ポリアミン
ポリアミン Vol.2 No.2
Polyamine
Polyamine

Oct. 2015

巻頭言
川喜田 正夫シリーズ ポリアミン研究
河合 剛太
照井 祐介
シリーズ 実験手技ノート
中村 篤央
森谷 俊介
学会報告
鈴木 秀之
学会レビュー松本 靖彦
田島 彩沙
Dan Ge吉田 健人
奈良 未沙希日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Researchポリアミン Vol. 2 No. 2
Polyamine

Oct. 2015

巻頭言学会で育ち、学会を育てる - 若い研究者と学会へのエール -シリーズ ポリアミン研究
ポリアミンとRNA構造

河合 剛太

41

ポリアミンによる蛋白質合成促進

照井 祐介

46

中村 篤央

54

シリーズ 実験手技ノート

GC-MSを用いたポリアミンの分析

質量分析計を用いたポリアミンの分析
編集部より筆者への質問コーナー

森谷 俊介

川喜田 正夫

40

59

67

学会報告

日本農芸化学会2015年度大会におけるシンポジウム開催のご報告

鈴木 秀之

72

学会レビューInternational Conference on Antimicrobial Resistance, Novel Drug Discovery andDevelopment:Challenges and Opportunitiesに参加して2015 GRS&GRCに参加して

田島 彩沙

松本 靖彦

81

83

Gordon Research Conference ̶ Polyamines 2015

Dan Ge84

Gordon Research Seminar及びGordon Research Conferenceに参加して吉田 健人

2015年ゴードン研究会議「ポリアミン」に参加して

86

事務連絡

89

編集後記

90

奈良 未沙希85

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research巻頭言

ポリアミン（2015）2:40

学会で育ち、学会を育てる- 若い研究者と学会へのエール 川喜田

正夫

東京都医学総合研究所
学会は本来、権威の縛りから離れて会員が自由な知的活動を同学の士と共有できる場であることにその意義があります。創刊号の巻頭に大島会長がお書きになったのもほぼ同じ趣旨のことでありました。
私も、「日本ポリアミン学会」が会員にとって永くそのような活動の場であり続けてほしいと強く願っています。そして、そのような学会を作り上げる役割の担い手として、大学院生やポストドクター、メーカー所属の研究者など、20代、30代の若い研究者たちに大きな期待を寄せています。
幸いなことに、この学会の前身である「日本ポリアミン研究会」立ち上げ以来の古参メンバーも含めて、会員の中には、ご自身が「権威あるいは権威者」だと考えておいでの方は一人としておられないよ
うに私には見受けられます。その空気の中で、「日本ポリアミン研究会」からは「日本ポリアミン学会」の立ち上げの中心になって下さった方々の多くが立派に育ってこられました。この学会に集う若い研究者たちには、是非ともそのよき伝統を引き継いでいってほしいと思うのです。
そのために一つの提案をしたいと思います。それは、＜この学会を全員参加型の学会にしようではな
いか＞ということです。主体的に参加することを通じて学会を自分たちのものだと実感することは、学会を自分たちの手で育てていくという大きな実りを生み出す原動力ですが、同時に、それぞれの積極的な参加の営みそのものが、自らが研究者として成長していくための貴重な糧を手にする途でもあるのです。小さな学会を育てる一方で、自身は大きく育っていってほしい、私はそう願います。
学会誌上で前号から始まった「シリーズ

実験手技ノート」はその意味でもよい企画だと思います。

多くの若いメンバーに、それぞれが得意とする実験手技について、どんどん執筆・紹介していってほし
いと思います。「編集部より筆者への質問コーナー」も記事を身近に引きつける面白い趣向だと思いました。後続号に読者から筆者への質問や提案が寄せられ、それを契機に新たなフォーラムが形成されていったら・・・。楽しい想像です。さらに新しい企画が読者からも提案されて、学会誌を中心に学会員の交流の輪が広がり、お互いの顔がよく見える学会になっていくことを期待します。
大学院生であった20代の頃を思い起こして、学会、研究会の年会のフロアで手を挙げて口を挟むのには正直、気後れがありました。それでも、＜折角学会に参加したら、1回は手を挙げて質問してから帰ってこい＞という先輩のきつい助言は、駆け出し者にはプレッシャーではありましたが、今になれば大切な、有り難い助言であったと思います。小さな学会なら、それもできそうには感じませんか？

やってみようか、とは思いませんか？
若い研究者たちの気後れ、遠慮、引っ込み思案には、身に覚えがないでもありませんが、それがつのると、結局誰かが「権威」に祭り上げられてしまい学会の硬直化が起こります。それが私の気がかりです。この学会に集う若い研究者たちが、私の気がかりを杞憂に終わらせてくれることを、そして、この学会が知的な若々しさをいつまでも保ち続けてくれることを願っています。

40

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research

シリーズ

ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:41-45

ポリアミンとRNA構造河合剛太

千葉工業大学工学部生命環境科学科（275-0016

習志野市津田沼2-17-1）

連絡先河合剛太 e-mail: gota.kawai@p.chibakoudai.jp

1．はじめにが相互作用している可能性は高い。ATPとさまざま

生体内において、ポリアミンは主としてRNAとな酵素との結合がポリアミンの影響を受けていると結合して存在していると考えられている1)。特に、考えられる。また、ポリアミンがATPとMg2+の複tRNAとポリアミンとの結合については、X線結晶

合体と相互作用するという報告もある2)。そこで、構造解析によってその詳細が明らかにされている

NMR法によってATPとスペルミン（Spm）の相互（図1）。筆者はこれまで、五十嵐一衛先生、大島

作用を解析した（図2）3)。Mg2+非存在下ではATP

泰郎先生および松藤千弥先生との共同研究として、のリン酸基のシグナルは大きくは変化しないが、ポリアミンとRNAとの相互作用の解析を進めてき

Mg2+存在下ではリン酸基のシグナルは広幅化し、た。本稿では、ポリアミンとRNAとの相互作用に

特にβリン酸基のシグナルの広幅化が顕著であっ

関するこれまでの研究内容について紹介する。

た。一方、ATPのプロトンシグナルはMg2+およびSpmの影響をほとんど受けないことから、Spmが2．ポリアミンとATP

トリリン酸基に結合していること、およびその相互

動 物 細 胞 に お いて、 ポ リ ア ミ ン、 AT P お よ び

作用はMg 2+ の影響を受けることが明らかとなっMg 2+ はそれぞれ数mM程度存在しており、それら

た。また、ATP : Mg2+ : Spmの複合体中の分子数

A

図１
A:

B

C

t R N A に 結 合 し た スペ ル ミ ン

yeast tRNAPheのTループに結合（PDB ID: 1EVV）、B: yeast tRNAPheのDアームに結合（1TN2）、C: yeast tRNAAspのアクセプタステムに結合（2TRA）。いずれも主溝側に結合している。

41

日本ポリアミン学会

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シリーズ

ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:41-45

系についてポリアミンとの相互作用解析も行われている 5-7) 。ポリアミンモジュロンにおける制御は、
mRNAの二次構造の変化、コドン・アンチコドン
相互作用におけるwobble塩基対の安定化、あるいはsuppressor tRNAの構造の安定化などによって行われていると考えられている。これらの現象には、
γα

ポリアミンとRNAとの相互作用が必須であり、そβの基本的な組み合わせはRNAステムループとポリアミンとの相互作用と考えることができる。特に、RNAが内部ループあるいはバルジループを含む場
合に、ポリアミンとの特異的な相互作用が起こると

図2 ATPの31P-NMRスペクトル思われる。千葉大学の東らによって、図3に示した

ルミンおよびMg2+をそれぞれ終濃度で3 mMとなるように相互作用解析が行われた 8) 。このRNAは、ヒトの3 mM ATPを用い、 pH 7.8および298 Kで測定した。スペRNA（U6-34）を用いたスペルミジン（Spd）との加えた。

U6 snRNAの一部に相当し、インフルエンザウイル
スのNS1タンパク質に由来するペプチドとの相互作の比は2 : 2 : 1であり、この分子比で電荷がゼロと用が解析され、その二次構造がNMR法によって明なる。同様な結果が、GTP、CTPおよびUTPでもらかとされているものである9)。このRNAとペプチ得られている。これらのことは、ヌクレオチドトリ

ドとの相互作用がSpdによって阻害されることかリン酸（NTP）を利用した生化学反応を考えるとら、SpdがRNAのコンホメーション変化を起こしてき、ポリアミンの存在を考慮する必要があることを示している。

いる可能性が示唆された。そこで、SpdがRNAのコ

3．ポリアミンとRNAステムループ

図3は、SpdあるいはMg2+の添加によるRNAの化学

リアミンの濃度を介して制御されていることが知らは、Mg2+の添加によって変化せず、Spdの添加によ

ンホメーションに与える影響が詳しく解析された。
シフトの変化をまとめたものである。図中の赤色大腸菌では、特定のタンパク質の翻訳効率が、ポってある一定以上の変化が観測された残基を示してれており（ポリアミンモジュロン）4）、いくつかの

A
5' GGAACGA

I I I I I ICAUAC GAG U U
I I IAUAC GA U U
I I I I I I
I I I I I I
U CUC C
3' ACCUUGC
G
A
A
5'

I I I

GUG CUC C
3' ACCUUGC
G
G A
A

B

5' GGAACGI I I I I I

ADA
UAC GAG U U
I I I

AACG

5' GGAACGI I I I I I

I I I

A

A

A
UAC GAG U U
I I I

I I I

GUG CUC C
3' ACCUUGCGG A
A

GUG CUC C
3' ACCUUGC
G
G A
A
図3 U6-34とSpdの相互作用

A. アデニン塩基のH8の化学シフト変化。B. アデニン塩基のH2の化学シフト変化。C. グアニン塩基のH8の化学シフト変化。D.
ピリミジン塩基のH5/H6の化学シフト変化。赤：Spdのみによって変化。緑：SpdおよびMg2+のいずれによっても変化。青：
変化なし。白抜き：SpdとMg2+の添加によってシグナルが消失。

42

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シリーズ

A

ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:41-45

図4は、大腸菌のtransfer-messenger RNAに含D

まれる4つのシュードノットの一つ（PK1）とTaaの相互作用を解析した例である。PK1は、Mg2+に依存してシュードノット構造を形成する13)。Mg2+あC

るいはTaaが存在しない場合には、PK1はシュード
ノットを形成せず、10-11 ppm付近にステム構造にB含まれない塩基に由来するシグナルが多数重なって観測される。これは、多くの分子がランダムなコン
ホメーションとなっていることを示している。PK1

Chemical shift (ppm)にMg2+を加えるとスペクトルが大きく変化し、シ

図4 TaaとRNAシュードノットとの相互作用

ャープなシグナルが観測されるようになる。これ

A. 大腸菌transfer-messenger RNAに含まれるシュードノ

は、シュードノット構造の形成を示している。一ットRNA。B.シュードノットRNA単独のNMRスペクトル。

方、Taaを加えた場合にも10-11 ppmのシグナルは

C. Taa存在下のNMRスペクトル。D. Mg2+存在下のNMRス
ペクトル。

ほぼ消失し、比較的シャープなシグナルが観測されおり、バルジアウト残基およびこれに近接した残基

すシグナルが観測されており、その化学シフトはに限られている。一方、緑色はSpdあるいはMg2+のMg2+存在下でのAU塩基対のものと一致している。

いずれの添加によって、ある一定以上の化学シフト

非変性条件で電気泳動を行うと、Taa存在下におい変化が観測された残基を示しており、ステムを含むて移動度が大きくなることからRNAのコンホメー

分子全体に観測されている。このことから、ポリア

ションがコンパクトになることが分かっており、こミンは、RNAのステムにも結合するが、バルジア

れらのことは、PK1がTaa存在下でシュードノット

ウト残基の存在する領域に強く結合することが示唆

構造を形成していることを示唆している。

る。特に、14.5 ppm付近にはAU塩基対の形成を示された。

tRNAの場合にも、非変性条件の電気泳動を行う

東京慈恵会医科大学の小黒らは、SpmとSpdを区と、Taaの結合によってtRNAの移動度が大きくな別できるRNAアプタマーの取得に成功しているることから、TaaはtRNAのコンホメーションをコ10) 。このアプタマーは、ステムループを2つもつ二次構造であることが分かっているが、結合により強Aく関与していると考えられているステムループにはB

内部ループが存在していることから、この領域がスペルミンとの特異的な結合に関与している可能性があり、NMR法による相互作用解析が進められている11)。
4．分岐状ポリアミンとRNAの相互作用

高度好熱菌などの好熱性の細菌には、Spmよりも長い直鎖状ポリアミンのほかに、tetrakis(3aminopropyl)ammonium（Taa）などの分岐状ポ

図5 tRNAと分岐状ポリアミンの相互作用（NMR法）

リ ア ミ ン が 含 ま れて い る こ と が 知 ら れて お り 、

A. yeast tRNAPheの立体的相互作用部位（赤）。 B. TaaとRNAの熱安定化に寄与していると考えられているの相互作用。赤： 化学シフト変化あるいは広幅化。青: 小さ
な化学シフト変化。

12)。

43

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ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:41-45

5．今後の展望ポリアミンは塩基性物質であることから、酸性物質であるRNAとは静電的に相互作用する。したがって、ポリアミンとRNAには非特異的な結合が存在する。しかしながら、以上に示したNMR法によるさまざまな解析によって、ポリアミンはRNAの特徴的な立体構造を認識し、特異的に結合することも解明できる。今後、RNAとポリアミンの相互作用に関する研究をさらに進め、ポリアミンの機能発
現のメカニズムに迫りたいと考えている。

参考文献
1.

図6 ドッキングシミュレーションによる相互作用解析

yeast tRNAPheとTaaの相互作用を解析した。エネルギーの2.

低い２つの結果について示してある。PDB ID: 1EVVの構造を用いた。

ンパクトにすることが示唆されている。図5は、yeast tRNAPheとTaaとの相互作用を、tRNAのイミ

3.

ノプロトンの化学シフト変化によって解析した結果である。Taaによって化学シフトが変化する領域がtRNAの立体的相互作用部位とよく一致していることがわかる。一方、図6は、プログラムICMPro（molsoft社）を用いて行ったyeast tRNAPheに4.

