宮野構造生物物理研究室
Structural Biophysics Laboratory
主任研究員

宮野

雅司

MIYANO, Masashi
脂質は、生体の高密度エネルギー源で主要な細胞膜構成成分で、様々な化学修飾を受け多彩な生理活性信号伝達物質としても働く。多様な構造を持つ脂質は多くの疾患・病態と連関しているので、脂質関連タンパク質研究は医学薬学分野の応用への基盤情報となる。例えば、ロイコトリエンC4 (LTC4) はアラキドン酸を出発物質として生合成されるエイコサノイドの一つで、強力な平滑筋収縮物質として知られ、喘息増悪時にLTC4産出が増大するので、LTC4合成酵素の特異的阻害剤は抗喘
息抗アレルギー薬候補となる。そこで、未解明の本酵素の立体構造は、特異的薬剤設計の貴重な情報となる。我々は、基礎生物学としての脂質生物学の発展と医学薬学の基盤、創薬展開を視野に入れ、脂質関連タンパク質の構造・機能研究を中心に行っている。また、応用展開支援として化学生物学研究と、タンパク質結晶構造解析基盤技術向上のために、結晶イメー
ジの自動判別法開発と、新規分子置換アルゴリズムと高精密化アルゴリズムの検証を共同で進めている。

1．脂質関連タンパク質の構造・機能解析（１）病原性セリウス菌由来スフィンゴミエリン水解酵素の構造機能解析（吾郷、津下*2、宮野）
病原性セリウス菌（Bacillus cereus）由来スフィンゴミエ
リン水解酵素（BcSMase）（EC:3.1.4.12）は、中性スフィン
ゴミエリナーゼに属し、スフィンゴミエリンをセラミドとコリンリン酸に加水分解するスフィンゴミエリナーゼ C
活性と溶血活性示す。これらの活性はいずれも金属イオン依存的に発現する。BcSMase が分解するスフィンゴミエリ
ンは、生体膜を構成する複合脂質の主要構成リン脂質の一つであり、その分解産物であるセラミドは、二次情報伝達物質として細胞外からの情報伝達にかかわる。またセラミドは外傷性の神経細胞アポトーシスにも関わり、この観点から、脳に分布しスフィンゴミエリナーゼ活性 C を示す
中性 SMase（nSMase）が注目されている。BcSMase は、
アミノ酸配列が nSMase と有為な相同性を示すだけでなく、特定の種類の金属イオン依存的に活性を発揮する点でもnSMase と類似しているため、スフィンゴミエリンの認識機構や金属イオンの役割なども共通であると考えられる。
本研究では、BcSMase のスフィンゴミエリナーゼ C 活性の分子機構を明らかにするため、BcSMase のスフィンゴミ
エリナーゼ C 活性を著しく活性化する金属イオン二種類と、弱く活性化する金属イオン一種類に付いてそれぞれ
BcSMase との複合体の結晶構造を解析した。その結果、高い活性を示す為には、水分子１個を共通の配位子として間に挟む２個の金属イオンがそれぞれスフィンゴミエリン
結合部位にあるヒスチジンとグルタミン酸に結合する事が必要である事が明らかになった。また、溶血活性に関わる特異構造を明らかにし、この構造機能が酵素活性と構造・機能的に連関していることを明らかにした。
（２）ロイコトリエンB４ 12-水酸基酸化酵素／15-ケトプ
ロスタグランジン還元酵素の結晶学的研究（堀、石嶋*3、吾郷、清水（孝）*１、宮野）脂質メディエーターは、生体恒常性維持や炎症細胞の活性を制御するホルモン脂質である。本酵素は、脂質メディ
エーターのうち安定なロイコトリエンB4（LTB4）の 12 位の水酸基を酸化してLTB4を不活性化し、また 15-ケトプロ

スタグランジンE2 (15-keto-PGE2)や 15-ケトリポキシンA4(15-keto-LXA4)の 13 位の二重結合を還元してPGE2やLXA4を完全に不活性化する。本酵素は生体内脂質メディエータ
ー濃度を調節する必須酵素であるが、いくつかの非ステロ
イド抗炎症薬で活性阻害を受ける。非ステロイド抗炎症薬の一つであるインドメタシンの作用機構を複合体結晶構
造解析により明らかにし、結合の熱力学を明らかにした。
（３）長鎖脂肪酸アシル化 CoA 合成酵素の結晶構造解析（吾郷、宮野）長鎖脂肪酸アシル化 CoA 合成酵素(LC-FACS あるいはACSL)は、長鎖脂肪酸に補酵素 A を結合し長鎖脂肪酸アシ
ル化 CoA を合成することで、脂肪酸の細胞への取り込みなどの脂肪酸代謝過程で重要な役割を果たす。その重要性にもかかわらず LC-FACS の立体構造研究は未開拓の領域
で、我々は先に高度好熱菌由来 LC-FACS の立体構造を明らかし、30 年以上前に酵素速度論解析から予想されながら実験的に確証できなかった 3 基質 3 生成物の 2 段階反応の反応中間体を初めて実態としてとらえるとともに
Bi-Uni-Uni-Bi 反応進行に従い、ホモ２量体にある脂質結合の穴に結合した長鎖脂肪酸が空間的に一方向にアシル化
CoA 生成物として運ばれることを原子レベルで明らかにした。高等動物では脂質選択性が異なる LC-FACS のアイ
ソザイムを組織依存的に発現させる事で、組織に必要な脂肪酸の選択的取り込みを可能にしている。この組織依存的な脂肪酸取り込みの分子機構を明らかにする事は、脂質代謝が関わる肥満や高脂血症などの生活習慣病の分子レベ
ルでの理解に寄与する。本研究では高等動物 LC-FACS の
基質選択性を決定する構造を明らかにする事を目指し、哺乳動物由来の LC-FACS の立体構造を決定する。現在、LC-FACS の発現精製系の検討を行っている。
（４）ヒト由来ロイコトリエンC４合成酵素の構造研究（吾郷、入倉*3、金岡*2、島村*3、宮野）
膜貫通型タンパク質であるロイコトリエンC４合成酵素(LTC4S)は、ロイコトリエンＡ４(LTA4)に還元型グルタチオンを付加しロイコトリエンC４(LTC4)を生合成する酵素である。LTC4とその代謝物であるLTD4、LTE4は、総称して播磨研究所 放射光科学総合研究センター
平成 17 年度 研究年報

