薬 剤 学, 78 (6), 270-274 (2018)≪若手研究者紹介≫

生体関門輸送の分子機構とその破綻による疾患発症機序の解明

伊藤慎悟*

Shingo Ito

熊本大学大学院生命科学研究部（薬学系）微生物薬学分野

1．はじ

め

また，岡部先生は「胃の起源はなんだろう？」とよにく楽しそうに自問自答されていた．今思えば，こう今年度，日本薬剤学会に入会した．そして，数カした一風変わった教育と自身の後ろ姿から，研究者

月．若手研究者紹介の執筆依頼がやってきた．まだ，として重要な偶然を幸運に変える力と研究への情熱

年会での発表も行っておらず，何で私が入会したこについて最初に教えてくれたのだと思う．そして岡とが分かったのだろう？ とその調査力に驚愕し，そ部先生は熊本大学薬学部の出身である．私は現在熊して，私，まだ若手？ と思いながらも，その依頼を本大学薬学部で教員をしており，不思議な縁を感じ引き受けてしまった．本稿では，これまでの私の研ている．研究テーマは，薬物処理した酢酸胃潰瘍の究人生を振り返り，「大学入学時には病院薬剤師にな組織中タンパク質発現・局在の解析であった．研究ることを夢見ていた私が，なぜ研究室を転々としなの詳細はあまり覚えていないが，自分が出した結果がら，現在，大学の教員として研究に励んでいるのが論文として発表されたのは嬉しいものであった．

か，そしてどんな未来予想図を描いているのか」を

実は，大学の講義の中で一番興味があったのは山紹介させて頂くことにした．
2．研究との出会い（京都薬大本昌先生が講義された「薬剤学」であった．特に，学部・修士）

血液脳関門（BBB）の話が衝撃的であり，魅了された．これが BBB との出会いであった．そこで，大私が薬学部を志望した理由は，子供の頃，病院で学院修士課程では，薬剤学の中でも注目されていたたくさんの薬の効果を知っていて，それを調剤するトランスポーターの研究と臨床で活躍できる薬剤師薬剤師がかっこいいと思ったからである．そこで研の両立を目指して，この両方を満たした研究をされ究室配属の際には薬理の研究室をと考え，消化管のていた衛生化学教室の長澤一樹先生（当時助教授）薬理研究をされていた岡部進先生主宰の応用薬理学のもとに移動した．そこで与えられた研究テーマは，教室を選択した．鮮明に覚えていることは，研究室

in vitro BBB モデル細胞を用いた BBB におけるクに入って最初に行ったことがセレンディピティ（偶エン酸アルミニウム輸送の特性とその輸送に関わる然の発見）の起源となる物語の日本語訳であった．

トランスポーター分子の同定であった．培養細胞を用いた輸送実験の習得から始まり，ICP-MS による*2006 年 3 月東北大学大学院薬学研究科単位取得満期退学後，JST 研究員．2006 年 7 月博士（薬学）．2007 年
11 月東北大学大学院薬学研究科助教．2010 年 4 月 NRCIBS Research associate．2012 年 4 月熊本大学大学院生
命科学研究部（薬学系）助教，2018 年 1 月同准教授．
研究テーマ：輸送機構と疾患．趣味：写真撮影，サイクリング．連絡先：〒862–0973 熊本市中央区大江本町
5–1 E-mail: ishingo@kumamoto-u.ac.jp.
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アルミニウム測定法の確立を行いながら，同時に，1 日 3～4 コマの大学院講義と膨大なレポートがあってなかなか研究は進まなかった．二兎を追う者は一兎をも得ずという感じであった．しかし，この時に実験方法を 1 つ 1 つ原理から勉強して実験系を構築することができたし，BBB の研究に出会うことがで

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きた．私の研究を基盤として，数年後には論文とし失における LRP-1 や P-gp の関与を検討していったて成果を発表することもできた．修士 1 年生の後期が，BEI 法を用いた検討では，その寄与はほとんど

では京都桂病院にて 6 カ月間の臨床実務実習を行っ見られなかった．当時，LRP-1 は apolipoprotein Eた．これは薬剤師の仕事を現場で見ることができ，（apoE）などの LRP-1 基質と複合体を形成した Aβ

さらに，長澤先生の計らいで医師の回診にも参加すを脳内から BBB を介して消失させると報告されてることができたため，充実していた．この実務実習いた．そこで，どのような脳内 Aβ が BBB を介してにおいて，「薬剤師の仕事は調剤だけではないよ．こ

消失するかを明らかにするために，Aβ の重合体やれからの時代，病院で薬剤師として医師と対等にデapoE などの結合タンパク質との複合体を作成し，ィスカッションして活躍する必要があり，そのため

