ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ
ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

II Международная конференция
молодых ученых: биотехнологов,молекулярных биологови вирусологов
Сборник тезисов

Новосибирск
Наукоград Кольцово
2015

УДК 577.2:62.01:578+(001)ББК 28.07:30.16:28.4
М431

М431 II Международная конференция молодых ученых: биотехнологов,молекулярных биологов и вирусологов — 2015 : Сб. тез. / Новосиб.
гос. ун-т. — Новосибирск : РИЦ НГУ, 2015. – 224 с.

ISBN 978-5-4437-0438-8
Сборник тезисов составлен на основе материалов, присланных
российскими и иностранными учеными в оргкомитет Международной конференции молодых ученых биотехнологов, молекулярных
биологов и вирусологов, проходящей в рамках площадки открытых
коммуникаций OpenBio-2015.
Издание предназначено для преподавателей и научных сотрудников, аспирантов, магистрантов и студентов, интересующихся актуальными проблемами и разработками в области биотехнологии,вирусологии и молекулярной биологии.
Тезисы публикуются в авторской редакции.

УДК 577.2:62.01:578+(001)ББК 28.07:30.16:28.4

ISBN 978-5-4437-0438-8© АНО «Инновационный центр
Кольцово», 2015c3
Раздел 1Биотехнология

АНТИФУНГАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ МЕСТНЫХ ИЗОЛЯТОВ
Bacillus thuringiensis КАК ЭКОЛОГИЧЕСКИ
БЕЗОПАСНЫХ АГЕНТОВ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ
М. И. Камбаралиева, О. А. Федорова, Е. Б. Магай, А. М. Мавжудова
Институт микробиологии АН РУз, Ташкент, УзбекистанВ настоящее время ассортимент микробиологических средств
биоконтроля вредителей сельскохозяйственных культур и объемыих применения значительно уступают экологически опасным химическим пестицидам. Среди микробиологических средств защиты
растений наиболее широко используются биопрепараты на основе энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis (Вt). Белковые кристаллы, или ����������������������������������������
δ���������������������������������������
-эндотоксины обусловливают, главным образом, инсектицидную активность Bt, хотя многие штаммы этого
вида продуцируют и другие физиологически активные соединения:термостабильный β���������������������������������������������
����������������������������������������������
-экзотоксин, лецитиназу (фосфолипаза С), протеазы, хитиназы и так называемые VIP�������������������������
����������������������������
-токсины, белки, секретируемые во время фазы вегетативного роста клеток Bt. В последние
годы открылись новые возможности применения данной бактериии ее токсинов. Рядом ученых показана антимикробная активность
δ-эндотоксинов Bt в отношении различных бактерий и микроскопических грибов, в том числе и фитопатогенных — возбудителей
основных болезней сельскохозяйственных культур. Это позволяет
расширить область практического применения Bt, особенно в хлоп-4Раздел 1ководческих хозяйствах республики Узбекистан, где в последние
годы отмечается нарастание поражения районированных сортов
хлопчатника вертициллезным и фузариозным вилтом, вызываемым
грибами Verticillium dahliae Kleb. и Fusarium� oxysporum����������� f������
�������
. sp������. ����
vas�
infectum. Целью настоящего исследования явился поиск и отбор
местных изолятов бактерий Bt, антагонистически активных в отношении возбудителей грибных болезней хлопчатника — вертициллезного и фузариозного вила.
С целью пополнения коллекционного фонда местных изолятов Btи выявления потенциальных природных резервуаров энтомопатогенных бактерий были исследованы посевные участки Ташкентской области под различными сельскохозяйственными культурами в ширкатных
хозяйствах Паркентского и Кибрайского туманов, посевы хлопчатника Юкори-Чирчикского и Урта-Чирчикского туманов, биолаборатории
Урта-Чирчикского тумана и Ташкентского Аграрного Университета, некоторые горные и речные массивы, а также продуктовые склады.
Свыше 160 биологических образцов (почва, песок, вода, больныеи погибшие насекомые, птичий помёт, поражённые насекомыми растения и зерновые продукты) были отобраны и подвергнуты микробиологическому анализу (Табл. 1). Из них 147 собранных образцов — этобольные и погибшие насекомые на разных стадиях развития. У всех собранных особей регистрировали клинические признаки заболевания,такие как отсутствие реакции на механическое раздражение, изменение цвета тела насекомого, размягчение и разрывы кожных покровов.
В общее количество собранных насекомых вошли как вредные насекомые (например, хлопковая и озимая совка), так и полезные (например,божья коровка). В результате микробиологического анализа гомогенатов выделено 22 культуры местных изолятов кристаллообразующих
бактерий Bt. Исследования показали, что изученный биологический
материал неравнозначен в отношении выделения из него кристаллообразующих бактерий. Личинки вощинной моли занимают первое
место среди изученных насекомых по количеству выделенных из нихместных штаммов Bt. Общее количество штаммов, выделенных ихэтих насекомых, составляет 5. На втором месте — имаго габрабраконаи личинки хлопковой совки, из них выделено по 4 штамма кристаллоо-5Биотехнология

бразующей бактерии. Из чернотелки, непарного шелкопряда выделено по 2 штамма, из трупов божьей коровки, озимой совки, кузнечика,колорадского жука и неидентифицированных личинок — по одному
штамму. Из образцов почвы выделено 2 штамма, из птичьего помета и растений, поврежденных насекомыми-вредителями — по одному
штамму. Исследования нетрадиционных образцов, таких как птичий
помёт, позволили утверждать о расширении бациллоносительства данной группы бактерий Bt в природе.
Таблица 1Источники выделения новых изолятов BtИсточник выделения

Количество Количество
изученных выделенных
образцов
штаммов

Номервыделенных
штаммов
Т115-1,
Т115-23,
Т115-24,
Т115-25,
Т115-26

Вощинная моль(Galleriae mellonella L.)

20

5Божья коровка
(Coccinella septempunctata)61Габрабракон
(Habrabracon)324Хлопковая совка
(Heliothis obsoleta F.)

28

4

6

1

Т115-9182

Т115-10,
Т115-113

1

Т115-1210

1

Т115-13Озимая совка
(Agrotis segetum S.)Чернотелка
(Tenebrio molitor sp.)Кузнечик
(Tetligonia viridissinna sp.)Колорадский жук(Leptinotansa decemlineata L.)

Т115-21
Т115-2,
Т115-3,
Т115-4,
Т115-9
Т115-5,
Т115-6,
Т115-7,
Т115-8Раздел 1

6Окончание табл. 1
Непарный шелкопряд
(Lymantria dispar)Неидентифицированные
личинки
Смыв с листа, поврежденного
насекомыми-вредителями

13

2

11

2

5

1

Образцы почвы

102Птичий помет
Общее количество

5
167

1
26

Т115-14,
Т115-15
Т115-16,
Т115-17
Т-115-22
Т115-18,
Т115-19
Т115-20Несмотря на достаточно малую выборку исследуемых образцов,прослеживается чёткая закономерность распространения кристаллообразующих бактерий. Полученные результаты коррелируют с литературными данными, указывающими на то, что больные и погибшие
насекомые являются наиболее вероятными источниками выделения
кристаллообразующих бактерий и служат благоприятными природными резервуарами Bt.
Помимо 26 новых изолятов для проведения первичного скрининга
культур по отношению к возбудителям вертициллезного и фузариозного вилта хлопчатника было обновлено свыше 100 местных штаммов
бактерий Bt коллекционного фонда Института микробиологии АН РУз.
Методом блоков было подтверждено о наличии у местных изолятов
энтомопатогенной бактерии Bt выраженных антифунгальных свойствпо отношению к фитопатогенам хлопчатника — грибам Verticillium
dahliae и Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum. Установлено, что местные изоляты являются активными антагонистами изученных штаммов
грибов. Согласно литературным данным, одним из возможных механизмов антифунгального действия Bt (а также других бацилл) являетсяих способность утилизировать мицелий и клеточные стенки грибовфитопатогенов за счет хитиназ и протеаз — внеклеточных литических
ферментов. В результате проведения первичного скрининга отобрано
18 культур наиболее активных в отношении — грибов-фитопатогенов,с диаметром зоны подавления роста грибов d = 25 – 60 мм (табл. 2).

7Биотехнология

Таблица 2Антагонистическая активность местных изолятов Вt
Штамм
7_1
88
80
49
44-2
44-1
47
17
6
74
71 паст.
73
Вр. Зер. 22
12 ФО
Т-115-2
Т-115-4
Т 115-11
Т 115-25Диаметр зоны подавления роста грибов d (мм)
Verticillium dahliae Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectumКоллекционные культуры
25
23
55
25
45
45
55
50
45
60
45
30
50
45
30
25
40
25
42
22
55
25
55
35
20
20
25
20
Новые изоляты
60
22
20
16
25
12
25
30

Совокупность полученных экспериментальных данных указываетна возможность использования местных изолятов Bt в качестве перспективных продуцентов биопрепаратов, сочетающих антифунгальную и энтомоцидную активности. Создание банка изолятов Bt с полифункциональными свойствами необходимо для дальнейшего развития
производства по выпуску биопрепаратов в Республике Узбекистан.

8Раздел 1ВАЛИДАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОПЛАЗМ
Н. С. Куцерубова, М. П. Богрянцева,С. С. Сайфутдинова, Е. А. Нечаева
ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор»В соответствии с современными требованиями GMP, все методики, используемые для контроля качества лекарственных препаратови их компонентов, должны быть провалидированы.
Одним из важных контролей медицинских иммунобиологических
препаратов (МИБП), в том числе вакцин, является контроль на отсутствие посторонних агентов, а именно микоплазм.
В настоящее время на рынке отсутствуют зарегистрированныев установленном порядке коммерческие питательные среды для выделения и культивирования микоплазм.
Целью данного валидационного испытания явилось подтверждение пригодности компонентной питательной среды (среда Каган
полужидкая) с содержанием 0,3 % агара и 15 % сыворотки эмбриональной телячьей (Gibco), приготовленной в условиях лаборатории
биологического контроля ОБТК ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», для выделения и культивирования микоплазм.
Основными действующими нормативными документами, регламентирующими проведение контроля на отсутствие посторонних
агентов, являются Государственная Фармакопея РФ (ГФ), методические указания МУК 4.1/4.2.588-96 — "Методы, контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям", общие
фармакопейные статьи (ФС) и фармакопейные статьи предприятия(ФСП) на МИБП.
В соответствии с ГФ XII издания, ч. 1 исследование ростовых
свойств испытуемой среды заключается в сравнении роста тест —микроорганизмов в емкостях (пробирках, чашках Петри) с испытуемой средой и в емкостях со стандартной питательной средой.

Биотехнология

9Процедура валидации питательной среды проводилась путем
сравнения биологических (ростовых) свойств и стерильности испытуемой и стандартной среды. Для валидации использовали питательную среду для выделения и культивирования микоплазм полужидкую
(среда Каган полужидкая), приготовленную из компонентов в лабораторных условиях. В качестве контрольной стандартной среды былаиспользована питательная среда для обнаружения микоплазм (�����
Mycoplasma�������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������
Broth�������������������������������������������������������
������������������������������������������������������
Base��������������������������������������������������
�������������������������������������������������
w������������������������������������������������
/�����������������������������������������������
o����������������������������������������������
���������������������������������������������
CV�������������������������������������������) с содержанием 0,3 % агара и 15 % сыворотки эмбриональной телячьей (Gibco) импортного производства.
Валидация была проведена на 3 сериях питательной среды длявыделения и культивирования микоплазм полужидкой (среда Каган
полужидкая) и 3-х серий стандартной импортной среды.
Пригодность методики испытания
1. Использовался стандартный образец тест-штамма Мycoplasmaarginini G 230 (СО), аттестованный в соответствии с рекомендациями ВОЗ;2. ���������������������������������������������������������
Подготовка всех испытуемых серий питательной среды проводилась в асептических условиях;3. Был проведен контроль физико-химических свойств каждой
партии испытуемой и стандартной питательной среды;4. ���������������������������������������������������������
Проведен контроль ростовых свойств каждой партии испытуемой и стандартной питательной среды.
По завершению всех этапов контроля каждое отдельное исследование оформлялось в виде протокола.
Во всех испытуемых и стандартных сериях питательной среды рост тест штамма Мycoplasma arginini G 230 (СО) в разведении
10-7 был выявлен на 3–4 сутки культивирования, что соответствует
заявленным критериям приемлемости по ростовым свойствам.
По характеру микрофлоры в испытуемых и стандартных средах
были выявлены мелкие небольшие колонии в виде беловатых полупрозрачных комочков, на 7 сутки после посева в некоторых пробирках происходит распад клеточной стенки Mycoplasma arginini.
Питательная среда для выделения и культивирования микоплазм
(среда Каган полужидкая) с содержанием 0,3 % агара и 15 % сыворотки эмбриональной телячьей (Gibco) и стандартная питательная
среда для обнаружения микоплазм (Mycoplasma Broth Base w/o CV)Раздел 1

10

с таким же содержание агара и сыворотки, приготовленные в условиях микробиологической лаборатории, соответствовали требованиям
МУК 4.1/4.2.588-96 и были использованы при испытании жидкого
полуфабриката коревой вакцины, посевного вируса, растворов желатозы, первичных культур клеток, трипсина и др. Приготовленная
таким образом питательная среда позволит, при наличии, выявить
микоплазмы в компонентах вакцины и в дальнейшем избежать контаминации микоплазмами готового лекарственного препарата.
Вывод: по результатам проведенной валидации, данная методика контроля лекарственных препаратов и их компонентов на отсутствие микоплазм с использованием питательной среды для выделения и культивирования микоплазм, приготовленной в лабораторных
условиях, гарантирует получение стабильных, достоверных результатов и считается пригодной.
Список литературы
1. О. В. Гунар, И. А. Буйлова, Л. В. Колосова, А. В. Доренская.
Применение валидационнных исследований для оценки микробиологических методик//Ведомости научного центра экспертизы средств
медицинского применения. 2013. № 3. С. 4–7.
2. �����������������������������������������������������������
Государственная фармакопея РФ XII издание, часть 1. М: «Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения». 2007. С. 181–193.
3. ��������������������������������������������������������
МУК 4.1/4.2.588-96. «Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов вводимых людям», МЗ России, Москва,1998, С. 41–59.
МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ
COTINUS OBOVATUS RAF. В УСЛОВИЯХ IN VITRO
В. М. Оксантюк, Л. А. Колдар
Национальный дендрологический парк «Софиевка» НАН Украины
Среди растений, используемых в зеленом строительстве Украины малоизвестными и недостаточно распространенными, являются

Биотехнология

11представители рода Cotinus Mill. семейства Anacardiaceae Lindl.,
которые имеют высокие хозяйственно-ценные, декоративные и лекарственные свойства. Жизненная форма растений рода Cotinus —деревья высотой до 12 м или кусты c густой шаровидной кронойи последовательными, простыми, яйцевидными листьями, длиной
до 8 см.
Это очень декоративные растения, соцветия которых покрыты белыми или фиолетовыми волосками, в связи с чем образованные метелки
имеют вид пышного султана и сохраняют очень красивый вид до конца
вегетации. Цветки мелкие, желто-белые или зеленые, длиной 2–3 мм,часто недоразвитые, собранные в рыхлые широко-конусообразные метёлковые соцветия длиной 15–30 и шириной 7–12 см.
К данному роду принадлежат два вида Cotinus coggygria Scop.
и Cotinus obovatus Raf., а также их декоративные формы и сорта.
Наиболее распространенным в Украине является вид C������
. ����
cog�
gygria. Это дерево до 4–5 м высотой с шаровидной иногда зонтиковидной кроной или же ветвистый куст с простыми яйцевиднымиили овальными листьями. К почвам не требователен, хорошо растет на засоленных почвах. C. coggygria дико растет на территории
Украины в лесах Закарпатской, западной и юго-западных областях,в восточной части по реке Донец, в Крыму — на южных и северных
склонах Крымских гор, на Кавказе — предгорьях Северного Кавказаи Закавказья. В культуре распространен как декоративное и лесомелиоративное растение в насаждениях степной и лесостепной зон европейской части бывшего СССР.
Однако малораспространенным в Украине есть интродуцированный вид — C. obovatus. Природные ареалы его занимают территорию
северной и юго-восточной Америки: штаты Техас, Оклахома, Миссури, Арканзас, Алабама, Теннеси. Согласно ботанико-географического
районирования А. Л. Тахтаджяна, район распространения C��. ������
obova�
tus, относится к провинции Атлантической низменности, которая является частью Атлантическо-Североамериканской области, Бореального подцарства, Голарктического царства.
Сегодня в Украине, в условиях культуры C. оbovatus культивируется единичными экземплярами только в Криворожском Ботаническом

12Раздел 1саду НАНУ и в Ботаническом саду им. акад. А. В. Фомина Киевского
национального университета им. Тараса Шевченко.
В Национальный дендропарк «Софиевка» НАН Украины C������
. ����
obo�
vatus попал в виде отсадков из Ботанического сада им. акад. А. В. Фомина, а также выращенный из семян полученых по делектусу из ботанического сада Люблинского Университета Марии Кюри (Польша).
Культивируются растения в кв. № 3 на интродукционном участке
им. В. В. Митина. Растения данного вида не требовательны к условиям выращивания, а их декоративность в течение всей вегетации
делает их перспективными для использования в озеленении.
Основной предпосылкой получения растительного материаладля использования в различных отраслях народного хозяйства является разработка методов массового размножения и доращиванияего до определенной кондиции с сохранением хозяйственно-ценных
признаков. Однако низкая эффективность размножения растений C.
obovatus традиционными методами (вегетативно и семенами) ограничивает их распространение. Поэтому одним из условий успешного внедрения C. оbovatus в озеленение является разработка эффективных методов массового размножения с сохранением ценных
признаков.
К альтернативным, современным методам принадлежит размножение растений в культуре in vitro — выращивание растительного
материала (клеток, тканей, органов и растений) в асептических условиях на искусственных питательных средах. Это один из способов
вегетативного размножения растений, в основу которого положена
тотипотентность клеток, то есть их свойство под действием рострегулирующих веществ полностью реализовать свой генетический
потенциал, который обеспечивает их дифференциацию и развитиедо целого организма.
Исследования проводились в лаборатории микроклонального
размножения Национального дендрологического парка «Софиевка» НАН Украины. В качестве эксплантов использовали микропагоны с апикальной меристемой длинной 1–1,5 см взятые из побегов
2-летних растений C. оbovatus. Полученный материал стерилизовали для освобождения от эпифитных микроорганизмов и грибов. ДляБиотехнология

13подбора оптимальных вариантов стерилизации испытывали водные
растворы различных химических реагентов, в том числе 2,5 % гипохлорит натрия (NaClO), 0,1 % дихлорид ртути (HgCl2) и 1,0 % нитрат
серебра (AgNO3) при различных экспозициях. С целью повышения
эффективности стерилизующих реагентов к раствору добавляли
эмульгатор «Твин 80». Наиболее эффективной была стерилизацияс применением 0,1 % -ного водного раствора дихлорида ртути с экспозицией 1,5 мин.
Питательные среды, материалы, инструменты и посуду готовили согласно общепринятых методик. Культивирование эксплантов
C. оbovatus in vitro проводили в культуральной комнате при температуре 25 ± 1 °С, 16-часовом фотопериоде, освещенности 3000–5000 лки относительной влажности воздуха 70 %.
Культивирование микропагонов осуществляли на базовой среде
Мурасиге и Скуга (МС), с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара
7 г/л при рН среды — 5,6–5,8.
Как известно, для активации пазушных меристем исходную концентрацию цитокинина в среде повышают в несколько раз до появления аномальных побегов В наших опытах для активации в эксплантов C. оbovatus морфогенетических процессов и роста дополнительных побегов, питательные среды модифицировали добавлением 6-бензиламинопурина (6-БАП) в концентрации 1,0–2,5 мг /л и β-индолилмасляной кислоты (β-ИМК) — 0,05–1,0 мг/л. Оценку
эффективности действия питательных сред на активизацию ростаи развития эксплантов проводили через 20–25 суток после их введения в культуру in vitro.
В результате удачного подбора количественного соотношения фитогормонов, в отдельных случаях наблюдали формирование адвентивных почек. Это служило началом прямого морфогенеза, при котором путем активации меристемных тканей начинали формироваться
дополнительные побеги. Наиболее эффективной была питательная
среда с добавлением 2,0 мг/л 6 БАП без содержания ��������������
β�������������
-ИМК, где коэффициент размножения составил 4–8, что значительно превышало
результаты других вариантов. Увеличение концентрации фитогормонов приводило к появлению витрифицированных побегов.

14Раздел 1Таким образом, результаты полученных экспериментальных исследований дают основание утверждать, что экспланты C. оbovatusпри экзогенном действии фитогормонов цитокининовой группы имеют высокий морфогенетический потенциал. Среди изученных модификаций питательных сред наиболее эффективной для повышения
морфогенного потенциала эксплантов была питательная среда с добавлением 6-БАП 2,0 мг / л, где коэффициент размножения за одинпассаж составлял 4–8.
ХРОНОТЕХНОЛОГИЯ ЛЕЧЕНИЯ ПУТЕМ КОРРЕКЦИИ
БИОРИТМОВ БОЛЬНОЙ ТКАНИ
П. И. Бабич, В. Н. ЗарубинООО «Сибирский инновационный центр»Исследования проведённые в области магнитотерапии показали,что при лечении различных заболеваний положительная динамика
наблюдается в 60 % случаев, отсутствие положительных результатов
составляет 30 %, отрицательный эффект достигает 10 %. При этомбыло установлено, что эффективность магнитотерапии зависитот частоты электромагнитного поля (ЭМП). Обоснованного научного
объяснения этой зависимости специалисты найти не смогли. Целью
работы является разработка новой биомедицинской технологии, направленной на повышение эффективности и безопасности лечения
соматических заболеваний низкочастотным ЭМП.
Для достижения поставленной цели потребовалось решение двухзадач: разработать новый способ лечения и аппарат для его реализации. Способ лечения базируется на хронобиологическом подходе:1) ритмичности биологических процессов; 2) лабильности биоритмов; 3) явлении усвоения внешних ритмов живыми организмами.
Свойство ритмичности биологических процессов означает, что всефизиологические процессы, протекающие в организме, сопровождаются соответствующими колебательными процессами, т. е. име-Биотехнология

15ют свои биоритмы [1]. Поскольку эти процессы взаимосвязаны, толечение заболеваний возможно путём воздействия на биоритмы организма. При заболевании происходит нарушение физиологических
процессов, которое вызывает отклонение биоритмов от нормы —патологический десинхроноз. Таким образом, одна и та же больнаяи здоровая биоткань имеют разные биоритмы. Лабильность означает,что частоты биоритмов организма не являются постоянными величинами во времени, а изменяются в определённых диапазонах.
Явление «усвоения ритма» было открыто академиком А. А. Ухтомским [2]. Учёный установил способность тканей, органов и организма в целом перестраивать свои ритмы в соответствии с ритмами внешних раздражений. В нашем случае внешним раздражителем
является ЭМП. Способ лечения осуществляется путём коррекции
отклонений, возникших в биоритмах больной ткани, импульсным
магнитным полем частотой биоритмов здоровой ткани. Суть новой
хронотехнологии заключается в следующем: если на больную тканьс частотой биоритмов �����������������������������������������
f����������������������������������������
1 подействовать ЭМП большей мощности частотой биоритмов здоровой ткани f2, то в больной ткани установятся
вынужденные колебания на частоте биоритмов здоровой ткани f2.
В результате чего произойдёт устранение патологического десинхроноза, которое повлечёт за собой восстановление нарушенных физиологических процессов и выздоровление. Способ коррекции возможен
благодаря тому, что биоритмы обладают свойством лабильности.
Для реализации способа лечения был разработан низкочастотный
магнитотерапевтический аппарат «ФизиоМаг» — генератор биоритмов здорового организма. Аппарат охватывает лечением все ткании органы, биоритмы которых попадают в диапазон его рабочих частот. На аппарат получен патент РФ на полезную модель [3]. На способ лечения подана патентная заявка на изобретение.
В настоящее время имеющиеся на рынке магнитотерапевтические
аппараты работают на частотах, которые подобраны эмпирическим
путём или определены косвенными методами. Такие частоты не могут гарантировать получение только положительного терапевтического эффекта, т.к. они далеко не всегда попадают в соответствующие диапазоны биоритмов тканей и органов здорового организма.

Раздел 116Положительная динамика от их применения в основном достигается за счёт общей или локальной магнитотерапии и опосредованного
воздействия на больную ткань или орган. В отдельных случаях такие
аппараты решают задачу биоуправляемой хронофизиотерапии — согласования терапевтического воздействия с основными биоритмами
организма (пульса и/или дыхания) [4]. Существующая магнитотерапия не лечит, а улучшает состояние больного за счёт магнитной
составляющей ЭМП, которая действует при любой частоте. Новое
направление — хрономагнитотерапия уже позволяет осуществлять
лечение заболеваний частотой биоритмов здоровой ткани и органов.
Высокая эффективность хрономагнитотерапии на аппарате «ФизиоМаг» достигается за счёт отсутствия побочного воздействия на организм и комплексного лечения путём частотной коррекции биоритмов
больной ткани с одновременным воздействием на неё методом локальной магнитотерапии. Клинические исследования, проводимые при лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта, показали, что в зависимости от вида заболевания, положительная динамика увеличивается на 10–12 %, значительно снижается употребление лекарственных
препаратов, а сроки лечения сокращаются на 10–15 %. Планируется
проведение исследований по применению разработанной биомедицинской технологии в лечении опухолевых заболеваний.
Список литературы
1. Загускин С. Л. Ритмы клетки и здоровье человека. Монография // Ростов-на-Дону, ЮФУ, 2010. 292 с.
2. Ухтомский А. А. Усвоение ритма в свете учения о парабиозе. //Избранные труды.   Под редакцией Е. М. Крепса. Ленинград: Издательство «Наука», 1978. Серия «Классики науки».
3. Зарубин В. Н., Семин М. М. Магнитоимпульсный низкочастотный терапевтический аппарат // Патент РФ № 120878. Приоритет
10.01.12.
4. Загускин С. Л., Борисов А. А. Биоуправляемая хронофизиотерапия при травмах и гастроэнтерологических заболеваниях // Вестник
РАМН, 2000, № 8, с. 49–52.

Биотехнология

17НОВАЯ LIKE-СИСТЕМА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ
ПРОМЫШЛЕННО ВАЖНЫХ БЕЛКОВ
А. О. Тихонова, А. А. Тойменцева
Казанский (Приволжский) федеральный университет,Институт фундаментальной медицины и биологии
Рост населения Земли предполагает увеличение масштабов производства промышленно важных белков — для биотехнологий, биофармацевтики (факторы крови, тромболитики и антикоагулянты, гормоны,ферменты, факторы роста, интерфероны и интерлейкины, вакцины),сельского хозяйства (ферменты животных кормов; средства защиты
растений), производства моющих средств, природоохранной деятельности (ферментные системы биодеградации токсичных соединений
окружающей среды). Интерес к ферментам микроорганизмов объясняется недостаточной способностью белков животного и растительного
происхождения удовлетворять рыночный спрос на жизненные потребности населения планеты. Для производства любого рекомбинантного
белка необходима экспрессионная система, обеспечивающая повышенный выход продукции. Выбор системы экспрессии зависит от свойств
целевого белка и способности хозяйской клетки продуцировать белок
нужного качества при соблюдении минимального набора требований.
Таким образом, актуальной задачей является как совершенствование
известных, так и создание новых экспрессионных систем.
Как правило, экспрессионная система представляет собой плазмиды (векторы), в составе которых располагаются все необходимые
регуляторные элементы (промоторы, соответствующие гены белковрегуляторов) для последующей интеграции под их контроль целевых
генов. Такие плазмиды переносят в клетку-продуцент (бактериальные, эукариотические) для производства целевого белка.
На основе промотора PliaI Bacillus subtilis нами создана новая LIKEсистема экспрессии (от нем. LIa-Kontrollierte Expression), позволяющая направленно изменять экспрессию генов при добавлении стрессо-Раздел 118вого фактора (индуктора) в питательную среду. В качестве индуктора
использован антибиотик бацитрацин. Эксперименты с использованием генов lacZ и gfp под контролем промотора PliaI показали особо высокий уровень экспрессии (до 1000 раз) этих генов при воздействии антибиотика. Причем накопление целевого белка проявляется уже через
10–15 мин, в отличие от аналогов, проявляющих свое действие только
через несколько часов! LIKE-система основана на двух типах векторов: pLIKE-int и pLIKE-rep. Первый тип позволяет получать экспрессию интересуемого гена в геноме. Второй, pLIKE-rep тип — на плазмиде. LIKE-система содержит оптимизированный промотор PliaI, что
6-кратно повышает эффективность трансляции. По сравнению с интегративной экспрессией, репликативная экспрессия даёт повышенный
выход белка вследствие мультикопийности вектора.
Использование обнаруженного нами промотора B. subtilis и созданной на его основе системы производства рекомбинантных белков различного целевого назначения, является высокоперспективной
основой промышленных биотехнологий получения импортозамещающих белковых препаратов.
ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ГЕННО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ
ПРЕПАРАТ АНТИОНКОРАН-М ПОВЫШАЕТ
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ *И. В. Алексеенко 1, 2, О. А. Безбородова 3, Е. Р. Немцова 3,
А. Р. Геворков 3, Е. В. Хмелевский 3, А. С. Соболев 4,
Р. И. Якубовская 3, Е. Д. Свердлов 1, 2
1ФБУН Институт молекулярной генетики РАН, 2 ФБУН Институт
биоорганической химии им. ак. М. М. Шемякина
и Ю. А. Овчинникова РАН, 3 ФГБУ «ФМИЦ им. П. А. Герцена»Минздрава России, 4 ФБУН Институт биологии гена РАНРазработан новый генно-терапевтический препарат АнтионкоРАН-М, который представляет собой комплекс генной конструкции,Исследование поддержано грантом Президента России МК-6185.2015.4
и КОМФИ № 13-04-40170-H.
*Биотехнология

19содержащей ген-убийцу тимидинкиназы вируса простого герпеса
(HSVtk) и ген-иммуномодулятор гранулоцитарно-макрофагального
колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и блок-сополимер ПЭГ(полиэтиленгликоль)-ПЭИ (полиэтиленимин). Для облегчения проникновения в клетки к блок-сополимеру ПЭИ-ПЭГ дополнительно
присоединен фрагмент ТАТ-белка, повышающий эффективность проникновения блок-сополимера в клетки.
Тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSVtk) — фермент, который способен фосфорилировать низкотоксичный аналог гуанозина — ганцикловир до ганцикловирмонофосфата. Когда в опухолевые
клетки доставляется извне ганцикловир, клетки, трансформированные HSVtk, погибают, поскольку HSVtk превращает его в ганцикловирмонофосфат, который затем клеточные киназы фосфорилируютдо ганцикловиртрифосфата. Последний при клеточном делении
включается во вновь синтезированную цепь ДНК и обрывает ее дальнейший синтез. Таким образом, происходит селективное уничтожение раковых клеток, так как нормальные покоящиеся клетки не синтезируют ДНК и не включают фосфорилированный ганцикловир.
Очень важной особенностью данного подхода является способность вновь образуемого ганцикловиртрифосфата высвобождатьсяиз клетки, в которой он был образован, и проникать в соседние раковые клетки, вызывая их гибель. Образование токсинов внутри раковых клеток и их диффузия в соседние клетки резко снижает токсичность препарата и увеличивает его терапевтический индекс.
Полагают, что совместная экспрессия генов HSVtk и GM-CSF
в клетках опухоли приводит к гибели раковых клеток за счет работы HSVtk и высвобождению из них опухолевых антигенов, которые
эффективно представляются антиген-представляющими T- клетками
иммунной системы, активированными ���������������������������
GM�������������������������
-������������������������
CSF���������������������
, обеспечивая активацию специфического противоопухолевого иммунитета.
В ходе доклинических испытаний АнтионкоРАН-М показано, чтопрепарат обладает высокой противоопухолевой активностью: увеличение продолжительности жизни животных 30–86 %, торможение
роста опухоли 75–83 %, торможение метастазирования 80–82 % в зависимости от типа опухоли, и низкой токсичностью.

Раздел 120

На мышах с привитой опухолью С26 (аденокарцинома кишечника) показано, что эффективность увеличивается при комбинированном использовании АнтионкоРАН-М и лучевой терапии, не приводяк появлению дополнительной токсичности. Увеличение продолжительности жизни животных, получавших только лучевую терапию
составило 18 %, только АнтионкоРАН-М — 35 %, сочетанное лечение (АнтионкоРАН-М+лучевая терапия) — 71 %.
ВЫЯВЛЕНИЕ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ
МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО УДЛИНЕНИЯ
АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОГО ПРАЙМЕРАС ДВОЙНОЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ *Е. Е. Башмакова 1, 2, В. В. Красицкая 2, Л. А. Франк 1, 2
1ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет, 2 ФГБУН
Институт биофизики Сибирского отделения
Российской академии наукВыявление генетических полиморфизмов важно при исследовании генетических основ заболевания, оценки предрасположенностик тем или иным патологиям, индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам и т. д.
В качестве альтернативы существующим методам определения
однонуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphism,
SNP) нами разработан метод, включающий в себя ферментативное
удлинение аллель-специфичного праймера с последующим анализом
продуктов реакции с помощью биолюминесцентных меток на основе
цветных вариантов рекомбинантного фотопротеина обелина. Биолюминесцентный сигнал этого белка возникает в момент присоединения ионов кальция и имеет характер короткой вспышки. Благодаря
высокому квантовому выходу реакции и низкому уровню шума обеРабота выполнена при поддержке грантов Российского научного фонда
(проекты № 14-14-01119 и 14-35-00107).
*Биотехнология

21

лин выявляют в аттомолярных количествах, используя современные
фотометры различных форматов и конфигураций. Величина сигналане зависит от наличия субстрата или каких-либо кофакторов и при избытке Ca2+ линейно связана с концентрацией мишени. К настоящему
времени рекомбинантный обелин и его генно-инженерные вариантыс существенно разной биолюминесценцией являются доступными
стабильными белками, что позволяет применять их в составе химических коньюгатов с различными биоспецифическими молекуламив качестве высокочувствительных репортеров в иммуно- и гибридизационном анализах [1,2].
На основе мутантных вариантов фотопротеина обелина, существенно различающихся по цвету и кинетике биолюминесцентных
сигналов, нами был разработан метод одновременного анализа двухмишеней в одном образце [3]. Метод был успешно использован и апробирован на большом количестве клинических образцов сывороткипри одновременном иммуноанализе 2-х гонадотропных гормонов (ЛГи ФСГ), а также тотального и иммуноглобулин-связанного пролактина
[4,5]. Эти же репортеры использовали для одновременного выявления
аллельных вариантов гена при выявлении однонуклеотидных замен.
Принцип разработанного нами метода представлен на рисунке. Фрагмент ДНК, содержащий искомые SNP, амплифицировали и полученные ПЦР-продукты без очистки использовали как матрицу для PEXT(������������������������������������������������������������������
primer������������������������������������������������������������
-�����������������������������������������������������������
extention��������������������������������������������������
) реакции. Реакционная смесь содержит пару праймеров: комплементарный аллелю дикого типа, помеченный на 5'-конце
6-карбоксифлюоресцеином, и комплементарный мутантному аллелю,помеченный олигоаденилатом (dA)27. В случае полной комплементарности матрицы и аллель-специфичного праймера происходит егоудлинение ДНК-полимеразой. В противном случае синтез не происходит. Вместо тимидинтрифосфата реакционные смеси содержат биотинилированное производное дезоксиуридинтрифосфата (Bio-dUTP),благодаря чему синтезированные олигонуклеотиды содержат остаток
биотина. Продукты PEXT реакции переносили в лунки планшета, поверхность которых активирована стрептавидином. Иммобилизованные на поверхности праймеры, удлиненные ДНК полимеразой, выявляли при помощи смеси конъюгатов мутантного обелина H22E;W92F

22Раздел 1с политимидилатом (dT)30 и мутантного обелина Y138F с антителамик флуоресцеину. Биолюминесцентную реакцию обоих репортеров
инициировали добавлением раствора CaCl2 и регистрировали последовательно на планшетном люминометре с использованием широкополосных светофильтров, отсекающих сигналы соседнего репортера.
Генотип определяли по соотношению биолюминесцентных сигналов
BLзел/BLфиол (дискриминационный фактор, Д). Значения Д для разных генотипов различаются существенно, что позволяет проводить генотипирование с высокой достоверностью.

Рис. 1. А — продукты PEXT реакции и результаты биолюминесцентного анализа при разных вариантах генотипа; Б — твердофазный биолюминесцентный микроанализ продуктов PEXT реакции. St — стрептавидин; В — остаток биотина; W92F,H22E и Y138F — репортерные
белки, фиолетовый и зеленый, соответственно. FAM — остаток флуоресцеина; В — результаты генотипирования полиморфизма гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR)Например, при выявлении мутации Лейден в клинических образцах ДНК одновременно предложенным способом и сертифицированным методом на основе ПЦР-РВ (набор НПО «Литех») не обнаружено ни одного расхождения результатов (��������������������������
N�������������������������
= 84). Кроме того, пока-Биотехнология

23

зано, что биолюминесцентный способ не уступает методу на основе
ПЦР-РВ по параметрам экономической эффективности [6].
Предложенный метод использовали для одновременного определения полиморфизмов 4-х разных генов, ассоциированных с риском
развития нарушений системы гемостаза. Три из них: мутация Лейден
(FV, rs6025), полиморфизм гена метилентетрагидрофолатредуктазы
(MTHFR, rs1801133) и мутация гена протромбина (FII, rs1799963) повышают риск развития тромботических явлений и развития тромбофилии. Четвертый полиморфизм — полиморфизм гена фактора свертываемости VII (FVII, rs 6046), как предполагают, имеет защитный
эффект относительно риска развития тромбозов. Определение данных
полиморфизмов важно в комплексе, поскольку тромбофилия — многофакторное заболевание, являющееся результатом совместного воздействия внешних факторов и генетических вариантов нескольких генов.
При генотипировании клинических образцов ДНК на наличие
исследуемых четырех полиморфизмов на первом этапе все матрицы
получали одновременно в одной пробирке с помощью мультиплексной амплифицикации и полученную смесь без очистки использовали для четырех отдельных PEXT реакций. Результаты мультиплексного биолюминесцентного генотипирования полностью совпалис результатами раздельного генотипирования, полученными методом на основе ПЦР-РВ (N = 30).
Еще одним примером использования предложенного метода является генотипирование трех полиморфизмов в гене меланокортинового рецептора первого типа (MC1R), ассоциированных с фенотипом
(«red-hair mutations») и имеющих связь с риском развития меланомы и немеланомного рака кожи. Нами исследованы созданные модельные плазмиды со вставкой полиморфного фрагмента гена MC1R
(нормального варианта и с тремя однонуклеотидными полиморфизмами rs1805007; rs1805008 и rs1805009), а также ряд ДНК из клинических образцов [7]. При генотипировании SNP�������������������
����������������������
гена MC1R амплифицированный полиморфный участок ДНК использовали как матрицудля трех отдельных PEXT реакций, определяющих три исследуемых
полиморфизма. Все результаты биолюминесцентного анализа подтверждены секвенированием (N = 77).

Раздел 124Таким образом, разработанный нами способ выявления аллельных вариантов гена на основе PEXT реакции с последующим биолюминесцентным анализом полученных продуктов обеспечивает
достоверное генотипирование. Анализ проводится в высокоэффективном планшетном формате и занимает около 2 ч (вместе с наработкой матрицы). Биолюминесцентные метки стабильны при хранениив растворе (не менее 2-х месяцев при 8°С) и в замороженном виде(неменее года), что делает возможным создание аналитических наборов для клинического применения. Возможно дальнейшее развитие
метода в направлении автоматизации ряда процедур и увеличения
числа анализируемых полиморфизмов.
Список литературы
1. Frank L. A., Ca2+-regulated photoproteins: effective immunoassay
reporters // Sensors — 2010, 10, 11287–11300.
2. Frank L. A., Krasitskaya V. V., Application of enzyme bioluminescence for medical diagnostics // Adv Biochem Eng Biotechnol — 2014,
144,175–197.
3. Frank L.A, Borisova V. V., Markova S. V., Malikova N. P., Stepanyuk G. A., Vysotski E. S. Violet and greenish photoprotein obelin mutants for reporter applications in dual-color assay // Anal Bioanal Chem —2008, 391, 2891–2896.
4. Kudryavtsev A. N., Krasitskaya V. V., Petunin A. I., Burakov A. Y.,
Frank L. A. Simultaneous bioluminescent immunoassay of serum total
and IgG-bound prolactins // Anal Chem — 2012, 84, 3119–3124.
5. Krasitskaya V. V., Kudryavtsev A. N., Shimomura O., FrankL. A. Obelin mutants as reporters in bioluminescent dual-analyte binding
assay // Anal Methods — 2013, 5, 636–640.
6. Красицкая В. В., Субботина Т. Н., Ольховский И. А., Франк
Л. А. Определение мутации Лейдена методом ферментативного удлинения аллель-специфического праймера с двойной биолюминесцентной детекцией (��������������������������������������������
PED�����������������������������������������
-Биолюм) // Клиническая лабораторная диагностика — 2013, 12, 26, 39–41.

Биотехнология

25

7. Башмакова Е. Е., Красицкая В. В., Бондарь А. А., Козлова А. В.,
Т. Г. Рукша, Франк. Выявление однонуклеотидных полиморфизмов
(R160W, R151C, D294H) в гене рецептора меланокортина -1 (MC1R)
биолюминесцентным анализом // Молекуляр. биология — 2015. 49,
5 (принята в печать) DOI: 10.7868/S0026898415050031.
РАЗРАБОТКА ПОРТАТИВНОГО МИКРОФЛЮИДНОГО
КАРТРИДЖА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗНАЧЕНИЯ
МЕЖДУНАРОДНОГО НОРМАЛИЗОВАННОГО
ОТНОШЕНИЯ В ОБРАЗЦАХ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ *С. А. Долгушин 1, Т. А. Середина 2, Е. С. Одинцова 2, 3, Н. А. Базаев 1,
П. В. Руденко 1, А. В. Тронин 2ОАО «Зеленоградский инновационно-технологический центр»,2
ЗАО «МБС-Технология», 3 ФГБУН «Институт химической
биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения
Российской академии наук»1В России, по данным Минздрава, среди всех причин смертности
заболевания системы кровообращения занимают лидирующие позиции, опережая заболевания органов дыхания, пищеварения и новообразования. За последние 20 лет смертность от заболеваний системы
кровообращения составляет около 50 %.
Система свёртывания крови (гемостаза) представляет собой многофакторный механизм, направленный на поддержание оптимальных
реологических свойств крови. Условно гемостаз подразделяется на коагуляционный и тромбоцитарно-сосудистый. Оба пути имеют сложно
устроенные механизмы реализации и регуляции, любые нарушенияв которых являются причиной развития заболеваний. В коагуляционном гемостазе участвуют плазменные факторы свертывания. Этот этапРабота выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (соглашение № 14.607.21.0066, уникальный идентификатор
проекта RFMEFI60714X0066).
*

26Раздел 1включает активацию плазменных факторов и образование фибрина,скрепляющего тромбоцитарную пробку. Тромбин — основной фермент коагуляционной системы, катализирующий превращение фибриногена в фибрин. Динамикой и количеством образовавшегося тромбина определяются скорость и интенсивность превращения фибриногенав фибрин, а, следовательно, и всего процесса тромбообразования.
Протромбиновое время (ПТВ) и его производные протромбиновый индекс (ПТИ) и международное нормализованное отношение(МНО) — лабораторные показатели, определяемые для оценки внешнего пути свёртывания крови. Значения ПТВ у одних и тех же здоровых пациентов варьируются в разных лабораториях в зависимостиот используемого тканевого фактора (тромбопластина). ПараметрМНО был введён в клиническую практику с целью стандартизации
результатов ПТВ. Производители тканевого фактора для тестов ПТВобязаны указывать значение международного индекса чувствительности (МИЧ) для каждой произведенной партии реагента, где значение МИЧ (от 1.0 до 2.0) показывает активность тканевого факторав данной партии в сравнении со стандартизованным образцом. МНОрассчитывается как отношение ПТВ исследуемого образца к ПТВнормального (контрольного) образца, возведённое в степень МИЧиспользованного при тесте реагента (МНО = (ПТВtest/ПТВnormal)МИЧ).
Полученные значения ПТВ или МНО позволяют осуществлять
эффективную терапию варфарином и тем самым снижать риск тромбообразования. Быстрое и точное измерение показателей ПТВ илиМНО важно для проведения безопасной и эффективной антикоагуляционной терапии. В последнее время достаточно широкое распространения получили компактные приборы (коагулометры), позволяющие мониторировать МНО пациентам самостоятельно в домашних
условиях. К таким приборам, использующим метод импедансной
коагулометрии, относятся INRatio (Alere, США) или CoaguCheck(Roche, Швейцария). Для проведения анализа используются либопластиковые картриджи (Alere), либо одноразовые тест-полоски
(�������������������������������������������������������������
Roche��������������������������������������������������������
). В настоящее время российских аналогов подобных приборов не существует, при этом стоимость расходных материалов длязарубежных приборов достаточно высока.

Биотехнология

27Принцип работы данного типа коагулометров основан на измерении значения импеданса исследуемого образца в контрольнойи тестовой ячейках. Для анализа используется цельная капиллярная
кровь пациента. При активации свёртывания за счёт тканевого фактора, на электродах в области реакции оседают слои фибриновых
сгустков, вследствие чего происходит повышение импеданса образца. По мере изменения импеданса можно дать оценку динамики образования фибринового сгустка.
В работе представлены результаты разработки портативного
микрофлюидного картриджа для определения значения МНО в образцах цельной капиллярной крови. Картридж представляет собой
пластиковый чип с микрофлюидной системой каналов, соединяющих четыре ячейки (ячейка для внесения образца, тестовая и двеконтрольные). Данный картридж предназначен для использованияв разрабатываемом отечественном компактном коагулометре.
Первый слой картриджа (подложка) представляет собой фольгированный полиимид (толщиной около 100 мкм) у которого стравлены
участки фольги таким образом, чтобы получился рисунок электрических контактов. Второй и третий слой картриджа изготавливалсяиз одного листа многослойной пленки на которой вырезался рисунок
микрофлюидных каналов, ячейки для определения МНО, ячейки длявнесения образца и двух контрольных ячеек.
На поверхность покровной пленки в зону микрофлюидного канала, прилегающему к ячейке для определения МНО наносился точечно
рабочий раствор тканевого фактора, состоящий из тканевого фактора
(НПО «Ренам»), глюконата кальция и хлорида натрия. Подготовленный лист покровной пленки наклеивали на первый слой (подложку)картриджа таким образом, чтобы электрические контакты находились точно в пределах ячейки для определения МНО и контрольных
ячеек. Затем полученную заготовку нарезали на индивидуальные
картриджи размером 8.0 на 2.2 cм.
Изготовленные картриджи будут использованы для экспрессизмерения образцов цельной капиллярной крови при помощи разрабатываемого отечественного компактного коагулометра.

Раздел 128КОНСТРУИРОВАНИЕ БИОСОВМЕСТИМЫХ АССОЦИАТОВНА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА МЕТОДОМ
«СЛОЙ-ЗА-СЛОЕМ» *В. В. Ершкова 1, 2Новосибирский государственный университет,2 Институт
химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН1Благодаря своим уникальным свойствам наночастицы благородных металлов (например, золото, серебро) широко применяют какобъект фундаментальных исследований, так и в прикладных разработках. Наночастицы золота (НЧЗ) обладают хорошей способностью
проникновения в клетки, уникальными физическими и химическими
свойствами, а также низкой токсичностью.
Перспективными объектами конъюгации с наночастицами золота являются различные низкомолекулярные биологически активные
соединения (гормоны, лекарства, антибиотики и т. д.), высокомолекулярные биополимеры: белки, НК (нуклеотиды, олигонуклеотиды,ДНК, РНК). Однако до сих пор остались нерешёнными проблемы
создания стабильных нековалентных и «многослойных» ассоциатов на основе наночастиц золота. Остаются вопросы по получению
неагрегированных НЧЗ и их биосовместимых конъюгатов. «Слой-заслоем» — это простой, эффективный способ модификации поверхностей и получения нековалентных наноструктурированных полимерных многослойных тонких пленок и нанокомпозитов с учетом
толщины, структуры, свойств и функций с любым типом субстрата.
Целью работы является конструирование и изучение свойств нековалентных ассоциатов наночастиц золота с олигонуклеотидом(ON) и полиэтиленимином (PEI), а именно Au/PEI/ON/PEI методом
«слой-за-слоем».
Были синтезированы широко-используемые НЧЗ размером
14±2 нм, используя в качестве восстановителя золотохлористоводородной кислоты цитрат натрия. Частицы характеризовали методом
*Научный руководитель — канд. хим. наук И. А. Пышная.

29Биотехнология

спектрофотометрического анализа (рис. 1, а), а размерные данные
(диаметр) определяли методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (рис. 1, б) и фотонно-корреляционной спектроскопии (ФКС). Таким образом, были получены НЧЗ размером 14 нм и споверхностным зарядом –30 мВ.

абРис. 1. Спектрофотометрический спектр наночастиц золота (а), ПЭМизображения НЧЗ (б)Для стабилизации и усиления связывания наночастиц с первым
слоем на основе �����������������������������������������������
PEI��������������������������������������������
модифицировали НЧЗ меркаптоундекановой кислотой (MUA), так как благодаря cвоим гидрофобным «хвостам» онаспособна образовывать монослой, присоединяясь к поверхности наночастиц золота. Далее методом «слой-за-слоем» присоединяли разветвленный или линейный PEI, меченный флуоресцеином. Наночастицы
золота, модифицированные MUA���������������������������������
������������������������������������
, имели отрицательный поверхностный заряд, а введение PEI приводило к его смене на положительный
(+50 мВ). Размер данного ассоциата, согласно ПЭМ, является суперпозицией размера исходной НЧЗ (14 ± 2нм) и ��������������������
PEI�����������������
-«короны» — плотного однородного слоя, размер которого составил 10 нм. Количество
присоединившегося полиэтиленимина оценивали по интенсивности
флуоресценции в супернатанте после отмывочных процедур.
Далее присоединяли олигонуклеотид A26 через электростатические
взаимодействия. Заряд ассоциатов Au/PEI/ON менялся на отрицатель-30Раздел 1

ный (-11 мВ), а согласно ПЭМ изображениям происходило уплотнение
внешнего слоя. Количественный расчет сорбированного олигонуклеотида проводили с помощью введения радиоактивно меченого олигонуклеотида. Считали радиоактивность по Черенкову в пробе супернатанта от промывочных процедур после присоединения олигонуклеотида.
Аналогично первому слою на заключительном этапе создания
ассоциатов присоединяли дополнительный слой полиэтиленимина.
В результате получали положительно заряженные наночастицы, обладающие 14 нанометровой «короной».

