鼻粘膜過敏性亢進抑制作用を指標とした第２世代抗ヒスタミン薬の再評価
広島大学 原爆放射線医科学研究所
かみぬま

神沼おさむ

修教授

鼻粘膜過敏性亢進抑制作用を指標とした
第 2 世代抗ヒスタミン薬の再評価

広島大学原爆放射線医化学研究所

神沼修

【要旨】
花粉症等アレルギー性鼻炎治療を目的として、多くの第２世代抗ヒスタミン薬がスイッチ OTC化されているが、その有効性の優劣は明らかではない。われわれは最近、マウスアレルギー性鼻炎を用いた解析により、その各種症状誘発やその悪化に繋がる本質的な病態として、鼻粘膜過敏性亢進（NHR）が発症することを見いだした。そこで今回、感作マウスにおける抗原誘発NHR 発症モデルを用い、第２世代抗ヒスタミン薬の効果を検討した。感作マウスに抗原を点鼻チャレンジすることにより、即時型鼻炎反応（INR）、NHR および鼻粘膜への好酸球ならびに好中球浸潤が誘導された。エピナスチン、ベポタスチン、フェキソフェナジンおよびクロルフェニラミンの経口投与によって、それらの反応は影響を受けなかった。一方ロラタジンも、鼻粘膜炎症細胞浸潤には影響を与えなかったが、INR および NHR は有意に抑制した。ロラタジンが、他の抗ヒスタミン薬類とは異なる未知の作用機構を介し、アレルギー性鼻炎に高い治療効果を示す可能性が示唆された。

１、調査・研究目的
加速度的に患者数が増加している花粉症等のアレルギー性鼻炎領域では、セルフメディケーションが重点的に推進されており、近年、多くの第２世代抗ヒスタミン薬について、スイッチOTC 化が実現している。一方、即効性や持続性、眠気等の副作用の点で若干の相違がみられるものの、各製品間の決定的な相違に関する情報が乏しいことから、各患者が自らの判断で製品を選択することが困難な状況となっている。結果として、多くの患者が今なお医療機関を受診し続けており、それがセルフメディケーション推進の妨げとなっている。
エピナスチン、エバスチン、セチリジン、ベポタスチン、フェキソフェナジン、ロラタジン等に代表されるスイッチ OTC 第２世代抗ヒスタミン薬類の殆どが、各々臨床試験時には、比較対照とされた既存の抗ヒスタミン薬より優れた有効性を示したことから、医療用医薬品として上市に至った経緯がある。しかしながらその優位性の要因を、主たる薬効メカニズムの抗ヒスタミン作用だけで説明することは難しい。一部の薬剤には、マスト細胞の脱顆粒抑制効果や、ロイコトリエン・27インターロイキン産生抑制効果がみられることも報告されているが、それが臨床効果にどれだけ寄与するかも不明である。
アレルギー性鼻炎の罹患および重症度は、一般的にくしゃみ、鼻漏および鼻閉等の臨床症状を指標に評価されるが、申請者は最近、そのマウスモデルを解析する中で、種々の症状悪化に繋がる本質的な病態とその発症機構の存在を明らかにした。感作マウスに抗原を反復点鼻チャレンジすると、徐々にくしゃみ反応を呈する。しかしこれは、単純に IgE を介して抗原特異的に脱顆粒したマスト細胞から放出されたヒスタミンに対するくしゃみ応答ではなく、非特異的刺激に対するくしゃみ応答の増強、すなわち鼻粘膜過敏性亢進（Nasa hyperresponsiveness：NHR）を反映した反応であることを見いだした [1]。さらにこの抗原誘発 NHR に、IgE ／マスト細胞は殆ど関与しない一方、抗原特異的 T 細胞の存在が、その発症の必要十分条件となることや、アレルギー性鼻炎に対するステロイド剤の強い有効性の少なくとも一部分は、NHR 抑制作用に基づくことも解明した [2]。
この新たに見いだした病態メカニズムに対する、各種第２世代抗ヒスタミン薬の作用はこれまで明らかにされていない。T 細胞依存性病態への有効性も期待できる。そこで本研究は、申請者が樹立した、感作マウスにおけるアレルギー性 NHR 発症モデルを用い、第２世代抗ヒスタミン薬の効果、およびその薬剤間での相違を明らかにすることを目的として実施した。

２、調査・研究方法
2-1動物

6-8 週齢の雌性 BALB/c マウス（広島実験動物、広島）を用いた。本実験計画について、事前に広島大学動物実験委員会の承認（承認番号：A21-32）を得て研究を実施した。
2-2