対するTaaのドッキングシミュレーションの結果である。Taaは、アンチコドンステムとDステムの分岐部位付近およびDステムとTステムの間に結合することが示唆されている。NMR法による解析によ5.

っても同様な位置に化学シフト変化が観測されており、Taaはこれらの部位に結合してtRNAの立体構
造を安定化していると考えられる。
以上の結果は、TaaがRNAの立体的相互作用を形成している部位に選択的に結合することによって、RNAの立体構造を安定化していることを示してい

6.

る。

44

五十嵐一衛：ポリアミン研究−これ迄の取り組み.
ポリアミン、1: 2-6（2014）
Günther T, Vormann J, Konstanczak P, &Schäfer A: Interactions of polyamines in themeasurement of free magnesium concentration by mag-fura-2 and 31P-NMR. Biochim.
Biophys. Acta. 1192: 281-285 (1994)
Meksuriyen D, Fukuchi-Shimogori T, Tomitori
H, Kashiwagi K, Toida T, Imanari T, Kawai G, &Igarashi K: Formation of a complex containing ATP, Mg2+, and spermine, structural evidence and biological signiﬁcance. J. Biol.
Chem. 273: 30939-30944 (1998)
Igarashi K, & Kashiwagi K: Polyamine modulon in      : genes involved in thestimulation of cell growth by polyamines. J.
Biochem. 139: 11-16 (2006)
Yoshida M, Meksuriyen D, Kashiwagi K, Kawai G, & Igarashi K: Polyamine stimulation of
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Biol. Chem. 274: 22723-22728 (1999)
Yoshida M, Kashiwagi K, Kawai G, Ishihama A,& Igarashi K: Polyamine enhancement of thesynthesis of adenylate cyclase at the translational level and the consequential stimulationof the synthesis of the RNA polymerase σ28

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research

シリーズ

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:41-45

subunit. J. Biol. Chem. 276: 16289-16295(2001)
Yoshida E, Kashiwagi K, Kawai G, Ishihama A,& Igarashi K: Polyamines enhance synthesisof the RNA polymerase σ38 subunit by suppression of an amber termination codon in
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Higashi K, Terui Y, Inomata E, Katagiri D, Nomura Y, Someya T, Nishimura K, Kashiwagi K,
Kawai G, & Igarashi K: Selective structuralchange of bulged-out region of doublestranded RNA containing bulged nucleotides
by spermidine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370: 572-577 (2008)
Someya T, Hosono K, Morimura K, Takaku H,& Kawai G: Recognition of a bulged RNA bypeptides derived from the inﬂuenza NS1 protein. J. Biochem. 143: 339-347 (2008)
小黒明広、柳田明日美、天野亮、坂本泰一、河合剛太、松藤千也: 等温滴定型カロリメーターを用いたRNAアプタマーとスペルミンの相互作用解析.
日本ポリアミン学会第6回年会、品川（2014）
柳田明日美、藤枝裕大、小黒明広、松藤千也、河合剛太：スペルミンに結合するRNAアプタマーの結合様式のNMR法による解析. 日本ポリアミン学会第6回年会、品川（2014）
Terui Y, Ohnuma M, Hiraga K, Watashima E &Oshima T: Stabilization of nucleic acids byunusual polyamines produced by an extreme
thermophile,      
. Biochem. J. 388: 427-433 (2005)
Nameki N, Chattopadhyay P, Himeno H, Muto
A, & Kawai G: An NMR and mutational analysis of an RNA pseudoknot of   tmRNA
involved in trans-translation. Nucleic Acids
Res. 27: 3667-3675 (1999)

45

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research

シリーズ

ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:46-53

ポリアミンによる蛋白質合成促進
千葉科学大学照井

薬学部（〒288-0025

祐介

病態生化学研究室

銚子市潮見町15-8）
連絡先

1. はじめに

照井祐介、e-mail: yterui@cis.ac.jp（1）蛋白質の合成促進1, 2）

ポリアミンは、細胞増殖・生存率に必須な生理活

In vitroの蛋白質合成系では、大腸菌S30画分抽出性物質であるにもかかわらず、その機能解明は非常液を用いたポリフェニルアラニンの合成、及びウサに遅れている。ポリアミンは細胞内では主にRNA

ギ網状赤血球溶血液を用いたオルニチンデカルボキと結合して存在することから、ポリアミンによる細シラーゼ (ODC) の合成がポリアミンにより促進さ

胞増殖促進効果は、蛋白質合成促進によって起こるれることが報告されている。また、ウシリンパ球にと考えられる。本稿では、現在明らかとなっている

おけるチミジンキナーゼの合成が、ポリアミンによポリアミンによる細胞増殖促進・生存率維持に関すり促進されることが報告されている。いずれの蛋白るメカニズムについて解説する。

質の場合もポリアミンがmRNAに結合して構造を変化させることに起因して、翻訳効率を促進するこ

2. ポリアミンと蛋白質合成とが明らかとなっている。

ポリアミンがRNAとの相互作用により、蛋白質の合成促進・翻訳精度の上昇・リボソームの会合促（2）翻訳精度の上昇3, 4）進などの働きをすることが、千葉大学名誉教授五十

動物細胞において、ポリアミンによるtRNAのア

嵐一衛博士の研究グループを中心として多数報告さ

ミノアシル化（20種のうち特にIle-tRNA）の形成れている1-6）。特に、ポリアミンが核酸との相互作反応の促進と、アミノアシルtRNAのリボソームへ用において、K+やMg2+イオンなどのカチオンとはの結合促進が報告されている。アミノアシルtRNA

違う機構で立体構造を変化させ、様々な面で細胞増のリボソームへの結合過程において、ミスリーディ

殖促進に寄与していることが示された。
16S rRNA

ング（読み間違い）が起こると蛋白質合成が阻害さ

23S core

5'

23S coreme meme A me A3'

30S subunits

3'

3'
5'

5'

30S ribosomal
proteins

 
 

7 split proteins7 split proteins21 proteins

図1

ポリアミンによるリボソームの成熟促進

ポリアミンが、16S rRNA中のアデニンのメチル化を促進することにより、30Sサブユニットの会合促進が起こる。

46

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Researchポリアミン研究A

ポリアミン（2015）2:46-53

B



1.4

A540

1
0.8
0.6
–PUT

0.4

+PUT

0.2
0

0

Cell number (cells/mL)

1010

1.2

12 24 36 48 72 96

Time (h)C 


–PUT
+PUT

Polyamine(nmol/mg protein)

シリーズ

109

108

50
40

–PUT

PUT

+PUT

30
20
10
0
15

–PUT

SPD

+PUT

10
5

107

0
1

2 3 4

5 6

7

0.2 0.6 24h 36h 48h 72h 96hTime (day)Harvesting point

図2  ポリアミン生合成酵素欠損株MA261における細胞増殖、細胞生存率及びポリアミン含量
MA261を用いて、ポリアミン添加の有無における細胞増殖 (A)、細胞生存率 (B)、細胞内ポリアミン含量 (C)を測定した。細胞増殖において、ポリアミン非存在下では、細胞増殖及び細胞生存率が低下するが、ポリアミンを添加すると著しい上昇が見られた。このときの細胞内ポリアミン含量を見ると、添加されたPUTは細胞内に取り込まれ、尚且つPUTからのSPD合成が増加していることがわかる。

れるが、このミスリーディングの割合がポリアミンを合成することはできないが、培地にPUTを加えにより低下することが明らかとなっている。

ると、細胞外のPUTを取り込み、PUTからスペル
ミジン（SPD）を合成することが可能な大腸菌株で（3）リボソームの会合促進5, 6）ある。大腸菌においてポリアミンによる全体の蛋白

大腸菌のリボソームの30Sサブユニットは、16S

質 合 成 促 進 は 、 3 0 S サ ブユ ニ ッ ト に お け る 1 6 S

rRNAと21個のリボソーム蛋白質から成っている。
ポリアミンが、16S rRNA中のアデニンのメチル化を促進することにより、30Sサブユニットの会合の









;@4<C>8?BC

促進が起こることが報告されている（図1）。この$効果により、全体の蛋白質合成が約2倍促進するこ

RpoE, RpoS,
RpoN, FecI,
Fis, H-NS,
StpA, Cra,
SoxR, EmrRとが明らかとなっている。
3. ポリアミンモジュロン

OppA,
GshA, Cya,
RF2

3000mRNA+rRNA
1tRNA0 '

大腸菌などの微生物は、生育環境が変化した際に素早く対応する能力を持っている。この適応能力;@4<C/23
'は、大腸菌が生育環境からの刺激に応じて細胞内でつくる蛋白質の種類を常に変化させていることに起図3因する。著者らは、ポリアミンこそが環境応答に必/,-3;@4<C%&!#+)
1";@4<C>8?BC
 ($/*.3

UvrY
CpxR

SpoT
RpoZ
(ppGpp)967:5A='"/*.3

RRF(ribosome recycling factor)

RMF(ribosome modulation factor)



細胞増殖及び細胞生存率におけるポリアミンモジュロ

ンの役割

要な蛋白質の合成を調節している物質であると考えポリアミンにより翻訳レベルで合成促進をうける蛋白質をコた。

ードする遺伝子群はポリアミンモジュロンと命名され、現在までに大腸菌において20種類が同定されている。これまでに大腸菌のプトレッシン生合成酵素欠損株同定されたポリアミンモジュロンの多くが転写因子をコード(MA261) を用いて、ポリアミンの有無で細胞増殖している。特に、プロモーター領域を認識するRNAポリメラ

速度を比較してみたところ、培地にプトレッシンーゼのシグマ因子のうちシグマ70以外のシグマ因子がポリ(PUT) を添加することで、細胞増殖が3倍〜5倍上

アミンモジュロンもしくはポリアミンモジュロンによって転昇し、生存率は７日目で10倍上昇するという知見写が促進されるシグマ因子であり、遺伝子の発現に非常に深く関わっていることが明らかとなった。

を見出した（図2） 7） 。MA261は、細胞内でPUT

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日本ポリアミン学会

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シリーズ

ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:46-53

表1

同定されたポリアミンモジュロン

:

OppA
Cya


Fis

rRNA

tRNA

RF2
FecI

RNA

σ18

RpoE
RpoS

RNA

σ24

RNA

σ38

RpoN

RNA

σ54

70S

100S

Cra
H-NS
StpA
RMF

)

RRF
SpoT
(ppGpp)
RpoZ
UvrY

RNA

ω

(ppGpp

:

CpxR
SoxR

:

EmrR
GshA

:

COX4



Cct2
Hnrpl

mRNA

Pgam1
eEF1A

rRNA中のアデニンのメチル化による会合促進によコードする遺伝子群を同定し、「ポリアミンモジュ

り、約2倍上昇したが、MA261は3倍〜5倍で細胞ロン」と命名した。

増殖促進が起こる8）。よって、全体の蛋白質合成促

大腸菌では、対数増殖期において細胞増殖に重要進機構に加え、別の新たな蛋白質合成促進機構が考な役割を果たす蛋白質12種を、定常期において生えられた。そこで、どのような蛋白質がポリアミン

存率に重要な役割を果たす蛋白質8種を同定したにより強く発現促進を受けるのかを検討したとこ

7-22) （表1）。これらのポリアミンモジュロンのうろ、細胞増殖に重要な役割を果たす蛋白質が、ポリち13種が転写因子として機能することから、ポリアミンにより強く発現促進を受けることが明らかとアミンが多くの遺伝子発現を調節し、細胞増殖や生なった 9） 。ポリアミンにより翻訳レベルで合成促

存率維持に寄与していることが明らかとなった（図進をうける細胞増殖や生存率維持に必要な蛋白質を3）。真核細胞では、酵母で1種、動物細胞で４種

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ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:46-53

表2

大腸菌とラット肝臓におけるポリアミン分布




(pH 7.5 10 mM M g2+ 150 mM K +)(pH 7.5 2 mM M g2+ 150 mM K +)

 

 

 
mM (%)

mM (%)

32.2 (100)6.88 (100)1.15 (100)0.88 (100)

12.5 (38.8)

0.26 (3.8)

0.08 (7.0)

0.02 (2.3)

DNA

3.0 (9.3)

0.35 (5.1)

0.05 (4.3)

0.05 (5.7)

RNA

15.4 (47.9)

6.17 (89.7)

0.90 (78.3)

0.75 (85.2)



0.46 (1.4)

0.05 (0.7)

0.07 (6.1)

0.04 (4.5)

ATP

0.84 (2.6)

0.05 (0.7)

0.05 (4.3)

0.02 (2.3)

mM (%)

mM (%)

を同定した23-25)（表1）。いずれも細胞増殖に必要れることが考えられた。大腸菌の全ゲノムが解読さな蛋白質であり、ポリアミンの細胞増殖への重要性

れ、細胞増殖に必須の蛋白質の大部分が明らかとなが示された。

った。細胞増殖・生存率に関わる重要な遺伝子の4.

mRNAの構造を調べてみたところ、翻訳効率の悪ポリアミンによるポリアミンモジュロンの合成

い構造を有しているmRNAが多数あることが示唆

促進メカニズム

され、次の①〜③のような特徴があることが明らか

ポリアミンは細胞内では主にRNAと結合して存となった。

在しており（表2）26,27)、ほとんど全ての蛋白質は①

ポリアミンと直接結合していないため、ポリアミン

配列と開始コドンが離れている。

による細胞増殖・生存率維持に関するメカニズムの②1つとして、ポリアミンがmRNAの特定構造に結合

開始コドンがAUGではなくGUGやUUGである。

することによって構造変化が起こり、翻訳が促進さ
1. Shine-Dalgarno (SD) 

翻訳開始に重要なシャイン・ダルガーノ (SD)③mRNAの翻訳領域に終止コドンが存在する。


OppA, FecI (σ18), RpoE (σ24), RpoN (σ54), Fis, H-NS,
StpA, RMF, RpoZ (ω), CpxR, SoxR, EmrR
5'

+ 

AUG

SD

fMet



UAC

5'

2. 

Initiator tRNA

SD

AUG



Cya, Cra, SpoT, UvrY, RRF, GshA
fMet

5'

SD

3. 



