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アオコの有毒物質を探る
構造解析と分析法の開発

APRIL 2014

アオコが作る有毒物質が世界中で問題となっています︒
アオコの有毒物質の化学構造解析や簡便で迅速な高精度分析手法の開発など︑
有毒アオコ問題に化学の目で挑戦しています︒

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52 APRIL 2014

「21 世紀は水不足の世紀」と言われています。 貴重な水資源である湖沼では富栄養化が進行し、アオコの発生による水質低下が危惧されています。 日本では、
アオコは、池や湖の水質低下を引き起こすことで知られていますが、世界的には、アオコの中に含まれる有毒物質が引き起こす家畜やヒトの健康被害が問題になっています。アオコ由来の有毒物質にはさまざまな種類があり、種類によって性質や強さも異なることがわかっています。 そこで、アオコの有毒物質によるリスクを評価するには、アオコの中にどのような化学構
造を持つ有毒物質が含まれているかを解析するとともに、それらがどの位の量含まれているのかを高い精度で分析する手法の開発が必要です。
国立環境研究所では、アオコの有毒物質の化学構造解析を進めるとともに、精度の高い分析手法を開発しています。
本号では、複雑な構造を持つアオコの有毒物質の構造解析と新しい分析手法の開発の歩みと意義について紹介します。

アオコの有毒物質を探る
構造解析と分析法の開発● Interview 研究者に聞く

世界に先がけ、アオコ有毒物質のp4 ～ 9
分析法を開発● Summary

アオコの有毒物質の化学─構造解析と高精度分析手法の開発─

p 10 ～ 11● 研究をめぐって有毒アオコをめぐる研究の動向

p 12 ～ 13● 国立環境研究所における「アオコの有毒物質に関する研究」
p 14
のあゆみ
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nterview

研究者に聞く
国立環境研究所では、アオコなど微細藻類が作る有毒物質の構造の解析や分析法の開発を行っています。
この研究に取り組んでいる環境計測研究センター環境
計測化学研究室主任研究員の佐野友春さんに、研究の取り組みと成果についてうかがいました。

佐野友春 / 環境計測研究センター
環境計測化学研究室 主任研究員

世界に先がけ、
アオコ有毒物質の分析法を開発
有毒物質を作るアオコ

ランクトンが大量発生する現象です。一方、アオコは池や湖沼などの淡水でしか起こりません。都市化が進4

Q：アオコとは何ですか。

んだり、産業活動が発展したりして、排水に含まれる

佐野：夏の日に池や湖の水面が緑色の粉をまいたよう

窒素やリンなどが池や湖に大量に流れ込んで、富栄養に見えることがあります。あの現象が「アオコ」です。

化したことが原因です。アオコが腐敗すると悪臭が発藍藻（シアノバクテリア）という植物プランクトンが生しますし、大量の酸素を消費するために、魚類が酸大量に発生したものです（図 1）。
「水の華」と呼ばれる欠状態になって大量死を招くことがあります。

こともあります。

Q：アオコに毒があるのですか。

Q：水の華とは、おもしろいですね。

佐野：藍藻にはたくさんの種類がありますが、その中

佐野：水面の色を変えてしまうほどだからでしょうには肝臓や神経に対する毒性をもつものがあります。

ね。赤潮とよく似ていますが、赤潮は主に海で植物プ

その有毒物質が自然の生態系や人の健康に深刻な影響う。そのためにもアオコの有毒物質についての研究を進める必要があります。

Q：どんな毒が知られていますか。
佐野：肝臓毒では「ミクロシスチン」や「シリンドロス
パーモプシン」、神経毒では「アナトキシン」や「サキシトキシン」などがよく知られています（図 1）。中でも私たちが注目し、研究を進めているのが「ミクロシスチン」です（図 2）。

Q：ミクロシスチンとはどんな物質ですか。
アオコが発生した湖

佐野：ミクロキスティス属などに分類される藍藻が作る肝臓毒で、100 種類以上の同族体が知られています。同族体は、一つの一般式で示すことができ、化学を及ぼすことがあるんですよ。アオコが発生すると、的性質が互いに類似した一連の有機化合物のことをい地域の飲料水の供給が滞ることもあります。有効な水います。ときに構造はよく似ていながらも、作用が大資源の減少にもつながる深刻な問題です。それに加え

きく違うことがあります。先のブラジルの事故の原因て、有毒なアオコが問題になっています。

もミクロシスチンでした。

Q：過去に有毒なアオコで事故などが起こったことは

Q：毒は規制されているのですか。

あるのですか。

佐野：1998 年には WHO から有毒アオコや有毒物質

佐野：1920 年代から世界中で問題になっており、国に関する報告がなされて、暫定的な規制値として飲料

内外で野鳥や家畜に被害があった例が多数報告されて水中のミクロシスチンの濃度を 1µg/L 以下にするよいます。1996 年にはブラジルで、アオコが発生する

うに勧告しています。日本でも環境基準の要調査項目

水源を利用していた病院で 50 名以上の透析患者が亡や水道法の要検討項目に指定されていて、健康被害をくなるという不幸な事故がありました。原因を詳しく抑制するために感度や精度の高いミクロシスチンの分調べてみると、水源に有毒な藍藻が発生していました。

析法の開発が求められています。

さらに、水が十分に浄化されていなかったようです。
そのため、アオコの毒が透析に用いる水に混入したの新しいミクロシスチンを発見です。幸い日本では、人への目立った健康被害は報告されていませんが、いろいろなところで富栄養化が進

