牛乳タンパク質由来の低分子ペプチドによる食欲抑制作用
京都大学大学院農学研究科食品生物科学専攻

耕作
教授吉川正明大学院生侯依静

食品生理機能学分野准教授大日向

大学院生末次建太朗

要約
牛乳タンパク質の酵素消化によって派生する種々の生理活性ペプチドから摂食調節ペプチドを‑ラクトアルブミン由来の Gly‑Lue‑Phe(GLF)、およびβラクトグロプリン由来のニュー探索した。 αロテンシンアゴニスト His‑lle‑Arg‑
Leu (HIRL，s‑ラクトテンシン)をマウスに腹腔内投与 (100mg/kg)することにより、用量依存的な摂食抑制作用を示すことを初めて見出した。このうちβラクトテンシン (500mg/kg) は、経口投与により有意な摂食抑制作用を示すことを見出した。さらに、 βラクトテンシンは 30‑60nmolJmouseの脳室内投与により用量依存的な摂食抑制作用を示す

0nmol
Jmouseの脳室内投与により胃排出能 (gas
凶 cemp抑 g) を抑制することを明らとともに、 6かにした。したがって、本ペプチドの摂食抑制作用は、胃排出の遅延による可能性が考えられる。 s‑ラクトテンシンは牛乳タンパク質由来の経口投与で有効な摂食抑制ペプチドとしては初めての例であり、今後のより詳細な検討が必要である。

キーワード:乳タンパク質、食欲調節、生理活性ペプチド、

s‑ラクトグロプリン、 s‑ラクトテンシン、ニューロテンシン、消化管運動

1.はじめに牛乳は、栄養価の優れた食品であるという認識が定着している一方で、肥満を増長するのではないかという潜在的なイメージも浸透している。しかしながら実際には、牛乳摂取量と BodyMass

Index (B~直)が、むしろ逆相関するという疫学調査結果も報告されており [lJ 、牛乳は肥満を促進する食品には分類されていない。この一因として、牛乳タンパク質から派生する低分子ペプチドが、食欲を抑制している可能性が考えられる。
近年、レプチンやグレリンなどに代表される内因性の摂食調節ペプチドおよびそれらの受容体が数多く見出され、食欲調節に重要な役割を演じていることが明らかとなっている。既に食品タンパク質の酵素分解により多彩な生理作用を示す低分子ペプチドが派生することが判明しているが、これらの中には食欲を調節するものがあることを見出している問。そこで本研究では、特に牛乳タンパク質の酵素消化によって得られる低分子の生理活性ペプチドに着目し、食欲に及ぼす影響について検討した。
ー74‑

2. 実験方法
2‑1. 試薬

牛乳タンパク質由来の低分子ペプチド Gly‑Leu‑
Pheおよび回s‑
lle
‑
Arg‑
Le
uは、 Fmoc法により固相合成し、逆相 HPLCを用いて精製し、さらに凍結乾燥したものを使用した。

2‑
2. 摂食実験

実験動物として 7週齢雄性 ddYマウス個別飼育し、固形飼料(日本 SLC、静岡) を用いた。プラスチックケージに(CE‑2、日本クレア) および水を自由摂取させた。 3日間以上予備飼育し、摂食実験を行った。 18時間絶食後、ペプチドを投与し、予め重量を測定した固形飼料を与え、経時的に固形飼料の重量を測定し、摂食量を算出した(図1)。
経口投与および腹腔内投与の場合は、各ペプチドを生理的食塩水に溶解した。また、経口投与には胃ゾンデを用いた。
脳室内投与の場合は、手術によりマウス脳室内にガイドカニューレを予め移植し、回復したのちに、摂食実験に供した [3‑5J。すなわち、ネンブタールを ddYマウスに腹腔内投与し (80‑85mg
Jkg)、麻酔したのち、第三脳室内にペプチド溶液が投与できるように、 bregma より 0.9mm後方、0.9mm側方、深さ 3mmの位置に 24Gカニューレーセーフレットキヤス(ニプロ、大阪) を加工したガイドカニューレを、脳位固定装置を用いて移植、固定した。カニュレーション手術から 1週間程度経過したのちに、摂食実験を行った。ペプチドは人工脳脊髄液(artificia1cerebrospinalfluid: ACSF; 138.
9m MNaCl， 3.
4m MKC，l 1.3m MCaCl，4.
0m MNaH
C03， 0.
6m MNal長PO~，z5.
6m Mglucose，pH7.4)に溶解し、無麻酔・無拘束状態のマウスにマイクロシリンジを用いて 4μl投与した。

自由摂食

o1 2‑184(時間)

固形飼料重量測定
図 1 摂食実験方法

自由摂食‑1‑190

固形飼料
重量測定

2 (時間)
胃内容物
重量測定

図 2 胃排出能 (gastricemptyingrate)測定方法
ー75‑2‑3. 胃排出能
ddYマウスを 18時間絶食したのちに、 1時間、固形飼料を与え、その摂食量を測定し、ペプチド溶液を脳室内投与した(図 2)[3，4J。さらに 2時間絶食し、頚椎脱臼後、開腹し、胃内容物の流出を防ぐため幽門と噴門を結紫し、胃を摘出した。さらに、胃内容物を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。胃排出能は以下の式に従って計算した。
胃排出能(~){1‑ (胃内容物重量/摂食量)} x100.

