がん免疫キリングアッセイ

Cr リリースアッセイ、LDH アッセイ、フローサイトメトリーに比べて多くの利点がある新たな実験手法のご提案

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がん細胞に対する免疫細胞の細胞傷害活性を同一ウェルからラベルフリーでリアルタイムに連続測定します。

国内販売元

がん細胞に対する免疫細胞の細胞傷害活性いまの実験手法にご満足ですか？
免疫細胞のキリング活性の測定や抗体医薬品の抗がん活性のスクリーニングでは、 クロムリリースアッセイ （51Cr アッセイ）、LDH アッセイ、 フローサイトメトリーなどが用いられてきました。
xCELLigene RTCA システムによるがん免疫キリングアッセイ
は、 近年多くの学術論文や製薬会社でのスクリーニングで活用されている新しい実験手法です。
xCELLigence RTCA システムを用いることで、 従来法の課題を克服して、 誰でも簡単に優れたデータを取得していただけます。

✓ ラベルフリー
RI や蛍光試薬を用いずに非染色で測定が可能です。 Non-RI でしかも従来法よりはるかに少ない手間で測定が可能です。

✓ すべての時間を網羅した連続データ
同一ウェルの細胞のデータを短期から長期まで連続的に測定します。 従来の 1 ウェル 1 タイムポイントでデータを取得する実験手法と異なり大切なキリング活性を見逃しません。 また細胞傷害スピードを指標とした評価を可能にします。

✓ ハイスループット
最大 96 ウェル x6 枚まで同時に実験を行っていただけます。 多くの抗体医薬品候補や様々なコンストラクトのCAR-T 細胞を同時にスクリーニングできます。

✓ ビボ実験の予測性が高いデータを取得
極めて高感度で測定できるため低い ET 比で実験が可能です。 動物体内に近い ET 比でビボ実験の予測性が高いデータを取得します。

● 測定原理 ： ターゲット細胞の生死を電気抵抗値で追跡 ●
Step1

Step2

接着系のターゲット細胞 （がん細胞） をバイオセンサープレート （E-Plate） の各ウェルに播種します。 細胞が増殖すると Cell Index( 電気抵抗値） が上昇します。

ターゲット細胞播種の 24 時間後、あるいは Cell Index を見ながら適切な時間に、エフェクター細胞 （免疫細胞） をウェルに加えます。 エフェクター細胞は浮遊細胞なので電気抵抗値に寄与しません。
※ 細胞が沈んで電極に接することで多少は電気抵抗値が上がりますが、 その上昇は極めてわずかです。
また、 ソフトウェアでエフェクター細胞のみのシグナルを差し引くことができます。

Step3

Step4

エフェクター細胞によりターゲット細胞が傷害を受けると、 ターゲット細胞が電極面に接着しなくなり、 Cell Index が下がります。 xCELLigence RTCA システムでは細胞傷害を極めて高感度かつ客観的にモニタリングできます。

RTCA IMT Software （ が ん 免 疫 キ リ ン グ 実 験 用 オ プ シ ョ ン ソ フ ト ウ ェ ア ） で CellIndex を % Cytolysis に変換し、 様々な解析を実行します。 イメージングデータと異なり主観に頼らず、 短時間で結果を得ることができます。

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● 多くのがん免疫治療モダリティに使用可能 ●CAR-T/TCR-T 細 胞 な ど の 遺 伝 子 改 変 T 細胞から、 免疫チェックポイント阻害薬、 ADCC/
BiTE 活性抗体まで多くの種類のがん免疫療法の in vitro 実験にお使いいただけます。
腫瘍溶解性ウイルスによる溶解試験も可能です。
さらに、 複数のモダリティを組み合わせた複合免疫療法のご実験など、 抗がん効果のタイムスケールが読めない場合でも、 すべてのタイムポ
イ ン ト の デ ー タ を 取 得 可 能 な xCELLigence
RTCA システムは大切な反応を見逃しません。

● 確かなデータ ●xCELLigence RTCA システムを用いて細胞傷害活性を測定した後に、 エフェクター細胞添加 6 時間後および24 時 間 後 の ウ ェ ル か ら タ ー ゲ ッ ト 細 胞 を 回 収 し てフローサイトメーターでアポトーシスアッセイを行いました。
xCELLigence RTCA システムとフローサイトメーターで% Cytolysis が一致することが確かめられました。

