−報33

文−

Fc レセプター固定化分離剤を用いた抗体糖鎖構造に基
づく分離
寺
山
朝
遠
田
大
井

尾
中
岡
藤
中
江
出

陽
直
義

正
輝

介＊ 1
紀＊ 1
晴＊ 2
諭＊ 2
亨＊ 3
剛＊ 2
彦＊ 4

Separation of Antibody by Fc Receptor Resin Based on Antibody’s Glycan
Structures
Yosuke TERAO
Naoki YAMANAKA
Yoshiharu ASAOKA
Satoshi ENDO
Toru TANAKA
Seigo OE
Teruhiko IDE

We have developed a new and unique affinity resin coupling Fc gamma receptor IIIa(FcR) that efficiently
separates antibodies based on their glycan structure. Fc gamma receptor IIIa is known as one of key moleculesin the human immune system and is expressed on the surface of our immunocytes. The binding affinity between
antibodies and FcR affects the efficacy of the therapeutic antibody drugs, especially the ADCC (Antibody Dependent
Cellular Cytotoxicity) activity.
ADCC activity is one of the important efficacies of antibody drugs and is reported to be enhanced by the specificamino acid mutations of the antibody drugs, or the specific glycan structure changes of antibody drugs, e.g. lack of
the core fucose.
We found that our FcR resin can clearly separate the antibodies with core fucose and those without core fucose on
their glycan structure. Two CHO cell lines producing the fucosylated or non-fucosylated antibody were establishedby our laboratory. The evaluation of ADCC activity of the fractions containing the fucosylated or non-fucosylated
antibody separated by our FcR resin revealed that the ADCC activity of the fraction containing the non-fucosylated
antibody was 100 fold higher than that of the fucosylated antibody. The glycan structure analysis of the separated
fractions in the FcR chromatography elucidated that the antibody without core fucose showed longer elution time,that means high affinity with FcR, while on the other hand, the fraction with core fucose showed shorter elution
time, that means low affinity with FcR.
These results provide new insight into our FcR resin. It could be a powerful tool for the analysis of the glycan
structure of antibodies or for monitoring and controlling the glycan structure during antibody manufacturing.
＊1＊2

ライフサイエンス研究所
ライフサイエンス研究所

バイオプロセスグループ
生物機能工学グループ＊3＊4

バイオサイエンス事業部第二開発部セパレーショングループ
ライフサイエンス研究所

TOSOH Research & Technology Review Vol.61（2017）

34

1．緒

我々は、これまでに Fc 受容体の一つであるヒト Fcγ

言Receptor I に着目し、抗体との高い親和性を利用した

近年、抗体医薬品の開発が大きく進展しており、医抗体精製用のアフィニティークロマトグラフィー用分

薬品売り上げトップ 10 のうち半分を占めるに至って離剤の開発を進めてきている 8）。同分離剤は、近年、いる。また、その市場は、年率 8％もの高成長率にて

特に抗体凝集体や抗体薬物複合体（ADC）の分離に適

全世界で 9 兆円（2020 年）にも達すると予想されて応できるのではないかと注目されている。

いる 1）。

本報告では、抗体の糖鎖構造を識別する Fc 受容体

一方、現状の医療費高騰問題や、より低コストな抗（Fcγ Receptor IIIa）を利用した高機能抗体医薬品分離体医薬品の需要から、低投与量でもより薬効の高い抗のための分析カラムに関する開発結果を報告する。

体医薬品の開発が求められている。より高機能な次世
代抗体医薬品の例として、抗がん剤などでは高い細胞殺傷作用（ADCC 活性：抗体依存性細胞傷害）を得られるよう改良した抗体、血中安定性を改良した抗体、２つの特異的な抗原結合部位を有する抗体等の開発が
2）

2．方

法

［1］発現系構築
ヒト Fcγ Receptor IIIa（以下、FcR）のアミノ酸配進行している 。特に ADCC 活性を向上させた抗体医列をコードするポリヌクレオチド配列を遺伝子組換え薬品の開発が広く行われている。ADCC 活性の作用機

