実験動物ニュース

Vol. 65

65

No. 4

実験動物感染症の現状

齧歯類分離 CAR バチルスの新学名，Filobacterium rodentium について
池郁生

国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター実験動物開発室

要

約“CAR（カー）バチルス は，寒天培地を用いた培養ができず，学名は未定であった。2016 年，“CAR
バチルス のラット分離株である SMR-CT はバクテロイデス門スフィンゴバクテリウム目の新科フィロバクテリウム科（Filobacteriaceae）に，新属・新種として「フィロバクテリウム・ローデンティウム（Filobacterium rodentium）」と命名された。基準株は SMR-CT である。

“CAR（カー）バチルス” はラットやマウスに見られる慢性呼吸器疾患（chronic respiratory disease）の一因として発見されたグラム陰性のフィラメント状桿菌である [5]。この菌はそれら動物の気道の線毛上皮細胞（ciliated epithelial cell）に主に感染し，菌の形状が線毛と類似しているため Ganaway らにより CARバチルス（Cilia-Associated Respiratory bacillus）と命名された [5]。 CAR バチルス” はいわゆる培養困難菌であり，1980 年の発見 [20] 以来，本菌には学名がつけられていなかった。理化学研究所（理研）バイオリソースセンター（BRC）実験動物開発室の池，同微生物材料開発室（JCM）の坂本，放射線医学総合研究所生物研究推進課の小久保らの共同研究グ
ループは， CAR バチルス” が分類学の「科」レベルで新しい生物群であることを明らかにし， CARバチルス” のラット分離株である SMR-C T をフィロバクテリウム科（Filobacteriaceae）フィロバクテリウム属のフィロバクテリウム・ローデンティウム（Filobacterium rodentium）と命名した [6]。本稿ではこれについて概説する。
CAR バチルス” は寒天培地で培養できない [5, 7,9]。この菌の分離には孵化鶏卵漿尿膜腔への注入培養 [5] や，3T3 細胞等に感染させて共培養する方法 [2,15, 17] が取られ，ラット・マウスからは CAR-NIH [5]，SMR [10]，CBR [7]，CAT-StL および X シリーズ [15]，
CBM [16] の諸株，そしてウサギ分離株として B シ
リーズ [3]，ブタ分離株として PigCAR-1 など [13] が報告されている。これら分離株は以下の CAR バチルス” としての特徴を示す。すなわち，感染動物の呼吸器線毛上皮の線毛部で増殖し，感染実験で慢性呼吸器疾患を起こし，菌自体はグラム染色陰性かつ銀染色陽性のフィラメント状桿菌を呈し，電子顕微鏡で 3 層の外膜が確認され，滑走運動を行う。
細菌に学名を命名するためには，国際原核生物分類
命名 委 員会（International Committee on Systematics ofProkaryotes, ICSP）
による国際細菌命名規約（InternationalCode of Nomenclature of Bacteria）に沿い，ICSP の公式機関誌である Int. J. Syst. Evol. Microbiol. にその性状を記載して提案しなければならない。他誌での学名提案も可能だが，その場合は提案した学名とその性状を記載した論文を Int. J. Syst. Evol. Microbiol. に送り，ICSP の審査を受ける必要がある。細菌の学名命名については，森と中川による解説が参考になる[12]。
国際細菌命名規約によると，学名命名には表 1 の要件が必要である。簡単に述べると，学名は菌株に対して命名されるものであるため，培養可能な基準株（Type strain）を決め，それを誰もが自由に使えるようにカルチャーコレクションに無条件で寄託し（要件 1），その基準株について必要な記述を行い（要件2–5），ラテン語文法に適った学名を考案し（要件 6），Int. J. Syst. Evol. Microbiol. に提案する。提案が認められれば，同誌に採択され，LPSN（List of Prokaryoticnames with Standing in Nomenclature, www.bacterio.net/index.html）や，NCBI の Taxonomy Browser（www.ncbi.
nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/）に記載さ

