NAD+前駆体を用いた老化に対するセルフメディケーションの開発
慶應義塾大学 薬学部 薬物治療学講座
さいとう齋藤よしまさ義正教授

NAD+前駆体を用いた老化に対するセルフメディケーションの開発
慶應義塾大学薬学部

齋藤義正

【要旨】
老化の分子メカニズムを解明し、老化に対するセルフメディケーションを開発するため、老化マウスの腸管上皮からオルガノイド（組織構造体）を樹立し、遺伝子発現変化やエピゲノム変化を解析した。
老化マウス由来のオルガノイドにおいては、増殖能や組織構築能力が低下していた。また、エピゲノム変化により、幹細胞マーカーである Lgr5 や Wnt シグナル経路の遺伝子発現が老化マウス由来オルガノイドで低下していた。さらに、NAD+ 前駆体であるニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）の投与により、老齢マウス由来腸管上皮オルガノイドが若齢由来のような形態に変化し、幹細胞関連遺伝子の発現も回復した。NMN が NAD+ 活性を上昇させ、抗加齢効果を示していると考えられた。今後の更なる研究により、老化に対する新たなセルフメディケーションが開発されることが期待される。

１、調査・研究目的
超高齢社会に突入した我が国において、高齢者における医療費や介護負担の増大が深刻な問題となっており、抗加齢により健康寿命を延長させることは喫緊の課題となっている。
これまでの様々な研究から、摂取カロリーを抑えると寿命が延長するというカロリー制限仮説が支持されている（1）。カロリー制限によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）依存性のヒストン脱アセチル化酵素であるサーチュインが活性化されることが報告された（2）。
NAD+ は、全ての生物種に存在する古典的な補酵素であり、酸化還元反応で中心的役割を果たしている。長寿遺伝子であるサーチュインが NAD+ 依存性であることや、NAD+ が加齢とともに体内で減少することから、NAD+ 前駆体であるニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）を投与することにより、NAD+ 濃度を体内で上昇させることで寿命を延長させる研究が大きな注目を集めている（3）。サーチュインが活性化することにより、様々なエピゲノム変化が生じ、長寿遺伝子群の発現を制御していることが予想されるが、その詳細なメカニズムは明らかになっていない。
近年、組織幹細胞を 3 次元で培養することにより、in vitro で各臓器を模倣した組織構造体を培養するオルガノイド培養法が開発された。研究代表者の齋藤は、老齢マウスの腸管上皮か135

らオルガノイドを樹立し、老化モデルを確立することに成功している。
本研究では、老齢マウスの腸管上皮からオルガノイドを樹立し、エピゲノム変化を網羅的に解析することで老化の分子機構を解明する。さらに、NAD+ の制御およびエピゲノム制御に基づく新たな抗加齢介入についても検討を行うことで、高齢者の健康寿命を延長するセルフメディケーションを開発することを目的とした。

２、調査・研究方法
2-1

加齢マウスからの腸管上皮オルガノイドの樹立と加齢変化の検討

C57BL/6 マウスを用いて、10 週齢未満の若齢マウスおよび 50 ～ 100 週齢の加齢マウスから腸管上皮を採取し、オルガノイドを樹立した。
若齢および老齢の腸管上皮から樹立したオルガノイドにおいて、形態変化・増殖能および老化マーカーであるβ -galactosidase の蓄積や Cdkn1a（p21）および Cdkn2a（p16）の発現変化、サーチュイン活性などを解析することで加齢変化の検討を行った。
2-2

エピゲノムおよび遺伝子発現の網羅的解析による加齢特異的なエピゲノム変化の探索樹立した腸管上皮オルガノイドにおける遺伝子の発現変化をマイクロアレイにより網羅的に解析した。
また、DNA メチル化やヒストン修飾などのエピゲノムの変化をバイサルファイトシーケンスやクロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイにより解析した。エピゲノム変化と全遺伝子の発現変化および加齢変化などを統合的に解析することで、加齢特異的なエピゲノム変化を特定した。
2-3

NAD+ およびエピゲノムの制御による老化メカニズムの解明と新たな抗加齢介入の開発

NAD+ の前駆体である NMN を老齢腸管上皮オルガノイドに投与することで NAD+ の回復を試みた。 NAD+ およびエピゲノムの制御に伴う腸管上皮オルガノイドの増殖能、サーチュイン活性、老化マーカーの変化および加齢特異的なエピゲノム変化を詳細に解析することで、老化の分子メカニズムを解明すると共に新たな抗加齢介入の開発を試みた。

３、調査・研究成果
3-1

若齢および老齢マウス由来腸管上皮オルガノイドの形態変化

老化を培養皿の中で再現するモデルとして、老齢マウス由来の腸管上皮オルガノイドを確立した。若いマウスと老化したマウスの腸管上皮からオルガノイドを樹立し、網羅的な遺伝子発現やエピゲノム変化などを検討することで老化の分子機構の解明を試みた。