システイニルロイコトリエン(Cys-LT)と呼ばれ、特異的受容体に結合する事で気道平滑筋の収縮や毛細血管からの血漿漏出など喘息特有の症状を誘発する。また最近の遺伝
子欠損動物による実験から様々な免疫反応の制御に関わることが明らかになってきている。これらの点からLTC4S
はCys-LTによる生体反応において鍵となる酵素である。本
研究では、LTC4Sの構造をX線結晶構造解析によって明らかにし、さらに基質認識や触媒反応の構造的基礎を明らかにする。現在までに、LTC4Sを転換体Schizosaccharomyces
pombe で発現させdodecylmaltosideを用いて精製し結晶化した。また、転換体S. pombeをセレノメチオニン存在下で培養し、構造決定に必要なセレノメチオニン置換LTC４ Sを発現・精製した。
（５）ロイコトリエンB4レセプターと血小板活性化因子
受容体の構造研究（佐藤（高等動物タンパク質構造解析
研究チーム）、堀、石井*2、清水（孝）*１、宮野）ヒトゲノム中には 800 を超える G タンパク質共役型受容体(GPCR)がコードされているが、これらの多くが創薬
ターゲットとなる可能性を持つ。脂質メディエーター受
容体のほとんどは GPCR に分類され、最も構造解析が困
難な膜蛋白として知られている。構造解析を困難にしている理由としては、まず安定した大量発現が困難である
ことが挙げられる。本研究では、昆虫細胞にヒト脂質メディエーター受容体を発現させ生理活性の解析を行うと同時に、構造解析を目的とした受容体の大量発現・精製系の確立にむけて基礎的な検討を行っている。
ショウジョウバエ卵母細胞由来細胞株は小型で細胞の体積に比べ膜面積比が他の細胞よりも大きく、高密度培養が可能なことから、膜タンパクの高発現には適しているので、Drosophila melanogaster 2（D.mel-2）を用いた脂質メディエーター受容体の安定発現株の構築を試みた。
そして、D.mel-2 によりロイコトリエンB4 レセプター（BLT1）、血小板活性化因子受容体（PAFR）について、遺伝子の動物種によらず比較的安定した発現し、その安定発現株を樹立をし、さらに高安定発現株を選抜・増殖
した。
BLT1 高発現安定発現株を使っての大量培養では 107
cells/mlの密度となり、3 リットル培養で 1011個の細胞生産となった。
BLT1、PAFR それぞれの産生株の膜粗抽出画分を調製し、さらに可溶化して His-タグ精製を行った。質量分析
計で目的受容体であることを確認した。BLT1 産生株の膜画分を用いてリガンド結合活性を確認し、各種アンタゴ
ニストを用いた薬理学的活性も確認した。
一方、発現精製が容易な大腸菌および分裂酵母を用いた両受容体の発現系構築を行った。大腸菌においては、結晶化を行えるだけの発現量を達成することはでき、さらに発現誘導条件の最適化により、温和な界面活性剤で可溶化できた。しかしながら、発現受容体のリガンド結合活性はな
かった。
（６）プロスタグランジンE2 (PGE2)認識マウスモノクロ
ナールIgG1 の構造解析（菅原、石嶋*3、倉橋*2、勝川*5、
山本*2、宮野）PGE2は、炎症作用と抗炎症作用を併せ持ち，血管拡張、
血圧降下、胃液分泌抑制など様々な生理作用を引き起こす。

