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光刺激で薬効制御が可能な抗体薬物複合体の開発

Author(s)渡邉, 貴嘉Citation

科学研究費助成事業研究成果報告書: 1‑5

Issue Date

2018‑06‑01

TypeResearch Paper

Text version

publisher

URL

http://hdl.handle.net/10119/15413

RightsDescription

若手研究(B), 研究期間：2015〜2017, 課題番号：15K16561, 研究者番号：70554020, 研究分野：化学
生物学

Japan Advanced Institute of Science and Technology

２版

様式

Ｃ−１９、Ｆ−１９−１、Ｚ−１９ （共通）

科学研究費助成事業

研究成果報告書
平成 ３０ 年

６ 月

１ 日現在

機関番号： １３３０２
研究種目： 若手研究(B)
研究期間： 2015 〜 2017
課題番号： １５Ｋ１６５６１
研究課題名（和文）光刺激で薬効制御が可能な抗体薬物複合体の開発

研究課題名（英文）Development of antibody‑drug conjugate for controlling drug efficacy byphoto‑irradiation
研究代表者
渡邉貴嘉（WATANABE, TAKAYOSHI）

北陸先端科学技術大学院大学・先端科学技術研究科・助教

研究者番号：７０５５４０２０
交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）

3,100,000 円

研究成果の概要（和文）：本研究では、非天然アミノ酸を用いずに、タンパク質の活性を損なうことなく、タンパク質のN末端特異的に機能性分子を修飾する新手法の開発を行った。そして、このN末端特異的修飾法を用いて、抗体医薬として臨床で用いられているIgG抗体に対して抗がん剤を修飾した抗体薬物複合体の新規合成法を開発した。さらに、これらの研究過程を通じて、ケージド抗体薬物複合体の合理的な設計指針に関する知見を得ることができた。

研究成果の概要（英文）：In this study, a novel method for modifying functional molecules specific tothe N‑terminus of proteins while maintaining the activity of proteins without using non‑naturalamino acids was developed. By using this N‑terminal‑specific modification method, development of anovel method for synthesizing an antibody‑drug conjugate in which an anticancer drug has been
modified against IgG antibody used in clinical practice as antibody drugs was achieved. Furthermore,through these research processes, the findings on rational design guidelines for synthesizing caged
antibody‑drug conjugate could be obtained.

研究分野： 化学生物学
キーワード： タンパク質抗体

抗体薬物複合体

非天然アミノ酸

ケージド化合物

様式Ｃ－１９、Ｆ－１９－１、Ｚ－１９、ＣＫ－１９（共通）１．研究開始当初の背景ことから、この技術を実用的なレベルに発展
近年、抗体医薬として抗体に抗がん剤などさせるためには、抗原認識部位や ADCC 活性の薬剤を結合させた「抗体薬物複合体」が注に関与しない抗体部位に薬剤を修飾した抗目されている。これは、抗体の高い抗原特異体薬物複合体の大量合成を可能にする必要性を利用して薬剤を疾患部位に効率よく送がある。さらに、非天然アミノ酸を用いずに達できるため、単独では生体内毒性が強すぎ
市販の抗体の特定部位に薬剤を修飾する技る薬剤が改めて薬剤候補となる可能性を持術が開発されれば、様々な抗体に適用可能なっている。抗体薬物複合体は「①抗体」、「②抗体薬物複合体の汎用的な合成法になるこ抗がん剤などの薬剤」、「③抗体と薬剤を連結とが期待される。
するリンカー配列」から構成され、複合体は標的細胞に取り込まれた後リソソーム分解
２．研究の目的系においてリンカー配列が分解されること
以上のような背景のもと、本研究では標的で薬剤が放出される（Acc. Chem. Res. 41,細胞に送達されるまでは複合体が安定かつ98-107 (2008)）。そのため、抗体薬物複合体
薬剤活性が抑えられ、標的細胞において光照は標的細胞内で適切に薬剤が放出されるよ射によって確実に薬剤を放出可能なケージうに設計する必要があり、現在はリンカー配ド抗体薬物複合体の開発を目的とする（図列にジスルフィド結合や標的細胞内で発現１）。
上昇している酵素で分解される構造を組みそのためにまず、薬剤もしくはケージド薬込み、標的細胞内で自発的にリンカーが分解剤を抗体の特定部位に高効率に修飾するたされ薬剤を放出させる設計が一般的であるめの新手法の開発を行う。具体的には、タン（Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2010)）。しパク質の活性を損なうことなく薬剤を抗体かし、このようなリンカー配列は血中で分解の N 末端特異的に修飾する新手法の開発をされる場合があり、標的細胞送達前に毒性の進める。
高い薬剤が非特異的に放出されることに伴続いて、この部位特異的修飾法を用いて、う副作用が懸念されている（Cancer Res. 69,
抗体医薬として用いられている IgG 抗体に2358-2364 (2009)）。よって、標的細胞に送達対して抗がん剤を修飾した抗体薬物複合体されるまでは複合体が安定かつ薬剤活性もの新規合成法の開発を目指す。さらに、抗が抑えられ、標的細胞内で確実に薬剤を放出可
ん剤に光分解性保護基を修飾し薬効を一時

