分子シグナリング研究チーム
Molecular Signaling Research Teamチームリーダー

山下 敦子

YAMASHITA, Atsuko
視覚・聴覚・触覚・味覚・嗅覚などの「感覚」は、環境や異なる個体から受け取ったさまざまな情報を変換、統合、認知、処理するという生物にとって重要な機能である。当研究チームでは、感覚受容の第一段階、すなわち外界からのシグナルを受容しそれを生体内で伝達されるシグナルに変換するまでの過程に焦点をあて、それらに携わるタンパク質の構造を知ることにより、その分子メカニズムを明らかにすることを目標として研究を行っている。具体的には、感覚受容体やその後のシグナル伝達に関わるタンパク質・イオンチャネルなどを対象に、SPring-8 を利用した X 線結晶構造解析を中心とした立体構造解析、および生化学的・生理学的手法を用いた機能解析を平行して行い、得られた知見を統合して感覚受容のしくみを理解することを目指している。

１．感覚受容体の構造・機能解析
感覚受容，すなわち「我々は外界をどのように認識するのか」という問題に対し分子レベルでアプローチする上で極めて重要な第一歩となるのが、外界からの刺激を受容する最前線の感覚受容体タンパク質が，ある化学物質をいかに認識するか，機械刺激にいかに反応するかというメカニズムを理解することである．そこで，本年度発足した当研究チームの第一の研究課題として、感覚受容体の構造・機能研究を開始した。具体的には、化学刺激に対する受容体の代表として味覚受容体，機械刺激に対する受容体の代表として浸透圧受容体，の２種の受容体の結晶構造解明を目指した立体構造研究に着手した．
感覚受容体は，我々ヒトにおける言語（音声）受容や昆虫におけるフェロモン受容など、生物の個体間の情報伝達に重要な役割を果たしている．これまで生体内（細胞間や細胞内）での情報伝達については分子のレベルからのアプローチがなされてきたが，感覚受容体研究は、個体間の情報伝達のメカニズムを分子レベルで考える第一歩となると考える．さらに，感覚受容体の類似の受容体タンパク質が生体内での細胞間の情報伝達にも使われているため，感覚受容体研究で得られる知見は、生体内外を含めたタンパク質による情報認識・伝達の分子機構解明へ重要な知見になると考える．
(1) 味覚受容体の構造・機能解析（芦川、山下）
味覚受容体である甘味受容体および旨味受容体は、舌上および口腔内の味蕾にある味細胞の細胞膜に存在する膜タンパク質であり、G タンパク質共役型受容体(GPCR)ファミリーに属するタンパク質群である。これらの受容体は、
T1R ファミリーと呼ばれる３種類のタンパク質(T1R1,
T1R2, T1R3)がヘテロ二量体を構成して機能しており，
T1R1/T1R3 二量体が旨味受容を，T1R2/T1R3 二量体が甘味受容を担っている．またこれらの分子には細胞外ドメインが存在し，多くの味物質の結合・認識部位となっている．
これら甘味・旨味受容体について、結晶構造解析を目指した発現条件の検討に着手した。まず、ヒトおよびマウス由来で種々の発現長（全長、細胞外ドメインなど）を持つ T1Rの発現スクリーニング用のベクターを構築した。また、大腸菌を用いた発現系で、宿主や培養条件などを様々に変え、発現条件の検討に着手した。本年度探索した限りにおいては、残念ながら期待する発現長、フォールディングおよび発現量で受容体が発現する条件を見いだすことができなかったため、今後引き続き検討を行う。
(2) 浸透圧受容体ホモログの構造・機能解析（伊原、山下）
近年いくつかの酵母から、液胞膜に存在し浸透圧依存的にチャネルを開いて陽イオンを透過させる浸透圧受容体が見いだされている。この受容体について、結晶構造解析を目指した発現条件の検討に着手した。まず、データベース検索を行い、報告されている受容体と相同性を持つ酵母および真菌由来のタンパク質をいくつか新たに見いだした。このうち、５種のホモログタンパク質の遺伝子について、酵母および真菌からクローニングを行った。浸透圧受容体として機能が同定されている３種を含め、これら合計８種の遺伝子の発現スクリーニング用のベクターを構築し、大腸菌を用いて発現条件の検討を行った。これらの受容体あるいは受容体ホモログタンパク質を発現させた大腸菌は強い増殖阻害が観察されたが、発現条件の検討により、ある程度の細胞増殖を示しタンパク発現が見られる条件を確立することができた。その結果、これらの受容体は非常に不安定で全長での発現はほとんど得られなかったが、あるホモログについては、細胞内ドメインと見られる部分領域を安定かつ多量に発現できることを見いだした。
得られた領域は溶液中で単分散状態を示し、結晶構造解析の対象として有望であると考えられる。
２．感覚受容細胞内シグナル伝達に関わる分子の構造・機能解析（山下）
感覚受容細胞における外界からの刺激の受容機構を理解するには、感覚受容体分子そのものの理解に加え、それらの受容体を制御するタンパク質や、受容体からの情報伝達を担うシグナル伝達タンパク質などの機能メカニズムを知ることも重要である。本年度は機械刺激受容体制御タンパク質について、データベース検索を行い、いくつかの高度好熱菌由来のホモログタンパク質の存在を見いだした。その中から、６種の遺伝子のクローニングを行い、発現スクリーニング用のベクター構築を行うなど、構造・機能解析に向けた準備作業を行った。
播磨研究所