66

実験動物ニュース

Vol. 65

No. 4

表 1．細菌とアーキアの学名命名に必要な項目
1．最低 2 カ国のカルチャーコレクションに寄託
培養可能であること，無条件寄託であること
2．菌のコロニー性状，細胞形態の記述
3．生理・生化学的性状試験結果の記述
至適生育温度・pH，耐塩性，生化学試験性状など
4．化学分類学的性状試験結果の記述
菌体脂肪酸組成分析（分類群の特徴を表す）
細胞壁アミノ酸組成分析（グラム陽性菌で重要）
キノン類分析（呼吸における電子伝達系補酵素）
G+C 含量測定
5．16S rDNA 塩基配列に基づく分子系統関係の記述
6．ラテン語文法に適った学名れる。
CAR バチルス” の学名命名の場合も，培養可能な基準株を決めてそれをカルチャーコレクションに寄託する必要があった。共同研究グループは Schoebらの方法を参考に， CAR バチルス” のラット分離株である SMR [10] が Vero E6 細胞と共培養するとよく増殖することを見いだした。3T3 細胞など他の細胞との共培養でも SMR は増殖したが，SMR の培養初期では増殖可能な状態に至るまで 2–3 週間必要とし，寿命の長い Vero E6 細胞のほうが SMR の増殖支持効果が高いと判断した。SMR は菌端を Vero E6 細胞上に付着させ，もう一端を培地中に伸ばした。位相差顕微鏡を用いて培養中の菌を観察すると，VeroE6 細胞に付着した SMR 菌体は培地中でイソギンチャクの触手のようにゆらゆらと揺れた。
SMR はいったん増殖を始めると，一部は Vero E6細胞に付着しないで浮遊状態で増殖した。そこでVero E6 調整培地（Vero E6 細胞を 37℃，5%CO2 インキュベータで 10% ウシ胎児血清添加 IMDM 培地を用いて 3 日間，集密培養し，その培養上清を 0.22μm フィルターろ過したもの）を使用すると，SMRを 37℃，5%CO2 インキュベータで単独培養可能なことが分かった。こうして単独培養できるようになった SMR を改めて SMR-C 株と名付け，学名命名のための基準株とした。SMR-CT を理研 BRC の微生物材
料 開 発 室 と ド イ ツ の DSMZ（German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures）に条件無しで寄託した（JCM 19453T = DSM 100392T）。
SMR-CT の培養条件は，Vero E6 調整培地を用い，SMR-CT を様々な温度，pH，NaCl 濃度で培養し，増殖するか否かで評価した。SMR-CT の生化学性状はRapid ID 32A（bioMérieux）を用い，キットの説明書にしたがって判定した。菌体脂肪酸組成は，湿菌体をアルカリけん化処理後にメチル化し脂肪酸メチルエステルとして抽出して，菌体脂肪酸組成分析システム（MIDI Inc.）を用いて決定した [8, 11]。SMR-CTのゲノム DNA はフェノール / クロロホルム法で抽出し，次世代シーケンサーでドラフトゲノムを定め，欠失部分は別途シークエンスを行って完全な環状ゲノム塩基配列を決定した（東京大学大学院新領域創成科学研究科附属オーミクス情報センター 服部正平元教授らとの共同研究）。MiGAP（www.migap.org）[18]を用いてゲノム DNA 塩基配列から 16S rRNA 遺伝子領域を推定し，また G+C 含量を計算した。SMR-CTの 16S rRNA 遺伝子はゲノム中に 1 セットのみ存在した。16S rRNA 遺伝子（LC055729, GenBank/EMBL/DDBJ） を 対 象 に BLASTN 解 析（blast.ncbi.nlm.nih.
gov/blast.cgi）[1] を行って近縁の基準株を選び，各遺伝子配列を MUSCLE 法で整列させ，近隣結合法 [14,19] ならびに最尤法 [4] で系統樹を描いた（ブートストラップ値 1,000）。
SMR-CT は微好気性で，胞子を形成せず，グラム染色陰性かつ好銀性のフィラメント状桿菌であった。
増殖中の菌は位相差検鏡で容易に確認できた。分裂時間は 20–24 時間。4–37℃で増え，最適温度は 37℃だった。pH は 6 から 8 が最適であった。ラット・マ
ウ ス の 生 理 的 な 塩 濃 度 以 上 で は 成 長 し な か っ た。
Vero E6 調整培地を用い，超低付着性培養器で培養すると，菌は単独で浮遊状態で増え，大きさは 0.8–0.9×8.3–10.0 μm であった。SMR-CT は鞭毛や線毛といった運動器官を持たないが，滑走運動を行った。SMRCT を BALB/c マウスに投与すると慢性呼吸器疾患を発症した。SMR-CT を透過型電子顕微鏡で観察すると，他の CAR バチルス 同様に 3 層の外膜を確認

実験動物ニュースVol. 65

67

No. 4

表 2．Filobacterium rodentium の学名

表 3．Filobacterium rodentium SMR-CT の主要性状

学名
門綱目科属種
基準株

分離源
グラム染色
銀染色
細胞長
形状
胞子形成
鞭毛・線毛
滑走運動
DNA G+C 含量
ウレアーゼ活性α- ガラクトシダーゼ活性
β- ガラクトシダーゼ活性
α- グルコシダーゼ活性
α- フコシダーゼ活性
主要脂肪酸