абвг
Рис. 2. Сканированные и флуоресцентные изображения 1 % агарозно-го геля электрофоретичсекого анализа: Au, Au-MUA (А), Au-MUA/PEI(Б), Au-MUA/PEI/ON (В), Au-MUA/PEI/ON/PEI (Г). Внизу представлены ПЭМ изображения общего вида золей наночастиц и увеличенныйвид одной частицы в каждом золеИз полученных данных можно сделать вывод, что при присоединении MUA размер частиц почти не меняется, а при присоединении
PEI���������������������������������������������������������������он значительно возрастает, при этом образуется чёткий слой од-Биотехнология

31нородной плотности. При конъюгации с олигонуклеотидом происходит уплотнение внешнего слоя на поверхности наночастиц, вероятно
олигонуклеотид сорбируется не монослоем, а несколько разрыхляет
предыдущий слой. На конечном этапе при присоединении полиэтиленимина мы видим увеличение «короны», а также на изображенияхПЭМ видны чёткие границы сорбированных слоёв (рис. 2, а-г)На каждом этапе синтеза полученные ассоциаты были характеризованы ФКС относительно размера и поверхностного заряда.
Кроме этого, аналогичные эксперименты по конструированию ассоциатов Au/PEI/ON/PEI повторили для наностержней золота.
Таким образом, охарактеризованы все стадии создания положительно заряженных ассоциатов наночастиц, что важно для проникновения ихчерез клеточную мембрану. Получены как сферические, так и стержневые наночастицы золота, несущие полиэтиленимин и олигонуклеотид.
ШТАММ PANTOEA VAGANS 3.2 — ПРОДУЦЕНТ
СИДЕРОФОР КАТЕХОЛОВОГО РЯДАД. Л. Илюхина 1, А. Д. Сулейманова 2Федеральное государственное автономное образовательное
учреждение высшего профессионального бразования
«Казанский (Приволжский) федеральный университет»(ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный универси�тет» ) Институт Фундаментальной Медицины и Биологии,Россия, Казань
Заражение кормов, продуктов питания и сельскохозяйственных культур растений фитопатогенными грибами вызывает необходимость постоянного санитарно-микробиологического контроля почвы, и приводитк экономическому ущербу народное хозяйство. Борьба с микозами растений является одним из приоритетных направлений развития сельского хозяйства. В связи с этим, актуальной задачей является поиск новых
штаммов способных подавлять рост патогенных микроорганизмов.

32Раздел 1Из почв лесного массива Республики Татарстан выделен и идентифицирован штамм Pantoea vagans ВКПМ: В11689 (3.2). Известно,что P. vagans является одной из эффективнейших бактерий в борьбес заболеваниями растений, вызванными фитопатогенными микроорганизмами. В связи с этим, целью данной работы явилось изучение
антимикробных свойств P. vagans 3.2.
Продукцию сидерофор определяли на дифференциальной средес хром азуролом S������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������
(����������������������������������������������������
CAS�������������������������������������������������
среда) [1]. В двух повторностях по 5 мкл суспензии промытых клеток на бедной питательной среде М9. Плотность клеток опытного и контрольного штамма одинакова и составила ОД590=0,1Формирование минимальной зоны просветления (0,7 см) на CASагаре штаммом P. vagans 3.2 происходило через 16 часов инкубации
при 37оС. Максимальная зона просветления (2,0 см) наблюдаласьна третьи сутки инкубации. В качестве контроля был использован
штамм Salmonella typhimurium.

Рис. 1. Выявление зон просветления на дифференциальной CAS среде

Метод Арноу использовали для детекции сидерофор катехолового
типа на жидкой среде М9 с внесением бипиридила [2]. Среду М9, содержащую 5 μМ FeSO4, использовали в качестве контроля.

Биотехнология

33Сидерофоры катехолового типа в концентрации 26,78 µM были задетектированы после 4ч выращивания штамма P. vagans 3.2 на жидкой среде М9. Максимальная продукция сидерофор (82,05 µM) приходилась на 28 ч культивирования.

Штамм P. vagans 3.2 продуцирует сидерофоры катехолового типа,которые способны эффективно связывать железо. Сидерофоры являются поставщиками железа для бактериальных клеток. Также сидерофоры, продуцируемые почвенными бактериями-симбионтами
растений, способны поступать в растительные клетки, обеспечиваяих железом. Связывание железа сидерофорами приводит к железодефициту у фитопатогенных микроорганизмов и их конкурентному исключению из ризопланы. Это может служить основой для создания
инновационных микробных агробиотехнологий для решения проблем, связанных с заболеваниями растений, вызванных фитопатогенными микроорганизмами и недостатком железа.
Список литературы
1. B. Schwyn and J. B. Neilands, Anal. Biochem (1987). Methods inenzymology. Vol. 235
2. L. E. Arnow, J. Biol. Chem. (1937). Methods in enzymology.
Vol. 235

Раздел 134ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ —ТЕХНОЛОГИЯ КАРТИРОВАНИЯ САЙТОВ
МЕТИЛИРОВАНИЯ DE NOVO В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА *В. В. Кузнецов 1, М. А. Абдурашитов 1, 2,
В. Н. Томилов 2, С. Х. Дегтярев 1, 2
1ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», 2 ООО «СибЭнзайм»Метилирование ДНК у млекопитающих играет важную рольв процессах регуляции экспрессии генов, геномного импринтинга,инактивации X-хромосомы и поддержания целостности генома [1].
Развитие технологий полногеномного секвенирования (�����������NGS��������
) позволило получать генетический портрет организма, неизменный в течение жизни. Профиль метилирования, напротив, отличается у разных
типов клеток, а также меняется в зависимости от стадии клеточного
цикла и воздействия окружающей среды. Таким образом, эпигенетическое картирование метилированной ДНК в геноме позволяет
охарактеризовать функциональное состояние клетки и организмав целом, что является крайне актуальным для современной персонализированной медицины.
Современные полногеномные методы изучения метилома используют 3 способа предварительной обработки ДНК [2]: 1) бисульфитная конверсия; 2) афинное обогащение (путем связывания метилированных фрагментов ДНК специфическими белками); 3) расщепление
метил-чувствительными или метил-зависимыми эндонуклеазами.
Бисульфитная конверсия позволяет получить достаточно полную картину расположения 5-метилцитозина в геноме, однако ей сопутствует
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации по Соглашению № 14.576.21.0072
от 06.11.2014 г. (уникальный идентификатор RFMEFI57614X0072), заключенному в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014–2020 годы».
*Биотехнология

35значительная деградация ДНК при обработке бисульфитом натрия,трудность достижения полной конверсии, необходимость секвенирования огромного числа фрагментов и большие затраты времении средств. Афинное обогащение отличает небольшая трудоемкостьи стоимость анализа, но в результате получается недостаточно четкая
картина метилирования генома. Предварительный гидролиз ДНК C5метил-зависимыми ферментами рестрикции обогащает библиотеки
фрагментами промоторов и генов, хотя его применимость ограничена небогатым выбором сайтов узнавания ферментов.
В настоящей работе для создания эпигенетической карты геномов
клеточных линий L���������������������������������������������
����������������������������������������������
-68 (фибробласты легкого), ������������������
Raji��������������
(лимфома Беркитта) и U-937 (гистиоцитарная лимфома) была использована метилзависимая эндонуклеаза GlaI чей сайт R(5mC)GY является продуктом
метилирования de novo метилтрансферазами Dnmt3a и Dnmt3b [3].
Таким образом, при использовании GlaI изучаемая ДНК обогащается
фрагментами, участвующими в регуляции экспрессии генов.
Эпигенетическое секвенирование проходит в несколько этапов:1) Расщепление геномной ДНК эндонуклеазой GlaI;2) Отделение фракции фрагментов 140–400 п.н.
3) Парноконцевое секвенирование фрагментов на Illumina GA-IIx.
4) Фильтрация и анализ данных.
При выборе диапазона длин GlaI-фрагментов для секвенирования
учитывалось то, что геном содержит огромное число повторов, которые не слишком значимы для запланированного анализа (нас интересуют, прежде всего, гены и их регуляторные участки), но обычно
сильно метилированы и могут образовывать основную долю выщепляемых при порезке фрагментов. С помощью разработанного намипрограммного обеспечения �����������������������������������
GenomeDivider����������������������
были подсчитаны количества возможных GlaI-фрагментов для всего генома и для выборок
основных групп повторов (Alu, LINE и satellite, см. рис. 1).
Серым цветом отмечена зона фрагментов длиной <140 п.н. В этойобласти расположено большое число пиков, образуемых фрагментами из повторов (главным образом, Alu), таким образом, использоватьэту фракцию нерационально. Поэтому для секвенирования была выбрана фракция фрагментов с длинами 140–400 п.н. (желтый цвет),36Раздел 1которая должна содержать значительно меньшее число последовательностей из повторов.

Рис. 1. Результаты анализа гидролиза полностью метилированного генома человека эндонуклеазой GlaI��������������������������������
������������������������������������по длинам в программе GenomeDi���������
vider. По оси абсцисс — длины возможных GlaI-фрагментов, по осиординат — длина таких фрагментовДля составления эпигенетической карты необходимо определить
позиции расщепления ДНК ферментом GlaI����������������������
��������������������������
, указывающие на метилирование этих сайтов, поэтому на следующем этапе работы мы составили выборку позиций, которые соответствуют началам и концам
уложенных парноконцевых ридов. Для сокращения полученной выборки убирались те позиции, покрытие которых было меньше 7 длявсех трех геномов. В итоге получили базу данных позиций расщепления GlaI, содержащую 1 696 422 сайта расщепления. В результате
мапирования сайтов на референсный геном человека, было показано
насыщение анализируемой фракции фрагментами генов: 2/3 метилированных позиций лежит в телах генов, но около половины приэтом — в интронных повторах (рис. 2.)

Биотехнология

37

Рис. 2. Диаграмма распределения точек гидролиза GlaI относительно
расположения генов

Следующий этап анализа заключался в том, чтобы оценить какие
предположительные условно-регуляторные участки генов (±500 п.н.
от старта транскрипции) сильнее всего метилированы в трех различных клеточных линиях. Для этого провели суммирование расщеплений для каждого участка для каждой клеточной линии. Это позволило
определить те гены, которые являются общими для трех геномов, длякаждой пары геномов или являются специфическими лишь для одного генома. На рисунке 3 изображена диаграмма Венна, отражающая
число общих элементов для 3-х множеств (сайт http://bioinformatics.
psb.ugent.be/webtools/Venn/), построенная по полученным данным.
Таким образом, из проанализированных 22083 регуляторных
участков были составлены списки генов, которые: 1) метилированыв малигнантных клетках, но не метилированы в нормальной клеточной линии (условные маркеры для рака); 2) метилированы лишьв одной из малигнантных линий (типа специфические для определенного вида рака); 3) метилированные лишь в �������������������
L������������������
-68 (маркеры деметилирования при раке). В списках 1–2 находится значительное число
генов, описанных в литературе в качестве потенциальных онкомаркеров, например SFRP1, EGFR, TWIST1, DAPK1.
Проделанная работа демонстрирует возможности использования
метода эпигенетического картирования геномов по сайтам RCGY
с целью поиска маркеров онкопатологий. Получаемые с помощью

Раздел 138

Рис. 3. Диаграмма Венна для метилированных регуляторных участков
генов в геномах L-68, Raji и U-937. В скобках указано количество геновс известной функцией

метода данные могут быть использованы для дополнения данных
сходных методов HpaII/MspI-, SmaI/ХmaI-, MspJI — секвенирования,а также для данных RRBS-секвенирования, поскольку в большинстве
случаев, данные не пересекаются. Метод отличается простотой и придальнейшем удешевлении ������������������������������������NGS���������������������������������
может быть применен для масштабного эпигенетического анализа геномов.
Список литературы
1. Moore L, Le T, Fan G DNA Methylation and Its Basic Function //Neuropsychopharmacology REVIEWS. 2013. V. 38. P. 23–38.
2. Sarda S, Hannenhalli S Next-Generation Sequencing and Epigenomics Research: A Hammer in Search of Nails // Genomics Inform.
2014 Mar. V. 12. №1: P. 2–11.
3. Handa V., Jeltsch A. Profound flanking sequence preference of Dnmt3a and Dnmt3b mammalian DNA methyltransferases shape the humanepigenome // J.Mol.Biol. 2005. V. 348. № 5. Р. 1103–1112.

Биотехнология

39Создание рекомбинантного штаммапродуцента новой MD-эндонуклеазыиз энтеробактерий для использованияв эпигенетике и онкодиагностике *Е. Н. Ломаковская, С. Х. Дегтярёв, Д. А. Гончар, А. Г. Акишев,Т. Н. Наякшина, О. И. Шляхова, А. Н. Куксова, Н. А. Хлопова,М. А. Сорокина, С. Г. Удальева, В. А. Чернухин
Сайт-специфические метилзависимые ДНК-эндонуклеазы (MDэндонуклеазы) — относительно новый и слабо изученный класс ферментов, узнающих и расщепляющих только метилированную ДНКи не расщепляющих неметилированную ДНК.
Проведены биоинформационные исследования, в результате которых выявлены предполагаемые рамки трансляции MD-эндонуклеазв геномах энтеробактерий. Высокая консервативность первичной
структуры ДНК данных рамок трансляции в разных родах энтеробактерий (Escherichia, Klebsiella и Cronobacter) позволила создать праймеры (рис. 1) для проведения поиска новых ��������������������
MD������������������
-эндонуклеаз с помощью ПЦР (ПЦР-скрининга), который был осуществлён на ДНКэнтеробактерий.
Энтеробактерии для проведения ПЦР-скрининга были выделены из природных источников и отобраны на селективной среде
Эндо.
Из геномной ДНК одного из диких штаммов E�����������������
������������������
. ���������������
coli�����������был амплифицирован фрагмент ДНК длиной около 440 п.н. и встроен в вектор
pMTL22 (полученная плазмида получила название pElmI).
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации по Соглашению № 14.576.21.0075 от
06.11.2014 г. (уникальный идентификатор RFMEFI57614X0075), заключенному в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014–2020 годы».
*40Раздел 1Результаты множественного выравнивания амплифицированного
фрагмента и наиболее высокогомологичных нуклеотидных последовательностей приведены на рисунке 1 (множественное выравнивание
выполнено в программе VectorNTI 7.1 (http://www.lifetechnologies.
com/ru/ru/home.html).

Биотехнология

41

Рис. 1. Выравнивание нуклеотидной последовательности предполагаемого гена, кодирующего ����������������������������������������
ElmI������������������������������������
, c���������������������������������
����������������������������������
ближайшими наиболее гомологичными последовательностями ДНКОбозначения
Обозначения последовательностей:elmI — последовательность амплифицированного фрагментаиз дикого штамма Escherichia coli.
enterobact��������������������������������������������������
1 — последовательность гена, кодирующего гипотетический белок в штаммах ���������������������������������������
Escherichia����������������������������
coli�����������������������
���������������������������
BL��������������������
����������������������
21(�����������������
DE���������������
3) (идентификатор в ��������
Genbank� �������������������������������������������������
CP�����������������������������������������������
010585.1), а также идентичная её последовательность в штамме Escherichia coli C41(DE3) (идентификатор в Genbank
CP010585.1).
e���������������������������������������������������������
nterobact2 — последовательность гена, кодирующего гипотетический белок в штамме Klebsiella pneumoniae (идентификатор
в Genbank WP_032444776.1).
e�����������������������������������������������������������
nterobact3 — последовательность гена, кодирующего гипотетический белок в штамме Escherichia coli (идентификатор в Genbank
WP_024239143.1).
e�����������������������������������������������������������
nterobact4 — последовательность гена, кодирующего гипотетический белок в штамме Cronobacter malonaticus 681 (идентификатор
в Genbank CCJ93299.1).

42Раздел 1В рамочке, в последовательности гена, кодирующего ElmI�������
�����������
, выделен единственный нуклеотид, по которому ген отличается от ближайших гомологов из штаммов Escherichia coli BL21(DE3) и С41(DE3).
Рамочками с 5’- и с 3’-концов выделены последовательности, соответствующие праймерам, с помощью которых был проведён ПЦРскрининг на геномных ДНК колиформных бактерий, выделенныхиз природных источников.
Как видно из данного рисунка, последовательность отличается всего на один нуклеотид от ближайших гомологов из штаммов
Escherichia coli BL21(DE3), С41(DE3).
Таким образом, клонированный фрагмент ДНК, выявленный в результате ПЦР-скрининга, и представленный предполагаемым геном
метилзависимой ДНК-эндонуклеазы �����������������������������
ElmI�������������������������
, оказывается высокогомологичным участкам геномных ДНК из хорошо известных штаммов
Escherichia coli.
Все приведённые последовательности начинаются с предполагаемого стартового кодона ATG из заканчиваются предполагаемым стопкодоном TAA и могут предположительно рассматриваться как рамки
трансляции. Предполагаемая аминокислотная последовательность
ElmI отличается от ближайших гомологов из штаммов Escherichia
coli BL21(DE3) и С41(DE3) на одну аминокислоту в позиции 26:остаток серина в ElmI находится в этой позиции вместо аспарагинав полипептидах из BL21(DE3) и С41(DE3).
В результате трансформации плазмидой pElmI штамма E. coli
ER2267 был получен рекомбинантный штамм-продуцент В лизате полученного штамма тестировалась эндонуклеазная активностьна плазмиде pFsp4HI3, в которой во всех последовательностях 5’GCNGC�������������������������������������������������������
-3’ метилазой Fsp��������������������������������������
�����������������������������������������
4�������������������������������������
HI�����������������������������������
метилирован первый цитозин в положении С5 [1]Из биомассы данного штамма хроматографическими методами был получен препарат фермента, названного согласно общепринятой номенклатуре ElmI. Оказалось, что данный фермент
специфично расщепляет метилированную последовательность
ДНК 5’-GCNGC-3’ при условии наличия в ней не менее трёх5-метилцитозинов, то есть является MD-эндонуклеазой. СайтБиотехнология

43узнавания данного фермента сходен с таковым для другой MDэндонуклеазы — ����������������������������������������������
PkrI������������������������������������������
[1], однако в отличие от последней расщепляет метилированную последовательность 5’-GCNGC-3’ не после, а перед центральным нуклеотидом N.
Таким образом, впервые с помощью ПЦР-скрининга (а именнона ДНК энтеробактерий) был клонирован ген сайт-специфической
метилзависимой ДНК-эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей
С5-метилированную последовательность. Данный подход в поиске и клонировании новых �����������������������������������
MD���������������������������������
-эндонуклеаз может быть использован и для других селективно отобранных таксономических групп
бактерий.
Полученный фермент может быть использован в эпигенетических
исследованиях и медицинской онкодиагностике.
Список литературы
1. Чернухин В. А., Наякшина Т.Н, Гончар Д. А., Томилова Ю. Э.,Тарасова М. В., Дедков В. С., Михненкова Н. А., Дегтярёв С. Х. Новая
сайт-специфическая метилзависимая ДНК эндонуклеаза PkrI узнаёти расщепляет метилированную последовательность 5`-GCN^GC-3`/3`CG^NCG-5`, содержащую не менее 3-х 5-метилцитозинов // Вестник
биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова, Т. 7, № 3, с. 35–42 (2011).

Раздел 144ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ
ХОЛАНГИОКАРЦИНОМЫ, АССОЦИИРОВАННОЙС ОПИСТОРХОЗОМ
Г. А. Максимова 1, А. В. Ковнер 1, 2ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт
цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии
наук», 2 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт
экспериментальной и клинической медицины»1Введение: В настоящее время актуальной проблемой трансляционной медицины остается обоснованность выбора экспериментальной модели заболеваний. Холангиокарцинома, или рак желчных протоков, занимает второе место по встречаемости среди злокачественных заболеваний печени и является агрессивным видом, — быстро
прогрессирующим и трудно поддающимся лечению. Как правило,холангиокарцинома выявляется только на поздних стадиях заболевания и большинство пациентов с этим диагнозом живет не более 5 лет.
Известно, что существует тесная ассоциация между раком желчных протоков и глистной инвазией печени, вызванной трематодами
Clonorchis sinensis и Opisthorchis viverrini (Flavell, Lucas, 1982, Sripaet���������������������������������������������������������������
al������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������
., 2007; ���������������������������������������������������
Aunpromma������������������������������������������
et���������������������������������������
�����������������������������������������
al������������������������������������
��������������������������������������
., 2012) и классифицированных международным агентством по исследованию рака как канцерогенные факторы первой группы опасности (IARC, 2012)]. В отличие от своих
ближайших родственных видов, Opisthorchis felineus на данный момент по классификации IARC отнесен к канцерогенам третьей группы опасности, как потенциально опасные для человека (IARC, 2012;
WHO��������������������������������������������������������������
, 2015), что, вероятно, может быть связано с небольшим количеством данных. Исследование роли O. felineus в формировании опухолей печени на экспериментальной модели описторхоза с использованием золотистых хомячков является одним из важных первых этапов
тестирования канцерогенного потенциала этого паразита. При сочетанном воздействии диметилнитрозамина (ДМН) и O. felineus после

Биотехнология

45

18 недель от начала эксперимента в печени хомячков формируется
холангиофиброз, что является стадией предрака (Максимова и др.,2015). Таким образом, целью нашего исследования явилось оценить
канцерогенный потенциал инфекции O. felineus у золотистых хомячков при сочетанном действии диметилнитрозамина, а также провести подробный патоморфологический анализ и дать комплексную
оценку течения заболевания.
Материалы и методы: Для эксперимента было использовано
78 золотистых хомячков, в возрасте 6–8 недель, которые были разделены на 3 группы:1) контрольная группа (30 животных);2) получала диметилнитрозамин (ДМН) (12 ppm);3) получала ДМН (12 ��������������������������������������
ppm�����������������������������������) и была инфицирована 50 метацеркариями O. felineus.
Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище.
Наличие инфекции у хомяков проверяли после одного месяцас помощью копроовоскопии (Pavlyukov I. A., Berezantsev Y. A., 1991).
Доза ДМН была выбрана в соответствии с опубликованными раннее
данными (Songserm N. et al., 2009).
Животных выводили из эксперимента путем эвтаназии (CO2) на 10,
14, 18, 22, 26, и 30 неделю после инфицирования. Объектом исследования служила печень. Образцы тканей фиксировали в 10 % водном
растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов
возрастающей концентрации и ксилолах (STP-120, Thermo Scientific),после заключали в парафиновую среду HISTOMIX (BioVitrum). Длягистологического и иммуногистохимического анализа (ИГХ) срезы
толщиной 4–5 мкм приготавливали на автоматическом ротационном
микротоме Microm����������������������������������������������
����������������������������������������������������
HM�������������������������������������������
���������������������������������������������
355���������������������������������������
S��������������������������������������
(������������������������������������
Thermo������������������������������
Scientific�������������������
�����������������������������
). Использовали обзорную окраску гематоксилином и эозином, а для ИГХ-анализа использовали специфические первичные антитела Ext1, Anx1 и CK7.
Визуализацию проводили на микроскопе Axioskop 2 Plus (Zeiss)с фотокамерой AxioCam MRc (Zeiss).
Для морфометрии использовали закрытую тестовую систему
из 100 точек площадью 3.52х104 мкм2. Определяли объемную плот-46Раздел 1ность (Vv) деструктивных изменений, а также численную плотность
(��������������������������������������������������������������
Nai�����������������������������������������������������������
) клеток печени различного гистогенеза, экспрессирующих исследуемые маркеры. Средние величины исследованных параметров
определяли с помощью пакета программ Statistica��������������������
������������������������������
6.0 (Statsoft). Достоверными отличия считали при p<0.05.
Результаты и их обсуждение: Макроскопическое исследование
печени показало выраженные различия в цвете ткани, состояние
желчных протоков и цвета желчи между группами. Одним из основных показателей является состояние поверхности печени и ее краев.
В контрольной группе и в ДМН-обработанной группе (группа 2), поверхность печени остается упругой, гладкой и блестящей, а края печени хорошо выражены, в то время как стенки внепеченочных желчных протоков и желчного пузыря были прозрачными; желчь былапрозрачной и светло-желтого цвета в течение почти всего эксперимента. Только к концу эксперимента, через 26 и 30 недель, в группе 2 края печени изменили очертания. Желчные протоки у хомяковс описторхозом (3 группа) были значительно утолщены и имели непрозрачные стенки. Поверхность печени была неровной (небольшие
шишки), края органа стали неравномерными, а желчь приобрела
темно-зеленый цвет.
Также была проведена комплексная оценка: воспаления; дисплазии, гиперплазии и пролиферации желчных протоков; перидуктального фиброза; количества гранулем с яйцами О. felineus, кист, холангиофиброза и холангиокарциномы в течение 30 недель. У животных,получавших только ДМН, отмечена дисплазия гепатоцитов и слабое
воспаление, степень которых увеличивается с течением срока эксперимента. Начиная с 22-й недели была зафиксирована небольшая пролиферация желчных протоков. Однако в целом, у животных 2 группыне было активной пролиферации клеток эпителия желчных протокови признаков перидуктального фиброза, образования гранулем, гиперплазии желчных протоков. В конце эксперимента, на 30 неделе,было отмечено появление холангиокарцином у половины животных,у этих же животных слабо выраженный холангиофиброз, дисплазия
печеночных протоков, а также образование цист из уплощенного
эпителия.

Биотехнология

47

В 3 группе, находящейся под сочетанным влиянием O. felineusи ДМН, воспалительный процесс был выражен сильнее, чем у животных 2 группы. Увеличена степень дисплазии гепатоцитов и воспалительной инфильтрации на протяжении всего срока эксперимента.
На 18-й неделе обнаружены цисты, выстланные плоским эпителием.
У большинства животных обнаружен холангиофиброз. На этом же сроке эксперимента были отмечены первые признаки злокачественности
патоморфологических образований: — нерегулярность в строении новообразованных желчных ходов; исчезновение базальной мембраныу некоторых протоков; обнаружена холангиокарцинома у одного животного. На 22-й неделе у одного из хомяков была найдена холангиокарцинома на ранней стадии развития (T1N0M0). На 26-й неделе у половины
хомячков была найдена дифференцированная холангиоцеллюлярная
карцинома, которая представляли собой холангиокарциному массового формирования. Опухоль демонстрировала инфильтративный рост.
К 30-й неделе у всех животных данной группы были найдены холангиоцеллюлярные опухоли с разной степенью дифференцировки от высокодифференцированной до малодифференцированной опухоли.
При этом, у животных 3 группы (сочетанное воздействие ДМНи O. felineus) была повышенная секреция онкомаркеров Ext1, Anx1,
но пониженная секреция СК7 по сравнению с контрольной группой.
У животных 2 группы секреция онкомаркеров была ниже, чем у сочетанной группы, что, вероятно, подтверждает позитивное влияние
O.felineus на развитие холангиокарциномы у золотистых хомячков,что согласуется с трехстадийной теорией канцерогенеза. Согласно этой теории, злокачественные опухоли развиваются при синергическом воздействии двух агентов. В модели холангиокарциномыс использованием золотистых хомячков инициатор возникновения
злокачественных клеток — ДМН (содержится в большом количестве в окружающей среде, в пище и сигаретном дыме), а O. Felineus,вероятно, способствует гиперплазии клеток печени различного гистогенеза. Известно, что печень больных описторхозом значительно
увеличивается в размерах, а клетки протоков активно пролиферируют. При данном эксперименте наблюдается близкая картина патологических изменений печени. В нашем исследовании также были вы-Раздел 148

явлены пролиферация желчных протоков, гиперплазия и метаплазия
эпителия желчных протоков, холангиофиброз и полипы, что следует
рассматривать как состояние предрака. Согласно результатам патоморфологического и морфометрического анализа, модель холангиокарциномы на фоне действия ДМН и O. felineus с использованием
золотистых хомячков демонстрирует показатели, близкие к обнаруженным у пациентов, страдающих холангиокарциномой на фоне хронического описторхоза.
Таким образом, данная модель может быть использована для тестирования противораковых препаратов, исследования механизмов
образования холангиокарциномы, поиска и тестирования существующих молекулярных маркеров для ранней диагностики рака желчных протоков.
Разработка эпигенетических сигнатурдля выявления колоректального ракана ранних стадиях *Б. С. Малышев, Е. С. Давидович, М. А. Абдурашитов,А. А. Евдокимов, Н. А. Сметанникова, В. Л. Ситько, И. А. Рязанкин,В. В. Кузнецов, А. Г. Акишев, Т. Ф. Хасанов, Н. А. Нетесова,С. Х. Дегтярев
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии
биотехнологии «Вектор»Онкологические заболевания являются одной из основных причин высокой смертности в современном мире и представляют соРабота проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации по Соглашению № 14.604.21.0102 от
05.08.2014 г. (уникальный идентификатор RFMEFI60414X0102), заключенному в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014–2020 годы».
*Биотехнология

49

бой серьезную медико-социальную проблему. Колоректальный рак(КРР) — один из наиболее часто встречающихся видов онкопатологий. В развитых странах мира ежегодно диагностируется более миллиона случаев этого заболевания и смертность от этой формы ракасоставляет более 33 % даже в высококвалифицированных с медицинской точки зрения регионах [1].
Как и в случае других онкозаболеваний, выявление этого видарака на ранних стадиях значительно влияет на успешность лечения.
Однако начальные стадии патологии внутренних органов, зачастуюне сопровождаются симптомами, определяемыми при наружном
осмотре, что делает раннюю диагностику в этих случаях крайне затруднительной. Ввиду чего, для диагностики колоректального ракаиспользование биохимических и генетических методов анализа является более предпочтительным.
Исследования последних десятилетий позволили установить,что в основе возникновения рака лежат генетические факторы, вызывающие дисбаланс экспрессии генов в клетке, в результате чего,происходит неконтролируемый клеточный рост. Немаловажную рольв онкогенезе играют эпигенетические процессы. Наиболее изученным и перспективным для диагностики онкозаболеваний эпигенетическим нарушением, на сегодняшний день, является аберрантное метилирование регуляторных участков ДНК. Аберрантное метилирование хорошо известный процесс, часто выявляемый уже на начальном
этапе возникновения опухоли, что делает его одним из наиболее перспективных методов диагностики рака. В связи с чем, в последние
годы заметно возросло число исследований, направленных на поиск
эпигенетических маркеров, позволяющих как детектировать онкозаболевания, так и контролировать успешность лечения [2].
В настоящее время существует множество методов, позволяющих
определять присутствие метильных групп в цитозиновых остатках
ДНК. Однако, все они, как правило, трудоемки, дорогостоящи илиимеют ряд иных недостатков. Методы полного и ограниченного бисульфитного секвенирования (WGBS и RRBS) недоступны для рядовых лабораторий или использования в диагностических целях. Результаты поиска и выбора оптимальных эпигенетических маркеров

50Раздел 1методом ДНК-микрочиповых технологий компании Illumina, в большинстве случаев не согласуются друг с другом. Авторы четырех несвязанных друг с другом работ, использовали один и тот же ДНКмикрочип для получения данных по метилированию генов в сходных
объектах исследования (биопсийный или хирургически отделенный
материал из колоректальных опухолей и прилежащих тканей), но приэтом панели выбранных генов-биомаркеров оказались совершенно
различны. Кроме того, неспецифическая кросс-гибридизация с нецелевыми участками генома в ДНК-чипе может достигать существенных значений (~6,5 %), что приводит к искажению количественной
оценки степени метилирования [3].
В целях лабораторной диагностики ферментативный метод определения статуса метилирования небольших участков ДНК (или отдельных CG-пар) более эффективен, т.к. прост в исполнении, требует
меньшего времени и является более щадящим по сравнению с бисульфитным подходом при сопоставимой чувствительности и качестве получаемых данных [4]. При анализе небольших количеств
ДНК, ферментативные способы имеют дополнительное преимущество, связанное с отсутствием значительной деградации ДНК, наблюдаемой при бисульфитной обработке, которая проводится в жестких
условиях (высокая температура и сильнощелочная среда).
Настоящее исследование проведено недавно разработанным
методом GLAD-ПЦР-анализа. Представленный метод позволил
решить две наиболее важные проблемы диагностики: малое количество ДНК, получаемых при выделении из образцов крови, и то,что любой препарат ДНК, полученный от доноров с онкозаболеваниями, содержит не только нуклеиновые кислоты из малигнантных
клеток, но и некоторое количество примесной ДНК из нормальных
клеток. GLAD-ПЦР-анализ смеси разнородной ДНК позволяет детектировать только сигнал, получаемый в результате амплификацииДНК из опухолевых клеток.
Суть метода можно описать трех стадийной схемой гидролизсшивка-ПЦР (см. рис.). Гидролиз геномной ДНК метилзависимой
эндонуклеазой GlaI по специфическому сайту содержащему 5mCG,фиксирует наличие метилирования ДНК в анализируемых участках.

Биотехнология

51Схема определения статуса метилирования сайта RCGY методом
GLAD-ПЦР-анализа. Цвета прямоугольных областей: белый — геномная ДНК, серый — олигодуплексный адаптор, черный — анализируемый сайт RCGYСшивка с универсальным олигонуклеотидным дуплексом (адаптором), позволяет в дальнейшем получать сигнал лишь с метилированных фрагментов ДНК и отсечь получение сигнала из примесных
неметилированных ДНК здоровых клеток. С помощью гибридного
праймера, частично комплементарного последовательности сшитого
адаптера (5’-конец), с одной стороны, и небольшому участку геномной последовательности (3’-конец), с другой, происходит амплификация метилированной ДНК. Для детекции сигнала используется методПЦР в режиме реального времени с изпользованием флюоресцентномеченого Taqman-зонда, что устраняет необходимость проведения
электрофоретического разделения продуктов амплификации, а также
дает возможность количественно оценивать число метилированныхпо анализируемому сайту молекул ДНК путем сравнения с контрольными образцами, содержащими заранее определенные количества
молекул ДНК.
Анализ литературных данных последних лет показал 56 геновонкомаркеров, метилирование которых происходит с высокой частотой в ДНК малигнантных клеток при колоректальном раке. Однако

Раздел 152неоднородность и разнообразие картин метилирования ДНК, присущих одному и тому же типу рака приводит к низкой достоверности
статуса метилирования в случае любого отдельного гена. В результате проведенного биоинформатического исследования регуляторных участков каждого из 56 генов, для проведения экспериментального исследования были отобраны 15 участков, удовлетворяющих
всем требуемым критериям проведения анализа с помощью метода
GLAD-ПЦР и пригодных для использования в диагностической панели генов (сигнатуре).
Проверка чувствительности и специфичности 15 отобранных
генов-онкомаркеров проводилась на 15 образцах опухолевой ткани
оперированных больных с диагнозом «колоректальный рак». По результатам скрининга обнаружено 9 эпигенетических онкомаркеров
имеющих больше 50 % метилирования ДНК, коррелирующего с колоректальным раком (см. табл.).

Число выявленных
образцов
из 15 тестируемых
образцов опухолей КРР

ELMO1

RXR1

SEPT9b

UCHL1

SOCS3

FBN1

ESR1

CNRIP1

RYR2

Гены-онкомаркеры

Результаты скрининга эпигенетических онкомаркеров методом
GLAD-ПЦР на наличие метилирования, коррелирующегос колоректальным раком, в клинических образцах

15
14
13
13
12
12
11
10
8
(100 %) (93 %) (87 %) (87 %) (80 %) (80 %) (73 %) (67 %) (53 %)Биотехнология

53Для дальнейшей работы выбраны наиболее перспективные
гены RYR2, CNRIP1, ESR1, FBN1, SOCS3 и UCHL1, выявившие
от 80 до 100 % исследованных образцов колоректального рака. Созданная из отобранных генов диагностическая панель (сигнатура) позволит диагностировать наличие КРР с высокими показателями чувствительности и специфичности.
Список литературы
1. Walther A, Johnstone E, Swanton C, Midgley R, Tomlinson I, Kerr
D. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer // Nat
Rev Cancer. 2009. V. 9. P. 489–499.
2. Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний. [под ред. М. А. Пальцева
и Д. В. Залетаева]. М.: изд-во Медицина, 2009.
3. Chen YA, Lemire M, Choufani S, Butcher DT, Grafodatskaya D,
Zanke BW, Gallinger S, Hudson TJ, Weksberg R. Discovery of cross-reactive probes and polymorphic CpGs in the Illumina Infinium HumanMethylation450 microarray // Epigenetics. 2013. V. 8. P. 203–209.
4. Jorda M, Peinado MA. Methods for DNA methylation analysis andapplications in colon cancer // Mutat Res. 2010. V. 693. P. 84–93.
ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНЫЕ СПОСОБЫ ОЗДОРОВЛЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ ОТ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ
А. И. Перфильева
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского
отделения Российской академии наук, г. Иркутск, Россия
Россия находится в списке стран, возделывающих картофель, занимает второе место — после Китая. Это — более 3 млн. га с урожаем до 37 млн. тонн в год. Средний уровень урожайности картофеляпо России составляет около 180 ц/га, однако, потенциальная урожай-54Раздел 1ность картофеля 240 ц/га. Ежегодные потери в России от заболеваний
картофеля могут составлять около 10 млн. тонн картофеля, т. е. около
120 000 000 р. Единственным способом повышения рентабельности
любой культуры является внедрение интенсивных технологий выращивания, в том числе, усовершенствованных пестицидов. Рынок
средств защиты растений в России демонстрирует уверенный рост.
Пестицидная нагрузка на 1 га пашни с 2008 по 2010 гг. увеличилась
на 0,2 кг и составила 2,9 кг/га. Негативные тенденции, связанныес кризисом и санкциями, а также последствиями засушливого летагода во многом преодолены, что повышает спрос на пестициды.
На сегодняшний день широко распространены различные заболевания картофеля, большинство из которых вызываются патогенными
грибами и бактериями. Наблюдаемые в последние десятилетия изменения в температуре окружающей среды способствует расширению
ареала особо опасных заболеваний, к примеру, таких, как кольцевая
гниль картофеля. До 60 % урожая картофеля может быть потеряно
из-а заболевания кольцевая гниль картофеля, вызываемого грамположительной бактерией Clavibacter michiganensis subsp. ���������
sepedoni�
cus (Cms). Во многих странах мира (Канада, США, Европа) данный
микроорганизм является карантинным (Eichenlaub, Gartemann, 2011),
однако в России эта бактерия не относится к таковым. Мы считаем,что в нашей стране кольцевой гнили уделяется не достаточно внимания, в Московской области уже потери урожая картофеля от поражения Cms достигают 30 % (Афонин и др., 2006). Предполагается,что в связи с глобальным потеплением ареал возбудителя кольцевой
гнили из стран Северной Европы и Канады будет расширяться на Север и Восток, в сторону России.
В настоящее время не существует эффективных и экологически
безопасных методов борьбы с фитопатогенными бактериями, всеимеющиеся препараты, направлены против фитопатогенных грибов.
Для ограничения распространения Cms рекомендуются профилактические приемы по снижению численности возбудителя: дезинфекция
овощехранилища, инвентаря, клубней перед посадкой. Дезинфекция
овощехранилища перед закладкой клубней 2–3 %-м раствором медного купороса и хлорной известью (формалином) (Калач и др., 2010).

Биотехнология

55

В овощехранилище должны быть дезинфицирующие барьеры: коврики, пропитанные 5 % сульфатом меди. Стены, закрома, потолок,контейнеры и щиты белят 10–20 %-ной гашеной известью (Калач
и др., 2010). Необходимо обрабатывать колеса автомобильного транспорта хлорной известью (5 %-й раствор). Рекомендуется следующая
обработка инвентаря: медным купоросом (2–3 %-й раствор), изаром
(1–2 %-й раствор), формалином (2 %-й раствор), марганцевокислым
калием, хлорной известью, перекисью, аммонием, гидрооксидом натрия, альдегидами, сульфатом аммония, хлоридом основным, хлоридфенолом основным, соляной кислотой, органическими кислотами, гипохлоридом натрия, этанолом (70 %). Перед посадкой клубни
протравливают препаратами ТМТД, поликарбоцином (Secor et al.,
1988; Анисимов и др., 2009; Калач и др., 2010).
В качестве потенциальных агентов для регулирования численности Cms нами впервые были исследованы два вещества: монойодацетат натрия и нанокомпозиты селена.
Монойодацетата натрия (МИА) — ингибитор глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы (Досон и др., 1963) и алкогольдегидрогеназы (Кнорре, Мызина, 1998). В отличие от других пестицидов МИАслабо персистентен и при повышении температуры до 40оС через
2 ч полностью разлагается на уксусную кислоту и йод (Webb., 1963).
Известно, что обработка сои МИА способствовала повышению содержания фитоаллексинов в ней (Keen et al., 1981). Нами показано,что обработка 1 мМ МИА оказывает ярко выраженный токсический
эффект на жизнеспособность клеток Cms и грибов. Следовательно,этот агент обладает бактерицидным и фунгицидным эффектом (Рымарева и др., 2008). В то же время, МИА не оказывал отрицательного влияния на прорастание клубней картофеля. В полевых экспериментах, было показано, что предпосадочная обработка МИА может
увеличивать продуктивность картофеля (Перфильева и др., 2013).
Бактерицидный эффект МИА усиливается при повышении температуры. Поэтому нами в вегетационных и полевых экспериментах
было проверено влияние МИА и термообработки (450С, 1 ч) клубнейна вегетацию и продуктивность картофеля. Было показано, что предпосадочная обработка МИА способствовала повышению продуктив-56Раздел 1ности картофеля сорта Луговской (Перфильева и др., 2013). Результаты вегетационных экспериментов показали отсутствие симптомов
заболевания у растений картофеля сорта Лукьяновский, клубни которого были термически обработаны до посадки.
Таким образом, учитывая глобальное потепление, происходящеена нашей планете, можно предположить, что температура почвы
будет увеличиваться, что повышает актуальность использования
МИА. Концентрации агента и способы обработки подобраны экспериментально, проведены лабораторные эксперименты и полевые
испытания.
В настоящее время активно изучаются наноматериалы. Интерес
вызывают нанокомпозиты, представляющие собой частицы наноселена, помещенные в матрицу из арабиногалактана. Такое сочетание
материалов удобно в использовании, так как токсичные частицы селена плотно упакованы полисахаридом и высвобождаются только
после расщепления молекулы арабиногалактана. Таким образом, селенсодержащие нанокомпозиты сохраняют бактерицидное действие
селена, но при этом не токсичны для организма, что обуславливает
перспективность их исследования для дальнейшего использованияна практике. В настоящей работе нами был использован НК (наночастицы селена, стабилизированные арабиногалактаном), а также егопредшественники (арабиногалактан, бис(2фенилэтил)диселенофосфинат натрия) разработанные и синтезируемые в Иркутском институте органической химии им. А. Е. Фаворского СО РАН. Все агенты
хорошо растворимы в воде и удобны в использовании. Было показано
отсутсвие негативного эффекта нанокомпозитов на растения картофеля in vitro (изменение уровня активности пероксидазы и влияниена прирост растений), а также наличие бактерицидного эффекта исследуемых нанокомпозитов на жизнеспособность Cms (путем измерения оптической плотности и методом определения КОЕ) и изменение
морфологии клеток бактерий после их инкубации с нанокомпозитами, что возможно, связано с изменением мембранной проницаемости
клеток бактерий в результате влияния нанокомпозитов (Papkina et al.,2015; Папкина и др., 2015). Таким образом, полученные результаты
свидетельствуют о перспективах исследований нанокомпозитов се-Биотехнология

57

лена в качестве средств для ограничения распространения кольцевой
гнили картофеля.
Список литературы
1. Eichenlaub R., Gartemann K. H. The Clavibacter michiganen�
sis subspecies: molecular investigation of gram-positive bacterial plant
pathogens // Annu Rev Phytopathol. 2011. V. 49. P. 445–64.
2. Калач���������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������
 ��������������������������������������������������������
В�������������������������������������������������������
.������������������������������������������������������
 �����������������������������������������������������
И., �������������������������������������������������
Жукова�������������������������������������������
 ������������������������������������������
М�����������������������������������������
.����������������������������������������
 ���������������������������������������
И., �����������������������������������
Ильяшенко��������������������������
 �������������������������
Д������������������������
.�����������������������
 ����������������������
А., ������������������
Ерчик�������������
 ������������
В�����������
.����������
 ���������
М., �����
Романович А. С., Криштофик Л. Д. Методические указания по локализациии ликвидации бактериальной кольцевой гнили картофеля Clavibactermichiganensis subsp. sepedonicum (Spieckermann and Kotthoff) Daviset al. ������������������������������������������������������
Самохваловичи: РУП «Научно-практический центрНАН Беларусии по картофелеводству и плодоовощеводству», 2010. 12 с.
3. Webb E. C. Enzyme and metabolic inhibitors. New York, 1963. V. 1.
340 p.
4. Keen N. T., Ersek T., Long M., Bruegger B., Holliday M. Inhibition of the hypersensitive reaction of soybean leaves to incompatible
Pseudomonas spp. by blasticidin Streptomycin or elevated temperature //Physiology Plant Pathology. 1981. V. 18. P. 325–337.
5. Рымарева Е. В., Рихванов Е. Г., Торгашина М. А., Перфильева А. И., Копытчук В. Н., Варакина Н. Н. Влияние монойодацетатана термотолерантность Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicusи дрожжей Sacharomyces сerevisiae // J. of Stress Physiology & Biochemistry. 2008. V. 4. №. 2. P. 4- 13.
6. ������������������������������������������������������������
Перфильева А. И., Рымарева Е. В., Рихванов Е. Г. Влияние монойодацетата натрия и тепловой обработки на продуктивность картофеля в вегетационных и полевых опытах // Агрохимия. 2013. № 6.
С. 54–60.
7. Папкина������������������������������������������������
�������������������������������������������������������
 �����������������������������������������������
А����������������������������������������������
.���������������������������������������������
 ��������������������������������������������
В., Перфильева������������������������������
����������������������������������������
 �����������������������������
А����������������������������
.���������������������������
 ��������������������������
И., Живетьев��������������
����������������������
 �������������
М������������
.�����������
 ����������
А., Боров������
ский������������������������������������������������������������
 �����������������������������������������������������������
Г����������������������������������������������������������
.���������������������������������������������������������
 ��������������������������������������������������������
Б., Граскова��������������������������������������������
����������������������������������������������������
 �������������������������������������������
И������������������������������������������
.�����������������������������������������
 ����������������������������������������
А., Лесничая����������������������������
������������������������������������
 ���������������������������
М��������������������������
.�������������������������
 ������������������������
В., Клименков�����������
��������������������
 ����������
И���������
.��������
 �������
В., Су���хов��������������������������������������������������������������
 �������������������������������������������������������������
Б������������������������������������������������������������
.�����������������������������������������������������������
 ����������������������������������������������������������
Г., ������������������������������������������������������
Трофимов����������������������������������������������
���������������������������������������������
Б��������������������������������������������
.�������������������������������������������
 ������������������������������������������
А.����������������������������������������
Влияние��������������������������������
�������������������������������
нанокомпозита������������������
�����������������
селена�����������
����������
и���������
 ��������
арабиногалактана на жизнеспособность фитопатогена Clavibacter michigan�
ensis subsp. sepedonicus // Доклады академии наук, 2015, том 461,
№ 2, С. 239–241.

