亜鉛欠乏したシロイヌナズナの根端細胞で蓄積する未知構造体の生理的意義の解明
Elucidation of physiological significance of unknown structure in root tip cells ofArabidopsis under Zinc deficiency

代表研究者 立命館大学

深尾 陽一朗Ritsumeikan University

Yoichiro FUKAO

協同研究者 名古屋大学

佐藤 良勝

Nagoya University

Yoshikatsu SATO

Zinc is an essential micronutrient for plants, and it plays an important role in the structure and function of a wide rangeof proteins, including metabolic enzymes and transcription factors. Plants have developed regulatory mechanisms for
intracellular zinc homeostasis in the process of adaptation to a zinc-deficient growth condition. Zinc transporters areupregulated in zinc-deficient plants and that their expressions are regulated by transcription factors (bZIP19 and bZIP23).
However, little is known about other phenomena. Therefore, this study elucidates the physiological significance of starch
accumulation in plastids in zinc-deficient roots. Our results indicate that no or little starch accumulation was observed
under conditions of deficiency of essential elements other than zinc. As no starch accumulation was observed under thecondition of high zinc concentration, it was shown to be a phenomenon that is specific to zinc deficiency. Gravity-sensing
amyloplasts containing starch are present in columella cells at root tips of plants. Plants can recognize the direction ofgravity based on the sedimentation of amyloplasts in the direction of gravity. Starch accumulation in columella cells wasunaffected by changes in zinc concentration, suggesting that the starch accumulation observed during zinc deficiency is anovel phenomenon.

研究目的

研究代表者は、亜鉛欠乏したシロイヌナズナの根A

DEFL203-GFP
亜鉛欠乏

成熟領域

通常条件を用いたプロテオーム解析やトランスクリプトーム解析から、複数の Defensin-like (DEFL) family proteinの発現量が増加することを見出した（Inaba et al.,

伸長領域

2015; Nakayama et al., 2020）。このうち、DEFL203 の細胞内局在を解析する過程において、DEFL203 が細胞壁および細胞膜に局在すると共に（Kimura et al.,CT-GFP
分裂領域accepted）、亜鉛欠乏した根において、直径 5 µm 以

デンプン

下のオルガネラと考えられる構造にも局在することが示唆された。各種オルガネラの GFP 蛍光マーカー

Bを用いた顕微鏡観察を行ったところ、プラスチドマ

亜鉛欠乏ーカーとして用いられる CT-GFP 株では、明視野でも確認できる構造体を GFP 蛍光が囲っているように観察された（Fig. 1）。この構造体は亜鉛欠乏したシロイヌナズナの根端細胞で多く観察され、亜鉛濃度が十分に存在するとまったく観察される事はない。
本研究では、亜鉛欠乏特異的に根端に存在するプラデンプン
DEFL203-GFP
CT-GFP

通常条件CT-GFPプラスチド

Fig. 1：Characteristics of plastids observed in zinc-deficient roots.
(A) DEFL203-GFP fluorescence (arrowhead) was observed insideplastids, and CT-GFP fluorescence (arrowhead) was observed
surrounding starch under zinc-deficient condition. (B) shows therelationship between plastids, starch, DEFL203-GFP, and CT-GFP inzinc-deficient and basal conditions.

スチド内部に観察される構造体がどのように形成さ経過と共にデンプン蓄積量が増加することを発見しれるのか、またこの構造体あるいは構造体をもつプた。例えば葉におけるプラスチド（葉緑体）は、日中ラスチドの生化学的特徴や形成機構を調べることで、 に光合成によりスクロースを合成し、そのスクロー未知の構造体が亜鉛欠乏特異的に形成される生理的スをデンプンとして蓄積する。一方、夜間では光合意義を明らかにすることを目的とする。

