九州シンクロトロン光研究センター
県有ビームライン利用報告書
課 題 番 号 ： 1505053F

Ｂ Ｌ 番 号 ： BL11

（様式第 5 号）

X 線小角散乱によるヌクレオシド二リン酸キナーゼ融合蛋白質およびストレプトアビジン融合蛋白質の会合構造の解明
SAXS analysis of the assembly forms of nucleoside diphosphate kinase fusion
protein and streptavidin fusion protein
新井栄揮、柴崎千枝、清水瑠美、安達基泰

Shigeki Arai, Chie Shibazaki, Rumi Shimizu, Motoyasu Adachi
日本原子力研究開発機構・量子ビーム応用研究センター

Quantum Beam Science Center, Japan Atomic Energy Agency※１※２

先 端 創 生 利 用（ 長 期 タ イ プ 、長 期 ト ラ イ ア ル ユ ー ス 、長 期 産 学 連 携 ユ ー ス ）課 題 は 、実 施 課 題
名 の 末 尾 に 期 を 表 す （ Ⅰ ）、（ Ⅱ ）、（ Ⅲ ） を 追 記 し て く だ さ い 。
利 用 情 報 の 公 開 が 必 要 な 課 題 は 、本 利 用 報 告 書 と は 別 に 利 用 年 度 終 了 後 2 年 以 内 に 研 究 成 果 公
開 ｛ 論 文 （ 査 読 付 ） の 発 表 又 は 研 究 セ ン タ ー の 研 究 成 果 公 報 で 公 表 ｝ が 必 要 で す 。 (ト ラ イ アルユース、及び産学連携ユースを除く)

１．概要（注：結論を含めて下さい）
蛋 白 質 の 空 間 配 置 や 会 合 を 自 在 に 操 作 で き れ ば 、高 密 度 に 空 間 充 填 し た 固 定 化 酵 素 等の 新 規 機 能 性 分 子 材 料 や バ イ オ セ ン サ ー の 開 発 、結 晶 構 造 解 析 に 有 利 な 結 晶 格 子 ・ 空 間群 を 人 工 創 製 す る 技 術 開 発 、難 結 晶 性 蛋 白 質 を 結 晶 化 す る 新 規 技 術 の 開 発 な ど が 可 能 になると考えられる。我々は、蛋白質の空間配置・会合を制御する研究の一環として、Deinococcus radiodurans 由 来 DNA 修 復 促 進 蛋 白 質 (PprA) の N 末 端 側 に 六 量 体 を 形 成 する Thermus thermophilus 由 来 ヌ ク レ オ シ ド 二 リ ン 酸 キ ナ ー ゼ (TtNDK) を 接 続 し た“ TtNDK+PprA 融 合 蛋 白 質 ”（ 以 下 TtNDK+PprA と 呼 ぶ ）や 、PprA の N 末 端 側 に 四 量 体を 形 成 す る Streptomyces avidinii 由 来 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン (StAv)を 接 続 し た “ StAv+PprA
融 合 蛋 白 質 ”を 作 製 し 、TtNDK や StAv を 介 し た PprA の 会 合 制 御 の 可 能 性 を 調 査 し て いる 。 今 回 我 々 は 、 PprA 単 独 と 、 TtNDK+PprA の X 線 小 角 散 乱 測 定 を 行 い 、 そ れ ら の 溶液 構 造 の 解 明 を 試 み た 。得 ら れ た 散 乱 曲 線 か ら dummy atom model を 構 築 し た 結 果 、PprA
単 独 で は 直 鎖 状 の 会 合 体 を 形 成 す る の に 対 し 、 TtNDK+PprA は 三 又 に 分 岐 し た ネ ッ ト ワーク状の会合体を形成する可能性が示された。
To operate the spatial arrangement and assembly of protein molecules is helpful todevelop the immobilized enzyme, a biosensor and so on. In order to operate the assembly of
the pleiotropic protein promoting DNA repair A (PprA) from Deinococcus radiodurans via thenucleoside diphosphate kinase (TtNDK) from Thermus thermophilus, we made theTtNDK+PprA fusion protein. In this study, we collected small-angle X-ray scattering profilesof the wild-type PprA and the TtNDK+PprA fusion protein to clarify their assembly forms.
Ab initio dummy atom models obtained from the scattering profiles suggest that theTtNDK+PprA fusion protein forms a Y-shaped network, while the wild-type PprA forms thestraight chain-like structure.

