The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.3 No.1 2014

ASSOCITATION OF THE ONSET OF MASTITIS AFTER CALVING WITH
IMMUNE INDEX AND NUTRITION CONDITION

原著論文

分娩後の乳房炎の発生と白血球ポピュレーション、
リンパ球幼若化反応及び栄養状態との関連性
阿部憲章 1）、佐藤千尋 1）、木戸口勝彰 1）、菊
1）岩手県中央家畜保健衛生所（〒 020-0173

佳男 2）＊、高橋秀之 3）

岩手県岩手郡滝沢村滝沢字砂込 390-5）2）（独）
農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究所（〒 062-0045

北海道札幌市豊平区羊ヶ丘 4）3）（独）農業・食品産業技術総合研究機構生物系特定産業技術研究支援センター（〒 331-8537 埼玉県さいたま市北区日進町 1-40-2）＊連絡責任者：菊佳男（独）農業・食品産業技術総合研究機構動物衛生研究所（〒 062-0045

北海道札幌市豊平区羊ヶ丘 4）

TEL：011-851-2175

FAX：011-853-0767

E-mail：yokiku@affrc.go.jp［要約］

分娩後の乳房炎発症と細胞性免疫及び栄養状態との関連性について検討した。周産期のホルスタイン
種乳用牛 14 頭から血液及び乳汁を採取し、負のエネルギーバランス、リンパ球幼若化反応及び初乳中の単核球構成について調査した。分娩後 1 週間以内に 5 頭が臨床症状を伴う環境性乳房炎に罹患し（乳房炎群）、9 頭は罹患しなかった（対照群）。乳房炎群は対照群に比べ、初乳中の CD14＋細胞率及び分娩後 1 週間のリンパ球幼若化反応が低値であり、分娩直後の遊離脂肪酸（1,006±146、682±95μEq/l）
並びに分娩後 1 週間のβヒドロキシ酪酸（824±26、621±66μmol/l）が高値であった。一方、分娩前後 4 週間のリンパ球幼若化反応と遊離脂肪酸濃度は負の関連を示し、分娩後 1 週間のリンパ球幼若化反応は体細胞数と負の関連、初乳中の CD14＋細胞率とは正の関連を示した。以上のことから、負のエネ
ルギーバランスが分娩後の免疫能低下に関連し、乳房炎の発症を誘導した可能性が示された。
キーワード：CD14＋細胞、エネルギーバランス、リンパ球幼若化反応、乳房炎、周産期［緒を引き起こし、乳房炎を始めとする周産期疾病論］に罹患するリスクを増大させる［4，7，9］。

分娩直後の乳房炎の発生は、生乳出荷期間の乳汁に含まれる好中球、リンパ球、単球/マ

短縮並びに年間乳量の減少に直結するため、経クロファージ等の免疫細胞は乳腺局所の細胞性済的被害が大きい。周産期は、分娩によるスト

免疫機能に重要な役割を果たしており、これら

レスあるいは分娩後の乳汁合成のため栄養要求

免疫細胞の構成変動及び機能低下は乳房炎への量増大に対する乾物摂取量不足に陥りやすい。

感受性を増大させることが示唆されている［1，そのため負のエネルギーバランスの増大等に

8，15-18］。一方、負のエネルギーバランスは

よって、代謝・内分泌機能及び免疫機能の低下

血液の細胞性免疫能を低下させることが報告されており、周産期疾病の発生原因の 1 つとして考えられる［10，19］。しかしながら、乳腺局

受付：2013 年   8 月 30 日
受理：2013 年 10 月   3 日

所における細胞性免疫機能と負のエネルギーバ－ 23 －

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分娩後の乳房炎発生と免疫指標並びに栄養状態との関連性

thiazol-2-yl］-2,5-diphenyltetra-zolium bromide;

ランスの関連性は十分に検討されていない。
本研究では、乳用牛の分娩後の乳房炎発生とSigma-Aldrich Co.）法により測定した。評価は、周産期における初乳及び血液中の免疫学的及び刺激指数（SI 値：PHA 添加ウェルの吸光度／

