種目（特定研究）

ラマン顕微鏡を用いた未病検出技術の開発

申請代表者

渡邉 朋信

理化学研究所生命機能科学研究センター・先端バイオイメージング研究チーム

チームリーダー

所外共同研究者

市村 垂生

大阪大学先導的学際研究機構・超次元ライフイメージング研究部門

特任准教授

所外共同研究者

春木 孝之

富山大学学術研究部都市デザイン学系

准教授

所外共同研究者

吉田 泰彦

富山大学工学部

学部生

研 究 統 括 者

門脇 真

病態制御研究部門消化管生理学分野

教授

所内共同研究者

小泉 桂一

臨床科学研究部門漢方診断学分野

准教授■背景・目的中国最古の医学書「黄帝内経」（こうていだいけい）の中に未病の概念が記されているが、その存在は科学的には証明されていなかった。研究統括者の門脇、小泉、奥（和漢研）ら、および東京大学生産技術研究
所 合原教授らの共同研究グループは、複雑系数理学の「動的ネットワークバイオマーカー」理論（DNB 理論）を用いて 1)、生体の遺伝子レベルでのゆらぎを捉える事で、メタボリックシンドロームの未病の存在を世界で初めて科学的に証明した 2)。このことにより、今後、従来の枠組みを超えた未病に対する先制医療戦略の構築が期待されている。しかしながら、この基礎研究の成果を臨床の場に実装するには、DNB 理論によって検出される生体のゆらぎ情報を非侵襲的に計測可能な技術の開発が必須である。現在、情報処理の専門家である富山大学都市デザイン学部の春木らも参画し、これらを積極的に推進しているところである。
一方で、ラマン散乱現象がチャンドラセカール・ラマンによって初めて発見されたのは 1928 年のことであり、材料科学では、物質の組成・構造の標準的な分析法の 1 つとして一翼を担ってきた 3)。現在、ラマン
顕微鏡は細胞イメージングへの応用が積極的に推し進められている 4)。具体的には、細胞内をラマン計測する
場合、観測されるラマンスペクトルは、細胞に含まれる多種多様の生体分子のスペクトルを同時に含んでおり、ほぼすべての生体分子がラマン活性であるため、原理的には、そこにあるすべての分子の情報を内包していることになる。研究代表者の渡邉（理研）、市村（阪大）は、細胞のラマンスペクトルを「細胞の指紋」と見做し、細胞状態によってスペクトルが異なるのであれば、それらの非侵襲的な識別・同定に使用できると考え、すでに成果を報告している 5)。各種細胞株や分化前後等、様々な細胞の種類や状態が、ラマン散
乱スペクトルの形状により異なっており、多変量解析などを用いることで細胞毎に分離される 5, 6)。さらに、
上記手法により細胞の状態遷移がエネルギー地形上の「アトラクター」の消失と出現として可視化される 7)。
アトラクターの消失と出現とにはタイムラグがあり、細胞状態が遷移する際には不均一性が増加する、すなわち「細胞状態はゆらぐ」ことが確認された。細胞状態の遷移とは、細胞内で遺伝子発現の変化である。遺伝子発現の変化に伴い構成分子の種類や比率も変化し、それに伴いラマン散乱スペクトルも変化すると考えられる。渡邉らは、薬剤耐性大腸菌を研究題材とし、ラマン散乱スペクトルが遺伝子発現と相関があることを実証し 7)、未知の薬剤耐性菌の遺伝子発現の推定にも挑戦している。ラマン散乱スペクトルは、代謝ネットワークに大きく依存する。ラマン散乱光スペクトルと遺伝子発現パターンとの相互関係をクラスタリングすることで、これまでの分析・分解型研究では別々に扱われていた、代謝ネットワークと遺伝子発現ネットワークと言う層の異なるネットワーク間の関連性を同時に扱える。すなわち、従来のサイエンスとは異なり、多層を交えた定義が定量的に可能になる。本手法は、従来の分析・分解型研究では別々に扱われていた代謝ネットワークと遺伝子発現ネットワークと言う層の異なるネットワーク間の関連性を同時に扱うこととなる。細胞内にある素子間の共同性が細胞の内部状態の「ゆらぎ」を抑制している。遺伝子発現が揺らぐより種目（特定研究）前に、かならず、相互相関の減少が確認されるはずである。DNB 理論により相互相関のゆらぎを解析することで、「遺伝子レベルでのゆらぎ」よりさらに早く細胞の状態遷移を予測できる可能性がある。
従って、本共同研究は和漢医薬学研究所で遂行されている未病検出技術の開発に関する課題を、研究代表者の渡邉（理研）らの革新的な技術で解決するのみならず、ラマン顕微鏡のデータ解析手法に DNB 理論を応用することも可能であり、和漢医薬学研究所および研究者代表者ら双方にとって Win-Win の理想的な共同研究形態である。

