2019年11月15日 臨床ゲノム情報解析ハンズオントレーニング

VarSeq（クリニカルシークエンス編）

フィルジェン株式会社 バイオサイエンス部(biosupport@filgen.jp)
1

VarSeq起動画面の確認

 VarSeqを起動した際に、上の図のように表示されていることをご確認ください。下の図のように、ログイン画面や、「Viewer」と表示されている状態では、ソフトウェアを使用できません。

2

本日使用するデータ

 Databases- 各種データベースのアノテーションファイルが納められている。
 Exome_trio- 遺伝性疾患の解析に用いるサンプルデータが納められている。

 Somatic_cancer- がん体細胞変異の解析に用いるサンプルデータが納められている。

 USBメモリで配布した「VarSeq」フォルダを、PC上の任意の場所（デスクトップなど）にコピーしてください。
 VarSeqフォルダ内に、上記3つのフォルダが入っていることを確認してください。

3本日使用するデータ

 VarSeq上より、Tools -> Open Folder -> Annotations Folderをクリックし、フォルダを開きます。
 配布した「Databases」フォルダ内のすべてのファイルを、 Annotations Folder内にコピーしてください。
4体細胞変異解析ワークフロー
手順1： サンプルデータのインポート
 解析プロジェクトを作成
 腫瘍・正常サンプルそれぞれのVCF, BAMファイルをインポート

手順2： アノテーション付加
 変異データに対して、様々なデータベースを用いたアノテーション付加の実行

手順3： フィルタリング
 体細胞、生殖細胞系列変異の抽出 ゲノムブラウザーによる確認

手順4： レポート作成
 抽出変異情報を用いてレポートの作成
5手順1. サンプルデータのインポート

6

プロジェクトの作成

1.
2.

メイン画面の「Create New Project」をクリック
任意のプロジェクト名を入力し、またProject Templateに「Empty Project」、Genome Assemblyが「Homo sapiens (Human), GRCh37 (hg19) (2 2009)」となっていることを確認したら「OK」をクリック
7

腫瘍・正常サンプルファイルのインポート

3.
4.
5.

次の画面で、「Import Variants」をクリック
Import Variant Sources画面で「Add Files」をクリックし、Somatic_cancerフォルダ内の「N990005.vcf.gz」と「T990005.vcf.gz 」を選択
Import Variant Sources画面に両ファイルが表示されたら、「Next」をクリック
8

腫瘍・正常サンプルファイルのインポート

6.
7.
8.

Sample Relationshipsで、「Tumor/Normal Samples」を選択し、Nextクリック
サンプル情報の入力画面で、「T990005」のNormal Sampleフィールドに「N99005」、Tumorフィールドに「Tumor」を選択
Add sample fieldsの「Associate BAM File」をクリック

9腫瘍・正常サンプルファイルのインポート

9.

各サンプルのFile Nameフィールドのドロップメニューより、各サンプル名のBAMファイルを選択し、「OK」をクリック＊ドロップメニューにBAMファイルが表示されない場合は、上部の「Browse」よりSomatic_cancer
フォルダを選択する
10腫瘍・正常サンプルファイルのインポート

10. 各サンプルのBAM Pathフィールドに、先の画面で指定したBAMファイルへのパスが正しく表示されていることを確認し、「Next」をクリック

11

腫瘍・正常サンプルファイルのインポート

11. Assemblyに、「GRCh_37_g1K, Chromosome, Homo sapiens」と表示されていることを確認し、「Finished」をクリック
12

腫瘍・正常サンプルファイルのインポート

12. Tumor (T990005)とNormal (N990005)両サンプルの変異データがインポートされ、プロジェクト画面に表示される
13

手順2. アノテーション付加

14

RefSeq Genesアノテーションの付加

1.
2.

プロジェクト画面の「Add」をクリックし、メニューより「Variant Annotation」を選択してクリック
Select Data Source画面において、画面左側のLocationに「User Annotations」を選択し、続く画面右側のデータベースリストより「RefSeq Genes 105 Interim v1, NCBI」にチェックを入れ、「Select」をクリック
15RefSeq Genesアノテーションの付加

3.

