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Proc. Arthropod. Embryol. Soc. Jpn. 54, 33–34 (2022)Ⓒ 2022 Arthropodan Embryological Society of Japan
ISSN 1341–1527

透明化試薬を用いたカイコ胚の観察
酒井弘貴・ 冨田秀一郎

Hiroki SAKAI and Shuichiro TOMITA: Observation of Silkworm Embryos Using a Tissue-clearing
Reagent＊
Institute of Agrobiological Sciences, National Agriculture and Food Research Organization, 1–2 Owashi, Tsukuba, Ibaraki 305–8634, Japan
E-mail: tomita@affrc.go.jp (ST)

カイコの胚発生は、養蚕業の蚕種保護取扱いにおける重要性から、古くから様々な研究がなされている（高見・北沢，1960；大槻・村上，1968）。近年、光学技術の発展による顕微鏡の進歩に伴って、それに適した新しい組織標本の作成手法が開発されている。そこで我々はカイコの胚発生に関しても、それらの新しい手法によって作成された標本を観察することで、今まで観察できなかった形態学・組織学的な特徴を捉えることができるのではないかと考えた。
中でも目覚ましい進歩を遂げている観察手法の一つとし て、 組 織 の 透 明 化（ Kurihara et al., 2015; Tainaka etal., 2016）があげられる。組織を透明にすることで、これまで切片を作成する必要があった組織深部が簡便に観察でき、しかも組織内の三次元構造を正確に捉えることができる。多くの場合、組織の透明化は、観察組織から光吸収体や高屈折率成分の除去と、組織と溶媒の屈折率を近づけることによってなされる。この目的のために開発されている透明化試薬は、組織へのダメージを最小限に抑えつつ透明化できるため、組織深部の微細な形態の三次元観察が可能になる。
本研究では、カイコ胚を観察する目的で、透明化技術であ る CUBIC（Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging
Cocktails and Computational analysis） 法（Tainaka et al.,2014）に着目した。CUBIC 法で使用されている透明化試薬には、尿素とアミノアルコールが含まれており、尿素には組織の屈折率を最適化する働きが、アミノアルコールには生体色素を除去する働きがある（Tainaka etal., 2014）。この CUBIC 法は、哺乳類の組織に最適化されているが、CUBIC 法とキレート剤や過酸化水素水処理を併用することで、昆虫（Kuroda and Kuroda, 2020）および甲殻類（Konno and Okazaki, 2018）の組織にも応用できることが報告されている。
我々は、卵殻を取り除いたカイコ卵に対して、透明化処理を行ったところ、様々なステージで透明化に成功した（Fig. 1）。 次 に、 透 明 化 に 成 功 し た 卵 に 対 し て
4ʼ,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）で核染色を行い、Fig. 1 Clearing of the Bombyx mori eggs at 24–216 h after egg-laying. Scale = 1 mm.
＊Abstract of paper read at the 57th Annual Meeting of the Arthropodan Embryological Society of Japan, July 9–10, 2021, Ushiku-numa, Ibaraki,Japan.

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Fig. 2 DAPI staining of cleared Bombyx mori eggs at 24–216 h after egg-laying. Scale = 1 mm.
蛍光実体顕微鏡で、胚の形態を観察した（Fig. 2）。その結果、産卵後 24 h では胚帯が観察され、その後、産卵後
168 h で、胚全体が明瞭に観察できた。しかし、産卵後192 h 以降は、ヘッドカプセルの脱色が不完全なためDAPI 染色による頭部内部の形態観察は難しかった。
続いて、この透明化手法を用いて、受精時期の核の挙動を観察したところ、卵核や精子核の挙動を明確に観察できた。透明化手法によってカイコ受精期の核の挙動を観 察 し た 本 研 究 成 果 は、 査 読 付 き 論 文 に 受 理 さ れ た（Sakai et al., 2022）。
以上のことから、カイコ卵における透明化は、胚の観察において、非常に有効な方法であり、今後、この方法を用いることで、今まで捉えることができなかった形態学・組織学的な特徴を観察できることが期待される。
引用文献
Konno, A. and S. Okazaki (2018) Aqueous-based tissue
clearing in crustaceans. Zoological Letters, 4, 13.
Kurihara, D., Y. Mizuta, Y. Sato and T. Higashiyama (2015)
ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant

fluorescence imaging. Development, 142, 4168–4179.
Kuroda, M. and S. Kuroda (2020) Whole-body clearing ofbeetles by successive treatment with hydrogen peroxide
and CUBIC reagents. Entomological Science, 23, 311–315.
大槻良樹・村上昭雄（1968）カイコ卵の発生初期における核分裂について．動物学雑誌，77，383–387．
Sakai, H., T. Yokoyama and S. Tomita (2022) Observing
silkworm embryos at the fertilization stage using a tissue
clearing reagent. Journal of Insect Physiology, doi:
10.1016/j.jinsphys.2022.104386.
Tainaka, K., S.I. Kubota, T.Q. Suyama, E.A. Susaki, D. Perrin,
M. Ukai-Tadenuma, H. Ukai and H.R. Ueda (2014)
Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue
decolorization. Cell, 159, 911–924.
Tainaka, K., A. Kuno, S.I. Kubota, T. Murakami and H.R. Ueda
(2016) Chemical pinciples in tissue clearing and staining
protocols for whole-body cell profiling. Annual Review ofCell and Developmental Biology, 32, 713–741.
高見丈夫・北沢敏男（1960）家蚕の胚発生段階表Ⅰ．日122号，日124号，支122号，支124号．蚕糸試驗場彙報，75 ，1–31．