博 士 （ 水 産 学 ） Manal Nader Raif
学 位論 文題 名Studies on the effects of growth faCtorS
OntheSpermatogenetiCCyCleoftheJapaneSeee1，4 な 彫Zぬ ゾめ 〇〃 ぬロ（ ニホ ンウ ナギ の精 子形 成に およ ぼす増殖因子の作用に関する研究）

学位論文内容の要旨
配 偶子形成の制御機構の詳細を調べることは、有用生物資源の人工種苗生産技術 を開発、あるいは改良する上で、非常に重要である。しかしながら、雄の配偶 子形成である精子形成は、脊椎動物および無脊椎動物に共通の現象であるに も か か わ ら ず 、 そ の 制 御 機 構 は 現 在 の と こ ろ 不 明 な 点 が 多 r。
養 殖環 境 下 の ニ ホ ンウナ ギ(AngufJ7ajaponj ca)の精 巣に は、 増殖 開始 前の精 原細胞のみが存在し、それ以上に発達した生殖細胞は全く認められない。
これ らの ウナギ に対 し、 ヒト 絨毛 性生 殖線 刺激 ホル モン くHCG)を投与することに より、精原細胞の増殖から減数分裂、精子変態にいたる一連の精子形成を誘導 することができる。またウナギは、すでに開発されている生体外精巣器官培養 を用い、ホルモンの制御により生体外で全精子形成を誘導することができる唯 一の動物であり、精子形成を解析する上で優れた実験動物である。これまで の 研究 に よ り 、 ウ ナギの 精子 形成 は、 HCGの刺 激によ り、 精巣 中の ステ ロ
イド ホル モンで ある 11‑ケト テス トス テロン (11 ‑ KT)が 、増 殖因子を含む多くの タンバク性の因子を増減させることにより、進行するものと推察されている。 そこで本研究は、ニホンウナギの器官培養を用いた組織学的手法および分子生 物学的手法を用い、生殖細胞の増殖、分化に関与すると考えられるいくつかの 増殖 因子の 精子 形成 への 作用 機構 を解 析し た。

（ 1） インスリン様増殖因子(IGF)まず、IGFの精子形成への作用を精巣器官培養系を用いて解析した。これまでの研究により、インスリンを含む培養液中に11‑ KTを添加すると精子形成は誘起されるが、インスリンを含んでしゝない培養液に11‑KTを添加しても、精子形成は全く進行しないことが解っている。培養系でのこのインシュリンの作用は、生体内ではIGFの働きを示している可能性が高い。そこで、A型および初期B型精原細胞のみを有する精子形成開始前の精巣片を11‑KT10 ng/mlの存在、非存在下の培養液中に、ヒトリコンビナント(rh) IGF‑エ及び矼をさまざまな濃度で添加し、15日間培養した。11‑KTの非存在下にthIGF‑エ、Hを添加しても、精原細胞は増殖しなかったが、11‑ KTの存在下でthIGF．I、nを ぞれ ぞれ 100 ng/mlを添 加した群では、精原細胞が増殖し、後期B型精原細胞が認められた。また、11‑KTの存在下、thIGF‑エ、100ng/mlの実験群
で tま 、 培 養 開 始 45日 目の 精巣 片中 に変態 した 精子 が多数 認め られ た。
次に、ウナギ精巣IGF．I及びIIcDNAのクローニングを行い、それらの一次構造を調ぺた。他の動物種で明らかにされているIGF．エ及ぴIGF‑IIの保存領域を基にプライマーを合成し、IGF ‑エはHCG未投与魚の精巣cDNAを、IGF‑
Hは HCG投 与 6旨 目 の 精 巣 cDNAを 鋳 型 に PCR反 応 を 行 い 、 そ れ ぞ れ のcDNA断 片 を 得 た 。 ウ ナ ギ 精 巣 (et) IGF‑エ の cDNA断片 は、 212塩基 対であり、それより予想されるアミノ酸配列は、ニジマスおよびキンギョと96％、ゼ //ヾ ス と 89％ の 相 同性 を 示 し た 。 ま た etIGF・ Hの cDNA断 片 は 、 448
塩基対であり、そのアミノ酸配列は、ヨーロッパヘダイ及びテイラピァとそれぞれ73％、 71％ の相 同性を 示し 、ニ ジマ スとは 67％ の相 同性を示した。
次に、これらetIGF‑I、Hの精巣での発現を調べた。HCG投与により精子形成を誘起させたウナギの精巣から経時的にmRNAを抽出し、それらを逆転写した
cDNAを用い、RT‑ PCR解析を行った。その結果、etIGF‑エ、etIGF‑II両方のmRNAの発現が全ての精子形成過程に認められた。これらのことより、IGF‑I及びnは、精巣で産生され、11 ‑KTによって誘起される精子形成に対し、必要不可欠な役割を果たしていることが明らかとなった。

