，博士′゛（水産学）工．′藤秀明

学位論文題名Biochemical and molecular biological studies on.theolfactory system of several salmonid specles.
（サ ケ科 魚類 嗅神 経系の生化学的・分子生物学的研究）

学位論文内容の要旨
降海 性サ ケ科 魚類 は、 稚魚 期に 河川 に放 流され ると その 川を記憶（母川記銘）
し て降 海し 、海 洋を 数年 間回 遊し た後 、産 卵のた め放 流さ れた川に回帰（母川回帰 ）す るこ とか ら、 我が 国水 産増 殖上 の有 用対象 魚の ーつ になっている。特にシロサケ（Oncorhynch us keta）の人工孵化放流事業は産業的に成功をおさめている。
近年、より付加価値の高いべニザケ（〇． nerka）およびサクラマス（〇．masou）の放 流 事 業 が 試験 的に 試み られ てい るが 、こ れら の種 は1年 以上 の淡 水生 活を へた
後 に降海するこ、とから、効率のよい放流法の確立が望まれており、サケ科魚類の母川記銘と母川回帰機構の解明が重要な課題になっている。
サケ の母 川回 帰時 の母 川水 識別 には 母川 水の「 匂い 」が 関与し、それを感知す
る 嗅神 経系 （嗅 上皮 、嗅 神経 およ び嗅 球） が重要 な役 割を 果たしていることが行動 学的 およ ぴ電 気生 理学 的研 究に より 示唆 されて きた 。し かし、嗅神経系が実際に どの よう な機 序で 母川 記銘 と母 川識 別に 関与し てい るか は殆ど解明されておらず 、特 に、 分子 レベ ルで 嗅神 経系 の生 化学 的およ び分 子生 物学的解明を試みた研究は殆どない。
本研 究で iま 、将来 の放 流技 術ヘ応用可能な嗅神経系内の分子の検索のための基礎的知見を得ることを目的とし、3種のサケ科魚類（〇． keta，〇．nerka，〇．masou）を 用い 、嗅 神経 系に 特異 的に 存在する甲状腺ホルモンレセプター（THR）、サケ型生 殖腺 刺激 ホル モン 放出 ホル モン（sGnRH）およびサケ科魚類嗅神経組織特異蛋白（N24）の3種類の分子に注目し、それらの母川記銘と母川回帰に伴う変化を形態学 的 手 法 に 基 づ ぃ て 生 化 学 的 お よ び 分 子生 物 学 的 に 解析 し た 。
サケ科魚類の降海行動時前すなわち銀化変態時には、血中甲状腺ホルモン（T4）が増加し、降海直前には著増することが知られている。これらの変化は、海水適応能の獲得や体表の銀白化、降海行動およぴ母川記銘などに関与することが示唆されているがその詳細は不明である。血中T4は標的細胞に到達すると活性型の甲状腺ホルモン（T3）に転換され核内レセプターに結合することにより作用することから、銀化変態に伴う天然サクラマスの嗅神経組織と脳におけるTHRの局在性と結合能を新たに開発した放射標識T3を用いた組織切片上でのラジオレセプター
アッセイ法により調べた。その結果、各組織の切片上でT3の特異的結合がみられ、高親和性（Kd￣3.86x10，10）で一種類の結合部位を持つTHRの存在が確認された。
さらに、嗅上皮は嗅球を含む脳の他の部位よりT3結合性が高いこと、および銀化変態に伴い降海直前のフルスモルト個体の嗅上皮でT3結合量が急増していることが明らかとなった。これらのことから、降海時のサクラマス嗅上皮でTHRが嗅覚機 能 に 関連 し た 重 要な 役 割 を 演じ て い る 可能 性 が 示 された 。
sGnRHは 視床 下部以外に嗅覚の一次中枢である嗅球にも局在すること、またsGnRH産生細胞が発生学的に嗅上皮原基由来であることから、嗅覚機能に関与して いる こと が示唆 され てい る。 そこで 2種のサ ケ科 魚類 の嗅 神経系 にお ける
sGnRHの局在と動態を機能形態学的に調べた。その結果、サクラマスの嗅上皮と嗅球の軸索に高電子密度のsGnRH含有顆粒状構造物が存在することを免疫電顕法により観察し、sGnRHが実際に嗅上皮にも軸索を介して輸送されていること、および嗅神経背面部に新たなsGnRH産生神経細胞が存在することをはじめて明らかにした。産卵回遊に伴うシロサケのsGnRH産生神経細胞の変化を免疫細胞学的手法と血situハイブリダイゼーション法により調べた結果、嗅神経背面部のsGnRH
産 生 神 経 細 胞 は 母 川接 岸 時 ま で sGnRH前駆 体mRNAの 発現と sGnRHの 産生 が認められるが、母川遡上後には両方法とも検出不能となりsGnRH産生が停止していることが示され、sGnRHが母川回帰時の嗅覚機能に神経修飾物質として関与している可能性が示唆された。―方｀視索前野および終脳のsGn
