生活科学

キノコでダイオキシン類 を分 解
生活化学課 吉川 大介
１ はじめに黒島、与那国島、石垣島、小浜島、竹富島、鳩本調査研究は、沖縄県の商工労働部 もの間島、西表島、波照間島、伊江島)において、づくり振興課(旧新産業振興課)発注による補

二 人 一 組 で GPS (GARMIN 製 ハ ン デ ィ助事業、平成 23～26 年度「微生物等を活用

GPS モデル GPSMAP60Csx)を用いて現した汚染土壌の浄化処理技術開発事業」で得在位置を確認しながら、各島内偏りなく移動し、られた成果の一部である。一般財団法人沖縄

子実体を採取した。子実体の採取地点の緯度・県環境科学センター、株式会社大鏡建設、照経度を記録し、得られた GPS データから採取

屋土建株式会社の 3 社で、土壌浄化共同企業

地点と島内を移動した軌跡を記入した地図を体を結成し、国立沖縄工業高等専門学校の田作成した(図 1)。採取日数延べ 82 日間、採取

邊俊朗准教授を微生物単離と培養技術の専地点 1615 地点において、子実体 1946 個を門家として迎え技術開発を行った。

採取した。

沖縄県の土壌汚染の主なターゲットは、米軍基地やその返還跡地等であり、各種燃料の漏洩等による油等の土壌汚染が懸念される。
平成 25 年には、返還跡地である沖縄市サッカー場において、ダイオキシン類を含むドラム缶が埋設されているのが発見されている。
これらの土壌汚染対策として、白色腐朽菌が出すリグニン分解酵素がダイオキシン類を分解する性質 1)を活用し、生態系と生物多様性に配慮した沖縄県産キノコ（白色腐朽菌）に

図 1 与那国島の子実体採取地点および移動軌跡よる土壌中のダイオキシン類の分解･除去技術の開発を行った。

2.2 微生物の単離と上位株の絞り込み採取した子実体を５ mm 角から１ ｃｍ角の2 研究開発
2.1 微生物試料の採取大きさに切断し 、ＰＤ Ａ（potato dextroseagar）プレート培地に植菌した。これを２５ ℃、ダイオキシン類を分解する能力を有する白

相対湿度７５ %で３日～１週間培養した。その色腐朽菌の単離を目的として、沖縄本島およ後、伸長した菌糸を培地ごと１ ｃｍ角に分離し、び離島から島内偏りなく探索し、キノコの子実新たなＰＤＡ培地に植え替え、同様の条件で培体を１９４６個採取した。

養した。目視で細菌やカビなどのコンタミネー

平成 24 年 2 月から 7 月にかけて、沖縄本島及び渡航可能な離島 24 島 (粟国島、久米ションが無い場合に単離できたとみなし、５３６株が単離できた。

島、伊是名島、伊平屋島、北大東島、南大東島、単離できた５３６株の菌体のリグニン分解活

渡嘉敷島、渡名喜島、阿嘉島、慶留間島、座間性を、バーベンダム反応 2)を用いて測定し、上味島、宮古島、伊良部島、下地島、多良間島、位株の絞り込みを行った。基本培地を調製し、生活科学
900添加した。単離した菌体を培地ごと上記の基本培地に植菌した。２５ ℃、相対湿度７５ ％で５日間培養し、分解斑の直径を測定した。培養５日後の分解斑が大きいものほどリグニン分解活性が高い株として、上位 7 株に絞り込みを行った。

ダイオキシン類毒性当量(pg-TEQ/g)

