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構造認識モノクローナル抗体を高効率で選択的に取得する作製法の開発と評価法の確立
坂口 敦美（東京工業大学オープンファシリティセンター）

Sakaguchi Atsumi : Development of a highly efficient and selective preparation method and establishment of anevaluation method for stereo-specificities monoclonal antibodies
I have plan to apply my excellent technique on high-quality monoclonal antibody [mAb] production to my work. Although the needs forantibodies in the research at my university are extremely high, many commercially available antibodies shows low specificities, andoutsourced antibody productions by commercial companies take many cost and time-consuming. Therefore, I would like to develop amAb production service that can provide high-quality mAbs within the university in a short time and at low cost. Last year, I showed thetime-, labor- and cost-saving mAb production method (MIHS method), Then, here I presented a new and simple method for evaluating
structure recognition ability of antibodies. The method would be suitable to assess the quality of the mAbs.

価法として開発した SAST 法は、ビオチンとストレプ

1. 目的
発表者は現在、高品質なモノクローナル抗体[mAb]

トアビジンビオチンが強固に結合することを利用す作製技術を業務に役立てたいと考えている。そこで、る。抗原にビオチンを酵素的に付加した後、ストレプ学内の抗体使用状況を調査したところ、生命理工学系

トアビジンをコートした ELISA プレートにこの抗原研究室の約 6 割が実験で抗体を使用しており、査読付を結合させた。その後の手順は通常の ELISA 法と同き論文の 4 割で抗体が使用されていることが分かった様の操作を行い、抗体の抗原への結合能を発光強度で（調査対象：教授 37 名、過去 2 年分の論文）。このよ測定した。この方法では、ストレプトアビジンとビオ

うに、本学の抗体ニーズは非常に高い一方、市販抗体チンを介することで、ウェルと抗原の間に距離がでには特異性が低いものが多く、外注の抗体作製受託はき、抗原の構造を保つことが可能になる。また、SDS高額で時間がかかり、課題がある。そこで、目的用途を加えて煮沸し、人工的に変性させた抗原でも同様のに適した mAb を短期間で安価に作製し、提供できるサ手順を行い、非変性抗原の場合と反応性を比較すれービスを学内で展開することを目的とした。昨年発表

ば、抗体が認識する構造を確認できる（図 1）。

した時間、手間、コストを削減した mAb 作製法（MIHS法）1)の次のステップとして、この基盤構築に必要な抗体の品質評価方法（SAST 法）を開発した。
2. 方法
抗体の品質を評価する際に重要なことは、抗体が非変性構造の抗原を認識することである。例として、タンパク質 A がどのタンパク質と複合体を形成するか確認する、共免疫沈降を行う際に用いる抗体は、生体内の構造（非変性構造）を認識する必要がある。
MIHS 法は、抗体を産生するハイブリドーマの膜状に発現する膜型免疫グロブリンに、培養液中で非変性構造を保持した抗原を結合させてスクリーニングを行う。したがって、取得 mAb は非変性抗原に反応する
図 1. SAST 法の概要ことが期待できる。そこで、これらの抗体の簡便な評

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生理学・生物学技研報2023

3. 結果MIHS 法取得 mAb の約 8 割が、非変性構造のみを認識（1）抗原へのビオチン付加の検討

する mAb で、免疫沈降や免疫染色で使用可能な構造認プロトコルに従いビオチン付加した EGFP-BirHis タ

識 mAb を多く取得できていることが確認された。

ンパク質が、確実に付加できているか確認するため、シフトアップアッセイを行った。2)ビオチン付加していない EGFP-BirHis、ビオチン付加した EGFP-BirHis それぞれにストレプトアビジンを加える/加えないサンプルを作製し、SDS-PAGE で泳動した（図 2）。4 と 5を比較すると、ビオチン付加した EGFP-BirHis にストレプトアビジンを加えると、EGFP-BirHis 単体の分子量には全くバンドが見られず、他のサンプルには見られないストレプトアビジンのバンドより高い位置にバンドが確認できた。これらのバンドが EGFP-BirHis と

図 3. 各 SAST 法陽性率

ストレプトアビジンが結合した複合体と判断でき、完全に付加ができていることを確認できた。

4. 考察
開発した SAST 法は mAb が認識する構造を簡単に評価でき、MIHS 法では非変性抗原を認識する高品質mAb を高効率で取得できることが確認できた。今後は、これらの技術の活用を目指し、学内での抗体作製基盤を整備していきたい。
謝辞
本法の確立にあたり、研究の本質、実験操作や結果解釈の方法のみならず、物事の思考方法まで親身にご指導いただいた横浜国立大学栗原靖之教授に深く感謝いたします。本研究に不可欠な横浜国立大学 RI センタ

図 2. SDS-PAGE による Biotin 付加の確認

ー共用機器の使用に際し、機器の使用法やトラブル時の対応、研究への助言をしていただき、共に研究を進めてくださった田中陽一郎博士に深く感謝いたします。

（2）SAST 法再現性の確認
抗 EGFP mAb 94 クローンの培養上清を用いて SAST法の再現性を確認した。同じ実験を 2 回行った結果を、本研究にかかわってくださったみなさま、ありがとうございました。

縦軸、横軸に 1、2 回目の吸光度値をとったグラフにプロットし、直線近似した結果、y=0.9672x とほぼ y=x の関係にあった。したがって、非常に高い再現性で SAST法を行えることが確認できた。
（3）抗体の非変性/変性抗原への反応性評価
従来法、MIHS 法取得 mAb について、SAST 法により非変性/変性抗原への反応性を評価し結果、反応性は以下の 3 パターンに分けられた。
①変性抗原のみ陽性②変性/非変性抗原両方陽性③非変性抗原のみ陽性
従来法、MIHS 法取得 mAb の各割合を図 3 に示す。

参考文献
1)Sakaguchi A., Nakajima C., Sawano A., Tanaka Y., andKurihara Y.: Rapid and reliable hybridoma screening methodthat is suitable for production of functional structurerecognizing monoclonal antibody., J. Biosci. Bioeng.
131(6)696–702(2021)
2)I G Winkler, M Löchelt, J P Levesque, J Bodem, R M
Flügel, R L Flower:A rapid streptavidin-capture ELISA
specific for the detection of antibodies to feline foamy virus.,
J. Immunological Methods. 207,(1) 69-77(1997)
特許
特願 2022-008917 抗体を製造するための方法及び抗体を評価するための方法並びにこれらに関連するキット
栗原靖之、坂口敦美

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