転移性遺伝因子の転移活性決定要因の解析
Factors determining transposition activity of transposable elements
研究代表者

立教大学理学部生命理学科助教授

関根靖彦

Associate Professor, Department of Life Science, College of Science
Rikkyo (St. Paul’s) University, Yasuhiko SEKINE
トランスポゾンはあらゆる生物のゲノムに存在し、転移能力によりゲノムの変異や再編成を引き起こす。
本研究は大腸菌の代表的なトランスポゾン IS1 を中心に、その転移に影響を与える諸要因について解析を行った。その結果、IS1 の転移に必要な宿主因子 H‑NS に関して、H‑NS の DNA 結合活性は必要無いが、マルチマー形成活性が重要であること、
H‑NS は IS1 の転移部位の選択にも影響を与えることが明らかになった。
また、
hns ‑株でも転移がおこるトランスポゼース側の変異と宿主側の変異を同定した。さらに、IS1 の転移に影響を与える新規の宿主因子を同定した。また、新しい IS1 ファミリーメンバーをラン藻や古細菌のゲノムから発見し、その配列比較と変異導入実験によりトランスポゼースの活性中心 D‑D‑E モチーフを同定した。
AbstractInsertion sequences (IS) are discrete DNA segments able to move to new sites. IS1 is the smallest
active transposable element in bacteria and is involved in various kinds of genomic rearrangements.
H‑NS is a host‑encoded factor required for IS1 transposition. In this study, the central domain ofH‑NS, which is involved in oligomerization of the H‑NS protein, was found to be important for IS1
transposition. It was found that H‑NS affects target site selection for IS1 transposition. Usingthe papillation assay, mutations in either the transposase genes or chromosomal genes, which can induce
transposition of IS1 in the absence of H‑NS, were identified. IS1 transposase was shown to have theD‑D‑E motif that represents the active center of the protein.

1. 研究目的

証されつつある。IS が細菌ゲノムのダイナミズムの原動転移性遺伝因子（トランスポゾン）は生物のゲノムに普力の１つであることは疑う余地のないことであるが、「IS遍的に存在し、それが引き起こす様々な DNA 組換え現象は宿主菌がどのような状態のときに転移するのか？」といを通してゲノムの変異や再編成を引き起こす。トランスポう問いに対する明確な答えは得られていない。本研究は大ゾンは自身がコードするトランスポゼースの作用により腸菌の IS の転移活性に影響を与える因子（宿主因子なら標的 DNA 上のランダムな位置に転移する。様々な細菌ゲノびにトランスポゼース内のアミノ酸残基）を探索し、そのムの全塩基配列が明らかになっているが、それらのゲノム作用機作を解析することを通して、IS の転移反応を内外上には例外なく多種多様な IS（insertion sequence；小の因子との関わりあいの中で捉えることを目的として行型のトランスポゾンの総称）が存在しており、ゲノム配列った。の比較によって IS が関与するゲノム構造の変動が広く実2 . 研究経過2.1

I S 1 の遺伝子発現機構について

IS1 をクローニングしたプラスミドを各種制限酵素で切断

本研究の主たる対象である IS1 は全長が 768 bp で、して生じた DNA 断片に対する H‑NS タンパク質の結合活性active なトランスポゾンでは最小の因子である。IS1 は内をゲルシフト法により解析した。その結果、IS1DNA には部に out‑of‑frame の２つの orf、insA と B’‑insB をコー

H‑NS の特異的結合部位は存在しないことがわかった。

ドし、トランスポゼースは両 orf が重なる部位で insA の(b) IS1 の転移に関与する H‑NS の機能ドメインの解析：

翻訳の読み枠が‑1 方向にずれること（翻訳フレームシフ

H‑NS は、①各種の遺伝子の転写抑制の必要な N 末ドメイト）を介して両 orf の融合タンパク質として産生される。

ン、②マルチマー形成に必要な中央ドメイン、③DNA 結合

翻訳フレームシフトが起こらない場合は、InsA タンパクに必要な C 末ドメイン、から成る。IS1 の転移にどのドメ質が産生され、これは転移のインヒビターとして機能するインが必要であるかを調べるため、各ドメインに変異をも（Figure 1）。

つH‑NS を産生する大腸菌内でのIS1の転移活性を調べた。

IS1

その結果、N 末や C 末ドメインの変異がある場合は転移はA 6 Csequence

IRLIRR起こるが、中央ドメインの変異がある場合に転移は起こら

insA
B'

insBなかった。この結果は、IS1 の転移には H‑NS のマルチマ
768mRNA1
no frameshifting

結合能は不要であることを示す。

-1translationalframeshiftingInsA(transpositioninhibitor)

