The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.3 2016

短EPIDEMIOLOGICAL SURVEY OF MANNHEIMIA SPP.

報

牛から分離される Mannheimia 属菌の PCR による同定法の確立
勝田賢 1） 小嶋暢 2） 富山美奈子 3） 佐藤裕夫 4） 三上修 1）1）農研機構・動物衛生研究部門〒 305-0856

茨城県つくば市観音台 3-1-52）山形県中央家畜保健衛生所〒 990-2161

山形県山形市漆山 736

3）青森県十和田家畜保健衛生所〒 034-0093

青森県十和田市西十二番町 19-23

4）岩手県中央家畜保健衛生所〒 020-0605
連絡担当者： 勝田

岩手県滝沢市砂込 390-5

賢

Tel & Fax：029-838-7925
E-mail：katsuda@affrc.go.jp［要約］

PCR 法による Mannheimia 属菌 5 菌種の菌種同定法を検討し、良好な成績が得られたので報告する。
今回確立した PCR は Mannheimia 属の参照株を含め、供試した全ての菌株で 16SrRNA 解析の結果と一致した同定結果が得られた。このことから recN 遺伝子をターゲットにした PCR 法は Mannheimia属を同定するため有用な方法と考えられる。
キーワード：Mannheimia 属菌、生化学的性状、16SrRNA 解析、血清型別

Mannheimia haemolytica は，牛呼吸器病の解析結果との比較により、生化学的性状試験主要原因菌の 1 つである［6］。本菌はパスツを 用 い た 同 定 キ ッ ト で M. haemolytica と 同レラ科に属するグラム陰性短桿菌であり、莢定 さ れ た 菌 株 の 6.5 ％ は M. haemolytica 以 外膜の抗原性によりに 12 種類の血清型に分類さの菌種であり、生化学性状検査キットだけでれている［5］。また、本菌には複数の生物型

Mannheimia 属菌を正確に同定することは困難が存在し、M. haemolytica complex とも呼ばれであることを報告した［8］。ていた。近年、16S rRNA の塩基配列や DNA-近年、Alexander らが、M. haemolytica、M.

DNA hybridization な ど の 解 析 に よ り、M.

glucosida および M. ruminalis の 3 菌種を同定

haemolytica complex には少なくとも、5 菌種（M.

可 能 な multiplex-PCR 法 を 報 告 し た［2］。 こglucosida, M. granulomatis, M. haemolytica,の multiplex-PCR 法 は、Mannheimia 属 菌 をM. ruminalis, M. varigena） が 含 ま れ る こ と同定するために非常に有用なツールと考えらが報告された［4］。我々は以前に、16SrRNAれるが、牛に病原性が認められる M. varigenaと M. granulomatis は 同 定 で き な い。 ま た、
16SrRNA 解析は菌種同定に非常に有効な手法

受付：2015 年 12 月 16 日
受理：2016 年 5 月 25 日

であるが、本解析を実施するためには、機器－ 93 －

家畜感染症学会誌
5 巻 3 号 2016

Mannheimia 属菌の野外実態調査の整備が必要であり、また、外部委託にはコ

M. haemolytica10 株、M. ruminalis7 株およびストがかかるなどの問題点がある。このため

M. varigena10 株を用いて PCR 産物のダイレ

Mannheimia 属の 5 菌種を菌種レベルで同定可クトシークエンスにより塩基配列の決定を実施

能な PCR 法の確立が必要と考えられる。今回、した。

Mannheimia 属菌の recN 遺伝子を対象に PCR

今回検討した recN 遺伝子を対象とした PCR法による菌種同定を検討し、良好な結果が得らは Mannheimia 属 5 菌種の基準株および参照れたので報告する。

株を特異的に検出可能であり、Mannheimia 属参照株としてパスツレラ科に属する細菌以外のパスツレラ科細菌の参照株と非特異的なの 内、Mannheimia 属 の 基 準 株 5 株（M.

反応は認められなかった。また、供試した 263

haemolytica NCTC 9380T, M. glucosida

株の野外株で 16SrRNA 解析の結果と一致した

CCUG 38457T, M. varigena CCUG 38462T,

成績が得られ、Mannheimia 属 5 菌種が同定可

M. granulomatis CCUG 45422T and M.

能と考えられた。また、recN 遺伝子の菌種内

ruminalis CCUG 38470T）、 参 照 株 6 株（M.

相同性は 99.2％～ 100.0％であり、菌種間でのgranulomatis CCUG 26828, M. granulomatis

相同性は 75.5％～ 98.7％であった。

CCUG 38473, M. granulomatis CCUG38474,

既報の Multiplex-PCR［2］との比較では M.