Q：ミクロシスチンにはそんなにたくさんの種類があんでいますから、これからも問題となり続けるでしょるのですか。

■ 図 1 アオコをつくる藍藻類と有毒物質
アオコとは、藍藻（シアノバクテリア）と呼ばれる植物
プランクトンが富栄養化した湖沼などで異常に増殖し、水面に集積したもので「水の華」とも呼ばれます。アオ
コを形成する主な藍藻として、ミクロキスティス属、ア
ナベナ属、プランクトスリックス属、アファニゾメノン属、
シリンドロスパーモプシス属等が知られています。
アオコは見た目が悪いだけでなく、腐ったときに悪臭を放つとともに、魚類の大量死を引き起こしたりします。
また、アオコを形成する藍藻の中には有毒な種類も知られていて、いろいろな化学構造の有毒物質を作っています。主な有毒物質はミクロシスチン、シリンドロス
パーモプシン、アナトキシン -a、サキシトキシンなどですが、これらの毒性は青酸カリよりもずっと強く、1/10
から 1/200 程度の量で致死毒性を示すことが知られています。 1 種類の藍藻が多種類の有毒物質をつくったり、1 種類の有毒物質を様々な藍藻類が作っていることが知られています。

5佐野：そうなのです。私がミクロシスチンの構造解析を始めた 20 年ほど前で、すでに 70 種類以上のミク
ロシスチンが報告されていました。ですから、もう新
しい種類はみつからないだろうと思われていました。
そのころ、ミクロシスチンの構造を解析する方法として、高速液体クロマトグラフ - タンデム型質量分析計（LC-MS/MS）を使って解析することが主流となりつつありました。この方法ならば、少量の試料で高感度に解析できるからです。ところが、当時の研究室には、
まだその装置がありませんでした。そのため、私たちは、藍藻からミクロシスチンの成分を取り出して、分離精製後、核磁気共鳴装置（NMR）で構造を解析するという従来の方法を使って解析することにしました。

サンプリング

Q：新しいミクロシスチンを見つけることはできましたか。

体（例えばミクロシスチン -LR）と比べると、マウス

佐野：はい。NMR での分析では、有毒物質を作る藍に対する毒性は若干弱いです。しかし、肝細胞に対す藻を 1000 リットル以上培養しなければならないときる毒性を指標として比較すると、Dhb- ミクロシスチもあり苦労しました。おかげで NMR を使わないと他

ン類はミクロシスチン -LR よりも毒性が強いというと区別が難しい新しいミクロシスチンを見つけること

結果が出ています（表 1）。Dhb- ミクロシスチンは代ができました。Dhb- ミクロシスチンと名付けたもの

謝されにくいので、生物の体内に入ると長期間毒性をで、ミクロシスチンの構造の中でわずかに官能基の位示す可能性があり、発ガン物質となるのではないかと

置が違うものです。NMR を使わなければ、わずかな危惧しています。

構造の違いは見分けられなかったでしょう。Dhb- ミ

Q：ミクロシスチンの中には無毒のものもあるのです

クロシスチンは NMR で分析したからこそ見つかったか。

と思っています。今報告されている 11 種類の Dhb-

佐野：無毒の種類もあります。また、ミクロシスチン

ミクロシスチンのうち 9 種類は私たちが構造を決めたは紫外線が当たると無毒な [6-（Z）-Adda5] ミクロシ

ものです（図 3）。

スチンに変わることが知られています。このミクロシ

Q：見つかったミクロシスチンの毒性は強いのです

スチンは、湖沼でアオコを採集してくると、10% 程か。

度含まれています。さらに、[6-（Z）-Adda5] 体以外

佐野：ミクロシスチンの中で毒性が強いとされる同族にも、無毒なトリシクロ体が生成することを見つけて■ 図 2 ミクロシスチンの構造
ミクロシスチンは 7 つのアミノ酸からなる環状ペプチドで、一般構造式は Cyclo-[D-Ala-L-X-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-GluMDha] で表されます。 2 番目と 4 番目の L型のアミノ酸を 1 文字表記で表し、2 番目がロイシン（L）、4 番 目がアル ギニン（R）のものは、ミクロシスチン -LR と呼ばれます。 また、この 一 般 構 造 式とは異 なるア
ミノ酸残基を持つものは、その残基とアミノ酸の位置がわかるように、例えば 3 番目の D-MeAsp が D-Asp になったミクロシ
スチン−LR は、[D-Asp3] ミクロシスチン-LR のように表します。ミクロシスチンには、2 番目と 4 番目の L- 型アミノ酸の組み合わせが異なる同族体や 3、5、7 番目のアミノ酸残基のメチル基が少ない同族体など、100 種類以上の同族体が報告されています。

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ロシスチンの毒性を評価する生物学的な方法もあります（表 3）。
生物学的な方法では、試料中に含まれているすべての
ミクロシスチンを総量として分析できますが、精度はあまりよくありません。

Q：それで新たな分析法を開発したのですね。
佐野：そうなんです。MMPB 法という試料中のすべてのミクロシスチンを分析する方法を開発しました（図 4）。

Q：どのように分析するのですか。
アオコの培養佐野：すべてのミクロシスチンに共通する部分構造に着目し、その部分（MMPB）を化学的に分析します（図4）。この方法では、100 種類以上あるミクロシスチ
います。

ンの総量を一つの化合物を測定することで分析できるのです。効率よく測定できるとてもよい方法だと思っアオコの毒を分析するています。

Q：MMPB 法はどんな特徴があるのですか。
Q：なぜ水の中のアオコの有毒物質ミクロシスチンを佐野：MMPB 法では、生体成分と結合したミクロシ分析するのでしょうか。

スチンも測定できるのが特徴です。そのため、生物試

佐野：健康被害を防ぐためです。まず飲料水源や飲料料中のミクロシスチンの測定にも使われています。

水中のミクロシスチン量を分析することが必要とされ

Q：どんな時に生物試料を測定するのでしょうか。

ました。そのため、二つの方法が検討されました。一

佐野：たとえば、動物がミクロシスチンを含む水を飲つは、危険性の目安としてミクロシスチンの総量を分んで、筋肉や内臓中にミクロシスチンが蓄積すること析する方法で、もう一つは毒性を正しく評価するためがあります。そんな時に筋肉や内臓にどれくらいのにたくさんある同族体を個別に分析する方法です。

