福岡県保健環境研究所年報第28号，77−82，2001

原著論文
簡易生物評価法の開発と問題点−8‑ヒドロキシグアニン試験について−

世良暢之，志水信宏，塚谷裕子，田中義人＊１，北森成治，内海英雄＊2
活性酸素による酸化的損傷や酸化ストレスを評価するのに最も適した指標の 1 つに，グアニン塩基の修飾産物である8‑ヒドロキシグアニン（8‑hydroxyguanine, 8‑OH‑Gua）がある．この8‑OH‑Gua は従来から HPLC‑ECD 法で高感度に測定されてきたが，機器が高価なことに加え，複雑な前処理が必要であることから，その代替法が求められていた．そこで8‑OH‑Gua に対するモノクローナル抗体に着目した
ELISA 法を開発した．この ELISA 法を用いて255化学物質について検討したところ，21化学物質（8.2%）が8‑OH‑Gua 生成能を示し，HPLC 法と同等の検出能を示した．また，最近では多くの食品成分が抗酸化剤としてがんの予防に効果があることが示唆されていることから，高等植物に含まれているフラボノイド類について検討したところ，ルテオリンが化学物質による8‑OH‑Gua 生成能を抑制することが明らかとなった．これらの結果から，8‑OH‑Gua に対するモノクローナル抗体を用いた ELISA 法は従来からの HPLC‑ECD 法とほぼ同等の8‑OH‑Gua 検出能を有しており，かつ簡便で安価なバイオアッセイであると考えられた．
〔キーワード：化学物質，活性酸素，8‑ヒドロキシグアニン，ELISA 法〕
electrochemical detector， HPLC‑ ECD）により高感度に検１．はじめに
エームス試験は 化学物質の発がん性を予測するため出できる．しかしこの 8‑OH‑ Gua は DNA の抽出過程あに世界中で使用されている試験系の 1 つである．しかしるいは酵素分解中に，空気との接触，光の作用，微量作

エームス試験で探索された変異原物質はあくまでも発が用などにより，アーティファクトとして生じ，細胞ん候補物質であって必ずしも発がん性があるとは限らな

DNA 中の 8‑OH‑ Gua の微妙な変化を測定するには注意

いこと，エームス試験では検出できない発がん物質（非を要することが指摘されている 1 ) ．現在，この HPLC‑変異発がん物質，non-genotoxic carcinogen） などの新しECD に替わる検出法が求められている．

い問題がでてきた．これらのことから，培養細胞，動物

これらの状況を踏まえ，本報告は 8‑ OH‑ Gua のモノ個体を用いた新しい試験法（代表的なものとして染色体クローナル抗体を用いた競合的酵素免疫測定法異常，小核形成などがある）が次々に開発されてきた．

化学物質

最近，その1つとして活性酸素生成系を介した遺伝子損傷が着目されるようになってきた（図 1 ）．
8 ‑ ヒ ド ロ キ シ グ ア ニ ン （ 8 ‑ hydroxyguanine， 7 , 8 ‑酸素ラジカル

HNO

N

5'HON

NOHHO

3'H OO
HOO‑NOH
HH

HNONH2N

修復HHHOHHH OH

HN
8HO

修復

NO
HOHN

NOH
H

H

H
N

O
NH2NH

H
H

分析HPLC
ELISA

H OH

グアノシン

8‑ヒドロキシグアノシン

8‑ヒドロキシ
グアニン

二重らせん

は，電気化学検出器付き高速液体クロマトグラフ

NH2
NO‑DNA

図1

化学物質による8‑ヒドロキシグアニンの生成機構（high performance liquid chromatograph equipped with福岡県保健環境研究所（〒818‑0135 太宰府市大字向佐野39）*1

現：福岡県環境部環境政策課（〒812‑8577

福岡市博多区東公園7‑7）*2九州大学大学院薬学研究院機能分子解析学（〒812‑8582 福岡市東区馬出3‑1‑1）- 77 -

遺伝子損傷

Pある核酸のこと）複製反応における複製エラーを反映する酸化的損傷を持つ塩基の 1 つである．この8‑ OH‑ Gua

HNO

NH2N

dihydro‑ 8‑ oxoguanine, 8‑ OH‑ Gua）は，細胞内の DNA（deoxyribonucleic acid， ヌクレオチドの巨大な重合体でDNA付加体