M. granulomatis CCUG46479 M. ruminalis

granulomatis1 株の結果を除いて一致した成績

CCUG 38466 and M. ruminalis CCUGが得られた（表 2）。本菌株は既報の Multiplex-38471）、Bibersteinia trehalosi ATCC29703 株、PCR では M. haemolytica と同定されたが、生Actinobacillus pleuropneumoniae ATCC 27089

化学的性状検査では M. granulomatis の基準株

株 お よ び Pasteurella multocida CCUG37250と D- キシロース分解の 1 項目を除いて一致し株 を 用 い た。 ま た、2000 年 か ら 2015 年 に 国た性状を示しており、16SrRNA 解析でも M.

内の牛から分離され 16SrRNA の塩基配列解granulomatis の基準株と 99.5％と非常に高い析（約 1,500bp）により同定した Mannheimia相同性を示した。このことから、今回確立した属 の 野 外 分 離 株 263 株 を 供 試 し た。 な お、PCR と既報の PCR で結果が一致しなかった菌

16SrRNA の塩基配列解析は既報に準じて実施

株は M. granulomatis と考えられる。Guenther

した［4］。全ての菌株は 30％グリセリンを添ら［7］は、Mannheimia 属菌 5 菌種を同定可加 し た tryptic soy broth（Becton, Dickinson

能な Real-time PCR 法を報告しているが、供試and Company, USA）、1ml に 濃 厚 浮 遊 さ せ

菌株数が非常に少なく、M. haemolytica と M.

-80℃に冷凍保存し、必要に応じて 5％羊血液

glucosida の区分が困難なケースが認められ、

寒 天 培 地 を 用 い、 好 気 性 下 で 37 ℃、24 時 間加えて専用機器も必要なことから実用的ではな培養し試験に供した。PCR プライマーは M.

いと考えられる。

glucosida、M. granulomatis、M. haemolytica、

今 回、recN 遺 伝 子 を 対 象 に、Mannheimia

M. ruminalis お よ び M. varigena の recN 遺属 菌 5 菌 種 を 同 定 可 能 な PCR 法 を 確 立 し

伝 子 を 対 象 に し て Genetyx ver. 10 software

た。Mannheimia 属 の 同 定 に は、 既 報 の（Genetyx, Tokyo, Japan）を用いて検索し決定

Multiplex-PCR が我が国では広く用いられてし た。（ 表 1）。PCR 反 応 は 鋳 型 DNA に PCRいるが、本法は、牛呼吸器病の主要原因菌と反 応 液（1 × PCR buffer, 0.2mM each dNTP,して重要な M. haemolytica と家畜の上部気道

0.5μM each primer お よ び 1.25U の Taq goldやルーメン等に常在している M. glucosida おDNA polymerase）を加え 20μl とし、95℃ 10

よ び M. ruminalis と 区 別 す る こ と を 目 的 と分間反応後、95℃／ 30 秒、62℃／ 30 秒、72℃しており、牛に病原性を示す M. varigena と／ 30 秒 を 25 サ イ ク ル 行 い、 最 後 に 72 ℃ で

M. granulomatis は 対 象 と さ れ て い な い。M.

7 分 間 反 応 を 行 っ た。 ま た、Alexander ら のgranulomatis は牛の皮下脂肪織炎から分離さMultiplex-PCR［2］ も 合 せ て 実 施 し た。recN

れ、シカの気管支肺炎や結膜炎の原因菌であ遺伝子の菌種内および菌種間での相同性についり［4］、近年、牛の潜在性乳房炎に関与するこては M. glucosida11 株、M. granulomatis10 株、とも報告されている。M. varigena は牛の口腔、－ 94 －

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EPIDEMIOLOGICAL SURVEY OF MANNHEIMIA SPP.

ルーメン、腸管などに常在しており、肺炎、乳引用文献

房炎および敗血症の原因菌として、また、豚の1.

腸炎、肺炎、敗血症の原因となることが知られており［3］、我が国でも子牛の壊死性腸炎、敗血症、化膿性髄膜炎などの症例が報告されている［1, 9］。

2．

今回我々が確立した PCR 法は 16SrRNA による解析結果と完全に一致した成績が得られており、Mannheimia 属の 5 菌種全てを同定可能な方法であり、本属菌の野外分離株の同定に有用な方法となると考えられる。

