溶液 NMR 測定における磁場と分解能および感度の比較検討〇尾山 公一 A)、沢田義治 B)
A)

分析・物質技術支援室 組成分析・構造解析技術グループ

B)

国立大学法人東海国立大学機構岐阜大学 高等研究院全学技術センター科学研究基盤技術支援室

概要
400、500、600、800 MHz の核磁気共鳴装置 (NMR)を用いて、磁場、分解能および感度の比較検討を行った。2022 年現在で稼働している装置で、低分子有機化合物の 1H および13C の測定においてこれらの選択がどのように測定結果に影響するのかに興味を持ち調べた。いくつかの有機化合物を測定したが、入手が容易で重クロロホルム (CDCl3)に良く溶けて室温で安定かつ適度に複雑なスペクトルパターンを与えるβ-D-glucose pentaacetate を主に用いて系統的に 1 次元と 2 次元の測定を行った。
1. はじめに400、500、600 および 800 MHzの核磁気共鳴装置 (NMR)を用いて、溶液 NMR の磁場の大きさの違いによる分解能および感度の比較検討を行なった。装置は名古屋大学と岐阜大学の NMR を用いた(図1, 2)。名古屋大学の NMR は、物質科学国際研究センター化学測定機器室の日本電子製の 400、500 および 600 MHz の装置を用いた。岐阜大学のNMR は、高等研究院科学研究基盤センター機器分
析分野の Bruker 社製の600 と 800 MHz の装置を用いた。大学における溶液 NMR 測定では図 3 のような有機化合物の測定に使用されることが多い。NMR 測定では、サンプル量は常に十分な測定量があるとは限らない上、サンプルの性質が測定上問題となることがある。どの1程度の濃度で測定するか、どの溶媒を使用するか、どのくらいの磁場の大きさのどのような測定方法を選択するかが測定データの質を大きく左右する。例えば、化合物の溶解度の特性上サンプル濃度を上げられないときは濃度の問題が重大な問題となる。また、4 級炭素は感度が低いことや立体的に混み入った構造では予想外の挙動を示すことなどを考慮した化合物の構造の特性を見極めた測定方法の選択が重要になることもある。研究のスピードに直結する積算回数の選択も重要な測定ファクターである。本調査研究では、測定条件の違いとしてサンプル濃度、磁場の大きさおよび積算回数に特に焦点を当てて行った。また、NMR の世界二大メーカを比較検討できたのも特徴である(図 1, 2)。NMR 測定では低温で測定すると感度が向上することが知られている。クライオプローブを用いた測定を行うことができたので 600 MHz の NMR を用いて感度の限界にも挑戦した。測定化合物は、
図 3 のβ-D-glucose pentaacetate (1)を主に用いて行った。2022 年現在で稼働している NMR装置を用いて実測のデータを取得して測定の傾向や限界の実際について比較検討し、最新の溶液 NMR の測定指針の参考となる情報を得たので報告する。

