透過低波数ラマン分光の活用による固形製剤中共結晶の定量的評価法の開発
明治薬科大学 分子製剤学
いのうえ

井上

もとき

元基

講師

透過低波数ラマン分光の活用による固形製剤中共結晶の定量的評価法の開発

明治薬科大学 薬学部

専任講師

井上元基

【要旨】
共結晶化は原薬物性を改善する有用な手法である。共結晶は製剤中において、より安定な元の結晶に戻ることや共結晶多形に転移することもある。そのため、固形製剤中において正確か
つ迅速に共結晶を分析できる手法が必要である。本研究では透過低波数ラマン分光を用い、錠剤中共結晶多形をモニタリングする手法の開発を目的にした。錠剤には準安定形のカフェインおよびグルタル酸からなる共結晶を用意し、異なる湿度下で保管した。結晶割合の異なる錠剤を検量線サンプルとし、低波数ラマンスペクトルの部分最小二乗解析（PLS）により結晶成分の数値化を行った。準安定形共結晶は時間経過に伴い安定形への転移がみられた。その速さは相対湿度により異なり、湿度の高い条件で転移速度が速かった。このことは他の分析法での評価と一致しており、透過低波数ラマン分光は錠剤中共結晶の定量的評価に有用であることが示唆された。

１、調査・研究目的
結晶多形の識別には一般的に熱分析法，PXRD，IR 法，固体 NMR 法等各種分光法が用いられる 1-3）．これらにはそれぞれ長所もあるが，熱分析法ではサンプルの回収ができないこと，
PXRD は前処理が必要であること，IR では結晶多形の識別が難しいケースや固体 NMR では測定に長時間を要するといった課題もある．製剤中の医薬品有効成分（API）の識別および定量は，そのままの状態で，短時間に大量測定できることが望ましいことから分光光学的手法が活用されつつある．共結晶は 2 つ以上の分子間で働く水素結合等の非イオン結合によって形成される結晶格子をもつ分子結晶であると定義されている 4）．API の共結晶化は化合物特有の溶解性や安定性，打錠時の成形性といった物理化学的特性を改善することができる 5）．共結晶はAPI の結晶構造候補の 1 つとみなされており，実際に API の共結晶を含んだ固体医薬品の製品が上市されている 6）．共結晶多形は単一分子で構成された結晶多形と同様，異なる水素結合配列をしていることが報告されており，これらの結晶多形間も物理的性質が異なる 7,8）．錠剤中の共結晶と添加剤として加えた塩の交換が起こり，意図しない塩の生成を引き起こしてしまうという125

例が複数報告されている．そのため，共結晶の安定性評価も重要性が増している．9-11）
低波数ラマン分光法は芳香環におけるπ-π相互作用のような分子間相互作用を検出できる 12）．
低波数領域ラマンスペクトルの 0-100 cm-1 はフォノンと呼ばれる結晶格子振動間での変動を反映しており，100-200 cm-1 は分子間相互作用によって電子が局在化による極性の変化を反映している 13-15）．これまでに低波数ラマン分光法を用いた共結晶の分析に関する報告はいくつか知られる．通常領域ラマンスペクトルでは分析が困難なケースとして，異なる化学量論比の共結晶をプ

16）ローブ型低波数ラマン分光法によりモニタリンングした報告がある．カルバマゼピン/ 4- アミノ安息香酸の 1 : 1 と 2 : 1 共結晶多形の識別は通常領域ラマンスペクトルでは困難であったが，低波数ラマン分光法をケモメトリックスで解析することで半定量的に共結晶の生成ならびに転移をモ
ニタリングしている 17）．本分光法であれば結晶構造に起因したスペクトルが得られるため，共結晶多形の識別ならびに定量もできることが推測できる 18）．ラマン分光法は，レーザー光照射により生じるラマン散乱を取得する検出器の位置により反射型と後方散乱 ( 透過 ) 型の 2 種に大別される．反射型は試料にレーザー光を照射し，表面近傍（数十マイクロメートル）の散乱光をレーザーと同じ側に配置した分光器で検出する．一方，透過型は試料へ励起光を照射させ透過したラマ
ン散乱光を得るため，錠剤内部を反映したスペクトルを得ることができる．つまり，粒子を混合して得られた錠剤のような不均一なサンプルを定量する場合，反射法よりも透過法の方が優れた
定量性を示すと考えられている．低波数領域においても透過型と反射型によるラマンスペクトルを取得し，ケモメトリックス処理することで結晶多形の定量性を比較した報告があり，透過型は反射型と比較して定量性が高いことが明らかとなっている 19）．本研究では透過型低波数ラマン
分光法を用いて共結晶とその原料ならびに共結晶多形の定量性について評価した．

