性フェロモン神経回路の活動依存的な可視化と操作による機能解明
Activity-dependent visualization and analysis of sex pheromone neural circuits（日本動物学会推薦）

代表研究者 金沢大学

木矢 剛智

Kanazawa UniversityTaketoshi KIYA

How do animals select their behavior in response to certain sensory inputs? Appropriate responses to sensory
information are critical for survival. In the present study, we focused on the brain of insects which has low complexity,
but has similar circuit property and molecular basis as the brain of higher animals. In many insects, sex pheromone
induces stereotypic courtship behavior with clear relationship between receptor activation and behavioral outcome. Here,
we established a novel neural circuit tracing method utilizing an activity-dependent gene expression. Recently, weidentified a novel immediate early gene Hr38, whose expression increases in response to neural activity. In the present
study, using the promoter activity of Hr38, we generated a genetic system to drive expression of GFP upon neuralactivity to visualize the neural circuit activated by sex pheromone or courtship behavior. With this novel method, we
revealed that neurons in the higher brain center, as well as olfactory neurons, are active in response to pheromone
stimulation in silkmoths. In the vinegar fly, we identified novel neural circuits involved in courtship behavior, inaddition to previously known neural circuits. These results indicate that our neural circuit tracing method is highly
useful for functional analysis of insect neural circuits.

研究目的
動物は外界からの情報を正確に受容・認識し、適切な行動により反応する。しかしながら、感覚情報用いた神経機能の解析や比較が可能であるといった観点から、カイコガとショウジョウバエの 2 種の昆虫を用いて研究を行ってきた。

が行動出力を生み出す神経機構には不明な点が多く

最近、本研究者は新規な神経活動のマーカー遺伝残されている。特に脳の高次中枢は、感覚情報の統子として Hr38 を同定し、これらの昆虫の脳で性フ合や運動指令の判断において最も重要であると考えェロモンに反応する細胞の分布を包括的に明らかにられるにも関わらず、有効なアプローチがないためした（参考文献１）。本論文では、嗅覚中枢や運動中その動作原理は未解明のままである。

枢のみならず、脳の高次中枢として知られる領域の感覚情報が行動を生み出す神経機構の解明には、細胞群が性フェロモンの刺激に応じて活動すること特定の感覚刺激に対する定型行動に着目し、その神を明らかにし、脳高次中枢における感覚情報処理機経回路及び機能を包括的に明らかにすることが有効

構の解明には本研究者のアプローチが極めて有効でである。昆虫の性フェロモンは、特異的な嗅覚受容あることを示してきた。

体の活性化が、性行動といった定型行動を誘発する

本研究では上述の研究結果を更に発展することを点で入出力関係が明確であり、感覚入力と行動の関主眼に、Hr38 によってラベルされた細胞が構成する係を調べる目的に適している。また昆虫の脳は、脊神経回路の形態や機能を明らかにすることを大きな椎動物の脳に比べ極めて少数の神経細胞で構成され目標とした。具体的には、Hr38 の転写活性を利用しており、神経回路の包括的な解析が可能である。本

た遺伝子組換えカイコガやショウジョウバエの作成

研究者はこれらの研究上の利点と、遺伝学的手法をに取り組み、性フェロモンに反応した神経細胞・回路の特異的な可視化・操作を行い、その機能解明を低く、神経回路の包括的な可視化には不向きであっ目的とした。

たため、次に GFP の発現強度を増加させる条件の検討を行った。

研究経過

まず UAS-mCD8GFP を 20xUAS-IVS-Syn21-myr::（１）遺伝子組換え（Tg）カイコガを用いた性フェGFP-p10T 系統に変えて同様の実験を行った。ここでロモン情報を処理する神経回路の同定の改善点では、UAS の繰り返し数を 5x→20x としてカイコガの脳において、神経活動の起こった細胞転写活性を増加させたこと、人工的なスプライシンを可視化するための新規な遺伝学的手法“NBRE シ

グ配列 IVS や翻訳エンハンサーSyn21 配列や p10T 配ステム”を考案・構築した。その原理は以下の通りで列をベクターに付加して翻訳効率の増加を試みたこある。とである。その結果、やはり 15x 系統の 1 系統のみで性フェロモン刺激依存的な GFP の発現が認められたが、GFP の発現強度の増加はわずかであった。
そこで次に NBRE-GAL4Δ 系統の改変を行った。
まず、転写活性が高いことが知られていた
GAL4::VP16 と GAL4::p65 に GAL4Δ を置き換えた系