RpoS (σ38), RF2

fMet

Initiator tRNA

+ 

UAC
UUG
G


5'

SD

UAC
UUG
G


Gln

Suppressor tRNA

Gln

RF1
AU C

+ 
5'

AUG

UAG


5'

UAA

AUG

+ 
AUG

product

図4

UGA C

UAA

Asp

RF2

5'

AU C
UAG


5'

UGA

AUG

product

peptideCU G
U GA CUGA

σ38 or RF2大腸菌のポリアミンモジュロン及びその発現調節機構

ポリアミンモジュロンのmRNAの3つの特徴を示した。1つ目は、翻訳開始に重要なSD配列と開始コドンとの距離が離れている
mRNAである。2つ目は、開始コドンがAUGではなく、UUGやGUGといったmRNAである。3つ目は、ORF中に終止コドンが存在するmRNAである。ポリアミンはこのような特徴ある翻訳効率の悪いmRNAの蛋白質合成を促進する。

49

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ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:46-53

1. Ribosome shunting : Cox4, Cct2
Cap
m 7G

poly(A)

AUG

40S

Shunting (+# $)Met

2. CR  $ : eEF1A
CR
Cap
m7G


+ # $

AUG

40S

CR

Cap

Met

Met

3. ORF

60S

$: Antizyme

Cap
m7G



AUG

m7G

AUG

product

UGAU+ # $

UAG

Cap
m7G

AUG

product

short peptide

UGAU
CUA

UAG

Asp

Antizyme

4. "!: Hnrpl, Pgam1
図5

真核細胞のポリアミンモジュロン及びその発現調節機構

ポリアミンモジュロンの翻訳促進機構の3つの特徴を示した。1つ目は、リボソームシャンティングが起きる特徴を持つmRNAでは、ポリアミンがリボソームシャンティングを促進する。2つ目は、CR配列と開始コドンとの距離が離れている場合、ポリア
ミンがmRNAの構造を変化させ、蛋白質合成を促進する。3つ目は、アンチザイムのようにORF中に終止コドンが存在する場

合、ポリアミンはフレームシフトを促進する。他にもメカニズムは不明であるが、ポリアミンにより蛋白質合成が促進されるタ
ンパク質がある。

ポリアミンにより強く合成促進を受けるポリアミ

真核生物のポリアミンモジュロンのmRNAにおンモジュロン蛋白質は、翻訳効率が悪いmRNAのいても翻訳効率が悪い構造を有していることが示唆特徴を有していた。これらの蛋白質のmRNAの特された25)。現在までに明らかとなっている真核細胞定構造（2本鎖を形成しないバルジ構造やステム・におけるポリアミンモジュロンの翻訳促進機構は、

ループ構造）に、ポリアミンが結合して構造変化を3種類の特徴がある（図5）。

引き起こすことにより、翻訳レベルでの発現を上昇① 酵母のCOX4、動物細胞のCct2のmRNAの5ʼ-非させることが示された28,29)（図4）。①のmRNAで翻訳領域には、ポリアミンが結合すると予想さは、ポリアミンがバルジ構造を有するmRNAに結れるステム・ループ構造が存在した。そこで詳合することによって、SD配列と開始コドン付近の細に検討したところ、ポリアミンがその領域に構造が変化し、相対的な距離が縮まることで、翻訳結合してリボソームシャンティング（40Sリボ開始複合体形成の効率を高めた。②のmRNAでソームサブユニットが5ʼ-非翻訳領域上のステは、ポリアミンが開始コドンとfMet-tRNAとの相ム・ループ構造を飛び越えること）を引き起こ

互作用を高めて翻訳開始を促進した。③のmRNA

し、蛋白質合成を促進することが明らかとなっでは、ポリアミンが終止コドンのリードスルー（終た。

止コドンが読み過ごされ、実際の蛋白質より長鎖の② 原核生物と同様なSD配列が存在することが明ら

ペプチドが合成される現象）や＋1フレームシフト

かとなり、18S rRNAとの相補的な配列を発見を促進し、目的とする蛋白質合成の効率を高めた。

し、complementary sequence to 18S

ポリアミンはこのように特徴ある翻訳効率の悪い

rRNA「CR配列」と命名した。ポリアミンがバmRNAの蛋白質合成を促進させた。

ルジ構造を有するmRNAに結合することによって、CR配列と開始コドン付近の構造が変化し、50

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ポリアミン（2015）2:46-53

相対的な距離が縮まることで、翻訳開始複合体

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形成の効率を高めることが示唆された。
③ アンチザイムのようにORF中に終止コドンが存在する場合、ポリアミンはフレームシフトを促進させた。
この他、ポリアミンにより翻訳レベルで合成促進される蛋白質がいくつかあるが、真核細胞の蛋白質
合成開始反応機序は、原核細胞の蛋白質合成開始反応とは異なるため、完全なるメカニズムの解明には未だ至っていない。今後明らかにしていきたい。
おわりにポリアミンモジュロンの研究を通して、細胞に何らかの原因でストレスがかかったとき、ポリアミン
はストレスを除去する蛋白質の翻訳効率を上昇させ、細胞自体を活性化させるという新たな機能の存在が示唆された。ポリアミンの細胞増殖促進機構を調べることにより、原核生物におけるバイオフィル
ムの新規形成機構の発見、真核細胞におけるCR配列の発見など、様々な研究分野の発展の手掛かりになることも興味深いことの１つである。また、最近、老化の原因といわれている酸化ストレスにおいて解毒に関わる転写因子群及び動物細胞における翻訳伸長因子などの細胞増殖に重要な遺伝子群がポリ
アミンモジュロンであることが明らかになり、原核生物から真核生物へ至る共通性や普遍性という非常に興味深い謎の解明にもつながることが期待され
る。

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ポリアミン研究

ポリアミン（2015）2:46-53

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25.

26.

27.

28.

29.

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ポリアミン（2015）2:46-53

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53

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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:54-58

GC-MSを用いたポリアミンの分析中村篤央

協同乳業株式会社研究所技術開発グループ（190-0182 東京都西多摩郡日の出町平井20-1）
連絡先

中村篤央

e-mail: a-nakamura@meito.co.jp【はじめに】

り、当社で使用しているGCMS-QP2010装置（島ポリアミンの分析方法としては、高速液体クロマ津）もEI法を用いている。EI法では分子イオンとしトグラフ（HPLC）を用いた分析方法が比較的簡易てイオン化した後に、高い内部エネルギーの作用にで汎用性が高く主流である。我々の研究室でもポリより分子の開裂が発生し、フラグメントイオンが生

アミンの定量は分析効率の良いHPLCによる方法で成される。この開裂は成分の構造に特有なパターン

行っているが、ポリアミンの質量分析を目的としたで起こるため、EI法で得られたフラグメントイオン

実験にはガスクロマトグラフ-質量分析装置（GC-を含んだマススペクトルを解析することにより、成MS）を使用している。そこで、本稿では「シリー分の定性が可能となる。また、成分特有のイオンのズ実験手技ノート第2弾」として、GC-MSを用いたみを検出する選択イオン検出法（SIM）を用いるこ

ポリアミンの分析方法について紹介する。

とでさらに高感度な分析が可能であり、高感度な定ガスクロマトグラフィー（GC）は、気体を移動

量、未知物質の同定、安定同位体の質量分析におい相とするカラムクロマトグラフィーであり、液体クては、GC-MSの使用は有効である。このような特ロマトグラフィーと比較し理論段数が高いため、分性から、GC-MSを用いるポリアミン分析手法も論離が良く高感度で分析できる特徴を持っている。そ文中に散見され2,3）、我々も安定同位体を用いたトのため、多成分系混合試料、微量成分の定性・定量レース試験の分析にGC-MSを使用している。以下

分析に広く用いられている。一方でGCはその原理に 、 我 々 の グル ープ で 行 って い る ポ リ ア ミ ン の上、熱に不安定な物質や難揮発性成分は直接測定でEthylchloroformate（ECF）、Triﬂuoroacetic

きない。このような物質は官能基を修飾し、①熱安

anhydride（TFAA）による2段階の誘導体化法、定性を高め、②沸点を下げることで揮発性に変え、

GC-MSによる分析条件、及び主要ポリアミンのマ③極性を低下させることで目的成分ピークの分離を

ススペクトルを記載する。また、その応用例として改善する誘導体化が必要である 1） 。ポリアミン検G C - M S を 用 い た 、 腸 内 菌 叢 に よ る ア ル ギニ ン

出においても、この誘導体化のための前処理が必要（Arg）からのプトレッシン（Put）産生についてである。

の実験データも紹介する。

一般にGCは、多成分を含む試料から各成分を分【実験手法】

離することは得意であるが、GCだけでは分離した
各成分の正確な同定は困難である。GCに質量分析

サンプル調製装置（MS）を結合したGC-MSは、GCで分離した・各種サンプル（糞便/菌体/組織抽出液/培養上清

単一成分についてマススペクトルを測定することになど）400 µlに等量の冷20% Trichloroacetic

より成分の定性を行い、MSにより検出されたイオ

acid（TCA）と内部標準として0.01% 1,6-ンの強度により定量を行うことができる。GC-MS

Diaminohexaneを10 µl添加する。十分に撹拌しに使用されている質量分析装置のイオン化法で最もた後、氷冷で20分間静置し、15,000

一般的なものは、電子衝撃イオン化（EI）法であ間、4 ℃で遠心分離し、タンパク質が除去された
54

gで10分

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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:54-58

我々はより正確に定量するために内部標準で補正後に外部標準で定量化を行っている。

ECF

誘導体化

ECFによる誘導体化

TFAA

・2本を1本のチューブにまとめ、5M NaOHでpH
11〜12に合わせる。pH調整後の溶液500 µlを2mlチューブに測り取る。
Put

図1・50 µlのECFを含む1 mlのジエチルエーテルを加Spd

えボルテックスで室温30分間振盪する。

誘導体化されたPut及びSpdの構造式

・15,000

ルエーテル層をφ13スクリューキャップ試験管

上清を得る。定量用外部標準として、段階希釈（ガラス製）に移す。この抽出を2回繰り返す。

したポリアミン溶液も同様に処理する。
・上清300 µl

・35 ℃に温めたブロックヒーター上でN2ガスを当2本を新しいチューブにとり、ジエてながらジエチルエーテルを飛ばす。約5分間。

チルエーテルを1 ml添加し1分間撹拌を行う。
15,000g で5分間、 4 ℃で遠心分離しジエチ

gで5分間、4 ℃で遠心分離し、脂質おTFAAによる誘導体化

よび低極性の有機物を含むジエチルエーテル層を・100 µlの酢酸エチルとTFAA 200 µlを加え、混合

可能な限り除去する。この操作を2回繰り返す。

する。

遠心濃縮機でジエチルエーテルを除去する。

・キャップをしっかり締め75 ℃に温めたブロック
ヒーターで1時間加熱する。

✔ポイント

・35 ℃に温めたブロックヒーター上でN2ガスを当抽出効率、誘導体化率の補正のために内部標準としてながら乾燥させる。

て自然界に存在しない1,6-Diaminohexaneを使用

・200 µlの酢酸エチルで溶解し、GC-MS用のガラ

し た 。 1 , 7 - D i a m i n o h e p t a n e を スペ ル ミ ジ ン

スバイアルにパスツールピペットを使い、全量（Spd）・スペルミン（Spm）用に、重水素で標識を移す。ECF、TFAA誘導体化後のポリアミンの化したD4Putや1,3-DiaminopropaneをPut用の濃度構造式を図1に示す。

計算用の内部標準とし使用している文献もある。

Spd

Spm
Put

図2

Put、Spd、SpmのTICモードでのクロマトグラム

55

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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:54-58

GC-MS条件
GC

A

・カラム : Equity-5（30 ｍ 0.25 mm 0.25 µm,(

mass spectrum

ut

-258
((

Sigma-Aldrich）
・カラム温度 : 140 ℃ → 8 ℃/min →190 ℃（4min）→20 ℃/min → 300 ℃（4 min）→20℃/

MW424

)

-69

min → 320 ℃（4 min）
・インジェクション方法 ：Splitless法
・キャリアガス：He・流速：1 ml/min

・注入量

：2 µL

・注入口温度：260 ℃

(

B

)

(

,
(

mass spectrum

pd

)

)

MS

((

・イオン源温度：150 ℃

・インターフェース温度：250 ℃

(

MW553

-73

-258

)

( (

・分析モード ：Total ion chromatogram（TIC）( ( ( )(or Selected ion monitoring（SIM）

C

・TIC スキャンレンジ：m/z 50-800
・SIM モニタリングイオン Put: m/z 355、Spd: m/z,(

mass spectrum

pm

)

(

-73

480、Spm: m/z 609 etc.
)

上記のGC-MS

MW682

-258

測定条件で３種のポリアミン標

準物質を分析したTotal

)

(

((

Ion

(

Chromatogram（TIC）モードのクロマトグラフを

((

(
)

(

(
(

)

図2に示す。Put、Spd、Spmのマススペクトルを図3に示す。各ポリアミンで特徴的なマススペクトル

図3が得られることが分かる。未知の成分であれば全フン

ラグメントイオンが得られるTICモードでの分析が各ポリアミンのマススペクトルと代表的な開裂パター（A）ジアミンであるPutでは、69のイオンフラグメントが必要となるが、既知の成分であれば特異的なフラグ

開裂したメント（Put：m/z 166･m/z 355、Spd: m/z 295･m/z

 355と、258のイオンフラグメントが開裂した

 166 の特徴的なイオンフラグメントが検出される。

480、Spm: m/z 424･m/z 609など）をSIMモードで（B）Spdでは、73のイオンフラグメントが開裂した測定することで、より高感度に定量分析を行うこと

480と、258のイオンフラグメントが開裂した

ができる。



 295の特徴的なイオンフラグメントが検出される。（C）Spmでは、Spd同様

 73のイオンフラグメントが開裂した

【GC-MSを用いたポリアミン分析例】

609と、258のイオンフラグメントが開裂した認するために安定同位体ラベル化Argを用いて実施

開裂パターンをSpdのマススペクトルに記す。258のイオン

424のイ

オンフラグメントが検出される。73のイオンフラグメントの腸内菌叢がArgからPutを産生していることを確

フラグメントの開裂パターンをSpmのマススペクトルに記した実験を紹介する。

す。

56

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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:54-58