用いたマウスIgG1 は非常に高い抗原認識能力をもち、結合して不活性化するため、その動態研究のツールとして、実際に検査試薬として使われている。そこでPGE2やその基質アナログとの高PGE2 特異抗体およびそのFabの複合体を解析することで、その脂質メディエーター分子の認識機構を解明する。今年度は、抗体およびFab化抗体の高純
度精製に成功し、結晶化を検討中である。
２．化学生物学を目指した構造・機能解析（１）β-ラクタマーゼ、Toho-1 の超高分解能X線結晶構造解析（内山*4、島村*3、宮野）
β-ラクタマーゼToho-1 は、基質特異性拡張型β-ラクタマーゼであり、近年の薬剤耐性菌に対して開発された第三世
代セフェム系抗生物質に対しても高い加水分解活性を持つ。既にToho-1 の立体構造は、酵素-基質複合体のものが高分解能で解明されている。さらに、基質拡張型β-ラクタ
マーゼの触媒機構の詳細を明らかにして、酵素-基質複合体における基質とβ-ラクタマーゼとの詳細な非共有結合
分子間相互作用を水の構造を含めて実験的に明らかにすることで、新規抗生物質開発の構造情報基盤を提供する。
このため、Toho-1 の超高分解能X線結晶構造解析を進めた。
分子間接触に関与する残基を置換した人工型酵素を使った結晶化により、結晶内での分子配向性が良くなり、この変異体Toho-1 アポ結晶で、大きさ 0.5x0.5x0.4 mmの結晶で0.98 Åまで回折斑点が認められた。空間群、格子定数とも
野生型と同じであった。既報の天然型構造を用いた分子置換法で位相決定をし、結晶学的精密化とモデル再構築をすすめた。1.00 Åまでの分解能でR = 13.4 %、Rfree = 16.2 %の立体構造モデルを得た。酵素-基質複合体結晶でも 1.00 Åに近い(1.10〜1.20 Å)高分解能での回折データが得られ、現在構造精密化中である。更なる高分解能データを得るため、結晶化条件の最適化を進めている。
（２）ホーミングエンドヌクレアーゼI-Tsp061Iの結晶構造に基づくDNA認識機構の解析（中山*4、島村*3、津下*2、
宮野）
ホーミングエンドヌクレアーゼ(HEase)はイントロン中にコードされたイントロンやインテインの水平伝播の鍵酵素である。HEase は長い DNA 配列（14-40bp）を認識して切断する特異性が極めて高い部位特異的 DNA エンドヌ
クレアーゼとして機能する。この長い DNA 配列認識はまた、極めてまれな位置で切断する rare-cutting enzyme として機能するので、ゲノム研究において HEase は部位特異的な遺伝子組み換えや長い DNA 断片のクローニング（メガベース・クローニング）等に応用の可能性がある。現在のところ、切断出来る対象部位が限定されており、広く応用出来るまでには至っていない。そこでこの汎用性の低さを克服するため、既存の認識配列を改変した HEase のデザインを目標としている。HEase の効率的な認識配列改変を行う第一歩として、超好熱古細菌 Thermoproteus sp. IC-061
株の 16S rDNA イントロン内部の ORF にコードされていた I-Tsp061I の X 線結晶構造に基づき DNA 複合体モデルを作成し、相互作用を検討した。DNA と塩基特異的な相互作用をするアミノ酸残基候補を複数選択し、位置特異変異導入した I-Tsp061I の変異体について、基質特異性変化を検定した結果、活性が野生型より高い変異型酵素が複数

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平成 17 年度 研究年報

得られた。
（３）ヒトM1 ファミリー亜鉛アミノペプチダーゼの結晶、構造解析（菅原、石嶋*3、服部（辻本細胞生化学研究室）
辻本（辻本細胞生化学研究室）、宮野）
哺乳動物において重要な生理機能を担っている糖タン
パク質である M1 亜鉛アミノペプチダーゼのうちヒト由
来の脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼ（A-LAP）
およびアミノペプチダーゼ A（APA）について、天然糖鎖修飾型および糖鎖のない変異体を昆虫細胞により大量発現・精製し、結晶化の検討を行っている。
（４）カンピロバクター由来シアル酸転移酵素の大量調製とX線結晶解析（菅原、石嶋*3、梶原*2、宮野）
シアル酸は細胞膜表面のオリゴ糖の末端に存在して、リ
ガンド-受容体および細胞-細胞間相互作用に重要な生物学的機能を担っている。シアル酸転移酵素は糖タンパク質のムチン型糖鎖やアスパラギン結合型糖鎖およびスフィ
ンゴ糖脂質の非還元末端糖残基（ガラクトース，N-アセチ
ルガラクトサミン，N-アセチルグルコサミン，シアル酸）に CMP-シアル酸を糖供与体として転移する酵素群である。
基質とする糖鎖や形成される結合様式の違いにより異なる酵素が関与する。これらの酵素とその変異体を作成し、結晶化および酵素学的な反応メカニズムの検討をおこなっている。
（５）ヒト由来カルシニューリンホモロガスプロテイン(CHP)の精製および結晶化（菅原、石嶋*3、若林*2、宮野）CHPは、細胞に普遍的に含まれ細胞内部のpHを調節す
る膜タンパク質であるNa+-H+ exchanger (NHE1)に結合し、何らかの制御因子として働くことが示唆されている。
NHE1 のCHP結合配列部分のペプチド断片とCHPを大腸菌で共発現させて得られた複合体試料の高純度精製に成功
し、添加剤としてイットリウムなどを含む条件から 3 Å分
解能を越えるX線回折能のある結晶が得られ、構造解析を行っている。
（６）膜タンパク質の構造解析（島村*3、岩田*2、宮野）タンパク質全体の約30%を占めている膜タンパク質は、細胞の中と外の間の情報、エネルギー、物質の輸送や伝達等で重要な働きを担っている。さらに、創薬ターゲットの約50%が膜タンパク質である。このようなことから、膜タンパク質の立体構造を明らかにすることは、意義がある。
しかし膜タンパク質は大量に精製することが難しいため、構造はほとんど分かっていない。
そこで我々は、好熱菌由来の数種の膜タンパク質について立体構造の解析を目指し、まず、発現及び精製系の構築を行った。対象とした膜タンパク質は、細菌だけでなく、真核生物由来のものも含んでいる。発現は、主に大腸菌を用いた。また、精製を容易にするために、His-tagを導入した。新たに、1種の膜タンパク質について、結晶化の検討を行うに十分な純度と量で精製する系を確立することに成功した。
３．タンパク質構造解析技術の高度化を目指した研究（１）タンパク質結晶化の効率化（菅原、国島（多量体タンパク質構造解析研究チーム）、川端（分散適応ロボティ
クス研究ユニット）、宮野）タンパク質の X 線結晶構造解析で、最大のボトルネックである。そこで結晶化のための全自動結晶化観察ロボット（TERA）の開発により、多数の試料の標準条件での結晶化に成功した。ロボットによる実際の稼働によるこれまでの経験と蓄積された膨大な数の結晶化イメージを使って、結晶化写真の自動判別ソフトウェア開発をロボティク
ス研究グループと共同でおこなっている。結晶化ドロップの形状と画像の撮影条件の均一化により、90%を越える判別が可能となった。
（２）構造解析の高度化（石嶋*3、吾郷、西堀*2、坂田*1、
戎崎（情報基盤研究部）、宮野）
超精密構造解析 − タンパク質の超高分解能精密解析は、タンパク質の構造や機能の源泉となって生体機能発現の中心的役割を果たしている水の構造を含む水素結合など
非共有結合相互作用を検討する上で必須である。しかし、有機小分子、材料結晶などと違い、実在のタンパク質結晶の不完全性、タンパク質結晶の損傷、さらに回折データ収集システムの限界など多くの実験的制約の中で、水を含む
非共有結合相互作用を再検討する基礎データとなりうる
超高分解能解析が出来るタンパク質結晶の数は少ない。またさらに、現在の結晶解析計算がフーリエ解析に基づいていることによる原理的限界が存在する。これまでに C60、
シリコン結晶などの超高分解能解析に実績があり、フーリ
エ解析の原理的限界を超えうる電子密度改良法であるマキシマムエントロピー法 (MEM) を準原子分解能のタン
パク質結晶の回折強度データに対して適応し、タンパク質
結晶解析の精密解析における MEM 法の有用性と限界を検討した。
分子置換法 − 分子置換法はタンパク質の X 線結晶構造解析の主要な構造決定法であるが、構造の相同性が十分高いタンパク質の立体構造モデルがあらかじめ必要であると言う制約がある。このためアミノ酸配列の相同性と立体構造の相同性の間の相関が低いタンパク質の構造を決定する場合には、解析出来ない。この限界の緩和・解決を目指して、遺伝的アルゴリズムを取り入れた分子置換法 GA−MR 法の開発に参画した。
*1

