脂溶性ビタミン製剤はアレルゲン免疫療法のアジュバントになり得るか
摂南大学薬学部
なべ奈邉たけし健教授

脂溶性ビタミン製剤はアレルゲン免疫療法のアジュバントになり得るか

摂南大学薬学部

薬効薬理学研究室

教授

奈邉

健

【要旨】
アレルゲン免疫療法は、アレルギー疾患に対する唯一の根治療法であり、その効果発現には制御性 T（Treg）細胞の誘導が深く関与する。しかし、充分な治療効果を得るために長期間の抗原投与が必要であることから、その効果を増強する薬物の創出が求められている。そこで、本研究では、ビタミン D3（コレカルシフェロール）、抗ヒスタミン薬（レボセチリジン）、ならびに抗アレルギー薬（クロモグリク酸ナトリウム）が、抗原による Treg 細胞の誘導を増強するか否か検討を行い下記の成績を得た。卵白アルブミン（OVA）感作マウスの脾臓細胞を抗原および上記 3 種の薬物存在下にて 7 日間培養を行い、その後、flow cytometry にて Treg 細胞の解析を行った。
（1）抗原およびコレカルシフェロールの存在下においては、抗原のみの条件と比較して、Treg 細胞の一種である type 1 regulatory T (Tr1) 細胞の顕著な増加が認められた。
（2）レボ
セチリジン並びにクロモグリク酸ナトリウムの存在下においては、抗原による Treg 細胞の誘導に対する増強効果は認められなかった。コレカルシフェロールは、脾臓細胞中のマクロファージなどによって取り込まれた後に活性型となり、Tr1 細胞の増加を示したものと考えられる。以上
より、コレカルシフェロールは、アレルゲン免疫療法の効果を高める有用なジュバンドとなる可能性が示唆された。

１、調査研究目的
アレルギー疾患の患者数は、近年さらに急増しており、現在では国民の約半数が罹患している。
これを抑制することは我が国の国家戦略の１つである。アレルゲン免疫療法は、少量の抗原を皮下あるいは舌下に長期間投与することで、抗原に対する免疫寛容を誘導する治療法であり、アレルギー疾患に対する唯一の根治療法である。1) しかし、充分な治療効果を得るためには最低3 年間の抗原投与が必要である。2,3 ) したがって、アレルゲン免疫療法の効果を増強するアジュバンドを見出すことができれば、抗原投与期間の短縮が期待できる。
Treg 細胞は、マスター転写因子として forkhead box P3（Foxp3）を発現し抗炎症作用を示す
CD4+ T 細胞（Foxp3+ Treg 細胞）である 4 ) が、それ以外にも抗炎症性サイトカインである
IL-10 を高産生する Foxp3 − CD4+ T 細胞（type 1 regulatory T 細胞、Tr1 細胞）5） などの55

サブタイプが存在する。我々は、アレルゲン免疫療法を行うことでヒトおよびマウスのいずれの種属においても、末梢血ならびに炎症部位において Foxp3+ Treg ではなくTr1 細胞が顕著に増加することを明らかにしてきた。6 , 7）これらのことから、アレルゲン免疫療法による Tr1 細胞の誘導を増強することができれば、抗原に対する免疫寛容を効率よく誘導できる可能性がある。
コレカルシフェロール（ビタミン D3）は、主として肝臓および腎臓においてカルシトリオールなどの活性型に変換されることで、カルシウムの吸収を調節する。8） さらに、カルシトリオールは、マクロファージなどの免疫細胞に取り込まれて活性型となり 8）、Treg 細胞を誘導することで免疫環境の調節にも関与するとされる。9,10） これらのことから、コレカルシフェロールは、骨ならびに免疫の健康を保つためにサプリメントとして使用されてきた。11) また、ヒスタミン H1 受容体拮抗薬のレボセチリジンや抗アレルギー薬として市販されているクロモグリク酸ナトリウムもTreg 細胞の誘導作用が示唆されている。12,13,14）しかしながら、これら薬物のアレルゲン免疫療法の効果に及ぼす影響は不明である。
そこで、本研究では、抗原による Tr1 細胞の誘導効果に対する上記 3 種の薬物による増強効果を明らかにすることを目的に、抗原感作マウスの脾臓細胞を抗原および上記 3 種の薬物存在下にて培養することで、IL -10 産生ならびに Tr1 細胞の誘導が増強されるか否か解析した。

