乳中に含まれる骨代謝を調節する成分に関する研究
明海大学歯学部口腔解剖学第一講座教授久米川正 女子

はじめに
近年、高齢化に伴い骨粗君主症が深刻な問題となっている。骨粗怒症は、老年期にみられる典型的な骨の疾患であり、骨の体積あたりの骨量すなわち骨基質と骨塩の両者が減少していくことを特徴としている。骨粗怒症の予防や骨強化のためには、カルシウム摂取量を増やすことも重要であるが、それだけでは不十分であると考えられる。すなわち、骨は、骨塩とともにコラーゲンなどの骨基質の両者がタイミングよく増加することで、骨量が増加し維持される。そのため、カルシウムのみを摂取しでも、骨基質地対量えなければ骨粗怒症の予防および治療に効果が弱いことも考えられる。そこで、骨基質を増加させる骨形成促進物質、および骨基質の減少をくい止める骨吸収抑制物質が求められている。
長期間マイルドな条件で摂取し、骨形成を促進し骨吸収を抑制する成分を食品成分中から見つけることができれば、骨粗君主症の予防および改善に有効であると考えられる。このような作用を有する食品成分の候補として、牛乳由来の乳清タンパク質に注目した。牛乳は、古くから完全栄養食品として飲用されており、豊富なカルシウムを含む。その上、乳児の成長の過程では骨の成長、形成およびリモデリングが活発に行われているので、牛乳中には、カルシウム以外にも、骨代謝に影響を及ぼす成分が含まれていることが推定される。特に、乳清タンパク質は、チーズ製造の副産物であるが、多くの魅力的な成分を含むことが予想された。骨には骨芽細胞、破骨細胞および骨細胞などが存在し、それぞれ相互に重要な役割をしながら、骨が作られ維持されている。骨は、骨芽細胞により骨基質の主成分であるコラーゲンなどが産生され、コラーゲンにヒドロキシアパタイトが沈着して作られる。また、i
青タンパク質の inv
itroでの骨吸収は、骨形成とともに骨代謝に重要である。そこで、本研究では、宇L3T3‑効果を、骨芽細胞および破骨細胞を用いて検討することとした。まず、株化骨芽細胞である MCE1細胞および'MG‑63細胞を用いて、乳清タンパク質の細胞増殖活性および分化誘導活性について検討した。そして、乳清タンパク質の破骨細胞に及ぼす作用について、うさぎの全骨細胞を用いた破骨細胞による骨吸収評価法と新たに開発した単離破骨細胞の系で評価した。本論文では、これらの乳清タンパク質の骨芽細胞および破骨細胞に及ぼす効果について報告する。

材料と方法

1̲実験材料10
週齢の日本うさぎは、埼玉実験動物(埼玉)より購入した。 α‑Modifiedminimumessentialmedium (α‑MEM) はFlowLaboratories (McLean，VA，USA) から、牛胎児血清 (FBS) はGibco(GrandIsland，NY) からそれぞれ購入した。 1，25‑DihydroxyvitaminD1， 25 (OH)品)は帝人より、 human3 (つdlpo[1ω34]para世lyroidhormone (11判官)は、!t!!化成より妻子殺でI震いた。 SalmonCT (sCT) はUCB‑Bio繍products(Chemin，Belgiu顕〉から、{出I]‑scn、
ま AmershamIntemationaJ(Buckinghamshire，UK) よrype‑1collagen，Cell開 封 出 I‑A) は書 Ellゼラチン{大絞)、級号機入した。コラーゲンゲル溶液 U
生物コヲーグナ-~は和光絡築工業(大阪)、プロナーゼは科研製薬(東京〉よりそれぞれ簿入した。ぎし清タンパク質;土、生学しを遼心分離して乳鎗訪を除去した後綴貫主でp狂4.7にしカゼインを除去し、エパポレータ…で談調書f
麦、透析絞で透析することによ時議製した。

