静電気学会誌，38, 1（2014）2-8

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論

文

誘電泳動速度計測による加熱処理酵母の膜変性評価
高澤 晋 ，白井 直機 ，内田 諭 ，杤久保 文嘉
＊

＊

＊, 1＊

（2013年9月10日受付；2013年10月28日受理）

Investigation of Membrane Degeneration for Heat-Treated Yeast
by Dielectrophoretic Velocimetry＊＊＊, 1Shin TAKAZAWA , Naoki SHIRAI , Satoshi UCHIDA＊and Fumiyoshi TOCHIKUBO(Received September 10, 2013; Accepted October 28, 2013)
Constant monitoring and detailed inspection of microbial metabolism have been required for advanced quality control in foodindustry and medical practice. In the present work, the change in membrane states for injured Saccharomyces cerevisiae (S.
cerevisiae) with heat treatment was investigated using dielectrophoretic (DEP) velocimetry in a micro-cell. Fluorescentobservation of stained S. cerevisiae showed gradual destruction of the membrane structure by heat treatment. Numericalanalyses of Clausius-Mossotti function for various electrical parameters clarified that DEP velocity depends strongly on innerwall conductivity from 0.1 to 1 MHz and cytoplasmic conductivity from 1 to 10 MHz. These results suggest that DEPvelocimetry would be available for rapid and simple estimation of the metabolic states.

1．はじめに利用した生死菌分離 ，Villanueva らは，生死微細藻類

醸造や燃料生成などのバイオ製造業では，品質保持やの分離 を行っている．Gascoyne らは血液細胞から同径性能向上を目途にした発酵工程の精密制御において，菌のがん細胞を誘電特性の違いから分離精査している ．

代謝状態の常時管理が必須となっている．また，医療現また，円城寺らは，誘電泳動により捕集した大腸菌や酵場においては，薬剤耐性菌への対応として，薬種薬量の母のインピーダンス計測値から，その代謝状態を間接的感受特性を菌体ごとに十分把握する必要がある．これらに評価しているの各課題における効率化の観点から，菌体の代謝状態を法と比較して，選択性，迅速性及び簡便性に極めて優れ迅速かつ簡便に監視できる自動化システムの開発が望まている．ただし，十分な検出感度を得るためには一定以れている．

上の捕集量が必要であり，高導電媒質への適用は難しい

4）

微生物試験の公定法は現在のところ，培養法を基本と5）6）．これらの手法は，従来の代謝計測7-9）といった問題点がある．

している．しかしながら，本手法では測定に多大な時間

そこで筆者らは誘電泳動力と代謝状態のより直接的なを 要 す る． 生 化 学 手 法 で あ る ア デ ノ シ ン 三 リ ン 酸相関について検討するため，画像解析による誘電泳動速（ Adenosine Triphosphate; ATP ）法は，短時間での簡易的度計測に着目した．本手法は原理的に単一粒子から適用な代謝判定を可能とするが，周辺環境に存在する ATPでき，様々な泳動方向の計測が可能であるため，極微量と区別することが困難である．他に，フローサイトメト検体や高導電媒質に対しても有効である．

リーなどの蛍光分光法があるが，高精度な計測には高価な試薬及び分析装置が不可欠となる．

本研究では，誘電泳動速度計測から菌体の代謝状態を評価できる新たな生体粒子計測システムの構築を目的とし最 近， 効 果 的 な 菌 検 出 法 と し て， 誘 電 泳 動ている．本報では，その基礎的段階として，加熱処理によ（ Dielectrophoresis; DEP ） を利用した電気的計測法に期り代謝状態の異なる酵母を実験的に調整し，誘電泳動速待が集まっている．実際に本手法は簡易な代謝計測技術度の処理温度特性を調査した．また，蛍光染色による膜代として用いられている．Jen らは，誘電泳動力の違いを謝計測及び電気定数変化の数値解析から，酵母の膜活性1-3）及び膜損傷度と誘電泳動速度の相関を定量的に検証した．
キーワード：誘電泳動，速度計測，加温処理，酵母，マイクロセル

