※本資料は文部科学記者会、神戸市政記者クラブ、大阪科学・大学記者クラブに同時資料提供しています。
記者資料提供：2023 年 12 月 25 日

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造血と白血病を制御する未知の機構を解明
公益財団法人神戸医療産業都市推進機構（理事長：本庶佑）は、先端医療研究センター血液・腫瘍研究部（部長：井上大地）による「造血と白血病を制御する未知の機構の解明」についての研究成果が、2023 年 12 月 16 日 （日本時間）付の国際学術誌『Nature Communications』に掲載されましたので、お知らせします。

【本研究のポイント】
近年 DNA レベルで変異を認めなくとも、RNA レベルでスプライシング異常により機能が喪失する遺伝子が報告されています。血液がんを中心に、BRD9 という遺伝子が RNA レベルで分解される現象をこれまでの研究で捉えてきましたが、BRD9 の生物学的な役割についての理解は不十分でした。
BRD9 が造血に果たす役割を初めて解明：今回の報告では、BRD9 が造血において果たす役割を初めて詳細に解明しました。ヒト・マウスの造血幹細胞で BRD9 を喪失させると分化運命を大きく変化させ、ノックアウトマウスではヒトと同様に長期間かけて血液がんである骨髄異形成症候群を発症しました。BRD9 はクロマチン構造の制御において重要な役割を果たしており、BRD9 が喪失した条
件ではクロマチンのループ構造や開閉状態の変化を介して遺伝子発現に変化が生じ、正常な分化機構に異常をきたすことを発見しました。
BRD9 を標的とした白血病治療法の可能性：一方で、BRD9 を阻害することにより急性骨髄性白血病細胞の分化を誘導できることから、短期的な BRD9 阻害は白血病治療に有用であるという知見を得ることができました。
これらの結果により、正常造血における BRD9 遺伝子の重要性をクローズアップするだけでなく、骨髄異形成症候群など増加の一途を辿る血液がんにおいて RNA レベルで発現制御される遺伝子が主要な役割を果たしていることを初めて証明しました。また、白血病に対して BRD9 を標的とした治療応用にも焦点を当て、今後の開発に直結する成果といえます。

本研究では、当機構先端医療研究センター血液・腫瘍研究部の井上大地部長、Muran Xiao 研究員、野村真樹研究員、西村耕太郎主任研究員が、国立遺伝学研究所（当時）の近藤伸二博士、名古屋大学の日野原邦彦特任准教授、メモリアルスローンケタリング癌センターのオマー・アブデルワハブ医師らとの共同研究により、BRD9 の発現制御とクロマチン制御をつなぐ新しいパスウェイが、造血幹細胞の維持・分化ならびに血液がんの発症・進展に重要な役割を果たしており、病態理解だけでなく治療応用につながる成果を明らかにしました。

※研究成果等の具体的な内容につきましては、添付資料をご参照ください。

■ 発表者：井上 大地
公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
先端医療研究センタ― 血液・腫瘍研究部長
2005/3 京都大学医学部医学科卒業
2005/4-2010/3 神戸市立医療センター中央市民病院免疫血液内科初期・後期研修医
2010/4-2014/3 東京大学大学院医学系研究科博士課程修了
2014/4-2015/9 東京大学医科学研究所細胞療法分野特任助教
2015/10-2019/3 Memorial Sloan Kettering Cancer Center 博士研究員
2019/2- 神戸医療産業都市推進機構先端医療研究センター血液・腫瘍研究部上席研究員
2021/10- 現職■お問合せ
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_添 付 資 料_

