パン酵母におけるストレス応答
The Stress Response of Budding Yeast(Saccharomyces cerevisiae)

愛媛県立南宇和高等学校自然科学部 1年

松本 実夢・加納 璃乃・下田 葵・桑原 紘己・沖中 心兵

はじめにパン作りに利用されているパン酵母は単細胞の真核生物であり，分類学的には真菌類に属している。パン酵母は，温度，ｐH，アルコールといった様々なストレスを受ける。
筆者らは，高温（熱）耐性や急激な温度変化といったストレスに興味をもち，耐熱性に関係するHSPがどこで作られているかという主題で研究するとともに，急激な温度変化というストレスをパン酵母に与えた場合の現象について研究し，いくらかの知見を得たので報告する。

先行研究
熱ストレス，特に高温耐性の先行研究では，アルコー
ル発酵に関係する酵素群では，in vivoにおいてのみＨＳＰのような分子シャペロンがつくられること，さらにはミトコンドリアのクエン酸回路におけるコハク酸デヒドロゲナーゼでは，42℃5分間のヒートショック処理でＨＳＰのような分子シャペロンが形成される可能性や事前に高温にしていくと耐熱性を獲得することが明らかにされている(早川ほか，２００３:小永井ほか，２００４：市川ほか，２００６：仲川ほか，２００７）。

指導教輸 橋越 清一

Ⅲ 急激な温度変化（低温領域）に酵母はどのように対応するのか？

仮説：「パン酵母のＨＳＰは急激に低温の温度変化にも対応できる」
実験１

４２℃で５分間ＨＳ処理し，その後０℃，１０℃，２０℃，３０℃で５分放置した場合と，ＨＳ処理無しで各温度で処理した場合の２つについて，最適温度の４２℃で反応速度を計測した。

実験の様子
実験２
４２℃HS処理を５分間行い，０℃，２℃，５℃，７℃，１０℃，２０℃，３０℃に温度を変化させ，５分間処理した場合のものを，再び４２℃に戻し反応速度を測定した。

実験材料及び薬品・器具

実験１の結果実験２の結果

30℃の場合は，HS処理を行ったものとHS処
７℃付近までは、反応速度が急激に速くなり、理を行わなかったものが反応速度がそれぞれ ７℃以降は反応速度がほぼ一定だった。
速くなっていた。ところが，20℃，10℃の場合は ８回同様の実験を行った結果、ほぼ同様の結果を得られた。
HS処理を行ったものの方が反応速度が遅くなっていた。一方，0℃の場合は，反応速度が不安定であった。

材料：パン酵母（スーパーカメリア（日清フーズ）
薬品及び溶液酵母液750μｌ ・コハク酸ナトリウム水溶液350μｌ
・ｐH７バッファー340μｌ ・メチレンブルー（以下Mb) 50μｌ
器具
ウォーターバス・マイクロピペット・マイクロチューブ
・ストップウォッチ・遠心分離機など

Mbの脱色時間（t秒）の逆数(1/t)を反応速度として求めた！

Ⅰ 先行研究の追試
42℃で予め5分間HS処理を行い，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃に入れて，Ｍｂの脱色時間を測定しその逆数(1/t)を反応速度として求めた。

Ⅳ HSPはどれぐらいの時間で合成されるのか。 (先行研究の追試)

仮説：「HSPは処理を始めて５分間で合成される」結果及び考察42℃でそれぞれ0分，5分，10分，15分，20分HS処理をし、反応速度１/ｔを測定する。
先行研究の結果と同様になり，予めHS処理を行うと高温耐性を獲得することがわかった。このように，クエン酸回路内のコハク酸デヒドロゲナーゼも42℃のHS処理によってHSPのような分子シャペロンが合成され，パン酵母が高温耐性を獲得することが示唆された。

結果
０分（HS処理無し）の反応速度を０とした場合、HS処理時間が長いほど反応速度が速くなった。しかし、15分と20分の反応速度はそこまで変化がなかった。

抽出したミトコンドリアを42℃ＨＳ処理5分

1.2
吸光度

1.1
10.90.80.70.6

考察

Ａ ＥＤＴＡ無し、ＨＳ有り
Ｂ ＥＤＴＡ無し、ＨＳ無し
簡易的な方法で抽出された Ａ・Ｅ ＥＤＴＡ有り、ＨＳ有り
Ｂ・Ｅ ＥＤＴＡ有り、ＨＳ無し
ミトコンドリア

0.50.40.0150.010.005

5101520考察
実験１では，30℃はHS処理を行ったものとHS処理を行わなかったものとの関係が明瞭ではなく、HS処理でパン酵母はHSPを合成したが、HSPが有効に利用されず混乱していると推察された。それに対して，20℃，10℃の場合はいずれもHS処理を行った場合の方が反応速度が遅くなっていることから，パン酵母がHSPを合成したが低温であるために有効に機能していないと考えられた。しかし，０℃の場合はいずれもHS処理を行った場合の方が反応速度が速くなっていることから，HSPが低温というストレスに対して何らかのはたらきをしている可能性があるが、今後さらに検討を要する。また、低温処理であるためCSPがはたらいている可能性も捨てきれない。
実験２では，８回同様の実験を行ったが、どれも同様の傾向が見られた。このことから７℃付近が一番混乱するところではないかと考えられる。
実験3では、HS処理時間が15分～20分にした時が一番反応速度が速かったことから、１５分～２０分でHSPが合成されることが示唆された。

