セスキテルペン代謝工学に向けた基盤研究木村真

名古屋大学大学院 生命農学研究科
研究の目的
イソプレン単位が３つ重合してできるセスキテルペンには様々な有用化合物がある。
様々なセスキテルペンの基本骨格を大量安価に有機合成することは難しいが、目的の反応を触媒するファルネシルピロリン酸（FPP）環化酵素を導入した微生物を用いて大量に基本骨格を供給することができれば、希少有用セスキテルペン半合成による大量供給への道が拓ける。この際、一次代謝と二次代謝の双方に用いられる原料 FPP を、菌がタイムリーに二次代謝へ供給できるかが大量生産の成功の可否につながる。本研究ではセスキテルペンであるトリコテセン（TCN）を大量に生産する能力を有する Fusarium
graminearum の TCN 産生制御機構を転写因子 FgTri6 の転写制御の観点から理解し、セスキテルペンの代謝工学へ向けた基盤研究を行う。

方法
以下の２つの知見を手がかりに、Tri6 転写制御機構を解析する。
（１）近縁の Fusarium sporotrichioides の TCN 生合成では、FsTri6 活性化にトリコテセン産生誘導物質であるスクロース 1)を必要としない
Tri6 プロモーター上の未同定シス配列の存在や TRI6p タンパク機能の相違が両Fusarium 種間でスクロース応答性が異なる原因となっているのかどうかを明らかにするため、F. graminearum の FgTri6 遺伝子領域の該当する DNA 断片を F. sporotrichioides
由来の DNA 断片に置き換えた。また、Tri6 を構成的に大量発現させた F. graminearum
株も構築した。これらの株を用いて、スクロース非存在下および存在下での TCN 産生を解析した。
（２）Tri6 プロモーター領域には TRI6p 転写因子および窒素飢餓応答の転写因子 AreApの結合コンセンサスサイト 2)が存在する
Tri6 プロモーターに存在する２箇所の TRI6p 結合サイト（5´-AGGCCT-3´）を部位特異的変異導入によって（5´-AGGgCT-3´）へ変換した株、および Tri6 プロモーターの AreAp結合サイト 15 箇所を全て変異させた合成 DNA へ置換した株を作出した。さらに前者の株を宿主に、Tri6 と逆方向の共通プロモーターを有する Tri4 を TEF プロモーター制御下に配し遺伝子クラスター外から構成的に大量発現させた株も作出した。これらの株を用いて、スクロースを炭素源とした TCN 産生誘導培地中における Tri 遺伝子の発現および TCN 量を解析した。
なお、TCN 生合成（Tri）遺伝子クラスターコア領域を伸張させたり 3)、コア領域のTri 遺伝子プロモーターをクラスター外へ移動させたりする 4)と、遺伝子発現制御が正常ではなくなる。このため、ポジティブ選択とネガティブ選択の２回の形質転換での相同組換えによってマーカー遺伝子を残さずに必要な変異導入やゲノム改変を行い、遺伝子クラスターの構造を保ったまま FgTri6 領域の遺伝子操作を施した 5)。

結果
F. graminearum の FgTri6 プロモーターを丸ごと FsTri6 プロモーターに置き換えた株、FgTri6 コード領域を丸ごと FsTri6 コード領域に置き換えた株のいずれもスクロース非存在下では Tri6 および初発の環化酵素遺伝子 Tri5 の発現が見られず、TCN も蓄積しなかった（図１AB）。また、Tri6 を F. graminearum で大量発現させてもスクロースが存在しないと Tri 遺伝子発現の誘導や TCN の蓄積はほとんど見られないが、100 µM の少量のスクロースを培地に添加することによって Tri5 遺伝子発現の誘導や TCN の蓄積が劇的に見られるようになった（図１C 右）。なお、同様に野生株に 100 µM スクロースを添加しても Tri 遺伝子発現や TCN 産生は誘導されない（図１C 左）。
Tri6 プロモーターの転写因子結合サイトを変異させた株のうち、TRI6p 結合サイトを変異させたものでは、極めて弱い Tri6 の転写が見られたが、Tri5 の発現や TCN 蓄積は見られなかった（図２）。一方、この組換え株で Tri4 を大量発現させると少量ながら TCNを生産した。このことから、スクロースが存在すれば TRI6p 非依存的に発現したごく少量の TRI6p タンパクの存在で TRI6p 結合サイトを有する他の Tri 遺伝子プロモーターの転写活性化、ひいては TCN 産生が起こることが示された。データには示していないが、AreAp 結合サイトを変異させた株の TCN 産生は野生株と比べてほぼ同程度の TCN を生産した。

結論
セスキテルペンを大量生産することのできる F. graminearum のスクロースによるTCN 産生誘導は、スクロースからのシグナルを介した TRI6p タンパクの機能化を介して起こることが明らかとなった。機能化されていない TRI6p タンパクが F. graminearum
細胞内にいくら豊富に存在しても他の Tri 遺伝子の発現を活性化させることはできず、逆にスクロースによって機能化された少量の TRI6p タンパクしか存在しなくても他の経路酵素 Tri 遺伝子の発現をある程度は活性化し、TCN 産生につながることが示唆された。今後、菌の生育とセスキテルペン生合成へ導くタイミングを上手く調整することで、効率的異種セスキテルペンの生産への応用が期待される。

文献
1) Nakajima, Y. et al. (2016) Oligosaccharides containing an α-(1 → 2)
(glucosyl/xylosyl)-fructosyl linkage as inducer molecules of trichothecene biosynthesis forFusarium graminearum. Int. J. Food Microbiol. 238:215-221.

2) Merhej, J., Richard-Forget, F., Barreau, C. (2011) Regulation of trichothecene biosynthesis inFusarium: recent advances and new insights. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91: 519-528.
3) Chen, L., McCormick, S.P., Hohn, T.M. (2000) Altered regulation of15-acetyldeoxynivalenol production in Fusarium graminearum. Appl. Environ. Microbiol.
66:2062-2065.
4) Tokai, T. et al. (2013) A promoter of Fusarium graminearum Tri4 does not function whenplaced at the end of the trichothecene gene cluster. Mycotoxins 63:17-25.
5) Nakajima, Y., Ichikawa, H., Maeda, K., Nishiuchi, T., Kobayashi, T., Kimura, M. (2013)
Genome engineering of Fusarium species by using positive and negative selection approaches
for studying regulation of mycotoxin production. (Review in Japanese) Mycotoxins 63:85-92.

図１ スクロースに依存した F. graminearum の Tri 遺伝
子発現および TCN 産生。ノーザンおよび TLC 解析の結果を示す。YS_60 およびYG_60 培地はそれぞれスクロース、グルコースを炭素源とする培地である。
A FsTri6 プロモーターに置き換えた株。B FsTri6 コード領域に置き換えた株。CTri6 を構成的に大量発現させた株。100 µM スクロースの有無（YG_60 培地）が Tri遺伝子および TCN 産生に与える影響を解析した。

図２

Tri6 プロモーター領域に変異を導入した株の作出と解析。△は TRI6p結合サイト、◯は AreAp 結合サイト（一部のみ表示）を示す。A 作成した株。Wild-type は野生株、PTri6_M1 は Tri6 プロモーター上の 2 つの TRI6p 結合サイトを変異させた株、PTri6_M1/ PTEF::Tri4 はさらに Tri4 をクラスター外から過剰発現させた株である。B 作出した株の Tri 遺伝子発現および TCN産生。ノーザンおよび TLC 解析の結果を示す。