ユビキチン類似因子 SUMO‑1 による細胞機能変換システム
The analysis of the novel ubiquitin-like protein, SUMO-1,
that regulates cell functions
研究代表者

島根大学生物資源科学部生命工学科

助教授

田中克典

Associate Professor, Department of Life and Environmental Science, Shimane
University, Katsunori Tanaka

和文アブストラクト
SUMO-1はユビキチンと構造的に類似したタンパク質であり、真核生物間で進化上高度に保存されている。SUMO-1化経路では、ユビキチン経路とは異なった酵素群が働いているが、その修飾機構は非常に類似している。ユビキチンが標的タンパク質の選択的タンパク質分解を誘うための識別分子であるのに対して、SUMO-1にはタンパク質の分解シグナルとしての機能はこれまで知られていない。SUMO-1修飾の生理機能の全貌を明らかにするには、網羅的にSUMO-1化基質タンパク質を同定し、その機能を系統的に解析するアプローチが必要である。
本研究では、プロテオミクス技術を用いてSUMO化基質タンパク質を網羅的に解析し、SUMO-1化による細胞機能制御機構を明らかにする事を目的とした。今回、分裂酵母においてTop2(DNAトポイソメラーゼII)とClr6(class 1 HDAC)がSUMO-1化を受ける可能性を見出した。
Abstract
Unlike ubiquitin, the ubiquitin-related protein modifier SUMO-1 and its
budding yeast homologue Smt3p have been shown to be more important for
posttranslational protein modification than for protein degradation. We haveshown that fission yeast SUMO-1 is required for a number of nuclear events
including the control of telomere length and chromosome segregation.
To understand the mechanisms of regulation by sumoylation, we purified
SUMO-protein conjugates by TAP method and identified the proteins by MudPIT mass
spectrometric analysis. We found the peptide masses that matched those of tryptic
fragments predicted for the gene products of top1, top2, and clr6 (HDAC1 homolog)
and could confirm the SUMO-dependent modified form of Top2 and Clr6 proteins,so far. Now we are trying to characterize the sumoylation sites and thephysiological roles of sumoylation for Top2 and Clr6 proteins.

１．研究目的して働くこと、そしてユビキチン化は細胞周期

タンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質合成や細胞外刺激などにより時間的空間的に厳密な終了後のタンパク質の機能、活性、あるいは局コントロールを受けていることが明らかとなっ在を変換する重要な機構であり、細胞内情報伝てきた。

達や細胞周期制御において極めて重要な役割を一方、ゲノム研究の飛躍的な進展により、ユ果たす。翻訳後修飾の代表例としてタンパク質

ビキチンと類似したタンパク質の存在がここ数のリン酸化が挙げられるが、近年、ユビキチン年のうちに明らかとなってきた。ユビキチン類

がタンパク質翻訳後の選択的分解の標的分子と似タンパク質 SUMO-1 はその代表例であり、真1核生物間で進化上高度に保存されている。の核内を中心とした多面的機能に重要な役割をSUMO-1 は標的タンパク質へ可逆的に共有結合果たしている事を既に明らかにしている 1）。

する移動性の翻訳後修飾分子で、その付加修飾現在、SUMO-1 化を受ける基質タンパク質は幾

反応は E1 活性化、E2 結合、E3 連結酵素によりつか同定され、SUMO-1 修飾の生理機能が推測さ協調的に制御される（図 1）。

れつつあるが、基質同定は場当たり的なアプローチしかなされていない。SUMO-1 修飾の生理機能の全貌を明らかにするには、網羅的に SUMO-1化基質タンパク質を同定し、その機能を系統的

E1:Rad31/Fub2
E2:Hus5

C-terminalに解析するアプローチが必要である。

E3:?

hydrolase

SUMO-XXX

SUMO

SUMO

本研究では、プロテオミクス技術を用いてIsopeptidases

Ulp1
K

Ulp1?, Ulp2

SUMO-1 化基質タンパク質を網羅的に解析する事で、SUMO-1 化による細胞機能制御機構を明らかにする事を目的とした。

２．研究経過図１：分裂酵母の SUMO-1 翻訳後修飾経路

２．１

SUMO-1 化基質タンパク質の精製

最近、SUMO-1 による翻訳後修飾（SUMO-1 化）

SUMO-1 化標的タンパク質を網羅的かつ集中が細胞の癌化のメカニズムにも密接に関与して的に同定するために、TAP タグ法による精製をいることが示唆され、細胞の癌化を初めとした行う。TAP タグとは、二種類の Affinity タグ

疾患への対処の観点からも、SUMO-1 の普遍的なを用いることで飛躍的に精製度を高める方法で機能解明が現在急務となっている。

ある。２つの Affinity タグと TEV プロテアー

ユビキチンが標的タンパク質の選択的タンパ

ゼ に よ る 切 断 部 位 を 直 列 に 繋 い だ

ク質分解を誘うための識別分子であるのに対しProtA-TEV-CaM (TAP) タグを付加した Pmt3て、SUMO-1 にはタンパク質の分解シグナルとし（分裂酵母 SUMO-1）タンパク質を精製に用いた。ての機能はこれまで知られていない。現時点で分裂酵母 10L 培養液より TAP タグを付加した

