研究技術開発室
Division of Bio-Crystallography Technology
室 長

神

谷

信

夫

KAMIYA, Nobuo
当室は SPring-8 に設置された理研ビームラインの運営にあたるとともに，ビームラインを利用した個別研究についてユーザーへの技術支援を行っている。また独自の利用研究をすすめる過程で技術的ノウハウを蓄積し，利用研究を飛躍的に発展させる研究技術の開発を行う。
よって活性化される。本研究では NHase の酵素反応の全行
1. 理研ビームラインを利用した生体巨大分子結晶構造解析研究のための技術支援（河野，内藤，中島，松，神程を時間分割（動的）構造解析によって追跡することを目谷（信）；足立，城（生体物理化学研究室）；藤澤，飯塚，前的としている。本年度は，顕微分光装置を用いてタンパク田（構造生物化学研究室）；山本，石川（X 線干渉光学研究
質結晶中での一酸化窒素の光脱離過程の追跡を行った。
室）；北村（X 線超放射物理学研究室））（2）イソニトリルヒドラターゼ（IsoNHase）は基質であタンパク質や核酸など生体巨大分子の立体構造を解明す
るイソニトリル（R-NC）に水を付加して N-ホルムアミド
ることは構造生物学の基礎である。当室では，構造生物学研 （R-NHC(O)H）を生成する酵素である。その立体構造を解
究用理研ビームラインを用いて実施される生体巨大分子の明し，IsoNHase の水和反応機構を明らかにすることを目
構造解析研究についてユーザーへの技術支援を行っている。 的として研究を行っている。本年度は IsoNHase の分解能
（1）構造生物学研究用ビームライン；BL45XU-PX
1.7 Å における結晶構造解析に成功した。
（3）DNA 相同組換えを行う RecA タンパク質は協同的に生体巨大分子の結晶構造解析の内，多波長異常分散法に
らせん状に単鎖 DNA に結合し，単鎖 DNA と二重鎖 DNA
よる自動解析に特化したビームラインである。本年度は本の間の相同性を探索し，相同部位を対合させ，交換するとビームラインを利用した回折実験におけるユーザー対応をいう多彩な機能を有している。既知のものとは異なるらせ行った。また，タンパク質の紫外-可視吸収測定用の顕微分ん構造を持つ結晶を得ることに成功し構造精密化を進めた
光装置のビームラインへの設置のために，周辺装置の設計
結果，これまで明らかにされていなかった DNA 結合部位
および製作を行った。
の立体構造の決定に成功した。構造情報を基に DNA 結合（2）構造生物学研究用ビームライン；BL44B2様式を考察すると共に，変異体の調製を進め，機能の解明
BL44B2 は生体巨大分子の動的結晶構造解析と X 線吸収を進めている。
スペクトロスコピー（XAFS）との兼用ビームラインであ（4）ストラクチュローム連携研究に協力して，主にグリり，(i) 単色 X 線を利用した回折実験，(ii) マイクロ秒からシン開裂系，金属活性中心を持つエネルギー伝達系と解糖ミリ秒程度の時間分解能における白色ラウエ回折実験，(iii)
系のタンパク質群を中心にして網羅的構造解析を進めてい蛍光および吸収法による XAFS 実験に利用されている。本る。本年度は 2 種類のタンパク質の発現・精製と 10 種類の
年度は新型ゴニオメータの導入を行い，結晶のリモートセ
タンパク質の結晶化および構造解析を進め，2 種類のタン
ンタリングを可能にした。またデータ処理用コンピュータ
パク質の構造を決定した。
を増設してデータ処理能力の向上を計った。
（5）光化学系 II 粒子は葉緑体のチラコイド膜上にあって（3）構造生物学研究用ビームライン；BL45XU-SAXS
太陽光のエネルギーを吸収し，水を分解して酸素を発生さ溶液からの X 線の散乱情報に基づいて生体巨大分子のせる。本年度は好熱性らん藻から単離された光化学系 II 粒
ドメイン構造やドメイン間での構造変化を追跡するための子の結晶について，3.7 Å 分解能における構造解析を進めた
ビームラインである。本年度のユーザーへの技術支援は構結果，光化学系 II 粒子を構成する 4 種類の主要な膜貫通サ
造生物化学研究室に依頼した。
ブユニットについて，その可溶性ループ部分の構造を決定することに成功した。また 3 種類の可溶性サブユニットの2. 生体巨大分子結晶構造解析（河野，引間，内藤，中内，12 kDa タンパク質の立体構造を世界で初めて同定する
井 ＊1 ，野尻 ＊1 ，古瀬 ＊2 ，中島 ＊3 ，松，大須賀 ＊4 ，神谷ことに成功し，可溶性サブユニット間の相互作用の様式を（信）；尾高（バイオ工学研究室）；中山，瀧尾（生体分子解明らかにした。
析室）；井川，柴田（遺伝生化学研究室）；沈（構造生物物（6）イネ萎縮ウイルス（RDV）の RNA 結合タンパク質理研究室）；野嶽，石嶋，中川，倉光（ストラクチュローム
連携研究グループ）；牧野，小林（スフィンゴ脂質機能研究 （P7）の構造解析
P7 は RDV が mRNA 合成を行う際の構造的および機能
チーム））
的な基盤となる分子である。本研究は P7 の構造解析を行（1）ニトリルヒドラターゼ（NHase）はニトリル化合物
うことにより RDV の mRNA 合成機構の仕組みを明らかにに水を付加して対応するアミド化合物を生成する酵素であしようとするものである。本年度は P7 の大量発現系の構る。活性中心に 3 価の非ヘム鉄または非コリノイド・コバ
築を行って今後の精製・結晶化への道筋をつけた。
ルトを含み，鉄型 NHase は一酸化窒素（NO）の光脱離に

