MonoFas® 口腔粘膜細胞ゲノムDNA抽出キットⅧ トラブルシューティング
トラブル

DNA回収量が少ない

抽出・精製した核酸のA260/A280比率が高い

予想原因

対処法

①

口腔粘膜細胞とBuffer A8との混和が不十分なために細胞溶解が不完全

口腔粘膜細胞に加えたBuffer A8の量を確認（適量な細胞量であればBuffer A8を200 µL、多量な場合は400 µLに調整する
その場合はBuffer B8の量も400 µＬにする
新しいサンプルで再度DNA精製を行なう
Buffer A8に添加後、ボルテックスで完全に溶解させる②

インキュベーション時間が不十分なためにBuffer A8中での細胞溶解、タンパク質変性が不完全

新しいサンプルで再度DNA精製を行なう
細胞サンプルの溶解を確認し、インキュベーション時間を延長する③

SpinColumnにロードする前にライセートにイソプロパノールを添加していないイソプロパノールを正確に添加したか確認する
メタノールやメチルエチルケトンのような物質を含んだ変性アルコールは使用しない
新しいサンプルで再度DNA精製を行なう④ DNAの溶出が効率的でない

モノリス表面の中央部分にBuffer D8を添加して全体が馴染むようにする
溶出効率を高めるため、Spin ColumnにBuffer D8あるいは精製水をピペットで添加後、遠心操作前に室温でカラムを１分間インキュベートする⑤ 溶出BufferのpHが適正でない（酸性）DNAは10 mMのTris-HCl, pH 8.5～9.0或いは精製水のみで溶出させる
溶出効率はpHに依存し、pH 7.0～8.5で効率が最も高い
低いpHはDNA収量を低下させることがある
精製水で溶出したい場合はpHが7.0以下でないことを確認するか、Buffer C6を溶出に使用する⑥ BufferA8が沈殿している

BufferA8を約40℃で温めて再溶解する⑦ Buffer B8とC8の順番を間違えて使用

Buffer B8とC8をプロトコールの順序に従って使用したか確認
新しいサンプルで再度DNA精製を行なう⑧ 多量のBuffer D8 で溶出100 µL以下で溶出を行なう場合は、溶出液中のDNA濃度は増加するが、トータルのDNA収量が多少低下する
微量DNAを含むサンプルには10 µLのBuffer D8あるいは精製水での溶出を推奨する①

SpinColumnにロードする前にライセートにイソプロパノールを添加していない新しいサンプルで再度DNA精製を行なう②

Buffer A8 とBuffer B8が残っている、またはBuffer C8による洗浄が不十分

抽出・精製ＤＮＡをエタノール沈澱して回収する③ 溶出液中にエタノールが残留、不純物が混入

溶出の前に洗浄ステップを行ったことを確認する
洗浄工程の追加又はDNA吸着後、カラムにBuffer C8 500μLを添加して、５分間室温でインキュベートしてから、遠心する④ RNAの残留量が多い

プロトコールに記載されているBuffer RNase Aなしでの精製でなく、RNAフリーを求める場合、精製後のDNA溶液をRnase Aで処理すること
RNase A溶液での処理方法
PCRの前にテンプレートのRNAを除去する場合、溶出DNA 200 μLに対し0.5 μLのRNase A溶液を入れ、37℃で15分間インキュベーションする

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トラブル

予想原因

⑤ サンプル中のDNA量が不十分

溶出液中にDNAが少ない場合は、反応に添加する溶出液量を増やす
必要に応じて、DNAを真空濃縮するか、使用したサンプル量を増やして、再度精製を行なう
精製したDNA量が相変わらず少ない場合には、溶出量を50 μLに減少する
溶出量を減少するとトータルDNA量はわずかに低下するが、溶出液中の核酸濃度は増加する
Spin Column上に残留したDNAは溶出ステップ後に、同一溶出液を再度カラムにアプライし溶出ステップを繰り返して回収できる⑥ RNAの残留量が多少ある

プロトコールに記載されているBuffer RNase Aなしでの精製でなく、RNAフリーを求める場合、精製後のDNA溶液をRNase Aで処理すること⑦ PCR増幅反応の感度が低下

PCR増幅反応にテンプレートとして添加する溶出液の量を調節する⑧ PCR増幅反応セットアップを変更

添加された溶出液量を調節して増幅システムを再度至適化する① 溶出液中のDNA量が不十分

溶出液中にDNAが少ない場合は、反応に添加する溶出液量を増やす
必要に応じて、DNAを真空濃縮するか、細胞数が少ない場合は、サンプル量を増やして、再度精製を行なう
もしくは、溶出量を50 µLにするなど液量を減らす
溶出量を減らすとトータルDNA量はわずかに低下するが、溶出液中の核酸濃度は増加する
カラム上にDNAが残っている場合があるので、溶出ステップ後に、同一溶出液を再度カラムにアプライする
溶出ステップを繰り返して回収すると回収量があがる場合がある② 調製中の阻害物質可能性のある原因をトラブル及び対処法の「精製した核酸のA260/A280比率が低い」の項をチェックする③ 溶出液中にBuffer D7が残留プロトコールにおける洗浄工程２の後に乾燥ステップを行なう（エタノールを完全にとばす）溶出の前に、カラムに廃液が付着していないことを確認する④ Buffer C7とD7の順番を間違えて使用

Buffer C7とD7をプロトコールの順序に従って使用したか確認する⑤ RNAの残留量が多少ある

完全に残留RNAをなくす場合は、精製後のDNA溶液をRNase Aで調製行う⑥ PCR増幅反応の効率が悪い

PCR増幅反応にテンプレートとして添加する溶出液の量を調節する
添加された溶出液量を調節して増幅システムを再度至適化する① カラムから回収したDNAにコンタミがある

DNAをエタノール溶液で再度精製する② Buffer B8が残っている残余のDNAを再度モノリスカラムで遠心する、残余のDNAサンプルに2倍のBPP色素を添加する

抽出・精製した核酸のA260/A280比率が高い

抽出・精製したDNAが酵素反応効率が低い

精製DNAをアガロースゲルにアプライできないアガロースゲルで確認したDNAより精製後に確認したDNAが少ない

対処法

アガロースゲル上のDNAにコンタミ成分がある

アガロースゲル上のDNA量をエチジウムブロマイドで定量する

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トラブル

予想原因

ライセートがカラムを完全に通過しない①
精製効率が悪い対処法

細胞濃度が高く、完全に溶解されてない

プロトコール通りの細胞量で使用する
速度で1分間あるいは全ライセートがモノリスを通過するまで遠心分離する

Buffer A8が残っている、溶出液中にエタノールが残留不純物が混入

本取扱説明書の各ステップが確実に実行されていないため、もう一度確認して各ステップを忠実に実行する② 溶出液中に変性ssDNAを含む用意した反応液を95℃で2分間インキュベート後、室温まで冷却する、その後酵素を加えて酵素反応させる① 酵素濃度、消化時間が不十分

酵素量と消化時間を増やす適切な温度と最適Bufferで消化する② カラムを通過させたDNAにエタノールが残っている

DNAをエタノール沈殿で回収または濃縮する

制限酵素消化がうまく行かない

株式会社アニモス Tel：048-606-2892 E-Mail：monofas@animos.co.jp
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