Unintegrated HIV DNA サイレンシングの HIV 複製サイクルにおける意義
Exploring the role of silencing of unintegrated HIV DNA in HIV replication cycle
所属機関：INSTITUTE OF HUMAN GENETICS
代表研究者氏名：町田 晋一
研究期間：2021 年 4 月 1 日～2022 年 3 月 31 日
滞在研究機関： Institute of human genetics (CNRS, France)
141, rue de la Cardonille, 34396 Montpellier - Cedex 5, France
共同研究者等： Dr. Monsef Benkirane

Early in HIV life cycle, HIV RNA genome is reverse transcribed into a double-stranded HIV DNA. HIV DNA isthen delivered into the nucleus, and integrated into the human genome by the HIV integrase protein, forming theprovirus. However, a portion of HIV DNA is not integrated (uinDNA), and is rapidly silenced. This mechanism iscommon in retroviruses, but the molecular mechanism and biological significance of this silencing is still unclear. In thisstudy, we identified POLE3 protein as the HIV-1 uinDNA silencing factor by the Proteomics of Isolated Chromatin
segments (PICh) method and the siRNA screening using HIV-1 integrase mutant. Knockdown and knockout
experiments demonstrated POLE3 is transcriptional repressor of uinHIV-1 DNA with marginal effect on expression
from integrated provirus, unintegrated Murine Leukemia Virus, and plasmid DNA. Remarkedly depletion of POLE3
impairs HIV replication, suggesting transcriptional repression of uinDNA is beneficial for HIV-1 replication.

研究目的

HIV-1 uinDNA は安定に保持され、さらに潜伏感染再現在までに、HIV 感染及び複製サイクルをターゲ活性化剤によって複製可能な HIV-1 を産出する。まットとした様々な抗 HIV 薬が研究開発されてきた。

た、HIV-1 uinDNA はヒトのゲノムにインテグレーシそして、それらを組み合わせて投薬する多剤併用療ョンされた HIV-1 DNA と同じ遺伝子および制御要法により、HIV 感染者のエイズ発症を阻止すること素を含んでいる。しかし、HIV-1 感染における HIV-1が実現した。しかし、薬剤耐性ウイルスの出現や薬uinDNA サイレンシングの意義は明らかになってお剤の副作用などの問題が残されている。 そのため、らず、 HIV-1 uinDNA の本質的な理解は HIV-1 感染

HIV 複製サイクルのメカニズムの更なる解明が、画制御に重要な知見を与える。そこで、本研究では、期的な HIV 治療法の開発に必要である。

HIV-1 uinDNA のサイレンシング機構および HIV 複

HIV-1 が細胞に感染すると、その遺伝情報である製サイクルにおける意義を解明するを目指した。

HIV-1 RNA をもとに、逆転写によって HIV-1 DNA が新規に合成される。その後、HIV-1 DNA は細胞核内研究経過に侵入し、ヒトのゲノムにインテグレーションされ本研究では、HIV-1 uinDNA のサイレンシング機構る。しかし、一部の HIV-1 DNA は宿主ゲノムにインおよび HIV-1 複製サイクルにおける意義を明らかにテグレーションされず (uinDNA)、速やかに転写不するために、サイレンシング因子の同定を試みた。

活化される。このサイレンシング機構は他のレトロ

まず、特定の DNA 配列に相互作用する因子を網羅ウイルスにおいても共通である。しかし、サイレン的に同定する方法

シングの分子機構の詳細および生物学的意義は明らsegments (PICh)法)により、HIV-1 uinDNA に集積するかになっていない。興味深いことに、静止期の CD4因子を同定した。具体的には、HIV-1 LTR 領域に相T 細胞において、宿主ゲノムに組み込まれていない補的な RNA プローブを用いて、細胞核内のクロマ(Proteomics of isolated chromatin

チンから HIV-1 uinDNA を特異的にプルダウンし、

Murine Leukemia Virus (MLV)の uinDNA の発現への質量分析法により HIV-1 uinDNA に結合する因子を影響を評価した。その結果、POLE3 はインテグレー459 種類同定した。続いて、インテグラーゼの活性ションされた HIV 遺伝子および MLV uinDNA の発現部 位 に 変 異 を 有 す る HIV-1 IND116A を 用 い たにほとんど影響を及ぼさないことがわかった。また、

siRNA スクリーニングにより、uinDNA サイレンシ

HIV 遺伝子を含むプラスミド DNA の発現への影響ングに機能する因子として POLE3 を同定した。

を解析したところ、POLE3 は HIV 遺伝子を含むプラPOLE3 は POLE4 と複合体を形成し、ヒストンシ

スミド DNA の発現に影響を及ぼさないことがわかャペロンとして機能することが知られている。そこった。これらの結果は、POLE3 が逆転写によって新で、POLE3 および POLE4 のノックダウンした HeLa

規に合成された HIV-1 uinDNA を特異的にサイレン

細 胞 を 用 い て 、 POLE3 お よ び POLE4 の HIV-1シングすることを示唆する。

サイレンシング能を評価した。その結果、

次に、HIV-1 uinDNA サイレンシングの HIV-1 複製

POLE3 および POLE4 が HIV-1 uinDNA サイレンシンサイクルにおける意義を解明するために、POLE3 をグに機能することが明らかになった。次に、POLE3ノックアウトした T 細胞由来の SupT1 細胞にて、および POLE4 が直接 uinDNA のサイレンシングに機HIV-1 複製サイクルを長期にわたって観察した。本能することを明らかにするために、POLE3/POLE4解析では、POLE3 を完全にノックアウトした SupT1の uinDNA への集積を解析した。具体的には、HIV-1細胞を樹立することができなかったが、部分的にノIND116A を 感 染 さ せ た HeLa 細 胞 を 用 い て 、ックダウンした細胞を樹立することに成功した。まPOLE3/POLE4 抗体を用いた Cut&Run/ChIP 解析を行た、これら POLE3 ノックダウン細胞では、HIV-1った。その結果、POLE3/POLE4 が HIV-1 uinDNA 上uinDNA からの発現が亢進した。次に、これら細胞に集積することが明らかになった。さらに、を用いて、replication competent HIV の複製サイクル

