城生体金属科学研究室
Biometal Science Laboratory
主任研究員

城 宜嗣

SHIRO, Yoshitsugu
生体内の要所に数多く存在する金属タンパク質・酵素は、電子移動、分子状酸素の結合・活性化、さらには一酸化窒素の生成・消去などの化学反応を通して、生体の物質・エネルギー代謝、恒常性維持など多くの重要な生理作用に関与している。最近では、細胞内情報伝達系の重要な因子として機能している事も知られている。当研究室では、X 線結晶構造解析法や各種分子分光法
等による分子構造解析と共に、分子生物学・生化学的な手法を駆使した機能解析を併せ、「金属
タンパク質・酵素およびその関連生体高分子の構造情報を基にした生理作用の分子レベルでの理解」を目標に研究を行っている。

１．特異な化学反応を触媒する金属酵素の構造機能研究(1) 二原子酸素添加酵素の結晶構造解析と機能解析（杉本、佐藤*1、大槻*２、福村*２、四ッ谷*２、城）インドールアミン 2,3 ジオキシゲナーゼ(IDO)はヘム（ポルフィリン-鉄錯体）を活性中心として、トリプトファン代
謝における第一段階かつ律速段階の反応を触媒する。基質のインドール環への二原子酸素添加の過程を原子レベルで理解することを目的として解析をおこなった。本年度は分子表面の残基に変異をいれた IDO を利用することで、
CN 結合型の結晶化に成功し、その立体構造を決定した。
すでに得られているフェニルイミダゾール結合型の構造と比較すると基質結合ポケットを形成する長いループの
位置が 6Å 以上移動していた。この基質結合部位の柔軟性が酵素の基質特異性に関与していることが示唆された。ス
トップドフロー装置を用いて IDO に対する酸素の結合速度を求めた。その結果、基質非結合型の方が基質結合型よりも酸素を速く安定に結合することが明らかとなった。もうひとつの二原子酸素添加酵素であるトリプトファン 2，3ジオキシゲナーゼ（TDO）については、４量体に会合した状態を保ちつつ、さらに精製中にフラグメント化することなく純度の高い標品を調整する方法を確立した。
(2) 哺乳動物のグロビンタンパク質の構造機能解析(澤井*３、牧野*２、杉本、城)近年ほ乳類から発見されたサイトグロビン(Cgb)とニューログロビン(Ngb)は、ミオグロビン(Mb)やヘモグロビン(Hb)と同じファミリーに属するヘム結合型グロビンタン
パク質である。Mb と Hb の軸配位子が１つのヒスチジン残基であるのに対し、Cgb と Ngb は酸化状態に関わらず２つのヒスチジン残基を軸配位子とする六配位構造をとることが知られている。以前に Cgb と Ngb の CO 結合型のピコ秒時間分解能共鳴ラマン分光測定を行ったが、本年度は野生型および変異体を用いたシアン結合型の共鳴ラマン
分光測定により、Ngb では鉄に配位した CN に対する遠位ヒスチジンの影響が他のグロビンと比較して非常に強いことが明らかとなった。ヒトの野生型 Ngb の分解能 2.8Åでの結晶構造解析により、酸素結合能を制御しているといわれているシステイン残基側鎖の構造を明らかにし、その役割について考察した。また、これまでに観測されていな

