抗体ガイド

抗体の基本に関する完全ガイド：
抗体の構造・作製から抗体の選択・取扱いまで

目次
第 1 章 抗体の基本.................................................................................................................................. 4- 抗体の構造とアイソタイプ.................................................................................................................... 4- 抗原の概要と実験での考慮事項......................................................................................................... 7- 免疫系と抗体反応................................................................................................................................. 8

第 2 章 抗体の作製................................................................................................................................ 10
第 3 章 抗体を用いた方法および技術........................................................................................... 15

第 4 章 抗体の選択と使用方法........................................................................................................ 20- 一次抗体の選択..................................................................................................................................... 20- 二次抗体の選択..................................................................................................................................... 23- 抗体特異性の検証. ................................................................................................................................ 27- 抗体の保管と取扱い............................................................................................................................... 31- 抗体のフォーマットと精製....................................................................................................................... 33- 抗体の希釈と滴定.................................................................................................................................. 36

第 5 章 抗体用語集. ............................................................................................................................. 37

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第 1 章 抗体の基本

抗体の構造とアイソタイプ
抗体の構造

抗体は、一次免疫応答として B 細胞によって産生される Y 字型の大きな糖タンパク質で、免疫グロブリン（Ig）
としても知られます。抗体は、病原体の固有の分子（抗原といいます）に特異的に結合し、4 本のポリペプチド鎖で構成される Y 字型を基本単位とし、Y 字型が 1 つ以上集まって 1 つの分子を形成します（図 1）。

各 Y 字型には、同一の重鎖（H）2 本と同一の軽鎖（L）2 本が含まれ、重鎖と軽鎖では配列と長さが異なります。Y 字型の上部にある可変領域（V）はフラグメント抗原結合（F(ab)）領域としても知られ、エピトープと呼ばれる抗原の特定部位に強固に結合します。

抗体の基部には定常領域（C）があり、フラグメント結晶化可能領域（Fc）を形成します。この領域は免疫応答における抗体の機能において非常に重要です。

抗原結合部位ヒンジ

図 1. 抗体の構造。Y 字型の抗体は、中央にある柔軟性のあるヒンジ領域により結合しています。抗原との結合は、免疫グロブ

リンの重鎖（H）と軽鎖（L）からなる可変領域（V）で起こります。抗体の基部には定常領域（C）があります。VH – 重鎖の可変領域、VL – 軽鎖の可変領域、CH – 重鎖の定常領域、CL – 軽鎖の定常領域

F(ab) と Fc 領域

抗体の Y 字型は、タンパク質分解酵素のペプシンによって 3 つのフラグメント、すなわち 2 つの F(ab) 領域と 1 つの Fc 領域に切断されます。F(ab) 領域は、同種（特異的）抗原に結合する可変領域を含みます。Fc

フラグメントは、リンパ球表面上の内在性の Fc 受容体と二次抗体の結合部位となります。また、実験での可視化のため、色素や酵素を抗体の Fc 領域上に共有結合させることができます。

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抗体フラグメントは、特定の免疫化学技術において明確なメリットがあります。F(ab) フラグメントは（1）抗原を沈殿させず、（2）Fc 領域がないために in vivo 試験では免疫細胞に結合しないことから、IgG 抗体の断片化が有用な場合があります。F(ab) フラグメントはサイズが小さく、クロスリンクしないため（Fc 領域がないため）、機能試験では F(ab) フラグメントを放射性標識することが多いです。Fc フラグメントは、免疫組織染色において Fc 受容体ブロッキング剤として使用されることが多いです。

F(ab) および F(ab’)2 フラグメントのメリットについてはこちらをご覧ください。

重鎖

重鎖のタイプによって、抗体の全体的なクラスまたはアイソタイプが決まります。哺乳類の Ig 重鎖は 5 種類あり、ギリシャ文字（α、δ、ε、γ、μ）で表されます。この 5 種類の重鎖はそれぞれ IgA、IgD、IgE、IgG
および IgM 抗体に存在します。重鎖のサイズと組成はさまざまであり、αとγは約 450 アミノ酸、μとεは約 550 アミノ酸を含みます。

各重鎖には定常領域（CH）と可変領域（VH）の 2 つの領域があります。定常領域は、同じアイソタイプの抗体

ではすべて同一ですが、異なるアイソタイプの抗体では異なります。重鎖γ、αおよびδには、3 つのタンデム

Ig ドメイン（CH1、CH2、CH3）からなる定常領域と柔軟性のあるヒンジ領域があります。重鎖μとεには、4 つの免疫グロブリンドメインからなる定常領域があります。重鎖の可変領域（VH）は、その Ig を産生した B 細胞

によって異なりますが、単一の B 細胞または B 細胞クローンによって産生された抗体ではすべて同じです。
各重鎖の可変領域の長さは約 110 アミノ酸で、単一の Ig ドメインから構成されています。

軽鎖

哺乳類の軽鎖はλとκの 2 種類のみで、ポリペプチド配列にわずかな違いがあります。軽鎖には定常領域（CL）と可変領域（VL）の 2 つの連続したドメインがあります。軽鎖の長さは約 211 ～ 217 アミノ酸です。各抗体には、必ず同一の軽鎖が 2 本含まれます。軟骨魚綱や真骨下綱などの下等脊椎動物では、他にもι（iota）鎖などの軽鎖が認められます。

抗体のアイソタイプ

哺乳類では、抗体は IgG、IgM、IgA、IgD および IgE の 5 つのアイソタイプに分類されます。図 2 に示すように、
各アイソタイプには独自の構造があります。アイソタイプは Y 字型の基本単位の数と重鎖のタイプによって異なります。また、生物学的性質、機能部位および各抗原に対処する能力にも違いがあります（表 1）。

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4

IgG 1,2,4

IgM 細胞

抗原結合

軽鎖 k
またはλ

生物活性
重鎖γ

図 2. 抗体の構造とアイソタイプ

表 1. 抗体の各アイソタイプの構造と機能
アイソタイプ

重鎖

軽鎖

IgA1

α1

λまたはκ

IgA2

α2

分子量

構造

機能

150 ～ 600

単量体

マウスおよびヒトで最も豊富に産生される抗体

（kDa）

- 四量体

のアイソタイプ。腸、呼吸器、泌尿生殖器などの粘膜領域に認められ、病原体のコロニー形成を防ぎます。消化への耐性があり、母乳に分泌

IgD

IgE

δ

ε

λまたはκ

λまたはκ

150

190

単量体

単量体

されます

機能の詳細は不明です。B 細胞の発生段階でIgM と連携します。多くは B 細胞と結合しています

アレルゲンと結合してマスト細胞からのヒスタミンの放出を引き起こし、アレルギーの原因となります。寄生虫に対する防御作用もあり

IgG1

IgG2a

IgG2b

γ 1、γ 2、γ 3、 λまたはκ
γ4

150

単量体

IgM

血清中に最も豊富に存在する Ig で、ヒトの総血清中抗体の約 75% を占めます。病原体の侵入に対して起こる抗体ベースの免疫の多くに関与します。中程度の補体固定能があります

IgG3
IgG4

ます

μ

λまたはκ

900

五量体

最初に反応する抗体です。B 細胞の表面上に発現し、非常にアビディティが高い分泌型です。
B 細胞性免疫の初期段階で、十分な IgG が産生される前に病原体を除去します

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抗原と抗体の相互作用：抗体の結合の仕方と結合部位

抗体の F(ab) 領域には、パラトープと呼ばれる抗原結合部位が含まれます。パラトープは、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分（抗原のごく一部で、長さがわずか数個のアミノ酸の場合もあります）に結合します（図 3）。

パラトープとエピトープは相補的な形状をしており、ファンデルワールス力、水素結合、静電相互作用および疎水性相互作用などの分子間相互作用によって結合します。このような力の強さによって抗体の親和性が決まります。

エピトープ

可変領域
定常領域

免疫原または抗原

パラトープ

図 3. 抗原と抗体の相互作用の概略図

抗原の概要と実験での考慮事項

イムノアッセイの基本原理は、特異的な抗体がその抗体に特異的な抗原と結合し、排他的な抗体 - 抗原複合体を形成することです。この章では、抗原とは何か、抗体産生のために抗原をどのように選択するかについて説明します。

抗原の定義

抗原とは、生体内に侵入すると、それに対する免疫系の応答を引き起こす外来物質のことで、免疫系により特異的抗体が産生され、特異的抗体は外来物質（抗原）に結合します。

抗原は一般的に分子量が大きく、タンパク質や多糖である場合が多いですが、ポリペプチド、脂質、核酸など、他にも多くの物質が抗原となる可能性があります。

ハプテン

ハプテンは、大きなキャリアタンパク質と化学的に結合した場合に免疫応答を引き起こす可能性のある小さな物質です。一般的なキャリアタンパク質として、ウシ血清アルブミン（BSA）、スカシガイ由来ヘモシアニン（KLH）やその他の合成マトリックスなどがあります。

薬物、単糖、アミノ酸、小さなペプチド、リン脂質またはトリグリセリドなど、多くの分子がハプテンとして機能する場合があります。このため、十分な時間があれば、免疫系はほぼあらゆる外来物質を特定し、特異的な抗体を産生します。ただし、この特異的な免疫応答は非常に多様で、抗原のサイズ、構造および組成によって異なります。強い免疫応答を引き起こす抗原は強免疫原性と呼ばれます。

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抗原と抗体の相互作用

エピトープとは、特異的な抗体が認識・結合する抗原の部分です。効率的な抗原と抗体の相互作用には、エピトープがすぐに結合できる状態になっている必要があります。ターゲット分子が変性している場合（固定、還元、pH の変化を通して、またはゲル電気泳動用に調製している場合など）、エピトープが変化して抗体と相互作用する能力に影響を及ぼす可能性があります。

例えば、ウエスタンブロットでは機能しなくても、免疫組織染色（IHC）では良好に機能する抗体もあります。
これは、IHC では組織内で複雑な抗原部位が維持されるためです。対照的に、ウエスタンブロットではサンプル

調製の過程でタンパク質の立体構造が変化するため、抗原部位が破壊されて抗体が結合できなくなります。
そのため、エピトープは自然な細胞の状態で存在することもあれば、変性した場合にのみ露出することもあります。自然の状態では、エピトープは細胞質性（可溶性）、膜結合性または分泌性です。エピトープの数、部位およびサイズは、抗体産生プロセスで利用できる抗原の量に左右されます。

優れた抗原の特徴は以下のとおりです。
•

分子内に構造的に安定かつ化学的に複雑な領域がある•分子量は最小で 8,000 ～ 10,000 Da（ただし、キャリアタンパク質の存在下では 200 Da という低分子量

•

•
•
•
•
•

広範にわたる反復単位がなく、非常に動きやすい構造をしているのハプテンが使用される）免疫系により対処できる

抗体産生機構が免疫原領域にアクセスできる
構造的要素が宿主と十分に異なる

ペプチド抗原：少なくとも 30% の免疫原アミノ酸（リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミンおよびアスパラギン）を含む領域がある

ペプチド抗原：顕著な親水性残基または荷電残基がある

免疫系と抗体反応

この章では、免疫系の一般的な概要と免疫系が特異的抗体の産生に果たす役割について説明します。

免疫系の概要免疫系の機能は、外来物質や感染性微生物から生体を防御することです。特定の方法で病原体に反応し、病原体への曝露を長期間記憶しておくことができます。免疫系には 2 つの機能的要素があります。
1.
2.

