バイオバンク情報を活用した
鎮咳薬の代謝的モルヒネ中毒に関わる遺伝子多型の探索
東北大学大学院 薬学研究科
ひらつか

平塚まさひろ真弘准教授

バイオバンク情報を活用した
鎮咳薬の代謝的モルヒネ中毒に関わる遺伝子多型の探索

東北大学大学院薬学研究科

平塚真弘

【要旨】
鎮咳成分ジヒドロコデインは、薬物代謝酵素シトクロム P450 2D6（CYP2D6）により生体内でモルヒネに変換されるが、遺伝的に酵素活性が高いヒトではモルヒネ濃度が上昇し、副作用（代謝的モルヒネ中毒）が発現しやすくなる。本研究では、東北大学・東北メディカルメガバンク機構の一般住民バイオバンクで解析された 8,300 人の全ゲノム情報を活用し、CYP2D6 遺伝子多型の位置、頻度およびバリアント酵素の機能変化を詳細に解析することで、日本人集団における代謝的モルヒネ中毒のリスク遺伝因子を明らかにし、副作用回避の基礎情報を得て、将来のゲノムセルフメディケーションに役立てることを目指して立案した。その結果、今回解析した日本人集団の CYP2D6 遺伝子上には、既報の一塩基多型、挿入、欠失およびコピー数多型の他に、新規のレアバリアントが多数同定された。特に、CYP2D6 活性の上昇につながる一部の一塩基多型や遺伝子コピー数増加のゲノム構造多型は、通常のジヒドロコデイン投与でも代謝的モルヒネ中毒発現が懸念されるため、今後、より詳細なゲノム解析、薬物血中濃度解析、副作用発現解析等が必要であると考えられた。

１、調査・研究目的
一般用医薬品・総合感冒薬には、鎮咳成分としてジヒドロコデインリン酸塩を 8 ～ 10mg 含有する製剤が多い。ジヒドロコデインは、通常、その 80％が肝臓中の薬物代謝酵素 CYP3A4 で代謝され、ノルコデインやコデイン -6- グルクロニドとなる。一方で 10％が CYP2D6 によってモルヒネに代謝され、これらが中枢に働き鎮咳作用を示す。CYP2D6 遺伝子が重複した構造多型を有する人では、コデインが超迅速に代謝されるため、特に小児患者ではモルヒネ中毒になりやすいことが判明している 1, 2。ジヒドロコデインの迅速代謝を起こす遺伝子多型を持つ人の頻度には人種差があり、欧米人の 10％に対して日本人では 1％程度である 3。本研究では、塩基配列ホモロジーが高い偽遺伝子やコピー数多型が存在する CYP2D6 遺伝子の特徴を考慮して、報告者らが独自に開発した解析法を駆使して、CYP2D6 酵素活性上昇を引き起こす遺伝子多型を網羅的に探索することを目的とした。

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２、調査・研究方法
2-1

CYP2D6 遺伝子多型情報のリスト化

東北大学・東北メディカルメガバンク機構の全ゲノム解析データベース jMorp から CYP2D6の遺伝子多型情報（一塩基多型、挿入、欠失）を抽出し、それらに由来するアミノ酸置換、頻度情報等をリスト化した。コピー数多型に関しては、jMorp に収載されていないため、次世代シークエンサーデータからカバレッジ計算およびデジタル PCR により解析した。
2-2

CYP2D6 のハプロタイプ解析

遺伝子配列データベースから得られる塩基情報のみでは、同一検体から複数の異一塩基多型が検出された場合、対立遺伝子（アレル）のどちらにそれらの多型が存在するかが分からない。したがって、ハプロタイプ解析する必要がある。CYP2D6 に関してはオープンリーディングフレームを含む領域が約 5kb 程度であるため、long PCR を行うことにより、ゲノム DNAから容易に遺伝子全長のクローニングが可能である。得られた PCR 産物をプラスミドにライゲーションし、大腸菌にトランスフォームした後、抗生物質に対する耐性選択により単一クローンを得た。複数のコロニーをピックアップし、インサートされたそれぞれのアレルをシークエン
ス解析することにより、検出された一塩基がどちらのアレルに位置するかを確認した。
2-3

CYP2D6 バリアント発現系の構築

ハプロタイプが特定された CYP2D6 バリアント酵素をヒト胎児腎由来 293FT 細胞株に発現させ、酵素機能変化を明らかにした。方法としては、それぞれ遺伝子多型を導入した
CYP2D6 発現ベクターを作製し、培養細胞にトランスフェクションし、組換えバリアント酵素を発現させた。293FT 細胞を超音波破砕後、遠心法によりミクロソーム画分を調製した。得られたタンパク質を SDS-PAGE により分離後、抗 CYP2D6 抗体を用いたウェスタンブロットによりその発現を確認した。すでにタンパク質当たりのモル数が判っている市販の CYP2D6バキュロソームをスタンダードとして検量線を引き定量を行った。なお、発現ベクターのトランスフェクション効率の補正はβガラクトシダーゼ遺伝子を挿入した発現ベクターを共トランスフェクションして行った。
2-4