  Arg Put

L-Arginine-13 C6 ,15 N4
+10

 

Putrescine-13 C4 ,15 N2
+6

図4 安定同位体ラベル化アルギニン（13C6,15N4 Arg･1 HCl）
●は13C、●は15Nを示す。

腸内菌叢によるArgを基質としたPut産生の証明

171（イオン開裂によりPut骨格中の窒素1原子も外・大腸にカテーテルを挿入したラット（SD、雄れるので+5となる）のマススペクトルが検出され性、8週齢）に安定同位体ラベル化アルギニン（図５青矢印）、安定同位体ラベル化アルギニン

Arg･1 HCl） 6.6 mg/kg body

（13C6,15N4 Arg･1 HCl）からPutがラット大腸内でweightをイソフルラン麻酔下で大腸へ直接注入産生されたことが示された。総Put量に対するラベ

し、6時間後に開腹し結腸内容物を採取した。

ル化Putの比率は約44 %であることが確認された・結腸内容物をPBSで抽出し、前述の方法で誘導体（表1）4）。

化を行いGC-MSにて分析を行った。
・安定同位体ラベル化アルギニン（13C6,15N4 Arg･

【おわりに】

1 HCl）から産生されるPutの質量は+6となる

本稿ではECFとTFAA を用いた誘導体化法2）を紹（図4）。

介したが、その他にもECFとPentaﬂuoropropionyl anhydride を用いる誘導体化法に結果てポリアミンをGC-MSで分析する手法もある3）。

検出されたPutのマススペクトルを図5に示す。通カラムの種類、カラム温度、溶離液（グラジエン

常のPutのフラグメントイオンm/z 355に対し＋6の図5から産生されるPutとその誘導体物

m/z 361（図５赤矢印）、m/z 166に対し＋5のm/z

方法（13C6,15N4

Putrescine-13 C4 ,15 N2 (delivatized)
+6ト）、流速といった可変パラメータが多いHPLCと安定同位体ラベル化アルギニン（13C６,15N４ Arg･1 HCl）から産生されたと考えられるPutのマススペクトル57

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表1

実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:54-58

Putに占める安定同位体標識化Putの割合
Peaks
m/z

Relative abundance（%）

m/zNormal

166

97.7

355

25

Labeling

171

73.4

361

20.1

Ratio of labeling（%）

42.9

Relative

abundance（%）

44.6

比較すると、GC-MSは可変パラメーターが少ない
ため、計測したいポリアミンの種類、夾雑物の有無により適した誘導体化法を選択することが望ましい。本稿で紹介したECFとTFAAを用いた誘導体化
法は、文献中2）では6時間以内に分析することが推奨されている。誘導体化法によっては安定性が変わるので注意が必要である。

参考文献
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58

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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:59-66

質量分析計を用いたポリアミンの分析
森谷俊介

東京都医学総合研究所

幹細胞（156-8506東京都世田谷区上北沢2-1-6）
連絡先森谷

1.はじめに俊介、e-mail: moriya-ss@igakuken.or.jp

クのシグナル強度比から測定対象を精密に定量化す

1980年代以来、ポリアミンの測定にはHPLC法

ることが可能となる。

による測定が広く普及し、使用されている。学会誌

この方法では、測定前処理に先だって試料に内部の前号にもあったように、HPLC法は現在でも多く標準物質を添加し、その後、ポリアミンの固相抽の先生方によって測定対象により様々な工夫や改良

出、誘導体化の操作を行う。そして、一度の測定でがなされ、依然としてポリアミン分析の主流であ

複数のポリアミン成分を同時に測定できる（図1）

る。一方で、これまで取り扱いの難しかったGC-

ため、多量の試料を効率良く測定できる。

MS、LC-MS、NMRなどの精密機器がやや扱いやす

固相抽出は、フリーおよびモノアセチル体ポリア

くなり、各分野の利用が急速に進んでいる。我々

ミンの測定とジアセチル体ポリアミンの測定（とくは、こうした機器を使い、生体試料中のポリアミンにN1,N8-diacetylspermidine（DiAcSpd））とで量を正確に、効率よく測定することを目的として、は、操作が異なるため、後述のように測定対象に適質量分析装置（LC-（Q）TOF/MS）を利用した新した操作を選択する必要がある。

しいポリアミン分析法の開発を行ってきた。質量差

質量分析計は、（Q）TOF型の質量分析計を用いによって物質を検出・識別するこの分析法は、さらる。試料であるポリアミンの誘導体化を行い、エレにポリアミン代謝酵素の活性測定への応用も可能でクトロスプレーイオン化（ESI）法によりイオン化ある。

して、測定する。さらに、この方法の発展として、

本稿では、これまで我々が検討してきたポリアミ

MS/MS分析を用いることで、アセチルスペルミジンの分析法について紹介する。

ン異性体であるN1-acetylspermidine （N1AcSpd）とN8-acetylspermidine （N8AcSpd） の同定を、

2.質量分析による測定のアウトライン

試料前処理の手間などは変わらず、行うことができ

本稿で紹介する測定法は、安定同位体標識ポリア

る。

ミンを用いた、LC-（Q）TOF/MSによるフローイ
ンジェクション測定である。フローインジェクショ

以下に、操作の手順や注意点などを尿検体中のポン測定は、測定時にカラムを使用した分離を行わな

リアミン測定を実験例とし、解説する。

いため、分析時間が短く、操作が単純で、再現性も高い。また、質量数が異なるだけで物理的・化学的3.測定法の詳細

性質はほぼ変わらない安定同位体標識ポリアミンを

安定同位体標識ポリアミン―

内部標準物質として用いることで、固相抽出などのポリアミンの定量は、未知濃度の試料に既知濃度操作による損失や測定時のイオン化過程での分子イの内部標準物質を添加し、それらのシグナル強度比

オンの損失によるシグナルの低下などの影響を最小から濃度を求める内部標準添加法を用いる。そのた化して、測定対象と内部標準物質の分子イオンピー

めに、各ポリアミン成分の内部標準物質となる安定

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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:59-66

図1．TOF/MS分析による3種のポリアミンおよび4種のアセチルポリアミンの誘導体の同時測定結果
上図は

 100 ~ 1100のスキャン範囲のスペクトル。下図は各ポリアミン測定域の拡大図。TOF/MS 分析のAcSpd 領域では

N1AcSpd とN8AcSpd が同一の分子イオンピークとして測定されるが、MS/MS 分析を用いれば2つの分離定量が可能である(図2を参照）。

同位体標識ポリアミンが必要である。ここでは、以定同位体標識ポリアミンは、検出時における天然ポ

下の物質をそれぞれの参考文献の記載にしたがってリアミンの同位体イオンピークの影響を避けるた

準備した。

め、通常、天然ポリアミンの主同位体のみからの精
密質量（モノアイソトピック質量）から3 ~ 4質量

1,4-13C2,1,4-15N2-putrescine•2HCl

数が大きくなるよう設計し、合成した。

（13C2,15N2-Put）1）、

N1AcSpd、N8AcSpd分析には天然AcSpdより質量

1,4,8-15N3-spermidine•3HCl （15N3-Spd）2）、数2大きい内部標準物質を準備した。これは、MS/[acetyl-1,2-13C2]-N1-acetylspermidine•2HCl

MS分析を行う際に天然AcSpd由来の分子イオンと安定同位体標識AcSpd由来の分子イオンの両方に（13C2-N1AcSpd）3）、対して、十分な衝突エネルギーを与えられるように[acetyl-1,2-13C2]-N8-acetylspermidine•2HCl

することと、天然AcSpdの同位体イオンピークの影（13C2-N8AcSpd）3）、響を最小限にすることの2つの要素を同時に考慮し

1,4,7-15N3-N1-acetylspermidine•2HCl

たためである。

（15N3-N1AcSpd）4）、
1,4,8-15N3-N1,N8-diacetylspermidine•HCl

フリーポリアミン、モノアセチルポリアミンの固相（15N3-DiAcSpd）5）、抽出―

1,4,9,12-15N4-spermine•4HCl （15N4-Spm）2）、測定試料は、イオン化の抑制などの感度低下の要

4,9,12-15N3-N1-acetylspermine•3HCl

因となる塩や測定対象以外の夾雑物を極力除去する（15N3-N1AcSpm）3）、

ために、固相抽出によって部分精製して用いた。試1,4,9,12-15N4-N1,N12-diacetylspemine•2HCl

料からのポリアミン固相抽出は、陽イオン交換樹脂（15N4-DiAcSpm）4）を用い、Put、Spd、Spm、N1AcSpd、N8AcSpd、
N1AcSpm、DiAcSpmを固相抽出した。陽イオン交

質量分析では、物質を構成する元素組成の質量ピ換カラムには、CM-セルロース樹脂（和光純薬、ークの他に、この構成元素の天然同位体による質量C a t # : 0 3 3 - 1 9 3 6 1 ） を 使 用 し 、 P i e r c eTM

数の異なる同位体イオンのピークも検出される。安Disposable Columns, 2 mL（Thermo Scientiﬁc,
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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:59-66

Inc.、Cat#: 29920）に0.3 mLの樹脂を充填して、以下に、この方法で尿検体を処理した代表的な実使用した。

験例を示す。

試料に測定対象となるポリアミンに対応した内部標準物質を任意濃度（目安としては測定対象のポリ実験例）尿検体からのPut、Spd、Spm、アミンの3 ~ 10倍程度）添加した。この溶液にトリN1AcSpd、N8AcSpd、N1AcSpm、DiAcSpmの固クロロ酢酸溶液を終濃度3 ~ 5%となるように添加

相抽出

し、遠心分離により、除タンパクを行った。この遠1.

1.5 mLチューブに尿検体0.2 mLを採取し、心上清はカラムにロードする前に50 mMピリジン

40 µM 13C2,15N2-Putを25 µL（ﬁnal. 1 nmol/を用いて、中和した。

tube）、40 µM 15N3-Spdを50 µL（ﬁnal. 2

カラム操作には、揮発性の酸・塩基を用いたピリ

nmol/tube）、40 µM

15N4- S p m を 5 0

ジン／酢酸緩衝液（Pyr/AcOH）を使用している。

µL（ﬁnal. 2 nmol/tube）、40 µM

不揮発性塩を使用すると、MS測定でのイオン化のN 1 AcSpdを12.5 µL（ﬁnal. 0.5 nmol/

際に塩によるイオン化への阻害やイオンソースへのtube）、40 µM

沈着などによる感度低下が起こるため、使用を避けµL（ﬁnal. 0.5 nmol/tube）、40 µM 15N4-

る必要がある。試料をロードしたカラムはイオン強DiAcSpmを12.5 µL（ﬁnal. 0.5 nmol/tube）

度（塩濃度）を変えることによる、2段階のステッ添加した。

プワイズ洗浄を行った。溶出は1 M Pyr/AcOHで行

2.

い、溶出してきたポリアミン画分を回収した。

15N3-

15 N 3 -N 1 AcSpmを12.5

10%トリクロロ酢酸溶液を0.3 mL添加し、20,000 x g、4 C、15分間遠心を行った。

この画分は、遠心エバポレータ（CVE-3100、東3.

京理化器械）に冷却トラップ（UT-2000、東京理遠心で得た上清を新しい容器に回収し、50mMピリジンを2 mL添加した。

化 器 械 ） と 真 空 ポ ン プ （ G C D - 0 5 1 X 、 U LVAC

4.

作製したCM-セルロースカラム（樹脂容量0.3

KIKO, Inc.）を連結した装置を用いて一度乾固させmL）は、樹脂容量の10倍量（3 mL）の1 M

た後、0.1 M塩酸／70%エタノールを添加して溶解

Pyr/AcOHで洗浄後、10倍量（3 mL）の10し、再び乾固させた。一度目の乾固で、溶媒の除去

mM Pyr/AcOHで平衡化を行った。

が不完全であると、塩酸添加の際にピリジン塩酸塩

5.

4.で準備したCM-セルロースカラムに試料をを生じ、測定時の妨害となる。塩酸の添加操作によロードし、10 mM Pyr/AcOHで3 mL、100

り、溶出したポリアミンは酢酸塩から塩酸塩へ置換

mM Pyr/AcOHで3 mL、カラム洗浄を行っされる。誘導体化の前に塩酸塩に置換することは、た。以下のカラム操作は、いずれも自然流下

後の誘導体化の際に混合酸無水物の生成を避けるたで行った。

めに重要な操作である。混合酸無水物は、誘導体化

6.

の際にポリアミンのアセチル化を引き起こし、定量

1 mLの1 M Pyr/AcOH で溶出を行い、ねじ口試験管に回収した。

に影響を与える。

7.

多量の夾雑物が混在する生体試料の測定において回収したサンプルを37 Cに設定した遠心エバ
ポレータにセットし、真空ポンプで-100 kPa

は、しばしばイオン化の抑制によって測定が妨害さ以下の減圧度で乾固させた。（約2時間）

れ、分析の信頼性が低下することがあるが 6） 、安

8.

定同位体標識ポリアミンを用いた我々の測定条件下

試料に0.1 M塩酸／70%エタノールを0.1 mL添加した。

ではイオン化の抑制は起こらなかった。仮に、抑制9.

が起こった場合でも、内部標準物質添加法 5） を使

再び、遠心エバポレータで乾固した。（約20分）

用しているので、イオン化の抑制によるエラーを最小限にすることができる。
61

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ポリアミン（2015）2:59-66

DiAcSpdおよびDiAcSpmの固相抽出―実験例）尿検体からのDiAcSpd、DiAcSpm の固相

ジアセチル体ポリアミンは、フリーおよびモノア

抽出

セチル体ポリアミンに比べ電荷が弱い。そのため、

1.

1.5 mLチューブに尿検体0.2 mLを採取し、とくにDiAcSpdは、CM-セルロースカラムを用いる

40 µM

上 述 の 方 法 で は 十 分 に 回 収 で き な い 。 そ こ で、

DiAcSpm を各12.5 µLずつ添加した（ﬁnal.

DiAcSpd、DiAcSpmの定量に際しては、強陽イオ

各0.5 nmol/tube）。

ン交換カラムを使用して対象物質を固相抽出する方2.