POLE3/POLE4 による uinDNA サイレンシングが転写を観察した。具体的には、培養液に放出された HIVレベルにて引き起こされることを新生 RNA 沈降法粒子量(p24)を測定することで HIV-1 複製を評価した。

により解析した。その結果、POLE3/POLE4 ノックダ解析の結果、POLE3 ノックアウト細胞において、ウンにより、HIV-1 uinDNA からの転写の顕著な亢進HIV-1 複製が抑制されることが明らかになった。まが観察された。また、HIV プロモーターおよびエンた、CD4 受容体を安定発現した HeLa 細胞を用いて、ハンサーを含む LTR 上のエピゲノムを解析したとこ

POLE3 ノックアウト細胞を樹立し、POLE3 欠損のろ、POLE3 ノックダウンにより、LTR 上における活HIV-1 複製サイクルへの影響を解析した。その結果、性化ヒストンマーク H3Ac 及び RNA ポリメラーゼ II

SupT1 細胞で観察された結果と同様に、POLE3 欠損の集積の亢進が観察された。これらの結果から、により HIV-1 複製が抑制されることが明らかになっ

POLE3 は転写レベルにて HIV-1 uinDNA サイレンシた。一方で、POLE3 欠損細胞にて産出された HIVングに機能することが明らかになった。

virion の成熟およびその感染性を解析したところ、

uinDNA次 に 、 よ り 生 体 内 に 近 い 条 件 で の POLE3 のPOLE3 欠損の影響はほとんど見られなかった。

uinDNA サイレンシング能を解析するために、ヒト

以上の結果から、POLE3 は HIV-1 uinDNA のサイの末梢血から精製した初代 CD4T 細胞を用いて、レンシングに機能すること、さらには、POLE3 欠損

POLE3 の uinDNA サイレンシング能を評価した。具は HIV 複製サイクルを抑制することが明らかになっ

体的には、POLE3 をターゲットとした siRNA をエレた。

クトロポレーション法により CD4T 細胞に導入し、POLE3 の uinDNA サイレンシング能を解析した。そ考察の結果、POLE3 は培養細胞だけではなく、初代 CD4

本研究により、HIV-1 uinDNA サイレンシング因子細胞においても uinDNA サイレンシングに機能するとして POLE3 を同定した。また、POLE3 が HIV-1ことが明らかになった。

uinDNA に集積し、転写レベルにて HIV-1 uinDNA

次に、POLE3 依存的なサイレンシングの特異性をサイレンシングに機能することが明らかになった。

評価した。具体的には、インテグレーションされた

また、そのサイレンシング能は培養細胞だけでなく、HIV 遺伝子の発現、およ び他のレトロウイルスヒトの末梢血から精製した初代 CD4T 細胞にても観察された。
本研究課題を遂行中に、別のグループから、HIV口頭発表
1.

○Shinichi Machida, Suzie Thenin-Houssier, Lucie

uinDNA サイレンシング因子として SMC5-6 複合体

Bonnet,および CAF1 複合体が同定された(Dupont et al., CellCharacterization

Host & Microbe, 2021, Geis et al., PNAS, 2022)。我々のsilencing. The 2021 Cold Spring Harbor meeting:

グループでは、SMC5-6 複合体および CAF1 複合体

Retroviruses, Virtual (2021)

に関しても、POLE3 と同様の解析を行った。特に、プラスミド DNA を用いた解析から、SMC5-6 複合体

誌上発表

および CAF1 複合体は、外来の DNA を非特異的に該当なしサイレンシングすることがわかった。一方で、興味深いこ とに、 POLE3 は逆転写 後の新 規の HIV-1uinDNA を特異的にサイレンシングする。この結果
は、HIV-1 uinDNA に結合した HIV 由来のタンパク質群が POLE3 の集積に関与していることを示唆する。よって、HIV 由来のタンパク質群と POLE3 の相互作用解析により、POLE3 によるサイレンシング機構の更なる理解が進むと期待される。
POLE3 欠損細胞を用いた HIV-1 複製サイクルの解析により、POLE3 が HIV-1 複製サイクルに必要であることが明らかになった。一方で、POLE3 欠損細胞から産出された HIV-1 virion は正常に成熟およびその感染性が維持されていたことから、POLE3 によるHIV-1 uinDNA のサイレンシングが HIV-1 複製サイクルに必要であることが示唆された。一方で、本研究により、POLE3 は逆転写後の HIV-1 uinDNA を特異的にサイレンシングすることが明らかになった。
これらの結果は、インテグレーション前の HIV-1uinDNA のサイレンシングはインテグレーションを保証するために必要である可能性を示唆する。よって、HIV-1 uinDNA のサイレンシングによる HIV インテグレーション制御の理解が、HIV-1 uinDNA のサイレンシングの意義の解明に必要になると考える。

参考文献
1.

Dupont, L. et al. The SMC5/6 complex compacts
and silences unintegrated HIV-1 DNA and isantagonized by Vpr. Cell Host and Microbe 1–21(2021) doi:10.1016/j.chom.2021.03.001.

2.

Geis, F. K. et al. CHAF1A/B mediate silencing ofunintegrated HIV-1 DNAs early in infection. Proc
National Acad Sci 119, e2116735119 (2022).

研究の発表

JérômeDejardin,of

Monsefunintegrated

Benkirane.

HIV-1DNA