2章

2 章 ゲノム編集の基本原理：ゲノム編集ツール

ゲノム編集の基本原理：ゲノム編集ツール

ゲノム編集は，人工 DNA 切断酵素（ゲノム編集ツール）によって細胞内で目的の遺伝子を特異的に切断し，切断された DNA の修復過程を利用して遺伝子を改変する技術である。
ゲノム編集ツールのほとんどは，細菌が防御機構，獲得免疫機構や，宿主遺伝子の発現制御のために巧妙に進化させてきたシステムを利用して開発されたものである。ゲノム編
集ツールは，人工制限酵素（人工ヌクレアーゼ）と RNA 誘導型ヌクレアー
ゼに大きく分類される（図 2.1）
。ここでは，それぞれのゲノム編集ツー
ルの開発の歴史，基本構造や切断様式について詳しく紹介する。

2.1

ゲノム編集ツールの開発の歴史

ゲノム編集は，基盤となるゲノム編集ツールの開発と共にその技術開発が進められてきた。細胞中で特異的に遺伝子を切断できれば，細胞の DNA 二本鎖切断（DSB : double-strand break）修復機構を利用した遺伝子改変が可能になることに多くの研究者は気づいていたが，狙って切断する酵素をどうやって作るかが大きな課題であった。トランスポゾンやウイルス由来のインテグラーゼによる遺伝子改変技術の開発は進んできたものの，任意の配列に対して DNA を切断し自由に改変できる技術については，ほとんど報告はなかった。そのため，標的配列の選択の自由度や改変の正確性を第一に考えると，相同組換え（HR : homologous recombination）を利用した方法に頼るしかなく，大腸菌や酵母，マウス ES 細胞の遺伝子ターゲティングが大きく注目されてきた。
122.1a）人工制限酵素（人工ヌクレアーゼ）

DNA 切断ドメイン

DNA 切断酵素

ガイド RNA

図 2.1 2 つのゲノム編集ツール
ゲノム編集ツールは，DNA 認識・結合ドメインと DNA 切断ドメインから構成される人工制限酵素（人工ヌクレアーゼ）と，ガイド RNA とよばれる短鎖 RNA とDNA 切断酵素の複合体として働く RNA 誘導型ヌクレアーゼがある。

このような状況で，1996 年に第一世代の人工制限酵素としてジンクフィ
ンガーヌクレアーゼ（ZFN : zinc-finger nuclease）が開発された 2-1)（図 2.4参照）。21 世紀に入り，多くの研究者が ZFN による培養細胞や生物個体での遺伝子改変に着手した。2002 年にショウジョウバエでの遺伝子改変が報告されたのをはじめ 2-2)，ZFN による生物個体での変異導入や遺伝子ノックインが報告された。しかし，実際に任意の配列に対して使えるようになるま
でには 10 年以上を要した。ZFN の受託作製で入手は可能であったが，残念なことに作製費用が高額であり，研究資金の豊富な研究室しか使うことができなかった。ZFN を独自に作ることが難しかったこともあり，ZFN を利用したゲノム編集研究は国内外で大きな広がりを見せることはなかった。
ZFN を使った遺伝子改変が国内でも可能になった頃，大きな変化が訪れた。2009 年，独国マルチン・ルター大学のボッホ（Jens Boch）らは，植物病原細菌の転写活性化因子様エフェクター（TALE : transcription activatorlike effector）が単純な繰り返し構造をもち，1 リピートが DNA の一塩基を特異的に認識・結合することを明らかにした 2-3)。そして翌年，この TALEを使った第二世代のゲノム編集ツールとして TALE ヌクレアーゼ（TALEN :transcription activator-like effector nuclease）が発表された 2-4)（図 2.7 参照）。
ZFN で苦労してきた研究経験を生かし，TALEN の開発は予想以上のスピー
13

