自然集団変異を利用した嗅覚・ラ雨翠]σ粥鈴ネ ットワークの構築―
inference of Functional Connections of Drosοla Chemoreceptor Genes
ρわ′Based on Linkage[)isequ‖ ibrim in Natural Populations(日 本遺伝学会推薦 )代表研究者

国立遺伝学研究所 高野敏行 NaJonallnstttute of GeneJcs ttosh

協同研究者

九州大学

猪股伸幸 Kyushu Universた yuK ttAKANO

Nobuyuk lnomata

Mult‖ ocus selection such as truncation selection can effectively reduce

mutation load. Many quantitative characters including complex genetic
diseases are likely to be under this type of selection;however,dlrect rneasureof selection in natural populations remains difficult,Multilocus selection withepistasis can generate linkage disequ‖ ibriurn,from which we can infer thepattern and degree of selection. Previous Drosoph‖ a studies revealed theexlstence of recombination load, which is the reduction of fitness byrecombination. Decreased fitness through recombination can occur when
there are epistatic fitness interactions: in other words, gene combinations
present in adult organisrns that have survived selection are superior to thosegenerated by recombination.丁 hus,some natural varlants are not randon∩ ly
combined in an individual but are lnstead in linkage disequilibriumo We

undertook an analysis of ‖nkage disequilibria between polymorphisms atDrο sOρ ttj′ a chemoreceptor genes, finding many significant non― random

associations and a significant excess of haplotypes composed of one frequent

and one less cornrnon a‖ ele in replacement polymorphlsms.

丁hese results

suggest that multilocus selection plays a significant role in shaping wlthin―

specles variation, particularly to reduce the frequencies of replacement
variants.We could,in turn,rnake candidate functional connections of genes
based on the linkage disequilibria generated in natural populatlons.

