J. Mass Spectrom. Soc. Jpn.

Vol. 51, No. 3, 2003

COMMENTARYMALDI-MS による非イオン系界面活性剤の生分解機構の解析
Biodegradation Mechanisms of Non-Ionic Surfactants
Evaluated by MALDI-MS
佐藤浩昭῎a)῎柴田敦司b)῎吉川博道c)῎田村廣人b), d)
Hiroaki S6ID, Atsushi S=>76I6, Hiromichi YDH=>@6L6, and Hiroto T6BJG6(Received November 28, 2002; Accepted January 14, 2003)

Bacterial biodegradation mechanisms of non-ionic surfactants under aerobic conditions were studied bymeans of matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS). First, biodegradationintermediates of octylphenol polyethoxylate (OPEO) were characterized by MALDI-MS. Since the formation ofcarboxylated OPEO (OPEC) and the changes in molecular weight distribution during biodegradation test wereobserved, it was proposed that the biodegradation of OPEO was proceeded mainly according to the exo-scissionof EO chain accompanied with oxidation of the hydroxyl terminal side. Then, to clarify the mechanisms of theoxidative biodegradation in detail, biodegradation test was carried out using 18O-labeled water as a incubation
medium. The incorporation behavior of 18O into OPEC molecules suggested that the formation of an enzyme (orcoenzyme)-substrate complex linked via a covalent bond might be formed as a reaction intermediate. Finally,
biodegradation proﬁles of non-ionic surfactants with a variety of hydrophobic moieties were investigated using
18O-labeled water. The incorporation rates of 18O into corresponding carboxylated intermediates were correlatedwith the hydrophobicity of the surfactants.の末端水酸基側から生分解反応が進行するモデル ῐexo 型

1. は じ め に分解ῑ が広く受け入れられている῍ しかしながらῌ なぜ環

アルキルフェノ῏ルポリエトキシレ῏ト (APEO) はῌ ア

境中で PEO 鎖の末端がカルボン酸に酸化された成分やῌ

ルキルフェノ῏ルとポリエチレンオキシド (PEO) が結合

EO 単位の数が 2 や 3 の成分も多く検出されるのかῌ 末端した代表的な非イオン性界面活性剤でありῌ 工業用洗剤やから EO 単位が切断῎遊離する単純な exo 型モデルでは説

農薬補助剤などの素材として多量に使用されている῍

明がつかないことが多くῌ 詳細な生分解機構は十分に理解

APEO が環境中に漏出するとῌ 微生物の作用により PEOされているとは言いがたい῍ そのためῌ 生分解過程におけ鎖部分が選択的に生分解されῌ その結果ῌ アルキルフェる分子構造の変化を詳細に解析することが重要であるがῌ

ノ῏ル類 (AP) や短鎖の APEO およびその酸化物が環境界面活性剤などの合成高分子はῌ 高分子鎖の長さや末端化中に残存することが知られている (Fig. 1)῍ これらはῌ 内学構造などが異なる分子の集合体であるためῌ クロマトグ分泌かく乱作用が強く疑われているῌ いわゆる ῒ環境ホルラフィ῏や分光分析法などの方法でキャラクタリゼ῏ショモンΐ の一種である῍ンを行うのはῌ 一般に困難である῍

すでに APEO の生分解機構の概要についてはῌ PEO 鎖

一方ῌ マトリックス支援レ῏ザ῏脱離イオン化῍質量分῎a) 独立行政法人産業技術総合研究所環境管理研究部門 ῐῌ305῍8569 つくば市小野川 16῍1ῑ
Institute for Environmental Management Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) (Tsukuba 305῍8569, Japan)b) 名城大学農学部 ῐῌ468῍8502 名古屋市天白区塩釜口 1῍501ῑ
Faculty of Agriculture, Meijo University (Nagoya 468῍8502,Japan)c) 九州共立大学工学部 ῐῌ807῍8585 北九州市八幡西区自由が丘 1῍8ῑFaculty of Engineering, Kyushu Kyoritsu University (Kitakyushu 807῍8585, Japan)d) 名城大学農学ハイテクリサ῏チセンタ῏ ῐῌ468῍8502 名古屋市天白区塩釜口 1῍501ῑ
Agricultural High-Tech Research Center, Meijo University(Nagoya 468῍8502, Japan)

