神経細胞の活動とネットワーク構築のメカニズムの解析
The analysis of neuronal activity and the mechanism of neuronal
network construction.
研究代表者

大阪市立大学

大学院医学研究科講師

豊岡和人

Osaka City University
Graduate School of Medicine
Assistant Professor, Kazuhito Toyo-oka
和文アブストラクト
自動車化が進んだ現代において交通事故の減少は我々にとって取り組まなければならない重要な課題である。車の運転は、「認知」、「判断・予測」、「操作」の繰り返しであるが、事故はこれらの手順のどこかでミスをすることにより起こると考えられる。特に「認知」の段階でのミスが最も多く、運転手の過去の経験・記憶によって得られた基礎情報、つまり「思いこみ」は「認知ミス」の主な原因の一つである。本研究では「認知」と「記憶」に関わる脳の活動、特に大脳皮質と海馬における神経細胞の発生と活動について細胞レベル、分子レベルのみならず、個体レベルでの解析を行う。特に個体レベルの解析ではノックアウト(遺伝子破壊)マウスの系を用いて「認知」や「記憶」に関わる遺伝子の解明と神経細胞ネットワークの構築メカニズムを生体内で明らかにすることを目指す。
Abstract
It is an important issue that we decrease a traffic accident. A drive consists of threecontinuous processes, "recognition", "judgment" and "operation". The mistake in theseprocesses, especially recognition, causes a traffic accident. The information from pastexperiences and memories, this is, prejudice is a primary cause of mistakes inrecognition process. The purpose of this study is to clarify the genes that contribute torecognition or memory process, and the construction mechanism of neuronal network inbrain by using in vitro and in vivo techniques. These studies contribute to understandingof the mechanisms of recognition or memory process.

1. 研究目的
本研究の目的は認知と記憶のメカニズには NUDEL の相互作用についてより詳細

ムを利用した人工知能・人工頭脳による危な解析を行うためには、リコンビナントの険回避システムの開発につながる神経細胞細胞質ダイニンを大量に精製し、細胞質ダの活動とネットワーク構築機構の解析であイニンの活性を試験管内で再現することがる。
「認知」と「記憶」の場である大脳皮質重要である。そこで、私は細胞質ダイニンおよび海馬の機能を分子レベル、細胞レベのどの部位が活性に重要であるのかを調べルさらには個体レベルで解明する。特に大るために、細胞質ダイニンのさまざまな領脳皮質と海馬の神経回路の形成に異常がみ域からなる変異分子を昆虫細胞にて作成・られる Lis1 および 14-3-3εノックアウトマウ精製した。そして、作成したリコンビナンスの解析により「認知」および「記憶」とトの細胞質ダイニンを用いて微小管上においう神経細胞の活動のメカニズムを個体レける滑走試験を行い、活性を持つ細胞質ダベルで明らかにする。また、LIS1 およびイニンの精製に成功した。この細胞質ダイ14-3-3εと結合することが明にされているニンを用いればこれまで困難であった細胞NUDEL(NDEL1)のノックアウトマウスを作

質ダイニンの微小管上での滑走に重要な成しその解析を行う。

個々のドメインを分離して解析できる。そしてこの系を応用して LIS1, 14-3-3εさらに2.

研究経過

は NUDEL が細胞質ダイニンの滑走にどの(1) 細胞質ダイニン、LIS1、14-3-3εおよびように作用しているのかを明らかにするこ

NUDEL の相互作用解析のための新しい実とができる。

験系の開発
私は細胞質ダイニン、LIS1 および 14-3-3εの相互作用解析を行うために新しい実験系(2) 細胞質ダイニンおよび微小管の活性制御における脱リン酸化の役割の開発を試みた。
「認知」や「記憶」を含む細胞質ダイニンの活性発現にはさまざま

すべての脳の活動は千数億個にも及ぶ神経な分子との結合とリン酸化・脱リン酸化が細胞の緻密なネットワークによるものであ重要である。リン酸化に関しては多くの分る。細胞質ダイニンは膨大な脳の神経細胞子が同定され、メカニズムの一端が明らかがネットワークを構築する上で大変重要なにされているが、脱リン酸化に関してはあ役割を担っていることが明らかにされていまり解析は進んでいない。私は細胞質ダイる。それ故、分子生物学的、細胞生物学的ニン・微小管の制御分子であるNUDELの脱な側面から多くの研究がなされてきた。しリン酸化を介して細胞質ダイニン・微小管かし、細胞質ダイニンは 500kDa を越える巨の活性化をコントロールしている脱リン酸大分子であるため精製やリコンビナント分化酵素、Protein Phosphatase 4 (PP4) を同定