58Раздел 1

8. Papkina A. V., Perfileva A. I., Zhivet’yev M. A., Borovskii G. B.,
Graskova I. A., Klimenkov I. V., Lesnichaya M. V., Sukhov B. G., Trofimov
B. A. Complex effects of selenium-arabinogalactan nanocomposite on both
phytopathogen Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus and potato
plants / // Nanotechnologies in Russia, 2015, V. 10, (5–6), P. 484–491.
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ
ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ
ВЫСШИХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ
М. А. Проценко
ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор»Изменение условий существования человечества, связанное с воздействием химических, биологических и физических факторов окружающей среды, привело и продолжает приводить к снижению адаптационных возможностей человеческого организма и его способностей к сопротивляемости и как следствие этого — плохое состояние
здоровья населения и неблагоприятный прогноз. Все это требует расширения спектра доступных и эффективных лекарственных средств.
Исходя из этого, разработка новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов является одной из важнейших задач современной фармакологии и биотехнологии. Следует признать, что приналичии современных технологий, спектр противоопухолевых и противовирусных препаратов настолько узкий, что практически не даетправо выбора для пациентов. Лекарственные препараты для лечения
онкологических заболеваний и вирусных инфекций, используемыев официальной медицине, в основном токсичны, дорогостоящи и обладают узконаправленным действием при наличии побочных эффектов.
Неоднозначность проблемы проявляется в том, что фармакологи вновь возвращаются к тысячелетнему опыту древних врачевателей — к лекарственным средствам из природной среды. Препараты

Биотехнология

59природного происхождения по сравнению с синтетическими лекарственными средствами обладают мягким терапевтическим действием и низкой токсичностью при практически полном отсутствии побочных эффектов.
Перспективны в качестве природного сырья грибы отдела базидиомицеты для разработки новых лекарственных препаратов. Базидиальные грибы представляют огромный потенциал в качестве источников биологически активных метаболитов: полисахаридов, белков,терпенов, меланинов фенольных соединений и др. Сложность и многообразие химического состава базидиомицетов и обуславливает ихширокий спектр действия на организм.
Тем не менее, несмотря на возрастающее количество публикаций,описывающих наличие биологической активности грибов, лекарственные препараты на основе высших базидиомицетов практически
отсутствуют на фармацевтическом рынке. Российской Федерации.
При этом лекарственных средств, получаемых на основе растений,существует значительное количество.
Цель работы. Разработка методов препаративного выделения
комплекса биологически активных веществ из базидиальных грибов,проявляющих противовирусную и противоопухолевую активность,качественный и количественный анализ химического состава полученных экстрактов.
Задачи
• разработка экологически безопасной и безотходной технологии
выделения комплекса биологически активных соединений из базидиомицетов.
• выделение в чистую культуру гриба Daedaleopsis tricolor.
• разработка методик анализа групп БАВ в препаратах из высших
грибов
• анализ физико-химических параметров полученных препаратов,полученных из высших базидиомицетов.
• исследование биологической активности препаратов из базидиомицетов.
На сегодняшний день имеется обширный спектр публикаций, в которых описаны результаты исследований по разработке и оптимизации

60Раздел 1технологии извлечения БАВ из растительного сырья. Однако при этомсуществуют лишь единицы публикаций, посвященных оптимизации
технологических параметров извлечения БАВ из грибного сырья. Учитывая значительные морфологические и анатомические отличия между
растениями и грибами, технология выделения БАВ из грибного сырья
имеет свои особенности и отличия. Нами разработана универсальная
технология выделения спектра БАВ из высших базидиомицетов.
Процесс перевода природного объекта в чистую культуру нацелен как на создание штаммов-продуцентов для нужд биотехнологии,так и на благородную миссию сохранения биоразнообразия природы. Создание препаратов на основе культивируемого мицелия гриба
обладает рядом преимуществ, связанных с тем, что качество сырьяи выход БАВ контролируется биотехнологическими методами путем
изменения состава питательной среды и условий культивирования.
Для создания новых лекарственных препаратов на основе биотехнологии необходимы эффективные штаммы-продуценты биомассы.
В качестве одного из таких источников перспективен дереворазрушающий базидиомицет Дедалеопсис трехцветный Daedaleopsis tricolor(Bull.) Bondartsev & Singer 1941. Известно, что БАВ из плодовых телэтого гриба проявляют противоопухолевую, антиоксидантную и слабую антибактериальную активность. При этом практически отсутствуют данные о культивировании данного гриба в чистой культуре.
Наличие выявленной биологической активности делает Daedaleopsis
tricolor перспективным для отбора новых штаммов гриба в чистую
культуру и изучения их в стационарных и динамических условиях
культивирования на жидкой среде.
Для выделения Daedaleopsis tricolor в чистую культуру были собраны плодовые тела гриба в лесных массивах Новосибирской области в 2013 г. Тканевым методом были выделены три штамма ксилотрофного гриба Daedaleopsis tricolor. На следующем этапе полученные культуры Daedaleopsis tricolor очищали от микофильных грибов
путем многократных последовательных пересевов с одной с одной
чашки с агаризованной средой на другую.
Культивируемые грибы при соблюдении правил биотехнологии
сохраняют способность к синтезу БАВ. Однако при этом могут на-Биотехнология

61блюдаться как количественные, так и качественные изменения в составе комплекса синтезируемых БАВ.
Оптимизация процесса культивирования гриба путем изменения
состава питательной среды и условий проведения данной биотехнологической стадии позволяет получить мицелий с требуемым биохимическим составом для повышения его биологической активности.
Выращивание мицелия гриба Daedaleopsis tricolor в стационарныхи динамических условиях осуществляли на среде с глюкозой и соевой мукой, среде содержащей крахмал и кукурузный экстракт и наглюкозопептонной среде.
Одним из важнейших этапов создания лекарственных препаратов является разработка методов их стандартизации по группам
БАВ. Инструментальные методы анализа, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография, газожидкостная хроматография,хромато-масс-спектрометрия, обладают высокой чувствительностьюи позволяют устанавливать структуру БАВ. При этом используется
дорогостоящее оборудование и требуется затратная по времени и ресурсам пробоподготовка. Для характеристики препаратов сотрудниками сектора биохимии были разработаны экспресс-методики анализа полисахаридов, белка, каротиноидов, тритерпенов, фенольных
соединений и флавоноидов с использованием доступного общелабораторного оборудования.
К особенностям разработанных методик относятся простота,быстрота, использование общелабораторного оборудования, малые
объемы исследуемых проб и реактивов. Предложенные методики
позволяют проводить серийные анализы в несколько десятков образцов. Валидационную оценку методик проводили по параметрам:линейность, правильность, сходимость и внутрилабораторная прецизионность.
Разработанные нами методики использовали для характеризации
полученных препаратов в виде сухих экстрактов Daedaleopsis tricolorпо содержанию полисахаридов, общего белка, фенольных соединений, флавоноидов и каротиноидов.
На заключительном этапе проводили анализ биологической активности приготовленных препаратов (экстрактов) in vitro. Исследовали

62Раздел 1их антиоксидантную, противоопухолевую и противовирусную активности. Перед контролем экстрактов на противоопухолевую и противовирусную активности, оценивали их токсичность на перевиваемых
клеточных линиях Vero и MDCK.
Обнаружено, что экстракты Daedaleopsis tricolor в концентрациях ниже 1,25 мг/мл не проявляли токсического действия на перевиваемые клетки �������
MDSC���и ���������������������������������������
Vero�����������������������������������
. Установлено, что наибольшую антиоксидантную активность проявили водные экстракты из культивируемого мицелия Daedaleopsis tricolor. При исследовании цитотоксической активности на культуре клеток Hep-2 (карцинома гортани
человека), было выявлено, что концентрация, ингибирующая ростклеток на 50 % (IC50), водного экстракта из плодового тела гриба находилась в пределах 200–300 мкг/мл, а IC50 экстракта из мицелия —100–115 мкг/мл. Таким образом, водный экстракт мицелия проявлял
более высокую противоопухолевую активность в отношении клеточной линии Hep-2, чем экстракт из плодового тела гриба. Показана
некоторая противовирусная активность этанольных экстрактов плодового тела и мицелия Daedaleopsis tricolor (штамм Db-14) in vitroв отношении вируса осповакцины (штамм Л-ИВП) и вируса простого
герпеса 2-го типа (штамм MS) на клеточной линии Vero. При этомводные экстракты Daedaleopsis tricolor заметной противовирусной
активности не проявляли.
Выводы
• Разработана экологически безопасная оптимальная технология
выделения широкого спектра БАВ из высших базидиомицетов.
• В чистую культуру введено три штамма гриба Daedaleopsis
tricolor из природных местообитаний Новосибирской области. Штаммы Db-14 (коллекционный номер F-1315) и Db-18 (коллекционный
номер F-1314) депонированы в коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
• Проведено исследование, определяющее биотехнологию глубинного культивирования созданных штаммов гриба Daedaleopsis
tricolor, как наиболее перспективную.
• Разработаны и апробированы экспресс-методики анализа группБАВ в экстрактах базидиомицетов. Валидация разработанных методик показала их соответствие критериям приемлемости.

Биотехнология

63• Препараты, полученные из плодовых тел и сухой биомассы мицелия
Daedaleopsis tricolor, охарактеризованы по основным группам БАВ.
• Выявлены антиоксидантная, цитотоксическая и противовирусная активности препаратов из плодовых тел и мицелия Daedaleopsis
tricolor.
• Показано, что препараты, полученные из культивируемого мицелия гриба Daedaleopsis tricolor, в большинстве случаев показывают биологическую активность выше, чем препараты, выделенныеиз плодовых тел.
• Штамм Daedaleopsis tricolor Db�����������������������������
-14 — перспективный биотехнологический источник для разработки и получения новых лекарственных препаратов.
ФОРМОВАННЫЕ УГЛЕРОДНЫЕ СОРБЕНТЫДЛЯ АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ: СИНТЕЗ,ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА
Л. Г. Пьянова 1, 2, О. Н. Бакланова 1, А. В. Седанова 1,
С. В. Баринов 3, О. В. Баракина 3, В. Т. Долгих 3Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт проблем переработки углеводородов Сибирского
отделения Российской академии наук (ИППУ СО РАН),2Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение Высшего профессионального образования «Омский
государственный технический университет»(ОмГТУ),3Государственное бюджетное образовательное учреждение
Высшего профессионального образования
«Омский государственный медицинский университет»Министерства здравоохранения РФ (ОмГМУ)1Одной из актуальных проблем современного акушерства и гинекологии во многих странах остаются гнойно-воспалительные за-64Раздел 1болевания. Несмотря на многочисленные научные исследования,посвященные данной проблеме, а также внедрение новых методов
диагностики и терапии, инфекционные осложнения послеродового периода сохраняют свою значимость. Эндометрит — наиболее
распространенная форма инфекции, связанная с воспалительными процессами в слизистой оболочке матки или эндометрии.
Широкое применение антибиотикотерапии и антибиотикопрофилактики не решает проблему септических осложнений пуэрпия:частота развития эндометрита в настоящее время не снижается.
Очевидно, разработка новых подходов и препаратов для леченияи профилактики, отличающихся по механизму действия от антибиотиков и обладающих высокой антимикробной активностью,является актуальной задачей.
В настоящее время одним из приоритетных направлений медицины является сорбционная терапия, в частности аппликационная
сорбция (вульнеросорбция) [1–3]. Особый интерес представляют собой углеродные сорбенты, давно применяемые в медицинеи фармацевтике. Область применения углеродных сорбентов постоянно расширяется, чему способствуют высокая биосовместимость углерода, а также наличие у данных сорбентов развитой
структуры с регулируемыми размерами пор, обуславливающих ихвысокую адсорбционную способность по отношению к токсичным веществам [4–5].
В работе приведены результаты исследований изделий медицинского назначения, разработанных в Институте проблем переработки
углеводородов СО РАН. Описана технология получения изделий,приведены схемы синтеза. Представлены результаты исследований
физико-химических и медико-биологический испытаний формованных углеродных сорбентов.
Микробиологические испытания «in vitro» показали наличие
антибактериальных свойств у углеродных сорбентов. Клинические
испытания показали, что после проведения традиционной антибиотикопрофилактики из полости матки продолжает определяться патогенная микрофлора более чем в 50 % случаев. ������������������
C�����������������
охраняется достаточно высокий уровень местных провоспалительных цитокинов, чтоБиотехнология

65создает угрозу развития отсроченных, вялотекущих, стертых формэндометритов с хронизацией процесса. Предложенный способ профилактики эндометрита у пациенток с инфекционным риском с помощью внутриматочного введения пористого углеродного аппликатора является более эффективным по сравнению с традиционным
подходом и позволяет улучшить результаты лечения за счет полной
элиминации патогенных возбудителей из полоти матки и снижения
уровня местных провоспалительных цитокинов.
Разработана новая форма изделий медицинского назначения —формованные углеродные сорбенты, которые являются перспективными материалом для вульнеросорбции («Формованный сорбент ВНИИТУ-1» регистрационный номер РЗН 2015/2967; «Формованный сорбент ВНИИТУ-1ПВП регистрационный номер РЗН
2015/2969).
Список литературы
1. Самсонов К. В. Сравнительная эффективность сорбции
бактерий и бактериальных токсинов углеродными и углеродминеральными сорбентами. Бюл. физиологии и патологии дыхания
2008; Вып. 29: 48–50.
2. Belik E. V., Brykalov A. V., Bostanova F. A. et al. Fabrication andstudy of biologically active organosilica polymer composites used for application sorption. Fibre Chemistry 2008. Vol. 40; № 5: 445–446.
3. Levashov P. A., Afanasieva O. I., Dmitrieva O. A. et al. Preparationof affinity sorbents with immobilized synthetic ligands for therapeutic
apheresis. Biochemistry 2010; Vol. 4; № 3: 303–307.
4. Коваленко Г. А., Семиколенов В. А., Кузнецова Е. В. и др. Углеродные материалы как адсорбенты для биологически активных веществ и бактериальных клеток. Коллоидный журнал 1999; Т. 61; № 6:
787–795.
5. Лисичкин Г. В. Химия привитых поверхностных соединений /Г. В. Лисичкин. М.: Физматлит, 2003.

Раздел 166Фактор молока человека, стимулирующий
образование биспецифичных
иммуноглобулинов *С. Е. Седых, В. В. Принц, В. Н. Бунева, Г. А. Невинский
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук,Новосибирский государственный университет
Получение биспецифичных иммуноглобулинов для терапевтических целей является важной задачей современной фармакологиии биотехнологии: в 2014 году журнал Nature Reviews Drug Discoveryназвал такие терапевтические молекулы названы «антителами нового поколения».
Сравнительно недавно было показано, что в результате восстановления дисульфидных связей между тяжелыми цепями, диссоциации HL-фрагментов (тяжелых и легких цепей, соединенных дисульфидными связями), и реассоциации HL-фрагментов с различными антигенсвязывающими центрами, образуются биспецифичные
молекулы иммуноглобулинов. Этот процесс получил название обмена HL-фрагментами и описан в научной литературе in vivo и invitro. Согласно литературным данным, в крови человека и других
млекопитающих обмен HL-фрагментами происходит только между молекулами IgG4, причем обмениваться могут как природные,так и моноклональные антитела, использующиеся для специфической терапии. Интересно, что такой обмен HL-фрагментами между
IgG4 может происходить между и in vitro, в присутствии восстановленного глутатиона.
Ранее мы показали, что молоко человека содержит белковый
фактор, стимулирующий обмен иммуноглобулинов структурными
компонентами — HL-фрагментами, но не свободными тяжелыми
Исследование частично поддержано грантами РФФИ: проекты 13-0400205, 13-04-00208.
*

Биотехнология

67

или легкими цепями. В результате обмена половинами молекул,IgG и sIgA молока человека становятся би- и полиспецифичными,связывают сорбенты с иммобилизованной ДНК, АТР, липидами,казеином и катализируют реакции гидролиза ДНК, АТР, олигосахаридов, фосфорилируют липиды, олигосахариды и казеин. Причем,в молоке человека in vivo, а также в присутствии плазмы молока
человека in vitro с участием восстановленного глутатиона обмениваются не только IgG4, но и остальные подклассы IgG, а также
sIgA. Уровень образования химерных антител, содержащих одновременно легкие цепи типа каппа и лямбда, в молоке достигает
50 %. Мы показали, что иммуноглобулины классов G и A молока человека in vitro в присутствии восстановленного глутатиона,а также плазмы молока человека, содержащий неизвестный в настоящее время фактор, эффективно обмениваются половинами
молекул.
Би- и полиспецифичные иммуноглобулины молока не могут выполнять функции, присущие иммуноглобулинам крови, но в то жевремя могут играть совершенно другую роль. Известно, что антитела молока человека действуют в основном в кишечнике ребенка и непопадают в кровь. Таким образом, этот феномен может значительно
расширить современные представления о роли иммуноглобулинов
молока в организме ребенка.
Дальнейшие исследования будут направлены на изучение фактора молока, благоприятствующего обмену HL-фрагментами, а такжена разработку новых способов получения биспецифичных иммуноглобулинов.

Раздел 1

68КЛОНИРОВАНИЕ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ
НОВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ
M.AGSI, M.ALUBI И M.FATI, УЗНАЮЩИХ И УНИКАЛЬНО
МОДИФИЦИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
TTSA(М6A), (М6A)GCT И (М5C)ATG СООТВЕТСТВЕННО *Е. Н. Ширяева, М. А. Абдурашитов, Д. А. Гончар, С. Х. Дегтярёв,В. С. Дедков, Е. Н. Ломаковская, Н. А. Михненкова, Г. В. Мутыло,С. Г. Удальева, Л. А. Урюмцева, В. А. ЧернухинООО «СибЭнзайм», Новосибирск
Новые ДНК-метилтрансферазы являются перспективными инструментами для изучения метилирования ДНК в биологии и медицине. В бактериальных системах рестрикции-модификации ДНКметилтрансферазы защищают хозяйскую ДНК от сопряжённых эндонуклеаз рестрикции.
Данные о том, что выбранные ДНК-метилтрансферазы уникальны, основывались на свойствах сопряжённых эндонуклеаз.
Так, AgsI не имеет изошизомеров, следовательно, и сопряжённая
ДНК-метилтрансфераза должна быть прототипом. A���������������
luBI�����������и ��������
FatI����
являются изошизомерами AluI и NlaIII, однако, расщепляют ДНКштаммов-прототипов. Это указывает на уникальность сопряжённых ДНК-метилтрансфераз продуцентов изошизомеров. ГеныДНК-метилтрансфераз из Agrococcus species 25, Arthrobacter luteus
B и Flavobacterium aquatile NL3 клонировали в E. coli RR1- в составе
вектора pUC19. Продуценты отбирали по устойчивости ДНК плазмид к сопряжённым эндонуклеазам. Рекомбинантные плазмиды показаны на рис. 1.
Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации по Соглашению № 14.576.21.0077 от 06.11.2014 г. (уникальный идентификатор
RFMEFI57614X0077), заключенному в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы».
*Биотехнология

69

Рис. 1. Карты рекомбинантных плазмид, кодирующих M.AgsI (а),
M������������������������������������������������������������������
.�����������������������������������������������������������������
AluBI������������������������������������������������������������(б) и �����������������������������������������������������
M����������������������������������������������������
.���������������������������������������������������
FatI�����������������������������������������������
(в): тонкая линия — pUC�����������������������
��������������������������
19 ДНК, жирная — встроенная ДНК; ORI — точка начала репликации; P(BLA) — промотор генаβ-лактомазы, amp������������������������������������������������
���������������������������������������������������
— ген устойчивости к ампициллину, �������������
P������������
(�����������
LAC��������
) — промотор гена β-галактозидазы, agsIMA,agsIMB, aluBIM и fatIM — геныДНК-метилтрансферазДНК рекомбинантных плазмид секвенировали и открытые рамки
трансляции (ОРТ) определили. По программе BLAST определили,что белки генов M.���������������������������������������������
AgsI�����������������������������������������и ��������������������������������������
M�������������������������������������
.������������������������������������
AluBI�������������������������������
относятся к аминометилтрансферазам, а белок M.FatI — к цитозин (C5)-ДНК-метилтрансферазам.
M.AgsI, узнающая TTSAA, по-видимому, состоит из двух субъединиц.
На рис. 2 показано выравнивание аминокислотных последовательностей M.AgsIА и M.AgsIВ с М.TaqI, образующей TCG(m6A). Среди
мотивов ДНК-метилтрансфераз в M.AgsIВ выявили мотив I (A-G-G)для связывания ����������������������������������������������
SAM�������������������������������������������, а в M.�����������������������������������
AgsI�������������������������������
А — мотив IV (�����������������
NPPF�������������
) для катализа. В настоящее время известны лишь три ДНК-метилтрансферазы
М.AquI, М.EaeI, М.EcoHK31I, которые состоят из двух субъединиц.
Все они относятся к классу цитозин (C5)-ДНК-метилтрансфераз.
M.AgsI, таким образом, может являться первой субъединичной
аденин-(N6)-ДНК-метилтрансферазой.
Биомассы рекомбинантных продуцентов нарабатывали. Из нихпри помощи хроматографических процедур выделяли препараты
ДНК-метилтрансфераз, пригодные для молекулярно-генетических
работ. По защите от сопряжённых эндонуклеаз определили оптимальные условия активности ферментов.
Специфичность ДНК-метилтрансфераз определяли путём мечения посредством [3������������������������������������������
H�����������������������������������������
]-���������������������������������������
SAM������������������������������������
оснований в олигонуклеотидах, кото-70Раздел 1

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей субъединиц М.���������������������������������������������������������
AgsI�����������������������������������������������������
с М.������������������������������������������������
TaqI��������������������������������������������и выявление консервативных мотивов аминометилазрые затем расщепляли по сайтам метилирования эндонуклеазами
рестрикции IIs-типа. Также метилируемые основания определяли
путём блокирования активности эндонуклеаз рестрикции на ДНКфагов λ и Т7, метилированных M.AgsI, M.AluBI и M.FatI.
Таким образом, результаты анализа аминокислотных последовательностей, 3Н-мечения метилируемых оснований, «зондирования»метилированных сайтов эндонуклеазами рестрикции — показали,что M.AgsI образует 5'-TTSA(m6A)-3' на ДНК, M.AluBI — 5'-(m6A)
GCT-3', M.FatI — 5'-(m5C)ATG-3'. Все три ДНК-метилтрансферазы
обладают новой специфичностью и вполне могут представлять интерес для молекулярно-генетических работ.
ДНК фагов λ и Т7 метилированные M.AgsI, M.AluBI и M.FatI
использовали для определения специфичности ряда эндонуклеаз
рестрикции, производимых в РФ, к новым видам метилирования.
Полученные результаты расширяют возможности применения
промышленных эндонуклеаз рестрикции для изучения метилирования ДНК.

Биотехнология

71ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ
ESСHERICHIA COLI И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОйСТВ
Э. Т. Тайлакова, О. В. Червякова, К. Т. СултанкуловаРГП Научно-исследовательский институт проблем биологической
безопасности КН МОН РК, пгт Гвардейский Жамбылской области,Казахстан
Оспа овец это тяжелое, высококонтагиозное заболевание, которое
согласно МЭБ относят к особо опасным болезням животных. Заболевание наносит овцеводству огромный экономический ущерб, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарныхи охранно-карантинных мероприятий.
Решающая роль в борьбе с инфекционными болезнями животных
отводится специфической профилактике с использованием живыхи инактивированных вакцин. Исследования по созданию вакцин нового поколения против каприпоксвирусов имеют важное значениедля сельского хозяйства Казахстана, где основу животноводства составляет овцеводство.
В настоящее время для профилактики оспы овец в Республике
Казахстан и в ряде стран ближнего зарубежья используют культуральную вакцину, полученную на основе аттенуированного вируса
оспы овец (ВОО), штамм «НИСХИ». Однако ограничения на использование живых аттенуированных вакцин в районах благополучных по данному заболеванию и их недостатки такие как: реактогенность, сохранение риска остаточной вирулентности, возможная
генетическая нестабильность, приводящая к возвращению свойств
патогенности, их биологическая нестабильность при хранении и использовании, а также аллергенное воздействие на некоторых вакцинируемых, создают необходимость разработки профилактических
препаратов нового поколения.

72Раздел 1Последним достижением молекулярной биологии, генной инженерии и биотехнологии стало создание вакцин, содержащих высокоиммуногенные вирусные белки. Получение вакцин на основе рекомбинантных белков является новейшим поколением профилактических
препаратов. Субъединичные вирусные вакцины обычно являются
набором или отдельным поверхностным протективным вирусным
белком. Обладая протективной активностью эти антигены способны обеспечить развитие устойчивости иммунизируемого организмак последующему инфицированию. Главным преимуществом данного
типа вакцин является их низкая реактогенность, что обуславливаетих широкое применение в медицине и ветеринарии для вакцинации
населения и сельскохозяйственных животных.
Целью данной работы является получение рекомбинантных белков обладающих иммуногенными свойствами для разработки высокоэффективного средства специфической профилактики против
оспы овец.
В данных исследованиях белки вируса оспы овец выбраны по гомологии с изученными иммуногенными белками вируса коровьей
оспы А4, А27, А33, В5, L1, Н3.
На первом этапе исследований был проведен анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей генов целевых белковВОО на наличие трансмембранных доменов. В результате установлено, что четыре белка SPPV060 (ортолог L1), SPPV074 (ортолог
Н3), SPPV122(ортолог А33) и SPPV141(ортолог В5) имеют трансмембранные домены на N- или C-конце. Тогда как в аминокислотных
последовательностях белков SPPV095 (ортолог А4) и SPPV117 (ортолог А27) эти домены отсутствовали. С учетом результатов анализа
были сконструированы праймеры. Для возможности последующего
клонирования целевых генов в экспрессирующие плазмиды в последовательности праймеров были внесены соответствующие сайты рестрикции. С использованием подобранных праймеров были амплифицированы целевые гены, которые далее клонировали в экспрессирующий вектор рЕТ26b(+) или рЕТ28b(+).
В результате было получено 6 конструкций (pSPPV060ΔТМ,pSPPV074ΔТМ,pSPPV095,
pSPPV117,
pSPPV122ΔТМ

Биотехнология

73

и �����������������������������������������������������������
pSPPV������������������������������������������������������
141���������������������������������������������������
Δ��������������������������������������������������ТМ) для экспрессии генов вируса оспы овец под контролем промотора Т7 в бактериальной системе E.coli штамм Т7.
Для очистки и детекции рекомбинантных белков аминокислотные последовательности были модифицированы путем добавленияна С-конце шести молекул гистидина HIS-Tag6.
В результате индукции бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды pSPPV�������������������������
������������������������������
060����������������������
Δ���������������������
ТМ, pSPPV������������
�����������������
074���������
Δ��������
ТМ, pSP����
PV095, pSPPV117, pSPPV122ΔТМ и pSPPV141ΔТМ, установлена
экспрессия белков, молекулярный вес которых соответствовал расчетным значениям для SPPV060, SPPV074, SPPV095, SPPV117,
SPPV122 и SPPV141 — 22, 30, 20, 19, 17 и 22 кДа, соответственно.
Подобран оптимальный протокол индукции экспрессии для каждого гена, обеспечивающий высокий выход рекомбинантного белка.
Анализ клеточных лизатов методом вестерн блота с использованием анти-HIS мышиных иммуноглобулинов подтвердил наличие экспрессии целевых белков. Все полученные рекомбинантные белки
специфически связывались с антителами к полигистидину. Кроме
того, все полученные белки специфически выявлялись сывороткойот экспериментально инфицированных ВОО овец. Также было установлено, что рекомбинантные белки SPPV060, SPPV074, SPPV117,
SPPV122 и SPPV141 в организме животных вызывают образование
антител с вируснейтрализующей активностью.
Исследования выполнены в рамках проекта грантового финансирования Г.2015/0115РК01983 «Рекомбинантная вакцина для профилактики оспы овец».
Выполнение исследований по теме обеспечит разработку высокоэффективного средства специфической профилактики нового поколения против оспы овец, являющегося одним из основных моментовв улучшении благосостояния страны по особо опасным инфекционным заболеваниям.

74Раздел 1ПОЛУЧЕНИЕ БИБЛИОТЕКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ
НИТЧАТЫХ БАКТЕРИОФАГОВ М13 ДЛЯ СОЗДАНИЯ
ЭКСПРЕСС ТЕСТ ПОЛОСКИ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ АНТИТЕЛ
ПРОТИВ ГЕПАТИТА С
Н. В. Волкова
ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор»Начиная с 1989 года, когда впервые был выделен вирус гепатита С,его распространенность в мире постоянно растет, и, согласно оценкам
Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на данный момент
достигает 130–200 миллионов случаев. Около 350 000 человек ежегодно умирают от последствий гепатита С. Эпидемия гепатита С — однаиз самых серьезных угроз для общественного здравоохранения.
В России постоянно регистрируются новые случаи инфицирования, и в то же время не уделяется достаточного внимания профилактике данного заболевания. В настоящее время вакцины от гепатита C несуществует, но в этой области ведутся научные исследования[1]Поскольку острая инфекция вируса гепатита С обычно протекаетбез симптомов, инфекции вируса гепатита С редко диагностируется на раннем этапе. Хотя диагностирование на раннем этапе может
предотвратить проблемы со здоровьем, которые могут возникнуть
вследствие инфекции, и предотвратить передачу вируса.
Современные методы диагностики слишком дороги и недостаточно точны, а также занимают много времени [2]. На данный моментдля диагностики используется иммуноферментный анализ и ПЦР.
Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием
фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Однако слабым
местом этого метода являются используемые коммерческие антигены — они слишком дороги. Немало важным недостатком является
время диагностики на наличие антител. Чтобы сделать диагностикуна наличие в крови антител против гепатита С человеку нужно идтив больницу и затем, спустя время известны только результаты.

Биотехнология

75Поэтому мы предлагаем альтернативный подход с использованием нитчатых бактериофагов, как векторов презентации иммуногенов
вируса и выявления с помощью их антител против гепатита С.
Достигается это путем встройки пептидов в pIII белок нитчатых
бактериофагов, что позволит вместо химического синтеза, который
значительно увеличивает цену, использовать биологическую амплификацию для наработки антигена. Бактериофаги один из самых простых и удобных молекулярно-биологических систем амплификациии экспрессии пептидов.
Отдел биоинженерии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», возглавляемая
профессором Ильичевым А. А., была первой в России и одной из первых в мире, где начались исследования по фаговому дисплею. Подруководством Ильичева А. А. впервые в мире была проведена работапо встройке чужеродного пептида в основной белок нитчатого бактериофага М13 — рIII, было показано что этот белок может быть использован для получения фаговых пептидных библиотек. Разработанряд уникальных векторных систем для дисплея пептидов и белковв составе нитчатых бактериофагов. При помощи фаговых библиотек
найден ряд антител представляющих диагностическую и терапевтическую ценность.[3]Встраивание пептидов производилось следующим образом, сначала
производился ферментативный гидролиз репликативной формы бактериофага М13 и олигонуклеотидов, входящих в поверхностный белок
вируса гепатита С. Ферментативный гидролиз проводили по определенным сайтам рестрикции. Затем производили лигирование («сшивку») олигонуклеотида и репликативной формы бактериофага М13.
В настоящее время встроены три пептида в рIII белок бактериофага
М13. В дальнейшем данные пептиды будут проверены с помощью дотблота на связывание с антителами, содержащимися в сыворотки крови.
Главное преимущество нашего экспресс теста перед существующими методами диагностики заключается в том, что встройка пептидов в некоторые белки бактериофагов не влияет на их жизнеспособность, и в то же время позволяет получить химерные вирусные
частицы, несущие на своей поверхности желаемые пептиды. Далее,путем конкурентного отбора будут выбраны наиболее эффективные

Раздел 176

и чувствительные пептиды, которые и будут использоваться для выявления антител против вируса гепатита С.
Разрабатываемый экспресс тест будет использоваться в исследовательских и медицинских лабораториях, а так же для бытового применения.
Список литературы
1. В. В. Серов, З. Г. Апросина //Хронический вирусный гепатит —М.: Медицина, 2004. 384 с.; ил
1. Пименов Н.Н, Чуланов В. П., Комарова С. В., Карандашова И. В.,Неверов А. Д., Михайловская Г. В., Долгин В. А., Лебедева Е. Б., Пашкина К. В., Коршунова Г. С. (2012) Гепатит С в России: эпидемиологическая характеристика и пути совершенствования диагностики и надзора. Эпидемиология и инфекционные болезни, № 3, 2012, с. 4–10.
2. ����������������������������������������������������������
Отбор методом фагового дисплея и анализ пептидов, узнаваемых широконейтрализующим антителом VRC01 Щербаков Д. Н.,Волкова Н. В., Бакулина А, Щербакова Н. С., Чикаев А. Н., Рудометов А. П. Инфекция и иммунитет, специальный выпуск 2014, с 107.
ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ЭФФЕКТ РЕКОМБИНАНТНОГО
ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГО
АПОПТИН, НА МОДЕЛИ ИСКУССТВЕННОГО
МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ КАРЦИНОМЫ А431 *А. Ю. Юнусова 1, Г. В. Кочнева 2ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной
медицины СО РАН, г. Новосибирск, 2 ФБУН Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово
1Онколитические свойства ряда вирусов предполагается использовать для лечения онкологических заболеваний. Вирус осповакци*Научный руководитель — проф., д-р биол. наук Е. И. Рябчикова.

Биотехнология

77

ны (ВОВ) обладает природной онкоселективностью, однако, в виротерапии опухолей для предотвращения возможных осложнений
необходимо использовать аттенуированные штаммы. Делеция двухгенов — тимидинкиназы и вирусного фактора роста (������������
VGF���������
) — лишает ВОВ возможности размножаться в нормальных клетках, тогда какспособность вируса инфицировать и разрушать опухолевые клетки
сохраняется. Онколитическую активность аттенуированных штаммов можно усилить при помощи встройки генов дополнительных
эффекторных молекул, среди которых особый интерес представляют
белки-индукторы апоптоза. Апоптин — неструктурный белок вируса анемии кур, избирательно вызывает апоптоз в опухолевых клетках. Раннее нами был установлен выраженный противоопухолевый
эффект рекомбинантного штамма ����������������������������
VVdGF�����������������������
-����������������������
ApoS������������������
24/2 �������������ВОВ с делецией гена �����������������������������������������������������
VGF��������������������������������������������������и встройкой гена апоптина на ксенографты карциномы А431, привитые мышам �����������������������������������
nude�������������������������������. В настоящей работе исследовали противоопухолевый эффект другого рекомбинантного штамма
ВОВ, VVdGF-GFP2, с делецией двух генов (VGF и тимидинкиназы)и встройкой генов апоптина и GFP.
Цель работы: изучить противоопухолевый эффект рекомбинантного штамма VVdGF-GFP2 ВОВ и его способность диссеминироватьиз опухоли, в которую его вводили, в отдаленный опухолевый узел(метастаз) и разрушать его ткань.
Для этого мышам nude подкожно в область правой и левой заднихлап вводили суспензию клеток карциномы А431 (5х106 кл/мышьв 100 мкл 0,9 % NaCl), через 10–12 дней у мышей формировались двеопухоли размером 100–150 мм3. В опухоль над левой лапой вводили суспензию рекомбинантного ВОВ VVdGF-GFP2 (107 БОЕ/мышьв 100 мкл 0,9 % NaCl�������������������������������������������
�����������������������������������������������
). Забор опухолей для микроскопического исследования осуществляли каждые 2–3 суток в период с 4-х по 35-есутки после введения вируса. Исследование осуществляли методами
световой и электронной микроскопии и иммуногистохимии.
Светооптическое исследование установило, что введение рекомбинантного штамма VVdGF-GFP2 ВОВ в один из двух ксенографтов,приводит к деструкции обеих опухолей. Деструкция инфицированной опухоли происходит постепенно, на парафиновых срезах опухо-78Раздел 1левых узлов в период наблюдения отмечается увеличение очагов деструкции и уменьшение участков визуально неповрежденной ткани.
Разрушение опухолевой ткани в «метастазе» происходит более медленно. Полная деструкция ткани опухоли и «метастаза» регистрируется через 12 и 20 суток после инъекции вируса, соответственно. Разрушенная опухолевая ткань имеет признаки отека и небольшой лейкоцитарной инфильтрации. Маркером репродукции вируса в клетках
опухоли является экспрессируемый вирусом белок апоптин. Иммуногистохимически апоптин выявлен в цитоплазме опухолевых клеток и опухоли, и «метастаза», причем отчетливая позитивная реакция
отмечается в клетках опухоли через 4 суток после инъекции вируса,а в клетках «метастаза» — через 8 суток (рис. 1А).
Ультраструктурное исследование выявило избирательную репродукцию рекомбинантного штамма ВОВ в опухолевых клетках какопухоли, так и «метастаза» (рис.1Б). Морфологических признаков
репродукции ВОВ в клетках стромы опухолевых узлов не обнаружено (рис. 1В).

Рис. 1. Репродукция рекомбинантного штамма VVdGF-GFP2 ВОВв опухолевых клетках карциномы А431. А — иммуногистохимическое
выявление апоптина в клетках искусственного метастаза (8 суток после
инъекции вируса), визуализация антигена хромогеном AEC, докраска
гематоксилином; Б — вирусные частицы в ткани искусственного метастаза, иссеченного через 12 суток; В — эндотелиоцит без признаков
репродукции ВОВ, ультратонкие срезы

Биотехнология

79Таким образом, проведенное исследование показало, что рекомбинантный штамм ВОВ VVdGF-GFP2, экспрессирующий апоптин,способен разрушать клетки первичного опухолевого узла, мигрировать в отдаленный узел, разрушать его ткань, что указывает на антиметастатический потенциал данного штамма.
DE NOVO СБОРКА ГЕНОМА МИКРООРГАНИЗМОВ
ПОЛУЧЕННЫХ НА ПРИБОРЕ MISEQ ILLUMINA
Ж. А. Жаниязов, С. Т. Даугалиева, С. А. Айткельдиева, Е. А. СвиркоРГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РККлючевые слова: NGS���������������������������������������
Секвенирование, de��������������������
����������������������
�������������������
novo���������������
, Биоинформатическая обработка, геном.
Введение. Секвенирование геномов микроорганизмов является
наиболее актуальным исследованием в молекулярной биологии.
Наиболее распространенным на сегодняшний день является секвенирование первого поколения по методу Сэнгера, основанноена технологии капиллярного электрофореза. Однако возможности
этого метода ограничиваются максимальной длиной прочтения
около 1000 нуклеотидов, что не подходит для рутинного секвенирования протяженных регионов генома. Кроме того этой технологии присущи ограничения в пропуске, масштабировании, стоимости, скорости и в разрешениях, препятствующих ученым получать генетическую информацию. Для преодоления этих барьеров
была разработана новая технология — секвенирование нового иливторого поколения (next-generation sequencing — NGS). Её появлению способствовало развитие компьютерной индустрии, технологий изготовления микропроцессоров и цифровых носителей
информации.
Материалы и методы. В работе было использовано 14 видов
культур микроорганизмов.

Раздел 1

80
№
п/п
1
2

Наименование микроорганизма

Длина генома
п.н
5,0
4,57

4
5

Pseudomonas azotifigens
Pseudomonas ztutzery
Tetrathiobacter mimigardefordensis(Advenella mimigardefordensis)
Bradyrizobium japonicum
Rizobium Leguminosarum

6

Bacillus Licheniformis

4,3

7

Bacillus coagulans

3,07

8

Propionibacterium
freudenreichii subsp. shermanii

2,616

9

Streptococcus thermophilus

1,845

10

Bacillus subtillis

5,0

11

Lactobacillus bulgaricus

1,87

12

Erwinia amylovora

3,81

13

Cellulomonas biazotea

4,12

14

Bacillus flavigena

3,31

3

4,7
9,21
5,06

В работе наряду с классическими микробиологическими методами было проведено ��������������������������������������������NGS�����������������������������������������
-секвенирование на полногеномном секвенаторе нового поколения MiSeq (фирмы �����������������������������
Illumina���������������������
, США), который сочетает в одном инструменте: модуль для генерации кластеров, модульдля парноконцевого секвенирования и модуль для анализа и хранения полученных данных.
Геномную ДНК выделяли с помощью набора PureLink® Genomic
DNA Kits. Секвенирование полного генома бактерий осуществлялипо технологии Illumina, основанной на массовом параллельном секвенировании миллионов одноцепочечных фрагментов ДНК с помощью флуоресцентно-меченых нуклеотидов.
В нашем исследовании было проведено парноконцевое секвенирование (Paired-end Sequencing), которое позволяет проводить секве-Биотехнология

81нирование ДНК фрагмента с двух концов. В этом случае расстояние
между каждой парой ридов известно, алгоритм выравнивания может
использовать эту информацию для отображения ридов повторяющихся регионов более точно. Результатом этого является лучшее выравнивание ридов, особенно трудносеквенируемых повторяющихся
регионов генома.
Биоинформатическую обработку проводили с использованием программ FastQC, Trimmomatic, Quast, Contiguator, GeneMarkSи Rast, ассемблеров SPAdes версии 3.0, Velvet.
Результаты исследований. В результате секвенирования былиполучены данные о полном геноме 14 видов микроорганизмов в формате .����������������������������������������������������������
fastq�����������������������������������������������������, в связи с тем, что при полногеномном ��������������NGS�����������
секвенировании бактериального образца получается большой объем данных,представленных в виде ридов, биоинформатическая обработка былапроведена на примере одного вида микроорганизма — Bacillus�����
����
Sub�
tillis. Оценивали полученные риды с помощью программы FastQC,в результате чего обнаружили проблемы в некоторых ридах. Для исправление проблем в ридах использовали программу Trimmomatic.
De��������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������
novo���������������������������������������������������
сборку генома из очищенных ридов проводили с помощью двух разных ассемблеров: SPAdes�������������������������������
�������������������������������������
версии 3.0 и �����������������
Velvet�����������
. Для оценки результатов работы сборщиков использовали программу Quast,учитывая только контиги >500 bp.
Выравнивание полученных данных на референсный геном проводили в программе С�����������������������������������������������
ontiguator�������������������������������������, в качестве референсного генома взяли Bacillus subtilis subsp. subtilis str. BAB-1, который скачали из базыNCBI.
На референсный геном было выравнено 47 контигов (4062364 п.н.
из 4178896) и получена «псевдохромосома» — упорядоченный набор
контигов, высокое число выравнивание указывает на высокое сходство с референсом и подтверждает принадлежность нашего штаммак этому виду микроорганизма. Также на наш геном не было выравнено 109 контигов, хотя число контигов много, но длина всех этих контигов составляет 116532 п.н., скорей всего не выравненные контиги
принадлежат к плазмидной ДНК. Для аннотаций генов использовали
программы GeneMarkS и Rast.

82Раздел 1Обсуждение результатов. Секвенирование нового поколенияна приборе MiSeq (Illumina) позволило получить данные о полном
геноме 14 видов микроорганизмов за один запуск прибора. После
секвенирования был получен набор прямых и обратных ридов. Показатель качества секвенирования составил Q>30 (вероятность ошибки
1 из 1000, точность прочтения 99,9 %), что говорит о хорошем качестве полученных данных. В результате NGS�����������������������
��������������������������
секвенирования на приборе ����������������������������������������������������������
MiSeq�����������������������������������������������������
Illumina��������������������������������������������
����������������������������������������������������
были получены данные о полном геноме 14 видов бактерий. Выравнивание полученных данных на референсный
геном Bacillus Subtillis показало высокую схожесть контигов.
РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ МЕТОДА ИЗМЕРЕНИЯ
ИНДЕКСА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ МОНОНУКЛЕАРОВ
ПЕРЕФЕРИЙНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Л. С. Адаменко 1, М. А. Гуляева 1, С. А. Зайцев 2, А. М. Шестопалов 1
1ФГБНУ Научно-исследовательский институт экспериментальнойи клинической медицины, 2 ООО «Диатек»Проблема онкологических заболеваний остается приоритетной длясовременного общества. Особая актуальность обусловлена высоким
уровнем распространенности данной патологии среди населения, высокой летальностью, а также большими экономическими потерями.
По данным Всемирной организации здравоохранения, каждый год отонкологических заболеваний в мире умирают более 7,5 млн. человек.
Каждый год только в России выявляется около 500 тысяч онкобольных. Так, в Российской федерации в 1998 году было зарегистрировано
440 721 новых онкобольных, а в начале 2009 года в онкологических
диспансерах России состояло на учете 2 607 223 человек.
По данным Международного Агентства по Исследованию РакаРоссия в 2012 году заняла 5-е место в мире по числу смертей онкологических больных. Высокий уровень смертности в России от онкологи-Биотехнология

83ческих и сердечно-сосудистых заболеваний обусловлен поздним выявлением недугов. В 60 % заболевание диагностируется в III–IV стадиях.
На современном этапе развития медицины и здравоохранения особую
актуальность приобретает вопрос внедрения инновационных технологий, направленных на своевременное определение заболевания. Выявляемость рака на ранних (I и II) стадиях – залог успешного леченияи сохранения высокого качества жизни у пациента.
Целью данной работы стала ранняя диагностика онкологических
заболеваний, основанной на эффекте возрастания ИКЦ при развитии
процесса неопластической трансформации.
Работа осуществлялась на клеточной линии рака молочной железы, способной экспрессировать опухолеспецифические антигеныв крови пациента. Нами было исследовано 40 человек с заболеванием рак молочной железы, находящихся в стационаре отделения
№3 Городской клинической больницы №1 г. Новосибирска. Анализ
цитотоксического эффекта проводился с помощью оценки лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в кондиционной среде при совместном культивировании человеческой популяции клеток (ДК+МНК) и клеточной
линии MCF-7. В результате проведенных исследований установлено,что группы условно здоровых доноров имеют достоверно меньший
индекс цитотоксичности (5,6+-1,5) по сравнению с группами больных РМЖ (22,5+-7) на клеточной линии аденокарциномы молочной
железы человека MCF7. При этом обнаружено, что индекс цитотоксичности МНК больных раком молочной железы (позитивных по
HLA-A*02 и позитивных по Her2) по отношению к линии MCF-7составляет 26+-4, тогда как индекс цитотоксичности МНК больных
раком молочной железы, позитивных по HLA-A*02 и негативных по
Her2 равен 16,5+-5. Это указывает на значительный вклад в индекс
цитотоксичности антигензависимой цитотоксичности, связанной сактивацией гамма\дельта Т-лимфоцитов.
Таким образом, можно сделать вывод, что метод измерения ИКЦпозволяет надёжно различить больных раком молочной железы иусловно-здоровых пациентов.

84cРаздел 2Вирусология

МОНИТОРИНГ ПАРАМИКСОВИРУСОВ ПТИЦВ КАПЧАГАЙСКОМ ВОДОХРАНИЛИЩЕ
П. Г. Алексюк, М. С. Алексюк, А. С. Турмагамбетова,А. П. Богоявленский, В. Э. БерезинРГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК,Алматы, Республика Казахстан
Вирусы рода Avulovirus являются причиной инфекций птиц, характеризующимися поражением всех внутренних органов и систем
организма и способны вызывать крупные эпизоотии среди домашних и диких птиц. Представители этого рода вирусов являются одним из наиболее распространенных инфекционных агентов, циркулирующих практически во всех регионах мира. Вирусы способны
вызывать массовую гибель птиц в птицеводческих хозяйствах, нанося
значительный экономический ущерб. По современной классификации
парамиксовирусы делятся на 12 серотипов. В Казахстане вирусы
этого рода были впервые выделены в 1980 г. и с тех пор вспышки
заболеваний, вызываемых парамиксовирусами птиц периодически
возникают на территории Республики, принося значительные
экономические потери птицеводству.
Быстрое развитие птицеводческой промышленности в Казахстанена индустриальной основе, а также наличие большого числа
мелких фермерских хозяйств, требует постоянного контроля заВирусология

85распространением подобных инфекций и проведения регулярных
противоэпизоотических мероприятий.
Среди обширного числа методов диагностики парамиксовирусов
внастоящее
времяприменяются
РГА,
РТГА,
РНГА
и иммуноферментный анализ. Однако эти методы выявления
либо недостаточно чувствительны, либо трудоемки в исполнениии требуют дорогостоящего оборудования и высококачественных
реагентов. Поэтому, разработка надежных, простых в употреблениии высокочувствительных методов и тест-систем для диагностики
парамиксовирусов птиц является весьма актуальной задачей
современной вирусологии, имеющей не только теоретическое, нои большое практическое значение.
В наших исследованиях были проведены метагеномные исследования нуклеиновых кислот, выделенных из Капчагайского водохранилища. Водные образцы были выбраны по ряду причин, основнымииз которых является возможность эффективной концентрации образца методом ультрацентрифугирования и способность представителей данной группы сохранять инфекционность в водных образцах неменее 45 дней.
Пробы воды из Капчагайского водохранилища были отобраныв летнее время, что соответствовало среднему количеству микрофлоры водоема в среднесезонном значении. Отобранные пробы
воды последовательно фильтровали через поликарбонатные фильтры (Millipore) с диаметром пор 1,2; 0,8; и 0,2 мкм с последующей
концентрацией ультрацентрифугированием. Из полученных образцов выделили суммарную ДНК, которую затем анализировали
методом полного секвенирования на ДНК секвенаторе “Illumina”.
Риды собирали программой Edena, т.к. она позволяет варьировать
минимальную длину общей части ридов, при которой они будут
считаться пересекающимися. С целью нахождения наибольшего
числа вирусов необходимое пересечение ридов было установлено
в 35 нуклеотидов. Для поиска использовалась standalone версия
blastnNCBI�������������������������������������������������������
, 2.2.30. В качестве источника вирусных геномов использована NCBInucleotide, содержащая 6079 полных геномов вирусов.
Анализ полученных данных показал, что в Капчагайском водохра-86Раздел 2нилище обнаружен целый ряд фрагментов нуклеотидных последовательностей парамиксовирусов птиц. Филогенетический анализ
последовательностей показал, что 64 % последовательностей соответствовало ������������������������������������������������
PMV���������������������������������������������
1, а остальные PMV���������������������������
������������������������������
2–12. При этом среди серотипов 2–12 с максимальной частотой встречались последовательности PMV9 и 4.
Таким образом, метагеномные исследования образцов, содержащих последовательности парамиксовирусов птиц способны привезти к новым данным эволюционных превращений вирусов родаAvulovirus.

ИЗУЧЕНИЕ ЦИРКУЛЯЦИИ ВИРУСА ГРИППА СРЕДИ
НАСЕЛЕНИЯ АКТЮБИНСКОЙ ОБЛАСТИ В 2015 Г.
С. Б. Байсейіт, Т. И. Глебова, Г. В. Лукманова, Н. Г. Кливлеева,М. Г. ШаменоваРГП на ПХВ «Институт микробиологии и вирусологии»КН МОН РК, г. Алматы
Грипп — это тяжелая вирусная инфекция, занимающая первое
место среди других острых респираторных заболеваний. Гриппозная
инфекция протекает с различной степенью тяжести и может сопровождаться смертностью, особенно часто регистрируемой среди маленьких детей и лиц пожилого возраста. По данным ВОЗ, ежегодно во всем мире гриппом заболевают 20–30 % детей и от 5 до 10 %взрослых, а от тяжелых осложнений, вызванных гриппозной инфекцией, умирают от 250 до 500 тыс. человек.
В эпидемический период 2015 г. в больницах и поликлиниках Актюбинской области от больных людей было собрано 39 носоглоточных смывов: 37 проб (94,9 %) — от пациентов с диагнозом ОРВИ,2 пробы (5,1 %) — аденовирусная инфекция.

Вирусология

87Первичный скрининг 39 биопроб на наличие антигена вируса
гриппа типов А и В проведен с помощью РТ-ПЦР с использованием
реагентов «АмплиСенс» производства ЦНИИ эпидемиологии (г. Москва). ПЦР диагностика клинических образцов показала, что генетический материал вирусов гриппа обнаружен в 10 смывах (25,6 %от общего числа исследуемых проб). РНК вируса гриппа типа А выявлена в восьми биопробах (20,5 %): А/H1N1 в пяти смывах (12,8 %),А/H3N2 — в одной пробе (2,6 %). В двух пробах (5,1 %) обнаруженаРНК одновременно обоих подтипов вируса гриппа А (H1N1+H3N2).
Вирусы гриппа типа В выявлены также в двух образцах (5,1 %). Этиданные указывают на циркуляцию в Актюбинской области вирусов
гриппа смешанной этиологии.
В ходе первичного заражения и двух последовательных пассажейна куриных эмбрионах ПЦР положительного материала удалось выделить пять гемагглютинирующих агентов с титрами гемагглютинации 1:256 –1:1024. Инфекционная активность выделенных изолятов
составила 3,77 — 8,77 lg ЭИД50/0,2.
Идентификацию изолятов проводили в реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА) и в реакции ингибиции
нейраминидазной активности (РИНА) согласно рекомендации ВОЗ.
Гемагглютинирующая активность исследуемых изолятов в РТГАв титрах 1:20 — 1:320 подавлялась иммунными сыворотками к вирусам A/USA/1976/31 (H1N1), А/Solomon Islands/03/06 (H1N1) и А/
California�����������������������������������������������������
/04/09 (H1N1)pdm. Нейраминидазная активность выделенных изолятов в титрах 1:100 подавлялась иммунной поликлональной
сывороткой к вирусу гриппа А (Н1N1).
Таким образом, по результатам РТГА и РИНА изоляты 02/15,
03/15, 06/15, 18/15 и 20/15, выделенные от больных людей в г. Актобе, отнесены к вирусу гриппа А (Н1N1), что указывает на циркуляцию данного вируса гриппа на этой территории в 2015 г.

