心身科学 第 11 巻第 1 号（45 50）（2019）

マウス胎児期におけるエンビジンの発現

市原啓子＊１）

エンビジンは、GP70 とも称される細胞表面の 1 回膜貫通型糖タンパク質である。エンビジンはマウスの発生中期で発現が高く成体での発現は限定的とされる。エンビジンが肝臓の幹細胞のニッチ分子として機能することやエンビジンの発現が亢進したすい臓がん細胞では細胞増殖や転移にエンビジンが関与することから、細胞間の微小環境の形成に関与する可能性が示唆されている。しかしながら、エンビジンの生体内での役割については不明な点が多い。
筆者は、マウス胎児においてエンビジンの免疫組織染色を行なってきた。発生中期では脳、心臓、肝臓で染色が認められる。それらの臓器でのエンビジンの発現量を比較するため、マウスの 10.5 日胚の脳、11.5 日胚と 15.5 日胚からそれぞれ脳、心臓、肝臓について、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）で調べた。さらに、同じ時期のエンビジンタンパク質をウェスタンブロット法で発現量を確認することにした。エンビジンは脳と心臓では発生に伴って減少する傾向が認められた。エンビジンは主として 66 kDa タンパク質として検出された。肝臓では、66 kDa タンパク質のほかに大きなサイズのスメアなバンドとして検出された。肝臓では脳や心臓とは異なる修飾が付加されていると考えられる。肝臓の発生や胎児期の機能におけるエンビジンの役割について今後の研究が期待される。
キーワード：エンビジン、定量的 PCR、ウェスタンブロット、マウス発生

ジンの生体内での役割については不明な点が多い。

I. はじめに

筆者は、エンビジンのマウスの発生における役割を明らかにする目的でエンビジンの免疫組織染色をエンビジンは、GP70 とも称される細胞表面の 1行なってきた。エンビジンは 10.5 日胚の心臓や脳回膜貫通型糖タンパク質である 1 - 3 ）。エンビジンはマで発現が認められ、15.5 日胚では肝臓も免疫染色さウスの発生中期で発現が高く成体での発現は限定的れる（未発表データ）が、発現量の大小についてはとされる 4 , 5 ）。エンビジンは、ファミリータンパク質染色像から比較することは難しい。本研究では免疫であるベイシジンとともにモノカルボン酸輸送体と染 色 さ れ る 脳、 心 臓、 肝 臓 に つ い て、 エ ン ビ ジ ン

6,7）

エンビジンの機能の mRNA の発現量を定量的ポリメラーゼ連鎖反応については不明な点が多い。エンビジンは筋肉が損（qPCR）で調べることにした。さらに、同じ時期の傷した時に新たな神経筋接合部位で発現する遺伝子

エンビジンタンパク質をウェスタンブロット法で発のひとつであり 8 ）、肝臓での幹細胞のニッチ分子と現量を確認することにした。エンビジンは脳と心臓複合体を形成するとされるが9）して機能すること 、膵臓がんにおいては発現の上では発生に伴って減少する傾向が認められた。肝臓

昇、上皮ー間充織の転移に関係すること10）から、細では、66 kDa タンパク質のほかに大きなサイズのス胞増殖や細胞分化に伴う微小環境の形成に関与するメアなバンドとして検出された。肝臓の発生とエン可能性が示唆されている。しかしながら、ノックアビジンの機能について今後の研究が期待される。

ウトマウスでの異常については報告がなく、エンビ＊ 1 ）愛知学院大学心身科学部健康栄養学科（連絡先） 〒 470-0195 愛知県日進市岩崎町阿良池 12 E-mail：kichi@dpc.agu.ac.jp― 45 ―

市原啓子

3. ウェスタンブロット法

II．材料と方法

胎児組織を、プロテアーゼインヒビターミックス（1.0 mM AEBSF、0.80 μM Aprotinin、15 μM
E-64、20 μM Leupeptin hemisulfate、50 μM

