プ口スタグランディンJの骨芽細胞機能に汲ぼす影響に関する細胞生物学的研究
大絞市立大学医学部第ご内科助教授西沢良 記

w{務ま表}プロスタグランディン JPGJ2) は PGD，の誘導体であり、その代 媛2(物であるどH2‑PGJ，はとトの尿中で検出されている。 PGD2 は鼠終決たはアルブミン存在化で PGJ2…に転換される。 PGJ2 f
まヒト安芸F
綴胞においてアルカリホスファターゼ(ALP)活性およびカルシウム沈若を主義泌させることが季語をきされていI甲状線ホルモン受容体の発務、事警慕警護る。しかし、その他の脅芽総抱機能〈露J，の作用機序については明らかにされタンパクの発現など〉に対する影響や PGJていない。
滋近、 PGJ，がその受容体である peroxisomeproliferatoトactiv
誌な:d receptorγ'Y)を介して脂肪紹胞の分イ乙を調節することが紛らかにされている。 PPARγ(PPARには 2つのアイソフォーム (PPAR'Yl、PPAR"(2)の存在が線認されており、務妨"(2が主として関与している。また、 PPAR悼の発現は細胞の分化調節には PPAR脂肪組織に特異的であるが、 PPARγiは種々の組織で認められている。しかし、PPAR'Y1の機能特に脂肪組織以外の組織での機能については不明である。また、糖尿病治療薬である thiazolidinedione誘導体が PPAR'Yに特災的に絡会し、脂肪細胞への分化を促進するととが報告されているの5deoxy‑tJ.12・
I4̲PGJ，および
そとで、本研究では、 PGJ2、その活性裂である 1thiazolidinedione誘導体のひ 2こつである伽glitazoneの符芽細胞機能に対する影響
石1)をFおいて検討した。また、破骨細胞の分化誘導をマウス骨芽細胞株(MC3T3nvi位。での破に脅芽細胞の関与が報告されているととから、とれらの化合物の i
脅総胞分化誘導に対する作照についても検討した。

{検討項目]PGJ，、 15-deoxy-tJ. 12 • 14‑PGJiおよび troglitazoneの骨芽紹胞機能に対する作用として以下の夜自について検討会行った。
1) 脅芸事綴胞におけるアルカリ役ホスファターゼ (ALP) 活性に対する作用
2) 脅芽綴E
告の invi
加でのお灰化に対する作 ffl3) 脅芸滞留胞における Peroxiso鰍 Pro総 f詰.
tedReceptor‑'Y(狩 AR‑坊の遺伝子発現にますする {1主用4) invi
troでの被脅級殺分伶誘導に対する作用[方法}1) 細胞培養:符努紛織としてマウス骨芽線抱妹 (MC3T3・E1)を用いた。
MC3T3-El 細胞は理研細胞パンクより入手した。 MC3T3-El 網抱は IO~思ウシ胎児血清 (FCS) 1i:含む αModifiedEagleMedium(αM自ので培養・維持した。
欄Invi
加における般傍細胞の分化誘導は、マウス脅骨造由来の非付着性単核総胞‑607‑

