酵素の基質誤認識を利用する
不活性炭化水素の水酸化●

荘司長三

名古屋大学大学院理学研究科物質理学専攻准教授

不活性な有機化合物を高効率に水酸化することが可能な細菌由来のシトクロムP450（P450）は，基質に対する選択性が非常に高く，対象基質と異なる形状の分子を酸化することが難しい。本来の対象基質に構造がよく似た疑似基質をP450に取り込ませるとP450が誤作動して酸化活性種を生成し，その誤って生成してしまった強力なP450の酸化活性種を利用して，ガス状アルカンやベンゼンなどの高難度な酸化反応を行うことができる新しい触媒反応システムを開発した。

るためには，高い基質特異性を変換する必はじめに要がある。

酵素は，常温，常圧の温和な条件下での反応を可能にする優れた生体触媒であり，アルキル鎖長の違いで酵素を騙す

酵素機能を高度に制御することができれ枯草菌由来の P450BSb は，例外的に過酸ば，環境負荷の低い理想的な物質生産が可化水素によって酸化活性種を生成し，長鎖能になる。酵素反応は，鍵と鍵穴の関係で脂肪酸を水酸化する。安価な過酸化水素を説明されるように，鍵穴に合致する化学物利用可能であったにもかかわらず，この酵質以外とは通常は反応しないように設計さ素を利用しようとする試みはほとんどされれている。ところが，鍵穴の形状に近い疑なかった。なぜなら，P450BSb は長鎖脂肪酸似基質（デコイ分子と名付けた）を酵素に以外を水酸化することができなかったから結合させると酵素が誤作動し，様々な物質である。一般的に，過酸化水素を利用可能変換ができるようになる。本稿では，筆者

なヘム酵素のヘムの近傍には，酸化活性種らが行ってきたデコイ分子を用いる細菌由生成に必要なヒスチジンやアスパラギン酸

来 P450 の基質特異性の変換に関して紹介などの一般酸塩基触媒として働くアミノ酸したい。

が存在するが，P450BSb ではそのようなアミノ酸はみられず，それらの代わりに，長鎖シトクロムP450脂肪酸のカルボキシル基が酸化活性種の生

P450 は，生物界に広範に存在する金属酵成に関与する（図 1 左）1）。基質のカルボキ素で，ヘムと呼ばれる鉄ポルフィリン錯体

シル基が酸化活性種の生成に不可欠な独特を利用して酸素分子を活性化することによの反応機構のために，P450BSb は長鎖脂肪酸り，不活性な有機化合物の水酸化を行うことができる。P450 の中でも細菌由来の P450 は，触媒活性が非常に高く，バイオ触媒としての利用が期待されてきた。しかしながら，細菌由来のP450 は，基質に対する選択性が高く，対象基質以外とはほとんど反応しない。細菌由来の P450を広く物質変換に利用可能にす

図 1 P450BSβによる長鎖脂肪酸の水酸化反応（左）とデコイ分子存在下でのエチルベンゼンの水酸化反応（右）の模式図

CHEMISTRY & CHEMICAL INDUSTRY │ Vol.66-9 September 2013733

しょうじ・おさみ
2002 年千葉大学大学院自然科学研究科博士後期課程修了。同年科学技術振興機構戦略的創造研究推進事業博士研究員（奈良先端科学技術大学院大学小夫家研究室），05 年名古屋大学物質科学国際研究センター博士研究員，
06 年日本学術振興会特別研究員，07 年名古屋大学
物質科学国際研究センター特任助教，08 年名古屋大学理学研究科物質理学専攻化学科助教を経て，13 年より現職。その間，12 年ドルトムント工科大学（ドイツ）にて客員研究員。第 27 回若い世代の特別講演会（2013），第五回バイオ関連化学シン。
ポジウム講演賞（2011）
E-mail: shoji.osami@a.mbox.nagoya-u.ac.jp

