博 士 （水 産 学 ）安藤忠

学位 論 文 題名
硬骨魚類インスリンの一次構造，遺伝子構造および分泌動態に関する研究
学位論文内容の要旨
硬 骨 魚 類 に お い て 、 イン ス リン は栄 養 素、 特 にタ ン バク 質 ・ア
ミ ノ 酸 の 同 化 制 御 に key hormoneと し て 深 く 関 わ っ て い る 。 し た がっ て 、 硬 骨 魚 類 に お い て イン スリ ン の分 泌 動態 、 作用 機序 を 明ら
か に す る こ と は 、 栄 養 素 の効 率的 な 同化 、 ひい て は成 長を 促 進する 技 術 を 開 発 す る 上 で 重 要で ある 。 そし て 、硬 骨 魚類 のイ ン スリン の 一 次 構 造 は 変 異 性 が 高く 、魚 種 ごと に 生物 活 性が 異な る ことが 予想 され 、 さら に複 数の分子種を 有する魚種が 認められるため 、各 魚 種 に お い て 各 分 子 種 の生 化学 的 同定 お よび 分 泌動 態を 調 査する こと が必 要 であ る 。
以 上 の よ う な 背 景 を 踏ま え 、本 研究 は マツ カ ワお よ ぴ数 種 の硬骨 魚 類 に お い て イ ン ス リ ンの 一次 構 造、 遺 伝子 構 造を 解明 し 、複数 の イ ン ス リ ン 分 子 種 の 産生 様式 を 明ら か にし た 。さ らに 、 マツカ ワイ ンス リ ン酵 素免 疫 測定法 を新たに開発し、 マツカワにおけ る 2分 子 種 の イ ン ス リ ン の 分 泌 動 態 の 一 端 を 解 明 し た 。
第 1章 で は 、 マ ツ カ ワ は B鎖 の N末 端 の 伸 長 （ Pyr‑Ala） の 有 無の み が 異 な る 2分 子 種 の イ ン ス リ ン を 有 す る こ と を 明 ら か に した 。 そ し て 、 5個 体 の 膵 抽 出 物 を 個 体 ご と に 調 製 し て 、 逆 相
HPLCに 負 荷 し た と こ ろ 、 イ ン ス リ ン ‐ Iお よ び IIに 対 応 す る
UV吸 収 ピ ー ク が す べ て の 個 体 に 認 め ら れ 、 両 イ ン ス リ ン は 非 対対 立 性 遺 伝 子 に 支 配 さ れ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 次 に 、 PCRに− 174―

よ ル マ ツ カ ワの ゲ ノ ミ ッ ク DNAからブ レプロ インス リン 遺伝子を増幅し、塩基配列の解析を行った。その結果、単一の遺伝子が得られ、この遺伝子から演繹されたアミ丿酸配列はインスリン‐Iおよ びIIに一致 した。そして、この遺伝子の一部の塩基配列をプ ロー ブとし てゲノミックサザンブロットを行ったところ、3種の 制 限 酵 素 のそ れ そ れ に よ り消化 された ゲノミ ックDNAにおいて 1本 ずつ のバン ドが検出された。これらのことから、マツカワの 2分 子種 のイン スリンは単一のブレブロインスリンからシグナ
ル ペブ チドの C末 端の切 断箇所 が2箇所 にわた るため 生じると考えられた。
第2章で は、マ ツカワ におけ る2分子 種のイ ンスリ ンの産生様式がマツカワに特異的なものか否かを、イシガレイ、カツオ、ホッ ケの 3種 からイ ンスリンを精製するとともに、それらの一次構造を解析することにより検討した。
マツ カワと 系統的 に遠縁 である イシ ガレイ もB鎖のN末端の伸長（Pyr‑Ala）の有無のみが異なる2分子種のインスリンを有することが確認された。このことからカレイ類の多くの種がマツカワ
イ ンス リン‐ Iお よびIIに対応 する 2分 子種の インス リンを含むことが考えられた。
1個体のカツオからインスリンを精製したところ、インスリン‐
Iお よ び IIが 得 ら れ た 。 こ れ ら の 間 に は 50残 基 中 11残 基 の 配列置換が認められ、インスリン‑ IIのB鎖のN末端はインスリン−Iのそ れに 比較し て1残基伸 長して いた 。また 、脊椎 動物のインス リ ン の B鎖 16残 基 目 は レ セプ ターと 結合す る領域 を構 成するた め保 存性が 高く、ほとんどの種においてTyrであるが、カツオ
イ ン ス リ ン ‐Iの そ れ は Asnであっ た。さ らに、 3個 体の 膵抽出
物 を 個 体 ご と に 逆 相 HPLCに 負 荷 し た と こ ろ 、 イ ン スリ ン ‐ I
お よび IIに対 応する UV吸収 ビーク がす べての 個体に おいて確認さ れた 。これ らのことから、カツオのインスリン‐IとIIは異な―175―