能な抗体薬物複合体が開発されれば、副作用  的に抑えたケージド抗がん剤を合成し、IgGが抑えられて高い治療効果が見込める新規抗体への部位特異的修飾についての検討も抗体医薬の開発に繋がると期待される。
行う。
このような抗体薬物複合体を開発するた 
めに、ケージド化合物の化学は有用である。

タンパク質や核酸などの生理活性に関わる官能基を光分解性保護基で修飾しその生理活性を一時的に不活性化させたケージド化
" !  合物は、光照射により生理活性を ON にする# $ことができる。そこで、抗体にケージド薬剤
図１．ケージド抗体薬物複合体を連結させることで、薬剤にドラッグデリバリー機能を付与するだけでなく、標的細胞の３．研究の方法
みで活性を持つ薬剤の放出を制御可能だと（１）タンパク質の N 末端特異的修飾法の開発着想した。
これまでの研究を通じて、アルデヒド誘導
一方、抗体のリシン側鎖やシステイン側鎖体を用いることでタンパク質やペプチドの Nにランダムに薬剤を修飾する従来法では、抗末端特異的な機能性分子の修飾が可能にな原認識部位まで修飾されて抗原との親和性るだろうと着想した。そこで、N 末端特異的が 低 下 し た り （ Clin. Cancer Res. 10,修飾法を構築するために、機能性分子として7063-7070 (2004)）、抗体の Fc 部位が修飾さ蛍光標識アルデヒドを化学合成し、弱酸性条れて抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性が低件下で市販の IgG 抗体と還元剤を混合し還下することが懸念される（ Biochem. Soc.
元的アミノ化反応を行った。IgG 抗体への蛍Trans. 30, 487-490 (2002)）。このようなラン光基の修飾は、電気泳動および質量分析で評ダム修飾法に対し、研究代表者らは 4 塩基コ価した。さらに、蛍光標識 IgG 抗体に対してドン法などの拡張遺伝暗号を用いて非天然抗原を添加し蛍光スペクトル測定を行うこ
アミノ酸をタンパク質へ部位特異的に導入とで、抗原の結合に伴う蛍光強度変化を測定する技術を開発してきた。さらにこの技術をした。
応用し、研究代表者は生細胞内で芳香族アミンを有する非天然アミノ酸を導入したタン（２）N 末端特異的に抗がん剤を修飾した抗パク質を発現させ、その芳香族アミン特異的体薬物複合体の開発に化学修飾する技術を開発してきた。しかし、上記のタンパク質の N 末端特異的修飾法
生細胞内における非天然アミノ酸を導入しを用いて、IgG 抗体の N 末端特異的に抗がんたタンパク質の発現量はそこまで高くない剤を修飾した抗体薬物複合体の合成を行っ 

