腸管免疫に関わる新たな指標を用いた
OTC薬の安全性評価
北海道大学大学院薬学研究院
こばやし小林まさき正紀准教授

腸管免疫に関わる新たな指標を用いた
OTC 薬の安全性評価

北海道大学

大学院薬学研究院准教授

小林正紀

【要旨】
本邦において認知症の悪化予防・軽減は重要な課題であることは言うまでもない。 脳と腸が互いに密接に影響を及ぼしあう「脳腸相関」の概念が脚光をあび、腸管機能の大部分を担う腸管免疫の改善が記憶形成の維持に寄与することが示されている。そこで申請者はセルフメディケーションの観点から OTC 薬の安全な使用を目的に腸管免疫に関わる抗菌ペプチドの分泌能に及ぼす影響を評価するスクリーニング系を構築し、その機序を検討することとした。腸管由来細胞として American Type Culture Collection (ATCC)、Deutsche Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ)、RIKEN の 3 種のセルバンクの Caco-2 細胞を用いて、抗菌ペプチドであるα- defensin5 の分泌について検討した。その結果、α- defensin5 分泌はいずれの Caco-2細胞でも認められた。また ATCC の Caco-2 細胞におけるα- defensin5 分泌は培養日数の経過に伴い、直線的に増加した。さらに同条件下においてサイトカインの mRNA 量は培養日数の経過に伴い上昇し、特に IL - 8 および TNF -αの mRNA 量の増大はα- defensin5 分泌と同様の傾向を示した。したがって Caco -2 細胞におけるα- defensin5 分泌の機序に IL - 8 や TNF-α等の関与が示唆された。さらにα -defensin5 を処理後 24 時間後におけるサイトカイン mRNA 量を測定したところ、I L - 8、TN F-α等のサイトカイン mR NA 量は上昇した。以 上の結果から

α- defensin5 の分泌はサイトカイン発現と関連することが示唆されたとともに、Caco-2 細胞がα- defensin5 分泌に影響を与える OTC 薬を評価するためのツールとなる可能性を示した。

１、調査研究目的
本邦において高齢化に伴い、認知症患者数は増加の一途を辿り、認知症の症状の中でも記憶の低下を軽減することは患者の QOL 改善に大きく寄与する。近年、脳腸相関の概念が浸透し、腸管の機能改善が記憶の低下を軽減することが期待されている。申請者は OTC 薬の認知機能に及ぼす作用を腸管免疫の観点から明らかにすべく、腸管免疫に深く関わる抗菌ペプチドのα- defensin5 分泌 1 に着眼した。本研究では OTC 薬が腸管免疫に与える影響を迅速に評価するため、培養細胞を用いた実験系に着目し、腸管由来細胞を用いて腸管免疫のスクリーニング評価系を構築することを目的とした。

47

２、調査研究方法
2-1 試薬Alkaline Phosphatase Assay Kit は BioAssay Systems より、Human α- defensin5ELISA kit は LifeSpan Biosciences から購入した。また Human α- defensin5 peptide はペプチド研究所より購入した。
2-2 使用細胞
ATCC、DSMZ、RIKEN より購入したヒト結腸癌由来 Caco - 2 細胞を使用した。培養液は、Dulbecco's Modified Eagle Medium に 10％ウシ胎児血清、1％ペニシリンストレプトマイシン、1% non-essential amino acids を添加したものを用い、37℃、5％ CO2 の条件下で培養した。
2-3 細胞生存率の測定
細胞生存率は 3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)
assay により評価した。0.6-1.8 ×10 4 cells/well となるように 96 穴プレートに播種した。既定
時間培養後、MTT を 250μg/mL となるように添加し、1 時間インキュベートした。細胞をphosphate buffered saline で洗浄後、Dimethyl sulfoxide を 200μL 加え、ホルマザンを溶解した。その後、マイクロプレートリーダー (Tecan) で 562 nm の吸光度を測定した。
2-4 Alkaline Phosphatase (ALP) 活性およびα -defensin5 分泌の測定
2-3 で示した条件で細胞を播種した後、7 日間間隔で 28 日間まで培養した。上清中の ALPを Alkaline Phosphatase Assay Kit により測定した。また上清中に分泌されたα- defensin5量は Human α- defensin5 ELISA kit を用いて測定した。
2-5 Real-time PCR
Real-time PCR は、KAPA SYBR Fast qPCR kit (KAPA Biosystems) を用いて行った。
反応及び検出には Mx3000 TM Real-Time PCR System (STRATAGENE) を使用した。

３、調査研究成果および考察
3-1 Caco - 2 細胞の分化、α- defensin5 分泌と培養日数との関連
Caco -2 細 胞は 培養によって小腸上 皮 細 胞 様に分 化 することが 知られている。 また、
Alkaline Phosphatase (ALP) は腸分化マーカーであり、その上昇によって分化が特徴づけられる 2。一方でサイトカインの一つである IL - 8 発現もまた培養日数の経過に伴い増加し、細胞増殖に関与することが報告されている 3。さらにセルバンクの異なる Caco -2 細胞においてグ48

