鼻粘膜過敏性亢進抑制作用を指標とした第２世代抗ヒスタミン薬の再評価
広島大学 原爆放射線医科学研究所
疾患モデル解析研究分野 教授
かみぬま

神沼おさむ修鼻粘膜過敏性亢進抑制作用を指標とした第２世代抗ヒスタミン薬の再評価

広島大学原爆放射線医科学研究所

神沼

修

【要旨】
花粉症等アレルギー性鼻炎治療を目的として、多くの第２世代抗ヒスタミン薬がスイッチ OTC化されているが、その有効性の優劣は明らかではない。昨年度実施した貴財団助成研究によって、ロラタジン（Loratadine、LRT）だけが、他の抗ヒスタミン薬と異なり、感作マウスにおける抗原誘発鼻粘膜過敏性亢進（NHR）の発症を抑制する可能性を見いだした。そこで本年度は、LRT の作用点を絞り込むため、in vitro および in vivo での検討を行った。LRT およびその活性代謝産物であるデスロラタジン（Desloratadine、DES）は、Th2 細胞において活性化刺激に伴い誘導される I l4 、I l 5 および I l13 遺伝子発現を、10μM 以上の濃度で同程度抑制した。Th2細胞依存性の NHR 発症モデルを用いて検討したところ、LRT は抗原誘発 NHR および鼻粘膜炎症細胞浸潤に影響を与えなかった。LRT および DES は、高濃度で Th2 サイトカイン発現抑制作用を示すものの、その効果を介して臨床的に NHR の発症を抑制する可能性は低いことが明らかになった。

１、調査・研究目的
加速度的に患者数が増加している花粉症等のアレルギー性鼻炎領域では、セルフメディケーションが重点的に推進されており、近年、多くの第２世代抗ヒスタミン薬について、スイッチOTC 化が実現している。一方、即効性や持続性、眠気等の副作用の点で若干の相違がみられるものの、各製品間の決定的な相違に関する情報が乏しいことから、各患者が自らの判断で製品を選択することが困難な状況となっている。結果として、多くの患者が今なお医療機関を受診し続けており、それがセルフメディケーション推進の妨げとなっている。
エピナスチン、エバスチン、セチリジン、ベポタスチン、フェキソフェナジン、ロラタジン（Loratadine,LRT）等に代表されるスイッチ OTC 第２世代抗ヒスタミン薬類の殆どが、各々臨床試験時には、比較対照とされた既存の抗ヒスタミン薬より優れた有効性を示したことから、医療用医薬品として上市に至った経緯がある。しかしながらその優位性の要因を、主たる薬効メカニズムの抗ヒスタミン作用だけで説明することは難しい。一部の薬剤には、マスト細胞の脱顆粒抑制効果や、ロイコトリエン・インターロイキン産生抑制効果がみられることも報告されているが、それが臨床効2果にどれだけ寄与するかも不明である。
アレルギー性鼻炎の罹患および重症度は、一般的にくしゃみ、鼻漏および鼻閉等の臨床症状を指標に評価されるが、申請者は最近、そのマウスモデルを解析する中で、種々の症状悪化に繋がる本質的な病態と、その発症機構の存在を明らかにした。感作マウスに抗原を反復点鼻チャレンジすると、徐々にくしゃみ反応を呈する。しかしこれは、単純に IgE を介して抗原特異的に脱顆粒したマスト細胞から放出されたヒスタミンに対するくしゃみ応答ではなく、非特異的刺激に対するくしゃみ応答の増強、すなわち鼻粘膜過敏性亢進（Nasa hyperresponsiveness：NHR）を反映した反応であることを見いだした [1]。さらにこの抗原誘発 NHR に、IgE ／マスト細胞や好酸球は殆ど関与しない一方、抗原特異的 T 細胞の存在が、その発症の必要十分条件となることや、アレルギー性鼻炎に対するステロイド剤の強い有効性の少なくとも一部分は、NHR 抑制作用に基づくことも解明した [2]。
この新たに見いだした病態メカニズムに対して、各種第２世代抗ヒスタミン薬が効果を示すか、これまで明らかにされていない。しかし申請者は、昨年度実施した貴財団助成研究において、感作マウスに抗原チャレンジすることによって誘発される NHR の発症を、他の抗ヒスタミン薬と異なり、LRT だけが抑制する可能性を見いだした [3]。そこで本年度は、LRT の作用点を絞り込むため、LRT の活性代謝産物であるデスロラタジン（Desloratadine、DES）も含め、Th2 細胞機能に与える影響や、独自に開発した Th2 細胞依存性の NHR 発症モデルに対する効果を明らかにすることを目的として実施した。

