課題番号：２３指１０１
研究課題名：炎症性腸疾患の新規診断マーカー及び治療標的の開発
主任研究者名 ：河村 由紀
分担研究者名 ：櫻井 俊之
キーワード ：炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、Wnt/Notch シグナル、レクチン
研究成果
：
概要
研究の背景
炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）は、近年著しい増加傾向にある若年発症の重篤な慢性
炎症性疾患である。消化管局所の免疫応答異常を特徴とするが、根治療法がない。慢性化した患者の予後を左右する最も重大な因子は大腸癌の合併であり、実際にこれらの疾患に罹患した患者は、非罹患者と比べて高い発癌リスクを有している。そのため、長期にわたり発癌のスクリーニングのため定期的に内視鏡検査を受けているが、患者及び医療費負担の面から検査の頻度にも限界があり、また検査には早期の粘膜病変を検出するための高い技術が要求される。このため、より簡便で客観的なマーカー開発が急務である。また、発癌高危険群だけでなく、治療抵抗性で、重症化により手術適応に至るような患者を事前に選別し、予防対策を講じるためには、炎症の重篤化を予測する分子マーカーの同定とこれに基づく予防法の開発が急務である。そこで本研究では、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）の臨床検体を用いて、新しい予後サーベイランスマーカーや治療標的となる分子の探索を行った。
研究の実施内容
炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）の新しい予後サーベイランスマーカーとして、より簡便な検査法への応用を目指し、炎症局所で見られる変化を反映する、末梢血中のマーカーを探索した。
治療標的となる分子の探索としては、炎症・傷害粘膜の修復過程で見られる細胞増殖の亢進と、糖鎖産生を担う杯細胞の消失過程の制御に重要であることがマウスモデルで示されている Wnt／Notch シ
グナルに着目して研究を行った。
炎症性腸疾患の遷延化診断のための末梢血マーカーの探索
潰瘍性大腸炎手術症例 26 例の、摘出病変部の炎症粘膜において、上皮に発現する糖鎖の変化を組織免
疫染色により検討した。その結果、正常消化管上皮に発現する血液型糖鎖 Sda 抗原および 6 スルホシア
リルルイス x 糖鎖が広範に消失していることが明らかになった。自然免疫細胞（マクロファージや樹状細胞）は、これらの正常上皮細胞に発現する糖鎖を認識するレクチン分子（セレクチン、ガレクチ
ン、シグレック等）を発現している。従って、末梢血中のマクロファージ／樹状細胞が炎症に伴う消化管局所の糖鎖発現変化を反映し、受容体レクチン分子の発現パターンに変化を生じていれば、消化管局所の糖鎖発現変化を調べる方法と比較して、末梢血中のマクロファージ／樹状細胞の細胞表面分子の解析という、より簡便な検査法により消化管病変部の炎症状態を知ることが出来る。そこで、末梢血中の自然免疫細胞を解析対象として、正常上皮細胞に発現する糖鎖を認識するレクチン分子の発現を検討した。クローン病 22 例（21-57 歳、平均年齢 41.5 歳）、潰瘍性大腸炎 41 例（20-91 歳、平均
年齢 47.0 歳）の炎症性腸疾患症例と、対照非炎症性腸疾患症例としてベーチェット病 3 例、腸結核患者 3 例の末梢血を解析した。解析症例の臨床情報は、本研究に特化した Case Report Form を作成し、これを用いて収集した。CD33 陽性マクロファージ／樹状細胞における糖鎖認識レクチンの発現を、健常
人ボランティア（26-54 歳、平均年齢 34.0 歳）と比較した結果、シグレック陽性頻度が潰瘍性大腸炎症例で 8 倍、クローン病症例で 5 倍以上有意に高かった。クローン病症例と潰瘍性大腸炎症例との間ではマーカーの発現頻度に有意差は無かった。また、ベーチェット病および腸結核症例と健常人ボラン
ティアとの間にもマーカーの発現頻度に有意差は認められなかった。以上より、本マーカーの発現ではクローン病と潰瘍性大腸炎の鑑別は困難であるが、炎症性腸疾患特異的変化であると考えられた。
潰瘍性大腸炎症例において、検査値との関連を更に検討した結果、CRP 値、ALB 値、Hb 値、ESR 値、