(BMぬとマウス脅緩ストローマ綴総総 (ST2)を 104¥M 1，25‑dihydroxyvitaminD

宅7および 10‑M dexamethasone存在下で 10日間共存積雪量ずることにより行った。
この系に用いた細胞はいずれも 10% ウシ胎児血清 (FCS) そ含む α‑Modis吋EagleMedium(α一MEM)で培養した。
2) アルカリ性ホスファターゼ務伎の総定:MC3T3‑El細胞令嬢務後、細胞!震の蜜Elそを 0.1%TritonX‑100を含む 0.9%NaCl諺液により可溶化し、 p‑nitrophenyIphosph総後議策として 495r
協の後光度を浪!淀することにより務索活性を求めた。最後に、総胞!震の蛋白量により善事索活伎の補正を行った。
3) invitroでの石灰化能の評価:MC3T3必 l細胞を confluentになるまで培養した後、 10m Ms・‑glyceroposphate(βGP)および 50μg/mlascorbicacidを添加することにより石灰化を誘導した。石灰化誘導後に出現する細胞j替の石灰化 nod出lesをvonKossa染色し、その数を算定することにより石灰化能を評鎖した。
4) Norther
設Blot法による P邑roxisomeP
ro
Iifer
詣:
tedRe
むeptorマ (PPMミヴ〉議室伝子二発現の検討:マウスれroxisomeProIifer
縦 dl
主総怠ptorヴ 1(PPAR‑yI) の cDNAprobeはDr
̲J̲K.Reddy(NorthwestemUniversityMedica1SchooI，Chicao，江)より供与 iされた。
ot
必 RNAを acidguanidiu
mphenoIchloroform法により抽出し、 1%培養細胞より tag紅 oseで電気泳動した後、 nylonmembraneに転写した。 cDNAprobeは randomprunrng 法を用いて fヤ]α‑dCTPで標識した。
5) 滋石後抵抗後緩ホスファターゼ σRAP)染色:上記の共存培養により得られた多核注総胞を被務総砲の分化マーカーのひとつである酒石重量抵抗後数ホスファターゼ (TRAP)で酵霊祭化学的に染色し、 τ3ミAPI
湯性で 3つ以上の核を夜ずる細脇を破脅細胞どして算定した。
6) 吸収霞アッセイ (PitAssay):invi
加で形成 dれた破骨細胞の脅吸収総受検討するため、 pitassay射すった。ウシ腔骨より lows
peeddiamondsawを用いて 7x7，
"0.5mm骨片を作製した。骨片上で共存培養を行い、 10B1，麦に骨片言と 10%
fo
罰 対 lsで箆定した。その後、 0.
1M 水酸化ナトリウムで i蒋情処理し、 PBSで洗浄した後、 トルイジンブルー染色を行った。吸収議は境界明擦なトルイジンブルー務性領域として光学顕微鏡下で観察された。

608ー

{給条]
1)骨芽細胞におけるアルカリ性ホスファターゼ (ALP)活性に対する作用
回
骨芽級協の分化マーカーのひとつである ALP活性を測定した o MC3T3‑線胞を 7日間培養した後、 PGJ2および出第五tazoneを添泌した。添加 4 日後のMC3T3‑El細胞における ALP浴後を測定したところ、 PGJ07剛lO" Mの範闘は12::ALP活憶を抑制し、 10'5M ではコントロールに比して約 50号
るまで用量依存的 1で ALP活性を低下させた哩1)。また、甘oglitazoneは 105M でコントロール号るまで低下させた{図1)。に比して約 40
ョ

，，

図1. PGJ2およびtroglitazoneのMC3T3‑E
1細胞における ALP活性に対寸る flH
J500sz 4号号
8
恥f300Xz〉

200話100¥0，6
同 J2(M)υ︽¥0，5ー、守C

手B

10ドMtroglitazone2) 脅さ手線胞の invi位0'1:の石灰化に対する作用'符:w総抱機能のひとつとして invi加での石灰化総について検鈴した。
MC3T3石 l細胞愛 7日問機饗した後、 10n判事 ‑GPおよび 50ド喜加1ascorむjcacidを::形成され添加することにより石灰化後誘導した。石灰化誘導 4日後に総胞層 1た石灰化 nodulesを vonKossl1染色した後、その数をカウンドヂることにより石1，'，15̲deoxy̲d.14PGJtazoneは石灰化誘導開灰化能そ評価した。 PGJおよび肋ぷi22(lO'6問、 15‑di酎oxy帥d.12.
14̲PGJ2(10'6時および、 troglit晶zone(10'5始時に添加した♂ GJ
2司hめは MC3T3-引の石灰化に対して存主まな変化を与えなかった(~裂の。

3)骨芽細胞における PeroxisomeProliferatedReceptor‑y(PPAR‑y) の遺伝子発現に対する作用
PGJ2
ミマの遺伝子発現を No
拍 車m B
10t法により解釈しの受理器体である PPAI一白骨‑

た。 PP人 約 に は 2つのアイソフォームが知られており、 PPAR"がは稜々の組織に発現しているのに対して、 PPAR‑'}'乏の発現は脂肪綴胞に特異的であると考えられている。 MC3TIEl では、 PPAR‑'γ
1 の発潔が線認されたが、 PGJ2および同troglitazoneの添加でも PPARy2の発現は誘導されなかった。

図2. PGJ 2 、 15-ct e oxy-ó I2 ， 14.PGJ2 およびtroglìtazone のおJj( f~ に対する作用300u唱
意書 hmち︒ロ hohGAE
口広200100む