生化学的因子との関連性について検討した。

対照ウェルの吸光度）によって算出した。
乳汁検査：分娩直後及び分娩後 1 週間に採取［材料と方法］

した乳汁を CMT 変法により検査し、また同乳供試動物及び材料の採取：2010 年 5～10 月

汁 100μl を 10％羊血液寒天培地で 37℃ 24 時に、搾乳牛 60 頭を飼養する 1 酪農場のホルス間培養後、分離菌を定法に従い同定した。また、

タイン種搾乳牛 14 頭（初～4 産）を供試した。

既報［8，14，17，20，22］に従い、比重液（比供試牛の乾乳期間は 74±15 日（平均値±標準

重 1.077、リンホセパール I、㈱免疫生物研究所、

誤差）で、分娩予定日から換算し初産牛は 4 週群馬）を用いて初乳中の単核球を分離し、マ間、経産牛は 3 週間前まで農場内で放牧された。

ウス抗ウシ CD3（clone: MM1A, VMRD, WA,

その後、繋ぎ畜舎で分娩後 1 週間まで飼養（乾U.S.A.）及び CD14（clone: CAM36A, VMRD）、

草及び TMR 飼料を給与）された後、フリース

FITC 標 識 マ ウ ス 抗 ウ シ CD21（clone: CC1,

トールに移動された。分娩直後から分娩後 1 週

Serotec, Oxford, U.K.）及び WC1（clone: CC15,までに CMT 変法（PL テスター、日本全薬工

Serotec）を付与した。特異抗原 CD3 及び CD14

業㈱、福島）で陰性もしくは疑陽性であった牛については、FITC 標識ヤギ F（ab’）2 抗マウス

を対照群（n＝9、平均産次 1.7±0.3、乳房炎既IgG1 抗体（ベックマン・コールター㈱、東京）

往歴 2 頭）とし、陽性であった牛を乳房炎群（nを二次抗体として使用した。単核球構成比の解＝5、2.8±0.5、3 頭）とした。乳房炎群は、分析は、フローサイトメーター（EPICS XL、ベッ娩後 0 日に 2 頭、1、5、6 日に各 1 頭が CMT

クマン・コールター㈱）を用いて、単核球集団

変法陽性と判定された。材料採取は、分娩予定を抽出後、それら細胞中の特異抗原保有率の計日から換算し分娩前 3 及び 2 週間、また分娩直測によって行った。さらに分娩後 1 週間の乳汁後及び分娩後 1 週間の午前 9：00～10：00（採の体細胞数を体細胞数測定装置（Fossomatic

食後 1.5 時間）に実施し、その後臨床検査に供FC、フォス・ジャパン㈱、東京）により測定した。頸静脈より採取した血液は、37℃で 20した。

分間静置後、血清を分離した。乳汁は分娩直後

体細胞数と乳汁及び血液検査成績の関連：血及び分娩後 1 週間に後搾り乳を各分房から採取

液リンパ球幼若化反応及び初乳中単核球の免疫し、等量を混合して 4 分房の合乳とした。試験細胞（CD3＋、CD14＋、CD21＋、WC1＋細胞）期間中に、乳房炎群は 3 頭が食欲不振を呈し、構成比の分娩後 1 週間の体細胞数との関連性、

うち 2 頭はブドウ糖により加療され、残る 2 頭

また、試験期間を通じた（分娩前 3 及び 2 週間、も乳汁性状の異常がみられ、臨床型乳房炎の病

また分娩直後及び分娩後 1 週間）血液生化学検態を呈していた。

査成績とリンパ球幼若化反応との関連性をピア

臨床検査：ボディーコンディションスコア

ソン回帰分析により解析した。

（BCS）を Ferguson 法［12］により測定した。

統計処理：両群の各採材時結果の値は平均値

血液検査：血清を用い、遊離脂肪酸（NEFA）±標準誤差で示し、Student の t 検定で比較し及びβヒドロキシ酪酸（BHB）の各濃度を酵た。5％以下の危険率を統計学的有意差、10％素法（NEFA-C テストワコー、
和光純薬工業㈱、以下のそれを傾向とした。

大阪）及び比色法（ケトメーター N、アークレ［結イファクトリー㈱、滋賀）によりそれぞれ測定果］

した。また、Ohtsuka らの報告［14］に従って、

乳汁検査成績：分娩後 1 週間における乳房炎

ヘパリンにより抗凝固処理した血液から単核球

群の体細胞数は 809±199×103/ml であり、対を分離し、PHA（Phytohaemagglutinin; Sigma-

照群の 156±10×103/ml より有意に高値を示し

Aldrich Co., St. Louis, MO, U.S.A.）刺激によるた（p＜0.05）。乳房炎群の 5 頭から環境性乳房

リンパ球幼若化反応を MTT（3［4,5-dimethyl-炎菌である CNS（表皮ブドウ球菌）及び OS（環－ 24 －

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IMMUNE INDEX AND NUTRITION CONDITION

