The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.4 2016

総

BIOFILM FORMATION AND PATHOGEN FROM BOVINE CLINICAL MASTITIS

説

臨床型乳房炎由来菌のバイオフィルム形成能の検出と病原性の実態
山下祐輔、小千田圭吾、酒詰史子、山中俊嗣、牧野康太郎、中田理美、
下平敏之、丹倫枝、小林玲欧那、吉田

隆、角田

浩

上川北農業共済組合〒 095-0044 北海道士別市東山 3343-2［要約］

バイオフィルム（BF）は慢性あるいは難治性感染症に関わっていると考えられているが、国内の産業動物の分野における報告は少ない。今回臨床型乳房炎罹患分房の乳汁から分離されたブドウ球菌
属（Staphylococcus aureus:SA, Coagulase Negative Staphylococci:CNS）、レンサ球菌属（Streptococcus
uberis:SU, Streptococcus dysgalactiae:SD, Other streptococci:OS）、腸球菌（Enterococcus spp.:Ent）、計
382 株の BF 形成能、薬剤感受性および病原性について調査を行った。BF 形成能の検出にはコンゴレッド培地（CRA）を用い、黒色コロニーを形成したものを BF 形成株（BF+ 株）、赤色あるいは透明コロニーを形成したものを BF 非形成株（BF- 株）とした。薬剤感受性の調査にはディスク法を、病原性の調査には、発症後翌月の牛群検定成績の体細胞リニアスコア（LS）を用いて、BF+ 株と BF- 株間で菌種ごとに比較した。分離された 382 株のうち BF+ 株は SA9/80（11.3%）、CNS23/90（25.6%）、SU65/68（95.6%）、
SD35/45（77.8%）、OS53/88（60.2%）、Ent10/11（90.9%）であった。薬剤感受性試験では、SA のペニ
シリンとエリスロマイシンを除き、BF+ 株と BF- 株との間で感受性率に有意な差は認められなかった。
また発症翌月の LS は、いずれの菌種においても BF+ 株と BF- 株の間で有意な差は認められなかった。
本調査から国内の臨床型乳房炎由来菌の一部は BF 形成能を有する事がわかった。一方薬剤感受性および病原性については、BF が in vitro と in vivo での薬剤感受性の不一致の要因とも言われていること、また慢性乳房炎の科学的指標が確立されていないことなどから、本調査に用いた方法では BF 形成下での薬剤感受性や病原性について正しく評価できていない可能性も示唆され、本調査の結果の解釈については慎重にならければならない。
キーワード：バイオフィルム、コンゴレッド培地、牛臨床型乳房炎、慢性感染症、薬剤感受性

26］、嚢胞性繊維症などの難治性感染症の原因【はじめに】

として注目され［29］、今なおその詳細なメカ

バイオフィルム（以下 BF）とは、微生物がニズム解明のために研究が進められている。近自ら産生した高分子基質に包まれ、生体、非生

年、動物の感染症由来の細菌からも BF 形成菌体問わず、その表面に接着した集合体のことでが複数発見されており［31, 36］、特に牛の乳房ある［7］。BF を形成することにより抗生物質炎由来の細菌も BF を形成し、難治性乳房炎のや生体の免疫機構などから身を守ることができ原因の一つとして注目されている［12, 14, 15,

るため、医療分野では、古くから医療器具関連

18, 35, 38, 45］。しかし、国内における乳牛の感 染 症（device related infections:DRIs）［17,

臨床型乳房炎由来菌の BF 形成能についての報
告は少ない。今回、当診療所管内で発生した臨床型乳房炎由来細菌の BF 形成能、薬剤感受性、受理：2016年10月13日－ 121 －

家畜感染症学会誌
5 巻 4 号 2016

臨床型乳房炎由来菌のバイオフィルム形成能と病原性

病原性についての調査結果と近年盛んに行われり簡便で感度の高い slime 形成能の定性的検査ている BF に関する報告とを合わせて、産業動方法が開発された［16］。その間 Christensen

物獣医療に関わる獣医師が BF 形成菌による乳らは 96 ウェルのマイクロタイタープレートと房炎とどう向き合っていくべきかを考えていき

分光光度計を用いた BF 形成の定量的検査方法

たい。

（以下 MP 法）を開発した［6］。その後、多くの研究者により CRA 法や MP 法に改良が加え【BF とは？】られ［12, 15, 20, 28］、PCR による遺伝子解析

BF の形成もあわせることによって微生物の BF 関連遺伝

生体において BF は、BF 形成菌が生体組織の子（icaADBC、bap など）の発見につながった

表面に接着（adhesion）し、集合（aggregation）、［3, 8-10, 18, 35, 37, 44］。ここで MP 法は実際に成熟（maturation）することで形成される。成BF 形成を検出しているが、CRA 法は BF の主

