ポリアミン
ポリアミン Vol.3 No.2
Polyamine
PolyamineNov. 2016

巻頭言
柏木 敬子
シリーズ ポリアミン研究
坂本 明彦、富取 秀行
シリーズ 実験手技ノート
高尾 浩一
最新の研究紹介渡辺 健太
阪中 幹祥
最新の論文紹介
西村 和洋
松本 靖彦
学会報告
五十嵐 一衛日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Researchポリアミン Vol. 3 No. 2
PolyamineNov. 2016

巻頭言

ポリアミン研究の新展開・多彩化を目指して

柏木 敬子

37

シリーズ ポリアミン研究

ポリアミンの酸化分解により産生されるアクロレインの細胞毒性と疾患シリーズ 実験手技ノート

HPLCを用いたポリアミン分析
質問コーナー

その②

高尾 浩一

坂本 明彦、富取 秀行

38

47

54

最新の研究紹介

加齢に伴うアクロレイン産生の増加とグルタチオンの減少による脳梗塞の悪化

史、五十嵐 一衛渡辺 健太、植村 武

57

カルボキシルスペルミジン脱炭酸酵素は、腸内常在菌最優勢種の一種であるBacteroides
thetaiotaomicronのスペルミジン生合成に必須であり、その正常な生育に重要である
阪中 幹祥、栗原 新
最新の論文紹介57

リボソームに結合したハイプシン化された翻訳因子eIF5Aの構造

西村 和洋

ポリアミン代謝の亢進によるジカ熱の原因ウイルスの増殖（複製）抑制
学会報告

第4回ポリアミンの機能並びに臨床応用に関する国際会議に参加して

事務連絡

61

編集後記

63

58

松本 靖彦

58

五十嵐 一衛60

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research巻頭言

ポリアミン（2016）3:37

ポリアミン研究の新展開・多彩化を目指して柏木敬子

千葉科学大学薬学部

ポリアミン学会誌は、2014年から年2回発行され、今回で通算第６号となりました。広報委員会の多大な御尽力に感謝申し上げます。
学部4年生で千葉大学薬学部・五十嵐先生のもとでポリアミン研究の一端を始めさせて頂き、あいだに4年間の会社員経験を挟んで、35年間ポリアミン研究に携わって参りました。1年に1回のポリアミン研究会・ポリアミン学会年会では、長年ポリアミン研究に携わってこられた方々ばかりでなく、フレッ
シュな会員の方にもお会いでき、情報交換を行い、研究の大切な拠りどころになっています。また、一般の方々にも時折、「何を研究しているの？」と尋ねられ、「ポリアミン」と答えられる幸せを感じています。勿論、ポリアミンって何？と必ず聞かれますが。
さて、ポリアミン学会誌発行の目的は、学会員相互を繋ぎ、若手研究者の育成に役立てると共に、広く社会へ情報発信することだと思われますが、もう一つの目的として、ポリアミン学会が、「日本学術会議協力学術研究団体」としての認定を目指していることが挙げられると思います。「日本学術会議協力学術研究団体」になると“正式な学会”として認められたことになり、国際会議開催のための科学研究費などの申請も可能となります。また、年会開催の際、一部の企業では“正式な学会”以外への出張が認められておらず、ポリアミンに興味があっても参加できないという事例があり、正式な学会にならないとポリアミン研究人口の増加の妨げにもなると思われます。この「日本学術会議協力学術研究団体」としての認定には、定期的な学会誌の発行と、一定人数以上の学会員が必要です。現在、定期的な学会誌発行はなされていますが、会員数が、少し不足していると伺っております。
ポリアミン学会の会員を増やすにはどうしたら良いか？簡単に解決できる課題ではありませんが、ポリアミンに少しでも関連する学際領域との共同研究を進め、新展開・多彩化を目指すことも良い方策と考えられます。この点に関して、第6回トランスグルタミナーゼ研究会・日本ポリアミン学会合同学術集会が、第89回日本生化学会大会前日の9月24日に仙台で開催されました。トランスグルタミナーゼは様々な疾患との関連が報告されており、ポリアミンはトランスグルタミナーゼの基質になることは判っていますが、その他は不明であり、ポリアミン研究の新領域になると思われます。その他、国外のポリアミン研究者に会員になっていただくことや、少しでもポリアミンに興味を持っている研究者や企業の方に年会への参加を勧め、更には会員になっていただく等、評議員の一人として、少しでも会員増加を目指して協力できればと思っております。
ポリアミン研究の拠点となるポリアミン学会の更なる発展を、心より願っております。

37

日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research

シリーズ

ポリアミン研究

ポリアミン（2016）3:38-46

ポリアミンの酸化分解により産生されるアクロレインの細胞毒性と疾患
坂本明彦、富取秀行

千葉科学大学薬学部病態生化学研究室（〒288-0025

1.

千葉県銚子市潮見町15-8）
連絡先 坂本明彦、e-mail: asakamoto@cis.ac.jp

はじめに学物質である。生体外においてアクロレインは、石ポリアミンは細胞増殖因子として機能する一方

油、石炭、プラスチックや木材の燃焼により生成さで、ポリアミン酸化酵素により酸化分解を受けるとれ、揚げ物、アルコール飲料、焦げた肉などの食事

アクロレイン（CH2=CHCHO）という非常に毒性性のものやタバコの煙にも含まれているが、生体内の強い物質を産生する。本稿では、ポリアミンからでも産生される。生体内では、スレオニンの分解、産生されるアクロレインの毒性機序やアクロレイン

不飽和脂肪酸における脂質過酸化や抗悪性腫瘍薬でが関与する疾患について概説する。

あるシクロフォスファミドの代謝、そしてポリアミンの酸化分解によって産生されることが知られてい2.

生体内外におけるアクロレイン産生

る 1,2) 。ポリアミンから産生されるアクロレイン

アクロレインは、最も単純な不飽和アルデヒドでは、2つのポリアミン酸化分解経路により産生されあり、非常に反応性が高く、強い刺激臭を発する化る 。 ス ペ ル ミ ン が ス ペ ル ミ ン オ キ シ ダー ゼ

H
N

H2N

N
H

NH2

SSAT

NHCOCH3N
H

Spermine
SMO

H
N

H2N

N1-Acetylspermine
NHCOCH3

AcPAO
O

3-Acetamidopropanal
H2N

NH 2

H
N

Spermidine

3-Aminopropanal

SSAT

H
N
H2 N

AcPAO

H2N

O

O

NH2

NHCOCH3

N1-Acetylspermidine
NHCOCH3

NH2

Putrescine

AcroleinO

3-Acetamidopropanal
SMO, spermine oxidase
AcPAO, acetylpolyamine oxidase
SSAT, spermidine/spermine N1-acetyltransferase

図1

ポリアミン酸化分解によるアクロレインの産生

ポリアミンの酸化分解によるアクロレインの産生経路を示した。アクロレイン産生はスペルミンからスペルミンオキシダーゼ（SMO）により産生される経路と、スペルミン及びスペルミジンからスペルミジン/スペルミンN1-アセチルトランスフェラーゼ（SSAT）及びN1-アセチルポリアミンオキシダーゼ（AcPAO）によって産生される経路が存在する。

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ポリアミン研究

ポリアミン（2016）3:38-46

B Hydrogen peroxide(H2O2)

Cell concentration (cells/ml)

A Spermine

図2106  , none

C Acrolein(CH2=CH-CHO)
 , none£ , 7.5 µM Acrolein¢ , 15 µM Acroleinr , 15 µM Acrolein+ ALDH 30 u

 , none£ , 0.1 mM H2O2
¢ , 0.2 mM H2O2
r , 0.2 mM H2O2+Cat 8 u£ , 30 µM SPM¢ , 30 µM SPM+Cat 8 u
r , 30 µM SPM+ALDH 30 u

105

104

p , 30 µM SPM + ALDH 30 u
+ Cat 8 u

0

1

2

0

1
Time (day)

2

0

1

2

スペルミン、過酸化水素及びアクロレインの細胞毒性の比較

マウス乳がん細胞FM3Aを用いて、スペルミン（SPM）、過酸化水素（H2O2）及びアクロレインの細胞毒性を比較した。培地中に30 µMのSPMを添加すると、細胞増殖が著しく阻害された。SPM添加による増殖阻害は、H2O2の分解酵素であるカタラーゼ（Cat）を添加しても回復しないが、アクロレインを分解する酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）の添加により回復した（A）。また、H2O2は200 µMで細胞増殖阻害を示すが、Catを添加することにより回復が見られた（B）。一方、アクロレインは15 µMで細胞増殖を阻害し、ALDHを添加することにより回復が見られた（C）。

