主任研研究者、H26年
年度、中間報
報告
課題番
番号：225指105
研究課
課題名：膠原病におけ膠る、ＡＣＥ2阻阻害病態の分析
析と治療法開発
発、および抗抗ＧＡＢＡ受容容体抗体による診断法の開発
発主任研
研究者名 ：三三森明夫
キーワ
ワード ：抗抗 ACE2 抗体
研究成
成果：下下記1.

SSLE 患者の血清と髄液液中に、抗 G
GABA 受容体体 b 抗体がが出現するこことを論文掲掲載した：T
Tsuchiya H, Haga
HS, Takahhashi Y, Ishizzaka Y, Mimoori A: Identifiication of novvel autoantibodies toGABA
A-B receptorrs in patientss with neuroopsychiatric systemicslupu
us erythemato
tosus. Rheum
matolgy(Oxfoord) 2014 Mar
M 4. [Epub ahhead of print]]

2. 肺
肺高血圧症など血管病態に対する抗 ACE2 阻害抗抗体の、強皮皮症、MCTD
D における出出現頻度、病病態との相関関を検討した
た。
【背景景】我々は、、SLE・強皮皮症/SSc・MCCTD の血管病病態（肺動脈脈性肺高血圧圧症 PAH、末末端壊死）と相関する抗抗 angiotensiin 変換酵素 2/ACE2 抗体体を見出し、また SLE 活活動期に抗 ACE2害抗体陽性ををみること、ACE2 阻害害抗体のみが血管病態と相相関することた。今非阻害とを報告した
回、強強皮症/SSc、MCTD で抗抗 ACE2 阻害害抗体と血管管病態の相関を検討した。
。SSc は、活活動性を明確確に定義しににくく、ステテロイド治療療する機会もも少ない。SSSc, MCTD のの診療においいて、血管病病態（PAH, 末端壊死）は、現在進進行形というよりも既往往症として出出会うことが多い。
そこでで今回、SScc, MCTD 患者で検討症例
患、血管病態ああり 12 人（（新規 5、既報報 7）、例を増やし、なし（40 人）について、抗 ACE2 抗体、、抗 ACE2 阻害抗体の出阻出現頻度を評評価した。
【方法】患者血清の抗ACE22-ELISA 測定定、および血血清 IgG
G 分画を抽出出し、1μg 添
加で in vitroACE22 活性（基質質APK-Dnp、EENZO）へののMca-A阻害 効果を調べべた（健常者者添加との比較
較：3 回測定定IgG 添t 検定定）。
【 結 果 】 IgG 分 画 に よ る
ACE22 活性の有意意な低下が、PAH 、末端端壊死にみらられ（6 人/11 人で阻害ああり）、うち 4 人で大幅なな阻害（対照照の 5〜25%%への低下） を示した。収縮性血管病態のない 19 人の血清
清 IgG
は、すすべて ACE2 活性を阻害害しなかったた（PowerPoint 図）。
【結論論】既報 SLLE での検討
討と同様、強皮血管病態の血血清に、ACCE2 阻皮症・MCTD の収縮性血害自己己抗体の存在在が示唆されれる。

Inhibitory serum autoantibodies to angiotensin converting enzyme 2 in patients withscleroderma or MCTD having pulmonary hypertension or digital necrosis[Backgrounds] We have reported serum autoantibodies to angiotensin converting enzyme 2 (ACE2)in patients with rheumatic diseases and pulmonary arterial hypertension (PAH) or digital necrosis. In
this study, we estimated in vitro ACE2-inhibition by serum IgG from patients with MCTD or
systemic sclerosis (SSc).
[Methods] Anti-ACE2 antibody-ELISA: Serum from patients with MCTD or SSc including 12vasculopathy patients (5 PAH-, 2 SSc renal crisis-, 4 digital necrosis-cases), and 40 non-vasulopathy
patients were studied. Inhibition assay for in vitro ACE2 by purified IgG fraction from patients’serum. ACE2 activity under co-incubation with 1 mcg IgG fraction from each patient was assayedusing substrate Mca-APK-Dnp. Triplicate assay compared with control data was evaluatedstatistically by t-tests.
[Results] Significant inihibition of ACE2 activity by IgG was shown in 6 (3 PAH, 3 digital necrosis)
out of the 11 vasculopathy pts, and four of the patients showed 5-25% of the control ACE2 activity.
Anti-ACE2-ELISA titer was positive in 7 out of 12 vasculopathy patients having PAH or digitalnecrosis. One SSc patient having the history of renal crisis seven years ago showed negative serumanti-ACE2-antibodies. None of the IgG fractions from non-vasculopathy patients showed ACE2inhibition.
[Conclusion] Patients with constrictive vasuculopathy and SSc or MCTD have inhibitory serum
autoantibodies to ACE2.