アノテーション付加が完了すると、変異データテーブルにRefSeq Genesデータベースのアノテーション列が追加される
16

RefSeq Genesアノテーションの付加

4.

変異テーブル上部の「Hide/Show details window」をクリックすると、テーブル右側に詳細データの表示スペースが現れ、テーブル上で選択した変異に付加されたアノテーション情報を確認できる
17

RefSeq Genesアノテーションの付加

5.

変異テーブル上のフィールドのヘッダーをクリックすると、現在表示されている変異データから選択フィールドの項目を集計したグラフが、詳細データの表示スペースに表示される

18

その他アノテーションの付加

選択データベースリスト
••
•
•
•
•
•

1.
2.

1kG Phase3 - Variant Frequencies
CIViC - Variant
ClinVarClinVar Assessments
COSMIC Mutations 89
dbNSFP Functional Predictions 3.0
HGVD1210-V2_30

再びプロジェクト画面の「Add」をクリックし、メニューより「Variant Annotation」を選択してクリック
Select Data Source画面において、上記データベース名にすべてチェックを入れ、「Select」をクリック
19

その他アノテーションの付加

3.
4.

変異データテーブルに、選択した全データベースのアノテーション列が追加される
アノテーションフィールドの表示・非表示や順序を変更する場合は、変異テーブル上部の「Hide/Showcolumns and column groups」をクリックして実行する
20

手順3. フィルタリング

21フィルターコンテナの作成

1.
2.
3.

変異テーブル上で任意のフィールドのヘッダー（この例では「Tumor (T990005)」の「Read Depths (DP)」）を右クリックし、メニューより「Add to Filter Chain」を選択してクリック
画面左側のFilter Variantsに、選択したフィールドのフィルターコンテナが表示されるので、任意の検索条件を指定する
コンテナ内の右側に表示される各数字は、指定された条件で抽出される変異数を表し、この数字をクリックすると、変異テーブルに表示される変異データ数も変更される
22

体細胞変異抽出ワークフローの作成

1.

•Tumor (T990005)の「Read Depths (DP)」 ≧ 50•

Tumor (T990005)の「AF」 ≧ 0.05•

Normal (N990005)の「AF」 < 0.01 or Missing

腫瘍サンプルにおける体細胞変異抽出のため、T990005（Currentサンプル）の「Read Depths (DP)」と「AF」、さらにN990005（Normalサンプル）の「AF」の3フィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する
23

体細胞変異抽出ワークフローの作成

2.

•

COSMIC Mutationsの「In COSMIC?」 is TRUE•COSMIC Mutationsの「Sample Count」 ≧ 100

データベースに高頻度に登録されている生体に有害な変異の抽出のため、COSMIC Mutationsの「In COSMIC?」、「Sample Count」の2フィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定
する
24

体細胞変異抽出ワークフローの作成

3.
4.
5.

ワークフロー下側の空きスペース上で右クリックし、メニューから「Add Filter Container」選択してクリック
新たなコンテナが作成されるので、コンテナ名をダブルクリックし、「Somatic」に変更
Somatic以外のコンテナをすべて選択し、Somaticコンテナ内にドラッグ＆ドロップ
25

生殖細胞変異抽出ワークフローの作成

1.
2.
3.

ワークフロー最上段の「Filter Variants」の「Show Filter Configuration」をクリックし、検索条件に「OR」を指定
Somaticワークフロー右側の空きスペースで右クリックし、メニューから「Add Filter Container」を選択してクリック
新たなコンテナが作成されるので、コンテナ名をダブルクリックし、「Germline」に変更
26

生殖細胞変異抽出ワークフローの作成

4.

•

Normal (N990005)の「Read Depths (DP)」 ≧ 50•

Normal (N990005)の「AF」 ≧ 0.05

正常サンプルにおける生殖細胞変異抽出のため、N990005（Normalサンプル）の「Read Depths (DP)」と「AF」の2フィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する
27

生殖細胞変異抽出ワークフローの作成

5.

•

1kG Phase3 - Variant Frequenciesの「Allele Frequencies」 < 0.01 or Missing•

HGVD1210-V2_30の「Allele Frequencies」< 0.01 or Missing

人種特異的なSNPの除去のため、 1kG Phase3 - Variant Frequenciesの「 Allele Frequencies」、さらにHGVD1210-V2_30の「Alt_allele_freq」の2フィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する
28

生殖細胞変異抽出ワークフローの作成

6.

