野生動物由来大腸菌の薬剤耐性小川恵子
岐阜大学大学院連合獣医学研究科（〒 501-1193

岐阜県岐阜市柳戸 1-1）

る。そこで，本研究では，野生動物における薬剤1．はじめに耐性菌の拡散に重要な要因の推定を目的とし，その基礎データとして，日本各地の野生動物の薬剤近年，一般の人々のアウトドア活動の増加に伴耐性 E. coli 保有状況とその伝播動態を調べた。

い，野生動物の活動域と人・家畜の利用域が重複

2．材料及び方法する機会が増加している。野生動物による農林業被害報告も多数見られる。このような人と野生動（1）調査地概要及び採材物の活動域の重複が，人・家畜・野生動物間の関係性にもたらす変化として，病原体の伝播動態の2008 年から 2009 年にかけて，北海道知床半島変化が予想される。これまで，野生動物における南部，青森県下北半島西部，岐阜県，鹿児島県屋

薬剤耐性菌の拡散は，人間活動との直接的・間接

久島西部の 4 地域で野生動物の糞便 350 検体を採。
的接触によると考えられてきた［16］公有林・取した（表 1）。これらの調査地は国有林，これまでに，様々な環境にある野生動物の薬剤民有林，一般道，林道・登山道，集落，市街地を耐性菌保有状況に関する研究が行われている。多含み，国有林以外の地域では一般人の利用がある。

くの研究は人［2］，家畜［12］，あるいは人や家路上や林内の落下糞便を採取し，糞便の外見から畜の排泄物［1］と隣接して生息する野生動物か動物種を推定した。落下糞便の他，岐阜大学応用らの耐性菌の分離を報告している。しかし，我々生物科学部野生動物医学研究室，青森県下北郡佐が青森県下北半島の野生ニホンザル（以下サル）

井村役場から，狩猟もしくは有害鳥獣駆除で捕獲に対して行った先行研究では，農業被害や住居付された個体の直腸便の提供を受けた。また，岐阜

近を通過するなどの人との間接的接触があるにも大学人獣共通感染症学研究室で凍結保存されていかかわらず，薬剤耐性 Escherichia coli 保有率はたイノシシ捕獲個体の糞便懸濁液の上清の提供を低いという結果が得られている［15］。人間活動受けた。凍結保存されていた糞便懸濁液上清を除の影響が最も少ないと考えられる極地に生息する

く糞便検体は，細菌分離に供するまで常温もしく鳥類から，多剤耐性 E. coli が分離されたというは 4˚C で保存した。
ア．E. coli の分離・同定報告もある［18］。これらの報告から，野生動物における薬剤耐性菌の拡散メカニズムは，従来考糞便を滅菌リン酸緩衝液（PBS）で懸濁した

えられていたように人間活動の影響だけでなく，10％及び 1％希釈液を DHL 寒天培地に塗布し様々な要因に影響される複雑なものだと思われ37℃で 16-24 時間培養した。一部の糞便検体は共同研究者：大屋賢司，福士秀人連絡責任者：福士秀人（岐阜大学大学院 連合獣医学研究科，〒 501-1193 岐阜県岐阜市柳戸 1-1）
本稿は平成 23 年 11 月 19 日に開催された第 38 回動物用抗菌剤研究会シンポジウムにおける講演の概要である。