分子の分子量分布および化学構造に関する情報をῌ ごく微

析法 (MALDI-MS) はῌ 生体関連物質のみならずῌ 合成高量の試料で比較的容易に解析しうる手法としてῌ 高分子
キャラクタリゼ῏ションの分野でも注目されている1)῍ そこでῌ 筆者らはῌ APEO の一種であるῌ オクチルフェノ῏
ルポリエトキシレ῏ト (OPEO) の微生物分解試験を行いῌ
その過程で生分解して生じた中間物質の分子量分布および化学構造を MALDI-MS によって解析することを試みた῍
本稿ではῌ 重酸素水を培養液に用いる安定同位体ラベル法の開発などの分析化学的な方法論も交えながらῌ MALDIMS による OPEO の生分解挙動の観測結果からῌ OPEO の生分解機構を解析しῌ さらに分解酵素の構造῎機能を推定した内容を紹介する῍ῌ 415 ῌ

A. Shibata et al.

Fig. 2.

Fig. 1.

Structure of OPEO.

Formation of biodegradation products ofAPEOs with estrogenic activity.

2. オクチルフェノῌルポリエトキシレῌト (OPEO)の生分解挙動2)
OPEO は Fig. 2 に示すような構造をもつ Triton X100 Aldrich, 数平均分子量 Mn620, 多分散度 PDI
1.04 を用いた 生分解試験は 水田土壌から単離されたバクテリア (Pseudomonas putida S-5)3) を OPEO 試料(0.1 vol) および栄養源を加えたリン酸緩衝溶液 (5 mL)

中で 30 の好気性条件下で振とう培養して行った そして 所定の時間が経過後 培養液を乾燥し 酢酸エチルを加えて 抽出して得られた酢酸エチル層を測定試料とした

Fig. 3.

Typical MALDI mass spectra of OPEO. (a)original sample; (b) the sample recovered after
the incubation for 48 h. ῍ Corresponding toimpurities and/or matrix peaks.

Fig. 4.

Proposed biodegradation mechanism of OPEO.

合成高分子の MALDI-MS 測定は タンパク質などを測定する場合とは異なった独特の試料調製法が必要になる
ここでは マトリックス剤には 2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB) を用い さらにカチオン化剤としてヨウ化ナトリウムを微量加えた そのため マススペクトル上には 主として試料分子のナトリウムカチオン付加体 [MNa]が主に観測される マススペクトルは Voyager DE-PRO(Applied Biosystems) のリフレクタ

モドを使用して観測した
Fig. 3 に 生分解試験前の試料 (a) と 生分解試験を 48時間行った試料 (b) に対して観測された MALDI マススペ
クトルを比較して示す まず 生分解試験前の試料のマススペクトル (Fig. 3a) を見ると 質量数 400 から 1000 付
近にかけて エチレンオキシド (EO) 単位の質量数に相当する 44 質量単位間隔で OPEO のナトリウムカチオン付加体 [M Na] が観測されており 図中 印 これらは
10 量体付近に分布の極大をもち 3 から 17 量体までの範囲に分布していることがわかる これに対して 48 時間生分解試験を行った試料のマススペクトル (Fig. 3b) を見る

験前の試料にはあまり存在していなかった 3 量体付近にと 分子量分布は低質量数側へシフトしており 生分解試分布の極大が観測されている一方で 8 量体以上の成分は

ῌ 416 ῌ

Biodegradation Mechanisms of Non-Ionic Surfactants Evaluated by MALDI-MS

ほとんど観測されておらず 明らかに EO 鎖の分解が進行したことがわかる さらに 図中および印で示した新たなピク系列が現れており 観測された質量数から こ
れらは試料分子の EO 鎖の末端水酸基側がカルボキシル基に 酸 化 さ れ た 成 分 (OPEC) お よ び そ の ナ ト リ ウ ム 塩(OPECNa) のナトリウムカチオン付加体であると帰属されたFig. 4 に 本実験で得られた観測結果を基に考察した
OPEO の生分解モデルを示す すでに 好気性条件下でのポリエチレングリコル (PEG) の生分解機構は 水酸基
末端側の酸化とそれに続くエテル結合の加水分解を繰り返していく exo 型の分解モデル4)が提案されている しかし このモデルは代謝物であるグリオキシル酸の生成から推測されたものであり 反応中間物の化学構造は確認されていなかった これに対して 本実験では MALDI-MS 測Fig. 5.