代謝活性化

酸化ストレス（ competitiveassay，ラット初代肝臓細胞から抽出精製した DNA で 8‑ OH‑ELISA）の開発を行うことを目的とした．この ELISA 法Gua を含む）と抗8‑OH‑Gua モノクローナル抗体を同時を用いて種々の化学物質による DNA 中の8‑OH‑ Gua のに加え競合反応を行う．試料中の8‑OH‑ Gua が多いとそ生成を調べるとともに，DNA 損傷を抑制する物質（食れに結合する抗体が多くなり，固相化8‑OH‑ Gua と結合品成分など）の検索に適用できるかどうかについて検討するモノクローナル抗体量が減少する．反応後，洗浄しした．て試料中の8‑OH‑ Gua と結合したモノクローナル抗体をenzyme-linkedimmunosorbent

除去し，固相化8‑OH‑ Gua と結合したモノクローナル抗２．材料及び方法

体のみを残す．次に酵素標識抗体（POD 標識抗 IgG マ２．１ウス抗体）と反応させ，発色剤（ O‑フェニレンジアミ

化学物質

化学物質は，生体影響（ 急性，慢性毒性，変異原性，ン）で呈色し，吸光度（492‑610nm）を測定する．最後

発がん性，内分泌攪乱，水生生物毒性，生殖毒性，生体に，別途作成した標準曲線から8‑OH‑ Gua 生成量を読みへの刺激性及び神経毒性など ），環境暴露 （生産量，使とる．試料中の8‑OH‑ Gua 量が多いほど，吸光度は低く用量及び暴露量など） の観点から重要と思われる255化なる．

学物質を選択した．これらの化学物質は，農薬65種類

２．３

エームス試験

（殺虫剤，除草剤，燻煙剤等 ），多環性芳香族炭化水素

エームス試験はプレインキュベーション法で実施し，104種類，脂肪族炭化水素60種類，重金属13種類，無機ラット肝臓 S9mix(オリエンタル酵母工業(株))による代物 3 種類，植物エストロゲン10種類に分類され，すべ謝活性化法を併せて実施した．試験菌株は S.Typhimuriuて和光純薬工業(株)から購入した．これらの化学物質は

YG3003株で，8‑ヒドロキシグアニン修復酵素欠損株でジメチルスルホキシド( dimethylsulfoxide， DMSO) あるあり，酸化型変異原に高感受性である3)．

いは蒸留水に溶解させ，被検試料とした．
また，DNA 損傷を抑制する食品成分としてルテオリ

３．

ン，モリン及びミリセチンなど高等植物に普遍的に含ま３．１れているフラボノイドを選択した．

比較

２．２

結果及び考察8‑OH‑Gua測定におけるHPLC‑ECD法とELISA法の抗8‑OH‑ Gua モノクローナル抗体を用いた ELISA 法

8‑OH‑Gua試験

ラット初代肝臓細胞は Sprague‑ Dawley ラット（ 8 ‑12が HPLC‑ ECD 法の代替法としてどの程度有効かを検討

週齢）からコラゲナーゼ処理で分散させて調製し（2.0した．活性酸素生成能を有する代表的な21化学物質を用

8×10 cells），96穴マイクロタイタープレートに 5 ×10いて HPLC‑ ECD 法及び ELISA 法の両方法で8‑OH‑Gua5cells ずつ播種して20時間前培養した後，化学物質を添加を測定したところ， 2 種類の試験法は非常に良く相関すしてさらに24時間暴露し，HPLC‑ ECD 法及び ELISA 法ることが明らかとなった（図 2 ）．8‑ OH‑ Gua 標 準 液により8‑OH‑ Gua を測定した．

（デオキシグアニン10 ６ に対して8‑ OH‑ Gua をそれぞれHPLC-ECD 法 による8‑OH‑Gua の測定は従来法で測定0.1，0.5，2.5，12.5，62.5nM 添加したもの）を用いて，した2）．肝臓細胞中の DNA は凍結融解で細胞破砕，遠心ELISA 法と HPLC‑ ECD 法の感度比較を行った．ELISA

