課題番号：24指107
研究課題名：HLAアリルでの層別解析によるB型慢性肝炎の発症およびB型肝炎ウイルス排除に関わる宿主因子の探索
主任研究者名 ：西田奈央
分担研究者名 ：大橋順
キーワード ：ゲノムワイド関連解析、B 型慢性肝炎、B 型肝炎ウイルス、HLA、次世代シークエンス
研究成果 1：
アジア人 4 集団（日本人、韓国人、香港人、タイ人）の肝炎患者群、HBV 排除群、健常対照群の合計3,167 例を対象として HLA-DPA1、-DPB1 アリルタイピングを実施し、B 型肝炎慢性化に対する感受性・抵抗性を示す HLA-DP アリルの同定を試みた。
日本人における肝炎患者群と健常対照群の比較から、B 型肝炎慢性化に対して進行性の関連を示す
HLA-DP アリルを 2 種類（DPB1*05:01、*09:01）、また抵抗性の関連を示す HLA-DP アリルを 3 種類（DPB1*02:01、*04:01、*04:02）同定した。5 つのうち、進行性アリル DPB1*09:01 および抵抗性アリルDPB1*02:01 は、日本人において新規に同定された B 型肝炎慢性化に関連する HLA-DPB1 アリルであった。
また、韓国人および香港人において検出された進行性、抵抗性の関連を示す HLA-DP アリルは日本人で検出されたアリルと共通するが、タイ人で検出されるアリルは他の 3 集団とは異なることが明らかとなった。
アジア人 4 集団でのメタ解析を実施したところ、抵抗性アリル DPB1*02:01、および進行性アリル
DPB1*05:01 がアジア 4 集団における共通の HLA-DPB1 アリルであることが明らかとなった。加えて、アジア人 4 集団において、肝癌患者群と慢性肝炎患者群の 2 群を比較したところ、DPB1*02:01 アリルが肝発癌に対して抵抗性の関連を示すことを明らかにした（P 値=1.55×10-7、OR=0.50）。
この成果については、論文報告を行った（Nishida et al. Journal of Clinical and Translational
Hepatology 2013、Nishida et al. PLoS One 2014）。
研究成果 2：
国内の研究協力施設で採血した B 型肝炎患者のゲノム DNA、血清サンプルを SRL 経由で国立国際医療研究センター・国府台病院に収集・保管する検体・臨床情報収集システムを構築した。今年度はこのシステムを利用して新たに 959 例を収集し、合計 1,163 検体のゲノムと血清を収集した（SRL 経由：763検体、施設直送：400 検体）。
簡易版データシートを用いた臨床情報の収集を進め、SRL 経由で収集した 763 検体のうち 700 検体、および施設直送 400 検体のすべてについての臨床情報を収集した。また、詳細版データシートを用いた臨床情報の収集を進め、SRL 経由で収集した 763 検体のうち 181 検体、施設直送 400 検体のうち 162検体についての臨床情報を収集した。
研究成果 3：

これまでに収集した HBV 患者症例（上記の 1,163 検体および既収集 3,667 検体）のうち、4,558 例のHLA-DP タイピング結果および 1,308 例のゲノムワイド SNP タイピング結果の取得を完了した。B 型肝炎慢性化および肝発癌に関連する HLA-DP アリルを有する検体を用いた HLA-DP 層別化 GWAS を実施し、複数の疾患感受性候補領域（P<1.0×10-4）を検出した。GWAS に用いた検体とは独立の検体を用いたReplication 解析を今後実施する予定である。

Subject No.

：24SHI107

Title：Screening of host genetic factors associated with chronic hepatitis B and viralclearance by means of stratified analysis with HLA alleles
Researchers ：Jun Ohashi
Key word：Genome-wide association studies, Chronic hepatitis B, Hepatitis B virus, HLA,

Next generation sequencing
Abstract：This work is published in PLoS One. (Nishida et al. PLoS One 2014)

