乳脂肪を用いた脂肪負荷試験確立のための基礎研究(中間報告)
東京医科歯科大学第三内科講師団

中明

1.調査・研究の目的
ヒトは l日3回の食事の他に間食する機会も多く、また、糖尿病、動脈硬化性疾患例における脂質の日内変動の検討から、 1日の生活時間の大部分 (20時間以上)は食後の状態にあることが指摘されている。したがって、動脈硬化のリスクを評価する場合に、従来の空腹時の高脂血症のみでは不十分であり、食後の高脂血症の評価が重要であることは研究者の一致した意見である。
しかし、食後高脂血症を動脈硬化のリスクとして評価しようとする試みは、国内外の多くの研究者によりなされてきたが、その評価方法が様々であるため、お互いの結果を比較、利用することができず、この分野の研究に著しい進歩が見られていないのが現状である。
食f
最高脂血症を評価するためには、脂肪負荷試験が有効な手段と考えられるが、負荷する脂肪も、卵、各種オイル類、生クリームなど様々で、負荷量も様々、測定する脂質の種類もコレステロール、トリグリセリド、レチニールパルミテイト、脂肪酸など様々で、測定時間も一定しておらず、今後、すべての研究者間に共通した脂肪負荷試験の確立が必要である。共通した脂肪負荷試験の確立は、食後高脂血症の共通した評価を可能にし、臨床レベルでの動脈硬化リスクの評価に有効な手段となることが期待できる。
われわれは、共通の脂肪負荷試験確立のために、缶詰めタイプの乳脂肪 (0町Tクリーム)を試作品として用い、その有用性を検討している。
また、動脈硬化のリスクであるレムナントリポ蛋白は食後の変化が著明で、脂肪負荷試験の測定脂質として有用であることは指摘されていたが、その測定方法か溶易ではなく、臨床レベルでの大量検体の処理は困難であった。しかし、われわれは、レムナントリポ蛋白を反映し、簡便に測定可能なレムナント様リポ蛋白 (RemnantL
ikeParticles、RLP)を開発し、臨床レベルでの測定を可能にした。動脈の有用性は国際レベルでも評価されつつある(米国、 FraminghamHe
制硬化リスクにおける RLPStudyの発表<Clinicalchemistry，1998>など)。
われわれは、 RLPを脂肪負荷試験の測定脂質として、その有用性を検討している。
本研究の目的は、共通の負荷脂肪およびその量、共通の測定脂質および測定時間で実施される脂肪負荷試験を確立するための基礎検討を行うことであるが、具体的には、負荷脂肪として試作された乳脂肪 (OFTTクリ}ム)およびレムナントリポ蛋白を反映する、われわれの開発したレムナント様リポRLP)の測定脂質としての有用性を検討することである。全国共通の脂肪負荷試験が確立すれば、蛋白 (結果の比較検討が可能となり、食後高脂血症の共通の評価ができるようになる。また、臨床レベルでは、空腹時のみの高脂血症の評価よりも、脂肪負荷試験により、糖尿病におけるブドウ糖負荷試験と‑30‑同様に、潜在的な、より感度の高い動脈硬化リスクの予知手段となることが期待される。
本研究の目的を達成するために、日本全国から 9施設の大学と研究会を組織し共同研究をおこなっ
0年度からは、スウェーデンのカロリンスカ研究所、米国のカリフォルニア大学、アているが、平成 1ラバマ大学、カナダのモントリオール大学との国際共同研究も開始した。

2. 研究計箇および方法
平成百年度は、健常例を対象に脂肪負荷試験を行い、 RLPは脂肪負荷試験の測定脂質として有用で0年度は、冠状動脈造影を施行した 12C例を対象に、動脈硬化を評価する脂あることを示した。平成 1