862

平成 14 年度

（7）ライセニンはミミズの粘液に大量に含まれ，生体膜の主要な構成要素の 1 つであるスフィンゴミエリンを特異的に認識することで生体膜の多様な機能を制御していると考えられている。その構造生物学を目指して，本年度は大腸菌による大量発現系の構築を試みた。
3. 構造生物学に関わる諸技術の開発（引間，河野，内藤，神谷（四），中島，松，大須賀 ＊4 ，三城 ＊5 ，神谷（信））（1）タンパク質の結晶化に関する技術
新規の生体巨大分子を結晶化するには，多数の結晶化条件を試行し結晶化の可否を観察する必要がある。この一連の作業を完全自動化するために試作したタンパク質結晶化
および自動観察装置を基に，共同研究相手のメーカーにて市販化用の新型装置が開発された。
（2）結晶化チップ利用技術
近年のタンパク質 X 線回折実験は液体窒素温度での低温条件下で行うことが主流となっている。結晶化用のタンパ
ク質と沈澱剤の混合溶液のドロップをそのまま低温回折実験に用いることを可能とする X 線マウント兼用結晶化チップの開発を行い市販化した。このチップの利用により X 線
回折装置への結晶のマウントの簡易化，迅速化が可能となりタンパク質構造解析のハイスループット化に有効である。
（3）タンパク質結晶試料のハンドリング技術
低温条件下での X 線回折実験用に凍結された結晶試料は凍結保存することにより再測定も可能であり長距離の運搬も容易である。凍結保存された結晶の回折装置へのマウン
トと回収の自動化といったハイスループット化への要求も大きい。既設の X 線回折装置に設置可能な結晶マウントロ
ボットを開発し，ビームラインと，実験室用の X 線回折装
置の両方に対して，その設置と動作試験を行った。
（4）タンパク質分子の誘電特性を利用した結晶化制御
タンパク質は分子表面に様々な極性を持つアミノ酸残基を有しており，溶媒中では永久双極子を持つ誘電体として振舞っている。外部電場を印加することで溶媒中でのタン
パク質分子の会合状態に揺動を与え，結晶化を促進する試みを開始した。加えて結晶化溶液の誘電特性を測定し，タンパク質結晶化過程の動的変化の解明を進めている。
（5）結晶解析用回折計の高度化
大きな角度の回転結晶（LOT）法は，回折像の記録に要する時間を分オーダーまで短縮することにより，単色 X線を用いた時間分割結晶構造解析を可能にする。本年度はBL45XU-PX の回折計制御ソフトウエアを改作して LOT 法によるデータ収集を可能とし，エラスターゼを標準試料として良好な結果が得られることを示した。また LOT 法で必要となる結晶の軸立てを行うために新規のミニカッパーゴニ
オメーターを開発して BL45XU-PX の回折計に設置した。
（6）動的結晶構造解析に必要な周辺技術
動的結晶構造解析では，タンパク質結晶中で変化する状態をモニターするために顕微分光装置が必要となる。本年
度は昨年度に引き続き装置の改良と周辺整備を進めた。特に本装置のビームラインへの設置のため，周辺装置の設計および製作を行った。
（7）非結晶学的対称を利用した位相決定法の開発
タンパク質複合体の構造解析を通じて新たな解析方法の開発を目指している。解析に適したタンパク質複合体（非理研研究年報

