腸管上皮の細胞間アミノ酸吸収の制御による高齢者フレイルティの予防に関する研究
岐阜薬科大学 生命薬学大講座 生化学研究室
いかり

五十里あきら彰

副学長兼教授腸管上皮の細胞間アミノ酸吸収の制御による高齢者フレイルティの予防に関する研究主任研究者

岐阜薬科大学 生命薬学大講座 生化学研究室 教授

分担研究者

五十里

富山大学 研究推進総合支援センター 教授

田淵静岡県立大学食品栄養科学部 准教授

久由

林彰圭章

【要旨】
高齢者は食事摂取量と栄養素吸収量が低下し、アミノ酸不足などに起因する虚弱（フレイルティ）のリスクが増大する。アミノ酸不足の予防に向け、腸管における吸収機構を解明する必要がある。本研究では、腸管アミノ酸吸収の制御における細胞間密着結合（タイトジャンクション）の役割を検討した。若齢と老齢マウスの腸管を用いて、タイトジャンクション構成因子であるクローディン（CLDN）の発現量を比較したところ、老化に伴い CLDN8 発現量が低下することを見出した。マウス腸管由来の MCE301 細胞をアミノ酸除去培地で培養したところ、CLDN8 発現量が低下した。アミノ酸除去により CLDN8 の転写活性は変化しなかった。また、アミノ酸除去によりオートファジーが誘導されることが知られているが、CLDN8 の発現低下はオートファジー阻害剤で阻害されなかった。そのため、オートファジー以外の経路を介して、CLDN8 発現が低下することが示唆された。次に、細胞間透過性に対する CLDN8 発現の影響を検討した。
CLDN8 発現ノックダウンにより上皮膜間電気抵抗値が低下し、管腔側から血管側へのルシファーイエロー（水溶性蛍光マーカー）およびアミノ酸の透過性が増大した。以上より、CLDN8 は細胞間イオン透過性を制御するだけでなく、アミノ酸に対するバリアを形成することが示唆された。
高齢者の腸管では、アミノ酸不足によって CLDN8 発現が低下し、細胞間バリア機能が低下するとともに、細胞間アミノ酸輸送が亢進している可能性がある。

１、調査研究目的
高齢者は食事摂取量と栄養素吸収量が低下し、アミノ酸不足に起因する虚弱（フレイルティ）のリスクが増大する。アミノ酸不足の予防に向け、腸管における吸収機構を解明し、吸収促進剤の開発が必要である。これまで食事から摂取されたタンパク質は腸管内でアミノ酸やジ・トリペプチドに分解され、細胞膜上に発現するトランスポーターを介して吸収されることが報告されて95いる 1)。一方、細胞間結合の一つであるタイトジャンクションは完全なバリアを形成するのではなく、電解質イオンや低分子に対するポアを形成する。そのため、アミノ酸も細胞間輸送を介して吸収される可能性がある。
タイトジャンクションは 4 回膜貫通型タンパク質であるクローディン（CLDN）やオクルディン、足場タンパク質である ZO-1 や ZO-2 などによって形成される 2)。哺乳類の CLDN には 27 種類のサブタイプが存在し、各サブタイプの組み合わせによってタイトジャンクションの機能が変化することが明らかになってきた。小腸や大腸には、CLDN2、3、4、7、12、14、15 が高発現している 3)。電解質イオンや水の透過性を指標として、CLDN3、4、7、14 はバリア形成型、CLDN2、12、15 はポア形成型に分類される。一方、分子量が 500 Da 程度までの低分子は、タイトジャンクションを通過することができるが、CLDN サブタイプによる低分子透過性の制御機構は大部分が不明である。
本研究では、老化による CLDN サブタイプの発現変化を調べ、細胞間アミノ酸輸送との関係を検討した。さらに、腸管由来培養上皮細胞を用いて、CLDN サブタイプの発現制御機構を分子レベルで解析した。

2、調査研究方法
2-1

実験動物と組織サンプルの調製

実験には若齢（6 週齢）および老齢（49 週齢）の C57BL/6N マウスを使用した。動物実験は、岐阜薬科大学動物実験委員会の承認を得て実施した。各群のマウスから腸管を摘出後、TRI
reagent を用いて全 RNA を抽出した。
2-2細胞培養とトランスフェクション

