The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.4 2016

総UTERINE FUNCTION説

ウシの子宮機能と受胎性について
木村康二 1）、松山秀一 2）1）岡山大学大学院環境生命科学研究科・動物機能開発学講座・動物生殖生理学研究室
2）農業・食品産業技術総合研究機構・畜産研究部門・飼養管理技術研究領域
連絡担当者：木村康二
岡山市北区津島中 1-1-1
Tel：086-251-8349, Fax：086-251-8385
kimurak@okayama-u.ac.jp［要約］

近年、我が国だけでなく世界的にウシの受胎率低下が問題となっている。我々は胚移植における受胎率向上研究を実施している。研究を進めるにあたり、移植後の胚の死滅時期の特定を試みた。移植後の不受胎牛の約 70％は正常周期内に発情を回帰すること明らかとなった。胚が妊娠認識時期にインターフェロンタウ（IFNτ）を分泌している場合、発情が遅延するため、これらの牛では子宮内で妊娠認識時期以前（発情後 16 日以前）に胚が死滅していることが予想された。このことから胚移植の胚死滅は移植直後（発情後 7 日）から発情後 16 日の間に多発することが明らかとなった。次にこの胚死滅多発期間をバイパスすることで受胎率の向上が達成できるかについて検討するため、伸長胚（13-14 日齢胚）の非外科的移植を行った。しかしながら、不受胎牛のうち正常発情回帰を示す牛は約 30% に低下した
ものの、低受胎傾向牛の受胎率改善は見られなかった。以上の結果から、我々は低受胎の原因の一つは子宮機能の低下と判断し、低受胎傾向を示すウシの子宮内膜が正常受胎牛とどのように違うのかを子宮内膜で発現している遺伝子についてマイクロアレイを用いて検討した。正常妊娠牛で発現が上昇している遺伝子は 97 個であるのに対し、低受胎傾向牛では 713 個存在した。このことから低受胎傾向牛の子宮内膜では何らかの機能亢進が生じている可能性が示唆された。
キーワード：胚移植、胚死滅、子宮機能、伸長胚雑に相互関与した結果であり、それを紐解くこ【緒論】とは容易ではない。ウシの低受胎の問題が未だウシの受胎率低下が畜産現場で問題視されるに解決がなされず、依然として状況が悪化し続ようになってから久しい。家畜改良事業団の調けている原因の一つはこの点にあると思われ査によると、乳牛の凍結精液を使用した際の初る。

回受胎率は平成元年の 62.4% から平成 25 年にウシの生理的側面から低受胎を考えると、受は 44.3% と約 20 ポイント近く低下している。

精・胚発生が正常に行われるような環境とそれこのような受胎率の低下は、様々な牛側の要因に応えることが出来る胚や精子、卵子の存在がだけで無く、人間側の社会的要因も含めて、複必要とされる。したがって、受胎に関わるウシの生理的要因を大きく胚およびそれを受け入れる母体という 2 つに分類し研究が進めている。

受理：2016年10月26日－ 145 －

家畜感染症学会誌
5 巻 4 号 2016

子宮機能本稿では、牛低受胎要因解明と受胎率向上を目

トから我々は胚移植における受胎率向上研究を指して進めている我々の研究について報告す行っている。

る。

緒論で述べたように、現在の乳牛の人工授精での受胎率は 44.3% である。それに比べて胚【胚移植と低受胎】移植における平均受胎率は 50% 前後を推移し、現在我が国の畜産現場での牛の繁殖には人工ここ 20 年間安定しているが、決して高い値と授精と胚移植の 2 つの手法が主に普及していは言えない。しかしながら、人工授精で受胎がる。人工授精は発情後の適切な時間に凍結精液得られなかった牛への胚移植により受胎の改善を融解し、子宮内に注入することで行われるが、が見られること［3］、また、暑熱環境において胚移植の場合は、凍結または未凍結の胚（桑実