抗ヒスタミン薬

Epinastine Hydrochloride（EPN）、Bepotastine Besilate（BPT）、Fexofenadine
Hydrochloride（FXF）、Loratadine（LRT） および Chlorpheniramine Maleate（CLP） は、東京化成工業（東京）より購入した。各薬剤は、0.5% メチルセルロース溶液に懸濁して経口投与（p.o.）し、コントロール群の動物には溶媒のみを投与した。
2-3

感作および抗原チャレンジ

実 験スケジュールを図 1 に示した。マウスに 20μg ovalbumin（OVA; Sigma, St. Louis,MO, USA）と 2 mg alum（Inject Alum; Thermo Fisher Scientific, Chicago, IL, USA）のエマルジョンを day0, 7, 14 および 21 の 4 回、腹 腔内投与（i.p.）することにより感作した。
Day35 から 4 日間、感作マウスに 20μl phosphate-buffered saline（PBS）に溶解した OVA（600μg）を 1 日 1 回、点鼻チャレンジ（i.n.）した。陰性コントロール群の動物には PBS のみをチャ28レンジした。薬剤の効果検討にあたり、EPN（20 mg/kg）、BPT（20 mg/kg）、FXF（120mg/kg）、LRT（10 mg/kg）および CLP（24 mg/kg）を Day35 から 3 日間、OVA チャレンジの 30 分前に投与した。
2-4

即時型鼻反応（immediate nasal response：INR）と NHR

3 回目のチャレンジ直後から 5 分間、マウスにみられたくしゃみ反応の回数を計数することにより、INR を評価した。最終チャレンジの 6 時間後に 10μl のヒスタミン溶液（100 mM；ナカライテスク、京都）を投与して誘発されるくしゃみ反応の回数を 5 分間計数することにより、NHR を評価した。
2-5

鼻粘膜炎症細胞浸潤反応

NHR 解析後、マウスを過麻酔により安楽死させ、鼻腔洗浄を行って炎症細胞を回収した。
鼻腔洗浄液（nasal lavage fluid：NALF）中の細胞数を計数した後、サイトスピン 4（Epredia,Kalamazoo, MI, USA）で細胞の単層塗抹標本を作製した。Differential Quik Stain Kit（Dade Behring, Deerfield, IL, USA）で染色後、形態学的評価により細胞分類を行った。
2-6

統計解析

実験結果は、平均値±標準誤差で表示した。統計解析として、一元配置分散分析の後、Dunnett の方法で検定を行った。p < 0.05 を統計学的有意差有りと判定した。

３、調査・研究成果
3-1

INR および NHR に対する作用感作マウスに反復抗原チャレンジすることにより、PBS をチャレンジした陰性コントロール群に対し、有意なくしゃみ反応の増加、すなわち INR が認められた（図 2A）。この反応は、
LRT 投与により有意に抑制された一方、EPN、BPT、FXF または CLP 投与では影響を受けなかった。
また、ヒスタミンによって誘発されるくしゃみ反応も有意に増強され、NHR の発症が観察された（図 2B）。この反応も、LRT 投与により有意に抑制されたが、その他の薬剤では影響を受けなかった。
3-2

鼻粘膜炎症細胞浸潤に対する作用感作マウスに反復抗原チャレンジすることにより、好酸球の有意な鼻粘膜浸潤と（図 3A）、好中球の浸潤増強傾向が観察された（図 3B）。それらの炎症細胞浸潤反応に対し、いずれの薬剤も有意な影響を与えなかった。

