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51巻２号 2005〔臨床検査ひとくちメモ〕 33

ONE POINT MEMO No.194
臨床検査ひとくちメモ

Qの感染診断法としての病理組織検査の方法について説明してください。

浮遊，あるいは表層粘液細胞表面に接着して棲息しAています。腺窩の深部ほど菌数は減少し，腺頸部よ信州大学医学部保健学科
検査技術科学専攻

羽山正義
太田浩良

り深層にはほとんど見られなくなります１）。H.pyloriの胃内分布は不均一で，腸上皮化生上皮には認められません。
Ⅱ．

はじめに感染胃粘膜の組織病変

H.pylori 感染胃粘膜の組織像は，表層粘液細胞像

病理組織検査におけるHelicobacter pylori（H.pylori）の変化と粘膜固有層の炎症性細胞浸潤像に特徴的なの感染の有無は，H.pylori の感染する胃粘膜に特徴所見を示します。H.pylori 感染粘膜表面は表層粘液的な病理組織所見と菌体を確認することよって判断細胞の一つひとつが丸みを帯びて突出（ドーム状のされます。除菌治療後のように菌数が少ない場合や盛り上がり）し，細胞膜は不明瞭となり，細胞の脱菌形態が変形してみられる場合には，H&E 染色標落がみられるようになります（写真１）。一方，粘本のみでの判定は困難で，免疫染色などの特殊染色膜固有層では粘膜の深部ではリンパ球の浸潤が主体法による追加検索を必要とします。したがって，病で，しばしばリンパ濾胞の形成がみられ，表層部で理組織での H.pylori 感染診断および除菌判定は，病は形質細胞を主体として，リンパ球，形質細胞，マ理医の診断能力と優れた特殊染色技術によるところクロファージなどの単核球浸潤を伴った慢性胃炎のが大きいと言えます。

像を示します（写真２）。慢性胃炎の活動期には，好中球浸潤が腺頸部周囲に多くみられます２，３）。

Ⅰ．の胃粘膜分布

H.pylori は表層粘液細胞の分泌する粘液ゲル中にその他，H.pylori 感染胃粘膜に特徴的な病変としては，胃粘膜表層細胞が脱落してびらんが生じた
り，増殖細胞の分布する腺頸部（増殖帯）では細胞（ 11 ）34

増 殖 能 が 高 め ら れ 著 し い 拡 大 が み ら れ ま す。 また，十二指腸粘膜においては球部に活動性炎症がみられ，幽門粘膜への化生である胃上皮化生を伴う像がみられることがあります２）。
なお，H.pylori の感染胃粘膜にみられる病理組織所見の評価については，Updated Sydney System が提唱されています３）。
Ⅲ．病理組織標本におけるの検出方法

１）材料採取写真１ H.pylori 慢性活動性胃炎（ホルマリン固定・H&E 染色）

前述したように H.pylori の胃内分布が不均一で，粘膜固有層の表層部では , 形質細胞が主体の細胞浸潤がみられる。粘膜表面には , 好塩基性に淡染する菌体や脱落過程にある表層粘液細胞の集塊がみられる。

腸上皮化生上皮には認められないので，腸上皮化生の頻度の高い日本人の胃では幽門前庭大弯と胃体上部〜中部大弯の２カ所からの採取が推奨されています４）。
２）固定方法
組織材料の固定方法は，通常 10 〜 20％中性緩衝ホルマリン液（非緩衝でもよい）でもかまいません
が，除菌治療後のように菌数が少ない場合にはカルノア液による固定が推奨されます。カルノア固定を行うと粘液ゲル中に浮遊する菌体がよく保持され，検出精度が向上します１）。
３）染色方法
H.pylori は通常の H&E 染色標本でヘマトキシリンに淡染するため，菌数が多い場合には菌体の確認

写真２ H.pylori 慢性活動性胃炎（カルノア固定・H&E 染色）は容易にできますが，除菌治療後の検体のように菌リンパ濾胞の形成と炎症性細胞浸潤による固有層の拡大がみられる。

数が少なく菌形態が変化している場合には，特殊染色法による検索が必要となります。一般的に用いられ る 特 殊 染 色 法 と し て は，鍍 銀 法（Genta 法 ），Giemsa 染色，Gimenez 染色（MuMullen 変法），酵素抗体法などがあります。Giemsa 染色は菌量が少ない検体には適しませんが，スクリーニング的に用いる方法として簡便な方法です。酵素抗体法はこれらの染色法のうち最も感度がよく，他の診断法との一致率も 98％と良好です（表１）５）。
ここでは H.pylori の基本的な染色法となる H ＆E 染色法，Giemsa 染色法，酵素抗体法について紹介しておきます。
⑴ヘマトキシリン・エオジン（H＆E）染色法

写真３ H.pylori 感染胃粘膜（カルノア固定・H.pylori 免疫染色）

H.pylori は通常の H＆E 染色でもヘマトキシリンで好塩基に淡染してみえるのですが，ヘマトキシリンの染色時間を延長すると，いっそう濃く染色され表層粘液細胞の表面に接着および粘液ゲル中に浮遊して存在する H.pylori が茶褐色に染色されている。

（ 12 ）

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表１染色法

各種 H.pylori 特殊染色法の比較一致率（％）

j係数

95％信頼限界

評価

酵素抗体法

980.970.71 〜 1.00

優れている

McMullen 法変法

900.800.55 〜 1.00

優れている

Giemsa 染色法

870.730.49 〜 0.98

良いH.pylori 鍍銀染色

850.700.45 〜 0.94

良いて観察しやすい標本になります。カルノア固定組織

るので施設ごとの検討が必要，*）⑦流水洗５分後，の H ＆ E 染色では，通常のホルマリン固定組織よ脱イオン水で洗浄，⑧ 0.85％塩化ナトリウムを含むりも赤味の強い標本となるため，切片を脱パラフィ0.05M トリス・塩 酸 緩 衝 液（TBS），pH7.6， ５ 分，６）