（SMO）により酸化されて生じる3-アミノプロパ

ポリアミンを添加した際に細胞が死滅した原因は、ナールから自発的にアクロレインが産生される経路

過酸化水素であると推測された。しかし、Igarashiと、スペルミン及びスペルミジンがスペルミジン/

らの研究グループで、過酸化水素とアクロレインのスペ ル ミ ン N1- ア セ チル ト ラ ン ス フェ ラ ー ゼ

毒性の強さを比較したところ、培養細胞が同程度死滅する濃度は、過酸化水素が200 µMであるのに対（SSAT）及びN1-アセチルポリアミンオキシダーゼ

し、アクロレインは15 µMであった。培養細胞の種（AcPAO）によって産生される3-アセトアミドプ類によっても異なるが、アクロレインの方が10倍以

ロパナールより生じる経路が存在する。このとき、上も毒性が強いことが明らかとなり、培養細胞にポ等量の過酸化水素（H2O2）も産生される（図1）。

リアミンを添加した際に死滅する主な原因はアクロ

3-アミノプロパナールからは効率的にアクロレイン

レインであることが示された（図2）3)。

が産生されるが、3-アセトアミドプロパナールは比アクロレインは、酸化ストレスの一種であると考較的安定なためアクロレイン産生の効率が低い。ポ

えられており、酸化ストレスに関連する研究が進ん

リアミンは細胞内にmMオーダーで存在することかでいる。酸化ストレスとは、生体内で発生した活性ら、生体内におけるアクロレイン産生に対し、寄与度が高いと考えられている。

酸素種と抗酸化ストレス因子とのバランスが崩れ、

3.

アポトーシスなどを起こすことである。生体内にお細胞膜破壊、DNAやミトコンドリアの機能障害、アクロレインの細胞毒性

ける酸化ストレス防御機構には、Keap1-Nrf2系と細胞増殖因子として働くポリアミンを培養細胞の呼ばれるストレス応答型転写制御システムがあり、培地に添加すると、細胞が死んでしまう。培地には酸化ストレスにより活性化され、転写因子であるウシ血清を添加するが、ウシ血清中にはアミンオキ

Nrf2が抗酸化防御因子を誘導し、酸化ストレスかシダーゼが含まれており、ポリアミンも基質としてら生体を守っている4)。しかし、アクロレインの強酸化分解されて、アクロレインと過酸化水素を生じ

い求電子性により酸化ストレス防御機構が破綻するる。一般的に、過酸化水素を代表とする活性酸素と、核酸や蛋白質などの生体因子が障害を受ける。

は、がんや生活習慣病などの様々な疾患の原因や症状悪化に寄与すると考えられている。したがって、
39

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シリーズ

ポリアミン研究

ポリアミン（2016）3:38-46

A

1D-PAGE

2D-PAGE

Molecular weight
(kDa)

5

6

7

8

5

6

7

pH

8

94

94

66

66

45

45

29

29

Acrolein(40 µM, 9 h)

-

+

-

+

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 
1
61
121
181
241
301

MVKVGVNGFG RIGRLVTRAA ICSGKVEIVA INDPFIDLNY MVYMFQYDST HGKFNGTVKAENGKLVINGK PITIFQERDP TNIKWGEAGA EYVVESTGVF TTMEKAGAHL KGGAKRVIISAPSADAPMFV MGVNHEKYDN SLKIVSNASC TTNCLAPLAK VIHDNFGIVE GLMTTVHAITATQKTVDGPS GKLWRDGRGA AQNIIPASTG AAKAVGKVIP ELNGKLTGMA FRVPTPNVSVVDLTCRLEKP AKYDDIKKVV KQASEGPLKG ILGYTEDQVV SCDFNSNSHS STFDAGAGIALNDNFVKLIS WYDNEYGYSN RVVDLMAYMA SKE
図3B

B アクロレイン抱合によるGAPDHの核移行とアポトーシス惹起Western blotting of GAPDHTUNEL Propidium iodide

Merge

Cytoplasm Nucleus

Acrolein(8 µM, 6 h)None

Relativeamount

-

+

-

+

100

75

13

32

IP: antiacetyl-lys

4 mM
Acrolein

TUNEL assay

TUNEL

TUNEL positive
cells (%)

TUNEL positive cells (%)

100
100

8 mM
Acrolein
20 mm

80
80
60
60
40
40
20
20
00

Acrolein(mM, 24 h)

図3

0

0

4
acrolein (mM)

4

8

8

アクロレイン抱合蛋白質の同定及びアクロレイン抱合GAPDHによるアポトーシス惹起

FM3Aを40 µMのアクロレインで37℃、9時間処理し、1次元及び2次元電気泳動を行った。アクロレイン処理によって消失した蛋白質（赤枠）をLC-MS/MSにより解析し、得られた11個のペプチド断片（赤字）のアミノ酸配列を解析した結果、グリセ

ルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）に相当した（A）。さらに、アクロレイン抱合GAPDHによる細胞死メカ
ニズムを解析したところ、アクロレイン抱合GAPDHは核内に移行し、アポトーシスを引き起こした（B）。

（1）アクロレインによる蛋白質障害

り、酸化ストレスのセンサーとして働く役目を担っアクロレインは強い求電子性により、求核性の生たりと生体内で非常に重要である。筆者らは、アク体分子と速やかに反応する。特に、ターゲットにな

ロレインの毒性機構を解明するために、細胞培養系

る生体分子が蛋白質である。アクロレインは蛋白質を用いてアクロレイン抱合蛋白質を探索した結果、に含まれるシステイン、リジン、ヒスチジン残基とその一つとして、グリセルアルデヒド-3-リン酸デ

マイケル付加反応やシッフ塩基を形成する 5,6) 。こ

ヒドロゲナーゼ（GAPDH）を同定した（図3A）。

れらのアミノ酸残基は、酵素の活性中心であった

また、アクロレインはGAPDHの活性中心である

40

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ポリアミン研究

ポリアミン（2016）3:38-46

Cys-150とCys-282に抱合し、細胞内ATP量を低下

decreasing Neuro2a）の単離に成功した（図4A,

させると共に、不活化したGAPDHを核内移行し、B）。Neuro2a-ATD1の性質を解析したところ、細アポトーシスを引き起こした（図3B）。これらの胞内グルタチオン量が親株の1.5倍を示した。まことから、アクロレインの細胞毒性機序の一つとした、グルタチオン合成酵素の発現量が転写レベルでて、アクロレインがGAPDHを不活化し、細胞死を増加していた。そこで、グルタチオン合成酵素に関もたらすことが明らかとなった 7) 。また、2分子のわる転写因子を探索したところ、酸化ストレスで活アクロレインが蛋白質中のリジン残基と結合するこ性化されるAP-1やNF-κBが恒常的に活性されていとにより、Protein conjugated-acrolein

た。さらに、アクロレイン暴露によりGSHが減少（PC-Acro）としてN ε -(3-Formyl-3,4-dehydro-

すること、親株よりPC-Acro量が低下していることが認められた（図4C）。したがって、Neuro2a-

piperidino)lysine（FDP-lysine）及びNε-(3-ATD1は細胞内グルタチオン量を増加させること

Methylpyridinium)lysine（MP-lysine）を形成す

で、アクロレインに耐性を示すこと、及び細胞レベることが知られている8,9)。FDP-lysineには不飽和ルにおいてもアクロレイン代謝にグルタチオンが重カルボニル基が存在し、これがさらにグルタチオン

要な役割を果たすことが示された15)。最近、性質ののようなチオール化合物と反応し10)、他の蛋白質の異なるアクロレイン耐性細胞Neuro2a-ATD2の単離

求核性部位と架橋形成する11)。このようにアクロレに成功した（図4D, E）。Neuro2a-ATD2の細胞内

インは、蛋白質中のアミノ酸残基に結合することにGSH量は、親株と比べ、変化は見られなかったより、蛋白質を不活化させることが報告されているが、細胞内PC-Acro量が有意に減少していた（図1,12)。アクロレインが結合した蛋白質は、異常蛋白4F）。そこで、アクロレイン産生酵素であるポリ質となり小胞体ストレス（ERストレス）を引き起

アミン酸化酵素（AcPAO及びSMO）の発現量を比こす。臍帯静脈内皮細胞においてアクロレインは、較した結果、親株より低下していた（図4G）。こERストレス及びそれに対応するERストレス応答をれ ら 遺 伝 子 上 流 の転写 因 子を探索したところ、誘発し、炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-6
及びIL-8の発現を増加させることが報告されているAP-1を構成する蛋白質であるFosB及びC/EBPβの13)。

発現低下が認められた。また、親株でこれらの転写（2）アクロレインの代謝因子をsiRNAによりノックダウンさせると、これまでアクロレインの毒性機序について述べて

AcPAO及びSMOの発現が抑制された。さらに、

きたが、生体内にはアクロレインの毒性を除去する

AcPAOまたはSMOを過剰発現させたNeuro2a細胞機構が備わっている。生体外もしくは生体内のアクではアクロレインに対する感受性が著しく増加しロレインに暴露されると、抗酸化ストレス因子であた。したがって、Neuro2a-ATD2ではポリアミン酸

るグルタチオン（GSH）、システイン及びチオレド化酵素の発現を抑制し、内在性のアクロレイン量をキシンと急速に反応し、解毒される。特にGSHと低下させることでアクロレイン耐性を獲得しているは良好に反応し、いくつかの酵素反応を経て、メルことが明らかとなった16)。

カ プ ツ ール 酸 2 - c a r b o x y e t h y l m e r c a p t u r i cacid（CEMA）及び 3-hydroxypropyl

4.

