， 三重から術品までの関東，そして東北太平洋イフ。
系統樹の分11皮ノ号
タ ー ン とを照 らし合わせて直感的に行なプが紺l分されて瀬戸 内海アカモ ク集団，北九州シダモ ク集団，

法 が 提 案 さ れ て い る (Av ise 2000 ，K n o九.v les & M addisoll

岸の東北の 3 ク、、ル ー プに分かれ， k= 5 の場合は西日本 、ルーグ
そ してそれ以外の集 問 (1三￨本海沿岸のアカ モ ク集団と瀬戸 内守ル ー プに分かれた。高い Fct 値は海のシダモク集団) の 3 ク

各集団がほぼ例外 なく 一つの系統群 (図 5 の地理的グループ)に属す るハプ ロタイフ。
を持っていた こと， また特に k=3 の時は各グ、ルー プのハプ ロタイプの 問に 大きな辿伝的距離 が見られたことに起因する 。 なお日本海のア カモ ク と瀬戸 内海のシ

われていたが，最近ではより客観的に解析を行なうための方2002) 。 その 一 つ が T e m pleton et al. (1995) に より考案された Nested clade analysis ( N C A ) である ( T e m pleton 2004の文献参照) 。例えば地理的に分布域が隔離されてい る二 つの集団において遺伝的分化 が検出 された場合を想定してみる 。
単にハプ ロタイプ頻度が統計的に 奥なる場合には両集問の聞の遺伝子流動が制限されたため( つまり最近の 出来事) と考179: 北九州一 、¥: シダモク....m.. よ斗; グレード姐却自/"で‑..............、、‑¥..

/ 寺F 寄V 瀬戸内福a 包" 1 ‑ / /1i¥ } 号i 7 喝事 クレー

1相主歩岳性自F

日本海

1:アカモク J
1
クレード /j…西日本クレード…
関

クレード

図 6 Nesting の作業手順。ネットワーク全体が一つにクレードに含まれるまで，この図に示す手順を繰り返した後に，系統関係をテキストで表すために各クレードに階層に準じた名前をつける(1 ‑step クレードなら 1‑1 ，1・2，1‑3，2・step なら 2‑1 ，2‑2 など)。
である。 k=3 のときの S A M O V A グループとネットワーク上で長い枝で分かれている 3 クレードそれぞれの分布域はほぼ，、
陸時，: . J ; ，. 東北

クレード一致している。これは歴史的に分断されてきた集団の聞にみられる特徴である。日本海のアカモクと瀬戸内海のシダモクを含むクレードと瀬戸内海のアカモク集団に相当するクレードには分布域の拡大が示唆された。西日本グループ全体に相図5 ハプロタイプ聞のネットワーク系統樹。マルで示したものが今回見つかったハプロタイプ，棒は仮想上のハプロタイプを示す。
各クレードのおおまかな地理的分布を示す。 S A M O V A グループとは完全に一致していないことに注意。
えられるし，両集団で見つかるハプロタイプが全く異なっていれば( 加えてハプロタイプ聞の遺伝的距離が大きければ)当するクレードには遺伝子流動の制限が示唆された。

ここまでの結果から日本沿岸のアカモク・シダモク集団について以下のような考察ができる。まずアカモクとシダモクの関係であるが，今回の結果からは明らかに西日本のアカモクは東北や関東地方のアカモクよりはシダモクの方に遺伝的に近い。西日本グループ内をみるとアカモク集団とシダモク集団の聞には明らかにハプロタイプ頻度の違いがみられるが，二集団は歴史的に分断されてきたと考えられる。このように

N C A ではこのような遺伝的分化は長い間隔離されてきた結果を統計的に判断するのが N C A の特徴である。

唆されている。他方関東・東北地方のアカモク集団とは形こ

統樹にみられる系統関係と他の形質状態の関係の相闘を検証

ただ，形態的には西日本，関東，東北のアカモクを区別する

eta.l 2000) により，系統地理的解析に頻繁に使われるようにらの結果からはアカモクとシダモクは同種であることが示唆検出された地理的分化がどのような過程をへて形成されたか

N C A 自体は系統地理に限った解析方法ではなく，分子系する方法である。近年開発された解析ソフト Geodis (Posadaなった。 N C A は次の 2 つの手順で行なわれる; まずネットワー
ク系統樹に対し Nesting と呼ばれる階層化を行う( 図 6) 。これは各ハプロタイプを O‑step クレードとし，近縁なハプロタというよりは最近の遺伝的流動の制限が原因であることが示そ似ているものの歴史的に遺伝的交流がなかったようである。

ことは難しく，これらを別種とみなすことは困難である。これされる。また日本海沿岸のアカモク集団，瀬戸内海のアカモク集団などに分布域の拡大が示唆されたことは最終氷期以降の沿岸環境の変化から説明できる。日本海は寒冷化と低塩分イプ同土を一つの l‑step クレードにまとめ，近縁な l‑step ク化で，また瀬戸内海は陸化していて，最終氷期の間( とくにトワークを階層化していく作業である( これによりハプロタイいなかったと推定されている。いずれの地域も最終氷期以降

