藻類 Jpn. J. Phycol. (Sôrui) 61: 149-153, Nobember 10, 2013149

rbcL 遺伝子に働く自然選択とルビスコの適応進化
加藤
藻類を含め，植物の系統分類研究者にとって “rbcL 遺伝子” は最も馴染みの深い DNA 領域の一つだろう。rbcL 遺伝子は，植物の光合成反応の最初のステップである炭酸固定反将

速度の上限とみなし，これより進化速度が低ければ（dN/dS< 1）負の自然選択が働いていると考えられる。逆に進化速応を触媒する “リブロース 1,5- ビスリン酸カルボキシラー

度が高ければ（dN/dS > 1）適応的な進化，つまり正の自然選択が働いていると考えられる。これらをコドン置換モデルドする遺伝子であり，ルビスコの触媒部位はこの大サブユ選択が存在するモデル（対立仮説）” の尤度を計算し，尤度

ゼ / オキシゲナーゼ（ルビスコ）” の大サブユニットをコーニットに存在する（Spreitzer & Salvucci 2002, Andersson& Backlund 2008）。ルビスコは，光合成系において CO2 の固定を支配する最も重要な酵素であるにも関わらず，機能効率が非常に悪いことでよく知られている。したがって，その機能向上を促すような分子進化は植物の適応度を直接変化させると考えられ，ルビスコをコードする rbcL 遺伝子は，“正の自然選択” の対象となったはずである。

として，“中立進化モデル（帰無仮説）” ならびに “正の自然比検定により正の自然選択を検出する（Yang et al. 2005）。
ちなみに，計算は PAML のパッケージ（最新版は ver. 4,Yang 2007）で行える。この検定を行った結果，対象にした3 つの遺伝子の中で rbcL のみにおいて正の自然選択が検出されたのである。さらに，正の自然選択を受けている rbcLのアミノ酸サイトをベイズ法によって推定した（事後確率0.99 以上で dN/dS > 1 であるサイト , Yang et al. 2000）。その結果，選択を受けているサイトは，上記 3 つの遺伝子で最近になり，この rbcL 遺伝子における正の自然選択の例
が分子進化学的な解析によって続々と検出されており，ルビ構築した系統樹上の古い分岐（内部の分岐）で固定されたもスコの適応進化が示されている。本稿では，陸上植物で広範のであることが確認され，自然選択が働いたと考えられる置囲に発見された rbcL 遺伝子の自然選択，そして次に藻類に焦点を当てた研究例，最後に筆者が研究している車軸藻目藻類の 1 種 であるシャジクモ Chara braunii での研究を紹介させていただきたい。

陸上植物で続々と示される rbcL 遺伝子の自然選択とルビスコの進化

rbcL 遺伝子における正の自然選択は，Kapralov & Filatov（2006）によって最初に示された。Kapralov & Filatov（2006）

換は末端よりも内部に見られるという過去の報告を支持した（Ruiz-Pesini et al. 2004）。また，選択されているアミノ酸サイトはルビスコアクチベースタンパクと相互作用する部位であり，自然選択とルビスコの機能の間の相関が示された。

翌年，植物全体の rbcL 遺伝子を網羅的に解析した論文が同じ著者により発表された。Kapralov & Filatov（2007）では，78 目 279 科 1747 属より収集した 3228 の rbcL の配列を用いて，上記同様な検定を 151 の主要な系統に分割して行った。
その結果 112 の系統で正の自然選択が検出され，rbcL の自は，光合成を支配している葉緑体ゲノムに働いた自然選択を然選択は植物において普遍的に存在していることが示され検証するため，ハワイ諸島で適応放散し様々な光環境に進出た。また，ベイズ法で推定された選択サイトは，特定のサイしている属である Schiedea（ナデシコ科）に着目し，葉緑体ゲノムコードである matK，psbA，rbcL の 3 遺伝子について，コドン置換モデルを用いた正の自然選択の検定を行った。

