大腸菌を利用した医薬中間体テトラハイドロパパベリンとその派生物であるメチル化ノルラウダノソリン発酵生産系の構築
中川明

石川県立大学 生物資源工学研究所
研究の目的
ベンジルイソキノリンアルカロイド(BIA)は、モルヒネ(鎮痛剤)、ベルベリン(止瀉薬)、マグノフロリン(抗ガン剤)といった医薬品をはじめとする化合物群を含んでおり、強い生理活性を有している．BIA はその複雑な骨格やキラリティの問題から化学合成が難しく多量には得にくいが、昨今、微生物を利用した BIA 生産系の構築が盛んに研究されている．
世界保健機構必須医薬品モデル・リストに挙げられている鎮痙剤アトラクリウムは、比較的高価であり、安価なアトラクリウム生産系の構築が望まれている．アトラクリウ
ムの原料となるテトラハイドロパパベリン(THPP、図 1)は、BIA の 1 つであるが、我々は、THPP の微生物発酵法を用いた生産系構築を目的とする研究を遂行した．更に、
THPP の生産過程において得られる派生物(メチル化ノルラウダノソリン)は新規なものも多く、様々な医薬品原料になりうる構造を持っている．そこで、メチル化ノルラウ

6ダノソリンのコレクション作製も同時に7目指す．

3'

本研究は、安価なアトラクリウムの供給に貢献するだけでなく、BIA を用いた創薬研究にも大きく貢献できる可能性がある．

4'ノルラウダノソリン(NLS)

テトラハイドロパパベリン(THPP)

図1 ノルラウダノソリンとテトラハイドロパパベリン

方法
我々は既にグルコースからの BIA 生産に成功しており、その発酵法を本研究にも適用する．THPP はノルラウダノソリン(NLS)の 4 つの水酸基をすべてメチル化することによって得られる(図 1)．4 つの水酸基、6 位、7 位、3'位、4'位をメチル化する酵素はそれぞれ黄連由来のコクラウリン 6-O メチル基転移酵素(6OMT)、ハナビシソウ由来のレチクリン 7-O-メチル基転移酵素(7OMT)、ヒト由来のカテコール O メチル基転移酵素(COMT)、黄連由来の 3'-ヒドロキシ-N-メチルコクラウリンメチル基転移酵素(4'OMT)が触媒する．
各酵素の大腸菌での発現確認後、細胞破砕液を用いた in vitro での活性特性を調べ、メチル化 NLS 合成能を検証した．また、THPP 生成に対する最適な酵素の反応順を検証した．更に、菌体を分け、段階的に培養することによりメチル基転移酵素の反応順を制御し、THPP 生産を試みた．

結果
1. 各メチル化転移酵素の反応性と生成物
4 つのメチル基転移酵素の組み合わせは全部で 15 通り存在する．また、NLS の水酸基は 4 つあるため、生成しうるメチル化 NLS は 15 種類存在する．NLS に対し 15 通りの組み合わせで酵素を反応させ、その生成物を解析した．その結果、想定しうる 15種類のメチル化 NLS の内、12 種のメチル化 NLS の生成が確認された(表 1)．3'位、4'位の 2 つのみの水酸基がメチル化された 3',4'-O ジメチル NLS はいずれの反応産物からも検出されなかった．また、6,3',4'-O トリメチル NLS と 7,3',4'-O トリメチル NLS については、分離条件が見つからなかった．しかし、ピークは確認されるため、どちらかあるいは両方生成されていると考えられる．THPP については驚いたことに 6OMT を用いなくても生成されることがわかった．
更に細かく調べた所、4'OMT に 6OMT 活

表1 NLSに対するメチル基転移酵素の組み合わせによる反応性性があることがわかった．ただ、生成量は6

生産には 6OMT を利用することを想定し6○ ○ ○
7○
3'○
4'○6763'○
64'○ ○73'○74'○
3'4'673'674'
63'4'
73'4'673'4'た．尚、4'OMT の 6OMT 活性は、コクラ
ウ リ ン N- メ チ ル 基 転 移 酵 素 と も に(R,S)-NLS を反応させると(R)-レチクリンを生成する 1)．これは本研究と直接関係ないが、(R)-レチクリンの生成は非常に困難であるため、(R)-レチクリン由来の物質生生成物のメチル化の位置

