サルファ剤による Bordetella bronchiseptica の莢膜合成阻止作用
桑野昭

ハムリー株式会社 筑波研究センター（〒 306-0101 茨城県古河市尾崎 2654-3）

胞への付着因子として重要な莢膜の合成を阻止す

1 ．はじめにる作用を SMMX が有することが示唆され，一連の検討を加えた。なお，本研究は著者が第一製薬

豚萎縮性鼻炎（AR）の原因菌である Bordetella
bronchiseptica はⅠ相菌，ⅠからⅢ相菌への移行㈱に所属していた時に実施したものであり，本研型であるⅡ相菌，Ⅰ相菌の形態学的変異型である

動物実験倫理委員会の承認条件である供試頭数のⅢ相菌およびラフ型菌の四つに分類される。Ⅰ相削減および安楽死における全身麻酔薬の使用（苦菌は莢膜抗原（K 抗原），線毛性赤血球凝集抗原

痛の軽減）を遵守して実施した。

究で実施した豚を用いた動物実験は，第一製薬㈱（HA 抗原），鞭毛抗原（H 抗原）および外膜の多2 ．B. bronchiseptica の莢膜合成に及ぼす
SMMX の影響 − in vitro での検討−

糖抗原（O 抗原）を有するが，Ⅲ相菌は K および HA 抗原を欠損する［5］。Ⅰ相菌は病原性と密接な関係があり，赤血球凝集性，溶血性，壊死毒素（DNT）産生および感染防御活性などを持つが，（1）目

Ⅲ相菌はこれらの活性をすべて欠いている。
特に，Ⅰ相菌の莢膜は鼻粘膜上皮細胞への付着因子とし

SMMX の存在下で培養したサルファ剤耐性 B.
bronchiseptica が，莢膜抗血清（K 因子血清）とて，また，感染防御抗原として極めて重要であるの反応性が消失する現象，すなわち，豚の鼻粘膜ことが報告されている［7］。AR の予防対策とし上皮細胞への付着因子として重要な莢膜の合成を阻止する作用を in vitro で調べた［2］。

てⅠ相菌不活化ワクチン，Ⅰ相菌不活化ワクチン

的と抗菌薬の併用などが行われている。抗菌薬とし（2）材料および方法ては主にサルファ剤とテトラサイクリン系が用い

ア．供試菌株られているが，最近，長年の使用によりサルファ

野外において AR の症状を示す 2 〜 3 カ月齢剤に対する耐性菌が多く分離されるようになった。しかし，サルファ剤耐性の B. bronchisepticaが分離されるにもかかわらず，臨床的あるいは病の子豚の鼻腔から分離された SMMX 耐性の B.
bronchiseptica の Ⅰ 相 菌（SM2-4，NS-1，S-11） お

理学的にサルファ剤の効果が認められる現象が多よび SMMX 感受性の 3 株（S1，FB2301，BB-18）

く見受けられる。著者は，サルファ剤の一つであを供試した。Ⅰ相菌の参照株として S1 株を用いた。

るスルファモノメトキシン（SMMX）の存在下で培養したサルファ剤耐性 B. bronchiseptica が，また，Ⅲ相菌の参照株とした SM2-4-CV 株は，ク
リスタルバイレットを用いる Ishikawa と Isayama

莢膜抗血清（K 因子血清）との反応性が消失し，の方法［1］に準じて作製した。各供試菌株の分莢膜が欠如する現象を偶然発見した。このことはB. bronchiseptica のⅠ相菌を病原性のないⅢ相菌

離年，分離地およびサルファ剤に対する薬剤感受性を表１に示した。

に変異させる作用，すなわち，豚の鼻粘膜上皮細14桑野昭／サルファ剤の B. bronchiseptica 莢膜合成阻止／ 31（2009） 15

表１ B. bronchiseptica 供試菌株のサルファ剤に対する感受性
菌相

菌株名

分離年

分離地

Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ

SM2-4
NS-1
S-11

1984
1987
1985

Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ

S1
FB2301
BB-18

・
1984
1985

Ⅲ

SM2-4-CV（SM2-4 のⅢ相菌）

MIC（mg/L）
SMMXa）

SDMXb）

千葉県
群馬県
新潟県

＞ 400
＞ 400
＞ 400

＞ 400
＞ 400
＞ 400

・
北海道
千葉県

0.4
0.1
0.1

0.8
0.2
0.4

＞ 400

＞ 400

a）スルファモノメトキシン b）スルファジメトキシン
S1 株：農水省家畜衛生試験場より分与
SM2-4-CV 株：クリスタルバイオレットを用いて作製
MIC 測定培地：Mueller-Hinton 寒天培地

イ．使用培地とⅠ相菌の選定
B. bronchiseptica のⅠ相菌の性状を保持するため，7 ％ 馬 脱 線 維 素 血 液 加 Bordet-Gengou 寒 天（BGA）培地を用いた。各菌株を BGA 培地に接種