自然免疫系または非特異的免疫系
適応免疫系または特異的免疫系

自然免疫系

自然免疫系は感染に対する最初の防御となるものです。感染に対する物理的な障壁には、病原体の侵入を防ぐ皮膚や、病原体を捕捉して除去する粘液などの体液があります。

補体タンパク質、自然免疫を担当する白血球および食細胞などの多くの細胞成分および生化学的成分が病原体を特定して体内から除去します。

自然免疫系の機能および効率は、外来病原体に繰り返し曝露しても変化することはありません。

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適応免疫系

自然免疫系によって病原体を体内から除去できなかった場合、適応免疫系が活性化されます。さまざまな細胞および分子から構成され、リンパ球および抗体が重要な要素です。

骨髄中の前駆細胞からリンパ球が常時産生されます。リンパ球は細胞表面受容体を合成するか、外来分子に特異的に結合するタンパク質を分泌します。こうして分泌されるタンパク質は抗体として知られています。
抗体に結合できる分子を抗原といいます。抗体という用語は免疫グロブリンと同義です。
抗体が結合した病原体には、除去または破壊のために印がつけられます。

適応免疫系の機能のほとんどは、リンパ球を以下 3 つの基本タイプに分類することで説明できます。
1.

B 細胞

3.

ヘルパー T 細胞（Th 細胞）

2.

細胞傷害性 T 細胞（TC 細胞）

適応免疫応答は、液性免疫応答と細胞性免疫応答に分けられます。B リンパ球は、病原体に特異的な抗体を放出することによって液性免疫応答を媒介します。細胞性免疫応答では、TC 細胞が外来細胞または感染細胞に結合し、溶解させます。

これらの細胞はサイトカインタンパク質の放出を介して両免疫応答に関与します。3 種類のリンパ球には

いずれも、抗原に結合できる細胞表面受容体があります。いずれの抗原受容体も糖タンパク質であり、1 つの細胞内で合成される受容体は 1 種類のみです。免疫系の特異性は、1 つの細胞が 1 つの抗原のみを認識するという事実の影響を受けます。

ヒト T 細胞の発生に関するポスターはこちらをご覧ください

抗体反応

抗体と抗原の相互作用はあらゆるイムノアッセイの基礎となるものですが、免疫応答の基礎でもあります。
抗原と反応する抗体の領域を、パラトープといいます。抗体と相互作用する抗原の領域を、エピトープといいます。親和性は、抗体に対するエピトープの結合強度の指標で、解離定数 KD で表されることが多いです。
アビディティは、抗体と抗原によって形成される複合体の全体的な安定性の指標です。
Kd と抗体性能に対する影響についてはこちらをご覧ください

抗体反応とは、マクロファージ、T リンパ球および B リンパ球の間の一連の相互作用の結果です。病原体抗原は、
マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、リンパ節および単球などの抗原提示細胞（APC）に取り込まれ、部分的に分解されます。

この抗原の断片は、MHC II（主要組織適合性複合体）として知られる細胞表面糖タンパク質と結合した APCの表面上に提示されます。MHC 分子には以下の 2 種類があります。MHC クラス I はほとんどの細胞の表面に発現しており、クラス II は APC の表面にのみ発現しています。抗原 -MHC II 複合体が形成されると Th 細胞
が APC に結合し、Th 細胞の増殖とサイトカイン放出を引き起こします。その後、T 細胞が B 細胞の MHC複合体に結合し、B 細胞の増殖および分化を引き起こします。B 細胞は形質細胞に変化し、外来物質に特異性を示すよう微調整された抗体を大量に分泌します。一部の B 細胞は記憶細胞に形質転換し、将来の感染時に抗体による免疫応答が素早く生じるようになります。

MHC による抗原の処理に関するポスターはこちらをご覧ください

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第 2 章 抗体の作製

ここでは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびリコンビナント・モノクローナル抗体のメリットとデメリット、産生／作製方法について見ていきましょう。

ポリクローナル抗体の作製

ポリクローナル抗体は、不均一な抗体の混合物であり、特定の抗原に対して各抗体が異なるエピトープを認識します。  

ポリクローナル抗体を作製するには、通常、まずターゲット抗原によって動物を免疫して免疫応答を刺激し、免疫動物の B 細胞から抗原特異的抗体が産生されるようにします（図 4）。動物の体内で抗原特異的抗体の数と親和性を高めるため、数週間の間隔で同じ抗原による免疫を繰り返します。得られた免疫血清（抗体を含む血液部分）はそのままで使用することもできますが、アフィニティ精製により抗体を単離することもできます。

ポリクローナル抗体は、ある抗原に対して自然免疫応答を示す抗体の混合物です。そのため、適切なアプリ

ケーションではターゲット抗原に対して強力なシグナルを生成でき、単一のエピトープに偏りません。ただし、供給の点で制約があり、モノクローナル抗体よりもバッチ間のばらつきが大きいというデメリットがあります。

ポリクローナル抗体は、配列の似ている他のタンパク質と結合するリスクが高いため、交差反応性を示したり、特異性がなかったりする可能性があります。このような問題に対処するため、ポリクローナル抗体混合物を交差吸着（追加精製）し、望ましくない結合特性をもった抗体（多くは特定の種における類似抗原に対するもの）を除去します。

採血する

血清を
分離する

抗原
免疫化する

セファロース
ビーズ

固定された
抗原

精製された抗原特異的
ポリクローナル抗体

抗原特異的
抗体

血清中の
すべての抗体抗原を認識しない抗体

図 4. ポリクローナル抗体作製の一般的なプロセス

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ハイブリドーマ技術を用いたモノクローナル抗体の作製

ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は親細胞である単一の B 細胞のクローンに由来し、
1 つの抗原につき 1 つのエピトープのみを認識します（図 5）。ハイブリドーマ法では、B 細胞とハイブリドーマ
細胞とを融合させて不死化し、免疫グロブリン（Ig）を長期間にわたって産生できるようにしています。

モノクローナル抗血清

ポリクローナル抗血清

抗体

エピトープ

抗原

図 5. ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の特異性の違い

ハイブリドーマ法によりモノクローナル抗体を作製するには、まず、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫化を行います。免疫後に脾臓から抗体産生細胞（B 細胞／形質細胞）を採取し、不死化させた腫瘍細胞と融合させてハイブリドーマを樹立し、抗体の産生と性能をスクリーニングします（図 6）。  

抗体を産生するハイブリドーマ細胞を分離してクローニングし、組織培養技術を用いて培養します。細胞により培養培地に分泌された抗体を採取します。そのままで使用することもできますが、アフィニティ精製により精製することもできます。ハイブリドーマには、正確なクローンであることを識別できるよう固有のクローン名（MJFF5 (68-7) や EPR19759 など）があります。ポリクローナル抗体とは異なり、モノクローナル
抗体は均一で、1 つのエピトープに対してのみ特異性があります。

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免疫原によりマウスを
免疫化する

組織を
培養する

脾臓から採取した
抗体産生細胞（B細胞および形質細胞）

不死化
腫瘍細胞

融合

抗体産生
ハイブリドーマ

A

B
C

D
E
F

G

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

抗体産生に対してスクリーニングしたハイブリドーマ

12

ハイブリドーマの1クローンを単離する。
最良の抗体を産生する最も効率的なクローンを培養し、抗体を採取する

抗体を産生するハイブリドーマをクローン化する（1つの細胞クローン
は1種類の抗体を産生）

図 6. ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の作製

モノクローナル抗体は、抗原上の 1 つのエピトープのみを検出するため、他のタンパク質と交差反応する可能性が低く、ポリクローナル抗体よりもバッチ間のばらつきが小さくなります。モノクローナル抗体は特徴が十分に明らかにされており、特異性と感度を兼ね備えています。

ハイブリドーマ細胞株を用いて作製したモノクローナル抗体は、時間とともに遺伝的浮動（genetic drift）が生じる傾向があります。数年後に同じ細胞株を用いて作製した抗体は、初代の抗体とわずかに異なる可能性があります。そのため、抗体の長期供給を保証し、製品の品質を維持するため、ハイブリドーマ由来抗体をリコンビナント型に変換しました。  

リコンビナント・モノクローナル抗体の作製

リコンビナント抗体とは、合成遺伝子を用いて in vitro で作製した抗体です。コードする配列を慎重にコントロールできるため、ハイブリドーマから産生される抗体と比較して発現を最適化（抗体収量の増加）し、再現性を改善することが可能です。従来のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と比較して、リコン
ビナント抗体は長期の供給保証が可能で、バッチ間のばらつきを最小限に抑えられます。また、抗体をコードする配列が明らかにされているため、用途に応じてさらに改変・操作が可能です。例えば、配列を修飾する
ことにより抗体の結合特性を改善したり、タグを付加したり、別の種の FC フラグメントを組み込んだりすることが可能です。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください11リコンビナント抗体は、抗体をコードする遺伝子を哺乳類高収量発現ベクターにクローニングすることによって作製します。その後、得られたベクターを発現宿主に導入し、機能性抗体を作製します。正しい翻訳後修飾（グリコシル化など）を保存するため、発現宿主としては通常 HEK 293 や CHO-K1 などの哺乳類細胞株が使用されます。

ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ、B 細胞クローニングおよび次世代シーケンシング（NGS）など、抗体をコードする遺伝子の導出には複数の方法があります。ここでは、ハイブリドーマおよびファージ
ディスプレイ技術に基づくリコンビナント抗体の作製プロセスについて説明します。

既存のハイブリドーマによるリコンビナント・モノクローナル抗体の作製

既存のハイブリドーマによるモノクローナル抗体は、リコンビナント・モノクローナル抗体に変換することで一貫性と特異性を向上させることができます。ハイブリドーマから抗体産生遺伝子の配列を取得し、哺乳類細胞株に発現させることにより、リコンビナント抗体への変換を行います。以下にプロセスの概要を示します。
1.
2.

3.
4.
5.

上記の図 6 と同じ手順を用いてハイブリドーマを作製します。

特定のハイブリドーマの mRNA を単離し、cDNA に変換した後、PCR を用いて増幅し、抗体をコードする
配列を特定することにより、in vitro でリコンビナント抗体を作製することができます。
抗体をコードする配列をシーケンシングし、発現ベクターにクローニングします。
その後、遺伝子を哺乳類細胞株（HEK 293 など）に発現させます。

得られたリコンビナント抗体を検証し、性能がハイブリドーマによる抗体と一致することを確認します。

ファージディスプレイによるリコンビナント・モノクローナル抗体の作製

In vitro ファージディスプレイ技術を用いれば、ターゲットに対するリコンビナント・モノクローナル抗体を素早く特定でき、動物の免疫化も不要になります（ナイーブライブラリーの場合）。この技術では、抗体ライブラリーの作製、関心のあるターゲット／抗原に結合する抗体の選択および親和性成熟が必要です（Groff et al., 2015）。  

ファージディスプレイには以下のステップがあります（図 7）。
1.

