23−技術資料−●全自動心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）測定試薬の開発
バイオサイエンス事業部

開発部

試薬開発 G佐藤 弘樹
新谷 晃司
林俊典

う ANP 測定試薬の AIA 試薬化を進め、全自動エンザ

1．はじめにイムイムノアッセイ装置 AIA シリーズを用いた測定試薬の開発を行ったので報告する。

心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）は、28 個のアミノ酸から構成されるホルモンであり、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、C 型ナトリウム利尿ペ2．測定原理と材料プチド（CNP）とともにナトリウム利尿ペプチドファミリーとして知られている。これらは分子内に特徴的

開 発 し た ANP 測 定 試 薬（E テ ス ト「TOSOH」 Ⅱ

な環状構造を有し、生体内においてナトリウム利尿作（ANP））は抗原抗体反応に関与する物質が凍結乾燥体用や血管拡張作用などさまざまな生理作用を果たしてとして試薬カップに封入されている。

1）

いる 。

本試薬の測定原理は 1 ステップサンドイッチ蛍光酵

ANP は主に心房で合成され、心臓に対する負荷に素免疫測定（FEIA）法であり、試薬カップに含まれ応じて血中に放出されることが報告されているため、る 2 種類のモノクローナル抗体は各々 ANP の異なる

心不全、心肥大、腎不全といった心臓に負荷がかかる部位（エピトープ）を特異的に認識し結合することにような疾患の重症度及び治療効果の判定指標として測より免疫複合体（磁性担体結合抗体−抗原（ANP）−酵定が行われている2）− 7）。また、透析患者の水分管理時

素標識抗体）を形成する（図１）。試薬カップに抗原の目安となる体重、いわゆるドライウエイトの指標とを含む検体を分注することにより、凍結乾燥体は溶解しても広く使用されている

8），9）され抗原抗体反応が開始する。37℃、10 分間の反応後、。

ANP の測定は、外注され検査センターで主に行わ未反応の抗原および酵素標識抗体を B ／ F 分離によりれているのが現状である。その一方で臨床現場では報洗浄除去し、酵素基質である 4 −メチルウンベリフェ告時間の短縮や診療前検査などの診療支援の要望が強リルりん酸（4MUP）を分注して経時的に蛍光強度をくなってきており、院内測定のニーズが高まっている。

測定し単位時間あたりの 4 −メチルウンベリフェロン

我々は全自動エンザイムイムノアッセイシステムと（4MU）の生成量を測定する。基質の蛍光強度は酵素して施設セグメント別に大型、中型、小型の装置をラ量に依存することから、酵素とともに免疫複合体を形インアップし、検査センター、大学病院、クリニック成する ANP 抗原の量にも比例することとなる。したなどの幅広いユーザーに 50 項目以上の診断薬を販売がって、あらかじめ既知濃度の ANP を含む標準品をしている実績から、本ニーズに応えるために ANP 測用い、その蛍光強度と ANP 濃度による標準曲線を作定試薬の開発を進めた。

