胎児の成長・発達に及ぼすコレステロールと多価不飽和脂肪酸(PUFA)の影響に関する研究
帝京大学医学部小児科学教室教授 阿 部 敏 明助

手花香里子

園立健康・栄養研究所臨床栄養部室長 松 本 明 世

国立健康・栄養研究所特別客員研究員板倉弘重

要約:
胎児、乳幼児期における脳神経系の正常な形成・発達にとって栄養は重要な因子である。発達期におけるドコサヘキサエン酸 (DHA)の多量摂取は学習能力向上や網膜発達に影響を与えるなど、その機序の解明は小児栄養の大きな課題である。一方、 DHAは脂質代謝調節に影響を与えることが知られている。コレステロールはミエリンを含め、脳神経系の形成に必須な物質であるが、中枢神経系における脂質代謝は血液・脳関門の存在からも他の臓器とは異なる機構で制御されることが予測され、特に成長・発達期における脳のコレステロール代謝系に及ぼす DHAの影響は解明されていない。我々はこれまでに、コレステロールは諸臓器および器官の形成・発達に強く影響することに注目し、コレステロール合成系の律速酵素である HMG‑CoA還元酵素の発達に伴う発現量の変動を解析し、脳の骨造鞘化に伴いその発現量は増加することを示した。また血中リポ蛋白から細胞へのコレステロールの取り込み(供給)量を検討するため、 L
DL受容体の発現が一定であることを示した。さらに、出生前のコレステロール代謝の変化も解析し、 L
DL受容体と H
MG‑CoA還元酵素の発現量を検討した結果、出生以前において脳の H
MG‑CoA還元酵素発現量の増加を認めた。そこで本年度は、コレステロール代謝の発達に伴う変動を制御する機構あるいは互いに影響を及ぼし合う因子を解明するために、 DHAを多量摂取させ発達期における各臓器の脂肪酸組成の変動を解析し、摂取脂肪酸が脳をはじめ組織脂肪酸組成に強く影響することを示した。

目的:

脂質代謝調節が成長・発達の過程で、脳を含めた様々な臓器形成の発生・分化に関与していることが考えられる。コレステロールは成長・発達に重要な役割をはたしており、生体内におけるその合成系は食事内容(摂取脂質の差異)や摂取量等によって調節されている。神経の発達にコレステロールの合成が重要な働きをしていることはこれまでの研究(1、 2)によって明らかとなっており、脳の髄鞘化を含めた成熟に影響することも考えられる。すなわち、諸臓器および器官の形成に関与しており、ひいては脳神経細胞の成長に強く影響を及ぼしている。発達に伴うコレステロール代謝系の調節機構‑159ーを解析することにより、形成期に必要とされるコレステロール供給メカニズムを解明するための糸口をつかむことができると考え、これまでにマウスをモデル動物として、発達に伴うコレステロールの代謝系酵素の発現量を解析した。
一方近年、ある穫の脂肪酸が生理活性物質として、ポリベプタイドと結合しその活性に関与するなど、新たな役割を示すことが知られ、脂質が互いにその代謝に関与しうることが示唆された。脳神経p田 A)のひとつであるドコサヘキサエン酸 (DHA)
系及び網膜などに多く存在する多価不飽和脂肪酸 (の多量摂取は、学習能力の向上や視力の発達を促進するとされている。 DHAはエイコサベンタエン酸(EPA)やアラキドン酸 (AA)とともに生理活性をもっ物質であり、様々な食品や調整乳などに添加されてきている。脂肪酸が脳の形成期に必要なコレステロールの代謝系に関与していることが考えられ、DHAがコレステロールの代謝に何らかの影響を与えていることが十分に考えられる。

そこで本年度は、モデル動物としてマウスを使い、妊娠時母胎がDHAを多量摂取した場合による発達段階における脂質代謝への影響を検討するために、組織中の脂肪酸量の変動を解析した。

実験対象と方法:

妊娠マウス (ddY)を受精後から授乳後

表 1 飼料組成

由(DHA24%、EPA7%、まで 10%の魚 i
AA396、リノール酸 2%)を混ぜた固形飼料で飼育し、さらに仔マウスは離乳後も母マウスと同様の飼料で飼育した。対照群としてコーン池 (DHA、EPA、AAは共に 0 %、リノール酸47%)を同様にあたえた仔マウスを用いた。仔マウスから
0、5、10、15、20、25日鈴)に脳、経時酌 (肝臓を採取し液体窒素中にて直ちに凍結成分

シュークロース (g)カゼイン (g)αコーンスターチ (g)塩化コリン (50%) (m)セルロースパウダー (g)ビタミン混合 (g)
ミネラル混合 (g)D
Lーメチオニン (g)4502001504501035oi1(g)3100

し脂質抽出まで保存した。表 lに飼料組成を示した。
凍結保存しておいた各臓器は凍結乾燥した後、総脂質を B
lign‑
Dyer
法により抽出した。
含量は凍結乾燥した総脂質に 5 %塩酸組織中の PUFA

