テロメア維持機構の進化 —無性・有性生殖様式との関係に着眼して—The evolution of telomere maintenancein light of asexual and sexual reproductive modes
慶應義塾大学
派遣期間
研究機関
研究指導者

野殿 英恵
2013 年 10 月 3 日～2014 年 4 月 3 日
Department of Zoology, University of Oxford
Tinbergen Building, South Parks Road, Oxford, OX1 3PS, UK
Prof. Aziz A. AboobakerIn the previous study, the host lab studied the telomere biology of planarian Schemidtea mediterranea. They
showed that somatic telomere maintenance is different in asexual and sexual animals. Asexual animals maintaintelomere length somatically during regeneration, whereas sexual animals only achieve telomere elongation throughsexual reproduction. They demonstrated that this difference was reflected in the expression and alternate splicing of theprotein subunit of the telomerase enzyme tert. Asexual adult planarian stem cells appear to maintain telomere length
over evolutionary timescales without passage through a germ-line stage. In this study, we examined telomere biology ofDugesia ryukyuensis. This species can switch reproductive mode between sexual and asexual. When sexualization wasinduced to asexual animals, their telomere length was same as asexual animals. After cycles of amputation andregeneration, sexual worms did not showed dramatic telomere shortening, which is apparently different from sexualstrains of S. mediterranea. These results indicates that telomere maintenance capacity is not correlate with reproductivemode in D. ryukyuensis. Corresponding to the capacity of telomere maintenance in D. ryukyuensis, Dryu-tert expression
during regeneration is higher than intact state in all reproductive modes. Dryu-tert has one splicing site and active
isoform is always highly expressed than negative form.

研究目的

体細胞では細胞分裂時にテロメアの短縮が起こるた生殖とは次世代を創ることを指し、その様式はゲめ、細胞分裂回数の上限＝寿命ができた。一般に有ノムの混合（広義の「性」）の有無により無性生殖と性生殖と引き換えに生物は寿命をもったと考えられ有性生殖に大別できる。各生殖様式には、生殖コスているが、寿命がうまれた理由にいまだ定説は無い。

トや遺伝的多様性の創出といった点において相異な果たして生殖様式と寿命は相関するのか？有性生殖る利点・欠点があるが、自然界では多くの生物が環に老化は不可避だったのか？この問題に対し、無性境条件等に応じて両生殖様式を転換し、相異なる利個体は無限の再生能力をもち不死であり、ある有性点を享受している。有性生殖を行う生物では個体の種は有限の寿命を持ち、さらには一個体において無死が不可避である。体細胞は寿命を持ち、生殖細胞性生殖と有性生殖を転換可能な種も存在するという、を次世代へ繋ぐ。一方、無性生殖を行う生物に個体種によって多様な生殖様式と寿命をもつプラナリアの死は無い。このように性と寿命は深く関わっていを用いて挑む。

る。原核生物から真核生物への進化の際、生物は子派遣先研究室は Schmidtea mediterranea において、孫に多様性を生むため有性生殖を獲得したが、ゲノ無性系統と有性系統の間にテロメア維持能の差異をムの巨大化に伴い染色体は環状から棒状に変化した。

見出し、その差を生む分子機構を明らかにした 1。無これによりテロメア複製問題が生まれた。すなわち性系統では無性生殖（切断・再生）を経ると、徐々に短くなっていたテロメアが元の長さに戻るのに対と D. ryukyuensis を並行解析して比較し、1 個体が生し、有性系統では年齢とともにテロメア長は短くな殖様式を転換する際にテロメア維持能（寿命）も変り、また切断と再生を経てもテロメア長はリセットえるのか否か？すなわち「生殖様式（性）」と「寿命」されず、有性生殖（交雑・産卵）でのみリセットさは不可分なのか考察する。

