牛乳のフラビンの組成に関する研究
一牛乳のフラビン誘導体の簡易定量法の確立ー

宇都宮大学農学部教授

菅野長右エ門平 成 3年度で確立した牛乳のフラピン誘導体の簡易定量法は次の通りである。牛乳、透析牛乳あるいは乳脂肪球皮膜 (MFGM) の1.0gを 3分間煮沸し、水道水で冷却後、プロナーゼを試料蛋白質の 1/50量を加え、 45'Cで 1時間インキュベートし、その量を最終的に 2.0gに 10mMNaH，PO. (pH5.
5) で調整し、遠心分離Cl2，000Xg、 10分〕後その上清をろ過し (0.45μm)、これの 100μEを高速液体クロマトグラフィー(HPLC、 SP‑8700) に注入し、分離定量した。 C18逆相カラム (4.
6X250mm、 5μ0'Cで、 90%メタノーノレ水溶液の 35%から 95%までと 10mMm) を用い、溶出は、 4NaH，PO，(pH5.
5) の 65%から 5 %まで、の直線勾配で行った。流速は 0.8mZ/minで、、蛍光波長 520口mで羽u定した。
溶出益の蛍光強度は励起波長 462nm

HPLCにおいて、フラビンアデニンヌクレオチド (FAD) は 4.
34分に、フラピンモノヌクレオチド (FMN) は 5.
65分に、リボフラピン (RF) は 8.
13分 に 溶 出 さ れ ( 図1)、その蛍光は測定範囲内で直線であった(図 2)。
牛乳を試料とした時の FAD、FMN、RFの回収率はいずれも 97‑99%であり、遊離フラピンを除去した透析乳でも日 5‑100%、またフヲピンに富む MFGMでも 99‑100%であった。方法の再現性 (SD/XX100) はいずれも 5 %以下であり、その HPLCにおける感度は FADで 5pmol、 FMNと RFでは 2pmolであった。
本研究の特徴は、

1) 牛 乳 か ら の フ ヲ ピ ン の 抽 出 は 、 プ ロ テ ア ー ゼ 消 化 に よ っ て 除 タ ン パ ク と 同 時 に行ったロすなわちトリプジンよりもプロナーゼの方が、またプロナーゼでも試料タ
ンパク質の 1/100量よりも 1/50量の方が短時間c1時間〕で乳タンパク質を消化することができ、しかもフラピンの抽出率が勝っていた〔図 3および表1)。

2) FADを FMNに変換するピロホスファターゼおよび FMNを RFに 変 換 す る ホ ス
ファターゼを失活させるためには、阻害剤として EDTAを用いるよりも加熱するこ151ーとが最適であった。 MFGMのピロホスファターゼを失活させるには 3分 間 の 煮 沸が必要であった。他方、煮沸によるフラピンの分解等は HPLCで分析した限りでは認められなかった。ピロホスファターゼを失活させない試料での FADの回収率は低く、逆に RFのそれが高い値を示した〔表 2)。

3) HPLCでの RF、 FMN、FADの分離は、シリコンポリマーをコートした C18
逆栢カラムおよび 90%メタノノレ水溶液と 10mMNaH，PO，(pH5.
5) との溶出により、上記のように、 3フヲピンを分離することができ(図 1)、しかも高い回収率を示した〔表 3)。
本方法によって定量された牛乳中のフヲビン含量は、 FADが 49.
0土 14.
8、 FMNが9.
1土O回目、 RFが 144.
2土22.7μg/100g (n=6)であった。また重量比はそれぞれし
24.
2土 7.
3、 4.
5:
t0.5、 71.3土 11.2%であった〔表 4)。
本 方 法 で 定 量 さ れ た RF含量は、これまでに HPLCで測定された牛乳の RF含量、119土 9 (Ashooretal.
)、 128土 5 (Ashooretal.
)、 142 030‑155、 Ribarovaetal.)、および 150(Johnsoneta.
l)μg/100gと近似していた。しかし、 3フラビンの分離定量を報告している R
oughead& McCormickの RF含量は 54‑64μg/100gで、全フラピンの 35‑61%にすぎず、その他に、 FADが 23‑46%、 10ー (2'‑hydroxyethyJ)flavinが 11ー 19%、マイナーな成分が含まれている。本方法と顕著に異なる点は、Roughead& McCormickの方法では、 FMNが検出されず、 10ー (2'‑hydroxyethyl)flav
i口が常在していることである。
次年度では、 Roughead& McCormickの方法に従ってフラビンの定量を行い、これを本方法と比較し、さらに 10ー (2'‑hydroxyethyl)flav
inが出現する要因について検討することを計画している。