（3）成

績

ア．SMMX 含有ディスクの周囲に発育した集落の観察

し，コンラージ棒で広げ，37℃，36 時間好気培養

SMMX のディスク（400μg）存在下で SMMX
耐性 B. bronchiseptica のⅠ相菌を培養した結果，した。β溶血を示す正円，灰白色の直径 1mm 以

ディスクを中心とした半径 15mm の円内では，下の集落を形成し，かつ，これらの菌が K 因子血莢膜を欠くⅢ相菌の集落に極めて類似した集落

清と凝集することを確認してⅠ相菌とした。

が，また，ディスクの中心から 15mm 以上離れ

ウ．K 因子血清の作製
ホルマリン不活化Ⅰ相菌で作製した抗血清を，た部分では，
Ⅰ相菌に類似した集落が観察された。
イ．SMMX の最小莢膜合成阻止濃度

同じくホルマリン不活化Ⅲ相菌の菌体で吸収して2 倍希釈系列で 0.1 〜 100 mg/L の SMMX を含作製した。この K 因子血清に対してⅠ相菌の参む BGA 培地に発育した各菌株の全集落について

照株である S1 株は凝集するが，Ⅲ相菌の参照株

K 因子血清に対する凝集性を検査した。その結果，である SM2-4-CV 株は凝集を示さなかった。

SMMX 耐性の SM2-4，NS-1 および S-11 株では，

エ．SMMX の最小莢膜合成阻止濃度の測定

SMMX の 1.56 mg/L 以上の濃度で K 因子血清に2 倍希釈系列の SMMX を含む BGA 培地に各試対する凝集性が消失した。一方，SMMX 感受性

験用菌液を菌接種機で接種し，37℃，36 時間培の S1，FB2301 および BB-18 株の各菌株では，0.4養した。培養後，発育菌の K 因子血清に対するあるいは 0.8 mg/L 以下の濃度で集落が形成され凝集性をスライド凝集反応法で検査し，K 因子血たが，これらの集落は K 因子血清に対して凝集

清に対する凝集性が消失した SMMX の最小濃度した（表 2）。

を最小莢膜合成阻止濃度とした。
オ．K 因子血清に対する凝集性の復帰

ウ．K 因子血清に対する凝集性の復帰
SMMX の 1.56 mg/L 以上の濃度で K 因子血清にK 因子血清に対する凝集性が消失した SMMX

対する凝集性が消失した SMMX 耐性の SM2-4，の各濃度の発育菌を SMMX を含まない BGA 培

NS-1 および S-11 の各菌株の発育集落を SMMX を地に接種し，37℃，36 時間培養した。培養後，含まない BGA 培地に接種し，37℃，36 時間培養

発育した菌の K 因子血清に対する凝集性を検査した。培養後，発育した各菌株の全集落についてした。

K 因子血清に対する凝集性を検査したところ，凝集性の復帰がすべてに認められた（表 2）。

16 動物抗菌会報 31（2009）
表 2 B. bronchiseptica の K 因子血清に対する凝集性
菌株名

SMMX の濃度（mg/L）
0.1

0.2

0.4

0.8

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

SM2-4
NS-1 a ）S-11 a ）

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
＋
＋

−
−
−

−
−
−

−
−
−

−
−
−

−
−
−

−
−
−

−
−
−

S1 b ）
FB2301 b ）BB-18 b ）

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
・
・

・
・
・

・
・
・

・
・
・

・
・
・

・
・
・

・
・
・

・
・
・

SM2-4-CV c ）

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

a）

＋ 陽性，− 陰性，・菌の発育なしa）サルファ剤耐性株b）サルファ剤感受性株
使用培地：Bordet-Gengou 寒天培地c）Ⅲ相菌する目的で SMMX 耐性 B. bronchiseptica の人工（4）考察

感染豚を用いて検討した［4］。

BGA 培地中の SMMX 濃度が 1.56 mg/L 以上の存在下で，供試した SMMX 耐性の 3 株を培養した場合，いずれも K 因子血清に対する凝集性が（2）材料および方法
ア．供試豚