2023 年 12 月 25 日
公益財団法人神戸医療産業都市推進機構

造血と白血病を制御する未知の機構を解明
概要

１．背景
高齢化の進行とともに血液がんは増加の一途を辿り、その病態解明や治療応用に様々な取り組みがなされてきました。特にシーケンス技術の発達により、がん細胞の DNA 上の遺伝子変異が同定されるようになると、血液がんの多くに RNA スプライシング（※1）を制御する因子の変異が認められることが明らかとなりました。特に骨髄異形成症候群（※2）の半数ではスプライシング遺伝子の変異が検出され、ある病型では SF3B1 という遺伝子の変異割合が 80%を超えるなど、疾患発症に重要な役割を果たしていると予想されます。これらの変異は、様々な標的遺伝子の RNA スプライシングに異常をきたし、DNA レベルではなく RNA レベルで機能を喪失させたり、機能を変容させてしまうことを報告してきました（Inoue et al. Nature. 2019, Inoue et al. Nature Genetics. 2021, Tanaka et al. Blood. 2022）。これまでの我々の研究（Inoue et al. Nature. 2019）において、臨床検体の大規模な解析と機能的 CRISPRスクリーニング法（※3）を駆使して、BRD9 (Bromodomain Containing 9) 遺伝子が SF3B1 変異に伴うスプライシング異常によって RNA レベルで喪失する現象の重要性を報告しました。
BRD9 はアセチル化リジン等を認識するブロモドメイン（※4）を有する分子群のひとつであり、創薬標的として有名な BRD4 とともに大きな注目を浴びています。我々のグループを含むこれまでの研究により、BRD9 は、DNA 上での変異ではなくスプライシング異常によって RNA レベルで機能喪失され、そしてクロマチン制御複合体である ncBAF (non canonical BAF) （※5）に特異的な構成因子である、という 2 点から非常に興味深い因子として知られています。一部の肉腫などで ncBAF や BRD9 の役割について研究が進んできましたが、はるかに高頻度に生じる血液がんや造血機能そのものにおいて、BRD9 が果たす役割については全く解明されていませんでした。本研究は、この分子機序をヒト・マウス両面から明らかとすることを突破口として、生物学的な意義を探索し病態解明と治療戦略へと迫ることを目的に研究を行いました。

２．研究手法・成果

我々の造血は自己複製能と多分化能を有する造血幹細胞（※6）を頂点として、各系統にコミットした前駆細胞を経て、B 細胞などのリンパ球や好中球などのミエロイド系列の細胞などに分化成熟しながら維持されています。研究ではまず、この分化ヒエラルキーの頂点に存在する骨髄内の造血幹細胞における BRD9 の役割について調べました。BRD9 は造血幹細胞としての性質を維持する上で不可欠であり、https://www.fbri-kobe.org
1

BRD9 の喪失は B 細胞系列への分化を阻害し、ミエロイド系列への分化を促進しました。B 細胞への分化には BRD9 のブロモドメインが不可欠であることも見出しました。造血細胞で長期間 BRD9 が欠失したノックアウトマウスモデルでは、やはりヒトと同じように骨髄異形成症候群を発症し（図 1）、ミトコンドリア機能低下や DNA ダメージ蓄積の観点からも加齢形質を再現しました。これらはスプライシング遺伝子 SF3B1 の変異を伴う骨髄異形成症候群において、BRD9 のスプライシング異常による RNAレベルでの喪失が病態理解の鍵になっていることを示唆していました。

上記の通り、新たに作出した BRD9 ノックアウトマウスを用いた解析では、造血幹細胞の数が減り、ヒト臍帯血由来造血幹細胞やマウス造血幹細胞を用いた体外での実験でも幹細胞性の維持が難しいことが確認されました。しかし、興味深いことに、BRD9 野生型の骨髄細胞と BRD9 ノックアウト骨髄細胞を、骨髄破壊的な放射線照射を施したレシピエントマウスに競合的に移植した実験モデルでは、野生型細胞に対してノックアウトマウス由来の造血幹細胞や前駆細胞の比率が保たれ、ミエロイド系列への造血も維持されていました。一方でノックアウトマウス由来の B 細胞はほぼ消失していました。これらの知見は、ヒトの MDS 幹細胞においても一見すると自己複製能が減弱し弱々しいクローンに見えるにも関わらず、骨髄内でしぶとく残存し分化異常をきたす現象を再現しているものと考えられます。