熟した BF 内で増殖した細菌の代謝活動で発生成分である slime の形成を検出している点を注した老廃物により環境が悪化すると、BF の一

意されたい。

部が破壊され、遊離菌（planktonic cell）とし【当診療所管内で発生した

て離脱（dispersal）し、異なる場所に接着し感

臨床型乳房炎由来菌の BF 形成能】

染を広げることがわかっている［5, 13］。
BF の構成成分と BF 形成能の検出

臨床現場で応用可能な BF の検出方法

BF は 微 生 物 が 作 る 細 胞 外 多 糖

前述した BF 形成能検査の中で、臨床現場に（Exopolysaccharide: 以 下 EPS）、 蛋 白 質、

おいて簡便かつ低コストで実施可能な検査法

eDNA を 構 成 成 分 と す る が、 多 く の 細 菌 では分光光度計などの高額機器を必要としない

EPS が BF の重要な構成成分であると言われ

CRA 法である。牛の乳房炎由来菌で CRA 法ている［13］。EPS は微生物が生成する slimeを用いて BF 形成能を見た報告は複数ある（表として発見され、Christensen らにより DRIs

1）。そこで筆者らも、CRA 法を用いて当診療の 主 要 な 原 因 菌 で あ る S. epidermidis に よ所管内で発生した臨床型乳房炎由来菌の BF 形

る slime 形成を定性的に検査する方法（Tube

成能について調査を行った。

Method: 以下 TM）が開発された［5］。しかし、材料と方法

TM では、BF 形成能の弱い微生物を検出しづ

平成 28 年 2 月から 8 月に管内で発生した臨床らいとし、Freeman らによりコンゴレッド培型乳房炎のうち、細菌分離培養検査および薬剤

地（Congo Red Agar: 以下 CRA）を用いたよ感受性試験を行った 427 分房のデータを用い

表1 CRA法を用いてBF形成能を検出した研究
表1 CRA法を用いてBF形成能を検出した研究
著者

年代

菌種および検体数

BF形成能検査結果

潜在型および臨床型乳房炎由来の黄色ブドウ球菌
70株

CRA法
MP法

CRA法でBF形成能あり 8/70（11.42%)
MP法で強いBF形成能 9/70(12.86%) 中程度 21/70(30%)
弱いBF形成能 40/70(57.14%)

牛乳房炎由来黄色ブドウ球菌
92株

CRA法

BF形成能あり 11/92(12%)

Dubravka et al(12)2010Baselga et al(2)1993Castelani et al(3)2014

牛乳房炎由来黄色ブドウ球菌
未経産 83株 初産および経産27株

CRA法
PCR

CRA法でBF形成能あり
未経産 52/83(62.7%) 初産および経産9/27(33.3%)
PCRでica遺伝子陽性
icaA 未経産 82/83(98.8%) 初産および経産26/27(96.3%)
icaD 未経産 83/83(100%) 初産および経産27/27(100%)

Melo et al(28)2013

潜在型乳房炎由来黄色ブドウ球菌
94株

CRA法
MP法
PCR

CRA法でBF形成能あり 80/94(85%)
MP法でBF形成能あり 93/94(98.9%)
PCRでicaAD遺伝子陽性 90/94(95%)
CRA法でBF形成能がある株は全てicaAD陽性

Turkyilmaz and Eskiizmirliler(36)2006

様々な動物から採取した
コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(CoPS) 90株
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌(CoNS) 90株

CRA法
MP法
TM

CRA法でBF形成能あり CoPS 70/90(77.7%) CoNS 40/90(44.4%)
MP法でBF形成能あり CoPS 67/90(74.4%) CoNS 33/90(36.6%)
TMでBF形成能あり CoPS 60/90(66.6%) CoNS(34.4%)

He et al(18)2014

牛潜在型乳房炎由来黄色ブドウ球菌
102株

CRA法
MP法
PCR

CRA法でBF形成能あり 80/102(78.4%)
MP法でBF形成能あり 44/102(43.1%)
中国においてBF形成に最も重要とされる遺伝子はrbf SigB icaAD

Vasudevan et al(37)2003

牛乳房炎由来黄色ブドウ球菌
35株

CRA法
MP法
PCR法

CRA法でBF形成能あり 32/35(91.4%)
MP法でBF形成能あり 24/35(68.6%)
PCRでicaAD遺伝子陽性 35/35(100%)－ 122 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.4 2016

BIOFILM FORMATION AND PATHOGEN FROM BOVINE CLINICAL MASTITISた。本調査の流れを図 1 に示す。細菌分離培養

ラーヒントン寒天培地に、SU、SD、Ent、OSは罹患分房から無菌的に採取した乳汁を 5％羊のコロニーは 5% 羊血液寒天培地にそれぞれ塗血液寒天培地で 37℃ 24 時間好気的に培養し、抹し、感受性ディスク（BD センシ・ディスク、

コロニーの形状、溶血性、種々の生化学的検査

ベクトン・ディッキンソン）を用いてペニシリ

により菌種の同定を行った。本調査は、過去

ン、カナマイシン、オキシテトラサイクリン、の報告から CRA 法で slime 形成能が判定可能

エリスロマイシン、セファゾリン、セフロキシ

な、Staphylococcus aureus（SA）、Coagulase

ムについて薬剤感受性試験を行った。結果の解Negative Staphylococci（CNS）［2, 3, 12, 18, 28,

釈は CLSI（Clinical and Laboratory Standards

36, 37］、Other Streptococci（OS）を対象としInstitute）：Performance Standarads forた［30］。OS はさらに草場らの方法［22］を用Antimicrobial Disk Susceptibility Test に従っ

