遺伝子修飾を基盤とする個別化した
禁煙指導実施のためのマーカーの確立
富山大学学術研究部 薬学・和漢薬系 薬物治療学研究室
にった

あつみ

新田

淳美

206

教授

遺伝子修飾を基盤とする個別化した禁煙指導実施のためのマーカーの確立

富山大学 学術研究部 薬学・和漢系 教授
分担研究者

同

宮西

新田淳美

肇、泉尾直孝【要旨】
タバコに含まれるニコチンは強い依存性を示す。医師とともに禁煙を目指しても、ニコチンへの依存状態が患者の主観的な情報からしか得られないため、患者に最適な禁煙プログラムを提供することが困難であり、禁煙の成功率は低い。申請者らは、精神依存との関連が非常に深い分子である Shati/Nat8l の研究を永年行い、依存性物質乱用者では、同分子の DNA がメチル化修飾を受けていることを明らかにしている。そこで、本遺伝子 DNA 修飾と喫煙欲望の相関を検討し、ニコチンへの依存状態を客観的に測定するツールの確立を目的とし、本研究を行った。
喫煙者の非連結匿名化された DNA（関係研究機関の倫理委員会での承認を得た上で、文書同意を得ている）を用いて、Shati/Nat8l の DNA メチル化率を Pyro sequence 法にて測定した。
対照グループには、同年代の非喫煙者を用いた。
修飾される可能性のあるShati/Nat8lのプロモー
ター領域における DNA メチル化部位の約 20 箇所から、依存と関係の深い修飾部位である 8箇所（転写開始位置から 1714、1700、1696、1532、1509、1492、1482、1480 ベースペア (bp)の領域）を調査対象部位とした。喫煙対象者の 1 日当たりの喫煙本数、ファーガストロームニコ
チン依存度テスト（Fagerstrom Test for Nicotine Dependence: FTND）のスコア、ニコチン依存症スクリーニングテスト（Tobacco Dependence Screener: TDS）のスコアと DNA メチル化率の相関も調べ、喫煙依存段階を評価する血液バイオマーカーの可能性も検討した。
対象となる 8 箇所の修飾部位において、非喫煙者と喫煙者との間に DNA メチル化率の有意な差は観察されなかった。さらに、DNA メチル化率と 1 日当たりの喫煙本数、FTND スコア、
TDS のスコアとの間に有意な相関は観察されなかった。
本研究において調べたメチル化修飾部位は、ニコチン以外の依存性物質の使用によって変化が確認されていた。今回の結果は、Shati/Nat8l の遺伝子が全ての依存性物質により影響を受けるではなく、特定の物質において特異的に遺伝子修飾されることを示唆した。本研究から喫煙欲望の程度を表す血液バイオマーカーの可能性を見出すことはできなかったが、現在の禁煙成功率の低さを鑑みると、保険薬局等で、薬剤師が対応することで、患者の喫煙欲望を容易に評価できるバイオマーカーの探索、確立は必要と考えられる。

207

1.

