地球環境研究,Vol.6(2004)

沈水植物コカナダモ Elodea nuttallii 培養水中に放出されるアオコ形成シアノバクテリア Microcystis aeruginosa の増殖抑制活性
＃

渡

辺真利代＊

仁木拓志＊

上野祐子＊＊

浪越通夫＊＊＊

キーワード：アオコ形成シアノバクテリア､ 沈水植物､ シアノバクテリア増殖抑制活性１

近年では､ アオコ防除策として､ 大型の水生植物とのはじめに相互関係を利用する方法が大きな注目を集めている｡ シ

第二次世界大戦後の急速な経済発展に伴い､ 水域にはアノバクテリアと水生植物との相互作用として､ 光や栄様々な生活・産業・農業排水等が流入するようになった｡

養塩をめぐる競争 (特にウキクサ等の浮葉性植物)､ 水

これらの人為起源排水は水域の富栄養化を引き起こし､生植物から放出される化学物質を介したアレロパシー効

各地の湖沼で､ しばしば藻類の大増殖による水の変色

果 (沈水性､ 浮葉性を含む幅広い水生植物)(いわゆる ｢水の華 (water bloom)｣)が観察されるよられる｡ 水生植物の保護・増殖､ 移植等によってアオコうになっている｡ このようなブルームを起こす生物の中発生が防除できるならば､ そのコストやエネルギーは比でも､ シアノバクテリア (cyanobacteria；ラン藻類と較的小さく､ なおかつ景観上､ 環境教育上も大きな効果も呼ばれる)が期待できる｡には､ 細胞内にガス胞を有し高い浮上性等が考えを持った Microcystis 属等が含まれる｡ これらが大増殖

このような背景に基づき､ 水生植物からシアノバクテし､ 水面に集積すると､ 緑色の粉を撒いたような様相をリアの増殖阻害活性を持つ物質を分離・同定した報告は呈する｡ このような状態は ｢アオコ｣ と呼ばれ､ 景観の比較的多い (Anthoni et al. 1980; Aliotta et al. 1991)｡

著しい悪化､ その分解に伴う悪臭の発生や貧酸素水の形

しかし､ 実際に起こるアレロパシー現象を考えた場合､成等､ 多くの問題を引き起こす (渡辺ら1994)｡ また､その活性物質は植物体から水中に放出されなければならアオコを形成するシアノバクテリアの中には毒素を産生ないのだが､ この点を考慮した報告は極めて少ない｡ 本する種も多く､ 中毒や死亡といった家畜・人間被害も数

研究は､ アオコ防除へ応用できる可能性を持った水生植多く報告されている (Francis 1878; Galey et al. 1987;

物を探索するとともに､ 大型水生植物とアオコ形成シア

Kimura 1999)｡ また､ 致死量以下でも発ガン促進作用ノバクテリアの間のアレロパシー現象を､ 化学生態学的を持つという指摘もある (Fujiki and Suganuma 1993)｡

視点から明らかにすることを目的としている｡ 本稿では､アオコの問題は現代社会の水環境問題における重大な関草体抽出物を用いたプレスクリーニングの結果､ シアノ心事の一つである｡

バクテリア増殖抑制活性の認められた沈水植物コカナダ

水域におけるアオコ防除策としては､ 凝集剤や殺藻剤

モ Elodea nuttallii を用い､ その培養水から抽出されたの散布があるが､ それら自身の毒性や残留性が常に問題成分について､ アオコ形成シアノバクテリアの増殖抑制となる｡ また､ シアノバクテリアの毒素は細胞内に保持活性を検討した｡

されるものが多く､ 細胞が死んで破壊されると毒素が水域に流出してしまうため､ 効果的な方法とは言えない｡
富栄養化した水域から栄養塩を除去するのが最も本質的な解決策であるが､ 流入負荷量を効率的に減少させ､ さ２

