異性体，極性物質・困ったときのもう一本C30，PFP
クロマニックテクノロジーズ
塚本友康，小島 瞬，長江徳和
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

C30カラムの注意点
結合密度が高いほど異性体分離に優れる
CH3

結合密度が高すぎるとピークがテーリングする

H3C

トリアコンチル (C30)

結合密度が低いと分離が不十分になる

結合密度の影響
1
Company A C30, 5 μm

234

非対称性

結合密度

細孔径

1.02

1.9 μmol/m213 nm

非対称性

結合密度

細孔径

1.63

3.7 μmol/m220 nm

非対称性

結合密度

細孔径

1.04

3.0 μmol/m213 nm

1Company B C30,5 μm

2 3412, 3

Conventional C18, 5 μm
405101520

Retention time / minColumn dimension, 250 x 4.6 mm;sample,mobile phase, methanol/water = 97/3
1 = δ-tocopherol,
flow rate, 1.0 mL/min;
HOtemperature, 30 oC;
Odetection, UV295 nm;

3 = β-tocopherol,

HO

25

3035

2 = γ-tocopherol,
HOO

4 = α-tocopherol
HOO

O核酸塩基の分離
2

Company A C30, 5 μm
Ligand density = 1.9 μmol/m2
N6=17,100
34TF6=1.04
5611Company B C30, 5 μm
2Ligand density = 3.7 μmol/m2

30Column dimension, 250 x 4.6 mm
Mobile phase: 10 mM phosphate buffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 30 oC
Detection: UV 254 nm
Sample:1 = Sodium Nitrite,
2 = Cytosine
3 = Uracil
4 = Cytidine
5 = Uridine
6 = Thymine

410N6=4,000
6 TF6=1.70520

移動相の有機溶媒の組成比に関わらず，結合密度の高いC30は段数が低くテーリングする。
30

使用した表面多孔質（コアシェル）シリカ

細孔径

比表面積

110.2 nm

112 m2/g

210.8 nm

106 m2/g

312.0 nm96.1 m2/g

415.0 nm79.6 m2/g

515.5 nm73.5 m2/g

0.5 μm

1.6 μm
2 .6 μm

Core

C30カラムの物性値と分離係数
Batch number241215 241115 230216 110714 280314 220713 081112

Particle diameter (μm)

2.6

2.6

2.6

2.6

2.6

2.6

2.6

Thickness of porous layer (μm)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Core shellSpecific surface area a (m2/g)
silicaPore volume a (mL/g)

112

106

96.1

79.6

79.6

73.5

73.5

0.287

0.286

0.288

0.299

0.299

0.285

0.285

Average pore diameter a (nm)

10.2

10.8

12.0

15.0

15.0

15.5

15.5

Carbon loading of only C30 (%)

6.59

5.48

6.08

4.43

5.40

4.10

5.20

Carbon loading including end-capping (%)

7.56

6.57

7.04

5.30

6.05

4.70

5.86

Ligand (C30) density (μmol/m2)

1.79

1.55

1.91

1.64

2.03

1.64

2.11

Separation factor of β/γ-tocopherol b
Volume of 1.5 nm thickness inside pore c(μL/m2)
Ligand (C30) density d (mol/L)

1.0625 1.0570 1.0640 1.0376 1.0626 1.0415 1.0629
1.279

1.292

1.313

1.350

1.350

1.355

1.355

1.400

1.200

1.455

1.215

1.504

1.210

1.557

a: Measured by Quantachrom Autosorb.
b: Mobile phase, methanol/water=97/3; temperature, 25 oC.
c: Postulated a pore as a cylinder with a same diameter, listed as the volume of per square meter.
d: Ligand density in the volume of 1.5 nm thickness inside of pore.

