広島体育学研究40：1 ～ 7，2014〔原著〕

低頻度疲労に伴う筋原線維 Ca2+ 感受性の変化
渡和邊田大正輝*信*Changes in myofibrillar Ca2+ sensitivity with low-frequency fatigue
Daiki WATANABE（Graduate School of Integrate Arts and Sciences, Hiroshima University）

Masanobu WADA

（Graduate School of Integrate Arts and Sciences, Hiroshima University）

Abstract
Low-frequency fatigue (LFF) is characterized by reduced tetanic force at low frequency stimulation
while tetanic force at high frequency stimulation is close to normal. The purpose of this study wasto examine changes in myofibrillar Ca2+ sensitivity in rat fast-twitch muscle fibers with LFF. Intact
rat gastrocnemius muscles (GAS) were electrically stimulated (fatiguing stimulation; 70 Hz, 0.35s train, every 3 s) via the sciatic nerve until force was reduced to 50% of initial. Tetanic force inintact GAS induced through various frequencies of stimulation was measured 30 min after theend of fatiguing stimulation. A loss of tetanic force was significantly greater with low frequency
stimulation than with high frequency stimulation (a 36.5±8.9% decrease at 20 Hz vs. a 14.3±4.7%
decrease at 100 Hz). After the measurement, mechanically skinned fibers were prepared from thesuperficial region of GAS. Skinned fibers were directly activated in heavily buffered Ca2+ solutions
to assess myofibrillar Ca2+ sensitivity. Fatiguing stimulation did not bring about changes in[Ca2+]50, a Ca2+ concentration at half-maximum force (1.04±0.06 μM for control vs. 0.99±0.07 μM for
stimulation). When skinned fibers were subjected to S-glutathionylation by successive treatmentswith 2,2’-dithiodipyridine and glutathione, [Ca2+]50 was changed to a greater extent in unfatigued
fibers than in fatigued fibers. These findings suggest that decreases in myofibrillar Ca2+ sensitivity
are not responsible for LFF at least in an in situ fatigue model and that S-glutathionylation that
occurs during muscle contractions would offset the depressive effect of contraction to fatigue on theCa2+ sensitivity.
Key words: S-glutathionylation, muscle fatigue, glutathione, skinned fiber* 広島大学大学院総合科学研究科― 1 ―広島体育学研究Ⅰ．緒第 40 巻

平成 26 年３月ている。しかしながら，ROS は筋の機能に対し言てマイナスに作用するばかりではなく，条件に筋疲労とは，最大張力の低下もしくは一定の張よってはプラスに働きかけることもある（Dalle-力を維持できなくなる現象と定義される。筋疲労

Donne et al. 2007）。その現象の１つが，スルフに関する多くの研究では，電気刺激を用いて筋のヒドリル基と還元型グルタチオンが，ジスルフィ収縮を誘起し，得られた値から筋疲労の程度が評ド結合を形成する反応である S-glutathionylation

価されてきた。この方法を用いると，与える電気が生じたときにみられる。近年，速筋線維に含ま刺激の頻度が高まるにつれ張力は増加し，ヒトのれるトロポニン I に S-glutathionylation が発生す場合，刺激頻度が 50 Hz 前後で張力は最大となると，筋原線維の Ca2+ 感受性が増加することがる（ここでは，ほぼ最大張力が得られる刺激を高報告されており（Mollica et al. 2012），筋収縮時

頻度刺激，最大値に対して約 60％以下の張力がに生体内においても，S-glutathionylation に起因得られる刺激頻度を低頻度刺激と呼ぶことにすする変化が起こることが推察されるが，この点にる）。Edwards et al.（1977）は，運動後の回復期ついての報告はなされていない。これらのことかにおいて，高頻度刺激によって発揮される張力よら本研究では，生体内で収縮させた筋を対象とし，りも低頻度刺激によって発揮される張力の方が大

1） LFF 発 生 時 に， 筋 原 線 維 の Ca2+ 感 受 性 がきく低下し，その状態は長時間持続することを報

変 化 す る か 否 か，2） 変 化 す る と す れ ば，

告 し た。 以 後， こ の 現 象 は 低 頻 度 疲 労（low-S-glutathionylation がそれに関与しているか否か

frequency fatigue: LFF）と呼ばれるようになっを検討することを目的とした。

た。LFF は，神経を除去した筋でも発生するこⅡ．実験方法とから（Chin and Allen 1996, Westerblad et al.
1993），神経系の変化ではなく，筋細胞における興奮収縮連関の機能低下によって生ずると考えられている。