RH産生神経細胞は母川遡上 後に発現が高まり、従来から指摘されているsGn
RHの機能である脳下垂体からの生殖腺刺激ホルモン放出に関与している可能性が示唆され、生殖腺の最終成熟に作用していると推察された。しかし、嗅覚機能と性成熟機能に各々関与するsGn
RHの物質的異同は明らかにされなかった。
電気泳動法によルヒメマス嗅神経組織から見つけられたN24に対する抗血清は、他のサケ科魚類とも免疫交差性を有し、母川記銘と母川回帰時に免疫性が増加すること が明らかにされている。そこでN24のより詳細な局在性を免疫細胞化学的に調べ た結果、N24は嗅上皮の嗅細胞の核周辺部と頂上部側の細胞質および嗅細胞基底部側から伸長する軸索に存在することが、嗅球では嗅神経が入り込む糸球体層までの軸索に存在することが明らかになった。ヒメマス初期発生に伴う解析
では、 嗅上皮原基中で嗅細胞の形態形成が確認された時期以降にN24が出現し、その後 増加することが明らかにされた。シロサケ母川回帰に伴うN24の免疫細胞学的反応性は、北洋での索餌回遊中に強く、産卵回遊および母川識別時にtま雌雄差が存 在する可能性が示唆された。さらに嗅上皮摘除実験によりN24の産生部位が 嗅細 胞 であ る こと 、 摘除 後 嗅球内のN24免疫性の 消失時間よ りN24は嗅 覚情報の伝達に関与する神経修飾物質として作用している可能性が示唆された。次に、嗅神経 組織におけ るN24の性 状を生化学 的に調ぺた結果、N24はサイトゾール画分中に存在し、ゲル濾過法により分子量約43.
3kDaのホモ二量体であることが明ら かに な った 。 N24の 一次 構 造解 析 を行 う ため に 、ま ず N24を抗 N
24抗体を 用いた免 疫アフイニ テイークロ マトグラフ イーとHPLCによる逆相クロマトグラフ
イーにより蛋白精製を行い、その後、リジルエンドベプチターゼ消化によるべプチド断 片を得てN24アミノ酸 内部配列と N末端配列を気相プロテインシークエンサーにより決定した。得られたアミノ酸一次構造の情報を元に作製したプライマー を用 い てヒ メ マス 嗅 上皮 cDN
Aを 鋳型 に した PCR
法 に より N24 cD
NA断 片を得て、N24の部分塩基配列を決定した。その塩基配列と既知の物質との相同性をデータベースにより検索した結果、グルタチオンS．トランスフェラーゼ（GST）クラス ″ と ぃう 、 近年 嗅 覚 との 関 連 が示され ている生 体内転換 （薬物代 謝）酵素 の一種 と 高 い相 同 性を 有 す るこ と が 示さ れ た。 さ ら に、 同 酵素 の 性質 を利用し たGST
ア フイニテイ一一・クロマトグラフイーにより精製される蛋白質のうち約24kDaの蛋白 質 と 抗 N24抗 血 清 が 免 疫 交 差 反 応 を 示 す こ と か ら 、 N24は GSTと し て の 酵 素
活 性 を 持 っ こ と が 示 唆さ れ た。 ま た 、N24cDNA断 片 をプ ロ ー ブに 用 いた ノ ー ザン プ ロ ッ ト 解 析 に よ り、 ヒ メマ ス 嗅 上皮 と 嗅球 に お ける N24mRNAの 発現 を 調 べた 結 果 、嗅 上 皮の み で 約950baseのバ ンドとして 発現が認 められた 。これら のこと か ら 、 N24は嗅 細 胞 にお い てGST活 性 を利 用 した 匂 い 物質 の 体 外へ の 排出 な どの 生 体 内 転 換 酵 素 と し て 嗅 覚 機 能 に 強 く 関 わ る可 能 性が 示 され た 。
以 上の 結 果 から 、 サケ 科 魚 類嗅 神 経系 に お いて THRは特 に 銀 化変態と 降海行動
時 の 嗅 覚 機 能 に 、 sGnRHは 神経 修 飾 物質 と し て母 川 回帰 時 の 嗅覚 機 能に 、 N24は生 体 内 転換 酵 素と し て 嗅覚 機 能 に関与し ている分 子である ことが示 唆された 。しか し 、 これ ら 3分 子の 詳 細 な嗅 情 報伝 達 機 構に つ い ては 今 後の 課題 として残 された 。 ま た、 新 たな 手 法 によ る 匂 いの記憶 などに関 わる分子 の検索が サケ科魚 類の母 川 記銘 と 母 川回 帰 機構 を 解明 す る上 で 重要 な 課題 に なる と考 えられた。

学 位 論 文 審 査の 要 旨
主 査 教
授 山 内 晧 平
授 麦 谷 泰 雄
副 査 教教 授彦
副 査 教
授 原 田 彰 宏師 上 立
副 査 助
次伸
副 査 講
足学 位 論 文 題 名Biochemical and molecular biological studies on theolfactory system of several salmonid species.
