The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.3 No.3 2014

EVALUATION OF DAGNOSTIC CRITERIA OF BOVINE LEUKEMIA

原著論文

リンパ節生検材料の細胞構成比率に基づいた牛白血病診断基準の検討
田川道人 1） 堀内雅之 2） 松本高太郎 1） 古林与志安 2） 古岡秀文 2） 猪熊
1）帯広畜産大学

臨床獣医学研究部門

2）帯広畜産大学

基礎獣医学研究部門＊連絡担当者：猪熊〒 080-8555

壽 1 ＊）

壽

帯広市稲田町西 2 線 11

TEL：0155-49-5370

FAX：0155-49-5370

E-mail：inokuma@obihiro.ac.jp［要約］

牛白血病牛の腫大リンパ節 7 検体（牛白血病群）、非腫瘍性疾患牛のうち、近傍に炎症性疾患のある腫大リンパ節 6 検体（反応性腫大群）および近傍に炎症のない正常リンパ節 8 検体（正常群）の細胞診塗抹標本を用いて、細胞構成比率に基づいた診断基準が牛白血病に適応可能かどうか検討した。その結果、正常群（3.0±1.0％）、反応性腫大群（10.8±3.2％）と比較し、牛白血病群（89.0±6.1％）において大、中リンパ球の顕著な増加が確認され、牛白血病群の全ての検体で“大、中リンパ球を合わせた大型リンパ球の割合が 50％以上”を満たした。また、核分裂像は、牛白血病群（9.6±6.5/5 HPF）は反応性腫大群（3.5±3.1/5 HPF）、正常群（0.0±0.0/5 HPF）と比較し増加していたが、反応性腫大群において、牛白血病群で観察された核分裂像の下限を超える例が 6 検体中 2 検体存在した。体表リンパ節の腫大が特徴的な牛白血病症例において、細胞構成比率に基づいた診断基準は有用であると思われた。
キーワード：核分裂、リンパ節、細胞診、細胞構成比率、牛白血病［緒［3，16］。また、牛白血病ウイルス抗体の検出

言］

においても、発症の有無を鑑別することはできない［16］。

牛白血病とは全身性のリンパ節腫脹およびリンパ球増多症等を主徴とする牛に最も一般的な小動物のリンパ腫診断も身体検査および血液腫瘍性疾患であり、牛白血病ウイルスに起因す検査に加え、画像診断等が行われるが、とくにる地方病型と原因が不明である散発型に大別さ細胞診は、簡便、安価で迅速に診断可能である

れる［13，14］。診断は白血病による臨床症状ことから、最も重要な診断ツールのひとつと位に加え、体表リンパ節腫大とその組織生検所見、置付けられている［7，9］。細胞診において、末梢血液中の異型リンパ球増加、牛白血病ウイ固形腫瘍では細胞の異型度をもとに診断を行う

ルス抗体検査等による［13，14］。しかしながら、のに対し、リンパ節の細胞診では、腫瘍化した腫大したリンパ節や腫瘍細胞の臓器浸潤によるリンパ球と正常なリンパ芽球の区別は困難であ

多彩な臨床症状は非特異的であり、末梢血液中ることから、出現する細胞の構成比率をもとにに出現する腫瘍性リンパ球と反応性に増加した診断が下される［6，7］。一方、牛においても異型リンパ球を鑑別することは容易ではない

リンパ節の細胞診は行われているものの［16］、その細胞構成比率は不明であり、炎症との鑑別や診断基準は明確ではない［10］。そこで今回、受理：2014 年 1 月 21 日

－ 83 －

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細胞診による牛白血病診断基準の検討

細胞診により白血病発症牛のリンパ節細胞構成た。塗抹標本は風乾、メタノール固定の後、ラを明らかにし、細胞構成比率に基づいたリンパイトギムザ染色（ライト染色液、ギムザ染色液、腫診断基準が牛白血病に適応可能かどうか検討