1. β-D-glucose pentaacetate (1)の 1 次元測定について最も汎用的に使用されている 400 MHz の NMR (JNMECZ400, JEOL)を用いて、β-Dglucose pentaacetate (1) (図 3)の 1H-NMR (図 4)と 13C-NMR(図 5)を測定した。
測定サンプルは、0.6 mL の CDCl3 に 20mg の 1 を溶かして調整した。
それぞれのスペクトルの帰属は、図 4 と図 5 に示す通りである。
磁場の大きさの違いによる 1 の 5 位のプロトンのシグナ ルの 比較を行った(図6)。磁場が大きくなるにつれて分解能がよくなっているのが分かる。分解能がよくなると重なったピークが分離できる様子がよく分かる例として、α-D-glucose pentaacetate (2)の 2 位と 4 位のプロトンのスペクトルを図 7 に示す。400 MHz の NMR では重なっていた2ピークが、磁場が大きくなるにつれて徐々に分離して行く様子が良く分かる。600 MHz で完全に分離し、800 HMz ではピークの間に空間が出来るほど離れている。
1 の濃度依存性について調べた。0.6 mL の CDCl3に 0.2 mg、1 mg、5 mg、10 mg、20 mg の 1 を溶解して 1H-NMR を測定した。リファレンスには、溶媒のピークを用いた。1 の 5 位のプロトンのシグナルの変化を図 8 に示す。濃度が濃くなると徐々に高磁場シフトしているのを確認することができる。
1 の測定溶媒の違いによる 1H-NMR のスペクトルの変化を比較した。溶媒には、CDCl3 と DMDO-d6を用いて測定した(図 9)。CDCl3 を用いた時よりDMDO-d6 を用いたときに、1 位、3 位、5 位のプロトンのシグナルは低磁場シフトし、2 位、4 位、6 位、6’位のプロトンのシグナルは高磁場シフトした。
1 を用いて、1H-NMR 測定のサンプル濃度の限界につ い て 調 べ た 。 JNMECA600 (600 MHz) を 用 いて、0.6 mL の CDCl3 に 1 mg、200 µg、50 µg、10 µg の 1 を溶解して 1H-NMR を測定した。10 µg を用いた測定では、16 回3の積算 (約 3 分)ではピークがほとんど検出できなかった。しかし、256 回の積算(約 40 分)を行うと、解析するのに十分な形状ではないが全てのピークを確認できることが分かった(図 10)。さらに検討を重ねた結果、
JNM-ECZ400 (400 MHz)でよりピーク形状が向上し、クライオプローブを用いた AVANCE III (600 MHz)の測定では、解析可能なスペクトルが得られることが分かった(図 11)。
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Ｃ-NMR についても 1 を用いてサンプル濃度の限界について調べた。種々検討した結果、AVANCE III(600 MHz)でクライオプローブを用いて 1 mg を 0.6 mL の CDCl3 に溶かして 32,000 回積算すれば、投稿論文に十分なスペクトルが得られることが分かった(図 12)。

2. β-D-glucose pentaacetate (1)の 2 次元測定について
JNM-ECA600 (600 MHz)を用いた 1 (20 mg/0.6 mL)の COSY 測定は、1 回の積算では 5 位と 6 位の相関を得ることが出来なかった(図 13、左)。他の相関は全て 1 回の積算で相関が得られた。積算の効果は大きく 8 回積算すれば 5 位と 6 位でも十分な相関を得ることができた(図 13、右)。これらのことから、1 の測定では溶媒に DMDO-d6 を用いて COSY 測定を行うと 5 位と 6 位の相関が出にくいことが分かった。一方、溶媒に CDCl3 を用いると 1 の5 位と 6 位の COSY の相関は 1 回の積算で確認することができ、溶媒に CDCl3 を用いると相関は出やすいことが分かった。これらのことから、溶媒を変化させることで二次元測定の相関の得られやすさが変化することが分かった。溶媒に CDCl3 を用いた場合、AVANCE4III (600 MHz)でクライオプローブを用いると 10 µg/0.6 mLの濃度でも 4 回の積算で十分な相関が得られた(図 14)。

3. まとめ600 MHz クライオ NMR を使用した場合、1H-NMR 測定では 10 µg 程度のサンプルがあれば、2 次元測定までできることが分かった。また、13C-NMR 測定では、1 mg 程度のサンプルがあれば論文に投稿できるデータが得られることが分かった。DMSO-d6 を溶媒に用いた
β-D-glucose pentaacetate (1)の COSY 測定では、5 位と 6 位のプロトンの相関のうちカップリング定数が小さい方のプロトンとの相関が出にくいことが分かった。溶媒に CDCl3 を用いるとこの相関は出やすかった。これらのことから、溶媒を変化させると二次元測定の相関の得られやすさが変化することが分かった。これらの測定結果は、NMR 測定のユーザーのための測定の指針や参考データとして活用できると考えている。

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