＜微生物等による化学物質の分解度試験＞
Ⅰ

適用範囲
ここでは、微生物等による化学物質の分解度試験の標準となるべき方法について規定する。

Ⅱ

用語
この試験法において使用する用語は、日本工業規格（以下「JIS」という。
）において使用する用語の例による。

Ⅲ

活性汚泥の調製

１

汚泥採集場所
全国的な地域分布を考慮の上、多種類の化学物質が消費、廃棄されるとみられる場所を中心に全国十カ所以上とする。

２

汚泥採集回数
年間４～６回とする。

３

汚泥採集方法３－１ 都市下水 下水処理場の返送汚泥 1L
３－２ 河川、湖沼又は海 表層水 1L 及び大気と接触している波打際の表土 1L

４

調製
各所から集めた汚泥を一つの容器内で混合かくはんして静置したのち浮んだ異物を除去し、上澄液を No.2 ろ紙を用いてろ過する。ろ液の pH を水酸化ナトリウム又はりん酸で 7.0±1.0に調整し、培養槽に移してばっ気する。

５

培養
４によって得られた液のばっ気を約 30 分間止めたのち、全量の約 3 分の 1 量の上澄液を除去し、これと等量の 0.1％合成下水（注１）を加えて再びばっ気する。この操作を毎日１回繰り返す。培養温度は、25±2℃とする。
（注 1）0.1％合成下水
グルコース、ペプトン、りん酸二水素一カリウムおのおの 1ｇを水 1L に溶解し、水酸化ナト
リウムで pH を 7.0±1.0 に調整したもの

６

管理
培養段階での管理は、次の項目を点検し、所要の調製を行う。
６－１ 上澄液の外観 活性汚泥の上澄液は透明であること。
６－２ 活性汚泥の沈でん性 フロックが大きく、沈でん性がすぐれていること。
６－３

活性汚泥の生成状態

フロックの増加が認められない場合には 0.1％合成下水の添加

量又は添加回数を増やすこと。
６－４ pH 上澄液の pH は、7.0±1.0 であること。
６－５ 温度 活性汚泥の培養温度は、25±2℃であること。

６－６ 通気量

上澄液と合成下水を交換する時点において、培養槽内の液中溶存酸素濃度が少なくとも 5mg/L 以上となるように十分通気すること。
６－７

活性汚泥の生物相

活性汚泥を顕微鏡（100～400 倍）で観察したとき、雲状のフロックとともに種々の原生動物が多数見られること。
７

新旧活性汚泥の混合
新旧活性汚泥の均一性を保つため、現に試験に供している活性汚泥の上澄液のろ液と新たに採集してきた汚泥の上澄液のろ液との等量を混合し、培養する。

８

活性汚泥の活性度の点検
標準物質を用いて少なくとも 3 ヶ月に 1 回定期的に活性度を点検する。試験法はⅣに準ずる。特に、新旧活性汚泥を混合したときは、旧活性汚泥との関連性に留意する。
［活性汚泥の調製と使用期間の例（年間６回採集の場合）］
1 月 2 月 3 月
使用期間
培養
3 月 4 月 5 月
混合 使用期間
培養
5 月 6 月 7 月
混合 使用期間
培養
7 月 8 月 9 月
混合 使用期間
培養
9 月 10 月 11 月
混合 使用期間
培養
11 月 12 月 1 月
混合

使用期間

培養
以下同じ

Ⅳ

試験方法

１

分解度試験装置
閉鎖系酸素消費量測定装置

２

基礎培養基
JIS K0102-2008 の 21 で定められた組成のＡ液、Ｂ液、Ｃ液及びＤ液それぞれ３ml に水を加えて 1L とする。

３

被験物質の添加及び試験の準備
次の試験容器（各 300ml）を準備し、これらを試験温度に調整する。なお、被験物質が水に試験濃度まで溶解しない場合は、可能な限り微粉砕したものを用い、溶媒や乳化剤は使用しない。
３－１ 水に被験物質が 100mg/L となるように添加したものを入れた試験容器 1 個
３－２

基礎培養基に被験物質が 100mg/L となるように添加したものを入れた試験容器

3

基礎培養基にアニリンが 100mg/L となるように添加したものを入れた試験容器

1

個
３－３
個
３－４ 基礎培養基のみを入れた試験容器 1 個
４活性汚泥の接種３－２、３－３及び３－４の試験容器に JIS K0102-2008 の 14.1 で定められた懸濁物質濃度が 30mg/L になるように活性汚泥を接種する。ただし、３－２については必要な場合には接種の前に溶液の pH を 7.0 に調整する。なお、活性汚泥は合成下水を添加してから 18～24 時
間後のものを使用する。

５

分解度試験の実施
遮光した条件のもとで 25±1℃で十分かきまぜながら一定期間（注２）培養し、酸素消費量の変化を経時的に測定する。
一定期間培養した後、残留する被験物質と変化物を分析に供し、その量を測定する。被験物
質が水に溶解する場合は、溶存有機炭素の残存量も測定する。また、試験液の pH を測定する。
（注 2）通常は 28 日間とする。

６

試験結果の算出方法
６－１ 試験条件の確認
試験終了時の被験物質の分解度の最大値と最小値の差が 20％未満であり、酸素消費量から求めたⅣの３－３のアニリンの分解度が 7 日後に 40%を超えかつ 14 日後に 65％を超えるときは、この試験は有効とする。
６－２ 酸素消費量から分解度（％）を算出する方法
BOD－B
×100

分解度（％）＝
TOD（注 3）

BOD：被験物質の生物化学的酸素消費量（測定値）（mg）

B：基礎培養基に活性汚泥を接種したものの酸素消費量（測定値）（mg）
TOD：被験物質が完全に酸化された場合に必要とされる理論的酸素消費量（計測値）（mg）（注 3）窒素を含む被験物質が分解した場合、硝化の程度に応じた TOD を算出する。

６－３ 直接定量（注４）から分解度（％）を算出する方法
SＢ－SＡ
×100

分解度（％）＝
SＢ

SＡ：分解度試験終了後の被験物質の残留量（測定値）（mg）
SＢ：水に被験物質のみを添加した空試験における被験物質の残留量（測定値）（mg）（注 4）直接定量による化学分析法①

全有機炭素分析計を用いる場合
試験容器から試験液を適当量分取し、これを約 40,000m/s2 で 15 分間遠心分離又はろ過（0.45μm）し、その上澄液又はろ液から適当量を分取して全有機炭素分析計により残存する溶存有機炭素を定量する。

②

その他の分析計を用いる場合
試験容器内の内容物を被験物質等に適した溶剤により抽出、濃縮等適切な前処理を行った後分析機器等による定量分析を行う。この場合、原則として JIS に規定された分析法通則（ガスクロマトグラフ分析法、吸光光度分析法、質量分析法、原子吸光分析法等）に従い分析を行う。

Ⅴ

結果のまとめ
試験の結果を様式１によりまとめ、最終報告書を添付するものとする。

＜魚介類の体内における化学物質の濃縮度試験＞

Ⅰ：魚を用いた濃縮度試験（水暴露法）

Ⅰ－Ⅰ 適用範囲
ここでは、魚介類のうち特に水（経鰓）を介した魚類の体内における化学物質の濃縮性を評価する試験の標準となるべき方法について規定する。魚を用いた生物濃縮度試験については、原則、本試験法を用いる。

Ⅰ－Ⅱ 用語
この試験において使用する用語は、日本工業規格（以下「JIS」という。）において使用する用語の例による。

Ⅰ－Ⅲ 試験方法
１

試験の概要
本試験法は、魚類体内への水（経鰓）を介した化学物質の取込及び蓄積を評価する方法である。本試験では、化学物質が溶解した試験水に試験魚を暴露して、試験水及び試
験魚中における化学物質濃度を測定し、定常状態における生物濃縮係数（BCFSS）を算出する。また、必要に応じて、上記の取込期間に加えて、取込期間終了後の試験魚を化
学物質が含まれない試験水に移動し排泄期間を設ける。この場合には、取込・排泄の両期間を通して速度論による生物濃縮係数（BCFK）を算出することができる。