定によりカルボン酸誘導体の生成に基づいて exo 型の酸化加水分解モデルを実証することができた
3. 重酸素水 (H218O) を用いた OPEOの生分解機構の解析5)

Enlarged MALDI mass spectra (trimer region) of
the biodegraded OPEO recovered after 48 h
incubation using normal water (a) and 18Olabeled water (b).

分子の酸素との交換反応が起こりうる 本実験の場合で前項で述べた酸化的な生分解機構をさらに詳細に解析すは Fig. 6 に示すように OPEO 分子が脱水素化される過るために 重酸素 (18O) でラベル化した水 (H218O) を用い

程で おそらくアルデヒド中間体を経由した後に バクテた生分解試験を行い 酸化物に 18O 原子が導入される過程

リアの酵素 あるいは補酵素 との間にエステル中間体を観測することを試みた

酵素῍基質複合体 が形成され そこでカルボニル酸素のここでは 貴重な重酸素水の使用量を低減するために

一部が 溶媒である重酸素水の 18O と交換したと考えられ200 mL の重酸素水培養液を用いた生分解試験法および分る そして 2 種類の酵素῍基質複合体 (I) および (II) から解中間物の抽出法を開発した6) まず 通常の水を用いて遊離の OPEC 分子が生じる過程で必ず 18O が一つ導入さ調製した試料を含む無機塩培地を小容積のバイアル瓶 内

れ 結果として 18O が一つあるいは二つ導入された OPEC

径 11.7 mm高さ 32 mmに 200 mL 加え 凍結乾燥しが混在すると考えられる

た後に 200 mL の重酸素水 Cambridge Isotope Laboratories Inc., 純度 95

98 atomを加えて無機塩類を一方 OPEC からグリオキシル酸が遊離して低分子量のOPEO が生じる過程 (Fig. 4) で新たに生じる末端水酸基再溶解することによって培養液を調製した そこへ前培養の酸素は エテル酸素が保存されたものであるのか あ

液 4 mL を添加して 30

るいは水の酸素原子が導入されたものなのだろうか 本実で振とう培養した

Fig. 5 に 普通の水 (H216O) および重酸素水 (H218O) 中験の結果では 低分子量化した OPEO への 18O の導入がで生分解試験を行った試料の MALDI マススペクトルの認められなかったことから エテル酸素が保存される分拡大図を示す 重酸素水中で生分解試験を行った試料で解機構を推定することができる すなわち Fig. 7 に示すは OPEO 

ように 末端カルボキシル基に隣接するメチレン基が酸化の質量数は変化していないが OPEC およびそのナトリウム塩である OPECNa  の質量数がされてヘミアセタル中間体が形成され そこで電子の収2 および 4 Da 増加していることがわかる この結果は受が起こることによって エテル酸素が OPEO に保存

O が一つあるいは二つ導入されたことを示している バ

されるように結合が切断し グリオキシル酸が放出された

18

クテリアが存在しないコントロル実験では OPEC の生と考えられる成は観測されず また合成した OPEC を重酸素水中に加4. 界面活性剤の疎水基の化学構造と生分解性の関係8)

えても 18 O は導入されなかったので 本実験の条件下では バクテリアが水を利用して OPEO の水酸基末端側をこれまで述べたように APEO の生分解の主な舞台が親酸化していることが明らかになり Fig. 4 の分解機構をよ水性 PEO 鎖の末端側であるのは間違いないようである

り確実に支持することができた

それでは 界面活性剤の疎水基の化学構造は生分解性に影

なぜ 18 O が一つのみならず二つ導入された成分も混在響しないのであろうか 興味深いことに 本研究で用いたするのであろうか この理由は エステルの酸素交換反バクテリア (P. putida S-5) は 分子全体の親水性が高い

応7)によって説明することができる 遊離のカルボキシル

PEO Mn約 1,500 をほとんど生分解しなかったことか

基の酸素原子は 通常は溶媒である水分子の酸素と交換すら PEO 鎖をもつ界面活性剤の生分解には 疎水性部分がることはないが エステル化合物のカルボニル酸素は 水重要な役割を果たしていることが示唆された そこで 疎ῌ 417 ῌ

A. Shibata et al.

Fig. 6.

Possible formation pathways of OPEC molecules. X represents heteroatoms such as O, N, and S.

水基の化学構造が異なる界面活性剤を用いてῌ それらの生オロフェニルῑポルフィリン (F20TPP, Mwῒ974.6)9) (Fig.

