カスガマイシン生合成の経路特異的調節遺伝子 kasT の rpoZ 依存性転写活性化遺伝子のクローニング
春日 和（秋田県立大学生物資源科学部

応用生物科学科）

研究の目的
我々は，抗稲イモチ病用農薬カスガマイシン(KSM)を生産する放線菌Streptomyces kasugaensis
において，rpoZの遺伝子産物であるωサブユニットを含むRNAポリメラーゼ(RNAP)によるKSM生合成遺伝子の転写制御・調節機構を研究している。既にrpoZを破壊したS. kasugaensis R6D4 はKSMを生産せず，また形態分化の初期段階の気菌糸を形Fig.1. kasZ および kasZ 関連遺伝子群成しなくなることを明らかにした1） 。また，KSM非生産の原因は，KSM生合成酵素遺伝子群の経路特異的転写調節因子遺伝子kasTの転写抑制にあり，R6D4 にてkasTを強制発現させるとKSM生産が復帰することを明らかにしている。KasTは，ストレプトマイシン(SM)生産菌 Streptomyces griseusのSM生合成の特異的転写活性化因子StrRと 50% のidentityを示した2) 。strRの転写にはstrRプロモーター上流域に結合する転写活性化因子AdpAが必要であることが知られていることから 3) ，
我々は kasT においてもプロモーター上流域(PkasT)に特異的に結合して kasT 転写を活性化するKasZが存在し，さらにkasZの発現にrpoZが関与していると考えた（Fig.1）。
本研究は，rpoZ の存在を必須とする KSM 生合成の制御・調節機構の解明のために，kasZ さらには kasZ や kasT の発現を活性化する調節遺伝子群をクローン化することを目的した。

方法と結果(1) kasZクローニングベクターpAK557 の構築とゲノムライブラリーの作製

kasZ および kasZ や kasT の転写・発現を活性化する調節遺伝子群をクローン化する目的でkasT プロモーター領域(PkasT)からの転写開始が検出できるpAK557 を構築した（Fig.2）。すなわち，PkasTの下流にTerrabacter属細菌DBF63 株由来のメタ開裂酵素

Fig.2. Cloning vector pAK557

遺伝子dbfB4)の構造遺伝子部分を連結し，S. kasugaensis用ベクターpSK2162 に導入した。pAK557 ではクローニング用にBamHIが使用可能で，活性化遺伝子がクローン化されれば活性化因子によりPkasTからの転写が始まりdbfBが発現して，その結果，DbfBが無色の 2,3-dihydroxybiphenyl (DHB)を黄色物質に分解させる(Fig.3)。
すなわち，この発色を指標としてPkasT の転写活性を誘導する遺伝子のクローン化が可能となる。さらに， BamHIのごく近傍には強Fig.3. kasZ クローニングの原理

力なプロモーターPermEが存在するため，クローン化遺伝子の転写増強が期待できる。
Table 1 に示すように S. kasugaensis の野生株 A1R6 の pAK557 形質転換株は DHB 分解活性を示すが，rpoZ 破壊株 R6D4 および rpoZ をもち KSM を生産しない Streptomyces lividansTK21 の形質転換株のいずれも分解活性を示さなかった。これは，kasZ や kasT の転写活性化遺伝子やkasZ が S. kasugaensis に特異的に存在して，それらの転写に rpoZ が必要であることを示唆している。
そこで，S. lividans を宿主として，pAK557 のBamHI 部位に，R6D4 株のゲノム DNA の Sau3AI

Table 1. pAK557 形質転換体の rpoZ, KSM 生産, DHB分解rpoZ
KSM 生産DHB 分解部分分解物（平均 4kb）を導入しショットガンクロ

S.kasugaensisーニングを行った。32,000 の S. lividans の形質A1R6/pAK557

S.kasugaensis

転換株について DHB 溶液を噴霧することにより， R6D4/pAK557
明らかに黄色に変化した 37 の陽性クローンを得

S.lividans
TK21/pAK557+++---+--ることができた。
(2)メタ開裂酵素遺伝子bphCのクローン化
陽性クローンの中で DHB 分解活性が特に強かった KW6 および KW13 では挿入 DNA断片が 3.5kb にわたって重複していた（Fig.4）。
この重複領域の塩基配列を決定して遺伝子機能を推定したところ 3 つの完全長の openreading frame(ORF; orf1〜orf3)と 1 つの不完全 ORF（Δorf4）が見出された（Table 2）。orf3
は bphC のホモログ遺伝子でレポーター遺伝子として用いた dbfB と同様に遺伝子産物がDHB のメタ開裂活性を示す。そこで orf3 をFig.4. KW6 と KW13 の解析
Table 2. KW6 と KW13 の解析
遺伝子推定機能
orf1
ヌクレオチド二リン酸-糖エピメラーゼ
orf2HpcE ホモログ
（デカルボキシラーゼ/イソメラーゼ）
orf3(bphC)
BphC ホモログ（メタ開裂酵素）
Δorf4
HppA ホモログ（フェノールヒドロキシラーゼ）

