II 型コラーゲンペプチドをコラーゲンペプチドを含有する含有する GM ライスのライスの開発研究～経口免疫寛容による経口免疫寛容によるリウマチによるリウマチ性関節炎
リウマチ性関節炎の性関節炎の予防と予防と治療を治療を目指して目指して～して～名古屋大学大学院
生命農学研究科応用分子生命科学専攻
日野真吾
１．緒言
リウマチ性関節炎とは、遺伝的な背景及び病原菌、ストレス、ホルモンバランスなどの環境因子を原因とする自己免疫疾患であり、滑膜増殖、破骨細胞活性化などによる関節の慢性的な炎症の慢性化とそれに伴う関節の破壊が起こる。患者数は日本全国で 70～100 万人と推定され、遺伝要因

MHC class II

環境要因

病原菌，病原菌，ストレス，ストレス，ホルモンバランス etc.

自己反応性T
自己反応性T細胞活性化

Th2

自己抗体産生ILIL-4・ILIL-6・ILIL-10

形質細胞

男女比は 1 対 4 と女性に多い疾病である。早ければ 20 歳代で発症し、30～50 歳代が発症のピークで高齢ILIL-4・ILIL-10

IFNIFN-γ・ILIL-12

B細胞

破骨細胞

マクロファージ

Th0

IFNIFN-γ

CD4+ T細胞
T細胞
軟骨細胞

TNFTNF-αILIL-1
リウマチのリウマチの発症化に伴い増加傾向にあると言われ
繊維芽細胞
ILIL-6ている。発病原因は明らかにされて
図１．リウマチ性関節炎
リウマチ性関節炎の性関節炎の発症機構
いないが、いくつかの因子の関与が示唆されている。例えば、HLA-DR1 と-DR4 など特定のタイプのヒト主要組織適合遺伝子複合体（HLA）の関与（Todd et al., 1988）や性ホルモンバランスの関与（Cutolo et al., 2002）が報告されている。また、患者血清中には、IgG の Fc 領域に対する自己抗体（リウマトイド因子）や、DNA に対する抗体が検出されることが知られている（山本, 1994）。さらに、患者血清中には自身の関節軟骨に存在するⅡⅡ型コラーゲンに対する自己抗体が検出され、自己免疫性炎症反応のコラーゲン原因のひとつであると考えられている（Cremer et al., 1998）（図１）。
リウマチ性関節炎の治療法として、薬剤療法と手術療法があるが、複数の因子により発症する自己免疫疾患であるため、根本的治療法は無いのが現状である。薬剤療法として、免疫調整剤や免疫抑制剤を用いて、自己免疫性の関節炎を抑制し、関節の変形及び破壊を防ぐ方法がある。この場合には、効果の発現までに数ヶ月を必要とし、また、皮膚、腎、肺、造血器への副作用があるため、定期的な検査と専門医の指導に基づく適切な処方が必要である。
近年、抗原由来のＴ細胞エピトープを含むペプチドを注射や経鼻、経口ルートにより投与することによって、免疫寛容が成立することが報告されている。免疫寛容とは、特定の抗原に対して免疫応答が抑制される現象で、その機構としては、Ｔ細胞応答の抑制・不応答や、Ｔ細胞自身がアポトーシスにより死滅することが示唆されている。腸管は摂取された食物を介して、常に外来抗原に曝されており、最大の免疫組織であると言うこともできる。経口ルートで侵入する抗原に対して特異抗体を産生し、異物を排除するシステムを持っており、この抗体による異物排除の機構には腸上皮細胞やリンパ球が関与する。その一方で、腸管では食物抗原などに対する不要な反応を抑えるために経口免疫寛容といわれるシステムも持つ。つまり経口的経口的に摂取した抗原
経口的に摂取したした抗原に抗原に対1

してはそれらに特異的してはそれらに 特異的に特異的 に 免疫抑制反応が反応が誘導される誘導されるのである。
される
この経口免疫寛容を利用して、ニワトリの II 型コラーゲンやヒト II型コラーゲンのＴ細胞エピトープを含むペプチド（免疫寛容原性ペプチド）を経口投与することにより、リウマチ性関節炎の予防・治療効果が期待できるという報告がある（Trentham D.E. et al, 1997, KhareS.D et al 1995）（図 2）。そこで、リ
ウマチ性関節炎の原因のひとつと・3量体を量体を形成
・約300ｋ
300ｋDa・関節の関節の主要構造タンパク
主要構造タンパク質
タンパク質

