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蚕への各種ストレスの供与と産生される絹糸の品質に関する研究

タイトル：14 ポイ

ント Bold,

河原 壽治・衣笠三郎

著者名：12 ポイント、
所属：10 ポイント群馬大学大学院理工学府 環境創生部門 〒376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1
１．２．
・・のタイトルは 12 ポイント、Bold

１. 研究背景と目的

当財団理事、評議員であっても所属、住所は記載する
本文は、10.5 ポイント

これまでの広食性カイコ（Bombyx mori）の摂食行動・植物選択行動に関する研究から、多種多 様な人工飼料の開発が可能となり、農学面だけでなく、養蚕経済学的にきわめて重要な成果が得 られている。 その中で、クワ葉中の炭酸カルシウムは、摂食促進因子であることが確
文献は、番号で示し、2件の場合も、一認されて いる[1]。 クワ葉中の炭酸カルシウムは、時間の経過とともに葉に蓄積されるが、特括して[ ]で括る。にクワは他の植物と異なり、葉の特定部位に著しい量が蓄積される[2]。クワ葉に蓄積される炭酸カルシウムに着目したとき、春と秋では蓄積量が異なる。炭酸カルシウムに対して摂食行 動を示すカイコにとっても、もし、他の動物と同様であれば炭酸カルシウムの多い秋の葉は春に比べてストレスとなる。その不完全な延伸が起こると、フィ ブロインは silk1 結晶[3,4]を生成するのではないかと考えられる[5]。
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２．材料および方法 （or 調査方法）
2.1

DNA の抽出

11 ポイント、Bold
人工飼料で育成したカイコ（Bombyx mori 交雑種 ‘錦秋’ Ｘ ‘鐘和’）の５齢幼虫から、左右の絹 糸腺を摘出した後、後部糸腺（約 0.3 g／頭）のみを選択的に採取した。後部糸腺組織を 0.8% NaCl を含む 0.01M クエン酸ナトリウム溶液 （SSC）で磨砕し、遠心分離により沈殿画分を得た。その 画分を SSC で洗浄した後、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 溶液中で撹拌することにより蛋白質を可溶化した。この DNA 溶液を適宜希釈した後、分光光度計で波長 200～300nm 範囲の吸光 度を測定した。260nm の吸光度 1.0 が 50μg/mL と してDNA 濃度を算出した。

2.2 PCR の条件
PCR の反応液の組成（40μL）は、鋳型 DNA 5μL, プライマー（Forward と Reverse を含む）5μL, Quick Taq HS DyeMix TM (TOYOBO）20 μL、滅菌 蒸留水 10μL であった。
Quick Taq HS DyeMix には、Tag DNA ポリメラーゼ、dNTP、電気泳動用 色素、反応緩衝液が入っており、2 倍濃縮のプレミックス液である。PCR 条件は、特に断りのない 限り、次の通りである：反応① 94℃（30 秒間） →反応② 60℃（30 秒間）→反応③ 70℃（1 分間）の 30 回繰り返した。反応 は，反応液 40μL を入れた 200μL 容チューブをフロートラックに装着して、反応①で は 30 秒間、反応②では 30 秒間、反応③では 1 分間，それぞれの水槽に順次浮かべて行なった。
3

2.3 アガロース電気泳動と染色2%アガロースゲルのウェルに PCR 増幅産物 (20μL) を注入し、100 V で 30～40 分間電気泳動した。なお，標準 DNA サイズマーカーとして、50 bp DNA Ladder Marker を用いた。
電気泳動後、 ゲルを 100 倍希釈の Fast BlastTM DNA 染色液（Bio-Rad）に浸し、緩やかに振盪しながら数分間染色した。その後，水道水で脱染色した。

３．研究成果（or 調査結果）
3.1 抽出した DNA の純度と収量
磨砕した後部糸腺組織からの DNA 抽出は簡単であり、SDS で可溶化した蛋白質を高塩濃度条 件で凝固・沈殿化する操作のみである。 DNA の紫外部吸収スペクトルを測定した結果、
A260／A280＝2.0、A260／A230＝1.7 であり、夾雑タンパク質が少なく極めて純度が高く、そのDNA 収量は 300～400μg／頭であった。この DNA 標品を適宜希釈して、鋳型 DNA 溶液を調製した。