bphC とした。欠失解析から，bphC は orf2 の上流域のプロモーターにより転写されていた。したがって，KW6 および KW13 では dbfB とは関係なくbphC によって DHB 分解反応を行ったことが明らかとなった。S. kasugaensis 単独では DHB 分解活性を示さないことから，bphC はクローン化による遺伝子増幅効果によって発現に至ったのではないかと推定している。
さらに，bphC に特異的なプライマーを用いた PCR により，残りの 35 陽性クローン中の 11 クローンが bphC を含むことがわかった。したがって，以後これらのクローンを除外して研究を進めた。
(3）サブクローン化と塩基配列の決定
陽性クローンの中の挿入 DNA 断片を high fidelity の PCR により増幅して pUC18/19 にサブクローン化した。挿入 DNA 断片の両末端の塩基配列を決定し，すでに全塩基配列が決定している

Streptomyces coelicolor A3(2)および Streptomyces avermitilis のゲノム情報と比較することによりクローン化遺伝子を推定した。なお，一部のクローンについては既に全塩基配列を決定している（Table 3）。

Table3. kasZ 遺伝子スクリーニングの概要
DHB assayGroupAB

CClone

A23
A17
KW22
K8
K9
K33
KW19
KW24
KW36
AS6A12
M7
K13
K14
K17
K23
KW37
KW40
A18
A22
A24
A26
KW16
KW17

S.lividans

S. kasugaensis

TK21

R6D4

++++
+++
+++
++++
++++
++++
+++
++++
+++
+++
++
++++
++++
+++
+
+++
+++
+++
++
++
++++++++++++++++++++++++++
+++
+++++
+++

KSM 生産(R6D4)

挿入
断片(kb)

塩基配列
決定

-4.5
4.5
5.2
4.3
3.7
3.6
4.2
4.5
5.4
5.0
3.7
5.0
5.2
5.0
4.5
3.7
4.0
3.4
3.6
4.5
5.0
3.0
3.3
4.5

○

二成分制御系（sensor kinase, response regulator）○

transposase

*
*
○
○
○
○
○
○

○
○
*

*

推定された遺伝子機能

bldA(tRNAUUA-Leu)
不明
acyl-CoA synthetase
機能不明
asparagine synthetase, methyltransferase
機能不明
1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase
LacI-family 転写制御因子
グリコーゲン脱分枝酵素, トリプシン様プロテアーゼ
制御タンパク質
enolase、cytochrome P-450
rrnF(16SrRNA, 5SrRNA, 23SrRNA)
トランスロカーゼ SecA サブユニット
ABC transporter
zinc protease
ABC transporter
機能不明
DNA polymerase III β サブユニット
機能不明
leucyl-tRNA synthetase○, 完了； ＊, 進行中