ゲノム編集の基本原理：ゲノム編集ツール

DNA 認識・結合
ドメインb）RNA 誘導型ヌクレアーゼ

２

Fok I

ゲノム編集ツールの開発の歴史

2.2

2.2.5

様々なゲノム編集ツール

クリスパー・キャス 9（CRISPR-Cas9）

2012 年，第三世代のゲノム編集ツールとして発表されたのが，クリス質の DNA 認識・結合ドメインによって標的塩基配列へ結合するのに対して，配列の切断はガイド RNA と複合体を形成する Cas9 ヌクレアーゼ（Cas9）
が行うことから，CRISPR-Cas9 は RNA 誘導型ヌクレアーゼとよばれている。Cas9 は，標的遺伝子ごとに変える必要はなく，標的配列に対応する短鎖 RNA（ガイド RNA）さえ準備すれば，簡単に遺伝子改変が可能である。
ガイド RNA は，化学合成によって作製した DNA から簡便に調製することができ，ZFN や TALEN のような煩雑な作製過程も必要としない。このことから，
CRISPR-Cas9 は汎用性が高いゲノム編集ツールとして，2013 年以降，
予想をはるかに越えるスピードで世界中に広がっている。
CRISPR-Cas システムは，もともと古細菌や真正細菌の有する獲得免疫機構である（図 2.8）2-18)。細菌は，ファージなどの外来 DNA が侵入すると，ファージの DNA を 30 塩基対程度に断片化し，ゲノム中の CRISPR へ取り込む（獲得過程）。CRISPR は，繰り返し配列とスペーサー配列が交互に現れるという特徴をもっており，スペーサー領域に複数の外来 DNA 断片を取り込む。
繰り返し配列内には短い回文配列が見られることやクラスター構造が存在することから CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic
repeats）の名前がつけられている。細菌は，外来 DNA を自身のゲノムとすることで，敵の塩基配列の情報を記憶するのである。
ゲノム編集に利用されるタイプⅡの CRISPR-Cas システムでは，再び同じ配列をもつ外来 DNA が侵入すると，外来 DNA 断片の塩基配列情報を含む
前駆 CRISPR RNA（pre-crRNA）を転写する（発現過程）。pre-crRNA は，別のゲノム領域から転写された tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA）と pre-crRNA の繰り返し配列部分および Cas9 が結合し，プロセッシングによって断片化された後，crRNA : tracrRNA : Cas9 の複合体が形成される。
複合体は，ファージ DNA 上を動き，標的の塩基配列を探索していく。複合25

ゲノム編集の基本原理：ゲノム編集ツール

CRISPR-Cas9 は短鎖 RNA を利用して塩基対形成によって結合する。標的２

パー・キャス 9（CRISPR-Cas9）である 2-6)。ZFN や TALEN が，タンパク2 章 ゲノム編集の基本原理：ゲノム編集ツールa）獲得過程b）発現過程再び侵入

crRNA : tracrRNA : Cas9
プロセッシング
tracrRNA
スペーサー配列
cas遺伝子群 CRISPR

pre－crRNA
転写

繰り返し配列c）切断過程切断

cas 遺伝子群Cas9

CRISPR

cas 遺伝子群CRISPR

図 2.8 CRISPR-Cas9 による獲得免疫機構a) ファージが感染すると，細菌では cas
遺伝子群から発現した切断酵素が働き，
フ ァ ー ジ DNA を 切 断 し， ゲ ノ ム 中 の
CRISPR に断片化したファージ DNA を取り込む（獲得過程）。ファージ DNA が取り込まれた部分はスペーサーとよばれ，ス
ペーサーは繰り返し配列と交互に現れる。
b) 再び，ファージが感染すると，CRISPR
か ら pre-crRNA が 発 現 さ れ，cas 遺 伝
子 群 か ら 発 現 し た Cas9 タ ン パ ク 質 とtracrRNA が結合して，複合体（crRNA :tracrRNA : Cas9） を 形 成 す る。 そ の 後，
プロセッシングによって 1 つのスペーサー配列を含む複合体へ分離する（発現過程）。
c) crRNA : tracrRNA : Cas9 は，侵入した
ファージ DNA と塩基対形成によって結合
し，DSB を誘導する（切断過程）。

体がプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM : proto-spacer adjacent motif）
4 4とよばれる目印の配列に結合すると，標的配列と crRNA が塩基対を形成し，二本鎖 DNA を切断・不活性化する（切断過程）。化膿レンサ球菌（Streptococcus
pyogenes） の Cas9（SpCas9）: crRNA : tracrRNA 複 合 体 は，PAM 配 列（5´-NGG-3´）に結合すると，2 つの DNA 切断ドメイン（RuvC ドメインと
26

2.2

様々なゲノム編集ツール

HNH ドメイン）によって，PAM 配列から 3 塩基離れた箇所の DNA 二本鎖を切断する。PAM 配列は数塩基と短いが，由来する細菌種や CRISPR のタ
ゲ ノ ム 編 集 ツ ー ル と し て 改 良 さ れ た CRISPR-Cas9 で は，crRNA と: single-guide RNA）が使われる（図 2.9）
。この改良によって，sgRNA と
Cas9 の 2 つの因子を細胞内で発現させることができれば，sgRNA：Cas9 複合体が染色体上の標的配列に結合して DSB を誘導することができる。標的配列として必要なのは，SpCas9 であれば PAM としての 5´-NGG-3´のみであり，標的となる 20 塩基に大きな制限はない。そのため，遺伝子を破壊する実験であれば，PAM となる配列を目印として sgRNA の標的箇所はいく
つも選ぶことができる。2 本の相補的な合成オリゴ DNA を塩基対形成させ，プラスミドに挿入することによって，Cas9 と sgRNA の両方の発現用ベク

Cas9
RuvC

5´-GACGCTTCAG
3´-CTGCGAAGTC

標的配列
AGTCTACTGTGGAGGAACTCPAM
TGGCTACGCATGTA-3´
ACCGATGCGTACAT-5´

HNH
TCAGATGACACCTCCTTGAG
5´-AGUCUACUGUGGAGGAACUC
ガイド配列（20 塩基）sgRNA3´
図 2.9 ゲノム編集ツールとしての CRISPR-Cas9 の基本構造
ゲノム編集では，crRNA と tracrRNA をリンカーで連結した一本鎖ガ
イド RNA（sgRNA）が利用される。sgRNA のガイド配列と標的 DNA
配列の結合と Cas9 による切断には，PAM 配列が必要とされる。Cas9
は RuvC ドメインと HNH ドメインの 2 つの DNA 切断ドメインをもつ。
27

ゲノム編集の基本原理：ゲノム編集ツール

tracrRNA をリンカーでつないだ 100 塩基程度の一本鎖ガイド RNA（sgRNA２

イプによって，その配列が異なることが知られている。

3.3

実験法 3.2

ゲノム編集による遺伝子ノックイン

クロマチン免疫沈降（ChIP）解析

クロマチン免疫沈降（ChIP : chromatin immunoprecipitation）法は，転写調節因子など DNA 結合タンパク質が結合する DNA 領域を検出する方法である。目的のタンパク質因子が DNA へ結合した状態で固定し，DNA を断片化し，特異的抗体を用いて免疫沈降する。その後，沈降物中に含まれる DNA 断片を

３

PCR で増幅し，結合配列領域を決定する。さらに，次世代シークエンサー（NGS: next generation sequencer）でタンパク質因子が結合する箇所をゲノムワイ
ChIP 解析では，タンパク質因子の特異抗体を必要とするが，必ずしも特異性の高い抗体が準備できるとは限らない。そのため，ゲノム編集によって目的の遺伝子に Flag などのタグ配列を挿入し，タグ配列に対する特異抗体でChIP 解析をすることにより，安定した結果を得る方法も開発されている。