２

試験に用いる装置及び 材料

２－１ 装置及び器具
すべての装置及び材料は、溶解、吸着、あるいは浸出により試験魚に有害な影響を与えないものを用いる。試験水槽は、化学的に不活性な材料で、流量に応じた適切な容量の角型あるいは円筒形とする。テフロン、ステンレススチール又はガラス配管を使用し、軟質プラスチック配管の使用は最小限とし、やむを得ない箇所に限る。合成ピレスロイ
ド類のように高い吸着性を有する被験物質には、シラン処理ガラスが必要な場合もある。

２－２ 試験用水(１) 試験用水とは、被験物質及び溶解補助剤（溶剤及び分散剤）を含まない試験用の水である。汚染されていない水質の水源から得られる天然水、脱塩素した水道水又は人工調製水（特定の栄養素を既知量添加した脱塩素した水道水）とし、選択した魚種がじ

1/30

ゅん化及び試験期間中に異常な外観や挙動を示さずに生存できる水質でなければならない。試験用水は、少なくとも pH、硬度、全粒子状物質濃度、全有機炭素（TOC（1））
濃度を測定する。アンモニウム、亜硝酸及びアルカリ度についても測定することが望ましい。
(２) 試験期間中、試験用水の水質を一定に保つ。試験開始時の pH は 6.0 から 8.5 までの範囲とし、試験期間中の変動幅は±0.5 以内とする。試験用水が試験結果に影響（例えば、被験物質の錯体形成による影響）を与えないようにする。試験魚の活動に有害な影響を与えないことを保証するために、定期的（少なくとも試験開始時及び終了時）に試験用水を採取し、重金属類、主要なアニオン類及びカチオン類、農薬、TOC、全粒子状物質の濃度等を測定する（試験法解説参照）。試験用水の水質が一定であることが確認できれば、測定頻度を 3 か月ごとなどにしてもよい。さらに、1 年間以上にわたって一定であると示される場合は、測定頻度を 6 か月ごとなどにしてもよい。試験用
水中の TOC だけでなく天然粒子の含量も可能な限り低減する。必要に応じて、試験用
水を使用前にろ過する。また、試験魚の排泄物及び残餌による有機炭素量を可能な限り小さくする。

２－３ 試験魚

２－３－１ 魚種の選択
コイ又はメダカ（ヒメダカ）が推奨されるが、試験法解説に示す他の魚種を使用してもよい。

２－３－２ 蓄養及びじゅん化(１) 蓄養した魚群を試験水温で少なくとも 2 週間じゅん化させ、その間十分な餌を与える。
じゅん化中の水及び餌は試験に使用するものと同じ種類のものとする。48 時間の観察期間に続いて、じゅん化期間中の死亡率を記録し、以下の基準に従い試験に使用する。
7 日間で 10%を超える死亡率の場合：試験に使用しない。
7 日間で 5%から 10%の死亡率の場合：さらに 7 日間延長してじゅん化する。次の 7日間で 5%より高い死亡率になった場合には試験に使用しない。
7 日間で 5%より低い死亡率の場合：試験に使用できる。
(２) 試験に使用する魚に外観上、病気や異常がないことを確認する。病気の魚は試験に使用しない。試験開始前 2 週間あるいは試験期間中に病気などに対する処置はしない。
２－３－３ 給餌(１) じゅん化及び試験期間中は、試験魚を健康な状態に保ち、かつ、体重を一定に維持す
るため、脂質や総蛋白質含量が既知の餌を適切な量与える。給餌量は魚種、試験条件（1） 全有機炭素（TOC ）には、粒子状有機炭素（POC）及び溶存有機炭素（DOC）が含まれる（TOC = POC + DOC）。

2/30

及び餌のカロリー値を考慮して設定し、じゅん化及び試験期間中に毎日餌を与える（例えば、コイの場合は魚体重の 1-2%程度（湿重量））。給餌量は、急激な成長及び脂質含量の増加がないように設定し、各試験水槽から直近に採取した試験魚の体重から適宜、再計算する（週 1 回など）。
(２) 給餌後 30 分から 1 時間以内に、試験水槽から食べ残しの餌及び糞便を吸い上げる。
有機炭素の存在は、被験物質の生物学的利用能を制限する可能性があるため、試験期間を通して試験水槽を清掃し、有機炭素濃度を可能な限り低く保つ。

３

試験の実施

３－１ 試験水(１) 試験水とは、試験用水に被験物質や溶解補助剤を加えた水である。試験原液は、被験物質を試験用水に単純に混合又は撹拌し調製することが望ましい。溶解補助剤を使用する場合は最小限にする。また、それらの臨界ミセル濃度を超えてはならない。使用可能な溶剤としては、アセトン、エタノール、メタノール、N,N-ジメチルホルムアミド、
トリエチレングリコールなどがある。使用可能な分散剤としては、Tween®80、メチル
セルロース 0.01%、NIKKOL®HCO-40 などがある。試験水中の溶解補助剤濃度は、すべての試験区及び対照区において同一とし、かつ溶解補助剤が試験魚に毒性影響を与えないようにする。溶解補助剤の最高濃度は、100 mg/L（又は 0.1 mL/L）とする。試験水における有機炭素の総量に対する溶解補助剤及び被験物質の割合を把握する。試験期間を通して、試験水中の TOC 濃度は 10 mg/L（±20%）以下とする（被験物質及び溶解
補助剤由来の有機炭素濃度を除く）。試験水中の被験物質濃度は、溶解補助剤の使用に関わらず、水溶解度以上の濃度は使用しない方が良い。生分解性のある溶解補助剤を用いる場合、バクテリアの増殖をもたらすので注意が必要である。
(２) 試験水槽中の被験物質濃度を維持するには、試験水槽に試験原液を連続的に供給・希釈する流水式システムが有効である。少なくとも 1 日に試験水槽容量の 5 倍量の試験
水を流すことが好ましい。流水式による試験が推奨されるが、流水式が不可能であり、有効性基準を満たす場合は、半止水式による試験を実施してもよい。試験原液及び試験用水の流量を、試験開始の 48 時間前と試験期間中に毎日確認する。各試験水槽の流量の変動及び試験水槽間の流量の差異は 20%以内とする。
(３) 試験水中被験物質濃度について、流水式による試験において試験原液交換前後で濃度変動が認められる場合や、半止水式による試験において換水前後で濃度変動が認められる場合は、OECD テストガイドライン 211 の付属書 6 の手順に従って、時間加重平均（TWA；Time Weighted Average）により試験水中被験物質濃度（Cw）を算出してもよい。
３－２ 水質測定の頻度
試験期間中は、すべての試験水槽について、溶存酸素濃度、TOC 濃度、試験水温及び pH を測定する。全硬度については、試験区（設定濃度が最も高い区の 1 水槽）及び対照区の水槽を測定する。溶存酸素濃度については、取込期間中は少なくとも 3 回（取込期間の開始時、中間時及び終了時）、排泄期間中は 1 週間に 1 回測定する。TOC 濃度については、取込期間開始の 24 及び 48 時間前、取込期間中及び排泄期間中は 1 週間に1 回測定する。試験温度は毎日 1 回、pH は取込期間及び排泄期間の開始時及び終了時、3/30

全硬度は取込期間及び排泄期間に 1 回測定し記録する。試験温度については、少なくとも一つの試験水槽中で連続的にモニターすることが好ましい。

３－３ 流量
取込期間開始時の試験魚の搬入による試験水中の被験物質濃度の低下を最小限にし、かつ、溶存酸素濃度の低下を避けるため、試験魚尾数に応じて、試験水の流量を調整する。流量は使用する魚種によって調整する。通常、流量は魚体重（湿重量）1.0 g 当たり 1-10 L/日が推奨される。
３－４ 試験魚の条件
各試験区において、試験開始時の魚体重の最小値は最大値の 2/3 以上であること。同
じ年齢で同じ供給源の魚を用いる。魚の年齢及び体重が BCF に大きく影響する可能性があるため、これらの詳細を記録する。試験開始時の平均魚体重を推定するため、試験開始直前にじゅん化中の予備魚の体重を測定することが推奨される。