研究 目的
多重遺伝子解析の基盤 となる綱羅的な 「遺伝子ネ ッ トワーク」の構築 のため、自然集団中の多型的 DNA変 異間の 「連鎖不平衡解析」 とい う新たなアプ ローチの開発 ・応用が本研究の 目的である。 この方法 は 「相互作用の分子基盤 についての仮定 (直 接の接触 ・結合な ど)を 必要 としな い」点で 2ハ イブ リッ ド法
な どの分子的方法 と比 べ て決定的に優れている。ゲノムワイ ドの遺伝子ネ ッ トワークの構築法 の開発はポス トゲノム後の緊急課題である。タンパ ク質問の相互作用を検出する 2ハ イブ リッ ド法、発現解析のマイク ロアレイ等幾つかの方法が存在するが、どれ 一つ として絶対的な方法ではな く、固有の欠点・ 限界を有 している。機能破壊変異体 の表 現型解析 を骨幹 とする遺伝学的解析 も最 も重要な手法のひ とつで あるが、その最大 の障害は代理機能の存在である。例えば、 マウスや ヒ トでは約 1000の 嗅覚受容体遺伝子が見 つか っている。 これ らの受容体はそれぞれ複数の匂 い分子と結合 し、ひとつの匂 い分子 も複数の受容体 と結合すると予想 されている。 したが って嗅覚情報 はどの匂 い受容体が活性化 されたかではな く、どの組み合せの受容体が活性化 されたか によって決まっていると考え られていて、 この遺伝子相関図を構築す る方法の開発が急務 とされている。 この場合、当然、タンパ ク対タンパ クの相互作用や発現解析は役立たない。 2重 、 3重 突然変異体の作 出が必要となるが、 この組み合せの数だけで莫大な数 になる。 さらに、表 現型のタイ ビングが 「実験室の条件下」である ことも解析に重大な限界を与えている。
一方、 自然集団中には多量の遺伝的変異が存在 し、そのあ らゆる組み合せが常に「 自然淘汰のふるい」にかけられて いる。「連鎖不平衡」とは染色体上の「複数の」遺伝子座の変異の 「偏 った」組み合わせ頻度 (独 立性)を 示す指標で、もし複数の変異が独立でな いな ら、それ らの間に何 らかの 「機能的関係」がなければな らない。連鎖不平衡解析は「自然淘汰に有利・不利」とい う条件のもとで、自然集団中の対立遺伝子の組み合わせを通 して 「遺伝子の機能上の相互作用」を探索することを意味 している。 このよ うに「多型的 DNA変 異間の連鎖不平衡解
析」は 「研究者の目」や 「既存の知識」に頼 らず、「自然淘汰のふるい」によって「遺伝子間の機能相関」を網羅的 に探索するもので、全くこれまでにな い考え方・手法であ り、新たな相互作用を検出できる可能性が極めて高い。この方法の有効性をキイ ロショウジョウバエの感覚受容体遺伝子に応用することで検証 した。
研究経過
キイ ロシ ョウジ ョウバエ (D.meranο gasterlで 同定されて いる 121の 味覚 ロ
嗅覚受容体遺伝子のうち 104遺 伝子 について変異を調査 し、 300以 上のアミノ酸変化を伴 う非同義置換を含む約 1700の SNP、 挿入/欠 失変異を同定 した。 この中には 10の 遺伝子で 12の 機能喪失型と予想されるノンセンス、フレーム シフ ト変異も含まれて いた。外挿すれば個体当た り 8個 あるいはそれ以上の機能喪失型変異を持 っていると推測 される。近縁種の塩基配列を決定する ことで、祖先配列を推定 した。新 たに生 じた変異の頻度分布、同義、非同義置換 の種内、種間変異 の比較解析か ら、受容体遺伝子上 に多くの正の淘汰を受けた (有 利な )ア ミノ酸置換が種間で固定 していること、種内変異 については非同義置換の多くが弱有害である ことを示唆する証拠を得た。
こ ららの変異の うち、 98遺 伝子 に 114の ASO(allele specinc Oligo)、RFLP(restncuOn fragmentlength polymorphism)等 のタイ ビングマーカーを構築 した。秋、春 、異なる時期の 2サ ンプル、約 400個 体、 800染 色体 についてタイ ビング、連鎖不平衡解析を行 つた。 50の マーカーペア (2%)
が両 2サ ンプルで 0.5%レ ベルで有意な連鎖不平衡を示 し、15の ペ ア (0.
5%)は 多重テス トの補正を行 った O.0017%レ ベルでも有意 であった。
これ らの変異間には遺伝子間相互作用を通 した淘汰の働きが予想される。 X染色体 についてはさらに 5サ ンプル、総計約 1400染 色体 について解析を行 つた。比較的隔離されて いる沖縄、西表 のサ ンプルを用 い、異なる時期に採集 したサ ンプルの頻度変化 から、約 2200の 集団の有効な大きさの推定値 を得た。
この推定値 とマーカー間の組換え頻度か ら連鎖不平衡の期待値を推定、実際の集団には遺伝的浮動か ら期待される量の 1.2〜 1.6倍 の連鎖不平衡が存在する ことを明らかにした。
連鎖不平衡の方向は、全てのマーカーを用 いた解析では、偏 りは観察 されなか ったが、春 のサンプルでは非同義置換についてのみ有意な方向性、すな わち
稀な対 立遺伝子の組み合せハ プ ロタイプの頻度が期待値 よ り低 い方向性を見 い出 した。組合せ解析 における非独立性の欠点を補 うため、ブー トス トラップ解
析、Permutatton解 析を行 い、 100%ブ ー トス トラップ確率と、観察値以上の偏 りを生 じる PermutaJon確 率が 1.6%に 過ぎな いことを示 した。 したがって偏 った方向性は非同義置換に対する淘汰の影響を反映 したものと理解 される。 この仮説 と一致 して、同義置換間、あるいは非同義置換と同義置換 の間には方向性の偏 りは観察 されない。また、秋のサンプルでも同様 の方向性は観察されなか った。冬における集団サイズの減少は単純な瓶首効果ではなく、淘汰圧の上昇を伴 うものである ことが推論 される。
考察
自然集回は味覚・嗅覚受容体遺伝子座 に多量の変異、特 に機能喪失型変異を含んでいる こと、機能喪失型変異の頻度も 1%〜 39%と 高 いことが 明かとなった。 これ らの遺伝子も実際に、感覚受容器官 において発現が確認 されてお り、機能を完全 に喪失 しているわけではな い。弱 い淘汰が働 いていると考え られる。
例え遠 く離れた変異間でも有意な連鎖不平衡が多くの遺伝子変異の組合せで観察された。 これ までの電気泳動で分離可能な可溶性タンパ クのア ロザイム変異や遺伝子内変異の解析結果か らすれば、連鎖不平衡は距離とともに速やかに崩壊 し、1〜 2kbも 離れるとほとんど連鎖不平衡は存在 しな いと考えられ てきた。本研究の結果は この常識を見直す必要があることを強く示唆する。本研
究では、味覚 ・嗅覚受容体遺伝子群 という機能的な関連がある ことが予想される遺伝子を対象とした ことが、 これまでの解析 と一線を画 し、本研究の目的である、連鎖不平衡 によつて機能相関する遺伝子を探索することが可能である ことを支持する。有意な連鎖不平衡は嗅覚受容体遺伝子間、味覚受容体遺伝子間だけでな く、嗅覚受容体 一味覚受容体遺伝子間でも検出された。嗅覚、味覚受容体の分類 はアミノ酸配列のホモ ロジー に基づいたもので、必ず しも機能を反映 しているわけではな い。事実、幼虫においては嗅覚受容体遺伝子の多くは発現 していない。本研究の結果は、 これまでの嗅覚、味覚の分類を支持せず、化学受容体 として統一 し、分類の再考 を促す ものである。
多遺伝子の関与す るいわゆる 複雑な疾患"な どにおいては、閾値をもって表現型が現れると考え られて いる。 しか し、こうした 多因子淘汰が 自然界 において実際に遺伝子 レベルで働 いていることを示す証拠はほとんど得 られていない。本研究が示 した連鎖不平衡の偏 つた方向性は、ある閾値をもったせつ頭型淘汰が非同義置換間に働 いていること示すものである。 これは連鎖不平衡解析が弱い淘汰の多因子効果 を検 出可能であることを示すもので、機能相関を探索する方法 として有用である ことを強 く支持する。今後、シ ョウジョウバエ を含む様 々な生物種での幅広 い遺伝子 への応用が待たれる。
研究発表
口頭発表
河 邊 昭 、 高 野 敏 行 ;「 キ イ ロ シ ョウ ジ ョウバ エ の 味 覚 口嗅 覚 レセ プ ター 遺 伝 子 群 の DNA変 異 」、 日本 遺 伝 学 会 (福 岡、 2002)
2.

