フジテレビジョン賞

細胞機能を維持するペルオキシソームの分裂装置（リング）の発見〜ゲノム科学が拓く、ナノ構造の分裂装置が制御する単膜系オルガネラ増殖分子機構解明〜

東京大学大学院

新領域創成科学研究科
博士課程 3 年

井元 祐太

先端生命科学専攻

1 ．緒

言ほとんどの真核生物は 1 個の受精卵が細胞分裂を繰り返し形成されたものであり、ヒトでは約 60 兆個の細胞から構成されている。生命の基本単位である一つの細胞内は、遺伝情報の保存と伝達を担う細胞核に加え、重要な細胞活動を担う、DNA を含む二重膜に包まれた 2 種の複膜系オルガネラ（ミトコンドリア、葉緑体（植物のみ））と、DNA を含まない単膜に包まれた4種の単膜系オルガネラ（ゴ
図１ 真核細胞の基本構造
ルジ体、小胞体（ER）、リソソーム、ペルオキシソーム）から構築されている（図1）。細胞機能の中心は、生命維持と運動エネルギー生産を担う複膜系のミトコン
ドリア、葉緑体と単膜系のペルオキシソームである。これらのオルガネラは分裂増殖し［1, 2］、20 億年前の真核細胞誕生以来、今日まで細胞分裂の際に娘細胞へと受け継がれてきたと考えられている。ミトコンドリアと葉緑体に関しては分裂装置（リング）である Mitochondrialdividing（MD）machinery 及び Plastiddividing（PD）machinery の構造が発見され、分裂の分子機構が明らかになって
図２ ミトコンドリア、葉緑体の分裂装置
きた（図 2）［3-7］。
バクテリア由来である FtsZ リングが、分裂初期に内一方で DNA を含まない単膜系オルガ膜の内側に形成される。MD、PD リングは電子密度ネラのペルオキシソームの分裂機構につの高い構造体として観察され、外膜の内側（図では省いては研究が少なく全く明らかでなかっ略）と外側に形成される。ダイナミン Dnm1（葉緑体た。
ペルオキシソームの基本的な機能は、 の場合は Dnm2）分子が MD ring（葉緑体の場合は PD
生物の 3 大栄養素の一つである脂質の代ring）の繊維間で滑り込み運動を行うことにより装置謝や生命活動の際に必ず生じる有害な活は収縮し包膜の収縮が行われる。分裂の最終段階であ性酸素の除去である［8］。さらに、ヒト
る膜の分断にはダイナミンが機能する。などの高等動物では、脳の神経細胞膜を構成し、その根本的な機能を制御しているプラスマローゲンの合成を行う。また、陸上植物
では種子の発芽に必要なエネルギーを供給し、菌類ではペニシリンなどの抗生物質の合成に関与するなど、ペルオキシソームは地球上のすべての生物の生存を支えている重要なオルガネラである［9］。その分裂障害はペルオキシソーム病などの重篤な疾患や代謝異常、アルツハイマー型認知症と関係していることから、Rhodin や De Duve らによって 1967 年にペルオキシソームが発見されて以来［10, 11］、数多くのモデル生物を使って分裂に関する研究が― 20 ―

盛んに行われてきた。
しかし、ヒトなど高等動植物の細胞では、1 個の細胞当たりにペルオキシソームが数百から数千あり、大きさも小さく、しかもそれらがランダムに増えるため（図 3A）、遺伝学的な解析に留まっていた。
そのため、ペルオキシソームの分裂機構、特に分裂の中心的役割を担う分裂装置の構造は半世紀に渡って全くの未知であり、その全貌解明は急務の課題であった。

図３

ヒトとシゾンの細胞構造Ａ

ヒトの細胞におけるペルオキシソーム（赤）と細胞核（青）の位相差蛍光像
Ｂ シゾンのペルオキシソーム、及び他のオルガネラの位相差免疫
蛍光像
Ｃ シゾンの細胞構造のモデル
シゾンは単一の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体（色素体）、ペルオキシソーム、ER、ゴルジ体、2 〜3 個のリソソームを含む。DAPI :DNA 染色像、CN：Cell nucleus、MN : Mitochondrial nucleus、PN: Plastid（chloroplast）nucleus、ER : Endoplasmic reticulum、Scalebars ＝ 1μm.

