同一農場から分離された複数の薬剤耐性パターンを示す
Salmonella Typhimurium の解析
菅原
福島県会津家畜保健衛生所（〒 965-0077

克福島県会津若松市高野町上高野字村前 90）

施するうえで非常に重要である。

1 ．はじめに過去の福島県牛由来 S. Typhimurium 分離株の調査では，1 農場につき一つの薬剤耐性パターン

牛においての Salmonella Typhimurium 感染症しか示さず，本事例のように同一農場で複数の耐は子牛のみならず搾乳牛においても，発熱，下痢性パターンを示す事例は皆無であった［12］。本などの症状を示し，重篤例では死に至る場合も稿の目的は，同一農場から分離された異なる薬剤ある伝染性疾病である。また，S. Typhimurium

耐性パターンを示す株を材料に，①農場内に複数は，サルモネラ属菌の中で代表的な人獣共通感染株存在するのか，あるいは単一株から派生したも症原因菌として認識されており，さらに本菌の多のなのか，②単一株由来ならばどのように派生し剤耐性化が近年公衆衛生上問題視されている。S.

たのかを検証するため解析を実施した。

Typhimurium の多剤耐性菌として代表的なもの

2 ．材料と方法

は，1990 年代に流行した 5 薬剤（アンピシリン（ABPC），ストレプトマイシン（SM），テトラサイクリン（TC），クロラムフェニコール（CP），使用菌株は，2007 年 11 月から 2008 年 2 月に 1

サルファ剤に耐性を示すファージ型 DT104 があ農場から分離された異なる薬剤耐性パターンを示り ［7］，近年には医療上重要薬剤なセフェム系

す S. Typhimurium 5 株を用いた（表 1）。

薬剤に対する耐性増加が欧米諸国で報告されていファージ型別は，国立感染症研究所に依頼し，MIC 測定による薬剤感受性試験は CLSI 法に準拠る［3］。
2007 年 11 月，福島県において交雑種約 300 頭した寒天平板希釈法［10］により ABPC，セファの牛を飼養する農場で発熱，下痢を主徴とする S.

ゾ リ ン（CEZ）， セ フ チ オ フ ル（CTF），SM，

Typhimurium 感染症が発生した。その後，約 3 ヵ

カナマイシン（KM），ゲンタマイシン（GM），月にわたって同農場の発症牛および環境材料からTC，CP，トリメトプリム（TMP），ナリジクス

分離した S. Typhimuruim を用い一濃度ディスク酸（NA），エンロフロキサシン（ERFX）の 11 薬法による薬剤感受性試験を実施した結果，5 つの剤について実施した。なお，各薬剤のブレイクポ

薬剤耐性パターンに分類され，そのうち 3 パター

イントは以下の文献などの値を参考にした［6, 8,ンは公衆衛生上重要なセフェム系薬剤についても11］。

耐性であった。薬剤感受性試験は，有効薬剤の選プラスミドプロファイルおよび PFGE は常法択に使用されるだけではなく，簡易に表現型を識により実施した。プラスミドサザンハイブリダイ