We conducted HLA-DP genotyping using a total of 4,830 samples (including Japanese(n=2,954), Korean (n=586), Hong Kong (n=661) and Thai (n=629)) for HBV patients (including
chronic hepatitis B (CHB), liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC), healthycontrols and resolved individuals (HBsAg-negative and anti-HBc-positive), based on
PCR-SSO system according to manufacturer’s protocol. The Fisher’s exact test in a
two-by-two cross table was applied to acquire exact P values. We used the DerSimonian-Laird
method for a meta-analysis in four populations. The phase of each individual (i.e., acombination of two DPA1-DPB1 haplotypes) was estimated using PHASE software, assuming
samples are selected randomly from a general population.
A total of successfully genotyped 4,558 samples revealed one high-risk
haplotype (HLA-DPA1*02:01-DPB1*09:01) and one protective haplotype(HLA-DPA1*01:03-DPB1*04:01) to be associated with CHB infection over the previously
reported HLA-DP haplotypes in Asian populations (P= 3.38×10-6; OR=1.95; 95% CI, 1.46–2.64
for HLA-DPA1*02:01-DPB1*09:01; P= 1.17×10-5; OR=0.32; 95% CI, 0.18–0.56 for

HLA-DPA1*01:03-DPB1*04:01). Moreover, a significant association of DPB1*02:01 withprotection not only against HBV infection but against disease progression from CHB to HCC,
was identified in Asian populations (P= 1.55×10-7; OR=0.50; 95% CI, 0.39–0.65).
Trans-ethnic association study of HLA-DP in Asian populations revealed thatspecific HLA-DPB1 alleles (i.e. DPB1*02:01, *04:01, and *04:02) worked to be protective
against HBV infection, and different alleles (i.e. DPB1*05:01, *09:01) worked to besusceptible to HBV infection. To determine all the associated DPB1 alleles for HBV infection
would enable HBV infected individuals to divide into two groups who need treatment or not.
Moreover, DPB1*02:01 allele was associated with disease progression as well as CHB in
Asian populations. DPB1 alleles would be key host factors to recognize HBV derived antigen
peptides, which will lead the following functional studies of HLA-DP molecules in the future.
Based on HLA-DP genotypes, we performed a stratified GWAS with HLA alleles andidentified candidate genetic regions for CHB and HCC with P<1×10-4. We will perform areplication study of these candidate genetic regions using an independent set of samples.

Researchers には、分担研究者を記載する。

研究のマイルストーン（HLA層別解析研究）【平成24年度】
日本人健常群420検体のゲノムワイドSNP解析

HBV患者群1,345検体のゲノムワイドSNP解析（H25.9完了）（感受性・抵抗性に関わる）HLA
アリルのTagging SNP選択【平成25年度】
HBV患者群1,300検体のゲノムワイドSNP解析
HLAアリルによる層別解析
日本人HBV患者群のHLAアリル
追加解析@湧永製薬
候補遺伝子を対象としたReplication解析
HBV‐DNAのNGS解析【平成26年度】
SNP間相互作用解析、パスウェ
イ解析
疾患感受性遺伝子の同定
次世代シークエンスによる遺伝子機能解析

Total number of samples

1,345

Re‐analysis

23

Scan error

0Dish QC error (< 0.82)

1Call rate error (< 0.97)

22

Overall call rate (average)

99.41%

がん患者群（n=400） vs. 慢性肝炎患者群（n=515）

新規の疾患関連候補遺伝子の選択・Replication解析へ

HLAアリルによる層別解析
HLA‐DP遺伝子のTagging SNPを現在選択中（東京大学・徳永）。選択したTagging SNPでHLA‐DPアリルでの層別解析を実施する
新規の疾患関連候補遺伝子の選択・Replication解析へ

日本人HBV患者群のHLAアリル追加解析@湧永製薬
徳永班で収集した1,307例のHBV患者群を対象としたHLA‐DPB1
アリルタイピングを湧永製薬で実施した（H25.11、H26.3完了）
HLA‐DPB1アリルを揃えたHBV患者群における血清を用いて、ウイルス因子の解析へ【平成25年度 実施内容】
HBV慢性化および肝発癌に関わるHLA‐DPアリルを明らかとするために、アジア人集団（日本、韓国、香港、タイ）全3,167検体を対象としてHLA‐DPA1/DPB1アリルタイピングを実施した。
B型肝炎慢性化に対して、抵抗性・感受性を示す新たなHLA‐DPB1アリルを同定した（図1）。加えて、DPB1*02:01は慢性化だけでなく肝発癌に対しても抵抗性の関連を示すことを明らかにした（図2）。
B型肝炎ウイルス感染に抵抗性・感受性を示すDPB1アリルには進化的な共通性があることが示唆された（図3）