コラム 3.1

ミトコンドリア DNA のゲノム編集

ヒトのミトコンドリア DNA（mtDNA : mitochondrial DNA）は，約 16 キ
ロ塩基対の環状 DNA で，ATP 合成に関わる遺伝子がコードされている。ミトコンドリア DNA は，多い場合は細胞あたり数千コピーもあるので，mtDNAのゲノム編集では，この膨大な遺伝子コピーへ同時に改変を行う必要がある。
これまでに，TALEN や ZFN などの人工ヌクレアーゼにミトコンドリア ター
ゲット配列（MTS : mitochondrial targeting sequence）を付加し，mtDNA の切断と変異導入の成功例が複数報告されている 3-11, 12)。
一方，CRISPR-Cas9 を使った mtDNA のゲノム編集については限られた報告しかない。これは，sgRNA の輸送効率が悪いことが原因と考えられ，
CRISPR-Cas9 の適用には，sgRNA と Cas9 複合体をミトコンドリアへ運ぶ
デリバリー技術の開発が必要である。

49

ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復経路を利用した遺伝子の改変

ドにシークエンス解析する方法は ChIP-seq とよばれている。

4章

4 章 哺乳類培養細胞でのゲノム編集

哺乳類培養細胞でのゲノム編集

ゲノム編集の魅力は，原理的にすべての細胞や生物において利用可能な点である。本章では，ゲノム編集を利用した哺乳類培養細胞での遺伝
子ノックアウトと遺伝子ノックインについて焦点を当て，具体的な方法を紹介する。ゲノム編集は細胞内の DNA 二本鎖切断（DSB : doublestrand break）修復経路に依存した改変技術である。そのため，対象とする細胞種によってはゲノム編集効率が上がらないケースもあるので，その注意点や実験のポイントについて紹介する。

4.1

哺乳類培養細胞での遺伝子ノックアウト

培養細胞での遺伝子改変は簡単なように思われがちだが，ゲノム編集以前の技術を使って，狙って改変を行うことは想像以上に難しい。正確な遺伝子
改変は，これまで相同組換え（HR : homologous recombination）修復活性の高い，限られた細胞種（ニワトリ B 細胞由来の DT40 細胞など）でのみ可能であった。DT40 細胞では，HR 修復を介した外来遺伝子の挿入によって遺伝子を分断し，多くの遺伝子の機能が解析されてきた。
このような状況の中，ゲノム編集による遺伝子改変が，現在様々なタイプの哺乳類培養細胞（がん細胞，不死化細胞，幹細胞，初代培養細胞など）で可能となってきた。培養細胞のゲノム編集では，ゲノム編集ツールを発現するプラスミド DNA ベクターを対象の細胞種に導入（トランスフェクション）できれば，標的遺伝子の切断を導入し，非相同末端結合（NHEJ : nonhomologous end-joining）修復を介した indel（インデル：挿入・欠失）変異
50

4.1

哺乳類培養細胞での遺伝子ノックアウトの導入が可能である（図 4.1）。
最近では，プラスミド DNA を導入する代わりに，RNA やタンパク質として一過的に導入する方法も可能である。さらに，CRISPR-Cas9 では，
Cas9 タ ン パ ク 質 と 一 本 鎖 ガ イ ド RNA（sgRNA : single-guide RNA） の複合体（リボ核タンパク質 ; RNP : ribonucleoprotein）を in vitro で調製
プラスミド DNA

mRNA

タンパク質や RNP

リポフェクション，エレクトロポレーション

ウイルスベクター

４

ゲノム編集ツールの導入（トランスフェクション）

哺乳類培養細胞でのゲノム編集

培養細胞
ゲノム編集による
遺伝子改変

改変細胞の選択クローン化

図 4.1 培養細胞へのゲノム編集ツールの導入法と変異導入細胞のクローン化
ゲノム編集ツールの培養細胞への導入は，発現プラスミド DNA，mRNA，
タンパク質をリポフェクションやエレクトロポレーション（実験法 4.1 参照）
によって行う。導入効率が低い細胞の場合は，ウイルスベクターによるゲノム編集ツールの導入も可能である。改変された細胞の選択が可能であれば，選択後にクローン化することが望ましい。遺伝子改変効率が高い場合は，選択することなくクローン化ができる場合もある。
51