分離で核分画を採取し，proteinase K 処 理，イソプロパ法では2.5，12.5，62.5 nM の測定が可能であったが，ノール抽出，nuculease P1 処 理，alkaline phosphatase 処 理
後，ミリポア（Ultra free C3 GV）で精製した．HPLC は ，ELISA法(8‑OH‑Gua nmol)

150

LC-1 0 AD（ Shimazu, 1ml/min）， UV 検 出 器 UV‑ 8 0 2 0（Shimazu, 290nm），電気化学検出器 Coulochem II（ ESA,E2;300mV, R2;50nA），オートインジェクター AS‑8010

100y = 58.149x ‑ 18.978
2
R = 0.9076（ Tosoh），カラムオーブン TX‑48（ Toho，25℃），レコーダー LR‑4220（Yokogawa）で構成した．移動相は 8 %501.5

メタノール‑10mM リン酸緩衝液を用いた．
また8‑OH‑ Gua に対する特異性が高い抗8‑OH‑Gua モ22.5HPLC法(8‑OH‑Gua/105dG/nmol)3

図2 HPLC法とELISA法の相関について

ノクローナル抗体を用いた ELISA 法は以下のようにして測定した．まず8‑OH‑ Gua をマイクロプレートに固相HPLC‑ ECD 法ではさらに低濃度の0.1，0.5でも測定が化し，これに調整した試料 DNA（化学物質を暴露した可能であり，HPLC‑ ECD 法の方が高感度であった．

- 78 -しかし， HPLC‑ ECD 法では複雑な前処理（細胞からあった．の DNA の抽出，精製）と高価な機器が必要であると同21化学物質の8‑OH‑ Gua 生成能は，57‑140nM であっ時に，その操作に熟練を要する．一方，ELISA 法では特た．最も強い8‑OH‑ Gua 生成能を示した化学物質は4‑ニ異性が高い抗8‑OH‑ Gua モノクローナル抗体を用いていトロキノリン‑N‑オキサイドであった．21化学物質のうるため複雑な前処理，機器を必要とせず，共存物質の多い生体内（invivo）での酸化的 DNA 損傷に対する修復を忠実にみるためには優れた分析法であると考えられた．

S . Typ him uri um YG3 003 株 で の 突 然 変 異 誘 発 能 と

表1

ラ ッ ト 初 代 肝 細 胞 を 用 い た 8 ‑OH ‑Gu a生 成 量 の 比 較細胞を用いた簡易生物評価法が定量性を得るためには，

化学 物 質名

投与する化学物質の量を段階的に増やしたときに現れる毒性反応の大きさとの間に一定の関係が無くてはならな

YG3 003 変 異 誘 発 能

8 ‑OH ‑Gu a生 成 能

代謝 活 性化 非 代謝 活 性化

( nM )

Af lat oxi n B 1‑‑+

(2 ‑Am ino ant hra cen e+‑+(62 )2 ‑Am ino ant hra qui non e+‑+(57 )3‑N itr ofl uor ant hen e‑＊‑+(90 )4‑ニトロキノリン‑ N‑オキサイドを標準物質として，

1‑N itr opy ren e‑＊‑+( 11 0 )4‑ Nit roq uin oli ne‑ N‑o xid e‑++( 14 0 )ELISA 法 を用いた8‑ OH‑ Gua の用量−反応曲線（ dose-Cu men e‑‑+(86 )Di ben zyl et her‑++(90 )D iet hyl ben zen e, mix tur e‑++( 11 0 )グモイド型の曲線が得られた．4‑ニトロキノリン‑N‑オFo rma lde hyd e‑‑+( 11 0 )ME P‑‑+(76 )キサイドでは0.01mM 以上の濃度で8‑OH‑ Gua 生成能がMe tho xyc hlo r‑‑+(67 )+( 12 7 )い．しかし細胞を用いる毒性試験においては，培養液，細胞密度及び細胞株など変動要因が多い．このことから，

response curves） を求めたところ，図 3 に示すようなシ認められたことからこの濃度が8‑OH‑ Gua 生成能を発現する必要最小限の閾値であり，それ以下の量では無作用であると考えられる．閾値以上では8‑OH‑ Gua 生成能を現わし，投与量の増加に伴って強くなり，さらに用量を増して10 mM 以上を投与すると100 %細胞死に至った．
このことから，ELISA 法を用いた場合，4‑ニトロキノリ＊