トにほぼ集中しており，ほとんどがサブユニット間のインタラクションに関与する重要な部位であることが明らかになっこの検定は，配列間における非同義置換率（dN）と同義置た。さらにこの研究では rbcL 遺伝子を使った系統解析へ影響についても解析している。選択下にあるコドンを除去して化の中立説（Kimura 1968, 1983）によれば，有害な突然変トストラップ値が 5% 以上増加したという（ある 2 つの系統換率（dS）を比較することによって適応進化を検出する方法である（Yang 2006）。ここで少し原理を説明する。分子進
異はただちに負の自然選択として集団から取り除かれるため観測はほぼ不可能であるが，適応度に影響を及ぼさない中立的な置換は一定の速度で固定される。一方で有利な変異は中行った系統解析と除去せずに行った解析を比較したところ，選択下にあるコドンを除去した場合，全体の 29% の枝でブーでは 55% も増加）。これらの系統では，正の自然選択がホモプラシー（塩基またはアミノ酸の収斂）を招いている可能性が示された。分類群間の分子系統解析は，用いるマーカーのたがって遺伝子に観測される置換は，非同義置換に比べて同変異が中立であることが前提であるが，rbcL には自然選択が存在していることを考慮に入れることで，より枝の支持が義置換が多数を占めることとなる。同じ遺伝子内という物理より強く得られることが示唆された。

立的なものに比べて圧倒的に少ないが，速く固定される。し的に近い領域内で突然変異率に有意な違いがあるとは考えにくいため，同義置換の進化速度をその遺伝子の中立的な進化

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上記２つの論文を皮切りに，現在（2013 年）まで様々な系統に焦点をあてた解析が行われている。例えば，C4 経路

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150（CO2 濃縮機構）を獲得した系統である C4 植物と，機構を藻類に見られるルビスコの進化と大気 CO2 濃度の変化

et al.（2008）では，C4 植物の系統に特異的な rbcL への正の自然選択が検出され，また C4 系統において選択されべて上記のような研究例は未だ少ないが，今回は Young etal.（2012）が行った解析を紹介したい。
大気中の CO2 濃度は，酸素発生型の光合成能力を持つ生命が出現して以来，約 24 億年の歴史を経て減少してきた。
ルビスコは，CO2 を固定する（カルボキシラーゼ活性 ) 本来の役割がある一方で，O2 分子ともまた結合して（オキシゲナーゼ活性 ) 光呼吸を行うという欠点を持つが、これら 2 つ持たない C3 植物に焦点を当て同様な解析を行った Christin

藻類に関しては，陸上植物（コケ，シダ，種子植物）に比たアミノ酸は組み合わせが類似していることを明らかにした。C4 植物の葉緑体内の CO2 は高濃度に保たれるため（von Caemmerer & Furbank 2003），ルビスコが受ける選択圧が切り替わったことが示されたのである。また，Iida etal.（2009）では，水草の進化において働いた光合成への選択圧を解析している。水草には環境に応じて可塑的に沈水葉・浮葉・陸生葉を形成する “異型葉形成種” が多く見られる。
したがって外環境が劇的に変化するため，光合成能力に選択の活性は競合する関係にある。ルビスコの機能的効率は，それぞれの基質（CO2 と O2）との親和性と触媒回転速度と，そして細胞内の CO2 ／ O2 濃度に依存する。かつての，O2濃度が低く CO2 濃度が高かった時代の地球であれば，オキ圧が働いたことが予想された。異型葉形成の適応進化の代表例とされるヒルムシロ属に焦点を当てて解析した結果，異型シゲナーゼ活性は欠点として顕在化しなかったと考えられる葉形成種の系統のみで rbcL の正の自然選択が検出され，環境の変化への対応が光合成能力へのより強い選択圧となってが，次第に酸素分圧が上昇し，光合成の律速要因となった。
したがって，ルビスコは低 CO2 濃度環境へと適応してきたいることが示された。上記２つの例の “C4 植物” および “異と考えられているが（Badger & Andrews 1987, Badger etal. 1998, Tortell 2000），その適応進化のタイミングと大気型葉形成系統” は，いずれも多系統的に出現しているものであり（Sage 2004，Lindqvist et al. 2006），同様な環境がルビスコの性質を収斂進化させていることを示している。

環境の変化との関連についての知見はほとんどなかった。

Young et al.（2012）はこの問題を明らかにすることを目

0.5

Rhodophyta(Cyanidiales)