3．

4．

5．

6．

7．

阿 部 祥 次， 小 池 新 平， 半 田 真 明， 蓼 沼 亜 矢子，田中理栄子，市川 優，湯澤裕史．2013．
Mannheimia varigena 感染による化膿性髄膜炎及び肺炎の多発性巣状壊死を呈した和牛子牛の 1
例．日獣会誌．66：248-251．
Alexander, T.W., Cook, S.R., Yanke, L.J., Booker,C.W., Morley, P.S., Read, R.R., Gow, S.P. andMcAlister, T.A. 2008. A multiplex polymerase
chain reaction assay for the identification of
Mannheimia haemolytica, Mannheimia glucosida
and Mannheimia ruminalis. Vet. Microbiol. 130:
165-175.
Angen, O., Ahrens, P. and Bisgaard, M. 2002.
Phenotypic and genotypic characterization ofMannheimia (Pasteurella) haemolytica-like strains
isolated from diseased animals in Denmark. Vet.
Microbiol. 84:103-114.
Angen, O., Mutters, R., Caugant, D.A., Olsen, J.E.
and Bisgaard, M. 1999. Taxonomic relationshipsof the [Pasteurella] haemolytica complex as
evaluated by DNA-DNA hybridizations and 16S
rRNA sequencing with proposal of Mannheimia
haemolytica gen. nov., comb. nov., Mannheimia
granulomatis comb. nov., Mannheimia glucosida
sp. nov., Mannheimia ruminalis sp. nov. andMannheimia varigena sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol.
49:67-86.
Biberstein, E.L 1978. Biotyping and serotyping ofPasteurella haemolytica, In: Bergam, T., Norris, J.R.
(eds.), Methods in Microbiology, vol. 10: AcademicPress, London, pp. 253-269.
Frank, G. 1989. Pasteurellosis of cattle, In: Adlam
CF, Rutter JM (eds.), Pasteurella and Pasteurellosis,Academic Press, London pp. 197-222.
Guenther, S., Schierack, P., Grobbel, M., LubkeBecker, A., Wiele, LH. and Ewers, C. 2008. Realtime PCR assay for the detection of species of thegenus Mannheimia. J. Microbiol. Method

8． 勝田 賢，小嶋 暢，富山美奈子，佐藤裕夫，
三上 修．2015．牛から分離される Mannheimia
属菌の野外実態と生化学的性状について．家畜感染症学会誌．4：81-86．
9． 又吉正直，片桐慶人，安富祖誠，相澤真紀，大城 守，津波 修．2010．Mannheimia varigenaが分離された早産子牛の敗血症．日獣会誌．
63：275-277．

－ 95 －家畜感染症学会誌
5 巻 3 号 2016

Mannheimia 属菌の野外実態調査

Table 1. Nucleotide sequences of primers used for identification of genus Mannheimia.
genus Mannheimia
M. haemolytica

Sequence (5’-3’)

PCR product size (bp)

(F ) gggctatgcttgggttatcgttc

112

ab

(R ) gccataaataagcagggctatgtgg
M. glucosida(F) cctttactatgcagccaaccag

180(R) gatattgccccaactctcgaag
M. gramulomatis(F) tagccggaaggattgagcaaga

379(R) tctacaaagtcagccccattggag
M. varigena(F) agcattgcctgtttcgcaactg

514(R) agaactcgcttcttgcacctga
M. ruminalis(F) gatgcactaggcttatgtttgggt

299(R) agcaactgaggtgcgtgttg
abForward primer
Reverse primer

Table 2. Results of identification of field isolates by PCR
No. of isolates
Genus Mannheimia

16S rRNA

Multiplex PCR*

PCR in this study

M. haemolytica

198

199

198

M. glucosida

101010M. ruminalis444

M. varigena

28

Reject28

M. gramulomatis

5

Reject (4)5M. haemolytica (1)Mannheimia sp.

18

Reject* Identification by multiple PCR (Alexander, TW. 2008).

－ 96 －Reject

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EPIDEMIOLOGICAL SURVEY OF MANNHEIMIA SPP.

PCR identification of Mannheimia species isolated from cattle
Ken Katsuda1）, Toru Ojima2）, Minako Tomiyama3）, Yasuo Sato4） and Osamu Mikami1）1）National Institute of Animal Health, NARO, 3-1-5 Kannondai, Tsukuba, 305-0856, Japan.
2）Yamagata Prefecture Central Livestock Hygiene Center, 736 Urusiyama, Yamagata, 990-2161, Japan.
3）Aomori Prefecture Towada Livestock Hygiene Service Center, 19-23 Nishi-Nijyuubantyou, Towada, 034-0093, Japan.
4）Iwate Prefecture Central Livestock Hygiene Service Center, 390-5 Sunagome, Takizawa, 020-0605, Japan.
Representative Author: Ken KATSUDATEL & FAX: 029-838-7925
E-mail: katsuda@affrc.go.jp［Summary］
Reinvestigation of Mannheimia haemolytica-like organisms resulted in reclassification of theseorganisms and a new genus, Mannheimia, containing at least 5 species（M. haemolytica, M.
glucosida, M. varigena, M. granulomatis and M. ruminalis）was established. The aim of the present
study was to design a PCR assay to identify genus Mannheimia.
The validity of the PCR assay was examined against 8 reference strains of the family
Pasteurellaceae. Additionally, 263 isolates of genus Mannheimia were screened using PCR. The PCR
assay positively identified all genus Mannheimia, as confirmed by 16S rRNA analysis.
The PCR assay required no additional phenotypic tests for identification of genus Mannheimia
and become effective tool for the proper identification of these organisms.
Key words: Biochemical identification, Mannheimia species, PCR, 16S rRNA analysis－ 97 －