分泌型ルシフェラーゼをつかったレポーターアッセイシステム

CLucタンパク質はウミホタル由来です
写真は Cypridina noctiluca です。

特長「分泌」 を活かした利用方法●細胞溶解が不要 （細胞外へ分泌）★ハイスループットアッセイ●細胞内への蓄積が非常に少ない★同一細胞でのタイムコース実験（このため、細胞毒性が低く継続して培養可能）

遺伝子発現 ・ 転写制御の研究●発光試薬と混ぜるだけで検出可能

刺激応答による創薬 ・ 薬理研究

●発光反応はATPなどが不要●動物細胞用と酵母細胞用をラインナップなどに最適

システム概要とCLuc 諸性質
システムの概要とＣＬｕｃの性質●システム概要
CLuc reporter assay kit はウミホタル近縁種(Cypridina noctiluca)に由来する発光酵素(61.4kDa)と、 基質であるウミホタルルシフェリンの酸化により発する青い光(460nm付近)を利用して遺伝子転写活性を測定するレポーターアッセイシステムです。(Ref. 1) また、発光反応に ATP などを必要としません。
近年、 レポーターアッセイはタンパク質相互作用解析、 プロモーターの機能解析、 転写因子の機能解析、 遺伝子発現ネットワーク解析などのポストゲノム研究における重要な実験技術のひとつとなっています。 ポストゲノム時代におけるバイオアッセイは、 ハイスループット対応 ・ 高感度 ・ 簡便であることが重要な要件となっています。 これまでよく用いられてきたレポータータンパク質にはホタルルシフェラーゼ、 b ガラクトシダーゼ等があります。 これらの酵素は細胞内の酵素で、 測定には細胞の回収、 破砕が必要です。
細胞の回収、 破砕はロボットによる自動化に適さず、 ハイスループット化が非常に困難でした。
本システムで用いられるシプリジナ ・ ルシフェラーゼ(CLuc)レポータータンパク質は細胞外へ速やかに分泌されるので、 培地をフラクションしてルミノメータで計測すればよく、 そのため細胞溶解の必要がありません。 これにより、 同一細胞を継続して培養し遺伝子発現の連続モニターが可能となり、 多検体が必要であったタイムコース実験を行うことができます。
これらの特長によってポストゲノム時代の鍵となっているハイスループット、高感度、簡便の要素を満たし、革新的な実験時間短縮・新規実験手法の開拓が可能になります。

●ＣＬｕｃ発光反応図
ONHO

CLucNNH
NN
H

NH
NH2N＋ O2NHHNNNH

ウミホタルルシフェリン

NH＋NH2Blue Light＋ CO2( max=460nm)

オキシルシフェリン●ＣＬｕｃの性質
CLuc Spectrum

CLuc Kinetics

CLuc linearity

10.8
0.6
0.4
0.2
0350

RLU (count/3sec)

6.E+03RLU(count/0.1sec)

Normalized Intensity

1.2

4.E+03

2.E+030.E+00
400

450

500

550

600

051015Time(sec)Wavelength (nm)CLuc は 460nm の極大発光波長を示します。

CLuc は 20 秒間安定して発光します。

201.0E+07
1.0E+05
1.0E+03
1.0E+01
0.0010.1101000

CLuc (pg)CLuc のダイナミックレンジは 5 桁です。
(培地、 測定機器などの条件によって変化します。)●細胞外への分泌

RLU/20 sec

3.E+07rat1

左のグラフは、 ラット繊維芽細胞rat1にCLucコントロールベクターをトランスフェクションした後、 分泌された CLuc と細胞内に残った CLuc の量を活性測定により比較した

mediumCell

2.E+07
1.E+07

ものです。 トランスフェクション後、 12 時間ごとにフラクションした培地 （分泌されたCLuc を含む） と細胞内の CLuc の活性をルミノメータで計測しました。

0.E+00

その結果、 CLuc は時間経過ごとに発現量が増えると、 細胞外への分泌量は増加しますが、 細胞内の CLuc の蓄積は少ないことが推測されました。
01224Time(hr)3648(本データは産業技術総合研究所セルエンジニアリング研究部門よりご提供いただきました。)

1

システム概要とCLuc 諸性質ＣＬｕｃの特長を生かした実験例
同一細胞でのタイムコース実験 (培養細胞)●従来の方法(ホタルルシフェラーゼ)では ・ ・ ・14・ 測定時間ごとの細胞回収。 大量の細胞が必要。

