日本生物学的精神医学会誌

特集 2

31 巻 2 号

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自閉症学の魅力

1 ．自閉症基礎研究を加速させる新技術とその展望
野村淳 ，内匠1）

透

1，2）

抄録：社会性行動の障害をコアドメインとする『自閉スペクトラム症（自閉症）』は，コア症状に付随する表現型が多岐に及ぶ神経発達障害である。名称に含まれる『スペクトラム』とは，境界が曖昧でありかつ連続体という意味であり，自閉症疾患表現型の多彩さ，複雑さを意味している。既に複数のヒト死後脳，モデル動物脳を用いた解析から自閉症に共通して変動する遺伝子，パスウェイ，ネットワークの同定が進んでいるが，これら臓器レベルの解析結果は多数の細胞種の影響を受けやすく，マイナーな細胞種の表現型はマスクされる傾向にある。これを解決したのが次世代シークエンスを用いた一細胞 RNA シークエンス（scRNA‑seq）である。本技術は，一細胞レベルの解析を可能にしたことで，マイナーな細胞群での転写産物解析のみならず，メジャーな細胞も発現様式に応じて細かく分類し，解析を行う事が可能となった。本稿では scRNA‑seq を用いた最新の研究結果の紹介，そして本技術を用いた自閉症研究の展望を行う。
日本生物学的精神医学会誌 31（2）：71‑75, 2020
Key words：single cell RNA‑seq，autism，cell type‑specific analysis，CRISPR

1．自閉症研究を加速させる新技術
近年，一細胞レベルの分解能を持つトランスクリ
プトーム解析，一細胞 RNA シークエンス（scRNA‑seq：single cell RNA sequence）が生物系の基礎研究に大きなブレイクスルーをもたらしている。特に2015 年に Cell 誌で back‑to‑back で発表されたハー14）
バード大学の Steve McCarroll のグループ ，そして David A. Weitz と Marc W. Kirschner の共同研究
11）グループ による Drop‑seq 法は一細胞と識別バー
コードをマイクロ流路内でナノリットルレベルの一ドロップ（液滴）に分離することで，一細胞レベルでの分析，そしてハイスループットを同時に実現した。実際，本手法を用いることで McCarroll のグループは 44,808 個のマウス網膜細胞から 39 種類の遺伝子発現パターンの異なる細胞クラスターを同定，Weitz と Kirschner はマウス ES 細胞からマイナーな細胞クラスターの同定に成功している。
一細胞解析とともに近年脚光を浴びた技術としては，CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat）/Cas9 に代表されるゲノム編
12）
集技術が挙げられる 。本手法を用いた細胞 / 動物モデルは多数作製されており，モデル作製のデフォルト技術となった感がある。現在，先に紹介した一細 胞 解 析 技 術 と ゲ ノ ム 編 集 技 術 を 組 み 合 わせた
1，6）
9）
5）
Perturb‑seq ，CRISP‑seq ，そして CROP‑seq
な ど 興 味 深 い 技 術 が 次 々 に 開 発 さ れ て い る。
Perturb‑seq は “Perturb” の名の通り，ユニークなバーコード（Guide Barcode：GBC）が付加されたguide RNA（gRNA）のプール型ライブラリーを細胞に導入し，ゲノム編集された細胞を一細胞レベルで 解 析 を 行 う。CRISP‑seq，CROP‑seq と も に
Perturb‑seq とは細かい点で手技手法が異なるものの，プール型 gRNA を細胞に導入するという点で同一である。
次世代シーケンサーによる scRNA‑seq は膨大なアウトプットデータを生み出すことから，それらを適切に処理するバイオインフォマティクスの解析パ