3.結 果3‑1. 牛乳タンパク質由来の摂食抑制ペプチドの探索
牛乳タンパク質由来の低分子ペプチドを腹腔内投与した際に、どのように摂食量が変化するか
is‑lle‑Arg‑Leu(s‑ラクトテンシン) [6Jを検討した。その結果、種々の生理活性ペプチドの中で Hおよび Gly‑Lue‑Phe(GLF)[7Jという 2種類の低分子ペプチドが摂食抑制作用を示すこと見出した。

3‑1‑1. Gly‑Leu‑Pheの摂食抑制作用。ーラクトアノレブミン由来の免疫促進ペプチドである GLFを 100mg/kg腹腔内投与したところ、投与後 20分および 120分において有意な摂食抑制作用を示した(図 3)口Cont
図 GLF10mg/kg
目]]GLF30mg/kg
00mg/kg• GLF1c)

、ー"

31.
.
.
.

c

刀OOL

O

2012060

日

Pく0.
01vscontrol

Timeaftera
dministration(min)
図 3 GLFの腹腔肉投与による摂食抑制作用

口 Cont内)ωu右主(白ιJ

図 HIRL30mg/kg•HIRL100mg/kg

刀OOLO2060120240

Timeafteradministration(min)図4.
Pく0.05，日中く 0.001vs∞ntrols‑ラクトテンシン (HIRL) の腹腔内投与による摂食抑制作用‑76‑

0・ラクトテンシン
ニューロテンシン
図5 s‑ラクトテンシンとニューロテンシンのホモロジー
表 1 ニューロテンシンとトラクトテンシンのニューロテンシン NT，
および NT2受容体に対する親和性と選択性
Kj(μM)

ニューロテンシン
日ーラクトテンシン

NMT2，

NT20.00012

0.
0054

0.
0227.
747NT360s‑ラクトテンシン)の摂食抑制作用
Ile‑Arg‑Leu(3‑1‑2.His‑g) の腹腔内投与により、用量依存的な摂食量の低下が認めら
30‑100mg!
ks‑ラクトテンシン (れ、 1g投与群の摂食量は、投与後 20分および 600mg0分において有意に低い値を示した(図!
k4)。したがって、本ペプチドは摂食抑制作用を有することが明らかとなった。 βラクトテンシン

は、。ーラクトグロプリンのキモトリプシン消化物から単離した回腸収縮ペプチドで、脳ー腸ホルモンとして知られるニューロテンシンにホモロジーを有し(図 5)、 2種類のニューロテンシン受容)。
2受容体に選択的なアゴニストであることを、これまでに明らかにしている(表 1体のうち NT3・2. 経口投与で摂食抑制作用を示すトラクトテンシン
腹腔内投与により摂食抑制作用を示した βラクトテンシンおよび GLFが、経口投与により作用を示すか否か ddYマウスを用いて検討した。図 6に示したように、 s‑ラクトテンシン (500mg!kg)
は経口投与後 60分まで摂食量の低下が認められた。したがって、本ペプチドは、経口投与で有効な摂食抑制ペプチドといえる。 s‑ラクトテンシンは乳タンパク質由来の摂食抑制ペプチドとしては初めての例である o吋吋

同3IF/J+L71L

CGHnu︑nu初日mum

口図・M(O)ωU
42c一刀00比
O2012024060
Timeafteradministration(min).
P<O.
01.vs∞ntrol.
P<O.
05..