ターゲット・タンパク質またはペプチドを、ELISA プレートまたはコーティングした磁気ビーズで捕捉します。このような抗原でコーティングした表面を用いて、ファージディスプレイ・ライブラリーをスクリーニングします（scFv や Fab などの抗原特異的抗体のドメインを発現したバクテリオファージが、
コーティングした表面に付着します）。

2.

プレートを洗浄して非特異的バインダーを除去します。

4.

抗原特異的バクテリオファージの量を増やすため、追加のパニング／スクリーニングを実施します。通3.

その後、特定のファージディスプレイ・バインダーを溶出させ、細菌細胞に形質導入して増幅します。
常は 2 ～ 3 回実施します。

5.

ELISA などの結合アッセイによりターゲットの特異性を確認します。その後、陽性バインダーから DNA

6.

抗体をコードする配列を哺乳類発現ベクターまたは IgG 発現ベクターに導入することで、リコンビナント・

7.

その後、ウエスタンブロット、免疫蛍光染色、フローサイトメトリーおよび免疫組織染色などの適切なを単離し、シーケンシングします。

モノクローナル抗体の大規模製造が可能になります。
アッセイで抗体を検証します。

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抗原でコーティングしたビーズ

ファージの構造

ファージライブラリー

コートタンパク質

DNA分子4. 2～3回繰り返す

テールファイバー

1. ビーズ（またはウェル）をタンパク質／ペプチドでコーティングし、
ファージ
ライブラリーとインキュ
ベートする

コントロールとしてブロッキングしたウェル

検討した48個のバインダー
A

3. ファージを溶出させ
増幅させる

B
C

D

2. 洗浄によりバインダー以外
を除去する

E
F

G

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

5. パニングを2～3回繰り返した後、結合の特異性をELISAで判定する

図 7. ファージディスプレイ法の例（ステップ 1 ～ 5）

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第 3 章 抗体を用いた方法および技術

抗体は、さまざまなアッセイで使用される強力な研究ツールです。ここでは、抗体がどのように使用されているのかに焦点を当てながら、一般的なアッセイについて簡単に説明します。

酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）

ELISA は、生体サンプル中の抗原を検出するプレートベースの技術です。ELISA は他のイムノアッセイと同様に抗体を使用しますが、抗体と抗原の高度に特異的な相互作用を利用してターゲット抗原を検出します。
分析物および分子間相互作用を定量化し、特性を明らかにすることができます。

ELISA では抗原を固体表面に固定します。直接固定することもできますが、表面に固相化した捕捉抗体を介することが多いです（図 8）。表面を洗浄し、次に酵素や蛍光色素などの分子で標識した検出抗体とインキュ
ベートします。

抗原の存在下では、検出抗体がプレートに結合したままの状態となり、シグナルを生成します。このシグナルの強度はサンプル中の抗原の濃度に対応しています。

ストレプトアビジンHRP

ビオチン
検出抗体

ターゲット・
タンパク質

A

捕捉抗体

B
C

D
E
F

G

H

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

図 8. サンドイッチ ELISA の仕組み。マルチウェルプレート上の捕捉抗体により関心のある抗原が固定されます。この抗原は、ビオチンやストレプトアビジン -HRP で標識した検出抗体によって認識され、結合されます。

ELISA は通常マルチウェルプレート（96 ウェルまたは 384 ウェル）で実施し、抗原を固定することにより、抗原を残りのサンプル成分から分離しやすくします。このような特徴があるため、複数のサンプルを容易に同時に測定できます。

ELISA には主に直接法、間接法、サンドイッチ法および競合法の 4 種類があり、それぞれにメリット、デメリット、適合性があります。各実験に最適な ELISA 法は、所望の感度、特異性およびアッセイ時間など、多くの因子に左右されます。適切なタイプの ELISA を選択するには、こちらの情報をご覧ください。

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酵素免疫スポット（ELISPOT）

酵素免疫スポット（ELISPOT）は、サイトカインや増殖因子などの細胞によって分泌されるタンパク質の検出に使用されます。この技術により、さまざまな刺激に対する免疫応答を定量化および比較することができます。
抗体でコーティングした PVDF またはニトロセルロース膜とともに 96 ウェルプレートで細胞を増殖させます。
一次抗体および標識済み二次抗体を用いて、関心のある分泌タンパク質を検出します。関心のあるタンパク質を分泌する細胞は、有色または蛍光のスポットとして可視化されます。膜をスキャンおよび分析し、タンパク質を分泌する細胞数またはその割合を定量化します。

詳細な手順については、ELISPOT プロトコールをご覧ください。

ウエスタンブロット（WB）

ウエスタンブロットは、タンパク質を分離・同定する方法として研究で広く使用されています。ウエスタン
ブロットにより、タンパク質を検出し、サンプル間の相対的なタンパク質レベルを測定し、ターゲットの
分子量を確立することで、翻訳後プロセシングの理解を深めることができます。

ウエスタンブロットには主に、（1）タンパク質のサイズによる分離、（2）タンパク質の膜への転写、（3）一次抗体および二次抗体を用いたターゲット・タンパク質の可視化の 3 つのステップがあります（図 9）。

最初のステップでは、タンパク質をゲルにロードし、ゲル電気泳動によりサイズに基づいて分離します。

その後、電流を流してタンパク質バンドを膜に移動させます。電気泳動に使用されるゲルの表面はこの後に実施する免疫染色に適しておらず、抗体はゲルのタンパク質にくっつかないため、タンパク質を膜に転写することが不可欠です。

最後に、膜を関心のあるターゲットに特異的な抗体でさらに免疫染色した後、二次抗体と検出試薬を用いて可視化することができます。

-ve

ゲル電気泳動を用いてタンパク質をサイズによって分離する

一次抗体および二次抗体により、メンブレン上のタンパク質バンドを免疫染色する

免疫染色を可視化する（蛍光ウエスタンブロット
画像の例）
WT KO

タンパク質を
メンブレンに転写する+ve
図 9. ウエスタンブロットの概略図。

詳細な手順については、ウエスタンブロットプロトコールをご覧ください。

免疫沈降（IP）およびクロマチン免疫沈降法（ChIP）

免疫沈降は、個々のタンパク質およびタンパク質複合体を単離・精製する多用途な技術です。この技術では、抗体は固相基質（磁気ビーズ／アガロースビーズなど）に固定され、複合体溶液中の抗原を捕捉します。

クロマチン免疫沈降法（ChIP）は、あるタンパク質が生体内（in vivo ）で特異的 DNA 配列と結合するか否かを特定するために用いられる方法です。ChIP により、関心のあるタンパク質が結合する特定の遺伝子と配列をゲノム全体にわたって特定し、その調節機能や機序について重要な手がかりを得ることができます。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください

15

ChIP（図 10）では、抗体を用いて、転写因子などの関心のあるタンパク質とともに結合した DNA を免疫沈降させます。その後、結合した DNA を回収し、PCR、マイクロアレイまたはシーケンシングにより解析し、ゲノム配列およびタンパク質結合部位を特定します。

1
2

3
4
5

ダウンストリーム解析

図 10. ChIP プロトコールのワークフロー。ChIP を実施するための step-by-step のアプローチ：1 - クロスリンク、2 - クロマチン
断片化、3 - 免疫沈降、4 - DNA の回収と精製、5 - DNA の解析

ChIP の手順については、ChIP ガイドをご覧ください。

免疫組織染色（IHC）

免疫組織染色（IHC）は、抗体と抗原の相互作用を用いて組織切片中の抗原の分布と局在性を把握するための方法です（図 11）。ウエスタンブロットや ELISA に比べると定量性は劣りますが、IHC は未処理の（intact な）
組織におけるタンパク質発現を明らかにできるというメリットがあります。

IHC は、がんなどの疾患で組織異常を診断するためによく用いられる方法です。他の方法から得られたデータについて、背景を考慮して捉えるための貴重な視点を提供してくれる補助ツールです。

IHC 染色は、ターゲット抗原を認識する抗体を使用して実施します。この抗体と抗原の相互作用を可視化するには、検出方法として発色法または蛍光法を使用できます。発色法では、クロモゲンに曝露すると着色沈殿物を生成する酵素で抗体を標識します。蛍光法では、蛍光色素で抗体を標識します。サンプルの調製および可視化にはさまざまな方法があり、使用する方法はサンプルタイプと必要な感度に合わせて調整する必要があります。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください16

図 11. 左：正常ヒト扁桃腺組織（ホルマリン固定パラフィン包埋切片）の蛍光マルチプレックス IHC 染色。抗 PD1 抗体（ab237728、

オレンジ、Opal ™ 520）、抗 PDL1 抗体（ab237726、緑色、Opal ™ 540）、抗 CD68 抗体（ab192847、黄色、Opal ™ 570）、

抗 CD3 抗体（ab16669、赤色、Opal ™ 620）、抗 Ki67 抗体（ab16667、
ライトブルー、Opal ™ 650）および抗 PanCK 抗体（ab7753、

グレー、Opal ™ 690）の染色をマージ。右：正常ヒト扁桃腺組織（ホルマリン固定パラフィン包埋切片）の抗 Ki67 抗体（ab16667）
による IHC 染色。

IHC での免疫染色に関する詳細はこちらをご覧ください。

免疫細胞染色（ICC）

免疫細胞染色（ICC）は、標識した抗体を用いてタンパク質の細胞内分布を研究する際に用いられます。IHC とは対照的に、組織ブロックではなく細胞のサンプルに焦点を当てた技術です。

ICC 染色では、ターゲット・タンパク質に対する抗体を、固定・透過処理した細胞培養サンプルに添加します。
ICC には直接法と間接法の 2 種類があります。直接 ICC では標識済み一次抗体を用いるのに対して、間接 ICC

では標識していない一次抗体を使用し、標識済み二次抗体によって検出します（図 12）。ほとんどの ICC では蛍光色素で標識された抗体を使用します。蛍光色素は共局在性の研究に最適です。シグナルの検出には、広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡またはスピニングディスク顕微鏡などのさまざまな画像技術を用いることができます。

野生型 SH-SY5Y 細胞

野生型 A431 細胞
KRT14 ノックアウト A431 細胞

マージ

PDGFRA ノックアウト SH-SY5Y 細胞

マージ

図 12. 左：SH-SY5Y 細胞における抗 PDGFRA 抗体（Alexa Fluor® 488 二次抗体で検出 - 緑色）および抗チューブリン抗体（Alexa
Fluor ® 594 二次抗体で検出 - 赤色）による間接 ICC です。右：標識済み抗 KRT14 抗体（Alexa Fluor 647® - 赤色）および標識済み抗チューブリン抗体（Alexa Fluor 488® - 緑色）による直接 ICC です。核は DAPI で染色されています（青色）。
上：野生型細胞では対象のシグナルを確認できます。下：ノックアウト細胞では特異的シグナルを確認できません。画像は共焦点顕微鏡を用いて撮影しました。

詳細な ICC プロトコールはこちらをご覧ください。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください17

