別紙4 (課程博士)
Date of subnusslon

平成StudentlD Numbef

環境・生命工学専攻専攻
Pplicant's name氏名7月

今女条誓雫旨号'

第 093829号

長尾信義

Supervlsors

梅影

指導教員

平石

15日

創明

Depa11ment

28年

Abstract

論文内容の要旨(博士)Rhod0Ⅷルm 則mdophiルm におけるネ醐包外核N安放出機構のゲノム規模による解析とTitle ofThesis

博士学位論文名

RNA生産への応用(Genome・、Nide analysis ofthe extraceⅡUlar nudeic acids excretion mechanism inRhodovulU刀I SUグidophi11/1π and its application to RNA か'oduction)f︑(Approx.80o words)(要旨 1,200字程度)

海洋性光合成細菌Rhod0Ⅷルm sWガdophiルmは、増殖と同時に白身の核酸をネ朋包外へ放出するという特徴を持つ。また、培養液中の核酸分解酵素1舌陛が著しく低いため、放出されたRNAは培養液中で安定に蓄積する。先行研究によって、本細菌を利用した機能性RNAの細胞外生産技術が開発されている。しかしながら本細菌の核酸放出メカニズムはいまだ明らかになっていない。そこで本研究では、本細菌のゲノム規模による解析を行い、核酸放出メカニズムに関する知見を得ることを目指した。
第一に、本細菌のゲノムDNA配列の決定と全遺伝子の発現解析を行った。ここでは、基準株であるDSM B74T株およびDSM2351株を解析対象とし、それぞれの株のゲノムDNA配列および遺伝子発現を比較し、既知の表現型の違いと照らし合わせることで、本細菌が持つ遺伝子の機能について考察した。その結果、細胞凝集体(フロック)の形成やアルコール代謝1舌性、そして形質転換能力の有無など、それぞれの株に特異的な表現型について遺伝子レベルでの知見を得ることができた。

第三に、 DSM B74T株が生産するgenetransferagent(GIA)の解析を行った。 GTAはある種の細菌が生産するウィルス様粒子であり、内部にはホスト細菌のゲノムDNAがランダムに内包されている。 GTAは、細菌群の一部が溶菌することで細胞外に放出されることが知られている。ゲノム解析により、 DSM B7ず株がGTA構造遺伝子を有していることが明らかとなった。電子顕微鏡観察によって、 DSM B741株はGIA粒子を生産し細胞外に放出していることが示された。また、 GTA様粒子に含まれるDNAの長さは約4.5 kbであり、ゲノムDNAがランダムに断片化されたものであることが示された。この結果から、 DSM B74T株の細胞外核酸放出にはGIAの生産が関与してぃることが示唆された。
第三に、細胞外への核酸放出能力が低下した変異体SNK0田株を作製し、ゲノムDNA配列解析と遺伝子発現解析を行い、野生株との比較解析を行った。その結果、SNKO01株ではゲノムの一部領域において欠落が生じていること、そして欠落領域に含まれる遺伝子群が細胞外核酸放出に関与している可育昌陛が示された。加えて、細胞外RNAの配列を次世代シークエンサーによって網羅的に解析し、細胞外に特異的に放出されているRNAを探索した。

最後に、 DSM B741株の核酸放出機構を応用し、 shorthairpinRNA(shRNA)のネ醐包外生産を試みた。その結果、 DSM B74T株はShRNA生産に利用可能であることが明らかとなった。この結果は、本細菌を用いたRNA生産手法は様々な機能性RNAに対して応用可能であることを示している。

別紙4 (課程博士)
Date of submission

平成StudentlD Number

環境・生命工学専攻専攻
Pplicant'S 11al】1e

氏名

7月

学籍番号

弟 093829 号

長尾信義

Supervisols

梅影

指導教員

平石

15日

創明

Depa11ment

28年

Abstract

論文内容の要旨(博士)Rhod0Ⅷ1脚1 釧mdoP加加1 における細胞外核酸放出機構のゲノム規模による解析とTitle ofThesis

博士学位論文名

RNA生産への応用(Genome‑wide analysis ofu〕e extl'ace11Ular nucleic acids excl'etion mechanism inRhodovulum sUぴldophilWπ and its application to RNA PI'oduction)(Approx.80o words)(要旨 1,200字程度)

A lnarine photou'ophic bacterium RhodovU1υ1π SUぴ'idophi1切π releases DNA and RNA into
extraceⅡUlar lnilieu durinσ growtl〕. Extrace11Ular nucleic acids are accumulated in culture
Inediuln due t010w activity ofextrace11Ular nucleases. previously, we succeeded in producing
a streptavidin RNA aptalner and halnlnerl〕ead ribozyn〕es extraceⅡUlarly by usinσ thisbacteriuln. HO、Never, the lnechanisms of extrace11Ular nucleic acids excretion ren〕ain to beelucidated. Extrace11Ular nucleic acids eX仇'etions have been found in lnany bacterial species,and its n〕echanisln and physi010gical significance are divergent. Today, genon〕e・、Nlde
analysis is powa'ful tool for colnprehensive unda'standing of organiS1η's property
Unfortunately, genetic infonnation of RhodovulU刀I suljldophilU刀I wa'e insufncient forgenon)e・wide analysis.1n d〕is study,1 Conducted whole・σenon〕e sequencing and RNA・seq
analysis ofRhodovulU刀I SUぴi'dophilU刀lto obtain insights into d〕e n〕echanism of extrace11Ular
nucleic acids excretion.1n addition,1 appHed u〕is lnechanisn〕 to nlnctional RNA productionn)et110d
4︑