C1L(今CI工作) t
roglitazonePGJ2 15・
4
関 xy‑PGJ2IOJ.
tM

10吾M l号、吾滋4) invitroでの磯脅綴胞の分化誘導に対する作用

invi柱。での破骨納胞の分化誘導に対する作用を上記の共移培幾系を用いて2.
1にPGJおよび t、1検討した。 PGJ5‑<1巴oxy‑LiIrogli
回 oneはそれぞ、れ用幾依存的に22および、 1破骨細胞の形成を抑制した(図 3，4， 5) 0 PGJ25ω
deoxy‑Li'2.，に PGJ2は、コントロールに比して 10，5 M でそれぞれ 50%および 33%まで低下させた。
また、 troglitazoneは 50μMでコントロールの 15%まで抑制した。これらの化合物が共存培養に用いている恐h必4と ST2細胞のいずれに主として作用し抑制効果を発揮しているのかそ明らかにするため、 2段階培養法をもちいでこれらの化合物の作用を検討した(~ 6)令これらの化合物の B主命在に対する作潟は、Bぬ 4を 5∞，oU/mlM‑CSF存在下で滋害毒する践にこれらの化合物を添加し、 4B間培養した後に ST2締結と共浮壌き棄を開始し、 10日後の破脅細胞形成絡により評価した。またもこれらの化合物の創立総胞に対する作用は、 Sね納胞滋独で筋書義ずる際にこれらの化合物を添加し、添加 3日後に BMMと共存情幾を開始し、10日後の磁骨細胞形成能により評価した。 Bl‑.
仏4に対するこれらの化合物の処理量は、その後の共存培養における破常細胞形成絡に対して影響を示さなかった(際‑610‑

j滋 3. PGJ 2 およびtroglila間関il)~まf号車部2草分化銭湯 iこますする 1'ßffl600υ
ω

府内用惨な口500400

む広州民 φ﹀弘︿剖(H300200

詰告1§0‑事Co
批1'01 110‑710‑6105 troglitazone
J 2 印 配 聞 甘ation(M)PG
25μM
皿1仁 PGJ2の磁骨純j
厄分化誘j
持iニ対する刊，
1
1114. 15.d即時‑d12，500(=ω ﹀ ミ 昌 吉U)UZ2(+)向︿肖H

400

300

200

100ei

10与κuυnControl

10‑515‑<1開xy‑a12，14̲
PGJZ(M)…611…

m図5.troglitazoneの娘骨細胞分化誘導に対する作用↑oE¥怠一00)OZ2(iT)dえ‑z{ロI~J6 ‘(A)1.
01025Trog
向調Zゅne(μM)

0.
1Control50

2段階共存域奇襲法.
.OCcoculture(10days)

日MC+ST2↑Tro(a)十Tro(b)(B)

主‑CSF(4days)

BMC?
Tro(c)

担胸Adl
警告r
脅殺を おon嘗
n言語rro獅
m語cropl
望書§号

C
Qcuiture(10days)

OCー‑争ST27、 8、 9) 。それに対して、 ST2に対するとれらの化合物の処理では、それぞれ破符細胞の形成を抑制した(図 10、 11， 12) 。したがって、破骨細胞分化誘導の初期におけるとれらの化合物の作用の主な標的は ST2細胞であることが示唆 dれた。しかし、分化誘導の後半にもとれらの化合物が作用している
可能枝、若者えられる。そとで、共存培養の待簸を 1‑4日、 4‑7日、 7‑1O日の 3つに分けてそれぞれの時期に出glitazoneの添加を行い、いずれの時期がその作用発現に議事喜であるかを検討したところも作潟期間が渓くなるにした

‑612‑

fl
図7. PGJ2の破脅細胞分化誘導における BMMへの隊機作 f800

ω凡据え mm‑oU)UZW品ずに︿出ト合同500

400

300

200

100BContro!