アクロレインと疾患

mercapturic acid（3-HPMA）として尿中に排泄さアクロレインは、強い細胞毒性を示すことから通れることが知られている14)。筆者らは、細胞レベル

常、生体内において積極的には産生されず、細胞障におけるアクロレイン代謝機構の解明を試みた。マ

害 を 受 け た と き に 産 生 さ れ る と 考 えら れ る 。

ウス神経芽細胞腫Neuro2aを用いて、変異導入剤でIgarashiらの研究グループでは、脳梗塞患者の血中処理しアクロレインに暴露することで、アクロレイ

においてSMO活性、AcPAO活性、及びPC-Acro量

ン耐性細胞Neuro2a-ATD1（Acrolein toxicityが増加することを見出した。脳梗塞の大きさはPC41

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シリーズ

ポリアミン研究A

ポリアミン（2016）3:38-46

C

Cell viability

Glutathione

100

PC-AcroCell viability (%)

IC50 Neuro2a = 4.2 µM
IC50 Neuro2a-ATD1= 8.4 µM

kDa

40

10

Glutathione

0(nmol/mg protein)

50

0

100

Acrolein (µM)

B

30

35

Cell number(x 104 cells/mL)

27

10
**
n.d.

0

5

0

4

Neuro2a3

Neuro2a-ATD1

1

1

2

N2a ATD1 N2a ATD1

200

200
0
Acrolein (µM)

Acrolein (µM)

Neuro2a-ATD1+ 6 µM acrolein
Neuro2a+ 6 µM acrolein

2

0

97
66

20

Growth curve

0

N2a
N2a
-ATD1

**

Relative amount
100 93 400 263

 : Neuro2a (N2a) : Neuro2a-ATD1 (N2a-ATD1)

3Time (Day)D

Cell viability

F

IC50 Neuro2a = 4.2 µM

10

100

Acrolein (µM)

97
66

10

35

27

0
N2a

Growth curve3

Neuro2a-ATD2
Neuro2a-ATD2+ 6 µM acrolein
Neuro2a+ 6 µM acrolein

2
1

0

1

2

Relativeamount100

76

3

Levels of AcPAO and SMO mRNAs
AcPAO

Ratio

Neuro2aTime (Day)(AcPAO/b-actin)

Cell number(x 104 cells/mL)

4

0

ATD2

G

5

SMO

1.2

1.2

1.0

1.0

0.8

*

0.6
0.4
0.2
0

 : Neuro2a (N2a) : Neuro2a-ATD2 (N2a-ATD2)

図4

20

Ratio

E

kDa

(SMO/b-actin)

0

N2a ATD2

30

50

0

Western blotting(PC-Acro)

Glutathione

IC50 Neuro2a-ATD2= 6.8 µM

GSH
(nmol/mg protein)

Cell viability (%)

100

*

0.8

0.6
0.4
0.2
0

N2a

ATD2

N2a

ATD2

アクロレイン毒性除去機構の解明

マウス神経芽細胞腫Neuro2a（N2a）を変異導入剤で処理し、アクロレイン耐性細胞Neuro2a-ATD1（ATD1）を樹立した。

0~30 µMアクロレインを添加した培地でN2a及びATD1細胞を3日間培養し、Cell viabilityからIC50を算出した。アクロレインに対するIC50はN2aが4.2 µM、ATD1は8.4 µMを示した（A）。アクロレイン6 µM添加時におけるN2a及びATD1の細胞増殖速度を比較した（B）。アクロレインを暴露した際に細胞内グルタチオンが著しく減少すること及び蛋白質抱合型アクロレイン（PC-Acro）がATD1で低下していた（C）。2つ目のアクロレイン耐性細胞をNeuro2a-ATD2（ATD2）と命名し、アクロレイ

ンに対するIC50は6.8 µMを示した（D）。ATD1と同様に、アクロレイン6 µM添加時におけるN2a及びATD2の細胞増殖速度を比較した結果、ATD2の細胞増殖はあまり阻害されなかった（E）。ATD2の細胞内グルタチオン量を測定した結果、Neuro2aと比べ、変化は認められなかったが、PC-Acro量は低下していた（F）。ポリアミン酸化酵素であるAcPAO及びSMOの発現量が低下していた（G）。

42

日本ポリアミン学会

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シリーズ

ポリアミン研究A

ポリアミン（2016）3:38-46

ROC 

Bvs " (40)

RRV 0.14: 0.90: 0.80: 0.76: 0.65: 0.46
1.2

80
60

 * 84.1%
*83.5%40
20

Relative value
(AU)

(%)

100

" 
(Age/ PC-Acro/IL-6/CRP)

AUC: 0.8940

0
0

20

40

60

80

***

1.0

***

***

***

***

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

100

%(')
Control:

図5 260

アクロレイン測定による脳梗塞リスク評価

SBI: "214
CA: &$ !
263
WMH: "# 245

脳梗塞の前段階である無症候性脳梗塞（SBI）を、年齢、PC-Acro、インターロイキン-6（IL-6）及びC反応性蛋白質（CRP；肺炎球菌の細胞壁のC多糖と反応する血清中βグロブリン）を測定した（A）。脳梗塞リスク値（RRV: Relative risk
value）を0〜1として表し（1に近い方が脳梗塞のリスクが高い）、脳梗塞の危険因子である頸部動脈硬化（CA）が0.76、大脳白質病変（WMH）においても0.46と顕著な上昇が認められた（B）。

Acro量や総ポリアミンオキシダーゼ（SMO +イマー病発症の原因の一つとして考えられているアAcPAO）活性に相関し、PC-Acroとポリアミンオ

ミロイドペプチドの凝集を抑え、アミロイドペプチ

キシダーゼが脳梗塞の良いバイオマーカーとなるこ

ドの細胞毒性を軽減するという報告がされた23)。脳と を 見 出 し た17)。 ま た 、 イ ンタ ー ロ イ キ

疾患以外にも、がん14)、たばこを長期間吸入するこン-6（IL-6）やC反応性蛋白質（CRP）量を測定とで肺や気道が炎症する慢性閉塞性肺疾患

し、年齢を加味することで、脳梗塞の前段階である（COPD）24,25)、動脈硬化症26)、涙腺や唾液腺を標

無症候性脳梗塞（Silent brain infarction: SBI）を的とする臓器特異的な自己免疫疾患の原発性シェー

約84%の精度で発見できることを報告した（図5）グレン症候群患者の唾液中27)など多くの疾患に関与

18)。次に、脳梗塞モデルマウスを用いて、脳梗塞部

していることが報告されている。今後、アクロレイ

位におけるポリアミンとアクロレインの関係性につンが原因や症状・予後を悪化させる疾患が見出さいて解析したところ、梗塞部位のPC-Acro量が約れ、それら疾患の治療法の開発が期待される。

30倍に増加し、スペルミンやスペルミジン量が減少することを明らかにした。アクロレイン除去剤を

5.