6章

6 章 ゲノム編集の発展技術

ゲノム編集の発展技術

ゲノム編集は，標的配列を特異的に切断する技術として開発されてきた。一方，ゲノム編集は標的配列に特異的に結合するタンパク質やsgRNA を基盤とした技術であるため，様々な機能ドメインを連結させることによって新しい技術が開発されている（図 6.1）。本章では，人工の転写調節因子やエピゲノム修飾因子による遺伝子の発現調節技術について紹介する。さらに，蛍光タンパク質の連結による DNA 可視化技
術や核酸の検出技術，機能ドメインを集積する技術を中心に新技術を紹介する。

zinc-ﬁnger
TALE
dCas9

VP16, VP64, VP160, VPR

転写活性化

KRAB

転写抑制

DNMT/TET1

DNA メチル化 / 脱メチル化

デアミナーゼDNA 塩基の脱アミノ化

リコンビナーゼ

DNA の組換え

HAT/HDAC

ヒストンアセチル化 / 脱アセチル化

HMTase/LSD1

ヒストンメチル化 / 脱メチル化

GFP などの蛍光タンパク質

DNA 標識図 6.1 ゲノム編集の発展技術
人工 DNA 切断酵素に利用される zinc-finger や TALE に様々な機能ドメインを連結した人工の転写調節因子やエピゲノム酵素，蛍光因子の作製が可能である。同様に，ヌクレアーゼドメインを欠失させた Cas9
（dCas9）に機能ドメインを付加した機能因子が作製されている。
88

6.1

6.1

人工転写調節因子技術

人工転写調節因子技術

遺伝子の発現は，プロモーター上流や下流のエンハンサーやサイレンサー
によって調節される。エンハンサーやサイレンサーには，標的配列に結合して転写を活性化や抑制するタンパク質因子（転写調節因子）が結合し，必要な時期や細胞での遺伝子発現調節が行われる。転写調節因子の多くには，標的配列に結合する DNA 結合ドメインに加えて，転写開始複合体を調節する
活性化 / 抑制ドメインや調節ドメインを有する。このような内在の転写因子と同じ機能を備えた人工の転写因子が作製できれば，標的遺伝子の調節に加えて，合成生物学での遺伝子ネットワーク構築など様々な活用法が考えられる。このような人工転写調節因子の概念は，第一世代のゲノム編集ツール
ZFN が開発された頃からすでに確立し，実証的な実験が開始されていた。
人工転写調節因子として，効率的な転写調節が実現したのは，TALE にや VPR（VP64-p65-Rta：VP64 に 2 つの転写活性化因子 p65 と Rta を融合し

６

転写活性化因子 VP64（へルペスウイルスの転写活性化因子 VP16 の 4 連結体）た因子）などを結合した人工転写活性化因子の開発からと考えられる 6-1)（図カセットの一過的発現や mRNA の導入で可能となる。持続的な発現活性化であれば発現カセットをゲノムへ挿入した発現安定株の樹立も効果的と考えられ，トランスジェニック技術を利用して個体での発現にも応用可能である。CRISPR-Cas9 を使った人工の転写活性化システムがすでに確立されており，この場合 Cas9 の 2 つのヌクレアーゼドメインに変異を導入した切断活性をもたない Cas9（dCas9 : dead Cas9）が利用される。dCas9 と転写活性化ドメインを連結した活性化因子は，sgRNA によって標的に結合し，転写活性化を誘導することが報告されている。この技術は，
CRISPRa（CRISPR
activation）とよばれている。上述の VP64 や VPR, VP160 を dCas9 に連結し，sgRNA と共発現することによって，効率的な転写活性化の成功例が報告されている（図 6.2b）。
転写抑制には，ヒトのジンクフィンガー転写因子群に見られる転写抑制
89

ゲノム編集の発展技術

6.2a）。これら人工転写活性化因子による活性化は，培養細胞であれば発現

7章

7 章 ゲノム編集の農水畜産分野での利用

ゲノム編集の農水畜産分野での利用

ゲノム編集は，幅広い生物種に利用可能な技術であることから，有用品種の作出など産業利用を視野にいれた研究・開発が進行中である。ゲ
ノム編集を利用した品種改良では，遺伝子組換え技術との差別化を図る
ため，遺伝子の欠失変異導入による有用形質個体の作出が主流となっている。本章では，農作物，養殖魚（マダイなど）および家畜（ニワトリやブタ）において進められている，ゲノム編集を用いた有用品種の作出研究について紹介する。

