LED 誘起蛍光法による植物葉とミドリムシの光合成活性の測定○増田 健二 a)・竹本 裕之 a)a)

静岡大学技術部

1. はじめに植物にダメージを与えることなく、光合成活性を測定できる LED 誘起蛍光法を開発した[1]。従来の方法には、紫外・可視レーザー光を用いたレーザー誘起蛍光法[2],[3]があり、植物葉のクロロフィル蛍光スペクトルを測定している。レーザー光を植物葉に照射するとその熱のため、植物の光合成活性は衰退し、正確な測定ができなかった。本技術では、ほとんど熱がでない（赤外線カット）LED を照射するため、植物葉の光合成活性を衰退させることなく、クロロフィル含量の定量的な測定ができ、精度が高い光合成活性の診断が可能となった。またこの技術を用いて、ミドリムシの光合成活性の測定に応用した。
2. ミドリムシの反射・吸収スペクトルミドリムシ（ユーグレナ）は、葉緑体内の Chlbに二酸化炭素を取り込んで酸素に変換する炭酸同化作用を行い、多糖類のパラミロンを生成して栄養として蓄える。藻類には、ミドリムシのように光合成を行うものがよく知られている。
例えば緑藻には、Chlb とカルテノイドが存在する[4]。
LED 光を用いたスペクトル測定には、CCD 分光器（Ocean Optics USB2000 : 波長範囲 180－880nm,波長分解能 0.4nm,感度 14bit）を使用した。図 1(a)のように、ミドリムシ(赤線)から白板(点線)の反射光を差分したのが青線である。
差分強度から、緑の反射と青と赤の吸収が確認できる。また、685nm にピークのある Chlb 蛍光を発する。図 1(b)では、ミドリムシの培養液（乾燥重量ベース 0.957 mg/m  ）を 100%として、20%ごとに希釈した場合の測定結果を示している。
図 1(a)の差分強度(青線）を白板の反射強度(点線)で割ったのが図 1(b)の青線(培養液 100%)であり、黄緑(F570)の反射率と青(F440)・赤(F650)の吸収率を示している。
図 1(c)では、ミドリムシの濃度とクロロフィ

図 1 ミドリムシの反射・吸収スペクトルルの存在を示す緑の反射率、青・赤の吸収率が(a) 反射強度スペクトル (b) 反射・吸収率スペいずれも 0.98 以上の高い相関を示した。クロロ

クトル (c) 反射・吸収率と濃度の関係

フィルの吸収による影響が小さい緑の反射率は、より F685 蛍光を放出する。緑葉とミドリムシのミドリムシの濃度に伴う増殖の診断に適していカルテノイドの F500 蛍光とクロロフィルのる。赤の吸収率(相関係数 0.991)からは、ミドF685 蛍光は類似している。ミドリムシは、緑葉リムシの相対的なクロロフィル含量の推定が可のような光化学系Ⅰ(PSⅠ)からの F740 蛍光は能である。青の吸収率も同様に高い相関を示し発しない。

た（相関係数 0.990）が、赤の吸収よりも 4 倍

図 3(a)に、ミドリムシの培養液（乾燥重量ベ程度大きな値となっている。これは、クロロフース 3.82 mg/m  ）を 100%とし、20%ごとに希釈ィルの吸収が赤の吸収より青の吸収の方が大きして測定した Chlb 蛍光強度スペクトルを示す。

いこととカルテノイドの吸収が合わさったため

図 3(b)は、横軸に濃度、主軸に F685 (684.5-である。

685.4nm)蛍光強度値、2 軸に赤の吸収率を取ったグラフである。ミドリムシの濃度の上昇に伴って、

3. 植物葉とミドリムシの蛍光スペクトルの比較実験室（暗室）において LED 光源を利用し、CCD 分光器（Ocean Optics QE65Pro : 波長範囲500－870nm,波長分解能 0.1nm,感度 16bit）を用いて、Chl 蛍光スペクトル測定を行った。
図 2 (a)に示すように、LED 光(破線)をシアンフィルタ(620～740nm カット)とホットミラー(675nm～カット)を透過させて、620nm より長波長側をカットした光(青線)で誘起すると、685nmと 740nm にピークのある緑葉の Chla 蛍光スペク、トル(緑線)が検出できる。同様に、620nm より長波長側をカットした光(青線)で誘起すると、ミドリムシ（赤点線）の 685nm のピークは Chlb蛍光を示している。
UV(350－400nm)ライトを用いたスペクトル測定には、CCD 分光器（Ocean Optics USB2000）を使用した。図 2(b)に UV ライト(AlonefireXHP99)を誘起光源に用いた場合のミドリムシの蛍光検出方法を示す。ホールスライドガラスに80L のミドリムシの培養液を入れ、UV ライト光を照射して、ミドリムシの反射光（赤線）を取得した。ミドリムシ(赤線)から水(黒線)の反射光を差分したのが蛍光強度スペクトル(緑線)である。
図 2(c)に、植物葉とミドリムシの蛍光スペクトルの比較を示す。図 1 (b)のように、カルテノイドは 400nm～500nm の光を吸収して F500 蛍光を発する。また、ミドリムシの Chlb は、600nm

図 2 緑葉とミドリムシの蛍光スペクトル比較～670nm の波長の光を吸収して、光合成反応に(a) LED 誘起蛍光 (b) ミドリムシの蛍光取得法(c) 紫外線誘起蛍光

赤の吸収率（吸収エネルギー量）が増加する。
同様に蛍光強度値も同じ割合で増加する。このことから、蛍光強度値は、Chlb が吸収した光エネルギー量に比例する。つまり、蛍光強度のピーク値を指標とするミドリムシの光合成活性の診断が可能となった。
4. おわりにミドリムシは、単細胞の微細藻類である。光合成反応を行い、細胞内貯蔵物質としてミドリムシ固有の多糖類のパラミロンを生成する。その栄養素をもとに夜に細胞分裂して増殖する。
これらの生成物質は、ミドリムシの培養条件（温度、培地成分、光の強度等）によっても大きく影響を受ける。
本研究の方法は、非破壊・非接触でミドリムシの光合成活性を測定し、緑の反射率による増殖の評価や Chlb 蛍光強度を用いた光合成活性の診断を行う技術としてのシステム開発への応用が期待できる。
LED 誘起蛍光法による植物葉の光合成活性の

図 3 ミドリムシの蛍光強度値(a) 蛍光強度スペクトル (b) 蛍光強度値の濃測定については、当日講演にて報告いたします。

度依存性謝辞[2] Masuda, Kenji, Saito, Hayato, Mabuchi ,本研究を実施するにあたりミドリムシを提供

Yusaku, Manago, Naohiro , Kuze,Hiroaki :して頂きました、静岡市立高校の曲田澄子先生、

Stand-off measurement of solar-radiation

科学探究科 2022 年度課題研究ミドリムシ班のinduced vegetation fluorescence using oxygen

生徒の皆様に感謝申し上げます。

A-band., IGARSS IEEE International, 2014,2993-2996,DOI:10.1109/IGARSS.2014.6947106

参考文献[1] 増田健二:「植物群落の太陽光誘起蛍光による光合成測定」静岡大学技術報告 27 31-34（2022）【静岡大学学術リポジトリ「技術報告 増田健二」検索】[3] 増田健二：「植物葉の蛍光リモートセンシン
グ計測システムの開発とストレス障害」静岡大学技術報告 19 25-30（2014）[4] 日本光合成学会「クロロフィルとカルテノイドの吸収スペクトル」光合成事典