成を行えないため、日中に蓄積したデンプンをスクロースに分解し、エネルギー源として植物の生長に研究経過用いている。この現象と根におけるデンプン蓄積量

・プラスチド内部に蓄積する構造体の特定の変化が同様であるかを調べるために、亜鉛欠乏培

既知のプラスチド機能としては、デンプンや脂肪地に播種した Col-0 を 6 日間長日条件で生育した後、酸の蓄積、あるいは窒素同化に関与する事が知られ連続光（24 時間明条件）、暗所（24 時間暗条件）、長ている。亜鉛欠乏時に観察される構造体を特定する日条件でさらに 1 日生育した。この結果、連続光やために、野生型シロイヌナズナ（エコタイプ: Col-0）

長日条件ではデンプン蓄積が観察されたものの、暗を亜鉛欠乏培地で生育し、デンプンを可視化できる所に 1 日置いた植物の根では観察されなかった。まヨウ素染色液で処理したところ、プラスチド内部のた亜鉛を含む通常培地へ移植した後、連続光や長日構造が染色された。さらにデンプを可視化できる蛍条件で 1 日生育した場合は、デンプン蓄積が観察さ光プローブ VISTA を用いたところ、プラスチド内にれなかった。そこで根に蓄積するデンプン量を定量デンプンが蓄積していた。一方、脂肪酸の染色液ナしたところ、デンプン蓄積量は長日条件で最も多く、イルレッドを用いて亜鉛欠乏培地で生育した Col-0

次に連続光、暗所の順になった。以上のことから、の観察したところ、内部構造は染色されなかった。

根端におけるデンプン蓄積は、日長に応答している

また電子顕微鏡観察では、通常培地で生育した Col-ことと、亜鉛が存在するとデンプン蓄積は観察され0 の根においてもデンプンの蓄積が見られたものの、ないことが確認された。

亜鉛欠乏時により多く蓄積していた。以上のことか・スクロース供給源の検討

ら、亜鉛欠乏時にプラスチド内部に観察される構造デンプンは、光合成反応によって合成され、葉緑体はデンプンであることが判明した。なお、デンプ体内に蓄積する。またスクロースの形で貯蔵器官へンを蓄積するプラスチドは、一般的にアミロプラスと輸送され、デンプンへ変換された後に蓄積する。

トと呼称するが、ここではプラスチドとする。

そこで亜鉛欠乏時に蓄積するデンプン合成が培地に・デンプン蓄積条件の検討含まれるスクロースから由来するのか、光合成によ野生型シロイヌナズナを、亜鉛以外の必須元素欠って合成されたスクロースに由来するのかを確かめ

乏条件で生育し、デンプン蓄積の有無を明視野顕微るためにスクロース濃度を 0％、1%（基本となる濃鏡により観察した。必須微量元素として、マンガン、度）、3%、5%にした亜鉛欠乏培地を用いて Col-0 を鉄、銅、コバルトを、必須多量元素としてマグネシ生育した。この結果、0%ではデンプン蓄積がほぼ見ウムを調べた。この結果、マンガンおよびマグネシられなかった。一方、1%、3％、5％では観察された

ウム欠乏した Col-0 の根において少数のデンプンをが、スクロース濃度に応じてデンプン蓄積量が変化蓄積するプラスチドが観察された。定量的データはすることはなかった。一方、地上部からのスクロー得られていないものの、亜鉛欠乏時に観察される数ス供給を絶つために、胚軸を切断した後 1 日後に観と比較すると、ごく少数であったことから、根端に察したところ、亜鉛欠乏培地においてもデンプン蓄おけるプラスチドへのデンプン蓄積は亜鉛欠乏特異積は観察されなかった。このため、スクロース供給的な現象であることが示された。

源は現時点で特定することはできていない。今回観デンプンが蓄積する環境要因として光環境変化察した播種後 7 日目の幼苗体は、種子に貯蔵されたに着目した。シロイヌナズナの生育は 1 日を 16 時間

