昆虫共生細菌Profftella_Dcoの特異なポリケチド合成系

中鉢 淳1, Jörn Piel2, Igor Malenovský3, Ilia Gjonov4, 広瀬 侑1 (1豊技大, 2チューリッヒ工科大, 3マサリク大, 4ソフィア大)
私どものEIIRISプロジェクト研究では、昆虫共生細菌からの新規二次代謝産物の獲得と、その応用利用を目指した機能解析を進めている。これまでに、1) 重要害虫「ミカンキジラミ（Diaphorina citri, 半翅目・キジラミ上科）」のオルガネラ様共生細菌Candidatus Profftella armatura （Profftella_DC, Gammaproteobacteria: Burkholderiales）が、新規ポリケチド「ディアフォリン」を産生して宿主昆虫を天敵から防衛していること、2) ディアフォリンが抗腫瘍活性を示すこと、などを明らかにしている。今回は、ミカンキジラミ近縁種からのProfftella姉妹系統(Profftella_Dco)の発見と、このゲノム解析に基づくユニークなポリケチド合成系の発見について報告する。
SV1 Ca. Profftella armatura [Diaphorina citri (psyllid)] (TAAA01000001)(=CP003468, CP012591, EF433792)

B

100

A

1. Profftella姉妹系統の探索と発見

86
SV2 Ca. Profftella armatura [Diaphorina cf. continua (psyllid)] (TAAA01000002)

ミカンキジラミの同属２種Diaphorina cf. continua (フランス・コルシカ島個体群)およびDiaphorina lycii (ブルガリア個体群)よりDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を標的とした
16S_341Fmod (5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGYYTAMGGRNGGCWGCAG-3’)
16S_805R (5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)
プライマーセット、シークエンサーMiSeqシステム(Illumina)、QIIME2ソフトウェアおよびSILVAデータベースを用いたアンプリコン解析を行った。

Relative abundance (%)

79
SV3 Ca. Profftella armatura [Diaphorina lycii (psyllid)] (TAAA01000003)

75
Carsonella
Profftella
Liberibacter
Wolbachia_i
Wolbachia_ii
Wolbachia_iii
Wolbachia_iv
Diplorickettsia
others50

Oxalobacter formigenes HC-1 (CP018787)

Limnobacter thiooxidans APBSDSB87 (MG705633)

0.2

87Noviherbaspirillum canariense BT339 (MN204069)

Herbaspirillum seropedicae SARCC-RB16g (HQ877486)

25
Ca. Tremblaya princeps PCIT [Planococcus citri (mealybug)] (CP002244)
96

ua

yc
ii
.l

Cupriavidus necator (AF027407)

D

co
n

87
87

D
.c

f.

D

.c

itr
i

0
tin

D. cf. continua、D. lyciiの両者が、Profftellaの姉妹系統 を保有することが明らかとなった。

Burkholderia sp. RPE66 [Riptortus pedestris (stinkbug)] (AB558210)

96

その他、栄養共生体Carsonella、柑橘病の病原体に近縁なLiberibacter、昆虫の生殖を撹乱する
Wolbachia、ヒト病原体に近縁なDiplorickettsiaなどの存在を明らかにした。動物-植物-細菌間の相互作用について新たな洞察をもたらし、ミカンキジラミの新規防除法開発の基盤となる成果。
(Microb Ecol 2020, 80(2):410-422)

Polynucleobacter necessarius [Euplotes aediculatus (ciliate)] (X93019)
93

図1. (A) Diaphorina属キジラミの細菌叢。各分類群に対応する
リードの相対頻度を示す。
(B) Profftellaの最尤系統樹。
ブートストラップ値は50%以上を表示。スケールバーは１塩基座位あたり置換数。角括弧内は宿主昆虫。太字が今回得られた配列。
Diaphorina属キジラミ由来の配列が、高いブートストラップ値で支持されるクレードを形成している。

63
Collimonas sp. (KT005686)

Ca. Kinetoplastibacterium sorsogonicusi MF-08 [Kentomonas sorsogonicus (flagellate)](CP025628)
Ca. Zinderia insecticola CARI [Clastoptera arizonana (spittlebug)] (CP002161)

Ca. Vidania fulgoroideae HO1-V [Hyalesthes obsoletus (planthopper)] (FR686932)

Ca. Nasuia deltocephalinicola NAS-ALF [Macrosteles quadrilineatus (leafhopper)] (CP006059)

SV4 Ca. Carsonella ruddii [Diaphorina citri (psyllid)] (TAAA01000004)

