[ノート]
珪藻類を対象とした植物プランクトン由来の難分解性溶存有機物に関する特性評価
仲川
１
２

直子 １

金澤

良昭 １

上村

育代 １

宮原

一隆 ２

梅本

諭３

兵庫県環境研究センター 水質環境科（〒654‑0037 神戸市須磨区行平町 3‑1‑27）

兵庫県立農林水産技術総合センター 水産技術センター（〒674‑0093 明石市二見町南二見 22‑2）

３

財団法人国際エメックスセンター （〒651‑0073 神戸中央区脇浜海岸通 1‑5‑2 人と防災未来センター東館 5F）

Characteristics of Refractory Organic Mattersfrom Planktonic Diatom Species

Naoko NAKAGAWA1, Yoshiaki KANAZAWA1, Ikuyo KAMIMURA1,
Kazutaka MIYAHARA2 and Satoshi UMEMOTO3
1 Water Environment Division, Hyogo Prefectural Institute of Environmental Sciences,3-1-27, Yukihira-cho, Suma-ku, Kobe, Hyogo 654-0037, Japan
2 Hyogo Fishers Technology Institute, Hyogo Prefectural Technology Center for Agriculture Forestry and

Fisheries,22-2, Minami-Futami, Akashi, Kobe, Hyogo 674-0093, Japan
3International EMECS Center

DRI East Bldg. 5F,1-5-2, Wakinohama-kaigan-dori, Chuo-ku, Kobe, Hyogo 651-0073, Japan近年，瀬戸内海では化学的酸素要求量（COD）の負荷量が減少したにもかかわらず，COD の値は横ばいの状態が続いており，その原因の一つとして難分解性有機物の存在が懸念されている．
そこで，これまでの大阪湾表層水中難分解性有機物の特性評価に加え，珪藻類を対象とした植物プランクトン由来有機物の生分解試験を行い，全有機炭素，紫外線吸光度及び３次元蛍光スペクトルの分析とゲルクロマトグラフィーを実施することで、内部生産の影響を検討した．
その結果，珪藻類の場合，植物プランクトン由来有機物の 20〜30％が難分解性有機物として残存する等，大阪湾の難分解性有機物の生成に内部生産が関与していることが示された．

Ⅰ

はじめに
そこで,これまで検討してきた陸域起源有機物及瀬戸内海は，総量規制等の対策により産業排水やび大阪湾における難分解性有機物の特性1)2)に加え，

生活排水からの有機物負荷量の大幅な削減が行われ，

内部生産起因の難分解性有機物についての特性を把

水質汚濁や赤潮発生件数等で改善がみられてきた．

握するため，大阪湾の植物プランクトン群集の中でしかし，依然としてCODに係る環境基準の未達成海

最も優勢である珪藻類（例えば，城 3)）を対象とし域は存在しており，その原因の一つとして難分解性た植物プランクトン由来有機物の生分解試験を行い，

1)

有機物の存在が考えられている ．

生分解前後における分解特性，構造特性，蛍光特性1及び分子サイズ特性について解析した．

料について次に示す(1)〜(4)の分析を行った．
なお，各分析結果に示す試料番号については,ブラⅡ

方ンク及び Skeletonema sp.，Chaetoceros affine，法

Coscinodiscus wailesii の植物プランクトン由来有機物試料による生分解試験前の結果を BL、P‑a、P‑b、

1. 植物プランクトン由来有機物試料の調製方法
大阪湾および播磨灘で採取した赤潮プランクトン

P‑c とし、それらの 100 日生分解試験後の結果をである Skeletonema sp.（不等毛植物門，珪藻綱，

BL(R)、P‑a(R)、P‑b(R)、P‑c(R)として表記すること

中心目，タラシオシラ科），Chaetoceros affine（不とする．

等毛植物門，珪藻綱，中心目，キートケロス科），(1) 全有機炭素の分析

Coscinodiscus wailesii（不等毛植物門，珪藻綱，

島津製全有機体炭素計 TOC−5000A を用いて，JIS

中心目，コスキノディスクス科）の供試株（クローK0102 22.27）に定める燃焼酸化−赤外線式 TOC 自動ン株）を MP1 培地 4)を用いて，光強度 200μmol/m2/s，

