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モダンメディア

60 巻 2 号 2014［細菌］【第 4 9 回 小島三郎記念文化賞】

病原細菌の分類手法の開発とそれを使った社会基盤の確立
New genome based pathogenic bacterial classification at species level andestablishment of social infrastructure of education & infectious diseaseえ江

Ⅰ. DNA/DNA ハイブリッド法による細菌の菌種を計測した時代

ざき

﨑

たか

ゆき

孝 行

Takayuki EZAKI

プやハイドロキシアパタイトを使う方法であったので、日本では使用しにくく、思うように実験ができなかった。そこで biotin 標識 DNA 法を作成して、1971 年、大学入学後、柔道部の先輩の仕事を見

市販のマイクロプレートで細菌の DNA 相同性を測学に医学部微生物講座に足を踏み込んだ。そこでは定する方法を開発し、仕事が飛躍的に進んだ。

3 ～ 5）

第 7 回の小島三郎記念文化賞をいただいた鈴木祥一

自信作の論文を鈴木祥一郎先生に提出したら“初郎−上野一恵両先生が無芽胞嫌気性菌の研究に没頭めてにしてはよく書けた、でもこの論文を読んでわされていた活気ある研究室だった。学生時代はそこ

かるのは君だけだよ”とのコメントをいただいた。

で微生物同定の仕事をもらって、当時微生物同定の文章と論理の進め方が下手だと指摘されたのに気がバイブル的存在であった Bergey’s manual を片手に、つかないまま、数カ月後、鈴木先生は引退され、新manual と菌の性状を比べる学生生活を送った。卒

しく着任された藪内英子先生に同じ論文を英語にし業後、同講座の大学院に入り嫌気性球菌の分類の仕て、提出した。論文は 30 分で突き返され、“あなた事に携わり、Bergey’s manual の記載に一致しないに失望しました。この論文には全く主張がない、私

細菌が沢山いることに気がついた。未熟な私はそれは血のにじむような思いで自分が出したデータを最らが新しい細菌種であることは微塵も疑わず、首を大限活用して主張するのに、あなたの論文は人にひねる時が続いた。大学院の 3 年目で、嫌気性菌のデータをあげるだけで何の主張もない”とのコメン研究をリードしていた米国バージニアテックの Theトをいただき愕然とした。言われることがもっとも

Anaerobic Laboratory に留学の機会を得て、大腸癌で反論できなかった。

と腸内フローラの関連を研究していた Tracy Wilkins

この経験から論文の書き方が大きく変わった。藪

教授の研究室に入り、糞便の発がん物質とエイムズ

内先生の細菌分類に対する考え方を叩き込まれ、藪テストによる発がん性のアッセイに明け暮れる日を内先生の Pseudomonas mallei、Pseudomonas pseu-

送った。一年後、鈴木祥一郎先生から手紙をいただ

domallei を新しく Burkholderia 属を作る研究に協力

き、研究費が取れたので、嫌気性球菌の分類の研究

して Pseudomonas cepacia を Burkholderia 属の基準をやるか、それとも米国に残って発がんの仕事を継種として指定し、分類学的に新属 Burkholderia 属

続するかとの連絡をいただき、帰国することを選択を記載したした。帰国前にバージニアテックの隣の実験室に、

DNA を使ったマイクロプレート・ハイブリダイゼー

Bergey’s manual に菌種の決定法として DNA/DNA

ション法で、菌種の定義に関する考え方と、菌種をハイブリッド法を記載していた J.J. Johnson 博士

決定する方法に自信をもって取り組むことができる1）がおられたので、急遽技術を習ってから帰国した。

。この時役に立ったのは biotin 標識

6, 7）ようになった。

当時の DNA/DNA ハイブリッド法 はアイソトー
2）

岐阜大学大学院医学系研究科 再生分子統御学講座
病原体制御分野 教授〠501 - 1194 岐阜市柳戸 1 - 1

Regeneration and Advanced Medical Science
Gifu University Graduate School of Medicine(1-1 Yanagido, Gifu)

（4）

25

共通な保存配列が存在するため、保存配列をプライ

Ⅱ. 16S rRNA 配列で菌種を決めた時代

マーにして、容易に全配列が決定できる。しかし
16S rRNA 以外の遺伝子に系統分類の解決方法を模1990 年代になるとリボソーム RNA のデータが蓄索しようと分類学が目を向けても遺伝子情報が少な積され、1980 年代半ばに Woese が地球上の生物