武藤化学、東京）またはヘマカラー染色（He-した。

macolor® staining kit, Merck, Germany）を行
い、封入後、光学顕微鏡下で細胞を分類した。

［材料と方法］

リンパ球は赤血球の大きさにより小リンパ球

材料は 2011 年 6 月〜 2013 年 8 月に帯広畜産（リンパ球の核の直径が赤血球の直径 2 個分未大学に搬入された牛白血病牛 7 頭の腫大リンパ満）、中リンパ球（同 2 個分）、大リンパ球（同節 7 検体（牛白血病群）、非腫瘍性疾患牛 14 頭2 個分以上）とし［11］、200 細胞計測し細胞構のうち、近傍に炎症性疾患のある腫大リンパ節成比率を算出した（図 1）。また、高倍率視野（4006 検体（反応性腫大群）、近傍に炎症のない正倍；HPF）における核分裂像を 5 視野計測した。

常リンパ節 8 検体（正常群）を用いた（表 1）。

なお、細胞の観察は核濃縮や裸核、膨化、破壊

細胞診塗抹標本は、腫大した体表リンパ節に対など変性の強い部位を除外し行った。各群間のしては 21G 針を経皮的に複数回穿刺し、スラ比 較 に は、Kruskal-Wallis 検 定 お よ び Steel-

イドガラスに吹き付け、腫大のないリンパ節もDwass 法による多重比較検定を用い、p 値がしくは体腔内のリンパ節に対しては病理解剖時0.05 以下を有意差ありと判定した。にリンパ節割面よりメス刃を用い掻破し作製しTable 1.Sample information and characteristics of each groups

No.

Group

Sampling region

BreedAgeDesease

BLV
antibody

Total
lympohcytes

1BL

Subiliac LN

HF

4Y

EBL ＊＋

54782

＊

2

BL

Subiliac LN

HF

2Y

EBL＋

21248

3

BL

Inguinal LN

HF

9Y

EBL ＊＋

4662

4

BL

Mandibular LN

HF

4Y

Not classification

－2491

＊

5

BL

Mandibular LN

JB

2Y

EBL＋

43890

6

BL

Subiliac LN

HF

3Y

Skin ＊－2025＊a)

7BL

Subiliac LN

HF

6Y

EBL＋

6314

8RLN

Necka)

HF

3Y

Enteritis

－

─

9

RLN

Inguinal LN

HF

6Y

Mastitis

＋

─

10

RLN

Inguinal LN

HF

6Y

Mastitis

－

─

11

RLN

Superficial cervical LN

HF

1M

Arthritis

－─

12

RLN

Inguinal LN

HF

2Y

Mastitis

NE

─

13

RLN

Tracheobronchial LN

HF

6M

Pneumonia

NE

─

14

NLN

ND

HF

2M

Spinal deformity

－

─

15

NLN

ND

HF

7D

Meningocele

－

─

16

NLN

Inguinal LN

HF

3Y

Endometritis

＋

─

17

NLN

Superficial cervical LN

HF

6M

Weakness

－─

18

NLN

Superficial cervical LN

HF

7M

VSD－─

19

NLN

Superficial cervical LN

HF

5Y

HemopericardiumNE

─

20

NLN

Popliteal LN

HF

9M

Pituitary abscessNE

─

21

NLN

Superficial cervical LN

HF

2M

TympanitisNE

─

BL: bovine leukemia, RLN: reactive lymph node, NLN: normal lymph node, LN: lymph node, HF: Holstein-Friesian, JB: Japanese Black, BLV: bovine leukemia virus, EBL: enzootic bovine leukemia, VSD: ventricular septal defect, NE: not examined, ND: no data, Y: year, M: month, D: day.
Total lympohcytes in bold are lymphocytosis (/μl).
a): sampling from a lymph node which existed subcutaneously in neck.
b): examined by PCR.
＊: multicentric lymphadenopathy.