首都大理工（〒192-0397 東京都八王子市南大沢 1-1）＊

Tokyo Metropolitan University, 1-1 Minami-Osawa, Hachioji,
Tokyo 192-0397, Japan
1s-uchida@tmu.ac.jp

2．原理
2.1 誘電泳動
誘電泳動とは，不均一電界中において分極した誘電微粒子が電界勾配に沿って泳動する動電現象である．誘電泳動力は次式で表せる．

誘電泳動速度計測による加熱処理酵母の膜変性評価（高澤 晋ら）（1）
ここで，r は粒子半径，E は電界の平均二乗根である．
ま た，は 界 面 の 分 極 状 態 を 表 す Clausius-Mossotti

3mS/m となった．

3.2 加熱処理工程
本実験では，代謝活性の異なる菌を調製する手段として，加熱処理によるストレス負荷を用いた．28°C で保管した懸濁原液 1.5 mL を，滅菌済みスクリューチュー（ CM ）関数であり，以下の式で表せる．
（2）

ブに分取した後，ウォーターバス（ HWA-50D, AS ONE ）で加熱した．

ここで， ，ε 及び σ は複素誘電率，誘電率及び導電率

3.3 誘電泳動速度計測である．なお，添字 p 及び m は粒子及び媒質を表す．

図 1 に本実験で用いた誘電泳動速度計測装置を示す．

Re［］が正値の場合，電界強度の強い方へと力が働

本装置は誘電泳動デバイスを中心に電気回路系，媒質送

く正の誘電泳動が，負値では逆方向に負の誘電泳動が生液系及び光学計測系で構成されている．電源として，じる．

DEP デバイスの電極端子にファンクションジェネレー

2.2 誘電泳動速度

タ（ AFG3012, Tektronix ）を接続した．また，DEP デバ

対象粒子に対する重力や浮力の影響が十分に小さいとイス内への懸濁液搬送には，シリンジポンプ（ KSP-111,見なせるとき，流体中における粒子の運動方程式は以下

KYOTO CHROMATO ）を使用した．なお，泳動濃縮にのとおりとなる．

よる初期菌濃度変化の影響を除外するため，送液路は循（3）環型とせず，通過型とした．DEP デバイス内における菌挙動撮影のために，工業顕微鏡（ LV-100D-U, Nikon ），なお，m は粒子質量，Fdrag は粘性力である．Fdrag は次式

高速度 CCD カメラ（ HAS-220, DITECT ）及び画像解析で表せる．

用パーソナルコンピュータを設置し，菌挙動部へ焦点が（4）合うように調整した．

ここで，η は媒質の粘性率である．速度の緩和時間が十図 2 に本実験で用いた誘電泳動デバイスを示す．本デ分に短いとき，FDEP と Fdrag が釣り合うため，誘電泳動速バイスは，電極基板，マイクロ流路及びデバイスホルダ

度 VDEP は以下のように表せる．

からなる．電極は石英基板上へ酸化インジウムスズ（5）（ Indium Tin Oxide; ITO ）を蒸着形成してあり，さらにSiO2 の絶縁薄膜を積層している．電極構造としては，図上式より，誘電泳動速度は二乗電界勾配及び二乗半径に3 に示すように 500 μm（ L ）× 240 μm（ W ）の薄膜電極比例する．よって，誘電泳動速度，電界分布及び粒子径が電極間隔 20 μm で二枚配置されているものを使用しが得られれば，Re［］が導出され，細胞状態を電気定数変化として間接的に評価できる．

3．実験方法
3.1 菌種及び調製方法
対象菌種として，Saccharomyces cerevisiae JCM 7255（ S.
cerevisiae, 理研バイオリソースセンター）を選定した．培地にはポテトデキストロース寒天培地（ Potato dextroseagar, MERCK ）を使用し，301 K（28°C），72 h の条件で増菌培養した．培養酵母を滅菌済み 0.1 M D- マンニトール（ DM ）溶液 1 mL に適量混和させた後，遠心分離（6,000rpm × 10 min ）を行い，分離沈殿した酵母を同 DM 溶液で 2 回洗浄した．洗浄済み酵母を，新たな DM 溶液に混和したものを懸濁原液とした．なお，懸濁原液の菌濃度は分光光度計（ UV mini 1240，島津製作所）における吸光特性から導出し，2.5 × 10 CFU/mL であった．この時，5DM 溶液及び懸濁原液の導電率は，0.2 mS/m 及び 0.25

図 1 実験装置の概略図
Fig. 1 Schematic of the present experimental apparatus.

