MECHANISM OF BILFILM FORMATION AND EFFECT

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.4 2016

総OF BACTERIOCINS ON MRSA BIOFILM

説

バイオフィルム感染症制圧に向けての展望
水之江義充、杉本真也、奥田賢一
所属機関：東京慈恵会医科大学 細菌学講座
慈恵バイオフィルム研究センター〒 105-8461 東京都港区西新橋 3-25-8
TEL: 03-3433-1111 FAX: 03-3436-3166
E-mail: mizunoe@jikei.ac.jp［要約］

黄色ブドウ球菌は、創傷感染などの皮膚感染症から心内膜炎や骨髄炎のような重症感染症まで幅広い感染を引き起こす［3］。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）は院内感染症の重要な原因菌であり、治療困難な症例を増加させている。また、人工医療材料を用いた治療に伴い、バイオフィルムに関連した難治性の感染症が増加し問題となっている。バイオフィルム感染症の予防法や治療法の開発には、バイオフィルム形成メカニズムの解析が必要と考えられる。完成したバイオフィルムの構成成分（マトリクス）は、多糖、DNA、タンパク質によりなっていると考えられている。しかしながら、マトリクスタンパク質の解析はほとんどなされていない。我々は高濃度の塩処理によりマトリクスを抽出し、そこに含まれるタンパク質を同定した。マトリクス中には、130 種類のタンパク質が存在することが判明した。さらに、細菌によって産生されるペプチド性抗菌物質であるバクテリオシンのバイオフィルムに対する殺菌効果を解析した。構造と作用機作がそれぞれ異なる 3 種のバクテリオシ（ナイシン A、ラクティシン Q、ヌカシン ISK-1）を使用した。ナイシンとラクティシン Q は液体培養した MRSA に対してはほぼ同等の殺菌活性を示し、バイオフィルムを形成した MRSA に対してはナイシンの方が高い活性を示した。ヌカシン ISK-1 は液体培養した MRSA に静菌活性を示し、バイオフィルムに対する殺菌活性は示さなかった。ナイシンとラクティシン Q は細菌の細胞膜に孔を形成して殺菌活性を示すことが知られており、バイオフィルム内においても同様の作用機作により活性を示すと考えられる。以上の結果から、マトリクスタンパク質を利用したワクチンの作製や孔形成を行うバクテリオシンの使用がバイオフィルム感染症の予防・治療の開発に繋がると考えられる。
キーワード：黄色ブドウ球菌、バイオフィルム、マトリクス、バクテリオシンの開発、ii）バイオフィルム形成阻害・破壊因はじめに子の発見、iii）バイオフィルム内の菌に対する中心静脈カテーテル、人工関節等の医療材料殺菌剤の発見等が考えられる。上記のことを達を体内に留置する機会が増加し、難治性のバイ成するためには、バイオフィルムの形成メカニオフィルム感染症が重要な問題となっている。

ズムの解明が重要である。本稿では、院内感染バイオフィルム感染症の予防や治療にあたって症の原因菌として重要な MRSA のバイオフィ

は、i）バイオフィルムのできにくい医療素材ルムマトリクスを構成するタンパク質の解析およびバイオフィルム殺菌剤の開発について述べる。また、グラム陰性菌および陽性菌のバイオ

