植物トリテルペノイド生合成制御機構の解明
Regulatory mechanisms of triterpenoid biosynthesis in plants（日本生物工学会推薦）

代表研究者 大阪大学

關光

Osaka University

Hikaru Seki

Biosynthesis of plant specialized metabolites is strictly regulated as it is often limited in the specific organs or
tissues, or induced in response to external or internal stimuli. However regulatory mechanism of triterpenoid
biosynthesis is largely unknown. Glycyrrhizin is a triterpenoid saponin produced only in roots and stolons of
Glycyrrhiza species (licorice) in the legume family. It is widely used as medicines and natural sweetener. Glycyrrhizin isbiosynthesized through, cyclization of 2,3-oxidosqualene by β-amyrin synthase (bAS) and oxidations at C-11 and C-30
positions of β-amyrin by two cytochrome P450 monooxygenases, CYP88D6 and CYP72A154, and subsequentglycosylations. Besides glycyrrhizin, licorice also produces soyasaponins. Soyasaponins are also derived from β-amyrin,and CYP93E3 catalyzes hydroxylation at C-24 position of β-amyrin, leading to soyasaponin biosynthesis. The objectiveof this research is to identify TF(s) regulating the expression of glycyrrhizin and soyasaponin biosynthesis in licorice. In
this study, we obtained eight candidate TFs from licorice transcriptome database and analyzed their activity to activatetranscription from the promoter of triterpenoid biosynthetic genes (bAS, CYP88D6 and CYP93E3) by transienttransactivation assays using tobacco BY-2 protoplasts. As a result, two candidate TFs were able to activate transcription
from bAS and CYP93E3 gene promoters.
研究目的キセル）はもともとタイヘイヨウイチイという針葉植物は動物とは異なり、自ら移動することが出来樹の樹皮から発見された化合物である。また、近年、ない。そのため植物は周囲の環境変化に適応するた抗マラリア薬原料として世界的に重要なアルテミシ

めに、多様な二次代謝産物（近年は特化代謝産物とニンは,中国で古くから生薬として用いられてきたも呼ばれる）を生産する。二次代謝産物とは,アミノクソニンジンというヨモギ属植物の一種が特異的に酸、糖、核酸などの生物に共通に存在し生存に必須生産する化合物である。と考えられるいわゆる一次代謝産物とは異なり、植テルペノイドは二次代謝産物の中で最も構造的に物の一部の属や種が特異的に生産する低分子化合物多様性に富む化合物群である。テルペノイドは炭素である。植物が生産する二次代謝産物は植物界全体

数 5 のイソプレンユニットを構成単位とする化合物で 100 万種以上と推定されており（Afendi et al.,

群であり、イソプレン単位の数によってモノテルペ

2012）、一般に、生物的、非生物的ストレスに対するン（C10）からポリテルペン（>C40）に分類されるが、防御に重要な役割を持つと考えられている。例えば、そのうち 6 個のイソプレン単位からなる炭素数 30

害虫による食害に対しては直接的に害虫の生育を阻の 2,3-オキシドスクアレンを共通前駆体とする化害するアルカロイドや、害虫の天敵をおびき寄せる合物群はトリテルペノイドと称される。トリテルペテルペノイドなどを生産することが知られている。

ノイドには、カンゾウ（甘草）のグリチルリチンや同時に、植物二次代謝産物は、医薬品、香料,食品薬用ニンジン（人参）のジンセノサイドに代表され添加物原料などとしてヒトにとって重要な化合物群

る漢方原料（生薬）の主活性成分の他、オレアノーである。例えば、20 世紀最高の抗がん剤といわれ、ル酸やベツリン酸など、機能性食品素材、化粧料素乳がん治療等に広く使われるタキソール（パクリタ材、あるいは新規医薬品のリード化合物となりえる多様な生理活性物質が含まれる。これらの化合物が統において顕著に高いことを見出した。このことは、有する生理活性については多数の薬理学的研究がな両系統間におけるグリチルリチン含量が生合成酵素されてきた一方で、植物においてこれらの化合物が遺伝子の転写レベルで決定づけられていることを示