境性連鎖球菌）が分離された。Table 1 に乳房

BCS を Table 2 に示した。分娩前 3 週間では炎群と対照群との初乳中単核球の各種免疫細胞

乳房炎群が 3.35±0.17、対照群が 3.36±0.11 と構成率の比較を示した。CD14＋細胞率は乳房同水準で、その後分娩後 1 週間にかけて両群と炎群が 20.0±2.3％であり、対照群の 30.8±2.5％もに低下したが、分娩後 1 週間の乳房炎群（2.80に比較し有意に低かった（p＜0.05）。CD3＋細±0.15）及び対照群（3.08±0.09）のスコアに

胞率は乳房炎群が 10.0±2.9％、対照群が 16.6

両群間の差はなかった。また、分娩前 3 週間か±3.1％であり、WC1＋細胞率は乳房炎群が 9.3

ら分娩後 1 週間における BCS スコアの減少は、±2.9％、対照群が 18.8±3.0％と、両細胞群共乳房炎群は 0.55±0.05、対照群は 0.28±0.05 でに 乳 房 炎 群 が 低 い 傾 向 を 示 し た（p＜0.1）。

あり、両群間に有意な差を認めた（p＜0.05）。

CD21＋細胞率には両群間に有意な差は認めら

NEFA、BHB 及びリンパ球幼若化反応の推移を Table 3 に示した。NEFA 及び BHB 濃度

れなかった。
血液及び臨床検査成績：分娩前後の両群のは、両群ともそれぞれ分娩前に比較して分娩後に増加し、分娩直後における NEFA 濃度は、乳房炎群（1,006±145μEq/l）は対照群（682±

Table 1 Percentages of marker positive cells in colostrum mononuclear cells of control and mastitic cows
Surface antigen

Mastitic cows

Control cows

CD3 (%)

10.0±2.9

16.6±3.1†

CD14 (%)

20.0±2.330.8±2.5*

CD21 (%)

6.1±1.6

11.5±1.6

WC1 (%)

9.3±2.918.8±3.0†

95μEq/l）と比較して有意に高値を示し（p＜0.05）、BHB 濃度は、分娩 1 週間後に乳房炎群（824±26μmol/l）は対照群（621±66μmol/l）と比較して有意に高値を示した（p＜0.05）。リ
ンパ球幼若化反応の SI 値は、分娩前 3 週間では両群共に同水準であったが、分娩後 1 週間にValue was expressed as the mean±S.E.M.
Dagger indicates marginally significant diffenences as determinedby Student’s t-test. (p＜0.1)
Asterisk indicates significant diffenences as determined by Student’s t-test. (p＜0.05)

乳 房 炎 群（1.75±0.26） は 対 照 群（2.80±0.15）と比較して有意に低値となった（p＜0.01）。

Table 2 Change of body condition scores (BCS) of control and mastitic cows during the peripartum
period and difference in BCS between the three weeks before calving and each study day
Difference in BCS between the three weeks
before calving and each study day

BCSTime relative tocalving (calv)

Mastitic cows

Control cows

Mastitic cows

Control cows

－3 wk calv

3.35±0.17

3.36±0.11

──

－2 wk calv

3.30±0.22

3.36±0.11－0.05±0.02

0.00±0.04

0 d calv

3.05±0.24

3.22±0.13－0.30±0.07－0.14±0.04

1 wk calv

2.80±0.15

3.08±0.09－0.55±0.05－0.28±0.05*

Value was expressed as the mean±S.E.M.
Asterisk indicates significant diffenences as determined by Student’s t-test. (p＜0.05)

Table 3 Changes of NEFA and BHB concentrations and lymphocyte proliferation responses in blood of control
and mastitic cows
Time relative tocalving (calv)

NEFA (μEq/l)

BHB (μmol/l)

Lymphocyte proliferation(stimulation index)

Mastitic cows

Control cows

Mastitic cows

Control cows

Mastitic cows

Control cows

－3 wk calv

488±156

340±91348±41451±444.06±1.03

3.49±0.44－2 wk calv

436±78343±77539±67426±522.74±0.37

3.68±0.16†

0 d calv

1,006±145

682±95*502±46434±312.18±0.37

2.62±0.21

1 wk calv

924±51725±108824±26621±66*1.75±0.26

2.80±0.15**

Value was expressed as the mean±S.E.M.
Dagger indicates marginally significant diffenences as determined by Student’s t-test. (p＜0.1)
Asterisk indicates significant diffenences as determined by Student’s t-test. (p＜0.05)
Double asterisks indicates significant diffenences as determined by Student’s t-test. (p＜0.01)
stimulation index: Absorbance of wells contained PHA / absorbance of control wells－ 25 －