発現用プラスミドベクターに挿入し、生産用大腸菌を序として、抗原を認識した抗体が免疫細胞上の Fc 受

形質転換することで大腸菌発現系を構築した。発現ベ容体（Fcγ Receptor IIIa）に結合し、その後、免疫細クターには pTrc99A を用い trc プロモーターの下流に胞から免疫シグナルが発せられ、抗原（抗がん剤の場

シグナルペプチド遺伝子、FcR 遺伝子、評価用または合には、がん細胞）を攻撃、破壊することが明らかに固定化用タグ遺伝子の順に遺伝子を挿入した。生産用

3）されている 。また、抗体と Fc 受容体との結合には、大腸菌として、W3110 株を使用した。なお、FcR のア抗体のアミノ酸配列のみならず、抗体に結合している

ミノ酸配列は公的データベース等で公表されている 9）。

糖鎖構造も大きくその結合に関与していることが明らかになっており 4）、抗体と免疫細胞上の Fc 受容体（Fc［2］安定化 FcR の作製

Receptor）との結合に関する機能解明がなされている。

ヒト由来タンパク質である FcR の各種安定性を向糖鎖構造を制御することで抗体医薬品の薬効（ADCC

上させるため、ランダム変異導入による安定化変異活性）を高めることが可能となっており、特に N −結体の作製をエラープローン PCR 法 10） により行った。

合型糖鎖におけるコアフコース欠損型の糖鎖構造がFcR 配列に変異を導入した変異ライブラリーから、生

5）

ADCC 活性を高めることが見い出され 、一部この原産性、酸処理後の残存活性を指標とした耐酸性の向上

6）した変異株を取得し、変異を組み合わせることで耐酸理を利用した高機能な抗体医薬品も製品化されている 。
抗体は、DNA 配列の情報を基に動物細胞（抗体医

性の向上した改良型ヒト FcR 遺伝子を作製した。

薬品の場合は CHO 細胞等）の培養により基本的には単一のアミノ酸配列を持つタンパク質として生産され［3］FcR の生産る。その際に、抗体の Fc 領域の特定位置に動物細胞

遺伝子組み換え大腸菌を当社独自の組成の培地を用

特有の糖鎖修飾がなされ、様々な糖鎖構造をもった混

いた高密度培養法により、大腸菌内に FcR を発現させ、合物として生産される。抗体医薬品は、抗体生産細胞生産した。大腸菌を回収後、界面活性剤や酵素によるの培養後、除細胞、カラムクロマトグラフィーによる抽出の後、最適化された条件によるカラムクロマトグ

精製、ろ過等の工程を経て製剤化される。このように

ラフィーにより、高純度に FcR を精製した 11）。精製生産される抗体は複雑な糖鎖構造を有しており、糖鎖した高純度 FcR に関して各種規格値を設定し、品質構造の型によりその薬効（特に ADCC 活性）にも影を測定した。

7）

響が出てくることから 、その糖鎖構造の制御や制御方法の開発が求められている。

［4］FcR 固定化分離剤および FcR カラムの作製

また、次世代の高機能抗体医薬品の開発に、各種

当社独自の分析用ベース基材（非多孔性、平均粒子

Fc 受容体との結合力の評価が利用され、Fc 受容体（特径 5 μm）に固定化用官能基を導入し、FcR を固定化に Fcγ Receptor IIIa）との結合力、親和性を簡便に評した。作製した FcR 固定化分離剤を分析用カラムへ価することが求められていた。

と充填し、FcR カラムを作製した。

東ソー研究・技術報告第 61 巻（2017）35

腸菌コドンへと変換最適化し、発現タンパク質を大腸［5］FcR カラムの評価作製した FcR カラムを用いて、目的抗体を中性緩菌のペリプラズム領域に分泌させる PelB シグナルペ

衝液で結合させ、酸性緩衝液のグラジエント溶出によ

プチドを N 末端側に、評価用または固定化タグを Cり、抗体の分離クロマトグラムを得た。

末端側に挿入した FcR 遺伝子を発現ベクター pTrc99Aに挿入した。FcR 生産用大腸菌 W3110 株を形質転換し、FcR 発現系を構築した。使用した宿主ベクター系は安［6］FcR カラム分離フラクションの評価
FcR カラムにより分離された抗体をピークごとに分取し、分取フラクションに含まれている抗体の糖鎖構全性が確認され、経済産業省の GILSP リストに掲載されている。