フローサイトメトリーと FACS

フローサイトメトリーは、細胞や粒子の特性を分析するレーザーを用いたポピュラーな技術です（図 13）。

混合した集団の個々の細胞に結合した標識抗体によって放出される蛍光を測定します。また、さまざまな細胞による光散乱に基づき、そのサイズと特性を評価します。

フローサイトメトリー

サンプル（懸濁液中の染色細胞）

シース液

ノズル

流体力学的絞り込み（細胞は一列に並んで通過）

染色細胞からの蛍光を検出する

レーザー光源すべての細胞からの前方散乱光および
側方散乱光を検出する

図 13. フローサイトメーターの概要。

フローサイトメトリーでは、細胞表面および細胞内分子の発現を解析し、不均一な細胞集団における各種細胞の特性を明らかにし、単離した部分集団の純度を評価し、細胞のサイズと容積を分析することができます。
これにより、単一細胞のマルチパラメータ解析を同時に実施することができます。詳細についてはフロー

サイトメトリーの手引きをご覧ください。

蛍光活性化セルソーティング（FACS）はフローサイトメトリーから派生したもので、蛍光標識に基づいて細胞集団を部分集団に物理的に分離します。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください18

第 4 章 抗体の選択と使用方法
一次抗体の選択一次抗体とは、ターゲット・タンパク質に直接結合する抗体のことで、タンパク質のエピトープを認識する
抗体領域はさまざまです。一次抗体を選択する際には、以下を考慮してください。

抗体のクローン性と製造方法

クローン性は、抗体がさまざまな B 細胞に由来するのか（ポリクローナル抗体）、親クローンに由来する

同一の B 細胞であるのか（モノクローナル抗体）によって決まります。いずれの抗体も、第 2 章で説明したとおり、それぞれメリットとデメリットがあります。

要点をまとめると、ポリクローナル抗体は不均一な抗体の混合物であり、特定の抗原に対して各抗体が異なる
エピトープを認識します。
（図 5、第 2 章）
。複数の異なるエピトープに結合するため、適切なアプリケーション

ではターゲット抗原に対して強力なシグナルを生成でき、単一のエピトープに偏りません。ただし、供給の点で制約があり、バッチ間のばらつきが大きく、交差反応性を示し、特異性がありません。

ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は 1 つの抗原につき 1 つのエピトープのみを認識します（図 5、第 2 章）。モノクローナル抗体はターゲットに対する特異性が高く、非特異的な交差反応の可能性が低く、バッチ間のばらつきが非常に小さいです。

「リコンビナント」という用語は、合成遺伝子を用いて in vitro で作製した抗体を指します。従来のモノクロー
ナル抗体およびポリクローナル抗体と比較して、リコンビナント抗体は長期の供給保証が可能で、バッチ間のばらつきを最小限に抑えられます。抗体をコードする配列が明らかにされているため、用途に応じてさらに改変・操作が可能です。

実験の再現性を確保し、抗体の長期供給を保証するため、特定のターゲットおよびアプリケーションに適したクローンが存在する場合、リコンビナント・モノクローナル抗体の使用をおすすめします。従来、ポリクローナル抗体が使用されるアプリケーション（量が少ないターゲットを解析する場合や複数の翻訳後修飾を一度に検出する場合など）では、リコンビナント・マルチクローナル抗体が理想的なソリューションとなる可能性があります。リコンビナント・マルチクローナル抗体とは、同じ抗原上の異なるエピトープを認識するよう設計され、慎重に選択されたリコンビナント・モノクローナル抗体の混合物です。このため、高い特異性と再現性を兼ね備えた優れた感度を提供することができ、これはリコンビナント抗体でのみ実現できます。

特定のアプリケーションおよび種を対象とした抗体検証

一次抗体を選択する際は、ターゲットへの結合が検証されていることを確認してください。抗体データシートには、テストで抗体がうまく機能することが確認されたアプリケーションと種が記載されています。

また、テストで抗体がうまく機能しなかったアプリケーションと種についても記載されているはずです。
データシートに記載のないアプリケーションと種については、抗体がどのように機能するかは不明です。

この場合、関心のあるアプリケーションと種を用いて抗体をテストした顧客のレビューがないか、確認してください。当社のウェブサイトのデータシートの「カスタマーレビューと Q&A」タブには、特定の製品について公開されているすべてのカスタマーレビューが一覧表示されます。

当社の抗体は継続的にテストされており、データシートには、検証済みのアプリケーションと種に関する最新情報が記載されています。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください19ノックアウト検証による抗体特異性の確認

優れた抗体はターゲットに対して特異性を示し、対象のタンパク質の発現レベルが低い場合でも検出可能です。
しかし、すべての抗体がこのような特異性を示すわけではなく、ターゲット以外のタンパク質と交差反応を示す抗体も多いことが多くの研究から明らかにされています。

ノックアウト（KO）検証は、抗体の特異性を検証するプロセスとして、最も受け入れられた信頼されたプロセスの 1 つです。KO 検証は頑健な技術で、ターゲット・タンパク質を発現しない KO 細胞株、細胞

ライセート、組織を用いて検証することで、抗体の特異性を確認することができます。特異的抗体であれば、
KO 細胞株ではシグナルが生成されず、野生型細胞株では特定のシグナルが生成されるはずです。このように、
KO 検証は真のネガティブ・コントロールとして機能します。

以下の図 14 は、免疫細胞染色（ICC）における Ki67 抗体の KO 検証の例です。Ki67 ノックアウト HAP1 細胞（下）には Ki67（緑色）の発現が認められません。

Ki67 ノックアウト HAP1 細胞

野生型 HAP1 細胞

マージ

図 14. 野生型細胞（上）と Ki67 ノックアウト HAP1 細胞（下）における Ki67 抗体のノックアウトテストの ICC/ 免疫蛍光染色

画像。緑：抗 Ki67［EPR3610］（ab92742）とヤギ抗ウサギ IgG（Alexa Fluor® 488）
（ab150081）、赤：抗αチューブリン［DM1A］（Alexa Fluor® 594）（ab195889）、青：DAPI 標識した核 DNA

複数のアプリケーションで検証された抗体を選択することをおすすめします。KO 検証が理想的です。代わりに、
適切な KO 細胞株、KO 細胞ライセートまたは組織を用いて、ご自身で抗体を検証することも可能です。

免疫原の詳細

第 2 章で説明したように、抗体の開発は、宿主動物を免疫原で免疫することによって始まることが多いです。
免疫原としては、完全長タンパク質、ペプチド、または全細胞などが考えられます。免疫原に関する情報は、
通常、データシートに記載されています。ただし、免疫原配列が専有情報である場合、配列情報は記載されていません。

使用する免疫原により、抗体のどの領域に結合するかが決定されます。免疫原配列が公開されている場合、免疫原が検出対象のタンパク質の結合領域と一致している（または含まれている）ことを確認します。例えば、
FACS によって生細胞の細胞表面タンパク質を検出しようとする場合、そのタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体を選択します。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください20サンプル処理抗体は、特定の立体構造において、エピトープに特異性を示します。サンプル処理によりエピトープの構造が変化する（例：固定によりホルムアルデヒドがメチレン架橋を誘導し、タンパク質のクロスリンクが起こる）
ため、特定の方法で処理されたサンプルにしか反応しない抗体もあります。多くの抗体は、還元および変性したタンパク質のみを認識します。これは、こうした変化によって、隠れていたエピトープが露出するためです。一方、天然状態のタンパク質上のエピトープしか認識しない抗体もあります。

免疫組織染色の場合は、未固定の凍結組織にのみ適している抗体もあります。その他、ホルマリン固定およびパラフィン包埋されているサンプルの場合、抗原賦活化手順によってエピトープを露出させる必要があります。
抗体データシートにサンプル処理に関する制限事項が記載されているかどうか、確認することをおすすめ
します。

宿主種

二次抗体による間接検出を行う場合、理想的には、サンプルとは異なる種から作製された一次抗体を選択する必要があります。これは、二次（抗免疫グロブリン）抗体とサンプル中の内在性免疫グロブリンとの交差反応を避けるためです。例えば、マウスタンパク質を検討する場合、マウス以外の種（ウサギなど）から作製された一次抗体を選択します。交差反応はサンプル中の宿主抗体の存在により生じるため、組織サンプルの場合は注意が必要ですが、細胞株の場合はその心配はありません。

組織サンプルと同じ宿主種に由来する一次抗体を使用する場合、バックグラウンド染色を低減するために、

プロトコールの変更方法を慎重に検討する必要があります。あるいは、異なる種のドメインで構成されるキメラ抗体を使用することで、交差反応を避けることができます。

内在性免疫グロブリン（IgG）を含まない細胞ライセートを使用するウエスタンブロットや一次標識済み抗体を使用する直接検出法などのアプリケーションでは、一次抗体の宿主種について心配する必要はありません。

非モデル生物に関する注意事項

非モデル生物（すなわち、研究であまり使用されていない種）を用いた研究では、研究対象の種でテストされていない抗体を使用する必要があるかもしれません。タンパク質配列は複数の種の間で十分に保存されていることが多いため、その種で検証されていない抗体でも認識される可能性があります。

未検証の抗体を使用する以外に選択肢がない場合、抗体の免疫原配列について、ターゲット・タンパク質とのアライメントを確認することをおすすめします。
•

抗体の免疫原配列は、オンラインデータシートのリンク（UniProt/SwissProt タンパク質データベース）•

この免疫原配列を、CLUSTALW のようなオンラインツールを用いてターゲット・タンパク質と比較し•からご確認いただけます。
ます。

アライメントスコアが 85% 超の場合、抗体が対象のタンパク質に結合する可能性があることを示します。
ただし、抗体が機能することを保証するものではありません。意図したとおりに機能することを確認するには、実験に複数のコントロールを含める必要があります。

キャリアおよび保存剤

抗体は通常、ウシ血清アルブミン（BSA）などのキャリアタンパク質、およびグリセロールやアジ化ナトリウムなどの保存剤を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で保存されています。保存剤は抗体の安定性を維持し、コンタミネーションを予防するうえで不可欠ですが、ラベル（例：蛍光色素、酵素、金属）の効果的な標識を妨げ、生細胞系に影響を及ぼすだけでなく、高度に専門化されたハードウェアの設定を妨げる可能性もあります。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください

21

BSA は、一般的な標識反応中に一次抗体と競合して目的のラベルと結合し、標識効率を大幅に低下させます。
抗体溶液中のアジ化ナトリウムは、細胞に対して毒性があるため、細胞培養での抗体の使用を制限し、標識に悪影響を及ぼします。したがって、一次抗体の標識、または一次抗体を用いた生細胞の染色を予定している
場合、キャリアや保存剤を含まない抗体試薬を選択することが推奨されます。

一次抗体を選択するためのチェックリスト

以下は、一次抗体の選択に役立つチェックリストです。
•

抗体のクローン性、アプリケーション、宿主種、種の反応性を確認してください。これらはデータシート•

当社の Abpromise ™が保証するのは、抗体データシートに記載されているアプリケーションと種のみで••に記載されています。

あることにご注意ください。

提供される画像とデータから、データの頑健性をご確認ください。

データシートに記載されている、抗体を使用した最新の論文とカスタマーレビューをご確認ください。
抗体の機能に関するヒントが得られるはずです。

二次抗体の選択二次抗体は一次抗体に結合することで、ターゲット抗原の検出、選別、精製が可能になります。一次抗体の種およびアイソタイプに対する特異性により、ターゲット・タンパク質を検出することができます。二次抗体の使用が必要かどうかは、抗体を検出する方法によって異なります。