い Ngb の２量体形成様式を明らかにした。
(3) 脱窒菌由来の膜結合型一酸化窒素還元酵素の反応機構
解析と結晶化（永野、日野*４、山本*２）
硝酸イオンから窒素分子を生成する脱窒は、自然界の窒素サイクルのプロセスのひとつであると共に、嫌気的なエネ
ルギー代謝である硝酸呼吸として機能する重要な物質変換である。一酸化窒素還元酵素（NOR）は、この硝酸呼吸、脱窒の過程で一酸化窒素（NO）から亜酸化窒素(N2O)を合成する膜結合型のヘム酵素である。NORの作動機構を解明する上で最も重要な中間体は、活性部位にNOが結合した複合体であるが、半減期が 1 ミリ秒ときわめて短寿命であるため反応機構には不明な点が多く残されている。そこでこの中間体を捕捉するために低温下、凍結NORを高圧一酸化窒素ガスに暴露し、一酸化窒素複合体を調製するクライ
オガスサイターの作製を行った。この装置では-130℃まで試料を冷却した状態で、20 気圧の気体に曝露することが可能である。一方、立体構造を基盤として反応機構を理解す
ることを目的とし、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来のNORの三次元結晶化に取り組んでいる。これまでに、いくつかの界面活性剤を用いて結晶を得ているが、結晶性が悪く、分解能 6Åであり構造決定には至っていない。本年度は、結晶性を向上させるため、NORに特異的に結合する
モノクローナル抗体の作成に取り組んだ。その際、天然に存在する膜蛋白質を抗原とするモノクローナル抗体の効
率的なスクリーニング法を開発した。その結果 10 種類の抗体を得ることができた。現在、これらの抗体のFab部分を調製しNOR-Fab複合体の結晶化を行っている。
(4) ウシ心筋チトクロム酸化酵素の結晶構造解析（青山、
吉川*5）
蛋白質の機能を理解するためには、全ての構成成分を明らかにすることが不可欠である。生体膜に存在する膜蛋白質に、特異的に脂質が結合し機能に関与していると提唱されているが、未だその完全な構造情報は得られていない。ミ
トコンドリア内膜に位置し、分子状酸素を水にまで還元するとともに、水素イオンを内膜の内側から外側に能動輸送する膜蛋白質複合体であるウシ心筋チトクロム酸化酵素に存在する脂質の構造決定を行った。質量分析により、脂質の極頭部と脂肪酸の結合位置、炭素数及び二重結合の位
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置を決定した結果、７種類のリン脂質と７種類のトリアシ
ルグリセロールの存在が明らかとなった。1.8Å分解能 X
線解析により各脂質の電子密度を確認し、酵素１分子に 13個の脂質が存在することが明らかとなった。
(5) 脂肪酸水酸化酵素チトクロムP450BSβの触媒機構解
析（永野、金*４、城 ）Bacillus subtillis 由来のチトクロムP450（P450BSβ）は過酸化水素(H2O2)を利用して、基質である長鎖脂肪酸（パルミチン酸）の水酸化反応を触媒するヘム酵素である。本研
究では、この触媒反応の分子機構を解明することを目的とし、反応中間体の結晶構造解析を試みている。酵素と過酸
化水素の反応によって得られる中間体は不安定だったので、酸素化型を二電子還元して中間体を得ることを試みた。
還元型酵素と酸素の反応をストップドフロー用いて−15℃で行った。自動酸化速度を小さくする事が可能になり、溶液状態において酸素化型をとらえる事に成功した。この結果を基に、酸素化型の結晶作製を試みた。
２．気体センサーとして働く金属タンパク質の構造機能研
究
細菌や菌類、植物の環境（光、酸素、栄養など）感知・細胞内情報伝達は，環境センサーとして働くヒスチジンキナーゼ（HK）と，レスポンスレギュレーター（RR）のふた
つのタンパク質間の ATP 依存性のリン酸基転移反応を介して行われ，「二成分情報伝達系」と呼ばれる。現在、数千種もの二成分情報伝達系遺伝子があきらかになっているものの、HK の環境因子（リガンド）結合に共役した自己リン酸化反応の制御やリン酸基受容による RR の活性化といったタンパク質レベルでのスイッチングのメカニズ
ムは依然不明のままである。
(1) 酸素センサータンパク質FixL/FixJの情報伝達機構の解析（中村(寛)、田中*3、菊地、城）
根粒菌のヘム結合型酸素センサーFixL/FixJ タンパク質はそれぞれ二成分情報伝達系の HK と RR である。FixL はセンサードメインにヘムをもち、酸素存在下（酸素結合型）
ではキナーゼ活性が抑制され，低酸素下（酸素解離型）ではキナーゼ活性が上昇する。転写因子 FixJ は FixL からリン酸基を受け取ることで活性化され，マメ科植物に共生して窒素固定関連遺伝子（nifA，fixK）を発現させる。FixLのヘムには酸素以外の一酸化炭素なども結合する。しかし、
FixL は酸素とそれ以外の気体状小分子を正確に見極めて、酸素分子が結合/解離した場合にのみ、その情報をキナーゼドメインに伝達する。この認識メカニズムの詳細を解明する目的で、picosec〜millisec の時間スケールで時分割共鳴
ラ マ ン ス ペ ク ト ル 測 定 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 0.2 〜 2microsecond の時間範囲で、ヘムに配位した小分子の種類に依存してヘム周辺の構造が変わること、さらに、その変化はキナーゼドメインの構造変化とも連動していることを明らかにすることができた。FixL のヘムでの酸素結合が自己リン酸化を抑制する初発機構はヘム遠位側アミノ酸によって支えられていると考えられるため、多数の変異体を用いてリガンド結合型タンパク質のリン酸化活性などの生化学的、および NMR やラマン分光などの分光学的解析を行った。その結果、遠位アミノ酸群は結合酸素の安定化に寄与していること、また酸素結合による周囲の構造の均一化がリン酸化抑制に連関していることが示唆された。

