⼤阪教育⼤学附属⾼等学校池⽥校舎（⽣物科）岡本

元達

環境DNAを⽤いた指標⽣物調査要約
新教育課程では「探究の過程」を踏まえた授業づくりが重視されるようになってきている。これまで「探究の過程」を踏まえた授業づくりで活⽤できる教材として指標⽣物調査の教材化について研究を⾏ってきた。指標⽣物調査には「探究の過程」の各要素が含まれており、それを⽣徒が経験できるように教材化を試み教育現場で実践してきた。「ウシガエル・アメリカザリガニ・イモリ」といった⽔⽣⽣物の調査は実際に⾒つけることは困難なため、鳴き声を聞いたことがあるか、⾒かけたという話を聞いたことがあるかといった形も有効にしている。しかし、⽣物・地域・環境への理解と興味関⼼が⾼い⽣徒と低い⽣徒での調査の信頼性が⼤きく異るという課題があった。
近年、環境DNAを⽤いて特定の⽣物の⽣息の有無を客観的に信頼できるデータとして収集することが可能となってきている。この調査⼿法を⽤いることで⽔⽣⽣物の調査の課題であった⽣徒による信頼性を検証するためアンケート法による調査結果と環境DNAを⽤いた調査結果の⽐較を⾏った。アンケートの調査地点から任意の地点で採⽔及び環境DNAを抽出し、「ウシガエル・アメリカザリガニ・イモリ」の特異的プライマーを⽤いて調査した。各種において「その⽣物がいない」とアンケートで答えた地点でPCR法によるDNAの増幅が確認された。この結果からアンケート法では本来調査対象の⽣物が⽣息しているにも関わらず⽣息していないと誤って判定してしまっている可能性があると考えられる。しかし、環境DNAの分析が初の試みであったこと、近年環境DNAの分析と実地調査のどちらを信頼すべきかの議論がでていることを踏まえるとアンケート結果が正しく、環境DNAの分析の結果が誤っている可能性も否定できない。今回の結果のみでアンケート調査の信憑性を判断せず継続してアンケートによる調査と環境DNAによる調査の両⽅を⾏い検証していく必要がある。

⽬的・背景
新教育課程の⼤きな狙いは「コンテンツベースからコンピテンシーベースへ」である。授業でどのような内容を教えるかではなく、授業でどのような資質・能⼒（コンピテンシー）を育むかに重点が置かれるようになった。⾼校理科で求められる「資質・能⼒」を育む過程で働く「⾒⽅・考え⽅」として「科学的に探究する⽅法を⽤いて考えること」と⽰されている。そのため、「探究の過程」を踏まえた授業づくりが重視されるようになってきている。これまで「探究の過程」を踏まえた授業づくりで活⽤できる教材として指標⽣物調査の教材化について研究を⾏ってきた。指標⽣物調査には「探究の過程」の各要素が含まれており、それを⽣徒が経験できるように教材化を試み教育現場で実践してきた。
「ウシガエル・アメリカザリガニ・イモリ」といった⽔⽣⽣物の調査は実際に⾒つけることは困難なため、鳴き声を聞いたことがあるか、⾒かけたという話を聞いたことがあるかといった形も有効にしている。しかし、⽣物・地域・環境への理解と興味関⼼が⾼い⽣徒と低い⽣徒での調査の信頼性が⼤きく異るという課題があった。そこでアンケート法による指標⽣物調査の精度を検証するため本研究をおこなった。

従来のアンケート調査

実験

近年、環境DNAを⽤いて特定の⽣物の⽣息の有無を調査することが可能となっている。環境DNAは⽣物が⽣息する⽔中に存在するその⽣物由来のDNAである。環境DNAを⽤いた調査では調査者が⾝近な環境の⽔を採取し、PCR法で特定の⽣物のDNAが増幅されるかどうかを分析するため、客観的に信頼できるデータを収集することができる。この調査⼿法を⽤いることで⽔⽣⽣物の調査の課題であった⽣徒による信頼性を検証するためアンケート法による調査結果と環境DNAを⽤いた調査結果の⽐較を⾏った。アン
ケート調査地点から任意の地点で採⽔し環境DNAを抽出に成功した５サンプルに対して、「ウシガエル・アメリカザリガニ・イモリ」の特異的プライマーを⽤いて調査した。
本来はrealtimePCRを⽤いた解析が主流であるが⾼校現場では実施が困難であるため従来のPCR法によりバンドが⾒られるかどうかでで判断することにした。

