Flash nanoprecipitation 法を活用した即効性を期待するOTC 医薬品の開発
静岡県立大学 薬学部
やまだ山田

こうへい

幸平

助教

Flash nanoprecipitation 法を活用した即効性を期待する OTC 医薬品の開発
静岡県立大学 薬学部

山田幸平

【要旨】
消費者 ( 患者 ) が OTC 医薬品を使用するケースとして，例えば急な発熱や頭痛の軽減を目的とした応急処置的な使用が挙げられる．この場合，服用した OTC 医薬品が消化管内で速やかに溶解し，吸収される必要がある．本研究は，最先端ナノテクノロジーである Flashnanoprecipitation method ( FNP) を難水溶性医薬品の経口吸収性改善に向けた機能性微粒子調製法として応用し，即効性が期待できる OTC 医薬品開発に貢献しようとするものである．これまでに申請者らグループは，Multi-inlet vortex mixer (MIVM ) を用いた FNP によって均一なナノ粒子が調製できること，得られるナノ粒子のサイズをコントロールできること，機能性付与を指向した粒子の表面物性改変がナノ粒子化と同時に行えることを報告してきた．本研究では，上記手法により難水溶性モデル化合物を含有する粘膜透過性ナノ粒子 ( Mucopenetratingnanoparticles: MP) を調製し，その薬物動態学的特性を評価した．原薬ならびに単純なナノ粒子をラットへ経口投与した際，生物学的利用能 ( Bioavailability: BA) はそれぞれ 0.6 ならびに13.5%，最高血中濃度到達時間 (Time to maximum concentration: Tmax ) は 3.4 と 6.0 h であった．MP 製剤の BA は 30.1%，Tmax は 2.3 h であり，単純なナノ粒子と比較して難水溶性化合物の経口吸収性をより一層改善した．FNP を戦略的に活用した MP 製剤化アプローチは即効性を指向した OTC 医薬品開発に有用であろう．

１、調査・研究目的
OTC 医薬品，処方箋医薬品あるいはサプリメントの活性成分の多くは難水溶性であることが知られている．これまでに，Biopharmaceutical classification system ( BCS) で class 2 に分類される化合物に関しては，溶解性改善技術の適用により経口吸収性改善がもたらされることが報告されてきた [1]．難水溶性化合物の溶解性改善にフォーカスした製剤化アプローチの 1 つには微粒子化が挙げられ，top-down process ならびにbottom-up process の両アプローチから様々な技術が確立されている [2]．これらの技術を用いて調製されるナノ粒子は原薬と比べて経口吸収性の改善を示す一方で，単純なられない事例に直面することはナノ粒子化では顕著な BA 増大や Tmax の短縮が見決して少なくない．このような場合には，難水溶性化合物のナ102

ノ粒子化に加えて何らかの製剤学的工夫を凝らすことでより一層の経口吸収性改善を達成することが望まれる．
消化管内における粒子の挙動は粘液成分 Mucin と粒子間の相互作用によって支配されており，相互作用の種類として静電相互作用，水素結合，ポリマーと Mucin の物理的な絡み合いなどが提唱されている [3]．Mucosal drug delivery system (mDDS) はこれらの Mucin- 粒子間の相互作用を調節することで消化管粘液中における粒子の拡散特性をコントロールし，その結果として化合物の消化管吸収を制御するアプローチである [4]．特に，速やかな血中濃度の立ち上がりを期待する場合においては，管腔側から小腸上皮細胞近傍への速やかな粘液拡散を指向した MP 製剤化が効果的であろう．しかしながら，MP 製剤の開発では戦略的なナノ粒子の表面物性改変が必須であり，そのニーズに応えつつ工業生産に対応可能な画期的ナノ粒子調製法を確立することが喫緊の課題である．そこで我々は，目的とする粒子径にて粒度分布の狭いポリマー修飾ナノ粒子が 1 step で調製でき，さらにはスケールアップが比較的容易である FNP に着目し [5, 6]，粒子の表面電荷コントロールに焦点を当てた難水溶性化合物の MP 製剤開発に挑戦した．
本研究では，OTC 医薬品としての使用実績は無いものの，多くの有効成分と同様に BCS
class 2 に分類される Cyclosporine A ( CsA; 水への溶解度 20μg/mL; logP 2.9 ) を難水溶性モデル化合物として採用した．MIVM を用いて CsA 含有粘膜透過性ナノ粒子 (CsA-loaded
mucopenetrating nanoparticles: MP/CsA) を調製し，各種物性評価を実施した．単純な CsA
ナノ粒子 ( CsA-loaded nanoparticles: nCsA) を比較群として含む