エネルギー源を利用して生長している従属栄養成長明条件で、8 時間暗条件の長日条件で生育している。の時期から独立栄養成長へ移行する時期である。今デンプンを観察する過程で、暗条件から明条件に切後は長期生育を行い、地上部の葉が光合成能力を完り替わった直後においてはデンプンの蓄積量が少な全に獲得する時期において詳細な観察が必要である。

いかほとんど見られないのに対して、その後の時間・プラスチドの生化学的特徴の解析

プラスチドを単離してプロテオーム解析を行うた蓄積するプラスチドが存在した。コルメラ細胞におめに、葉緑体単離キットとして販売されているキッけるアミロプラスト内のデンプンは、葉で合成されト（invent 社）を用いたが、現在のところプロテオーたスクロースが根に転流され，デンプンとして長期ム解析を行うために十分な純度および収量のプラス的に保存される 。本研究で観察された亜鉛欠乏に応チドは得られていない。今後は、密度勾配遠心によ答したデンプン蓄積は日長に応答していたが、コルる単離や、亜鉛欠乏および亜鉛を含む通常条件で生メラ細胞のアミロプラストでは観察時間や日照条件育した Col-0 の根全体を用いたプロテオーム解析もの変更により蓄積量や形態等に明確な差が見られな検討する。

かった。さらに、亜鉛欠乏した根の重力屈性が変化

・デンプン蓄積に関わる遺伝子の探索することはなかったことを考え合わせると、亜鉛欠通常培地で生育した Col-0 を亜鉛欠乏培地に移植乏によってデンプンを蓄積するプラスチドは、コルし、デンプン蓄積の経時変化を観察したところ、6 時メラ細胞におけるアミロプラストとは全く異なる機間後にはデンプン蓄積が見られた。そこで今後は亜能を有すると言える。

鉛欠乏への移植後 0、1、2、4、6 時間後に RNA 抽出

光の明暗応答によるデンプン量の変化は、地上部を行い、RNA-seq によるトランスクリプトーム解析の葉緑体に一時的に蓄積されるデンプンにおいて見を実施する予定である。

られる。植物は日中に葉において光合成で得たエネ・他の植物における観察ルギーを一時的にデンプンとして蓄積する。夜間は亜鉛欠乏によって観察されるデンプン蓄積がシロ

光合成が行えず、呼吸のみ行っているが、この間にイヌナズナ特異的な現象かを調べたところ、現時点日中に蓄積したデンプンを分解してエネルギーを得では少なくともタバコの根では亜鉛欠乏時にデンプて生長している。このことから、亜鉛欠乏でプラスン蓄積するアミロプラストが観察された。今後は他チド内に蓄積するデンプンは、地上部の葉緑体のデの植物の観察を引き続き実施すると共に、より組織ンプンと同様に、光の明暗によって調節されているの大きいタバコの根を用いたプラスチド単離とプロ可能性が示唆された。

テオーム解析も試みる予定である。

デンプンは、植物細胞内のプラスチドのストロマで合成され、短期的および長期的なエネルギー貯蔵考察としての役割をもつ。亜鉛欠乏時に見られるプラスプラスチドは、2 枚の包膜で包まれており、水溶性チドは重力屈性に関与しないことから、単にデンプのストロマがあるという共通点をもつ。一方、プランとしてエネルギーを蓄積している可能性がある。

スチドの種類によってチラコイドの発達度合いは異植物が意図してデンプンを蓄積しているのか、亜鉛なる。葉緑体の場合、チラコイドが平面的な内膜構欠乏による障害を受けた結果としてデンプンが蓄積造を発達しているのに対し、デンプンを蓄積するプしているのかにより、この現象の生理的意義の解釈

ラスチドではチラコイドの発達がほぼ見られずデンが大きく異なる。前者のようにこの現象が能動的にプン顆粒で埋め尽くされている。事実、我々が実施起こると仮定すると、根の伸長阻害が起こる亜鉛欠した電子顕微鏡観察では、亜鉛欠乏した根における乏の環境下において、植物がエネルギー源としてデプラスチドの内膜構造は発達しておらず、デンプンンプンを蓄積していると考えられる。植物は亜鉛欠顆粒が蓄積していた。