6OMT を用いた方が多いことから、THPP4'Cメチル基転移酵素の組み合わせ
6+ 6+ 6+ 4'+ 4'+ C+ 6+ 6+ 6+ 4'+ 6+
4' C 7 C 7 7 4'+ 4'+ C+ C+ 4'+7
C 7 7 7 C+
7○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
○
○
○
○
○
○
○
○
○ ○
○
○ ○ ○
○
○
○
○ ○
○ ○ ○
○ ○
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
○
○
○
○
○
○
○
○

○
○ ○
○ ○ ○
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○○○○ ○○ ○

産に利用しうる性質である．
2. in vitro での THPP 生成と酵素反応順
4 つの酵素を用いれば、THPP を生成することが判明したが、非常に微量にしか作られない．メチル基転移酵素の基質特異性は他の水酸基のメチル化の有無によって変化することが知られている．よって、酵素の反応順が重要であると考えられた．そこで、invitro において、各酵素発現株の細胞破砕液を用いて、全 24 通りの反応順を試した所、COMT を一番初めに反応させると良好な生産性が確認された(図 2A)．更に COMT 以
外の 3 酵素に関して、順番はさほど関係ないことがわかった(図 2B)．よって、THPPは NLS 生産菌に COMT を導入した株及び 4'OMT-6OMT-7OMT3 酵素発現株の 2 菌体を用いて段階的に培養すれば生産できることが示唆された．
3. THPP の発酵生産
NLS 生産系に COMT を導入した株を作製し、グルコースからのメチル化 NLS 生産

を試みた所、メチル化 NLS が検出された．この培養液を 4'OMT-6OMT-7OMT3 酵素
発現株の培養液と混ぜ、THPP 生産を試みた所、THPP は検出されなかった．2 種以上のトリメチル NLS が検出されたことから、途中までの生合成経路は構築できていると考えられる．
A7B

612

Signal intensity (×106 cps)

Signal intensity (×106 cps)

141086454320

0

C＋4'→6→7
C＋4'＋6→7
C＋4'＋6＋7
C→4'＋6＋7
C→4'＋6→7
C→4'→6＋7
C→4'＋6＋7

1

7→4'→6→C
7→4'→C→6
7→C→4'→6
7→C→6→4'
7→6→4'→C
7→6→C→4'4'→7→C→64'→7→6→C
4'→C→7→64'→C→6→7
4'→6→7→C
4'→6→C→7
C→7→4'→6
C→7→6→4'C→4'→7→6
C→4'→6→7
C→6→4'→7C→6 →7→4'
6→7→4'→C
6→7→C→4'6→4'→7→C
6→4'→C→7
6→C→7→4'
6→C→4'→72

図2 酵素反応順を変えた時のin vitroでのTHPP生成

A. 4段階で各酵素を反応させた．B．C→4'→7→6の順番に関して、まとめられるステップを探索した．→は段階的、＋は同時に加えている

結論
今回、THPP の生成には酵素の反応順が重要であることがわかった．今後、どの酵素のどの性質が反応順の重要性を規定しているかを精製基質、精製酵素を用いて明らかにしたい．in vitro では THPP の生成に成功したが、in vivo では生産できなかった．1
菌体目の反応では、COMT が NLS の基質であるドーパミンに反応してしまい、NLS生産能が落ちていることが予想される．また、2 段階目の反応においても、ジメチル
NLS が大量に余っており、4'OMT、6OMT、7OMT のいずれかまたはすべての反応性が弱い．各酵素の性状解析等を詳細に行い、系の改良につなげる．

文献
1) Nakagawa A, Matsumura E, Koyanagi T, Katayama T, Kawano N, Yoshimatsu K,
Yamamoto K, Kumagai H, Sato F, and Minami H (2016) Total biosynthesis ofopiates by stepwise fermentation using engineered Escherichia coli

Nat Commun 7:10390