博 士 （ 水 産 学 ） 水野 伸 也
学位論文題名Ultrastructural and molecular biologicalstudies on hormonal control of osmoregulationin the gill of masu salmon durlngSmolti丘 Cation（銀化変態期のサクラマス鰓における浸透圧調節のホルモン制御に 関 す る 微 細 構 造 学 的 お よ び 分 子 生 物学 的 研 究 ）学位論文内容の要旨
サクラマスは本道で重要な沿岸漁業対象種となっているが、近年乱獲が進行しその天然資源が激減している。そのため、稚魚を河川および海洋に放流する事業が積極的に行われている。しかし、この放流魚の中に、スタント（成長しない魚）や死亡する個体が生じることから、必ずしもサクラマスの回帰率は上昇していない。このスタントおよび死亡の原因のーつには、海水適応能の発達が不十分なことが挙げられる。この問題を解決するためには、サクラマスの浸透圧調節機構に関する基礎的知見の集積が必要である。
一般に、サクラマスを含む降海型サケ科魚類には、コルチゾル、成長ホルモン、プロラクチンおよび甲状腺ホルモンをはじめとする複雑な内分泌制御のもと、降海前に河川で銀化変態（バーからスモルトへの変化）が起こる。この銀化変態には、海水適応能の発達、体色の銀自化等の様々な変化が含まれる。このうち、海水適応能の発達で、淡水型から海水型への浸透圧調節機構の変化に関わる重要な細胞のーっが鰓塩類細胞（CC）である。しかし、これまで天然魚の銀化変態に伴うCCの動態を調べた報告は殆ど無く、さらにはCCの内分泌制御機構にも不明な点が多い。また、銀化変態を支配する内分泌制御機構をホルモンの受容体に着目し解明しようとした試みは僅かであり、銀化変態期におけるホルモン受容体の分子レベルでの動態も不明である。

そこで本研究では、サクラマスの銀化変態期の鰓における浸透圧調節のホルモン制御機構を微細構造学的および分子生物学的に明らかにすることを目 的と して、 1）天然 魚の 銀化 変態 に伴う CCの 微細 構造 変化、 2）
CCの微細構造に及ぼすホルモンの影響、3）天然魚の銀化変態に伴うコルチ ゾル受容体であるグルココ少チコイド受容体（GR）mRNAの鰓における 発現 変化、 4）鰓GR mRNAの発現 に及 ぽす ホルモ ンの 影響 を調 べた。
先ず、銀化変態に伴うCCの微細構造変化を調べるために、バーからスモルトまでの天然サクラマスから鰓を採集し、透過型電子顕微鏡による観察に供した。その結果、全ての個体に1次鰓弁上で、微細構造学的に2型（Q型 お よ ぴD型 ） の CCお よ び 未 成 熟 型 a細 胞 と 推 察 さ れ る Accessory
cellが観察された。Q細胞およびAccessorycellは2次鰓弁基部に位置し、血管と隣接し低い電子密度を有するのに対し、B細胞は2次鰓弁間に位置し、血管と隣接せず高い電子密度を有していた。c細胞では、基底部側部細胞膜であるtubular systemの発達のピークがフルスモルトの5月に、粗面小胞体（er）およびゴルジ体の発達のピークがプレスモルトの3月および4月に観察され、その細胞数tま銀化変態に伴い増加し5月にピークに達した。このうち、tubular systemの発達および細胞数の増加は鰓Na+，K+‑ATPase活性の上昇が示す海水適応能の発達と同調していた。また、B細胞では銀化変態に伴い、細胞内に微細構造変化は観察されなかったものの、その数は有意に減少した。さらに、1次鰓弁基底部に、幼弱型CCと推察される細胞が銀化変態の進行に伴い多数出現するのが観察された。一方、 2次 鰓弁 上で は、微 細構 造学 的に1次鰓弁上のQ細胞に相当するCCのみ が観察された。2次鰓弁上のCCでは、銀化変態に伴いQ細胞と同様の微細構造変化が観察されたが、その数はa細胞と異なり減少した。これらの結果から、天然降海型サケ科魚類の銀化変態に伴うCCの微細構造変化が初めて明らかとなった。また、海水適応能の発達には、2次鰓弁基部 に お け る Q細 胞 の 発 達 が 最 も 重 要 だ と 考 え ら れ た 。
次に、銀化変態に伴うCCの微細構造変化に関わる内分泌制御機構を明らかにするため、ホルモンの生体内投与実験を行い、サクラマスのCCの微細構造に及ぼすホ彫モンの影響を調べた。供試魚には池産魚パーを用い、コントロール、ヒッジ成長ホルモン（oGH）投与群、コルチゾル投与群、ヒッジプロラクチン（oPRL）投与群および甲状腺ホルモン投与群を設けた。投与終了後に全群から鰓を採集し、透過型電子顕微鏡による観察に供し た 。 そ の 結 果 、 全 群の 魚で 、1次鰓 弁上 にQ細胞 、B細胞 およ び
Accessory cellが、2次鰓弁上にはQ細胞に相当するCCのみが観察された。Q細 胞およ び2次鰓 弁上 のCCにお いて、 tubular systemの発達はoGH投与により、erおよびゴルジ体の発達はコルチゾル投与により、これらの細胞数の増加がoGHおよびコルチゾ´レ双方の投与により誘導された。ま た、 B細 胞数 の減 少は oGH投与により、1次鰓弁基底部で多数の幼弱型CCの出現がコルチゾル投与により誘導された。以上の結果から、銀化変態に伴うCCの微細構造変化が主に成長ホルモンおよびコルチゾルにより制御されていることが示された。
銀化 変態 に伴 う鰓GR mRNAの発現 変化 を調 べるた め、 競合的PCR法を用い た鰓 GR mRNAの高 感度 測定系 の確 立を 試みた 。競 合的PCRに用いるプ ライ マー には、 既知 のニジマスGR cDNAの塩基配列からGRのみが特異的に増幅される領域を選択した。競合体には、人為的に作製したサクラマス[3‑actin cDNA断片を含む全長360 bpのDNAを用いた。サクラ
マス鰓total RNA lygを逆転写した試料を鋳型に、サクラマスGR cDNA断片および競合体のPCRにおける競合性を検討した結果、その両者は互いに競合性を示した。この結果から、本測定系がサクラマス鰓GR mRNAの測定に有効であることが示された。
確立された本測定系を用い、天然サクラマスの銀化変態に伴う鰓GR