人工授精よりも胚移植の方が高い受胎率が得ら期胚～胚盤胞期胚）を非外科的に発情後 6 ～ 7

れる［1, 4］などの報告もあり、胚移植を用い日の雌牛の子宮内に移植する。これら 2 つの手た受胎率向上研究やその周辺技術の開発は有効法において受胎の成立条件は大きく異なる。人であると考えられる。

工授精において、適正な内分泌環境における正常な卵胞発育と排卵、適正な授精、授精の成功、【胚移植における胚死滅時期】

精子の受精能、正常な初期胚発生、正常な卵管最初に胚移植における受胎率向上研究の取り機能による胚の輸送、等様々な条件がすべて満掛かりとして、移植後の胚死滅時期について検たされた場合のみに受胎が成立する。一方胚移討を行った。発情後 7 日目の雌ウシに凍結融解

植においては、移植胚の生存、適切な内分泌環後、実体顕微鏡下で生存性を確認した胚盤胞境など、受胎成立に必要な条件は人工授精のそ期胚または桑実期胚を黄体側子宮角に定法にれと比べて非常に少ない。さらに胚移植におけ従い移植した。移植後、1 日 2 回発情回帰を発る受胎必要条件は人工授精のそれと重複するた

情行動および直腸検査により調査した。のべめ、胚移植における受胎率向上条件を達成でき466 頭の雌ウシに胚を移植したところ、受胎率れば、人工授精の低受胎に関わる要因のいくつは 48.1% であり、242 頭が不受胎であった。こ

かを解決出来、人工授精特有の条件に絞って研の不受胎牛の発情回帰日を詳細に検討したとこ究を進めることができる。このようなコンセプ

ろ、正常範囲内の発情回帰（25 日以内）した

図1

7日齢胚移植後の不受胎牛の発情回帰日数とその頻度－ 146 －

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ウシは不受胎牛全体の 60% 以上を占めていた識時期の末梢血中単核球を採取し、ISG15 の遺（図 1）。このことから胚移植の場合、不受胎牛伝子発現を調べたところ、妊娠牛と比較して有の大部分が正常な周期で発情を回帰することが意に低い値であるとともに、人工授精・胚移植示され、この胚損耗を防ぐことが胚移植におけを実施していない未処置対照群と同等の発現量る受胎率向上に大きく寄与すると考えられる。

であることを報告している［7］。
以上のことから、前述のように胚移植後、非【胚死滅時期を回避すれば胚移植における妊娠牛の約 60% は正常な周期で発情回帰をし受胎性は高まるのか？】

めすが、これらの不受胎牛では既に妊娠認識のウシ胚が子宮内膜上皮細胞と接着し着床する

時期に胚は IFNτを分泌する能力を失っている、までは約 25-30 日必要とされている。ウシの発すなわち生存性が失われていることが推測でき

情周期は 21 日前後であるため、胚が着床する、る。すなわち、胚移植における胚死滅は移植直すなわち胚と母体が直接的なコミュニケーショ後（発情後 7 日）から IFNτ分泌が顕著となるンを成立させる前に、何らかの手段を用いて胚16 日の間に生じると考えられる。さらに、我々は母体にその存在を知らせる必要がある。そのは発情後 7 日に胚移植し、6 日後に再回収するシグナル物質として胚はインターフェロンタウことにより、胚の生存性を確認したところ、胚（IFNτ）と呼ばれるタンパク質を子宮腔内に分移植を行った 12 頭のうち、生存胚を回収でき泌する［10］。このインターフェロンは子宮内たのは 5 頭（42%）であり、残りの 7 頭からは膜上のレセプターに結合し、子宮からの PGF2α

生存胚回収は出来なかった（未発表データ）。

分泌を抑制することによって、黄体退行を防い

このことからも胚移植の場合、移植後かなり早でいる［5］。また、妊娠認識時期（day 16-18）期に胚死滅が発生していることがうかがえる。の子宮内に type I IFN を投与すると発情周期この胚死滅にとっての「危険区間」をバイパが延長されることが明らかとなっている［9］。