図、表の番号は Bold3.2 サーマルサイクラー機器による PCR 条件の検討
1) 反応の繰り返し回数と鋳型 DNA 濃度
鋳型 DNA 濃度を増加させても、雌特異的 W マーカーの DNA バン ド (W-Yukemuri-S)が検出できなかった（図１）。25 回繰り返しでは，鋳型 DNA 量を 2.5 ng/μL にした場 合、
１）片括弧

表２．大腸菌接種個体における PGRP 遺伝子の発現量変化

表のタイトル（10ポイント、Bold）
は表の上に、説明（9 ポイント）下。

極めて薄いバンドが現れたが、明確でなかった。それに対して、30 回の繰り返し反応では、 供両端を揃える試したいずれの鋳型 DNA 濃度でも明瞭な１本のバンドが検出された (図 3) 。この増幅された バンドは、標準 DNA サイズマーカーとの比較から、300 bp と 350 bp の間に現れた。Abeら（ 2005） は、この増幅バンドの塩基対（bp）は 324 bp であること報告しており、本結果と完全に一致して いた。
2) 反応温度の許容範囲

4手動 PCR 法では、水槽の温度を持続的に一定に維持することは困難であり、繰り返しの反応工 程で温度変化が起こり、DNA 増幅に影響を与える可能性がある。各反応温度を 4℃または 5℃の幅をもたせて、PCR を行なった。反応①では 96℃、94℃、92℃で行ない、反応②では 61℃、58℃、56℃で、反応③では 73℃、 70℃、68℃で実施した。

４．今後の展望
クワ葉の厚壁異形細胞に含まれる結晶性 Ca の吸収 絹糸腺は繭の原料を合成するだけでなく、生理的役割として、過剰に摂取した Ca の選択的排泄 も担っている (赤尾 1943)。つまり、絹糸腺のイオンバランスは摂食したクワ葉からのミネラルの 影響を受けやすい。しかし、これまでの実験結果では、Ca に注目したと図のタイトル（10 ポイント、Bold）は、き、クワ葉由来の結晶性 Ca は、絹糸腺に図の下に。説明は続けて（９ポイント）取り込まれないと考えられる。この結果をさらに強固にするため、季節だけでなく複数の異なる品種の交雑種について追試実験を行い、絹糸腺の生理機能的特徴を確認する。 ・・・・
11 ポイント、Bold
謝辞

図３．ソラマメとアブラムシのシロツメクサ上での生存率の推移と Regiella 移植の効果
Regiella 移植虫（実践）、移植していない虫（破線）ともに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・シロツメクサ上での生存率が有意に増加し（一般化線形モデル、p<0.05）、移動前には成虫にさえなれなかった系統でも産仔が確認された。

謝辞文章：９ポイント

本研究の遂行に当たり、〇をご提供下さいました群馬県蚕糸技術センター・○○研 究員、無機分析にご協力下さいました○○技術研究所・○○研究員、並びに繊維構造解 析にご協力下さいました○○大学・○○〇教授、○○博士研究員へ深謝致します。

5. 引用文献

引用文献は９ポイント、本文中での引用順に並べる。

[1] 赤尾 晃 (1943) 家蚕の吐糸に関する研究 IV. 絹糸腺除去蚕の生化学的態度より観たる絹糸腺の生 物学的意義に就いて. 蚕試報. 11(3), 295-309.

番号と著者名の間は半角開ける[2] Asakura, T., Ashida, J., Yamane, T., Kameda, T., Nakazawa, Y., Ohgo, K., Komatsu, K. (2001) A
repeated β-turn structure in Poly(Ala-Gly) as a model for silk I of Bombyx mori silk fibroin studied
with twodimensional spin-diffusion NMR under off magic angle spinning and rotational echo double
resonance. J. Mol. Biol. 306, 291-305.

なお、参考文献、参考図書の記載は、特に重要なものがあれば記載して下さい。
学術雑誌名は、論文中、最初はフル・ネーム、2 度目からは略名。最初：蚕糸試験場報告、2 度目からは蚕試報、 最初：Jounal of Molecular Biology ,2 度目から J. Mol. Biol. と記載する
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