造を LC − MS を用いた市販標準品との比較により解析した。また、同様に各分取フラクションに含まれる抗体の薬効（ADCC 活性）を ADCC アッセイキット（プ［2］安定化 FcR の作製
ヒト天然型 FcR 遺伝子を鋳型に、FcR 遺伝子中に
1 ～ 2 個のアミノ酸が置換されるよう条件を最適化しロメガ社）により測定した。

たエラープローン PCR を実施し、変異ライブラリー［7］コアフコースフリー型リツキシマブ生産株の作製を作製した。FcR の生産性および耐酸性を指標にスク12）市販発現ベクターにリツキシマブ（DrugBank ：リーニングすることで、安定性向上株を取得した。取DB00073）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ

得した安定性向上株の FcR 配列を解析し、安定性向

チド配列を挿入し、リツキシマブ発現ベクターを作製、上に寄与するアミノ酸置換位置および種類を同定し、生産用 CHO 細胞に遺伝子導入した。CHO 細胞としてそれぞれで得られたアミノ酸置換を組み合わせること

浮遊細胞である DG44 株を使用した。発現ベクターにで安定性向上株を作製した。さらに安定性向上株を鋳導入した選択マーカーで選択後、dhfr ／ MTX 遺伝子型に変異ライブラリーを作製し、安定性向上株をスク増幅により、リツキシマブ安定生産株を作製した。さリーニングすることを繰り返すことで、高生産性、高らに作製した生産株から単クローニング操作により、耐酸性を有する安定化 FcR を作製した。得られた安リツキシマブ高生産株を取得した。

定化 FcR は複数個のアミノ酸が置換され、天然型とコアフコース欠損株作製のため、市販遺伝子ノック

比較して大きく耐酸性が向上し、pH 3.0 の酸性条件下、アウト用ベクターに、フコース転移酵素（FUT8）を100 時間以上浸漬した後でも抗体結合活性を保持してターゲットとした配列を挿入し、フコース欠損株作製いた（Fig. 1）。

用ベクターを作製した 13）。続いて、リツキシマブ生産
CHO 細胞株に、フコース欠損株作製用ベクターを遺［3］安定化 FcR の生産

伝子導入し、薬剤選択マーカーおよびフコースを認識

安定化 FcR 生産用大腸菌の培養を高密度培養にてするレクチン（LCA）を用いてフコース欠損株を取得実施した。当社独自の処方による動物由来原料不使用した。同様の単クローン化により、フコースフリー型の培地を使用し、溶存酸素濃度により追加培地量を制

リツキシマブ高生産株を作製した。

御する培養法にて、大腸菌を濁度（OD600）150 以上の高密度に増殖させた。IPTG を用いた発現誘導により、［8］リツキシマブの生産安定化 FcR は培養液あたり 1 g ／ L 以上の高濃度に生コアフコースフリー型リツキシマブ生産 CHO 細胞を培養し、培養液からプロテイン A カラムによるアシマブを作製した。また、フコースを欠損していない
フコース結合型リツキシマブを生産し、同様にアフィ
ニティー精製により取得した。

3．結果と考察

120
Remaining activity［％］

フィニティー精製によりコアフコースフリー型リツキ

80の細胞外領域をコードするポリヌクレオチド配列を大Prototype FcR

60
Wild−type FcR

40
20
0

［1］FcR 発現系の構築
ヒト Fcγ R IIIa のアミノ酸配列（Uniprot：P08637）

Stabilized FcR（final）

100

0

50

100

150

200

Incubation time［hr］

Fig.１

Evaluation of stability of improved FcR under acidic
conditionTOSOH Research & Technology Review Vol.61（2017）

