Technical Note: No. S1008

水移動相で C18 カラムは使えるの？
アルキル基は立ってるの？寝込んでいるの？
《水・緩衝液を用いた逆相カラムの保持挙動および固定相としてのアルキル基の存在状態について》

株式会社クロマニックテクノロジーズ

長江徳和が 2007 年に開発された．全多孔性充塡剤で 1.5 倍

１．はじめに1969 年にカークランドにより発表された HPLCの理論段数を得るためには粒子径を 2/3 にする必要

Chromatography)1)は半世があり，カラム背圧が 2 倍以上になってしまう．粒紀以上の歳月が経過し，様々な改良がなされ高性能子径の微小化によるカラム背圧の上昇を伴うことな化が進み，医学・薬学，食品，環境，工業製品など

く 理 論 段 数 の 向 上 可 能 な Superficially porous

多くの分野での分離分析の手法として欠かすことのparticle 技術は将来の方向性を大きく変えることにできないものとなっている．最初の HPLC 用充塡剤なると思われる．

(High Pressure Liquidは直径 30 μm のガラスビーズに 0.5μm の多孔質層HPLC を用いた分離分析には様々な試料が試みらを表面に形成させた表面多孔性充塡剤 2)であった．

れており，アミノ酸や糖のような高極性化合物から，

これは現在の Superficially porous particle (silica)，

トリグリセリドやカロチノイドなどの脂溶性化合物

通称コアシェルの元祖である．その後 1972 年以降など，極性（疎水性）の大きく異なる試料が分離分は全多孔性シリカが HPLC 充塡剤の主流になり，粒析されている．これらの試料の逆相 HPLC 分離には，子形状も破砕形から球形に，粒子径も 10 μm から

ほとんど緩衝液のみの移動相を用いたり，逆に水を5 μm，3 μm と小さくなり 2,000 から 3,000 段の理含まない有機溶媒のみ，さらにクロロホルムなどの論段数から 20,000 段以上の理論段数が得られるよ疎水性溶媒を移動相として用いられることがある．

うになった．現在では粒子径が sub 2 μm (1.8 μm

逆相分離では C18 (ODS) が最も多く使用されていな ど ) ま で 小 さ く な り ， UHPLC (Ultra High

るが，有機溶媒濃度が 5%以下の移動相条件では保Performance Liquid Chromatography) 装 置 を

持時間の再現性が低くなることから，この移動相条用い高速・高理論段数の分離が達成されるようにな

件では C18 の使用を避けるべきだと言われてきた．

った．最も多用される逆相モードの固定相・充塡剤

実際通常の C18 は緩衝液のみの移動相を用いた場も改善が進んでおり，特にシリカ系逆相充塡剤の性合，保持時間が徐々に減少する．本稿では水・緩衝能を左右する残存シラノール基の処理（エンドキャ

液のみの移動相を用いた場合の逆相充塡剤の状態をッピング）技術も大きく進化した．35 年前はトリ考察し，保持時間の減少の原因やその解決策を提示

エチルアミンを移動相に添加し，残存シラノール基する．また，2000 年以前は水移動相条件下ではに吸着させることによりシラノール基の影響を封鎖

C18 固定相のアルキル基は立ち上がっている状態していたが，現在では高度なエンドキャッピング処

から寝込むことにより保持が減少すると解釈 4)する理により，移動相に何も添加しなくても塩基性化合ことが常識であったが，実際には C18 固定相のア物がテーリングすることのない充塡剤（充塡カラム）

ルキル基はどのような状態であるのか，メタノーが利用できようになった．さらに革新的な基材とし

ル・水，アセトニトリル・水，テトラヒドロフラて，前述した Superficially porous particle の粒子

ン・水系の移動相たけでなく，クロロホルムなどの径を 2.7 μm まで小さくし全多孔性シリカ基材に比有機溶媒も含めた場合の考察を行った．

べ 1.5 倍の理論段数が得られようになった充塡剤 3)- 1 -２．水および緩衝液を移動相として用いた場合の2.2

細孔径の異なる 5 μm のシリカゲルにアルキル鎖

逆相固定相
2.1

アルキル鎖長および充塡剤細孔径の影響

水を移動相として用いた場合の C18 カラムの保持挙動

長の異なる，C30，C18，C8 及び C1 (TMS，トリ
メチルシラン) の一官能性試薬を過剰量で反応させ，

C18 固定相を代表とする逆相固定相において，さらに TMS でエンドキャッピングを施した各充塡

100%水系の移動相を用いた場合，保持が減少する剤について，1 時間の送液停止前後の保持時間の減ことはよく知られている．従来 90%以上の，特に少を 10 mM リン酸緩衝液移動相で測定 5-7)した．

95%以上の水を含む移動相は保持の再現性が低くな

その結果を図 2 に示す．横軸の細孔径はシリカ基

るため，これらの移動相は逆相固定相では避けるべ

材ではなく，それぞれの固定相（アルキル基）が結き移動相として扱われてきた．図 1 には細孔径 10合した後の窒素ガス吸着法により測定した充塡剤のnm の C18 固定相と水移動相を用いた場合の亜硝細孔径である．アルキル鎖長が異なっていても，細酸ナトリウムと 2-プロパノールの 40℃での保持の孔径が大きいほどポンプ停止後の相対保持時間は変化を示す．全く保持せず溶出する時間(t0)を測定

100%に近くになり，細孔径が小さいほど保持持間する成分として亜硝酸ナトリウムを用いた．C18は減少した．細孔径 15 nm の比較では C18 より

カラム内を水移動相に置換し，さらに保持を測定す

C8 の方が保持時間の減少率は高く，また C18 がる間，カラム出口以降に背圧をかけた．1 時間以上80%の保持時間減少を示す細孔径 10 nm でも C30

送液しカラムが安定した後，試料を注入して得られは数%のみの保持時間の減少であり，C8 からアルたクロマトグラムを上段の A に示す．また，そのキル鎖長が長くなるほど，保持時間の減少し始める