88Раздел 2ЦИРКУЛЯЦИЯ ВИРУСА ГРИППА
ПОПУЛЯЦИИ СВИНЕЙ В 2014 Г. В КАЗАХСТАНЕ
М. Қ. Қалқожаева, Н. Т. Сактаганов,Н. С. Онгарбаева, Н. Г. КливлееваРГП на ПХВ «Институт микробиологии и вирусологии»КН МОН РК, г. Алматы
Вирус гриппа является широко распространенным и значимым
возбудителем респираторного заболевания у свиней. Эпизоотии среди животных имеют большое социальное значение в связи со способностью вируса к реассортации и возникновению штаммов, высокопатогенных для людей [Кузнецова Т. В. и др., 2009; Ишмухаметова Н. Г.,2013]. Эпизоотическая ситуация по гриппу особенно обострилась
после заболевания и гибели людей от "нового" пандемического вируса гриппа свиней типа А, начавшегося в апреле 2009 г. в Мексикеи распространившегося по всему миру и в Казахстане [Гендон, 2010;Икранбегийн Р., 2012].
С целью изоляции вируса гриппа свиней в 2014 г. в животноводческих хозяйствах Костанайской, Карагандинской, ВосточноКазахстанской и Алматинской областей от животных проведен сбор192 носоглоточных смывов и 170 сывороток крови. Для исследованияв РТ-ПЦР, иммуноферментном анализе на нитроцеллюлозной мембране (ИФА) и реакции иммунофлуоресценции (РИФ) использовали
107 биопроб (носоглоточные смывы).
В результате ПЦР диагностики выявлено 23 положительных образца (21,5 %). Генетический материал вируса гриппа А/H1N1 былобнаружен в 20 смывах, что составляет 18,7 % от общего числа проб.
РНК вируса подтипа А/H3N2 выявлена лишь в трех материалах
(2,8 %). Таким образом, первичный скрининг носоглоточных смывовв РТ-ПЦР показал, что в популяции свиней в Казахстане циркулируют в основном вирусы гриппа А/H1N1.

Вирусология

89Данные ИФА на выявление антигенов вируса гриппа, показали
наличие вируса в 16 образцах от общего числа проб (15 %). В результате проведенной РИФ антигены вируса гриппа были обнаружены
в 13 носоглоточных смывах (12,1 %): к А/Н1N1 — в девяти (8,4 %),к А/Н3N2 — в четырех (3,7 %).
В результате первичного заражения куриных эмбрионов 192 пробами, собранными в 2014 г., было выделено восемь гемагглютинирующих агентов с титрами гемагглютинации 1:2 — 1:4. Однако в ходепоследовательных пассажей три изолята утратили гемагглютинирующую активность, титры двух усть-каменогорских (20/14; 21/14)
и трех алматинских (05/14; 06/14 и 10/14) вирусов удалось повысить
до 1:16 — 1:256.
Серологический анализ проводили в реакции торможения гемагглютинирующий активности с использованием референсных штаммов: А/swine/Iowa/15/30 (Hsw1N1), А/California/07/09 (H1N1)v, А/
Wisconsin/67/05 (H3N2).
Результаты серологических исследований 170 сывороток крови
показали, что наибольшее количество положительных образцов к вирусу гриппа А/Iowa/15/30 (Нsw1N1) зарегистрировано в Костанайской
(восемь проб, 4,7 % от общего числа) и Карагандинской (семь материалов 4,1 %) областях. Кроме того, в Карагандинской и ВосточноКазахстанской областях зарегистрированы случаи выявления антител к вирусам гриппа А/California/07/09 (H1N1) — 2 пробы (1,1 %)и А/Wisconsin/67/05 (H3N2) — 3 сыворотки крови (1,8 %).
Таким образом в результате скрининга биологических образцов (носоглоточные смывы и сыворотки крови) установлено, чтона территории республики среди свинопоголовья циркулируют
разные штаммы вируса гриппа А, с явным преобладанием вируса
гриппа А/H1N1.
Постоянный надзор за гриппом в популяциях свиней играет важную роль в уменьшении вероятности межвидовой адаптации и распространения вирусов гриппа, в минимизации роли этих животныхкак источника возбудителя следующей пандемии.

90Раздел 2Социально-медицинские аспекты
папилломавирусной инфекции у больныхс патологией шейки матки в Томской области
О. В. Шпилева
ФГБНУ «Томский НИИ онкологии», г. ТомскРак шейки матки (РШМ) занимает второе место в структуре онкологических заболеваний у женщин. Ежегодно в России погибаетот РШМ 6 тысяч женщин. Заболеваемость РШМ в России в 2011 г.
составила 19,7 на 100 000 женского населения. [Давыдов М. И., Аксель Е. М. и соавт., 2011]. Отмечается негативная тенденция роста заболеваемости РШМ в молодом возрасте, а учитывая, что до 40 % больных РШМ выявляется в запущенных стадиях, одногодичная летальность составляет от 27–37 %. [Чиссов В. И., 2009] Томская область
относится к территории повышенного онкологического риска. Стандартизованный показатель РШМ в Томской области в 1,87 раз выше,чем по России и составляет 20,40/0000 [Л. Ф. Писарева, И. Н. Одинцова,с соавт. 2012г.], а в структуре онкологической заболеваемости женского населения в возрасте 15–39 лет занимает 1-ое место. [Чуруксаева О. Н., Коломиец Л. А., Шпилева О. В. 2012г.].
Доказанная роль ВПЧ в развитие предопухолевых заболеванийи РШМ, определяет перспективность использования профилактических вакцин против папилломавирусной инфекции в качестве первичной профилактики.
Проведенные в НИИ онкологии эпидемиологические исследования показали, что средний возраст больных интраэпителиальными неоплазиями и раком шейки матки составляет 39,9±8,5 лет,при этом 89,5 % обследуемых женщин HPV позитивны, что также соответствует мировым тенденциям. Наибольший удельныйвес среди обследуемых женщин составляют больные с предраком
шейки матки (H-SIL) 45,9 %, средний возраст которых составляет
до 30 лет.

Вирусология

91Оценка удельного веса различных онкогенных типов HPV��������
�����������в зависимости от возраста представлена на рис. 1.

Рис. 1. Особенности распространения онкогенных типов ВПЧ в зависимости от возрастаКак видно из представленных данных, доминирующим подтипомВПЧ в Томской области, так же как и в по мировым данным, является 16 подтип, который преобладает у молодых женщин в возрасте до 40 лет. Максимальный пик инфицированности ВПЧ 16 (74 %)приходится на возрастную группу 36–40 лет, где отмечались и более высокие показатели заболеваемости РШМ. У больных старших
возрастных групп (51–60 лет) развитие РШМ коррелировало в 25 %
с 18 типом ВПЧ, а в кдиническом плане, это ассоциируется с развитием аденокарциномы шейки матки, которая является менее благоприятным вариантом, имеет худшие отдаленные результаты и частое
рецидивирование. Отмечена высокая частота встречаемости ВПЧ31типа, причем только у женщин до 45 лет, с максимальным пикомв возрастной группе до 20 лет (17 %).
Выявленные региональные особенностей распространения ВПЧ,наряду с разработанными и зарегистрированными в настоящее времяв России профилактическими вакцинами Гардасил и Церварикс, позволили разработать эффективную технологию, позволяющую осу-92Раздел 2ществить первичную профилактику РШМ в и Томской области. К сожалению, данные профилактические вакцины не включены в обязательный календарь прививок в России. В рамках областных целевых
программ «Неотложные мероприятия по совершенствованию онкологической помощи населению Томской области на 2008–2013 гг.»,на территории Томской области, был реализован пилотный проект,на основе которого в 2010 году на базе НИИ онкологии был открыт
кабинет иммунопрофилактики РШМ. Целевым контенгентом длявакцинации были девушки 9–26 лет, с приемущественной возрастной когортой 11–13 лет, удельный вес которых составил 43 %. Всего,в рамках областной программы, было провакцинировано 627 девочек, введено 1653 дозы вакцин. Проведена оценка комплаентности
дозовой схемы введения вакцины: трехкратно вакцина поставлена
414(66 %) девочкам, двукратно 198 (31,6 %) девочкам. Проводилась
оценка безопасности по наиболее часто встречаемым реактогенным
реакциям, удельный вес которых не превышал 9,6 %,и в основном характеризовался головокружениями и болью в месте инъекции. В целом отмечена хорошая переносимость вакцинации.
Выявленные территориальные особенности по распространенности основных онкогенных типов ВПЧ инфекции в Томской области, при доказанной в профилактических вакцинах перекрестной
эффективности в отношении генотипов ВПЧ, не входящих в состав
вакцины, позволили обосновать целесообразность их использованияв Томской области. Хороший профиль безопасности и реактогенности, позволил выявить социально-экономическую обоснованность,новой, эффективной, технологии первичной профилактики РШМ.
При расчете социально-экономической обоснованности предлагаемой технологии, так же учитывался не только экономический ущербот высокой смертности женщин от РШМ, но и затраты на лечение
предраковой патологии, так как на каждые 10 случаев РШМ, приходится 25 случаев не выявленного предрака (������������������������
CIN���������������������
��������������������
II������������������
-�����������������
III��������������
). Вакцинопрофилактика может предотвратить рост заболеваемости РШМ в Томской области. На основе полученных данных, был произведен расчет
ожидаемого ущерба от заболеваемости РШМ в Томской области, гдеучитывались не только стоимость диагностики и лечения предрака

Вирусология

93шейки матки, но и убытки, связанные с временной постоянной нетрудоспособностью (выплаты социальных пособий, в т.ч. пенсии по инвалидности до достижения возраста 55 лет), а также размер ущерба,определяемый стоимостью недопроизведенного продукта за время
недожития до пенсионного возраста. Расчеты показывают, что суммарный экономический ущерб, обусловленный ведением пациентовс РШМ, ежегодно, в зависимости от возрастных групп, может составить от 20 до 40 млн. руб. в год.
Таким образом, выявленные особенности распространения папилломавирусной инфекции в Томской области, и проведение первичнойи вторичной профилактика РШМ, с учетом данных особенностей,позволит не только снизить заболеваемость раком шейки матки, нои сохранить репродуктивный, трудовой потенциал жительниц Томской области.
МЕТАГЕНОМИКА НОВЫХ ПАРАМИКСОВИРУСОВВ ВОДНЫХ ОБРАЗЦАХ
КАПЧАГАЙСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА
А. С. Турмагамбетова, М. С. Алексюк,А. П. Богоявленский, В. Э. БерезинРГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК,Алматы, Республика Казахстан
Вирусы, принадлежащие семейству Paramyxoviridae, хорошо
известны из-за их способности вызывать разнообразные инфекционные заболевания человека (корь, свинка, респираторные и энцефалитные синдромы) и животных (чума крупного рогатого скота,болезнь Ньюкасла, пневмония мышей и обезьян). Опасность данного семейства вирусов была доказана тем, что за последние 20 летобнаружены и охарактеризованы по крайней мере три новых инфекции, вызываемые вирусами Хендра, Нипах, Мененгле. Применение техники метагеномики при изучении вирусов летучих мышей

94Раздел 2и мелких грызунов позволило выявить более 66 новых разновидностей этих вирусов.
Дальнейший мониторинг инфекционных агентов данного семейства, циркулирующих в популяциях животных и птиц, обусловлен
рядом причин: (I) инфекционная — вспышки новых заболеваний
связаны с представителями животного мира; (II) антропологическая — контакт между человеком и популяцией животных, в которой
циркулирует вирус, приводит к повышению риска возникновения заболевания; (III) поиск инфекционного агента в образцах окружающей среды, позволяющий в разработке профилактических мероприятий по ограничению риска возникновения заболевания.
Поэтому мониторинг данной группы вирусов является однойиз основных задач диагностической вирусологии. В наших исследованиях были секвенированы образцы нуклеиновых кислот, выделенных из крупнейшего в Казахстане искусственного водохранилища — озеро Капчагай. Пробы воды из Капчагайского водохранилища были отобраны в летнее время, что соответствовало среднему
количеству микрофлоры водоема в среднесезонном значении. Отобранные пробы воды последовательно фильтровали через поликарбонатные фильтры (Millipore) с диаметром пор 1,2; 0,8; и 0,2 мкмс последующей концентрацией ультрацентрифугированием. Из полученных образцов выделили суммарную ДНК, которую затем анализировали методом полного секвенирования на ДНК секвенаторе
“Illumina”. Риды собирали программой Edena, т.к. она позволяет
варьировать минимальную длину общей части ридов, при которойони будут считаться пересекающимися. С целью нахождения наибольшего числа вирусов необходимое пересечение ридов было установлено в 35 нуклеотидов. Для поиска использовалась standaloneверсия blastnNCBI, 2.2.30. В качестве источника вирусных геномов
использована NCBInucleotide, содержащая 6079 полных геномов
вирусов. Анализ полученных данных показал, что в Капчагайском
водохранилище обнаружен целый ряд фрагментов нуклеотидных
последовательностей парамиксовирусов крупного рогатого скота,летучих мышей, свиней, грызунов и птиц. Множественное выравнивание в базе данных полных геномов вирусов позволило вычле-Вирусология

95нить ряд последовательностей гена полимеразного белка вирусов
летучих мышей. Филогенетический анализ гена полимеразного
белка показал, что водные образцы Капчагайского водохранилища
содержат фрагменты генов вирусов, родственных летучим мышами мелким грызунам Африки и Индии. Полученные результаты способны стать предметом более детального изучения эволюционных
превращений вирусов семейства Paramyxoviridae.
ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛНОГЕНОМНОЙ ПЛАЗМИДЫ,СОДЕРЖАЩЕЙ КОПИЮ ГЕНОМА АДЕНОВИРУСА
6-ГО СЕРОТИПА, ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В РАЗРАБОТКЕ СРЕДСТВА
ПРОТИВОРАКОВОЙ ТЕРАПИИ
Е. В. Демидова 1, М. В. Тарасова 1, 2, С. В. Нетесов 1, 2
1ФГАОУИО «Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет», 2 ФБУН «Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»По данным Росстата (http://www.gks.ru) в России ежегодно регистрируется около 526000 онкологических больных, и их число неуменьшается. Одним из новых подходов к лечению рака является использование онколитических вирусов.
Среди различных семейств вирусов, используемых в качестве онколитиков, одними из самых популярных являются аденовирусы в связис несколькими особенностями их строения и жизненного цикла.
В подавляющем большинстве работ по конструированию онколитических аденовирусов основой для создания новых штаммов служит аденовирус 5-го серотипа в связи с высокой степенью изученности его генома и жизненного цикла, а также благодаря наличию
коммерчески доступных наборов реагентов для генно-инженерных
манипуляций с его геномом. Однако при проведении ряда клинических испытаний препаратов, созданных на основе аденовируса 5-го

96Раздел 2серотипа, выяснились существенные ограничения в его использовании. Выявленные трудности можно преодолеть, используя аденовирус 6-го серотипа (������������������������������������������
Ad����������������������������������������
6). Он обладает меньшей распространенностью среди населения, а также большим временем элиминации присистемном введении.
При создании эффективного вируса-онколитика необходимо произвести изменения генома исходного вируса, с одной стороны, дляусиления опухолевой специфичности, с другой — для усиления литических свойств. Первым фагом при создании модифицированного
штамма является получение полногеномной копии ДНК вируса в составе плазмидного вектора.
Таким образом, цель даной работы — получение плазмиды,несущей копию полного генома аденовируса 6-го серотипа, дляпроведения генно-инженерных манипуляций с геномом с целью
создания модифицированного аденовирусного штамма, обладающего повышенными онколитическими свойствами по сравнениюс исходным Ad6.
Полногеномная плазмида была получена путем гомологичной рекомбинации ДНК Ad6 с плазмидным вектором, содержащим начальныйи конечный фрагменты генома Ad6 (pAdEnds) в клетках E.coli BJ5183.
Сначала в плазмиду pBR322 был встроен сайт рестрикции AsiSI,отсутствующий в геноме Ad�������������������������������������
���������������������������������������
6. Параллельно с этим начальный и конечный фрагменты генома ������������������������������������
Ad����������������������������������
6 были амплифицированы таким образом, чтобы их «внешние» концы были фланкированы сайтами AsiSIдля последующих встраивания/вырезания копии генома из плазмиды, а «внутренние» содержали сайт GsaI для сшивки друг с другом.
Фрагменты имели длину 800–900 пн, что является оптимальным дляпрохождения последующей гомологичной рекомбинации.
Для получения плазмиды �����������������������������������
pAdEnds����������������������������
вектор ��������������������
pBRAd���������������был линеаризован по сайту рестрикции AsiSI. Далее проводили лигазную сшивку
полученного вектора и сшитых друг с другом начального и конечного фрагментов. Полученной лигазной смесью трансформировали
клетки E.coli штамма XL-Blue. Для подтверждения встройки былипроведены рестрикционный анализ ДНК, выделенной из клонов,а также секвенирование.

Вирусология

97

В результате котрансформации клеток E.coli BJ��������������
5183 предварительно наработанной и очищенной ДНК Ad6 и линеаризованнойпо уникальному сайту плазмидой pAdEnds, была получена плазмида
pAd6, содержащая полный геном аденовируса 6-го серотипа.
Для подтверждения встройки ДНК Ad6 в плазмиду pAdEnds былпроведен рестрикционный анализ ДНК, выделенной из клонов.
На основании совпадения теоретической и экспериментальной картин расщепления установлено, что полученная плазмидная ДНК действительно соответствует заявленной плазмидой pAd6, содержащей
полный геном аденовируса 6-го серотипа.
Копия ДНК Ad6, содержащаяся в составе плазмиды pAd6, былапроверена на инфекционность путем трансфекции клеток линии
Ad���������������������������������������������������������
293 с липофектамином. Наблюдалось хорошо выраженное цитопатическое действие, что подтверждает инфекционность копии ДНКAd������������������������������������������������������������
6, содержащейся в ������������������������������������������
pAd���������������������������������������
6. Данный факт говорит об успешном клонировании копии ДНК ������������������������������������������
Ad����������������������������������������
6 в составе плазмидного вектора с сохранением ее инфекционности и возможности использования данного
вектора для создания различных онколитических штаммов Ad6.
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ИНФЕКЦИЙ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ
ТЯЖЕЛУЮ ПЕРИНАТАЛЬНУЮ ПАТОЛОГИЮ
А. В. Демина 1, Г. Д. Акопов 2, В. А. Терновой 1,
А. О. Семенцова 1, Е. В. Чаусов 1ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехно�логии «Вектор» (Кольцово), 2 МУЗ Новосибирский муниципальный
родильный дом № 61Введение: внутриутробная (врожденная) инфекция — инфекционное заболевание плода и новорожденного, при котором инфицирование плода различными возбудителями происходит в антенатальныйили интранатальный периоды. Этиологическим фактором являются

Раздел 298

как вирусы, бактерии, так и простейшие. Своевременное выявление
возбудителя заболевания позволяет проводить этиотропную терапиюи помогает избежать развитие тяжелых патологий органов и систем
ребенка. Таким образом, актуальность проблемы своевременнойи адекватной терапии врожденных инфекций обусловлена не только
возможностью сокращения перинатальных потерь, но и сокращением неблагоприятных отдаленных последствий для здоровья детей.
Материалы и методы: исследованы сыворотки новорожденных,находившихся на лечении в реанимационном отделении Новосибирского муниципального родильного дома № 6 с 2010 г. по 2014 г. РНК/ДНК из клинических образцов выделяли с использованием набора длявыделения РНК/ДНК из сыворотки или плазмы крови (НПФ Литех,Россия). кДНК была получена методом обратной транскрипции с использованием набора Реверта-L (ИЛС, Россия). Все образцы были исследованы методом ПЦР (ИЛС, Россия) на наличие следующих инфекций: Candida spp., HSV I и II, VZV, EBV, CMV, HHV6, HHV7, HHV8,
Toxopl. gondii, HCV, HBV, HAV, HEV, Trep.pallidum, Myc. tuberculosis,
Parvovirus B19, Rubella, Chl. trachomatis, Mycoplasma spp., Ureaplasma
spp., HPV (16, 31, 33, 35), Influenza A, Parainfluenza, Trich. vaginalis,
Neisseria spp., Pneumocystis carinii, а также исследованы на РНК ���Enterovirus (наборы для ПЦР диагностики ФБУН ГНЦВБ «Вектор»,Кольцово, Патент РФ №2459830, Патент РФ №2542968)).
Результаты и обсуждение: исследована 121 сыворотка от новорожденных детей, из них положительными на инфекции оказались 69 сывороток (57 %). В положительных образцах выявлены следующие инфекции: CMV (30,5 %); EBV (20,3 %); HHV6 (11,6 %); HSV I,II (10 %);Enterovirus (10 %); Toxopl.gondii (5,8 %); �����������������������������
Mycoplasma�������������������
spp���������������
������������������
. (5,8 %); Can����dida spp. (3 %); HBV (1,5 %); Ureaplasma spp. (1,5 %) (табл. 1).
Таблица 1
п/п
1
2
3

Инфекции
CMV
EBV
HHV6

Количество больных
21
14
8

Доля, %
30,5 %
20,3 %
11,6 %

99Вирусология

Окончание табл. 1
4
5
6
7
8
9
10

HSV I,IIEnterovirus
Toxopl.gondii
Mycoplasma spp.
Candida spp.
HBV
Ureaplasma spp.

7
7
4
4
2
1
1

10 %
10 %
5,8 %
5,8 %
3%
1,5 %
1,5 %

Наибольшее количество детей с инфекционной патологией былирождены с июля по сентябрь за весь период наблюдения с 2010 по2014 гг. Самое низкое количество новорожденных с инфекционной патологией было отмечено в январе-феврале за тот же период. Герпесвирусные инфекции отмечались у новорожденных в течение всего года.
Выводы: наблюдение в течение 5 лет установило, что наиболее
часто инфекционную перинатальную патологию новорожденных
обуславливают герпесвирусы CMV, EBV и HHV6 (62,4 %). Благодаря
немедленной диагностике детей им своевременно проводилась этиотропная терапия Ацикловиром, в связи с чем предотвращены неблагоприятные последствия для их здоровья.
ВАКЦИНОМИКА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ:ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
О. С. Ермилова, В. А. Белявская
ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор»Вакциномика — новое направление медико-биологических наук,изучающее влияние полиморфизма генов иммунного ответа на неоднородность приобретенного иммунитета и врожденных иммунных
реакций на вакцинацию на индивидуальном и популяционном уровнях. Вакциномика изучает закономерности связей между эффектив-100Раздел 2ностью вакцинации и генотипическими особенностями индивида,привлекая для исследований арсенал самых совершенных методов,приемов, новых высокопроизводительных «-omics»-технологий: протеомики, транскриптомики, метаболомики и др.
Вакцина против натуральной оспы на основе осповакцины является наиболее эффективной из существующих вакцин, применение которой привело к эрадикации этого опаснейшего заболевания в результате
внедрения программы глобальной иммунизации. Сегодня, несмотряна отсутствие очагов инфекции в природе, интерес к данному возбудителю и к разработке вакцин против ортопоксвирусных инфекций неослабевает: США, Франция, Германия, Ю. Корея, проводят активную
иммунизацию военных и гражданских лиц для проведения противоэпидемических мероприятий в случае возрождения вируса в результате
актов биотерроризма или распространения в человеческой популяции
близкородственных вирусов из природных резервуаров. Так же активно разрабатываются и испытываются вакцины 2–3 поколений, т.к.
основным препятствием для применения вакцин 1-го поколения былоналичие сопутствующих серьезных осложнений. Кроме того, сегодня
ортопоксвирусы рассматриваются как перспективный объект для создания рекомбинантных вакцин против бешенства, гриппа, гепатита,туберкулеза, ВИЧ и в терапии онкологических заболеваний.
Для выяснения причин индивидуальных различий в эффективности и безопасности вакцинации зарубежными учеными проводятся
ассоциативные исследования по оценке связи между полиморфизмом генов цитокинов.
Целью нашей работы является выявление взаимосвязи между
полиморфизмом генов цитокинов, участвующих в формировании
клеточного и гуморального иммунного ответов, и особенностями
вакцинального процесса на сибирской популяции с использованием
российской вакцины против натуральной оспы. Результатом такого
изучения станет выявление механизмов, как именно генотипические
особенности индивида реализуются в фенотипические в конкретных
условиях окружающей среды.
В основе работы лежит проспективное изучение когорты лиц, иммунизированных против натуральной оспы по профессиональным

Вирусология

101показаниям, постоянно проживающих на территории новосибирской
области, с возможностью постоянного пополнения когорты. После
получения согласия Этического комитета ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»была создана база данных вакцинированных лиц и банк биологических образцов сывороток и ДНК.
На основании ретроспективного анализа выделены группы, гетерогенные по течению вакцинального процесса, определены индивиды, предположительно являющиеся носителями аллелей генов, проявляющихся фенотипически крайними показателями в течение процесса вакцинации, и, в дальнейшем, показателями приобретенного
гуморального и клеточного иммунитета. Изучение когорты вакцинированных выявило серьезные различия как в клиническом течении
вакцинального процесса, так и в его результатах. Было показано, чтов более чем 80 % случае первичная вакцинация против оспы протекает значительно тяжелее по сравнению с повторной вакцинациейи
сопровождается сильными вакцинальными реакциями (высокая лихорадка, подмышечный лимфадентит, выраженная местная гиперемия и отек и т. д.).
Оценка эффективности сформированного гуморально иммунного ответа по функциональной активности специфических антител в сыворотке крови вакцинированных лиц проведена методом
нейтрализации на культуре клеток Vero. Анализ полученных данных подтверждает, что после первичной вакцинации уровень защитных антител значительно ниже, чем после регулярной вакцинации, а у отдельных лиц не достигает защитного уровня. Изучено
также влияние ряда демографических факторов (пол, возраст первичной и повторных вакцинаций и т. д.) на показатели вакцинного
процесса.
В настоящее время совместно с ФГБНУ «НИИ терапии и профилактической медицины» планируется провести скрининговое
исследование значительного количества образцов сыворотки крови
(более 10 000) из различных возрастных групп, в том числе лиц,вакцинированных в детстве, чтобы определить корреляты исключительной эффективности вакцины, связанной с пожизненной циркуляцией B- и T- клеток памяти. Для проведения этой важной работы

Раздел 2102необходимы скриниигновые экспресс-методы, разработку которыхмы планируем провести с учеными «Вектора» и ряда диагностических фирм.
Эффективность клеточного звена планируется определить с помощью метода ELISPOT с использованием инактивированного вируса
осповакцины и пептидных мимеиков эпитопов для индукции синтеза
цитокинов. Фенотипированние планируется провести методом ПЦРпо конечной точке и в реальном времени генов цитокинов (TNF-α,
ИЛ-10,ИЛ-18, ИЛР-18, ССR5 и др.).
Выявленные ассоциации помогут более полно представить картину взаимодействия многочисленных звеньев иммунитета и возможностей его регулирования, оценить генетическую неоднородностьи различия сибирской популяции в сравнении с мировыми данными.
Полученные данные позволят усовершенствовать вакцины против
натуральной оспы, а также разработать на основе осповакцины более эффективные и безопасные вакцины нового поколения для профилактики социально-значимых заболеваний.
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОГРИППОЗНОЙ АКТИВНОСТИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO
Е. И. Филиппова 1, Г. И. Высочина 2, И. Е. Лобанова 2,
Т. М. Шалдаева 2, Н. А. Мазуркова 1
1ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор», 2 ФГБУН Центральный
сибирский ботанический сад СО РАНВирусы гриппа А являются этиологическими агентами опасных
инфекционных заболеваний человека и животных, способных протекать в форме обширных эпизоотий, эпидемий и пандемий с высокой
смертностью.
Многие эксперты считают, что именно вирус гриппа птиц субтипа
H5N1 является главным претендентом на роль нового пандемическо-Вирусология

103

го штамма в связи с его взаимосвязью со штаммом H1N1, вызвавшим
пандемию в 1918 году.
На сегодняшний день лишь две вирусные мишени используютсядля направленного действия химиопрепаратов. Это, во-первых, белок М2 вируса гриппа, играющий роль ионного канала в вирусной
мембране, который блокирует препараты адамантанового ряда —римантадин и амантадин. Во-вторых, мишенью для лекарственного вмешательства является вирусная нейраминидаза — фермент,необходимый для почкования вирусных частиц и проявления инфекционных свойств вируса, против которой эффективны нейраминидазные ингибиторы занамивир, осельтамивир и перамивир. Обегруппы соединений имеют свои недостатки. В отношении группы производных адамантана можно отметить сравнительно высокую токсичность, узкий спектр действия и быстрое формирование
устойчивости к ним вируса. Для ингибиторов нейраминидазы также характерно формирование резистентности и высокая стоимость
синтеза, что делает эти препараты менее доступными для широкого
использования.
Поэтому в настоящее время особо актуальны исследования,направленные на расширение ассортимента противогриппозных
препаратов. Доступным и дешевым сырьем для производства лечебных средств являются лекарственные растения, которые обладают широким спектром фармакологических свойств и низкой
токсичностью.
Цель исследования — изучение противовирусных свойств растительных экстрактов в отношении вирусов гриппа на лабораторных
животных.
Материалы и методы исследования. Для оценки противовирусной
активности исследуемых образцов мы использовали высокопатогенный штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)
и штамм вируса гриппа человека А/Aichi/2/68 (H3N2), полученныеиз коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
На противовирусную активность нами были исследованы этанольные экстракты монарды дудчатой (Monarda fistulosa L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), репейничка волосистого

104Раздел 2(Agrimonia pilosa Ledeb), полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris)и дербенника иволистного (Lythrum salicaria L.). В качестве референспрепарата использовали Тамифлю (Ф. Хоффманн — Ля Рош Лтд.,Швейцария).
Моделью экспериментальных животных служили аутбредные
мыши ICR массой 14–16 г, полученные из питомника ФБУН ГНЦВБ «Вектор». Мышам перорально вводили экстракты в объеме
200 мкл/гол. Суточная доза образцов составляла 26,6 мкг/г массы
мыши.
Статистическую обработку проводили стандартными методами с помощью пакета прикладных компьютерных программ
“Statistica 6,0”. Сравнение доли выживших мышей в инфицированных группах при введении экстрактов и контроле проводили
по Chi-square (χ2) критерию, а СПЖ животных — по U-критерию
Манна-Уитни.
Результаты исследования. В культуре клеток MDCK был проведен первичный скрининг противовирусной активности 127 экстрактов из 101 вида растений, произрастающих на территории Западной
Сибири, в отношении вирусов гриппа H3N2 и H5N1. Установлено,что этанольные экстракты, обладающие выраженной противогриппозной активностью in vitro, являются нетоксичными для лабораторных мышей и проявляют противовирусное действие в экспериментах
in vivo.
Нами были выявлены критерии защиты животных от вирусной
инфекции — выживаемость, коэффициент защиты и средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей в опыте и контроле после ихзаражения вирусами гриппа человека и птиц. В отношении вируса
гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) достоверное отличие доли выживаемости мышей в опыте относительно контроля отмечалось в группе инфицированных животных, которым вводили экстракт полыни обыкновенной. Экстракт, полученный на основе репейничка волосистого,проявил защитный эффект по всем трем показателям, однако этотэффект был ниже такового для коммерческого противогриппозного
препарата Тамифлю® (табл. 1).

105Вирусология

Таблица 1Противовирусная активность этанольных экстрактов
высших растений в экспериментах на мышах,инфицированных 10 ЛД50 вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2)
по лечебно-профилактической схеме

Группы мышей,получавших
препараты
Монарда дудчатая
Шалфей
лекарственный
Репейничек
волосистый
Дербенник
иволистный
Полынь
обыкновенная
Тамифлю
Контроль (безпрепарата)Показатели выживаемости мышей, зараженных
10 ЛД50 вируса гриппа (n=10)
СПЖ (сут)Количество и ( %)выживших

Коэффициент
защиты (КЗ)

2 (20 %)20 %M ± Sm
8,6 ± 4,00 (0 %)

0%6,4 ± 0,8

4 (40 %)*

40 %

10,6 ± 3,0&0 (0 %)

0%7,4 ± 1,6

4 (40 %)*

40 %10,0 ± 5,2

6 (60 %)*

60 %11,4 ± 3,4&

0 (0 %)-

6,2 ± 1,6

Примечание: коэффициент защиты (КЗ)= % гибели в контроле — % гибели в опыте; * — отличие от контроля по критерию χ2 при p≤0,05;&— отличие от контроля по U-критерию Манна-Уитни при р<0,006;
СПЖ рассчитывали, принимая за максимальный срок жизни выживших животных 16 сут; M — среднее, Sm — стандартное отклонение;n — число животных.

Вотношении
вируса
гриппа
субтипа
A/chicken/
Kurgan/05/2005 (H5N1) достоверный защитный эффект проявили всерастительные экстракты. При этом экстракт, полученный на основе полыни обыкновенной, обладал наибольшим противовирусным
эффектом, который был сравним активностью противогриппозного
препарата Тамифлю® (табл. 2).

106Раздел 2Таблица 2Противовирусная активность этанольных экстрактов высших растений в экспериментах на мышах, инфицированных 10 ЛД50 вируса
гриппа А/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)
по лечебно-профилактической схеме
Показатели выживаемости мышей, зараженных
10 ЛД50 вируса гриппа
Группы мышей,получавших препараты Количество и ( %) Коэффициент СПЖ (сут)выживших
защиты (КЗ)
M ± SmМонарда дудчатая
8 (50 %)*
50 %
12,4 ± 3,9&n = 16
Шалфей лекарственный
8 (50 %)*
50 %
12,4 ± 3,8&n = 16
Репейничек волосистый
4 (40 %)*
40 %13,0 ± 3,1&
n = 10Полынь обыкновенная
6 (60 %)*
60 %13,2 ± 3,7&
n = 10Дербенник иволистный
4 (40 %)*
40 %
12,8 ± 3,1&
n = 10Тамифлю
6 (60 %)*
60 %13,2 ± 3,6&
n = 10Контроль
(без препарата)0 (0 %)
8,0 ± 1,3
n = 10Примечание: коэффициент защиты (КЗ)= % гибели в контроле — % гибели в опыте; * — отличие от контроля по критерию χ2 при p≤0,05;&— отличие от контроля по U-критерию Манна-Уитни при р<0,006;
СПЖ рассчитывали, принимая за максимальный срок жизни выживших животных 16 сут; M — среднее, Sm — стандартное отклонение;n — число животных.

На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что разработка препаратов на основе сырья из лекарственных растений может
оказаться весьма перспективной для борьбы с гриппозной инфекцией.

Вирусология

107Африканская чума свиней: современные
аспекты распространения в РФи странах Восточной Европы
А. С. Иголкин
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»Введение
Африканская чума свиней (болезнь Монтгомери, восточноафриканская лихорадка, Pestis africana suum, АЧС) — природноочаговая вирусная болезнь домашних свиней и кабанов, характеризующаяся лихорадкой, геморрагическим диатезом, дистрофическими, воспалительными и некротическими изменениями внутренних
органов. В соответствии с современной международной классификацией, она включена в список Всемирной организации здравоохранения животных (МЭБ) в категорию «болезни и инфекции свиней»,которые подлежат обязательной декларации. Высокая летальность,отсутствие средств специфической профилактики и необходимость
массового уничтожения заболевших и контактировавших с нимисвиней представляет АЧС, как одну из самых экономически значимых и опасных инфекций. Возбудителем АЧС является сложноустроенный ДНК-содержащий арбовирус семейства Asfariviridae.
В настоящее время учеными идентифицировано 22 генотипа вируса. Штаммы возбудителя различаются по вирулентности (от высоковирулентных до авирулентных), по серологическим и иммунологическим свойствам. Вирус достаточно устойчив во внешней средепри широком диапазоне температур. Восприимчивыми животными
являются домашние свиньи и кабаны. Для человека инфекция неопасна, однако во многих случаях именно антропогенный фактор
является основным в распространении АЧС. В случае переболевания животные остаются практически пожизненными вирусоносителями. До ХХ века традиционной стационарно неблагополучной зоной по АЧС являлись многочисленные страны африканского

108Раздел 2континента. Однако регистрация в 2007 году инфекции в Грузии,масштабное распространение в РФ и появление очагов в странах
Восточной Европы в очередной раз доказали возможности заноса
вируса АЧС в любую страну мира.
Результаты исследованийНа территории Африки стационарно выделяют штаммы вирусаАЧС различных генотипов. В ряде стран, расположенных вдоль атлантического побережья континента, циркулирует возбудитель I���������генотипа, который в ХХ-м веке стал причиной вспышек АЧС в странах Европы и Латинской Америки: Португалия, Испания (1960 г.),Франция (1964 г.), Бельгия, Голландия (1965 г.), Италия, Сардиния
(1967 г.), Куба (1971 г., 1980 г.), Доминиканская Республика, Гаити,Бразилия (1978 г.).
К концу ХХ века (1998 г.) АЧС, обусловленная вирусом II������
��������
генотипа, была занесена на Мадагаскар, где широко распространилась
среди домашних и диких свиней. В 2007 г. она была обнаружена ужев Грузии, а затем быстро распространилась в Армению, Абхазию,Азербайджан, Южную Осетию и Россию.
В РФ впервые вирус АЧС был выделен от обнаруженных на территории Чеченской Республики на границе с Грузией в трупах павших
кабанов разного возраста в ноябре 2007 г. Уже летом и осенью 2008 г.
зарегистрированы очаги АЧС в популяции домашних свиней в Северной Осетии, Ингушетии, а также среди кабанов в Р. КабардиноБалкарии, на территории Ставропольского и Краснодарского краев.
В июле 2008 г. установлен первый «выносной» случай АЧС в Оренбургскую область, граничащую с Республикой Казахстан.
Распространение АЧС по регионам Северо-Кавказского и Южного федеральных округов продолжилось в 2009–2010 гг. Выявлены
вспышки АЧС среди домашних свиней и кабанов в Волгоградскойи Астраханской областях. Отмечен вынос АЧС на территорию Ленинградской области. В 2011–2012 гг. эпизоотическая ситуация по АЧСв стране ухудшилась. Зона распространения болезни охватила территорию 5 федеральных округов: Южного, Северо-Кавказского, Центрального, Приволжского и Северо-Западного. В течение 2007–2014 гг.
неблагополучными по АЧС в России оказались 39 субъектов.

Вирусология

109

За 8 месяцев 2015 г. зарегистрировано 57 вспышек АЧС, в томчисле 25 среди кабанов в Волгоградской, Калужской, Орловской,Ярославской, Саратовской, Владимирской, Рязанской областях и Р.
Кабардино-Балкарье и 25 среди домашних свиней в Брянской, Волгоградской, Курской, Московской, Орловской, Смоленской, Саратовской, Рязанской областях и Краснодарском крае.
Вся информация, начиная с первого случая обнаружения вирусаАЧС на территории Российской Федерации, аналитические обзоры,карты, прогнозы распространения, обсуждения складывающейся
ситуации, представлена в открытом доступе на официальном сайте
Россельхознадзора.
В 2012 г. АЧС официально установлена на территории Украины,в 2013 г. в Республике Беларусь, в 2014 г. в Польше, Литве, Латвиии Эстонии.
Как правило, при заносе инфекции на благополучную территорию
отмечается медленное распространение АЧС («ползучая инфекция»).
Однако в некоторых случаях возможно и скачкообразное распространение вследствие нарушения людьми ветеринарно-санитарных
требований при ведении хозяйственной деятельности, нелегального
перемещения инфицированной продукции свиноводства и свинейна большие расстояния (распространение вдоль транспортных магистралей, вокруг воздушных и транспортных узлов). В ряде случаевот первых фактов гибели животных, остающихся вне подозрения,до массового падежа проходит 1,5–3 месяца.
К распространению инфекции в РФ привели ряд факторов:– недооценка опасности АЧС хозяйствующими субъектами и населением;– нарушение ветеринарно-санитарных правил;– незаконный оборот животных и продукции свиноводства;– скармливание свиньям необезвреженных пищевых отходов;– сокрытие фактов заболевания и гибели животных;– низкий уровень биологической защиты свиноводческих объектов от заноса возбудителя АЧС;– несоблюдение правил по утилизации биологических отходов;– недостаточность правовой базы для решения перечисленных
проблем.

110Раздел 2Разработанный МСХ РФ «Актуализированный план мероприятийпо предупреждению распространения и ликвидации вируса африканской чумы свиней на территории Российской Федерации» (утв.
25 октября 2012 г.) включает меры, подлежащие реализации различными структурами на всей территории РФ.
Ситуация по АЧС в странах Европейского СоюзаЗа прошедшее чуть более 1,5 года с момента первого официально
нотифицированного случая АЧС в начале 2014 года в Европе зарегистрировано более 700 очагов АЧС, что сопоставимо с количеством
очагов за 8 лет эпизоотического неблагополучия России. Сегодняв прибалтийских странах (Эстония, Латвия, Литва) сформировалась
стационарно инфицированная по АЧС зона.
Несмотря на повсеместную декларацию предпринимаемых действий на различных официальных и неофициальных уровнях, включающих: контроль над природным резервуаром (дикие кабаны), стемпинг аут, карантин, контроль передвижения восприимчивого поголовьяи зонирование, в странах восточной Европы практически ежедневно
регистрируют возникновение новых очагов инфекции не только среди
кабанов, но и в фермерских и коммерческих хозяйствах. Это указывает на укоренение заболевания и повышения риска к распространениюна пока благополучные территории (Чехия, Германия, Австрия).
Особую озабоченность РФ вызывают очаги инфекции возникающие в 2015 году в Латвии и Эстонии. Проведенный анализ российскими учеными показал высокий риск реинтродукции вируса в Псковскую и Ленинградскую области РФ, где расположен ряд крупных
свиноводческих предприятий. Обширное распространение вирусав Литве угрожает благополучной (на 12.08.2015 г.) Калининградской
области.
В Литве заболевание первоначально установлено 24 января
2014 года. За весь период наблюдения на 19.08.2015 г. установлено
116 очагов, из них в этом году сообщено о 68 вспышках АЧС в популяции дикого кабана и домашних свиней. В июле 2014 г вспышка
инфекции обнаружена на ферме, принадлежащей компании Idavangв Игналинском районе. В ходе проведения ликвидационных мероприятий уничтожено более 20000 голов свиней.

Вирусология

111

В Польше заболевание впервые установлено феврале 2014 года.
За весь период наблюдения зафиксировано 78 вспышки инфекции.
За 2015 год — 46 вспышки, из которых 45 в популяции дикого кабанана территории Подлядского воеводства.
В Латвии согласно данным МЭБ первый случай установлен
16 июля 2014 года, когда было сообщено о 3 павших диких кабанах
найденных возле границы с Беларусью, в этот же день АЧС установлена у 3 домашних свиней из личного подсобного хозяйства. За весьпериод наблюдения сообщается о 532 очагах заболевания. 38 вспышек болезни произошли среди домашних животных, 494 — среди
диких кабанов. В 2015 году выявлены случаи заболевания домашних
свиней АЧС: в Даугавпилсском (3 очага), Циблском (1 очаг) и Алойском (2 очага) краях.
Официально Эстония о первой вспышке заболевания впервые сообщило 2 сентября 2014 года, когда был обнаружен труп дикого кабана. Всего за этот период страной нотифицировано 193 очага АЧС. Болезнь выявлена на территории 11 уездов (IDA-VIRU, JÄRVA, JÕGEVA,
L�����������������������������������������������������
ÄÄ���������������������������������������������������
NE�������������������������������������������������
-������������������������������������������������
VIRU��������������������������������������������
, ������������������������������������������
P�����������������������������������������
Ä����������������������������������������
RNU�������������������������������������
, PÕLVA, RAPLA, TARTU, ��������������VALGA���������
, �������VILJANDI���������������������������������������������������������������
, �������������������������������������������������������������
V������������������������������������������������������������
Õ�����������������������������������������������������������
RU���������������������������������������������������������
). В 2015 году случаи заболевания свиней АЧС на коммерческих фермах отмечены в уездах: VILJANDI, JÄRVA, JÕGEVA, TARTU,
V�����������������������������������������������������������������
Õ����������������������������������������������������������������
RU��������������������������������������������������������������
(8 очагов) и в личных подсобных хозяйствах на территории уездов VALGA, VILJANDI и ����������������������������������������
L���������������������������������������
ÄÄ�������������������������������������
NE�����������������������������������
-����������������������������������
VIRU������������������������������
(4 очага). Остальные 165 случаев заболевания диагностированы у диких кабанов.
По официальным данным ФАО, численность кабанов на территории Европы достигает 4,5 млн. особей. Высокая плотность поголовья
этих животных на территории континентальной Европы не только
усложняет контроль и искоренение инфекции, а также являться вектором прогрессии географического распространения АЧС как в западном, так и в восточном направлении.
Не стоит оставлять без внимания и резко ухудшившуюся в 2015 ситуацию по АЧС на Украине.
По данным МЭБ за период с 30.07.2012 г. по 21.07.2015 г. на территории Украины выявлено 28 очагов АЧС. Из них 19 — среди домашних животных и 9 — среди диких. В конце июля этого года инфекция поразила самый крупный свиноводческий комплекс УкраиныООО «Калита», на котором уничтожено более 60 тыс. голов свиней.

112Раздел 2Сложная на сегодняшний день экономическая ситуация в стране
существенно осложняет контроль за выполнением противоэпизоотических мероприятий при возникновении очагов инфекции, не может
гарантировать контроль и не распространения в западные регионы
страны и далее на территорию балканских стран, где популяция дикого кабана многочисленна.
ЗаключениеПо мнению российских ученых и компетентных служб однойиз основных проблем распространения АЧС в странах Европы является использование ветеринарными службами стран-членов ЕС«мягких» подходов к купированию очагов инфекции, проведению
ликвидационных и профилактических мероприятий, включающих
регулирование численности дикого кабана, тем самым создавая достаточную буферную зону между благополучными и неблагополучными регионами.
ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОСЛЕ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С СУБСТРАТОМ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
О. В. Иунихина 1, Н. В. Рева 2
1Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Научно-исследовательский институт эпидемиологиии микробиологии имени Г. П. Сомова», 2 Дальневосточный
федеральный университет

Хантавирусы (род Hantavirus, семейство Bunyaviridae) являются возбудителями зоонозных, природно-очаговых инфекций, таких как хантавирусный легочный синдром (ХЛС) в Новом Свете и геморрагическая
лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) на евразийском континенте.
Самой многочисленной группой, среди инфицированных хантавирусами, мелких млекопитающих являются мышевидные грызуны.
Попадая в окружающую среду с экскретами природных хозяев хантавирус способен сохраняться в течение определенного времени, неВирусология

113теряя инфекционности, что определяет воздушно-пылевой путь заражения людей. Так, например, вирус Puumala сохранял свои биологические свойства при комнатной температуре в подстилке, зараженной
выделениями грызунов в течении 2-х недель [1]. В отношении сохранения инфекционности вируса Hantaan, при экспериментальном исследовании во влажных условиях, отмечалась зависимость от температуры: более высокая температура окружающей среды снижала выживаемость хантавируса. Вирус сохранял инфекционность при +4˚Св течение 96 дней, при +20˚С этот период сокращался до 9 дней [2].
Вирусы, в том числе хантавирусы, находящиеся во внешней среде,вне чувствительного организма подвергаются воздействию комплекса абиотических и биотических факторов, которые могут изменятьих биологические свойства.
В ходе предыдущих исследований была установлена способность
хантавируса адсорбироваться на разнообразных субстратах внешней
среды с последующей десорбцией белоксодержащим раствором нейтральной pH [3].
Цель работы — показать изменение биологических свойств хантавируса после взаимодействия с субстратами внешней среды приэкспериментальной хантавирусной инфекции in vivo.
Материалы и методы. В качестве модели экспериментальной
хантавирусной инфекции использовали беспородных белых мышей в возрасте 24–48 ч. Опытную группу животных заражали in cerштаммом Аа 6034379-95 вируса Hantaan�����������������������������
������������������������������������
, геновариант ���������������
Far������������
�����������
East�������
, полученного после адсорбции хантавируса на луговой почве и инкубации
при 4°С в течении 7 дней с последующей десорбцией белоксодержащим раствором (5 % БСА на ФСБ pH 7,2). Полученный элюат до заражения животных пассировали в течение 2 пассажей на культуре
клеток Vero E6 для накопления инфекционного вируса. Контрольную
группу животных заражали вируссодержащей жидкостью нативного
Аа 6034379-95. Дозы при заражении и титр вирусов были одинаковы
(0,001 мл и 4,4 ФОЕ/мл соответственно).
РезультатыВ результате исследования было показано, что в контрольной
группе животных к с 17 дня наблюдались первые признаки экспе-114

Раздел 2риментальной хантавирусной инфекции, характерные для данной
модели: вялость, взъерошенность шерсти, потеря в массе, атаксия.
Затем присоединялись парезы задних лап, переходящие в параличи,агония. Смертность среди животных данной группы составила 100 %на 20 сутки после инфицирования. В мозге погибших животных обнаруживался хантавирус в титре 1-2 �����������������������������
lg���������������������������
ФОЕ/мл. Данные эксперимента соответствовали наблюдениям других исследователей [4]. В опытной группе (1 пассаж) (хантавирус после адсорбции) все животные
оставались клинически здоровы до 40 дня наблюдения, однако у сосунков мышей, выведенных из опыта на 20 день в мозге также обнаруживался хантавирус в титре 1-2 lg ФОЕ/мл. При последовательном
заражении этой суспензией мозга другой группы неинфицированных
новорожденных белых мышей (����������������������������������
in��������������������������������
�������������������������������
cer����������������������������
, 2 пассаж) животные оставались клинически здоровы до 40 дня наблюдения. Аналогичная картина наблюдалась при 3 пассаже. Инфекционный хантавирус в мозге
определялся только на 20 день у животных на втором пассаже и отсутствовал на всем протяжении эксперимента в последующем.
Также установлено, что, несмотря на снижение вирулентностидо полного ее отсутствия, у хантавируса после взаимодействия с субстратом внешней среды, на модели внутримозгового заражения новорожденных белых мышей, способность вызывать выработку специфических антител сохранялась на протяжении двух пассажей, хотя и отмечено более позднее антителообразование. Так на первом пассаже
(на 30 день наблюдения среднее значение титра анти-хантавирусных
антител в крови составило 1:56, на 40- 1:60), по сравнению с контролем (к 17–20 — 1:22,8). На втором пассаже анти-хантавирусные
антитела обнаруживались только на 20 день после инфицирования
у 71,4 % животных, среднее значение титра составило 11,4, на третьем пассаже отсутствовали на всем протяжении эксперимента.
Таким образом, обнаружено снижение вирулентности хантавируса
варианта Far East после взаимодействия с субстратами внешней среды до полной ее потери при пассировании на модели внутримозгового
заражения белых мышей в возрасте 24–48 ч. при сохранении способности вызывать выработку специфических антител на протяжении
двух пассажей. Полученные результаты могут свидетельствовать о не-Вирусология

115гативном воздействии некоторых факторов окружающей среде, способствующих селекции высоко- и низковирулентных клонов вирусной
популяции, что может лежать в основе цикличности эпизоотическогои эпидемического процессов при хантавирусной инфекции.
Список литературы
1. Kallio E. R., Klingstrom J., Gustafsson E., Manni T., Vaheri A.,
Henttonen H., et al. Prolonged survival of Puumala hantavirus outside
the host: evidence for indirect transmission via the environment // J. Gen.
Virol. 2006.Vol. 87.P. 2127–2134.
2. Hardestam J., Simon M., Hedlund K. O., Vaheri A., Klingstrom J.,
Lundkvist A. Ex vivo stability of the rodent-borne Hantaan virus in comparison to that of arthropod-borne members of the Bunyaviridae family //App. end environmental microbial.2007.Vol. 73, No. 8.P. 2547–2551.
3. Иунихина О. В. Вирусолого-эпизотологическое обоснование
воздушнопылевого пути заражения хантавирусом: автореф. дис.
канд. мед. наук Владивосток2010.
4. Компанец Г.Г. Биологические свойства хантавирусов, циркулирующих в Приморском крае // Тихоокеанский медицинский журнал
2008.№ 2(32). С. 61–64.
ISOLATION OF INFLUENZA A VIRUSES FROM WILD BIRDS
IN CENTRAL KAZAKHSTAN IN 2004–2013
Ye. T. Kasymbekov, K. Kh. Zhumatov, M. Kh. Sayatov,
A. I. Kydyrmanov, K. O. Karamendin, S. E. Asanova, K. D. Daulbayeva
Institute of Microbiology and Virology, 103 Bogenbai batyr St. 050010,
Almaty, Kazakhstan
Background. Wild birds populations are natural niche and gene poolof all varieties of influenza A viruses. Influenza A/H5 viruses represent
highly pathogenic group of agents while H3 subtype viruses are the mostcommon in Orthomyxoviridae family, and infect humans, birds, and somemammals. This makes Kazakhstani isolates of these pathogens subject interesting for further research.