(2) 好熱菌二成分情報伝達系の構造機能解析（山田*4、大野*4、小林*2、杉本、中村(寛)、城）
二成分系の HK におけるセンサー部位とキナーゼ活性制御の相関を明らかにする事を目的に、好熱菌由来のHK(ThkA)と RR(TrrA)を選び出し、Ｘ線小角散乱、結晶回折によりその複合体構造を 4.2Å分解能で決定した。その結果、ThkA 二量体の中心に二つの TrrA 分子が結合していた。また、ThkA のセンサー部位のみの高分解能構造を決定し、複合体構造に当てはめたところ、リガンド結合により構造変化の起きると推定される部位と、触媒ドメインとの接触が見られ、この相互作用がキナーゼ活性制御に重要である事を明らかにした。一方、ThkA 特異的な制御因子を探索したが、候補化合物は見つからなかった。TrrA にお
いては、NMR 滴定測定により ThkA との接触残基を特定する事ができた。
(3) エチレンセンサータンパク質ETR1 の立体構造解析にむけた大量発現系構築（菊池、小原*1、城）エチレンは植物における様々な生理作用に関与する植物
ホルモンの一種である。エチレンの情報伝達機構に関する研究は、主に遺伝学的解析による研究が 1980 年代から盛んに行われ、その後の分子生物学的解析の結果、ETR1 やERS1 がエチレン受容体として機能していることが明らかになった。しかし、情報伝達機構に関しては不明な点が多く残されている。そこで、我々はエチレン受容体の性質を
分子レベルで解明することを目的とし、ETR1 の大量発現系構築に取り組んでいる。現在までに、大腸菌、シロイヌ
ナズナの組換体や植物培養細胞を利用した発現系構築に取り組んできたが、いずれの場合にもタンパク質レベルで構造機能解析を行える量のタンパク質を得ることはできなかった。本年度は酵母を利用し、エチレン受容体の大量発現系を構築することを目的に、酵母の培養を行える環境を整えた。
３．新規人工タンパク質の分子設計（磯貝、石田*6）
天然蛋白質のアミノ酸配列とフォールディング特性の関係を調べるために、ミオグロビンの疎水性コア変異体を作成し、変性実験を行った。その結果、ミオグロビンのアミノ酸配列は、フォールディングの反応中間体を不安定化す
るように厳しく選ばれており、それによって協同的な折りたたみ反応を実現していることが明らかになった。中間体の形成は、大きな球状蛋白質が正しく折りたたまれるのに不可欠なステップであるが、過度に安定な中間体は、細胞内でミスフォールドした分子重合体の形成を促進する。従って、中間体の不安定化は、蛋白質分子進化の淘汰圧となっていると考えられる。
４．タンパク質構造解析測定法の開発と応用(1) 分子構造を基盤にした蛍光タンパク質の発光機構の解明（菊地、福村*2、高*1、Jeyakanthan*1、城）オワンクラゲ由来の GFP やサンゴ由来の GFP 様タンパク質を基盤にした in vivo イメージングの技術に目覚しい進展が見られている。それに伴い、外部刺激で蛍光色が変化するものなど、従来にはない機能を持つ GFP 様タンパク質の作製が求められるようになってきた。機能性を持つタ
ンパク質の構築にはランダムミューテーションによる方法に依存している部分が多いが、立体構造をベースとする