● スループットに応じて装置をチョイス ●システムxCELLigence DP

xCELLigence SP

xCELLigence MPスループット

3 x 16 wells(48 ウェル同時測定）

1 x 96 wells（96 ウェル同時測定）

6 x 96 wells（576 ウェル同時測定）P. 2

がん免疫キリングアッセイの生産性を向上！
RTCA IMT ソフトウェア （がん免疫実験用 オプションソフトウェア）
RTCA IMT Software は、 xCELLigence RTCA システムによるがん免疫キリングアッセイのために開発されたオプションソフウェアです。 プレートレイアウトの設定からデータ解析まで行うことができます。
電気抵抗値のプロットデータから % Cytolysis に簡単にデータ変換できるだけでなく、 xCELLigence RTCA システムでは指標 （KT50 値） を用いて細胞傷害活性を評価していただけます。
動画でわかりやすくご理解いただけます
https://www.agilent.com/en/video/
software-pro-for-immunotherapyapplications% Cytolysis と KT50 値の算出
xCELLigence RTCA システムでは、 一次データとして Cell Index （≒電気抵抗値） の時間変化データが得られます （増殖曲線に相当）。
RTCA IMT ソフトウェアを用いると、 Cell Index カーブを、 わずか数クリックのソフトウェア操作で、 % Cytolysis カーブに自動変換できます。 また、 任意の時間における % Cytolysis の数値を棒グラフとして表示して実験群間で比較していただけます。
さらに、 リアルタイム連続データの特性を活かして、 50% のターゲット細胞が傷害を受けるまでの時間 (KT50) を算出することが可能です。 開発中の細胞や抗体医薬品を 「どれだけ速くがん細胞を殺すことができたか」 という指標で評価しランキングしていただけます。 KT50 だけでなく KT20 / KT40 / KT60 / KT80 も算出できます。
抗体製剤の実験において求められる EC50 の算出も可能です。
Cell Index カーブ% Cytolysis

Time to kill 50% target cells (KT50)

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% Cytolysis と KT50 値の算出
% Cytolysis の計算では、 様々なコントロールウェルを用いて補正を行っていただけます。
● ターゲット細胞のみ （Target Cells Alone）● エフェクター細胞のみ （Effector Cells Alone）● ターゲット細胞＋ Mock 細胞 （Target + MockEffectors）● 100% キリングコントロール （Full Lysis Control）
Mock コントロールを用いることで CAR- Ｔ / TCR-T
細胞実験における % Specific Cytolysis の算出が可能です。

シンプルで簡単な実験設定
がん免疫キリングアッセイは、 異なる ET 比での実験、異なる抗体濃度 （dose） での実験に加えて、 ターゲット細胞コントロール、 エフェクター細胞コントロールなどの各種コントロールウェルを設定するため、 プレートのウェルレイアウトが複雑になりがちです。
RTCA IMT Software は標準付属のソフトウェアよりも、 各ウェルの条件 （ターゲット細胞数 ・ エフェクター細胞数 ・ 薬剤濃度 ・ 属性など） をシンプルな操作で設定してただけます。
また、 カラーパイチャートを用いて、 各ウェルの ET 比や薬剤濃度の設定に間違いがないかを視覚的に確認していただけます。

対応装置
製品番号

品名

適用DPSPMP

310100270

RTCA IMT ソフトウェア シングルライセンス (DP 用 )〇1 ライセンス購入時

310100280

RTCA IMT ソフトウェア サイトライセンス (DP 用 )〇20 ライセンス同時購入時

310100290

RTCA IMT ソフトウェア シングルライセンス (SP 用 )〇1 ライセンス購入時

310100300

RTCA IMT ソフトウェア サイトライセンス (SP 用 )〇20 ライセンス同時購入時

310100230

RTCA IMT ソフトウェア シングルライセンス (MP 用 )〇1 ライセンス購入時

310100240

RTCA IMT ソフトウェア サイトライセンス (MP 用 )〇20 ライセンス同時購入時

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浮遊細胞に対する免疫細胞キリングアッセイを行いたい！
IMT アッセイキット （浮遊細胞用キリングアッセイキット）
遺伝子改変 T 細胞療法 （CAR-T 療法 / TCR-T 療法） をはじめとする養子免疫療法は、 現在までのところ、 主に血液がんを対象に開発と実臨床応用が進められています。
IMT アッセイキットは、xCELLigence RTCA システムを用いて、浮遊細胞株に対する免疫治療細胞のキリング活性を測定するために開発されたキットです。
抗体を用いて浮遊系のターゲット細胞をウェル底面に捕捉する（Tethering） ことで、 電気抵抗値によるキリングの評価を可能にします。

原理とデータ例

A. IMT アッセイキットの原理を示す。 バイオセンサープレート （E-Plate） にコートされた抗体 （上図の例では anti-CD71）により浮遊系のターゲット細胞をバイオセンサー表面に捕捉する。 捕捉用抗体はウェル全面にコートされるためターゲット細胞が増殖しても捕捉され続ける。 ターゲット細胞の増殖と細胞死をバイオセンサーを介して電気抵抗値としてモニタリングすることが可能になる。
B. anti-CD71 抗体をコートした E-Plate とコートしていない E-Plate を用意し、 それぞれに K562 細 胞 株 （15,000cells /well） あるいは NK-92 細胞株 （15,000 cells/well） を播種して、 電気抵抗値 （Cell Index） を 72 時間モニタリングした。 ターゲット細胞である K562 細胞は、 anti-CD71 抗体をコートしたウェルだけで電気抵抗値の上昇がみられた。 エフェクター細胞である NK-92 細胞は非コートウェルだけでなく抗体コートしたウェルでも電気抵抗値がほとんど増加せず、 anti-CD71 が NK-92 細胞を捕捉していないことがわかる。
C. anti-CD71 抗体をコートした E-Plate に K562 細胞を播種し （15,000 cells/well）、 24 時間後に様々な ET 比でNK-92 細胞を添加して電気抵抗値 （Cell Index） を 48 時間モニタリングした。 NK-92 細胞 ET 比依存的なキリングが認められた。

