丁子の適正使用に向けた品質評価に関する研究
日本大学 薬学部
やはぎ

矢作

ただひろ

忠弘

助教

丁子の適正使用に向けた品質評価に関する研究

日本大学薬学部生薬学研究室

助教

矢作

忠弘

三宅克典

分担研究者
東京薬科大学薬学部薬用植物園講師【要旨】
Higenamine はイソキノリン系アルカロイドの一種であり、世界アンチドーピング機構が定める禁止表国際基準の「S3. ベータ 2 作用薬」に分類され、競技会（時）および競技会外で常に使用が禁止されている物質である。漢方処方や一般用医薬品に用いられる生薬においても、higenamine を含有するものが存在するため、アスリートの「うっかりドーピング」の危険性が懸念されている。含有するとされている生薬の 1 つに、薬用酒や食品などにも幅広く用いられている丁子がある。
この情報は1970 年代にされた学会発表が higenamine 含有を裏付ける証拠となっているが、この情報が元となりそれ以降の単離情報は存在しないにも関わらず、ドーピング対象生薬としての扱いを受けている。
そのため本研究では、丁子を含めた 5 種の higenamine 含有報告のある生薬（南天実、南天葉、呉茱萸、細辛、丁子）の市場品や栽培品について、LC-TOF/MS を用いて higenamine の疑似分子イオンピーク [M ＋ H ]+（m /z 272.129）を指標に分析を行った。その結果、5 種の生薬の中で丁子のみが当該保持時間に m /z 272.129 のピークを検出することができなかった（n=23）。さ
らに、薬用部位である蕾以外の葉や枝などについても同様に分析を行ったが検出することはできなかった。これらのことから、丁子に higenamine が含まれる可能性は極めて低いと考えられた。
本研究で得られた情報が元となり、医薬品の適正使用やセルフメディケーション推進の一助になることを期待したい。

１、調査・研究目的
ドーピングとは、「スポーツにおいて禁止されている物質や方法によって競技能力を高め、意図的に自分だけが優位に立ち、勝利を得ようとする行為」のことである。2015 年にはロシアの国家ぐるみの組織的なドーピング問題が明らかとなり、関係のない選手まで国際大会への出場資格が停止するなど世界的にも大きな問題となった。日本におけるドーピング違反は、海外製のサプ

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リメントやドラッグストア等で購入した医薬品による意図しないドーピングである「うっかりドーピング」が殆どである。
Higenamine は世界アンチドーピング機構の禁止表国際基準「S3. ベータ 2 作用薬」に分類されており、協議会時および競技会外で常に使用が禁止される物質である 1)。HG は植物に含まれる成分として広く分布しているため、それらを服用したことにより生じるうっかりドーピングが問題となっている。
丁子（チョウジ）はチョウジ Syzygium aromaticum Merr. et L.M.Perry のつぼみを用いた生薬で、治打撲一方や女神散などの漢方薬の構成生薬としてだけでなく、薬用酒、香水、防虫剤や、クローブの名でカレーなどの食品にも幅広く用いられている。この丁子に higenamine が含有されるという発表が 1978 年になされて以来、含有成分の一つとして教科書やインターネット上に記載されている 2)。しかしながら、それ以降の単離報告は存在せず、またアルカロイドの単離もこの 1 化合物のみであることから、生合成的な解釈においても疑わしいと考えられるが、この情報が元となり丁子はドーピング対象生薬としての扱いを受け、適正使用に問題が生じている。
そのため本研究では、丁子の適正使用を目指した新たなエビデンス構築に寄与するために、
LC-TOF/MS を用いて higenamine の m/z 272.129 [ M ＋ H ] ＋を指標に higenamine を含有するとされる生薬の市場品を中心に分析を行った。