３－５ 試験水濃度
３－５－１ 急性毒性試験の実施（LC50 測定）
本通知で定められた魚類毒性試験、JIS K0102-2013 の 71.で定められた方法又はOECD テストガイドライン 203 で定められた方法に準じて急性毒性試験を実施する。ただし、被験物質の最大無影響濃度（NOEC）のデータが得られている場合は実施しなくてもよい。

３－５－２ 試験濃度の設定(１) 試験は少なくとも 2 濃度区で実施する。第 1 濃度区の試験濃度の設定は、被験物質の急性毒性値（LC50 値）の 1%以下もしくは NOEC 以下とし、技術的に可能な限り低くする。試験水の分析における被験物質の定量下限濃度より、少なくとも 10 倍程度
高い濃度を目安とする。第 2 濃度区は、第 1 濃度区より 10 倍低い濃度とする。ただし、毒性及び分析感度から、これが不可能であれば、10 倍より小さい濃度比で行う
か、放射性同位元素を使って標識した被験物質（高純度、例えば＞98%）を使用してもよい。いずれの試験濃度も被験物質の水溶解度を超えないように注意する。

4/30

(２) BCF の濃度依存性がないと予想される物質については、試験は 1 濃度区でよい場合がある。
一連の試験に加えて、試験用水のみの対照区又は試験原液に溶解補助剤を用いる場
合は溶解補助剤のみを含む対照区を設定する。

３－６ 照明及び試験温度
照光時間は通常 12 から 16 時間とする。照明の種類及び特性を把握しておく。試験における照明条件下では被験物質が光分解する可能性があるので注意する。人工的な光反
応生成物の試験魚への暴露を避けるために適切な照明を使用する。場合によっては、290 nm より低波長の UV 照射を遮蔽する適切なフィルターを使用する。試験温度は試験
魚の推奨試験温度とし、その変動は±2℃未満とする。

３－７ 試験期間

３－７－１ 取込期間取込期間は、試験魚中の被験物質濃度が取込期間の早い段階で定常状態（試験法解説参照）に達することが確認される場合を除き、28 日間とする。試験魚中の被験物質濃度が少なくとも 2 日間の間隔をおいて採取したサンプルについて、連続した 3 回の被験物質濃度の分析結果が±20%以内の場合は定常状態に達したと判断する。ただし、試験魚を複数尾まとめて分析する場合には、少なくとも連続した 4 回の試験魚分析で定常状態を判断する。28 日間で定常状態に達しない場合、定常状態に達するまで又は 60 日間のどちらか短い方まで取込期間を延長し、定常状態における BCF（BCFSS、試験法解説参照）を算出する。BCF が 100 未満の場合は、試験魚中の被験物質濃度の変動が 20％を超えても、28 日後には定常状態に達しているとみなしてよい。排泄試験を実施した
場合は、速度論による BCF（BCFK、試験法解説参照）を算出する。28 日後に明らかに被験物質の取込が確認されない場合は、試験を終了できる。BCFSS が 1000 以上の場合（BCFSS が得られなかった場合においては、個々の試験魚について分析を行った際は取込期間における最後の連続した 3 回の測定における BCF の平均値が 1000 以上の場合、試験魚を複数尾まとめて分析を行った際は取込期間における最後の連続した 4 回の測定における BCF の平均値が 1000 以上の場合）には、部位別試験を実施する。部位については、頭部、内臓、外皮（鰓及び消化管を含む）及び可食部（頭部、内臓、外皮を除く
その他の部位）の 4 部位に分けて実施し、それぞれの部位における被験物質濃度と BCFを報告する。

３－７－２ 排泄期間
BCFSS が 1000 以上の場合（BCFSS が得られなかった場合においては、個々の試験魚について分析を行った際は取込期間における最後の連続した 3 回の測定における BCF の平均値が 1000 以上の場合、試験魚を複数尾まとめて分析を行った際は取込期間における最後の連続した 4 回の測定における BCF の平均値が 1000 以上の場合）、又は BCFKを算出する場合は、排泄期間を設ける。排泄期間は、試験魚中の被験物質濃度が十分に減少（例えば定常状態の 95%が消失）するまでの期間とすることが望ましい（試験法解説参照）。試験魚中の被験物質濃度が 95%消失するまでの期間が通常の取込期間の 2 倍

5/30

以上の場合は、期間を短縮してもよい（例えば、試験魚中の被験物質濃度が定常状態の10%未満に減少するまでの期間とする）。ただし、取込及び排泄が 1 次速度式による 1
コンパートメントモデルより複雑なパターンを示す化学物質については、排泄速度定数を求めるために、より長い排泄期間を必要とする。排泄期間を延長する場合は、試験魚の成長が試験結果に影響する可能性を考慮する。

３－８ 採取及び分析

３－８－１ 分析方法
(１) 分析方法については、化学分析の正確さ、精度及び再現性、さらには試験水及び試験
魚からの被験物質の回収が十分であるかを実験的に確認する。また、被験物質が試験用水中で検出されないことを確認する。必要な場合、回収値と対照区のバックグラウ
ンド値によって、試験で得られた試験水及び試験魚における被験物質濃度値を補正する。試験水及び試験魚の採取を行う際は、被験物質の汚染及び損失（例えば、採取装置への吸着）を最小限にする。
(２) 被験物質の分解などを防止するために、採取後、直ちに試験魚と試験水を分析する。
速やかに分析できない場合は、サンプルを適当な方法で保存する。被験物質について、適切な保存方法、保存期間及び前処理などに関する情報を試験開始前に得る。

３－８－２ 試験水の分析(１) 被験物質濃度の決定のために、取込期間開始前及び取込期間中に試験水を分析する。
また、排泄期間を設定した場合は、排泄期間中にも試験水を分析する。試験水の分析
は給餌前に試験魚の分析と同時に行う。ただし、排泄期間開始時の試験水分析において、被験物質が検出されないことが確認できる場合は、その後の排泄期間における試
験区及び対照区の試験水の分析を省略してもよい。
(２) 試験水は、例えば試験水槽の中心から不活性チューブなどを通して吸い取り分析する。
このとき、通常、試験水の汚れをろ過や遠心分離により取り除かない。これらを分離する場合は、その分離技術の根拠又は妥当性を報告する。特に高疎水性化学物質（すなわち log POW＞5 の化学物質）については、フィルターの材料又は遠心分離の容器への吸着が起こるため、このような処理を行わない。代わりに、可能な限り試験水槽を清浄に保つための処置を行う。また、取込期間及び排泄期間に TOC 濃度を測定する。
３－８－３ 試験魚の分析(１) 各試験魚の分析は、1 試験区当たり最低 4 尾とし、個々の試験魚について実施する。
ただし、個体ごとの分析が困難な場合には、各分析時における試験魚を複数尾まとめて分析する。その場合は、2 群以上とすることが望ましい。
(２) 取込期間中に少なくとも 5 回、試験魚を分析する。排泄期間を設定した場合には、排泄期間中に少なくとも 4 回、試験魚を分析する。排泄期間を開始する前に、試験魚を清浄な試験水槽に移す。特に、取込及び排泄が単純な 1 次速度式に従わないことが予想される場合は、正確な BCF の算出が困難であるため、両期間において、より高頻度の分

6/30

析が推奨される（試験法解説参照）。動物愛護の観点から最も適した方法で採取した試験魚を安楽死させ、体重及び全長を測定する。それぞれの個体の体重及び全長は、識別コードなどを付して、被験物質濃度（該当する場合は脂質含量も）の結果と整合させる。
(３) 脂質含量は、少なくとも取込期間の開始時及び終了時、排泄期間終了時に測定しなければならない。脂質含量は、被験物質濃度測定と同一の試験魚を用いて測定するが、同一の試験魚を用いた測定が困難な場合は、上記 3 回の測定時に、少なくとも別途 3 尾を採取し測定する。対照区の試験魚において被験物質が顕著に検出されないことが明らかな場合、対照区の試験魚は脂質含量のみ測定し、被験物質濃度は測定しなくてもよい。
(４) BCFSS が 1000 以上の場合は、被験物質が主に脂質に蓄積しないと考えられる場合を除き、5%の脂質含量で標準化（湿重量に基づく）した BCFSS（BCFSSL）も報告する。
(５) 試験に放射性同位元素を使って標識した化学物質を使用する場合、全標識化物（すな
わち親化合物及び代謝物）として測定するか、あるいは、サンプルをクリーンアップ
して親化合物のみを測定する。親化合物に基づいて BCF を決定する場合は、主な代謝物を少なくとも取込期間の終了時に確認する。