ヒトⅡ
ヒトⅡ型コラーゲン免疫寛容原性
コラーゲン免疫寛容原性ペプチド
免疫寛容原性ペプチド
250

270

…GPKGQTGKPGIAGFKGEQGPK…
GPKGQTGKPGIAGFKGEQGPK…
T細胞エピトープ
細胞エピトープをエピトープを含む配列◆ 関節リウマチ
関節リウマチ患者
リウマチ患者への患者へのニワトリへのニワトリⅡ
ニワトリⅡ型コラーゲンのコラーゲンの経口投与による経口投与による症状による症状の症状の緩和（ Trentham D.E. et al, 1997 ）◆ 関節炎発症マウス
発症マウスへのコラーゲン免疫寛容原性ペプチド
マウスへのヒトへのヒトⅡ型コラーゲン免疫寛容原性
免疫寛容原性ペプチドのペプチドの経口投与による症状による症状の症状の予防・予防・治療効果（治療効果（ Khare S.D. et al, 1995 ）図２．ヒト II 型コラーゲンとコラーゲンと免疫寛容原性ペプチド
免疫寛容原性ペプチド

して知られている II 型コラーゲンの免疫寛容原性ペプチドを日常的に食べることが可能なイネ種子の中に組換え DNA 技術を用いて蓄積させることができれば、経口免疫寛容現象を利用した、“食べることでリウマチべることでリウマチ性関節炎予防・治療効果を治療効果を期待できる期待できるコラーゲンペプチド
ライス”
リウマチ性関節炎の性関節炎の予防・できるコラーゲンペプチド GM ライス”を開発できるという発想の下に、II 型コラーゲン免疫寛容原性ペプチドを種子に集積する形質転換イネの開発に着手した。
２．開発の開発の特徴① イネの胚乳特異的プロモーターを用いて、4 つの免疫寛容原性ペプチドを連結したポリペプチドをコードする遺伝子を登熟期イネ種子で高発現させ、胚乳中に蓄積させた。通常、ペプチドは胚乳内に集積しにくいことが知られており、集積を高めるため、主要な貯蔵タンパクであるグルテリンとの融合タンパク質として発現させた。
② 経口摂取した場合に、消化管内でこれらの融合タンパク質から効率的に免疫寛容原性ペプチドが切り出されるよう、グルテリン及び各ペプチド間に腸管の消化酵素であるキモトリプシンによって切断されるアミノ酸（チロシン）を導入した。
③ 免疫寛容原性ペプチドを高発現させるため、４連続ペプチドの人工遺伝子の配列には、イネの貯蔵タンパク質で高頻度に使用されるコドンを用いて作成した。
④ 消費者の安全性に対する懸念に配慮して、選抜マーカー遺伝子である抗生物質耐性遺伝子を含まない形質転換イネを選抜した。
３．材料と材料と方法
１）コラーゲンペプチド発現用
コラーゲンペプチド発現用ベクター
発現用ベクターのベクターの構築
ヒト II 型コラーゲンペプチドのアミノ酸配列をもとに、イネで最も使用頻度の高いコドンを用いた塩基配列を決定した。この配列を基に、制限酵素認識配列、及び消化酵素によって認識されるアミノ酸（チロシン）をコードするコドンを付加したもの

合成２
合成２本鎖cDNA
本鎖cDNA

コラーゲンペプチドcDNA
コラーゲンペプチドcDNA＋
cDNA＋Tyr
Sal I
Xho I

グルテリンｃグルテリン
ｃDNA

プラスミドへのプラスミドへのクローニング
へのクローニング、クローニング、
酵素処理
酵素処理、処理、連結

PCRによるPCRによるチロシンによるチロシン（チロシン（Tyr)
Tyr)、SalI,SalI,XhoI siteのsiteの挿入(コラーゲンペプチド 2本鎖cDNA本鎖cDNA)
cDNA) x４
x４