細孔表面から1.5nmの厚さの体積
Volume of 1.5 nm thickness inside pore d (L/m2)

r1 (5 nm)

1.5 nmr2 (7.5 nm)

1.5 nm

単位面積当たり
アルキル基
細孔を円柱と仮定・アルキル基は細孔表面から1.5nmの厚さに存在すると仮定

1.5nm

シリカ表面

異なる細孔径での結合密度

1.07"10.2 - 12.0 nm of pore""15.0 - 15.5 nm of pore"

Separation factor of β/γtocopherol

1.065
1.061.055
1.051.045
1.041.035
0.5

1

1.5

C30 ligand density (mol/L)

2Separation factor of β/γ-tocopherol

2種類の結合密度と分離係数
1.070

10.2 - 12.0 nm of pore15.0 - 15.5 nm of pore

1.065
1.060
1.055
1.050

Too highhydrophobici
ty to performa good peak.

1.045
1.040
1.035
00.5

1

1.5

2

C30 ligand density (μmol/m2)2.5結合密度と段数・テーリングファクターとの関係
32Batch: 081112
Ligand density: 2.11 μmol/m2
N3=15,500, TF3=1.34

4123Batch: 280314
Ligand density: 2.03 μmol/m2N3=14,000, TF3=1.06

4123412134

Batch: 220713
Ligand density: 1.64 μmol/m2
N3=18,100, TF3=1.25
Batch: 110714
Ligand density: 1.64 μmol/m2
N3=18,700, TF3=1.11

Column dimension: 100 x 2.1mm
Mobile phase:
Acetonitrile/water = 60/40
Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 30 oC
Sample: 1 = Uracil
2 = Ethylbenzoate
3= Acenaphthene
4 = Butylbenzene

ビタミンE異性体の分離
1C30 batch# 230216(SunShell C30)
2 34Column: C30 batch# 230216, 2.6 mm
150 x 3.0 mm
Mobile phase: Methanol/water = 97/3
Flow rate: 0.43 mL/min
Temperature: 25 oC
Detection: UV 295 nm
Sample: 1 = δ-tocopherol
2 = γ-tocopherol
3 = β-tocopherol
4 = α-tocopherol

Retention time / minCompany A C30, 5μm
250 x 4.6 mm

Company B C30, 5μm
250 x 4.6 mm

SunShell C30, 2.6μm
150 x 3.0 mm

Separation factor of β/γtocopherol

1.048

1.062

1.064

Resolution of β/γ-tocopherol

1.30

0.85

2.01

ビタミンK1の異性体の分離
Column: C30 batch# 230216 (SunShell C30), 2.6mm
Company C core shell C30, 2.6 mmColumn size: 100 x 2.1 mm
Mobile phase: methanol/water = 96/4
Flow rate: 0.35 mL/min;
Detection: UV 250 nm;
Sample: vitamin K1 isomers (trans and cis).
transO
H 3C
H

H 3C
H

CH3

CH 3

H

CH 3

CH 3

Ocis
Vitamin K1 isomers (trans and cis)o35 C

Separation factor
C30 batch#
Company C C30
2302161.042
1.024

OResolution
C30 batch#
Company C C30
230216
1.23---o30 C

1.065

1.031

1.94

---o

25 C

1.094

1.042

2.88

0.91

o20 C

1.130

1.061

3.33

1.41

15 oC

1.167

1.080

3.791.78OCH3CH 3HCH3HCH 3HCH 3CH 3溶媒の違いによる分離の変化
Sample : アマニ油b) 2-propanola) methyl tert-butyl ether

15202530354045oColumn dimension, 150 x 4.6 mm; flow rate, 1.0 mL/min; temperature, 25 C
mobile phase : A:acetonitrile,, B: methyl tert-butyl ether (MTBE) B% 5 to 50 in 55 min
mobile phase : A:acetonitrile,, B:2-propanol B% 10 to 50 in 55 min

50

C18との比較
Sample : アマニ油

SunShell C30 150 x 4.6 mm

SunShell C18 150 x 4.6 mm

1520253035Column dimension, 150 x 4.6 mm; flow rate, 1.0 mL/min; temperature, 25 oC
mobile phase : A:acetonitrile,, B:MTBE B% 10 to 50 in 55 min

