脳内の概⽇リズムの司令塔は低温で停⽌し､再加温により時刻がリセットして再開することを発⾒ー⻑年の謎であった冬眠時の概⽇リズムのメカニズムの理解に貢献ー
⾃然科学研究機構 ⽣命創成探究センター (ExCELLS) / ⽣理学研究所の榎⽊亮介准教授､根本知⼰教授らの研究グループは、名古屋⼤学トランスフォーマティブ⽣命分⼦研究所（WPI-ITbM）の⾦尚宏特任講師､北海道⼤学低温科学研究所の⼭⼝良⽂教授らとの共同研究で、脳にある約 24 時間リズム（概⽇リズム）の司令塔である神経細胞の集団は､低温にさらされるとリズムを刻むのを停⽌し､再び温めると時刻がリセットしてリズムを再開することを⾒いだしました｡またこのリズムの停⽌と再開のしくみには､細胞内にあるカルシウムイオンが重要であることも分かりました｡
私たちの⾝体を構成する細胞や臓器は約 24 時間のリズム持っており、⼼と体の健康に重要です。その 24 時間のリズムを制御しているのは､概⽇リズム中枢と呼ばれる脳の深部の視交叉上核(しこうさじょうかく)という部分の神経細胞の集団の活動であることが知られています｡今回、その概⽇リズム中枢が時を刻む様⼦を､温度を変えながら⻑期間に渡ってリアルタイムに観察することに成功しました。この研究結果は､哺乳類の冬眠に⾒られるような極端な低体温の状態ではリズムは停⽌すること､冬眠が終了すると時刻がリセットされてリズムが再開することを⽰唆しています｡この発⾒は､⻑年の謎である冬眠のメカニズムの理解に貢献するものと期待されます。
本研究成果は、国際科学雑誌 「iScience」 (2023 年 11 ⽉ 3 ⽇付) に掲載されました。

発表のポイント1.

哺乳類の概⽇リズム中枢の神経細胞は､15℃付近の低温ではリズムが停⽌し､35℃付近の温度に戻すと時刻がリセットして再開することを発⾒。

2.

概⽇リズムの停⽌とリセットの仕組みには､細胞内のカルシウムイオンが重要であることが明らかに。

3.

哺乳類の冬眠のような極端な低体温では概⽇リズムは停⽌し､冬眠が終了した後には新たな時刻から再開することを⽰唆｡

4.

研究結果は､⻑年謎であった哺乳類の冬眠時の概⽇リズムのメカニズムに関する基礎科学的な価値を持つものであり､冬眠という不思議な⽣命現象の全容解明への重要な⼀歩であると期待。

研究のイメージイラスト
ネズミたちがアリスの "狂ったお茶会 "でテーブルを囲んで座っており､ネズミたちはそれぞれ時計を持っている。テーブル
奥側の寒い冬の季節にいるネズミたちは、冷たいお茶を出されているが眠っており､時計は⽌まっている｡⼀⽅、テーブル⼿前の暖かい春の季節になったネズミたちは､⽬を覚まして暖かいお茶を飲んでおり､同じ時刻で時計が動いている｡イラストは株式会社スペースタイム･中村景⼦､SOFA GRAPHIC DESIGN･安達浩之の協同制作｡

背景
地球上のほぼ全ての⽣物は､約 24 時間の時を刻む｢概⽇リズム｣*1 の機能をもっており､昼夜の明暗サイクルや温度変化などの環境変化を予測し､特定の時刻に⽣理機能が最⼤になるようにするなど､⾃⾝の⽣存を有利にしています｡私たち哺乳類では､概⽇リズムは全⾝ほぼすべての細胞で観察され､細胞レベルでの概⽇リズムの分⼦メカニズムは｢時計遺伝⼦｣*2 の転写と翻訳によるフィードバックループにあると考えられています｡哺乳類の概⽇リズムの中枢は､脳の深部に位置する｢視交叉上核(しこうさじょうかく)｣*3 と呼ばれる部位に局在しており､睡眠覚醒サイクルや体温リズム､ホルモン分泌など､全⾝のあらゆる⽣理機能の概⽇リズムを調節しています(図１)｡概⽇リズムは､⾃律振動性(⾃ら時を刻む)､同調性(周囲の環境に合わせる)､温度補償性(温度が変わってもリズム周期が変わらない)の 3 つの要素を持つことが不可⽋であると考えられています｡
哺乳類は体温を恒常的に保つ｢恒温動物｣であり、体温を 37℃前後の⾮常に狭い範囲に維持し､わずか数度の体温変化でも⽣理機能が影響を受け､低体温が⻑く続くと不可逆的な細胞損傷を受けます。しかし冬季のように⾷物が不⾜する過酷な環境では､⼀部の哺乳類は｢冬眠｣という状態に⼊り､⾃⾝の熱産⽣や代謝を抑制した｢低体温低代謝状態｣になり､体温が環境温度の付近まで低下します｡冬眠中の体温が極端に低下した動物において､温度補償性の機能をもつ概⽇リズム中枢のリズムが継続しているのかという素朴な科学的な疑問に関しては､過去数⼗年にわたり多くの研究が⾏われてきましたが､いまだ決着がついていませんでした｡これまでの研究では､⽣きた細胞や組織から⻑期的に概⽇リズムを計測することが技術的に難しかったこと､また概⽇リズムの存在を判断するために｢時計遺伝⼦の発現を計測すれば⼗分なのか?｣という根本的な問題がありました｡時計遺伝⼦は概⽇リズムの主要な構成要素であることは間違いないものの､時計遺伝⼦を⽋損した細胞や組織でもリズムが観察されることも報告されており､時計遺伝⼦以外にも時を刻むメカニズムがある可能性も指摘されてきました｡