計測法により求めた．

明暗周期 16hL：8hD，温度 20℃の条件下で培養し，なお，生試料から得られた結果を全有機炭素（TOC），

それぞれ Table 1 に示す平均細胞密度の培養液を得ろ過試料から得られた結果を溶存態有機炭素（DOC），

た．次に，これらの培養液を Table 1 に示す液量ず

TOC から DOC を差し引いた値を懸濁態有機炭素（TOC

つ種別に孔径 5μｍのナイロンメッシュを用いて吸−DOC）とした．

引ろ過し，捕集したナイロンメッシュ上の細胞を(2) 紫外部波長 260nm の吸光度の分析

3％NaCl 溶液に分散した．そして，これらの溶液は芳香族化合物や不飽和二重結合を持つ化合物が紫直ちに超音波により細胞を破砕し，種別の植物プラ

外部波長 250〜280nm に大きな吸収を示す 8）ことかンクトン由来有機物試料として生分解試験に供した．

ら，日立製分光光度計 U−2001 により，光路長 5cmの石英セルを用いて，紫外部波長 260nm における吸光度（UV260）について測定した．

Table 1 Average cell density and volume of culture

ただし，単位はセル長当たりのミリ吸光度とし，medium for each species
Species

Skeletonema sp.
Chaetoceros affine
Coscinodiscus wailesii

Cell density(cell/mL)
6
1.36×1056.36×102
1.44×10mABS/cm で表現した．

Volume of Medium
(mL)
440
880
880

(3) 3 次元蛍光スペクトル分析
日立製分光蛍光光度計 F‑4500 を用い，励起波長200〜500nm，蛍光波長 200〜600nm の間の蛍光強度を励起波長 10nm，蛍光波長 5nm の間隔で 3 次元測定を行った．

2. 生分解試験方法
1 で調製した種別の植物プランクトン由来有機物

なお，腐植物質の定量方法 9）に従い，0.05Ｍ硫酸

試料を活性炭処理した大阪湾中央部のろ過海水で希溶液の 10μg/L 硫酸キニーネ溶液における励起波長

釈して基質としたものと，ブランクとしてろ過海水

350nm ， 蛍 光 波 長 455nm で の 蛍 光 強 度 を 10QSU

のみを基質としたものについて，10%となるように大(Quinine Sulfate Unit)として，試料の相対蛍光強阪湾沿岸域の表層水を植種し，暗所，20±1℃の条件度を見積もった．

下で通気性を保ち，毎分 50 回転の振とうを 100 日間(4) ゲルクロマトグラフィー
分析に用いる試料をロータリーエバポレーターを行った．
また，これらの生分解試験前後に，それぞれ試料

用いて 5 倍濃縮になるように減圧濃縮を行い，シリの一部を分取し，生試料と Whatman GF/C により吸ンジフィルター（Whatman GD/X）でろ過したものを

引ろ過を行ったろ過試料とに分けた．

ゲルクロマトグラフィー測定用試料とした．

5)6)に従い，この 100 日間の生ゲルろ過には，内径 2.5cm のカラムを用いて，担分解試験後に残存する有機物を難分解性有機物，そ体として Sephadex G‑15 を 90cm の高さになるようにの溶存態を難分解性溶存有機物と見なすこととする．

充填し，亀井らの報告 10）11）に準拠した方法で実施

なお，今井らの報告

した．
なお，ゲルクロマトグラフィー測定用試料の添加

3. 分析方法
2 において調製した生分解試験前後の生試料につ量は 5ｍL とし，蒸留水を溶離液として用いて，自然

いて次に示す(1)の分析を，生分解試験前後のろ過試

流下速度で 5mL ごとに試験管に分取した．分取した
2

溶出液について，それぞれ DOC と UV260 を測定し，相当するという星加ら 13）の見積りより，大阪湾では，ゲルクロマトグラムを作成した．

植物プランクトン由来有機物が相当量含まれていると考えられる．これらのことから，大阪湾表層水中Ⅲ結果および考察の難分解性有機物の生成に内部生産である植物プラ
ンクトン由来有機物が関与していることが示唆され

