研究課題名

籾殻・竹からのバイオエタノール生産研究代表者：県立広島大学生命環境学部教授 森永 力
共 同 研 究 ：県立広島大学生命環境学部教授 武藤 徳男（株）ジュオン里山などに多く繁茂する竹の処理が問題となっています。現在その竹は竹細工などにしか利用されておらず、この竹を有効利用するためのバイオエタノール生産技術も、まだ確立されていません。この研究では、竹材を使って、環境に負荷がかからないバイオエタノール生産技術の確立を目指します。
化学的

木質（竹）

処理＋糖化
濃硫酸などを使用するので廃液処理の問題
発酵
生物的今 注目されているのが微生物＋化学的な前処理技術

EtOH

目的
竹はイネ科であり、植物壁にヘミセルロースを含んでいる。

木質（竹）

生物的処理

発酵

EtOH

この処理の過程ではヘミセルロース（Xylan）を分解する様々な酵素Xylanaseなどが必要とされています。そこで、本実験ではこのような酵素を分泌する微生物を土壌中よりスクリーニングし同定。そして、至適培養条件や酵素の精製をすることが目的である。

Screening ①土壌sample
ボルテックス

５ ml
滅菌水

1 ml

１〜２週間培養（２５℃）

Czapek-Dox培地 (pH 6.0)

Czapek-Dox培地 (pH 6.0)
・竹の粉末(粗)・K2HPO4・MgSO4・7H2O
・NaNO3・KCl・FeSO4・7H2O

１〜２週間培養
（２５℃）

2.0%
0.1%
0.05%
0.2%
0.05%
0.001%

・竹の粉末（細）写真；竹の粉末（細）2.0%QuickTimeý Ç²TIFFÅià•èkÇ»ÇµÅj êLí£ÉvÉçÉOÉâÉÄ
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ボールミルで処理

SomogyiNelson法

液体培地

Czapek-Dox培地(pH6.0)
竹の粉末（細）2.0%

還元糖量が多いsample

７days振盪培養（２５℃）

PDA(pH 5.8)
（天然培地）

一次スクリーニング

0.06

0.05

吸光度（ＡＢＳ）

0.04

0.03

0.02

0.01

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940414243444546474849505152535455565758

菌株番号

同定方法

菌体の凍結乾燥（菌体量50mg）

DNA抽出（CTAB法）

PDB
ITS領域をPCRで増幅
PCR増幅産物の塩基配列を解析
相同性検索

28株のITS領域(5’末端から３’末端)
ATGCCAGAACCAAGAGAGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGTGTATGATTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCGATTTGGGGAACGCGGGTTACCGCGAGTCCCAACACCAAGCTGAGCTTGAGGGTTGAAATG
ACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATT
TTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTT
TTGATTTATTTGTTTGTTTTACTCAGAAGTTCCACTAAAAACAGAGTTTAGGG
GTCCTCGGGCGGGCCGTCCCTTGTTACGGGGCGCGGGCCTGATCCCGCCCGAGGCCAACG

表；BRASTACCESSTION
Numberstrain

Identities

GQ365157

Fusarium equiseti isolate By222 18s ribosomal RNA gene

100%(375/375)

GQ505743Fusarium equiseti strain NRRL36478 18s ribosomal RNA gene

99%(374/375)

GQ505694

Fusarium equiseti strain NRRL29134 18s ribosomal RNA gene

99%(374/375)

GQ505690

Fusarium equiseti strain NRRL26922 18s ribosomal RNA gene

99%(374/375)

FN394681

Fusarium equiseti strain 18s rRNA gene(partial),ITS1,5.8s rRNA
gene and ITS2,isolate3358

99%(374/375)

（C源；誘導物質について）
3 days振盪培
養 （２５℃）

100 ml液体培地

５ ml

Czapek-Dox培地 (pH6.0)
C源について〜①竹の粉末（細）2.0%②Glucose
2.0%③竹の粉末（細）2.0%Glucose
0.1%

Czapek-Dox培地 (pH6.0)
・Glucose・K2HPO4・MgSO4・7H2O・NaNO3・KCl・FeSO4・7H2O

４ days振盪培養（３０℃）

2.0%
0.1%
0.05%
0.2%
0.05%
0.001%

1hr,37℃振盪

1.5 ml

４℃,10000 rpm
１０ minSomogyi-Nelson法
Buffer（pH6.0,8.0） 1.5 ml
Xylan 20 mg
上清 0.2 ml☆Buffer(McILvaine)ジャーファーメンターでの経時変化
3982.5765
1.5pH(mｇ/ml)