どのように合成されるのか？、生合成およびその制唆する。そこで、β-アミリン合成酵素、CYP88D6 お御機構についての研究は極めて少ない。

よび CYP93E3 遺伝子について、グリチルリチン高含

本研究では、マメ科の薬用植物「甘草（カンゾウ）」

量系統と低含量系統の両系統から転写制御に重要とのみが生合成するトリテルペノイド配糖体であり肝推定される翻訳開始点上流約 2 kb のプロモーター領炎治療剤、抗炎症剤等として多用されている「グリ域 DNA 断片を単離し塩基配列を比較した。その結果、チルリチン」（Hayashi and Sudo et al., 2009）お両系統間でプロモーター領域中に DNA 多型が見られよび、マメ科植物全般が共通して生産するトリテルたことから、これら DNA 多型によってプロモーターペノイド配糖体であるソヤサポニンに注目して、そ活性が変化している可能性が考えられた。そこで、れらの生合成がどのようにコントロールされているこれらのプロモーターの活性を評価することを目的のかを明らかにすべく、カンゾウにおけるグリチルとして、各プロモーター断片を GUS レポーター遺伝リチンおよびソヤサポニン生合成酵素遺伝子の発現子に連結したキメラ遺伝子を作成した。カンゾウの制御に関わる転写制御因子の同定を目的として研究

形質転換体作出系は未だ確立されていないため、形を進めた。

質転換個体の作出が容易なモデル植物であるシロイヌナズナに導入した。得られた形質転換シロイヌナ

研究経過

ズナを GUS 染色した結果、bAS のプロモーターでは植物二次代謝産物の生合成は時間的、空間的に高根全体で発現が見られたのに対し、CYP88D6 のプロ度に制御されており、一般に高い組織特異性や外部モーターでは根のごく一部でのみ特異的に発現が見刺激応答性を示す。カンゾウのグリチルリチンの場られた。また、系統間でプロモーター配列に多型が合、地下部の根および地下茎に特異的に蓄積し地上見られたが、少なくともシロイヌナズナにおける部組織からは検出されない。こうした生合成制御に

GUS 発現に顕著な量的・質的な差は認められなかっ

おいては転写制御因子による生合成酵素遺伝子の転た。このことから、「高含量系統では両遺伝子の発現写制御が特に重要であると考えられる。

レベルが低含量系統よりも高い」といった発現レベ研究代表者らは、グリチルリチン生合成に関わるルの違いが、プロモーター配列中の多型よりも両遺酵素として、トリテルペノイドの共通前駆物質であ伝子の発現制御にかかわる転写因子の発現レベルのる炭素数 30 の鎖状化合物である 2,3-オキシドスク違いに起因する可能性が高いと推察された。

アレンを閉環してβ-アミリンを生成するβ-アミリ

そこで、これら生合成遺伝子の転写制御にかかわン合成酵素(bAS)、および、β-アミリンの 11 位炭素る転写制御因子の探索を進めた。カンゾウの培養細および 30 位炭素の酸化反応をそれぞれ触媒しグリ胞におけるβ-アミリン合成酵素遺伝子の発現は、培チルリチン生合成に向かわせるシトクロム P450 酸

養細胞にメチルジャスモン酸を処理した場合に上昇化酵素（P450）として CYP88D6（Seki et al., 2008）

し、酵母抽出物エリシターを処理すると逆に低下す

および CYP72A154（Seki, Sawai, and Ohyama et al.,

ることが報告されている（Hayashi et al., 2003）。

2011）を先に同定している。また、同じくβ-アミリ同様の現象は、マメ科モデル植物のタルウマゴヤシンの別の位置（24 位炭素）の水酸化を触媒しソヤサにおけるトリテルペノイド生合成関連酵素遺伝子

