日産科学振興財団研究報告書

環境にやさしい新規触媒（超デオキシリボザイム）の創製
Invention of Novel Biocatalysts by in vitro Selection
研究代表者

群馬大学工学部応用化学科 助手

桒原 正靖

Department of Applied Chemistry, Gunma University, Masayasu KUWAHARA
和文アブストラクト
試験管内選択法によりリボザイムやアプタマーなどの機能性核酸が創製されてきた。特に、DNAは化学的安定性やPCRによる直接的な増幅が可能なため、機能性核酸の材料として魅力的である。しかし、DNA触媒やDNAアプタマーの活性はタンパク質酵素や抗体に比べはるかに劣っている。近年、ピリミジン環の5位に機能基を導入した修飾基質（dUTP誘導体）がある種の耐熱性DNAポリメラーゼに基質として認識されることが分かった。そこで本研究では、PCRに適用可能な修飾基質のレパートリーの拡張やPCRにおいて修飾基質を認識する耐熱性DNAポリメラーゼの探索を行うことによって試験管内選択系の最適化を図ると共に、試験管内選択法によってC-C結合形成反応のひとつであるアルドール反応を基質特異的に触媒する超デオキシリボザイムの創製を試みた。
Abstract
Much interest has been given to the development of functional nucleic acids such as ribozymes andaptamers by in vitro selection or SELEX techniques. Especially, DNA is an attractive material for
functional molecules due to its chemical stability and availability for direct enzymatic amplification by apolymerase chain reaction (PCR). Recently, dUTP analogs with a functional group at a C5 position of apyrimidine ring were found to be substrate for a thermostable DNA polymerase during PCR. In this study,
we optimized the in vitro selection system by expanding repertories of modified substrates applicable toPCR and searching thermostable DNA polymerases tolerant for modification of triphosphate substrates,
and then attempted to invent modified DNAzymes which catalyze aldol reactions by in vitro selection.

倍に増やす（増幅させる）ことができないという欠点もある。一方DNAはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による直接的な増幅が可能であるが、触媒活性や基質特異性はタンパク質酵素に遥かに及ばない。その理由のひとつに、DNAには酵素の活性中心に見られるような触媒残基がないことが考えられる。そこで、筆者は触媒残基が導入された修飾DNAのライブラリー（混合物）を

１． 研究目的酵素（タンパク質）やリボザイム（RNA触媒）、デオキシリボザイム（DNA触媒）といった生体高分子は、水溶液中（有機溶媒を使わないクリーンな条件下）で化学反応を特異的に触媒する点で大変有用である。酵素には高い触媒活性や基質特異性といった大きな利点があるが、DNAやRNAのように試験管内で簡便にコピーして数百万1

ー末端に導入した種々の修飾デオキシウリジン三リン酸（2-10）や5位のリンカーの化学構造が異なる修飾デオキシウリジン三リン酸（11, 12）を新規に合成した。
さらに、修飾デオキシウリジン三リン . 酸（12）の中間体を原料として、核酸塩基が異なる修飾デオキシシチジン三リン酸（13）も合成した(Figure 1)。

天然型のDNAライブラリーの代わりに用いれば験管内選択法によって、より活性の高い触媒DNAを選び出せるのではないかと考えた。本研究ではその一例として、アルドール反応を基質特異的に触媒する超デオキシリボザイム（修飾DNA触媒）の創製に取り組んだ。
２． 研究経過２．１ 修飾ヌクレオシド三リン酸の合成
これまでの研究で古細菌由来の耐熱性DNAポリメラーゼ（KOD Dash）により、5位置換修飾デオキシウリジン三リン酸（1）が基質として認識されることを明らかにした。本研究において、アミノ酸をリンカOHNR NH

２．２ PCRによる修飾DNAの酵素的合成合成した修飾ヌクレオシド三リン酸のうち、2-6, 8, 10-13が耐熱性DNAポリメラーゼに基質として認識され、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により対応する修飾DNAが生成することを明らかにした(Figure 2)｡

NHONOOO-O P O P O P O
OOO-OOOH

C5-modified dUTP (1-7)
O

O

H

NH2NH2O

NH

2 OH

13O

O

NO

O
NH2NH2NH2NH2OH

R

O

4O

OH

O

NH25NH276O

Figure 2. Ethydium bromide stained 2% agarose gelof 108 nt PCR products. Amplifications wereperformed as follows; a hot start (1 min at 94°C) wasused, followed by 30 cycles of amplification (0.5 minat 94°C, 0.5 min at 52°C, 1 min at 74°C) and a final
incubation for 5 min at 74°C (Lane 1-11); a hot start(1 min at 94°C) was used, followed by 30 cycles ofamplification (0.5 min at 94°C, 1 min at 52°C, 2 minat 74°C) and a final incubation for 5 min at 74°C
(Lane 12-14). Lane 1, negative control; lane 2,positive control; lane 3-11, a PCR containing dATP,dGTP, dCTP and one of dUTP analogs (1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8 and 9); lane 12-14, a PCR containing dATP,dGTP, dCTP and one of dUTP analogs (2, 7 and 9).
KOD Dash DNA polymerase used.

