東京農総研研報

19：41-50, 2024

（原著論文）

ブバルディアの成長点培養苗の生産に及ぼす培地の植物ホルモン濃度の影響
大槻優華1 ＊・小坂井宏輔1 ・鈴木克彰2 ・宮下智人112現

東京都農林総合研究センター

東京都島しょ農林水産総合センター

摘

要東京都大島町の特産花きブバルディア（Bouvardia spp.）について，現地の生産者組織では基幹 2 品種のウイルスフリー苗の生産を培養企業に委託しているが，雑菌汚染により培養苗の増殖効率が著しく低下して苗供給が滞ったため，培養技術の改善が必要となった。そこで培養技術の改変を行ったところ増殖効率は改善したが，従来苗に比べて奇形花が多発する傾向であった。奇形花の発生は培養中の植物ホルモン濃度の影響による培養変異に起因し，培地中のホルモン濃度を低くすることにより低減できると考えられた。
これを検証するためにはまず，ブバルディアの培養に適用できる低ホルモン濃度の培地条件を明らかにする必要がある。そこで本研究では，ブバルディアの成長点培養に適した培地の植物ホルモン濃度を検討した。
従来の B 1 培地（MS 培地＋ BA1.0mg/L，NAA0.01mg/L）よりも植物ホルモン濃度を低減した B 2 およびB 3 培地で成長点培養を行ったところ，B 3 培地（MS 培地＋ BA0.2mg/L，NAA0.01mg/L）で伸長シュートを得ることができた。 次に B 3 培地の培養苗の増殖効率を評価するため， 計 7 品種を用いて B 1 およびB 3 培地で成長点培養を行った。その結果，すべての品種で両培地由来の培養苗を得ることができた。ただし，B 3 培地における培養苗の生産効率は B 1 培地の 1 / 4 ～ 1 /10程度にとどまった。今後は B 3 培地で作出した培養苗について，奇形花の発生程度や収量性などを評価する必要がある。
キーワード：アカネ科，ウイルスフリー苗，オーキシン，サイトカイニン，マイクロプロパゲーション
簡略表題

ブバルディアの組織培養

東京都農林総合研究センター研究報告＊

著者連絡先：大槻優華

19：41-50，2024

Email：y-otsuki@tdfaﬀ.com－ 41 －

東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

るためにはまず，ブバルディアの培養に適用できる緒言

低ホルモン濃度の培地条件を明らかにする必要がある。また，大島町では，近年，東京都育成の新品種

ブバルディア（Bouvardia spp.） はアカネ科の低（宮下ら，2021；宮下ら，2022）の導入が進んでい木であり，農業生産的には主に切り花や鉢物としてるが，これらの培養特性はまだ明らかでない。そこ利用されている。

で本研究では，まずブバルディアの成長点培養に適

ブバルディアは挿し木で容易に増殖できるため，した低ホルモン濃度の培地条件を明らかにし，次い国内主要産地である東京都大島町において，生産用で育成新品種を含めた複数品種を供試し，低ホルモの苗は自家増殖が一般的であった。しかし1980年代ン濃度の培地の適用性を評価した。なお，本報告の後半に同生産者圃場でキュウリモザイクウイルス

一部は園芸学会令和 5 年度春季大会で発表したもの（CMV）によるモザイク病が多生し，大きな問題とである。

なった（栄森，1995）。本病対策のため，東京都は材料および方法MS 培地（Murashige and Skoog, 1962）に植物ホルモンを添加した培地における成長点培養，シュート増（小林，1995），その手法を用いて生産者にウイルス