•

RefSeq Geneの「Effect (Combined)」 is LoF, Missense•

ClinVarの「Classification」 is Likely Pathogenic, Pathogenic

データベースに登録されている生体に有害な変異の抽出のため、 RefSeq Geneの「Effect (Combined)」、ClinVarの「Classification」の2フィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する
29

ワークフロー解析結果の確認

1.

Somaticワークフロー、Germlineワークフローでそれぞれ1つずつ変異が検出され、合計2種類の変異がテーブルに表示される
30

ワークフロー解析結果の確認

2.

詳細データ表示スペースより、各変異のアノテーション情報を確認する

31

ゲノムブラウザーの表示

1.
2.

プロジェクト画面の「Plot」をクリックし、メニューより「Plot BAM for Current Sample」を選択してクリック
ゲノムブラウザーが起動し、CurrentサンプルのRead Alignmentデータが表示されたら、同じくPlot ->Plot BAM for Current Normal」を選択してクリック

32

ゲノムブラウザーの表示

3.
4.

変異テーブルの任意の変異データをクリックすると、ゲノムブラウザーの該当位置に自動的に移動する
各サンプルのCoverageグラフの任意の位置をクリックすると、リード数の集計データなどが表示される

33

ゲノムブラウザーの表示

5.
6.

ゲノムブラウザーの「Plot」をクリックし、メニューより「Plot new source」を選択してクリック
Select Data Source画面において、データベースリストより「ClinVar」と「COSMIC Mutation」にチェックを入れ、「Plot & Close」をクリック

34

ゲノムブラウザーの表示

7.
8.

ゲノムブラウザーに、データベースのアノテーションがプロットされる
プロットされた任意のアノテーションをクリックすると、アノテーションの詳細が表示される
35

手順4. レポート作成

36

OMIMアノテーションの付加

選択データベースリスト• OMIM Genes• OMIM Phenotypes• OMIM Variants

1.
2.

再びプロジェクト画面の「Add」をクリックし、メニューより「Variant Annotation」を選択してクリック
Select Data Source画面において、上記3つのOMIMデータベース名にすべてチェックを入れ、「Select」をクリック
37

OMIMアノテーションの付加

3.

変異データテーブルに、選択した3種類のOMIMデータベースのアノテーション列が追加される

38

変異セットの作成

1.

2.

変異テーブル上部の「Manage Variant sets」をクリックし、メニューより「Create Variant Set」を選択してクリック
Primary FindingとIncidental Findingの2セットを、任意のColorで作成すると、変異テーブルにフラグが表示される

39レポート作成

1.

2.

変異テーブル上で各フラグをクリックし、任意の変異をPrimary FindingとIncidental Findingに指定（この例ではPIK3CA遺伝子の変異をPF、RAD50遺伝子の変異をIFに指定）「Open a new tab」をクリックし、メニューより「Report」を選択してクリック

40

レポート作成

3.
4.

「Create a New Report Template」をクリック
レポートテンプレートの選択で、「Based On:」に「Cancer Gene Panel Template」を選択し、「Name:」に任意の名前（この例ではCancer Gene Panel）を入力し、 「OK」をクリック

41

レポート作成

5.
6.

レポートの情報入力画面で、必要に応じてサンプル情報やコメントなどを入力
最上段右側の「Configure and reload this report template」をクリックし、メニューより「ConfigureReport Template」を選択してクリック

42

レポート作成

7.

Somatic_cancerフォルダ内の「Gene_list.txt」の遺伝子名リストをコピーし、Set Report Parametersの「Reportable Genes」にペーストして「OK」をクリック

43

レポート作成

8.
9.