神経活動依存的に発現する遺伝子 Hr38 は転写因子 HR38 をコードしており、HR38 は NBRE という 9塩基の配列に結合し、下流の遺伝子の転写を誘導する性質を持つ。この活性を利用し、NBRE 配列の下流に任意の遺伝子（本研究では GAL4）を配置することで、神経活動依存的にその遺伝子を発現させることが出来るというものである。これまでに Hr38の神経活動依存的発現制御を行うプロモーターを探索したが、少なくとも Hr38 の周辺ゲノム領域 20kbにおいては、神経活動依存的な遺伝子発現制御領域は見つからなかった。この結果は神経活動によるHr38 の転写制御は、遠位のエンハンサーによって制御されていることを示唆している。カイコガにおいてプロモーターを詳細に探索することは労力的に困難であることから、本“NBRE システム”を用いることで、本研究の目的達成を試みた。
まずプロモーターに用いる NRBE 配列の適切な繰り返し回数を調べた。具体的には 5x, 15x, 25x, 35xのいずれかの回数で NRBE 配列をタンデムに並べ、その下流に GAL4Δ（細胞毒性の少ない GAL4 バリアント）を配置したコンストラクトを作成し、各コンストラクトにつき 3 系統ずつ、計 12 系統の遺伝子組換えカイコガ系統を作出した。これらの系統をすべ統を作出した。しかし、GAL4::VP16 と GAL4::p65は共に高い細胞毒性を持つようで、作出した系統を維持することが出来ず、系統が絶えてしまい GAL4の転写活性増加による GFP 強度の増加を検討することは出来なかった。
そこで更に別のアプローチとして、 GAL4Δ にSyn21・p10T 等の配列を付与し、GAL4Δ 自身の発現量を増加させることで、GFP 発現量の増加を試みることにした。15xNBRE・25xNBRE それぞれの下流にSyn21-GAL4Δ-p10T を配置したコンストラクトを作成し、各コンストラクトにつき 3 系統ずつ系統の作出を行い、20xUAS-IVS-Syn21-myr::GFP-p10T 系統と掛け合わせ、GFP の発現を検討した。その結果、神経回路の可視化に十分な強度の GFP の発現を達成することが出来た。これらの中でも特に、15xNBRE のLine3 が最も GFP の発現強度が良いことを確認した。
本系統における GFP の発現を詳細に調べたところ、嗅覚情報の一次中枢である触角葉の性フェロモンに応答することが知られている領域や脳高次領域において、性フェロモン刺激依存的に GFP シグナル見られるようになることが観察された。この結果は、以前に行った Hr38 の in situ hybridization の結果とも一致しており、性フェロモンに応答した神経回路を可視化することに成功したと判断した。て UAS-mCD8GFP（膜移行型シグナル付 GFP）系統と掛け合わせ、性フェロモン刺激の後に抗 GFP 抗体（２）性フェロモンに応答した神経細胞の機能的意を用いた免疫染色を行った。その結果 15x 系統の 1

義の解明系統のみで性フェロモン刺激依存的な GFP の発現が認められた。
本実験で得られた系統の GFP の発現強度は非常に上記のシステムを完成したことから、神経活動依存的に GFP 以外の機能操作用タンパク質を発現させることも出来るようになった。そこでまず、本シス領域においても、メス刺激依存的な GFP 陽性細胞数テムを利用し、活動の起こった神経回路に温度依存の増加は、感覚情報入力の遮断によって減弱・消失的に開口するイオンチャネル dTrpA1 を発現するカすることを確認した。その中でも特に Area6 と本研

イ コ ガ を 作 出 し た 。 性 フェ ロ モ ン 刺 激 に よ っ て究者が定義した領域は、メスで刺激した際にのみdTrpA1 を発現させたカイコガを用い、温熱刺激によGFP 陽性細胞が認められること（オスで刺激した場る神経回路の再活性化を試みた。現時点では 5 個体合には GFP 陽性細胞が一切認められなかった）、そ中 2 個体のみの成功率であるが、温熱刺激による性の反応は感覚入力量依存的であることを見出した。

行動の再活性化を行うことが出来た。本結果により、そこで次に Area6 の細胞の性質を調べることにしNBRE システムを用いることで神経回路を可視化出た。様々な転写因子との二重染色によるスクリーニ来るのみならず、機能操作を行うことが可能である

ングの結果、Area6 の細胞群は性決定遺伝子 fruitlessことが示された。只、上述の通り、再活性化率が低陽性であることが分かった。そこでショウジョウバ

いことから更なる技術面での改良が必要であると考エの遺伝学的手法により、fruitless 陽性神経回路のみえられる。

で、活動依存的な神経回路の可視化を行った（下図）。
その結果、Area6 の細胞は asp2 という細胞群である（３）ショウジョウバエの脳において性フェロモンことを見出した。

情報を処理する神経回路の同定と解析
本研究の開始時点でショウジョウバエでは、Hr38転写開始点に GAL4 をノックインした系統の作出に成功していた。本研究では、この系統を用いて Hr38を発現する細胞の可視化・機能解析を行った。
まず、本系統を用いてオスのショウジョウバエにメスのショウジョウバエを提示した際にどの様な神経回路が活動するかを可視化した。その結果、下図のように様々な脳領域においてメス刺激依存的なGFP 陽性細胞の発現が認められた。