結晶学的対称を持つ）に位相フィルターを適用して，類縁構造からの位相や実験的な位相測定を必要としない方法の検証を行った。
＊1

基礎科学特別研究員，＊2 協力研究員，＊3 研修生（姫工大大学院），＊4 研修生，＊5 共同研究員

Our division has recently launched several new initiatives in user support and development of new technologies
at the RIKEN Structural Biology beamlines at SPring8. Several research and development programs are alreadyunder way, and these will contribute to the expanding program in structural biology research at the RIKEN Harima
Institute.
1. Technical support for users of the RIKEN
beamlines dedicated to structural biology
BL45XU is an undulator beamline designed for protein crystallography using the multi-wavelength anomalous
dispersion technique (experimental hutch; BL45XU-PX)
and for small-angle X-ray scattering of biological macromolecules (BL45XU-SAXS). We support user experiments
at BL45XU-PX with improved beamline devices. Of special note, a microspectrophotometer was designed and installed at BL45XU-PX this year. The maintenance anduser support services for BL45XU-SAXS have been entrusted to the Structural Biochemistry Laboratory.
BL44B2 is a bending-magnet beamline designed forthree applications: time-resolved protein crystallography with white X-rays, conventional structure analysis
of protein crystals with monochromatic X-rays, and Xray absorption ﬁne structure analysis of biological macromolecules. We have supported users of BL44B2 by designing and installing a remote centering system for sample
crystals in the experimental hutch.
2. X-Ray crystal structure analyses of biologicalmacromolecules
Photosystem II (PSII) is a multi-subunit membraneprotein complex that carries out light-induced electrontransfer and water-splitting reactions, leading ultimately
to the formation of molecular oxygen. We obtained the
crystal structure of PSII from Thermosynechococcus vulcanus at 3.7 Å resolution. The structure revealed four major transmembrane (TM) subunits: D1, D2, CP47, andCP43, as well as several low molecular mass TM subunits
and three hydrophilic extrinsic proteins: 33- and 12-kDa
proteins and cytochrome c550. This structural analysis
yielded much information concerning the molecular interactions within this large protein complex.
The RecA protein in Escherichia coli plays an important role in homologous genetic recombination. We determined a new crystal structure for this molecule, and wereable to visualize its DNA binding loops. The structure ofthese loops had not been reported in the literature previously because they were disordered in the other crystal
forms. Several mutations in the DNA binding loops havebeen associated with deﬁciencies in homologous genetic recombination.
Nitrile Hydratase from Rhodococcus is an enzyme capable of catalyzing hydration of nitriles, and it contains
a mononuclear non-heme iron as its reaction center. The
iron center is activated by photo-driven NO release. To
gain a deeper understanding of structures, intermediates,863