マウス腸 管由来 MCE301 細 胞を、5% 牛 胎 児 血 清を 含 む Dulbecco’s modified Eagle
Medium で培養した。TRPM6 のプロモーター領域を組み込んだ pGL4 ルシフェラーゼレポー
ターベクターを、HilyMax を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション効率を標準化するため、pRL-TK ベクターを使用した。Dual-Glo Luciferase Assay System を用いて転写活性を測定した。
2-3

逆転写反応と polymerase chain reaction（PCR）反応

腸管組織および培養細胞から抽出した RNA を鋳型とし、ReverTra Ace を用いて逆転写反応を行った。得られた cDNA を鋳型とし、Thunderbird SYBR qPCR Mix を用いてリアルタイム PCR を行った。
2-4

SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウエスタンブロット

96

Lysis buffer を用いて、細胞膜および細胞質タンパク質を抽出した。12.5% SDS- ポリア
クリルアミドゲルにサンプルをアプライ後、100 ～ 120V で約 90 分間電気泳動した。ゲルをPVDF 膜に転写後、2% スキムミルクで 30 分間処理することによりブロッキングを行った。
その後、各種一次抗体（1,000 倍希釈）を 4℃で約 16 時間処理した。PVDF 膜を洗浄後、二次 抗体（3,000 倍希 釈）を室温で 60 ～ 90 分間反 応させた。EzWestLumi plus またはImmunoStar LD を用いて、各タンパク質のバンドを検出した。
2-5タンパク質の細胞局在の解析

カバーガラス入りの培養皿で細胞を培養した。冷メタノールで細胞を固定後、0.5% Triton
X-100 ／ PBS 溶液で細胞を可溶化した。4% ブロックエースでブロッキング後、各種一次抗体（100 倍希釈）を 4℃で約 16 時間処理した。一次抗体を洗浄後、Alexa Fluor 488 を付加した二次抗体（100倍希釈）を室温で 90 分間反応させた。カバーガラスをスライドガラスに固定後、LSM700 共焦点レーザー顕微鏡を用いて、標的タンパク質の細胞局在を解析した。
2-6

細胞間バリア機能の評価

細胞をトランスウェルに培養し、Volt ohm メーターを用いて上皮膜間電気抵抗値を測定した。
また、水溶性蛍光色素である lucifer yellow（LY）の透過性を指標として、低分子に対する細胞間バリア機能を評価した。
2-7

細胞間アミノ酸輸送量の評価

細胞をトランスウェルに培養し、上皮膜を介したアミノ酸輸送を解析した。管腔側から血管側への輸送量を調べるため、管腔側を 100% アミノ酸含有溶液、血管側をアミノ酸不含溶液に置換し、30 分間インキュベーション後、血管側溶液を回収した。アミノ酸定量キットを用いて、アミノ酸の輸送量を算出した。なお、4℃でインキュベーションすることによってアミノ酸トランスポーターの働きを阻害し、経細胞間輸送の関与を除外した。

3、調査・研究成果
3-1

老化による CLDN サブタイプの発現変化

若齢マウスと老齢マウスを用いて、腸管における CLDN サブタイプの発現に対する老化の影響を検討した。老齢マウスでは、CLDN4 と CLDN8 mRNA 量が有意に低下した。一方、数種類の CLDN サブタイプの発現量が増加した。細胞老化促進剤である tenovin-1 でMCE301 細胞を処理したところ、CLDN8 mRNA 量が低下した 4)。そのため、老化に伴ってCLDN8 の発現量が低下し、腸管のバリア機能や栄養吸収機能に影響を及ぼすことが示唆された。

97

3-2

CLDN サブタイプの発現に対するアミノ酸濃度の影響

MCE301 細胞を通常培地、50% アミノ酸含有培地、0% アミノ酸含有培地（不含培地）で6 時間インキュベーション後、CLDN サブタイプの発現量を測定した。アミノ酸濃度の低下に
より CLDN8 mRNA が低下した（図 1）。一方、数種類の CLDN サブタイプの発現量が増加した。これらの結果は、老齢マウスの腸管における発現変化と類似する。
3-3