後 1 時間送液ポンプを停止し，再度送液開始した後細孔径が小さくなった．アルキル鎖長の最も短いに得られたクロマトグラムを下段の B に示す．1 時

C1 は 8 nm 以下の細孔径で急激に保持時間は減少

間の送液停止後の亜硝酸ナトリウムの溶出時間(t0)した．

と 2-プロパノールの保持時間が両方とも減少した．
一般には t0 の減少は考えられないが t0 の減少が起こった．

図 2 充塡剤細孔径と水移動相条件下の相対保
持時間との関係図1

Column, C30 (○), C18 (□), C8 (●), and TMS (Trimethylsilyl silica) (♦); column dimensions, 150 mm x
4.6 mm; mobile phase, 10 mM phosphate buffer(pH7.0); flow rate, 1.0 mL/min; column pressure, 6.0
MPa; temperature, 40 ºC; detection, UV at 254 nm;
sample, thymine. 相対保持時間は初期に対する 1 時間送液停止後の相対値とする．

水移動相条件下の C18 カラムの保持挙動(A)は初期状態，(B)は 1 時間送液停止後再度測定; Column,
150 mm x 4.6 mm, 5 μm dp C18, 10-nm pore size;
mobile phase, water; flow rate, 1.0 mL/min;column temperature, 40 ºC; detection, refractive
index; peaks, 1 = sodium nitrite (t0), 2 = 2-propanol.
カラムの出口以降に 1.7MPa の背圧をかける．

- 2 -

2.3

保持時間が減少する原因

互作用が起こらないため，保持時間が減少したと考

アルキル基の寝込みにより保持時間が減少するのえられる．

であれば，細孔径が 22 nm 以上の C8 や C18 固定
相の保持時間の減少度合いが少ないことは，アルキ

2.4

ル基が寝込んでいないことになるのか．また，C1

毛管作用は次式で表される．

は物理的にアルキル基の寝込みは起こりえないが，

h=2γcosθ/rρg

毛管現象

8 nm 以下の細孔径では保持時間は減少した．これ

ここで h は毛管の内外の液面の高さ，r は管の半径、

らの結果によりアルキル基の寝込みでは保持の減少

ρ は液体の密度、γ は液体の表面張力、θ は接触角、を説明のできないことが確認された．図 1 での実験

g は重力加速度である．ガラス製の細管は水に濡れにおいて，ポンプ停止後ポンプ出口での圧力表示がるすなわち接触角が 90°以下であるため，水にガラ

0 MPa になった後，すぐにカラム in 側のカラムエ

ス細管を接触させると重力に反して細管内を水面はンドに密栓をし，カラム出口からの移動相の溶出量上昇する．また，ポリテトラフルオロエチレンを測定すると，初めの 1 分間で 0.3 mL，その後の(PTFE)細管は水に濡れない，すなわち接触角が 90°

9 分間で 0.29 mL の移動相がカラムからの溶出する以上であるため PTFE 細管を水に接触させるとガラことが確認 5)された．溶出量は合計で 0.59 mL であス細管とは逆に水面は下がるようになる．逆相充塡り，図 1 の 1 時間ポンプ停止後に短くなった亜硝剤の細孔内部は C18 などのアルキル基が結合して酸ナトリウムの溶出時間(t0)に一致した．つまり，

おり，PTFE 細管と同様に水に濡れないために，毛ポンプを停止し放置している間にカラム内から移動管現象により，細孔から水を抜け出させる力が作用

相が抜け出ている．カラム内部の粒子間隙または充する．図 2 に示されているように，充塡剤細孔径が塡剤細孔内部のどちらか，または両方の移動相が抜小さくなるほど保持が減少しているのは毛管現象にけ出ていることになるが，次項以降に述べられていよるもので，毛管作用の式が表している液面の高さるように，毛管作用により充塡剤細孔内部の移動相と管の半径は反比例関係であり，充塡剤細孔径が小が抜け出たと結論 8)付けられた．図 3 にポンプ停止

さいほど，毛管作用により発生する細孔内から移動

後の充塡剤細孔内からの水（移動相）の抜け出す状

相を抜け出させる力が大きくなることを示している．

態の概略図を示す．溶質は固定相と移動相とに分配

また，毛管作用の式の他のパラメーターとして，液して保持されるが，充塡剤細孔内に移動相が存在し体の密度 ρ と液体の表面張力 γ が作用しているが，ておらず，固定相の大部分は充塡剤細孔内にあり，移動相の塩の種類・濃度やカラム温度を変えること移動相が抜け出た細孔内では固定相と移動相との相により，これらのパラメーター値は変化する．例えば水のみ，10 mM 酢酸アンモニウムおよび 100
mM 酢酸アンモニウム移動相を用いて，40℃でポンプ停止 1 時間後の保持時間の減少率を比較すると，塩濃度が高いほど保持時間の減少率は低く，水のみの移動相では 90%以上であるが，100 mM 酢酸アンモニウム移動相は 70%であった．さらに 1-オク
タンスルホン酸ナトリウム などのイオンペアー試
薬を 10 mM のリン酸緩衝液と共に移動相として用いると，1 mM の 1-オクタンスルホン酸ナトリウ
ムの場合には保持時間は 50%減少するが，10 mMの 1-オクタンスルホン酸ナトリウムでは保持時間