調査研究目的背景
タバコの有害性が着目されてから、日本では受動喫煙防止を掲げた健康増進法が施行され、現在に至るまで様々な施設で禁煙化が進んでいる。喫煙により、がんや呼吸器疾患のリスクが何倍にも高まり、喫煙本数が増えるほどそのリスクが増加することが報告されている 1)。さらに、タバコには強い依存作用があり、その原因としてニコチンがあげられる。ニコチンは中枢神経系に作用し、ドパミン、セロトニン、ノルアドレナリンといった様々な神経伝達物質を調節し、脳内報酬系に影響を与えることが報告されている 2)。ニコチンの依存性は非常に強く、自力での禁煙は困難なことから米国精神医学会では、喫煙をニコチン依存症として精神疾患と定義している。
現在は、禁煙補助薬による禁煙プログラムを用いて、医師とともに禁煙を目指すことが可能であり、スマートフォンのような電子媒体を用いるデジタル医薬品も承認されている。一方で、当該者は働き盛りや子育て世代のことが多く、定期的な通院や治療ができなくなり、禁煙の成功率は高
くない。また、禁煙状況が自己申告に基づくものであり、患者のタバコへの欲望状態を客観的に測定することができず、最適の禁煙プログラムを提供できないことも成功率の低下の原因と考えられている。また、禁煙への取り組みによる効果を患者が目に見えて実感しづらいことも、挫
折につながっている。そこで現在のタバコに対する欲望状態や禁煙の達成度がイメージ化される
バイオマーカーを開発することは、適切な禁煙プログラムの提供、成功率の向上に繋がり、禁煙
希望者および医療経済的にも大きな貢献となると考える。また、これらについては、保険薬局で、サンプルを採取できれば、セルフメディケーションへの大きな貢献となる。
DNA のメチル化はエピジェネティック修飾の一つであり、メタンフェタミンや大麻のような法的規制のある乱用物質の使用で変化することが報告されている 3,4)。さらに、エピゲノムワイド関連
研究によって、DNA のメチル化変化が喫煙によって誘導されることが明らかになっている 5)。我々は、精神依存との関連が非常に深い分子である Shati/Nat8l の研究を永年行い、依存性物質
使用者では、Shati/Nat8l の DNA がメチル化修飾を受けることを明らかにしている 6)。そこで、
Shati/Nat8l DNA のメチル化修飾が喫煙と関与しており、喫煙欲望を表す指標となる可能性を考えた。本研究では、喫煙欲望と Shati/Nat8l DNA のメチル化率の相関を検討し、タバコへの依存状態を客観的に測定するツールの確立を目指す。相関があれば、禁煙指導を保険薬局で実施するための、バイオマーカーとして、活用することを期待する。

2.

調査研究方法
2.1. DNA サンプル
本研究は、富山大学および東京都医学総合研究所の遺伝子解析研究に関する倫理審査委
員会の審査の承認を得て行われた ( 承認番号 : I2012003、20-23、20-60)。東京都医学総合208

研究所にて喫煙群 (129 サンプル )、非喫煙群 (129 サンプル ) の血液サンプルの提供を受け
DNA を精製した。被験者の詳細な情報は表 1 に示した。
2.2. Bisulfite sequence
DNA では 4 つの塩基のうちシトシンがメチル化されるが、このメチル化シトシンを検出する
ためには Bisulfite sequence を用いる。ゲノム DNA を Bisulfite 処理すると、DNA 中の非メ
チル化シトシンは脱アミノ化によりウラシルに変換される。一方、メチル化シトシンはシトシンのまま残る。ここから、目的の配列が PCR により増幅され、ウラシルはチミンに、シトシンはシ
トシンのままで、増幅される。よって Bisulfite sequence では非メチル化シトシンはチミン、メ
チル化シトシンはシトシンとして検出される。
200ng の DNA を Fast DNA Bisulfite Kit (Qiagen, Tokyo, Japan) を用いて Bisulfite 処理を行った。次に、Bisulfite 処理済 DNA 20ng 使用して、PyroMark PCR Kit (Qiagen) を用
いて PCR を行い、標的部位の増幅を行った。PCR 条件は 95℃ × 15min →《94℃ × 30 秒
→ 56℃ × 30 秒→ 72℃ × 30 秒》× 45 Cycles → 72℃ × 10 min とした。PCR プライマー
は Pyrosequencing Assay Design Software (ver.2.0, QIAGEN, Hilden, Germany) を用いてPCR プライマーを設計した ( Invitrogen, Carlsbad, CA) ( 表 2)。PCR プライマーは reverse
側にビオチン化プライマーを使用した (Eurofins Genomics, Tokyo, Japan)。
2.3. Pyro sequence
2.3.1. 検量線の作成
Bisulfite 処 理された標準品・非メチル化 DNA (Unmethylated human control DNA、
10ng/μl・QIAGEN ) と メ チ ル 化 DNA (Methylated human control DNA、10ng/μl・
QIAGEN ) を使用した。メチル化 DNA と非メチル化 DNAを 0 :10、2.5 : 7.5、5 : 5、7.5 : 2.5、
10 : 0 の割合で混合した後、それぞれ PyroMark PCR Kit (QIAGEN ) で PCR を行い増幅した。PCR 条件は 95℃ × 15min →《94℃ × 30 秒→ 56℃ × 30 秒→ 72℃ × 30 秒》
× 45Cycles → 72℃ × 10min とした。その後 PyroMark Q24 システム (QIAGEN ) により混合 DNA のメチル化割合を測定し、検量線の作成をした。シークエンスプライマーはPyrosequencing Assay Design Software (QIAGEN ) を用いて設計した (Invitrogen) ( 表 3)。
2.3.2. ヒトサンプルのメチル化解析
Bisulfite 処 理し、増幅を行った PCR 産物を用いて、検 量線を作成した際と同様に、
PyroMark Q24 システム (QIAGEN ) にて測定した。

