全ゲノム／全エクソームシークエンスにおけるCNV解析

フィルジェン株式会社 バイオインフォマティクス部(biosupport@filgen.jp)
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はじめに
次世代シークエンサー

MLPA

マイクロアレイ

SNV, Small InDel

Small CNV

Large CNV

プラットフォームの一本化
次世代シークエンサー◼ 従来CNVの検出には、サイズに合わせて複数のプラットフォームを使い分ける必要があり、コストや実験手技の習熟などの問題を抱えていた✓ SNV, Small InDel✓ Small CNV✓ Large CNV◼ すでにSNVの検出には、次世代シークエンサーを用いることがスタンダードになっているが、同じくCNV検出にも使用できるようになれば、プラットフォームの一本化によって、これらの問題をクリアできる
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VS-CNV◼ BAMファイルのリードカバレッジデータをもとに、CNV検出を行う機能を付加する、VarSeq®用の有償アドオン◼ 遺伝子パネルや全エクソーム、全ゲノムシークエンスデータに対応◼ 検出されたCNVは、ゲノムブラウザーでグラフィカルに表示◼ 検出CNVに対して、公共データベースの情報を用いたアノテーション付けや、ACMGガイドラインに基づいた臨床的意義の評価も可能

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他手法との比較

検出可能なCNV
Small:
150bp+
MLPA

Medium:1 – 10kb

Large:
10kb+

✓Gene
Panel

Whole
Exome✓✓

Whole
Genome✓Microarray
VS-CNV

データタイプ

✓✓

✓
✓

✓

✓

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VS-CNV導入のメリット

◼

実績-

◼

15報以上の論文実績
MLPA法との100%の相関(Iacocca et al. 2017)

メリット-

実験コスト・時間の節約
ワークフローのシンプル化

5データ解析の流れ
ターゲット法

ビン法（遺伝子パネル、全エクソームシークエンス）（全ゲノムシークエンス）

ターゲット（エクソンなど）ごとにカバレッジを算出

任意指定のビンサイズごとにカバレッジを算出

CNVコール6

カバレッジの正規化✓ リファレンス用サンプル群の正規化済み
カバレッジの平均値✓ 解析対象サンプルの正規化済み
カバレッジ✓ CNV検出結果

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セグメンテーション◼ ゲノム上で、連続するターゲットまたはビンでCNVが検出された場合は、それらを連結させて一つのCNVとする◼ 外れ値などのノイズ除去のため、Circular Binary Segmentation (CBS) または CNAM
Optimal Segmentationアルゴリズムを使用

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VAFによる検証◼ 検出されたCNV上に存在する、SNVなどのVAF（Variant Allele Frequency）の値に基づき、CNVの信頼性を自動で検証◼ VAFの値が1/3、2/3になっていれば、Duplicationが起こっている根拠とされる

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LOH補正◼ 染色体上に、大規模なDeletionまたはDuplicationが存在する場合、サンプルの平均カバレッジが影響を受ける◼ VAFの値を基にLOH (Loss of Heterozygosity) を自動で検出し、染色体上の2倍体以外の領域は、カバレッジの正規化の計算対象から除外する

正規化の対象から除外

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必要なデータファイル◼

必要ファイル-VCFファイル
BAMファイル
BEDファイル（オプション） ＊一部のパネルのBEDファイル（ターゲット領域データ）は、ソフトウェア上からダウンロードも可能

VCF
FASTQ
BAM

BED
*遺伝子パネル、全エクソーム解析の場合のみ
11データとサンプルの条件◼ カバレッジ（リード深度）-

遺伝子パネル、全エクソームシークエンスの場合は、100x 以上が必要-

全ゲノムシークエンスの場合は、0.02x 以上が必要（ビンサイズ：1Mbpの場合）◼ サンプル-

30以上のリファレンス用サンプル-

同一の実験条件（パネルの種類、サンプル調整、シークエンスデータ量など）

12出力データ◼ ターゲット（ビン）ごと-

Ratio: 解析サンプルとリファレンスサンプルのカバレッジ比-

Z-score: 解析サンプルとリファレンスサンプルのカバレッジの差を、標準偏差で割った値◼ CNVごと-P-value: 検出されたCNVの信頼値-Flag: 検出されたCNVのQC情報（低カバレッジ、極端なGC含量など）◼ サンプルごと-Flag: サンプルごとのQC情報（低カバレッジ、リファレンスサンプルとのミスマッチなど）