客員主幹研究員、*2客員研究員、*3協力研究員、*4ジュニ
ア・リサーチ・アソシエイト、*5研修生
We have been focusing on the structural-based functional
analyses for enzymes and receptors related to lipids. These
proteins are biologically important and the major targets for thetherapeutics for inflammation and immuno-modulation. We
also develop new technologies for SR protein crystallography
in collaboration.
1. Structural based functional study of lipid-related proteins(1) Crystallographic analysis of neutral-sphingomyelinase from
Bacillus cereus (BcSMase)
BcSMase exerts phosphodiesterase C activity on sphingomyelin(SM) as well as hemolysis activity. BcSMase requires divalentcations for these activities. The crystal structures of BcSMasewith various divalent cations reveal that the essential
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平成 17 年度 研究年報architecture for the efficient hydrolysis of SM is thewater-bridged two divalent cations of which one cation binds toglutamic acid and the other one binds to histidine in thesubstrate binding site. Because of the similarities on the aminoacid sequence and the divalent cation dependency, thearchitecture would be common to human neutral
sphingomyelinase involved in the traumatic neural apoptosis.
(2)
Crystallographic
studyof
leukotriene
B412-hydroxydehydrogenase/15-oxo-prostaglandin 13-reductase(LTB4 12-HD/PGR)
The bi-functional LTB4 12-HD/PGR is an essential enzyme foreicosanoid inactivation. Anti-configuration indomethacin was
found to bind to one of the two active sites of LTB4
12-HD/PGR homo-dimer.
(3) Crystal structure analysis of mammalian long chain fattyacyl-CoA synthetase (LC-FACS)
LC-FACS catalyses the formation of long chain fatty acyl-CoA
from long chain fatty acid and CoA in the ATP dependent
manner. Mammal cell/tissue-specific LC-FACS isozymes withdifferent substrate specificities selectively absorb specific fatty
acids to cells. We started to establish the over-expression andpurification system for mammalian LC-FACSs.
(4) Crystal structure analysis of leukotriene C4 synthase(LTC4S)
LTC4S is the membrane integrated enzyme responsible forbiosynthesis of cysteinyl leukotrienes and a potent target for thedevelopment of therapeutic agents for allergic diseases
includingasthma.
LTC4S
wasover-expressedin
Schizosaccharomyces pombe, purified and crystallized.
Selenomethionyl LTC4S was also over-expressed in thepresence of selenomethionine.
(5) Establishment of high yielding Drosophila-derived
Schneider 2 cell line (S2 cell) for large-scale G-protein coupled
receptor production.
We established the S2 cells for large-scale expression of human
BLT1 in active form and characterized the pharmacological
profile of the membrane fraction as the first step toward thestructural analysis. The advantages of the systems forexpression of active GPCRs are the applications of high-density
suspension culture with serum-free medium and the availabilityof inducible Drosophila metallothionein promoter to avoid thepotent toxicity of recombinant GPCR on stable cell lines. The
expression systems of BLT1 and PAFR in E. coli and
Schizosaccharomyces pombe have been also developed. The
expressed receptors by E. coli and S. pombe were not active
forms.
(6) Crystallographic analysis of anti-prostaglandin E2 (PGE2)
mouse monoclonal IgG1
PGE2 has both inflammation and anti-inflammation actions,and exerts various physiological functions. We have purified
the Fab fraction of a highly specific anti-PGE2 mousemonoclonal IgG from hybridoma cell and tried to crystallize.
2. Structural and functional analysis of other proteins.
(1) Ultra-high resolution crystal structure of β-Lactamase,Toho-1β-Lactamases hydrolytically inactivate β-lactam antibiotics andthus the expression of β-lactamases is a prevalent resistancemechanism of pathogenic bacteria to β-lactam antibiotics.
Toho-1 is an extended-spectrum β-lactamase. Refinements ofatomic models of Toho-1 at 1.00 Å are currently in progress.
(2) Characterization of DNA recognition mechanisms bystructural and mutational studies using homing endonuclease(HEase) I-Tsp061I
HEase is a site-specific DNA endonuclease, which recognizes
and cleaves a relatively long sequence (14-40bp). To create anovel I-Tsp061I with optional recognition sequences, wepredicted the residues that could interact with the substrate
DNA and introduced mutations based on the modeled
I-Tsp061I/DNA complex. Some of these mutants showed thehigher cleavage activities against the substrate than the wild
type enzyme.
(3) Structural analysis of the two types of human M1 zincamino peptidases
We try to purify and crystallize adipocyte-derived leucinaminopeptidase (A-LAP) and aminopeptidase A (APA)
including their natives and mutants without modified-sugar
chains expressed by insect cells, Sf9.
(4) Crystallographic analysis of sialyltransferase fromcampylobacter.
Sialic acid on the end of oligosaccharide of the cell membranesurface takes an important biological function on aligand-acceptor and cell-cell interactions. Sialyltransferases
transaminate CMP-sialic acid as a sugar donor to a mucin-typesugar chain of glyco-protein, an asparagine bound carbohydrate
chain and a non-reduction end sugar residue ofsphingoglycolipid(galactose,N-acetylgalactosamine,
N-acetylglucosamine and sialic acid). We have been trying topurify the recombinant native and inactive mutant proteins
expressed in E. coli.
(5) Purification and crystallization of human calcineurin
homologous protein (CHP)
CHP binds to Na+-H+-exchanger (NHE1) and regulates
intracellular pH. We have obtained crystals of CHP complex
with NHE1 fragment, which diffracted beyond 3 Å resolution.
(6) Crystallographic studies of membrane proteins
In order to determine the structures of membrane proteins, wefirst tried to construct expression and purification systems forseveral membrane proteins including mammalian proteinsusing mainly bacterial cells. We succeeded in establishing theexpression and purification systems for a membrane proteinwith amount and purity enough for the crystallization trials.
3. Development of novel methodology in protein
crystallography.
(1) Protein crystal evaluation
Development of an automatic crystallization observation robot(TERA) contributed to structure determination of a lot ofproteins. We have been developing of automatic crystal
evaluation system for an enormous number of crystallization
images in cooperation with a robotics research group of RIKEN.
By uniformity of crystallization plate and photographic
condition, the correct rate in the evaluation of crystals reachedmore than 90%.