Filobacterium rodentium
Bacteroidetes
Sphingobacteriia
Sphingobacteriales
Filobacteriaceae fam. nov.
Filobacterium gen. nov.
rodentium sp. nov.
SMR-CT = JCM 19453T = DSM 100392T

ラット呼吸器疾患肺陰性
陽性
8–10 μm
フィラメント状桿菌なしなし
あり
47.7 mol%あり
なし
なし
なし
なし
iso-C15:0, anteiso-C15:0,C16:0, C14:0

することができた。
SMR-CT のゲノム塩基配列から推定した 1,491 塩基の 16S rRNA 遺伝子配列を用いて BLASTN 解析を行うと，ラットやマウスから分離報告のある CAR バ
チルス の株と 99–100% 一致した。 CAR バチルス
ブタ分離株との相同性は 87-88% であった。 CAR バ
チルス 以外の基準株との比較では，一番近縁だったのが Chitinophaga pinensis DSM 2588T，Terrimonas
ferruginea DSM 30193 T，Chitinophaga ginsengisoli
ですべて陰性を示したものはなかった。
Gsoil 052 T，Chitinophaga filiformis NBRC 15056 T，
16S rRNA 遺伝子配列を対象とした系統樹解析でChitinophaga cymbidii R156-2T お よ び Chitinophaga
は，SMR-CT は CAR バチルス” の他の齧歯類由来
skermanii CC-SG1BT であり，すべてキティノファー株とクレイドを形成したが，近隣結合法と最尤法のガ科（Chitinophagaceae）に属し，SMR-CT との相同双方ともに SMR-CT はキティノファーガ科のいずれ性はいずれも 86% であった。の属ともクラスターを形成せず，SMR-CT が細菌のT
SMR-C の 脂 肪 酸 組 成 は，iso-C15:0（41.0%）， 新たな系列を代表することが示唆された。
anteiso-C15:0（25.8%），C16:0（17.0%），C14:0（10.3%），
以上から，共同研究グループは，SMR-CT などラッ
iso-C16:0（4.4%），そして anteiso-C17:0（1.7%）であった。 トやマウスから分離された CAR バチルス” は「科」
不飽和脂肪酸やヒドロキシ脂肪酸は認められなかっレベルで新しい生物群であると考えた。そしてこのた。SMR-CT の最優勢脂肪酸は iso-C15:0 であり，キティSMR-CT を，バクテロイデス門スフィンゴバクテリウ
ノファーガ科に属する他の基準株と同様であったが， ム 目 の 新 し い 科 で あ る フ ィ ロ バ ク テ リ ウ ム 科
anteiso-C15:0，C16:0 および C14:0 の構成比はいずれの基 （Filobacteriaceae），その中の新しい属であるフィロバ準株とも異なっていた。
クテリウム属の新種「フィロバクテリウム・ローデ
ゲノム塩基配列から計算した G+C 含量は，47.7ンティウム（Filobacterium rodentium）」と命名した [6]。
mol% であった。文献から調べたキティノファーガ科
Filobacterium は，新ラテン語でフィラメント状細菌に属する他の基準株の G+C 含量は 40.7–51.9% だっの意味，rodentium は，マウスやラットが属する齧歯た。
類由来であることを意味する。基準株は SMR-CT でT
SMR-C の生化学性状で特徴的であったことは， ある（表 2）。表 3 に Filobacterium rodentium SMR-CT
ウレアーゼ陽性，ならびに α ガラクトシダーゼ，βの主要性状を記載した。
ガラクトシダーゼ，α グルコシダーゼ，α フコシダー
CAR バチルス” は 1980 年の最初の報告 [27] からゼがそれぞれ陰性だったことである。文献から調べ35 年を経て，SMR-CT を基準株として学名を得るこたキティノファーガ科に属する他の基準株ではととなった。しかし，SMR-CT の病原性発揮機構にT
Chitinophaga ginsengisoli Gsoil 052 と Chitinophaga
ついては未解明のままである。上記のように SMRpinensis DSM 2588T のほかはウレアーゼ陰性（一部のCT のゲノム塩基配列は既に決定しているが，類縁菌株では未検査）であり，α ガラクトシダーゼ，β ガラを含め未知の遺伝子が多く，SMR-CT の病原性関連クトシダーゼ，α グルコシダーゼ，α フコシダーゼに遺伝子候補は不明である。今後，病原性発揮機構のついては，キティノファーガ科に属する他の基準株研究が必要である。

実験動物ニュース68
謝Vol. 65

辞10.