2皿機'芽細胞溶幾および磁石孝C57BL/6~系新生児マウス波頭脅から樹立した事長化iif 芽細総MC3T3-E1 および入の骨芽細胞である

MG63
級滋 i
、
立 37'
Cの co，1ンキュベータ‑ (5%Cα、お %air) 内で、 α‑MEMに10%血清を織っ土、手，hosphate‑bufferedsaline(PBS) に0.
001%prona
部記(科務たものを思いて尊号室委した Q 組総選室代 i
製薬、東京}およぴ'0.02%滋 )TAを加えた溶液マ綴総を剥がし、 1:50
つ希釈務懇で 3 Bごとに行った。
屈の主義養周プラスチァクシャーレに 40，0ω惣rJ)細胞を播縫い IO%FBSを会主pα 岐 部fに細胞は 35m
より 3尽罪君主者養した。そして、 0.3%FBS会含む α命 館Mに乳清タンパク震を添加した竣薬品にラ託金集し、所定の期襲警培養した。主苦言霊終了後、 3[jj]PBSi:洗浄し、 O.2%NonidetP‑40(SigmaChemical，SILouis)
を 2mt加え、ラパーポリスマンで綴胞を号車rc，がして集め、プラスチックチューヅに移した。そして、
1定局総胞霊長喜平液とした。
超音波縮胞破砕務を潟いて綴君主を氷冷下で破事学し、各種韻)

3. 昏:w線総の DNA量の澱定f
李芽細胞のひNA
畿は、 3，5トdiaminobenzoicacid ゆABA) によるさ設光発伝法によ与潟lt
5Eした。上認.6NTCA Ctrichloroaceticacid) をO.lmtの方法で得られた級極右底砕液O.lmtをガラス遠心管;こ悪事し、 O添加して 10分間氷冷した。主主心後、 i
主義主に 3泌のょにタノ}ル (0.1Nl'ft;票差カリウムを含ひ}を力量えて0分間氷冷した。遠心によりよ洛を除き、沈殿によL タノ‑)レをき言えパラフィルムで澄ませしま後鉾し、 15分間淡路した。 E話脂後主主心して上機を除いた f
麦、 1N
水酸化アンモニウムを 0.1m
草加えてて6O'C、 1、100、200、エパポレータ…で乾燥させた。標準物質として、字書裂した子守二の胸線DNAを潟いて、 50400、800、1，0∞ p患の DNAを含む O.lmtの1N
水酸化アンモニウム液をょにパポレ…ターで乾燥させ援活主になるように蒸't
I
i水で溶解 l，i
毒殺炭によ持者塩酸澄のた。また、あらかじめ DABAを0.4g/mti
そEを脱色させた。そして、ガラス絞殺管にDABAをO.
lmt添加し、パラフィルムで後書Iした後、 60℃で30分間秘書名した。冷却後、 4mtの0.6N
遜浅素直変を加えて遠心した後、 J
ニ後を蛍光光E宣言十で415n
舶の励怒ぎまにおける 515nmの蛍光を測乏した。

4. ['H] Thymidineの取り込み畿の翠1J:iE管芸事細胞主主C3T3‑Elを10%FBSを会む←MEM培地で l火当たち 2，∞01
還の細胞を 96
火プレートに播殺し、 37'
Cで24日寺罪事培養した。そして、 FBSを含まない αぷ 偲M主審;
地で 1B間培養後、乳済タン
内4qucoパク質を主審主義;こ添加し、 18湾問機養した。 1穴おたり 0.5pCiの ['H]thymidine.(20Ci / 間 関01、第一化学薬品、主主主主)を添加し、 2U
寺問主警察後、 ["H]thymidineの取り込み愛を、液体シンチレーシ
ヨンカウンターを用いて測定した。

5. ハイドロ今シプロリン量のま霊祭およびブロコラーゲン type1
ペプチド畿の測定
輸

コラーゲン滋は、 Woes知erの1.i~長によ号、毒自砲および違憲質のハイドロキシプロリン援をま主議することにより求めた。ハイドロキシブロリン量の後蚤 i
立、十ジメチルアミノベンズアルダヒドを用い