グルテリンｃ
DNA＋ｃDNA
グルテリン＋Tyr
制限酵素処理、制限酵素処理、挿入

グルテリンｃ
DNA＋グルテリン
ｃDNA＋Tyr

GluGlu-pro

融合コラーゲンペプチド
コラーゲンペプチド遺伝子
グルテリン融合
コラーゲンペプチド遺伝子
グルテリン融合NOSNOS-t

NOS-t
35S HPT NOS

グルテリンｃグルテリンｃDNA＋
DNA＋Tyr

図３．コラーゲンペプチド発現用遺伝子
コラーゲンペプチド発現用遺伝子コンストラクト
発現用遺伝子コンストラクトのコンストラクトの構築
2

を 1 つの単位として、これを 4 つ連結した DNA 断片を作成した。この 4×II 型コラーゲンペプ
チドをコードした DNA 断片を、グルテリン cDNA と連結した後、アグロバクテリウム法でのコトランスフォーメーション用ベクター(pSB26)のプロモーター直下に挿入し、グルテリン融合タンパク質として登熟期種子特異的に発現させるベクターを構築した(( 図３ ) 。
２）コラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有ＧＭ
含有ＧＭライス
ＧＭライス系統
ライス系統の系統の作出と作出と選抜作成したベクターと薬剤耐性遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子を含むベクターとを相同組換え法
を用いて融合し、アグロバクテリウムを形質転換後、コシヒカリカルスに感染させ、形質転換イネを作成した（コトランスフォーメーション）。作成した形質転換イネ再分化個体の幼苗をゲノム DNA-PCR に供し、遺伝子が導入された株のみを選抜し、生育させた。

自殖第１世代種子(T1)の採取
健全な（倍数体等でない）稔実株で50粒以上の株

形質転換イネ(T0)

種子を種子を半分（半分（半粒）半粒）に分割
次世代植物（T1）を残せるだけでなく、PCR分析、ウエスタン分析を併用して選抜を効率化できる

自殖第１世代の種子を半分に分割し、胚乳側をコラーゲンペプチド特異抗ＧＭライス系統
ライス系統の系統の選抜法概略
体を用いたウエスタンブロット解析 図４．ＧＭライス

分割した
分割した胚側した胚側からの胚側からの発芽からの発芽に供し、一方、胚側は発芽させて幼苗をゲノム DNA-PCR により解析した（（図 4）。さらに、自殖第２世代の遺伝型分析も併用し、最終的に薬剤耐性遺伝子を持たず、且つ、ホモ接合型の目的遺伝子を持ちコラーゲンペプチドを多く発現・蓄積している系統を選抜した。
３) マウスへのマウスへのコラーゲンペプチドへのコラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有 GM ライスのライスの経口投与による経口投与による関節炎抑制能による関節炎抑制能の関節炎抑制能の評価
DBA/1J マウスは、ヒトのリウマチ性関節炎の動物モデルとして、またコラーゲン誘導関節炎を発症するマウスとして多くの研究で用いら・リウマチ性関節炎
リウマチ性関節炎の性関節炎の動物実験モデル
動物実験モデルとしてモデルとして頻用として頻用れている。DBA/1J マウスに異種Ⅱ型コラーゲ・異種Ⅱ異種Ⅱ型コラーゲンでコラーゲンで感作することにより感作することにより関節炎することにより関節炎を関節炎を発症
ン を ア ジ ュ バ ン ド で あ る FCA （ Freund’scomplete adjuvant）と共に免疫することによって関節炎を誘発できることが示された（ Courtenay et al.,1980 ）。 こ の 報 告 以 降 、DBA/1J は主要なコラーゲン誘導関節炎発症モデルマウスとして用いられるようになった。
正常発症
本研究では、このマウス関節炎モデルを用いて、関節の腫脹（（図 5）などの炎症反応と コラーゲンコラーゲンにコラーゲンに対する免疫性する免疫性 (コラーゲンにコラーゲンに対する抗体価する抗体価の抗体価の上昇）上昇）
骨・軟骨の軟骨の浸蝕 (滑膜細胞活性化、滑膜細胞活性化、軟骨の軟骨の破壊）破壊）の正の相関がある、II 型コラーゲンに対する 骨
血清抗体応答を指標とし、コラーゲンペプチ
ド含有 GM ライスの関節炎抑制能の評価を行った。具体的には、

