大 阪 大 学 免 疫 学 フロンティア研 究 センターの石 井 優 教 授 らの研 究 グループは、特 殊 な顕 微 鏡 を使 って、生きたままで骨の内 部を観 察することに成功 し、破 骨細 胞が実 際に骨 を壊 していく様子 を、リアルタイムで可視化することに世界で初めて成功しました。

研究の背景
骨 粗 鬆 症 や関 節 リウマチ、がんの骨 転 移 などの病 気 では、骨 が異 常 に壊 されていきます。これらの病態 で骨 を壊している細 胞が、「破 骨細 胞」と呼ばれる特殊に分化 したマクロファージです。これまでの研究において、骨 が壊 されている部 位 に破 骨 細 胞 が集 まっていることが確 認 されていましたが、それらの細 胞がどのようにして硬い骨を壊しているのかについては不明でした。
本研究成果が社会に与える影響 (本研究成果の意義)
石 井 優教 授 らの研 究グループは、生きたままで骨の内 部 を観 察することに成功 し、破 骨細 胞が実 際に骨 を壊 していく様 子 を、リアルタイムで可 視 化 することに成 功 しました。この可 視 化 により、「骨 の表 面 にヒルのように強力に貼りついて骨を壊している破骨細胞 (R 型と命名)」と、「骨の表面でアメーバのように動き回っていて骨を壊していない破骨細胞 (N 型と命名)」の 2 種類の細胞が存在し、破骨細胞は R 型と N 型を短 い時 間 で遷 移 していることも分 かりました。さらに、骨 粗 鬆 症 などの状 態 では、破 骨 細 胞 の総 数 だけでなく、R 型の数が増えていることや、治療薬 (ビスホスホネート製剤 )を投与すると、破骨細胞の総数が減るだけでなく、N 型が増えることで骨の破壊が抑えられることが分かりました。さらに、関節リウマチなどの骨破壊に関与すると言われていた Th17 という炎症性 T 細胞は、骨の表面で破骨細胞に接触し、N 型を R型へと変換させることで骨の破壊を引き起こすことが、実際のライブイメージングで解明できました。
実は破骨 細胞には骨を壊 す働きだけではなく、骨 芽 細胞という骨を修復する細胞を活性化する作用もあり、現 在 の治 療 薬 で破骨 細 胞 の総 数 を減 らすと骨 の修 復 ができなくなり、逆 に骨 が脆くなってしまうことが大きな問題 点となっています。今回 成功 したライブイメージング系は、破骨 細胞の総数は減らさずに、R型 から N 型 に変 化 させる理 想 的 な薬 を今 後 開 発 していく上 で、極 めて重 要 な研 究 成 果 であると考 えます。
特記事項
本成果は、米国の科学雑誌 本研究成果は、2013 年 1 月 16 日に米国臨床医学雑誌「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション」オンライン版に掲載されました。また本研究は、独立行政法人科学技術振興機構(JST)・戦 略的創造研究推進事 業 チーム型研究 (CREST)「炎症の慢性化機構の解明と制御に向けた基盤技術の創出」研究領域における研究課題「次世代の生体イメージングによる慢性炎症マクロファージの機能的解明」，および文部科学省新学術領域研究「蛍光生体イメージ」領域における研究課題「骨の生体イメージングによる骨髄細胞・骨転移癌の遊走・分化やニッチ環境の可視化」の支援を受けて行われたものです。

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研究の詳細な説明＜研究の背景＞
骨 粗 鬆 症 や関 節 リウマチ、がんの骨 転 移 などの病 気 では、骨 が異 常 に壊 されていくことが大 きな問 題です。これらの病態で骨を壊している細胞が、「破骨細胞」と呼ばれる、骨を壊すために特殊に分化したマクロファージです。
これまでの骨 の研 究 では、骨 を取 り出 してナイフなどで薄 く切 ってから、顕 微 鏡 で観 察 していました。この方 法 でも骨 が壊 されている部 位 に多 数 の破 骨 細胞 が集 まっている様 子 は観 察 されていましたが、それらが実 際 にどうやって骨 を壊 しているのかについては明 らかになっていませんでした。取 り出 して薄 く切 った骨の組織の中では、破骨 細胞の形は残っていますが、すでに死んでいますので動きは見ることはできません(図１)。
また、容器内(in vitro)でマクロファージを特殊な環境下で培養すると、大型の「破骨細胞様」の細胞ができ、これまでの多 くの破 骨 細 胞 の研 究 がこの細 胞 を用 いて行 われてきましたが (図 ２)、この細 胞 が実 際に生体 内にいる破骨 細 胞と同 じであるという証 拠はなく、私 たちの体の中で破 骨 細 胞がどのように骨を壊しているかについては不明なままでありました。

