医療保健学研究９号：1-10頁（2018）ISSN 2185-2227

原著論文

サトウキビからの納豆菌（Bacillus subtilis natto）の分離と納豆製造
加藤志織1，小松明美1，伊部さちえ2，熊田薫2
1

つくば国際大学医療保健学部保健栄養学科2

つくば国際大学医療保健学部臨床検査学科────────────────────────────────────────────
【要 旨】納豆製造には、純粋培養の納豆菌が使用されている。我々は、サトウキビからの納豆菌の分離を試み、納豆製造が可能かを検討した。サトウキビの採取場所は４地点を選んだ。納豆菌を分離するために伝統的方法で納豆を作り、納豆菌を17株分離した。これらの株で納豆を製造後、外観などを指標とし評価を行った。コロニー形状の検査も行った。また生化学的な同定を行い、枯草菌(Bacillus subtilis)であることが確認できた。納豆ができないものは粘りが少なく、粘性物質を作らないことが考えられた。しかし、生化学的分類では B.subtilis であった。納豆と判断したものは、食感に多様性があることが分かった。サトウキビから納豆菌の分離ができたことから、他のイネ科の植物から納豆菌の分離ができる可能性が示唆された。納豆を作るのに適している納豆菌に関しては、実用化も可能だと考える。
キーワード：納豆菌，枯草菌(Bacillus subtilis)，分離，サトウキビ────────────────────────────────────────────
序論

り製造されており、これらの研究に使われる納豆菌は稲わらから分離された株のみが使われて納豆に関しては今まで様々な研究が行われている。また、産業としての納豆の製造は稲わらかきた。例えば、粘性物に関する研究(村松他<

ら分離・純粋培養された納豆菌が使われている。

1997)、柔らかく糸引きが良い納豆の研究(三星

枯草菌は稲わらの他にも枯れた植物から分離

他<2006)、製造法に関する研究(村松他<2001)、することが知られていることから、稲わら以外イソフラボンの研究(伊部他<2001)、フィブリンからも枯草菌の一種である納豆菌を分離するこ溶解能(熊田他<1993)や抗菌作用(須見と大杉<とが可能ではないかと考えられる。しかし、稲1999)に関する研究などがある。納豆は稲わら

わら以外から納豆菌を分離するという実証的なから分離された枯草菌の一種である納豆菌によ研究は今のところ知られていない。稲わら以外─────────────────────
連絡責任者：加藤志織〒300-0051 茨城県土浦市真鍋6-8-33
つくば国際大学医療保健学部保健栄養学科
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から納豆菌を分離できれば、納豆菌の採取場所の選択肢を広め、より官能的・機能的に評価が高く、また、今までと異なる特性の納豆を製造できる可能性が期待される。
本研究では、稲わら以外の植物として同じイネ科であるサトウキビから納豆菌を分離するこ

2加藤志織 他／医療保健学研究９号：1-10頁（2018）とを試み、納豆製造の可能性についても検討した。

材料と方法
サトウキビの採取場所と採取方法───────────────
納豆菌を分離するためのサトウキビは①沖縄
県八重山郡竹富町小浜島、沖縄県石垣市の②八重山ヤシ群生地そば、③新石垣空港そば、④旧

図２．サトウキビの苞の様子

石垣空港そばのサトウキビ畑４地点で採取したサトウキビの両端をビニールひもで結び、サトウキビの中央に大豆を入れ、培養する前の苞の様子である。苞の作成方法は稲わらで納豆を製造する際と同様の方法で行った。

（図１)。
材料となるサトウキビは、枯れて乾燥した葉の部分を採取し、清潔な袋に入れ、実験室に持

納豆菌の分離方法────────

ち帰った。
４地点のサトウキビから作成した納豆からそれぞれ２粒を滅菌ピンセットで取り出し、0.85%滅菌生理食塩水9mLで十分に攪拌した。
この液を10倍段階希釈法により105倍希釈し、希釈液0.1mLを普通寒天培地に滴下後、コンラージ棒を用いて塗布した。この普通寒天培地を37℃で24時間培養してコロニーを作成し、単独コロニーを得た。
図１．サトウキビの採取場所