法をとることとした。ここでは、より効果的に固相

15N

3-DiAcSpd、40

µM

15N

4-

10%トリクロロ酢酸を0.2 mL添加し、20,000
x g、4 C、15分間、遠心を行った。

抽出を行うため、陽イオン交換カラムの使用前に、

3.

強陰イオン交換カラムにより、試料中の陰イオン性

遠心上清を新しいチューブに回収し、0.5 M
炭酸ナトリウム水溶液を0.15 mL添加した。

物質を吸着除去する方法を紹介する。固相抽出に使

4.

Oasis MAX Cartridgeは、メタノール1 mLで用する陰イオン交換カラム・陽イオン交換カラムと洗浄後、超純水1 mLで平衡化した。以下のカ

してはOasis MAX 1 cc Vac Cartridge（Waters

ラム操作は、いずれも自然流下で行った。

Corp.、Cat#: 186000366）とOasis MCX 1 cc

5.

Oasis MAX Cartridge に試料をロードし、素Va c C a r t r i d g e （ Wa t e r s C o r p . 、 C a t # :通り画分を回収した。さらに、超純水1 mLで186000252）を用いた。

カラムを洗浄し、素通りした洗浄液も同じ容試料中に、測定対象となるポリアミンに対応した器に回収した。

内部標準物質を任意濃度（目安としては測定対象の

6.

素通り画分に0.1 M塩酸を0.4 mL添加した。

ポリアミンの3 ~ 10倍程度）添加し、トリクロロ酢

7.

Oasis MCX Cartridgeは、メタノール1 mLで酸による除タンパクを行った。除タンパク後の試料洗浄後、超純水1 mLで平衡化した。

は、0.5 M炭酸ナトリウム水溶液を用い、pHを中

8.

素通り画分をOasis MCX Cartridgeにロード

性よりややアルカリ側へと調整した。これをOasis

し、0.1 M塩酸2 mL、メタノール2 mLで順次

MAX Cartridgeにロードし、素通り画分と超純水1カラムを洗浄した。

mLでの洗浄画分を回収した。次に、素通り＋洗浄

9.

画分のpHを0.1 M塩酸によって中性よりやや酸性

28%アンモニア水／メタノール（1: 9）1 mL
で溶出させた。

側に調整し、Oasis MCX Cartridgeにロードした。

10. 溶出画分を37 Cに設定した遠心エバポレータ

カラムを0.1 M塩酸、メタノールで洗浄後、28%アにセットし、真空ポンプで-100 kPa以下の減

ンモニア水（和光純薬、Cat#: 016-03146）の10

圧度で乾固した。（約1時間）

倍メタノール希釈液で溶出した。

11. 試験管中の試料に0.1 M塩酸／70%エタノール

アンモニアで溶出した遊離塩基形のポリアミン

を0.1 mL、添加した。

は、一般的に塩酸塩と比べると不安定である。ジア

12. 再び、遠心エバポレータで乾固した。

セチル体はフリーポリアミンほど不安定ではないが、一層の安定化のために、一度減圧乾固を行った

ポリアミンの誘導体化―

後、0.1 M塩酸／70%エタノールを添加し、塩酸塩

ポリアミンは分子量が100~300程度と小さく、に置換し、再び乾固させた。

検出の際にベースラインノイズの大きい検出域にあ

以下に、この方法で尿検体を処理した代表的な実る。これを誘導体化することで、質量数が増大し、験例を示す。

ベースラインノイズの少ない検出しやすいm/z域へシグナルが移動する結果、検出感度が改善する。誘導体化にはまた、イオン化効率を高め、感度を向上させる効果もある。誘導体化試薬には、ヘプタフルオ
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ポリアミン（2015）2:59-66

ロ酪酸無水物（Sigma-Aldrich, Inc.、cat#:5.

測定に適当な濃度へ調整するため、試料溶液

394912）を用いた。フッ素含有誘導体化試薬にを20 µL分取し、溶解液を0.18 mL添加した。

は、フッ素（19F）の天然存在比が 100%であるた
め、試薬による誘導体化後の同位体イオンピークの

LC-TOF/MS分析を用いたポリアミン測定―

影響を無視することができる利点がある。

測定には、Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF

試料にアセトニトリル、ヘプタフルオロ酪酸無水

LC/MS system（Agilent Technologies, Inc.）を物を添加し、密閉系で反応させた。ヘプタフルオロ

使用し、ESI法のイオンソースとしてDual ESIを用

酪酸無水物は、試料中に水が残っていると加水分解いた。移動相としては、0.2%酢酸アンモニウム、するため、誘導体化の前の乾固は十分に行う必要が0.05%ギ酸／50%アセトニトリルを使用した。測定

あ る 。 ま た 、 固 相 抽 出 が 終 わ っ た 段 階 で、 試 料には、カラムを使用せず、流速0.1 ml/minの移動の-20 Cでの保存が可能であるが、冷凍保存した試

相に試料1 µLをロードし、装置に注入、ポリアミ料を誘導化する際は、湿気を避けるために常温に戻ンの検出を行う。その他の測定条件は表1に示ししてから開封するというような注意を払う必要があた。

る。反応終了後は窒素ガスを吹き付けることで、試料を乾固させた。乾固した試料を0.2%酢酸アンモ

表1．TOF/MS分析の分析条件

ニウム、0.05%ギ酸／50%アセトニトリル溶液1Agilent

mLで溶解させた。検出に適した濃度に調整するた装置

め、さらに同じ溶解液で10倍希釈を行い、測定試

イオンソース
イオン化モード
乾燥ガス
ネブライザー
キャピラリー電圧
フラグメンター電圧
スキャン範囲ポリアミンは、誘導体化によりアシル化を受け、遊離アミノ基にヘプタフルオロ酪酸1分子が付加される。しかし、アセチル基が付加しているアミノ基に対してはヘプタフルオロ酪酸が導入されないた
め、質量分析においてはアセチル体ポリアミンとフリー体ポリアミンの質量数（m/z）が逆転して検出
される。

移動相

以下に代表的な実験例を示す。

乾固した試料が入ったねじ口試験管中に、ア
セトニトリル0.1 mL、ヘプタフルオロ酪酸無
水物20 µLを添加した。

0.05%ギ酸／50%アセ

移動相流量
注入量
分析時間

1 µL
60 secなし

P u t 、 S p d 、 S p m は ア ン モ ニ ウムアダク ト （ [ M+ N H 4 ] + ） と して 、 A c S p d （ N 1 A c S p d と反応終了後、窒素ガスを溶液に吹き付け、乾N8AcSpd）、DiAcSpd、N1AcSpm、DiAcSpmは

固した。
4.

ム、

誘 導 体 化 さ れ たポリ ア ミンの分子イオンは、ねじ蓋をしっかりと閉め、ブロックヒータで100 C、30分間加熱した。

3.

Dual ESIESI（+）
N2, 350 C, 10 mL/min
N2, 35 psi
3500 V
130 V
100 ~ 1100
0.2%酢酸アンモニウ

トニトリル
0.1 mL/min

カラム

実験例）固相抽出後の試料の誘導体化

2.

Accurate-Mass
Q-TOF LC/MS system

料とした。

1.

6530

プロトンアダクト（[M + H] + ）として検出される。

乾固させた試料を0.2%酢酸アンモニウム、

従って、各ポリアミン成分とそれに対応した内部標

0.05%ギ酸／50%アセトニトリル1 mLで溶解

準物質は以下のm/zで検出された。Put（m/z 天然ポさせた。

リアミン、498 : 安定同位体標識ポリアミン、
63

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ポリアミン（2015）2:59-66

ークとして検出される。以下に述べるように、この2種類の異性体はMS/MS分析によって分離定量することができる。
MS/MS 分析を用いたN1AcSpd、N8AcSpd の定量―
TOF/MS分析でAcSpd領域に検出される天然
AcSpdと安定同位体標識AcSpdの2つのシグナルを与える成分に対し、選択的に衝突エネルギーを与えることでMS/MS分析によるN1AcSpd、N8AcSpdの定量が行える。測定試料からのN1AcSpd、
N8AcSpdの固相抽出は、“フリーポリアミン、モノ
アセチルポリアミンの固相抽出”の項で述べたとおりCM-セルロースカラムを用いて行う。ただしここでは、内部標準物質として天然ポリアミンより質量数が2大きい13C2-N1AcSpdと13C2-N8AcSpdをそれぞれ終濃度0.5 nmol/tubeとなるように添加した。
この内部標準物質を用いた場合、TOF/MS分析において、誘導体化されたAcSpdはプロトンアダクトとして、m/z値は580と582に検出される（図2、上図）。この2つのピーク成分（プリカーサーイオン）の強制的フラグメンテーションを起こさせるため、装置のコリジョン電圧を34 Vに設定し、プリカーサーイオンに対し衝突エネルギーを加える。す図2．AcSpd分子イオンのMS/MS分析によるN 1 AcSpd

ると、N1AcSpd（またはN8AcSpd）からはそれぞとN8AcSpdの同定（上図） TOF/MS分析によるAcSpdの測定結果（

れ、中心にある二級アミンとN1（またはN8）側の 100炭素の間で解裂した、アセチルアミドプロピル基~ 1100）。（中図） TOF/MS分析で検出されたAcSpdに（またはアセチルアミドブチル基）に由来するフラ

対して、MS/MS 分析を行った際のプリカーサーイオン（★
印）から生じたフラグメントイオンの測定結果（

グメ ン ト イ オ ン が 検 出 さ れ た （ 図 2 、 中 図 と 下

 50 ~

図）。この時、内部標準物質ではアセチルアミドプ

1100）。（下図） MS/MS分析におけるアセチルアミドプ
ロピル基（（

ロピル基（またはアセチルアミドブチル基）内に標 100: 102）とアセチルアミドブチル基識された2個の炭素があるため、天然のAcSpd分解

 114: 116）領域の拡大図。

物より質量数2大きな分子イオンが検出される。したがって、N 1 AcSpdに由来するアセチルアミドプ502）、Spd（m/z 751: 754）、AcSpd（m/z 580:

ロピル基（m/z 100: 102）と、N8AcSpdに由来す583）、DiAcSpd（m/z 426: 429）、Spm（m/z

るアセチルアミドブチル基（m/z 114: 116）を、そ

1004: 1008）、N1AcSpm（m/z 833: 836）、

れぞれ、内部標準物質との比較によって、同定・定DiAcSpm（m/z 679: 683）（図１参照）。

量することができる。

AcSpdについては、TOF/MS分析ではN1AcSpdとN8AcSpdの2種類の異性体が同一の分子イオンピ
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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:59-66

4.おわりに

参考文献

この方法を用いれば、ポリアミン代謝の経路に関1.

係する全3種類のポリアミンおよび4種類のアセチ
ルポリアミンを同時に測定することができる。そしXu YJ, Hara T, Samejima K, Sasaki H, Kobayashi

M, Takahashi A, Niitsu M, Simultaneous
determination of endogenous and orallyて、対応する内部標準物質とのピーク面積比に基づ

administered

いてそれぞれの成分の量を正確に求めることができ

15 N-labeledpolyamines in rat

organs. Anal Biochem. 301（2）:る。質量分析装置の前段にカラムを使用しないた

2.

め、測定は迅速に行える。さらに、MS/MS分析を利用すればN1AcSpdとN8AcSpdの異性体を同定、255-260（2002）.

Hara T, Xu YJ, Sasaki H, Niitsu M, Samejima K,

Syntheses of [13C,15N]-labeled polyamines, J
Labelled Cpd Radiopharm. 43（10）:定量することもできる。ここでは、2種類の異性体の 内 部 標 準 物 質 と して 1 3 C 2 - N 1 A c S p d と 1 3 C 2 -3.

N8AcSpdを利用し、MS/MS分析により生じるフラ

1005-1011（2000）.

Moriya S, Iwasaki K, Samejima K, Takao K, Kohda

K, Hiramatsu K, Kawakita M. A mass

spectrometric method to determine activities of

グメントイオンを内部標準物質との面積比に基づいenzymes involved in polyamine catabolism. Analて定量する方法について説明した。
私たちは現在、この方法をポリアミン代謝酵素の4.

活性測定に応用したいと考えて研究を進めている。
酵素活性の測定に関しては、これまでも種々の方法

Chim Acta. 748: 45-52（2012）.

Kobayashi M, Samejima K, Hiramatsu K, Kawakita

M. Mass spectrometric separation anddetermination of N1,N12-diacetylspermine in theが工夫され、利用されている。しかし、その中に

urine of cancer patients. Biol Pharm Bull.

は、たとえばオキシダーゼ反応の活性値を反応の産5.

物である過酸化水素の量から求めるなど、間接的に活性値を求める方法も多い。そのため、内在性物質

25（3）: 372-374（2002）.

Samejima K, Hiramatsu K, Takahashi K, Kawakita

M , Ko b a y a s h i M , Ts u m o t o H , Ko h d a K .
Identiﬁcation and determination of urinary

による妨害や副反応の影響を受けやすく、とくに

acetylpolyamines in cancer patients by

種々の細胞成分や酵素が混在する生体試料中の弱い

electrospray ionization and time-of-ﬂight mass

spectrometry. Anal Biochem 401（1）:

酵素活性を正確に測定することが困難であった。安
定同位体標識ポリアミンを基質として反応させれ

6.

ば、天然物とは質量の異なる生成物が生じる。上述の実験に用いたものよりもさらに質量の大きい標識

22-29（2010）.

Bruins CH, Jeronimus-Stratingh CM, Ensing K,

van Dongen WD, de Jong GJ. On-line coupling ofsolid-phase extraction with mass spectrometry

ポリアミンを準備し、それを内部標準物質として用for the analysis of biological samples: I.

いれば、ここで説明した方法と同様に酵素反応の生Determination of clenbuterol in urine. J
Chromatogr A 863（1）: 115-122（1999）.