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図 1 に示す通り、若齢マウス由来の腸管上皮オルガノイドは、“budding” と呼ばれる腸管陰窩に相当する幹細胞が存在する突起状のコンパートメントが認められるのに対し、老齢のマウス由来のオルガノイドにおいては、腸管陰窩構造が認められず、培養開始から 8 日目には細胞増殖が減退していく様子が観察された。若い幹細胞が旺盛な増殖能を示すのに対し、老化した幹細胞では増殖能が低下し、老化に伴う幹細胞の枯渇につながっていることが示唆された。
さらに、老齢マウスの腸管上皮から樹立したオルガノイドにおいて、老化マーカーである
β -galactosidase の蓄積や Cdkn1a（p21）および Cdkn2a（p16）の発現上昇を確認した。
3-2

老化に伴うエピゲノム変化による Wnt シグナル経路の抑制

マイクロアレイおよびリアルタイム PCR により網羅的な遺伝子発現解析を行ったところ、幹細胞マーカーである Lgr5 の発現が老齢マウス由来の腸管上皮オルガノイドで有意に低下しており（図 2a）、Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) により、老齢マウス由来の腸管上皮オルガノイドにおいて Wnt シグナル経路が有意に抑制されていることが示された（図 2b）。
また、加齢に伴うエピゲノム変化について解析を行ったところ、クロマチン免疫沈降（ChIP）
アッセイにて Lgr5 のプロモーター領域における遺伝子発現抑制系のヒストン修飾であるヒストン H3 リジン 27 トリメチル化（H3K27me3）が老齢マウス由来の腸管上皮オルガノイドにおいて有意に亢進していた（図 2c）。
ヒストンメチル化阻害薬である 3-deazaneplanocin A ( DZNep) の投与により Lgr5 の発現は回復した（図 2c）。
以上の結果より、老化したマウスの腸管上皮オルガノイドでは、幹細胞の増殖能や組織構築能力が低下しており、これらの一連の変化はエピゲノム変化が重要な役割を果たしていることを示唆している。
3-3

老齢マウス由来腸管上皮オルガノイドに対する NMN の効果

腸管上皮オルガノイドにおける NAD+活性および NMN の効果について検証を行った（図 3）。
上述の結果と同様に、若齢（6 週齢）由来の腸管上皮オルガノイドでは、旺盛な増殖能と共に “budding” と呼ばれる幹細胞を含む腸管陰窩を模倣した突起構造が認められたのに対し、老齢（78 週齢）由来の腸管上皮オルガノイドでは腸管陰窩構造が少なく、増殖能も低下していた。
興味深いことに、NAD+ の前駆体である NMN の投与により、再び若齢由来のような形態に変化することを確認している。また、NAD+ 活性についても、老齢マウス由来のオルガノイ
ドでは若齢に比べて低下していたが、NMN の投与により回復した（図 3）。
さらに、老齢マウス由来の腸管上皮オルガノイドに対して NMN を投与することにより、細胞内 NAD+ 量の増加に伴う Sirt1 の活性化、幹細胞マーカー Lgr5 の H3K27me3 の低下に伴う発現上昇、老化マーカーである p16、p21 の発現低下を確認した。

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４、考察
近年、CRISPR-Cas9 技術を改変し、領域特異的にメチル化酵素や脱メチル化酵素をリクルートすることでエピゲノム変化を制御する画期的なエピゲノム編集技術が開発された（4）。今後、加齢特異的なエピゲノム変化をエピゲノム編集技術により是正することで、老化の分子メカニズムを解明すると共に新たな抗加齢介入の開発にも応用できると考えられる。さらに、エピゲノム編集だけではなく、現在臨床試験にも用いられている NAD+ 前駆体の NMN や DNA メチル化阻害薬、ヒストンメチル化阻害薬などのエピゲノム作用薬の効果についても検証することで、個々の症例に合致した最適な抗加齢アプローチを開発できる可能性が考えられる。
今後、マウスでの研究成果をヒトで応用するために、十分なインフォームド・コンセントのもと、80-100 歳程度の高齢者から内視鏡下生検や外科手術によって採取された大腸粘膜組織を用いてオルガノイドを樹立する予定である。各年齢の健常人由来の大腸粘膜組織のみならず、大腸がんを発症した患者の大腸粘膜組織などからも樹立を行い、加齢と関連した疾患の病態解明などにもつなげていきたい。
老化の分子メカニズムの解明および新たな老化に対するセルフメディケーションの開発に成功すれば、高齢者の健康寿命の延長ならびに QOL の向上が実現し、がんをはじめとする加齢関連疾患の予防や高齢者の臓器移植の成功率向上などにつながることが期待される。最終的には、高齢者における医療費や介護負担の軽減にもつながり、現在我が国において大きな問題となっている医療経済の改善にも大きく貢献することが期待される。