基本培地にα－ナフトール５０ ｍＭとなるよう

850800750700650600

2.3 ダイオキシン類分解能試験

コントロール

ダイオキシン類分解能の測定では、焼却飛対照株

佐手2株

図 3 ダイオキシン類分解能試験結果

灰を赤土(島尻マージ)と混合した模擬汚染土壌を調製し、これに単離株菌体を加えて、模擬汚染土壌中のダイオキシン類毒性等量を測定した。

2.4 安全性の確認
佐手 2 株の哺乳類に対する影響を、ＯＥＣＤ
毒性試験ガイドライン 420 急性経口毒性試験

木材チップ培地で培養した上位 7 株を培地ごと１０ ｇ秤量後、模擬汚染土壌（赤土１００ ｇ、－固定用量法のガイドラインに従いマウスを用いて確認した。

焼却飛灰２.５ ｇ）に混合し４週間培養し、１日試験に供する菌体破砕液は、単離株をＹＭに１回容器ごと培地を振って撹拌した。絞り込液体培地で１週間振とう培養し、吸引ろ過によんだ上位７株のうち、佐手２株と命名した株がって菌体のみを回収し、マルチビーズショッカ

最もダイオキシン類毒性当量が減少していたー多検体細胞破砕機を用いて菌体を破砕し作ため、佐手２株を最優秀株とした。

成した。

佐手 2 株のダイオキシン類分解能を図 2 にマウスは、体重測定を行ったのち、菌体破砕示す試験装置を用い測定した。佐手２株菌体液 300 mg/ｋｇを経口投与し、30 分、1 時間、１０ ｇ、模擬汚染土壌（赤土１００ ｇ、焼却飛灰

2 時間、24 時間後に経過観察を行った。その２.５ ｇ）を混合し、未処理区（コントロール）と後 14 日間は、1 日 1 回の経過観察及び 3 日対照株および佐手２株で装置を組み、10 週間に 1 回の体重測定を行い、急性毒性・目視によ後のダイオキシン類毒性当量を測定した。（図る異常行動の有無・体重の著しい増減を調査3）。佐手 2 株は、コントロールに比べダイオキした。

シン類毒性当量が 160 pg-TEQ/g 減少した。

パールダニオを用いて佐手 2 株の魚類に対する影響も確認した。菌体破砕液はマウスと同様のものを使用した。パールダニオは、７ Ｌの空気水中に１０匹飼育し、菌体破砕液を最終濃度１００ mg/L となるよう水中に添加した。３時間後、６時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後に経過観察を行い、水模擬汚染土壌＋白色腐朽菌

図 2 試験装置

活性炭

菌体に急性毒性が無いか調査した。
佐手 2 株は、マウスおよびパールダニオについて、安全性が確認された。

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2.5 菌種の同定

広げて接種し、ＬＥＤ（波長４７０ ｎｍ付近の青

安全かつダイオキシン類分解能の高いもの

色光：５８０から６００ Ｌｕｘ（約１５００ μＷ））照として、佐手２株を選抜した。佐手２株は、遺伝射下、２５ ℃、相対湿度７５ ％で２週間培養し子解析の結果、マラスミエルス・パルミボラスた(図 5)。培養後は、佐手２株の菌糸が十分にｉｓｏｌａｔｅ Ｂａｎｇｉ３など１０種以上のマラスミエ生育し、培地が真っ白になるほどであった。こルス・パルミボラスに９９ ％の高い相同性を示のＬＥＤ照射下の培養により佐手２株の菌糸のした。佐手２株は、和名シロホウライタケ、学名

成長速度は、これを照射しない通常の培養とマラスミエルス・パルミボラスと同定された。

比較して、１.５～２倍となった。

2.6 実証試験
実証試験では、糸満市に実証試験場を建設(図 4)し、佐手 2 株を用いたダイオキシン類汚染土壌の浄化工法の検討を行った。
実証試験場は、20 の試験槽を備え、それぞれトン単位の土を使用して条件を様々に変更しながら最適な工法を検討できる設備である。
沖縄県環境科学センター、大鏡建設、照屋土建の 3 社は、実証試験場に各社一名を派遣し、