１．実験動物および実験プロトコール
本研究の実験プロトコールは，広島大学動物実験委員会で認められたものである。実験には９週

ミオシンフィラメントとアクチンフィラメント

齢の Wistar 系雄性ラット 9 匹を用いた。電気刺を主成分とする筋原線維は，興奮収縮連関におい激は，Mishima et al.（2008）の方法に基づいて行って 主 要 な 役 割 を 担 う 器 官 で あ る。Bruton etた。ペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg）

al.（2008）は，収縮を繰り返し張力が低下したラッ麻酔下にて，ラットを仰臥位に置き，足部をフッ2+トの速筋線維では，筋原線維の Ca 感受性が低トホルダーに固定した。右脚の坐骨神経に電極を下することを示し，この変化が LFF の原因の１

取り付け，電気刺激装置（日本光電社製，SEN-つであることを示唆している。しかしながら，こ7230）を用い，電気刺激を腓腹筋（gastrocnemius:の研究では単離した単一筋線維が用いられておGAS）に与え，筋収縮を誘起した。発揮張力は，り，生体内で同様の現象が生じるか否かは不明でフットホルダーに接続した張力計（日本光電社製，ある。

TB-611T）を用いて記録した。

活 性 酸 素 種（reactive oxygen species: ROS）

種々の刺激頻度（1, 20, 40, 60, 80, 100 Hz）でとは，通常のものより反応性の高い酸素化合物を張力を測定した後，筋疲労を誘起するために連続指し，筋収縮とともにその産生量が高まる。この

電気刺激（疲労刺激 ; 70 Hz, 0.35-s train, every

化合物が，細胞内小器官を修飾することが，筋疲3 s）を張力が初期値の 50％に至るまで与えた。

労の原因の１つであると考えられている。例えば，疲労刺激終了後，30 分の安静期間を置き，疲労Moopanar and Allen（2005）は，ROS の除去剤

刺激前と同様の方法で各刺激頻度での張力を測定の添加によって筋疲労が軽減されたことを報告しし た。 右 脚 を 疲 労 刺 激（stimulated: Stim） 群，― 2 ―低頻度疲労に伴う筋原線維 Ca2+ 感受性の変化

４．S-glutathionylation の影響刺激を与えていない左脚をコントロール（control:S-glutathionylation が Ca2+ 感 受 性 に 及 ぼ す 影Con）群とし，張力測定後両脚から GAS を摘出した。

響は，Molica et al.（2012）の方法に基づいて測定した。筋原線維の Ca2+ 感受性を測定した後，２．スキンドファイバーの作製

スキンドファイバーを 100 µM の 2,2’- ジチオジピ

摘 出 し た GAS の 表 層 部 か ら，Brotolotto et

リ ジ ン（2,2’-dithiodipyridine: DTDP） を 含 む 溶al.（1999）の方法に基づき，スキンドファイバー液に５分間，続いて 5 mM の還元型グルタチオを作製した。顕微鏡下で，ピンセットを用い単一ン（reduced glutathione: GSH）を含む溶液に２筋線維を単離し，筋形質膜を剥離した。その後，分間曝露した（DTDP-GSH 処置）。その後，筋原筋線維長が安静時の約 1.2 倍になるように張力計

線維の Ca2+ 感受性を再び測定した。DTDP-GSH（Scientific Instruments 社製，SI-MKB-OXY）に処 置 前 の [Ca2+]50 と 処 置 後 の [Ca2+]50 の 差（Δ取り付けた。これらの作業は，すべてパラフィン[Ca2+]50）を S-glutathionylation の発生量として評オイル内で行った。

価した。この評価法では，
Δ[Ca2+]50 が小さいほど，DTDP-GSH 処 置 前 に S-glutathionylation が 多 く

３．筋原線維の Ca2+ 感受性発生していたことになる。DTDP-GSH 処理で用2+筋原線維の Ca 感受性は，Molica et al.（2012）

いた溶液は，100 mM DTDP（100％エタノールの方法に基づいて測定した。スキンドファイバーに溶解）および 100 mM GSH（K-HDTA 溶液に2+2+-9.0-6.4を Ca 濃度（[Ca ]）が異なる溶液（10 , 10 ,溶解）をストックしておき，それらを上記の濃度