（2） 血小板由 来増殖因子(PDGF)

2つ目 の 増殖 因 子 とし て 、PDGFの精 子形成へ の作用を 調ぺた。 PDGFは、血清中 に 存 在 す る 細 胞 分 裂 促 進 物 質 で あ り 、 2つ の ポ りベ ブ チド 鎖 A、 Bが PDGF‑
AA、 AB、 BBの 3つ の ア イ ソ フ オ ー ム を 形 成 する 。 そ のレ セ ブタ ー も Q及 びlBの サブ ユ ニッ ト か ら構 成 され て い る。 そ こ で、 精 子形 成 開始前の 精巣片を イン ス リ ン 1pLg/mlの 存在 、 非存 在 下 の培 養 液中 に 、 thPDGF‑ AA及 び BBを さま ざま ， な濃 度 で 添加 し 、9日間 培 養 した 。 精原 細 胞 の増 殖は、DNAの 複製時に 取 り 込 ま れ る 5‑Bromo・ 2‑deoxyuridine(BrdU)をサ ン プ リン グ 24時 間 前に培養 液中に添 加し、免疫 組織化学 的に検出 した。thPDG
F‑AA、BB
添加群ともに低濃 度添加群 に比べ、高 濃度添加 群でBrdUの取 り込み率 が有意に 高かった。
インス リンの影 響は、thPDGF‑AA
では認められなかったが、thPDG
F‑B
Bでは、インスリ ン非存在 下に比ベイ ンスリン 存在下の thPDGF‑BBl、10ng/ml添加群 で、BrdUの取り 込み率が 有意に増加 した。
次 に 、 ウ ナ ギ 精 巣 よ り 、 PDGF‑RQ及 び pcDNAの ク 口 ー ニ ン グ を 行 っ た 。
PDGF‑Rの ク ロ ー ニ ン グ に あ た っ て 、 ま ず他 の 動 物種 で 明 らか に され て い る
PDGF‑Rの 保 存 領域 を 基に プ ラ イマ ー を 合成 し 、ウ ナ ギ 脾臓 cDNAを 鋳型 に PCR
反 応 を 行 い 、 cDNA断 片 を 得 た 。 そ の 後 、 脾臓 で 得 られ た cDNAのシ ー ク エンス を も と に 、 再 度 プ ラ イ マ ー を 合 成 し 、 HCG未 投与 魚 の 精巣 cDNA鋳 型に PCRを 行 っ た 。 そ の 結 果 、 etPDGF‑Rの cDNA断 片の ア ミ ノ酸 配 列 はフ グ p型 と7っ％ の 相 同 性 を示 し 、チ キ ン a型 と57％ の相 同 性を 示 し たこ と から 、 etPDGF‑Rp型 で ある と 予想 さ れ た。 以上 より、PDGFは 、ヒトリ コンビナ ントが精 原細胞の増殖 を誘導す ること、そ のレセプ ターが精 巣に存在 すること より、精 子形成の制御 に関わっ ており、そ の作用に は、精子 形成誘起 ホルモン ：11‑KTの存在を必ず しも必要 としないも のと考え られた。 また、thPDG
F‑AAとBBのインスリンとの 関係の違 いから、そ れぞれの サブタイ ブは異な る機能を 持つ可能 性が示示唆さ れた。
ー 方 、 細 胞 増 殖 の 制 御 に 関 わ ろ 増 殖 因 子 であ ろ TGFa、 EGF及 ぴ IGFの 発 現