mRNAの 発 現 変 化 を 調 べ た 。 その 結 果 、 鰓 GR mRNAの 発 現 量は3月 のプレスモルトの時期から徐々に増加し、4月にピークに達し（3月の約4倍）、海水適応能が最も発達するフルスモルトの5月に既に減少傾向を示した。また、銀化変態に伴う血中ホルモン量の変化を調ぺたところ、GH量は2月のパーの時期から上昇し、3月に最も高値を示し、その後減少したのに対し、コルチゾル量は1月のバーの時期から3月まで低値を示し、

4月 に 急増 し ピ ーク に 達し 、 5月 に 減少 傾向を 示した。以 上の結果 から、天 然サ ク ラ マス の 銀 化変 態 に伴 う 鰓 GR mRNAの 発 現変 化 が 明ら か とな った 。こ の 変 化は 血 中 コル チ ゾル 量 の 変化 に 酷似 し て おり 、 GR mRNAの 発
現カミコルチゾルのポジテイブフイードノヾックの制御を受けている可能性が考えられた。
最後 に 、サ ク ラ マス の 鰓GR mRNAの 発 現に 関 わる 内 分 泌制 御 機構 を明ら かに す る ため 、 ホ ルモ ン の生 体 内 投与 実 験を 行 い 、鰓 GR mRNAの発 現に 及ぼ す ホ ルモ ン の 影響 を 調べ た 。 供試魚 には、池産 バー、プ レスモル
ト 、フ ル ス モJレト お よび ポ ス トス モ ルトを 用い、コン トロール 、oGH投与 群、 コ ル チゾ ル 投 与群 、 oGH十 コ ル チゾ ル 複合 投 与 群を 設 けた 。 投与終 了後 に 全 群か ら 鰓 を採 集 し、 先 に 確立 し た測 定 系 を用 い 鰓GR mRNAの発 現量 の 測 定を 行 っ た。 そ の結 果 、 鰓GR mRNAの 発現 量 は バー の コル チゾ ル投 与 群 、プ レ ス モル ト のoGH、 コ ルチゾJレ ならびに複 合投与群 、ポス トス モ ル トの oGHお よび 複 合投 与 群 で有 意 に増 加 し た。 こ れら の 結果か ら、 銀 化 変態 期 に 観察 さ れる GR mRNAの 発現 量 の増 加 に は全 期 間を 通じ 、主 に コ ルチ ゾ ル が、 プ レス モ ル トの時 期以降にGHが 作用して いると考えられた。

学 位 論 文 審 査 の要 旨
主査
副査
副査
副査
副査教授教授教授
助教授助教授

山内晧平
麦谷泰雄
原 彰彦
上田 宏
足立伸次

学位論文題名Ultrastructural and molecular biologicalstudies on hormonal controlof osmoregu
lationin theg
illofmasusal
mondurlng
SmoltiflC
ati
on（銀化変態期のサクラマス鰓における浸透圧調節のホルモン制御に関する微 細構造学的および 分子生物学的研究）