１ ．材料
本実験では ICR 系統の妊娠マウス（SLC）を購入

Bestatin、10 μM Pepstatin A、Nacalai tesque） をし使用した。頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、胎児組添加した可溶化バッファー（0.6 % CHAPS, 0.1 %織を採取した。

sodium deoxycholate, 10 mM Hepes -NaOH pH

２．RNA 抽出と定量的ポリメラーゼ連鎖反応

7.2、150 mM NaCl）を加えガラスホモジナイザーで採取した組織は 50 mg あたり 0.5 ml の Isogen IIすり潰し、4 ℃で 30 分間振とうしてタンパク質の抽出（ニッポンジーン）を加え、24 ゲージ注射針をつけたを行った。15000 rpm、4 ℃で 10 分間遠心し上清を得シリンジまたはポリトロンホモジナイザーを用いて組た。この上清のタンパク質濃度を BCA タンパク質定織を破砕し均一化した。すぐに解析を行なわない場合

量キットで定量し、SDS-PAGE サンプルバッファーをには試料を破砕した後 -80 ℃で保存した。破砕した加えて 100 µg/ 100 µl の泳動用試料を作成した。 １

試料には 0.2 ml のリボヌクレアーゼ（RNase）フリー

レーンあたり 10 µg のタンパク質を用い、10 % アク水を加えて激しく攪拌し、室温で 15 分間放置した。

リルアミドゲルで電気泳動を行い、ゲル内のタンパク

その後、12000 x g で 20 ℃、10 分間遠心した。上清質を PVDF 膜（Immobilon-P, Merckmillipore）に転を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを写した13）。ポンソー染色でタンパク質の転写像を確認

加えて転倒混和し、室温で 10 分間放置した。さらに、した後、 ５ ％スキムミルクを含む TBS-T バッファー

12000 x g で 20 ℃、10 分間遠心し、沈殿を得た。こ（20 mM Tris-Cl pH 7.4、150 mM NaCl、0.1 %の沈殿を RNase フリー水に溶解し、エタノールと 3Tween20） で ブ ロ ッ キ ン グ し、 抗 エ ン ビ ジ ン 抗 体

M 酢酸ナトリウム pH5.0 を加えて得られた沈殿をC20（ 1 :2000、ウサギポリクローン抗体、Sigma）まRNA 試料とした。ホルマリンゲル電気泳動を行い11）、

たは抗β - アクチン抗体（ 1 :500、ウサギポリクロー

18S と 28S のバンドを確認するとともに、260 nm でン抗体、Gene Tex）と反応させた。TBS-T で洗浄後、の吸光度を測定することによって濃度を測定した。

二次抗体として HRP 標識抗ウサギ IgG 抗体（ 1 :6000,

逆転写反応は、0.5 µg の RNA に対して ReverTra

ヤギポリクローン抗体、Jackson ImmunoResarch）

Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（東と反応させた。洗浄後、ECL Prime（GE ヘルスケア）洋紡）を用い、用法に従い37 ℃、15分間反応させと反応させ、得られた化学発光のシグナルをライト

cDNA を得た。この cDNA を鋳型とし、THUNDERBIRD

キャプチャー II（ATTO）で検出し、画像を保存した。

Probe qPCR/ RT Set III（東洋紡）を用いて、定量的各バンドの発光強度は CS アナライザー（ATTO）で12）

PCR を行なった 。鋳型は各時期の各臓器について測定した。

４ つずつ作成し反応を行なった。使用したプライマー

III．結果の配列は、エンビジンプライマー For: 5 ʼ- TGGGC
AACACCTTAACCAGTCA - 3 ʼ, Rev: 5 ʼ- CCCAC
GTAAGCGATCAACGA - 3 ʼ、ベイシジンプライマー