成物を直接かつ正確に定量することができる。
5.謝辞

本稿を執筆するに当たり、川喜田正夫先生、鮫島啓二郎先生、お二人の先生方には多くのご指導をいただきました。厚く御礼を申しあげます。

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ポリアミン（2015）2:59-66

コラム：質量分析の用語説明
質量分析が身近になり論文で目にする機会が多くなっていると思います。本稿でもいくつかの関連用語を使用していますが、馴染みのない用語について簡単に説明します。
LC-（Q）TOF/MS
Liquid Chromatography−quadrupole Time-of-Flight/Mass Spectrometry (液体クロマトグラフ四重極飛行時間型質量分析計） の略。装置としてはHPLCの後に四重極飛行時間（（Q）TOF） 型の質量分
析計（MS） を連結させたもの。TOF/MS分析は、イオン化された試料が真空中で飛行する時間を計測する
ことにより対象の質量を測定する分析法である。試料に由来するシグナル（分子イオンピーク） から試料の分子量情報が得られる。
フローインジェクション測定
測定ではLC部でカラム分離を行うのが通常だが、カラムを使用せず移動相の流れに試料をのせてMSに注入する分析法をフローインジェクション測定という。LC部を使用せずシリンジを用いて試料を直接連続注入する分析法をインフュージョン測定という。
イオンソースとイオン化法
LC部から移動してきた試料を、MS部への注入前でイオン化させる部位をイオンソースという。イオン化法には 様 々 な 方 法 が あ る が 、 本 稿 で は エ レ ク ト ロ ス プ レ ー イ オ ン 化 （ E S I ） を 用 い て い る 。 ESIは一般的に試料に対してマイルドなイオン化法の一つと言われている。
MS/MS分析
本稿で用いた質量分析装置の構造は2台のMSが直列に結合されたものである。TOF/MS分析ではイオン化された試料を1台のMSを使用し測定しているが、MS/MS分析では、1台目で検出されたある特定のイオン（プリカーサーイオン） にさらに衝突エネルギーを与え、生じた二次イオン（フラグメントイオン） を2台目のMSで質量分離し、検出している。MS/MS分析では、目的の物質由来のフラグメントイオン情報を得ること
で、対象の構造解析などが行える。
モノアイソトピック質量と同位体イオンピーク
多くの元素には天然の同位体存在比が存在するため、測定を行った際には質量数が異なるいくつかのシグナ
ルが検出される。試料分子を構成する各元素の主同位体のみからの精密質量をモノアイソトピック質量といい、同位体元素を含む元素で構成された質量を同位体イオンピークという。
アダクトイオン
試料のイオン化は、過程の最後で電子が試料に付加されてイオン化が完了する。イオン化条件、分子種の極性、移動相の特性などにより多様なアダクトイオンが検出されが、正イオン測定モードの測定では、プロト
ン、アンモニウムなどが付加したプロトンアダクト、アンモニウムアダクトがよく形成され、検出される。

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ポリアミン（2015）2:67-71〜 編集部より筆者への質問コーナー 〜＜GC-MS を用いたポリアミン測定について＞
Q. 前処理から分析終了までどのくらい時間がかかりますか？
中村：検体数にもよりますが、おおよそ前処理に1時間、誘導体化に4時間を要します。GC-MSによる分析は1検体あたり30分を要します。
Q. 途中でサンプルを保存できる箇所があったら教えてください。
中村：TCAによりたんぱく質を除去し、ジエチルエーテルにより脂質および低極性の有機物を除去した
後の水層は−20℃にて保存可能です。
Q. 操作中、最も気を遣うことは何ですか？
中村：TFAAでの誘導体化時に最も気を遣います。以下の点に注意し作業しています。
・TFAAの誘導体化前にN2ガスで十分乾燥させる。水分の移行は反応を阻害します。
・TFAA 200μlを添加する前に、酢酸エチルにて試験管の底部と内壁のECFによる誘導体化物を十分に溶解させた後にTFAAを加える。
・TFAAは揮発性が高いため、75℃で1時間反応させる際に完全に密栓できるものを使用する。
Q. GC用誘導体化法としてシリル化、アシル化、アルキル化などが知られていますが、ポリアミン測定にアシル化を選択した理由を教えてください。
中村：ポリアミンのGC用の誘導体化方法としては、アシル化反応を用いた報告が多いです。これはアミノ基に対する反応性と誘導体化物の保持強度が高いことが理由だと考えられます。アシル化剤
としてはTFAAの他に無水ペンタフルオロプロピオン酸を用いたポリアミンの誘導体化法も報告されていますが、TFAAの方がピークがシャープであり且つ揮発性が高いとの報告があることか
らTFAAを採用しました。
Q. 未反応の無水フルオロアシル化剤や、反応副生成物の酸はどうされていますか？ 何か影響ありますか？
中村：未反応のTFAAはブロックヒーター上でN2ガス噴射により留去されます。TFAAは腐食性が高い
ため、後の操作に移行しないようにしっかり乾燥させます。また、留去に際しブロックヒーター
ごとドラフト内に入れて操作しています。反応副生成物のうち揮発性が高いものについてはしっ
かりと乾燥させることで、未反応のTFAA同様に留去されると考えられます。揮発性が低いものについてはポリアミンの誘導体化物と同様に酢酸エチルに溶解されていると考えられます。副生
成物の影響を少なくするためにGC-MSに注入する量は少ない方が好ましいと考えられます。
Q. 誘導体化から分析までの時間を考慮すると、一度に何検体まで同時に誘導体化処理可能ですか？
中村：誘導体化物の安定性と GC-MS での測定時間を考慮すると12検体までが安定して測定ができる検体数と考えられます。

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ポリアミン（2015）2:67-71

Q. 有害性や危険性のある試薬については、操作段階、廃棄段階でどのような注意や工夫をすればよい
か教えてください。
中村：ECF、TFAAは吸引、皮膚へ付着しないように必ずドラフト内で手袋着用の上、操作するように注意してください。
ECF、TFAAともに水との反応性が高いため、水との接触を避けて保存するように注意してください。
廃液処理は廃棄物処理業者に依頼しています。

＜尿サンプルについて、LC-MSシステムを用いたポリアミン測定について＞Q.

尿サンプルの保管上の注意点があったら教えてください。

森谷：採尿した検体に、微生物の繁殖を防ぐために0.05~0.1%程度となるようにアジ化ナトリウムを添加し、-20 C以下で保管しています。アジ化ナトリウムを添加した尿であれば、数日、4 Cで保存した試料でもポリアミン測定には問題ありませんでした。
Q. 前処理から分析終了までどのくらいの時間がかかりますか？
森谷：前処理に要する時間は、一度に処理する検体数にもよりますが、これらを大きく左右するのは乾固操作に用いる遠心エバポレータの能力です。我々の研究室にある遠心エバポレータには一度に48本まで試験管が架けられますので、この場合の処理時間についてお話します。
前処理は慣れてくれば、その当日中に試料の測定まで行えます。固相抽出に1~2時間、乾固に2~3時間、誘導体化に1~2時間ほどかかります。測定は1検体に対し、1分間の測定、そのまま移動相を流し続けるブランクRUN状態で2分間の洗浄＆平衡化を行います（48検体だと、3分
48 145分かかる）。従って、固相抽出からおよそ9.5時間で測定結果を得ることができます。
ですが、普段は夜間中に自動プログラムで測定を行い、翌日に結果を解析するといった流れで操作を行っています。
Q. 途中で止めてサンプルを保存できる箇所があったら教えてください。
森谷：途中で試料を保存できるのは、誘導体化前の乾固した段階です。乾固した試料への湿気を避ける
ため、試験管の蓋をしっかりと閉め、ジッパー付きビニール袋に入れて、-20 C以下で保存しています。
Q. 逆に、フリーポリアミン、モノアセチルポリアミンの固相抽出に、DiAcSpd, DiAcSpm 固相抽出の方法を用いると何か不都合はありますか。
森谷：不都合な点は、フリーポリアミンやモノアセチルポリアミンとOasis MCXカラムの相互作用が強く、カラムからの溶出が難しくなることです。そのため、より相互作用の弱く、溶出が容易な
CM-セルロースカラム（弱陽イオン交換カラム）を使用しています。2種の固相抽出の使い分け
は、ポリアミンがもつ遊離アミノ基の数が基準になります。たとえば、Putには2個の遊離アミノ基がありますが、DiAcSpdには遊離アミノ基が1個しかありません。本文では、DiAcSpmの固相68

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ポリアミン（2015）2:67-71

抽出はOasis MCXカラムを用いると記述しましたが、構造内に遊離アミノ基が2個ありますので、実際にはCM-セルロースカラムでも行えます。
質問内容からは話がずれてしまいますが、CM-セルロースカラムは繰り返し使用することができます。カラムの使用後は、1M Pyr/AcOH（3mL）を用いてカラム洗浄し、保存する場合は4 Cでといった方法で、同じカラムを繰り返し5回ほど使用できます。
Q. 操作中、最も気を遣うことは何ですか？
森谷：試料乾固の際に、溶出溶媒を完全に乾燥させることです。乾固操作は試料の乾燥状態を客観的に示す指標がないため、乾固に十分な時間をかけ、最後は目視で乾燥状態の確認をしています。そのため、急いでいる時などには、わずかに水滴が残っていることを見落として次のステップに進んでしまうことがありました。そうなると、測定の際にノイズが目立ち、良い測定結果が得られなくなります。他には、使用試薬はできるだけLCMSグレードを用いること、操作中にプラスチ
ック類を使用しないことなど気をつけていますが、回避しようのないこともあるので、できる限りの範囲でそれらに注意を払っています。
Q. LC用誘導体化試薬もいろいろあるようですが、ヘプタフルオロ酪酸を選択した理由を教えてください。
森谷：もともとGC-MSでの誘導化剤として使用されており、LC-MSでも他の誘導化剤より修飾後の化合物の揮発性がよくなるのではないかと考えています。また、本稿中にも書きましたが、誘導体化することの目的は、大きな修飾基を付加することで、検出対象の質量を大きくし、ノイズの少ない検出域で測定を行うことによってS/N比を改善させることです。一方、大きな修飾基を付加させると、その修飾基を構成する元素の同位体天然存在比の影響をうけ、元の化合物の同位体イ
オンピークと付加した修飾基の同位体イオンピークの効果が合わさって、一般に誘導体化化合物の質量分布が幅広くなってしまいます。そうなると、質量数+3の内部標準物質よりさらに大きな
質量数の内部標準物質を使用しなくてはならないという問題が生じます。その点、フッ素は19Fの天然存在比が100%であるので、無水ヘプタフルオロ酪酸での修飾後の化合物の同位体イオン
ピークにはほとんど影響しません。さらに、誘導体化後の化合物が分解などせずに比較的安定であったということも使用の理由の一つです。
Q． GC-MS誘導体化剤として使用されているものをお使いになられているということでしたが、誘導体化後の乾固試料を適当な溶媒に溶かせば、GC-MSにも転用可能と考えてよろしいでしょうか。
森谷：実際にGC-MSで測定を行ったことはありませんが、この誘導体化法は、現在MSに関してご指導をいただいている鮫島先生がGC-MSでポリアミンを測定された際に用いられた方法だということですので、転用は可能です。
Q． 本試料を他のLC-MS システムで測定したことがありますか。
森谷：本稿では Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS system を利用していますが、以前に
QSTAR Elite Hybrid LC/MS/MS System（AB SCIEX）を利用していた際にも変わりなく測定ができました。しかし、同じ前処理法で調製した試料を、イオントラップ型のOrbitrap LC-MS Q
Exactive（Thermo）で測定した際には、ポリアミン検出の感度が悪かったという経験をしたこ
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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:67-71とがあります。各機器のイオン化法の原理は基本的に同じでしたが、検出方法が異なるとずいぶん測定結果が変わるものだと感じたことがあります。各メーカーの装置の特徴の違いもあるので、本稿で紹介した方法がそのまま使用機器に適用できない場合があると思います。
Q. 未反応の無水フルオロアシル化剤や、反応副生成物の酸はどうされていますか？ LC-MS分析に何か影響ありますか？
森谷：誘導体化後の試料は乾燥した窒素ガスを吹きかけ、試料を完全に乾燥させますが、この際に未反応の無水ヘプタフルオロ酪酸や溶媒であるアセトニトリル、また、誘導体化反応の副反応物で生じるヘプタフルオロ酪酸などは、蒸発除去されます。ただ、揮発しない反応副産物があれば測定
試料中に混在した状態です。しかし、本稿で紹介した方法での分析の際に、大きな問題が起こったことは特にありません。
Q. 誘導体化から分析までの時間を考慮すると、一度に何検体まで同時に誘導体化処理可能ですか？
森谷：我々の使用している装置では、一度に乾固できる試料数がおよそ48本なので、普段からそのくらいの検体数で誘導体化を行っています。誘導体化後の試料は、4 Cで1日の保存後でも、前日と変わらない測定結果が得られることを確認しています。LC-MS装置には、たいてい冷却機能付きのオートサンプラーが設置されていると思いますので、測定への影響を考えて誘導体化処理数を気にする必要はないのではないかと思います。
Q. 安定同位体標識ポリアミンのうち、市販されていて購入可能なものがあれば教えてください。
森谷：購入する際に気をつけることは、測定対象のポリアミン質量から3以上大きなものであること、
しかし、あまり質量数が大きすぎないことが大切です。主なポリアミンについては以下のメーカ
ーで 取 り 扱 って い る よ う で す。 プ ト レ シ ン ： 大 陽 日 酸 （ c a t N o . 5 9 , 3 4 4 - 3 ） や S i g m a Aldrich（catNo.491136）、スペルミジン：Sigma-Aldrich（catNo.740780）、スペルミン：
Sigma-Aldrich（catNo.705330）。標準物質として利用できる同位体標識ポリアミンは上記の他にも販売されていると思いますが、いずれも高価なものです。もし、本稿でご紹介させて頂いた方法でポリアミンを測定してみたいという方がいらっしゃいましたら、mgオーダーでお譲りすることもできますので、ご連絡ください。
Q. 有害性や危険性のある試薬については、操作段階、廃棄段階でどのような注意や工夫をすればよい
か教えてください。
森谷：無水ヘプタフルオロ酪酸はかなり強いにおいがするので、添加操作や反応時はドラフト内で行ってください。反応時にはしっかり蓋をしめたつもりでも、臭いが漏れてくることがあります。また、無水ヘプタフルオロ酪酸の保存については、湿気に弱く、加水分解しやすいので、注意してください。操作内では、劇・毒・危険物に指定されている、アセトニトリル、ギ酸、トリクロロ
酢酸、ピリジン、メタノールなどを使用していますが、これらについては一般的な取り扱いの注
意以上のことはしておりません。廃液については、揮発性で回収が困難なものもありますが、できる限り回収し、廃棄業者に処理をお願いしています。この点については、各施設でそれぞれ規定があるはずですので、それに従ってください。