図 3 C18 充塡剤の細孔内の水の存在状態の概略図の減少率は 0%で，保持時間の変化は認められなかった．塩やインペアー試薬の添加は移動相の表面張- 3 -力を下げるために，毛管作用が減少したと考えられこの状態からカラム出口以降に内径 0.1 mm の配管る．またイオンペアー試薬の場合にはこのイオンペを接続し，カラム出口以降に背圧をかけた． 2.5

アー試薬の極性部が表面に出るような状態で固定相

MPa の背圧時が①で 11 MPa，16 MPa およびに吸着するため，イオンペアー試薬を吸着した固定

30Mpa は②，③および④である．30 MPa の背圧

相は水との接触角が 90°に近づき毛管作用が減少をかけ，相対保持時間が 100%になった状態から送したとも考えられる．図 1 で示した図は 40℃のカ液を止めずにカラム出口以降の背圧を 5MPa まで

ラム温度での保持時間の減少率であったが，カラム下げた状態が⑤である．②のカラム出口以降の背圧温度を下げることによりこの減少率は下がる．

が 11 MPa の場合はカラム自身に 6 MPa の圧力が30℃では 50%の，10℃では 10%の保持時間の減少かかるため，カラム入口の圧力は 17 MPa となる．

になり，5℃では保持時間の減少率は 10%以下とな

カラム出口以降の背圧を上げている曲線から，一度り，ほぼ問題なく使用できるようになる．温度を下充塡剤細孔内から移動相が抜け出した後は 16 MPa

げると移動相の表面張力は上がるので，毛管作用はの圧力がかかった状態で初めて充塡剤細孔内に水移増大し，充塡剤細孔内から移動相は抜け出しやすく

動相が入り込んでいる．②の状態はカラム入口からなり，保持時間の減少は大きくなるはずであるが，数パーセントの充塡剤細孔内に移動相が入り込み，

実際にはその逆であった．これは温度が下がること

その分相対保持時間が上昇した．③の状態ではカラによる固定相と移動相との接触角の減少の方が毛管ム内の 90%近くの充塡剤細孔内に移動相が入り込作用に，より大きく寄与するためだと推察される．

み，相対保持時間は約 90%まで回復した．④のよ
うに 30 MPa 以上の圧力がかかった状態では全て

2.5

毛管現象のヒステリシスの充塡剤細孔内に移動相は入り込んでいる．⑤の状

自然界ではヒステリシスが起こることがよく知ら態は④と同じで充塡剤細孔内には移動相は抜けるこれている．例えば外部磁場（横軸）と磁化（縦軸）となく全て入り込んでいる．つまり，いったん充塡

の関係を示したグラフはヒステリシス曲線と言われ剤細孔内から移動相が抜けた状態では細孔内に移動ている．また，物質の融点測定においても，温度を相が入り込むためには 16 MPa の圧力が必要とな

融点以下から上げて測定した値と，融点以上から下るが，細孔内に移動相が入り込んでいる状態では 5

げて測定した値は異なることもヒステリシスとして

MPa の圧力がかかっていれば細孔内から移動相は知られている．図 4 には毛管作用による充塡剤細孔

抜け出すことはない．これが充塡剤細孔内部で起こ

内からの移動相の抜け出し（相対保持時間の減少）っている毛管作用のヒステリシスである．充塡剤細とカラム出口以降の背圧との関係，およびカラム内

孔内に移動相が入り込んでいる状態で，カラム出口の充塡剤細孔内の移動相の存在状態を示す．クロマ

以降の背圧を 0 MPa にしてもすぐには細孔内からトグラフィーの条件は図 1 と同じである．ポンプを

移動相は抜け出さず，数時間かけてカラム出口付近

1 時間停止後相対保持時間は 8%まで下がっている．

の低い圧力しかかかっていない充塡剤細孔内から移

図4

カラム出口以降の背圧と相対保持時間の関係とカラム内の充塡剤細孔内の水の存在状態

Column, 150 mm x 4.6 mm, 5 μm dp C18, 10-nm pore size. 他の条件は図 1 と同じ．

- 4 -動相が抜け出す．その結果相対保持時間は 77%にきくなるため，撥水性（水との濡れにくさ）も同様なった．

に大きくなると考えがちであるが，実際にはその逆

C18 固定相でもカラム出口以降に背圧を加えるであった．疎水性は水との混ざりにくさであり，n-ことにより水移動相でも十分な分離が達成される．

オクタノールと水との分配比の対数 (LogP) で定これらの固定相と移動相は濡れることはなく，0.2

義されるが，撥水性は水との接触角で定義される．

nm から 0.3 nm の隙間が空いた状態の界面で接し定義自体が異なる両パラメーターに対して相関性がていると考えられる．お互いが混ざり合わないヘキ

ないことは決して不自然ではない．表 1 にトリフル

サンと水を用いて溶質を液液分配させることと同様

オロメタン(CHF3)，オクタン (C8H18)，オクタデカに，C18 固定相と水移動相はある界面で接していン (C18H38)およびトリアコンタン (C30H62) の水のれば溶質はそれぞれの相に分配することができる．

接触角，疎水性および水への溶解度を示す．トリフ

固定相に溶質が分配できれば保持でき，分離するこ

ルオロメタンは疎水性が低いにも関わらず，水とのとができる．従来言われてきた｢固定相は移動相に接触角は大きく，オクタデカンと同程度の撥水性を濡れないと分離できない｣は実は｢充塡剤細孔内に移示している．

動相が存在していないと分離できない｣と表現すべきであると考えられる．

海外では“Dewetting”という言葉で保持時間の減少を説明することが多く，水・緩衝液移動相を用いると，固定相のアルキル基が立ち上がっている状態

2.6(Wetting) から寝込んでしまい，固定相が移動相と各固定相と水との接触角

図 4 の結果からここで用いた C18 充塡剤の細孔

濡れない状態 (Non-wetting) に変化し，保持時間内に水移動相が入り込む圧力を 16 MPa とした場は減少する．そして同時に細孔内からも移動相が抜合，実測の細孔半径 5.2 nm と 40℃の水の表面張力