2. D. cf. continua由来Profftella姉妹系統のゲノム解析
上記D. cf. continuaより抽出したDNAをMiSeqにより解析し、 Profftella姉妹系統(Profftella_Dco)および Candidatus Carsonella ruddi (Carsonella_Dco)のゲノム構造を決定した。
比較ゲノム解析により、1) Profftella_Dcoにもディアフォリン合成経路が存在すること、2) ただし複数の合成酵素でアシルキャリアタンパク質ドメインが異常に増幅していること、などが明らかとなった。有用物質の工業生産効率改善にヒントを与える成果と言える。（その他、 Profftella_DcoとProfftella_DCでのヘモリシン相同遺伝子や、ビタミン、カロテノイド合成系遺伝子の保存や、ProfftellaおよびCarsonella系統のゲノムのシンテニー、安定性などを解明した。）(Genome Biol Evol 2020, 12(11):1975-1987)
0 kb

Color scale for (ii) sequence similarity to the corresponding symbiont genome in D. citri.
75

80

85

90

95

表1. D. cf. continuaおよびD. citri由来Profftellaのゲノムの概要。

100 (%)

Functional categories of (iii, iv) genes encoded by Profftella_Dco and Carsonella_Dco.

400 kb[Q] Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism[L] DNA replication, recombination and repair[K] Transcription[J] Translation, ribosomal structure and biogenesis[O] Posttranslational modification, protein turnover, chaperones[C] Energy production and conversion

100 kb[I] Lipid transport and metabolism[E] Amino acid transport and metabolism

469,264 bp[P] Inorganic ion transport and metabolism

100[H] Coenzyme transport and metabolism[M] Cell wall/membrane/envelope biogenesis[D] Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning[N] Cell Motility[U] Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport[T] Signal transduction mechanisms[R] General function prediction only / [S] Function unknown / Not in COGsrRNA

図2. Profftella_Dcoゲノム。ポリケチド合成系遺伝子クラスターを強調表示。外周より(i) kb表示スケール、(ii) Profftella_DCゲノムとのヌクレオチド類似性、(iii) プラス鎖コード遺伝子、(iv) マイナス鎖コード遺伝子、(v) ジヌクレオチドバイアス、(vi) GCスキュー、(vii) GC含量。
(iii), (iv)の遺伝子の機能カテゴリーを色別表示。 (v), (vi), (vii)の計算にはウィンドウ幅1000 bp、ステップサイズ100 bpを使用。

200 kb

dipS, T

PedI
KR
GN
AT

KS

PedF
?

ECH

MT KS

ECH

KS

KR

A

C

KS0

DipP_DC
KR
GN
AT

KS

ECH

KS

KR

KS0

A

C

KS

92

OXY

DipN_DC

DH PS
KR
KS

KS KR KS

DH

OXY
67

DipT_Dco
?

ECH

MT KS

KR
MT
KS KR KS

ECH

KS

KR

KS0

C

A

KR
KS KR KS MT

DipN_Dco
DH PS
KR
KS

KS KR KSDH

100 Profftella_Dco, DipP, KS3 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
Profftella_DC, DipP, KS3 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915398)
Paederus fuscipes symbiont, PeG,, K6>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$5
Labrenzia sp. PHM005, PKS4, KS>Į5KL]RELDOHV@ :3B
Nostoc sp. N6, NspA, KS3 [Cyanobacteria] (ADA69237)
Cuspidothrix issatschenkoi, CusA, KS3 [Cyanobacteria] (WP_133163982)
100
Entotheonella factor, OnnB, KS3 [Tectomicrobia] (AAV97870)
100
Entomycale ignis, Myc,.6>Ȗ@Psammocinia aff. bulbosa symbiont, PsyA, KS2 [?] (ADA82581)
100 Profftella_Dco, DipT, KS9 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
78
Profftella_DC, DipT, KS9 >Ȗ%XUNKROGHULDOHV@(WP_020915462)
68
Paederus fuscipes symbiont, PeGF, KS>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$6
57
Entomycale ignis, MycF, KS>Ȗ@
Entotheonella factor, Onn,, KS9 [Tectomicrobia] (AAV97877)
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
Endobugula sertula, Br\$.6>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV] (ABK51304)
100
87
Endobugula sertula, Br\'.6>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $%.
Endobugula sertula, BryB, KS>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV] (ABK51300)
88
Paraburkholderia rhizoxinica, 5KiE_KS13 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (CAL69893)
51
Bacillus velezensis'LI,.6>)LUPLFXWHV@ :3B7)
100
Psammocinia aff. bulbosa symbiont, PsyD, KS9 [?] (ADA82585)
68
Burkholderia thailandensis, TaiD, KS2 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_146032765)
Chitinophaga pinensis(OV3.S>%DFWHURLGRWD@ :3B9)100 Profftella_Dco, DipT, KS7 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
72
Profftella_DC, DipT, KS7 >Ȗ%XUNKROGHULDOHV@(WP_020915462)
Paederus fuscipes symbiont, PeGF, KS>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$6
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
Entomycale ignis, MycF, KS>Ȗ@
62
Entotheonella factor, Onn,, KS7 [Tectomicrobia] (AAV97877)
50
Psammocinia aff. bulbosa symbiont, PsyD, KS6 [?] (ADA82585)
Paraburkholderia rhizoxinica, 5KiD, KS9 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_013435480)
Paraburkholderia rhizoxinica, 5KLC, KS7 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_013435481)
Psammocinia
aff. bulbosa symbiont, PsyD, KS8 [?] (ADA82585)
100
Streptomyces albus, O]PH, KS6 [Actinobacteriota] (ABS90471)
Nostoc sp. N6, NspC, KS7 [Cyanobacteria] (ADA69239)
Cuspidothrix issatschenkoi, CusC, KS7 [Cyanobacteria] (WP_104385913)
100
59