く、膨大な時間を費やしても仕事の進展は歯がゆいを three kingdoms に分類すると提案した方法が研ものであった。

8）

究者に受け入れられてきた。分類学者の視点も簡単

16S rRNA 配列より遺伝子配列の多型情報が大きに配列が決定できる 16S rRNA の配列を利用して菌い遺伝子としていくつかの候補があった。House

種を決める方向に動いていった。膨大なリボソーム

Keeping Genes（HKG）と呼ばれる DNA Gyrase、

RNA データが蓄積し、16S rRNA の配列が 98.5% 以

RopB、Heat shock タンパク遺伝子等は 16S rRNA上類似する株の集団を菌種とする概念が出来上がっ

より配列の多型があり、ほぼすべての細菌に共通し。この定義は環境微生物者の研究を爆発的にて存在する。しかし、これらの遺伝子の配列の決定が広げ、この基準で地球環境、あるいは特殊極限環境

なかなかできなかった。多型配列が大きいこれらのに生息する新菌種が次々と記載され、データが発表

遺伝子には、シークエンス用の共通なプライマーをされるようになった。2010 年を過ぎてもこの考えデザインすることができなかったからである。我々方は優性で、環境中の微生物集団を次世代シークエは 16S rDNA より 10 倍遺伝子多型が大きい dnaJ 遺

ンサーで網羅的に解析する方法が盛んに行われてい伝子に着目し、この遺伝子情報を 1995 年から 10 年

るが、微生物データの解析には 16S rRNA 配列が使以上蓄積してきた

われている 。

る系統は少なく、約 10 年間で一万株程度の配列をた

9, 10）

11）

ところが、環境から分離される菌株の配列を見て。しかし、配列が決定でき

17 ～ 19）

決定したにすぎなかった。

みると、医学細菌学の分野で 100 年以上の歴史の中

このような背景の中で DNA のシークエンス技術で受け入れられてきた病原菌種の配列と、ほぼ 99%

は目覚ましい進歩がみられた。1990 年代に Haemo-

以上一致する配列が沢山見つかるようになった。

philus influenzae の全ゲノム配列が決定された時は医学細菌学でも病原性菌種の中には病原因子を欠数億円以上の経費が一株のシークエンスに費やされ損している株が存在することが知られていた。しかた。これに対して 2013 年の今日では効率よく実験し、これらの株は病原性菌種と 100% リボソームを行えば一株 1 万円で全ゲノム配列が決定できる時

RNA 配列が一致しており、病原因子欠損株として代になった。核酸を抽出し、断片化した DNA の末考えられてきた。これに対し環境から分離され、端に共通の既知の Tag 配列をつけることで、この99% 以上リボゾーム配列が病原性菌種と一致する

Tag 配列を使って配列を効率よく決定するため、未株は 98.5% 以上リボソーム RNA 配列が一致するの

知の遺伝子でも簡単に配列が決定できる。よりコスで、16S rRNA の配列から見ると、病原性菌種と同トの少ない新しいシークエンス法も続々と出現してじに見えるが、分類学者は病原菌に近い類縁菌と考いる。今や全ゲノム配列は一日で決定できる時代に。しかし 16S rRNA で分類する限り、なったので、この配列の山から、どのように系統分