メタノール混液を加え加熱してトランスメチルエステル化したのち冷却し、メチル化した脂肪酸をヘキサンにて抽出した。ニトリルシリコンを
HR‑SS‑
10)を装填したガスクロマトフィーで内部標準 (Heneicosanoic
液相とするキャピラリーカラム (acid(21:0))をおき、定量した。ガスクロマトグラフィーの分析では窒素をキャリアガスとし、昇?昆

条件 1iEO‑
190'C:3'C/min、190‑
200'
C・1'C/min、200‑
215'C:1.5'C/minoこ設定した。飼料に用いたオイルの組成を表 2に示した。
‑160‑

表2∞rnoil
脂肪酸組成

Fishoil
脂肪酸組成

同FattyAcid
12:
014:
016:
016:1
18:
0
18:ln
918・2n618:
3n
‑
618:
3n
‑
320:
O20:120:3n6n620・422:
l20:
5n3;
!
4:
OFa!
!
yA
cid
12:
0
14:
0
16:
0
16:1
18:
0
18:
1n9
18・2n
6
18:
3n‑
6
18:
3n‑
3
20:
0
20:1
20:
3n
6
2
0・4
n
622:1
20:
5n
3
2
4・022:
4
n
622:
5n
62
4:1
22:
5n
3
22・6n
3

百ー

0.
0
49.
0
80.
20.9
1
132.5
74
6.
96O.282.
49O.51O.530.
2
9:~2:4n622:
5n624:122:5n322:
6n3相.

Z0.
032.
9618.215.
494.
5723.2
92.
4
9O.2
60.
84O.3
42.
83O.1
12.70O.1
87.
33O.33.
1330.
70
1.
79
24.
22

結果:
仔マウスの体重増加は、出生後から飼育期間中の 25日齢まで両群関に差は認められなかった。
マウスの肝臓における総脂肪酸中のリノール酸含有率の変化を図 lに示した。リノール酸を多く含摂取群と比較して、会期間を通して高い値を示した。一般に、肝臓の脂肪酸組成はむ対照群は、 DHA食餌の脂肪酸組成を反映しているといわれており、母乳中の脂肪酸組成の影響が推測された。脳におけるリノール酸の含有率は、対照群で1.2%、DHA群では0.
5%以下と肝臓と比較して 1/10程度の低値を示した(図 2)。
肝臓における総脂肪酸中のアラキドン酸の含有率は、対照群では0、5日齢の 10%から 10日齢で 7%に減少したが、再び15%以上に増加した。 DHA摂取群では、 0日齢の 5%から漸次増加し、 10日齢で5日齢で最大に達し、以降減少傾向を示した(図対照群が減少したため対照群より高値に転じたが、 13)。脳におけるアラキドン酸の含有率の変化を図 4に示した。対照群では 12‑15%で、 DHA摂取群の7‑10%に比べ常に高い値を示した。
161ー肝臓における EPA含有率の変化を図 5に示した。 DHA
摂取群の O日齢で 5 %のEPA含量を示し、 5日0日から 15日齢にかけて約 3 %、20日齢以降再ぴ 5 %以上に増加した。
齢で 1 %程度まで減少したが、 1

しかしながら、対照群ではほとんど蓄積は認められなかった。図 6に脳における EPA含有率の変化を摂取群は対照群と比較し、 0日齢で 1C倍以上の含有率を示し、成長に伴って減少した。
示した， DHA含有率の変化を示した。。日齢で DHA
摂取群は対照群の約 5倍の含有率
図7oこは肝臓における DHA(35%)を示し、また全期間とも摂取群でDHA含量撃は高値を示したが、成長に伴って減少し、 25日齢では 22%であった。一方、対照群では全期間とも 10%以下で、ほぼ一定の値であった。マウスは20日齢前後で離乳し親と同じ飼料を摂取するようになるので、ここから減少傾向が強くなる原因として母乳が図形飼料より特定の脂肪酸を濃縮しているか、または吸収されやすいからではないかと考察された。
脳神経系細胞膜の構成脂肪酸として DHAが多量に存在することが知られているが、コーン油で飼育した対象群でも出生直後のO日齢で 12%と高含量を示し、成長に伴って増加し 15日齢で 16%とプラトー摂取群では O日齢で 18%と対象群の1.5倍の含有率を示し全期間を通して対象群に達した(図 8)0 DHAと比較して有意に高い値を示した。しかしながら、脳の DHA含有率に与える DHA摂取の影響は肝臓に含量が通常食の摂取でも多較べて少ないことが示唆され、これは脳細胞膜の構成脂肪酸に占める DHA含有率が増加し、対象群より早期の 10日齢でほいためであると考えられる。また、成長に伴ってDHA)ぼプラトーとなる 22%にまで増加した(図 8。

