様式 4-1

研究助成 2019－がん領域－

研究成果報告書（最終）<概要>
所属

⾦沢⼤学ナノ⽣命科学研究所

⽒

名中⼭隆宏

研 究 テーマll

がん抑制因⼦ p53 の凝集の⽴体構造動態と機能の解明

研 究 助 成 報 告 と して広 報 資 料 に掲 載 さ れる点 を留 意 するこ と 。
概 要 の構 成 は⾃ 由 と するが、 研 究 ⽬ 的 、 研 究 ⼿ 法 、 研 究 成 果 など を、 １ ページにまと めるこ と 。
（ 図 表 、 写 真 など の貼 付 を含 む）

がんの症例の半分を占めるがん抑制因⼦ p53 の変異が細胞のがん化を誘導するメカニズムの⼀つとして、p53 がアミロイド凝集して、プリオン様伝播する説が提唱されている。アミロイド凝集は、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病などの神経変性疾患、2 型糖尿病の原因タンパクが持つ特徴で、特に近年、神経変性疾患では、アミノ酸配列が同じでもアミロイド線維構造の異なる多型（株）が存在し、型の種類によって誘導される症状（表現型）が異なるというアミロイド凝集体構造と症状の相関が概念として確⽴しつつある。私たちは、p53 がアミロイド凝集してプリオンのように振る舞うのであれば、p53 凝集体の構造と p53 機能喪失レベルあるいは変異による新たな機能の発現レベルが相関するのではないかと考え、研究に着⼿した。
本期間では、in vitro で p53 がアミロイド様の凝集体を形成するか検証を進めた。凝集反応の in vitro 解析には⼤量のタンパクを必要とするため、⼤腸菌組換えでヒト p53 全⻑を調製する⽅法の確⽴に取り組んだ。全⻑ p53は凝集しやすく、可溶性タンパク（マルトース結合タンパク︓MBP）と融合すると、p53 の部分で凝集し、その周囲を MBP が覆う可溶性凝集体が得られてしまうことを⾼速原⼦間⼒顕微鏡で明らかにした。そこで、⼤腸菌内でわずかに存在する可溶性状態の p53 全⻑を分離することとした。同時に、ホットスポット変異が集中する DNA 結合ドメイン（94-312 番⽬の範囲のアミノ酸配列）の組換えタンパクを調製した。
可溶性状態の組換えヒト全⻑ p53 を⾼速原⼦間⼒顕微鏡（⾼速 AFM）で観察したところ、3 nm 程度の粒⼦の周りを 2 つ程度のより⼩さい領域が絶え間なく拡散運動する様⼦を野⽣型、R175H 変異型（構造を変化させる変異 Structure mutation の⼀つ）の両者で観察することができた。pH を変えてステージ基板と分⼦の静電相 互 作 ⽤ を 調 整 し 、 運 動 の 変 化 を 観 察 し た 結 果 、 3 nm の 粒 ⼦ は 、 DNA binding domain とOligomerization domain、⼩さい領域は N 末端側の transactivation domain に相当すると推定できた。
p53 がアミロイド様の凝集体を形成するか検証するため、アミロイド特有のクロスβ構造を標識する蛍光⾊素チオフ
ラビン T を⽤いて、37℃で p53 をインキュベート中にクロスβ構造を形成するか測定した。その結果、特に R175H変異型全⻑は明確に蛍光強度の増加を⽰し、クロスβ構造を形成することを⽰唆した。R175H の DNA 結合ドメインのみの試料でさらに解析を進めたところ、可溶性状態をインキュベートすると、⼀般的なアミロイドと同様にチオフラビ
ン T の蛍光強度増加が始まるまでのラグ時間、急激な蛍光強度上昇、⼀定の強度で飽和する時間と続いていくタイムコースを⽰した。次に、この凝集体が⾃⼰複製能を持つか検証した。⼀般的なアミロイドは、可溶性凝集体を⾃⾝と同じ不溶性型構造に変えて凝集体を増加させるので、可溶性状態の試料に少量の凝集体を加えるとチオフラビ
ン T の蛍光強度は急激に増⼤して飽和し、ラグ時間が短くなる。しかし、R175H-DNA 結合ドメインの凝集体を少量、可溶性状態の試料に加えてもラグ時間の短縮は⾒られなかった。また、凝集体の⼀部を⾼速 AFM で撮影した
ところ、現状、線維状の凝集体は観察されていない。
以上の結果は、現状、構造変異型の⼀つである R175H は凝集過程でクロスβ構造を形成し得るが、⾃⼰複製能はない可能性が⾼いことを⽰している。今後は、他の変異型でも in vitro の凝集解析を進めるとともに、培養細胞に⼩さいタグ付きの全⻑ p53 変異型を発現させ、少量精製して⾼速 AFM 観察し、細胞内での p53 の⽴体構造動態も明らかにして、in vitro 解析と⽐較しながら研究を進める。

