OTC薬への転用促進に向けた難吸収性薬剤の皮膚透過促進剤の開発
岐阜薬科大学 生命薬学大講座 生化学研究室
いかり

五十里

あきら

彰

教授

OTC 薬への転用促進に向けた難吸収性薬剤の皮膚透過促進剤の開発

主任研究者

岐阜薬科大学 生命薬学大講座 生化学研究室 教授

分担研究者

静岡県立大学薬学部 准教授
理化学研究所 研究員

五十里 彰

石川 吉伸

篠田 雄大

【要旨】
目的：超高齢化社会を迎えた現代において、経口投与薬物による治療困難者が徐々に増加しており、経皮吸収剤の需要が高まっている。しかし、皮膚表皮細胞間のタイトジャンクション（TJ）を主とした強力なバリア機能が存在するため、多くの薬剤は皮膚透過が困難であり、経皮吸収製剤化には皮膚透過促進剤の開発が不可欠である。本研究では、新規
皮膚透過促進剤の候補として、TJ 形成を司るタンパク質であるクローディン - 1（CLDN1）を標的として表皮細胞間バリアを可逆的に緩める化合物を探索し、その機序を解明することを目的とした。
方法：FDA 承認済み薬剤ライブラリ（約 1,700 種類）を用いてドッキングシュミレーションを実施し、CLDN1 と相互作用する可能性のある低分子化合物を同定した。ヒト表皮角化細胞由来 HaCaT 細胞を用いて、CLDN1 発現や細胞局在、バリア機能へ及ぼす化合物の作用を検討した。化合物処理後の細胞における CLDN1 および CLDN4 タンパク質の TJ 局
在は免疫染色法、CLDN1 タンパク質発現量はウェスタンブロット法、CLDN1 mRNA 発現
量はリアルタイム PCR 法によりそれぞれ検討した。バリア機能の評価としてトランスウェ
ルを用いて培養した細胞の経表皮膜電気抵抗値（TER）を測定し、lucifer yellow（LY）、ケ
ルセチン、インスリンの透過量をそれぞれ測定した。
結果：11 種類の化合物の効果を検討したところ、化合物 #10 の処理により CLDN1 タン
パク質の TJ 局在が減少することを発見した。一方、CLDN4 タンパク質の局在は変化しなかった。また、CLDN1 のタンパク質および mRNA 発現量は変化しなかった。処理後に化合物を培地から除去して培養すると、CLDN1 の TJ 局在は元のレベルまで回復した。化合物 #10 の作用は、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤の共処理により消失した。
TER 値の低下および LY 透過量の増加から、バリア機能の可逆的な低下が認められた。薬
剤透過性を調べた結果、インスリン透過量に変化はなかったが、ケルセチン透過量が増加した。
考察：本検討結果から、CLDN1 との結合が予測された構造を持つ低分子化合物 #10 がCDLN1 発現には作用せず、CLDN1 タンパク質の TJ 局在および細胞間バリア機能を特異

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的かつ可逆的に低下させることが示された。CLDN に結合する化合物は CLDN タンパク質同士の相互作用を減少させることで、エンドサイトーシスを介した細胞内取り込み機構に
より TJ 局在を減少させると考えられている。本研究で見出した化合物 #10 は CLDN1 を標的とした表皮 TJ バリアを可逆的に緩める化合物であり、新規メカニズムを有する可逆的皮膚透過性促進剤の有力な候補になると考えられる。今後、経皮吸収製剤の充実化により、OTC 薬転用化に伴うセルフメディケーション推進が期待される。

