薬 剤 学, 68 (2), 122―126 (2008)≪若手研究者紹介≫

転写因子およびエピジェネティクス系によるトランスポーターの発現制御

菊地良太

Ryota Kikuchi

東京大学大学院薬学系研究科分子薬物動態学教室

1．はじめ

その後博士課程に進学したわけだが，その頃の当に研究室には，博士課程の学生は自分自身で Ph. D. に

筆者は東京大学薬学部在籍時より杉山雄一教授の値する研究テーマを設定し遂行するという暗黙の了主宰する分子薬物動態学教室においてトランスポー解があった．筆者もこれに従い，いざ自身の研究ター研究に携わり，修士課程・博士課程を修了後，テーマについて思いを巡らせてみたのだが，予想は平成 19 年 4 月からは日本学術振興会特別研究員していたものの作業は難航を極めた．当初提案した（PD）として，同教室で日々研究に勤しむ日々をテーマは，修士課程での研究テーマの延長とも呼ぶ送っている（ことになっている）．最近は，数人の社べきものであったが，いまいち具体性に欠けるとと会人研究生・大学院生・学部生とともに転写チーム

もに目新しさの感じられない内容であったように思を結成し，自身の博士課程在籍中の研究成果を基盤う．そんな折，生物学系の雑誌の総説を読んでいてとしてトランスポーター研究の新たな方向性を探っ目に留まったのが，「エピジェネティクス」という単ている．同僚と研究成果を分かち合う喜びを感じる語であった．

一方で，指導者としての自分の未熟さも痛感してい当時，分子生物学・遺伝学の知識に乏しかった筆る今日この頃である．本稿では筆者が現在の研究課者には，この単語の意味することが全く想像できな題に至った経緯にも触れつつ，これまでの研究成かった．これは何だろう，そんな軽い気持ちで総説果・今後の展望について概説したい．

を読み進めていったのだが，次第に，エピジェネ2．エピジェネティクスとの出会い

ティクスというのは遺伝子発現制御に関する新しい概念であるということ，従来考えられていた転写因筆者が修士課程で取り組んだ研究テーマは，所属子群による発現制御システムよりも高次の制御シス研究室における所謂「王道」な内容であった．詳細テムであること，ポストゲノム時代における生命科は割愛するが，修士課程 2 年間を通じて血液脳関門学の新たなパラダイムであることがわかってきた．に発現する薬物トランスポーターの機能解析を行

様々な実験ツールが揃い，分子論を含めた本格的ない，脳内から循環血中への排出輸送における有機ア研究が始まったのは 90 年代以降らしい．この概念

ニオントランスポーター群の重要性を明らかとした．

をトランスポーター研究に応用できたとしたら…．
ここから筆者の博士課程の研究生活が始まった．

筆者紹介：2002 年 3 月東京大学薬学部薬学科卒業，2007 年 3 月同大学大学院薬学系研究科博士後期課程修了，博士（薬学）を授与される．2006 年 4 月〜 2007 年
3 月日本学術振興会特別研究員（DC2），2007 年 4 月より同 PD として分子薬物動態学教室（杉山雄一教授）に所属．研究のモットー：常にストイック．楽な方向に行かない．趣味：20 年来続けているピアノ，映画鑑賞．
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3．研 究 の 背 景
前置きが長くなってしまったが，ここからは筆者らのこれまでの研究成果について概説していきたいと思う．できる限り平易に記したつもりだが，多少薬 剤 学 Vol. 68, No. 2 (2008)

なりの専門用語についてはご容赦いただきたい．

トランスポーターの基質特異性・組織分布について既に御存じの読者の方々も多いと思うが，トランは多くの情報が蓄積され体系化されつつある．一方

スポーターは医薬品を含む低分子化合物の細胞膜透で，トランスポーターの組織特異的発現制御メカニ過を制御し，細胞内への取り込みあるいは排出を行ズムに関する知見は殆ど得られていない．だが上述

う膜タンパク質群である．これらは肝臓，腎臓，小したように，トランスポーターの組織特異性は基質腸など体内の様々な組織に発現し，薬物・内因性物薬物の体内動態や薬効，毒性と直結することから，質の吸収・分布・排泄に重要な役割を果たしている．

