微細・局所・微量電気化学デバイスを用いた生細胞・生組織の刺激観察法の開発
一粒のキレート樹脂による生体環境からのCa2+の回収
電気・電子情報工学系 服部敏明

背景

樹脂のCa2+回収

ツリガネムシの収縮
電気化学刺激電極の開発

・樹脂には多くの種類があり、樹脂によって特徴や特性が大きく異なる
・工業分野で広く使用されている⇨各特性により、適する用途が分かれる

CCD型pHイメージセン
サ⚫ 電圧制御⚫ 刺激物質(イオン)のみを放出⚫ 細胞一個レベルでの局所刺激が可能(用途)・純水・軟水製造の水処理 ・廃水処理 ・医薬品・食品の精製,触媒 ・塩水精製 ・薬液精製 ・ホウ酸除去 etc
強酸性陽イオン交換樹脂

50.0 μm

4.7mm

Cell
stimulatio
n4.7 mm

Detector特徴・イオン濃度を可視化
・リアルタイムで測定可能
・イオン感応膜の作製により様々なイオンに応答
Ca2+, K+, ACh+ etc…

H+型

イミノニ酢酸型キレート樹脂
吸着前
吸着後

Na+型
キレート(錯体)を形成して金属イオン(Ca 2+)を補足する

樹脂の分子中の- SO3H基によりH+ をNa+ やCa2+に交換できる・Zooid(個虫) : 20~40 µm
・Stalk(柄): 0~200 µm
・収縮時のCa2+濃度 :10-8~10-5 M
・収縮時ATP不要・死滅後も収縮可能周りの水溶液樹脂？

？

目的

樹脂によってCa2+回収挙動が異なる？

イオン交換およびキレート樹脂のCa2+回収特性 を評価し、ツリガネムシでの試験を行う

樹脂のCa2+に対する動的特性を評価する

Ca2+

樹脂の評価方法
シミュレーション

CCD型pCaイメージセンサの作製
POSS下地膜の組成溶液Ⅰ
試薬

組成比

POSS

10.0 mg

トルエン

5 mL

THF

Ca2+感応膜の組成溶液Ⅱ

重量比30 wt%
70 wt%

拡散方程式（前進差分法）

樹脂の設置

試薬

組成比

PVC

16.0 mg

DOPP

10.8 mg

HDOPP-Ca

1.2 mgTHF

2 mL

実際の系との比較

1. 樹脂一粒を測定溶液に24時間漬ける
2. 棒の先端に接着剤で固定
3. 高さ調節可能なマニュピュレーターに固定
4.測定開始から30秒でセンサに近づけ、 測
定開始から330秒でセンサから遠ざける

参照電極(センサ)

105℃のホットプレート上で溶液Ⅰを加熱しながら、30 μL（10 μL×3）pHセンサ上に滴下実験

シミュレーション

Ag/AgCl(sat.KCl)-

溶液Ⅱを50 μL（10 μL×3）pHセンサ上に滴下

12時間室温で乾燥

𝑡−1
𝑡−1
𝐶 𝑥+1− 2𝐶 𝑥𝑡−1 + 𝐶 𝑥−1+ 𝐷𝛥𝑡
𝛥𝑥2= 𝐶𝑥𝑡−1

C :濃度 / M , t :時間/ sec , x :距離/ m , D :拡散係数/ m2 s-1

樹脂サイズ

直径0.8 mm

計測時間

360 sec

樹脂の投下

開始：30 sec
終了：330 sec

測定溶液

CaCl2 1 mM
Tris-HCl 10 mM(pH7.4)

初期濃度(Ca2+)

𝐶𝑥𝑡

Ca2+ Recovery
area

𝜙0.8 mm

𝜙0.8 mm𝑧10−3 M樹脂-センサ間距離50 µm

56.2 µm

センサ長さ4.8 mm × 4.8 mm

4.8 mm × 4.8 mm

ピクセル数(XY平面)