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合理的な設計も一部で行われるようになった。そこで我々は、様々な色の GFP 様色素・蛍光タンパク質の結晶構造解析を進めている。本年度は新たに３種の色素タンパク質の構造解析に成功した。また、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）イメージングでの利用に大きな期待が持てる、ドナーとアクセプターの２つのドメインから成る蛍光タ
ンパク質の結晶化にも成功した。
(2) X 線吸収スペクトルを利用した金属タンパク質の電子状態の解析（菊地、城）Ｘ線吸収スペクトル（XAS）の高エネルギー側に広がる微細構造は EXAFS と呼ばれ、測定対象の状態を問わずに金属イオン周辺の構造を明らかにすることができる。そのため、金属タンパク質をはじめとする生体関連試料溶液に対しても、その金属イオン周辺構造情報を得るために極めて有用な手法の１つであるである。既に我々は、生体試料を測定対象としたＸ線吸収スペクトル（bioXAS）に最適化させた測定システムを構築しているが、本年度はこの測定システムを利用して金属タンパク質の活性部位のモデルとなる得る金属錯体の測定を行うなど、さらに測定の対象を広げた。
(3) DNA 相同組換えを調節する蛋白質群の機能解析（美川）DNA 傷害等の結果生じた ssDNA 領域は ssDNA 結合蛋白質（SSB）によって保護され、実際に組換え修復を行う RecA
は結合できない。RecF、RecO、RecR はこの ssDNA 領域を
SSB から RecA に受け渡すことがしられているが、その詳細は不明である。そこで我々はこの系に参加するすべての蛋白質を調製し、まずその傷害認識機構を調べることにした。その結果、RecF は RecFR 複合体を形成して dsDNA に強く結合すること、また、RecO は ssDNA 上の SSB と結合すること、RecR は RecO とも結合することが明らかになった。これらの結果をもとに、これら蛋白質群による傷害領域の認識機構に対する新しいモデルを提唱した。
(4) DNA 相同組換えを行う RecA 蛋白質を用いたマルチプ
レックス PCR 法の確立（美川）PCR 法は特異的な DNA 断片を効率よく増幅する方法として、医療分野やライフサイエンス分野において広く受け入れられている。しかしながら、目的とする DNA 断片以外の増幅が生じるという問題があり、このバックグラウンド
が PCR 法を用いた検査試薬などへの応用の障害になっていた。我々はこの問題を解決することを試みて、PCR の反応系に DNA の対合反応を触媒する耐熱性の RecA を加えることにした。その結果、正確なプライマーの対合により非特異的な増幅は大きく抑えられ、1 本のチューブ内で 10以上の PCR 反応を同時に効率よく起すことに成功した。
このマルチプレックス PCR 法により PCR 法の応用範囲が大きく広がった。
(5) 四次元結晶構造解析法による酵素反応の構造生物化学（河野）本研究では結晶構造解析を用いて酵素反応を動的に追跡することを目的とした研究開発を行っている。現在は、ニトリルヒドラターゼ(NHase)の酵素反応過程の追跡を行っている。NHase はニトリル化合物に水を付加して対応する
アミド化合物を生成する酵素である。活性中心に 3 価の非ヘム鉄または非コリノイド・コバルトを含み，鉄型 NHase
は一酸化窒素(NO)の光脱離によって活性化される。本年度
は、通常の回転法を用いた時間分割結晶構造解析を行い、試料温度 140K 下で基質の鉄への配位過程を捕らえることに成功した。
(6) マウス由来グリセロホスホジエステルホスホジエス
テラーゼの酵素学的解析（大嶋*4）
グリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼ(GDE)は、リン脂質の分解産物であるグリセロホスホジエステルを加水分解しグリセロール３−リン酸と各種リン脂質に対応する極性基を生じさせる酵素である。ほ乳類の GDE は、１種類について酵素活性が報告されているのみである。一次配列からマウスの GDE と予測される６種のタンパク質の発現系を構築した。それらは一次配列から膜タンパク質であると推定される。大腸菌を用いた発現系を試みたが、ほとんど発現が見られなかった。しかしながら、HEK293
細胞で GDE を発現させることに成功した。抗体を用いてGDE を精製し N 末端のアミノ酸配列を解析しシグナル配列の有無を検討した。
５．構造生物学研究の支援業務（瀧尾、中村(光) *1、高橋*7）
精製タンパク質の品質評価及び播磨理研共通施設である
昆虫細胞培養室の維持管理、タンパク質の解析に関する支援業務を行った。年度を通じて行った精製タンパク質の品
質評価に関してはプロテインシークエンサーによる解析
８００件、質量分析による解析１１００件、精製タンパク
質の SDS-PAGE および Native-PAGE６５０件となっている。
昆虫細胞培養室の利用研究室は現在３研究室･グループ（４名）である。タンパク質の解析に関する支援業務に関してはこれまで５研究室･グループ（１３名）からの相談を受け、種々の測定や解析を行った。また、先端タンパク質結晶学研究グループの国島多量体タンパク質構造解析
研究チームとの共同研究で、結晶の改質に役立つ情報を集めるため重水素置換による方法を検討した。