おわりに

投与すると、梗塞巣の拡大が有意に抑制され、脳梗

ポリアミンは核酸、主にRNAと相互作用するこ塞の症状悪化にアクロレインが深く関与すること、とで蛋白質合成を促進し、細胞増殖因子として機能

またアクロレインの除去が脳梗塞の治療に有効であする。しかし、酸化分解を受けると低濃度で細胞をることが実験的に証明された（図6） 19,20) 。さら死滅させるという逆の反応を起こすアクロレインをに、アルツハイマー病患者の血中アクロレイン量の産生する。アクロレインの毒性機序は、徐々に明ら増加や尿中アクロレイン代謝物である3-HPMAが脳かになりつつあるが、未だ不明な点が多い。アクロ

梗塞及びアルツハイマー病患者尿で有意に減少する

レインは強い毒性から細胞死に着目されがちである

ことを見出しており、細胞障害性疾患においてアクが、生理機能に関しても非常に興味が持たれる。

ロレインが関与していることが証明されつつある

アクロレインは素早く生体内の分子と反応してし21,22) 。最近では、Tsutsuiらによって、アクロレイ

まうため、動向を掴むことが難しい。最近、細胞かンとポリアミンが8員環化合物を形成し、アルツハ

ら産生されたアクロレインを細胞が生きたまま可視
43

日本ポリアミン学会

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ポリアミン研究

ポリアミン（2016）3:38-46

A
Control

Infarct

CBB staining

Western blotting(PC-Acro)

Control Infarct

Control InfarctkDa
68Albumin32

Infarct
area

18

B

SalineDensity 1 : 26***

NAC

Infarct volume (mm3)30

250 mg/kg, 

図6

25
20

*

15
10
5
0

SalineNAC

脳梗塞モデルマウスにおける蛋白質抱合型アクロレイン及びアクロレイン除去剤による梗塞巣の減少

脳梗塞モデルマウスを用いて、梗塞部位の蛋白質抱合型アクロレイン（PC-Acro）量を比較した。梗塞部位のPC-Acroを

Western blotting法により調べた（A）。また、アクロレイン除去剤であるN-acetylcysteine（NAC）を腹腔内に投与すると、生理食塩水（Saline）と比べ、梗塞巣の有意な減少が認められた（B）。

化することができる化合物が見出された28)。このよ
うな試薬の開発がさらに期待され、アクロレインは4.

これからますます発展していく研究分野である。この拙文を読み、アクロレインに興味を持った方々によって、アクロレインの毒性、並びにアクロレイン5.

が関与する疾患の究明が進行することを期待する。
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ポリアミン（2016）3:38-46

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実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:47-53

HPLCを用いたポリアミン分析 その②
ダンシル誘導体化によるポリアミンのHPLC分析高尾浩一

城西大学薬学部薬科学科生物有機化学研究室（埼玉県坂戸市けやき台１−１）
連絡先 高尾 浩一、e-mail: ktakao@josai.ac.jp

・はじめに

本シリーズは、「これからポリアミン研究を始める学生（研究者）の皆さんを対象にしている。」とのことなので、いくつか異なる分析法も少し紹介します。これまでポリアミンのHPLCによる分析法については、飛躍的な機器の進歩に合わせて様々な方法が開発され報告されて来ました。それぞれの方法%*(&)

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ンプがなければどうしましょうか、そんなときにもば、持っているポンプが1台なのか2台なのか、検使えるのが溶離液の送液のみでよいプレラベルによ出器は紫外可視分光光度検出器か蛍光検出器なのかる分析法です。もちろん、ポンプが2台あればグラなど、各自の環境に合わせて方法を選択する必要がディエント溶出ができ、分析時間の短縮、高感度化あります。先のシリーズ 実験手技ノート HPLCをが可能になりますので、実際にはポンプ2台は持っ用いたポリアミン分析その①にて、森屋先生と東先

ていたいところです。

生がご紹介されていたo-フタルアルデヒド（OPA）

表2には筆者がこれまでに実施したことのある
HPLCを用いるポリアミンの分析法をまとめましポストカラムラベルイオン交換HPLC法1,2)は、汎用

た。

性が高く、試料の前処理も比較的簡便な方法でした),*&;14QU<RX 

り、蛍光検出器も必要になります。もし1台しかポ器によっても選択する分析法が変わります。例え

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が、溶離液と反応液の送液にポンプは2台必要になに長所と短所があり、また、皆さんが持っている機

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実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:47-53

これまでに筆者は、OPAポストラベルでは、イ

そこで、今回は、ポリアミンのダンシル誘導体化

オン交換HPLC1-3)とイオン対逆相HPLC4,5)をそれぞとリニアグラディエント溶出を用いるHPLC分析法

れ用いる方法、紫外可視分光光度検出器で測定できを紹介します。

るダブシル化法6)などを実施した経験があります。
例えば、イオン交換HPLCでは、高塩濃度の溶離液・実験方法を用いるため、ポンプをはじめとした機器等へのダメージが問題になりますが、試料の前処理が簡便＜ポリアミン測定用サンプルの調製＞で、ほとんどの試料に適用できる利点があります。
イオン対逆相HPLCは機器へのダメージは少ないも

1.

試料（培養細胞、動物組織、植物など）に0.1のの、一般に、高感度化や測定時間短縮のために、

M 塩酸を４倍容加えます。

CM-セルロースやBond-Eluteなどを用いた試料のEx) 約100 mg に 400 µL加えます。

前処理が必要になります。ダブシル化法は、蛍光検塩酸を用いてホモジネーションすることでポ出器がなくでも測定できるのですが、感度が低いた

リアミンを効率よく抽出できます。

め試料が十分確保できる時に応用できます。この他

培養細胞などに10% トリクロロ酢酸を直接加にもそれぞれの方法に関して種々条件があります

えて処理することもあります。

が、残念ながらすべてを紹介することはできないの

2.

で、ご興味のある方は引用文献をご参照ください。

ここに内部標準物質としてアミノプロピルカ
ダベリン（3-5）を約20 µMになるように添加

ここからは、表に示した方法の中でもダンシル

します。

化法 7-9) を用いたポリアミン分析に焦点を絞って紹Ex) 1 mM 3-5を20 µL加えます。

介しようと思います。付録にも記載しましたが、構造の類似したポリアミンやジアミン（図1）

OPAポストカラムラベルイオン交換HPLC法では、を内部標準物質とする内部標準法を用いるこ

1級アミンを持つポリアミンのみが検出可能です。

とで定量をより簡便に行えます。

従って、ジエチルポリアミンなど2級アミンしかも

3-5などのポリアミンの溶解には0.01 M塩酸

たないポリアミンを直接分析することはできませを用います。これにより保存による変化を抑ん。一方、ダンシル化やダブシル化では2級アミン

制できると考えられています。3-5は合成品なとも反応するのでジエチルポリアミンの検出が可能

ので、内部標準物質に市販の1,7-ジアミノヘプになります。ここが大きな違いになります。ダンシ

タンを用いることもできます。

ル化やダブシル化以外にもOPAを用いたプレラベ

3.

調製した試料をポリトロンホモジナイザーで

ル化法10,11)も報告されていますが、筆者は、OPAポ

均質化した後、遠心分離します。

ストラベルイオン交換HPLC法を用いた際、後述のEx)ようにアミノプロピル部分との反応性や反応生成物

4.

の安定性に不安が有り、OPAプレラベル化法を用

10,000 x g、5分程度。

上清150 µLをサンプルチューブに移し、20%
トリクロロ酢酸水溶液150 µLを加え良く撹拌いた経験がありません。また、前述のように、プレした後、遠心分離します。

ラベル誘導体化法は、ポンプが1台でも測定が可能

Ex)になりますが、実際には、スペルミンなどの溶出が10,000 x g、10分程度。

トリクロロ酢酸による除たんぱく操作をしっ遅く測定時間が長くなることや、溶出の遅いピーク

かり行うために良く撹拌します。

の幅が広くなるため、感度が落ちる欠点があります

5.

（溶出時間の遅い成分と早い成分を異なる溶離液で上清をポリアミン測定用試料として、ダンシル誘導体化に用います。

別途測定して用いることで感度を稼ぐことは可能で

なお、この上清（ポリアミン測定用試料）をす）。

OPAポストカラムラベルイオン交換HPLC法で直接48

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実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:47-53.0+/2

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図1  !"#&!

ポリアミンとアセチル体と内部標準物質の構造分析することも可能です（筆者は、内部標準物質に5.

3-5 を用いています）。

100 mg/mL プロリン水溶液 50 µLを加えます。
過剰なダンシルクロリドの除去。

＜ダンシル誘導体化＞生成するダンシルプロリンが引き続く抽出操
作で水層に移動し除かれます。

1.
2.

ポリアミン測定用試料50 µLを1.5 mLサンプ

6.

ルチューブに移します。

す。

ダンシルクロリドのアセトン溶液（10 mg/

黄色だった溶液の色が薄くなります。

mL）300 µLを加えます。

7.

アセトンも入っているのでトルエン層は500ることで夾雑ピークを軽減できます。

µLより多くなります。
8.