次に４地点のサトウキビのコロニーをそれぞ①小浜島（沖縄県八重山郡竹富町小浜）②八重山ヤシ群生地そば（沖縄県石垣市）③新石垣空港そば（沖縄県石垣市）④旧石垣空港そば（沖縄県石垣市）

れ実体顕微鏡で観察し（図３)、納豆菌の可能性が高いと考えられるコロニーを白金線を用いて平板に移し、培養した。納豆菌の可能性が高い

納豆菌の培養方法────────
４地点から採取したサトウキビの葉は、両端をビニールひもで固く縛り、１分間沸騰水につけて殺菌を行った。24時間浸漬したミヤギシロ
メ大豆を123℃20分蒸煮し、殺菌したサトウキ
ビの藁苞に50g充填し、中央をビニールひもで固く縛った（図２)。さらに、酸素の流通と湿度を維持するため、この藁苞をビニール袋に入れ、穴を空けて37℃で24時間培養した。
図３．納豆菌を顕微鏡で観察した際のコロニーの様子
４地点のサトウキビから作成した納豆からコロニーを作成し、顕微鏡で拡大して観察した様子である。

3加藤志織 他／医療保健学研究

かどうかの判断は、コロニーの形が不定形、目９号：1-10頁（2018）2>生化学的同定

視または顕微鏡でコロニーを観察した際に盛りアピ50CHB/Eメディウムを使用し、生化学的上がっている、コロニー表面の状態がザラついな同定を行った。今回使用したアピ50CHB/Eメている、コロニー自体が糸を引くなどの今までディウムは、Bacillus 及び関連菌種、腸内細菌科の経験の知見によった。選定したコロニーにはとビブリオ科に属するグラム陰性桿菌を同定す

採取地点ごとにナンバリングを行い（表３）、そる目的で使用する検査キットである。49種類のれぞれ培養を行った。

炭素源（表１）に対する分解能を確認することで同定が可能である。

納豆の製造
─────

表１．アピ50CHB/Eメディウムの49種類の炭素源平板に培養した菌をブイヨン培地5mLに植え、37℃48時間、振盪速度160rpmで振盪培養を行った。培養後、2500rpm、10℃、５分間遠心分離した。リン酸緩衝溶液を5mL加え、同じ方法で再度遠心分離した。その後、リン酸緩衝溶
液5mLで沈殿物を混合し、納豆製造の原菌液とした。
20℃で24時間浸漬したミヤギシロメ大豆300gを浸漬し、123℃、30分オートクレーブで蒸煮した。滅菌シャーレに、蒸煮した大豆を約30gずつ入れ、分離した菌液を約0.8mLずつ大豆全体に散布した。その後、37℃で24時間培養した。
ただし、八重山ヤシ群生地そば３に関しては、他の株より生育が遅かったため、37℃で48時間培養を行った。
納豆の評価方法───────

アピ50CHB/Eメディウムは、Bacillus 及び関連菌種、腸内細菌科とビブリオ科に属するグラム陰性桿菌を同定する目的で使用する検査キットである。49種類の炭素源に対する分解能を確認することで同定が可能となる。

納豆の製造を行ったものを、以下の方法で評価した。

3>コロニーの形状評価

1>官能評価
納豆の官能評価に対して、熟練した複数人に分離したコロニーの形状を顕微鏡で観察し、形状の評価を行った。

よる、主観的な官能評価を行った。評価項目として、外観（色、納豆らしさなど）、香り（納豆の香りであるか）、味（美味しさ、硬さ）、粘り結果（納豆を混ぜた時の糸引きはどうか）とした。粘りに関しては割り箸で10回転混ぜ、粘りを確認