別する方法として認識されている［1］。また，分ゼーションは各株のプラスミド DNA を抽出し，離株を型別することは，農場内のサルモネラ浸潤

アガロースゲルにて電気泳動後，Roche 社のマ状況，新たなサルモネラの農場内への侵入の確認，ニュアル［5］に基づき実施した。

発生農場のサルモネラ清浄化などの防疫対策を実

プラスミド伝達試験は，NA 耐性である大腸菌
43

44 動物抗菌会報 32（2010）
表1

S. Typhimurium 分離株およびそのトランスコンジュガントのファージ型と薬剤耐性パ
ターン
分離株 /トランスコンジュガント

ファージ型別薬剤耐性パターン

19-1820

DT104

19-1821

Untypable

ABPC, SM, KM, TC, CP,

19-1822

Untypable

ABPC, CEZ, CTF, SM, GM, TC, CP,

19-1823

Untypable

ABPC, CEZ, CTF, SM, KM, GM, TC, CP,

Untypable

ABPC, CEZ, CTF, SM, KM, GM, TC, CP, TMP19-1824
ML/19-1822

ABPC, SM, TC

NT

ABPC, CEZ, SM, GM, TC, CP, NA

ML/19-1823 a）

NT

ABPC, CEZ, SM, KM, GM, TC, CP, NA

ML/19-1824

NT

SM, TMP, NANTNAa）

a）

ML1410 c）

b）a） トランスコンジュガントの株名は，ML/ 親株としたb） NT: 実施せず
c）レシピエント

ML1410 株をレシピエントとして用い，Akiba ら［2］の方法を基に実施した。なお，得られたトランスコンジュガントの株名はドナー株名の頭にML/ を付けることとした（表 1）。
分離株およびトランスコンジュガントの PCR
によるプラスミド型別，βラクタマーゼ型別および IncA/C プラスミド backbone 解析は，それぞれ Carattoli ら［4］，Kojima ら［9］および Welchら［13］の方法に従い実施した。

3 ．結果

S. Typhimurium のファージ型別では 19-1820 株
のみ DT104 と型別され，その他の 4 株はファージ型別不能（untypable）であった （表 1）。
MIC 測定による薬剤感受性試験では，3 ～ 9薬剤に耐性が認められ，5 株すべて異なる耐性
パ タ ー ン を 示 し た（ 表 1）
。 ま た，19-1822 株，
19-1823 株および 19-1824 株の 3 株では，第 3 世代セフェムである CTF についても耐性を示した。
プラスミドプロファイルにおいても 5 株すべてで異なるプロファイル像を示し，19-1820 株以外の株については，165kbp 以上の巨大プラスミドを含む 2 つ以上のプラスミドの保有が確認された（図 1）。

図1

S. Typhimurium のプラスミド解析

A：プラスミドプロファイル，B：図の横に示されている特異遺伝子プローブを用いたプラスミドサザンハイブ
リダイゼーション
M：BAC-Tracker Supercoiled DNA ladder，1：19-1820，2：19-1821，3：19-1822，4：19-1823，5：19-1824.

菅原 克／複数の耐性パターンを示す同一農場由来 ST の解析／ 32（2010） 45

PFGE では XbaI，BlnI の両切断像において，19-1820 株以外の 4 株は非常に類似度の高い泳動像を示していた（図 2）。
分離株のβラクタマーゼ型別では 19-1820 株，19-1821 株および 19-1822 株でそれぞれ異なった
遺 伝 子 pse-1，tem-1 お よ び cmy-2 が PCR に て 検出され，19-1823 株および 19-1824 株では tem-1 とcmy-2 の 2 つの遺伝子が検出された（表 2）。プラ
スミド型別では，IncFIIA がすべての株， IncA/Cが 19-1820 株を除く 4 株， IncFIB が 19-1821 株，
19-1823 株 お よ び 19-1824 株 の 3 株， IncI1-Iγが 19-1824 株のみで検出された（表 2）。また，
IncA/C プ ラ ス ミ ド を 保 有 す る 4 株 で IncA/C
backbone PCR を実施した結果，19-1821 株のみ 4～ 9 のプライマーセットで陰性を示し，その他の4 株では 12 プライマーセットすべてで増幅産物が確認された（表 2）。
特異的遺伝子プローブを用いたプラスミドサ
ザンハイブリダイゼーションを実施した結果，
図 1 および表 3 に示したように， IncFIIA およびspvB が 95kbp ま た は 165kbp， IncA/C が 80kbp
ま た は 165kbp 以 上， IncFIB が 165kbp，IncI1I γが 95kbp プラスミドで特異的なシグナルが得られた。
大腸菌 ML1410 株をレシピエントとして用いた
プラスミド伝達性試験では，19-1822 株，19-1823