遠心後、有機相（上層のトルエン層）500 µL

用事調製しています。

を別のチューブに移し、遠心エバポレーター

ダンシルクロリドが古くなると不溶物が多くを用いて溶媒を留去します。

なる傾向があります。

500 µL以上回収しても問題ありません。

飽和炭酸ナトリウム水溶液を50 µL加えます。

機器がない場合、窒素気流下で蒸発乾固また飽和溶液は使用前に良く撹拌します。保存中は加温して溶媒留去します。

に溶液内で濃度差ができることがあり、撹拌

溶媒が残っているとHPLCでの分離に影響すしないとダンシル誘導体化が不十分になるこることがあります。

とがあります。
4.

トルエン500 µL加え、良く撹拌します。

ダンシルクロリドは、純度の高いものを用い
ダンシルクロリドのアセトン溶液は使用日に3.

70℃で5分間、または室温で30分間放置しま

9.

残渣にアセトニトリル：水＝1：1混液200 µL

70℃で15分間、または室温で１晩放置しまを加え溶解し、遠心後、上清を逆相HPLCです。

分析します。

以下の操作を省略し、Bond-Elutなどを用い

不溶物が残ることが有りますが、遠心上清をた固相抽出によりダンシル誘導体を粗精製し用いれば問題ありません。

てHPLCで測定することもできます。

49

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実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:47-53＜逆相HPLC＞
1.

Integrator
Pump

溶離液Aに20%アセトニトリル、溶離液BにA

100%アセトニトリルを用いたリニアグラディ
エント溶出を用います。

Ex 340 nm、Em 515 nmに設定します。

図2

条件検討が済んでいれば、溶離液Aに60%アを変更し、定量可能な範囲を確認します。

を変更しても構いませんが、初めて行う場合

6.

は、装置ごとに多少分離状況が異なると思う

ダンシル誘導体化後の試料を測定し、内部標
準物質のピークを基準に試料中のポリアミン

ので、溶離液Aに20%アセトニトリルを用い濃度を算出します。

て濃度の調節が可能な状態にしておくことを今回紹介した溶離液の条件では、溶出の早いア

お奨めします。

セチルポリアミンが試薬由来のピークと重なり、分測定開始前に、B濃度を50%で装置を平衡化

析できませんでしたが、20％の溶離液濃度からグします。

ラディエントを開始することで、測定時間は長くな

ポ ン プコ ン ト ロ ール の タイムプ ロ グ ラム でるものの、分析可能になりました。より理想的な分は、サンプルインジェクション後、0~10分ま離を得るために文献をご確認いただき、装置の最適でB濃度50%、10~30分にかけてB濃度をな条件をご検討ください7,12,13)。

50%~100%にリニアグラディエントで変更

以上のようにダンシル誘導体化によるポリアミ

し、30~45分はそのままB濃度100%で溶出ンの分析は感度が高く、様々な試料に適用可能です

後、45~60分はB濃度を50%に戻して平衡化が、前処理に時間と手間がかかる欠点があります。

後、次のサンプルをインジェクションしま

試料の前処理という点では、OPAポストカラムラ

す。

ベルイオン交換HPLCの方が圧倒的に簡便な方法に

ダンシル誘導体は構造中にアミンを含むのなりますが、測定に用いることのできる試料量が少で、トリフルオロ酢酸などを加えてピークをない場合や、毒物である2-メルカプトエタノールのシャープにしたいと考える方もいるかも知れ

使用やホウ酸の使用による環境への負荷を考えた廃ませんが、ダンシル誘導体は、酸性領域での液処理などの点からダンシル誘導体化法を用いるケ

感度が著しく低下するので避けた方が良いでースも増えています。

す。
サンプル測定に先立ち、水または試料の溶解・付録に用いる溶媒を用いてブランク測定を行い、クロマトグラムのベースラインを確認しま

前回のOPAを用いる方法1,2)の紹介ではアセチルす。
5.

ダンシル誘導体測定用逆相HPLCシステムの構成

測定条件が決まったら、スタンダードの濃度

セトニトリルを用い、下記タイムプログラム

4.

DetectorB

mL/min、カラムオーブン40℃、蛍光検出器

3.

Column ovenPump

カラムは一般的なODSカラムを用い、流速12.

injector

ポリアミンの測定結果がなかったので、参考にクロダ ン シル 化 し た ス タ ンダー ド の 測 定 を 実 施

マトグラムを紹介します。

し、クロマトグラムでピークを確認します。

アセタミド部分の極性が高いのでリテンションタ

溶出ピークの確認後、状況に応じてグラディ

イムが早くなります。本文中でも述べましたがOPA

エントの条件を変更します。

による標識は、1級アミンとの反応なので、ジアセ50

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実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:47-53

N1-Ac34

 
7
35
34
MDL

4

343
DE343
Ac343



図3

























ダンシルポリアミンのHPLCクロマトグラム（A）

ポリアミンの測定には、100 µMのPutrescine（4）、1,7-Diaminoheptane（7）、Spermidine（34）、3-5（35）、S p e r m i n e （ 3 4 3 ） 、 N1- A c e t y l s p e r m i d i n e （ N1- A c 3 4 ） 、 N1- A c e t y l s p e r m i n e （ A c 3 4 3 ） 、 N1, N12Diethylspermine（DE343）、MDL72527（MDL）を含む標準液を用いてダンシル誘導体化を行い、試料を10 µLインジェク
ションした。

チルポリアミンについては直接検出することはできものを用いています。場合によっては特級試薬などません。（定量のために加水分解してからの測定はでの代用も可能ですが、初めて行う場合は入手可能可能です。）

であれば分析用試薬の使用をお奨めします。）

筆者の用いている条件を下記に示します。（試薬については、アミノ酸分析用など比較的純度が高い
7

4

35

N8-Ac34

34

343

Ac343

N1-Ac34MDL

N1-Ac34



図4















DE343

















ダンシルポリアミンのHPLCクロマトグラム（B）

ポリアミンの測定には、100 µMのPutrescine（4）、1,7-Diaminoheptane（7）、Spermidine（34）、3-5（35）、S p e r m i n e （ 3 4 3 ） 、 N1- A c e t y l s p e r m i d i n e （ N1- A c 3 4 ） 、 N1- A c e t y l s p e r m i n e （ A c 3 4 3 ） 、 N1, N12Diethylspermine（DE343）、MDL72527（MDL）を含む標準液を用いてダンシル誘導体化を行い、試料を10 µLインジェク
ションした。

枠内にN1-Acetylspermidine（N1-Ac34）と N8-Acetylspermidine（N8-Ac34）のクロマトグラムを示した。

51

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実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:47-53

Ac343

出の早いピークを良好に分離できる可能性がありま4す。また、測定したいポリアミンに合わせて流速やN1-Ac34

34

カラム長を変更します。（例えば、長鎖ポリアミン

343の測定では流速を2倍にしたりします。）

35

以前にも記載がありますが、生体試料によってはプトレシンのピークと重なる成分（ヒスタミンなど）の妨害により、リテンションタイムの早い成分の定量ができないことがあります。
OPAとアミノプロピル部分の反応性が悪く、さらに反応生成物の安定性も低いため、OPA液との0

図5

混合後の流路について、検出器までの長さを調節し10 20 30 40 50 60て最適な条件を決めます。（筆者の場合はカラムオ

OPAポストラベルイオン交換HPLCのクロマトグラムーブン兼リアクションオーブンの温度を65℃にセッポリアミンの測定には、Spermineの反応性を考慮して、10トし、OPA液との混合後の流路を60 cmにしていまµM N1-Acetylspermidine（N1-Ac34）、10 µM

す。標品に用いるスペルミン濃度は他のポリアミン

Putrescinene（4）、10 µM Spermidine（34）、10 µM
Aminopropylcadaverine（35）、30 µMの3倍にしています。）

た。

・謝辞

Spermine（343）の標準液を10 µLインジェクションしカラムには、三菱化学のMCI GEL CK10Sを4.6

本原稿を書きながら、筆者が学部生・院生時代

mmφx 8 cmのステンレスカラムに充填して用いまを過ごした、城西大学薬学部薬品分析化学教室のこす。

とを思い出しました。当時は、鮫島啓二郎教授のも溶離液には、2 M 塩化ナトリウムを含む0.28 Mと、白幡晶先生、新津勝先生がポリアミン研究を行

クエン酸緩衝液（水酸化ナトリウムを用いてpHっていました。今回紹介したポリアミン測定法は、5.5にする）を用いて、メタノール濃度12.5%にな

当時から引き継いでいるもので、これからポリアミ

るように混合後、0.46 µmのフィルターを用いてろン研究を始める皆さんのご参考になれば幸いです。

過し、超音波処理により脱気した混液を用います。

最後に、このような機会を頂きました東京慈恵

OPA液には、6 mM OPA、0.4 M ホウ酸、0.2%

会医科大学の大城戸真喜子先生並びにポリアミン学

2-メルカプトエタノールを溶かし、水酸化カリウム会事務局の皆様に感謝申し上げます。

を用いてpH 10.4にした後、0.46 µmのフィルターを用いてろ過し、0.1%になるように20% Brij-35水

Integrator

溶液を加え混合後、超音波処理により脱気して用い

injector

ます。

Pump

溶離液の流速は、0.5 mL/min、OPA液の流速
は、0.25 mL/min です。

Column oven DetectorA

分離やリテンションタイムの調節のために、2：

Pump

1の比のまま流速を変更して用いることもありまBす。
また、溶離液のNaCl濃度を下げるとポリアミン
溶出のリテンションタイムが遅くなりますので、溶

図6

52

OPAポストラベルHPLCシステムの構成

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The Japanese Society of Polyamine Research

シリーズ

実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:47-53

参考文献
8.