４地点のサトウキビから、小浜島４株、八重した。味、粘りに関しては、文章での表現が困

山ヤシ群生地そば３株、新石垣空港そば３株、難なため、「◎とても良い、○良い、△良くな

旧石垣空港そば６株の合計で16株を分離できた。

い、×とても良くない」の四段階で評価をした。

小浜島４は培養がうまくいかなかったため、分離を断念した。16株のうち、15株が Bacillus

4加藤志織 他／医療保健学研究subtilis であることが分かり、また、サトウキビ９号：1-10頁（2018）

1>官能評価結果の苞から納豆を製造することができた（図４）。

官能評価の結果は、表２となった。出来上が納豆を製造できたと判断できたものは、小浜島った物は様々な特徴のものであった。各評価項

３、旧石垣空港そば３、八重山ヤシ群生地そば

目の結果は、以下のようになった。

２の16株中３株(12.5%)であり、実用化が可能であると判断できたものは小浜島３、旧石垣空
港そば３の16株中２株(18.8%)であった。

〈外観〉
外観に関しては、色が白いもの、茶色いものがあった。茶色のものについては色がまだらなものがあった。また、納豆らしいもの、納豆らしくないものがあった。
〈味〉
味に関しては、◎が１株、○が９株、△が１株、×が５株であった。大豆の味を強く感じるものや甘味があるもの、えぐみや苦味があるものなど、味に多様性があった。食べた瞬間に納豆らしいと感じるものでも、後味が良くないものも多くあった。×のものは、見た目や香り等も含め、食べることが難しいと判断され、実際に味を調べることはできなかった。16株のうち、

図４．サトウキビから分離した納豆菌により製造した納豆
大豆表面の白い部分は納豆菌が作った菌膜である。

小浜島３と旧石垣空港そば３の２株は非常に良い味であった。

表２．官能評価結果

サトウキビから分離した16株から、納豆を製造し、官能検査を行った結果である。評価項目として、外観、味、香り、粘りを指標とし、評価を行った。味、粘りは、言葉での表現が困難なため、◎〇△×の4段階で評価を行った。粘りは、割りばしで10回転かき混ぜ、評価をした。

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subtilis/amyloliquefaciens という表記になってい〈香り〉
香りに関しても、多様性があった。納豆らしる理由であるが、Bacillus amyloliquefaciens はいと思えるものもあったが、明らかに納豆とは元々 Bacillus subtilis に分類されていた経緯があ違うものや、納豆に似ているが臭いがツンとする。B. amyloliquefaciens は、多量の amylase をる、埃っぽいなど、不快な臭いのものもあった。

産生することが知られているため(Welker and香りが良くないものは、味の評価においても△

Campbell, 1967)、産業的利用の観点からも別菌や×など良い評価ではなかった。

種として取り扱うことが提案され、その結果本〈粘り〉菌種が正式に分類された。しかし、Bacillus

粘りに関しては◎〜×の４段階評価を行った

subtilis から B. amyloliquefaciens を遺伝子（16Sが、◎が３株、○が４株、△が７株、×が２株

rDNA 分析）同定においても明確に分離するこであった。新石垣空港そば１と新石垣空港３はとができないことから、アピ50CHB/Eメディウ

粘りの評価は◎であったが、粘着性が非常に強ムにおいて両菌種は区別されていない(Logan

く、混ぜていると全て一塊になり、納豆とは少and Berkeley, 1984)。

し粘り方が違うように感じた。
アピ50CHB/Eメディウムの結果と官能評価との──────────────────────
関連性について───────

2>生化学的同定
アピ50CHB/Eメディウムによって同定した結果（表３）、小浜島２以外は Bacillus subtil is/

各サンプルの49種類に対する発酵能はアピamyloliquefaciens(枯草菌)という結果となった。

50CHB/E メディウムの結果、表４となった。

小浜島２に関しては、Bacillus cereus(セレウス

表４のアピ50CHB/Eメディウムでの同定結果と菌)という結果であった。同定結果が Bacillus

表２の官能評価結果は、関連が有るものと無い

表３．アピ50CHB/Eメディウムでの同定結果(1)サトウキビから分離した16株をアピ50CHB/Eメディウムを使用し、同定を行った結果である。左の列が同定した株名、真ん中の列が同定結果、右の列が同定確率を表す。

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表３．アピ50CHB/Eメディウムでの同定結果(1)サトウキビから分離した16株を、アピ50CHB/Eメディウムを使用し、それぞれの株が炭素源を利用しているかどうかを示している。