Giga age

Rhodophyta

1.0Stramenopiles(inc. diatoms) Cryptophyta

1.5

Haptophyta

Umbilicosphaera sibogae
Calcidiscus leptoporus
Cruciplacolithus neohelis
Coccolithus pelagicus
Helicosphaera carteri
Emiliania huxleyi
Isochrysis sp.
Pavlova gyrans
Pavlova lutheri
Thalassiosira antarctica
Odontella sinensis
Chaetoceros calcitransHeterosigma akashiwo
Olisthodiscus luteus
Pylaiella littoralis
Pyremonas helgolandiiRhodomonas salina
Guillardia theta
Chilomonas paramecium
Chroomonas sp.
Chondrus ocellatus
Hypnea sp.
Griffithsia monilis
Corallina sp.
Palmaria palmata
Bangia atropurpurea
Porphyra purpurea
Rhodochaete parvula
Compsopogon coeruleus
Bangiopsis subsimplex
Rhodosorus marinus
Stylonema alsidii
Dixoniella grisea
Rhodella violaceae
Porphyridium aerugineum
Flintiella sanguinaria
Galderia sulphuria
Galderia sulphuria
Cyanidioschyzon merolae
Cyanidium caldarium

0rbcL 遺伝子の正の自然選択の系統的位置（破図 1. 色素体遺伝子（16S rRNA, psaA, psbA, rbcL, tufA）
を用いて解析された藻類の分岐年代と，線で示した枝上）。樹上に示した菱形，および灰色のバーは，それぞれ化石記録に基づいて導入した分岐年代の制約と，推定された分岐年代の95% 信頼区間をそれぞれ示す。Young et al.（2012）より改変。より詳細な解析結果（ハプト藻と珪藻）は，原著のサプリメントファイルを参照されたい。

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151

稲▲

水田

< 15 cm

Group A

浅い水環境

シャジクモ

束植物

管
水生維
シャジクモ

>1m

Group B

深い水環境
湖底外群（外国産シャジクモ）図 2. 日本産シャジクモの種内に見られる２大系統と生態的２型。系統樹は葉緑体 DNA（rbcL 遺伝子と atpB-rbcL 遺伝子間領域の合計約 3.6kbp）を用いて構築されたもの . Kato et al.（2008, 2011）に基づいて作図。

的に，一次共生起源である紅藻類（紅藻植物門）と，その後の二次共生起源のストラメノパイル，ハプト藻，クリプト藻の種を主な対象として研究を実施した。これらのグループの回転速度を高める進化が促進されると考えられる（Tcherkez

et al. 2006）。そこで，解析に含めた分類群についてこれまでに報告されているルビスコの酵素活性データ（e.g. Badger

rbcL 遺伝子（紅藻類 37 属 49 配列，ハプト藻綱 21 属 32 配列，褐藻綱 29 属 45 配列，ラフィド藻綱 2 属 2 配列，黄金色藻綱およびシヌラ藻綱 5 属 24 配列，珪藻綱 23 属 45 配列，クリプト藻綱 8 属 28 配列）について，コドン置換モデルのet al. 1998, Webster 2009）をまとめて照らし合わせてみると，ハプト藻と珪藻のルビスコは紅藻類に比べて CO2 へのづいて補正した分子分岐年代推定と，過去の地球における大と関連していることが示された。他にも，多くの種が CCM

尤度比検定による正の自然選択の検出を行い，化石記録に基気環境の変遷を比較した結果，以下のようなことがわかった。

rbcL 遺伝子の正の自然選択は，基本的に紅藻類・珪藻・ハプト藻・クリプト藻といった大きなグループ（高次分類群）の基部付近で検出された（図 1）。これは様々な系統で普遍的に自然選択が検出された陸上植物での例（前節で紹介）とは異なる結果であった。コケ・シダ・種子植物が生育する陸上環境においては，様々な環境要因（乾燥，高温など）がルビスコへの選択圧となるが，藻類の高次分類群の分岐といったレベルの長期的な歴史における海洋環境では，大気の CO2 濃度の減少に伴う水中の CO2 の減少が根本的な選択圧だったと考えられる。また，ルビスコの触媒効率は細胞内CO2 濃度に大きく左右されるため，多くの藻類は細胞内のCO2 を高濃度に保つメカニズム，“CO2 濃縮機構（CarbonConcentrating Mechanism, CCM）” を獲得した（Badger &Andrews 1987）。CCM によって細胞内の CO2 濃度が高く保たれればルビスコの CO2 への親和性を高める選択圧が弱まるため，機能的にトレードオフの関係にある CO2 の触媒