1.

シリーズ 実験手技ノート, HPLC によるポリアミン分析, 森屋 利幸, ポリアミン学会誌 Polyamine,Vol. 2, No. 1, 15-18 (2015).
2.
シリーズ 実験手技ノート, ポストカラムHPLC 法によるポリアミン分析, 東 恭平, ポリアミン学会
誌 Polyamine, Vol. 2, No. 1, 19-25 (2015).
＜ポストカラムラベルOPAイオン交換HPLC法＞
3.
Eﬀects of inhibitors of spermidine synthaseand spermine synthase on polyaminesynthesis in rat tissues., Shirahata A,
Takahashi N, Beppu T, Hosoda H, SamejimaK., Biochem. Pharmacol., 45 (9), 1897-903(1993).
＜ポストカラムラベルOPAイオン対逆相HPLC法＞
4.
Reversed-phase liquid chromatographic
separation and simultaneous ﬂuorimetricdetection of polyamines and their
monoacetyl derivatives in human and animalurine, serum and tissue samples: an
improved, rapid and sensitive method forroutine application., Löser C, Wunderlich U,
Fölsch UR, J. Chromatogr., 430 (2), 249-262(1988).
5.
Determination of covalently bound hypusineand deoxyhypusine to protein using
submilligram of protein samples by HPLC.,
Beppu T, Shirahata A, Samejima K., Biol.
Pharm. Bull., 19 (1), 1-5 (1996).
＜ダブシル誘導体化法＞
6.
Analysis of polyamines as their dabsyl
derivatives by reversed-phase highperformance liquid chromatography., Koski
P, Helander IM, Sarvas M, Vaara M., Anal.
Biochem., 164 (1), 261-6 (1987).
＜ダンシル誘導体化法＞
7.
Solid-phase extraction and determination ofdansyl derivatives of unconjugated andacetylated polyamines by reversed-phaseliquid chromatography: improved separation
systems for polyamines in cerebrospinal
ﬂuid, urine and tissue., Kabra PM, Lee HK,

9.

Lubich WP, Marton LJ., J. Chromatogr., 380(1), 19-32 (1986).
Rapid high-performance liquid
chromatographic method for thequantitation of polyamines as their dansyl
derivatives: application to plant and animal
tissues., Marcé M, Brown DS, Capell T,
Figueras X, Tiburcio AF., J. Chromatogr. B
Biomed. Appl., 666 (2), 329-335 (1999).
Eﬀects of conditional overexpression of

spermidine/spermine N1-acetyltransferaseon polyamine pool dynamics, cell growth,and sensitivity to polyamine analogs., Vujcic
S, Halmekyto M, Diegelman P, Gan G, Kramer
DL, Janne J, Porter CW., J. Biol. Chem., 275(49), 38319-38328 (2000).
＜プレカラムラベルOPA法＞
10.

11.

o-Phthalaldelhyde-N-acetylcysteinepolyamine derivatives: formation andstability in solution and in C18 supports.,
Campíns-Falcó P, Molins-Legua C, SevillanoC a b e z a A , To r t a j a d a G e n a r o L A , J .
Chromatogr. B Biomed. Sci., 759 (2),285-297 (2001).
Analysis of polyamines in biological samples
by HPLC involving pre-column derivatization
with o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-

cysteine., Dai Z, Wu Z, Wang J, Wang X, Jia
S, Bazer FW, Wu G, Amino Acids, 46 (6),1557-1564 (2014).

＜N1-Acetylspermidine及びN8-Acetylspermidineの分離＞
12. Circadian rhythmicity of polyamine urinary
excretion., Hrushesky WJ, Merdink J, AbdelMonem MM, Cancer Res., 43 (8), 3944-3947(1983).
13.

53

Separation of N1- and N8-acetylspermidine

isomers by reversed-phase column liquid
chromatography after derivatization withdansyl chloride., Stefanelli C, Carati D,
Rossoni C, J. Chromatogr., 375 (1), 49-55(1986).

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The Japanese Society of Polyamine Research

シリーズ

実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:54-56〜質問コーナー〜
Q１:ご自身でカラムに充填剤を詰められたことがあるようですが、具体的にどのように詰めるのでしょうか。何か必要な工具はありますか。コツや注意する点なども合わせて教えてください。

高尾：写真の器具を用います。「パッカー」という名称で、ジーエルサイエンス社製のものです。
用いているHPLC用空カラムのメーカーに合わせたものを購入しました。
カラムの一方のナット部分を外して直接器具と接続します。空のカラムに接続し、樹脂の懸濁液を器具の太い部分に入れた後、ふたをして、HPLCポンプと接続、一定の流速で溶離液（例えば20％メタノール）を流します。樹脂が詰まったら、ふたを外し、懸濁液を加え、同じ操作を繰り返します。
最終的にカラム全体に樹脂を詰めます。（器具のふたを開けた時に底に樹脂が見えるようになり、充填が終わったことを確認できます。）
充填終了後、器具を外し、余分な樹脂を除去後、外してあった
フィルター付のナットを装着して完了です。
コツとしては、ビーカーなどを用いて、詰める樹脂を予め溶離液（例えば20％メタノール）に懸濁し、数分間静置後、デカンテーションにより細かい粒子を除く操作を何度か繰り返してから用います。この操作により、カラム圧の上昇を軽減でき、分離も良くなります。
注意点は特にないですが、良く流してしっかり樹脂をカラムに詰めます。
Q２:ご自身で充填剤を詰める利点は？
高尾：ランニングコストが安く済むこと、不具合が出た時にすぐに詰替えられることでしょうか。（試料が詰まって、カラム圧が上昇したら、カラムの詰替えを実施しますが、この際、カラムの入り口部分の樹脂を廃棄して、残りの樹脂は再利用しています。）
Q３:カラムとネジをつなげるときに気をつけている点はありますか？ 規格や素材などの良し悪しなどもあったら教えてください。
高尾：力自慢の方はねじ切ってしまうことがありますので、要注意です。
強めに締めても液が漏れる場合には傷がついているので交換が必要です。

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実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:54-56

塩が出ている状態で締めたりすると傷がつきます、塩濃度の高い溶離液を用いる場合には使用後の洗浄など、メンテナンスをきちんと行うことや連結部のちょっとした塩の析出などに気付く繊細さが必要です。
また、イオン交換では、溶離液の塩濃度が高いため、適宜、接続部分を水などで洗浄するなど、
オシネ（ネジ）部分の手入れを小まめにすることで装置全体の寿命が延びます。
現在、ピーク樹脂のラインやオシネやフェラルを用いています。
編集部：カラムのフィッティングの形状は各社で異なり、異なるカラム使用した場合、デットボリュー
ムを生じる可能性のあるステンレス製のオシネ・フェラルに比べると、PEEK製のオシネ方式は汎用性がありますよね。
高尾：そうかもしれませんね。基本的にはステンレス製のオシネ・フェラルについてはカラムメーカーに合わせたものを用いています。
現在、耐性等の根拠はないのですが、高塩濃度の溶離液を用いているので金属製のものをPEEK製に変更しています。
Q４:イオン交換HPLCのときは、溶離液をフィルターに通していましたが、逆相HPLCのときはフィル
ターに通さないのですか？
高尾：液体（HPLC用のもの）を混合しただけの場合にはフィルターを通す操作を省いています。
固体を溶解した場合は必ずろ過します。
Q５:蒸発乾固後、再溶解した試料はフィルターを通して不溶物を取り除くのでもよいですか？
高尾：もちろんです。
本来はその方が良いのですが、コストの面から遠心上清を用いています。
Q６:ガードカラムやラインフィルターはHPLCシステムの中で使っていますか？
高尾：溶離液を吸い上げるところにサクションフィルターを付けています。
ガードカラムは逆相系カラムの使用時に付けたりしますが、現在は、カラムに比較的安価なものを用いているので付けていません。
Q７:カラムの性能が落ちてきたな、というのはどうやって判断していますか？
高尾：クロマトグラムの形が変化してきます。イオン交換カラムでは、リーディングが起こったり、分離が悪くなったら交換しています。逆相系のカラムでは、圧が上がったり、クロマトグラムのピー
クが太くなるなど、変化してきたら交換しています。
Q８:イオンペア試薬について少し説明をお願いします。
高尾：例えばイオン対試薬であるオクタンスルホン酸などを用いた場合、スルホン酸部分がアミンなどの陽イオンとイオン対を形成して、アミンを含む化合物の疎水性を見かけ上高め、逆相系では保持時間が延長します。また、テトラブチルアンモニウムなどはカルボン酸など陰イオンとイオン対を形成して同様に疎水性を見かけ上高め、保持時間が延長します。イオン対試薬は、目的成分の保持時間を変化させ、良好な分離を得るために添加します。

