日本生物学的精神医学会誌31 巻 2 号

93■ Mini Review

ASD リスク遺伝子産物ミオシン Id の樹状突起スパイン局在機構
佐々木哲也 ，武井＊陽介＊

抄録：ミオシンはアクチンと結合する分子モーターである。ミオシン Id は自閉スペクトラム症のリスク遺伝子であり，神経細胞での局在や機能は不明である。培養神経細胞に EGFP 融合ミオシン Id を発現させたところ，樹状突起スパインに集積が認められ，この局在には TH1 ドメインが重要であることが判明した。本研究結果は，自閉スペクトラム症発現・病態における本分子の役割を理解する最初の手がかりを与えると考えられる。
日本生物学的精神医学会誌 31（2）：93︲97, 2020
Key words：actin filament，autism spectrum disorder，dendritic spine，molecular motor，myosin Id

はじめにアクチン結合タンパク質であるミオシンは，アデノシン三リン酸（ATP）の加水分解エネルギーを用いてアクチンフィラメント上を移動する分子モーターである。ミオシンスーパーファミリーは改訂が続いており，現在のところ少なくとも 30 クラスが12）存在することがわかっている 。神経細胞に発現するミオシンは多数存在し，多種多様なカーゴの輸送およびアクチン構造の調節によってシナプス機能に6）影響を与える 。これまでに非筋肉型ミオシンⅡ，Ⅵが樹状突起スパインの形態形成に関与している
16，18）， ミ オ シ ン Va が AMPA 受 容 体（GluA1）
こと行動で特徴づけられる神経発達障害で，発症率は1％を超える。これまでにミオシンファミリーに属するいくつかの分子と ASD との関連が報告されている。ミオシン IXb は RhoA 活性を制御し，大脳皮質神経細胞における樹状突起形態形成に関与してお11）
り ，その変異が ASD リスクに影響を及ぼす可能性が示唆された 。また，コホート研究によって，
22）
ミオシン XVI と ASD との関係が示唆された 。さらに，一塩基多型（SNP）の連鎖解析研究により，ミオシン Id が ASD リスク遺伝子の候補に挙げられ19）ている 。
ミオシン I は単量体で存在するミオシンで Ia ～Ih のサブクラスを有し，それぞれ細胞接着やアク5）と結合し樹状突起シャフトからスパインへの輸送を4）行うことで長期増強に寄与すること ，ミオシン
Vb がリサイクリングエンドソームを輸送し，LTP中の AMPA 受容体挿入とスパインの成長に寄与し23）ていること など，シナプス可塑性への関与が報

チン構造の調節，エキソサイトーシスやエンドサイ
14）
トーシス，細胞内輸送に関与する 。ミオシン I は
ATP 加水分解によりアクチンと相互作用するモータードメイン，IQ モチーフを含むカルモジュリンあるいはカルモジュリン様軽鎖に結合する軽鎖結合告されている。
自閉スペクトラム症（ASD）の病態の背景にはシ17）
ナプスの構造・機能の異常があると考えられる 。
ASD は社会的コミュニケーション障害および常同

ド メ イ ン， そ し て 膜 脂 質 と 相 互 作 用 す る tail13）
homology 1（TH1）ドメイン という共通の構造を持つ。実際，ミオシン I はさまざまな細胞種でアクチンフィラメントと細胞膜とのリンカーとして機

受理日：2020 年 2 月 26 日
Localization Mechanism of Myosin Id, an ASD Risk Gene Product in Dendritic Spines＊国立大学法人 筑波大学 医学医療系 解剖学 ･ 神経科学研究室（〒 305︲8577 茨城県つくば市天王台 1︲1︲1）Tetsuya Sasaki,Yosuke Takei：Department of Anatomy and Neuroscience, Faculty of Medicine, University of Tsukuba. 1︲1︲1, Tennodai, Tsukuba︲shi, Ibaraki 305︲8577, Japan【佐々木哲也 E ─ mail：tsasaki@md.tsukuba.ac.jp】【武井陽介E─ mail：ytakei@md.tsukuba.ac.jp】

94

Japanese Journal of Biological Psychiatry Vol.31, No.2, 2020

能することが知られている。クラス I ミオシンに属するミオシン Id は，神経細胞で発現することがわ

ミオシンに保存されており，リン脂質との結合に重要である）に存在する特定の塩基性アミノ酸残基がかっているが，その局在や機能はこれまで不明のままである。本稿は，当研究室から発表された論文“Myosin Id localizes in dendritic spines through the9）tail homology 1 domain” の内容を Mini Review として紹介するものである。