ルコース輸送担体の輸送活性が異なることから各セルバンクの Caco -2 細胞でα- defensin5 を含めた様々な遺伝子発現量が異なることが推察される 4。そこで ATCC、DSMZ、RIKENの Caco -2 細胞の培養日数がα- defensin5 分泌に及ぼす影響を検討することとした。検討に先立ち、まず培養日数が Caco -2 細胞の分化に及ぼす影響を明らかにすべく、培養日数ごとの ALP 活性を測定した。その結果、いずれの Caco-2 細胞においても細胞播種から 14 日以降に横ばい傾向を示し、細胞播種から 14 日以降に細胞分化を生じることが示された (Fig.
1)。次に、培養日数の経過がα- defensin5 分泌に及ぼす影響を明らかにするため、同条件下におけるα- defensin5 分泌量を測定した。その結果、DSMZ および RIKEN の Caco -2 細胞は、細胞播種から 14 日後に横ばい傾向となった一方で、ATCC の Caco-2 細胞におけるα- defensin5 分泌量は培養日数の経過に伴い、直線的に増加した (Fig. 2)。以上の結果から、いずれの Caco -2 細胞においてもα- defensin5 の分泌が認められた。また ATCC の Caco -2細胞においてα- defensin5分泌量に培養日数による直線性が見られたことから、以降の検討に ATCC の Caco -2 細胞を用いることとした。
3-2 Caco - 2 細胞におけるサイトカイン mRNA 量と培養日数との関連

α- Defensin5 曝露は炎症性サイトカインである IL - 8 発現量を増加させることが報告されている 5。そこで培養日数の経過が、IL - 8 やその他のサイトカインの mRNA 量に与える影響を検証した。検討に先立ち、遺伝子発現解析の補正に用いるハウスキーピング遺伝子の探索を行った。その結果、検討した 8 種のうち 18S において培養日数の影響が少ないことが示唆された (Fig. 3)。したがって以降の検討にハウスキーピング遺伝子として 18S を用いることとした。次に培養日数がサイトカイン mRNA 量に及ぼす影響を明らかとするため、培養日数ごとの IL - 8、IL - 6、TNF-α、IL -1 β、IL -2 mRNA 量を測定した。その結果、いずれにおいても培養日数の経過に伴い上昇し、特に IL - 8、TNF-αの mRNA 量の推移はα- defensin5 分
泌と同様の傾向を示した (Fig. 4)。したがって、これらサイトカイン発現変動とα- defensin5分泌が関連している可能性が示された。
3-3 Caco-2 細胞におけるα -Defensin5 とサイトカイン mRNA 量との関連
最後にサイトカイン発現変動にα -defensin5 が関与するかを検証した。ヒト回腸内におけるα -defensin5 濃度は 6 ～ 30 μg/mL であることから 6、α- defensin5 を 18μg/mL となるように調製し、Caco -2 細胞へ処理後 24 時間後におけるサイトカイン mRNA 量を測定した。
その結果、α- defensin5 はサイトカイン mRNA 量を有意に上昇させた (Fig. 5)

ことから、α- defensin5 とサイトカイン発現との関連が示唆された。
しかしながら前述した Caco-2 細胞から分泌されるα- defensin5 濃度は、ヒト回腸におけるα- defensin5 濃度より低い。α- defensin5 の分泌機序として細菌の構成成分を認識した後、転写に関連する nuclear factor-kappa B (NF-κB) の経路に一部シグナルが伝達され、α- defensin5 の合成が促進されることが報告されている 7。一方で、サイトカイン発現もまた49

NF-κB 経路と一部関連し、フィードバックを受けることが報告されている 8 。したがって本結
果は、培養日数の経過による長期的なα- defensin5 曝露がサイトカイン発現に影響を及ぼしていること、さらにα- defensin5 と TNF-αを始めとするサイトカイン発現の間に NF-κB 経路を介したシグナル経路が影響している可能性が推察された。

4、まとめ
本研究により、ATCC、DSMZ、RIKEN の Caco -2 細胞においてα- defensin5 の分泌を認めた。
またその分泌機序には、IL-8 や TNF-α等が関与することが示唆された。

5、調査研究発表
Yasuda G, Kobayashi M, Kubota A, Narumi K, Furugen A, Saito Y, Satoh T, Suzuki N,Iseki K.
Analysis of α -Defensin 5 Secretion in Differentiated Caco-2 Cells: Comparison of Cell
Bank Origin.
Biol Pharm Bull. 2021 ;44 : 275 -278.