１．定量的 PCR によるエンビジンの発現解析

For: 5 ʼ-TAGGCATCGTGGCTGAGGTC - 3 ʼ Rev: 5 ʼ-

ウェスタンブロットの結果を確かめるために、定CTTGTCATTCATGTGAGTTCCACTG - 3 ʼ、ベータア

量的 PCR を行なった。胎齢 10.5 日マウスの脳におけ

クチン For: 5 ʼ- CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC

るエンビジンとβ - アクチンの発現を基準として胎齢- 3 ʼ, Rev: 5 ʼ- ATGGAGCCACCGATCCACA - 3 ʼ である。

11.5 日マウスと胎齢 15.5 日マウスの脳、肝臓、心臓

また、
PCR はサーマルサイクラー Dice（タカラバイオ）について相対的な mRNA の発現量を調べた（図 1 ）。

を用い、反応条件は（95℃、30 秒）x 1 回 →（95℃、エンビジンの発現は、胎齢 11.5 日では、肝臓が最も5 秒 → 60 ℃、30 秒 ）x 40 回 → 95 ℃ 15 秒 →大きく心臓、脳の順に少なかった。胎齢 15.5 日でも60℃ 30 秒 → 95℃ 15 秒で行なった。その結果は、同様に肝臓での発現が心臓や脳に比べて高かった。脳Thermal Cycler Dice Real Time System II ソフトウェ

では胎齢 10.5 日より胎齢 15.5 日で減少した。心臓でアで解析した。

は胎齢 11.5 日より胎齢 15.5 日の方がエンビジンの発現が少なかった。肝臓は、10.5 日胚の脳よりも 11.5― 46 ―

マウス胎児期におけるエンビジンの発現

日胚と 15.5 日胚の両方でエンビジンの発現量が高くアなバンドが観察され、心臓では 66 kDa バンドを中なっていた。

心に上下に淡いバンドが認められた。これらの淡いバ

２．ウェスタンブロットによるエンビジンの検出

ンドは糖タンパク質に負電荷をもつ糖鎖が付加していマウス胎児から脳、肝臓、心臓を採取し、エンビジる時にみられるものである。15.5 日胚においてもエンの発現を抗エンビジン抗体によるウェスタンブロッ

ンビジンは 66 kDa のバンドとして検出された（図 2トで調べた。代表的なウェスタンブロットの像を示す。

B、矢印）。脳では 66 kDa より上方にややスメアなバ11.5 日胚では、脳・肝臓・心臓のすべてで 66 kDa のンドとなった。また、肝臓では分子量の大きいサイズエンビジンのバンドが認められた（図 2 A、矢印）。のスメアなバンド（図 ２ B、アスタリスク）が観察

さらに、脳と肝臓では分子量の大きい側に淡いスメされた。胎齢 15.5 日のウェスタンブロットについて、

図 １ エンビジン mRNA 発現量の変化
ベータアクチンを内部標準とし、胎齢 10.5 日のエンビジン mRNA の発現を １ として、相対的な比を示した。レーン 1.E10.5 脳 ; 2. E11.5 脳 ; 3. E15.5 脳 ; 4. E11.5 心臓 ;5. E15.5心臓 ; 6. E11.5肝臓 ; 7. E15.5 肝臓ウェスタンブロット法によるエンビジンタンパク質の検出
胎齢11.5日マウス（A) と胎齢15.5日マウス（B）の脳、肝臓、心臓からタンパク質抽出した。10 % アクリルアミドゲルで分離し、PVDF 膜に転写後、抗エンビジン抗体 C20 または抗β - アクチン抗体でウェスタンブロットを行なった。
矢印はエンビジンの位置、＊は肝臓エンビジンの高分子バンドの位置を示す。

図２― 47 ―市原啓子

β - アクチンとエンビジンのバンドの発光強度を測定

Member of the Immunoglobulin Gene Superfamily. J Biol.

し、β - アクチンを内部標準としてエンビジンの発現

Chem . 263, 3059­3062

量を比較すると、脳 １ 、脳 ２ ではそれぞれ 4.60、5.42

２ ）Huang, R., Ozawa, M., Kadomatsu, K., and Muramatsu, T.となり、肝 １ 、肝 ２ ではそれぞれ 0.518、0.649、心（1990）Developmentally regulated expression of embigin,

は 1.831 となった。これらの結果から、66 kDa のエa member of the immunoglobulin superfamily found in

ンビジンタンパク質は脳でもっとも多く肝臓で少ない

embryonal carcinoma cells. Diﬀerentiation 45, 76­83.