消失した。一方，発育阻止濃度（0.4 あるいは 0.8

16 日齢のランドレース系の SPF 豚（雄）を 4mg/L）以下で発育した SMMX 感受性菌は K 因日間の予備飼育後，20 日齢から試験に供した。

子血清に対して凝集し，K 因子血清に対する凝集

SMMX 投薬群および無投薬対照群の 2 群を設定

性の消失は，選択的に SMMX 耐性菌のみに認めし，各群 4 頭の計 8 頭を用いた。各群は別々の動られることが明らかとなった。莢膜が欠損した菌

物室（室温：23 ± 2℃，湿度：55 ± 10％）で飼はⅢ相菌として定義され，鼻粘膜上皮細胞への育した。飼料および水は自由に摂取させた。飼料

付着能および病原性を欠くことが知られている。
したがって，in vivo においても SMMX は，サル

は抗菌性飼料添加物無添加の後期用人工乳（日本

ファ剤耐性の B. bronchiseptica の莢膜合成を阻止

クレア，SDS No.2）を用いた。

し，鼻甲介組織における本菌の定着を抑制する

イ．供試菌株B. bronchiseptica SM2-4 株を供試した。

可能性が示唆された。また，SMMX によって莢

ウ．Ⅰ相菌の確認

膜が欠損した菌は，SMMX を含まない BGA 培地

BGA 培地で 37℃，36 時間培養後，明瞭なβ溶に継代して培養すると莢膜を有するⅠ相菌の性状血を示す粘稠な小集落で，K 因子血清に対して凝に復帰することも明らかとなった。この成績か集し，莢膜を有するⅠ相菌であることを確認してら，SMMX による本菌の莢膜合成阻止作用は，供試した。
エ．B. bronchiseptica の接種

SMMX の存在下で生じる一時的なものであることが推察された。

3 ．B. bronchiseptica の莢膜合成に及ぼす
SMMX の影響 − in vivo での検討−

BGA 培地で明瞭なβ溶血を示す粘稠なⅠ相菌
集落を釣菌し，
これを PBS（pH 7.0）にマクファー
ランド No.5 の濁度に浮遊させた菌液（3.0 × 108
CFU/mL）の 3mL を各供試豚の鼻腔内（左右それぞれ 1.5mL）に注射器で注入した。

（1）目 的in vitro で認められた SMMX による本菌の莢膜合成阻止作用が in vivo でも生じるか否かを検証

オ．SMMX の投薬
抗菌性飼料添加物無添加の後期用人工乳（SDS
No.2）に SMMX が 500ppm の割合になるよう添

桑野

表3

昭／サルファ剤の B. bronchiseptica 莢膜合成阻止／ 31（2009） 17

SMMX に よ り K 因 子 血 清 に 対 す る 凝 集 性 が 消 失 し た B.
bronchiseptica を SMMX を含まない培地に培養後の K 因子血清に対する凝集性

菌株名

SMMX の濃度 a ）（mg/L）
1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
＋
＋

＋
＋
＋

SM2-4
NS-1
S-11

＋ 陽性
a）SMMX により K 因子血清に対する凝集性が消失した濃度
使用培地：Bordet-Gengou 寒天培地

加した飼料を菌接種 1 日前から剖検日（菌接種は AR 病変は認められなかった。これに対し，対後 11 日目または 25 日目）まで連続給与した。

照群では菌接種後 11 日目に剖検した 2/2 頭およ

SMMX の 500ppm は 25mg/kg に相当し，これはび菌接種後 25 日目に剖検した 1/2 頭の計 3 頭が臨床での投与量である。

中程度の AR 病変を示し，また，残りの 1 頭が軽カ．鼻甲介の病理学的検査
菌接種後 11 日目または 25 日目に各群それぞれ2 頭ずつペントバルビタール麻酔下で安楽死させた後，AR 病変を肉眼的に観察した。

度の AR 病変を示した（表 4）。
イ．走査型電子顕微鏡による鼻甲介粘膜表面の観察
SMMX 投薬群では，肉眼的に軽度の AR 病変

キ．鼻甲介粘膜の走査型電子顕微鏡学的観察を示した 1 頭のみに，粘膜上皮細胞の変性，剥離と殺後，鼻甲介を PBS（pH 7.4）で洗浄し，3％および粘膜線毛に少数の菌体付着が観察された。

グルタールアルデヒド液で前固定した。この組織AR 病変を認めなかった残りの 3 頭では粘膜上皮を標本用に細切した後，常法に従って標本を処理細胞の異常は認められず，粘膜上皮線毛に付着しし，走査型電子顕微鏡（日立 S-800 型）
で観察した。

た菌体も観察されなかった。対照群では，粘膜上ク．鼻甲介の細菌検査

皮細胞の変性と剥離が全頭に観察された。また，鼻甲介を無菌的に採取し，これを PBS（pH 7.0）

小塊状に残存している粘膜上皮線毛に菌体が多数で軽く洗浄した後，それぞれ 0.5g をガラスホモ
ジナイザー管に秤量，分取した。これに 4.5mL

付着している像も観察された。
ウ．鼻甲介からの B. bronchiseptica の検出の PBS を加えた後，氷冷下でよくホモジナイズ

菌接種後 11 日目における検出菌数は，SMMX

して，10 の組織乳剤を作製した。更に，PBS で投薬群の 2 頭では 104 および 106 CFU/g，対照群

10-2 〜 10-8 の希釈系列を作製した後，それぞれのの 2 頭では 10 ６および 108 CFU/g であった。また，

希釈液 0.1mL を BGA 培地にコンラージ棒で広げ

菌接種後 25 日目におけるそれは，SMMX 投薬群

た。37℃，36 時間培養し，生菌数を測定した。

の 2 頭はいずれも 104 CFU/g，対照群の 2 頭では-1ケ．抗体検査菌接種 1 日前および剖検日に頸静脈から採血し，試験管凝集反応により血清抗体価を測定した。