各 CsA サンプルをラットへ経口投与後の体内動態を精査した．

２、調査・研究方法
2-1

製剤調製
MP/CsA は MIVM を用いた FNP により調製した．Tetrahydrofuran (THF) を良溶媒として選択し，Co-core である Vitamin E，CsA，中性両親媒性高分子である 1.6kDa polystyrene-block-5.0-kDa poly (ethylene glycol) を溶解させた．MIVM を用いてTHF 溶液と精製水を高速で混合・攪拌し，得られた懸濁液を凍結乾燥保護剤として Poly(ethylene glycol) 2000 を溶解させた精製水中に回収した．回収液を FDU-1200 ( EYELA,Tokyo, Japan) を用いて凍結乾燥することで，MP/CsA を得た．
2-2

粒子特性評価MP/CsA の平均粒子径，多分散指数 ( Polydispersity index: PDI )，ξ-potential をZetasizer Ultra (Malvern Instruments, Southborough, MA) を用いて測定した．
MP/CsA の 形 態を HT7700 transmission electron microscope (Hitachi, Tokyo,103

Japan) を用いて観察した．透過型電子顕微鏡観察用グリッドの作製において，酢酸モリブ
デン溶液によるネガティブ染色を行った．
2-3

溶出試験
MP/CsA および CsA 原薬の溶出挙動を NTR 6100A (Toyama Sangyo, Osaka, Japan)を用いて評価した．試験条件は精製水 50 mL，37 ± 0.5℃，回転数 50 rpm の Paddle
method に設 定した．サンプル中の CsA 濃 度は UPLC/ESI-MS( Waters Co., Ltd.,Milford, MA) を用いて測定した．
2-4

粘液拡散性評価
人工粘液 (Artificial mucus: AM ) 中における各 CsA サンプルの拡散性を評価した．

AM は先行研究を参考に調製し [7 ]，下層の 0.28w/v% アガロースゲル (1 mL) と上層のAM (1 mL) から成る評価系を用意した．
カチオン性両 親 媒性高 分 子である 6 .7- k Da p oly st y rene - blo c k- 9 . 2 - k Da p oly(N , N -dimethyl aminoethyl methacrylate ) で 表 面 修 飾した CsA 含 有ナノ粒子( DMAEMA/CsA) を粒子表面が正に帯電した比較用サンプルとして調製した．
MP/CsA，DMAEMA/CsA ならびに CsA 原薬を少量の AM に分散させて上層に静かにアプライした．AM 層からアガロースゲル層へと移行した CsA 量を測定し，単位時間当たりの拡散量を算出した．
2-5

薬物動態試験
実験動物として 6–8 週齢の雄性 Sprague-Dawley rats ( Japan SLC, Shizuoka, Japan)を使用した．実験動物は室温 24 ± 1℃，湿度 55 ± 5%，明暗サイクル 12 時間の条件下，水ならびにラット用固形飼料 (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Japan) を自由に摂取できる環境にて飼育した．すべての動物実験は，静岡県立大学実験動物倫理委員会より承認を受けた上で，ガイドラインに準じて行った．
比較対象である nCsA は，CsA を溶解させた Ethanol 溶液と Lecithin を含む精製水を MIVM を用いて高速で混合・攪拌後することで得られた懸濁液を精製水にて希釈後，Büchi Mini Spray-Dryer B-290 apparatus ( Büchi Labortechnik, Flawil, Switzerland) にて噴霧乾燥することで調製した．
ラット 18 匹を 1 群あたり 6 匹の合計 3 群となるようにランダムに振り分け，約 12 時間の絶食後，MP/CsA，nCsA ならびに CsA 原薬をそれぞれ経口投与 (10 mg-CsA/kg) した．投与後 0.5, 1, 2, 3, 5, 7, 12 および 24 時間後に尾静脈より血液サンプルを採取し，サン
プル中の CsA 濃度を UPLC/ESI-MS にて測定した．得られた血漿中濃度 - 時間曲線より
各 CsA サンプルを経口投与した際の最高血漿中濃度 (Maximum plasma concentration:C max)，Tmax，BA を算出した．

