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Clear Native(CN)-PAGE を用いた光合成タンパク質複合体の分離
野田 千代（基礎生物学研究所技術課）

NODA Chiyo : Separation of photosystem protein supercomplexes in algae using CN-PAGE.
In the research department to which I am assigned, sucrose density gradient ultracentrifugation has been predominantly employed forthe separation of protein supercomplexes in photosynthesis. However, this separation technique is time-intensive due to the use ofultracentrifugation and also limits the number of samples that can be simultaneously processed. Furthermore, there is a concern that certain
subunits may undergo dissociation during the purification process. In contrast, Native-PAGE is an electrophoresis-based method thatenables the separation of protein supercomplexes while preserving their higher-order structure and activity without causing protein
denaturation. Thus, in order to expedite the processing of a larger number of samples in a shorter period, we initiated the separation ofprotein complexes by employing Clear Native (CN)-PAGE, a technique that had not been used before. We will provide a detailed reporton the experimental procedures and the improvements made at each stage of the process.

非変性条件で高次構造や活性を維持したままタンパク

1. 目的
環境の変化に対する細胞内の素早い応答は、タンパ質複合体を分離する方法である（表 1）。温和に作用すク質レベルの制御がおこなわれているとされる。光合る非イオン性界面活性剤を用いることで、解離しやす成電子伝達反応においても、チラコイド膜の複数の膜い膜タンパク質複合体の不安定な超分子集合体を保持タンパク質複合体が相互作用しながら機能している。

できる。

光合成機構を解明するうえで、光化学系膜タンパク質複合体のサブユニット組成の解析は不可欠であるが、解離しやすく不安定なタンパク質複合体の解析は難しい。配属先の研究部門ではこのような膜タンパク質複合体の分離・精製おこなうために、主にショ糖密度勾配遠心法（SDG）を用いていた。しかしこの方法では超遠心に時間がかかるうえに、多数のサンプルを同時に処理することが困難であった。また特定のサブユニットが精製の過程で解離してしまうことも懸念される。
それに対して、近年タンパク質複合体の解析に用いられるようになってきた Native-PAGE は、タンパク質を変性させずに電気泳動する方法であり、高次構造や活性を維持したままタンパク質を分離できる。そこで、短時間でより多くのサンプル数を処理するために、今まで殆ど使用していなかった Clear Native(CN)-PAGEによるタンパク質複合体の分離を始めたので報告する。

種類

可溶化

SDSPAGE

イオン性界面活性剤

SDS

変性

電荷付加

特徴＋SDS

ペプチド鎖長(分子量)のみが反映される

CBB
G-250

Blue
NativePAGE

非イオン性界面活性剤

−

Clear
NativePAGE

非イオン性界面活性剤

−

青い色素

Amphipol無色の高分子青い色素が結合するため分光測定には不適切使用する界面活性剤により様々な応用が可能

Clear-Native(CN)-PAGE の実験過程は以下のとおりである。①ゲルの作製、②チラコイド膜の抽出、③可溶化・安定化、④電気泳動① 本来は低温室（4℃）でおこなうのが望ましいが、10℃に設定した実験室にて使用する実験器具や溶液を冷却した。
② 細胞懸濁液を液体窒素で凍結、恒温ブロック(35℃)

2. 方法
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)において、SDS-PAGE が変性状態のタンパク質をペプチド鎖長に応じて分離するのに対し、Clear-Native(CN)-PAGE は52

表 1. ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)で融解した。細胞懸濁液にはプロテアーゼ阻害剤を添加した。
③ 膜タンパク質の可溶化には今までに実績のあるド

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デシルマルトシド（α-DM）を、安定化と負電荷の付与には Amphipol（A8-35）を使用した。
④ 電気泳動は 4℃に設定したインキュベーター内に

4. 考察
SDG と CN-PAGE で分離できた膜タンパク質複合体の種類に大きな差異はなかった。分離は可溶化に使用した界面活性剤に大きく依存すると考えられる。

泳動槽を置きおこなった。

現在のところ、CN-PAGE を試した藻類はプラシノ藻だけなので、他の藻類（クラミドモナスやクロレラな3. 結果
藻類において、CN-PAGE を用いてショ糖密度勾配遠ど）でも使用したいが、細胞膜・壁の強度が異なるの心法（SDG）と同様のタンパク質複合体の分画を分離で、改めてチラコイド膜の抽出方法を検討しなければできた（図 1）。ゲルのタンパク質バンドはシャープで、ならない可能性がある。

A3 分画（PSⅠ-LHCⅠ複合体）と A3L 分画（PSⅠ-LHCⅠ-

さらに CN-PAGE 後に 2D-PAGE（SDS-PAGE）をおLhcp 複合体）
周辺の分離能は高かった（図 1 矢印部分）。

こなうことにより、分子量を推定し、質量分析により微量でもタンパク質を同定することが可能である。今後は、光合成膜タンパク質複合体が様々な生理的条件下で離合集散する過程を明らかにするために、CNPAGE から 2D-PAGE までの実験法を確立させ、タンパク質複合体のサブユニット組成の解析に尽力したい。
謝辞
本実験を遂行するにあたり、ご指導いただいた環境
光生物学研究部門の横野牧生准教授に深く感謝いたします。
参考文献
M. Yokono et al. A megacomplex composed of bothphotosystem reaction centres in higher plants. Nat.Commun（2015）6：6675

A3: PSI-LHCI supercomplex
A3L: PSI-LHCI-Lhcp supercomplex
A1: LHCs
A4: Other complex
図 1. SDG と CN-PAGE に膜タンパク質複合体分画(Ostreococcus.tauri)の比較

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