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平成 17 年度 研究年報

(2) Novel procedures for structure determination andrefinement
High accurate refinement of protein crystals – It is rare to get acrystal diffracting beyond 1 Å resolution, although it is very
important the crystallographic refinement without chemical
restrain to elucidate non-bonding interactions of protein
structure including ligands as well as water molecules in detail.
The electron density modification based on the maximum
entropy method (MEM), which was proved in material science,is a potential method to overcome the resolution problem andlimitation by Fourier method in protein crystallography. We aredeveloping the protocol to apply the method on the protein
crystallographic structural refinement.
Molecular replacement method – The structural similarity
between the target and the reference proteins is crucial to themolecular replacement method, because of the fewer searchingparameters of the current MR programs in reciprocal space. We
start the development of a new molecular replacement system
based on the genetic algorism to extend the searchingparameters in real space.

Staff
Head
Dr. Masashi MIYANOMembers
Dr. Hideo AGO
Dr. Mitsuaki SUGAHARA
Dr. Tetsuya HORI
Dr. Tatsuro SHIMAMURA*1
Dr. Jun ISHIJIMA*1
Mr. Daisuke IRIKURA*1*1 Contract Researcher

in collaboration with
Dr. Masafumi TSUJIMOTO (Cellular Biochemistry Lab.)
Dr. Akira HATTORI (Cellular Biochemistry Lab.)
Dr. Yo SATOW (Advanced Protein Crystallography ResearchGroup Mammalian Protein Crystallography Team)
Dr. Naoki KUNISHIMA (Oligomeric protein crystallography
team)
Dr. Kuniaki KAWABATA (Distributed adaptive robotics
research unit)