ことがわかった。mRNA の発現が肝臓で多いことか３ ）Huang, R.-P., Ozawa, M., Kadomatsu, K., and Muramatsu,

ら、肝臓でのエンビジンは、66 kDa の他に異なる修T.（1993）Embigin, a Member of the Immunoglobulin

飾を受けていることが予想された。

Superfamily Expressed in Embryonic Cells, Enhances CellSubstratum Adhesion. Developmental Biology 155, 307­

IV．考察

314４ ）Fan, Q.-W., Kadomatsu, K., Uchimura, K., and Muramatsu,

マウスエンビジンの成熟ポリペプチドは 296 個のアT.（1998）Embigin/ Basigin subgroup of the immu

ミノ酸からなり約 30 kDa の大きさとなる。細胞表面

noglobulin superfamily: Different modes of expression

では糖鎖の付加により大きなサイズとなる。本研究でduring mouse embryogenesisi and correlated expression

はエンビジンは 66 kDa のバンドとして検出された。

with carbohydrate antigenic markers. Dev Growth Diﬀ 40,

これは、培養細胞で強制発現させたエンビジンのサイ

277­286ズとも一致する14）。胎齢 11.5 日では、エンビジンは５ ）Yue, F., Cheng, Y., Breschi, A., Vierstra, J., and et al.

66 kDa バンドとともにスメアなバンドが検出された。

（2014）A comparative encyclopedia of DNA elements in

一方、胎齢 15.5 日では 66 kDa のバンドが明瞭に見ら

the mouse genome. Nature 515, 355­364

れ、スメアなバンドは減少した。スメアなバンドは、

６ ）Perez-Escuredo, J., Van Hee, V. F., Sboarina, M., Falces,

負電荷の多い糖鎖を持つ糖タンパク質やプロテオグリ

J., Payen, V. L., Pellerin, L., and Sonveaux, P.（2016）

13,15）

カンに多く認められることから、エンビジンは胎Monocarboxylate transporters in the brain and in cancer.

齢 10.5 日では負電荷の多い糖鎖を有するポリペプチ

Biochim Biophys Acta 1863, 2481­2497

ドが多いこと、脳や心臓では胎齢 15.5 日までにその７）Forero-Quintero, L. S., Ames, S., Schneider, H. P.,

割合が減少した、あるいは糖鎖の構造が変化したと推Thyssen, A., Boone, C. D., Andring, J. T., McKenna, R.,定される。胎齢 15.5 日での肝臓は、mRNA の量が脳Casey, J. R., Deitmer, J. W., and Becker, H. M.（2018）

や心臓より多いにもかかわらず 66 kDa バンドの強度

Membrane-anchored carbonic anhydrase IV interacts withは最も小さくなった。これは、肝臓のエンビジンではmonocarboxylate transporters via their chaperones CD147

66 kDa の構造の他にスメアなバンドが多く発現してand GP70. J Biol Chemいると考えられる。実際にどのような糖鎖が付加され８ ）Lain, E., Carnejac, S., Escher, P., Wilson, M. C., Lomo, T.,ているかについては、エンビジンを精製して糖鎖の構

Gajendran, N., and Brenner, H. R.（2009）A novel role for

造を解析する必要があると考えられる。

embigin to promote sprouting of motor nerve terminals at

定量的 PCR によって得られた mRNA の量がウェthe neuromuscular junction. J Biol Chem 284, 8930­8939

スタンブロットの 66kDa のバンドの量と一致しない

9）Silberstein, L., Goncalves, K. A., Kharchenko, P. V.,のは、エンビジンが付加された糖鎖の構造により必ずTurcotte, R., Kfoury, Y., Mercier, F., Baryawno, N., Severe,