いて Streptococcus uberis（SU）、Streptococcusて行い、感性（S）以上を感受性ありとした。

dysgalactiae（SD）、Enterococcus spp.（Ent）、

CLSI に基準がない菌種と抗生物質の組み合わ

Other Streptococci（OS） に 分 類 し た。 分 離

せでは、明瞭な阻止円を形成したものを感受性

同 定 後、1 コ ロ ニ ー を 釣 菌 し Freeman ら のありとした。

方法［16］をもとに作成した CRA に塗沫後、BF による病原性の違いを検証するために、

37℃ 24 時間好気的に培養し、形成されたコロ

牛群検定情報を用いて発症翌月の体細胞リニア

ニーの色調を Very Black（VB）、Black（B）、スコア（LS）を菌種別に BF+ 株と BF- 株でAlmost Black（AB）、Bordeaux（Brd）、Red（R）、比較した。解析には発症分房が 1 分房のみで、Very Red（VR）の 6 段階比色で判定した［1,発症から 1 ヶ月以内に新たな乳房炎が発症して44］。VB、B、AB を slime 形 成 陽 性 す な わ ち

いないデータのみを用いた。

BF 形成能陽性（BF+）、Brd、R、VR を slime

統計解析

形成陰性すなわち BF 形成能陰性（BF-）とし菌種ごとの BF+ 株と BF- 株の薬剤感受性率

た。また同時に SA、CNS のコロニーをミュー

をフィッシャーの正確検定を用いて比較した。

5%羊血液寒天培地
37℃24時間好気培養

コロニーの形状
溶血性
種々の生化学的検査
37℃24時間好気培養

レンサ球菌

薬剤感受性試験SA CNS

37℃24時間好気培養

クロモアガーオリエンタシオン培地

コンゴレッド培地
37℃24時間好気培養

青透明

37℃24時間好気培養

SFブロス
黃
Enterococcus
spp.

SAPブロス

紫
薄ピンク

Other
Streptococci

図１

S. dysgalactiae

濃ピンク

Very Black(VB)

Bordeux
(Brd)

Black
(B)

Red
(R)

Almost Black(AB)

Very Red
(VR)

BF+

BF-

S. uberis

細菌分離培養およびCRAによるBF形成能判定の流れ

図１ 細菌分離培養およびCRAによるBF形成能判定の流れ－ 123 －

家畜感染症学会誌
5 巻 4 号 2016

臨床型乳房炎由来菌のバイオフィルム形成能と病原性

菌種ごとの BF+ 株と BF- 株の発症翌月の LS

77.8％、Ent で 90.9％、OS で 60.2％であった。

をマンホイット二検定を用いて比較し、いずれ

BF 形成能別薬剤感受性率においては、SAも有意水準 5% で検定を行った。

でのみペニシリンとエリスロマイシンの感受性

結果

率が BF+ 株で有意に小さくなっていたが、そ調査分房総数 427 分房中、調査対象菌種はの他の菌種については有意な差は認められな

382 株検出され、その内わけは、SA が 80 株、かった（表 2）。

CNS が 90 株、SU が 68 株、SD が 45 株、Ent

BF 形成能別の発症 1 ヶ月後の体細胞 LS のが 11 株、OS が 88 株であった。各菌種別 BF

比 較 で は、SA、SU、SD、OS で BF+ 株 は形成能保有率を図 2 に示す。BF+ 株は、SA で

BF- 株と比べ LS が高くなる傾向を認めたもの

11.8 ％、CNS で 25.6 ％、SU で 95.6 ％、SD での、有意差な差は認められなかった（図 3）。

表2 菌種ごとのBF+株とBF−株の薬剤感受性率の比較
表2 菌種ごとのBF＋株とBF−株の薬剤感受性率の比較
Biofilm

P

K

E

T

CZ

CXM

+

77.8

88.9

77.8

88.9

77.8

88.9

-

98.5

100

100

95.6

97.1

100

+

95.7

100.0

95.7

95.7

91.3

100

S. aureus
CNS
S. uberis
S. dysgalatiae
Enterococcus spp.
OS

*

*

-

87.5

100.0

84.4

96.9

96.9

100

+

98.2

98.2

71.9

5.3

75.4

100

-

100

100

100

0

100

100

+

100

100

97.1

5.9

70.6

97.1
100

-

100

100

100

10

90

+

100

90

60

10

40

70

-

100

100

100

0

100

100

+

100

97.9

97.9

4.2

91.7

95.8

-

96.9

90.6

90.6

0

93.8

100

* 有意差あり(p<0.05) Fisherの正確検定
P: ペニシリン K：カナマイシン E：エリスロマイシン T：オキシテトラサイクリン CZ：セファゾリン CXM:セフロキシム

100%
90%
80%
70%
60%
Biofilm-

50%

Biofilm+

40%
30%
20%
10%
0%

S. aureus

CNS

S. uberis

S. dysgalactiae

Enterococcus spp.