た。まず、抗がん剤 Monomethyl auristatin
F（MMAF）の末端アミノ基に対して、末端アルデヒドを有する PEG リンカーを連結させた抗がん剤アルデヒドを化学合成した。その後、抗体医薬であるハーセプチン抗体（抗Her2 IgG 抗体）とともに弱酸性条件下で混合し還元的アミノ化を行った。反応液を電気泳動で分離し CBB 染色を行うことで、抗がん剤の修飾効率を評価した。
さらに、光照射によって抗がん剤の放出を制御可能なケージド抗体薬物複合体の合成を目指して、ケージド抗がん剤の合成を行った。光分解性保護基として光分解効率が優れた 6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-ylmethyl基（Bhc 基）を用い、Bhc 基の 4 位に抗がん剤 MMAF を修飾し、7 位に末端アルデヒド基を持つ PEG リンカーを修飾したケージド抗がん剤の合成を試みた。

認したところ、IgG 抗体の重鎖・軽鎖それぞれが蛍光標識されていることが確認された。
その後、蛍光標識された IgG 抗体をプロテアーゼ分解しフラグメントのタンデム質量分析を行った結果、蛍光標識アルデヒドと抗体の濃度比を調節することで N 末端特異的に蛍光標識されることが確認された。さらに、蛍光標識 IgG 抗体に抗原を添加することで、抗原濃度依存的な蛍光強度の増大が確認されたことから、本手法を用いて IgG 抗体の N末端を修飾しても抗体の活性に影響しないことが実証された（図２）。

（２）N 末端特異的に抗がん剤を修飾した抗体薬物複合体の開発
上記のタンパク質の N 末端特異的修飾法を、抗がん剤を修飾した抗体薬物複合体の合成に応用した。抗がん剤 MMAF のアルデヒド誘導体を化学合成し（図３a）、乳がん治療
４．研究成果薬として臨床応用されているハーセプチン（１）タンパク質の N 末端特異的修飾法の開発
抗体とともに弱酸性条件下で混合し、還元的非天然アミノ酸を導入したタンパク質をアミノ化による抗がん剤の修飾反応を行っ得るためには遺伝子から発現させることがた（図３b）。反応液を SDS-PAGE で分離し必要となるが、市販のタンパク質やペプチドCBB 染色したところ、抗体重鎖の N 末端アに対する部位特異的修飾法が開発されればミノ基への MMAF の修飾は確認できたもの汎用性・実用性の高い技術になると期待されの、IgG 抗体への修飾効率は低かった。このる。そこで、修飾時の反応液の pH を制御す
原因について、前述の研究では低分子の蛍光ることで、タンパク質やペプチドの N 末端特色素を用いたのに対し、MMAF アルデヒド異的な修飾が達成することを試みた。つまり、 はペプチド程度の中分子であることが反応N   
N 末端アミノ基の pKa 値（7〜8）はリシン効率に影響したためと推測した。
側鎖の pKa 値（9〜10）より低いため、pH 5(a)程度の弱酸性条件下における還元的アミノ化反応によって N 末端選択的な修飾が可能 %" PEG$&'(MMAF)になると期待される。そこでまず、リシンを(b)含まない HA ペプチドとリシンを含む FLAG—NHO—NH
HN—
H N—
ペプチドの 2 種類に対して、弱酸性条件下にH%"
おいて蛍光標識アルデヒドを用いた還元的pH 5アミノ化を行った。そして得られたペプチドN
!'#& をタンデム質量分析で確認したところ、両ペプチドとも N 末端が蛍光標識化されていた
図３．(a) 抗がん剤アルデヒドの構造、(b) N
ことから、本手法は市販のペプチドの N 末端末端特異的に抗がん剤を修飾した抗体薬物特異的修飾が可能であることが実証された。
複合体の合成続いて、市販の IgG 抗体に対してもペプチド同様に蛍光標識化を行い（図２）、反応液
*)
IgGN! #% #"
そこで修飾条件の最適化を MMAF アルデを SDS-PAGE で分離後に蛍光イメージを確
ヒドに近い分子量の PEG アルデヒドを用い-NH (α-amino groups)
H Nて進めたところ、反応効率が低下すると考えNH
られる 0 ºC 以下の低温において、IgG 抗体の(ε-amino groups)
N 末端特異的修飾反応が促進されることを発IgG
見した。これは凍結濃縮効果によって修飾反応が促進したと推測しており、引き続き検証&を進めている。一方、0 ºC 以下の低温で修飾+pH 5 4 ºC反応を行うことによる IgG 抗体の活性への影響を調べるために、前述の IgG 抗体の N
TAMRA
末端特異的蛍光標識化を低温で行ったあとHH-N
Nに抗原を添加し蛍光スペクトル測定したと