そのメカニズムの解析は基礎のみならず臨床上も重特に異物解毒に重要な組織である肝臓，腎臓には，要な意味を持っている．

異物排泄に働く薬物トランスポーター群が発現し，従来，遺伝子発現制御機構を解析する際は転写因

これまでの多くの in vivo，in vitro の研究により，子群のネットワークによる制御系に主に焦点が当てトランスポーターの組織特異的発現は基質薬物の組られてきたが，近年，クロマチン構造を介したより織分布や消失経路，また薬効や毒性の重要な決定因高次の制御メカニズム（エピジェネティクス系）の子となっていることが明らかとなってきた 1）．

重要性が認識されつつある．エピジェネティクスと

一般的に，比較的高分子量で両親媒性の薬物は主

は「細胞世代を超えて継承され得る，塩基配列の変に肝臓での代謝・胆汁排泄を受けるのに対し，低分化を伴わない遺伝子機能について研究する学問領

子量で親水性の薬物は主に腎臓において尿中に排泄域」と定義され，DNA メチル化やヒストンのアセチされる．両親媒性の有機アニオン化合物についてル化・メチル化などのクロマチン修飾は，エピジェは，肝細胞の血管側膜に主に Organic Anion Trans-ネティック制御機構の中心的役割を果たしている．

porting Polypeptide（OATP）family に属するトラ

これまでにゲノムインプリンティング，X 染色体不ンスポーターが発現し，肝取り込み過程に重要な役活性化，発生・分化，発癌など，多くの生命現象が割を果たしている．一方で，比較的親水性の高い薬

エピジェネティクス系により制御されることが報告

物や一部の両親媒性有機アニオン化合物について，されている．これらに加え，時期・組織特異的な遺腎臓近位尿細管上皮細胞の血管側膜に Organic An-

伝子発現における DNA メチル化の重要性も明らか

ion Transporter（OAT）family に属する二つのトになりつつある 2）．

ランスポーター（OAT1 および OAT3）が同定され，脊椎動物においては 5’-CG-3’ 配列（CpG dinucleo-in vitro，in vivo の解析によりこれらの化合物の尿tide）中の cytosine 残基が DNA メチル化のターゲッ細管分泌に関与することが示された．また OAT1，トとなり，CpG dinucleotide のメチル化は，配列特OAT3 と同じ遺伝子ファミリー（SLC22）に属する異的な転写因子の結合阻害，あるいは配列非依存的OAT4 および Urate Transporter 1（URAT1）は尿なクロマチンリモデリング因子（メチル化 DNA 結細管再吸収に関与することが示唆されており，特に合タンパク質やヒストン脱アセチル化酵素など）のURAT1 は尿酸の再吸収に重要な役割を果たしてい結合によるヘテロクロマチン化を引き起こす．転写る（図 1）．

因子による調節は，DNA が低メチル化状態でクロ薬物トランスポーター研究における分子生物学的マチンが弛緩している領域においてのみ有効であアプローチが始まって 20 年以上が経過し，主要なり，不活性化領域では機能できない．故に，DNA メチル化やヒストン修飾による転写制御は，遺伝子発現調節機構の最上位に位置する（図 2）．
筆者らが研究をスタートさせる以前は，主に肝臓に発現する薬物トランスポーターや胆汁酸トランスポーターに関して転写因子による制御機構が解析され情報が整理されていたが 3），一方で腎臓に発現するトランスポーターに関する情報は殆ど得られてい図 1 肝臓・腎臓における薬物の排泄に関与するトランスポーターなかった．また肝臓，腎臓いずれにおいても，エピジェネティクス系がトランスポーター発現制御に寄薬 剤 学 Vol. 68, No. 2 (2008)123図 3 HNF1α/β による hOAT3 プロモーターの活性化
図 2 転写因子とエピジェネティクス系による遺伝子発現調節機構の変異の導入により HNF1 による転写活性化が低下 す る こ と，ゲ ル シ フ ト 法 に よ り そ れ ぞ れ の与するのかどうかは検討されてこなかった．このよ