スすることで受胎率の向上が達成できるのでは近年、IFNτがごく少量、母牛の末梢血中にないかと我々は考えた。前述のようにウシ胚は混入し、末梢血単 核球のインターフェロン誘

子宮に到達後、しばらく着床せずに子宮腔内で導性遺伝子 15（interferon stimulated gene 15:成長する。その際に胚は球形、楕円体から紐状ISG15）の遺伝子発現を上昇させることが明らへと著しく伸長する［2］。我々はこの伸長期のかとなっている［8］。我々は人工授精または胚胚（伸長期胚）を利用することで胚死滅多発時

移植後、正常に発情回帰する不受胎牛の妊娠認期のバイパスが可能であるのではと発想した。

図2

伸長胚移植における胚長径と移植後の受胎率の関係
図内の数値は妊娠頭数/移植頭数を表す。
＊：区間で有意差有り（p<0.05）－ 147 －

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子宮機能Day13-14 の伸長期胚は目視できるほど大きい

伸長胚は移植の際、物理的損傷を受けていると（長径数ミリ）。これは従来の胚盤胞期胚（直径仮定し、胚が損傷を受けにくくするために、改約 120μm）を想定した移植法が適応できない良型シース（図 3）または採卵時に用いるバルー可能性を示している。これまでに伸長胚移植をンカテーテルを用いた移植により受胎が得られ外科的に移植した例は見られるが［2］、非外科るか検討した。表 1 に示したように改良型シー的移植についての報告は見られない。そこで

スを用いた移植法でもバルーンカテーテルを用

我々はまず伸長胚を非外科的に移植する方法のいた移植法でも 40% 以上の受胎率が得られた開発に取り組んだ［6］。

が、従来の移植器具を使用した場合では受胎例最初に従来の day 7 胚を用いた移植手法に準が見られなかった。以上のように伸長期胚の非じて伸長胚移植を実施した。その結果、3mm外科的移植が可能となった。

以内では胚長径が増加するほど受胎率は上昇し次にこの手法を用いて低受胎傾向の牛（3 回たが、3mm 以上では受胎率は低下し（図 2）、の移植で受胎しなかった牛）への伸長胚移植を

胚長径が大きくなると従来の移植器具が使用出試みた。先述のように、一般の胚移植において来ないことが示された。この原因として大きなは図 1 に示すように、不受胎牛の約 60％が正		

図3AB
伸長胚移植用に改良した移植用シース管
A：先端部を横から見たもの、B：先端部を上から見たもの
従来の移植に供されるシース管を横穴部で切断して作製した。切断面は胚に損傷を与えないように研磨してある。
表1

各移植器具による伸長胚移植後の受胎率

移植法

移植頭数

妊娠頭数（%）

移植伸長胚長径（mm ± SEM）

改良型シース2913（44.8）a18.9 ± 2.5

バルーンカテーテル

2512（48.0）a13.5 ± 1.8

従来の移植法110（0）b

11.3 ± 1.4

a, b：異符号間で有意差有り（p<0.05）－ 148 －

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常周期で発情回帰を示していたが、伸長胚移【受胎性の低い牛の子宮では植に置いて正常周期内で発情を回帰する牛は何が生じているのか？】

約 30% まで減少した（図 4）。さらに、表 2 に示すように、3 回以上の人工授精や胚移植で妊これまで述べてきたように、牛の受胎性には娠しない牛（低受胎傾向牛）に伸長胚移植を実子宮内の環境が大きく影響を及ぼしていること施しても受胎率の向上は見られなかった。以上は明らかであるが、受胎する牛と受胎しない牛の結果から、一般的な胚移植において胚死滅がの子宮がどのように違うのかについては定かで多発する時期をバイパスするために IFNτを分ない。