白血球数、好中球数、血小板数と CD33 陽性マクロファージ／樹状細胞におけるシグレック陽性頻度には相関は認められなかったことから、炎症程度のみを反映する変化ではないことが明らかとなった。
症状（発熱、腹痛、血便）、病変範囲による病型、臨床的重症度（pUCDAI スコア）との関連では、腹痛と有意に関連し、全大腸型の重症例で陽性となる傾向が見られた。そこで、治療介入の前後や、再燃／寛解等病勢に変化が見られた場合には再解析を行うこととし、更に有用性を評価した。現時点
での前向き検討例が 11 例と少ないため有意差は無かったが、陽性症例では陰性症例よりも通院間隔が短く、ステロイド治療に依存性または抵抗性を示すことが明らかとなった。以上より、本マーカー発
現が再燃の予知、治療反応性の予知に有用である可能性が示唆された。今後も本研究への症例の登録と、前向き解析登録症例の経過追跡を継続して行うことで、統計学的解析においても本マーカーの有用性を示すことが出来ると考えている。
炎症性腸疾患の新規診断マーカーの探索
末梢血マーカーの解析より、CD33 陽性マクロファージ／樹状細胞細胞において糖鎖認識分子の発現異常が認められたため、潰瘍性大腸炎、クローン病および健常人ボランティアの末梢血由来 CD33 陽性
マクロファージ／樹状細胞、潰瘍性大腸炎の摘出標本、クローン病の手術組織、ないし非炎症性腸疾
患患者の炎症粘膜固有層より分離した CD33 陽性マクロファージ／樹状細胞細胞を対象として、更なる新規マーカー分子の探索を行った。次世代シーケンサーを用いた網羅的解析には通常 107-108 細胞が必要とされるが、臨床情報との統合を行うためには各検体の個別解析を行う必要が有るため、SAGE-seq(serial analysis of gene expression sequencing) による網羅的な mRNA 発現解析と、MeDIP-seq (methylated
DNA immunoprecipitation sequencing) による網羅的な DNA メチル化解析を、105 細胞を用いて同時に行う方法を開発した。本法を用いて得られたシークエンス結果において、CD33 およびマクロファージ／
樹状細胞特異的分子の mRNA 発現は確認出来ており、次世代シークエンサーを用いた免疫細胞の小ス
ケール解析法を確立出来た。バイオインフォマティックス解析により、CD33 陽性マクロファージ／樹状細胞細胞においては、特定領域(遺伝子)における DNA メチル化異常よりも、反復配列におけるゲノ
ムワイドな低メチル化が顕著であることが明らかとなった。
炎症粘膜で見られる再生上皮における Notch/Wnt シグナル異常の解析
炎症・傷害粘膜の修復過程で見られる細胞増殖の亢進と、糖鎖産生を担う杯細胞の消失過程の制御において Wnt/Notch シグナルが重要であることがマウスモデルで示されているので、Wnt/Notch シグナル強度を調節するチューニング分子（NLK、Nrarp、Numb 等）に着目して検討を行った。その結果、両シグナルに抑制的に作用するレオスタット分子 Nemo-like kinase の発現が潰瘍性大腸炎組織において有意に低下していることを見出した。この分子をコードする遺伝子の転写制御部には、DNA メチル化による発現抑制を受ける CpG アイランド領域が存在するため、パイロシークエンス法によりメチル化状態を検討した結果、潰瘍性大腸炎組織において顕著なメチル化亢進が見られた。この分子を発現していない大腸癌細胞株を DNA メチル化阻害剤 5-aza-2’-deoxycytidine 処理すると mRNA 発現が回復し、また、DNA メチル基転移酵素（DNMT1 および DNMT3b）のダブルノックダウンによりゲノムワイドに殆ど DNA メチル化が認められない大腸癌細胞株においても、親株と比べて著しい発現が認められた。
以上より、本分子の発現は DNA メチル化による制御を受けていることが示され、これまで不明であった炎症性腸疾患における Wnt/Notch シグナル破綻の分子機構が明らかとなった。
炎症粘膜で異常が見られる Notch/Wnt シグナル調節分子の機能解析
本研究で見出した潰瘍性大腸炎における Wnt/Notch シグナル調節分子の発現低下が、細胞機能に影響を及ぼす変化か否かを in vitro で評価した。散発性大腸癌の切除大腸粘膜の正常部より単離したヒト由来大腸上皮細胞を、我々が確立した大腸上皮細胞の三次元培養法を用いて培養し、siRNA を導入することで Wnt/Notch シグナル調節分子の発現抑制を試みたが、ゲル培養等の特殊な条件下のためか、
siRNA 導入そのものがうまくいかなかった。そこで、Wnt/Notch シグナル調節分子の発現が低下している潰瘍性大腸炎の切除組織より再生上皮細胞を単離して同様に三次元培養し、DNA メチル化阻害剤
5-aza-2’-deoxycytidine を添加することで Wnt/Notch シグナル調節分子の発現回復を試みた。

