太陽地球システム・エネルギー学講座
水資源システム学分野

Solar and Terrestrial Systems and Energy Sciences

Urban and Regional Environmental Systems

水資源と水環境に関する研究
Researches on Water Resources and Environments

准教授 佐野 大輔

教授 李 玉友准教授 小森 大輔

Associate Professor

Professor （協力教員）

Associate Professor

Daisuke Sano

水資源システム学分野では、世界の水問題を解決することを目指し、以下の研究に取り組んでいる。

Yu-You Li

Daisuke Komori

れている遊離塩素への繰返し曝露により耐性を得ることを示したも

1）気候変動と土地利用変化が自然環境に与える影響評価手法の開発のである。遊離塩素への繰返し曝露により、遊離塩素耐性は徐々に

2）地球温暖化と林業の衰退など森林の荒廃による流木発生メカニズムの解明増加し、希釈のみを施した対照集団と比較して曝露集団は 10 倍から

3）下水処理場における温室効果ガス発生と最適な浄化機能の解析

100 倍の耐性を示した（Fig.1）。遊離塩素への繰返し実験は独立に二4）嫌気性消化槽にかかる排水処理と微生物群集動態の解明回行ったが、二回ともに遊離塩素耐性集団が得られた。

5）水インフラへの病原ウイルスの遺伝的適応評価

MNV に遊離塩素耐性をもたらした原因を探るため、ウイルス粒子

Our research topics in 2018 were
1) The development of evaluation approaches for the effect of climate change and land utilization change on natural environments
2) Mechanisms of flood wood generation caused by global warming and forest industry declination
3) The optimization of wastewater treatment and greenhouse gas emission4) Bacterial community structure in wastewater treatment and anaerobic digestion reactors5) Water infrastructure and enteric virus evolutionの外殻タンパク質遺伝子の配列を次世代シーケンス技術により解析した。その結果、2 つの非同義置換および 1 つの同義置換が遊離塩素曝露実験で得られた 2 つの集団において共通して観察された（Fig.2）。
2 つの非同義置換のうちの 1 つは 7280 番目の遺伝子変異によるフェニルアラニンからセリンへの変異であり、このアミノ酸変異の存在割合は遊離塩素曝露集団において当初の 1％から 10 回目の曝露後に99％まで増加した。

次に、MNV 集 団 間の 遺 伝 的 距 離を評 価 するために Principal-胃腸炎ウイルスの進化と水インフラ国連の持続可能な開発目標の 6 番目（Sustainable Development

Goal 6: SDG6）として、2030 年までに世界中の人々に安全な飲料水と安全なトイレを普及することが謳われている。この SDG6 を達成するためには、導入・運転コストが低く、維持管理が容易な水インフ

ンフラを用いる人々の水系感染症リスクが本当に守られているのかについても慎重に評価することが求められる。しかしながら、新しい水インフラ導入下における微生物暴露に関する情報は限られているので、水系感染症を引き起こす病原体がどのように新しい水インフラに適応するかを予測することは容易ではない。特に、ある種の RNA ウイルス（世界中で感染症リスクをもたらしているノロウイルスやロタウイルスをとから、特に注意が必要である。

本研究は、ヒトノロウイルスの代 替としてのマウスノロウイルス（murine norovirus: MNV）が、消毒剤として世界中で広く用いらの集団に近い位置でクラスターを形成したのに対し、遊離塩素曝露 5回及び 10 回後の集団は、遊離塩素曝露前集団及び対照集団とは異なる位置でクラスターを形成した。これらの結果から、遊離塩素曝露が MNV 集団に対して選択の効果をもたらしていると言える。

Fig.2 に示したアミノ酸変異が遊離塩素耐性をもたらしているか否かを確認するために、遊離塩素曝露集団及び対照集団から 6 株ずつの MNV を精製し、それらの遊離塩素感受性を評価した。遊離塩素曝露集団から得られた 6 株全てが当該変異を有しており、対照集団に由来する株は有していないことを確認した。遊離塩素感受性試験の結果、遊離塩素曝露集団から得られた株は対照集団から得られた株よりも有意に遊離塩素耐性が高いこと確認された（Fig.4）。

本研究の知見により、進化により胃腸炎ウイルスが示しうる最大の遊離塩素耐性を知ることが可能であることから、水の消毒の立場から考えれば、安全な水を創出するうえで必要最低限の消毒剤投入量を算出することが可能となる。このことは、トリハロメタンなどの消毒副生成物の発生を最小限に抑えた環境にやさしい消毒法の確立につながるものと考えられる。

Fig.1 Log10 reduction of chlorine-treated population (whitebar) and control population (black bar) during the 1st trial (A)and 2nd trial (B) of cycle experiments. *, statistically different
at α < 0.05 (Wilcoxon signed-rank test); **, statisticallydifferent at α < 0.01 (Wilcoxon signed-rank test)

40 Coexistence Activity Report 2018

Fig.2 Changes in nucleotides in the 1st, 5th,and 10th cycles in the chlorine-treated andcontrol populations in the first (upper) andsecond trials (lower).