そこで、著者らは Cyanidioschyzon merolae（ シ ゾ ン ）に 着 目 し た。 シ ゾ ン は 高 温（45 ℃）、強酸性（pH1.5-2.5）の極限環境に生息する原始紅藻で、1）一細胞あたりに一つのペルオキシソームを含み（図 3B、C）、2）光明暗周期によってオルガネラの分裂を同調化でき、3）細胞壁が未発達なためオルガネラの単離が容易であるなど、本研究を進めるのに極めて有利な特徴を持っていた。また、ゲノムが完全解読されており、タンパク質遺伝子数は 4775 個と非常に少ないため質量分析機（MALDI-TOFMS）によるタンパク質の同定が容易である。増殖など基本現象に関わる重要な遺伝子はヒトやイネなどの高等動植物にまで保存されており、真核生物の「基」となるモデル生物であった［12, 13］。
本研究の目的は、ペルオキシソーム分裂装置の構造を同定し、その動作機構を解明することであった。
著者らは、上記のシゾンが持つシンプルな生物学的特徴を最大限に利用し、以下のことを明らかにした。
（1）分裂期ペルオキシソームの単離技術を開発し、MALDI-TOF MS とゲノム情報によってナノサイズのリング構造であるペルオキシソーム分裂装置 Peroxisome-dividing（POD）machinery を世界で初めて発見した。（2）分裂期ペルオキシソームから、invivo の状態を保ったまま POD machinery を単離することに成功した。その微細構造を解析した結果、装置の正体はダイナミン Dnm1 を含む糸状構造 Dynamin-based（DB）ring と、その内側に形成され、装置の骨格となる繊維構造 Filamentous（F）ring の二重構造であった。
（3）
POD machinery の機械的仕組みを調べるために、DB ring と F ring を人工的に乖離、分岐させ、微細構造をホールマウント免疫電子顕微鏡法・ネガティブ染色法によって解析した。

― 21 ―

装置の収縮力発生機構は F ring ではなく DB ring に備わっていることが分かった。（4）DBring による収縮力発生には、その糸状構造に含まれるダイナミン Dnm1分子が必須であった。
（5）ペルオキシソーム分裂の前半（分裂面の収縮）では DB ring が発揮する収縮力が内側の Fring に伝わり装置を収縮させ、後半（包膜の分断）では F ring が分解され DB ring がペルオキシソーム膜へ直接作用して膜分断を行う。このような POD machinery による 2 段階での制御によって、ペルオキシソームの分裂が行われていることが明らかになった［14］。

2 ．材料と方法（1） ペルオキシソームの大量高度分裂同調培養系の開発
12 時間明暗周期で同調培養を行ったシゾンのペルオキシソームの分裂過程を、免疫蛍光顕微鏡法によって調べた結果、葉緑体とミトコンドリアの分裂後に、ペルオキシソームが 2 分裂することが分かった（図4）。しかし、この期間は非常に短く、ペルオキシソームの分裂同調率が 2% 未満と極めて低かった。そこで阻害剤を用いた同調を検討した。図 4 に示したように、分裂期のペルオキシソームは両端が娘ミトコンドリアと物理的に結合している［15, 16］。娘ミトコンドリアの娘細胞への分配とペルオキシソームの分裂は協調的に進む。娘ミトコンドリアの分配は微小管の働きによって行われるため［17, 18］、微小管重合阻害剤であるオリザリンで細胞を処理することで、ペルオキシソームの分裂速度を著しく遅延させることが可能となった［18］。結果として、光の明暗とオリザリンを用いた系により、ペルオキシソームの分裂同調率が約 40% まで上昇している細胞培養液を得ることができるようになった。

図４ 細胞周期におけるペルオキシソームとミトコンドリアの位相差免疫蛍光染色像と分裂過程のモデル
PC : 位相差像、Mito : ミトコンドリア、Po : ペルオキシソーム、Nu : 細胞核、Chl : 葉緑体、Sp : 紡
錘体極、MTs : 微小管、Scale bar ＝ 1μm.