5-aza-2’-deoxycytidine 処理するとゲル培養中でも転写制御部位に存在する CpG アイランド領域の DNA
メチル化が解除された。ゲル培養液中に EdU を添加し、その取り込みにより細胞増殖能を同時に評価した結果、DNA のメチル化解除に伴い細胞増殖も抑制された。DNA メチル化阻害剤により再生上皮で見られる過増殖が抑制されたことから、Wnt/Notch シグナル調節分子の転写制御部位を含む DNA メチ
ル化異常の是正が、炎症性腸疾患の治療標的となる可能性が示された。
炎症性サイトカイン誘導性エピジェネティック異常の Notch/Wnt シグナルへの影響の解明
潰瘍性大腸炎およびクローン病の組織サンプルおよびマウス腸炎モデルを用い、炎症局所において発現亢進が著明な因子について検討した。その結果、炎症性サイトカイン IL-6 が炎症の重症度ならびにDNA メチル化レベルと相関することを見出した。また、IL-6 は上皮における DNMTs の発現を誘導した。散発性大腸癌の切除大腸粘膜の正常部より単離したヒト由来大腸上皮細胞のゲル培養中に IL-6 を添加しても NLK 転写領域の DNA メチル化亢進は認められなかった。一方、潰瘍性大腸炎の切除組織より単離した再生上皮のゲル培養中に IL-6 中和抗体を添加すると、NLK 転写領域の DNA メチル化レ
ベルが低下し、細胞増殖は亢進した。これらの結果は、IL-6 阻害剤は再生上皮で見られる DNA メチル化を介した過増殖を抑制するという点からも、炎症性腸疾患の治療として有効であることを示している。一方で、IL-6 は潰瘍性大腸炎でみられる傷害上皮の修復に必須であり、他にも複数の因子が関与していることが示唆されている。病態に関連する分子機構の更なる全貌解明を目指して、潰瘍性大腸炎の摘出標本およびマウスモデルより分離した再生上皮細胞を対象として、網羅的トランスクリプトーム解析（マイクロアレイ解析、SAGE-seq 解析）ならびに網羅的メチローム解析（メチル化アレイ解
析、MeDIP-seq 解析）を施行した。現在、バイオインフォマティックス解析中であるが、炎症粘膜に特徴的なムチン産生性杯細胞の消失と関連する、ムチン型糖鎖合成遺伝子、MUC2 ムチン、TFF2 等に加えて、Wnt/Notch 標的遺伝子、エピゲノム修飾編集因子の DNA メチル化亢進による発現抑制が見出されており、今後さらにバイオインフォマティックス解析を進めていくことで、潰瘍性大腸炎の病態
および炎症遷延化に関連する分子機構を解明し、IL-6、Wnt/Notch シグナル異常の重要性を明らかに出来ると考えている。
サーベイランスマーカーとしての有用性をヒト消化器疾患において検証する
潰瘍性大腸炎およびクローン病の手術組織、生検標本を用い、炎症消化管粘膜で発現変化が見られた
糖鎖の生合成に関わる分子、Wnt/Notch シグナル関連分子とその強度を調節するチューニング分子、エ
ピゲノム修飾編集因子の発現と炎症の重症度、dysplasia や癌合併との相関を解析した結果、潰瘍性大腸炎において、ムチン型糖鎖合成遺伝子 B4GALNT2 の DNA メチル化が、疾患活動度、癌合併と有意に相関し、ステロイド治療後の内視鏡的粘膜治癒と関連する傾向が認められた。現時点で前向きに解析可能であった治療介入例で、治療効果が判定出来た症例数が 8 例と少ないため、今後も本研究への症例の登録を継続して行うことで、統計学的解析においても本解析がサーベイランスマーカーとして有用であることを示すことが出来ると期待される。

Subject No.