CYP2D6 バリアントの酵素機能変化解析

In vitro で発現させた CYP2D6 バリアントを酵素源とし、特異基質として、デキストロメト
ルファンおよびブフラロールを様々な濃度で反応させた。代謝物を HPLC- 蛍光検出器で定量することにより、酵素反応速度論的キネティックパラメータ（Km、Vmax および CLint（Vmax/Km））を算出した。なお、ジヒドロコデインを基質として、代謝物であるモルヒネを定量する測定系は現在構築中である。

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３、調査・研究成果
3-1

CYP2D6 遺伝子多型情報のリスト化とハプロタイプ解析

東北大学・東北メディカルメガバンク機構の全ゲノム解析情報から CYP2D6 の遺伝子多型に由来する50種のミスセンスバリアントが同定された（論文執筆中のためデータは記載しない）。
また、これらのミスセンスバリアントは、サンガー法によるリシークエンス解析によって、シークエンスエラーでないことが証明された。次に、1 つの遺伝子上に複数のバリアントがある場合について、Long-PCR とクローニング法により同じアレル上にある組み合わせを同定した。さらに、コピー数多型について、1070 人の次世代シークエンサーを用いた全ゲノム解析データより遺伝子コピー数を同定するアルゴリズムの作製に成功し、解析した集団における CYP2D6遺伝子のコピー数を決定した（図 1）。この結果は、既存の CYP2D6 コピー数多型コールアルゴリズムである StellarPGx4 および Cyrius5 とほぼ同様であった。
3-2CYP2D6 バリアント発現系構築と酵素機能変化解析

従来の哺乳動物細胞株を利用した組換えシトクロム P450 発現系において、発現量が約 10pmol P450/mg と低いことがウィークポイントであったが、今回、ヘムの原料である鉄イオンと5- アミノレブリン酸の添加や培養時間の最適により約 200 pmol P450/mg まで増加させる系の構築に成功した（図 2）。これはこれまで極めて困難とされていた哺乳動物細胞株発現系における一酸化炭素吸収差スペクトル法によるホロ P450 の分光学的定量を可能にした革新的な組換え P450 発現系であった。この系を応用して、50 種の CYP2D6 バリアントを 293FT 細胞に発現させて、活性変化を酵素反応速度論的に解析した結果、多くのバリアントで活性低下や消失したが、一部のバリアント（CYP2D6.53（F120I および A122S のアミノ酸置換導入））は、野生型に対して約 3 倍の固有クリアランス CLint の上昇が認められた（図 3）。

４、考察ジヒドロコデインは CYP2D6 により代謝されてモルヒネに変換されるが、CYP2D6 活性が高い場合、モルヒネの血中濃度が高くなりすぎて中毒を起こす可能性がある。本研究の結果より、日本人集団における CYP2D6 のコピー数多型は、極めてバリエーションに富んでいた。特にコピー数が 2 以上の構造多型を有しているヒトでは、CYP2D6 遺伝子が野生型の場合、高活性になりやすいことが知られている。一方で、コピー数多型を有していても、バリアント型である CYP2D6*10 や *36 アレルの場合は、酵素タンパク質自体にほとんど活性がないために、モルヒネ中毒の可能性は限りなく低いと考えられる。一塩基多型においては、CYP2D6*53 アレルは野生型と比較して酵素活性が高くなることが示された。したがって、ジヒドロコデイン投与前のCYP2D6 遺伝子多型解析により、遺伝的な代謝性モルヒネ中毒を回避できる可能性が示された。

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５、まとめ本研究により、日本人集団中に CYP2D6 活性が高くなると予想される遺伝子多型が同定された。このような遺伝子型を有しているヒトでは、通常のジヒドロコデイン投与でも代謝的モルヒネ中毒発現が懸念されるため、今後、より詳細なゲノム解析、薬物血中濃度解析、副作用発現解析等が必要であると考えられた。