Reportタブに戻り、「Primary Findings」と「Incidental Findings」のそれぞれの「Select a Variant set」に、フラグ付けした変異セットを選択最上段の「Create the Report」をクリック
44

レポート作成

10. フラグ付けした変異セットのOMIMアノテーションの情報をまとめたレポートが作成される45

単一遺伝子病解析ワークフロー
手順1： サンプルデータのインポート
 解析プロジェクトを作成
 患者、父親、母親サンプルのVCFファイルをインポート

手順2： アノテーション付加
 変異データに対して、様々なデータベースを用いたアノテーション付加の実行

手順3： フィルタリング
 遺伝形式に基づいた変異の抽出 表現型関連変異のスコアリング

46

手順1. サンプルデータのインポート47

プロジェクトの作成

1.
2.

メイン画面の「Create New Project」をクリック
任意のプロジェクト名を入力し、またProject Templateに「Empty Project」、Genome Assemblyが「Homo sapiens (Human), GRCh37 (hg19) (2 2009)」となっていることを確認したら「OK」をクリック
48

家族サンプルファイルのインポート

3.
4.
5.

次の画面で、「Import Variants」をクリック
Import Variant Sources画面で「Add Files」をクリックし、Exome_trioフォルダ内の「F12891.vcf.gz」「M12892.vcf.gz」「P12878.vcf.gz 」を選択
Import Variant Sources画面に両ファイルが表示されたら、「Next」をクリック

49

家族サンプルファイルのインポート

6.
7.

Sample Relationshipsで、「Family Samples」を選択し、Nextをクリック
サンプル情報の入力画面で、「P12878」のMotherフィールドに「M12892」、Fatherフィールドに「F12891」、Tumorフィールドに「Affected」を選択してNextをクリック
50

家族サンプルファイルのインポート

8.

Assemblyに、「GRCh_37_g1K, Chromosome, Homo sapiens」と表示されていることを確認し、「Finished」をクリック
51

家族サンプルファイルのインポート

9.

Proband (P12878)、Mother (M12892)、Father (F12891) の変異データがインポートされ、プロジェクト画面に表示される
52

手順2. アノテーション付加

53

アノテーションの付加

選択データベースリスト••••••

RefSeq Genes
1kG Phase3 - Variant Frequencies
ClinVarClinVar Assessments
dbNSFP Functional Predictions 3.0
HGVD1210-V2_30

1.
2.

プロジェクト画面の「Add」をクリックし、メニューより「Variant Annotation」を選択してクリック
Select Data Source画面において、上記データベース名にすべてチェックを入れ、「Select」をクリック
54

アノテーションの付加

3.

アノテーション付加が完了すると、変異データテーブルに各データベースのアノテーション列が追加される

55

手順3. フィルタリング

56基本ワークフローの作成

1.

•

Proband (P12878)の「Read Depths (DP)」 ≧ 30•

Proband (P12878)の「Variant Allele Freq」 ≧ 0.2

Proband (P12878サンプル）の「Read Depths (DP)」と「Variant Allele Freq」の2フィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する
57

基本ワークフローの作成

2.

•

1kG Phase3 - Variant Frequenciesの「Allele Frequencies」 < 0.01 or Missing•

HGVD1210-V2_30の「Allele Frequencies」< 0.01 or Missing

人種特異的なSNPの除去のため、 1kG Phase3 - Variant Frequenciesの「Allele Frequencies」、さらにHGVD1210-V2_30の「Allele Frequencies」の2フィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する
58

基本ワークフローの作成•

3.

RefSeq Geneの「Effect (Combined)」 is LoF, Missense

生体に有害な変異の抽出のため、 RefSeq Geneの「Effect (Combined)」のフィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する
59

解析アルゴリズムの実行

1.
2.
3.
4.

プロジェクト画面の「Add」をクリックし、メニューより「Computed Data」を選択してクリック
Select an Algorithm画面において、任意の解析アルゴリズムを選択して、「OK」をクリック
解析アルゴリズムの種類によっては、計算時のパラメータなどを指定する
多くの解析アルゴリズムでは、計算が終了すると、変異テーブルに計算結果のアノテーションが付加され、フィルタリングに使用できるようになる

60

接合体情報の付加

1.
2.

Select an Algorithm画面より「Genotype Zygosity」を選択して「OK」をクリック
変異テーブルに、各サンプルの各変異ごとに接合体情報のフィールドが追加される

61

メンデル遺伝情報の付加

1.
2.