２、調査・研究方法
2-1

生薬検体について実験に用いた生薬検体は、（株）ウチダ和漢薬、（株）栃本天海堂からの購入品や、（株）
前忠および蘭州大学薬学院 楊志剛先生より提供していただいたものを使用した。また、チョウジの栽培品（葉、枝、若枝、細根および根）は東京薬科大学薬用植物園、ゴシュユの栽
培品は日本大学薬用植物園にてそれぞれ採取し、検体として用いた。全ての検体は日本大学
薬学部薬用植物園の標本室に保存してある。生薬名を表すときは漢字、植物名を表すときはカタカナで表記した。
2-2

サンプル調製生薬（約 5 ～ 10 g）を 10 倍量の水で 50 分間熱水抽出を行った。ろ過後、－ 30℃で凍結させた後に凍結乾燥を行い、エキスをえた。エキスを 50%CH3OH に溶解し、終濃度 100ppm になるように希釈し、フィルターろ過（0.45μm GL Chromatodisk 13 A, GL Sciences）したものを用いて分析を行った。
2-3

LC-TOF/MS の条件

LC 条件は以下の通りである。

55

LC: ACQUITY UPLC ( Waters)
Column: Waters BEH C18 (2.1 mm i. d. ×150 mm, 1.7μm)
Column temperature: 40℃
Solvent A: 0.1% Formic acid aq.
Solvent B: 0.1% Formic acid/CH3CN
Solvent Gradient: B = 0% (0-1 min) → 0-50% (1-10 min)Flow rate: 0.250 mL/min
MS 条件は以下の通りである。
MS: Xevo G2-S QTof ( Waters)
Mode: ESI positive, resolution mode
Capillary and Cone voltage: 3.0 kV, 40 V
Source Temperature: 120℃
Desolvation Temperature and Gas Flow: 450℃ , 800 L/hr
Cone Gas Flow: 50 L/hr
Scan range and time: m /z 100 －1000, 0.2 sec
2-4

生薬検体の DNA 解析と原植物の同定

DNA 解析と原植物の同定および電気泳動は以下の条件で行った。
全 DNA の抽出と PCR 条件
DNA 抽出 : DNeasy plant mini kit (QIAGEN )DNA 精製 : PowerClean® Pro DNA Clean-Up Kit (MO BIO Laboratories, Inc.)PCR 酵素 : KOD-plus- ver.2 (TOYOBO)PCR 条件 : hot start, 94℃ 2min
(1. 94℃ 15 sec, 2. 55℃ 30 sec, 3. 68℃ 45 sec) 30cycles, 68℃ 5min, 4℃
電気泳動
試薬 : Agarose for 50 ～ 800bp fragment ( nacalai tesque )濃度 : 2%
溶媒 : TBE buffer
検出 : ethidium bromide
プライマー : ITS-F…GACGTCGCGAGAAGTTCATT
ITS-R…GTAAGTTTCTCTTCCTCCGC
trnLF-F…CGAAARCGGTAGACGCTACG
trnLF-R…ATTTGAACTGGTGACACGAG

56３、調査・研究成果3-1

検出指標と検出限界の決定

まず初めに、LC-TOF/MS 分析において指標とする m /z を決定するために、higenamine標準品の MS スペクトルを測定した。その結果、疑似分子イオンピークとして m /z 272.129[ M+H ]+ が認められたことから、この値を用いて生薬検体の分析を行うこととした。次にhigenamine の検出限界を設定した。疑似分子イオンピークである m /z 272.129 [ M+H ]+ を対象に、higenamine の濃度を段階的に希釈したものを測定したところ、0.5 ppb の濃度まで S/N 比 3 以上を保ったまま検出することが可能であったため、検出限界を 0.5 ppb とした（図 1）。
3-2 Higenamine 含有生薬の LC-TOF/MS 分析
Higenamine を含むとされる生薬の市場品 78 検体について分析を行ったところ、細辛、呉茱萸、南天実および南天葉では一部の検体を除いて検出されたが、丁子からは全て検出されなかった（n= 23, 図２）。
3-3