and dynamics along the reaction pathway, we are developing techniques of time-resolved crystallography. This year
we also observed a photo-activated process in a crystal using a newly developed microspectrophotometer.
In cooperation with the Structurome Research Group,
we determined crystal structures of proteins in the glycinecleavage system, the energy transfer system, and theglycolysis system of Thermus thermophilus. Isonitrile
Hydratase is a novel enzyme in Pseudomonas putida thatcatalyzes the conversion of isonitriles to the corresponding N- substituted formamides. We determined its crystal
structure at 1.7 Å resolution and elucidated the structural
basis of its biochemical function. In order to reveal themolecular mechanism of mRNA synthesis in a Rice Dwarf
Virus (RDV), we constructed a large-scale expression system for the mRNA binding protein P7 of RDV, using E.
coli as host cells.
3. Development of new techniques for structural
biology research
We developed a protein crystallization support system utilizing the vapor diﬀusion technique, termed “Crystal Finder”, which consisted of two parts: (1) automatic
preparation of screening solutions and (2) observation ofprotein crystallization drops. A polymer-based micro arraydevice (PBMD) was developed for high-throughput protein crystallization and simple mounting of the resulting
crystals on a goniometer head for X-ray diﬀraction experiments. The PBMD can immobilize protein crystallization
drops in a vapor- diﬀusion well, and we can directly mountthe crystal in one chip of PBMD under cryogenic condition
at 100 K. Furthermore, an automated cryo-crystal mounting system was developed at our institute using a six-axis
robot arm.
A microspectrophotometer is a powerful tool for timeresolved protein crystallography. It can be used to monitor reactions in crystals when the proteins or reactants
undergo spectral changes along the reaction pathways. A
notable advance this year was the improvement of our microspectrophotometer, which was installed in the experimental hutch of BL45XU-PX. The large-angle oscillation
technique (LOT) is another data collection method usedin for time- resolved crystallography. The LOT requiresalignment of one axis of the sample crystal with the rotation axis of the goniometer prior to X-ray diﬀraction datacollection. For this purpose, a mini-kappa goniometer was
designed and installed in BL45XU-PX, and the goniometer
itself was improved to make it capable of supporting LOT
data collection.
We have investigated the protein nucleation process inan electric ﬁeld of alternating current, in an eﬀort to develop new methods of enhancing protein crystallization.
We are also developing a new technique to determine
phases of diﬀraction data from protein crystals using noncrystallographic symmetries. A phase ﬁltering technique
was tested as a method to verify this approach.

Research and Development Subjects and Members of Division of Bio-Crystallography Technology
1. Technical support for users of RIKEN beamlines dedicated to structural biology
2. X-ray crystal structure analyses of biological macro-

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molecules
3. Development of new techniques for structural biology
research

Head
Dr. Nobuo KAMIYA

Members
Dr. Yoshiaki KAWANO
Dr. Takaaki HIKIMA
Dr. Hisashi NAITOW
Dr. Tadashi NAKAI＊1
Dr. Masaki NOJIRI＊1
Dr. Munenori FURUSE＊2
Mr. Shiro KAMIYA
Mr. Taiji MATSU
Mr. Hiroki NAKAJIMA＊1＊2

Special Postdoctoral Researcher
Contract Researcher

in collaboration with
Dr. Shin-ichi ADACHI (Biophysical Chemistry Lab.)
Dr. Tetsuro FUJISAWA (Structural Biochemistry Lab.)
Mr. Takashi IIZUKA (Structural Biochemistry Lab.)
Dr. Shukuko IKAWA (Cellular & Molecular Biology
Lab.)
Dr. Tetsuya ISHIKAWA (Coherent X-Ray Optics Lab.)
Dr. Jun ISHIJIMA (Structurome Research Group)
Dr. Hideo KITAMURA (Coherent Synchrotron Light
Source Physics Lab.)
Dr. Toshihide KOBAYASHI (Sphingolipid Functions
Lab., FRS)
Dr. Seiki KURAMITU (Structurome Research Group)
Dr. Yuichiro MAÉDA (Structural Biochemistry Lab.)
Dr. Asami MAKINO (Sphingolipid Functions Lab.,FRS)
Dr. Noriko NAKAGAWA (Structurome ResearchGroup)
Dr. Hiroshi NAKAYAMA (Biomolecular Characterization Div.)
Dr. Yuuichi NODAKE (Structurome Research Group)
Dr. Masafumi ODAKA (Bioengineering Lab.)
Dr. Jian-Ren SHEN (Structural Biophysics Lab.)
Dr. Yoshitsugu SHIRO (Biophysical Chemistry Lab.)
Dr. Takehiko SHIBATA (Cellular & Molecular Biology
Lab.)
Dr. Koji TAKIO (Biomolecular Characterization Div.)
Dr. Masaki YAMAMOTO (Structural Biophysics Lab.)