Emerging technologies for autism spectrum disorders
1）理化学研究所脳神経科学研究センター（〒 351‑0198 埼玉県和光市広沢 2‑1）Jun Nomura, Toru Takumi：RIKEN Center for
Brain Science. 2‑1 Hirosawa, Wako, Saitama 351‑0198, Japan）
2）神戸大学大学院医学研究科（〒 650‑0017 兵庫県神戸市中央区楠町 7‑5‑1）Toru Takumi：Kobe University Graduate School ofMedicine. 7‑5‑1 Kusunokicho, Tyuo‑ku, Kobe, Hyogo 650‑0017, Japan）【内匠透 E ─ mail：toru.takumi@riken.jp】

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Japanese Journal of Biological Psychiatry Vol.31, No.2, 2020

イプラインも重要である。現在，ニューヨーク大の20）
Rahul Satija による Seurat（R） ，ドイツヘルムホル ツ 研 究 セ ン タ ー Fabian J. Theis に よ る Scanpy26）（Python） が主要解析プラットフォームと考えら
れ る が，10xGenomics 社 が 開 発 し た Loupe CellBrowser も一細胞データ解析に有効なツールである。特に一細胞レベルでの分析でコピー数多型およびクロマチン状態を同一プラットフォームで解析可能である点は魅力的である。

2．中枢神経系における一細胞トランスクリプトーム解析
脳 神 経 科 学 分 野 に お い て も scRNA‑seq シ ー ク
エンスによる解析が年々増えており，細胞種特異的な疾患への寄与が次々に明らかとなってきている。
7，15），ALS（筋萎縮性側索硬特にアルツハイマー病17，21）
13，22）
2），ハンチントン病 ，化症） ，パーキンソン病
19）
多発性硬化症 といった主要神経変性疾患では，神経細胞に限定しない細胞種特異的な細胞内分子病態・メカニズムが明らかとなりつつある。これら一細胞レベルの解析結果は，既存の臓器レベルでのトランスクリプトーム解析ではわからなかったものも含まれる。一方，自閉症を含む精神疾患研究分野ではどうであろうか。神経変性疾患に比較し，必ずしも多くの論文が発表されたわけではないが，興味深い知見が得られつつある。
アルバートアインシュタイン大の Deyou Zheng
らのグループは，既存のヒト scRNA‑seq を実施した複数のデータセット（ヒト胎生 12 〜 13 週胎児の脳新皮質，ヒト ES 細胞を用いた脳オルガノイド
3）
4）
培養 ，ヒト成人の側頭葉 の細胞種特異的トランスクリプトームデータ）を用い，自閉症，統合失調症，アルツハイマー病，ハンチントン病といった疾患のリスク遺伝子とさまざまな細胞種とのエンリッ
25）チメント解析を行った 。この結果，成人ヒト脳サン
プルからは，自閉症リスク遺伝子と神経細胞，オリゴデンドロサイト，オリゴデンドロサイト前駆細胞への顕著なエンリッチメントが認められた。神経細胞では特に抑制性神経細胞への顕著なエンリッチメントが認められた一方，アストロサイト，マイクログリアでは認められなかった。胎児脳データセッ
トでも成熟神経細胞とのエンリッチメントが認められた。自閉症患者脳では興奮性・抑制性神経細胞のバランス異常が既にさまざまな方面から指摘され18）ており ，本研究では改めて自閉症における抑制性神経細胞の脆弱性が示される結果となった。