量のミクロシスチンが蓄積したのかを測定するのに

Q：ミクロシスチンの総量の分析はどうやって行うのでしょうか。

MMPB 法はよい方法なのです。生物試料中のミクロ
シスチンの測定では、MMPB 法が世界中で使われて佐野：分析機器を使って毒を解析する化学的な方法もいます。

あれば、マウスや細胞・酵素・抗体などを使ってミク■ 表 1 ミクロシスチン同族体の相対細胞毒性
ミクロシスチン同族体の初代培養肝細胞に対する細胞毒性の強さをミクロシスチン -LR（10）を 1 として評価しました。 表の上の相対LC50（半数致死濃度）の値が小さい同族体ほど細胞毒性が強いことを表しています。ミクロ
シスチン同族体の構造により、毒性の強さにかなり差があることがわかりました。私たちが発見した Dhb- ミクロシスチン類（1、2、3、4）は、肝臓の細胞に対する細胞毒性がミクロシスチン− LR（10）より強いという結果になっています。
また、Dhb- ミクロシスチンでは 7 位の Dhb 残基が Z 型の配置を取っているもの（1、2）が細胞毒性は強いことがわかりました。
一 方、2 番 目と 4 番 目 の アミノ酸 が ア ル ギ
ニンのミクロシスチン -RR（16）とその類縁体（12、13、14、15）は比較的細胞毒性が弱いこ
LC50：半数致死濃度とがわかりました。

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ミクロシスチン分析法を開発
Q：かなり広く使われるようになったのですね。
佐野：そうですね。今では、環境省の要調査項目の測定にも使われています。
なるべくたくさんのところで、

MMPB 法を使ってほしいのですが、開発してしばら
くはなかなか使ってもらえませんでした。

Q：どうして MMPB 法が使われるようになったのですか。
佐野：2002 年に ISO（国際標準化機構）でミクロシス

NMR

チン分析の国際比較実験を行ったのですが、測定結果にずいぶんばらつきがありました。そこで、ミクロシ

MS で分析しています。

スチン分析の精度を管理するための環境標準物質を開Q：他にどんな分析法を開発しましたか。

発しました（図 6）。測定する人がみんな使える標準物

佐野：これまで開発してきた方法は、高額な分析機器

質があれば、精度を管理でき、測定値のばらつきが少や専門的な知識を必要とします。アオコの問題は世界なくなり、測定の信頼度も増します。そうすればみん中で起こっていますから、だれでも分析できる簡便ななが MMPB 法を使ってくれると考えたのです。

方法を開発しなければならないと考えました。という

Q：それはどうすれば手に入るのですか。

のは、途上国の研究者に「高価な機器を買えない私た

佐野：研究所のホームページで購入方法をご案内して

ちは、ミクロシスチンを分析できずにその毒で死んでいます。これは標準物質の成分の分析をきっちりとしまうの？」と言われたことがきっかけです。

行ったもので、ミクロシスチンの含有量の保証をしてQ：それで新しい分析法を開発したのですか。

います。

佐野：グルタチオン付加法という簡単にミクロシスチ

Q：開発で苦労したことは何ですか。

ンを測定できる方法を開発しました（図 5）。これは、

佐野：MMPB 法の開発当初は、分析した毒の量を決

グルタチオンという物質を利用して、ミクロシスチン

めるための標準品が市販されていませんでした。そを発色させて検出する方法です。高額な分析機器を必のため、自分たちで標準品や安定同位体（重水素）標

要としないで分析することができます。ただし、この識化合物（MMPB-d3）の合成を行ったことです。今

方法は Dhb- ミクロシスチン類や [MSer7] ミクロシス

では MMPB の標準品や MMPB-d3 が試薬として市販

チン類の分析には使えません。

されていて、切り出した MMPB をそのまま LC-MS/

■表 2

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一般的な機器分析手法と特徴

佐野：シリンドロスパーモプシンと呼ばれる肝臓毒についても注目しています。ミクロシスチンに次いで高頻度に検出される有毒物質です。熱帯や亜熱帯域で検出されていたのですが、最近、石垣島で類縁体が見つかりました。今後は、それらが北上する可能性があります。そのため、日本でも監視が必要となるでしょう。
欧米でも問題となっていて、近く WHO で基準値が設定される動きもあるので、監視のための正確な分析法が必要です。そのために、シリンドロスパーモプシン

LC-MS/MSについても窒素の安定同位体（15N）が入ったものを培養で作り、高精度な分析手法を開発しています。

ミクロシスチンを個別に測定

世界標準をめざす

Q：ミクロシスチンを個別に分析する方法はどうやって行うのでしょうか。

Q：開発中の分析法が世界で使われるようになるとい

佐野：WHO が設けているミクロシスチンの暫定基準いですね。

は、ミクロシスチン -LR の値ですし、日本の上水試

佐野：その通りです。これまで私たちはいろいろな方

験法も同族体（ミクロシスチン -LR, YR, RR）の個別法や標準物質を開発してきました。将来、私たちが開分析です。そうなるとやはり個別でミクロシスチンを発した分析法を世界標準や公定法にすることをめざし分析する必要があります。従来から LC-MS/MS で分ています。そのためには、精度がよいことはもちろん析する方法がありましたが、精度がよくありませんのこと、繰り返し測定しても苦にならず、だれでも使でした。そこで、窒素の安定同位体（15N）が入ったミ