抗体
抗体・抗体・補体の補体の沈着

図５．コラーゲン誘導関節炎
コラーゲン誘導関節炎の特徴と病態誘導関節炎の特徴と抗体産生抑制効果の評価
DBA/1 マウスにコラーゲンペプチド含有 GM ライス及び陰性対照として通常米を 2 週間経口3投与し、その後ウシⅡ型コラーゲンを腹腔内投与することにより感作した。定期的に採血を行い、ウシⅡ型コラーゲンに特異的な抗体価を測定し、2 群間での抗体応答を比較した((図 6-A)。
A)
抗体応答の低減化の評価
既に II 型コラーゲンに対する自己免疫応答が成立したマウスへのコラーゲンペプチド含有 GMライスの経口投与の影響を調べた。ウシⅡ型コラーゲンを尾付け根に皮内投与することで免疫感作を行い自己抗体産生を誘導したマウスを、血清抗体価の平均値と偏差がほぼ同等になるように2 群に分け、それぞれにコラーゲンペプチド含有 GM ライス及び通常米を精製飼料に混ぜて 2 週間経口投与した。その後、ウシⅡ型コラーゲンに特異的な抗体価の変動を追跡し、２群間で比較した((図 6-B)。
B)
抗体産生抑制効果の抗体産生抑制効果の評価-1401133321103233342105333637410333

経過日数

3

抗体応答低減化の抗体応答低減化の評価
-580

採血

14経口投与

4284

経過日数

腹腔内投与
ウシII
ウシII型
II型コラーゲン10
コラーゲン10μ10μg/匹g/匹

腹腔内投与
ウシII
ウシII型
II型コラーゲン100
コラーゲン100μ100μg＋FCA/匹FCA/匹図 6．マウスへのマウスへの GM ライス経口投与
ライス経口投与および経口投与および免疫および免疫スケジュール
免疫スケジュール

４．結果
１）コラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有 GM ライス系統
ライス系統の系統の作出
コラーゲンペプチド発現用ベクターを保持する形質転換アグロバクテリウムをコシヒカリのカルスに感染させ、薬剤選択後、再分化させることにより 93 系統の組換えイネ(T0)を得た。これらの T0 個体からゲノム DNA を抽出し、PCR 解析により、コラーゲンペプチド遺伝子が導入されなかったもの及び目的以外のサイズの DNA が挿入された系統を排除し、45 系統(T0)を選抜した。さらに、倍数体等ではない、正常な稔実系統（50 粒以上稔実のあるもの）のみを選択し、目的遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を共に持つ 33 系統(T0)が得られた。
これらの系統を自家受粉させて得られた種子(T1)４粒について、個々にタンパクを抽出し、ウエスタン１次選抜・・・4粒中2粒以上発現（非発現・低発現系統の淘汰）

ウエスタン２次選抜・・・16粒中8粒以上発現（１１因子遺伝候補の系統選抜）
因子遺伝候補12345678910 11：コラーゲンペプチド融合融合タンパク質
タンパク質
コラーゲンペプチド融合タンパク

図７．自殖第一世代（自殖第一世代（T1）T1）種子の種子のウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析による分析による T0 系統選抜
412 13 14 15 16

SDS-PAGE で分画後、抗コラーゲンペプチド特異抗体を用いたウエスタンブロット解析により、グルテリン融合コラーゲンペプチドの非発現・低発現系統を淘汰した。選抜された系統について、さらに粒数を増やし、16 粒中 8 粒以上についてペプチドの集積が認められた系統のみをコラーゲンペプチド含有 GM ライス系統として選抜した(7)。
(図 7)
選択した系統に稔実した種子(T1)を半分に分割し、胚を含む方を育種用に発芽させ、さらに、幼苗葉より抽出したゲノム DNA を用いて PCR 解析を行い、目的遺伝子のみを持ち、薬剤耐性遺伝子を持たない系統を選抜した。これらの系統については、胚乳側よりタンパクを抽出し、同様の方法でウエスタンブロット解析を行い、高発現自殖第１世代(T1)系統を得た（（図 8）。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

胚のある側のある側幼苗葉の幼苗葉のDNAのDNAのPCR分析
PCR分析• １因子遺伝の因子遺伝の確認• マーカー分離型
マーカー分離型T1
分離型T1のT1の選抜

選抜マーカー
選抜マーカー(マーカー(hpt）
hpt）

目的遺伝子（目的遺伝子（GluGlu-huCII)
huCII)

