九州シンクロトロン光研究センター
県有ビームライン利用報告書
Ｂ Ｌ 番 号 ： BL11

課 題 番 号 ： 1409129S（様式第 5 号）

広角・小角 X 線回折による骨組織内アパタイト・コラーゲンの力学挙動観察
Observation of Mechanical Response of Apatite/Collagen Phases in Bone Tissue
by Small and Wide Angle Diffractions
東藤正浩，箕輪政伸，但野茂

Masahiro TODOH, Masanobu MINOWA, Shigeru TADANO
北海道大学大学院工学研究院人間機械システムデザイン部門

Division of Human Mechanical Systems and Design, Faculty of Engineering,
Hokkaido University※１※２

先 端 創 生 利 用（ 長 期 タ イ プ 、長 期 ト ラ イ ア ル ユ ー ス 、長 期 産 学 連 携 ユ ー ス ）課 題 は 、実 施 課 題
名 の 末 尾 に 期 を 表 す （ Ⅰ ）、（ Ⅱ ）、（ Ⅲ ） を 追 記 し て く だ さ い 。
利 用 情 報 の 開 示 が 必 要 な 課 題 は 、本 利 用 報 告 書 と は 別 に 利 用 年 度 終 了 後 二 年 以 内 に 研 究 成 果 公
開 ｛ 論 文 （ 査 読 付 ） の 発 表 又 は 研 究 セ ン タ ー の 研 究 成 果 公 報 で 公 表 ｝ が 必 要 で す 。 (ト ラ イ アルユース、及び産学連携ユースを除く)

１．概要（注：結論を含めて下さい）
微視的には骨は無機成分のアパタイト結晶と有機成分のコラーゲン 線維からなる複合構 造 で あ る ．こ れ ら の コ ラ ー ゲ ン と ア パ タ イ ト が 骨 組 織 と し て の 力 学 的 特 性 の 要 因 と なっ て い る ．し か し ，こ れ ら の 微 視 構 造 が 巨 視 的 な 骨 の 力 学 的 特 性 に 与 え る 影 響 は 十 分 に
調 査 さ れ て い な い ．そ こ で 本 研 究 で は ，広 角 ・ 小 角 X 線 回 折 を 用 い て ，ア パ タ イ ト お よびコラーゲンの微視的な変形特性と皮質骨の巨視的な変形特性を調査した．その結果，
巨 視 的 な 組 織 ひ ず み の 増 加 に 伴 い ，ア パ タ イ ト 結 晶 ひ ず み お よ び コ ラ ー ゲ ン 線 維 ひ ず みは増加した．組織ひずみに対し，アパタイト結晶ひずみは小さい値を示し，コラーゲン
線 維 ひ ず み は 大 き な 値 を 示 し た ．こ れ ら の 結 果 か ら ，コ ラ ー ゲ ン 線 維 の 方 が 変 形 を 許 容し て い る こ と が 分 か っ た ．ま た ，巨 視 的 な 骨 組 織 の 弾 性 率 は ，微 視 的 な ア パ タ イ ト 結 晶 ，コラーゲン線維の変形割合に大きく依存していることが明らかになった．
（ English ）Bone is often regarded as a composite material consisting of mineral particl es and organic
matrix (mostly Type I collagen) on a microscopic scale. The mechanical properties of bone
tissues at a macroscopic scale depend on the structural organization and properties ofconstituents in the microscopic scale. However, both mechanical behaviors of mineral andcollagen phases are not clear yet. In this study, both microscopic strain of collagen and mineralphases in bovine cortical bone by using small and wide angle X -ray diffraction, respectively.
As the results, the strain of mineral a nd collagen matrix increased with increasing bone tissue
strain. The mineral strain showed lower value than bone tissue strain and collagen matrix strain
showed higher value. The collagen matrix strain allowed tensile deformation as compared withmineral phase. This study could suggest that macroscopic mechanical properties of bone tissue
depend on the degree of deformation of mineral and collagen matrix.