2.4. 統計解析
2 群間の有意差検定は . Student’s t-test により行った。相関の検討には、ピアソンの関立

209相関係数 ( Pearson's r ) を用いた。解析は全て、Prism version 5 を用いて行った。

3.

調査研究結果3.1. Pyro sequence の定量性の確認 ( 検量線の作成 )購入した Bisulfite 処理済非メチル化 DNA とメチル化 DNA の標準品をメチル化率が 0%、25 %、50 %、75 %、100 % となるように混合した。それぞれの割合で混合した DNAの標的領域を PCR で増幅し PyroMark Q24 システム (QIAGEN ) により各領域のメチル化割合を測定した。標的領域となる転写開始位置から 1714、1700、1696、1532、1509、1492、
1482、1480 bp の位置でそれぞれ測定を行い、検量線を作成した ( 図 1A-H ) (1714 bp: 相関係数 R2 = 0.9971、1700 bp: 相関係数 R2=0.9861、1696 bp: 相関係数 R2 = 0.9934、1532
bp: 相関係数 R2 = 0.9898、1509 bp: 相関係数 R2 = 0.9868、1492 bp: 相関係数 R2 = 0.9508、1482 bp: 相関係数 R2 = 0.9913、1480 bp: 相関係数 R2 = 0.9318)。
3.2. 非喫煙者、喫煙者の Shati/Nat8l DNA プロモーター領域におけるメチル化率の解析
PCR で増幅した非喫煙者、喫煙者の Shati/Nat8l のプロモーター領域における DNA メチ
ル化部位 8 箇所（転写開始位置から 1714、1700、1696、1532、1509、1492、1482、1480
bp の領域）を調査した。8 箇所全てにおいて DNAのメチル化率に変化は観察されなかった ( 表4) (1714 bp: 非喫煙者 73.34 ± 0.60 %、喫煙者 73.18 ± 0.64 %、1700 bp: 非喫煙者 44.18± 0.32 %、喫煙者 44.44 ± 0.37 %、1696 bp: 非喫煙者 32.01 ± 0.40 %、喫煙者 32.85 ± 0.45%、1532 bp: 非喫煙者 26.79 ± 0.56 %、喫煙者 26.21 ± 0.57 %、1509 bp: 非喫煙者 27.94± 0.35 %、喫煙者 27.87 ± 0.41 %、1492 bp: 非喫煙者 43.50 ± 0.45 %、喫煙者 44.02 ± 0.53%、1482 bp: 非喫煙者 45.58 ± 0.57 %、喫煙者 45.92 ± 0.65 %、1480 bp: 非喫煙者 30.60± 0.39 %、喫煙者 30.90 ± 0.48 %)。