ポニン生合成に向かわせる別の P450 として CYP93E3（β-アミリン合成酵素遺伝子および P450 遺伝子）を先に同定している（Seki et al., 2008）。

についても報告されている（Suzuki et al., 2002）。

カンゾウにはグリチルリチンの含量が異なる様々すなわち、マメ科カンゾウとタルウマゴヤシにおけな系統が存在する。グリチルリチン「高」含量系統るトリテルペノイド生合成は類似した制御機構によとグリチルリチン「低」含量系統における上記遺伝ってコントロールされていると推察される。マメ科子の発現プロファイルを比較した結果、上記の酵素モデル植物のタルウマゴヤシについては、メチルジ遺伝子の発現はいずれも、グリチルリチン「低」含ャスモン酸あるいは酵母抽出物エリシターで処理し量系統においてよりもグリチルリチン「高」含量系た培養細胞由来のトランスクリプトームデータセット （ TheSamuelRobertsNobleFoundation,

http://mtgea.noble.org/v3/index.php）が Web 上で転写因子はソヤサポニン生合成酵素遺伝子の発現制御に関与する可能性が示唆される。

一般に公開されている。そこで、タルウマゴヤシに今後，ソヤサポニン生合成酵素遺伝子の発現制御おいて、トリテルペノイド生合成関連酵素遺伝子とに関与する可能性が示唆された 2 種の転写因子につ発現パターンが類似する転写因子を絞り込んだとこ

いて、まずはこれらの転写因子が直接的に CYP93E3

ろ、1479 種の転写因子から 8 種の候補転写因子を選プロモーターに結合し転写を制御しているかを検証抜することができた。次に、得られた 8 種のタルウする必用がある。そのためにデリーションプロモー

マゴヤシ転写因子と構造的に類似する（アミノ酸配ターを用いたトランスアクチベーション実験を行い、列の相同性が高い）転写因子をカンゾウから単離す

プロモーター中のどの領域に結合するかを絞り込むべく、研究代表者らが作成したカンゾウのトランス予定である。

クリプトームデータベースを用いてホモロジー検索

またタバコ BY-2 培養細胞を用いたトランジェンを行った。これにより、各タルウマゴヤシ由来転写

トアッセイ系よりも、より実際のカンゾウ植物体に因子に対して 83％以上のアミノ酸配列同一性を示

近い条件での転写活性化能を評価するための新たなすカンゾウ転写因子を計 8 種見出した。これらの 8実験系の確立が必要である。上記 2 種の転写因子の種のカンゾウ転写因子について、RT-PCR 法により全機能を解明するための最も確実な方法は、これら転長 cDNA 断片のクローニングを行った後、恒常的な高写因子遺伝の発現を抑制した形質転換カンゾウ個体レベルの転写をもたらすカリフラワーモザイクウイを作出し、ソヤサポニン生合成遺伝子の発現量およルス由来 35S プロモーターの下流に連結したプラスびソヤサポニンの蓄積量を解析することである。しミド（エフェクターコンストラクト）を作成した。

かしながら、現在までに、形質転換カンゾウ個体作続いて、これらの候補転写因子の転写活性化能を出の成功例は報告されていない。ウイルスベクター

評価するためにタバコ BY-2 培養細胞由来プロトプを利用した一過的なジーンサイレンシング手法や形ラストを用いたトランジェントアッセイを行った。

質転換毛状根組織の作出などの手法を駆使して、今単離したプロトプラストに、bAS、CYP88D6 および回見出した 2 種の転写因子のカンゾウにおける機能

CYP93E3 遺伝子プロモーターをそれぞれ GUS レポーを明らかにして行く必要があると考えられる。

ター遺伝子の上流に連結したレポーターコンストラ
クトと各転写因子のエフェクターコンストラクトを参考文献

同時導入した後 GUS の活性を測定した。その結果、

1.