FⅡ'st, complete genolne sequences and transcriptolne analyses wa'e perfonned on the type

Strain DSN1 1374T and closely related strain DSM 2351.1hese strains differ in lnany
Phenotypes including ce11 aggregation (aocculation), alcoh01 1netabolisln, potential oftransfonnation and extrace11Ular nucleic acids excretion. Genolnic and tranS引'ipton〕ic
Conlparative analyses ＼Nere expected to reveal genotype of the su'ains and strain・specificgenes that lnay related typlcal phenotypes. C1Ⅱ'on〕osolne of DSM 1374 and DSN12351 Wa'e
Circular with a size of 4,132,586 bp and 4,454,432 bp, respectively. Nun)ber of coding

SequenceS 雛'e 3,876 for DSN1 1374T and 4155 for DSM 2351. AlthoUσh two plasnlids wereConsa'ved il〕 these strains, a unique plaslnid was possessed in DSN12351.1he unique plasn〕idiS 60,897 bp and carryil〕g a nulnber of exopolysaccl〕aride (EPS)・related genes.1t is 、NeHkno、Nn that bacterial EPS ω'e involved in lnany bi010σical process, e.σ. ce11 aggreσation,PI〕age absorption, virulence and protection against antibiotics. Non・consa'ved regions
between t、刃o genolnes seen)ed to be acquh'ed by horizonta1 σene transfer or phage infection
DSM 2351 hω'bored alcohol dehydr0σenase, aldehyde dehydr0σenase and restriction enzyn〕es
Coding genes in non・conserved regions. Both genomes contain prophage regions andStructural genes ofgene transfer agent (GIA)

Second, GTA of DSN1 1374T was subjected to study. GTAS ω'e sl〕aped like bacteriophaσeParticles that containing fraglnents of host genolne.1t is kno、刃n that lysis of subpopulation ofbacteria is required to release GTA particle. previously, we noticed tl〕at the exu'ace11Ular

Soluble DNA preparation from DSN1 1374T contained approxin]ately 4.5 kbp・10ng DNA,

Which is similar in that related bacterium Rhodohacter capsulalus produces GTA containing
4.5 kbp DNA. As described above, orth010gue of GTA structural genes were found in DSM

1374 genolne. Electron microscopy revealed that DSN1 1374T produces GIA、Hke particle
into culture lnedium. This GTA・1ike particle contained 4.5 kbp DNA that was randon〕

fragment fioln genomic DNA.1he 4.5・kbp DNA was not produced when the quoruln sensinσ
inhibitor a・cyclodextrin 、Nas added into d〕e culture. This result suggested tl)at GIA、1ike
Particle production are regulated by quorum sensing.1hese result suggested tl〕at releasing
GIA・1ike particle is associated extrace11Ular nucleic acids eXの'etion in the bacteriuln
Third, extrace11Ular nucleic acids excretion deficient lnutant sNKool was obtained fron]̲

DSM B74 by long・tenn subcultuling. Amount of extraceⅡUlar DNA of sNKool wasdecreased 30・fold as con〕pared with DSN1 1374丁. Genolne sequencing and transcriptolne
analysis were pa'formed in u〕e strain.1n sNKO01, tl〕ree chromosolnal tegions 、Nith size of 33
kbp (region D,16 kbp (region 2) and 8.6 kbp (region 3), and plasmid 2 Were deleted.
Transcripton〕e analysis revealed tl)at expression profile of sNKool was massively altered

Colnpared with DSN1 1374T. Both increased and decreased expression of genes were detected,
Suggested that transcriptional regulator(S) wa'e defected in sNKO01. To deta'n)ine tl〕e genes
related to extraceⅡUlar nucleic acids excretion, extrace11Ular RNA froln culture supa'natant ofDSN1 1374 Was analyzed by high・throughput sequencinσ f0ⅡOwed by comPω'ed withintraceⅡUlar RNAS. AlthoUσh lnost RNAs wa'e detected in intrace11Ular and extraceⅡUlarSalnples equa11y, some RNAS 、Nere significanuy abundant in extracelh11ar samples.1heextrace11Ular‑specific RNAs were transcribed fron]̲ chron〕osolne regions contail〕ing deleted
region 3 0f sNKO01.1his result suggested that extrace11Ular nucleic acids eX仇'etion isOccun'ed by expression of specific genes located in or do、Nnstrean〕 ofthe deleted reσion 3
Fina11y,1 developed extrace11Ular production l〕〕etl)od of short hairpin RNAS (shRNAS)

Using DSM 1374T and engineered plasmid.1he shRNA contains a long stem and loop
Sれ'ucture which is usua11y d)ought to cause transcriptionalterlnination or pause for bacterial
RNA polylna'ases. As a result, shRNAs are successfU11y produced extraceⅡUlarly by thisSysteln and the yield of the sl)RNA is a11nost the salne as that of tl〕e streptavidil〕 RNA
aptamer

Altogether, this study provideS 牙enome sequence, expression profiles and,︑

insi号ht of extrace11Ular nucleic acids excretion mechanisn)s of 冗hodovulum
SU16dophilum. These achievements are excepted to in〕prove functional RNA
Production method using the bacterium.