糸状菌におけるマーカーリサイクル法の確立
及び Aspergillus aculeatus 多重栄養要求性宿主の開発
川口剛司（大阪府立大学大学院 生命環境科学研究科）
研究の目的
現在セルロース系バイオマスからの燃料用エタノールなどのバイオマスエネルギーへの変換に焦点が当てられ実用化段階に入りつつあるが，糖化プロセスは硫酸処理が主流となっている。将来的には穏和な酵素糖化の実用化が望まれているが，現在の酵素剤の触媒効率が充分でなく大量の酵素が必要であるといった問題が工業化を阻んでいる。これらを克服するためには，個々のセルラーゼの機能強化や相乗効果の解明に加えて，最終的にはセルラーゼ高生産系を確立し強力なセルラーゼ剤を安価に供給することが必須と考えられる。

A. aculeatusはTrichoderma属のセルラーゼ剤と強い相乗作用を示す多様なセルラーゼ群を生産する糸状菌として土壌中から分離され，両者のセルラーゼ剤をアルカリ処理した稲ワラに同時に作用させるとほぼ完全に単糖にまで分解できることが示された1,2)。
その後，A. aculeatusの宿主ベクター系を開発し，ヘミセルラーゼの一種であるβ-マンノシダーゼ遺伝子を発現させたところ，A. oryzaeを宿主としたときの 10 倍近くの生産量を得た3,4)。これはA. aculeatusのタンパク質生産工場としての高いポテンシャルを示すものである。一方，結晶性セルロースを効率よく単糖にまで分解するためには作用機作の異なるセルラーゼ成分が協奏的に作用することが必要とされている。このことから，複数のセルラーゼ遺伝子を同時に高発現するスーパー麹菌を育種し強力なセルラーゼ剤を生産すると同時に固体培養でのセルロース性バイオマスの直接糖化を目指している。
それには，複数の遺伝子を同時に導入できる宿主すなわち多重栄養要求性変異体を遺伝子破壊により作製することが必要である。効率よく遺伝子をノックアウトするためには相同組換えの効率が高い必要があるが，糸状菌では一般的に非相同組換えが優先的といわれている。しかし最近非相同組換えに関わるヘテロダイマータンパク質（Ku70/80）
やLig4 ホモログを破壊することで糸状菌でも高い頻度で相同組換えが起こることが示された5-9)。これらのことから，本研究課題では，ⅰ）A. aculeatus におけるKu70/80
またはLig4 ホモログ破壊株の作製，ⅱ）糸状菌におけるマーカーリサイクリング法の確立，ⅲ）本方法を用いた遺伝子破壊による複数の栄養要求性変異マーカーを導入した

A. aculeatus宿主株の作製を目的とした。

方法
5-フルオロオロチン酸 (5-FOA) 耐性を指標に自然変異で取得したウリジン要求性株（pyrG13）3)をku80 ホモログ遺伝子（Aaku80）破壊カセットで形質転換し，ウリジンを含まない培地で生育する形質転換体を取得した（図１-ａ）。さらに，得られた形質転換体の中からサザンブロット解析によって、破壊カセットが二重交叉により目的の位置に１コピー導入された株を選択した（R1）。その後，得られた株の胞子を 5-FOAを含む培地に塗布し、分子内相同組換えによってpyrGが切り出された結果再び 5-FOA耐性

となり生育してきたコロニーを得た。このうちの一株をAaku80 破壊株（MR12）とした（図１ｂ）。MR12 株を用いて実際にargB遺伝子を標的とした遺伝子破壊を行い、野生株と比較することによってターゲティング効率を評価した。
MR12 株（Aaku80ー, pyrGー）にマーカーリサイクリング法により新たにargB変異を導入し，二重の選択マーカーを付与した宿主を作製した。
その際，20, 98, 495 bpの異なる長さの同方向反復配列（DR）を持つ破壊カセットを作製し，DRの長さが分子内交叉による切り出しの効率に与える影響を評価した。