け出すと主張するクロマトグラファーがほとんどでcm-1 を用いて，毛管作用の式からこのある．固定相は移動相と濡れていれば固定相と移動

C18 固定相と水との接触角を計算すると，126°の相への溶質の分配が起り，その結果溶質は保持され値が導き出された．また，図 2 の相対保持時間がるが，アルキル基が寝込み濡れなくなると固定相と50%の時のそれぞれの固定相の細孔径を求めると，移動相への溶質の分配が起らず，溶質は保持されな

C30 は 5.3 nm，C1(TMS)は 6.9 nm，C18 は 13.2

くなると解釈されている．この解釈に則ると，図 1

nm および C8 は 17.1 nm となる．図 2 の相対保持の A のクロマトグラムは 2-プロパノールを保持し時間が 50%になったときのそれぞれの細孔径と接ているので，安定化のための 1 時間以上の送液時に触角の余弦関数値(cosθ)が比例すると仮定すると，は C18 ア ル キ ル 基 は 立 ち 上 が っ て 移 動 相 に毛管作用の式を用いて C18 固定相と水との接触角

Wetting している状態であり，送液ポンプを停止す

126°から，他の固定相の接触角を逆算することがでると C18 アルキル基は寝込みだし Non-wetting のきる．その結果は C8 固定相は 140°，C1(TMS)固状態に変化することになる．図 2 に示されているよ定相は 108°，C30 固定相は 104°となった．C8 固

うに，水移動相は固定相に濡れていないが，毛管作定相が最も接触角が大きく，C8 よりもアルキル鎖用で働く圧力以上の圧力が充塡剤周りにかかってい長が長くなると接触角は小さくなり，水に濡れやするため，充塡剤細孔内に留まっており，送液を停止くなった．疎水性はアルキル鎖長が長くなるほど大し，充塡剤周りの圧力が毛管作用で働く圧力以下の69.6 dyne

表 1 トリフルオロメタン，メタン，オクタン，オクタデカンおよびトリアコンタンの物性- 5 -大気圧まで下がると，移動相は充塡剤細孔内から抜塡剤は適さない．通常の C18 固定相でも充塡剤細

け出す．つまり固定相は最初から水移動相に濡れて孔内から水移動相を抜け出さないように条件設定でおらず，濡れていないからこそ送液停止すると移動

きれば保持時間の再現性を上げることができる．一相が充塡剤細孔内から抜け出す．後の項目で詳細に例として内径 4.6 mm の C18 カラムを 40℃で水移述べるが，充塡剤細孔内から移動相が抜けた後，メ動相を用い，流速 1 mL/min で送液した場合，カラ

タノール/水=30/70 または 50/50 の移動相を通液

ム出口以降に 5 MPa 背圧がかかるように内径 0.1

しても，充塡剤細孔内にこの移動相は入り込まなく，mm，長さ 500 mm の配管を接続し，測定開始前保持は回復しない．メタノール/水=30/70 またはにはカラム内にメタノールまたはアセトニトリル濃50/50 移動相が C18 固定相に濡れるのであれば，度が 70%以上のメタノール/水またはアセトニトリ

毛管作用により充塡剤細孔内へ移動相を入り込ませ

ル/水移動相が入った状態にして，その後水移動相る力が働くが，実はメタノール/水=30/70 またはを通液開始し，送液を止めることなく，カラム圧を50/50 移動相も C18 固定相には濡れない．メタノ

維持し続ければ再現性のある分離が可能となる．こール濃度を 70%まで上げたメタノール/水=70/30

れはカラム内が水移動相に切り替わり始める時点か

移動相は C18 固定相を濡らすため，この移動相はら 5 MPa 以上の圧力がかかり続けることにより，充塡剤細孔内に入り込み，保持は回復する．このこ

毛管作用による充塡剤細孔内からの移動相の抜け出とから水移動相は最初から C18 固定相に濡れておしを抑えるためである．測定後に有機溶媒濃度の高らず，wetting 状態にはなっていない．したがって

い移動相でカラム洗浄を毎回行えば，水移動相でもDewetting は Wetting 状態から Non-wetting 状

連続して送液している限り，保持の再現性の高い分態に変化することであるならば，水移動相を C18離ができる．

カラムに通液した場合の保持時間の減少に対して

近年は C18 固定相でも水移動相を用いても保持

Dewetting と表現することは適切ではないと考え時間の再現性が高い AQ タイプが入手できるが，られる．図 2 にあるように，水移動相は C18 固定

この AQ タイプの C18 固定相は C18 アルキル基

相に濡れていないが細孔内に存在している．これは（ステアリル基）の結合密度を下げ，エンドキャッ

浸透している(Permeating)と言うべきであり，さピングである TMS の結合密度を上げ，固定相の性ら に 充 塡 剤 細 孔 内 か ら 抜 け 出 す 事 は質を TMS に近づけたり，極性の高い試薬を用いてDepermeating と言う表現がこの事象をより的確

エンドキャッピング処理をしたり，極性基埋め込みに表していると考えられる．

型のアルキル基を結合したりし，水との接触角を小さくしている．これらの処理を施した C18 固定相

2.7

水および緩衝液を移動相として用いた逆相分

離の再現性は通常の C18 固定相より固定相自身の疎水性が下がることから，移動相中の水がシリカ表面に接触し今までに述べてきたように，水・緩衝液移動相をやすくなり，酸によるアルキル基の加水分解やアル用いた場合の保持時間の減少は充塡剤細孔内からのカリによるシリカ自身への加水分解が起こりやすく，移動相の抜け出しが原因であった．この移動相の抜カラム寿命が短くなる欠点がある．C30 や C28 のけ出しを抑えるためには固定相への水の接触角を小ような長鎖アルキル基固定相は極性を上げるような

さくすればよく，C1 (TMS) や C30 などのアルキ処理を施していないため，水移動相条件での保持時

ル鎖長の長い固定相を用いることである．また細孔間の再現性を維持しつつ，かつ高い耐久性を示す．

径の大きな充塡剤を用いても保持の再現性は高くなるが，細孔径が大きくなるほど充塡剤の比表面積は3.