６、調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
現在投稿準備中である。

７、引用文献1. Gasche Y, Daali Y, Fathi M, Chiappe A, Cottini S, Dayer P, Desmeules J. Codeine
intoxication associated with ultrarapid CYP2D6 metabolism. N Engl J Med. 2004,
351:2827-2831.
2. Crews K R , Monte A A , Huddart R , Caudle K E , K harasch ED, Gaedigk A ,Dunnenberger HM, Leeder JS, Callaghan JT, Samer CF, Klein TE, Haidar CE, Van
Driest SL, Ruano G, Sangkuhl K, Cavallari LH, Müller DJ, Prows CA, Nagy M,Somogyi AA, Skaar TC. Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium
Guideline for CYP2D6, OPRM1, and COMT Genotypes and Select Opioid Therapy.
Clin Pharmacol Ther. 2021, 110:888-896.
3. Fukunaga K, Hishinuma E, Hiratsuka M, Kato K, Okusaka T, Saito T, Ikeda M,Yoshida T, Zembutsu H, Iwata N, Mushiroda T. Determination of novel CYP2D6
haplotype using the targeted sequencing followed by the long-read sequencing and thefunctional characterization in the Japanese population. J Hum Genet. 2021, 66:139-149.
4. Twesigomwe D, Drögemöller BI, Wright GEB, Siddiqui A, da Rocha J, Lombard Z,Hazelhurst S. StellarPGx: A Nextflow Pipeline for Calling Star Alleles in Cytochrome
P450 Genes. Clin Pharmacol Ther. 2021, 110:741-749.
5. Chen X, Shen F, Gonzaludo N, Malhotra A, Rogert C, Taft RJ, Bentley DR, Eberle
MA. Cyrius: accurate CYP2D6 genotyping using whole-genome sequencing data.
Pharmacogenomics J. 2021, 21:251-261.

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図１

次世代シークエンサー解析データから推定した CYP2D6 コピー数多型

上段はコピー数、下段は割合
図１
次世代シークエンサー解析データから推定した CYP2D6 コピー数多型
in-house の円グラフは今回報告者らが構築したアルゴリズムで解析した結果
上段はコピー数、下段は割合
StellarPGxおよび Cyrius は既存の CYP2D6 コピー数多型コールアルゴリズム
in-houseの円グラフは今回報告者らが構築したアルゴリズムで解析した結果
StellarPGx および Cyrius は既存の CYP2D6 コピー数多型コールアルゴリズム

図 2 293FT 細胞に組換え CYP2D6（野生型）を発現させた際の P450 含量5-ALA;
5-アミノレブリン酸
図2 293FT細胞に組換え CYP2D6（野生型）を発現させた際の P450 含量2+; 2 価鉄イオン
Fe5-ALA; 5-アミノレブリン酸

横軸は培養時間、縦軸はCO 差スペクトル法で測定したホロ P450 含量2+; 2 価鉄イオン
Fe
横軸は培養時間、縦軸は CO 差スペクトル法で測定したホロ P450 含量39

図 3 CYP2D6.53 バリアントおよび CYP2D6.1（野生型）のブフラロール水酸化
活性におけるミカエリスメンテンカーブとキネティックパラメータ
CYP2D6 遺伝子は 9 つのエキソンから構成されており、CYP2D6*53 アレルはエキソン 3 に 2 カ所のアミノ酸置換を生じる塩基多型がある

Search for genetic polymorphisms involved in metabolic morphine toxicity of
Search for genetic polymorphisms involved in metabolic morphine toxicity of antitussives
antitussives using biobank information
using biobank information
Masahiro Hiratsuka
Masahiro Hiratsuka
Graduate School of Pharmaceutical Sciences Tohoku University
Graduate School of Pharmaceutical Sciences Tohoku University
6-3 Aoba Aramaki Aoba-ku Sendai 980-8578 Japan、022-717-7049
6-3 Aoba Aramaki Aoba-ku Sendai 980-8578 Japan、022-717-7049
The antitussive ingredient dihydrocodeine is converted to morphine in vivo by theThe antitussive ingredient dihydrocodeine is converted to morphine in vivo by thedrug-metabolizing enzyme cytochrome P450 2D6 (CYP2D6), but in humans withdrug-metabolizing enzyme cytochrome P450 2D6 ( CYP2D6 ) , but in humans withgenetically high enzyme activity, morphine levels increase and adverse effects
genetically high enzyme activity, morphine levels increase and adverse effects (metabolic(metabolic morphine poisoning) are more likely to occur. In this study, we utilizedmorphine poisoning) are more likely to occur. In this study, we utilized the whole
the whole genome information of 8,300 individuals analyzed in the generalgenome information of 8,300 individuals analyzed in the general population biobank ofpopulation biobank of Tohoku University/Tohoku Medical Megabank Organization,40

Tohoku University/Tohoku Medical Megabank Organization, and analyzed the locationand frequency of CYP2D6 gene polymorphisms and functional changes of variant
enzymes in detail to identify risk genetic factors for metabolic morphine addiction in
the Japanese population. This study was designed to clarify the risk genetic factors
for metabolic morphine addiction in the Japanese population by analyzing the location,frequency, and functional changes of variant enzymes in detail, and to obtain basic
information for avoiding side effects and for future genomic self-medication. As a result,in addition to the previously reported single nucleotide polymorphisms, insertions,deletions, and copy number polymorphisms, many novel rare variants were identified in
the CYP2D6 gene of the Japanese population analyzed in this study. Particularly, some
single nucleotide polymorphisms that lead to increased CYP2D6 activity and genomic
structural polymorphisms that increase gene copy number may cause metabolic morphine
intoxication even with normal dihydrocodeine administration, and therefore, more detailed
genomic analysis, analysis of drug blood levels, and analysis of adverse drug reactions arenecessary in the future.

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