乏条件において根の伸長が阻害されるが、これは生植物の根の先端には根冠があり、中央にあるコル育環境に十分な栄養がないために意図的に根の伸長

メラ細胞には重力を感知するアミロプラスト（デンを抑制してバイオマスを増やさないことでエネルギプンを蓄積するプラスチド）がある。このアミロプー消費を抑えているとの解釈もできる。また亜鉛欠

ラストは重力方向に沈降することで植物に重力方向乏が解消された後には、生長を再開するためのエネを知らせる役割をもっており、根の重力屈性に関与ルギー源として蓄積したデンプンを分解する可能性している。本研究においてシロイヌナズナを通常条が考えられる。一方、後者の場合は通常状態の生育件および亜鉛欠乏条件で生育した場合、共にコルメ条件においてはデンプンの合成速度と分解速度が平ラ細胞ではアミロプラストが存在するのに対して、衡状態にあるのに対して，亜鉛欠乏条件ではデンプその他の細胞では亜鉛欠乏した場合のみデンプンをン分解に負の影響があり、平衡状態が崩れた結果としてデンプン合成速度が分解速度を上回ったことでInaba S., Kurata R., Kobayashi M., Yamagishi Y., Mori

デンプンの蓄積が観察された可能性が考えられる。

I., Ogata Y. and Fukao Y. “Identification of putative

分裂組織にはプロプラスチドが存在し、様々なプラスチドへと分化する。根は根端側において細胞分裂し、細胞が縦方向に伸長することで、根全体が伸長する。このことから、根は根端側から地上部側にtarget genes of bZIP19, a transcription factor essential for
Arabidopsis adaptation to Zn deficiency in roots.” PlantJ., 84 (2), 323-334, 2015.

向けて分裂領域、伸長領域、成熟領域に分類するこNakayama S., Sugano S.S., Hirokawa H., Mori I.C.,とができる（Fig. 1）。本研究で観察されるプラスチド

Daimon H., Kimura S. and Fukao Y. “Manganese

は、主に分裂領域と伸長領域において観察されこと

Treatment Alleviates Zinc Deficiency Symptoms inを考えると、分裂領域に存在するプロプラスチドがArabidopsis Seedlings.” Plant Cell Physiol., 61(10),

亜鉛欠乏を何らかの形で感受することでデンプンを1711-1723, 2020.

蓄積するプラスチドに分化する可能性がある。一方で、亜鉛欠乏条件から通常培地に移行した場合や暗所に移行した場合はデンプンが分解され、逆に通常培地から亜鉛欠乏条件に移行した場合や明所に移行した場合はデンプン蓄積が見られることから、プラ研究の発表

口頭発表
1.

応答する Defensin-like family proteins の解析（招スチドにデンプン合成や分解に関わる酵素およびス待講演）」植物の栄養研究会第 6 回交流会、2021

クロースを輸送するための輸送体が存在していると

年 11 月 13 日、オンライン開催（大阪府立大学）

考えることもできる。このような亜鉛欠乏時にデンプンを蓄積するプラスチドの生化学的特徴や形成機構を明らかにするためには、亜鉛欠乏と通常培地で生育したシロイヌナズナやタバコの根から単離したプラスチドのプロテオーム解析や、デンプン蓄積が始まるタイミングでの RNA-seq 解析などを行うことが、今後必要になると考えている。
参考文献

深尾陽一朗「シロイヌナズナにおいて亜鉛欠乏誌上発表
1.

Kimura S., Vaattovaara A., Ohshita T., Yokoyama K.,
Yoshida K., Hui A., Kaya H., Ozawa A., Kobayashi
M., Mori IC., Ogata Y., Ishino Y., Sugano SS., NaganoM. and Fukao Y. “Zinc deficiency-induced defensinlike proteins are involved in the regulation of root
growth in Arabidopsis.” Plant J., accepted.