図2

S. Typhimurium の制限酵素 XbaI（A）およびBlnI（B）を用いた PFGE
M：DNA size marker，1：19-1820，2：19-1821，3：19-1822，4：19-1823，5：19-1824.

表2株および 19-1824 株の 3 株でトランスコンジュガントが得られ，19-1820 株および 19-1821 株では得られなかった。得られたトランスコンジュガントを解析した結果，
表 1 および表 2 のようになった。

S. Typhimurium 分離株およびそのトランスコンジュガントのβラクタマーゼ型別，プラスミド型別およびIncA/C backbone PCR

分離株 /βラクタマーゼ
トランスコンジュガント型別19-1820
19-1821
19-1822
19-1823
19-1824
ML/19-1822 a）
ML/19-1823 a）
ML/19-1824 a）
ML1410 e）

pse-1
tem-1
cmy-2
cmy-2, tem-1
cmy-2, tem-1
cmy-2
cmy-2, tem-1NDb）
ND

プラスミド型別IncA/C プラスミド backbone PCRc）
1FIIANT d）
FIB, FIIA, A/C+FIIA, A/C+FIB, FIIA, A/C+FIB, FIIA, A/C, I1-I γ +A/C+FIB, A/C+I1-I γ
NTNDNT

2

3

4

5

6

7

8

9101112++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++a） トランスコンジュガントの株名は，ML/ 親株としたb） ND: 検出されず
c） IncA/C backbone PCR は Welch らの 12 のプライマーセットを用いた方法に従い実施した［12］d）NT：実施せずe）レシピエント

46 動物抗菌会報 32（2010）表3

 . Typhimurium 分離株のプラスミドサザンハイブリダイゼー
Sション結果分離株

プラスミドサイズ（Kbp）

プラスミド型別

spvB

19-182095

FIIA＋

19-1821
19-1822
19-1823

19-1824

80

A/C

－

165

FIB, FIIA＋

95

FIIA＋165<

A/C

－

165

FIB, FIIA＋165<

A/C

－

95

I1-I γ－165

FIB, FIIA＋165<

A/C－

ML/19-1822 株では，βラクタマーゼが cmy-2，ミドの保有が確認されたが，19-1821 株の incA/C

プラスミドが incA/C と型別され，薬剤耐性パター

プラスミドのみ 80kbp であった。また，19-1821

ンは ABPC，CEZ，SM，GE，TC，CP，NA であり，株の IncA/C プラスミドのみ自己伝達能がなく，ML/19-1823 株 で は，ML/19-1822 株 の 結 果 に β

IncA/C backbone PCR では，一部のプライマーラクタマーゼ，プラスミド型別，薬剤耐性パターセットで増幅産物が確認されなかった。一方，他ンがそれぞれ，tem-1，incFIB，KM 耐性が追加の 3 株の IncA/C プラスミドは自己伝達能をもつされた結果となった。ML/19-1824 株ではβラク165kbp 以上であり，IncA/C プラスミドのみ保有タマーゼが検出されず，プラスミド型別が IncI1-するトランスコンジュガントとともに，IncA/C

I γ，薬剤耐性パターンは SM，TMP，NA となった。

backbone PCR のすべてのプライマーセットでIncA/C プラスミドを持つ ML/19-1822 株および増幅産物を認めた。また 165kbp 以上の IncA/C

ML/19-1823 株の IncA/C backbone PCR では，12プライマーセットすべてで遺伝子の増幅が確認さプラスミドにはセフェム系薬剤耐性に関与するcmy-2 遺伝子が規定され，多くの薬剤に耐性をれた（表 2）。なお，19-1823 株および 19-1824 株示していた。以上の結果から，サイズの異なるをドナーとして用いた伝達性試験においても，

IncA/C プラスミドは何らかの原因により，cmy-2

ML/19-1822 株と同様の性状を示すトランスコンや 自 己 伝 達 能 に 関 す る 遺 伝 子 な ど が 脱 落 し，ジュガントが分離された。

80kbp となったことが示唆された。また，今回解4 ．考析した IncA/C プラスミドは Welch ら［13］が解
析した Salmonella Newport 由来 IncA/C プラスミ