19

20 動物抗菌会報 33（2011）
表 1 各調査地で採取した糞便検体数及びおよび E. coli 菌株数
調査地

動物種検体数

大腸菌陽性（分離率）

菌株数

45

29（64.4％）

139

142

69（48.6％）

253

31（33.3％）

4計14570（48.3％）257

哺乳類（サル，シカ，イノシシなど 14 種 a）

108

73（67.6％）373

鳥類（サギなど 4 種 ）75（71.4％）

20計

知

床

シカ

下

北

哺乳類（サル，カモシカ，タヌキなど 8 種 ）
a

ヤマドリ
岐阜

a

屋久島

115

78（67.8％）

393

サル

30

29（96.7％）

109

シカ

1312（92.3％）

48

タヌキ

21（50.0％）34542（93.3％）

160

350

219（62.6％）

949

計
合a計

糞便の外見から動物種を推定できなかった落下糞便は，不明哺乳類または不明鳥類とした。不明哺乳類・鳥類の糞便のうち，外見が類似しているものは 1 種として扱った。

調査地で直接 DHL 寒天培地に塗布し，常温で˚C で 16-24 時間培養した。抗菌剤含有培地上で最大 2 週間培養した。細菌の増殖が見られない増殖した菌株を耐性とした。

場合は，Luria-Bertani（LB）ブロスでの増菌培

上記のいずれかの方法により耐性と判定され養及び DHL 寒天培地と普通寒天培地の混合培た菌株と，一部の感受性株に対して，微量液体地での培養を試みた。1 検体あたり最大 20 コ希釈法（動物用抗菌剤研究会 2003 年改定標準

ロニーの乳糖分解菌または優勢な細菌を釣菌法）を実施し［8］，最小発育阻止濃度（MIC）し，DHL 寒天培地に 2 〜 3 回継代後，単コロニーを 測 定 し た。 薬 剤 耐 性 は 臨 床 検 査 標 準 協 会を普通寒天培地で培養した。
オキシダーゼ試験，（CLSI）の基準に従い判定した［6］。それぞれ

TSI 培地及び LIM 培地での培養による生化学の薬剤感受性試験で検査した抗菌剤を表 2 に示性状試験後，E. coli と生化学性状が一致する分した。

離株に対して，ID テスト EB-9（日水，東京）

ウ．薬剤耐性遺伝子の検索及び EB-20（日水）を用いて菌種を同定した。

OTC 耐性株及び同一地域で採取された感受ID テストにより E. coli と同定された 949 株（表性株の一部に対して，5 種類のテトラサイクリ1）を凍結保存し，以下の実験に供した。

tet（B），tet（C），ン耐性（tet）遺伝子（tet（A），
tet（D），tet（M））の PCR を実施した［14］。

イ．薬剤感受性試験
全分離株に対し，ディスク拡散法もしくは菌体を 1xTris-EDTA（TE）バッファーに懸濁し，抗菌剤含有ミュラーヒントン寒天培地での培加熱した上清を DNA 鋳型として用いた（以下養によるスクリーニングを行った。ディスク同様）。また，ABPC 耐性株及び同一地域で採拡散法は SN ディスク（日水）を使用し，E.
coli ATCC 25922 及 び Pseudomonas aeruginosa

取された感受性株の一部に対して，4 種類のβ-ATCC 27853 により精度管理を行った。抗菌剤

ラ ク タ マ ー ゼ（bla） 遺 伝 子（blaPSE，blaSHV，blaTEM，blaOXA）の PCR を実施した［3, 7］。

含有ミュラーヒントン寒天培地での培養によるキノロン系抗菌剤耐性株及び耐性株と同一スクリーニングは次のように行った。大腸菌株

地域で採取された感受性株の一部に対して，
gyrA，gyrB，parC，parE のキノロン耐性決定を抗菌剤含有培地及び非含有培地に接種し，37

小川恵子／野生動物由来大腸菌の薬剤耐性／ 33（2011） 21表 2 薬剤感受性試験で検査した抗菌剤
試験方法

抗菌剤 a)（含有量・濃度）

ディスク拡散法CEZ（30μg），
CTX（30μg），
CAZ（30μg），SM（10μg），
KM（30μg），
ABPC（10μg），
OTC（30μg），NA（30μg），NFLX（10μg），
OFLX（5μg），
CP（30μg），
GM（10μg），
ST（23.75/1.25μg）

抗菌剤含有培地によるスクリーニング，
CEZ（32μg /mL），SM（32μg /mL）
，OTC（16μg /mL），
NA（32μg
ABPC（32μg /mL）/mL），ERFX（4μg /mL），CP（32μg /mL, TMP（16μg /mL）