材料と方法

２. １

水生植物

らに､ 既に系内に負荷されてしまった栄養塩を効率的にコカナダモは､ 群馬県前橋市内の農業用水路から採集除去するのは､ 技術的にも経済的にも大きな困難を伴う｡

した｡ これを､ MA 培地 (市村1979) でエンリッチし＊立正大学地球環境科学部
東京水産大学大学院水産学研究科海洋環境学専攻＊＊＊
東京水産大学水産学部 (現：東京海洋大学海洋科学部)＃
立正大学大学院地球環境科学研究科オープン・リサーチ・センター＊＊

平成14年度業績

19沈水植物コカナダモ Elodea nuttallii 培養水中に放出されるアオコ形成シアノバクテリア Microcystis aeruginosa の増殖抑制活性 (渡辺・仁木・上野・浪越)

た約300L の水槽に入れ､ 雨水等が入らない場所で屋外

aeruginosa は主要なアオコ形成シアノバクテリアであ培養した｡ 培養期間は最低でも１ヶ月以上とし､ 混入・り､ microcystin と呼ばれる強い毒素を生産することで増殖したアオミドロはこまめに除去した｡

も知られている｡ 検定対象となる抽出物は､ エタノールを溶媒として定量的に溶解し､ マイクロプレートに分注

２. ２

培養液中の化学物質の抽出

２. ２. １

粗抽出した｡ 溶解しなかった成分については､ 超音波､ ボルテッ
クスで均一に分散させた後､ 分注した｡ 分注後､ クリー

コカナダモ培養水槽水240L を､ Whatman GF/C フィンベンチ内で静置してエタノールを完全に蒸発除去した

ルターで吸引ろ過し､ ろ液を試水とした｡ 試水中の化合後､ アッセイ時の初期細胞濃度が１×105cells ml−1にな

物は､ 固相抽出担体 SP-207 (三菱化成) 500ml (膨潤るように MA 培地で調製した検定藻を１ml ずつ分注し時 ) を 充 填 し た オ ー プ ン カ ラ ム ( ５ cm i.d. × 50cmた｡ なお､ アッセイにはマイクロプレートの中央24穴のlength) に通すことによって固相抽出した｡ 蒸留水

みを用いた｡ マイクロプレートはプレートシールで密封(1.5L) で非吸着成分を除去した後､ 1.5L のメタノールし､ 25℃､ 連続光下で､ マイルドシェーカーを用いて緩により吸着した成分を溶出させた｡ 溶出液はロータリーやかに攪拌しながら１週間培養した｡ 培養後､ 各ウェルエバポレータを用いてメタノールを除去した後､ 凍結乾の TAC20 細 胞 数 を ､ Fucks-Rosenthal 型 も し く は燥した｡ この SP-207メタノール溶出物について2.3節にThoma 型の血球計算盤により､ 計数した｡ コントロー

述べるシアノバクテリア増殖抑制試験を行った｡

ル (エタノールのみ) の細胞数と各対象抽出物を加えた系の細胞数との差分を､ コントロールの細胞数で除した

２. ２. ２

活性成分の分離SP-207メタノール溶出物は様々な化合物の混合物であると考えられるので､ より詳細な分離を行った｡

値 (％) をもって､ 増殖抑制活性とした｡ すなわち､TAC20がまったく増殖しなければ100％､ コントロールと差がない程度に増殖すれば０％の値となる｡

SP-207メタノール溶出物を少量の蒸留水で溶解し､固相抽出担体 ODS-SS-1020T (センシュウ科学) 20g を充填したオープンカラム (２cm i.d.×50cm length) に３結果吸着させた後､ 蒸留水 (100ml) で洗浄した｡ さらに､分離のフローチャートを Fig.１に､ 各過程で得られ25％､ 50％､ 75％､ 100％メタノール各100ml で順次溶た活性フラクションの重量及びシアノバクテリア増殖抑出させた｡ 洗浄水､ 溶出液は､ それぞれロータリーエバ制活性試験の結果を Table.１〜３に示した｡ SP-207メポレータで濃縮乾固した｡ 洗浄水フラクションを En1､タノール溶出物は､ 240L の試水から1.08g を得た｡ こ