直接法または間接法

ターゲット抗原は、直接法または間接法のいずれかで検出できます（図 15）。
•

直接法：直接標識された一次抗体（すなわち、標識済み一次抗体）によって抗原を検出するため、二次•間接法：一次抗体の宿主種に対して作製され、一次抗体に結合する標識済み二次抗体によって抗原を抗体は必要ありません。

検出します。各抗原に間接的に結合できる標識済み二次抗体は複数あることから、間接法ではシグナル強度が高くなります（図 15）。間接法では、シグナル強度を高めるための増幅ステップも含まれる場合があります。

一般的には、ターゲット抗原の発現レベルに応じて直接法または間接法を選択します。発現レベルが高い抗原の分析では、直接法が適しています。一方、発現レベルが低い抗原では、二次抗体によるシグナル増幅の恩恵を受ける間接法が適しています。
直接法

間接法

抗原

一次抗体

細胞

細胞

二次抗体
蛍光色素

図 15. 直接法または間接法による抗原検出（蛍光色素で標識した抗体を使用）

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください22

どちらの方法にもメリットとデメリットがあります。これらを前もって検討したうえで、実験に最適な方法をお選びください（表 2）。

表 2. 直接法と間接法の比較
直接法

間接法

間接法より短い。

ステップが必要となり時間がかかる。

時間

標識ステップが 1 回のみのため、通常は煩雑さ

プロトコールのステップが少ないため、

感度よりシンプル。

二次抗体の使用に伴うシグナル増幅が起こらないため、間接法よりもシグナルが弱くなる。

バックグラウンド 非特異的結合を抑えられる。

標識済み二次抗体を使用するため、追加のマルチプレックス実験では適切な二次抗体
や抗体の組み合わせを選択する必要がある
ため、より煩雑。

複数の二次抗体が一次抗体に結合すること
で、シグナルが増幅される。

内在性免疫グロブリンを含むサンプルは、
バックグラウンドが高くなる。

直接標識された一次抗体の選択

直接標識した一次抗体（例：酵素または蛍光標識抗体）を使用することで、二次抗体の染色ステップが省略されて、プロトコールがシンプルかつ短縮化されます。また、標識済み一次抗体の種間交差反応が最小限に抑えられ、二次抗体により起こり得る非特異的結合を排除することが可能です。蛍光標識済み一次抗体は、必要なマルチプレックスパネルを柔軟に組み立てることができることから、マルチカラーの実験に理想的なツールです。

標識済み一次抗体を選択する場合、抗体の特異性に注意してください。高い特異性とバッチ間一貫性を備えたリコンビナント・モノクローナル抗体が理想的です。

二次抗体と比較すると、標識済み一次抗体はシグナルの増幅をもたらさないため、サンプル中にターゲット・タンパク質が多量に含まれている必要があります。アブカムでは、蛍光標識または酵素を直接標識したリコン
ビナント一次抗体を幅広く取り揃えております。選択した抗体に対して適切な標識法を利用できない場合、
アブカムの抗体標識キットが使用できます。

抗体の標識方法の詳細については、抗体標識ガイドをご覧ください。

適切な二次抗体の選択

間接法を使用する場合、適切な二次抗体を選択する必要があります。

二次抗体は、免疫原として作用する抗体を用いて動物を免疫することによって作製されます。作製した二次抗体は、宿主動物が免疫された抗体のタイプに結合します。

二次抗体には、それらが結合する一次抗体のタイプを明らかにする記述名があります（図 16、17、18 を参照）。
これらの名称は、接頭辞である「anti-（抗 -）」によってその反応性が示されています。例えば、ウサギ IgG
で免疫された動物の場合、作製される二次抗体はウサギ IgG に結合し、抗ウサギ IgG と呼ばれます。

二次抗体を選択する際には、使用する一次抗体に選択的に結合するかどうか、抗原を検出できるかどうかを検討する必要があります。これらは、以下に概説するいくつかの重要な因子によって決定されます。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください

23

宿主種

二次抗体の作製に使用する宿主種は、一次抗体の宿主種とは異なるものを使用しなければなりません。例えば、一次抗体の宿主種がウサギの場合、二次抗体は別の動物種から作製されている必要があります。例えば、
ロバ抗ウサギ二次抗体が適しています。

ロバ 抗ウサギ
A. 二次抗体の宿主種

B. この種に結合（一次抗体の宿主種）

図 16. 二次抗体の名称から、どの種に反応するかが理解できます。二次抗体は、ロバ（A）に由来し、ウサギ抗体（B）に結合します。

結合するアイソタイプと特異性

二次抗体は一次抗体のアイソタイプに結合しなければなりません。

一次抗体は通常、IgG アイソタイプです。したがって、二次抗体は IgG に対して作製されている必要があります。通常、抗 IgG 二次抗体は重鎖および軽鎖（H&L）に結合しますが、一次抗体の他の領域に結合するように作製されていることもあります。

A. 二次抗体の宿主種

C. IgGアイソタイプに結合

ロバ抗ウサギ lgG H&L
B. この種に対して結合（一次抗体の宿主種）

D. 重鎖および軽鎖に結合

図 17. 二次抗体の名称から、その抗体が結合する一次抗体の種、アイソタイプおよび領域が理解できます。この二次抗体は

ウサギ IgG の H&L 領域（B、C、D）に特異的に結合します。

アプリケーションに応じた標識の選択

蛍光色素、タンパク質、酵素、ビオチンなどのラベルは、二次抗体に結合することで、ターゲット・タンパク質の存在を可視化します。
•

蛍光標識は、特定の波長の光によって励起されると、可視光を放出します。さまざまなものが使用でき、•

ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリホスファターゼ（AP）などの酵素標識は、•いずれも独自の励起および放出特性を有しています。

適切な基質との組み合わせにより、有色の沈殿物を形成します。

アビジンまたはストレプトアビジンが酵素または蛍光色素と結合したアビジン - ビオチン酵素または

蛍光色素複合体（ABC 試薬と略されることが多いです）を使用する場合、シグナル増幅にはビオチン
標識抗体が有用です。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください24

A. 二次抗体の宿主種

C. IgGアイソタイプに結合

E. 標識済み二次抗体として供給され、ラベルは通常ここに表示

ロバ抗ウサギIgG H&L (Alexa Fluor® 488)
B. この種に対して結合（一次抗体の宿主種）

D. 重鎖および軽鎖に結合

図 18. 二次抗体の標識は通常、抗体名の末尾で示されます。この二次抗体は、緑色の蛍光色素である Alexa Fluor ® 488 で標識されています。

標識済み抗体の選択はアプリケーションによって異なります。ELISA またはウエスタンブロットでは、酵素

結合二次抗体がよく使用されます。対照的に、フローサイトメトリーや ICC では、蛍光タンパク質または蛍光色素（Alexa Fluor® など）標識済み二次抗体が好まれます。

以下に、よく使用されるアプリケーションに対して推奨される二次抗体をご紹介します（表 3）。
表 3. 各アプリケーションにおける酵素または蛍光色素標識済み二次抗体の選択
二次抗体

酵素

蛍光色素

IHC

HRP、HRP ポリマー、ビオチン（アビジン／

Alexa Fluor®、Cy® 色素、FITC、PE

ICC-

Alexa Fluor®、Cy® 色素、FITC、PEELISA または

HRP、ビオチン（アビジン／ストレプトアビジン-

フローサイト-Alexa Fluor®、Cy® 色素、FITC、PE

ウエスタン

ブロット

ELISPOT

メトリーまたはストレプトアビジン結合酵素または蛍光色素）

HRP、AP

結合酵素または蛍光色素）

IRDye®、Alexa 680、Alexa 790

FACS

IHC = 免疫組織染色、ICC = 免疫細胞染色、FACS = 蛍光活性化セルソーティング、HRP = ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、AP = アルカリホスファターゼ

血清吸着処理およびフラグメントを用いた交差反応の回避

二次抗体を選択する際は、サンプル中のターゲット・タンパク質以外のタンパク質と交差反応しないことを確認する必要があります。血清吸着処理済み二次抗体および F(ab) 抗体フラグメントを用いることで、種間交差反応を最小限に抑えることができます。

血清吸着処理済み二次抗体

血清吸着処理済み二次抗体は、複数の一次抗体とこれに対応する二次抗体を同時に使用するマルチカラー実験

において、種間交差反応を排除するための理想的な手段です。血清吸着処理（交差吸着とも呼ばれます）は、抗体の特異性を高めるために導入される追加の精製ステップです。血清吸着処理をすることで、二次抗体が細胞および組織サンプル中に存在する内在性免疫グロブリンと交差反応するリスクが低減されます。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください25

F(ab) および F(ab’)2 抗体フラグメント

抗体全体ではなく、F(ab) および F(ab’)2 フラグメントと呼ばれる抗体フラグメントを用いることで、抗体の Fc
領域と細胞（マクロファージ、樹状細胞、好中球、NK 細胞および B 細胞など）上の Fc 受容体との非特異的結合を避けることができます。また、F(ab) および F(ab’)2 フラグメントは分子量が小さいことから、より効率的に組織に侵入します。フラグメント抗体には Fc 領域がないため、
抗 Fc を介した抗体検出を妨げません。

二重染色用の抗体の選択

細胞培養または組織の二重免疫染色には、宿主種が異なる 2 つの一次抗体と、1 つの種のみを認識する 2 つの二次抗体が必要です。交差反応を避けるため、他の動物種の免疫グロブリンに対する血清吸着処理済みの
抗 IgG 二次抗体を選択することもできますが、代わりに直接標識済み一次抗体を用いることで、二次抗体が不要になります。

二次抗体の選択に関するクイックヒント•

発現レベルが非常に低いタンパク質を標識するには、輝度が非常に高い蛍光色素を選択します。

•

血清吸着処理済み二次抗体は、マルチカラー分析に有用で、種間交差反応を抑えることができます。

•••

複数のラベルを使用する場合、二次抗体の宿主種をすべて同じにします。

フラグメント抗体は分子量が小さく、効率的に組織に侵入します（IHC に有用）。
ビオチン標識では、少量のタンパク質の検出が可能です。

抗体特異性の検証

ここでは、適切なポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールの選択と調製、特定のアプリケー
ションでの抗体の検証など、実験条件下で抗体特異性を検証するうえで考慮すべき必須事項について説明します。

抗体特異性を検証する理由

抗体の検証では、以下の 3 つの重要な側面を確認します。
•

特異性および機能性 - 使用予定のアプリケーションにおいて、抗体がさまざまな抗原を区別できること•

親和性 - 抗体とエピトープの結合強度を確認します。

•

を確認します。

再現性 - 検証データが他のラボでも再現できることを確認します。

ここでは、正確かつ一貫した結果を得るために、実際の実験条件下で抗体特異性を検証する方法について説明します。メーカーは通常、複数のアプリケーションと種を用いて抗体をテストしますが、研究者が使用するプロトコールや試薬は実にさまざまなため、すべてをカバーすることは不可能です。したがって、使用する抗体の検証ステップは、各自の実験の設定に特化したものとなるため、非常に重要です。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください26

