立是正調整に関わる平清錨および内皮細胞のカルシウム制御機構
東京大学大学線医学系研究科事務総分子薬瑳学分野教授鍍

野正 光

はじめに動脈の紋織は、末税抵抗を毒性御して鼠互のコントロールに中心的役剰を果たしている。
反撃さは内膜、中 E菜、外膜の三尊重からなり、内援には内皮細総、q:.膜にはネ滋筋細胞、動E
外践には結合組織とそのゆを走る交感神経線維が存在する o 血管平治務細胞は、交感神絞支配当と受け、衿経伝迷物質のノルアドレナリンは、 α受容俸を介して王子滑筋細胞内カ
I'青筋の収総合引き起こす。ー方、内皮依存性殺緩思子
ルシウム濃度を上昇させ、主f(EDRF)の発見により(1)、内皮細胞は生理活性物質合産生・放出して、立証管トーヌス調

節発事4こ関与していることが明らかにされた。すなわち、血管内皮綴脇は、アセテルコリ、ずり応カなどの刺激により、内皮由来t己管弛緩悶子こを放出す
ン、ブラジキニン、 ATPお采i鬼管弛緩関子として、一酸化き霊祭 (NO)が同定されている (2)。内皮綴る。この内皮 E合成酵素が存在し、いi
皮純胞内のカル胞にはカルシウム/カルモジ ユリン依存性の NO!
l上昇が、 NO合成の引き金となる o アセチルコリン等で、内 E主総胞を刺激する
シウム濃 Iと、内皮細胞においても、カルシウムオシレーシ詩ンとカルシウムウニL…ブが観察され3)。この際に、 NOが幾主主され、血管平滑筋細胞に拡激して血管のき滋緩を引き起こする(

工作F
誌については鈎々の刺脇レベルでは解明さと考えられている。しかし、総ぬ隠の相 3れていない。
我々は、すでに共焦点レーザー顕微鏡を潟いて、組織構築を維持した血管壁における4)。
倒キの綴ぬ応答を可筏{とするという新しいカルシウムイメ…ジング法を確立している (共焦点顕微鏡は、総点深度を浅くしたき設光顕微鏡であり、毅織機ヨドを渇いても、厚さ数rμmの断層 f象(たとえば工jZ背筋璽だけ)を観察することができる。さらに、焦点耐を上に動かすことにより、内皮細胞綴と平湾筋細胞層を偲別に観察できると考えられる。
そこで、内皮総総円滑筋総胞の相互作用会組制で解析するため、立す物レンズのピェゾドライフーを装備した共然点顕微銭安潟い、焦点童話を数 μm上下させることによ号、平潟筋層と内皮膚;こ交3
れこすばやく然点を会わ牧、それぞれのカルシウム動態を繍郊にかつ倍々の細胞において測定することを試みた。その給与柱、内皮綴胞による長誌をま収縮制御
誇筋細胞のカルシウムオシレーシ 3 ン頻度が関与することが切らかになった (5)。に、3ft635‑

方法》
ふ

本
{3量約 50g(J)雄性ラァトの頭部を 2
詳し、で炎衿させ、頚誌を弱弱し j
混血致死きそ丈:後、馬動脈を絞りおした。摘出した尾動厳令、金王室約主義溶液 (PSS，表1)中古こ没し、i
楽く総合組織を取り除き、分岐している総動脈を結殺した。この尾動派様本に、さ設光カ40凶，fFluo‑3AM) を会ItPSS"台、動脈壁の内際から渓流した o 長方形
ルシウム指示薬 (のガラス毛細管(幅 300c‑‑400μm)安、)E5動脈標本(長さ約 8加 ni)の内腔 lこ将入し v 平ら

t.oを作った(図 1A)o3ft
骨筋細胞の動怒を抑制するために、 10凶1サイト カラシン D'i

処主唱をした(6)。標本を固定した 3
経験機会側交顕微鏡(Ix70、オリンパス)のステージj二に濁定し、マイクロウオームプレートを沼いて実験槽内のi箆度を 28:""
30'Cに保った。

