1.1

脊椎動物への発生遺伝学の導入■

１章 ゼブラフィッシュ

脊椎動物発生研究における優れたモデル

動物の発生生物学における遺伝学的手法の重要性は，まずショウジョウバ
エなどの無脊椎動物で明らかとなった．次に期待されたのが脊椎動物における発生遺伝学であったが，従来の脊椎動物モデルでは困難が多い．長らく，ショウジョウバエでの遺伝子機構が脊椎動物でも成り立つことを確認するに留まっていたが，この手詰まり状態を打破したのが，1980 年代に発生遺伝学モデルとして登場したゼブラフィッシュ（Danio rerio）である．
本章では，発生遺伝学モデルとしてのゼブラフィッシュの特徴を述べた上，正常発生を解説し，最後に，この動物を使って発生遺伝学の研究を行う上での実際的なノウハウを紹介したい．

1.1

脊椎動物への発生遺伝学の導入

すべての動物は，単純な 1 個の細胞に過ぎない卵から出発し，複雑な構造をもつ成体に発生する．この際，核内に存在する数万もの遺伝子の発現が，時間的，空間的に厳密に制御されることが必要となる．
発生における遺伝子の役割の研究は，1970 年代の遺伝子工学の発展により活性化された．まず，様々な生体物質の生化学的精製，タンパク質のアミノ酸配列の決定，そしてこれに基づいた遺伝子のクローン化が行われた．その後，発生生物学への分子生物学的手法の導入に伴い，遺伝子強制発現法，遺伝子機能阻害法が開発され，同定された遺伝子各々について，胚発生における機能の解析が可能となったのである．こうした研究手法は，特定遺伝子に注目して人工的に変異体を作製し，解析する，という意味で突然変異に始まる古典的遺伝学とは逆であり，逆遺伝学とよばれる（図 1.1）．
近年の大規模ゲノム解析による膨大な塩基配列情報の取得により，逆遺伝学的手法は発生の理解において引き続き重要となっている．しかし，この手
11.4

1.4

ゼブラフィッシュの発生■

ゼブラフィッシュの発生

ゼブラフィッシュの発生についてはキンメルらにより詳述されている（Kimmelet al., 1995）．以下にその概略を述べるが，当然，基本的には脊椎動物の共通過程に従う．一般的な脊椎動物の発生については成書を参照されたい．
1.4.1

ゼブラフィッシュの正常発生過程（図 1.6，表 1.2，別表 1）

a．卵成熟と受精
ゼブラフィッシュの卵母細胞は形態的，生理学的，生化学的特徴により 5つのステージに区別される．ステージⅠでは，卵母細胞は卵黄をもたず，卵1 細胞期（12 分）

2 細胞期（45 分）8 細胞期
32 細胞期（1 時間 15 分） （1 時間 45 分）

128 細胞期（2 時間 15 分）

高胚盤期（3 時間 20 分）
2

1
3球形胚期
30％エピボリー期 50％エピボリー期（4 時間） （4 時間 40 分） （5 時間 20 分）

7

4

6
6 体節期
（12 時間）

1シールド期（6 時間）

875％エピボリー期（8 時間）

10尾芽期（10 時間）1195

18 体節期（18 時間）26 体節期（22 時間）

31 時間胚48 時間胚図 1.6 ゼブラフィッシュの正常発生
シールド期（上）とそれ以降の発生段階については右が背側，上が前方を示す．
シールド期（下）は動物極から見た図で上が背側である．1：胚循，2：ポルスター，3：尾芽，4：眼胞，5：体節，6：クッパー胞，7：耳胞，8：レンズ，9：総排泄口，10：心臓，11：孵化線．スケールバー，250 µm．（Kimmel et al., 1995 より改変）
13■1章ゼブラフィッシュ－脊椎動物発生研究における優れたモデル－（1）
22 hpf
心臓管E