肪負荷試験の測定脂質として、また、食後高脂血症の指標として RLPの有用性を検討するため、次のような脂肪負荷試験を行った。
コトコール
1)プ l
20例に、乳脂肪 (0町 Tクリーム)を負荷(脂肪量として30g/
体冠状動脈造影を施行した連続した 1
表面積m2)し、負荷前、負荷後 2、 4時間に採血した。サンプルは直ちに3，000rpm、15分で血清分離し 4度Cに保存された。試験中は水分以外の摂取は禁止した。平成 9年度の健常例を対象とした
脂肪負荷試験は負荷後 8時間まで変化を見たが、本年度の対象は冠状動脈硬化症例であるため、安全性を考慮して負荷後 4時間までとした。対象患者には、試験内容を説明し、承諾を得た。
TC)、トリグリセリド (TG)、HDLコレステロール
それぞれの検体について、総コレステロール ((HDL‑C)、RLPコレステロール (RLP‑C)、RLPトリグリセリド (RLドTG)、アポ蛋白(アポA‑I、A‑

E、B、C‑II、C‑III、E)の測定を行った。

2)冠状動脈造影eldinger法を用いた。 cme‑百lmsは少なくとも、 30deg
悶大腿動脈による Sright如 teriorobliqueと60degreeleftanteriorobliqueの 2種類を用いて、冠状動脈の狭窄率を評価した。 AmericanHeartAssocia‑tion(必fA)の基準により、狭窄率25%未満を正常冠状動脈とした。また、少なくともーカ所以上の群とした。
冠状動脈に 75%以上の狭窄を認めた例を CAD3)対象
2C例を対象とした。高LDLコレステロール血症のリスクを除冠状動脈造影を施行した連続した 1増加のリスクを検討するために、 12C例の対象のうち、負荷前の TC、外するため、また、食後の RLP
RLP‑C値の正常 (TC<220mg/dl、RLP‑C<7.5mg/dl)例を選択した。その結果、冠状動脈造影で冠状24例と 75%以上の有意冠状動脈狭窄を認めた冠動脈の狭窄を認めなかった正常冠状動脈群(対照群 )群)
33例が選択され、前群でRLP‑C、RLP‑TGはじめ、各脂質値が比較検討され状動脈硬化群 (CADた。
4)負荷乳脂肪 (OFTTクリーム)試作された負荷試験用脂肪(上毛食品、群馬 )OFTTクリームを使用した。 l缶当たり総量200g、‑31ー脂肪量として 70g。熱量341kcal/100g、コレステロ}ル 74mg/l00g。構成、水分56.9%、脂肪32.9%、
蛋白 2.5%、炭水化物 7.4%、ミネラル0.3%。脂肪酸構成、飽和脂肪酸64.1%、 l価不飽和脂肪酸29.3%、多価不飽和脂肪酸3.5%、その他2.9%。脂肪量として 30g/
体表面積m2が負荷された。

5)血清指質、アポ蛋白の測定
TCおよび'T
Gは酵素法により測定した。 HDL‑Cは直接法 (HDL‑CAuto第一化学)、各アポ蛋白は免値は Friedewaldの式を用いて計算した。
疫比濁法(第一化学)を用いた。 LDL‑C6) Rl.P‑Cおよび Rl.P‑TGの測定
JIMRO‑lI(日本抗体研究所)測定キットを使用した。すなわち、抗アポA Iおよぴ抗アポB‑l00モ司

ノクローナル抗体の混合ゲル300μlに血清 5μlを混合、 60
分間緩徐に振還した後、 15分間静置、上清(RLP分画)のコレステロール (RLP‑C)およびトリグリセリド (RLP‑TG)を測定した。カットオフ債.
5mg/dlとした。
は77)統計CAD群および対照群における負荷前の男女比、糖尿病の頻度、喫煙者の頻度の差の検定は F
isher'sex
acttest、負荷前の年齢、 BodyMassIndex(BMI)、各脂質値の差の検定には t‑testを用いた。また、
epeatedmeasuresANOVAを用いた。1'<0.05
両群における各脂質値の負荷後増加率の差の検定には rを有意とした。