128 × 128

172 × 172微小時間0.035 sec

0.1 sec

12時間コンディショニング

Resin𝑧𝑦

4.8 mm𝑥Sensor×𝑦

3D model𝑥

56.2 µm56.2 µm

Senso
r

SensorXZ Plane

Δ𝑦Δ𝑥

4.8mm

センサによる測定・格子点は立方体
Δx = Δy = Δz = 28.1 µm
・ CaCl2の相互拡散係数 D = 1.3 × 10-9 / m2 s1を用いて拡散方程式の計算を行う

4.8 mmXY Plane結果
実測
35 sec2Dイメージング

樹脂の位置-3

測定開始-3300 sec

180 sec

360 sec

log10[Ca2+]

測定表示ピクセル
樹脂の直下 座標X：69 Y：106
樹脂の近傍 座標X：63 Y：111
樹脂から遠方 座標X：24 Y：11

樹脂の位置-5

測定開始

シミュレーションの条件は、
Ca2+ 回収領域の濃度を常に0（無限希釈）とした

樹脂の直キレート樹脂

下Startmeasurement

-2.0

樹脂の近傍
樹脂から遠方𝐥𝐨𝐠𝟏𝟎[𝐂𝐚𝟐+]

-3.0

測定開始

樹脂の位置

イオン交換樹脂(Na+ 型)-4.0-32+Ca2+ の吸収量： log
10 [Ca ] -3.2→-4.5
その到達時間： 265 秒（40 → 305 秒）-5.0

End ofmeasurement

-6.0
-7.0

300 sec

log10[Ca2+]

180 sec

360 sec

060120180240300

360Time / sec

測定表示ピクセル樹脂の直下 座標X：55 Y：88
樹脂の近傍 座標X：50 Y：84
樹脂から遠方 座標X：95 Y：124
測定終了

-5

ツリガネムシの実験
処理溶液
組成
培養液

小麦草粉末+純水(100 mg/L)

洗浄液

100 mM KCl
4 mM EGTA
50 mM Tris-malate (pH7.0)

透膜液0.1%(w/w) saponin
0.1 M KCl
4 mM EGTA
50 mM Tris-malate (pH7.0)

収縮液

3 mM CaCl2
100 mM KCl
4 mM EGTA
50 mM Tris-malate (pH7.0)

測定液

10 mM NaCl
50 mM Tris-malate (pH7.0)

ツリガネムシへの処理

測定表示ピクセル
樹脂の直下 座標X：86 Y：86
樹脂の近傍 座標X：101 Y：86
樹脂から遠方 座標X：16 Y：16

実測とシミュレーションの比較-1.0

35 sec360 sec300 sec

測定終了

(白)
樹脂の大きさ測定終了-5180 sec

30 seclog10[Ca2+]

イオン交換樹脂(Na+ 型)

キレート樹脂Ca2+ の吸収量：log2+10[Ca ]-3→検出下限(-7)

その到達時間： 11 秒（35 → 46 秒）
両者の結果からキレート樹脂はイオン交換樹脂よりCa2+ の吸収速度が速く、その吸収量も多い

樹脂の投下直前

樹脂の直下におけるCa2+ 濃度変化
（実測は樹脂から遠方での濃度変化を考慮）

シミュレーション
Ca2+ の吸収量： log10[Ca2+] -3→-4.5
その到達時間： 138 秒（30 → 168 秒）

樹脂直下のピクセルでイオン交換樹脂の実測結果とシミュレーションの結果はおおよそ一致（330秒後の不一致は、樹脂の引き上げ時の撹拌による影響）
しかし、キレート樹脂とは明らかに一致しないことからイオン拡散以外の現象が生じてCa2+ を回収したと考えられる

柄の膨張の開始

1 . シ ャ ー レ 中 に 24時 間 ほ ど か け て 定 着 させる
2. 洗浄後、 透膜処理を行う
3. Ca2+を含む洗浄液で柄を収縮させる

柄の膨張の終了

ツリガネムシの柄の膨張は、樹脂の投下から約80秒後に確認された連絡先 豊橋技術科学大学 電気・電子情報工学系 服部敏明 thattori@ee.tut.ac.jp