18 hpf
原始心筋管

EPM

MPA

30 hpf
心房・心室形成

VA

V

36 hpf
心臓ルーピング（2）
24 hpf
LDA

体幹部での循環LDA′
DACA

VA

AA1′
AA1

CCV/DC PCV

26 hpf

CVDA

CA

PCV

CV

ACV
PICA
VA
＊

CCV/DC

頭部での循環図 1.12 心臓の発生と初期の血管系(1) 心臓原基からの心臓の形成．A：心房，E：心内膜，EP：心内膜前駆細胞，M：心筋層，MP：原始心筋管，V：心室．（Vogel & Weinstein, 2000 より）(2) 体節形成終了期における血管系の形成．24 hpf では主として体幹部で循環が見られるが，26 hpf になると，頭部での循環が始まる．黒矢印は動脈，赤矢印は静脈での血流の向きを示す．AA1：第 1 咽頭弓動脈，ACV：前主静脈，CA：尾動脈，CCV：総主静脈，CV：尾静脈，DA：背側大動脈，DC：キュビエ管，LDA：外側背側大動脈，PCV：後主静脈，PICA：原始内頸動脈，
VA：腹側大動脈，心臓（＊）から発する．（Isogai et al., 2001 より）
26

■2章

ゼブラフィッシュにおける変異体作製

変異原（ENU など）♀

F0♂

+/++/+F1+/++/m♀

♂

F2+/+：+/mn＝1：1+/+ × +/++/+ × +/mn+/+：+/mn＝1：1+/mn × +/++/mn × +/mn

F3

図 2.1 ゼブラフィッシュにおける 3 世代突然変異体スクリーニング
通常，雄魚を ENU 処理した上で野生型雌魚と交配し（F0），得られた F1 魚を野生型魚（または他の F1 魚）と交配して F2 魚ファミリーを得る．変異原処理 F0 魚，そして F1 魚は，様々な遺伝子について，変異（m）を通常ヘテロ接合体の状態で保有する．ある F1 魚に由来する F2 ファミリーでは，特定変異（mn）について半分が野生型，残り半分の個体がヘテロ接合体であり，F2 ファミリー内のランダムなペアで交配した場合，25％のペアの子孫胚では，当該変異のホモ接合体がやはり 25％の確率で出現すると予想される．

ると期待されている．
突然変異体が示す発生異常は，基本的には特定遺伝子の変異が原因である．ゼブラフィッシュの遺伝子情報はすでにほぼ解明されており，変異体の原因遺伝子を同定することは，後述のポジショナルクローニングにより容易となっている．これまで単離された変異体，そして今後単離される変異体の原因遺伝子を同定し，それらの遺伝学・分子生物学的解析を進めることによ
44

3.6

個体レベルでの細胞機能の操作■

3.6

個体レベルでの細胞機能の操作

3.6.1

個体における神経活動の操作：光遺伝学

近 年， 神 経 科 学 に お け る 新 た な 手 法 と し て， 光 に よ る 神 経 活 動 の 操
作 が 注 目 さ れ て い る（ 光 遺 伝 学，Optogenetics）．チャネルロドプシン（Channelrhodopsin, ChR）はもともと走光性をもつ単細胞緑藻類から，オプシンファミリーに属するイオンチャネルタンパク質として同定されたものである．青色光の照射により，これを発現する神経細胞の脱分極を引き起こすため，適切な神経細胞で ChR を発現する遺伝子導入魚において，光照射で神経細胞の活動を制御できる．一方，ハロロドプシン（Halorhodopsin）は高度好塩菌由来の光駆動性イオンポンプであり，緑・黄色光に依存して塩素イオンを細胞内に取り込ませるため，これを発現する神経細胞の興奮を，光照射により抑制することができる（図 3.14）．
ハロロドプシンチャネルロドプシン 2K＋