70

PedG

DH PS
KR
MT KS
KR KS KR KS DH
KS KR KS

DipT_DC
?

ECH

MT KS

DipP_Dco
KR
GN
AT

99

tRNA

300 kb93

53[F] Nucleotide transport and metabolism

dipA-R

Profftella_Dco, DipT, KS4 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
100
Profftella_DC, DipT, KS4 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915462)
Paederus fuscipes symbiont, PeG*.S4 [Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV] (AAS47564)
Entomycale ignis, MycF, KS4 [Ȗ]
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
Nostoc sp. N6, NspC, KS4 [Cyanobacteria] (ADA69239)
Cuspidothrix issatschenkoi, CusC, KS4 [Cyanobacteria] (WP_104385913)
51
100
Entotheonella factor, Onn,, KS4 [Tectomicrobia] (AAV97877)
Psammocinia aff. bulbosa symbiont, PsyD, KS3 [?] (ADA82585)
Pseudomonas fluorescens1&,0%0mpA, KS>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$0
100 Profftella_Dco, DipO, KS10 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
77
Profftella_DC, DipO, KS10 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915399)
53
Paederus fuscipes symbiont3HG+K6>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$6
100
Entomycale ignis0\F+.6>Ȗ@
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
100 Profftella_Dco, DipO, KS11 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
94
Profftella_DC, DipO, KS11 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915399)
97
Paederus fuscipes symbiont3HG+K6>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$6
Entomycale ignis0\F+.6>Ȗ@
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
100
60
Bacillus velezensis, BaeN, KS11 [Firmicutes] (WP_082998035)
100
Bacillus velezensis, BaeN, KS12 [Firmicutes] (WP_082998035)
99
Bacillus velezensis, BaeJ, KS2 [Firmicutes] (WP_129192901)
100 Profftella_Dco, DipT, KS8 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
72
Profftella_DC, DipT, KS8 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915462)
88
Paederus fuscipes symbiont, PeGF, KS>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$6
98
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
93
Entomycale ignis, MycF, KS>Ȗ@100
Entotheonella factor, Onn,, KS8 [Tectomicrobia] (AAV97877)
Endobugula sertula%U\&.6>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $%.
56
Psammocinia aff. bulbosa symbiont, PsyD, KS7 [?] (ADA82585)
0.5[G] Carbohydrate transport and metabolism

