構造生物化学研究室
Structural Biochemistry Laboratory
主任研究員

前 田 雄 一 郎
MAÉDA, Yuichiro

当研究室の研究対象は筋肉および細胞のアクチン・フィラメントである。アクチンフィラメン
トは細胞中で多くの重要な機能に関与していることが，近年の細胞生物学の発展で明らかとなってきた。多くの機能の中から，我々は「筋収縮」と，筋収縮の「カルシウム調節」の 2 つを取りあげて，それらメカニズムを深く理解することを目指す。筋収縮は，アクチンフィラメントとミオシンの滑り運動であり，カルシウム調節は，アクチン結合蛋白質（トロポニン・トロポミオシン）とミオシン分子がアクチンフィラメントに引き起こすアロステリック構造変化であろう。筋の生理学が明らかにしてきた現象を分子のレベルの現象として説明することが我々の目標である。その基本的態度は二点である。第一に，メカニズムの解明のためには，まず蛋白質分子の結晶構造を解明することが不可欠であるとの立場。第二に，しかし，得られた構造からメカニズムに到達することは更に重要であるとの立場，である。
昨年度から本年度にかけて，当研究室では三つの重要な蛋白質の結晶構造解明に成功した。第一は，トロポニン（3 量体）。これは筋収縮のカルシウム調節メカニズムの鍵を握る蛋白質である。第二は，CapZ（α-，β-ヘテロダイマー）。これはアクチンフィラメント B 端キャッピング蛋
白質である。第三は，トロポモジュリンの部分（C 端半分）
；P 端キャッピング蛋白質である。これらは多くの研究者から待望されていた成果であり，すべて初めての構造であったために，国際学会の場などで多くの議論がすでに交わされている。しかし，メカニズムを深く理解するとの目
標にはまだ距離がある。
今後の研究の中心的な課題は，メカニズムを全面的に理解するために，一方ではより大きな複合体，特にアクチンフィラメント全体の結晶構造を解明すること，他方ではアクチンフィラメン
ト上での蛋白質の動き（構造変化）を捉えることである。また，これらの課題をやり遂げるために，独自の研究方法と技術を開発し，蓄積していくことが依然として重要である。例えば，試料調製技術としての蛋白質大量発現系の開発・整備は不可欠であるし，また構造解析技術として，
電子顕微鏡を使った単粒子解析法，X 線繊維回折強度の解析法，蛍光 1 分子の立体方位測定法，などを新たに導入・開発して行く。
特に当研究室には藤澤哲郎先任研究員らのグループが所属し，SPring-8 の蛋白質小角散乱ビー
ムライン（BL45-XU）の運用とそれを使っての研究を担当している。X 線小角散乱法（繊維回折法と溶液散乱法）は複合体の構造を知る上で，また筋肉中あるいは溶液中での分子の構造変化を知る上で重要な方法である。特にビームラインの光源特性が優れていること，解析法が進歩した
こと，個々の分子の結晶構造が解明されたこと，などの要因が重なりその重要性は増している。
X 線小角散乱法の有効性をより高めるため，当研究室では高圧下での X 線溶液散乱測定システ
ムを独自に開発している。
1. トロポニン・トロポミオシンの構造とカルシウム調
節のメカニズム（1）トロポニン・トロポミオシン複合体の構造解析（武田 ＊1 ，山下，前田（雄）；前田（佳）＊2（細胞情報伝達研））
骨格筋および心筋の収縮制御の要となるトロポニン（Tn）
・
トロポミオシン（Tm）複合体の構造・機能解析を進めている。トロポニンは TnC（カルシウムイオン受容部），TnT，TnI の 3 サブユニットから成る複合体，他方トロポミオシ
ンは全長がほぼ α ヘリカル・コイルドコイルから成る細長
い分子である。筋の「細い繊維」はアクチンフィラメントに
トロポミオシンとトロポニンが結合した複合体である。筋収縮のカルシウム調節は TnC へのカルシウムイオン結合によって細いフィラメントの状態が変化し，ミオシン（モーター分子）との相互作用が調節される。この状態変化の実体を知るためには，トロポニンおよびトロポミオシンの立

理研研究年報体構造およびカルシウム濃度に依存した構造の変化を知ることが不可欠となる。
昨年度までに，調節に必須の部分を含むトロポニン複合体（Tn46k）より 2.8 Å 分解能のデータを得ていたが，本年度は理研ビームライン BL44B2 および BL45PX で得た 2 つの MAD（多波長異常分散）データセットより結晶構造を得ることに成功し，2.6 Å 分解能で精密化を行っている。これはトロポニン 3 量体としての初めての結晶構造であり，これによりサブユニット間の相互作用の詳細が明らかになった。さらにこの構造を基により大きな複合体（Tn52 k）の結晶を分子置換法により解くことに成功し，3.3 Å 分解能で精密化を行った。これらのトロポニンの結晶構造より，ト
ロポニンは複数のサブドメインに分かれ，サブドメイン間の連結は柔軟であることが明らかになった。この柔軟な連結に注目して収縮調節機構の仮説を構築している。