アクチン結合能に大きな影響を与えることを見いだしている。最後に，成熟した神経細胞において，EGFP︲Myosin Id（全長配列）と⊿ TH1 vector をそ1．EGFP 融合ミオシン Id を用いた細胞内局在解析研究の第一段階として，脳内でミオシン Id の発現量に差があるかどうか検討するため，定量 PCRを行った。ミオシン Id は成体マウス脳全体に発現がみられたが，線条体，視床，脳幹において特に強く発現していた。また細胞質分画とシナプトソームれぞれ導入し，ミオシン Id の局在の変化を調査した。その結果，⊿ TH1 vector では樹状突起におけるシグナルが弱く，樹状突起への局在が阻害されていること，さらに樹状突起スパインへの局在も減弱していることを見いだした（図 2）。

まとめ
ミオシン Id は神経細胞の樹状突起スパインに集積すること，従来考えられていたアクチン結合部位分画に分けてその細胞内分布を調査した結果，ミオシン Id はシナプトソーム分画に多く存在していることがわかった。
次に HEK293T 細胞に EGFP 融合ミオシン Id を発現させたところ，F アクチンに富む仮足にミオシン Id が集積することが認められた。さらに初代培養海馬神経細胞に EGFP 融合ミオシン Id を導入し観察した。スパインが形成された神経細胞（培養14 日）において，後シナプス部位のマーカーである PSD︲95 抗体を用いて抗体染色を行ったところ，樹状突起上で EGFP シグナルと PSD︲95 シグナルとの共局在が観察された（図 1）。さらに樹状突起シャフトにおける蛍光強度に対するスパインの蛍光強度の比を算出した結果，EGFP︲Myosin Id シグナ
ルは mCherry シグナル（神経細胞全体のシグナル検出に用いた赤色蛍光タンパク質）と比べシグナルを欠損させてもアクチン結合能が減弱しないこと，驚くべきことに TH1 ドメインがアクチン結合能に重要であることが示された。環境に応じてシナプス伝達を微調整するシナプス可塑性は，学習や記憶の7）基盤をなす 。これまでに樹状突起スパインに存在する分子の多くがシナプス可塑性の制御に関与することがわかっている。またシナプス形成・除去のダイナミクスの異常が，ASD や統合失調症といった17）
精神疾患の病態生理の原因となっている 。網羅的遺伝子多型解析により，ミオシン Id は ASD リスク19）遺伝子として報告されている 。ミオシン Id が樹状突起スパインに集積しアクチンフィラメントと結合することから，本分子が興奮性シナプス伝達の調整に関与し，その機能異常が ASD の病態に寄与している可能性がある。
ミオシン Id の TH1 ドメインは，N アセチルアスパラギン酸（NAA）アシル化酵素であるアスパル比が有意に高く，スパイン内部へ集積する傾向が明らかになった。

トアシラーゼの C 末端と相互作用することが示さ2）れている 。NAA は哺乳類の脳に高濃度で存在しミオシン Id の樹状突起スパインへの局在を制御する領域を明らかにするため，EGFP︲Myosin Id（全長配列）のほかに，モータードメインに存在するアクチン結合部位を欠失させたベクター（⊿ 584︲594ており，統合失調症や多発性硬化症，てんかんといった精神神経疾患との関連が指摘されている。ASDvector），TH1 ドメインを含む C 末端側を欠損させた EGFP︲Myosin Id ベクター（⊿ TH1 vector）と，の児童においても，定型発達児と比較して NAA の15）低下が観察されており ，この点においてもミオシン Id と精神疾患との関係について興味を喚起する。

モータードメインを含む N 末端側を欠損させた
EGFP︲Myosin Id ベ ク タ ー（IQ ＋ TH1 vector） を作製した。これらのベクターを HEK293T 細胞に導入して検討したところ，TH1 ドメインを欠損した神経細胞は高度に分化した樹状突起に各種分子を配送する細胞内輸送システムを有している。この輸送システムでは，キネシン，ダイニン，ミオシンと5）いった分子モーターが用いられている 。これらの分子は，微小管やアクチンなどの細胞骨格に沿ってベクター⊿ TH1 vector で，ミオシン Id の仮足への分布が顕著に低下した。さらに TH1 ドメイン内の3）
pleckstrin homology（PH1） ド メ イ ン（ ク ラ ス I「荷物」を目的地まで運ぶ。細胞内輸送の障害が統合失調症や認知症に関与することが明らかになりつ1，20）。アクチンフィラメントは樹状突起スパつある日本生物学的精神医学会誌31 巻 2 号