4

静電気学会誌 第38巻 第 1 号（2014）

3.4 蛍光染色による膜代謝計測
LIVE/DEAD 染色キット（ L13152, Invitrogen ）を用い®て菌染色を行い，前出の顕微鏡で蛍光観察した．本キット は，SYTO 9 及 び propidium iodide（ PI, C27H34I2N4） の®

核酸染色剤からなり，一般には生死菌判別に用いられる．
菌に膜損傷がない場合，膜透過性のある SYTO 9 のみが®

内部に取り込まれ，DNA が緑染色される．膜損傷がある場合，膜透過性のない PI も内部に取り込まれ，核DNA が赤染色される．
図 2 誘電泳動デバイス
Fig. 2 Dielectrophoretic microdevice.

具体的な手順としては，初めに各処理試料 1.45 mL に純水で調整した 30 μL の SYTO 9 と 20 μL の PI を混和®

した．次に遮光して常温保管した試料を誘電泳動デバイ
スの流路内に充満させて顕微観察した．観察時の蛍光色から膜活性及び膜損傷度を推定した．なお，各処理における酵母の膜損傷度は，デジタル画像色解析システム（ Feelimage Analyzer 1.3.2.3，VIVA Computer ）を用いて，撮影画像内の SYTO 9 と PI の発光色割合から評価した．
®

4．結果及び考察
4.1 誘電泳動速度計測の妥当性評価
本実験条件下における誘電泳動速度計測の妥当性を評価するために，本節では二乗電界勾配（ ∇E ）と二乗半2径（ r ）に対する依存性を検証する．まず，電極端から2の距離と ∇E の関係を導出した．図 4 に示す通り，電極2端に近づくにつれて ∇E は指数関数的に増加した．未処2理（28°C ）時における各位置での誘電泳動速度を計測し，図 4 を基準に ∇E 依存性として表したものが図 5 である．
2

図 3 電極上の電界分布
Fig. 3 Spatial distribution of electric field on electrodes.

ここで，駆動周波数は 100 kHz とし，粒子半径 2.5 μmの酵母のみを選定した．∇E の増加にともない，誘電泳2動速度が線形的に増加することがわかる．なお，速度分た．流路は軟性ポリジメチルシロキサン製で，設計仕様
は 55 mm（ L ）× 2.4 mm（ W ）× 0.5 mm（ T ）である．
実験手順としては，初めに加熱処理を施した酵母懸濁液を誘電泳動デバイスの流路内に通流して充満させた．
次に通流を止めて，レンズの焦点を流路底面に合わせた後，酵母が電極上に到達するのを確認した．そして，ファンクションジェネレータを用いて，振幅 10 Vpp の電圧を印加した．CCD カメラで酵母の挙動を撮影後，図 3に示すように，電極端より 55 μm の位置から電極間方向へ 10 μm 移動した距離を計測し，解析画像ソフトウェア（ DIPP Motion PRO 2.2, DITECT ）により速度を導出した．
そ の 後， 連 成 物 理 解 析 ソ フ ト ウ ェ ア（ COMSOLMultiphysics 4.3, COMSOL ）を用いて，電極付近の電界分布を求めた．なお，各処理条件に対して 10 サンプルの平均値を取り，2 回以上の工程を繰り返して測定した．

図 4 電極端からの距離と ∇E の関係
2Fig. 4 Relationship between ∇E and distance from edge ofelectrode.
2誘電泳動速度計測による加熱処理酵母の膜変性評価（高澤 晋ら）

