遺伝子バリアントの効率的なフィルタリング
ワークフロー作成

フィルジェン株式会社 バイオインフォマティクス部(biosupport@filgen.jp)
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はじめに✓ シークエンス✓ リードアライメント✓ バリアントコール✓ アノテーション✓ フィルタリング✓ データの閲覧✓ 解析結果の共有

TAAAA◼ 次世代シークエンサーより出力された遺伝子バリアントを評価し、疾患との関連を調べるには、バリアントの効率的なフィルタリングと高品質なアノテーションが必要◼ Golden Helix社VarSeq®ソフトウェアでは、遺伝子パネルや全エクソー
ム／全ゲノムシークエンスで得られたバリアントデータに対して、様々なデータベースを利用したアノテーション付けと柔軟なフィルタリングワークフ
ロー作成により、病原性バリアントの同定が可能
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VarSeq®
Annotation

Variant Filtering◼ 様々なデータベースを用いて、バリアントデータ（VCFファイル）へアノテーション付けを実行• RefSeq Genes• dbSNP• ClinVar• OMIM• CIViC• ICGC / TCGA
• MSK Impact• Orphanet• BRCA Exchange• PMKB• dbNSFP• REVEL• CADD• 1000 Genomes• NHLBI 6500 Exomes• ExAC Variant• gnomAD Exomes/Genomes• GenomeAsia 100K
• 各種遺伝子パネルのターゲットデータ...など◼ アノテーション付けされたバリアントデータより、任意の検索条件でデータのフィルタリングを行うワークフローを作成◼ カバレッジ計算やトリオ解析、表現型情報に基づく遺伝子ランキングなどの解析アルゴリズムを搭載◼ ゲノムブラウザーにより、サンプルのバリアントデータやリードアライメントデータ（BAM/CRAMファイル）、また各種アノテーションを可視化

Data Analysis

Genome Browser◼ 有償アドオンによる機能拡張で、CNV検出や臨床的意義の自動評価、パイプライン機能などが利用可能
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解析の手順ACTGCGGGGAGACCTAGGCGGCTCTGCGGACGCAGCTCCTTCGCCGCCTTCCCCCTCCCGTCC
AGTGCCCAGGCGGCTCCTGGCTGCGACGCTG
CCCTGGGTGGGAGGCGCGGCACCGCGGCAGCTGAGCCCTCTGCGCGGCGCAGCCAGCTCTCCCGCTCGCGCGGCGCCGTGACAGGTGCAGGG
TCCCCGCCCGAGACCCACCTGCAGGGGCTGT

Import◼ VCFファイルを読み込み

Annotation◼ データベースによるアノテーション付け◼ 解析アルゴリズムの結果データのア
ノテーション付け

遺伝子
データベース

アレル頻度
データベース

Filtering◼ フィルタリングワークフローの作成

表現型ランキング

トリオ解析

Review◼ 抽出バリアントの詳細データ確認

臨床情報
データベース

GCACC
病原性バリアント4

アノテーションリソースと解析アルゴリズム

アノテーションリソースライブラリー

解析アルゴリズム選択画面◼ アノテーションに用いるデータベースは、最新のデータをアノテーションリソース
ライブラリーよりダウンロード◼ 解析アルゴリズムは一覧より選択するだけで実行可能◼ 外部VCFやBEDファイルなども使用可能

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バリアントテーブルとフィルタリングワークフロー作成

アノテーション付けされたバリアントテーブル◼ アノテーション付けを実行すると、VCFファイルのデータ（バリアントテーブル）にデータフィールドが追加される◼ 追加した任意のフィールドを使用し、フィルタリングのためのワークフローを作成

フィルタリングワークフロー
6フィルターバリアントの詳細確認

リードアライメント表示◼ 詳細表示エリアにて、1バリアントごとに全アノテーションフィールドの詳細データを確認

アノテーション詳細表示◼ BAM/CRAMファイルがあれば、ゲノムブラウザーにリードアライメントを表示させ、バリアントの目視チェックなども可能

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基本型ワークフロー
シークエンスクオリティーによるフィルター✓ Read Depth✓ Variant Allele Frequency (VAF)✓ Genotype Quality