（ii）結晶化へ（前田（雄）；前田（佳）（細胞情報伝達研））
収縮調節機構をさらに詳しく知るためには，Tn/Tm 複構造の不安定さを理解するには分子の全長にわたる結晶
合体の結晶構造が必要である。Tn と（Tn 結合領域を含む）
構造が必要であると思われる。すでに N 端付近の断片の
短い Tm 断片との共結晶化が得られ，4.5 Å 分解能程度ま
結晶構造は既知であるが，現在，分子全体の構造解析に適でのデータ収集に成功している。今後位相決定を行い，モした結晶は得られていない。そこで蛋白質の立体構造を認デル構築へと進みたい。
識する抗体を得て，この抗体（Fv）との共結晶を作る目的（2）細いフィラメント上でのトロポニンの形態変化
で，ロブスタートロポミオシンに対する立体特異的なモノ
筋収縮のカルシウム調節メカニズムを知るために，細いクローナル抗体の調製を進めている。
（ドイツ・マックスプ
フィラメント上でのそれぞれの蛋白質分子の形態と形態変
ランク生物物理研究所，Dr. C. Hunte，Prof. H. Michel の化を解明しようとしている。
（i）トロポニンの位置変化（佐野，前田（雄）；前田（佳） 協力を得た）＊2（細胞情報伝達研））
2. アクチンフィラメントおよび細いフィラメント配向
トロポミオシンの領域 2–4 を削除した変異トロポミオシ
ゾルの X 線繊維回折ン D234Tm で再構成した細いフィラメントはカルシウムの筋肉の「細いフィラメント」は生体中でフィラメント構有無にかかわらず常に阻害状態をとる。TnI とアクチンの造として存在し機能する。機能研究のためにはこれらフィ間の蛍光エネルギー移動を D234Tm と正常 Tm とを比較
ラメント状態の構造を知る必要がある。この目的のために，検討して，どのような構造変化が筋収縮制御に必須である
我々はフィラメントをガラスキャピラリー中に高度に配向かを調べ，細いフィラメントがカルシウムおよび S1 結合させた配向ゾルのシステムをすでに確立し，X 線繊維回折によるトロポニンの位置変化に対応している 3 状態をとることを明らかにした。（福井大学工学部生物工学科，海氏， 強度から構造情報の抽出を目指してきた。
（1）アクチンフィラメントモデルの精密化（小田，前田
三木氏との共同研究）（ii）トロポニン C の構造変化（松本 ＊2 ，牧野 ＊3 ，前田 （雄））これまでのアクチンフィラメントの構造研究は，X 線繊（雄）；前田（佳）＊2 （細胞情報伝達研））
維回折と電子顕微鏡を用いて行われてきた。X 線繊維回折
細いフィラメント上での TnC の構造や構造変化を中性
は，高分解まで情報を記録することができるが，三次元再子散乱法を用いて調べている。この方法では，蛋白質分子構成に必要な構造因子のうち強度しか得られず，モデルのの選択的重水素化とコントラスト変調法を組み合わせるこ
ユニークネスに問題がある。また，電子顕微鏡による解析とにより，蛋白質複合体中のうち重水素化した特定成分のは，フィラメントの回折能が低いため，分解能 30 Å に相当
みからの構造情報を抽出することができる。すでに高重水する反射点でさえ著しい強度の減衰が観察され，この分解素化率（94%以上）の TnC を調製し細いフィラメント中の能を超えることはできていない。そこで，X 線繊維回折かTnC と交換する方法を確立した。中性子散乱強度を解析しらの強度と電子顕微鏡からの位相を使い，分解能 20 Å にてた結果，細いフィラメント中の TnC はカルシウムの存在に
三次元再構成を行った。得られた電子密度図から，フィラより慣性半径が小さくなり，またフィラメント軸からの距
メント中では，アクチンのサブドメイン 2 が伸びているこ
離も小さくなる方向に移動していることが示唆された。現と，C 末端の位置がアクチン単量体の結晶構造とは異なり，在モデルの精密化を行っている。
（原子力研究所先端基礎研
真下のアクチンサブユニットのサブドメイン 2 の近接に移究センター，藤原氏との共同研究）
動していることが示唆された。この研究で，アクチンのみ（3）トロポミオシンの構造と機能＊2からなるフィラメントの構造については，現在の技術で到（i）熱安定性（佐野，前田（雄）；前田（佳） （細胞情達可能な最良のモデルを得たと考えている。
（ドイツ・マッ
報伝達研））
クスプランク医科学研究所，Mr. H. Stegmann，Dr. R. R.
筋収縮のカルシウム調節機構の中でトロポミオシンはトSchröder，Prof. K. C. Holmes；ERATO 難波プロジェク
ロポニンと協同して重要な役割を担っている。トロポミオ
ト，難波氏，長谷川氏との共同研究）
シンがあって始めてアクチンフィラメントの（ミオシン分子（2）ファロイジンやドラスタチン 11 の結合部位（小田，との相互作用に見る）状態変化が協同的となる。この協同前田（雄））
性の原因は，トロポミオシンが列車のように head-to-tail に
アクチンは細胞骨格を形成する主な蛋白質であり，アク
連結してアクチンフィラメントに沿って縦走すること，トロチンの重合・脱重合を伴う細胞骨格の消滅・構築，そして，
ポミオシン分子は全長にわたって平行な 2 本鎖の α-helical
その制御が細胞の恒常性にとって重要である。ガンなどのcoiled-coil 構造であること，そして長さ方向に coiled-coil 構
疾病ではこの細胞骨格の暴走が起こっている。ファロイジ造が安定な部分と不安定な部分があり，しかも分子全体とンやドラスタチン 11 など，アクチンフィラメントに結合すして適当に不安定なこと，に求められよう，構造の不安定るペプチドは，脱重合を抑制するので，強制的にこの暴走さが機能発現（アクチンの状態変化を協同的にする）に重要であると考えられるが，それを実証したい。そのために， を抑える対処薬として期待されている。この研究では，こ普通のトロポミオシンに比して分子全体がより安定である， れらのペプチドとアクチンとの相互作用を分子レベルで理解するために，アクチン上の結合部位を決定した。
あるいは不安定である変異分子を調製することを試みていまず結合部位を決定する方法を開発した（詳細は省略）。
る。安定な部分を切除すれば分子の安定度が低下すると予ファロイジンとドラスタチン 11 は，アクチンフィラメント
想したが，実際には反対に安定度は上昇して，この方向での別の位置に結合するが，ともに，フィラメント形成に重の試みは失敗であった。
（福井大学工学部生物工学科，志鷹
要な 2 本のストランド間に結合し，この 2 本のストランド
氏，海氏，三木氏との共同研究）

