【三島海雲学術賞】（自然科学部門）

天然由来共役型脂肪酸の食品栄養学的特性に関する研究

都築東北大学大学院農学研究科
緒言

毅

准教授

あるα-ESA に興味を持ち、CLA にかわる安全な生理活

天然には、通常の二重結合ではなく共役化した二重性脂質になりうることを期待して、はじめにα-ESA の結合をもつ共役脂肪酸が存在する。牛肉や乳製品には、分析法を確立し、化学的性質を理解するうえで重要な酸リノール酸（LA, 9Z12Z-18:2）の幾何、位置異性体であ化安定性について検討した。そして、体内動態、脂質代る共役リノール酸（CLA）が、含まれている（Fig. 1）。

謝への影響や酸化ストレスの有無、抗癌活性試験、抗腫CLA は抗癌作用、脂質代謝改善作用、動脈硬化抑制作

瘍血管新生試験を行い、食品へ応用するために共役脂肪用、免疫増強作用、骨代謝改善作用などが認められ、健酸の安全性や有用性を検討した。

康補助食品として販売されている。CLA は、天然にお共役脂肪酸の分析法の確立 1）いて非常に少ないため、アルカリ異性化によって化学合成されている。近年、化学合成によって作られた天然にCLA については分析法が確立されていたが、α-ESAはない異性体に副作用が見出され、その安全性に疑問がの分析法は過去に検討されていなかった。共役トリエン持たれている。一方、天然には CLA 以外にも共役二重構造は共役ジエン構造と比べて不安定であることが考え結合をもつ脂肪酸が存在する。キリやニガウリなどのあられ、様々な試験を行ううえで分析法の確立が必要である 種 の 植 物 種 子 に はα-エ レ オ ス テ ア リ ン 酸（α-ESA,ると考えられた。そこで、異性化を極力防いでガスクロ

9Z11E13E-18:3）が存在している（Fig. 1）。また、紅藻

マトグラフ（GC）分析を行うための最適なメチル化条あるいは緑藻には、さらに長鎖の共役 EPA や共役 DHA件を明らかにしようとした。メチル化の方法は、酸触媒が見出されている。CLA についてはさかんに研究され法と塩基触媒法に分けることができる。酸触媒法は、脂ているが、他の共役脂肪酸は食品成分として摂取してい肪酸がエステル型、遊離型両方ともメチル化が可能な方る可能性はあるものの、生理活性や栄養的な調査はほと法ではあるが、条件が厳しく、時間がかかるという欠点んどされていない。我々は、比較的手に入れることが容がある。塩基触媒法は、温和な条件でメチル化ができ易なキリやニガウリの種子に含まれる共役リノレン酸でて、短時間で処理ができる方法である。しかし、それぞれの方法でメチル化できる脂質の選択性がある。結果、いずれの塩基触媒法でも共役脂肪酸のメチル化を安定に行うことができた（Table 1）。しかしながら、塩基触媒法には脂質選択性があるため、試料が限定される。そこで、塩基触媒法と同程度安定にメチル化を行える酸触媒法も決定する必要があった。その結果、キリ油由来のα-ESA を極力異性化することなくメチル化できたのは、14％BF3/MeOH 法であった（キリ油を弱アルカリ処理して遊離脂肪酸を調製し、室温で 30 分の処理）。また、遊離脂肪酸に調製した後、塩基触媒法のトリメチルシリルジアゾメタンを使用しても異性化することなくメチル化できた。したがって、α-ESA を含む試料の場合には、弱アルカリ処理をした後、14％BF3/MeOH 法もしくはFig. 1.

