色素修飾を必要としない単一タンパク質分光
Single-protein spectroscopy without dye-labeling(個人推薦)

代表研究者

東京工業大学藤芳 暁Tokyo Institute of Technology

Satoru FUJIYOSHI

An advantage of single-molecule fluorescence imaging is the localization precision of molecule beyond thediffraction limit. Although longer signal-acquisition yields a nanometer precision, acquisition time at an ambient
temperature is limited by photobleaching, thermal diffusion, and so on. At low temperature of a few kelvins, much
longer acquisition is possible and will improve precision if the sample and the objective are held stably enough. Thepresent work examined holding stability of the sample and objective at 1.5 K in superfluid helium in the helium bath.
The stability was evaluated by localization precision of a point scattering source of a polymer bead. Scattered light wascollected by the objective, and imaged by a home-built rigid imaging unit. The standard deviation of the centroid
position determined for 800 images taken continuously in 17 min was 0.5 nm in the horizontal and 0.9 nm in thevertical directions.

研究目的

微弱な信号をとらえられるようにすること、（２）にタンパク質には、天然状態で可視の蛍光団を持つ

ついては、空間分解能を向上させ、目標の分子からものがある。このような蛍光団を利用して低温１分の信号を空間的に分離することで解決できる。これ

子分光をおこなえば、色素の修飾せずに、天然状態

ら 2 つの問題は、共に対物レンズの開口数 NA を向のタンパク質をとらえることができる。このような上させることが有効である。そこで、我々は新たな目標の元、我々は低温で使える反射対物レンズや反反射対物レンズを開発している。その結果、これま射顕微鏡の開発をおこなってきた。その結果、Greenで用いていた反射対物レンズの NA = 0.53 から、NAFluorescent Protein やビタミン B2 誘導体を結合した= 0.97 という空気中の原理限界（NA = 1）に近い反光センサータンパク質の温度数ケルビンの 1 分子分射対物レンズの開発に成功した[3]。これにより、集光に世界ではじめて成功した[1,2]。本課題は、この光立体角が 5.2 倍向上し 1.2 str となった。また、空顕微技術をさらに発展させ、紫外蛍光性の芳香族ア間分解能は焦平面方向で 2 倍向上し 0.32 µm となり、ミノ酸の低温 1 分子分光に挑戦するものである。芳光軸方向で 5 倍向上し 1.2 µm となった。都合、空間香族アミノ酸は、タンパク質を構成するアミノ酸で分解能は 20 倍向上した。これらの技術革新により、あり、ほとんどすべてのタンパク質が持っている。

近い将来、芳香族アミノ酸の低温 1 分子分光が実現

もし、芳香族アミノ酸を 1 分子観測する技術を獲得するはずである。

すれば、ほぼ全てのタンパク質を色素修飾無しに分芳香族アミノ酸の低温 1 分子分光が実現した後、析できることになる。しかし、残念ながら研究期間

次の課題は、芳香族アミノ酸同士の相対位置をナノ中には、芳香族アミノ酸からの信号をとらえることメーターの精度で観測することである。そのためにができなかった。この実験の難しさは、（１）芳香族は、低温の光学顕微鏡の機械的安定性をそのレベルアミノ酸の光退色が早いことと（２）励起波長が紫まで引き上げなければならない。そこで、我々は低外(280 nm)であるために高い背景光が発生すること