分解性を比較した῍8) をマトリックス剤として用いた῍

Table 1 にῌ 本実験で用いた界面活性剤をまとめて示

Fig. 9 にῌ 生分解試験を 96 時間行った各試料の MALDIす῍ ここではῌ APEO 試料として OPEO とノニルフェノ῏

マススペクトルを示す῍ いずれの試料においてもῌ 末端がルポリエトキシレ῏ト (NPEO) をῌ またアルキルエ῏テルカルボン酸に酸化された成分が主でῌ EO 単位が 8 から低ポリエトキシレ῏ト (AEO) 試料としてῌ 脂肪族鎖の長さ分子量側に分布していることがわかる῍ しかしながらῌが異なる 2 種の直鎖 AEO ῐA12EO および A14EOῑ およびAPEO 類 ῐOPEO および NPEOῑ と分岐 A8EO ではῌ EO

分岐構造をもつ AEO ῐ分岐 A8EOῑ を用いた῍ PEO 鎖の単位 nῒ2 あるいは 3 まで低分子量化して分解が停止して鎖長を同一にするためにῌ シリカゲルを用いたカラムクロ

いるがῌ 直鎖 AEO 類 ῐA12EO および A14EOῑ ではῌ nῒ1

マトグラフィ῏により 8 量体 ῐオクタエトキシレ῏トῑ 成まで分解が進行している῍ この結果はῌ PEO 鎖の生分解の分を分取῎精製した῍ またῌ MALDI-MS 測定ではῌ 低分子進行度にはῌ 界面活性剤の疎水基の化学構造が影響するこ

量成分のピ῏クを明瞭に観測するためにῌ m/z 700 以下とを示唆している῍ APEO 類のみならず分岐 A8EO でもの領域にマトリックス剤由来の妨害ピ῏クがほとんど観測nῒ3 で分解反応が停止したことからῌ PEO 鎖の分解を阻されない特徴をもつῌ 5,10,15,20-テトラキスῐペンタフル

害する要因はῌ 芳香環の存在ではなくῌ 疎水基の立体障害

ῌ 418 ῌBiodegradation Mechanisms of Non-Ionic Surfactants Evaluated by MALDI-MSFig. 8.

Structure of F20TPP matrix.

対ピ῎ク強度を指標にしてῌ 酸素交換反応の効率 (I ῔) を次式により見積もった῍
Iΐ

P18O2
P18O1ῑP18O2

ῒ100(1)

ここでῌ P18 O2 は酸化物の末端カルボキシル基に 18O が 1Fig. 7.

Table 1.

Possible formation pathways of shortened
OPEO molecules.

原子導入された成分のピ῎ク強度でῌ これは酸素交換反応を受けていないものでありῌ 一方ῌ P18 O2 は 18O が 2 原子

Chemical Structures of Surfactant Samples
and Their Monoisotopic Mass

Sample (code)

Chemical structure

導入された成分のピ῎ク強度でῌ 酵素῍基質複合体が形成されたときに酸素交換反応を受けたものである῍

Monoisotopicmass

Octylphenol
octaethoxylate(OPEO)

558.4

Nonylphenol
octaethoxylate(NPEO)

572.4

Fig. 10 にῌ 各界面活性剤試料の 8 量体の酸化物に対して観測された酸素交換反応の効率を示す῍ PEO 鎖の長さは同一であるにもかかわらずῌ 酸素交換反応の効率はῌ 明
らかに界面活性剤の疎水基の構造の違いによって異なっておりῌ 疎水基が大きいほど酸素交換反応が起こりやすくなっている῍ さらにῌ それぞれの試料においてῌ 重合度と酸素交換反応の効率の関係についても調べたところῌ いず

2-Ethylhexyletheroctaethoxylate(branched A8EO)

482.3

Laurylether
octaethoxylate(A12EO)

538.4

Myristylether
octaethoxylate(A14EO)

566.4

れの試料でも重合度が低下するほど ῏すなわち相対的に疎水性が高いほどῐ 酸素交換反応が起こりやすくなっている
ことがわかった῍ 酸素交換反応はῌ 酵素῍基質複合体を形成している時間 ῏寿命ῐ が長いほど起こりやすいと考えられるのでῌ これらの結果はῌ この分解酵素の活性中心には反応部位以外に疎水相互作用による基質認識部位がありῌ 酵
素῍基質複合体の安定化が図られていることを示唆している῍ 本酵素の活性中心はポケット状になっておりῌ その入

῎ Hydrophobic moiety of NPEO has various branchedstructure.