いやすい方法にすることが必要だと思っています。

クロシスチンを作り、それを使ってミクロシスチン

Q：アオコの毒もまだみつかりそうですか。

-LR、-RR、-YR を高精度で分析する手法を開発しま

佐野：アオコの有毒物質には未知のものがまだたくさした。今では、安定同位体で標識したミクロシスチンんあります。これからも新しいものを見つけたいですも市販されているので、いずれこの分析手法が世界標ね。そうして、見つけた新しい有毒物質が、アオコの準になることを期待しています。

毒性のメカニズムの解明や新薬の開発につながること

Q：アオコの有毒物質で、ミクロシスチン以外にも注を期待しています。

目しているものはありますか。

■ 表 3 ミクロシスチン分析手法の比較
主なミクロシスチン分析手法について WHOの暫定基準値である 1µg/L 程度のミクロシスチ
ンを測定する場合を想定して比較してみました。
個別分析法では、LC-MS/MS 法が感度・精度・選択性・迅速性すべてで優れていますが、分析機器が高額です。NMR は感度が低いので、低濃度の分析は現実的ではありません。
総量分析法では、ELISA 法は感度は高いのですが精度が高くなく、キットも高額です。グル
タチオン付加 - 発色法は精度は良くないですがコストが安く、高額な機器を必要としないことから、開発途上国でも使いやすい分析法と思われます。

LC-PDA：高速液体クロマトグラフ−フォトダイオードアレイ検出器；
TLC：薄層クロマトグラフィー；ELISA：酵素結合免疫吸着法 ; PP2A：蛋白質脱リン酸化酵素（測定値のばらつきが小さいと精度が高い、微量で測定できると感度が高い、同族体を区別できると選択性が高いと表示しています）

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Summary

アオコの有毒物質の化学─構造解析と高精度分析手法の開発─

アオコを形成する藍藻類の中には有毒物質を産生する種類があり、様々な構造を持つ有毒物質が報告されています。
研究所ではアオコが産生する有毒物質による健康被害を抑制するために、アオコが産生する有毒物質の構造を解析するとともに、簡便・迅速で精度の高い分析手法の開発を行ってきました。

アオコが産生する有毒物質の構造解析した。また、Dhb- ミクロシスチンはグルタチオン抱合による解毒を受けにくいことが知られていて、発が有毒物質の性質を理解するためには、まずその化学ん物質である可能性も指摘されています。現在までに構造を知ることが大切です。アオコが産生する有毒物質であるミクロシスチンの構造は 1980 年代中頃に決11 種類の Dhb- ミクロシスチン類が報告されていますが、研究所ではそのうちの 9 種類についてその構造を定されました。その後、ノーベル化学賞も受賞した 2

決定・報告してきました。

次元核磁気共鳴（NMR）を含む化学分析の進歩によりミクロシスチン以外では、1993 年には魚毒性を示

1990 年代初めころには 70 種類以上のミクロシスチン

すチオンスルフォリピドの単離・構造解析、2011 年に同族体の構造が決定されていました。

は筑波大学の彼谷教授のグループと共同で環境ホルモ研究所でも 1990 年代からアオコが産生する有毒物
質について研究を行っていて、一つの藍藻株についてン作用が疑われている 7- ヒドロキシレチノイン酸の単離・構造決定も行っています。

数百リットル培養しては有毒物質を抽出・精製し、構造解析をしてきました。1995 年にはスコットランドの
株保存施設から預かった藍藻株の中から、新しいタイ

アオコが産生する有毒物質の毒性評価手法の開発

プのミクロシスチン類を見つけることができ、Dhb- ミ
クロシスチンと命名しました（図 3）。Dhb- ミクロシス

有毒物質は構造とともにその毒性（強さ、作用機序）

チン類は NMR スペクトルでは特徴的なパターンを示

に関する研究も大切です。ミクロシスチンは哺乳類でしますが、当時一般的に行われていた質量分析によるは肝臓に特異的に取り込まれ、急性肝炎を起こすこと

解析では区別が難しく、発見が遅れたものと思われまが知られていて、ミクロシスチンの毒性はマウスに注す。さらに、Dhb- ミクロシスチンの中には NMR でし

射して調べられていました。

か区別できない幾何異性体の同族体も存在していて、しかし動物実験を行うことが難しくなってきたこと

NMR による解析が重要であることを認識させられまから、培養細胞を使った毒性試験法の開発を試みまし■図 3

Dhb ミクロシスチンの発見

ミクロシスチンを構成する 7 番目のアミノ酸残基がデヒドロアラ
ニン（Dha）からデヒドロブチリン（Dhb）に変わったミクロシス
チンの総称。 1995 年に Dhb- ミクロシスチン− RR の構造を世界に先駆け報告し、Dhb- ミクロシスチンと命名しました。 Dhbミクロシスチンの Dhb 残基には幾何異性体（E と Z）が存在していて、核磁気共鳴スペクトル（NMR）以外では識別が困難です。
上段の図（[Dha7]microcystin-LR）では赤い矢印部分に鋭いシグナルが 2 本見られますが、 中段の図（[D-Asp3,(E)-Dhb7]

microcystin-LR）では一組の 4 重線が 5.7ppm 付近に見られます。下段の図（[D-Asp3,(Z)-Dhb7] microcystin-LR）では一組の 4 重線が 6.4ppm 付近に見られます。このように NMR ス
ペクトルでは Dhb- ミクロシスチンは 6ppm 付近に特徴的な 4 重線のシグナルが現れるので、容易に区別することができますが、質量分析では同じ質量数の同族体、特に [D-Asp3] ミクロシスチ
ン類との区別が困難です。

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た。1996 年には、電気刺激により細胞膜に穴を開ける手法として、世界中で利用されています。