２、調査・研究方法
2-1

動物

6-8 週齢の雌性 BALB/c マウス（広島実験動物、広島）および卵白アルブミン（ovalbumin、OVA）特異的 T 細胞受容体を発現する DO11.10/RAG2 / マウス [1, 2] を用いた。本実験計画- -について、事前に広島大学動物実験委員会の承認（承認番号：A21-32）を得て研究を実施した。
2-2

T 細胞サイトカインの解析
DO11.10/RAG2 -/- マウスから脾細胞を調整し、EasySep Mouse CD4 + T Cell Isolation

Kit（Veritas）を用いてナイーブ CD4 陽性 T 細胞を分取した。それを X 線照射した脾細
胞、OVA323-339 ペプチド、IL -2、IL - 4 および抗 IFN -γ抗体と 7 日間共培養し、抗原特異的 Th2 細胞を分化誘導した。生細胞を回収後、LRT（東京化成工業）または DES（東京化成工業）存在／非存在下で、抗 CD3/CD28 抗体ビーズ（Dynabeads Mouse T-Activator
CD3/CD28、Thermo Fisher Scientific）による刺激 培養を 6 時間行った。RNeasy minikit（Qiagen) を用いて RNA を抽出後、SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit（ThermoFisher Scientific）で逆転写反応を行った。I l4 、I l5 および I l13 遺伝子 遺伝子の発現を、

3

TaqMan gene expression probes（Thermo Fisher Scientific）を用いたリアルタイム PCR システム（ABI StepOnePlus Real-Time PCR System、Thermo Fisher Scientific）で検出した。
2-3

Th2 細胞依存性鼻炎モデル

分化誘導した抗原特異的 Th2 細胞を、尾静脈から BALB/c マウスに移入した（2 x 10 7cells/head）。Th2 細胞移入 6 時間後から、OVA（600μg）を 1 日 1 回、5 日間連続で点鼻チャレンジ（i.n.）した。陰性コントロール群の動物には PBS のみをチャレンジした。最終日を除くOVA チャレンジの 30 分前に、LRT を 0.5% メチルセルロース溶液に懸濁して経口投与（10mg/kg, p.o.）した。陽性コントロール群の動物にはメチルセルロース溶液のみを投与した（図 1）。
2-4

鼻炎病態の解析

最終抗原チャレンジの 6 時間後に、10μl のヒスタミン溶液（100 mM；ナカライテスク、京都）を投与して誘発されるくしゃみ反応の回数を 5 分間計数することにより、NHR を評価した。NHR 解析後、マウスを過麻酔により安楽死させ、鼻腔洗浄を行って炎症細胞を回収した。
鼻腔洗浄液（nasal lavage fluid：NALF）中の細胞数を計数した後、サイトスピン 4（Epredia）で細胞の単層塗抹標本を作製した。Differential Quik Stain Kit（Dade Behring）で染色後、形態学的評価により細胞分類を行った（図 1）。
2-5

統計解析

実験結果は、平均値±標準誤差で表示した。統計解析として、Student の t 検定を行った。
p < 0.05 を統計学的有意差有りと判定した。

３、調査・研究成果
3-1

Th2 サイトカイン発現に対する作用
DO11.10/RAG2 -/- マウスのナイーブ CD4 陽 性 T 細胞から分化誘導した Th2 細胞を抗CD3/CD28 抗体ビーズで刺激したところ、I l4 、I l5 および I l13 遺伝子の発現が著しく増強された（図 2A）。これらの反応は、LRT および DES の添加により、10μM 以上で濃度依存的に抑制された（図 2B）。Th2 サイトカイン発現抑制効果において、LRT および DES は同程度の活性を示した。
3-2