ものがあることが分かった。

実際に官能評価も似ていた。

〈同定結果と官能評価に関連性が有るもの〉〈同定結果と官能評価に関連性が無いもの〉①小浜島２はエリスリトール(アピ番号22)<ア①小浜島５はリボース(アピ番号５)<トレハロミドン(アピ番号36)<グリコーゲン(アピ番号ース(アピ番号32)<イヌリン(アピ番号33)が陰37)が陽性、イノシトール(アピ番号17)<マンニ性であったが、その３項目が陽性となっている、

トール(アピ番号18)<ソルビトール(アピ番号

小浜島１に官能評価が類似しており、官能評価19)が陰性で、他の株とは異なった炭素源の利との関連性が無いようだった。

用をしており、同定結果と官能評価が関連をし②八重山３は、他のサンプルが陽性となっていていた。

るものが少ない、D-キシロース(アピ番号６)、②新石垣空港１<３はα-メト-グルコシド(アピN-アセチル-グルコサミン(アピ番号22)、アミ番号21)以外、全く同じアピの結果となっておドン(アピ番号36)、D-ツラノース(アピ番号40)

り、官能評価も似ていた。の４項目が陽性になっているが、官能評価は際③旧石垣空港そば５<６は分離した株の中で唯一立って特徴的でない、無難な結果であった。

サリチン(アピ番号26)<セロビオース(アピ番号〈官能評価で良い評価であった２株と同定結果と27)<β-ゲンチオビオース(アピ番号39)が陽性、の関連性〉

イヌリン(アピ番号33)が陰性であった。両者は実用化が可能であると判断した、小浜島３と

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加藤志織 他／医療保健学研究

旧石垣空港そば３のアピ50CHB/Eメディウムで９号：1-10頁（2018）

表５．コロニーの形状と官能評価との関連性の同定結果では、他の株の多くが共通して行っている炭素源の利用と同様の部分が多く、特徴が少なかった。この２株は、似ているわけではなく、異なる官能評価結果であった。小浜島３に関しては、甘さや旨みが強く、柔らかい納豆であった。一方、旧石垣空港そば３は癖がなく、シンプルな味わいで食べやすいという評価であった。しかし、旧石垣空港そば２と八重山２も、官能評価において、良い評価であった２株と同様の炭素源の利用をしているという結果であったが、旧石垣空港そば２は味に苦味があり、香りも埃のような不快な香りがした。八重山２は、味は悪くないが、香りがえぐい臭いや、臭い自体が強すぎるという官能評価であった。後者の２株の官能評価が良いものではなかったことから、アピ50CHB/Eメディウムの結果と官能評価との関連性があるとは言い切れない。
3>コロニーの形状評価分離した16株はコロニーの形状により大きく５種類に分類することができた（表５）。分類１
は、コロニー中央が盛り上がり、周りに薄く広がるという特徴であった。分類２は、正円に近くて表面光沢がある特徴であった。分類３は、コロニー周辺が不定形で、白くなっているという特徴であった。分類４は、正円に近く透明、周りに毛綿状のものが見える特徴であった。分
類５は、やや楕円形で、中心に円状のものがある特徴であった。

コロニーの形状と納豆の官能評価との関連性に─────────────────────ついて───

５種類の形状のうち分類1に属する株が一番多く、16株中８株(50%)であった。経験上、納分類１では、前述した、最も良い結果であっ豆菌の可能性が非常に高いと考えられる形状でたと評価した旧石垣空港そば３と、食べられそあった。分類２は16株中１株(6.3%)が該当しうにないと評価した旧石垣空港そば１と４が当た。分類３も分類1と同様に経験上、納豆菌の可てはまった。このように様々な特徴のものが含能性が非常に高いと考えられる形状であり、16まれていた。

株中３株(18.8%)であった。分類４は16株中２

分類2は他とは異なる同定結果であった株(12.5%)、分類５は16株中２株(12.5%)が該

Bacillus cereus(セレウス菌)であり、小浜島２の当した。

みから分離された。食中毒菌として知られている細菌であり、納豆としては好ましくない。
分類３に関しては、官能評価において新石垣8加藤志織 他／医療保健学研究９号：1-10頁（2018）

空港２と旧石垣空港２は類似している特徴があい納豆も販売されるようになってきていることったが、同じ分類３に属する、小浜島３と官能から、粘性だけで納豆菌であるかどうかは判断評価は異なっていた。この分類では、納豆になできない。しかし、食べた時のおいしさは味・るものとならないものがあった。