1. 植物プランクトン由来有機物の分解特性

た．

生分解試験前後の TOC を溶存態（DOC）と懸濁態（TOC‑DOC）とに分けて Fig.1 に示す．

2. DOC に対する UV260 の比による溶存有機物の構造

本研究では，あらかじめ培養した植物プランクト

特性

ンを超音波により破砕し，細胞の溶存化を図ったが、各試料の DOC，UV260 の分析結果及び DOC に対する

Fig.1 の P‑a,P‑b 及び P‑c より，90％近くの有機物

UV260 の比（UV260/DOC）を Table 2 に示す．

を溶存化できたのは P‑c だけであることが分かった．

Table 2 より，生分解試験前の各試料における

これは,生分解試験に用いた平均細胞密度の違い等

UV260／DOC は約 6〜11（mABS/cm/(mg/L)）となり，によるものと考えられるが，溶存化率が 50〜60％程

土壌腐植物質を多く含む森林流出水の報告値である度であった P‑a,P‑b においても生分解試験後にはど

約 30（mABS/cm/(mg/L)）14）に比べてかなり低い値とちらも 80％以上が溶存態となっていた．そのため,なった．そのため，腐植物質等を多く含む外来性由

生分解前の溶存化率にかかわらず,生分解を受ける

来の有機物に比べて植物プランクトン由来の有機物ことで植物プランクトン由来有機物の大部分は溶存の方が DOC に対する UV260 の比が低いという報告 14）

態になることが分かった．

と一致する結果となった．また，大阪湾の表層水のUV260／DOC が 10〜16（mABS/cm/(mg/L)）という結果

さらに，このことは，大阪湾表層水中の難分解性
１）

有機物の約 80％以上が溶存態となった結果 と一致2)しており，外洋中の溶存有機物の約 50％は安定で微示す外来性由来の有機物と UV260／DOC が低い値を生物により分解されにくいフラクションであるとの示す植物プランクトン由来有機物とが大阪湾表層水報告 12）もあることから，難分解性有機物の実体解明

中で混合していることが伺えた．

が得られていることから，UV260／DOC が高い値をにおいて溶存態に焦点を当てることの重要性が示さ

さらに,生分解試験後の結果をみると，どの試料にれた．

おいても生分解試験前に比べて UV260／DOC の値が高くなることが認められ，UV260 に吸収を示す芳香本研究で植物プランクトンとして用いた珪藻類が難族や不飽和二重結合等の官能基を持たない有機物の分解性有機物として残存する有機物の割合は 20〜方が生分解を受けやすいことが示唆された．また，30％であることが示され，大阪湾沿岸域の表層水中

この傾向は，大阪湾の DOC 値が高い地点の傾向 2)とに占める難分解性有機物の割合 1)と比べると約半数一致しており，DOC 値が高い海域において生分解をの割合となることが分かった．また，大阪湾におけ受けている有機物の多くを植物プランクトン由来のる内部生産起源の有機物は全有機物現存量の 47%に有機物が占めていることが推察できた．

TOC(mg/L)

次に, Fig.1 の P‑a(R),P‑b(R)及び P‑c(R)より，

16
14
12
10
8
6
4
2
0

Suspended

Table 2

Dissolved

UV absorbance at 260nm to DOC

P-c

P-c（R）

P-b（R）

P-b

P-a（R）

P-a

BL（R）

BL

TOC

changes

Sample
No．
BL
P‑a
P‑b
P‑c
BL(R)
P‑a(R)
P‑b(R)
P‑c(R)

Sample No.

