ATPase (MsiK)を用いた新規オリゴ糖輸送系タンパク質の探索齋藤明広（千葉大学大学院 融合科学研究科）
研究の目的
生態系では生物遺骸が時間的にも量的にも不規則に生じる。微生物は，これらの生物遺骸に含まれる物質を迅速に識別し，効率的に分解・利用するシステムをもつ。我々の研究グループでは，微生物の持つ生体高分子の認識・分解・輸送・代謝システムを総合的に明らかにすることを通じて，バイオマス利用（例えば，有用オリゴ糖生産）やバイオコントロールの技術開発に資する基盤的知見を得ることを目指している。
これまで，土壌での代表的な生体高分子分解微生物である放線菌の物質の認識・分解系への考察を深めるため，モデル放線菌の一つStreptomyces coelicolor A3(2)を対象とし，キチン（アセチルグルコサミンを構成単位とする多糖）の認識・分解・輸送系について研究してきた。キチナーゼ遺伝子（以下，chi ）の構造と転写制御現象を明らかにする1-3)とともに，キチン分解二糖であるN,N’-ジアセチルキトビオース [(GlcNAc)2] の細胞内への輸送が，chi 遺伝子の発現誘導に必須であることを示した4)。S. lividans において，セロビオース（セルロース分解二糖）とキシロビオース（キシラン分解二糖）の輸送活性が，セルラーゼとキシラナーゼの生産誘導にそれぞれ必須であること5)を合わせると，Streptomyces 属放線菌での多糖分解酵素の生産誘導には，それぞれに対応する二糖の細胞内への輸送が必須であると考えられる。

Streptomyces 属放線菌での二糖輸送系は，二つの (GlcNAc)2輸送系 NgcEFG 6)とDasABC 7)が発見される以前から，マルトース輸送系MalEFG 8)，セロビオース輸送系CebEFG 9)，キシロビオース輸送系BxlEFG 10)が知られている。これらはいずれもABC（ATP-binding cassette）輸送系（図１）である。興味深いことに，これらの輸送系の全ては，同一のATPaseサブユニットMsiKとともに機能すると考えられている
4,9)。

msiK が培地中に存在する糖質の種類にかかわらず転写されるのに対し，輸送系受容体遺伝子malE, cebE, bxlE, dasA は各々の輸送糖質によって転写誘導される4)。

S. coelicolor のゲノムには，オリゴ糖とポリオール（以下、OSP）の輸送に関わると考えら れるABC輸 送系（以下 OSP-ABC輸 送系）遺 伝子群が３ ７セット存 在する（ ABCISSE デ ー タ ベ ー ス よ り 計数）。他の真正細菌では，OSP-ABC輸送系遺伝子群１セットに対して特異的なATPaseサブユニット遺伝子が一つずつ存在する傾向があるのに対し，放線菌では３７のOSP-ABC輸送系遺伝子群に対してATPaseサブユニット遺伝子と推定されるものは二つしか存在しない。

図１．S. coelicolor での二糖輸送のモデル．
MsiK は，DasABC，MalEFG，CebEFG に共通のATPase サブユニットであり，それぞれの複合体が各種糖質に対する輸送系として機能する。

これら二つのATPase遺伝子の産物は，３７セットのOSP-ABC輸送系に二者択一的に相互作用する可能性が考えられる。本研究では，これらのうちの一つMsiK 4,11)に着目し，その特性を利用することで，S. coelicolor のゲノムに存在する２８セットの機能不明遺伝子にコードされる輸送系の機能（輸送物質）を明らかにすることを目指している。ここでは，MsiKと相互作用するタンパク質の獲得方法の確立について報告する。

方法
推定プロモータ領域を含むmsiK遺伝子を，C末端側にヒスチジンタグ（Hisタグ）が付加されるように設計したプライマーを用いて増幅した。増幅された断片を放線菌用プラスミドベクターpWHM3 に挿入した後，S. coelicolor A3(2)のmsiK破壊株ASC3 4)に導入し，形質転換株ASC3-b2 を作成した。また，ASC3 株にプラスミドベクターのみを導入したASC3-a1 株を得た。一方，組換えMsiKタンパク質を大腸菌で生産し，精製した後，それを抗原として抗MsiK抗血清を調製した。ASC3-b2 のエンベロープ画分からのHisタグ付きMsiKの獲得は，Chenら12)の報告を参考にして，ATPaseの拮抗阻害剤であるバナジン酸添加下でのニッケル親和性カラムクロマトグラフィーによって行った。

結果
１）S. coelicolor A3(2) msiK 変異株での His タグ付き MsiK の生産系の確立
C末端側にヒスチジンタグ（Hisタグ）が付加されるように設計したmsiK遺伝子を，土着の推定プロモータを含めて，多コピープラスミドベクターを用いて，S. coelicolor
A3(2)のmsiK破壊変異株ASC3 4)に導入し，ASC3-b2 株を得た。野生株M145, msiK破壊株ASC3，ベクターコントロールASC3-a1 株，およびmsiK相補株ASC3-b2 をLB培地で培養し，菌体破砕懸濁液をイムノブロット解析に供した。抗msiK抗血清を用いたところ，M145 株とmsiK相補株ASC3-b2 で，それぞれ約 40 および 45kDaの位置にバンドが検出された。また，抗Hisタグ抗体を用いた結果，ASC3-b2 株においてのみ，約45kDaのバンドが検出された。これらの結果から，msiK遺伝子破壊株を宿主として，C末端側にHisタグを付加したMsiKタンパク質（MsiKHis）の生産系が確立できたと判断した。
２）MsiK の細胞内局在

S. coelicolor A3(2)の野生株M145 およびmsiK相補株ASC3-b2 を各種糖質の存在下で培養した後，細胞質画分とエンベロープ画分に分画し，イムノブロット解析によってMsiKの局在を調べた。その結果，MsiKは糖質の種類に関係なく，エンベロープ画分で検出されることが判明した。また，MsiKHis もエンベロープ画分で検出された。これらの結果から，C末端のHisタグの有無にかかわらず，MsiKは，膜タンパク質と相互作用していることが考えられた。
３）MsiK と相互作用するタンパク質の獲得系の確立
Chenらの方法12)を参考にすることで，msiK相補株ASC3-b2 のエンベロープ画分から，MsiKHisをニッケル親和性クロマトグラフィーによって獲得する実験系を構築できた。

MsiKとともに溶出画分に得られたタンパク質を，野生株M145 やベクターコントロー
ル株ASC3-a1 とSDS-PAGEによって比較したところ，ASC3-b2 株に特異的なタンパク質が検出された。本結果から，MsiKと相互作用すると考えられるタンパク質が本実験系で得られるものと判断した。

結論
本研究によって，MsiKHisと相互作用すると考えられるタンパク質を獲得する実験系が確立された。今後，本実験系をもとにMsiKと相互作用するタンパク質を同定し，輸送系未知の糖質に対する新規輸送系を同定することを試みていく。新規輸送系同定の後には，それらの生理機能を解明することはもとより，有用糖質生産への応用へ向けた基盤となる知見を得る予定である。

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