次に、BRD9 はクロマチンリモデリング複合体 ncBAF に必須の構成因子であることから、BRD9 及びncBAF 喪失下のクロマチンや遺伝子発現における影響を調べました。このような制御因子は同じ分子であっても細胞系列によって振る舞いが異なることが報告されていますが、ES 細胞では既報があるものの造血幹細胞における BRD9 の役割、ましてや生体レベルでの報告はこれまでに皆無でした。そこで、
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2ノックアウトマウスの造血幹細胞を用いて、シングルセルレベルを含めた RNA シーケンス、ATAC シーケンス（※7）、ChIP シーケンス（※8）、HiC 解析（※9）などを用いたマルチオミックス解析を行いました。興味深いことに、BRD9 の喪失はクロマチンをよりオープンにすること、それらは特にスーパーエンハンサーやミエロイド系列の遺伝子において顕著であることを見出し、造血幹細胞の運命制御においてクロマチン制御に深く寄与する分子であることを見出しました（図 2）。

それでは、BRD9 はクロマチン上で一体何をしているのでしょうか？ これまで、我々が指摘してきたように、BRD9 はゲノム上で、クロマチンや転写単位の区画化に重要な CTCF（※10）が結合する部位に強く局在していることを造血幹細胞レベルで明らかにしました（図 3）。そして、BRD9 の喪失はCTCF 自身のゲノムへの結合を増強させるという全く新しい現象を発見しました。HiC 解析によりクロマチンの 3 次元構造をゲノムワイドに推測する手法を用いて、この現象がプロモーター領域で生じる場合には、同部位のクロマチンループを亢進させ、とりわけミエロイド系列遺伝子の発現を正に制御する傾向が確認されました。

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3これらの研究と並行して、CRISPR 技術による BRD9 ノックアウトや BRD9 分解誘導剤（※11）などを用いて、上述のクロマチン変化を介したミエロイド分化プログラムの促進は、阻害後速やかに生じること、自己複製能が異常に亢進した白血病細胞でも速やかに分化誘導が可能であることを見出しました。
白血病の中で最も多い急性骨髄性白血病の多くは、未だ予後不良であり、ミエロイド系列にわずかな分化コミットメントを示すものの、正常分化が著しく抑制された疾患です。分化した白血病細胞は生存し続けることができないため、歴史的にも分化誘導療法（※12）は白血病の重要な戦略となってきました。
実際に 100%白血病を誘導しうるヒト転座遺伝子（MLL-AF9）を導入しても、BRD9 をノックアウトした造血幹細胞を形質転換することはできず、ひとたび発症しても BRD9 阻害により分化が誘導され、脾臓への白血病細胞浸潤などが改善し長期生存することから、新規治療戦略の大きな可能性を示唆する成果が得られました（図 4）。正常造血で認められたように、BRD9 阻害は ncBAF が元々結合するゲノム領域や CTCF 結合領域においてクロマチンをよりオープンにすることでミエロイド系列への分化を誘導することが明らかとなり、BRD9/CTCF 部位のクロマチン状態の変化が急性骨髄性白血病の治療において重要であることが示されました。

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4３．波及効果
まず、RNA レベルで発現が消失するような遺伝子が組織幹細胞のクロマチン制御においてこれほど重要な役割を果たしていることを広範な実験から証明した報告は今回が初めてであり、がん領域だけでなく分子生物学や遺伝学全般に大きなインパクトを与える成果となりました。特に、RNA、すなわち転写後レベルでの異常が、他の遺伝子の転写に深く関与するという知見は、BRD9 だけでなく、転写因子EVI1 におけるスプライシング異常（Tanaka et al. Blood. 2022）による機能変容についても報告を重ねてきました。これらは、がんにおける遺伝子発現調節がより複雑であることを示唆しており、今後のさらなる病態解明が期待されます。また、ブロモドメインタンパクは BRD4 をはじめとして、がん領域で非常に注目をされる創薬標的として知られています。これまでに、横紋筋肉腫や滑膜肉腫など比較的まれながんで BRD9 を治療標的とする臨床試験が進んでおり、その効果が期待されます。しかし、長期的な投与は本研究で示したように造血幹細胞の幹細胞性や分化機構にも大きな影響を与えるものと考えられます。一方で短期的な分化誘導療法として急性骨髄性白血病での治療応用についてのコンセプトは本研究で確立しており、クロマチンレベルでのメカニズムに基づいた開発が期待されます。

