コリネ型アミノ酸生産菌の低酸素適応性に関わる遺伝子の解明
池田 正人（信州大学 農学部）
研究の目的
アミノ酸発酵は多量の酸素を必要とする。酸素が不足すると、アミノ酸の代わりに有害な有機酸が蓄積し、発酵は成立しない。このため、溶存酸素を一定レベル以上に維持することが重要であり、その管理に多大なコストと労力が割かれている。もし、酸素が不足してもアミノ酸を効率よく生産する、いわば“低通気適応株”を育種できれば、アミノ酸発酵のみならず、酸素を要する発酵全般にプロセス効率化を図る新しい技術になるが、現在、そのような技術はない。我々は先に、種々の好気性菌の酸素要求特性を比較し、アミノ酸発酵菌コリネバクテリウム・グルタミクムが比較的低濃度の酸素濃度下でも生育することを報告した(1)。このことを踏まえれば、同菌には何らかの低酸素適応機能が備わっている可能性がある。そこで、我々は酸素の要求量が逆に高まった変異株を分離し、その回復遺伝子を特定する方法で、本菌における低酸素適応性に関わる機能をゲノム上から探索することを試みた。

方法
各種の低濃度酸素環境は、嫌気性菌や微好気性菌の簡易培養用に販売されている酸素吸収剤（スギヤマゲン、アネロパックシリーズ）および専用密閉容器を用い、メーカーのマニュアル（http://www.sugiyama-gen.co.jp/micro/p35.html）に従って酸素吸収剤の量を調節することにより構築した。高濃度酸素要求株は、ニトロソグアニンジンを用いて定法により変異処理した野生株の変異処理菌体から、ビロードレプリカ法にて、低濃度（0.5%付近）の酸素環境下では生育できない変異株を選択することにより取得した。高濃度酸素要求株の同形質を回復させる遺伝子は、野生株のゲノムライブラリで高濃度酸素要求株を形質転換し、酸素濃度が 0.5%または 6%の低酸素条件で生育する形質転換株を選択することによって取得した。このようにして取得した遺伝子の各種高濃度酸素要求株に対するクロス相補能は、各形質転換株を上述の低濃度酸素環境でプレート培養する方法、ならびに MM 培地を含む試験管で静置培養する方法により調べた。

結果
１．高濃度酸素要求株の誘導
酸素濃度を大気レベル（21％）から 0％まで段階的に減らすと、コリネバクテリウム・グルタミクム野生株 WT-96 は酸素濃度の低下に伴い徐々に生育が弱まり、0.5%濃度付近にコロニー形成の限界があることがわかった(1)。WT-96 株を変異処理し、大気条件では生育するが、低濃度（0.5%付近）の酸素環境下では生育できない変異株を多数分離した。これらの変異株の酸素に対する依存性をコロニー形成能によって調べた結果、いずれの変異株とも大気条件では生育するものの、酸素が 0.5%や 6%の低い条件では生育できないか生育が著しく悪化することが示された。この内、典型的な表現型を示した５株（OX-3、OX-96、OX-109、OX-112 および OX-119）の酸素依存性を図１に示す。
２．高濃度酸素要求性を回復させるＤＮＡ断片の取得
これら５種の高濃度酸素要求株を受容菌として、野生株 WT-96 のゲノムライブラリから同形質を回復させる DNA 断片のクローン化を試みた。
いずれの変異株においても、酸素濃度が 0.5%または 6%の低酸素条件で選択することにより目的とする形質転換株が取得された。これら形質転換株のプラスミドを解析した結果、OX-3 株の相補プラスミドとして 1.9Kb の EcoRI 断片を有する pEco1.9 が、OX-96 株の相補プラスミドとして2.1Kb の BamHI 断片を有する pBam2.1 が、OX-109 株の相補プラスミドとして 3.2Kbの EcoRI 断片を有する pEco3.2 が、OX-112 株の相補プラスミドとして 1.1Kb の EcoRI断片を有する pEco1.1 が、そして OX-119 株の相補プラスミドとして 1.8Kb の BamHI
断片を有する pBam1.8、3.2Kb の BamHI 断片を有する pBam3.2、および 2.5Kb のSalI 断片を有する pSal2.5 の３種プラスミドが得られた。
図１に各々の形質転換株の種々酸素濃度条件下における生育能を示した。高濃度酸素要求株は酸素濃度が低い条件では生育しないのに対し、形質転換株はその形質が野生株に近いレベルにまで回復しているのがわかる。なお、同様なショットガンクローニングを別の 10 株の高濃度酸素要求株についても行ったが、得られたＤＮＡはいずれも上記のいずれかの DNA と同一であった。
Oxygen concentrations (%)