２、調査研究方法
2-1

抗原感作Nabe ら 15,16 ) の方法に準じ、（OVA）+Al（OH）3 を 50 µg OVA/2 mg Al（OH）3/0.5 mL/
animal 宛 2 週間間隔で 3 回腹腔内投与することによりマウスを感作した。
2-2

脾細胞からの IL-10 産生、ならびに Tr1 細胞の誘導抗原感作マウスを pentobarbital（50 mg/mL）および xylazine（20 mg/mL）のいずれも30μL/animal の腹腔内投与により麻酔状態にし、脾臓を摘出した。その後、頸椎脱臼を行い安楽死させた。50μM 2-mercaptoethanol、100μM non-essential amino acid、100 U/mL penicillin、100μg/mL streptomycin および 10% FBS 含 有 IMDM（medium 1） を5mL 添加した 6 -well ポリスチレン製 plate 内に 70μm のセルストレイナー (BD Biosciences)を設置し、その上で摘出した脾臓を 2.5mL 注射筒（Terumo）のプランジャーを用いてすりつぶした。得られた細胞懸濁液は遠心（310 × g、4℃、7 min）し、得られたペレット中の赤血球は、ACK lysis buffer を用いて除去した。再び遠心（310 × g、4℃、7 min）して得られたペレットは medium 1 を 10 mL 宛添加し遠心操作による洗浄（310 × g、4℃、7 min）を行ない、再度 medium 1 を 10 mL 宛添加し懸濁させ 40μm セルストレイナーに通した。その後、脾細胞の総数を 0.4% trypan blue で染色し、血球計算盤（Erma）を用いて測定した。平面 96 well plate（Falcon）に終濃度が 2 ×10 6 cell/mL となるように medium 1 で懸濁した細胞を

56

200 µL/well 宛添加し、OVA（終濃度 10 - 5 g/mL）、コレカルシフェロール（ビタミン D3、東京化成、終濃度 10 - 9 〜 10 -5 M）、レボセチリジン（東京化成、終濃度 10 - 5 M）、ならびにクロモグリク酸ナトリウム（東京化成、終濃度 10 -5 M）をそれぞれ添加し 37℃、5％ CO2 環境下にて 7 日間培養した。
2-3

IL-10 濃度の測定

培養上清中の IL-10 濃度は、ELISA MAX™ Deluxe Set Mouse IL-10（BioLegend）により測定した。
2-4

Tr1 細胞の解析

2-1 の項に示す培養開始の 6 日後に、全てのサンプルに monensin（Merck）を添加し、37℃、5% CO2 環境下、さらに 24 h 培養した（終濃度 2μM）。培養終了後、各 well の細胞懸濁液を V 底 96 -well plate（アズワン）に移し、遠心（310 × g、4℃、7 min）および上清除去後、2% FBS 含有 PBS を 200μL/well 宛添加し懸濁した。さらに、遠心操作による洗浄を 2 回繰り返した。その後、抗 CD16/32 抗体（2.4G2、10 µg/mL）を 50μL/well 宛添加し、攪拌後、4℃にて、15 min インキュベーションした。遠心後（310 × g、4℃、5 min）、Pacific
BlueTM 標識 抗 CD4 抗体（BioLegend、GK1.5、1:100） ならびに FITC 標識 抗 CD3 抗体（BD Bioscience、17A2、1:100）を 50μl/well 宛添加し、さらに 4℃、20 min インキュベーションした。その後、2% FBS 含有 PBS を用いた遠心操作による洗浄を 3 回繰り返し、得られた細胞に Fixation/Permeabilization Concentrate（Thermo Fisher Scientific）を 100µl/well 宛添加し、撹拌後、遮光下、4℃にて 15 h 以上インキュベーションすることにより固定および細胞膜透過処理した。遠心（310 × g、4℃、5 min）後、Fixation/Permeabilization
concentrate を 100 µL/well 宛添加し、攪拌後、遮光下、4℃、15 h 放置することにより固定および細胞膜透過処理を行った。その後、細胞を遠心し上清を除去し、超純水で 10 倍希釈した Permeabilization Buffer（Thermo Fisher Scientific）を 200 µL/well 宛添加し、攪拌後、遠心（400 × g、室温、5 min）した。この遠心洗浄を 2 回繰り返した後、上清を除去し、PE 標 識 anti-mouse IL -10 抗 体（Thermo Fisher Scientific、JES5 -16E3、1 :100） な
らびに eFluor 660 標識 anti-mouse