ー形成能が必要であることを示すとともに、H‑NS の DNA

atA

6C(c) hns‑株でも転移能を有する変異トランスポゼースの取得：プロモーターを持たないβ—ガラクトシダーゼ(lacZ)

α helxi-turn

α helxi

遺伝子を内部に持つ IS1（ミニ IS1(lacZ)）をトランスポ
InsA-B'-InsB(transposase)

ゼース遺伝子とともにプラスミドにクローンニングする。
α helxi-turn-

α helxi

D - 56aa - D - 24aa -E

D-D-E motif（ここで用いるトランスポゼース遺伝子は翻訳フレーム

Figure 1. Structure and gene expression of IS1

シフトなしで発現するように、フレームシフト部位に１塩2.2基の挿入変異を持つ。
）このプラスミドを保持する大腸菌転移に関与する宿主因子の解析(1)IS1 の転移における H‑NS の作用機構の解析

内でミニ IS1(lacZ)が染色体上の転写領域に挿入した場合、我々は、大腸菌のヒストン様タンパク質 H‑NS の欠損株

lacZ 遺伝子が発現するので、X‑gal を含む寒天培地上のコ(hns‑)では hns+ 株に比べ IS1 の転移頻度が 1/100 以下(検ロニーには青い斑点（パピリ）が生じる。パピリの数が転出限界以下)になることから、H‑NS がIS1 の転移には必須移頻度を反映する。hns‑株の大腸菌のコロニーにはパピリであることを既に報告している。しかし H‑NS がどのようは殆ど生じなかった。次に、この実験系（パピレーションに IS1 の転移に関与するのかについての分子機構は全くアッセイ）において、IS1 のトランスポゼースを運ぶプラ不明である。そこで、その分子機構の解明を目的として、スミドにランダムな変異を導入し、hns‑株であるにもかか以下の解析を行った。

わらず、パピリが多数生じたコロニーを得た。これらのコ(a)H‑NS の DNA 結合活性：H‑NS は DNA 結合活性を有していロニーからプラスミドを抽出し、その塩基配列を解析した

ることが知られている。H‑NS は IS1 の DNA に結合するこ

ところ、2 例についてはトランスポゼースの 130Arg→Ser、とにより転移を促進している可能性を検討するために、

1 例については 131Leu→Phe、1 例については 105Ala→Val の一塩基置換変異を持っていた。hns‑株におけるこれらの変野生株の 1/5 から 1/20 であった（Figure 2B）。galT はガ

異トランスポゼースの転移能を測定したところ、その転移ラクトース代謝に関与する遺伝子であることから、この結能は野生型トランスポゼースの約７０倍以上に上昇して果は IS1 の転移に細胞内の糖代謝やエネルギーレベルがいた。変異部位は H‑NS の作用機作と何らかの関連がある関与している可能性を示唆する。と考えられる(d) H‑NS が IS1 の転移部位の選択に与える影響：(c)で述A (a)

(b)

(c)

べた H‑NS 非依存的転移能を有するトランスポゼースによる hns＋株と hns‑株における標的プラスミドへの IS1 の転移部位の分布を調べた。その結果、hns＋株ではある特異的な AT‑rich の領域に集中して転移がおこったのに対し、

hns -hns‑ 株ではその領域への集中傾向が弱くなり､他の(1)

non‑AT‑rich な領域にも転移がおこった。
この結果は､H‑NSB (a)hns aspA ( >8.37 )(b)

hns mhpD ( >7.16 )(c)が IS1 の転移における標的部位の選択に関与していることを示唆する。
(e) hns‑株で IS1 の転移を回復させる宿主側のサプレッサー変異の同定：hns‑株の染色体に Tn10 のランダム挿入変wt(1)異を導入し、パピレーションアッセイにより、パピリの数が増加する株の取得を試みた。その結果、２種の変異株をFigure 2.

ybhD ( 0.19 )galT ( 0.05 )Colonies of E.coli strains. Relative

取得し、その変異部位を決定したところ、Tn10 は aspA とvalue of transposition frequency of mini‑IS1 in each

mhpD に挿入されていた。
これらの変異体での転移頻度は、

strain is indicated in parenthesis.

hns‑株の 7 8 倍以上だった（Figure 2A）。これらの遺伝子産物は、アミノ酸や芳香族化合物の分解酵素であり、こ2.3

れらの代謝産物は共通して TCA サイクルの中間体となる因の解析

ことから、この結果は IS1 の転移にある種のアミノ酸代謝(1) トランスポゼース遺伝子の発現のマイクロアレイにや TCA サイクルが影響を及ぼすことを示し、IS1 の転移に細胞内の物質代謝やエネルギーレベルが関与している可トランスポゼース遺伝子の発現に影響を与える要よる解析
大腸菌MG1655 株の染色体には約６０コピーのIS が存在能性を示唆する。