２．研究方法2-1

材料

カフェイン（CAF）ならびにグルタル酸（GLA）は東京化成工業製を使用した．その他の試薬は和光純薬製特級品を使用した．
2-2

共結晶の調製

結晶多形（I，II 形）が知られるモル比 1:1 の CAF および GLA からなる共結晶をモデル主薬として選択した．CAF 5.93 g および GLA 4.14 g（モル比 1 : 1）をクロロホルム 166.6 mL
中に加え，40°C の水浴で溶解させた後，約 1 時間かけてエバポレーターで溶媒を留去することで I 形共結晶を得た．これを 25℃の恒温槽に入れ，相対湿度 95% とし，1 日静置させることで安定形の II 形へと転移させた．相対湿度の保持は飽和塩法を利用しており，飽和塩には硫酸カリウムを使用した．I および II 形共結晶は粉末 X 線回折（PXRD）パターンおよび低波数ラマンスペクトルにより確認した．

126

2-3

粉末 X 線回折測定（PXRD）

Miniflex 600（リガク社製）を使用し，線源には Cu Ka 線，管電圧は 40 kV，管電流は15 mA，測定速度は 4.0°/min，サンプリング幅 0.02°の条件で共結晶および原料の PXRD
パターンを取得した．なお，調製した共結晶の参照スペクトルは Mercury 3.10.1 software 収
載のものを使用した．
2-4

錠剤の調製

安定形である II 形を主薬とし，主薬，CAF および GLA をそれぞれ 355μm 以下に篩過後，各成分の含有量を三成分相図（Figure 1）のようになるようにし，均一に混合後，粉末 50 mg
を 20 MPa で打錠し，直径 8.0 mm の錠剤を作成した．
2-5

ラマンスペクトルの測定

ラマンスペクトルは Kaiser 社製 Workstation による反射測定により行った．なお，低波数領域の測定には超狭帯域ボリュームホログラフィックグレーティングノッチフィルターを搭載した XLFCLM モジュール（ONDAX Inc.）を装着した．なお，原料のスペクトルは反射測定を行い，通常領域および低波数領域は励起レーザー波長を 785 nm と 976 nm とした．透過型は錠剤に励起光を照射し，照射した面と反対側からスペクトルを取得し，反射型は励起光の照射面と同じ側におけるラマンスペクトルを取得した．なお，
錠剤サンプルの測定には透過および反射測定において，低波数領域は励起レーザー波長 853 nm（50 ± 5 mW），300 秒露光，1 回積算により測定した．
2-6

PLS 解析を用いた検量線の作成

反射型と透過型を用いて錠剤の低波数ラマンスペクトルを測定した．透過型は錠剤に励起光を照射し，照射した面と反対側からスペクトルを取得し，反射型は励起光の照射面と同じ側におけるラマンスペクトルを取得した．得られたラマンスペクトルデータを用いて，データ解析
ソフト Isys5.0（Malvern Instruments Ltd）によりベースライン処理および Standard Normal
Variate（SNV） を行った後，Grams/AI8.0（Thermo ELECTRON CORPORATION） を用いて Partial Least Squares（PLS）解析を行った．検量性の予測性を確認するためのバ
リデーションとして群内変動を考慮した．誤差の予測には Root mean square error of crossvalidation（RMSECV）を用いた．含量と予測含量との相関は R 2 値により求めた．

３．調査・研究成果
3-1

PXRD による結晶の評価

Figure 2 は本実験で得たサンプルおよび既報の結晶構造データからシミュレートされた
PXRD パターン（calc.）を示す．calc. と調製した共結晶のそれを比較すると，ほぼ同じ 2 θに

127

ピークが確認された．したがって，化学量論比 1 : 1 のカフェインとグルタル酸からなる共結晶の I 形および II 形を調製できたといえる．
3-2

ラマンスペクトルによる結晶の評価

Figure 3 は通常領域および Figure 4 は低波数領域ラマンスペクトルをそれぞれ示す．通常領域ラマンスペクトルでは共結晶 I 形および II 形でスペクトルに違いは見られず結晶多形での識別は困難であった．一方，低波数領域ラマンスペクトルにおいては，I 形共結晶では 35 cm-1，II
形では 40, 55, 67, 82, および 105 cm-1 に特徴的なピークが確認された．また，21 および 37 cm-1にピークが確認された原料の CAF，70 および 92 cm-1 にピークの確認された GLA とも共結晶は異なるスペクトルを示すことから，結晶多形間および原料との識別を行えることが示唆された．
3-3