１. 調査研究目的
近年、セルフメディケーション促進の一環として、医師による処方が必要な医療用医薬品から、処方箋なしで購入可能な一般用医薬品（OTC 薬）への転用が進められているものの、経口投与薬以外の医薬品では進んでいない。注射剤等の OCT 薬転用実現の鍵を握る技術として、非侵襲的かつ自己服用の容易な経皮吸収製剤化が注目されている。
超高齢化社会を迎え、嚥下困難者など経口投与製剤が使用できない患者の増加に伴い、経皮吸収製剤の需要はさらに高まっている。経皮吸収製剤は、肝初回通過効果を回避できること、侵襲性が低いこと、投与の中断が可能であるなど多くの利点を有する。しかし、皮膚には角質層と表皮顆粒層の 2 種類のバリアにより分子の移動が厳密に制限されるため、経皮吸収製剤化が可能な薬剤は一部に限定される。角質層の脂質配向性に着目した研究は古くから行われ、角質層の拡散性を向上させる薬剤は経皮吸収剤に応用されているものの、表皮顆粒細胞間のタイトジャンクション（TJ）バリアを制御する薬剤は未だ開発されていない。経皮吸収剤の開発を目指すうえで、安全で可逆的な TJ バリア制御方法を確立することは喫緊の課題である。
TJ は 4 回膜貫通タンパク質であるクローディン（CLDN）、オクルディン、細胞膜裏打ち
タンパク質である ZO、骨格タンパク質であるアクチン等により構成される細胞間接着構造であり、水や分子の移動を制限するバリアとして機能する [1]。特に、CLDN は TJ 形成に必須であり、20 種類以上存在するサブタイプが臓器ごとに異なる分布を示し [2]、それぞれ異なった機能を担うと考えられている。皮膚の有棘層や顆粒層には、CLDN のサブタイ
プのうち、1、4、6、7、18 が発現し、特に CLDN1 と CLDN4 が表皮バリアの形成に重要であると報告されている [3]。CLDN1 遺伝子欠損マウスは皮膚からの水分喪失により出生後間もなく死亡することや [4]、アトピー性皮膚炎患者の皮膚において CLDN1 の発現量が減少していることから [5]、CLDN1 が皮膚バリアにおいて重要な因子と考えられている。
これまでに我々は、酸化ストレスや紫外線照射によるストレスによって CLDN1 の細胞局在が変化し、分子透過性が増大することを見出した [6, 7]。本研究では、新規皮膚透過促
進剤の候補として、CLDN1 タンパク質を標的として表皮細胞間バリアを可逆的に緩める
化合物を探索し、薬剤の透過性に対する作用とその機序を解明すること目的とした。

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2. 調査研究手法
2.1. ドッキングシュミレーション
共同研究者の石川（静岡県立大学）とともに、FDA 承認済薬剤ライブラリを対象として、独自に構築した CLDN1 の第二細胞外ループ領域の予測構造と相互作用する化合物をコン
ピュータシミュレーションにより探索し、検討に用いた。
2.2. 細胞の培養
実験にはヒト皮膚由来の HaCaT 細胞を使用した。細胞は 5% 牛胎児血清を含む Dulbecco’s
modified Eagle Medium で培養した。0.5% trypsin 溶液を用いて 3 ～ 4 日ごとに継代し、実験に用いた。
2.3. 細胞毒性の評価
細胞を 96 well plate（Thermo Fisher Scientific 社）に播種し、3 日間培養した。培地を交換し、化合物処理から 24 時間後、WST-l cell proliferation assay system（Takara 社）を用いて細胞生存率を測定した。
2.4. RNA 抽出とリアルタイム PCR
化合物処理 6 時間後、TRI reagent（コスモバイオ社）を用いて細胞から RNA を抽出した。
ReverTra Ace（東洋紡社）を用いて逆転写反応させ、cDNA を調製した。定量的リアルタイ
ム PCR 法では、Real time PCR Eco（アズワン社）を用いて mRNA 発現量を測定した。
2.5. SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット法
Lysis buffer（1% Triton X-100, 0.1% sodium dodecylsulfate, 150 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4）を用いて細胞内タンパク質を可溶化し、遠心により可溶性画分を抽出した。12.5% SDS- ポリアクリルアミドゲルにタンパク質サンプルをアプライし、30mA で 80 分間電気泳動した。ゲルを PVDF 膜に転写後、2% スキムミルクで 30 分間処理し、ブロッキングを行った。各種一次抗体（1,000 倍希釈）を 4℃で一晩処理した。PVDF 膜の洗浄後、二次抗体を室温にて 60 分間反応させた。EzWestLumi plus（ATTO 社）を用いて各タンパク質のバンドを検出した。
2.6. 蛍光免疫染色
細胞をカバーガラス入りの培養皿で培養した。メタノールによる固定の後、0.5% Triton
X-100 含有 PBS で可溶化処理を行った。4% ブロックエース処理してブロッキングを行った後、各種一次抗体（100 倍希釈）を 4℃で一晩処理した。一次抗体を洗浄後、AlexaFluor 488 ま
たは AlexaFluor plus 555 で標識された二次抗体を室温で 90 分間反応させた。DAPI を反82応させ、細胞の核を可視化した。カバーガラスをスライドガラスに固定し、共焦点レーザー顕微鏡（LSM700、Zeiss 社）を用いて標的タンパク質の細胞局在を解析した。
2.7. 細胞間透過性の評価
細胞をトランスウェルに播種後、4 日間培養した。Volt-ohmmeter（Millipore 社）を用いて
経表皮膜間電気抵抗値（TER）を測定した。管腔側溶液に水溶性蛍光マーカーであるルシ
ファーイエロー（LY、50μg/mL）、ケルセチン（50μg/mL）、インスリン（ 1 U/mL）を添加し、30 分後に血管側溶液を回収した。Infinite F200 PRO（TECAN 社）を用いて蛍光強度を測定し、LY またはケルセチンの透過性をそれぞれ算出した。Insulin ELISA kit（10-1113-01、Mercodia 社）を用いてインスリンの透過性を算出した。