HNF1-motif には in vitro で HNF1α/β が直接結合すうな状況を踏まえ，筆者らは腎臓特異的に発現し薬ることを確認した．さらに HNF1α-null マウスの腎物・内因性物質の尿細管分泌・再吸収に重要な役割臓では，Oat1，Urat1 の mRNA 発現量が顕著に低を果たす OAT1，OAT3，URAT1 に焦点を当て，そ下していることを示した（Oat3 については，同時期れらの組織特異的発現制御メカニズムを転写因子制に他グループより，HNF1α-null マウスにおいて発御系，エピジェネティクス系の両面から解析した．

現量が野生型マウスに比べて有意に低下しているこ

4．Hepatocyte Nuclear Factor 1 a /b による転写制御と が 報 告 さ れ た 5））．以 上 の 解 析 結 果 よ り，
HNF1α/β が腎臓特異的有機アニオントランスポーターの発現制御に関与する共通の因子であることが腎臓特異的トランスポーターの発現制御に関わる転写因子を同定するため，筆者らはまずヒト（h）およびマウス（m）OAT1，OAT3，URAT1 遺伝子

明らかとなった 6 〜 8）．
5．エピジェネティクス系による発現制御のプロモーター領域について，転写因子結合部位の腎臓特異的有機アニオントランスポーター群の転in silico 予測を行った．その結果，いずれのトラン写調節における HNF1α/β の重要性を示したもの

スポーターにおいても転写開始点より 60 bp 程上流の，組織特異的発現制御機構については，まだ解決に Hepatocyte Nuclear Factor 1（HNF1）の認識配せねばならない大きな問題があった．前述の通り，列が存在し，このモチーフは種間で保存されている

HNF1 が同定された当時は，肝臓特異的遺伝子の発ことが明らかになった．HNF1 は薬物トランスポー現に重要な転写因子という位置付けであった．だがターを含む多くの肝臓特異的遺伝子の転写を正に制遺伝子欠損動物の作成・解析なども含めたその後の御する因子であり，HNF1α と HNF1β の 2 つの分子研究により，腎臓・膵臓など，肝外組織における種 が homo- あ る い は heterodimer を 形 成 し て 働

HNF1 の機能が次第に明らかとなってきた．筆者らく 4）．の研究結果もその一端をなし，腎臓トランスポー

次に，in silico 予測の結果を検証するため，lu-

ターの発現制御における HNF1 の役割を一般化し

ciferase assay により h/mOAT1，OAT3，URAT1 のた．だが，HNF1α/β とそのターゲット遺伝子の組プロモーター解析を行った．HNF1α/β を内因性に織分布は一致しない．HNF1α/β は肝臓・腎臓・膵臓・発現しない HEK293 細胞を用い，各トランスポー

小腸など様々な組織に発現しているが，筆者らが解ターのプロモーター活性に対する HNF1α/β 強制発

析した OAT1，OAT3，URAT1 は腎臓特異的な発現現の影響を検討したところ，いずれのトランスポーを示す．同様な組織分布の不一致は，これまでにターにおいても HNF1α/β による強いプロモーター

HNF1 による転写制御を受けることが示されている活性上昇が観察された（図 3）．また HNF1-motif へその他多くの遺伝子においても観察される．この問

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題に対する答えはエピジェネティクス系にある，筆ロファイルを決定したところ，肝臓および腎臓髄質者はそう確信し，腎臓特異的トランスポーターの発においてプロモーター領域は高メチル化状態である現制御における DNA メチル化の関与を検討した．

一方で，腎臓皮質では低メチル化状態であった（図まず筆者らは hOAT3 遺伝子が DNA メチル化に5）．この DNA メチル化プロファイルは腎臓皮質特よる発現調節を受けていることを in vitro で実証し異的に発現する mUrat1 の組織分布と一致していた．HEK293 細 胞 に HNF1α/β を 一 過 性 に 発 現 さた 7）．OAT1 遺伝子については，現在，DNA メチルせ，DNA メチル化阻害剤である 5-aza-2’-deoxycyti-化のみならずクロマチン構造も視野にいれ，腎臓特dine（5azadC）で処理し，RT-PCR 法により hOAT3異的発現の決定因子としてのエピジェネティクス系の発現を検討したところ，HNF1α 単独あるいはの関与を検討している．