２．背景と目的
微視的には骨は無機成分のアパタイト結晶と有機成分のコラーゲン分子からなる複合構造である．
特に，剛性・強度の高いアパタイト結晶は骨密度と密接な関係があり，上述の従来の骨強度推定手法の根拠となっている(1)．一方，近年，骨コラーゲンの異常がマイクロダメージ発生の原因となることや，原発性骨粗鬆症や糖尿病などにおいて骨コラーゲンの異常による骨強度低下が認められ，このような微視構成成分に関わる「骨質」の重要性が指摘されている．しかし，コラーゲンの力学的役割，特にアパタイトとの力学的相互作用については複雑かつ微細であり，可視化等による解明も困難であり，その詳細は未だ不明である．
そこで本研究では，Ｘ線回折を利用したコラーゲン－アパタイト両者の構造および力学挙動を観察可能とする小角・広角回折測定系を構築し，微視的力学挙動観察から骨コラーゲン－アパタイト複合構造モデルを提案する．Ｘ線回折測定による両成分の結晶・分子のひずみ情報と負荷応力の関係から，複合構造モデルの材料パラメータ同定を行う．それによりマクロな力学特性を推定する新たな骨質評価手法の提案を目的とする．
３．実験内容（試料、実験方法、解析方法の説明）
試料には，23ヶ月齢のウシ大腿骨を使用した．骨試験片は大腿骨骨幹部皮質骨から切り出した．加工には，ダイヤモンド・ソー（South Bay Technology, MODEL650）を使用した．試験片長軸方向を骨軸方向，試験片短軸方向を円周方向に一致させたものを骨軸方向試験片とした．また，試験片長軸方向を円周方向，試験片短軸方向を骨軸方向に一致させたものを円周方向試験片とした．ダイヤモンド
ソーで切り出した試験片の表面を#1000のエメリー紙で研磨し，試験片厚さを0.2 mmに加工した．試験片表面の洗浄のため，超音波洗浄機（US-1, エヌエスディ社製）を用いて洗浄を行った．自然乾燥させた後，治具間距離3 mmとして引張試験治具に固定した．
本研究では，局所構造ビームライン（BL11）を使用した．エネルギー8keVの偏光電磁石からのシンクロトロン放射光をモノクロメーターSi(111)で分散させ，単色X線として分離した．第一スリットでビームの整形を行い，第二スリットで散乱を除去した．また，真空パスにより空気散乱を抑えた．
試験片に引張負荷を与えるため，図1に示すように引張小型負荷装置を用いた．試験片から2,705 mmの位置に検出器IP（300 mm×300 mm）を設置した．皮質骨の骨軸方向，円周方向の引張強度を考慮し，骨軸方向試験片では，0, 25, 50 MPaの引張負荷を与えた．また，円周方向試験片では，0, 10, 20 MPaの引張負荷を与えた．それぞれの試験片の各負荷条件において，X線を30分間照射し，X線回折像を取得した．IPからのデータ読み取りには読取装置（R-AXIS4, Rigaku）を用いた．読取解像度は100 μmに設定した．取得したX線回折像から１次のコラーゲンピークを使用して，コラーゲン線維ひずみの解析を行った．

図 1 X 線回折系
４．実験結果と考察
図 2 に放射光を使用した時の骨軸方向，円周方向の X 線回折像を示す．図中に対応するコラーゲンの回折次数を記す．回折像の円周上の濃淡はコラーゲン周期の存在頻度を示している．管球式 X線を使用した際は，3 次のコラーゲンピークのみ確認できたが，シンクロトロン放射光を使用した場合，1 次，3 次のコラーゲンピークが明確に確認できた．