P ara qua t‑

P ent ach lor oph eno l‑P ota ssi um dic hro mat e‑Si met ryn e‑T hio ben car b‑

TP N

‑

1,2 ,4‑ Tri chl oro ben zen e+＊＊＊‑＊96 )‑+( 10 5 )++(‑+(90 )‑＊+(86 )
82 )

80 )

‑+(‑+( 12 0 )2, 4,5 ‑Tr ich lor oph eno l‑‑+( 11 4 )T rip hen ylt in (IV ) c hlo rid e+‑+(80 )＊‑ ： 化 学物 質 によ る 細胞 毒 性が 強 いた め 、測 定 不可

ン -N- オキサイドによる8‑ OH ‑ Gua 生成は，0.01 mM −1 mM の幅広い濃度範囲で測定可能であり，化学分析にち 8 化学物質（2‑アミノアントラセン，2‑アミノアント比較して適用範囲がかなり広いことが示唆された．

ラキノン，4‑ニトロキノリン -N-オキサイド，ジベンジルエーテル，ジメチルベンゼン混合物，重クロム酸カリ
ウム，1,2,4‑トリクロロベンゼン及び塩化トリフェニル

8‑OH‑Gua (nM)

200スズ）は，S.Typhimurium YG3 003株を用いたエームス試

150

験で変異原性を示した．しかしながら，その他の13化学物質（61.8%）はエームス試験では検出できなかった．

100

このことは8‑OH‑ Gua 修復酵素欠損株であり，酸化型変50

異原に高感受性である S.Typhimurium YG3 003株を用いたエームス試験では，8‑OH‑ Gua 生成能を有する化学物

00.001

0.01

0.1

110

4‑NQOの濃度（mM）質を全て検出することができないことを示している．即図3 ELISA法を用いた8‑OH‑Guaの測定

ち，化学物質によるラット初代肝臓細胞を用いた8‑OH‑Gua 生成能とネズミチフス菌を用いた変異原性との間に３．２

ELISA法による255化学物質の8‑OH‑Gua生成能測

定量的な関連は認められなかった．
8‑OH‑ Gua 生成能を示した21化学物質を構造的に分類

定及びエームス試験による変異原性との比較
ELISA 法を用いて255化学物質について検討したとこ

すると，芳香族炭化水素が104化学物質中10化学物質

ろ，表 1 に示すような21化学物質に8‑OH‑ Gua 生成能が（9.6% ）（芳香族ニトロ化合物が 3 化学物質，芳香族ア認められた（8.2%）．HPLC‑ ECD を用いた場合にはこれ

ミンが 2 化学物質，その他が 5 化学物質 ），農薬が65化らの化学物質に加え，亜ヒ酸ナトリウム，塩化ニッケル

学物質中 8 化学物質（12.3%），脂肪族炭化水素が60化学(Ⅱ)に8‑OH‑ Gua 生成能が見られた（9.0%）．この 2 化学物質中 2 化学物質（3.3%），重金属が13化学物質中 1 化物質の8‑OH‑ Gua 生成能は ELISA 法では検出限界以下で学物質（7.7%）であった（図 4 ）．多環性芳香族炭化水- 79 -

素と農薬の8‑OH‑ Gua 生成能が高い傾向にあるが，これ4‑ニトロキノリン‑N‑オキシド（4‑NQO）を選んだ．抗はフリーラジカルと呼ばれる不対電子を持っており，近酸化効果を有する食品成分としてルテオリン，モリンおくの分子から電子1個を奪いその分子の酸化を引起こす