病原因子欠損株と類縁菌種を明確に識別する決め手

類に必要な遺伝子配列を取出し、加工するかが分類はなかった。類縁菌種の全 DNA を使った DNA/

学者にとっての重要な課題となってきた。

えてきた12 ～ 15）

DNA 交雑試験で、識別できるケースもあるが、多Ⅳ. 全ゲノム配列からみた系統分類学

くのケースでは DNA/DNA 交雑試験のデータでは
70% 近傍で決定的な決め手にはならなかった。

多くの病原細菌の全ゲノムが決定され、その数はⅢ. House keeping Gene の遺伝子配列からみた菌種

日々蓄積されている。その中で菌種内の株の配列情報の蓄積も多くなった。大腸菌では数百株のゲノム情報が公開され、菌種内の株の遺伝子多型が明らか

細菌の 16S rRNA 配列はその配列の中に全細菌にになっている。その結果、同じ大腸菌と呼ばれる株

（5）

26

の中でも、保有している遺伝子の種類に 30% 以上

Keeping Genes（HKG）の個々の遺伝子配列を見ると、の違いがあることがわかってきた。大腸菌の病原性

一つの遺伝子配列は株の間では多型はほとんどなはこの 30% の遺伝子に含まれる株特有の情報であい。平均した遺伝子の多型は同一菌種内では 1% 以

り、すべての野生の大腸菌株が病原因子を保有して内に収まっている（図 2）。

いるわけではない。

菌種をこえて類縁種、あるいは同一属内の菌種とこのことから全ゲノムを使った系統樹は菌種の分比較すると、明らかに菌種間で多型の大きさに境界類ではなく菌種内の株の多型、分子疫学には重要ながみられる。16S rRNA で 99% 以上類似して区別で情報を提供してくれることがわかってきた。しかしきなかった類縁種が HKG で比較することで識別でFamily 内の系統や、その上の分類に利用するにはきることがわかった（図 3）。今後はこれら多型が違いが大きすぎて、全ゲノム情報をそのまま系統分

多 い HKG を 全 細 菌 に わ た っ て 蓄 積 し て い け ば、類に使えないこともわかってきた（図 1）。

16S rRNA で識別できない類縁種を共通に保有する遺伝子を使って区別できるので、医学細菌領域のよと こ ろ が 菌 種 内 の 株 に 保 存 さ れ て い る House

うに正確な菌種の同定が必要とされる分野での重要
2010年

全ゲノム情報からどの微生物も保有しているHouse keeping
Geneを選択し、分類学に有効な遺伝子を比較し、菌種を決定する手法が台頭性は大きい。

2000年

全ゲノム情報を分類学に取り込む時代（同一菌種の菌株間で保有している遺伝子に30%もの違いがあることが判明。16Sで菌種を識別できないケースが多く見つかった）の類縁菌種と考えられてきた菌種が、実は同一種で、1990年

16S rRNAによる系統分類が主流になった。
（16S rRNA配列が98.5%以上の株の集団を同一種とみなす）あったケースが多く見つかってきた。代表的なもの

1980年

1970年
以前

この解析の中で逆にわかってきたことは、病原菌保有している遺伝子が異なる、いわゆる株の違いでアイソトープを使わないDNA/DNA交雑法を開発し分類に応用

は大腸菌と赤痢菌である。古くから両者は類縁菌種

アイソトープを使って標識した染色体DNAを使ったDNA/DNA
交雑法により、70%以上のハイブリッドを形成する株を同一種とされてきたがゲノム情報から解析すれば、両者は国際命名規約の優先権から大腸菌として統一される

生化学的、生理学的、血清学的、形態的特徴に比較で菌種を決定べき菌群である。Shigella 属の全菌種と全血清

12 ～ 16）型のゲノム配列が決定され、血清学的にも大腸菌の

図 1 菌種を決定する方法の変遷

大腸菌の菌株間でHKGのアミノ酸配列を比較するとDNAの配列
多形は同一菌種内では遺伝子の多型は0.75%と少なかった。

HKGのアミノ酸配列を独立した菌種間で比較すると配列多型の違いが少ないものから、多型が大きいものと遺伝子によって大きく異なった。

HKG配列が菌種を超えて保存されている遺伝子を上位分類の指標へ、類縁菌種間で多型が大きい遺伝子を菌種の識別用遺伝子として使い分ける。

図 2 House keeping gene（HKG）の多様性と保存性（6）

E.coli

27

Eschericia

Citrobacter
Salmonella

KlebsiellaEnterobacter

Cronobacter
Hermania
Shimmwellia
Yersinia
図 3 E. coli から最も遠い Yersinia までの遺伝子の配列の違いを 16S rRNA と 22 個のHKG を結合して（C22HKG）
比較した。左のが 16S rRNA、右のが HKG。
16S rRNA では５％の違いしかないが HKG では 34％の配列の違いがあった。
一方、赤痢菌をはじめとする大腸菌群は 16S rRNA では明確に識別できなかったが HKG では、独立種である E. albertii, E. fergusonii を識別した。