29

４、考察
独自に樹立した感作マウスにおける抗原誘発 NHR モデルにより、各種スイッチ OTC 第 2 世
代抗ヒスタミン薬の効果を比較検討した。その結果、LRT は INR および NHR を有意に抑制したが、EPN、BPT、FXF および CLP は、いずれにパラメーターに対しても影響を与えないことが明らかとなった。
鼻漏、鼻閉と共にアレルギー性鼻炎の三大症状に含まれるくしゃみ反応は、抗原感作された患者の鼻粘膜に曝露された抗原を、IgE を介して認識したマスト細胞が脱顆粒することにより放出されたヒスタミン等のケミカルメディエーターの作用によって誘発されると考えられている [3]。
今回の被験薬を含めた抗ヒスタミン薬類は、そのヒスタミンによる症状発現の低減を目的として臨床応用されている。しかし、LRT 以外の薬剤が INR 反応を抑制しなかったことから、この反応にはヒスタミンが関与しない可能性が示唆される。このことは、感作マウスにおける抗原誘発 INR 反応が、IgE を介したマスト細胞の脱顆粒によって放出されたヒスタミンの作用ではなく、非特異的刺激に対するくしゃみ反応の増強、すなわち NHR を反映したものであることを明らかにしたわれわれの報告 [1] と合致する。
そこで、抗原誘発 NHR に対する各薬剤の効果を検討したところ、やはり LRT のみに NHR抑制効果が認められた。LRT は、今回検討した他の抗ヒスタミン薬類と異なり NHR を抑制し、その結果として INR 抑制効果もみられた可能性が示唆された。
一方、INR および NHR を抑制した LRT を含め、今回検討した抗ヒスタミン類は、抗原チャレンジによって誘発される鼻粘膜への好酸球および好中球浸潤に対する影響を示さなかった。
われわれは、感作マウスにおける抗原誘発鼻粘膜炎症細胞浸潤に対し、抗原特異的 IgE およびマスト細胞が殆ど関与しないことを明らかにしている [1]。また好酸球は、気管支喘息等、他のアレルギー疾患では重要な役割を担うことが示されているが [4]、われわれの鼻炎モデルで発症する NHR には、好酸球も殆ど関与しないことを確認している [1]。今回の結果は、それらの報告と矛盾しないだけでなく、LRT に独特の新たな作用メカニズムを示唆するものとなった。すなわち LRT は、好酸球または好中球浸潤に対する影響を介することなく、INR および NHR を抑制したことが明らである。
われわれは、感作マウスに抗原チャレンジすることにより発症する NHR に、抗原特異的 CD4陽性 T 細胞が強く関与していることを明らかにしている [1]。それだけでなく、in vitro で分化誘導したさまざまな T 細胞サブセットを移入したマウスに抗原チャレンジすると、各々の特徴的に誘導される鼻粘膜の炎症像の違いにかかわらず、共通して NHR が発症することを見いだした[1]。このことは、各種 T 細胞サブセットが、好酸球や好中球の浸潤誘導を介することなく、直接 NHR を制御する可能性を示唆しており、LRT が炎症細胞浸潤に対する影響を介さず INR お
よび NHR 抑制作用を示した今回の結果とも良く合致する。Bryce らは、感作マウスの気管支喘息モデルに LRT の活性代謝産物である desloratadine を投与することで、抗原チャレンジに伴う気管支肺胞洗浄液中の Th2 サイトカイン濃度上昇が抑制されたことを報告しており [5]、LRT の30標的細胞が T 細胞である可能性が示されている。
LRT の影響による NHR 抑制作用が、薬剤投与から 24 時間以上経過してもみられたこと、ならびに検討した他の抗ヒスタミン薬に効果が認められなかったことから、その効果は、抗ヒスタミン作用以外のメカニズムで得られたことは明白である。今後、T 細胞の活性化機構に対するLRT の影響を詳細に検討してゆくことで、他抗ヒスタミン類と異なる LRT の、これまで知られていなかった有効性発現機構の解明に結びつくと共に、未知の NHR 発現誘導因子を標的としたアレルギー疾患治療法開発への新たな道が開ける可能性が示唆された。

５、まとめ検討した 5 種類のスイッチ OTC 第２世代抗ヒスタミン薬（EPN、BPT、FXF、LRT、CLP）のうち、LRT だけが感作マウスにおける抗原誘発 INR および NHR に対する抑制作用を示し、その効果は、鼻粘膜への炎症細胞浸潤への影響とは関係なく発揮されることが示唆された。
LRT が、他の抗ヒスタミン薬類とは異なる未知の作用機構を介し、アレルギー性鼻炎治療において高い有効性を示す可能性が示唆された。

６、調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
1)

神沼修ほか、感作マウスにおける抗原誘発鼻粘膜過敏性亢進に対するロラタジンの作用．

投稿準備中．

７、引用文献1. Nishimura, T.; Kaminuma, O.; Saeki, M.; Kitamura, N.; Matsuoka, K.; Yonekawa, H.;
Mori, A.; Hiroi, T., Essential contribution of CD4+ T cells to antigen-induced nasal
hyperresponsiveness in experimental allergic rhinitis. PLoS One 2016, 11, e0146686.
2. Nishimura, T.; Kaminuma, O.; Saeki, M.; Kitamura, N.; Gotoh, M.; Mori, A.; Hiroi, T.,
Effects of anti-allergic drugs on T cell-mediated nasal hyperresponsiveness in a murine
model of allergic rhinitis. Allergol. Int. 2018, 67 Suppl 1, 25-31.
3. Okubo, K.; Kurono, Y.; Ichimura, K.; Enomoto, T.; Okamoto, Y.; Kawauchi, H.; Suzaki, H.;
Fujieda, S.; Masuyama, K., Japanese guidelines for allergic rhinitis 2020. Allergol. Int.
2020, 69, 331-345.
4. Garcia, G.; Taille, C.; Laveneziana, P.; Bourdin, A.; Chanez, P.; Humbert, M., Anti-31

interleukin-5 therapy in severe asthma. Eur. Respir. Rev. 2013, 22, 251-7.
5. Bryce, P. J.; Geha, R.; Oettgen, H. C., Desloratadine inhibits allergen-induced airway
inflammation and bronchial hyperresponsiveness and alters T-cell responses in murine
models of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2003, 112, 149-58.