（2）分裂期ペルオキシソーム単離法の開発
この大量高度分裂同調培養系を用いてペルオキシソームを分裂期に同調させたシゾン培養液から、分裂期ペルオキシソームをミトコンドリアと葉緑体との複合体として単離した（図5A）。この複合体の画分に対して、低調処理と低濃度の非イオン性活性剤による処理で、ミトコンドリアと葉緑体を選択的に破砕・乖離した画分を得た。これを遠心操作によって純化し、ペルオキシソームのみを含む画分を得ることに成功した（図 5B）。ペルオキシソームのマーカーである、抗カタラーゼ抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡法によって、この画分を観察し― 22 ―たところ、分裂時の形態を保ったまま無傷に単離されていることが分かった（図 5C）。
（3） ホールマウント免疫電子顕微鏡法・ネ
ガティブ染色法による POD machinery の超微細構造の動作機構解析
単離した POD machinery に抗 Dnm1 抗体
を 結 合 さ せ、 次 に そ れ ら に 金 粒 子（ 直 径15nm）を 含 む 抗 体 を 反 応 さ せ た。SDS とUrea を微量含んだ溶媒を考案し、これによって POD machinery を 処 理 し DB ring と Fring を乖離・分岐させることが出来た。これをニッケルメッシュにマウントし脱水した
のち、高い分解能が得られるネガティブ染色法を行い透過型電子顕微鏡によって微細構造を観察した。

図５

単離された分裂期ペルオキシソーム

PC : 位相差像、Mito : ミトコンドリア、Po : ペルオキシソーム、Scale bar ＝ 1μm.

3 ．結果・議論（1）ペルオキシソーム分裂装置の同定
2 章で述べたペルオキシソームの大量高度分裂同調培養と単離法に基づき、分裂期ペルオキシソームを大量に単離した。MALDI-TOF MS によって解析した結果、カタラーゼ等と共にダイナミン Dnm1 が含まれていることが分かった。Dnm1 は、MD machinery の構成タンパク質として知られている［19］。しかしイムノブロット解析によっても、Dnm1 はミトコンドリアを含む画分に加え、分裂期ペルオキシソーム画分にも非常に濃縮されていることが分かった。一方、Mda1 や FtsZ1 、FtsZ2 、Dnm2 といったミトコンドリア、葉緑体分裂タンパク質はペルオキシソーム画分に含まれておらず、Dnm1 のみがミトコンドリア分裂に加えて、ペルオキシソーム分裂にも関与することが予測された。
そこで、免疫蛍光染色法により Dnm1 の局在解析を行った。その結果、Dnm1 はミトコン
ドリア分裂後に細胞質に複数の点状の局在として観察され、その後ペルオキシソームの分裂面に集められ局在することが分かった（図 6）。また、Dnm1 が局在していたペルオキシソー
ム分裂面を超薄切片の透過電子顕微鏡観察によって解析したところ、分裂面には電子密度の高い構造体が形成されていることが明らかになった。分裂面に対して平行に近い角度の切片
では、直径約 200nm のリング状構造の存在が明らかになった（図 7）［14, 20］。この構造の正体を明らかにするため、単離した分裂期ペルオキシソームの免疫蛍光、及びホールマウント
免疫電子顕微鏡解析を行った。その結果、分裂面に Dnm1 の局在が保たれたままペルオキシソームは単離されており（図 8A）、Dnm1 でラベルした金粒子は分裂面の構造に集中していることが分かった（図 8B）。膜を低濃度の界面活性剤で部分的に溶解したところ、直径約300nm のリング状構造体 POD machinery を得ることに成功した（図 9）。

― 23 ―

図６ Dnm1 の分裂期ペルオキシソームにおける局在
PC : 位相差像、Po : ペルオキシソーム、Enlarged : Merge 像の拡大、Bars : 1μm.

図７ 分裂期ペルオキシソーム超薄切片
TEM 像
Ａ

分裂面に対して垂直方向の切片像との拡大像
Ｂ 分裂面に対して平行方向の切片像
黄矢印：分裂面に形成される高電子密度構
造体、Bar ＝ 50nm（A）、200nm（B）.