Oxygen concentrations (%)

21216
++

0.5
++

+

Wild

0.5++

++

++

--++

++/-+

--++

+/--++++/-++

++/-

Wild+

-OX-112OX-3+++/OX-112(pEco1.1)

OX-3(pEco1.9)+--OX-96

OX-119+++/-OX-96(pBam2.1)

OX-119(pBam1.8)++-OX-119(pBam3.2)

OX-109++
OX-109(pEco3.2)

6+++
OX-119(pSal2.5)

図１．高濃度酸素要求株と相補クローンの各種酸素濃度下での生育
C. glutamicum 野生株WT-96およびその高濃度酸素要求株の培養希釈液(約103/ml)をBY寒天プレートに50μl塗布し、示された酸素濃度条件下、30℃で2日間培養後の生育を示す。

３．高濃度酸素要求性に関わる遺伝子の特定
上記で得た７種のプラスミドにクローン化されたDNA断片の塩基配列を決定し、コリネバクテリウム・グルタミクムのゲノムデータベース(2)に照合して各DNA断片上に存在する完全長の遺伝子を検索した。その結果、pEco1.9 にはCgl0807 が、pBam2.1にはCgl1101 とCgl1102 の 2 遺伝子が、pEco3.2 にはCgl2859 とCgl2861 の 2 遺伝子が、
pEco1.1 にはCgl0600 が、pBam1.8 にはCgl1427 が、pBam3.2 にはCgl2857 とCgl2858の 2 遺伝子が、そしてpSal2.5 にはCgl2857 とCgl2859 の 2 遺伝子が存在することがわかった。挿入断片上に２遺伝子を有するpBam2.1、pEco3.2 およびpBam3.2 について
は、各遺伝子のサブクローニングと相補試験により、相補能に関わる目的遺伝子が、それぞれ、Cgl1102、Cgl2859、Cgl2857 であることを明らかにした。以上から、RNAポリメラーゼσ24因子Cgl0600、鉄の取り込みに関わるシデロフォア関連タンパク質Cgl0807、呼吸鎖に関わるフェレドキシンタンパク質Cgl1102、核酸の合成に関わるシチジル酸キナーゼCgl1427、そして機能未知の膜タンパク質Cgl2857 およびCgl2859 の計 6 遺伝子が、高濃度酸素要求性に関わる遺伝子として特定された（表１）(3)。いずれの遺伝子についても低酸素適応性との関連はこれまでに知られていない。なお、機能未知の膜タンパク質Cgl2857 およびCgl2859 のオーソログは、大腸菌や枯草菌等、他の属に属する微生物には見出せず、コリネバクテリウム・グルタミクムやコリネバクテリウム・エフィシャンス等、いわゆる“グルタミン酸菌”に特有の遺伝子である。
４．各遺伝子の５種高濃度酸素要求株に対するクロス相補能OX-119 株を相補するプラスミドとして、異なる２種の遺伝子 Cgl1427 と Cgl2857を有するプラスミド、それぞれ pBam1.8、pBam3.2 が取得された（図１）。このことは、取得した遺伝子が別の遺伝子に変異をもつ変異株の高濃度酸素要求性をサプレスする能力を有することを示唆する。この可能性を、取得した全ての遺伝子について調べる
表 1. 取得したプラスミドと挿入断片上の推定遺伝子

