P-16
30nm細孔コアシェルシリカ粒子の開発とペプチド分析への適用
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康 長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

市販されているコアシェルカラム
SunShell（クロマニックテクノロジーズ） : C18, PFP, C8, Phenyl, RP-Aqua: C18, PFP, CN, PentaHILIC, BioClass
Halo（AMT）: C18, PFP, AQ, PC
Capcell Core（資生堂）: C18, PFP, C8, XB-C18, HILIC,
Kinetex （フェノメネックス）
Kinetex Aeris（フェノメネックス）: C18, C8, C4 (タンパクペプチド分析用)
Ascentis Express（シグマアルドリッチ） : C18, F5(PFP), C8, OH5, RP-Amide: C4, C8, C18
BioSehll（シグマアルドリッチ）: C18, C8, CN, Phenyl-Hexyl, SB-AQ
PoroShell（アジレントテクノロジ－）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, aQ, RP-MS
Accucore（サーモフィッシャー）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, HILIC
Nuculeoshell（ナーゲル）: C18, PFP, C8, Amide, HILIC
Brownlee SPP（パーキンエルマー）: C18, PFP, Phenyl-Hexyl, C18A, HILICBlue Shell（KNAUER）: C18, C18+, HILIC
Cortecs （Waters）: Biphenyl, ARC18
Raptor （Restek）
Ultracore (Ace): C18, Phenyl-Hexyl
SpeedCore (Fortis): C18, PFP, Diphenyl, HILIC
Coresep (Sielc): Mixmode
COSMOCORE (Nacarai):C18
Meteoric Core (YMC):C18, C8, C18Bio(固定相は抜粋)

コアシェルカラムは広く使用されるようになってきている

2

市販されているコアシェルシリカ
核の径は1～3.2μm
多孔質シリカ層の厚さ0.2～0.6μm

・粒子径は1.3～5 μm
・細孔径は9～30 nm(3μm以下の粒子径では8～20 nm)

粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子はまだ販売されていない
粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子の開発を試みた
3

Desorption Dv (log d) (cc/g)

作成したコアシェルシリカの細孔分布0.90.8Core shell 30nm

0.70.6

Core shell 16nm

0.50.40.30.20.101101001000

Pore Diameter (nm)4

高分子分離用コアシェルカラム作成した粒子径2.6 μmで30 nmの細孔を持つ
コアシェル粒子を用いて以下のカラムを作成した
P/N

Pore
Surfacediameterarea

Carbonloading

C18EndSurface
capping
coverage

SunShell C18-30
2.1 x 100 mm

C46961

30 nm

40 m2/g

1.3%

1.2mmol/m2

Yes

SunShell C8-30
2.1 x 100 mm

C36961

30 nm

40 m2/g

1.2%

2.5mmol/m2

Yes

SunShell C4-30
2.1 x 100 mm

C26961

30 nm

40 m2/g

0.9%3mmol/m2

Yes

Particle diameter is 2.6 mm for all.

5

タンパクの分離
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 25 or 35 min
%B20%
65%
oFlow : 0.5 mL/min , Temperature: 60 C Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin,
5 = Ovalbumin

SunShellHFC18-30

SunShellC8-30

SunShellC4-30
02468

10

126

グラジエントの違いによる分離の変化
Column:SunShell C8-30, 2.6 um (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 25 or 35 min%B20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin,
5 = Ovalbumin

390000340000○290000

35 min25 min15 min240000190000140000Time 0 min%B 20%

15min
65%

90000

Time 0 min%B 20%

25min
65%

40000

Time 0 min%B 20%

35min
65%-1000005101520257多孔質層の厚さが異なるコアシェルシリカ
SunShell particle

Prototype particle

コア0.2 mm

0.5 mm
2.6 mm

3.4 mmParticle size: 2.6 μm
Thickness of porous layer: 0.5 μm
Specific surface area: 40 m2/g

Particle size: 3.4 μm
Thickness of porous layer: 0.2 μm
Specific surface area: 15 m2/g8多孔質層の厚さが異なるコアシェルカラムの比較１Column: SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 100 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 100 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 or 35 min
%B20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 60 or 80 oC, Detection: UV@215 nm,Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

260oCでは、粒子径、多孔質相の厚さが異なってもピーク幅は同じ

31460 oC and 15 min gradient

W0.5=2.5 sec
5

W0.5=2.5 sec

Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)

W0.5=4.8 sec

80 oC and 35 min gradient

80 oCでも大きな違いはない

W0.5=4.2 sec
Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)
05101520

Retention time/min

Surface area works well for separation.