温の顕微鏡の機械的安定性を検査する方法論を開発にある。
（１）については、集光の立体角を向上させ、したので、以下に紹介する。

色素分子の大きさと同程度（< 1 nm、rAB < 0.01 r1stの条件）の精度で色素１分子の位置を決定できる方法 や [6] 、 STORM （ stochastic optical reconstructionmicroscopy）という光学課程を用いて、回折限界よりも近接した複数の分子の位置を< 10 nm の精度で決定する方法[7]が開発されている。一方、2002 年、Matsushita らは、温度数ケルビンでは、回折限界内にある数百個の分子の位置を数 nm の精度で決定した上で、それぞれの分子のスペクトルと配向を 1 分子ごとに取得できることを報告している[8, 9]。
生体試料の観察において、Far-field 蛍光顕微鏡は、非接触で、試料の厚さ方向を含む３次元情報が得られ、かつ一分子レベルの感度を持つ強力な方法である。しかし、光の回折現象のために、分子やタンパク質の大きさに比べて、１〜２桁空間分解能が低いという原理的な制約がある。例えば、1 個の分子が発する波長λの蛍光を、理想的な蛍光顕微鏡で観測した場合、得られる蛍光画像は、エアリー関数となる。強度の極大から、初めて強度がゼロになる距離
r1st は第１暗環半径と呼ばれ、r1st = 0.61 λ NA–1 M で表される（NA: 対物レンズの開口数、M: 顕微鏡の倍率）。レイリーの定義では（図 1A）、二つの分子からの蛍光像の距離 rAB が r1st に一致する場合（rAB = r1st）が、それぞれの像が分離して見える限界であるとし、これを空間分解能としている。よって、試料位置では M を割り算した距離 r1st_obj = 0.61 λ NA–1 がこれに対応する。NA の限界値は〜1.5 であり、λ = 0.50 µmとすると、rRES〜 0.20 μm となる。また、レイリーの定義と同様に有名なスパローの定義（図 1B、rAB =0.78 r1st）では、rRES 〜 0.16 µm となる。いずれにせよ、可視光による分解能の限界 rRES は、分子やタンパク質の大きさに比べて１〜２桁大きい。
２分子間の距離で定義される空間分解能に対して、蛍光像の位置決定の精度は光子数ゆらぎで決まり、光子数の平方根に比例して精度が向上する[4]。もし 、二つの分子を別々に蛍光させることが出来れば、ス
パロー限界はもとより、rAB = 0.1 r1st の条件（図 1C）
でも、それぞれの位置の違いを蛍光イメージから求めることができる。
このような１分子の位置決定は、1995 年に T.
Schmidt らによって実験的に示された。彼らは、室温下（300 K）で、色素１分子の位置を 30 nm（rAB 〜0.1 r1st の条件）の精度で決定した[5]。現在では、顕微鏡の機械的ドリフトをアクティブ制御することで、室温、低温を問わず、これらの実験の成功の鍵は、蛍光顕微鏡の機械的安定性を、目的とする精度よりも高くすることにかかっている。しかし、一般に、顕微鏡の機械的安定性は回折限界（数百nm）を基準として設計される場合が多く、決定したい位置精度とは1桁以上の開きがある。そこで、我々はポリスチレンビーズの位置決定を用いて、蛍光顕微鏡の機械的安定性を±0.1 nmの精度で定量的に決定できる光学系を作製した。その結果、温度1.5 Kの1分子蛍光顕微鏡の機械的ゆれが、15分にわたり±1 nmに抑制できることを実験的に確かめたので紹介する。
経過と考察
図 2A に、作製した光学系を示す。超流動ヘリウ
ム恒温槽はこれまで数ケルビンのタンパク質 1 分子分光に用いてきたものである[1,2,10]。これは、文献5,6 で用いたものとほぼ同一の設計で制作したものであり、機械的な安定性も同程度であると考えられる。試料と対物レンズ（反射型、焦点距離 f = 2 mm
[11]、NA = 0.53）は超流動ヘリウム中に配置した。
試料には、直径 100 nm のポリスチレンビーズをスピンコートしたガラス基板を用いた。コートの際に、面密度を 10-3 μm-2 に調整することで、個々のビーズの画像を分離して観測出来る条件にした。試料の後方からレーザー光（λ = 633 nm）を集光し、ビーズからの散乱光を対物レンズで集め、f = 200 mm の結像レンズで CMOS カメラ（ARTCAM-130MI-BW、フレームレート：>15 fps、画素サイズ：5.2 m × 5.2m）に結像させた。この結像レンズと CMOS カメ
ラはアルミで一体成形したホルダーに固定し、特に、CMOS カメラはエポキシ樹脂で接着することで、結像レンズと CMOS カメラの相対位置の変化を±10nm に抑えた。図 2A の光学系は倍率 100 倍の光学顕微鏡になっている。このため、結像レンズと CMOS