107 および 109 CFU/g であった（表 5）。
エ．検出された B. bronchiseptica の菌相
SMMX 投薬群および対照群から分離された菌はすべてⅠ相菌であった。

（3）成

績

ア．肉眼的 AR 病変

オ．凝集抗体価の推移
菌接種前 1 日における全供試豚の抗体価は，10

SMMX 投薬群では，菌接種後 11 日目に剖検し倍以下で抗体は陰性であった。SMMX 投薬群でた 1/2 頭に軽度の AR 病変が認められたが，残りは，菌接種後 11 日目または 25 日目に剖検したその 1 頭および菌接種後 25 日目に剖検した 2 頭でれぞれ 2 頭が，いずれも 10 および 20 倍の抗体価

18 動物抗菌会報 31（2009）
表 4 鼻甲介骨萎縮病変の検査成績
群

豚 No.

SMMX
投薬群

対照群

ＡＲ病変の程度
菌接種後 11 日

菌接種後 25 日

1
2
3
4

−
＋
・
・

・
・
−
−

5
6
7
8

＋＋
＋＋
・
・

・
・
＋＋
＋

− 正常，± 疑似，＋ 軽度，＋＋ 中程度

表5
群

SMMX
投薬群

対照群

鼻甲介からの B. bronchiseptica の検出成績
豚 No.
1
2
3
4
5
6
7
8

菌

数（CFU/g）

菌接種後 11 日

菌接種後 25 日

5.0 × 10
1.7 × 10 6・・・（未検査）
・
1.4 × 10 4
1.0 × 10 4

3.3 × 10 6
5.6 × 10 8・・・・
2.7 × 10 7
1.6 × 10 94使用培地：Bordet-Gengou 寒天培地を示し，経過に伴う抗体価の上昇は認められず，

vitro と同様に SMMX の存在下においてのみ生じ低値で推移した。これに対し対照群では，菌接種る一時的な作用と推察された。

後 11 日目に剖検した 2 頭が 20 および 40 倍を，また，25 日目に剖検した 2 頭は 80 および 160 倍の抗体価を示し，経過とともに抗体価の上昇が認

4 ．B. bronchiseptica の莢膜合成に及ぼす
各種サルファ剤の作用められた（表 6）
。
（1）目
（4）考

察

SMMX による SMMX 耐性 B. bronchiseptica の的豚に使用される 9 種のサルファ剤について B.
bronchiseptica の莢膜合成に及ぼす影響について

莢膜合成阻止作用が，in vivo においても生じる比較検討した［3］。

か否かを人工感染豚を用いて検討した結果，invivo においても SMMX の存在下で SMMX 耐性
B. bronchiseptica の莢膜合成が阻止され，本菌の（2）材料および方法
ア．供試菌株

鼻甲介への付着が抑制されることを示唆する成績

北海道，岩手県，千葉県，山梨県，新潟県およが得られた。また，SMMX 投薬群および対照群

び長崎県下の計 10 カ所の AR 発生養豚場から分離された B. bronchiseptica 計 10 株（1 養豚場当たから分離された菌はすべてⅠ相菌であったことから，in vivo における本菌の莢膜合成阻止は in

り 1 株）を供試した。これらの菌株に対する供試桑野昭／サルファ剤の B. bronchiseptica 莢膜合成阻止／ 31（2009） 19

表 6 B. bronchiseptica のⅠ相菌に対する凝集抗体価の推移
群

豚 No.

SMMX
投薬群

1
2
3
4

対照群

5
6
7
8

菌 接 種
1 日前

11 日後

25 日後

＜ 10（倍）
＜ 10
＜ 10
＜ 10

10
20
・
・

・
・
10
20

＜ 10
＜ 10
＜ 10
＜ 10

40
20
・
・

・
・
80
160

・未検査

サルファ剤の MIC は 400 mg/L 以上であった。

一方，MeO 基を有しない SMXZ，STAZ，SMTZ

イ．供試サルファ剤

および SIXA の最小莢膜合成阻止濃度は 100 ある

SMMX に つ い て は， ピ リ ミ ジ ン 環 の 6 位 のいは 100 mg/L 以下であり，莢膜合成阻止活性は

位 置 に 1 個 の -OCH3 基（MeO 基 ） を 有 す る
6-MeO-SMMX（SMMX） お よ び 2 位 の 位 置 に 1個の MeO 基を有する 2-MeO-SMMX の 2 剤を用

極めて弱いことが明らかとなった（表 7）。
イ．供試サルファ剤の抗菌活性と莢膜合成阻止
活性との相関性いた。1 および 2 の試験で用いた SMMX は前者

供試サルファ剤のサルファ剤感受性B. bronchisepticaに属する。SMMX 以外のサルファ剤として豚でに 対 す る 6-MeO-SMMX，2-MeO-SMMX，SMXZ