図８ 単離された分裂期ペルオキシソームにおける Dnm1 の局在Ａ 免疫蛍光像Ｂ 免疫電子顕微鏡像と分裂面の拡大像
PC : 位相差、Po : ペルオキシソーム、15nm 金粒子: Dnm1 、Bar ＝ 1μm（A）、100nm（B）.

図９ 膜を部分的に溶解した単離分裂期ペルオ
キシソームの電子顕微鏡像
Ａペルオキシソーム包膜とリング状構造体の電子顕微鏡像
BA 赤枠拡大像 リング周辺に抗 Dnm1 抗体でラベルされた 15nm 金粒子が局在している。
CA 白枠拡大像 膜の溶け残り部分に抗カタラーゼ抗体でラベルされた 10nm 金粒子が局在している。
Bars ＝ 200nm（A）、50nm（B and C）.

― 24 ―

（2） ペルオキシソーム分裂装置の単離と微細構造解析
前節で得られたリング状の装置 POD
machinery の動作機構を明らかにするため、それを単離し装置の微細構造を明らかにする必要があった。そこで
次に、微量の界面活性剤処理を短時間行うことで、膜を完全に溶解し PODmachinery を純化した。純化された
POD machinery は位相差では微かに観察され、免疫蛍光染色ではリング状に沿って Dnm1 が局在した（図 10A）。
POD machinery は、Mda1 や FtsZ1 、PDR1 といった既知のミトコンドリアや葉緑体分裂タンパク質では染色されなかった。また、純化された PODmachinery の画分は分裂期ペルオキシソーム画分に比べ MALDI-TOF MSで検出される Dnm1 のバンドが濃くなっていた（図 10B）。よって、in vivoの状態を反映した POD machinery が単離されていることが明らかとなった。抗 Dnm1 抗体で染色された POD
machinery のリング幅は直径が小さくなるほど太くなり、Dnm1 の蛍光輝度の総量は直径に関わらず一定であった（図 10C）。従って、POD machineryの収縮過程を通して Dnm1 は分解されずに常に一定量含まれていると考えられる。そのため POD machinery はDnm1 のみで構成される装置であると考えられた。しかし、ホールマウン
ト免疫電子顕微鏡法によって微細構造の解析を行ったところ、抗 Dnm1
抗 体 で ラ ベ ル さ れ た 金 粒 子 は POD
machinery の繊維から約 20nm の距離に局在し（図 11A）、リングは部分的に乖離し易く、Dnm1 を含む糸状構造のdynamin-based（DB）ring と、その内側に形成されている Dnm1 を含まない繊維状構造の Filamentous（F）ring

図 10

単離された POD machineryＡ
Ｂ

POD machinery の免疫蛍光像
POD machinery の 純 度 検 定 分 裂 期 ペ ル オ キ シ
ソーム画分（左）と POD machinery 画分（右）の SDS
PAGE。
Ｃ 抗 Dnm1 抗体で染色された POD machinery の直径に対するリング幅と Dnm1 蛍光輝度の総量との相関
PC：位相差、Po：ペルオキシソーム、Bar ＝ 500nm

図 11

POD machinery の免疫電子顕微鏡像

Ａ 単離した POD machinery と一部の拡大像
Ｂ 乖離した DB ring と Filamentous ring
黄色矢印：15nm 金粒子：Dnm1 、Bars ＝ 200nm（A）、50nm（A 拡大像、B）― 25 ―

が存在することが分かった（図 11B）。以上の結果から、POD machinery の正体は DB ringと F ring の 2 重構造から成る複合装置であることが明らかになった。
（4）POD machinery の収縮機構解析
前節において、POD machinery が DBring と F ring の二重構造であることが明らかとなったが、ではどちらの構造が装置の収縮力を発生させているのだろうか。そこで 0.2% SDS と 20mM Urea を含む溶媒によって POD machinery を一定時間処理し人工的に DB ring と F ring を強く乖離させ、2種類の構造を分岐させた。
その結果、分岐させた DB ring の先端部位は F ring側に向かって渦巻き状に構造変化を起こすことが分かった。一方、F ring は構造変化せず、直線状に伸びた構造を示すことが分かった。
（図 12A）。よって、DB ring が収縮力の発生に重要であると考えられる。
この結果は、アンチセンス法を用いて DBring に含まれていた Dnm1 を発現抑制することによっても検証された。Dnm1 発現抑制下では Dnm1 で染色される DB ringは分裂面に形成されなかった（図 12B）。このとき、ペルオキシソームの収縮は阻害され、肥大したペルオキシソームも見られた（図 12C）。以上の結果から、POD machinery の収縮力を発生させているのは F ring
ではなく、ダイナミン Dnm1 を含んだ DBring であることが分かった。