４．今後の予定
まず、急性骨髄性白血病を中心とした血液がんにおいて BRD9 を標的とした治療応用について阻害剤開発を進めていきます。同時に、BRD9 スプライシング異常を利用した治療戦略についても、ゲノムワイドなスクリーニングから合成致死性遺伝子の探索などを行っていきます。また、造血における BRD9の役割について、胎児レベルでの造血ではどうか？、
BRD9 のブロモドメインが何を認識しているのか？、
BRD9-CTCF による詳細なクロマチン制御メカニズムとは何か？など、まだまだ分子レベルで解決すべ
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5き問題が残されています。このように、がんのメカニズム解明、ブロモドメインタンパクの分子基盤の観点から、大きな発展性を孕んだ同領域を推進する成果に挑戦していきます。

5．謝辞
本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業（JP20H00537、JP20H03717、16H06279 (先進ゲノム支援)、JP20H00537、JP20KK0184、JP20H03512）、日本医療研究開発機構（21ck0106697h0001、22ck0106697h0002、23ck0106697h0003、23ama221126h0001）に加えまして、日本血液学会、日本白血病研究基金、アステラス病態代謝研究会、持田記念医学薬学振興財団、化血研、ブリストルマイヤーズスクイブ、三菱財団、住友財団、千里ライフサイエンス振興財団、Leukemia & Lymphoma Society、American Society of Hematology の研究助成のもと進めることができました。関係者の皆様、研究にご協力いただいた皆様に深く御礼申し上げます。

■ 論文タイトルと著者
掲載誌：Nature Communications
英文タイトル：BRD9 determines the cell fate of hematopoietic stem cells by regulating chromatinstate
タイトル和訳：BRD9 はクロマチン状態を制御して造血幹細胞の運命制御を決定する
著者名：肖慕然 1,2,*, 近藤伸二 3,4*, 野村真樹 1,5,*, 加藤真一郎 6,7,8, 西村耕太郎 1, 臧維嘉 1,9, 張一帆 1,9,
紅朋浩 8,10, Aaron Viny11, 重廣司 12, 伊川友活 12, 山嵜博未 1, 福本未記 1, 田中淳 1,13, 林康貴 1, 小池優依
1, 青山有美 1,9, 伊藤裕美 1, 西川博嘉 6,7,8,14, 北村俊雄 1,2, 金井昭教 15,16, 横山明彦 17, 藤原亨 18,19, 合山

進 20, 野口英樹 3,4, Stanley C. Lee21,22, 豊田 敦 4,23, 日野原邦彦 6,7,8, Omar Abdel-Wahab24, 井上大地 1,9所属：
1 公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
2 東京大学

先端医療研究センター血液・腫瘍研究部

医科学研究所 細胞療法分野

3 国立遺伝学研究所

情報・システム研究機構 データサイエンス共同利用基盤施設ゲノムデータ解析

支援センター
4 国立遺伝学研究所
5 京都大学

先端ゲノミクス推進センター

iPS 細胞研究所

6 名古屋大学

大学院医学系研究科 分子細胞免疫学

7 名古屋大学

高等研究院

8 名古屋大学

大学院医学系研究科 5D 細胞ダイナミクス研究センター

9 京都大学

大学院医学研究科 血液・腫瘍内科学

10 名古屋大学

大学院医学系研究科神経疾患・腫瘍分子医学研究センター システム生物学分野

11Department of Medicine, Division of Hematology and Oncology, and Department of Genetics &Development, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA
12 東京理科大学 生命医科学研究所
13 京都大学

免疫アレルギー部門

医生物学研究所 再生免疫学分野
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6

14

国立がん研究センター 早期・探索臨床研究センター 腫瘍免疫分野

15

広島大学 原爆放射線医科学研究所 がん分子病態研究分野

16

東京大学 大学院新領域創成科学研究科 メディカル情報生命専攻情報生命科学講座

17

国立がん研究センター 鶴岡連携研究拠点がんメタボロミクス研究室

18 東北大学

大学院医学系研究科 血液免疫病学分野

19 岩手医科大学医学部
20

臨床検査医学講座

東京大学 大学院新領域創成科学研究科 先進分子腫瘍学分野

21Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, United States.
22

Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, Seattle, WA, UnitedStates.