微量液体希釈法

ABPC，CEZ，DSM，OTC，NA，ERFX，CP，TMP（0.0625-128μg/ml）a）ABPC：アンピシリン，CEZ：セファゾリン，CTX：セフォタキシム，CAZ：セフタジジム，SM：ストレプトマイシン，KM：カナマイシン，GM：ゲンタマイシン，OTC：オキシテトラサイクリン，NA：ナリジクス酸，NFLX：ノルフロキサシン，OFLX：オフロキサシン，CP：クロラムフェニコール，ST：スルファメトキサゾール・トリメトプリム，
ERFX：エンロフロキサシン，TMP：トリメトプリム，DSM：ジヒドロストレプトマイシン

領域（QRDR）の塩基配列解読を実施した［9,19］。塩基配列解読はタカラバイオ株式会社（三3．結重）に委託した。得られた塩基配列は既報のgyrA（GenBank accession no. X06373），gyrB

果（1）野生動物由来 E. coli の薬剤耐性（X04341），parC（M58408 及び L22025 の修正），
parE（M58409 及び M37833 の修正）の塩基配

知床半島のニホンジカ（以下シカ）糞便 1 検体から OTC 耐性株を 1 株分離した。また，下北列と比較した。

半島のタヌキ糞便 1 検体から ABPC，NA，ERFX

エ．血清型別の 3 剤耐性株を 4 株分離した。狩猟個体，有害鳥（デンカ生研，東京）を用いた O 群別試験を実獣駆除個体からは耐性株は分離されなかった。E.
coli 陽性検体あたりの薬剤耐性菌保有率は，4 地施した。

域合計で 0.91％（2/219）だった。各地域の薬剤

オ．系統グループ分類

耐性菌保有率はそれぞれ知床で 3.45％（1/29），

全菌株に対して，病原大腸菌免疫血清「生研」全菌株に対して，マルチプレックス PCR に

下北で 1.43％（1/70），岐阜と屋久島で 0％だっ

よる 4 系統グループ（グループ A，B1，B2，D）

た。地域間で薬剤耐性菌保有率に有意差はなかっ。
への分類を実施した［5］た（フィッシャーの直接確率検定，P ＝ 0.19，nカ．ランダム増幅遺伝子多型（RAPD）解析＝ 219）。

耐性株及び耐性株と同一地域で採取された耐性株及び同一検体・同種動物から分離された感受性株の一部に対して RAPD 解析を実施し感受性株の性状を表 3 に示した。シカ由来 OTC

た［11, 20］。PCR に は GoTaq® Green Master

耐性株からは tet（B）遺伝子が検出された。タヌ

Mix, 2x（Promega, Wisconsin, USA）を用い，

キ由来 3 剤耐性株からは blaTEM 遺伝子が検出されPCR 反応液中の DNA 鋳型濃度は 4 ng/µl に統た。また，QRDR の塩基配列には，gyrA に 2 カ所一した。PCR は M13 及び DAF4 の 2 種類のプ（S83L，D87N），parC に 2 カ 所（S80I，E84V），ライマーそれぞれについて 2 回ずつ実施し，2回とも増幅された再現性のあるバンドを用いて計 4 カ所のアミノ酸置換が認められた。gyrB 及びparE には変異は認められなかった。感受性株か無荷重平均距離法（UPGMA 法）により系統樹

らは tet 遺伝子，bla 遺伝子は検出されず，QRDRを作成した。の変異も認められなかった。

キ．統計解析
野生動物の薬剤耐性 E. coli 保有率を，フィッシャーの直接確率検定により地域間で比較した。P<0.05 を統計的に有意とした。

（2）知床及び下北半島の野生動物由来 E. coli の伝播動態
知床由来株 48 株及び下北由来株 83 株に対して

22 動物抗菌会報 33（2011）
表 3 野生動物由来耐性株と同一検体・同種動物由来感受性株の性状菌株 No.