使用されるスルファジメトキシン（SDMX），ス

および STAZ の MIC は，いずれも≦ 0.1 〜 0.4 mg/L

ルファドキシン（SDX），スルファメトキサゾー

であり，ほぼ同等の強い抗菌活性を示したが，こル（SMXZ），スルファチアゾール（STAZ），ス

れらの 4 薬剤のなかで MeO 基を有する 6-MeO-

ルファメトキシピリダジン（SMPD），スルファ

SMMX お よ び 2-MeO-SMMX の 2 薬 剤 の み が 強メサジン（SMTZ）およびスルフイソキサゾール

い莢膜合成阻止活性を示し，抗菌活性と莢膜合成（SIXA ）の 7 薬剤を供試した。

阻止活性との相関性は認められなかった（表 8）。

ウ．供試サルファ剤の最小莢膜合成阻止濃度
2 倍希釈系列の供試サルファ剤を含む BGA 培

（4）考

察

地に各試験用菌液を菌接種機で接種し，37℃，36

莢膜合成阻止活性が認められたサルファ剤は，時間培養した。培養後，発育菌の K 因子血清に

化学構造的に MeO 基を有する化合物であり，対する凝集性をスライド凝集反応法で検査し，K

MeO 基が莢膜合成阻止活性に深く関与してい因子血清に対する凝集性が消失した供試サルファることが示唆された。また，MeO 基を有するピ剤の最小濃度を最小莢膜合成阻止濃度とした。

リミジン系サルファ剤のなかで SMMX および
2-MeO-SMMX の 2 剤は最も強い莢膜合成阻止活

（3）成

績

性を示した。一方，2 位と 5 位に MeO 基を有す

ア．供試サルファ剤の最小莢膜合成阻止濃度

る SDX は，SMMX および 2-MeO-SMMX と同様

化学構造的にピリミジン環およびピリダジン

な位置に MeO 基を有するにもかかわらず，それ環に MeO 基を有するサルファ剤が 1.56 〜 3.13
mg/L の濃度で B. bronchiseptica の莢膜合成を強らの莢膜合成阻止活性は SMMX および 2-MeO-

く阻止するとともに，SMMX のように MeO 基を

SMMX に比べやや劣ることも明らかとなった。
これらの成績は，サルファ剤が B. bronchiseptica

1 個有するサルファ剤が最も強い活性を示した。

の莢膜合成を阻止するには，ピリダジン環に付く

20 動物抗菌会報 31（2009）表7

サルファ剤耐性 B. bronchiseptica 対する各種サルファ剤の莢膜合成阻止活性
最小莢膜合成阻止濃度（mg/L）

菌株名

6-MeOSMMX

2-MeOSMMX

SDMX

SDX

SMXZ

STAZ

SMPD

SMTZ

SIXA

BB113
SM2-4
K-5
MS-5
MY-931
YM-4
OKM-5
I-11
S-11
SM24-3

3.13
1.56
3.13
1.56
1.56
3.13
3.13
1.56
1.56
1.56

3.13
1.56
3.13
3.13
1.56
3.13
3.13
3.13
3.13
3.13

25
25
12.5
12.5
12.5
12.5
50
25
12.5
12.5

25
12.5
25
12.5
12.5
25
50
25
25
12.5

＞ 100
＞ 100
＞ 100
100
100
＞ 100
＞ 100
100
＞ 100
＞ 100

＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100

50
50
50
12.5
12.5
50
100
25
25
50

＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100

＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100
＞ 100

6-MeO-SMMX：6-MeO- スルファモノメトキシン，2-MeO-SMMX：2-MeO- スルファモノメトキシン，
SDMX：スルファジメトキシン，SDX：スルファドキシン，SMXZ：スルファメトキサゾール，
STAZ：スルファチアゾール，SMPD：スルファメトキシピリダジン，SMTZ：スルファメサジン，
SIXA：スルフイソキサゾール