しており、これらは配列の類似性からいくつかのファミリ(2)新たな宿主因子の探索ー（IS1 ファミリー、IS3 ファミリー、IS4 ファミリー、hns+株の染色体に Tn10 のランダム挿入変異を導入し、IS630 ファミリーなど）に分類される。これらの IS の中パピレーションアッセイにより、パピリの数が減少する株には内部が欠失しているものもあるが、大半は内部にプロの取得を試みた。その結果、２種の変異株を取得し、変異モーターとトランスポゼース遺伝子をコードしている。IS部位を決定したところ、Tn10 はgalT と ybhD（機能未知遺の転移活性は当然トランスポゼース遺伝子の転写量と密伝子）に挿入されていた。これらの変異体での転移頻度は接に関連していると考えられる。そこで、各種 IS のトランスポゼース遺伝子の転写量の変化を包括的に解析する

D‑D‑E モチーフを構成する３つの酸性アミノ酸が保存されためにマイクロアレイを作成した。具体的には、奈良先端ていることを見出した（Figure 1）。実際に、この３つの大の森浩禎博士、大島拓博士の協力を得て、大腸菌 K‑12

酸性アミノ酸への置換変異は転移活性を著しく低下させ株の全遺伝子マイクロアレイに、代表的な９種の IS(IS1,た。この結果は、IS1 においても D‑D‑E モチーフが活性中IS2, IS3, IS5, IS30, IS150, IS186, IS609, ISEc1)のト心として機能することを示す。

ランスポゼース遺伝子 DNA をスポットした。これを用いて、

3.

研究成果

大腸菌生育条件（生育温度、栄養、各種ストレス）を変えH‑NS の作用機作を探るために有効な、hns‑株で IS1 の転た場合のトランスポゼース遺伝子の転写量の変化の解析移が回復する宿主側およびトランスポゼース側の変異をを行っている。

同定できた。また、H‑NS 以外の新たな宿主因子を同定で(2)翻訳フレームシフトの効率に影響を与える因子の同定きた。これらの結果は、IS の転移が宿主の機能によりど2.1 で述べたように、IS1 は転移を引き起こすトランスのように調節されているかという興味深い問題に新しいポゼースと転移のインヒビターである InsA タンパク質を糸口を与えるものである。また、IS1 は他のトランスポゾ産生し、転移活性は両タンパク質の量比により変動する。

ンと同様に D‑D‑E モチーフを有することが証明でき、この量比は翻訳フレームシフトの効率により決定される。

D‑D‑E モチーフの普遍性を示した。

そこで、翻訳フレームシフトの効率に影響を与える因子の4.

今後の課題と発展同定を試みた。パピレーションアッセイで用いたプラスミ

H‑NS の作用機構を知るために、IS1 転移の in vitro 系

ドとほぼ同じであるが、翻訳フレームシフトが起こらないを構築し、そこに H‑NS を添加した場合の効果を調べる。とトランスポゼースが産生されないような遺伝子を運ぶ本研究で取得した H‑NS なしで転移能を有する変異体トラプラスミドを大腸菌に保持させる。この大腸菌のコロニー

ンスポゼースを用いた場合の in vitro での転移を調べる。には数日でパピリが生じる。この大腸菌の染色体に Tn10

本研究で同定された宿主因子について、その作用機構を、のランダム挿入変異を導入し、パピリ形成が早くなる株、H‑NS との関係も念頭に置きながら、遺伝学的、生化学的もしくは遅くなる株を選択することによって、翻訳フレーに解析する。

ムシフトの効率に影響を与える宿主側の因子の探索を行

マイクロアレイ解析で、トランスポゼース遺伝子の発現っている。

が変動する条件が見つかった場合は、その条件における当2.4 IS1 のトランスポゼースの活性中心 D ‑ D‑E モチー

該 IS の転移頻度の変動を調べる。

フの同定

5.

発表論文リスト

IS1 トランスポゼースでは、ラムダファージインテグレ

1. Transposition of cyanobacterium insertion elementースファミリーに保存されている H‑R‑Y モチーフが活性ISY100 in Escherichia coli. Urasaki, A., Sekine, Y. and中心であるとされてきた。我々は、大腸菌以外の生物（ラOhtsubo, E. J. Bacteriol., 2002, 184, 5104‑5112.

ン藻、古細菌）ゲノムから IS1 ファミリーに属する因子６2. Presence of a characteristic D‑D‑E motif in IS1

種を同定し、それらのトランスポゼースを調べたところ、

transposase. Ohta, S., Tsuchida, K., Choi, S., Sekine,

H‑R‑Y モチーフは保存されておらず、多くの転移性遺伝因

Y., Shiga, Y., and Ohtsubo, E. J. Bacteriol. 2002, 184,

子のトランスポゼースの活性中心として指摘されている

6146‑6154 .