ypelペプチド (P1P) の泌定 i
立、 P1P
測定キット(:i':ることによち行うた。また、ブロコラ…グン !
内返送主〉により frった。

6. 金券義理飽を用いた骨吸収評償法
会骨組目撃は、 1
0日紛のうさぎ?の大腿骨、疑脅および上腕守普から調裂した。主毒機した骨の数組織をI'v
飽MI
こ5 %血清を織った主書士車中て、 1
5分間解剖IJ
ffllまさみを潟いて細かく破砕した。こ
耳立ち除き、 α‑の破砕物をさらにチューブミキ号ーーで30秒間還ましく撹鈴し、2分問静置することにより大きな後礎物を除いた。生細胞委主は血球計測量生で縦走し、五度唱号総互主と骨芽細胞は、それぞれ!
art
国.
te‑resis
回 tacidlkalinephosphatase (ALP) IJ)染色を行うことにより議車きした。破竹籾砲に
phosphatase (TRAP) とa
よる乳液タンパク質の後吸収活倣 l
立、長官会綴胞を含んだ 5%FBSを織った 200μ6の α‑ME
泌を 96
穴プレート中の象牙片ょに矯緩し、 2s年間培養した後、乳液タンパク交を含む機黄色にlO'M1，25(OH，)D，を添加した培地 l
こ還まき換え、 4日間主喜怒することによ与手すった。機器警終了後、 96
穴プレート中でHandyEngine (寄宿務工、東京) I
ニブラシを遺産着して 10秒間作用させることによち多額胞を取り除き、
acidhematoxylin(Sigma) で 3分鱒染色した。霊童青細胞によって形成されたす吸収活倣 i
ムピット数をどットを積っているメッシ品の数を測定することによち行った。

7. 挙襲撃した破働総胞を簸いた評舗法
0日齢のうさぎの大機管、経?をおよび上腕骨から話題運送し、 aふ怨MIこ5%WI清を争議っ全脅露関胞を、 1こ滋種した。 4ft
寺長持続養f
麦、主義着していない総滋と細かいた楼主主主ド守合、コラ…ゲンコ…トした disM
こより取り除き、培養物音 0.02%の 加TA討議った 0.001%のブロナーゼで処理し'I'fの破砕物を PBSIきを絞り除いた。そして、 0.01%と3ラゲナ…ぜを処理裂して、て、家主義着後IJ)Ull主主総践とストローマ綴5ストロ… γ 細胞などを完全に現立ち徐き、破骨綴織のみにした。そして、 0.1%のコラグナーゼを処理裂して破脅豪語綴を剥がし、低迷遼心 (50らpmで 2分関) して、単離彼す号線君主を終めた。乳液タンパ
ク:lIif1J)骨吸収活性は、五農骨細胞を念んだ 5%FBSを争議った 200μ slJ)a MEMを96
災プレート中の象周牙片ょに怒還し、 2時問機獲した。そして、乳清タンパク震を 13"tJ
緑地に 10'''M1，25(OH)，D，を添加した等生患に後き換え、 2日問機饗することにより行った。瀦養終了後、総穴プレートやで日andy恥偽記問(吉田総工、系米)にブラシを装着してお秒、 i制作用させることにより綴E
告を絞り除主、 acidhe‑…363matoxylin(Sigma) で 3王子総染色した。喜主管細胞によゃて形成された骨吸収?舌性 i
立、ピット数とどツトを覆っているメッシュの数を総支託することにより行った。

8. 電子顕微鏡による綴察
象牙片上S
こ主審養された護主守縮織は、1.25発以前町 aldehyde(0.
1%cacodyla
詩意義者
奇1夜、 pH7.4)で閣支託し、 10
1
3問O.IMEDTAで紙灰し、 l事
長 osmiumtetraoxideで爽に固まさした。そして、エタノ… Jレで汲水してよLポン務総包機し、ダイヤモンドナイフでカットした縁切サンプルを 2000c透過裂後予綴微鏡 (JEOL、東京)で義霊祭した。

9.(1"Ils‑Gτー絡会実験
2パ3∞のうさぎ議議量産主骨細胞を 96穴multisc
悶nfilterplate(Ni註関誌をiIlipo
問、東主主}に 160，
" $の 10%即S を会主fα-MEM~こ主義経した。そして、 20 1' $[出I]窓口{最終淡民主0.5nM;選手活性74kB弓/pmol)

とおよ"$の各i
A
急援をのsCTまたは hCTを添加した。綴主主 i
立、 4"Cで 1傍若号培養し、lO%FBSを含む G

勾MEM"L"5@]洗浄した。フィルターは、パンチアウトして、ァカウンタ… (ARC必00，アロカ) I
ニて計測した。

10. 統計処理
すべてのパラメ w ターの総督十主義務ま~:7ê限定のう子数分析を行い、平均{僚の差の緩ま在は、 Tukey幅広F

ameri:去による多重比較主主によ号行った。

結果および考察I 事u
脅タンパク突の骨:5f細胞による評価
乳淡タンパ夕飯が骨芽室議総にどのような効糸を示すかについて、守幸美子豊富Jl&
MC
3T3‑E1
綴総およびMG‑63
綿胞を用いて検討した。乳清タンパク質 i
立、骨芽縦Jl&MC
3T3必l
への ['H]thymidineの耳支持込