れた。この差異はテロメア配列伸長酵素であるテロメラーゼの構成サブユニット tert（telomerase reverse

研究経過transcriptase）活性型アイソフォームの発現量と相関

D. ryukyuensis のテロメア長については、無性系統し、無性系統の再生時にのみ活性型の発現比が高までは年齢や再生過程でのテロメアの短縮は一切見らることが見出された。

れず、先天的有性系統では年齢に応じてテロメア長

上記 S. mediterranea の生殖様式は染色体転座の有が短縮し、人為的有性化個体ではテロメア長の短縮無により先天的に決定しているのに対し、筆者の扱は見られないことが、テロメア配列を含む terminal

う Dugesia ryukyuensis においては生殖様式に相関すrestriction fragment（TRF）のサザンハイブリダイゼる染色体転座は存在しない。さらに D. ryukyuensisーション解析により示された 3。よって「有性生殖」は同一個体が生殖様式を転換できることから、生殖と「テロメア短縮」は定説に反して必ずしも相関し様式とテロメア維持能および機構の関係について新ない可能性が示唆された。そこで両種を同時に同じたな知見が期待できると考えた。

手法で解析し、種間での比較を行うことにした。まD. ryukyuensis では、同種内に先天的無性系統、先た D. ryukyuensis については、tert の同定や発現解析

天的有性系統、そして生殖様式を季節転換する系統など分子的な解析は行われていなかったため、本研が共存する。有性系統は成長とともに雌雄同体性の究において取り組んだ。

生殖器官を形成し、他個体との交雑・産卵を経て次世代を形成するが、無性系統は生殖器官を形成する

1.

生殖様式とテロメア長の関係こと無く、自切・再生によりクローン増殖する。さ生殖様式や生殖からの経過時間（齢）とテロメアらに本種を用いる最大の利点として人為的有性化実長の関係を調べるため、数か月の間自切をしていな

験系 2（Fig. 1）が確立していることが挙げられる。

い無性個体、年齢の異なる先天的有性個体、人為的有性化個体について、テロメア長を測定した。テロメア長の測定には定量的 PCR による手法 4,5 を用いた。またそれら各生殖様式個体について切断・再生を短期間に繰り返した場合についても解析し、テロメ ア 維 持 能 の 差 異 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 S.
mediterranea においては有性系統と無性系統の間にはテロメア長に明確な差があり、無性系統の方が長Fig. 1 Experimental induction of sexualization

かった。一方、D. ryukyuensis では、先天的無性、有無性系統に対して有性成熟個体のミンチを毎日投餌

性、人為的有性化の 3 系統間に明確な差は見られず、すると、生殖器官が順序だてて形成されていき有性いずれも S. mediterranea の無性系統と同程度の長さ生殖可能な個体となる。このように先天的には無性のテロメアを有していた。さらに切断・再生を繰り生殖のみを行う無性系統が人為的な刺激により有性返した場合、D. ryukyuensis では S. mediterranea の有生 殖 す る よ う に な っ た 個体 を 人 為 的 有 性 化 個 体性系統で見られるような劇的なテロメア短縮は見ら（Acquired Sexual）と命名した。いったん有性化しれず、有性生殖個体においても再生時の細胞分裂にた個体は、投餌をやめても無性状態に戻ることはなおいてテロメア長を回復する能力があることが示唆い。これは餌として与えていた有性生殖個体内に含された。

まれる「有性化因子」を自身の体内で産生するようになるためである。

2.

TRAP 法によるテロメア伸長活性測定

本研究では、年齢や再生過程におけるテロメア長テロメア長維持能に差が見られたため、テロメアの変化や tert の発現変動について、S. mediterranea

伸長活性を Telomere Repeat Amplification Protocol

（TRAP）法により比較することを試みた。本法ではた Alt II 部位の isoform の比は変化せず、常に Alt II+虫体ホモジネートに基質プライマーを添加し、インが大半であった。

キュベートすることでテロメアリピート配列の伸長

Smed-tert ではこれまで Alt I 部位の isoform 発現比活性を検出する。その結果、HeLa 細胞を用いたポジは調べられており、インタクトでは Alt I-が優位に発ティブコントロール実験は成功したものの、プラナ現するが、無性個体の切断時にのみ、+型と-型の発リア試料を用いた場合に有意な活性を検出できなか現比が逆転し、Alt I+型が発現上昇することが知られった。先行研究においてプラナリア試料でも活性がていた。今回、その再現が取れ（Fig. 2 の右図）、さ見られたことから、プラナリア個体のホモジネート

らに新たに Alt II 部位についても再生前後で isoform

調 製 に 問 題 が あ る と 思 わ れ る 。 本 研 究 で は D.

