タイトル
不定胚形成メカニズムのϺ明にむけて—不定胚形成と細胞接着—

京૖大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻‫ټ‬畑公紀（たかはたきみのり）

指導教官

佐藤文彦

博士ϥ程 4 年（さとうふみひこ）

はじめに植物は動物と異なり自ら移動することは出来ない。一方、植物には動物にはない可塑性をもって環境に適応している。例えば、植物の枝を折って、土に挿しておくと切り口から根が再生し、すくすくと植物は成੝する。このような植物に備わる可塑性のメカニズムϺ明が私の取り組んでいる研究テーマである。
不定胚とは植物が示す可塑性の一つに不定胚形成というものがある。通常植物は受精により種子が形成される（図１）。種子の中には種子胚という将来の植物にあたる組織があり、球状胚、心臓型胚、ԝ雷型胚と成੝して発芽の時期をּえる。例えば柿の種を割ってみると種子の中に種子胚があることを簡単に確認できる。一方、不定胚形成というのは成੝した植物の体細胞を植物ホルモン等の処理により前述の胚だけを作り出すことを指している。種子胚では胚は胚乳や種皮で覆われているが、不定胚ではそれらに覆われていない。また不定胚も種子胚と同じように成੝し、完全な植物個体となる。

不定胚の重要性
この不定胚形成は生物学的にఏ常に重要な現象を示している。不定胚形成は一つの細胞にはその個体を作り出せる能力が備わっていることを証明している。これを分化全能性と呼んでいる。不定胚形成は分化全能性を如実に現しているにもかかわらず、そのメカニズムはϺ明されていない。また産業上にとってもこの不定胚形成は重要な技術である。有益であるが不稔な植物を不定胚形成技術を用いた人口種子という形で育種することができる。このため不定胚形成のメカニズムをϺ明することで生物学的疑問、産業上の技術革新に貢献できる。そのため特に不定胚形成に関与する̰伝子を単離、Ϻ析することとした。

1

不定胚の誘導
不定胚形成は数多くの植物種で観察されているが、すべての植物種で不定胚が誘導できるわけでなく、またその誘導頻度も植物種によって異なっている。一方、ニンジンは古くから不定胚形成系が確立しており、大量に同੘した不定胚を容易に誘導することが出来る。そのためニンジン不定胚形成系を用いて不定胚形成に関与する̰伝子の単離を݄みた。ニンジンを含む多くの植物種の不定胚形成法はほぼ同様の操作により誘導することが出来る（図２）。つまり体細胞を植物ホルモンの一種であるオーキシンを含んだ培地上で 1~2 ヶ月培養することにより、不定胚形成能を有する embryogeniccells(EC)を生じさせ、オーキシンを含んだ培地にて EC を維持、増殖させる。増殖した EC のうち 37μｍ−63μｍ径の細胞塊をオーキシンを含まない培地に移植することによって EC から不定胚を誘導することができる。不定胚形成能を有する EC の維持、増殖にはオーキシンが必要であるが、EC から不定胚を誘導する際にはオーキシン除去操作が必ࢪとなっている。オーキシン除去により初めて EC から不定胚が形成されるのである。私はこのオーキシン除去操作という点に注目した。オーキシン除去により不定胚形成に関与する̰伝子が発現上昇すると考え、オーキシン除去により一過的に発現上昇する̰伝子の単離を݄みた。

オーキシン除去により一過的に発現上昇する̰伝子の単離不定胚形成に関与する̰伝子を単離するために、オーキシンを除去した培地で 6 時間培養した EC(不定胚形成開始直後)とオーキシン存在下で培養している EC から cDNAを作製し、サブトラクションを行った（オーキシン除去培地培養 ECマイナスオーキシン含有培地培養 EC）。この結果不定胚形成開始直後に特異的に発現している̰伝子を濃縮したサブトラクションライブラリーを得た。この作成したサブトラクションラ
イブラリー中から 417 クローン選抜し、塩基配列を決定した。決定した塩基配列をもとに相同検索を用いて、その推定される機能を得た。推定される機能が不定胚形成に関与していると考えられるクローンについては RT-PCR 法、ノザン法を用いてその発現
パ タ ー ン を Ϻ 析 し た 。 そ の 結 果 オ ー キ シ ン 除 去 に よ り 一 過 的 に 発 現 上 昇 す る C-ESE1(CarrotEarlySomaticEmbryogenesis1)の単離に成功した。

C-ESE1 の発現パターン
C-ESE1 はオーキシン除去後 8 時間でその発現量は最大となり、オーキシン除去後 24時間目までは‫ټ‬発現を維持したが、その後発現は減少に転じ、球状胚、心臓型胚、ԝ雷型胚での発現は認められなかった（図３a）。また体細胞である実生や花芽における2

