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質量分析装置を用いたジスルフィド結合の解析
牧野 由美子（基礎生物学研究所技術課）

MAKINO Yumiko : Analysis of disulfide bonds by mass spectrometry
3. 反応条件

1. はじめにタンパク質のシステインとシステインの結合でもあタンパク質として、2 本鎖で 3 組のジスルフィド結るジスルフィド結合（架橋）は、三次元構造に大きく合を持つインスリンと、1 本鎖で 4 組のジスルフィド干渉する。このためタンパク質の構造、機能などの解結合を持つリゾチームを用いた。また、2 種類のペプ析には、ジスルフィド結合の解析が重要である。

チドから 3 組の結合反応を行ったペプチドについても

1 年半ほど前に、質量分析のタンパク質同定システムである MASCOT Server のバージョンアップに伴いクロスリンクペプチド検索機能が追加されてジスルフ正しく結合しているか確認のため用いた。
消化酵素はペプシンとトリプシンを用いた。条件は以下の通りである。

ィド結合の解析が可能となった。これを用いて、市販タンパク質：20pmol（インスリン、リゾチーム）のタンパク質、及び 2 種類のペプチドを合成にてジス消化酵素：1pmol

ルフィド結合反応を行ったペプチドについて正しい部

溶媒：0.1%TFA/H2O or 0.04N HCl（ペプシン）位のジスルフィド結合が検出できるか試みた。

：50mM 重炭酸アンモニウム（トリプシン）
反応：37℃ 18 時間

2. MASCOT Server によるジスルフィド結合の解析
クロスリンクペプチド検索機能では、下記の 3 種類

インジェクション量：1pmol
インスリンとジスルフィド結合反応を行ったペプチの結合パターンが検出可能である。

ドについては、ペプシン消化のみ行った。トリプシン

1. 同一タンパク質内の別ペプチド間の結合

消化では、検出可能なペプチドが得られないためであ

2. 異なる 2 種類のタンパク質のペプチド間の結合る。リゾチームはペプシン消化とトリプシン消化を行

3. 同一ペプチド内での結合った。

タンパク質のままでは検出できないため、検出可能な酵素消化ペプチドとして質量分析装置で測定を行っ

4. 測定方法た。得られたデータのクロスリンクペプチド検索でジ測定は、MS 測定でペプチド質量を得て、次に各ペプスルフィド結合を検出し、結合部位の同定を行った。

チドの MS/MS 測定を行って配列情報を得る方法であ

例えば、2 本鎖でジスルフィド結合が 3 か所あるウる。用いた質量分析装置は、2 種類の分析部での測定

シ インスリン（図 1）の解析においては、ペプシン消が可能で、それぞれ下記の特徴を持つ。

化で生じるジスルフィド結合をもつペプチド（図 2）

Iontrap：データ取り込みが速く、多くのデータが得らの A は検出可能となる。B は 2 か所結合が存在するため検出できない。

れる
Orbitrap：分解能、質量精度は高く、精度の高いデータが得られる

A鎖
B鎖      
図 1. インスリン（ウシ）の配列とジスルフィド結合A B     

図 2. ジスルフィド結合を有するペプチド

下記の 2 種類の方法で測定を行った。
1. MS 測定（Orbitrap）→ MS/MS 測定（Iontrap）
2. MS 測定（Orbitrap）→ MS/MS 測定（Orbitrap）
5. インスリンとリゾチームの結果
検索の結果、検出されたジスルフィド結合を有するペプチドの PSM（Peptide Spectrum Match）数をカウントした。PSM は、配列とスペクトルの組合せである。

生物学・生理学技研報 202264

6. 合成にてジスルフィド結合反応を行ったペプチド(1) インスリン
2 種類の溶媒と 2 種類の測定方法について、それぞれ 2 回測定し、検索した結果を表 1 に示した。

目的は、2 本鎖で 3 か所のジスルフィド結合を有するペプチド（図 5）の合成、精製である。反応は、最初検出されたジスルフィド結合は全て正しい組合せでに A 鎖のみで架橋反応を行い、続けて B 鎖を加えて架あった。0.1%TFA 溶媒の方が PSM を全体的に多く検橋反応を行なった。
反応液を HPLC で分画・分取した。

出できた。溶媒に 0.04N HCl を用いた Orbitrap 測定で各フラクションの MS 測定を行い、目的の 3 か所の架は検出できなかった。

橋が存在するペプチドの質量を検出したフラクションをサンプルとした。

表 1. インスリンのジスルフィド結合検出結果
溶媒番号0.1%TFA

0.04N HCl

MS/MS測定：Iontrap

MS/MS測定：Orbitrap

正しい架橋のPSM数違った架橋のPSM数

正しい架橋のPSM数違った架橋のPSM数

A鎖11406027020

B鎖

1404022000C10 C11C15C25C17C5：ペプシン消化でC末端切断されるアミノ酸：システイン

図 5. 目的の 2 本鎖ペプチド

ペプシン消化し、MS/MS 測定に Orbitrap を用いた測(2) リゾチーム

定を行い、検索した。目的通りにジスルフィド結合反リゾチーム（図 3）のペプシン消化で検出可能なペプチド（図 4a）とトリプシン消化で検出可能なペプチ応が起きていれば、図 6 のペプチドが検出される。
結果として、図 6 のペプチドは検出され、C 末端に近いジスルフィド結合は存在していることが示された。

ド（図 4b）を示す。
                   

しかし、図 7 のように目的以外の部位での結合や、架橋反応が起こらなかったシステインが存在するペプチ     


ドも検出された。これは、分取したフラクションに目

図 3. リゾチーム（ニワトリ）の配列とジスルフィド結合的以外のペプチドが存在したためと思われ、HPLC 分ab

ペプシン消化画・分取の条件検討が必要である。

トリプシン消化      


C25C17

図 6. 目的のペプチド

図 4. 検出可能なジスルフィド結合を有するペプチド2 種類の測定方法で測定し、検索した結果、ペプシン消化ではジスルフィド結合を有するペプチドは検出

C25C25C5C17C5

図 7. 目的以外のペプチド

7. まとめされなかった。
トリプシン消化については、各測定方法 について 3今回の検討として下記の結果が得られた。

回ずつ測定を行った結果を表 2 に示す。MS/MS 測定に

1. インスリンでは、正しい部位のジスルフィド結合のIontrap を用いた測定では、違う部位のジスルフィド結みを検出することができた。

合も多く検出された。Orbitrap ではほぼ正しいジスル2. インスリンのペプシン消化時の溶媒は、0.04N HClフィド結合が検出された。

よりも 0.01%TFA/H2O の方が比較的多く検出できた。
3. MS/MS 測定に Orbitrap を用いた方が、正しい部位

表 2. リゾチームのジスルフィド結合検出結果
番号MS/MS測定：Iontrap

MS/MS測定：Orbitrap

正しい架橋のPSM数違った架橋のPSM数

正しい架橋のPSM数違った架橋のPSM数

163502874036452のジスルフィド結合が検出される傾向であった。
謝辞

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合成にてジスルフィド結合反応を行ったペプチドについてのデータ掲載にご快諾くださいました、基礎生物学研究所の大野薫助教に感謝いたします。

生物学・生理学技研報 2022