よびミリセチンの 3 種類を選んだ．その結果，最終濃度物質群が構造的にこれらに分類されるものが多かったこ

50mM で，ルテオリンは2‑AA，1‑NP 及び4‑NQO によとからきていると考えられる．これらの化学物質のうちる8‑OH‑ Gua の生成を約87−92%抑制したが，2‑AAQ にメトキシクロル，ペンタクロロフェノール，1,2,4‑トリ対しては約70%，3‑NF に対しては約50%の抑制を示した

クロロベンゼン，2,4,5‑トリクロロフェノール及び塩化にとどまった．また，モリン，ミリセチンは1‑ NP，4‑トリフェニルスズなどのような塩素化合物は動物個体にNQO に対しては約68−76 %の抑制効果を示したが，そ対して肝臓障害を引き起こすことが知られている．しかの他の化学物質による8‑OH‑ Gua の生成にはほとんど抑しながらこれらの塩素化合物は強い細胞毒性を有するた

制効果を示さなかった（図 5 ）．

めエームス試験では変異原性の測定が難しいことが指摘されていた4)．ラット初代肝臓細胞を用いた ELISA 法において8‑OH‑ Gua 生成能が測定されたことから（化学物質 1 mM で 67‑10 nM）， これらの 塩素 化合物は 細胞内DNA に対して塩基部分の酸化反応と側鎖の切断反応を引き起こし，毒性発現の引き金となっていることが示唆される．

４．まとめ
Chemical Abstractsによると1999年現在で,1600万種の化学物質と400万件の生体成分の情報が登録されており，その登録数は約10年で倍増している．これらに加３．３

ELISA法による8‑OH‑Gua測定の応用例え，トリハロメタン等の消毒副生成物，ダイオキシン類

最近，国や地域による発がんリスクの差は食事習慣の等の燃焼副生成物などの非意図的生成物などを含めると，影響が強いことが多くの疫学的調査から明らかにされてその種類や量は我々の把握できる範囲をはるかに凌駕しきた．しかし科学的根拠は明確であるとは言い難く，食ている．一方で，実際に用いられている化学物質は品中に存在する抗発がん物質や抗変異原物質の摂取量の学物質の審査及び製造等の既製に関する法律差によるのではないかとされている 5) ．例えば，クロロ

すると約 6 ‑10万種と予想されている． 市場に提供する

フィルは物理的に複合体を形成することにより発がん物には様々な毒性試験を行うことを義務として課されてい質を吸着，除去することが知られており，アスコルビン

るが，現行の動物実験を用いた毒性試験は多額の費用と酸やα -トコフェロールはニトロ化，ニトロソ化剤であ長い年月を要する．より短期間により安価で毒性発現のる亜硝酸を還元分解することにより，発がん物質の生成機構の解析が可能な系として細胞を用いた毒性試験法へを抑制することが知られている．特に最近注目を集めての代替が議論されている．

化から推定いるのは DNA へ の活性酸素による攻撃により生じる

このような状況下で，個体と代謝活性が基本的に一致

DNA 修飾産物である8‑OH‑ Gua を指標に，活性酸素そしている細胞培養系の毒性試験への採用は意義があるものものを消去するポリフェノールなどの食品成分に関すのとして認められつつある．特に肝臓は多くの薬物を代る研究である．そこで，抗酸化物質でありかつ8‑ OH‑謝，解毒するので，薬物の毒性や安全性を調べるために，Gua 生成を抑制する食品成分の検索を ELISA 法を用い利用されている．なかでも初代肝臓細胞は化学物質の代て試みた．8‑OH‑ Gua を生成する化学物質の中から，代謝活性化に必要なミクロソーム酵素の活性を有している

表的な芳香族炭化水素として，2‑アミノアントラセン

ことから，化学物質自体は毒性が無くてもその代謝産物（2-AA），2-アミノアントラキノン（2‑AAQ），3-ニトロが毒性を示すような場合には非常に有用である．これら

フルオランテン（3‑NF）， 1-ニトロピレン（1‑NP）及び- 80 -

のことを踏まえ，今回調整が比較的容易なラット初代肝試験）と in

臓細胞を用い，8‑OH‑ Gua を指標とした簡易生物評価法

れの変異原性試験を組合わせて用いても発がん物質の検（バイオアッセイ， bioassay， 生物材料を用いて生物応出には限界があることを指摘している6)．これは in vitro

