ミトコンドリアをターゲットとした新たな醸造酵母育種の研究
北垣浩志（佐賀大学 農学部）
研究の目的
酵母ミトコンドリアは基本的には酸素呼吸のための細胞内小器官であるため、これまで酸素呼吸の起こらない酒類醸造における役割や存在の研究は非常に少なかった。従って、発酵産業における酵母ミトコンドリアの役割もほとんど研究されてこず、ミトコンドリアを直接のターゲットした醸造酵母の育種も行われてこなかった。しかし近年、
我々のグループによる解析の結果、酒類醸造においても酵母ミトコンドリアが最後まで存在することが明らかになった1)。ミトコンドリアは酸素呼吸だけではなく、さまざまな生物学的イベントの場でもある。そこで、発酵産業における酵母ミトコンドリアの研究を行うことで、発酵産業で取られる工程での酵母ミトコンドリアの役割が明らかになったり、ミトコンドリアをターゲットとした、まったく新しい発想の醸造酵母の育種が可能になるのではないかと考え、研究を開始した。

方法
１. 発酵から呼吸への転換における酵母ミトコンドリアの役割の解明
実験室株JK93d-αを用いた。酵母はYPD培地にOD600=0.1 の濃度で接種し、振盪して30℃で培養して 4 時間後、24 時間後にサンプリングした。ミトコンドリアＤＮＡの欠落は、盛んに増殖している酵母を 2 ×106 cells/mlの濃度に 1% yeast extract, 2%peptone, 2% dextrose, 50 mM potassium phosphate, pH 6.24 に懸濁し、50 µM のEthidium bromideを加えて遮光して 30℃で 8 時間培養し、YPDプレートに塗布し 30℃で 2 日間培養することによって行った。非発酵性糖を含むプレートでの非増殖性により呼吸能の欠損を確認した。
RNAの抽出・精製は、酵素による溶菌の後、QiagenのRNeasy RNA Isolation Kitを用いて行った。cDNAの合成とマイクロアレイへのハイブリダイゼーションはAffymetrix
Expression Analysis Technical Manualに従って行った。全体のシグナルを２５００になるようにnormalizationを行った。呼吸可能株の 24 時間における発現が 300 以上のもので、かつ 24 時間後の発現が 4 時間後の発現の 2 倍以上となった遺伝子を選抜し、発現値のLog10値を取り、培養 4 時間後と 24 時間後の発現値の比率を計算してグラフにプロットした。
２. ミトコンドリアの形態をターゲットとする清酒酵母の育種
清酒酵母より胞子形成により取得した株で、発酵力が二倍体と同等の一倍体酵母No. 868を親株として用いた。FIS1遺伝子の破壊には、配列情報に基づいてPCR により作成した破壊カセットを用いた。形質転換体は、100 µg/ml nourseothricinを含む培地で選抜した。またミトコンドリア可視化プラスミドを保持させるため、宿主ゲノム上のLEU2遺伝子の破壊を、配列情報に基づいてPCR により作成した破壊カセットを用いて行った。形質転換体を500μg／mlのG418を含む培地で選抜を行った。清酒酵母の野生株における酵母ミトコンドリアの可視化には、山口大学赤田倫治教授にご供与いただいた
RAK1536と基礎生物学研究所の岡本浩二博士にご供与いただいたpYX142-mitoGFP、Utah大学のShaw教授にご供与いただいたpRS413GPD-mtGFPを用いた。清酒は2×109cellsの酵母を、60gのα米と、23gの乾燥麹、45μlの乳酸、200mlの蒸留水と混ぜて15℃で14日間置くことで醸造した。有機酸含量の測定は電導度検出器CDD-10AとShim-pack SPR-Hを装着したHPLC LC-10AD（島津）で行った。

結果
１．発酵から呼吸への転換における酵母ミトコンドリアの役割の解明
発酵産業においては、酵母の拡大培養工程を必ず伴う。この際、振盪培養で酵母を培養している企業は実態として非常に多い。このとき酵母は呼吸状態にあると考えられ、一方酒類醸造時には酵母は発酵状態にあると考えられる。このように、発酵産業で発酵と呼吸の状態をコントロールすることは非常に大事である。しかし、呼吸と発酵との転換の間で酵母ミトコンドリアがどのような役割を持っているかは明らかにされていない。
そこで、酵母ミトコンドリアＤＮＡを欠落させ、発酵から呼吸の状態に酵母を移した
時の酵母の遺伝子発現をゲノムワイドに調べた（図 1）。
その結果、酵母ミトコンドリアの機能が健全な株に比べて、酵母ミトコンドリアＤＮＡを欠落させた株では、発酵から呼吸への転換（diauxic shift）時の、遺伝子発現の変化が抑制されていた。すなわち、野生株において、発酵から呼吸への転換時に、発現が上昇する遺伝子群のうち、一部の遺伝子の発現上昇が、ミトコンドリア DNA 欠落株では、抑制されていた。ミトコンドリア DNA 欠落株で発現上昇が抑制された遺伝子群は、グルコース抑制される遺伝子群とは必ずしも一致していなかったため、ミトコンドリア
ＤＮＡにコードされるミトコンドリアの機能は、発酵から呼吸への転換を特異的に制御すると考えられた。
以上の結果から、酵母が発酵から呼吸に代謝を移行させるときの遺伝子発現制御に、ミトコンドリアの機能が関与していることが世界で初めて示された2)。