ラインナップ
IMT アッセイキットには、 現在 5 種類の捕捉抗体がラインナップされています。 それぞれ右表に示してあるターゲット細胞でワークすることをバリデーション済です。
エ フ ェ ク タ ー 細 胞 と し て は、 NK-92 細 胞、 CAR-T 細 胞、CD-8+ T 細胞などをご使用いただけます。
右表にないターゲット細胞については弊社までお問い合わせください。

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キット （捕捉抗体）

バリデーション済のターゲット細胞

anti-CD9

NALM6, RS4;11, RPMI 8226,
MM1R

anti-CD19

Daudi, Raji, Ramos

anti-CD29

K562, HEL 92.1.7

anti-CD40

Daudi, Raji, Ramos, MEC2

Anti-CD71

K562, HEL 92.1.7

ワークフロー
1 日目

2 日目

E-plate に希釈抗体溶液 （Tethering Reagent） を加えて、 室温で 3 時間インキュベーション。
E-Plate の各ウェルを捕捉抗体でコートする。

各ウェルから培地を一部抜き取り、エフェクター細胞、 抗体、 IL-2 などを加える （クリーンベンチ内）。
E-Plate をインキュベーター内の装置に戻し、 細胞傷害活性をリアルタイムモニタリング

希釈抗体溶液を取り除き PBS で洗浄する。
各ウェルに培地を加えて 37℃で 1 時間平衡化する。
培地のみのバックグランド電気抵抗値を測定する（1 分）。

各ウェルにターゲット細胞を播種して室温で 30 分間放置し、 抗体に細胞を捕捉させる （クリーンベンチ内）。
E-Plate を イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 の xCELLigence
RTCA システムに装着し、 ターゲット細胞の増殖をそのまま 24 時間モニタリングする。

ご注文情報
梱包内容
製品番号

品名

対応枚数

Tethering
Reagent

10xTethering
Buffer

Cytolysis
Reagent

E-Plate 16

E-Plate 968100005

IMT アッセイ ( 抗 -CD40) テザリングキット

250 μ L10 mL

1.5 mL

36 枚分

6 枚分

8100008

IMT アッセイ ( 抗 -CD29) テザリングキット

125 μ L10 mL

1.5 mL

36 枚分

6 枚分

8100011

IMT アッセイ ( 抗 -CD19) テザリングキット

250 μ L10 mL

1.5 mL

36 枚分

6 枚分

8100014

IMT アッセイ ( 抗 -CD9) テザリングキット

250 μ L10 mL

1.5 mL

36 枚分

6 枚分

8100017

IMT アッセイ ( 抗 -CD71) テザリングキット

250 μ L10 mL

1.5 mL

36 枚分

6 枚分

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● さらなる情報をお求めの方へ ●ハンドブック （Cancer Immunotherapy Handbook 英語）
免疫治療のモダリティごとにデータ例と論文例をご覧いただけます。
下記で e-mail アドレスを入力していただくことでダウンロード可能です。
▸ https://explore.agilent.com/CancerImmunotherapyHandbook

アプリケーションノート （英語）xCELLigence シリーズのアプリケーションノートの中から、 がん免疫キリングアッセイに関連するものをセレクションしました。
▸ Ex Vivo Phenotyping and Potency Monitoring of CD19 CAR-T Cell Killing▸ Real-Time Potency Assay for CAR-T Cell Killing▸ Real Time Potency Assay for CAR-T Cell Killing of Adherent Cancer Cells▸ Real-Time, Label-Free Measurement of Natural Killer Cell Activity and Antibody-Dependent
Cell-Mediated Cytotoxicity▸ Label-Free Assay for NK-Cell Mediated Cytolysis▸ Tumor Cell Killing by T Cells▸ Real-Time Specificity and Potency Assessment of Human Papilloma Virus SpecificEngineered T Cells▸ Evaluating Functional Potency of Immunotherapies Targeting Tumors of B Cell Origin

プロトコル （英語）▸ A Human In Vitro T Cell Exhaustion Model for Assessing Immuno-Oncology Therapies▸ In Vitro Functional Assay Using Real-Time Cell Analysis for Assessing Cancer
Immunotherapeutic Agents;▸ A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid andHematological Cancer Cells.

ビデオ （英語）▸ xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) instrument
（測定の原理がわかりやすく紹介されています）
▸ Software Pro for Immunotherapy Applications（がん免疫キリングソフトウェアの紹介）▸ Checkpoint Inhibitor Research Workflow Challenges▸ Checkpoint Inhibitors for Cancer Treatment▸ Maximize CAR-T Killing of Cancer Cells with the xCELLigence Real Time Cell Analysis (RTCA)
eSightDE44839154※本装置は試験研究用です。 医療や診断目的にはご使用いただけません。
※価格、 外観、 仕様などは、 予告なしに変更することがあります。
※それぞれの商標や登録商標、 製品名は各社の所有する名称です。

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