Afendi, F. M. et al.: KNApSAcK family databases:

２種の候補転写因子が転写活性化能を示した。そのintegrated metabolite-plant species databases for

うち一種は、bAS、CYP88D6 および CYP93E3 遺伝子プ

multifaceted plant research. Plant Cell Physiol., 53,

ロモーター全てに対して転写活性化能を示し、特に1-12 (2012)

CYP93E3 遺伝子プロモーターからの GUS 活性を約 17

2.

licorice, Plant Biotechnol., 26, 101-104 (2009)倍上昇させた。またもう一方は CYP93E3 遺伝子プロモーターからの GUS 活性を約 7 倍上昇させた。以上

Hayashi, H. and Sudo, H.: Economic importance of

3.

Seki, H. et al.: Licorice β-amyrin 11-oxidase, aの結果から、これら 2 種の転写因子がカンゾウにおcytochrome P450 with a key role in the biosynthesis

けるソヤサポニン生合成酵素遺伝子の発現制御に関of the triterpene sweetener glycyrrhizin, Proc. Natl.

与する可能性が示唆された。

Acad. Sci. USA, 105, 14204-14209 (2008)
4.

functional genomics in licorice for identification of

考察

CYP72A154 involved in the biosynthesis of

植物細胞における bAS，CYP88D6 および CYP93E3

glycyrrhizin, Plant Cell, 23, 4112-4123 (2011)

に対する 8 種の候補転写因子の転写活性化能を調べた結果、2 種の候補転写因子が CYP93E3 プロモータ

Seki, H. Sawai, S. and Ohyama, K. et al.: Triterpene

5.

Hayashi, H. et al.: Up-regulation of soyasaponin

ーの活性を上昇させた。またこれら 2 種の候補転写

biosynthesis by methyl jasmonate in cultured cells of

因子の発現パターンを調べたところ、CYP93E3 と発Glycyrrhiza glabra. Plant Cell Physiol., 44, 404-411

現パターンが類似していたことから、これら 2 種の(2003)

6.

Suzuki, H. et al.: A genomics approach to the early

biosynthetic genes using transgenic Arabidopsis

stagesthaliana.

oftriterpene

saponinbiosynthesisin

25thInternational

Conferenceon

Medicago truncatula. Plant Journal 32, 1033-1048

Arabidopsis Research (Vancouver, Canada, July

(2002)

2014)3.

田村啓太、關

光、平岡靖子、斉藤和季、村中研究の発表

俊哉：薬用植物カンゾウのグリチルリチン生合口頭発表

成遺伝子のプロモーター解析、第 32 回日本植物1.

田村啓太、關

細胞分子生物学会大会（2014 年 8 月、盛岡）光、平岡靖子、持田恵一、斉藤和季、村中俊哉：植物トリテルペノイドサポニ

4.

K. Tamura, H. Seki, Y. Hiraoka, K. Saito, T.

ン生合成制御機構の解明、第 55 回日本植物生理

Muranaka: Promoter activities of glycyrrhizin

学会年会（2014 年 3 月、富山）

biosynthetic

genes

intransgenic

Arabidopsis

thaliana. Metabolomics Workshop (Ardmore, USA,March 2015)

ポスター発表1.

2.

田村啓太、關

光、平岡靖子、斉藤和季、村中俊哉：薬用植物カンゾウのグリチルリチン生合

誌上発表

成遺伝子のプロモーター解析、根研究学会 第 40

1.

H. Seki, K. Tamura, T. Muranaka: P450s and回根研究集会（2014 年 5 月、北海道当別）

UGTs: key players in the structural diversity ofK. Tamura, H. Seki, Y. Hiraoka, K. Saito, T.

triterpenoid saponins, Plant Cell Physiol., in press.

Muranaka:

Promoteranalysisof

glycyrrhizin