NGS変異データの三次解析

フィルジェン株式会社 バイオインフォマティクス部(biosupport@filgen.jp)
1はじめにシークエンス

二次解析

三次解析

✓ ベースコール✓ リードマッピング✓ バリアントコール✓ アノテーション付け / フィルタリング✓ トリオ解析 / 集団解析
✓ 各種データのビジュアライゼーション✓ レポート作成
...など

TAAAA

⚫ 次世代シークエンサーによる変異解析では、データ作成の基本となる二次解析に加え、おもにデータの解釈を行うための三次解析を行うことが必要⚫ 三次解析では、変異情報データベースのような外部データリソースや、サンプルの表現型情報・家系情報などが必要
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Golden Helix ソフトウェア製品ラインナップ

GWAS & SNP Analysis
Large-N DNA-Seq Analysis
Genomic Prediction
Copy Number Analysis
RNA-Seq Analysis••••••••••

Cancer & Rare Disease Diagnostics
ACMG & AMP Guidelines Workflow
CNV Calling
Clinical Reporting
High-throughput NGS Testing⚫

Golden Helix社では、遺伝統計解析ソフトウェア「SNP & Variation Suite」と、クリニカルシークエンス解析ソフトウェア「VarSeq®」の2種類のソフトウェアパッケージを販売⚫

医学・生物学研究や、家畜や作物の品種改良などの農学研究、さらに疾患の診断や最適な治療オプションの決定における医療分野、遺伝学的解析などの教育現場などで利用される
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VarSeq®
⚫ キュレーションされた様々なデータリソースを使用し、変異データへアノテーション付けを実行• RefSeq Genes• dbSNP• ClinVar• CIVic• ICGC / TCGA
• PhrmaGKB• BRCA Exchange• 1000 Genomes• NHLBI 6500 Exomes• ExAC Variant• gnomAD Exomes/Genomes• dbNSFP (SIFT, PolyPhen...)• 各種遺伝子パネルのターゲットデータ...など⚫ VCFファイルに含まれる変異データから、任意の検索条件でデータのフィルタリングを行うワークフローを作成⚫ カバレッジ計算やトリオ解析、表現型情報に基づく遺伝子ランキングなどの解析アルゴリズムを搭載⚫ ゲノムブラウザーを搭載し、BAMファイルデータや各種アノテーションデータをグラフ表示⚫ 有償アドオンによる機能拡張で、CNVコールやレポート作成、パイプライン機能などが利用可能
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解析使用ファイル⚫

VarSeq®では、二次解析によって取得した、サンプルごとの変異データ（VCFファイル）が必須で、オプションでリード配列のマッピングデータ（BAMファイル）を使用⚫

遺伝子パネルやエクソーム解析の場合は、オプションでゲノム上のターゲット領域データ（BEDファイル）も使用可能*一部のパネルのターゲット領域データは、ソフトウェア上からダウンロードが可能

VCF
FASTQ

BAM

BED
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VarSeq®メイン画面⚫

VCFファイルとBAMファイルのインポートを行うと、それぞれ変異テーブルとゲノムブラウザーで表示される

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NGS三次解析
クオリティーチェック⁃ Ti/Tv、Homo/Hetero Ratio、Call Rate
⁃ 親縁チェック、性別チェック⁃ 遺伝子パネルのターゲットカバレッジ計算アノテーション⁃ 遺伝子アノテーション⁃ 臨床情報データベース⁃ アレル頻度データベース⁃ 機能予測アノテーション⁃ 疾患別の関連遺伝子ランキング

サンプル間比較⁃ トリオ解析⁃ 腫瘍-正常サンプルのペア解析⁃ 集団サンプル解析

ビジュアライゼーション⁃ ゲノムブラウザー⁃ 各種データの集計グラフ

7クオリティーチェック

Ti/Tv、Homo/Hetero Ratioなど

親縁チェック？

⚫

性別チェック？

サンプル情報テーブルにて、Ti/Tv、Homo/Hetero Ratio、親縁チェック、性別チェックなどの結果を確認
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クオリティーチェック
カバレッジテーブル