カメラの機械的ドリフトが±10 nm であれば、試料位置での機械安定性の検査精度が±0.1 nm となる。
図 2B に、図 2A の顕微鏡で得られたビーズの光散乱イメージを示す。原点にあるのが、１個のビーズからの散乱光である。図 2A のような配置では、ビーズで散乱されなったレーザー光は反射対物レンズの小さい球面鏡で遮蔽されるために観測されない。
このため、得られる散乱像は図 2B のような暗視野の画像となる[10]。解析では、直径 2r1st= 0.11 µmの円（第一暗環）の中の信号のみを用いて 1 次のモーメントを求め、これをビーズ散乱像の位置（x, y）とした。試料基板とビーズとの相対位置は数ケルビン下であるため、固定されている。よって、光学系で検出されるビーズ散乱像の動きは、試料と対物レンズとの相対位置の変化によるものと考えられる。
低温での光学顕微鏡の検査を行う前に、検査光学系（図 2A、緑の枠内）の安定度を定量的に検査した。

ー（λ = 633 nm）を入射することで、レーザーのビ検査には、理想的な平面波が必要である。そこで、ーム位置安定性が検査に影響しないようにしている。

検査光学系のデザインを元にした光源を作製した

検査結果を図 3B に示す。1 点あたり 300 回の測定（図 3A、赤の枠内）。この光源は直径 10 μm ピンホをおこない、その標準変化を 1 フレームあたりの時ールとコリメータレンズからなり、検査光学系との間 tframe に対してプロットした。図中の最小の tframe =違いは、CMOS カメラがピンホールになっただけで0.06 秒でも、r1st (= 0.05 μm)に比べて３桁高い精度である。ピンホールはカメラより安定に保持できるの位置を決定できる。さらに、tframe を 1 秒まで長くしで、その機械的安定度は、検査光学系と比べて、同ていくと、CMOS 上での標準偏差は、時間の平方根程度以上である。さらに、直径 10 μm ピンホールにに反比例して減少し、最終的に±10 nm になった。こ対して、十分に大きいスポット径 600 μm のレーザ

れは、tframe < 1 秒では、偏差の主な要因が光子数ゆらぎによることを意味している。一方、tframe > 1 秒

8.

では、偏差は時間と共に増加した。長時間の領域に、

Schmidt, E.J.J. Groenen; J. Chem. Phys., 117, 3383 -あらわれる偏差は設置する定盤の剛性を向上させる

3390 (2002).と減少するため、主に、定盤の歪みに由来すると考9.

えられる。
図 3B の結果から、以下の検査は tframe = 1.5

Meer, G.J. Brankenhoff, J. Schmidt; J. Microscopy; 205,秒で行うことにした。この場合、CMOS 面でのビー

76 - 85 (2002).

ズ散乱像の位置の標準偏差は±10 nm であり、試料面10.

では±0.1 nm の精度になる。

Matsushita; J. Phys. Chem. Lett.; 1, 2541 - 2545 (2010).

図 4A に、図 2A の光学系を用いて測定した対物レンズと試料との機械的ゆれの結果を示す。右の縦軸

M. Matsushita, A. Bloeß, Y. Durand, J.Y.P. Butter, J.

A. Bloeß, Y. Durand, M. Matsushita, H. van derS. Fujiyoshi, Y. Furuya, M. Iseki, M. Watanabe, M.

11. M. Fujiwara, S. Fujiyoshi, M. Matsushita; J. Opt. Soc.
Am. B, 26, 1395 - 1399 (2009).

は CMOS 面で検出されるビーズ散乱像の位置の標準偏差であり（図 3B の縦軸と同じ物理量）、これか研究の発表

ら見積もった対物レンズと試料との相対位置の変化

学会発表の標準偏差を左の縦軸に示す。図の横軸の原点はヘ1.