平成 13 年度

れは既に昆虫細胞での発現系を確立してある。
(d) アクチンの昆虫細胞での発現系を確立しつつある。
（4. 参照）（2）トロポモジュリンの結晶構造の解明（Krieger＊3 ，山下，似内 ＊2 ，前田（雄））トロポモジュリンはアクチン・トロポミオシン・フィラメ
ントの P 端に結合しフィラメントの長さや安定性を制御する蛋白質である。アクチンの重合・脱重合を基にした細胞
内オルガネラ輸送において重要な役割を果たしており，また筋肉においてはアクチンフィラメントの長さを一定に保つ仕組みをも担っているらしい。
昨年度に，この蛋白質の C 端半分の結晶構造を解明した。
この C 端半分は Leucine-Rich Repeat（LRR）という繰返し構造からなるコンパクトなドメインを形成しており，この構造はアクチンとの結合に使われているらしい。本年度は，得られた結晶構造を詳細に検討して，アクチンとの結合様式と P 端キャッピングのメカニズムについての仮説を提唱した。P 端あたりトロポモジュリン 1 分子が結合し，この分子はフィラメントの伸長点に結合して，そこへのア
クチン単量体結合を競合的に阻害するのであろう（米国・ニュージャージー医科歯科大学，Dr. Kostyukova との共同
研究）。
（3）トロポミオシン・トロポモジュリンの結合（佐野，前田（雄）；前田（佳）＊2 （細胞情報伝達研））
3. 短く長さの揃ったアクチンフィラメントの調製法の確立をめざしてトロポモジュリンは，一方でアクチンと，他方でトロポ（1）計画の全体と発現系の確立（山下，瀧 ＊2 ，似内 ＊2 ， ミオシンと結合しアクチンフィラメントをキャッピングする。現在，トロポモジュリンとトロポミオシンの結合比を
岩佐 ＊2 ，佐野，前田（佳）＊2 ，前田（雄））確定することを試みている。
筋肉の「細いフィラメント」は複合体として機能を担う（4）CapZ の結晶構造の解明（山下，前田（雄）；前田（佳）
ので，筋収縮のメカニズムとカルシウム調節のメカニズム＊2を知るには，どうしても複合体全体の立体構造を知ること（細胞情報伝達研））が必要である。特に蛋白質間の相互作用を理解するためにCapZ は，アクチンフィラメントの B 端をキャッピングすは，X 線結晶構造解析法によってフィラメント全体の原子る蛋白質で，筋肉や一般の細胞内でアクチンフィラメント
座標を得る必要がある。ところが「細いフィラメント」の核の安定化，フィラメントの配向やネットワークの形成，フィをなすアクチンは長いフィラメントになり易く，フィラメ
ラメントのダイナミクスの制御に重要な役割を担っている。
ントの結晶はこれまで不可能とされてきた。そこで，我々またそのアクチンキャッピング活性は細胞骨格運動の調節
は，以下の 4 つの方法をすべて検討して，長さの揃った短物質であるリン脂質によって阻害されることが報告されていフィラメントを調製して結晶化する課題に挑戦している。 おり，CapZ は細胞情報伝達系からの情報を受けアクチン（i）両端での伸長を抑えるキャッピング蛋白質と，長さをの重合・脱重合を制御することによって，細胞運動を制御
決める「物差し」蛋白質を活用して人工的に作る。
する一役を担っていると考えられる。本研究では，これら
まず，B 端をキャップする CapZ，P 端をキャップするトロ
CapZ の機能発現のメカニズムを解明するために CapZ のポモジュリンの 2 つの蛋白質の結晶構造を解明した。
（後述） 結晶構造を解明した。この蛋白質の構造はこれまでまった（ii）化学架橋したアクチン・オリゴマーとキャッピング
く未知であった。
蛋白質との結晶化を試みる。
本年度良質の CapZ 結晶を得ることができ，SPinrg-8 の（iii）アクチンフィラメントをつくりにくいアクチンの変
理研ビームライン I（BL45XU）および II（BL44B2）にて異体をつくり，キャッピング蛋白質との結晶化を試みる。
その回折強度データ収集を行い，金誘導体および白金誘導（iv）自然界に存在する短いアクチンフィラメントを単離体結晶を用いた MAD 法によって 2.2 Å 分解能での立体構する。この目的でダイナクチン複合体の単離法の改良を試造を解明することに成功した。CapZ は α（33 kDa）およみている。（後述）び β（31 kDa）の異なる 2 つのサブユニットからなるヘテ
この一連の研究の基礎として，以下の蛋白質の発現系をロ二量体蛋白質で，両者のアミノ酸配列に相同性はないが，これまでに確立した。
今回の構造は，両サブユニットが非常に類似した立体構造を取っており，それらが擬似 2 回対称の関係で会合して 1(a) トロポモジュリンの各種アイソフォームをクローニ
つの分子を形成していることを示す。さらに，これまでのングし昆虫細胞（Sf9）での発現系を確立した。
知見と照合すると CapZ にはアクチン結合部位が 2 箇所存(b) 「物差し」蛋白質として使うためトロポミオシンの在し，それらがやはり 2 回対称で関係づけられる位置にあ昆虫細胞（Sf9）での発現系を確立した。
ると結論された。これはいささか意外である。というのも，(c) B 端キャッピング蛋白質としては CapZ を使うが，この解離を抑制することによって，フィラメント構造を安定化すると結論された。（米国・アリゾナ大学化学科，Prof.
R. B. Bates，Prof. Z. D. Crane，Prof. C. W. Dicus，Prof.
B. A. Suﬁ との共同研究）（3）筋肉「細いフィラメント」のカルシウム結合による構造変化（小田，牧野 ＊3 ，西川 ＊4 ，藤沢，前田（雄））配向ゾルを調製し X 線繊維回折強度から構造情報を得る
方法を筋肉の「細いフィラメント」に適用している。近年
フィラメントを構成する蛋白質単体の結晶構造が明らかにされているので，この原子構造と X 線繊維回折強度を結合することによって信頼性の高い構造モデルを構築できると考えている。これまで配向ゾル調製法に改良を加えてきた
結果，SPring-8 の高輝度 X 線を用いることで高分解能領域
まで回折強度を得ることができるようになった。本年度は特に解析に必要なプログラムの改良を行った。予備的な解析の結果では，トロポニンのカルシウム調節に重要な部分の構造はフィラメント軸方向に細長く伸びた構造をしていることが示唆された。これは本年明らかになったトロポニンの結晶構造とよく符号する。現在これらのデータを用いてアクチンフィラメント上でのトロポニンの構造変化のより詳細なモデルを検討中である。
（ERATO 難波プロジェク
ト，長谷川氏，難波氏との共同研究）