察ドと近縁であり，セフェム系を含む多くの薬剤耐今回解析した薬剤耐性パターンが異なる S. Ty-性に関与する自己伝達性プラスミドであるが，一phimurium5 株は，プラスミドプロファイルにお部の遺伝子が脱落したと示唆された株も検出されいてもすべて異なるパターンに型別された。
一方，たことから，遺伝子的に不安定なプラスミドであファージ型別および PFGE 結果では 2 つのグルーることが推察された。

プに分類され，1 つはファージ型 DT104 が 1 株，19-1822 株が他のファージ型 untypable の 3 株

もう一つはファージ型 untypable が 4 株であり，と異なる点は，KM 感受性であること，tem-1 お

後者の 4 株は PFGE では株間で非常に遺伝子的よび IncFIB プラスミドが検出されなかったこと類似度が高い関係であることが示唆された。

であった。また，IncA/C および IncFIB プラスミ

ファージ型 untypable の 4 株は IncA/C プラス

ドを保有する ML/19-1823 株は，IncA/C プラス

菅原 克／複数の耐性パターンを示す同一農場由来 ST の解析／ 32（2010） 47

ミドのみ保有する ML/19-1822 株と比べて tem-1ロファイルを持っており，このことが異なる耐性と KM 耐性が追加されていた。以上の結果から，パターンを示す理由であるかもしれない。

IncFIB プラスミドは tem-1 および KM 耐性に関与する遺伝子が規定されていると推察された。

引用文献

19-1824 株では，他のファージ型 untypable の 3株で検出されなかった 95kbp の IncI1-I γプラス1 ）Adaska JM, Silva JA, Berge ACB, Sischo WM:

ミドを保有しており，このプラスミドは，伝達性

Genetic and phenotypic variability among Salmo-試験によって，TMP 耐性に関与する自己伝達性

nella enteric serovar Typhimurium isolates fromプラスミドであることが示唆された。

Calfornia dairy cattle and humans. Appl Environ

以上の結果から，分離株が得られた農場には，

Microbiol, 72, 6632-6637 (2006)

ファージ型 DT104 と untypable の 2 つの株が流2 ）Akiba M, Nakaoka Y, Kida M, Ishioka Y, Sameshi-

行していたことが示された。また，ファージ型

ma T, Yoshii N, Nakazawa M, Uchida I, Terakado

untypable の 4 株は① IncA/C プラスミド，② In-

N: Changes in antimicrobial susceptibility in acFIB プラスミド，③ IncI1-I γの 3 つのプラスミ

population of Salmonella enterica serovar Dublin

ドの獲得もしくは脱落という変化により，薬剤耐isolated from cattle in Japan from 1976 to 2005. J

性やプラスミドプロファイルがそれぞれ 4 つに型

Antimicrob Chemother, 60, 1235-1242 (2007)

別されたことが示唆された。多剤耐性に関与する

3 ）Arlet G, Bar rett TJ, Butaye P, Cloeckaer t A,自己伝達性プラスミドやセフェム系薬剤耐性遺伝

Mulvey MR, White DG: Salmonella resistant to子の流布は，公衆衛生上非常に重要であり，今後extended-spectrum cephalosporins: prevalenceともこれらの動向をモニタリングなどで注意深く

and epidemiology. Microbes Infect, 8, 1945-1954

見守る必要がある。

(2006)4 ）Carattoli A, Bertini A, Villa L, Falbo V, Hopkins

5 ．謝辞

KL, Threlfall EJ: Identiﬁcation of plasmids by PCRbased replicon typing. J Microbiol Methods, 63,

ファージ型別を実施して頂いた国立感染症研究所の泉谷秀昌先生ならびに多大な御助言，技術指導を賜りました（独）農業・生物系特定産業技術研
究機構動物衛生研究所の秋庭正人先生に深謝します。