メタノール/水移動相の C18 固定相への濡れ性

小さくなり，保持が小さくなるので，保持時間を長

水が C18 固定相に濡れないことは，水移動相をくするために移動相の有機溶媒比率をゼロ近くに下用いると保持時間が減少することから確認できたが，げている場合には，細孔径が大きく保持の小さい充

メタノール/水=30/70，50/50 及び 70/30 の移動相

- 6 -

は C18 固定相に濡れるのか濡れないのか．これら

ように送液停止すると充塡剤細孔内から移動相が抜の移動相を用いて保持時間が変化することはないた

け出し保持時間が減少するが，その後メタノール/

め，また従来は濡れてないと固定相と移動相に溶質

水=50/50 移動相を流しても保持時間は回復しない．

は分配できないと考えられていたため，当然 C18

これはメタノール/水=50/50 溶液は C18 固定相に

固定相にこれらの移動相は濡れると考えられていた．

濡れず充塡剤細孔内に入り込まないためであり，逆

図 5 にはメタノール/水の混合溶液を用いた時のにメタノール/水=70/30 移動相を流せば保持時間がC18 充塡剤の分散状態を示す．A はメタノール/水回復するのは，メタノール/水=70/30 溶液は C18=30/70，B はメタノール/水=50/50，C はメタノー

固定相を濡らすため，充塡剤細孔内に入り込むため

ル/水=70/30 溶液を用いた．図 1 で用いた C18 カである．メタノール/水=50/50 溶液は C18 固定相

ラムに用いられた充塡剤と同じ C18 充塡剤を十分に濡れないのであれば，この溶液を移動相として用乾燥してそれぞれの溶液に投入し，超音波振動を加いると毛管作用により充塡剤細孔内から移動相を抜えながらかき混ぜた． A は全く分散せず，すべてけ出させる力が働くはずであるが，実際には充塡剤の充塡剤が液面上に浮いていた．B は一部の充塡剤

細孔内から移動相は抜け出さず，保持時間の減少はが分散したが，多くの充塡剤は A と同様に液面上起こらない．これは図 4 で示されているように細孔に浮いていた．C では充塡剤は溶液に分散し沈降し内へ浸透させる力と細孔内から排除させる力が大き始めていた．つまり C のメタノール/水=70/30 溶

く異なっているためで，メタノール/水=50/50 溶液

液は C18 固定相に濡れることを示しており，毛管を C18 充塡剤細孔内へ浸透させるには大気圧では不十分で，メタノール/水=50/50 溶液が C18 充塡
剤細孔内にあらかじめ入っている場合に細孔内から抜け出させる圧力（力）は大気圧より低いためである．充塡剤周りの圧力を真空乾燥器内で 0.01 MPa（約 0.1 気圧）にしてカラムから抜け出した移動相の重量をカラムの重量減として測定した結果を図 6に示す．メタノール/水=10/90，30/70，50/50，
70/30 及び 80/20 の溶液を封入したカラムを温度

図 5 メタノール/水の混合溶液中で超音波振動を加えた状態で撹拌した C18 充填剤の分散状態
Packing material, 5 μm dp C18, 10-nm pore size;
solution, A = methanol/water=30/70, B = methanol/w
ater=50/50, C = methanol/water=70/30.

作用により充塡剤細孔内へ溶液が簡単に入り込み溶
液中に分散した．A のメタノール/水=30/70 溶液は
C18 固定相には濡れず，液面上に浮いており，B の
メタノール/水=50/50 溶液は超音波振動のエネルギーで一部の C18 充塡剤は分散したが，ほとんど液面上に浮いていることは C18 固定相はこの溶液にも濡れないことを示している．図 1 に示されている

- 7 -

図6
関係

移動相中のメタノール濃度とカラム重量のColumn, 250 mm x 4.6 mm, 5 μm dp C18, 10-nm
pore size; enclosed solution, methanol/water =10/90, 30/70, 50/50, 70/30, 80/20; temperature, 40 ºC.
カラム重量の差は初期と 20 分間 0.01 MPa の圧力に維持した後の重量差を測定した．

40℃に設定した真空乾燥器に入れ 0.01MPa の圧力

ら，メタノールとは混ざらない．オクタデカン

下に 20 分間静置し，カラムの重量減を測定した．

(C18H38) はロウソクのロウのような状態であり，メタノール/水=70/30 及び 80/20 溶液は C18 固定

オクタデカンはヘキサン以上にメタノールとは混ざ相に濡れるため，カラムの重量減はほとんどなかっ

らない．C18 カラムにメタノールを移動相としてた．しかし他の溶液はカラム重量が下がっており，通液した場合に C18 固定相は隣接するステアリル

C18 充塡剤細孔内から溶液が抜け出していること

基間にメタノールが入り込んでステアリル基自身がを示している．つまりこれらの溶液は C18 固定相立ち上がるのか．実際にはそうではなく，ステアリに濡れず，毛管作用により働く細孔内から溶液を抜