泌し、生存性の高い伸長胚を移植しても、最終近年、網羅的な遺伝子発現解析により、受胎的な受胎率は改善されないことが明らかとなっ性のある牛とこれが失われたウシの子宮内膜のた。また、伸長胚移植においては正常周期内で違いについての報告がされている［11］が、そ発情を回帰する不受胎牛は半減するが、高い受の詳細は定かでない。我々はこれまでの研究を胎率が得られていないことから、妊娠認識時期元に、以上の研究を元に、低受胎傾向牛の子宮を生き残ったとしてもその後胚は死滅すること環境は正常に受胎する牛とどのように異なるのを示しており、胚側要因よりも母体側要因、すかについて検討した。発情後 7 日の子宮内膜をなわち子宮内の環境が受胎性に大きく関与して採取し、その遺伝子発現をマイクロアレイによいることがうかがえる。

り網羅的に捉える手法により子宮環境を評価し

表2

低受胎傾向牛への伸長胚移植の受胎性への影響
受胎率（%）

移植の種類

正常繁殖牛

低受胎傾向牛

従来の胚移植（day 7）47.4（9/19）

5.6（1/18）

伸長胚移植（day 14）54.5（18/33）

2.4（1/42）

図4

伸長胚移植後の不受胎牛の発情回帰日数とその頻度－ 149 －

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子宮機能た。サンプルの精度を担保するために、正常受胎牛を、これまでの産次すべてで 3 回以内の人工授精や胚移植で妊娠し、バイオプシー後の次6.の発情周期で妊娠した牛と定義した。低受胎傾
向牛は過去の妊娠のいずれもが 3 回以降の人工授精や胚移植で妊娠し、バイオプシー後も 3 周期で妊娠が成立しなかった牛と定義した。これ

7.

らの子宮内膜サンプルの網羅的遺伝子発現解析を行った。低受胎傾向牛と正常妊娠牛の間で発現量が 2 倍以上変化する遺伝子は 810 確認できた。そのうち正常受胎牛で発現が上昇していた遺伝子数は 97 である一方、低受胎傾向牛で発現が上昇していた遺伝子は 713 個確認された。

8.

このことから低受胎傾向を示すウシの子宮内膜では多数の遺伝子が活性化していることから、何らかの機能の異常亢進が低受胎の要因であることが示唆された。現在、これらの遺伝子解析データを詳細に検討し、子宮機能回復手法の開9.

発とともに受胎率向上、低受胎要因解明研究を実施中である。
【参考文献】
1.

2.

3.

4.

5.

10.

Al-Katanani, Y. M., Drost, M., Monson, R. L.,
Rutledge, J. J., Krininger, C. E. 3rd., Block, J.,
Thatcher, W. W. and Hansen, P. J. 2002. Pregnancy
rates following timed embryo transfer with fresh orvitrified in vitro produced embryos in lactating dairy
cows under heat stress conditions. Theriogenology.
58 : 171-182.
Betteridge, K. J., Eaglesome, M. D., Randall, G. C.
and Mitchell, D. 1980. Collection, description andtransfer of embryos from cattle 10–16 days afteroestrus. J. Reprod. Fertil. 59 : 205–216.
Dochi, O., Takahashi, K., Hirai, T., Hayakawa, H.,Tanisawa, M., Yamamoto, Y. and Koyama, H. 2008.
The use of embryo transfer to produce pregnancies
in repeat-breeding dairy cattle. Theriogenology. 69 :124-128.
Drost, M., Ambrose, J. D., Thatcher, M. J., Cantrell,C. K., Wolfsdorf, K. E., Hasler, J. F. and Thatcher,W. W. 1999. Conception rates after inseminationor embryo transfer in lactating dairy cows during
summer in Florida. Theriogenology. 52 : 1161-1167.
Han, C. S., Mathialagan, N., Klemann, S. W. andRoberts, R. M. 1997. Molecular cloning of ovine
and bovine type I interferon receptor subunits fromuteri, and endometrial expression of messenger

11.