丁子の各部位ごとの LC-TOF/MS 分析

東京薬科大学薬用植物園で栽培しているチョウジから葉、枝、小枝、根および細根を採集し、それぞれエキスを作製し分析を行った。その結果、どの部位においても higenamine の m /z
272.129 [M+H ]+ は検出されなかった（表 1）。このことから、他の部位が混入したことによりhigenamine が検出された可能性は極めて低いと考えられる。
3-4

生薬検体の DNA 解析と原植物の同定

3-2 の分析結果のうち、南天葉および呉茱萸のそれぞれ一検体のみ higenamine が検出されなかったため、基原植物が異なる可能性が考えられた。そこで、ITS および trnLF 領域を用いた PCR 解析および配列解析を行い、基原植物の遺伝子学的同等性を検討した。その結果、呉茱萸に関してはゴシュユ Euodia ruticarpa の配列と 99％以上の相同性を示したが、南天葉は種の同定までにいたらなかった（図３）。検出されなかった南天葉は中国市場品であるが、生薬名は一緒でも基原植物が異っていた可能性が示唆された。
3-5

採集時期の異なる呉茱萸の LC-TOF/MS 分析

3-4 の結果から、higenamine が検出されなかった呉茱萸も基原植物は同じであることが確認できた。そのため、呉茱萸の採集時期の違いが higenamine 含有量に変化をもたらした可能性を検討するために、未熟果実をつける 9 月頃から成熟しきる 12 月上旬まで１週間ごとに採集し、それぞれエキスを作製し分析を行った。しかしながら、採集時期の異なる呉茱萸
においても higenamine の m /z 272.129 [ M+H ]+ は検出されたことから、果実の成熟具合がhigenamine の含有に影響しない可能性が示唆された（表 2）。ゴシュユは雌雄異株の落葉小57高木であるが、日本には雌株のみが存在するため果実はできるものの不稔である。ところが、higenamine が検出されなかった検体は中国市場品であり、種子の形成を確認することができた。このことから、胚珠が種子へと変化する際に higenamine が消失し、LC-TOF/MS で検出できなかった可能性が示唆された。

４、考察
漢方薬の構成生薬や食品に用いられる丁子を中心に、higenamine を含有するとされる生薬について LC-TOF/MS 分析を行った結果、丁子の全ての検体において higenamine の m /z
272.129 [M+H ]+ は検出できなかったことから、丁子に higenamine が含まれる可能性は極めて低いと考えられる。丁子は香辛料としてインドカレーなどによく用いられているため、もし本当にhigenamine を含有しているのならば、日常的に摂取している国では沢山のドーピング違反者が生じているはずである。WADA による国別のドーピング違反例の調査 3) によると、インドにおける違反が疑われる分析報告のうち大半が S1. 蛋白同化薬を用いたものであり、S3. ベータ 2 作用薬によるものは 0.1% 以下であった。このような食経験による情報も丁子に higenamine が含まれないという結論を支持するものと考える。

５、まとめ
今回の研究により、丁子の誤解が解け丁子含有製品の適正使用の一助になることを期待するが、生薬は多成分系でありそれら 1 つ 1 つの成分が禁止物質にあたるかどうか特定するのが困難なことから、「うっかりドーピング」を防ぐためにも生薬製剤や漢方薬は服用を避けるのが望ましいとされている。しかしながら、患者の訴える症状の多様化や西洋薬の効かない疾患に対して漢方薬が著効する例も増えており、一概に全てを禁止としてしまうのは違うのではないかと感じている。医薬品の適正使用やセルフメディケーション推進のためにも、多成分系という言葉で逃げるのではなく精査された生薬成分情報を構築することが今後の課題であると考える。