36

産された。

［4］FcR 固定化ゲルの分離性能評価

高密度培養液を回収後、遠心分離により培養上清精製された安定化 FcR をリガンドとして使用し、を除去し、FcR 発現大腸菌菌体を回収した。界面活性

独自の固定化タグ配列を活用することで配向性を制御剤や酵素等を用いた薬剤による抽出により安定化 FcR

して、官能基を変換・修飾した分析用分離基材に固定を抽出した後、遠心分離、フィルターろ過により清澄化した。FcR 固定化ゲルをφ 4.6 mm × 75 mm の分析な抽出液を得た。

用カラムに充填し、FcR カラムを作製した。FcR カラ抽出液の pH、電気伝導度を調整し、イオン交換カ

ムの分離性能評価として、Table 2 の条件（分析条件

ラムクロマトグラフィーにて精製することで、高純の一例）にて抗体医薬品の分析を実施した。抗体医薬度安定化 FcR を取得した。イオン交換ゲルとして、品として市販されているリツキサンを使用した。通常®

TOYOPEARL CM − 650M を使用し、2 段階の塩濃度の SEC 分析カラム（TSKgel® G3000SWXL）を用いたで洗浄後、溶出することで、1 ステップのカラムクロ

分析では単一ピーク（Fig. 3）であった抗体医薬品が、マトグラフィーのみで高純度、高収率にて安定化 FcR開発した FcR カラムによる分析では Fig. 4 のように、を精製することが可能となった（Fig. 2）。精製に用

複数のピークに分離することが判明した。これは、抗いるゲルや器具を NaOH によりアルカリ洗浄した後、体に付加している糖鎖の構造には多様性があり、その脱エンドトキシン水で充分に洗浄し、使用する緩衝液

構造の違いによって抗体と FcR との結合性が異なるも脱エンドトキシン水を使用することで、陽イオン交ことから、溶出時間が異なっていることを表している。

換クロマトグラフィーにより大腸菌の細胞膜に含ますなわち、FcR は抗体に付加する糖鎖構造によって結れる発熱成分（エンドトキシン）を効率的に除去で合親和性が異なり、ゲル表面上で抗体を保持する結合

き、各種分析結果も規格値を満たすことを確認した

力が異なることから、Fig. 4 のような分離パターンが（Table 1）。

得られると考えられる。
また、精製された抗体のみならず、抗体産生細胞の3,500

培養上清液を直接分析することも可能である。Fig. 5

80

Cond.

に示したように、培養液成分は FcR カラムには吸着
60

3,000
2,500

40

2,000
1,500

20

1,000

Absorbance at 280 nm［mAU］

UVConductivity［mS／ cm］

Absorbance at 280 nm［mAU］

4,000

500
0

0

Fig.２

50

100
150
200
Elution time［min］

250

300

0

Chromatogram of FcR purification withTOYOPEARL CM−650M

Table１0

5
1015
Elution time［min］

Chromatogram of Rituxan using SEC column

Fig.３

Analysis of purified FcR※

Analysis items
SEC

Standard value≧95％

Results
Lot A

Lot B

98％

99％

RP−HPLC

≧95％

99％

99％

SDS−PAGE

Single band

singlesingle

≧1.2

2.5

2.6

Protein Concentration

2±0.1 g／ L

2.0

2.0

Endotoxin Concentration≦20 EU ／ mg

0.5

2.1

Conductivity

60−90 mS／ cm

72

86

Spectrum ratio of 280／ 250※

FcR；MW＝21 kDa，pI＝6.4，Tm＝57.1℃
stable under acidic condition（pH 3.0, ≧100 hr）

東ソー研究・技術報告

Table２

第 61 巻（2017）37

Analysis condition

Equipment

HPLC system

ColumnFcR column（4.6 mmI.D.×75 mm）

Buffer A

20 mM sodium acetate ＋ 50 mM NaCl pH 5.0

Buffer B

10 mM glycine−HCl pH 3.0

Gradient

0−2 min

0％B

2−30 min

0％B to 100％B linear

30−40 min 100％B
40−50 min 0％B（re-equilibration）
Temperature

25 ℃

Flow Rate

0.6 mL／ min

Sampleantibody 5 μg

Detection

UV absorbance at 280 nm

Absorbance at 280 nm［mAU］

Absorbance at 280 nm［mAU］

4000
3000
2000
1000
0

−1000

2500

20

25
30
Elution time［min］

mAb

1500

500

−500
15

Impurities from cell culture

0

10

20
30
Elution time［min］

35

40

Direct analysis of mAb from cell culture

Fig.５

Fig.４ Chromatographic profile of Rituxan using FcR column［5］分離フラクションの糖鎖構造解析
せず素通りし、培養液に含まれる抗体成分のみが吸着
し、分析することが可能である。