－ 150 －

ribonucleic acid for ovine receptors during the
estrous cycle and pregnancy. Endocrinology. 138 :4757-4767.
Kimura, K. and Matsuyama, S. 2014. Successfuln o n s u rg i c a l t r a n s f e r o f b o v i n e e l o n g a t i n g
conceptuses and its application to sexing. J. Reprod.
Dev. 60 : 210-215.
Matsuyama, S., Kojima, T., Kato, S. and Kimura
K. 2012. Relationship between quantity of IFNT
estimated by IFN-stimulated gene expression inperipheral blood mononuclear cells and bovine
embryonic mortality after AI or ET. Reprod. Biol.
Endocrinol. 10 : 21.
Oliveira, J. F., Henkes, L. E., Ashley, R. L., Purcell,
S. H., Smirnova, N. P., Veeramachaneni, D. N.,
Anthony, R. V. and Hansen, T. R. 2008. Expressionof interferon (IFN)-stimulated genes in extrauterine
tissues during early pregnancy in sheep is theconsequence of endocrine IFN-tau release from theuterine vein. Endocrinology. 149 : 1252-1259.
Plante, C., Hansen, P. J., Martinod, S., Siegenthaler,B., Thatcher, W. W., Pollard, J. W. and Leslie, M.
V. 1989. Effect of intrauterine and intramuscularadministration of recombinant bovine interferonalpha 1 on luteal lifespan in cattle. J. Dairy Sci. 72 :1859-1865.
Roberts, R. M., Leaman, D. W. and Cross, J. C.
1992. Role of interferons in maternal recognition ofpregnancy in ruminants. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
200 : 7-18.
Walker, C. G., Littlejohn, M. D., Mitchell, M. D.,
Roche, J. R. and Meier, S. 2012. Endometrial gene
expression during early pregnancy differs between
fertile and subfertile dairy cow strains. Physiol.
Genomics. 18 : 47-58.

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Vol.5 No.4 2016UTERINE FUNCTION

Relationship between uterine function and establishment of pregnancy in cattle

Koji Kimura1）, Shuichi Matsuyama2）
1) Laboratory of Animal Reproductive Physiology, Graduate School of Environmental and Life Science, Okayama University2)	Institute of Livestock and Grassland Science, National Agriculture and Food Research Organization 768 Senbonmatsu,Nasushiobara, Tochigi 329-2793, Japan
Correspondence：Koji KIMURA（kimurak@okayama-u.ac.jp）［Abstract］
The low pregnancy rate of cattle became a big issue to be solved in livestock industry. We
have been focusing on improvement of pregnancy rate after embryo transfer（ET）in cattle.
Firstly, we investigated when the non-pregnant cows returned to estrus after ET. More than 70%
of non-pregnant cows after ET showed estrus in normal estrus cycle length（>25 days）. When thetransferred embryos are alive in the period of maternal recognition of pregnancy（days 16-18）, they
can produce interferon-tau（IFNτ）, inhibit the secretion of PGF2α, and delay the return to estrus.
Taking together with these findings, we speculated that the conceptuses in the cows which returnedto the estrus >25 days might die before day 16 and the critical period for embryo survival might bebetween day 7 to day 16. To bypass this critical period for embryo survival, we developed a nonsurgical day 13-14 elongating conceptus transfer method and investigated whether this conceptus
transfer could improve pregnancy rate of sub-fertile cows. Although the rate of non-pregnant cows
which showed estrus within > 25 days decreased significantly（approximately 30%）
, the pregnancy
rate was not improved. Form these results, we considered that it was difficult to increase pregnancy
rate by improving embryo viability and we shifted our target of research from the embryo to theuterine environment. Then we investigated the gene expression analysis of uterine endometria ofsub-fertile and fertile cows using microarray. It was demonstrated that 713 genes were expressedhigher in sub-fertile cows than fertile cows, whereas 97 genes expression were higher in fertile cows
than sub-fertile cows. In endometria of sub-fertile cows, some functions might be activated.
Key words: Embryo transfer（ET）, Elongating conceptus, Pregnancy loss, Uterine functions－ 151 －