1 ．供試品種試験には，‘チェリーピンク，ヨホワイト’，東京フリー苗を供給する事業を実施した（東京都農業試

都育成品種‘東京スター

験場，1991；東京都農業試験場，1998）。本事業でシルキーホワイト），東京スター

クリアピンク（以は当時の大島町における基幹品種である‘チェリー

下，クリアピンク），東京スター

パールピンク（以ピンク，ハイブリットホワイト，ヨホワイト’の種下，パールピンク），東京ダブルスター

苗を配布し，事業終了後は‘チェリーピンク，ヨホド（以下，サニーレッド），東京ダブルスター

ワイト’のウイルスフリー苗の生産を民間企業に移

ノーピンク（以下，スノーピンク）’の計 7 品種を行した。しかし雑菌汚染により増殖率が著しく低下用いた。いずれも直径 9 cm のポットで育成（栽培）し，苗供給が滞ったため，培養技術の改善が必要とした挿し木増殖苗で，東京都立川市圃場のガラス温なった。

室において最低温度15℃で栽培管理したものを，後殖によるウイルスフリー苗作出の基礎技術を確立しブバルディアの組織培養は，葉や茎，根などの組シルキーホワイト（以下，サニーレッ
ス

述の成長点培養の供試材料とした。

織培養（Fernández and Jiménez，1982） や茎頂培養（信太，1992）で実施例がある。しかし雑菌汚染や増殖効率に関する詳細な知見は乏しい。

2 ．培地の植物ホルモン濃度の検討（試験 1 ）‘チェリーピンク’を供試し，植物ホルモン濃度

そこで鈴木ら（2013）は従来の培養系を用い，殺を従来より低減した培地（以下，低減培地）につい菌法の検討や初代培養時の詳細な観察を行った結て，成長点培養（以下，初代培養）が可能な濃度条果， ブバルディア組織内に感染した内生菌の存在件を検討した。東京都農林総合研究センターで2012と，感染した培養シュートの増殖効率の低下を確認

年からブバルディアの培地として使用している従来した。また，内生菌に非感染のシュートの判別技術培地（以下，B 1 培地；鈴木・宮下，2012）を対照を確立したことで，雑菌汚染率と培養苗の増殖効率とし，これに対して植物ホルモン濃度を低減した 2は改善した。一方，本法で作出した苗を本圃で栽培種類の培地として B 2 ，B 3 培地を設計した。培地したところ，長年挿し木で継代維持していた苗に比の基本組成は MS 培地（Murashige and Skoog, 1962）

べて奇形花（図版 1 ）が多発する傾向であった（未で， これにショ糖 2 %， ゲランガム0.3% を加えて発表）。そのため奇形花を低減するための新たな培pH 5.8に調整した。植物ホルモンは，サイトカイニ養法の確立が必要となった。

ンとしてベンジルアミノプリン（以下，BA），オー

一般に高濃度の植物ホルモンは突然変異を引き起キシンとしてナフタレン酢酸（以下，NAA） を用こす要因となる（Marum ら，2009）。ブバルディア

いた。培地ごとの濃度は，B 1 培地では BA1.0mg/L，は，植物ホルモンに対して感受性が高い可能性があ

NAA0.01mg/L，B 2 培地では BA0.2mg/L，NAA なし，り，低ホルモン濃度の培地で培養することで奇形花

B 3 培地では BA0.2mg/L，NAA0.01mg/L とした。培（培養変異）を低減できると考えた。これを検証す

地は直径 3 cm のガラス試験管に約10mL の培地液
－ 42 －

ブバルディアの成長点培養苗の生産に及ぼす培地の植物ホルモン濃度の影響を充填し，斜面状に固めたものを使用した。これら

殖本数とした。

3 培地で初代培養を行った。

次に継代培養の繰り返しによる増殖を行った。継外植体は茎頂および腋芽として，母株から新梢を代培養の培地組成は初代培養と同様とし， 直径採取し， 葉を切除して 1 節ごとに分割する調整を8 cm のガラス製培養瓶に約30mL の培養液を充填行った。殺菌処理は，調整した外植体を中性洗剤溶し，水平に固めたものを使用した。培地へ定植後，液で 5 分，70％エタノール溶液で10秒， 有効塩素初代培養と同一の環境で培養した。ブバルディアの0.5％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で 5 分間それぞ培養苗は，事前の同様の試験において，同一母株のれ撹拌し，その後クリーンベンチ内において，滅菌異なる成長点に由来する培養苗で奇形花の発生程度