7.1

農作物でのゲノム編集による品種改良

人類の長い歴史の中で，有用な農作物品種は，交雑と選抜を繰り返すことによって作出されてきた。この品種改良は，自然界で低頻度に起こる自然突然変異に頼る方法であり，有用な栽培種の作出には長い年月が必要とされる。例えば，栽培品種のキャベツは，野生種のケールの品種改良によって作られたキャベツの野生種から作られたものだが，同じキャベツの野生種からブロッコリーやカリフラワーなども品種改良によって作られてきた。しかしながら，交雑と選抜による方法は，偶然に起こる自然突然変異に頼らざるを得ず，様々な形質をもつ品種を思い通りに作出することは難しい。そのため，放射線や紫外線によるランダムミュータジェネシスが開発され，国内ではガンマ線を用いて高効率に突然変異体を作出する突然変異育種が 1960 年代から始まった。
突然変異育種によって，これまで様々な農作物品種が作られてきた。世界
104

7.1

農作物でのゲノム編集による品種改良

７では，200 を越える植物種から 3200 以上の突然変異体が作出され，FAO/
IAEA Mutant Variety Database（https://mvd.iaea.org）に登録されている。
宮市）において，
低アレルゲン米，
低タンパク質米や黒斑病抵抗性ナシ（ゴールド二十世紀）を代表とした数多くの突然変異品種が作出されてきた。最近では，TILLING（targeting induced local lesions in genomes）法（1 章 2
節を参照）による目的遺伝子が改変された個体の選抜が可能となり突然変異
品種は一般的に広く利用されている。一方，作出された品種には，目的の変異に加えて多数の変異が同時に導入されているが，多くの場合それらの変異は取り除かれてはいない（図 7.1a）。
放射線や紫外線によるランダムな変異導入に比べ，ゲノム編集による品種改良は目的の遺伝子にのみ改変を加える有効な技術である（図 7.1b）。遺伝
子組換えでは外来の DNA を導入するのに対して，ゲノム編集では自然突然
a) 放射線・紫外線b) 人工 DNA 切断酵素

修復

修復

標的遺伝子

標的遺伝子

図 7.1 突然変異育種での変異導入（a）とゲノム編集での変異導入（b）
突然変異育種では，多くの箇所に突然変異が導入される。一方，ゲノム編集では，目的の遺伝子のみに変異導入が可能である。
105

ゲノム編集の農水畜産分野での利用

国内においても，国立の農業生物資源研究所 放射線育種場（茨城県常陸大8章

8 章 ゲノム編集の医学分野での利用

ゲノム編集の医学分野での利用

ゲノム編集は，医学分野の基礎研究から臨床研究において，不可欠な技術となることが予想されている。疾患モデルの作製とそれを用いた疾患の発症メカニズムの解明，創薬スクリーニング，がん研究など様々な研究が進展している。特に海外では，ゲノム編集を利用した治療（ゲノム編集治療）が特定の遺伝性疾患やがんについて臨床試験段階に進んでおり，注目されている。本章では，医学研究におけるゲノム編集の重要性と，現在進行中の基礎から応用の研究について紹介する。

8.1

疾患モデル細胞・動物の作製

8.1.1

遺伝性疾患モデル

ヒトでは 8000 を越える遺伝性疾患が存在すると予想され，そのうち約5000 の遺伝性疾患について，現在までに原因遺伝子が明らかにされている。
原因遺伝子が明らかな疾患については，対象の遺伝子を改変したモデル細胞やモデル動物を作製して発症メカニズムの解明が可能であるが，従来技術（遺伝子ターゲティングなど）では効率的な作製が困難であった。このような状況で開発されたゲノム編集は，疾患モデル作製において革新的な技術となり，
単に遺伝子を破壊するだけでなく，疾患の原因となる変異を正確に再現することも可能となりつつある。
疾患の原因となる遺伝子の機能解析は，相同組換え（HR : homologous
recombination）修復を介した薬剤耐性などの選択カセットの導入（4 章 2
節を参照）によって，限られた細胞種（DT-40 細胞，幹細胞など）で行われ
112