10-6.2, 10-6.0, 10-5.8, 10-5.6, 10-5.4, 10-4.7 M）に曝露し，になるよう弛緩溶液で希釈することによって作製張力を測定した。測定（measurement）溶液中した。なお，スキンドファイバーを用いた測定は2+-10の [Ca ] は，弛緩（relaxation）溶液（<10M）

室温（25℃）で行った。と最大 Ca2+（maxCa）溶液（10-4.7 M）とを種々５．統計処理の割合で混合することによって調整した。Hill の2+統計量は，平均値±標準偏差で示した。各刺激式に基づき，張力 -[Ca ] 曲線の近似式を算出した。
2+近似式から，最大張力の 50％が得られる [Ca ]頻度間での発揮張力の差異の検定には，一元配置（[Ca2+]50）を算出し，Ca2+ 感受性を評価した。この分散分析を用いた。有意な F 値が得られた場

2+2+の評価法では，[Ca ]50 が高いほど Ca 感受性が合は，Holm-Sidak の方法に従って統計学的有意低いことを表す。Table 1 に，用いた溶液の組成性を検定した。スキンドファイバーを用いた実験を示した。

における Con 群と Stim 群間の差異の検定には，対応のない t 検定を用いた。なお，有意水準は５％Table 1. Composition of solutions used to determine myofibrillar Ca2+ sensitivity.
All solutions contained (mM): Na+, 36; K+, 126; HEPES, 90; ATPtotal, 8; creatine phosphate, 10. The pH of allsolutions was 7.10.
solutionsMg2+free(mM)

EGTAtotal(mM)

HDTAtotal(mM)[Ca2+]free(M)

K-HDTA

1-50

10-7.1

MaxCa

150-

10-4.7

Relaxation

150-<10-10Measurement150-

10-9.0-10-4.7― 3 ―広島体育学研究

第 40 巻未満とした。

平成 26 年３月

で 77.5±6.7％，60 Hz で 85.5±5.8％，80 Hz で87.3±3.5％，100 Hz で 85.7±4.7％ で あ っ た。60Ⅲ．実験結果

Hz，80 Hz および 100 Hz の張力は，1 Hz，20 Hz

１．全筋の発揮張力および 40 Hz に対して有意な高値を示した。

Fig. 1A に 疲 労 刺 激 中 の 張 力 変 化 の 一 例 を，
Fig. 1B に疲労刺激終了 30 分後における張力を疲

２．筋 原 線 維 の Ca2+ 感 受 性 お よ び

労刺激前の値に対する割合で示した。疲労刺激にS-glutathionylation が 筋 原 線 維 の Ca2+おいて，張力が初期値の 50％に低下するのに要感受性に及ぼす影響した時間は 266±36 秒であった。疲労刺激終了後

Fig. 2A に張力 -[Ca2+] 曲線を，Fig. 2B に [Ca2+]50における疲労刺激前に対する張力の割合は，1を示した。[Ca2+]50 は，Stim 群で 0.99±0.07 µM，

Hz で 62.4±8.9％，20 Hz で 63.5±9.4％，40 Hz

Con 群で 1.04±0.06 µM であり，両群間に有意なFig. 1. Effects of stimulation on the tension in the intact gastrocnemius muscles.
A: Time course changes in tetanic tension with fatiguing stimulation (70Hz, 0.35-s train, every 3 s).
The dash line represents 50 % of initial tetanic tension. Data is from one sample. B: Ratio of tension
after stimulation to that before stimulation. Values are means ± SD (n=9). aP < 0.05, vs 1 Hz, bP< 0.05,vs 20 Hz, cP< 0.05, vs 40 Hz.

Fig. 2. Effects of stimulation on myofibrillar Ca2+ sensitivity.
A: Hill fits to force-Ca2+ concentration ([Ca2+]) data. [Ca2+] is expressed as log10 scale. Open circles, Stim;
filled circles, Con. B: [Ca2+]50 values. [Ca2+]50, a concentration at half-maximum force. Values are means± SD (n=6).

― 4 ―低頻度疲労に伴う筋原線維 Ca2+ 感受性の変化

Fig. 3. Effects of DTDP-GSH treatment on myofibrillar Ca2+ sensitivity.
A and B: Hill fits for force-[Ca2+] data before (filled circles) and after (open circles) DTDP-GSHtreatment in Con (A) and Stim (B). [Ca2+] is expressed as log10 scale. C: DTDP-GSH treatment-inducedchange in [Ca2+]50. Values are means ± SD (n=6). aP <0.05, vs Con.