C-ESE1 の発現を観察したところその発現は認められなかった（図３b）。

次に EC の培養過程においてオーキシン除去操作を行っても決して不定胚に発達することの出来ない non-embryogenic cells(NC)を得ることが出来る。この NC において C-ESE1 の発現を確認したところ不定胚形成能を喪失した NC においては C-ESE1 の発現は観察されなかった（図４）。これらの結果より C-ESE1 が不定胚形成能力を有する細胞に特異的に発現していると考えられた。さらに C-ESE1 の発現が不定胚形成能の‫ټ‬い細胞において特異的に発現していることを確かめるために、以下の 2 つの実験を行った。(1)オーキシン除去によりすべての EC から不定胚が誘導するわけでなく、EC の大きさによって不定胚形成効率が大きく異なることが知られている。そこで EC を小（37μm−63μm）、中（63μm−1mm）、大（1mm 以上）と分別し、不定胚形成効率と C-ESE1 の発現比йを行った（図５）。その結果 C-ESE1 は不定胚形成効率の‫ټ‬い小さな細胞塊で強く発現しており、不定胚形成効率の低い大きな細胞での発現はఏ常に弱かった。またその発現はオーキシンの除去により促進されることが分かった。(2)EC からの不定胚形成においては、その不定胚形成は表面の細胞に特定されていることが明らかとなっている。そこで C-ESE1 の EC における発現౮位を in situ ハイブリダイゼーション法にて決定することとした（図６）。その結果、C-ESE1 の発現は不定胚が形成される表面の細胞に特異的に発現していた。以上の 2 つの実験により C-ESE1 は不定胚形成能のある細胞に特異的に発現している事が確かめられ、C-ESE1 は不定胚形成に関与しているこが示唆された。

C-ESE1 の機能Ϻ析
次に C-ESE1 の全੝配列を単離し、コンピューターによる機能予測を行うと共に、C-ESE1 の発現を抑制することで C-ESE1 の生体内での機能を明らかにすることとした。
C-ESE1 は全੝ 1523 塩基を含み、推定アミノ酸残基は 443 残基であった。推定タンパク‫ݵ‬の予想される分子量は 48.73KDa であった。この推定アミノ酸中には複数の細胞を架橋し、細胞接着に関与すると考えられている agglutinin domain が存在していた（図７）。またタンパク‫ ݵ‬C-ESE1 には二つの膜貫通ドメインの存在が予想され、細胞接着に関与すると考えられる agglutinin domain が細胞外に配向するように膜中に挿入されると予想された。この予想された機能を実証するために C-ESE1 の発現が低下した形‫ݵ‬転換体を作成した。C-ESE1 の発現低下は継代培養を行った細胞においても安定に観察されたことより、C-ESE1 の発現低下が EC の表現型に及ぼす影Ձを観察した（図８a）。
まずオーキシンを含んだ培地で培養した EC における形態変化を観察した。その結果、コントロール細胞では 1mm 以上の細胞塊を含む不ӎ則なサイズの細胞塊を形成した。

3

一方、C-ESE1 の発現が低下した形‫ݵ‬転換体 EC ではその細胞塊は 63μm-1mm 径とサイズが小さくなるとともに、球形の細胞塊を形成していることが観察された。C-ESE1 発現抑制 EC の表現型と予想される機能から C-ESE1 の発現抑制によって細胞接着が弱まっているのではないかと考え、細胞塊を固定後、切片を作成し、透過型ે子顕微Հを用いた細胞微細構造の観察を行った（図８b）。その結果コントロール EC では各々の細胞が密に接着し、細胞塊を形成しているのに対して C-ESE1 発現抑制 EC では著しい細胞間隙が観察された。この形‫ݵ‬転換 EC の観察から細胞塊の形成には、積極的に細胞接着を維持する機構が存在することを示唆しているとともに、C-ESE1 が細胞接着に関与する分子であることが示唆された。

不定胚形成時における C-ESE1 の影Ձ

C-ESE1 の発現抑制によって EC の細胞塊構造に変化が認められた。そのため C-ESE1発現抑制 EC をオーキシンを含まない培地に移植し、不定胚形成時における C-ESE1 の役割を明らかにすることを݄みた。その結果、C-ESE1 発現抑制 EC からの不定胚形成はコントロール EC に比べて明らかにਟれが見られた（図９）。球状胚の形成に 10 日程度のਟれが観察された。しかしながら C-ESE1 発現抑制 EC からの不定胚誘導の進行（球状胚の形成）には明らかなਟれが観察されたものの、その不定胚の形態には異常が見られず、コントロール EC から誘導した不定胚と同様の形態を示した（図９）。また最終的に形成された不定胚頻度にも影Ձは見られなかった。以上の実験結果より C-ESE1は不定胚形成初期において重要な役割を担っていることが示唆された。