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３、調査・研究成果
3-1

物理化学的特性
MP/CsA の平均粒子径は 180 nm，PDI は 0.16 であり，単分散の均一なナノ粒子であった ( Fig. 1A)．MP/CsA の ξ-potential は − 2 mV であり，おおよそ電気的に中性あった．
透過型電子顕微鏡観察では MP/CsA の顕著な凝集を認めず，そのサイズは動的光散乱法にて算出された値と良い対応を示した ( Fig. 1B)．
精製水中における MP/CsA および CsA 原薬の溶出挙動を評価したところ ( Fig. 2)，
CsA 原薬は試験開始から 120 分経過時においても溶出率は 3% であったが，MP/CsAは試験開始 20 分経過時に溶出率 80% に達した．ナノ粒子化による有効表面積の増大が顕著な溶出速度の増大に寄与したと考える．
AM 中 に お ける 各 CsA サン プ ル の 拡 散 性 につ いて，CsA 原 薬，DMAEMA/CsA，MP/CsA の拡散速度はそれぞれ 5.2，5.8 ならびに 16 μg/h であった ( Fig. 3)．
DMAEMA/CsA および MP/CsA はいずれも 200 nm 程度の均一なナノ粒子であるが，前者はナノ粒子化を施しているにも関わらず分散・溶出性の乏しい CsA 原薬と同等の粘液拡散速度を示した．その一方で，MP/CsA では CsA 原薬と比して粘液拡散速度は 2.8倍に向上した．DMAEMA/CsA は MP/CsA と同様にナノ粒子化によって分散・溶出性が向上しているものの ( Data not shown)，粒子表面が正に帯電しているため静電相互作用により Mucin に捕捉されたと推察する．
3-2

薬物動態学的特性
ラットへ各 CsA サンプル (10 mg-CsA/kg) を経口投与した際，CsA 原薬投与群のC max，T max，BA はそれぞれ 0.12μg/mL，3.4 h，0.6% であった．nCsA 投与群においては，
C max，T max，BA はそれぞれ 0.87 μg/mL，6.0 h，13.5% であり，経口吸収性は CsA 原薬と比べて顕著に改善した．これはナノ粒子化による CsA の溶解性改善が寄与したものと考える．注目すべきことに，MP/CsA 投与群では C max，T max，BA はそれぞれ 2.19 μg/mL，2.3 h，30.4% であり，BA に関しては CsA 原薬と比べて 51 倍，nCsA と比べて 2.3倍増大した．以上の結果より，FNP 法を用いた MP 製剤化は単純なナノ粒子化以上に難水溶性化合物の消化管吸収量および速度の向上をもたらし，即効性を指向した OTC 医薬品の開発に貢献すると期待できる．

４、考察
MP/CsA の粒度分布は極めて狭く，均一な球形粒子であった．これは CsA ナノ粒子の表面電荷を電気的中性に調節するために添加した中性両親媒性高分子が，MIVM 中におけるナノ粒105子形成過程で安定化剤として働いたためと推察する．FNP による難水溶性化合物含有ポリマー
修飾ナノ粒子の形成は以下の 4 つの過程を経る．良溶媒と貧溶媒が高速で混合・攪拌されることによって引き起こされる過飽和 (supersaturation)，難水溶性化合物の核形成 (nucleation)，それに続く核成長 (growth)，添加剤による粒子の安定化 (stabilization) である．Vitamin E とCsA から成るナノ粒子は疎水性であるため安定化剤を含まない場合には一部のナノ粒子が凝集し，粒度分布が広くなることが想定される．MP/CsA の表面電荷が 0 mV 付近に調節できていることを考慮すると，界面活性作用を有する Polystyrene-block-poly(ethylene glycol) の添加がCsA ナノ粒子の表面物性改変のみならず，分散安定性向上にも寄与したと言えよう．
精製水を試験液として用いた溶出試験ならびに粘液拡散性評価の結果より，MP/CsA は速やかな CsA の溶出をもたらす粘膜透過性ナノ粒子であることが示された．本研究の目的は即効性を指向した OTC 医薬品の開発に向けた製剤化技術の構築であり，溶出挙動の観点では更なる処方検討は行わなかった．粘液拡散性に関して，MP/CsA は CsA 原薬や正に帯電したDMAEMA/CsA と比べて高い拡散性を示したものの，拡散速度の増大は約 3 倍にとどまった．さらなる粘液拡散性の増大を試みる前に，まずは難水溶性化合物の経口吸収性改善における MP 製剤化の有用性を担保するために薬物動態学試験を実施した．MP/CsA は nCsA および CsA 原薬と比較して T max を約 2 時間にまで短縮し，BA を 30.4% にまで増大したことから，溶解性改善を指向したナノ粒子化に加えて粒子に粘膜透過性を付与することでより一層の経口吸収性改善がもたらされることが示された．本結果を受けて現在，CsA 含有ナノ粒子のさらなる
粘液拡散性向上に取り組んでいる．具体的には最適な粒子径，Poly(ethylene glycol) の分子量や表面修飾比率の探索を行っている．また，上記検討と並行して，今回 MP/CsA の調製に使用した Polystyrene-block-poly(ethylene glycol) を医薬品添加剤としての使用実績があるもので置き換え，難水溶性化合物を含有するナノ粒子に対して同等の特性を付与する試みも行っている．
今後，これらの知見を蓄積していくことで MP 製剤の実用化を目指し，即効性を指向した OTC医薬品開発に貢献していきたい．

