（株）機能性ペプチド研究所「エンブリオパック」非共培養を用いた牛体外受精胚の作成

裸化受精卵無血清培養法（低酸素培養）
Ｖｅｒ. 1.2

1997年12月1日
本プロトコールは「（株）機能性ペプチド研究所」で作製されたものです。無断複写、転載を禁止します。
編集、発行者（株）機能性ペプチド研究所
山形市下条町４丁目３-３２〒 990-0823
TEL 023-646-2525

IFP
株式会社機能性ペプチド研究所

（株）機能性ペプチド研究所①

卵子回収(OCM)

卵子成熟用培養液(IVMD-101)の準備

第１日

①
卵子選別

③

成熟培養(IVMD-101)⑤

精子洗浄、調整(IVF-100)⑥

第２日⑨35.8℃
5%CO 2, in air

裸化受精卵培養液(IVD-101)の準備

④24hr

⑥⑦

媒精液(IVF100)の準備

洗浄

第３日

⑩
卵子裸化

⑪

低酸素培養(IVD-101)(IVF-100)

38.5℃
5%CO 2,5%O 2
90%N 2

6hr
⑧

洗浄

③

胚盤胞形成まで培養（６ー８日）

受精卵前培養(IVMD-101)

-1-

洗浄

⑪

媒精卵子成熟用培養液(IVMD-101)の準備＊気相の酸素濃度をコントロールできる炭酸ガス培養装置または相当の装置が必要。

35.8℃
5%CO 2, in air-2-

（株）機能性ペプチド研究所

必要器材

裸化受精卵無血清培養法操作説明（低酸素培養法）

1)「エンブリオパック」非共培養基本セット（製品番号、IFP3456K）
卵子成熟、共培養用培養液（IVMD-101）
媒精液（IVF-100）、タイプＩコラーゲン液
または「エンブリオパック」非共培養完全セット（製品番号、IFP3456C）※タイプＩコラーゲン液に代わってリプロＣ-１プレートが入っています。
2) 卵子回収液（OCM）（製品番号：IFP9611）

第一日(1) 卵子回収・屠場で採取した卵巣を、約38.5℃で保温した滅菌生理食塩水で洗浄し、ハサミで子宮間膜に接着していた部分から縦半分に切開し、余分な組織や血管、黄体を取り除き、約38.5℃に保温した滅菌生理食塩水中に保存する。
・全ての卵巣を切開後、殺菌のため１分以内で70%エタノール洗浄し、エタノールを捨て、保温した滅菌生理食塩水でただちにエタノールを洗い流す。
・切開法あるいは吸引法等で卵子を卵子回収液（OCM）に採卵する。
・採取された卵子卵胞液等の混合物を適量の卵子回収液（OCM）で希釈し、

3) 滅菌生理食塩水／1〜2リットル

プラスチックシャーレ（FALCON 1012）に約10mlづつ分け入れ、実体顕

4) 70%消毒用アルコール／500ml

微鏡下で観察し、卵丘細胞が膨潤せずに5層以上ついている卵子を回収する。

5) 酒精綿6) ディスポーザブル注射器及び注射針

注意：7) 替え刃メス（フェザーＮｏ.20）

屠殺牛卵巣卵子を用いる場合、卵巣は屠殺直後から酸素欠8) 採卵用プラスチックシャーレ（ファルコン1012）乏状態に陥ります。そのため時間の経過と共に多量の乳酸

9) 篩い（500µm,が組織内に蓄積し、卵子や顆粒層細胞にさまざまな傷害がステンレス製、）

10) 組織培養用プラスチックシャーレ（住友ベークライト製浮遊 培養用、引き起こされることが考えられます。このような酸素欠乏

カタログNo. MS-1160R）による組織への悪影響をできるだけ少なくすることが体外または、リプロＣ-１プレート（（株）機能性ペプチド研究所、IFP967C）

受精を成功させるための大事なポイントになります。

卵巣11) 15ml滅菌試験管（スピッツ型、ポリプロピレン製）

運搬時の温度を15〜20度 に設定し、卵子採取開始までの12) 培養試験済みミネラルオイル（パラフィンオイル）

時間を 屠殺後３時間以内 に設定することをお奨めします。

13) 実体顕微鏡
14) 炭酸ガスインキュベータ(2) 成熟培養液（IVMD-101）の準備

15) O２／CO２インキュベータ（酸素濃度制御可能な 培養装置）

・ 事前に成熟培養（IVMD-101）バイアルから滅菌ディスポーザブル注射器

16) 恒温水槽で培地を抜き取り、350μlの培養液ドロップをシャーレ（住友ベークライト17) 滅菌ビーカー

MS-1160R、直径60mm）1枚当たり7個作り、5%炭酸ガスインキュベータ

18) その他内でガス平衡する。
-3--4-

（株）機能性ペプチド研究所（培養液ドロップの作り方：50µlの培養液をシャーレ1枚につき7ケ所にピ（培養液ドロップの作り方：50µlの培養液をシャーレ１枚につき７カ所にピペットの先端で滴下する。ミネラルオイル13mlをそそぎ込み、更にそれぞれペットの先端で滴下する。ミネラルオイル13mlをそそぎ込み、洗浄用培地の培地ドロップに300µlずつ培養液を追加する。最終培地量：350µl。）