*1

協力研究員、*2研修生（兵庫県立大学大学院）、*3ジュニ
ア・リサーチ・アソシエイト、*4基礎科学特別研究員、*5客員主管研究員、*6 客員研究員、*7協力技術員
Metal ions are present in biological system in the form of
metal-binding proteins and enzymes, and are involved inphysiologically important actions such as biological redox
reactions, cellular signal transductions. Research in Biometal
Science Laboratory focuses on understanding the functions ofsuch metalloproteins and metalloenzymes at molecular andatomic levels on the basis of their molecular structures, which
are determined by the SPring-8 RIKEN beam lines.
1. Structural and Functional Analyses of Several
Metalloenzymes:(1) IDO is a heme-containing dioxygenase and catalyzes theincorporation of dioxygen (O2) into indole rings, that is thefirst and rate-limiting step in the main pathway ofhumantryptophan
catabolism.
We
determinedthecyanide-bound form of IDO which suggest the role of loop in
the active site for the wide substrate specificity. We also purified
and crystallized the tetrameric human tryptophan
2,3-dioxygenase.
(2) Neuroglobin and cytoglobin are two recently
discoveredmembers of the vertebrate globin family. Both are
intracellular proteins with hexacoordinated heme-Fe atoms in
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the ferrous and ferric forms. We measured the resonance Raman
spectroscopy of cyanide-bound form of Ngb. The steric effect of
distal His on the cyanide ligand is stronger than those of otherglobin proteins. The structure of native form of human Ngb wasdetermined at 2.8 Å resolution which implicates the role of Cys
residues for the regulation of the oxygen binding ability.
(3) Bacterial nitric oxide reductase (NOR) is a membrane-boundcytochrome cbb3 type respiratory enzyme, which contains theheme b3 and non-heme iron binuclear center. NOR produces
nitrous oxide (N2O) from nitric oxide (NO) by two-electron
reduction. Although NO-complex of NOR is a key catalyticintermediate, it is very difficult to characterize due to its very
short half life at room temperature. To overcome the difficulty,
we have developed a cryo-gas-citer, which forces gas molecules
to penetrate into NOR at cryo-condition. We also have been
trying to solve the crystal structure of NOR to clarify its
molecular mechanism. So far, many single crystals wereobtained but, unfortunately, their diffraction quality was poor. In
this year, we developed a new hybridoma screening techniqueand generated 10 monoclonal anti-NOR antibodies which is
expected to improve crystal quality.
(4) The chemical structures of lipids of bovine heart cytochromec oxidase including the head group structures, the chain lengths
and unsaturated bond positions of the hydrocarbon tails were
determined by MS analysis. All 13 lipids were identified in the
X-ray structure at 1.8Å resolution.
(5) Cytochrome P450 from bacillus subtilis (P450BSβ) is aperoxygenase that catalyzes the hydroxylation reaction of fatty
acid using hydrogen peroxide (H2O2) as an oxidant. Oxygen
complex of P450BSβ which can be transformed into a catalyticintermediate by X-ray reduction, was observed withstopped-flow rapid scan at -15°C. To elucidate the catalytic
mechanism, we are trying to prepare oxygen-bound P450BSb
single crystals.
2. Structural and functional analyses of metalloporteins
relating to cellular signal transduction
The two-component regulatory system is widely distributed inbacteria, fungi and plants. It is well known that sensory
histidine kinases (HK) sense individual environmental stimuli,
and the cognate response regulators (RR) transduce their signals
downstream upon receiving the phosphoryl group. However,it has been still unknown how HKs are autophosphorylated
upon ligand-binding, and how RRs are activated upon
phosphorylation.
(1) FixL is a paradigm of heme-based oxygen-sensing proteins.
Spectroscopic and mutagenesis studies have suggested thatamino acid residues of the heme distal side stabilize the boundO2, and that a single convergent structure of the sensor domainof the ligand-bound form is relevant to the downregulation ofkinase activity. FixL uses a heme moiety as an oxygen
molecule sensing. We succeeded in the measurements oftime-resolved resonance Raman spectra of the protein spanningof time-orders from ps to ms. The spectra suggested that thestructural change around heme associating with the dissociationof the oxygen molecule are coupled to those of the kinasedomain of FixL.
