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ガラス化を利用した質の高い凍結組織包埋標本作製の検証
竹内 朋代（筑波大学附属病院つくばヒト組織バイオバンクセンター）

TAKEUCHI Tomoyo : Validation of high quality preparation of OCT-embedded frozen tissue utilizing vitrification
In order to promote clinical research, human biobanks that collect and provide clinical specimens have been constructed at university
hospitals and medical facilities in Japan. Optimal Cutting Temperature compound (OCT)-embedded frozen tissues stored in the biobanks
are useful research specimens that can be used for both morphological observation and genetic analysis. In this study, we exanimatedwhether the reagents used for vitrification are useful for maintaining the quality of OCT-embedded frozen tissues. OCT-embedded frozen
tissues prepared using tissue preservation solution maintained good morphology, but staining tended to be slightly weaker. The histologicalmorphology did not differ much from that of the usual preparation method.

組織損傷や細胞核の空砲化の少ない質の高い凍結包埋

1. 背景・目的
近年、臨床研究を促進するために全国の大学病院、標本を調整・保存することを目的として、ガラス化法

医療施設を中心に臨床検体を収集、提供するヒト試料の有用性を検証する。ガラス化法により従来の凍結包バイオバンクの構築が進められている。ヒト試料バイ

埋標本作製における欠点を克服できれば、信頼性の高オバンクでは手術や検査の残余試料を回収、保存し、い研究結果に繋がる高品質な研究用試料の保存が実現

必要に応じて研究者への提供を行っている1),2)

。筑波大

できる。

学附属病院に設立したつくばヒト組織バイオバンクセ
ンターは 2009 年より筑波大学附属病院の癌患者組織、人間ドック受診者血液等を凍結保存し、企業を含む学内外の研究者へ提供している（図 1）。主に遺伝子解析に使用する数ミリ角に細切した凍結組織片と形態学的解析に利用するホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)標本の保存を行っている。この他に術中迅速診断に使用する標本と同じ方法で作製する凍結包埋(OCT)標本の作製、保存も実施している。OCT 標本は標本作製か

図 1. つくばヒト組織バイオバンクセンターの事業内容

ら薄切切片の調整までを数十分で実施することができ、また、加熱や有機溶媒の使用をしないため、抗原性の2. 材料・方法保持や細胞膜の構造維持に優れている。遺伝子解析にガラス化法を応用し、研究用の組織保存液を用いても形態学的解析にも使用できる優れた研究用試料であ

凍結包埋標本を調整することで再現性の高い組織切片る。しかし、凍結時の氷晶形成による組織損傷や出入の作製が実現できるかを明らかにする。これまでに予庫を繰り返すと細胞核の空砲化が生じるという欠点が備検証を行った腎臓組織を対象とした。腎臓組織は、ある。凍結包埋標本を研究用試料として有効に利用す筑波大学附属病院つくばヒト組織バイオバンクセンタ

るためには、これらの欠点を補う質の高い凍結包埋標

ーに保存されている手術検体の残余試料で 10 症例を本の作製が望まれる。そこで、生殖医療分野で卵子や使用した。

受精卵を保存するために実施されている「ガラス化法」(1)組織保存液を用いた凍結包埋標本の作製、(2)組織を凍結包埋標本作製に応用することを思案した。ガラ切片の作製・染色、(3) 組織像の評価、を行った。

ス化法は高濃度の凍結抑制剤を使用して急速凍結する(1)研究用の組織保存用に市販されている組織用冷蔵ことで細胞中のを水を結晶化させずに凍結する方法で保存液（セリオキープ#株式会社バイオベルデ）に組織細胞へのダメージが少ない。本研究は氷晶形成によるを浸漬し 1 日冷蔵保存した後で凍結包埋標本を作製し34

生理学・生物学技研報2023

た（以下、保存液標本）。コントロールとして従来の包埋剤のみを使用した方法でも作製した。

A.

B.

C.

D.

(2)作製した保存液標本、コントロール標本より薄切組織切片を作製してヘマトキシリン・エオジン(Hematoxylin Eosin:HE)染色を実施した。
(3) HE 染色標本を観察して、保存液標本の組織像とコントロール標本を比較した。さらに標本を再凍結、再薄切して HE 染色を行い組織像の変化、再現性について検証した。
図 3. 保存液標本とコントロール標本の組織像

3. 結果

A. C. : 保存液標本（薄切 5 回目）

保存液標本は保存液に浸漬し、1 日冷蔵保存をした

B. D.：コントロール標本（薄切 5 回目）

後に作製したが、包埋や凍結等の作製の過程でコントロールとの差は無かった。包枚剤の変性もなく凍結時間もコントロールと同様に 1 分半から 2 分程度であっ4. 考察
保存液標本は作製の過程もコントロールと変わらず、た。HE 染色の過程ではコントロールと比較して、やや組織像も変性などの悪影響を与えることなく良好に保染色性が弱い傾向にあった。しかし、形態観察に影響つことができることがわかった。しかし、今回の症例するものではなかった。組織像も良好に保たれていた。

ではコントロール症例においても 5 回の薄切を実施し氷結晶による組織像の乱れもほとんどなく、核の抜けた後も良好な組織像が保たれており、保存液標本が特落ちも観察されなかった（図 2）。に優れているとは判断ができなかった。今後は保存液に浸漬する時間やさらに薄説の回数を増やした時の検A.

証を行い、高品質に OCT 標本を保存できる方法を見出

B.

したい。
謝辞
C.

本研究は JSPS 科研費 JP21H04120 の助成を受けたもD.のです。
参考文献
図 2. 保存液標本とコントロール標本の組織像

1) 竹内朋代、野口雅之.オミックス解析研究のための病A. C. : 保存液標本（薄切 1 回目）

理検体の取り扱い標準手技 1 凍結組織の採取・保管・B. D.：コントロール標本（薄切 1 回目）

移送. 病理と臨床 臨時増刊号, 34:21-26,2016
2) 竹内朋代、大和田洋平、宮崎貴寛、小田竜也、武川

薄切を繰り返した標本においても検証を行った。薄切を 2 週間おきに 5 回繰り返したが、薄切過程におい寛樹、西山博之、大河内信弘.ヒト組織バイオバンクの今.Organ Biology, 26(1):43-49,2019て保存液標本とコントロール標本で切りやすさ、スライドグラスへの貼付けのしやすさ等に差は生じず、両標本共に順調に作製ができた。HE 染色の過程では、1回目の薄切と同様に保存液標本はコントロールと比較して、やや染色性が弱い傾向にあった。しかし、形態観察に影響するものではなく、組織像も良好に保たれていた。5 回の薄切を繰り返した標本においても氷結晶による組織像の乱れはほとんどなく、核の抜け落ちも観察されなかった（図 3）。

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