６、調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
下記シンポジウムにて招待講演を行った。また、得られたデータを元に学会発表および学術誌への投稿を検討している。
1）矢作忠弘 , 渥美聡孝 , 楊志剛 , 松﨑桂一 , ドーピング対象生薬の LC-TOF/MS による評価～ハンゲに関する研究を中心に～ , 第 49 回生薬分析シンポジウム (2021)582）矢作忠弘 , ハンゲ・チョウジにドーピング禁止物質は含まれない , 医療薬学フォーラム 2021(2021)

７、引用文献1）World Anti-Doping Agency (2020) PROHIBITED LIST. World Anti-Doping Agency(2020 )2）小菅卓夫ら , 第 2 回天然薬物の開発と応用シンポジウム講演要旨集 (1978 )3）2019 ANTI-DOPING TESTING FIGURES, WADA (2019 )

59

図1

Higenamine の検出限界

図 1 図Higenamineの検出限界
1 Higenamineの検出限界

図２
Higenamineを含有するとされる生薬のLC-TOF/MS
分析
図２
Higenamineを含有するとされる生薬のLC-TOF/MS
分析 分析
図２
Higenamineを含有するとされる生薬のLC-TOF/MS

60

図３図３

Higenamine が検出されなかった呉茱萸および南天葉の DNA 解析と原植物の同定

Higenamineが検出されなかった呉茱萸および南天葉のDNA 解析と原植物の同定
EF-17 および
NL-6: higenamine が検出されなかった呉茱萸および南天葉

EF-17および
NL-6:higenamineが検出されなかった呉茱萸および南天葉
EF-leaf
およびNL-leaf:
薬用植物園栽培品
EF-leaf
および NL-leaf:
薬用植物園栽培品
EF-JM およびNLJM: 日本市場品

EF-JM および NLJM: 日本市場品

表１ チョウジの各部位ごとのチョウジの各部位ごとのLC-TOF/MS
LC-TOF/MS
分析 分析
表１
チョウジの各部位ごとの LC-TOF/MS 分析
Sample partExperimental sample

表１

Sample partExperimental sample

Leaf
Leaf

BranchBranchPlace of production

Place of production

Cultivatied
Cultivatied
plant plant

Cultivatied
Cultivatied
plant plant

LC/MS(100 ppm)(100 ppm)
2022.N.1 D.
N. D.

Collectionyear
LC/MS

Collection year

Tokyo, Japan 2022. 1
Tokyo, JapanTokyo, Japan 2022. 1
Tokyo, Japan

2022.N.1 D.

N. D.

branchYoung
YoungbranchCultivatied
Cultivatied
plant plantTokyo, Japan 2022. 1
Tokyo, Japan

2022.N.1 D.

N. D.

Root
Root

Cultivatied
plant plant
Cultivatied

Tokyo, JapanTokyo, Japan 2022. 1

2022.N.1 D.

N. D.

RootletRootletCultivatied
plant plant
Cultivatied

Tokyo, JapanTokyo, Japan 2022. 1

2022.N.1 D.

N. D.

表２LC-TOF/MS
分析
表２ 採集時期の異なる呉茱萸の採集時期の異なる呉茱萸のLC-TOF/MS
分析

表２

採集時期の異なる呉茱萸の LC-TOF/MS 分析

Collection date

Collection date

LC/MS
(100 ppm)
LC/MS

2021. 9/21

(100＋ ppm)

2021.
9/21
2021.
9/28＋ ＋2021.
10/5
2021.
9/28＋ ＋

2021.
10/12
2021.
10/5
2021. 10/19＋ ＋＋

2021. 10/26＋2021. 11/02＋2021. 11/09＋2021. 10/12
2021. 10/19
2021. 10/26

2021.
11/02
2021.
11/16

＋＋＋＋ ＋

2021.
11/09
2021.
11/22＋ ＋2021.
11/29
2021.
11/16＋ ＋2021.
12/07
2021.
11/22
2021.
12/14
2021.
11/29

＋ ＋＋ ＋

2021. 12/07＋2021. 12/14＋61