博士（水産科学）

ム ハ マ ド イ ク ノ ヾ ル イ リヤ ス

学位論文題名Lipi
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ウカッZ
励（ 紅藻オゴノりの脂質とプロスタグランジン）

学位論文内容の要旨
Gracilaria vermiculophylla, an agar‑producing red alga, has been reported tocontain eicosanoid compounds, such as prostaglandins (Fusetani & Hashimoto, 1984;
Noguchi et al., 1994; Nakajima et al., 1998; Imbs et al., 2001), which are essenti
alsubstances for humans.However,in1
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1994)
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E2,andl5‑keto‑PG
E2(Fusetani & Hashimo
to, 1984;Noguchi etal.,1994; Nakajimaet al., 1998;Imbset al.,2001). In biosynthesis of prostaglandins,20:4
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rate(Nakajima et al., 1998).Howev
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prostaglandin synthesis in G.vermi
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― ユ239―liquid nitrogen and boiled for 30 min). Highest am
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en andthawed sample (26.5% of total lipids), followed by the sample stored at 20 0C (18.0%),
frozen sample (15.5%), freeze‑dried sample (5.2%), but very low amounts of FFA weredetected in the fresh and boiled samples (1.3 and l.1%). The FFAs were isolated by
preparative TLC with hexane‑diethyl ether‑acetic acid (80:20:1, v/v/v) and ana
lyzedby gas
chromatography. The major FFA components in all samples were palmitic acid (16:0;
18‑40% of total fa
tty acids)andarachidonic aci
d (20:4n‑6; 23‑43%).
Purification and characterization of glycerolipid acyl‑hydrolase
For confirmation of FFAs released from membrane lipids, a study on glycerolipidacyl‑hydrolase (galactolipase), an enzyme responsi
ble for glycogl
ycero
lipidhydr
olysis, wasconducted. The results showed that the galactolipase activity was higher toward
monogalactocyldiacylglycerol (MGDG), the major membrane lipid and phophatidylcholine(PC). Both of the membrane lipids are rich in 20:4n‑6. The glycerolipid acy
l‑hydrolase waspurified (18.9 fold) by sequential column chromatographies and characterized. SDS‑PAGE
showed a single band at molecular mass of about 20 kDa, which indicated the high pur
ity ofthe enzyme. The molecular mass of the enzyme was also determined by FPLC. The
estimated molecular mass of the enzyme was found to be about 40 kDa. These observations
demonstrated that the glycero
lipidacyl‑hydrolasefromG ve
rmicu
lophy
lla is lik
ely to bea homodimer of a 20 kDa subunit. Optimum temperature and pH for the enzyme were 37 0Cand 8.0, respectively. The purified enzyme also hydrolyzed both glycoglycerolipids andphospholipids. The enzyme was considered to be responsible for releasing arachi
donicacid,a subst
ratem prostagl
andinsynt
hesis
Prostaglandin contents
Five types of prostaglandins, PGE3, PGF2a, PGE2, 15‑keto‑PGE2, PGA2 and a‑ 1240 ‑prostaglandin intermediate, 15‑hydroperoxy‑PGE2 from G. vermiculophylla samples treateddifferently were identified by LC‑MS and quantified by ODS‑HPLC. The major
prostaglandins detected were PGE2 and l5‑keto‑PGE2. The highest amounts of PGE2 and15‑keto‑PGE2 were obtained from frozen‑thawed samples (109.9 and 97.2 Ug/g wet weight,respectively). The lowest amounts of both prostaglandins were found inboil
ed sa
mple(5.2and4.5yg/gwet w
eig
ht,respectively).
Mechanism of prostaglandin synthesis
Foreluci
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heacetonepowder (as a crude enzyme) prepared from the alga was incubated with arachidonic acid
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robiccondition
s. With the incubati
on underanaerobic
conditions, the production of PGE2 and l5‑keto‑PGE2 was declined along wi
th alow amountof l5‑hydroperoxy‑PGE2. Similar results were obtained when incubated in the presence of

5.6 mM and 10.1 mM ofaspi
rin,thusindicat
ingthatcyc
looxy
gena
se,an enzymeresponsible for synthesis of prostaglandins in mammals, is involved in theprost
aglan
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synthesis in t
his alga.Furth
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sionof l5‑hydr
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xy‑PG
E2 intoPGE2 was conducted. The hydroperoxy‑PGE2 was reduced using mild and strong
reductants, SrlCl2 and NaBH4, respectively. The l5‑hydroperoxy‑PGE2 was converted to
PGE2 under mild reducing conditions, whereas the l5‑hydroperoxy‑PGE2 was converted to
PGE2 andPGF2aunde
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pathway of prostaglandins in the alga might be similar to that of mammals. The proposedpathwayof prostag
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hesisis summar
izedin thefig
urebelow.

― 1241 ‑Glycoglycerolipids

PhospholipidsGalactolipa
sePhospholipase

Arachidonic acidooxygenase

H―ーーーー―一トOOH
15‑hydroperoxy‑PGE7――↓HHOHPGEー

Endoperoxides found in mammals

Fig. 1. Proposed pathway of pro
stagl
andinsynt
hesisin t
he red alg
aGv
ermiculoph
ylla.