116Раздел 2

Methods. Virus isolation was performed by inoculating each sampleof the material in the allantoic cavity of 10–11-day-old chick embryos. To
establish relatedness of hemagglutinating agents to influenza A viruses
RT-PCR was used with primers to the M gene. Viral RNA was extractedusing QIAamp Viral RNA Mini Kit. Reverse transcription was performed
with AMV reverse transcriptase with primers Uni 12 (agcaaaagcagg).
Amplification of cDNA was performed using primers recommended forsequencing the genome segments of influenza A viruses. After purification, the PCR products were sequenced on an ABI 3730xl DNA analyser(Applied Biosystems).
Phylogenetic trees were generated using the Neighbour-joining method, and the Tamura-Nei model with 500 bootstrap replicates in MEGA
5.0 software.
Results. During the period of 2004–2013 in Central Kazakhstan
804 probes from 784 wild waterfowls belonging to eight families of fourorders were collected. 32 influenza A viruses were isolated from cloacal
swabs, seven were identified as H3N6 viruses, 14 as H3N8, two as H4N6,
and nine as N5N3 viruses. Viruses were allocated mainly from representatives of Anseriformes, except for two which were derived from Charadrii�
formes.
Members of Н3 subtype were isolated from mallard (Anas platyrhyn�chos), pintail (Anas acuta), garganey (Anas querquedula), green-winged
teal (Anas crecca), common tern (Sterna hirundo), graylag goose (Anser
anser), common shelduck (Tadorna tadorna), common gull (Larus canus),
red-crested pochard (Netta rufina) and eurasian wigeon (Anas penelope).
Н4N6 viruses were allocated from ruddy shelduck (Tadorna ferrug�inea) and green-winged teal.
In 2009 nine viruses with Н5N3 antigenic composition were isolated
from wild geese (graylag goose, greater white-fronted goose — Anser al�bifrons, lesser white-fronted goose — Anser erythropus). Sequencing ofНА��������������������������������������������������������������������
, M, NP and NS genes of this viruses showed their phylogenetic relationship with Western strains of this subtype.
Conclusions. Wild avifauna in Central Kazakhstan represents one of
the centers of dissemination in Eurasia of influenza A subtype H3, H4 andH5 viruses, belonging to various phylogenetic clusters.

Вирусология

117ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК
БАКТЕРИОФАГА AP22 МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ
Д. В. Корнеев 1, А. В. Попова 2ФБУН Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор», 2 ФБУН Государственный научный
центр прикладной микробиологии
1Атомно-силовой микроскоп позволяет осуществлять манипуляцию одиночными наноразмерными частицами и исследовать их механические характеристики. Данный метод называется атомно-силовой
спектроскопией и широко применяется в исследованиях различных
биологических объектов.
Бактериофаг AP22 принадлежит к семейству Myoviridae, имеет
икосаэдрическую головку диаметром около 65 нм и сокращающийся
хвостовой отросток длиной 85–90 нм. Аппарат адсорбции данного
бактериофага состоит из базальной пластинки диаметром 22–23 нми хвостовых фибрилл.
Для проведения измерений одиночный вирион необходимо зафиксировать на острие зонда атомно-силового микроскопа. Использовали зонды CSG01/Au производства NT-MDT (Россия), изготовленныеиз кремния и покрытые слоем золота, который обеспечивает проводимость и позволяет использовать их в качестве электродов. Длядостижения селективности при сорбции вирионов использовали эффект положительного диэлектрофореза в 0,3 М растворе сахарозыпри частоте электрического поля 1.75 МГц.
После силовых измерений зонды визуализировали методом просвечивающей электронной микроскопии (JEM 1400, Jeol, Япония)с использованием специального держателя чипа. Учитывались результаты лишь тех измерений, после которых на острие зонда удавалось обнаружить фрагменты вириона.
В результате обработки полученного массива силовых кривых припомощи программного пакета ForceReader собственной разработки,были получены следующие величины, характеризующие взаимо-Раздел 2118действие бактериофага AP22 с поверхностью модельной микробной
пленки:Амплитуда сокращения хвостового отростка: 34 ± 8 нмПик амплитуды силы при отрыве вириона от поверхности:18 ± 6 нН.
Впервые осуществлено прямое механическое измерение амплитуды сокращения хвостового отростка бактериофага.
Список литературы
1. D. Alsteens, E. Pesavento, G. Cheuvart,at al. / Controlled manipulation of bacteriophages using single-virus force spectroscopy, ACS Nano,
2009, 3(10), pp. 3063–3068.
2. E. V. Dubrovin, A. V. Popova, S. V. Kraevskiy at al., Atomic force
microscopy analysis of the acinetobacter baumannii bacteriophage
AP22 lytic cycle / PLOS ONE, 2012, 7(10), pp. 1–9.
3. H. A. Pohl / Dielectrophoresis, Cambridge University Press, Cambridge, 1978.
4. Корнеев Д. В. / Наука из первых рук, 2014, Т. 57–58, № 3–4,
С. 182–187.
ВИРУСИНГИБИРУЩИЕ СВОЙСТВА ЭКСТРАКТОВ
ЛИШАЙНИКА CETRARIA ISLANDICA
В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГРИППА А
Е. В. Макаревич 1, М. О. Скарнович 1,
Н. В. Седельникова 2, Н. А. Мазуркова 1ФБУН Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор», 2 ФГБУН Центральный сибирский
ботанический сад СО РАН1Вирус гриппа является единственным вирусом, способным вызвать пандемию в современном мире и поражающий в период сезонных вспышек эпидемий до 20 % населения планеты. В дополнениек вакцинации, как основной стратегии борьбы с гриппом, ВОЗ реко-Вирусология

119мендовано применение противовирусных этиотропных химиопрепаратов, подавляющих размножение вируса и направленных на определенную вирус специфическую мишень в его цикле. На сегодняшний
день в мире для лечения и профилактики гриппа применяется двегруппы таких препаратов, отличающихся по мишеням и механизму
действия в жизненном цикле вируса гриппа: это препараты адамантанового ряда и ингибиторы нейраминидазы.
В последнее десятилетие в мире наблюдается повышенный интерес к препаратам, в том числе и противовирусным, на основе соединений природного происхождения, что обусловлено низкой токсичностью таких лекарственных средств.
Одним из перспективных видов растительного сырья для разработки новых лекарственных препаратов являются лишайники.
Лишайники содержат вещества, которые не встречаются в других
растениях: лишайниковые кислоты, лихенин, изолихенин, эвернини другие, которые обладают выраженной антимикробной активностью. Среди огромного разнообразия лишайников особый интерес
представляет Цетрария исландская, как наиболее сложный в химическом отношении вид, на основе которого созданы антибиотические препараты.
Целью данной работы было изучение противовирусных свойстви механизма действия водного и этанольного экстрактов Цетрарии
исландской в экспериментах ������������������������������������
in����������������������������������
���������������������������������
vitro����������������������������
. Нами были исследованы токсические и противовирусные свойства водного и этанольного экстрактов лишайника Cetraria islandica в культуре клеток MDCK.
В работе были использованы вирус гриппа птиц — штамм A/
chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и вирус гриппа человека — штамм A/
Aichi/2/68 (H3N2). Штаммы вируса гриппа и культура клеток былиполучены из коллекций ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Установлено, что растительные экстракты малотоксичны длякультуры клеток MDCK�������������������������������������������
�����������������������������������������������
. После изучения токсического действия экстрактов в культуре клеток была исследована противовирусная активность этих образцов в отношении вируса гриппа А в экспериментах
in vitro. Оценка противовирусного действия экстрактов в отношении
вируса гриппа проводилась разными методами.

120Раздел 2В первой серии экспериментов оценивалась способность экстрактов
защищать клетки от цитопатогенного действия вируса гриппа. Противовирусную активность растительных экстрактов определяли в инфицированных вирусом гриппа культурах клеток MDCK, в которые вносили
разные концентрации экстрактов за 24 ч до заражения клеток вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) или A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)
и в момент их заражения (множественность заражения составляла
0,1 ТЦД50/кл.). Противовирусную эффективность экстрактов определяли по их способности защищать клетки ����������������������
MDCK������������������от цитопатогенного действия вируса в сравнении с контрольными инфицированными
культурами (без экстракта). Водный экстракт Цетрарии исландской,внесенный за 24 ч до заражения клеток вирусом, частично (доля защищенных клеток 30,0 %) защищал клетки только от патогенного
действия вируса гриппа A������������������������������������������
�������������������������������������������
/�����������������������������������������
Aichi������������������������������������
/2/68(������������������������������
H�����������������������������
3����������������������������
N���������������������������
2), в то время как этанольный экстракт этого же лишайника, внесенный на культуру клеток также за 24 ч до их инфицирования, более эффективно защищал клеткиот гибели, индуцированной и вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2)(доля защищенных клеток 49,2 %), и вирусом гриппа птиц A/chicken/
Kurgan������������������������������������������������������������
/05/2005 (��������������������������������������������������
H�������������������������������������������������
5������������������������������������������������
N�����������������������������������������������
1) (доля защищенных клеток 50,9 %). Таким образом, наибольшим противовирусным эффектом в этих условиях обладал
этанольный экстракт цетрарии исландской — в концентрации 80 мкг/мл он был способен защитить от патогенного действия штаммов A/
chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2). При внесении
растительных экстрактов в момент инфицирования клеток вирусом
гриппа ����������������������������������������������������������
A���������������������������������������������������������
/��������������������������������������������������������
Aichi���������������������������������������������������
/2/68 (��������������������������������������������
H�������������������������������������������
3������������������������������������������
N�����������������������������������������
2) также наблюдали противовирусную активность экстрактов. В этом случае обнаружен противовирусный эффектдля этанольного экстракта Цетрарии исландской (доля выживших клеток составила 40,5 %). В аналогичном эксперименте с вирусом другого
субтипа (������������������������������������������������������
H�����������������������������������������������������
5����������������������������������������������������
N���������������������������������������������������
1) наибольшим противовирусным действием также обладал образец этанольного экстракта Цетрарии исландской. При внесении экстрактов на клетки MDCK в момент их инфицирования вирусом
гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) этот раствор экстракта
защищал более 70 % клеток MDCK в концентрации 80 мкг/мл.
В дальнейшем была изучена зависимость ингибирования репродукции вируса гриппа (доза инфекции — 100 ТЦД50) в клетках

Вирусология

121

от концентрации растворов экстрактов. Полное ингибирование репродукции вируса гриппа A/H5N1 с индексом нейтрализации (ИН),равным 5,1 lg����������������������������������������������������
������������������������������������������������������
, наблюдалось при концентрациях экстрактов в растворе, значительно более низких, чем их максимально переносимые концентрации для клеток MDCK�������������������������������������
�����������������������������������������. В аналогичных экспериментах с вирусом гриппа другого субтипа — A/H3N2 установлено, что для водного
экстракта Цетрарии исландской вирусингибирующий эффект былнезначительным (ИН = 1,5 lg), в то время как, ингибирование репродукции вируса гриппа под влиянием этанольного экстракта этого желишайника было значительно выше (ИН = 3,0 lg).
Следующим этапом наших исследований была попытка изучения механизма действия экстрактов на репродукцию вируса гриппав культуре клеток MDCK. Это исследование показало, что в целом
растворы экстрактов оказывают выраженное ингибирующее действие на размножение вируса гриппа А. При этом снижение продукции вируса гриппа А/Aichi/2/68 (H3N2) происходит под действием
этанольного экстракта в течение 0–6 ч (через 3, 6 ч после заражения), а под действием водного экстракта — в течение 0–24 ч (через
3, 6 и 24 ч после заражения), есть основания полагать, что данные
образцы экстрактов влияют на стадию репликации вируса гриппа
человека. Для вируса гриппа A/H5N1 установлено, что снижение
продукции данного вируса происходит только под влиянием этанольного экстракта Цетрарии исландской при внесении экстракта за 1 ч.
до заражения клеток вирусом и в течении 0–6 ч. после заражения. (за1 ч до заражения, через 1, 3, 6 ч после заражения), что дает основания
предполагать о влиянии данного образца экстракта, как на стадию
адсорбции, так и на стадию репликации данного вируса.
Различие в ингибировании репродукции двух штаммов вируса
гриппа под действием образцов исследуемых экстрактов может бытьсвязано с разными вирусными мишенями для экстрактов.
Таким образом, обнаружение противовирусной активности экстрактов Цетрарии исландской делает перспективным данный растительный объект для дальнейшего изучения и разработки на его основе препаратов против гриппа.

122Раздел 2ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ВИРУСА ГРИППА
ПТИЦ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ САХАВ. Ю. Марченко, И. M. Суслопаров, Н. И. Гончарова, Н. П. Колосова,А. В. Шиповалов, Т. Н. Ильичева, А. Г. Дурыманов, А. Б. Рыжиков
ФБУН Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор»Высокопатогенные вирусы гриппа субтипа H5 способны вызывать масштабные эпизоотии в популяциях домашних птиц, наносит
существенный экономический ущерб и является угрозой для здоровья человека[1, 9]. Вспышки высокопатогенного вируса гриппа птицрегистрируются по сей день, в 2014 году наблюдалось широкое распространение вируса гриппа субтипа H5N8 в Европе и Азии, чтоставит мировое сообщество перед вопросом о возникновении нового
субтипа вируса гриппа с пандемическим потенциалом.
Настоящее исследование посвящено изучению штамма вируса гриппа A/wigeon/Sakha/1/2014 (H5N8), выделенного от дикой
утки в октябре 2014 года в ходе мониторинга гриппа птиц в северовосточной части Российской Федерации. Всего за 2014 г. на территории Республики Саха (Якутия) было собрано 835 образцовот птиц.
Штамм A/wigeon/Sakha/1/2014 (H5N8) был выделен из трахеи
свиязи (Anas penelope), добытой на территории поселка Белая Горав Республике Саха (Якутия). Штамм хорошо культивируется в 10-идневных развивающихся куриных эмбрионах и обладает высокой
степенью репродукции, показывая высокий титр вируса в аллантоисной жидкости. В реакции гемагглютинации максимальный титр вируса составил 5120 ГАЕ/мл. При титровании на РКЭ инфекционный
титр вируса составил 6,2 lg ЭИД50. Антигенные свойства штамма исследованы в РТГА [1] с сыворотками и антигенами штаммов вируса
гриппа субтипа H5 различных клад, полученными во ФБУН ГНЦ ВБ«Вектор». Штамм A/wigeon/Sakha/1/2014 (H5N8) не взаимодействует

Вирусология

123

с большинством из исследованных антисывороток, кроме сывороткик штамму A/Common gull/Chany/2006 (H5N1).
С целью определения пандемического потенциала штамма A/
wigeon/Sakha/1/2014 (H5N8) были определены количественные
показатели инфекционности и вирулентности для лабораторных
мышей. Величина 50 %-ной инфекционной дозы (ID50) при интраназальном заражении мышей линии Balb/c составила 2,9 lg EID50.
Летальная доза (LD50) для мышей составила 4,1 lg EID50, что указывает на наличие вирулентности исследуемого штамма для млекопитающих [4].
Был проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов
гемагглютинина и нейраминидазы. Последовательности депонированы в базе данных GISAID (EPI553349, EPI553350).
Анализ нуклеотидной последовательности гемагглютинина выявил наличие сайта протеолитического расщепления ����PLRERRRKRGLF���������������������������������������������������
, что является признаком высокой патогенности штамма для птиц [1].
Филогенетический анализ показал высокую степень гомологии
генов HA������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������и ���������������������������������������������������
NA�������������������������������������������������
штамма A/wigeon/Sakha/1/2014 (������������������
H�����������������
5����������������
N���������������
8) с нуклеотидной последовательностью штаммов Евразийской линии, выделенныхв Юго-восточной Азии от домашней птицы.
Анализ первичной структуры гемагглютинина выявил 1 мутацию, расположенную в сайтах связывания антител, что указываетна антигенный дрейф гемагглютинина Н5 по отношению к ранее
выделенным вариантам. Мутация A201E встречается только одинраз в штамме A/chicken/Egypt/Q1769B/2010(H5N1), выделенномв Египте в мае 2010 года. В гене NA найдено 2 мутации A190T
и G271R, которые отличают его от консенсусной последовательности гена N8, и, возможно, мутация G271R может влиять на резистентность к ингибиторам нейраминидазы. Однако, результаты
наших исследований активности нейраминидазы штамма A/wigeon/
Sakha/1/2014 (H5N8) в присутствии препаратов занамивир и озельтамивир показали, что 50 % ингибирующая доза препарата озельтамивир составила 0,1 nM, занамивира — 0,05 nM, что по критериямВОЗ позволяет отнести этот штамм к разряду высокочувствитель-124Раздел 2ных к ингибиторам нейраминидазы. Полученные данные имеют
важное значение для оценки возможного пандемического риска
циркулирующего вируса гриппа A(H5N8).
Территория Республики Саха является регионом, играющим важную роль в экологии вируса гриппа. Данный регион располагаетсяна пересечении нескольких пролетных путей диких птиц. На территории республики обитает более 300 видов диких птиц, из которых около 220 являются мигрирующими [9]. Это указывает на широкие территориальные связи различных видов птиц, в частности,водоплавающих, которые являются основным резервуаром вируса
гриппа птиц [9]. Выделение штамма A/wigeon/Sakha/1/2014 (H5N8)
в России, очевидно, указывает на его распространение мигрирующими дикими птицами из Юго-Восточной Азии. Также он, предположительно, был занесен в 2014–2015 гг. в Европу и Северную
Америку в результате приполярной миграции птиц [6, 7]. Вспышки высокопатогенного вируса гриппа птиц на территории России
регистрируются с 2005 года [5], однако, не все они имели массовый характер. Хронология и характер вспышек высокопатогенного
вируса H5N8 в Юго-Восточной Азии, Европе, Северной Америкеи появление его на территории России ставит мировое сообщество
перед вопросом о возникновении нового субтипа вируса гриппас пандемическим потенциалом, и, возможно, указывает на способность перелетных птиц к переносу гриппа из Юго-Восточной Азиив Европу, используя приполярный путь миграции через Российское
побережье Северного Ледовитого океана. Эта гипотеза также подтверждается исследованиями Verhagen J. H. с соавт. и Ip H. S. с соавт. [3, 6, 7].
На сегодняшний день не зарегистрировано ни одного случая заражения человека вирусом гриппа H����������������������������
�����������������������������
5���������������������������
N��������������������������
8, но результаты наших исследований, указывающие на его инфекционность и вирулентностьдля млекопитающих, а также на его генетическую близость со штаммами, выделенными в Юго-Восточной Азии и в Западной Европе,подчеркивают важность принятия своевременных мер по контролюнад распространением вируса гриппа птиц на территории Сибирии Дальнего Востока.

Вирусология

125Список литературы
1. Alexander D. J. A review of avian influenza in different bird species.
Vet. Microbiol. 2000. V. 74. P. 3–13.
2. Hoffmann E., Stech J., Guan Y. et al. 2001. Universal primer set
for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch. Virol.
146:2275–2289.
3. Ip H. S., Torchetti M. K., Crespo R. et al. Novel eurasian highly
pathogenic avian influenza a h5 viruses in wild birds, Washington, USA,2014.Emerg Infect Dis. 2015 May;21(5):886–90.
4. Maines T. R., Lu X. H., Erb S. M. et al. Avian
��������������������������
Influenza (H5N1) Viruses Isolated from Humans in Asia in 2004 Exhibit Increased Virulencein Mammals. J Virol. 2005 Sep; 79(18): 11788–11800.
5. Sharshov K., Romanovskaya A., Uzhachenko R. et al. Genetic
and biological characterization of avian influenza H5N1 viruses isolated
from wild birds and poultry in Western Siberia. Arch Virol. 2010. 155(7):1145–1150.
6. Verhagen J. H., Herfst S., and Ron A. M. Fouchier. Wild birds may
spread the H5N8 virus. Science 6 February 2015: Vol. 347. Issue 6222.
616-617.
7. Verhagen J. H., van der Jeugd H. P., Nolet B. A. et al. Wild bird surveillance around outbreaks of highly pathogenic avian influenza A(H5N8)
virus in the Netherlands, 2014, within the context of global flyways. Euro
Surveill. 2015;20(12):pii=21069.
8. Vladimirtseva M. V., Germogenov N. I. Birds of Yakutia: Fauna Diversity, Ecology, Role in Ecosystems and Human Life. J Biodivers Endanger Species.2013: 1:114.
9. Webster R. G., Bean W. J., Gorman O. T. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol. Rev. 1992. 56:152–179.

126Раздел 2оценка фармакодинамических и фармакокинетических показателей противооспенного ХИМИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ НИОХ-14
О. Ю. Мазурков 1, А. С. Кабанов 1, М. О. Скарнович 1,
Н. И. Бормотов 1, М. А. Скарнович 1, О. А. Серова 1,
Л. Н. Шишкина 1, А. А. Черноносов 2Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», 2 ФГБУН
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук1Актуальность. После завершения программы «глобальной ликвидации оспы» на Земле благодаря массовой иммунизации населения и отмены вакцинации против оспы в 1980 году, в мире сложилась опасная ситуация, когда более половины людей на планетене имеет иммунитета против ортопоксвирусных инфекций. Ортопоксвирусы могут вызывать у людей спектр заболеваний в широком диапазоне клинических проявлений: от серьезных диссеминированных повреждений в случае заражения вирусом натуральной
оспы (ВНО) до локальных повреждений при инфекции, вызванной
вирусом оспы коров. Более того, в настоящее время существует угроза возникновения оспы, поскольку невозможно исключить
наличие нелегального хранения ВНО и преднамеренного использования против населения природных или рекомбинантных штаммов ВНО и вируса оспы обезьян (ВОО) в качестве биологического
оружия. Недавно в США был разработан противооспенный препарат ST-246 (4-трифторметил-N-(3,3a,4,4a,5,5a,6,6a-октагидро-1,3диоксо-4,6-етеноциклопроп[f]изоиндол-2(1H)-ил)-бензамид).
При этом наиболее полное исследование противовирусной эффективности ST-246 было проведено на модели летальной инфекции
мышей вирусом эктромелии (ВЭ), который является естественным
патогеном для мышей и вызывает у них генерализованное заболева-Вирусология

127

ние, называемое мышиной оспой, аналогичное оспе у человека. Совместно с Новосибирским институтом органической химии Сибирского отделения Российской академии наук (НИОХ СО РАН) намибыло получено новое химическое соединение НИОХ-14 (7-[N`-(4трифторметилбензоил)-гидразинокарбонил]-трицикло[3.2.2.0 2,4]
нон-8-ен-6-карбоновая кислота), обладающее сравнимой с ST-246,активностью в отношении ортопоксвирусов.
Цель исследования. Изучение фармакодинамических и фармакокинетических показателей противооспенного химического соединения НИОХ-14 в экспериментах на мышах.
Материалы и методы. В экспериментах использовались аутбредные мыши �����������������������������������������������
ICR��������������������������������������������
массой 12–14 г. Мышей интраназально заражали ВЭ (штамм К-1) в дозе 10 ЛД50/гол. (10 × 50 % летальных доз/голову). Инфицированным ВЭ мышам перорально вводили препараты ST-246 и НИОХ-14 в различных дозах схемах. Концентрацию ВЭв сыворотке крови и 10 %-х гомогенатах органов определяли методом
титрования в культуре клеток Vero�������������������������������
�����������������������������������(в десятичных логарифмах бляшкообразующих единиц — lg БОЕ/мл).
НИОХ-14 не растворяется в воде и в растворителях, обычно используемых в масс-спектрометрии (ацетонитрил, спирты). Для построения калибровочных кривых НИОХ-14 растворяли в 10 % ДМСОв ацетонитриле. В таком растворителе НИОХ-14 превращается в активный метаболит ST-246.
Определение фармакокинетичских параметров активного метаболита ST-246 и вторичного метаболита К в сыворотке кровии гомогенатах органов мышей осуществляли с помощью массспектрометрического анализа, который проводили в режиме SIM(����������������������������������������������������������������������
single����������������������������������������������������������������
reaction�������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������
monitoring��������������������������������������������
������������������������������������������������������
) для ионов с ������������������������������
m�����������������������������
/����������������������������
z���������������������������
375 (���������������������
ST�������������������
-246), 189 (метаболит К) и 337 (внутренний стандарт N-98).
Для изучения фармакокинетики НИОХ-14 вводили мышам в дозе50 мкг/г массы мыши однократно перорально в 0,2 мл раствора метилцеллюлозы с твином-80. Через 1, 6, 9, 12, 15, 18, 24 и 48 ч эвтаназировали по 6 мышей и производили забор крови, легких, селезенки, печени, почек и мозга. Затем в образцах сыворотки крови и гомогенатов органов мышей определяли концентрацию метаболитов

128Раздел 2

НИОХ-14: активного метаболита ST-246 и вторичного метаболитаК по калибровочным кривым.
Определяли следующие фармакокинетические параметры:1. Время полувыведения Т1/2 (ч) — время, в течение которого концентрация препарата в крови (органе) снижается на 50 %, величина
постоянная и не зависит от дозы или начальной (максимальной) концентрации препарата в крови (органе).
2. Время достижения максимальной концентрации Tmax (ч) — время, за которое достигается максимальная концентрация веществав крови (органе).
3. Максимальная концентрация Cmax (нг/мл) — максимально достигаемая концентрация лекарственного средства в крови (органе).
4. AUC (ч×нг/мл) — площадь под кривой изменения концентрации вещества «концентрация — время» (площадь под кривой «концентрация — время») от 0 до ∞ (AUC0-inf) или в интервале от момента введения до времени t, прошедшего после введения вещества
(AUC0-t), в крови (органе).
5. Тканевая доступность (fT) для органов ( %) — проникновение
вещества в ткани по формуле fT = AUC0-inf-T ‫ ׃‬AUC0-inf-S (где AUC0-inf-T —площадь под кривой «концентрация — время» от 0 до ∞ в ткани органа, AUC0-inf-S — площадь под кривой «концентрация — время»от 0 до ∞ в сыворотке крови).
Результаты исследования. Было показано, что при пероральном
введении препаратов НИОХ-14 и ST-246 их 50 %-е эффективные дозы(ЭД50) для мышей, инфицированных ВЭ, достоверно не отличалисьи составили 3,59 и 5,08 (мкг/г массы мыши) соответственно. При определении «терапевтического окна» было обнаружено, что начало введения мышам НИОХ-14 за 1 сут или за 1 ч до заражения, а также через 1, 2 и 4 сут после заражения и далее в течение 9 сут обеспечивало
100 %-ю выживаемость животных. Начало введения НИОХ-14 через
5 и 6 сут после инфицирования приводило к снижению выживаемости
мышей до 60 %, хотя она оставалась выше, чем в контрольной группе.
Введение НИОХ-14, так же как ST-246, приводило к достоверному снижению относительно контроля титров ВЭ в легких, носовой полости,головном мозге, печени, селезенке, почках и поджелудочной железе.

129ВирусологияВ таблицах 1 и 2 представлены фармакокинетические параметры активного метаболита ST-246 (табл. 1) и вторичного метаболитаК (табл. 2) в сыворотке крови и органах мышей при однократном пероральном применении НИОХ-14 в дозе 50 мкг/г массы мыши.
Заключение. По-видимому, НИОХ-14, являясь аналогом ST-246,имеет такой же механизм действия, а именно, ингибирует вирусный белок р37 и препятствует освобождению внеклеточных формвируса, которые обеспечивают диссеминацию вируса в организмеи развитие заболевания.
Полученные нами результаты доказывают, что эффективность
отечественного соединения НИОХ-14 по всем исследованным фармакодинамическим показателям сопоставима с эффективностью
антиортопоксвирусного препарата ST-246, который разработан и внастоящее время проходит клинические испытания в США.
Фармакокинетические
параметры
активного
метаболита
ST-246 в сыворотке крови и органах свидетельствуют о высокой тканевой биодоступности НИОХ-14.
Таблица 1

t1/2 (ч)
Tmax (ч)
Cmax(нг/мл)

Почки

Мозг

Селезенка

Печень

Легкие

Сыворотка крови

Параметры
(размерность)Фармакокинетические параметры активного метаболита
ST-246 в сыворотке крови и органах мышей при однократном
пероральном применении НИОХ-14 в дозе 50 мкг/г массы мыши

4,20
12,46
5,59
8,51
13,22
5,54
6
9
6
9
9
6
2057,71 ± 2008,86 ± 1043,12 ± 286,33 ± 251,90 ± 1072,04 ±641,21
1745,96
514,02
158.1638.07
453,41Раздел 2130Окончание табл. 1
AUC
0-t (нг/мл)×чAUC
0-inf (нг/мл)×ч
fT ( %)

22665,56 21879,51 15025,60 3988,52 4276,72

13813,37

23550,52 23972,45 16390,92 4786,15 6314,47

14909,68

-

100

69,6

20,3

26,8

63,3

Примечание: Cmax представлена как М±SM, число животных n = 6.

Таблица 2

t1/2 (ч)
Tmax (ч)
Cmax (нг/мл)
AUC 0-t(нг/мл)×ч
AUC
0-inf (нг/
мл)×ч

Почки

Мозг

Селезенка

Печень

Легкие

Сыворотка
кровиПараметры
(размерность)Фармакокинетические параметры вторичного метаболита Кв сыворотке крови и органах мышей при однократном пероральном
применении НИОХ-14 в дозе 50 мкг/г массы мыши

9,74
34,34
9
15
227,13 ± 341,92 ±
59,47
407,21

9,33
10,47
17,80
17,38
6
15
9
6
459,18 ± 237,55 ± 353,44 ± 306,32 ±
229,55112,9579.54
108,203313,79

10191,42

6103,52

4359,655959,153395,144406,1118608,587622,156264,13 11129,91

5111,11Примечание: Cmax представлена как М±SM, число животных n = 6.

Вирусология

131ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К ВИРУСУ ОСПЫ ОБЕЗЬЯН МЫШИДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВООСПЕННЫХ
ПРЕПАРАТОВ
А. С. Овчинникова, Ал. А. Сергеев, К. А. Титова, А. С. Кабанов,Л. Е. Булычев, Ар. А. Сергеев, Д. О. Галахова, Л. Н. Шишкина,О. С. Таранов, А. П. Агафонов, А. Н. Сергеев
ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»),630559, п. Кольцово, Новосибирская обл., РоссияВ настоящее время в качестве мелких модельных животных дляоспы обезьян при оценке эффективности противовирусных препаратов используют иммунодефицитных мышей, частично воспроизводящих инфекционный процесс у людей с подавленной иммунной системой, доля которых во время эпидемических вспышек оспы обезьян,вероятно, не очень значительна. Поэтому иммунодефицитные мышине являются абсолютно адекватной модельной системой in vivo дляоценки противовирусного действия препаратов. Данное исследование было направлено на изучение возможности применения с этойцелью иммунокомпетентных мышей аутбредной популяции ICR.
В работе были использованы вирусологические, гистологическиеи электронно-микроскопические методы исследований.
При интраназальном (и/н) заражении мышей вирусом оспы обезьян (ВОО, штамм V79-1-005) были зарегистрированы некоторые
клинические признаки заболевания: гнойный конъюнктивит, блефарит, взъерошенность шерсти. 50 %-я инфицирующая доза, оцениваемая по наличию внешних клинических проявлений (KID50) ВОО дляэтих животных, равнялась 4,8 log10 БОЕ, а LID50, оцениваемая по наличию вируса в легких мышей через 7 сут после заражения (п/з)с учетом 10 %-й его аппликации в респираторном тракте животных,составляла 1,4 log10 БОЕ и была близка к таковой у человека, теоретически определенной по наличию клинической картины заболевания
(A. A. Sergeev et al., 2015).

132Раздел 2При изучении динамики распространения ВОО в организме и/нзараженных мышей 25–30 LID50 через 7 сут п/з было обнаружено максимальное накопление патогена в слизистой носовой полости, легкихи головном мозге: 5,7±0,1, 5,5±0,1 и 5,3±0,3 log10 БОЕ/мл гомогената
органа соответственно.
При проведении световой микроскопии органов и тканей этихживотных были зарегистрированы воспалительно-пролиферативныеи некротические изменения (в основном в органах респираторного
тракта), которые напоминали таковые у известных модельных
животных для оспы обезьян (I. M. Langohr et al., 2004; A. J. Goffet al., 2011; A. A. Sergeev et al., 2015). В результате электронномикроскопического исследования органов и тканей этих животных
отмечены факты присутствия и размножения патогена в традиционных первичных клетках мишенях для ВОО (в клетках системы мононуклеарных фагоцитов и эпителиоцитах органов респираторного
тракта), а также в некоторых других клетках организма (эндотелиоцитах, клетках соединительной ткани).
Использование мышей аутбредной популяции ICR при оценке
противовирусной эффективности двух противооспенных препаратов
(НИОХ-14 и ���������������������������������������������������
ST�������������������������������������������������
-246) продемонстрировало наличие значимого эффекта по снижению продукции ВОО в легких у инфицированных мышейи адекватность полученных нами результатов таковым, описаннымв научной литературе (G. Yang et al., 2005; А. С. Кабанов и др., 2013;
E. M. Mucker et al., 2013).
Таким образом, иммунокомпетентные мыши аутбредной популяции ICR могут быть использованы в качестве модельных животныхдля оспы обезьян с целью оценки эффективности противовирусных
препаратов в отношении ВОО.

Вирусология

133ЦИРКУЛЯЦИЯ НОВЫХ И ИЗВЕСТНЫХ СЕРОТИПОВ
ПАРАМИКСОВИРУСОВ В ПОПУЛЯЦИЯХ ДИКИХ ПТИЦНА ТЕРРИТОРИИ
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН В 2013–2014 ГГ.
А. Б. Сейдалина, Е. Я. Хан, К. О. Карамендин,А. И. Кыдырманов, К. Д. Даулбаева, С. Е. Асанова,Е. Т. Касымбеков, К. Х. Жуматов, М. Х. Саятов
Республиканское государственное предприятие на праве хозяй�ственного ведения «Институт микробиологии и вирусологии»Комитета науки Министерства образования и науки
Республики Казахстан
РНК-содержащие парамиксовирусы (ПМВ) птиц относятся к родуAvulavirus семейства Paramyxoviridae и вызывают массовые инфекции домашних, синантропных и диких птиц, протекающие в видеэпизоотий, энзоотий и латентного вируносительства без проявления
клинических признаков болезни [1]. Род авуловирусов объединяет известные к настоящему времени ПМВ птиц 12 серотипов (ПМВ-1 —ПМВ-12), которые поражают птиц 241 вида, относящихся к 27 отрядам авифауны во всех регионах мира. Дикая авифауна играет ключевую роль в сохранении ПМВ в биосфере и является потенциальным
природным источником возникновения новых опасных вариантов
вирусов [1; 2; 3].
Целью работы, проведенной в 2013 и 2014 гг., явилось вирусологическое исследование ПМВ, циркулирующих в популяциях диких
птиц в различных регионах Казахстана.
Материал собран в местах массовых скоплений мигрирующих и гнездящихся птиц в Центральном Казахстане (ТенгизКоргалжынская система озер), на побережье Каспийского моря и натерритории Балхаш-Алакольской системы озер.
При вирусологическом исследовании биологических проб, собранных в 2013 г. в Западном, Южном и Центральном Казахстане

134Раздел 2

от 165 диких птиц водного и околоводного комплексов, на 10-дневных
развивающихся куриных эмбрионах выделено 20 гемагглютинирующих агентов. Идентификация их в полимеразной цепной реакции(ПЦР) с праймерами к консервативному участку L-гена, общему длявсех ПМВ, позволила отнести 18 агентов к этому семейству.
В результате последующего секвенирования продуктов амплификации L-гена и проведения сравнительного BLAST-анализа полученных нуклеотидных последовательностей с таковыми депонированными в Genbank, установлена принадлежность одного из нихк ПМВ-1, шести к ПМВ-8 и одного — к ПМВ-6. В соответствиис этим изоляты получили следующие обозначения: ПМВ-1/огарь/Чокпак/5717/13, ПМВ-6/красноносый нырок/Балхаш/5842/13,
ПМВ-8/белолобый гусь/СКО/5747/13, ПМВ-8/белолобый гусь/СКО/5749/13, ПМВ-8/пискулька/СКО/5764/13, ПМВ-8/белолобый
гусь/СКО/5765/13, ПМВ-8/лебедь кликун/СКО/5767/13, ПМВ-8/кулик-воробей/Чокпак/5669/13.
Анализ нуклеотидных последовательностей десяти других изолятов, выделенных в 2013 году от четырех видов птиц (пискульки, белолобого гуся, озерной чайки, шилохвости), выявил, их значительные
генетические расхождения по консервативному фрагменту L-генаот известных в науке серотипов ПМВ, что позволило высказать предположение об их принадлежности к новым ранее неизвестным генотипам вируса этого семейства.
При исследовании биопроб, полученных от диких птиц в 2014 г.
в Западном Казахстане, выделены шесть изолятов ПМВ, нуклеотидная последовательность фрагментов L-генов которых так же значительно отличалась от аналогичных последовательностей уже известных серотипов вируса.
Таким образом, в 2013–2014 гг. на территории Казахстана циркулировали ПМВ птиц, принадлежавшие к трем из двенадцати известных к настоящему времени серотипам вирусов этого семейства.
Получены новые данные о циркуляции в РК ПМВ птиц ранее неизвестных серотипов, что указывает на необходимость проведения
постоянного мониторинга вирусов этого семейства в популяциях
диких птиц.

Вирусология

135Список литературы
1 Nichole L. Hines, Cathy L. Miller Avian Paramyxovirus Serotype-1:
A Review of Disease Distribution, Clinical Symptoms, and Laboratory Diagnostics Hindawi Publishing Corporation // Vet. Med. Inter. — 2012. —Vol. 2012. — 17 p. doi:10.1155/2012/708216.
2. Alexander D. J. Newcastle disease and other avian paramyxoviruses,and pneumovirus infections / In: Diseases of Poultry. — Ames, IA: Iowa
State Press, 2003. — 1248 p.
3. Briand F. X., Henry A., Massin P., Jestin V. Complete Genome Sequence of a Novel Avian Paramyxovirus // J. Virology Vol. 86 (14). —p. 7710.
4. Alexander D. J. Ecology and epidemiology of Newcastle disease. In:
Capua, I., Alexander, D.J. / Eds. Avian Influenza and Newcastle Disease:
A Field and Laboratory Manual. — 2009. — P. 19–26.
ИЗУЧЕНИЕ чувствительностик противовирусным препаратам in vitro и патогенности ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА А(H3N2),
А(H1N1), А(H5N1) И А(H7N9) in vivo
М. А. Скарнович, М. О. Скарнович, О. Ю. Мазурков, Л. Н. Шишкина
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный
научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»Актуальность. Грипп представляет собой серьезную проблему
общественного здравоохранения. Вирус гриппа (ВГ) А является самым известным и распространённым среди вирусов, обусловливающих инфекционные заболевания верхних дыхательных путей. Сезонными штаммами ВГ А являются представители двух основных субтипов ����������������������������������������������������������
H���������������������������������������������������������
1��������������������������������������������������������
N�������������������������������������������������������
1 и ���������������������������������������������������
H��������������������������������������������������
3�������������������������������������������������
N������������������������������������������������
2, при этом каждый из них имеет множество постоянно изменяющихся разновидностей. Как правило, в эпидемические
периоды доминирует ВГ A/H3N2. В настоящее время значительный

136Раздел 2вклад в развитие эпидемий гриппа вносит появившийся в 2009 г. новый пандемический ВГ А(H1N1)pdm09, характерной особенностью
которого является то, что он продемонстрировал способность вызывать быстро прогрессирующее заболевание лёгких, лечить которое
чрезвычайно сложно. С 1997 г. объектом пристального внимания
стал вирус гриппа птиц А(H5N1), учитывая высокий уровень контагиозности для человека, он может стать причиной пандемии гриппа.
В марте 2013 года в Китае впервые зафиксированы случаи заражения
людей ВГ птиц А/Н7N9, приводящие к смертельным исходам. Из существующих противовирусных препаратов в отношении ВГ наиболее активны ингибиторы нейраминидазы (Тамифлю — озельтамивир, Реленза — занамивир и др.). В связи с ежегодными эпидемиями
гриппа, возможностью заражения людей ВГ животного происхождения остро встаёт вопрос об изучении биологических свойств штаммов ВГ для дальнейшего тестирования и выбора надёжных средствих профилактики и лечения.
Цель исследования. Изучение чувствительности к противовирусным препаратам в культуре клеток MDCK и патогенных свойств ВГА различных субтипов в экспериментах на аутбредных мышах ICR.
Материалы и методы. В работе использовали штаммы ВГ A/
Aichi/2/68 (H3N2), А/Bishkek/03/2009 (H1N1)pdm09, A/chicken/
Kurgan/05/2005 (H5N1) и А/Anhui/1/2013 (H7N9), полученные из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Титр вируса определяли в культуре
клеток MDCK (клетки почки собаки) по методу Спирмена-Кербера,выражали в десятичных логарифмах 50 %-х тканевых цитопатических дозах в 1 мл (lg ТЦД50/мл). Оценку чувствительности исследованных штаммов ВГ к противовирусным препаратам производилив культуре клеток �������������������������������������������
MDCK���������������������������������������. В работе использовали коммерчески доступные в аптечной сети противовирусные препараты: ингибитор
нейраминидазы Тамифлю (Ля Рош Лтд., Швейцария) в концентрации
100 мкг/мл, ингибитор М2–белка Ремантадин (ОАО «Биосинтез»,Россия) — 10 мкг/мл и Ингавирин (ОАО «Валента Фармацевтика»,Россия) — 200 мкг/мл. Определяли титр ВГ (в lg ТЦД50/мл) при егокультивировании в присутствии препаратов и в контроле. Эффектив-Вирусология

137

ность препаратов оценивали по индексу нейтрализации (ИН, в lg) ВГ,где ИН = Титрконтроль – Титропыт.
При интраназальном заражении мышей аутбредной популяции
ICR определяли 50 %-ю летальную дозу (ЛД50) и 50 %-ю инфицирующую дозу (ИД50) для каждого штамма ВГ. ЛД50 и ИД50 выражали в lg
ТЦД50/голову с учетом 95 %-х доверительных интервалов (±I95), вычисленных по методу Спирмена-Кербера.
Результаты исследования. Чувствительность штамма A/
Aichi/2/68 (H3N2) (титр в контроле 7,6±0,7 lg ТЦД50/мл) к исследуемым препаратам in vitro была следующая: для Тамифлю
ИН = 4,7 lg, для Ремантадина ИН = 2,0 lg, для Ингавирина ИН =1,7 lg при достоверном (р≤0,05) снижении титров во всех случаях.
Менее выраженную чувствительность к противовирусным препаратам проявлял штамм А/Bishkek/03/2009 (H1N1)pdm09 (титрв контроле 7,1±0,6 lg ТЦД50/мл): для Тамифлю ИН = 2,2 lg, дляРемантадина ИН = 0 lg и для Ингавирина ИН = 0,5 lg. Штамм A/
chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) (титр в контроле 7,3±0,7 lg ТЦД50/мл) чувствителен к Тамифлю (ИН = 3,3 lg), Ремантадину (ИН= 2,2 lg) и Ингавирину (ИН = 1,2 lg) с достоверным снижением
титров под влиянием этих препаратов. В отношении штамма А/
Anhui/1/2013 (H7N9) (титр в контроле 10,5±0,5 lg ТЦД50/мл) in
vitro наиболее выраженную активность проявляет Тамифлю (ИН= 3,0 lg), тогда как Ремантадин (ИН = 1,67 lg) и Ингавирин (ИН =1,5 lg) были менее активны при достоверном понижении титровпод их влиянием.
Были определены показатели ЛД50 и ИД50 для штаммов ВГ А/
Anhui/1/2013 (H7N9), А/Bishkek/03/2009 (H1N1)pdm09, A/Chicken/
Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2) (табл.). Полученные
показатели для штамма ВГ А/Bishkek/03/2009 (H1N1)pdm09 свидетельствовали о его высокой патогенности для аутбредных мышей
ICR без предварительной адаптации к данному виду животных. Наиболее патогенным для аутбредных мышей ICR оказался штамм ВГ
A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), поскольку его ЛД50 и ИД50 имели самые низкие значения (табл.). При этом наименее патогенными
свойствами для данной популяции мышей обладал штамм ВГ А/Раздел 2

138

Anhui/1/2013 (H7N9), поскольку его ЛД50 и ИД50 были самыми высокими среди всех полученных соответствующих значений (табл.).
Показатели ЛД50 и ИД50 при интраназальном заражении
аутбредных мышей ICR штаммами ВГ А(H7N9),
А(H1N1), А(H5N1) и А(H3N2)

Штаммы вируса
гриппа
A/Aichi/2/68(H3N2)
А/Bishkek/03/2009(H1N1)pdm09
A/Chicken/
Kurgan/05/2005(H5N1)
А/Anhui/1/2013(H7N9)

ЛД50

ИД50

lg ТЦД50/
гол., ±I95

ТЦД50/гол.

lg ТЦД50/
гол., ±I95

ТЦД50/гол.

2,3 ± 0,33200

0,1 ± 0,33

1,26

1,1 ± 0,57

12,6

0,8 ± 0,57

6,3

0,1 ± 0,33

1,26

-0,4 ± 0,33

0,4

4,3 ± 0,4419953

0,9 ± 0,44

7,9Примечание: значения указаны как М±I95, М — концентрация вируса,I95 — 95 %-й доверительный интервал.

Заключение и выводы. Полученные результаты показывают, чтонаибольшей чувствительностью все исследованные в данной работе
штаммы ВГ субтипов А(H3N2), А(H1N1), А(H5N1) и А(H7N9) обладают к ингибитору нейраминидазы Тамифлю, под влиянием которого индексы нейтрализации достигают наиболее высоких значений.
Установлено, что все исследованные работе штаммы ВГ субтипов
А(H3N2), А(H1N1)pdm09, А(H5N1) и А(H7N9) обладают высокой
патогенностью для аутбредных мышей ICR, судя по показателям
ЛД50 и ИД50, что позволит в дальнейшем проводить сравнительные
исследования эффективности различных противогриппозных препаратов в отношении данных штаммов ВГ in vivo.

Вирусология

139ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МТТ-МЕТОДА ДЛЯ ОЦЕНКИ
ПРОТИВОВИРУСНОЙ АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТИ
ХИМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
П. Ю. Ачигечева, Ю. В. Никонорова,С. М. Балахнин, Н. М. Гашникова
ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор»Выявление новых препаратов, обладающих противовирусной
активностью не теряет своей актуальности. Для оценки анти-ВИЧактивности химических соединений чаще всего применяется ИФАметод для определения степени подавления накопления белка р24.
Однако этот метод достаточно трудоемкий и затратный.
Использование МТТ–метода при работе с вирусом ВИЧ-1 на культуре клеток затруднительно ввиду того, что вирус, как правило, невызывает острую инфекцию с деструкцией клеток в течение 4-6 суток. Исключение составляет суспензионная культура клеток МТ-4,при размножении на которой некоторые лабораторные штаммы иизоляты вируса, с тропностью CXCR4, способны вызывать полную
деструкцию клеток уже на 5 сутки после заражения.
В настоящее время на территории России наиболее распространён субтип А ВИЧ-1, и его различные рекомбинантные формы (CRF).
Считается, что определение противовирусной активности препаратов лучше всего проводить по отношению к актуальным (циркулирующим в данное время) субтипам ВИЧ-1.
В нашей лаборатории был получен изолят ZN субтипа А ВИЧ-1с тропностью CXCR4 который вызывает 100 % деструкцию клеток
МТ-4. После нескольких пассажей на культуре клеток МТ-4 он получил название MTZN.
Для оценки противовирусной активности и цитотоксичности различных химических соединений, с целью поиска новых перспективных противовирусных препаратов нами был освоен МТТ-метод,Раздел 2140определяющий метаболическую активности клеток. Метод основанна способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать
водорастворимый3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5 — 2Н-тетразолиум
бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри живых
клеток. Результаты цитотоксичности и противовирусной активности,исследуемых соединений, определяют по жизнеспособности клеток
относительно контроля, измеряя оптическую плотность при помощи
фотометрии. По полученным данным строят график зависимости
жизнеспособности клеток, от возрастающих доз соединения и вычисляют 50 % токсическую концентрацию (TC50) и 50 % ингибирующую концентрацию (IC50)
Использование этого метода позволяет проводить скрининговые
исследования большого количества химических соединений.
В виде тестовых испытаний были проверены анти-ВИЧ субстанции МТТ-методом (табл. 1).
Таблица 1Определение МТТ-методом 50% токсической концентрации
(TC50) и 50% ингибирующей концентрацию (IC50)
анти-ВИЧ субстанций
TC50, мкг/мл

IC50, мкг/млАбакавир

55,43

0,66

Зидовудин

14,84

0,005

Ставудин

28,73

0,048

Лопинавир

17,82

0,00062Ритонавир

22,02

0,035

Вирусология

141

Рис. 1. Определение цитотоксичности и анти-ВИЧ активности на примере Абакавира (МТ-4, MTZN субтип А ВИЧ-1)Таким образом, получение данных по цитотоксичности и противовирусной активности коммерческих препаратов обладающих антиВИЧ активностью с использованием изолята MTZN на культуре клеток МТ-4 позволяет проводить тестирование МТТ методом.