Fig.1

Suspended

andDissolved

during 100 days incubations
3

DOC,UV absorbance at 260nm and ratio of

DOC(mg/L)
0.9
7.9
5.6
7.2
0.5
2.4
2.2
1.5

UV260
(mABS/cm)
7
48
48
81
6
25
31
22

UV260/DOC(mABS/cm/(mg/L))
8.0
6.1
8.5
11.3
12.0
10.4
14.1
14.7

3. 3 次元蛍光スペクトル分析による溶存有機物の蛍

B にピークが現れることが分かった． そのため，生

光特性分解を受ける前の植物プランクトン由来溶存有機物

ブランクを除く各試料の 3 次元蛍光スペクトル分はその大半がタンパク質様の蛍光を発する有機物で析を行った結果をスペクトル図として Fig.2 に示し，あるが、その有機物の一部が生分解を受けることにこれらの図から読みとれるピーク位置とその相対蛍より，腐植物質様の蛍光を発する有機物へと変化す

光強度を Table 3 に示す．

ることが推察できた．

なお，スペクトル図中の矢印は等高線のピーク位

さらに，このことは大阪湾表層水中溶存有機物の置を示しており，それぞれのピークは，福島らによ生分解前後における蛍光特性の変化 1)と一致しておりまとめられた 3 次元蛍光スペクトルのピーク位置

り，大阪湾表層水中に含まれる難分解性溶存有機物

の報告

15)

を参考に，タンパク質様ピーク（チロシンの一部を植物プランクトン由来の溶存有機物が構成

及びトリプトファンがピークを示す位置と類似したしていると考えられた．

位置に現れるピーク）と腐植物質様ピーク（腐植物
質がピークを示す位置と類似した位置に現れるピー

Table 3 Fluorescence peak positions (Excitationク）の 2 つのグループに分類し，それぞれ Group A，/Emission

Group B として表記した．

fluorescence intensity

Table 3 より，生分解試験前の P‑a，P‑b，P‑c は，wavelengths)

and

their

relative

Sample Position Position Position Position Position
No.
QSU
QSU
QSU
QSU
QSU

相対蛍光強度に差があるもののピーク位置は類似していることが分かった．また，これらの生分解試験

P-a後である P‑a(R)，P‑b(R)，P‑c(R)では，生分解試験

P-b

前に比べて，各試料間の相対蛍光強度の差が小さくなるとともに,いずれの試料においても，生分解試験

P-c

前に認められたピークにおける相対蛍光強度より値が低くなることが分かった．そのため，植物プラン

P-a (R)

クトン由来の溶存有機物を構成する有機物のうち，P-b (R)

強い蛍光強度を示す有機物の方が生分解を受けやすいということが示唆された．

P-c (R)

次に，Fig.2 より，生分解試験前では、Group A

220/31030.5
220/30528.5
220/33080.4
230/355
11.9
230/34513.3
220/3409.8

220/33040.3
220/32034.1
220/34588.7
340/42021.2
330/41517
230/41021.1

270/34024.5
270/34529.8
280/34569.2
230/43023.9
240/43521.1
340/41520.1

220/36035
220/355 220/380
49.4
35.3
220/360
79.3

240/44022.7にのみピークが認められたのに対して，生分解試験
後には，Group A のピークの数が減り，代わりに Group
500

500

P-a

P-a(R)

40

25

20
30

400
Excitation(nm)Excitation(nm)

400

20

Grorp A

Grorp B
15

Grorp A

10

300

300
10

5

0

0

200

200
200

300

Fig.2.1

400
500
Emission(nm)

200

600

300

400
500
Emission(nm)Characteristics of fluorescence spectra of sample P‑a and P‑a(R)
4

600

500

500

P-b

P-b(R)

40

25

20

30

400
Excitation(nm)Excitation(nm)

400

20

Grorp A

Grorp B
15

Grorp A

10

300

300
10

5

0

0
200

200
200

300

400
500
Emission(nm)

200

600

500

300

400
500
Emission(nm)

600

500

P-c

P-c(R)

80

25

70
20

60
Excitation(nm)Excitation(nm)

400

400

50
40

Grorp A30

Grorp B
15

Grorp A

10

300

300
20

5

10
0

0
200

200
200

Fig.2.2

300

400
500
Emission(nm)

200

600

300

400
500
Emission(nm)600Characteristics of fluorescence spectra of sample P‑b, P‑c, ,P‑b(R) and P‑c(R)