(2) We determined the low resolution structure of thetwo-component system (ThkA•TrrA complex) of thethermophilic bacterium with small angle X-ray scattering andcrystallographic techniques. Two TrrA molecules bind to thecenter of ThkA dimer in the complex structure. The fitting of
the high resolution structure of ThkA sensor domain into thecomplex structure revealed a conformational change of thesensor domain induced upon the ligand binding should bedirectly transmitted to the ThkA catalytic domain through thespecial region. On the other hand, we could not find thecandidate compound for the specific inhibitor of ThkA. An
NMR titration study revealed the specific residues of TrrA for
ThkA binding.
(3) A gaseous ethylene acts as a hormone in plants. In
Arabidopsis, ethylene is perceived by receptor proteins such as
ETR1 and ERS1 that are membrane-bounded proteins withthree transmembrane helices. Although we have tried toestablish overexpression systems of ETR1 by using E.coli,transgenic Arabidpsis and plant culture cells, the expressed
protein were insufficient in quantities. Then, we have started toestablish overexpression systems of ETR1 and/or ERS1 byusing yeast as a host.
3. De novo protein design
Hydrophobic core mutants of sperm whale apomyoglobin wereconstructed to investigate the amino acid sequence features that
determine folding properties. The denaturation experiments ofthese mutant myoglobins suggest that the two-state transition ofprotein folding or the transient formation of the unstableintermediate, which seem to be required for effective productionof the functional proteins, have been a major driving force ofmolecular evolution of natural globular proteins.
4. Development and application of new methods to protein
structural determination(1) Green fluorescence protein (GFP)-based techniques holdgreat promise for in vivo imaging. The three-dimensional
structural information is imperative to construct new
fluorescence proteins with some desirable functions. We havesucceeded in crystallization and determination of three new
GFP-like proteins. The structures help us to construct new
fluorescent proteins as in vivo markers.
(2) Biological application of X-ray absorption spectra (XAS)
have been recognized as a tool for characterization ofenvironment around metal ions in metalloproteins. We haveestablished bioXAS measurement system that enables us toobtain XAS data from 1 µL sample. In this year, the targets havebeen extended to model complexes that were inspired bymetalloproteins.
(3) ssDNA regions that result from DNA damage are
immediately coated by SSB. RecF, RecO, and RecRproteinsrecognize the dsDNA-ssDNA junction and mediate the loadingof RecA protein onto the SSB-coated ssDNA. We demonstrated
that RecFR complex binds to dsDNA preferentially, that RecO
binds to SSB on the ssDNA and that RecR interacts with not
only RecF but also RecO. These results proposed a newmodel for RecFOR assembly at dsDNA-ssDNA junctions.
(4) Although PCR method is widely accepted, the non-specificproducts often complicate the analysis.
To reduce thenon-specific amplification, we employed a heat-stable RecA
protein that catalyzes the pairing of homologous DNA strands.
We demonstrated that the RecA protein could minimize
non-specific amplification and enable more than one dozen
simultaneous PCRs in a single test tube.
(5) To understand reaction mechanism of enzymes, we aredeveloping novel techniques of time-resolved crystallography.
Nitrile Hydratase (NHase) from Rhodococcus is an enzyme
capable of catalyzing hydration of nitriles, and it contains amononuclear non-heme iron as its reaction center.
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This year, we obtained diffraction data in the process of thesubstrate molecule binding to NHase at 140K.
(6) Glycerophosphodiester phosphodiesterase (GDE) catalyzes
the hydrolysis of glycerophosphodiesers, degradation productsof phospholipids, producing glycerol 3-phosphate andcorresponding alcohols. Among mammalian GDEs, only GDE1
is reported to have GDE activity. We have constructed an
expression system for 6 kinds of mouse GDEs. GDEs are
expressed in HEK293 cells and the protein was purified. We
have analyzed the existence of signal sequences by determining
the N-terminal sequences of the purified GDEs
5. Supporting system for structural biology research in
Harima InstituteWe supported researchers of the Harima Institute in proteincharacterization. This year, more than 1500 protein samples
have been characterized by protein sequencer, mass
spectrometer, PAGE, HPLC, fluorescence spectrometer andothers.