図 5 誘電泳動速度の ∇E 依存性
2Fig. 5 Dependence of DEP velocity on ∇E52

図 7 各処理温度における平均誘電泳動速度の周波数特性
Fig. 7 Frequency characteristics of average DEP velocity forvarious heat treatment temperatures

未処理では，100 kHz で速度が最大となった後，周波数の増加とともに減少した．処理温度が 47°
C の場合は，100 kHz で僅かな減少が見られるものの，本実験条件下
では加熱処理時間を増やしても未処理時と大きな違いはなかった．60°
C では，計測した周波数領域全体で速度が大きく減少した．なお，5 MHz 以降では酵母が動かなかったか，負の誘電泳動により電極の逆方向へ移動した
ため，速度は 0 μm/s とした．80°
C では，60°
C と比較して低周波領域の速度が更に減少した．高周波領域では60°
C の場合とほぼ同じ速度となった．なお，各条件の誤差は低速度（80°C，1 MHz ）の場合を除き 0 - 20％の

図 6 誘電泳動速度の二乗半径依存性
Fig. 6 Dependence of DEP velocity on radius squared.

範囲内であり，一定の再現性が確認された．
次に，低周波領域と高周波領域における速度変化の違

布は電圧印加開始時の位置に依存しなかった．図 6 に未いを検証するため，処理温度に対する誘電泳動速度の経2処理（301K, 28°C ）時の酵母における誘電泳動速度の r時変化を調査した．処理温度は各周波数とも 301 K（28°C，依存性を示す．r の増加にともなって誘電泳動速度は線未処理），309 K（36 °C），320 K（47 °C），333 K（60°C）

形的に増加した．

及び 353 K（80°C ）とした．図 8 及び図 9 に周波数 1002以上の結果より，速度の緩和時間が十分に短く，基板kHz 及び 1 MHz における速度変化を示す．100 kHz にお上における摩擦の影響も小さいと推察される．すなわち，いて，28°
C から 47°
C までは処理時間を増加させても速本実験条件下における誘電泳動速度計測では，式（5）度に大きな変化が見られなかった．60°
C では，10 minを満たしている．そこで次節以降では，速度実測値に対以降で速度の減少が確認された．80°
C では，5 min からして粒子半径 2.5 μm を基準に規格化補正した結果につ10 min にかけて僅かな速度上昇が見られるが，加熱直後いて考察する．と 15 min の速度が 30 μm/s で一定となったので，誤差範4.2 誘電泳動速度の加熱処理特性囲と考えられる．

本節では，加熱処理により酵母の代謝状態を変化させ

1 MHz の場合，28°
C から 36°
C では 100 kHz と比べてて誘電泳動速度を計測した結果を考証する．図 7 は 301

若干速度が減少しているが経時変化は見られなかった．

K（28°C，未処理），320 K（47°C），333 K（60°C ）及び47°
C では，加熱直後から緩やかな速度減少が始まり，353 K（80°C ）で 15 min 加熱処理した場合の周波数特性

10 min 以降では減少が僅かなものとなった．60°C では，である．

加熱直後から急激に速度が減少し，15 min 処理時では

6

静電気学会誌 第38巻 第 1 号（2014）

図 8 各処理温度における平均誘電泳動速度の経時変化（100kHz ）Fig. 8 Temporal change in average DEP velocity at 100 kHz forvarious treatment temperatures.

図 10 誘電泳動速度の規格化度数分布（60°C）
Fig. 10 Normalized degrees of DEP velocity at 60°
C,（ a ）100kHz,and（ b ）1 MHz.

近の速度が増加している．その後 10 min 処理以降では
図 9 各処理温度における平均誘電泳動速度の経時変化（1 MHz ）Fig. 9 Temporal change in average DEP velocity at 1 MHz forvarious treatment temperatures.

