猛毒リシンの超高感度検出技術
致死量の1万分の1をわずか10分で判定可能に
リシンは、バイオテロに使用されたこともある猛毒のタンパク質性毒素である。われわれは、リシンが細胞表層の糖鎖に結合して生体に感染する事実に着目し、この感染機構を材料工学的に模倣することで、リシンを検知するシステムを開発した。すなわち、毒素と結合しやすい人工糖鎖を独自に設計・合成し、この糖鎖を固定化した毒素検知用糖鎖チップを開発した。この糖鎖チップを表面プラズモン共鳴法と組み合わせることで、致死量の 1 万分の 1 のリシンを 10 分で検知することができた。この検知方法は、猛毒リシンの判定法として広く公的機関に配備され、安心・安全な社会の構築に大きく貢献すると期待される。
Ricinus communis toxins are highly poisonous proteins once used illegally in the past. Against such bioterrorisms using
toxins and pathogenic microbes in the form of the "white powders", we have to be prepared with facile detection andmedical treatment methods. Recently, we developed an SPR (surface plasmon resonance) detection system applying
synthetic carbohydrates as the toxin probes, which allows us a facile and highly sensitive detection within 10 min evenat protein concentration of less than 1/10,000 of LD50 value. The present analytical method may oﬀer one of the highly
eﬀective methods against the bioterrorism.

リシン検出法の必要性
リシンは、1978 年に、ブルガリア人ジャーナリストの暗殺に使用された。また、2003 〜 04 年には、米国のホワイトハウスや上院に白い粉のリシンが郵送される事件が起きている。リシンは、ヒマ、あるいは、トウゴマの種子（写は 3 〜 5µg/kg（体真 1）から精製され、致死量（LD50、吸入）
重 50kg の人の場合、150µg）である。青酸カリと比べて 500〜 1000 倍も毒性が強いため、生物化学兵器として最も使用され得る毒素であり、バイオテロへの使用が懸念されている。米国ナノテク国家戦略においても、バイオハザードセンサーの重要性が謳われているが、これまでのところ必ずしも十分な成果は得られておらず、国家レベルの研究が急務であった。

ことができた 1 〜 5）。

現在使われている代表的なリシン検出方法には遺伝子診

これらの研究開発で培ってきた「糖鎖の合成技術」6 〜 8）と断法や抗原抗体法などがある。しかし、専門家による判定「糖鎖を利用した毒素検出技術」を活用し、リシン検出技術が不可欠であり、また、検出感度や時間、操作性などに問の開発に取り組むこととした 9、10）。

題がある。抗原抗体法の場合、抗体は海外から輸入されるが、低温での保管、管理が必要であり、室温保管が可能であっても保証有効期限が短いなど問題がある。

糖鎖を利用した検出技術

リシンの感染機構と検知原理
タンパク質リシンは、分子量 32,000 の A−サブユニット（A−鎖）と分子量 34,000 の B−サブユニット（B−鎖）がジス結合で結合したものである。A−サブユニッ
ルフィド（S−S）

これまでわれわれは、大腸菌 O−157 が生産するベロ毒

トは、リボヌクレアーゼ活性（細胞内のリボ核酸（RNA）を素を糖鎖によって検出する技術を開発してきた。ベロ毒素

分解する力）を持ち、B−サブユニットは、細胞表層にあは腎臓細胞表面の糖鎖に結合して感染するが、この糖鎖をる糖鎖と結合して A- サブユニットを細胞内へ侵入させる。

模倣した「人工糖鎖」を独自に開発し、これにベロ毒素を結

この細胞表面の糖鎖は、末端にガラクトース、N−アセチ合させ、その微量の質量変化を水晶振動子によって測定すルガラクトサミンを持ったものである。

ることで、1 時間以内に致死量以下のベロ毒素を検出する

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写真 1 トウゴマ（ヒマ種子：Ricinus communis）
大きさ 約 1cm × 2cm