以外を水酸化しないように高度に設計され原子が原子半径の近いフッ素原子に置換さていた。そこで，それ自体は水酸化されなれたパーフルオロアルキルカルボン酸を利いが，カルボキシル基を有するために酸化用することを考えた。C-F 結合の結合解離活性種の生成はできてしまう疑似基質（デエネルギー（116 kcal/mol）は C-H 結合（95コイ分子）を取り込ませて P450BSb を強制的99 kcal/mol）よりも大きく，P450BM3 は C-Fに「ON」の状態にすることを考えた（図 1結合を水酸化することができない。鎖長が右）。P450BSb は炭素数が 14 前後の長鎖脂肪短い一連のパーフルオロアルキルカルボン酸を効率よく水酸化するが，炭素数 10 以下酸（炭素数 8-14）をデコイ分子として添加のアルキルカルボン酸を水酸化できない。

して反応を行うと，デコイ分子なしでは全鎖長の短いカルボン酸は，デコイ分子としく反応が進行しないプロパンやブタンなどて機能すると予想し反応系に添加すると，のガス状飽和炭化水素やベンゼンの水酸化

長鎖脂肪酸とは全く構造の異なるエチルベ

4〜 6）反応が進行した（図 2 下）
。興味深いこンゼンやスチレンなどの様々な基質をP450BSbとに，プロパンのような小さなアルカンの2）が酸化することを明らかにした 。P450BSb

場合には鎖長の長いデコイ分子が，ベンゼが鎖長の短いアルキルカルボン酸を，対象ンやシクロヘキサンのような比較的大きな基質であると間違えた誤作動を利用した反アルカンの場合には鎖長の短いデコイ分子応系である。デコイ分子を利用する手法はが 効 果 的 に 機 能 し， デ コ イ 分 子 に よ り

過酸化水素を利用可能な他の P450 にも利P450BM3 の反応空間の制御が可能であっ3）用できることを確認している 。

た。また，ベンゼンの水酸化では，フェノールが選択的に得られ，フェノールが過フッ素原子で酵素を騙す剰酸化されることはなかった。疎水性のア巨大菌由来の P450BM3 は，P450 の中でミノ酸から構成される活性部位とパーフルも最大の活性を有する長鎖脂肪酸の水酸化

オロアルキルカルボン酸の疎水的な性質の酵素で，炭素数が 16 前後の長鎖脂肪酸のアため，フェノールは直ちに活性部位から離ルキル鎖末端部分を水酸化する（図 2 上）。

脱していると考えられ，生成物が過剰に酸

P450BSb とは反応機構は異なるが P450BM3化されない理想的な反応空間が形成されても長鎖脂肪酸の取り込みが反応を開始するいると考えている。

トリガーとなっていて，長鎖脂肪酸と構造が大きく異なる基質の場合には酸化活性種おわりにが生成されず酸化反応は進行しない。構造

このように，基質特異性の高い細菌由来は似ているが P450BM3 に酸化されないデP450 の高度に設計された反応機構を逆手にコイ分子として長鎖脂肪酸のすべての水素とり，疑似基質を添加してあえて誤作動を引き起すと，タンパク質のアミノ酸の置換（変異導入）を一切施すことなしに酵素の基質特異性を大きく変換することができる新規手法を開発することができた。最後に，本研究を遂行するにあたりご指導いただきました渡辺芳人教授に心から感謝いたします。また，学生諸氏と博士研究員の努力に，そして多くの共同研究者の方々に深く感謝いたします。

図 2 P450BM3 による長鎖脂肪酸の水酸化反応（上）とデコイ分子存在下でのアルカンとベンゼンの水酸化反応（下）1）D. S. Lee et al.,2）O. Shoji et al.,3）O. Shoji et al.,4）O. Shoji et al.,5）O. Shoji et al.,6）O. Shoji et al.,2003,, 9761.
2007, , 3656.
2012, , 2286.
2011, , 5315.
2013, , 2344.
2013, , 6606.
Ⓒ 2013 The Chemical Society of Japan734

化学と工業 │ Vol.66-9 September 2013