142cРаздел 3Молекулярная биология

Разработка ОТ-ПЦР для диагностики
вируса бешенства
Б. М. Исмагамбетов, М. и. Богданова, Ж. К. Кошеметов,В. М. Матвеева, С. Ш. Нурабаев, Г. Д. Сугирбаева,Н. К. Оразымбетова
Научно-исследовательский институт проблем биологической
безопасности РГП НИИПББ КН МОН РК. Жамбылская обл.,Кордайский р-н, пгт Гвардейский
Ключевые слова: вирус бешенства, ОТ-ПЦР, амплификация, па�тологический материал, электрофорез, РНК.
Введение
Бешенство входит в пятёрку инфекционных болезней, общих длячеловека и животных, наносящих наибольший экономический ущерб,который складывается из потерь в результате падежа животных, затрат на проведение карантинных и профилактических мероприятий,на отлов бродячих собак и кошек, регулирование численности диких
хищников, а также на проведение диагностических исследований.
Азиатский континент в течение многих лет известен как одиниз серьезных эндемических очагов бешенства. В большинстве азиатских стран доминируют эпизоотии собачьего бешенства. По эпи-Молекулярная биология

143

зоотиям собачьего бешенства в настоящее время являются неблагополучными Индия, Индонезия, Пакистан, Непал, Лаос, Шри-Ланка,Бирма, Филиппины, Афганистан, Южная Корея, КНДР, Таиланд,Ирак, Камбоджа. Спорадическая заболеваемость.
Современная и точная лабораторная диагностика бешенства, особенно экспресс-диагностика, остается актуальной для практической
ветеринарной медицины.
В связи с этим, целью наших исследований была разработка ОТПЦР для идентификации вируса бешенства.
Материалы и методыВ процессе проведения экспериментальных исследований былиспользован вирулентный штамм «CVS» вируса бешенства и пробы
патологических материалов в виде мозга от павших животных.
Выделение РНК проводят с использованием набора QIAamp�����
�����������
® ���
ViralRNAMiniKit�������������������������������������������������в соответствии с наставлением по применению данного набора.
В исследованиях использовали пару праймеров Rab-f и Rab-r.
Данные праймеры ограничивают участок РНК размером 332 п.н.
Для электрофоретического анализа кДНК-амплификатов используют 1,0 % раствор агарозы в ТБЕ.
РезультатыС целью подбора праймеров для выявления вируса бешенства,был проведен поиск и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей вируса бешенства из сети Internet и в международной
базе данных GeneBank.
По результатам сравнительного анализа, была выбрана одна паранаиболее специфичных праймеров. Данная пара праймеров нарабатывает ПЦР- продукт размером 332 п.н.
Эффективность метода ПЦР и его специфичность зависит от многих параметров, включающих буферный состав реакционной смеси,температурно-временной режим амплификации, концентрацию фермента в реакционной смеси, количество ДНК матрицы, концентрацию праймеров.
Результаты исследований показали, что наиболее оптимальной
температурой плавления отжига, для подобранной пары прайме-144Раздел 3ров, является 55°С, концентрация MgCl2 — 2,5 мМ, праймеров —0,4 мМ/мкл, чувствительность метода ПЦР составила 0,6 пг РНКВБ в пробе.
В результате, оптимизированный нами метод ОТ-ПЦР был испытан на пригодность и эффективность при исследовании проб патологического материала, взятого от павших животных, с подозрениемна бешенство. Патологический материал был отобран в ходе эпизоотологического мониторинга, проводимого в 2014 году сотрудниками
НИИПББ РК в Республике Таджикистан. Результаты данных исследований представлены на рис. 1.

Рис. 1. Исследование в ОТ-ПЦР полевых проб патологического материала с праймерамиRab-fи Rab-r: М — маркер ДНК 1kbFermentas, 1 —пробы от сурка (Чиргаталский район), 2 — пробы от собаки 1 (г. Душанбе), 3 — пробы от собаки (Еванский район), 4 — пробы от КРС(Раштскийрайонон), 5 — пробы от собаки 2 (г. Душанбе), 6 — пробыот КРС 1 (Файзабадская обл.), 7 — пробы от летучей мыши, 8 — пробыот КРС 2 (Файзабадскаяобл.), 9 — пробы от МРС (Софорова), 10 —РНК вируса бешенства,11 — деионизированная водаНа рис. 1 видно, что из 9 исследованных проб мозга, взятых от павших животных с подозрением на бешенство, в шести была выявленаРНК вируса бешенства. По результатам ОТ-ПЦР можно судить, чтов Республике Таджикистан среди собак активно циркулирует возбудитель вируса болезни бешенства.

Молекулярная биология

145Данные результаты показали, что отработанный метод ПЦР обладает высокой специфичностью, чувствительностью и эффективностью.
Таким образом, в результате приведенных исследований, по применению оптимизированного метода ОТ-ПЦР для обнаружения вируса бешенства, из патологических материалов от павших животных,доставленных из Республики Таджикистан был обнаружен РНК вируса бешенства. Предложенный метод ОТ-ПЦР является специфичными чувствительным и позволяет достоверно определять наличие РНКвируса бешенства в биологических пробах без предварительного накопления тестируемого вируса. Данный метод в дальнейшем будет
использован для экспресс-идентификации данного возбудителя.
ВКЛАД ЭФФЛЮКС СИСТЕМЫ МАСАВ SERRATIAMARCESCENS В УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ
Т. В. Ширшикова 1, Л. Х. Камалетдинова 1, А. М. Марданова 1,
М. Р. Шарипова 1, Л. М. Богомольная 1, 2ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный
университет», 2 Техасский Аграрно-Технический Университет,г. Колледж Стэйшн, Техас, США
1Многие заболевания человека и животных вызываются бактериями семейства Enterobacteriaceae, в частности, такими известными патогенами, как Escherichia coli, Salmonella enterica, Shigelladysenteriae и другие.
В отличие от этих болезнетворных микробов, бактерия Serratia
marcescens обычно обитает вне организма человека. В связи с этим,долгое время считалось, что S. marcescens не является патогеном, и лишь в последние годы были получены данные о том, что
S. marcescens является одним из опасных возбудителей внутрибольничных инфекций [Abbott et al., 1999; Hejazi et al., 1997; Mahlen, 2011;
Ostrowsky et al., 2002].

146Раздел 3В середине 1970-х годов было показано, что S. marcescens способна вызвать широкий спектр инфекционных заболеваний. Установлено, что у многих пациентов больничных стационаров S. marcescensможет вызывать заболевания центральной нервной системы (менингит), инфекции мочеполовой системы, болезни дыхательных путей,эндокардит и сепсис. Наибольшую опасность S. marcescens представляет для пациентов групп риска, в частности, для больных с ослабленной иммунной системой, находящихся в палатах интенсивной
терапии. Основной проблемой эффективного лечения инфекций,вызванных S. marcescens, также является уникальная устойчивостьк большинству классов антибиотиков [Mahlen, 2011]. В частности,большинство клинических изолятов S. marcescens устойчивы к действию β-лактамных антибиотиков, макролидам и цефалоспоринам
[Stock et al., 2003].
Существует три наиболее изученных механизма появления антибиотикоустойчивости: модификация внутриклеточной мишени антибиотика или самого антибиотика, например, в случае антибиотиковиз класса аминогликозидов [Shaw et al., 1993]; уменьшение экспрессии белков-поринов, что предотвращает попадание антибиотиков
класса β-лактамов в клетки бактерий [Jaffe et al., 1982] и мутациив генах гиразы, уменьшающие чувствительность бактерий к антибиотикам класса фторхинолонов [Heisig, 1993]. Тем не менее, наиболее эффективным способом возникновения антибиотикоустойчивости у грамотрицательных микроорганизмов является четвертый
механизм: быстрая активация эффлюкс систем, осуществляющих
активный экспорт антибиотиков из клетки [Oethinger et al., 2000].
В клетках S. marcescens в настоящее время охарактеризованы
6 эффлюкс систем [Марданова с соавт., 2014]. Проведенный биоинформационный анализ геномной последовательности S. marcescensпозволил выявить новую эффлюкс систему ABC-типа. Эта системане изучена у представителей рода Serratia, но гомологична MacAB
системе E. coli, защищающей клетки от эритромицина и других антибиотиков класса макролидов [Kobayashi et al., 2001].
Таким образом, актуальной задачей является изучение новых эффлюкс систем S. marcescens, выяснение их роли в антибиотикоустой-Молекулярная биология

147

чивости, что может послужить базой для создания новых эффективных способов борьбы с этим патогеном. В связи с этим целью данной
работы является изучение роли эффлюкс-системы MacAB в защите
S. marcescens от антибиотиков.
Наиболее продуктивным методом анализа микробных генов с неизвестной функцией является их инактивация (нокаутирование) с последующим изучением фенотипов мутантных клеток. Эффективныйи быстрый способ инактивации генов при помощи метода ПЦРи системы рекомбинации фага λ-ред был разработан для близкородственной бактерии E. coli [Datsenko, Wanner, 2000]. Используя данную методику, а также метод трансдукции при помощи бактериофага
ФОТ8, нами был получен мутантный штамм клинического изолята S.
marcescens SR41-8000 с инактивированным геном эффлюкс-системы
MacAB (далее S. marcescens SR41-8000 ∆macAB).
Следующим этапом работы стало качественное определение
антибиотикоустойчивости
штаммов
S.
marcescens
SR41-8000 и SR41-8000 ∆macAB диско-диффузионным методом(ДДМ). В ДДМ в качестве носителя антибактериального препарата(АБП) используют бумажный диск. Образование зоны подавления
роста микроорганизмов, посеянных на поверхности агара, происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду.
В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста
обратно пропорциональна минимальной ингибирующей концентрации антибиотика (МИК).
Для определения чувствительности ДДМ использовали агаризованную (2 %) питательную среду LB. Использовались коммерческие
стандартизированные диски (производство ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург). При определении чувствительности ДДМ использовали бактериальную суспензию ночной культуры, c плотностью 0.5 единиц по стандарту
Мак-Фарланда [МУК 4.2.1890-04; 2004].
Инокуляцию приготовленных чашек проводили внесением бактериальной суспензии на поверхность агара в объеме 100 мкл, после
чего равномерно распределяли ее с помощью шпателя Дригальского.
Не позднее чем через 15 мин после инокуляции на поверхность пи-148Раздел 3тательной среды с помощью стерильного пинцета наносили дискис АБП. После аппликации дисков чашки инкубировали при температуре 37 °С в течение 18–24 ч.
Учет результатов проводили при измерении зон полного подавления видимого роста [МУК 4.2.1890-04; 2004]. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. В ходе экспериментов выявлено, чтодля фторхинолонов I поколения (ципрофлоксацин) и цефалоспоринов
I поколения (цефазолин) отмечено уменьшение диаметра зоны подавления роста у мутантного штамма S. marcescens SR41-8000∆macAB.
Это может объясняться наличием у S. marcescens нескольких эффлюкс систем. Благодаря разнообразию эффлюкс систем, дополняющих друг друга, S. marcescens способна выводить из клетки широкий
спектр антибиотиков [Kobayashi et al., 2001]. Кроме того, в экспериментах c E.coli, проводимых группой K. Nishino, показано, что приинактивации одной из эффлюкс систем, увеличивается экспресиия
генов, кодирующих другие эффлюкс системы [Nishino et al., 2009].
По данным литературы, штаммы S. marcescens являются устойчивыми к нитрофурантоину и имеют переходную устойчивость к аминогликозидам [Mahlen, 2011]. Исходя из данных таблицы видно, чтоштамм S. marcescens SR41-8000∆macAB стал, по сравнению с переходным по чувствительности диким типом, чувствительным к таким
АБП, как канамицин, гентамицин, которые относятся к классу аминогликозидов I и III поколения, соответственно. Такая же реакция
штаммов была замечена по отношению к нитрофурантоину, относящегося к классу нитрофуранов.
По данным литературы, MacAB эффлюкс система E. coli, защищает клетки от антибиотиков класса макролидов [Kobayashi et al, 2001].
Наши эксперименты показали, что инактивация эффлюкс системы МасАВ S.marcescens не оказывала влияния на чувствительность бактерийк антибиотикам класса макролидов. Вместо этого нами показано, чтов отличие от эффлюкс системы E. coli, ее гомолог в S. marcescens защищает бактерии от аминогликозидов и нитрофуранов.
Таким образом, эффлюкс система MacAB Serratia marcescens защищает бактерии от антибиотикам класса аминогликозидов I и IIIпоколения и нитрофуранов.

149

Молекулярная биология

Таблица 1Содержание в диске, мкг

SR41-8000

SR41-8000∆
macAB

SR41-8000

SR41-8000∆
macABканамицин

30

16

19

П

Ч

неомицин

30

13

23

П

Ч

аминогликозиды
II поколения

гентамицин

10

14

16

П

Ч

аминогликозиды
III поколения

амикацин

30

28

26

Ч

Ч

макролиды

кларитромицин

15

13

13

У

У

нитрофураны

нитрофурантоин

300

15

21

П

Ч

нитрофураны

фурагин

300

17

10

–

–

оксихинолины

нитроксолин

20

20

22

–

–

п/синт.
пенициллины

ампициллин

10

22

23

Ч

Ч

Группа АБПАБПЧувствительность

Диаметр зонподавления
роста,мм (±0.5мм)Чувствительность к антибактериальным препаратам
штаммов Serratia marcescensаминогликозиды
I поколения

Раздел 3150Окончание табл. 1
тетрациклины

доксициклин

30

19

20

Ч

Ч

фторхинолоны
I поколения

ципрофлоксацин

5

37

27

Ч

Ч

хинолоны

налидикс. кислота

30

27

29

Ч

Ч

цефалоспорины
I поколения

цефазолин

30

14

0

У

У

цефтазидим

30

29

33

Ч

Ч

цефотаксим

30

32

36

Ч

Ч

цефалоспорины
III поколения

Ч — чувствительный, П — переходная чувствительность, У — устойчивый; «–» — нетАнализ онколитических свойств
рекомбинантного штамма MVA вируса
осповакцины, экспрессирующего ген белка
NS1 парвовируса
А. В. Ткачёва, Г. Ф. Сиволобова, А. А. Гражданцева, Г. В. Кочнева
ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор»Онкологические заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Существующие
методы терапии опухолей характеризуются низкой эффективностью в плане предупреждения прогрессирования заболеванияи побочными эффектами на организм больного.В настоящее время особенно актуальными являются работы по разработке противоопухолевых препаратов с многофункциональным механизмом
действия в связи с колоссальным многообразием типов опухолей,нестабильностью либо отсутствием иммунного ответа на раковые

Молекулярная биология

151клетки и появлением иммунодефицитных состояний при онкологических заболеваниях.
Использование онколитических вирусов — это новый подход в терапии онкологических заболеваний, основанный на естественной способности вирусов лизировать клетки, в которых он размножается.
Терапия с применением онколитических вирусов имеет ряд преимуществ перед стандартными методами противораковой терапии.
Во-первых, вирусы могут быть быстро модифицированы с применением технологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, можно быстро внедрять интенсивно появляющиеся новые знания о клеточных
сигнальных путях в процессе создания онколитических вирусов. Вовторых, непатогенные или аттенуированные природные и рекомбинантные вирусы имеют механизмы распознавания раковых клетоки обладают избирательным цитолитическим потенциалом. Также показано, что виротерапия эффективна при лечении метастазирующих
опухолей, которые являются неоперабельными и/или плохо поддаются радиотерапии и обычной химиотерапии.
В настоящее время наряду с другими вирусными семействами
значительное внимание уделяется использованию потенциальных
возможностей вирусов семейства ���������������������������������
Poxviridae�����������������������в борьбе с онкологическими заболеваниями. Наиболее изученным среди онколитических
поксвирусов является вирус осповакцины.
Многочисленные природные свойства вируса осповакцины делаютего перспективным онколитическим вирусом. Вирус осповакцины:– реплицируется и лизирует раковые клетки с высокой скоростью;– обладает тропизмом к широкому кругу клеток, для его проникновения не требуется определенных клеточных рецепторов и инфицирование происходит эффективно путем слияния клеточной и вирусной мембран, что увеличивает эффективность заражения in vivo;– реплицируется в цитоплазме в специфических структурах, такназываемых вирусных фабриках, и никогда не интегрирует свой геном в геном хозяина;– имеет большой размер генома, что позволяет встраивать
до 25000 пар оснований чужеродной ДНК, не нарушая инфекционности вируса;152Раздел 3– способен системно распространяться по организму человека,что обеспечивает его эффективную доставку к отдаленным опухолями метастазам;– генетически стабилен и имеет низкую скорость спонтанного мутагенеза.
Однако вирус осповакцины является инфекционным для человека, и иногда, после вакцинации, проводимой в качестве профилактической меры по борьбе с натуральной оспой, у вакцинированных людей наблюдались серьезные осложнения. Риск для здоровья человекаили животных, связанный с применением данного вируса в качестве
вектора, может быть снижен путем использования высокоаттенуированного (ослабленного) штамма вируса осповакцины.
MVA (modified vaccinia virus Ankara) является высокоаттенуированным вариантом вируса осповакцины за счет того, что имеет делеции большого количества факторов вирулентности. В 2010 годуMVA был одобрен в США и европейских странах как противооспенная вакцина для предотвращения и ликвидации последствий
возможных террористических атак или других случаев угрозы натуральной оспы.
Для усиления адресности и противоопухолевых свойств MVA
необходима реконструкция генома. Одним из перспективных трансгенов для повышения онколитической активности вирусов является первый неструктурный белок NS1 парвовируса крыс H-1. Белок
NS1 является главным фактором, ответственным за специфическую
онколитическую активность парвовирусов, и способен индуцировать
апоптоз раковых, но не нормальных клеток человека. Показано, чтобелок NS1 парвовируса особенно эффективен в отношении клеток
глиом человека, которые наиболее трудно поддаются лечению стандартными методами противораковой терапии.
В процессе работы был получен рекомбинантный вирус на основе штамма MVA вируса осповакцины со встройкой гена апоптозиндуцирующего белка NS1 парвовируса H-1. Наличие встройки былоподтверждено методом ПЦР и секвенирования. Методом Вестернблоттинга показано, что происходит экспрессия гена �������������
NS�����������
1. Исследование цитолитической активности вируса ����������������������
MVA�������������������и его рекомбинант-Молекулярная биология

153

ных вариантов проводилось на панели опухолевых клеток человека
разного тканевого и органного происхождения с использованием реагента XTT.
Использовали панель опухолевых клеток человека различного
генеза:1) Huh-7.5 — клетки гепатомы человека
2) C33A — клетки рака шейки матки человека
3) MCF-7 — клетки аденокарциномы молочной железы человека
4) U87MG — клетки глиобластомы человека
5) А431 — клетки эпидермоидной карциномы человека
Результаты оценки цитотоксической активности штаммов вируса осповакцины с использованием реагента ХТТ представленына рисунке.

Как следует из представленной диаграммы, рекомбинантные варианты вируса MVA со встройкой гена белка NS1 имеют достоверно(на уровне значимости 95 %) большую цитотоксическую активностьдля клеток глиобластомы человека U87MG по сравнению с исходным
родительским штаммом. Из диаграммы также видно, что для остальных культур клеток онколитическая активность рекомбинантных вариантов вируса не отличается достоверно от онколитической активности вируса дикого типа.

Раздел 3154ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНОГО
АНТИТЕЛА К ОПУХОЛЬ-АССОЦИИРОВАННОМУ БЕЛКУPMEPA1 И АНАЛИЗ ХАРАКТЕРА ЕГО ЭКСПРЕССИИВ ТКАНИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЖЕЛУДКА *В. В. Волкоморов 1, 2, Е. С. Григорьева 1, 2, М. С. Карбышев 3,
И. В. Митрофанова 1, 2, Е. В. Кайгородова 1, 2, Н. В. Чердынцева 1, 2Томский НИИ онкологии, г. Томск, 2 Национальный
исследовательский Томский государственный университет,г. Томск, 3 Международный биотехнологический центр «Генериум»,Владимирская обл.
1Актуальность исследования. Сигнальный путь TGF-β играет
ключевую роль в процессах клеточного роста, дифференцировки,апоптоза, вовлечен в регуляцию иммунного ответа, формирование
злокачественных опухолей и их метастазирование. Одним из белков,чья экспрессия непосредственно индуцируется в результате активации
TGF-β сигнального пути, является PMEPA1 (Prostate Transmembrane
Protein, Androgen Induced 1). Данный белок непосредственно связываться с молекулами R-Smad (Smad 2 и 3), которые являются посредниками в передаче сигнала от молекулы рецептора TGF-β в ядро, темсамым блокируя трансдукцию сигнала. Анализ имеющихся в литературе данных о функции белка PMEPA1 определил его важное значениев процессах пролиферации и дифференцировки ряда тканей эпителиального происхождения, что позволило говорить о роли PMEPA1 в развитии злокачественных новообразований различных локализаций. Существующие разрозненные данные свидетельствуют в пользу весьма
неоднозначной роли данного белка в онкогенезе, требующей более
детального уточнения. На собственной коллекции парных образцов
нормальной и опухолевой ткани нами была показана повышенная
экспрессия гена PMEPA1 в ткани аденокарциномы желудка интестиРабота выполнена при поддержке гранта РФФИ мол_а №14-04-31500\15
от 30.04.2015.
*Молекулярная биология

155нального гистологического типа. Проведенные нами предварительные
исследования его белкового продукта показали неэффективность использования ряда коммерческих антител для его детекции в экстрактах
тканей и на гистологических срезах. Это обусловило актуальность получения собственных высокоспецифичных антител к PMEPA1, с последующим анализом их специфичности и оценкой экспрессии данного белка в ткани аденокарциномы желудка.
Материал и методы. Получение моноклональных антител
(мкАТ). В качестве антигена при иммунизации крыс использовался
синтетический пептид 275WSKEKDKQKGHPL287, конъюгированный с овальбумином (PSL, Германия). Гибридизация лимфоцитов
проводилась по стандартной методике. мкАТ, показывающие специфическую активность против PMEPA1, подвергались дальнейшему анализу с помощью иммуноблота. Очистку полученных мкАТпроводили с помощью аффинной хроматографии на колонке HiTrap
MabSelect (GE Healthcare).
Получение рекомбинантного белка PMEPA1 в культуре клеток
линии HEK293T. Полноразмерный ген PMEPA1 амплифицировалис использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции Nhe1 и EcoR1 и клонировали в плазмиду pIRES-EGFP (Clontech, США). Трансфекция
проводилась кальций-фосфатным методом. Иммуноблотинг. Клеточные лизаты подвергали электрофоретическому разделению по методу Лэммли в полиакриламидном геле. После разделения белки
подвергали электропереносу на поливинил-дифторидную мембрану
Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore, США), используя Mini
Trans��������������������������������������������������������������
-�������������������������������������������������������������
Blot���������������������������������������������������������
transfer������������������������������������������������
��������������������������������������������������������
cell�������������������������������������������
�����������������������������������������������
(Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. При исследовании образцов специфическую
реакцию определяли на пленке для выявления хемолюминесценциис помощью ECL Plus Western Blotting Detection System.
Иммуноцитохимическое исследование. Способность полученных мкАТ к связыванию белка PMEPA1 была проанализирована с помощью иммуноцитохимии на трансфицированных клетках линии
HEK��������������������������������������������������������������
293�����������������������������������������������������������
T����������������������������������������������������������. В качестве вторичных антител использовали овечьи антитела к IgG кролика, конъюгированные с родамином в разведении 1:300.

156

Раздел 3Иммуногистохимическое исследование. В качестве материаладля тестирования использовали срезы тканей рака простаты 2 пациентов. Операционный материал фиксировали 10 % формалином, забуференным фосфатным буфером в течение 24 ч. Связавшиеся антитела выявляли, используя козьи антитела против первичных антител,конъюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:100.
Результаты. Основной белковый продукт гена PMEPA1 содержит 287 аминокислотных остатков, являясь самой длинной формой,состоит из экстрацеллюлярного домена (40 аминокислот), трансмембранного домена (28 аминокислот) и длинного цитоплазматического «хвоста» (227 аминокислот). Для получения специфичных
к PMEPA1 мкАТ нами был выполнен поиск участков локализации антигенных детерминант, топологически наиболее доступных для взаимодействия антител с выявленным мембранным белком. В качестве антигена использовался синтетический пептид
275WSKEKDKQKGHPL287, представляющий собой C-концевую
цитоплазматическую часть белка PMEPA1.
Способность полученных антител распознавать целевой белокв клетках линии HEK293T, транзиентно экпрессирующих PMEPA1,
оценивали с помощью метода вестерн-блота и иммуноцитохимии.
Клетки трансфицировали экспрессионным вектором pIRES-EGFP,содержащим вставку, кодирующую полноразмерный белок PMEPA1.
При проведении иммуноцитохимического исследования визуализацию проводили с помощью антивидовых конъюгатов, меченных
родамином. Полученные антитела выявляли цитоплазматическую
локализацию белка PMEPA1. Трансфицированные клетки, содержащие генетическую конструкцию pIRES-EGFP-PMEPA1, характеризовались более высоким уровнем флуоресценции, по сравнениюс нетрансфицированными контрольными клетками. Для оценки
специфичности и пригодности применения полученных мкАТ для детекции PMEPA1 в клинических образцах нами был использован иммуногистохимический анализ срезов ткани из парафиновых срезов.
В качестве положительного контроля была выбрана нормальная ткань
простаты. Наблюдалась выраженная ядерно-цитоплазматическая экспрессия PMEPA1.

Молекулярная биология

157

Определение характера экспрессии PMEPA1 с помощью полученных мкАТ в парных клинических образцах больных аденокарциномой желудка методом вестерн-блот анализа показало значительное
снижение содержания белка в опухолевой ткани по сравнению с соответствующей нормой. Чтобы установить возможность использования полученных АТ для выявления PMEPA1 в опухолевых тканях,была проведена оценка экспрессии белка на срезах нормальной ткании аденокарциномы желудка. Выявляемая ядерно-цитоплазматическая
экспрессия PMEPA является характерной и для некоторых других белков, имеющих в своей структуре мотивы, взаимодействующие с WW-доменами убиквитин лигазы Nedd4. Для оценки ролиPMEPA1 в патогенезе рака желудка был проведен анализ его экспрессии в опухолевой ткани in situ в образцах аденомы, аденокарциномыи нормального эпителия желудка. В результате нами обнаружена высокая экспрессия PMEPA1 в нормальной слизистой желудка, однакопри оценке препаратов аденомы и аденокарциномы желудка, клетки,содержащие белок PMEPA1 не были выявлены. При этом важным
является тот факт, что клетки эпителия желудка теряют экспрессиюPMEPA1 с момента возникновения морфологических признаков тяжелых диспластических изменений.
Заключение. Нами получено новое моноклональное антитело против опухоле-ассоциированного белка PMEPA1, вовлеченного в TGF-βсигнальный путь, играющего важную роль в процессе метастазирования злокачественных опухолей. Полученные мкАТ обладают достаточной чувствительностью для детекции PMEPA1 в клиническом
материале и выявления особенностей его экспрессии в различных
тканях. Проведенный анализ экспрессии PMEPA�������������������
������������������������
1 в клинических образцах желудка и в ткани in situ позволяет говорить о возможности
использования данного белка в качестве маркера риска злокачественной трансформации эпителия желудка. При этом феномен несоответствия транскрипционного и трансляционного уровня экспрессии
гена PMEPA1 требует более детального изучения и выяснения механизмов данного явления.

158Раздел 3РОЛЬ БЕЛКА KU В ИНГИБИРУЮЩЕМ ДЕЙСТВИИ ДНКНА дцРНК-ЗАВИСИМУЮ АКТИВАЦИЮ
NFkB В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
А. В. Черепанова, В. В. Власов, П. П. Лактионов
Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАНОдним из перспективных направлений в противоопухолевой терапии является регуляция опухолеассоциированного воспаления путем воздействия на паттерн-распознающие рецепторы. В частности, было показано, что дцРНК и ее синтетический
аналог poly(I:C) — лиганды рецепторов TLR3, RIG1 and MDA5,активируют апоптоз в опухолевых клетках. Однако взаимодействие
дцРНК с TLR3 также приводит к активации транскрипционного
фактора NF-kB, что может усиливать воспаление вокруг
опухоли, активировать пролиферацию опухолевых клеток,ангиогенез и метастазирование. Таким образом, специфические
ингибиторы NF-kB после активации TLR3 позволили бы повысить
эффективность дцРНК в противоопухолевой терапии.
Ранее в нашем исследовании было показано, что ДНК и ОДНспецифической
последовательности
ингибируют
poly(I:C)индуцированную продукцию провоспалительных интерлейкиновв первичных фибробластах и эндотелиоцитах человека (Cherepanova et al, Immunobiology, 2013). Методом аффинной модификации/выделения с последующей масс-спектрометрией в качестве
основной клеточной мишени иммуноингибирующих ОДН былидентифицирован белок Ku (гетеродимер Ku70 и Ku80) (Cherepanova et al, Exp. Opin. Biol. Ther., 2012). В задачи этого исследования
входило выяснить ингибируют ли ОДН poly(I:C)-индуцированную
активацию опухолевых клеток (���������������������������������
карциномы шейки матки Hela и эпидермальной карциномы A431), а также участвует ли белок Ku в наблюдаемом эффекте.

Молекулярная биология

159

Показано, что poly(I:C) активирует продукцию ИЛ-6 в клетках
Hela и A431, а специфические ОДН, как и в первичных клетках, ингибируют эту активацию. При этом ОДН снижают как концентрацию
ИЛ-6 в клеточном супернатанте, так и уровень экспрессии мРНКв poly(I:C)-активированных клетках, что свидетельствует об ингибировании активации NF-kB.
Для того, чтобы выяснить роль �����������������������������
Ku���������������������������
-комплекса в реализации иммуносупрессирующего действия ОДН, было использование ингибирование экспрессии Ku��������������������������������������
����������������������������������������
70 под действием si�������������������
���������������������
РНК, которые снижают уровень зкспрессии Ku70 в мембранно-цитозольной фракции
клеток на 60–65 %. Эффективность ингибирования ОДН в 1,7 разниже, в клетках, предварительно трансфицированных Ku70 siРНК,по сравнению с контрольной siРНК. Таким образом, взаимодействие
Ku70 с иммуноингибирующими ОДН в клетках, по-видимому, необходимо для ингибирования poly(I:C)-индуцированной продукции
провоспалительных интерлейкинов. Дальнейшие исследования покажут, вовлечен ли белок Ku напрямую во взаимодействие нуклеиновых кислот с паттерн-распознающими рецепторами, или выполняет
вспомогательную функцию, регулируя локализацию ОДН в клеткеили взаимодействие poly(I:C) с другими белками. Так или иначе, ингибирование ����������������������������������������������
NF��������������������������������������������
-�������������������������������������������
kB�����������������������������������������
специфическими ОДН может повысить эффективность дцРНК в противоопухолевой терапии.

160Раздел 3СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ОРОФАРИНГЕАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ ПАЦИЕНТОВПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ И ХРОНИЧЕСКОЙ
ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ
Ю. Б. Дорофеева 1, И. В. Салтыкова 1, В. А. Петров 1,
С. В. Федосенко 1, Л. М. Огородова 1, А. С. Попенко 2, А. В. Тяхт 2,
Н. А. Кириллова 1, Е. С. Куликов 1, И. А. Деев 1, В. М. Говорун 2, 3,
Е. С. Кострюкова 2, 3
1ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет
Минздрава России, г. Томск, 2 ФГБУН «Научно-исследовательский
институт физико-химической медицины» ФМБА Российской
Федерации, г. Москва, 3 ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский)федеральный университет

Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь
легких (ХОБЛ), — наиболее распространенные хронические заболевания органов дыхания у взрослых, приводящие к существенному
снижению качества жизни, ранней инвалидизации и высокой смертности больных.
В наши дни человеческий организм принято рассматривать в свете симбиотических отношений с населяющим его сообществом микроорганизмов, появляется все больше информации об изменении
состава микробиоты человека при различных заболеваниях и ее ролив патогенезе различных расстройств. Ранее микробиота дыхательных
путей при БА и ХОБЛ уже была охарактеризована, но не проводиласьее сравнительная характеристика.
В исследование были включены 138 пациентов с БА и ХОБЛ.
Для получения микробиоты были забраны орофарингеальные мазки,по которым оценивался видовой состав путем секвенирования по вариабельным регионам V3-V4 последовательности генов 16S рРНКна приборе Illumina MiSeq.

Молекулярная биология

161Фильтрация ридов по качеству и их классификация по таксонам
были выполнены при помощи программного обеспечения QIIME,
в качестве референсной базы данных послужила Greengeens версии
V���������������������������������������������������������������
13.5. Для статистического анализа был применен пакет ����������
metagenomeSeq языка R.
В ходе исследования было выяснено, что наиболее представленными родами метагеномных сообществ со значениями 10 % и более,как для пациентов с БА, так и для групп больных с ХОБЛ, являются
Streptococcus, Prevotella и Veillonella. Среди преобладающих микроорганизмов, составляющих от 2 до 10 % микробиоты, в образцах
больных ХОБЛ следует выделить роды Fusobacterium, Neisseria,
Leptotrichia, Haemophilus, Actinomyces, Rothia и Porphyromonas,а в образцах пациентов с БА — роды Fusobacterium, Neisseria,
Leptotrichia, Porphyromonas, Haemophilus, Actinomyces, Rothia
и ActinobacillusТак же в ходе исследования обнаружено преобладание у больных
ХОБЛ с 1–2 степенью тяжести над пациентами с легкой (контролируемой и частично контролируемой) БА бактерий родов: Mycoplasma,Actinomyces�������������������������������������������������������������
, Bordetella�������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������
, Aggregatibacter��������������������������������
�����������������������������������������������
, Veillonella�������������������
������������������������������, Prevotella�������
�����������������
, Cato������nella, Alloiococcus, Peptoniphilus, Sediminibacterium. Тогда как у больных с легкой персистирующей БА более высокой, чем у пациентов
с 1–2 степенью тяжести ХОБЛ оказалась представленность рода Sele�
nomonas, Granulicatella и Gemella.
В то же время у больных тяжелой неконтролируемой БА и ХОБЛтяжелого и очень тяжелого течения (3–4 степени тяжести) статистически значимые различия в составе микробиоты не выявлены, чтопозволяет предположить схожий характер активности иммунной системы при тяжелых стадиях патологий.

162Раздел 3Влияние экспрессии NEDD9 в первичной
опухоли и опухолевом микроокружениина развитие эпителиального рака яичников
Р. Габбасов 1, 2, Л. Бикл 2, Ш. О’Брайн 2,
С. Сио 3, С. Литвин 2, Э. Големис 2,
Э. Бабынин 1, Д. Конолли 2ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный универ�ситет»; 2 Онкологический центр Фокс Чейз, Филадельфия, США;3Университет Токио, Токио, Япония.
1Повышенная экспрессия белка NEDD9 (Neural precursor cell Expressed, Developmentally Downregulated 9) связана с рядом онкологических заболеваний, однако о роли NEDD9 в развитии эпителиального
рака яичников (ЭРЯ) известно мало. ЭРЯ — наиболее опасный ракженской половой системы, занимающий пятое место среди причин
онкологической смертности российских женщин. Обычно ЭРЯ развивается беcсимптомно, и на момент диагностики пациентка имеет
множественные метастазы в перитонеальной полости. В связи с этим,поиск новых диагностических маркёров и мишеней для химиотерапии — приоритетное направление борьбы с ЭРЯ.
Цель исследования — определить влияние экспрессии
NEDD9 на развитие ЭРЯ. Для достижения поставленной цели, ЭРЯмоделировался путём имплантации клеток рака яичника мыши(MOVCAR) в яичники мышей линии MISIIR-TAg-low. В задачи исследования входило определить, зависит ли развитие ЭРЯ от экспрессии
NEDD9 1) в первичной опухоли и 2) в опухолевой микросреде.
Для решения первой задачи, мы провели серию из 3-х имплантаций Nedd9+/+ клеток линии MOVCAR 5009 вяични+/+-/ки Nedd9 и Nedd9 мышей (общее n мышей каждого генотипа = 30). В результате, не было обнаружено значимых различий
у Nedd9+/+ и Nedd9-/- мышей в скорости роста опухолей, количестве
сопровождавших их метастазов и частоте появления асцитов.

Молекулярная биология

163

Для решения второй задачи, мы имплантировали Nedd9+/+ и Nedd9-/MOVCAR клетки в яичники Nedd9+/+ мышей, смоделировав делецию
Nedd9 в первичной опухоли в организме с неизменённым генотипом.
В 3-х независимых экспериментах использовали 6 клеточных линий
(Nedd9+/+: MOVCAR 5009, 6111, 8248; Nedd9-/-: MOVCAR 136, 145,168), каждую из которых имплантировали в 10 мышей. Отсутствие
внутриопухолевой экспрессии NEDD9 привело к снижению скорости
роста опухолей (74±2 и 102±7 дня; p<0,0001; здесь и далее показаны
средние ± SEM для опухолей с генотипами Nedd9+/+ и Nedd9-/- , соответственно), уменьшению количества метастазов в перитонеальной
полости (69,0±3,7 против 30,7±4,3; p<0,001) и уменьшению частоты
появления асцитов (100 % против 68 %, p<0.0001).
Результаты исследования указывают на то, что: а) экспрессия
NEDD9 ускоряет рост и распространение ЭРЯ, б) принципиально
возможно использовать NEDD9 и/или связывающихся с ним белкив качестве мишеней для химиотерапии ЭРЯ, и в) NEDD9 не подходитна роль диагностического маркёра ЭРЯ.
СВОЙСТВА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ СЛЕЗНОЙ
ЖИДКОСТИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ И БОЛЬНЫХ
ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМОЙ
А. Е. Григорьева 1, С. Н. Тамкович 1, М. Р. Кабилов 1, А. В. Еремина 2ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной
медицины, 2 Новосибирский филиал МНТК «Микрохирургия глаза»1Цели и задачи. Глаукома — это комплексное заболевание со сложным патогенезом и невыясненной этиологией, при котором происходят патологические изменения оптического диска. Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ), самая распространенная разновидность
глаукомы, занимает одно из первых мест среди причин неизлечимой
слепоты и имеет важнейшее социальное значение. Анализ механизмов развития глаукомы осложняются тем, что ткани, подверженные

164Раздел 3патологическим изменениям находятся внутри глазного яблока и, соответственно, недоступны для прямого исследования без повреждения структур органа зрения. Слезная жидкость (СЖ) — единственный доступный субстрат для анализа, сбор которой безопасен дляпациента. СЖ — это интерфейс, через который передний отдел глаза
взаимодействует с внешней средой, состав слезной жидкости определяется состоянием всех тканей органа зрения и влиянием внешней
среды, и может служить надежным индикатором патологических
процессов.
В СЖ присутствуют внеклеточные везикулы, включая экзосомы,и микрочастицы — компактные агрегаты макромолекул. Обе группы
частиц присутствуют во всех биологических жидкостях и не выделяются одна без другой. Образцы внеклеточных везикул, выделенные из СЖ, содержат многочисленные маркеры, исследование и характеризация которых может помочь в понимании патогенеза ПОУГи предсказании развития данного заболевания. Цель данного исследования: выделить и исследовать образцы внеклеточных везикул
больных первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) и сравнитьих с образцами здоровых людей.
Материалы и методы. Описанным ранее способом собирали образцы СЖ у 33 больных ПОУГ (45–60 лет, 22 женщины и 11 мужчин)из которых у 16 пациентов была начальная стадия ПОУГ (ПОУГ I),
у 10 — развитая (ПОУГ II) и у 7 — далеко зашедшая (ПОУГ III). В качестве группы сравнения использовали 29 образцов СЖ людей безофтальмологических заболеваний. Образцы СЖ центрифугировалидля осаждения клеточного дебриса, 20 мкл полученного супернатанта СЖ использовали для электронно-микроскопического исследования, оставшийся — для выделения экзосом и микрочастиц.
Для выделения экзосом и микрочастиц супернатант СЖ подвергали ультрафильтрации и двойному ультрацентрифугированию. Данный препарат в дальнейшем именуется «экзосомы», в отличие от супернатанта СЖ.
Образцы изучали методом негативного контрастирования в просвечивающем электронном микроскопе �����������������������������
JEM��������������������������
1400 (�������������������
Jeol���������������
, Japan��������
�������������) с цифровой фотокамерой Veleta (SIS, Germany). Размер частиц измеряли

Молекулярная биология

165

непосредственно на экране камеры, используя пакет программ iTEM
(Olympus SIS, Germany). В 18 образцах супернатанта больных ПОУГI и II измерен диаметр случайно выбранных 970 структур и обнаружено, что соответственно и 69 % из них были везикулами, размером
40–100 нм. В 15 образцах супернатанта здоровых людей измерено
770 структур, 72 % из них имели размер 40–100 нм.
Концентрацию экзосомной ДНК СЖ определяли с помощью
М-ПЦР-РВ. Выделенную из образцов ДНК инкубировали с РНКазой
А, концентрировали переосаждением и фрагментировали с помощью
Covaris���������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������
S�������������������������������������������������������
2 (����������������������������������������������������
Covaris���������������������������������������������
). Полученные фрагменты секвенировали на секвенаторе Genomics Core Facility on MiSeq (Illumina).
Результаты и обсуждение. Везикулы являются обязательным
компонентом любой биологической жидкости. СЖ не является исключением — в супернатантах СЖ содержится множество везикул.
Везикулы имеют ограничивающую мембрану, обычно округлуюили чашеобразную форму и размер 40–250 нм. Везикулы размером
40–100 нм по морфологии можно отнести к экзосомам. Образцы СЖбольных ПОУГ I и II и образцы здоровых людей содержат одинаковое количество везикул. Образцы СЖ больных ПОУГ III отличаются от других морфологией и концентрацией везикул — количество
везикул меньше, некоторые везикулы покрыты «оболочкой» из материала низкой электронной плотности. Микрочастицы — компактные
агрегаты макромолекул (20–40 нм), присутствуют в СЖ здоровых
людей и больных ПОУГ. Исследование показало, что микрочастицыв образцах здоровых людей и больных ПОУГ ведут себя по-разному.
В образцах здоровых людей микрочастицы не связаны друг с другом или другими белками, в то время как в образцах больных ПОУГмикрочастицы часто образуют крупные комплексы друг с другом илиже с белковыми агрегатами.
Доля микрочастиц (20–40 нм) в образцах как больных ПОУГ, таки здоровых людей составляла в среднем 20 %. Никаких статистически
значимых отличий в размерных характеристиках везикул и микрочастиц между группами супернатантов СЖ не наблюдалось.
Ультрафильтрация и двойное ультрацентрифугирование супернатантов СЖ обеспечивают элиминацию частиц размером больше

166Раздел 3

100 нм, однако, не влияют на морфологию остальных везикул и микрочастиц. Стоит отметить, что в образцах «экзосом» больных ПОУГIII были обнаружены везикулы с оболочкой из материала низкой
электронной плотности, как и в образцах супернатантов. Так же долямикрочастиц в образцах «экзосом» уменьшается и составляет у больных ПОУГ в среднем 10 %, у здоровых людей — 15 %. Тем не менее,никаких статистически значимых отличий в размерных характеристиках частиц в образцах экзосом здоровых людей и больных ПОУГобнаружено не было.
Было показано, что концентрация ДНК в образцах больных ПОУГсильно варьирует. У некоторых больных она на порядок выше, чемв образцах здоровых людей, а у других — ниже. Образцы больных
ПОУГ с самой высокой концентрацией ДНК содержат фрагменты
бактериального генома. Эти данные согласуются с недавно выдвинутой теорией, что на развитие глаукомы оказывают влияние микроорганизмы.
В работе показано присутствие экзосом в СЖ больных ПОУГи проведено сравнение их свойств с экзосомами СЖ здоровых
людей. Экзосомы и микрочастицы супернатантов больных ПОУГI и ПОУГ II не отличаются друг от друга по морфологическим характеристикам, тогда как образцы больных ПОУГ III имеют рядособенностей, которые явно выделяют их среди остальных образцов. Образцы больных ПОУГ так же отличает вариабельность концентрации ДНК. Таким образом, состав СЖ меняется на субклеточном и молекулярном уровне в процессе развития глаукомы, и СЖпредстает как перспективный источник диагностических маркеров
офтальмологических заболеваний, требующий дальнейших тщательных исследований.

Молекулярная биология

167

ИССЛЕДОВАНИЕ ФОРМИРОВАНИЯ ВТОРИЧНЫХ
СТРУКТУР ДНК В РАЙОНЕ ЛОМКОГО САЙТА FRAXAУ ПАЦИЕНТОВ С СИНДРОМОМ МАРТИНА-БЕЛЛИ. В. Грищенко 1, А. А. Дольский 1, С. В. Кулемзин 3,
В. О. Пустыльняк 4, К. Усдин 2, Д. В. Юдкин 1, 3Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск,The National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases,
Bethesda, United States, 3 Институт молекулярной и клеточной
биологии СО РАН, г. Новосибирск, 4 ГУ Научно-исследовательский
институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН12Экспансия повторенных микросателлитных последовательностейэто особый тип мутаций, который заключается в резком увеличении
количества повторов на сотни и даже тысячи единиц. Это явление
приводит к ряду генетических заболеваний человека таких, как болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующая миоклоническая эпилепсия и др. На сегодняшний день причина развития этой мутации неизвестна. Согласно одной из теорий,объясняющих это явление, экспансия связана с образование термодинамически устойчивых вторичных структур ДНК, обогащенных
гуанином — G-квадруплексов. На участках с этими структурами
происходит сбой работы систем репарации, а также ДНК-полимераз,что приводит к нарушению репликации и к резкому увеличению размера повтора.
Одним из распространенных заболеваний, связанных с экспансией является синдром Мартина-Белл (синдром ломкой X-хромосомы).
Он обусловлен экспансией повтора CGG в промоторной области генаFMR���������������������������������������������������������
1. Данное заболевание приводит к развитию у пациентов наследственной умственной отсталости, аутизму, эпилепсии, расстройствам речи и некоторым физическим аномалиям. Количество этихповторов в норме варьирует от 5 до 54 единиц, синдром развиваетсяпри количестве повторенных триплетов более 200.