結果
Aaku80 遺伝子の破壊とpyrGマーカーの除去：
破壊カセットでpyrG13 株を形質転換し，ウリジンおよびウラシルを含まない再生培地上で 40 株

(図１) Aaku80 遺伝子破壊とマーカーリサイクリングの形質転換体を取得した。続いて，これらすべての形質転換体からゲノムを抽出し、サザンブロット解析によって破壊カセットがAaku80 座位に正しく導入された株のスクリーニングを行った結果，二重交叉によってシングルコピーで導入された 1 株が得られた（R1）。次に，Aaku80 破壊の際のマーカーとして用いたpyrGを以後の形質転換に再利用するために，S. cerevisiaeで報告された方法10)を参考にR1 株（Aaku80ー, pyrG＋）からのpyrGマーカーの切除を試みた。約 104個の胞子を 5-FOA含有培地に塗布したとこ
ろ培養 10 日目において 20〜30 株の 5-FOA耐性株が出現した。得られた株をサザンブ
ロッティング解析したところ，9 割以上の確率でDR間の分子内相同組換えによってpyrGを含む断片の除去が起こっていることが明らかとなった。これらのDR間の分子内組換えによりpyrG を失った株は、ウリジン要求性であることを確認した。これら株のうちの 1 株 (MR12) を以下の実験に用いた。

Aaku80 遺伝子破壊株の生理学的特徴：MR12 株（Aaku80ー, pyrGー）とその親株であるpyrG13 株（Aaku80＋, pyrGー）の基底菌糸伸張には有意な差は認められなかった。
また，両株のコロニーを観察した結果，胞子形成能についても有意な差は見られなかった。一方，methyl methanesulfonate（MMS）に対する感受性はMR12 株の方が高く，0.05% MMS存在下において有意な生育の差が認められた。これは N. crassa や A.

fumigatus について報告されたku破壊によってMMSに対する感受性が高くなるという知見と一致する5,9)。

Aaku80 遺伝子破壊株の argB 座位におけるターゲティング効率：pyrG をマーカーとする argB 破壊カセットにより pyrG13 と MR12 をそれぞれ形質転換しウリジンを含まない培地で一次選択した。pyrG13 株より得られた 32 株の形質転換体のうち 1 株がアルギニン要求性を示しターゲティング効率は 3%であったのに対し，MR12 株より得られた形質転換体 31 株中 29 株がアルギニン要求性を示しターゲティング効率は 94%であった。さらに MR12 株から得られたアルギニン要求性株は、調べた限り全て argB 座位に二重交叉によってシングルコピーで導入されていることがサザンブロット解析で明らかとなった。

pyrG, argB二重欠損株の作製とDRの長さが分子内相同組換えに与える影響：pyrGを選択マーカーとするマーカーリサイクリングを行うため、保持するDRの長さが異なる（20，98，495 bp）3 種類のargB破壊カセットを作製し、MR12 株を形質転換した。その結果、３種類の破壊カセットによる形質転換から、それぞれ 15 株，10 株，20 株のpyrG＋の表現系を示す形質転換体を取得した。このうち，アルギニン要求性を示した株は、それぞれ 11 株，10 株，17 株であった。次に、サザンブロット解析により、これらのアルギニン要求性株の中より、各破壊カセットが、相同組換えによってゲノム上に 1 コ
ピーで導入されている株を同定した [mrTA1-14 (DR; 20 bp)，mrTA2-1 (DR; 98 bp)，mrTA3-6 (DR; 495 bp)]。その後，mrTA3-6 の胞子約 106個を 5-FOA，ウリジン，アルギニンを含む培地に塗布したところ、5-FOA耐性株が出現した。得られた 10 株の耐性株は全てウリジン要求性を示したことから，計画通りにpyrG，argB二重欠損株を作製できた。一方，mrTA1-14，mrTA2-1，mrTA3-6 株からの 5-FOA耐性株出現頻度を算出したところ，それぞれ 5.7×10-6，1.4×10-5，1.2×10-4であり，DRが長いほど耐性株出現頻度は高かった。さらに、得られた耐性株についてのサザンブロット解析の結果、分子内相同組換えによってpyrG遺伝子が正しく切り出された目的の株が得られていることが明らかになった。

結論
本研究で，A. aculeatus においても ku の破壊によってターゲティング効率が飛躍的に向上することが明らかとなった。また，酵母では一般的に行われているマーカーリサイクリング法が糸状菌でも利用できることが示され，pyrG のように positive/negative
selection が可能な変異体を取得できれば，標的となる遺伝子配列情報を利用して次々に遺伝子破壊を行うことが可能である。酵母では分子内相同組換えのための DR の長さは 20 bp 程度で充分と言われているが，糸状菌ではさらに長い DR が必要と考えられていた。しかし，効率は低いものの、酵母と同程度の長さの DR でも正しく切り出された株を取得することができた。20 bp の DR でこのようなマーカーリサイクリング系を利用できることは，破壊カセットの構築の簡便化という観点から非常に有用であると考えられる。
今後この技術を利用して，さらに多くの選択マーカーを付与した宿主を作製し，結晶性セルロースの効率のいい分解に必須なセルラーゼ成分を大量に生産する菌株の育種を行っていきたい。

文献
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