コモンバリアントの除去✓ gnomAD✓ 1000 Genomes

遺伝子機能に影響を及ぼすバリア
ントの抽出✓ Missense Variant✓ Nonsense Variant✓ Splice Region Variant

良性バリアントの除去✓ ClinVar✓ ACMG Classifier

表現型と関連する遺伝子のバリアントの抽出✓ PhoRank Gene Ranking✓ Genes Linked to Phenotypes

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シークエンスクオリティーによるフィルター-

VCFファイルに含まれているバリアントごとのシークエンスクオリティーの値でフィルターを行う✓ リード深度（Read Depth）✓ バリアントアレル頻度（Variant Allele Frequency）✓ 遺伝型クオリティー（Genotype Quality）-

シークエンス実験のノイズデータなどの除去に使用-

カットオフ値はシークエンスプラットフォームやデータ量、サンプルの種類により異なる

9コモンバリアントの除去-

バリアントの一般集団内のアレル頻度でフィルターを行う-

一般集団内のアレル頻度が高いバリアントは良性とみなし、集団内に存在しないものや頻度が低いものを病原性バリアントとして抽出-

VarSeqでは様々な種類のデータベースが用意されていて、複数のデータベースを組み合わせてフィルタリングに使用することが可能
✓✓
✓
✓
✓
✓

gnomAD Exome/Genome
1000 Genomes
ExAC
NHLBI ESP6500
TOPMedGenomeAsia 100K

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遺伝子機能に影響を及ぼすバリアントの抽出-

タンパク質のアミノ酸配列の変化などの遺伝子機能に影響を及ぼすバリ
アントを抽出-RefSeqによる遺伝子アノテーション付加により、ミスセンスバリアントや機能喪失バリアント（ナンセンス・フレームシフト・スプライシングドナー／アクセプター部位バリアントなど）を抽出可能-

配列オントロジーや遺伝子領域に関するアノテーションも同時に付加され、フィルタリングに利用することも可能

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遺伝子機能に影響を及ぼすバリアントの抽出-

RefSeqでは、In Silico予測されたスプライシング異常を引き起こすバリアントに対しても、アノテーション付けとフィルタリングが可能-

以下4種類のプログラムで予測された、エクソンスキップなどのスプライシング異常や何種類のプログラムで予測が一致したかのデータでフィルタリングを実行✓ GeneSplicer✓ NNSplice-✓ MaxEntScan✓ PWM

スプライシング部位からの距離が近いバリアントを抽出することで、未知のスプライシング異常の候補バリアントを抽出することも可能
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良性バリアントの除去-

既知の良性（Benign）バリアントの除去を行う-

ClinVarに登録されているバリアントの分類情報で、「Benign」と「Likely Benign」と一致しないものだけをフィルター抽出する-

ClinVarの代わりにVSClinical ACMG Classifier（有償アドオンが必要）を用いることで、ACMGガイドラインで良性と判断されたバリアントを除去することも可能

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表現型と関連する遺伝子のバリアントの抽出-

サンプルの表現型を表すHPO (Human Phenotype Ontology) タームを入力し、入力タームと関連が強い遺伝子に優先順位付けを行う-

順位は0～1の数値で付けられ、1に近いほど関連が強い遺伝子ということになる-

順位付けまで行う場合はPhoRank Gene Rankingアルゴリズムを、関連する遺伝子を抽出するだけならGenes Linked to Phenotypesアルゴリズムを使う