み髭と DNA:I撃を漫皮依存約 3こ場加させた (Pig.
l、2)。そして、 MG‑63
細般においても、?沼]
thy
加idi‑
委設を濃度依存会きに増加させたわatanotshown)。このことから、総済タンパne(l)液号込み殺と DNAク質 l
立、管芽幸喜君主の地殖を促進させることが紛らかとなった。次 i
こ、乳清タンパク質の骨芽綴胞
MC3T3‑E1およびM G
必3綴胞に対する分化誘導作尽について語調べた。コラーゲンに革審者量的なハイド
3
ロキシプロリン蚤i
立、乳液タンパタ質のi
添加によち j幾&依存自きに機加した (Fig.
3)。そして、ヅ ロE

コラ…グン t守y許pe
斗ベフ.チド支幾愛;はま、手Lt
資タンパク資により淡渓依存的に主要加した (Pig.4)。このことか
ら、乳液タンパク主要 i
立、 t
干の 3器禁であるコラーゲンの合成を促進することがわか?た。乳液タンパ
ク紫が、殺妻子、滋胞の嶋晃童と分 lt誘導の 2ilii
殺の活性を示すことは、たいへん興味深い。乳清タンパ
ク銭的には、牛乳中の足立長を助ける多くの符効成分詰菅谷宅をすることが知られている。これらのいく‑
364‑500040004匂九3000
F，守一イ;寸山{渓乱︒}噂MMWHam 曲
EW thhぷトs*

2000

9*︹X 円山

1000。
Control

0.01

0.
1

1.
0Wheyprotein(mg/ml).Effectofwh
母yproteinon[3H]
thymldi災曹 u
pt
昌ke
Fi
g.1
in0器teoblasti
cMC3T3E1cells.Valuesaremeans土SD.
•Significantlydifferentfromthecontrolgroup(p~0.05).
嶋20*hoo ︿Z Q{ぷ的一判M¥切礼}何回い借料開15105OControl。
.
1

1.0Wheyprot告 in(mg/ml)
Flg.
2.E
ffectofwheyprotei
nonDNAcontenti
nosteoblasticells.Valuesarem思ans+SD.
MC3T3‑阪1c
合 S
ignl
fic
antlyd!
fferentfromthecontrolgroup(P<0.
05).

ーお5‑5*{ぷ斡て3、、4E語ぇ=}.
ce。3c。
。
網制思c。
a2・・o3kh1』て〉3、

ヱO

0.
1Control1.
0

Wheyprotein(mg/ml)
Fig.
3.E
ffectofwheyprotei
nonhydroxyprolineωntent
喜ti
cMC3T3・E
1cells.Valuesa
remeans土SD.
inosteobla
Sign
if
icantlydlfferentfromthecontrolgroup(P<O.
O号.

合

4nunU
0
30a

四開閉
三 zcp時hWC由occo&F仏‑C¥冒・{oControl0.
010.
11O姐

Wheyprotein(mg/ml)
Fig.
4.Effectofwheyprotei
noncollagenp
rodu
ctloninosteoblasticuesar
emeans土SD.• Signi
ficantlydlfferentfromthe
MG63cells.V語lcontrolgroup(P<0.
05)
.

‑366ー

っかが、骨苦手線総のま善策を促進し、 コラーゲンなどの合成金俊道議寸る分化誘導活性を有していたものと者まえられる。乳清タンパク質 l
立、骨芽綴胞による脅形成を促寸撃することが考えられ、今後その有効成分について検討していきたいと考えている。いずれにしても、乳液タンパク質が、骨芽縮機による骨形成を促進することから、骨粗繋症のそ予防およひ激怒に有効である可能性が示唆された。

立 乳清タンパク質の破骨細胞による評価
乳清タンパク貨の破骨細胞による骨吸収活性に及ぼす効泉を調べるために、 うさぎの破骨細胞による令吸収減定を行った。既存の銀管細君主による管現段収喜子鏑系において、乳清タンパク質は淡1f依