図１．骨破壊の組織像．骨(bone)の表面に多くの破骨細胞がへばりついている様子が観察される(白色矢印)が、これが実際にどのように機能しているかは不明であった。

図２．培養容器内で出現した「破骨細胞様」の細胞．真ん中の巨大な細胞が破骨細胞様細胞であるが、周囲の小型のマクロファージに比べて異常に大きい。時には直径が 1mm にも到達することもあり、これが生体内の破骨細胞と同一のものかは実際にはかなり疑わしい。

大 阪 大 学 免 疫 学 フロンティア研 究 センター・細 胞 動 態 学 教 室 の石 井優教授らの研究グループでは、２光子励起顕微鏡 という特殊な装置 を使って、様 々な組 織 を「殺 さずに生 きたままで」観 察 する方 法 をこれまでに次 々と立 ち上 げてきました。骨 の内 部 についても、すでに可 視 化 する系を立 ち上 げておりましたが(Nature 誌 (2009)などに報 告 )、その解 像 度 は十 分 ではなく、骨 の中 に細 胞 が出 たり入 ったりすることを観 察 することができる程度でありました(図３)。
今 回 、石 井 教 授 らは、イメージング系 をさらに改 良 し、また特 殊 な蛍 光
標識技術を活用することで、骨の表面で骨を破壊 ・吸収する破骨細胞の動 きを鮮 明 に捉 えることに世 界 で初 めて成 功 しました。後 に詳 しく述 べますが、この方 法 により、「骨 の 表 面 で実 際 に骨 を壊 している破 骨 細 胞 (R型)」と、「骨の表面にいるが骨を壊していない破骨細胞 (N 型)」の 2 種類の細 胞 が存 在 することが分 かりました。この２つの破 骨 細 胞 を区 別 できる

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図３．以前の骨組織のイメージ
ング画像．個々の細胞は緑色のスポットとして描出されている。
細胞の大きな動きは解析できるが、細かい機能(骨破壊など)の観察は困難であった。

ようになったことは、今後の治療薬開発の上で非常に重要であります。
以 前 より、破骨 細胞には骨 を壊す働 きだけではなく、骨芽 細胞という骨 を修復 する細胞 を活 性化 して、骨 の修 復 を促 す作 用もあることが知 られており、治療 の際には、破骨 細 胞の数 を減 らしすぎると骨の修復ができなくなり、逆 に骨 が脆 くなってしまうことが大 きな問 題 となっているからです。今 回 、破 骨 細 胞 にも、実際に骨を壊しているもの(R 型)とそうでないもの(N 型)が存在することが明らかになったため、今後の治療としては、破骨細胞の総数を減らすのではなく、R 型を減らして N 型を増やすことを目指すべきであることが明 らかになり、これは今 後の骨破 壊 治療 薬の臨 床 開発にとって極めて重 要で意 義の大 きな知 見であると言えます。

