知識データベースを用いたがんゲノム解析

フィルジェン株式会社 バイオインフォマティクス部(biosupport@filgen.jp)
1はじめに がんゲノム医療における、次世代シークエンサーを用いた遺伝子パネル解析では、治療薬情報など、臨床的意義のある解析結果を得るために、様々な知識データベースを活用して解析を行う必要がある。
 Golden Helix社VarSeq®では、次世代シークエンサーより得られた遺伝子変異データに対して、様々な臨床データベースの情報をアノテーションとして簡単に加えることができ、これらアノテーションを用いたバリアントフィルタリングのワークフローを作成することによって、解析の効率化を行うことができる。
HarocheJ. et al. Dramatic efficacy of vemurafenib in
both multisystemic and refractory Erdheim-Chester
disease and Langerhans cell histiocytosis harboring
the BRAF V600E mutation. Blood 2013 121
2Golden Helix ソフトウェア製品ラインナップ

GWAS & SNP AnalysisLarge-N DNA-Seq Analysis
Genomic Prediction
Copy Number Analysis
RNA-Seq Analysis••••••••••

Cancer Diagnostics
Gene Testing & Rare Disease Diagnosis
CNV Calling
Clinical Reporting
High-throughput NGS TestingGolden Helix社では、遺伝統計解析ソフトウェア「SNP & Variation Suite」と、遺伝子診断支援ソフトウェア「VarSeq®」の2種類のソフトウェアパッケージを販売



医学・生物学研究や、家畜や作物の品種改良などの農学研究、さらに疾患の診断や最適な治療オプションの決定における医療分野、遺伝学的解析などの教育現場などで利用される
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VarSeq®
 キュレーションされた様々なデータリソースを使用し、変異データへアノテーション付けを実行• dbSNP• RefSeq Genes• 1000 Genome• NHLBI 6500 Exomes• ExAC Variant• gnomAD Exomes• SIFT and PolyPhen• dbNSFP Functional Predictions• ClinVar• CIVic• ICGC Simple Somatic Mutation• 各種遺伝子パネルのターゲットデータ...など

 VCFファイルに含まれる変異データから、任意の検索条件でデータのフィルタリングを行うワークフローを作成
 カバレッジ計算やトリオ解析、表現型情報に基づく遺伝子ランキングなどの解析アルゴリズムを搭載
 ゲノムブラウザーを搭載し、BAMファイルデータや各種アノテーションデータをグラフ表示
 無償提供のビューワーソフトウェアが利用でき、解析結果を容易にシェアすることが可能
4有償アドオン- 臨床レポートの作成- コマンドライン型インターフェース- アノテーション・フィルタリング- CNV（コピー数多型）解析

COSMIC- 体細胞変異データベース

OMIM- データシェアリング用Webサーバー- 遺伝子・疾患情報データベース

CADD- 変異スコアデータベース- ACMG/AMPガイドラインによる変異評価
5使用するデータ

次世代シークエンサーの変異解析パイプラインで作成したVCFファイル（変異データ）とBAMファイル（リードアライメントデータ）を使用して、各種データ解析を実行
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アノテーションリソース

Golden Helix社によってデータの精査・メンテナンスが行われている各種アノテーションリソースを、Data Source Libraryより自由にダウンロードし、変異データへのアノテーション付けに使用可能

日本人変異データベースHGVDなどのカスタムアノテーションデータをインポートし、アノテーションリソースとして使用が可能
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アノテーションリソース
Assemblies• GRCh 37 (hg19)• GRCh 38 (hg38)
Genes• RefSeq• Ensembl＊赤字は有償アドオン
Cancer Annotations• COSMIC• CIViC• Cancer Hotspots• ICGC Simple Somatic Mutations• TCGA Variants• MSK Impact

Population Catalogs• dbSNP• 1000 Genome• NHLBI 6500 Exomes• ExAC Variant• gnomAD• TOPMed

Clinical Annotations• ClinVar• OMIMFunctional Annotations• dbNSFP (SIFT, PolyPhen, MutationTaster...)• CADD

Targeted Panels• TruSight• Ion AmpliSeq8

がん遺伝子とがん抑制遺伝子
Hallmarks for PTEN:がん遺伝子（Oncogene）⁃ 細胞増殖を促進させる遺伝子⁃ 機能獲得型の遺伝子変異によって、細胞増殖が亢進する⁃ 変異が遺伝子上の特定領域（ホットスポット）に集中することがある⁃ 代表的な遺伝子：KRAS, BRAFなど

がん抑制遺伝子（Tumor Suppressor Gene）⁃ 細胞増殖を抑制する遺伝子⁃ 機能喪失型の遺伝子変異によって、細胞増殖が亢進する⁃ 遺伝性腫瘍の原因遺伝子であることが多い⁃ 代表的な遺伝子：BRCA1/2, APCなど

Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of Cancer: The next generation. Cell . 2011; 144:646–674
Tate J et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer, Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1,08 January 20199

体細胞変異と生殖細胞系列変異

NormalTumor

体細胞変異

生殖細胞系列変異⁃ 後天的に取得する遺伝子変異で、変異が起こった細胞にのみ存在する⁃ 次世代に遺伝しない⁃ サンプル中にごく微量にのみ存在することがあるため、高感度な検出法が必要⁃ 検出の際は、生殖細胞系列変異と区別するために、腫瘍サンプルと正常サンプルの両方が必要⁃ 個人が生まれながらに持っていて、生涯変化しない⁃ すべての細胞で共通のものが存在する⁃ 次世代に遺伝する⁃ 血縁者間で一部共有されている

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がんゲノム関連データベース
COSMIC⁃ Mutations: がん関連変異のカタログ（臓器情報やサンプルカウント情報含む）⁃ Cancer Gene Census: がん関連遺伝子のカタログ⁃ Fusions: 融合遺伝子の情報⁃ Hallmarks: がん特質に関する情報⁃ Transcript Counts: 転写物ごとに登録されているサンプル数や変異数

サンプルカウントデータベース⁃ ICGC Simple Somatic Mutations⁃ TCGA Variants⁃ MSK-Impact

知識データベース⁃ ClinVar⁃ CIViC⁃ The Precision Medicine Knowledgebase (PMKB)

その他⁃ Cancer Hotspots⁃ パスウェイデータベース⁃ 各種遺伝子パネルのターゲット領域データ（TruSight, Ion AmpliSeqなど）⁃ 各種アリル頻度データベース（1000 Genomes, gnomADなど）

11アノテーションデータ



アノテーション情報は変異データテーブルにそのまま追加され、データベースへのハイパーリンクもつく

変異データテーブル上の任意のデータをクリックすると、アノテーションの詳細情報も閲覧可能

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フィルタリングワークフロー

フィルタリングワークフロー



付加したアノテーション情報などを用いて、変異データに対する任意のフィルタリングワークフローを作成

ワークフローの各項目ごとに、フィルタリング結果の変異データテーブルを確認可能で、項目を変更するとフィルタリング結果の変異データテーブルも自動的にアップデートされる
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COSMICCOSMIC Mutation⁃ がんに関連した体細胞変異を網羅的に収集したカタログで、アノテーションとして以下の情報をもつ⁃ 変異の各種分類⁃ 論文リスト⁃ 変異が認められたサンプル数⁃ 原発部位およびそれぞれのサンプル数⁃ がんサブタイプおよびそれぞれのサンプル数⁃ Sample Countでフィルタリングをかけることで、高頻度に存在する変異のみを抽出することが可能⁃ ICGCなどの他のサンプルカウントデータベースも、ほぼ同じ種類のアノテーションをもつ⁃ Cancer Gene CensusやFusionsなどのCOSMICの他のデータベースは、基本的に遺伝子レベルのカタログとなっており、各遺伝子ごとの機能やがんの発生における役割、関連するがんの種類や融合遺伝子情報、論文リンクなどをアノテーションとしてもつ

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ClinVar
ClinVar⁃ 疾患と関連する変異を網羅的に収集したデータベースで、アノテーションとして以下の情報をもつ⁃ 変異の病原性分類（Classification）⁃ キュレーション状況（Review Status）⁃ 変異が報告された研究レコード⁃ Classificationでフィルタリングをかけることで、病原性を持つ変異のみを抽出することが可能

ClinVar Assessments⁃ 変異評価のエビデンスとなる、実際にClinVarに登録された研究プロジェクトの情報で、アノテーションとして以下の情報をもつ⁃ 研究プロジェクトのソース⁃ 変異の病原性分類⁃ 変異が報告された条件（疾患名など）⁃ 報告者による解釈⁃ 論文リスト⁃ 疾患の種類ごとに、報告者による変異に対する解釈を確認できる

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CIViC

CIViC⁃ がんに関連する遺伝子変異の臨床的解釈を集めたオープンア
クセスのデータベースで、アノテーションとして以下の情報をもつ⁃ 変異の各種分類⁃ がんの種類や臓器⁃ 変異のサマリー⁃ 治療薬の種類⁃ 臨床的意義⁃ エビデンスレベルと関連する記述⁃ 論文リスト⁃ 研究プロジェクトで用いられた治療薬とその効果などを、説明付きで確認できる⁃ Clinical SignificanceやEvidence Levelでフィルタリングを行うことで、任意の臨床的意義を持つ変異を抽出できる⁃ SNV, InDelの他、データベースにはコピー数異常に関する情報ももつ
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PMKB
The Precision Medicine Knowledgebase(PMKB)⁃ 病理学者によるデータの精査が行われている、がんに関連する遺伝子変異の臨床的解釈をまとめたデータベースであり、アノテーションとして以下の情報をもつ⁃ 変異の各種分類⁃ 変異の臨床的解釈⁃ 治療薬の種類⁃ がんの種類や臓器⁃ 論文リスト⁃ 治療薬とその効果などを、説明付きで確認できる⁃ SNV, InDelの他、データベースにはコピー数異常に関する情報ももつ