：23-101

Title：A search for novel diagnostic markers and molecular targets for therapeutic

approach of inflammatory bowel disease
Researchers ：Yuki Kawamura and Toshiyuki Sakurai
Key word：inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn’s disease, Wnt/Notch signals,

lectinAbstract：

Background and Aim
Inflammatory bowel disease (IBD), such as ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD), arecharacterized by relapsing/remitting nature of the inflammatory process. While some cases with
IBD are relatively stable and controllable by means of medical treatment, we encounter manycases with recurrent deterioration of disease which necessitates intensive treatment like high doseof steroid therapy, immunosuppressant or even surgery. In damaged intestinal mucosa of IBD,
the mucus layer, which covers intestinal epithelial cell surface with heavily glycosylated mucin, isdeteriorated and abnormaly glycosylated. Recently, we reported that colonic immune cells
express sialic acid-binding Ig-like lectins, which recognize cell surface glycans preferentiallyexpressed in normal colonic epithelium. We have speculated that the interaction of these lectinswith these glycans might be involved in immune tolerance in the mucosal tissue. However,differential expression of these lectins and its regulation in the peripheral immune cells, as well as
their function in these cells, has been largely unknown. The goal of this project is to develop
novel surveillance markers and molecular targets for therapeutic approach of IBD. The specific
aim of this study is to clarify whether these lectin expressions of peripheral blood mononuclear
cells may reflect the condition of damaged/unhealed mucosa with abnormal glycosylation, andmoreover, predict exacerbation of the disease.

1. A search for novel diagnostic and surveillance markers for IBD
Methods and Results
In inflamed mucosa, the aberrant glycosylation on epithelial cells was observed, including theloss of 6-sulfo-Lewis x carbohydrate antigen, which is abundantly expressed in normal
gastrointestinal mucosa. Since innate immune cells express sialic acid-binding Ig-like lectinsthat can recognize cell surface glycans preferentially expressed in normal colonic epithelium,
we examined the expression of these lectins in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) byflow cytometric analysis. We isolated PBMCs from 63 IBD patients (22 CD and 41 UC) as well
as 3 patients with Behcet’s disease and 3 patients with intestinal tuberculosis as non-IBD
controls. Flow cytometric analysis revealed that the frequency of lectin-positive cells in CD33+
PBMCs isolated from UC (mean age, 47.0 years, range 20-91) and CD (mean age, 41.5 years,
range 21-57) was significantly higher than that of non-IBD subjects (mean age, 34.0 years,
range 26-54), however; there was no difference between UC and CD. High frequency oflectin-positive CD33+ cells was not observed in intestinal tuberculosis nor Behcet’s disease
blood, even at active stage. In IBD patients, the incidence of lectin-positive cells in CD33+
Researchers には、分担研究者を記載する。

PBMCs correlated with abdominal pain, but not CRP, ALB, Hb, ESR, the number of WBC,
neutrophils, and platelets. These results suggest that inflammation is not essentially parallelto the expression of lectins. In contrast, the expression of lectis in CD33+ PBMCs tended tocorrelate with pUCDAI score, which reflects disease severity, but it did not reach statisticalsignificance due to few numbers of lectin-positive patients. In fact, the incidence oflectin-positive cells in CD33+ PBMCs was decreased in some UC patients with remission after
steroid therapy, while other patients with remission have kept high frequency of lectin-positive
cells, aggravated later.
Conclusion
The emergence of lectin-positive cells in the peripheral CD33+ PBMCs reflects presence of themucosal damage in an IBD-specific manner, which may be clinically cryptic without apparent
sign of inflammation. It may predict exacerbation or relapse in IBD patients.
2. A search for novel molecular targets for therapeutic approach of IBD
Methods and Results
Using murine colitis models, it has been reported the significance of Wnt/Notch signals toregulate cell proliferation and differentiation in the regenerative process of inflamed mucosa.
In this project, we found that the expression of nemo-like kinase, which is a negative regulatorof Wnt/Notch signals, was dramatically decreased in UC mucosa as compared with that in
non-IBD colonic mucosa. Since DNA methylation of CpG islands, clustered around theregulatory region, has been shown to be associated with gene inactivation and the promoter
region of nemo-like kinase gene contains a CpG island, we examined the methylation status ofnemo-like kinase gene by bisulfite-pyrosequencing. In UC mucosa, the methylation frequencyof nemo-like kinase was significantly higher than that in non-IBD colonic mucosa. Whenhuman colon cancer cell lines were treated with 5-aza-2’-deoxycytidine, an inhibitor of DNA
methyltransferases, the transcription of nemo-like kinase was induced. In the humancolorectal cancer cell line HCT116 with genetic disruption of both DNA methyltransferase 1(DNMT1) and 3b (DNMT3b), in which genomic DNA methylation was nearly eliminated, theexpression of nemo-like kinase was rescued. These results collectively suggest that DNA
hypermethylation may contribute to gene silencing of Wnt/Notch modulators. To investigate
the relation between DNA hypermethylation-mediated gene silencing of Wnt/Notch modulators
and accelerated epithelial cell turnover during inflammation, we isolated epithelial cells frominflamed colon of patients with UC and examined the methylation status of nemo-like kinaseby pyrosequencing as well as their potential of growth in vitro 3D-culture using Matrigel. In
epithelial cells isolated from UC mucosa, the methylation frequency of nemo-like kinase wassignificantly higher than those from non-IBD colonic mucosa. In our culture condition,epithelial cells separated from UC mucosa were able to survive and proliferate, however; theaddition of 5-aza-2’-deoxycytidine inhibited this unusual potential along with the concomitantloss of the nemo-like kinase methylation.
Conclusion
Researchers には、分担研究者を記載する。