4045

C18との比較2Sample : ピーナッツ油

SunShell C30 4.6 x 150 mm

SunShell C18 4.6 x 150 mm

202530354045

Column dimension, 150 x 4.6 mm; flow rate, 1.0 mL/min; temperature, 25 oC
mobile phase : A:acetonitrile,, B:MTBE B% 10 to 50 in 55 min

505560

ペンタフルオロフェニル（PFP)
FFFFF• 疎水性相互作用• 水素結合性• 双極子相互作用• π-π相互作用• 静電的相互作用• 極性化合物の保持が可能• 立体選択性に優れている• ハロゲン化合物の分離に有効標準試料の分離

15243

12,34

17SunShell RP-Aqua

675SunShell PFP

6Hydrogen Hydrophobicity
Steric(Amylbenzene/bondingselectivity

722SunShell C18 446810(Caffeine/Phenol)

Butylbenzene)(Triphenylene/o-Terphenyl)

RP-Aqua

0.52

1.52

1.30

PFP

1.00

1.31

2.38

C18

0.39

1.60

1.46

56

30Column dimension: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine,3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

121416

Retention time/min18202224

クレゾール異性体の分離
1,2SunShell C18

3123
SunShell PFP

Column:SunShell C18, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
SunShell PFP, 2.7 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºCSample: 1 = p-Cresol
2 = m-Cresol
3 = o-Cresol

C18カラムではp-クレゾールとm-クレゾールは分離不可能
PFP は分離可能

キサンチン類の分離
3SunShell
1C18Water24132

SunShellPFP
SunShellPFPSunShell
PFP01Water

41213432420mM
phosphatebuffer pH7

SunShell C18, PFP 2.6 mm 150 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3OH/water or buffer=30/70
Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Theobromine
2 = Theophyline
3 = Caffeine
4 = Phenol

50mM
SunShell PFPはC18に比べ極性のphosphate buffer
高いカフェインを強く保持
pH7

塩濃度の調節で分離が変化

234Retention time/min

5C18とPFPによる塩基性化合物の保持比較
2,3,4SunShell C18

Column: SunShell C18, PFP, 2.6μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/10mM Phosphate buffer pH7.0 = 80/２0
Flow rate: 1.8 mL/min
Temperature: 25 ºC

1Sample: 1 = Uracil, 2 = Propranolol, 3 = Nortriptyline, 4 =Amitriptyline

1SunShell PFP
234

PFPでHILIC・イオン交換？
• HILICモード

有機溶媒リッチな移動相

固定相上に形成された水和層と移動相との分配
静電的相互作用，水素結合
水リッチな固定相• イオン交換物質がイオン成分を取り込み、代わりに物質が持っていた他のイオン成分を放出する現象

H3C

R
N+CH3OHOOPFPでHILIC・イオン交換
ペンタフルオロフェニル
pKa―

分配係数(LogP)

3.54

水の溶解度 (㎎/L)

50.8• PFPの化学的特性から水を保持するとは考えにくい• PFP基が電化を持つ構造をしていない• フッ素の強い電気陰性度により、電子の偏りが生じている
イオン交換に似た分離機構を示す

ウリジンの保持

00.20.40.60.8

11.2

1.4Column: SunShell PFP, 2.6μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/10mM Phosphate buffer pH7.0 = 80/20
Flow rate: 1.8 mL/min
Temperature: 25 ºC
Sample: 1 = Uridine

ウリジンはPFPカラムに保持されない

まとめ• 長鎖アルキル基は脂溶性化合物(ビタミンE , K1)の異性体分離に優れている。
• 細孔径により，単位面積当たりの結合密度(μmol/m2)が同じでも，単位体積当たりの結合密度(mol/L)は変化する。
• C30カラムは，溶媒を低極性な溶媒に変更することで選択性が変化する• C18カラムと比較した場合，C30カラムは異なった選択性を示す。
• PFPカラムは，優れた立体選択性を示す。
• PFPカラムでは，HILICモード，イオン交換とは異なった相互作用が働いている