理研研究年報フィラメント端でのアクチン分子の配置は 2/1 らせん対称であるのに，そこに 2 回対称の CapZ が結合している。この対称性の違いを補正して結合を適合させるために，CapZはホモ二量体ではなくヘテロ二量体構造を取っているものと推測される。
（5）生体内に存在するフィラメント複合体の結晶化をめざして（瀧 ＊2 ，前田（雄）；前田（佳）＊2（細胞情報伝達研））
自然界に存在するアクチン・ミニフィラメントとしてダイ
ナクチン複合体を対象に選び，その結晶構造解析を進める
ために分離・大量精製に取り組んでいる。ダイナクチンは，
ダイニンとダイニンが輸送する積み荷（膜，小胞体，染色体など）の間のリンカーとして働いている分子量約 1.03 MD，11 種の蛋白質からなる巨大複合体であり，複合体中にアクチンとアクチン様蛋白質（Actin related protein，Arp1）から形成されるミニフィラメントを含む。本年度は，牛脳からこの複合体全体の大量精製に成功した。しかしその直後，国内で狂牛病（BSE）が発見され牛脳の供給が途絶えたため，ブタ脳に切換え，ブタ脳からも複合体を得ることができた。現在，結晶化条件の検索を行っている。
（米国，ジョ
ン・ホプキンス大学，Prof. T. Schroer との共同研究）
4. 昆虫細胞を用いた高効率蛋白質発現系の構築（1）発現増強因子（佐野，前田（雄）；前田（佳）＊2 （細胞情報伝達研））
大腸菌発現系を用いて得られた蛋白質試料に問題がある
場合，従来バキュロウイルス・昆虫培養細胞を用いた発現系が利用されてきた。しかし収量が不足であることも多い。
我々は，21 残基からなるロブスター由来のリーダー配列(L21) により，バキュロウイルス発現系において，細胞骨格蛋白質の発現量の大幅な上昇が見られることを見いだした。そこで，L21 の効果の一般性を検討するためにホタル・
ルシフェラーゼを発現した。L21 を 5’ 非翻訳領域に挿入した場合，その発現量は L21 がないときに比べ約 7 倍上昇した。さらに L21 の内部配列の検討を行い，L21 に存在する
2 つの sequence element の両方が L21 による発現量の上昇に必須であることを明らかにした。
（2）アクチンの大量発現（岩佐 ＊2 ，佐野，前田（雄）；前田（佳）＊2 （細胞情報伝達研））
上述の発現促進因子を用いてアクチン発現量も飛躍的に向上することを見いだした。アクチンフィラメントの構造
変化と機能発現の関係を深く理解するためには，アクチンを組換え蛋白質として大量に得ることが不可欠であるが，これまで世界のどこでも成功していなかった。現在，精製法の検討を行っている。
5. 大型放射光施設を利用しての生体高分子溶液中および筋肉中での構造生物研究（1）理研ビームライン I（BL45-SAXS）の高度化（藤澤，西川 ＊4 ，高橋 ＊5 ）BL45XU において小角散乱ブランチと結晶構造解析ブランチの共同運用を円滑にするために，現在小角散乱で使用している波長を 1.0 Å から 0.9 Å に変更した。それに伴い
0.9 Å 使用時に結晶側の GAP 変更に伴うビーム位置の変動，強度の変化，検出器の応答などを評価した。
（2）高圧下での蛋白質相互作用研究システムの構築（i）電気泳動装置の開発（藤澤，Shtykova＊3 ，桑本 ＊2 ，西川 ＊4 ）