差異はみられなかった。Fig. 3A に Con 群，Fig.

知見は，単離した無傷の単一筋線維（インタクト

3B に Stim 群における DTDP-GSH 処置前後の張ファイバー）を対象に，試験管内で収縮を負荷す

力 -[Ca2+] 曲線を，また，Fig. 3C に両群のΔ[Ca2+]50るかあるいは薬理的な処置を施すかしたものであ2+を 示 し た。Δ[Ca ]50 は，Stim 群 で 0.302±0.04

り，生体内でこのような現象（Ca2+ 放出量あるµM，Con 群で 0.369±0.03 µM であり，Con 群にいは Ca2+ 感受性の低下）が起こっているかの否対して Stim 群では有意な低値を示した。なお，かについては不明であった。そこで本研究では，腓腹筋には速筋線維だけではなく，少量ではある生体内で収縮させた筋を用い，LFF に伴う Ca2+が遅筋線維が存在する。遅筋線維の測定結果を除感受性の変化について検討したところ，インタクいたため，使用したラット数９匹に対して，このトファイバーで得られた知見とは異なり，Ca2+実験でのサンプル数は６となった。

感受性は変化しないことが観察された（Fig. 2）。

Ⅳ．考近年，速筋線維に発現しているトロポニン I の察

133 番目のシステイン残基に S-glutathionylation

本研究で用いた疲労刺激では，疲労刺激後の張が発生すると，トロポニン I の構造が変化し，筋力の評価において，張力発揮を誘起する電気刺激

原線維の Ca2+ 感受性が亢進することが報告されの頻度が低いほど，刺激前と比較して張力が大きて い る（Molica et al. 2012）。 本 研 究 に お い て，く低下することが認められ（Fig. 1），本実験モデ

S-glutathionylation が Ca2+ 感 受 性 に 及 ぼ す 影 響

ルで LFF が生じたことが確認された。これまで，を分析したところ，DTDP-GSH 処置による Ca2+LFF が 起 こ る 原 因 と し て は， 筋 小 胞 体 か ら の感受性の変化の程度（Δ[Ca2+]50）は，Con 群と比Ca2+ 放出量の低下あるいは筋原線維の Ca2+ 感受

べ Stim 群の方が小さいことが観察された（Fig.

性 の 低 下 が 示 唆 さ れ て き た（Westerblad et al.

3）。この知見は，Con 群と比較して Stim 群では，

1993, Molica et al. 2012）。しかしながらこれらのDTDP-GSH 処 置 前 に S-glutathionylation が 多 く― 5 ―広島体育学研究

第 40 巻のトロポニン I で発生していること，また，Stim2+群で Ca 感受性が変化しなかったのは，「何らか の 要 因 」 に よ る Ca2+

平成 26 年３月

では，拡散による過酸化水素の細胞外への流出が生じにくいことが推察される。

感受性の低下とここまで述べてきたように，本研究では，筋原

S-glutathionylation による感受性の亢進が拮抗し線維の Ca2+ 感受性の低下が LFF の成因ではないた結果であること示唆するものである。

ことを示唆する結果が得られた。したがって，前Andrade et al.（1999）は，インタクトファイバー

述のもう１つの要因すなわち筋小胞体からのを 100 µM の過酸化水素を含む溶液に曝露する

Ca2+ 放出量の低下が，LFF を招来していると考2+と，筋原線維の Ca 感受性が低下することを観えられる（Westerblad et al. 1993）。今後，Ca2+察しており，感受性の低下を招来する「何らかの放出量の低下が生体内でも生じているか否か，生要因」としては，過酸化水素の作用があげられる。

じているとすればどのようなメカニズムが関与し同じくインタクトファイバーを用い，スーパーオているのかなどについて明らかにする必要があ

キシドジスムターゼ活性の高いラット骨格筋でる。また，本研究で用いた実験モデルでは，生体

2+は，LFF に伴い筋原線維の Ca 感受性の低下が内で行ったとはいえ，麻酔下にて電気刺激によっ生じるが，活性の低いマウスでは感受性は変化して収縮させる手法を用いており，筋細胞が置かれないことを示す Bruton et al.（2008）の報告は，た環境が，生体内のものと全く同様であったとはこれを支持するものである。これに対して，スキ言い難い。今後，ランニングなどの日常行われるンドファイバーを用いた研究では，過酸化水素に運動における変化も検討すべきであろう。