検体 No.

動物種

HOK-92

北 -22

シカ耐性

系統パターン a)

グループ

OTC

B1

北 -22

シカ感受性

HOK-93
SHIM-166〜 169

QRDR 変異 c)
gyrA

parCtet（B）b)

NTNTNT̶NTNTNTNT

blaTEMS83L,
D87N

S80I,
E84V

NT̶wtwt

D
B2

下 -77

タヌキ

ABPC,NA,
ERFX

下 -117タヌキ

感受性SHIM-274
SHIM-278

blaA

HOK-90
HOK-91

tet

B2
B1

SHIM-282

DB2a）OTC：オキシテトラサイクリン，ABPC：アンピシリン，NA：ナリジクス酸，ERFX：エンロフロキサシンb）NT：未実施c）QRDR：キノロン耐性決定領域，S：セリン，L：ロイシン，D：アスパラギン酸，N：アスパラギン，I：イソロイシン，
E：グルタミン酸，V：バリン，wt：野生型

RAPD 解析を実施した。知床由来株では，M13認められなかった（図 1-B）。サル由来株では，

プ ラ イ マ ー を 用 い た RAPD 解 析（ 以 下，M13-異なる検体由来にもかかわらず，今回実施した遺RAPD 解析）により，42 タイプの RAPD 型が認伝子型別及び血清型別で互いに識別できない菌株められた。DAF4 プライマーを用いた RAPD 解が多数認められた（図 1-B）。一方，サル以外の析（以下，DAF4-RAPD 解析）により，30 タイプ動物由来株では，いずれかの型別方法で異なる検の RAPD 型が認められた。下北由来株では，25体由来株を識別することができた（図 1-B）。また，タイプの M13-RAPD 型，及び 23 タイプの DAF4-知床由来株と同様，同一検体由来の菌株間で遺伝RAPD 型が認められた。より多くの RAPD 型に子型及び血清型に多様性がある例が認められた。

識別することができた M13-RAPD 解析に基づいて作成した下北由来株の系統樹を，図 1 に示した。

4．考察

知床のシカ由来 OTC 耐性株（HOK-92）と，同一検体から分離された感受性株（HOK-90，91，

本研究の調査地のうち，国有林以外の地域は一93）とは系統グループが異なった（表 3）。同様に，般人の利用があるにもかかわらず，野生動物の薬これら 4 株の M13-RAPD 型，DAF4-RAPD 型は異剤耐性菌保有率は 4 地域のいずれも低かった。まなった。

た，頻繁に人里に出没する有害鳥獣駆除個体から

下 北 の タ ヌ キ 由 来 3 剤 耐 性 株（SHIM-166 〜耐性菌は検出されなかった。したがって，野生169）は M13-RAPD 解析により感受性株とは識別

動物における耐性菌拡散には，人間活動の有無よ。DAF4-RAPD 解析でも同様の結果された（図 1）

りも重要な影響要因が存在する可能性が示唆されが得られた。下北由来株は M13-RAPD 解析によた。

り 4 つのクラスター（クラスター I 〜 IV）に分類

OTC 耐性株が知床のシカから分離された。テされた（図 1-A）
。サル以外の野生動物由来株はトラサイクリン系抗菌剤（TCS）は獣医領域で最主にクラスター I と II に，サル由来株は主にクラも広く使用されている抗菌剤であり［10］，TCSスター III と IV に分類された。異なる動物種から耐性は日本の食用動物で最も多く検出される耐性分離された菌株間で M13-RAPD 型，DAF4-RAPDである［10］。本研究の調査地に大規模な畜産地型，系統グループ，血清型がすべて一致する例は帯は含まれていないものの，知床半島では野生の小川恵子／野生動物由来大腸菌の薬剤耐性／ 33（2011） 23