CLDN8 の細胞局在に対するアミノ酸濃度の影響

MCE301 細胞における CLDN8 の発現と局在を、それぞれウエスタンブロット法と蛍光免疫染色法で解析した。アミノ酸濃度の低下により、CLDN8 タンパク質量も低下した（図 2）。また、通常培地でインキュベーションした細胞において、CLDN8 の一部はタイトジャンクションに分布していたが、アミノ酸不含培地でインキュベーションした細胞において CLDN8 の発現が消失した。
3-4

アミノ酸濃度の低下による CLDN8 の発現低下機構

CLDN8 のレポーターベクターを用いて、転写活性に対するアミノ酸濃度の影響を検討した。
MCE301 細胞をアミノ酸不含培地でインキュベーションしたところ、CLDN8 の転写活性は有意に変化しなかった（図 3）。そのため、別の調節機構の関与が示唆された。アミノ酸が欠乏
すると細胞は成長を停止し、オートファジーによる自己分解を引き起こす。CLDN8 発現の低下におけるオートファジーの関与を解明するため、オートファジー阻害剤であるクロロキンと 3メチルアデニンの効果を検討した。アミノ酸不含培地における CLDN8 発現の低下は、オートファジー阻害剤の処理によって改善しなかった（図 4）。以上の結果から、アミノ酸濃度の低下によりオートファジー以外の経路を介して CLDN8 発現が低下することが示唆された。
3-5

細胞間バリア機能に対する CLDN8 発現の影響

MCE301 細胞の細胞間バリア機能を評価するため、TER と LY 透過性を調べた。50% お
よび 0% アミノ酸含有培地で培養した細胞において、TER が増加し、LY 透過性が低下した（図 6）。アミノ酸濃度の低下により、CLDN サブタイプの発現パターンが変化し、細胞間バリア機能が増強することが明らかになった。細胞間バリア機能に対する CLDN8 発現の影響を検討したところ、CLDN8 発現の低下により TER が低下し、LY 透過性が増加した。そのため、アミノ酸濃度の低下による細胞間バリア機能の変化には、複数の CLDN サブタイプの発現変化が関与することが示唆された。
3-6

細胞間アミノ酸輸送に対する CLDN8 発現の影響

細胞をトランスウェルに培養し、上皮膜を介したアミノ酸の輸送量を測定した。管腔側から血管側へのアミノ酸輸送量は、CLDN8 発現の低下によって増加した（図 7）。一方、血管側から管腔側へのアミノ酸輸送量は、CLDN8 発現の影響を受けなかった。以上より、細胞間アミノ酸吸収の制御に CLDN8 の関与が示唆された。

98

4、考察
MCE301 細胞における CLDN サブタイプの発現に対するアミノ酸濃度の影響を検討したところ、CLDN4、15 の発現量が増加したのに対し、CLDN8 の発現量が低下した。一方、他のCLDN サブタイプの発現は有意に変化しなかった。高齢マウスの腸管においても CLDN8 の発現が低下していた。CLDN8 の発現低下機構は未解明であるが、miRNA の関与が報告されているため 5)、今後の検討が必要である。また、クローン病患者において、CLDN8 発現の低下が報告されており 6)、細胞間バリア機能の低下が示唆される。
LY透過性を調べたところ、
CLDN8ノックダウンにより透過性が増大したため、CLDN8 はバリア機能の維持に関与することが明らかになった。
大腸において、CLDN8 の発現はアルドステロンによって調節される 7)。アルドステロンは上皮型ナトリウムチャネルの発現誘導を介して、ナトリウムイオンの吸収を促進する。CLDN8 の発現増加によって細胞間バリア機能を増強し、血管側から管腔側へのナトリウムイオンの漏れを防御することが示唆される。本研究において、CLDN8 ノックダウンにより TER が低下したため、過去の報告と一致する。一方、アミノ酸濃度の低下により TER が増加したため、CLDN8 以外のCLDN サブタイプの発現変化が、イオン透過性に大きく寄与することが示唆された。
アミノ酸輸送に対する CLDN8 発現の影響を検討したところ、CLDN8 ノックダウンにより管腔側から血管側へのアミノ酸輸送量が増加した。この結果は LY 透過性の結果と一致する。一方、血管側から管腔側へのアミノ酸輸送量は CLDN8 発現の影響を受けなかった。CLDN8 が低分子に対するバリアを形成するならば、輸送方向性があるとは考えにくいため、他の CLDN サブタイプの細胞局在の変化などが関与する可能性がある。今後、蛍光免疫染色により、CLDN サブタイプの局在に対するアミノ酸濃度の影響を検討する必要がある。
経口摂取したタンパク質は、アミノ酸やジペプチドに消化され、細胞膜上のトランスポーターを介して吸収されると考えられてきた。今回、アミノ酸濃度の変化によって CLDN サブタイプの発現が変化し、さらに CLDN サブタイプの発現を外因的に変化させることによってアミノ酸透過性が変化したため、CLDN もアミノ酸吸収の制御に関与することが示唆された。