表 8 サルファ剤感受性 B. bronchiseptica 対する各種サルファ剤の抗菌活性
最小莢膜合成阻止濃度（mg/L）
菌株名

6-MeOSMMX

2-MeOSMMX

SDMX

SDX

SMXZ

STAZ

SMPD

SMTZ

SIXA

Ｓ1
SP-89
IWA9-2

0.4
0.2
≦ 0.1

0.4
0.4
≦ 0.1

0.8
0.8
0.2

0.8
0.4
≦ 0.1

0.4
0.4
≦ 0.1

0.4
0.4
≦ 0.1

0.8
0.8
0.2

3.2
1.6
0.8

0.8
0.8
0.4

参考）最小莢膜合成阻止濃度
・6-MeO-SMMX，2-MeO-SMMX：1.56 〜 3.13mg/L
・SMXZ ，STAZ；100 〜＞ 100mg/L

MeO 基の数が重要であることを示唆している。
この場合，MeO 基の数が 1 個であるサルファ剤
が，2 個であるサルファ剤に比べ，より強い莢膜

5 ．豚における SMMX の体内分布−特に鼻甲介の組織内濃度についてー

合成阻止活性を示すことが明らかとなった（図1）。また，宇田ら［6］は莢膜と同様に鼻甲介粘

（1）目

的

膜上皮細胞の付着因子として推定されているシ

SMMX がサルファ剤耐性本菌の莢膜合成を阻

アル酸特異的赤血球凝集素（HA）の活性発現に止するには 1.56 〜 3.13 mg/L 以上の濃度が必要

対しても，SMMX は 3.13 mg/L 以上の濃度でそである。豚に SMMX を投与した場合の体内分布の活性を消失させること，さらに，その HA 活性については全く明らかにされていない。SMMXによる B. bronchiseptica の莢膜合成阻止作用が，の消失作用は MeO 基の数が 1 個である SMMXが最も強い作用を示すことを報告している。invitro と in vivo が一致しない原因として SMMX

豚の鼻甲介組織で生じるか否かを体内分布の面かの HA 活性の消失作用も関与しているものと考察

濃度および組織内濃度を検討した。

された。

ら明らかにする目的で，SMMX 投与後の血清中

桑野

図1

昭／サルファ剤の B. bronchiseptica 莢膜合成阻止／ 31（2009） 21

供試ピリミジン系サルファ剤の化学構造a）最小莢膜合成阻止濃度（2）材料および方法
ア．供試動物変化体（SMMX）とその代謝物であるアセチル体（Ac-SMMX）を分別定量した。本法による血血清中濃度の測定には SPF 豚の 5 頭（ランド

清中濃度の定量限界は SMMX が 0.05，Ac-SMMX

レース系，雄，46 日齢，体重 12.5 〜 16.1kg）をが 0.1 mg/L である。また，組織内濃度の定量限使用した。また，組織内濃度の測定には SPF 豚

界は SMMX が 0.1，Ac-SMMX が 0.1 mg/L である。

の 5 頭（ランドレース系，雄，40 日齢，体重 9.6〜 10.8kg）を使用した。

オ．薬物動態パラメーターの算出
血 清 中 の SMMX と Ac-SMMX の 最 高 濃 度

イ．SMMX の投薬量および投薬方法（Cmax），最高濃度到達時間（Tmax），生物半減0.5％のカルボキシメチルセルローズナトリウ

期（t1/2）および時間曲線下面積（AUC）を算出した。

ム（CMC）溶液に SMMX を懸濁（50mg/mL）し，
経口カテーテルを用いて 25mg/kg を単回経口投ア．血清中濃度の推移

薬した。
ウ．採

（3）成 績

材

SMMX の濃度は，投与後 1 時間で著明に上昇

血清中濃度の測定では，SMMX 投与後，1，2，3，

し，投与後 3.8 時間に Cmax の 23.1μg/g を示し

4，5，6，8，12 および 24 時間後に頸静脈から採た。その後，SMMX の濃度は 2.2 時間の t1/2 で速血し，4℃，3,000rpm で 10 分間遠心して血清をやかに減衰し，投与後 24 時間には 0.05μg/g 以

分離し，測定時まで -20℃に凍結保存した。組織

下となった。一方，Ac-SMMX の濃度は，投与後 5.6

内濃度では，SMMX の血清中濃度が最高値を示

時間に Cmax の 8.3μg/g を示した。その後，Ac-す投与後 4 時間にペントバルビタール麻酔下で安

SMMX の濃度は 2.8 時間の t1/2 で減衰し，投与後楽死させ，鼻甲介，気管，肺，心臓，肝臓，腎臓，

24 時間には 0.1μg/g 以下となった（表 9）。

小腸，筋肉および脳を採取した。これらの組織はイ．組織内濃度

測定時まで -20℃に凍結保存した。

SMMX の血清中濃度が最高値を示す投与後 4エ．定量法

時間における SMMX の組織内濃度の順位は，腎高速液体クロマトグラフィー法で SMMX の未臓＞気管，心臓＞筋肉＞小腸，肝臓＞鼻甲介骨

22 動物抗菌会報 31（2009）
表9豚における SMMX の経口投与後の血清中未変化体 SMMX とそのアセチル体である Ac-SMMX のファーマコカイネティック・パラメーター（25mg/kg，n=5）
Tmax a ）（時）

