細菌感染に対するヒト抗菌蛋白質BPIを介した自然免疫系の研究
Study on innate immunity mediated by human BPI
upon bacterial infection
研究代表者

筑波大学応用生物化学系 講師

西村 仁

Institute of Applied Biochemistry, University of Tsukuba
Assistant Professor, Hitoshi NISHIMURA
和文アブストラクト
生体には細菌などの異物に対する防御機構(自然免疫系)が存在しており，その研究が活発に行なわれている．しかし，個々の研究は特定の分子に焦点が絞られており，自然免疫系全体におけるその分子の位置付けは不明であることが多い．本研究は，自然免疫系を代表する
bactericidal/permeability-increasing protein (BPI)と補体系の関わりを分子レベルから個体レベルで明らかにすることを目的としている．最近，毒性細菌の感染が国内外において問題となっているが，抗生物質は細菌の生育を妨げる薬剤であり，本研究が目指す知見は殺菌および菌体の除去に関係することで，全く別の視点である．従って，抗生物質の開発に加えて生体が本来もっている自然免疫系を活用する薬剤を開発することで，細菌感染や臓器移植における拒絶反応に対するより多角的な治療が可能になると思われる．
Abstract
This study was undertaken to elucidate how bactericidal/permeability-increasingprotein (BPI) acts on innate immunity. When we examined phagocytosis of several strainsof bacteria by neutrophils in the presence of human serum, several substrains derived
from the same parental strain were engulfed at remarkably different levels. This result
suggests that the differences of genetic backgrounds among the substrains affect thephagocytosis.

Since BPI promotes phagocytosis of Gram-negative bacteria by neutrophils

through acceleration of complement activation, BPI may be a useful tool to identify
Gram-negative bacteria to survive from a host defense system.
ヒト好中球のアズール顆粒に存在する抗菌1. 研究目的グラム陰性菌が生体内に感染すると炎症反タ ン パ ク 質 bactericidal/permeability-

応 が惹起 され る．重 篤な 場合は 血圧 低下 や

increasing protein (BPI)は，グラム陰性菌

disseminatedcoagulation

特異的な抗菌作用およびLPS中和作用をもつこ(DIC)などの敗血症の症状が見られ，死に至るとが知られている．一方，補体系は約20種類こともある．これまでの研究より，グラム陰の血清タンパク質から構成されるセリンプロ性 菌 外 膜 の 主 要 構 成 成 分 で あ る

テアーゼのカスケード系で，細菌表面に膜傷lipopolysaccharide (LPS，リポ多糖)がその害性複合体を形成して殺菌したり，補体フラ原因物質であることが明らかになっている．

グメント(オプソニン)を細菌表面に沈着させintravascular1

て貪食細胞による細菌の貪食を惹起させる役を試みた．目的タンパク質の遺伝子の発現は割をもつ．最近，申請者は，BPIがグラム陰性

ノーザンブロット分析で，活性はカブトガニ菌(大腸菌)上での補体系活性化を促進し，好血球由来factor Cを用いたLPS中和活性測定法

中球による大腸菌の貪食を劇的に増強するこで調べた．
BPIのC末端領域(194-456アミノ酸残基，C-とを見出した．
本研究の目的は，グラム陰性菌の感染に対BPI)はチオレドキシン(Trx)タグとポリヒスチするBPIを介した自然免疫系の分子基盤を理解

ジン(His)タグの融合タンパク質(C-BPI/Trx &することである．具体的には，(1)貪食亢進にHis)として大腸菌で産生させた．

必要なBPIの機能領域の同定，(2)細菌の貪食BPIのKOマウスの作製に対する効果が上昇または低下したBPI変異体

マウスBPI遺伝子に対するターゲティングベの作製，(3)貪食亢進に関与するBPI結合性分クターを構築した後，ES細胞に遺伝子導入し子の同定，(4)BPIのノックアウト(KO)マウス

た．相同組換えを介してBPI遺伝子に変異が導および(2)で得られた変異体のトランスジェニッ

入されたESクローンを選別した後，定法に従っク(TG)マウスの作製，および(5)ヒトに感染すてKOマウスの作製を試みた．

るグラム陰性菌の好中球による貪食の測定，ヒトに感染するグラム陰性菌の好中球によるを試みた．

貪食の測定

2. 研究経過細 菌 の 表 面 タ ン パ ク 質 を fluorescein

2.1. 方法

isothiocyanate (FITC)で標識した後，各濃度BPIのNおよびC末端領域の産生のヒト血清存在下で，ヒト末梢血由来の好中ヒトBPI (wtBPI)は全456アミノ酸残基から球とインキュベーションした．好中球の細胞なる．Figure 1に本研究で産生させたBPIのN