2,000 気圧の高圧下での蛋白質の振る舞いを調べるために native ポリアクリルアミド電気泳動を高圧下で行う高圧
電気泳動装置を開発した。標準蛋白質として牛血清アルブ
ミンとアポフェリチンを用いて最適条件を決定し，2,000 気
圧下でも電気泳動が正常に行われることを立証した。
（ii）高圧ストップドフロー装置の開発（藤澤，桑本 ＊2 ，
西川 ＊4 ）
2,000 気圧下での 2 液混合を行い，蛋白質の構造変化をX 線小角散乱によりモニターする事が可能な装置を開発している。本年度は 2 液混合のミキサー部を改造し，様々な方式の流路を持つミキサーを製作し，その評価を行った。
（iii）筋蛋白質への応用（桑本 ＊2 ，藤澤，西川 ＊4 ）X 線小角散乱用高圧ジャンプ装置を用いて平滑筋ミオシ
ン S1，骨格筋ミオシン S1，骨格筋ミオシン HMM の分子
形態の圧応答を調べる予備実験を行った。実験には単分散系のサンプルが必要とされるため，papain，chymotrypsin
そして V8 protease で調製した S1 に関しての会合特性を調べた。その結果，chymotrypsin 処理による骨格筋 S1 は安定性も高く，ATP 結合に伴って回転半径が 5%変化した。
この系について高圧条件での最適化を行った。
（室蘭工大大学院工学研究科，岡本氏との共同研究）（3）筋蛋白質と筋肉の構造変化
筋肉中には蛋白質分子が極めて良く秩序だって集合しているので，生きて動いている筋肉からの X 線回折強度には
蛋白質分子の形態変化の情報が含まれている。筋肉からのX 線回折強度はそのままでは解釈できないが，主要な構成
蛋白質の結晶構造の情報と，また電子顕微鏡で解明された
筋細胞中でのこれらの蛋白質の配置についての情報を結合することで，構造変化を解釈することが可能になってきた。
（i）ホタテ貝ミオシンの構造変化（Popp＊2 ，Shtykova＊3 ，桑本 ＊2 ，藤澤，前田（雄））筋収縮の張力発生はミオシン分子の “頭振り” に因るとの説のひとつの根拠は，ミオシン分子の ATP 結合部位の状態に対応して結晶中でのミオシン頭部の形態が異なるとの実験結果である。しかし，この対応関係が筋肉中でも成り立つとの証拠はない。ここでは結晶中での形態変化の根拠に使われているホタテ貝柱ミオシンを取上げ，溶液中での構造変化，筋肉中での構造変化を解明する。本年度はホ
タテ貝ミオシンから均一で X 線溶液散乱法に適したミオシ
ン頭部を単離精製する方法を確立した。
（ii）甲殻類筋肉の X 線回折（Popp＊2 ，藤澤，前田（雄））従来，カエル筋からの X 線回折強度が解析されてきたが，本研究では甲殻類（ロブスター）筋肉を用いる。この筋肉はアクチンフィラメントが長く，また筋の単位断面積あたり本数が多いので特にアクチンフィラメントの構造変化の測定には有利である。本年度は，本研究に必要な温度制御付きの測定系を構築し，ビームライン BL45 で使用を開始
した。
（iii）架橋処理 X 線回折像による筋肉の細いフィラメン
ト蛋白質の状態研究（藤澤；鈴木 ＊6 （光物性研究チーム，
FRS））
骨格筋細いフィラメントの制御システムには，“oﬀ”（Ca2+非結合），“on”（Ca2+ 結合），“potentiated”（ミオシン頭

