最近の研究から

X 線自由電子レーザーを用いた生きた細胞のナノイメージング

北海道大学 電子科学研究所
西野 吉則、木村 隆志
公益財団法人高輝度光科学研究センター
XFEL 利用研究推進室
城地 保昌
台湾中央研究院 物理研究所
別所 義隆
Abstract
SACLA が発生する極めて短い発光時間のコヒーレント X 線を利用して、生きた細胞を、放射線損傷なく、ナノイメージングすることに成功した。実験ではパルス状コヒーレント X 線溶液散乱（PCXSS）法と名付けた独自構築したコヒーレント X 線イメージング手法を用いた。PCXSS 法では、溶液試料を独自開発したマイクロ液体封入アレイ（MLEA）チップ中に、環境を制御して保持する。SACLA を用いた生きた細胞の PCXSS 測定により、高密度の DNA の存在を示唆する内部構造などが定量的にイメージングされた。
PCXSS 法は生物試料のみならず、溶液中で機能する物質材料のナノレベル観察にも極めて有効である。
1. はじめに回折顕微法とも呼ばれ、SPring-8 などの第 3 世代の生物試料に対する電子顕微鏡や X 線顕微鏡によ放射光を用いて発展してきた［2-5］。CDI では、対物る高分解能イメージングにおいては、放射線照射にレンズを用いず、測定したコヒーレント回折パターよる試料損傷が、空間分解能を制限する要因としてンから計算機を用いて試料像を得る。回折現象を利大きな問題となってきた。放射線損傷を低減するた用するが、従来の結晶構造解析とは異なり、結晶以めに、これまで、試料を極低温に保つ対策が広く行外の試料もイメージングできるのが特徴である。

われてきた。X 線自由電子レーザー（XFEL）の発CDI と XFEL を組み合わせることにより、生物秒）オーダー試料を放射線損傷なく、高い画像コントラストでと、試料の放射線損傷が顕著に起こる時間スケールナノイメージングできる。我々は世界に先駆けて、よりも短い。このため、従来技術では不可能であっXFEL の新たな可能性を示す、生きた細胞のナノイた、放射線損傷のない測定が可能となる 。すなわ

メージング実験に成功した［6］。

光時間（パルス幅）は、フェムト秒（10-15［1］ち、XFEL は、試料を時間的に「凍らせる」ことにより、放射線損傷の問題を根源的に解決する道を切り拓いたのである。

2. パルス状コヒーレント X 線溶液散乱（PCXSS）

我々は、XFEL 回折を用いて生物試料などを溶

生物試料のイメージングでは、画像コントラスト液中の自然に近い状態で高分解能イメージングで（内部構造の見やすさ）も重要な要素である。細胞きるパルス状コヒーレント X 線溶液散乱（PCXSS:などの生物試料の観察では、しばしば、試料を重金

Pulsed Coherent X-ray Solution Scattering）法の属などで染色して画像コントラストを人為的に高め「パッ構築を進めている［6,7］。ちなみに、PCXSS は、ることが行われている。しかし、この方法では、染クス」と発音する。図 1 に PCXSS の概念図を示す。

色した特定の構造は画像コントラストが強調されてPCXSS では、マイクロ液体封入アレイ（MLEA:見えるが、それ以外の構造を見ることは困難である。

Micro-Liquid Enclosure Array）という独自開発しまた、染色が生物試料の構造に影響を与えることもた微小サイズの溶液槽の中に、自然に近い状態で試しばしばである。

料を保持する。図 2(a) に、我々が開発した MLEA細胞などの生物試料を高い画像コントラストで観チップを示す。MLEA チップでは、2 枚の窒化ケイ察できるコヒーレント回折イメージング（CDI）は、素薄膜の間に溶液試料をサンドイッチして、溶液試
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FROM LATEST RESEARCH

図1

パルス状 X 線溶液散乱（PCXSS）の概念図

料を真空から隔てる。MLEA チップの窒化ケイ素薄

牛乳中に生息する熱に強いサブミクロンサイズのグ膜は、XFEL のシングルショットで壊れてしまうた

ラム陽性菌を用いた。耐熱菌による生乳の汚染は農め、多数のマイクロ液体封入セルを 2 次元配置する。

業において大きな問題となるが、サブミクロンサイ
ズの M. lacticum は、光学顕微鏡での観察は困難な

MLEA チップは、北海道大学オープンファシリティを用いたフォトリソグラフィーにより作製した。
XFEL を用いた CDI 測定では、飛翔した試料ビーため、細胞生物学的な知見はほとんど得られていない。