NHR および鼻粘膜好酸球浸潤に対する作用

Th2 細胞移入マウスに反復抗原チャレンジすることにより、PBS をチャレンジした陰性コントロール群に対し、ヒスタミンによって誘発されるくしゃみ反応の有意な増加、すなわち NHRの発症と（図 3A）、鼻粘膜好酸球浸潤（図 3B）が観察された。これらの反応は、LRT 投与

4により影響を受けなかった。

４、考察
LRT は、Th2 細胞におけるサイトカイン発現を in vitro で抑制するが、in vivo では、Th2 細胞依存性に発症する NHR および鼻粘膜好酸球浸潤に影響を与えないことが明らかになった。
LRT の代謝産物である DES は、転写因子 signal transducer and activator of transcription（STAT）ファミリーの DNA 結合活性を阻害することで、T 細胞機能を抑制することが報告されている [3]。LRT は、肝臓の cytochrome P450 によって DES に代謝されることから [4]、invitro の実験条件下で LRT が DES に代謝された可能性は考えにくい。従って、DES だけでな
く LRT も、T 細胞に直接作用することにより、サイトカイン発現抑制効果を示したと考えられる。
昨年度実施した貴財団助成研究で作用検討したエピナスチン、フェキソフェナジン、ベポタスチン等は、今回検討した DES と共に、いずれもTh2 細胞におけるサイトカイン産生抑制効果を示すことが報告されている [5 -7 ]。しかしながら昨年度の検討において、感作マウスにおける抗原誘発 NHR 発症モデルに対し、LRT 以外の薬剤は明らかな影響を与えなかった。そこで今回、より Th2 細胞の関与が明確な実験モデルで検討を行ったところ、LRT はいずれのパラメーターに対しても明らかな影響を与えなかった。この結果は、LRT によって Th2 サイトカイン発現抑制効果がみられた in vitro の実験結果や、DES 投与により T 細胞依存性のアレルギー性炎症抑制効果がみられたとする先行研究報告 [7 ] 等と相反する。その原因は明らかではないが、成人に対する臨床投与量（10 mg）の経口摂取によって、LRT の血中濃度は 10 nM 程度まで上昇する。
本研究において、臨床投与量の約 60 倍相当量をマウスに投与したことを考慮しても、その血中濃度が 10μM に到達する可能性は低い。従って、LRT および DES でみられた Th2 細胞サイトカイン発現抑制効果が、臨床的に発揮される可能性は低いと考えられた。
感作マウスにおける抗原誘発 NHRを抑制した LRT が、Th2 細胞依存性のNHRに無効であった原因は不明である。両モデルにおける明確な相違点として、感作モデルでは抗原チャレンジ毎にマスト細胞の脱顆粒が起こり、種々のケミカルメディエーターが放出されていることが想定される点が上げられる。特にこの一連の研究で、NHR の評価に用いたヒスタミン誘発くしゃみ反応に関わるヒスタミン H1 受容体は、ヒスタミンの作用により発現亢進することが報告されている [8]。
感作マウスモデルにおいて、マスト細胞から放出されるヒスタミンに LRT が拮抗することにより、結果としてヒスタミン H1 受容体の発現レベルが低下し、NHR の抑制に結びついた可能性が考えられた。また、第２世代抗ヒスタミン薬の一部は、ヒスタミン H1 受容体の定常的な活性化状態に影響を与える inverse agonist 活性を示すことが報告されている [9]。これらの特性を介した第２世代抗ヒスタミン薬の作用を詳細に検討してゆくことで、これまで知られていなかった有効性発現機構の解明に結びつくと共に、未知の NHR 発現誘導因子を標的としたアレルギー疾患治療法開発への新たな道が開ける可能性が示唆された。

5

５、まとめLRT は、少なくともその臨床投与量において、Th2 細胞活性や Th2 細胞依存性に発症するNHR に対する抑制効果は期待できない可能性が示された。ヒスタミン H1 受容体の発現に対する影響や inverse agonist 活性を介し、NHR を含めたアレルギー性鼻炎病態に与える第２世代抗ヒスタミン薬の効果について、今後さらに検討を加える必要性が考えられた。

６、調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
1） マウス抗 原誘 発鼻 粘 膜 過 敏 性 亢 進モデルに対 する第２世代 抗ヒスタミン薬の 効 果 ．
尾形佐和子、宇田直人、山崎憲政、三浦健人、森晶夫、後藤穣、神沼修．

第 71 回日本アレルギー学会学術大会（東京）、2022.10.7- 9．
2） Uda N, Ogata S, Yamasaki N, Miura S, Hosomi N, Mori A, Gotoh M, Kaminuma O. Reevaluation of over-the-counter histamine H1-receptor antagonists based on their effects
on murine models of allergen-induced nasal hyperresponsiveness. J Pharmacol Sci,
150:275-278, 2022.