機構 に関与す ると考え られる成 長ホルモンは、ウナギ精巣器官培養系では効果が認 められな かった。

以上本 研究によ り、生殖 細胞の増 殖、分化に関わると考えられる増殖因子のう ち IGF‑I、 H及 び thPDGF‑ AA、 BBが ニ ホ ン ウ ナ ギ の 精 子 形 成 の 制 御 に 関与する ことが明 らかとな った。

学位論文審査の要旨
主 査 教 授 山内 晧 平
副査 教授 原 彰彦
副 査 教 授 荒井 克 俊
副査 助教授 上田 宏
副査 助教授 足立伸次

学位 論文題名Studi
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ロ（ ニホ ンウ ナギ の精 子形 成におよぼす増殖因子の作用に関する研究）

配偶子形成の制御機構の詳細を調べることは、有用生物資源の人工種苗生産技術を開発、あるいは改良する上で、非常に重要である。しかしながら、雄の配偶子形成である精子形成は、脊椎動物および無脊椎動物に共通の現象であるにもかかわらず、その制御機構は現在のところ不明な点が多い。
養殖環境下のニホンウナギ(Anguilla.iaponica)の精巣には、増殖開始前の精原細胞のみが存在し、それ以上に発達した生殖細胞は全く認められない。これらのウナギに対し、ヒト絨毛性生殖線刺激ホルモン(HCG)を投与することにより、精原細胞の増殖から減数分裂、精子変態にいたる一連の精子形成を誘導することができる。またウナギは、すでに開発されている生体外精巣器官培養を用い、ホルモンの制御により生体外で全精子形成を誘導することができる唯一の動物であり、精子形成を解析する上で優れた実験動物である。これまでの研究により、ウナギの精子形成は、HCGの刺激により、精巣中のステロイドホルモンである11−ケトテストステ口ン(11‑KT)が、増殖因子を含む多くのタンパク性の因子を増減させることにより、進行するものと推察されている。そこで本研究は、二ホンウナギの器官培養を用いた組織学的手法および分子生物学的手法を用い、生殖細胞の増殖、分化に関与すると考えられるいくっかの増殖因子の精子形成への作用機構を解析した。
まず、インシュリン様成長因子くIGF)の精子形成への作用を精巣器官培養系を用いて解析した。これまでの研究により、インスリンを含む培養液中に11一KTを添加すると精子形成は誘起されるが、インスリンを含んでいない培養液に11ーKTを添加しても、精子形成は全く進行しないことが解っている。培養系でのこのインシュリンの作用は、生体内ではIGFの働きを示している可能性が高い。そこで、A型および初期B型精原細胞のみを有する精子形成開始前の精巣片を11‑KT10 ng/mlの存在、非存在下の培養液中に、ヒトリコンビナント(rh) IG
FーI及び矼をさまざまな濃度で添加し、15日間培養した。11‑― 1078―

