薬 剤 学, 73 (2), 106‑110 (2013)≪若手研究者紹介≫

RNA 干渉の適用による疾患治療法の開発

高橋有

己* Yuki Takahashi

京都大学大学院薬学研究科というテーマのもとで研究を開始した．RNA 干渉に

1．は じ め による遺伝子発現抑制効果は強力かつ特異的である

筆者が研究室に配属され，薬剤学分野における研が，siRNA あるいは siRNA 発現プラスミド DNA が究生活を始めてちょうど 10 年が経過した．配属さ存在する細胞においてのみ誘導されるために，RNAれてからの学部生・大学院生時代，および 1 年間の干渉を用いた癌治療の実現にはこれらの分子を癌細ポスドクの後は助教として京都大学大学院薬学研究胞内へデリバリーすることが必須となる（図 1）．筆科の病態情報薬学分野（主宰 高倉喜信教授）で研究者が RNA 干渉に関する研究を始めた当時は，RNA生活を送ってきた．今回は，若手研究者紹介という干渉に関する研究は培養細胞を用いたものがほとん形で寄稿する機会をいただいたので，筆者が薬剤学どであり，in vivo RNA 干渉の効率的誘導についてという分野で現在までに行ってきた研究について紹の報告はほとんど存在せず，その方法論についても介させていただきたい．

確立されていなかった．そこで筆者らは既に遺伝子治療の分野において開発されてきた DDS 技術を応2．修 士 課 程用することで，in vivo において標的細胞への効率的筆者が研究室に配属され，薬剤学における研究をな siRNA デリバリーが可能になるのではないかと考開始したのは 2003 年の 4 月であるが，当時は 1998えた．また，癌細胞において効率的に RNA 干渉を年に線虫において発見された RNA 干渉という現象誘導可能な方法の開発には，癌細胞内の遺伝子発現が哺乳類においても適用可能であることが報告され量を定量的に評価可能な実験系の利用が非常に有用間もない時期であった．RNA 干渉は短い 2 本鎖 RNAであると考え，マウス黒色細胞腫 B16 細胞をモデル（siRNA）が塩基配列特異的に相補的な配列を有するの癌細胞とし，ホタルおよびウミシイタケの 2 種類

mRNA を分解可能な現象であり，その遺伝子発現抑のルシフェラーゼを安定に発現する細胞株 B16/dual

制効果は非常に特異性が高くかつ強力であることか

Luc を樹立することで癌細胞における遺伝子発現抑ら注目を集め始めていた．当時の研究室はいち早く制効果についての定量的な評価方法を開発した．ここの現象に着目し，その利用に向けての研究を始めの細胞をマウス皮下に移植することにより作製したていた．そのような研究室の中で，筆者は in vivo

原発性腫瘍モデルにおいて，ホタルルシフェラーゼ

RNA 干渉の効率的誘導法の開発と癌治療への適用を標的とする siRNA または siRNA 発現プラスミド
DNA 水溶液を腫瘍組織内に注入後に電気パルスを*2008 年 3 月京都大学大学院薬学研究科博士課程修了．
2008 年 4 月〜2009 年 3 月ピッツバーグ大学博士研究員．
2009 年 4 月より京都大学大学院薬学研究科助教，現在に至る．好きな言葉：一石二鳥．趣味：スポーツ全般．
連絡先：〒606–8501 京都府京都市左京区吉田下阿達町 46–29 E-mail: ytakahashi@pharm.kyoto-u.ac.jp
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加えることで投与 24 時間後の標的遺伝子発現を対照群の約 30% にまで抑制可能であることを見出した．また，B16 細胞において癌細胞の増殖等に関与し た 遺 伝 子 で あ る b-catenin，hypoxia inducible
factor-1a（HIF-1a）の発現を抑制することで癌細薬 剤 学 Vol. 73, No. 2 (2013)13/02/01 16:49

図 1 RNA 干渉の誘導による疾患治療

遺伝子発現抑制効果は，ある時点での最大抑制率を指標に評価されることが多いが，遺伝子発現抑制の結果として表れる効果の観点からは抑制強度のみならず抑制時間も重要である．そこで，薬物速度論解
析において用いられるモーメント解析を，B16/dual
Luc 細胞のルシフェラーゼ活性の経時変化データに当てはめ，AUCIE および MRTIE を RNA 干渉効果の強度および持続時間の新たな指標として提唱した．また，siRNA および siRNA 発現プラスミド DNAによる遺伝子発現抑制効果の定量的比較を行う際にも本方法論は有用であり，1 分子あたりの遺伝子発現抑制効果は siRNA 発現プラスミド DNA の方が図2