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分娩後の乳房炎発生と免疫指標並びに栄養状態との関連性

Figure 1 Relationship of somatic cell counts and immune examinations in milk and blood(a) somatic cell counts and lymphocyte proliferation response at 1 week after calving, (b) somatic cell counts at 1 week after calving and percentage of CD14＋ cells in colostrum, (c) percentage of CD14＋ cells in colostrum and lymphocyte proliferation response at 1 week after calving

体細胞数と乳汁及び血液免疫機能検査成績のCD21＋及び WC1＋細胞率はいずれも低値で、関連：分娩後 1 週間の体細胞数は、同時点のリ

本試験で用いた特異抗原を認識しない細胞が高ンパ球幼若化反応（r＝－0.70、p＜0.01、figure率に含まれた。既報［8］では、分娩後 1 週間1a）及び初乳中 CD14＋細胞率（r＝－0.53、p以内に乳房炎と判定された 8 頭の試験牛のう＜0.05、figure 1b）と有意な負の関連を示した。

ち、初乳採取時に乳房炎と判定された牛は無く、また分娩後 1 週間のリンパ球幼若化反応は初乳

分娩後 1 日で 1 頭（12.5％）が乳房炎と判定さ

中 CD14＋ 細 胞 率（r＝0.56、p＜0.05、figure

れた。それに対して、本試験では乳房炎群 5 頭1c）と有意な正の関連を示した。また、他の特のうち 3 頭（60％）が分娩後 0～1 日に乳房炎

異抗原を発現する免疫細胞と体細胞数あるいはと判定されたため、既報［8］に比べ初乳採取

リンパ球幼若化反応との関連性は見られなかっ時の乳性状が悪化していたことが考えられた。

た（結果は示さない）。

単核球を構成するマクロファージあるいは T

一方、試験期間を通じて、リンパ球幼若化反細胞は、ブドウ球菌の感染によりアポトーシス

応は NEFA 濃度（r＝－0.49、p＜0.01、figure 2）

あるいは空胞変性を起こすことが知られていると有意な負の関連を示したが、BHB との関連

［12，20］。本試験においても、初乳採取時に単はみられなかった（結果は示さない）。

核球が既に侵入した病原微生物に対する役割を［考

終え、アポトーシスを起こしていたことが推察察］された。そのため、特異抗原を認識できなかった単核球が存在した可能性が考えられた。

本試験では分娩後 1 週間以内に 14 頭中 5 頭が乳房炎に罹患し、周産期における乳房炎対策

その中でも、乳房炎群の初乳中 CD14＋細胞の重要性が再確認された。乳房炎群並びに対照

率は、対照群のそれと比較し有意に低値であっ群の間で免疫学的及び血液生化学的因子の特性た。初乳に豊富に含まれる CD14＋細胞（単球/に違いがみられた。

マクロファージ）は、細菌などの異物を貪食し、乳房炎群の初乳単核球中の CD3＋、CD14＋、－ 26 －

ヘルパー T 細胞に抗原提示を行うことによっThe Journal of Farm Animal in Infectious Disease
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IMMUNE INDEX AND NUTRITION CONDITION

分娩後の体重あるいは BCS の減少の著しい牛では、分娩後の乳房炎罹患率が高いことが報告されている［2，13］。本試験においても、乳房炎群の 60％（3/5 頭）では分娩後に食欲低下がみられ、BCS は分娩前 2 週から分娩後 1 週間にかけて減少し、分娩後 1 週間において対照群と比較して、その減少程度が有意に大きかった。分娩後の乳房炎群の NEFA 及び BHB は対照群より有意に高く、リンパ球幼若化反応はNEFA と 負 の 関 連 を 示 し た。 乳 房 炎 群 はNEFA 及び BHB の増加が示すように負のエネ

Figure 2 Relationship of NEFA concentration andlymphocyte proliferation response during the peripartum

ルギーバランスの増大等がみられ［6］、この状態がリンパ球幼若化反応の抑制に関与していることから［10，19］、負のエネルギーバランスて、特異的な免疫反応を誘発させると共に、サによる細胞性免疫機能の抑制が乳房炎の誘因とイ ト カ イ ン（TNF-α、IL-8 及 び TGF-α 等 ）なったことが示唆された。

の放出により、炎症部位に食細胞（好中球）を本試験では、周産期に環境性乳房炎に罹患し動員させる機能を有する［5，7］。著者らは既た牛に末梢血及び乳汁における細胞性免疫指標に初乳中の CD14＋細胞率が低値である場合、の低下が認められ、要因解析から、重度の負の分娩直後には乳房炎が確認されなくとも分娩後エネルギーバランスに伴う代謝異常が関与して