219-228 (2005)
5 ）DIG アプリケーションマニュアル For Filter Hybridization, Roche
6 ）Esaki H, Morioka A, Ishihara K, Kojima A, Shiroki
S, Tamura Y, Takahashi T: Antimicrobial susceptibility of Salmonella isolated from cattle, swine

要約and poultry (2001-2002): report from the Japanese
Veterinar y Antimicrobial Resistance Monitoring

福 島 県 の 一 肉 牛 農 場 に お い て，Salmonella
Typhimurium 感染症が発生した。薬剤感受性試

Program. J Antimicrob Chemother, 53, 266-270(2004)

験の結果，S. Typhimurium 分離株は異なる 5 つ7 ）Helms M, Ethelberg S, Mølbak K, DT104 Studyの薬剤耐性パターンを示した。これらの分離株

Group: International Salmonella Typhimuriumの疫学的関連性を明らかとするために，それぞDT104 infections, 1992-2001. Emerg Infect Dis, 11,れの耐性パターンを示す代表的な 5 株について，

859-867 (2005)

表現型別および遺伝学的手法により解析した。

8 ）Ishihara K, Takahashi T, Morioka A, Kojima A,

ファージ型別の結果，1 株は DT104 であり，残Kijima M, Asai T, Tamura Y: National surveillance

り 4 株は型別不能であった。また，後者の 4 株は，of Salmonella enterica in food-producing animals

IncA/C, IncFIB, IncI1-I γプラスミドの多様なプ

in Japan. Acta Vet Scand, 51: 35, 1-5 (2009)

48 動物抗菌会報 32（2010）
9）
Kojima A, Ishii Y, Ishihara K, Esaki H, Asai T, Oda C,

susceptibility testing: Thirteen Informational Sup-Tamura Y, Takahashi T, Yamaguchi K: Extended-

plement M100-S13, Wayne, PA, USA. Natio (2003)

spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia

12）菅原克，千葉正，荻野 隆明，伊藤等， 今

coli strains isolated from farm animals from 1999

田 由 美 子： 福 島 県 で 分 離 さ れ た 牛 由 来 Salmo-to 2002: report from the Japanese Veterinary Anti-nella Typhimurium の分子疫学的解析．日獣会誌，

microbial Resistance Monitoring Program. Antimi-59, 820-825（2006）

crob Agents Chemother, 49, 3533-3537 (2005)13）Welch TJ, Fricke WF, McDermott PF, White DG,10）National Committee for Clinical Laboratory Stan-

Rosso ML, Rasko DA, Mammel MK, Eppinger

dards. Performance standards for antimicrobial

M, Rosovitz MJ, Wagner D, Rahalison L, Leclerc

disk and dilution susceptibility test for bacteria

JE, Hinshaw JM, Lindler LE, Cebula TA, Carniel

isolated from animals-second edition: Approved

E, Ravel J: Multiple antimicrobial resistance inStandard M31-A2, Wayne, PA, USA. (2001)

plague: an emerging public health risk, PLoS11）National Committee for Clinical Laboratory Stan-ONE, 2, e309 (2007)

dards. Performance standards for antimicrobial

Analysis of Salmonella enterica serotype Typhimurium withDifferent Antimicrobial Resistance Patterns Isolated from a Farm
Masaru SUGAWARA
Fukushima Prefecture Aizu Livestock Hygiene Service Center,
90 Muramae, Kamikoya, Koyamachi, Aizuwakamatsu, Fukushima 965-0077, JapanAn outbreak of Salmonella Typhimurium infection occurred on a beef cattle farm in Fukushima prefecture. By antimicrobial susceptibility testing, the S. Typhimurium isolates exhibited ﬁve different resistance patterns. To clarify
epidemiological relatedness among the isolates, ﬁve representatives from isolates with each resistance pattern were
further analyzed by phenotypic and genetic techniques. Phage typing revealed that one strain was DT104, whereas theremaining four strains were untypable. In addition, the four untypable strains had varied proﬁles of IncA/C, IncFIB
and IncI1-Iγ plasmids, which may be reason of different resistance patterns among these strains.