藤芳暁・大友康平・古屋陽・出羽毅久・南後守・リウムが超流動状態になった時である。定盤に対し

伊関峰生・渡辺正勝・松下道雄; 「タンパク質 1て、水平、鉛直方向（x, y 軸）共に、ヘリウムが超分子の中赤外分光」第 39 回生体分子科学討論会

流動状態になってから数時間で機械的安定性が増加

2012、2012 年 6 月 9 日

していき、5.7 時間後に±1 nm に到達した。この条件

2.

S. Fujiyoshi; 「Observation of vibrational absorptionであれば、文献 5, 6 の数 nm の位置決定は十分に実of single protein at a few kelvins」第 50 回日本生物行可能である。

物理学会年会、2012 年 9 月 23 日

最高の性能となった 5.7 時間後における、基板と3.

稲川博敬・丸尾美奈子・松下道雄・藤芳暁;「温対物レンズとの相対位置の時間変化を図 4B, C に示

度数 K における一分子分光のための高開口数対す。図から、y 軸は x 軸に比べて、約 4 分間間隔の物レンズの開発」分子科学討論会 2012、2P020、

数 nm の揺れがある。この周期は部屋のエアコンの2012 年 9 月 19 日

ON OFF の周期と一致しており、部屋の温度変化に4.

より恒温槽に歪みが生じたためと考えている。

稲川博敬・丸尾美奈子・松下道雄・藤芳暁;「開口数 0.8 の極低温用対物レンズ：一分子蛍光観察による評価」日本物理学会年会、20pFJ-12、2012 年 9 月 20 日

参考文献
1.

S. Fujiyoshi, M. Fujiwara, M. Matsushita; Phys. Rev.

5.

丸尾美奈子・稲川博敬・松下道雄・藤芳暁;「温Lett. 100, 168101 (2008).

度数 K における色素１分子の 3 次元イメージン

2.

グ」日本物理学会年会、2012 年 3 月 27 日.

S. Fujiyoshi, M. Hirano, M. Matsushita, M. Iseki, M.

Watanabe; Phys. Rev. Lett. 106, 078101 (2011).

6.

稲川 博敬・松下 道雄・藤芳 暁;「限界性能を3. 稲川 博敬・松下 道雄・藤芳 暁; 「限界性能を持つ反射対物レンズの開発と数 K での色素 1 分持つ反射対物レンズの開発と数 K での色素 1 分子イ子イメージングへの応用」
分子科学討論会 2013､メージングへの応用」分子科学討論会 2013､3P087、3P087、2013 年 9 月 26 日.

2013 年 9 月 26 日.

7.

虎谷泰靖・丸尾美奈子・稲川 博敬・喜井勲・林4.

Bobroff; Rev. Sci. Instrum., 57, 1152 - 1157 (1986).

宣弘・細谷孝充・松下 道雄・藤芳 暁;「温度数5.

T. Schmidt, G.J. Schütz, W. Baumgartner, H.J.

K の色素分子の三次元イメージング技術の設計

Gruber, H. Schindler; J. Phys. Chem., 99, 17662 - 17668と実現」分子科学討論会 2013､3P088、2013 年 9(1995).

月 26 日.

6.

A. Pertsinidis, Y. Zhang, S. Chu; Nature, 466,

8.

若尾佳祐・濱田裕紀・日野原拓也・松下 道雄・647-651 (2010).

藤芳 暁;「温度 1.5 K のたんぱく質 1 分子イメ

7.

ージング装置の機械的安定性の評価と向上」分

M.J. Rust, M. Bates, X. Zhuang; Nature Methods, 3,793 (2006).

子科学討論会 2013､3P089、2013 年 9 月 26 日.

9.
誌上発表1.

T. Hinohara, Y.I. Hamada, I. Nakamura, M.

Matsushita, S. Fujiyoshi; Chem. Phys., 419, 246-249(2010).