糸状菌に特有の小胞体ストレス下における分泌タンパク質 mRNA の減少：その機構の解明およびタンパク質分泌生産への応用に向けて
新谷 尚弘
東北大学大学院 農学研究科
研究の目的
真核細胞をジチオトレイトール (DTT) やツニカマイシンで処理すると、立体構造が異常なタンパク質が小胞体に蓄積し、小胞体シャペロン遺伝子などの転写活性化が起こる。この現象は unfolded protein response (UPR)と呼ばれる。糸状菌では、UPRに加えて主要分泌タンパク質遺伝子の転写量が特異的に減少する repression undersecretion stress (RESS)という現象が観察される。RESS の原因は分泌タンパク質遺伝子プロモーターに依存した転写抑制だと推測されているが 1)、詳細は不明である。
一方、私たちは麹菌 Aspergillus oryzae がその主要な分泌酵素である α−アミラーゼを生産する培養条件下で UPR を引き起こすことを明らかにしている 2)。また、麹菌で折り畳みが異常な分泌タンパク質を発現させると、UPR を誘導することも示している 3)。つまり、タンパク質の生産現場で麹菌は小胞体ストレスを受けており、そのストレスにより RESS を介した分泌タンパク質生産の負のフォードバック制御が働いている可能性が危惧された。そこで、私たちは麹菌における RESS の機構を明らかにすることを目的とした。
方法
RESS の検出法
麹菌株を 1%フルクトース、0.1%ペプトンを含む Czapek-Dox (CD)液体培地で 24時間培養した後、炭素源を 1%マルトースに変えた同培地で 2 時間培養し、α−アミラーゼ遺伝子の発現を誘導した。その後、培養液に DTT（終濃度 20 mM）を添加し、経時的に回収した菌体から mRNA を調製し、ノーザンブロット解析に供した。チアミン抑制性 nmtA プロモーター制御下で ireA を発現する場合は、上記培養にチアミン（終濃度 10 µM）を加えた。
結果
１）DTT 処理による α−アミラーゼ遺伝子 mRNA の減少におけるプロモーター依存的な転写抑制の関与
DTT 処理区で麹菌野生株において amyA/B/C mRNA 量の急激な減少がみられた。
同条件で amyA/B/C の転写活性化因子である amyR の mRNA 量も緩やかであるが減少したため、AmyR の減少に伴う amyA/B/C の転写不活性化が RESS の原因であることが示唆された。そこで、amyB をエノラーゼ遺伝子 enoA のプロモーター制御下で発現させたところ、依然として DTT 処理に伴う mRNA の減少が観察された。これらの結果から、プロモーターに依存した amyA/B/C の転写抑制は mRNA 減少の主原因ではないことが示された。
２）小胞体ストレス条件下で α−アミラーゼ mRNA は IreA 依存的に分解される細胞質で合成された分泌タンパク質の新生鎖はリボソーム、mRNA との三者複合体として小胞体膜上にターゲティングされる。従って、合成中の分泌タンパク質のmRNA はストレスを受けた小胞体によって除去されることが考えられた。そこで、小胞体ターゲティングシグナルのみにフレームシフト変異を持つ AmyB（AmyB-FS）
を発現する麹菌株を作製し、DTT 処理に伴ってその mRNA が減少するか解析した。
その結果、amyB-FS の mRNA の急激な減少は回避されることが明らかとなった。このことから、amyB mRNA の減少は amyB mRNA の小胞体へのターゲティングと深く関わっていることが示唆された。
次にこの現象が UPR 制御下にあるか調査した。小胞体ストレス条件下では、bZIP型転写因子 HacA の mRNA が小胞体膜貫通型キナーゼ/エンドリボヌクレアーゼである IreA によって特殊なスプライシングを受け、UPR が起こることが知られている 4)。
そこで、ireA 発現抑制株で RESS を解析したところ、amyA/B/C mRNA の減少は回避された。また、活性化型 HacA（HacA-i）を発現する ireA 破壊株においても amyA/B/CmRNA の減少が回避されたことから、RESS は UPR の下流ではなく IreA によって直接的または間接的に制御されていることが示唆された。
私たちは、amyA/B/C mRNA が DTT 処理下で IreA 依存的に分解されていると仮定した。そこで、amyA/B/C mRNA の分解産物の検出を試みた。RNA がエンドリボヌクレアーゼで切断されると、生じた mRNA 断片はエクソリボヌクレアーゼで消化されることが知られている。mRNA の 3’側からの分解に関わっているエクソソームのサブユニット Ski2 の遺伝子破壊株では DTT 処理によって、低分子の amyA/B/C mRNAが検出された。つまり、断片化された amyA/B/C mRNA がエクソソームの欠損で検出されるようになった。このことは mRNA の分解が amyA/B/C mRNA の減少に関わっていることを示している。
結論
DTT による小胞体ストレス条件下で起こる麹菌分泌タンパク質の mRNA の減少には、mRNA 分解が関わっていることが示された。分泌タンパク質新生鎖、リボソームとの複合体として小胞体膜上にターゲティングされた mRNA が小胞体ストレス条件下で活性化された IreA によって切断を受け、生じた mRNA 断片をエクソソームが分解するというモデルを想定している。DTT 処理下における分泌タンパク質 mRNAの分解は Regulated Ire1-dependent decay (RIDD)として、ショウジョウバエで初めて報告され 5)、哺乳類や植物でも報告されており、糸状菌でも RIDD が分泌タンパク質

mRNA の分解に関わっていることが示唆された。
異種タンパク質の分泌発現で惹起される小胞体ストレスが RIDD を活性化するのであれば、タンパク質生産の障害となり得る。今後は異種分泌タンパク質の過剰生産が RIDD を引き起こすか解析する必要がある。
謝辞
本研究は横田淳一、杉山優子、佐藤駿、田中瑞己博士、張斯来博士、五味勝也教授らの協力の下、行われました。御礼申し上げます。

図 ジチオトレイトール処理下における amyB mRNA の分解モデル
野生型 amyB mRNA は新生鎖の小胞体ターゲティング・シグナルに依存して小胞体膜上にリクルートされ、分解を受ける。小胞体ターゲティング・シグナル領域にフレームシフト変異を持つ amyB-FS mRNA は小胞体にターゲティングされず、分解から回避される。
文献
1)
Pakula, T. M., Laxell, M., Huuskonen, A., Uusitalo, J., Saloheimo, M. and Penttilä, M.
(2003) The effects of drugs inhibiting protein secretion in the filamentous fungus
Trichoderma reesei. Evidence for down-regulation of genes that encode secreted
proteins in the stressed cells, J. Biol. Chem., 278: 45011-45020.

2)

3)

Tanaka, M., Shintani, T. and Gomi, K. (2015) Unfolded protein response is required
for Aspergillus oryzae growth under conditions inducing secretory hydrolytic enzyme
production, Fungal Genet. Biol., 85: 1-6.
Yokota, J.-I. et al. (2017) Cellular responses to the expression of unstable secretory
proteins in the filamentous fungus Aspergillus oryzae, Appl. Microbiol. Biotechnol.,

4)

101: 2437-2446.
Saloheimo, M., Valkonen, M. and Penttilä, M. (2003) Activation mechanisms of the5)HACI-mediated unfolded protein response in filamentous fungi, Mol. Microbiol., 47:1149-1161.
Hollien, J. and Weissman, J. S. (2006) Decay of endoplasmic reticulum-localized
mRNAs during the unfolded protein response, Science, 313: 104-107.