FcR カラムにより分離した抗体の各フラクションを
ピークごとに収集し、そのフラクションに含まれている抗体の糖鎖構造を解析した。その結果、Fig. 6 のよ

0 10 20 30 40 50 60 70

Absorbance at 280 nm［mAU］

G0

Fraction A

Fraction B

Original mAb

G0F

Fraction A

G1Fa
Fraction B

Non−separated
original mAb
G1Fb

15

20
25
Elution time［min］

30
GlcNAc;Man;

Glycan structure

Fig.６

Fraction B

G2F
Gal;

Fuc;

Contents［％］

Glycan structure analysis of the mAb s fraction separated by FcR column

TOSOH Research & Technology Review Vol.61（2017）38

いては確認できていない。

うに、溶出時間の早い成分には、糖鎖構造の末端にガラクトースの無いものが多く、溶出時間の遅い成分にはガラクトースが多くついたものが含まれる等の特徴［7］各種抗体医薬品の分離例が見い出された。また、他にも糖鎖構造により、各フ数種類の抗体医薬品を同様に分析した分離パターン

ラクションに含まれる量やその組成比が異なることがの結果を Fig. 8 に示した。抗体医薬品の種類によっ判明した。すなわち、FcR と抗体の親和性が抗体に付て、FcR カラムの分離パターンが異なることが判明し加する糖鎖構造により変化することが確認された。

た。これは各抗体に結合している糖鎖構造がそれぞれ異なっているためであると考えることが出来る。すな［6］分離フラクションの抗体活性（ADCC 活性）評価

わち、FcR カラムが示す分離パターンは、糖鎖構造のさらに FcR カラムにより分離された各フラクション

違いが、各抗体医薬品の薬効（ADCC 活性）の指標に含まれる抗体の ADCC 活性を測定した結果を Fig. 7となっていることを表している。例えば、抗ガン剤でに示した。FcR カラムにより分離された各フラクショ

あれば、より強い細胞を殺傷する能力が必要であるこンは溶出時間に応じた ADCC 活性の違いを示した。

とからより強い ADCC 活性を保持していることが望すなわち、溶出時間の早いフラクションは ADCC 活

まれる。一方、阻害（中和）作用を中心とした抗体医性が低く、溶出時間の遅いフラクションは ADCC 活

薬品では、自己細胞を殺傷する作用は弱い方が良いと性が高いことが判明した。これらの結果から、FcR と考えられるので、ADCC 活性が弱いものが望まれる。

抗体の結合親和性の強弱と ADCC 活性の強弱が相関

FcR カラムからの溶出時間が遅い画分は、FcR と強いし、抗体に付加する糖鎖の構造がその結合親和性に影結合力を持つ糖鎖構造を含んだ抗体画分であり、生体響することが確認された。特に糖鎖構造末端のガラク

内の FcR の主な機能である免疫活性化に伴う細胞をトースの有無による ADCC 活性の違いは Fig. ６より殺傷する能力（ADCC 活性）が強い抗体成分を含んで推察できるが、一方で、その他の糖鎖構造の影響についると考えられる。逆に、FcR カラムからの溶出時間が早い、もしくは結合しない画分は、FcR と結合力が弱い糖鎖構造を含んだ抗体画分であり、細胞を殺傷す

ADCC activity（intensity）

4.E＋04る能力（ADCC 活性）が弱い抗体成分を含んでいると
3.E＋04

考えられる。

2.E＋04抗体医薬品の分析例を示したが、同じ抗体医薬品でもまた、Fig. 9 に同じ抗体医薬品でも、ロット違いの
製造ロットが異なると分離パターンが若干異なることが示され、抗体に付与する糖鎖構造の比が異なること