図Linoleicacid(18:2n6)contents(%)intotallipid0
1inliver302520(~ 15・d105。

。

510152025
Oays (n=5"Meanま50)

一162‑

図2 Linoleicacid(18:2n6)contents(%)intotallipi
d0
1mouseb
rai
n

1
1.
6'
1.
4'
1.2

1ポ}0.
80.
60.
40.
2。

。

52520
15Oays(n=5"Mean:50)

10

図 3 AA(20:4n6)contents(%)intotallipid01liver

252015}ポ{105。

。

5252015Oays(n=5"Mean主50)

10口w図4 A
A(20:4n6)∞ntents(%)intotallipid01brain
18
161412々(' 108642。

。

51
5102025Days (n=5"Mean定5D)

図5EP
A(20:5n3)contents(%)intotallipid01liver

8765){
ポ 432。
1。

510152025Oays (n=5"Mean士50)‑164‑図 6 EPA(20:5n3)contents(%)intotallipidofbrai
n'
1.4

1.
2
10.
8}
ポ{

0.
60.
4。
。
.
2。

510152025

Oays (n=5"Meanま50)

図 7 DHA(22:6n3)
contents(%)intotallipi
dofliver40353025
ポ 2015105。

。

5101520

Oays (n=5"Meanま50)

165ー25図 8 DHA(22:6n3)contents(%)intotallipid01brain3025105。

。

510152520主50)
Oays(n=5"Mean考察:

多価不飽和脂肪酸である DHAを摂取させたマウスの発達期における脳及び肝臓の脂肪酸組成の変動
摂取の実験群は対照群と比較して脳、肝臓とも DHA含量が有を解析した。検討会期間において、 DHA意に高値を示し、摂取脂肪酸が組織脂肪酸組成に強く影響することが認められた。一方、脂肪酸の種類、臓器別にその変動は異なり、ある一定以上摂取し続けてもプラトーに達する脂肪酸と増加または減少を続ける脂肪酸が認められた。
以上のように、組織により摂取脂肪酸の紙織脂肪酸含有量に及ぼす影響の程度や各脂肪酸含量の変動に組織特異的な差異が認められ、これは組織・器官には機能発現のため細胞構成に違いがあり、それを維得するための制御機構が働いているためであると考えられる。したがって、摂取脂肪酸の脳をはじめとしてそれぞれの器官形成に及ぼす影響について、コレステロール代謝系遺伝子の発現調節に及ぼす作用の解析も含め、胎児期から、また他の臓器においてもさらなる検討が必要と思われる。

結由.
日間 .

昨年度までに、出生前後のLDL受容体と田1G‑CoA還元酵素の発現量を解析した。目的ーCoA還元酵0日齢で増加が認められた。 LDL受容体の発現量が一定で変化が見られない
素の脳の発現量はー5、5、2ことより、 5日齢での増加は胎仔の脳の発達に伴う細胞増殖の為の膜合成に必要とされるコレステ

0日齢の増加はオリゴデンドロールの増加に、また 5日齢の増加は髄鞘化に伴うものと考えられる。 2‑7倍の増加は、オリゴデロサイトの増殖に伴うものと考察される。胎生期、ミエリン形成期における 4ンドロザイトの増殖によると考えられる 3倍の増加量に比べ非常に大きなものであった。この胎生期、‑166ーオリゴデンドロサイトの増殖期における増加によって、脳内で代書官的に安定なコレステロールが相当量蓄積されてきており、ミエリシ形成期に必要なコレステロールを賄っているために、発現の増加が軽度にとどまっているのではないかと推論される。また、脳では他の臓器と比較しでも成熟マウスに対してこれらの時期の増加率が大きいものであった。さらに、出生以前における勝体血中の脂質分析のデータにおいて膝体静脈血と際体動脈血を比較した場合、コレステロール含量や LDLコレステロールには有意な差は認められなかった。このことはコレステロールの供給が母体の勝帯静脈に依存しているとは考えにくく、胎児自身の合成によりまかなわれている可能性が高いと考察される。脳の形成発達に際し必要とされるコレステロールの胎児期、乳児期における denovo合成の重要性がより明らかとなった。また、コレステロール合成系最後の酵素ム 3， 7̲S町 '01，ム 7 reduc阻seの障害によりヲ i
き起こ司される Smith‑Lemli‑Opitz症候群に見られるように、全身の様々な臓器の未成熟による奇形が生じることからも、胎児自身によるコレステロールの合成が行われなければならないことが言える。我々のこれまでのコレステロール代謝関連の酵素の変化が示す結果は、胎児期におけるコレステロールの重要性を示し、その供給が脳自身の合成により賭われていることを示した。本年度、コレステロール代謝に関連していると考えられる脂肪酸をターゲットに解析を行った。組織脂肪酸は摂取脂肪酸の種類によって変動し、その臓器に特異的な脂肪酸が増減していた。今後、摂取脂肪酸の相違によるコレステロール代謝系の酵素の変動を解析していく予定である。

参考文献:(1) AstemisPS
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