平成 13 年度

部と強い結合をもつ）” の 3 つの状態がある。生化学的な研究は，“on” 状態だけがミオシンと弱い相互作用を与えることを示した。これらの状態間の平衡は，実験条件により容易にシフトするためそれぞれの状態の特徴づけは非常に困難である。この問題を克服するために，我々は 3 つの状態の骨格筋細いフィラメントを EDC で架橋した。制御蛋白質の状態は，X 線回折強度で確認した。“on” 状態で架橋した細いフィラメントは第 2 層線強度を “potentiated” 状態のレベルに上昇させることなしに，ミオシン頭部と強く相互作用し，しかも ATP 分解反応はアクチンにより加速された。これは，生化学的研究からの予想と反対し，EDC 架
橋してもカルシウム制御系は正常に機能しており，構造の研究に適していることを示している。アクチン第 2 層線強度と機能の間の非対応は，細いフィラメント制御機構に新たな見識を提供した。
（高輝度光科学財団，岩本氏；通信総合研究所，大岩氏との共同研究）（iv）微小ビームを用いた単一筋原繊維からの小角 X 線
回折（西川 ＊4 ，藤澤）ピンホールスリットにより 0.9 µm に整形したビームを単
一筋原繊維に照射したところ，アクチンフィラメントとミオシンフィラメントで形成される 6 方格子に対応する回折点が得られた。これにより生体内での秩序構造がサルコメ
ア周期を超えて 1 mm 程度の長さに維持されていることが初めて示された。このマイクロビームを使えば，光学顕微
鏡観察に適したサイズの組織から，分子の配置についての情報を得られる。他の生体内秩序構造への応用が期待される。（高輝度光科学財団，岩本氏，若山氏との共同研究）（4）X 線溶液散乱法によるクラミドモナス鞭毛内腕ダイ
ニン亜種 c の分子構造（藤澤）クラミドモナス鞭毛内腕ダイニンは，電子顕微鏡の負染色法観察ではカーボン支持膜上でドーナツ状の頭部から微小管結合部位とされる柄（stalk）と幹（stem）が突出していることが知られている。溶液中での形態を確認するためにダイニンの希薄溶液（0.1 mg/ml 以下）からの X 線溶液
散乱を ab initio 法を用いて三次元形状を推定した。その結果ドーナツ状の頭部と幹は確認されたが柄の部分は頭部の裏側に巻き込んでいるような形となった。（通信総合研究所，大岩氏；高輝度光科学財団，岩本氏との共同研究）（5）CAG リピート病の配列を持つ変異ミオグロビンのフィラメント形成初期課程の研究（田中 ＊4 （CAG リピー
ト病研究チーム，BSI）藤澤，西川 ＊4 ）CAG リピート病は CAG リピート配列（ポリグルタミン）が挿入された蛋白質がアミロイドを形成する病気であることが知られている。50 個の CAG リピート配列を挿入した
変異ミオグロビンのアミロイド繊維形成過程を X 線溶液散
乱で調べ，繊維を形成する前に回転半径 110 Å 程度の中間体を経ることが判明した。
（6）人工設計蛋白質の構造評価（藤澤，新井 ＊7 ，西川 ＊4 ）2 つの緑色蛍光蛋白質 EBFP と EGFP からなるキメラ蛋
白質のリンカー部分を設計し，その全体構造を溶液散乱により得られた散乱曲線を使って電子密度像を計算した。さらにその低分解能電子密度像に対し高分解能構造をモデリングする事によりリンカー部分の構造を推定した。（米国
Scripps 研究所，Dr. W. Willy との共同研究）（7）時分割溶液散乱による蛋白質 refolding の研究（鵜澤理研研究年報＊8，高橋 ＊6 ，木村 ＊8 ，西川 ＊4 ，藤澤）
高速混合型フローセルを用いてチトクローム C の 2 次構造形成と 3 次構造形成の相関について初めて実験的に明らかにした。また，アポミオグロビンの構造形成を調べるた
めに様々な状態のアポミオグロビンの溶液構造に対し X 線
小角散乱測定を行い，サブミリ秒の時分割溶液散乱測定の予備実験を行った。
（京都大学大学院工学研究科，秋山氏との共同研究）＊1

科学技術振興事業団さきがけ研究 21 研究員兼務，＊2 研
究協力員，＊3 協力研究員，＊4 基礎科学特別研究員，＊5 委
託研究生，＊6 共同研究員，＊7 ジュニア・リサーチ・アソシ
エイト，＊8 研修生

Research Subjects and Members of Structural
Biochemistry Laboratory
1. Mechanism of Calcium Regulation of Muscle Contraction
2. Mechanism of Muscle Contraction
3. Mechanism of Actin Filament-Dynamics Driven
Movement of Cell Organelle
4. Mechanism of Capping and the Stabilization of Actin
Filament
5. Establishing New Methods for Structural Analysis
of Large Protein Complexes as well as for Studying
Movements of Protein Molecules within Complexes
6. Structural Studies on Protein Solutions Using Synchrotron Small-Angle X-ray Scattering

Head
Dr. Yuichiro MAÉDA

Members
Dr. Tetsuro FUJISAWA
Dr. Toshiro ODA
Dr. Soichi TAKEDA
Dr. Atsuko YAMASHITA
Dr. Ken-Ichi SANO
Mr. Akihiro YAMAMOTO
Dr. Yukihiro NISHIKAWA＊1
Ms. Inna KRIEGER＊2
Mr. Kouji MAKINO＊2
Ms. Evegenia SHTYKOVA＊2
Mr. Mitsusada IWASA＊2
Mr. Shigeo KUWAMOTO＊2
Ms. Fumiko MATSUMOTO＊2
Dr. Yasushi NITANAI＊2
Dr. David POPP＊2
Dr. Keiko TAKI＊2＊1＊2

Special Postdoctoral Researcher
Contract Researcherin collaboration with
Dr. Kayo MAEDA (Cellular Signaling Lab.)
Dr. Motomasa TANAKA (Lab. for CAG Repeat Diseases, BSI)
Dr. Takuya SUZUKI (Lab. for Tera-Photonics, PRC)
Dr. Hiroyuki IWAMOTO (JASRI)