Fig.3 Principal-coordinate analysis used toillustrate similarities and difference in thesubstitution rate using single-nucleotide
polymorphism composition as distance matricesof two populations in the 1st, 5th, and 10th
cycles of chlorine-treated (TP) and controlpopulations (NP) in the 1st and 2nd trials

In conclusion, we proved that the free-chlorine treatment can work as aselection pressure on MNV’s evolution, and a single mutation in the capsid
protein may change its susceptibility to free chlorine. Based on thisknowledge, it is possible to expect the highest resistance of viral mutants
to the disinfection processes. In the other words, we can identify theminimum disinfectant doses to reduce pathogenic viruses significantly,
leading to the establishment of environmentally friendly water disinfection
practices because the excess usage of disinfectants can be prevented andthe formation of toxic disinfection byproducts, such as trihalomethane, isminimized.

Department of Frontier Sciences for Advanced Environment含む）は、高い変異速度を駆動力とした高い適応能力を有しているこ

The United Nations’ Sustainable Development Goal 6 (SDG6) is to supply
all people on the globe with improved drinking water and sanitation
systems by 2030. The development of sustainable water infrastructuresthat are easily installable and maneuverable is essential to achieve theSDG6, but at the same time, it must be carefully determined whether thenewly installed water infrastructure’s users are really protected frommicrobial risks. However, it is not a simple task to determine how to adapt
water pathogens to the human community using a brand-new water
infrastructure because there must be no accumulated datasets about water
pathogens’ genetic responses to the water infrastructure in the early years
of its installation. The precise understanding of water-related pathogens’
adaptation mechanisms is very important to protect the health of the newly
developed water infrastructures’ users. Particularly, some types of RNA
viruses require special attention because they have a relatively higher
adaptation capability among water-related pathogens due to their higher
mutation rate.

1 回（対照集団では希釈―培養サイクル 1 回目）後は遊離塩素曝露前

先端環境創成学専攻

ラを新たに創出することが必要不可欠であるが、同時に、新しい水イ

Water Infrastructure andEnteric Virus Evolution

Coordinate Analysis を行った（Fig.3）。その結果、遊離塩素曝露

In this study, we proved that a population of murine norovirus (MNV), a
surrogate of human noroviruses, can be resistant to free chlorine after
repeated exposure to a disinfectant. Free chlorine is the most widely useddisinfectant around the world. Populations’ susceptibility to free chlorine
gradually decreased compared to the control populations after repeatedexposure (Fig.1). A next-generation sequencing (NGS) technique was used
to investigate the genomic basis for MNV’s lower chlorine susceptibility.
PCR products of capsid genes were obtained from the MNV populations(chlorine-treated and control populations from the first and second trials)
in the first, fifth, and tenth cycles and analyzed by NGS. Both trials
resulted in two nonsynonymous and one synonymous mutations. One of
the two shared nonsynonymous mutations was located at nt7280, in which
phenylalanine was substituted for serine, and appeared only in thechlorine-treated populations from both trials. The relative quantity of thismutation gradually increased from 1%, 90%, and 99% through cycles 1, 5,and 10, respectively (Fig.2). The principal-coordinate analysis wasemployed to examine the differences in the substitution rates among the
populations using single nucleotide polymorphisms as distance matrices
from the original population (before free-chlorine exposure) and thechlorine-treated and control populations in the first, fifth, and tenth cycles(Fig.3). After the first exposure, the chlorine-treated (TP) and control
populations (NP) were clustered together close to the original populations.
Meanwhile, the chlorine-treated populations in the fifth (TP5) and tenthcycles (TP10) were clustered separately from the original (ORI) andcontrol populations (NP). These results indicate the presence of a selection
pressure on MNV populations after free-chlorine exposure. To determine
whether the mutations found in the capsid region are associated with thelower susceptibility to free chlorine, a chlorine sensitivity test was carriedout. Six plaque-purified clones were acquired from each population in thetenth trial. All clones from the chlorine-treated population had thenonsynonymous mutation at nt7280. The plaque-purified clones’ freechlorine sensitivity was evaluated to determine whether the nonsynonymousmutation (T7280C[VP2:F200S]) would affect MNV’s susceptibility tofree chlorine. As a result, the plaque-purified clones from the chlorinetreated population had significantly lower susceptibility to free chlorine
than those from control populations (Fig.4).

Fig.4 Log10 reduction ratio of clones from the control
population to those from the chlorine-treated population
Coexistence Activity Report 201841