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［結EVALUATION OF DAGNOSTIC CRITERIA OF BOVINE LEUKEMIA

Table 2.果］

Comparison of cell constitution ratio oflymph node among each groups

細胞構成は正常群では小リンパ球 96.7±1.6％（平均±SD）、中リンパ球 2.3±0.7％、大リンパBovine leukemia (n＝7)

Reactive LN(n＝6)

Normal LN(n＝8)

10.3±6.6 ＊＊86.6±4.6 ＊＊96.7±1.6 ＊＊＊＊2.3±0.7 ＊＊Lymphocyte

球 0.7±0.5％であり、好中球、形質細胞がごくSmall軽度に観察された。反応性腫大群は正常群と比Medium

24.8±22.9

6.7±1.9

較し、小リンパ球（86.6±4.6％）の低下と、中Large

64.1±24.7 ＊＊4.2±2.8 ＊＊0.7±0.5 ＊＊＊＊3.0±1.0 ＊＊リンパ球（6.7±1.9％）、大リンパ球（4.2±2.8％）の増加がみられ、好中球、形質細胞も増加していた。一方、牛白血病群では大リンパ球（64.1±24.7％）、中リンパ球（24.8±22.9％）が著増しており、小リンパ球（10.3±6.6％）は低下していた。また、形質細胞は観察されず、好中球、

＊＊

L＋M

89.0±6.1

10.8±3.2

Neutrophil

0.5±0.82.0±3.90.1±0.2

Macrophage

0.1±0.2

0.2±0.3

0.0±0.0

Plasma cell

0.0±0.0

1.5±2.6

0.1±0.2

LN: lymph node.
L＋M: large and midium lymphocytes.
＊＊: p＜0.01 (significant differences between the same symbols)

マクロファージもごく軽度であった（図 1、表2）。なお、各群の構成比において年齢による相違は認められなかった。
核分裂像は、牛白血病群（9.6±6.5/5 HPF）、反応性腫大群（3.5±3.1/5 HPF）で観察され、正常群では観察されなかった（図 2）。牛白血病群、反応性腫大群はともに正常群と比較し有意（p＜0.01）に高値であったが、牛白血病群と反応性腫大群の間に有意差はみられなかった（図 2）。なお、全ての症例は病理解剖に供され、組織学的に診断が確定された。また、白血病群

Fig. 2. Comparison of the number of mitosis among
each groups.の 7 頭中 6 頭は体表、体腔内を含む全身諸リンパ節にリンパ肉腫の浸潤が観察された。
［考(** shows significant differences (p＜0.01). LN: lymph node)察］や細胞異型の評価が困難であることから、細胞リンパ節の細胞診は非常に簡便であることか診によるリンパ腫の診断は採取された細胞の構ら、人医療および小動物獣医療において広く用成比率が重要となる［7］。通常、リンパ節の細いられている［6，9］。また、組織構造の破壊

胞診では刺入された針が皮質、リンパ濾胞、傍皮質、髄質を貫くため、均一ではない細胞集団（A）Bovine leukemiaが得られる［6］。反応性過形成のリンパ節では、（B）Reactive lymph node （C）Normal lymph node

炎症性刺激によってリンパ濾胞は増大し、胚中心由来の中〜大型リンパ球の割合が増加し［6，7］、リンパ腫では腫瘍細胞の増殖によりリンパ節構造が破壊され、採取された細胞は単一形態のリンパ系細胞が優位となる［6］。
牛白血病の診断において、牛の腫大した体表リンパ節に針吸引検査を行った報告［16］では、Fig. 1.
smear.

感度 41 〜 53％、特異性 100％であり、コア生

Cytological findings of each lymph node

検よりも特異的であったとされるが、実際に細胞診が用いられることは稀である。その要因と(A) Bovine leukemia obtained from sample No. 1. (B) Reactive
lymph node obtained from sample No. 10. (C) Normal lymph node
obtained from sample No. 16. (Hemacolor® staining, original magnification×1000)して、牛では屋外での診療が基本であることや、炎症性に腫大したリンパ節との鑑別が困難であ－ 85 －

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細胞診による牛白血病診断基準の検討の診断根拠とすべきではないと思われた。

ること［10］、さらに、小動物で一般的に用いられる細胞の構成比率をもとにした診断基準が今回用いた牛白血病群は地方病型が 5 検体、これまで検討されていないことに起因する。犬皮膚型が 1 検体、分類不能型が 1 検体であった

猫のリンパ腫診断では、“大、中リンパ球を合が、いずれも体表リンパ節の腫脹を特徴としてわせた大型リンパ球の割合が 50％以上”といいた。近年、体表リンパ節の腫大が見られない