図 1 下北半島の野生動物由来 E. coli 株の系統関係
M13 プライマーを用いた RAPD 解析の結果に基づき，UPGMA法により系統樹を作成した。菌株間の類似度としてはダイス係数を用いた。A は下北由来株全体の系統樹，B はクラスター II および III（A 灰色枠内）を拡大したものである。タヌキ由来 3 剤耐性株の菌株番号を太字で示した。

24 動物抗菌会報 33（2011）

シカによる牧草の食害が発生している。したがっることが示唆された。同種の動物由来株間の遺て，ウシ由来の TCS 耐性株もしくは環境中のウ伝的近縁性は，他の動物種に比べサル由来株間でシ由来の TCS 残留物に野生のシカが曝露されて比較的高かった（図 1-B）。この結果から，E. coliいる可能性が考えられる。しかし，OTC は土壌の種内伝播の可能性は動物種によって異なると考，細菌が産生する天然由来の抗菌剤であるため［4］えられる。サルは，同一の群れに属する個体間で野生動物由来 E. coli において，獣医領域での使グルーミングなど直接的な接触を頻繁に行う。こ用とは無関係に OTC 耐性が存在する可能性も考のような動物の習性が E. coli の種内伝播に影響えられる。野生動物由来株における OTC 耐性のに及ぼす可能性が考えられる。したがって，耐性起源を解明するには，今後，畜産農家付近に生息菌のモニタリングを行う際の対象動物の選定，及する野生動物についても同様の疫学調査を行う必び耐性菌伝播リスクの推定には動物の習性を十分要がある。に考慮する必要があると思われる。

下北半島のタヌキから，ABPC，NA，ERFX のRAPD 解析と系統グループ分類により，同一検3 剤耐性株が分離され，blaTEM 遺伝子が検出され体由来の菌株間に遺伝的多様性があることも明らた。blaTEM を保有する ABPC 耐性は人間活動のかになった（表 3）。この結果は，今回耐性株が影響の少ない自然地域の野生哺乳類でも報告さ分離されなかった検体にも耐性株が潜在しているれているため［12］，農村部に生息するタヌキか可能性を示唆している。今後は，細菌分離の際にら検出されたことは驚くべきことではない。一抗菌剤による選択を行う等，腸内細菌叢の優勢株

方，ERFX は合成抗菌剤であるフルオロキノロンだけでなく劣勢株も含めて野生動物の保有する薬（FQ）の一種である。本研究で分離された耐性株

剤耐性菌について詳細に調査する必要がある。

では，gyrA 及び parC の QRDR に高度の変異（4本研究では，日本の農村部及び山間部では，人カ所のアミノ酸置換）が認められており，ERFXもしくは他の FQ による選択圧のない状況下で，間活動が行われていても野生動物から薬剤耐性 E.
coli はほとんど検出されず，野生動物間で耐性菌偶発的な点突然変異により耐性が出現したとは考が伝播する危険性も低いことが明らかになった。

え難い。したがって，タヌキ由来株の ERFX 耐

また，耐性菌に限らず，野生動物における E. coli性は，医療・獣医領域における FQ 使用と関連がの伝播動態・宿主との共生関係は複雑であるこあると考えられる。日本のタヌキの行動範囲はとが示唆された。その一方で，合成抗菌剤である10-600 ha と言われている［17］。今回耐性株が検ERFX に対する高度耐性が認められたことから，出されたタヌキ糞便の採材地点から 5 km 以内に医療・獣医領域における抗菌剤使用が野生動物

3 つの集落が位置していることから，これらの集の耐性菌保有の影響要因の一つであることは明ら落内で FQ の投薬治療を受けた人もしくは家畜かかである。これらの結果は，野生動物における薬らタヌキに耐性株が伝播した可能性が考えられ剤耐性菌の拡散メカニズムの複雑さを示唆しておる。また，キノロン系抗菌剤は人では主に尿中にり，今後，人間活動の有無だけでなく，その種類［21］，動物では尿中または糞便中に排泄されるや頻度，あるいは対象動物の習性など様々な人為［13］。したがって，もう一つの可能性として，タ的・生態的要因との関連性について検討する必要