O

NH2NHCbz

NH2OBzl
O8O

H2NOBzl

NH

910NH

O

HNO

H2NNH
O

NO
O
O
-O P O P O P O
OOO-O

O
OH

C5-modified dUTP (11)
O
H2NO

O
O
O
-O P O P O P O
OOO-O

NH2NH

NO
OH

C5-modified dUTP (12)O

H2NOOOO-O P O P O P O
OOO-ONNOO

興味深いことに、天然型のデオキシシチジン三リン酸（dCTP）とチミジン三リン酸（TTP）の代わりに、誘導体（13）と誘導

OH

C5-modified dCTP (13)Figure 1. Nucleotide analogs prepared in this study2

行 っ た 。 そ の 結 果 、 KOD Dash の 他 にVent(exo-)やPfuがチミジンの5位への修飾に寛容であることが新たに分かった(Figure 3)｡

体（11或いは12）を用いてPCRを行った結果、両方の修飾ヌクレオチドが導入された修飾DNAの生成が確認された。これは２種類の異なる機能基をもつ修飾DNAが酵素的に合成できることを示唆している。一方、修飾ヌクレオシド三リン酸を基質として認識する耐熱性DNAポリメラーゼの探索も２．３ 反応基質の誘導体化
芳香族アルデヒドを誘導体化しビオチンとのゴンジュゲートを合成した。基質の水溶性を考慮し親水性のリンカーを用いた。

(a)

OHNNHHNSOOO

O

NHOOO

NH
CHO

２．４ 修飾DNAライブラリーの調製と試験
管内選択
前述したいくつかの修飾ヌクレオシド三リン酸を用いて5’-末端にケトン基を結合させた修飾DNAのライブラリーを調製した。耐熱性DNAポリメラーゼにはKOD Dash或いはVent(exo-)を用いた。アルドール反応によってビオチン標識アルデヒドと共有結合を形成した修飾DNAのみをアビジンカラムで選択的に捕捉しこれをPCRで増幅した。この操作を繰り返し行い、触媒活性のある修飾DNAを濃縮する操作を遂行中である。

(b)

２．５ まとめ
PCR に利用可能な種々のアミノ酸を修飾した dUTP 誘導体や、アミノリンカーをもつ dCTP 誘導体を新たに開発し、修飾基質のレパートリーを拡張した。また、PCR において修飾基質を認識する耐熱性 DNA ポリメラーゼを探索したところ、KOD Dash の他にいくつかの古細菌由来の DNA ポリメラーゼ(ファミリーB)が修飾 DNA の合成に利用可能であることが分かった。これらの知見

Figure 3. Ethydium bromide stained 2% agarose gelof 108 nt PCR products. All amplifications wereperformed as follows; a hot start (1 min at 94°C) wasused, followed by 30 cycles of amplification (0.5 minat 94°C, 0.5 min at 52°C, 1 min at 74°C) and a final
incubation for 5 min at 74°C. Lane 1, positivecontrol; lane 2, negative control; lane 3-8, a PCR
containing dATP, dGTP, dCTP and one of analogs (1,10, 12, dUTP, 5-(3-aminoallyl)-dUTP and5-propynyl-dUTP); (a) Vent(exo-) DNA polymerase(b) Pfu DNA polymerase used.

3

５． 発表論文リスト
は本研究課題を遂行する過程で生じる可能性がある諸問題を解決し得る。例えば、 1. Enzymatic Incorporation of Chemicallymodified Nucleotides into DNAs.,
得られた修飾 DNA 触媒の活性が低い場合は、
Masayasu Kuwahara, Tsutomu Ohbayashi,
修飾基を変えたり、修飾基を二種類にした
Kazuo Hanawa, Atsushi Shoji, Akiko N.
りするという試みを解決手段として用い
Ozaki, Hiroaki Ozaki and Hiroaki Sawai.
ることができる。また、試験管内選択後、Nucleic Acids Res. Suppl. 2002, 2, 83-84.
修飾 DNA の増幅効率が低い場合、耐熱性
2. Substrate Properties of C5-Substituted
DNA ポリメラーゼを変えて最適化を図るこPyrimidine 2’-Deoxynucleoside 5’-Triとが可能になった。
phosphates for Thermostable DNA
Polymerases during PCR., Masayasu
３． 研究成果
Kuwahara, Yumi Takahata, Atsushi Shoji,
従来の修飾dCTPはDNAへの導入効率が低
Akiko N. Ozaki, Hiroaki Ozaki and
いため、天然型のdCTPを共存させないとHiroaki Sawai （投稿中）
PCRに用いることは一般に困難であった。
3. Simultaneous incorporation of three
今回、DNAへの導入効率の高い修飾dCTPをdifferent modified nucleotides during開発し、これを用いてPCRによる修飾DNAのPCR., Masayasu Kuwahara, Shin-ichi
直接的な合成に成功した。さらに、これをHososhima, Yumi Takahata, Rina Kitagata,
修飾dUTPと同時に用いることにより、異なAtsushi Shoji, Kazuo Hanawa, Akiko N.
る二種類の修飾ヌクレオチドが導入されOzaki, Hiroaki Ozaki, Hiroaki Sawai （投た修飾DNAのPCRによる直接的な増幅も可稿中）能であることが分かった。
また、ファミリーBのDNAポリメラーゼが触媒するPCRを修飾基質を用いて詳細に検討することにより、ピリミジン環の5位に同じ官能基を修飾した誘導体でも、修飾dUTPと修飾dCTPとでは基質特性が大きく異なることを新たに見出した。
４． 今後の課題と発展
より活性の高い修飾DNA触媒を得るには、修飾DNAの構成単位である修飾ヌクレオチドに何を用いるかが鍵となる。筆者は複数種の触媒残基の導入や一本鎖DNAの構造を安定化する官能基の導入は、より高活性な選択産物を与えると考えている。本年度内に研究課題を完結させられなかったが、この点を詳細に検討しながら今後も継続して行う。

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