博士（水産学）蒋 建橋
学位論文題名Eel(Angu)illa japonica)Testicularii B‑Hydroxylaseandll母 ‑Hydroxysteroid Dehydrogenase : cDNA Cloning,Enzyme Activities and Expression
日本ウナギ(Anguilla Japonica）精巣の11pー水酸化酵素とiiB―ステ口イド
水 酸 基 脱 水 素 酵 素 ： cDNAク 口 一 ニ ン グ 、 酵 素 活 性 、 及 び 発 現学 位 論 文 内容 の 要 旨

11‑ケトテストステロンは魚類の主要な雄性ホルモンであり、ウナギでは精子形成誘起ホ彫モンとして精子の生産に関与し、また他の魚類では第二次性徴の発現に重要な役割を果たすことが知られている。11‑ケトテストステ口ンは脳下垂体から分泌される生殖腺刺激ホJレモンが精巣の体細胞に作用することにより生成される
カぞ、その際前駆体（テストステロン）を11‑ケトテストステロンに転換させる11p.水 酸化 酵素 (P450(iip））とiip‑ステロイド水酸基脱水素酵素（iip・HSD)が重要な役割を果たすと考えられる。しかし、これまで魚類においてこれら2種のステロイドホJレモン代謝酵素の遺伝子、酵素活性、精巣における発現の研究はまったくなされていない。また、これら酵素の遺伝子ク口ーニングに関する研究は哺乳類の副腎を用いてわずかになされているが、生殖腺における発現を解析した研 究は脊 椎動 物全体 を通 しても これ までま った くなさ れて いない。
日本産養殖ウナギの精巣は精原細胞、未発達な体細胞（セルトリ細胞、ライデイッヒ細胞）からなる。しかし、このような未成熟個体にヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン(HCG)を一回投与すると精巣での11．ケトテストステ口ンの合成が高まり、このホルモンの働きで精子形成が開始され、その後約3週間で精子が出現し、精巣は成熟する。したがって、ウナギ精巣は精子形成のホルモン制御機構を解析する格好な実験系である。本研究では、ウナギの精子形成誘起ホルモンである11‑ケトテストステロンの生成機構を分子レベルで明らかにする目的で、ウナギ
精巣 から P450(iip）とiip‑HSDのcDNAをクローニングし、それら2種の酵素の―186−活性、 及ぴHCG投与 前後の精 巣と頭腎 における両 酵素遺伝子の発現を解析した。
得られ た結果は 、以下の 通りであ る。

