速度論的結晶学研究チーム
Kinetic Crystallography Research Team
チームリーダー加 藤

博 章

KATO, Hiroaki
当研究チームでは、反応過程におけるタンパク質の動きを捉え、タンパク質の分子装置の仕組みを詳細に解明することを目標として、速度論的結晶学の研究手法の開発とその利用研究を行っている。
速度論的結晶学とは、分子構造の経時変化を捕えるというＸ線結晶学の一分野である。高速度のＸ線回折データ収集には超高輝度の放射光Ｘ線が必要であり、大型放射光施設（SPring-8）の利用が不可欠である。ただし、構造生物学研
究における速度論的Ｘ線結晶構造解析は、単なる高速のＸ線結晶解析ではない。たとえば酵素反応に伴う構造変化を結晶解析で捕捉しようとすると、結晶中に含まれるすべての分子が同時刻に同じ反応状態にあるように、分子を同調的に動かすための化学的な工夫が必要となる。したがって、動的結晶構造解析の際に結晶中の動きを同調させるための有機化学的、分子酵素学的手法の開発や、結晶化に適したタンパク質を合理的に得るための戦略の確立も行っている。計画では、構造変化と生物機能が密接に関わる対象として以下の３つの問題にこの解析を適用している。

1．生物発光の分子機構−速度論的Ｘ線結晶構造解析によるホタル・ルシフェラーゼの発光色制御機構（中津*1，市山*2，加藤）
ホタルの発光現象は、その仕組みに科学的な興味が持たれているだけでなく、細胞生物学、分子生物学の研究や、臨床検査での利用研究が進んでいるなど、実用的な価値も認められている。その発光はルシフェラーゼによる酵素反応によって引き起こされている。すなわち、ATP に依存して基質のルシフェリンが分子状酸素によって酸化されてオキシルシフェリンに変換され、この生成物が発光するものと考えられている。本研究課題では、ゲンジボタルの遺伝子から調製したルシフェラーゼの速度論的Ｘ線結晶構造解析を行うことにより、同酵素の反応機構の構造的な基盤を明らかにし、発光の仕組みを解明することを目的としている。
野生型ルシフェラーゼは黄緑色の発光を行うが、S286N 変異体では赤色に発光することが知られている。いずれの酵素についても同一の基質を用いて反応を触媒することから、発光色の違いは酵素の立体構造に起因することが考えられる。そこで反応中間体であるルシフェリル
AMP 中間体のアナログである 5'-O-[N-(dehydroluciferyl)sulfamoyl adenosine (DLSA)との複合体のＸ線結晶構造解析
を野生型、S286N 変異体について行った。その結果、野生型では Ile288 が DLSA のベンゾチアゾール環の方に近づき、側鎖を使って非常に疎水的な環境を形成していた。一方
S286N 変異体では Ile288 は近づいてはおらず、DLSA との間に空間ができていた。したがって野生型ではエネルギーの損失が起こらないように、励起状態のオキシルシフェリ
ンを疎水的な環境でしっかりと取り囲む構造を形成していることが予想された。そこで Ile288 の側鎖をより小さなアミノ酸である Val, Ala に変異させ、発光色を測定したところ、それぞれ橙色、赤色となった。したがって、Ile288の動きにより励起状態のオキシルシフェリンがどの程度分子振動するかということが、発光色を決定している原因であることが明らかとなった。