Staff
Head
Dr. Yoshitsugu SHIROMembers
Dr. Hiroshi AOYAMADr. Yasuhiro ISOGAI
Dr. Yoshiaki KAWANO
Dr. Akihiro KIKUCHI
Dr. Tsutomu MIKAWA
Dr. Shingo NAGANO
Dr. Hiro NAKAMURA
Dr. Hiroshi SUGIMOTO
Dr. Tomoya HINO*1
Dr. Misa KIM*1
Dr. Ayako OHNO*1
Dr. Noriyasu OHSHIMA*1
Dr. Seiji YAMADA*1
Dr. Jeyaraman JEYAKANTHAN*2
Dr. Atsuko KOHARA*2
Dr. Mitsuhiro NAKAMURA*2
Dr. Hideaki SATO*2
Mr. Jun-ichiro TAKA*2
Ms. Naoko TAKAHASHI*3*1

Special Postdoctral Researcher
Contract Researcher*3
Contract Technical Scientist*2

Visiting Members
Dr. Shin-ichi ADACHI (PF, KEK)
Prof. Yoshiki HIGUCHI (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)
Prof. Masao IKEDA-SAITO (IMRAM, Tohoku Univ.)
Mr. Manabu ISHIDA (Res. Center for Micro-Nano Technol.,
Hosei Univ.)