う基準が一般に用いられており、そのほとんど非典型的な牛白血病症例が報告されているで大型リンパ球が 80％を超えるとされるが［2，［12］。その場合、生前の細胞診は適応とはなら

6，7］、牛においてこの診断基準が適応可能かないが、中心部の壊死により細胞がうまく採取どうかはこれまで評価されていない。

できない場合や、血液混入により評価が困難な

今回、細胞診を用いて各病態における細胞構もの［5］を除き、体表リンパ節の腫大が特徴

成比率を計測したところ、牛白血病群では大、的な牛白血病症例において、細胞診を用いた診中リンパ球を合わせた大型リンパ球の割合が全断法は極めて有用であると思われた。今回検討ての検体で 80％を超えており、また反応性腫できなかったが、子牛型や胸腺型牛白血病にお大群、正常群の大型リンパ球の割合は最大でいても、腫大した体表リンパ節や胸水の細胞診16％と、50％を超えるものは存在しなかった。

において大型リンパ球の増加が報告されている

よってリンパ節の構成細胞比率をもとにした診ことから［1，15］、今後、様々なタイプの牛白断基準である“大、中リンパ球を合わせた大型血病症例を加え更なる検討が必要と思われた。

リンパ球の割合が 50％以上”は、牛においても適応可能であると思われた。しかしながら、犬猫ではリンパ腫発症の初期段階において大型リンパ球が 50％未満となることや、反応性であっても 20％以上出現する可能性が指摘されている［6］。牛においても症例の病態によりこのような所見が得られる可能性があることから、その場合、臨床所見や各種腫瘍マーカー［16］を用いるなど、総合的な判断が必要になるものと思われた。また、反応性リンパ節では形質細胞の増加がみられる場合があるとされ［6］、今回用いた反応性腫大群 6 例においても形質細胞が出現している例が 3 例存在した。反応性腫大群の 1 例において好中球の増加（10％）が観察され、化膿性リンパ節炎であると思われた。
牛白血病群の核分裂像は反応性腫大群と比較し増加していたものの、有意な差は認められなかった。また、反応性腫大群の 6 検体中 5 検体で核分裂像が観察されており、牛白血病群で観察された核分裂像の下限（4/5 HPF）を超える例が 2 検体存在した（9 および 5/5 HPF）
。犬猫のリンパ腫における核分裂像は、腫瘍の分化度（High grade、Low grade）を判断するひとつの指標であり［7，11］、腫瘍化の判断には用いない。組織学的にも反応性に腫大したリンパ組織内では核分裂像が散見されることが知られており［4］、核分裂像の増加は牛白血病診断の一助となり得るが、核分裂像の有無を牛白血病－ 86 －［引用文献］
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EVALUATION OF DAGNOSTIC CRITERIA OF BOVINE LEUKEMIA

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Evaluation of diagnostic criteria of bovine leukemia
based on the cell constitution ratio of lymph node biopsy materials
Michihito Tagawa1), Noriyuki Horiuchi2), Kotaro Matsumoto1),
Yoshiyasu Kobayashi2), Hidefumi Furuoka2), Hisashi Inokuma1)1) Department of Clinical Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine,
Inada, Obihiro, Hokkaido, 080-8555, Japan2) Department of Basic Veterinary Medicine, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine[Abstract]
Smear samples obtained from enlarged lymph node of bovine leukemia (n＝7), reactive lymph nodes(n＝6) and normal lymph nodes (n＝8) were examined whether diagnostic criteria based on the cell
constitution ratio were adaptive. The remarkable increase of large and middle lymphocytes was observed in the bovine leukemia group (89.0±6.1%) compared with the reactive (10.8±3.2%) and normallymph node (3.0±1.0%) groups. The bovine leukemia group (9.6±6.5/5 HPF) had higher number of mitosis than reactive (3.5±3.1/5 HPF) and normal lymph node (0.0±0.0/5 HPF) groups. However, 2 samples among 6 reactive lymph nodes exceeded the lower limit of mitosis observed in bovine leukemia
group. It was thought that the diagnostic criteria for bovine leukemia based on the cell constitution
ratio was useful.
Key words: Bovine Leukemia, Cell Constitution Ratio, Cytology, Lymph Node, Mitosis－ 87 －