Visiting Members
Dr. Osamu MATSUMOTO (Grad. Sch. Med., Kyoto
Univ.)
Dr. Yao MIN (Grad. Sch. Sci., Hokkaido Univ.)
Dr. Atsushi NAKAGAWA (Inst. Protein. Res., Osaka

平成 14 年度

Univ.)
Dr. Masayosi NAKASAKO (Inst. Mol. Cel. Biosci.,
Univ. Tokyo)
Dr. Kazuhiro OGATA (Sch. Med., Yokohama City
Univ.)
Dr. Akira SANJO (Protein Wave Co.)
Dr. Isao TANAKA (Grad. Sch. Sci., Hokkaido Univ.)
Dr. Nobuhisa WATANABE (Grad. Sch. Sci., Hokkaido
Univ.)

Trainees
Mr. Koji KUMAGAI (Grad. Sch. Med., Kyoto Univ.)
Mr. Hiroki NAKAJIMA (Fac. Sci., Himeji Inst. Technol.)Mr. Hisao OSUKA (Fac. Sci., Himeji Inst. Technol.)

誌 上 発 表 Publications［雑誌］（原著論文） ＊印は査読制度がある論文
Fujihashi M., Peapus D. H., Nakajima E., Yamada T.,
Saito J., Kita A., Higuchi Y., Sugawara Y., Ando A.,
Kamiya N., Nagata Y., and Miki K.: “X-ray crystallographic characterization and phasing of a fucose-speciﬁc
lectin from Aleuria aurantia”, Acta Cryst. D 59, 378–
380 (2003). ＊Nakai T., Nakagawa N., Maoka N., Masui R., Kuramitsu
S., and Kamiya N.: “Coexpression, puriﬁcation, crystallization and preliminary X-ray characterization ofglycine decarboxylase (P-protein) of the glycine-cleavage
system from Thermus thermophilus HB8”, Acta Cryst.
D 59, 554–557 (2003). ＊Kamiya N. and Shen J.: “Crystal structure of oxygenevolving photosystem II from Thermosynechococcus valcanus at 3.7-Å resolution”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
100, 98–103 (2003). ＊（その他）
河野能顕: “第 7 回 Biology and Synchrotron Radiation(BSR2001) 報告”, 放射光 14, 395–396 (2001).
口 頭 発 表 Oral Presentations（国際会議等）
Kawano Y., Nojiri M., Odaka M., Endo I., and Kamiya
N.: “Role of post-translational modiﬁcations around thereaction center of photoreactive nitrile hydratase”, 7thInt. Conf. on Biology and Synchrotron Radiation (BSR
2001), Sao Pedro, Brazil, July–Aug. (2001).
Nojiri M., Kawano Y., Odaka M., Endo I., and Kamiya
N.: “Crystal structure of the complex of photoreactive
nitrile hydratase with substrate analogue, cyclohexyl isocyanide”, 10th Int. Conf. on Bioinorganic Chemistry(ICBIC 10), (Magnetic Resonance Center (CERM), University of Florence), Florence, Italy, Aug. (2001).
Nakai T., Ishijima J., Nakagawa N., Masui R., Kuramitsu
S., and Kamiya N.: “Comparison of strategies for coex-