﹁lD

釘︐︒

表 1.プロナ ゼおよびトリプシンで消化した乳脂肪球皮膜 (MFGM)および透析乳から遊離された全フラピン量

Enzyme Incubation
Djalyzed milk
MFGMーー』ー』一一一句一一‑‑‑‑‑‑‑‑ー‑‑‑ーーーー司自問ーーー‑
at45・C
FlavinRatio
FlavinRatio(min)(ng/g(%)(ng/g(%)
milk)
sample)RFTotalー‑‑‑‑‑‑‑‑‑.flavinμg/g) (克μg/g)
0.64
0.39
0.39
0.38
0.39

4.91
4.88
5.08
4.90
5.00

HeatingFAD
FトlN
一一一一一一ーーー
time( m i n ) μ g / g ) (%)μg/g) (克

13.1
7.9
7.7
7.7
7.8
83.3
57.4
52.7
53.5
53.4
4.09
2.80
2.68
2.62
2.64
3.7
34.7
39.8
39.1
39.8
0.18
1.6日
2.02
1.92
1.97
0.5
135
10100
106.1土8.9

114.0士5.4
107.4土8.3

116.9~0.9

3912
4151
5061
4459
4203
100105.0土8.0
113.4士6.0
113.5士7.8
土5.4
112.9
21222324024123990240306090

Diastase
TrypsinPronase

試料タンパク質に対するトリプシンの量は、透析乳では 1/7、 MFG
Mでは 1/4で、プロナ ゼの場合には両者とも1/50であった。プロテアーゼ消化物からの抽出
PLCで分析され、 FADとFM
Nは RFに補正され、ジアスタ ゼ逗てー測定された
物は H
FG
Hのタンパク質含量は 9.
4mg/皿Uであった。ま
全フラビン量と比較された。 H
た表中の数値は平均値士 SD (nニ3)で示されている o

表 2. ~L 脂肪球皮膜(トlFGM) の 37 ラビンの組成に及ぼす加熱処埋の影響
7.53 rngの タ ン パ ケ 質 を 含 む I m
Lの MFGMが 一 定 時 間 煮 沸 し 、 冷 却 し 、 室 温 に
30分 間 放 置 後 、 プ ロ 7 ー ゼ で 消 化 し た の 試 料 タ ン パ ク 質 に 対 す る プ ロ ナ ゼ の量は 1/50で あ っ た 。 各 フ ラ ビ ン は H
PL
Cで 測 定 さ れ 、 結 果 は 全 フ ラ ビ ン に 対 す る比で示されている。

﹄

bu‑Y一一 v
d 句一一一ut‑‑‑‑‑di 一 一 一 ‑‑01)一426‑521‑472B
一E 1 % 一 ‑ ‑ ‑ ‑ ‑ 一 ‑ ‑ 一一p b (一555‑245‑444‑e'l 一 日 一 一‑Re‑‑一一ーと一一町一一け町
1‑‑P一一一﹀
2し司一
m421‑582 一明 5一2‑0‑6‑‑‑‑‑‑‑一日 !
加一 r
一555‑245 一4 4 4 ‑ ui
一一品一[︑一土士土偏土+一士‑土全士一豊主

E‑eき‑V)

向に% 4 5 2 一0 7 3 ‑ 4 2 2 4 Z I‑‑‑CO(‑‑‑‑‑一・句偏値
H‑e‑779‑50?129 一 ;m u ‑ R ‑ 9 9 9 ‑ 9 0 9 F 0 0 9 一 様 刊 現ao
1 一1 1 一棚田る

