Photon Factory Activity Report 2022 #40 (2023)

BL-5A/2019G015

酵素活性が向上した超好熱菌マルチ銅オキシダーゼ変異体の構造解析
Structural analysis of hyperthermohilic multicopper oxidase mutant with enhanced
enzyme activity
里村武範 1 , 平野達也 1, 稲垣康平 1, 堀永耕作 1, 高村映一郎 1, 坂元博昭 1, 大志田達也 2,
大島敏久 3, 櫻庭春彦 2,*, 末信一朗 11
福井大学大学院工学研究科, 〒910-8507 福井県福井市文京 3-9-1
2
香川大学農学部, 〒761-0795 香川県木田郡三木町池戸 2393
3大阪工業大学工学部, 〒535-8585 大阪市旭区大宮 5-16-1
Takenori Satomura 1, *, Tatsunari Hirano 1, Kohei Inagaki 1,, Kosaku Horinaga 1,,Eiichiro Takamura 1,, Hiroaki Sakamoto 1, Tatsuya Ohshida 2, Toshihisa Ohshima 3,Haruhiko Sakuraba 2, Shin-ichiro Suye1
1
Division of Engineering, Faculty of Engineering, University of Fukui, Bunkyo, Fukui, Japan2
Department of Applied Biological Science, Faculty of Agriculture, Kagawa University, Miki-cho,Kagawa, Japan3
Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Osaka Institute of Technology,Osaka, Japan
1 はじめにマルチ銅オキシダーゼ (MCO) は 基質分子の酸化を介して酸素分子の水分子への 4 電子還元を触媒する酵素の総称である。MCO はタイプ 1 (T1) 銅で基質から電子を受け取り、タイプ 2 (T2) およびタイプ3 (T3) 銅からなる三核中心で酸素の水への還元を行う。このように MCO は電子供与体と電子受容体との電子授受を担う部位が異なる。このことから、酵素-電極間の電子伝達においてメディエーターを介さず直接電子移動が可能であるため、バイオセンサやバイオ電池用素子への応用が期待されている。しかし、現在、主に用いられている真菌由来の MCOは高温やアルカリ条件下、塩存在下において不安定であることから、応用展開が制限されている[1]。
一方、超好熱菌に由来する酵素の多くは熱や幅広い pH 領域において高い安定性を示すことが報告されている。我々は、超好熱性アーキア Pyrobaculum
aerophilum から新規な MCO (McoP) を見出し、酵素の立体構造を含む詳細な機能解析に成功した [2]。
McoP は高い熱安定性および長期安定性を有しているが、これまで見出されている他の MCO に比べ酵素活性が低いことが応用利用への課題となっている。
そこで、分子進化工学的手法を用いて McoP をコードする遺伝子にランダムに変異の導入を行い、野生型よりも比活性が高い変異型 McoP を創製することに成功した。この変異型 McoP には 4 つのアミノ酸置換が導入されていたが、これらのうち単一のアミノ酸置換を導入した単一変異型酵素を構築して解析を行った結果、262 番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された F290I のみが有意に高い触媒活性を示すことを明らかにした。そこで、McoPの酵素活性活性向上メカニズムを明らかにするために F290I 変異体の立体構造解析を行った。
2 実験
大腸菌によって発現し、精製した組換え F290I 変異体を 13.7 mg/mL にまで濃縮し、25% (w/v) PEG
1500、 100 mM MMT 緩衝液を含むリザーバー液を用いたハンギングドロップ蒸気拡散法によって結晶化を行った。結晶は 25℃で 30 日間成長させた。抗凍結剤には 30% (w/v) PEG 1500 を含むリザーバー溶液を用い、X 線回折強度測定は BL5A ビームラインで行い、野生型 McoP（PDB 3AW5）を鋳型とした分子置換法によって構造決定を行った。
3 結果および考察
F290I 変異体のタンパク質立体構造（PDB 6K3D）を 1.92 Å の分解能で決定した。構造決定した F290I
変異体と野生型 McoP の立体構造比較を行ったとこ
ろ、酵素の全体構造に大きな変化は認められなかった（図 1 左）。さらに、変異を導入したアミノ酸残基付近を詳細に観察すると野生型 McoP に存在していた F290 と F265 および W436 との間のアロマティックペアが、変異体酵素では側鎖に芳香族環を持たないイソロイシンに置換されたことによって消失していることが示唆された (図 1 右)。このことにより
F290I では変異導入部位周辺の疎水性クラスターの相互作用が低下することで P390、H391、P392 から構成されるループ構造の柔軟性が高まり、結果として T1 銅がより電子を受け取りやすくなった可能性が考えられた。

Photon Factory Activity Report 2022 #40 (2023)

図 1 : 野生型 McoP（blue）と F290I 変異体（gray）との構造比較。（左）全体構造の比較。（右）変異部位の拡大図。F290（green）と F290I（red）はスティックモデルで、銅は球状モデルで示している。
そこで野生型酵素の 290 番目のフェニルアラニンを同じ芳香族環を有するチロシン（F290Y）、F290I
変 異 体 の 290 番 目 の イ ソ ロ イ シ ン を バ リ ン（F290V）、ロイシン（F290L）、アラニン（F290A）に置換した変異酵素を作成し酵素活性を測定したところ、側鎖に芳香族環を持たない F290A、F290V、F290L はいずれも野生型よりも高い比活性を示した。
また、芳香族環を側鎖に有する F290Y の酵素活性は野生型酵素と変わらなかった。これらの結果から、変異導入によって McoP F290 付近の疎水性クラスターの相互作用が低下することで銅と配位するアミノ酸残基を含むループ構造の柔軟性が高まり McoP の触媒活性が向上していることが明らかとなった。
4 まとめ
F290I 変異体のタンパク質立体構造を決定し、野生型酵素との構造比較を行うことによって酵素活性向上メカニズムを明らかにした。本研究成果は国際学術誌 Journal of biotechnology に発表した。
謝辞
タンパク質 X 線構造解析実験を行うにあたり、ご協力いただきました Photon Factory ビームラインス
タッフの方々に感謝申し上げます。
参考文献[1] P. Sharma et al., World J. Microbiol. Biotechnol., 23,823-832 (2007)[2] H.Sakuraba, et al., Acta Crystallogr. F Struct. Biol.
Commun., 67, 1-5 (2011)
成果
1. T. Satomura, T. Hirano, K. Inagaki, K. Horinaga, E.
Takamura, H. Sakamoto, T. Ohshida, T. Ohshima, H.
Sakuraba, S. Suye, Activity enhancement ofmulticopper oxidase from a hyperthermophile via
directed evolution, and its application as the elementof a high performance biocathode. J. Biotechnol. 325,
226-232 (2021)* sakuraba.haruhiko@kagawa-u.ac.jp