図 12

DB ring の機能解析Ａ分岐させた DB ring（黄色矢印）の構造変化（赤矢印）と F ring（白矢印）、分岐点（青矢印）。
Ｂ Dnm1 発現抑制下におけるダイナミンの局在。
Ｃ Dnm1 発現抑制下におけるペルオキシソームの直径。
15nm 金粒子：Dnm1、Scale bars＝50nm（A）、1μm（B）

そこで、POD machinery の収縮機構をさらに検討するために、装置の動作機構が明らかにされている PD machinery や MD machinery（図 13A）との比較を行った。DB ring に含まれていたダイナミン Dnm1 は、直径に関わらず、リング外周から 20 〜30nm の距離に局在した（図 13B）
。一方、Dnm1 のホモログであり PD machinery に含まれるダイナミン Dnm2 はリングの繊維構造と密着しており、収縮が進むと一部は繊維の内側へ局在していた（図13B）。これは、PD machinery では繊維間で Dnm2 分子が滑り込み運動を行いリングが収縮力を発揮するためであると考えられる［21］。MD machinery も同様の収縮機構であることが示唆されている［19］。従って、POD machinery は PD、MD machinery とは異なり、ダイナミン Dnm1 を含む DB ring が外側からの力によって収縮力を発揮する構造である。Fring と DB ring を人工的に乖離、分岐させた際に、DB ring が F ring 側向きに渦巻き構造となったのはそのためと考えられる。恐らくペルオキシソーム分裂の前半には、DB ring は― 26 ―

図 13

単離された POD、PD、MD machinery の比較

ＡPOD（15nm 金粒子（黄矢印）：Dnm1）、PD（15nm 金粒子：Dnm2）、MD（15nm金粒子：Dnm1 、10nm 金粒子：Mda1）machinery の構造比較
Ｂ POD machinery 及び PD machinery の直径に対するリングの外周からのダイナミン金粒子の距離の相関
Scale bar ＝ 200nm

強い力を内側に形成される F ring へ伝え絞り込んでいるのであろう。
そこで次に、F ring の収縮過程を明らかにするため、PD machinery の構造との比較を行った。F ring は部分的に幅 4nm 程の繊維断片を含む（図 14A）。PD machinery には装置の骨格となる幅 7nm の繊維束が含まれていることが知られているため［7, 22］、F ring と PDmachinery は部分的に類似した構造を持つと考えられる。恐らく F ring は POD machineryの骨格となるものであろう。F ring と PD machinery それぞれの、直径に対するリング幅の相関を調べたところ、F ring は直径に関わらず繊維束の幅は約 30nm と一定であった（図14B）。一方、PD machinery は繊維の分解を伴わず収縮するため［23］、単離されたリングは直径が小さくなるほど幅は太くなり、最大で約 100nm まで太くなることが示された（図14B）。従って F ring の収縮には繊維の分解を伴うと考えられる。直径 50nm 以下の PODmachinery では DB ring のみが観察されたため、内側の F ring の分解によって DB ring に含まれるダイナミン分子がペルオキシソーム膜に直接結合し、膜のくびり切りを行うと考えられる。
図 14Ａ

F ring の動態解析

POD machinery の F ring に含まれる繊維断片（白枠）の電子顕微鏡像とその拡大像
Ｂ F ring と PD machinery の直径に対するリング幅の相関。
Scale bars ＝200nm（A）、10nm（A拡大像）― 27 ―