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実験手技ノート

ポリアミン（2016）3:54-56

Q９:HPLCについてもっと勉強したいと思っている学生さんにお奨めの教科書や専門書やサイトなどあったら、教えてください。
高尾：簡単なものでは、「これならわかる液体クロマトグラフィー

その仕組みと使い方」化学同人、

また、より詳しく知りたい方には、版は古いですが、「高速液体クロマトグラフィーハンドブッ
ク」丸善などでしょうか。
サイトについては、あまり利用経験はないですが、分析機器関連のメーカーのHPなども参考になりそうです。

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The Japanese Society of Polyamine Research最新の研究紹介

加齢に伴うアクロレイン産生の増加とグルタチオンの減少による脳梗塞の悪化
渡辺健太1、植村武史2、五十嵐一衛1,2

1千葉大学大学院薬学研究院、2株式会社アミンファーマ研究所

Aggravation of brain infarction through an increase in acrolein production and a decrease inglutathione with aging.
Takeshi Uemura, Kenta Watanabe, Misaki Ishibashi, Ryotaro Saiki, Kyoshiro Kuni, Kazuhiro
Nishimura, Toshihiko Toida, Keiko Kashiwagi, Kazuei Igarashi.
Biochemical and Biophysical Research Communications 473 (2016) 630-635
脳 梗 塞 時 に は 細 胞 増 殖 因 子 で あ る ポ リ ア ミ ン が 細 胞 外 へ と 漏 出 し 、 毒 性 の 強 い アク ロ レイ ン
(CH2=CHCHO) へと代謝される。また、加齢は脳梗塞の重要なリスク因子であるが、そのメカニズムは明らかになっていない。本研究では、加齢による脳梗塞リスク上昇のメカニズムを明らかにするため、脳梗塞モデルマウスを用いて検討を行った。その結果、加齢に伴い、梗塞体積及び梗塞部位、血漿中の蛋白質抱合型アクロレイン量は増加した。また、スペルミン酸化酵素（SMO）活性が、加齢により増加していた。一方、アクロレインの毒性解除に関わるグルタチオン量は減少し、グルタチオン合成
酵素も減少していた。以上の結果より、加齢による脳梗塞のリスク増加は、SMO活性の上昇によるアク
ロレイン産生の増加とグルタチオン合成の低下によることが示唆された。
カ ル ボ キ シ ルスペ ル ミ ジ ン 脱 炭 酸 酵 素 は 、 腸 内 常 在 菌 最 優 勢 種 の 一 種 で あ る B a c t e r o i d e sthetaiotaomicronのスペルミジン生合成に必須であり、その正常な生育に重要である
阪中幹祥、栗原新

石川県立大学 生物資源環境学部 腸内細菌共生機構学寄附講座
Carboxyspermidine decarboxylase of the prominent intestinal microbiota species Bacteroides
thetaiotaomicron is required for spermidine biosynthesis and contributes to normal growth.
Mikiyasu Sakanaka, Yuta Sugiyama, Aya Kitakata, Takane Katayama, and Shin Kurihara. Amino
Acids, 2016, 48: 2443-51 PMID: 27118128.
ヒト大腸腸管内に数100 µMという高濃度で存在するポリアミンは、腸内細菌によって生産されており、ヒト健康に重要な役割を果たしている。本研究では、ヒト腸内常在菌最優勢種の一種であるBacteroides thetaiotaomicronのスペルミジン生合成系の最終ステップを触媒するカルボキシスペルミジン
脱炭酸酵素遺伝子（casdc）について解析した。ポリアミンを含まない最少培地で生育させたB.
thetaiotaomicronの野生株では数10 nmol/mg程度のスペルミジンが存在していた。推定カルボキシスペ
ルミジン脱炭酸酵素遺伝子（casdc）を破壊した株では菌体内スペルミジンがほぼ消失し、casdc相補株
では野生株とほぼ同濃度のスペルミジンが菌体内に存在していた。また、casdc遺伝子破壊株では、野生株や相補株と比較して生育の遅延が観察された。

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The Japanese Society of Polyamine Research最新の論文紹介

リボソームに結合したハイプシン化された翻訳因子eIF5Aの構造
西村和洋

千葉大学大学院薬学研究院病態分析化学研究室
Structure of the hypusinylated eukaryotic translation factor eIF-5A bound to the ribosome.
Christian Schmidt, Thomas Becker, André Heuer, Katharina Braunger, Vivekanandan
Shanmuganathan, Markus Pech, Otto Berninghausen, Daniel N. Wilson and Roland Beckmann
Nucleic Acids Research, 2016, 44: 1944-1951
eIF5Aはスペルミジンによってハイプシン化されて活性型となる翻訳因子である。近年の研究により、ポリプロリン配列を含む蛋白質合成時に起こるリボソームの停止をeIF5Aが回復させる機能を持つことが示されている。本論文ではその機能を裏付けるようにクライオ電子顕微鏡を用いて、酵母80Sリボソーム上に結合するハイプシン化eIF5Aの複合体の構造を3.9 Åという高解像度で解明した。この複合体の構造解析から、ハイプシン化eIF5AはリボソームのPTC（ペプチド鎖転移反応中心）で、P部位のtRNAに隣接して結合し、そのtRNAのCCA末端のA76にハイプシン残基が相互作用することを明らかにした。この結果は、ハイプシン残基がP部位tRNAのCCA末端の向きを安定化してペプチド結合形成を促進するモデルをサポートする重要な報告である。
ポリアミン代謝の亢進によるジカ熱の原因ウイルスの増殖（複製）抑制
松本靖彦

帝京大学医真菌研究センター

Interferon-Induced Spermidine-Spermine Acetyltransferase and Polyamine Depletion Restrict Zika
and Chikungunya Viruses.
Bryan C. Mounce, Enzo Z. Poirier, Gabriella Passoni, Etienne Simon-Loriere, Teresa Cesaro, Matthieu
Prot, Kenneth A. Stapleford, Gonzalo Moratorio, Anavaj Sakuntabhai, Jean-Pierre Levraud, Marco
Vignuzzi
Cell Host Microb, 2016, 20:167-77
ジカ熱は、小頭症の原因となるウイルス感染症である。最近、南米を中心としてジカ熱が流行しており、治療法や予防法の確立が望まれている。Mounceらは、ジカ熱を起こすジカウイルスの増殖（複製）にポリアミンが必要であることを報告した。ウイルスの複製の抑制に関わるtype I インターフェロ
ンがポリアミン代謝に関わるspermidine/spermine N1-acetyltransferase (SAT1)の量の増加とジカウイルスの複製の阻害を引き起こした。さらに、阻害剤の処理によりポリアミン量を低下させるとジカウイルスの複製が阻害された。本研究で著者らは、ジカ熱に対する治療や予防のためにはポリアミン合成阻
害、もしくはポリアミン代謝の亢進が有用ではないかと提案している。ポリアミンがインターフェロンによる抗ウイルス作用において重要な働きをしていることが示唆された注目の研究である。

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日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research「最新の研究紹介」「最新の論文紹介」の原稿募集「最新の研究紹介」「最新の論文紹介」は今号より開始した新企画です。このコーナーはポリアミン学
会員に向け、ポリアミン関連の最新の研究についての有用な情報を提供することを目的としています。
「最新の研究紹介」はポリアミン関連の論文を公表した著者がその研究内容を紹介するコーナーです。
皆様が発表した最新の研究を解説した原稿を募集いたします。本学会誌を研究のアピールの場としても利用していただきたいと思います。
「最新の論文紹介」はポリアミン関連の注目の論文を見つけた人がその研究内容を紹介するコーナーです。