2．膜タンパク質装置の動作機構解析a) ABC タンパク質の機能発現の仕組みと動作機構
ABC（ATP Binding Cassette）タンパク質とは、分子内によく保存されたATP結合部位を２つ有する膜タンパク質の総称であり、トランスポーター、レセプター、チャンネルといった多様な生理機能を示し、生命維持に必須な役割を果たしている。例えば、SUR１は、細胞内ATP/ADPのレセプターであり、Ｋ +チャネルの開閉を制御する。MDR1やMRPは、ガンの化学療法の障害となっている生体異物排出ポンプである。さらにCFTRやMDR1 には、レギュレー
ターなどとしての多機能性も報告されている。本研究課題
では、膜タンパク質である分子全体の結晶化を試み、膜貫通領域についても結晶構造をもとに生理機能の解明を目指す。さらに、静的なＸ線解析ができた系については、結晶状態での反応速度解析と反応制御法を確立し、ATP駆動による動作機構について四次元構造解析を行う予定である。
（１）結晶化に適した ABC タンパク質発現系の構築（小段，寺角*3，崎山，柴田*4，加藤）
ヒトのガン細胞の多剤耐性の主要因と考えられる ABC タ
ンパク質（MDR1）に着目し、バキュウロウィルス・昆虫
細胞系を用いることによって、Ｘ線結晶解析に適したタン
パク質標品を調製する系の確立を試みてきた。その結果、10ℓ規模の液体培養を連続的に実施し、MDR1 を安定に生産する系を確立できた。一方、結晶化能を高めるため、立体構造の不安定化に寄与するアミノ酸残基を置換した変
異体 MDR1 についても同様に培養して結晶化条件の探索に用いることができるようになった。
（２）ペルオキシソーム ABC タンパク質 PMP70 の機能解析と大量発現の試み（柴田*4，中津，今中*5，加藤）
ペルオキシソームは細胞内オルガネラの一つで、過酸化物や脂質の代謝に関わる酵素を多く含んでいる。ペルオキ
シソームの ABC タンパク質の一つである PMP70 は、ペルオキシソーム内のβ酸化を誘導することにより発現の上昇が認められ、極長鎖脂肪酸の代謝に関与するものと推測されるが、その機能の詳細は不明である。本研究の目的は、
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PMP70 をはじめとするペルオキシソーム膜タンパク質（PMP）がペルオキシソームに輸送される機構を明らかにし、立体構造解析に向けた PMP70 の過剰発現を達成することである。PMP70 の細胞内輸送には、ペルオキシソーム
形成異常の原因となる遺伝子産物であるタンパク質（Pex）のいくつかが関与する。すなわち、生合成された PMP70に Pex19p が結合し、細胞質を移動した後、ペルオキシソーム膜上で Pex3p がその複合体を認識すると推測されている。そこで、PMP70 と Pex19p の相互作用様式を解明する
ため、種々の PMP70 断片を Pex19p 存在下で無細胞合成し、Pex19p との結合力を調べた。その結果、アミノ末端側 61
残基と、6 番目の膜貫通へリックス部分が Pex19p との結合に必須であることが明らかとなった。また、細胞内でペルオキシソームに輸送されるのに必要な領域でもあることが判明し、この部分が PMP 輸送シグナルを含むと示唆された。一方、PMP70 をペルオキシソーム膜上で受け入れるのに機能する Pex3p についても、Pex19p との相互作用部位に関して解析をおこなった。すなわち、Pex3p の Trp104 がPex19p の結合に直接機能することを解明した。この残基のインドール環が Pex19p に対して特異的な疎水性表面を提供することが、変異導入実験の結果から明らかとなった。
（３）電子線単粒子解析を目的とした ATP 感受性カリウムチャネルの発現・精製系の構築（木村，加藤）
ATP感受性カリウムチャネル（KATP）は細胞内の代謝状態を監視し、インスリンの分泌等、代謝状態の変化に対応する生体反応において重要である。KATPは、ABCタンパク質に属する制御サブユニットSUR1 とチャネル孔サブユ
ニットKir6.2 が 4 分子ずつ会合した巨大な膜タンパク質複合体であり、その分子量は 800KDaを超える。KATPの形成にはタンパク質の高度な品質管理機構が必要であり、有効
な大量発現系は未開発の状態であった。本研究では浮遊培養が可能なヒト培養細胞に着目し、バイオリアクターを併用することでKATPの大量発現系の構築を試みた。その結果、遺伝子導入試薬、培養条件等の最適化により最終的に 10ℓ規模での培養系を構築した。続いて精製に用いる界面活性剤等の改良を試み、1ℓ培養当たり約 25 μgの精製KATPを得る事に成功した。精製KATPは 8 量体構造を保持していることがサイズ排除クロマトグラフィー、負染色による電子顕微鏡観察により明らかとなり、単粒子解析に向けての基盤が確立できた。
b)その他の膜タンパク質装置（４）バクテリア由来ナトリウムチャネルの構造解析（入江）
電圧感受性Na+ チャネル（Navch）は膜電位の変化を感知して活性化されるイオンチャネルであり，膜電位の脱分極の伝播はこのチャネルの働きによるものである。そのため，Navchの異常は様々な疾患の直接原因となる。したがって，Navchのチャネル開閉やイオン透過のメカニズムを分子レベルで明らかにすることは関連する疾患の病因解明に大きな役割を果たす。しかしながら、高等生物のNavchは巨大で複雑なタンパク質であることから，X 線結晶構造解析を行うのは非常に困難である。我々は原核生物においても電圧感受性Na+ チャネル（NachBac）が存在す
ることに着目した。これまでに、NachBacの全長をHis-tag
融合タンパク質として発現することに成功した。