1.E＋04が示唆された。
0.E＋00Fraction A Fraction B［8］コアフコースフリー型リツキシマブ生産株の作製
市販 pIRES ベクターに遺伝子増幅のための dhfr 遺ADCC activity analysis of the mAb s fraction
separated by FcR column

Absorbance at 280 nm［mAU］

Fig.７

original
mAb

mAb A

5000

伝子を挿入、IRES 領域を除去、プロモーター領域を

mAb B

mAb C

mAb D

mAb E

4000
3000
2000
1000
0
−1000

15

20

25

30

35

15

20

25

30

35 15

20

25

30

35 15

20

25

30

35 15

Elution time［min］

Fig.８

Chromatographic profiles of several mAbs separated by FcR column

20

25

30

35

Absorbance at 280 nm［mAU］

東ソー研究・技術報告第 61 巻（2017）39

産、精製し、取得した。
Lot B

Lot A

［10］フコースフリー型およびフコース結合型リツキ
シマブの FcR カラムによる分離
作製した各リツキシマブの FcR カラム分離を実施
し、Fig. 10 のようなクロマトグラムを得た。抗体の糖鎖構造のうち、コアフコースは FcR との結合に大きく寄与することが知られていることから、FcR カラ
Elution time［min］

Fig.９

Chromatographic profiles of mAbs with different
production lot

ムを用いた分離においても、フコースフリー型リツキ
シマブは FcR と強く結合し、溶出時間が遅い画分に溶出された。一方、通常のフコース結合型リツキシマ
ブは FcR と強く結合はせず、溶出時間もより早いもCAG プロモーターへと変更、および新たに CAG プロのであることが判明した。

モーターを挿入した抗体発現ベクター pCAG_dhfr を構築した。リツキシマブの重鎖、軽鎖のそれぞれのア［11］分離フラクションの分析

ミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入することで抗体

分離フラクションに含まれる抗体の糖鎖構造の解

発現ベクターを作製した。作製した抗体発現ベクター

析、 お よ び ADCC 活 性 を 測 定 し た。 糖 鎖 構 造 解 析を CHO 細胞（DG44 株）へ遺伝子導入し、リツキシ（Fig. 11）では、コアフコースを欠損させたフコース

マブ産生細胞株を作製した。数段階のメトトレキサー

フリー型リツキシマブが、コアフコースの無い糖鎖構ト（MTX）による遺伝子増幅の後、限外希釈法を用造であることを確認し、さらに溶出時間の早いものはいた単クローニング操作により、安定的にリツキシマ

末端のガラクトースが無いもの、溶出時間の遅いもの

ブを発現するリツキシマブ高生産株（リツキシマブ生はガラクトースを含んでいるものであることを確認す

産量：数 10 mg ／ L）を取得した。

ることが出来た。一方、通常のフコース結合リツキシ

CRISPR − Cas9 遺伝子ノックアウト用ベクターに、マブでも同様の傾向が確認された。

フコース転移酵素（FUT8）をターゲットとしたガイ

また、ADCC 活性測定では、フコースフリー型リツ

ド RNA 配列を挿入し、コアフコース欠損株作製用ベキシマブはフコース結合型と比較して、Fig. 12 に示

クター pDel_FUT8 を作製した。続いて、リツキシマ

したように約 100 倍薄い濃度でも同等の細胞殺傷能力

ブ高生産 CHO 細胞株に、コアフコース欠損株作製用（ADCC 活性）を有していることが確認できた。すな

ベクター pDel_FUT8 を遺伝子導入し、ネオマイシン

わち、フコースフリー型リツキシマブはフコース結合

による薬剤選択およびコアフコースを認識するレクチ型リツキシマブよりも約 100 倍強い ADCC 活性を有ン（LCA）を用いたスクリーニングによりフコース欠しており、抗体の糖鎖構造のフコースの有無で ADCC