ル基はメタノールとの接触面積が最低になるような

け 出 さ せ る 圧 力 （ 力 ） は 大 気 圧 よ り 低 く ， 0.01

コンフォメーションをとり，シリカ表面でステアリ

MPa よ り は 高 い こ と を 示 し て い る ． も し 0.01

ル基は折れ曲がった状態で固まっていると推測され

MPa の気圧の環境（高地）で HPLC を操作し，る．またテトラヒドロフラン (THF) と水との混合

C18 カラムとメタノール/水=30/70 移動相を用い溶液を移動相として用いた場合には，THF はオクタ

た場合，送液を停止すると，その後は保持時間が減

デカンを溶かすため，ステアリル基の塊の中に入り少してしまう．

込み，C18 固定相は THF で膨潤し，THF がある濃細孔径 10 nm の C30 充塡剤は水との接触角が度以上になると，隣接するステアリル基間に THF

104°で 90°より大きく，水には濡れないが，水移動は十分入り込み，ステアリル基は立ち上がるように相を用いても保持時間が減少しないのは，C18 カなると推測される．

ラムのメタノール/水=30/70 移動相使用時と同じで，
C30 充塡剤細孔径内から水移動相を抜け出させる

4.2

逆相固定相への有機溶媒和

圧力が大気圧より低いためで，大気圧によって水移図 7 に示されているように C18 カラムに水移動

動相は C30 充塡剤細孔内に押し込まれているため相を用いるとメタノール，エタノール，アセトニト

である．

リル，プロパノールは保持し分離される．アセトニ
トリル/水=1/99 移動相を用いた場合にもアセトニ

4．充塡剤の状態

トリルは保持し，保持係数(k)は 0.62 となる．同様

4.1にアセトニトリル/水=10/90 および 20/80 移動相

アルキル基の状態についての推測

今まで水移動相を用いた場合の逆相カラムの保持でもアセトニトリルの保持係数(k)はそれぞれ 0.36

時間減少の原因や，固定相および充塡剤細孔内の移と 0.32 となる．保持係数 (k) は固定相中の溶質成動相の存在について述べてきたが，固定相のアルキ分の存在量 (S) と移動相中の存在量 (M) の比としル基の状態については言及してこなかった．2000
年以前の保持時間の減少についての説明では，アルキル基が立ち上がって移動相と濡れている場合は保持があり，寝込むことにより保持はなくなるとされていた．また最近の特に欧米のクロマトグラファーの間では，充塡剤細孔内から移動相が抜け出ることを肯定しているが，アルキル基が寝込むことにより移動相は固定相に濡れなくなり，保持しなくなるが，それと同時に充塡剤細孔内から移動相が抜け出すと解釈されていることが多い．ではアルキル基の状態はどうのようになっているのであろうか．水移動相で C18 固定相のステアリル基は立ち上がっている
ことはあるのか．炭素数 6 のヘキサン(C6H14)です- 8 -

図 7 アルコールとアセトニトリルの C18 カラ
ムを用いた分離
Column, 250 mm x 4.6 mm, 5 μm dp C18, 10-nm
pore size; peaks, 1 = methanol, 2 = ethanol, 3 =acetonitrile, 4 = 1-propanol, 5 = 2-propanol. 他の条件
は図 1 と同じ．

mm カラム内には C18 および C28 充塡剤は約 1.5て表される．

g 充塡されており，炭素含有量 16%の C18 と炭素

k=S/M（S：固定相中の溶質の存在量，M：移動相中の存在量）

含有量 16%の C28 の固定相の容積は両方とも約移動相には決まった濃度のアセトニトリルが常時含0.35 mL と計算される．各有機溶媒の固定相への溶まれているため，アセトニトリル/水=1/99 移動相

媒和は移動相中の有機溶媒のある濃度で飽和していでの保持係数 0.62 は移動相中の 1%のアセトニトリ

る．また，THF の溶媒和量については，C18 固定

ル量の 0.62 倍の量のアセトニトリルが固定相中に相では固定相の容積とほぼ同じ量の有機溶媒が溶媒分配されていることになる．内径 4.6 mm，長さ和しており，C28 固定相では固定相容積の 1.5 倍の150 mm カラムで計算すると，C18 固定相へは有機溶媒が溶媒和している．これらの結果と前項の0.011 mL のアセトニトリルが分配されている．同推測からアルキル基の状態は図 9 に示されているよ様にアセトニトリル/水=10/90 および 20/80 移動

うに，メタノールは固まった固定相上に溶媒和して相では 0.059 mL と 0.101 mL のアセトニトリルがいるが，THF はアルキル基の間に入り込みアルキル

分配されている．この分配量は固定相への溶媒和量

基は立ち上がった状態になっていると考えられる．

と同一であると考えられる．メタノール，エタノー

同じ炭素含有量の C28 と C18 固定相でもアルキル

ルおよびテトラヒドロフラン(THF)について同様に鎖長の違いにより THF の溶媒和量は異なり，アル溶媒和を求めた．溶媒和した有機溶媒は固定相としキル基の長い C28 固定相の方が溶媒和量は多くなて働くため，溶媒和量の増加量分が移動相量（t0 のる．Schure ら 9）はコンピューターシミュレーショ

値）の減少分と一致した．有機溶媒量の多い移動相ンの手法を用いメタノール/水およびアセトニトリ

では保持係数の測定誤差が大きくなるため，t0 の値

ル/水移動相中での C18 固定相のアルキル基の存在の減少分を溶媒和量の増加分として総溶媒和量を求状態を考察している．温度 50℃の条件で，有機溶めた．移動相中の有機溶媒濃度と固定相への溶媒和

媒 0%の水のみの移動相ではほとんどアルキル基は量の関係を図 8 に示す．内径 4.6 mm，長さ 150

固まっており，メタノール/水=82/18 移動相中でも70%以上アルキル基は固まっていると結論付けており，本稿の溶媒和量からのアルキル基の状態の推論を肯定する内容となっている．

図 9 メタノールとテトラヒドロフラン(THF)の固定相への溶媒和4.3
図 8 移動相中の有機溶媒濃度と固定相への有機溶媒の溶媒和の関係
Column, 150 mm x 4.6 mm, 5 μm dp C18, C8 and C
30, 10-nm pore size; temperature: 40 ºC.