成し、ANP 濃度未知の患者検体の蛍光強度に相当す

今回、我々は ANP を迅速に精度よく測定できるよ

る ANP 濃度を標準曲線より算出することにより ANP

抗体固定化磁性ビーズ

FreeE

EEE
EEEE検体分注

BoundEE

基質分注
（洗浄）

図１

E

酵素標識抗体検体（抗原）

B／F分離（抗原抗体反応）E

酵素基質（4MUP）（蛍光測定）

ANP測定の免疫複合体模式図

酵素反応生成物（4MU）TOSOH Research & Technology Review Vol.57（2013）24

表１

ANP 測定試薬の主な仕様

測定項目
測定原理

EDTA 血漿中 ANP
1 ステップサンドイッチ蛍光酵素免疫測定法（抗 ANP マウスモノクローナル抗体）
測定装置
全自動エンザイムイムノアッセイ装置（AIA−1200 シリーズおよび AIA−600 は除く）
免疫反応温度・時間 37℃・10 分
酵素反応温度・時間 37℃・5 分
測定対象検体EDTA 血漿測定範囲
5.0〜2,000pg ／ mL
検体量／分注水量
50μL ／ 100μL
標準品形状
凍結乾燥品（6 濃度）
濃度単位pg ／ mLの定量が可能である。測定の際、検体のカップへの分べく添加する各種蛋白質、各種糖類の組成及び分量を注、一定時間下での抗原抗体反応、B／F 分離、基質分注、最適化した。また検体中に含まれる可能性のある異好蛍光強度の測定は全自動エンザイムイムノアッセイ装性抗体（Heterophilic Antibodies）との非特異的反応置により自動で行われ、各試薬ともに測定開始から約を抑えるために複数の蛋白質をブロッキング剤として18 分後に結果が得られる。
（試薬の主な仕様を表１に、添加した。

全自動エンザイムイムノアッセイ装置 AIA − 2000 を使用したときに得られる検量線の例を図２に示す。）

また、標準品にはヒト血清が用いられることが多いが、血清成分中に含まれるプロテアーゼによる ANP分解が懸念されるため、ヒト血清ベースではなく蛋白質と緩衝液を使用する組成にすることで安定性を確保

3．AIA 試薬の開発した。またそれに伴い、ANP の容器へ吸着を防止す

ANP の 測 定 試 薬 と し て 短 時 間 か つ 精 度 の 高 い 測るため、各種蛋白質濃度も最適化した。

定試薬の開発をするために塩野義製薬株式会社よりその結果、他社キットと同等の基本性能を有し、短ANP への親和性の高い 2 種類のマウスモノクローナ時間で精度の高い測定試薬を開発することができた。

ル抗体を導入した。この 2 種類の抗体は ANP の生理活性発現に重要とされる C 末端部位及び環状構造を認識する抗体である 7）。固定化抗体について固定化量及び固定化の条件を最適化し、酵素標識抗体については酵素を結合させる架橋試薬の使用量等を最適化し十分な感度を得られるように使用濃度を決定した。
免疫反応液組成について、再現性、安定性を向上す

4．基本性能評価（1）感度試験
ANP ゼロ濃度の標準品を 10 重同時測定し、得られたレート値の平均値＋ 2SD の濃度換算値より最小検出限界を求めたところ 0.27 pg ／ mL であった。また、
0.62 pg ／ mL から 15.6 pg ／ mL の範囲で 10 種の低 ANP濃度サンプルを作製し、5 日間に渡り 1 日 2 回各 1 重測定することで 10 個の測定値を得た。変動係数（CV）

蛍光強度［nmol／（L・s）］

が 10％の理論値を実効感度として算出したときの濃度は 2.13 pg ／ mL となり、良好な結果が得られた（図３）。
（2）再現性試験
同時再現性および日差再現性について、ANP 濃度の異なる 3 種の EDTA 血漿を用いて行った。使用した試料は 1 回の測定分を小分け分注し使用まで− 80℃
ANP濃度［pg／mL］

図２

ANP測定試薬の検量線例にて凍結保存した。5 重同時測定による再現性試験の結果、CV は 1.3 ～ 2.2％であった（表２）。1 日 2 回各2 重測定し、試薬、装置を変えずに 20 回繰り返して東ソー研究・技術報告

第 57 巻（2013）

2,00050

血漿−E（ANP濃度：206.2pg／mL）
y＝206.3x＋0.2，r＝1.00
血漿−F（ANP濃度：1026.0pg／mL）
y＝1030.9x＋7.1，r＝1.00
血漿−G（ANP濃度：1448.5pg／mL）
y＝1440.9x＋7.6，r＝1.00