７、引用文献1.

Nishimura, T.; Kaminuma, O.; Saeki, M.; Kitamura, N.; Matsuoka, K.; Yonekawa,H.; Mori, A.; Hiroi, T., Essential contribution of CD4+ T cells to antigen-induced nasalhyperresponsiveness in experimental allergic rhinitis. PLoS One 2016, 11, e0146686.

2.

Nishimura, T.; Kaminuma, O.; Saeki, M.; Kitamura, N.; Gotoh, M.; Mori, A.; Hiroi,T., Effects of anti-allergic drugs on T cell-mediated nasal hyperresponsivenessin a murine model of allergic rhinitis. Allergol. Int. 2018, 67 Suppl 1, 25-31.

3.

Döbbeling, U.; Waeckerle-Men, Y.; Zabel, F.; Graf, N.; Kündig, T. M.; Johansen,P., The antihistamines clemastine and desloratadine inhibit STAT3 and c-Mycactivities and induce apoptosis in cutaneous T-cell lymphoma cell lines. Exp
Dermatol 2013, 22, 119-24.

4.

Yumibe, N.; Huie, K.; Chen, K. J.; Snow, M.; Clement, R. P.; Cayen, M. N., Identificationof human liver cytochrome P450 enzymes that metabolize the nonsedatingantihistamine loratadine. Formation of descarboethoxyloratadine by CYP3A4 andCYP2D6. Biochem Pharmacol 1996, 51, 165-72.

5.

Kanai, K.; Asano, K.; Watanabe, S.; Kyo, Y.; Suzaki, H., Epinastine hydrochloride

6antagonism against interleukin-4-mediated T cell cytokine imbalance in vitro. Int.
Arch. Allergy Immunol. 2006, 140, 43-52.
6.

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H1 receptor up-regulates histamine H1 receptor itself through activation of receptor
gene transcription. Journal of pharmacological sciences 2007, 103, 374-82.

9.

Mizuguchi, H.; Ono, S.; Hattori, M.; Sasaki, Y.; Fukui, H., Usefulness of HeLa cells toevaluate inverse agonistic activity of antihistamines. Int Immunopharmacol 2013, 15, 539-43.

10. Garcia, G.; Taille, C.; Laveneziana, P.; Bourdin, A.; Chanez, P.; Humbert, M., Antiinterleukin-5 therapy in severe asthma. Eur. Respir. Rev. 2013, 22, 251-7.
11. Bryce, P. J.; Geha, R.; Oettgen, H. C., Desloratadine inhibits allergen-induced airway
inflammation and bronchial hyperresponsiveness and alters T-cell responses in murine
models of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2003, 112, 149-58.
12. Okubo, K.; Kurono, Y.; Ichimura, K.; Enomoto, T.; Okamoto, Y.; Kawauchi, H.; Suzaki, H.;
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図 1．Th2 移入マウスモデルの実験方法とタイムスケジュール．
図 1．Th2 移入マウスモデルの実験方法とタイムスケジュール．
DO11.10/RAG2 -/- マウスのナイーブ CD4 陽性 T 細胞から in vitro で分化誘導した抗原特異DO11.10/RAG2-/-マウスのナイーブ CD4 陽性 T 細胞から in vitro で分化誘導した抗的 Th2 細胞を、BALB/c マウスに移入した（2 x 10 7 cells/head）。Th2 細胞移入 6 時間後から、原特異的 Th2 細胞を、BALB/c マウスに移入した（2 x 107 cells/head）。Th2 細胞移入 6OVA を 1 日 1 回、5 日間連続で点鼻チャレンジ（i.n.）した。最終日を除くOVA チャレンジの 30時間後から、OVA を 1 日 1 回、5 日間連続で点鼻チャレンジ（i.n.）した。最終日を除分前に、LRT を経口投与（10 mg/kg, p.o.）した。最終チャレンジの 6 時間後に NHR およびく OVA チャレンジの 30 分前に、LRT を経口投与（10 mg/kg, p.o.）した。最終チャレ
NALF 中の好酸球数を解析した。
ンジの 6 時間後に NHR および NALF 中の好酸球数を解析した。