Cmax b ）（μg/g）

t1/2 c ）（時）

AUC0-24d ）（μg・時 /mL）

SMMX

3.8 ± 1.1 e ）23.1 ± 4.7

2.2 ± 0.0

144.7 ± 6.4

Ac-SMMX

5.6 ± 1.0

8.3 ± 0.4

2.8 ± 0.3

72.6 ± 12.9a）最高濃度到達時間，b）最高濃度，c）生物学的半減期，d）時間曲線下面積e）平均値±標準偏差

表 10 豚における SMMX の経口投与後 4 時間における組織内濃度（25mg/kg，n=5 ）単位：μg/g
組

織

鼻甲介骨
気
管
肺
心
臓
肝
臓
腎
臓
小
腸
筋
肉
脳

SMMX a ）7.09 ± 2.89
10.40 ± 4.39
6.25 ± 1.99
10.04 ± 3.51
7.44 ± 3.11
26.10 ± 5.75
7.82 ± 3.52
8.01 ± 2.84
6.55 ± 2.34c）

Ac-SMMX b ）アセチル化率（%）

6.98 ± 3.11
6.57 ± 2.09
7.62 ± 3.69
1.93 ± 0.90
4.89 ± 1.78
17.61 ± 6.34
4.83 ± 1.89
1.01 ± 0.58
1.21 ± 0.49

49.6
39.9
54.9
16.1
39.7
40.3
38.2
11.2
15.6

a）SMMX の未変化体，b）SMMX のアセチル体，c）平均値±標準偏差＞脳，肺であった。特に，B.bronchiseptica の感をいただいた当時の酪農学園大学大学院獣医学研

染部位である鼻甲介における SMMX および Ac-

究科平棟孝志教授，梁川SMMX の濃度は，それぞれ 7.09 および 6.98μg/

種池哲朗教授に深甚の謝意を表します。また，御g であった（表 10）。

指導をいただいた当時の第一製薬㈱開発研究所特薬研究センター

（4）考

察

舘

良教授，阿部光雄教授，

裕センター長，第一製薬㈱特薬開発部加藤正博部長，傍士和彦博士に感謝の

本試験の結果から，鼻甲介における SMMX は意を表します。さらに，実験遂行上御協力をいた

7.09μg/g が分布することが明らかとなった。サ

だいた当時の第一製薬㈱開発研究所坂下昭夫氏をルファ剤耐性 B. bronchiseptica の莢膜合成を阻止

はじめ関係各位の皆様に感謝の意を表します。

するには SMMX が 1.56 〜 3.13 mg/L 以上の濃度が必要であるが，それ以上の濃度の SMMX が鼻甲介に分布することが示唆され，薬物動態学的にも SMMX による莢膜合成阻止作用が in vivo でも

要 約
豚萎縮性鼻炎（AR）対策として主にサルファ十分生じることが推察された。

剤とテトラサイクリン系が長年にわたり用いられ

6 ．謝ており，サルファ剤に対する耐性菌が多く分離されるようになった。しかし，サルファ剤耐性の B.

辞bronchiseptica が分離されるにもかかわらず，臨
本研究は，著者が第一製薬㈱開発研究所特薬研

床的あるいは病理的にサルファ剤の効果が認めら究センターに所属していた時に実施したものであれる現象が多く見受けられる。著者は，スルファる。本研究の遂行にあたり御指導と論文の御校閲

モノメトキシン（SMMX）の存在下で培養したサ桑野昭／サルファ剤の B. bronchiseptica 莢膜合成阻止／ 31（2009） 23

ルファ剤耐性 B. bronchiseptica の莢膜が欠損する

引用文献

現象を偶然発見した。このことから，
SMMX は B.
bronchiseptica のⅠ相菌が豚の鼻粘膜上皮細胞へ

1 ）Ishikawa H, Isayama Y: Bordetella bronchisepticaの付着因子として重要な莢膜の合成を阻止する作

phase variation induced by cr ystal violet. J Clin用を有することが示唆され，一連の検討を加えた
ところ，次のことが明らかとなった。in vitro に2 ）Kuwano A: Inhibitor y effect of sulfamonometh-

おいて SMMX の莢膜合成阻止作用は SMMX 耐

oxine on capsule antigen formation of Bordetella性菌のみで生じ，その最小作用濃度は 1.56 〜 3.13

bronchiseptica.Zentralbl Veterinarmed B, 38,

mg/L であった。また，SMMX 耐性菌（Ⅰ相菌）685-688 (1991)

Microbiol, 23, 235-239 (1986)の人工感染豚において，SMMX 投薬群で AR 病3 ）Kuwano A, Ito T, Tachi H: Comparison of the in-

変の抑制がみられ，かつ，鼻甲介粘膜上皮細胞

hibitory effect of sulfamonomethoxine and otherにおける付着菌数の低下をきたしたことから，invivo においても SMMX による莢膜合成阻止が示

sulfonamides on the capsule formation of Borde-

唆された。

tella bronchiseptica. J Vet Med Sci, 54, 1057-1059(1992)

また，豚に使用される 9 種のサルファ剤のなか4 ）桑 野昭， 舘裕， 石 井 良 和， 加 藤 正 博：で，化学構造的にピリミジン環およびピリダジン

Bordetella bronchiseptica の莢膜抗原形成に及ぼす環に -OCH3 基（MeO 基）を有するサルファ剤がB. bronchiseptica の莢膜合成を強く阻止するととスルファモノメトキシンの影響．日本獣医師会