様式 4-3①

研究助成 2019－がん領域－研究成果報告書（最終）<発表実績/予定⼀覧>
所

属 ⾦沢⼤学ナノ⽣命科学研究所

⽒

名 中⼭隆宏

1. 論⽂発表実績llllll

研 究 助 成 報 告 と して広 報 資 料 に掲 載 さ れる点 を留 意 するこ と 。
掲 載 年 次 順 （ 新 しいものから ） に 記 ⼊ するこ と 。 ただし 、 本 研 究 助 成 ⾦ 交 付 後 のものに限 る。
著 者 名 、 論 ⽂ 名 、 掲 載 誌 名 、 巻 、 最 初 と 最 後 の⾴ 、 発 表 年 ( ⻄ 暦 ) 、 査 読 の有 無 について記 ⼊ する。
なお、 著 者 名 は省 略 せず、 全 てを記 ⼊ し、 ⾃ 分 の名 前 に下 線 を引 く 。
国 内 外 雑 誌 を問 わない。
印 刷 中 は i n p r e s s と 記 ⼊ 、 投 稿 中 の論 ⽂ はその旨 を記 載 するこ と 。 なお学 会 のアブスト ラ ク ト は含 めない。
欄 が⾜ り ない場 合 は、 増 やし て記 ⼊ するこ と 。

T. Watanabe-Nakayama, K. Ono, Acquisition and processing of high-speed atomic force１microscopy videos for single amyloid aggregate observation, Methods, 2022,197,4-12, 査
読有り
H. Nakano, T. Hamaguchi, T. Ikeda, T. Watanabe-Nakayama, K. Ono, M. Yamada,

２Inactivation of seeding activity of amyloid β-protein aggregates in vitro, J Neurochem, inpress, 査読有り
B.R. Sahoo, C.L. Souders, T. Watanabe-Nakayama, Z. Deng, H. Linton, S. Suladze, M.I.

３Ivanova, B. Reif, T. Ando, C.J. Martyniuk, A. Ramamoorthy, Conformational Tuning ofAmylin by Charged Styrene-Maleic-Acid Copolymers, J Mol Biology, 2021,434,167385167385, 査読有り
K. Lim, G. Nishide, T. Yoshida, T. Watanabe-Nakayama, A. Kobayashi, M. Hazawa, R.

４Hanayama, T. Ando, R.W. Wong, Millisecond dynamic of SARS-CoV-2 spike and its
interaction with ACE2 receptor and small extracellular vesicles, J Extracell Vesicles,
2021,10,e12170, 査読有り

5

K. Ono, T. Watanabe-Nakayama, Aggregation and structure of amyloid β-protein,
Neurochem Int, 2021, 44531,151,105208-105208, 査読有り
G. Nishide, K. Lim, M.S. Mohamed, A. Kobayashi, M. Hazawa, T. Watanabe-Nakayama, N.

6

Kodera, T. Ando, R.W. Wong, High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals Spatiotemporal
Dynamics of Histone Protein H2A Involution by DNA Inchworming, J Phys Chem Lett,2021, 44308,12,3837-3846, 査読有り
M. Qu, T. Watanabe-Nakayama, S. Sun, K. Umeda, X. Guo, Y. Liu, T. Ando, Q. Yang, High-7

Speed Atomic Force Microscopy Reveals Factors Affecting the Processivity of Chitinases
during Interfacial Enzymatic Hydrolysis of Crystalline Chitin, ACS Catal, 2020,44155,10,13606-13615, 査読有り
M.S. Mohamed, M. Hazawa, A. Kobayashi, L. Guillaud, T. Watanabe-Nakayama, M.

8Nakayama, H. Wang, N. Kodera, M. Oshima, T. Ando, R.W. Wong, Spatiotemporally
tracking of nano-biofilaments inside the nuclear pore complex core, Biomaterials, 2020,44105,256,120198-120198, 査読有り

T. Watanabe-Nakayama, M. Nawa, H. Konno, N. Kodera, T. Ando, D.B. Teplow, K. Ono,
9

Self- and Cross-Seeding on α-Synuclein Fibril Growth Kinetics and Structure Observed byHigh-Speed Atomic Force Microscopy, ACS Nano, 2020, 44068,14,9979-9989, 査読有り
T. Watanabe-Nakayama, B. R. Sahoo, A. Ramamoorthy, K. Ono, High-Speed Atomic Force

10Microscopy Reveals the Structural Dynamics of the Amyloid-β and Amylin Aggregation
Pathways, Int J Mol Sci, 2020, 43998,21,4287, 査読有り
H. Konno#, T. Watanabe-Nakayama#, T. Uchihashi, M. Okuda, L. Zhu, N. Kodera, Y.

11

Kikuchi, T. Ando, H. Taguchi (#Equally contributed), Dynamics of oligomer and amyloid
fibril formation by yeast prion Sup35 observed by high-speed atomic force microscopy,Proc Nat Acad Sci U S A, 2020, 43928,117,7831-7836, 査読有り

様式 4-3②

2. 学会発表実績
llll

発 表 年 順 （ 新 しいものから ） に 記 ⼊ するこ と 。 ただし 、 本 研 究 助 成 ⾦ 交 付 後 のものに限 る。
発 表 学 会 名 、 発 表 者 名 、 演 題 を記 ⼊ する。
国 内 外 を問 わない。
欄 が⾜ り ない場 合 は、 増 やし て記 ⼊ するこ と 。

発表時期

発表学会名、発表者名、演題
単⼀⽣体分⼦の動的プロセス評価に向けた⾼速 AFM 技術（ブルカー・ジャパン株１

2020/12/15

式会社ウェビナー）、中⼭隆宏、⾼速原⼦間⼒顕微鏡による医学薬学研究への展開―アミロイド凝集過程とその抑制因⼦の作⽤機序の解明を⽬指して―

２

３４3. 投稿、発表予定
投稿/発表時期

雑誌名、学会名等

１2022 年

第 45 回⽇本分⼦⽣物学会年会

２2023 年

Research article, Journal of Molecular Biology

３４