10 – 20 μm/s の低速域に分布を持っている．図 10（ a ）と図 10（b）を比較すると，100 kHz の場合よりも 1 MHz時の速度分布の方が狭くなっている．分布の変位は酵母の異なる部位の変化によるものだと考えられる．

80°
C の速度とほぼ同じ値となった．80°
C では加熱直後か

4.3 膜活性及び膜損傷度の実験的検証

ら速度が 10 μm/s となり，経時変化は見られなかった．

加熱処理温度と代謝状態の相関を精査するために，蛍以上より，誘電詠動速度は加熱処理時間や温度，及び光染色による膜活性及び膜損傷度を計測した．図 8 及び駆動周波数によって異なることが示された．本結果から，9 より，60°C において 100 kHz と 1 MHz において速度加熱処理による菌電気定数の変化が，式（5）の Re［変化に大きな差が出たため，本温度の蛍光観察を行った．

］の変動として検出できていると考えられる．

加熱処理を施した酵母の LIVE/DEAD 染色画像を図 11®

また，60°
C 処理時における誘電泳動速度の規格化度数に示す．60°
C，1 min 処理時には生菌の割合が多いが，分布を図 10 に示す．図 10（a）
は 60°
C，100 kHz 時の分布

10 min 以降は PI により赤発色する死菌の増加が確認さである．分布は広がりを持っていることが分かる．10れた．これは細胞壁及び細胞膜に損傷が生じ，細胞膜をmin 処理以降では高速域が急激に減少し，分布が低速域介しての物質流動が殆ど行われなくなったためである．に移動している．図 10（b）の 1 MHz 時では速度分布が

図 12 は，蛍光画像における菌の発色状態から生菌，徐々に低速側へ変化している．初期速度は 40 – 50 μm/s

死菌，及び損傷菌の存在割合を定量化したものである．に集中しているが，5 min 処理時で一次的に 30 μm/s 付

緑色発光しているものを生菌，赤色発光のものを死菌，

誘電泳動速度計測による加熱処理酵母の膜変性評価（高澤 晋ら）

7

表 1 四層細胞モデルの電気的及び幾何学的パラメータ
Table 1 Electrical and geometrical parameters of the four shelled
yeast cell model from Ref.［10］．

RegionRadiusεrσ（ S/m ）Cytoplasm

2.500

51

1Membrane

2.508

510

Inner wall

2.708

600.01

Outer wall

2.758

60.02

Suspension conductivity⊖70.2 mS/mを Table 1 に示す．上記パラメータを個々に変化させて数値解析を行った結果，本実験における周波数領域（50kHz – 10 MHz ）において細胞外壁，細胞内壁，及び細胞質の導電率に強く依存することを確認した．図 13 に細胞外壁，細胞内壁，及び細胞質の導電率が減少した場合
図 11 加熱処理を施した酵母の LIVE/DEAD 染色画像
Fig. 11 Image series of heat-treated S.cerevisiae dying by Live/®
C）
Dead BacLightTM Bacterial Viability Kit .（60°®

における，Re［］の周波数特性を示す． Re［］の減少は，周波数 100 kHz – 1 MHz では細胞内壁の導電率変化が，1 MHz – 10 MHz では細胞外壁と細胞質の導電率が支配的となった．
4.2 及び 4.3 節の結果も踏まえて，加熱処理時の菌体における誘電泳動速度と細胞電気定数の相関について考察する．60°C の加熱処理において，処理時間が 5 min の時，高周波領域で速度が減少している．これは，加熱後すぐに細胞外壁が損傷を受けた結果，膜タンパクの変性や空隙の形成に起因して，その導電率が減少したと考えられる．これは，図 10（b）において 30 μm/s の速度数が増加している事に対応している．10 min から 15 min の加熱では細胞内壁の損傷も生じ，測定周波数領域全体で速度が減少したと推察される．すなわち加熱処理において，酵母は外側から順次損傷し，外部媒質の流入により

図 12 膜損傷菌の存在割合（60°C）
Fig. 12 The proportion of membrane-injured S.cerevisiae.（60°C）

各層の導電率が変化したと言える．図 10（a）は細胞内壁の導電率変化に対応していると見られ，実際に 10 min以降で高速度の酵母が減少している．

それ以外を損傷菌とした．生菌の割合は，未処理時で約処理後 15 min では，誘電泳動速度は高周波側になる90％以上の割合を占めたが，1 min，5 min，10 min，及につれて減少し，10 MHz では反転して負の誘電泳動がび 15 min では 67％，63％，35％，及び 9％と減少して生じた．10 MHz では細胞質導電率の減少が著しい事かいった．大きく減少したのは 10 min 処理時であった．