る2遺伝子座に支 配された分子種で あり、生物活性が異なることが予想された。
ホッケ においても2分子種のインスリ ン（エ、II）の存在が確認され た。そして、両分子種間に51残 基中 11
残 基 の置 換、 およ び イン スリ ン ‑IのA鎖 のN末 端に 3残基 の伸 長 が認 めら れた。
また 、ホッケインスリン‑IIとカツオインスリン‑II間のアミノ酸配 列の置換残基数は 4残基であっ たが、ホッケインスリン，エと カ ツ オ イ ン ス リ ン ‐ Iの そ れ は 17残 基で あ った 。さ ら に、 5個 体 の ホ ッ ケ か ら 得 ら れ た 膵 抽 出 物を 逆 相HPL
Cに 個体 ごと に負荷 したところ、すべての個体においてインスリンーエおよびIIに 対 応す るUV吸収 ピークが 認められた。これ らのことは、ホッケに おいてもインスリ ン‐エおよぴIIは異なる 2遺伝子座に支配され ていること、およびカツオとホッケが分岐した後にそれそれの種においてインスリン‐I遺伝子はインスリン‑II遺伝子の重複によ り生じたことを示唆している。また、ホッケのインスリン・IとII間において、レ セプターと結合す る領域を構成する部分にアミ 丿酸配列の置換および伸長が認められたことから、ホッケにお い ても カツ オ と同様 にインスリン‑IとII間の生 物活性が異なることが予想された。
第3章においては、 ビオチン標識マツ カワインスリン‑IIと抗マツカワインスリン‑II血清を使用した競合免疫、測定法を開発した。 そして、この測定法によルアミ丿酸とグルコースのインスリン分 泌誘導能を投与実験により比較したところ、アルギニンが強い誘 導能を有することが示された。一方、哺乳類において強い誘導能 を示すグルコースの効果は弱かった。次に、アルギニン投与
ある いは餌料給餌によルインスリン分泌を誘導したマツカワから
血 漿 を 採 取 し 、 逆 相 HPLCに 負 荷 して 得 られ た各 フ ラク ショ ンのイ ンスリン量を測定した。その結果、インスリン免疫反応はアルギ ニン投与および餌 料給餌のいずれの実 験区においても2つの―176―

反応ビークとして認められ、それらの溶出時間はマツカワのインスリン‑IとIエのそれらにそれそれがー致した。このことはマツカワにおいて2分子種のインスリンが成熟分子として血液中に分泌されること、およぴアルギニンおよぴ摂餌後の栄養素の同化に両 イ ン ス リ ン が と も に 作 用 す る こ と を 示 唆し てい る。
本研究において、硬骨魚類のインスリンには（1）単一のブレブロインスリンから成熟型ヘ変換される過程でシグナルペブチドの切断箇所が異なるために2分子が生じる様式と、（2）2遺伝子座の産物として2分子種が生じる様式の2っの分子多型の産生様式が存在することが明らかになった。そして、本研究において使用した4魚種すべてにおいて複数のインスリンの存在が明らかになったことから、さらに他の硬骨魚類においても未知のインスリン分子が存在する可能性が考えられる。そのため、栄養素代謝の研究対象種において複数のインスリンの存在可能性、分泌動態さらにそれらの間に機能分化があるか否かを検討することが必要であろう。そして、これらの知見およびインスリンの測定法は硬骨魚類、特に異体類においてインスリンを中心にした内分泌系制御による効率的なタンバク質・アミノ酸の同化制御技術開発の基礎として重要になると考えられる。

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学位論文審査の要旨
主査 教 授 山崎文雄
副査 教 授 西田清義
副査 教 授 原 彰彦
副査 助教授 後藤 晃