3. 結 果1) CAD群および対照群の特徴の比較(表)CAD
群は 33例中、男性 19、女性 4例、対照群は 24例中、男性 10、女性 14例と CAD群で男性が多p=0.0014)。年齢は CAD
群62::1:9歳、対照群65:
t11歳、 BMIはCAD
群23.5土 3.
2、対照群
かった (22.
9:t3.4、喫煙者は CAD群は 33例中、 15例、対照群は 24例中、 5例、糖尿病例は CAD群は 33例中、10例、対照群は 24例中、 2例と、いず子れも両群で、有意差を認めなかった(年齢:p=0.1602、BMr:
p=G.4835、喫煙:p=0.0908、糖尿病:p=O.0549)。
2) CAD群および対照群の負荷前の各脂質僚の比較(表)C，日群および対照群ともに、 TCおよびRLP‑C
値の正常例 (TCく220mg/dl、RLP‑C<7.5mg/dI)を対象としたため、各脂質、アポ蛋白値の負荷前値に有意差を認めなかった。すなわち、 RLP‑CはCAD
群3.
6土1.2、対照群3.7土1.4mg/dl(p=O.6742)、RLP‑TGはCAD
群12.7:
t7.4、対照群 11.9土7.4mg/dl(p=0.6545)、TCはCAD群 18l:t24、 対 照 群 188土21mg/dl(p=0.
2692)、HDL‑CはCAD群36.6:
t12.
8、対照群42.5土 12.3mg/dl(p=0.0876)、TGはCAD
群116土 43、対照群 109:
t37mg/dl(p=O.5721)、
LDL‑CはCAD群 12l:t26、対照群 123:
t22mg/dI(p=0.7401)、アポA‑IはCAD
群105:t25、対照群 115:
t20mg/dl(p=O.1272)、アポA‑l
IはCAD群28.4:
t6.6、対照群27.8:
t4.Omg/dl(p=O.6538)、アポB
はCAD
群98土20、対照群 98土 17mg/dl(p=0.9533)、アポC EはCAD
群3.
9土1.7、対照群3.5士1.2田今οっmg/dl(p=0.3220)、アポC 日はCAD群8.0士3.
2、対照群8.0士2.8mg/dl(p=0.9902)、アポEはCAD.9:
t1.3mg/dl(p=O.6552)であった。
群4.8土1.3、対照群43) CAD
群および対照群の負荷後RLP‑CおよびRLP‑TG
値の増加の比較(図1)CAD
群および対照群の負荷前紅P‑C1i
直に有意差を認めなかったが、 CAD
群の負荷後 2時間値はt2.5mg/dl(Mean土 SD)、4時間値は7.
9:t4.4mg/dlと、対照群の負荷後 2時間値4.5:
t1.8mg/dl、4.9::
t2.7mg/dlよりも有意な増加を認めた (p=0.0141)。
4時間値6.l同様に、 CAD
群および対照群の負荷前RLP‑TG
値に有意差を認めなかったが、 CAD群の負荷後 2:t22.Omg/dl、 4時間値は63.
3:t45.5mg/dlと、対照群の負荷後 2時間値21.7土11.9
時間値は30.1

t22.3mg/dlよりも有意な増加を認めた (p=0.0031)。
mg/dl、 4時間値38.2:4) CAD
群および対照群の負荷後TC、TGおよびHDL‑C値の治加の比較(図 2)
CAD
群および対照群の負荷前TGに有意差を認めなかったが、 CAD群の負荷後 2時間、 4時間値は、対照群よりも有意な増加を認めた (p=0.0012)。
負荷後のTCおよび日DL‑C億の変化は両群で有意差を認めなかった (TC:p=0.1157、HDL‑C:p=0.(255)。
5) CAD
群および対照群の負荷後各アポ蛋白値の増加の比較(図 3)
値の変化は両群で有意差を認めた(アポC‑ill:p=O.OOOl、アポ E:
負荷後のアポC‑illおよびアボE
p=O.ool1)。
負荷後のアポA‑1、アポA‑Il、アポBおよぴC‑Il値の変化は両群で有意差を認めなかった(アポA411、アポC‑Il :p=0.1897)。
‑1 :p=O.1
366、アポA‑I
l :p=0.1025、アポ B:p=O.56) OFTTクリームの安全性
OFTTクリーム負荷により、特に副作用を認めなかった。