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平成 18 年度 研究年報

“Sense”, such as vision, audition, touch, gustation, andolfaction, is an important function for living organisms toreceive, transduce, integrate, recognize and process a wide arrayof information from environment. In this research team, wefocus on the first step of sensing through signal reception fromenvironment to signal transduction and transfer in a cell. We
aim to elucidate molecular mechanisms of this process byknowing structures of involving proteins. The pivot of our study
is structural analysis of sensory receptors, signaling proteins,and ion channels by X-ray crystallography using SPring-8
beamlines. We also carry out functional analysis of theseproteins with biochemical and physiological approaches. The
object of this team is to understand the sensing mechanisms byintegrating the structural and functional information.
1. Structural and functional analyses of sensory receptors:
In order for the first step of a molecular-level approach on aquestion how we recognize environments, it is indispensable toknow mechanisms how sensory receptors at the front line
toward environments recognize chemical substances or response
upon mechanical stimuli. In this first year of our research team,
we started structural and functionally studies of sensoryreceptors as our first and primary research project. Our current
targets are taste receptors, as a representative of chemoreceptors,
and an osmosensor protein, as a representative ofmechanoreceptors.
Sensory receptors play key roles for receiving informationfrom environment, and thus enable signaling between
individuals, such by human verbal communication and insect
pheromonal communication. Although analyses of proteins
responsible for signaling inside and between cells in our bodies
have so far preceded in the research field of molecular biology
and biochemistry, molecular analyses of sensory receptors
might serve as the first step for understanding of signaling
between individuals at molecular level. Furthermore, membersof the same protein families of sensory receptors also function
as receptors for various intercellular signaling substances, suchas hormones, cytokines, and neurotransmitters. Structural
studies on sensory receptors thus might provide significant basis
to address mechanisms how proteins recognize and transduce
information both from outside and inside of our bodies.
(1) Taste receptors.
Taste receptors are membrane proteins existing in taste buds on
tongues and oral cavities. Among those, sweet and umami taste
receptors belong to the G-protein coupled receptor family. They
function as heterodimers consisting of the T1R family proteins;umami taste receptors of T1R1/T1R3, whereas those for sweetconsist of T1R2/T1R3. These proteins possess extracellulardomains responsible for binding and recognition of many taste
substances. In this year, we started to explore conditions forexpression of these receptors toward crystallographic studies. In
the first, we constructed vectors of T1r proteins for expression
screening using human- and mouse-derived genes with various
kind of lengths (such as for full length, extra cellular domains,etc.) . We then began to screen expression conditions using E.
coli expression systems by changing host cells and culture
conditions. Among we tested, we have unfortunately not foundappropriate conditions for expression in the aspect of molecularweight, folding, and amount of expressed proteins. Thus we aregoing to continue screening of expression condition.