Раздел 3168

В 2013 году в Кембриджском университете был сконструирован
scFv-фрагмент антитела специфичный к G-квадруплексам. Авторы
подтвердили его сродство к этим структурам на геномной ДНКна фиксированных препаратах фибробластов человека.
Цель нашей работы — показать возможность формирования
G-квадруплексов в районе вероятной экспансии повторов в живой
клетке, а так же подтвердить высокую степень сродства scFv к этимвторичным структурам in vitro.
Работа была проведена на культурах иммортализованных
В-лимфоцитов пациентов (gm04025, gm06897) и контрольных клеточных линиях (gm06895), полученных из клеточного банка Института
Кориелла (США).
В ходе исследования нами проведена колокализация сигналов антител и ВАС клона (RP11-489K19), содержащего полную копию генаFMR1 на фиксированных препаратах ядер и метафазных хромосом
клеток пациентов и контрольных линий.
ИНТЕГРАТИВНАЯ И ЭПИСОМАЛЬНАЯ ФОРМЫ ВИРУСА
ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ГЕНОТИПА В ИЗМЕНЕННОМ
ЦЕРВИКАЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ *М. К. Ибрагимова 1, 2, М. М. Цыганов 1, 2, И. В. Карабут 1Томский НИИ онкологии, г. Томск, Россия, 2 Национальный
исследовательский Томский государственный университет,г. Томск, Россия
1Актуальность. В инфицированной клетке вирус папилломы человека (ВПЧ) может существовать в эписомальной форме (вне хромосом клетки) — считается доброкачественной, интегрированной
Работа поддержана грантом РФФИ 15-34-20568 «Изменение генетического ландшафта дисплазии в процессе злокачественной трансформации»и программой повышения конкурентоспособности Национального исследовательского Томского государственного университета.
*Молекулярная биология

169(встроенной в геном клетки) — расценивается как злокачественная
форма персистирования вируса и смешанной форме (наличие свободного и встроенного в ДНК клетки-хозяина вируса). Прогрессияот клеточных изменений, связанных с ВПЧ-инфекцией, до развития
рака шейки матки (РШМ) занимает около 10–40 лет, но редко может
развиться и за 1–2 года, что, несомненно, доказывает важность своевременного мониторинга больных папилломавирусной инфекциейи проведения вирусологических исследований для выявления групп
риска развития онкологической патологии.
Целью настоящей работы явилось изучение частоты интегрированных форм ВПЧ 16 при предопухолевых и злокачественных патологиях шейки матки.
Материал и методы. Вирусологическое исследование было проведено 148 женщинам Томской области в возрасте от 20 до 76 лет,проходивших осмотр (условно здоровые женщины) и/или получавших лечение в Томском НИИ онкологии (с различными патологиями
шейки матки). Все пациентки являлись носителями моноинфекции
ВПЧ 16 генотипа. Материалом для исследования послужили соскобы эпителия цервикального канала и шейки матки. В зависимости от диагноза все пациентки были разделены на группы: 1 группа — условно здоровые женщины (n=30, средний возраст 30,1±1,6),
2 группа — женщины с LSIL(CINI) и HSIL (������������������������
CINII�������������������
-������������������
III���������������
) эпителия шейки матки (n=53, средний возраст 38,5±0,8), 3 группа — женщиныс РШМ I-IV (n=65, средний возраст 44,3±1,2). Всем пациентам былопроведено определение физического статуса ДНК ВПЧ 16 типа. Выявление и оценка физического статуса генотипа ДНК ВПЧ 16 в ДНКклетки-хозяина проводилось с использованием набора реагентов
фирмы «Amplisens®» (кат. номер R-V31-F) (Москва, Россия). Значение вирусной нагрузки рассчитывалось в геномных эквивалентахДНК ВПЧ/105 клеток. Согласно инструкции к наборам порог клинически значимой (высокой) вирусной нагрузки принимался равным
3 lg ДНК ВПЧ /105 клеток в соскобе. Выявление области Е6 при отсутствии области E1/Е2 интерпретировалось как интеграция вируса в ДНК человека, выявление области Е6 при наличии области E1/
Е2 — как смешанная форма вируса, отсутствие области Е6 при на-Раздел 3

170

р; OR (95CI %)OR-Odds Ratio(Отношение
шансов)Здоровые (n = 30) 21 (70,0 %)

9 (30,0 %)–LSIL (CIN I) (n = 6) 5 (83,3 %)

1 (16,7 %)–CIN II (n = 16) 4 (25,0 %)

12 (75,0 %)HSILВысокая
вирусная
нагрузка
> 3 lg ДНКВПЧ/105 клеток

Низкая вирусная
нагрузка
< 3 lg ДНКВПЧ/105 клеток

Всего
148 моноинфицированных
ВПЧ16+
пациенток

личии области E1/Е2 — как эписомальная форма вируса. Для оценки
статистической значимости различий в распределении частот качественных признаков между группами использовали критерий Фишера. Подсчеты осуществляли на калькуляторе http://vassarstats.net/
odds2x2.html. Для таблицы 2 × 3 был использован калькулятор http://
gen-exp.ru/calculator_or.php.
Результаты и обсуждение. При сравнении частоты встречаемости
клинически значимой вирусной нагрузки для выбранных ВПЧ16+пациенток, было показано, что частота встречаемости высокой вирусной нагрузки у пациенток групп CIN II, всех больных и другими
патологиями матки статистически значимо превышает частоту встречаемости высокой вирусной нагрузки для группы здоровых женщин(р от 1,98*10-7 до 0.004 (табл.1)). Также было показано, что частота встречаемости высокой вирусной нагрузки у пациенток групп
РШМ I-II, РШМ III-IV и общей группы с диагнозом РШМ (РШМI���������������������������������������������������������������
-��������������������������������������������������������������
IV������������������������������������������������������������
) статистически значимо превышает частоту встречаемости клинически значимой вирусной нагрузки для группы пациенток с CIN
I (р от 0.001 до 0.01) (табл. 1).
Таблица 1Вирусная нагрузка ВПЧ16 (моноинфекция)у пациенток с патологией шейки матки

CIN III(n = 31)

2 (6,4 %)р1 = 0.004, OR = 7.0 (1.8–27.7)
р2 = 0.02, OR = 15 (1.3–169.9)
р1 = 1,98*10-7, OR =33.83 (6.62–173.0)
29 (93,6 %)р2= 0.0002, OR =72.5 (5.5–958.1)

171Молекулярная биология

Окончание табл. 1
Все больные CIN
11 (20,8 %) 42 (79,2 %)I-III (n = 53)

РШМ I-II (n = 20)

2 (10,0 %)

18 (90,0 %)РШМ III-IV(n = 45)

8 (17,8 %)

37 (82,2 %)Все больные
10 (15,4 %) 55 (84,6 %)РШМ I-IV (n = 65)

р1 = 0.00001, OR =8.91 (3.2–24.8)
р2 = 0.004, OR =19.1 (2.0–180.7)
р1 = 0.00003, OR =21 (4.0–110.1)
р2 = 0.001, OR =45 (3.4–604.0)
р1 = 0.000008, OR =10.8 (3.6–32.1)
р2 = 0.002, OR =23.1 (2.4–225.9)
р1 = 2,7*10-7, OR =12.8 (4.6–36.0)
р2 = 0.001, OR =27.5 (2.9–261)Примечание: р1 — различия статистически значимы по сравнениюс группой здоровых лиц, р2 — различия статистически значимыпо сравнению с группой CIN I

Следующим этапом работы была оценка частоты интеграции
ВПЧ 16 генотипа в ДНК на изучаемой выборке. Частота интегрированных форм составила: в группах с патологией шейки матки (CINIIII и РШМI-IV) была в два раз выше, чем у условно здоровых (рис.1).
Частота смешанных форм в группе РШМI-IV была несколько выше,чем у здоровых и пациенток с дисплазией. Частота эписомальных
форм ВПЧ снижалась по мере утяжеления диагноза и была равна
0 в группе РШМI-IV. Статистически значимые различия по частоте встречаемости различных форм ВПЧ 16 в группах наблюденияна уровне р < 0,002 выявлены для эписомальной формы ВПЧ 16 типав группе больных РШМ (по сравнению с группой здоровых лиц,OR(95CI %) = 1.2 (1.08 – 1.48), а также для группы больных РШМпо сравнению с группой больных дисплазией эпителия шейки матки
(р = 0,02, OR��������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������
(95�����������������������������������������������������
CI���������������������������������������������������
%) = 1.11 (1.01 – 1.22)). Для смешанной и интегрированной формы ВПЧ статистически значимых различий выявленоне было (рис. 1). Сравнение распределения частот всех трех форм

172Раздел 3(эписомальной, смешанной и интегрированной) между больнымиРШМ и ��������������������������������������������������������������
CIN�����������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������
I���������������������������������������������������������
-��������������������������������������������������������
III�����������������������������������������������������в таблице 2 × 3 (тест хи-квадрат) показало, что распределение частот форм вируса статистически значимо различаетсяна уровне значимости 95 % (р = 0,04).

Рис. 1. Частота встречаемости различных форм ВПЧ 16 в группах наблюдения

Заключение. Полученные данные относительно физического
статуса ВПЧ подтверждают значимость трансформирующего воздействия интегрированной формы ВПЧ на клетку-хозяина. Дальнейшее изучение патогенеза, особенностей клинического течения ВПЧ,а также раннее выявление физического статуса вируса в диагностическом плане позволит разработать более совершенную тактику комбинированной терапии с учетом различных клинических проявлений, что приведет к снижению количества рецидивов и прогрессии
злокачественной трансформации при патологиях шейки матки.

Молекулярная биология

173ИЗУЧЕНИЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ РИККЕТСИЙИ ИХ ПЕРЕНОСЧИКОВ НА ТЕРРИТОРИИ
НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ
М. Ю. Карташов 1, 2, Т. П. Микрюкова 1, 3, В. А. Терновой 1, 3,
Н. С. Москвитина 3, В. Б. Локтев 1, 2, 3ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор», 2 Национальный исследовательский
Новосибирский государственный университет,3 Национальный
исследовательский Томский государственный университет
1Введение. Инфекции, передающиеся иксодовыми клещами, составляют подавляющую часть всех регистрируемых случаев природноочаговых инфекций в России. Наряду с вирусным клещевым энцефалитом и иксодовым клещевым боррелиозом, риккетсиозы занимают важное место в структуре инфекционной патологии. В настоящее
время в России регистрируют заболевания только двумя риккетсиозами из группы клещевой пятнистой лихорадки: североазиатский
клещевой риккетсиоз, вызываемый R. sibirica и распространенный
преимущественно в азиатской части России, и астраханская пятнистая лихорадка, встречающаяся на побережье Каспийского моряи вызываемая R. conori subsp. caspia. Кроме того, случаи риккетсиоза, вызванного R. heilongjiangenesis, зарегестрированы в Хабаровском крае. Использование современных молекулярно-биологических
методов позволило обнаружить в клещах, собранных на территории
России, генетический материал и других патогенных для человека
видов риккетсий, а так же риккетсий с неустановленной патогенностью (R. slovaca, R. raoultii, R. helvetica, R. aeschlimannii, Candidatus
R. tarasevichiae и др.).
Цель данного исследования состояла в изучении распространенияи видового разнообразия риккетсий в клещах рода Ixodes и Dermacentor,собранных в различных биотопах Новосибирской области или снятыхс людей, обратившихся в пункт серопрофилактики.

174Раздел 3Задачи, поставленные для решения цели исследования, включалив себя сбор клещей; установление их видовой принадлежности путем определения нуклеотидной последовательности фрагмента генацитохромоксидазы; детекция генетического материала риккетсийв собранных клещах методом ПЦР; генотипирование выявленных
риккетсий путем определения нуклеотидных последовательностей
фрагментов ряда маркерных генов, а также анализ полученных результатов.
Материалы и методы. В исследование взято 805 клещей:305 клещей было собрано в окрестностях г. Новосибирскав весенне-летний период 2014�������������������������������������
 ������������������������������������
г. методом сбора «на флаг», 500 клещей было снято с людей, обратившихся за медицинской помощьюв пункт серопрофилактики в мае 2014������������������������
 �����������������������
года. Гомогенизацию образцов осуществляли с использованием лабораторного гомогенизатора TissueLyser LT (Qiagen, Германия) в 300�������������
 ������������мкл стерильного физраствора. Выделение нуклеиновых кислот производили
из 100 мкл гомогената методом фенол-хлороформной экстракциис использованием коммерческого набора «Литех» (Россия) согласно инструкции производителя. Для генотипирования вида клещей
были использованы праймеры на фрагмент гена субъединицы �����
I����
цитохромоксидазы COI, локализованного в митохондриальном геноме клещей [1]. С целью скрининга исследуемых образцов на наличие ДНК риккетсий была использована пара праймеров CS409d
и RP1258n [2], предназначенных для выявления фрагмента генаgltA длиной 769�������������������������������������������
 ������������������������������������������
н. ДНК-фрагменты были секвенированы на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems, США). Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с ранее опубликованными при помощи
поискового приложения BLAST c использованием сервера NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Результаты. В исследование вошла выборка из 305 клещей
(220 клещей рода Ixodes и 85 клещей рода Dermacentor), собранных«на флаг» в окрестностях г. Новосибирск. Среди клещей рода Ixodes
встречались представители двух видов — I. persulcatus (42 клеща)и I. рavlovskyi (178 клещей). Клещи рода Dermacentor были представ-Молекулярная биология

175лены одним видом Dermacentor reticulatus. По результатам исследования методом ПЦР уровень зараженности риккетсиями клещей родаIxodes составил 13,1±2,2 %, для клещей D. reticulatus он составил
38,2±5,4 %.
Из 500 снятых с людей клещей 309 были отнесены к роду Ixodes(226 — I. persulcatus и 83 — I. рavlovskyi); 191 образец к родуDermacentor (164 — D. reticulatus и 27 — D. marginatus). Уровень инфицированности клещей рода Ixodes составил 24,5±2,4 %. Для клещей рода Dermacentor показатель оказался равным 40,3±3,5 %.

Рис 1. Видовой состав исследуемых клещей и уровень зараженности
клещей риккетсиями

Результаты генотипирования риккетсий по гену gltA показали,что клещи рода Ixodes в подавляющем числе случаев инфицированы
Candidatus R. tarasevichiae, однако из двух клещей I. persulcatus, снятых с людей, была изолирована ДНК R. helvetica. Генотипирование
риккетсий, изолированных от клещей рода Dermacentor показало ихпринадлежность к R. raoultii. В одном случае из клеща D. marginatus,снятого с человека, была изолирована ДНК R. sibirica.
Уровень гомологии по фрагменту гена gltA всех выделенных изолятов Candidatus R. tarasevichiae из Новосибирской области составил 100 % с изолятами, раннее обнаруженными в Западной Сибири
(Candidatus R. tarasevichiae strain Ust'-Tarka, DQ168981) и Восточной
Сибири (Candidatus R. tarasevichiae strain Stolby, DQ168982), а также в Китае (Candidatus R. tarasevichiae isolate MDJ13, JX996054).

176Раздел 3Гомология нуклеотидной последовательности гена gltA выделенной R. helvetica составила 100 % с последовательностью изолятов
R. helvetica, циркулирующих в Германии (HQ232251) и Румынии
(JX683116). Изоляты R. raoultii из Новосибирской области по фрагменту гена gltA идентичны ранее описанным изолятам, циркулирующим в Европе (DQ365803, AF120029). Кластеризация на филодендрограмме изучаемых изолятов со своими прототипами при достоверном индексе поддержки ветвей (≥�������������������������������
 ������������������������������
70) свидетельствует о корректности проведенного нами генотипирования.
Заболевания, вызываемые выявленными в клещах возбудителями,отличаются разнообразием клинических симптомов, поэтому онимогут быть ошибочно приняты за более распространенный Североазиатский клещевой риккетсиоз разной степени тяжести [3].
До недавнего времени Candidatus R. tarasevichiae находиласьв статусе риккетсии с неустановленной патогенностью. В 2013 годукитайскими врачами была описана клиническая симптоматика
у 5 пациентов, в крови которых была детектирована ДНК этойбактерии [4]. Присутствие Candidatus R. tarasevichiae выявленов иксодовых клещах, собранных в различных регионах Россииот Архангельской области до Камчатки и Приморского края, однако инфекции, вызываемые этим патогеном, в России пока не диагностированы.
Клинические проявления инфекции, вызываемой R. helvetica, довольно разнообразны. Инфекция может иметь мягкое течение с развитием лихорадки, сыпи и миалгии. Инфекция может протекать и более серьезно. Так ДНК R. helvetica была изолирована от пациентовс менингитом, а также обнаружена в образцах от нескольких больных, умерших от перимиокардита. R. helvetica циркулирует в клещах I. ricinus и I. рersulcatus на обширной территории от Франциидо Японии и Таиланда. В России R. helvetica детектирована в Пермском крае, Челябинской области и на Камчатке.
В настоящее время роль R. raoultii в качестве этиологического
агента синдрома TIBOLA (tick-borne lymphadenopathy; лимфаденопатия, передающаяся клещами) подтверждена серологическими
методами и выявлением ДНК в крови больных. R. raoultii широко

Молекулярная биология

177распространена в Европе (Франция, Испания, Германия, Венгрия,Польша), встречается также в Азии и Северной Африке. Ранее ДНКриккетсий, генетически близких к R. raoultii, была обнаруженана территории Омской области и Алтайского края, а также на территории Казахстана.
Полученные данные подтверждают широкое распространениеи разнообразный видовой состав риккетсий, переносимых клещамина территории Новосибирской области, и поднимают вопрос о необходимости коррекции существующих методов дифференциальной
диагностики вызываемых ими инфекций. Совершенствование лабораторной диагностики, основанной прежде всего на молекулярных
методах, позволит осуществлять более быструю и надежную идентификацию классических и новых риккетсиозов, а также клинических
случаев с атипичными симптомами.
Список литературы
1. Mikryukova T. P. и др. Complete������������������������������������������
mitogenome of the ixodid tick Ixodes pavlovskyi (Acari: Ixodida) // Mitochondrial DNA. 2014.
2. Roux V. и др. Citrate synthase gene comparison, a new tool forphylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae // Int. J. Syst.
Bacteriol. 1997. Т. 47, № 2. С. 252–261.
3. Еремеева М. Е., Шпынов С. Н., Токаревич Н. К. Современные
подходы к лабораторной диагностике риккетсиозов // Инфекцияи иммунитет. 2014. Т. 4, № 2. С. 113–134.
4. Jia N. и др. Human infection with Candidatus Rickettsia tarasevichiae // N. Engl. J. Med. United States, 2013. Т. 369, № 12.
С. 1178–1180.

178Раздел 3ФОРМИРОВАНИЕ НЕОБРАТИМЫХ
КОМПЛЕКСОВ С ДНК — ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ ФУНКЦИЯ
ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ *А. А. Косова, С. Н. Ходырева, О. И. Лаврик
Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАНГлицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) (КФ 1.2.1.12)
широко известна как фермент гликолиза, катализирующий реакцию:D-глицеральдегид-3-фосфат + NAD+ + HPO42- ↔ 1,3-дифосфоглицерат
+ NADH + H+. Активный фермент является тетрамером с молекулярной массой около 150 кДа, состоящим из одинаковых субъединицс массой около 37 кДа. Мономер GAPDH имеет NAD+-связывающий
центр, находящийся в пределах амнокислотных остатков 1–150.
GAPDH — эволюционно консервативный белок; ее доля может составлять до 10–20 % от общего количества белка в клетке. Кроме того,GAPDH имеет множество дополнительных функций, не связанныхс гликолизом, участвуя в мембранном транспорте, сборке микротрубочек, клеточной сигнализации и др. GAPDH способна взаимодействовать с ДНК и РНК, повреждениями ДНК (структурными аналогами нуклеотидов и ковалентными аддуктами ДНК с алкилирующими агентами) и ферментами репарации ДНК (APE1, HMGB1).
Апуриновые/апиримидиновые (AP) сайты, возникающие в клетках млекопитающих с частотой от 10000 до 50000 раз в сутки, —одни из наиболее распространенных повреждений геномной ДНК.
Потеря оснований ДНК и последующее формирование AP-сайтов
происходят путем спонтанного гидролиза N-гликозидной связи илив результате катализируемого ДНК-гликозилазами удаления поРабота поддержана РНФ (проекты № 14-24-00038, 14-14-00501), программой президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», РФФИ(проект № 13-04-01426).
*

Молекулярная биология

179

врежденных оснований на ранней стадии процесса эксцизионной
репарации оснований. Нерепарированные AP-сайты мутагенныи цитотоксичны.
Целью данного исследования являлась идентификация белка клеточных экстрактов человека, специфично взаимодействующего с APсайтом в составе одноцепочечной ДНК и частичного ДНК-дуплекса,содержащего длинные одноцепочечные концы. В работе использовали сшивку белков с ��������������������������������������������
AP������������������������������������������
-ДНК в присутствии боргидрида натрия, опосредованную образованием основания Шиффа, в комбинации с гельэлектрофорезом и MALDI-TOF масс-спектрометрией.
Белок, который в присутствии боргидрида формирует преобладающий ковалентный аддукт с молекулярной массой около 45 кДас ��������������������������������������������������������
AP������������������������������������������������������
-ДНК, содержащей одноцепочечные участки, был идентифицирован как изоформа GAPDH методом пептидного картированияна основе данных масс-спектрометрии. Затем GAPDH была выделенаиз клеток HeLa��������������������������������������������������
������������������������������������������������������для изучения ее взаимодействия с различными типами AP-ДНК. Показано, что GAPDH формирует не только боргидридзависимые, но и боргидрид-независимые аддукты с AP-сайтами.
Доля последних составляет около 30 %, они являются необратимыми(в отличие от оснований Шиффа) и формируются, вероятно, при участии окисленных ����������������������������������������������
SH��������������������������������������������
-групп белка. Данное предположение подтверждается тем, что после восстановления дисульфидной связи GAPDHтеряет способность образовывать аддукты с AP-ДНК. NAD+ также
ингибирует образование аддуктов GAPDH–AP-ДНК, поскольку вовзаимодействии GAPDH с ДНК участвует ее NAD+-связывающий
центр. Установлено, что GAPDH�������������������������������
������������������������������������
взаимодействует преимущественно с AP-сайтами, расщепленными по механизму β-элиминирования
(спонтанно или под действием AP-лиаз), однако не обладает APлиазной активностью. Кроме того, была исследована возможность
использования AP�����������������������������������������������
�������������������������������������������������
-ДНК в качестве зонда для детекции ������������GAPDH�������в клеточных экстрактах. Показано, что GAPDH формирует аддукты с APДНК с наибольшей интенсивностью в экстрактах клеток лимфоидного происхождения.
На основе вышеописанного в клетках может осуществляться следующий сценарий. В условиях окислительного стресса в ���������GAPDH����
об-Раздел 3180разуется дисульфидная связь, что, согласно литературным данным,повышает ее способность связываться с ДНК. Затем GAPDH��������
�������������
перемещается в ядро, где она может присутствовать в форме мономера илидимера. В то же время при окислительном стрессе повреждается ДНКи активируется ������������������������������������������������
PARP��������������������������������������������
-1, синтезирующая поли(���������������������
ADP������������������
-рибозу) с использованием NAD+. В результате этого истощается клеточный пул NAD+,освобождается NAD+-связывающий центр ���������������������GAPDH����������������, и фермент приобретает способность связываться с ДНК. Если в одноцепочечном
фрагменте ДНК присутствует расщепленный AP�����������������
�������������������
-сайт, ����������GAPDH�����
формирует стабильный ковалентный аддукт с этим повреждением. Таким
образом, формирование необратимого комплекса GAPDH����������
���������������с ДНК является «суицидальным» событием, которое препятствует репарацииДНК в случае, если накоплено слишком много повреждений, и может
быть одним из факторов, приводящих к апоптозу.
Список литературы
Kosova A. A., Khodyreva S. N., Lavrik O. I. (2015) Glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase (GAPDH) interacts with apurinic/apyrimidinicsites in DNA. Mutat. Res., 779, p. 46–57.
ИССЛЕДОВАНИЕ СУБСТРАТНЫХ СВОЙСТВ
ФОСФОРИЛГУАНИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В РЕАКЦИЯХ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ
ДНК- ПРОЦЕССИРУЮЩИМИ ФЕРМЕНТАМИ *О. С. Кравчук, М. С. Купрюшкин, Е. В. Дмитриенко
Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирский государственный университет
Достижения в области молекулярной биологии в конце XX векапривели к широкому использованию олигонуклеотидов и их про*Научный руководитель — канд. хим. наук Е. В. Дмитриенко.

Молекулярная биология

181

изводных в качестве эффективного инструмента для исследований.
В настоящее время, аналоги олигонуклеотидов, содержащие в своем составе различные модификации, продолжают завоевывать всебольший интерес исследователей. Модификации позволяют вводитьв состав олигонуклеотида различные реакционноспособные, интеркалирующие, репортерные группы, с помощью которых удается направленно изменять свойства олигонуклеотидов или придавать имнеобходимые функции.
Существует несколько типов модификации структуры олигонуклеотидов в зависимости от места их введения: модификация по гетероциклическому основанию, модификация по дезоксирибизе, модификация по межнуклеотидной связи.
Зачастую, при использовании аналогов нуклеиновых кислот, возникают проблемы, связанные с недостаточным и не специфичным
проникновением олигонуклеотидов в клетки в отсутствие доставочных систем, а также, с невозможностью последних выжить в клеточных структурах или иных биологических средах. Одним из важных
направлений модификации, позволяющее решить вышеуказанные
проблемы- модификация природной фосфодиэфирной связи между
соседними нуклеотидами. Таким образом, в конце 2014 г. в ИХБФМСО РАН был предложен новый тип производных нуклеиновых кислот на основе фосфорилгуанидинов (ФГ) с регулируемым числом заряженных остатков. [1] В отличии от нативных нуклеиновых кислот
место фосфатных групп занимают незаряженные фосфорилгуанидиновые группировки. Так как новые фосфорилгуанидиновые аналогине несут отрицательный заряд, то теоретически, они должны проще
проникать сквозь клеточную мембрану. Что касается устойчивостик действию ферментов- данные аналоги нуклеиновых кислот прошли
испытание на устойчивость к действию фосфодиэстеразы змеиного
яда. Стоит обратить внимание на ещё одно важное свойство фосфорилгуанидинов. Установлено, что двойные спирали с фосфорилгуанидиновыми группами мало отличаются по стабильности от природной спирали ДНК.
Следовательно, фосфорилгуанидиновые производные нуклеиновых кислот расширяют возможности научных методов конструи-182Раздел 3рования синтетических нуклеиновых кислоткак возможных лекарственных препаратов нового поколения и средств медицинской диагностики.
Цель работы — исследование субстратных свойств фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов в реакциях, катализируемых ДНК-процессирующими ферментами.
Сконструированы модельные системы для исследования субстратных свойств модифицированных олигонуклеотидов под действием ДНК-зависимых ферментов. В случае ферментативного удлинения с помощью Taq-полимеразы и фр.Кленова комплексы состояли
из 20- звенной модифицированной матрицы и 8- звенного праймера
или 30- звенной матрицы и 20- звенного модифицированного праймера. В случае лигирования исследована одна система, содержащая
20- звенную модифицированную матрицу и короткие лигируемые
олигонуклеотиды длинной 8-и 12- звеньев. Таким образом, на примере 20- и 30-звенных олигонуклеотидных комплексов, содержащих ФГ-модификацию в разных положениях олигонуклеотида, выступающего как в качестве матрицы, так и удлиняемого фрагмента,изучена эффективность реакции элонгации с использованием ДНКзависимых ДНК-полимераз и реакции лигирования с использованием ДНК-лигаз.
Показано, что число и положение модифицированных остатков
является фактором, определяющим особенности топологии ферментсубстратного комплекса.
Список литературы
М. С. Купрюшкин, Д. В. Пышный, Д. А. Стеценко // Acta naturae,
2014, 6, 53.

Молекулярная биология

183

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРИРОДНОГО МУТАНТА
ТИРОЗИЛ-ДНК-ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 1 (SCAN1)НА МОДЕЛЬНЫХ ДНК-СУБСТРАТАХ
Т. А. Кургина 1, Р. О. Анарбаев 2, О. И. Лаврик 2Алтайский государственный университет (Барнаул, Россия),Институт химической биологии и фундаментальной медицины
(Новосибирск, Россия)12Тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 (TDP1) — фермент, препятствующий накоплению ковалентных аддуктов топоизомеразы
I (TOP1) с ДНК, гидролизует 3'-фосфотирозильные связи (Pouliot et.
al�������������������������������������������������������������
. 2001). Каталитический механизм ����������������������������
TOP�������������������������
1 включает в себя образование ковалентного интермедианта TOP1-ДНК. (Champoux, 2001).
Зачастую, под действием каких-либо факторов комплекс TOP1-ДНКне разрушается, и фермент «застревает» на ДНК. TDP1 гидролизует
остаток тирозина TOP1, ковалентно связанного с 3'-фосфатом ДНК,что также происходит с образованием ковалентного интермедианта
(комплекс TDP1-ДНК) (Pommier et. al. 2006). Гомозиготная мутацияв гене TDP1(замена гистидина на аргинин в активном сайте TDP1)
является причиной редкого нейродегенеративного заболевания —спиноцеребеллярной атаксии с аксональной нейропатией (SCAN1)(Takashima ��������������������������������������������������������
et������������������������������������������������������
.�����������������������������������������������������
al���������������������������������������������������
. 2002). Исследования показали, что к появлению фенотипа SCAN1 приводит накопление ковалентных комплексов TDP1ДНК, т.к. SCAN1 способен катализировать лишь стадию образования
ковалентного интермедианта TDP1-ДНК, но не последующий гидролиз этого комплекса (Interthal.et. al. 2005)
Целью нашей работы было выявление активности SCAN��������
������������
1 на модельных ДНК-субстратах.
В качестве тест-системы для определения активности TDP1 использовались олигонуклеотиды различной длинны, имеюшие флуорофор 5(6)-карбоксифлуоресцеин (FAM) на 5'-конце и тушитель Black
Hole Quencher 1 (BHQ1) на 3'-конце. В данных структурах за счет

184Раздел 3резонансного диполь-дипольного переноса энергии (FRET) от FAM
к BHQ1 флуоресценция минимальна. Когда фермент отщепляет тушитель с 3'-конца, происходит распад структуры с последующим
возгоранием флуоресценции. Для измерения флуоресценции использовался флуориметр CLARIOstar производства BMG LABTECH(Германия).
Нами была изучена активность SCAN1 на олигонуклеотидахс длинной цепи 6, 10 и 16 нуклеотидных остатков (н.о.) и шпилечнойДНК с 1,12-додекандиол-фосфатом, произведено варьирование концентрации субстрата. Сравнена активность SCAN1 и TDP1.
Реакционные смеси (объемом 20 мкл) содержали буфер (50 мМ
TrisHCl, pH=8,0; 50 мМ NaCl; 1 мкМ DTT;) и субстраты концентрацией 100–3нМ. Реакция запускалась добавлением SCAN1 до конечной
концентрации 20нМ. Обсчёт данных проводился в программе MARS
Data Analisys 2.0 (BMG LABTECH).
SCAN1, как и TDP1 способен катализировать отщепление
BHQ1 с 3’-конца данных олигонуклеотидов и 1, 12-додекандиолфосфат со шпилечной ДНК. С увеличением длинны олигонуклеотидов увеличивается скорость реакции, а наибольшие показатели характерны для шпилечной ДНК. Активность SCAN����������������
��������������������
1 на данных субстратах значительно ниже активности TDP1.
Таким образом мы изучили активность природного мутаната
тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 (SCAN1) на различных ДНКсубстратах. Шпилечная ДНК с додекандиол-фосфатом может использоваться в качестве тест-системы для определения активности
SCAN1 in vitro. Данная тест-система позволяет выявлять активность
SCAN1 наномолярной концентрации.
Список литературы
1. Pouliot J. J., Robertson C. A., Nash H. A. Pathways for repair of
topoisomerase I covalent complexes in Saccharomyces cerevisiae // Genes
Cells. — 2001. — № 6. — P. 677–687
2. Champoux JJ., DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism //Annu. Rev. Biochem. — 2001. — №70 — P. 369–413.

Молекулярная биология

185

3. Pommier Y., Barcelo J., Rao R., Sordet O., Jobson A., Repair of
Topoisomerase I-Mediated DNA Damage // Prog Nucleic Acid Res Mol
Biol. — 2006. — №81. — P. 179–229.
4. Takashima H., Boerkoel C. F., John J., Saifi G. M., Salih M. A.,
Armstrong D., Mao Y., Quiocho F. A., Roa B. B., Nakagawa M., Stockton D. W., Lupski J. R., Mutation of TDP1, encoding a topoisomerase Idependent DNA damage repair enzyme, in spinocerebellar ataxia withaxonal neuropathy // Nat Genet. — 2002. — №32 (2). — P. 267–72.
5. Interthal H., Chen H. J., Kehl-Fie T. E., Zotzmann J., Leppard J. B.,
Champoux J. J. SCAN1 mutant TDP1 accumulates the enzyme — DNA
intermediate and causes camptothecin hypersensitivity // EMBO J. —2005. — №24 (12). — P. 2224–2233.
ЭФФЕКТЫ ИЗОФЛУРАНА И ДРУГИХ АНЕСТЕТИКОВНА УРОВЕНЬ КЛЮЧЕВЫХ МЕТАБОЛИТОВВ ГИППОКАМПЕ НЕОНАТАЛЬНЫХ КРЫС *П. Н. Меньшанов 1, 2, А. Е. Акулов 2
1Новосибирский государственный университет,2Институт цитологии и генетики СО РАНИнгаляционный галогенированный анестетик изофлюран и егоаналоги способны существенно увеличивать уровень лактата в головном мозге взрослых животных [Boretius et al., 2013]. Нейроны
очень чувствительны к изменениям pH [Ruusuvuori et al., 2010],поэтому индуцируемое изофлюраном увеличение уровня лактатаи кислотности межклеточной среды может объяснить появление нейротоксических эффектов, наблюдаемых в мозге после длительного
изофлюранового наркоза. Однако приводит ли подобное воздействиекак ингаляционными, так и неингаляционными анестетиками к поРабота поддержана бюджетным проектом ИЦиГ СО РАН №48, грантами МОН РФ МК-1207.2014.4, РФФИ № 15-34-20574 мол_а_вед, РФФИ14-04-00219 А.
*186Раздел 3тенциально опасным метаболическим изменениям в незрелом мозге,остается неясным.
В работе исследовали эффекты ингаляционного анестетика изофлюрана и неингаляционных анестетиков пентобарбитала и уретанана уровень ключевых метаболитов в гиппокампе трехдневных крысят линии Вистар методом 1H магнитно-резонансной спектроскопиина МРТ-томографе «Bruker BioSpec 117/16USR» (11.7 Тесла). Исследовали уровни аланина, аспартата, ГАМК, глутамата, креатинаи фосфокреатина, лактата, таурина, N-ацетиласпартата. Для выявления базального уровня ключевых метаболитов в полном соответствии с “Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных” [приказ Минздрава СССР № 755 от 12 августа 1977 г.] и Директивой Европарламента 2010/63/EU также былразработан метод неинвазивной прижизненной фиксации, позволяющий регистрировать спектр ключевых метаболитов без применения
общих анестетиков.
Показано, что однократное введение уретана дозозависимо увеличивало уровень лактата в гиппокампе трехдневных крысят на протяжении всего времени действия анестетика. Аналогичное увеличение уровня лактата было выявлено и после введения пентобарбитала.
Однако в отличие от взрослых животных, полуторачасовая изофлюрановая анестезия не влияла на уровень этого ключевого метаболитав гиппокампе неонатальных крысят.
Полученные данные подтверждают возможность применения непродолжительного изофлюранового, но не уретанового и пентобарбиталового наркоза для прижизненного определения уровня ключевых метаболитов в головном мозге неонатальных крыс методом
1Н магнитно-резонансной спектроскопии. Результаты работы также
свидетельствуют о существенных отличиях действия как ингаляционных, так и неингаляционных анестетиков в формирующемсяи взрослом головном мозге.

Молекулярная биология

187МИКРОРНК СЛЮНЫ В ДИАГНОСТИКЕ
ПАТОЛОГИЙ ГОРТАНИ
Е. Г. Никитина, О. В. Черемисина, Н. В. Литвяков
ФГБНУ «Томский НИИ онкологии»Актуальность: обнаружение внеклеточных РНК в слюне
открыло для ученых новое поле возможностей и зародило интереск исследованиям природы, происхождения и биологических
качеств РНК слюны [Park N. J.et al., 2006; Zhang L.et al., 2010],
в том числе и микроРНК [Li Y.et al., 2004; Park N. J.et al., 2009].
Благодаря значительному количеству исследований посвященных
слюне в настоящее время в литературе даже вошел в обиход
термин «salivaomics» (Yan, Yu et al. 2008). Однако же в мировой
литературе исследований посвященных проблеме канцерогенезаи предсказательной ценности использования микроРНК слюны призлокачественных опухолях крайне ограничено.
Цель работы: исследование паттерна микроРНК слюны пациентов с предопухолевыми и злокачественными патологиями гортани.
Материалы и методы: в работе использован супернатант слюны, полученной от пациентов с первичным гистологически верифицированным плоскоклеточным раком гортани (n=16) и лиц с предопухолевой патологией — дисплазией I-III степени (n=7). Уровень
микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205, -221 в слюне рассчитанпо методу ΔCt (Livak and Schmittgen 2001), в качестве гена-рефери
использована микроРНК-103. Статистическая обработка данных
произведена с использованием t-теста Уэлша с применением критерия Бенджамини-Хохберга (FDR — false discovery rate) и дискриминантный анализ.
Результаты: проведен сравнительный анализ изменения уровня
микроРНК в группе лиц с предопухолевой патологией и раком гортани (РГ). Дискриминантный анализ данных по уровню 7 микроРНК
позволил выявить значимое различие в показателях между пациента-188Раздел 3ми с предраковыми изменениями и раком гортани (F (21,29) = 5,55,
p < 0,0033, рис. 1), причем участие в стратификации образцов принимают все семь микроРНК. Показатели чувствительности и специфичности этого теста составили 71 % и 93 %, соответственно.

Рис. 1. Уровень 7 микроРНК в слюне в зависимости от диагноза. Примечание — А: по осям Х и ���������������������������������������
Y��������������������������������������в виде ������������������������������
ROOT��������������������������
-1 и ���������������������
Factor���������������
-1, представлены результаты дискриминантного анализа в виде условных значенийпо уровню микроРНК-18а, -21, -155, -200а, -200с, -205 и -221, в зависимости от диагноза

Показано статистически значимое различие в уровне некоторых
отдельных микроРНК в слюне пациентов в зависимости от диагноза.
Так, у пациентов с предопухолевой патологией в слюне обнаружен
повышенный уровень микроРНК-21 и -200с в сравнение с группой
пациентов с диагнозом рака гортани (7���������������������������������
vs�������������������������������
16, р = 0,011, p ��������������
����������������
= 0,0061, со-Молекулярная биология

189

ответственно). Более того, при сравнении подгрупп лиц с дисплазией
II��������������������������������������������������������������������
-�������������������������������������������������������������������
III����������������������������������������������������������������
степени и пациентов с 1–2 стадией рака также показана статистическая значимость разницы значений уровня микроРНК-18а, -21, -200с
(4vs6, р=0,002, р=0,007, p=0,013, соответственно), что говорит в пользу
возможности использования этого параметра в слюне для уточнения
диагноза в дополнение к основным диагностическим методам.
Полученные результаты по определению уровня микроРНКв слюне пациентов с предопухолевой патологией и раком гортани
свидетельствуют, что этот биоматериал подходит для данной процедуры и показывает стабильный, воспроизводимый результат. Данные
дискриминантного анализа, показавшие наличие значимой разницыв уровне микроРНК-18а, -21 и -200с между подгруппами лиц с дисплазией II-III степени и больных РГ Т1-2 свидетельствует о том,что слюна, биоматериал полученный неинвазивным путем, может
быть использована для уточнения диагноза. Однако эти пилотные
данные требуют уточнения на более крупной и унифицированнойпо клинико-патологическим параметрам выборке и выявления показателей чувствительности и специфичности подхода.
КОНСТРУИРОВАНИЕ ИММУНОГЕНА ПРОТИВ ВИЧ-1,ВКЛЮЧАЮЩЕГО ЭПИТОП
ШИРОКОНЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО АНТИТЕЛА 10E8
А. П. Рудомётов 1, Д. Н. Щербаков 1, 2, А. Ю. Бакулина 1, 3ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор», 2 Алтайский государственный
университет, 3 ГОУ «Новосибирский национальный
исследовательский государственный университет»1Вирус иммунодефицита человека продолжает представлять серьезную угрозу в России и в мире. Традиционные методы создания
вакцины показали свою несостоятельность в случае ВИЧ, и требуется развитие новых подходов к получению эффективной анти-ВИЧ190Раздел 3вакцины. Одним из перспективных подходов является создание искусственных иммуногенов, содержащих фрагменты вирусных белков. Примером такого иммуногена является TBI, входящий в состав
вакцины КомбиВИЧвак, которая успешно прошла первую фазу клинических испытаний.
Мы решили использовать аналогичный подход и создать иммуноген, несущий эпитопы антитела 10E8. Это широконейтрализующее
моноклональное антитело было описано в 2012 году, оно связываетсяс вирусным гликопротеином gp41 в районе, близком к мембране, приэтом не обладает аутореактивностью и не взаимодействует с фосфолипидами, в отличие от других антител связывающихся с MPER регионом.
С помощью классификатора белковых структур SCOP была выбран небольшой глобулярный белок, в N-конец и C-конец которого
были встроены эпитопы 10E8. Им оказался неохарактеризованный
белок B. subtilis YkuJ Моделирование структуры полученного искусственного белка YkuJ-10E8e показало, что с ним могут связываться
одновременно два антитела 10E8.
Был, синтезирован ген белка YkuJ-10E8e с полигистидиновым тагом для очистки металл-хелатной аффинной хроматографией. В генбыли введены сайты рестрикции, чтобы каждый из эпитопов былонетрудно заменить. Ген был клонирован в состав плазмиды pET21a,которой была трансформирована культура BL���������������������
�����������������������
21. После трансформации наращивали культуру до ОП 0.8 и проводили индукцию IPTG.
Экспрессию белка YkuJ-10E8e оценивали электрофорезом в ПААГ.
Электрофорез показал интенсивную полосу, по подвижности соответствующую рассчитанному белку.
Для подтверждения того, что белок YkuJ-10E8e связывается с антителами 10E8, был проведен дот-блот анализ. Он подтвердил, что эпитопы 10E8 в составе искусственного белка распознаются антителами.
Белок YkuJ-10E8e был наработан и очищен для иммунизации мышей. После первой иммунизации все мыши остались живы, это говорит о том, что белок не токсичен.
Способность полученного иммуногена индуцировать в организме
образование широконейтрализующих антител будет оценена в реак-Молекулярная биология

191

ции вируснейтрализации с использованием коллекции псевдовирусов ВИЧ-1 существующих стандартизованных панелей и штаммов,циркулирующих в Сибирском Федеральном округе, сыворотками иммунизированных мышей.
В дальнейших исследованиях планируется заменить эпитопы
10E8 на эпитопы других антител, связывающихся в том же районе
gp41, либо на их аналоги, полученные методом фагового дисплея.
Ожидается, что аналоги эпитопов могут лучше сохранять своюструктуру в отсутствие мембраны, и поэтому лучше вызывать протективный иммунный ответ против ВИЧ-1.
ENV-ПСЕВДОВИРУСЫ ВИЧ-1, ПОЛУЧЕННЫЕИЗ ИЗОЛЯТОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ
НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ
Н. С. Щербакова, А. П. Рудометов, С. Ф. Орешкова, Л. И. Карпенко
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»На сегодняшний день число ВИЧ-инфицрованных людей в миренасчитывает 35 млн. человек. В России, к началу 2015 г. выявлено более 900 тыс. ВИЧ-инфицированных (http://www.hivrussia.ru/).
В Новосибирской области проблема стоит особенно остро. На 1 января 2015 года более 1 % трудоспособного населения области являются ВИЧ-положительными. В этих условиях разработка новых антиретровирусных препаратов и создание профилактической вакцины против ВИЧ-1 является необходимым. Перспективным направлением в разработке вакцин против ВИЧ инфекции является создание иммуногена, который способен стимулировать в организме
образование антител, обладающих нейтрализующей активностьюв отношении большинства первичных изолятов ВИЧ-1. При этомоценка нейтрализующих свойств сывороток, полученных после иммунизации такими иммуногенами становится одной из центральных задач.

192

Раздел 3Использование технологии env-псевдовитипрованных вирусов
ВИЧ-1 является сегодня одним из самых популярных методов анализа нейтрализующей активности вакцин против ВИЧ-1 в странах
Европы и США. ���������������������������������������������
Env������������������������������������������
-псевдовирусы ВИЧ-1 представляют собой получаемые in vitro вирусные препараты, которые имитируют первичные изоляты ВИЧ-1. Данная система обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью, позволяет значительно сократить
время анализа по сравнению с другими подходами. Преимуществом
системы является также возможность использования вирусных частиц из большого числа субтипов ВИЧ-1.
Цель работы — создание env-псевдовирусов ВИЧ-1 штаммов,циркулирующих на территории НСО.
Для работы были взяты 20 сывороток ВИЧ-инфицированных
пациентов из Новосибирского областного центра по профилактикеи борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями. Для амплификации гена Env была проведена полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с вирусной РНК и последующая
гнездовая ПЦР. Были определены нуклеотидные последовательности
амплифицированных фрагментов, и проведен их анализ при помощи специализированных программ. На основе полученной информации было построено филогенетическое дерево и было показано, чтоВИЧ-1 в исследуемых образцах сывороток принадлежат к рекомбинантной форме CRF63_02A1.
Далее амплифицированный полноразмерный ген Env был клонирован в составе вектора pcDNA 3.1/V5-His TOPO. Для получения
псевдовирусов была проведена магнитная ко-трансфекция эукариотических клеток 293T двумя видами плазмид: одна, полученная нами,содержит ген Env, а другая — backbone-плазмида — содержит всеостальные гены ВИЧ-1, за исключением гена Env. В результате котрансфекции, клетки 293-Т начинают продуцировать псевдовирусы
ВИЧ-1, способные к однократному инфицированию чувствительных
клеток, но не способные к дальнейшей репликации. Функциональную
активность и TCID50 псевдовирусов определяли на чувствительных
клетках TZM-bl по величине сигнала люминисценции вследствие
экспрессии Tat- индуцируемого гена люциферазы в клетках.

Молекулярная биология

193

Таким образом, нами были получены функционально активные
псевдовирусы рекомбинантной формы CRF63_02A1, распространенной в Новосибирской области.
РАЗРАБОТКА БИОЧИПА НА ОСНОВЕ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦН. С. Кожабергенов, В. М. Строчков, Е. Д. Бурашев,К. А. Шораева, К. Т. СултанкуловаРГП «Научно-исследовательский институт проблем
биологической безопасности» КН МОН РК(Республика Казахстан, пгт. Гвардейский)В последние годы всё большее применение при постановке диагноза
находят биочипы (микрочипы, микроматрицы) — небольшие аналитические устройства, имеющие в себе компоненты биологического происхождения и предназначенные для проведения одновременного параллельного анализа многих межмолекулярных взаимодействий. Биочип
представляет собой твердый субстрат, на поверхность которого нанесен
упорядоченный рисунок (чаще всего решетка) микропятен одного илинескольких биологических веществ. На подложке биочипа могут бытьиммобилизованы молекулы различных веществ биологического происхождения. Чаще всего это молекулы белков или нуклеиновых кислот.
Биочипы используются для самых разных целей. В медицине биочипы помогают за считанные часы обнаруживать у больных лекарственно устойчивые формы туберкулеза. Еще одно очень важное медицинское применение биочипов — это диагностика лейкозов и других раковых заболеваний.
Основной целью научно-исследовательской работы является разработка современного средства идентификации возбудителей птичьих вирусных инфекций для повышения эффективности борьбыс биологическими опасностями.

194Раздел 3В результате исследований сформированы требования для разработки ДНК-биочипов, и определён спектр выявляемых возбудителей птичьих инфекций, для детекции которых предназначена данная
тест-система. В ходе исследований был выполнен сбор, компьютерный анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей
генов вируса гриппа, болезни Ньюкасла, инфекционного бронхитаи инфекционного бурсита кур. Определены консервативные областидля каждого отдельного гена вышеуказанных вирусных инфекций.
Проведен отбор и синтез олигонуклеотидных зондов и показана ихвысокая специфичность. Подобранные зонды были проанализированы с помощью программы BLAST на предмет их возможной гомологии со всеми известными последовательностями, имеющимисяв базе данных GenBank на текущий момент времени.
При разработке диагностического биочипа были использованы
олигонуклеотидные зонды длиной 40 — 60 нуклеотидов. Для иммобилизации олигонуклеотидов использовали микробиологические
стекла с альдегидным покрытием. Зонды наносили на подложку методом контактной печати на принтере ������������������������������
Nano��������������������������
�������������������������
Print��������������������
�������������������
LM�����������������
60, Arrayit�����
������������
����
Corporation, США. Исследуемые образцы амплифицировали с помощью
подобранных рандом праймеров и метили цианиновым красителем
Су-5 (��������������������������������������������������������
dCTP����������������������������������������������������
) на стадии ОТ-ПЦР. Для детекции комплементарно связавшихся меченых проб со специфическими зондами в процессе гибридизации, использовали флуоресцентный сканер InnoScan 710 ALс программным обеспечением MAPIX 5.5.
Данная работа выполняется в рамках республиканского проекта на тему: «Разработка и испытание микрочипа для экспрессдиагностики вирусных болезней птиц» на 2015–2017 гг., шифр программы Г.2015, номер гос. регистрации №0115РК01976.
По завершению проекта будут разработаны лабораторнотехнологические регламенты изготовления и использования биочипов для конструирования на их основе отечественных высокоэффективных тест-систем, предназначенных для раннего выявления и дифференциальной диагностики вирусных возбудителей болезней птиц.
Прикладная значимость проекта заключается в появлении возможности проведения ранней диагностики и идентификации ви-Молекулярная биология

195русных болезней птиц методом, основанным на технологии ДНКмикрочипов.
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ РАННЕГО ОТВЕТА C-FOS И C-JUNВ ОТДЕЛАХ НЕОНАТАЛЬНОГО МОЗГА КРЫСПОД ДЕЙСТВИЕМ ДЕКСАМЕТАЗОНА *Е. В. Сухарева, Д. А. Ланшаков
Институт цитологии и генетики СО РАНБелки раннего ответа семейств Jun и Fos регулируют экспрессию генов, образуя АР-1 транскрипционный комплекс — в видегомодимеров Jun/Jun или гетеродимеров Jun/Fos белки взаимодействуют с консенсусной последовательностью TGACTCA, широко
распространенной в промоторах генов. В состоянии покоя уровень
экспрессии этих генов невысок, но значительно возрастает при активации клеток, в том числе и нервной системы. Именно поэтому
уровень экспрессии гена c-fos считается показателем активности
нейронов. Исследование в работе уровней мРНК генов c-jun и c-fosв развивающемся мозге крысят первой недели жизни выявило хорошо детектируемую методом ПЦР в реальном времени экспрессию
генов, кодирующих белки семейств Jun и Fos, в отделах неонатального мозга, в отличие от взрослых животных, что свидетельствуето высокой интенсивности морфогенетических процессов в раннем
онтогенезе. Известно, что в критический период перинатального
развития мозг особенно чувствителен к действию внешних неблагоприятных факторов. Стресс, повышающий уровень глюкокортикоидов в крови, как и гормональная терапия дексаметазоном, приводит к долговременному и даже постоянному изменению активности нейромедиаторных систем мозга и регулируемых ими функцийи поведения. Важным компонентом этих процессов может быть активация экспрессии генов раннего ответа. Изучение уровней мРНК*Работа поддержана грантами 13-04-01104, 13-04-40014-Н, 14-04-31314.