Prof. Yutaka ITOH (Tokyo Metropolitan Univ.)
Dr. Takashi IYANAGI
Dr. Hirofumi KOMORI (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)
Prof. Tsutomu KOYAMA (Grad. Sch. Sci., Nagoya Univ.)
Prof. Yukio MORIMOTO (Res. Reactor Inst., Kyoto Univ.)
Prof. Takumi NOGUCHI (Inst. Mater. Sci., Univ. Tsukuba)
Ms. Hitomi SAWAI (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of Hyogo)
Dr. Naoki SHIBATA (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of Hyogo)
Dr. Yasuhito SHOMURA (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)Mr. Atsunari TANAKA (Fac. Sci., Yokohama City Univ.)
Prof. Chikashi TOYOSHIMA (IMCB, Univ. Tokyo)
Dr. Masaki UNNO (IMRAM, Tohoku Univ.)
Mr. Mamoru YAMANISHI (Okayama Univ.)
Prof. Shin-ya YOSHIKAWA (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)

Trainees
Ms. Eiko FUKUMURA (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)
Mr. Hiroshi IMAMURA (Ritsumeikan Univ. Grad. Sch.)Ms. Miki KOBAYASHI (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)Mr. Masatomo MAKINO (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)Mr. Masaharu NISHIHARA (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)
Mr. Takashi OHTSUKI (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)
Ms. Yukiko TAKAI (Tokyo Inst. of Technol. Grad. Sch. of
Biosci. and Biotechnol.)
Mr. Keita YAMAMOTO (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of
Hyogo)
Mr. Norihiko YOKOI (Grad. Sch. Sci., Nagoya Univ.)
Ms. Keiko YOTSUYA (Grad. Sch. of Life Sci., Univ. of Hyogo)
Mr. Eduardo VOTTERO (Univ. of British Columbia)

誌 上 発 表Publications[ 雑誌 ]（原著論文）＊印は査読制度がある論文誌
Hirata K., Yamashita E., Aoyama H., Muramoto K.,
Yoshikawa S., and Tsukihara T.: "Scaling of one-shot
oscillation images with a reference data set", J. SynchrotronRad. 11, 60−63 (2004). ＊Yamashita E., Aoyama H., Yao M., Muramoto K.,
Itoh-Shinzawa K., Yoshikawa S., and Tsukihara T.:"Absolute configuration of the hydroxyfarnesylethyl groupof haem A, determined by X-ray structural analysis of bovine
heart cytochrome c oxidase using methods applicable at 2.8Åresolution", Acta Cryst. D61, 1373−1377 (2005). ＊Sugahara M., Ohshima N., Ukita Y., Sugahara M., andKunishima N.: "Structure of ATP-dependent
phoshoenolpyruvate carboxykinase from Thermus
thermophilus HB8 showing the structural basis of induced fit
and thermostability", Acta Cryst. D61, 1500−1507 (2005).
＊
Nakabayashi M., Shibata N., Komori H., Ueda Y., Iino H.,
Ebihara A. , Kuramitsu S. , and Higuchi Y.: "Structure of aconserved hypothetical protein, TTHA0849 from Thermus
thermophilus HB8, at 2.4Åresolution: a putative member

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of the StAR-related lipid-transfer (START) domainsuperfamily", Acta Cryst. F 61, 1027−1031 (2005). ＊Jeyaraman J., Taka J., Kikuchi A., Kuroishi C., Yutani K., andShiro Y.: "Purification, crystallization and preliminary X-ray
crystallographic study of the L-fuculose-1-phosphate
aldolase (FucA) from Thermus thermophilus HB8", Acta
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近藤 英昌, 西宮 佳志, 安井 雅範, 野呂 奈津子, 佐藤
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平成 17 年度 研究年報