カリフォルニア大学サンフランシスコ校のArnold R. Kriegstein のグループは，自閉症で細胞種特異的に変動する遺伝子を同定するため，死後脳41 サンプル（内訳：ASD 患者 15 名，コントロー
ル 16 名 の 前 頭 前 皮 質， 前 帯 状 皮 質 ） を 用 い て24）
scRNA‑seq を実施した 。神経細胞を含む全細胞を俯瞰したジーンオントロジー（GO）解析からは，既存の遺伝子発現解析で得られた知見同様，『シナプスのプロセッシング・トランスミッション』や『軸索誘導』，『神経細胞移動』といった神経発達に関与する遺伝子群の変動が認められた。一細胞レベルの解析では，興奮性神経細胞，抑制性神経細胞，アストロサイト，オリゴデンドロサイト，マイクログリアを中心に 17 種類の細胞クラスターを形成した。
本論文の特筆すべき点としては，大脳皮質の表層2/3 層，4 層の興奮性神経細胞，および 5/6 層の神経細胞といった大脳皮質の層を遺伝子発現パターンに応じて細かく分離，それぞれの細胞種と疾患の相関を解析したことにある。実際，本論文では，大脳皮質の表層（2/3 層）およびマイクログリアが自閉症と高い相関を示すことを明らかにしている。
また，新技術として紹介した Perturb‑seq を用いた自閉症の研究が早くも BioRxiv に掲載されてい10）る 。 本 論 文 で は， エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ で あ る
Cas9 を発現する妊娠トランスジェニックマウスの胎生 12.5 日の胎児側脳室にレンチウィルスでプール型 gRNA を導入（35 種類の ASD と相関する遺伝子に対応），出生 7 日目のマウス脳（大脳皮質，線条体）で細胞種毎の遺伝子発現解析を実施している。
本研究の目的は自閉症と相関する 35 遺伝子のバリアントが脳の発達にどのような影響を及ぼすかを一細胞レベルで解析すること，そして本技術の検証を行うことにある。特に本論文では，オリゴデンドロサイトに関して興味深い知見が得られた。ASD のリスク遺伝子である CHD8 は主に神経幹細胞の増殖と神経細胞への分化を制御する遺伝子であることが知られているが，今回オリゴデンドロサイトへの分化，成熟に関与する可能性も示唆された。つまり
CHD8 は神経細胞のみならず，オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞まで負の影響を与えていることになる。このことは，自閉症の創薬ターゲットが神経伝達因子というシンプルな構造になりえないことを示唆している。

おわりに
本稿では，近年発展が目覚ましい scRNA‑seq の日本生物学的精神医学会誌31 巻 2 号

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nervous system development (GO:0007399)
modulation of chemical synaptic transmission (GO:0050804)
chemical synaptic transmission (GO:0007268)
anterograde trans-synaptic signaling (GO:0098916)
positive regulation of synaptic transmission (GO:0050806)
regulation of transcription from RNA polymerase II promoter (GO:0006357)
regulation of synaptic transmission, glutamatergic (GO:0051966)
glutamate receptor signaling pathway (GO:0007215)
positive regulation of gene expression (GO:0010628)
modulation of excitatory postsynaptic potential (GO:0098815)[Biological processes]

transmitter-gated ion channel activity (GO:0022824)
ion channel activity (GO:0005216)
ligand-gated ion channel activity (GO:0015276)
glutamate receptor activity (GO:0008066)
neurotransmitter receptor activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential (GO:0099529)
voltage-gated ion channel activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential (GO:1905030)
voltage-gated cation channel activity (GO:0022843)
sodium channel activity (GO:0005272)
transmitter-gated ion channel activity involved in regulation of postsynaptic membrane potential (GO:1904315)
voltage-gated sodium channel activity (GO:0005248)[Molecular function]

integral component of plasma membrane (GO:0005887)
dendrite (GO:0030425)
axon (GO:0030424)
ionotropic glutamate receptor complex (GO:0008328)
neurotransmitter receptor complex (GO:0098878)
chromatin (GO:0000785)
main axon (GO:0044304)
axon initial segment (GO:0043194)
GABA-A receptor complex (GO:1902711)
nuclear chromatin (GO:0000790)

図1[Cellular component]

自閉症と相関する Gene Ontology（GO）term トップ 10

技術，そして一細胞解析から得られた自閉症に関す解析の細胞・組織で scRNA‑seq を行った場合，細る最新の知見を紹介した。現在，自閉症に相関すると考えられる遺伝子は次々に同定され，その数はヒ胞種毎に GO の結果大きく変動し，想定外の結果が得られるかもしれない。