環境DNA調査の流れ

・アメリカザリガニ
F 5 -AAACTAGGGGTATAGTTGAGAG-3・採水

R 5 -CAGAAGCTAAAGGAGGATAA-3・濾過吸着（Whatman Glass microﬁberFiltersGF/F）（Qiagen CNeasey Blood&Tissue kit）
・PCR法によるDNAの増幅（TaqMan™ Environmental Master Mix 2.0）
・電気泳動によるDNAの増幅の確認
一般社団法人環境DNA学会

引用元：Environmental DNA surveillance for invertebrate species: advantages andtechnical limitations to detect invasive crayﬁsh Procambarus clarkii in freshwater ponds

・ウシガエル・DNAの抽出

参考プライマー

環境 DNA 調査・実験マニュアルVer.2.2 2020年

今回の実験⽅法の流れ

F 5'-TTACACCGAGAAAATGTCCGTTT-3'
R 5'-GAAATTTTTCGATCGCCTGTACTATA-3'
引用元：環境 DNA による絶滅危惧種・外来種の生息場所把握
・アカハライモリ
F 5ʼ-TATTTTTCCTATAAAGACCTG-3ʼ
R 5ʼ-CAAGGATCAAAATAGATATTAGA-3ʼ
指導助言

神戸大学大学院人間発達環境学研究科 教授

源利文

濾過吸着の様⼦

今回の実験で⽤いたプライマーDNAの抽出結果
ウシガエルでは５サンプル中アンケート結果と環境DNAの解析結果が⼀致したものは４サンプルであった。１サンプルアンケートではウシガエルが「いない」と回答していたが環境DNAの解析結果では「いる」という結果であった。アメリカザリガニでは５サンプル中アンケート結果と環境DNAの解析結果が⼀致したものは２サンプルであった。３サンプルアン
ケートではアメリカザリガニが「いない」と回答していたが環境DNAの解析結果では「いる」という結果であった。イモリでは５サンプル中アンケート結果と環境DNAの解析結果が⼀致したものは２サンプルであった。３サンプルアンケートではアメリカザリガニが「いない」と回答していたが環境DNAの解析結果では「いる」という結果であった。上記の様にウシガエル・アメリカザリガニ・イモリそれぞれにおいて「その⽣物がいない」とアンケートで答えた地点でPCR法によるDNAの増幅が確認された。

考察
これらの結果からアンケート法では本来調査対象の⽣物が⽣息しているにも関わらず⽣息していないと誤って判定してしまっている可能性があると考えられる。しかし、環境DNAの分析が初の試みであったこと、近年環境DNAの分析と実地調査のどちらを信頼すべきかの議論がでていることを踏まえるとアンケート結果が正しく、環境DNAの分析の結果が誤っている可能性も否定できない。今回の結果のみでアンケート調査の信憑性を判断せず継続してアンケートによる調査と環境DNAによる調査の両⽅を⾏い検証していく必要がある

謝辞
・共同実験者（天野 怜・⻄⽥ 勇耶・河津 葵・和気 史奈・⻄⽥ 郁哉）のみなさん放課
後・⼟⽇お疲れさまでした
・⽇本学術振興会令和３年度科学技術研究費助成事業の助成を頂きありがとうございました・神⼾⼤学⼤学院⼈間発達環境学研究科教授 源 利⽂にご指導助⾔を頂きありがとうございました。
・ボジティブコントロールの採⽔には滋賀県⽴琵琶湖博物館⾦尾滋史博⼠にご協⼒いただきありがとうございました

アメリカザリガニ

ABCDE

アンケートの回答○✕○✕✕

環境DNAの解析

○○○○

○

ウシガエル

ABCDE

アンケートの回答○✕○○✕✕

環境DNAの解析

○○○

○イモリ

ABCDE

アンケートの回答○○✕✕✕

環境DNAの解析

○○○

○

○

アンケートの回答と環境DNAの分析結果
それぞれの生物が「いる」と判断できる場合 ・・・○
それぞれの生物が「いない」と判断できる場合・・・✕

PCR法による増幅

アカハライモリ

NC PC

電気泳動による増幅確認