3．超原子分解能 X 線結晶構造解析による酵素反応機構研究（清水*6，中津*1，加藤）
酵素反応の仕組みを理解するためには、反応に伴う構造変化を明らかにするだけでなく、反応の鍵となる状態の構造をできるだけ精密に解析することも必要である。たとえば、inverting 型のグリコシダーゼの反応は、一対のカルボン酸による一般酸塩基反応によって触媒されることから、このプロトン（水素）の動きを捉えることが出来れば、より詳細な反応加速機構の理解が可能になる。そこで、本研究では、inverting 型のグリコシダーゼである Stereum
purpureum 由来エンドポリガラクツロナーゼ I（endoPG I）の反応機構の理解を目指し、0.8 Å 以上の超原子分解能（subatomic resolution）X 線結晶構造解析による水素を含めた構造決定を試みた。さらに、endoPG I の基質認識機構を解明するため、変異体酵素を用いて酵素基質複合体結晶の構造決定を行った。
（1）超原子分解能 X 線結晶構造解析
前年度、endoPG Iの結晶化条件、クライオプロテクタン
トの改良の結果、0.68 Å分解能のデータ収集に成功した。
そこで、データ測定条件、データ処理方法を改良し更なる高分解能を目指した。測定は、SPring-8 のBL41XUにて、短波長（0.45 Å）のX線と大面積CCD検出器（ADSC Q315）を使用し行った。0.2 度の微小振動角測定や、放射線損傷低減のため 40 Kのヘリウムクライオの利用や測定中の照射位置変更を導入した。さらに、redundancy向上のため 2結晶の分のデータを測定した。その結果、0.62 Å分解能で
Rpim = 2.4%（最外殻 21.6%）の回折データを得た。
プログラム SHELXL を用いた構造解析の結果、R/Rfree =8.82%/9.81%の構造を得た。解析中、予想される水素原子57%にあたる約 1600 の水素原子を Fo-Fc マップ上で、3.0
sigma 以上の強度で測定に成功した。さらに、幾つかの Asp残基の解離性水素原子や水分子の水素原子も観測された。
（2）変異体酵素を用いた酵素基質複合体の解析
酵素基質複合体の構造を捉えるためには、変異体酵素や基質アナログ等の酵素反応を停止させる仕組みが必要である。前年度、一般酸触媒残基の Asp173 を Asn に置換した D173N と基質の複合体の構造解析に成功している。そこで、新たに一般塩基触媒残基の候補である Asp153 に変異を加えた D153N と基質の複合体の解析を試みた。その結果、0.85 Å の高分解能で－４～＋１のサブサイトに基質が結合した構造が得られた。得られた構造を、D173N と基質の複合体の構造と比較した結果、Ile89 – Thr94 のループの構造が異なっていた。D153N 基質複合体のループ構造は、天然型酵素と反応生成物ガラクツロン酸（GalA）との複合体のそれと同じことから、D153N 複合体の方がより実際の
酵素基質複合体に近い構造と考えられた。
D153N と D173Nの比較の結果、D173N では切断されるグリコシド酸素への水素結合のドナーが、酸素原子から窒素原子に代わっていることから、このグリコシド酸素との水素結合が基質の正しい結合に不可欠であることが明らかになった。
＊１客員研究員（京大大学院）、＊2 客員研究員（学習院大学）、＊3JRA（京大大学院）、＊4 客員研究員（国立循環器病センター研）、＊5 客員研究員（富山医科薬科大学）、＊6
客員研究員（京大大学院）