図 1 呼吸可能株と呼吸欠損株の diauxic shift に伴う遺伝子発現の変化の比較

２．ミトコンドリアの形態をターゲットとする清酒酵母の育種
それまでの研究から、清酒醸造中に酵母ミトコンドリアは醸造途中で断片化していくことが観察されていた1)。そこで、この知見を元に、ミトコンドリアの形態をターゲットとする新規な醸造酵母が育種できないかを調べた。
まず、清酒醸造中の酵母ミトコンドリアの断片化に必須な因子を調べた。ミトコンドリ
ア外膜を貫通する膜たんぱく質であるFis1 をコードするFIS1 遺伝子破壊するとエタノールで誘導されるミトコンドリアの断片化が起きなかった3)ことから、遺伝子としてはFIS1 遺伝子をターゲットとした。清酒酵母でFIS1 遺伝子を破壊し、得られた遺伝子破壊株のミトコンドリアの形態を栄養増殖条件下で調べたところ、栄養増殖条件下の実験室株と同じく4)網目状の形態になっていた。次にこの株を使って清酒を醸造してミトコ
ンドリアの形態を調べた。その結果、清酒酵母野生株では酵母ミトコンドリアは清酒醸造初期ではフィラメント状であったが清酒醸造中に断片化していった（図２）のに対し、清酒酵母fis1 破壊株ではミトコンドリアの断片化は起きず、網目状のまま清酒醸造の最初から最後まで推移した（図 3）。

図 2 清酒酵母野生株における清酒醸造時酵母ミトコンドリアの形態変化

図 3 清酒酵母 fis1 遺伝子破壊株の清酒醸造中の酵母ミトコンドリアの形態

800700
Content (mg/l)

600
WT500

fis1-3400

fis1-6300

fis1-72001000

図 4 清酒酵母野生株と fis1 遺伝子破壊株醸造清酒の有機酸組成以上のことから、清酒醸造中の酵母ミトコンドリアの断片化には Fis1 が必須であることが明らかとなった。
次に、このミトコンドリアの形態変化が醸造特性にどのような影響を与えるかを調べるため、fis1 破壊株を用いて醸造した清酒の有機酸組成を測定して、野生株（親株）を用いて醸造した清酒と比較した。その結果、fis1 破壊株を用いて醸造した清酒中には、さわやかな酸味を持つとされるリンゴ酸が、2 倍近く多く存在し、オフフレーバーとされる酢酸は少なかった（図 4）ことから、fis1 破壊株は、良好な醸造特性を持つ、優良な醸造酵母と考えられた。以上のことから、ミトコンドリアの形態が醸造酵母の育種のターゲットとなることが世界で初めて示された5-10)。

結論
本研究により、（１）発酵から呼吸への転換に酵母ミトコンドリアの機能が重要な役割を持つこと、及び（２）酵母ミトコンドリアの形態が醸造酵母の育種のターゲットになりうること、が世界で初めて示された。

参考文献
1. Kitagaki H, Shimoi H. (2007) Mitochondrial dynamics of yeast during sakebrewing. J. Biosci. Bioeng. 104, 227-230.
2. Kitagaki H, Cowart LA, Matmati N, Montefusco D, Gandy J, de Avalos SV,
Novgorodov SA, Zheng J, Obeid LM, Hannun YA. (2009) ISC1-dependent
metabolic adaptation reveals an indispensable role for mitochondria in inductionof nuclear genes during the diauxic shift in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol.

Chem. 284, 10818-10830.
3. Kitagaki H, Araki Y, Funato K, Shimoi H. (2007) Ethanol-induced death inyeast exhibits features of apoptosis mediated by mitochondrial fission pathway.

FEBS Lett. 581, 2935-2942.
4. Okamoto K, Shaw JM. (2005) Mitochondrial morphology and dynamics in yeast
and multicellular eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 39, 503-536.
5. Kitagaki H, Kato T, Isogai A, Mikami S, Shimoi H. (2008) Inhibition of
mitochondrial fragmentation during sake brewing causes high malate
production in sake yeast. J. Biosci. Bioeng. 105, 675-678.
6. 北垣浩志、三上重明、下飯仁、(2007) 酵母のリンゴ酸生産性を向上させる方法、特願 2007-320389

7. Kitagaki H. (2009) Mitochondrial-morphology-targeted breeding of industrial
yeast strains for alcohol fermentation. Biotechnol. Appl. Biochem. 53, 145-153.
8. 北垣浩志 (2009) 清酒醸造における酵母ミトコンドリアの役割の解析とその育種への応用、生物工学会誌、87, 66-71.

9. 北垣浩志 (2008) 細胞内空間を制御する微生物育種、生物工学会誌、86, 238.
10. 北垣浩志、下飯仁(2008) 酒類醸造における酵母ミトコンドリアの役割とその育種への応用、日本醸造協会誌、103, 314-320.