溶媒和した固定相による分離比較

図 10 にはメタノール/水=75/25 移動相とテトラヒドロフラン/水=50/50 移動相を用いた標準試料の分離を示す．6 番のアミルベンゼンの保持時間を比- 9 -に炭素含有量が同じ C28 と C18 は固まった状態で表面に少量のメタノールが溶媒和しており，溶媒和
している有機溶媒を含めた固定相の体積は C28 とC18 はほぼ同じであるため，同じ保持時間になったと考えられる．一方テトラヒドロフラン/水=50/50 移動相ではテトラヒドロフランの溶媒和量は非常に多く，図 9 に示されてようにアルキル鎖長の長い固定相ほど多く溶媒和しており，溶媒和している有機溶媒を含めた固定相全体では C28 が最も大きな体積になる．固定相体積が大きいほどアミル
ベンゼンの保持時間は長くなったと考えられる．メ
タノールとテトラヒドロフランによる保持時間の差
は溶媒和量が異なり，固定相の体積が大きく変化す
ることに起因していると推察される．しかしながら
アミルベンゼンより極性が高い 3 番ピークのフェノールの保持時間を比較すると，両移動相において固定相に関係なく保持時間はほぼ同じであった．メタ
ノール/水=75/25 移動相ではフェノールの保持時間が短く比較しづらいが，メタノール/水=30/70 移動相を用いるとフェノールの保持係数は約 3 になり，十分保持するようになる．この条件での比較でも，
C28，C18 および C8 の保持時間はほぼ同じであった．このようにアミルベンゼンとフェノールは大きく異なる保持挙動を示した．この現象はフェノールに限ったことではなく，極性が高い他の化合物でも
図 10

標準試料の分離同様であった．フェノールはアミルベンゼンよりも

Column, 150 mm x 4.6 mm, 5 μm dp, Sunniest C28,
C18 and C8; mobile phase, methanol/water=75/25
and tetrahydrofuran/water=50/50; flow rate,
1.0 mL/min; temperature, 40 ºC; detection, UV at
250 nm; peaks, 1 = uracil, 2 = caffeine, 3 = phenol,
4 = butylbenzene, 5 = o-terphenyl, 6 = amylbenzene,
7 = triphenylene.

極性が高いため，アミルベンゼンはオクタンやオク
タデカンに溶け，固定相全体と相互作用するのに対し，フェノールはオクタンなどに難溶で固定相内部に入り込むことがなく，固定相の表面付近でのみで相互作用していると推測される．固定相の表面は炭

較すると，メタノール/水=75/25 移動相では,炭素素含有量の大小に関係なく，シリカ基材が同じでれ含有量が同じ C28 と C18 はほぼ同じ保持時間となば，ほぼ同じ表面積であるため，保持時間はどの固り，炭素含有量の低い C8 は C18 の 1/2 以下の保定相でも同じになったと考えられる．

持時間であったのに対し，テトラヒドロフラン/水=50/50 移動相ではアルキル鎖長の最も長い C285.

高極性化合物と脂溶性化合物の分離が最も長い保持時間を示し，アルキル鎖長が短くな

核酸と有機酸の分離を図 11 と図 12 に示す．いるほど保持時間は短くなった．メタノールとテトラ

ずれも C28 固定相カラムと有機溶媒を含まない緩ヒドロフランではアミルベンゼンの各固定相の相対

衝液移動相を用いた．前述したように長鎖アルキル

的な保持時間は大きく異なった．メタノール /水

基は緩衝液のみの移動相でも安定した保持時間を示=75/25 移動相移動相では図 9 に示されているよう

し，なおかつ高い耐久性を示すため，高極性化合物- 10 -

コアシェル型充塡剤の特徴は，充塡剤粒子の内部に無孔性の核を有することと粒度分布が狭く粒子径が揃っていることにより，試料成分の拡散が抑えられることであり，この試料成分の拡散抑制が高理論段数を導き出す．
図 13 と図 14 にはトコフェロールとカロテンの分離を示す．通常の C18 カラムと C28 カラムの分離比較も同時に行った．トコフェロールの分離は逆
相 C18 カラムではベータトコフェロールとガンマ
図 11

トコフェロールの分離ができないため，従来はシリ核酸の分離

Column, Sunniest RP-AQUA (C28) 3 µm, 4.6 x 150 mm;
mobile phase, 20mM phosphate buffer pH6.0; flow
rate, 1.0 mL/min; temperature, 40 ºC; detection, UV
at 250nm; peaks, 1 = 5’-GDP, 2 = 5’-GMP, 3 = 5’-ATP,4= 5’-ADP, 5 = 5’-AMP.