受理：2016年11月14日－ 113 －

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5 巻 4 号 2016

バイオフィルム形成メカニズムおよびバクテリオシンのバイオフィルム殺菌効果

フィルム形成過程をそれぞれの代表的な菌であ

この様な過程をバイオフィルムの成熟と呼んでる大腸菌およびブドウ球菌を用いて説明する。

いる。バイオフィルムの成熟には、さらに、カーリー（curli）と言う構造物が必要である。図 2

細菌のバイオフィルム形成メカニズムに線毛・鞭毛・カーリーの電顕写真を示す。カー

細菌のバイオフィルムは、平坦なシート状のリーは、大腸菌やサルモネラ等の菌体表面上にものだと考えられていたが、コンフォーカル発現するクルクルとした構造物でカーリーへレーザー顕微鏡や走査型電子顕微鏡などの観察ヤーに因んで命名された。通常の培養法（寒天により、キノコの様な複雑な形態（英文では、培地や液体培地）では、低温（30℃以下）でのmushroom like structure）をしていることがみ発現することより病原性に関与していないとわかってきた（図 1）。バイオフィルム内の菌考えられていた。しかし、バイオフィルム内では、薬剤耐性になることが知られている。あるは、37℃でもカーリーが発現することが示され薬剤に対しては 1,000 倍の耐性を示す事もある。

た［1］。走査型電子顕微鏡でバイオフィルムをそのメカニズムは、バイオフィルムの膜を薬剤観察すると、野生株（カーリー保有株）は、典が通過できないことによるものと考えられてき型的なキノコ様の成熟したバイオフィルムを形た。しかし、最近の研究により、バイオフィル成するが、カーリー欠損変異株では、典型的なム内では薬剤をトラップして汲み出す遺伝子がバイオフィルムは形成されない（図 3）。バイ

発現し、そのことが薬剤耐性獲得に重要な役割オフィルム形成能と病原性との関連をマウスのを果たしていることがわかってきた。

尿路感染症モデルを用い検討すると、感染後 3

細菌は、グラム染色法により、紫色に染まる日目で、キノコ様バイオフィルムを形成する野

グラム陽性菌と赤色に染まるグラム陰性菌の 2生株（カーリー陽性株）感染マウスは全頭死亡つに分けられる。大腸菌、緑膿菌などは、グラしたが、カーリー欠損株感染マウスは 70% がム陰性菌である。大腸菌を例にとり、グラム陰生存していた（図 4）。細菌のバイオフィルム

性菌のバイオフィルム形成過程と必要な因子に形成能は、病原性に強く関与していることが判ついて図 1 に示す。菌は、まず鞭毛で遊走し医明した。バイオフィルム内の細菌は、遺伝子発療材料・組織表面に付着する。その後、線毛を現が浮遊細菌とは異なり、通常 37℃（生体内）発現し強固に付着し増殖する。やがて菌体外多では、発現しないと考えられていたカーリーな糖体を分泌しキノコ様のバイオフィルムを形成

どの病原因子を発現する可能性が示された。

する。菌塊と菌塊の間には水チャンネルがあり、以上よりバイオフィルム内の細菌の遺伝子発栄養や老廃物が行き来すると考えられている。

現やバイオフィルム形成メカニズムを解明する

付着バイオフィルムの成熟

定着・増殖

バイオフィルム形成に必要な因子

カーリー
菌体外多糖体

鞭毛

線毛

１）鞭毛
２）線毛
３）菌体外多糖体
４）カーリー

水チャンネル

医療材料・組織表面
図１

バイオフィルムの形成過程（大腸菌）

図1 バイオフィルムの形成過程（大腸菌）－ 114 －

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OF BACTERIOCINS ON MRSA BIOFILM

線毛線毛鞭毛鞭毛
カーリー
カーリー
図２

TEM（ネガティブ染色）による大腸菌の鞭毛、線毛、カーリー

図2
図2
TEM（ネガティブ染色）によるTEM（ネガティブ染色）によるWild
type：Curli(＋)
Curli(−)(−)mutantmutantWild
type：Curli
(＋)
Curli
大腸菌の鞭毛、線毛、カーリー
大腸菌の鞭毛、線毛、カーリー

マッシュルーム様バイオフィルム
平坦なバイオフィルム
図３ Curliの有無によるバイオフィルム形態の相違

マッシュルーム様バイオフィルム
マッシュルーム様バイオフィルム

平坦なバイオフィルム
平坦なバイオフィルム

100

生存率

図3
図3 Curliの有無によるバイオフィルム形態の相違
Curliの有無によるバイオフィルム形態の相違

(%)