抗体特異性を検証する際に考慮すべき重要なポイント

1. ポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールの選択および調製抗体の検証を成功させるには、適切なポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールを特定し、使用することが不可欠です。
•

ポジティブ・コントロールとは、ターゲット・タンパク質を強く発現し、使用する抗体の選択的な結合を•ネガティブ・コントロールとは、ターゲット・タンパク質を発現せず、使用する抗体の非選択的な結合を確認できる適切な細胞株または組織サンプルを指します。

確認できる細胞株または組織サンプルを指します。真のネガティブ・コントロールが使用できない場合、代わりに、ターゲット・タンパク質の発現レベルが低いサンプルを使用することも可能です。

ターゲット・タンパク質を発現する、または発現しない細胞や組織のタイプの特定には、困難を伴うことが多いです。各種組織または細胞株におけるターゲット・タンパク質の発現に関する情報は、査読論文や以下のオンラインタンパク質データベースで確認することができます。
•

https://www.proteomicsdb.org/proteomicsdb/#overview•

portals.broadinstitute.org/ccle

•

•
•
•

www.genecards.org

www.ncbi.nlm.nih.gov/genewww.proteinatlas.org

https://www.uniprot.org/

オンラインデータベースを使用してタンパク質発現プロファイルを明らかにするには、いくつかデメリットがあります。
•

発現データが不完全な場合がある。

•

タンパク質の量を決定するには、RNA レベルの信頼性が非常に低いことが多い。

•

ネガティブな細胞株や組織、特に必須のハウスキーピング遺伝子の確認が困難な場合がある。

上記に加えて、抗体が天然状態または変性状態のタンパク質を認識したり、しなかったりする可能性もあります。このため、サンプルを適切に調製することが不可欠です。例えば、天然状態のタンパク質のみを認識する抗体は、ウエスタンブロットのような、変性状態のサンプルを使用するアプリケーションでは使用すべきではありません。
2. プロトコール

プロトコールを最適化することで、抗体が検証プロセスを無事にパスする可能性を最大限に高めることができます。例えば、インキュベーション時間は、4°C で最低 1 時間から最長一晩と実に幅広い設定が可能なため、各抗体に対する最適なインキュベーション時間を決定する必要があります。インキュベーション時間が短すぎると感度に問題が生じ、時間を長くするとバックグラウンド染色を招く可能性があります。また、希釈率、ブロッキング条件、天然状態／変性状態など、他の要素を最適化することも必要になります。
3. バッファーの選択抗体を用いたアッセイの大半で、PBS または TBS の 2 種類のバッファーを使用します。バッファーの性能に影響を及ぼす可能性のある pH などのパラメータを考慮して、実験に最適なバッファーを決定する必要があります。

ポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールをデザインするためのモデル

ターゲット・タンパク質を内在的に発現するまたは発現しない細胞株または組織は、それぞれポジティブ・
コントロールまたはネガティブ・コントロールとして使用することができます。タンパク質発現レベルが異なるさまざまな細胞株を複数使用することで、多様なコントロールが得られます。あるいは、ノックアウト
モデル、siRNA ノックダウンおよび細胞処理などといった複数の方法を用いることで、適切なポジティブ・
コントロールおよびネガティブ・コントロールをデザインすることも可能です（表 4）。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください27

表 4. 適切なポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールをデザインするためのモデル
検証

ノックアウト（KO）

メリット•

KO モデルは真のネガティブ・コン

タンパク質をコード•

ターゲット遺伝子の発現がないこと

が、遺伝子編集技術•

モデル

するターゲット遺伝子（例：CRISPR）により除去されている細胞

株、組織、またはライセート

トロールとして機能するが保証されるデメリット•

必須遺伝子の KO 細胞株は、必ず•

KO サンプルでシグナルが検出されタンパク質を検出することを示す。

フローサイトメトリーなどのすべて

これは、その抗体が、別のサン

プルバックグラウンドにおいて、が使用できる

無関係のタンパク質に非特異的に独自の KO を作製するよりも、ター結合しないことを保証するもの

ゲット遺伝子に対する市販の KO

ではない細胞株またはライセートを使用することで（入手可能であれば）、時間
siRNA ノックダウン

短鎖干渉 RNA（siRNA）などの転写後遺伝子

調節ツールを用いて、タンパク質をコード••を節約できるターゲット・タンパク質のダウン

レギュレーションを通して特異性を
確認できる

•

ノックダウンは一過性である

ノックダウンが 100% 有効である
ことはまれなため、リアルタイム
PCR やコントロール遺伝子に対しブロット、ICC、フローサイトメト
できる

抑制

•

ノックダウン細胞株は、ウエスタン
リーなど、すべてのアッセイで使用する遺伝子の発現をないということは、その抗体が野生型サンプルでターゲット・ウエスタンブロット、IHC、ICC、のアッセイで、KO 細胞株または組織•

しも生存可能とは限らないて十分に確立された siRNA など、•優れたコントロールが必要となる

類似した転写産物への結合により、
siRNA が「オフターゲット」に結合し抑制すると、非特異的な発現の低下が観察される可能性が
細胞処理

タンパク質発現レベルを細胞内で操作••特定のタンパク質の発現レベルを•（飢餓によるリン酸化など）に作用•上昇・低下させたり、翻訳後修飾させたりすることができるポジティブ・コントロールまたはある適切な細胞処理の実施には、追加のコントロールが必要である

実 験のデザインが難しくなる可能性がある

ネガティブ・コントロールとして使用できる可能性がある

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください28各種アプリケーションでの抗体特異性の検証

抗体の検証には、さまざまな方法を使用できます。以下に、一般的なアプリケーション、そのメリットとデメリットについて説明します。
検証

質量分析／免疫沈降 質量分析（IP-MS）

最初に細胞ライセートからタンパク質複合体を免疫メリット•

ハイスループットフォーマット

•ノーマライゼーション技術の

•
•
•

•

利用により、関心のある抗体•

パク質の量を推定できる•に結合したターゲット・タン

沈降させ、その後、質量分析法で分析

に対応できるデメリット

抗体が結合するすべてのタン
パク質アイソフォームを認識できる翻 訳後修飾、相互作用する•

パートナーや複合体を特定メントに基づいて特異性を確認できる

結合や中程度の結合が除去される可能性があるすべての抗体が IP に適しているとは限らない

複合体内へのパートナータンパク質の取込みとオフターゲット結合との区別が難しいEnrichment score の最高スコアは、
必ずしも対象の抗体が優先的に結合するターゲットであることを示すとはできる

分解されたタンパク質フラグ

IP の洗浄回数が多すぎると、弱い限らないため、データの解釈が難しい
1.

例：オフターゲット結合は証明が難しく、アイソタイプ・コントロール抗体が必要となるが、IP 間で不整合が生じる
可能性があるウエスタンブロット

サンプル中のタンパク質
は、最初にサイズ分離に•より検出された後、メン•グされ、抗体によって•免疫細胞染色（ICC）•

ブレン上にブロッティン
可視化

特異的抗体およびレポー
ター分子を介して細胞内のタンパク質を検出

免疫組織染色（IHC）

特異的抗体およびレポー
ター分子を介して組織内のタンパク質を検出

•
•

•
•

分子量に基づくターゲット・タンパク質に対する抗体

特異性の判定に有用である••

還元／変性されたタンパク質

アッセイに時間がかかる他のアプリケーションと比較して、自動化が容易ではないの検出に最適である

定性的なアッセイである
細胞局在性に基づいて抗体が適切なタンパク質を認識する•かどうかを検証できる

同様の細胞局在性の非特異的な他のタンパク質を抗体が認識するかどうかは判断できないターゲット・タンパク質を発現する・発現しない細胞のいずれかで特異性を確認できる
定性的なアッセイである

組織内局在性に基づいて抗体が適切なタンパク質を認識するか•どうかを検証できる

ターゲット・タンパク質を発現

同様の組織局在性の非特異的な他のタンパク質を抗体が認識するかどうかは判断できない

する・発現しない組織サンプルのいずれかで特異性を確認で•きる

定性的なアッセイである

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください29タンパク質／ペプチドアレイ

最初にペプチド／タンパク質のアレイにスポッティ
ングし、次に抗体を添加して、抗体の結合を検出••

多様なタンパク質／ペプチドと結合する抗体をスクリーニ

•

ングできる

ハイスループットスクリーニ
ングのプロセスである

タ ンパク質アレイのみ：アレイが大腸菌（細菌）合成タンパク質でできている場合、翻訳後修飾タン•（ELISA と同様）

パク質のスクリーニングはできない

ペプチドおよび変性されたタンパク質のアレイでは、線状エピトープしか提示できないなお、以下の 2 つの方法は、抗体特異性の包括的なテストとみなすことができません。したがって、当社では、これらを単独で使用することは推奨しておりません。
••

免疫ペプチドによるブロッキングでは、抗体が免疫原に結合することを確認できます。しかし、免疫ペプチドは特異的抗体と非特異的抗体の両方をブロックするため、抗体の特異性を確認するための包括的な方法としては使用できません。

一次抗体の省略は、組織または二次検出試薬の評価は可能ですが、一次抗体の特異性は評価できません。

抗体の保管と取扱い適切な保管と取扱いをすれば、ほとんどの抗体は、数年とまではいかなくとも、数ヵ月は活性を保つはずです。
このセクションでは、抗体の保管と取扱いに関する一般的なガイドラインをご紹介します。推奨される具体的な保管方法に関しては、メーカーのデータシートを常に参照ください。

一般的な保管ガイドライン

抗体を受け取ったら、10,000 × g で 20 秒間遠心し、バイアルの蓋に付着した溶液をバイアルの底に集めます。
次に、微量遠心機用のタンパク質低吸着チューブに分注（アリコート）にします。分注することで、凍結／

解凍サイクルの繰り返しによるダメージ、すなわち抗体が変性することで凝集体が形成され結合能が低下する

ことを最小限に抑えられます。分注は、1 本のバイアルを複数回ピペット操作することで生じるコンタミネー
ションを最小限に抑えるうえでも有用です。  

アリコートは、一度凍結して解凍したら、その後は 4°C で保管する必要があります。抗体は -80°C で保管する
ことに大きなメリットがないため、通常は -20°C で保管することが推奨されます。  

アリコートのサイズは、実験で通常使用する量によって異なります。アリコートは 10 μ L 以上とします。

アリコートの量が少ないと、蒸発や保管バイアル表面への抗体の吸着により、ストック濃度への影響が大きくなります。

ほとんどの場合、抗体は、受領後 1 ～ 2 週間は 4°C で保管できます。ただし、データシートの推奨事項に従うことが重要です。

凍結／解凍によるダメージの防止  

霜取り機能付き冷凍庫は使用しないでください。ラボ内で起こる可能性は低いですが、凍結と解凍が繰り返されるのを避ける必要があります。同じ理由から、抗体バイアルは、冷凍庫内の温度変化が最小限に抑えられる場所（例えば、ドアポケットではなく庫内の奥の方など）に置いてください。