DNA hypermethylation may contribute to promotion of rapid epithelial cell turnover during
inflammation and it may be a therapeutic target of IBD.

Researchers には、分担研究者を記載する。

２３指１０１：炎症性腸疾患の新規診断マーカー及び治療標的の開発
主任研究者：河村由紀（研究所 消化器疾患研究部 消化器病態⽣理研究室）

研究の概要
炎症性腸疾患の病変組織を用いた解析
炎症による傷害上皮の増殖・分化シグナル異常（河村・土肥）炎症による上皮変化を反映す
る免疫細胞異常（河村・後藤田・櫻井俊之）

末梢血解析
末梢血における
免疫細胞異常（櫻井・小島・前屋舗）

異常を惹起するメカニズム解析

異常細胞の同定・機能解析

影響を受ける分子の機能解析

網羅的ゲノム・エピゲノム解析

病態の分子メカニズム解明

新規マーカー分子の探索

診断マーカーとしての有用性評価（河村・土肥・櫻井俊之・秋山・小島・前屋舗・櫻井恵）
臨床情報との関連性
同一患者の生検を用いた経時的・比較解析

炎症性腸疾患患者の予後改善

１．炎症性腸疾患の遷延化診断のための末梢⾎マーカーの探索対象

潰瘍性大腸炎クローン病
ベーチェット病
腸結核
健常者

3例
15例

 末梢血中のマクロファージ/樹状細胞における細胞表面マーカー(糖鎖認識レクチン)発現のフローサイトメトリー解析
 Case Report Formによる臨床情報収集と、マーカー発現との関連解析

 末梢血中のCD33+細胞における細胞表面マーカー発現は炎症性腸疾患で有意に高いが、潰瘍性大腸炎とクローン病の鑑別は困難
 CRP、ALB、Hb、ESR、⽩⾎球数、好中球数、⾎⼩板数とは相関しない
 腹痛、全⼤腸型の重症例で陽性傾向有り
 陽性例では陰性例よりも通院間隔が短く、ステロイド治療依存性・抵抗性を⽰す

解析時点での炎症程度を反映するマーカーではないが、再燃・治療応答性の予知に有益な可能性があり、前向き解析を継続予定
潰瘍性⼤腸炎3
通院間隔(⽉)

正常
マーカー

結果

41例
22例
3例

2
1
0

陰性例

陽性例

２．炎症再⽣上⽪で⾒られるWnt/Notchシグナル異常
 潰瘍性⼤腸炎組織において、Wnt/Notch両シグナルに抑制的に作⽤するレオスタット分⼦の発現は有意に低下した
 潰瘍性⼤腸炎組織において、Wnt/Notchシグナル抑制分⼦の転写制御部位におけるDNA
メチル化が有意に亢進した
 DNAメチル化阻害剤処理またはDNAメチル基転移酵素のノックダウンにより発現は回復した DNAメチル化解除、またはDNAメチル基転移酵素誘導活性を有するIL-6の中和により再⽣
上⽪の細胞増殖は抑制された

Fold expression

DNAメチル基転移酵素(DNMTs)のノックダウンによる発現回復

DNA methylation（％）

潰瘍性⼤腸炎におけるWnt/Notchシグナル破綻の分⼦機構(過剰なIL-6により誘導されたDNAメチル基転移酵素が、Wnt/Notchシグナル抑制分⼦発現を転写制
御部位のDNAメチル化亢進を介して抑制し、細胞増殖を亢進させる)を解明した。

Fold expression

結果３．サーベイランスマーカーの探索とヒト検体を⽤いた検証
切除炎症粘膜より再生上皮を分離治療前

 SAGE(Serial Analysis of Gene Expresssion)-seqによる網羅的トランスクリプトーム解析
 MeDIP-seqによる網羅的メチローム解析