Foxp3（Thermo Fisher Scientific、FJK-16s、1 :100）

を 50μL/well 宛添加し、攪拌後、遮蔽下、室温、40 min インキュベーションした。その後、同様に Permeabilization Buffer を用いて遠心洗浄 (310 × g、4℃、5 min) を 2 回繰り返した
後、2%FBS-PBS を 200μL/well 宛添 加し、FACS AriaTM Fusion および FACS DivaTM
version 8.0.1 (BD Biosciences) により解析した。
2-5

統計学的解析

多群間の検定には一元配置分散分析を行った後、Dunnett’s multiple comparison test を行った。また、2 群間の検定には対応のない t 検定を行った。また、危険率 5% 未満を有意とした。

57

３、調査研究成果
3-１ 抗原による IL-10 の誘導に及ぼすコレカルシフェロールの影響
IL -10 は、Tr1 細胞などの Treg 細胞が産生する抗炎症性サイトカインの一種である 5)。初期的に、抗原による培養液中への IL -10 の産生に及ぼすコレカルシフェロールの影響を観察した。OVA のみの条件下においては、IL -10 の産生が増加する傾向にあった（Fig. 1）。一方、
OVA による IL -10 の産生は、コレカルシフェロール 10 - 8 および 10 - 7 M の存在下において増強される傾向にあった（Fig. 1）が、顕著な影響は認め難かった。
そこで、IL -10 を産生する細胞である Tr1 細胞に着目し、flow cytometer によって検出する方法に変更することとした。
3-2抗原による制御性 T 細胞の誘導に及ぼすコレカルシフェロール、レボセチリジンならびにクロモグリク酸ナトリウムの影響

Tr1 細胞は、Fig. 2 に示すように、IL -10 産生性 Foxp3 - CD4+ T 細胞として検出した。
脾細胞を OVA のみで刺激した場合、Tr1 細胞数が増加する傾向にあった（Fig. 3A）。これに対し、上記の検討に比較して高濃度（10 - 5 M）のコレカルシフェロールを共存させた場合、OVA のみの条件に比べて、有意かつ顕著な Tr1 細胞数の増加が認められた（Fig. 3A）。
一方、OVA 刺激下にレボセチリジンあるいはクロモグリク酸ナトリウムのいずれも 10 - 5 Mを存在させた場合は、OVA による Tr1 細胞の誘導効果はむしろ減弱される傾向にあった（Fig.
3B および 3C）。

４、考察
抗原および高濃度のコレカルシフェロールの存在下において脾臓細胞を培養することで、Tr1 細胞が顕著に増加することが明らかとなった。コレカルシフェロールは、生体内に投与した場合、肝臓および腎臓において水酸化されることで、活性型であるカルシトリオール等となり生理活性を示す。8）
また、in vitro 実験において、免疫細胞もコレカルシフェロールからカルシトリオールへの変換に関わることが報告されている。8） Gottfried ら 17） は、免疫細胞であるマクロファージに取り込まれたコレカルシフェロールは、CYP27A1 および CYP27B1 によって水酸化されることで、カルシトリオールへと変換されることを明らかにした。したがって、本研究において培養環境に加えたコレカルシフェロー
ルは、脾臓細胞中のマクロファージによって取り込まれ、カルシトリオールに変換されることで、抗原によるTr1 細胞の誘導作用を増強した可能性が考えられる。今後、免疫細胞内におけるコレカルシフェロールの活性型への代謝経路を明らかにするとともに、コレカルシフェロールとカルシトリオー
ルの Tr1 細胞の誘導増強作用を比較する必要がある。さらに、コレカルシフェロールの Tr1 細胞誘導増強効果を介したアレルギー疾患抑制効果を in vivo モデルを用いて明らかにする必要がある。

58

５、まとめ
抗原感作マウスの脾臓細胞を抗原および 3 種の薬物存在下にて培養し、抗原による Tr1 細胞の誘導作用が上記薬物により増強するか否か解析を行い、下記の成績を得た。
1.