図 5 大量培養状況

それぞれの得意分野である調査・コンサルタン
ト(沖縄県環境科学センター)、設計(大鏡建実証試験では、焼却飛灰と赤土（国頭マージ）設)、施工(照屋土建)の技術交流を行い、キノを混合した模擬汚染土壌約 3 t を調製し、これコでダイオキシン類を分解するバイオレメディに約 30 kg の培地に培養した佐手 2 株を加えエーション技術の開発と技術習得を目的として、模擬汚染土壌中のダイオキシン類毒性等量た人材育成も行った。

を測定した。菌体約 30 kg のうち約 22 kg は模擬汚染土壌に十分に混合し、約 8 kg は土壌表面に散布した。日常管理は、攪拌混合はせずに散水による水分調整のみを行った。
実証試験では、125 日で 65 %のダイオキ

図 4 実証試験場

実証試験に必要な菌体量を確保する為、菌相対ダイオキシン類毒性当量（％）

シン類毒性当量の減少が確認された（図 6）。

100806040200050100

体の大量培養方法を確立した。佐手 2 株をブ浄化工期（日）ナ木粉、小麦ふすまおよび水を含む培地上に

図 6 実証試験結果

150

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3 大地クリアの設立

マラスミエルス・パルミボラスと同定され、マウ

沖縄県環境科学センター、大鏡建設、照屋スおよびパールダニオについて、安全性が確

土建の 3 社は、土壌浄化技術の事業化に向け認された。佐手 2 株の大量培養法を確立し、約て、開発した技術および既存の技術を組み合

3 ｔの模擬汚染土壌において、ダイオキシン類わせて土壌浄化工事を実施する体制作りを進

毒性等量の減少を確認することができた。「芳めている。体制作りの一環として、土壌浄化業

香族塩素化合物分解剤およびこれを用いた芳務（工事）を獲得し施工することを目的とし、平香族塩素化合物の分解方法」として特許

成 26 年 11 月に新会社「株式会社 大地クリ（第６５２４２１３号）を取得した。

ア」を設立した。

6 おわりに
4 特許の取得

本調査研究において特許を取得したことで大地クリアでは、本調査研究の結果から、直ちに土壌汚染の浄化事業を行えるわけでは「芳香族塩素化合物分解剤およびこれを用いない。技術的には分解速度をさらに加速させ、た芳香族塩素化合物の分解方法」として特許同時に浄化工法を確立し、実績を積み重ねる（第６５２４２１３号）を取得した(図 7)。

ことが必要である。本調査研究が、「県産の微また、今回発見された佐手 2 株(マラスミエル

生物を活用した浄化技術」として広く周知され、

ス ・ パ ル ミ ボ ラ ス ｓ ａ ｔ ｅ ２ （ Marasmiellus

沖縄県内の汚染土壌を浄化し、環境問題解決

palmivorus sate2）)については、平成２６年の一助になればと考える。

１２月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ ＢＰ－０１９８４として国際寄託されている。

7 謝辞
本調査研究に協力頂いた 沖縄高専准教授
田邊俊朗先生、大鏡建設専務取締役 山入端豊氏、照屋土建常務取締役 照屋正悟氏に感謝する。本調査研究は、平成 23～26 年度「微生物等を活用した汚染土壌の浄化処理技術開発事業」の補助を受けたものである。

8 参考文献1) 橘燦郎、木材腐朽菌を用いたバイオレメデ
ィエーションによるダイオキシン及び環境ホル
図 7 特許証

モ ン 汚 染 土 壌 の 浄 化 、 地 球 環 境 、 Vol.15 、
No.1、 p.63-68（2010）

5 まとめ

2) Chroma, L., Demnerova, K., Mackova,

本調査研究では、白色腐朽菌による土壌中M., Macek, T.，Decolorization of RBBR byのダイオキシン類の分解･除去技術の開発を

plant cells and correlation with the行った。

transformation of PCBs，Chemosphere,

沖縄県内からダイオキシン類分解能を有する佐手 2 株を単離・選抜した。佐手 2 株は、Vol. 49, p.739-748（2002）)