トリメチルシリルジアゾメタン法で行うこととした。

Chemical structures of fatty acids.
1

都

Table 1Methods*

築毅

Artiﬁcial isomerization of tung oil fatty acids depended on diﬀerent methylation procedures.
Reaction temp.
（℃）

Reaction time（min）

α-ESA

100
RT6060608080
100
1006060608080
100100
RT100
RT53051020510510510205105105530

67.685.281.9
72.0
62.1
54.3
26.1
40.6
12.9
84.6
77.6
65.5
75.4
56.2
63.2
37.6
91.8
90.8
79.7

AOCS（BF3/MeOH）
BF3/MeOH
HCl/MeOH

H2SO4/MeOH

NaOCH3/MeOH
TMG/MeOH
TMSN2CH3β-ESA

9,11,13-LnA

Others（％ of total conjugated fatty acids）
17.4
9.5
8.3
10.6
14.1
17.0
26.0
21.6
27.9
8.1
9.9
13.2
10.1
16.9
14.4
22.1
6.9
6.6
18.7

10.7
1.9
6.1
12.9
18.8
22.3
38.1
30.2
44.1
3.8
8.8
15.8
9.4
21.9
16.6
31.6
ND
0.4
0.54.3
3.4
3.6
4.5
5.0
6.4
9.8
7.6
15.2
3.5
3.7
5.5
5.1
5.0
5.8
8.8
1.3
2.1
1.1

* Details for the method s see the Materials and Methods section in the text.
The area of each peak of conjugated fatty acid was divided by the sum of all the peaks of conjugated fatty acids to calculate
percentages. Unknown artifacts were calculated as Others. AOCS, American Oil Chemists Society; ESA, eleostearic acid;
LnA, α-linolenic acid; RT, room temperature; TMG, Tetramethylguanidine; TMSN2CH3, Trimethylsilyldiazomethane.

共役脂肪酸の酸化安定性 2）

α-ESA の生理活性試験を行い、食品に応用する場合、安定性に関する情報は必要不可欠である。そこでα-ESAと酸素の反応性を、CLA や非共役脂肪酸と比較しながら評価した。遊離脂肪酸｛LA、9Z11E-CLA、10E12ZCLA、α-リノレン酸（LnA）、α-ESA｝の酸化安定性を評価するために、残存脂肪酸量、酸素吸収量、脂質ヒドロペルオキシド量、酸化二次生成物量を測定した。残存脂肪酸量や酸素吸収量の結果から、共役脂肪酸（CLAとα-ESA）は非共役脂肪酸（LA と LnA）より酸化されやすかった（Fig. 2）。しかし、脂質ヒドロペルオキシド量や TBARS 量は、共役脂肪酸ではほとんど生成しなかった（Fig. 2）。これより、共役脂肪酸と非共役脂肪酸
では酸化機構に違いがあると考えられた。また、α-ESAの酸化速度は、CLA よりはるかに早かった。次に、トFig. 2. Thin ﬁlm oxidation of fatty acids（LA, 9Z11E-CLA,10E12Z-CLA, LnA, and α-ESA）in an airatmosphere（0.5 mg/10 ml-test tube）at 37℃ for0–24 h. Changes in unoxidized fatty acids（A）,oxygen absorption（B）, lipid hydroperoxide（LOOH）
formation（C）and TBARS（D）are shown. Values
are means±SD（ ＝6）.

リアシルグリセロール（TG）型で試験した。共役脂肪酸はエステル型になっても、非共役脂肪酸と比べると酸化されやすかった（Fig. 3）。しかし、遊離型のときと比べると約 10 倍も酸化安定性が増すことがわかった。また、共役脂肪酸は抗酸化剤であるα-トコフェロール添加により、約 2 倍近く酸化安定性が増した（Fig. 3）。これ
により、共役脂肪酸の酸化安定性はエステル体にし、抗2天然由来共役型脂肪酸の食品栄養学的特性に関する研究

Fig. 4. Signiﬁcant occurrence of 9Z11E-CLA in the liverand plasma lipids of rats fed α-ESA-supplemented
diet.

