２．調査研究［食品科学部］

病原菌迅速検出キット Food System の評価
仲里 尚子 1）、屋比久 善昭 1）、金城 高子 1）
福村 圭介 1）、児玉 千恵 2）、中川 弘 1）1）（財）沖縄県環境科学センター 2）（株）ベリタス１．はじめにた。本キットは増菌を行うための Innoculation

食品衛生法に示された食品の規格基準の検査

solution 及び 12 種類の基質の入った試薬プレーは、公定法として採用されている食品衛生法や食トで構成されている（写真 1）。使用方法は食品品衛生検査指針（微生物編）に準拠して行わなけを 10g または 25g 採取し、9 倍量のペプトン水ればならない。しかし、食品製造メーカーなどのあるいはリンゲル溶液に加えてホモジネートし、社内の自主検査では公定法に固執することなく、

そ の 2ml を Innoculation solution に 加 え、 パ

検査結果を直ちに現場にフィードバックすること

ラフィルムで蓋をして 36 ± 1℃で 4 〜 6 時間培が可能な簡易迅速法でも十分対応することができ養する。増菌培養後、試薬プレートの 12 種類のる 1）,2）。

基質が固相されている各ウェルに 200 μ l ずつ

Food System は食品中に存在する Salmonella

添加し、No1、2、3 のウェルにワセリンを 2 滴

spp, Citrobacter spp, Proteus /Providencia

加え、蓋をして 36 ± 1℃で 18 〜 24 時間培養しspp, Pseudomonas spp, Escherichia coli ,たのち、各ウェルの色調の変化を目視により観察

Staphylococcus aureus , Bacillus cereus ,して判定を行う。

Listeria spp, Yeast /Moulds などを一枚のマイクロプレートで検出する簡易迅速同定キットである。今回は Salmonella Enteritidis, E. coli , P.

aeruginosa , S. aureus を用いて、本キットの検出感度および食材を用いた実用性の検討を行ったので報告する。

２．材料および方法
１使用菌株

Salmonella Enteritidis 3株 （IFO755、

写真 1 試薬プレート（左）とInnoculation solution（右）IFO 761、IFO 732）、E. coli IFO 13500、

Staphylococcus aureus JCM 5962、
Pseudomonas aeruginoza JCM 2413 の計 6 株を用いた。

３検出感度試験
Food System の 検 出 感 度 を 調 べ る た め、

S. Enteritidis3株、E. coli 、S. aureus 、P.
aeruginoza 各 1 株の計 6 株を用いて検討を行っ

２使用キットた。それぞれの菌株を普通ブイヨン培地（栄研（ 株 ） ベ リ タ ス 社 の Food System を 用 い化学）を用いて 35℃で 24 時間、2 回継代培養− 24 −

を行った後、滅菌リン酸緩衝液を用いて 103 〜

Innoculation solution に 2ml 分注し、35℃で 4107cfu/ml に調整し、Food System の試薬プレー時間インキュベーションを行った。所定時間培養

トの各反応ウェルに 200 μ l ずつ滴下して 35℃後、試薬プレートの各反応ウェルに培養した調製で 18 時間培養した後、判定は使用方法に従って菌液を 200 μ l 滴下し、以下検出感度試験と同色調による目視で行った（図 1）。なお、同一株様に培養し、判定を行った（図 2）。また、供試は 3 プレートについて実施した。

試料の一般生菌数、大腸菌群数、サルモネラ、大腸菌及び黄色ブドウ球菌の測定も併せて行った。

103〜107cfu/mlに希釈

４接種菌量の確認
各試験において、接種した菌数の確認を行った。
接種菌液をそれぞれ 100 μ l ずつ 10 枚の標準寒天平板に塗抹し、35℃で 24 時間培養したのち出現した集落を計数し、その平均値を接種菌量とした。

６菌培養時間の検討
供試菌株は S. Enteritidis 及び S. aureus の計
2 株を用い、供試試料は鶏肉、豚肉、弁当の市販の 3 食材を用いて、Innoculation solution に５食品への接種試験

おける増菌培養時間による検出率の違いを検討

実際の食品からの検出感度を調べるために、した。試料 25g に滅菌リン酸緩衝液 225ml を食品へ菌を接種し検討を行った。供試菌株は S.

加え、普通ブイヨン培地（栄研化学）を用いてEnteritidis、E. coli 、S. aureus 各 1 株の計 3 株

35 ℃ で 24 時 間 前 培 養 し た S. Enteritidis 及 びを用い、供試試料は鶏肉、豚肉、生野菜、ギョウ

S. aureus を、 そ れ ぞ れ 1.5 〜 5.0 × 103cfu/gザ、弁当の市販の 5 食材を用いた。試験品の調となるように接種して 30 秒間ストマッキング

製は、試料 10g に滅菌リン酸緩衝液 90ml を加え、し た の ち Innoculation solution に 2ml 分 注

普通ブイヨン培地（栄研化学）を用いて 35℃し、4 時間、5 時間及び 6 時間のインキュベー

で 24 時 間 前 培 養 し た S . Enteritidis、E. coli 、ションを行った。これらを試薬プレートの各反応

S. aureus をそれぞれ 50 〜 100cfu/g となるよ

ウェルに 200 μ l 滴下し、以下検出感度試験とうに接種し、30 秒間ストマッキングしたのち同様に培養し、判定を行った。また、増菌後の− 25 −

Innoculation solution を希釈し、S. Enteritidis

３．結果は DHL 寒天培地（栄研化学）上に、S. aureus

１検出感度試験は卵黄加マンニット食塩寒天培地（栄研化学）上S. Enteritidis は 3 株で試験を行った。その結に 0.1ml 塗沫培養し、増菌後の推定菌量の確認