12108・少ないサンプリングポイント。

64201

大量の細胞が必要

357911少ないサンプリングポイント●ＣＬｕｃでは ・ ・ ・ ・培地の一部で経時的に測定可能。
・灌流培養では連続サンプリングも可能。
・ 細胞回収の必要なし。

OUTIN
CL
↓

P ER I ST A

16Meduim

141210CL↓864201357911

連続サンプリングが可能
灌流培養培地の一部で測定可能

ハイスループット測定に対応 (酵母)
●従来の方法(βガラクトシダーゼ(β -gal)、 ホタルルシフェラーゼ)では ・ ・ ・・測定のステップが多い。
・ 自動化が困難。

培養細胞回収遠心分離溶解剤･緩衝液●ＣＬｕｃでは ・ ・ ・・ 培地のまま測定可能。
・ 96well フォーマットに対応し、 分注ロボットによるハイスループット化が可能。

培地の一部を測定
96穴ディープウェルプレートで培養

2測定

細胞溶解 ・ 破砕
遠心分離ＣＬｕｃレポーターアッセイキット 動物細胞用「CLuc レポーターアッセイキット 動物細胞用」 は培地中の CLuc 活性を測定するレポーターアッセイキットで、 動物細胞用ベクターセッ
ト、 発光基質セット、 標準酵素セットで構成されています。 レポータータンパク質である CLuc は速やかに動物細胞外 （培地中） へ分泌されます。 このため CLuc の活性測定は細胞の破砕 ・ 溶解の必要がなく、 培地を採取すればルミノメータで測定できます。 CLuc は発現したタンパク質のほとんどが細胞外へ分泌されるため、 細胞毒性が低く、 連続培養が可能です。

●転写活性のタイムコース測定
4.0E+08

Fig.1

RLU(count/20sec)

RLU(count/20sec)

CHX処理
3.0E+08

1.6E+08

Fig.2

未処理

2.0E+08

1.0E+080.0E+00

1.2E+088.0E+07

4.0E+07

0.0E+000244872961201Time(hr)471013161922TIme(hr)COS7 細胞に CLuc コントロールベクター pCL-sv を導入し、 その 24 時間後から培地中の CLuc 活性を 1 時間ごとに計測しました。 CLuc タンパク質は培地中で長期間安定なので （Fig.1）、 各タイムポイントごとの発光量の差をプロットすることで、 転写活性の経時変化を示すことができます。

CLuc タンパク質の安定性を調べるために、 COS7 細胞の CLuc安定発現株にシクロヘキシミド(CHX)を加えてタンパク合成を阻害しました。 未処理の細胞の場合では CLuc 活性値が経時的に上昇するのに対して、 CHX 処理した細胞の CLuc 活性は 5 日間でほぼ一定でした。 したがって、 CLuc は培地中で長時間安定なことが示されました。

●実験例 ： 時計遺伝子 Bmal1 プロモーターの転写活性測定(K. Yamagishi, et al., Ref.2, ※ 1)

Fig.3

Relative activity (fold)

(A)

(B)

454035302520151050352520151050

pBmal1+CLucpCMVIRESFL

RORα4

Fig.4
Detrended bioluminescence

体内時計の制御に関与する時計遺伝子 Bmal1 プロモーターの転写活性を CLuc を用いて測定しました。 Bmal1 プロモーターは 24時間周期で遺伝子発現を制御すること、 転写因子 RORa4 によって発現が誘導されることが知られています。
転写因子 RORa4 を共発現させ、 RORa4 ベクター導入量依存的に Bmal1 の転写活性が促進されることを測定できました(Fig.3A)。
また、 レポーターとして従来使われているホタルルシフェラーゼ(FL)で測定した場合(Fig.3B)と比較して、 よく一致する結果が得られました。

30共発現 したROR α4ベクタ ーの量0 ng

3 ng

30 ng

300 ng薬剤投与

Bmal1 プロモーターを挿入した CLuc ベクターを rat1 細胞に導入して灌流培養し、 フラクションコレクターで灌流液を連続分取して発光測定することによって、 転写活性の経時変動を連続測定しました(Fig.4)。
一過的に灌流液に Dexamethasone を加えて流し （Fig.4 上側の白ヌキ部分）、 約 24 時間周期のリズムを検出しました （○）。
さらに Dexamethasone と共に SP600125 （c-Jun N-terminal
kinase 阻害剤） を与えた場合には、 リズムの位相が後方へシフトしました （●）。