5、まとめ本研究において、老化に伴い腸管における CLDN8 発現が低下することを見出した。アミノ酸濃度の低下により、オートファジー以外の経路を介して、CLDN8 mRNA 量が低下することが示唆された。また、CLDN8 はアミノ酸に対するバリアを形成しており、高齢マウスではアミノ酸吸収を促進するために CLDN8 発現が低下することが示唆された。今後、アミノ酸輸送に対する他の CLDN サブタイプの関与を検討する必要があるが、CLDN を標的とした機能性食品素材や薬を開発することにより、高齢者のフレイルティの予防に繋がることが期待される。

99

6、調査研究発表（口頭叉は誌上発表）
本調査研究成果の一部について、第 99 回日本生理学会大会（2022 年 3 月 16-18 日、宮城県）で発表した。

7、引用文献1) Miner-Williams W M, Stevens B R and Moughan P J ( 2014) Are intact peptides
absorbed from the healthy gut in the adult human? Nutr Res Rev, 27, 308-329.
2) Umeda K, Ikenouchi J, Katahira-Tayama S, Furuse K, Sasaki H, Nakayama M, MatsuiT, Tsukita S and Furuse M (2006) ZO-1 and ZO-2 independently determine whereclaudins are polymerized in tight-junction strand formation. Cell, 126, 741-754.
3) Holmes J L, Van Itallie C M, Rasmussen J E and Anderson J M (2006) Claudin profilingin the mouse during postnatal intestinal development and along the gastrointestinal
tract reveals complex expression patterns. Gene Expr Patterns, 6, 581-588.
4) Hirota C, Takashina Y, Ikumi N, Ishizuka N, Hayashi H, Tabuchi Y, Yoshino Y,Matsunaga T and Ikari A (2021) Inverse regulation of claudin-2 and -7 expression byp53 and hepatocyte nuclear factor 4alpha in colonic MCE301 cells. Tissue Barriers, 9,1860409.
5) Li M, Zhao J, Cao M, Liu R, Chen G, Li S, Xie Y, Xie J, Cheng Y, Huang L, Su M, Xu
Y, Zheng M, Zou K, Geng L, Xu W and Gong S (2020) Mast cells-derived MiR-223
destroys intestinal barrier function by inhibition of CLDN8 expression in intestinalepithelial cells. Biol Res, 53, 12.
6) Barmeyer C, Fromm M and Schulzke J D (2017 ) Active and passive involvement ofclaudins in the pathophysiology of intestinal inflammatory diseases. Pflugers Arch, 469,
15-26.
7 ) Amasheh S, Milatz S, Krug S M, Bergs M, Amasheh M, Schulzke J D and Fromm
M ( 2009 ) Na+ absorption defends from paracellular back-leakage by claudin-8
upregulation. Biochem Biophys Res Commun, 378, 45-50.

100

2.5

2.0

2.0

2.0

2.0

1.5

NS1.0NS0.5010050

1.5
1.0100501.5NS

1.00.500NS10050

1.50.52.5

2.02.02.0

2.0010050

1.0100AA (%)

2.02.0NS

1.00.5010050AA (%)

Fig. 10CLDN15 mRNA

2.5NS50

1.5
1.0

∗∗

0.500NS

100AA (%)

2.5

1.5

NS

0.500NSNS

1.00.50100502.0

2.01.0NS

0.50010050

1000

1.5500NSNS50

01.00.50100

AA (%)

AA (%)NSAA (%)
2.5NS00.500NS

1.02.51.550

1.5AA (%)∗∗1.550ZO-1 mRNA

0.51.5OCLN mRNA

1.0NS

CLDN10 mRNA

2.5

CLDN8 mRNA

2.5NS100AA (%)