Visiting Members
Dr. Kosuke ARITAKE (Osaka Biosci. Inst.)
Dr. Shuichiro GODA (Fac. Eng., Univ. Tokushima)Dr. Hiroshi HASHIMOTO (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama
City Univ.)
Dr. Koh IDA (Sch. Sci., Kitazato Univ.)
Dr. Katsuaki INOUE (JASRI)
Prof. Tsuyoshi INOUE (Grad. Sch. Eng., Osaka Univ.)
Dr. Satoshi ISHII (Grad. Sch. Med., Univ. Tokyo)
Prof. So IWATA (Imperial Col., UK)
Prof. Yasuhiro KAJIWARA (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama
City Univ.)
Dr. Yoshihide KANAOKA (Harvard med. Sch., USA)
Dr. Yuko KURAHASHI (Fac. Human Life Sci., Doshisha

Women’s College of Liberal Arts)
Prof. Masayoshi MAEJIMA (Grad. Sch. Bioagric. Sci., Nagoya
Univ.)
Dr. Michitaka MASUDA (Nat. Cardiovascular Center)
Dr. Naoki MOCHIZUKI (Nat. Cardiovascular Center)
Dr. Nanae NAGATA (Osaka Biosci. Inst.)
Mr. Hitoshi NAKAYAMA (Grad. Sch. Agric., Kyoto Univ.)
Dr. Eiji NISHIBORI (Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)
Prof. Toshihisa Ohshima (Fac. Eng., Univ. Tokushima)
Prof. Makoto SAKATA (Grad. Sch. Eng., Nagoya Univ.)
Dr. Haruhiko Sakuraba (Fac. Eng., Univ. Tokushima)
Prof. Mamoru SATO (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Prof. Takao SHIMIZU (Grad. Sch. Med., Univ. Tokyo)
Dr. Toshiyuki SHIMIZU (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Prof. Hideaki TSUGE (Inst. Health Sci., Tokushima Bunri
Univ.)
Mr. Takuro UCHIYAMA (Grad. Sch. Biosci. Biotech., Tokyo
Inst. Tech.)
Dr. Yoshihiro URADE (Osaka Biosci. Inst.)
Ms. Hiroko UTSUNOMIYA (Inst. Health Sci., Tokushima
Bunri Univ.)
Dr. Shigeo WAKABAYASHI (Nat. Cardiovascular Center)
Prof. Shozo YAMAMOTO (Grad. Sch. Home Econ., Kyoto
Women’s Univ.)

Trainees
Ms. Mayuko AKABOSHI (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Mr. Kyouhei ARITA (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Mr. Kodai HARA (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City Univ.)
Ms. Asami HISHIKI (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Ms. Kumiko IGARI (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Mr. Tsuyoshi IMAZAKI (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Ms. Saki IRIE (Grad. Sch. Home Econ., Kyoto Women’s
Univ.)Mr. Makoto IWAMOTO (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Ms. Michiko KATSUKAWA (Grad. Sch. Home Econ., Kyoto
Women’s Univ.)
Mr. Shigeta KAWAGUCHI (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama
City Univ.)
Mr. Shigeyuki MOMOZAWA (Fac. Eng., Univ. Tokushima)
Ms. Nahoko NAGASAKI (Grad. Sch. Bioagric. Sci., Nagoya
Univ.)Mr. Yoichi NAOE (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City Univ.)
Mr. Takashi ODA (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City Univ.)
Mr. Yasuhiro SHIMIZU (Fac. Eng., Univ. Tokushima)
Mr. Yasushi SUGIMOTO (Inst. Health Sci., Tokushima Bunri
Univ.)Mr. Mayuki YAMABE (Grad. Sch. Int. Sci., Yokohama City
Univ.)
Mr. Kazunari YONEDA (Fac. Eng., Univ. Tokushima)
誌 上 発 表Publications[ 雑誌 ]（原著論文）＊印は査読制度がある論文誌
Imagawa T., Nakayama H., Katunuma N., Sakuraba H.,
播磨研究所 放射光科学総合研究センター
平成 17 年度 研究年報