A95

BPSD‒95Merge

蛍光 輝 度GFP

EGFP‒Myosin Id

2.5

＊2.0
1.5
1.0
0.50.0

樹状突起 PSD‒95 陽性シャフト スパイン

図 1 海馬培養ニューロンにおけるミオシン Id の局在
A．成熟した神経細胞（培養 14 日目）において，EGFP-Myosin Id（全長配列）を導入し，後シナプスのマーカーである PSD-95 抗体を用いて免疫染色を行った。樹状突起上で EGFP シグナルが強い部分と PSD-95シグナルの共局在が観察された（矢頭）。Scale bar＝5μm。B. EGFP のシグナルは，樹状突起シャフトよりも PSD-95 陽性スパインのほうが強い。＊P＜0.05. 本図は文献 9 より抜粋・改変した。

AmCherry

ΔTH1
図2B
蛍光輝度比GFP（スパイン 樹/ 状突起シャフト）

全長配列

EGFP‒Myosin Id3.0＊

2.52.01.51.00.50.0

全長配列

⊿TH1

ミオシン Id の樹状突起スパインへの局在には TH1 ドメインが重要である

A．EGFP- ミオシン Id 全長配列を発現させた樹状突起（上段）と EGFP- ミオシン Id（TH1 ドメイン欠損）を発現させた樹状突起（下段）の拡大図。mCherry を同時導入して樹状突起の形態を可視化してある。Scale bar＝5μm。B．TH1 ドメインを欠損したミオシン Id は，樹状突起スパインへの局在が阻害されている。＊P＜0.05. 本図は文献 9 より抜粋・改変した。

インだけでなく，樹状突起シャフト内にも存在して8）いることが報告されている 。興味深いことに，アクチンの脱重合を促進する薬剤で処理すると，特定の分子の樹状突起への局在が阻害されることが報告10）されている 。例えばミオシン Va はアクチン依存性の樹状突起内輸送を担っていると考えられている。TH1 ドメインを欠損したミオシン Id は，intactなミオシン Id と比較して樹状突起への局在が阻害されていたことから，本分子はアクチンフィラメントと相互作用することで樹状突起内を移動するのかもしれない。
これらの結果を踏まえて，ニューロンにおけるミオシン Id の機能解析を進めたいと考えている。さまざまな細胞種でクラス I ミオシンはアクチンフィに局在化する傾向がある。またクラス I ミオシンは，細胞膜に小胞を融合またはつなぎとめる機能があることが提案されている。ミオシン Id がこれらの機能を共有している場合，樹状突起スパインの構造または小胞輸送を制御することでシナプス伝達を調節する可能性がある。本研究成果は，ASD 発現とその病態における本分子の役割を理解する最初の手がかりをもたらすと考えられる。今後，遺伝子改変マウスやヒトを対象とした研究により，さらに機能の詳細が明らかになることを期待する。
本研究は，筑波大学医学医療系の大塚優江さんに技術的なサポートをいただいた。本研究の一部は，ラメントとリン脂質とのリンカーとして機能するこ14）とが知られている 。実際，クラス I ミオシンは，AMED（Brain/MINDS）および上原記念生命科学財団のサポートの下で行われた。佐々木は，新学術領 域「 マ ル チ ス ケ ー ル 脳 」（http：//multiscale︲brain.umin.ne.jp/）のサポートを受けている。すべ微絨毛や卵母細胞（ミオシン Ia, Id），聴覚有毛細胞の不動毛（ミオシン Ic），および糸球体上皮細胞の足突起（ミオシン Ie）などのアクチンに富む突起ての動物実験は国立大学法人筑波大学動物実験取扱規程に従って行われた。開示すべき利益相反は存在しない。

Japanese Journal of Biological Psychiatry Vol.31, No.2, 2020

96

文献13）Mazerik JN, Kraft LJ, Kenworthy AK, et al（2014）

1 ）Alsabban AH, Morikawa M, Tanaka Y, et al（2019）

Motor and tail homology 1（TH1）domains antago-Kinesin Kif3b mutation reduces NMDAR subunit

nistically control myosin︲1 dynamics. Biophys J,

NR2A trafficking and causes schizophrenia︲like phe-

106：649︲658.