23 国立遺伝学研究所

比較ゲノム解析研究室

24Molecular Pharmacology Program, Sloan Kettering Institute, Memorial Sloan Kettering Cancer

Center, New York, NY, United States.

*These authors are equally contributed.

*責任著者:
井上大地, MD, PhD, d-inoue@fbri.org
公益財団法人神戸医療産業都市推進機構 先端医療研究センター血液・腫瘍研究部

DOI：10.1038/s41467-023-44081-6■ 用語解説
※1 RNA スプライシング；RNA 転写後修飾の一つ。転写された RNA 前駆体の一部（イントロン）が切断、除去された後、残りの部分（エクソン）が再結合する反応。真核生物において、主に mRNA の成熟過程で起こる。
※2 骨髄異形成症候群；造血幹細胞における遺伝子変異などが原因で、骨髄内での造血細胞の異常な増殖と細胞死を特徴とする腫瘍性疾患であり、正常な血液細胞が造られなくなる。貧血、出血傾向、感染に伴う発熱などの症状が現れる。
※3 CRISPR スクリーニング法； 遺伝子をノックアウト可能な CRISPR-Cas9 システムを用いたスクリーニング手法。
CRISPR ライブラリーと呼ばれる多数の遺伝子をターゲットにした gRNA プールと Cas9 タンパク質を細胞に導入した後、細胞増殖や薬剤耐性など目的に応じた指標をもとにノックアウトされた遺伝子を特定する方法。
※4 ブロモドメイン；アセチル化されたリジン残基を認識するタンパク質ドメイン。アセチル化ヒストンを認識し、クロマチン構造や遺伝子発現を制御する機能がよく知られる。
※5 ncBAF (non canonical BAF)；BAF（SWI/SNF）複合体の一種。BAF 複合体は ATP 依存的にクロマチン構造を制御しゲノム全体の包括的な遺伝子制御に寄与している。構成するサブユニットの違いにより cBAF, PBAF, ncBAF に分類され、それぞれ特異的な生体機能を有することが近年明らかにされている。
※6 造血幹細胞；主に骨髄の中で血球をつくり出す源の細胞。赤血球・白血球（リンパ球や好中球など）・血小板などさまざまな細胞に成長、分化する。造血幹細胞は自らを複製可能な性質をもっており、このことによって持続的に血液を造https://www.fbri-kobe.org
7り出している。
※7 ATAC シーケンス；トランスポゼースを用いてゲノム DNA のオープンクロマチン領域を同定する次世代シーケンス技術。さらにヌクレオソーム位置の特定や転写因子の DNA 占有状態の解析も可能である。
※8 ChIP シーケンス；クロマチンと結合する転写因子、リモデリング因子やヒストン修飾を特異的一次抗体で免疫沈降（IP）し、IP したクロマチン断片を次世代シーケンスにより解析し、相互作用領域やヒストン修飾のマッピングを可能とする手法。
※9 HiC 解析；次世代シーケンスによりゲノムワイドにクロマチン相互作用や 3 次元構造を検出、解析する手法。
※10 CTCF；CCCTC-binding factor。ジンクフィンガー（ZF）ドメインを有する転写調節因子。CTCF は他の因子と共に転写活性化因子、転写抑制因子、両方の機能が知られている。また、エンハンサーとプロモーター間の会合を制御するインシュレーターとして機能することも知られている。
※11 BRD9 分解誘導剤；タンパク質分解経路であるユビキチン-プロテアソーム系を利用し BRD9 を選択的に分解誘導する低分子化合物。
※12 分化誘導療法；白血病細胞を正常細胞に分化させることで、増殖を止め死滅させる治療法。急性前骨髄球性白血病における all-trans retinoic acid (ATRA)などが臨床応用されている。

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FBRI：Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe
神戸医療産業都市推進機構（理事長：本庶佑）は、阪神・淡路大震災からの創造的復興プロジェクト「神戸医療産業都市」の中核的支援機関および先端医療研究機能を併せ持つ財団法人として 2000 年 3 月に設立されました。2018 年 4 月、神戸医療産業都市推進機構へと組織を発展的に改組、「健康長寿社会に向けた課題解決策を神戸から世界へ発信していく」
ことを掲げ事業を推進しています。

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