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1. Mechanism of Biological luminescence – Elucidation of
the control mechanism of the luminescent color based on the
kinetic X-ray crystallography.
To elucidate the bioluminescence mechanism of firefly,
reaction mechanism of the firefly luciferase has been studied.
The firefly luciferase catalyzes an oxidative reaction involving
ATP, firefly luciferin and molecular oxygen, yielding anelectronically excited oxyluciferin species.
This excitedspecies emits visible light. The luminescent color change bysingle amino acid mutation of luciferase and the high quantum
yield in luciferin/luciferase reaction are interesting research.
The aim of the study is to capture the structures of the enzyme
during the reaction by kinetic crystallography. We determinedthe crystal structures of wild-type and red emitting S286N
mutant luciferases complexed with 5'-O-[N-(dehydroluciferyl)sulfamoyl adenosine (DLSA) which is luciferyl-AMP
intermediate analogue. The wild-type luciferase changes theconformation that Ile288 is close to the benzothiazole ring of
DLSA and forms hydrophobic microenvironment in the activesite. On the other hand, the red-emitting S286N mutant does
not induce the conformational change and is less hydrophobic
microenvironment. The wild-type luciferase will cause theconformational change forming tightly rigid and nonpolar
environment of the excited oxyluciferin in order to minimize
energy loss before emitting yellow-green light. In order toconfirm ouridea, we prepared the I288V and I288A mutants andexamined the luminescent color. I288V and I288A mutants
emitted orange and red colored light, respectively.
Consequently, the degree of the molecular rigidity of the excitedoxyluciferin involved in the movement of Ile288 determines thecolor of bioluminescence during the emission reaction.
2. Mechanism of molecular motion of membrane protein
machinery.
a) Mechanistic aspects for the function and molecular motion in
ABC proteins.
ATP-binding cassette (ABC) proteins comprise a familyof structurally related membrane proteins sharing
well-conserved nucleotide binding domains. Although theirpredicted secondary structures are very much alike, they havedivergent functions and can be classified as transporters,
channels, and regulators. They commonly use ATP hydrolysis as
an energy source for various functions. Therefore, determinationof three-dimensional structure at high resolution is important toelucidate their functional differences. In this project, we have
two aims in mind. First, we study P-glycoprotein, also termed as
MDR1, that contributes to the multi-drug resistance developedin the course of the AIDS and cancer chemotherapy, in order tounderstand the mechanism of the multi-drug resistance.
Second, we also try to find out ways to overcome the difficulties
for overproduction of properly folded membrane proteins. Ouridea is to utilize the peroxisome as a folding and storage devicefor overproduced membrane proteins. Since PMP70 and ALDP
are the peroxisomal ABC transporters, successful
over-expression of these proteins would prove our strategy.
(i) Structural basis of multi-drug resistance ABC transporter
P-glycoprotein form human.
Large-scale production of P-glycoprotein (MDR1) was
conducted by baculovirus/insect cell expression system andsable MDR1 expression was thus confirmed. To maintainprotein stability, various factors were screened and thepurification conditions were thus improved. The stability andmonodispersity of the purified preparation were better thanthose of previous one. Furthermore, several site-directed