259多孔質層の厚さが異なるコアシェルカラムの比較２Column: SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 100 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 100 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 or 35 min
%B
20%
65%
Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 60 or 80 oC, Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
W0.5=0.87 sec

2

高速分離においては多孔質相が薄いほうが分離が良好
W0.5=0.93 sec

135480 oC and 5 min gradientPrototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)

W0.5=4.8 sec

80 oC and 35 min gradient

W0.5=4.2 sec

Prototype 3.4 μm (0.2 μm)
SunShell C8-30 2.6 μm (0.5 μm)
05

101520Retention time/min

Surface area works well for separation.

2510

多孔質層の厚さが異なるコアシェルカラムの比較３Column:
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm, 0.5 μm layer) 100 x 2.1 mm, Sunshell C8-30, 3.4 μm (30 nm, 0.2 μm layer) 100 x 2.1 mm (prototype)
Mobile phase: A) 0.1% TFA in water B) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 35 min%B20% 65%○Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C Detection: UV@215 nm,Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA, 4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin

23154

Sunshell C8-30, 3.4 μm
SunShellC8-30, 2.6 μm

3135

1015

20

541517

1925

21

23

25

11選択性の異なるC18の比較

P/N

PoreSurface
diameterarea

Carbonloading

C18EndSurface
capping
coverage

SunShell HFC18-16CG6471
4.6 x 150 mm

16 nm

90 m2/g

2.5%

1.2mmol/m2

Yes

SunShell C18-WP
4.6 x 150 mm

16 nm

90 m2/g

5%2.5mmol/m2

Yes

CW6471

HFC18-WP は1対のシリル基によりC18を結合しますので，結合密度が低くなります。C18-WPに比べ約1/2です。
ペプチドやタンパク質はC18の結合密度により，分離が変化します。
12

HFC18とは
Hexa-Functional C18 は６個の官能基を持つ6カ所のシロキサン結合により耐酸性は高くなる

SunniestBonding
Technology
Hexamethydichlorotrisiloxane+Trimethylchlorosilane (TMS)
X
X

X
Si

Si

X

X

Si
SiX

（X: Cl, OCH3, OC2H5)

HFC18試薬の概略図

OOO

SiO
Si

Si OOOSiSiOOOOOSiO O

SiOOSiSiOSiO

Si OSi
Si O OSiSi OO OOOOSiHO OOSiSi
SiSiOOSiOOOSiSiOOOOO
Si O

O OO

シリカ表面への結合状態の概略図
13

HFC18カラムのLC/MS移動相条件における耐酸性

Relative retention (%)

10095% line

8060
400.1% formic acid, pH2.670 ºC

2000200

400600Time (h)

800

1000

Durable test condition
Column : SunShell HFC18-162.6mm, 50 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3CN/0.1%formic acid, pH2.6=40/60
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 70 ºC
Measurement condition
Mobile phase: CH3CN/H2O=60/40
Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil
2 = Butylbenzene

14結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm, SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 min 40 min%B
5% 5%50%
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC, Detection: UV@210 nm,
Sample: Tryptic digest of cytochromC

15結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm, SunShell C18-WP, 2.6 mm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 min 40 min
%B
5% 5%
50%
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 25 ºC, Detection: UV@210 nm,
Sample: Tryptic digest of myoglobin

16

ペプチドの分離(SunShell HFC18-16)
Column:Amplus C18-16, 2.6 mm (16 nm) 100 x 2.1 mm,Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 1 min 21 min%B 10% 10% 40%
Flow rate: 0.50 mL/min ,Temperature: 40 oC
Detection: UV@214 nm,Injection volume: 10 μL,
Sample:1. Bovine Serum Albumin Digest

17まとめ• 30 nm細孔を持つコアシェルシリカの合成に成功した。
• 多孔質層の厚さが異なるコアシェルシリカを比較した
結果、タンパク分離において差が観察された。
• 結合密度の低いHFC18-16カラムにおいて，いくつかのペプチドで分離の改善が見られた。
• HFC18-16のLCMSでの使用を想定した耐酸試験において，1000時間以上の耐酸性能を確認できた。
• 今後コアシェルカラムは、多くの固定相が開発されていくと考えられる。

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