発現比を調べた結果、Dryu-tert と同様に常に Alt II+ryukyuensis で の テ ロ メア伸 長 活 性測 定 およ び S.

が優位に発現しており、再生による isoform 比の逆

mediterranea との比較はできなかった。

転は見られなかった（Fig. 3）。しかし S. mediterranea
は再生過程において、総発現量が無性個体では増加

3. D. ryukyuensis の tert（Dryu-tert）のクローニングするのに対し有性個体では減少した点で、生殖様式

S. mediterranea の tert 遺伝子（Smed-tert）は 16 個に関わらず再生過程で上昇した D. ryukyuensis とはのエキソンから成り、ORF は 1878 bp で 2 か所の異なっていた。これは先行研究で示唆された、S.

alternative splicing 部位（Alt I = exon 4〜6、Alt II = exon

mediterranea では有性個体で齢とともにテロメア長11〜12）があるために 4 つの splicing variant が存在が短くなり、切断・再生によっても短縮化が進むが、する。スプライシングによるエキソン欠損は活性に無性では再生過程を経ることでテロメア伸長が起こ重要な機能ドメインの欠失やストップコドンの挿入ること、それに対し D. ryukyuensis ではいずれの生殖を引き起こすため、全長型のみが活性を持つと考え様式においても齢によるテロメア短縮化が比較的緩られている。そこで、D. ryukyuensis の tert を同定し、やかであることや、切断・再生を繰り返しても S.

スプライシングの有無を検討することとした。

mediterranea のような有性系統でのテロメアの劇的筆者らの構築した D. ryukyuensis のトランスクリな短縮が見られないこととも相関した。

プ ト ー ム デ ー タ ベ ー ス 中 に は 、 tert の 部 分 配 列（Smed-tert における exon 9 の途中に対応する部分以降、3’UTR の途中まで）が含まれていたので、それを元に RACE 法により S. mediterranea で見出されている 2 か所の alternative splicing 部位を含むほぼ全長を同定した。
4.

tert の isoform 発現比の定量
D. ryukyuensis においても tert が同定されたので、各生殖様式と切断・再生前後での isoform の発現をFig. 2 RT-qPCR analysis of the ratio of tert alternate
region 1-positive and -negative transcripts. int,intact; reg, 72h regeneration.

比較した。Fig. 2, 3 はエキソンの模式図中に矢印で示した位置のプライマーで+型と-型を同時に RT-PCRした結果である。
厳密な発現量の定量は各 isoform を識別して増幅するプライマーセットを別途設計し、qPCR を行った。その結果、無性・先天的有性・人為的有性化のいずれの系統においても Alt I 部位の欠失は見られず、Alt II 部位では Smed-tert と同じ部位での欠失が見られ、Dryu-tert では Alt I+/Alt II+とAlt I+/Alt II-という 2 種類の splicing variant の発現が確認された。また切断・再生により全 isoform の総発現量、Alt I+型、Alt II+型の発現量は増大した。まFig. 3 RT-qPCR analysis of the ratio of tert alternate
region 2-positive and -negative transcripts. int,intact; reg, 72h regeneration.