は、SUMO-1 修飾の生理機能という観点から以下Pmt3 タンパク質の精製を行い、通常の生育条件に示す３つのパターンに分類可能である。１）

での SUMO-1 化タンパク質精製及び検出に成功

SUMO-1 化がユビキチン化に対して拮抗的に働した（図２）。

くパターン、２）SUMO-1 化により新たな相互作

標的タンパク質に結合していない遊離の用の形成、3)現時点では上記の二つのパターン

SUMO-1 と共に数多くの特異的なバンドが検出に分類できないもの、である。

できた。分裂酵母 SUMO-1 抗体による解析により、これらのバンドの多くは実際に SUMO-1 化

我々は遺伝学的解析により分裂酵母 SUMO-1されているものである事が確認できた。

が染色体分配やテロメア維持を始めとする細胞2２．３で同定したタンパク質の内、Top2 と Clr6
12タンパク質に関して、ゲノム上で抗体タグを付加し、SUMO-1 欠損株と野生株でのタンパク質の性質を比較検討し、実際に SUMO-1 化されうる
SUMO-1 化蛋白質かを検証した。その結果、Top2 と Clr6 のどちらにおいても SUMO-1 修飾の可能性を示すバンド が 確 認 す る 事 が で き 、これらのバンドはFree SUMO-1

SUMO-1 破壊株では検出されなかった（図３）２）。
今後、SUMO-1 化部位の特定及び SUMO-1 化の
図２：TAP 法による SUMO-1 化タンパク質の精有無による標的タンパク質の質的な変化を検証

製する事で、SUMO-1 化修飾の生理的機能に迫る事

SDS-PAGE 泳動後の銀染色像。レーン１；TAPが期待できる。

タグのみ、レーン２；TAP-SUMO-1 精製

２．２

(A)

SUMO-1 化基質タンパク質の質量分析

wt pmt3 ∆２．１で得られた精製 SUMO-1 化タンパク質を TCA 沈澱により回収後、トリプシン消化し、ショットガン的手法による多次元質量分析

Top2-TAP(B)(MudPIT : multidimensional protein

wt pmt3 ∆Clr6-3HAidentification technology)法により部分アミノ酸配列を決定した。
２．３

SUMO-1 化基質タンパク質の特定

図３：ウエスタンブロットによるTop2(A)及び２．２で得られたペプチド配列情報を基に分Clr6(B)のSUMO-1化修飾の検出。矢印で示し

裂酵母のゲノム情報データーベースを利用してた位置のバンドがSUMO-1化されたタンパク質

該当タンパク質をコードする遺伝子の特定を行と考えられる。

った。その結果、それらのホモログが他の生物で SUMO-1 化修飾される事が報告されている

３．研究成果Top2(DNA ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ II) や

SUMO-1 化を受ける基質タンパク質は幾つClr6(class 1 ヒストンデアセチラーゼ)のペか同定され、SUMO-1 修飾の生理機能が推測されプチド情報が優位に検出された。また、それ以つつあるが、基質同定は場当たり的なアプロー外にも、多数の候補タンパク質が特定することチしかなされていない。今回、プロテオミクスができた。

的手法により網羅的な SUMO-1 化基質タンパク

２．４

質の同定を試み、２つの基質タンパク質を発見

SUMO-1 化修飾の検証

3

した。それにより、今後 SUMO-1 化の有無によた大きな課題の基礎的且つ普遍的な知見の蓄積る標的タンパク質の質的な変化を検証する事が及び新たな概念の発見へと期待できると考えて可能となった。

いる。

４．今後の課題と発展

5．発表論文リスト

生化学的解析により網羅的に SUMO-1 の標的

1. Characterization of a fission yeast

タンパク質を特定できれば、SUMO-1 が何をど

SUMO-1 homologue, Pmt3p, required for
multiple nuclear events, including theの様に修飾制御するのか、又それによってどのcontrolように細胞周期に関与しているのかという大きchromosomeな問題の解明の何らかの手がかりが得られるとNishide J., Okazaki K., Kato H., Niwa

oftelomere

lengthandsegregation.

TanakaK.,O., Nakagawa T., Matsuda H., Kawamukai

期待できる。また、分裂酵母の研究から既に得M., and Murakami Y. Mol. Cell Biol.

た知見により、この SUMO-1 が真核生物の細胞1999, 19, 8660-8672
2. SUMO modification of Fission yeast

周期制御において極めて重要な機能を果たして

histone deacetylase, Clr6. Iwase H.,いることが予想できる。具体的には、染色体分MacDonald H., Yate 3 rd J., and Tanaka K.

配異常やテロメアの異常といった現象から、動（投稿準備中）

物細胞に置き換えれば細胞の癌化、老化といっ4