(2) Osmosensor proteins.
Recently presence of cation permeable channel proteins which
are located at vacuole membranes and response to osmotic force
has been reported in several yeasts. We started to explore
conditions for expression of these osmosensor proteins toward
crystallographic studies. In the first, we carried out a databasesearch and newly found several proteins homologous to thereceptors from yeasts and fungus. Among them, we cloned 5
different genes from yeast and fungus sources. We thenconstructed vectors of 8 genes, including three alreadyidentified their functions, for expression screening, and started
to explore expression conditions using E. coli systems.
Although E. coli cells showed strong growth inhibition upon
expression of these receptors and receptor homologs, we
successfully found out a condition enabling moderate cell
growth and protein expression. As a result, we found that acytoplasmic region from one homolog protein showed stable
and high expression, though expression of full length receptor
proteins were hardly observed among all tested proteins. Theregion showed monodispersity in solution and is thus expected
to be a promising candidate for a crystallographic study.
2. Structural and functional analyses of signaling proteins insensory cells
In order to understand mechanisms of reception ofenvironmental stimuli by sensory cells, it is indispensable toknow functional mechanisms of proteins responsible forregulation and downstream signaling of sensory receptors, aswell as those of the receptors themselves. In this year, westarted preparation toward structural and functional analyses of
those proteins. In the first, we carried out a database search andfound several proteins homologous to a regulatory protein formechanosensor proteins from hyperthermophilic bacteria.
Among them, we cloned 6 different genes and constructed
vectors for expression screening.

StaffHeadDr. Atsuko YAMASHITA

Members
Dr. Yuji ASHIKAWA
Dr. Makoto IHARA

誌 上 発 表Publications[ 雑誌 ]（原著論文）＊印は査読制度がある論文誌
Narita A. ,Takeda S. ,Yamashita A. ,and Maéda Y. : "Structural
basis of actin filament capping at the barbed-end:acryo-electron microscopy study", EMBO J. 25, 5626--5633(2006). ＊（総説）山下 敦子 : "トランスポーターの立体構造と機能", 22, 実
験医学 24, No. 17, pp.2576--2582 (2006).
山下 敦子 ,岩田 想 : "既存の説を「ひっくり返した」輸送播磨研究所

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体の構造", 実験医学 25, No. 4, pp.494--495 (2007).
口 頭 発 表 Oral Presentations(国際会議等)
Yamashita A . ,Singh S. K . ,Kawate T . ,Jin Y . ,and Gouaux
E . : "Crystal structure of a bacterial homolog of
Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters", 5th East
Asian Biophysics Symposium and 44th Annual Meeting of
the Biophysical Society of Japan (EABS and BSJ 2006),
Naha , Nov. (2006).
(国内会議)
山下 敦子: "細菌由来ホモログの結晶構造から探るNa+/Cl-依存性神経伝達物質トランスポーターの構造と機能", 第16回細胞電気薬理研究会 , 横浜 , 3月 (2006).
山下 敦子: "X線結晶構造解析で知るタンパク質のはたらくしくみ", 第15回理化学研究所里庄セミナー , 岡山県里庄町 , 8月 (2006).
山下 敦子: "Na+/Cl-依存性神経伝達物質トランスポーター細菌由来ホモログの構造・機能解析", 第44回慶応義塾大学総合医科学研究センターセミナー , 東京 , 8月
(2006).
山 下 敦 子 : "Crystallographic and functional studies of abacterial homolog of Na+/Cl- dependent neurotransmittertransporters", 自然科学研究機構分子科学研究所ナノフ
ォーラム「New Cutting Edge and Perspective of StructuralBiology」 , 岡崎 , 10月 (2006).
山下 敦子: "Na+/Cl-依存性神経伝達物質トランスポーター細菌由来ホモログの構造と機能", 平成18年度生理学研究
所シナプス研究会「シナプス形成と可塑性機考得の統合的理解へ向けた学際的アプローチ」 , 岡崎 , 11月(2006).
成田 哲博,武田 修一,山下 敦子,前田 雄一郎:
"Determination of actin filament end structure by cryo
electron microscopy", 日本分子生物学会2006フォーラム「分子生物学の未来」 , 名古屋 , 12月 (2006).

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