241320.5100061224487296 120 144 168 192 228 264(hours)

７２hで酵素精製に適していることが示唆された。

pH 6.0pH 8.0タンパク量pH

28株由来粗酵素の至適pH、温度

1hr,１５,28,37,50,60,70℃で振盪させる。

Somogyi-Nelson法

Buffer（pH 3.0~11.0） 1.5 ml
Xylan 20 mg
粗酵素液0.2 ml

４℃,10000 rpm
10 min☆Buffer(McILvaine（３.0〜８.0）,Atkins＆Patin（８.0〜１１.0）)

粗酵素の至適pH ☆Buffer；McILvaine（pH 3.0〜8.0）,Atkins＆Patin（pH 8.0〜11.0）
3.5

3糖濃度（mg/ml）

2.52A
B

1.5

10.50
34567ｐH8910

至適pH 6.0or 8.0をもつだろうと示唆された。

11

粗酵素の至適温度

Buffer；McILvaine（pH 6.0、8.0）3.5
3糖濃度（mｇ/ml）

2.52buffer pH6buffer pH81.510.5015℃

28℃

37℃

50℃

60℃70℃

至適温度３７℃前後の酵素の存在、また至適pH 6.0、至適温度６０℃前後の酵素の存在が示唆される。

pH安定性43.5(OD=500nm)(×10-1)

32.5
pH 6.0pH 8.021.5
10.50
pH 3.0pH 4.0pH 5.0pH 6.0pH 7.0pH 8.0４℃の条件下では、至適pH 6.0の酵素では、pH 6.0において最も安定であることが示唆された。また、至適pH 8.0の酵素では、pH 8.0において最も安定であることが示唆された。

温度安定性0.40.35

活性（吸光度）

0.30.25
pH 6.0pH 8.00.20.150.10.0501525

37506070温度

至適pH 6.0、pH 8.0の酵素では、共に４〜３７℃において安定であることが示唆された。５０℃以上の温度では、両方の酵素は、失活すると考えられる。

バイオエタノール生産
酵母菌（S.cerevisiae）（培養約８hour後）
３７℃
５hour

竹；１200mg
Beffer pH 6.0;90ml
酵素液；12ml(1;Cellulase 0.1g)(2;Xylanase＋Cellulase 各0.1g)（3;Xylanase 0.1g）

30℃
１６hour

4℃、12000rpm
10min F-kit エタノール測定F-Kitによるエタノール量測定
EtOH量0.60.5（g/l）

0.40.3EtOH量0.20.10Cellulase

Cellulase＋Xylanase

Xylanase

Xylanase分解産物による阻害は、あまり見られなかった。

キシロース資化性エタノール生産菌のスクリーニング
ダーラム管拡大図気泡(炭酸ガス)
エタノール定量(F-kit)単離またはDGGE後同定
土PCR条件Czapek液体培地＋2%xylose

培養(25℃)

94.0℃
94.0℃
64～56.0℃
72.0℃
94.0℃
55.0℃
72.0℃
72.0℃
4.0℃

4min
20sec
10sec ⇒ (2cycle毎1℃ずつ下がる)
30sec
20sec
10sec
30sec
×２０cycles
5min∞

PCR Primer
Bact 357 F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)
Bact 937 R(3’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-5’)

500

No.28

400

xy28-2

Sample No.
βNo.6Noxy 1 . 82xy 1 16xy 1 272No.1 9No.2 1xy 2xy 2 36保 126-3No.2xy 2 88xy 3 52xy 3 24xy 3 16xy 3 17xy 3 18xy 3 29xy 4 10xy 4 21xy 4 33xy 4 142No.4xy 5 952
No.5 8xy 60xy 6 282
No.7xy 7 02
α -2
11
α .2
12
α .2
21.1

エタノール濃度(μg/ml)

キシロース資化性エタノール生産菌のスクリーニング
No.40

450

土壌sample
単離菌

No.26

350

300

250

xy40-1200

150

100

500本研究のまとめ
竹粉砕物分解菌として土壌よりFusarium equisetiを分離し、キシラン分解酵素の性質を明らかにした。
本菌の生産する酵素を竹粉砕物に作用させ、グルコースとキシロースを生産することができた。
本酵素を竹粉砕物に作用させたのち、Saccharomyces cerevisiaeを用いてバイオエタノールを生産することができた。
キシロース発酵性の2種類の細菌を自然界から分離することができた。
ブナシメジ廃菌床から籾殻を分解できる酵素の抽出をすることができた。
その酵素を用いて、籾殻からグルコースを生産することができ、Saccharomyces cerevisiaeによるアルコール生産が期待できる。