1）ウ ナ ギ の精 巣 か らク ロ ーニ ン グ され た P450(11ロ )cDNAは 、 511個 の アミ ノ酸
から な る推 定 分 子量 58kDaの 蛋 白質 を コ ード する。そ の予想さ れるアミ ノ酸配列
をこ れ まで に 報 告さ れ た哺 乳 類 やカ エ ルの 副腎 からク口 ーニング されたP450(11ロ）と比較 すると、 38‑48％のホモ ロジーを 示した。
2） ウ ナ ギ P450(iip)cDNAを 発 現 さ せ た 喃 乳 類 の 培 養 細 胞 (COS‑1細胞 ） では 、基質として 加えたア ンド口ス テンジオ ンを11ロ・ヒド口キシアンド口ステンジオンに、 デ オキ シ コーチ コステロ ンをコーチ コステロ ンに、ま たデオキ シコーチ ゾルをコ ー チゾ ル に 転換 し た。 こ れ らの 結 果か ら、 得られた cDNAがP450(11ロ）を コード す るこ と が確認 されると ともに、ウ ナギP450(iip）は 性ステロ イドやコ ーチコス テ ロイ ド に対す る基質特 異性を示さ ないこと が明らか になった 。また、 ウナギP450(iip)cDNAを 発 現 させ た C〇 S‑l細 胞 でデ オキシコー チコステ 口ンを基 質として も アル ド ステロ ンは合成 されなかっ たことか ら、魚類 でアルド ステロン が検出されない のは、P450(iip） にアJレド ステロン 合成活性 が欠けて いるためであると推察され る。
3） ウ ナ ギ 精 巣 か ら ク 口 ー ニ ン グ さ れ た P450ciip)cDNAを ブ ロ ーブ と して ウ ナ
ギの 精 巣及 び 頭 腎組 織 で行 っ た ノー ザ ンブ 口ッ ト解析の 結果から 、HCG処理前 のウナ ギ から 得 られた 精巣には P450(11p）遺伝子の 発現は認 められな いが、間 腎組織には強い 発現（1． 8kb)がみられ ることが明らかになった。一方、HC
Gを一回投与一日後の精 巣で強い 発現（1． 8kb）が認め られ、3日 後に最大 となった。ホルモン投与6一9日後 の精巣に おけるP450(iip） 遺伝子の 発現は減 少したが、ぞの後12・18日にかけて 再ぴやや 上昇した 。．
4）カ エ ル のP450(11ロ）に対 する抗体 （大阪大学 医学部・ 岡本光弘 博士より 提供され た ）を プ ローブ としてウ ナギの精巣 と頭腎組 織につい て免疫組 織化学を 行った。 こ の抗 体 で はHCG投 与後 の 精 巣の ラ イデ イッヒ 細胞が強 く反応し た。一方 、頭腎 組 織で は HCG投与 の 有無 に 関 係な ＜ 常に 強い反 応を示し た。これ らの結果 より、 精 巣に お けるP450(iip） 合成部位 は体細胞の ライディ ッヒ細胞 であると 結論される。ま た、精巣 と頭腎に おけるP450(11ロ ）のホル モン制御 機構は異なると考えられる。
‑187−5）ウ ナギ の精巣 から ク口 ーニン グさ れた iip‑HSDcDNAは、436個のアミノ酸からなる推定分子量約48kDaの蛋白質をコードする。その予想されるアミノ酸配列をこれまでに報告された哺乳類の副腎からク口ーニングされたiip・HSDと比較すると、哺乳類2型iip‑HSDともっともよく類似しており、ホモロジーは約50％であった。
6）ウ ナギ iip‑HSDcDNAを 発現 させ たCOS‑1細胞 では、 基質 として加えたコーチコステロンを11‑デヒドロコーチコステロンに、またコーチゾルをコーチゾンに転換した。これらの結果から、得られたcDNAはウナギiip‑HSDをコードするこーとが確認された。
7）ウ ナギ 精巣か らク ロー ニングされたiip‑HSDcDNAをプローブとしてウナギ精巣で行ったノーザンブロット解析の結果から、精巣におけるiip‑HSD遺伝子の発現は、HCG投与前にはみられないが、ホルモン投与一日後にはすでに認められ(2.7kb)、その後3日後までに最高となり、以後(6‑18日）徐々に減少することが明らかになった。
本研究により、日本産養殖ウナギの精巣から魚類でははじめてP450(iip）と11p ‑HSDのcDNAがクローニングされ、これら酵素のアミノ酸配列や酵素活性の特性が明らかになった。さらに、これらcDNAをプローブとしてウナギ精巣で行ったノーザンブロット解析により、ウナギの精巣でHCGにより11‑ケトテストステロンが急激に合成される際に、P450(iip）とiip‑HSD遺伝子の転写活性が急激に高まることがはじめて示され、HCGによる両酵素の活性促進は転写レベルで調節されていることが明らかにされた。今後、この転写調節がどのような仕組みで行われているかを調べるとともに、コレステロールから前駆体のテストステ口ンが合成させる過程で作用する4種のステロイド代謝酵素についても遺伝子レベルでの解析を行う必要がある。

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学位論 文審査の要旨
主 査 教
授 山 内 晧 平
授 山 崎 文 雄
主 査 教教 授 麦 谷雄
主 査 教
授 長 濱 泰 孝
授 足 立 嘉 次
主 査 教
副 査 助
伸
学 位 論 文 題名Eel(Anguillajaponica)Testi
cular1118‑Hy
droxylaseand11)8‑HydroxysteroidDehydrogenase : cDNA Cloning,Enzyme Activities and Expression
日 本ウ ナギ （月nguilla Japonica） 精巣 のiip―水 酸化 酵素 と11B― ステ口イド
水 酸 基 脱 水 素 酵 素 ： cDNAク □ − ニ ン グ 、 酵 素 活 性 、 及 び 発 現

