遺伝子配列を材料素子とする河川水中有害物質の簡易測定系構築
金沢大学

大学院自然科学研究科
助手

物質科学専攻荻野千秋

Construction of facile bio-assay system of dissolved organic solvent in waterby using short length fragment DNA as sensor material
Ogino Chiaki. Assistant Professor.
Graduate School of Natural Science & Technology, Kanazawa University.
アプタマー (aptamer) は核酸分子が連なって一本鎖を形成し、多様な高次構造をとることにより分子認識を行い、結合する生体機能性分子である。現在、アプタマーはタンパク質、抗体、糖、また各種有機化合物等、様々な物質に対して結合することが明らかになっている。アプタマーのターゲットは比較的高い分子量の物質が多く、低分子量の物質をターゲットとしたものは、その研究の蓄積が更に必要であると言える。本研究で我々は、DNAアプタマーのターゲットとしてフェノールに注目した。フェノールは環境汚染物質である
環境ホルモン物質に共通な骨格を有している。この DNA アプタマーを取得することで水環境中における環境ホルモン等の環境汚染物質を検出するバイオセンサとしての応用が考えられる。目的の DNA アプタマーを得るため、60 塩基のランダムな配列を有する一本鎖 DNAのライブラリを用いた。初期の DNA ライブラリは 460 の多様性を有しており、そこからSELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 法による選抜とPCR (Polymerase chain reaction) 法による増幅を繰り返し、スクリーニングすることによって、ターゲットにより結合する DNA アプタマーの取得を目指した。
SELEX 法による DNA の選抜に関しては、フェニル基が修飾されている疎水性ビーズを用いて、増幅した ssDNA とビーズを混合して室温で結合反応させ、分離用チューブによりビーズと液体を遠心分離し、TE buffer による洗浄を行った後、95o C による熱溶出を行った。この操作を 10 回繰り返すことにより、ターゲットと結合する DNA の選抜を行った。
こうして得られた DNA 群を T-Vector プラスミドに導入し、DNA ライブラリを作製した。
得られたライブラリのクローンをシークエンサーにより塩基配列を決定し、それぞれについてターゲットとの結合確認を行った。その結果、フェノール分子を認識する 10 種の DNAアプタマーを取得出来た。これより、フェニル基に結合する DNA アプタマーを DNA ライ
ブラリより選抜できたと考えられる。

Single strand DNA (ssDNA) can form a wide variety of three-dimensional conformation.
Some of these structure forms are able to interact with proteins and small molecules with highspecificity and affinity. These oligonucleotides sequences are called DNA aptamers. The in vitro
selection of specific DNA aptamer is done by systematic evolution of ligands by exponential

enrichment (SELEX). In this study, to detect endocrine distributor chemicals (ECDs) by DNAaptamer, we focused the phenol ring, the common structure of ECDs, as a target for DNA
aptamers, and selected by SELEX strategy. After 12 rounds of SELEX, ten DNA aptamers werescreened by using FITC-labeled DNA aptamer from about one hundred DNA aptamer
candidates. Additionally, ten DNA aptamers showed no cross-reaction with hydrophobic gel
beads, TOYOPEARL Butyl-650M. Comparing the DNA sequence of these DNA aptamers, itwas revealed that these DNA aptamers were consisted of between one high homology region (I)and one of two relative high conserved regions (II and III). Based on DNA sequence
information, it was assumed that the region I was at least necessary for recognition of the phenylmolecule.
１．研究目的我々の社会は、河川・湖沼・海など多様イブラリよりアプタマーを選抜するため、次のような操作について、操作条件を確立な水環境に取り巻かれており、その安全性した。

をモニタリングすることは非常に重要であ•二本鎖 DNA (dsDNA) 、及び ssDNAる。環境汚染物質は、極微量で生体に影響の 取 得 の た め の PCR (Polymeraseを与える物質が多いことから、その物質をchain reaction) 法の条件

迅速にかつ高感度にセンシングするバイオ•

フェニル基が修飾されている疎水性ビセンサの素子の開発が望まれる。分子認識ー ズ で の 、 SELEX(Systematic能をもつ機能性 DNA 分子、DNA アプタマ

evolution of ligands by exponentialー(DNA aptamer)、は、その素子としてのenrichment) 法によるアプタマー選抜可能性を持つ生体材料である。DNA アプタ

そして、アプタマーの結合評価と解析のマーは核酸分子が連なって一本鎖ため、次のような検討を行った。

DNA(ssDNA)を形成し、多様な高次構造を•FITC (Fluorescein isothiocianate) ラとることにより分子認識を行い、結合する

ベル化 DNA アプタマーによる結合評

生体機能性分子であり(Fig. 1)、熱や pH に価実験対して比較的安定で、その合成も容易である。現在、アプタマーはタンパク質、抗体、糖、また各種有機化合物等、様々な物質に対して結合することが明らかになっている。

Stem type

Bulge type

Pseudoknot typeG-quartet type

アプタマーのターゲットは比較的高い分子量の物質が多く、低分子量の物質をターゲットとしたものは、充分な知見の蓄積がなされていないのが現状である。本研究で我々は、DNA アプタマーのターゲットとしてフェノール(Fig. 2)に注目し、460 の多様Fig.