治療後

ムチン型糖鎖合成
遺伝⼦のメチル化

ムチン型糖鎖合成
遺伝⼦のメチル化

26.1%

22.9%

難治例
奏効例

重症化・遷延化と相関する因子を探索
ヒト生検検体を用いて検証結果

ムチン型糖鎖合成
遺伝⼦のメチル化

ムチン型糖鎖合成
遺伝⼦のメチル化

9.1%

1.3%

 ムチン型糖鎖合成酵素遺伝⼦のDNAメチル
化が、潰瘍性⼤腸炎の疾患活動度、癌合併と有意に相関した ステロイド治療奏効例では治療後にDNAメ
チル化レベルは低下したが、不応答例では治療前後でDNA化レベルは変わらなかった
DNAメチル化異常の蓄積が発癌の⺟地となる可能性が⽰唆された⇒DNAメチル化是正は治療標的として有⽤課題番号：２３指１０１
研究課題名：炎症性腸疾患の新規診断マーカーの開発
主任研究者名 ：河村 由紀
分担研究者名 ：櫻井 俊之
キーワード ：炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、自然免疫細胞、レクチン
研究成果：
本研究では、消化管の慢性炎症性疾患である炎症性腸疾患、クローン病の新しい予後サーベイラン
スマーカーとなる分子の探索を目指している。特に、より簡便な検査法への応用が期待できる、炎症
局所で見られる変化を反映する、末梢血中のマーカーを見出すことを目的とし、臨床検体を用いた評価を行っている。消化管の炎症粘膜では上皮細胞上に発現する糖鎖変化が起こるが、この糖鎖を認識して結合するレクチン分子を自然免疫細胞（マクロファージや樹状細胞）は発現している。消化管の炎症に起因する上皮細胞側のリガンド糖鎖変化に伴い、マクロファージや樹状細胞側の受容体レクチ
ン分子の発現異常が生じているか否かを、クローン病および潰瘍性大腸炎の炎症性腸疾患症例と、対照非炎症性腸疾患患者としてベーチェット病症例対象として検討を行った。大腸粘膜組織より粘膜固有層細胞を酵素的に分離し、自然免疫担当細胞（マクロファージや樹状細胞）における糖鎖認識レク
チン分子の発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。対照非炎症性腸疾患患者の自然免疫担
当細胞における糖鎖認識レクチン分子の発現パターンと比較して、クローン病症例で発現が増強している糖鎖認識レクチン分子を見出したが、このマーカー候補分子の発現が高値となっている症例は潰瘍性大腸炎では見られなかった。続いて、我々が炎症性腸疾患病変部の粘膜固有層細胞で見出した糖鎖認識レクチン分子の発現異常が、末梢血中のマクロファージや樹状細胞においても見られるか否かを検討した。末梢血中のマクロファージや樹状細胞においては、クローン病のみならず潰瘍性大腸炎
症例においても糖鎖認識レクチン分子の発現に異常が生じていることを見出したが、当初予想していたよりも炎症性腸疾患症例におけるマーカー候補レクチン陽性者の頻度が低かったことため、研究開始後に、十分な症例数で末梢血自然免疫担当細胞における糖鎖認識レクチン分子の発現と疾患活動度を含む臨床所見との関連を詳細に検討することを目的とし、倫理委員会に変更申請を行い（予定集積症例数をクローン病 80 例、潰瘍性大腸炎 80 例に変更）、平成 24 年 6 月 14 日付けで承認された（承認番号 NCGM-A-000121-04）。また、本研究に特化した Case Report Form を作成し、統合解析のための臨床情報の収集の徹底を図った。最終的にクローン病 22 例（21-57 歳、平均年齢 41.5 歳）、潰瘍性大腸炎 41 例（20-91 歳、平均年齢 47.0 歳）の計 63 例の炎症性腸疾患症例と、対照非炎症性腸疾患症例としてベーチェット病 3 例、腸結核患者 3 例の末梢血解析を施行した。末梢血中の CD33 陽性マクロ
ファージ並びに樹状細胞における上記糖鎖認識レクチン分子の発現頻度は、健常人ボランティア（26-54
歳、平均年齢 34.0 歳）と比べて、潰瘍性大腸炎症例で 8 倍、クローン病症例で 5 倍以上有意に高かった。クローン病症例と潰瘍性大腸炎症例との間ではマーカーの発現頻度に有意差は無かった。また、
ベーチェット病および腸結核症例におけるマーカー陽性率は＜1％で、健常人ボランティアとの間にも有意差は認められなかった。以上より、本マーカーの発現ではクローン病と潰瘍性大腸炎の鑑別は困難であるが、炎症性腸疾患特異的変化であると考えられた。クローン病と潰瘍性大腸炎の鑑別に加えて、マーカー候補レクチン分子の発現と CRP 値、ALB 値、Hb 値、ESR 値、白血球数、好中球数、血小板数等の検査値、発熱、腹痛、血便の有無等の症状、直腸炎型、非直腸炎型等の病変範囲、pUCDAIで評価した臨床的重症度、ステロイド依存性やステロイド抵抗性の有無等、治療応答性や難治性について検討を行った。その結果、種々の検査値とマーカー分子の発現には相関が認められなかったことから、炎症程度のみを反映する変化ではないことが明らかとなった。一方で、腹痛有症例においてマーカー候補レクチン分子の発現は有意に高く、重症例が少ないため有意差は無かったが病変範囲では全大腸炎型、pUCDAI 評価で重症例においてマーカー分子の発現が高い傾向が見られた。健常人におけるマーカー候補レクチン分子の平均陽性率をカットオフ値としてマーカー陽性例と陰性例に分類した場合、陰性例と比較して陽性例の通院間隔が短く、ステロイド治療に依存性または抵抗性を示すことが明らかとなった。以上より、本マーカー発現が再燃の予知、治療反応性の予知に有用である可能性が示唆された。今後も本研究への症例の登録と、前向き解析登録症例の経過追跡を継続して行うことで、統計学的解析においても本マーカーの有用性を示すことが出来ると考えている。炎症性腸疾患の再燃・治療反応性の予知マーカーとしての糖鎖認識レクチン分子の評価結果については、協力研究者の前屋舗（旧姓 平野）が第 99 回日本消化器病学会総会で報告した。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：