て強制的に細胞に取り込ませるエレクトロポレーショ

MMPB 法はミクロシスチン総量を測定する手法でンという手法により、本来はミクロシスチンを取り込

すが、世界保健機関（WHO）が勧告したミクロシスチ

まない培養細胞を使って毒性評価をする方法を開発

ンの暫定基準値はミクロシスチン -LR という一つの同しました。また、平成 19～21 年度には沖縄県の株式族体についての基準値だったことから、同族体を個別

会社トロピカルテクノセンターとの共同研究で、遺伝に測定する手法も開発されてきました。その中でも高子操作により安定性を高めた蛋白質脱リン酸化酵素

速液体クロマトグラフ - タンデム型質量分析計（LC-（PP2A）を利用した毒性評価（定量）手法の開発も行い

MS/MS）を用いる手法が同族体の同定および分析感ました。

度で優れています。ただし、この手法の弱点は測定時

さらに、平成 21～23 年度には、国立医薬品食品衛の夾雑物等によりイオン化する効率が不安定なことで生研究所との共同研究において、冷凍状態で市販さした。この弱点の克服には、安定同位体で標識されたれている初代培養肝細胞を用いるとともに、定量的化合物を使うのが一般的ですが、市販品はありません

NMR で濃度をきちんと把握したミクロシスチン同族でした。研究所ではミクロシスチンを作る藍藻株を窒体を使うことにより再現性の良い毒性評価を行い、ミ素の安定同位体（15N）を含む培地中で培養することで、クロシスチンによるリスクの評価手法を確立しました。

ミクロシスチン中の窒素（通常は 14N）を効率よく安定アオコが産生する有毒物質の分析手法の開発

同位体（15N）に置き換えることができることを見つけ、大量培養により 15N を含むミクロシスチンを調製しました。この 15N で標識したミクロシスチンを内部標準物質として測定したい試料に添加して分析することに有毒物質の構造と毒性が解明されたら、そのリスクより、精度よくミクロシスチンの分析を行うという手を評価するために有毒物質の量を測定する分析手法の法を 2010 年に世界に先駆けて報告しました。今では、開発が重要になります。研究所がミクロシスチンに関15する研究を始めた頃にはすでに 70 種類以上のミクロシ

識ミクロシスチンを用いた高精度分析手法が日本国内

スチン類が報告されていましたが、標準品は 6 種類ほのみならず世界の標準的な分析手法になることを期待

どしか市販されていなかったことから、まずミクロシ

しています。

N 標識ミクロシスチンが市販されているので、15N 標

スチン類の総量を測定する手法の開発を試みました。

また、有毒アオコへの対処を実際に担当される地方

ミクロシスチン類の Adda と呼ばれる共通構造を酸

自治体の環境研究所と共同研究も行っていて、宮城県化することにより MMPB（3- メトキシ -2- メチル -4-

保健環境研究所、千葉県環境研究センター、奈良県景フェニル酪酸）とし、生成した MMPB を測定すること

観・環境総合センター、福岡県保健環境センター、佐でミクロシスチンの総量を測定する手法を 1992 年に賀県くらし環境本部環境センター、沖縄県衛生環境研開発しました（MMPB 法）。この手法は、現在でも生究所の研究者の方々と有毒アオコのモニタリング手法

物試料中や湖沼の底質中のミクロシスチン類を測定すについて検討を続けています。
■ 図 4 ミクロシスチンの総量測定法（MMPB 法）の開発
ミクロシスチンの構造には Adda と呼ばれる炭素 20 個のβ- アミノ酸、3- アミノ -9- メトキシ -10- フェニル -2,6,8-トリメ
チル -4,6- デカジエン酸が共通構造として存在しています。この Adda の二重結合部分を過マンガン酸カリウム（KMnO4）と過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）で酸化して分解すると、ミクロシスチン 1 分子から MMPB（3- メトキシ -2- メチル -4フェニル酪酸）が 1 分子生成します。 生成した MMPB を測定することにより、ミクロシスチンの総量を測定する方法が

MMPB 法です。 開発当初は生成した MMPB を蛍光ラベ
ル 後、HPLC−蛍 光 検 出 器で測 定していました。 そ の 後、

MMPB をメチルエステルとした後、GC/MS で測定する方法も開発しました。今では生成した MMPB を固相抽出し、誘導体化することなしに LC-MS（/MS）で測定しています。筋肉などの生体試料や湖沼の底質に含まれるミクロシスチンの測定法として広く世界中で使われています。

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研究をめぐって

有毒アオコをめぐる研究の動向

世界ではより報告された後、多くの同族体の構造が日本人研究者により報告されてきました。日本のアオコは欧米の1980 年代からアオコの有毒物質であるミクロシス

アオコと比較して毒性が弱いものが多く、健康被害やチン、シリンドロスパーモプシン等の構造解析が行わ

家畜の斃死などは記録されていませんが、日本各地のれていて、現在では 100 種類以上のミクロシスチン

富栄養化が進んだ湖沼で有毒アオコの発生が確認され同族体が報告されています。高速液体クロマトグラています。

フ - タンデム型質量分析計（LC-MS/MS）を用いたミ

アオコの有毒物質の中ではミクロシスチンが最も高クロシスチン同族体の個別分析手法についても早くか頻度で確認されていて、環境省では平成 10 年に要調ら検討されていて、定量だけでなく構造解析も LC-

査項目、厚生労働省では要検討項目や上水試験法の試

MS/MS で行われてきました。

験項目に指定していますが、基準値にはなっていませWHO では、1996 年に起きたブラジルでのヒトの死亡事故をうけて、1998 年にミクロシスチン -LR の暫定基準値（1µg/L）を勧告しました。この勧告を受ん。また、ミクロシスチンやシリンドロスパーモプシ