Fig. 3. Oxidation of triacylglycerol samples（0.5 mg/10 mltest tube）in the presence of α-tocopherol. 0.1％
α-tocopherol was added to the triacylglycerol
samples and the mixtures were left to stand in an
air atmosphere at 37℃ for 12 d. The changes inunoxidized fatty acids after 12 d（A），and TBARS
after 12 d（B），are given. Values are means±SD（ ＝6）.

酸化剤を添加することによって飛躍的に安定性が増し、食品などに応用できることが明らかになった。また、非共役脂肪酸と比較して、抗酸化剤の影響をより強く受けることが明らかとなった。
Fig. 5. 9Z11E-CLA concentration in liver homogenate（HG）of male SD rats aged 5 weeks. α-ESA and coenzyme（CO）were added to liver homogenate. The
reaction was stopped after 10 min, and the 9Z11ECLA concentration was analyzed by GC. * Not
detected. Values are mean±SEM, ＝6. Values not
sharing the same superscript letter（* is excluded）
in each tissues are signiﬁcantly diﬀerent, ＜0.05.

共役リノレン酸の脂質代謝および生体内脂質過酸化の影響と吸収代謝 3 9）–共役脂肪酸は非共役脂肪酸と比較して酸化されやすいことがわかった。したがって、共役脂肪酸の摂取は体内で酸化ストレスを促進する可能性が考えられた。また、摂取したα-ESA が吸収されているかなど体内動態を扱った報告はない。α-ESA を食品に応用するために酸に CLA と保持時間が同一の未同定の脂肪酸が検出さも生体への安全性と体内動態を明らかにする必要があれた。これを Ag＋-HPLC にて単離し、GC-EI/MS 分析る。そこで、α-ESA についてラットでの吸収と代謝、と 13C-NMR 分析により、この脂肪酸は 9Z11E-CLA と決体内脂質過酸化に与える影響を明らかにしようとした。

定された（Fig. 4）。この興味深い代謝機構を詳細に検討

ラ ッ ト に LA、CLA、LnA、α-ESA を そ れ ぞ れ 摂 取 さした。同様の試験を無菌ラットで行ったところ、体内にせ、4 週間飼育した。血漿と肝臓の脂質組成と酸化スト

おいて 9Z11E-CLA が検出されたことから、この代謝反レス指標に 4 群で有意差はなかった。このことは、共役応はラット体内で起こることが明らかとなった。正常脂肪酸が、生体に対し悪影響を及ぼさないことを示してラットにα-ESA を経口投与すると、3 時間という短時間いる。α-ESA 食ラットの血漿と肝臓の総脂質構成脂肪で各部位（血漿、肝臓、腎臓、小腸粘膜、盲腸内容物）
3

都築毅に CLA が検出されたこと、α-ESA 摂取により生成するCLA が 9Z11E-CLA のみであることから、この反応は酵素反応であると考えられた。ラット肝臓ホモジネイトとα-ESA に補酵素を加えて反応させたところ、NADPH で9Z11E-CLA の生成が促進された（Fig. 5）。よって、αESA は、NADPH 依存性の酵素によりΔ13 位が飽和化され 9Z11E-CLA に代謝されることが明らかとなった。肝臓ばかりでなく、腎臓や小腸粘膜ホモジネイトでもΔ13 飽和化反応が確認されたこと、ラットの種（SD とWister）が違ってもΔ13 飽和化反応が確認されたことか
ら、この反応は、様々な種の組織や細胞で起こることが示唆された。
共役リノレン酸の抗癌作用 10 13）–

α-ESA がラット体内で CLA に転換されることを見出し た。 こ れ よ り、α-ESA は CLA 同 様 に 抗 癌 作 用 な ど
有益な生理活性を持つ可能性が考えられた。そこで、
Fig. 6. The back of nude mice transplanted with DLD-1
cells that received forcible fatty acid medication for
32 d. A, Transplanted mice fed the control（saﬄoweroil fatty acid）diet; B, Transplanted mice fed the
9Z11E-CLA diet; C, Transplanted mice fed the10E12Z-CLA diet; D, Transplanted mice fed the tung（tung oil fatty acid） diet. E, Tumor weight, bodyweight, and liver weight of mice transplanted with
DLD-1 cells that were fed a control, 9Z11E-CLA,
10E12Z-CLA, or tung diet. Values are shown as themean±SD （ ＝10）
. a, b, c; values with diﬀerent
superscripts are signiﬁcantly diﬀerent at ＜0.05.

