ニホンジカ・カモシカ識別キット
取扱説明書 Version 10.0.0【はじめにお読みください】
このたびは、ニホンジカ・カモシカ識別キットをお買い上げいただき、誠にありがとうございます。この取扱説明書をよくお読みの上、正しい方法でキットを使用してください。
使用上の注意1.

本キットは、LAMP 法を用いてニホンジカあるいはカモシカの糞あるいは食痕から動物種を判別するための試薬です。医療行為および臨床診断等の目的では使用できません。

2.

本キットの保存方法は、【キット内容と保存温度】 (2 ページ) に記載していますのでご確認ください。各試薬は納品後正しい温度で遮光して保存し、1 年以内を目安に使用してください。また、過度の冷却および試薬の凍結、融解の繰り返しは避けてください。一度開封した試薬はキャップが緩んでいないことを確認の上、再度適切に保存してください。

3.

本キットを使用する際は、この取扱説明書の記載内容に従ってください。記載内容と異なる使用方法および使用目的により発生するトラブルに関しましては、株式会社ニッポンジーンでは一切の責任を負いかねますので、あらかじめご了承ください。

4.

本キットによる判定結果を二次利用する場合は、必ず使用者の責任の下で行ってください。キット性能の異常によって発生するトラブルの場合を除き、株式会社ニッポンジーンでは一切の責任を負いかねますので、あらかじめご了承ください。

5.

検査環境の汚染を防ぐため、検査後サンプルの電気泳動法等による操作やオートクレーブ高圧滅菌処理は行わないでください。

6.

本キットに含まれていない化合物を併用する場合は、使用する化合物の危険性に関して十分な知識が必要です。また、本キットに含まれている試薬に他の化合物を混合しないでください。本キットの安全な取り扱いについては株式会社ニッポンジーンホームページにて製品安全データシート (SDS) を公開していますので、ご参照ください。
株式会社ニッポンジーン; https://nippongene.com/kensa/list.html

7.

本キットは食べ物ではありません。飲み込んだり、目に入れたりしないようご注意ください。検査中は皮膚等に試薬が触れないよう、白衣、手袋等で身体を保護してください。

8.

LAMP 法は栄研化学株式会社が特許を保有しています。株式会社ニッポンジーンは、本品の製造および販売を許諾されています。
LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification)法は、栄研化学株式会社により開発された日本産の等温遺伝子増幅法です。

【検査を行う前の準備および注意事項】
サンプルの準備陰性コントロール
検査の成否を確認するには、糞や食痕などの検体を入れずに熱処理を施した DNA 抽出液を添加する 2つの「陰性コントロール検査溶液 (ニホンジカ検査溶液、カモシカ検査溶液)」の作製が重要です。
DNA サンプル準備
検査には糞あるいは食痕から抽出した DNA を使用します。本キットは、糞や食痕から DNA を簡易抽出するための試薬 (DNA 抽出液)、および簡易抽出プロトコルを備えていますので、検査を行う前にニホンジカあるいはカモシカのものと思われる糞あるいは食痕を検体として準備してください。
肉片を検体として用いる場合は、別途、株式会社ニッポンジーンまでお問い合わせください。
器具、機器の準備インキュベーター (恒温器)
インキュベーター (恒温器) の電源を入れ、それぞれ温度を設定します。ウォーターバス、ヒートブロックを使用する場合は温度が安定するまでに時間を要する場合がありますので、あらかじめ電源を入れ、温度計を用いて目的の温度に到達していることを確認してください。エアーインキュベーターを用いる場合、機器によってはドアの開閉時に庫内温度が大きく変化しますので、ドアの開閉は速やかに行ってください。
器具
器具
マイクロピペット
チューブラック
チューブ
フィルター付マイクロチップ
(滅菌済)