5

胚の無い側78

11 12 15 16 20 22 23

マーカーフリーT1
マーカーフリーT1のT1のウエスタン分析
ウエスタン分析• 高発現T1
高発現T1 （固定系統候補）候補）の選抜・選抜・育苗

図 8．半粒分析による半粒分析による組換による組換え
組換えイネのイネの T１系統選抜

これらの系統からさらに後代を作成し、それらの遺伝型及び表現型を解析して、遺伝的遺伝的に遺伝的に安定な、コラーゲンペプチド含有コラーゲンペプチド含有 GM ライス系統
ライス系統を作出した。
系統を作出した
した。大腸菌で発現させた免疫寛容原性ペプチドを標準品とした免疫定量分析により、この GM ライスには、平均して１粒あたり約 1 µgのコラーゲンペプチドが含まれることが明らかとなった（（図 9）。
２）コラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有 GM ライスの 経口投与による経口投与 による自己抗体応答による 自己抗体応答の自己抗体応答 の 誘発予防効果の防効果の評価

GMライス
GMライス

通常米

TrxTrx-HuCIIX4↓

0 7.5 15 30 60 (ng(ng)ng)

コラーゲンペプチド
融合タンパク
融合タンパク質
タンパク質

コラーゲンペプチド含有 GM ライス、及び、通常米を粉末にして精製飼料に添加して自由摂取させ、その後ウシⅡ型コラーゲンを腹腔内に投与することによって感作した。その後の抗体応答を観察することにコラーゲンペプチド
コラーゲンペプチド 9 7
6 892 86 105 113（ng/ng/粒）

1粒あたり 約1µgのコラーゲンペプチド
図 9．コラーゲンペプチドのコラーゲンペプチドの免疫定量分析より、コラーゲンペプチド含有 GM ライスの経口投与の有無がⅡ型コラーゲン特異抗体の産生に及ぼす影響について解析した。コメ一粒の平均重量を 1.8 ｍｇとして 45 ｍｇの粉末状 GM ライス、及び、陰性対照として通常米を 5 ｇの餌に配合した。経口投与は 2 週間行い、1 匹あたり 2 週間で 40 g の餌を与えた。すなわち、1匹あたり 200 µg のコラーゲンペプチドを摂取させた。経口投与終了後、ウシⅡ型コラーゲンで5感作し、経時的に採血を行い、コラーゲン誘導関節炎の指標のひとつであるⅡ型コラーゲンに対する抗体応答の推移を ELISA 法により計測した。
コラーゲンペプチド含有 GM ライス投与群では、対照群と比較して II 型コラーゲンに対する抗体価が上昇してくるしてくるタイミングタイミングがらかに遅その程度程度もIgG1 抗体価が上昇してくるタイミングが明らかに遅く、その程度も弱いことが明らかとなった(図 1010-A, B)。また、抗Ⅱ型コラーゲンB)
IgG2a 抗体の経時的変化についても、IgG1 と同様に抗体価の上昇の遅延が観察された((図 10日後には、コラーゲンペプチド含有10-D,E)。さらに、74D,E)
GM ライス投与群では通常米投与群と比べ統計的にも有意に II 型コラーゲンに対する IgG2a 抗体価の上昇がえられていることが明らかとなった（
10体価の上昇が低く抑えられている（図 10-F）。
IgG1抗体IgG1抗体IgG2a抗体
IgG2a抗体AD
ELISA value

2.5

ELISA value

B

GMライス
GMライス投与群
ライス投与群

GMライス
GMライス投与群
ライス投与群
高応答

10.50
2.5

中低E

通常米投与群

通常米投与群

10.50
pre 0

11 21 32 42 53 63 74

Cpre 0F

74日後
74日後

0.50

74日後
74日後
ELISA value

ELISA value

111 21 32 42 53 63 74

GMライス
GMライス 通常米投与群 投与群2.52P < 0.051.510.50
GMライス
GMライス 通常米投与群 投与群

図 10．
10．コラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有 GM ライスのライスの経口投与による経口投与による抗体産生による抗体産生抑制作用
抗体産生抑制作用

プチド含有 GM ライスの経口投与により症状を軽減できれば、治療への応用も期待できる。そこで、経口投与前に II型コラーゲンによる免疫感作を行い、抗体産生を誘導したマウスにコラーゲンペプチド含有 GM ライスを経口投与した場合の、抗体価の変動を解析して低減化を評価した。ウELISA value３）コラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有 GM ライスのライスの経口投与による経口投与による自己抗体応答による自己抗体応答の自己抗体応答の低減化の低減化の評価
既に関節炎を発症している患者に対して、コラーゲンペ
210A群