錠剤の反射および透過型低波数ラマンスペクトル

Figure 5 は CAF および GLA を一定の質量比とし，II 形共結晶を 0, 33, 66, 100％と変えて調製した錠剤の反射および透過低波数ラマンスペクトルを示す．いずれも共結晶の含有率が少ない場合には CAF と GLA のスペクトルをかさね合わせたような形状のスペクトルを示した．
一方，共結晶の含有率が増えるとその含有率に応じたスペクトル形状の変化が確認され，定量できることが示唆された．
3-4

PLS より求めた含量と予測値との関係

各成分の実際の含有率とその予想値との関係は -200-200 cm-1 のスペクトルを PLS 回帰することで行った．Figure 6 は各成分の実際の含量と PLS で求めた予想値との関係を示す．
いずれの成分においても透過の方が反射よりも RMSECV が低いため定量性が高いことがわ
かった．これは反射測定が表面近傍のスペクトルを得るのに対し，透過測定は錠剤内部のスペクトルが得られるためであると考えられる．したがって，透過低波数ラマン分光法は錠剤中結晶だけでなく共結晶の定量にも有用な手法であることが示唆された．MCC を加えて錠剤の厚さを一定にしたものの結果を Figure 7 に示す．MCC を加えることによって RMSECV は低下し，定量性は向上することがわかった．

４．考察
共結晶の固体状態での分析には，赤外分光（IR），ラマン分法，固体 NMR，熱分析，X 線
回折などさまざまな方法がある．Soares らは従来からの分析法の共結晶における測定精度を比較するため，
RMSECV で評価した．それによれば，
IR（23.5）> DSC= PXRD
（11.4）> Raman（3.5）
で，ラマン分光法が最も測定誤差が小さいと報告されている 21）．Barmpalexis らは ATR-FTIRとラマンの定量性を比較しており 22），ラマンの方が誤差は少ないと報告した．これらの報告では

128

スペクトルをケモメトリックスにより解析し，錠剤中の共結晶の定量を行っている．本研究では，
低波数領域に拡大するとともに，反射から透過とすることで定量性の向上を企図した．PXRD のパターンを比較すると，パターンは類似しており，シミュレーションのパターンは実測のそれがシフトしたような形状を示した．これは低温での単結晶測定の結果をもとにシミュレーションしているためと考えられる．今後のバッチ生産から連続生産への移行を考慮すると製剤は非破壊・非接触での分析する必要がある．上述の条件を満たすためラマン分光法は PXRD と比較して最適な分析法といえる．共結晶の通常領域ラマンスペクトルは出発化合物のそれを重ね合わせたような形状を示し，それらの識別は困難であった．低波数ラマンスペクトルはそれぞれの結晶形を容易に識別できた．このことより低波数ラマンスペクトルは PXRD 同様にパターンとして認識できるといえる．なお，
カフェインの低波数ラマンスペクトルは Hédoux らの既報と一致した．これまでの我々の検討では透過低波数ラマン分光と反射を比較すると透過の方が高い定量性を示すと報告している．共結晶は製剤化工程または保管条件によっては分解するリスクがあり，それを分析することが重要である．透過と反射の定量性を比較すると，カフェインとグルタル酸において透過は反射と比較して改善した（共結晶を除く）．結晶間の RMSECV の違いは，屈折率や反射率などの結晶の物理化学的特性だけでなく，錠剤の厚さにも起因すると考えた．すなわち，各成分の密度が異なるため，錠剤の厚さは 0.91± 0.07 mm で誤差が大きかった．したがって，予測誤差の違い
は，サンプルタブレットとサンプルジオメトリにおける励起レーザーの侵入深さによるものであると考えた．以前の研究では，透過ラマン散乱の強度とレーザー照射の間にトレードオフの関係が観察されており，生じるラマン散乱はタブレットの厚さとともに増加するが，錠剤を透過しない散乱も増えると考察されている．そこで，錠剤の厚さを一定にするため，MCC を追加すると 1.40 ± 0.01
mm となり，結晶性材料のみからなる錠剤に比べて定量性が向上した．Figure 6（c）に示すように，x 軸が共結晶の場合，定量的能力は著しく向上した．透過型を使用した実際のコンテンツと予測されたコンテンツの相関は，反射型を使用した場合よりも高かった．反射のスポットサイズは，錠剤中の各成分の粒度よりも小さいためと考えられる．対照的に，透過型は錠剤の厚み方向を平均化したスペクトルが得られるため，反射と比較しており定量性が高くなったものと考えられる．
これらの結果は，透過型が，錠剤中の共結晶および結晶成分の混合物を定量するには，反射型よりも優れていることを示す．錠剤中の共結晶は低波数ラマンスペクトルで定量化でき，反射型か
ら透過型に変更することで，より高い定量性となることがわかった．透過低波数ラマン分光法は，定量能力が他の結晶の存在に影響されにくいため，結晶成分の定量化に有用な方法といえる．