4. 考 察1)動脈硬化のリスクを評価する脂肪負荷試験測定脂質としての RLPの有用性
米国、 FraminghamHeartStudyをはじめとする多くの大規模試験により、高TC血症(高LDL‑C血症)が冠状動脈硬化症 (CAD)の発症頻度を増加させ、それを治療することにより CADの発症頻度を減少しうることが示され、高LDL‑C血症と CADとの関連性は確立した事実と考えられるようになった。
しかし、 CAD例のすべてが高LDL‑C血症を伴うとはかぎらず、高LDL‑C血症を伴わないCAD例のリスクとしてわれわれはレムナントリポ蛋白に注目した。特に、わが国の心筋梗塞例は高LDL‑C血症しC血症以外のリスクが重姿であると考えられる。
を伴わない例が少なくないことから、高LDレムナントリポ蛋白がCADのリスクとなることは、 RLPを用いた検討を含めて多くの報告がある
lI
nghamHeartStudy、ClinicalChemistry、1998)。また、前年度の健常例を用いた検討により、(FamRLPは脂紡負荷により著明な増加を認め、試験測定脂質として有用であることが示されたことから、‑33ー本年度は空腹時ではなく、脂肪負荷後(食後)の RLPの増加がCADのリスクとなるか否かを検討した。
P‑C
値の正常例を選択して、対象としこのような目的を検討するために、空腹時の TC値および'RLた。
今回対象とした、 CAD群および対照群において年齢、 BMI、喫煙率、糖尿病合併率に有意差を認めず、また、負荷前のTC(LDL‑C)、TG、HDL‑C、RLP‑C、RLP‑TG、各アポ蛋白値も有意差がなかっ
P‑TG
値の有意な増加た。それにもかかわらず、 CAD群は対照群よりも、負荷後に RLP‑Cおよひ'RLを認めた。
この結果から、高 LDL‑C血症を合併しない対象では、 CADのリスクとしてレムナントリポ蛋白の増加が重要であり、レムナントリポ蛋白は空腹時が正常でも食後の増加がCADのリスクとなることが示された。
レムナントリポ蛋白は食後に著明な増加を認め、ヒトは 1日の大部分が食後の状態にあることを考慮すると、食後のレムナントリポ蛋白の増加は CADの重要なリスクとなると考えられる。また、空腹時のみでなく、食後にレムナントリポ蛋白を測定することの重要性が認識された。
‑illおよびアポE値も、 CAD群は対照群よりも脂肪負荷後に有意な増加
今回の検討で、 TG、アポCを認めた。これらの変化はレムナントリポ蛋白の変化を反映した結果と考えられる。
2)脂肪測定時間と RLPリスクの感度

前年度の健常例では脂肪負荷後 8時間までの経過を観察したが、今回は、対象がCAD例で、あったために、患者に与えるストレスを考慮して脂肪負荷後 4時間までの経過を観察した。一部の対象で、LP{i直の差がより負荷後 6時間まで経過観察したが、 4時間よりも 6時間の方がCAD群と対照群の R顕著になる傾向が認められ、食後高脂血症のリスクの評価をするには 6時間まで経過観察した方がより感度が増加すると思われた。
3) 負荷脂肪としての OFTTクリムの有用性

初jのCAD
例を含む対象で、 30g/体表面積m'の脂肪を負荷したが、特に、副作用は認め
今回、 120られなかった。共同研究している他の施設から、健常例を対象に便通異常と脂肪負荷量との関係を7g/体表面積m'以下では全く異常を認めないことが示された。
検討した結果、 15.結 論
高LDL‑C血症を伴わない CADのリスクとしてレムナントリポ蛋白 (RLP)の増加が重要であることが示唆された。また、空腹時のみでなく、食後のレムナントリポ蜜白 (RLP)の増加がCADのリスクとなることが示唆された。レムナントリポ蛋白は食後に著明な増加を認め、ヒトは 1日の大部分が食後の状態にあることを考慮すると、食後のレムナントリポ蛋白の評価が感度が高く重要であり、脂肪負荷値測定が有用であることが示された。
試験での負荷後の RLP‑34ー6.結果の発表
今回の検討結果の l部は、 1998年の日本動脈硬化学会総会 (6月)、日本動脈硬化学会冬季大会 (12月)、米国臨床生化学会(シンポジウム、 8月)において、発表し、現在、論文投稿中である。
lin.Chim.Acta275:43‑
52，1998(TanakaA，etなお、健常例を対象とした平成 9年度の検討結果は、 C