図 1．実験方法とタイムスケジュール．
+ alum を 4 回腹腔内投与することにより感作した BALB/c マウスに、各抗ヒスタミン
図OVA
1．実験方法とタイムスケジュール．
投与下でより 1 日一回、被験薬を経口投与し、その30 分
OVA +OVAalumを点鼻チャレンジした。Day35
を 4 回腹腔内投与することにより感作した
BALB/c マウスに、各抗ヒスタ後にOVA を点鼻チャレンジした。3回目のチャレンジ直後によりINR を評価し、最終チャレンジのミン投与下でOVA を点鼻チャレンジした。Day35
1 日一回、被験薬を経口投与し、6 時間後に NHR および NALF を解析した。

その 30 分後に OVA を点鼻チャレンジした。3 回目のチャレンジ直後に INR を評価し、最終チャレンジの 6 時間後に NHR および NALF を解析した。

図 2．感作マウスの抗原誘発 INR および NHR に対する抗ヒスタミン薬の作用．
感作マウスに EPN（20 mg/kg）、BPT（20 mg/kg）、FXF（120 mg/kg）、LRT（10 mg/
図 2．感作マウスの抗原誘発INRおよび NHR に対する抗ヒスタミン薬の作用．
kg）および CLP（24 mg/kg）投与下で OVA チャレンジした。3 回目のチャレンジ直後に INR感作マウスに EPN （20 mg/kg）、BPT（20 mg/kg）、FXF（120 mg/kg）、LRT（10（A）を評価し、最終チャレンジの 6 時間後に NHR（B）を解析した。p < 0.05, OVA チャレンmg/kg）および CLP（24 mg/kg）投与下で OVA チャレンジした。3 回目のチャレンジ直ジしたコントロール群との比較（N = 6）。

後に INR（A）を評価し、最終チャレンジの 6 時間後に NHR（B）を解析した。p <0.05, OVA チャレンジしたコントロール群との比較（N = 6）。
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図 3．感作マウスの抗原誘発炎症細胞浸潤に対する抗ヒスタミン薬の作用．
感作マウスに各抗ヒスタミン薬投与下で OVA チャレンジした。NHR の解析後に鼻腔洗浄を
図 3．感作マウスの抗原誘発炎症細胞浸潤に対する抗ヒスタミン薬の作用．

行い、NALF 中の好酸球（A）および好中球（B）数を計数した。p < 0.05, OVA チャレンジし感作マウスに各抗ヒスタミン薬投与下で OVA チャレンジした。NHR の解析後に鼻腔たコントロール群との比較（N = 6）。

洗浄を行い、NALF 中の好酸球（A）および好中球（B）数を計数した。p < 0.05, OVA
チャレンジしたコントロール群との比較（N = 6）。
Title: Reevaluation of second-generation anti-histamines through the effect on nasal
hyperresponsiveness
Name: Osamu Kaminuma
Name of Affiliation: Research Institute of Radiation Biology and Medicine
Address: 1-2-3 Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8553, Japan
Tel: +81-82-257-5819
Abstract:
Although many second-generation antihistamines have been switch-OTC for thetreatment of allergic rhinitis, differences in their efficacy are not clear. We recently foundthat nasal hyperresponsiveness (NHR) is an intrinsic pathological condition that leads
to the induction and worsening of various symptoms of allergic rhinitis. In the present
study, we investigated the effects of second-generation antihistamines on our original
allergen-induced murine NHR model. Nasal allergen challenge to sensitized mice evoked
an immediate nasal reaction (INR), NHR, and eosinophil and neutrophil infiltration into
the nasal mucosa. These responses were not affected by oral administration of epinastine,
bepotastine, fexofenadine, or chlorpheniramine. On the other hand, loratadine also did notaffect nasal inflammatory cell infiltration, but significantly suppressed INR and NHR.
It is suggested that loratadine may have a high therapeutic effect on allergic rhinitis
through an unknown mechanism of action different from other antihistamines.

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