５．まとめ
透過型低波数ラマン分光法は医薬品錠剤中の結晶多形転移を定量的にモニタリングできることが明らかとなった．この分光法は前処理なしで，共結晶の結晶形を簡便かつ迅速に測定することができるため，医薬品製造分野においては様々な添加剤を含んでいる医薬品錠剤中の結晶129

形を保証する試験に応用できること，医薬品錠剤中の共結晶多形の転移の安定性を定量的に評価する方法の 1 つとして有用であることが示唆された．

６．調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
投稿中

７．引用文献（1）Vogt, F. G.; Clawson, J. S.; Strohmeier, M.; Edwards, A. J.; Pham, T. N.; Watson, S. A.
Cryst. Growth Des. 2009, 9, 921-937.
（2）Lu, E.; Rodriguez-Hornedo, N.; Suryanarayanan, R. CrystEngComm 2008, 10, 665-668.
（3）Croker, D. M.; Hennigan, M. C.; Maher, A.; Hu, Y.; Ryder, A. G.; Hodnett, B. K. J.
Pharm. Biomed. Anal. 2012, 63, 80-86.
（4）Karimi-Jafari, M.; Padrela, L.; Walker, G. M.; Croker, D. M. Cryst. Growth Des. 2018,18, 6370-6387.
（5）Malamatari, M.; Ross, S. A.; Douroumis, D.; Velaga, S. P. Adv. Drug Deliv. Rev. 2017,
117, 162-177.
（6）Duggirala, N. K.; Perry, M. L.; Almarsson, Ö.; Zaworotko, M. J. Chem. Commun. 2016,
52, 640-655.
（7）Eddleston, M. D.; Madusanka, N.; Jones, W. J. Pharm. Sci. 2014, 103, 2865-2870.
（8）Eddleston, M. D.; Thakuria, R.; Aldous, B. J.; Jones, W. J. Pharm. Sci. 2014, 103, 2859-2864.
（9）Duggirala, N. K.; Vyas, A.; Krzyzaniak, J. F.; Arora, K. K.; Suryanarayanan, R. Mol.
Pharm. 2017, 14, 3879-3887.
（10）Tanaka, R.; Duggirala, N. K.; Hattori, Y.; Otsuka, M.; Suryanarayanan, R. Mol. Pharm.
2020, 17, 274-283.
（11）Abourahma, H.; Urban, J. M.; Morozowich, N.; Chan, B. CrystEngComm 2012, 14,6163-6169.
（12）Colaianni, S. E. M.; Nielsen, O. F. J. Mol. Struct. 1995, 347, 267-283.
（13）Woods, K. N.; Pfeffer, J.; Dutta, A.; Klein-Seetharaman, J. Sci. Rep. 2016, 6, 37290.
（14）Aviv, H.; Nemtsov, I.; Mastai, Y.; Tischler, Y. R. J. Phys. Chem. A 2017, 121, 7882-7888.
（15）Kalanoor, B. S.; Ronen, M.; Oren, Z.; Gerber, D.; Tischler, Y. R. ACS Omega 2017, 2, 1232-1240.
（16）Otaki, T.; Tanabe, Y.; Kojima, T.; Miura, M.; Ikeda, Y.; Koide, T.; Fukami, T. Int. J.
Pharm. 2018, 542, 56-65.