高濃度のコレカルシフェロールは、抗原による Tr1 細胞の誘導を顕著に増加させた。

2.

レボセチリジンならびにクロモグリク酸ナトリウムは、抗原による Tr1 細胞の誘導を増強しなかった。
以上より、コレカルシフェロールは、アレルゲン免疫療法の効果を高める有用なアジュバンドとなる可能性が示唆された。

５、調査研究発表（口頭叉は誌上発表）
現在投稿準備中である。

６、謝辞
本研究を遂行するにあたり研究助成を賜りました、一般用医薬品セルフメディケーション振興財団ならびに関係者の皆様に感謝申し上げます。

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59

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60図および表図および表1500

Cholecalciferol
1500 Cholecalciferol
Concentration of IL-10 in culture supernatant (pg/ml)

Concentration of IL-10 in culture supernatant (pg/ml)

図および表

1000

500

1000

500

0+ 0+++OVA (10-5 g/ml)+-7- (10- -5 g/ml)
10-9 10--8 10
Cholecalciferol (M) OVA
Cholecalciferol (M)+++10-9 10-8 10-7CD4CD4SSCSSC

Fig. 1. Effects of cholecalciferol on OVA-induced production of IL-10 from
Fig. 1. Effects of cholecalciferol on OVA-induced production of IL-10 fromof OVA-sensitized
mice. Splenocytes
isolated
fromsensitized
miceFig. 1.splenocytes
Effects of cholecalciferolon OVA-induced
productionof IL-10
fromsplenocytesof weresplenocytes of OVA-sensitized mice. Splenocytes isolated from sensitized mice wereincubatedwith OVA
inSplenocytes
the presenceor absencecholecalciferol
for 7incubateddays. Each
OVA-sensitized
mice.
isolatedfrom ofsensitizedmice wereincubated with OVA in the presence or absence of cholecalciferol for 7 days. Eachcolumn
represents
the meanor± absence
S.E.M. ofexperiment. for 7 days. Each column
with OVA
in the presenceof 1cholecalciferol
column represents the mean ± S.E.M. of 1 experiment.
represents the mean ± S.E.M. of 1 experiment.

FSC

CD3
FSC

CD3

Tr1

IL-10

IL-10

Tr1

Foxp3
Foxp3- CD4+ T cells.
2. cytometric
Flow cytometricof Tr1cells, IL-10-producing
Foxp3
Fig. 2. Fig.
Flowanalysisanalysis
of Tr1 cells,IL-10-producing
Foxp3- CD4+T cells.

Fig. 2. Flow cytometric analysis of Tr1 cells, IL-10-producing Foxp3- CD4+ T cells.

61Cholecalciferol

B

Levocetirizine

C0.6

***

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0Disodium cromoglycate
0.6% of Tr1 cells in 7-day cultured splenic cells% of Tr1 cells in 7-day cultured splenic cells

1.2% of Tr1 cells in 7-day cultured splenic cells

A0

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0OVA

➖

➕

➕

OVA➖

➕

➕

Cholecalciferol

➖

➖

➕

Levocetirizine

OVA➖

➖

➕

Disodiumcromoglycate➖

➕

➕

➖

➖

➕

Fig. 3. Effects of cholecalciferol, levocetirizine and disodium cromoglycate on OVAinduced
increasein Tr1 cells. Splenocytes
from sensitized
mice
Fig. 3. Effectsof cholecalciferol,levocetirizineisolated
and disodium
cromoglycate
on wereOVA-induced
incubatedwith OVA
in cells.
the presenceor absencecholecalciferol(A), levocetirizineincreasein Tr1Splenocytes
isolated offrom
sensitized mice
were incubated(B) or disodium(C) for7 days. Eachcolumn represents
the mean(B)± orwith OVAcromoglycate
in the presenceor absenceof cholecalciferol(A), levocetirizine
S.E.M. disodiumof 4 experiments.
***: (C)P<0.001.
cromoglycate
for 7 days. Each column represents the mean ± S.E.M.
of 4 experiments. ***: P<0.001.

62