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親和性は低いものとなっていた。したがって，ハプト藻や珪藻における rbcL 遺伝子の自然選択とルビスコの進化は，海洋中の CO2 濃度の減少と両グループにおける CCM の獲得を持つと考えられている紅藻類でも，シアニディウム綱とそれ以外の系統を隔てる分岐で自然選択が検出された。さらに，
分子分岐年代推定と大気環境の変遷を比較した結果，ハプト藻と珪藻のそれぞれにおいて自然選択が働いた時期（それぞれ 3.75 ～ 2.85 億年前，1 ～ 0.3 億年前）は，大気中の CO2濃度が比較的急に減少したとされる時期と関連することが明らかになった。
これらのことより，それぞれの藻類の系統は，大気環境の変化に対応して異なるルビスコの機能を獲得し，適応放散に成功したことが示されたのである。Young et al.（2012）は今後の展望として，それぞれ系統において獲得した生理的機能（それぞれの系統における CCM の機能など）とルビス

コの機能進化との関連をより詳しく明らかにすることを挙げている。ただ，この研究は，非常に大きい時間的スケールに焦点を当てており，また扱った分類群は藻類のなかでも一部だった。淡水藻や気生藻などの，海洋とは異なる環境に生育する分類群においては，系統特異的な自然選択以外にも，環13/11/12 10:18

152

境特異的なルビスコの自然選択と機能的進化が明らかになるかもしれない。

意な逸脱は検出されなかった。この結果は，葉緑体 DNA の２型は環境の違いに起因する多様化選択によって維持されていることを示唆するものだった。ただし，シャジクモ属の葉シャジクモの生態的集団分化において見られた rbcL の自然選択
ここでは，筆者の研究する淡水性大型藻類 シャジクモ

Chara braunii の種内で見いだされた rbcL 遺伝子の自然選択について紹介したい。シャジクモは，水田や湿原といった水深数センチの浅い所に出現する一方で，湖やため池の底といった水深数メートルの深い水環境にも生育する種である。

緑体 DNA 上の遺伝子 は連鎖して母性遺伝すると同時にミトコンドリア DNA も同様な遺伝様式であること考慮すると（Sun et al. 1988），中立性検定の結果からは生態的分化に影響を与えた自然選択は少なくとも１個はオルガネラゲノム上に存在する遺伝子に働いたものだろうと考えられた。

そして，コドン置換モデルを用いた尤度比検定の結果，シャジクモの rbcL 遺伝子における正の自然選択が検出された。

強度や，温度と CO2 濃度の日周的な安定性）が明らかに異一方で核コード遺伝子（アミノ酸置換が見られた hsp90 遺伝子）からは検出されなかった。ちなみにここでは，より正確による種内の系統解析を行った。その結果，２つの単系統群考慮すると，尤もらしい結果であると思われる。生態的２型

この水深の異なる２つの環境は，光合成に関する環境条件（光なり，したがってシャジクモは種内に “生態的 2 型” を示すかつ保守的な解析を行うため，断片的だった rbcL の完全長と言える。Kato et al.（2008）はこの生態的２型に着目し， （1428 bp）を全サンプルについて決定したデータセットを日本全国から収集した 88 のサンプルを用いて葉緑体 DNA用いている。ルビスコをコードする rbcL 遺伝子で正の自然（rbcL 遺伝子および atpB-rbcL 遺伝子間領域 , 合計約 3kb） 選択が検出されたことは，生態的２型間における環境の差を（Gourp A と B）が示され，それらは生態的２型を完全に反映するものであることが明らかになった（図 2）。と rbcL 遺伝子の多型は一致しており，281 番目のアミノ酸サイトにおいて浅所産（Group A）のものはセリン残基を持た，日本産集団においては種内に生態的分化が存在し，外国