Visiting Members
Dr. Satoshi TAKAHASHI (Sch. Technol. Kyoto Univ.)
Dr. Yojiro TAMURA (Suzuka Natl. Coll. Technol.)Trainees
Mr. Yoshikazu TAKAHASHI, (Toray Res. Cen.)
Mr. Takanori UZAWA (Fac. Eng., Kyoto Univ.)
Mr. Tetsunari KIMURA (Fac. Eng., Kyoto Univ.)誌 上 発 表 Publications［雑誌］（原著論文） ＊印は査読制度がある論文誌
Nakasako M., Fujisawa T., Adachi S., Kudo T., andHiguchi S.: “Large-scale domain movements and hydration structure changes in the active-site cleft of unligatedglutamate dehydrogenase from thermococcus profundus
studied by cryogenic X-ray crystal structure analysis andsmall-angle X-ray scattering”, Biochemistry 40, 3069–
3079 (2001). ＊Kostyukova A. S., Tiktopulo E. I., and Maeda Y.: “Folding properties of functional domains of tropomodulin”,
Biophys. J. 81, 345–351 (2001). ＊Toyokawa H., Fujisawa T., Inoko Y., Nagayoshi T., Nishii
Y., Nishikawa Y., Ochi A., Suzuki M., and Tanimori T.:“Performance of a micro-strip gas chamber in solution
X-ray scattering”, Nucl. Instrum. Methods Phys. Res. A
467, 1144–1147 (2001). ＊Nishikawa Y., Fujisawa T., Inoko Y., and Moritoki M.:“Improvement of a high pressure cell with diamond windows for solution X-ray scattering of proteins”, Nucl.
Instrum. Methods Phys. Res. A 467/468, 1384–1387(2001). ＊Hai H., Sano K., Maeda K., Maeda Y., and Miki M.:“Ca2+ - and S1-induced conformational changes of reconstituted skeletal muscle thin ﬁlaments observed by ﬂuorescence energy transfer spectroscopy: Structural evidence for three states of thin ﬁlament”, J. Biochem. 131,
407–418 (2002). ＊Akiyama S., Takahashi S., Kimura T., Ishimori K.,
Morishima I., Nishikawa Y., and Fujisawa T.: “Conformational landscape of cytochrome c folding studied
by microsecond-resolved small-angle x-ray scattering”,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1329–1334 (2002). ＊（総 説）岩本裕之, 大岩和弘, 鈴木拓, 藤澤哲郎: “活性化された筋収縮蛋白の X 線繊維回折”, SPring-8 利用者情報 6, 223–226(2001).

［単行本・Proc.］（総 説）
Fujisawa T., Nishikawa Y., and Inoko Y.: “The use ofa small-angle X-ray scattering technique with a thirdgeneration synchrotron X-ray source in high-pressure
biochemistry”, Trends in High Pressure Bioscience andBiotechnology, edited by Hayashi R., Elsevier Science,
Amsterdam, pp. 615–620 (2002).
口 頭 発 表 Oral Presentations（国際会議等）
Krieger I., Kostyukova A., Yamashita A., Tiktopulo E. I.,
Fujisawa T., and Maeda Y.: “Crystal structure of the
C-terminal half of tropomodulin and the mechanism of
P-end capping”, Alpbach Workshop on Molecular Motors, 2001, (Max Planck Institute for Medical Research),
Alpbach, Austria, Apr. (2001).
Oda T. and Holmes K. C.: “Determination of phallodin
position in f-actin using the ﬁbre diﬀraction data”, 10th
Ann. Fibre Diﬀraction and Non-Crystalline Diﬀraction
Workshop, (Collaborative Computational Project for Fibre Diﬀraction (CCP13)), Stirling, UK, June (2001).
Takahashi S., Akiyama S., Kimura T., Ishimori K.,
Morishima I., Nishikawa Y., and Fujisawa T.: “The timing of secondary and tertiary structure formations observed in fast folding processes of globular proteins”, 8th
CGGH Symp. on New Paradigms of Molecular Chaperones in the Postgenome Era, (The Biochemical Societyof Japan), Sapporo, Aug. (2001).
Oda T.: “Structural analysis of F-actin using X-ray ﬁbre diﬀraction from ﬁlament sols”, Alpbach Workshop
on Coiled-coins, Collagen & Co-proteins III , Alpbach,
Austria, Sept. (2001).
Oda T.: “Comparison of F-actin models using X-ray ﬁbrediﬀraction”, RIKEN Symp. on Int. Workshop on Actin
Filament from Structure to Mechanism, Harima, Nov.
(2001).
Yamashita A., Maeda K., and Maeda Y.: “Crystal structure of actin capping protein CapZ”, RIKEN Symp.
on Int. Workshop on Actin Filament from Structure to
Mechanism, Harima, Nov. (2001).
Krieger I., Kostyukova A., Yamashita A., Nitanai Y., andMaeda Y.: “Crystal structure of the C-terminal half of
tropomodulin: A leucine-rich repeat domain caps actin
ﬁlament”, RIKEN Symp. on Int. Workshop on Actin
Filament from Structure to Mechanism, Harima, Nov.
(2001).
Sano K., Maeda K., Oki M., and Maeda Y.: “Enhancement of protein expression in insect cells: using a leader
sequence of lobster tropomyosin cDNA”, RIKEN Symp.
on Int. Workshop on Actin Filament from Structure to
Mechanism, Harima, Nov. (2001).
Kimura C., Hai H., Maeda K., Maeda Y., and Miki M.:“The behavior of N-terminal and C-terminal region of
TnI on the reconstituted thin ﬁlament observed by ﬂu-