ムを用いる研究グループも存在するが、その場合、我々は、PCXSS 実験に先立ち、MLEA チップにXFEL のパルスとパルスの間に反応領域を通過した生細胞を封入し長時間保持できることを、蛍光顕微

試料は、測定に用いられず無駄になる。これに対鏡を用いて確認した。細胞の生死を確かめることのできる蛍光試薬を用いて M. lacticum 細胞を観察しして、MLEA チップを用いると、XFEL のシングルショット当たりに必要な試料の量は、XFEL の繰りた結果を図 2(b)、(c) に示す。この蛍光試薬を用い返し周波数に依らないため、微量な溶液試料を有効ると、生細胞は緑色に発光し、死細胞は赤色に発光に測定に用いることができる。また、飛翔した試料する。MLEA チップに生細胞を封入後に、チップ

では、試料環境の制御も困難である。
我々の実験では、Microbacterium lacticum という、を真空中に置き、1 時間後に観察しても、99％ 以上

図2の細胞が生きていることを確認した。これにより、

MLEA チップへの生細胞封入実験

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最近の研究から

MLEA チップが、XFEL を用いた生細胞イメージン

成は、Shrink-Wrap、Relaxed Averaged Alternating

グにおける試料保持に必要な性能を有することが示

Reflections（RAAR）アルゴリズムや Noise-Tolerantされた。

Hybrid Input-Output（HIO）アルゴリズムを用いて行った。図 4 に再 構成した M. lacticum 細胞の像を示す。

3. PCXSS 法による生細胞ナノイメージング

PCXSS 実験は、SACLA の BL3 において行った。

光子エネルギー 5.5 keV の XFEL を、K−B ミラー（1

再構成像は幅およそ194 nm、長さおよそ570 nm のロッド形状で、典型的な M. lacticum 細胞のサイズや形状と一致する。位相回復伝達関数（PRTF: Phaseµm コヒーレント集光装置）を用いて 1.5 µm × 2.0Retrieval Transfer Function）を用いて評 価した、µm（半値全幅）のスポットサイズに集光し、汎用再構成像の全周期分解能は干渉縞方向でおよそ37コヒーレントイメージング装置（MAXIC: Multiplenm である。

Application X-ray Imaging Chamber）内に設置し再構成像において、細胞全体に亘って不均一な内部た MLEA チップ中の溶液試料に照射した。MAXIC構造が観察された。細胞下部のイメージ強度が高い内には、上流の光学系からの寄生散乱を除去するた部分はダンベル型をしている。このイメージ強度が高め、試料上流に 2 段の 4 象限スリットを設置した。

い部分には電子密度の高い DNA などの物質が存在す

さらに、我々の実験により、20 µm 程の開口を持ることが示唆される。実際に、細胞の上部がタンパク

つ MLEA チップの個々のマイクロ液体封入セルが、質で構成され、細胞の下部が核酸で構成されていると試料位置でのガードスリットの役割を果たし、上流単純に仮定し計算すると、それぞれの部分のイメージの光学系からの寄生散乱を低減する事が示された。

強度の差をほぼ説明することができる。

図 3 に XFEL のシングルショットで測定した、放射線損傷のない生きた M. lacticum 細胞のコヒーレ
ント X 線回折パターンを示す。測定では、試料の下流 2.319 m に設置した MultiPort Charge-CoupledDevice（MPCCD）のオクタルセンサーを用いた。
測定したコヒーレント X 線回折パターンには、明瞭な干渉縞が 1 方向に延びている。干渉縞の間隔から、試料の幅が 194 nm であることが分かる。また、干渉縞の最大散乱角から、全周期分解能は 28 nmと見積もられる。
コヒーレント X 線回折パターンからの試料像再構
図4