討論（座長：江口正志，畜安研）

質問（江口正志，畜安研）
セフェム耐性 S, Typhimurium が分離された同一農場から，5 種類の薬剤感受性パターンが見つかったが，それらのパターンを示す株の分離時期は。
答（菅原克）

から分離された。
質問（藤倉孝夫，動物衛生研究所 OB）① S, Typhimurium は人獣共通感染症の菌の 1 つだが，人に異常はでなかったか。
② S, Typhimurium で人に大変な下痢を引き起こした

19-1821，19-1822，19-1823 の 3 株 と 同 様 の 薬 剤 耐ことがあったと聞いている。遺伝子型を比較する性パターンを示す株は，初発時の牛サルモネラ症発と人から分離されたものと，牛から分離されたも症牛 6 頭程度の材料（糞便，消化管内容物，臓器）のが別だという話で，感染源が違うのではとのこ

菅原 克／複数の耐性パターンを示す同一農場由来 ST の解析／ 32（2010） 49とだった。先生の成績だとどうか。

IncFIB と IncFIIA が存在することが知られている。

答（菅原165kb プ ラ ス ミ ド が IncFIB プ ラ ス ミ ド と IncF Ⅱ克）①人に異常があったとは聞いていない。

A プラスミドの融合したものであるかは不明であ②当時の遺伝子型解析の方法がよく分からないのでる。IncA/C プラスミド pSN254 にはトランスポゾン何ともいえない。感染源が違う可能性はある。

（IS26）が 4 コピー存在することが知られており，本

質問（藤本修平，東海大）

研究における IncA/C プラスミドのサイズ低下が IS26

FIIA，FIB プラスミドのマップ上に，コ・インテグを介した一部領域の脱落に基づく可能性は考えられレイトを作り易いようなものはありますか。
答（菅原克）

そこまでは調べていません。A/C プラスミドはコ・る。
発言（菅原克）

病原性プラスミドにのっている FIB は PCR では検インテグレイトされていない。

出されないが，報告した 165kbp プラスミドは FIIA

質問（藤本修平，東海大）

とともに FIB についても PCR とサザンハイブリで検コインテグレイトはよくあることですか。
答（菅原克）

もともと S, Typhimurium の 95kbp 病原性プラスミ
ドは FIIA と FIB がコ・インテグレイトされているプラスミドだが，今回報告した FIB プラスミドは検査結果から異なったタイプの薬剤耐性遺伝子が規定されている R プラスミドであると考えます。

出された。病原性プラスミドに存在する FIB プラス
ミドとは異なる FIB・R プラスミドが，コ・インテグレイトされたのではないか。
質問（江嵜英剛，畜安研）① ST が分離された農場において，過去に第 3 世代セフェム系抗菌剤の使用歴はあったか。
②最近，第 3 世代セフェムに対する耐性の増加傾向

質問（藤本修平，東海大）

を指摘していたが，CTF に関して，最近，趾間ふ報告はありますか。

らんにも使用できるようになったと思うが，その答（菅原点との関連性についての意見を聞きたい。

克）

私が調べた限りは同様のプラスミドの報告はない。
質問（藤本修平，東海大）

答（菅原克）①今回の農場では第 3 世代セフェムは使っていない。

IncFIB と IncFIIA が同時に検出された 165kb プラス

診断以前に第 2 世代セフェムは使っていた。診断

ミドは，2 つのプラスミドが融合したものか。そのプを受けてからの治療は，薬剤感受性試験の結果にラスミド上には IS などの動く遺伝子は存在するのか。
発言（秋庭正人，動衛研）
S, Typhimurium の病原性プラスミド（95b）には，基づいて投薬したので，セフェムは使っていない。
②関連性は不明である。