固形腫瘍組織における RNA 干渉の誘導による治療効果

siRNA と比較して約 50 倍強力であることを示した．
また，遺伝子発現抑制効果の持続について MRTIE を用いて評価を行ったところ，siRNA 発現プラスミド胞の増殖を抑制可能であることを培養細胞におけるDNA の方が 2〜3 倍有利であった．

実験系で見出し，上述の方法を用いて腫瘍組織にお3．博 士 課 程ける b-catenin あるいは HIF-1a の遺伝子発現を抑制することで，腫瘍組織の増殖を大幅に抑制するこ
1）とに成功した（図 2） ．

博士課程に進学し引き続き RNA 干渉を利用した癌治療法の開発を行った．原発性腫瘍に関する検討

また，構築した B16/dual Luc 細胞は簡便かつ定においては腫瘍内への直接投与が有効であったが，量的に RNA 干渉効果を評価可能とする細胞である．

癌細胞が広範囲に分布する転移癌に対しては経血管筆者らの検討において，種々の濃度の siRNA をトラ投与が有効であると考えた．そこで，肝臓への高効ンスフェクションした後のルシフェラーゼ活性を経率遺伝子導入法として知られるハイドロダイナミク

時的に評価し，遺伝子発現抑制効果が siRNA の濃度ス法を利用することで，肝臓に転移した癌細胞にも依存的であることが示されている．RNA 干渉による血流を介して siRNA および siRNA 発現プラスミド

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図 3 肝転移腫瘍における RNA 干渉の誘導による治療効果

DNA をデリバリー可能ではないかと考えた．その伝子発現抑制以外の要因が肝臓における RNA 干渉

結果，ルシフェラーゼ遺伝子で標識した B16/dualの誘導による癌細胞増殖抑制効果に関与しているとLuc 細胞を門脈内に移植することで作成した実験的推察された．HIF-1a は低酸素条件下で誘導され，肝転移モデルマウスにおいて，肝臓中癌細胞での標VEGF に代表される癌細胞の転移・増殖を促進する的遺伝子発現を有意に対照群の 40〜50% 程度にま遺伝子の転写を亢進する遺伝子であるが，正常細胞で抑制可能であることを見出した．
そこで，マウス結においても低酸素状態によって誘導される遺伝子で腸癌細胞株 Colon26 細胞を門脈より移植することであり，正常細胞におけるその発現の誘導によっても作製した肝転移腫瘍モデルを用いて b-catenin また癌細胞の増殖・転移を亢進しうる．より詳細な検討

は HIF-1a を標的とする siRNA 発現プラスミド DNAを行ったところ，癌細胞の肝臓への転移によって肝の癌細胞増殖抑制効果について調べた．培養 Colon26臓構成細胞においても HIF-1a の発現が亢進するこ細胞を用いた in vitro の系においては b-catenin をと，肝臓構成細胞における HIF-1a の発現のみを抑標的とする siRNA 発現プラスミド DNA の方が HIF-制した場合においても癌転移・増殖を有意に抑制し1a を標的とする pshRNA より強力な癌細胞増殖抑たことから，肝臓構成細胞における HIF-1a の発現制効果を示した．両 siRNA 発現プラスミド DNA のが癌転移を促進することが明らかとなった．その一物性は同じであり肝臓中の癌細胞へのデリバリー効方，癌細胞および肝臓構成細胞の両細胞群での HIF-率は同程度であることから，b-catenin を標的とす

1a の発現を抑制することで，肝臓構成細胞におけるる siRNA 発現プラスミド DNA の方が肝転移性腫瘍

HIF1a の発現を抑制した場合より顕著に癌細胞増モデルにおいて高い癌細胞増殖抑制効果を示すと考殖が抑制されたことから，肝臓に到達した癌細胞おえられた．しかしながら b-catenin を標的とする

よび肝臓構成細胞の両者における HIF-1a の発現がsiRNA 発現プラスミド DNA の投与では癌細胞増殖癌転移・増殖を促進することが明らかとなった．以

抑制効果はほとんど認められなかった一方で，HIF-上の結果から HIF-1a を標的とすることで，癌細胞1a を標的とする siRNA 発現プラスミド DNA を投のみならず肝臓構成細胞も標的細胞となりえること，与したところ癌細胞の増殖を効率よく抑制可能であおよび HIF-1a を標的とした RNA 干渉が肝転移抑った（図 3）．このことから，肝臓中の癌細胞内の遺制に有効であることが示された 2）．