XFEL で観察した生きた M. lacticum 細胞

4. まとめ我々の研究により、PCXSS 法が、生きた細胞内部の自然な構造を、重金属等による染色の必要なく、ナノスケールで明らかにできる能力を持つことが示された。現在、細胞の複数のスナップショット像からダイナミクス情報を得るべく、科研費基盤（S）の研究を推進している。また、今後 XFEL のパルス当たりのフルエンスが飛躍的に増大すれば、PCXSS
図3

生 き た M. lacticum 細 胞 に XFEL を 1 パ ル ス
当てた際のコヒーレント X 線回折パターン

法は溶液中の生体分子のイメージングにも適用できる。重要なテーマとして、結晶化が難しい生体超分子複合体や天然変性タンパク質などのイメージング
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FROM LATEST RESEARCHが挙げられる。
PCXSS 法は、生物試料のみならず、溶液中でのみ構造を保ち、機能を発揮できる物質材料のナノレベル観察にも大きな可能性がある。PCXSS 法の物(2012) 670-678.
［ 8 ］R. Iida, H. Kawamura, K. Niikura, T. Kimura, S.

Sekiguchi, Y. Joti, Y. Bessho, H. Mitomo, Y. Nishino
and K. Ijiro: Langmuir 31 (2015) 4054-4062.

質科学への応用に関して、我々は、産業応用も含め、様々なグループとの共同研究を推進している［8］。
謝辞

本研究は、国立研究開発法人理化学研究所の石川哲也センター長、矢橋牧名グループディレクター、Changyong Song チ ー ム リ ー ダ ー、Sangsoo Kim
博士、（公財）高輝度光科学研究センターの登野健介チームリーダー、共和化工株式会社環境微生物学研究所の大島泰郎所長、森屋利幸博士、東京薬科大学の玉腰雅忠准教授との共同研究である。
PCXSS 測 定 は、SACLA 課 題 番 号2012A8034、2012B8039、2013A8046 で行った。PCXSS 測定における、SACLA スタッフの支援に感謝する。MLEAチップ作製における、文部科学省ナノテクノロジープラットフォーム事業の支援に感謝する。MLEA 組
み立てジグは、北海道大学電子科学研究所技術部と共同で開発した。
本研究は、外部資金として、文部科学省 X 線自由電子レーザー重点戦略研究課題、JST CREST、科研費、物質・デバイス領域共同研究拠点等の支援を受けて実施した。

参考文献［ 1］R. Neutze, R. Wouts, D. van der Spoel, E. Weckert
and J. Hajdu: Nature 406 (2000) 752-757.
［ 2 ］J. Miao, P. Charalambous, J. Kirz and D. Sayre:
Nature 400 (1999) 342-344.

［ 3］西野吉則、石川哲也：放射光 19 (2006) 3-14.
［ 4 ］J. Miao, K. O. Hodgson, T. Ishikawa, C. A. Larabell, M.
A. LeGros and Y. Nishino: Proc. Natl Acad. Sci. USA100 (2003) 110-112.
［ 5］Y. Nishino, Y. Takahashi, N. Imamoto, T. Ishikawa
and K. Maeshima: Phys. Rev. Lett. 102 (2009) 018101.
6［ ］T. Kimura, Y. Joti, A. Shibuya, C. Song, S. Kim,
K. Tono, M. Yabashi, M. Tamakoshi, T. Moriya, T.
Oshima, T. Ishikawa, Y. Bessho and Y. Nishino: Nat.
Commun. 5 (2014) 3052.
［ 7］J. Pérez and Y. Nishino: Curr. Opin. Struct. Biol. 22

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西野 吉則 NISHINO Yoshinori
北海道大学 電子科学研究所〒001-0021 北海道札幌市北区北21 条西10 丁目
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e-mail : yoshinori.nishino@es.hokudai.ac.jp

木村 隆志 KIMURA Takashi
北海道大学 電子科学研究所〒001-0021 北海道札幌市北区北21 条西10 丁目
TEL : 011-706-9342
e-mail : takashi.kimura@es.hokudai.ac.jp

城地 保昌 JOTI Yasumasa（公財）高輝度光科学研究センター XFEL 利用研究推進室〒679-5198 兵庫県佐用郡佐用町光都1-1-1
TEL : 0791-58-0992
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別所 義隆 BESSHO Yoshitaka
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