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Cancer Hotspots

Cancer Hotspots⁃ がん関連遺伝子における、高頻度に変異が発生するゲノム領域（ホットスポット）データで、アノテーションとして以下の情報をもつ⁃ 遺伝子名⁃ 該当領域の野生型のアミノ酸配列⁃ 変異ごとに観察されたアミノ酸配列とサンプル数⁃ がんの種類とサンプル数⁃ コドン内の変異によって、高頻度に観察されたアミノ酸残基などを確認できる⁃ ゲノムブラウザーにプロットさせることで、遺伝子上のホットスポットを視覚的に表示させることも可能⁃ バリアントフィルタリングを行う場合は、ホットスポット領域内に存在する変異のみを抽出することが可能
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アリル頻度データベース

アリル頻度データベース⁃ 人種などの特定集団内のアリル頻度を変異ごとに計算したデー
タベースで、以下種類のデータベースが利用できる⁃ dbSNP⁃ 1000 Genome⁃ NHLBI 6500 Exomes⁃ ExAC Variant⁃ gnomAD Exomes/Genomes⁃ TOPMed⁃ UK10K⁃ データ解析時には、任意のアリル頻度でフィルタリングを行うこと
で、ごくまれに存在する変異のみを抽出することが可能⁃ データベースの種類によっては、特定人種のアリル頻度データをフィルタリングに使用することも可能⁃ Human Genetic Variation (HGVD)などの日本人SNPデータベースを別途インポートすることによって、同様にフィルタリングに用いることも可能

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解析例1
解析サンプル：腫瘍細胞のみ解析に用いるデータファイル：各サンプルのVCFファイル
解析の目的：がん遺伝子における機能獲得型変異と、がん抑制遺伝子における機能喪失型変異の検出

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デモンストレーション



遺伝子パネルデザインに用いられたターゲット領域、およびサンプルデータのリード深度（Read Depths）とアリル頻度（Variant Allele Freq）のフィルター設定を行う
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デモンストレーション



続いて2種類のアリル頻度データベースを用いて、それぞれの集団内で頻度が小さい変異と、COSMIC Mutationデータベースに登録されている変異のフィルター設定を行う

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デモンストレーションOncogeneの選択とホットスポット上の変異の抽出、加えて病原性のある変異の抽出のフィルター設定を行う

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デモンストレーションOR

Tumor Suppressor Geneの選択に続き、病原性のある変異または機能喪失型変異の抽出のフィルター設定を行う

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デモンストレーションOncogeneとTumor Suppressor
GeneのフィルターコンテナをOR検索で繋げ、同時に検索を実行できるようにする

このフィルター設定により、集団内にまれに存在するCOSMIC登録済みの変異より、がん遺伝子とがん抑制遺伝子においてがんの発生に関わるものを検出できる

各変異の臨床的意義や治療薬情報など
は、各変異の詳細情報ウインドウより確認

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解析例2
解析サンプル：腫瘍細胞と正常細胞のペアサンプル
解析に用いるデータファイル：各サンプルのVCFファイル、BAMファイル
解析の目的：がん関連の体細胞変異と、病原性の生殖細胞系列変異の抽出

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デモンストレーション



腫瘍細胞サンプルデータのリード深度（Read Depths）とアリル頻度（AF）、および正常細胞サンプルデータのアリル頻度のフィルター設定を行う

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デモンストレーション



続いて、COSMIC Mutationデータベースに登録されている変異、および登録サンプル数のフィルター設定を行う

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デモンストレーション



正常細胞サンプルデータのリード深度（Read Depths）とアリル頻度（AF）のフィルター設定を行う

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デモンストレーション



続いて2種類のアリル頻度データベースを用いて、それぞれの集団内で頻度が小さい変異のフィルター設定を行う

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デモンストレーション



非同義変異または機能喪失型変異の抽出に加えて、病原性のある変異の抽出のフィルター設定を行う

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デモンストレーション



体細胞と正常細胞のフィルターコンテナをOR検索で繋げ、同時に検索を実行できるようにする

このフィルター設定により、COSMIC登録済みでサンプル数の多い体細胞変異、集団内にまれに存在するClinVar登録済みの病原性の生殖細胞系列変異を検出できる

各変異の臨床的意義や治療薬情報など
は、各変異の詳細情報ウインドウより確認

必要に応じて、ゲノムブラウザーに表示させたBAMファイルデータより、リード配列上の変異の有無の目視チェックなどを行う

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お問い合わせ先：フィルジェン株式会社

TEL: 052-624-4388 (9:00～18：00）
FAX: 052-624-4389
E-mail: biosupport@filgen.jp

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