196Раздел 3генов c-jun, c-fos и соотношения их экспрессии в отделах неонатального мозга трехсуточных крысят после введения избирательного
лиганда глюкокортикоидных рецепторов — дексаметазона (0.2 мг/кг) выявило специфические для передних (кора, гиппокамп) и задних (ствол) отделов мозга закономерности. Уровень мРНК генараннего ответа c-fos повышался в гиппокампе и префронтальной
коре головного мозга на протяжении 30–60–120 минут после введения дексаметазона. В стволе головного мозга, имеющего более
высокий уровень базальной экспрессии гена c-fos, чем в коре и гиппокампе, введение гормона приводило через 2 часа к снижению количества транскрипта. Обнаруженные на уровне мРНК изменения
гена c-fos подтверждались оценкой экспрессии его белка методом
иммуногистохимического окрашивания специфическими антителами в гиппокампе и области синего пятна ствола мозга. В результате, под действием дексаметазона соотношение уровней мРНК c-jun
к c-fos в стволе мозга неонатальных крысят двукратно увеличивалось. Смещение соотношения экспрессии транскриптов c-jun/c-fosв сторону преобладания c-jun способно индуцировать экспрессию
генов, содержащих АР-1 элемент в своем промоторе. Основаниемдля такого предположения является известная зависимость от компонентного состава белков, образующих АР-1 комплекс, для усиления или подавления экспрессии регулируемых транскриптов. Белки
АР-1 комплекса активно взаимодействуют с другими транскрипционными факторами. Так, регуляция глюкокортикоидами экспрессии
генов, помимо канонического механизма, обусловленного взаимодействием активированного гормоном глюкокортикоидного рецептора (GR), являющегося транскрипционным фактором, с гормонзависимым элементом промотора генов (GRE), задействует и такназываемый неканонический механизм, основанный на взаимодействии GR с белками АР-1. Этот механизм функционирует при регуляции глюкокортикоидами экспрессии генов, не содержащих GRE
в своем промоторе, но изменяющих экспрессию под действием гормона. При этом образование АР-1 комплекса гомодимерами Jun/Junповышает, а гетеродимерами Jun/Fos, напротив, понижает экспрессию зависимых генов. Впервые обнаруженное в работе смещение со-Молекулярная биология

197

отношения транскриптов c-jun/c-fos, приводящее к относительному
увеличению c-jun под действием дексаметазона в стволе головного
мозга неонатальных крысят, способно индуцировать экспрессию
генов за счет белок-белкового взаимодействия глюкокортикоидного
рецептора с Jun/Jun гомодимером АР-1 комплекса. Примером такого механизма является ген ключевого фермента синтеза катехоламинов — тирозингидроксилазы, который не имеет функционально
активного GRE, но его экспрессия индуцируется глюкокортикоидами. Промотор гена ТГ содержит два АР-1 элемента и известно участие дистального АР-1 в глюкокортикоидной индукции ферментав культуре феохромацитомы. Установленное в работе смещение поддействием дексаметазона соотношения белков Jun и Fos способно
обеспечить обнаруженную индукцию гена и белка тирозингидроксилазы в стволе головного мозга неонатальных крысят к 6 часу после введения глюкокортикоидов.
АКТИВАЦИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
РЕКОМБИНАНТНЫМ АНАЛОГОМ ЛАКТАПТИНА *О. С. Троицкая 1, 2, А. В. Ткаченко 1, О. А. Коваль 1, 2ФГБУН Институт химической биологиии фундаментальной медицины СО РАН, 2 Федеральное
государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования «Новосибирский национальный
исследовательский государственный университет»1В последние десятилетия одной из успешных противоопухолевых стратегий, отличных от хирургического вмешательства, рассматривают стратегию «двойного действия», когда с одной стороны, противоопухолевый препарат напрямую индуцирует апоптози гибель большинства раковых клеток, а с другой стороны, активирует иммунную систему, клетки которой далее распознают, атакуют
*Научный руководитель — канд. биол. наук О. А. Коваль.

198Раздел 3и уничтожают раковые клетки, слабочувствительные к химиотерапии. Ранее в лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН из молока человека был выделен белок — лактаптин — протеолитический
фрагмент каппа-казеина человека, вызывающий гибель раковых
клеток в культуре.
Целью данной работы являлось изучение активации иммунной
системы и вклада такой активации в противоопухолевое действие рекомбинантного аналога лактаптина RL2.
В экспериментах in vivo изучено цитокин-стимулирующее действие RL2. Методом Bio-Plex проанализировано изменение уровня
23-х цитокинов в сыворотке крови лабораторных мышей, получавших инъекции RL2. Показано, что после инъекций RL2 происходит
достоверное увеличение уровня цитокинов: IL-10, IL-1β, IL-2, G-CSF,
KC, MCP-1, по сравнению с контрольными животными.
Исследована возможность индукции иммуногенного апоптоза
аналогом лактаптина RL2. Экспозиция калретикулина на внешнюю
клеточную мембрану (CRT), увеличение уровня внеклеточного АТФи HMGB1 являются ключевыми событиями для реализации иммуногенного апоптоза. Методом проточной цитометрии показано, чтопри инкубации клеток аденокарциномы молочной железы человека
MCF-7, MDA-MB-231 и рабдомиосаркомы мыши MХ-7 с RL2 в течение 2–4 ч происходит увеличение CRT-положительной популяции
клеток, что свидетельствует в пользу экспозиции CRT на внешней
плазматической мембране, характерной для иммуногенного апоптоза. Также показано увеличение уровня внеклеточного АТФ после
инкубации клеток MDA-MB-231 и MX-7 с RL2 в течение 20–24 ч,что является характерным признаком иммуногенной гибели клеток.
Таким образом, RL2 является потенциальным индуктором гибели
клеток по пути иммуногенного апоптоза.

Молекулярная биология

199

ОДНОНУКЛЕОТИДНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ В РЕГУЛЯЦИИ
ГЕНОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ
УСТОЙЧИВОСТИ В ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
М. М. Цыганов 1, 2, М. К. Ибрагимова 1, П. В. Казанцева 1,
Е. М. Слонимская 1, Н. В. Чердынцева 1, 2, Н. В. Литвяков 1, 2Томский НИИ онкологии, Томск, Россия,Лаборатория трансляционной клеточнойи молекулярной биомедицины Национального исследовательского
Томского государственного университета, Томск, Россия
12Наши предыдущие исследования показали, что эффективность
неоадъювантной химиотерапии (НХТ) рака молочной железы (РМЖ)связана не с исходным уровнем экспрессии АВС-транспортеров(ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1, ABCG2) в опухоли,а с изменением их экспрессии в процессе лечения. Если в процессеНХТ экспрессия генов АВС в опухоли снижается, то у больных отмечается клинический ответ на химиотерапию, если же при воздействии химиопрепаратов экспрессия генов АВС в опухоли повышается, то у таких больных формируется фенотип множественной лекарственной устойчивости и ответ на химиотерапию отсутствует (�������
Litviakov, N. V., et al., 2013). Кроме этого нами были получены данные ободнонаправленном изменении экспрессии генов АВС-транспортеровв опухоли молочной железы при проведении неоадъювантной химиотерапии (Литвяков Н. В. и др., 2013). Несмотря на то, что все исследованные гены АВС располагаются в разных хромосомах, быловысказано предположение о существовании функционального экспрессионного кластера АВС-транспортеров, за счет работы которогоу большинства пациентов и происходит однонаправленное изменение их экспрессии в опухоли под действием химиопрепаратов. Следует отметить, что формирование фенотипа МЛУ обусловлено комплексной работой нескольких ключевых генов АВС-транспортеров.
Таким образом целью настоящей работы явилось доказательство

200Раздел 3существования функционального экспрессионного кластера геновАВС у пациентов в опухоли молочной железы.
Материал и методы. В исследование было включено 68 больныхРМЖ со стадией IIA — IIIC, получавших в 2006–2010 годах лечениев клинике Томского НИИ онкологии. Больные в неоадъювантном режиме получали 2–4 курса ХТ по схемам �������������������������
FAC����������������������
(фторурацил, доксорубицин, циклофосфан) или CAX�����������������������������������
��������������������������������������
(циклофосфан, доксорубицин, кселода). Затем проводилась операция и 2 курса адъювантной химиотерапии по схеме FAC������������������������������������������������
���������������������������������������������������
, лучевая терапия и/или гормональное лечение назначались по показаниям. РНК выделяли из 68 образцов после НХТс помощью набора RNeasy�������������������������������������������
�������������������������������������������������
������������������������������������������
Plus��������������������������������������
�������������������������������������
mini���������������������������������
��������������������������������
Kit�����������������������������
(���������������������������
Qiagen���������������������
, �������������������
Germany������������) в соответствие с инструкцией производителя. Оценку экспрессии генов МЛУ:ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC2, ABCC5, ABCG1, ABCG2 проводилипри помощи ����������������������������������������������������
qRT�������������������������������������������������
-������������������������������������������������
PCR���������������������������������������������
. Относительная экспрессия была оценена с помощью метода Pfaffl, относительно гена-рефери GAPDH и нормальной ткани молочной железы. ДНК выделяли из 68 биопсийных образцов и опухолевой ткани с помощью набора QIAamp DNA mini Kit(Qiagen, Germany).
Микроматричный анализ проводили на микроматрицах (ДНКчипах) высокой плотности фирмы Affymetrix (USA) CytoScanTM HD
Array, которые содержат по 750 000 �������������������������������
SNP����������������������������
(��������������������������
Single��������������������
Nucleotide���������
�������������������
Polymor��������
phism) для каждого больного. Ассоциацию уровня экспрессии геновАВС после НХТ с ���������������������������������������������
SNP������������������������������������������
оценивали с использованием языка программирования «R» в программе «��������������������������������������
R�������������������������������������
������������������������������������
version�����������������������������
3.0.2.». Для коррекции уровней значимости на множественные сравнения использовалась поправка Бонферрони.
Результаты. Прежде всего, при помощи корреляционного анализа, были определены группы коэкспрессии генов АВС-транспоретровдо лечения и после НХТ. Считалось, что гены могут образовывать кластер, если все гены в него входящие коэкспрессируются друг с другом.
Корреляционный анализ показал, что наибольшая группа, в которой
АВС-транспортеры до лечения и после НХТ коэкспрессированы, имеет место быть для генов ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2 (коэффициент корреляции Спирмена r = 0,27–0,81, p<0,05) (Таблица 1), что может
говорить об общности механизмов регуляции экспрессии этих генов.

201Молекулярная биология

Таблица 1

АВСВ1 доАВСC1 доАВСC2 доАВСG2 доАВСВ3 доАВСC5 доАВСG1 доКорреляция уровней экспрессии АВС-транспортеровв опухоли молочной железы до лечения и после НХТАВСВ1 после

0,81*

0,30*

0,59*

0,61*

–0,00

0,34*

–0,11

АВСC1 после
АВСC2 после
АВСG2 после
АВСВ3 после
АВСC5 после
АВСG1 после

0,41
0,47*
0,58*
0,02
0,23
–0,01

0,63
0,33*
0,27*
0,05
0,13
0,11

0,50
0,72*
0,57*
0,05
0,15
0,07

0,42
0,60*
0,74*
–0,02
0,30*
–0,06

0,17
0,19
–0,09
0,23
–0,18 0,31*
0,47* –0,29*–0,29* 0,61*
0,33* –0,13

0,11
–0,15
–0,14
0,36*
–0,22
0,48*

*

*

*

*

Примечание: в таблице представлен коэффициент корреляции Спирмена;до — уровень экспрессии до лечения в биопсии; после — уровень экспрессии после НХТ в операционном материале; цветом и знаком * выделены статистически значимые корреляты.

Далее мы попытались связать экспрессию генов до лечения и после НХТ друг с другом через нормальную генетическую вариабельность, обусловленную генным полиморфизмом (������
SNP���
). �����������
C����������
использованием лог-линейной регрессии (с учетом поправки Бонферронина множественные сравнения) была проанализирована связь SNP
с уровнем экспрессии генов АВС до лечения и после НХТ в рецессивной модели наследования. Если группа генов имела общие SNP,связанные с уровнем экспрессии всех генов и экспрессия генов АВСу носителей редкого генотипа была статистически значимо вышеили ниже чем у носителей гетерозиготного и частого генотипов, этопоказывало связь этих генов и давало аргументы в пользу наличиеу них функционального экспрессионного кластера. В результате
статистической обработки данных, было показано, что максималь-202Раздел 3но возможную группу образуют те же четыре гена, что и по результатам корреляционного анализа: ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2.
Для них было выявлено наибольшее количество перекрывающихся
SNP. Установлено, что с начальным уровнем экспрессии полученных
генов коррелирует 21 SNP: DISP1 (rs17535305), DISP1 (rs61840266),
SPAG16 (rs35945601), NAF1 (rs17571991), ECHDC1 (rs6569487),
TXLNB (rs9495425), ZNF890P (rs62442010), AMPH (rs12701634),
LOXL2 (rs13272093), C8orf37-AS1 (rs12549485), KCNQ3 (rs7818112),
ST3GAL1/ZFAT (rs13255060), ZBED5 (rs10840501), DAOAAS1 (rs4771495), DHRS4L1 (rs10147475), CHD2 (rs28458425),
RGMA (rs7165938), STXBP4 (rs9303363), ADCYAP1 (rs304400),
FHOD3 (rs12965274), RALGAPA2 (rs3827963).
Установлено, что у носителей мутантных генотипов всех вышеописанных полиморфизмов, кроме SPAG16 (rs35945601), начальный
уровень экспрессии был в 1,5–2 раза статистически значимо выше,по сравнению с носителями гетерозиготного или частого генотипов
(��������������������������������������������������������������
p�������������������������������������������������������������
<0,001). Эти данные могут подтверждать наличие функционального экспрессионного кластера исследуемых генов в опухоли молочной
железы до воздействия химиопрепаратов.
После проведения НХТ количество общих полиморфизмовдля группы генов ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2 уменьшается
до 6: EPHA4 (rs2680835), SCN10A (rs4676478), H2AFY (rs6896596),
SLC25A21 (rs1154121), RTN1 (rs1951366), RTN1 (rs12018988),(рис. 1).
У всех носителей мутантного генотипа полиморфизмов
EPHA4 (rs2680835), RTN1 (rs1951366) и RTN1 (rs12018988), уровень
экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости после
проведения НХТ достоверно ниже, чем у носителей гетерозиготногои дикого генотипа (p-level<0,001)
Заключение. Можно полагать, что нами приведены достаточно
серьезные доводы, доказывающие существование в опухоли молочной железы функционального экспрессионного кластера генов АВСтранспортеров, состоящего из генов АВСВ1, АВСС1, ABCC2 и ABCG2,который, по-видимому, имеет общий механизм регуляции экспрессии. Это подтверждается взаимной корреляцией уровня экспрессии

Молекулярная биология

203

Рис. 1. Уровень статистической значимости связи SNP с экспрессией
генов ABCB1, ABCC1, ABCC2 и ABCG2 после НХТПримечание: по оси ординат — значение десятичного логарифма уровня
статистической значимости (p-level), по оси абсцисс — однонуклеотидные
полиморфизмы (n = 258586 SNP). На рисунке красной пунктирной линией
обозначено значение номинального p������������������������������������
�������������������������������������
-�����������������������������������
level������������������������������
, красной сплошной линией значение p-level с учетом поправки Бонферрони

этих генов до лечения и после НХТ и наличием общих S�����������
NP���������
, связанных с их экспрессией до лечения и после НХТ. Исследование непосредственно механизмов регуляции именно кластера генов АВСтранспортеров может способствовать выявлению новых мишенейдля управления формированием фенотипа множественной лекарственной устойчивости опухоли в процессе химиотерапии.

204Раздел 3ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ В ГЕТЕРОФАЗНОМ ВАРИАНТЕС ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВЫХ
НЕЗАРЯЖЕННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
А. В. Волкова 1, 2, А. А. Ломзов 1, 2, М. С. Купрюшкин 1,
Е. В. Дмитриенко 1, 2
1Институт химической биологии и фундаментальной медициныСО РАН, Новосибирск, 2 Новосибирский
государственный университет

Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот — актуальноеи перспективное направление в настоящее время, когда диагностика стремится к индивидуализации, компактизации и максимальной
простоте в использовании. Совмещение указанных требований с темили иным методом анализа возможно при конструировании биосенсорных систем, которые способны воспринимать и преобразовывать
количественную или полуколичественную аналитическую информацию с импользованием биологического распознающего элемента, находящегося в теснном контакте с преобразователем.
Лидирующим направлением развития области диагностических биосенсоров являются нанобиосенсоры на основе одномерной кремниевой нанопроволки в качестве затвора полевого
транзистора, чувствительность и эффективность которого привыявлении нуклеиновых кислот зависит от заряда на поверхности нанопроволок.
Целью настоящей работы была разработка модельной системы
гибридизациооного анализа нуклеиновых кислот на поверхности,имитирующей нанопроволочный биосенсор, а именно: изучение
эффективности иммобилизации незаряженных олигонуклеотидных
зондов на поверхность, имитирующую нанопроволоку, и последующей гибридизации с нуклеотидными мишенями, в том числе после
регенерации поверхности.

Молекулярная биология

205

В качестве анализируемых мишеней использовались 20-звенные
маркерные последовательности флуоресцентно-меченных РНКи ДНК, а в качестве зондов для иммобилизации — соответствующие
олигомеры, несущие первичную аминогруппу, на основе незаряженных пептидил-нуклеиновых кислот (ПНК) и фосфорилгуанидиновых
нуклеиновых кислот (НОНА).
Было проведено исследование эффективности иммобилизации
зондов на поверхность, имитирующую кремниевую нанопроволоку, — модифицированные эпоксисиланом стеклянные слайды, а также эффективность гибридизации зондов с флуоресцентно-меченымиДНК и/или РНК мишенями. В качестве контроля иммобилизации
выступал аминосодержащий флуоресцентный олигонуклеотидный
зонд. Показано, что предложенная модельная система позволяет
успешно выявлять целевые матрицы-мишени как в буферных, таки в водных условиях, однако, в последнем случае наблюдается высокая неспецифическая сорбция. Уменьшение данного эффекта обеспечивали добавлением формамида в гибридизационную смесь, объемное содержание которого зависит от устойчивости образующегося
гибридизационного комплеса. Продемонстрирована также возможность регенерации поверхности для проведения повторного гибридизационного анализа.
Стоит отметить, что в рамках данной работы впервые были исследованы гибридизационные свойства НОНА в формате гетерофазного
гибридизацонного анализа. Как видно из результатов работы, оптимизация условий необходима на каждом этапе процедуры, особенно
тщательного проработки требуют непосредственно гибридизационные смеси, состав которых влияет на эффективность и специфичность получаемого результата. Проведенные пробные экспериментыпо пробоподготовке анализируемого образца демонстрируют перспективность данного подхода, что говорит о необходимости проведения дальнейших экспериментов в этом направлении.

206Раздел 3СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДЫ,ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЙ СБОРКУ ПСЕВДОВИРУСНЫХ
ЧАСТИЦ, ЭКСПОНИРУЮЩИХ НА ПОВЕРХНОСТИ
GP ВИРУСА ЭБОЛА
А. В. Зыбкина, Н. С. Щербакова, Д. Н. Щербаков
ФБУН «Государственный научный центр вирусологиии биотехнологии «Вектор»Геморрагическая лихорадка Эбола — острое вирусное заболевание. Впервые болезнь, вызываемая вирусом Эбола, заявила о себев 1976 году. Последняя вспышка, начавшаяся в декабре 2013 годаи не прекратившаяся по сей день, является самой крупномасштабнойи сложной [3]. Вакцины и антивирусные препараты против вируса
Эбола отсутствуют, что делает актуальным разработку специфических
терапевтических препаратов [4]. Основным препятствием к включению большого числа научных коллективов в работу по разработке профилактических средств является высокий уровень летальности, ассоциированный с этим возбудителем. В последнее время для изучения
различных аспектов особо опасных вирусных инфекций используют
технологию псевдотипированных вирусов одного цикла инфекции.
С использованием этой технологии удается получать вирусные частицы, имитирующие молекулярные особенности поверхности натурального вируса, но не способные к репликации и поэтому безопасныедля работы. Разработаны системы для псевдотипирования ВИЧ-1 [1],гриппа [2], клещевого энцефалита [5] и др. Использование этой технологии для получения псевдовирусов Эбола позволит значительно обезопасить и удешевить исследования этого патогена.
Цель работы — создание рекомбинантных плазмид, обеспечивающих сборку псевдовирусных частиц, экспонирующих на поверхности GP вируса Эбола.
Процедура получения псевдовируса заключалась в следующем.
Для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей

Молекулярная биология

207гликопротеин вируса Эбола, был проведен анализ геномов вируса, представленный в GenBank, была выбрана последовательность
соответствующая изолятам вируса, полученным в ходе вспышки
2014–2015 годов. Синтез нуклеотидной последовательности былосуществлен коммерческой фирмой (ДНК-синтез, Москва). Соответствие нуклеотидной последовательности было подтверждено секвенированием. Полученная последовательность была клонированав составе вектора pcDNA 3.1/V5-His TOPO. После трансформации
компетентных клеток E.coli был проведен отбор плазмид, содержащих встроенный ген GP, методом ПЦР со следующими праймерами:Ebola 1: 5'-GTT-TCT-TTC-GGC-GAT-GAA-GAT-TAA-GCC-GACAGT-G-3', Ebola back: 5'-GTT-TCT-TTC-AAA-CCT-TGT-TTA-TGATTA���������������������������������������������������������
-��������������������������������������������������������
ACT�����������������������������������������������������
-����������������������������������������������������
GTG�������������������������������������������������
-������������������������������������������������
AG����������������������������������������������
-3'. Для получения псевдовирусов была проведена магнитная ко-трансфекция эукариотических клеток 293T двумя
видами плазмид: одна, полученная нами, содержит ген GP вируса
Эбола, а другая — backbone-плазмида — содержит гены ВИЧ-1,за исключением гена Env (аналогом которого у вируса Эбола является ген GP���������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������
). В результате ко-трансфекции клетки 293-Т начинают продуцировать псевдовирусные частицы, внутри которых располагается
backbone������������������������������������������������������
-плазмида, а снаружи находятся поверхностные гликопротеины вируса Эбола. Такие псевдовирусы способны к однократному
инфицированию чувствительных клеток, но не способные к дальнейшей репликации.
Функциональную активность псевдовирусов определяли на чувствительных клетках TZ����������������������������������������
M���������������������������������������
-bl — генетически модифицированной клеточной линии HeLa, которая презентирует на своей поверхности большое число рецепторов с которыми способен связываться гликопротеин
вируса Эбола и содержит репортерные гены люциферазы светлячкапод контролем �������������������������������������������������
Tat����������������������������������������������
-индуцируемого промотора. Уровень вирусной инфекции определялся по величине сигнала люминесценции вследствие
экспрессии Tat- индуцируемого гена люциферазы в клетках TZM-bl.
Отобранный нами псевдовируссодержащий супернатант показал
превышение сигнала люминисценции в 100 раз по сравнению с контролем, это говорит о том, что полученные псевдовирусы эффективно инфицируют чувствительные клетки.

Раздел 3208Таким образом, была получена рекомбинантная плазмида, обеспечивающая сборку псевдовирусных частиц, экспонирующих на поверхности GP вируса Эбола.
Список литературы
1. Рудометов,�����������������������������������������������������������
А. П. C�����������������������������������������
������������������������������������������
оздание env������������������������������
���������������������������������
псевдовирусов на основе штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в Новосибирской области / А. П. Рудометов, Н. С. Щербакова //Научно-Исследовательский журнал. 2015.
№ 2 (33). С. 19–21.
2. D’Aoust, M. A.The production of hemagglutinin‐based virus‐likeparticles in plants: a rapid, efficient and safe response to pandemic influenza / M. A. D’Aoust et al.//Plant biotechnology journal. 2010. Т. 8. №. 5.
С. 607–619.
3. Labouba, I. Ebola outbreaks in 2014 / I. Labouba, E. M. Leroy //Journal of Clinical Virology. 2015. Т. 64. С. 109–110.
4. Wong, G. Backs against the Wall: Novel and Existing Strategies
Used during the 2014–2015 Ebola Virus Outbreak / G. Wong, G. P. Kobinger //Clinical microbiology reviews. 2015. Т. 28. №. 3. С. 593–601.
5. Yoshii, K. Establishment of a neutralization test involving reporter gene-expressing virus-like particles of tick-borne encephalitis virus /K. Yoshii et al //Journal of virological methods. 2009. Т. 161. №. 1.
С. 173–176.
АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОГО СХОДСТВА ГЕНОВ
16 ПОДСЕМЕЙСТВ ЦИТОХРОМОВ Р450 6-ГО СЕМЕЙСТВА(CYP6) В РАЗНЫХ ОТРЯДАХ НАСЕКОМЫХ
С. А. Белая
Белорусский государственный университетВ настоящее время серьезную экологическую проблему представляет собой широкое использование пестицидов для борьбы с насекомыми-Молекулярная биология

209фитофагами, переносчиками заболеваний человека и животных, вредителями запасов и т. д. Однако, как показывает практика, зачастую вредители демонстрируют способность быстро формировать устойчивость кядам, в то время как полезные виды, например, пчелы и другие опылители, серьезно страдают от пестицидного пресса. В связи с этим изучение
особенностей реализации «ответа» организма насекомых на инсектицидное давление является важной научной и прикладной задачей.
Как известно, ключевой ферментативной системой, обеспечивающей нейтрализацию токсинов у животных, является система цитохромов Р450. Это группа ферментов, обеспечивающих метаболизм
ксенобиотиков в клетках всех эукариот. У насекомых в детоксикации
участвуют преимущественно цитохромы семейства 6 (����������
CYP�������
6), состоящего, как минимум, из 16 подсемейств. Несмотря на крайнюю
важность системы детоксикации для жизни насекомых, точное количество генов CYP���������������������������������������������
������������������������������������������������
6, особенности их экспрессии, скорость эволюции этих систем у насекомых до сих пор не изучены в достаточной
мере. Исследование генов, кодирующих цитохромы Р450, представляет большую важность, прежде всего, поскольку знания такого родамогут быть чрезвычайно полезными в будущем для разработки инсектицидов избирательного действия. Изучение цитохромов Р450 насекомых представляет собой непростую задачу из-за значительной
вариабельности этих генов и большого числа их копий в геномах упредставителей одного отряда (или даже вида). Целью нашей работы
было оценить уровень подобия последовательностей генов цитохромов Р450 6 семейства в разных таксонах насекомых с использованием методов биоинформатики с тем, чтобы соотнести направление
эволюции семейства генов с эволюцией таксонов насекомых.
В работе были использованы 508 последовательностей геновCYP6 различных подсемейств 22-х видов насекомых, относящихсяк отрядам: Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Hemiptera, Phthiraptera.
Множественное выравнивание последовательностей провели в программе MEGA�����������������������������������������������������
���������������������������������������������������������
����������������������������������������������������
6���������������������������������������������������
, используя алгоритм Muscle������������������������
������������������������������
. Генное дерево построили с использованием алгоритма Minimum��������������������������
���������������������������������
-�������������������������
Evolution����������������
���������������
Tree�����������
, статистическую достоверность топологии дерева провели методом бутстрэпанализа для 500 реплик.

210Раздел 3При построении генных деревьев мы полагали выяснить, как будет
проходить кластеризация последовательностей: в соответствии с подсемейством белка, кодируемого конкретным геном цитохрома Р450 6семейства, или таксономической принадлежностью насекомого, длякоторого этот ген был расшифрован. Получение такого рода данных
важно с точки зрения оценки общего уровня вариабельности генови того, как они меняются в процессе видообразования у насекомых.
Это позволит делать заключение о том, в какой степени сведения о генах цитохромов Р450 6 семейства, полученных для насекомых одного
вида, могут быть применены для генов, кодирующих белки того жеподсемейства, в геноме насекомых других видов и отрядов.
Наши исследования показали, что кластеризация последовательностей генов цитохромов Р450 6 семейства на генном дереве происходила значительно чаще в соответствии с отрядами насекомых,чем с их принадлежностью к подсемействам кодируемых белков. Вчастности, гены представителей отряда Diptera образовали на генном дереве несколько крупных кластеров. Например, последовательности представителей видов Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti,
Anopheles gambiae отряда Diptera образовали на генном дереве отдельный кластер с индексом бутсрепа 100, несмотря на то, что белки,кодируемые этими генами, относятся к разным подсемействам («А»и «М») (рис. 1).

Рис. 1. Кластер, образованный последовательностями генов CYP6, кодирующих белки подсемейств «А» и «М»Молекулярная биология

211Гены C. uinquefasciatus и A. aegypti, кодирующие белки подсемейств «А» и «���������������������������������������������������
N��������������������������������������������������
», также на генном дереве образовали кластер с индексом бутстрепа 74.
Отдельный кластер на генном дереве был образован последовательностями вида Plutella xylostella отряда Lepidoptera. Индекс бутстрепа данного кластера составляет 18, что является очень низким
показателем статистической значимости топологии ветвей. Белки,кодируемые этими генами, относились к подсемействам «А» и «В».
В то же время последовательности видов P. xylostella, Solenopsis����in����victa, Apis mellifera и Harpegnathos saltator (отряд Hymenoptera) образовали на генном дереве еще один самостоятельный кластер, причем
значение индекса бутстрепа было равным 85, что является высоким
показателем. Белки, кодируемые генами, объединившимися в указанный кластер, относятся к подсемействам «K», «B», «G» (рис. 2).

Рис. 2. Кластер, образованный последовательностями генов CYP������
���������
6, кодирующих белки подсемейств «K», «B», «G»Гены представителей вида Acyrthosiphon pisum отряда Hemipteraобъединились в кластер с индексом бутстрепа 100, что является очень
высоким показателем достоверности. Белки, кодируемые этими генами, также относились к разным подсемействам («А» и «К»).
Часть генов, кодирующих белки, относящиеся к подсемейству
«А», образовали самостоятельный кластер на общем генном дереве,а именно, последовательности генов CYP6 представителей видов
S. invicta, A. mellifera и H. altator отряда Hymenoptera. Индекс бутстрепа для этого кластера был равен 85. Другая часть генов видов
S. invicta, A. mellifera и H. saltator отряда Hymenoptera также обра-212Раздел 3зовали отдельный кластер на генном дереве с индексом бутстрепа
99. Белки, кодируемые этими генами, относились к подсемействам
«������������������������������������������������������������
A�����������������������������������������������������������», «�������������������������������������������������������
B������������������������������������������������������» и «�������������������������������������������������
K������������������������������������������������
». Однако два вышеописанных кластера, образованных последовательностями CYP6 видов отряда Hymenoptera, былиобъединены в еще больший кластер с индексом бутстрепа 8, что также является очень низким показателем статистической значимости
топологии ветвей.
Следует отметить, что для многих расшифрованных последовательностей цитохромов Р450 6 семейства подсемейства, к которым
относятся белки, кодируемые этими генами, не были определены.
Следовательно, кластеры, образованные данными последовательностями, учитывались нами в меньшей степени.
На основе полученных данных можно заключить, что в одном
таксоне насекомых уровень нуклеотидного сходства между генами,кодирующими белки из разных подсемейств CYP6, выше, чем между
генами, кодирующими белки одного подсемейства, в случае, когдаони выделены из насекомых разных таксонов. Указанный факт свидетельствует о невозможности широкой экстраполяции данных, касающихся генов CYP6, между насекомыми разных отрядов.

СОДЕРЖАНИЕ

Биотехнология
Камбаралиева М. И., Федорова О. А., Магай Е. Б.,Мавжудова А. М. АНТИФУНГАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ
МЕСТНЫХ ИЗОЛЯТОВ Bacillus thuringiensis КАКЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНЫХ АГЕНТОВ ЗАЩИТЫ
РАСТЕНИЙ...............................................................................................3Куцерубова Н. С., Богрянцева М. П., Сайфутдинова С. С.,Нечаева Е. А. ВАЛИДАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОПЛАЗМ..........8Оксантюк В. М., Колдар Л. А. МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ
ПОТЕНЦИАЛ COTINUS OBOVATUS RAF. В УСЛОВИЯХ
IN VITRO.................................................................................................10Бабич П. И., Зарубин В. Н. ХРОНОТЕХНОЛОГИЯ
ЛЕЧЕНИЯ ПУТЕМ КОРРЕКЦИИ БИОРИТМОВ БОЛЬНОЙ
ТКАНИ....................................................................................................14Тихонова А. О., Тойменцева А. А. НОВАЯ LIKE-СИСТЕМАДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОМЫШЛЕННО ВАЖНЫХ БЕЛКОВ..........17Алексеенко И. В., Безбородова О. А., Немцова Е. Р.,Геворков А. Р., Хмелевский Е. В., Соболев А. С.,Якубовская Р. И., Свердлов Е. Д. ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ
ГЕННО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ АНТИОНКОРАН-МПОВЫШАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ..............18
Башмакова Е. Е., Красицкая В. В., Франк Л. А. ВЫЯВЛЕНИЕ
ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ МЕТОДОМ

ФЕРМЕНТАТИВНОГО УДЛИНЕНИЯ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОГО
ПРАЙМЕРА С ДВОЙНОЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ
ДЕТЕКЦИЕЙ..........................................................................................20Долгушин С. А., Середина Т. А., Одинцова Е. С., Базаев Н. А.,Руденко П. В., Тронин А. В. РАЗРАБОТКА ПОРТАТИВНОГО
МИКРОФЛЮИДНОГО КАРТРИДЖА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЗНАЧЕНИЯ МЕЖДУНАРОДНОГО НОРМАЛИЗОВАННОГО
ОТНОШЕНИЯ В ОБРАЗЦАХ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ............................25Ершкова В. В. КОНСТРУИРОВАНИЕ БИОСОВМЕСТИМЫХ
АССОЦИАТОВ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА
МЕТОДОМ «СЛОЙ-ЗА-СЛОЕМ».......................................................28Илюхина Д. Л., Сулейманова А. Д. ШТАММ PANTOEA VAGANS
3.2 — ПРОДУЦЕНТ СИДЕРОФОР КАТЕХОЛОВОГО РЯДА.........31Кузнецов В. В., Абдурашитов М. А., Томилов В. Н.,Дегтярев С. Х. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ —ТЕХНОЛОГИЯ КАРТИРОВАНИЯ САЙТОВ
МЕТИЛИРОВАНИЯ DE NOVO В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА................34Ломаковская Е. Н., Дегтярёв С. Х., Гончар Д. А., Акишев А. Г.,Наякшина Т. Н., Шляхова О. И., Куксова А. Н., Хлопова Н. А.,Сорокина М. А., Удальева С. Г., Чернухин В. А. Создание
рекомбинантного штамма-продуцента
новой MD-эндонуклеазы из энтеробактерийдля использования в эпигенетикеи онкодиагностике.....................................................................39Максимова Г. А., Ковнер А. В. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ
МОДЕЛЬ ХОЛАНГИОКАРЦИНОМЫ, АССОЦИИРОВАННОЙС ОПИСТОРХОЗОМ.............................................................................44Малышев Б. С., Давидович Е. С., Абдурашитов М. А.,Евдокимов А. А., Сметанникова Н. А., Ситько В. Л.,Рязанкин И. А., Кузнецов В. В., Акишев А. Г.,Хасанов Т. Ф., Нетесова Н. А., Дегтярев С. Х. Разработка
эпигенетических сигнатур для выявления
колоректального рака на ранних стадиях...................48
Перфильева А. И. ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНЫЕ СПОСОБЫ
ОЗДОРОВЛЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ ОТ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ...........53Проценко М. А. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
РАЗРАБОТКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТАНА ОСНОВЕ ВЫСШИХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ...............................58Пьянова Л. Г., Бакланова О. Н., Седанова А. В., Баринов С. В.,Баракина О. В., Долгих В. Т. ФОРМОВАННЫЕ УГЛЕРОДНЫЕ
СОРБЕНТЫ ДЛЯ АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ:СИНТЕЗ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА......................................63Седых С. Е., Принц В. В., Бунева В. Н., Невинский Г. А.
Фактор молока человека, стимулирующий
образование биспецифичных иммуноглобулинов.....66Ширяева Е. Н., Абдурашитов М. А., Гончар Д. А., Дегтярёв С. Х.,Дедков В. С., Ломаковская Е. Н., Михненкова Н. А.,Мутыло Г. В., Удальева С. Г., Урюмцева Л. А., Чернухин В. А.
КЛОНИРОВАНИЕ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ
НОВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ
M.AGSI, M.ALUBI И M.FATI, УЗНАЮЩИХ И УНИКАЛЬНО
МОДИФИЦИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
TTSA(М6A), (М6A)GCT И (М5C)ATG СООТВЕТСТВЕННО.........68Тайлакова Э. Т., Червякова О. В., Султанкулова К. Т.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ
ESСHERICHIA COLI И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ........................71Волкова Н. В. ПОЛУЧЕНИЕ БИБЛИОТЕКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ
НИТЧАТЫХ БАКТЕРИОФАГОВ М13 ДЛЯ СОЗДАНИЯ
ЭКСПРЕСС ТЕСТ ПОЛОСКИ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ АНТИТЕЛ
ПРОТИВ ГЕПАТИТА С........................................................................74Юнусова А. Ю., Кочнева Г. В. ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ
ЭФФЕКТ РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ,ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГО АПОПТИН, НА МОДЕЛИ
ИСКУССТВЕННОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ
КАРЦИНОМЫ А431.............................................................................76Жаниязов Ж. А., Даугалиева С. Т., Айткельдиева С. А.,Свирко Е. А. DE NOVO СБОРКА ГЕНОМА
МИКРООРГАНИЗМОВ ПОЛУЧЕННЫХНА ПРИБОРЕ MISEQ ILLUMINA.......................................................79Адаменко Л. С., Гуляева М. А., Зайцев С. А., Шестопалов А. М.
РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ МЕТОДА ИЗМЕРЕНИЯ
ИНДЕКСА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ МОНОНУКЛЕАРОВ
ПЕРЕФЕРИЙНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА.............................................82Вирусология
Алексюк П. Г., Алексюк М. С., Турмагамбетова А. С.,Богоявленский А. П., Березин В. Э. МОНИТОРИНГ
ПАРАМИКСОВИРУСОВ ПТИЦ В КАПЧАГАЙСКОМ
ВОДОХРАНИЛИЩЕ.............................................................................84Байсейіт С. Б., Глебова Т. И., Лукманова Г. В., Кливлеева Н. Г.,Шаменова М. Г. ИЗУЧЕНИЕ ЦИРКУЛЯЦИИ ВИРУСА
ГРИППА СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ
АКТЮБИНСКОЙ ОБЛАСТИ В 2015 г...............................................86Қалқожаева М. Қ., Сактаганов Н. Т., Онгарбаева Н. С.,Кливлеева Н. Г. ЦИРКУЛЯЦИЯ ВИРУСА ГРИППА
ПОПУЛЯЦИИ СВИНЕЙ В 2014 Г. В КАЗАХСТАНЕ........................88Шпилева О. В. Социально-медицинские аспекты
папилломавирусной инфекции у больныхс патологией шейки матки в Томской области........90Турмагамбетова А. С., Алексюк М. С., Богоявленский А. П.,Березин В. Э. МЕТАГЕНОМИКА НОВЫХ
ПАРАМИКСОВИРУСОВ В ВОДНЫХ ОБРАЗЦАХ
КАПЧАГАЙСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА.........................................93Демидова Е. В., Тарасова М. В., Нетесов С. В. ПОЛУЧЕНИЕ
ПОЛНОГЕНОМНОЙ ПЛАЗМИДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ
КОПИЮ ГЕНОМА АДЕНОВИРУСА 6-ГО СЕРОТИПА,ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В РАЗРАБОТКЕ
СРЕДСТВА ПРОТИВОРАКОВОЙ ТЕРАПИИ...................................95Демина А. В., Акопов Г. Д., Терновой В. А., Семенцова А. О.,Чаусов Е. В. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ИНФЕКЦИЙ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИХ ТЯЖЕЛУЮ
ПЕРИНАТАЛЬНУЮ ПАТОЛОГИЮ ..................................................97Ермилова О. С., Белявская В. А. ВАКЦИНОМИКА
НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ...........99Филиппова Е. И., Высочина Г. И., Лобанова И. Е.,Шалдаева Т. М., Мазуркова Н. А. ИЗУЧЕНИЕ
ПРОТИВОГРИППОЗНОЙ АКТИВНОСТИ РАСТИТЕЛЬНЫХ
ЭКСТРАКТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO...............................102Иголкин А. С. Африканская чума свиней:современные аспекты распространения в РФи странах Восточной Европы..............................................107Иунихина О. В., Рева Н. В. ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ ПОСЛЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С СУБСТРАТОМ
ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ.............................................................................112
Kasymbekov Ye. T., Zhumatov K. Kh., Sayatov M. Kh.,
Kydyrmanov A. I., Karamendin K. O., Asanova S. E.,
Daulbayeva K. D. ISOLATION OF INFLUENZA A VIRUSES FROMWILD BIRDS IN CENTRAL KAZAKHSTAN IN 2004–2013............115Корнеев Д. В., Попова А. В. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЧЕСКИХ
ХАРАКТЕРИСТИК БАКТЕРИОФАГА AP22
МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ СПЕКТРОСКОПИИ................117Макаревич Е. В., Скарнович М. О., Седельникова Н. В.,Мазуркова Н. А. ВИРУСИНГИБИРУЩИЕ СВОЙСТВА
ЭКСТРАКТОВ ЛИШАЙНИКА CETRARIA ISLANDICA
В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГРИППА А............................................118Марченко В. Ю., Суслопаров И. M., Гончарова Н. И.,Колосова Н. П., Шиповалов А. В., Ильичева Т. Н.,Дурыманов А. Г., Рыжиков А. Б. ВЫДЕЛЕНИЕ
ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ВИРУСА ГРИППА ПТИЦНА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ САХА........................................122Мазурков О. Ю., Кабанов А. С., Скарнович М. О.,Бормотов Н. И., Скарнович М. А., Серова О. А.,Шишкина Л. Н., Черноносов А. А. оценка
фармакодинамических и фармакокинетических
показателей противооспенного ХИМИЧЕСКОГО
СОЕДИНЕНИЯ НИОХ-14...................................................................126Овчинникова А. С., Сергеев Ал. А., Титова К. А.,Кабанов А. С., Булычев Л. Е., Сергеев Ар. А., Галахова Д. О.,Шишкина Л. Н., Таранов О. С., Агафонов А. П., Сергеев А. Н.
ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К ВИРУСУ ОСПЫ ОБЕЗЬЯН МЫШИДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ПРОТИВООСПЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ...........................................131Сейдалина А. Б., Хан Е. Я., Карамендин К. О.,Кыдырманов А. И., Даулбаева К. Д., Асанова С. Е.,Касымбеков Е. Т., Жуматов К. Х., Саятов М. Х. ЦИРКУЛЯЦИЯ
НОВЫХ И ИЗВЕСТНЫХ СЕРОТИПОВ ПАРАМИКСОВИРУСОВВ ПОПУЛЯЦИЯХ ДИКИХ ПТИЦ НА ТЕРРИТОРИИ
РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН В 2013–2014 ГГ................................133Скарнович М. А., Скарнович М. О., Мазурков О. Ю.,Шишкина Л. Н. ИЗУЧЕНИЕ чувствительностик противовирусным препаратам in vitroи патогенности ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА А(H3N2),
А(H1N1), А(H5N1) И А(H7N9) in vivo............................................135Ачигечева П. Ю., Никонорова Ю. В., Балахнин С. М.,Гашникова Н. М. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МТТ-МЕТОДАДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОТИВОВИРУСНОЙ
АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.......139Молекулярная биология

Исмагамбетов Б. М., Богданова М. И., Кошеметов Ж. К.,Матвеева В. М., Нурабаев С. Ш., Сугирбаева Г. Д.,Оразымбетова Н. К. Разработка ОТ-ПЦРдля диагностики вируса бешенства..............................142Ширшикова Т. В., Камалетдинова Л. Х., Марданова А. М.,Шарипова М. Р., Богомольная Л. М. ВКЛАД ЭФФЛЮКС
СИСТЕМЫ МАСАВ SERRATIA MARCESCENSВ УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ.....................................145Ткачёва А. В., Сиволобова Г. Ф., Гражданцева А. А.,Кочнева Г. В. Анализ онколитических свойств

рекомбинантного штамма MVA вируса
осповакцины, экспрессирующего ген белка
NS1 парвовируса..........................................................................150Волкоморов В. В., Григорьева Е. С., Карбышев М. С.,Митрофанова И. В., Кайгородова Е. В., Чердынцева Н. В.
ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛАК ОПУХОЛЬ-АССОЦИИРОВАННОМУ БЕЛКУPMEPA1 И АНАЛИЗ ХАРАКТЕРА ЕГО ЭКСПРЕССИИВ ТКАНИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЖЕЛУДКА................................154Черепанова А. В., Власов В. В., Лактионов П. П. РОЛЬ БЕЛКА
KU В ИНГИБИРУЮЩЕМ ДЕЙСТВИИ ДНК НА дцРНКЗАВИСИМУЮ АКТИВАЦИЮ NFkB В ОПУХОЛЕВЫХ
КЛЕТКАХ . ..........................................................................................158
Дорофеева Ю. Б., Салтыкова И. В., Петров В. А.,Федосенко С. В., Огородова Л. М., Попенко А. С., Тяхт А. В.,Кириллова Н. А., Куликов Е. С., Деев И. А., Говорун В. М.,Кострюкова Е. С. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ОРОФАРИНГЕАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ ПАЦИЕНТОВПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ И ХРОНИЧЕСКОЙ
ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ.........................................160
Габбасов Р., Бикл Л., О’Брайн Ш., Сио С., Литвин С.,Големис Э., Бабынин Э., Конолли Д. Влияние экспрессии
NEDD9 в первичной опухоли и опухолевом
микроокружении на развитие
эпителиального рака яичников . .....................................162Григорьева А. Е., Тамкович С. Н., Кабилов М. Р., Еремина А. В.
СВОЙСТВА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ
ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ И БОЛЬНЫХ
ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМОЙ....................163Грищенко И. В., Дольский А. А., Кулемзин С. В.,Пустыльняк В. О., Усдин К., Юдкин Д. В. ИССЛЕДОВАНИЕ
ФОРМИРОВАНИЯ ВТОРИЧНЫХ СТРУКТУР ДНК В РАЙОНЕ
ЛОМКОГО САЙТА FRAXA У ПАЦИЕНТОВ С СИНДРОМОМ
МАРТИНА-БЕЛЛ................................................................................167Ибрагимова М. К., Цыганов М. М. , Карабут И. В.
ИНТЕГРАТИВНАЯ И ЭПИСОМАЛЬНАЯ ФОРМЫ ВИРУСА
ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ГЕНОТИПА В ИЗМЕНЕННОМ
ЦЕРВИКАЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ........................................................168Карташов М. Ю., Микрюкова Т. П., Терновой В. А.,Москвитина Н. С., Локтев В. Б. ИЗУЧЕНИЕ
РАСПРОСТРАНЕНИЯ РИККЕТСИЙ И ИХ ПЕРЕНОСЧИКОВНА ТЕРРИТОРИИ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ.......................173Косова А. А., Ходырева С. Н., Лаврик О. И. ФОРМИРОВАНИЕ
НЕОБРАТИМЫХ КОМПЛЕКСОВ С ДНК —ПРЕДПОЛАГАЕМАЯ ФУНКЦИЯ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ................................................178Кравчук О. С., Купрюшкин М. С., Дмитриенко Е. В.
ИССЛЕДОВАНИЕ СУБСТРАТНЫХ СВОЙСТВ
ФОСФОРИЛГУАНИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В РЕАКЦИЯХ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ
ДНК- ПРОЦЕССИРУЮЩИМИ ФЕРМЕНТАМИ............................180Кургина Т. А., Анарбаев Р. О., Лаврик О. И. ОПРЕДЕЛЕНИЕ
АКТИВНОСТИ ПРИРОДНОГО МУТАНТА ТИРОЗИЛ-ДНКФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 1 (SCAN1)НА МОДЕЛЬНЫХ ДНК-СУБСТРАТАХ...........................................183
Меньшанов П. Н., Акулов А. Е. ЭФФЕКТЫ ИЗОФЛУРАНАИ ДРУГИХ АНЕСТЕТИКОВ НА УРОВЕНЬ КЛЮЧЕВЫХ
МЕТАБОЛИТОВ В ГИППОКАМПЕ НЕОНАТАЛЬНЫХ КРЫС......185Никитина Е. Г., Черемисина О. В., Литвяков Н. В. МИКРОРНК
СЛЮНЫ В ДИАГНОСТИКЕ ПАТОЛОГИЙ ГОРТАНИ.................187Рудомётов А. П., Щербаков Д. Н.,Бакулина А. Ю. КОНСТРУИРОВАНИЕ ИММУНОГЕНА
ПРОТИВ ВИЧ-1, ВКЛЮЧАЮЩЕГО ЭПИТОП
ШИРОКОНЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО АНТИТЕЛА 10E8.....................189Щербакова Н. С., Рудометов А. П., Орешкова С. Ф.,Карпенко Л. И. ENV-ПСЕВДОВИРУСЫ ВИЧ-1, ПОЛУЧЕННЫЕИЗ ИЗОЛЯТОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ
НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ.........................................................191Кожабергенов Н. С., Строчков В. М., Бурашев Е. Д.,Шораева К. А., Султанкулова К. Т. РАЗРАБОТКА БИОЧИПАНА ОСНОВЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ...............193
Сухарева Е. В., Ланшаков Д. А. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ
РАННЕГО ОТВЕТА C-FOS И C-JUN В ОТДЕЛАХ
НЕОНАТАЛЬНОГО МОЗГА КРЫС ПОД ДЕЙСТВИЕМ
ДЕКСАМЕТАЗОНА.............................................................................195Троицкая О. С., Ткаченко А. В., Коваль О. А. АКТИВАЦИЯ
ИММУННОЙ СИСТЕМЫ РЕКОМБИНАНТНЫМ
АНАЛОГОМ ЛАКТАПТИНА............................................................197Цыганов М. М., Ибрагимова М. К., Казанцева П. В.,Слонимская Е. М., Чердынцева Н. В., Литвяков Н. В.
ОДНОНУКЛЕОТИДНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ В РЕГУЛЯЦИИ
ГЕНОВ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ
УСТОЙЧИВОСТИ В ОПУХОЛИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.............199
Волкова А. В., Ломзов А. А., Купрюшкин М. С.,Дмитриенко Е. В. ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ГЕТЕРОФАЗНОМ ВАРИАНТЕС ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НОВЫХ НЕЗАРЯЖЕННЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ....................................................................204Зыбкина А. В., Щербакова Н. С., Щербаков Д. Н. СОЗДАНИЕ
РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЙ
СБОРКУ ПСЕВДОВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ,ЭКСПОНИРУЮЩИХ НА ПОВЕРХНОСТИ
GP ВИРУСА ЭБОЛА...........................................................................206
Белая С. А. АНАЛИЗ НУКЛЕОТИДНОГО СХОДСТВА ГЕНОВ
16 ПОДСЕМЕЙСТВ ЦИТОХРОМОВ Р450
6-ГО СЕМЕЙСТВА (CYP6) В РАЗНЫХ ОТРЯДАХ
НАСЕКОМЫХ.....................................................................................208Научное издание

II Международная конференция
молодых ученых: биотехнологов,молекулярных биологови вирусологов
Сборник тезисов

Верстка А. С. Терешкиной

Подписано в печать 14.09.2015 г.
Формат 60 х 84 1/16. Уч.-изд. л. 14. Усл. печ. л. 13.
Тираж 150 экз. Заказ №Редакционно-издательский центр НГУ
630090, Новосибирск-90, ул. Пирогова, 2.