LFおよびトラクトテンシン (図6 GHIR
υ の経口投与による摂食抑制作用‑77‑

口 Cont
囚 HIRL3nmol/mouse~ HIRL10nmol/mouse)
ωv‑mw‑c 百OOL

四皿 HIRL30nmol/mouse•OHIRL60nmol/mouse

2060

120'P
く0.
05vscontrolTimeafteradministration(rnin)sーラクトテンシンの脳室内投与による摂食抑制作用

図7〆、、
与'
円、，.~。80ELUE2GEC3LP
E6040Sb 20EE3n。
Cont
図8HIRL
60nmol/mouse'P
く0.
05vscontrols‑ラクトテンシンの脳室内投与による胃排出抑制作用

なお、腹腔内投与で摂食抑制作用を示した GLFは、経口投与では有意な摂食量の変化を示さなかった

3‑3.s‑ラクトテンシンの脳室内投与による摂食抑制作用と胃排出遅延作用

s‑ラクトテンシンが腹腔内投与および経口投与により摂食抑制作用を示したことから、次に中30‑60
枢神経系に直接投与した場合の、摂食量の変化を検討した。その結果、 βラクトテンシン (nmolJmouse) は用量依存的な摂食抑制作用を示した(図 7)。摂食抑制作用を有する生理活性ペプチドの多くは、消化管運動に影響をおよぼし、胃排出を抑制することが知られている。そこ
Jmouseの脳室内投与にで、 βラクトテンシンの胃排出能に及ぼす影響について検討した。 60nmolより、 s‑ラクトテンシンは、有意に胃排出能を抑制したことから、 s‑ラクトテンシンは消化管運動を抑制する作用を有することが判明した(図 8)。摂食抑制作用が認められる濃度で、胃排出能が阻害されることから、 βラクトテンシンによる摂食抑制には、胃排出能の遅延が影響しているかもしれない。

ー78‑C

505c、
4ωU
4 何日C oちohL0)OHIRL++(60nmol/mouse，.
ic.
v.
)

+

SR48692(2.5μg/mouse，.
ic.
v.
)

+

"P<0.01，ーP<0.05 V$control

図9s‑ラクトテンシンの摂食抑制作用に及ぼす NT受容体アンタゴニストの影響
1(cEoqm)
一1.
03
05c
4回 doちohLOHIRL(60mg/kg.
ip.
)
SCH23390(0.3mg/kg.
ip) ‑raclopride(0.5mg/kg.
ip.
)+++ー++"P<0.01，P<0.05 V$conlrol合

図 10 s‑ラクトテンシンの摂食抑制作用に及ぼすドーパミン 01および 02受容体アンタゴニストの影響

3‑4.s‑ラクトテンシンの摂食抑制機構

s‑ラクトテンシンの摂食抑制の作用機構を種々のアンタゴニストを用いて検討した。 βラクトテンシンは、 NT2受容体に選択性を示すが、ニューロテンシン自身の摂食抑制作用は、 NT2受容体ではなく、むしろ NT1受容体を介するため、まず、 NT1受容体が関与するか検討した。意外なことに、 βラクトテンシンの摂食抑制作用は、 NT
R48692では阻害されな1受容体アンタゴ、ニストの Sかった(図 9)。さらに、 NT
R142948によっ1および NT2受容体に対する非選択的アンタゴニスト Sても、阻害されなかったことから (datanotshown)、βラクトテンシンの摂食抑制作用は、ニューロテンシン受容体以外の受容体を介しているものと考えられる。また、摂食抑制作用を有する神経伝達物質であるドーパミンの関与についても検討したところ、

s‑ラクトテンシンの摂食抑制作用は、ドーパミン D1受容体アンタゴニストの SC
H23390および D2受容体アンタゴニストの racloprideにより影響を受けなかった(図 10)。したがって、 βラクトテンシンは、ドーパミン系とは別の経路を介して摂食抑制作用を示すものと考えられる。

79‑ー4.考 察
牛乳タンパク質の酵素消化によって派生する種々の生理活性ペプチドの摂食調節作用を検討し‑ラクトアルブミンのキモトリプシン消化によって生成する βラクトテンシンが、経口たところ、 s投与で摂食抑制作用を示すことを初めて見出した。これまでに、本ペプチドは、コレステロール低下作用、胆汁酸分泌促進作用、鎮痛作用、学習促進作用および恐怖学習抑制作用を有すること

1)[
8‑11J、さらに、本研究により摂食抑制作用という新しい作用を有すを見出してきたが(図 1ることが判明した。 βラクトテンシンは、コレステロール低下作用や、胆汁酸分泌促進作用などの末梢作用に加え、学習促進作用および摂食抑制作用などの中枢作用を示すことから、消化管から吸収されたのちに、脳ー血液関門を越え、中枢神経系に作用している可能性が考えられる。さらに、脳室内投与により中枢に直接投与した場合にも、摂食抑制作用を示すことは、この仮説を支持している。
これまでに、 βラクトテンシンは、ニューロテンシン NTz受容体に親和性を示し、本ペプチドのコレステロール低下作用、鎮痛作用、および恐怖学習抑制作用は、 NTz受容体を介することを明らかにしている [9‑11J。また、 s‑ラクトテンシンは NTz受容体に選択性を示すが、 NT1受容体にも弱い親和性を示し、回腸収縮作用は NT1)。しかしな1受容体を介することが判明している(図 1T
がら、 βラクトテンシンの摂食抑制作用は NT1および Nzのいずれの受容体も介さないことが明らかとなり、摂食抑制作用に関しては、ニューロテンシン受容体以外の受容体を介しているものと考えられる。
なお、s‑ラクトテンシンによるコレステロール低下作用、鎮痛作用、学習促進作用はドーパミ