3.3. 喫煙者における喫煙依存程度と Shati/Nat8l DNA プロモーター領域におけるメチル化率の相関解析
喫煙依存の指標となる 1 日当たりの喫煙本数、ファーガストロームニコチン依存度テスト（Fagerstrom Test for Nicotine Dependence: FTND）のスコア、ニコチン依存症スクリーニ
ングテスト（Tobacco Dependence Screener: TDS）のスコアと Shati/Nat8l DNA プロモー
ター領域におけるメチル化率の相関を調査した。8 箇所すべてにおいて、1 日当たりの喫煙本
数、FTND スコア、TDS スコアと Shati/Nat8l DNA プロモーター領域におけるメチル化率の相関は観察されなかった ( 表 5) (vs 1 日当たりの喫煙本数 ; 1714 bp: r = 0.129, p = 0.660、1700 bp: r = 0.021, p = 0.943、1696 bp: r = 0.035, p = 0.904、1532 bp: r = 0.187, p = 0.520、210

1509 bp: r = 0.030, p = 0.919、1492 bp: r = 0.028, p = 0.925、1482 bp: r = 0.073, p = 0.804、1480 bp: r = 0.009, p = 0.976、vs FTND スコア ; 1714 bp: r = -0.069, p = 0.814、1700 bp:
r = -0.020, p = 0.947、1696 bp: r = -0.015, p = 0.959、1532 bp: r = 0.104, p = 0.722、1509
bp: r = -0.089, p = 0.761、1492 bp: r = -0.056, p = 0.849、1482 bp: r = -0.044, p = 0.882、1480 bp: r = -0.047, p = 0.874、vs TDS スコア ; 1714 bp: r = 0.133, p = 0.649、1700 bp: r= 0.044, p = 0.881、1696 bp: r = 0.024, p = 0.935、1532 bp: r = -0.003, p = 0.991、1509
bp: r = 0.127, p = 0.664、1492 bp: r = 0.109, p = 0.709、1482 bp: r = 0.020, p = 0.946、1480 bp: r = 0.036, p = 0.903)。

4.

考察
Shati/Nat8l の DNA プロモーター領域におけるメチル化率は、依存性薬物メタンフェタミンの使用により増加することを我々は報告している。しかしながら今回の結果から、ニコチン使用者
においてはそのメチル化修飾に変化は観察されなかった。さらに、喫煙依存状態の指標となる
1 日当たりの喫煙本数、FTND のスコア、TDS のスコアとの相関も観察されなかったことからも、ニコチンの使用と Shati/Nat8l の DNA プロモーター領域のメチル化は関係ないことが示唆された。このことは、Shati/Nat8l の DNA メチル化修飾が全ての依存性物質により影響を受けるではなく、特定の物質において特異的に遺伝子修飾されることを示している。

5.

まとめ
本研究では、タバコに対する欲望状態や禁煙の達成度がイメージ化されるバイオマーカーを開発するために、DNA のメチル化に着目し、薬物依存と関係が深い Shati/Nat8l を解析した。
本研究から喫煙欲望の程度を表す血液バイオマーカーの可能性を見出すことはできなかったが、禁煙成功率の低さを鑑みると、今後も喫煙欲望を簡易に評価できるバイオマーカーの探索、確立は必要と考えられる。このことは、適切な禁煙プログラムの提供、成功率の向上に繋がり、禁煙希望者および医療経済的にも大きな貢献となるであろう。

6.

調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
投稿準備中

211

7.