5PGJ21O‑PGJ21告6PGJ210ヴ(M)2，14̲ii¥U喜作用図8. 15‑deoxy‑A1
PGJ2の政党怜品目』担分化誘導における BMMの800(︻吉区︑一ωυUZ20ふ弘︿出トm‑500

4003002君。

100oControl

10‑5!
(}u

710‑

15‑deoxy‑
A12，
14̲
PGJ2(M)‑613‑

図 9. trogli
細川の五ます誉総君主分化誘導i
こがする BMM!
こ対するi¥If
査作用mwO)022{+)江︿広↑{一一申書¥時間

1.
0 10 25 50
Troglitazone(μM)

2の磁脅細抱分{獄禁事における s
ηへの蕊紛争淑
図 1O. 附 J
7002‑GbP3=ωG)υZ2(÷)仏︿出H告。e500

400300200100DControl5PGJz10‑‑614ーPGJ
210‑6PGJzl日7(M)図 11.15‑d開xy̲il
I2，14̲PGJ2の彼骨組E
草分化誘導における Sねへの直後作
700(‑Z詠¥約一怒じ)UZWA(十﹀向︿出い自005004申告
300200100。
10‑5Con!
rol

10‑
6710‑

I
5‑deoxy‑il
12，14
̲
‑(M)
PGJ2E
霊12.trogli
脂肪限の磯怜細胞分化長寿導における S
T2への直接 fi;
flJ700(一一倍雰km30)O之友(ふ仏︿江ト義。11.01025Troglit設zone(!
LM)

‑615

50m

がって務制効果が強くなることが鳴らかにされた〈図 13)。絡に、共手子縫違憲 4
自白以降に trogli
緑zone唱を添加した場合でも明らかな抑税効果が認められたことから、その作潟は破骨組総分化の後期にも善意められることが示唆された。

Il<J13. troglitazoneの処汲?総司による殺す総滋分化誘導 iこだずる };~;~~l
700(一⁝申﹀﹀川市北60030)OZE︿や﹀仏︿ぽ↑400

仰(+) い) (+) (+) (→{→(+) (+) {ー.
) (四) (+) (+)(+) →ー) (分{→( い) (Troglitazon
告25pM

一品16‑JrJFJJ

剛{{{Day14Day4‑7Day710︑斗︑寸分O

五段脅総胞の脅吸収能に対する trogぬzoneの作用を pitlll
宝sayそ用いて検討した。 Trog
話細心ne により吸収罪悪の形成は用量依存的に務秘されたく滋 1針 。 したがって、加が3ぬ泌総は被告号線抱形成だけではなく、その機能も務織することが示唆された。

誘導体および間前閥的の破脅締胞分化抑制作用の上記の検討から、 PGJz
主な標的が Sね細胞であることが示唆されたためもこれらの化合物の ST2細胞に対する作用特に脂肪細胞への分化作用について検討した。 ST2細胞を 25詳MtroglitazO担eで 6日間処獲した後、 ST2綴E裂を oilred0染色を行った。 T
roglitazone
により S古級胞はその形態そ紡銭形から円形に変えるとともに綴胞質向に oiIredO染色揚伎の脂肪務が認められた{溺 15) PGJ2誘導体では、 4日間の処0.t
roglitazoneOう際立主主審ぬへの分化促進作潟蕩 15i‑617‑

理では trogliωzone でみられたほどの形態学的変化は見られなかったが、14~21日間の処浬により弱いながら脂肪細胞への形態学的変化が観察された。最後にも結妨綴総への分化に E重要な PPA仰の遺伝子発現に対する往oglit
獄。nむの作煎について NorthernBlot法により検討した。 25泌をなoglit詰zon
告は ST2総般における PPAI
し12の遺伝子然現が経詩的に潟加した(図 16)。

E芸1品 . 加'gli
担zoneのPPA設yj
藍伝子の発漢にまぎする f
1om

PPARy1
帝HPPAR)'2~

Oa子s:

容

3 5 1 9 11L‑
̲̲̲̲̲̲̲̲̲̲̲̲̲̲

351

9 11~ILTr
時 限az
棚 e(十}

Troglitazone守([考察]本研究から、 PGJ2誘導体および伽g五回oneは骨芽細胞機能に対して抑制的に作潟することが示唆された。また、被号線胞の分化誘導に対しても抑制的に作用することから、これらの化合物は号警のりモデリングを低下させる可能性が考えられる e したがって、高回転裂の符粗暴露症モデルそ用いた rnVIVO での検討が今後必要であることが推察される。また、これらの化合物の破骨細胞の分化誘導
抑織作用は主として骨随ストロ…マ細胞に作用することによると選手えられた。
また、その機序として脅髄ストローマ総泡を脂紡線路に分化させることにより、その破脅綴胞支持能を低下させる可能性が示唆された。

‑618‑‑