40

1,50030

ANP［pg／mL］

CV％

25201000.0

5.010.015.0
ANP濃度［pg／mL］

図３

1,000

50020.0

実効感度

00.00

0.250.50

行った日差再現性試験の結果（検量線作成後 92 日間）、
CV は 1.7 ～ 3.8％であった（表３）
。

表２

図４AB
CANP 平均値［pg ／ mL］
54.2
266.0987.8

表３血漿ABC1.00

希釈直線性

同時再現性
表４

血漿0.75希釈率SDCV［pg ／ mL］ ［％］1.22.24.4
1.612.6
1.3

日差再現性

ANP 平均値［pg ／ mL］
53.6
266.9980.4

SDCV［pg ／ mL］ ［％］
2.0
3.8
4.4
1.616.3
1.7

共存物質および抗凝固剤の影響
添加量

遊離型ビリルビン
抱合型ビリルビン
脂質
ヒト血清アルブミン
アスコルビン酸
EDTA

0.8〜16.8［mg ／ dL］
0.8〜18.4［mg ／ dL］
83〜1,660［mg ／ dL］
0.3〜5.0［g ／ dL］
1.0〜20.0［mg ／ dL］
0.5〜10.0［mg ／ mL］

プール血漿
回収率［％］
98.7〜99.5
96.5〜98.5
100.0〜100.4
95.1〜100.1
97.4〜100.2
100.1〜100.2（5）健常者の濃度分布
健常者 155 例について、血漿中の ANP 濃度を測定した結果のヒストグラムを図５に示す。ノンパラメトリック法による 95％基準範囲を求めた結果、7.3 ～（3）希釈直線性試験

42.9 pg ／ mL であった。

希釈直線性試験を ANP 濃度の異なる 3 種の EDTA血漿を用いて行った。各々の試料を専用希釈液で 5 段50階の希釈系列を作製し測定した結果、原点に収束する

4540

良好な希釈直線性性能を有していることが認められた35（図４）。
頻度30（4）共存物質および抗凝固剤の影響
検体中に含まれる可能性のある各物質を高濃度で、プール血漿（EDTA 血漿）へ添加し、測定値への影響を確認した。共存物質としては遊離型ビリルビン、抱合型ビリルビン、脂質、ヒト血清アルブミン、アスコ

2520151050〜6 〜12 〜18 〜23 〜29 〜35 〜40 〜46 〜52 〜58
ANP濃度［pg／mL］

ルビン酸を、抗凝固剤としては EDTA を各々表４に記載の濃度範囲で添加し測定した結果、未添加に対す

図５

健常者の濃度分布る測定値はいずれも 100 ± 10％以内であり、これら物質による影響は添加量上限まで認められないと判断した。

（6）他社キットとの相関性
254 例の EDTA 血漿検体を使用し、多くの検査センターで使用されている全自動化測定キットの A 社

TOSOH Research & Technology Review Vol.57（2013）26

CLEIA 法（x）と本試薬（y）との相関性を確認した結果、

図８では 0 時間目に測定した濃度値を 100％としてA 社 CLEIA 法と良好な相関性が認められた（図６）。

各時点における回収率を算出し、5 例の平均値をプ

171 例の EDTA 血漿検体を使用し、全自動測定キッロットした（y 軸誤差範囲は± 2 倍標準偏差（SD））。

トの B 社 CLEIA 法（x）と本試薬（y）との相関性を結果、5 時間後の回収率の平均値は室温（23℃）条確認した結果、B 社 CLEIA 法と良好な相関性が認め件で 87％、4℃、5 時間の条件で 91％とどちらの条件られた（図７）。

も時間の経過に伴い、測定値の低下傾向が認められた。
特に室温（23℃）では短時間での測定値の低下がみられたため、採血から測定までの検体の取り扱いには注

5．検体の安定性評価

意が必要であると考えられた。また、健常者検体 5 例

温度の影響を用いた別の評価では、− 20℃で 1 ヶ月間保存した場

ANP は血中の蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）に合、凍結保存前の測定値に対する回収率は 95 ～ 97％より分解が促進されるため、検体中の ANP は不安定であった。検体を冷蔵保存しても測定値の低下は免れ