サンプル情報テーブル⚫

遺伝子パネル解析では、各ターゲットキャプチャー領域ごとのリードカバレッジと、サンプルごとのカバレッジデータを確認⚫

計算にはBAMファイルと、ターゲット領域データ（BEDファイルなど）が必要

9アノテーション一覧
Assemblies••

GRCh 37 (hg19)
GRCh 38 (hg38)

Genes
••

RefSeqEnsemblClinical Annotations••••

ClinVarOMIM
PharmaGKB
BRCA Exchange

Cancer Annotations•••••••＊赤字は有償アドオン

COSMIC
CIViC
Cancer Hotspots
ICGC Simple Somatic Mutations
TCGA Variants
MSK ImpactPrecision Medicine Knowledgebase (PMKB)

Functional Annotations•••

dbNSFP (SIFT, PolyPhen, MutationTaster...)REVEL Functional Prediction
CADD

Population Catalogs
••
•
•
•
•
•

dbSNP
1000 Genomes
NHLBI 6500 Exomes
ExAC Variant
gnomAD Exomes/Genomes
TOPMedUK10K

Targeted Panels••

TruSight
Ion AmpliSeq10

アノテーション付加⚫

アノテーション情報は変異データテーブルにそのまま追加され、データベースへのハイパーリンクもつく⚫

変異データテーブル上の任意のデータをクリックすると、アノテーションの詳細情報も閲覧可能

11アノテーション例
RefSeqClinVarCOSMIC12

アノテーション例
1000 Genomes

dbNSFP

PhoRank13

フィルタリングワークフロー

フィルタリングワークフロー⚫

付加したアノテーション情報などを用いて、変異データに対する任意のフィルタリングワークフローを作成⚫

ワークフローの各項目ごとに、フィルタリング結果の変異データテーブルを確認可能で、項目を変更するとフィルタリング結果の変異データテーブルも自動的にアップデートされる
14サンプル比較用の解析アルゴリズム

Genotype Zygosity• 各変異ごとの接合性情報（Homozygous, Heterozygousなど）
によるアノテーション付けの実行

Mendel Error• 各変異ごとのメンデル遺伝情報（親からの遺伝、De Novo変異など）
によるアノテーション付けの実行

Count Alleles• 全サンプルあるいはサンプルグループごとに、プロジェクトデータ内のアレル数や頻度情報などのアノテーション付けの実行

Compound Het Detection• 複合ヘテロ接合体の検出

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トリオ解析

✓ de Novo変異✓ 劣性ホモ変異✓ 優性ヘテロ変異

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トリオ解析
✓ 複合ヘテロ変異

17腫瘍-正常サンプル解析⚫

腫瘍-正常細胞の比較解析では、各サンプル内のアレル頻度データを比較し、腫瘍サンプル特異的な変異の抽出を行う
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集団サンプル解析

サンプルグループ1

サンプルグループ2⚫

全サンプル、またはユーザー定義のサンプルグループごとに、各変異のアレル数や頻度、変異をもつサンプル数を計算し、フィルタリングに用いることが可能⚫

サンプル数は、ホモとヘテロそれぞれの数をカウント

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ゲノムブラウザー⚫ VCFファイルに加えて、BAMファイルの情報もプロットを行うことができ、シークエンスデータの目視チェックなどに活用⚫ アノテーション用データベースも同時にプロットし、アノテーションの詳細情報などの確認が可能✓ データベース

RefSeqGenes

ClinVardbSNP✓ サンプルデータ

VCF

BAM

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ゲノムブラウザー✓ BAMファイルプロット✓ VCFファイルプロット

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データ集計グラフ⚫ 変異データテーブル上の各フィールドのデータは、ワンクリックで集計グラフの作成が可能✓ Sequence Ontology✓ Read Depth22

お問い合わせ先：フィルジェン株式会社
TEL: 052-624-4388 (9:00～18：00）
FAX: 052-624-4389

E-mail: biosupport@filgen.jp

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