しも 66kDa のサイズにならないことが理由と考えら

N., Bachand, J., Spencer, J. A., Papazian, A., Lee, D.,れる。特に、肝臓でスメアなバンドとなるエンビジン

Chitteti, B. R., Srour, E. F., Hoggatt, J., Tate, T., Lo Celso,が多いことは、エンビジンが胎児期の肝臓の分化や機C., Ono, N., Nutt, S., Heino, J., Sipila, K., Shioda, T.,

能に関係することが期待される。

Osawa, M., Lin, C. P., Hu, G. F., and Scadden, D. T.（2016）
Proximity-Based Differential Single-Cell Analysis of the文献

Niche to Identify Stem/Progenitor Cell Regulators. Cell

Stem Cell 19, 530­543１）Ozawa, M., Huang, R., Furukawa, T., and Muramatsu,T.（1988）A Teratocarcinoma Glycoprotein Carrying a10）Chao, F., Zhang, J., Zhang, Y., Liu, H., Yang, C., Wang, J.,

Developmentally Regulated Carbohydrate Marker Is aGuo, Y., Wen, X., Zhang, K., Huang, B., Liu, D., and Li, Y.

― 48 ―

マウス胎児期におけるエンビジンの発現（2015）Embigin, regulated by HOXC8, plays a suppressiverole in breast tumorigenesis. Oncotarget 6, 23496
11）Ichihara-Tanaka, K., Titani, K., and Sekiguchi, K.（1990）
Recombinant Carboxyl-terminal Fibrin-binding Domainof Human Fibronectin Expressed in Mouse L Cells J. Biol.

Chem . 265, 401­40712）Ichihara-Tanaka, K., Kadomatsu, K., and Kishida, S.（2017）
Temporally and Spatially Regulated Expression of theLinker Histone H1fx During Mouse Development. Journalof Histochemistry & Cytochemistry 65, 513­53013）Ichihara-Tanaka, K., Oohira, A., Rumsby, M., andMuramatsu, T.（2006）Neuroglycan C is a novel midkine
receptor involved in process elongation of oligodendroglial
precursor-like cells. J Biol Chem 281, 30857­30864
14）市原啓子 .（2018）フィブロネクチン基質におけるエンビ
ジンタンパク質による細胞の接着伸展の亢進 心身科学 11,85-90
15）Muramatsu, T.（2000）Protein-bound carbohydrates
on cell-surface as targets of recognition: An Odyssey inunderstanding themTakashi Muramatsu. Glycoconjugate

Journal 17, 577­595（平成 30 年 12 月 25 日受理）

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Journal of the Institute for Psychological and Physical Science, Vol. 11, No. 1 , 45 50, 2019

Expression patterns of embigin at mid-gestation stages of mouse development.
Keiko ICHIHARA-TANAKA

Abstract
Embigin is a cell surface transmembrane protein called GP70, which is classified as theimmunoglobulin superfamily. Embigin is known to be the cofactor of monocarboxylatetransporter 2. Recently embigin was found to promote cell growth and metastasis in somecancer tissues, but its function is not fully understood yet.
In this paper, to evaluate the gene expression of embigin at brain, heart and liver in the midgestation stages of mouse development, the quantitative polymerase chain reaction method
was adopted. Furthermore embigin protein expression was examined by western blotting. Gene
expression of embigin was reduced at brain and heart, and slightly increased at liver from E10.5
to E15.5. Embigin protein was detected as 66-kDa protein at brain, heart and liver at all thestages studied. Expression patterns of 66-kDa protein at brain and heart were consistent withthe expression level of mRNA. At liver the 66-kDa protein level was low as compared to brain
and heart at E15.5, but heterogeneous larger bands were observed. Thus embigin expressedat embryonic liver may have different post-translational modification from brain and heart.
These results suggest that embigin may have some roles at liver development and function atembryonic stage.
Keywords：embigin, quantitative PCR, western blotting, mouse, development― 50 ―