C-ESE1 と細胞接着
C-ESE1 は細胞接着を通じて不定胚形成初期に関与している事が明らかとなった。そこで C-ESE1 による細胞接着機構メカニズムを明らかにすることとした。特に細胞の表面構造ならびに細胞壁を構成する多等ะ成分の分析を行った。C-ESE1 発現抑制 EC の細胞表面構造を走査型ે子顕微Հを用いて観察した（図 10a）。コントロール EC の細胞表面が突ӑ状構造に覆われているのに対し、C-ESE1 発現抑制 EC の表面は滑らかであった。このことから C-ESE1 は細胞表面の突ӑ状構造形成に関与していることが明らかとなった。また C-ESE1 アミノ酸配列中には多糖ะが結合し、細胞接着に関与していると考えられている agglutinin domain が存在することから、この突ӑ状構造は多糖ะで構成されていると予想された。そこでこの突ӑ状構造の組成を明らかとすることを目的に、多糖ะを特異的に染色する PATAg (periodic acid-thiocarbohydrazidesilverproteinate)により突ӑ状構造が染色されるかを検討した（図 10b）。その結果

4

C-ESE1 により形成される細胞表面上の突ӑ状構造は PATAg に特異的に染色され、その組成は多糖ะで構成されていることが分かった。これらのことより、 C-ESE1 は細胞表面上に存在する多糖ะで構成された突ӑ状構造を介して細胞接着に関与している事が明らかとなった。
次に C-ESE1 発現抑制により細胞表面上の突ӑ状構造を構成する多糖ะが培地中へ分泌する可能性について検討する事とした。コントロール EC ならびに C-ESE1 発現抑制
EC をオーキシン含有培地で 2 週間培養後、培養液を回収し同培地中における多糖ะ成分の分析を行った。まず、回収した多糖成分を HPLC により分子量分布分析したところコントロール培地から回収した多糖の平均分子量が 10 万であるのに対して、 C-ESE1発現抑制 EC 培地から回収した多糖では 4 万-10 万と幅広い分子量を示した。次に回収した多糖成分の組成を分析した（Table 1）。C-ESE1 発現抑制 EC の培地からはアラビノース、キシロースそしてフコースをより多く含む多糖ะが培地中に分泌されていることが分かった。特にアラビノースとキシロースの絶対量の増加は大きかった。一方、マンノースとガラクトースを含む成分の分泌はわずかに多いのみであった。ウロン酸とグルコースの分泌量変化はそれ程認められず、ラムノースの分泌量については減少していた。これらのことより C-ESE1 発現抑制 EC ではその培地にアラビノース、キシロース残基を多く含む多糖ะが分泌されていることが明らかとなった。この多糖ะ成分が突ӑ状構造を構成していたものと同一であるかは不明であるが、同一である可能性は‫ټ‬いと考えられる。

結論
本研究により次のことが明らかとなった。（１）不定胚形成開始直後の細胞にのみ特異的に発現する C-ESE1 を単離した。
（２）単離した C-ESE1 は細胞表面上に存在する多糖ะで構成された突ӑ状構造形成に関与していた。（３）この突ӑ状構造を介して C-ESE1 は細胞接着に関与していた。（４）そして C-ESE1 は不定胚形成初期に関与する事が示唆された。これらの実験結果は不定胚形成初期には細胞接着による積極的な細胞塊形成が必要である事を示した。そして不定胚形成メカニズムには、細胞接着がその一端を担っている事を明らかとしたことで、不定胚形成機構の生物学的疑問、産業上の技術革新に貢献できたと考えられる。

‫މ‬辞本研究を行うにあたり実際に指導して下さった京૖大学大学院生命科学研究科佐藤文彦教授に感‫މ‬いたします。京૖大学生存圏研究所の竹内美子博士、京૖大学大学院

5農学研究科藤田稔教授にはે子顕微Հの技術を教えて頂き、糖成分の分析には京૖大学大学院農学研究科東順一教授より助‫׼‬を頂き感‫މ‬します。また筑波大学大学院生物科学系џ田博教授には不定胚全般の知見を助‫׼‬頂き感‫މ‬いたします。

参考文献
Takahata, k., Takeuchi, M., Fujita, M., Azuma, J., Kamada, H. and Sato, F.
Isolationofputativeglycoproteingenefromearlysomaticembryoofcarrotanditspossibleinvolvementinsomaticembryodevelopment. PlantCellPhysiol.45:
1658-1668,2004