3. 調査研究成果
3.1. CLDN1 の細胞局在に対する化合物 #10 の作用
ドッキングシミュレーションによって CLDN1 との相互作用が予測される化合物 11 種類を同定し、そのうち 2 種類に CLDN1 局在の変化が認められた。特に効果の強い化合物 #10 に着目して検討を行った。
表皮角化細胞由来の HaCaT 細胞に対して化合物 #10 を処理すると、免疫染色法による観察の結果、6 時間以降において TJにおけるCLDN1の局在が顕著に減少した（Fig. 1）。一方で、
CLDN4 の局在に変化は見られなかった。また、ウェスタンブロット法およびリアルタイム PCR
法により CLDN1 の発現を調べた結果、タンパク質発現量および mRNA 発現量はともに変化しなかった。また、WST-1 assay により細胞毒性を評価したところ、化合物 #10 は 1 nM の濃度において顕著な毒性を示さなかった。以上の結果より、化合物 #10 は CLDN1 タンパク質特異的に作用し、その発現には影響を及ぼさず、TJ における局在を減少させることが示された。
次に、化合物 #10 による CLDN1 タンパク質の細胞局在変化の可逆性を調べた。化合物の6 時間処理後、培地交換を行い、さらに 6 時間培養したところ、CLDN1 タンパク質の TJ における局在が回復した（Fig. 2）。そのため、化合物 #10 による CLDN1 局在への作用は可逆的であることが示された。
3.2. CLDN1 細胞局在に対するエンドサイトーシス阻害剤の作用
これまでに我々は、皮膚の TJ に存在する CLDN1 がクラスリン依存性エンドサイトーシス
により細胞内へ取り込まれることを解明してきた [6]。本検討において、化合物 #10 による
CLDN1 局在変化の作用機序を解明するために阻害剤を用いた検討を行った。リソソーム酸性化の阻害剤であるクロロキンの処置により CLDN1 の細胞内における凝集塊が観察されたた83

め (Fig. 3)、リソソームにより分解を受けていることが示された。また、クラスリン依存性エン
ドサイトーシス阻害剤であるモノダンシルカダベリンの処理により、化合物 #10 による CLDN1
局在変化が抑制された。一方で、プロテアソーム阻害剤であるラクタシスチン、カベオラ介在性エンドサイトーシス阻害剤であるメチルβシクロデキストリンの処理では変化が見られなかった。以上より、化合物 #10 はクラスリン依存性エンドサイトーシスを介した機構で CLDN1 のTJ 局在を変化させることが示された。
3.3. 細胞間バリア機能に対する化合物 #10 の作用化合物 #10 が CLDN1 の TJ 局在を減少させる作用が示されたため、トランスウェルを用いた検討により細胞間バリアに対する影響を調べた。化合物 #10 の処理 6 時間後において、
TER の低下と、LY 透過性の亢進が認められた（Fig. 4）。また、ペプチドホルモンであるインスリンの透過性には影響を及ぼさなかったが、抗酸化食品成分であるケルセチンの透過性を亢進させた。化合物 #10 処理の後、培地交換して 6 時間培養すると、CLDN1 の局在変化と同様に、TER 及びケルセチン透過性は元のレベルと同程度にまで回復した。以上の結果から、化合物 #10 は CLDN1 の形成する細胞間 TJ バリアを可逆的に緩め、ケルセチンなどの低分子化合物の透過性を高める作用があることが示された。

4. 考察
本研究において、CLDN1 と相互作用が予測された化合物 #10 の処理により、CLDN1 の TJ
における局在が減少し、分子透過性が増加することが明らかになった。また、化合物を取り除いて培養することで、CLDN1 の細胞局在も回復することから、可逆的な作用であると考えられる。
ケルセチンはタマネギなどの食品に多く含まれ、強力な抗酸化作用の他、血圧低下や抗がん作用など多岐にわたる生理活性を有するフラボノイドの一種であり [8-11]、サプリメントとしての有用性も広く認知されつつある。ケルセチンを経口摂取した場合、肝臓で代謝を受け、グルクロン酸や硫酸によって水酸基が抱合された形で血液中に取り込まれる [12]。フラボノイドの水酸基は活性に重要であり、非抱合体が主な活性を持つと考えられているため、既存のサプリメントよりも非代謝体として効率よく摂取できる手段としても経皮吸収は有効な戦略となると考えられる。
化合物 #10 による透過亢進がみられたため、経皮吸収型抗酸化サプリメント開発にも有用な可能性がある。
また、薬剤透過性の評価に用いた分子量約 5,000 のペプチドホルモンであるインスリンはの透過性は変化しなかった。本検討でみられた CLDN1 局在変化に起因する TJ バリアの緩みは限定的であり、大きな分子を透過させるにはさらに強力な作用が必要と考えられる。また、
CLDN1 の担う TJ バリアは、部分的には CLDN4 により代償される可能性があるが、詳細な機序は未だ不明であり、今後検討が必要である。