ことに，このアミノ酸置換は C4 植物の系統で正の自然選択

シャジクモは他の近縁種とは形態的に明確に区別でき，ま産の同種を加えたシャジクモ属の系統解析において単系統を示す。したがって，生態的分化の進化研究を行う格好の材料になると考え，Kato et al.（2011）では，核ゲノムコードのつが，深所産（Group B）はアラニン残基を持つ。興味深いが働いていると示されたサイトの位置と置換の両方に一致する（Christin et al. 2008, Kapralov et al. 2012）。C3 植物の281 番目のアミノ酸はほぼアラニン残基であり，C4 植物でDNA 領域（それぞれ両端 UTR を含む hsp90 と EF1-alpha
遺伝子領域 , 合計約 6.5 kb）を加えて，系統解析と進化の中立性検定（Tajimaʼ s D 検定 , Tajima 1989），そしてコドンが示唆される。しかし，この置換はアミノ酸の極性を変化さを行った。に変化させるかは明らかになっていない。今後，遺伝学的研

置換モデルを用いてコード領域における正の自然選択の検定

生態的２型間を分集団としたときの遺伝的分化の度合い（Fst 値 , Wright 1951）は，系統樹でも見られたとおり葉緑体 DNA 領域で最も大きいものであり，核 DNA においても分化は見られた。しかし，生態的２型を反映する２大系統は

核 DNA では確認されなかった。このことから，両水環境間における核 DNA の遺伝子流動の存在が示唆される一方で，葉緑体 DNA の流動については環境の差異によって妨げられは多くの系統でセリン残基に置き換わっていることから，細胞内 CO2 濃度の変化とルビスコの機能進化との重要な関連せるが（Nelson & Cox 2005），ルビスコの性質をどのよう究や生理学的研究によって性質の変化が解明されること期待したい。
ここまでの解析はすべて天然環境より得られたサンプルによるものだったが，筆者は湖沼の底土に含まれる埋土接合子（卵胞子）より発芽させたシャジクモも解析している。その結果，株を得ることができた 3 つの湖沼すべてから，GroupA と B の葉緑体 DNA ハプロタイプの両方が確認された。湖ているものと考えられた。次に , 解析に用いた各 DNA 領域

沼から得られた天然サンプルはすべて Group B のハプロタ検定を行った。ここで，Tajimaʼ s D とは，配列中の多型サイトの割合（θ）と塩基多様度（π）の差に基づいて推定さ水環境間でも卵胞子の移入は存在することが示唆された。まの進化的背景を調査するため，Tajimaʼ s D を用いた中立性イプだったのにも関わらず，である。このことから，異なるた，異なる環境タイプの葉緑体 DNA を持つ卵胞子の発芽のれる統計量であり，自然選択の有無の検定にしばしば用いら抑制，または発芽後の成長が抑制されている可能性が予想される。理想集団おいて突然変異に自然選択がはたらいていなれた。この結果については，より多くのサンプルに基づいたい場合（中立な場合），π と θ の期待値は等しいため D の値は 0 になると期待されるが，中立から逸脱して進化している場合，0 から有意に異なる D の値となる。この中立性検定の結果，葉緑体 DNA 領域（rbcL 遺伝子および atpB-rbcL遺伝子間領域）のみで有意に正の D が得られ，中立進化からの逸脱が示された。しかしながら，葉緑体 DNA 領域で浅所産と深所産（Group A と B）を別々に検定したところ，有61(3)149-153藻類学最前線加藤.indd 152

解析と発芽実験を行って確認してゆきたい。
この研究は，植物の生態的集団分化おけるオルガネラ遺伝子の自然選択を示したはじめての報告となった。そして，その遺伝子の候補の一つが rbcL 遺伝子である可能性を示した。
筆者は，シャジクモの生態的２型を用いた生態的集団分化の研究を発展させるため，より多くの領域の DNA データに基づいて自然選択が働いた遺伝子（適応遺伝子）を探索すると13/11/12 10:18

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ともに，ルビスコの酵素活性測定や光合成特性差異を特定する生理学的実験解析，そして形質転換も視野に入れた遺伝学的実験を行っていきたいと考えている。その過程で，生態的２型における rbcL 遺伝子の自然選択，そしてルビスコの機能進化に関するさらなる知見が得られることが期待される。

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（神戸大学）

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