mutations were introduced into MDR1 to reduce its
conformational flexibility and consequently to increase its
crystallizability. Crystallization of the purified mutant MDR1
is in progress.
(ii) Construction of crystallography-oriented overexpression
system for membrane proteins derived from peroxisomaltranslocation.
PMP70 is a peroxisomal ABC transporter that is assumed toresponsible for the metabolism of very long chain fatty acids.
During the cellular localization of PMP70, a peroxin protein
Pex19p seems to function like a chaperone to carry PMP70
toward another peroxin Pex3p on the peroxisomal membrane.
To identify the regions that interact with Pex19p, various
truncated PMP70 were synthesized by a cell-free system in thepresence of Pex19p. The amino-terminal 61 residues and thesixth transmembrane helix of PMP70 were required for both theinteraction with Pex19p and the intracellular translocation
toward peroxisomes. We meanwhile examined the Pex3p
residues necessary for binding to Pex19p. Several sitedirected mutagenesis experiments revealed that Trp104 of
Pex3p directly interact with Pex19p with hydrophobic contacts.
Our investigation of the protein-protein interactions(Pex3p—Pex19p—PMP70) will be expected to explore protein
samples suitable for the crystallization.
b) Structural biology studies on the other membraneproteins—Voltage-gated sodium channel.
To elucidate the structural basis of the voltage-gated sodium
channel mechanism, a small size sodium channel form abacterium, Bacillus halodurans (NachBac) has been studied.
NachBac with His-tag was expressed in E. coli and purified byan affinity and size-extinction column chromatographies.
Exploring of good detergents and lipids for crystallographic
works are in progress.
3. Capture of hydrogen behavior in enzymatic reaction by
ultra-high resolution crystallography
The availability of high-intense synchrotron X-ray beamand efficient X-ray image detectors has also led to open thedetermination of three- dimensional structure at subatomic
resolution (d < 0.8 Å). In such a resolution, we can recognizehydrogen atoms and identify the protonation state of functional
residues in enzymes.
Endopolygalacturonase (endoPG) is an inverting
glycosidase, which is involved in the degradation of pectin byhydrolyzing the a-1,4 glycosidic bonds. It is considered thatthe reaction is accelerated by acid-base catalyst. To visualizehydrogen atoms and/or protons involved in the reaction, we
started subatomic resolution X-ray crystallography of endoPG
from Stereum purpureum.
The crystals for subatomic resolution were prepared using
sitting drop vapor diffusion method coupled with macro seeding.
Data collection was performed at beamline BL41XU using an
ADSC Q315 CCD detector. The data was integrated andscaled to 0.62 Å resolution. Rpim of overall and outer shell(0.64 - 0.62 Å ) were 2.4% and 21.6%, respectively. Even in
the most outer shell, the completeness and the mean I/σ(I)were 55.0% and 3.0, respectively. The model was refined withan R factor of 8.82% and a corresponding Rfree factor of 9.81%
using a program SHELXL97. About 1600 hydrogen atoms
were observed in the Fo - Fc maps contoured at 3.0 σ during
the refinement. These observed hydrogen atoms contain thelabile hydrogen atoms of two asparagine residues and hydrogen
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atoms of 13 water molecules.