各濃度のメタノール溶出フラクションを25％メタノールの粗抽出物の TAC20増殖抑制活性は200ppm で45％で溶出フラクションから順に En2､ En3､ En4､ En5 とし､あった｡ また､ この粗抽出物を ODS カラムで分離してそれぞれシアノバクテリア増殖抑制試験に供した｡

得た En1 から En5 の各フラクションの重量及び抽出物

さらに､ En1 と En2 については､ TSK-gel TOYO-

濃度100ppm におけるシアノバクテリア増殖抑制活性をPEARL HW-40S (東ソー) 充填カラム (１cm i.d.×30

Table.１に示した｡ 活性が認められたのは､ ODS 非吸cm length) による MPLC を行った｡ 移動相には水着フラクションである En1 (100ppm で13％) と25％メ−1(0.5ml min ) を用い､ 溶出物はフラクションコレクター

タノール溶出フラクションである En2 (100ppm で17を用いて分取した｡ MPLC に接続した UV 検出器 (検％) であった｡ En3 〜En5 には抽出物濃度100ppm にお出波長210nm) によって得られたクロマトグラムを元に､いて増殖抑制活性は認められなかった｡

En1 は En11〜En14､ En2 は En21〜En28のフラクショ

この結果を受け､ 活性の認められた En1 及び En2 にンに分けてそれぞれ凍結乾燥し､ シアノバクテリア増殖

ついては､ さらに HW-40充填カラムを用いた MPLC に抑制試験を行った｡

より､ 活性成分の分離を行った｡ MPLC クロマトグラ
ムと各フラクションの分取位置を Fig.２に示す｡ 各フ２. ３シアノバクテリア増殖抑制試験

ラクションについてシアノバクテリア増殖抑制試験を行っ抽出物のシアノバクテリア増殖抑制活性は, 48穴マイた結果､ En1 からは En11 (35mg) に活性が認められクロプレートを用いてアッセイした｡ 検定藻にはた｡ このフラクションの増殖抑制活性は100ppm で16％

Microcystis aeruginosa strain TAC20を用いた｡ M.

であった｡ また､ 同条件の MPLC で En2 を分離したク

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Fig. 1：コカナダモ培養水からのシアノバクテリア増殖抑制活性物質の分離フローチャート(太字は活性の検出されたフラクションを示す)
Table. 1：SP-207メタノール溶出物の ODS オープンカラムによる分離で得た各フラクションの重量とシアノバクテリア増殖抑制活性フラクション

En1En2En3En4En5

溶出溶媒

蒸留水

25％ MeOH

50％ MeOH

75％ MeOH

100％ MeOH

重量(mg)

644984430173増殖抑制活性(％)

1317−−−

増殖抑制試験の際の濃度：100ppm, −：活性なし
Table. 2：En1 の MPLC による分離で得た各フラクションの重量とシアノバクテリア増殖抑制活性
En11En12En13En14重量(mg)

フラクション

35432増殖抑制活性(％)

16−

−−

増殖抑制試験の際の濃度：100ppm, −：活性なし

Table. 3：En2 の MPLC による分離で得た各フラクションの重量とシアノバクテリア増殖抑制活性
En21En22En23En24En25En26En27En28重量(mg)

フラクション

330

12710222増殖抑制活性(％)−−−

4364604239

増殖抑制試験の際の濃度：100ppm, −：活性なし

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沈水植物コカナダモ Elodea nuttallii 培養水中に放出されるアオコ形成シアノバクテリア Microcystis aeruginosa の増殖抑制活性 (渡辺・仁木・上野・浪越)Fig. 2：En1 の HW-40カラムを用いた MPLC クロマトグラムと各フラクションの分取位置

