油糧酵母におけるトリグリセリド蓄積機構の解明
高桑直也

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
北海道農業研究センター
研究の目的
油脂（トリグリセリド, TG)は、食用・工業用として生活に不可欠のものであり、通常、広く油糧植物や動物から採取されている。しかし、日本の油脂自給率は 13％であり、世界的な油脂原料の需給逼迫に備え、油脂原料の確保は極めて重要な課題となっている。
油糧植物に頼らない TG の製造法の一つに、 Yarrowia 属、Lipomyces 属およびCryptococcus 属などの油糧酵母からの抽出法が古くから試みられている。しかし、これらの油糧酵母はこれまで食経験がないため、食品として利用するには安全性が懸念される。また、これらの油糧酵母の TG を構成する脂肪酸には、低温下で固形化しやすい飽和型が多量に含まれるため、北海道などの寒冷地ではバイオディーゼル燃料用途には適していない。
一部の Kluyveromyces 属酵母は、古くから食経験を有するとともに、全ゲノム配列が解読済みであるため、TG の蓄積機構を解明するための格好のモデル細胞として利用できる。本研究では、食用および燃料用の双方で活用可能な TG の効率的生産技術を目指す一環として、Kluyveromyces 属酵母の TG の合成系遺伝子の機能および培養条件による TG の生産量の変動について解析した。

方法
酵母 Saccharomyces cerevisiae の遺伝子配列情報を基に、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)から TGの合成に至るまでの 11 種の酵素遺伝子について、K.lactis のゲノム DNAからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。増幅されたそれぞれの遺伝子は、既報 1)に従って遺伝子発現ベクターに連結した後、K.lactis のゲノム DNA に組み込んだ。それぞれの遺伝子過剰発現株の TG の含量は、既報 2)に従って解析した。
また、K.lactis よりも高濃度に TG を蓄積する Kluyveromyces 属酵母を新規に見出す一環として、生乳における酵母の分布を調べた。スイートソルガムの搾汁液を培養培地として、生乳から分離した K. marxianus の TG の含量を解析した。

結果造成した 11 種の遺伝子過剰発現株は、菌体収量については親株と差は認められなかった。一方、培養菌体における TG の含量は、3 種の遺伝子過剰発現株において増加傾向が見られた（図 1）。最も TG の含量が増加したのは DGA1 遺伝子過剰発現株であり、親株と比べて 1.4 倍増加した。また、LPP1 遺伝子過剰発現株および ARE 遺伝子過剰発現株ではそれぞれ 1.3 倍の増加傾向が見られた。DGA1 遺伝子、LPP1 遺伝子および ARE遺伝子は、TG の合成に至るまでの中間体であるホスファチジン酸(PA)の合成以降に作用する遺伝子であった。PA は細胞膜に存在するリン脂質の合成系にも利用され、
S.cerevisiae においては SNF2（RNA ポリメラーゼⅡ転写因子、ATP アーゼ）を欠損させた菌株では TG 収量が増加し、リン脂質収量が減少するという報告がある 3)。そのため、
K. lactis でも PA の合成以降の遺伝子（LPP1、DGA1 および ARE）の過剰発現によって、リン脂質の合成系が細くなり、結果として TG の生産量が増加したと予想される。
2.0

相対値1.5

図 1. 11 種の TG 合成系遺伝子を過剰発現させた K. lactis の菌体収量と TG含量。 GPD1, グルセロール-3-リン酸(G3P) 脱水素酵素; GAT1 および GAT2,G3P アシル基転移酵素; AYR1, 1-アシル DHAP 還元酵素; SLC1 および SLC4,1- ア シ ル G3P ア シ ル 基 転 移 酵 素 ;PAH1, DPP1 および LPP1, ホスファチジン酸脱リン酸化酵素; DGA1 および ARE,ジアシルグリセロール アシル基転移酵素。

□ 菌体収量■ TG 含量

1.00.5

ARE

DGA1

LPP1

DPP1

PAH1

SLC4

SLC1AYR1

GAT2

GAT1

GPD1

親株0

また、生乳から分離した K. marxianus は、その標準株および K. lactis と比べて効率的に TG を生産した。分離株の TG 収量が最大となる培地の初期 pH は、pH5.0 から pH 6.0の範囲であり、この範囲では 4.1 g/L の TG が生産可能と推定された。分離株が生産した TG の構成脂肪酸は、いずれも食用油の TG に見出されるものであった。また、分離株が生産した TG の脂肪酸組成は、動粘度やセタン価など、脂肪酸組成から推定可能なバイオディーゼル規格にすべて適合していた（表 1）。
表 1.

K. marxianus が生産するバイオディーゼルの燃料特性
密度
動粘度
特性
引火点(℃)(g/cm3)(mm2/s)0.88
4.9162
K. marxianus (分離株)0.86-0.90
3.5-5.0
規格(EU および日本)≧120セタン価

ヨウ素価59≧5197≦120結論
酵母 K. lactis においては、DHAP から TG の合成に至るまでの酵素遺伝子うち、PA の合成以降の酵素遺伝子の過剰発現によって TG の生産性が向上することが明らかとなった。酵母 Y. lipolytica では、TG の分解系の酵素遺伝子の破壊や、脂肪酸合成系の酵素遺伝子の過剰発現によって TG の生産性が向上することが明らかになっている 4)。そのため、K.lactis においてもこれらの遺伝子の機能改変によって、TG の生産性が向上する可能性がある。
また、生乳から分離した K. marxianus は、食品および燃料用途の双方に使用可能なTG の生産能に優れた菌株であることが示唆された。この分離株においても TG の合成系遺伝子の改変が可能であれば、更なる TG の収量向上が期待できるものと考えられる。

文献
1) Takakuwa, N., Ohnishi, M., and Oda, Y. (2008) Significance of the KlLAC1 gene inglucosylceramide production by Kluyveromyces lactis. FEMS Yeast Res. 8: 839-845.
2) Takakuwa, N., Nagahama, S., Matsumura, H., Kinoshita, M., and Ohnishi, M. (2013)
Efficient conversion of crude glycerol into triacylglycerol by the yeast Pseudozyma sp.
TYC-2187 for biodiesel production. J. Oleo Sci. 62: 605-612.
3) Kamisaka, Y., Noda, N., Tomita, N., Kimura, K., Kodaki, T., and Hosaka, K. (2006)
Identification of genes affecting lipid content using transposon mutagenesis in
Saccharomyces cerevisiae. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70: 646-653.
4) Tai, M., and Stephanopoulos, G. (2013) Engineering the push and pull of lipid biosynthesis inoleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15: 1-9.