M一一一
町一一一一一的でい・日﹄︻﹄

裂mi;zn

切一﹃一日一一‑一一﹃1 6 9 7 1 6 日宣0対0聞
8てhM
一 ↑ 0 3 6 ‑ 3 m 8 3 1 4 相附れE 一一n ‑ ‑ 1 1 ‑2‑tf
71d 一 一 士 士 士 一 土 士 士 一1
土 全 士 一 住 ︒ 4C
聞一 682‑419‑820‑ 性た示
M
制 一 vn 一
時 一 um 一防白河一幻 H 同 一 幻 同 日 一 現 し で理一 Ff;2;‑44
一T‑a一一一一M
一e一 一 一 一 ︒ 煮 の判一
H 一一一一るにり
は一回一一一一い桂た
同 一 m d四 一 一 一 一 て 析 当削一町由一回日目一日日間一臼四月一れ遺憾
日:id‑219 7一2651‑ さは置
1 一示乳懸一一
制 一 F a M一1
I一唱一一一一で析刷
r一一一一町透肝︑ハ一M一 e 一一一一=rwu'‑n1 一721‑917‑765一‑uott
11 ︿n r ‑ k u q L 1 一︒ ORd 一︒
︐ u a q ‑ ‑ t x u A百論一回開二+一+一札一一土土士一士士士一一1 s 一
一 699‑757 一674‑の回一 F ‑ ‑ 6 6 2 一2 6 8 ‑ 2 2 0 一士て置
で の 一 山 一 一 6 1 M 一5
一日目 Z 一置しク
一均示パ
法ン
平てン
方ピ ‑n
一
一一一一はしタ1
本ラ 7一V一一一‑瞳とのフ ‑a
一D N 一D N ‑ D N ‑ ‑ E L
AMF‑ 艶O M‑‑
A M F 一AMF‑F3a
圏一FR‑101
F
一F F R ‑ F F Rlg
圭喜一一‑‑一j‑d一一‑一M
一一一一c‑G
一一一一
M‑M‑F一一MW
一 nu‑MH‑qurD

表 4. 全 乳 (WM)お よ び 乳 脂 肪 球 皮 膜 (MfGM)の フ ラ ビ ン の 濃 度 お よ び そ の 組 成 n
数値は平均値士 S
D (n二日)で示きれている。

Flavinμg/100 g
mllk

Weight 克

nmol/l00 g
milk

mol 克

Relative%)
SD (FADFMN
RF

49.0+14.8
9.1+0.9
144.2+22.7

Whole Milk
24.2+ 7.3
62.4+18.8
4.5+ 0.5
20.0+ 2.0
71.3+11.2
383.2+60.3

13.8+5.0
4.3+0.6.9+5.48130.1
10.0
15.7

FADFMNRF

672.6+290.0
350.1+ 81.3
21.3+ 7.3

MFGM
64.4+27.8
856.2+369.5
33.5+ 7.8
767.2+178.2
2.1+ 0.7
56.5+ 19.4

49.3+8.0
47.2+7.3
3.4+0.9

43.2
23.2
34.2

A

B

EhzωZ@ 担EE@OZOO句@﹄02EhL

ιa~

10 0
10 0
Retentlon t
1me (mln)

A10

図 1. 7 ラピン標準品 (A) 、全~L(B)、事L 脂肪球皮膜 (C)7 ラピンの逆相力ラムにおける HPL
Cのクロマトグラムの(A) フラピン標準品川 T~16 にお付る FIO ， 107.8 pmol;FMN，66.
8pmol;RF.
22.
0pmol)、 (B)全事Lフラピン I
ITo64における FI
O，15.
3pmol;FH
N:11.0pmo1;RF，229.
4pmo1)、 IC)乳脂肪球皮膜 7ラピン (ATo32にお付る F
AD，133.
6pmo1;FM
N，103.
8pmol;RF，"5:jj'pmon:'A
T，感度。

日出ー

(?OFFMN

Hv

国@﹄岡高帽@且o50

75100間一示Hl)を

ベ州市崎川{クfpE'hHω附一︒
fFf線蛍ν闘の打叫
車 ンi ︒
た由‑フ叫つ標ビ

貯7 4あびたの吋でω
Hよれmおさ =1聞出)υ
F溶 叫 府D ︑P OHれ(肘るさ町ーす入二積ン帰印

対注は刊
にが式刷

面ピ回D‑7る ;ケラ︒Hν

ピ積い幻の各て4hfι

光のれ
蛍4さM

図が川悼す

2 M積4 ︒

E

25

Amountofflavins (pmol)

0.
6

C

D
D

こ0.4
6o"
'c0.
2zO20.
1』o〈。01。

0123

2312122

D

一MmIncubation tlme (h)図 3. 45"Cにおける透析乳および乳脂肪球皮膜{挿入図)白プロテアーゼ消化における時間の効果。
立 1:5010‑0)お よ び 1:100
試料タンパケ債に対するプロテア ゼの比率 lI.‑.Jで ト リ ブ シ ン の 場 合 は 1:7 I企 企)である。

3﹁51