Select an Algorithm画面より「Mendel Error」を選択して「OK」をクリック
変異テーブルのProbandサンプルにおいて、各変異ごとのメンデル遺伝情報のフィールドが追加される

62

複合ヘテロ接合体の検出

1.
2.

Select an Algorithm画面より「Mendel Error」を選択して「OK」をクリック
Select a Source and Field画面において、変異テーブル上の遺伝子名のフィールド（この例ではRefSeq GenesのGene Namesフィールド）を選択して、「OK」をクリック

63

複合ヘテロ接合体の検出

3.

2つ目のSelect a Source and Field画面において、変異テーブル上のアレル頻度データのフィールド（この例では1kG Phase3のAllele Frequenciesフィールド）を選択して「OK」または「Skip」をクリック＊本トレーニングでは「Skip」をクリック

4.

Advanced Parametersで、de Novoのヘテロ接合性変異を含めるか、また片親だけのサンプルデータしか存在しない場合も計算を行うかどうかを指定し、「OK」をクリック
64

複合ヘテロ接合体の検出
変異テーブル

ワークフロー

遺伝子テーブル5.
6.

ワークフローに自動的にCompound Het?のフィルターコンテナが作成される同時に変異テーブルへアノテーション付けされ、別タブで情報が付加された遺伝子テーブルも作成される65

トリオ解析ワークフローの作成

1.
2.
3.

ワークフロー下側の空きスペース上で右クリックし、メニューから「Add Filter Container」選択してクリック
新たなコンテナが作成されるので、コンテナ名をダブルクリックして「Trio Analysis」に変更し、さらに「ShowFilter Configuration」をクリックし、検索条件に「OR」を指定
Compound Het?コンテナを選択し、Trio Analysisコンテナ内にドラッグ＆ドロップ66

トリオ解析ワークフローの作成•

4.

Proband (P12878)の「Mendel Error」 is de Novo Allele

Proband (P12878サンプル）の「Mendel Error」のフィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する
67

トリオ解析ワークフローの作成

5.
6.
7.

•

Proband (P12878)の「Zygosity」 is
Homozygous Variant•

Mother (M12892)の「Zygosity」 is
Heterozygous•

Father (F12891)の「Zygosity」 is
Heterozygous

Trio Analysisコンテナ内の空きスペース上で右クリックし、メニューから「Add Filter Container」選択してクリック
新たなコンテナが作成されるので、コンテナ名をダブルクリックして「Recessive Homozygous」に変更
Proband (P12878サンプル)、Mother (M12892サンプル)、Father (F12891サンプル)それぞれの「Zygosity」のフィールドのコンテナをつくり、上記のとおり検索条件を指定する

68

遺伝子ランキングの計算

1.
2.

Select an Algorithm画面より「Variant PhoRank Gene Ranking」を選択して「OK」をクリック
Select a Source and Field画面において、変異テーブル上の遺伝子名のフィールド（この例ではRefSeq GenesのGene Namesフィールド）を選択して、「OK」をクリック

69

遺伝子ランキングの計算

3.
4.

PhoRank画面において、Phenotype Terms:に任意のHPO Term（この例ではmuscular dystrophy）を入力、あるいはTermの候補リストから選択して、「OK」をクリック
変異あるいは遺伝子テーブルに、遺伝子ごとの入力HPO Termとの関連の強さを数値化したフィールドが追加される
70

ワークフロー解析結果の確認

1.

複合ヘテロ接合体では3つ、de Novoアレルでは38個、劣性ホモ接合体では0個の変異が検出され、合計41個の変異がテーブルに表示される
71

ワークフロー解析結果の確認

2.
3.

Variants by Variant Genesテーブルでは、フィルタリングの結果抽出された変異に対して、画面左側に遺伝子名、右側に該当する変異をテーブル表示
必要に応じて、複合ヘテロ接合体のHas Compound Het?フィールドや遺伝子ランキングのGene Rank
フィールドで表示を並び替え、複合ヘテロ接合体の構成変異や、表現型との関連が高い遺伝子の変異を確認する
72

お問い合わせ先：フィルジェン株式会社

TEL: 052-624-4388 (9:00～18：00）
FAX: 052-624-4389
E-mail: biosupport@filgen.jp

73