有用酵素創成を目的とする halophilic タンパク質高発現系の開発藤原健智（静岡大学 理学部）
研究の目的
好塩性アーキアは，飽和濃度の塩水環境に適応した極限環境微生物である。この微生物が持つ酵素タンパク質の多くは，安定した酵素機能に高濃度の塩の共存を要求する1)。このような‘halophilic’な性質は，例えば発酵食品製造などへの応用可能性を期待させる。これまで私は，halophilicタンパク質の機能改変に応用しうる，好塩性アーキアの遺伝子操作法の改良に取り組んできた2)。そのシステムを利用し，好塩性アーキアにおける嫌気的代謝の誘導制御系の解析を行った。
好塩性アーキアHaloferax volcaniiは，嫌気的な環境の下では，酸素のかわりに硝酸塩（NO3¯）を呼吸基質とする硝酸塩呼吸，すなわち脱窒を行うことで増殖する3-5)。脱窒によりNO3¯は，亜硝酸塩（NO2¯），一酸化窒素（NO），亜酸化窒素（N2O）を経て窒素（N2）に変換されるが，各反応は，それぞれ異なる脱窒酵素により触媒される。これらの脱窒酵素は嫌気環境でのみ発現するが，アーキアにおいては，その発現制御のメカニズムはこれまで全く不明であった。

NO3¯からNO2¯への還元を触媒する異化型
硝酸塩還元酵素遺伝子narBCGHD の近傍には，新規な DNA 結合タンパク質をコードする遺伝子narRが存在する6)（図 1）。今回私は，脱窒の誘導制御におけるNarRの役割を明らかにするため， narR遺伝子欠損株の作成と，NarRリコンビナントおよ

図 1. Hfx. volcanii の硝酸塩還元酵素
NarBCGHD の遺伝子構造。硝酸塩還元酵素遺伝子は 11 個の ORF を含むオペロンであり，第2,3,5~8 番 ORF （緑）の遺伝子産物は酵素のサブユニットである。また，オペロンの直上流に DNA 結合タンパク質 NarR（赤）の遺伝子が存在する。

び変異体の発現実験を行った。

方法
narR遺伝子欠損株は，Hfx. volcanii H26（∆pyrE2）を用いたdouble-crossover法により作成した7)。まずnarR遺伝子の上流（USR），下流（DSR）領域を，ウラシル合成酵素遺伝子pyrE2 を含むpTA131 に挿入することで，組み換え用プラスミドpTAnarRを作成した（図 2A）。pTAnarRをHfx. volcanii H26 に導入し，ウラシル非要求性（Step1），およびフルオロオロト酸耐性（Step 2）をそれぞれ指標として相同組み換え体の選択を 2 回行うことでSH01 株を得た（図 2A）。USR-f, DSR-rプライマーを用いたPCRにより，SH01 株におけるnarR遺伝子（670 bp）の欠損を確認した（図 2B）。NarRリコンビナントの発現は，Haloarcula marismortuiの好塩性カタラーゼ遺伝子katG，あるいはHfx. volcanii の亜硝酸塩還元酵素遺伝子nirKのプロモーターにnarR遺伝子を連結し，Hfx. volcanii-E. coliシャトルベクターpMLH32Sにそれぞれクローニングした

pHKNR，pHNNRを用いて行った2,8)（図 2C）。ここで，KatG

図2．narR遺伝子欠損株の作成とリコンビナントNarRの発現。narR遺伝子の破壊は，ウラシル合成酵素遺伝子pyrE2を利用したdouble-crossover法によって行った（A, B）。リコンビナントNarRの発現には好塩性アーキアのkatGまたはnirK遺伝子プロモーターを利用した（C）。

は構成的に発現する酵素であり2)，またNirKは嫌気条件下でのみ発現する脱窒酵素である4)。pMLH32S，pHKNR，pHNNRをSH01 に導入し，それぞれSH02，SH03，SH09株とした。