カカラムを用い順相モードで行われていたが，C28
カラムを用いれば逆相モードでも分離可能である．
アルキル長鎖の長い C28 固定相は C18 固定相に比べ立体選択性が高く，異性体の分離に優れている
ため，ベータとガンマトコフェロールが分離できた．
またこれ以外に C28 固定相が C18 固定相より優れる点として，C18 のステアリル基よりも大きな分
子サイズの成分が C28 固定相で分離が良くなる傾向が強い．例えば糖が 2〜3 個結合した配糖体など
は C28 固定相を用いると大きく分離改善される．
アルファーとベータカロテンは C18 固定相でも

図 12

C28 固定相でも分離できるが，同じ炭素含有量の有機酸の分離固定相であるにも関わらず，C28 固定相は C18 固

Column, SunShell RP-AQUA (C28) 2.6 µm, 150 x 4.6 m
m; mobile phase, 0.025 M KH2PO4, pH2.5; flow rate, 1.
5 mL/min; temperature, 25 ºC; detection, UV at 210nm; Peaks, 1 = oxalic acid, 2 = tartaric acid,
3 = formic acid, 4 = malic acid, 5 = lactic acid,
6 = acetic acid, 7 = diglycolic acid, 8 = maleic
acid, 9 = citric acid, 10 = succinic acid,
11 = fumaric acid.

定相の 2 倍の保持を示し，アルファーとベータカロ
テンの分離度(Rs)は大きく改善され，C18 固定相は1.15 であるのに対し C28 固定相では 5.50 であった．天然物の分離ではアルファーとベータカロテンの間に溶出する成分の存在が知られており，C28の分離には適している．核酸分析においては，ピー

固定相ではこれらの成分が分離可能となる．トコフ

クテーリングを抑えるために高濃度のリン酸緩衝液

ェロールとカロテンの分離では同じカラムを用いてを用いることが多く，一般的に 100 mM リン酸緩いるが，メタノール/水移動相を用いたトコフェロ

衝液が移動相として用いられるが，図 11 の分離例

ールの分離では C18 カラムと C28 カラムで保持時

では，エンドキャッピングが十分施され，残存シラ間の差はほとんどないが，アセトニトリル/クロロ

ノール基の影響がほとんどないカラムを用いている

ホルム移動相を用いたカロテンの分離では両カラム

ため，20 mM 濃度のリン酸緩衝液を用いてもテーで 2 倍の保持時間の差が生じた．これは今まで述べリングしていない．有機酸の分離には粒子径 2.6てきたように疎水性の高いクロロホルムの溶媒和量μm の 表 面 多 孔 質 充 塡 剤 (Superficially porousは非常に多く，それぞれの固定相はクロロホルムに

particle, Core shell particle，コアシェル型充塡より膨潤し，アルキル基が立ち上がった状態になり，剤) カラムを用いており，高理論段数で高速分離を溶媒和した有機溶媒を含めた C18 固定相と C28 固達成している．コアシェル型充塡剤は従来の全多孔定相の体積が大きく異なるためであると考えられる．

性充塡剤と比較し，1.5 倍の理論段数を発揮する．

- 11 -

6．まとめ高極性化合物を保持させるために，移動相中の有機溶媒比率を下げ，最終的に有機溶媒を含まない移動相を用いることになった場合に起こる現象について述べてきた．さらに移動相中の有機溶媒の溶媒和について考察し，この溶媒和が分離に与える影響についても述べてきた．C28 固定相は高極性化合物
分離のための水・緩衝液のみの移動相使用時でも保持時間の再現性が高く，なおかつ耐久性も優れており，有機溶媒のみの移動相で脂溶性化合物分離する
場合にも，C18 固定相より優れている．今後，長鎖アルキル基の C28 カラムは C18 カラムと同様に逆相分離には欠かせないものとなると思われる．
文献
図 13

1)

トコフェロールの分離

Column, Conventional C18, Sunrise C28, C%, 18%;
column size, 250 x 4.6 mm; mobile phase, methanol/
water=97/3; flow rate, 1.0 mL/min; temperature:
25 ºC; detection, UV at 295nm;
HO
peaks, 1 = δ-tocopherol,
2 = γ-tocopherol,HO

3 = β-tocopherol,HO

4 = α-tocopherol.

HO

J.J Kirkland, J Chromatogr. Sci., 7 (1), 13-16(1969).
2)

J.J Kirkland, J Chromatogr. Sci., 7 (1), 7-12 (1969).

3)

J.J. Kirkland, T.J. Langlois, and J.J.

O

DeStefano, Am. Lab., 39, 18-21 (2007).

O

4)

Wolcott, G.R., Dolan, W. J. LC/GC, 17,316-321 (1999).

O

5)

O

N. Nagae, T. Enami, Bunseki Kagaku, 49, 887-893(2000).

分離度(Rs)=5.50

分離度(Rs)=1.15

6)

T. Enami, N. Nagae, Chromatography, 22, 33-39(2001).
7)

N. Nagae, T. Emani, S. Doshi, LC/GC, 20, 964-972(2002).
8)

T. Enami, N. Nagae, Bunseki Kagaku, 53, 1309-

1313 (2004).
9)Mark R. Schure, J. L. Rafferty, L. Zhang, J. I.

Siepmannet, LCGC North America, 31, 630-637(2013).

1908

図 14

株式会社 クロマニック テクノロジーズ
552-0001 大阪府大阪市港区波除 6-3-1
TEL: 06-6581-0885
FAX: 06-6581-0890
E-mail: info@chromanik.co.jp
Website: http://chromanik.co.jp

カロテンの分離Mobile phase, acetonitrile/chloroform=80/20;
temperature, 30 ºC; detection, UV at 450nm, 他の条
件は図 13 と同じ．
peaks, 1 =α-carotene,
CH3

H

H3C

2 =β-carotene.

CH3 H

CH
H3
H3C

CH3 H H

H

CH3

H

H

H

CH3

H
H

H

CH3

H

CH3

H

H

H

H H3C

CH3

H

H3C

H

CH3

CH3

H

H

CH3

H
H

H

H

CH3

H
H

H H3C

CH3

H
H3C

- 12 -