Plasmid

Insert size (kb)Genes (Putative functions)pEco1.9

1.9

Cgl0807 (Siderophore-interacting protein)pBam2.1

2.1

Cgl1101 ( Membrane protein)
Cgl1102 (Ferredoxin)

pBam2.1d0.54

Cgl1102 (Ferredoxin)

pEco3.2

3.2

Cgl2859 (Membrane protein)
Cgl2861 (Glycosyltransferase)pEco1.1

1.1

Cgl0600 (RNA polymerase 24 subunit)

pBam1.8

1.8

Cgl1427 (Cytidylate kinase)

pBam3.2

3.2

Cgl2857 (Membrane protein)
Cgl2858 (Acyltransferase)

pSal2.5

2.5

Cgl2857 (Membrane protein)
Cgl2859 (Membrane protein)ため、各々の遺伝子について５種の変異株に対するクロス相補能を調べた。導入するプラスミドとして、Cgl2857 およびCgl2859 以外の４遺伝子は各々の遺伝子を単独で含む
プラスミド、すなわちpEco1.9（Cgl0807 を含有）、pBam2.1d（pBam2.1 からCgl1102のみをサブクローニングしたプラスミド）、pEco1.1（Cgl0600 を含有）、pBam1.8（Cgl1427を含有）を用いた（表１)。一方、Cgl2857 とCgl2859 の両遺伝子は共に機能未知の膜タンパク質をコードし、ゲノム上で互いに隣接して存在することから、両遺伝子産物が複合体を形成して同一の機能を担っている可能性が高い。従って、両遺伝子をセットで持つプラスミドpSal2.5 を用いた（表１)。これら 5 種のプラスミドの各種変異株における導入効果を、酸素供給が不十分な静置培養にて調べた。その結果、pEco1.1（RNAポリメラーゼσ24因子）、pBam1.8（シチジル酸キナーゼ）およびpSal2.5（機能未知の膜タンパク質）の 3 種プラスミドは、対応する変異株の相補能だけでなく、他のいずれの変異株をも多かれ少なかれ相補する能力を有していることがわかった(3)。一方、他 2種のプラスミド、pEco1.9（シデロフォア関連タンパク質）およびpBam2.1d（フェレドキシンタンパク質）は、対応する変異株、それぞれOX-3 およびOX-96 に対してはクロス相補能を有していたが、他の 3 種変異株に対しては相補能を示さなかった(3)。つまり、これら 2 遺伝子については相補能が限定的であることを示している。以上と同様な結果は、プレート培養試験においても確認された。

結論
コリネバクテリウム・グルタミクムの野生株から変異誘導した高濃度酸素要求株を受容菌とし、それらの形質を回復させるDNA断片をクローン化することにより、高濃度酸素要求性に関わる遺伝子を計６種特定した。これらは、鉄の取り込みに関わるシデロフォア関連タンパク質Cgl0807、呼吸鎖に関わるフェレドキシンタンパク質Cgl1102、RNAポリメラーゼσ24因子Cgl0600、核酸の合成に関わるシチジル酸キナーゼCgl1427、そして機能未知の膜タンパク質Cgl2857 およびCgl2859 である。このうち後４者は、対応する変異株だけでなく他の変異株も広く相補する能力を有しており、低酸素環境での生育不良を回復させる汎用的能力を有することが示唆された。アミノ酸生産菌として長年にわたり変異育種された工業菌株は一般に、低酸素環境などのストレスに感受性を示し、野生株に比べて低酸素適応性が劣る。その遺伝的要因は不明であるが、本研究で特定した遺伝子を強化することで工業菌株の低酸素適応性を高められる可能性がある。

文献
1.

Takeno, S., Ohnishi, J., Komatsu, T., Masaki, T., Sen, K., and Ikeda, M.
Anaerobic growth and potential for amino acid production by nitrate
respiration in Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbiol. Biotechnol.
75:1173-1182 (2007)

2.

Ikeda, M., and Nakagawa, S. The Corynebacterium glutamicum genome:features and impacts on biotechnological process. Appl. Microbiol. Biotechnol.
62:99-109 (2003)

3.

Ikeda, M., Baba, M., Tsukamoto, N., Komatsu, T., Mitsuhashi, S., and Takeno,
S. Elucidation of genes relevant to the microaerobic growth of

Corynebacterium glutamicum. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73:2806-2808(2009)