6、引用文献1. Salzman NH, Hung K, Haribhai D, Chu H, Karlsson-Sjöberg J, Amir E, Teggatz P,Barman M, Hayward M, Eastwood D, Stoel M, Zhou Y, Sodergren E, Weinstock GM,Bevins CL, Williams CB, Bos NA. Enteric defensins are essential regulators of intestinal
microbial ecology. Nat Immunol. 2010 ;11 : 76 -83.
2. Matsumoto H, Erickson R H, Gum J R, Yoshioka M, Gum E, Kim Y S. Biosynthesis ofalkaline phosphatase during differentiation of the human colon cancer cell line Caco-2.
Gastroenterology. 1990 ; 98 :1199-1207.
3. Laurent F, Eckmann L, Savidge T C, Morgan G, Theodos C, Naciri M, Kagnoff M F.
Cryptosporidium parvum infection of human intestinal epithelial cells induces thepolarized secretion of C-X-C chemokines. Infect Immun. 1997; 65 : 5067-5073.

504. Steffansen B, Pedersen MDL, Laghmoch AM, Nielsen CU. SGLT1-mediated transport in
Caco-2 cells is highly dependent on cell bank origin. J Pharm Sci. 2017;106 : 2664-2670.
5. Zhao A, Lu W, de Leeuw E. Functional synergism of Human Defensin 5 and HumanDefensin 6. Biochem Biophys Res Commun. 2015 ;467: 967-972.
6. Elphick D, Liddell S, Mahida YR. Impaired luminal processing of human defensin-5 in
Crohn’s disease: Persistence in a complex with chymotrypsinogen and trypsin. Am JPathol. 2008 ;172 : 702-713.
7. Yang E, Shen J. The roles and functions of Paneth cells in Crohn’s disease: A criticalreview. Cell Prolif. 2021 ; 54 :e12958.
8. Blackwell TS, Christman JW. The role of nuclear factor-kappa B in cytokine gene
regulation. Am J Respir Cell Mol Biol. 1997;17(1) : 3-9.

ALP 活性Fig. 1. Different culture days effect on Alkaline Phosphatase activity (ALP) levels inFig. 1. Different culture days effect on Alkaline Phosphatase activity (ALP)each Caco-2 cell.

levelares ipresented
n each Caascothe-2 cmeans
ell. with S.D. (error bars) from 9 determinations.
Data

Data are presented as the means with S.D. (error bars) from 9 determinations.

51

Fig. 2. Different culture days effect on α -defensin 5 secretion levels in each Caco-2 cell.
Fig. 2. Different culture days effect on α-defensin 5 secretion levels in
Data are presented as the means with S.D. (error bars) from 9 determinations.

each Caco-2 cell.

Data are presented as the means with S.D. (error bars) from 9 determinations.

Fig.3.3.Different
Differeculture
nt cultdays
ure deffectays efonfechousekeeping
t on housekegenes
eping mRNA
genes mlevels
RNA lthatevels18S,thaβt
Fig.
-ACTIN, GAPDH, TBP, SDHA, HMBS, HPRT1, B2M in ATCC Caco-2 cells.
18S, β-ACTIN, GAPDH, TBP, SDHA, HMBS, HPRT1, B2M in ATCC Caco-2 cells.
Data are presented as the median with maximum or minimum range from 9

Data are presented as the median with maximum or minimum range from 9
determinations.
determinations.

52

IL-2anmRNAFFig.
ig. 44.. Different
Differenculturet cultudays
re daeffectys effonecIL-8,t on IL-6,IL-8,TNFIL-6,αT,NIL-1
F-αβ, Iand
L-1βd IL-2levels in ATCC Caco-2 cells. Transcript levels were normalized to the 18SmRNA levels in ATCC Caco-2 cells. Transcript levels were normalized to thehousekeeping gene.
presented
1Data
8S hoareusek
eeping gas
enethe. means with S.E. (error bars) from 3 independent experiments.
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. cell culture for 7 days by Dunnett's test.
Data are presented as the means with S.E. (error bars) from 3 independent

experiments. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. cell culture for 7 days byDunnett's test.

Fig. 5. Effect of 24 h exposure to 18 μ g/mL α -defensin 5 on mRNA of IL-8, IL-Fig. 5. Effect of 24 h exposure to 18 μg/mL α-defensin 5 on mRNA of IL-8,6, TNF- α , IL-1 β and IL-2 in ATCC Caco-2 cells. Transcript levels were

IL-6, Tnormalized
NF-α, IL-to
1βd Ihousekeeping
L-2 in ATCCgene.
Caco- 2 cells. Transcript levels werethean
18S
Data are presented as means with S.E. (error bars) of 3 independent experiments. *P <normalized to the 18S housekeeping gene.
0.05, **P < 0.01 vs. control by t-test.

Data are presented as means with S.E. (error bars) of 3 independent experiments.
*P < 0.05, **P < 0.01 vs. control by t-test.

53