５、まとめ
FNP を戦略的に活用することで，難水溶性化合物のナノ粒子化およびその表面電荷コントロールが可能であった．難水溶性化合物をナノ粒子することで溶解性は大幅に改善し，ナノ粒子表面を電気的中性に調節することで粘液拡散性の付与が可能であった．難水溶性化合物を含有する粘膜透過性ナノ粒子は，原薬や単純なナノ粒子化を施したサンプルと比較して，速やかな血中濃度の立ち上がりと吸収量の増大をもたらした．今後，さらなる知見の積み重ねが必要ではあるが，FNP を基盤とする MP 製剤化アプローチは即効性を指向した OTC 医薬品開発に有用であると期待する．

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６、調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
該当なし ( 本研究内容について国際学術論文への投稿準備中である．)

７、引用文献1. Kawabata Y., et al., Formulation design for poorly water-soluble drugs based on
biopharmaceutics classification system: Basic approaches and practical applications.

Int. J. Pharm ., 2011, 420 ( 1) : 1–10
2. Moribe K. and Higashi K., 難溶性薬物のナノ結晶製剤 . Drug Delivery System , 30 ( 2 ) :92–99
3. Leal J., et al., Physicochemical properties of mucus and their impact on transmucosal
drug delivery. Int. J. Pharm ., 2017, 532 ( 1) : 555–572
4. Netsomboon K. and Bernkop-Schnurch A., Mucoadhesive vs. mucopenetrating
particulate drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm ., 2016, 98: 76–89
5. Liu Y., et al., Mixing in a multi-inlet vortex mixer ( MIVM ) for flash nanoprecipitation. Chem. Eng. Sci ., 2008, 63 ( 11) : 2829–2842
6. Pagels R. F., et al., Controlling and Predicting Nanoparticle Formation by Block
Copolymer Directed Rapid Precipitations. Nano. Lett ., 2018, 18 ( 2 ) : 1139–1144
7. Craparo E. F., et al., Pegylated Polyaspartamide-Polylactide-Based Nanoparticles
Penetrating Cystic Fibrosis Artificial Mucus. Biomacromolecules , 2016, 17( 3 ) : 767–777

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表、図及び写真

Fig. 1

Particle properties of MP/CsA.

(A) Particle size distribution analyzed bydynamic light scattering using Zetasizer Ultra.
microscopic image.

(B) Transmission electron

White bar represents 300 nm.

Fig. 2

Dissolution behaviors of CsA samples in water.

CsA.

Data represent Mean±S.D. of 3 experiments.

108▲, MP/CsA; and 〇, crude

Fig. 3Diffusion property of CsA samples in artificial mucus.

Data represent

Mean±S.D. of 3 experiments.

Fig. 4

Pharmacokinetic behaviors of CsA samples after oral administration at

10 mg-CsA/kg to rats.

▲, MP/CsA; □, nCsA; and 〇, crude CsA.

Mean±S.E. of 6 experiments.

109

Data represent