蒸留水で 2 回洗浄した。殺菌後，実体顕微鏡下で茎が異なる事例があったことから（未発表），継代培

頂または腋芽から直径0.3～0.5mm の成長点を摘出

養の供試数は，初代培養で得られたシュートを初代した。摘出した成長点を培地に置床し，24℃設定・培養で摘出した成長点ごとに 1 系統として扱い，-2-1

光強度35µmol・m ・s ，24時間照明の恒温器で約‘チェリーピンク’は 2 系統，‘ヨホワイト’は10系

2 ヵ月間培養した。試験は2014年に，時期を変えて

統，‘パールピンク，シルキーホワイト’は 5 系統，計 2 回実施した。各試験区の供試数は 2 回の合計で‘クリアピンク’は 3 系統，‘サニーレッド’は13系20個以上を用いた。 供試数が培地により異なるの

統，‘スノーピンク’ は 8 系統を供試した。 なお，は，供試植物の状態により採取可能な成長点数が異品種によって供試系統数が異なるのは，初代培養でなったためである。培養開始から 2 ヵ月後に雑菌汚得られた伸長シュート数が異なるためである。 以

染率，生存率，無菌シュート伸長率（供試した成長降， 1 ヵ月ごと 3 ヵ月目まで同様の継代操作を繰り点に対する，雑菌・内生菌の感染がなくシュートが返し，各月の増殖本数から増殖倍率（継代培養にお伸長した成長点の割合）を調査し，実施した 2 回のける， 1 ヵ月で増殖したシュート本数の前月比）を平均値を求めた。

算出した。継代培養開始時のシュート本数は初代培養終了時のシュート増殖本数とした。

3 ．低減培地での培養苗生産効率の評価（試験 2 ）低減培地における培養苗の生産効率を評価するた

た。培地から取り出したシュートを水洗した後， 1め，対照の B 1 培地および試験 1 で供試した B 3 培

節以上を含み， 長さ 2 ～ 3 cm になるようにハサミ

地で初代培養，継代増殖，発根・順化（図版 2 ）をで切り分けた。各節の葉は残し，切断面は斜めにな行い，培養苗生産効率の評価指標として最終的な成るようにカットして，バーミキュライトを充填した苗獲得数を算出した。前述の 7 品種を供試し，2017

200穴セルトレイの培地に挿し木した。底面に水を～2020年に実施した。初代培養は 1 つの品種につい張ったプラスチック容器にセルトレイを入れて食用て時期を変えて複数回実施した。各品種で供試した

ラップで容器の開口部を覆い，約 2 ヵ月の間にラッ成長点の数と実施回数は，‘ヨホワイト’は22～45× 4 回，‘クリアピンク，パールピンク，シルキー

プの穴を徐々に増やすことで馴化を行った。馴化は-2-125℃， 光強度150µmol・m ・s ，24時間照明のクホワイト’は17～30× 2 回，‘サニーレッド，スノーリーンルームで行った。馴化した供試数は，‘ヨホピンク’は 7 ～16× 3 ～ 4 回とした。なお，‘チェワイト’は40～80本× 5 系統，‘パールピンク，シリーピンク’ は試験 1 で作出した初代培養の伸長

ルキーホワイト’ は20～80本× 5 系統，‘クリアピ

シュートを継代培養以降の工程にそのまま使用したンク’は20～80本× 3 系統，‘サニーレッド’は13ため，試験 2 での初代培養は省略した。供試数と統～50× 3 系統，‘スノーピンク’ は26～28× 2 系統

計処理については，試験 1 と同様に 1 つの実施回を（ただし B 3 区は欠測）とした。ただし，チェリー

1 つの集団として平均値の算出と統計処理を行っピンクでは15～20本× 2 系統× 8 反復（ 2 系統をた。また初代培養の培地，操作方法，調査内容も試分割して各 8 集団繰り返し）とした。馴化開始から