＜研究の内容＞
・破 骨 細 胞が骨 を壊す様子 を可 視 化することに世界 で初めて成 功 ：破骨細胞には、実際に骨 を壊 しているもの(R 型)と、今は壊していないもの(N 型)の２種類が存在することがわかる
破 骨細 胞が骨の表 面でどのようにして骨 を壊 しているのかをライブイメージングで可視 化するために、石井 教 授 らは破 骨 細 胞 が骨 を壊 すときに用 いる「プロトンポンプ(＝強 い酸 を細 胞 外 へ放 出 する装 置 )」にGFP(緑 色 蛍 光タンパク質 )で標 識 した蛍光リポーターマウスを作 成 しました。さらに、骨のライブイメージン
グシステムを改 良 し、骨 の表 面 を高 い解 像 度 で解 析 できるようにした結 果 、骨 の表 面 で骨 を破 壊 している破 骨 細 胞 の動態を捉えることに世界で初めて成功しました(図４参照)。
この動 画 を見 ると、様 々な複 雑 な形 をした破 骨 細 胞 が骨の表 面にへばりついている様子が観察 されます。さらによく見 ると、ヒルのように骨 に密 着 して動 きの少 ないもの(図 ４、左 下 )と、アメーバのように動 き回 っているもの (図 ４、右 上 )の２種 類 が存 在 することが分 かりました。密 着 して動 かない
細 胞 は、密 着 面 に沿 ってプロトンポンプ(緑 色 のシグナル)が存 在 しているため (図 ４、左 下 の矢 印 )、これはいま正 に骨 に向 かって酸 を出 して骨 を壊 している細 胞 であると考 えられました(「壊す＝resorbing」から“R 型 ”と名付けました)。
一 方で、右上のアメーバ運 動 をしている細胞 は、プロトンポンプが膜 表 面 になく、細 胞 内 に取 り込 まれている ことから( 図 ４ 、右 上 のアスタリ スク )、いまは骨 を壊 してい ないもの(non-resorbing より“N 型 ”としました)と考えられました。つまり、この方法で、破骨細胞 の数だけでなく、実際にどれがいま骨を壊していて、どれは働いていないか(壊 していないか)が、はっきりと区別できるようになりました。
またしばらくの間 、イメージングで細 胞 の動 きを追 いかけ

図４．骨表面に引っ付いて骨を壊している破骨細胞のライブイメージング．左下の細胞は骨に密着して動きが少なく、いま正に骨を壊しているもの(R 型)で、右上の細胞は骨表面上で移動していて、いまは骨を壊していない(N 型)。このイメージングでは各細胞の細かい動き、形・機能の変化を追うことができる。ていると、数十分くらいの間に、R 型であったものが N 型に変わったり、逆に N 型から R 型になったりするものが見られました。これらのデータから、破骨細胞は骨の表面で R 型と N 型を繰り返して、つまり、骨を壊したり、お休みしたりしながら過ごしていることが分かりました。
・骨の病気では、破骨細胞の数だけでなく、R 型と N 型の割合も大きく変化している
次に、骨の病気の際に、その内部のライブイメージング画像がどのように変化するか見てみました。

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まずは、薬 剤 で破 骨 細 胞を活 性 化 させて、骨 粗 鬆 症を人 為 的 に誘 導 したときに骨 の様 子 ですが(図 ５参 照 )、破 骨 細 胞 の数 がかなり増 えて い る こと が 分 か りま す が 、単 に数が増 えるだけでなく、そのほとんどが R 型となっていて、骨 を壊 していること が分 かります(図 ５の矢 印 )。一方 で、この骨 粗 鬆 症 の状 態を、現 在 汎 用 されている骨粗 鬆 症 治 療 薬 であるビスホスホネート製 剤 で治 療 した状 態 の骨 をライブイメージン図５．骨粗鬆症を誘導したときの骨の内部のライブイメージング．破骨細胞の絶対数が増えているだけでなく、そのほとんどが、骨破壊を行っている R 型となっていることに注目したい。

図６．骨粗鬆症治療薬(ビスホスホネート製剤)で治療したときの骨の内部のライブイメージング．破骨細胞の数が減っており、生き残っているものの骨破壊をしていない N 型となっている。