Fig. 3：En2 の HW-40カラムを用いた MPLC クロマトグラムと各フラクションの分取位置

ロマトグラムとフラクションの分取位置を Fig.３に示

本研究では､ コカナダモ培養水槽水から､ シアノバクす｡ ここで回収された各フラクションについてシアノバテリア増殖抑制活性を示す成分を､ SP-207を用いた固クテリア増殖抑制試験を行った結果､ 活性フラクション相抽出により抽出することができた｡ これがコカナダモは En24､ En25､ En26､ En27､ En28まで分散していた｡

によって放出されたアレロパシー物質であるかどうかを各フラクションの回収量と増殖抑制活性を Table.３に確認するためには､ 草体から抽出された物質との比較が示す｡

必要になる｡ ODS による分離では､ 非吸着画分と20％MPLC クロマトグラムを見てわかる通り､ この段階メタノール溶出画分にのみ活性が溶出したことから､ コ

では活性物質の分離は不完全であり､ En11､ En24〜En

カナダモ培養水から得られた活性物質は高極性の物質で28の各フラクションとも､ 複数の物質の混合物であるこあることが推測される｡ 高極性の成分は水中での拡散もとが明らかとなった｡

比較的早いと考えられるため､ 沈水性植物がシアノバクテリアに対抗するためのアレロパシー物質としては有利

４考察な反面､ 濃度当たりの増殖抑制活性が高い､ 恒常的に放出されている､ 比較的分解されにくい (あるいは分解生大型水生植物−藻類間のアレロパシーに関する研究で成物も増殖抑制活性を持つ)､ といった条件が整わないは､ 水生植物草体から直接化合物を分離した例と､ アレロパシー物質としては機能しない可能性がある(Anthoni et al. 1980; Aliotta et al. 1991) がほとんどため､ 活性物質そのものの環境中における分布濃度やシで､ 草体から放出されるか否かについては検証されていアノバクテリア増殖阻害活性を明らかにする必要がある｡

ないものが多い｡ 水生植物草体からシアノバクテリア増

また､ Fig.２及び３からわかる通り､ 活性物質は一種類殖抑制物質が単離・同定できたとしても､ それがアレロではない｡ 複数の活性物質が関わることで､ それぞれ単パシー物質として機能するかどうかについては､ その植独の時よりも活性が増大する可能性もある｡

物の生育する水域からその物質 (あるいはその分解物とコカナダモと同じ沈水性の植物における高極性のシア思われる物質) を抽出して確認する必要がある｡ 水中でノバクテリア増殖抑制物質としては､ ホザキノフサモのアレロパシー現象に関しては､ 草体外に放出された物

Myriophyllum spicatum から数種のポリフェノール類質が乱流等で速やかに拡散してしまうため､ 低濃度でもが報告されている (Nakai et al. 1999､ 2001)｡ ただし､効果を示す必要がある｡ しかし､ 低濃度で存在すると思ポリフェノール類は多くの植物が生成する物質であり､われる活性物質を､ 多様な物質の混在した環境中から取様々な抗菌､ 生理活性が知られているので､ 本研究で認り出すことは容易ではない｡

められたコカナダモ由来の活性物質がポリフェノール類

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地球環境研究,Vol.6(2004)

であった場合､ それがコカナダモ特有の物質なのか､ 類

引用文献似の化合物のシアノバクテリア増殖抑制活性がどうか等

Aliotta, G., P. Monaco, G. Pinto, A. Pollio and L. Previteraの検討を行った上で､ コカナダモからシアノバクテリア(1991)Potential allelochemicals from Pistia stratiotes L. J.