4 ．まとめと今後の展望
本研究によって単膜系オルガネラであるペルオキシソームの分裂装置が DB ring と Fring の 2 本のリングから成る超分子ナノマシン POD machinery であることが遂に明らかになった。単膜系オルガネラにおいて分裂装置の構造を発見しその機能を明らかにしたのは本研究が最初であり、その意義は極めて大きいと考えられる。本研究によって以下のことが明らかになった。
（1）POD machinery は DB ring と F ring から構成されていた。
（2）PODmachinery の機械的仕組みを調べるために、DB ring と F ring を人工的に乖離・分岐させる方法を開発し、ホールマウント免疫電子顕微鏡法・ネガティブ染色法を使って 1 個のPOD machinery を対象とした解析を行った。DB ring は F ring から分岐すると、渦巻き状の構造変化を起こし、一方で F ring は直線状に伸びた構造となっていた。Dnm1 の発現抑制によっても検証され、Dnm1 を含む DB ring が POD machinery の収縮力を持つことが分かった。
（3）DB ring と F ring の超微細構造を解析した結果、（i）DB ring によって発揮される収縮力が F ring に伝わり、F ring が少しずつ分解を伴いながら収縮することで分裂面の収縮が進行し、（ii）F ring の分解によって DB ring が包膜へ直接作用することで膜分断を行う。このように分子レベルで制御されて機能する、超分子ナノマシン POD machinery を使って単膜系オルガネラ、ペルオキシソームの分裂が行われることが明らかになった。（図 15）［14］。
今後の展開としては、今回 POD machinery の構造同定および単離法を開発したことによって、質量分析装置を用いた POD machinery の構成タンパク質の同定、さらにその機能解析が可能となったため、シゾンの全ゲノムが解読されている点を生かし、MALDI-TOF
MS による POD machinery のプロテオーム解析を進め、分裂装置の全機能形成の仕組みを明らかにすることを目指す。さらに、シゾンは高温環境に生息しており、タンパク質は熱に

図 15

POD machinery によるペルオキシソーム分裂モデル

POD machinery は収縮力を生み出す DB ring と装置の骨格となる F ring の二重構造から成る。ペ
ルオキシソーム分裂期には、1）DB ring と F ring による収縮、と 2）
DB ring によるペルオキシソー
ム胞膜のくびり切り、という二段階の収縮力発生機構が考えられる。

― 28 ―

安定性が高く、結晶構造解析に有利である。そこで原子分解能での POD machinery の高次構造の解明を目指す。
また、POD machinery に含まれていた Dnm1 ホモログは、オルガネラ分裂、細胞質分裂、小胞の形成等、いずれも膜分断に機能している［24, 25］。よって、POD machinery と同様の分裂装置が他の膜系にも存在している可能性があり、DNA を含んだ細胞核とミトコンドリ
ア、葉緑体の増殖のみならず、単膜系の 4 種のオルガネラの増殖機構の解明への発展が期待される［26-28］。脳の神経伝達に関わる小胞形成におけるエンドサイトーシスによる膜分断にも、POD machinery と類似した高電子密度の構造体が形成されることが分かっている［29］。そこで、今回開発した POD machinery 単離技術などを、脳の神経伝達機構の解明へ応用することを計画している。
さらに応用的側面として、ペルオキシソーム分裂を制御することによって医療への取り組みを考えている。ペルオキシソームの形成増殖障害は、その代謝産物の低下を引き起こし、その結果様々な疾患を引き起こすことが知られている。例えばアルツハイマー型認知症の原因として、ペルオキシソームにより合成され、神経細胞の形成維持に必須なリン脂質プラスマローゲンの代謝量低下が挙げられる［30］。よって POD machinery のプロテオミクスなどでペルオキシソーム分裂遺伝子を明らかにすることで、ペルオキシソーム増殖異常疾患の病因遺伝子の解明と治療への発展が期待される。

謝辞

本研究を遂行するにあたり，終始熱心なご指導を賜りました東京大学の河野重行教授と立教大学の黒岩常祥教授に深く感謝いたします。また、この研究を進める上でお世話になった
黒岩晴子博士（立教大学）、大沼みお博士（立教大学）、吉田大和博士（ミシガン州立大学）、藤原崇之博士（国立遺伝学研究所）、吉田昌樹博士（筑波大学）、西田敬二博士（神戸大学）、八木沢芙美博士（カルフォルニア大学）、三角修己博士（山口大学）、宮城島進也博士（国立遺伝学研究所）、廣岡俊亮博士（国立遺伝学研究所）に感謝いたします。

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