図２ 菌種別BF形成能保有率
図２ 菌種別BF形成能保有率－ 124 －

OS

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.4 2016

BIOFILM FORMATION AND PATHOGEN FROM BOVINE CLINICAL MASTITIS

10

体細胞リニアスコア（LS)

9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
BF-

BF+
SA

BF-

BF+

BF-

CNS

図３

BF+

BF-

SU

BF+
SD

BF-

BF+
Ent

BF-

BF+
OS

BF+株とBF-株の発症後翌月の乳検データのLSの比較

図３ BF+株とBF−株の発症後翌月の乳検データのLSの比較

行える BF 形成能検査としては信頼性のある検【考察とまとめ】

査と考える。

臨床型乳房炎由来菌による BF 形成の実態

一方、レンサ球菌属の BF+ 株の出現率は、

当診療所管内で分離された臨床型乳房炎由来

Moore の 報 告 同 様 で あ っ た。 特 に SU や Ent

菌でブドウ球菌属に分類される SA や CNS は、での BF+ 株出現率は 90％以上と非常に高く、

レ ン サ 球 菌 属 や 腸 球 菌 に 分 類 さ れ る に SU、いずれも難治性乳房炎の原因菌と言われる菌種

SD、Ent、OS と比べ BF 形成能保有率は低いであることを鑑みると、BF 形成が治癒を妨げ傾向を認めた。本調査における SA の BF+ 株ている可能性が示唆された。

の出現率は、Dubravka ら［12］や Baselga ら［2］BF 形成と薬剤感受性の関係が報告している牛乳房炎由来 SA の BF+ 株の

BF 内の細菌は様々な機構で抗生物質や免疫出現率に近いものであった。しかし、Castelani

細胞の攻撃から身を守っていることが知られら［3］、Melo ら［28］、Turkyilmaz ら［36］、ている［19, 23, 32, 39］。本調査で実際に BF+

He ら［18］、Vasudevan ら［37］ の 結 果 と 本

株 と BF- 株 と の 間 で 感 受 性 に 違 い が あ る か

調査の結果を比べると出現率は低かった。培ディスク拡散法を用いて検証したところ、SA

養環境によっては EPS 産生に関わる主要な遺の BF+ 株でのみペニシリンとエリスロマイシ

伝子である icaAD の保有している牛すべてが、ンで BF- 株に比べ有意に感受性率が低くなっ必ずしも CRA で slime 形成をするとは限らず、た。しかし、他の菌種では BF+ 株が BF- 株よ遺伝子型の検査に加え表現型の検査も組み合

りも感受性率が高いパターンも認められたた

わせた方がよいという報告もある［3, 28］。本め、SA の BF+ 株での感受率の低下が、純粋調査では遺伝子型の検査を行っていないため、に BF 形成によるものなのかは確証が得られな得られた結果は CRA 法の検査感度に左右さかった。さらに、複数の研究者が BF 形成菌のれる可能性はあるが、Melo ら［28］の報告で

薬剤感受性は、BF を形成した状況を再現しては、icaAD 遺伝子の保有を gold standard としいない従来の薬剤感受性試験で評価することた場合の CRA 法の検査感度は 88％、特異度はは難しいという報告をしている［4, 31］。実際

100％、Dhanawade［11］らの報告でも、同様に Olson ら［31］は Calgary Biofilm Device をの gold standard で CRA が最も感度の高い検開発し、バイオフィルムを形成した細菌を根絶査であったとしている。そのため CRA 法は多するために必要な最小薬剤濃度を表す MBEC

少の偽陰性は含む可能性はあるが、臨床現場で（Minimum Biofilm Eradication Concentration）－ 125 －

家畜感染症学会誌
5 巻 4 号 2016

臨床型乳房炎由来菌のバイオフィルム形成能と病原性の測定を行ったところ、多くの細菌で MBEC

Bigger らによって発見された。Persister は耐が MIC よりはるかに高い値を示していた。以性菌とは異なり、遺伝的には BF 内で共生し分上のことから、現在臨床現場で一般的に用いら裂を続ける細菌と変わらない。しかし、その分れているディスク拡散法による薬剤感受性試験

裂速度は非常に遅く、BF 内で共生する増殖がを用いて、BF 形成が疑われる感染症の薬剤感

盛んな細菌と比べても、その数は最大でも BF

受性を評価することは困難である。これは、臨内の総細菌数の 1％程度しか達しないと言われ床現場でしばしば遭遇する、従来の薬剤感受性ている。しかし、抗生物質により増殖盛んな細試験の結果と実際の in vivo での薬剤の反応の菌が死滅すると、抗生物質の濃度が下がったと不一致の原因の 1 つではないかと考える。