図2X 線回折像と X 線強度プロファイル

シンクロトロンを用いた引張負荷時の X 線回折測定により得られたコラーゲン線維ひずみと骨組織ひずみの関係を示す．骨組織ひずみは，光学顕微鏡下の引張試験により得られた組織弾性率と X 線回折測定の際に負荷した応力から算出した．図 3 に骨軸方向，図 4 に円周方向の結果を白丸で示す．
骨軸方向のプロット位置は，負荷応力 0, 25, 50 MPa と各試験片の組織弾性率から算出した骨組織ひずみにおいて測定された値である．円周方向のプロット位置は，負荷応力 0, 10, 20 MPa と各試験片の組織弾性率から算出した骨組織ひずみにおいて測定された値である．骨軸方向，円周方向とも試験片の本数は 1 本の結果を示している．
コラーゲン線維ひずみ εCollagen は，骨組織ひずみ εTissue の増加に伴い増加する傾向を示した．また，負荷方向で比較すると，負荷方向によって変形の割合が異なることがわかる．骨軸方向で，εCollagen=0.89εTissue, 円周方向で εCollagen=0.90εTissue となった．

図 3 骨軸方向負荷におけるコラーゲンひずみと組織ひずみの関係

図 4 円周方向負荷におけるコラーゲンひずみと組織ひずみの関係

５．今後の課題
今回の実験では，実験系の制約上，小角散乱によるコラーゲン線維ひずみの測定のみ行った．今後，骨の複合モデルの同定を行うためには，広角同時測定によるアパタイト結晶ひずみの同時測定が必要である．また試験片数も実験時間の都合上，各 1 本をなったため，個体差，不均質性を考慮すると測定試験片の増加が望まれる．
６．参考文献(1) Todoh M, Tadano S, Giri B, Nishimoto M (2009). “Effect of gradual demineralization on the mineral
fraction and mechanical properties of cortical bone”. Journal of Biomechanical Science and Engineering 4:230-238.
７．論文発表・特許（注：本課題に関連するこれまでの代表的な成果）
Fujisaki K, Todoh M, Niida A, Shibuya R, Kitami S, Tadano S (2012). “Orientation and deformation of mineralcrystals in tooth surfaces”. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials 10: 176-182.
Yamada S, Tadano S, Todoh M, Fujisaki K (2011). “Residual stress distribution in the bovine femoral diaphysis
measured by synchrotron”. Journal of Biomechanical Science and Engineering, 6(2): 114-124.
Todoh M, Tadano S, Giri B, Nishimoto M (2009). “Effect of gradual demineralization on the mineral fraction
and mechanical properties of cortical bone”. Journal of Biomechanical Science and Engineering 4: 230-238.
Giri B, Tadano S, Fujisaki K, Todoh M (2008). “Understanding site-specific residual strain and architecture inbovine cortical bone”. Journal of Biomechanics 41: 3107-3115.
Tadano S, Giri B, Sato T, Fujisaki K, Todoh M. Estimation nanoscale deformation in bone by X-ray diffraction
imaging method. Journal of Biomechanics, Volume 41, Issue 5, 4 March 2008, Pages 945-952.
Giri B, Tadano S, Fujisaki K, Todoh M. Microstructure of bone around natural hole in bovine lumber vertebra.
Journal of Biomechanical Science and Engineering 2: 1-11, 2007.
Todoh M, Ihara M, Matsumoto T, Tanaka M (2004). “Relationship between mechanical property of cancellous
bone and hardness of trabeculae”. JSME International Journal 47C: 1075-1078.
Todoh M, Tadano S, Shibano J, Ukai T. Polychromatic X-ray measurements of anisotropic residual stress inbovine femoral bone. JSME International Journal, Series C, Volume 43, No. 4, December 2000, Pages
795-801.
Tadano S, Todoh M, Shibano J, Ukai T. Residual stress evaluation of hydroxyapatite coating Ti implant. JSMEInternational Journal 40A: 328-335, 1997.
８．キーワード（注：試料及び実験方法を特定する用語を２～３）
生体骨，引張負荷，小角散乱
９．研究成果公開について（注：※２に記載した研究成果の公開について①と②のうち該当しない方を消してください。また、論文（査読付）発表と研究センターへの報告、または研究成果公報への原稿提出時期を記入してください（2014 年度実施課題は 2016 年度末が期限となります。
）
長期タイプ課題は、ご利用の最終期の利用報告書にご記入ください。

① 論文（査読付）発表の報告（印刷物の提出） （報告時期：２０１５年 １２月）
② 研究成果公報の原稿提出（提出時期：年月）