今後の課題ホモジナイザーで細胞を破砕

脱色を目視及び吸光度計で測定

結果

Ｚｙｍｏｌｙａｓｅバッファー
ホモジナイゼーションバッファーを添加

１２，０００ｒｐｍで15分，遠心分離

ミトコンドリアを傷つけないようにピペッティング

0.02

処理時間(分)ミトコンドリアの抽出とＨＳ処理

シェイカー２０分

0.025

0

仮説：「ミトコンドリア内でもHSPが合成される」

パン酵母

0.03

0

Ⅱ ミトコンドリア内でもHSPが合成されるか？

遠心分離
２５℃，３０００ｇ

0.035

プロトコールに従った方法及び簡易的な方法の両方でミトコンドリアを抽出することができた。その後，42℃でＨＳ処理を5分行い，脱色を目視及び吸光度計で計測した。

酵母菌の高温耐性に関するHSPはHSP104，sHSPなど多くあり，中でもミトコンドリア内のHSPにはHSP70sがある（永田ほか，2001；Jacob Verghese et al.,2012）。ＨＳ処理有りの方が吸光度が高くMbが脱色していないという結果になったが、目視では明らかに脱色しコハク酸デヒドロゲナーゼが働いたことが示唆された。吸光度の結果と目視の結果が大きく異なるため、その原因を明らかにする必要がある。また、外部からはコハク酸はミトコンドリア内に入らず（林・座古，私信）、 ミトコンドリア内ではタンパク質がつくられない可能性が高く，さらに研究を行う必要がある。

今後の課題としては，以下のようなことが考えられる。
１ コハク酸デヒドロゲナーゼを修復するＨＳＰはどこで合成されるのか？
(1)ミトコンドリア内で合成されるＨＳＰか？（仮説Ⅰ）(2)核のＤＮＡがもとになって合成されるＨＳＰか（仮説Ⅱ）(3)すでに細胞質基質にあるＨＳＰか？（仮説Ⅲ）
ただし仮説Ⅰについては、ミトコンドリア内でHSPが作られない可能性もあり、今度さらに研究を行う必要がある。
２ ＨＳＰの種類を特定し、定量する。
３ 酵母菌に急激な温度変化というストレスを与えた場合、細胞内でどのようなことが起こっているか？
４ HS処理時間を１５分以上にした場合、結果はどうなるか？
５ 低温処理とHS処理の関係を明らかにする。

謝辞

本研究において、研究計画などでご教示・ご指導いただいいた本校のＯＢである国立長寿医療研究センターの山崎泰豊研究員、インディアナ大学特任教授北山雅彦先生、愛媛大学理学部教授の林秀則先生、座古保先生に心から感謝いたします。さらに、ミトコンドリアの抽出など当初よりご指導いただいた愛媛大学南予水産センターの太田耕平准教授、清水園子准教授、そしてＴＶ会議などで有益なご助言やホモジナイザーなどの器具の提供をしていただいた愛媛大農学部の関藤孝之准教授、渡辺保夫教授、河田美幸准教授にも感謝申し上げます。また，パン酵母の文献の提供をしていただいた東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻相関基礎科学系若本研究室の小野すみれ氏にも感謝します。

文献・永田和宏・森正敬・吉田賢右， 分子シャペロンによる細胞機能制御． 219pp ， シュプリンガ―・フェアラーク東京株式会社．・Jacob Verghese ，Jennifer Abrams ， Yanyu Wang ， and Kevin A ．Morano2012 ，Biology of the Heat Shock Response and Protein Chaperon:Budding Yeast(sassharomyces cerevisiae) as a Model
System ，Microbiology and Molecular Biology Reviews ， 76 ， 115-158． ・水島 徹，2012．HSPと分子シャペロン，270pp.，講談社．・仲川千尋・兵頭遥子・福井沙希子・山口琴絵・石田幹・松平未来，2007．生物における42℃の意味を探る－パン酵母におけるヒートショック処理－，第48 回日本植物生理学会年会特別企画「高校生生物研究発表会」要旨集，日本植物生理学会．・早川実奈ほか，2003．パン酵母におけるヒートショック処理の影響Ⅰ，平成14年度ARD課題研究発表資料，愛媛県立宇和島東高等学校．・小永井丈二ほか，2004．Uwajimensis，(1)，1-10，愛媛県立宇和島東高等学校生物部．・石丸悠子ほか，2005．パン
酵母におけるヒートショック処理の影響Ⅱ，平成，16年度ARD課題研究発表資料，愛媛県立宇和島東高等学校．・市川明宏ほか，2006．パン酵母におけるヒートショック処理の影響Ⅲ，平成17年度ARD課題研究発表資料，愛媛県立宇和島東高等学校．