引用文献

1. Hou W, Hu S, Li C, Ma H, Wang Q, Meng G, Guo T, Zhang J. Cigarette Smoke Induced
Lung Barrier Dysfunction, EMT, and Tissue Remodeling: A Possible Link between
COPD and Lung Cancer. Biomed Res Int. 2019;2019:2025636.
2. Benowitz NL. Nicotine addiction. N Engl J Med. 2010;362:2295-303.
3. Markunas CA, Hancock DB, Xu Z, Quach BC, Fang F, Sandler DP, Johnson EO, Taylor
JA. Epigenome-wide analysis uncovers a blood-based DNA methylation biomarker oflifetime cannabis use. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2021;186:173-182.
4. Veerasakul S, Watiktinkorn P, Thanoi S, Dalton CF, Fachim HA, Nudmamud-Thanoi
S, Reynolds GP. Increased DNA methylation in the parvalbumin gene promoter isassociated with methamphetamine dependence. Pharmacogenomics. 2017;18:1317-1322.
5. Gao X, Jia M, Zhang Y, Breitling LP, Brenner H. DNA methylation changes of whole
blood cells in response to active smoking exposure in adults: a systematic review of
DNA methylation studies. Clin Epigenetics. 2015;7:113.
6. Yuka K, Nishizawa D, Hasegawa J, Uno K, Miyanishi H, Ujike H, Ozaki N, Inada T,
Iwata N, Sora I, Iyo M, Yamada M, Kondo N, Won MJ, Naruse N, Uehara-Aoyama
K, Ikeda K, Nitta A. A Single Medical Marker for Diagnosis of Methamphetamine
Addiction - DNA Methylation of SHATI/NAT8L Promoter Sites from Patient Blood.
Curr Pharm Des. 2020;26:260-264.

表および図
表および図
表
表 1.1. サンプル情報
サンプル情報Samplen

年齢

性別 (男性/女性)

一日平均喫煙本数

FTND スコア

TDS スコア

非喫煙者

129

72.61±0.46

120/9

-

-

-

喫煙者

129

73.93±0.61

114/1515.21±0.73

3.35±0.19

3.61±0.19

平均±SEM
FTND = Fagerstrom test for nicotine dependence
TDS = Tobacco dependence screener

表 2. プライマー情報 (PCR プライマー)
転写開始サイト (bp)212

Primer sequence平均±SEM
非喫煙者
129
72.61±0.46
120/9
TDS = Tobacco dependence screener
FTND喫煙者= Fagerstrom test
dependence
129 for nicotine
73.93±0.61
114/15
TDS= Tobacco dependence screener
平均±SEM---

15.21±0.73

3.35±0.19

3.61±0.19

FTND = Fagerstrom test for nicotine dependence
TDS = Tobacco dependence screener

表 2. プライマー情報 (PCR プライマー)
表 2. プライマー情報(PCR プライマー)
転写開始サイト (bp)Primer sequence
Forward1714, 1700 and 1696

5’-GGAGTTATGTGGGATTTTTAAAGATTA-3’

転写開始サイト (bp)Primer sequence
表 2.
2. プライマー情報
プライマー情報
プライマー)
5’-AAAAAAACAAAATACC TTCCAACAATTACC-3’
表(PCR(PCR
プライマー) Reverse
Forward5’-GGAGTTATGTGGGATTTTTAAAGATTA-3’
Forward5’-GGGTAATTGTTGGAAGGTATT-3’
Primersequence
Reverse5’-AAAAAAACAAAATACC TTCCAACAATTACC-3’
Reverse5’-CCCCCTCAATATCTAAAACC-3’
Forward5’-GGAGTTATGTGGGATTTTTAAAGATTA-3’
5’-GGGTAATTGTTGGAAGGTATT-3’

1714, 1700 and 1696
1532, 転写開始サイト
1509, 1492, 1482(bp)and 1480
1714, 1492,
1700 and
1532, 1509,
14821696
and 1480

1532, 1509, 1492, 1482 and 1480

Reverse5’-AAAAAAACAAAATACCTTCCAACAATTACC-3’
5’-CCCCCTCAATATCTAAAACC-3’

Forward5’-GGGTAATTGTTGGAAGGTATT-3’

Reverse5’-CCCCCTCAATATCTAAAACC-3’

表 3. プライマー情報 (Pyro sequence プライマー)

転写開始サイト(bp)
Primersequence表(Pyro
sequence
プライマー
)
表 3.
3. プライマー情報
プライマー情報(Pyro
sequence
プライマー)