HNF1α と HNF1β の両者を強制発現させ，DNA を

6．今 後 の 展 望脱メチル化することにより，hOAT3 の発現が転写誘導されることが明らかとなった（図 4）．この結果

筆者らの解析から，OAT3，URAT1，そしておそは，hOAT3 の転写には HNF1α/β の発現と DNA 脱らく OAT1 の腎臓特異的発現は，DNA メチル化にメチル化の協調作用が必要であることを示唆す

よる転写抑制及び HNF1α/β による転写活性化の協る 6）．また mUrat1 遺伝子について，in vivo で組織調作用により成り立っていることが示唆された（図特異的発現と DNA メチル化の間に負の相関がある6）．腎臓皮質ではプロモーター領域が低メチル化ことを示した．マウス肝臓，腎臓皮質，及び腎臓髄状態であるためクロマチンが弛緩した状態にあり，質より genome DNA を抽出し，bisulfite sequenc-HNF1α/β がプロモーター内の認識配列に結合し転ing 法によりプロモーター領域の DNA メチル化プ写が活性化される．一方で，肝臓など腎臓以外の組織においては DNA メチル化がスイッチとなって近図 4 DNA 脱メチル化による hOAT3 の発現誘導

図 5 mUrat1 プロモーターの DNA メチル化プロファイル

図 6 腎臓特異的トランスポーターの発現制御メカニズム薬 剤 学 Vol. 68, No. 2 (2008)125傍のクロマチン領域が凝縮することで，HNF1α/β引とプロモーターの相互作用が起こらず，腎臓特異的トランスポーターの発現が抑制されているものと思われる．従来，組織特異的遺伝子発現は複数の転写因子のネットワークにより制御されていると考えられてきた．だが，筆者らはより高次なレベルから組織特異性について解析し，DNA メチル化と HNF1の協調作用という概念を構築・実証した．今後はこのメカニズムが他の多くの肝臓・腎臓特異的遺伝子について成り立つのかどうか，HNF1 以外の転写因子についても同様の概念が成り立つのかどうか，より網羅的な解析が望まれる．
得られる情報の臨床応用も興味深い．DNA メチル化と癌との関連が指摘されているが，エピジェネティクス系による制御が生命科学の多岐の分野に及んでいることを考慮すると，その他多くの疾患の要因として DNA メチル化・クロマチン修飾を念頭に入れる必要があるだろう 9）．各細胞・組織や正常，病態時におけるゲノム全域のエピジェネティック状
況の解析，情報のデータベース化を目的としたエピゲノムプロジェクトも始まっており，様々な研究分野における成果を期待したい．
7．おわりに修士課程・博士課程を通じて，筆者の研究に際し終始御指導・御鞭撻を頂いた当研究室・杉山雄一教授，楠原洋之准教授に心より深謝いたします．またエピジェネティクス系の解析にあたり，多くの御助言を頂いた東京大学大学院農学生命科学研究科・塩田邦郎教授，八木慎太郎特任教授，服部中博士，佐藤俊博士，HNF1α-null マウスの御供与を頂いた
NIH の Dr. Gonzalez，Dr. Kim に感謝いたします．
そして最後に，筆者の研究を支えてくださったグループの皆様に，この場を借りて深くお礼申し上げます．

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用文献1) H. Kusuhara, Y. Sugiyama, Role of transporters
in the tissue-selective distribution and elimination of drugs: Transporters in the liver, small intestine, brain and kidney, J. Control. Release, 78(1-3), 43–54 (2002).
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3) G.A. Kullak-Ublick, M.B. Becker, Regulation ofdrug and bile salt transporters in liver and intestine, Drug Metab. Rev., 35 (4), 305–317 (2003).
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Shiota, T. Ushijima, J.M. Greally, Applying wholegenome studies of epigenetic regulation to study
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