11‑ケト テス トステ ロン は魚 類の 主要 な雄 性ホ ルモ ンであり、ウナギでは精子形成 誘起 ホル モン とし て精 子の生産に関与し、また他の魚類では第二次性徴の発現に重 要な 役割 を果 たす こと が知 られ てい る。 11‑ケ トテ ストステ口ンは脳下垂体から分 泌さ れる 生殖 腺刺 激ホ ルモンが精巣の体細胞に作用することにより生成されるが、その際前駆体（テストステロン）を11‑ケトテストステロンに転換させる11ロ・水酸 化酵 素(P450(1．ip）） と11 p‑ステ ロイ ド水酸 基脱 水素酵素（11ロ‑HSD)が重要な 役割 を果 たす と考 えら れる 。し かし 、こ れまで 魚類 においてこれら2種のステロ
イ ドホ ルモ ン代 謝酵 素の 遺伝子、酵素活性、精巣における発現の研究はまったくなされていない。
日本 産養 殖ウ ナギ の精 巣は精原細胞、未発達な体細胞（セルトリ細胞、ライディッ ヒ細 胞） から なる 。し かし、このような未成熟個体にヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン(HCG)を一回投与すると精巣での111‑ケトテストステロンの合成が高まり、この
ホ 彫モ ンの 働き で精 子形 成が 開始 され 、そ の後約 3週 間で精子が出現し、精巣は成熟 する 。本 研究 では 、ウ ナギ の精 子形 成誘 起ホ彫 モン である11‑ケトテストステロ
ン の 生成 機構 を分子 レベ ルで 明ら かに する 目的 で、 ウナ ギ精 巣か らP450(iip）とiip‑IISDの cDNAを ク 口 ー ニ ン グ し 、 そ れ ら 2種 の 酵 素 の 活 性 、及 びHCG投与 前後の 精巣 と頭 腎に おけ る両 酵素遺伝子の発現を解析した。得られた結果は、以下の通りである。
1）ク ロー ニン グされ たP450(】．1p)cDNAは、511．個のアミノ酸からなる推定分子―189―

量58kDaの蛋白質をコードする。予想されるアミノ酸配列をこれまでに報告された哺乳類やカエルの副腎からクローニングされたP450(iip）と比較すると、38‑48％のホモロジーを示した。
2）ウナギP450(ii p)cDNAを哺乳類の培養細胞(COS‑1細胞）で発現させた結果、得られたcDNAカ{P450(iip）をコードすることカq准認されるとともに、性ステロイドやコーチコステロイドに対する基質特異性を示さないことが明らかになった。
また、デオキシコーチコステロンを基質としてもアルドステロンは合成されなかったことから、魚類でアルドステロン．が検出されないのは、P450(iip）にアルドステロン合成活性が欠けているためであると推察された。
3）ウナギP450(11 p)cDNAをプ口ーブとしてウナギの精巣及び頭腎組織で行ったノーザンブロット解析の結果から、HCG処理前のウナギから得られた精巣にはその発現は認められないが、間腎組織には強い発現（1.8kb)がみられることが明らかになった。一方、HCGを一回投与一日後の精巣で強い発現（1.8kb)が認められ、3日後に最大となった。ホルモン投与6ー9日後の精巣における発現は減少したが、その後12‑18日にかけて再ぴやや上昇した。
4）カエルのP450(iip）に対する抗体を用いてウナギの精巣と頭腎組織について免疫組織化学を行った。この抗体ではHCG投与後の精巣のライデイッヒ細胞が強く反応した。一方、頭腎組織ではIICG投与の有無に関係なく常に強い反応を示した。これらの結果より、精巣におけるP450(iip）合成部位は体細胞のライデイツヒ細胞であると結論された。また、精巣と頭腎におけるP450(iip）のホルモン制御機構は異なると考えられた。
5）クローニングされたiip‑IISDcDNAは、436個のアミノ酸からなる推定分子量約48kDaの蛋白質をコードする。その予想されるアミノ酸配列をこれまでに報告された哺乳類の副腎からクローニングされたiip‑HSDと比較すると、哺乳類2型
iip‑HSDと も っ と も よ く 類 似 し て お り 、 ホ モ ロ ジ ー は 約 50％ で あ っ た 。
6）ウナギ11ロ‑I‑ISDcDNAをCOS‑1細胞で発現させた結果、得られたcDNAはウナ
ギiip‑HSDをコードすることが確認された。
7） ウナギ iip‑HSDcDNAをプ ロー ブとしてウナギ精巣で行ったノーザンブロッ
ト解析の結果、精巣におけるその発現は、HCG投与前にはみられないが、ホルモン投与一日後にはすでに認められ(2.7kb)、その後3日後までに最高となり、 以後（6‑18日）徐々に減少することが明らかになった。
上述のように、本研究では、日本産養殖ウナギの精巣から魚類でははじめてP450(iip）とiip‑HSDのcDNAのクローニングを行ない、これら酵素のアミノ酸配列や酵素活性の特性、ならびに、HCGによるP450(iip）とiip‑HSD遺伝子の発現促進は転写レベルで調節されていることを明らかにした。これらの結果は、魚類の成熟およぴ産卵を人為的に統御するための極めて重要な知見を提供したものとして高く評価され、本論文が博士（水産学）の学位請求論文として相当の業績であると認定した。