理研研究年報pressing two subunits of recombinant protein to fold into
its native structure”, Canada-UK-Japan Joint Symp.
on Toward Post DNA-Sequencing Era, Yokohama, Feb.
(2002).
Kamiya N. and Shen J.: “Crystal structure analysis of photosystem II from Synechococcus bulcanus at BL41XU ofSPring-8”, 19th Congr. and General Assembly of the Int.
Union of Crystallography (IUCr XIX), Geneva, Switzerland, Aug. (2002).
Nakai T., Ishijima J., Nakagawa N., Masui R., Kuramitsu
S., and Kamiya N.: “X-ray structure studies of H-and Lproteins of glycine cleavage system from Thermus thermophilus”, 19th Congr. and General Assembly of the Int.
Union of Crystallography (IUCr XIX), Geneva, Switzerland, Aug. (2002).
Sanjoh A., Cachau R. E., Hikima T., and Kamiya N.:“Automated crystallization screening and diﬀraction
data collection of protein crystals using heterogeneous
nucleation-induced solid material devices”, Int. Conf.
on Structural Genomics (ICSG 2002), Berlin, Germany,
Oct. (2002).
（国内会議）
河本正秀, 三浦圭子, 引間孝明, 沈建仁, 神谷信夫: “SPring8 におけるビームライン操作環境の整備，He クライオ装置，結晶化ロボット，光化学系 II 研究”, 文科省科研費補助金特定領域研究「生物マシーナリー」第 5 回ワーク
ショップ, 熱海, 7 月 (2002).
神谷信夫: “蒸気拡散法による蛋白質結晶化支援システムの開発”, 文科省科研費補助金特定領域研究「生物マシーナリー」第 5 回ワークショップ, 熱海, 7 月 (2002).
中井忠志, 中川紀子, 増井良治, 倉光成紀, 神谷信夫: “高度好熱菌グリシン開裂系 P タンパク (グリシンデカルボキシラーゼ) の結晶化および予備的回折実験”, 第 75 回日本
生化学会大会, 京都, 10 月 (2002).
河野能顕, 野尻正樹, 尾高雅文, 中島寛樹, 大須賀久織, 遠藤
勲, 神谷信夫: “クライオ凍結法と LOT 法を用いた FeNHase の反応機構の解明”, 第 40 回日本生物物理学会年会, 名古屋, 11 月 (2002).
引間孝明, 開俊樹, 井川しゅく子, 古瀬宗則, 柴田武彦, 神谷
信夫: “大腸菌 RecA 蛋白質の低温結晶構造解析”, 日本結晶学会平成 14 年度年会, 東京, 12 月 (2002).
神谷信夫, 沈建仁: “SPring-8 の BL41XU を利用した Synechococcus Vulcanus 由来光化学系 II 膜蛋白質複合体の結晶構造解析”, 日本結晶学会平成 14 年度年会, 東京, 12 月
(2002).
神谷信夫, 引間孝明, 開俊樹, 井川しゅく子, 古瀬宗則, 美川
務, 堂前直, 柴田武彦: “遺伝的相同組換えの構造生物学：
RecA タンパク質に見られる弱い相互作用”, 理研シンポ
ジウム「モレキュラー・アンサンブル 2002」, 和光, 12 月
(2002).
竹田一旗, 宮武秀行, 朴三用, 河本正秀, 神谷信夫, 三木邦夫:“I，Xe，Cs を用いた MAD 法による蛋白質 X 線結晶構
造解析”, 第 16 回日本放射光学会年会・放射光科学合同
シンポジウム, 姫路, 1 月 (2003).
神谷信夫, 沈建仁: “SPring-8 の BL41XU を利用した Syne-865

chococcus vulcanus 由来光化学系 II 膜蛋白質複合体の結晶構造解析”, 第 16 回日本放射光学会年会・放射光科学
合同シンポジウム, 姫路, 1 月 (2003).
神谷信夫: “好熱性らん藻の酸素発生光化学系 II 膜蛋白質複合体の 3.7Å 分解能における結晶構造”, 生物マシナリー・

866

蛋白研セミナー合同シンポジウム「膜蛋白質・生体超分子構造研究最前線」, 大阪, 1 月 (2003).
沈建仁, 神谷信夫: “結晶構造に基づく光化学系 II 複合体の分子機構”, 日本植物生理学会 2003 年度年会および第 43
回シンポジウム, 東大阪, 3 月 (2003).

平成 14 年度