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博士課程に進学したということで，もうひとつのおよび生理機能については未だ明らかとされていなテーマとしてインターフェロン（IFN）を遺伝子のい受容体が多数存在し，オーファン核内受容体と呼形で投与する，IFN 遺伝子治療に関する研究も行う

ばれている．AKR1B7（aldo-keto reductase family

ことになった．研究テーマが増えたことに伴い，そ1, member 7）は AKR スーパーファミリーの一員でのテーマの遂行のために 4 回生，修士課程の院生をあり，過酸化脂質の解毒に関して重要な役割を果た直接指導する機会をいただいたが，そのことによっすことが示唆されている酵素である．その遺伝子発て助教になった後の研究指導につながるいい経験と現の調節について核内受容体の関与が示唆されておなった．幅広い研究テーマに興味を持つきっかけにり，小腸における AKR1B7 の発現が Liver X Recep-もなり，その後の研究生活の幅を広げるのにも非常tor（LXR）によって誘導されることが既に報告されに役立ったのではないかと思われる．ていた．一方，pregnane X receptor（PXR）および博士課程に進学して 1 年目の春に早速アメリカ遺constitutive androstane receptor（CAR）は異物に伝子治療学会（ASGT）で発表する機会を与えてい対してセンサーとして働き，外因性および内因性有ただいた．このときの演題が口頭発表に採択され，害物質の解毒に関与する核内受容体であることか英語で口頭発表するという貴重な経験をすることがら，AKR1B7 の発現調節への関与が考えられたが，できた．博士課程に進学した当初からアカデミアにその詳細については不明であった．そこで筆者らは行きたいという希望を持っていたが，博士課程在学

PXR および CAR による AKR1B7 の発現調節への中に海外の学会に積極的に参加させていただいたこ

関与についてマウスモデルを用いて検討を行った．ともあり，博士課程の 2 年目には卒業後には海外でPXR のアゴニスト，PCN あるいは CAR のアゴニス研究を行ってみたいと思うようになっていた．病態トである TCPOBOP をマウスに投与することで，肝情報薬学分野の西川元也准教授に Pittsuburgh 大学

臓中，あるいは小腸における AKR1B7 の mRNA 発の Wen Xie 博士を紹介していただいた．Xie 博士の現が上昇した．また，PXR KO マウスにおいては，研究のメインテーマは，遺伝子発現の制御因子としPCN の投与による AKR1B7 の mRNA 発現の上昇て働く核内受容体による生理機能の解析であった．

は認められなかった一方で，TCPOBOP の投与によRNA 干渉とはまた別の機構で働く遺伝子発現制御る AKR1B7 の発現上昇が観察された．CAR KO マ機構であり，他の遺伝子発現制御機構について習得

ウスにおいては逆の結果が観察された．また，PCNするいい機会と考え Xie 博士の研究室にお世話になを投与したのち，マウス小腸中の過酸化脂質の指標ることに決めた．

である Malondialdehyde（MDA）量を測定したところ，PCN の投与により MDA 量は減少した．よっ4．留 学 時 代て，PXR の活性化により酵素活性を有した AKR1B7

2008 年の 3 月に博士課程を修了し，4 月よりアメが誘導されることが示唆された．AKR1B7 のプロモ

リカの Pittsburgh 大学薬学部の Xie 博士の Centerーターは PXR あるいは CAR によって活性化されfor Pharmacogenetics に postdoctoral associate とた．また，プロモーター中の塩基配列について調べしてお世話になった．渡米後，大学との雇用関係のたところ，3 つの Direct Repeat（DR）4 型の核内締結から始まり，実験を行うのに必要な，動物実験・受容体結合配列を見出した．発見した DR4 は PXR-放射性物質取り扱い・感染性サンプル取り扱いに関RXR および CAR-RXR ヘテロダイマーと結合可能でする講習を受けた後に研究を開始した．

あった．また，プロモーター中の DR4 に変異を導

核内受容体は細胞質または核内に存在し，各種ホ入したところ PXR および CAR による活性化は消失

ルモンや一部の脂肪酸など脂溶性の高い物質をリガした．以上の結果については幸運にも論文にまとめンドとする受容体であり，リガンドを認識した後特ることができた 3）．

定の遺伝子の DNA 配列に結合してその遺伝子発現別のテーマとして，Sulfotransferase 2（SULT2）を調節する．初期に同定された核内受容体の配列をと呼ばれるトランスポーターをノックアウトしたマ

