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あっと驚くコアシェルでのタンパク分析：層の厚さによる 分離比較
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

市販されているコアシェルシリカ
核の径は1～3.2μm
多孔質シリカ層の厚さ0.2～0.6μm

・粒子径は1.3～5 μm
・細孔径は9～40 nm(3μm以下の粒子径では8～20 nm)

タンパク用のコアシェルシリカは0.2µ等の薄い多孔質層が主流
ハイブリッドタイプのコアシェルカラムも市販され始めた
2

市販されているコアシェルカラム
SunShell（クロマニックテクノロジーズ） : C18, PFP, C8, RP-Aqua, C4-30, C8-30: C18, PFP, CN, PentaHILIC, BioClass
Halo（AMT）: C18, PFP, AQ, PC , MP, WP
Capcell Core（資生堂）: C18, PFP, C8, XB-C18, HILIC, EVOC18
Kinetex （フェノメネックス）
Kinetex Aeris（フェノメネックス）: C18, C8, C4 (タンパクペプチド分析用)
Ascentis Express（シグマアルドリッチ） : C18, F5(PFP), C8, OH5, RP-Amide: C4, C8, C18
BioSehll（シグマアルドリッチ）: C18, C8, CN, SB-AQ, HPH-C18
PoroShell（アジレントテクノロジ－）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, aQ, RP-MS
Accucore（サーモフィッシャー）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, HILIC
Nuculeoshell（ナーゲル）: C18, PFP, C8, Amide, HILIC
Brownlee SPP（パーキンエルマー）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, C18A, HILICBlue Shell（KNAUER）: C18, C18+, HILIC
Cortecs （Waters）: Biphenyl, ARC18
Raptor （Restek）
Ultracore (Ace): C18, Phenyl-Hexyl
SpeedCore (Fortis): C18, PFP, Diphenyl, HILIC
Coresep (Sielc): Mixmode
COSMOCORE (Nacarai): C18, Cholester
Meteoric Core (YMC): C18, C8, C18Bio(固定相は抜粋)

コアシェルカラムは広く使用されるようになってきている3コアシェルカラムでタンパク分析コアシェルカラムに変えると・・・

高分離能

高理論段数

高速化

高分子分析にもコアシェルカラムは効果的

4

『拡散による物質移動（の遅れ）』とC項
18
Fully porous 5 um

16

Fully porous 3 um
Fully proous 1.8 um

Plate Height, um

14Core Shell 2.6 um

12108642002468Mobile Phase Velocity, mm/sec

コアシェルシリカは・・
多孔質層が薄いため，溶質の拡散距離が短くなる

Cが小さくなる5

薄い多孔質層の利点• 高分子の拡散速度は遅い
多孔質層が薄いと・・・•溶質の拡散距離が短くなる

シャープなピーク
高速分離が可能•試料負荷量が小さい

6

多孔質相の厚さが異なるコアシェルシリカ
SunShell particle

Prototype particle

コア0.2 mm

0.5 mm
2.6 mm

3.4 mmParticle size: 2.6 μm
Thickness of porous layer: 0.5 μm
Specific surface area: 40 m2/g

Particle size: 3.4 μm
Thickness of porous layer: 0.2 μm
Specific surface area: 15 m2/g

7

作成したコアシェルシリカの細孔分布8タンパクの分離
C18C18Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 25 or 35 min%B20%65%oFlow : 0.5 mL/min , Temperature: 60 C Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin,
C85 = Ovalbumin
C8C4024SunShellHFC18-30
C4681012SunShellC8-30

024681012SunShellC4-30
0246810129グラジエントの違いによる分離の変化

195000Column:SunShell C8-30, 2.6 um (30 nm) 150 x 2.1 mm,Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 25 or 35 min
%B20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C Detection: UV@215 nm,Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin○145000

95000

45000

Time 0 min%B 20%

35min
65%

Time 0 min%B 20%

45min
65%

Time 0 min%B 20%

60min
65%

-5000
051015202530354045多孔質相の厚さが異なるコアシェルカラムの比較１Column: SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 100 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 100 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 35 min
%B
20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 60 or 80 oC, Detection: UV@215 nm,Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

260oCでは、粒子径、多孔質相の厚さが異なってもピーク幅は同じ

31W0.5=2.5 sec
460 oC and 15 min gradient

5W0.5=2.5 sec

Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)

W0.5=4.8 sec

80 oC and 35 min gradient

80 oCでも大きな違いはない

W0.5=4.2 sec
Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)
05101520

Retention time/min

Surface area works well for separation.