ト遺伝学に基づき十分に信頼しうるものから，可能性が低いと考えられるものまで 1,000 を超えている（自閉症データベース SFARI より）。その全遺伝子を用いジーンオントロジー（GO）解析を行った結果，最後に，中枢神経系にとどまらない最新の一細胞解析研究を紹介する。自閉症の発症リスクの一つに，父親の年齢が示唆されているが，その原因は精子に8，16）。今回ラトガース大学のあると考えられている
Jeffrey A Rosenfeld とコーネル大学の Christopher E
Mason の共同研究グループが 6 名のドナー（このう ち 2 名 が 自 閉 症 の 子 を 持 つ ） の 精 子 を 用 い，23）
scRNA‑seq を実施した 。サンプルサイズが小さ神経系の機能にそのほとんどがエンリッチしていることがわかる（図 1）。KEGG パスウェイ解析でも同様である（図 2）。しかし，自閉症症状は全身の細胞が複雑に絡み合いその総和が表現型に寄与している可能性があることから，今後は中枢神経系のみならず中枢非神経系，幹細胞，さらに末梢組織でもscRNA‑seq を行う必要がある。またこのような未いためサンプル間で生じた遺伝子発現変化を直接自閉症リスクとして考察することは難しい。しかし，遺伝子発現レベルではなく，ゲノムレベルすなわち

Japanese Journal of Biological Psychiatry Vol.31, No.2, 2020

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Calcium signaling pathway
Glutamatergic synapse
Neuroactive ligand-receptor interaction
Serotonergic synapse
Dopaminergic synapse
Thyroid hormone signaling pathway
Long-term potentiationcAMP signaling pathway
Circadian entrainment
Amphetamine addiction

図2

自閉症と相関するパスウェイ（KEGG）top10

一塩基バリアント（アレル頻度＜ 0.001）の出現頻度をサンプル間で比較したところ，自閉症の子を持つ父親の精子ではバリアントの出現頻度が有意に上昇することを見いだした。出現頻度は常染色体，性染色体に関係なく，またエキソン，イントロン，遺伝子間領域に関係なく自閉症の子を持つ父親の精子では上昇傾向にあった。先に述べたように本論文はサンプル数が極めて少ないため，自閉症との因果関係を考察することは難しいが，本論文の筆者が述べるように本手法は今後自閉症リスクを推定するうえで一つの手法・参考になりうるかもしれない。現在，一細胞レベルの研究は解析手法を含め，さらなる広がりを見せており，複雑な自閉症の病態生理をよりシンプルに説明する日が来るかもしれない。
本論文に開示すべき利益相反は存在しない。
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hensive integration of single‑cell data. Cell, 177：
1888‑1902.

■ ABSTRACT
Emerging technologies for autism spectrum disorders

Jun Nomura ，Toru Takumi
1）

1, 2）

1） RIKEN Center for Brain Science2） Kobe University Graduate School of Medicine
Autism spectrum disorder（ASD）is recognized as one of the major neuropsychiatric disorders defined as social deficits,
repetitive behavior and lack of communication skills. Since the word “spectrum” means “a condition that is not restricted toa specific set of values but can vary, without steps, across a continuum”, patients with ASD showed broad and various
phenotypes. Although the past bulk RNAseq studies have succeeded to identify converged pathways, genes, and networks
in ASD, these outcomes may reflect the results of major cell‑type alternation but not in minor cell‑type one. Here we
introduce a recent technique, single cell RNA‑sequence（scRNA‑seq）, which enables to analyze at a single‑cell resolution.
The scRNA‑seq sheds light on minor cell‑types that may be an important factor for ASD pathogenesis. The single cell
analysis with bioinformatics, combined with genome editing tools, will become a key player to understand heterogeneous
psychiatric disorders, such as ASD.
（Japanese Journal of Biological Psychiatry 31（2）：71 ─ 75, 2020）