8）性であることが知られている 。そこで健常者検体 5ないため、すぐに測定できない場合には、速やかに例を室温（23℃）と 4℃の温度条件下でそれぞれ保存− 20℃以下で凍結保存することが推奨される。

した時の検体中の ANP の安定性を検証した（図８）。

また、−80℃に凍結保存した健常者検体 5 例を用いて凍結融解を繰り返したときの影響を検証した（図９）。

y ＝ 0.960x ＋ 4.189
r ＝ 0.994
n ＝ 2541,500

検体安定性（室温：23℃）健常者5例
120
回収率［%］

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（ANP）［pg／mL］

2,000

1,000

110
10090807060

0135時間［hr］

500

検体安定性（室温：4℃）健常者5例
00500

1,000

1,500

2,000

A社 CLEIA法［pg／mL］

図６

回収率［%］

120110100908070

A社 CLEIA法との相関性

600135時間［hr］

図８
y ＝ 0.907x − 3.729
r ＝ 0.960
n ＝ 1711,500

検体の安定性：温度の影響

検体安定性

凍結融解回数

12110100

1,000
回収率［%］

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（ANP）［pg／mL］

2,0005009080706000500

1,000

1,500

2,0000

B社 CLEIA法［pg／mL］

図７

B社 CLEIA法との相関性

凍結融解回数図９

検体の安定性：凍結融解の影響

3東ソー研究・技術報告

第 57 巻（2013）

27

図９では凍結保存前に測定した濃度値を 100％としてに測定した時の濃度値を 100％として濃度回収率を算

各凍結融解数における回収率を算出し、5 例の平均出しプロットした（図 10）。どちらの検体においても値をプロットした（y 軸誤差範囲は± 2 倍標準偏差

自家製溶血ヘモグロビンを添加することで安定性が低（SD））
。

下したが、特に、ANP 低濃度の検体への影響が大き

結果、凍結融解を 3 回繰り返した検体の回収率はかった。ヘモグロビン濃度 250 mg ／ dL の検体では室89％と凍結前の測定値と比べ 10％低下していた。こ温 2 時間経過後に測定値が 26.7％まで低下した。これの結果から、可能な限り凍結融解を繰り返さないこと

らの結果から、正確な測定値を得るためには溶血の認が推奨され、正確な測定値を得るには凍結融解の繰りめられる検体は使用を避ける必要性があると考える。

返しは 2 回までが限度と考えられる。
6．まとめ

溶血の影響
EDTA 血漿中の ANP を測定する場合、溶血によって放出された赤血球由来のプロテアーゼが ANP の分解を促進することが知られている

10）

今回開発した ANP 測定試薬について基本性能を確認した。

、そこで赤血球溶同時再現性、日差再現性は CV3.8％以内と良好であ血物を EDTA 血漿検体に添加し、ANP の安定性検証

り、検体の希釈直線性も良好であった。また、最小検した。

出感度が 0.27 pg/mL、実効感度として CV が 10％のアプロチニン含有 EDTA 採血管を用いて採血した検体より自家製溶血ヘモグロビンを作製した。EDTA理論値を算出したときの濃度は 2.13 pg ／ mL となり、既存の方法と比較して良好な結果が得られた。

44.7、892

ANP のアプロチニン含有検体中での安定性についpg ／ mL）に対して自家製溶血ヘモグロビンを添加すて温度と溶血の与える影響について評価した。ANPる こ と で、 ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度 が 0 mg ／ dL、50 mg ／はプロテアーゼがより活性化される室温条件での測定

dL、100 mg ／ dL、250 mg ／ dL の偽似溶血検体を調製値の低下が大きかった。また、プロテアーゼが暴露すした。これを用いて室温（23℃）における ANP の安る溶血によっても測定値の低下は促進された。ANP定性を評価した。の測定で用いられている採血管には EDTA 以外にも−アプロチニン血漿検体 2 種類（ANP 濃度