KTの非存在下にthIGF―I、Hを添加しても、精原細胞は増殖しなかったが、11−KTの存在下でthIGF−I、IIをそれぞれ100 ng/mlを添加した群では、精原細胞が増殖し、後期B型精原細胞が認められた。また、11一KTの存在下、thIGF−I、100 ng/mlの実験群 で は 、 培 養 開 始 45日 目 の 精 巣 片 中 に 変 態 し た 精 子 が 多 数 認 め ら れ た 。
次に、ウナギ精巣IGF−I及びIIcDNAのク口一二ングを行い、それらの一次構造を調べた。他の動物種で明らかにされているI
GF
−I及びI
GF
‑IIの保存領域を基にプライマーを 合 成 し 、IGF− Iは HCG未 投 与 魚 の 精 巣cDNAを 、 IGF― nは HCG投 与6日 目の 精巣
cDNAを鋳 型に PCR反 応を 行い 、そ れぞ れの cDNA断片を 得た。ウナギ精巣(et)IGF―
IのcDNA断 片は 、212塩基 対で あり 、そ れよ り予 想さ れるアミノ酸配列は、二ジマ
ス お よ び キン ギ ョ と 96％ 、 ゼ ノ パ ス と89％の相 同性 を示 した 。ま たetIGFー nのcDNA断片 は、 448塩 基対 であり、そのアミノ酸配列は、ヨー口ッバヘダイおよびテイラピアとそれぞれ73％、71％の相同性を示し、二ジマスとは67％の相同性を示した。次に、etIG
F−Iの精巣での発現を調べた。HCG投与により精子形成を誘起させたウナギ の精 巣か ら経 時的に mRNAを抽出し、それらを逆転写したcDNAを用い、RT―PCR解析を行ったところ、etIGFーIm
RNAの発現は全ての精子形成過程に認められた。これらのことより、IGF―I及びnは、精巣で産生され、11−KTによって誘起される精子形成に 対し 、 必 要 不 可 欠 な役 割 を 果 た し て い るこ と が 明 ら か と なっ た。
2つ目の増殖因子として、血小板由来増殖因子(PDGF)の精子形成への作用を調べた。
PDGFは、 血清 中に 存在す る細胞分裂促進物質であり、2つのポりペプチド鎖A、BがPDGF‑AA、 AB、 BBの 3つ の ア イ ソ フ オ ーム を形成 する 。そ のレ セプ ター もa及 びbのサプュニットから構成されている。そこで、精子形成開始前の精巣片をインスリン1mg/mlの存 在、 非存 在下 の培養液中に、thPDGF―AA及びBBをさまざまな濃度で添加し、9日間培養した。精原細胞の増殖は、DNAの複製時に取り込まれる5−Bromo
一2―
deoxyuridine (BrdU)をサンプリング24時間前に培養液中に添加し、免疫組織化学的に 検 出し た。 thPDGF‑AA、BB添加 群と もに 低濃度 添加 群に 比べ 、高 濃度 添加 群でBrdUの取り込み率が有意に高かった。インスリンの影響は、rhPD
GFイAでは認められな か っ た が、 rhPDGF− BBで は 、 イ ン スリ ン非存 在下 に比 ペイ ンス リン 存在 下の
rhPDGF− BB1、 10ng/m1添 加 群 で 、 BrdUの 取 り 込 み 率 が 有 意 に 増 加 し た 。
次 に、 ウナ ギ精 巣より 、PDGF― RQ及 びBcDNAのク口 ーニングを行った。PDGF―Rのク口ーニングにあたって、まず他の動物種で明らかにされているPDGF−Rの保存領域を基 にプ ライ マー を合成 し、ウナギ脾臓cDNAを鋳型にPCR反応を行い、cDNA断片を得た。その後、脾臓で得られたcDNAのシークエンスをもとに、再度プライマーを合成し 、 HCG未 投 与 魚 の 精 巣 cDNA鋳 型 に PCRを 行 っ た 。 そ の 結 果 、 etPDGF―Rの cDNA
断片 のア ミノ 酸配 列はフ グB型と 77％ の相 同性 を示し 、チキンQ型と57％の相同性を示したことから、etPDGF・−RB型であると予想された。以上より、PDGFは、ヒトリコンピナントが精原細胞の増殖を誘導すること、そのレセプターが精巣に存在することより、精子形成の制御に関わっており、その作用には、精子形成誘起ホルモン：11−K
Tの存在を必ずレも必要としないものと考えられた。また、rhPD
GF―A
AとB
Bのインスリンとの関係の違いから、それぞれのサプタイプは異なる機能を持つ可能性が示唆された。
一方、細胞増殖の制御に関わる増殖因子であるTGF＆、EGF及びIGFの発現機構に関与すると考えられる成長ホルモンは、ウナギ精巣器官培養系では効果が認められなかった。
上記のように、本研究では、二ホンウナギの生体外器官培養系を用い、精子形成の制御に関与すると考えられる増殖因子に関する詳細な知見が数多く得られた。これらの結果は、今後、精子形成をより詳細に解析する上で極めて重要な知見を提供したものとして高く評価され、本論文が博士（水産学）の学位請求論文として相当の業績であると認定した。
一l079―