使用方法
各区域専用とし、他の区域で使用した場合は核酸除去操作を施してから元の場所に戻してください。
各区域専用とし、他の区域で使用した場合は核酸除去操作を施してから元の場所に戻してください。
市販のガンマ線滅菌済チューブ等、核酸フリー、ヌクレアーゼフリーのグレードを選択してください。
市販のガンマ線滅菌済疎水性フィルター付チップ等、核酸フリー、ヌクレアーゼフリーのグレードを選択し、各区域にて開封してください。また、連続分注を行うと試薬への汚染が発生する可能性がありますので、1 回ごとに使い捨てとして使用してください。

筆記用具

各区域専用とし、持込書類を置く専用のスペースを確保してください。

手袋

使い捨てとし、汚染が疑われる場合はすぐに手袋を交換してください。

白衣

各区域専用とし、袖口からの汚染に注意してください。

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検査環境
LAMP 法は高感度な DNA 増幅技術であるため、検査環境にニホンジカあるいはカモシカの DNA や検査後サンプル等、鋳型となる核酸の汚染が発生すると、以降正確な検査を行うことが困難になります。サンプルの取り扱いにおいては、作業用の着衣および器具への付着に十分注意し、着衣の交換を徹底してください。以後の検査における誤判定を防止するため、使用済みのチップ、チューブ、検査後サンプルは二重にしたビニール袋にまとめて廃棄してください。また、検査後サンプルの電気泳動法等による操作やオートクレーブ高圧滅菌処
理は行わないでください。
作業区域
核酸抽出および核酸増幅を実施していない (核酸による汚染が存在しない) クリーンベンチあるいは作業台を試薬調製作業区域とし、検査溶液は試薬調製作業区域にて作製してください。試薬調製作業区域では LAMP 法において鋳型となる核酸を含む溶液、試薬類の取り扱いは行わないでください。
検査溶液へのサンプルの添加を行うスペースは試薬調製作業区域と区分し、専用の核酸取扱区域を設けてください。


核酸除去操作
器具は常に清潔に保ってください。洗浄が可能である器具は大量の水道水でよくすすぐことにより、付着した核酸を希釈、除去できます。
高濃度の核酸を取り扱った場合など、核酸による汚染が疑われるような場合には、1%次亜塩素酸ナトリウ
ム水溶液を用いて検査環境中に存在する核酸の除去操作を行います。次亜塩素酸ナトリウム水溶液は塩素ガスを発生するので、使用の際には換気に十分注意してください。また、金属に対する腐食性があるため、金属に対して使用する際は、迅速に塩素成分を拭き取る等の対応が必要です。高温環境下における劣化が著しいため、1%水溶液調製後の経過日数や保存温度に注意してください。
＜方法＞i) 使い捨て手袋を装着します。
ii) 有効塩素濃度 10,000 ppm (1%) の次亜塩素酸ナトリウム水溶液を準備します。
iii) 次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含ませたペーパータオルで作業台、器具を丁寧に拭き、余分な塩素成分は 70%エタノールを含ませたペーパータオルで拭き取ります。
iv) 非金属の器具は次亜塩素酸ナトリウム水溶液に 1 時間以上浸し、よくすすいで乾燥します。
v) 作業台、器具は常に清潔に保ち、定期的に次亜塩素酸ナトリウム水溶液による拭き取り清掃を行います。

86. 文献・資料
1.

Aikawa T, Horino S, Ichihara Y. (2015) A novel and rapid diagnostic method fordiscriminating between feces of sika deer and Japanese serow by loop-mediatedisothermal amplification. Mamm Genome. 26 (7): 355

2.

Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T.
(2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12):e633.

Prince AM, Andrus L. (1992) PCR: how to kill unwanted DNA. Biotechniques. 12(3): 3584.

相川拓也・堀野眞一・市原優・高橋裕史 （2018） “ニホンジカ・カモシカ識別キット”－その使い方と使用例－．森林防疫 67: 157. 付録【品質管理】
ニホンジカあるいはカモシカの DNA 2.0 µl を鋳型として 20.0 µl (1 テスト分) の容量で DNA 増幅反応を行い、63˚C、60 分間で蛍光発色液 alpha が発色することを確認しています。

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【メモ欄】

【メモ欄】