カルシウムイメージングは芸名然ぷレーザー顕微鏡 (Fluoview、オリンパス}会 F
おいて行い、通常256x256ピクセル (120x120ドm)のイメ」ジを、:フレ…ム/秒の i
返さで取り込んだ。この共焦点顕微鏡のz絡の解像度 i立、約 2.5J.lmであった。さらに、後尽した顕微鏡には対物レンズ会ピエゾドライブで急速に上下させる機意告が付加冬れている。
これを用いて平滑筋層と内皮紛胞畷に交互に焦点を合わせることができた。この践の移.
2秒であった。カルシウムイメージ解析は、 I
PLabプログラムを使動に要する時間は 0いパーソナルコンピ品…タ上で、行った。

表1.実験に使脱した型的援溶液(PSS)の組成
(mM)
NaCI

154KCIヰCaClz

2MgClzHEPES*

5悲glucos

5.
6

HEPES:N2‑hydroxyethylpiperazine‑N'‑ethanesulfonicacid

ホ欄結果1)率湾筋綴織におけるカルシウムウエーブ
Fluo-3 を重要殺したラット尾動霊長血管組織において、交!議手~絞ネァトワークを電気刺激
すると、すべての王子治筋線胞が湾類して反応するのではなく、偲々の平滑筋線胞でばらばらに、細線内カルシウム濃度の愚綴的な上災，が綾察された (4)(
図 1C、下 3段)。ま‑63
喜一

た、この潔織的カルシウム濃度上昇(カルシウムオシレーシ謡ン〉は、さ芝織的にみると、0μml
器綬援の室長獲で伝援するカルシウムウエーブを形成していた (4)。このカ総胞内を 2
土、神経を電気科激した場合だけにみらルシウムオシレ…シ詩ン/カルシウムウエーブi4)。またノれるものではなく、…廷の渓lJtのノルアドレナリンを投与しても観測された (ルアドレナリシによる反応は線総外カルシウムを除去しでも観祭されたので、綴胞内カルシウム放出に依存した反応であることを示している。このように、カルシウムオジレ…
ション/カルシウぷウエ〕ブは、細胞内カルシウムストアによる動脈平滑筋細胞のまま本幾度上昇パタ…ンと考えられる。
的なカルシウム j
またカルシウムオシレ…ジ!沼ン l
立、図 1C下 3段のように細胞毎に具なった時相で起ニるため、平均化された組織食休のカルシウム濃度変化はオシレーショシとしては観測されず、平滑な反応として観測される(図 lC最上段参照) 0 すなわち、新しいカルシ

鼠専ウムイメ}ジング法により、綴織念体ではカルシウム応答が平滑化されてみえても、 fの細胞でみるとすべての王子湾筋線胞は同じように反応していないという事実が溺らかになった。
込".2) 内皮恕践とヰzi
号筋線胞のカルシウム議議室蓄の問雲寺可筏化

E
窓2I
主、動霊長壁 (}:J設内耳警の i
存主主総殺から、立す物レンズのピエゾドライアによって 3μm潟需で外側IH
こi
脅かつて焦点在立変動かして?専られた断層像を示している。外撲中にあluo‑
3負待によっては綴察しにくかったが、 10凶14‑
Dic2‑ASPる衿経ネットワークは、 Fを 短 待 問 (15秒)処理することで綴察できた。これから分かるように、焦点面を約 6μm移動させることで内皮細胞主平湾筋綿胞は別々に観測することができた。そこで、
関 3 に示すように、ピエゾドライブで対物レンズ;，r'~.、i迭に 6μmJニ下させて、交互に内皮細胞層と平滑筋細胞層を観測した。
図 4に示すように、アセチルコリンを投与すると、内皮細目訟でカルシウムオシレーションが観察された。さらに詳しく甑像解析を行うと、内皮鰍!阪でもカルシウムウエーブが観測されることが分かった。この持、電気刺激により交感衿綬念総激して王手務筋細殺におけるカルシウム動態を観察したところ、線々の縦脇で 7])
レシウムオシレーシ zンの頻5)。
度が、ア‑tチ Jレコりンを投与しないときに比べると滅少しているごとがわかった (J)額凌は回復しア‑tチルコリンを取り除くと平滑筋におけるカルシウムオシレーシ諮ン tた{鐙 4C) 。
‑637