（ サケ 科魚 類嗅 神経系の生化学的・分子生物学的研究）

降 海性 サケ 科魚類 は、 稚魚 期に 河川に放流されるとその川を記憶（母川記銘）して降 海し 、海 洋を数 年間 回遊 した 後、産卵のため放流された川に回帰（母川回帰）する こと から 、我が 国水 産増 殖上 の有用対象魚のーつになっている。特にシロサケの人 工孵 化放 流事業 は産 業的 に成 功をおさめている。近年、付加価値の高いべニザケ お よ び サ ク ラ マ ス の 放 流 事 業 が 試 験 的 に 試 み ら れ て い る が 、 こ れ ら の 種 は 1年 以
上の 淡水 生活 をへた 後に 降海 する ことから、効率のよい放流法の確立が望まれており 、 サ ケ科 魚 類 の 母 川 記 銘 と 母 川 回 帰 機 構 の 解 明 が 重 要 な 課 題 にな っ て い る。
サ ケの 母川 回帰時 の母 川水 識別 には「匂い」が関与し、それを感知する嗅神経系が重 要な 役割 を果た して いる こと が行動学的およぴ電気生理学的研究により示唆されて きた 。し かし、 嗅神 経系 が実 際にどのような機序で母川記銘と母川識別に関与して いる かは 殆ど解 明さ れて おら ず、特に、分子レベルで嗅神経系の生化学的および 分 子 生 物 学 的 解 明 を 試 み た 研 究 tま 殆 ど な い 。 ．
本 研究 では 、放流 技術 へ応 用可 能な嗅神経系内の分子の検索のための基礎的知見を得 るこ とを 目的と し、 嗅神 経系 に特異的に存在する甲状腺ホルモンレセプター（THR） 、 サ ケ 型 生 殖 腺 刺 激 ホ ル モ ン 放 出 ホ ル モ ン （ sGnRH） お よ び サ ケ 科 魚 類 嗅 神 経組 織 特 異 蛋 白 （ N24） の 3分 子 に 注 目 し 、 そ れ ら の 母 川 記 銘 と 母 川 回 帰 に 伴 う 変 化を生化学的および分子生物学的に解析した。．
サ ケ 科 魚 類 の 降 海 行 動 時 前 す な わ ち 銀 化 変 態 時 に は 、 血 中 甲 状腺 ホル モン 、 （T4）が 増 加 し 、 降 海 直 前 に は 著 増 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 血 中 T4は 標 的 細 胞 に 到 達
す る と 活 性 型 の 甲 状 腺 ホ 少 モ ン （ T3） に 転 換 さ れ 核 内 レ セ プ タ ー に 結 合 す る こ とによ り作 用す ること から 、銀 化変 態に伴う天然サクラマスの嗅神経組織と脳における THRの 局 在 性 と 結 合 能 を 新 た に 開 発 し た 放 射 標 識 T3を 用 い た 組 織 切 片 上 で の ラジ オ レ セ プ タ ー ア ッ セ イ 法 に よ り 調 べ た 。 そ の 結 果 、 各 組 織 の 切 片 上 で T3の 特 異的 結 合 が み ら れ 、 高 親 和 性 で 一 種 類 の 結 合 部 位 を 持 つ THRの 存 在 が 確 認 さ れ た さ

らに、嗅上皮は嗅球を含む脳の他の部位よ りT3結合性が高いこと、および銀化変態に伴い降海直前の個体の嗅上皮でT3結合量が急増していることが明らかとなった。これらのことから、降海時のサクラマス嗅上皮でTHRが嗅覚機能に関連した重要な役割を演じている可能性が示された。