ころで、persister が分裂を再開し BF 内の細BF による薬剤耐性機構

菌数をもとに戻そう働きはじめる。この様な機

BF は、①分子フィルターとして働き薬剤の構で BF 形成菌が慢性感染症や難治性感染症に浸透を妨げている、② BF 内環境が BF 内細菌

関わっていると言われている［25］。この様なの出す老廃物によって変化し、抗生物質の作用特徴から Persister cell は MRSA などに代表さしにくい環境（pH、pCO2 等の変化）になってれるような薬剤耐性遺伝子を獲得することによいる、③ BF 内の細菌の増殖速度が遅いことにる薬剤耐性（drug resistance）ではなく、薬剤より増殖期に作用しやすい薬剤への耐性を示す

寛容（drug tolerance）であると表現される。

など、様々な機構で薬剤に対する耐性を示して【BF 形成菌の病原性】

いると考えられている［13］。特に③の機構については、persister cell という BF 内の深層に今まで紹介してきた BF の特徴を鑑みると、存在し分裂が停止している状態の細菌が関与しBF 形成菌が非形成菌に比べ急性期で臨床症状ていると言われている［24, 25］。

が強くでるとは考えにくく、むしろ慢性化、難Persister cell の存在治化に関っていると考えられる。そこで本調査

Persister cell とは名前の通り、BF 内で抗生では、乳房炎発症翌月の体細胞 LS を見ること

物質による攻撃を受けても“persist= 存続すで乳房炎の慢性化、あるいは難治化を見ることる”細菌のことであり、その存在は 1944 年にができないかと考えたが、BF+ 株と BF- 株と

30

25

20
Ent

15

SD
SU

10

CNS
SA

5

0
BF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BF-

検出数

OS

A

B

C

D

E

F

G

H

I

J

K

L

M

N

O

P

Q

※左から調査機関中の平均バルク乳体細胞数が低い順に配列した

図４

農家別のBF+株とBF-株の検出数

図４ 農家別のBF＋株とBF−株の検出数－ 126 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.4 2016

BIOFILM FORMATION AND PATHOGEN FROM BOVINE CLINICAL MASTITISの間で差は認めらなかった（図 3）。今回の調れている［34, 41］。また 14 印環マクロライド査方法が適切であったかは疑問が残るが、現在の長期投与が慢性肺炎の治療に有効である可能

乳房炎の慢性化を科学的に立証できる方法はあ性について触れた報告もある［42, 43］。しかまりなく、今後有用な評価方法が開発されるこし、これらの報告は限定された菌種においてのとを願う。当初 BF+ 株は、乳房炎の発生が多み検証されていることに加え、sub-MIC でのく再発を繰り返す農場で多く検出され、BF+

マクロライドの投与やその他様々な抗生物質を株に感染した牛は、BF- 株に感染した牛に比sub-MIC で投与した場合、逆に BF 形成を促進

べ乳質が悪いと予想していたが、予想に反し、させたという報告もされていることから、産業

乳質が良好な農場でも BF+ 株は検出されてい動物の臨床現場での応用は慎重にならなければた（図 4, 5）。この結果は畜主の乳房炎に発見ならないと考える［21, 40］。現在 BF に関してする感度の違い、治療方法の違い、治癒判定基は未解明なことが多く、今後国内における産準の違いによるものと考える。感受性のある抗業動物の分野でも積極的な研究が必要である。

生物質を適正な量で、適正な期間投与していな

BF が形成されてしまった状態での有効かつ現

いと、前述したように persister cell が残った

実的な治療法はまだ確立されていないため、研状態で抗生物質の濃度が低くなり、分裂の再開

究が進む間、臨床現場においては BF を形成さを招くことになると考えられる。

せない治療法を確立させる必要があると考える。

【臨床現場における対 BF 関連感染症戦略】【引用文献】

本調査では、明確に BF+ 株の病原性につい1.

て示すことはできなかったが、医療の分野からの報告からもわかるように、BF が感染症の慢性化、難治化に関与している可能性は非常に高い。医療の分野ではマクロライド系抗生物質
が BF 関連遺伝子の発現を抑えるとの報告がさ

100

Aricola, C. R., Campoccia, D., Gamberini, S.,
Cervellati, M., Donati, E. and Montanaro, L.
2002. Detection of slime production by means ofan optimized Congo red agar plate test based oncolourimetric scale in Staphylococcus epidermidis
clinical isolates genotyped for ica locus.

30

90
25

80

20
OS

60

検出数

50
40

Ent

15

SD
SU

10

CNS
SA

30
5

20
10

0
BF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BFBF+
BF-

BF+株検出率（％）

70

0
A

B

C A D B

EC

FD

E
G

FH

G I

H J

I

K J

LK

ML

M
N

NO

OP

P Q Q

※左から調査機関中の平均バルク乳体細胞数が低い順に配列した※左から調査機関中の平均バルク乳体細胞数が低い順に配列した

図５ 農家ごとのBF+株検出率
図５ 農家ごとのBF＋株検出率
図４ 農家別のBF＋株とBF−株の検出数－ 127 －

家畜感染症学会誌
5 巻 4 号 2016

2.

3.

4

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

臨床型乳房炎由来菌のバイオフィルム形成能と病原性

12.