3') 平滑筋のカルシウムオシレーシ溺ンに対する NOの関与
以上の結果はーアセチルコリンによってを色じた内皮細胞のカルシウムオシレ…シ沼ン
カえ恐らく内皮由来血管制緩悶予である NOを介して、血管平滑筋のカルシウムオシレ…
ション頻度を低下させているこLと:r峻している。アセチルコリンの効果が、災際 NOを介しているかを明らかにするために、 NO合成組審薬である NG‑ニトローしアル'fニン(L‑NA)処理をした影響を調べた。アセチルヌリン投与の問、内皮細胞におけるカルシウ
ムオシレーション;ム L‑NA移設下でも変わりなく検出された。さらに電気科激により交感神経を料激した際の王子滑鯵綴胞におけるカルシウム動態を観察してみると、カルシ
ウムオシレーションの頻度の減少は綴察されなかった{図 5)o 5J1Jの NO
合成政3
毒薬である:∞J.iMNG-ニト江L- アルギニンメチルエステル (L-N品4めでも同様に、~滑筋のカルシウム応答に対するアセチルコリンの効果が消失した。これらの結果から、アセチルコリンによる反応は、主として NO:r介するものと考えられ、 NOは平滑筋細胞のカルシウムオシレーション機構を抑制して紛胞内カルシウム濃度を低下させていることが示唆された o
この仮説を検証するため、 NOドナーマあるソデイウムニトロプ jレシッド (SNP)の影電撃を調べた (7) 0 NOを介しているなら、主JZf
脅筋縦胞のカルシウム応答に対してアセチルコリンと同じ効果を示すことが予想される。関 Gで7Fすように、電気刺激によって引急怒こされた視野全体の平滑筋絡胞における綴胞内カルシウム濃度の増加は、 i同4の SNP投与ぺこより減少した。怨々の王子治務総滋レベルでは、雲~ 6(エリア 1‑3)I
こ示す

ように、カルシウムオシレーションの綴皮が減少していたが、ピーク伎にはあまり影響がなかった (5) 。実験構内にノルアドレナリンを投与した場合にも同様の結果が得られた。以上のことから、 SNPの平滑筋に対する作熔は、ゑとして NOを介するものと考えられ、 NOはカルシウムオシレーション機構に{学期してその頻度を低下させ、結果として細胞内カルシウム濃度を低下させていることが明らかになった。

おわりに最新のカルシウムイメージング法を駆使して、組織構築を維持した泊l
後援における憾々の細胞応~:r術後イじすることかできるようになっと。これにより、鼠後王子滑筋総胞では、縮施内ストアからのカルシウム放 i
誌により、カルシウムオシレーシ諸ン/カルシウムウエーブが形成され鼠撃を緊張の維持・総?却に深く穏与していることが鳴らかにされた。ま一邑38‑

た、内皮細胞から産生される NOは、カルシウムオシレーシ田ンの瀕g記念事変えることにtシレ…シ g ンより血管の弛緩を引き起こしており、従って、lUl圧調節にはカルシウム :の頻佼が深く関与することが示唆された。今後は、 NOのカルシウムオシレ…シ苛ンに対する作用のメカニズムおよび病態との関係についても所究会進めていきたい。

:.、本研究により、共焦点顕微鏡にピエゾドライブを緩み合わせたシステムを用い
まt
立、血管に絞らずることによって Z軸方向の情報も得られることが示された。この方法 i{患の総織への応用も期待される。今後、測定機器や蛍光指示薬の開発とアイデアを綴る
主主主きたままの綴ことでさらに詳綴なイメージングが可能になるであろう。また、将来 i
終における綴々の総胞害事におけるカルシウム動態もiiT設化できるようになるものと期待している。

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U
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図 1血管援内単一平浴室主総胞のカルシウム 1
み毒事A. ラット尾数派内壁にガラスキャピラリを挿入して標本を協定したの
ゐ "N

B F
I∞‑
3で染色されたま 語筋細胞i
議6

まBの視野会イ本のカルシウム波茂変化を平均化した反応。
C.最上段 i
下 3設は、 Bの し 2、 3でされた♂ノj、領域におけるカルシウム濃度変化。

‑
640，部
1

oμm

剛‑
3J!
m‑18μm

‑6μm.
l符3‑
21f

‑9μm

‑24μm

‑12μm

‑
27.J!m
.
.
.
.