Profftella_Dco
chromosome

OXY

83

100

Profftella_Dco, DipT, KS6 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
Profftella_DC, DipT, KS6 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915462)
Entotheonella factor, Onn, KS6 [Tectomicrobia] (AAV97877)
Paederus fuscipes symbiont, PeGF, KS>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$6
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
Entomycale ignis, MycF, KS>Ȗ@
100 Profftella_Dco, DipP, KS2 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
88
Profftella_DC, DipP, KS2 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915398)
67
Paederus fuscipes symbiont, PeG,, K6>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$5
Entomycale ignis, Myc,.6>Ȗ@
Labrenzia sp. PHM005, PKS4, KS>Į5KL]RELDOHV@ :3B
Entotheonella factor, OnnB, KS2 [Tectomicrobia] (AAV97870)
63
Nostoc sp. N6, NspA, KS2 [Cyanobacteria] (ADA69237)
100
62
Cuspidothrix issatschenkoi, CusA, KS2 [Cyanobacteria] (WP_133163982)
Psammocinia aff. bulbosa symbiont, PsyD, KS5 [?] (ADA82585)
Nostoc sp. N6, NspC, KS8 [Cyanobacteria] (ADA69239)
Cuspidothrix issatschenkoi, CusC, KS8 [Cyanobacteria] (WP_104385913)
100
99
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
74
Entomycale ignis,0\F+.6>Ȗ@88
100 Nostoc sp. N6, NspC, KS6 [Cyanobacteria] (ADA69239)
Cuspidothrix issatschenkoi, CusC, KS6 [Cyanobacteria] (WP_104385913)
Bacillus velezensis, 0OnF, KS9 [Firmicutes] (WP_059367069)
Streptomyces virginiae, VirA, KS4 [Actinobacteriota] (WP_033220290)
55 69
Entomycale ignis, MycH, KS12 [Ȗ]
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
100
100 Profftella_Dco, DipT, KS5 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
50
Profftella_DC, DipT, KS5 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915462)
Paederus fuscipes symbiont, PeG*.S5 [Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV] (AAS47564)
85
Entomycale ignis, MycF, KS5 [Ȗ]
58
Entotheonella factor, Onn,, KS5 [Tectomicrobia] (AAV97877)
Psammocinia aff. bulbosa symbiont, PsyD, KS4 [?] (ADA82585)
52
100
Bacillus velezensis, BaeJ, KS1 [Firmicutes] (WP_129192901)
100
Bacillus velezensis, BaeM, KS10 [Firmicutes] (WP_139138489)
Nostoc sp. N6, NspC, KS5 [Cyanobacteria] (ADA69239)
100
100
Cuspidothrix issatschenkoi, CusC, KS5 [Cyanobacteria] (WP_104385913)
Labrenzia sp. PHM005, PKS/1536K6>Į5KL]RELDOHV@ :3B
Nostoc sp. N6, NspD, KS9 [Cyanobacteria] (ADA69241)
100

PedH
DH
KR
KS
KS DH KS KR KS0

DipO_DCDHKR
KS
KS DH KR

DipO_Dco

DHKR
KS
KS DH KRC

A

TE

図3. Profftella_Dcoのポリケチド合成酵素群(Dip_Dco)の構造とディアフォリン
生合成の推定経路。比較のため、 Profftella_DCおよびPaederus共生体の相同酵素 (Dip_DCおよびPed)をDip_Dco上に灰字で示す。 A, 非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)アデニル化ドメイン; C, NRPS濃縮ドメイン; DH, 脱水酵素;
GNAT, GCN5-関連 N-アセチル基転移酵素スーパーファミリー; ECH, エノイルCoA還元酵素様ドメイン; KR, ケト還元酵素; KS, ケト合成酵素; KS0, 非伸長性
KS; MT, C-メチル基転移酵素; PS, ピラン合成酵素; OXY, 酸素添加酵素; TE, チオエステル加水分解酵素; ?, 機能未知領域. 灰色で示すドメインは、活性部位残基の喪失により不活性と推定される。黒丸はACP (アシルキャリアタンパク質)やPCP (NRPSペプチジルキャリアタンパク質)などのキャリアタンパク質ドメイン。
DipP_DcoとDipT_DcoでACPが異常に増幅(赤で強調)していることが分かる。

100

85
100

100

51

100

Hydrolysis
Diaphorin

100 Profftella_Dco, DipP, KS1 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV]
Profftella_DC, DipP, KS1 [Ȗ%XUNKROGHULDOHV] (WP_020915398)
Paederus fuscipes symbiont, PeGF, KS>Ȗ3VHXGRPRQDGDOHV@ $$5
Nostoc sp. N6, NspA, KS1 [Cyanobacteria] (ADA69237)
Cuspidothrix issatschenkoi, CusA, KS1 [Cyanobacteria] (WP_133163982)
Entomycale ignis, Myc,, KS1 >Ȗ@
Chitinophaga pinensis(OV,.6>%DFWHURLGRWD@ 0:+
Psammocinia aff. bulbosa symbiont, Psy, KS1 [?] (ADA82581)
Entotheonella factor, OnnB, KS1 [Tectomicrobia] (AAV97870)
Labrenzia sp. PHM005, PKS4, KS>Į5KL]RELDOHV@ :3B

Saccharopolyspora erythraea, DEBS3, KS5 [Actinobacteriota] (WP_009950919)
Saccharopolyspora erythraea, DEBS2, KS4 [Actinobacteriota] (WP_011873138)
Sorangium cellulosum, EpoD, KS3 [Myxococcota] (AAF26921)

図4. KSドメインから推定されるDipO_Dco, DipP_DcoおよびDipT_Dcoの系統的位置。各括
弧内は細菌の上位分類階層で、αとγはプロテオバクテリア門の綱を表す。シス-AT PKSのKS
配列を外群とした。 Profftellaの配列は赤字で、Profftella_Dcoの配列は赤太字で示す。