手事的i
こ高まf号綴震による骨吸収を抑制した (Fig.
5)。会す普憲議君主による骨吸収抑部作用が示されたことから、 このf宇F語が直接かまたは間接作尽かを議喜べるために、主草書量破脅納胞の骨吸収妻子儲系を害義;立することとした。全膏怨君主を、おお護舎のうさき舎の火薬草f
号、自察脅ま三よび上綴脅から調裂し、 a‑匙ffiMI
こ5%阪湾を綴った培地中で、 コラ…ゲンコishl
こさ委後したところ、多数の互主主ま綴君主、ストトしたdローマ総施、繊維芽綴総、骨募総胞などが義主要義された(Fig.
6A)0 4草寺湾培養後、多様の大きご量産器総ishに主義務していた。後最安していない織胞と綴かい管の破砕物愛 PBSによは、コラーゲンコートした dり取り除き、培養物0.02%のEDTAを字詰ったりぷ01%のプロナ}ゼで処理して、非袋五毒性の血球線路

Fig.
6B)。そして、 0.01%コラゲナーゼを処理して、ストロー?総とストローマ細胞を取り除いた (200﹄申S E 3 Cご &100G

Control0.
0
10.
11.
0

Wheyprotein (mg/ml)
ドig.
5.E
ffec
tofwheyproteinonosteoclasticboneresorption.
!
::
S
Dforfou
rcultures舞.Significantlydifferen
tfrom
Valuesaremeansご

thecontrolgroup(P<O.
05)
.

‑3る.
7‑

協などを完全に取り除き、奇襲菅細胞のみにした (Fig.
6C)
0 そして、 0.
1%のコラゲナ0‑1;'で処壊し菜室管細胞を紛がし、低速議室心{鉛Orpmで 2分総} して単機器量骨綴胞を集めた。--~のうち rg から、∞，oのT貼 P陽性看護脅細胞が得られた (Fig.
7)。コラ}ゲンコートした磁絡事露君主 i
立、電子40;0件 50uffledborder
心kemembraneとCI
回 rZoneが綴重要することができ、顕微鏡で観察すると、よく発主義したrnv
ivoにi丘い形態をしていた (Fig.
8)。国sCTラベルによるカルシトニン結合伎を謁べたところ、
よち i
カJ
レシトニン結合審sf
立を専をしていることが線認された (Fig.
事)。等主常世破寺号綴総について、綴総数を!
首位がおいことが示された(Fig.
10)。
変えて象王手ょに作JfIさせたところ、綴胞数に応じて、骨吸収j
そして、各署重'符吸収に関与するホルモンである 1，25(OH)品、 hPTHおよびsCTについての効楽につ守綿胞の系で調べた。その結糸、被骨綴総;こ産後作用を淡 i
ますカルシトニ
いて今問機立した単離破fンのみに骨吸収抑制作用がみられ、説的損al
紛胞を介してf乍JfIする 1，25(0土f)，o，、 h
円肢は、肴吸収に影響を及ぼさなかった(Fig.!1)。さらに、 strom
a細胞をイf下用きそた時のみ、 f
号理主絞{足t射す見られた(Fig.
12)。このことから、今問機立したゑ難破管細胞の分離とこれを潟いた単障壁骨量骨量密君主の評価系;主、直接作思議ベる優れた;震であると考えられる。この手泌を用いて、乳液タンパク質のすす吸絞抑

静U
f
下F
詩を調べたところ、被特細胞による骨吸収を乳液タンパク賓の淡度依存的に抑叡jしていた (Fig.

13)。このことから、乳液タンパク質 l
土、主主努繍胞に話室援f乍浴することによって、骨吸奴 (f)締約を干すっていることが濁らかとなった。今後、乳清タンパク笈の骨吸4文抑制成分の露手続とメカニズムをu明らかにしていく必姿がある。そして、この成分が管代議 こどのような霊長考撃を及ぼすかについて明らかにしていくとともに、う李総繋主主の予防および改を警に有効マある百J総性について研究していきたいと考えている。

Flg.6. Unfractionatedbonec思IIsoncollageng
eldurlngtheIsolatlonontr
astmicrographo
fun
fractionate
dbone.
cell
sb砲foreprocess.A;Phasec
enzymaticdigestion.B;A
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rdige対 lonwlt
hpronaseEIEDτA.C;A
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hcollagenasea
talowconcentration.
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Wheyprotein (mg/ml)
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