O 抗原の遺伝子に Shigella の血清型を当てはめる研ている。このように遺伝子で決着がついても、長年究が進行しており、多くの微生物学者を納得させる

使用されてきた菌名の変更は微生物学者の間でも容結論が出る日も近いと考えている。

易には受け入れられない。変革には社会的認知がな

Brucella 属の菌種も命名の混乱を招いてきた。

ければ広がらない。100 年以上の歴史を持つ病原性

1985 年に B. abortus, B. suis, B. melitensis, B. canis

菌種の命名には同様の多くの課題が残されている。

は同一菌種であるとの提案がなされ、B. melitensis

全 ゲ ノ ム 配 列 を 利 用 し た 菌 種 の 決 定 法 に ANI、この命名方法は獣医領域の病原微生

23）（Average Nucleotide Index）が提唱された 。これ

となったが

16）

物 学 者 か ら は 受 け 入 れ ら れ な か っ た。2006 年 には全ゲノム配列を約 1000 塩基程度に論理上切断し、Brucella の命名委員会は非公式に Brucella 属のこれ類縁種のゲノム配列も同じ考え方でデータ処理しらの菌種は従来どおり独立した菌種として取り扱う

データセットを準備する。切断された論理上の各々との議事録を分類の機関紙である IJSEM（Interna-の塩基を相手のすべての塩基配列と類似度を計算す

tional Journal of Systematic & Evolutional Microbi-

る。独立した菌種同士で計算すると明らかに異なる、この案は正式な提案でな

同一属の他の菌種間では 75 ～ 85% の ANI index 値

いので命名規約上は無効である。しかし獣医領域やが得られる。同一菌種内では ANI index は 95% 以

わが国の感染症法では、この 2006 年の提案に沿って上になることから、DNA/DNA ハイブリッド法で測Brucella 属の従来の菌種は独立菌種として記載され定された菌種の境界が 70% 以上という数値は ANI

ology）に掲載したが

17）

（7）

28

Index 法では 95% 以上になる。この方法は菌種の識が部分的に残っていれば共通のドメインを保有する

別には利用価値が大きいが、少し離れた菌種との比同じ機能を持つタンパクとして推測する。この考え

較をする場合、正確な情報の取得は難しい。いわゆ

方で整理すれば、時には 70% 以上もアミノ酸配列

る菌株の間に保有していない遺伝子が存在するたが異なるタンパクでも機能部分は同じであれば同一

め、DNA/DNA ハイブリッド法と同じく、少し離れアミノ酸ファミリーとして区分される。

た菌種と遠く離れた菌種の間の測定ができない。

このことから、特定の HKG をすべての分類階級

全ゲノム配列の解析から決定された遺伝子配列のの解析に利用することはできない。われわれは多型

種類が多く蓄積されてきたことから、われわれは幅の大きい遺伝子のアミノ酸配列を類縁の菌種間の識広い菌種が共通に保有する遺伝子に的を絞って解析

別遺伝子として利用し、配列が保存されている遺伝している。分類に使用できる遺伝子はすべての細菌

子のアミノ酸配列（リボソームタンパク）を属や科に共通な遺伝子でなければならない。数百種類のの上位分類に利用する方向でデータの蓄積を行ってHKG の中で多型が大きい遺伝子、あるいは配列がいる（表 1）。

24 ～ 26）

保存された遺伝子を比較しながら、分類階級のどの

Ⅴ. 系統分類情報の社会基盤への活用

段階に有効かを見極めなければならない。また細菌の菌種を定義するときその定義はすべての原核細胞ゲノム解析が容易になったことから、微生物のゲに共通の概念として提供される必要がある。
しかし、多型が大きい遺伝子は系統が遠くなるとノム情報を積極的に利用する分野が急速に拡大し共通の配列が見つけにくくなる。理論上 50% 以上ている。その一つとして、汚染土壌の修復作業中にの配列が異なる遺伝子を同じ遺伝子として判定する