Ohshima T., Itoh T., Sako Y., Nomura N., and Tsuge
H. : "Crystallization and preliminary X-ray diffraction
analysis of homing endonuclease I-Tsp061I", Acta
Cryst. D 60, 2006--2008 (2004). ＊"Beamline Scheduling Software: administration
software for automatic operation of the RIKEN
structural genomics beamlines at SPring-8", J.
Synchrotron Rad. 12, 380--384 (2005). ＊Saito K., Kawabata K., Asama H., Mishima T., SugaharaM., and Miyano M. : "Evaluation of protein
crystallization states based on texture information
derived from greyscale images", Acta Cryst. D 61,
873--880 (2005). ＊Ishihara G., Goto M., Saeki M., Ito K., Hori T., Kigawa T.,
Shirouzu M., and Yokoyama S. : "Expression of G
protein coupled receptors in a cell-free translational
system using detergents and thioredoxin-fusion
vectors", Protein Expr. Purif. 41, 27--37 (2005). ＊Sugahara M., Ohshima N., Ukita Y., Sugahara M., andKunishima N. : "Structure of ATP-dependent
phoshoenolpyruvate carboxykinase from Thermus
thermophilus HB8 showing the structural basis ofinduced fit and thermostability", Acta Cryst. D 61,
1500--1507 (2005). ＊Kawabata K., Takahashi M., Saito K., Asama H.,
Mishima T., Sugahara M., and Miyano M. : "Evaluationof crystalline objects in crystallizing protein droplets
based on line-segment information in greyscale images",
Acta Cryst. D 62, 239--245 (2006). ＊Ammar Y. B., Takeda S., Sugahara M., Miyano M., Mori
H., and Wakabayashi S. : "Crystallization andpreliminary crystallographic analysis of the humancalcineurin homologous protein CHP2 bound to thecytoplasmic region of the Na+/H+ exchanger NHE1",
Acta Cryst. F 61, No. 10, pp.956--958 (2005). ＊Lokanath N. K., Yamamoto H., Matsunaga E., SugaharaM., and Kunishima N. : "Purification,crystallizationand initial X-ray crystallographic analysis of theputative GTPase PH0525 from Pyrococcus horikoshii
OT3", Acta Cryst. F 61, 892--894 (2005). ＊Taka J., Ogasahara K., Jeyaraman J., Kunishima N.,
Kuroishi C., Sugahara M., Yokoyama S., and Yutani
K. : "Stabilization due to dimer formation ofphosphoribosyl anthranilate isomerase from Thermus
thermophilus HB8: X-ray analysis and DSC
experiments", J. Biochem. 137, No. 5, pp.569--578(2005). ＊Asada Y., Sawano M., Ogasahara K., Nakamura J., Ota
M., Kuroishi C., Sugahara M., Yutani K., andKunishima N. : "Stabilization mechanism of thetryptophan synthase α-subunit from Thermus
thermophilus HB:8 X-ray crystallographic analysis andcalorimetry", J. Biochem. 138, No. 4, pp.343--353 (2005).
＊
Kunishima N., Asada Y., Sugahara M., Ishijima J.,
Nodake Y., Sugahara M., Miyano M., Kuramitsu S.,
Yokoyama S., and Sugahara M. : "A novel induced-fit
reaction mechanism of asymmetric hot dog thioesterasepaal", J. Mol. Biol. 352, 212--228 (2005). ＊Lokanath N. K., Ohshima N., Takio K., Shiromizu I.,
Kuroishi C., Okazaki N., Kuramitsu S., Yokoyama S.,
Miyano M., and Kunishima N. : "Crystal structure ofnovel NADP-dependent 3-hydroxyisobutyrate
dehydrogenase from Thermus thermophilus HB8", J.
Mol. Biol. 352, 905--917 (2005). ＊Bagautdinov B., Kuroishi C., Sugahara M., andKunishima N. : "Crystal structures of biotin protein
ligase from Pyrococcus horikoshii OT3 and its
complexes: structural basis of biotin activation", J. Mol.
Biol. 353, 322--333 (2005). ＊Ueno G., Kanda H., Kumasaka T., and Yamamoto M. :Koike-Takeshita A., Shimamura T., Yokoyama K.,
Yoshida M., and Taguchi H. : "Leu309 plays a criticalrole in the encapsulation of substrate protein into theinternal cavity of groEL", J. Biol. Chem. 281, 962--967(2006). ＊Ishijima J., Uchida Y., Kuroishi C., Tsuzuki C.,
Takahashi N., Okazaki N., Yutani K., and Miyano M. :"Crystal structure of alanyl-tRNA synthetase
editing-domain homolog (PH0574) from a
hyperthermophile, Pyrococcus horikoshii OT3 at 1.45 Å
resolution", Proteins: Structure, Function, andBioinformatics 62, No. 4, pp.1133--1137 (2006). ＊（総説）
Okuno T., Yokomizo T., Hori T., Miyano M., and Shimizu
T. : "Leukotriene B4 receptor and the function of its
helix 8", J. Biol. Chem. 280, No. 37, pp.32049--32052(2005).
Miyano M. : "Amphiphilic Helices Drive Signaling",
Structure 13, 946--947 (2005).
宮野 雅司 : "エイコサノイド合成系酵素の構造生物：医薬品の分子作用機能理解とさらなる創薬を目指して", 実験医学 23, No. 6, pp.886--893 (2005).
[ 単行本 ]
（原著論文）＊印は査読制度がある論文誌
Takahashi M., Kawabata K., Saito K., Sugahara M.,
Asama H., and Mishima T. : "Protein crystal state
discrimination method by extracting line features on
the image", Proceedings of 31st Annual Conference of
the IEEE Industrial Electronics Society (IECON 2005),
Raleigh, USA, 2005-- 11, IEEE, Raleigh, pp.112--117(2005). ＊口 頭 発 表 Oral Presentations(国際会議等)Sugahara M. : "Development of full automatic protein
crystallization robot "TERA" and its data evaluation (inJapanese)", 4th International Bio Expo Japan, (Reed
Exhibitions Japan Ltd.), Tokyo, May (2005).
Suzuki K., Misaki S., Shiromizu I., Takimoto-Kamimura
M., Bando M., Kunishima N., Nodake Y., Sugahara M.,
and Nishijima K. : "Crystal structure of MCoA-ACPT
from Thermus thermophilus HB8", 20th Congress of
the International Union of Crystallography (IUCr2005),
Florence, Italy, Aug. (2005).
播磨研究所 放射光科学総合研究センター
平成 17 年度 研究年報