もとに配列の相同性から多数の核内受容体スーパーウスを創製することでその生理機能について明らかファミリーがクローニングされたが，そのリガンドにすることを目指す研究を開始した．ノックアウト

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マウスの創製は一般的に数年かかることが多く，筆ついて考えるいい機会となった．一方で，6 年制学

者は標的遺伝子のノックアウトに用いるプラスミド生は，4 回生時には OSCE および Computer Based

DNA の作成と ES 細胞への導入までを済ませて引きTesting（CBT）の準備期間，5 回生時は計 22 週間継いでいる．2009 年 4 月から京都大学の薬学部に助にわたる病院実習・薬局実習，6 回生時には国家試教として赴任することが決まり，1 年間のアメリカ

験とそのための試験準備期間があるために，4 年制

留学生活を終えて帰国することとなった．

学生に比べて研究に使える時間が減少するが，効果的に研究指導を行うことで効率的に研究を進めても

5．助 教 時 代

らえればと考える．

原発性腫瘍モデル，あるいは転移性腫瘍モデルい6．お わ り にずれの場合においても癌細胞の増殖の抑制に成功したが，癌細胞の根絶は非常に困難であった．効果的

以上，薬剤学の研究に関わるに至った経緯とそのな腫瘍増殖の抑制が可能であった原発性腫瘍モデル

後の研究生活について，振り返った．今後は，既存においても癌細胞の根絶は困難であり肺への癌細胞の DDS の概念にとらわれず，より効果的に RNA 干4）の転移も観察された ．その大きな原因はデリバリ渉を誘導可能な方法の開発を行っていきたいと考え

ー効率が十分ではないために，デリバリーされなかる．今回振り返ってみると，今までに多くの方々にった一部の生存した癌細胞が再び増殖してしまったお世話になってきたことを改めて実感したので，そためと考えられる．そこで，より効果的な治療法のれらの方々に感謝しつつ，筆者の方からも何かをお開発にはより多数の標的細胞において RNA 干渉を返ししながら研究を続けていけたらと思う．

誘導可能なデリバリーに関する方法論の開発が必要

引 用 文 献と考え，現在さらに効率的に RNA 干渉を誘導可能な方法の開発について研究を行っている．また，RNA 干渉の誘導による抗腫瘍効果を癌免疫療法などの他の手法との併用による，癌細胞の根絶方法の開発についても検討を行う予定である．RNA 干渉を疾患治療に直接適用するだけではなく，他の手法との併用の可能性についても検討しており，前述のIFN 遺伝子治療と RNA 干渉による遺伝子発現抑制効果を併用することで，IFN 遺伝子治療を改善可能であることも見出している 5）．今後は，併用の最適化についてさらに研究したいと考える．
筆者が着任した年は薬学部の 6 年制教育がスタートして初めての 4 回生が研究室に配属される年であった．配属された 6 年制学生については研究科全体でも当然初めてのこともあり，教育のカリキュラムも試行錯誤しているような状況であった．そのような状況において，教員として実務実習の事前学習，とくに Objective Structured Clinical Examination（OSCE）に関する教育に携わらせていただき，教員

1) Y. Takahashi, M. Nishikawa, Y. Takakura. Suppression of tumor growth by intratumoral injection of short hairpin RNA-expressing plasmid
DNA targeting b-catenin or hypoxia-inducible
factor 1a, J. Control. Release, 116, 90–95 (2006).
2) Y. Takahashi, M. Nishikawa, Y. Takakura. Inhibition of tumor cell growth in the liver by RNA interference-mediated suppression of HIF-1alphaexpression in tumor cells and hepatocytes, GeneTher., 15, 572–582 (2008).
3) M. J. Liu, Y. Takahashi, T. Wada, J. He, J. Gao, Y.
Tian, S. Li, W. Xie, The aldo-keto reductase Akr1b7
gene is a common transcriptional target of xenobiotic receptors pregnane X receptor and constitutive androstane receptor, Mol. Pharmacol., 76,604–611 (2009).
4) Y. Takahashi, M. Nishikawa, T. Suehara, N. Takiguchi, Y. Takakura, Gene silencing of b-catenin in
melanoma cells retards their growth but promotes
the formation of pulmonary metastasis in mice,
Int. J. Cancer, 123, 2315–2320 (2008).
5) Y. Takahashi, E. Vikman, M. Nishikawa, M.
Ando, Y. Watanabe, Y. Takakura, Persistent interferon transgene expression by RNA interference-mediated silencing of interferon receptors,
J. Gene Med., 12, 739–746 (2010).

生活をスタートするに当たり薬学部における教育に

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