産 総 研 TODAY 2005-12

図 1 に感染機構を示した。リシンが細胞表層に近づくと、

トピックスT PICS
(a)

(b)

(c)

A-サブユニット
B-サブユニット
糖鎖

S

S

S

S

細胞の外側

SH

細胞膜
HS

細胞の内側

RNAを分解（リボトキシン作用）

図 1 リシンが細胞表層に結合するメカニズム（a）B- サブユニットが細胞表層の糖鎖に結合。
（b）A- サブユニットが細胞膜に貫通。
（c）両サブユニット間のジスルフィド結合が切断されて A- サブユニットが細胞内に侵入後、RNA を分解。

表層の糖鎖に B−サブユニットが結合する（図 1a）。つづい

毒素検知の感度が大きく低下してしまうことを見い出して。ここでて、A−サブユニットが細胞膜を貫通する（図 1b）いる。糖鎖による毒素検出技術の開発において糖鎖の固定両サブユニット間を結合していたジスルフィド（S−S）結合化法の選定は、糖鎖自体の設計・合成と同じくらい重要なが切断されて、A−サブユニットだけが細胞内へ侵入する課題である。したがって、これら 2 つの課題がそろっては（図 1c）。A−サブユニットは、リボヌクレアーゼ活性を持っじめて十分な検知感度を持つ毒素検知方法として利用できており、細胞のタンパク質合成装置であるリボソームのることになる。

RNA（リボ核酸）を加水分解し、細胞に必要なタンパク質

まず、2 種類のアンカー分子を用いた固定化法についての生合成をできなくする。その結果、生体は、致死性のダ検討した。芳香族アンカーを介してガラクトースを固定化メージを受ける。

する方法と脂肪族アンカーを介してガラクトースを金基板

われわれは、上記の感染機構を材料工学的に模倣したリに固定化する方法である。アンカー分子を介して糖鎖を金シン検知法を考案した。つまり、リシンが細胞表層の糖鎖基板に固定化後、基板上の糖鎖密度を X 線光電子分光法に結合するメカニズムを検知原理に用いて、毒素と結合し（XPS）により評価した。その結果、脂肪族型のアンカーは、やすい糖鎖を化学的に設計・合成してその毒素を感度よく芳香族型アンカーよりも高密度に固定化されていることが検知するシステムである。図 2 には、センサーチップの写わかった。脂肪族型のアンカー分子を用いる固定化法は、

真およびリシン検知の原理を示した。センサーチップの中芳香族型のアンカーによる固定化よりも、高感度検知には央には、金薄膜が蒸着してある。この部分を拡大したもの有利であると考えられる。

が、図2の右側である。7mm四方の金薄膜の表面に、アンカー分子を介して糖鎖が固定化してある。リシンは、センサー基板上の糖鎖をあたかも細胞表層の糖鎖と思い込み、そのリシン金薄膜表面に結合する。タンパク質であるリシン分子が結7mm合すると質量がごく微量増加するので、その変化を、表面ブラズモン共鳴（SPR）によりリアルタイムに測定すれば、糖鎖毒素の有無や、毒素の量がわかる。

糖鎖の分子設計・合成とリシン毒素検知用チップ
感染機構の項目でも述べたように、リシンはガラクトー
スなどを末端にもつ糖鎖と結合することが知られている。
そこでわれわれは、10 種類の新しい人工糖鎖を独自に設