もに，SMMX のように MeO 基を 1 個有するサル5 ）尾形学監修：豚の萎縮性鼻炎，32-34，文永堂，

雑誌，46，463-468（1993）

ファ剤が最も強い活性を示すことが明らかとなっ東京（1979）た。さらに，薬物動態学的な面から SMMX の分

6 ）宇 田 庸 子， 石 川

整： サ ル フ ァ 剤 の Bordetella

布状況を調べた結果，豚の鼻甲介には 3.13 μg/g以上の濃度で分布し，in vivo でも本剤による莢

bronchiseptica 菌体シアル酸特異的赤血球凝集素

膜合成阻止作用が十分惹起されることを示唆する

収録集，21-23（1994）

成績を得た。

に対する影響．滋賀県家畜保健衛生所業績発表
7 ）Yokomizo Y, Shimizu T: Adherence of Bordetella
bronchiseptica to swine nasal epithlial cells and its
possible role in virulence. Res Vet Sci, 27, 15-21(1976)

Inhibitory Effect of Sulfamonomethoxine on Capsule Antigen Formation of Bordetella bronchiseptica
Akira KUWANO
Tukuba Research Center, Hamri Co., Ltd., 2654-3, Osaki, Koga-shi, Ibaraki 306-0101, Japan
Bordetella bronchiseptica phase I organism possesses a capsule and has the ability to agglutinate with K antiserum,
although phase III organism lacks both. The present study examined the effect of sulfamonomethoxine (SMMX) on
capsule formation of B. bronchiseptica. The result are summarized as follows.
1. Three SMMX-resistant strains of B. bronchiseptica phase I organisms showed loss of agglutinability with K antiserum by culturing them at a higher concentration of 1.56 mg/L of SMMX. These results indicated that capsuleformation of SMMX-resistant B. bronchiseptica is inhibited by SMMX.

24 動物抗菌会報 31（2009）
2. SMMX in form of a feed added at the level of 500 ppm was administered consecutively from one day before bacterial
inoculation to the day of autopsy, which was performed 11 and 25 days after bacterial inoculation. The SMMX-administered group showed distinct inhibition of bone atrophy of the concha nasalis (AR lesion) both macroscopicallyand electron microscopically, in contrast to the control group. Decrease in viable cell count of B. bronchiseptica in
the concha nasalis was noted in the former group. The serum agglutination titer in the former group decreased toa low value. The capsule formation of SMMX-resistant B. bronchiseptica would thus appear to be inhibited in thepresence of SMMX on the pigs concha nasalis, leading to inhibition of AR lesions.
3. The inhibitory effect of SMMX and other sulfonamides on the capsule formation of sulfonamide-resistant B. bronchiseptica was investigated. All the sulfonamides having MeO (-OCH3) groups inhibited the capsule formation of
B. bronchiseptica. Strong inhibition was obtained with SMMX. Inhibition was not seen with sulfonamides having no
MeO groups.
4. The turbinate bone concentration of SMMX was about 7 μg/g at Tmax of serum (4 hours after oral administrationof 25mg/kg). On the other hand, the concentration of SMMX in serum continued high level until 6 hours after oral
administration of SMMX. These results show that the concentration of SMMX in turbinate bone of pigs is higher
than minimum inhibition capsule formation on SMMX-resistant B. bronchiseptica.

討論（座長：澤田拓士 日獣大）

質問（原田和記，日獣大）B. bronchiseptica についてサルファ剤が莢膜合成阻
止作用を有するというご発表内容であるが，莢膜を子解析などが行われたという報告等がありますか。
答（桑野

昭）

他の菌で同様の現象（作用）が認められたといった有する他の菌種でも同様の現象が起こりうる可能性

報告は見当たりません。また，本現象の遺伝子解析があるかどうか，お考えがあれば聞きたい。

についても報告はありません。

答（桑野

昭）

もし，多剤耐性菌などが増えてきて，抗菌薬がほまず薬剤については，サルファ剤以外の数種の系

とんど効かない時代がきたとき，病原菌の病原性や統の抗菌性物質でも試したが，特に効果は認められ毒素をなくす方法も対応策の一つとして考えるのがなかった。また，他の菌種についても検討する予定

よいと思われる。

であったが，途中で断念した経緯がある。
質問（澤田拓士，日獣大）①サルファ剤で莢膜形成が阻止された菌の毒素（ＤＮＴ）産生性は，②他の菌で同様の現象（作用）が認められたといった報告があるか，③本現象の遺伝発言（藤倉孝夫，動物衛生研究所 OB）
莢膜を欠如した菌種としては B. bronchiseptica が知られており，現在でも弱毒ワクチン株としてアフリカ各地などで広く使われている。