けて、ヨーロッパの国やオーストラリアではミクロシ

環境中での有毒アオコやミクロシスチンの動態等につスチンの基準値を定めて、厳しく監視しています。まいても研究が進められています。

た、水酸化カルシウムを用いたリン酸の除去手法や、過酸化水素や草食魚等を用いたアオコの増殖抑制手法
等の検討が行われています。

日本では1980 年代後半にアジア地域で量が多いミクロシス
チン -RR の構造解析が筑波大学の楠見武徳博士らにン等の有毒物質を合成する酵素の遺伝子やミクロシス
チンを分解する酵素の遺伝子等を調べることにより、

国立環境研究所では生物系や工学系の研究者たちは、1980 年代から藍藻類の分類や増殖条件、ミクロシスチンの産生条件の検討、水生生物によるミクロシスチンの濃縮などについて研究を行っていて、「アオコの見た目指標」等も作成しました。最近では遺伝子解析による分類や有毒■ 図 5 グルタチオン付加法
ミクロシスチンをグルタチオンで処理すると、7位の Mdha（Dha でも可）残基にグルタチオンの硫黄原子が付加した化合物が得られます。この付加体を薄層クロマトグラフィー（TLC）で展開した後、アミノ酸の発色試薬であるニンヒドリンで発色させて、ミクロシスチンがあるかどうかとおおよ
その量を分析することができます。 TLC で展開しないで、試験管内で発色反応を行うと、比色法でミクロシスチンの測定ができます。この方法では、[MSer7] ミクロシスチンのように 7 位のアミノ酸残基に二重結合がないミクロシスチン同族体や Dhb−ミクロシスチン類はグルタチオンと付加体を作らないため、測定することができません。しかし、このグルタチオン付加法は、測定に高価な機器を必要としないので、開発途上国などでミクロシスチンを測定するための良い方法だと思います。

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有毒アオコによる事故は 1920 年代から報告されていましたが、1980 年代になりアオコの有毒物質の構造が決定されました。1998 年には世界保健機関（WHO）により飲料水中のミクロシスチンについて暫定的な基準値が勧告されました。また、アオコの増殖を抑制する技術や、ミクロシスチン等のアオコの有毒物質の除去・分解方法についても検討されています。

株の判定、分化の推定などについても研究しています。

認できるようにするために、ミクロシスチン分析用のまた、富栄養化の原因となる栄養塩類の推移やアオコ

環境標準物質（NIES CRM No.26 アオコ）を開発しの増殖抑制、生物膜処理によるミクロシスチンの分解ました（図 6）。2010 年には安定同位体標識ミクロシ等についても研究を行っています。

スチンの調製と高精度分析手法の開発等を行ってきま

化学系の研究者は、有毒物質の構造解析としては、した。

1995 年に Dhb- ミクロシスチンの発見、1996 年にまた、ミクロシスチン以外で高頻度で検出される有は魚類に毒性を示すチオンスルフォリピドの単離、毒物質シリンドロスパーモプシンについても、種類の2011 年には環境ホルモン作用のある 7- ヒドロキシレ

異なる固相抽出カートリッジを連結して使用することにより、簡便に濃縮する手法の開発や、安定同位体

チノイン酸の単離などを行っています。
毒性の評価法の開発としては、1996 年にはエレ（15N）で標識されたシリンドロスパーモプシンの調製

クトロポレーションによる細胞毒性評価手法の開発、と、それを用いた高精度分析手法の開発も行ってきま2010 年にはトロピカルテクノセンターとの共同研究で遺伝子組み換え蛋白質脱リン酸化酵素（PP2A）を利用したマイクロプレートアッセイ法の開発、2011した。
コ発生の主な原因は富栄養化であるためにアオコの制

年には国立医薬品食品衛生研究所との共同研究で凍結御は難しく、今後も地球温暖化の進行に伴い、世界中

初代培養幹細胞を用いた毒性評価システムの開発などで有毒アオコの発生が問題になると考えられていまを行ってきました（表 3）。

す。有毒アオコによる被害を抑制するためには、アオ

人為的な環境汚染物質による汚染とは異なり、アオ分析法としては、1992 年にミクロシスチン総量分

コの発生を抑制する技術の開発とともに、ミクロシス

析手法である MMPB 法を開発（図 4）、2001 年には、チン等の有毒物質を注意深く監視していく必要があり

高額な分析機器を持たない開発途上国でも分析ができます。今後もアオコの有毒物質の構造解析や、アオコ

るように、ミクロシスチンにグルタチオンを付加させの有毒物質に対する迅速・簡便・高精度な分析手法のて安価に分析する方法の開発も行いました（図 5）。

開発がますます重要になると考えています。

2005 年には研究者が自分の分析の確からしさを確■図 6

環境標準物質の調製

環境標準物質とは、そこに含まれている化学物質の濃度が正確に求められている環境試料で、環境分析における標準として極めて重要なもので、わが国では当研究所の前身である環境庁国立公害研究所が 1980 年から開発を進めてきました。現在 14 種類の環境標準物質を頒布しています。
環境試料は化学組成が極めて複雑なため、試料の前処理や測定が難しく、単純な標準溶液を用いたのではなかなか正しい分析値を求めることができません。このような場合には、分析試料と化学組成がよく似た標準物質を用いることにより、分析値の正確さを向上させることができます。
アオコの有毒物質ミクロシスチンの分析精度管理用の環境標準物質を作製するために、有毒な藍藻株を大量に培養し、凍結乾燥しました。乾燥藻体を混ぜ合わせ、63µm のふるいを通しました。この細かい粉体をビンに小分けした後、均質性試験、認証値付与、安定性試験を行い、環境標準物質（NIES CRM