図2 肝発癌とDPB1の関連解析
同義置換のみを用いた系
統樹（A）と非同義置換のみを用いた系統樹（B）
感受性アリルを で、抵抗性アリルを で示す

青色：抵抗性HLA‐DPB1アリル
赤色：進行性HLA‐DPB1アリル

図1．アジア人集団を対象としたHBV慢性化とHLA‐DPB1の関連解析

図3 DPB1アリルの系統樹とB型肝炎感受性・抵抗性課題番号：24指107
研究課題名：（分担研究課題名）遺伝統計学的解析の実施
主任研究者名 ：西田奈央
分担研究者名 ：大橋順
キーワード ：ゲノムワイド関連解析、B 型慢性肝炎、B 型肝炎ウイルス、HLA、次世代シークエンス
研究成果：
我々は、B 型肝炎ウィルス感染と関連する HLA-DPB1 アリルを 5 種同定し（感受性アリルとしてDPB1*05:01 と DPB1*09:01、抵抗性アリルとして DPB1*02:01、DPB1*04:01、DPB1*04：02）、それらを揃えた層別解析により、新たな関連遺伝子・多型の同定を目指している。HLA-DPB1 をケース・コントロール間で揃えた層別解析では、HLA 領域以外と HLA 領域内の双方の関連遺伝子を探索する。HLA 領域に新たな関連多型を同定するためには、感受性もしくは抵抗性を示す各 HLA-DPB1 アリルの進化的背景を把握する必要がある。そこで、コーディング領域の塩基配列をもとに、日本人で高頻度に観察される HLA-DPB1 アリルの分子系統樹を作製した（図１）。ここでは、非同義置換と同義置換のそれぞれに対し、Jukes-Cantor 法によりアリル間遺伝距離行列を求め、近隣結合法を用いて樹系図を作成した。
非同義置換をもとに系統樹を作製した場合は、B 型肝炎感受性アリル（赤丸）と B 型肝炎抵抗性アリル（青丸）との明瞭なリネージが観察されないが（図１(A)）、同義置換をもとに系統樹を作製した場合
では、感受性アリル（赤丸）と抵抗性アリル（青丸）との明瞭なリネージが観察された（図１(B)）。
HLA 遺伝子座は、その進化過程において非同義置換に対する正の自然選択を受けてきたため、進化経路を推定するには同義置換の方が適していると思われる。図 1(B)において、DPB1*05:01 アリルを除くと、同一リネージ内のアリル間遺伝距離が短く、このことから、同一リネージ内では、アリルの分岐が比較的最近起ったことがわかる。また、最も興味深いことに、感受性アリルのリネージに含まれる
DPB1*14：01、DPB1*03:01、DPB1*13：01 の各アリルは、統計学上有意差はないものの、B 型肝炎ウィルス感染に対して OR は１より大きく（感受性傾向）、抵抗性アリルのリネージに含まれる DPB1*02:02
アリルも有意差は検出されないものの、OR は 1 より小さく（抵抗性傾向）、感受性と抵抗性のアリルリネージが明瞭に区別された。
次に、感受性と抵抗性のアリルリネージを区別するアミノ酸置換を同定するため、多重アラインメントを行った（図 2）。113～116 番目、125 番目、200 番目のアミノ酸残基がリネージ間で異なっていることが確認された。これらの部位は、HLA 分子が抗原を提示する際に重要な抗原認識部位（ペプチド結合部位）ではないが、HLA 分子の構造に影響を与えている可能性がある。なお、125 番目と 200 番目のアミノ酸置換は SNP によって規定されており、アリルを区別するのではなく、感受性アリルリネージと抵抗性アリルリネージの区別を目的とするならば、これらの SNP は有用なマーカーといえよう。
現在は、日本人健常群 420 検体の HLA と SNP の両遺伝子型情報を用いて、感受性アリルリネージと抵抗性アリルリネージを区別しうる SNP が存在するゲノム領域の探索を行っている。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：24指107
研究課題名：HLAアリルでの層別解析によるB型慢性肝炎の発症およびB型肝炎ウイルス排除に関わる宿主因子の探索
主任研究者名：西田奈央
論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Khudayberganova D,
Sugiyama M, Masaki N,
Nishida N, Mukaide M,
Sekler D, Latipov R,
PLoS One
Nataliya K, Dildora S,
Sharapov S, Usmanova G,
Raxmanov M, Musabaev E,
Mizokami M.