BEI 法を用いて解析していったところ，Aβ の単量には「博士号」が必須だよ」と薬剤師や医師の先生体が BBB を介して排出輸送されることを見出しから何回も話を聞いた．これがきっかけになり，病．当時，過去の報告と一致しない結果が連続してた 1）

院で活躍できる薬剤師になるために「博士号」を取出てきて，相当なストレスがあった．「過去の報告と得しようと考えた．

私の実験結果の違いはどこにあるのか？」と考えた

3．研究者としての鍛錬（東北大博士・ポスドク・助教）

時に，1 つに種差があった．そこで，マウスで BEI法による実験をしたいと考えるようになった．しかし，寺崎先生から「マウスは小さくて BEI 法はでき基礎研究は博士号取得のための博士課程 3 年間だないよ」と言われた．そこで，やってみて駄目ならけと考えていたので，それならば，BBB のトップレ諦めようと思い，手元にある機器を組み合わせて試ベルの研究をしてみようと考え，世界的に有名な寺行錯誤したところ，1 カ月くらいでマウスの BEI 法

崎哲也先生主宰の東北大学大学院薬学研究科薬物送を確立することができた．そして，［ 125I］Aβ のマ達学分野に編入学した．これが人生の大きな転換と．その報告をした
ウス脳内からの消失を解析できた 2）なった．当時も今も寺崎研究室は研究レベルが非常際に，寺崎先生は最初信じられないという感じでデに高く，研究室に入った当初はあまりの次元の違いータを見られていたが，最後には褒めて頂いたことに驚き，この研究室で本当に博士号を取得できる研を記憶している．これが最初で最後のお褒めの言葉究を行っていけるのかと一抹の不安を覚えた．

だったかもしれない．その後，マウスにおいても研究テーマとして頂いたのが，「血液脳関門におけBBB を介した Aβ 排出輸送に LRP-1 の寄与は観察るアミロイド β ペプチド（Aβ）の排出輸送機構」でされなかった．一方で，大学院生であった藤吉正哉あった．当時，寺崎先生が開発された Brain Efﬂuxさん（現 岡山大学）が血液脳脊髄液関門では LRP-1Index（BEI）法を用いて脳内で産生されるアルツハを介した排出輸送が観察されることを見出されていイマー病の原因物質である Aβ の排出輸送機構を同た．過去の報告と脳内の Aβ 投与部位，脳内におけ定するという内容であった．研究を開始する時点で，る物質の拡散等を統合して考えたところ，脳内 Aβ既に low density lipoprotein receptor-related pro-

排出における LRP-1 の関与に関する新しい仮説を提tein 1（LRP-1）と P-glycoprotein（P-gp）が BBB唱した．

における Aβ の排出輸送分子であると報告されていマウスの BEI 法を確立したことで遺伝子改変動物た．しかし，それまでの研究室で得られた知見から，における実験が可能になった．その一例が横田隆徳

寺崎先生は別の分子が関与するということを提唱さ先生（東京医科歯科大学）との共同研究である．ビれ，その分子の同定を行うことになった．まず，

タミン E の輸送を担う α-tocopherol transfer proteinI］標識された Aβ の排出過程（αTTP）ノックアウトマウスで脳内 Aβ 蓄積が増加を解析できる実験系の確立から開始した．RI 測定系するがその機序が分からなかった．そこでマウスとして，γ カウンターと液体シンチレーションカウ

BEI 法を用いて解析したところ，14 カ月齢の αTTPンターの測定条件の設定から行い，［I］標識 Aβノックアウトマウスにおいてアミロイド β ペプチドのラット脳内からの消失における時間依存性を観察．の BBB 排出輸送は低下していることを見出した 3）

できた時は非常に嬉しかった．次に，脳内からの消貴重でかつ高齢のマウスを扱うということで大きなBEI 法を習得し，［125125

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（CVB2009）の懇親会において，特別講演をされた
National Research Council Canada（NRC）-IBS のDanica Stanimirovic 先生と出会い，所属する部門で Research Associate を募集していると情報を頂いた．私の脳裏に「カナダ，大自然，行ってみたい」と浮かび，後日，「私，応募します」と連絡したら，トントン拍子で NRC-IBS に留学する機会を得た．
2010 年 4 月から Danica 先生と同じ部門の Balu
Chakravarthy 先生の研究室で Research Associateとして研究をすることになった．研究テーマは，アルツハイマー病関連の内容で，Aβ に結合する新しいFig. 1.

Involvement of IDE in Aβ degradation andefﬂux clearance from the brain across the BBB
Aβ, amyloid-β peptide; BCEC, brain capillary
endothelial cell; IDE, insulin-degrading enzyme.