グで観察してみると(図６参照)、破骨細胞の絶対数が激減しますが、それだけでなく、残っている細胞も N型が多く、骨を壊していないことが分かります(図６のアスタリスク)。このように、骨の破壊がどうなっているかを考える上では、細胞の数だけではなく、その数のうちどれだけが R 型(機能型)か N 型(非機能型)かを評価することが重要であることが分かります。これは考えてみると当たり前ですが、私たちの職場も、ただ人数が多 ければ仕 事が進むというものではなく、そのうちのどれだけが「機 能的 」であるかが大 事です。破 骨細胞の世界も同じです。こういったイメージング技術革 新によって、どれだけが「機能的」なのかを区別することができるようになったことは大きな進歩であると言えます。
・炎症性の T 細胞である Th17 は、N 型の破骨細胞に働きかけて R 型へと変化させることによって骨の破壊を誘導する
少し複雑な話になりますが、関節リウマチでは炎症 がおこった関節では、関 節が腫れるだけではなく、骨が壊れて行 きますが、このときに骨 を壊 しているのも破 骨 細 胞 です。ただ、このときに誰が破 骨 細胞 に「骨を壊せ」という指令 を出 しているのかは不 明でありました。関 節リウマチなどの自己免疫疾患の発症 や増悪に重要な役 割を担 う、炎 症性の T 細胞である Th17 という細胞が、骨の破壊にも関わるのではないかと予想されていましたが、具体的なメカニズムは全く不明でありました。
石 井 教 授 らのグループは、このライブイメージング系 を利 用 して、生 体内での Th17 と破骨細胞の関係を可視化することにしました。その結果、Th17 が N 型の破骨細胞と接触することにより、R 型へと変化させることで骨の破壊を誘導していることが分かりました(図 ７参照)。つまり、働いていない(＝骨を壊していない)破 骨細 胞の頭 を叩いて回 って、骨を壊すように指示を出していることが分かりました。
これは、関 節 リウマチで骨 が壊 れて行 くメカニズムの本 質 を捉 えたものであり、関節リウマチで骨の破壊を抑える治療法を検討していく上で、重要な知見であると考えられます。

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図７．N 型の破骨細胞に Th17 が接触し、R 型へと変化していく過程のライブイメージング．Th17 との接触の前後で、破骨細胞の形態変化に差がある(N 型→R 型)が観察される。

＜今後の展開＞「よい骨疾患治療薬とは何か？」
日本全体で 1200 万人以上(先進国全体では 6000 万人以上)の患者が存在すると言われている骨粗鬆 症は、もはや日本に限らず先進国 高齢 社会の大 きな社会 問題であります。この大きなマーケットをめがけて様々な骨疾 患治療 薬が開 発されていますが、そもそも「よい薬とは何か」という最も重要 な点が意外と明瞭ではありません。
これまでビスホスホネート製 剤 を始 めとして、行 き過ぎた破骨 細 胞の働きを抑えるために、「破 骨 細胞 を殺 す(＝数 を減 らす)」薬剤 が主に使用 されてきました。今回のデータでも、ビスホスホネート製 剤は確かに
骨 表 面 での破 骨 細 胞 の絶 対 数 を大 きく減 らすことが分 かりました (図 ６)。しかし一 方 では、破 骨 細 胞 は、骨 を修 復する細胞 である骨 芽 細 胞に働きかけて、その分 化 ・機能 (骨 再生 )を促 すことが知 られており、破骨 細 胞 を減 らしすぎると逆 に骨 が脆 くなってしまうのでよくないとされています (顎 骨 壊 死 などの重 篤 な副作用もこれに起因するかもしれません)。
そういった観点から、「よい治療薬」とは、破骨細胞の絶対数を減らすのではなく、R 型を減らして、逆にN 型を増やすような薬である、と言えると思います。今回の研究成果によって、今まででは評価することができなかった、「破 骨 細胞の骨 破 壊機 能 」を見ることができるようになったため、これを指 標 とした新たな創薬 開 発が可 能となると思われます。実 際に、石 井教 授 らは、既 存 の治 療薬、および現在 開発 中の薬剤 をこの新しいイメージング系で評価することで、「総数は減らさないが、R 型を減らして N 型を増やす」といった、理想的なプロファイルに近いものを見つけております。こういった新しいコンセプトによる次世代の骨疾患 治 療 薬 が、現 代 社 会の大 きな悩 みである骨 粗 鬆症 の克 服に向 けて大 きく貢 献 できることを祈 念 して止みません。
＜掲載 論文名＞"Dynamic visualization of RANKL and Th17-mediated osteoclast function"(RANKL や Th17 による破骨細胞機能の動的可視化 )米国臨床医学雑誌(The Journal of Clinical Investigation)2013 年 1 月 16 日 12:00 pm, online 掲載 (日本時 間: 1 月 17 日 2:00 am)

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