7

図
トカイン発現に対する LRT の効果．
図2．Th2
2．Th2細胞のサイ細胞のサイトカイン発現に対する
LRT の効果．
/
DO11.10/RAG2 マウスのナイーブ CD4 陽性 T 細胞から in vitro で分化誘導した抗原特異DO11.10/RAG2-/-マウスのナイーブ CD4 陽性 T 細胞から in vitro で分化誘導した抗的Th2 細胞を、LRTまたは DES存在／非存在下で、抗CD3/CD28
抗体ビーズによる刺激原特異的Th2 細胞を、LRTまたはDES 存在／非存在下で、抗CD3/CD28抗体ビーズによ培養を6 時間行った。RNAを抽出て逆転写反応を行い、の発現をI l4 、I l5 およびIl4I l13遺伝子る刺激培養を6 時間行った。RNAを抽出て逆転写反応を行い、、Il5およびIl13 遺

リアルタイム PCR システムで検出した。
（A）無刺激（-）／刺激（CD3/CD28）間の発現比較。
（B）

伝子の発現をリアルタイム PCR システムで検出した。
（A）無刺激（-）／刺激（CD3/CD28）

薬剤非存在下で刺激した際の発現レベルを 100% として算出した薬剤の効果。*p < 0.05, **p <間の発現比較。（B）薬剤非存在下で刺激した際の発現レベルを 100%として算出した薬0.01, ***p < 0.001, 無刺激コントロール群との比較（N = 4）。

剤の効果。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 無刺激コントロール群との比較（N= 4）。

8図3．Th2
3．Th2 細胞移入
細胞移入マウスの抗原誘発
NHRおよび鼻粘膜好酸球浸潤に対するおよび鼻粘膜好酸球浸潤に対するの作
図
マウスの抗原誘発 NHRLRTLRTの作用．
用．
Th2 細胞を移入したマウスに LRT（10 mg/kg）投与下で連日 OVA チャレンジした。最終チャTh2 細胞を移入したマウスにLRT（10 mg/kg）投与下で連日チャレンジした。最レンジの6 時間後に NHR（A）を解析し、鼻腔洗浄を行ってNALF OVA中の好酸球（B）数を計数
終チャレンジの中の好酸球した。
p < 0.05, 6 p時間後に< 0.001, NHR（A）を解析し、鼻腔洗浄を行ってOVA チャレンジしたコントロール群との比較NALF（N =4-7）。

****（B）数を計数した。*p < 0.05, ***p < 0.001, OVA チャレンジしたコントロール群との比較（N = 4-7）。
Title: Reevaluation of second-generation anti-histamines through the effect on nasal
hyperresponsiveness
Name: Osamu Kaminuma
Name of Affiliation: Research Institute of Radiation Biology and Medicine
Address: 1-2-3 Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8553, Japan
Tel: +81-82-257-5819
Abstract:
Although many second-generation antihistamines have been switch-OTC to the treatmentof allergic rhinitis, differences in their efficacy are not clear. Last year, we found thatloratadine (LRT), unlike other antihistamines, may inhibit the development of antigeninduced nasal hyperresponsiveness (NHR) in immunized mice. Herein, we investigated
the in vitro and in vivo effects of LRT to narrow down its point of action. LRT and its
active metabolite desloratadine (DES) inhibited the stimulation-induced Il4, Il5, and Il13
expression in Th2 cells. LRT displayed no effect on antigen-induced NHR or eosinophil
infiltration into the nasal mucosa in Th2 cell-transferred mice. Although LRT and DES
inhibit Th2 cytokine expression at high concentrations, they are unlikely to inhibit thedevelopment of NHR clinically via their effects.

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