香り・見た目・かたさなどによるので、おいし分類４の２株は非常に類似した特徴を持っていたが、これらは納豆にはならなかった。
分類５の２株は非常に類似した特徴を持っていた。これらも納豆にはならなかった。

さを判断するためには、官能評価は重要である。
おいしさを生み出すものは大豆の成分と、納豆菌が生成する代謝産物による。本研究では、代謝と官能評価に部分的であるが一致が見られセレウス菌が同定されたことから、植物を煮た。今回アピ50CHB/Eメディウムによって、49沸した場合、基本的に枯草菌は生き残っている種の糖の利用性を調べたが、これは納豆菌の代が、芽胞形成する細菌についても、多くはない謝の一つの側面を反映するものなので、同じが生存している可能性があることが分かった。

Bacillus subtilis であっても官能評価は異なって3つの評価方法を行い、納豆と判断できたもくる部分もあったということが考えられる。今のを比較すると、美味しいと感じるものもあれ後は炭素源のみでなく、産生される臭い物質、ば、あまり美味しくないものもあった。外観や味に影響を与えるアミノ酸、有機酸について調香りなども違いはあったが、食感的にも多様性べることが重要である。同様に臭い物質についがあることが分かった。ても検討する必要がある。

小浜島２以外全て Bacillus subtilis/amyloliquefa-

本研究で分離した納豆菌の中で、味や香りのciens であったが、全体の官能評価は様々であっよい納豆を作ることのできた納豆菌に関しては、た。

実用化も可能であると考えられる。
今回の実験では納豆を食べて美味しいと感じるかどうかの官能評価、アピ50CHB/Eメディウ

考察

ムを使用した生化学的評価、コロニーの形状をみる形状の評価を行ったが、納豆には様々な機

サトウキビから納豆菌の分離ができたことか能性があるので、今後はイソフラボンやフィブら、他のイネ科の植物から納豆菌の分離ができリン溶解能など、機能性についても調べていきる可能性が示唆された。アピ50CHB/Eメディウ

たい。今後、分離した株についてより詳しく知ムによって Bacillus subtilis だと判断された株のるためには、遺伝子レベルで調べる必要もある

中には、官能評価において、香りや味が良くなと考えられるが、16SrDNA(RNA)の塩基配列

く、納豆菌として使うには難しい仕上がりのもでは不十分であると考えられるので、より詳細のもあった。納豆と評価できないものに関してな分類が可能となる MLST 法(木村<2006)など

は、粘りが少なく、粘性物質を作らないことがを用いて調べることは意義があるだろう。

考えられた。
また納豆になりやすいものはコロニー形状が分類１と分類３であると考えられる。

参考文献

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Original Article

Isolation of Bacillus subtilis natto from sugarcane
and production of natto
Shiori Kato1, Akemi Komatsu1, Sachie Ibe2, Kaoru Kumada2
12

Department of Health and Nutrition, Faculty of Health Science, Tsukuba International University

Department of Clinical Laboratory Testing, Faculty of Health Science, Tsukuba International University

Abstract
For the production of natto, pure-cultured Bacillus subtilis natto are utilized. In the present study, we attempted
to isolate B.subtilis natto from sugarcane to assess whether natto production can be achieved using suchbacteria. Sugarcane samples were collected at four different locations. To isolate B.subtilis natto, we madenatto in accordance with a traditional technique and, as a result, successfully isolated 17 strains. Nattoproduced with these strains was subjected to evaluation using various indices, including appearance. The
morphologies of their colonies were also examined. Finally, we biochemically confirmed these strains as
belonging to Bacillus subtilis. Some strains failed to produce natto due to less gluey texture, which leads tothe assumption that they cannot secrete a viscous substance. Nevertheless, they were B.subtilis from thebiochemical perspective. The ones those were determined as natto varied in their texture. The successfulisolation of B.subtilis natto from sugarcane suggests the possibility that B.subtilis natto may also be isolated
from other poaceous plants. Strains that are suitable for natto production could be put into practicalapplication in the future.
Keywords: Natto, Bacillus subtillus, Japanese traditional fermented food,isolate, sugarcane