24;9(3):e93011

2014

Nishida N, Sawai H,
Kashiwase K, Minami M,
Sugiyama M, Seto WK,
Yuen MF, Posuwan N,Poovorawan Y, Ahn SH,Han KH, Matsuura K,
Tanaka Y, Kurosaki M,
Asahina Y, Izumi N, Kang
New susceptibility and resistanceJH, Hige S, Ide T,
HLA-DP alleles to HBV-related
PLoS One.
Yamamoto K, Sakaida I,
diseases identified by a trans-ethnic
Murawaki Y, Itoh Y, Tamori
association study in Asia.
A, Orito E, Hiasa Y, Honda
M, Kaneko S, Mita E,Suzuki K, Hino K, Tanaka E,Mochida S, Watanabe M,
Eguchi Y, Masaki N, Murata
K, Korenaga M, Mawatari Y,Ohashi J, Kawashima M,
Tokunaga K, Mizokami M.

10;9(2):e86449

2014

Genome-wide association study ofatypical psychosis.

Kanazawa T, Ikeda M, Glatt
SJ, Tsutsumi A, Kikuyama
H, Kawamura Y, Nishida N, Am J Med Genet
Miyagawa T, Hashimoto R, B Neuropsychiatr 162B(7):679-86
Genet.
Takeda M, Sasaki T,
Tokunaga K, Koh J, IwataN, Yoneda H.

2013

DNA polymorphism in the FKBP5
gene affects impulsivity inintertemporal choice.

Kawamura Y, Takahashi T,Liu X, Nishida N, Tokunaga
Asia Pac
K, Ukawa K, Noda Y,Psychiatry.
Yoshikawa A, Shimada T,Umekage T, Sasak T.

2013

IL28B polymorphisms and clinicalimplications for hepatitis C virus
infection in Uzbekistan.

5(1):31-8

研究発表及び特許取得報告について

A low-frequency GLIS3 variant
associated with resistance toJapanese type 1 diabetes.

Awata T, Yamashita H,
Kurihara S, Morita-Ohkubo
T, Miyashita Y, Katayama
S, Kawasaki E, Tanaka S,Ikegami H, Maruyama T,Shimada A, Takahashi K,Kawabata Y, Kobayashi T,
Nishida N, Mawatari Y.

437(4):521-5.

2013

Evidence for shared genetic risk
between methamphetamineinduced psychosis andschizophrenia.

Ikeda M, Okahisa Y, Aleksic
B, Won M, Kondo N,
Naruse N, Aoyama-Uehara
K, Sora I, Iyo M, Hashimoto Neuropsychophar
38(10):1864-70
R, Kawamura Y, Nishida N, macology.
Miyagawa T, Takeda M,
Sasaki T, Tokunaga K,
Ozaki N, Ujike H, Iwata N.

2013

Biochem BiophysRes Commun.

Miyashita A, Koike A, JunG, Wang LS, Takahashi S,Matsubara E,
Kawarabayashi T, Shoji M,
Tomita N, Arai H, Asada T,Harigaya Y, Ikeda M, Amari
M, Hanyu H, Higuchi S,Ikeuchi T, Nishizawa M,Suga M, Kawase Y, Akatsu
H, Kosaka K, Yamamoto T,
Imagawa M, Hamaguchi T,
Yamada M, Moriaha T,Takeda M, Takao T, Nakata
K, Fujisawa Y, Sasaki K,
SORL1 is genetically associatedwith late-onset Alzheimer's disease Watanabe K, Nakashima K,
PLoS One.
Urakami K, Ooya T,in Japanese, Koreans andTakahashi M, Yuzuriha T,Caucasians.
Serikawa K, Yoshimoto S,
Nakagawa R, Kim JW, Ki
CS, Won HH, Na DL, Seo
SW, Mook-Jung I;
Alzheimer Disease Genetics
Consortium, St GeorgeHyslop P, Mayeux R,
Haines JL, Pericak-Vance
MA, Yoshida M, Nishida N,
Tokunaga K, Yamamoto K,Tsuji S, Kanazawa I, Ihara
Y, Schellenberg GD, Farrer
LA, Kuwano R.

8(4):e58618

2013

研究発表及び特許取得報告について

Genetic influences on prefrontal
activation during a verbal fluency
task in adults: a twin study basedon multichannel near-infrared
spectroscopy.