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一般的に、分子量 500 程度が通常の皮膚バリアを通過できる最大のサイズと考えられているが、CLDN1 発現が低下しバリア機能が破綻しているアトピー性皮膚炎患者皮膚では分子量900 程度まで透過可能になると考えられている [13]。また、他の研究グループの研究において、
CLDN1 結合性のウェルシュ菌毒素由来のペプチドによって表皮細胞間の分子透過度が顕著に増加することが報告されていることから [14]、表皮 CLDN1 を標的とするアプローチは皮膚透過促進に有効な戦略と考えられる。そのため、本研究の目的とする可逆的で安全な CLDN1 標的薬の開発によって、通常ほとんど皮膚透過が望めない分子量の薬剤の経皮吸収製剤への応用が可能と考えられる。経皮吸収対象とする分子のサイズや特性に合わせて TJ バリアへの作用強度が調節・選択可能になることが望ましく、今後詳細な検討が必要である。

5. まとめ本研究において、ドッキングシュミレーションにより得られた化合物 #10 が CLDN1 特異的に作用して TJ 局在を減少させ、バリア機能を一過性に低下させることを見出した。また、食品由来成分であるケルセチンの透過量を増大させることを解明した。化合物 #10 を応用することで、皮膚の TJ バリアを可逆的に緩める経皮吸収促進剤の開発に繋がることが期待される。また、経口投与が困難な注射製剤や食品成分を非侵襲的かつ簡便に経皮吸収させる技術は今後多岐にわたる応用の可能性があり、OTC 医薬品への転用とともに、セルフメディケーション促進に繋がると期待される。

6. 調査研究発表
本調査研究成果の一部について、日本薬学会第 141 年会（2021 年 3 月 26 - 29 日、広島）で発表した。

7. 引用文献[1] S. Tsukita, M. Furuse, M. Itoh, Multifunctional strands in tight junctions, Nat Rev Mol
Cell Biol, 2 (2001) 285-293.
[2] S. Tsukita, H. Tanaka, A. Tamura, The Claudins: From tight junctions to biologicalsystems, Trends Biochem Sci, 44 (2019) 141-152.
[3] K. Basler, S. Bergmann, M. Heisig, et al., The role of tight junctions in skin barrier
function and dermal absorption, J Control Release, 242 (2016) 105-118.
[4] T. Sugawara, N. Iwamoto, M. Akashi, et al., Tight junction dysfunction in the stratum
granulosum leads to aberrant stratum corneum barrier function in claudin-1-deficient85

mice, J Dermatol Sci, 70 (2013) 12-18.
[5] R. Gruber, C. Bornchen, K. Rose, et al., Diverse regulation of claudin-1 and claudin-4 in
atopic dermatitis, Am J Pathol, 185 (2015) 2777-2789.
[6] K. Marunaka, M. Kobayashi, S. Shu, et al., Brazilian green propolis rescues oxidative
stress-induced mislocalization of claudin-1 in human keratinocyte-derived HaCaT
cells, Int J Mol Sci, 20 (2019).
[7] M. Kobayashi, S. Shu, K. Marunaka, et al., Weak ultraviolet B enhances the
mislocalization of claudin-1 mediated by nitric oxide and peroxynitrite production inhuman keratinocyte-derived HaCaT cells, Int J Mol Sci, 21 (2020).
[8] B. Sultana, F. Anwar, Flavonols (kaempeferol, quercetin, myricetin) contents of selected
fruits, vegetables and medicinal plants, Food Chem, 108 (2008) 879-884.
[9] F. Babaei, M. Mirzababaei, M. Nassiri-Asl, Quercetin in food: Possible mechanisms of
its effect on memory, J Food Sci, 83 (2018) 2280-2287.
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[11] G. D'A ndrea, Quercetin: A flavonol with multifaceted therapeutic applications?,
Fitoterapia, 106 (2015) 256-271.
[12] A.J. Day, F. Mellon, D. Barron, et al., Human metabolism of dietary flavonoids:
identification of plasma metabolites of quercetin, Free Radic Res, 35 (2001) 941-952.
[13] J.D. Bos, M.M. Meinardi, The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemicalcompounds and drugs, Exp Dermatol, 9 (2000) 165-169.
[14] M. Nakajima, S. Nagase, M. Iida, et al., Claudin-1 binder enhances epidermal
permeability in a human keratinocyte model, J Pharmacol Exp Ther, 354 (2015) 440447.