ころ、抗原濃度依存的に蛍光強度が増大した
ことから、IgG 抗体の抗原結合活性は保持さN!TAMRA%
N!TAMRA%
IgG'#(IgG'#$(れていることが確認された。よって、新たに発見した低温条件下における N 末端特異的図２．IgG 抗体の N 末端特異的蛍光標識化と修飾反応は、IgG 抗体の活性に影響を与えな抗原濃度依存的な蛍光応答
O

HHNOOOOO2223+O

N
HO

HONH

O

O

H

ONO

N

H
N-H-NNOO2O

N
H

NOO

O

N

O

O

CO2H

N
H

H

いことが示された。
続いて、これまでに化学合成した MMAF
アルデヒドに光活性化機能を付与するため、光分解 性保護基であ る Bhc 基 の 4 位にMMAF を、7 位に末端アルデヒド基を持つ
PEG リンカーを修飾したケージド抗がん剤の合成を試みた。ケージド抗がん剤の合成は、MMAF アルデヒドを用いた IgG 抗体の修飾反応条件の結果をケージド抗がん剤の設計に反映させながら進めているため、引き続き新たな設計に基づいたケージド抗がん剤の合成を行い、今後、IgG 抗体への修飾および光反応性の評価を行う予定である。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計２件）
1. Keisuke Fukunaga, Takayoshi Watanabe,
Takahiro
Hohsaka,
Site-specificN-terminal Fluorescent Labeling ofUnprotected Peptides, Peptide Science
2015, 289-290 (2016)（査読有）https://www.prf.or.jp/ps.html
2. Atsushi Yamaguchi, Takayoshi Matsuda,
Kazumasa Ohtake, Tatsuo Yanagisawa,
Shigeyuki
Yokoyama,
Yoshihisa
Fujiwara,
Takayoshi
Watanabe,
Takahiro Hohsaka, Kensaku Sakamoto,
Incorporationofa
DoublyFunctionalized Synthetic Amino Acid
into Proteins for Creating ChemicalandLight-InducedConjugates,
Bioconjugate Chem., 27, 198-206 (2016)（査読有）
doi: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00602〔学会発表〕（計１５件）
1. 福永圭佑、Dian Novitasari、渡邉貴嘉、芳坂貴弘、抗原依存的蛍光変化を示す N
末端蛍光標識抗体の開発、日本化学会第98 春季年会、2018 年 3 月 21 日、日本大学理工学部船橋キャンパス（千葉県・船橋市）
2. Keisuke Fukunaga, Dian Novitasari,
Takayoshi Watanabe, Takahiro Hohsaka,
A novel IgG-based fluorescent probe
showing increased fluorescence uponbinding of antigen, The 6th Official
Conference of the International
Chemical Biology Society (ICBS2017),
Oct. 19th, 2017, Shanghai (China)
3. 福永圭佑、Dian Novitasari、渡邉貴嘉、芳坂貴弘、抗原応答性蛍光プローブ抗体の開発、第 11 回バイオ関連化学シンポジ
ウム、2017 年 9 月 8 日、東京大学弥生キ
ャンパス（東京都・文京区）
4. 芳坂貴弘、福永圭佑、Dian Novitasari、渡邉貴嘉、阿部亮二、大橋広行、N 末端