Sakakibara E, Takizawa R,Nishimura Y, Kawasaki S,
Satomura Y, Kinoshita A,
Koike S, Marumo K, Kinou
M, Tochigi M, Nishida N,
Tokunaga K, Eguchi S,
Yamasaki S, Natsubori T,Neuroimage.
Iwashiro N, Inoue H,
Takano Y, Takei K, Suga M,
Yamasue H, Matsubayashi
J, Kohata K, Shimojo C,
Okuhata S, Kono T,
Kuwabara H, IshiiTakahashi A, Kawakubo Y,
Kasai K.

85 Pt 1:508-17

2014

高密度マイクロアレイによるゲノムワ
イド関連解析（GWAS)の実際

西田奈央、徳永勝士、溝上雅
肝胆膵史67(1): 7-14

2013

学会発表
タイトル

Development of DigiTag2 fordetermination of human SNPs

発表者

Nao Nishida

学会名International
Conference inMedicine andPublic Health2013, The
Symposium on
SNP typing:Application inhuman and TB

場所

年月Faculty ofMedecine Siriraj
Hospital,Bangkok

2013年6月24日-28日

IL28B遺伝子によるC型肝炎の治療効 西田奈央、徳永勝士、溝上雅 第17回日本肝臓学
品川
果予測と、第二の関連遺伝子の探索 史会大会

2013年10月9日-12日

西田奈央、澤井裕美、馬渡頼子、杉山真也、川嶋実苗、大 日本人類遺伝学会
仙台
橋順、田中靖人、徳永勝士、 第58回大会
溝上雅史

2013年11月
20日-23日

B型肝炎慢性化および病態進展に関わるHLA-DP遺伝子のアジア人集団における横断的解析

HLAアリルでの層別解析によるB型肝炎慢性化
西田奈央
およびウイルス排除に関わる宿主遺伝子の探索「Liver Forum inKyoto」第16回学術 京都集会

2014年3月

西田奈央，田中靖人、杉山真
第49回 日本肝臓C 型慢性肝炎の治療効果に関連する也、馬渡頼子、石井真由美、
新宿学会総会第二遺伝要因の探索
徳永勝士、溝上雅史

2013年6月6日-7日

研究発表及び特許取得報告について

Trans-ethnic analyses of HLADPA1, DPB1 haplotypes to be
associated with hepatitis B virus
infection

Nao Nishida, Hiromi Sawai,
Kouichi Kashiwase,
Mutsuhiko Minami, Masaya
Sugiyama, Wai-Kay Seto,
Man-Fung Yuen, Yong
Poovorawan, Sang HoonAhn, Kwang-Hyub Han,
Kentaro Matsuura, Yasuhito
Tanaka, Masayuki Kurosaki,
Yasuhiro Asahina, NamikiIzumi, Jong-Hon Kang,
AmericanShuhei Hige, Tatsuya Ide,
Association for
Kazuhide Yamamoto, Isao
the study of Liver
Washington DCSakaida, Yoshikazu
Diseases The
Murawaki, Yoshito Itoh,Liver Meeting
Akihiro Tamori, Etsuro2013
Orito, Yoichi Hiasa, Masao
Honda, Shuichi Kaneko, Eiji
Mita, Kazuyuki Suzuki,
Keisuke Hino, Eiji Tanaka,
Satoshi Mochida, Masaaki
Watanabe, Yuichiro Eguchi,
Masaaki Korenaga, Yoriko
Mawatari, Minae
Kawashima, KatsushiTokunaga, Masashi
Mizokami

Nao Nishida, Yasuhito
Tanaka, Masaya Sugiyama,
Understanding of IL28B gene
61th Annual
Yoriko Mawatari, Mayumi
associated with treatment response
Ishii, Chieko Haga, Katsushi ASHG Meetingfor HCV patients
Tokunaga, Masashi
Mizokami

Boston

アジア人集団におけるB型肝炎患者を 西田奈央、澤井裕美、馬渡頼子、杉山真也、川嶋実苗、大 第36回日本分子生対象としたHLA-DP遺伝子の横断的神戸
橋順、田中靖人、徳永勝士、 物学会年
解析溝上雅史

2013年11月1日-5日

2013年10月22日-26日

2013年12月3日-6日

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
該当なし
特許取得状況について
発明名称※出願申請中のものは()記載のこと。

登録番号

B型肝炎の慢性化の素因の検出方法 特願2013-179634※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）（共願は全記載）

登録日(申請日)

徳永勝士、澤井裕美、溝上雅史、西 2013年8月30日
田奈央

出願国日本