1 週間以内に乳房炎に罹患しやすいことを見出いる可能性が示された。環境性乳房炎の低減にし［8］、CD14＋細胞が乳房内における感染防は、細胞性免疫機能の低下要因となり得る周産除に重要であることを示唆した。本試験におけ期における BCS の減少を緩和する飼養管理がる乳房炎群の CD14＋細胞率が低値であったこ必要と考えられた。

とは、環境性乳房炎起因菌感染初期に重要な役［謝割を果たす単球/マクロファージが、既に役割

辞］

稿を終えるにあたり、採材に終始ご協力を頂を終え、その構成比が低下していたことが示唆いた岩手県農業研究センター畜産研究所の諸先された。

生方に深謝する。

乳 房 炎 群 の CD3＋（T 細 胞 ） 及 び WC1＋（γδ型 T 細胞）細胞率は低下傾向を示した。
T 細 胞 はαβ 型（ ヘ ル パ ー T 細 胞（CD4＋ ）及びキラー T 細胞（CD8＋））、γδ型のサブ［引用文献］
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乳房炎群の分娩後のリンパ球幼若化反応は低下し、同指標は初乳中 CD14＋細胞発現率と分娩後 1 週間の体細胞数とそれぞれ正、負の関連を示した。乳房炎牛の末梢血単核球のリンパ球
幼若化反応の低下は佐藤らの報告［19］と同様であり、初乳の免疫指標である CD14＋及び体細胞数との関連は、末梢血液と乳汁の免疫機能の関連を示すことが推察された。

－ 27 －

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分娩後の乳房炎発生と免疫指標並びに栄養状態との関連性

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Lactation stage-dependent changes of lymphocyte subpopulations in mammary secre-

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.3 No.1 2014

ASSOCITATION OF THE ONSET OF MASTITIS AFTER CALVING WITH
IMMUNE INDEX AND NUTRITION CONDITION

tions: inversion of CD4+/CD8+ T cell ratios
at parturition. Am. J. Reprod. Immunol. 37:,378-383. New York.

Association of the onset of mastitis after calving with leukocyte populations,
lymphocyte proliferation and nutritional conditions
Noriaki Abe1), Chihiro Sato1), Katsuaki Kidoguchi1), Yoshio Kiku2)＊, Hideyuki Takahashi3)1) Iwate Prefecture Central Livestock Hygiene Service Center, 390-5 Sunagome, Takizawa-mura, Iwate-gun, Iwate, 020-0173, Japan
2) National Institute of Animal Health, NARO, 4 Hitsujigaoka, Toyohira-ku, Sapporo-city, Hokkaido 062-0045, Japan3) Bio-oriented Technology Research Advancement Institution, NARO, 1-40-2 Nisshin, Kita-ku, Saitama-city, Saitama 331-8537, Japan＊

Corresponding author: Yoshio Kiku
National Institute of Animal Health, NARO, 4 Hitsujigaoka, Toyohira-ku, Sapporo-city, Hokkaido 062-0045, Japan(TEL: 011-851-2175, FAX: 011-853-0767, E-mail: yokiku@affrc.go.jp)[Abstract]
The aim of this study was to clarify the relationship between cellular immune status and nutritive
condition, and relate these parameters to the onset of mastitis after calving. We investigated the negative energy balance and lymphocyte proliferation in blood, and the populations of the colostrummononuclear cells obtained from 14 Holstein cows during the periparturient period. Five cows developed clinical mastitis within a week after calving and the other 9 remained healthy (control group).
The percentage of CD14+ cells in colostrum and the value of blood lymphocyte proliferation on thefirst week after calving were significantly lower in mastitic cows than in healthy cows. Non-esterified
fatty acid (NEFA) levels just after calving and β-hydroxybutyric acid (BHB) levels on the first week
after calving were higher in mastitic cows than the others (NEFA; 1,006±146, 682±95μEq/l, BHB;
824±26, 621±66μmol/l). A correlation (r=－0.49, p<0.01) was found between the value of lymphocyte
proliferation and NEFA during the periparturient period. The value of lymphocyte proliferation on
the first week after calving showed negative correlation with somatic cell count (r=－0.70, p<0.01) andpositive correlation with CD14+ cells (r=0.56, p<0.05). These results demonstrate that the onset of
mastitis after calving may be associated with the immune suppression induced by negative energybalance.
Key words: CD14+ cells, energy balance, lymphocyte proliferation, mastitis, parturient period－ 29 －