2.51.5NS

1.000∗∗AA (%)

AA (%)

CLDN7 mRNA

CLDN5 mRNA

AA (%)

CLDN12 mRNA

NS

0.500NS

CLDN4 mRNA

2.5

CLDN3 mRNA

2.5

CLDN2 mRNA

CLDN1 mRNA

2.5

AA (%)

Effect of amino acid concentration on CLDNs expression in MCE301 cells

MCE301 cells were cultured for 7 days, followed by incubation with 100%, 50%, or 0% amino acid(AA)-containing medium for 6 h. After isolation of total RNA, real time PCR was performed using
primers pair of each CLDN isoform, occludin (OCLN), and ZO-1. The mRNA levels are represented
as a ratio of 100% AA. ** P < 0.01 and NS P > 0.05 vs 100% AA.

101

Fig. 2

Effect of AA concentration on expression and localization of CLDN8MCE301 cells were incubated with 100%, 50%, or 0% AA-containing medium for 24 h. (A) The celllysates were blotted with anti-CLDN8 and anti-β-actin antibodies. (B) The cells were immunostainedwith antibodies against CLDN8 and ZO-1. The nuclei were stained with DAPI. Merged images areindicated in the right panels.

Fig. 3

Effects of AA concentration on reporter activity of CLDN8MCE301 cells were transfected with CLDN8 promoter vector and pRL-TK vector. The cells wereincubated with 100% or 0% AA-containing medium for 6 h. The reporter activity was measured usinga Dual-Glo Luciferase Assay system and represented as a percentage of 100% AA. NS P > 0.05 vs100% AA.

102

CLDN8 mRNA

1.51.0∗∗

NS0Fig. 4

NS0.5

VehVeh CHL 3MA100 AA0 AA

Effects of autophagy inhibitors on AA-depletion-induced reduction of CLDN8expression
Cells were incubated with DMSO (veh), 10 µM chloroquine (CHL), or 2 mM 3-methyladenin (3MA).
After incubation with 100% or 0% AA-containing medium, real time PCR was performed using primer
pairs against CLDN8 and β-actin. The mRNA levels are represented as a ratio of 100% AA. ** P <0.01 vs 100% AA. NS P > 0.05 vs negative or vehicle with 0% AA. ## P < 0.01 vs negative with 0%AA.

∗∗

400
NS300
200
10001005000.020∗∗ ∗∗0.0150.010
0.005
0100AA (%)

si-CLDN82000.005
0.004∗∗0.003
0.002
0.0010si-Neg∗∗4000Fig. 5

LY permeability (cm/min)

600

0AA (%)

800

si-NegTER (Ω · cm2)

B50

si-CLDN8500

LY permeability (cm/min)

TER (Ω · cm2)

A

Effects of AA concentration and CLDN8 expression on barrier function(A) Cells were incubated with 100%, 50%, or 0% AA-containing medium for 24 h. (B) Cells weretransfected with negative (si-Neg) or CLDN8 siRNA (si-CLDN8). TER was measured using voltohmmeter. LY was added in the apical chamber and the cells were incubated for 30 min. After
collecting the solution in the basal chamber, the fluorescence intensity of LY was measured using anInfinite F200 Pro plate reader. ** P < 0.01 vs 100% AA or si-Neg. P > 0.05 vs 0% AA.

103(A) Cells were incubated with 100%, 50%, or 0% AA-containing medium for 24 h. (B) Cells weretransfected with negative (si-Neg) or CLDN8 siRNA (si-CLDN8). TER was measured using voltohmmeter. LY was added in the apical chamber and the cells were incubated for 30 min. After
collecting the solution in the basal chamber, the fluorescence intensity of LY was measured using anInfinite F200 Pro plate reader. ** P < 0.01 vs 100% AA or si-Neg. P > 0.05 vs 0% AA.

Fig. 6

Effect of CLDN8 expression on paracellular AA flux

Cells were transfected with negative (si-Neg) or CLDN8 siRNA (si-CLDN8). AA was added in theapical (A→B) or basal chamber (B→A), followed by incubation for 30 min at 4 ℃. The concentrationof AA was measured using an assay kit. ** P < 0.01 and NS P > 0.05 vs si-Neg.

104