２３指１０１

研究課題名： 炎症性腸疾患の新規診断マーカー及び治療標的の開発
主任研究者名：

河村

由紀

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Yuuki Obata,
Yukihiro
Furusawa,
Takaho A Endo,
Jafar Sharif,
Daisuke
Takahashi,
Koji Atarashi,
ManabuNakayama,
Satoshi Onawa,
YumikoFujimura,
Masumi
The epigenetic regulator Uhrf1
Takahashi,
facilitates the proliferation andNature Immunology Vol.15 No.6
Tomokatsu
maturation of colonic regulatory T cells
Ikawa, Takeshi
Otsubo, Yuki
I. Kawamura,Taeko Dohi,
Shoji Tajima,
Hiroshi
Masumoto,
Osamu Ohara,
Kenya Honda,
Shohei Hori,
Hiroshi Ohno,
Haruhiko
Koseki andKoji Hase

2014年

Kyoko InagakiOhara, H
Mayuzumi, S
Kato, Y
Enhancement of leptin receptor signaling Minokoshi,
Oncogeneby SOCS3 deficiency induces development Takeshi
Otsubo, Yuki
of gastric tumors in mice
I. Kawamura,Taeko Dohi, G
Matsumoto andA Yoshimura

2014年

Vol.33 No.1

研究発表及び特許取得報告について

Kenta Iijima,
Noriyuki
Okudaira,
Masato Tamura,
Akihiro Doi,
Yoshikazu
Saito, Mari
Shimura,Motohito Goto,
AkihiroMatsunaga,
Yuki I.
Kawamura,
Takeshi
Viral protein R of human
Otsubo, Taeko
immunodeficiency virus type-1 induces
Dohi, Ahigeki
Retrovirology
retrotransposition of long interspersed Hoshino,element-1
Shigeyuki
Kano, Shotaro
Hagiwara,
Junko Tanuma,
HiroyukiGatanaga,
Masanori Baba,
Taku Iguchi,
MotokoYanagita,
Shinichi Oka,
TadashiOkamura and
YukihitoIshizakaVol.10

2013年

Keiko
Miyazaki,Keiichiro
Sakuma, Yuki
I. Kawamura,
Mineko Izawa,
Katsuyuki
Colonic epithelial cells expressOhmori,
specific ligands for mucosal macrophage Motoaki
J Immunol
immunosuppressive receptors siglec-7 and Mitsuki,-9
Toshiyuki
Yamaji,
Yasuhiro
Hashimoto,Akemi Suzuki,
Yukio Saito,
Taeko Dohi and
Reiji Kannagi