ドロップに更に300µlずつ追加する。）
リプロＣ−１プレートを用いた培養

リプロＣ−１プレートを用いた培養
リプロＣ−１プレートを用いる場合、各ウエル200〜250µlの培地を入れ、約100µlのミネラルオイルを重層します。
成熟培養にはウエルに20〜25個の卵子を入れます。

リプロC-1プレートの各ウエルに、洗浄として250µl、媒精用に50µlの媒精液（IVF-100）を必要なウエルの数だけ準備する。

(5) 凍結精子洗浄、調製(3) 卵子選別及び成熟培養・ 回収した卵子を成熟培養用培養液（IVMD-101）の 1ドロップに集めさらに選抜し、選んだ卵子を3回以上洗浄した後、1ドロップ（350µl）に24〜30個ずつ入れ、体外成熟培養を行う。
培養条件（38.5℃, 5%炭酸ガス, 95%空気 , 22〜24時間）
注意：
＠、卵丘細胞以外の卵胞膜等の付属組織は出来るだけ取り除く。

・ 媒精液（IVF-100）を容量15mlのスピッツ型ポリプロピレン製滅菌試験管２本に、それぞれ6ml、10ml用意し、38.5℃の恒温水槽で保温。
・ 精子の凍結ストローを35℃前後の温水で融解し、保温した6mlの媒精液（IVF-100）に懸濁し、懸垂型遠心分離機で2,000回転／分、5〜7分間遠心し、精子を沈殿させる。
・ 遠心後、ただちに上清を捨て（この時、沈降した精子まで吸引しないように注意する、培養液約0.5mlを残すと精子のロスがない。）保温した媒精液（IVF-100）10mlの内、6mlを加えて懸濁し遠心。

第２日

・ 上清を捨て（培養液約0.2mlを残す）、保温した媒精液（IVF-100）を1ml(4) 媒精液（IVF-100）の準備

加え懸濁後、10μlを取り、3%食塩水で100倍に希釈して血球計算盤で精子・シャーレに媒精液（IVF-100）で卵子洗浄用（350μl）と媒精用（50μl）

数を計算する。のそれぞれの培養液ドロップを作成し、5%炭酸ガスインキュ ベータ内で・ もとの精子懸濁液の精子濃度が1ｘ10７個／mlになるように媒精液（IVF100）を加えて調整する。

ガス平衡する。
媒精液（ＩＶＦ-１００）(6) 卵子洗浄及び媒精・ 媒精用ドロップ（50μl）に、さらに50μlの精子懸濁液を加える。

50μl350μl（50μl+50μl=100μl 最終濃度5×10６精子／ml）
・ 体外成熟後の卵子を洗浄用ドロップ(350µl)で３回洗浄後、媒精用ドロップ（100μl）に移し、体外受精を行う。
培養条件（38.5℃, 5%炭酸ガス , 95%空気 , 6時間）

ミネラルオイル
卵子洗浄用

-5-

媒精用

-6-

（株）機能性ペプチド研究所

注意：
＠媒精液（IVF-100）はアルブミン、へパリンその他の精子受精能無処理シャーレ

コラーゲン処理シャーレ
共培養用培養液（ＩＶＭＤ-１０１）
350μl

獲得を促進する物質を含んでいます。そのため、精子は極めて早く受精能を獲得し、短時間で受精が終了します。６時間の培養で十分な受精率が得られます。
＠IVF-100はスウィムアップ法での精子の選抜には使用できません。

ミネラルオイル

＠IVF-100で洗浄調製した精子懸濁液は卵子に処理する前の前培養を必要としません。

培養用

受精卵洗浄用リプロＣ−１プレートを用いた培養(7) 受精卵前培養の準備◎シャーレのコラーゲン処理

リプロＣ−１プレートを用いる場合、プレートの各ウエルに培養液・ シャーレに冷却したコラーゲン液150μlでドロップをつくり（シャーレ（IVMD-101）を200〜250µl分注し、約100µlのミネラルオイル一枚当たり4ドロップまで）蓋をして室温で1時間静置する。
・ 1時間後、コラーゲンドロップを吸引除去し、150μlのＰＢＳ(-)を同じ場所に滴下する。
・ＰＢＳ(-)を吸引除去後、共培養用培養液（IVMD-101）で同様に洗浄し、ミネラルオイル（13ml）を流し入れ、コラーゲン処理した部分に、上から共培養用培養液（IVMD-101）を350µl 滴下して共培養用ドロップを作成する。
（コラーゲン処理シャーレは乾燥させて室温に保存できますので、時間の空いている時に多めに作っておくと便利です。ただしコーティング部分がを重層します。