15ょtm

50J
lm
・開閉剛附則剛阻鴎

問 2霊会光染色された動隊器産の j存会長点、綴微鏡による断緩像
般内 j
授にある内皮総胞から 3μm悶隠で得られた中淡および外股のの断罪霊像。内皮総H
止動産まのlUl流カ向;こ平行に、そして、中波平滑筋線燃は虫i
流と垂疫に並んでい胞の長車Iるのが分かる。内 E
長選JI胞と平機筋線!胞は F
luo‑
3で染色し、外股ゃにある交感神経ネット
ワークはふ訪朝子ASPで染色した。

‑641‑

工ララ\~\可空三三~ c:::::>
こー̲endo!helialcel
C ご 三 園 圃 圃 園 町noo!hmusclecells

亡ご之こコ

¥

開開図 3内皮制1111
包と平滑筋細胞の同時測定。
対物レンズを 6μm上下させることにより、内皮層と平滑筋層の単独の断層像古河専られる 内皮層と平滑筋層のイメージは、1.2秒(このうち、焦点面の移動に要する時間はp0.
2秒)間隔で交互に取り込むことができた。

‑642ーBAS開。 othmusclecellsendothelialcells

袋、lerage;~竺

:Lcd出向JV~~zjjg
みωJAill;~ユルムム。

20

融制 a0 ・w
由=由︒﹄F
E3Zc

T‑

40

T

8060

τ
1m.(.
)

，
100。

T

鵠

‑

4060

τ

80

100Time担}ControlAChAftercontrol

01234567890123456789 0123456789

Numberofoscillations図 4内j支事JI砲による司王滑筋のカルシウムオシレーシ宝ンの制御

A. アセチルコリンによる内皮紛!日立のカルシウムオシレぃシ羽ン {灰色紙)。
B.内皮細胞でカルシウムオシレーシ謂ンが起きている H
寺に交感神経を刺激すると、::J

ントロール (祭事議) I
こ比べると、オシレーション (J)綴度が減少しているのが分かる

0.叉低級)。
C 平湾筋線IJ
Y&.におけるカルシウムオシレーションの頻度 (J)解析。 アセチルコリンによちオシレーシ百ンの頻度が減少している細胞の委主が悶えているのが分かる (ゅうた} 。
アセチルコワンを取り除くと閥復した(:ti)。

一品43‑

a1、

u.
.32

1o20

4060

80100s語~5 NO会)ïIt~註療薬i の彩毒事ト101是認定!
縫ミ
整然 (1むOp1l遣しNA) 務処理後}こは、交感111
1経電気刺激によって生じる不十号

室主義副総内カルシウムオシレーションの頻J~;土、アセテルコリンによって変化しなかった。
従って、ア{!チルこJ'J ン投与による守主滑筋総~のカルシウムオシレーシヨン綴皮の減少は、 NOをチトしているものと考えられた。

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務総j版。ヲカルシウムオシレ…ション}こ対する SNPiI){全沼

電気車昔話設によって引き起こされた鞠子会終iI)綴!腕カルシウム淡皮の上部土、 NOドナーて、ある 1j.
!
MSNPによち夢手続された(:ti上;!災'I!lil)トレース) 0 I
幾ふな領域{エワァ;1‑3) では、カルシウムオシレ…シ詩ンiI)要義援が減少しているのが分かる〈左) 0
SNP!
こよちオシレーシヨンの綴渓告さま球少している最号機iI)委究会会i
替えているのが分かる{お下}。
一鎚4‑