ヘモグロビン濃度が 0 mg ／ dL の各検体を 0 時間目

プロテアーゼインヒビターとしてアプロチニンが含まれているが、これらの阻害能力ではプロテアーゼによる ANP の分解を完全には抑制できなかった結果、測定値の低下がみられたと考えられる。正確な測定値を低濃度検体回収率［%］

120

得るためには検体を室温に長時間置かないこと、溶血100の認められる検体は使用を避けることが必要である。

806040200

その他の検体中の共存物質や抗凝固剤は測定系に影響0mg／dL
50mg／dL
100mg／dL
250mg／dLを及ぼさないことを確認した。他社キットとの相関性試験においても良好な相関性を示した。

012

室温放置時間［hr］

り、病状のコントロールは重要な課題である。導入部にも述べたが、ANP は透析患者のドライウエイトの高濃度検体指標として広く使用されており、ドライウエイトを正120
回収率［%］

近年、我が国の透析患者数は増加の一途を辿ってお100確に管理するために本試薬による迅速測定が貢献でき80ると考えられる。

604020000mg／dL

また、ANP は BNP ほどではないが、心疾患イベン

50mg／dL
100mg／dL
250mg／dL

トの鑑別やモニタリングの指標として測定が行われている。特に、僧房弁狭窄症のように主として心房のみ
1

室温放置時間［hr］

2に負荷がかかるような症例では BNP の値は上昇せずANP の値のみが上昇するため、心疾患の診断を行う上では重要な役割を果たすと考えられる。

図10

検体の安定性：溶血の影響

さらに近年、腎疾患患者は心疾患を発生するリスク

TOSOH Research & Technology Review Vol.57（2013）

28が高いことが明らかとなってきている 12）。特に透析患者の心疾患合併症は予後不良となるため、病状のコントロールが重要であり、臨床現場では、カルシウム代謝状態を把握するだけでなく心臓の状況も把握することが必要となっている。
我 々 は、AIA 試 薬 の 心 疾 患 マ ー カ ー と し て 既 に
BNP 測定試薬、cTnI 測定試薬、CKMB 測定試薬、ミオグロビン測定試薬を、透析／腎疾患マーカーとしてIntact PTH 測 定 試 薬、CysC 測 定 試 薬、BMG 測 定 試薬を販売しており、複数の項目を同時に測定することが可能である。今回、本試薬を開発したことで透析患者をはじめとする腎疾患患者の心疾患発生リスクの予防、病状のコントロールに貢献できるものと考える。

7．謝辞

本試薬の開発に対してご協力していただいた各先生方に厚く御礼申し上げます。
医療法人鉄蕉会

文亀田総合病院

臨床検査部：大塚喜人

部長

：吉川康弘

先生

：積田智佳

先生

献１）Kangawa, K, et al, Biochem.Biophys.Res.Commun,
118, 131 − 139（1984）２）Sugawara, A, et al, Biochem.Biophys.Res.Commun,
129, 439 − 446（1985）
３）泰江弘文、他、最新医学、46、1、16 − 20（1991）
４）平田恭信、最新医学、46、1、21 − 30（1991）
５）笹貫宏、他、最新医学、46、1、31 − 38（1991）
６）小川佳宏、他、ホルモンと臨床、39、8、823 − 830（1991）
７）浜典男、他、基礎と臨床、25、13、4205 − 4212
（1991）
８）西川光重、他、基礎と臨床、26、8、3685 − 3692
（1992）
９）成瀬光栄、他、基礎と臨床、26、6、2581 − 2588
（1992）
10）片山信子、他、基礎と臨床、27、3、1145 − 1151
（1993）
11）鈴木洋行、他、Mebio、26、1、20 − 28（2009）12）甲斐久史、他、J Jpn Coll Angiol、50、6、659 −664（2010）