アンカー7mm

金薄膜
センサーチップの写真
課題2

課題1
糖鎖の分子設計・合成＋糖鎖の固定化法の開発

計・合成し、リシン検知に有効な糖鎖の探索を行った。また、糖鎖を金薄膜へ固定する方法が異なると、目的とする

図 2 リシン検知用チップの模式図

産 総 研 TODAY 2005-1217

試料注入

1400

洗浄

1200

RU
1200

レスポンス
（RU）

脂肪族型

1000

応答800

Kaで1000倍の差！

600
400

1000

200

600

1200

1800

固定化法の違い400

0-2000糖鎖構造の違い

600

200

芳香族型

0800

2400

3000

3600

4200

4800

5400

時間

ガラクトース

合成2糖ガラクトース

合成2糖6000s

脂肪族型

芳香族型

図 3 ガラクトースを用いたときのリシン凝集素 [RCA120] に対するSPR レスポンス
固定化法により、結合定数に大きな差が生じた。

図 4 糖鎖構造と固定化法の違いによる SPR レスポンス
リシンを 50ng 注入した後の SPR レスポンスを示す

効果の検証

ロブリン、いくつかのマメ科植物由来のレクチン（糖鎖結リシンそのものは産総研内で取り扱うことは出来ないの合性タンパク質）などについて検討したところ（図 6）、先ので、モデルタンパク質としてリシン凝集素（RCA120：リシ

合成 2 糖には結合せず、いずれの妨害タンパク質にも反応ンが 2 つ結合したもの。リシンとほぼ同じ構造を持つためすることはなかった。このことは、ここで調べた妨害タンモデルとして使えるが、毒性はほとんどない。
）を用いて、パク質が混在していても、偽陽性を示すことはなく、リシ

上記 2 つの固定化法によってガラクトースを固定化したセンのみを特異的に検知できることを意味している。つまりンサーチップについて、SPR 解析を行なった。図 3 に示す

この方法は、リシンに対して特異性が高く、また、信頼性ように、両者の結合定数の差は 1000 倍にも達する。つまり、の高い検知技術であることが明らかとなった。

脂肪族型アンカーを用いることで、より高感度に対象のタンパク質（RCA120）を検知できた。このことから、脂肪族型アンカーを用いれば、猛毒リシンの高感度検知が達成できると予想された。

実用化と社会貢献
この糖鎖法は、一般の抗原抗体法の感度に比べて、40 〜4000 程度も高感度であり、分析に要する時間も 10 分程度

そこで、科学警察研究所において実際のリシンを用い、である。現行の抗体法などは、検出限界や判定時間、操作高感度検知に有効な糖鎖構造を探索した。解析の結果、分性などにおいて問題のある方法である。たとえば、抗体は子設計した 10 種類の合成糖鎖のうち、脂肪族をアンカー低温での管理が必要であり、また、室温保管が可能であっに有する「合成 2 糖」のみがリシンの高感度検知に有効であても保証有効期間が短いなどの課題がある。ここで紹介しることが明らかとなった（図 4）。同じ糖鎖を用いても、固た糖鎖法は、研究室に設置してある SPR 装置を用いて判定定化法が異なると十分な感度が得られないこともわかった（図 4）。また、図 4 に示すように明らかにガラクトース単独ではリシン検知の目的には適していない。このように、糖鎖の設計と固定化法が、リシンの高感度検知に重要であ

猛毒リシンる。合成 2 糖を用いると、SPR により致死量の 1 万分の 1 のの超高感度検出！

リシンを 10 分で検知できた（図 5）。
さらに、先に述べたようにガラクトース単独の糖鎖は、致死量の１万分の1を10分で検出（ＳＰＲ）

リシン毒素とは結合しないが、毒性のほとんどないリシン凝集素と結合するので、この凝集素の検出に利用できるこ

リシンとがわかった。すなわち、ガラクトースと合成 2 糖の 2 種結合！

リシン

毒素発見！

類の糖鎖を組み合わせて用いることで、猛毒のリシンと毒性の低いリシン凝集素両方の識別が可能になった。
次に、リシン以外のさまざまな妨害タンパク質を上記で糖鎖分子基板
糖鎖分子リシン検知チップ作成した糖鎖チップに作用させたときに、正確な判定結果が得られるかどうかを検討した。血清アルブミン、免疫グ

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産 総 研 TODAY 2005-12

図 5 本糖鎖法の検知原理と検出限界

基板

データ処理

T PICS「合成2糖」
ガラクトースResponse(RU)