Biomaterials 23(21):4233-3239.
Baselga, R., Albizu, I., Cruz, M., Cacho, E. D.,
Barberan, M. and Amorena, B. 1993. Phase
Variation of Slime Production in Staphylococcus
aureus: Implications in Colonization and Virulence.
Infect. Immun. 61(11):4857-4862.
Castelani, L., Pilon, L. E., Martins, T., Pozzi,
C. R. and Arcaro, J. R. P. 2015. Investigation of
biofilm production and icaA and icaD genes in
Staphylococcus aureus isolated from heifers andcows with mastitis. Anim. Sci. J. 86.3:340-344.
Ceri, H., Olson, M. E., Stremik, C., Read, R. R.,
Morck, D. and Buret, A. 1999. The Calgary Biofilm
Device: New Technology for Rapid Determinationof Antibiotic Susceptibilities of Bacterial Biofilm. J.
Clin. Microbiol. 37(6):1771-1776.
Christensen, G. D., Simpson, W. A., Bisno, A. L. and
Beachey, E. H. 1982. Adherence of Slime-Producing
Strains of Staphylococcus epidermidis to SmoothSurfaces. Infect. Immun. 37(1):318-326.
Christensen, G. D., Simpson, A. W., Younger, J. J.,
Baddour, L. M., Barrett, F. F., Melton, D. M. and
Beachey, E. H. 1985. Adherence of CoagulaseNegative Staphylococci to Plastic Tissue Culture
Plates: a Quantitative Model for the Adherenceof Staphylococci to Medical Devices. J. Clin.
Microbiol. 22(6):996-1006.
Costerton, J. W., Stewart, P. S. and Greenberg, E.
P. 1999. Bacterial Biofilms: A Common cause of
Persistent Infections. Science 284:1318-1322.
Cucarella, C., Solano, C., Valle, J., Amorena, B.,
Lasa, I., Penades, J. R. 2001. Bap, a Staphylococcus
aureus Surface Protein Involved in Biofilm
Formation. J. Bacteriol. 183(9):2888-2896.
C u c a r e l l a , C . , To r m o , M . A . , K n e c h t , E . ,Amorena, B., Lasa, I., Foster, T. J. and Penades,
J. R. 2002. Expression of the Biofilm-AssociatedProtein Interferes with Host Protein Receptors of
Staphylococcus aureus and Alters the Infective
Process. Infect. Immun. 70(6):3180-3186.
Cucarella, C., Tormo, M. A., Ubeda, C., Trotonda,
M. P., Monzon, M., Peris, C., Amorena, B., Lasa, I.
and Penades, J. R. 2004. Role of Biofilm-AssociatedProtein Bap in the Pathogenesis of Bovine
Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 72(4):21722185.
Dhanawade, D. E., Kalorey, D. R., Srinivasan, K.
R., Barbuddhe, S. B. and Kurkure, N. V. 2010.
Detection of intercellular adhesion genes and biofilm
production in Staphylococcus aureus isolated frombovine subclinical mastitis. Vet. Res. Commun.
34(1):81-89.

13.

14.

15.

16.

17.
18.

19.

20.

21.
22.

23.

24.

－ 128 －

Dubravka, M., Lazic, S., Branka, V., Jelena, V.,
Bugarski, D. and Zorica, S. 2010. Slime production
and biofilm forming ability by Staphylococcus
aureus bovine mastitis isolates. Acta Vet. (Beograd).
60:217-226.
Dunne, W. M. 2002. Bacterial Adhesion: Seen
Any Good Biofilms Lately? Clinical Microbiology
Reviews. 15(2):155-166.
Ebrahimi, A., Moatamedi, A., Lotfalian, S. andMirshokrael, P. 2013. Biofilm formation, hemolysin
production and antimicrobial susceptibilities ofStreptococcus agalactiae isolated from the mastitis
milk of dairy cows in Shahrekord district, Iran. Vet.
Res. For. 4(4)269-272.
Fox, L. K., Zadoks, R. N. and Gaskins, C.T. 2005.
Biofilm production by Staphylococcus aureus
associated with intramammary infection. Vet.
Microbiol. 107:295-299.
Freeman, D. J., Falkiner, F. R. and Keane, C. T.
1982. New method for detecting slime production
by coagulase negative staphylococci. J. Clin. Pathol.
42:872-874.
Gotz, F. 2002. Staphylococcus and biofilms. Mol.
Microbiol. 43(6):1367-1378.
He, J., Wang, A., Liu, G., Gao, J., Ali, T. and Han,
B. 2014. Biofilm Formation and Biofilm-AssociatedGenes Assay of Staphylococcus aureus Isolated
from Bovine Subclinical Mastitis in China. Pak. Vet.
J. 34(4):508-513.
Jesaitis, A. J., Franklin, M. J., Berglund, D.,
Sasaki, M., Lord, C. I., Bleazard, J. B., Duffy, J. E.,
Beyenal, H. and Lewandowski, Z. 2003. Comprised
Host Defense on Pseudomonas aeruginosa Biofilms:
Characterization of Neutrophil and Biofilm
Interactions. J. Immunol. 171:4329-4339
Kaiser, T. D. L., Pereira, E. M., Santos, K. R. N.,
Maciel, E. L. N., Schuneck, R. P., Nunes, A. P. F.
2013. Modification of the Congo red agar method
to detect biofilm production by Staphylococcus
epidermidis. Diag. Microbio. Infect. Dis. 75:235239.
Kaplan, J. 2011. Antibiotic-induced biofilm
formation. Int. J. Artif. Organs 34(9):737-751.
草場信之 , 坂本道生 , 小野崎正修 , 鈴木貴博 , 三木渉 . 2014. 牛臨床型乳房炎由来レンサ球菌に対する簡易鑑別法の検討 . 家畜診療 10:627-632.
Leid, J. G., Shiirtliff, M. E., Costerton, J. W. andStoodley, P. 2002. Human Leukocytes Adhere to,
Penetrate, and Respond to Staphylococcus aureus
Biofilms. Infect. Immun. 70(11):6339-6345.
Lewis, K. 2001. Riddle of Biofilm Resistance.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45(4):999-