60000

0-60000

02448Time (hr)7296※ 1 本データは産業技術総合研究所セルエンジニアリング研究部門よりご提供いただきました。

3ＣＬｕｃレポーターアッセイキット 酵母細胞用「CLucレポーターアッセイキット 酵母用」 は培地中のCLuc活性を測定するレポーターアッセイキットで、 酵母用ベクターセット、発光基質セット、 標準酵素セットで構成されています。 レポータータンパク質である CLuc は速やかに酵母細胞外 （培地中） へ分泌されます。 このため CLuc の活性測定は細胞の破砕 ・ 溶解の必要がなく、 培地を採取すればルミノメータで測定できます。
酵母用ベクターに組み込まれている CLuc 遺伝子は、 酵母用として最適化されていますので効率的に発現します。 非特異的な転写を抑えるため、 既知の転写制御配列をできる限り排除するようデザインしました。

●ＣＬｕｃレポーターアッセイとβ－Ｇａｌ レポーターアッセイと の比較★β -Gal レポーターアッセイ法★ CLuc レポーターアッセイ法

酵母のいくつかのプロモーターで転写活性を CLuc レポーターアッセイ法(Fig.1)と代表的な従来法β-Gal レポーターアッセイ法( Fig.2)とで比較しました。 アッセイ時間で比較すると、 CLuc レポーターアッセイ法はβ -Gal レポーターアッセイ法のおよそ 1/10の時間で相関のある結果を得ることができ、ハイスループットアッセイに適していることが示されました。
1000
800
nmol/mg/min

RLU/OD

100000
80000
60000
40000

600400200200000Promoter（－ ）ACT1

ADH1 CYC1

TDH30TEF1

Promoter ACT1（－）

Fig.1

ADH1

CYC1 TDH3

TEF1

Fig.2

Fig.1

Fig.2

●プロモーター内の転写制御配列の探索●誘導実験
1200002% Galactose

80000

RLU/OD

RLU/OD

2000000.25 mM CuSO4

40000

0-698-471
TDH3

100000-432-411-295

control

0

CUP1

UAS1

UAS1

URS

UAS2

TATA

ATG

UAS1

URS

UAS2

TATA

ATG

URS

UAS2

TATA

ATG

UAS2

TATA

ATGTATAATG

UAS1；Fermentable carbon source-dependent upstream activ ation sequence
URS； Fermentable carbon source-dependent upstream repression sequence
UAS2；Non- f ermentable carbon source-dependent upstream activ ation sequencecontrol

0

20000

40000

60000

80000

100000GAL1

CUP1 プロモーターは培地へのCu イオンの添加によって、また GAL1 プロモーターは炭素源を培地のガラクトースとすることによって発現が誘導されることが知られています。
CUP1 及び GAL1 プロモーターを用いた CLuc レポーター
アッセイ法により、 これらの誘導剤による転写活性化が測定されました。
2+TDH3 プロモーターには 3 つの転写制御配列が知られています。
T D H 3 プロモーターの 5 ’ 側から順次欠失させた配列を用いてCLuc レポーターアッセイで転写活性を測定したところ、 転写制御
配列の有無による転写能の増減が測定されました。 この結果は既報の結果とよく一致しています。

＜上下データは産業技術総合研究所ゲノムファクトリー研究部門 扇谷悟先生よりご提供いただきました。

4動物細胞用ベクター
Nhe I
Pst I
Sac I
EcoR I
EcoR V
Hind III
Sma I
Xho I
Spe I

pol y(A) signal(for bac kgroundnoise r eduction)

pCL

Ampr

pol y(A) signal(for bac kgroundnoise r eduction)

1

SV40 promoter
Xho I
Spe I

CLuc

4814 bp

Nhe I
Pst I
Sac I
EcoR I
EcoR V
Hind III

pCL- sv

Ampr

CLuc5257 bp

BamH Ipol y(A)signal
BamH Iori

Mlu I
Xba I

Mlu Ipol y(A) Xba I
signalori

SV40 enhancer
コントロールベクター

プロモーターレスベクター

酵母用ベクター
Hind IIIori

pol y(A)signal x2

Ampr

pCLY

EcoR Vori

pol y(A)signal x2

Sma I

Ampr

pCLY- tdh

Xba I
CYC1 ter minator

1

EcoR V

URA3yCLuc7849 bp

Pst I

Xba I
CYC1 ter minator

Spe I
BamH I

TDH3 promoter

CEN6 / ARSH 4

Pst I
1

Hind IIIyCLuc

7263 bp

CEN6 / ARSH 4

Spe I
BamH I
Hind III ※
Sac I
Not I
EcoR IPst I ※
EcoR V ※
Sal I
Xho I
Sph I
Sma I