各クローンは，rpoZ 破壊株 S. kasugaensis R6D4 にも導入し，S. lividans 形質転換体とともにDHB 分解活性を 5 段階で評価した。この活性評価にしたがってクローンを３グループ（A，B, C）に分類した。A グループのクローンは，rpoZ をもつ S. lividans では活性が強いが(+++ 〜 ++++)，rpoZ破壊株での分解活性は弱く，クローン化遺伝子の発現が rpoZ に強く依存している可能性が高い。
一方，B グループクローンは，両菌株による DHB 分解活性がほぼ同じであり，したがってクローン化遺伝子の発現に rpoZ は関係していないと考えられる。また，C グループはクローン化遺伝子の発現が rpoZ に依存しているが，PkasT 活性化が A グループほど顕著でないと考えられる。以下，各グループのクローン化遺伝子の特徴について述べる。
(i) Ａグループクローン
クローンA23 はrpoZ依存性が強く，ωサブユニットの存在がその発現に大きく影響している。本ク
ローンは二成分制御系（sensor kinaseおよびresponse regulator）遺伝子5）の全長を含んでいたため，このシグナル伝達系がkasTを介して直接あるいは間接的にkas生合成遺伝子群の発現に関与していることが考えられる。
塩基配列決定中のK8 およびK9 はクローン化DNA領域が約 0.7kbが重複しており，そこにはbldAが含まれていた。bldAは放線菌では出現頻度が極めて低いUUAコドンに対するtRNALeuの遺伝子でUUAコドンを含む二次代謝関連の調節遺伝子の発現を翻訳レベルで調節していることが知られている6）。したがってS. kasugaensisにおいてもbldAがkasTを介してKSM生合成に翻訳レベルで関与している可能性がある。
(ii) Ｂグループクローン
Ｂグループのクローン化遺伝子はその発現が rpoZ には強く依存していない。おそらく，これらのクローン化遺伝子は直接的に PkasT の転写活性を向上させたのではなく，細胞内で何らかの代謝系の活性を向上させてその結果，間接的に dbfB 発現を誘導したものと推察される。
例えば，クローン M7 および K13 では LacI-family 転写制御因子およびグリコーゲン脱分枝酵素・トリプシン様プロテアーゼが発現して何らかの代謝系の活性向上に寄与し，またクローン K23 ではrrnF 遺伝子群が発現することによって細胞内の翻訳活性全体が上昇し，その結果，DHB 分解活性を上昇させたものと考えられる。
(iii) Ｃグループクローン
Ｃグループクローンは A グループクローンに比べて PkasT の転写活性化作用が小さいと考えられる。これらのなかでクローン KW17 は leucyl-tRNA synthetase を含んでおり bldA との関連で興味深い。

結論
KSM 生合成特異的活性化遺伝子 kasT のプロモーター領域 PkasT に作用して KSM 生合成遺伝子群の発現を導く kasZ および PkasT の発現向上をもたらす遺伝子群のクローニング系を構築して24 のクローンを得た。このなかで我々は二成分制御系の遺伝子と bldA および leucyl-tRNAsynthetase 遺伝子に注目している。これら遺伝子の発現や機能に関しては，遺伝子発現とそのrpoZ 依存性および KSM 生合成遺伝子群の発現との関連について検討していく。
S. kasugaensis の kasZ は S. griseus の adpA のホモログ遺伝子の可能性が高い。しかし，今回のクローニング系では adpA ホモログは得られていない。adpA ホモログの発現にさらに何らかの制御系が働いているならば，今回の系ではクローン化されない可能性もある。S. kasugaensis の adpA ホモログのクローン化，その遺伝子発現と rpoZ との関連，さらに KSM 生合成遺伝子群との発現の関連についても今後検討して行く予定である。

文献
1) Kojima, I., Kasuga, K., Kobayashi, M., Fukasawa, A., Mizuno, S., Arisawa, A. and Akagawa, H.
2002. The rpoZ gene, encoding the RNA polymerase omega subunit, is required for antibiotic
production and morphological differentiation in Streptomyces kasugaensis. J. Bacteriol.
184:6417-23.
2) Ikeno, S., Aoki, D., Sato, K., Hamada, M., Hori, M., and Tsuchiya, K.S. 2002. kasT gene ofStreptomyces kasugaensis M338-M1 encodes a DNA-binding protein which binds to intergenic
region of kasU-kasJ in the kasugamycin biosynthesis gene cluster. J. Antibiot. 55:1053-62.
3) Ohnishi, Y., Kameyama, H., Onaka, H. and Horinouchi, S. 1999. The A-factor regulatory cascade
leading to streptomycin biosynthesis in Streptomyces griseus: identification of a target gene of theA-factor receptor. Mol. Microbiol. 34:102-111.
4) Kasuga, K., Nojiri, H., Yamane, H., Kodama, T. and Omori, T. 1997. Cloning and characterizationof the gene involved in the degradation of dibensofuran by Terrabacter sp. strain DBF63. J. Ferment.
Bioeng. 84:387-399.
5) Champness, W. 1999. Cloning and analysis of regulatory genes involved in Streptomycessecondary metabolite biosynthesis. In Demain, A.L. and Davis, J.E. (ed.), Manual of industrial
microbiology and biotechnology, second edition, ASM Press, Washington, D.C., p725-739.
6) Fernández-Moreno, M.A., Caballero, J.L., Hopwood, D.A. and Malpartida, F. 1991. The act
cluster contains regulatory and antibiotic export genes, direct targets for translational control by thebldA tRNA gene of Streptomyces. Cell 66:769-780.