３－８－４ 試験魚の成長の測定
試験水槽に搬入する前の試験魚から取込期間開始時に 5 から 10 尾採取し、個別に体重及び全長を測定する。これらの試験魚は、取込期間開始前の被験物質濃度及び脂質含量の測定に用いることができる。試験期間中に採取した試験魚の体重及び全長は、被験物質濃度又は脂質含量の測定前に記録する。これらの測定値から、試験区及び対照区の
魚体重及び全長を推定する。試験区及び対照区における魚の平均成長率の顕著な差は、化学物質の毒性影響を示唆する。

４

試験結果の算出

４－１ 生物濃縮係数の算出
取込期間における試験魚中（又は特定の組織）の被験物質濃度（Cf）を時間に対してプロットし、取込曲線を得る。その曲線が平衡に達した場合、以下の式から定常状態における BCF（BCFSS）を算出する。
定常状態における試験魚中の平均被験物質濃度
BCFSS ＝定常状態における試験水中の平均被験物質濃度
また、速度論による生物濃縮係数（BCFK）を以下の式から算出する。なお、k1及びk2の算出法は試験法解説に示す。

7/30

取込速度定数(k1)
BCFK ＝排泄速度定数(k2)
４－２ 成長希釈補正と脂質含量の標準化(１) 排泄期間中の試験魚の成長は、見かけ上、試験魚中の被験物質濃度を低下させ、排泄速度定数（k2）に大きな影響を与える。そのため、BCFK を求める場合には、BCFK と合わせて成長希釈補正した BCFK（BCFKg）も報告する。成長希釈補正した排泄速度定数（k2g）は、通常、排泄速度定数（k2）から成長速度定数（kg）を差し引くことにより算出する。さらに、取込速度定数（k1）を成長希釈補正した排泄速度定数（k2g）で除する
ことにより BCFKg を算出する。成長希釈補正の方法については、上記以外の方法も含めて試験法解説に示す。
(２) BCFSS が 1000 以上の場合は、BCFK 又は BCFSS と合わせて 5%の脂質含量で標準化した BCFK（BCFKL）又は BCFSS（BCFSSL）も報告する（試験法解説参照）。また、BCFKを報告する場合には、成長希釈補正かつ 5%の脂質含量で標準化した BCFK（BCFKgL）
も報告する。被験物質濃度及び脂質含量の測定を同一の魚を用いて実施した場合には、それぞれの試験魚中被験物質濃度をその魚の脂質含量を用いて標準化する。試験区及び対照区の試験魚の成長が同程度であれば、対照区の試験魚の脂質含量を用いて標準化してもよい。

５

試験の有効性試験を有効なものとするために、次の条件を適用する。
温度変動は±2°C 未満であること（試験水温の大きな変動は試験生物へのストレスのほか、取込及び排泄に関する生物学的パラメータに影響する）。
溶存酸素濃度は飽和酸素濃度の 60%以下にならないこと。
試験水中の被験物質濃度の変動は、取込期間中の測定値の平均に対して±20%以内に保たれること。
（濃縮倍率が極めて高い場合には取込期間中の被験物質濃度の変動が大きくなる場
合がある。この場合には、定常状態における被験物質濃度の変動は測定値の平均に対して±20％以内に保たれること。）
死亡又は病気などの異常は、試験区及び対照区の試験魚において試験終了時に10％未満であること。試験が数週あるいは数か月延長になった場合には、死亡又は異常は、試験区及び対照区で１か月間に 5％未満かつ全期間で 30％を超えないこと。

６

結果のとりまとめ
試験の結果を様式２によりとりまとめ、最終報告書を添付するものとする。

8/30

Ⅱ：魚を用いた濃縮度試験（簡易水暴露法）

Ⅱ－Ⅰ 適用範囲
ここでは、魚介類のうち特に水（経鰓）を介した魚類の体内における化学物質の簡易な濃縮度試験の標準となるべき方法について規定する。この方法は、濃度依存性がないと予想される物質かつ取込及び排泄が 1 次速度式に従うものにのみ適用すべきである。

Ⅱ－Ⅱ 用語
この試験において使用する用語は、日本工業規格（以下「JIS」という。）において使用する用語の例による。

Ⅱ－Ⅲ 試験方法
１

試験の概要
本試験法は、魚類体内への水（経鰓）を介した化学物質の取込及び蓄積を評価する試験である。試験は、Ⅰ：魚を用いた濃縮度試験（水暴露法）に準拠するが、試験魚中の化学物質濃度の測定を 4 回（取込期間に 2 回、排泄期間に 2 回）に削減し、速度論による生物濃縮係数（BCFKm）及び定常状態における生物濃縮係数（minimised BCFSS）を算出する。

２

試験に用いる装置及び材料
Ⅰ：魚を用いた濃縮度試験（水暴露法）と同様とする。

３

試験の実施
Ⅰ：魚を用いた濃縮度試験（水暴露法）と同様とする。ただし、採取スケジュール及び計算方法は次のとおりとする。

３－１ 試験水の分析
被験物質濃度の決定のために、取込期間開始前に少なくとも 1 回と取込期間中に少な
くとも 5 回（そのうち 2 回は試験魚の分析と同時）、試験水を分析する。さらに、排泄
期間中は週 1 回とする。排泄期間開始時の試験水分析において、被験物質が検出されないことが確認できる場合は、その後の排泄期間における試験区及び対照区の試験水の分析を省略してもよい。

9/30

３－２ 試験魚の分析
次のとおり試験魚を分析し、試験魚中の被験物質濃度を測定する。
各試験魚の分析は、1 試験区当たり最低 4 尾とし、個々の試験魚について実施する。
ただし、個体ごとの分析が困難な場合には、各分析時における試験魚を複数尾まとめて分析する。その場合は、2 群以上とすることが望ましい。
取込期間の分析は、取込期間の中間及び終了時（終了時は排泄期間開始時に相当する）とする（例えば、取込期間の 14 及び 28 日後）。
排泄期間の分析は、排泄期間の中間及び終了時（被験物質濃度が最高濃度の 10%未満となることが望ましいが、少なくとも被験物質の排泄半減期が算出できるまで）とする（例えば、排泄期間の 7 及び 14 日後）。排泄が早いと予想される場合、試験魚中の被験物質濃度が定量下限未満とならないようにする。

４

試験結果の算出
取込終了時（t1）の試験魚中の被験物質濃度（Cf1）及び排泄終了時（t2）の試験魚中の被験物質濃度（Cf2）を用いて、式 1 に従い排泄速度定数（k2）を算出する。

k2

ln(C f1 ) ln(Cf2 )t 2 t1[式 1]得られた排泄速度定数（k2）、取込期間における試験水中の平均被験物質濃度（Cw）
及び取込期間終了時（t1）の試験魚中の被験物質濃度（Cf1）を用いて、式 2 に従い取込
速度定数（k1）を算出する。

k1

Cf k 2
C w 1 e k 2t

[式 2]

さらに、取込速度定数（k1）と排泄速度定数（k2）の比を用いて、式 3 に従い簡易水
暴露法における速度論による生物濃縮係数（BCFKm）を算出する。

BCFKm

k1
k2

[式 3]

取込期間中に定常状態に達したと仮定して、試験水中の被験物質濃度（Cw-minSS、
mg/L）と取込期間の終了時の試験魚中の被験物質濃度（Cf-minSS、mg/kg 湿重量）を用いて、式 4 に従い簡易水暴露法における定常状態による生物濃縮係数（minimised BCFSS）を算出する。
minimised BCFSS =Cf–minSS
Cw–minSS[式 4]脂質含量の測定、成長希釈補正はⅠ：魚を用いた濃縮度試験（水暴露法）と同様とする。