験 1 と同様である。 さらにシュート伸長率， 無菌

2 ヵ月後にシュートの生存率， 発根率（発根したシュートの伸長率を調査した。また初代培養開始かシュートの割合），発根程度を調査した。発根程度ら 2 ヵ月後，得られた伸長シュートを 1 節ごとにメは，生存した各シュートについて発根量を 0 （無），スで切り分けて継代培地に植え替えた。この時に得1 （少）， 2 （中）， 3 （多）の 4 段階で評価し，次られたシュート本数を初代培養終了時のシュート増の式により算出した； 発根程度 = Σ（発根量指数

3 回目の継代培養から約 3 週間後に馴化を行っ－ 43 －

東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

×指数別本数）／生存本数で評価）。得られたデー結タについて，品種と培地の影響の程度を評価するた

果め分散分析を行った。ただしスノーピンクの B 3 培
1 ．培地の植物ホルモン濃度の検討（試験 1 ）‘チェリーピンク’を植物ホルモン濃度の異なる地は欠測のため，分散分析はそれ以外の品種で行った。
最終的な培養苗の生産効率を評価するため，成苗培地で初代培養を行った結果，低減培地の B 3 で生獲得数を算出した。成苗獲得数はそれぞれの品種お存率が46％と， ほかの培地より比較的高い傾向によび培地において， 1 個の成長点から培養で得られあった。シュート伸長率伸長率は，B 1 および B 3る発根シュート本数を示し，次の計算方法で算出し培地において，それぞれ22％，17％であり，伸長した； 成苗獲得数（本） ＝初代培養における無菌たシュートはすべて無菌シュートであった（表 1 ）。

シュートの実質伸長率（％） × 1 /100×継代培養

一方，B 2 培地では伸長シュートがまったく得られ3 ヵ月目の増殖本数（本） ×馴化後の発根率（％）

なかった。

× 1 /100。
表1

チェリーピンクの成長点培養に培地中の植物ホルモン濃度が及ぼす影響

2 ．低減培地でのシュートの生産効率の評価（試験 2 ）植物ホルモン濃度の異なる培地で 7 品種の初代培出したところ，いずれの品種でも B 3 培地より B 1養を行ったところ，いずれの品種も B 1 と B 3 の両培地の方が多く，その差は約 1 / 4 ～ 1 /10であった培地で伸長シュートが得られた（表 2 ）。また初代（表 5 ）。

1 個の成長点の培養から得られる成苗獲得数を算

培養終了時のシュート増殖本数は，‘チェリーピン
考ク，クリアピンク，パールピンク，サニーレッド’

察の 4 品種で，B 3 培地よりも B 1 培地のほうが有意に多かった。

培養増殖はウイルスフリー苗を生産する上で必要継代培養における増殖本数は，反復間のばらつき不可欠な技術であり，ブバルディアにおいてはキュが大きいものの，各品種および時期の培地間で比べウリモザイウイルスを回避し，健全な苗を得るうえると，B 1 のほうが有意に多いか，両培地で同程度で重要である。また培養苗生産において，奇形花のであった。（表 3 ）。 各月の増殖本数は，‘シルキー

発生等の培養変異を低減できる技術を確立すること

ホワイト，クリアピンク，パールピンク，スノーピ

は，切り花の生産効率および品質を向上することにンク’で B 1 培地の方が有意に高い月があり，全期有用である。本研究では，奇形花の多発は培養変異間の平均の増殖倍率は‘シルキーホワイト，クリアに起因し，低ホルモン濃度の培地で発生を低減化でピンク，パールピンク’で B 1 培地のほうが有意にきるとの仮説を検証することをねらいとし，ブバル高くなった。

ディアの培養に適用できる低ホルモン濃度の培地条

伸長シュートの馴化後，すべての品種および培地件を検討した。その結果，ホルモン濃度を従来よりで発根シュートを得ることができた（表 4 ）。 培地低減した B 2 および B 3 培地のうち，B 3 培地で無と品種間で分散分析を行ったところ，品種の要因で菌シュートを得ることができた（表 1 ）。‘チェリー