B群シⅡ型コラーゲンを FCA と共にマウスの尾付け根に皮内投 図 11．
11．経口投与前における経口投与前における 2 群間の群間のIgG１抗体価与し、その後の抗ウシⅡ型コラーゲン IgG1 抗体価の経時的 抗 II 型コラーゲン IgG１変化を ELISA 法により測定した。皮内投与の約２ヶ月後、ほぼすべての個体で抗体価の上昇がみられたため、抗体価の高い個体から交互に A 及び B、2 群に振り分け、抗体価の平均値と偏差がほぼ等しい２群（A, B 群 10 個体／群）を得た((図 11)。一方の群には、コラーゲンペプチド11)
6

含有 GM ライス、もう一方の群には通常米を前項と同様の方法で 2 週間経口投与した。この 2群では抗体応答の強度や個体間のばらつきが均等であるため２群間での差異が観察しやすいと考えられる。
抗ウシⅡ型コラーゲン特異的な IgG1 抗体及び IgG2a 抗体について、試験飼料投与開始日から42 日後及び 84 日後における抗体価を経口投与前の抗体価に対する変化率(%)で表した（図 12）12）。
42 日後においては、コラーゲンペプチド含有 GM ライス投与群と通常米投与群でほとんど差がなく、どちらの群も増減がみられた個体が少ないのに対して (図(図 12－12－A)、84A)
日後ではコラーゲ
ンペプチド含有 GM ライス投与群では 10 個体全てにおいて IgG1 抗体価の低下が確認された((図12－12－B)。IgG2aB)抗体についても同様にして変化率を表した((図 12－12－C, D)。84D)
日後において、コラーゲンペプチド含有 GM ライス投与群で、IgG2a 抗体が上昇した 2 個体を除いては、全ての個体で抗体価の低下が観察された。このように、IgG2a 抗体についても IgG1 抗体と同様に低減化傾向が観察された。
以上のことから、コラーゲンペプチド含有 GM ライスは、経口投与することで既既に誘導され誘導されているⅡコラーゲンにする免疫応答免疫応答も低減化するすることが示された。ている
Ⅱ型コラーゲンに対する免疫応答も低減化
する

42日後
42日後

抗体価
抗体価のの変化率（ VS day 0 , ％）A

IgG1抗体IgG1抗体C120100408060302040201000-20-40-10-20-60-80

84日後
84日後

抗体価
抗体価のの変化率（ VS day 0 , ％）B

IgG2a抗体
IgG2a抗体50-30

D12010050408060304020200

100-20-40-10-60-20-80-30

GMライス
GMライス
投与群

通常米投与群

GMライス
GMライス
投与群

通常米
投与群

図 12．
12．コラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有 GM ライスのライスの経口投与による経口投与による抗体応答による抗体応答の抗体応答の低減化

５．考察及び考察及び今後の今後の展望
１）コラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有 GM ライス系統
ライス系統の系統の作出
II 型コラーゲンの免疫寛容原性ペプチド配列 4 つを連結して作製した人工遺伝子を、イネの主要な貯蔵タンパク質であるグルテリンに結合させ、発現、蓄積させた GM ライス系統を得た。
このように、本研究では、リウマチ性関節炎を標的とした免疫寛容原性ペプチド配列と他のタンパク質とを融合タンパク質として発現させることで、従来難しいとされていたペプチドの種子への蓄積に成功した。この方法論を用いることで、他の自己免疫疾患における免疫寛容原性ペプチドや生理活性ペプチドを容易に発現・集積することが可能になると考えられる。今回用いたタン7