外の蛍光をトリパンブルーで消光させ，貪食およびC末端領域の組換えタンパク質を示した．

さ れた細 菌由 来の蛍 光強 度を fluorescence-

BPIのN末端領域(1-193アミノ酸残基，N-BPI)

activated cell sorter (FACS)で測定した．

を産生させるためのベクターを構築して2.2. 結果

HEK293細胞に遺伝子導入した後，該当遺伝子BPIの機能領域の同定を恒常的に発現する細胞株(N-BPI/HEK)を選別

N-BPIのHEK293細胞による発現は転写レベルした．組換えタンパク質はN-BPI/HEKを無血清では確認されたものの，タンパク質の活性は培地中で3日間培養した後，培養上清から回収見出されなかった(Figure 2B)．最もmRNAの発

1456

wtBPI
1193

N-BPI194456

C-BPI/Trx & His: LPS-binding region,

Figure 1.

: Trx,: His.

BPI-related recombinant proteins examined in this study.
2A

B

Clone No.

Clone No.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2.1 kb

1.2 kb100

BPI activity (%)

BPI activity (%)

100

50

0500Figure 2. Production of (A) wtBPI and (B) N-BPI in HEK293 cells.
Upper; Northern blot analysis, lower; BPI assay using factor C.
現量が多かったクローンNo.5 (Figure 5B)を

本研究では，グラム陰性菌として大腸菌と無血清培地中で大量培養した後で培養上清か緑濃菌について調べた．大腸菌はDH5α，緑濃ら組換えタンパク質の回収を試みたが，N-BPI

菌はヒトに感染した親株から単離された亜種の 活性は 検出 されな かっ た．一 方， 対照 のPAO1-S，NH-17，およびEBRを用いて貪食の測

wtBPIはmRNAの存在およびタンパク質の活性が定実験を行った(Figure 3)．それぞれの細菌確認された(Figure 2B)．

について，ヒト血清(補体系)の濃度依存的に

C-BPI/Trx & Hisは大腸菌の封入体画分にの細菌の貪食が観察された．興味深いことに，み見出され，可溶性画分には存在しなかった．

緑濃菌の亜種は親株が同じでありながら，そ別のタグ(glutathione，GST)との融合タンパの亜種間で貪食量の違いが観察された．

ク質も試みたが，同じ結果であった(data not

3. 研究成果

shown)．

Figure 3の結果は，細菌間のわずかな遺伝BPIのKOマウスの作製的背景の違いがヒトの生体防御系から逃れる得られた陽性のESクローン10個のうち，5クことに繋がることを示唆している．補体系がローンについてキメラ雄マウスを作製して，細菌表層で活性化されることはよく知られて野性型C57BL/6雌マウスと交配した．しかし，おり，その活性化に関与する細菌の表層分子生殖系列の細胞に変異が伝播したヘテロマウも幾つか報告されている．BPIは細菌上で起こスは得られなかった．

る補体系の活性化を増強して，好中球によるヒトに感染するグラム陰性菌の好中球による細菌の貪食を劇的に増強する．LPSは補体系活貪食の測定性化分子のひとつなので，Figure 3で観察さ

3

200
160

0%
2%

120

10%
20%

DH5α

PAO1-SNH-17EBR

80
400

Cell number

20016012080
400100101102104 100103101102103

104

FITC-bacteria ingested(Fluorescence intensity)
Figure 3. Phagocytosis of Gram-negative bacteria by neutrophils inthe presence of various concentrations of serum.
れた細菌間の貪食量の違いは，LPSの構造差にたい．

起因する可能性が考えられる．事実，LPSの糖5. 発表論文リスト

鎖構造は細菌間でかなり異なることが知られなし．ている．BPIはLPS結合性分子なので，BPIを遺伝子的に改変した変異体は，野性型BPIでは結合できない細菌と結合して，補体系との共同作業でそれらの細菌をクリアランスできることが予想される．
4. 今後の課題と発展
まず，BPIの機能領域の同定とKOマウスの作製が急務である．それ以降は，BPIの活性が増強または低下した変異体を作製して，自然免疫系が増強されたモデルマウスの確立に繋げ4