丁oshiyuki‐ Takano― Shirnizu:ヽ Genome― wide analysis on
recombination load″ フ丁he 2nd」 apan― Korea Symposiun∩ :丁 owards theAssociation of Drosoph‖ a Research Cornrnunities(丁 okyO,2003)

3.高 野敏 行 、河 邊 昭、猪股伸 幸 、難 波紀 子 、近藤 るみ 、伊藤雅信 、井上寛 ;「 遺伝 的組 換え荷 重 のゲ ノム ワイ ド解 析」 日本進化 学会 (福 岡、2003)

4.難 波紀 子 、伊 藤雅信 、猪股 伸 幸、近藤 るみ 、河 邊 昭、井上 寛 、高野敏行 ;「 シ ョウジ ョウバ エ の X連 鎖 味覚 ・ 嗅覚 レセ プタ ー 遺伝 子 の連鎖

不 平 衡 解 析 」、 日本 遺 伝 学 会 (福 岡 、 2003)

5.

丁oshiyuki‐ Takano― Shirnizu;ヽ Genome― wide analysis on
recombination loadi Linkage disequilibriurn revisited〃,international

Symposiurn on Endo― Symbiosis and Molecular Evolution in lnsects(lbaragi,2003)
6.

丁oshiyuki ttakano― Shirnizu,Akira Kawabe,Masanobu ltoh,Nobuyukilnomata,Noriko Nanba,Rurni Kondo,and Yutaka lnoue;｀ Linkage
disequ‖ ibriun∩ revisited″ ,丁 he Mishirna VVorkshop on｀ 丁he pOst―

genome studies of genetic diversity and evolution of organisrnic
populations″

7.

(ShizuOka,2003)

丁oshiyuki ttakano― Shirnizu,Akira Kawabe,Nobuyukilnomata,NorikoNanba,Rurni Kondo,Yutaka lnoue,and Masanobu ltoh;̀̀Linkage
disequilibria between polymorphisms at Drosoph‖ a chemoreceptorgenes'',45th Annual Drosoph‖ a Research Conference(Washington,DC,2004)
誌上発表

1.

丁oshiyuki丁 akano― Shirnizu,Akira Kawabe,Nobuyukilnomata,NorikoNanba,Runni Kondo,Yutaka lnoue,and Masanobu ltoh;｀ lnter― locus
lanonrandorn association of polymorphisms in Drosο ρわ′chemoreceptor genes″ (subrnitted).