NO.26 アオコ）が完成しました。 NIES CRM NO.26 は、ミクロシスチンの分析用に開発された環境標準物質です。
環境標準物質のホームページ

http://www.nies.go.jp/labo/crm/index.html
13

国立環境研究所における「アオコの有毒物質に関する研究」のあゆみ
国立環境研究所では、環境中の有害物質の化学構造解析や高精度分析手法の開発に関する研究を行っています。ここでは、その中から、アオコの有毒物質に関するものについて、そのあゆみを紹介します。

課題名

有毒アオコが生産する毒物質の標識化とその生体影響作用機構に関する研究（1990～1994 年度）
重水素化標識化合物を用いたアオコ毒ミクロシスチンの総量分析手法を開発しました。

課題名

アジア地域の微生物研究ネットワークに関する研究（1995～1997 年度）
アジア地域で発生したアオコの有毒物質について構造解析および分析をしました。

課題名

アジアにおける水資源域の水質評価と有毒アオコ発生モニタリング手法の開発に関する研究（2004～2006 年度）
アジア地域の研究者に簡易分析手法を含むアオコ毒分析手法を伝授しました。

課題名

PP2A を利用した藍藻毒分析キットの開発（2007～2009 年度）

PP2A を利用したアオコ毒ミクロシスチンのマイクロプレートアッセイキットを開発しました。

課題名

藍藻類が生産するミクロシスチンのモニタリング手法とその評価に関する研究（2009～2011 年度）
アオコ毒ミクロシスチンの安定同位体標識体の調製と高精度分析手法の開発をするとともにモニタリング手法の検討を行いました。また、ミクロシスチン同族体毎の毒性を評価し、ミクロシスチンによるリスク評価
手法も検討しました。

課題名

微細藻類が生産する有毒物質ミクロシスチンのモニタリングに関する研究（2012 年度～）
安定同位体標識ミクロシスチンを用いた簡便・迅速・高精度なモニタリング手法の検討を行っています。

本号で紹介した研究は、以下の機関、スタッフにより実施されました（所属は当時、敬称略、順不同）＜研究担当者＞
国立環境研究所：佐野友春、彼谷邦光、白石不二雄、西川雅高、高木博夫、渡邉信、笠井文絵、広木幹也、河地正伸、今井章雄、
松重一夫
国立医薬品食品衛生研究所：西村哲治、清水久美子
地方環境研究所（福岡県、沖縄県、宮城県、奈良県、佐賀県、千葉県）
株式会社トロピカルテクノセンター
ダンディー大学（イギリス）：Geoffrey A. Codd
カセタート大学（タイ）：Wichien Yongmanitchal
タイ科学技術研究所（タイ）：Aparat Mahakhant
水生生物研究所（中国）
：劉
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永定

これまでの環境儀から、藻類や湖沼の環境保全に関連するものをいくつか紹介します。

No.44 試験管内生命で環境汚染を視る ─ 環境毒性の in vitro バイオアッセイ研究所では、環境汚染物質の毒性を評価するため、培養細胞や微生物を用いたさまざまな invitro バイオアッセイ法を開発してきました。こうした試験法は、今後、環境モニタリングにも応用できると期待されています。本号では、研究所が取り組む in vitro バイオアッセイ法の構築のあゆみと環境モニタリングへの応用について紹介しています。

No.43 藻類の系統保存 ─ 微細藻類と絶滅が危惧される藻類

藻類は光合成による有機物の生産者として地球上で重要な役割をはたしているほか、物質の循環や有用物質の生産などにも深くかかわっています。研究所の微生物系統保存施設（NIES コレクション）では、藻類を収集し、培養株として系統保存しています。本号では、わが国の藻類保存
プロジェクトの中核機関である NIES コレクションについて紹介します。

No.13 難分解性溶存有機物 ─ 湖沼環境研究の新展開

湖沼の水質がなかなか改善しない原因の一つに、難分解性溶存有機物の影響が考えられます。研究所では、湖沼において増大する難分解性有機物の発生原因と影響評価に関する研究に取り組んでいます。本号では、これらの研究成果とともに、難分解性溶存有機物の特性や湖沼での動態、環境への影響などについて紹介しています。

No.9

湖沼のエコシステム ─ 持続可能な利用と保全をめざして

No.7

バイオ・エコエンジニアリング ─ 開発途上国の水環境改善をめざして

湖沼の富栄養化が進む中、湖沼環境を改善し、保全していくためには、生物間の相互作用を含めた湖沼生態系の構造と機能を理解し、活用していくことが必要です。本号では、湖沼の水質が魚の影響を強く受けていた事実を通して、湖沼における生物間の相互作用を明らかにするとともに、生態系を保全・管理しつつ湖沼利用を進めるための道を探っています。

開発途上国で安全な飲み水を確保するためには、生活系排水の処理が重要です。研究所では、途上国において、排水を現場で処理、浄化できる、分散型で低コストの維持管理しやすい水処理シ
ステムの技術開発に取り組んできました。本号では、生物の機能を最大限に活用した「バイオ・エコエンジニアリング」技術を応用した新しい水処理システムについて紹介しています。

環境儀 No.52—国立環境研究所の研究情報誌—

2014 年 4 月 30 日発行
編

集

国立環境研究所編集委員会（担当 WG：稲葉一穂、佐野友春、玉置雅紀、石垣智基、近藤美則、滝村 朗）

発行

独立行政法人

国立環境研究所〒 305-8506 茨城県つくば市小野川 16-2
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編集協力

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本冊子は、グリーン購入法に基づく基本方針における「印刷」に係る判断の基準にしたがい、印刷用の紙へのリサイクルに適した材料「A ランク」のみを用いて作製しています。