よって，感受性は変化しないことが観察されてい本研究では，生体内で収縮させた筋を対象とし，る。Murphy et al.（2008）は，過酸化水素とミLFF に筋原線維の Ca2+ 感受性の低下が関与してオグロビンを含む溶液に，スキンドファイバーをいるか否かを，スキンドファイバーを用いて検討浸漬すると感受性が低下することを観察し，インした。得られた結果から，1） 筋原線維の Ca2+ 感

タクトファイバーでは，過酸化水素とミオグロビ

受 性 の 低 下 が LFF の 成 因 で は な い こ と，2）2+ンに含まれる Fe との反応（フェントン反応）

S-glutathionylation の 発 生 が Ca2+ 感 受 性 の 低 下により，ヒドロキシルラジカルが産生され，このを抑制していることが示唆された。

ROS が感受性の低下を誘起したのであろうと推Ⅴ．総察している。

括

インタクトファイバーでは Ca2+ 感受性の低下

本研究の目的は，生体内で収縮させた筋を対象が生ずるが（Bruton et al. 2008），生体内で収縮とし，1） 低頻度疲労（LFF）発生時に，筋原線を行わせた線維では，同様の現象が起こらない成維の Ca2+ 感受性が変化するか否か，2） 変化する因としては，後者と比べ前者（インタクトファイとすれば，S-glutathionylation がそれに関与してバ ー） で は，1）S-glutathionylation が 発 生 し にいるか否かを検討することであった。９週齢の2+Wistar 系雄性ラットを用い，右脚（Stim 群）にくいこと，あるいは 2）ROS の影響による Ca感受性低下の程度が大きいことが考えられる。

電気刺激による疲労刺激を負荷し，刺激終了 30

S-glutathionylation 発生に必須であるグルタチオ分後に腓腹筋を摘出した。左脚はコントロールンは膜透過性が低く，インタクトファイバーにお（Con）群として用いた。また，疲労刺激前後にいて，グルタチオンが細胞外部へ流出し，1） の腓腹筋の張力を種々の刺激頻度で測定した。摘出ような条件が形成されたとは考えにくい。2） のした腓腹筋からスキンドファイバーを作製し，疲条件が形成される理由については，過酸化水素の

労 刺 激 お よ び S-glutathionylation が 筋 原 線 維 の膜透過性が比較的高いことを考慮すると，血流がCa2+ 感受性に及ぼす影響について検討し，以下ある生体内の筋線維と比べインタクトファイバーの結果を得た。

― 6 ―低頻度疲労に伴う筋原線維 Ca2+ 感受性の変化

１．疲労刺激において，腓腹筋の張力が初期値のinduced prolonged low-frequency force depres-50％に低下するのに要した時間は，266±36

sion in skeletal muscle fibres of rats, mice and秒であった。

SOD2 overexpressing mice. J. Physiol., 586:

２．疲 労刺激終了 30 分後では，張力発揮を誘起

175-184.

する電気刺激の頻度が低いほど，刺激前と比Dalle-Donne, I., Rossi, R., Giustarini, D., Colombo,

較して張力が大きく低下することが認められ

R. and Milzani, A. (2007). S-glutathionylation inた。

protein redox regulation. Free Radic. Biol.

３．[Ca2+]50（最大張力の 50％が得られる [Ca2+]）は，Stim 群と Con 群とで差異は認められなMed., 43: 883-898.
Edwards, R. H. T., Hill, D. K., Jones, D. A. andMerton, P. A. (1977). Fatigue of long duration

かった。
2+2+４．Δ[Ca ]50（DTDP-GSH 処置前の [Ca ]50 と処置後の [Ca2+]50 の差）は，Con 群と比べ Stim群の方が小さかった。

in human skeletal muscle after exercise. J.
Physiol., 272: 769-778.
Mishima, T., Yamada, T., Sakamoto, M., Sugiyama,M., Matsunaga, S. and Wada, M. (2008). Time

以上の結果から，1） 筋原線維の Ca2+ 感受性

course of changes in in vitro sarcoplasmicの 低 下 が LFF の 成 因 で は な い こ と，2）

reticulum Ca2+-handling and Na+-K+-ATPase

S-glutathionylation の 発 生 が Ca2+ 感 受 性 の 低 下activity during repetitive contractions. Eur. J.

を抑制していることが示唆された。

Physiol., 456: 601-609.
Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley,

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