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.4 2016

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

BIOFILM FORMATION AND PATHOGEN FROM BOVINE CLINICAL MASTITIS

1007.
Lewis, K. 2007. Persister cells, dormancy andinfectious disease. Nature Reviews Microbiology.
5:48-56.
McCarthy, H., Rudkin, J. K., Black, N. S.,
Gallagher, L. and O’Neill, E., O’Gara. 2015.
Methicillin resistance and the biofilm phenotype in
Staphylococcus aureus. Front Cell Infect. Microbiol.
5:1-9.
Melchoir, M. B., Osch, M. H. J., Lam, T. J. G.
M., Vernooij, J. C. M., G. and Fink-Gremmels, J.
2011. Extended biofilm susceptibility assay for
Staphylococcus aureus bovine mastitis isolates:
Evidence for association between genetic makeup
and biofilm susceptibility. J. Dairy Sci. 94:59265936.
Melo, P. C., Ferreira, L. M., Filho, A. N., Zafalon,
L. F., Vicente, I. G. and Souza, V. 2013. Comparisonof methods for the detection of biofilm formation
by Staphylococcus aureus isolated from bovine
subclinical mastitis. Braz. J. Microbiol. 44(1):119124.
Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A. and O’Toole,
G. A. 2008. Pseudomonas aeruginosa biofilm
formation in the cystic fibrosis airway. A shortreview. Pulm, Pharmacol, Ther. 21(4):595-599.
Moore, G. E. 2009. Biofilm Production by
Streptococcus uberis Associated with Intramammary
Infections. (Thesis).
Olson, M. E., Ceri, H., Morck, D. W., Buret, A. G.
and Read, R. R. 2002. Biofilm bacteria: formationand comparative susceptibility to antibiotics. Can. J.
Vet. Res. 66:86-92.
Pozo, J. L. and Patel, R. 2007. The Challenge ofTreating Biofilm-associated Bacterial Infections.
Translational Medicine 82(2):204-209.
Raza, A., Muhammad, G., Sharif, S. and Atta, A.
2013. Biofilm Producing Staphylococcus aureus andBovine Mastitis: A Review. Mol. Microbiol. Res.
3:1-8.
Sato, K., Iinuma, Y., Hasegawa, T., Horii, T.,
Yamashino, T. and Ohta, M. 2000. Effect ofSubinhibitory Concentrations of Macrolides on
Expression of Flagellin in Pseudomonas aeruginosaand Proteus mirabilis. Antimicrobial Agents andChemotherapy. 44(10):2869-2872.
Snel, G. G. M., Monecke, S., Ehricht, R. and
Piccinini, R. 2015. Molecular characteristics of bappositive Staphylococcus aureus strains from dairy
cow mastitis. J. Dairy Res. 82(3):312-316.
Turkyilmaz, S. and Eskiizmirliler, S. 2006.
Detection of Slime Factor Production and Antibiotic

