乳酸菌のゲノムエンジニアリング
橋本昌征（信州大学 ファイバーナノテク国際若手研究者育成拠点）
研究の目的
現在、大腸菌および枯草菌において全一遺伝子破壊株群が作製されている。さらに、大腸菌において網羅的な領域欠失株群が報告されており、その実験結果から両細菌において約 300 の必須遺伝子が見積もられている1-3)。例えば約 4,400 の遺伝子を持つ大腸菌の場合、トランスポゾンなどによるランダムな変異によって全ての非必須遺伝子の欠損を網羅するためには数万の変異株群が必要となる。そのため、この様なライブラリーを用いてスクリーニングを行うには簡便なアッセー系を用いる必要がある。一方、一遺伝子破壊株群を用いた場合は約 300 の必須遺伝子を除いた 4,100 変異株によって全ての非必須遺伝子の欠損を網羅することができ、さらに網羅的領域欠失株群の場合は 551株で全てを網羅できる。つまり、より少ない変異株群によって全ての非必須遺伝子をカバーすることができるため、アッセーに手間のかかるスクリーニングが可能となる。実際、これらはバイオフィルム形成・スウォーミング・ ATP生成など様々なスクリーニングに用いられている。
乳酸菌とは炭水化物を乳酸へと代謝する細菌の総称で、様々な種の細菌を含んでいる。
有用な乳酸菌は世界中で食品加工に広く用いられてきており、近年では乳酸菌のプロバイオテクスが注目を集め、さらに脱石油エネルギーを目指したバイオプラスチックの原料生産にも利用されている。この様な観点から、乳酸菌のゲノム配列が多数報告されており、ゲノムスケールでの代謝工学が本格化しつつある。しかし、乳酸菌染色体の網羅的変異株群として挿入配列やトランスポゾンを用いた報告はなされているが、網羅的な一遺伝子破壊株群や領域欠失株群の報告は我々が知る限りない。今回用いている

Lactococcus lactis は非病原性の乳酸菌で、チーズのスターターとして良く利用されており、L. lactis IL1403 株は乳酸菌の中で初めてゲノムが解読された菌株である4)。我々は、この乳酸菌L. lactis IL1403 の網羅的領域欠失株群の作製を試みている。

実験方法および結果
L. lactis IL1403の染色体領域削除は温度感受性のプラスミドを利用して相同組換えの系で行った(Fig. 1)。温度感受性プラスミドpGh9をベースに、欠失用プラスミドベクター（pGhT000）を次のように作製した5)。まず始めに、pGh9のエリスロマイシン耐性遺伝子の中にある制限酵素XcmIサイトをアミノ酸置換がないように削除した。次に、

L. lactis IL1403由来のupp遺伝子をクローニングし、pGhT00を構築した。uppはuracilphosphoribosyltransferaseをコードし、ウラシルからUMPを生成する。野生株の L.

lactisは5-フルオロウラシルを含む培地上で生育できないが、uppの欠損株は生育することができる 6) 。そこで、これをネガティブセレクションマーカーとして利用して5-fluorouracil を 含 む 培 地 上 で upp を 持 た な い 組 換 え 体 の 選 抜 を 容 易 に 行 う こ とFig. 1 (A)The chromosomal deletion system. (B)Schematic drawing of a series of consecutive chromosomal
deletion mutants.

ができる。最後に、両脇に制限酵素 XcmIサイトを含むカナマイシン耐性遺伝子をpGhT00のマルチクローンングサイトにクローニングしてpGhT000を構築した。このプラスミドをXcmIで処理するとその切断部位の3'末端にTが一つ付加した形で切断されるように設計してあり、これによってPCR産物をTAクローニングすることができる。
削除させたい領域に隣接する上流・下流の各１kbの配列の間にスペクチノマイシン耐性遺伝子を挟んだDNA断片を2回のPCRによって調製し、pGhT000をベクターにTAクローニングした。まず、このプラスミドを用いてL. lactis IL1403 uppを形質転換した。
得られたスペクチノマイシン耐性（SpR）形質転換体を28 °Cで150分間液体培養し、その後35 °Cにてさらに150分間培養し、その一部をスペクチノマイシンを含む培地にプレーティングして35 °Cでインキュベーションした。得られたコロニーを28 °Cで液体培養し、スペクチノマイシンと5-fluorouracilを含む培地にプレーティングして35 °Cでインキュベーションした。これによって得られたコロニーはほとんどが染色体の領域欠失株であり、効率的に組換え体を得ることができた。なお、組換え体の染色体構造はPCRにて確認した。
網羅的な領域欠失株群を効率よく作製するためには、欠失する領域に必須遺伝子が含まないように設計することが重要である。しかし、L. lactisの必須遺伝子に関する報告はあまり多くない。そこで、L. lactisと同じグラム陽性細菌である枯草菌の必須遺伝子（271遺伝子）を参考にL. lactisの必須遺伝子を予測した。予測した必須遺伝子(約300遺伝子)とL. lactis IL1403の染色体長(約2.4Mb)から、欠失させる領域長を平均10kbとした。現在、必須遺伝子を除く領域を欠失させた株を上記の方法で順次作製している。

結論
乳酸菌 L. lactis IL1403 の染色体領域を削除させるためのプラスミド pGhT000 を構築した。pGhT000 は温度感受性複製起点とネガティブセレクションマーカーとして L.

lactis 由来の upp 遺伝子を含み、制限酵素 XcmI で処理する事で TA クローニングが可能なベクターである。温度感受性複製起点とネガティブセレクションマーカーを組み合わせたこのプラスミドを利用して効率的な L. lactis の染色体領域欠失に成功した。L.

lactis の必須遺伝子を枯草菌の必須遺伝子から推定し、約 10kb の非必須領域を欠失させた株を順次作製している。

参考文献
1) Baba T, Ara T, Hasegawa M, Takai Y, Okumura Y, Baba M, Datsenko KA, Tomita
M, Wanner BL, Mori H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame,
single-gene knockout mutants. Mol Syst Biol., 2, 2006.0008.
2) Kobayashi K et al. (2003) Essential Bacillus subtilis genes. Proc Natl Acad Sci U

S A., 100, 4678-4683.
3) Kato J, Hashimoto M. (2007) Construction of consecutive deletions of theEscherichia coli chromosome. Mol Syst Biol., 3, 132.
4) Bolotin A, Wincker P, Mauger S, Jaillon O, Malarme K, Weissenbach J, EhrlichSD, Sorokin A. (2001) The complete genome sequence of the lactic acid bacterium

Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res., 11, 731-753.
5) Maguin E, Prévost H, Ehrlich SD, Gruss A. (1996) Efficient insertionalmutagenesis in lactococci and other gram-positive bacteria. J Bacteriol., 178,931-935.
6) Martinussen J, Hammer K. (1994) Cloning and characterization of upp, a geneencoding uracil phosphoribosyltransferase from Lactococcus lactis. J Bacteriol.,
176, 6457-6463.