1714, 1700 and 1696
5’-AGAGATATTTGAGTATAGGGTTTTAGT-3’
転写開始サイト (bp)Primer sequence
表 3. プライマー情報(Pyroandsequence
1532, 1509, 1492, 1482
1480 プライマー)
5’-ATTTTTGGTGAATTTAGGAG-3’
1714, 1700 and 1696
5’-AGAGATATTTGAGTATAGGGTTTTAGT-3’
転写開始サイト (bp)Primer sequence
1532, 1509, 1492, 1482 and 1480
5’-ATTTTTGGTGAATTTAGGAG-3’
1714, 1700 and 1696
5’-AGAGATATTTGAGTATAGGGTTTTAGT-3’

1532, 1509, 1492, 1482
and 1480DNA プロモーター領域におけるメチル化率
5’-ATTTTTGGTGAATTTAGGAG-3’
表
Shati/Nat8l
表 4.4. 非喫煙者、喫煙者の非喫煙者、喫煙者のShati/Nat8l
DNA プロモーター領域におけるメチル化率

非喫煙者
喫煙者 (%)
表 4. 非喫煙者、喫煙者の Shati/Nat8l
DNA(%)
プロモーター領域におけるメチル化率
171473.34±0.60
73.18±0.64
非喫煙者
(%)
喫煙者
(%)
表 4. 非喫煙者、喫煙者の Shati/Nat8l DNA プロモーター領域におけるメチル化率
44.18±0.32
44.44±0.37
1700
1714
73.34±0.60
73.18±0.64
非喫煙者 (%)
喫煙者 (%)
32.01±0.40
32.85±0.45
169644.18±0.32
44.44±0.37
1700
1714
73.34±0.60
73.18±0.64
26.79±0.56
26.21±0.57
転写開始サイト1532
32.01±0.40
32.85±0.45
169644.18±0.32
44.44±0.37
170027.94±0.35
27.87±0.41
（bp）
1509
26.79±0.56
26.21±0.57
転写開始サイト1532
32.01±0.40
32.85±0.45
169643.50±0.4544.02±0.53
1492
27.94±0.35
27.87±0.41
（bp）
1509
26.79±0.56
26.21±0.57
転写開始サイト1532
45.58±0.57
45.92±0.65
148243.50±0.4544.02±0.53
1492
27.94±0.35
27.87±0.41
（bp）
1509
1480
30.60±0.3930.90±0.48
45.58±0.57
45.92±0.65
148243.50±0.4544.02±0.531492
平均 ± SEM.
1480
30.60±0.3930.90±0.48
表 5. 喫煙者における喫煙依存状態とShati/Nat8l DNA
プロモーター領域におけるメチ
45.58±0.57
45.92±0.65
1482
平均
±
SEM.
表
5. 喫煙者における喫煙依存状態とShati/Nat8lル化率の相関1480
30.60±0.39 DNA プロモーター領域におけるメチル化率の相関30.90±0.48
平均± SEM.
vs 喫煙者におけるメチル化率

転写開始サイト (bp)

1日当たりの喫煙本数

FTND スコア

TDS スコア

r

p

r

p

r

p

1714

0.129

0.660

-0.069

0.814

0.133

0.649

1700

0.021

0.943

-0.020

0.947

0.044

0.881

1696

0.035

0.904

-0.015

0.959

0.024

0.935

1532

0.187

0.520

0.104

0.722

-0.003

0.991

1509

0.030

0.919

-0.089

0.761

0.127

0.664

1492

0.028

0.925

-0.056

0.849

0.109

0.709

1482

0.073

0.804

-0.044

0.882

0.020

0.946

1480

0.009

0.976

-0.047

0.874

0.036

0.903

FTND = Fagerstrom test for nicotine dependence
TDS = Tobacco dependence screener

213

各メチル化部位における検量線 (Pyro sequenceの定量性の確認)
図図1.1. 各メチル化部位における検量線(Pyro sequenceの定量性の確認)214