グリセロールは -20°C 未満まで凍結点を下げることから、凍結／解凍によるダメージを防ぐために、凍結防止剤であるグリセロールを最終濃度 50% まで添加する研究者もいます。この方法は多くの抗体で許容されますが、メーカーがこの保管条件で抗体の安定性をテストしたかどうか、データシートを確認してください。  
グリセロールを添加した溶液を -80°C で保管することは推奨されません。この温度はグリセロールの凍結点を下回ります。また、グリセロールやその他の凍結防止剤が細菌で汚染される可能性もあるため、必ず無菌調製を行ってください。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください30標識済み抗体の保管

標識済み抗体は未標識の抗体よりも複雑であるため、保管および取扱いに関して追加の手順を必要とする場合が多いです。例えば、標識済み抗体は、蛍光色素、酵素またはビオチン標識のいずれの場合も、光への曝露によりラベルの活性が損なわれるため、暗色のバイアルで保管するか、バイアルをアルミホイルで包んでください。特に蛍光色素による標識は光退色を起こしやすいため、実験の全段階を遮光下で行う必要があります。

以下の表 5 に、標識済み抗体の適切な保管および取扱いに関する詳細なガイドラインを示します。
表 5. 標識済み抗体の取扱い、分注および保管に関するガイドライン

蛍光標識、例：Alexa Fluor®、Dylight®、 HRP

取扱い

分注

FITC、PE

納入時に分注する

納入時に分注する

暗所または UV 保護容器で保管する

暗所または UV 保護容器で保管する

凍結／解凍の繰り返しを避ける
直接光源から離して分注する

抗体受領時、10,000 × g で 20 秒間遠心する

ピペットで静かに混和した後、分注する
3 ～ 4 回繰り返す。泡立つ可能性がある
長期保管

ため、転倒混和しないこと

メーカーのデータシートの推奨事項に従う

凍結防止剤（グリセロールなど）が含まれている場合、-20°C で保管する *褐色のバイアルまたはチューブをアルミ短期保管

ホイルで包んで保管する+4°C で短期間（1 ～ 2 週間）保管する

凍結／解凍の繰り返しを避ける
直接光源から離して分注する

抗体受領時、10,000 × g で 20 秒間遠心する

アジ化ナトリウムは HRP 活性を阻害するため、HRP 標識済み抗体に添加してはならない

メーカーのデータシートの推奨事項
に従う

凍結防止剤（グリセロールなど）が含まれている場合、-20°C で保管する *褐色のバイアルまたはチューブをアルミホイルで包んで保管する+4°C で短期間（1 ～ 2 週間）保管する* 酵素標識済み抗体は、凍結および解凍によって酵素活性が低下し、抗体結合能が影響を受けます。したがって、酵素標識済み
抗体は、一切凍結させず、4°C で保管してください。ただし、抗体に凍結防止剤が含まれており、-20°C での長期保管で安定性が検証済みの場合を除きます。

アジ化ナトリウムによるコンタミネーションの回避

微生物によるコンタミネーションを防ぐために、抗体溶液にアジ化ナトリウムを最終濃度 0.02%（w/v）まで添加することができます。抗体に既にこの保存剤が含まれている場合、データシートの保存バッファーのセクションにその旨が記載されています。

アジ化ナトリウムを使用しない場合

抗体を用いて生細胞を染色・処理する場合、または in vivo 試験を実施する場合、アジ化ナトリウムを避ける必要があります。この抗菌剤は、
シトクロム電子伝達系を阻害し、ほとんどの微生物に対して毒性があります。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください31

アジ化ナトリウムはアミン基が関与するあらゆる標識を阻害するため、標識の手順を進める前に除去する必要があります。標識済み抗体はアジ化ナトリウム入りで保管できます。ただし、アジ化ナトリウムは HRP を阻害するため、HRP 標識済み抗体ではこの保管方法は不可です。アジ化ナトリウムに代えて、1 級アミンを含まない 0.01% チメロサール（メルチオレート）を使用できます。また、透析、限外ろ過またはゲルろ過により抗体溶液からアジ化ナトリウムを除去することも可能です。  

タンパク質濃度および安定性タンパク質は、一般的に高濃度で保管した場合、分解しにくくなるため、1 mg/mL 以上が理想的です。
したがって、抗体を作用濃度まで希釈して、4°C で 1 日を超えて保管することは避ける必要があります。

抗体濃度が低い場合、抗体溶液に BSA などの安定化タンパク質を添加することも可能です。また、安定化

タンパク質を添加すると、容器壁への吸着による抗体のロスを最小限に抑えることができます。ただし、標識予定の抗体に安定化タンパク質を添加すると、抗体と競合し、標識効率の低下を招くため、おすすめしません。

Alexa Fluor® は Life Technologies の登録商標です。Alexa Fluor® 色素標識抗体は、Life Technologies によりアブカムにライセンスが付与されている技術を含んでいます。

​DyLight®​ は、Thermo Fisher Scientific Inc. とその子会社の商標です。

抗体のフォーマットと精製

未精製の抗体は、実験で使用する前に精製する必要がある場合があります。抗体精製は非常に粗いものから特異性の高いものまでさまざまです。必要とされる精製レベルは抗体の目的のアプリケーションによって異なります。ここでは、最も一般的な未精製抗体のフォーマットと抗体精製方法について簡単に説明します。

抗血清

ポリクローナル抗体は、「血清」や「抗血清」などの比較的精製されていない状態で提供されることが多いです。抗血清とは、関心のある抗体（とその他の血清タンパク質と抗体）を含む、免疫された宿主から得られる血清のことです。

抗血清は、ターゲット抗原を認識する抗体に加えて、さまざまな非ターゲット抗原に対する抗体も含み、イムノアッセイで非特異的に反応することがあります。このため、血清タンパク質を除去し、ターゲット抗原と特異的に反応する免疫グロブリン分画を濃縮するために、精製を行う場合が多いです。

培養上清

モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞培養（サイトカイン産生細胞）を用いて作製し、ハイブリドーマ

組織培養上清として採取します。モノクローナル抗体の作製に関する詳細については、第 2 章をご覧ください。

腹水

腹水は in vivo での抗体作製方法として過去に使用されていましたが、現在では in vitro 技術では抗体を作製できない場合にのみ使用されています。

この方法では、マウス（またはラット）の腹腔内でハイブリドーマ細胞を増殖させることにより、モノクロー
ナル抗体を作製します。ハイブリドーマ細胞を宿主の腹部に注入すると、そこで増殖して液体（腹水）が生じるため、これを採取します。この腹水は抗体濃度が高く、通常はハイブリドーマ細胞培養よりも高い
抗体収量が得られます。ただし、腹水には宿主からの多くの非特異的免疫グロブリンも含まれます。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください

32

抗体精製

抗体精製は、血清（ポリクローナル抗体の場合）、腹水またはハイブリドーマ細胞株の細胞培養上清（モノクローナル抗体の場合）から抗体を選択的に濃縮または特異的に抽出することによって行います。以下では、ポリクローナル性の抗血清またはモノクローナル性の腹水／組織培養上清の典型的な精製方法について説明します。

プロテイン A/G 精製

プロテイン A およびプロテイン G（それぞれ黄色ブドウ球菌またはレンサ球菌により発現）は、抗体精製によく使用される抗体結合タンパク質です。プロテイン A/G 精製は、プロテイン A または G が免疫グロブリンの Fc 領域に対して高い親和性をもつことを利用します。プロテイン A/G 精製により、未処理の抗血清から

血清タンパク質の大部分が除去されます。ただし、非特異的な免疫グロブリン分画は除去されません。その結果、プロテイン A/G 精製済み抗血清は、依然として望ましくない交差反応を示す可能性があります。

プロテイン A、プロテイン G、その他のタンパク質の抗体結合特性の詳細については、こちらをご覧ください。

アフィニティ精製

アフィニティ精製では、親和性（アフィニティ）タグを用いて、似たような特性をもつ特定のタンパク質やタンパク質グループを単離します。この手法では、タンパク質とクロマトグラフィーマトリックスに結合した特異的なリガンドとの可逆的な相互作用に基づいて、タンパク質を分離します（図 19）。

抗原アフィニティ精製では、特異的免疫グロブリン分画がその産生に用いられた免疫抗原に対して親和性をもつことを利用しています。この精製方法では、非特異的な免疫グロブリン分画の大部分が除去されますが、ターゲット抗原と特異的に反応する免疫グロブリン分画は濃縮されます。この精製方法により得られた免疫グロブリンには主に、所望の特異性をもつ免疫グロブリンが含まれます。

ステップ 1：
細胞を溶解する

記号

タグ付きタンパク質

ステップ 2：
タグ付きタンパク質がアフィニティレジンに結合する

ステップ 3：
洗浄により不要なライセートを除去する

その他のタンパク質

ステップ 4：
タグ付きタンパク質を溶出させる

アフィニティレジン

図 19. アフィニティクロマトグラフィーのステップを示します。まず、サンプルを溶解してタンパク質を遊離します。このライセートをカラムに加えると、融合タグがアフィニティーレジンに結合します。不要なタンパク質はカラムを通して取り除かれ、目的のタンパク質が溶出されます。

プロテイン A/G またはアフィニティ精製を用いた市販の抗体精製キットを使用することもできます。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください33

血清吸着処理

ポリクローナル抗体は血清吸着処理される場合があります。血清吸着処理とは、他のタンパク質やさまざまな種に由来する血清で吸着させ、交差反応の可能性のある抗体を除去することを意味します。カラムマトリクスに交差反応の可能性のある種由来の血清タンパク質を固相化し、二次抗体を含む溶液をカラムに通過させます（図 20）。非特異的な二次抗体はカラム内に残りますが、特異性の高い二次抗体は通過します。交差反応性が著しく抑えられた精製抗体が得られます。

1

ウサギIgG軽鎖と反応する抗体血清吸着処理ヒツジIgG軽鎖と反応する抗体

ウシIgG軽鎖と反応する抗体2

マトリックスと マトリックスと
結合した
結合した
ウシIgG
ヒツジIgG

図 20. この例では、ウサギ IgG 軽鎖を認識する二次抗体溶液を、交差反応の可能性のある種由来の血清タンパク質（ヒツジ

IgG やウシ IgG など）を固相化したマトリクスに通過させます。ウサギ IgG 軽鎖に高い特異性をもつ抗体のみがカラムを通過しますが、ヒツジ IgG やウシ IgG 軽鎖と交差反応する二次抗体は、カラム内のタンパク質に結合したままとなります。

抗体の希釈と滴定

初めて抗体を使用する場合、特定のアプリケーションや実験条件に合わせて抗体の希釈を最適化する必要があります。ここでは、滴定により最適な抗体濃度を決定する方法と、データシートに推奨の希釈方法の記載がない場合の希釈方法についてご紹介します。

実験条件に対して抗体の希釈率を決定する必要がある理由

抗体と抗原の結合率（親和定数）は、温度、pH およびバッファーの成分の影響を受ける可能性があります。

抗体と抗原の溶液の相対濃度を変えることで、抗原抗体複合体の形成の程度もコントロールできます。通常、抗原濃度を変えることはできないため、各アプリケーションおよび実験条件に対して、各抗体の至適濃度を希釈により決定する必要があります。

通常、抗体はデータシートに記載されている各種アプリケーションに対して推奨される希釈率がありますが、特定の実験条件では最適化が必要な場合があります。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください34

