麹菌における細胞表層工学システムの構築
中島春紫（東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻）

研究の目的
細胞表層工学は微生物の表層に外来のタンパク質を発現させることにより、機能的なタンパク質にコートされた細胞を生物触媒として提供する技術である。細菌や酵母細胞において in vivo で GFP、グルコアミラーゼ、抗原ペプチド、重金属吸着ペプチドの表層発現が報告されているが、糸状菌は細胞表層へのアンカーとなるタンパク質が開発されていないため細胞表層工学の宿主となっていない。本研究では麹菌 Aspergillus oryzae
において有用な細胞表層アンカーを開発することを目的としている。

方法
麹菌のゲノムデータベース情報を利用して、細胞表層に局在すると考えられる分泌タンパク質β− アセチルグルコサミニダーゼおよびハイドロフォービンをコードする遺伝子 nagA および hypA – E を単離した。それぞれについて eGFP を結合した融合タンパク質を構築し、蛍光顕微鏡により融合タンパク質の局在を観察するともに、ウエスタン解析により融合タンパク質の挙動を検討した。

結果および結論
麹菌よりβ− アセチルグルコサミニダーゼをコードする nagA 遺伝子を単離した。
NagA は 600 アミノ酸よりなり、他生物のβ− アセチルグルコサミニダーゼと強い相同性を有していた。NagA-eGFP 融合タンパク質をコードする遺伝子を構築して麹菌に導入したところ、固体培養時に細胞表層への強い蛍光が観察された。しかし、NagA-eGFPの細胞表層への結合の安定性は低く、細胞表層アンカーとしての適応性は低かった。
ハイドロフォービンは特徴的なハイドロパシーパターンと保存された８個の Cys 残基を持つ低分子量タンパク質であり、糸状菌及びキノコの気中菌糸、胞子、子実体の表面を覆っている。ハイドロフォービンは分泌された後、細胞表層に自己集合して疎水性の層を作ることにより、細胞表層に撥水性を与えている。我々は麹菌よりハイドロフォービンをコードする可能性のある遺伝子を５つ(hypA - E)単離した（図 1）。
このうち hypAおよび hypB 遺伝子は固体培養特異的な mRNA の転写が観察されている。HypA の局在について解析するため、hypA 遺伝子自身のプロモーターにより hypA-egfp 融合遺伝子を発現するプラスミドを構築し、A. oryzae niaD300 株に導入した。液体培養の時、蛍光はほとんど観察できなかったが、固体培養では分生子頭および分生子表層に顕著な蛍光が観察された（図 2）。HypA (16 kDa)に対して eGFP (27 kDa)は大きなタグであるが、抗GFP 抗体を用いたウエスタン解析を HypA-eGFP 発現菌体に対して行ったところ、27kDa, 100 kDa, >300 kDa の３本のバンドが検出された（図 3）。一番小さな 27 kDa のバンドは HypA-eGFP の分解産物であり、100 kDa のバンドは HypA-eGFP が２〜３分子結合したオリゴマーと考えられる。最も強いシグナルを示したのが>200 kDa のバンドであったことから、大部分の HypA-eGFP は麹菌の表層で自己集合していたと考えられる。
重合したハイドロフォービンは SDS 存在下の煮沸によっても解離しないことが報告されている。自身の２倍の分子量を持つ eGFP タグを結合したハイドロフォービン HypA
は、固体培養時の気中菌糸および分生子の表層に発現し、SDS 存在下の煮沸によっても解離しない強固な自己集合によって層を形成していることが示された。以上の観察結果
は、麹菌のハイドロフォービン HypA が麹菌における細胞表層システムを構築するのに適した性質を有することを示していると考えている。

RodA
HypA
HypB
HypC
HypD
HypE

MKFSIAAAVVAFAASVAALPPAHDSQFAGNGVGNKGNSNVKFPVPENVTVKQASDKC--GDQAQLS-CC
MQFS-VAAVLALATAVAALP-PASGTGAGQQVGHSKN---DFPLPKELTTKQAADKC--GDQAQLT-CCMKFFAVAALFATAAMAAPGS--APVPGAAAAAGNGNA-----PVINQTQQKAFTDACMKFFAVAALFATAAMAAPGS--APVPGAAAAAGNGNA-----PVINQTQQKAFTDACSAKGNHPV--CCMKVTLLTTLCVLGVASSADP-------TAQ--------------------------C---DNGPVQ-CCMHSTNIFNFFMLAVAAASAAT---ISKAGDSKALQKVAEGK---------------C---DIGNTA-CCMKFLHTIALIATFTVASATP-------AGSTPSQ----------------------C---TAAQANKCCRodAHypA
HypB
HypC
HypD
HypENKATYAGDTTTVDEGLLSGALSGLIGAGSGAEGLGLFDQCSKLDVAVLIG---IQDLVNQK--CKQNIANKTVKTGDFTQVEEGLLAGLLSNLLGAGQGSQGLGLLDEC----TNIPVIPIISIASPQEK--CKQPIS-DQIDTSKTTTVNEGLLGGLLGEGLGGVLNNLVGGEPGAC-----------SGLVSALNKQ—-CQTSIG----ATGLPTDSVVSPLLGLLGVVVPDMSTPVGLT----C--------------NPIVQGGS-CPGHPV-----NNVHEEKDERLFNLVKQGLIDILAGNEDYA----CAKSGVIDEWNLFSLVKQTNDGPVCKNVTA-------------TGLTNGILNLNVLPAL----------C--------------LPLVGS---CNNQAARodA
HypA
HypB
HypC
HypD

CC-QNSPSD--ASGSLIG-IGLP-C-----VALGSIL-CC-QNTKSS--ADGDLVG-IGLP-C-----IALGSLL-CCQQNAKGDNYQSGLLNLNLQAP-C------LLSNGL-CC---------TGNNFNGLLALG-C----TPVLST---CC---------SSGK---------C-----VAIDG----

157
151
14699119

HypE

CC---------ETNGIVAPVELPHCGLMTRRLDMIYPI96

図１. 麹菌(A. oryzae)から単離した５つのハイドロフォービン(HypA - E)および A. nidulansの RodA のアミノ酸配列。保存された Cys 残基を下線で示す。

>300kDa

100kDa27kDa
図2

HypA-eGFP 融 合 タ ン パ ク 質 は A.

図3

HypA-eGFP 融 合 タ ン パ ク 質 は A.

oryzae の分生子頭（左図）および分生子（右oryzae の 細 胞 表 層 に 自 己 集 合 す る 。

図）の表層に特異的に局在する。

hypA-egfp 融合遺伝子を発現する A. oryzae

Bar: 20µm (左図) 5 µm (右図)を 固 体 培 地 で 培 養 し 、 抗 GFP 抗 体 に よ りWestern 解析を行った。