2511

多孔質相の厚さが異なるコアシェルカラムの比較２Column: SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 100 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 100 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 or 35 min
%B
20%
65%
高速分離においては多孔質相が薄いほう
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 60 or 80 oC, Detection: UV@215 nm,が分離が良好
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
0.5W =0.87 sec

2W0.5=0.93 sec
135480 oC and 5 min gradientPrototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)

W0.5=4.8 sec

80 oC and 35 min gradient

W0.5=4.2 sec

Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)
051015

20Retention time/min

Surface area works well for separation.

2512

多孔質相の厚さが異なるコアシェルカラムの比較３Column:
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 150 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 150 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 60 min%B
20% 65% ○Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

2 W0.5=6.0 sec

W0.5=8.0 sec

31

グラジエント時間が長い場合、粒子径の差以上のピーク幅の差が観察された45Sunshell C8-30, 3.4 μm
SunShellC8-30, 2.6 μm
03510152025303540

454

分離は多孔質層が厚いほうが、良好

24262830

32343638404213

リパーゼの分離(SuｎShell C8-30)
Column:SunShell C8-30, 2.6 mm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% Formic acid in waterB) 0.1 % Formic acid in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 10 min%B 15% 60%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 60 oC
Detection: MS,
Injection volume: 10 μL,
Concentration: 0.10 μg/μL each protein,Sample:1. Lipase Impurity
2. Lipase14選択性の異なるC18の比較

Pore
diameter

Surfacearea

Carbonloading

C18
EndSurface
capping
coverage

SunShell HFC18-16
CG6471
4.6 x 150 mm

16 nm

90 m2/g

2.5%

1.2mmol/m2

Yes

SunShell C18-WP
4.6 x 150 mm

16 nm

90 m2/g

5%2.5mmol/m2

Yes

P/N

CW6471

HFC18-WP は1対のシリル基によりC18を結合しますので，結合密度が低くなります。C18-WPに比べ約1/2です。

ペプチドやタンパク質はC18の結合密度により，分離が変化します。
15HFC18とはHexa-Functional C18 は６個の官能基を持つ6カ所のシロキサン結合により耐酸性は高くなる

Sunniest
Bonding
Technology
Hexamethydichlorotrisiloxane+
Trimethylchlorosilane (TMS)Si
SiO（X: Cl, OCH3, OC2H5)

HFC18試薬の概略図

OO

SiO
Si

Si O OO
SiSiOOOO

O
Si
O O

SiOO

Si

SiO

Si
O

Si O

Si
Si O O
Si
Si O
O O
OOO

Si
HO OO

Si

Si
SiSiOOSiOOOSiSiOOOOOSi OO OO

シリカ表面への結合状態の概略図
16

HFC18カラムのLC/MS移動相条件における耐酸性
Durable test condition
Column : SunShell HFC18-162.6mm, 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/0.1%
formic acid, pH2.6=40/60
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 70 ºC
Measurement condition
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Butylbenzene

17結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm, SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 min 40 min%B
5% 5%50%
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC, Detection: UV@210 nm,Sample: Tryptic digest of cytochromC18結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm, SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 min 40 min%B
5% 5%50%
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC, Detection: UV@210 nm,
Sample: Tryptic digest of myoglobin

19

ペプチドの分離(SunShell HFC18-16)
Column:Amplus C18-16, 2.6 mm (16 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 1 min 21 min%B 10% 10% 40%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,
Injection volume: 10 μL,Sample:
1. Bovine Serum Albumin Digest

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まとめ
• 多孔質層の厚さが異なるコアシェルシリカを比較した
結果、タンパク分離において差が観察された。
• 特にグラジエント時間が長い分析では、多孔質層が厚い粒子での分離が良好であった。
• 高速分離においては、多孔質層が薄いコアシェルカラ
ムのほうが優れたピーク形状を示した。
• 結合密度の低いHFC18-16カラムにおいて，いくつかのペプチドで分離の改善が見られた。
• HFC18-16のLC-MSの使用を想定した耐酸試験において，1000時間以上の耐酸性能を確認できた。
• 多孔質層の厚さの違うそれぞれのコアシェルカラムをサンプルや目的に応じて使い分けることが重要となる
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