青色光＋

K

K＋

黄色光

細胞外細胞内
N＋

Ca2＋

Ca2＋

Cl－N＋

Cl－

Cl－

膜電位

膜電位

光照射

光照射

図 3.14 光による神経細胞の機能調節
A：チャネルロドプシン 2（ChR2）．走光性を示す単細胞緑藻類のオプシンファ
ミリータンパク質．光依存性イオンチャネルであり，青色光照射により発現神経細胞を興奮させる．
B：ハロロドプシン（NpHR）．高度好塩菌由来の光駆動性イオンポンプ．緑 /黄色光に応答して塩素イオンを細胞内に取り込ませるため，緑 / 黄色光を個体に照射することにより，発現する神経細胞の興奮を抑制することができる．
101

■5章

ゼブラフィッシュにおける脳神経系の機能とその発達

A．カテコールアミン作動性ニューロン
Epi
DmOB

Dp

Ha

CCeTeO
Va

TLMON

Epi
DpHa

CCe

TeO
Va

TL

SCm

LCa

セロトニンニューロン

CCMON

Flo

Epi
Dp

Ha

CCe

TeO
TL

SCm

Va

アセチルコリンニューロン
ヒスタミンニューロン

LCa
CC
MONPr
SR
AP
Ⅲm/Ⅳm SRNMO
pTh Th
RTN LC
Ⅴmd/Ⅴ
Ⅶm
TPVv
IR
Ⅵmr/Ⅵmc
p paPO p pp
PVO IN PTN
DIL
Hd
Hc
LH

Vd

Ⅸ/ⅩmHcC．コリン作動性ニューロンおよびヒスタミン作動性ニューロン

OB

Ⅸ/ⅩmPrAP
Ⅲm/Ⅳm SRMO
SRN
VdpTh Th RTN
Ⅴmd/Ⅴ
LC
ⅦmTP
Vv
IR
p paPOp
Ⅵmr/Ⅵmcpp
PVO IN
PTN
DIL
Hd
LH

Dm

FloHc

B．セロトニン作動性ニューロン

OB

CCPr
AP
Ⅲm/ⅣmSRMO
SRN
VdpTh Th
RTN LCⅤmd/ⅤⅦm
TPVv
POp pa p pp
IRⅥmr/Ⅵmc
PVO IN PTN
DILHdLH

Dm

ドーパミンニューロン
ノルアドレナリンニューロン

LCa

Flo
Ⅸ/ⅩmSCm

図 5.1 ゼブラフィッシュの脳における主要な神経調節系
成体ゼブラフィッシュの脳におけるカテコールアミン作動性ニューロン（A），セロトニン作動性ニューロン（B），コリン作動性ニューロンおよびヒスタミン作動性ニューロンの分布を示す．ドーパミン細胞は主として脳前方に分布しており，間脳より後方には存在しないのに対し，ノルアドレナリン細胞は青斑核（LC）と延髄のみで見られる．
セロトニン細胞とコリン作動性ニューロンは脳全領域で見られており，ヒスタミン細胞は後方視床下部に分布する．（Bally-Cuif & Vernier, 2010 より改変）
Ⅲm ～Ⅹm：各々 第Ⅲ～Ⅹ脳神経運動核，AP：最後野，CC：小脳稜，Flo：顔面葉，
IN：中間核，LCa：小脳尾葉，LH：視床下部外側核，MON：内側聴側線核，ppa：前小細胞性視索前核，ppp：後小細胞性視索前核，PT：視床後部，PTN：後結節核，PVO：
旁脳室器官，RTN：前被蓋核，SCm：脊髄運動神経核，SRN：上網様核，TPZ：視蓋増
殖帯 .（その他の略称は表 4.1 と別表 6 参照）
134