ヌキの生息範囲内の環境が，投薬治療を受けた人・があると考えられる。

家畜から排泄された FQ によって汚染されていた可能性が考えられる。

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1-1 Yanagido, Gifu, Gifu 501-1193, Japan
We compared the antimicrobial resistance, serotypes and genotypes of Escherichia coli from wildlife among fourareas (Shiretoko, Shimokita, Gifu and Yakushima) to estimate factors affecting the spread of resistant bacteria
in wildlife. We collected 350 fecal samples in 2008 and 2009, and obtained 949 isolates of E. coli. All isolates werescreened for antimicrobial resistance. Resistant E. coli isolates and a subset of susceptible ones were examined by
PCR for tetracycline-resistant (tet) genes and beta-lactamase (bla) genes and the sequencing of quinolone resistancedetermining region (QRDR). They were also characterized by random ampliﬁed polymorphic DNA (RAPD) analysis,
serotyping, and phylogenetic grouping to investigate their transmission. The prevalence of resistant E. coli isolates
in Shiretoko, Shimokita, Gifu and Yakushima were 3.45% (1/29), 1.43% (1/70), 0% (0/78) and 0% (0/42), respectively.
One resistant E. coli isolate from a deer in Shiretoko was resistant to oxytetracycline, carrying tet (B) gene. Fourresistant E. coli isolates from a raccoon dog in Shimokita were resistant to ampicillin, nalidixic acid and enroﬂoxacin(ERFX), carrying blaTEM gene. Two amino acid substitutions were observed in the QRDR of gyrA (S83L, D87N) andparC (S80I, E84V), respectively. Resistant E. coli isolates were distinguished from susceptible ones by RAPD analysis.
No isolates have identical genotypes with those from different host species. These results suggest that resistant E.
coli rarely transmits among different host species. However, the detection of ERFX-resistance implies that the use of
antimicrobials in medical or veterinary ﬁelds is associated with the resistance in E. coli from wildlife.

討論（座長：澤田拓士 理事長，金井 久 群馬県家畜衛生研究所）

質問（浅井鉄夫，動物医薬品検査所）

質問（金井

フルオロキノロンなどの合成抗菌薬だけでなく，フルオロキノロン耐性の話で，系統分類をすると

久，群馬県家畜衛生研究所）

tet（B），βラクタマーゼも本来大腸菌が持っている

B2 が多いという以前の発表がありましたが，B2 耐性ので耐性遺伝子ではないのでは。自然界の中に，天株はあの系統図のどこに入りますか。人からは分離然のもので人為的に移ってきたのではと考えてよいされるが，野生動物からどのように系統図で分類さのではないか。

れるのか。MLST もやってみたらいいのではないか。

答（小川恵子）答（小川恵子）比較対照がない。おそらく人為的な影響はあるとキノロン耐性株はスライドで囲ったところに示し思っている。てあります。人との関連性があるのではと考えてい小川恵子／野生動物由来大腸菌の薬剤耐性／ 33（2011） 27

る。MLST でヒト由来株と比較したい。
質問（金井久，群馬県家畜衛生研究所）群の中での共通性といわれたが，逆に遺伝子により群を識別，区別することができますか？

発言（江嵜英剛，畜産生物科学安全研究所）
まとめに示してあった畑作関連，環境影響についてですが，一見動物薬の使用と関連がなさそうに見える畑作地帯においても，薬が糞便などに残留し，答（小川恵子）堆肥化して畑にまかれるなど，動物薬が関与する可群としての接触がないようなサルの群からも遺伝能性もあります。糞便が堆肥化処理された後も，薬子が一致した場合もあるので，RAPD 法では完全に剤によっては高い割合で力価を有していることもあ識別できないかもしれないので，PFGE の方がいいとります。抗菌薬は安定性が高いと畑にまかれても残思うので試してみたいと思います。しかし，過去に留するのでそういうのを考えても面白いのではと思はこの PFGE 法で群レベルの比較が可能でした。

います。