「

環

境

儀

」

既

刊

の

紹

介

海の呼吸─北太平洋海洋表層の CO2 吸収に関
する研究

No.29
2008 年 7 月

ライダーネットワークの展開─東アジア地域のエアロゾルの挙動解明を目指して

No.7
2003 年 1 月

バイオ・エコエンジニアリング─開発途上国の水環境改善をめざして

No.30
2008 年 10 月

河川生態系への人為的影響に関する評価─よりよい流域環境を未来に残す

No.8
2003 年 4 月

黄砂研究最前線─科学的観測手法で黄砂の流
れを遡る

No.31
2009 年 1 月

有害廃棄物の処理─アスベスト、PCB 処理の一翼を担う分析研究

No.9
2003 年 7 月

湖沼のエコシステム─持続可能な利用と保全を
めざして

No.32
2009 年 4 月

熱中症の原因を探る─救急搬送データから見るその実態と将来予測

No.10
2003 年 10 月

オゾン層変動の機構解明─宇宙から探る 地
球の大気を探る

No.33
2009 年 7 月

越境大気汚染の日本への影響─光化学オキシ
ダント増加の謎

No.11
2004 年 1 月

持続可能な交通への道─環境負荷の少ない乗り物の普及をめざして

No.34
2010 年 3 月

セイリング型洋上風力発電システム構想─海を旅するウィンドファーム

No.12
2004 年 4 月

東アジアの広域大気汚染─国境を越える酸性雨

No.352010 年 1 月

環境負荷を低減する産業・生活排水の処理システム～低濃度有機性排水処理の「省」「創」エネ化～No.13
2004 年 7 月

難分解性溶存有機物─湖沼環境研究の新展開

No.36
2010 年 4 月

日本低炭素社会シナリオ研究─ 2050 年温室効果ガス 70％削減への道筋

No.14
2004 年 10 月

マテリアルフロー分析─モノの流れから循環型
社会・経済を考える

No.37
2010 年 7 月

科学の目で見る生物多様性─空の目とミクロの目

No.15
2005 年 1 月

干潟の生態系─その機能評価と類型化

No.382010 年 10 月

バイオアッセイによって環境をはかる─持続可能な生態系を目指して

No.16
2005 年 4 月

長江流域で検証する「流域圏環境管理」のあり
方

No.39
2011 年1月「シリカ欠損仮説」と海域生態系の変質─フェリーを利用してそれらの因果関係を探る

No.17
2005 年 7 月

有機スズと生殖異常─海産巻貝に及ぼす内分泌かく乱化学物質の影響No.40
2011 年 3 月

VOC と地球環境─大気中揮発性有機化合物の実態解明を目指して

No.18
2005 年 10 月

外来生物による生物多様性への影響を探る

No.41
2011 年 7 月

宇宙から地球の息吹を探る─炭素循環の解明
を目指して

No.19
2006 年 1 月

最先端の気候モデルで予測する「地球温暖化」

No.42
2011 年 10 月

環境研究 for Asia/in Asia/with Asia ─持続可能なアジアに向けて

No.20
2006 年 4 月

地球環境保全に向けた国際合意をめざして─温暖化対策における社会科学的アプローチ

No.43
2012 年 1 月

藻類の系統保存─微細藻類と絶滅が危惧され
る藻類

No.21
2006 年 7 月

中国の都市大気汚染と健康影響

No.44
2012 年 4 月

試験管内生命で環境汚染を視る─環境毒性のin vitro バイオアッセイ

No.22
2006 年 10 月

微小粒子の健康影響─アレルギーと循環機能

No.452012 年 7 月

干潟の生き物のはたらきを探る─浅海域の環境変動が生物に及ぼす影響No.23
2007 年 1 月

地球規模の海洋汚染─観測と実態

No.46
2012 年 10 月

ナノ粒子・ナノマテリアルの生体への影響 ─ 分子サ
イズにまで小さくなった超微小粒子と生体との反応

No.242007 年 4 月

21 世紀の廃棄物最終処分場─高規格最終処
分システムの研究

No.47
2013 年 1 月

化学物質の形から毒性を予測する─計算化学
によるアプローチ

No.25
2007 年 7 月

環境知覚研究の勧め─好ましい環境をめざして

No.48
2013 年 4 月

環境スペシメンバンキング─環境の今を封じ込
め未来に伝えるバトンリレー

No.26
2007 年 10 月

成層圏オゾン層の行方─ 3 次元化学モデルで見るオゾン層回復予測

No.49
2013 年 7 月

東日本大震災─環境研究者はいかに取り組むかNo.27
2008 年 1 月

アレルギー性疾患への環境化学物質の影響No.50
2013 年 10 月

環境多媒体モデル─大気・水・土壌をめぐる有害化学物質の可視化

No.28
2008 年 4 月

森の息づかいを測る─森林生態系の CO2 フ
ラックス観測研究

No.51
2014 年 1 月

旅客機を使って大気を測る─国際線で世界をカバー●環境儀のバックナンバーは、国立環境研究所のホームページでご覧になれます。

http://www.nies.go.jp/kanko/kankyogi/index.html「 環境儀」

地球儀が地球上の自分の位置を知るための道具であるように、『環境儀』という命名には、われわれを取り巻く多様な環境問題の中で、われわれは今どこに位置するのか、どこに向かおうとしているのか、それを明確に指し示すしるべとしたいという意図が込められています。
『環境儀』に正確な地図・行路を書き込んでいくことが、環境研究に携わる者の任務であると考えています。
2001 年 7 月 合志 陽一（環境儀第 1 号「発刊に当たって」より抜粋）

このロゴマークは国立環境研究所の英語文字
N.I.E.S で構成されています。N= 波（大気と水）、
I= 木（生命）、E・S で構成される○で地球（世界）を表現しています。ロゴマーク全体が風を切って左側に進もうとする動きは、研究所の躍動性・進歩・向上・発展を表現しています。

52 APRIL 2014

No.6
2002 年 10 月