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実験手技ノート

ポリアミン（2015）2:67-71〜 質量分析をもっと勉強したい人のために 〜
書籍

・志田保夫ら（2001）「これならわかるマススペクトロメトリー」化学同人
・杉浦悠毅ら（2013）「見つける、量る、可視化する! 質量分析実験ガイド〜ライフサイエンス・医学研究で役立つ機器選択、サンプル調製、分析プロトコールのポイント 」（実験医学別冊 最強のステップUPシリーズ）羊土社
web・島津 ＧＣ­ＭＳ分析の基礎 http://www.an.shimadzu.co.jp/gcms/support/faq/fundamentals/
・島津 日常分析の留意点 http://www.an.shimadzu.co.jp/support/support.htm
・島津 e-Learning http://www.shimadzu.co.jp/sgs/e-learning/index.html
・アジレント 分析基礎講座 http://www.chem-agilent.com/contents.php?id=1000138
・アジレント e-セミナー http://www.chem-agilent.com/contents.php?id=12580
・日本分析機器工業会 (JAIMA) 分析の原理 http://www.jaima.or.jp/jp/basic/introduction.html
・Waters MS-質量分析装置の原理 http://www.jaima.or.jp/jp/basic/introduction.html
・ジーエルサイエンス 技術情報 http://www.gls.co.jp/technique/index.html

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The Japanese Society of Polyamine Research

学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80

日本農芸化学会2015年度大会におけるシンポジウム開催のご報告
世話役：鈴木秀之（京都工芸繊維大学応用生物学系）
栗原新（石川県立大学生物資源環境学部）
シンポジウムのテーマ：ポリアミン研究のさらなる発展と新たな展開をめざした農芸化学と医学薬学との融合

講演タイトルと演者：「肝臓機能におけるポリアミン代謝の役割」
植村武史（アミンファーマ研究所、京都府立医科大学大学院医学研究科）「ポリアミンによる大腸菌の生理機能の調節」
照井祐介（千葉科学大学薬学部）「腸内細菌のポリアミン代謝・輸送系同定の重要性」
栗原新（石川県立大学生物資源環境学部）「ポリアミンによる哺乳類の寿命延長効果」
早田邦康（自治医科大学さいたま医療センター）「ポリアミンを含むダイズ胚芽抽出物の開発とスキンケアへの展開」
春日部芳久（東洋紡バイオケミカル事業部）「腸内常在菌が産生するポリアミンの健康寿命伸長効果」
松本光晴（協同乳業研究所）
概要：

ポリアミン濃度がガン細胞で高いことやプトレッシンの生合成酵素であるオルニチン脱炭酸酵素の活性がガン細胞で亢進することから、ポリアミン研究はガンという疾患との関連を中心に行われてきました。そのため、ポリアミン研究者は、医学・薬学の分野には多いものの、農芸化学の分野でポリアミンの研究をしている研究者は少ないという現状があります。
農芸化学とは、動物・植物・微生物の生命現象、生物が作る物質、食品と健康などを主に化学的な考え方にもとづいて基礎から応用まで広く研究する学問分野です（農芸化学パンフレットよりhttp://
www.jsbba.or.jp/wp-content/uploads/ﬁle/nougei/jsbba̲pamphlet.pdf）。近年のポリアミン研究の進展は、従来の疾患を主な対象としたポリアミン研究の枠を越えて、農芸化学分野の研究者の興味を集

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学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80

めつつあり、食品での利用やバイオオリエンティッドな化学素材としてポリアミンに注目している企業も増えてきました。ポリアミンはRNAの安定化、翻訳制御、タンパク質のポリアミン修飾を通して生物の生理機能を調節しており、その適切な濃度の維持が健康維持に重要なことが分かってきており、基礎研究の対象としても応用研究の対象としても興味深いものです。医学・薬学分野と農芸化学分野で乖離しているポリアミン研究を融合できる方向性を探したいとこのシンポジウムを企画しました。
今年度の日本農芸化学会大会は岡山大学を主会場として、３月２６日から２９日の４日間に渡って開催されました。私達が企画した上記シンポジウムは最終日の午後からであったため参加者が少ないのではと心配していましたが、シンポジストの先生方にはたいへん興味深いご講演を頂き、最後の演題が終了するまでほぼ満席で、時には立ち見が出るほどの大盛況でした。
以下に、日本農芸化学会の許可を得て講演要旨を転載します。

73

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学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80?C6AI

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The role of polyamine metabolism in liver functionūşŶÝ 1, 2ɨñÔç 2ŽȤÏ 2Ëēȉ 1, 3
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74

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学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80

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75

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research

学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80

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2009

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2011

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PLoSOne e23652.

2013

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Sci. Rep.4:4548.

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学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80#:ÿǶȀ)ǶºǗȀ(#) 0.01%'4Ə&ɚĘ'qC^&ǆ#3ǶºǗȀ´Ðǆ( PA ȡȯȲǒȾā>àą:$4àű'ɆȐ#:(Ƕº Ǘ Ȁ ´ Ð ǆ ( ÿ Í > Ð 3 : ( ) Bacteroidetes Ɍ $ Firmicutes Ɍ ( Ǘ Ȁ #:

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77

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学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80

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DNA methyltransferase (Dnmt)
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Dnmt

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LFA-1

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LFA-1
LFA-1
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LFA-1

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学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80

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Development of polyamine-containing soybean germ extract and its application to skincare
cosmetics

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2

Plant Cell Physiol., 45(6), 712-722, 2004
SOD

6

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学会報告

ポリアミン（2015）2:72-80

Polyamines produced by intestinal microbiota delays senescence

1
CE-TOFMS

120[1]

putrescine

spermidine

spermine

RNA

Bifidobacterium animalis subsp. lactisLKM512
[2,3]
10

1

LKM512[4]
14

LKM51220[5]

1. Matsumoto M, et al. Sci Rep 2: 233, 2012.
2. Matsumoto M, et al. FEMS Immunol Med Microbiol 31: 181-186, 2001.
3. Matsumoto M and Benno Y. Mutat Res 568: 147-153, 2004.
4. Matsumoto M, et al. PLoS ONE 6: e23652, 2011.
5. Kibe R. et al. Sci Rep 4: 4548, 2014.

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学会レビュー

ポリアミン（2015）2:81-82

International Conference on Antimicrobial Resistance, Novel
Drug Discovery and Development:
Challenges and Opportunitiesに参加して

松本靖彦

東京大学大学院薬学系研究科微生物薬品化学教室
2015年3月2〜3日、インドの首都ニューデリーで、International Conference on Antimicrobial Resistance, Novel Drug Discovery and Development: Challenges and Opportunitiesと題する国際学会（以下、本学会）が行われました。私は、五十嵐一衛先生（株式会社アミンファーマ、千葉大学名誉教授）とともに招待講演者として出席させていただきました。本稿では、インドでの国際学会における五十嵐先生のポリアミンに関する発表や私が感じたいくつかのことについて報告させていただきたいと思います。
[学会の様子]本学会はインドの研究者ばかりでなく、アメリカ、オーストラリア、イギリスなどから多くの海外招待講演者が招待されておりました。そして、初日は厳格な雰囲気の中、数多くの式典行事とインド政府の方々やインドの大学関係者のスピーチが行われました。これは、本学会がインド政府や多くの企業がサポートして最近開校したSRM UniversityのHaryana校が取りまとめて開催された国際学会であることが影響していると思われました。ひとしきり行事が終わったところで学術的なセッションがスタートし、ほどなくして五十嵐先生が発表することになりました。
五十嵐先生は、病原性細菌のカテーテルなどの医療器具への接着に関わるバイオフィルムの形成へのポリアミンの役割についてと細菌のバイオフィルム形成を抑制する素材の開発に関する発表をされていました。細菌のバイオフィルムの形成は、病院内での日和見感染の拡大に寄与することが知られており、感染制御の観点から大変重要な研究課題であります。よって、細菌のバイオフィルムの形成におけるポリアミンの役割を理解することは医療上の問題解決の糸口になるかもしれません。五十嵐先生の発表により、ポリアミン研究の重要性が感染症分野の研究者にも伝わったと思います。さらに、五十嵐先
生は、細菌の増殖を抑制するサメ肌の表面構造に着目した新たな抗菌素材の提案と汎用化についての環
境衛生学的な意義について発表され、多くの聴衆から注目を集めておられました。特に公衆衛生的な問題を多く抱えるインドでの発表だったことから、インドの研究者や企業の開発者に大きなインパクトを与えたようで、五十嵐先生が発表後に質問攻めにあっておられる姿を何度か見かけました。
私は二日目にカイコを感染宿主として用いて黄色ブドウ球菌という病原性細菌の感染システムを解明することを目的とした研究について発表しました。初日の招待講演者の発表と質疑応答を聞いて、いく
つか思うことがあり、発表前夜にスライドを大幅に組み替えて理解が容易な内容に変更して発表しました。発表後、何人かの研究者から議論を持ちかけられました。発表内容が理解してもらえたようで、ほっとしました。

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学会レビュー

ポリアミン（2015）2:81-82[学会での出会い]本学会で、私は、梶昭先生（ペンシルバニア大学）や梶日出子先生（トーマスジェファーソン大学）とお会いしました。学会期間中は、五十嵐先生、梶昭先生、梶日出子先生、招待して下さったSamuelRaj先生（SRM大学）と色々とお話しさせていただく機会がありました。梶昭先生、梶日出子先生とは、何度かお食事をご一緒させていただき、色々なお話を聞かせていただきました。お二人の哲学に触れて大変驚き、大きな刺激を受けました。五十嵐先生とは、学会終了後もインドのいくつかの遺跡を観光して、200年以上前に作られた建造物を見ました。また、博物館で紀元前の飾り物等、歴史的に貴重な物品の数々を見ることができました。Samuel Raj先生は、ご家族の方々を紹介して下さり、お宅に招待してお食事をごちそうして下さりました。Samuel Raj先生のお話から、インドの文化について色々と学べました。本学会では、他にも色々な方々と知り合い、お話させていただく機会がありました。共同研究についての話もありました。学会参加により、素晴らしい出会いがあったことが何より大きな出来事でした。
[インドでの驚き体験]

また、私は、インド人の時間の捉え方について多く学びました。これは、日本とインドの文化の違いが影響しているのではないかと思いました。
学会のセッションが始まる５分前には海外招待講演者たちは前列に座り待機しておりましたが、多くのインドの方々は開始予定時刻より遅れてきました。学会のセッション開始時間が遅れることもしばしばで、また予定表とは違う順番でセッションが行われており、正直大丈夫かと少し不安になってしまいました。案の定、私は自分の発表予定時間の一時間以上前に急に名前が呼ばれ、いきなり発表することになりました。私は予告なしで予定より早く発表することになった経験がなく少し驚いてしまいましたが、私と同じセッションのインドの研究者は動じることはありませんでした。おそらく、インドの研究
者は発表時間の急な変更には慣れており、少しの時間の遅れや変更については私より寛容なのだと思いました。今後、私は、国際学会に招待講演者として出席したときは、発表時間がいつになっても大丈夫
なように気持ちを作っていくことにしようと決めました。ただ、時間に追われて生きていないインドの人々の悠然とした立ち居振る舞いは、時間に追われてストレスを過剰に感じてしまう日本人も少しは参考にしてもいいのかもしれないとインドに滞在しているときは思いました。
インドでの学会参加で色々と特殊な経験ができました。人生経験のためにも色々な国で行われる様々な国際学会に参加して行きたいと思いました。特に若い研究者の方々には率先して国際学会で発表し、新しい文化にふれる機会を作って欲しいと思います。

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学会レビュー

ポリアミン（2015）2:83

2015 GRS&GRCに参加して
田島彩沙

東京慈恵会医大大学院

医学研究科博士課程４年

私が初めてGordon Research Seminar / Conferences に参加したのは2011年、大学6年生の時でした。当時、国内外を含めて学会への参加も発表の経験もなかった私は、右も左もわからないまま会場に到着し、おなかが痛くなるほど緊張していたのを今でも覚えています。ですが、学会が始まると世界中の様々な国の方が「ポリアミン」という共通のテーマのもと活発に意見交換し、お互いの研究を称えアドバイスし合う姿がとても新鮮で緊張を忘れるほどわくわくしていました。そして、ポスター発表では私の拙い英語を一生懸命聞いて理解しようとしてくれる人がいることが、何よりも嬉しかったです。このとき、国や文化の違いに関係無く対等に様々な人と意見の交換ができる「研究」というものに大変魅力を感じました。そして、初対面な上に他大学の学生である私を暖かく迎えて下さり、今でも学会等で会うたびに気にかけて下さる日本人の先生方との出会いも大きな物でした。実は、その時のGRS&GRCへの参加がきっかけで大学院へと進学することを決心し、現在の私の研究生活があります。
そして2015年、私にとっての2度目のGordon Research Seminar / Conferencesへ参加してきました。4年前とは違い、今回は緊張よりも楽しみな気持ちの方が勝っての参加でした。4年前のGRS＆
GRC、2年前のトルコでのポリアミン国際学会で出会った海外の大学院生や先生たちと再会できたことも良かったです。また、4年前よりも落ち着いてポスターセッションで説明することができ、そこで自分の研究に興味を持ってもらえたことや質問、アドバイスをもらえたことはとても貴重な経験となりました。更に、今回はshort talk speakerとして選んで頂きました。初めての英語での口頭発表は本当に緊張しましたが、多くの先生方の励ましや支えがあり乗り越えることができました。この場を借りて御礼申し上げます。ありがとうございました。
毎回、私にとっての初めての経験と出会いを与えてくれるGRS&GRCに参加できたことを嬉しく思っています。これらかも、このような場に参加する機会を頂けるよう、日々研究に励んでいきたいと考えおります。
最後になりましたが、今回の渡航にあたり若手研究員補助をいただきましたこと感謝申し上げます。