いずれの項目でも有意差があり，培地よりも品種特ピンク’ の初代培養において，NAA を含まない性のほうが培養苗の発根に与える影響は大きかっ

B 2 培地では培養シュートを得ることができなかった。

たことから，‘チェリーピンク’ の培養には NAA－ 44 －

ブバルディアの成長点培養苗の生産に及ぼす培地の植物ホルモン濃度の影響

表2

表3

培地中の植物ホルモン濃度が初代培養に及ぼす影響

培地中のホルモン濃度がシュート増殖に及ぼす影響－ 45 －

東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

表4

培地中のホルモン濃度がシュート発根に及ぼす影響

表5

成苗獲得数が影響する可能性が示された。また，B 3 培地では地を用いて，多くのブバルディア品種で培養苗を生調査した 7 品種すべてにおいて培養苗生産が可能で産できることが明らかになった。今後は B 3 培地のあることが明らかとなった（表 2 ～ 5 ）。

実用化にむけて，奇形花発生の低減効果や収量など苗の生産効率を示す成苗獲得数は，従来の B 3 培の生産力検定が必要である。

地は B 1 培地の 1 / 4 ～ 1 /10程度と少なかった（表謝5 ）。 一方， 一連の苗生産の過程で， 初代培養の辞

シュート伸長率および順化時の挿し木発根率については，いずれの品種も両培地間に有意な差はみられ

本研究の実施にあたり，植物材料をご提供いただなかった（表 2 ，表 4 ）。初代培養の終了時およびいた東京都島しょ農林水産総合センター大島事業所

継代培養でのシュート増殖時には，多くの品種で増の皆様に厚く御礼申し上げます。

殖本数や増殖倍率において B 1 培地が有意に優れて引用文献いた（表 3 ）。これらのことから，苗の生産効率の差は，主としてシュート増殖の差に起因すると考えられた。
本実験では成苗獲得数において顕著な品種間差が栄森弘己（1995）伊豆大島のブーバルジア（Bouvardia
× hybrida hort.） に発生するモザイク病の病原ウみられた（表 5 ）。品種間差は初代培養，シュートイルス並びに弱毒ウイルスによる防除の試み．東増殖，挿し木発根の各段階でもみられた。組織培養

京農試研報．26：p51-82．

あり（岡田ら，2003；宮崎ら，1976），本研究におFernández, L., E. S. Jiménez（1982）In vitro culture ofBouvardia ternifolia. Canadian Journal of Botany. 6 0

いても植物ホルモンへの反応性の違い等が影響した（6）: p917-921.

可能性がある。

小林直恵（1995）ブーバルジアの茎頂培養．植物バに対する品種間の反応の違いは他の植物でも報告がB 3 培地で培養苗の生産効率が著しく低かった品
種については今後，挿し木発根率を高める条件を検討するなどし，生産効率の向上を図ることが重要と考えられる。
以上，本研究ではホルモン濃度を低減した B 3 培

イオテクノロジー試験成績書（昭和62年～平成 5年度）．東京都農業試験場．東京．p 8 ．
宮下智人・小坂井宏輔・大槻優華・小幡彩夏・大根田順子・澁澤直恵・鈴木克彰（2021）ブバルディ
アにおける倍数性および交雑育種の基盤技術の確－ 46 －

ブバルディアの成長点培養苗の生産に及ぼす培地の植物ホルモン濃度の影響

立と「東京スター」シリーズ 3 品種の育成．園学
研．20（別 1 ）：p292．
宮下智人・小坂井宏輔・大槻優華・木下沙也佳・小幡彩夏・ 大根田順子・ 澁澤直恵（2022） ブバル
ディアの第 2 期「東京ダブルスター」シリーズ 3
品種の育成．令和 3 年度

東京都農林総合研究センター成果情報．p31-33．
宮崎貞巳・田代洋丞・島田恒治（1976）キクの組織培養（第 1 報）． 器官形成に関する品種間差異．
佐賀大學農學彙報．40：p31-44．
Marum, L., Rocheta, M., Maroco, J., Oliveira, M.M. andMiguel, C（2009）Analysis of genetic stability at SSR
loci during somatic embryogenesis in maritime pine（Pinus pinaster）. Plant Cell Reports. 28: p 673-682.
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for rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Physiol. Plant. 15: p473-497.
大槻優華・ 小坂井宏輔・ 宮下智人（2020） ブバル
ディア「ヨホワイト」に適合する新たな培養増殖法の確立～奇形花の発生程度に及ぼす培地および培養期間の影響（ 2 ， 3 回目開花調査～．令和 2年度