(8) 受精卵の洗浄と受精卵前培養
・ 媒精６時間後、受精卵洗浄用のドロップ内で受精卵をピペッティングし、透明帯周囲の細胞を残し、余分な細胞と精子を取り除き（9ページ写真2と写真3を参照）、コラーゲン処理した培養用ドロップに移し、下記の培養条件下で24時間前培養する。
培養条件（38.5℃, 5%炭酸ガス , 95%空気、 24時間）
＠この培養によって、卵丘顆粒膜細胞はシャーレに結合し、受精卵の裸化操作が容易になります。

わかるように何らかの方法で印を付けて下さい。）
・ 無処理シャーレに共培養用培養液（IVMD-101）で洗浄用のドロップ（350µl)を作成し、インキュベータ内でガス平衡化する。
（培養スポット数+２〜３の割で作ると無駄がない。）

注意：
無血清培養液には細胞接着因子が含まれておりません。卵丘顆粒膜細胞の付着を促進するためコラーゲン処理を行う必要があります。
添付のコラーゲン液でのコーティングを忘れずに行って下さい。

リプロC-1プレート（（株）機能性ペプチド研究所、IFP967C）を用いるとコラーゲン処理の必要はありません。

-7--8-

（株）機能性ペプチド研究所

写真２：：媒精後6時間第３日(9) 裸化受精卵培養液（IVD-101）の準備
・ シャーレに裸化受精卵培養液（IVD-101）で発生培養用ドロップ（350ul、シャーレ当たり4ドロップまで）と洗浄用のドロップ（350μl）を用意し、インキュベータ内でガス平衡化する。
＠コラーゲン処理は必要ありません。
（38.5℃、5%酸素、5%炭酸ガス、 90%窒素）

裸化受精卵培養液（ＩＶＤ-１０１）
350μl

ミネラルオイル

写真３：

媒精終了後余分な卵丘細胞を除去した状態

受精卵洗浄用

発生用
リプロＣ−１プレートを用いた培養

リプロＣ−１プレートを用いる場合、プレートの各ウエルに培養液（IVD-101）を卵子数に応じて50〜250µl分注し、約100µlのミネラルオイルを重層します。
(10) 受精卵の裸化
・ 前日から培養していた卵丘・顆粒膜細胞で覆われている胚を、極細いピペット（使用時に洗浄済みのDrummondの100μlﾏｲｸﾛﾋﾟﾍﾟｯﾄを引いて作製）で、取り出し、注意深くピペッティングを行い、裸化胚にする。
（１１ページ写真4を参照）
注意：

-9-

卵丘顆粒膜細胞は出来るだけ完全に除去すること。

-10-

（株）機能性ペプチド研究所(11) 裸化受精卵の洗浄及び低酸素培養
・ 裸化した胚を洗浄用ドロップに移して洗浄し、卵丘・顆粒膜細胞が完全に剥離していることを確認。
・ 裸化受精卵培養液（IVD-101）で作成した発生用のドロップに移し換え、下記条件下で培養する。
培養条件（38.5℃, 5%酸素 , 5%炭酸ガス , 90%窒素 ）・ 裸化培養開始から３〜４日後に培養液を半量交換

写真4：して、培養を続ける。

卵丘細胞を完全に除去した受精卵【培養液使用上の注意】：
１、培養液は全て滅菌済みです。このまま使用して下さい。
２、ボトルに充填してある培養液は、再濾過滅菌は行わないでください。発生促進活性が失われます。
（再濾過滅菌の禁止）
３、無血清培養操作を行う場合、卵子操作用のガラスキャピ
ラリーピペット以外にガラス製の器具は使わないで下さい。
４、凍結厳禁、４°Ｃ保存。
５、使用期限厳守、ボトルの培養液は製造後２カ月。
６、 この培養液は牛受精卵専用です、他の動物では試験を行っていません。
７、 ヒト体外受精には使用しないで下さい。

8、注射薬ではありません。
本製品ならびに培養操作等に関するご質問は電話，ＦＡＸ等で下記宛にお願いします。
（株）機能性ペプチド研究所〒990 山形市下条町４丁目３-３２TEL
023-646-2525
E-mailservice@func-p.co.jp

-11-

Fax

023-646-2526