Bagautdinov B., Kuroishi C., Sugahara M., andKunishima N. : "Crystal structure of the biotin protein
ligase from Pyrococcus horikoshii OT3: insights into
the mechanism of biotin activation", 20th Congress of
the International Union of Crystallography (IUCr2005),
Florence, Italy, Aug. (2005).
Lokanath N. K., Ohshima N., Takio K., Shiromizu I.,
Kuroishi C., Okazaki N., Kuramitsu S., Yokoyama S.,
Miyano M., and Kunishima N. : "Crystal structure of
the NADP-dependent 3-hydroxyisobutyrate
dehydrogenase", 20th Congress of the International
Union of Crystallography (IUCr2005), Florence, Italy,
Aug. (2005).
Hori T. : "LTB4 12-hydroxydehydrogenase/15-oxo-PG
13-reductase and Indomethacin Complex", 20th
Congress of the International Union of Crystallography(IUCr2005), Florence, Italy, Aug. (2005).
Miyano M. : "Structural Basis of Multifunctional
Lipocalin-type Prostaglandin D2 Synthase", 20th
Congress of the International Union of Crystallography(IUCr2005), Florence, Italy, Aug. (2005).
Takahashi M., Kawabata K., Saito K., Sugahara M.,
Asama H., and Mishima T. : "Protein crystal state
discrimination method by extracting line features on
the image", 31st Annual Conference of the IEEE
Industrial Electronics Society (IECON 2005), Raleigh,USA, Nov. (2005).
(国内会議)
長崎 菜穂子, 石嶋 潤, 宮野 雅司, 井出 悠葵, 中西 洋一,
前島 正義: "植物新規Ca2+結合タンパク質RVCaBの構造学的、物理化学的特徴", 第46回日本植物生理学会年会, 新潟, 3月 (2005).
高橋 六徳, 齊藤 佳奈子, 川端 邦明, 菅原 光明, 淺間 一,
三島 健稔: "線分抽出に基づいたタンパク質の結晶化状態
判定", ロボティクス・メカトロニクス講演会'05(ROBOMEC'05), (日本機械学会), 神戸, 6月 (2005).

彦, 粂井 麻希, 和田 いづみ, 国島 直樹, 野嶽 勇一, 菅原 光明, 西嶋 和三: "Crystal structure of MCoA-ACPT
from Thermus Thermophilus HB8", 理研シンポジウム「高度好熱菌丸ごと一匹プロジェクト」第4回連携研究会,
播磨, 8月 (2005).
今川 貴仁, 宇都宮 敬子, 杉本 康志, 海老原 章郎, 津下
英明: "高度好熱菌由来 O-acetyl-L-homoserine
sulfhydrylase の結晶構造解析", 理研シンポジウム「高度好熱菌丸ごと一匹プロジェクト」第4回連携研究会, 播磨,
8月 (2005).
Bagautdinov B., Sato Y., 菅原 光明, 国島 直樹: "Crystal
structures of shikimate 5-dehydrogenase from
Thermus thermophilus HB8 and its cofactor andsubstrate complexes: insights into the enzymaticmechanism", 理研シンポジウム「高度好熱菌丸ごと一匹
プロジェクト」第4回連携研究会, 播磨, 8月 (2005).
長崎 菜穂子, 石嶋 潤, 宮野 雅司, 井出 悠葵, 中西 洋一,
前島 正義: "植物の新規Ca2+結合タンパク質RVCaBはαへ
リックスもβ構造も有さずCa2+に対して低親和性を示す",
第28回日本分子生物学会年会, 福岡, 12月 (2005).
清水 勝美, 藤本 弥生, 菅原 光明, 国島 直樹: "Pyrococcus
horikoshii OT3 由来の推定ペプチジル-tRNA 加水分解
酵素の結晶構造", 日本結晶学会2005年度年会および総会,
姫路, 12月 (2005).
淺田 征彦, 澤野 雅英, 小笠原 京子, 中村 順司, 太田 元規, 黒石 千寿, 菅原 光明, 油谷 克英, 国島 直樹: "X線
構造解析と示差走査熱量測定(DSC)を用いた高度好熱菌
Thermus thermophilus HB8 由来トリプトファン合成酵
素αサブユニットの安定化機構の検討", 日本結晶学会
2005年度年会および総会, 姫路, 12月 (2005).
内山 琢郎, 島村 達郎, 石嶋 潤, 西堀 英治, 坂田 誠, 熊坂崇, 宮野 雅司: "Toho-1 beta-lactamaseの超高分解能X線
結晶構造解析", 日本結晶学会2005年度年会および総会,
姫路, 12月 (2005).

小池 あゆみ, 島村 達郎, 横山 謙, 岩田 想, 吉田 賢右, 田口 英樹: "GroELの気質タンパク質閉じ込めにはGroELとGroESの多価結合が重要である", 第5回日本タンパク質科学会年会, 福岡, 6月 (2005).
高橋 六徳, 川端 邦明, 齊藤 佳奈子, 菅原 光明, 淺間 一,
三島 健稔: "輪郭線特徴抽出によるタンパク質の結晶化状
態判定", 2005画像電子学会：第33回年次大会, (画像電子学会), 長野, 6月 (2005).
中山 仁志, 島村 達郎, 野村 紀通, 佐子 芳彦, 津下 英明,
宮野 雅司: "ホーミングエンドヌクレアーゼI-Tsp061Iの基質DNA認識特異性の改変", 第5回日本タンパク質科学会年会, 福岡, 6--7月 (2005).
今川 貴仁, 杉本 康志, 宇都宮 敬子, 津下 英明: "高度好熱菌由来TT1382の結晶構造解析", 理研シンポジウム「高度好熱菌丸ごと一匹プロジェクト」第4回連携研究会, 播磨,
8月 (2005).
岬 真太郎, 鈴木 健司, 白水 郁也, 上村 みどり, 板東 政

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平成 17 年度 研究年報