果をもとに，ハプロタイプの地理的分布情報を記載( どのク

瀬戸内海は 13 ，000 年前後からの海水の流入; 八島 1994) に，step クレードにまとめ，というふうにネッレードを一つの 2・プ聞の系統関係をテキストとして示せる) ; 次に Nesting の結18，000‑20，000 年前の極寒期) は海藻が生育するには適して000 年前の対馬腰流の流入; 大場 1983，( 日本海はおよそ 8 ，

レードにどの集団がどれくらい含まれているかという形式) し現在のような環境になったと言われているが， N C A で検出さの地理的な距離の計算も必要となる。

けることが可能である。瀬戸内海の集団についてははっきりていく作業を行う。二つ目の手順にはサンプリングサイト聞
日本沿岸のアカモク・シダモク集団で N C A を行なうとい

くつかの有意な系統地理的推定が示される( 表1 ) 。最も顕著なものが東北，関東，そして西日本の 3 クレードの聞の分断れた分布域の拡大はこのような新しい生育地の出現と対応づしないが，日本海の集団は東シナ海沿岸に分布している集団が分布を拡大したものと考えられる。

最後に今回見つかったような日本沿岸の遺伝的多様性がど

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表 2 各クレードの分岐時代推定

表 1 Nested Clade Analysis の結果

クレード I

分布域推定されたイベント

全体

日本全体

過去の分断

西日本

日本海と瀬戸内海制限された遺伝子流動

日本海アカモク+
瀬戸内海シダモク

日本海( アカモクのみ) と瀬戸内海( シダモクのみ)

分布域の拡大瀬戸内海アカモク

瀬戸内海( アカモクのみ) 分布域の拡大

関東

関東・東海と北海道函館 過去の分断

東北東北太平洋岸l図

制限された遺伝子流動

5 のクレード。の時代に生まれたものかを考察したい。前述のようにミトコン
ドリアゲノムは組み換えがなく，また今回の場合は D N A の塩基配列を決定しているため ，cox3 遺伝子の進化速度が分かればそれぞれのクレードの分岐した時代を推定できる。残念ながら cox3 の進化速度は不明であるが， Hoarau et al. (2007)

が Fucus serratus でミトコンドリアゲノムのスペーサー領域の分子進化速度( 1 0 0 万年あたり 2‑3 . 4 % ) を算出しているので，多少不正確さは承知の上でその値からそれぞれのグルー

プ の 分 岐 年 代 (Time to M o s t R ，配ent C o m m o n A ncestor;

T M R C A ) を求めてみた。計算には Beast v 1.4 ( D r u m m o n d& R a m b a u t 2003) を用いた。なお詳細は省かせてもらうが，この Beast を用いることで分岐年代だけでなく，対象集団の集団サイズの歴史的変動を推定することも可能である。表 2が分岐年代の推定結果をまとめたものである。関東グループ
や東北グループのような遺伝的変異の少ないグループでも，分岐時代は 12 万年前後であり，時代としては最終間氷期の時代に相当した。また多様性の高い西日本グループは 3 7 万年前，アカモク・シダモク全体にいたっては約 100 万年前という値が出ている。この結果を信じるなら，最終氷期が日本沿岸のアカモク・シダモク集団に与えた影響は，少なくとも遺伝的多様性を減少させるような強力なものではなかったと推定される。また各グループの多様化が最終氷期以前であることから，主要 3 グループ( クレードとも言える) の分断は，少なくとも最終間氷期から続いていることも示唆された。

以上のように日本沿岸におけるアカモクの遺伝的構造と系統地理について，日本藻類学会第 31 回大会ワークショップでの発表をもとに一部改変した内容を本稿では紹介した。ミトコンドリアマーカーによる D N A 塩基配列の変異解析は，系統地理的解析に向いており，分岐年代や集団サイズの歴史的変化の解析に盛んに用いられている。一方で例えば西日本グJレープ内部での遺伝子流動がどのようになっているかを明らかにするためには，より分解能の高い D N A マーカー( マイクロサテライトのような核ゲノムの共優性マーカー) を用いる

クレード l分岐年代( l ∞万年)

全体0.986

関東0.136

東北0.118

西日本0.378

瀬戸内海アカモク
北九州シダモク

日本海アカモク Z

9 5 % lower‑upper Effective
鈎 mplesize∞nfidence 面凶t
0.626‑1. 39

0.062‑0.230
0.050‑0.197

0 .1 221102024940

0.065‑0.1825257

0.093‑0.256

0.171

12000

0.207‑0.583

0.057‑0.214

0.141

47210

7133
8932

l 図 5 のクレーに Z 瀬戸内海シダモクはのぞく。

必要があり，今後の課題といえる。

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