ペプチドの動態や性能評価や神経細胞死を惹起する．
p75NTR の発現制御機構に関するものであった 4）
実験はテクニシャンの方々に助けて頂きながら，なんとか成果を残すことができた．最近，Balu 先生のお話を伺う機会があり，当時の研究が前臨床段階まストレスを感じながら実験したが，成果が出た時ので進んでいて嬉しく思った．留学では，研究成果よ喜びは非常に大きなものであった．BBB におけるりも，世界の文化，人の思考回路，異分野融合の重Aβ の排出輸送に関わる分子同定に関して，マウスの要性，価値観の違いなど，日本にいただけでは分か

BEI 法とマウス BBB モデル細胞である TM-BBB 細らないことを知ることができた．さらに，留学中に胞を用いて Aβ の排出輸送分子の同定を行った結果，は，カナダの主要な観光地を訪問し，カナダの文化最終的にインスリン感受性であるインスリン分解酵や自然の雄大さを実感することができ，充実した留素（IDE）が BBB における Aβ の排出輸送分子の 1学であった．

つであることを突き止めた．酵素が物質輸送をするという点はなかなか理解されなかったが，IDE は脳5．研究者・教育者としてのめばえ（熊本大内の Aβ 分解と輸送と両方において寄与する面白い助教・准教授）成果を見出すことができたと考えている（Fig. 1）．

留学の 2 年目を迎えて契約更新か，今度こそ病院

寺崎先生は国際学会にて研究成果を発表する機会の薬剤師になるかと悩んでいた頃，大槻純男先生や，多くの著名な研究者と研究や世間話をする機会（当時東北大学）から熊本大学で主宰する研究室のセを与えて下さり，世界を相手に研究することの重要ットアップをサポートして欲しいと連絡があり，そ性を実感させてくれた．さらに，薬物送達の卒業生のオファーを受けた．2012 年 4 月に熊本大学薬学部

は企業や大学の研究職にて活躍されている方が多に赴任した時，研究室は質量分析器だけが稼働してく，様々な学会に参加した際にお互いに情報交換がいる状況であった．そこで，まずは実験室の使用目できる．寺崎先生の研究室に移動して得られた「出的や機器の配置等のハード面，次はソフト面の環境会い」はかけがえのない財産である．

整備を行っていった．自由に何でもできる環境はあ4．研究者としての醍醐味（留学）る意味酷であり，時には「伝統」がある研究室が羨ましくもなった．この時，「最初が，肝心」というこ学位を取得した頃から寺崎先生や大槻純男先生とを実感し，将来，独立することがあった際の良い（現 熊本大学教授），細谷健一先生（富山大学教授）勉強になった．現在，熊本大学に赴任してから 7 年

から「研究者として生きて行くなら，必ず留学しなが経ち，研究室員は約 20 名となり，大きな研究室さい，あなたの人生観を大きく変える」と助言を受に成長した．研究は，大槻先生が得意とするプロテけた．そして，どこか留学先はないかと探していたオミクスを取り入れ，私の研究テーマである「生体と こ ろ， 寺 崎 先 生 が 主 催 さ れ た 国 際 脳 血 管 学 会

関門輸送機能を基盤とした疾患メカニズムの解明と272

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Fig. 2.

Screening of cyclic peptide-displayed phage library by Caco-2 cell permeable assay.

治療への展開」について，糖尿病における BBB 障る戦略を考案した（Fig. 2）．しかし，最初から生体害と認知症発症機序の解明やオーファントランスポ関門の中で最も強固である BBB を標的にした CPPーターの生理・病態生理機能解析，クレアチントラ同定研究は相当難しいだろうと予想されたため，透ンスポーター遺伝子変異による脳クレアチン欠乏症

過実験で実績のあるヒト小腸上皮モデル細胞である群発症機序解明と治療薬開発，バイオ医薬品の生体

Caco-2 細胞を用いた研究から開始することにした．

関門突破を可能にする細胞膜透過ペプチド（CPP）

Caco-2 細胞で研究を進めた結果，小腸透過性環状ペの同定とドラッグデリバリーシステム（DDS）へのプチドを 3 種類同定することに成功した．特に，環応用について研究を行っている．以下には，薬剤学状ペプチド DNP は長さ約 1 μm の phage の in vitroに関連する内容として，バイオ医薬品を目的の組織および in vivo 小腸透過性を顕著に促進させることへ送達させる CPP の同定に関する研究を紹介させや小腸における毒性が低いことを明らかにした．さて頂く ．