5.4

情動と認知■

A．学習と記憶に関わる行動実験① T 字型迷路② 視覚性逃避テスト ab

スタート
好みの場所
③ 探索的攻撃テスト

d

回転④ 場所嗜好性テスト

cgef

B．不安：新規水槽ダイビングテスト

垂直遊泳
水槽システムビデオカメラビデオ追跡システム
図 5.3 ゼブラフィッシュの行動実験
A：学習と記憶の研究に用いる行動実験装置の例．① T 字型迷路．識別や空間的，非空間的な移動経路決定（ナビゲーション）に関わる学習と認知の研究に用いられる．②視覚性逃避テスト．移動する刺激（a）からの逃避行動により視覚機能を検討する．この場合，黒い縞模様（a）の回転に反応して魚は中心柱（b）の陰へ避難する．③探索的攻撃テス
ト．魚には，上方に設けられた台の上に入り口（c）から入ってガラス玉などの刺激（d）をつつくという行動を習得させる．行動（脳機能）の左右性，刺激に対する順応（慣れ）の研究が行われた．④場所嗜好性テスト．場所選択が条件刺激への親和性の評価に用いられる．この例ではテストの場は 2 つに仕切られており（e と f），一方の場に入れた魚に無条件刺激を与えた後，仕切り（g）を開放し，どの場を好むかを評価する．
B：新規水槽ダイビングテスト．ゼブラフィッシュは，新しい水槽に移されてまもなくは水底に沈んでそこに留まる傾向があるが，環境に慣れるにつれて上層に移る．これにより，不安，ストレスへの応答を評価する．（Levin and Cerutti, 2008 より改変）
141

７章 疾患研究モデルとしての7.1

先天性疾患のゼブラフィッシュモデル■ゼブラフィッシュ

従来，様々なヒト疾患に関する病因の研究と診断法・治療法の開発には，主としてマウス・ラットなどの齧歯類が用いられてきた．しかし，これらの動物では，大規模な遺伝学的研究，そして個体レベルの薬剤スクリーニングが困難である．
こうした限界を解決するための新たな疾患研究モデルとして，ゼブラフィッシュが注目されている．ゼブラフィッシュでは，突然変異体などによるヒト疾患の再現が可能であり，個体におけるリアルタイムでの病理学的研究，新規薬剤の大規模探索，治療法の開発などへの貢献が期待される．

7.1

先天性疾患のゼブラフィッシュモデル

発生異常突然変異体は先天性疾患と見なすことができる．したがって変異体作製が容易であり，ゲノム情報，各種ゲノム関連リソースを備えたゼブラフィッシュは，各種ヒト疾患の原因遺伝子の同定とその機能解析，発症機構の解明，そして治療法の開発に優れている（図 7.1）．
7.1.1

順遺伝学的アプローチ

ヒトで疾患原因遺伝子が判明している場合，今では相同遺伝子をゼブラフィッシュで破壊することが可能である．しかし，実際のヒト先天性疾患の病因は多様であり，原因遺伝子の機能欠損のみならず，機能低下や機能獲得変異も含まれるため，通常の遺伝子破壊法による完全機能欠失変異ではヒト先天性疾患の再現はむずかしい．変異原処理により作製される変異体が期待ゆえんされる所以である．さらに，原因遺伝子が不明であるヒト疾患と表現型が類似する魚変異体も，その疾患の貴重な研究モデルとして期待されている．
a．ヒト疾患の原因遺伝子が判明している場合同定されたゼブラフィッシュ変異体と特定ヒト疾患が同じ遺伝子の異常に起因する場合，発生遺伝学的，分子生物学的研究アプローチが豊富なゼブラ
161

7.3

創薬とゼブラフィッシュ■疾患モデル魚×♀

♂

整列疾患モデル胚

化学物質ライブラリー
薬剤添加
発生効果

効果

表現型の検討図 7.2 ゼブラフィッシュ胚を用いたケミカルスクリーニング
突然変異体などの疾患モデル魚胚を多数準備してマルチウェルプレートに整列し，各ウェルに化学物質ライブラリーの化合物を個別に添加した上で発生させ，表現型（症状）の緩和などの効果を検討する．