4. ゲルクロマトグラフィーによる溶存有機物のク位置を分類するために，みかけの分子量1,500

分子量分布特性

以 上 の 範 囲 を 画 群 Ⅰ ， み か け の 分 子 量 1,355 〜

ブランクを除く各試料のDOC及びUV260のゲルク

1,500の範囲を画群Ⅱ，みかけの分子量1,355付近

ロマトグラムをFig.3に示す。

を画群Ⅲ，みかけの分子量が低分子量域となる範なお，本研究に使用したSephadex G‑15は分画可

囲を画群Ⅳとして，Fraction No.20〜90を4つの画

能範囲が分子量1,500以下である 16） ため，分子量群に分割して図中に示した．

2,000,000 の Blue Dextran の 溶 出 位 置 で あ っ た

Fig.3より，どの試料においても高分子領域の画

Fraction No.32をみかけの分子量1,500以上の位群Ⅰにピークは認められなかった．このことと，置とし，分子量1,355の Vitamin B12の溶出位置で既報 2) において生分解試験前の大阪湾表層水及びあったFraction No.54をみかけの分子量1,355の武庫川河川水のゲルクロマトグラムの画群Ⅰにピ位置とした．また，ゲルクロマトグラムの各ピーークが認められていたことから，大阪湾表層水中
5に含まれる高分子領域の溶存有機物は陸域起源で
Ⅳ

20

1

10

0

0
30

ると，いずれの試料においても画群Ⅱより画群Ⅳに位置するピークの方が大きい値を示すことが分3

P‑b

DOC(mg/L)

かった．このことは，大阪湾表層水における難分
解性溶存有機物の特性 2) と一致しており，大阪湾
表層水中に含まれる難分解性溶存有機物を構成す

2

20

1

10

0
3

0
30

るみかけの分子量1,355〜1,500の範囲の溶存有機物と低分子量域の溶存有機物に植物プランクトン
由来の溶存有機物が含まれている可能性が示唆さDOC(mg/L)

P‑c

れた．
一方,大阪湾表層水中の難分解性溶存有機物では

2

20

1

10

0

0
30

認 め ら れ な か っ た 画 群 Ⅲ に お け る ピ ー ク 2) がP‑a(R)において認められ，また,大阪湾表層水では

3

P‑a(R)
DOC(mg/L)

生分解による減少がほとんど認められなかった画
2)

群Ⅳにおけるピーク が，P‑a及びP‑cでは生分解
試験後に大きく減少していたことから，植物プラ

2

20

1

10

0

0

ンクトン由来溶存有機物の中には，生分解を受けやすく，大阪湾の表層水中には残存しない溶存有DOC(mg/L)結

P‑b(R)

論

本研究では,珪藻類を対象とした植物プランク
トン由来有機物の種々の特性を把握するとともに，大阪湾表層水中の難分解性有機物の特性と比較検討することで, 植物プランクトン由来有機物が大阪湾の難分解性有機物の生成に関与していることを示唆できた．
しかし,大阪湾では，珪藻類以外の藻類による赤潮の発生も確認されており 17），内部生産を検討する上で珪藻類以外の藻類を対象とした植物プラン
クトン由来有機物に関する知見も得る必要がある．
そのため，今後は,さらなる植物プランクトン由来の難分解性有機物に関する調査や未検討である
陸域起源有機物の分解特性についての検討を加えた上で，大阪湾における難分解性有機物の生成メ
カニズムを解明していくべきと考える．

2

20

1

10

0
3

0
30

P‑c(R)
DOC(mg/L)

Ⅳ

30

3

機物も含まれていると考えられた．

UV260(mABS/cm)

2

2

20

1

10

UV260(mABS/cm)

DOC(mg/L)

クが示すDOCとUV260の値からUV260/ DOCを読みと

UV260

UV260(mABS/cm)

P‑a

れたのは画群ⅡとⅣであり，これらの位置のピー

30

DOC

3

P‑b(R)，P‑c(R)において共通してピークが認めら

UV260(mABS/cm)

Ⅲ

UV260(mABS/cm)

また,100日生分解試験後の試料であるP‑a(R)，Ⅱ

UV260(mABS/cm)

画群 Ⅰあると推察できた．

0

0
20

25

30

35

40

45

50 55 60 65
Fraction No.