Filobacterium rodentium SMR-CT 学名命名に関わったすべての方々，すべての機関に感謝申し上げます。
11.
文

献

1. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang,J., Zhang, Z., Miller, W. and Lipman, D. J. 1997.
Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generationof protein database search programs. Nucleic Acids
Res. 25: 3389–33402.
2. Cundiff, D. D., Besch-Williford, C., Hook, R. R. Jr,Franklin, C. L. and Riley, L. K. 1994. Detection of cilia-associated respiratory bacillus by PCR. J. Clin.
Microbiol. 32: 1930–1934.
3. Cundiff, D. D., Besch-Williford, C. L., Hook, R. R.
Jr, Franklin, C. L. and Riley, L. K. 1995. Characterization of cilia-associated respiratory bacillus inrabbits and analysis of the 16S rRNA gene sequence.
Lab. Anim. Sci. 45: 22–26.
4. Felsenstein, J. 1989. PHYLIP – Phylogeny Inference
Package (Version 3.2). Cladistics 5: 164–166.
5. Ganaway, J. R., Spencer, T. H., Moore, T. D. and Allen, A. M. 1985. Isolation, propagation, andcharacterization of a newly recognized pathogen, cilia-associated respiratory bacillus of rats, anetiological agent of chronic respiratory disease. Infect. Immun. 47: 472–479.
6. Ike, F., Sakamoto, M., Ohkuma, M., Kajita, A.,
Matsushita, S. and Kokubo, T. 2016. Filobacterium
rodentium gen. nov., sp. nov., a member of Filobacteriaceae fam. nov. within the phylum Bacteroidetes;
includes a microaerobic filamentous bacterium isolated from specimens from diseased rodent respiratorytracts. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 66: 150–157.
7. Itoh, T., Kohyama, K., Takakura, A., Takenouchi, T.
and Kagiyama, N. 1987. Naturally occurring CAR
bacillus infection in a laboratory rat colony and epizootiological observations. Exp. Anim. 36: 387–393.
8. Kuykendall, L. D., Roy, M. A., O’Neill, J. J. and Devine, T. E. 1988. Fatty acids, antibiotic resistance, anddeoxyribonucleic acid homology groups of Bradyrhizobium japonicum. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:358–361.
9. MacKenzie, W. F., Magill, L. S. and Hulse, M. 1981.
A filamentous bacterium associated with respiratory

12.
13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

No. 4

disease in wild rats. Vet. Pathol. 18: 836–839.
Matsushita, S. 1986. Spontaneous respiratory diseaseassociated with cilia-associated respiratory (CAR)
bacillus in a rat. Jap. J. Vet. Sci. 48: 437–440.
Miller, L. T. 1982. Single derivatization method forroutine analysis of bacterial whole-cell fatty acidmethyl esters, including hydroxy acids. J. Clin. Microbiol. 16: 584–586.
森 浩二 , 中川恭好 . 2011. 微生物名ってどうやって決まるの？ 生物工学 89(6): 336–339.
Nietfeld, J. C., Fickbohm, B. L., Rogers, D. G.,
Franklin, C. L. and Riley, L. K. 1999. Isolation of cilia-associated respiratory (CAR) bacillus from pigs
and calves and experimental infection of gnotobiotic
pigs and rodents. J. Vet. Diagn. Invest. 11: 252–258.
Saitou, N. and Nei, M. 1987. The neighbor-joining
method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4: 406–425.
Schoeb, T. R., Dybvig, K., Davidson, M. K. and Davis, J. K. 1993. Cultivation of cilia-associatedrespiratory bacillus in artificial medium and determination of the 16S rRNA gene sequence. J. Clin.
Microbiol. 31: 2751–2757.
Shoji, Y., Nozu, R., Takakura, A., Matsushita, S. andItoh, T. 1988. Enzyme-linked immunosorbent assay
for detection of serum antibody to CAR bacillus. Exp.
Anim. 37: 67–72.
Shoji, Y., Itoh, T. and Kagiyama, N. 1992. Propagation of CAR bacillus in artificial media. Exp. Anim.
41: 231–234.
Sugawara, H., Ohyama, A., Mori, H. and Kurokawa,K. 2009. Microbial genome annotation pipeline (MiGAP) for diverse users. In the 20th International
Conference on Genome Informatics. (Kanagawa, Japan), p. S001-1-S001-2 vol. 20.
Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J.
1994. CLUSTER W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting, position-specific gap penalties
and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:
4673–4680.
Van Zwieten, M. J., Solleveld, H. A., Lindsey, J. R.,
de Groot, F. G., Zurcher, C. and Hollander, C. F.
1980. Respiratory disease in rats associated with a filamentous bacterium: a preliminary report. Lab.
Anim. Sci. 30: 215–221.