86Fig. 1. Effect of compound #10 on cellular localization of CDLN1 and CLDN4 in HaCaT cells.
HaCaT cells were cultured with compound #10. (A) After treatment with compound #10 for 3-24 h, thelocalizations of CLDN1 and CLDN4 were visualized by immunofluorescent staining. Scale bars
represent 10 μm. (B) The cell lysates were blotted with anti-CLDN1 and anti-CLDN4 antibodies. (C)After isolation of total RNA, real time PCR was performed using primers pair of CLDN1 and β-actin.
(D) The cell viability was measured by WST-1 assay.

Fig. 2. Evaluation of reversibility on the effect for CLDN1 localization
After treatment with compound #10 for 6 h, culture medium was changed. The cells were cultured for
3 and 6 h. (A) The localization of CLDN1 and CLDN4 on TJ area were visualized by immunofluorescent
staining. Scale bars represent 10 μm. (B) The cell lysates were blotted with anti-CLDN1 antibody.

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Fig. 3. The effect of endocytosis inhibitors on the localization of CLDN1.
The cells were incubated with compound #10 and/or lactacystin (LC), chloroquine (CQ), methylβ-cyclodextrin (MβCD), monodancylcadaverine (MDC). Scale bars represent 10 μm.

Fig. 4. Effects on barrier functions.
The cells were incubated with compound #10 for 6 h. (A) TER was measured using volt-ohmmeter
after treatment with compound #10. (B-D) LY (B), quercetin (C), and insulin (D) were added in theapical chamber and the cells were incubated for 30 min. After collecting the solution in the basal
chamber, the fluorescence intensity of LY or quercetin were measured using an Infinite F200 Pro plate
reader. Concentration of insulin in the basal chamber was measured using human insulin ELISA kit. #P < 0.05 and NS P > 0.05 vs Control, ** P < 0.01, * P < 0.05 vs #10.

88Development of a reversible transdermal permeation enhancer of poorly absorbable drugs
to switch to OTC drugs
Name: Akira Ikari, Professor
Affiliation: Laboratory of Biochemistry, Department of Biopharmaceutical Sciences,
Gifu Pharmaceutical University
Address: 1-25-4 Daigaku-nishi, Gifu 501-1196, Japan
Tel: 81-58-230-8124

Abstract
In a super-aged society, transdermal drug delivery system has generated a lot of interest as nonoral drugs. However, the feasibility of transdermal product is highly limited due to protective
barriers in a skin; lipophilic stratum corneum layer and epidermal tight junction (TJ). An effective
reversible modulator against TJ barrier has not been developed. In the present study, weinvestigated the effect of a candidate of transdermal permeation enhancers, which interacts withclaudin-1 (CLDN1), an essential structure protein for TJ formation, on TJ barrier function using
human epidermis-derived HaCaT cells.
CLDN1-interacting candidates (compound #1-11) were obtained from FDA approved drugs byin silico docking simulation screening. Biological activities of obtained candidates on CLDNrelated TJ barrier functions were investigated by immunostaining, Western blotting, real time-PCR
and barrier function assay, respectively. Treatment with compound #10 decreased TJ localizationof CLDN1 protein but not CLDN4 protein without affecting expression levels of protein and mRNAcompared with untreated control. The mislocalization of CLDN1 was canceled by co-treatment
with monodansylcadaverine, an inhibitor of clathrin-mediated endocytosis. In the barrier function
assay, treatment with compound #10 decreased transdermal electrical resistance (TER) andincreased fluxes of fluorescent marker lucifer yellow and quercetin, which is an antioxidative
multifunctional flavonoid, but not insulin. Moreover, mislocalization of CLDN1, decreased TER
and increased quercetin flux were recovered to control level after removal of compound #10,
suggesting that the effect of compound #10 is reversible. These results suggest that compound #10
might interact with CLDN1 protein to induce CLDN1 mislocalization through clathrin-mediatedendocytosis, resulting in decreased barrier function and promotion of paracellular molecularpermeation.
In conclusion, CLDN1-targeting compound might be a useful candidate for reversible
transdermal permeation enhancer.

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