5.

tert の発現部位解析

テロメア配列（TTAGGG）n に対する蛍光標識ペプ

Smed-tert は、無性個体では成体多能性幹細胞に高チド核酸プローブを用いて蛍光 in situ hybridization

く発現しているのに対し、有性個体では卵巣・精巣法を行い、染色体上でのテロメア配列の局在を調べに高発現し、体性幹細胞での発現は高くない 1 。

た。その結果、全種および生殖様式において染色体Dryu-tert についても in situ hybridization 法により同末端にテロメア配列が存在することを確認できた。

様に発現部位を調べたところ、無性・有性のいずれ

現在、tert の isoform の発現解析を行っている。

でも間充織領域の成体多能性幹細胞に発現しており、卵巣・精巣では高い発現は見られなかった。
考察
S. mediterranea と D. ryukyuensis のテロメア維持能と tert 発現調節を比べた結果、両種間で生殖様式とFig. 4 Target species in this projectの関係に明確な差異が見出された。S. mediterranea
では無性系統の再生時には活性型 isoform の tert の発現が上昇しテロメア伸長が起こるが、有性系統の再生時にはテロメアは短縮する。一方、生殖様式の転参考文献
1.

Tan TC, Rahman R, Jaber-Hijazi F, Felix DA, Chen

換が可能な D. ryukyuensis においては、先天的無性・C, Louis EJ, Aboobaker A. Proc Natl Acad Sci USA

有性、人為的有性化の生殖様式に関わらず、常に活109: 4209-4214 (2012).

性型の tert が優先的に発現し、再生時には発現上昇

2.

JP, Hoshi M. Zool Sci 16: 291-298 (1999).

し、かついずれの生殖様式個体においても成体多能性幹細胞に発現が局在していた。
特に S. mediterranea

Kobayashi K, Koyanagi R, Matsumoto M, Cabrera

3.

Tasaka K, Yokoyama N, Nodono H, Hoshi M,Matsumoto M. Int J Dev Biol 57(1): 69-72 (2013).

で alternative splicing の劇的な違いが見られた Alt I
領域については、D. ryukyuensis では欠失型が見られ

4.

Cawthon RM. Nucleic Acids Res 30: e47 (2002)

ず、常に+型が発現していた。つまり D. ryukyuensis

5.

Gil ME, Coetzer TL. Mol Biotechnol 27(2):169-172(2004).

においては、再生の有無や生殖様式に関わらず、常に S. mediterranea の再生中の無性系統のような tert発現制御がなされており、この活性型 tert の発現量研究の発表

や発現細胞種における明確な差が、D. ryukyuensis と誌上発表

S. mediterranea のテロメア維持能の差を生んでいる1.

Tasaka K, Yokoyama N, Nodono H, Hoshi M,と考えられる。本研究で D. ryukyuensis の有性生殖個Matsumoto M. Innate sexuality determines the

体でもテロメア維持能および活性型 tert の多能性幹mechanisms of telomere maintenance. Int J Dev Biol細胞での発現が見られたのは、生殖様式とテロメア

57(1): 69-72 (2013).

維持の関係性に、従来とは異なる新たな一面を見出

2.

Chinone A, Nodono H, Matsumoto M. Triploidplanarian reproduces truly bisexually with euploid

した点で、意義深い。

gametes produced through a different meiotic system

このように 2 種間に明確な差が見られたことより、

between sex. Chromosoma 123(3): 265-72 (2014).

派遣前の計画では 2 種間比較であったが、派遣中に解析対象を近縁・遠縁種（Fig. 4）に拡大した。その中には年周期の有性生殖後に寿命を迎える種や、雌ポスター発表

性単為生殖を行う種など多様な生殖様式をとるもの

1.

Takagi S, Kouda Y, Nodono H, Aoto Y, Yoshitake K,がいるため、これらの解析も通じて生殖様式と寿命

Gojobori T, Sato K, Sakakibara Y, Matsumoto M.の関係について統合的・進化的考察を目指したい。

Comprehensive screening of peptide hormones that

これまでに、これらの種について染色体標本を作

induce planarian sexualization. 1st Asian Planarian

製し、各生殖様式について核型解析した。さらに、

Meeting, Hong Kong, China, May 2014