図 1. 概⽇リズム中枢の視交叉上核
マウス脳の断⾯図(⽮状断､冠状断)と視交叉上核の位置を⽰している｡
視交叉上核は脳深部の視床下部領域にある⼀対の神経核であり､約 2 万個の神経細胞から構成されている｡

本研究の内容
榎⽊らの研究グループはこれまで､⽣きたまま細胞の機能を観察できる光イメージング技術を駆使して､数⽇~週レベルの⻑い期間観察することで､概⽇リズム中枢である視交叉上核の単⼀神経細胞~神経回路でのリズム発振メカニズ
ムを研究してきました｡本研究では､さまざまな温度で概⽇リズムの光イメージング計測を⾏うため､タイムラプス顕微鏡システムを温度制御チャンバー内に設置し､マウスおよびハムスターの視交叉上核の時計遺伝⼦の転写リズムと細胞内カルシウムの概⽇リズムを同時かつ⻑期間計測し､視交叉上核の低温特性を詳しく解析しました（図２および図３）｡
その結果､視交叉上核の時計遺伝⼦の転写と細胞内カルシウムの概⽇リズムは､22℃~35℃の温度帯域ではリズムを刻み続けるものの（図４A）､15℃程度の低温にさらされると停⽌してリズムが⾒られなくなることを⾒いだしました（図４B）｡また予想しなかったことに､15℃の低温から 35℃付近の温度に戻すと､両⽅の概⽇リズムの時刻がリセットされ再度時を刻み始めることが分かりました（図４B）｡さらに詳しくデータを解析した結果､15℃では細胞内カルシウム濃度が上昇した状態でリズムが停⽌していること（図５）､また復温後には概⽇カルシウムリズムが速やかに安定なリズムを回復するのに対し､時計遺伝⼦の転写リズムは数⽇かけて次第に概⽇カルシウムリズムに追随するようにリズムが回復することを⾒いだしました（図 6）｡この結果は､細胞内カルシウムリズムが時計遺伝⼦の転写リズムを制御していることを⽰しており､時計遺伝⼦の転写のみならず細胞内カルシウムも重要であることを⽰しています｡

図 2. 研究⽅法の概要
A. 温度制御チャンバー内に構築した顕微鏡システム｡チャンバーの外から顕微鏡を⾃在に操作できる｡
B. チャンバー内の顕微鏡システム｡CCD カメラ､LED 光源､XYZ ステージ､培養装置､防振台などから構成される｡
C. 視交叉上核の培養法｡ 培養メンブレン上に組織切⽚を静置し､酸素透過フィルムでディッシュを密閉する｡
培養液が温度変化により蒸発しないようミネラルオイルを培養液上に添加している｡
D. 視交叉上核の組織切⽚への遺伝⼦導⼊法｡アデノ随伴ウイルス⽤い､カルシウムセンサー､および､時計遺伝⼦プロモーター下に蛍光タンパク質を発現する遺伝⼦配列を､神経細胞に発現させる｡

図 3.視交叉上核に発現するカルシウムセンサーと蛍光タンパク質の空間分布
A. CCD 撮影画像。組織全体にカルシウムセンサーおよび蛍光タンパクの発現を確認｡点線枠線は視交叉上核の位置を⽰す｡
B. ⾼解像-⾼倍率画像｡カルシウムセンサーおよび蛍光タンパクは細胞内の細胞質-核内に発現している｡

図 4. 時計遺伝⼦の転写(緑)と細胞内カルシウムイオン濃度(⾚)の概⽇リズム
A. 35℃で 12 ⽇間測定した概⽇リズムのデータ｡ほぼ逆位相(約 12 時間のタイミングのずれ)で両者のリズムが安定して継続している｡
B. 35℃で 4 ⽇間計測後､15℃の低温に暴露するとリズムが停⽌した｡再び 35℃に加温するとリズムが再開する｡