に対するアレロパシー物質として放出されているものなのかどうかを解釈する必要があるだろう｡
これらの問題を解決するためには､ 本研究で分離された活性フラクションに含まれる活性物質の精製と構造決定を行う必要がある｡ しかし､ 本研究の結果から､ コカナダモ由来の活性物質が一種類である可能性は低い｡ こChem. Ecol. 17(11): 2223−2234.
Anthoni, U., C. Christophersen, J. Madsen, S. WiumAndersen and N. Jacobsen (1980) Biologically active
sulphur compounds from the green alga Chara guobularis.
Phytochem. 19: 1228−1229.
Francis, G. (1878) Poisonous Australian lake. Nature 8: 11−12.

れらの物質は極性が高く､ MPLC クロマトグラムから

Fujiki, H. and M. Suganuma (1993) Tumor promotion by in-

見ると比較的挙動の似た夾雑物質との混合物であること

hibitors of protein phosphatases 1 and 2A: The okadaicが推測されることから､ 単純な極性による分離は困難であると考えられる｡ したがって､ 今後､ 化合物の誘導体化などを検討しながら分離・精製を進め､ 構造決定を行acid class of compounds. Adv. In Cancer Res. 61: 143−194.
Galey, F. D., V. R. Beaseley and W. W. Carmichael (1987)
Blue-green algae (Microcystis aeruginosa) hepatotoxicosisin dairy cows. Am. J. Vet. Res. 48: 1415−1420.

う必要がある｡

市村輝宜 (1979) 藻類の分離と培養法：淡水藻類. 西澤一俊,

謝Kimura, Y. (1999) Possible cause of unnatural mass death of

千原光男 (編) 藻類研究法. 294−305. 共立出版.

辞コカナダモ水槽や検定藻株の維持､ 採水､ 生物検定などでごwild birds in a pond in Nishinomiya, Japan: Sudden ap-

助力いただいた代紀世美氏に深く感謝いたします｡ また､ 研究

pearance of toxic cyanobacteria. Natural Toxins 7: 81−84.の遂行にあたりご助力いただいた､ 立正大学地球環境科学部環Nakai, S., U. Inoue, M. Hosomi and A. Murakami (1999)

境システム学科水界生態系研究室､ 東京水産大学水産学部海洋Growth inhibition of blue-green algae by allelopathic ef-

環境学科水圏生態化学研究室の学生諸氏に深く感謝いたします｡
なお､ 本研究は､ 文部科学省オープン・リサーチ・センター整備事業により実施した｡

fects of macrophytes. Wat. Sci. Tech. 39(8): 47−53.
Nakai, S., U. Inoue and M. Hosomi (2001) Algal growth inhibition effects and inducement modes by plant-producing
phenols. Wat. Res. 35(7): 1855−1859.
渡辺真利代, 原田建一, 藤木博太 (1994) アオコ−その出現と毒素−. 東京大学出版会.

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沈水植物コカナダモ Elodea nuttallii 培養水中に放出されるアオコ形成シアノバクテリア Microcystis aeruginosa の増殖抑制活性 (渡辺・仁木・上野・浪越)Growth Inhibition of a Bloom-forming Cyanobacterium, Microcystis
aeruginosa by Exudates of a Submersed Plant, Elodea nuttallii
Mariyo F. WATANABE＊, Takushi NIKI＊, Yuko UENO＊＊ and Michio NAMIKOSHI＊＊＊＊

Faculty of Geo-environmental Science, Rissho University
Graduate Student of Marine Environmental Science, Tokyo University of Fisheries＊＊＊
Faculty of Tokyo Fisheries, Tokyo University of Fisheries＊＊

Exudates of a submersed plant, Elodea nuttallii was extracted from the water sampled from E.
nuttallii culture by solid-phase extraction. The extract showed growth inhibition of Microcystis
aeruginosa strain TAC 20, which suggested an allelopathic interaction between E. nuttallii and M.
aeruginosa. The extract was separated by ODS open column and then MPLC to purify the anticyanobacterial fractions. The results showed that some polar compounds would participate in theanti-cyanobacterial activity originated from E. nuttallii.

Keywords: cyanobacteria, submersed plants, anti-cyanobacterial activity

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