sGnRHは嗅覚の一次中枢である嗅球にも局在すること、またsGnRH産生細胞が発生学的に嗅上皮原基由来であることから、嗅覚機能に関与していることが示唆され ている。そこでサケ科魚類の嗅神経系におけるsGnRHの局在と動態を機能形態 学的に調ぺた。その結果、サクラマスにおいてsGnRHが実際に嗅上皮にも軸索 を介して輸送されていること、および嗅神経背面部に新たなsGnRH産生神経細 胞が存 在す るこ とを はじめ て明 らかにした。産卵回遊に伴うシロサケのsGnRH産生神経細胞の変化を免疫細胞学的手法とin situハイブリダイゼーション法 により調べた結果、嗅神経背面部のsGnRH産生神経細胞は母川接岸時までsGnRH前駆 体 mRNAの 発 現 と sGn.RHの産 生 が 認 め ら れ る が 、母川 遡上 後に は両方 法とも 検出 不能 とな りsGnRH産生が停止していることが示され、sGnRHが母川回帰時の嗅覚機能に神経修飾物質として関与している可能性が示唆された。
ヒメマス嗅神経組織から見つけられたN24に対する抗血清iま他のサケ科魚類とも免疫交差性を有し、母川記銘と母川回帰時に免疫性が増加することが明らかにさ れてき た。 そこ でN24の 詳細 な局在 性を 免疫 細胞 化学的 に調 べた結果、
N24は嗅上皮の嗅細胞の細胞質および基底下の軸索に存在することが、嗅球では嗅神経が入り込む糸球体層までに存在することが明らかになった。シロサケ母川回 帰に伴うN24量の変化は、雌雄差が存在することが示唆された。さらに嗅上皮 摘除実 験に より N24の産 生部 位が嗅細胞であること、およびN24は嗅覚情報の伝達に関与する神経修飾物質として作用していることが示唆された。次に嗅・神経組織におけるN24の性状を生化学的に調べた結果、N24はサイトゾーJレ画分中に存在し、分子量約43.3 kDaのホモ二量体であることが明らかになった。
N24の一 次構 造解 析を行 うた めに 、まずN24の蛋白精製を行い、その後酵素消化に よるベプチド断片を得てN24アミノ酸配列の一部を決定した。得られた情報 を 元に ヒ メ マ ス 嗅 上 皮 cDNAを 鋳 型に し た PCR法 に よ り N24 cDNA断 片を 得て、 N24の部分塩基配列を決定した。その塩基配列は既知の物質との相同性か
ら、グルタチオンS・トランスフウラーゼ（GST）汀という、近年嗅覚との関連が示されている生体内転換酵素の一種であることが示された。さらに、同酵素の性質を 利用したGSTアフイニテイークロマトグラフイーにより精製される蛋白質の う ち約 24 kDaの 蛋 白 質 と 抗 N24抗血 清 が 免 疫 交 差 反 応 を示す こと から 、N24は GSTと し て の 酵 素 活性 を持 つこ とが示 唆さ れた 。こ れらの こと から 、N24は嗅 細胞 にお いてGST活性を 利用 した嗅覚機能に強く関わる可能性が示された。
以 上の結果から、サケ科魚類嗅神経系においてTHRは特に銀化変態と降海行動時 の嗅覚 機能 に、 sGnRHは 神経 修飾物 質と して 母川 回帰時 の嗅 覚機能に、
N24は 生体 内 転 換 酵 素 と し て 嗅 覚 機能 に 関 与 し て い る こ とが示 唆さ れた 。
上述のように、本研究では、降海性サケ科魚類の嗅神経系に特異的存在する3種類の分子のサケの回遊に伴う挙動を世界で初めて解析し、これらの分子が有用な嗅覚指標物質であることを示した。これらの結果は、降海性サケ科魚類の母川記銘および母川回帰を嗅覚機能から解明するために極めて重要な知見を提供したものとして高く評価され、本論文が博士（水産学）の学位請求論文として相当の業績であると認定した。