性を持つランダムな配列の一本鎖 DNA ラ

Schematic1これらより、フェニル基に対するアプタ

DNA を反応させ、熱による溶出の前後でのマーを取得し、環境ホルモンを含めた環境蛍光強度変化を蛍光マイクロプレートリー

汚染物質のセンサー素子としての応用を考ダーで測定した。コントロール DNA の熱溶え、併せて報告を行う。

出の前後での蛍光強度の変化の割合を基準として、各サンプルにおける蛍光強度の変化の割合を増加率で表し、アプタマーとフOH

HOOH

ェニル基の結合確認を行った。また、ブチル基が表面に修飾されているビーズ

Phenol

Bis-phenol A

TOYOPEARL Butyl-650M (TOSOH) を用いて同様に実験を行い、特異性についても検OH

OHClClFig.

12,4-dichlorophenol

討した。
３．研究成果DNA 作製条件の決定
PCR の検討を行い、DNA ポリメラーゼ

Fig. 2 Chemical structures of phenol

酵 素 に は Expand Long Template PCR

and endocrine disrupting chemicals

System (Roche)を使用し、dsDNA の作製に

２．実験経過は 95 o C, 15 sec、72 o C, 30 sec の 2STEP でSELEX 法による選抜

15 サイクル行い、100 µM のテンプレート

SELEX 法とは、ランダムな配列をもつを 1 µl 用いると、ssDNA やダイマー等の非DNA ライブラリから目的の物質に結合す特異的な増幅が最も少なく、目的の 120 bpる分子のみを選抜する方法である。フェニ付近の大きさに効率よく増幅されたバンド

ル基が表面に修飾されている TOYOPEARLが確認できた。

phenyl-650M (TOSOH)を使い、ssDNA との次に、dsDNA をテンプレートとして、結合反応の後に洗浄と溶出を行う。この操

ssDNA を増幅する PCR の条件を同様に検作を 10 回繰り返し、電気泳動により確認し討した。asymmetric PCR を行い、変性た。試験管内での選抜と PCR による増幅をPAGE による確認を行った。その結果、95繰り返すことにより、非常に多様なライブ

o C, 15 sec、72 o C, 30 sec の 2STEP で 40ラリ（本研究では 460 の多様性）から徐々にサイクル行い、切り出し精製してきた焦点を絞っていくことができる

dsDNA を 2 µl 用いると、効率よく増幅すターゲットとの結合確認ることができた。作製した ssDNA は、SELEX 後に得られた DNA 群を大腸菌に形質転換し、個々の配列のシーケンス解析、HPLC システムによっても確認した。
SELEX 法による選抜

及び Fluorescein isothiocianate（FITC）ラベ

各ラウンドにおいて精製した ssDNA を、ル化による結合評価実験を行った。FITC は変性 PAGE にて確認した。その結果、ラウ励起波長 488 nm、蛍光波長 530 nm で蛍光ンドを重ねていくごとに様々な長さのを発する。Phenol と 5’FITC ラベル化した各DNA 断片が増幅されていくことが確認された。

認できたと言える。また、同様にブチル基ターゲットとの結合確認が修飾されているビーズに対する DNA ア配列を確認した 83 サンプルについて、結プタマーの作用を検討した場合においては、合確認実験を行った。その結果、増加率が1 サンプルを除き有意差がないと判断され、1.5%を超えたものは 37 サンプルであった。

DNA アプタマーのフェニル基に対する結これを結合確認のスクリーニングの第一段合の特異性が確認できた。

階とし、この 37 サンプルについて 3 回の繰り返し実験を行った。その結果、6 サンプ

５．学会発表及び論文等

ルについてマン・ホイットニーの U 検定に

化学工学会第 68 年会（東京・東京大学）2003

より、コントロールとの差が確認できた。

年 3 月 24 日

これらについて、4 回目の繰り返し実験を機能性 DNA 分子の探索と水質評価への行ったが、同様に増加が確認できた (Table

応用、金平幸輝、村田知之、荻野千秋、清1) 。次に、フェニル基との結合が確認でき

水宣明

た サ ン プ ル に つ い て TOYOPEARLYABEC 2003 (Cheju island, Korea) 13〜15th ,Butyl-650M (TOSOH) を用いて、同様に結November, 2003

合確認実験を 4 回繰り返し行った。その結果、マン・ホイットニーの U 検定により、Screening of DNA aptamer that recognizes
phenol molecule

コントロールとの差がないことが確認でき
Screening of DNA aptamer that recognizes
phenol molecule
C. Ogino, T. Murata, N. Miyamoto, K.
Kanehira, and N. Shimizu
Proceedings of YABEC 2003, p.77, Jeju

た。
４．今後の課題と発展
ターゲットとの結合確認について
検定結果からビーズに修飾されているフIsland, KOREA (2003)

Table 1 Mann-Whitney U-test (n 1 = 4, n2 = 6)
for phenyl binding assay
Elution (%)
Sequence

1st2nd3rd

4th

Significant

samples round round round round difference*28c1.121 1.135 1.193 1.191*

1c1.068 1.110 1.172 1.172*6b1.165 1.208 1.196 1.184*9b1.104 1.216 1.201 1.195

*

*25c

1.157 1.287 1.275 1.210*26c1.065 1.181 1.200 1.198*

ェニル基に結合する DNA アプタマーを確