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応用型ワークフロー

FatherMother

遺伝性疾患

がん

✓ トリオ解析✓ 腫瘍－正常組織ペア解析✓ がん専用データベースによるアノテーション

集団ゲノム解析

バリアントの機能予測✓ 集団内のアレルカウント✓ 病原性予測の分類✓ 病原性スコアの計算

Proband15

遺伝性疾患◼

トリオ解析-VCFファイルにGTフィールド（1/1, 0/1など）が書き込まれている場合は、バリアントテーブルにHomozygous、Heterozygousなどの接合性データのフィールドを表示可能-

トリオ（患者と両親）などの複数サンプルのVCFファイルを読み込み、バリアントテーブルに全サンプルのデータを表示させることで、各サンプルのZygosityフィールドごとにフィルター項目を作成できる← 患者の接合性← 母親の接合性← 父親の接合性

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遺伝性疾患-De Novoバリアントと複合ヘテロ接合体は、解析アルゴリズムを実行することによって抽出

De Novoバリアント

複合ヘテロ接合体
17遺伝性疾患-

ワークフローを分岐させることによって、複数の遺伝形式によるフィルタリングを同時に実行-

VarSeq標準搭載のレディメイドワークフローを使用することで、ユーザー自身でワークフローを構築する必要なく、De Novoバリアントや優性ヘテロ・劣性ホモバリアント、複合ヘテロ接合体やX連鎖バリアントをまとめて抽出することも可能

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がん◼

← 腫瘍組織のバリアントアレル頻度

腫瘍－正常組織ペア解析-

腫瘍組織、正常組織の両サンプルのVCFファイルを読み込み、バリアントテーブルに両サンプルのデータを表示させることで、それぞれのバリアントアレル頻度フィールドごとにフィルター項目を作成できる-

腫瘍組織サンプルではバリアントアレル頻度が大きく、かつ正常組織サンプルでは低い（または未検出）バリアントを抽出することで、体細胞バリアントの検出が可能← 正常組織のバリアントアレル頻度19がんCIViC◼

Cancer Hotspots

がん専用データベースによるアノテーション-

がん研究に特化したデータベースが多数用意されており、アノテーション付けやフィルタリングに活用できる-

CIViCでは、がんに関連した遺伝子の抽出や臓器・治療エビデンス情報、Cancer
Hotspotsでは変異のホットスポット部位によるフィルタリングが可能

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集団ゲノム解析◼

集団内のアレルカウント-

多数のサンプルVCFファイルを同時に読み込んだ場合は、解析アルゴリズムにてサンプル集団内のバリアントごとのアレル数や頻度などを計算し、フィルタリングに利用することが可能-

サンプル集団を複数のグループに分け、各グループごとにカウントを行うことも可能

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バリアントの機能予測

dbNSFP 4.2dbNSFP 3.0◼

病原性予測の分類-

バリアントのタンパク質の機能に与える影響を、タンパク質立体構造やアミノ酸配列の進化的保存度を様々なプログラムで評価した
dbNSFPデータベースでアノテーション付け-バージョン4.2では30種類以上のアルゴリズムの評価結果を個別にフィルタリングし、バージョン3.0ではプログラムは6種類のみだが、6種類中のいくつのプログラムで有害と判定されたかという条件でフィルタリングが可能
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バリアントの機能予測◼

病原性スコアの計算-

タンパク質への影響をスコア化したデータベースとして、CADD（有償アドオンが必要）とREVELが利用可能-

CADDはすべてのSNVと既知のInDelsに対し、ヒトリファレンスゲノム上で取り得る全パターンのバリアントのランクを1 – 99の範囲でPHREDスコアとして算出（上位10%ではPHREDスコアが10、上位1%では20、上位0.1%では30）-

REVELはミスセンスバリアントに対して、SIFTやPolyphen-2などの13個の機能予測プログラムからのスコアの組み合わせに基づき病原性を予測したもので、0 – 1の範囲のスコアが算出される
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お問い合わせ先：フィルジェン株式会社
TEL: 052-624-4388 (9:00～18：00）
FAX: 052-624-4389

E-mail: biosupport@filgen.jp

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