10/30

５

試験の有効性Ⅰ：魚を用いた濃縮度試験（水暴露法）と同様とする。

６

結果のとりまとめ
試験の結果を様式２によりとりまとめ、最終報告書を添付するものとする。

11/30

試験法解説

１．定義及び単位取込期間とは、魚が化学物質に暴露される期間である。
排泄期間とは、魚体内に取り込まれた化学物質が、排泄あるいは代謝により減少する過程（半減期）を調べるための期間である。
取込速度定数（k1）とは、取込期間中の、試験魚の生体内及び表面（又は特定の組織）における被験物質濃度の増加率として定義される数値である（k1 は L/kg/day で表される）
排泄速度定数；depuration rate constant（k2）とは、排泄期間における試験魚（又は特定の組織）の被験物質濃度の低下率として定義される数値である（k2 は day-1 で表される）。
定常状態とは、取込期間に少なくとも 2 日間の間隔をおいて採取した試験魚の被験物質
濃度（Cf）のうち、連続した 3 回の Cf の分析結果が±20%以内であり、かつ 1 回目と 3 回目の分析において Cf に顕著な増加がない状態をいう。試験魚を複数尾まとめて分析する場
合には、連続した 4 回以上の Cf の分析結果が±20%以内である必要がある。取込が遅い化
学物質については、7 日間の間隔で採取することがより適当である。
生物濃縮係数（BCF；bioconcentration factor）とは、濃縮度試験の取込期間中の各時間における試験魚の生体内及び表面又は特定の組織における被験物質濃度（Cf、mg/kg 湿重量）
を周囲の水中の被験物質濃度（Cw、mg/L）で除したものである（BCF は L/kg で表される）。
定常状態における生物濃縮係数（BCFSS；steady-state bioconcentration factor）とは、定常状態における試験魚中被験物質濃度（Cf、mg/kg 湿重量）を定常状態における試験水中被験物質濃度（Cw、mg/L）で除したものである。
脂質含量標準化した定常状態における BCF（BCFSSL；lipid normalised steady-statebioconcentration factor）とは、5%の脂質含量で標準化した BCFSS である。
速度論による生物濃縮係数（BCFK；kinetic bioconcentration factor）とは、取込速度定数
k1 と排泄速度定数 k2 の比（k1/k2）である。本来、試験魚への化学物質の取込及び排泄が一次速度式に従う場合、この値は理論的に BCFSS と等しくなる。しかし、試験魚中の化学物
質濃度が定常状態に達していない場合、あるいは BCFK について成長希釈補正を行った場
合は、BCFSS と乖離が生じる可能性がある。
成長希釈補正した速度論による BCF（BCFKg；growth corrected kinetic bioconcentration
factor）とは、試験期間中の試験魚の成長希釈補正した BCFK である。
脂質含量標準化した速度論による BCF（BCFKL；lipid normalised kinetic bioconcentration
factor）とは、5%の脂質含量で標準化した BCFK である。
脂質含量標準化及び成長希釈補正した速度論による BCF（BCFKgL；lipid normalised,
growth corrected kinetic bioconcentration factor）とは、5%の脂質含量で標準化し、かつ試験期間中の試験魚の成長希釈補正した BCFK である。

12/30

オクタノール-水分配係数（POW；octanol-water partition coefficient）とは、平衡状態での1-オクタノール及び水に対する化学物質の溶解度の比（OECD テストガイドライン 107、
117、123）である。KOW と表記されることも多い。
溶存有機炭素（DOC；dissolved organic carbon）とは、試験水中に溶解している有機物質に由来する炭素である。
粒子状有機炭素（POC；particulate organic carbon）とは、試験水中に懸濁している有機物質に由来する炭素である。
全有機炭素（TOC；total organic carbon）とは、試験水中に溶解及び懸濁している有機物質に由来する炭素である。
UVCB 物質（chemical substances of Unknown or Variable composition, Complex reaction
products and Biological materials）とは、組成が未知か又は不定な構成要素を持つ物質、複雑な反応生成物又は生体物質である。

13/30

２．被験物質の水溶解度
被験物質の水溶解度は、以下の方法に従って測定した結果を入手する。濃縮度試験の報告書には測定結果、測定方法及び測定温度を記載する。なお、入手すべき被験物質の水溶解度の上限濃度は 100 mg/L とする。
2 濃度区での水暴露法を適用する場合は、OECD テストガイドライン 105 等の標準的な試験法を参考に実施した結果。
1 濃度区での水暴露法及び簡易水暴露法を適用する場合には、化学物質 GLPのほか何らかの GLP 基準の適合確認を受けた試験施設において OECD テス
トガイドライン 105 に定められた方法に準じて実施した結果。

14/30

３．測定することが望ましい試験用水の水質項目（試験法「２－２ 試験用水」）
試験用水における各測定項目の上限濃度については OECD テストガイドラインなどを参照するが、その濃度が実現困難な場合は、使用する試験用水で供試魚が飼育可能なことをあらかじめ確認すること。
物質
pH
硬度
全粒子状物質
全有機炭素
アンモニウム
亜硝酸
アルカリ度
非イオン性アンモニア
残留塩素
全有機リン系殺虫剤
全有機塩素系殺虫剤及びポリ塩化ビフェニル
全有機塩素
アルミニウム
ヒ素
クロム
コバルト
銅
鉄
鉛
ニッケル
亜鉛
カドミウム
水銀
銀
カルシウム
マグネシウムナトリウム
カリウム
塩化物イオン
硫酸イオン

15/30

４．試験魚４．１ 試験に使用可能な魚種（試験法「２－３－１ 魚種の選択」）
試験に使用可能な魚種、推奨する試験温度及び全長［頭部の先端（吻端）から尾の先端（尾端）までの長さ］は以下のとおりである。なお、コイ又はメダカが推奨されるが、その他の魚種を使用する場合は、魚種の選択根拠を報告する。
魚種

試験温度の推奨範囲（°C）

試験生物の推奨全長（cm）

コイ（Common carp）
Cyprinus carpio（コイ科）

20 – 25

8.0 ± 4.0

メダカ（Ricefish）
Oryzias latipes（メダカ科）

20 – 25

4.0 ± 1.0

ゼブラフィッシュ（Zebra-fish）
Danio rerio（コイ科）

20 – 25

3.0 ± 0.5

ファットヘッドミノー（Fathead minnow）
Pimephales promelas（コイ科）

20 – 25

5.0 ± 2.0

グッピー（Guppy）
Poecilia reticulata（カダヤシ科）20 – 25

3.0 ± 1.0

ブルーギル（Bluegill）
Lepomis macrochirus（サンフィッシュ科）

20 – 25

5.0 ± 2.0

ニジマス（Rainbow trout）
Oncorhynchus mykiss（サケ科）

13 – 178.0 ± 4.0

イトヨ（Three-spined
stickleback）
Gasterosteus aculeatus（トゲウオ科）18 – 20

3.0 ± 1.0

16/30

４．２ 試験魚の蓄養及びじゅん化（試験法「２－３－２ 蓄養及びじゅん化」）
蓄養及びじゅん化において、試験温度と蓄養池の水温に差がある場合には、例えば次の(１)又は(２)の方法によりじゅん化水槽中でじゅん化することができる。じゅん化の間に、エラや皮膚の損傷している試験魚あるいは衰弱していたり疾病にかかっている試験
魚は除去する。また、試験期間中に脂質含量の極端な変化が生じないように給餌量等を調整する。なお、蓄養池及びじゅん化水槽は流水とすることが望ましい。
(１) 試験温度が蓄養池の水温より高い場合は、蓄養池の水温より 5℃以内高い温度で 1 日
以上ならし、その後 1 日 3℃以内ずつ順次昇温し、最終的に試験温度と同一温度で 57 日間飼育する。
(２) 試験温度が蓄養池の水温より低い場合は、蓄養池の水温より 3℃以内低い温度で 1 日
以上ならし、その後 1 日 2℃以内ずつ順次降温し、最終的に試験温度と同一温度で 710 日間飼育する。