平成 13 年度

oresence measurements”, RIKEN Symp. on Int. Workshop on Actin Filament from Structure to Mechanism,
Harima, Nov. (2001).
Shitaka Y., Sano K., Hai H., Maeda K., Maeda Y., andMiki M.: “Thermal stability of tropomyosin”, RIKEN
Symp. on Int. Workshop on Actin Filament from Structure to Mechanism, Harima, Nov. (2001).
Hai H., Sano K., Maeda K., Maeda Y., and Miki M.:“Ca2+ -and S1-induced conformational changes of reconstituted skeletal muscle thin ﬁlaments observed by
ﬂuorescence energy transfer spectroscopy: Structural evidence for three-states of thin ﬁlament”, RIKEN Symp.
on Int. Workshop on Actin Filament from Structure to
Mechanism, Harima, Nov. (2001).
Matsumoto F., Makino K., Maeda K., Patzelt H., Maeda
Y., and Fujiwara S.: “In situ structural information of
troponin C on the thin ﬁlament obtained by neutron
scattering”, RIKEN Symp. on Int. Workshop on Actin
Filament from Structure to Mechanism, Harima, Nov.
(2001).
Yamashita A., Maeda K., and Maeda Y.: “Crystal structure of actin capping protein CapZ”, 46th Ann. Meet. ofBiophysical Soc., San Francisco, USA, Feb. (2002).
Krieger I., Kostyukova A., Yamashita A., Nitanai Y., andMaeda Y.: “Crystal structure of the C-terminal half of
tropomodulin: A leucine-rich repeat domain caps actin
ﬁlament”, 46th Ann. Meet. of Biophysical Soc., San
Francisco, USA, Feb. (2002).
Takeda S., Yamashita A., Maeda K., and Maeda Y.:“Crystal structure of troponin ternary complex”, 46th
Ann. Meet. of Biophysical Soc., San Francisco, USA,
Feb. (2002).
Shtykova E., Fujisawa T., Kuwamoto S., Nishikawa Y., andMaeda Y.: “High-pressure electrophoresis: A tool for investigating protein aggregation state and protein-protein
interaction”, Canada-UK-Japan Joint Symp. on Toward
Post DNA-Sequencing Era, Yokohama, Feb. (2002).
（国内会議）
藤澤哲郎: “第 3 世代放射光 X 線小角散乱の高圧生物化学への応用”, 日本材料学会 149 回高圧部門委員会, 草津, 4
月 (2001).
秋山修志, 高橋聡, 原田治幸, 石森浩一郎, 森島績, 西川幸宏,
藤澤哲郎: “マイクロ秒分別の X 線小角散乱とパルスラベ
ル NMR 法で観測したシトクロム C の折れ畳みランドス
ケープ”, 第 1 回日本蛋白質科学会年会, 吹田, 6 月 (2001).
松本富美子, 前田佳代, Patzelt H., 大木進野, 前田雄一郎,
藤原悟: “中性子溶液散乱による細いフィラメント上でのトロポニン C 形態の解明”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
海宏, 佐野健一, 前田佳代, 前田雄一郎, 三木正雄: “D234 変
異トロポミオシンを使った再構成細いフィラメントの蛍
光エネルギー移動測定”, 第 39 回日本生物物理学会年会,
吹田, 10 月 (2001).

理研研究年報大岩和弘, Burgess S. A., Walker M., Trinick J., 藤澤哲郎,
岩本裕之, 榊原斉: “X 線回折電子顕微鏡単粒子解析法お
よび X 線溶液散乱法によるクラミドモナス鞭毛内腕ダイ
ニン亜種 c の分子構造の解析”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
山下敦子, 前田佳代, 前田雄一郎: “アクチンキャッピングタ
ンパク質 CapZ の結晶構造解析”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
若山純一, 藤澤哲郎, 岩本裕之: “コントラスト変調法による骨格筋繊維の X 線回折像の解析”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
鵜澤尊規, 秋山修志, 木村哲就, 高橋聡, 石森浩一郎, 森島績,
西川幸宏, 藤澤哲郎: “サブミリ秒 X 線小角散乱測定を用いたアポミオグロビンの折れ畳み過程の研究”, 第 39 回
日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
武田壮一, 山下敦子, 前田雄一郎: “トロポニントロポミオ
シン複合体の結晶化と構造解析の戦略”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
志鷹祐司, 佐野健一, 海宏, 前田佳代, 前田雄一郎, 三木正雄:“トロポミオシンの熱安定性”, 第 39 回日本生物物理学会
年会, 吹田, 10 月 (2001).
Krieger I., Kostyukova A. S., 山下敦子, 前田雄一郎: “トロ
ポモジュリン C 端半分の結晶構造：LRR ドメインがア
クチンフィラメントの P 端をキャップする”, 第 39 回日
本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
高橋義和, 西川幸宏, 前田雄一郎, 藤澤哲郎: “一次元溶液散
乱曲線から低分解能三次元蛋白質形状の計算-2-”, 第 39回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
田中元雅, 西川幸宏, 町田陽子, 森島績, 藤澤哲郎, 貫名信行:“凝集性アミノ酸配列を有するミオグロビンの性質と構造的特徴”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月
(2001).
木邑智恵子, 海宏, 前田佳代, 前田雄一郎, 三木正雄: “蛍光偏光解消法による TnI の N 端/C 端側と thin ﬁlament 構
成タンパク質との相互作用の比較”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月 (2001).
岩本裕之, 大岩和弘, 若山純一, 藤澤哲郎: “軽鎖を除去または交換したアクト-S1 複合体の ADP による構造変化のX 線回折”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月
(2001).
田嶋佳子, 牧野浩司, 若林克三: “軟体動物平滑筋のキャッチ
状態の構造”, 第 39 回日本生物物理学会年会, 吹田, 10 月
(2001).
田中元雅, 町田陽子, 西川幸宏, 赤木巧, 森島績, 端川勉, 藤澤
哲郎, 貫名信行: “神経変性における病因遺伝子産物構造変化の解析”, 文科省科研費特定領域研究 C「先端脳」平
成 13 年度班会議, 東京, 12 月 (2001).
山下敦子, 前田佳代, 前田雄一郎: “アクチンキャッピングタ
ンパク質 CapZ の結晶構造”, 2002 年生体運動研究合同班
会議, 千葉, 1 月 (2002).
武田壮一, 山下敦子, 前田佳代, 前田雄一郎: “トロポニンの結晶構造とカルシウム調節のメカニズム”, 理研シンポジ
ウム「構造生物学 (VII)」, 播磨, 3 月 (2002).