α-ESA の抗癌作用を検討した。ヌードマウスの背部皮下 に ヒ ト 大 腸 癌 細 胞 で あ る DLD-1 を 移 植 し、LA、9Z11E-CLA、10E12Z-CLA、α-ESA を 32 日 間、 強 制 経口投与した。試験の結果、α-ESA は CLA と比較して強い癌増殖抑制効果が見出された（Fig. 6）。また、α-ESAは正常組織である肝臓に対しては何ら影響を与えていなかった。先の試験でもα-ESA 食ラットの血漿や肝臓で脂質組成や酸化ストレスに有意な差は見られなかった。

Fig. 7. Inhibitory eﬀect of ESA onangiogenesis（DAS assay）. Chambers ﬁlled with a suspension of DLD-1 humancolorectal adenocarcinoma cells were implanted subcutaneously in ICR mice. After 7 d of feeding with ESA（50 or100 mg/kg b.w.）or CLA（500 mg/kg b.w.）, the chambers were excised and the distribution of vessels around them
was photographed. Distribution of blood vessels in chambers ﬁlled with PBS and DLD-1 cell suspension in ESA- orCLA-treated mice. Control mice（−）or（＋）received chambers containing PBS（−）or DLD-1 cells（＋）and wereadministered corn oil（vehicle）. b.w., body weight of mouse. −, no addition; ＋, addition.
4天然由来共役型脂肪酸の食品栄養学的特性に関する研究

役 DHA についても、抗血管新生作用を見出した 20, 21）。

これより、α-ESA は癌細胞に選択的に細胞死を誘導することが考えられた。次に、細胞培養試験にて癌抑制メ

さらに、血管新生は肥満の進展にかかわっている。

カニズムの詳細な検討を行った。はじめに細胞生存試験

これに関係して、共役脂肪酸である共役 EPA や共役を行い、α-ESA が CLA より強い殺癌細胞効果を示すこ

DHA について、抗肥満効果を見出した 22, 23）。とを明らかにした。その後、細胞より DNA を抽出し、ま と め

DNA 断片化率を求め、アポトーシス実行因子であるCaspase3, 8, 9 の活性および mRNA の発現量を測定し、本研究は、従来不明であった分子内に共役二重結合α-ESA によりアポトーシスが誘導されることを見出しを有する脂肪酸について、その栄養生理作用を試験管試た。また、α-ESA が癌細胞に酸化ストレスを与えてい験から細胞培養試験、動物試験まで幅広く検討を行い、ることを、過酸化リン脂質量と TBARS 量を測定するこ食品への応用を目指した。はじめに食品や生体試料中のとで明らかにし、抗酸化物質であるα-トコフェロール添共役脂肪酸の定量法を確立し、さらにその酸化安定性が加によりアポトーシス誘導がキャンセルされたことかグリセリド構造をとることにより向上すること、抗酸化ら、α-ESA は癌細胞特異的に、脂質過酸化を介したア物質としてビタミン E の使用が有効であることを明らかポトーシスを誘導することが明らかとなった。にした。そして、動物試験で共役脂肪酸の体内動態と脂また、共役リノレン酸以外の共役脂肪酸である共役質代謝への影響を検討し、脂肪酸にこれまでには報告さ14–18）れていない独特な代謝経路を発見した。また、本研究にEPA や共役 DHA についても、抗癌活性を見出した。