17/30

５．水暴露法を実施する上での注意点

５．１ 溶解補助剤（試験法「３－１ 試験水」）
適切な濃度の原液を調製するために溶解補助剤を使用する場合は、最小限にする。
濃縮度試験に用いられる主な溶解補助剤の 48 時間 LC50 値（mg/L、w/v）

溶剤

分散剤

メタノール
エタノール
アセトン
N,N-ジメチルホルムアミド
ジメチルスルホキシド
テトラヒドロフラン
1,4-ジオキサン
エチレングリコールジメチルエーテル

16,20012,000
11,2009,800
33,0003,800
7,200
21,500エチレングリコールモノメチルエーテル
魚：メダカ 水温：25℃
HCO：ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油

22,000

HCO-10
HCO-20
HCO-40
HCO-50
HCO-100
Tween-40
Tween-80
SPAN-85

5,300>50,000>100,000>100,000>100,000
2,800
50,0001,000

５．２ 流量（試験法「３－３ 流量」）
通常、流量は魚体重（湿重量）1.0 g 当たり 1-10 L/day が推奨される。ただし、被験物質濃度を±20%以内で維持することができ、かつ溶存酸素濃度が飽和酸素濃度の 60%を超える場合には、推奨流量よりも下げてもよい。

５．３ 試験濃度（試験法「３－５－２ 試験濃度の設定」）
被験物質の魚体内への取込は設定した試験濃度によっては制限される場合がある（BCF の濃度依存性）。そのような場合、取込が制限されないことを確認するために、
少なくとも 2 濃度区、場合によっては 3 濃度区以上で試験を実施する必要がある。第 1
濃度区の試験濃度の設定は、被験物質の急性毒性値（LC50 値）の 1%以下もしくは最大
無影響濃度（NOEC）以下とし、技術的に可能な限り低くする。分析方法による試験水中における定量下限濃度より、少なくとも 10 倍程度高い濃度を目安とする。第 2 濃度区
は、第 1 濃度区より 10 倍低い濃度とする。ただし、毒性及び分析感度から、これが不可能であれば、10 倍より小さい濃度比で行うか、放射性同位元素を使って標識した被験物
質（高純度、例えば＞98%）を使用してもよい。また、水溶解度付近の試験濃度で実施せざるを得ない被験物質でも、設定濃度の信頼性を担保できるように、少なくとも 2 濃度区での試験が推奨される。
UVCB 物質のような多成分物質については、評価対象成分が水溶解度以下になるように試験濃度を設定すればよい。

18/30

５．４ log POW = 4 である被験物質の理論的なサンプリングスケジュール例（試験法「３－８ 採取及び分析」）
採取

サンプリングスケジュール
最低限必要な頻度（日）

水試料数

魚試料数（1）

1-2（3）

4（4）（3（6））

追加のサンプリング（日）

取込期間前
1

-1
0

取込期間
2

0.3

0.4

1-2

4

3

0.6

0.9

1-2

4

4

1.2

1.7

1-2

4

5

2.4

3.3

1-2

4

6

4.7

1-2

4 – 8（5）（3（6））

排泄期間を
設ける場合

被験物質を含まない
水に魚を移動

7

5.0

5.3

1-2

4

8

5.9

7.0

1-2（7）

4

（7）

4

9

9.3

11.2

1-2

10

14.0

17.5

1-2（7）

4 – 8（5）（3（6））（1）括弧内の値は、追加で採取する場合の試料数である。
（2）log POW が 4.0 のとき k2 の推定値は 0.652 day-1 である。試験の総期間は、3 × tSS = 3 ×
4.6 日すなわち 14 日間に設定される。tSS（定常状態到達時間）の推定については「６．
BCF の算出法」参照。
（3）少なくとも、水槽容量の 3 倍の水が供給された後に水を採取する。
（4）これらの魚は蓄養群から採取する。
（5）高い精度でのカーブフィッティングや代謝物の知見が必要な場合は、より多くの試験魚を採取する必要があるが、取込期間及び排泄期間の終了時に、特に多くの試験魚を採取した方がよい。
（6）試験開始時、取込期間終了時及び排泄期間終了時に、被験物質濃度測定用として採取した魚と同一の魚を脂質含量測定に使用できない場合は、追加で少なくとも 3 尾の脂質含量測定用の試験魚を採取する。その場合、試験区の魚ではなく対照区の 3 尾を脂質含量測定に用いてもよい。
（7）排泄期間開始時の試験水分析において、被験物質が検出されないことが確認できる場
合は、その後の排泄期間における試験水中の被験物質を測定しなくてもよい。

19/30

５．５ 成長の比較（試験法「３－８－４ 試験魚の成長の測定」）
試験区及び対照区における魚の成長速度定数を算出し、試験区と対照区の成長の差を統計的手法（例えば t 検定、又は試験濃度が複数の場合は F 検定）によって確認する。
試験区と対照区の成長に有意な差が認められる場合は、試験の信頼性と完全性に与える影響を考察することが望ましい。

20/30

６．試験結果の処理６．１ 試験設計のための取込期間の長さ予測（試験法 「取込期間 ３－７－１」）
排泄速度定数（k2）と n1-オクタノール／水分配係数（POW）、取込速度定数（k1）とBCF との経験的な関係を用いることで、試験実施前に k2 及び試験魚中被験物質濃度が定常状態の X%に達する時間 tx を推定することができる。ただし、これらの式は取込及び排泄が 1 次速度式に従う場合にのみ適用される。明らかに 1 次速度式に従わない場合は、
これらの予測は有効ではない。X と tx の関係は以下の式で示される。

X
1 e k 2t x
100

[式 A6.1]

k2（day-1）の推定値はいくつかの方法で得ることができる。例えば、以下の経験式を用いることができる。：

log k 2 1.47 0.414log POW （r2=0.95）[式 A6.2（注 1）]

又は

k2

k1
BCF

[式 A6.3]

log POW が 3 を超える化学物質の場合は、上式で、 k1

520 W 0.32 （r2=0.85）[式 A6.4 ]及び BCF 10

0.910 log K OW 1.975 log 6.8 10 7 K OW 1 0.786（r2=0.90）[式 A6.5（注 3）]

W =取込終了時／排泄開始時における平均魚体重（g 湿重量）
その他、k2 を推定する方法として「注 4」がある。例えば、代謝が早いと考えられる
場合には、複雑なモデルを用いて k2 を推定した方がよい場合もある（注 5、6）。ただし、モデルが複雑になるほど、予測結果の解釈にいっそう注意を払わなければならない。したがって、推定結果の取り扱いについては、被験物質の構造及び他の関連情報（例えば予備試験結果）と比較しつつ、慎重に判断すべきである。
定常状態に対し一定の割合に達するのに必要な時間は、取込及び排泄を記述する一般的な速度式（1 次速度式）に k2 推定値を代入することにより算出することができる。しかしながら、試験期間中の成長が著しい場合は、６．６「速度論による BCF についての
成長希釈補正」に記載する成長希釈補正した排泄速度定数（k2g）を用いて算出する方が適切である。

dC f
dt

k1C w

k 2Cf

[式 A6.6]

21/30

Cw が一定の場合

Cf

k1
Cw 1 e k t
k2[式 A6.7]2

定常状態に近づくと（t → ∞）、式 A6.7 は以下のように省略できる（注 7、8）。

Cf

k1
Cw
k2

[式 A6.8]

k1
k2[式 A6.9]

又は

Cf
Cw

BCF

すなわち、BCF × Cw は、定常状態における試験魚中被験物質濃度（Cf-SS）の近似値である。
式 A6.7 は、次のように書き換えられる。

Cf

Cf -SS 1 e k t[式 A6.10]

1 e kt[式 A6.11]

2

又は

Cf
C f -SS

2

式 A6.2 又は式 A6.3 を用いて k2 を事前に推定し、式 A6.11 に代入することで、tX を予測することができる。
蓄積が定常状態の 95%を超える場合は、BCFSS の算出が可能となる。BCFK を算出するための統計的に最適な取込期間として、試験魚中被験物質濃度が定常状態の 50%（0.69/k2）に達する期間が少なくとも必要である（注 9）。
定常状態の 80%に到達する時間（t80）は、以下に示される。