答変化を測定し，化学物質の生物への有害作用量を評価

及び in vivo での代謝・解毒機構の相違，生体内での薬する）を確立することとした．また生物試験を専門とし物動態（吸収・分布・排泄など）の相違及び種差（感受ない技術職員であっても容易かつ正確に測定・評価でき性，臓器特異性及び性差など）などの要因に起因するとるような簡易生物評価法とするため，簡便・簡略化し，考えられる 7,8,9,10)．今後は臓器標的性を考慮に入れた in

迅 速 か つ 定 量 的 に 試 験 結 果 が 得 ら れ る 方 法 と し て，vitro 及び inELISA 法を採用した．この ELISA 法を用いた8‑OH‑ Gua

危険度をより正確に評価する方法としてとして、ヒト肝試験は，255種類の化学物質についての検討を行った結臓由来の培養細胞系として広く使用されている HepG2な

果，経済的，時間的理由及び多くの化学物質を試験する

どを用いて8‑OH‑ Gua の検出が可能かどうかなどについことができるという観点からすると，優れた予備スクリて検討していく必要がある．

vivo 発がん性試験の一致率を検討し，いずvivo の試験系に加え，化学物質のヒトへのーニングであり，多くの成果が蓄積されつつある．
通常，活性酸素はウイルス，細菌感染症から身を守謝辞る働きなど有用な役割を担っている一方で，生体内での本研究は，環境省未来創造型基礎研究推進制度プロジ

バランスが崩れ過剰生産されると生体膜，酵素や遺伝子ェクトなどを傷つけ，糖尿病，動脈硬化及びがんなどの重要なの開発に関する研究 （平成9‑12年度，研究代表者 内海

原因と考えられている． 特に がん予防の重要な戦略の英雄教授）により実施した．

化学物質による生物・環境負荷の総合評価手法

1つとして野菜や果物などの食品中の抗酸化剤をうまく摂取することがあげられている．しかし活性酸素は不安

文献

定 で 捕 ら え 難 く ， そ の 検 出 の た めに は ESR（ Electron1) Claycamp, H.G. ： Phenol sensitization of DNA tospin resonance， 核磁気共鳴装置）などのごく限られた手

subsequent oxidative damage in 8 ‑hydroxyguanine assays,段に頼らざるを得なかった．今回開発した ELISA 法にCarcinogenesis, 13, 1289‑1292, 1992.

よる8‑OH‑ Gua 試験の応用例として，8‑OH‑ Gua の生成2 ） Kasai,

抑制能を指標に天然抗酸化物質をスクリーニングするこdeoxyguanosine of the C‑ 8 position by ascorbic acid andとにより，ルテオリンなどのフラボノイド類が有効であother reducing agents: Nucleic Acids Res., 12, 2137‑2145,

ることが示唆されるデータが得られた．今後，がん予防

1984.

薬，老化抑制薬などが見いだされることが期待される．

3) Suzuki, M., Matui, K., Yamada, M., Kasai, H.,

H.

and

Nishimura： S.

FormationofSofuni, T. and Nohmi, T. ; Construction of mutants of５．今後の問題点

Salmonella typhimurium deficient in 8 -hydroxyguanine DNA

8‑OH‑ Gua は時間の経過と共に減少することが報告さ

glycosylase and their sensitivities to oxidative mutagens,

れているが，これは8‑OH‑ Gua をはじめとする DNA 損

Mutation Res. ,393, 233-246, 1997.

傷を基質にする作用の異なる 2 つの修復酵素（8‑ OH‑4) Floyd, R. A., Watson, J. J., Wong, P. K., Altmiller, D. H.

Gua グリコシラーゼ，8‑OH‑Gua エンドヌクレアーゼ）

and Rickard, R. C. ： Hydroxy freeradical adduct ofが存在するためである．この8‑OH‑ Gua 修復酵素活性がdeoxyguanosine: Sensitive detection and mechanism of

誘導されたかどうかを調べることが忠実に細胞内での酸formation: Free Rad. Res. Comm., 1 : 163‑172, 1986.