2000

グルコース

1500

1000

500

ア
ル
ブ
ミン
グ
タロ
チブ
ナ
リ
タン
マ
メ
レ
ク
チン
大豆レ
ク
ピ
チーン
ナ
ッ
オ
ツ
サ
レ
ゲ
ク
オ
チレ
ン
ン
イ
ヌ
ジ
エ
レ
ク
ン
ジ
チ
ュン
マ
メ
レ
ク
サ
チル
ン
ビア
レ
ク
チン

リ
シン

0

図 6 さまざまなタンパク質に対するSPR レスポンス
合成 2 糖は、リシンにのみ高い特異性を示す。

する「ラボ向き」の検知法ではあるが、毒素検知の鍵となる

謝辞

糖鎖は、熱的、化学的に安定であり、常温で長期保存可能

本研究は、ハイテクものづくりプロジェクト「糖鎖を活用した有害蛋白、および、科学技術振興調整
質検出技術の実証」（平成 15 − 16 年度）費「化学剤・生物毒素の一斉現場検知法の開発」（平成 17 〜 19 年度）による成果を含んでいる。

であることから、取り扱いやすい検出方法といえる。
一方、糖鎖法は劣悪な環境でも機能することから、われ
われは、高温、高湿度といった過酷な現場での使用が可能な「簡易検出法」について予備的に検討した。詳細は省略す
るが、先述の合成 2 糖をナノ金粒子に固定化したところ、致死量の 1/3 程度の毒素をわずか 10 分で目視検知できた。

なお、リシンは、毒性が高いため、化学兵器の禁止及び特定物質の規制等に関する法律において特定物質に指定されており、その製造、所持、使用は禁止されている。本研究は、警察庁 科学警察研究所 瀬戸康雄室長との共同研究の成果である。本研究で実際のリシンを用いる実験は、科学警察研究所において十分な管理下で行われた。また、本研究は、当所の箕浦憲彦博士、大賀幸二博士とともに行ったものである。

この方法は、いつでも、どこでも、簡便で迅速にリシンを判定できるので、「現場向き」の判定方法として期待できる。
ここで紹介した検知技術は、白い粉がリシンかどうかを高感度に迅速に判定する技術であり、1次スクリーニング法としての利用が期待される。高感度で簡便であるだけでな
く、さまざまな妨害タンパク質とは反応せず、リシンのみを選択的に検知できるメリットを持っているので、最終的な確定検査を行うコストを大幅に節約できる。警察、消防、・関連情報● 1) プレス発表 2001 年 7 月 3 日：http://www.aist.go.jp/aist̲j/press̲release/pr2001/pr20010703/pr20010703.html● 2) 朝日新聞、読売新聞、毎日新聞、日本経済新聞、NHK ニュースで報道 (H13.7.4).
● 3) 鵜沢浩隆、AIST Today 9, 8 (2001).
● 4)H. Uzawa, et al., Biomacromolecules, 3, 411-414 (2002).
● 5)H. Uzawa, et al., Tetrahedron, 61, 5895-5905 (2005).

機動隊などの公的機関に配備されることになれば、安心・● 6)H. Uzawa, et al., Carbohydr. Res., 339, 1597-1602 (2004).

安全な社会の構築に大きく貢献できるものと確信している。

● 7)H. Uzawa, et al., Chem. Comm., 100-101 (2003).
● 8)H. Uzawa, et al., ChemBioChem - A European Journal ofChemical Biology, 4, 640-647 (2003).
● 9) プレス発表 2005 年 9 月 28 日：http://www.aist.go.jp/aist̲j/press̲release/pr2005/pr20050928/pr20050928.html● 10) 日本経済新聞、東京新聞、茨城新聞、日刊工業新聞 ( 以上
H17.9.29)、読売新聞 (H17.10.25)、科学新聞 (H17.10.14)
等で報道。
● 問い合わせ先
独立行政法人 産業技術総合研究所
バイオニクス研究センター 糖鎖系情報分子チーム
研究チーム長鵜沢 浩隆
E-mail: h.uzawa@aist.go.jp〒 305-8565 茨城県つくば市東 1-1-1 中央第 5

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