0.80 1 e k t[式 A6.12]

2 80

又は

t80

ln(0.20)
k2

1 .6
k2

[式 A6.13]

同様に、定常状態の 95%に到達する時間（t95）は、以下に示される。

t95

ln(0.05)
k2

3 .0
k2

[式 A6.14]

例えば、log POW = 4 である被験物質の t80 又は t95 は（式 A6.2、式 A6.13、及び式
A6.14 を用いて）、以下に示される：

22/30

log k 2 1.47 0.414 4
k2 = 0.652 day-1

t80

1.6
0.652

2.45 days (59 hours)

t 95

3.0
0.652

4.60 days (110 hours)

代わりに、以下の式を用いて、定常状態に達するまでの時間（teSS）を算出できる。

（注 10）

t eSS

6.54 10 3 POW

55.31 (hours)[式 A6.15]

log POW = 4 である被験物質の結果は以下に示される：

t eSS

6.54 10 3 10 455.31 121 hours

６．２ 試験設計のための排泄期間の長さ予測（試験法「排泄期間 ３－７－２」）
取込及び排泄を記述した一般的な数式を用いることで、試験魚中被験物質濃度が排泄期間の初期濃度に対して一定の割合まで減少するのに必要な時間を予測することができる。ただし、これらの式は取込及び排泄が 1 次速度式に従う場合にのみ適用される。明らかに 1 次速度式に従わない場合は、これらの予測は有効ではない。（式 A6.6 参照）（注 11）。
排泄期間において、Cw をゼロと仮定すると、以下の式で示される：

dCf
dt

k 2 Cf[式 A6.16]

Cf,0 e k t[式 A6.17]

又は

Cf

2

上式で、Cf,0 は排泄期間開始時の試験魚中被験物質濃度である。
式 A6.2 又は式 A6.3 を用いて k2 を事前に推定し、式 A6.17 に代入することで、Y%排泄される時間 tY を予測することができる。

23/30

50%排泄される時間（t50）は以下の式で示される：

Cf
Cf,0

1
2

t 50

ln(0.50)
k2

e kt

2 50

又は

0.693
k2

同様に、95%排泄される時間（t95）は以下の式で示される：

t 95

ln(0.05)
k2

3.0
k2

６．３ 逐次法（Sequential method）：排泄速度定数 k2 の決定（試験法「生物濃縮係数の算出４－１」）
排泄期間中の試験魚中被験物質濃度（自然対数）が時間軸に対して直線上にプロットされる（排泄が 1 次速度式に従う）場合、k2 は単純な二つのコンパートメント／二つのパラメータのモデルにより、説明が可能である。

k2 が直線上にプロットされない場合は、排泄が 1 次速度式より複雑なパターンである
可能性が示唆される。1 次速度式から外れる場合の排泄のパターンは、図式解法により明らかにすることができる可能性がある。
複数のサンプリングポイントから k2 を算出するためには、縦軸に ln（濃度）、横軸に時間を取り直線回帰を実施する。その結果得られる回帰直線の傾きが排泄速度定数 k2 である。切片からは、排泄期間開始時における試験魚中被験物質濃度の平均値（C0,d；取込期間終了時の試験魚中被験物質濃度の平均値に等しいが誤差範囲を含む）が算出可能
である。

C0,d

e intercept[式 A6.18]

24/30

k2 を算出するためのサンプリングポイントが 2 つしかない場合（簡易水暴露法の排泄期間開始時（すなわち取込期間終了時）及び終了時）は、各サンプリングポイントにおける平均濃度を下式に代入する。

k2

ln(C f1 ) ln(Cf2 )t 2 t1[式 A6.19]

上式で、ln（Cf1）及び ln（Cf2）は、それぞれ時間 t1 及び t2 における試験魚中被験物質
濃度の自然対数であり、t2 及び t1 は 2 つのサンプリングポイントの排泄開始時からの時間である。ただし、この方法を用いた場合は、k2 の標準誤差あるいは信頼区間を得ることができない。

６．４ 逐次フィッティング法（Sequential method）：取込速度定数 k1 の決定（試験法「４－１ 生物濃縮係数の算出」）
取込期間中における一連の連続した時間-濃度データから k1 を算出することができる。
その場合、コンピュータプログラムを用いて、データを以下のモデルにフィッティング
させる。

Cf (t )

k1
1 e ktk2

C w (t )[式 A6.20]2

上式で、k2 は６．３「逐次法」において算出した値であり、Cf（t）及び Cw（t）はそ
れぞれ時間 t における試験魚中及び試験水中被験物質濃度である。
k1 を算出するためのサンプリングポイントが 2 つしかない場合（簡易水暴露法の排泄期間開始時（すなわち取込期間終了時）及び終了時）は、下式を用いる。

k1

Cf k 2
Cw 1 e k t[式 A6.21]2

上式で、k2 は６．３「逐次法」において算出した値であり、Cf は排泄期間開始時の試験魚中被験物質濃度であり、Cw は取込期間中の平均試験水中被験物質濃度である。ただし、この方法を用いた場合は、k1 の標準誤差あるいは信頼区間を得ることができない。
測定したサンプリングポイントのデータをプロットすることで、目視により k1 及び k2の妥当性を判断できる。逐次フィッティング法による k1 の値が適切ではないと判断された場合は、同時フィッティング法を用いて k1 及び k2 を算出すべきである（６．５「同時フィッティング法」参照）。

６．５ 同時フィッティング法（Simultaneous method）による取込速度定数及び排泄速度定数の決定（試験法「４－１ 生物濃縮係数の算出）
コンピュータプログラムを用いて、一連の連続した時間-濃度データ及び下記のモデル
式より k1 及び k2 を算出することができる。

25/30

Cf

Cw

k1
1 e k 2t
k2

Cf

Cw

k1
e k 2 t tc
k2

e k 2t

0 < t < tc

[式 A6.22]

t > tc[式 A6.23]

上式で、 tc = 取込期間終了時の時間
この手法は、k1 及び k2 の標準誤差を直接算出できる。式 A6.22 及び式 A6.23 におけるk1/k2 を BCF に置き換えることで、BCF の標準誤差及び 95%信頼区間も推定可能である。
このことは、試験魚中被験物質濃度の対数変換の有無による BCF 算出結果の差異を比較する際に特に有用である。
同時フィッティング法で k1 及び k2 を算出する場合、k1 と k2 の間には強い相関関係が存在する。また、ほとんどの場合、k2 は、排泄曲線から比較的高い精度で算出可能である
ことから、まず、逐次フィッティング法を用いて k1 及び k2 を算出することが推奨される。
逐次フィッティング法で k1 及び k2 を算出する場合には、両方について同様なデータの取り扱いをする（試験魚中被験物質濃度を自然対数変換する／しない）ことが推奨される。
測定したサンプリングポイントのデータをプロットすることで、得られた曲線の妥当性を目視により判断する。逐次フィッティング法により得られた k1 が妥当でないと判断される場合は、同時フィッティング法を用いて k1 及び k2 を算出する。再度、得られた曲線の妥当性を目視により判断し、k1、k2 及び BCF について、逐次フィッティング法で得られた結果と比較する。
いずれの方法も妥当ではないと判断された場合には、1 次速度式に従っていない可能性があり、より複雑な他のモデルを採用すべきである。妥当性の判断を難しくする最も一般的な要因の一つとして、試験期間中の試験魚の成長が挙げられる。

６．６ 速度論による BCF についての成長希釈補正（試験法「４－２（１） 成長希釈補正と脂質含量の標準化」）
化学物質の取込及び排泄が 1 次速度式に従う場合に適用する。1 次速度式に従わない
場合は、被験物質量を基にした手法（mass based approach）を用いることが推奨される。
成長に伴う希釈を補正するための本方法は、精度が悪い場合や適切に補正できない場
合がある（例えば、成長が早い魚を用いて排泄が非常に遅い化学物質について試験を実施した場合、成長補正した排泄速度定数（k2g）に必要な2つの速度定数（k2及びkg）の誤差も大きくなり、k2gは非常に小さくなる可能性がある。そのような場合には、被験物質量を基にした代替法を用いてもよい。なお、BCFSSも成長による影響を受けるが、現在のところ、BCFSSを成長希釈補正するための適切な方法はない。