次にこの asp2 神経回路の機能的重要性を明らかにすることを目的に、asp2 特異的にシナプス伝達を阻害する破傷風毒素軽鎖(TeTxLC)を発現する系統を作出した。この系統では性行動の開始に異常はないが、性行動の活性が低くく、交尾を完遂することに障害があることを見出した。
そこで更に asp2 特異的に温度依存的に開口するイオンチャネル dTrpA1 を発現する系統を作出した。
この系統を用いて、asp2 の神経活動を亢進させた場合の性行動を調べたが、特に性行動や交尾活性を促また、この結果を定量的に解析するために各脳領進するような表現型は見られなかった。

域における GFP 陽性細胞の数を数えた。この際、触角を除去した個体や、触角と前足先端部を除去した考察個体を作成し、感覚情報入力をなくした場合にどの本研究では、神経活動依存的に発現量増加する初様な変化が起こるかを調べた。その結果、いずれの期応答遺伝子 Hr38 を遺伝学的に利用することで、活動依存的に神経回路を可視化・操作する手法を、経回路を見出した。また、この asp2 神経回路は交尾カイコガ及びショウジョウバエの 2 種の昆虫で確立行動に重要な役割を担う神経回路であることを明らした。Hr38 は線虫からヒトに至る幅広い生物種で高かにしつつある。先行研究によって明らかにされて度に保存された遺伝子であり、ゲノム配列の決定さいる fruitless 神経回路の構造から、asp2 神経回路にれた全て昆虫種に存在することが確認されている。

は触角・前足先端からの性フェロモン入力および視よって本研究は、カイコガとショウジョウバエに留覚からの入力があることが分かっている。また、asp2

まらず、幅広い昆虫種や他の動物門の生物において神経回路は性行動指令を発する P1 神経回路の上流も、Hr38 の転写活性やプロモーター活性を利用するに位置することも明らかとなっている。これらのこことで活動依存的に神経回路を可視化・操作することを総合すると、asp2 は様々な感覚情報を統合し、とが出来る可能性を示すものである。今後、昆虫科

P1 神経回路に入力することで、P1 神経回路の活動学以外の研究分野においても重要なツールとなるこに影響を与え、交尾行動の活性制御に関わっているとが期待される。

ものと推察される。今後、この仮説の検討を行ってゆきたい。

（１）カイコガにおける結果の考察
カイコガの脳において活動依存的な神経回路の可参考文献

視化を行った事により、嗅覚情報の入力部のみなら

1. Fujita N, Nagata Y, Nishiuchi T, Sato M, Iwami M,ず、脳高次領域において性フェロモン刺激依存的にKiya T. Visualization of neural activity in insect brains

GFP でラベルされる細胞を可視化することが出来た。

using a conserved immediate early gene, Hr38. Curr

多くの感覚情報は高次領域へ伝達されるに従い、情Biol. 2013 Oct 21;23(20):2063-70.

報処理経路が発散・複雑化する為、それを追跡する

2. Namiki S, Iwabuchi S, Pansopha Kono P, Kanzaki R.

ことは徐々に困難になってゆく。そのような観点にInformation flow through neural circuits for pheromone

おいて、脳高次領域において感覚刺激に応答する回orientation. Nat Commun. 2014 Dec 23;5:5919.

路を可視化できたことは、今後、感覚情報が行動を制御する機構を明らかにしてゆく上で極めて重要な研究の発表意義を持つと考えられる。

口頭発表

本研究の期間中に、他のグループより、高次脳領1.

木矢剛智 昆虫の生得的行動の神経基盤：活動依域において性フェロモンに反応する神経（SMP 神

存的な神経回路可視化法の開発によるアプロー経）の報告がなされた（参考文献２）。我々が可視化

チ. 平成 27 年度 蚕糸・昆虫機能利用学術講演

した細胞の中にも SMP 神経と推定されるものも含会. [招待講演]

まれていた。このようなことから、新規神経回路の2.

木矢剛智 昆虫の生得的行動の神経基盤：活動依同定という観点では新規性が下がってしまったが、存的な神経回路可視化法の開発によるアプロー

本手法の有用性が再度確認されたと考えられる。

チ. 日本動物学会北海道支部第 562 回支部講演

本手法の強みは可視化のみならず神経活動を人為会.

[招待講演]的に操作することが出来る点にある。今後、可視化した神経回路の人為的機能操作を行うことで、未だ誌上発表

報告のなされていない神経回路やその機能を明らか1.にしてゆきたい。

木矢剛智 神経活動依存的に発現する遺伝子
Hr38 を利用した昆虫の生得的行動時の神経活動の検出. 生化学（２）ショウジョウバエにおける結果の考察
ショウジョウバエの脳においても、活動依存的な第2号
2.

みにれびゅう2015 第 87 巻

pp.221-224 [総説]

Kiya T, Morishita K, Uchino K, Iwami M, Sezutsu H

神経回路可視化法を確立し、交尾行動時に活動するEstablishment of tools for neurogenetic analysis of

神経回路を明らかにすることに成功した。さらに既

sexual behavior in the silkmoth, Bombyx mori. PLoS

知の神経回路に加え、新規な神経回路として asp2 神One. 2014 Nov 14;9(11):e113156.