ら，高温処理により細胞膜及び細胞壁が完全に破壊され死菌の割合は，生菌とは逆に 2％，6％，10％，54％，て，内部物質の漏洩及び外部媒質の流入が生じたと考え及び 82％と処理時間とともに増加した．本観測結果は，られる．本事象は蛍光染色実験による菌損傷割合の結果

加熱処理により酵母は外側から徐々に損傷を受け，最終とも一致する．図 10（b）の 1 MHz における速度分布の変的に細胞質まで破壊されたことを示している．

化も同様の影響によるものと推察される．

4.4 細胞電気定数の変動解析

ただし，今回の結果では加熱時間 1 min における誘電誘電泳動速度と電気定数の相関を精査するため，Re泳動速度の低減や細胞膜の誘電率変化に対する影響まで］を数値的に導出した．酵母は細胞質，細胞膜，細は十分に検証できなかった．今後，電気定数や厚みなど胞内壁，及び細胞外壁で構成される四層球体としてモデのパラメータ相互の複合的影響も精査してモデル化するル化した．各層の電気定数（誘電率及び導電率）と厚み必要がある．

［

静電気学会誌 第38巻 第 1 号（2014）8

により酵母の膜構造は加熱処理により外側から徐々に破壊されることがわかった．また，数値解析から，細胞壁及び細胞質の損傷度による誘電泳動速度への影響が顕著になる周波数領域が存在することを定量的に示せた．本
結果は，評価対象に合わせて駆動周波数を適切に選択することにより，菌の状態を高精度に評価できる可能性を示唆している．
今後，ATP 法や他の蛍光染色法などでも酵母の膜活性及び膜損傷度を計測し，誘電泳動速度と代謝状態の相関について更に精査していく．また，細胞壁及び細胞膜に影響を与えずに代謝状態を変化させる処理法を模索し，同様の実験を行って本報の考察を検証する予定である．
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Divergent Electric Fields. J. Appl. Phys., 22（1951）869-871
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Hale: Correlations between the dielectric properties andexterior morphology of cells revealed by dielectrophoretic
図 13 導電率変化に対する Re［］の駆動周波数特性（ a ）細胞外壁，（ b ）細胞内壁，及び（ c ）細胞質］under various
Fig. 13 Frequency Characteristics of Re［conductivities（ a ）outer wall,（ b ）inner wall, and（ c ）interior.

field-flow fractionation, Electrophoresis, 34（2013）10421050
7） 円城寺隆治, 尼子恵里, 内田諭, 杤久保文嘉：インピー

ダンス計測法による損傷大腸菌の誘電特性解析. 静電気学会誌, 31（2007）8-13

5．まとめ

8） 尼子恵里, 圓城寺隆治, 内田諭, 杤久保文嘉：誘電泳動

誘電泳動速度計測を用いた微生物の代謝活性評価シス

インピーダンス計測法を応用した熱損傷菌の代謝評価にテムの構築を目的として，加熱処理により酵母の代謝状関する基礎検討. 電気学会論文誌 E, 128（2008）499-504

態を変化させて誘電泳動速度計測を行い，その加熱処理

9） 圓城寺隆治, 内田 諭, 杤久保文嘉：誘電泳動インピーダ

温度に対する平均速度及び速度分布特性を調査した．さンス計測法による細菌誘電特性と細胞膜活性状態及び流らに，加熱処理に対する細胞壁及び細胞質損傷度を精査

量依存性の相関検証. 静電気学会誌, 35（2011）139-144

するため，各処理を施した酵母に蛍光染色実験を行った．

10）J. L. Sebastián, S. Muñoz, M. Sancho, and G. Martínez :その結果，加熱処理温度や時間を増加させると平均速度

Electromechanical effects on multilayered cells in nonuniformは減少し，速度分布は低速側へ移動した．蛍光染色実験

rotating fields, Phys. Rev. E, 84（2011）011926