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成長速度定数差引き法による成長希釈補正
標準的な方法として、全ての個々の体重データを自然対数に変換し、試験区と対照区に分けて、ln（魚体重）又は ln（1/魚体重）を時間（日）に対してプロットする。この処理を取込及び排泄期間のデータについて別々に実施する。成長に伴う希釈補正に用いる成長速度定数（kg）は、一般に試験期間全体の体重データを使用することが望ましい
が、取込及び排泄期間における 2 つの成長速度定数の間に統計的に有意な差がある場合には、排泄期間における速度定数を使用し、報告する。

成長速度定数（kg）を排泄速度定数（k2）から差し引いて、成長補正した排泄速度定数（k2g）を算出する。

k2g

k2

kg

[式 A6.24]

取込速度定数を成長補正した排泄速度定数で除することで、成長補正した速度論による BCF（BCFKg）を算出する。
BCFKg =

k1
k2g

[式 A6.25]

被験物質量に基づく成長希釈補正「成長速度定数差引き法」の代替法として、以下の方法が使用可能である。
排泄期間の試験魚中被験物質濃度（すなわち、魚の単位質量あたりの被験物質量）を試験魚中の被験物質量に変換する。
ln（被験物質量）を時間（排泄期間）に対してプロットし、その傾きから排泄速度定数を算出する。
ただし、k1 を算出する際には６．３「逐次法」及び６．５「同時フィッティ
ング法」に記載された方法を用い、試験魚中被験物質濃度から算出する通常の k2 を使用することに注意する。
６．７ 5%脂質含量での標準化（試験法「４－２（２）成長希釈補正と脂質含量の標準化」）
BCFSS が 1000 以上の場合は、被験物質がほとんど脂質に蓄積されないことが明確な場
合を除き、5%脂質含量（湿重量に基づく）に対する BCF（BCFK 又は BCFSS）を報告すべきである。魚の濃度データ又は BCF は 5%脂質含量（湿重量に基づく）あたりの値に標準化する必要がある。
脂質含量の測定にはクロロホルム／メタノール抽出法及び Smedes 法の 2 種類を推奨する。他の方法を用いる場合は、推奨する 2 種類と同程度の抽出効率及び精度が得られることを事前に確認する。なお、脂質含量は、被験物質濃度測定に用いた試験魚と同一の魚について測定することが望ましい。

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0.05
Cf
L

C f, L[式 A6.26]

Cf,L = 5%脂質含量で標準化した試験魚中被験物質濃度（mg/kg 湿重量）L

= 脂質含量（湿重量に基づく）

Cf= 試験魚中被験物質濃度（mg/kg 湿重量）

すべてのサンプリングポイントにおいて、被験物質分析及び脂質含量測定を同一の魚を用いて実施した場合を除いて、BCFSS については、試験区の取込期間終了時の平均値を使用する。BCFK の標準化は脂質含量の平均値を用いて実施する。ただし、脂質含量が取込期間又は排泄期間中に大きく変化した場合等は、その旨と合わせて適切な値を用いて脂質含量で標準化した BCF を報告する。

BCFSSL

0.05
BCFSS
Ln

[式 A6.27]

BCFKL

0.05
BCFK
Ln

[式 A6.28]

BCFSSL = 5%脂質含量で標準化した BCFSS
BCFKL= 5%脂質含量で標準化した BCFK

Ln

= 平均脂質含量（湿重量に基づく）

BCFSS= 定常状態における BCF

BCFK= 速度論による BCF

すべてのサンプリングポイントにおいて、被験物質分析及び脂質含量測定を同一の魚を用いて実施した場合には、それぞれの試験魚中被験物質濃度をその魚の脂質含量を用いて標準化する。

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７．Ⅱ：魚を用いた濃縮度試験（簡易水暴露法）
この手法の原理は、水暴露法における生物濃縮係数は、試験魚中被験物質濃度と試験
水中被験物質濃度の比から BCFSS として算出できるが、取込速度定数 k1 と排泄速度定数k2 の比から BCFK としても算出できることに基づくものである。
試験魚中被験物質濃度（Cf1）の測定を取込期間終了時（t1）に実施し、その後、排泄期間中のある時間（t2）に試験魚中被験物質濃度（Cf2）を再度測定することにより、「６．BCF の算出法」の式 A6.19 を用いて排泄速度定数（k2）が算出可能である。
取込速度定数 k1 は、「６．BCF の算出法」の式 A6.20 を用いて算出することができる（この式で、Cf は Cf1、t は t1 とする）（注 12、13）。したがって、簡易水暴露法における速度論による生物濃縮係数（BCFKm）は、以下のとおりになる。

BCFKm

k1
k2

[式 A7.1]

可能であれば、試験魚中被験物質濃度や BCFKm は、「６．BCF の算出法」に記載のよ
うに、成長希釈補正を実施すべきである。
BCFKm の結果の妥当性を評価する際に必要な minimised BCFSS は、取込期間終了時に定常状態に達したと仮定して算出される BCF であり、Ⅰ：魚を用いた濃縮度試験（水暴露法）で規定する BCFSS とは異なることに注意が必要である。
minimised BCFss =Cf–minSS
Cw–minSS[式 A7.2]

Cf-minSS =取込期間終了時に定常状態に達したと仮定した場合の試験魚中被験物質濃度（mg/kg 湿重量）
Cw-minSS =取込期間終了時に定常状態に達したと仮定した場合の試験水中被験物質濃度（mg/L）（注 1） Spacie A. and Hamelink J.L. （ 1982 ） . Alternative models for describing thebioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1: 309-320.
（注 2） Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. （1995）.
Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated
perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
（注 3） Bintein S., Devillers J. and Karcher W. （ 1993 ） . Nonlinear dependence of fishbioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1:
29-39.
（注 4） Kristensen P. （1991）. Bioconcentration in fish: comparison of BCF’s derived from
OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailabilityof chemicals. Danish Water Quality Institute, Hørsholm, Denmark.
（注 5） Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling
R.S. （2009）. A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic
biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 11681177.
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（注 6） OECD （ 2011 ） . QSAR Toolbox 2.1. February 2011. Available from:http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
（注 7） Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. （1975）. Bioconcentrationof 2,2',4,4' tetrachlorobiphenyl in rainbow trout as measured by an accelerated test. T.
Am. Fish. Soc. 104: 785-792.
（注 8） Ernst W. （1985）. Accumulation in aquatic organisms, in Appraisal of tests to predict
the environmental behaviour of chemicals, Sheeman, P., et al., Editors. John Wiley &Sons Ltd, New York, NY, USA: 243-255.
（注 9） Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. （1977）.
Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first orderkinetic models. Can. J. Chem. Eng. 55: 614-622.
（注 10） Hawker D.W. and Connell D.W. （ 1988 ） . Influence of partition coefficient of
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
（注 11） Konemann H. and van Leeuwen K. （1980）. Toxicokinetics in fish: Accumulation andelimination of six chlorobenzenes by guppies. Chemosphere. 9: 3-19.
（注 12）Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. （2008）. Assessment of an
approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ.
Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
（注 13） Hashizume N., Inoue Y., Murakami H., Ozaki H., Tanabe A., Suzuki Y., Yoshida T.,
Kikushima E. and Tsuji T. （2013）. Resampling the bioconcentration factors data fromJapan’s chemical substances control law database to simulate and evaluate thebioconcentration factors derived from minimized aqueous exposure tests. Environ.
Toxicol. Chem. 32: 406-409

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＜1-オクタノールと水との間の分配係数測定試験＞

Ⅰ

適用範囲及び試験方法
水に可溶で界面活性を有さない化学物質（有機金属化合物を除く。）の 1-オクタノー
ルと水との間の分配係数の測定は、原則として OECD テストガイドライン 107 又はOECD テストガイドライン 117 で定められた方法に準じて実施する。

Ⅱ

結果のまとめ
試験の結果を様式３によりまとめ、最終報告書を添付するものとする。