notypes in mice. EMBO J, 39：e101090.
2 ）Benesh AE, Fleming JT, Chiang C, et al（2012）Expression and localization of myosin︲1d in the developing nervous system. Brain Res, 1440：9︲22.
3 ）Berg JS, Derfler BH, Pennisi CM, et al（2000）Myosin︲X, a novel myosin with pleckstrin homology domains, associates with regions of dynamic actin. JCell Sci, 113：3439︲3451.
4 ）Correia SS, Bassani S, Brown TC, et al（2008）Motor protein︲dependent transport of AMPA receptors
into spines during long︲term potentiation. Nat Neurosci, 11：457︲466.
5 ）De Rubeis S, He X, Goldberg AP, et al（2014）Synaptic, transcriptional and chromatin genes disruptedin autism. Nature, 515：209︲215.
6 ）Hirokawa N, Niwa S and Tanaka Y（2010）Molecu-14）Mclntosh BB and Ostap EM（2016）Myosin︲I molecular motors at a glance. J Cell Sci, 129：2689︲2695.
15）Moffett JR, Ross B, Arun P, et al（2007）N︲Acetylaspartate in the CNS：From neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol, 81：89︲131.
16）Osterweil E, Wells DG and Mooseker MS（2005）Arole for myosin VI in postsynaptic structure and glutamate receptor endocytosis. J Cell Biol, 168：329︲338.
17）Penzes P, Cahill ME, Jones KA, et al（2011）. Dendritic spine pathology in neuropsychiatric disorders.
Nat Neurosci, 14：285︲293.
18）Ryu J, Liu L, Wong TP, et al（2006）A critical role formyosin IIB in dendritic spine morphology and synaptic function. Neuron, 49：175︲182.

lar motors in neurons：Transport mechanisms and19）Stone JL, Merriman B, Cantor RM, et al（2007）

roles in brain function, development, and disease.

High density SNP association study of a major autism

Neuron, 68：610︲638.

linkage region on chromosome 17. Hum Mol Genet,7 ）Hotulainen P and Hoogenraad CC（2010）Actin indendritic spines：Connecting dynamics to function. J
Cell Biol, 189：619︲629.

16：704︲715.
20）Takei Y, Kikkawa YS, Atapour N, et al（2015）Defects in synaptic plasticity, reduced NMDA︲Receptor8 ）Konietzny A, Bär J and Mikhaylova M（2017）Den-transport, and instability of postsynaptic density pro-dritic actin cytoskeleton：structure, functions, andteins in mice lacking microtubule︲associated protein

regulations. Front Cell Neurosci, 11：147.

1A. J Neurosci, 35：15539︲15554.

9 ）Koshida R, Tome S and Takei Y（2018）Myosin Id21）Wagner W, Brenowitz SD and Hammer JA（2011）

localizes in dendritic spines through the tail homolo-Myosin︲Va transports the endoplasmic reticulumgy 1 domain. Exp Cell Res, 367：65︲72.

into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nat

10）Lewis TL, Mao T, Svoboda K, et al（2009）Myosin︲dependent targeting of transmembrane proteins toneuronal dendrites. Nat Neurosci, 12：568︲576.
11）Long H, Zhu X, Yang P, et al（2013）Myo9b andRICS modulate dendritic morphology of cortical neurons. Cereb Cortex, 23：71︲79.
12）Luna EJ（2019）Unconventional myosins muscle
into myofibrils. J Bio Chem, 294：7219︲7220.

Cell Biol, 13：40︲48.
22）Wang K, Zhang, H, Ma D, et al（2009）Common genetic variants on 5p14.1 associate with autism spectrum disorders. Nature, 459：528︲533.
23）Wang Z, Edwards JG, Riley N, et al（2008）Myosin
Vb Mobilizes Recycling Endosomes and AMPA Receptors for Postsynaptic Plasticity. Cell, 135：535︲548.

日本生物学的精神医学会誌31 巻 2 号

97■ ABSTRACT
Localization Mechanism of Myosin Id, an ASD Risk Gene Product in Dendritic Spines

Tetsuya Sasaki，Yosuke Takei
Department of Anatomy and Neuroscience, Faculty of Medicine, University of Tsukuba
Dendritic spines, the postsynaptic compartments at excitatory synapses, are capable of changing their shape and size tomodulate synaptic transmission. The actin cytoskeleton and a variety of actin︲binding proteins play a critical role in thedynamics of dendritic spines. Abnormalities of spine dynamics are implicated in several psychiatric disorders. Class I
myosins are monomeric motor proteins that move along actin filaments using the energy of ATP hydrolysis. Of these class I
myosins, myosin Id has been reported to be expressed in neurons, whereas its subcellular localization in neurons remained
unknown. The linkage analysis suggests that myosin Id is a potential risk gene for autism spectrum disorder（ASD）. Here,we investigated the subcellular localization of myosin Id and determined the domain responsible for it. We found thatmyosin Id is enriched in the dendritic spines of primary hippocampal neurons. The mutant form lacking the TH1 domain isless distributed in dendritic spines than is the full︲length form. Taken together, our findings reveal that myosin Id localizes
in dendritic spines through the TH1 domain. These results provide the first clues to understand the role of this molecule inthe development and pathophysiology of ASD.
（Japanese Journal of Biological Psychiatry 31（2）：93︲97, 2020）