らに，インスリンと環状ペプチド DNP の共投与は5）

生体関門は標的組織への治療薬の送達を妨げる大インスリンの小腸吸収を促進させて血糖降下作用をきな障壁となっている．特に，劇的な治療効果があ示すことを見出した．現在，患者 QOL を向上させるバイオ医薬品は分子量が大きいために生体関門をるために創薬領域においてバイオ医薬品の小腸吸収透過することができない．特に脳へのバイオ医薬品を改善する DDS の開発は重要な課題である．このの送達はほとんど実現していない．CPP はマクロピ

環状ペプチド DNP 研究の成果は新規小腸透過性ノサイトーシスを介して高分子化合物の細胞内の内CPP として有望であり，経口投与型 DDS 開発への在化を促進させることから，高分子化合物の輸送に応用が期待され，実用化を目指した研究を展開しては有効な方法である．しかし，これまでの CPP はいるところである．一方で，実験系の構築ができた高分子化合物の細胞外から細胞内への内在化を促進ことから，本方法を用いて BBB を突破する CPP のさせるが，細胞内から細胞外への排出には寄与しな同定を行い，新規 CPP の同定に成功した．特許申いことが報告されていた．そこで CPP をバイオ医請も行い，これから輸送分子機構と実用化に向けた薬品の生体関門透過型 DDS に応用するためには，研究を産学官で展開する予定である．

生体関門において細胞内への内在化と排出の両方を6．お促進させる新規 CPP を同定する必要があると考えわりにた．そこで，私は長さ約 1 μm の phage を高分子化

ここまで，薬剤師になることを夢見ていた私が，合物のモデルとし，標的親和性と安定性に優れる環現在，研究者として薬学研究を行っている一連の流状ペプチドを提示した phage display を in vitro 透れについて書かせて頂いた．今後の研究の未来予想

過実験によってスクリーニングすることで，高分子図としては，「BBB を標的とした神経変性疾患治療化合物の生体関門透過を可能にする CPP を同定す薬の開発」であろう．これまでに BBB 機能不全が薬 剤 学 Vol. 78, No. 6 (2018)273

神経変性疾患で観察され，発症や病態進行に重要な役割を果たしていることが分かってきているが，BBB を標的とした治療薬は今のところない．特に，BBB を標的とした認知症や小児の遺伝性神経変性疾患に対する治療薬を創薬したいと考えている．私が研究や人生に悩んでいた際に東北大学高度技術経営塾長である渡辺幸男先生から頂いた言葉が「天は必要な時に，必要な人に，必要な試練を与える」である．この言葉のおかげで，いろいろな苦難を乗り越えることができ，今があると思っている．また，どんな人と出会えるかが研究者人生に大きく影響を与えるため，これからも「出会い」を大切にしていきたい．
最後に，本研究を遂行するに当たり，ご指導・御協力を頂きました先生方に深謝するとともに，研究に御協力頂きました学生のみなさんにも感謝いたします．

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引用文

献1) S. Ito, S. Ohtsuki, J. Kamiie, Y. Nezu, T. Terasaki,Cerebral clearance of human amyloid-beta peptide(1–40) across the blood-brain barrier is reduced byself-aggregation and formation of low-density lipoprotein receptor-related protein-1 ligand complexes,J. Neurochem., 103, 2482–2490 (2007).
2) S. Ito, T. Ueno, S. Ohtsuki, T. Terasaki, Lack ofbrain-to-blood efﬂux transport activity of low-density lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP-1)
for amyloid-beta peptide (1–40) in mouse: involvement of an LRP-1-independent pathway, J. Neurochem., 113, 1356–1363 (2010).
3) Y. Nishida, S. Ito, S. Ohtsuki, N. Yamamoto, T. Takahashi, N. Iwata, K. Jishage, H. Yamada, H. Sasaguri, S. Yokota, W. Piao, H. Tomimitsu, T. C. Saido, K.
Yanagisawa, T. Terasaki, H. Mizusawa, T. Yokota,
Depletion of vitamin E increases amyloid beta accumulation by decreasing its clearances from brain
and blood in a mouse model of Alzheimer disease,
J. Biol. Chem., 284, 33400–33408 (2009).
4) S. Ito, M. Menard, T. Atkinson, C. Gaudet, L. Brown,
J. Whitﬁeld, B. Chakravarthy, Involvement of insulin-like growth factor 1 receptor signaling in theamyloid-beta peptide oligomers-induced p75 neurotrophin receptor protein expression in mouse
hippocampus, J. Alzheimer’s Dis., 31 , 493 –506
(2012).
5) S. Yamaguchi, S. Ito, M. Kurogi-Hirayama, S. Ohtsuki, Identiﬁcation of cyclic peptides for facilitationof transcellular transport of phages across intestinal epithelium in vitro and in vivo, J. Controlled
Release., 262, 232–238 (2017).

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