より、共役脂肪酸による抗癌作用、腫瘍血管新生抑制作
共役リノレン酸の抗血管新生作用 19）用、抗肥満作用を新たに見出した。

α-ESA に CLA より強い癌抑制効果があることを見出謝した。その時、α-ESA を投与したマウスの癌組織では、

辞内部が変色し、壊死を起こしていた。これは癌組織内部

このたびは大変栄誉ある三島海雲学術賞を授与してにまで栄養が行き届いていない状態であり、栄養を運ぶいただき、公益財団法人三島海雲記念財団関係者の方々血管が新生されていないと考えられた。よって、α-ESAをはじめ、選考委員の先生方、また本賞にご推薦頂きまに血管新生を抑制する可能性が考えられた。癌の発生とした日本栄養・食糧学会に厚く御礼申し上げます。本研

進展には、血管系がさまざまな形で密接に関係してい究は、東北大学大学院農学研究科で行われたものです。

る。癌が増殖するときには、宿主から癌組織に向かう血ご指導いただいた宮澤陽夫先生（東北大学教授）ならび管の新生が重要なステップになる。現在、癌治療の目的に研究に協力して下さった学生ならびに共同研究者ので血管新生を抑制する成分が注目されている。そこで、方々に深く感謝致します。

α-ESA の血管新生抑制効果をとで試験し、その作用機構を遺伝子発現レベルで検討した。マウ

文ス背部皮下法にて

1） M. Igarashi, et al.:121–128, 2004.
2） T. Tsuzuki, et al.:
3） T. Tsuzuki, et al.:195–200, 2003.
4） T. Tsuzuki, et al.:
5） T. Tsuzuki, et al.:
6） T. Tsuzuki, et al.:2034–2040, 2007.
7） K. Sato, et al.:371, 2011.
8） N. Shinohara, et al.:
9） R. Kijima, et al.:
10） T. Tsuzuki, et al.:
11） Y. Mizushina, et al.:
12） T. Tsuzuki, et al.:
2007.
13） N. Shinohara, et al.:988, 2012.

で 検 討 し、 ヒ ト 内 皮 細 胞（HUVEC）を用いて、血管新生の重要なステップである細胞の増殖、遊走、管腔形成を評価した。また、定量
RT-PCR 法にて、血管新生に関与する分子のタンパク質量と mRNA 量の動向を追った。その結果、α-ESA はで 血 管 新 生 を 強 力 に 阻 害 し た（Fig. 7）。 そ し て
HUVEC の管腔形成や細胞増殖、細胞遊走を抑制した。

α-ESA の血管新生阻害メカニズムは、血管内皮細胞増殖因子であるVEGF の受容体発現を阻害すること、PPARγ を活性化することを明らかにした。よって、α-ESA の生理機能として、強い血管新生抑制作用が新たに見出された。
また、α-ESA 以外の共役脂肪酸である共役 EPA や共5献（）, 50,, 39, 475–480, 2004.
（）, 49,, 134, 2634–2639, 2004.
, 136, 2153–2159, 2006.
（, 71,）,57, 364–, 61, 433–441, 2012.
, 62, 305–312, 2013.
, 25, 1417–1425, 2004.
, 39, 977–983, 2004.
, 1771, 20–30,1821, 980–都14） T. Tsuzuki, et al.:
15） T. Tsuzuki, et al.:16） Y. Yonezawa, et al.:2005.
17） Y. Yonezawa, et al.:206, 2005.
18） Y. Yonezawa, et al.:築毅19） T. Tsuzuki, Y. Kawakami:, 29, 797–806,2008.
20） T. Tsuzuki, et al.:
, 71,1902–1910, 2007.
21） T. Tsuzuki, et al.:, 137, 641–646, 2007.
22） T. Tsuzuki, et al.:
, 40, 1117–1123, 2005.
23） T. Tsuzuki, et al.:, 17, 518–524, 2006.

, 134, 1162–1166, 2004.
, 40, 147–154, 2005.
, 70, 453–460,, 435, 197–, 30, 1197–1204, 2007.

6