果、S. Enteritidis IFO 755 は 103cfu/200μl で。食品への接種試験と同様、供を行った（図 3）

は 0/3、105cfu/200μl で 1/3、107cfu/200μl

試試料の一般生菌数、大腸菌群数、サルモネラ、大で は 3/3、S. Enteritidis IFO 761 は 105cfu/腸菌及び黄色ブドウ球菌の測定も併せて行った。

200μl で は 0/3、106 及 び 107cfu/200μl で はいずれも 3/3 がサルモネラと判定された。一方、
S.
Enteritidis IFO 762 は 105cfu/200μl で 1/3、106 及び 107cfu/200μl ではいずれも 0/3 であった。

E. coli は 103、105、107cfu/200μl で い ず れも 3/3、S. aureus は 104 及び 105cfu/200μl で3/3、106 cfu/200μl で 2/2 が陽性と判定された。

P. aeruginosa は 103cfu/200μl で 0/3、105 及び 107cfu/200μl で 3/3 が陽性と判定された（表。
1）− 26 −

coli は 13/13、S. aureus は 4/6 が陽性と判定さ２食品への接種試験
食材 1g 当たりS. Enteritidis は 1.7 × 102cfu、E.

れたが、S. Enteritidis は 0/3 であった（表 2）。

coli は 9.0 × 10cfu、S. aureus は 3.6 × 10cfu

表 3 に供試した食材の細菌検査の結果を示した。

を接種した結果、所定の培養時間後の判定は E.

− 27 −３増菌培養時間の検討

検出率の比較を行った結果、培養時間が 4 〜 6

食材 1g 当たりS. Enteritidis を 4.4 × 103cfu、S.

時間では著しい差は見られなかった（表 6）。

3aureus を1.6×10 cfu 接 種 し、 増 菌 培 養 時 間 と４．考察判定するが、リジンの脱炭酸による黄色から赤色

一般的な簡易・迅速キットの検出感度は、食品への変化が、色の出方が弱い場合には淡黄色かでの汚染菌量が極めて少ないとされるサルモネラ

ら淡橙色となること、№ 2 のウェルにおける硫や O157 であっても、概ね 104cfu/ml 程度であ化水素の産生が弱い場合に淡灰色となることな3）

ことから、本キットはこれらと同等の感度

ど、この 3 つのウェルで鑑定する Citrobacter やを示すといえる。特に E.coli については 103cfu/Proteus /Providencia spp との区別が困難となml で 100% の検出率を示し、今回試験した中でり、サルモネラが検出できなかったものと考えらは最も感度が良好であった。

れる。本キットの検出率の向上には、より効果的る

しかし、食品への接種試験においては、E.coliな増菌培地を用いて目的菌を検出可能な菌数にまは 100%、S. aureus は 66.7% が陽性を示したが、で増菌させることや、発色を確実にし同定が容易

S. Enteritidis は陽性を示さなかった。これは、かつ的確にできるよう改良を加えるなど、今後さサルモネラ検出のための基質に対して食品由来のらに検討する余地があると考えられる。

油分等が阻害物質として作用しているか、菌の活

今回の評価試験で Food System の検出感度は性低下の可能性があり、これらの原因によって目E. coli は 103 cfu/ml、
S. aureus は 104 cfu/ml、
S.

的菌が検出限界以上まで増菌されず不検出になっEnteritidis 及び P. aeruginosa は 105 cfu/ml のたことも考えられる4）。本キットは色調変化によ菌量が存在すれば検出される結果が得られ、またり判定するキットである。すなわち Salmonella

Food System は、12 のウェルに凍結乾燥させ属菌は№ 1、2、3 の 3 つのウェルの色調変化でた種々の培地及び反応試薬が入っており、煩雑な− 28 −

操作を必要とせず、18 〜 24 時間培養した後の色調の変化を確認することで、他の簡易迅速法とは異なり同時に種々の細菌類を迅速に検出、簡易同定できることから、本キットは原材料および食品の製造・衛生管理スクリーニングに有効であると考えられる。

５．まとめ
１Food System の検出感度について

E. coli は 103 cfu/ml、S. aureus は 104 cfu/ml、S. Enteritidis 及 び P. aeruginosa は 105
cfu/ml で検出可能であった。
２食品への接種試験について

E. coli は接種菌量が 9.0 × 10cfu/g で 13/13、S.
aureus は 3.6 × 10cfu/g で 4/6 が陽性と判定され、S. Enteritidis は接種した菌株や食材によって差が認められた。
３増菌培養時間について

S. Enteritidis、S. aureus とも、Innoculation
solution における増菌時間は 4 〜 6 時間では著しい差は認められなかった。
なお、本研究は平成 17 年 11 月、第 26 回日
本食品微生物学会にて発表した。
参考文献
1）中川 弘：食品微生物検査施設の GLP と簡易・迅速検査法の現状と課題 . 食品機械装置 2005 年 1 月号 45-55
2）中川 弘：食品衛生及び公衆衛生における微生物迅速検出法の課
題 . 食品工業 Vol.46 No.16
3）伊藤 武、中川 弘：迅速・簡易化が進む食中毒検査の最新動向 . 食品と開発 Vol.34 No.5 9-114）中川 弘、星川理恵、岩田朋子、鈴木貴子、池戸正成、小沼博隆、坂井千三：ラピブロット Escherichia coli O157（栄研）の評価 . 日
本食品微生物学会雑誌 16（1）,39-42,19995）伊藤 武、中川 弘：食品病原菌の迅速測定法の細菌の進歩−免疫学的検出法を中心として− . 乳業技術 2001 Vol.51 77-88− 29 −