Staff
Head
Dr. Hiroaki KATO

Members
Dr. Atsushi KODAN
Dr. Yasuhisa KIMURA
Dr. Katsumasa IRIE
Mr. Keita SAKIYAMA

Visiting Members
Assoc. Prof. Toru NAKATSU (Grad. Pharm. Sci., Kyoto Univ.)
Prof. Tsuneo IMANAKA (Fac Pharm. Sci., Toyama Univ.)
Dr. Susumu ICHIYAMA (Fac Sci., Gakushuin Univ.)
Dr. Tetsuya SHIMIZU (Grad. Pharm. Sci., Kyoto Univ.)
Dr. Hiroyuki SHIBATA (Natl. Cardiovasc. Ctr. Res. Inst.)

JRA(国内会議)
入江 克雅, 中津 亨, 光岡 薫, 宮澤 淳夫, 祖父江 賢治, 廣明 洋子, 土井 知子, 藤吉 好則, 加藤 博章: "シナプス後膜におけるHormer1ファミリーによるタンパク質集積制御機構の構造生物学", 第10回放射光医学研究会講演会 , (放射光医学研究会), 吹田 , 1月 (2005).
加藤 博章: "生物時計タンパク質の立体構造と機能", 日本薬学会第125年会, 東京, 3月 (2005).
加藤 博章: "糖鎖修飾によるタンパク質構造安定化機構の構造生物学的研究", 文部科学省科学研究費補助金特定領域研究「糖鎖によるタンパク質と分子複合体の機能調整」第3回夏期シンポジウム , 岐阜 , 8月 (2005).
清水 哲哉, 中津 亨, 清水 伸隆, 佐藤 衛, 栗原 和男, 宮入一夫, 奥野 智旦, 新村 信雄, 山本 雅貴, 加藤 博章: "リンゴ銀葉病菌由来エンドポリガラクツロナーゼの超高分解能Ｘ線結晶構造解析と高分解能中性子結晶構造
解析", 日本結晶学会2005年度年会および総会 , 姫路 ,12月 (2005).
中津 亨, 清水 哲哉, 中野 博明, 小橋 信行, 柴田 洋之, 山本 雅貴, 佐藤 貴久, 佐々木 勝成, 加藤 博章: "微小タンパク質結晶Ｘ線回折装置の開発(2)", 日本結晶学会
2005年度年会および総会 , 姫路 , 12月 (2005).

Ms. Kanako TERAKADO (Grad. Pharm. Sci., Kyoto UNIV.)
誌 上 発 表Publications[ 雑誌 ]（原著論文）＊印は査読制度がある論文誌
Sakaue R., Nakatsu T., Yamaguchi Y., Kato H., and Kajiyama
N.: "Crystallization and preliminary crystallographic analysis
of bacterial fructosyl amino acid oxidase", Acta Cryst. F 61,
196--198 (2005). ＊Kawashima Y., Asahina K., Shibata H., Morita M., Muntau A. C.,
Roscher A. A., Wanders R. J., Shimozawa N., Sakaguchi
M. ,Kato H., and Imanaka T. : "Role of Pex19p in thetargeting of PMP70 to peroxisome", Biochim. Biophys. Acta
1746, 116--128 (2005). ＊Shimizu T., Shibata H., Araya T., Nakatsu T., Miyairi K., Okuno
T., and Kato H. : "Expression,purification,and crystallizationof endopolygalacturounase from a pathogenic fungus,
Stereum purpureum, in Escherichia coli", Protein Expr. Purif.
44, 130--135 (2005). ＊Nakatsu, T., Ichiyama, S., Hiratake, J., Saldanha, A., Kobashi, N.,
Sakata, K. and Kato, H. Structural Basis for Spectral
Difference in Luciferase Bioluminescence. Nature, 440,
372-376 (2006)[ 単行本 ]
（総説）
加藤 博章, 小段 篤史, 柴田 洋之 : "ABC蛋白質の立体構
造研究：現状と課題", ABC蛋白質 , 学会出版センター,
東京, pp.245--274 (2005).
口 頭 発 表 Oral Presentations(国際会議等)
Shimizu N., Kawamoto M., Hasegawa K., Sakai H., Nisawa A.,
Shimizu T., Nakatsu T., Kato H., and Yamamoto M . :"Ultra-high Resolution Measurement at BL41XU ofSPring-8", 20th Congress of the International Union of
Crystallography (IUCr2005) , Florence , Italy , Aug.
(2005).
Kimura Y., Matsuo M., and Ueda K.: "Cholesterol modulates
drug-stimulated ATPase activity of human
MDR1/P-glycoprotein", International Symposium on
Biological Membrane Transport 2005 , (Research Group forTransport Nano-machine-Project), Awaji , Aug. (2005).

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