URA3※ ユ ニ ーク サイ トではあ りません。

コントロールベクター

プロモーターレスベクター

本製品は研究用試薬です。 研究用途以外に使用しないで下さい。
本発光システムにはアトー株式会社及び(独)産業技術総合研究所の特許が使われています。
非営利目的で CLuc レポーターアッセイキット （遺伝子ベクター含む） をご購入の際には事前に購入申込書のご提出が必要になります。
営利目的でのご使用につきましては、 別途実施許諾契約が必要になります。 実施許諾契約に関してはアトー株式会社までお問合せ下さい。
掲載されている内容は予告なく変更される場合がありますのであらかじめご了承下さい。
お問い合わせアトー株式会社 顧客部 TEL 03-5827-4861 FAX 03-5827-6647

5e-mail ： info@atto.co.jp

販売方法が一部変更になりました。

価格

ＣＬｕｃレポーターアッセイキット
コードNo. 型式・製品名

容量

価格3512037

CL-M100 CLucレポーターアッセイキット動物細胞用

100アッセイ\38,800¥30,000\32,0003512038

CL-M1000 CLucレポーターアッセイキット動物細胞用

1000アッセイ\98,800¥80,000\82,0003512039

CL-Y100 CLucレポーターアッセイキット酵母細胞用

100アッセイ\38,800¥30,000\32,0003512040

CL-Y1000 CLucレポーターアッセイキット酵母細胞用

1000アッセイ\98,800¥80,000\82,000● CLucレポーターアッセイキットの購入に際しては、「購入申込書」へのご署名が必要です。詳しくはアトー株式会社へお問い合わせください。

ＣＬｕｃ消耗品 （継続購入用）
コードNo. 型式・製品名

容量価格

3512031

CL-S100 CLuc発光基質100100アッセイ\25,800¥15,000\20,0003512032

CL-S1000 CLuc発光基質1000

1000アッセイ\98,800¥60,000\80,0003512030

CL-E CLuc標準酵素

80μL\13,800¥8,000\8,8003512033

CL-VM1 CLucプロモーターレスベクター動物細胞用（pCL vector）

10μg\15,800¥10,000\11,0003512034

CL-VMC1 CLucコントロールベクター動物細胞用（pCL-sv vector）

10μg¥10,000\15,800\11,0003512035

CL-VY1 CLucプロモーターレスベクター酵母細胞用（pCLY vector）

10μg¥10,000\15,800\11,0003512036

CL-VYC1 CLucコントロールベクター酵母細胞用（pCLY-tdh vector）

10μg¥10,000\11,000\15,800

CLuc レポーターアッセイキットおよび消耗品は受注生産品です。

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コードNo. 型式・製品名

価格3511035

AB-2270 ルミネッセンサーOcta （分注ポンプ内蔵）

お問い合わせ¥1,200,0003511036

AB-2270-R ルミネッセンサーOcta （分注ポンプなし）

お問い合わせ¥980,000

3511140

AB-2350 フェリオス(Phelios) （分注ポンプ内蔵）

お問い合わせ¥2,900,000

AB-2350 フェリオスはコントロールにパソコン （別売 ： Windows） が必要です。

6References1) Nakajima, Y., Kobayashi, K., Yamagishi, K., Enomoto, T., and Ohmiya, Y., cDNA Cloning and Characterization of a Secreted Luciferase
from the Luminous Japanese Ostracod, Cypridina noctiluca. Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(3), 565-570 (2004)
2) Yamagishi, K., Enomoto, T., and Ohmiya, Y., Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Anal.
Biochem., 354(1), 15-21 (2006)
3) 中島 芳浩, 近江谷克裕 「遺伝子発現リアルタイム解析への発光イメージングの応用」 バイオテクノロジージャーナル Vol.6, No.2,
230-232 (2006)

ご用命は下記販売店まで

表紙写真ご提供 ：北海道大学大学院医学研究科
近江谷克裕先生

表紙写真ご提供 ：小江克典様