「この研究論文は面白いから是非とも紹介したい！！」「この研究論文は重要だから広く学会員に知ってもらいたい！！」と思われた方は是非ご投稿ください。もし同じ論文に複数投稿希望があった場
合、投稿者合意の上で全て掲載する予定でいます。ただし、同一グループからの重複投稿は事務局で調整いたします。原稿を作成する前にあらかじめ事務局に投稿希望の旨を連絡していただけると助かります。

[原稿の形式]
A4版の半分に収まるように作成して下さい（目安として35文字 20行）。
書式は本号の形式を参照して頂き、以下の三つの部分で構成して下さい。
1. 日本語の論文のタイトル、本解説文を作成した著者名と所属
2. 論文のタイトル、著者名、雑誌名、発表年、号、ページ
3. 研究内容の要約
投稿はポリアミン事務局宛（polyamine@jikei.ac.jp）でお願いします。
学会員参加型の企画ですので、皆様の積極的なご投稿お待ちしております！！

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日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research

学会報告

ポリアミン（2016）3:60

第4回ポリアミンの機能並びに臨床応用に関する国際会議に参加してアミンファーマ研究所
五十嵐一衛

この4th International Conference on Polyamines: Biochemical, Physiological and Clinical Perspectivesを、ローマ郊外のチボリでSapienza University of RomeのEnzo Agostinelli教授と共に開催
するのは、2006年、2010年に次いで今回が3回目となる。しかし、4thと命名されているのは、2014年にAgostinelli教授がブラジルのSão Paulo State UniversityのSando R.Valentini教授とブラジルで3rdを開催した為である。
この3回の学会の講演数は42題、43題、43題とほぼ同数であるが、ポスター展示数は60題、37題、33題と徐々に減少してきており、世界中のポリアミン研究者の減少が危惧されている。
次回は2018年に台湾での開催が予定されているが、奇数年の2年おきに開催されるポリアミンゴード
ン研究会議の参加者も減少傾向にあり、台湾での開催を機に、アジアにおけるポリアミン研究者の増加を期待している。
さて、今回の会議には日本人は13名参加しており、全体87名の参加者の中で、国別では第1位であった。開催地チボリはローマから地下鉄で約30分の距離にあり、観光地と離れているため、研究者の皆さんが、研究に関して討論するには適した処に位置しており、各研究者と必要な事は十分に討論する事が出来た。内容もポリアミンのヒト、動物、植物、微生物における役割と多岐に亘り、多くの新知見を学ぶ事が出来た。しかし、欲を言えば、ポリアミンの機能の現象論の解析に止まらず、ポリアミンが何処に作用し、その現象を引き起こすかを、追及してほしいと思っている。また、Agostinelli教授は学会の運営が非常に巧妙で、参加した皆さんが学問的にも社交的にも、十分に充実した時間を過ごす事が出来たと確信している。これ迄のAgostinelli教授の努力に心より感謝したいと思っている。
また、イタリアは美食の国であり、ワイン、食事共に、満喫した。食事はバイキング方式で、多くの種類が提供されたが、可能ならば毎日少しずつ食材が変化すると更に素晴らしかったと思う。
今後はポリアミン研究が、研究者の減少に歯止めをかけ、上昇に向かう事を皆さんと共に祈念し、今回の国際会議の報告とさせて頂きます。

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事務連絡
日本ポリアミン学会第８回年会のご案内
拝啓時下ますますご清栄のこととお喜び申し上げます。
さて、日本ポリアミン学会の第８回年会を千葉工業大学にて以下のように開催させていただきます。
大勢の皆様のご参加をお待ち申し上げております。
敬具
第8回年会担当 河合 剛太
根本 直樹
1. 年会概要
会期: 平成29年1月20日(金)13:00〜21日(土)15:00(予定)
会場: 千葉工業大学

津田沼キャンパス

2号館

3階

大教室

住所: 275-0016 千葉県習志野市津田沼2-17-1
交通案内 (http://www.it-chiba.ac.jp/institute/access/)
最寄りのJR津田沼駅からの地図(http://www.it-chiba.ac.jp/institute/access/tsudanuma/index.html)
キャンパスマップ(http://www.it-chiba.ac.jp/institute/campus/tsudanuma/)
特別講演: 産業技術総合研究所バイオメディカル研究部門の山崎和彦博士とアステラス製薬株式会社研究本部創薬化学研究所の新美達也博士を予定しています。
懇親会: 1月20日(金)17:30頃から
会場: 津田沼キャンパス1号館20階ラウンジ
2. 参加費
事前登録

当日参加

年会参加費

懇親会代

年会参加費

懇親会代

2,000 円

4,000 円

3,000 円

5,000 円

0円

2,000 円

2,000 円

3,000 円

非会員

4,000 円

5,000 円

5,000 円

6,000 円

学生非会員

2,000 円

3,000 円

4,000 円

5,000 円正会員
学生会員

3. 演題の申し込みと講演要旨の提出
演題の申し込みと講演要旨のご提出は平成２８年１２月５日(月)までにお願いいたします。
学会HPの所定の用紙(8th̲PA̲endai)にてMS Wordファイルとして作成し、pdf化したものとMS Word
ファイルの両方を第８回年会専用メールアドレス polyamine@it-chiba.ac.jp へ添付書類としてお送りください。
講演要旨は「講演要旨記載要領」の指示に従い、A4紙1枚以内でご作成ください。

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日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research4. 年会参加の事前登録
事前登録のための年会参加費・懇親会代のお振込みと参加登録票のご提出は平成２８年１２月５日(月) までにお願いいたします。これを過ぎますと当日参加となりますのでご注意ください。参加登録票
は学会HPの所定の用紙(8th̲PA̲sanka)をご使用ください。
振込先口座: SMBC 三井住友銀行
津田沼駅前支店(店番号:891)(普通)口座番号 1552565
口座名義; 日本ポリアミン学会 年会担当 根本直樹
【お振込みの際のお願い】
振込人名は、お名前(カタカナ)の後にご所属の略称(カタカナ)を付けてください。
ご所属先の皆さん一括でお振込みいただいても構いませんが、参加登録票は各自1枚ずつお書きいた
だき、メール添付にてお送りください。
振込時の受領証以外に年会事務局発行の領収書が必要な方は年会当日にお渡しできるよう準備いたしますので、参加登録票の「領収書の要否」の欄にご記載ください。
5. その他
発表者への諸注意やホテル情報等は学会HPに載せています。最新の情報と合わせてご利用ください。
http://pa.umin.jp/
6. 問い合せ先
日本ポリアミン学会第8回年会事務局
275-0016 千葉県習志野市津田沼2-17-1
千葉工業大学 先進工学部 生命科学科 分子細胞進化学研究室
根本 直樹
Tel: 047-478-0159
第8回年会専用メールアドレス: polyamine@it-chiba.ac.jp

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日本ポリアミン学会

The Japanese Society of Polyamine Research編集後記
日中でも寒さを感じる季節となりましたが，皆さんいかがお過ごしでしょうか。千葉工大では，１月開催の年会準備に向けて慌ただしく動き始めております。年会を準備する側としては，規模が大きくなればそれだけ大変になりますが，やはり多勢の参加を期待して過ごしています。柏木先生の巻頭言にありますように，学会員の数を増やすために年会はどう開催したら良いか。どのように年会参加者を増やし，どう学会員増につなげるかを考えながら準備を進めております。
広報委員会に入れていただいてから，もうすぐ２年が経ちます。通算第３号から携わっていますが，毎回，広報委員会の会議では他の委員に圧倒されています。誌面の連載をどうストーリー展開していくのかという議論に始まり，（世間一般では，皆さん良い年なのですが）若手の立場から，学会をどう盛り上げて行くか。学会員を増やすにはどうしたら良いか。様々なアイデアと熱い議論に圧倒されながらも何とかそこに加わろうとしています。
今号から「最新の研究紹介」「最新の論文紹介」がスタートしました。学会員の皆さんから最新の紹介記事を提供してもらい，学会内外にポリアミン研究をアピールすることで，より活気ある学会を創りたいという想いが込められた企画です。ぜひ紹介記事のご提供をお願いいたします。
（広報委員会委員根本直樹）

日本ポリアミン学会 学会誌「ポリアミン」
第3巻2号(2016年11月)
発行:日本ポリアミン学会

http://pa.umin.jp/

polyamine@jikei.ac.jp

製作:日本ポリアミン学会 広報委員会

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The Japanese Society of Polyamine Research