Vol.188 No.9

2012年

研究発表及び特許取得報告について

The monoclonal antibody HCM31
specifically recognizes the Sda
tetrasaccharide in goblet cell mucin

Daigo
Tubokawa,Yukin
obu Goso, Rei
Kawashima,
Hiroyoshi Ota,
TakeshiNakamura,
Kazuo
Nakamura,
Noriko Sato,
FEBS Open Bio
MakotoKurihara,
Taeko Dohi,
Yuki I.
Kawamura,
Takafumi
Ichikawa andKazuhiko
Ishihara

Rei Kawashima,
Yuki I.
Kawamura,
TomoyukiComprehensive analysis of chemokines and Oshio, Noriko
J Immunoassay
cytokines secreted in the peritoneal
Mizutani,
Immunochem
cavity during laparotomy
Toshihiko
Okada, Yutaka
J. Kawamura,
Fumio Konishi
and Taeko Dohi
潰瘍性大腸炎と糖鎖不全現象

河村由紀
土肥多惠子

日本臨床

Vol.2

2012年

Vol.33 No.3

2012年

第70号

2012年

Rei Kawashima,
Yuki I.
Kawamura,
Tomoyuki
Oshio, Aoi
Son, Motomi
Yamazaki,Teruki Hagiwara,
ToshihikoInterleukin-13 damages intestinal mucosa Okada, Kyoko
via TWEAK and Fn14 in mice - a pathway Inagaki-Ohara, Gastroenterology Vol.141 No.6
associated with ulcerative colitis
Suzanne Szak,
Yutaka J.
Kawamura,
Fumio Konishi,
Oki Miyake,
Hideaki Yano,
Yukio Saito,
Linda C.
Burkly andTaeko Dohi

2011年

研究発表及び特許取得報告について

The epithelia-specific membranetrafficking factor AP-1B controls gut
immune homeostasis in mice

Daisuke
Takahashi,
Hoji Hase,
Shunsuke
Kimura, Fubito
Nakatsu,
Masumi Ohmae,
Yasushi
Mandai, Toru
Sato, YasuhiroDate, Masashi
Ebisawa,
Gastroenterology Vol.141 No.2
Tamotsu Kato,
Yuuki Obata,Shinji Fukuda,
Yuki I.
Kawamura,
Taeko Dohi,
TatsuroKasuno, Osamu
Yokosuka,
SatoshiWaguri,
Hiroshi Ohno

2011年

学会発表
タイトル

発表者

Cell type-specific, genome-wide
epigenetic analysis for lamina propria
cells isolated from the colon withulcerative colitis

学会名

場所

大坪武史、河村
第42回日本免疫学
由紀、土肥多惠
千葉
会総会
子

年月

2013年12月

TajeshiOtusbo, Yuki
Involvement of L1 retrotransposition in I. Kawamura,murine experimental colitis-cancer model Yukihito
Ishizaka andTaeko Dohi

DDW2013

Orlando2013年5月

末梢血白血球レクチン発現は炎症性腸疾患の前屋舗千明
病勢を反映するマーカーである

第99回日本消化器
鹿児島
病学会総会

2013年3月

Genome-wide epigenetic analysis oflamina propria mononuclear cells
河村由紀
isolated from patients with inflammatory
bowel disease

第6回日米消化器病
東京学会議

2012年11月a

DNA hypermethylation of the Sdcarbohydrate synthase gene as a possible
櫻井俊之
biomarker for the prognosis ofulcerative colitis

DDW2012

San Diego, USA 2012年5月

河村由紀、豊田実、橋本真一、消化管でみられる癌性糖鎖不全とエピゲノム 萩原輝記、山崎
第20回日本病態治
異常 ワークショップ2 癌のepigeneticsと 元美、河村裕、
東京療研究会
microRNA
小西文雄、斉藤
幸夫、服部正平、土肥多惠子

2011年6月

研究発表及び特許取得報告について

IL-6, a potential inducer of DNA
hypermethylation and malignant-type
glycosylation in ulcerative colitis

Yuki I.
Kawamura,
Minoru Toyota,
Teruki
Hagiwara,
Hiromu Suzuki,
MotomiYamazaki,
DDW2011
Toshihiko
Okada, Yutaka
J. Kawamura,
Fumio Konishi,
Hideaki Yano,
Yukio Saito,
and Taeko Dohi

Chicago, USA

2011年5月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(

発明名称)記載のこと。
登録番号該当なし※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国