図 5. 低温に暴露した概⽇カルシウムリズム
35℃で概⽇カルシウムリズムを計測した後､15℃の低温を 4 ⽇間暴露し､その後 35℃に再び加温した｡概⽇カルシウ
ムリズムは低温に晒されると､カルシウム濃度が上昇してリズムが停⽌した(⻘レース)｡⼀⽅で､通して 35℃で計測した
際はリズムが継続した（⾚レース）｡

図 6. 概⽇カルシウムリズムと時計遺伝⼦の転写リズムのピーク位相の経時変化
縦軸は⽇数､横軸はリズムの⽇内でのピーク位相(タイミング)を⽰している｡低温暴露前は､視交叉上核のリズムは様々な位相でリズムを刻んでいる｡低温暴露後に 35℃復温すると､全ての視交叉上核のカルシウムリズムは同じ位相から再開する(左)｡⼀⽅で､時計遺伝⼦の転写リズムは復温後でも位相が揃っていないが､数⽇間徐々にカルシウムリズムとの位相関係を回復し､同様の位相に集約してゆく（右）｡本研究の発⾒の意義
本研究結果は､⻑年の謎であった｢冬眠時に概⽇リズム中枢のリズムが継続するか停⽌するか?｣という素朴な科学的な疑問に対しての解答を⽰すものです｡また概⽇リズムの分⼦メカニズムにおいて､時計遺伝⼦のみならず､細胞内カルシウムイオンの概⽇リズムも重要な役割を果たしていることを⽰しており､概⽇リズムおよび冬眠の研究分野における｢基礎⽣物学的な価値｣を有するものです｡さらに本研究は､極限環境を⽣き抜くための⽣存戦略である｢哺乳類冬眠｣のメカニズムを探究することを通じて､｢⽣命とは何か｣という命題に挑むものです｡

今後の研究の展望
本研究で開発した低温環境での細胞機能の光イメージング解析は､今後の冬眠の⽣理機能の研究に貢献する基盤技術となると考えられ､この⽅法を⽤いることで冬眠研究がさらに進むことが期待されます｡⼀⽅で､本研究で細胞~組織レベルでの概⽇リズムの低温特性が明らかになったものの､冬眠動物の脳内で同様の現象が起きているかは不明であり､今後さらに研究を進める必要があります｡概⽇リズム以外にも哺乳類の冬眠のメカニズムは未だ多くが解明されておらず､21 世紀に残された⼤きな研究のフロンティアの 1 つです｡冬眠のメカニズムを探究することで､これまで極めて狭い範囲の温度範囲でしか理解されてこなかった⽣理機能の理解が拡張され､これまで⾒過ごされてきた機能が明らかになることが期待されます｡(⽤語説明)*1 概⽇リズム
地球上のあらゆる⽣物が持つ約 24 時間周期の⽣体リズム。体内時計、⽣物時計ともいう。
*2 時計遺伝⼦
体内時計のリズム作りだしている遺伝⼦。細胞内の時計遺伝⼦の発現と、遺伝⼦から作られるタンパク質の合成とその分解のサイクルによって概⽇リズムが⽣成される。2017 年には時計遺伝⼦の同定に関わった 3 名の研究者にノーベル賞が授与された｡*3 視交叉上核(しこうさじょうかく)
哺乳類の概⽇リズムの中枢として役割を担っている脳領域。網膜からの外界の光情報を受け、視交叉上核で作り出された概⽇リズム情報を全⾝に送り出している。
研究サポート本研究 は、学術変 ⾰領 域 B｢冬眠 ⽣物学｣ およ び学術 変⾰ 領域 A｢冬 眠⽣物 学 2.0｣(20H05769,23H04943, 榎⽊亮介､⾦尚宏､⼭⼝良⽂)、科学研究費補助⾦(20H05769, 20H03425, 22K19319,23H04943, 榎⽊亮介; 20H05669, 20H00523, 根本知⼰; 20H05766, 23H04939, 23H04940, ⼭⼝良⽂)、ExCELLS 計画研究(21-205; 榎⽊亮介) 等の⽀援を受けて実施されました。
掲載論⽂
雑誌名: iScience
論⽂名: Cold-induced Suspension and Resetting of Ca2+ and Transcriptional Rhythms in the
Suprachiasmatic Nucleus Neurons
著者: 榎⽊亮介*, ⾦尚宏, 清⽔貴美⼦, ⼩林憲太, 廣蒼太, 張菁圃, 中根達⼈, ⽯井宏和, 坂本丞, ⼭
⼝良⽂, 根本知⼰ (*責任著者)
DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.108390
掲載 URL: https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(23)02467-7