今年度のポリアミン学会の活動の一環として、６月に開催された2015 Gordon Research Seminar : Polyamines (GRS) & Gordon Research Conference on Polyamines(GRC)に参加する若手研究者に対して参加補助費を交付いたしました。ここでは交付対象者の４名にGRS & GRCへの参加報告を行ってもらいます。なお、GRS & GRCでは発
表内容は非公開が原則となっています。そのため、参加報告では発表内容について許可を得ずに掲載することを控えさせて頂いていますので、ご了承願います。

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学会レビュー

ポリアミン（2015）2:84

Gordon Research Conference̶ Polyamines 2015
Dan GeGraduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba University
Since last year, I have entered this new area of research on “Preparation of Poly-ion Complex Generated
from Chondroitin Sulfate and Spermine and its Effect on Oral Intake”. May 2015, my supervisors, Prof. Toida andAssistant Prof. Higashi, encouraged me to participate as a poster presenter in Gordon Research Conference on
Polyamines held 06/14/2015 - 06/19/2015 at Waterville Valley in United States. Gordon Research Conference(GRC) is a conference gathering the great scientists of polyamine field from the entire world and affording
opportunities for the young scientists to express their own insights.
I really would like to express my sincere appreciation to The Japanese Society of Polyamine Research forproviding me the Financial Support to attend GRC. In this conference, not only did I have knowledge of the latest
research achievements of polyamines, but I also won an opportunity to discuss with the great scientists comingfrom the whole world and to exchange our views. During the tea break between the conference sessions, we wereable to communicate freely with the participants. This not only encouraged me to try to build up a friendship withthe foreign scientists, but also stimulated me to practice my spoken English. And it was also a little advance for myrelatively introverted character that I could take advantage of this opportunity to dare to express my own views inpublic.
Through this conference, I have learned more insights of polyamine field and more techniques related to mystudy, deepened the comprehension of some researches, and strongly felt that the skillful communication in spoken
English was very necessary for the international research work. GRC broadened my horizons, enriched myexperiences, extended my experimental considerations and crystallized my research directions. It will become themotivation for my future studies and my career plan. From now on, I determine to work harder and try my every
effort to achieve better results.

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ポリアミン（2015）2:85

Gordon Research Seminar及びGordon Research Conferenceに参加して吉田健人

千葉科学大学大学院薬学研究科薬学専攻

博士課程2年

今回私は、日本ポリアミン学会より若手会員補助として海外渡航費を援助して頂き、アメリカのニュ
ーハンプシャー州Waterville Valleyで行われましたGordon Research Seminars (GRS) 及びGordon
Research Conferences (GRC) に参加しました。
私は今回、人生で初めて海外に行き、国際学会に参加しました。国内の学会には5回ほど参加していますが、国際学会ではどのような雰囲気で、どのようにディスカッションが行われるのかなど全く分からず、不安と緊張の中、会場に向かいました。ボストンのホテルからバスで2時間ほどのところにある会場は、木々の生い茂ったとても美しい自然溢れる場所でした。「さすがアメリカ」と言えるような広大な敷地にはリスなども駆け回っており、その圧倒的なスケールに私自身、少し戸惑いながらも受付や宿にチェックインを済ませ、その日の午後から早速行われる口頭、ポスター発表に参加しました。まず、GRCに先駆けて行われる若手研究者による発表の場であるGRSでは、海外の若手研究者による積極的なディスカッションが繰り広げられ、最新のポリアミン研究の成果を聞くことができました。どの研究内容も非常に興味深く、新しいアイディアや考えたこともなかった視点からのディスカッションなどには多くの発見があり、非常に刺激を受けました。
また、GRSの次の日から開かれましたGRCでは、世界中から集まったポリアミン研究の第一人者であるベテランの方々の発表を聞くことができました。GRSではあまり聞くことができなかった包括的なポリアミン研究の発表には、これまで参加したどの学会よりも驚きや発見があり、交わされる熱いディス
カッションには強い刺激を受けました。また、お昼の後にあるフリータイムには、大勢の人と山にハイ
キングに行ったり、自転車を借り会場の周りを走ったりと、多くの人とコミュニケーションを取りながら親睦を深めることができ、非常に有意義な時間を過ごすことが出来ました。
今回私は、このGRS及びGRCに参加し、様々な人の発表を聞き、活発に意見交換できたことで、多くのことを知り、学ぶことが出来ました。私はこの体験をこれからの研究生活に生かしていきたいと考えています。
最後になりましたが、今回このような貴重な体験を支援してくださり、海外渡航費を援助して頂きました日本ポリアミン学会にこの場を借りて深く感謝致します。ありがとうございました。

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学会レビュー

ポリアミン（2015）2:86-88

2015年ゴードン研究会議「ポリアミン」に参加して
奈良

未沙希

石川県立大学 生物資源環境研究科 応用生命科学専攻

修士1年

私は2015年6月12日から18日にアメリカ・ニューハンプシャー州で行われたゴードン研究会議（Gordon Research Conference, GRC）と、これに先立って行われる若手を対象としたゴードン研究
セミナー（Gordon Research Seminar, GRS）に参加しました。大学に入学したときから国際学会に参加して、自分の研究内容を発表することが夢だったため、それを叶えることができて嬉しかったです。
学会期間中の7日間は毎日が充実しており、様々な体験をすることができました。
ポスター発表私はGRSとGRC期間中に合わせて2回、ポスター発表を行いました。英語でポスターを作って発表をすることは初めての経験でした。これまでに日常生活で英語を使う機会がほとんどなかったため、英語で文章を書く時はとても苦労し、研究室の先生や大学の英語の先生に指導していただいてようやくポス
ターを完成させました。アメリカへ向かう飛行機の中でも、外国人の方が自分の発表内容を理解してくれるのかという不安が消えなかったため、何度も何度も声に出して練習をしました。
いよいよGRSでのポスター発表1日目です。開始後、すぐに外国人学生に英語で「全部説明して」と言 わ れ ま し た 。 心 の 準 備 が 整 って な い と き に 来 ら れ た の で 焦 り ま し た が 、 何 回 も 「 D o y o u
understand?」と確認しながら、ゆっくり説明していき、なんとか発表を終えました。自分の英語の発音に自信がありませんでしたが、1回目の発表を経験して、1単語ずつゆっくりと話し、意味が通じていない時にはジェスチャーや絵を描いて一生懸命相
手に伝えようと努力をすれば相手は理解してくれ
ることがわかりました。GRSの発表時間中、休む間もなくたくさんの参加者が来ましたが、段々と自信がついてきて、堂々と発表をすることができるようになりました。GRCでは、外国人学生よりも外国人の先生方にポスター発表をする機会が多くなりました（図1）。また、ポスターの近くにいる人に声をかけて発表することができるほどの余裕ができました。しかし、外国人の方からの質問には上手に対応することができませんでした。ポスター発表を聞きに来てくれた方全員が質問をしてくれましたが、質問は聞き慣れない英語 図1 次期ゴードン会議（2017年）のチェアをされる Susanの専門用語が多かったので内容を半分も理解する Gilmour 先生（右）にポスター発表をしていることころです。

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学会レビュー

ポリアミン（2015）2:86-88

ことができませんでした。何度も質問を聞き返すと、「もういいよ」といって諦められてしまう場面もあったのでとても悔しかったです。普段から英語を聞くことで耳を慣らし、英語の論文を読むことでもっと多くの専門用語を頭に入れておけばよかったと思いました。
口頭発表

GRSとGRCの期間中、口頭発表が毎日行われました。発表中は意味の分からない英単語を電子辞書で引きながら発表を聞きました。私は腸内細菌の研究を行っているためDejea Christi-

図2 GRC最終日の懇親会では先生と学生の約40人でダンス

ne博士のご発表 "The Strange Case of N1, N12 を踊りました。ダンス後に撮った写真です。
Diacetylspermine: Evidence that Bacterial
Bioﬁlms Alter the Colon Cancer Metabolome"は特に興味深かったです。このような自分の研究分野に近い発表であればなんとなく内容はわかりましたが、自分の知らない専門用語が多く出てくる発表は、スライドのページごとのタイトルしか理解することが出来ませんでした。また、一番驚いたことはたくさんの外国人学生が積極的に質問を行っていることでした。日本の学会では学生が質問をしている場面をあまり見たことがありませんでした。私も学会の口頭発表で質問したことがありません。疑問に思ったことがあっても、こんなこと聞いたら馬鹿にされると思い、なかなか人前で質問をすることができませんでした。外国人学生が質問している光景を見て、人目を気にしてそのようなことを考えている自分が恥ずかしくなりました。私もこれから学会の口頭発表では疑問に思ったことがあれば積極的に質問してみたいと思いました。
研究者の方々との交流

学会期間中は、13時半から16時の自由時間と、学会終了後21時半から0時の懇親会（有志の先生方の出資で費用は無料でした）が毎日設定されており、会期中は学会参加者と三食を共にします。私はできるだけ多くの方（特に外国人の方）と仲良くなりたいと考え、毎晩懇親会には終了時間まで参加し（図2）、昼休みは学会参加者と遊び（図3、4）、食事の時には話したことのない外国人の方がいる席に座るようにしました（たまに疲れて日本人がたくさんいるテーブルに座ることもありましたが）。初めのころは、「Hello」とあいさつを交わし、相槌を打つことしかできなかったた
め、会話がなかなか続きませんでした。しかし、自由時間に他の日本人の参加者の方と外国人の方が話す会話を聞いて、どのように話を広げていく
か知ることができました。また、学会はとてもフランクな雰囲気だったため、私は積極的に外国人

図3 GRC 3日目の昼休みに参加したハイキングにて。

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学会レビュー

ポリアミン（2015）2:86-88の方に話しかけることができました。そのため、日が経つにつれて外国人の方との会話が続くようになりました。ついにはGRC終了後の会場から空港まで2時間のバス移動で、隣の席に座られたGeorgia State UniversityのLu ChungDar先生と途切れることなく話ができるようになりました。
GRSとGRCに参加して様々な貴重な経験をすることができました。思い切って国際学会での研究発表に挑戦してよかったと思います。また、以上の経験を通して研究に対するモチベーションがさらに上がりました。これからも頑張って研究し

図4 GRC 4日目の昼休みにはアップダウンの激しい砂利道へようと思います。また、今回の海外渡航に対して サイクリングに行きました。
ご支援いただきました、日本ポリアミン学会の皆様に感謝いたします。

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日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research

事務連絡
日本ポリアミン学会第7回年会のご案内
会期：平成 27 年11 月13 日(金)13:00 〜14 日(土)15:00(予定)
会場：京都工芸繊維大学 松ヶ崎キャンパス 東部構内 60周年記念館 1階 講義室
住所： 606-8585 京都市左京区松ヶ崎橋上町 1
交通案内(http://www.kit.ac.jp/uni̲index/access/)
最寄りの地下鉄松ヶ崎駅からの地図(http://www.kit.ac.jp/uni̲index/matsugasaki/)
キャンパスマップ(http://www.kit.ac.jp/uni̲index/campus-map/)
特別講演：11 月13 日(金)17:00（予定）Prof. Enzo Agostinelli (University of Rome)「Cytotoxicity of polyamine metabolites induces apoptosis on tumor cells: New approaches
in cancer therapy by nanocarriers through proteomic studies」
懇親会：11 月13 日(金)18:00 頃から 60周年記念館 2階 大セミナー室にて年会担当：鈴木秀之（京都工芸繊維大学）
第７回年会専用e-mail：polyamine@kit.ac.jp

BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）におけるワークショップ開催のお知らせ【1W8-p】生理活性物質ポリアミンから疾病と健康を考える
オーガナイザー：村井法之（東京慈恵会医科大学） / 松本 光晴（協同乳業株式会社研究所）
日時：2015年12月1日（火）14:00 - 16:30

会場：神戸ポートピアホテル 本館地下1階 北野（第8会場）
BMB2015の際に、開催予定であったTGaseとの学術合同会議は、来年に延期いたしました。

89

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research編集後記
空が青く澄み渡り、高く見える季節となって参りました。今年のポリアミン学会総会では、色づいた京都で皆様にお目にかかることになるかと思います。
さて、お陰様で本号も、多くの先生方のご協力をたまわり、発刊の運びとなりました。この場をお借りしてお礼申しあげます。
前号よりシリーズ化した「ポリアミン実験手技ノート」。本号ではポリアミンの質量分析についてとりあげました。さまざまな場面でのコツにも触れていただき、大変役立つものと思います。引き続き皆さまの役にたつ実験手技シリーズを企画できればと考えています。「うちのラボではこんな方法で分析しているよ」「うちではこんな前処理しているよ」「うちではこんなカラム使っているよ」など、皆さまからも実験手技に関する情報をドシドシお寄せいただければと思います。また巻頭言で川喜田先生が述べられているように、読者（特に若手メンバー）から筆者への質問や提案も紙面上で展開したいと考えています。今後、取り上げてほしい内容や企画のリクエスト等も含め、お近くの広報委員、もしくは
以下広報委員会宛までご意見をお待ちしております。
一般的な教科書を開いても、ポリアミンのことはほとんど掲載されていません。掲載されていても、わずかに数行、なかには欄外に小さな字で書かれている、といった具合です。ポリアミンは全ての生物、細胞に存在しているにも拘わらず、残念ながら一般的に認知度が低いです。ポリアミン学会誌はPDF化したデジタル媒体として公開しているので、HPからのダウンロードや、Google検索などを通してもアクセスできます。もしかしたら学会メンバー以外の人がポリアミンを知る機会にも繋がるのかな、と思います。ポリアミンに興味を持った仲間が増えるように、面白い魅力ある「ポリアミン」を皆さまと一緒に育てていければと思います。どうぞよろしくお願いいたします。
（広報委員会

委員

大城戸

真喜子）

筆者への質問、取り上げてほしい内容、企画提案、ご意見等をお寄せください。
広報委員会宛 polyamine@jikei.ac.jp

日本ポリアミン学会 学会誌「ポリアミン」
第2巻2号(2015年10月)
発行:日本ポリアミン学会

http://pa.umin.jp/polyamine@jikei.ac.jp

製作:日本ポリアミン学会 広報委員会

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日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research