抗体の希釈率の最適化：滴定実験

至適抗体濃度とは、最小限のバックグラウンドで最良の染色が得られる濃度です。アッセイごとに実験的に決定する必要があり、通常は滴定実験で段階的に希釈することにより決定します。例えば、製品データシート

で 1:200 の希釈が提案されている場合、1:50、1:100、1:200、1:400、1:500 の希釈を行うことが推奨されます。
滴定実験では、まずインキュベーション時間（一定）を選択してから、抗体を段階的に希釈します。実験条件を同じにするため、希釈は同じサンプルタイプで実施します。

多くの抗体でバッチ間一貫性はほぼ同じため、ほとんどの場合、滴定実験は 1 回のみで OK です。ただし、特にポリクローナル抗体で、同じ抗体でもバッチ間で染色に違いが生じる場合、滴定実験を再度実施する
ことをおすすめします。

データシートに推奨の希釈方法の記載がない場合の推奨希釈率

未精製抗体の調製は抗体の濃度によって大きく異なります。未精製抗体において抗体濃度が不明の場合、濃縮／精製キットの使用をおすすめします。ガイドラインとして以下の表を参照ください。
表 6 に、さまざまな抗体フォーマットのアプリケーション別の希釈率を示します。
表 6. アプリケーション別の抗体の推奨希釈率

WB/ ドットブロット

IHC/ICC

EIA/ELISA

FACS/ フローサイトメトリー

IP

IgG 濃度のおおよその推定値

培養上清

1/100

希釈しない～ 1/10

1/1000

1/100-

1 ～ 3 mg/mL

腹水1/10001/100

1/10000

1/1000

1/100

5 ～ 10 mg/mL

全抗血清

1/500

1/50–1/100

1/500

1/500

1/50–1/100

1 ～ 10 mg/mL

精製抗体

1 μ g/mL

5 μ g/mL

0.1 μ g/mL

1 μ g/mL

1 ～ 10 μ g/mL-

EIA = 酵素イムノアッセイ、FACS = 蛍光活性化セルソーティング、ICC = 免疫細胞染色、IHC = 免疫組織染色、IP = 免疫沈降、
WB = ウエスタンブロット

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください35

第 5 章 抗体用語集
用語定義

アジュバント

抗体作製の際、免疫ペプチドに添加されることのある化合物または化学物質で、親和性（affinity）

1 つの結合部位における抗体と抗原の結合強度の指標。親和性とは、エピトープ

アフィニティ精製

抗原と抗原に対して産生された抗体との結合強度を利用した抗体の精製。

（adjuvant)（Affinity

免疫応答刺激を促進します。

が抗体上の個々のパラトープ（抗原が結合する部位）に結合する強度を指します。

purification）
親和定数（affinity

抗体と抗原の結合強度を示す数値。結合定数または平衡定数とも言います。

抗体（antibody)

免疫応答を引き起こす抗原と特異的に結合する免疫グロブリンタンパク質。抗原

constant)の存在に反応して、一次免疫応答として B 細胞から産生されます。
抗原結合部位ヒンジ

抗原（antigen）

特異的な免疫応答を誘導する、体にとっての外来物質。

抗原賦活化（antigen抗体が組織または細胞内のターゲット・タンパク質にアクセスできるようにする

retrieval)

方法。通常、固定（特にパラホルムアルデヒドを使用）またはエピトープをマスキングし、抗原 - 抗体結合を妨げる化学的変化（例えば、エピトープ内のアミノ酸のクロスリンク）を引き起こす包埋処理の後に行います。

抗血清（Antiserum） 関心のある抗体（とその他の血清タンパク質と抗体）を含む、免疫された宿主から得られる血清。

腹水（Ascites fluid） 生きている宿主動物の腹部から採取した体液で、宿主内で増殖したハイブリドーマ
細胞により産生される未精製のモノクローナル抗体を含みます。

アビディティ（avidity） 抗原抗体複合体の総結合強度の指標。
BSA

ウシ血清アルブミン。抗体産生におけるキャリアタンパク質としてよく使用されます。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください36

捕捉抗体（capture
antibody）

アプライされたサンプルまたは溶液の抗原と結合させるための ELISA プレート上にコーティングされた抗体。
ストレプトアビジンHRP

ビオチン
検出抗体

ターゲット・
タンパク質

A

捕捉抗体

B
C

D
E
F

G

H

キャリアタンパク質（carrier protein）

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

ハプテンと呼ばれる低分子抗原が結合した、非常に抗原性の高い大きな分子。

抗体製品製造時に、免疫化した動物において、より効果的かつ特異的な免疫応答を誘導するために使用します（例えば、BSA や KLH）
。

クロモゲン

酵素タグ付き抗体の検出に用いられる化学的基質で、DAB などがあります。この標識済み抗体

標識済み抗体は、蛍光色素またはクロモゲンなどのラベルと化学的に結合し、antibody）

結合します。

化学的基質は、酵素存在下で色が変化します。

（chromogen）

抗体検出を可視化します。化学的基質は一次抗体と直接結合または二次抗体と（conjugated

交差反応性（cross-

抗体が、他の抗原やタンパク質上の類似したエピトープと結合すること。

変性（denatured）

抗原の天然状態からの立体構造変化。サンプルの変性により、エピトープの露出検出抗体（detection

サンドイッチ ELISA に使用する一次抗体のことで、固定された抗原を検出します。

reactivity)

antibody）

または破壊が容易になる場合があります。

この抗体は、直接結合により、または標識済み二次抗体により可視化できます。
ストレプトアビジンHRP

ビオチン
検出抗体

ターゲット・
タンパク質

A

捕捉抗体

B
C

D
E
F

G

H

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

ラベルに直接結合した一次抗体（すなわち、標識済み一次抗体）を使用して抗原直接染色（directを検出する方法。このため、二次抗体は不要です。

staining）
直接法

1

間接法

直接法

間接法

抗原

抗原

一次抗体

一次抗体

細胞

細胞

細胞

二次抗体
蛍光色素

細胞

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください

二次抗体
蛍光色素

37

エピトープ（epitope） 抗体が、可変領域を通じて抗原と結合する抗原分子の特異的部位。ただし、エピ
トープと免疫原は同じではなく、免疫原はエピトープを含み、エピトープよりもサイズがはるかに大きい場合が多いことに注意してください。
エピトープ

可変領域
定常領域

パラトープ

免疫原または抗原

蛍光色素［fluorochrome(fluorophore)］

励起後、測定可能なスペクトルの範囲内で蛍光を発する化学物質。これは、特定波長のレーザー光または化学的相互作用に反応します。

ハプテン（hapten）

より大きなキャリアタンパク質に直接結合させることで特異的抗体反応を引き

ハイブリドーマ脾臓から採取した抗体産生 B 細胞と不死化した腫瘍細胞株を融合させて作られた（hybridoma）

起こす小さな分子。

細胞株。精製されたハイブリドーマ培養や細胞株は、固有の特異的モノクローナル抗体を産生します。抗体産生のハイブリドーマ法については、第 2 章をご覧ください。

宿主種（Host

抗体を産生する動物種。

免疫原

免疫応答を誘導する能力を持つペプチド配列、化学物質または他の物質。

免疫原性

抗原が抗体産生を誘導する能力。

免疫グロブリン抗体としての機能を有するタンパク質ファミリーの総称。数種のサブクラスがspecies）（immunogen）（immunogenecity）［immunoglobulin(Ig)］

間接染色（indirect
staining）
直接法

直接法

あります。

一次抗体の宿主種に対して作製され、一次抗体に結合する標識済み二次抗体により抗原を検出する方法。
間接法

間接法

抗原

抗原

一次抗体
一次抗体

細胞

細胞

細胞

細胞

二次抗体
二次抗体
蛍光色素
蛍光色素

アイソタイプ・コント

一次抗体と同じ免疫グロブリンサブクラス、同じ種の抗体。この抗体は特異的な

control）

他のタンパク質相互作用によるものではなく、特異的なものであるか否か、確認

ロール（isotype

ものに対して作製されておらず、一次抗体結合が非特異的 Fc 受容体結合またはするために使用されます。

KLH

スカシガイ由来ヘモシアニン。抗体産生におけるキャリアタンパク質としてよくモノクローナル抗体

1 つの抗原につき 1 つのエピトープのみを認識する均一な抗体の集団。モノクロー（monoclonal
antibody）

使用されます。

ナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて作製されることが多いです。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください38

ネガティブ・コント
ロール・サンプル（negative control

関心のある抗原を発現しない・含まないことが判明している組織、細胞株、ライセートまたは精製タンパク質。

sample）

正常血清（normal

非免疫動物から採取した血清。コントロールとして使用されることが多いです。

パラトープ

抗原結合部位、すなわち抗原を認識し、結合する抗体の部分。

至適希釈率（optimal

バックグラウンドや非特異的染色を最小限に抑えつつ、陽性シグナルを最大化

serum）（paratope）
working dilution）

する抗体濃度（または希釈率）。至適希釈率は、滴定実験により、各抗体に対して最適化する必要があります。

ペプチド（peptide）

短鎖のアミノ酸。

ポリクローナル抗体

不均一な抗体の混合物であり、特定の抗原に対して各抗体が異なるエピトープを（polyclonal
antibody）

認識します。

ポリクローナル抗血清

抗体

エピトープ

抗原

ポジティブ・コント

ロール・サンプル（positive control

関心のある抗原を発現する・含むことが判明している組織、細胞株、ライセート
または精製タンパク質。

sample）

血清吸着処理済み

抗体を、他のタンパク質やさまざまな種に由来する血清で吸着させ、関心のある

免疫前血清（pre-免疫化する前に抽出した血清。コントロールとして使用されることが多いです。

一次抗体（primary

関心のある抗原と直接結合する抗体。直接染色の場合、一次抗体は標識済みです。

プロテイン A/G 精製

抗体の Fc 領域が高親和性黄色ブドウ球菌由来のプロテイン A またはプロテイン G（pre-adsorbed）

immune serum）
antibody）（Protein A/G

purification）

ターゲットと交差反応する可能性のある抗体を除去します。

間接染色の場合、一次抗体の検出には標識済み二次抗体が必要です。
に結合することを利用したカラム精製。

RabMAb®

高品質のウサギ・モノクローナル抗体を作製するアブカムの特許取得済み技術。

リコンビナント抗体

合成遺伝子を用いて in vitro で作製した抗体。

（recombinant
antibody）

二次抗体（secondary
antibody）

一次抗体に結合することで、可視化する標識抗体。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください39

特異性（specificity） ターゲット・タンパク質のみに結合する抗体の能力。ノックアウト検証モデルを含むさまざまな手法で、抗体の特異性を評価することが可能です。これらの手法の詳細については、「抗体特異性の検証」の章をご覧ください。
滴定（titration）

目的のアプリケーションに最適な抗体濃度を見つけるために設計された実験。

さまざまな希釈率で対象とする抗体を調べ、それらの結果を評価して至適濃度を特定します。滴定の詳細については、「抗体の希釈と滴定」の章をご覧ください。

詳細については、www.abcam.co.jp/nav/primary-antibodies をご覧ください40

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