25 指 105
「膠原病における、ACE2 阻害病態の分析と治療法開発、および抗 GABA 受容体抗体による診断法の開発」

代表

三森明夫

H26 年度研究報告
特許取得

なし

英文論文

以下

1. Tsuchiya H, Haga S, Takahashi Y, Ishizaka Y, Mimori A: Identification of novelautoantibodies to GABA-B receptors in patients with neuropsychiatric systemic lupus
erythematosus. Rheumatolgy (Oxford) 2014 Mar 4. [Epub ahead of print]
2. Ueda Y, Tomoe H, Takahashi H, Takahashi Y, Yamashita H, Kaneko H, Kano T, Mimori A:Interstitial cystitis associated with primary Sjögren’s syndrome successfully treated with a
combination of tacrolimus and corticosteroid: A case report and literature review. ModRheumatol 2014 Apr 11. [Epub ahead of print]
3. Yamashita H, Ito A, Tsuchiya H, Mimori A: Chronic active Epstein-Barr virus infection
mimicking autoimmune hepatitis exacerbation in a patient with systemic lupus
erythematosus. Lupus 2014 Mar 7. [Epub ahead of print]
4. Muto G, Yamashita H, Takahashi Y, Miyata Y, Morooka M, Minamimoto R, Kubota K,Kaneko H, Kano T, Mimori A: Large vessel vasculitis in elderly patients: early diagnosis
and steroid-response evaluation with FDG-PET/CT and contrast-enhanced CT. Rheumatol
Int. 2014 Mar 19. [Epub ahead of print]
5. Takahashi H, Yamashita H, Morooka M, Kubota K, Takahashi Y, Kaneko H, Kano T,Mimori A: The utility of FDG-PET/CT and other imaging techniques in the evaluation of
IgG4-related disease. Joint Bone Spine 2014 Feb 22. pii: S1297-319X(14)00031-1. doi:
10.1016/j.jbspin
6. Yamashita H, Takahashi Y, Kaneko H, Kano T, Mimori A: A patient with diffuse cutaneous
systemic sclerosis complicated by antineutrophil-cytoplasmic- antibody-associated vasculitis
showing honeycomb lung without volume loss. Int Med 2014;53(7):801-4
7. Yamashita H, Takahashi H, Kubota K, Ueda T, Ozaki T, Yorifuji H, Bannai E, Minamimoto,R, Morooka M, Miyata Y, Okazaki M, Takahashi Y, Kaneko H, Kano T, Mimori A:
Utility of fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography for early
diagnosis and evaluation of disease activity of relapsing polychondritis: a case series andliterature review.

Rheumatology (Oxford) 2014 Mar 27. [Epub ahead of print]

8. Bannai E, Yamashita H, Kaneko S, Ueda Y, Ozaki T, Tsuchiya H, Takahashi Y, Kaneko H,Kano T, Mimori A:

Successful tocilizumab therapy in seven patients with refractory

adult-onset Still's disease. Mod Rheumatol 2014 Apr 3. [Epub ahead of print]
9. Tsuchiya H, Tsuno H, Kaneko S, Yamashita H, Takahashi Y, Kano T, Mimori A:

Completeatrioventricular block and aseptic meningitis in a patient with adult-onset Still's disease andconcurrent hemophagocytic syndrome.

Mod Rheumatol. 2014 Feb 18. [Epub ahead ofprint]
10. Tsuchiya H, Tsuno H, Inoue M, Takahashi Y, Yamashita H, Kaneko H, Kano T, Mimori A:
Mycophenolate mofetil therapy for rapidly progressive interstitial lung disease in a patientwith clinically amyopathic dermatomyositis. Mod Rheumatol. 2014 Feb 7. [Epub ahead ofprint]
11. Yoshida Y, Takahashi Y, Yamashita H, Kano T, Mimori A: The incidence of
methotrexate-related lymphoproliferative disorders in RA patients. Mod Rheumatol 2014Feb 5. [Epub ahead of print]
12. Washio M, Fujii T, Kuwana M, Kawaguchi Y, Mimori A, Horiuchi T, Tada Y, Takahashi H,Mimori T; Japan MCTD study group. Lifestyle and other related factors for the developmentof mixed connective tissue disease among Japanese females in comparison with systemiclupus erythematosus. Mod Rheumatol. 2014 Feb 5. [Epub ahead of print]
13. Ueda Y, Yamashita H, Takahashi Y, Kaneko H, Kano T, Mimori A: Refractory
hemophagocytic syndrome in systemic lupus erythematosus successfully treated withintermittent intravenous cyclophosphamide: three case reports and literature review. ClinRheumatol. 2014, 33(2):281-6.
14. Ito K, Minamimoto R, Yamashita H, Morooka M, Okasaki M, Mimori A, Kubota K:
18F-FDG PET/CT findings preceded elevation of serum proteinase 3 antineutrophil
cytoplasmic antibodies in Wegener granulomatosis. Clin Nucl Med. 2014 Jan;39(1):e67-8.
15. Yamashita H, Ueda Y, Ozaki T, Tsuchiya H, Takahashi Y, Kaneko H, Kano T, Mimori A:
Characteristics of 10 patients with paraneoplastic rheumatologic musculoskeletal
manifestations. Mod Rheumatol. 2014 May;24(3):492-8