ン後，数時間から１晩ホルマリン液で再固定します 。

⑨ 抗 H.pylori ウ サ ギ ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体⑵Giemsa 染色法（DAKO-B0471），20 〜 30 倍 希 釈， 室 温 30 分 反 応，

【固定方法】10 〜 20％中性緩衝ホルマリン（非緩衝⑩ TBS で５分，３回以上交換して洗浄（サクラ振ホルマリン）液で数時間から 1 晩固定（1 晩以上で動器上で），⑪ HRP 標識抗ウサギ免疫グロブリンもかまわない）する。

（DAKO-P0399），50 倍 希 釈， 室 温 30 分 反 応， ⑫

【染色方法】①脱パラフィン後，水洗，②２％ギム

TBS で５分，３回以上交換して洗浄（サクラ振動ザ液（メルク社製 Giemsa 液を脱イオン水で 50 倍器上で），⑬ DAB 発色液に，７〜 10 分浸漬［DAB希釈）で 30 分染色，③軽く水洗，④純アルコール液 :DAB（3，3 -Diaminobenzidine tetrahydro-で分別・脱水（手早く），⑤キシレン透徹，封入。

chloride）（同仁堂化学）20mg/100ml 0.05M トリス・

【染色結果】H.pylori は紫青色。同系色の背景染色が塩酸緩衝液（塩化ナトリウムを含まない）＋過酸化水

残るため菌量が少ない検体では菌体の検出は難し

素水 5ll］，⑭流水洗５分，⑮マイヤー・ヘマトキ

い。

シリン液で核染色 30 秒，⑯余分なヘマトキシリン⑶酵素抗体法

液を洗い流してから TBS に浸漬して色出し，５分【固定方法】通常のホルマリン固定材料でかまわな以上，⑰脱水，透徹，封入。

いが，生検組織の除菌判定ではカルノア固定の冷固【染色結果】：菌体は茶褐色に染色され，菌形態（ら定数時間が推奨される。固定不十分なホルマリン固せん構造，鞭毛）の観察も可能である。
（写真３）**）

定材料やカルノア固定材料を用いる場合は，切片を脱パラフィン後ホルマリン液で再固定するとよい６）。

おわりに【染色方法】切片の厚さはやや厚めの 4 〜 5lm が適以上，H.pylori 感染胃粘膜にみられる病理組織所している。菌形態をより鮮明に観察するためには間６）接法が望ましい 。①脱パラフィン後，水洗，②

見と H.pylori の染色手技について解説させていただ

20％中性緩衝ホルマリン液（非緩衝ホルマリン液）きました。組織標本での H.pylori 感染診断は，病理で 30 分再固定する（カルノア固定の場合は必須），組織所見に特殊染色を組み合わせて行うため，他の③流水洗５分，④１％過酸化水素水を含むメタノー

感染診断と同等の精度が期待できます。必要に応じ

ル液 30 分（DAB 発色の場合），⑤流水洗後，脱イて他の感染診断法を併用することにより，診断はオン水で３回洗う，⑥トリプシン処理 : 処理条件は，いっそう正確なものとなります。本法は結果報告ま

材料，固定方法，トリプシン液の力価によって異なでに要する時間，コスト面，検査時期などについて*）Trypsin250（Difco215240）を使用した場合の目安は，ホルマリン固定材料では，生検材料，手術材料とも 37℃，45〜 50 分（恒温槽使用），カルノア固定後のホルマリン再固定材料では，生検材料で８分前後，手術材料で 10〜12 分［トリプシン液の調整：Trypsin250（Difco215240）（0.2g）＋塩化カルシウム（無水）（0.1g）＋0.05M トリス・塩酸緩衝液（TB），pH7.6（100ml）］。
**）アルカリフォスファターゼ・ニューフクシン発色系を用いると，ゴミなどとの識別が容易になる。

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は，他の検査法に比べると不利な面がありますが，and grading of gastritis: The updated Sydney System.
Am. J. Surg. Pathol. 20: 1161−1181, 1996.

病理組織所見が同時に得られるメリットは大きいと３）羽山正義，清水俊樹，勝山 努，他：H. pylori 感染の存在ならびに除菌判定─病理学的診断法─．Prog. Med.
15 : 1783−1790, 1995.
４）Yabki, N., Sasano, H., Tobita, M., et al.: Analysis of cell
damage and proliferation in Helicobacter pylori-infected言えます。

文献１）Shimizu, T., Akamatsu, T., Ota, H., et al.: Immunohistochemical detection of Helicobacter pylori in the
sur face mucous gel layer and clinicopathologicalsignificance. Helicobacter. 1: 197−206, 1996.
２）Dixon, M. F., Genta, R.M., Yardkey, J.H., Correa, P., and
the Participants in the International Workshop on theHistopathology of gastritis, Huston 1994. Classification

human gastric mucosa from patients with gastricadenocarcinoma. Am. J. Pathol. 151: 821−829. 1997.
５）Rotimi, O., et al.: Histochemical identification of H.pylori:comparison of staining method. J. Clin. Pathol. 53: 756−759, 2000.
６）羽山正義，太田浩良，勝山 努：カルノア固定を用いた
Helicobacter pylori の免疫組織化学的検索方法。病理と臨床 15: 553−555, 1997.

（ 14 ）