５、まとめ
NMN の投与により、老齢マウス由来の腸管上皮オルガノイドが若齢由来のような形態に変化し、幹細胞関連遺伝子の発現も回復した。抗老化物質である NMN が老化した腸管上皮において NAD+ 活性を上昇させ、抗加齢効果を示していると考えられた。今後の更なる研究により、老化に対する新たなセルフメディケーションが開発されることが期待される。

６、調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
齋藤義正．加齢に伴う消化器疾患と新たな抗加齢物質の開発．日本抗加齢医学会講習会．
2021 年 10 月

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７、引用文献(1) de Cabo R, Carmona-Gutierrez D, Bernier M, Hall MN, Madeo F.
The search for antiaging interventions: from elixirs to fasting regimens.
Cell. 2014 Jun 19;157 ( 7 ) :1515-26. doi: 10.1016/j.cell.2014.05.031.
(2) Imai S, Armstrong CM, Kaeberlein M, Guarente L.
Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone
deacetylase.
Nature. 2000 Feb 17;403 ( 6771 ) : 795-800. doi: 10.1038/35001622.
(3) Mills KF, Yoshida S, Stein LR, Grozio A, Kubota S, Sasaki Y, Redpath P, Migaud ME,Apte RS, Uchida K, Yoshino J, Imai SI.
Long-Term Administration of Nicotinamide Mononucleotide Mitigates Age-AssociatedPhysiological Decline in Mice.
Cell Metab. 2016 Dec 13 ; 24 ( 6 ) : 795-806. doi: 10.1016/j.cmet.2016.09.013.
(4) Morita S, Noguchi H, Horii T, Nakabayashi K, Kimura M, Okamura K, Sakai A,Nakashima H, Hata K, Nakashima K, Hatada I.
Targeted DNA demethylation in vivo using dCas9-peptide repeat and scFv-TET1
catalytic domain fusions.
Nat Biotechnol. 2016 Oct ; 34 ( 10 ) :1060-1065. doi: 10.1038/nbt.3658.

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Nakashima H, Hata K, Nakashima K, Hatada I.
Targeted DNA demethylation in vivo using dCas9-peptide repeat and scFv-TET1
catalytic domain fusions.
Nat Biotechnol. 2016 Oct;34(10):1060-1065. doi: 10.1038/nbt.3658.

図11 4 4週齢および週齢およ54び週齢のマウス由来腸管上皮オルガノ
54 週齢のマウス由来腸管上イ
皮オルガノイドの形態変化
図
ドの形態変化図22 老化に伴うエピゲ老化に伴うエピゲノム変Wnt化による Wnt シグナル経路の抑制
図
ノム変化によるシグナル経路の抑制140図3Title

老齢マウス由来腸管上皮オルガノイドにおける形態および NAD+ 活性の変化

Development of self-medication against aging using NAD+ precursors

NameSaito
Developmentof self-medication against aging using NAD+ precursors
Title Yoshimasa
NameofAffiliation
KeioUniversity
Name Yoshimasa Saito Faculty of Pharmacy
Address、Tel1-5-30, Shibakoen,
Tokyo;
03-5400-2647
Name of Affiliation
KeioMinato-ku,
University
Facultyof Pharmacy
Abstract
Address、Tel 1-5-30, Shibakoen, Minato-ku, Tokyo; 03-5400-2647
To elucidate the molecular mechanism of aging, we established organoids from theAbstract
intestinal
epithelium ofthe
agingmolecular
mice and analyzed
gene expression
changes
epigenomic organoids fro
To elucidate
mechanismof aging,
weandestablishedchanges.
the intestinal epithelium of aging mice and analyzed gene expression changes a
The organoidschanges.
from aged mice showed reduced proliferative capacity and tissue
epigenomicTheorganoids
fromaged mice
reducedproliferative
capacity and tissbuilding
ability.
In addition,
epigenomicchangesshowed
led to decreased
geneexpression of stem
building
In addition,
epigenomicchanges
led from
to decreasedexpression
cellmarkers ability.
such as Lgr5and Wnt signaling
pathwayin organoids
aged mice. geneInstem cellmarkers ofsuchas Lgr5mononucleotideand Wnt signaling
pathwayin organoids from ag(NMN), anaddition,
administration
nicotinamide
NAD+ precursor,
mice. In addition, administration of nicotinamide mononucleotide (NMN), an NADchanged the morphology of intestinal epithelial organoids from aged mice to that ofprecursor, changed the morphology of intestinal epithelial organoids from aged myoung mice and restored the expression of stem cell-related genes, suggesting that NMN
to that of young mice and restored the expression of stem cell-related gen
increases NAD+ activity and has an anti-aging effect.
suggesting that NMN increases NAD+ activity and has an anti-aging effect.

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