13ビジュアライゼーション◼ 各出力データは、ワンクリックでゲノムブラウザーにプロットが可能
Ratioと検出
CNVをプロット＋14臨床的意義の確認◼ VarSeqでは、VS-CNVによるCNVコールだけではなく、検出された各CNVへのアノテーション付けによる、臨床的意義の確認も可能-

CNVデータベース
表現型オントロジー
ACMG & ClinGenガイドライン（VSClinical）

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CNVデータベース◼ ソフトウェア搭載のデータソースライブラリーよりダウンロードが可能◼ アレル頻度データベース-

1000 Genomes Phase 3 / ExAC
DGV / gnomAD◼ 臨床情報データベース-ClinVar◼ 用量感受性遺伝子データベース-

ClinGen16

CNVデータベース◼ データベースの情報を付加すると、検出結果のCNVテーブルに、各アノテーションのフィールドが追加される

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表現型オントロジー◼ ユーザー指定の表現型オントロジー (HPO)に基づき、表現型と関連する遺伝子を検索するツールを搭載◼ 検索結果の遺伝子に対して、単純にアノテーション付けを行う場合と、関連の強さに応じたランク付けを行う2種類の手法を選択可能◼ Match Genes Linked to Phenotype-

ユーザー入力の表現型オントロジーと関連する、すべての遺伝子にアノテーション付けを行う◼ CNV PhoRank Gene Ranking-

ユーザー入力の表現型オントロジーとの関連の強さに応じて、遺伝子ごとのランク付けを行う

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表現型オントロジー◼ Match Genes Linkedto Phenotype◼ CNV PhoRank Gene Ranking◼ Match Genes Linked to Phenotypeでは、CNVとオーバーラップする遺伝子に対して、入力した表現型オントロジーとの関連を、TRUEとFALSEの2値で判別したアノテーションを、CNVテーブルに付加◼ CNV PhoRank Gene Rankingでは、遺伝子ごとの表現型との関連の強さをスコア化し、ランク付けしたデータをCNVテーブルに付加
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ACMG & ClinGenガイドライン◼ ACMGとClinGenのガイドラインに基づいた、生殖細胞系列CNVの評価用ツール◼ CNVごとの病原性評価（Pathogenic,Benignなど）を自動で実行し、評価結果をCNVテーブルにアノテーション付け◼ ダッシュボード画面で、評価の手動での調整や、レポート作成も可能◼ 使用するには、別途VSClinicalライセンスが必要

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ACMG & ClinGenガイドライン◼ 評価基準✓ CNVがオーバーラップしている遺伝子上の領域✓ オーバーラップしている遺伝子数✓ オーバーラップしている遺伝子の用量感受性（ハプロ不全など）✓ 既知の疾患と遺伝子の関連情報、CNVの遺伝様式...など

CNVごとに病原性を自動で評価
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ACMG & ClinGenガイドライン◼ CNVテーブルにアノテーション付けを行った場合◼ バリアントダッシュボードで評価を行った場合◼ CNVテーブル上の全CNVには、評価結果の各種データがアノテーションとして追加される◼ バリアントダッシュボードでは、評価結果を手動で調整することや、評価に関する説明や根拠など、詳細情報を確認することが可能

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フィルタリングとアノテーションの確認
フィルタリングワークフロー

CNVテーブル

アノテーション詳細データ◼ CNVテーブルにて、各データ（Flag, P-value, アノテーションなど）に基づきフィルタリングを実行◼ 各CNVに付加されたアノテーションは、詳細画面から全アノテーションの詳細データを確認することも可能
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お問い合わせ先：フィルジェン株式会社
TEL: 052-624-4388 (9:00～18：00）
FAX: 052-624-4389

E-mail: biosupport@filgen.jp

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