損株を取得した。さらに限外希釈法による単クローン

活性が大きく異なることが確認できた 5，14）。

化により、コアフコースフリー型リツキシマブ高生産

以上の結果より、フコースフリー型の糖鎖構造を持し、FUT8 遺伝子配列の解析を実施したところ、数塩基の欠失が認められ、FUT8 遺伝子が欠損していることが確認された。
［9］リツキシマブの生産
コアフコースフリー型リツキシマブ高生産株を市販
CD OptiCHO 培地を使用して 37℃、8％ CO2 存在下、Absorbance at 280 nm［mAU］

株を作製した。得られた生産株のゲノム DNA を回収

fucosylated
rituximab

non−fucosylated
rituximab

振とう培養を実施し、抗体含有培養液を取得した。培養上清から TOYOPEARL® AF − rProtein A HC − 650F ゲ
ルを用いたアフィニティー精製によりコアフコースフ
リー型リツキシマブを調製した。また、フコースを欠損していないフコース結合型リツキシマブを同様に生

15

20

25

30

35

Elution time［min］

Fig.10Chromatographic profiles of fucosylated or
non−fucosylated rituximab

40

TOSOH Research & Technology Review Vol.61（2017）40

fucosylated
rituximab

100 8060

40

non−fucosylated
rituximab

20

0

0

component ratio（％）

Fig.1120

40

60

80 100component ratio（％）

Glycan structure analysis of the fucosylated or non−fucosylated rituximab

Luminescence［RLU］

2.0E＋06
non−fucosylated
rituximab

1.6E＋06

fucosylated
rituximab

1.2E＋06
8.0E＋05
4.0E＋05
0.0E＋00
−5

−4

−3

−2

−1

0

1

Log mAb concentration［μg ／ mL］

Fig.12

Evaluation of ADCC activity of the fucosylated or non−fucosylated rituximab

つ抗体は、FcR カラムと強く結合し、溶出時間が遅くにも寄与していることから、FcR カラムを用いることなること、および抗体の薬効 ADCC 活性が強いこと

で簡便に抗体医薬品の薬効を測定できることが確認でが確認された。また、抗体と FcR との結合に糖鎖構きた。本開発品は、FcR を人工的に改良、分離剤表面

造中のフコースが大きく寄与しており、開発品の FcRに固定化させることで、抗体の糖鎖構造による結合性

カラムが抗体との親和性に基づいて分離できること、の違いといった FcR のヒト生体内での本来の働きをおよびその結果として抗体の薬効 ADCC 活性の強さ保持させ、抗体医薬品の分離を可能とした。

を判定できることが確認された。

本開発品の FcR カラムは、抗体医薬品の創薬研究
や、生産技術の開発における分析、生産された原薬や

4．ま と め製品の品質管理等、様々な場面での適応が可能である。
創薬研究では、最適な ADCC 活性を示す糖鎖構造を

以上のように、ヒトの免疫機構の一翼を担う Fc レ有する抗体を産生するような細胞の選別などに、生産セプターを利用した抗体医薬品分析用のカラムを開発

技術開発では、所望の強さの ADCC 活性を有する糖してきた。FcR カラムは、抗体と FcR との結合力の鎖構造となるよう培養プロセスにおける培養パラメー

違いから、抗体医薬品の糖鎖構造に基づく分離が可能

ターの最適化、精製プロセスの最適化などに使用可能であることを確認できた。さらに、FcR と抗体医薬品

である。さらに製造途中の工程分析としても ADCCの結合の強さが抗体医薬品の薬効である ADCC 活性

活性および糖鎖構造をモニターすることが可能であ東ソー研究・技術報告

り、品質管理では、生産された抗体の規格値の一部として ADCC 活性の確認に利用が可能である。
本研究開発の一部は、経済産業省の「平成 25 年度
産業技術実用化開発事業費補助金（個別化医療に向けた次世代医薬品創出基盤技術開発（国際基準に適合した次世代抗体医薬等製造技術））」及び平成 26 年度産業技術実用化開発事業費補助金（次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（国際基準に適合した次世代抗体医薬等製造技術））」、及び国立研究開発
法人日本医療研究開発機構（AMED）の「次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」の支援によって行われた。

5．参考文献1 ）JP モルガン・アセット・マネジメント㈱マーケッ
トレポート（2017 年 1 月）
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第 61 巻（2017）41