6種子胚形成
休眠後発芽

受精卵
種皮

球状胚 心臓型胚

魚雷型胚

脱分化細胞
Bar=50 µm

体細胞

不定胚形成 (受精、休眠が行われない。)
図１

種子胚形成と不定胚形成

1〜２ヵ月

オーキシン含有培地

オーキシン含有培地

胚軸
オーキシン含有培地

EC (Embryogenic Cells)

MS +2,4-DEC

不定胚1mmオーキシン除去培地

2週間63μm37μm

図２

ニンジンからの不定胚誘導

C-ESE1rRNA
48122448(h)

胚型
雷魚胚型
臓心胚状球

0オーキシン含有培地 オーキシン除去培地

Total RNA 10 µg

図３a C-ESE1の不定胚における発現

C-ESE1

rRNA

芽シ

花

生

実キーシキー(オ(オECEC)
8h去除ン)
有含ン

Total RNA 10 µg

図３b 体細胞におけるC-ESE1の発現オーキシン含有

オーキシン除去

C-ESE1rRNAECECNCNC(オ(オ(オ(オーーーーキキキキシシシシンンンン
含除含除有去有去)8h)8h))図４ オーキシン有無におけるNCでのC-ESE1の発現

オーキシン含有高不定胚形成効率

不定胚形成効率37μm - 63μm 63μm -1mm Over 1mm+++低高Total RNA 10 µg---C-ESE1
オーキシン除去rRNA-+

オーキシン除去8時間目
オーキシン含有8時間目

図５ 細胞塊サイズとC-ESE1の発現

Total RNA 15 µg

低C-ESE1 sense

C-ESE1 antisense
図６

Bar=100 µm

C-ESE1の発現部位をin situ ハイブリダイゼーション法にて解析した。

Agglutinin domain
SE
S
H
R
N
GM
R

NH2 M

P
S

Membrane

I
F

I

S
A

VCytosol

図７VFL
LISA
A
N
A
TF
KY
TNT
SSIL
S
II

VTVNSCQPPEAIYEGLEGIVEYDTLATFFRMRWVWDGAVPKARNRETQSSGVE L L G A N N W S Q L L D MK N A T N T L V F G V R V VA G D E K L V F D V S S E YT D V W D L L K H L S V A S
L T D A V E I G P L G I S YT G G V V L D K T T A K D PF
DGRNSTL223 a.a.

GALNQVAYA IV KH MS SA KN

COOH

LFTP

YQ

FF

PA S

L
TRY

PRIMARY HELIXSECONDARY HELIX

予想されるC-ESE1の膜貫通ドメインとagglutinin domain

C-ESE1発現抑制EC

図８aControl EC

Bar=1 mm

形質転換体ECの実体顕微鏡像

C-ESE1発現抑制EC

Control EC
NU, 核；SG, デンプン粒；VA, 液泡
Bar=5 µm

図８b

形質転換体ECの透過型電子顕微鏡像

誘導後２５日目
C-ESE1発現抑制EC

C-ESE1発現抑制EC

Control EC

Bar=2 cm

Control EC Bar=0.2 mm

図9 形質転換体ECからの不定胚誘導

C-ESE1発現抑制EC

図10aControl EC

Bar=5μm

形質転換体ECの走査型電子顕微鏡による細胞表面観察

PATAg
negative control
C-ESE1発現抑制EC

Control EC

PATAg染色PATAg法 : 糖を特異的に染色する。

Uranyl acetate,
Reynold's
lead citrate 染色Bar=1μm

図10b 形質転換体ECにおけるPATAg法による細胞表面上の突起状構造の染色Table 1 C-ESE1発現抑制ECとコントロールECの培養後、濾過により回収された培地中の多糖成分の組成

糖含有量, µg/100ml 培地

糖残基

C-ESE1-a

コントロール培地 +/-SD 発現抑制培地 +/-SD%

Arabinose

1281 +/- 209

2636 +/- 653

206

Xylose483 +/- 52

823 +/ - 94

171

Fucose71 +/- 19

115 +/- 34

161

Mannose185 +/- 36

245 +/- 29

133

Galactose

2343 +/- 264

2960 +/- 475

126

Uronic acid1392 +/- 162

1449 +/- 151

104

Glucose333 +/- 28

310 +/- 92

93

Rhamnose

126 +/-1898 +/- 3064SDは少なくとも３回の独立した実験から算出した。
a％（C-ESE1発現抑制ECの培養培地における糖含量／コントロールECの培養培地における糖含量）
オーキシンを含む培地でECを２週間培養し、その培養培地を分析に用いた。それぞれ約3.0gの細胞を移植し、２週間後に約5.5gの細胞を得た。