8，l1J(図11)、βラクトテンシンの摂食抑制作用は、ドーパミンを介することが判明しているが [lおよび Dz受容体アンタゴ、ニストにより阻害されなかったことから、ンDドーパミン系とは別の経路を介して摂食抑制作用を示すものと考えられる。このことは、 βラクトテンシンの摂食抑制作用が NTT1および Nz受容体を介さないという実験結果に一致する。
最近、 βラクトテンシンは、ニューロテンシン受容体以外に、アドレナリン受容体に親和性を鎮痛作用

4、恐怖学習抑制作用

コレス
テ
口ー
し 学習促進作用低下作用
図11s‑ラクトテンシンの生理作用とその作用機構
一‑80‑示すことが報告されている [12]。摂食抑制作用に加え、交感神経活性による代謝克進作用を示す可能性が考えられ、抗肥満作用が期待される。

参考文献
1.BarbaG， TroianoE， RussoP， VeneziaA， SianiA. BrJNu
甘. 2005; 93(1)
:15‑
9.Inv
erseilkconsumptioninchildren.
associationbetwee
nbodymassa
ndfrequencyo
fm
g‑
lle
‑
Tyr (RIY)deriv
edfromrapeseedproteindecreasesfoodintakeandg
astricemptyingafteroral
2. Ar
仕ationi
nmice.Peptides. 2006; 27 (9):2065‑
8.
adminis

K In
凶 A，AsakawaA，Wada，
K WadaE，Yoshikaw
aM. AlbutensinAan
dcomplement
3. O
hinata，
配 reasefoo
dintakei
nmice.Peptides. 2002;23 (1):1
27‑
33.
C3aduetsuguK，Fujiw
araY，YoshikawaM. Suppressionoffoodintakebyacomplement
4. O
hinataK，S中5]‑oryzatensin(5‑9).Peptides. 2007;28 (3):602‑
6.
C3aa
gonist[TakuradaS，YanaiK，YoshikawaM.Theanorecticeffect
5. O
hinataK，ShimanoT，YamauchiR，Seceptori
nmice.Peptides. 2004; 25(12):2135‑
8.
ofneurotensini
smediatedv
iaahistamineH1r
R UsuiH，Yunden，] TakenakaY，Tar
世F，YoshikawaM. Character
izat
ionofbeta‑
6. Yamauchi，，abioactiv
epeptidederiv
edf
ro
mbov
in
es
‑
lactoglobulin，asaneu
rotensinagonist.BioscilactotensinBiotechnolBiochem. 2003;67 (4):940‑
3.
igliore‑SamourD， SaffarL，JollesP. ImmunolLe
仕. Enhancementofp
hagocytic
7. GattegnoL， M
組 問sein.
activ
ityo
fhumanmonocytic‑
macrophagiccellsbyi
mmunostimulatin
gpeptides企omhum.
1988;18(1):27‑
318. Ohinata，
K SonodaS，InoueN，Yamauchi，
R Wada，
K YoshikawaM. s‑
Lactotensin，aneu
roten
sinov
in
es
‑
lactoglobu
lin，enhancesmemorycon
solidationi
nm
ice.Peptides.
agonistpeptidederiv
ed企omb2007; 28 (7):1470‑
4.
shikawaM，WadaK.Effectofs‑
lactotensi
nonacutestress
9. YamauchiR，WadaE，YamadaD，Yo
回rmemory. Peptides. 2006; 27 (12):3
1
76‑
82.
andfl，Ohina
匂 K，YoshikawaM.s‑
lactotensinandneurotensinrapidlyreduceserumc
holesterol
10.YamauchiR

eceptor.Peptides. 2003; 24 (12):1
955‑
61.
v
iaNT2r
11. YamauchiR，SonodaS， JinsmaaY， YoshikawaM. Antinociceptioni
nducedbys‑
lactotensin，a‑lactoglobulin，ismediatedbyNT
ndD1receptors.Lifeneurotensinagonistpeptidederived企oms
2aSci. 2003; 73(15):1917‑
23.
erAV，Proudfit田仁 GebhartGF.Neurotensin‑
producedan
tinociceptioni
ntheros仕alv
en仕omedial
12.B曲 l.2008;135(3):280‑
90.
medullaispartiallymediatedbys
pinalcordnorepinephrine.P剖n‑81‑