なお，ゼブラフィッシュを用いた治療法の研究においては，哺乳類，特にヒトとの間で，遺伝子機能，細胞・個体レベルの生理学，化学物質の取り込みと代謝などに違いがある可能性に注意する必要がある．当然ながら，ゼブラフィッシュで有効とされた化学物質については，哺乳類システムでさらに検討することになる．しかし，いずれにしても個体レベルでの効率的な検討が可能である点は大きな魅力である．また，現在は主として胚や稚魚が用いられているが，老化，生活習慣病，認知障害など，現在深刻となりつつある
各種疾患については，今後，成体を用いた大規模研究が必要となると予想される．
169別表 1
発生段階
接合子期
1 細胞期
卵割期
2 細胞期
4 細胞期
8 細胞期
16 細胞期32 細胞期64 細胞期
胞胚期
128 細胞期
256 細胞期
512 細胞期
1000 細胞期
高胚盤期
楕円胚期
球形胚期
ドーム期
30％エピ
ボリー期
原腸胚期
50％エピ
ボリー期
胚環期
胚楯期
75％エピ
ボリー期
90％エピ
ボリー期
尾芽期

ゼブラフィッシュ（Danio rerio）の発生段階表＊ 1

時間＊2（h）
0

特徴

細胞質が動物極方向に流動し，胚盤を形成する．

3/4
1
1 1/4
1 1/2

初期卵割は部分割（卵黄細胞と連絡をもつ）．
2 × 2 に配列．
2 × 4 に配列．
4 × 4 に配列（この段階以降，胚盤周縁部以外の細胞は卵黄細胞との連絡をも1 3/42たない）．
割球が 2 層を形成する．時に 4 × 8 に配列．
割球は 3 層となる．

2 1/4割球は 5 層となる．卵割面は不規則となる．

2 1/2割球は 7 層となる．

2 3/4割球は 9 層となる．また卵黄多核層（YSL）が形成される．

33 1/33 2/3
44 1/3
4 2/3

5 1/4
5 2/3
68910

割球数は約 1000 となり，11 層をなす．YSL の核が 1 列となって胚盤を囲む．
胚盤細胞の分裂がやや非同調的となる．
割球は 11 層以上となる．胚盤が平たくなり始め，YSL 核が 2 列となる．細胞分裂は顕著に非同調的となる．
胚体が楕円球形となり，YSL 核は多重の列をなす．
胚体は球形となり，胚盤と卵黄の境界は平面となる．
エピボリーが始まるとともに卵黄細胞が動物極方向に隆起する．
胚盤葉は均一の厚さで逆向きのお碗状となり，胚盤葉周縁部は動物極から植物極方向に向かって 30% の位置に達する．
胚盤葉の厚さは引き続き均一である．なお，胚循期までエピボリーは 50%の位置に留まる．
胚盤葉の辺縁部に環状の肥厚（胚環）が生じる．
将来の背部に対応する胚盤葉周縁部に肥厚（胚楯）が生じる．
胚盤葉の背側が肥厚するとともに胚体が前後軸に沿って伸長する．胚盤葉上層と胚盤葉下層が形成される．腹側胚盤葉が動物極周辺で薄くなる．
脳原基が肥厚し，脊索原基が体節板から分離する．
尾芽が顕著となり，脊索原基も神経キールと区別できる．神経板最前端部の深部で孵化腺前駆細胞が肥厚部を形成する ( ポルスター )．神経柱前部では正中部に溝ができる．エピボリーは 100％となる．

体節形成期
1 体節期 10 1/3 第 1 体節が分離する．
5 体節期 11 2/3 ポルスターが顕著となる．眼胞，クッパー胞が形成される．
14 体節期16
体長 0.9 mm．聴板，ニューロメア，V 字状の胴部体節，前腎管が形成される．
卵黄伸長部はまだ明瞭ではない．

170