8.1

疾患モデル細胞・動物の作製てきた。ゲノム編集によって様々な細胞種で標的遺伝子改変が可能になったを利用した indel 変異導入や相同組換え（HR : homologous recombination）
ES（embryonic stem）細胞や iPS（induced pluripotent stem）細胞などの幹細胞を用いて疾患モデル細胞の作製が実現している。一方，初代培養細胞（個体から採取し培養した細胞）は，正常細胞での遺伝子機能を正確に理解する上で有用であるが，株化細胞に比べるとゲノム編集ツールの導入効率や細胞増殖性が低く，総じてゲノム編集の難度は高い。また，疾患遺伝子破壊
によって細胞死が誘導される場合，破壊細胞株を樹立することが基本的に困難である。このようなケースでは，ゲノム編集ツールの発現を条件的に誘導するなどの工夫が必要となる。
遺伝性疾患は，単一の遺伝的変異に起因する単一遺伝子疾患（メンデル遺伝病）と，複数の遺伝的多型（遺伝的要因および環境要因）に起因する多因子遺伝疾患に分けられる 8-1)。近年，ゲノムワイド関連解析（GWAS :genome wide association study）によって，多因子遺伝疾患の原因と考えられる一塩基多型（SNP : single nucleotide polymorphism）が網羅的に推定されている。そのため，疾患の原因と考えられる SNP を培養細胞において効率良く再現することが，疾患研究や創薬では求められる。しかしながら，
ゲノム編集を駆使しても培養細胞での SNP 改変は簡単ではない。特に複数の SNP を同時に改変することは，現状の技術ではハードルが高い。4 章 3
節で紹介した一塩基レベルの改変法のうち，目的の変異を導入するための方法としてどれが最適かを検討する必要がある。例えば，iPS 細胞での疾患モ
デル細胞の樹立には，piggyBac を用いた方法が主に利用されている。一本鎖オリゴ DNA（ssODN : single-stranded oligodeoxynucleotides）を用いた方法も成功率は高くなってはきたが，遺伝子座や細胞種によって条件検討が必要であり，複数の一塩基改変は現状では難しい。
初代培養細胞や疾患患者から樹立した iPS 細胞は，様々な遺伝的背景を有しており，標準細胞と単純に比較するのが困難な場合がある（図 8.1）。そ113

ゲノム編集の医学分野での利用

修復を利用したノックインによって，現在，様々ながん細胞や不死化細胞，

８

ことで，非相同末端結合（NHEJ : non-homologous end-joining）修復エラー

8 章 ゲノム編集の医学分野での利用

連鎖解析あるいは
GWAS 解析

疾患の原因となる変異や一塩基多型（SNP）の絞り込み

a) ゲノム編集による変異や
SNP の再現b) ゲノム編集による変異や
SNP の修復

CRISPRーCas9
標準細胞株（標準 iPS 細胞など）

患者由来細胞（患者由来 iPS 細胞など）

＊

＊
疾患患者

VS
非ゲノム編集細胞（コントロール）＊
変異（多型）
導入細胞

表現型などの比較解析

VS
変異（多型）
修復細胞＊

非ゲノム編集細胞（コントロール）

表現型などの比較解析

図 8.1 疾患モデル細胞の作製
連鎖解析や GWAS 解析によって原因変異や多型を絞り込み，それらをゲノム編集によって再現あるいは修復する。
a) 標準細胞株では，変異あるいは一塩基多型を導入した細胞と導入前の細胞を比較解析する。
b) 患者由来の細胞は，特異的な遺伝的背景を有するため，患者由来細胞において変異を修復した細胞を作製し比較解析する。

のため，疾患原因と考えられる塩基配列の変異を標準的な細胞に導入することによって比較解析を行うか（図 8.1a），疾患患者由来の細胞において原因変異を修復することによって比較解析を行う（図 8.1b）ことが必要となる。
慶応大学の岡野栄之らのグループは，筋萎縮性側索硬化症（ALS）患者に見114