130

（17）Inoue, M.; Hisada, H.; Koide, T.; Carriere, J.; Heyler, R.; Fukami, T. Ind. Eng. Chem.
Res. 2017, 56, 12693-12697.
（18）Inoue, M.; Osada, T.; Hisada, H.; Koide, T.; Fukami, T.; Roy, A.; Carriere, J.; Heyler, R.
Anal. Chem. 2019, 91, 13427-13432.
（19）Inoue, M.; Hisada, H.; Koide, T.; Fukami, T.; Roy, A.; Carriere, J.; Heyler, R. Anal.
Chem. 2019, 91, 1997-2003.
（19）Trask, A. V.; Motherwell, W. D. S.; Jones, W. Cryst. Growth Des. 2005, 5, 1013-1021.
（20）Soares, F. L. F.; Carneiro, R. L. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 89, 166 −175.
（21）Barmpalexis, P.; Karagianni, A.; Nikolakakis, I.; Kachrimanis, K. J. Pharm. Biomed.
（21） Barmpalexis, P.; Karagianni, A.; Nikolakakis, I.; Kachrimanis, K. J. Pharm. Biomed. Anal.
Anal. 2018, 158, 214 − 224.
2018, 158, 214−224.
（22）Trask, A. V.; Motherwell, W. D. S.; Jones, W., Chem. Commun. 2004, 7, 890-891.
（22） Trask, A. V.; Motherwell, W. D. S.; Jones, W., Chem. Commun. 2004, 7, 890-891.
図図Figure 1 CAF，GLA，および II 形共結晶の 3 成分相図．
（a）有効成分となる結晶（CAF，
Figure 1 CAF，GLA，および II 形共結晶の 3 成分相図．
（a）有効成分となる結晶（CAF，GLA，
GLA，Ⅱ形共結晶）のみで構成された相図，（b）（a）の組成に添加剤として結晶セルロ
Ⅱ形共結晶）のみで構成された相図，（b）（a）の組成に添加剤として結晶セルロース（MCC）
ース（MCC）を加えたもの．●はキャリブレーション用の組成，○はバリデーション用を加えたもの．●はキャリブレーション用の組成，○はバリデーション用の組成．
の組成．

131

Figure 2測定した CAF，GLA，Ⅰ形，Ⅱ形共結晶の PXRD 回折パターンとその参照スペクトル．

測定した CAF，GLA，Ⅰ形，Ⅱ形共結晶の PXRD 回折パターンとそれぞれ

ペクトル．

e2

測定した CAF，GLA，Ⅰ形，Ⅱ形共結晶の
PXRD 回折パターンとそれぞれ
Figure 2 測定したCAF，
GLA，
Ⅰ形，
Ⅱ形共結晶のFigure形共結晶の通常領域ラマンスペクトル．
3 CAF，
GLA，
Ⅰ形，
Ⅱ形共結晶のFigure3 CAF，GLA，I
形，II

照スペクトル．

PXRD回折パターンとそれぞれの参照

通常領域ラマンスペクトル．

スペクトル．

CAF，GLA，I 形，II 形共結晶の通常領域ラマンスペクトル．

Figure 4

e3

CAF，GLA，I 形，II 形共結晶の低波数領域ラマンスペクトル．

CAF，GLA，I 形，II 形共結晶の通常領域ラマンスペクトル．

Figure 4 CAF，GLA，I形，II形共結晶のCAF，GLA，I 形，II形共結晶の低波数領域ラマンスペクトル．
低波数領域ラマンスペクトル．

e4

CAF，GLA，I 形，II 形共結晶の低波数領域ラマンスペクトル．

Figure 5

II 形共結晶の割合が0（Sample0（Sample7）, 33（Sample
10）,6）,100% 1）のFigure 5 II 形共結晶の割合が7）,33（Sample
10）,66（Sample
66（Sample 6）,100%（Sample（Sample 1）の（a）透過型，（b）反射型ラマンスペクトル．
（a）
透過型，
（b）
反射型ラマンスペクトル．

132

Figure 5

II 形共結晶の割合が 0（Sample 7）, 33（Sample 10）, 66（Sample 6）, 100%（Sample 1）の（a）透過型，（b）反射型ラマンスペクトル．

Figure 6

Figure 6

錠剤に含まれている結晶の実際の含量と予測値との間の回帰直線．定量性についての錠剤に含まれている結晶の実際の含量と予測値との間の回帰直線．定量性に透過型（a，b，c）と反射型（d，e，f）の比較．

ついての透過型（a，b，c）と反射型（d，e，f）の比較．

Figure 7

MCCを加えることによって厚さが一定となった錠剤に含まれている結晶の実際の含量と予測値との間の回帰直線．定量性についての透過型（a，b，c）と反射型（d，e，f）の比較．

○はバリデーション用の組成
Figure 7 MCC ●はキャリブレーション用，を加えることによって厚さが一定となった錠剤に含まれている結晶の実際の含量と予測値との間の回帰直線．定量性についての透過型（a，b，c）と反射型（d，e，f）の比較．●はキャリブレーション用，○はバリデーション用の組成
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