■方法
１．ES 細胞の分化過程および T 細胞活性化におけるラマン波長情報の集積
細胞のラマン散乱スペクトルは、倒立顕微鏡（Nikon Ti）を基盤とした、ラボラトリー製分光システムにより計測された。細胞はシリンドリカルレンズを通した線状に集光した波長 532 nm のレーザー光により照射される。発せられたラマン散乱スペクトルは、開口数 1.27 の 40 倍水浸対物レンズ（Nikon CFP Plan ApoIR）により集められ分光計（MK-300、日本分光）により取得される。通常用いられるガラスボトムディッシ
ュでは、ガラスに含まれる不純物が意図しないラマン散乱スペクトルを発するため、細胞はシリカカバースリップ上に接着させる。細胞のラマンスペクトルは、測定された生のスペクトルからバックグラウンドスペクトルを差し引いて求められる。ES 細胞の状態遷移や T 細胞の活性化状態は、表面マーカーの発現により確認した。

２．DNB 解析先行研究 7)で取得された T 細胞活性化データに対して DNB 解析を試みた。なお、T 細胞の活性化は、定法に従って、抗 CD3 と抗 CD28 抗体の刺激により行われた。0h（naïve、活性化前）、2 h、6 h、12 h、24 h、2 d（active、活性化後） の各時点の生体分子に対応するラマンシフト（入射光と散乱光のエネルギー差）のデータを基に、ガラス基板の光の強度（背景スペクトル）を除去後（規格化１段階目）、標準化処理（規格化２段階目）を行った（図 1）。これらに対して、クラスタリング、ネットワーク解析を基に DNB 解析を行なった。

図 1. 解析データの内訳と DNB 解析までの手順

種目（特定研究）■結果
DNB 解析により、 T 細胞の活性化にいたる過程の 2 h において以下に示す 2 つの範囲の波長が、6 h においても 2 つの範囲の波長が、「ゆらいでいる」ラマンピークとして検出された（表 1）。

表 1. DNB 解析により検出されたラマンピーク波長
2h6h920-964 cm-11010-1013 cm-1

1613-1645 cm-1

1086-1120 cm-1

■考察
本年度には、主に T 細胞の活性化について試行した。このプロセスには通常 48 時間以上を要する。一方で、DNB 解析では、活性化誘導後、わずか 2 h～6 h でもっとも揺らぎが大きかった（表１）。先行研究 7)により、表面マーカー（CD69）計測においても発現量の分布はひろく、CD69 の発現ゆらぎが大きいことが確認できていることから、DNB 解析が確かにラマン散乱スペクトルから細胞の状態遷移前の「ゆらぎ」を検出できることが実証された。また、先行研究 7)において、T 細胞の活性化を判定するピークとして、1000 cm-1 前半、および、1600 cm-1 前半を報告している（図 2）。今回の研究において「ゆらいでいる」と検出されたラマンピークも、主に 1000 cm-1 前半（1010-1013 cm-1）、および、1600 cm-1 前半（1613-1645 cm-1）であった。従って、主成分分析の判別では、48 h で判別可能であった T 細胞の活性化が、DNB 解析においては早期の 2 または 6 h で判別できる可能性が示唆された。また、ラマンスペクトルにおいては、トリプトファンは 1000 cm-1前半、および、1600 cm-1 前半のピークに含まれる。CD69 は、L トリプトファンの細胞内取り込みを制御していることで知られており、今回の DNB 解析は、CD69 発現による L トリプトファン取り込みの開始を検出したのかも知れない。これらの因果関係の解明のために、今後、詳細な生化学的な解析が必要である。

活性化前 :青分化後（48時間後） :赤
指紋領域の平均ラマンスペクトル

活性化の判定には1,000前半が指標
1,600前半

参考文献7. Ichimura, T. et al. (2016) Sci Rep. 6, 37562, Figure 3を改変

図 2. T 細胞活性化状態におけるラマンスペクトルの変化種目（特定研究）■結論
ラマン顕微鏡のデータ解析手法に対しても、DNB 理論が適応可能であることが明らかとなった。
このラマン顕微鏡技術をヒト臨床検体、特に血液細胞に適応することで、DNB 理論によって検出される生体のゆらぎ情報を非侵襲的に計測し、未病状態を検出することが可能となると思われる。また、未病状態の検出のためには、多くの生体分子の計測を行い、生体分子とラマンシフトの対応付けが不可欠である。この対応付けによって、DNB 解析のラマン顕微鏡へのさらなる適用が可能となる。

■参考文献
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)

Chen, L. (2012) Sci Rep. 2, 342. doi: 10.1038/srep00342.
Koizumi, K. (2019) Sci Rep. 9, 8767. doi: 10.1038/s41598-019-45119-w.
市村垂生 (2014) 生物物理 54, 315-317. DOI: 10.2142/biophys.54.315
市村垂生, 河田聡 (2010) 生物物理 50, 300-301. DOI:10.2142/biophys.50.300.
Ichimura, T. et al. (2014) PloS One 9, e84478. DOI: 10.1371/journal.pone.0084478.
Ichimura, T. et al. (2015) Sci Rep. 5, 11358, doi:10.1038/srep11358.
Ichimura, T. et al. (2016) Sci Rep. 6, 37562, doi:10.1038/srep37562.
Arno, G. et al. (2018) Comm. Biol. 1, 85, doi:10.1038/s42003-018-0093-8 (Jul. 2018).