大腸菌
カーリー欠損株

806040大腸菌
野生株（カーリー＋）

2000123感染後日数
図４

マウス尿路感染症モデルを用いたカーリーの病原性の検討

図4 マウス尿路感染症モデルを用いたカーリーの病原性の検討－ 115 －

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バイオフィルム形成メカニズムおよびバクテリオシンのバイオフィルム殺菌効果

ことは感染症の予防・治療法の開発過程に重要ドされた菌体外多糖体（PIA: polysaccharideであると考えられる。

intercellular adhesin）、 タ ン パ ク 成 分 の Eap

次に、グラム陽性菌の代表的な院内感染原因（extracellular adherence protein）や、菌体外菌である黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成DNA（eDNA: extracellular DNA）などが、バ過程を図 5 に示す。浮遊細菌が、カテーテルなイオフィルムの成熟に関与していることが示さ

どの表面に付着・増殖し、菌体外マトリクスれてきた［2］。今後バイオフィルム形成過程でを産生し、バイオフィルムが成熟する。やがの各々の因子の遺伝子発現の解析、バイオフィて、バイオフィルムから浮遊細菌が遊離し感染ルムマトリクスの詳細な成分解析が必要と考えが拡大する。黄色ブドウ球菌は、大腸菌などのられる。

グラム陰性菌のように遊走と初期付着に必要な黄色ブドウ球菌の鞭毛や強固な付着（定着）のための線毛などのバイオフィルムマトリクスの抽出と解析明瞭な役割を持った菌体外構造物を有していない。黄色ブドウ球菌では、初期接着因子とし

1M NaCl の処理によりバイオフィルムマトてクランピングファクター（ClfA）やフィブリクスを抽出した（図 6）。そこに含まれるタ

ロネクチン結合タンパク（FnBPA & FnBPB）

ンパク質を質量分析・アミノ酸シーケンスによなどが挙げられている。Ica 遺伝子群にコーり同定した。約 130 種類のタンパク質がバイオ

浮遊細菌

感染症の拡大離脱
バイオフィルム多糖体

初期付着

eDNA
タンパク質

成熟

カテーテルの表面
図５

黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成過程

図5 黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成過程
1 M NaCl

多糖体 eDNA

バイオフィルムマトリクス

タンパク質Release
細菌カテーテルの表面
図６

バイオフィルムマトリクスの抽出

図6 バイオフィルムマトリクスの抽出－ 116 －MECHANISM OF BILFILM FORMATION AND EFFECT

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フィルムマトリクス中に認められた。驚いたこシン Q、ヌカシン ISK-1）（図 9）の効果を比較とに 64% が細胞質タンパク質であり 12% が分した。ナイシンとラクティシン Q がメチシリ泌タンパク質、6% が膜タンパク質であった（図ン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）臨床分離株7）。MRSA（MR23 株 ） の バ イ オ フ ィ ル ム マのバイオフィルムに対して殺菌活性を示した

トリクスに多量に含まれる Eap（extracellularが、ヌカシン ISK-1 はバイオフィルムに対するadherence protein）についてバイオフィルム殺菌活性を示さなかった（図 10）。ナイシンと形成への効果を検討した。ブレビバチルスを用ラクティシン Q は濃度依存的にバイオフィル

い、大量に発現させ精製した Eap は、ブレビム内の細胞から ATP を漏出させ、殺菌活性とバチルスおよび黄色ブドウ球菌のバイオフィル

ATP 漏出量には相関性が見られたことから（図ム形成を増強することが判明した（図 8）［5］。

11）、胞膜上に安定的な孔を形成することがバイオフィルムの殺菌において重要であることがバクテリオシンのバイオフィルム殺菌効果示唆された［4］。

細菌によって産生されるペプチド性抗菌物質であるバクテリオシンのバイオフィルムに対す
図7 黄色ブドウ球菌のマトリクスタンパク質の種類まとめる殺菌効果を解析した。構造と作用機作が異な人工関節や血管内留置カテーテル等の人工医る 3 種のバクテリオシ（ナイシン A、ラクティ療材料の使用の増加により難治性のバイオフィ