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

－ 129 －

Resistance in Staphylococcus Strains Isolated from
Various Animal Clinical Samples. Turk. J. Vet.
Anim. Sci. 30:201-206
Vasudevan, P., Nair, M. K. M., Annamalai, T. andVenkitanarayanan, K. S. 2003. Phenotypic andgenotypic characterization of bovine mastitis isolatesof Staphylococcus aureus for biofilm formation.
Veterinary Microbiology. 92:179-185.
Veh, K. A., Klein, R. C., Ster, C., Keefe, G.,
Lacasse, P., Scholl, D., Roy, J. P., Haine, D., Dufor,
S., Talbot, B. G., Ribon, A. O. B. and Malouni, F.
2015. Genotypic and phenotypic characterizationof Staphylococcus aureus causing persistent andnon-persistent subclinical bovine intramammary
infections during lactation or the dry period. J. Dairy
Sci. 98:155-168.
Vuong, C., Voyich, J. M., Fisher, E. R., Braughton,
K. R., Whitney, A. R., DeLeo, F. R. and Otto, M.
2004. Polysaccharide intercellular adhesin (PIA)
protects Staphylococcus epidermidis against major
components of the human innate immune system.
Cellular Microbiology 6(3):269-275.
Wang, Q., Sun, F. J., Liu, Y., Xiong, L. R., Xie, L.
L. and Xia, P. Y. 2010. Enhancement of Biofilm
Formation by Subinhibitory Concentrations ofMacrolides in icaADBC-Positive and Negative
Clinical Isolates of Staphylococcus epidermidis.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy
54(6):2707-2711.
Wang, S., Yang, Y., Zhao, Y., Bai, J., Chen, J., Zhou,
Y., Wang, C. and Li, Y. 2016. Sub-MIC Tylosin
Inhibits Streptococcus suis Biofilm Formation and
Results in Differential Protein Expression. Frontiersin Microbiology 7:1-9.
Wozniak, D. J. and Keyser, R. 2004. Effectsof Subinhibitory Concentrations of Macrolide
Antibiotics on Pseudomonas aeruginosa. CHEST
journal.125(2)suppl:62S-69S.
Yanagihara, K., Tomono, K., Imamura, Y., Kaneko,
Y., Kuroki, M., Sawai, T., Miyazaki, Y., Hirakata, Y.,
Mukae, H., Kadota, J. and Kohno, S. 2002. Effectof clarithromycin on chronic respiratory infection
caused by Pseudomonas aeruginosa with biofilm
formation in an experimental murine model. Journalof Antimicrobial Chemotherapy. 49:867-870.
Zhou, H., Chao, X., Fei, M., Dai, Y. and Liu, B.
2013. Analysis of S. epidermidis icaA and icaD
genes by polymerase chain reaction and slime
production: a case control study. BMC Infectious
Disease. 13(1):1-7.
Zuniga, E., Melville, P. A., Saidenberg, A. B.
S., Laes, M. A., Gonsales, F. F., Salaberry, S.

家畜感染症学会誌
5 巻 4 号 2016

臨床型乳房炎由来菌のバイオフィルム形成能と病原性

R. S., Gregori, F., Brandao, P. E., Santos, F. G.
B., Lincopan, N. E. and Benites, N. R. 2015.
Occurrence of genes coding for MSCRAMM andbiofilm-associated protein Bap in Staphylococcus
spp. isolated from bovine subclinical mastitis andrelationship with somatic cell counts. Microbial
Pathogenesis 89:1-6.

－ 130 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.4 2016

BIOFILM FORMATION AND PATHOGEN FROM BOVINE CLINICAL MASTITIS

Detection of biofilm formation, antibiotic susceptibility and virulence in pathogens
isolated from bovine clinical mastitis
Yusuke Yamashita, Keigo Kosenda, Noriko Sakazume, Toshitsugu Yamanaka,
Koutarou Makino, Satomi Nakata, Toshiyuki Shimohira, Michie Tan,
Reona Kobayashi, Takashi Yoshida, Hiroshi Tsunoda
Kamikawa-kita Agriculture and Mutual Aid Association（3343-2 Higashiyama, Shibetsu-city, Hokkaido, 095-0044）【Abstract】
Biofilm formation and its relationship to recalcitrant and chronic infections are reported inseveral studies. However, there are not many reports regarding biofilm formation of pathogens
isolated from bovine clinical mastitis（CM）in Japan. Within this context, the objective of the present
study was to investigate biofilm formation of Staphylococci（Staphylococcus aureus : SA, Coagulase
Negative Staphylococci : CNS）, Streptococci（Streptococcus uberis : SU, Streptococcus dysgalactiae :SD, Other streptococci : OS）and Enterococci（Ent）isolated from 382 samples from CM on Congo
Red Agar（CRA）, the difference in antibiotic susceptibility and virulence between biofilm producers（BF+）and non-producers（BF-）of each pathogens. Disk diffusion method and the SCC linear score（LS）data from one month after the onset of mastitis was used to compare antibiotic susceptibility
and virulence between BF+ and BF- of each pathogen. 9/80（11.3%）of SA, 23/90（25.6%）of CNS,
65/68（95.6%）of SU, 35/45（77.8%）of SD, 53/88（60.2%）of OS and 10/11（90.9%）of Ent were
BF+. There was no significant difference in antibiotic susceptibility between BF+ and BF- in mostof the pathogens, but proportion of susceptible SA BF+ strains were significantly low in penicillin
and erythromycin compared to BF-（p<0.05）. There was no significant difference in LS data fromone month after the onset of mastitis between BF+ and BF- of each pathogen. These results showthat some of the pathogens from CM in Japan are BF+ and its antibiotic susceptibility and virulence
are not so different from BF-. However, the latter half needs more thorough investigation. Because
for antibiotic susceptibility, there are some studies indicating that standard susceptibility test cannot
properly evaluate the susceptibility of BF+ pathogens in vivo. Also for virulence, scientific evaluation
standard for chronic mastitis hasn’t been developed, so the possibility of our evaluation being
inadequate is undeniable.
Keywords: b
 iofilm, Congo Red Agar, bovine clinical mastitis, chronic infections, antibiotic
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