パク質発現系で得られたペプチドは GM ライス 1 粒あたり約 1 µg であったが、発現プロモーターや融合させるタンパク質の種類を検討することにより収量増加が見込め、食品としてだけではなくペプチド医薬の製造を行う植物工場としての応用も期待できる。また、常温で比較的長期にわたり安定的に保存が可能であるイネ種子という形状で目的の物質が得られることから、保管、及び、輸送コストの削減というメリットも期待できる。
２）コラーゲンペプチド含有
コラーゲンペプチド含有 GM ライスのライスの経口投与による経口投与による自己抗体応答予防・緩和効果
による自己抗体応答の自己抗体応答の予防・
コラーゲンペプチド含有 GM ライス及び通常米を２週間経口投与し、その後ウシⅡ型コラーゲンで感作した場合、コラーゲンペプチド含有 GM ライス投与群では、対照群と比較して抗ウ
シⅡ型コラーゲン IgG1 及び IgG2a 抗体の産生応答が遅延し、かつ、IgG2a 抗体に関しては 74 日後において統計的に有意な抗体応答の抑制が観察された。これらの結果は、コラーゲンペプチド含有 GM ライスの摂取がリウマチ性関節炎において予防効果を示す可能性を示唆している。
また、コラーゲンペプチド含有 GM ライスを経口投与することで既に誘導されているウシⅡ型コラーゲンに対する免疫応答についても低減する傾向が観察された。また、その作用は経口投与から２ヶ月以上が経過してから起こることが示唆された。このことから、既にリウマチ性関節炎を発症している患者に対して、長期にわたって経口投与するような臨床応用も期待できる。
本研究の結果から、精製した合成ペプチドと同様に、植物体に融合タンパク質として蓄積させた免疫寛容原性ペプチドをコメとして摂取しても、自己免疫性の抗体応答への抑制作用を示すことが明らかとなった。これまでに、自己免疫疾患を標的として、作物で発現させた免疫寛容原性ペプチドによる経口免疫寛容を目指す類似の研究は無いが、I 型糖尿病をはじめとする他の自己免疫疾患への適用も期待できる。
今後、ペプチド集積 GM ライスの投与量や投与期間を検討することにより更なる効果の増強も可能と考えられる。また、本研究では、経口投与後に効率的に消化管内でペプチドが消化酵素により切り出されるようにするため、ペプチド間及びタンパク・ペプチド間に消化酵素の認識配列を挿入したが、今後は、投与されたコメに含まれる融合タンパク質のうち、どの程度の割合でペプチドが切り出され、どのような形で免疫系に作用するのかを明らかにする必要がある。これ
らを明らかにすることにより、投与量及び投与期間の最適化へのフィードバックが可能であり、さらには、効果的な免疫寛容原性ペプチドを消化管内で遊離させるような人工ポリペプチドの設計にも繋がると考えられる。
本研究で得られた成果の一部は、筆者も発明者の１人となっている国内特許及び国際特許（米国とドイツ）として出願済みであり、この技術がバイオ関連企業によって活用され、近い将来に、関節炎や自己免疫疾患の予防と治療に用いる免疫寛容原性ペプチド含有米の商業的な生産が実現することを期待している。
６．謝辞
本研究を行うにあたり、ご指導・ご鞭撻を賜りました名古屋大学大学院生命農学研究科応用分子生命科学専攻の松田幹教授、青木直人助手（現・三重大学・准教授）、灘野大太准教授、岡島哲也助教、及び、共同して研究を進めた橋爪不二夫さん(三重県科学技術振興センター)、掛橋美沙子さん(現・アストラゼネカ)にこころより感謝申し上げます。
また、グルテリン関連の遺伝子、および共形質転換用ベクターを分譲いただいた日本たばこ株
式会社植物イノベーションセンターに感謝いたします。
8７．参考文献
Courtenay JS, Dallman MJ, Dayan AD, Martin A, Mosedale B. (1980) Immunisation against
heterologous type II collagen induces arthritis in mice. Nature 283, 666-668
Cremer MA, Rosloniec EF, Kang AH. (1998) The cartilage collagens: a review of theirstructure, organization, and role in the pathogenesis of experimental arthritis in animals
and in human rheumatic disease. J Mol Med. 76, 275-288.
Cutolo M, Villaggio B, Craviotto C, Pizzorni C, Seriolo B, Sulli A. (2002) Sex hormones andrheumatoid arthritis. Autoimmun Rev. 1, 284-289.
Khare SD, Krco CJ, Griffiths MM, Luthra HS, David CS. (1995) Oral administration of an
immunodominant human collagen peptide modulates collagen-induced arthritis. J Immunol.
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Todd JA, Acha-Orbea H, Bell JI, Chao N, Fronek Z, Jacob CO, McDermott M, Sinha AA,
Timmerman L, Steinman L, et al. (1988) A molecular basis for MHC class II-associatedautoimmunity. Science 240, 1003-1009
Trentham DE, Dynesius-Trentham RA, Orav EJ, Combitchi D, Lorenzo C, Sewell KL, Hafler
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山本一彦（1994）自己免疫疾患

羊土社

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