子の作製が困難であり、細胞質ダイニンのした。

詳細な機能解析の障害となっていた。よって細胞質ダイニン、LIS1 および 14-3-3εさらPP4は三つのサブユニットから構成され、そのうち二つの分子が活性を制御している

ことが明らかにされている。しかし、これが LIS1 以外の分子と結合し異なる機能をまでのところ機能はもちろんのこと、発現発揮していることを示唆している。そこで様式についても詳細な解析はなされていな

私はかった。そこでタンパク質レベルでの発現様式を解析するためにPP4の各サブユニットに対する抗体を作成して各サブユニットの細胞内局在について解析を行った。興味深いことに活性を持つPP4cサブユニットは細胞周期における核膜崩壊直前に核膜にダイナミックに集積してくることを明らかにした。
(3) NUDEL ノックアウトマウスの作成と解析
我々は LIS1 の結合分子として NUDEL を同定し、リン酸化 NUDEL が 14-3-3εと結合することを明らかにした。さらに私は
NUDEL の生体内での機能を明らかにするためにノックアウトマウスを作成し機能解析、特に大脳皮質および海馬形成における機能について解析を行った。その結果、
NUDEL ノックアウトマウスの大脳皮質および海馬では階層構造の形成異常が認められた。さらに LIS1 ノックアウトマウスとの

図１

NUDEL ノックアウトマウスおよびダブルノックアウトマウスを作成すること

LIS1/NUDEL ダブルノックアウトマウスにでその症状が重症になることを明らかにしおける大脳皮質および海馬の形成異常た（図１）。
(4) NUDEL の LIS1 非依存性機能の解析

NUDEL の新たな結合分子の同定を試みた

我々は LIS1 の結合分子として NUDEL を

結果、微小管の剪断活性を有する Katanin同定し、LIS1 および NUDEL の機能解析をp60 を同定した。さらに、リン酸化 NUDEL行ってきた。両分子が結合し同じシグナルが Katanin p60 と結合し、Katanin p60 の細胞伝達経路において機能していることは間違内における局在を制御する事によっていない。しかしながら、ノックアウトマウ

Katanin p60 の機能発現を制御していること

スの解析をとおして表現型に差があるとがを明らかにした（図２）。

明らかになってきた。このことは NUDEL

3. 研究成果

4. 今後の課題と発展

細胞質ダイニン重鎖は 500kDa を越える

私が作成した活性を保持したリコンビナ巨大分子であるため精製やリコンビナント

ント細胞質ダイニン重鎖は今後細胞質ダイニンの機能解明に貢献するものと考えられる。さらに細胞質ダイニンの活性を制御している LIS1、NUDEL および 14-3-3ε等の分子の機能を解析するために有用である。これらの解析を通して長年明らかにされなか

図２ NUDEL 欠損細胞における Kataninった細胞質ダイニンの機能は飛躍的に解明

p60 の局在異常されることになるものと考えられる。

Nudel ノックアウトマウスから調整した繊維芽細胞に RED-CRE を発現させ、Cre-LoxP

5.の系を用いて NUDEL を欠損させた。その

1. Recruitment

発表論文リスト
ofKataninp60by

結果、Katanin p60 は核への異常な局在を示

Phosphorylated NDEL1 is essential for

した。この表現型は正常な NUDEL(WT) -Mitotic

GFP の発現によって正常化したが、NUDEL

Migration. Toyo-oka K., Sasaki S., Yano Y.,の Katanin p60 結合部位に変異を導入した

Kobayashi T., Toyoshima Y. Y., Tokuoka M.

NUDEL(MT) - GFP ではレスキューできな

S., Ishii S., Shimizu T., Muramatsu M.,

かった。

Hiraiwa N., Yoshiki A., Wynshaw -Boris A.

Cell

Division

andneuronaland Hirotsune S., Submitted
分子の作製が困難であり、活性を保持した

2. Disruption of Ndel1 Causes Neuronal

リコンビナント細胞質ダイニン重鎖の作成

Migration Defect and Early Embryonicは報告されていなかった。しかし私は活性Lethality. Sasaki S., Mori D., Toyo-oka K.,を持つリコンビナント細胞質ダイニン重鎖

Chen A., Garrett-Beal L., Muramatsu M.,を昆虫細胞を用いて作成しその精製に成功

Hiraiwa N., Yoshiki A., Wynshaw -Boris A.

した。そしてこのリコンビナント分子を用

and Hirotsune S., submitted

いて試験管内で細胞質ダイニンの活性を測定できる系を確立し、LIS1 が細胞質ダイニンの活性を負に制御していることを直接的に明らかにした。この結果はこれまで LIS1は正の制御因子であると考えられていたことから非常に興味深く当該研究分野に新たな可能性をもたらすものである。