図8 Eapによる細菌の凝集とバイオフィルム形成促進
図７

黄色ブドウ球菌のマトリクスタンパク質の種類

図８

Eapによる細菌の凝集とバイオフィルム形成促進(Sugimoto et al. J. Bacteriol. 2013)－ 117 －家畜感染症学会誌
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バイオフィルム形成メカニズムおよびバクテリオシンのバイオフィルム殺菌効果

ルム感染症が、大きな問題となっている。バイ行った。今後、タンパク質の局在等を調べ、ワオフィルム感染症のコントロールは、容易なこクチンの開発などにも繋げたいと考えている。とではない。新しい試みとして、バイオフィル

また、細菌によって産生されるペプチド性抗菌

ムマトリクスを構成するタンパク質の解析を物質であるバクテリオシンのバイオフィルムに

図9 使用したバクテリオシンの構造

Nisin A produced by Lactococcus lactis (34 AA, M. W. = 3354)
1Ile

Ile
Dhb

Dha

Ala

SLeu
Ala Abu

Ala

Ala

ProS

LysLeuMet

GlyGlyAbu

Ala

GlyAlaAsnMetAbu

Lys Abu

20S10Class I: lantibiotic

SAla

Ala
His30
SerHis

Ile

Val

Dha34

Lys

S

Lacticin Q produced by Lactococcus lactis (53 AA, M. W. = 5962)
1fMet

10Ala

Gly

Phe

Leu

Lys

Val

Gln

Val

ClassII

20

Leu

Leu

Lys

Ala

Tyr

Gly

Ser

Lys

Ala

Val

Gln

Trp

Ala

Trp

Ala

Asn

Lys
Gly

53
Lys

50
Ile

Gly

Leu

40
Ile

Gln

Lys

Ile

Ser

Lys

Val

Val

Trp

Asp

30
Ile

Ala

Gly

Gly

Ala

Asn

Leu

Trp

Asp

Leu

Ile

Lys

Nukacin ISK-1 produced by Staphylococcus warneri 27 AA, (M. W. = 2960)
SAla

10 ValLys

LysSerGlyVal

IlePro

Ala

His

Ala

Asp

Abu

1
LysS

Phe

Dhb

Ala
His

27

Phe

SerGlnSMet Asn

図９Class I: lantibiotic

Val

20PheAla

使用したバクテリオシンの構造

図10 MR23バイオフィルムに対する殺菌活性
BHI-１％ Glucose培地を使用して96ウェルプレート上にバイオフィルムを形成（24 h）↓4×MIC のペプチドを添加（in PBS）
↓1, 24 h後のCFUを測定

CFU / well

1.E+081.E+071h
24 h

1.E+06

1.E+05Control

Nisin A

Lacticin Q

Nukacin ISK-1

Vancomycin

Nisin Aとlacticin Qはバイオフィルムに対して殺菌活性を示した。
図10MR23バイオフィルムに対する殺菌活性－ 118 －MECHANISM OF BILFILM FORMATION AND EFFECT

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対する殺菌効果を検討した。その結果、バイオbiofilm formation and host-pathogen interaction. J.
Bacteriol. 195(8) : 1645-1655.

フィルムを殺菌するバクテリオシンを見出した。バイオフィルム感染症の予防・治療においてはバクテリオシンの使用が有効であることが示唆された。
引用文献
1.

2.

3.

4.

5.

Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S.
and Yoshida, S. 2005. Curli fibers are required fordevelopment of biofilm architecture in Escherichia
coli K-12 and enhance bacterial adherence to humanuroepithelial cells. Microbiol. Immunol. 49(9) : 875884.
Merino, N., Toledo-Arana, A., Vergara-Irigaray, M.,
Valle, J., Solano, C., Calvo, E., Lopez, J, A., Foster,T, J., Penadés, J. R. and Lasa, I. 2009. Protein
A-mediated multicellular behavior in Staphylococcus
aureus. J. Bacteriol. 191(3) : 832-843.
水之江義充 , 杉本真也 , 岩瀬忠行 . 2014. 常在細菌による黄色ブドウ球菌排除メカニズム . 呼吸器内科 26（1）: 49-52.
Okuda, K., Zendo, T., Sugimoto, S., Iwase, T.,Tajima, A., Yamada, S., Sonomoto, K., Mizunoe, Y.
2013. Effects of bacteriocins on methicillin-resistant
Staphylococcus aureus biofilm. Antimicrob. Agents.
Chemother. 57(11) : 5572-5579.
Sugimoto, S., Iwamoto, T., Takada, K., Okuda,K., Tajima, A., Iwase, T., Mizunoe, Y. 2013.
Staphylococcus epidermidis Esp degrades specificproteins associated with Staphylococcus aureus

図11 MR23バイオフィルムに対する殺菌活性とATP漏出活性
ATP漏出量

死細胞由来の蛍光強度

ControlNisin A
図11

Lacticin Q

Nukacin ISK-1

Vancomycin

MR23バイオフィルムに対する殺菌活性とATP漏出活性

バイオフィルム殺菌活性とATP漏出量には相関性がみられた。
⇒細胞膜への孔形成が重要である。
－ 119 －家畜感染症学会誌
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Mechanism of biofilm formation and effects of bacteriocins on MRSA biofilm
Yoshimitsu Mizunoe, Shinya Sugimoto, Ken-ichi Okuda
Department of Bacteriology, Jikei Center for Biofilm Science & Technology, The Jikei University【Abstract】
We examined the profiles of biofilm matrix proteins by 1D SDS-PAGE analyses after 1 M NaCltreatment to detach biofilm matrix components from Staphylococcus aureus cells. Then Biofilm
matrix proteins were identified by N-terminal amino acid sequence analysis combined with mass
spectrometry. Hundred thirty proteins were identified in biofilm matrix (cytoplasmic, 64%; secreted,12%; membrane, 6%; cell wall, 3%; unknown, 15%). Eap was the most abundant protein in the biofilm
matrix fraction of MR23. To address the role of Eap in biofilm formation, we used a Brevibacillus
choshinensis expression-secretion system which enables us to produce a particular protein in theextracellular environment. Extracellular production of recombinant Eap triggered cell aggregation
and biofilm formation of B. choshinensis cells, whereas Efb, the other abundant protein in the biofilm
matrix fraction of MR23 did not. Development of a vaccine targeting proteins that contribute to S.
aureus biofilm formation and colonization of human skin and the human nasal cavity could be analternative approach to control biofilm infections. We also examined the effects of different kinds ofbacteriocins, which are ribosomally-synthesized antimicrobial peptides produced by certain bacteria,
on biofilms formed by a clinical isolate of methicillin-resistant S. aureus (MRSA). The activities andmodes of action of three bacteriocins with different structures (nisin A, lacticin Q, and nukacin ISK1) were evaluated. Vancomycin, a glycopeptide antibiotic used in the treatment of MRSA infections,showed bactericidal activity against planktonic cells, but not against biofilm cells. Among the tested
bacteriocins, nisin A showed the highest bactericidal activity against both planktonic cells and biofilmcells. Lacticin Q also showed bactericidal activity against both planktonic cells and biofilm cells, butits activity against biofilm cells was significantly lower than that of nisin A. Nukacin ISK-1 showedbacteriostatic activity against planktonic cells and did not show bactericidal activity against biofilmcells. Mode-of-action studies indicated that pore formation leading to ATP efflux is important for thebactericidal activity against biofilm cells. These results suggest that bacteriocins that form stable
pores on biofilm cells are highly potent for the treatment of MRSA biofilm infections.
Keywords: b acteriocin, biofilm matrix, Eap, MRSA, nisin A－ 120 －