Free- Style系で発現hACE2タンパクを抗原としたELISA：
患者血清のELISA値、および血清IgG分画によるin vitro ACE2活性への効果：＋阻害あり、ー阻害なし
P = 0.03

P = 0.07
1.2
10.8
0.6
0.4
0.2
001

MCTD

皮膚潰瘍
肺高血圧症

あり
4人
（0.70±0.3）

阻害活性低下

3/4人

2なし
12人
（0.36±0.2）
0/12人

3強皮症 4あり8人（0.65±0.35 ）なし
28人（0.2±0.13）

3/7人

0/7人

5血管病態患者血清IgG分画による、in vitro ACE2活性の抑制：
蛍光基質により酵素反応を時系列測定
吸光度 (RFU)（データの一部を呈示）

50000
45000

健常者
対照 SSc40000

SSc 皮膚潰瘍が35000

冬季のみ出現

30000
25000

IgGなし

20000
15000
10000

reference5000

SSc PH（ΔPG 50）
0151015202530354045

1150

55

60 （ min）

6年前に腎クリーゼ

分担研究者報告
課題番号：25指105
研究課題名：膠原病における、ＡＣＥ2阻害病態の分析と治療法開発、および抗ＧＡＢＡ受容体抗体による診断法の開発

主任研究者名 ：三森明夫
分担研究者名 ：石坂幸人
キーワード ：抗 ACE2 抗体
研究成果：下記【背景と目的】我々は、血管保護因子である Angiotensin converting enzyme 2（ACE2）に対する自己抗体を同定し報告した（Takahashi et al., Arthritis Res Ther, 2010;12(3):R85）。抗 ACE2 抗体は、膠原病（SLE、強皮症、MCTD）の収縮性血管病態（肺動脈性肺高血圧症/PAH、末端壊死）患者において、非血管病態の患者に比べ有意に高値を示した。さらに収縮性血管病態患者が有する抗 ACE2 抗体の中には、ACE2に対し中和活性を示す抗体が存在した。そこで本研究では、抗 ACE2 抗体が病因性抗体として作用するか否かを動物モデルで評価するため、抗 ACE2 抗体を作製した。
【方法】
ヘマグルチニンを付加した rat ACE2 タンパク質を発現する cDNA を 3 匹の Wister rat に直接皮下投与し免疫した。血中抗体価の上昇の有無を検定するため、DNA 免疫後６週間目に血清を採取し、ACE2 タンパク質を一過的に強制発現させた HEK293T 細胞に作用させた後、フローサイトメトリー解析を行った。次に得られたクローンのうち特に ACE2 への反応性が高かったクローンについて限界希釈によるクローニングを行った。さらに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて、ACE2 タンパク質に対する中和活性の有無を評価した。
【結果】
2 回のスクリーニングを経て最終的に 3 クローンが、コントロールとして用いた市販の ACE2 抗体よりも、ACE2 に対して高い
市販 ACE2 抗体親和性を示した（図 1）。
図 1. ラット ACE2 中和抗体の作製。HEK293T 細胞に強制発現させたラット ACE2 タ
さらに HPLC による ACE2ンパク質に抗血清を反応させ、タンパク質に反応性を示す抗体をスクリーニングした。コントロール：市販 ACE2 抗体。コントロールと同様にシグナルのシフトが起こ活性の測定の結果、クロり、抗体が反応したことが分かる。
ーン No.A41 が、リコンビ
ナント ACE2 と混合することで、濃度依存的に ACE2に対し中和活性を示した。即ち、最も高濃度の IgGと ACE2 を反応させた時（モル比、ACE2:IgG = 1:100）、コントロール IgG 添加時では、ACE2 活性が 36.3%だったのに対し、クローン No.A41 由来 IgG を添加すると、23.3％にまで低下した（図 2）。しかしながら、他の 2 クローンについては、中和活性は認められなかった。
今後は、クローン No.A41 を大量精製し、ラットへの投与を行い、血管病態が惹起されるか検証する。

コントロール IgG

No. A41

図 2. リコンビナント ACE2 に対する中和活性クローン No.A41 から精製した IgG は濃度依存的にACE2 活性を阻害した。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：25指105
研究課題名：膠原病における、ＡＣＥ2阻害病態の分析と治療法開発、および抗ＧＡＢＡ受容体抗体による診断法の開発
主任研究者名：三森明夫

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Identification of novel autoantibodies
to GABAB receptors in patients withneuropsychiatric systemic lupus
erythematosus.

Tsuchiya H,
Haga S,
Takahashi Y,
Kano T,
Ishizaka Y,
Akio Mimori A

Rheumatolog

53:1219-28

2014

発表者

学会名

場所

年月

発表者

発表先

場所

年月日

学会発表
タイトル
該当なし

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル
該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国