70

75

80

85

90

Fig.3 Gel chromatograms with Sephadex G‑15 ofsample P‑a, P‑b, P‑c, P‑a(R),P‑b(R) and P‑c(R)The fraction group(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ) wereshown in upper the figure.

謝

辞本研究を実施するにあたり，大阪湾広域臨海環
境整備センターによる「廃棄物・海域水環境保全に係る調査研究助成事業」の助成を受けました．
6

ここに記して謝意を表します．

尾崎則篤：EEMS による水中溶存有機物の特性解析．
水環境学会誌，24(10)，686−692（2001）

文献16) Sephadex‑gel filtration in theory andpractice, 6‑10 ， Pharmacia

1) 仲川直子, 金澤良昭，梅本諭，上村育代：大阪

東京（1974）

Fine

Chemicals,

湾表層水中有機物の生分解前後における特性変化17) 城久，矢持進：富栄養化の問題点，赤潮．村について．兵庫県環境研究センター紀要，1，

上彰男編，水産学シリーズ 62 漁業からみた閉鎖性25‑30(2010)

海域の窒素・リン規制，32‑47，恒星社厚生閣，東2) 仲川直子, 金澤良昭，梅本諭，上村育代：陸域

京（1986）

溶存有機物との比較における大阪湾域難分解性溶
存有機物．兵庫県環境研究センター紀要，1，

Abstract

31‑36(2010)3) 城久：海域環境の特徴とその推移，生物環境．

In recent years, the chemical oxygen demand (COD)

城久編，水産研究叢書 49 大阪湾の海域環境と生物

values in the Seto Inland Sea have not decreased in

生産，34‑46，社団法人日本水産資源保護協会，東spite of the reduction of COD loads, suggesting the

京（2002）

influence of refractory organic matters (ROM).

4) 長井敏，真鍋武彦:培養条件下における大型のThe ROM originated from dominant diatom species

珪藻類の Coscinodiscus wailesii の増殖胞子形成.

in the eastern Seto Inland Sea were investigated on

日本プランクトン学会報，40(2),151‑167(1994)

total organic carbon, UV absorbance, fluorescent5) 今井章雄：湖沼トレンドモニタリングでみる難property and analysis of molecular weight by gel

分解性有機物の特性と動態．地球環境研究センタ

chromatography.

ーニュース，14(7)，11‑14（2003）

It was shown that 20-30% of the organic matters6) 小田泰史，今村修，山崎文雅，山形卓，植木肇：from diatom species were ROM, and so on.

緑川の難分解性有機物負荷量．熊本県保健環境科

These results suggest that a part of ROM in Osaka

学研究所報，31，61‑65（2001）

Bay were derived from diatom species.

7) 日本工業標準調査会標準部会：工場排水試験方法 JIS K 0102，55−56，日本規格協会，東京（1998）8) 矢部禎昭：COD 及び排出量の測定技術．用水と廃水,22(10),11‑19（1980）
9) 長尾誠也：腐植物質（フミン物質）．日本分析化学会北海道支部編，水の分析，376‑378，㈱化学同人，京都（2005）10)亀井翼，丹保憲仁：水質のマトリックス的評価のためのゲルクロマトグラフィー．水道協会雑誌，（519），24‑41（1977）
11)丹保憲仁，亀井翼：マトリックスによる都市水
代謝の水質評価．水道協会雑誌，（ 502），2‑24（ 1976）
12)斉藤喜二，早野茂夫：フルボ酸のゲルクロマト
グラフィー．生産研究，29(3)，75‑78(1977)13)星加章，谷本照己，三島康史：大阪湾における富栄養化と内部生産有機物.水環境学会
誌,21,765‑771（1998）
14) 福島武彦，今井章雄：湖水溶存有機物の紫外
線吸光度：DOC 比の特性とそれの水質管理への利用.水環境学会誌,20(6),397‑403（1997）15) 福島武彦，中島俊之，今井章雄，松重一夫，
7