― 1242 ‑学 位 論 文 審 査の 要 旨
主査
副査

教授
教授

板橋豊
伏谷伸宏

副査
副査

教授
宮下和夫
准 教 授 三 上浩司

学位論文題名Lip
ids andP
rostaglandins
in the Red Alga Gracila
rza ver7niculophylla（紅藻オゴノりの脂質とプロスタグランジン）

紅藻オゴノリ6．′acm門aレげ加セ酊叩カヅ仏はプロスタグランジンを多量に産生する特異な海藻として知られるが， その機能も生合成経路も不明である。本研究は，オゴノりのプロスタグランジンと前駆体脂肪酸（アラキドン酸）の生成メカニズムを明らかにしようとしたものである。得られた成果は以下のように要約される。
（1） 函館 の海 岸で 採取 した オ ゴノ りを 種々 の条件で処理して，総脂質中の遊離 アラキドン酸含量とプロスタグ ランジン含量を測定した。その結果，遊離アラキドン酸とプロ ス タ グ ラ ン ジ ン は 採 取 直 後 の 新 鮮 な 試料 や加 熱処 理し た試 料中 には 極め て少な く， 凍結 保存や解 凍した試料中に著量存在することを見出した（アラキド ン酸含量 ： 総 脂 質 中 20t‑‑30％ ； プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン 含 量 ： 150〜 200弘 g/g藻 体 ） 。
(2)オゴノりの細胞膜を構成する脂質（モノガラクトシルジアシルグリセロールなどのグリセロ糖脂質及びホスファ チジルコリンなどのグリセロリン脂質）を加水分解する酵素（ ガラ クト リパーゼ ）活性が加熱処理した試料以外のすべての試料中に存在 することを見出した。
（3）新鮮なオゴノリ藻体より調製したアセトン粉末から種々のクロマトグラフィーを用いて ガラ クト リパ ーゼ を精 製し ，そ の性 質を 明ら かに し た。 すな わち，精製 酵素はSDS− PAGEで は 20kDaの 単 一 バ ン ド を 示 し た が ， FPLC分 析 で は 40kDaの 位 置に 溶 出 し た こ と か ら ， ホ モ ダ イ マ ー で あ る こ と ， 至 適 温 度 は 37℃ で 至 適 pHは7.
0―8.0であることを明 らかにした。また，精製酵素はグリセロ糖脂質とりン脂質を加水分解したことから， 本酵素がオゴノりの細胞膜脂質よルプロスタグランジンの基質であるアラキドン酸を 遊離させるものと結論した。
(4)
オ ゴノ りの ガラ クト リパ ー ゼは ，細 切， 凍結，解凍などの物理的刺激（細胞 膜の破壊）によって活性化し， 細胞膜を構成するグリセロ脂質（糖脂質，リン脂質）を加水分 解し てア ラキドン 酸を遊離し，これが幾っかの酵素反応によってヒドロペ ルオキ
シ―プロスタグランジン E2に変わり，その後還元されて主成分であるプロスタグランジンE2（PGE2)に変換されることを明らかにした。
（5）高速液体クロマトグラフイーとオンライン質量分析法(
HPL
C/ESI―MS）を駆使して，― 1243ーオゴノりの産生するアラキドン酸代謝産物（エイコサノイド）を詳細に調べた。その結果， 主 要 成分 の PG
E2と ヒ ドロ ペ ル オキ シ PG
E2の 他に 数 種 のプ ロ ス タグ ランジ ン（PGF2a， PG
E3，15―keto―PGE2，PGA2)の他に ヒドロ キシエイ コサテ トラエン 酸(HETE)， ジ ヒド ロキ シエイコ サテト ラエン酸 (diHETE)の異性 体が多数 検出さ れ，
オゴ ノ り のア ラ キドン 酸代謝産 物が極 めて複雑 な組成を 有する ことを明 らかに した。
(6)
オゴ ノりの PGE
2産生はシ クロオキシゲナーゼ阻害剤（アスピリン）によって低下することを 見出し， 従来の説 とは異 なる生合 成経路 の存在する可能性を示した。また，
オゴ ノ り にお け るPG
E2
合成 の中間体 と考え られる15ー ヒドロ ペルオキ シPG
E2の産生は 酸 素 雰囲 気 化 で増 加 し ， 低酸 素 雰 囲気 化 で は極 端 に 低下 す る こと を明ら かにした。これらの結果は，オゴノりにおけるプロスタグランジン生合成の全容を解明する上で有益な知見を与えるものである。
(7)
申請 者の母 国である インドネシアで採集されたオゴノりもプロスタグランジン産生能の高いことを初めて明らかにした。
(8)イ ンド ネ シ ア産 の希 少海藻 E
xophy]
lum wentiiの 脂質成 分を初め て分析 し，アラ キドン 酸 が 総脂 肪 酸中30％ を占めた ことか ら，本藻 が紅藻 に属する ことを化 学的観点から裏付けるとともに，本藻がプロスタグランジン産生能を有しないことを明らかにし た 。 この 結 果は比 較生化学 や化学 分類学の 観点から も興味 深く，高 く評価 されるものである。
以上，本研究は，オゴノりの産生するアラキドン酸とプロスタグランジンの組成，生合成過程及 び関連 酵素の性 質を明 らかにし たものであり，よって審査員一同は，、申請者が 博 士 （ 水 産 科 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れる 資 格の あ るも の と 判定 し た。

ー 1244−