結果
narR 遺伝子を持つ H26 株（図 3A），narR 遺伝子を欠損させた SH01 株（B）， SH01
株に pMLH32S，pHKNR，pHNNR をそれぞれ形質転換した SH02（C），SH03（D），

SH09 株（E）を用いて培養実験を行った。好気条件（●）ではいずれも活発に増殖した。
一方，嫌気・硝酸塩存在下（■）では，narR 遺伝子を持たない SH01, SH02 は増殖しないが，NarR リコンビナントを強制発現させることによって増殖能が回復した。この結果は，好塩性アーキアにおいて，NarR が脱窒の誘導に必須であることを示す。

NarR は C 末端部に Helix-Turn-Helix 構造を持つ DNA 結合タンパク質であり，4 ないし 5 残基のシステインを含む新規な Cys-rich モチーフを構造上の特徴とする。
図 4A は Hfx. volcanii と Har. marismortui に存在する NarR のホモログである。pHKNR上の narR 遺伝子に点変異導入することで，ホモログ間で保存されている第 17，81，83，91 番のシステイン，および保存されていない第 100 番のシステインをそれぞれセリンに置換した各変異 NarR をそれぞれ SH01 に発現させたところ，C100S 変異体以外は脱窒による増殖能が回復しなかった（図 4B）。

図3. リコンビナントNarRの発現による脱窒能の回復。好気的(●)，あるいは嫌気的(気相酸素分圧0.2%)に硝酸塩存在下(■)，非存在下(▲)で培養し，培養液濁度の変化を経時的に測定した。

図4．NarR中のCys-richモチーフの機能。Hfx. volcanii NarR (HVO_B0159)
は，C末端部にDNA結合モチーフ，N末端側に4ないし5残基のシステインを含む新規なCys-richモチーフを持つ。そのア ミ ノ 酸 配 列 を Hfx. volcanii と Har.
marismortuiに存在するホモログと比較した(A)。 pHKNRに点変異導入することで，第17,81, 83, 91番の保存システイン，および保存されていない第100番のシステインをそれぞれセリンに置換した変異NarRをSH01に発現させた(B)。
バーの色は図3と同じ培養条件を示し，培養開始8日後の培養液の濁度を表している(n=3)。

結論
新 規 な 構 造 を 持 つ DNA 結 合 タ ン パ ク 質

NarRは，好塩性アーキアにおいて脱窒の誘導を制御する機能を持つことが示された。バクテリアによる脱窒は，2 成分システムFixJLやFNRと呼ばれる転写制御系によって支配されているが9) これらの転写制御因子のホモログは，アーキアには存在しない。一方 NarR
は，好塩性アーキアに特有のDNA結合タンパク質である。NarRによる脱窒制御系はアーキ
アで独自に進化したものであろう。現在，全ゲノム構造が明らかになっている 9 種の好塩性アーキアの中の 6 種にNarRのホモログが存在する。脱窒を含む様々な嫌気代謝系を制御する因子として，これらのNarRは好塩性アー

図5. NarRによる脱窒の誘導制御の作用モデル。NarRのCys-richモチーフは，おそらくO2センサーとして機能する。嫌気環境下で活性化されたNarRは，脱窒酵素遺伝子プロモーター上のTATA-boxの約50b上流に存在するコンセンサス配列*に結合し，転写を活性化する。*CGAA(c/g)A(c/t)GTTC(a/g)

キアにおいて重要な役割を担っていると考えている10)。NarR特有のCys-richモチーフに含まれる 4 残基のシステインはその機能に必須である。NarRによる誘導制御の作用機作として，現在我々が提案しているモデルを図 5 に示す。このCys-richモチーフは，NarRの酸素あるいはレドックス・センサーとしての機能に必要と考えている。嫌気環境下で活性化されたNarRが，各脱窒酵素遺伝子のプロモーターに結合することで転写が活性化される，というモデルをもとに，今後さらに研究を進めていく。

文献
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