２．背景と目的
近年、蛋白質などの複雑な分子において、その機能を保持したまま一定の空間に規則正しく配置させる研究は、新規の分子デバイスの創製のために大きな注目を集めている。例えば、生体高分子を固定化して配置する技術（インクジェット技術、ピン法など）は、DNA チップ・プロテインチップやバイオセンサー等のバイオデバイスの開発に不可欠となっている。しかし、従来の技術は、基板などの支持体上に蛋白質分子を二次元的に配置させることに止まっている。
一方、生体分子を人工的に三次元配置させた例は、結晶化を除くと極めて少ない。一般に蛋白質結晶は高い含水率（体積の 40～70％程度）を有し、結晶内においても蛋白質分子は基質との結合や酵素活性の発現が可能な例が多数報告されている。また、結晶中の蛋白質は高度な安定化を受けることが知られる。従って、結晶と同程度に蛋白質分子を高密度に充填させ、蛋白質分子の三次元的配列や会合を自在に操作して固定化したり、蛋白質結晶内の分子配置を操作することが可能になれば、それ自身が新しい結晶化技術となるだけでなく、新規の機能性分子材料の創製に繋がると考えられる。
これらの背景から、我々は蛋白質の空間配置や会合構造を操作する技術の確立を目指している。その 研 究の 一環 と して 、多 量 体構 造を 有 する 分子(TtNDK)を介して空間配置・構造構造を操作したい蛋白質(PprA)を架橋し、PprA の会合構造の操作を試みた。
３．実験内容（試料、実験方法、解析方法の説明）
野生型 PprA は一次元的に連結したオリゴマーを形成すると予想されている[1]。また、変異型 PprAはホモ二量体、TtNDK はホモ六量体を形成することが知られている。今回我々は、大腸菌の遺伝子組換え発現系を利用して、(A) 野生型 PprA 単独、および、(B) 変異型 PprA の N 末端側にリンカーを介してTtNDK を接続した“TtNDK+PprA 融合蛋白質”を調製し、X 線小角散乱測定を行って、(A), (B)の会合構造の解明を試みた。測定条件・解析方法を下記に示す。

Fig. 1 (a) 野生型 PprA 単独における散乱曲線の濃度依存性。(b) GASBOR によって構築した野生型 PprA の dummy atom model。

ビームライン： BL11
溶媒：20 mM Tris-HCl buffer pH8.0, 0.2 M NaCl

露光時間：90 min
カメラ： Pilatus
カメラ長：2.649 m（コラーゲンを用いて校正）
波長：1.55Å

上記(A), (B)の二次元散乱像を測定後、プログラム
Fit2D を用いて二次元散乱像を散乱曲線に変換した。
続いて、溶媒の散乱曲線を蛋白質溶液の散乱曲線から差し引いて蛋白質由来の散乱曲線を得た。更に、得られた散乱曲線から、プログラム GASBOR[2]を用いて dummy atom model を構築し、(A), (B)の構造を比較した。
４．実験結果と考察
まず、野生型 PprA 単独における散乱曲線の濃度依存性を評価した(Fig.1a)。
2～5 mg/ml の野生型 PprA

Fig. 2 (a) 5mg/ml PprA 単独および 2mg/ml
TtNDK+PprA における散乱曲線の比較。(b)GASBOR によって構築した TtNDK+PprA のdummy atom model。

の散乱曲線は類似したプロファイルを描くが、q < 0.03 Å-1 の小角域においては、PprA 濃度の増加とともに散乱強度が増加する。この結果は PprA 濃度の増加とともに PprA 分子の会合が進行したことを示唆する。比較的精度良く測定できたと考えられる 5 mg/ml PprA の散乱曲線から、GASBOR を用いて dummy atom model を構築した結果、当初の予想通り、野生型 PprA は直鎖状のオリゴマーを形成することが明らかになった(Fig. 1b)。
続いて、TtNDK+PprA の X 線小角散乱測定を行った。TtNDK+PprA は沈殿しやすいため、蛋白質濃度は 2mg/ml とした。得られた散乱曲線と、GASBOR によって構築した dummy atom model を Fig.2に示す。本研究で構築した dummy atom model から、TtNDK+PprA は三又の分岐を多く有することが示唆された。即ち、TtNDK を介して PprA の会合構造を改変することができ、PprA 単独では形成できないネットワーク構造を形成できることが明らかになった。今回の実験により、蛋白質の空間配置・会合制御技術開発のための基礎的知見を得ることができた。
５．今後の課題蛋白質の会合構造を改変することは成功したが、蛋白質の空間配置に規則性を付与する必要が残されている。そのためには、TtNDK と PprA 間のリンカー配列を調整したり、StAv 等 TtNDK 以外の架橋分子の利用も検討する必要がある。
６．参考文献1. Adachi M, Hirayama H, Shimizu R, Satoh K, Narumi I, Kuroki R. Interaction of double-stranded DNA
with polymerized PprA protein from Deinococcus radiodurans. Protein Sci., (2014) 23, 1349-1358.
2. Svergun, D.I., Petoukhov, M.V. and Koch, M.H.J. (2001) Determination of domain structure of proteinsfrom X-ray solution scattering. Biophys. J., 80, 2946-2953.
７．論文発表・特許（注：本課題に関連するこれまでの代表的な成果）
今後、随時発表していく予定
８．キーワード（注：試料及び実験方法を特定する用語を２～３）
PprA、NDK、X 線小角散乱９．研究成果公開について（注：※２に記載した研究成果の公開について①と②のうち該当しない方を消してください。また、論文（査読付）発表と研究センターへの報告、または研究成果公報への原稿提出時期を記入してください（2015 年度実施課題は 2017 年度末が期限となります。
）
長期タイプ課題は、ご利用の最終期の利用報告書にご記入ください。

①

論文（査読付）発表の報告（報告時期：2017 年度末を予定）