1owingafatloading胞 st)に発表された。
al:
Measurementofpostprandialremnantlikeparticles(RLP)fol

7.今後の研究計画
われわれの例を含めた健常例、疾患例 (CAD、糖尿病、肥満など)についての脂肪負荷試験の検討は、全国 9施設で行われ、今後、研究会を通じて全体としての結果をまとめる予定である。
これまでの検討から、負荷脂肪量 (OFT1クリーム)l7g/体表面積m2以下では:便通異常が認められないことが示されたが、健常例で 17g/体表面積ゲの脂肪負荷試験を行い、これまでの30g/体表面積m2と比較する。

0年度から、スエ}デン、米国、カナダとの食後高脂血症に関する共同研究を開始しているが、
平成 1
これまでの検討から、日本人健常例の RLP債が欧米人に比較して低値であることが示されている。この原因を共同のプロトコールを用いた研究により解明する。この研究はすでに開始されており、一部
9S19年 8月に米国臨床生化学会にて発表予定である。
は、 1
CADについては、脂肪負荷試験で 6時間まで経過観察した CAD例を増加し、 4時間までの場合との感度を比較する。また、 P
1CA後の再狭窄の有無と脂肪負荷後の RLP増加との関連、複数回の冠紅P状動脈造影による冠状動脈狭窄度の変化と脂肪負荷後の紅P増加との関連を検討する。

‑35ー

表冠状動脈便化症(CAD)群と対照群 (Control)の特性の比較

Age(yrs)
Sex(M/F)
BMI
SmokerDiabetesMellitus
RLP‑C (mg/dl)
RLPTG(mg/dl)
TC(rng/dl)
TG(rng/dl)
HDLC(mg/di)
LDL‑C(mg/dl)
ApoJ~-I (mg/dl)
Apo，¥‑
11 (mg/dl)
ApoB(mg/dl)
ApoC‑I
I (mg/dl)
11 (mg/dl)
ApoC・1
生E旦E(mg/dl)
暢司

BMI:BodyMassIndex
会 Signifi
cant

CAD(n=33)
62土 9
28/5
23.
5土 3.
215
10
3.6+1.2
12.
7士74
181+24116+43
37+13
121+26105+252
8:!
:798+20
3.9+1.7
8.0+3.2
4.8+1.3

Control(n=24)
65+11
10/14
4
22.9土 3.
5
243.
7ま 1.
11.9+7.
4188:!
:21109土 37
43土 12
123:!
:
22
115ま20
28+4
98+17
3.5+1.2
8.0+2.8
4.
9土1.3

司

Mean+SD‑36ー

E
0.16020.0014*0.
4835
0.09080.05490.67420.65450.26920.57210.08760.74010.12720.65380.95330.32200.99020.6552

図1.冠状動脈硬化症 (CAD)群と対照群 (Conlrol)における脂肪負荷前後の RLP‑CおよびRLP‑TGの変化

987三E6L5J5己ロ4

p=0.
OI4132。

42Hr

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Hr

liCoronaryArteryDisease

Control Mean
土S
五4巧dqu図2.冠状動脈硬化症 (CAD)群と対照群 (Control)における脂肪負荷前後の TC、TGおよび H
DL‑Cの変化210
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‑d︐cp=0.1157

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図3.冠状動脈硬化症 (CAD)群と対照群 (Control)における脂肪負荷前後の各アポ蛋白値の変化

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