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ゼブラフィッシュにおける外来遺伝子の安定的発現を実現する基盤技術の開発
坂 季美子（国立遺伝学研究所技術課）

SAKA Kimiko : Development of a method to generate transgenic zebrafish stably expressing a foreign geneIn order to generate transgenic zebrafish stably expressing a foreign gene, we established a method to integrate the foreign gene into thepotential safe harbor locus by combining the CRISPR/Cas9 knock-in system and phiC31 integrase-mediated transgenesis.

抜し、成魚になるまで育て、掛け合わせによって得ら

1. 目的
外来遺伝子を安定的に発現するトランスジェニックれた次世代(F1)の中から、GFP の発現を指標に、attP ノ生物を作出するためには、ゲノム上においてサイレンックインフィッシュをスクリーニングした。その結果、シングの影響を受けにくいセーフハーバー領域に外来全身で GFP を高発現する F1 稚魚が得られた (図 2)。

遺伝子を導入する必要がある。そこで、ゼブラフィッ

この F1 稚魚からゲノム DNA を抽出し、PCR とシーケシュを用いて、セーフハーバー領域と推定される領域ンス解析を実施したところ、ドナーベクターのセーフに、外来遺伝子を効率的に導入する手法の開発を目指

ハーバー推定領域への導入が認められ、セーフハーバした。

ー推定領域に attP 配列を組み込んだノックインフィッシュの作出に成功したことが示された(図 3)。

2. 方法と結果
CRISPR/Cas9 法による遺伝子ノックインと部位特異的組換え酵素 phiC31 インテグラーゼによる遺伝子導入法を組み合わせて、セーフハーバー推定領域への目的遺伝子の導入を試みた。phiC31 インテグラーゼは認
識配列 attP と attB 間の組換えを触媒する。これにより、attP 配列をゲノムに導入した場合、attB 配列と目的遺伝子をもつドナーベクターは、attP 配列に組み込

図 1. attP ノックインフィッシュの作出に使用したドナーベクターと gRNAまれることになる。また、この遺伝子導入法は組み込み効率が高いことが知られている。なお、配属先研究室が過去に作出したトランスジェニックフィッシュの情報から、ある特定の領域をセーフハーバー領域と推1 mm定した。以下に実際に行った方法と結果を記す。
(1)CRISPR/Cas9 法による phiC31 インテグラーゼ認識

図 2. 五日齢の attP ノックインフィッシュ(F1)

配列 attP をセーフハーバー推定領域に組み込んだノックインフィッシュの作出
まず、セーフハーバー推定領域を標的とする gRNA1と、attP 配列、EF1αプロモーターにつなげた GFP 遺伝子、gRNA1 標的部位上流及び下流 100 bp の相同配列を含むドナーベクター、ドナーベクターを切り出す

図 3. セーフハーバー推定領域に導入されたための gRNA2 を作製した(図 1)。次に、これらの gRNAドナーベクターの構造とドナーベクターを Cas9 mRNA とともに受精卵に顕微注入した。その後、全身で GFP を発現する稚魚を選24

生理学・生物学技研報2023

(2)phiC31 インテグラーゼによる目的遺伝子のセーフ(3)組織特異的に機能を阻害することが可能なトラン

ハーバー推定領域への導入

スジェニックフィッシュの作出

可視化可能な赤色蛍光タンパク質遺伝子 mScarlet を

上述の手法を応用し、attP ノックインフィッシュを目的遺伝子とし、Gal4 認識配列 UAS の下流に mScarlet用いて、UAS の下流に NTR（nitroreductase）遺伝子と遺伝子を配置した attB ドナーベクターを作製した。こmScarlet 遺伝子をもつトランスジェニックフィッシュの attB ドナーベクターが attP 配列に組み込まれると、を作出した。
NTR は還元酵素であり、Mtz（metronidazole）

Gal4 依存的に mScarlet を発現することとなる(図 4)。

を活性化させ、活性化した Mtz は細胞死を誘導する。

次に、attP ノックインフィッシュと、配属先研究室

UAS の下流に NTR 遺伝子と mScarlet 遺伝子をもつトで作出された筋肉特異的に Gal4 を発現する系統

ランスジェニックフィッシュと、配属先研究室で作出(gSAIzGFFD3067B)を掛け合わせて得られた受精卵に、さ れ た 心 臓 特 異 的 に Gal4 を 発 現 す る 系 統

attB ドナーベクターを phiC31 インテグラーゼ mRNA(gSAIzGFFM476A) を 掛 け 合 わ せ 、 心 臓 特 異 的 にとともに顕微注入した。筋肉特異的に mScarlet を発現

mScarlet を発現する稚魚を選抜した。この稚魚に受精する個体を選抜し、成魚になるまで育て、掛け合わせ、

後 2 日目から Mtz を投与し、24 時間後に観察したとこ

次世代(F1)の中から筋肉特異的に mScarlet を発現するろ、心臓の浮腫や血液の滞留が認められ、心臓特異的個体をスクリーニングした。にその機能が阻害されていることが示された(図 6)。

その結果、筋肉特異的に mScarlet を強く発現する F1稚魚が得られた(図 5)。ゲノム DNA を抽出し、PCR とシーケンス解析を行ったところ、attB ドナーベクターが attP 配列に組み込まれたことが認められ、目的遺伝
子 mScarlet のセーフハーバー推定領域への導入が明らかとなった。これまでに、F2 世代においても筋肉特異的な mScarlet 遺伝子の高発現を確認している。
図 6. Mtz を 24 時間投与した心臓特異的に NTR を発現する三日齢のトランスジェニックフィッシュ（右）※矢尻は心臓を示す

3. 考察
CRISPR/Cas9 法により、attP 配列をセーフハーバー推定領域に組み込んだノックインフィッシュを樹立し、
phiC31 インテグラーゼを用いて効率的に目的遺伝子を図 4. phiC31 インテグラーゼによるセーフハーバー推定領域に導入することが可能となっattB ドナーベクターの attP 配列への導入た。また、本研究により開発した手法は、有用なトランスジェニックフィッシュ作出に応用できる。
セーフハーバー推定領域に mScarlet 遺伝子を導入したトランスジェニックフィッシュについては、今後継1 mm代を続け、mScarlet 遺伝子の高発現が維持されるか否

図 5. 目的遺伝子 mScarlet がセーフハーバー推定領域に組み込まれた五日齢のトランスジェニックフィッシュ(F1)かを検証する。
謝辞
ご指導いただいた国立遺伝学研究所・発生遺伝学研究室の川上浩一教授をはじめ、研究室の皆さまに心より御礼を申し上げます。
本研究は令和 4 年度科学研究費補助金（奨励研究:課題番号 22H04263）の助成を受けて実施いたしました。

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