化ストレスの状態を見ていると考えられる．哺乳動物細5) 大澤俊彦：抗がん機能の評価，フードケミカル，62-

胞からは8‑OH‑ Gua 修復酵素の完全精製までには至って

68，1996．

いないが，今後の展望としてこれらの測定系の開発が望

6) 黒木登志夫，松島泰次郎：化学物質のヒトに対するまれる．

発がん性の評価，IARC モノグラフ，7‑17，1985．

IARC（ the International Agency for Research on Cancer，

7) 常盤寛，世良暢之：肺癌の分子生物学，大気中発癌国際癌研究機関）は最も一般的に用いられている 4 種類

物質の DNA 付加体解析，呼吸，15(3)，306‑313，1996．の in vitro 変異原性試験（エームス試験，Chinese hamster

8) 世良暢之：ニトロアレーンの構造・変異活性相関おovary cell を用いた染色体異常試験，姉妹染色分体交換

よびヒト暴露の実態，環境変異原研究，20，97‑105，1998．

及びマウスリンパ腫細胞（ L5178 Y）を用いた突然変異

9) Tokiwa, H., Sera, N., Nakanishi, Y. and- 81 -Sagai,

M. ： 8-Hydroxyguanosine formed in human lung tissues

and Inuzuka S. ： Analysis of environmental carcinogens

and the association with diesel exhaust particles, Free Rad.

associated with the incidence of lung cancer, Toxicology

Biol. Med., 27(11/12), 1251‑1258, 1999.

Letters, 99, 33‑41, 1998.

10) Tokiwa, H., Nakanishi, Y., Sera, N., Hara, N.

Usage and limitation of ELISA for the quantitative measurement of 8 -hydroxyguanine
Nobuyuki SERA1, Nobuhiro SHIMIZU1, Hiroko TSUKATANI1,
Yoshito TANAKA2, Shigeji KITAMORI1 and Hideo UTSUMI3
1Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences,

39 Mukaizano, Dazaifu, Fukoka 818-0135, Japan
2

Environmental Policies Division, Environment Department, Fukuoka Prefectural Government,

7-7 Higashikouen, Hakata-ku, Fukuoka 812-8577, Japan
3Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University,

3-1-1 Maidashi, Higashi-ku, Fukuoka 812-8582, Japan

Millions of chemicals have been synthesized and thousands of them have been detected in our surrounding environment. Thishas caused great concern about human health. Some chemicals are well known to generate reactive oxygen species such as
superoxide anion radicals, hydrogen peroxide, hydrogen radicals and singlet oxygen, and these have been well correlated with
the incidence of cancer in animal models. 8-hydroxyguanine (8-OH-Gua) is one of the most popular markers for the evaluationof oxidative damage and oxidative stress. ELISA for 8-OH-Gua by a monoclonal antibody correlates well with 8 -OH-Gua
determined by high performance liquid chromatography with an electrochemical detector. The ELISA method, in contrast with
the HPLC-ECD method, does not require either the complicated processes for DNA extraction and hydrolysis, nor expensiveequipment. In this study, therefore, we determined the 8-OH-Gua level induced by 255 chemicals using fresh rat hepatocytes
in an in vitro reaction. Among 255 chemicals tested, 21 chemicals (8.2%) produced 8-OH-Gua. In particular,
3-nitrofluoranthene, 1-nitropyrene, aflatoxin

B1, cumene, formaldehyde, fenitrothion, methoxychlor, pentachlorophenol,simetryne, thiobencarb, chlorothalonil and 2,4,5-trichlorophenol produced 8-OH-Gua in fresh rat hepatocyte DNA, while they
showed no mutagenicity for S.Typhimurium YG3003 which is sensitive to reactive oxygen. Since it has been found that many
dietary antioxidants potentially inhibit the formation of DNA damaging products, we searched for natural antioxidants in plants
with the ELISA method. As a result, ruteolin was found to play an important role in protecting oxidative DNA damage due tochemicals.We conclude, therefore, that the ELISA method is useful not only for quantative evaluation of the toxicity of various
chemicals, but also for detecting antioxidants in plants.
[Key words; chemicals, reactive oxygen, 8-hydroxyguanine, ELISA]- 82 -