東京都農林総合研究センター成果情報．

p43-44．
大槻優華・ 小坂井宏輔・ 宮下智人（2022） ブバル
ディア第 2 期有望系統の培養法の確立～初代培養，シュート増殖及び発根に及ぼす培地のホルモン濃度の影響～．令和 3 年度

東京都農林総合研究センター成果情報．p27-28．
信太馨（1992）増補 / 図解組織培養入門（古川仁朗編）．誠文堂新光社，東京．P89-91．
岡田恵子・荒井滋・浅尾浩史（2003）イチゴ培養

増殖苗に及ぼすサイトカイニンの影響．奈良農技セ研報．34：p15-24．
鈴木克彰・宮下千枝子・菅原優司・竹内浩二・篠原弘亮（2013）ブバルディアの大量増殖における内生菌の影響．園学研．12（別 2 ）：p233．
東京都農業試験場（1991）Ⅲ大島特産花き原々種苗増殖事業． 平成元年・ 2 年度試験成績書．p4448．
東京都農業試験場（1991）Ⅲ大島特産花き原々種苗増殖事業．平成 7 ・ 8 年度試験成績書．p55-56．
豊田秀吉・大形浩・松田克礼・茶谷和行・平井篤造（1985）．トマト葉外植片からの植物体再生．植物組織培養． 2 （2）：p70-73．

－ 47 －東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

Phytohormone concentration effects on propagation in Bouvardia meristem
tissue culture
Yuka Otsuki 1＊ , Kosuke Kosakai 1, Katsuaki Suzuki 2, Chieto Miyashita 112

Tokyo Metropolitan Agriculture and Forestry Research Center

Currently Tokyo Metropolitan islands Area Research and Development Center of Agriculture, Forestry andFisheries

Abstract
In Bouvardia spp., the occurrence of malformed flowers in virus-free plants produced from meristem tissue cultures
is problematic. This was thought to be a culture mutation caused by the effects of plant hormones. This study, weevaluated the effects of phytohormone concentration in the culture medium on the production and growth efficiency ofregenerated plants to reduce malformed flower development. To confirm whether it is possible to culture plants on amedium with a reduced concentration of phytohormones compared to the conventional standard medium B1 (MSmedium + BA 1.0 mg/L, NAA 0.01 mg/L), plants on three different media with different phytohormone concentrations
were cultured, and regenerated shoots on B3 medium (MS medium + BA 0.2 mg/L, NAA 0.01 mg/L) were obtained.
Thereafter, to evaluate the growth efficiency of the regenerated plants on B3 medium, meristematic tissue cultures
were cultured on B1 and B3 media using seven cultivars. Although cultured shoots were obtained on the B3 medium
for all varieties, the growth efficiency of the cultured seedlings was higher on the B1 medium for all varieties. Furtherstudies are needed to evaluate the degree of malformed flower development in seedlings grown on B3 medium.
Keywords: auxin, cytokinin, micropropagation, Rubiaceae, virus-free plants
Bulletin of Tokyo Metropolitan Agriculture and Forestry Research Center, 19: 41-50, 2024
Corresponding auther: y-otsuki@tdfaff.com－ 48 －ブバルディアの成長点培養苗の生産に及ぼす培地の植物ホルモン濃度の影響

図版 1

奇形花の形態a）正常花（一重系品種： ‘東京スターシリーズ シルキーホワイト’）b）正常化（八重系品種： ‘東京ダブルスターシリーズ サニーレッド’）c～f）奇形花（c：曲がり，d：緑，e：花弁融合，f：不完全形成）－ 49 －

東京都農林総合研究センター研究報告第19号（2024年）

図版 2

本研究における成長点培養苗作出および調査の手順－ 50 －