学 位 論 文 題 名

硬骨魚類インスリンの一次構造，遺伝子構造
および分泌動態に関する研究
一般に動物に摂食される栄養素の同化にはインスリンが重要な役割を担っている。特に哺乳類 では糖代謝において血糖値降下作用を持つ唯一のホルモンとして、細胞内代謝から臨床応用の 分野まで極めて多くの知見が蓄積されている。しかし魚類においてはこれまでインスリンにっ いては、サケ、マス類、ウナギなどで生理学的研究が行われてきたが、インスリンの一次構造 や機能分化等に関しては殆ど知られていないのが実状である。更に現在養殖対象種となってい る海産魚種にっいての知見は皆無に近く、効率的な種苗養成技術を開発する上でも、インスリ ンの生化学的性質や分泌動態を明らかにすることは極めて重要である。特に魚類では肉食を主 とし て多 様な 食性を 有し てお り哺 乳類と は異 なる 生活活 性も 予想される。
申請者はこの点に注目し、寒冷地で養殖対象種として期待されるマツカヮを中心として水産上 重要な種であるイシガレイ、カツオ、ホッケを研究材料として選び、インスリンの種による違 いおよび同一種内にみられるインスリンの分子種にっいての生化学的同定を行い、分子構造と 栄養素の投与実験から推定される機能分化および分泌動態を明らかにしようとしたもので、本 研究の審査課程で評価した主な点を上げると次の通りで ある。
1． 調べた4
魚種共海産魚であり 、その内、特に異体類は養殖対象種として重要な魚種を 含ん
で お り 、 栄 養 代 謝 に 直 接 関与 す る イ ン ス リ ン の 研 究 を 推 進 し た 意 義 は 大 き い 。
2． 調べ た海 産4魚 種の いず れにおいてもインスリンには分 子構造の異なる2分子種が存 在する ことを明らかにした。この2分子種は調べた全ての個体に 存在し、インスリンI、矼に 相当す ることを明らかにした。
3.マ ツ カ ワ と イ シ ガ レ イ に み ら れ た イ ン ス リ ン の 2分子 種は B
鎖 のN末 端の P
yr‑ A
laが存在 するか否かの違いであり、その産生機構は1遺伝子座の支配を受けた単一のプレプロインス
リ ン から イン スリ ンIおよ びHに変換される過程で、シグナ ルペプチドのC末端の切断箇 所が2箇 所に わた るこ とに よる と推 定した。相違のみられたB鎖N末端はインスリンレセプタ ーと結 合 する 部位 と離 れて いる と考えられることから、異体類 2魚種のインスリンI、Hには 未だ生 物活性の機能的分化は起こっていないと推論した。
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4．カ ツオ とホ ッケ の2分 子種 （イ ンス リン I、H）は 異体類の 場合と異なる事を示した。カツ オ で は I、 n間 に 50残 基 中 11残 基 の 配 列 置 換 が あ り 、 イ ン ス リ ン nの B鎖 の N末 端 は インス リン Iと比 較し て1残 基伸 長し てお り、 しか もB鎖 1
6残 基目 はレ セプ ター と結 合する領域で あり 、 この 領域 は殆 どの 種で Tyrで ある のに 対し て、 カツ オイ ンス リン IではAsnであること、この2分子種は個体ごとに調べた結果、全ての個体に 存在することから、カツオのインス リン I、Hは 異な る2遺伝 子座に支配された分子種で機能的 に分化している可能性を示唆した。
5． ホ ッ ケ で は イ ン ス リ ン I、 H間 で 51残 基 中 11残 基 の 置 換 、 お よ び イ ン ス リ ン Iの A鎖のN末 端に 3残基 の伸 長が ある こと 、ホ ッケ にお いて もカツオ と同様に2分子種が2遺伝子座に支配され、機能的に分化してい る可能性を示唆した。更にカツオとホッケとの比較ではインスリ ンIで 17残 基、 イン スリ ンnで は4残 基の 置換 があ り、 魚類 のイ ンス リン は魚 種間で相当の変異があり、栄養素同化に多 くの多様性を含んでいることを示す貴重な結果を提示した。
6．本 研究 でビ オチ ン標 識マ ツカワ・インスリンHと抗マツカワ・インスリンu血清を使用したインスリン酵素免疫測定法を新 たに開発した点を評価した。この測定法により、アミノ酸とグルコースのインスリン分泌誘導 能を調べるためマツカワを使用した投与実験によルマツカワのインスリンと哺乳類のインスリ ンの機能差を明らかにした。アミノ酸としてアルギニンとヒスチジンを使用し、グルコースと 比較すると、哺乳類では強い誘導能を示すグルコースの効果はマツカワで弱く、逆にアルギニ ンの筋肉注射あるいは飼料給餌により血漿インスリン量が増加すること、この場合2分子種共に増加することから、アルギ ニンおよび摂餌後の栄養素の同化に両分子種が共に作用すること を確かめ、2分子種の分子構 造から推定した機能の同一性を実証した点を評価した。
7．本研究は魚類のインスリンの産 生過程において少なくとも2っの異なる様式のあることを示した。即ち、1っは単一のプレプ口インスリンから成熟型へ 変換される過程でシグナルペプ
チド の切 断 箇所 が異 なる ため に2分子 種 が生 ずる 様式 、他の1っは2遺伝子座の産物として 2分子種が生ずる様式で、少なくと も前者の様式は異体類で初めて見出された様式として注目される。 4魚種の内カツオとホッケで は、インスリンII遺伝子座の重複により、インスリンI遺伝子座が形成されたと推定した。 これは、現在両遺伝子座のいずれにおいても対立遺伝子が見出されておらず、魚類のインスリ ン分子の多様性を考える上で興味がもたれる結果であると評価した。
以上により、本研究は魚類イン スリンの分子種に関する先駆的研究であり、魚類特に海産魚類の栄養代謝を考える上で貴重な 知見を与えるものとして高く評価され、審査員一同は本研究の 申 請 者 が 博 士 （ 水 産学 ）の 学位 を授 与さ れる 十分 な資格 を有 する と判 定し た。

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