口付近が疎水相互作用による基質認識部位となっているのではないだろうか῍によるものである可能性が考えられる῍ APEO あるいは5. ま と め

AEO 系界面活性剤の PEO 鎖のエ῎テル結合の切断に関与する酵素の活性中心付近はポケット状になっておりῌ 疎

以上ῌ 筆者らが行ってきた MALDI-MS による非イオン水基部分がかさ高い分子は進入しにくい構造をもっている系界面活性剤の生分解機構の解析に関する研究例を述べことが考えられる῍た῍ これまでにもῌ 薬物などの低分子量化合物の代謝機構

次にῌ PEO 鎖の酸化過程における疎水基の影響を調べを解明するためにῌ 同位体ラベル法と GC-MS や LC-MSた῍ 前項で述べたようにῌ 重酸素水を用いた生分解試験のを組み合わせた解析は行われてきたがῌ 本研究で用いた界結果ῌ PEO 鎖の末端基の酸化過程において酸素交換反応面活性剤試料のような高分子化合物の構造変化をῌ 従来のが起こることが明らかとなりῌ エステル結合で結ばれた酵MS で解析することは困難あるいは不可能であった῍素῍基質複合体が中間体として形成されることが考えられ

MALDI-MS はῌ 試料の分離ῌ 抽出あるいは精製などの前た῍ この過程でῌ 疎水基の構造が酵素῍基質複合体の形成に処理をほとんど行うことなくῌ 数 mL の試料で高分子化合影響するのであればῌ 18O の導入率に変化が生じることが物の分子量関連ピ῎クを同位体レベルで明瞭に分離して観考えられる῍ そこでῌ 18O が 2 原子導入された酸化物の相測することができるためῌ こうした研究を進める上で非常ῌ 419 ῌ

A. Shibata et al.

Fig. 9.

Typical MALDI mass spectra of the biodegraded surfactants. (a) NPEO; (b) branched A8EO; (c) A12EO; (d) A14EO.

詳細については研究中である῍ それに対してῌ 基質の生分解機構と分解に関する酵素の機能῎特徴に関する知見を関連づけうることができる MALDI-MS はῌ 界面活性剤のみならずῌ 生分解性高分子材料の分解機構を解析するための重要な解析手段に発展していくものと考えられる῍
文Fig. 10.

1) 佐藤浩昭ῌ 大谷 肇ῌ ぶんせきῌ 467 (2001).
2) H. Sato, A. Shibata, Y. Wang, H. Yoshikawa, and H.
Tamura, Polym. Degrad. Stab., 74, 69 (2001).
3) E. Nishio, Y. Ichiki, H. Tamura, S. Morita, K. Watanabe,and H. Yoshikawa, Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 1792(2002).
4) F. Kawai, Spec. Publ.ῌR. Soc. Chem., 109, 20 (1992).
5) H. Sato, A. Shibata, Y. Wang, H. Yoshikawa, and H.
Tamura, Biomacromolecules, 4, 46 (2003).
6) A. Shibata, H. Sato, Y. Wang, H. Yoshikawa, and H.
Tamura, J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., 51, 256 (2003).
7) M. L. Bender, Chem. Rev., 60, 53 (1960).
8) 佐藤浩昭ῌ 柴田敦司ῌ 王艶ῌ 吉川博道ῌ 田村廣人ῌ 第 50
回質量分析総合討論会講演要旨集ῌ p. 132 (2002).
9) F. O. Ayorinde and E. Elhilo, Rapid Commun. MassSpectrom., 13, 2166 (1999).

Relationship between the size of hydrophobic
moiety of the surfactants and the degree ofoxygen exchange of carboxylated intermediates.に魅力的である῍
第 4 節ではῌ 界面活性剤の分子構造の変化に止まらずῌ
さらに生分解に関与する酵素の機能῎特徴まで推定した内容について述べた῍ 現在のところῌ この酸化῎加水分解に関与する酵素に関する知見は乏しくῌ 膜タンパク質である

献

Keywords: MALDI, Surfactant, Biodegradation, Octylphenol
polyethoxylate

可能性が挙げられているがῌ その構造ῌ 機能および特徴のῌ 420 ῌ