蛍光標識 IgG による抗原のリアルタイム蛍光検出、第 17 回日本蛋白質科学会年会、2017 年 6 月 22 日、仙台国際センター（宮城県・仙台市）
5. 福永圭佑、渡邉貴嘉、Dian Novitasari、芳坂貴弘、IgG 抗体の N 末端選択的化学修飾による抗原応答性蛍光プローブの開発、日本ケミカルバイオロジー学会 第12 回年会、2017 年 6 月 8 日、北海道大学
クラーク会館（北海道・札幌市）
6. 渡邉貴嘉、リポソームを用いたアミノア
シル tRNA 合成酵素の in vitro 分子進化法の開発と非天然アミノ酸導入タンパク質への応用、第 3 回新学術領域研究「動的秩序と機能」若手研究会、2016 年 10月 12 日、加賀観光ホテル（石川県・加賀市）（招待講演）
7. 福永圭佑、渡邉貴嘉、Novitasari Dian、阿部亮二、大橋広行、芳坂貴弘、N 末端
蛍光標識抗体プローブを用いた抗原の蛍光検出、第 68 回日本生物工学会大会、2016 年 9 月 28 日、富山国際会議場（富山県・富山市）
8. 芳坂貴弘、Huynh Nhat Kim Phuong、吉越健輔、福永圭佑、渡邉貴嘉、部位特異的蛍光標識抗体の合成と抗原の蛍光検出、
第 10 回バイオ関連化学シンポジウム、
2016 年 9 月 7 日、石川県立音楽堂（石川県・金沢市）
9. 渡邉貴嘉、植田淳子、松浦友亮、芳坂貴弘、リポソーム内アミノアシル tRNA 合成
酵素の in vitro 分子進化法の開発と非天然アミノ酸を導入したタンパク質の合成への応用、第 10 回バイオ関連化学シンポジウム、2016 年 9 月 7 日、石川県立音楽堂（石川県・金沢市）
10. 福永圭佑、渡邉貴嘉、Novitasari Dian、阿部亮二、大橋広行、芳坂貴弘、抗体のN 末端選択的蛍光標識による蛍光抗原センサーの開発、第 10 回バイオ関連化学シンポジウム、2016 年 9 月 7 日、石川県立音楽堂（石川県・金沢市）
11. Takayoshi Watanabe, Novel Method forsite-specificprotein
PEGylation
using
aromatic
amine-containing
non-natural amino acid, 8th Japan-Korea
Seminars on Biomolecular Science:
Experiments and Simulation, Feb. 15th,
2016, Okazaki Conference Center(Okazaki, Aichi) (invited).
12. Takayoshi Watanabe, Rumi Shiba,
Takahiro
Hohsaka,
Site-specificproteinPEGylation
throughincorporation
ofaromatic
amine-containing non-natural aminoacid, The international chemical
congress of pacific basin societies
2015 (PACIFICHEM2015), Dec. 20th, 2015,
Honolulu, Hawaii (USA)13. Keisuke Fukunaga, Takayoshi Watanabe,Dian Novitasari, Takahiro Hohsaka,
Novel IgG-based fluorescent biosensor
thatshowsantigen-dependentfluorescenceenhancement,
The
international chemical congress ofpacificbasinsocieties
2015(PACIFICHEM2015), Dec. 15th, 2015,
Honolulu, Hawaii (USA)14. 渡邉貴嘉、福永圭佑、Dian Novitasari、
芳坂貴弘、阿部亮二、大橋広行、N 末端特異的に蛍光標識した IgG による抗原の蛍光検出、第 38 回日本分子生物学会年会・第 88 回日本生化学会大会 合同大会
（BMB2015）、2015 年 12 月 3 日、神戸ポートアイランド（兵庫県・神戸市）
15. 福永圭佑、渡邉貴嘉、Novitasari Dian、阿部亮二、大橋広行、芳坂貴弘、抗原依
存的な蛍光増強を示す N 末端蛍光標識
IgG 抗体の開発、第 9 回バイオ関連化学シンポジウム、2015 年 9 月 10 日、熊本大学工学部黒髪南キャンパス（熊本県・熊本市）
〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）
名称：
発明者：
権利者：
種類：
番号：
出願年月日：
国内外の別：○取得状況（計０件）
名称：
発明者：
権利者：
種類：
番号：
取得年月日：
国内外の別：〔その他〕
ホームページ等
６．研究組織(1)研究代表者
渡邉 貴嘉（WATANABE TAKAYOSHI）
北陸先端科学技術大学院大学・先端科学技術研究科・助教
研究者番号：70554020(2)研究分担者なし(3)連携研究者
なし(4)研究協力者なし