近年、本道ではサクラマスの乱獲が進行しその天然資源が激減していることから、サクラマス稚魚の放流事業が積極的に行われている。しかし、この放流する稚魚の中にスタント（成長しない魚）や死亡個体が生じることから、必ずしもサクラマスの回帰率上昇には至っていない。このスタントおよび死亡の原因のーつには、海水に適応するための浸透圧調節能の発達が不十分なことが挙げられる。この問題を解決するためには、サクラマスの浸透圧調節機構に関する基礎的知見の集積が必要である。
サクラマスを含む降海型サケ科魚類には、降海前に河川で複雑な内分泌制御のもと、銀化変態が起こる。この銀化変態には、海水適応能の発達、体色の銀自化等の様々な変化が含まれる。このうち、海水適応能の発達において、浸透圧調節機構の変化に関わる重要な細胞のーっが鰓塩類細胞（CC）である。しかし、これまで天然魚の銀化変態に伴うCCの動態を調べた報告は無く．、さらにはCCの内分泌制御機構にも不明な点が多い。また、銀化変態を支配する内分泌制御機構をホルモンの受容体に着目し解明しようとした試

みは 僅 か であ り 、銀 化変態期 における ホルモン 受容体の分 子レベル での動態も不明で ある。
そこ で 、本 研 究 は先 ず 天 然サ ク ラマ ス の 銀化 変 態に 伴 う CCの 微 細構 造 変化 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 一 次 鰓 弁 上 に は Qお よ び Dの 2型 の CCが 、 2次 鰓弁上 に は Q型に 相 当 する 細 胞 のみ が 存在 す る こと が明らか となった 。また、
銀化 変 態 に伴 い 大き な 微 細構 造 変化 が 観 察さ れ るのは2次 鰓弁基部 における
CCで あ り、 こ れら の細 胞の発達 が本種の 海水適応 能の発達に 最も重要 だと考えられた 。
次に 、 CCの 内 分泌 制 御 機構 を 調べ る た め、 CCの微 細 構造 に 及 ぼす ホ ルモ
ン の 影 響 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 Q細 胞 お よ ぴ 2次 鰓 弁 上 の CCに お いて 、 成長ホルモ ン（GH）は tubularsystemの発達を、コルチゾルは粗面小胞体およびゴル ジ 体 の発 達 を誘 導すると 考えられ た。また 、コルチゾ ルはこれ らの作用に 加 え 、 1次 鰓 弁 基 底 部 で CCの 分 化 に 作 用 し て い る と 推 察 さ れ た 。
さ ら に、 コ ルチ ゾル の作用機 構を明ら かにする ため、銀化 変態に伴 う鰓グ
ル コ コ ル チ コ イ ド 受 容 体 （ GR） mRNAの 発 現 変 化 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、鰓GR mRNAの 発 現 量 は 3月 の プ レ ス モ ル ト の 時期 か ら徐 々 に 増加 し 、 4月に ピー ク に 達 し （ 3月 の 約 4倍 ） 、 海 水 適 応 能が 最 も発 達 す るフ ル ス モル ト の5月に 既 に 減少 傾 向を 示した。 この変化 は血中コ ルチゾル量 の変化に 酷似しており 、 GR mRNAの 発 現 がコ ル チ ゾル の ポジ テ イ ブフイ ードバ．ッ クの制御 を受けてい る可能性 が考えら れた。
最 後 に 、 サ ク ラ マ ス の 鰓 GR mRNAの発 現 に 関わ る 内分 泌 制 御機 構 を明 らか に す る た め 、 鰓 GR mRNAの 発 現 に 及 ぽす ホ ル モン の 影響 を 調 べた 。 その結 果 、 鰓 GR mRNAの 発 現 量 の 増 加 に は 銀化 変 態 期の 全 期間 を 通 じ、 主 にコル チ ゾル が 、プ レ ス モル ト の時 期 以 降に GHが作 用 して い る と考 え られ た 。
上 述 のよ う に、 本研 究はサク ラマスの 浸透圧調 節機構に関 して微細 構造学
的お よ ぴ 内分 泌 学的 側面から 基礎的知 見を提供 した。今後 、これら の知見は
サ ク ラマ ス 仔魚 の 放 流事 業 に応 用 可 能と 考 え られ る こと か ら 、高 く 評価 され、 本 論 文が 博 士（ 水産学） の学位請 求論文と して相当の 業績であ ると認定した。