添加する化学物質や分解促進に利用される肥料でことには躊躇する。

病原微生物が増加するとの懸念がある。環境微生物相の解析では土壌から抽出した DNA の全配列の中タンパクではアミノ酸配列を比較し、共通な配列

表 1 多型が大きい HKG（類縁菌種の識別に有効）
Category

gene

Amino
acid

Protein Full namechaperonin dnaJ chaperone protein DnaJ
（Hsp40）replication gyrB DNA gyrase subunit B
replication gyrA DNA gyrase subunit A
replication rpoH RNA polymerase sigma-32 factor
chaperonin groES co-chaperonin GroES
chaperonin hscA chaperone protein HscA
ftsW cell division protein FtsW
cell wall
mreD MreBCD transmembrane component MreD
cell wall
pssA CDP-diacylglycerol-serine O-phosphatidyltransferase
cell wall
replication holA DNA polymerase III, delta subunit
cca tRNA nucleotidyltransferasetRNA
mreC Rod shape-determining protein MreC
cell wallchaperonin lolA chaperone for lipoproteins
UDP-N-acetylmuramoyl-tripeptide : D-alanyl-D-alanine
murF
cell wallligasechaperonin hscB chaperone protein HscB
ftsQ cell division protein FtsQ
cell wall
ftsX membrane component of ABC superfamilycell wall
UDP-N-acetylenolpyruvoylglucosamine reductase,murB
cell wall
FAD-binding
chaperonin grpE chaperone protein GrpE
ftsY cell division protein FtsY
cell wall
replication holB DNA polymerase III, delta subunit
chaperonin hslJ heat shock protein HslJ

（8）

376
804
891
284
97
616
414
163
451
343
412
370
203

Distance
Distance
Escherichia Salmonella Yersinia
betweenbetweencoli
enterica
pestisSalmonella- Yersinia（n=120） （n=80） （n=65）
Escherichia Escherichia
2.10
0.27
0.27
4.79
11.17
0.07
0.05
0.00
3.48
13.15
0.15
0.21
0.05
9.00
15.91
0.09
0.09
0.00
3.52
16.02
17.14
18.57
0.00
0.00
0.00
0.81
0.97
2.60
5.68
20.46
0.00
0.24
0.00
9.90
21.50
1.84
1.23
0.00
4.94
24.69
2.22
0.67
0.00
6.21
25.72
0.68
0.76
0.12
10.5
28.49
1.46
0.00
9.69
28.64
1.21
2.16
1.62
0.00
13.08
29.08
0.00
0.28
0.00
6.40
29.56

452

3.32

0.66

0.18

13.05

30.35

171
276
352

0.00
1.09
1.14

0.49
1.09
0.57

0.00
0.01
0.00

8.77
7.22
7.39

34.48
35.13
35.69

342

3.22

1.46

0.24

18.42

39.13

197
497
334
140

0.00
3.26
0.50
0.00

0.00
0.60
0.57
1.11

0.01
3.26
0.40
0.00

7.61
18.85
20.66
32.14

40.10
41.12
49.12
56.29

29

から 16S rRNA 配列情報だけを抽出し、菌叢が解析ている。2 種から 4 種病原体で法律に記載された病されている。その中に本物の病原体が増加したかを原体の除外株を作成し、認知されるには国際的な評

16S rRNA 配列だけをモニターしても実態はわから

価を受けなければ、国には認めてもらえない。このない。16S rRNA の配列情報では類縁菌と真の病原活 動 に は 長 い 時 間 が か か る が、 文 部 科 学 省 の細菌を識別できないからである。16S rRNA 配列がNational Bio-resource Project（NBRP）事業や細菌

98.5% 以上ある類縁菌種が土壌には多く存在してお学会を経た社会的な認知活動が重要になってくる。

り、それらの菌種は人や植物に病気を起こさない未

文部科学省の支援を得て、わが国の病原微生物を分類の菌種であることが多い。

収集し、若手研究者や企業に分譲する NBRP 事業は

われわれは環境の微生物のモニターに際して 16S

平成 14 年から開始した。これまで岐阜大学で保有

rRNA と HKG、および病原因子を組み合わせたス

する GTC は大学のコレクションであったが、NBRP

クリーニング手法を作成し、BSL2 以上の病原体のとしてわが国レベルの病原体コレクションとしてのモニター方法を作成し、安全に事業を推進するため

顔を世界に発信する必要がある。GTC コレクショ。

ンは JNBP（Japan National Collection of Bacterial

感染症法が施行され、特定病原体の 2 種から 3 種

Pathogen）として、国レベル保存活動に移行する準の病原体の保有が制限された。危険な病原体の保有備を進めている。高度病原体に触れる機会のない若制限は必要なことであるが、教育現場では、検査技

手に、安全を担保した菌株を供給し、利用してもら師の教育機関や食品会社の検査室の担当者は一度もう社会基盤の整備は、食品の調達がグローバル化し目に触れたことが無いボツリヌス菌や炭疽菌の検査

た日本にとって極めて重要である。

の方法を提案してきた

28, 29）をすることが要求されている。
しかしボツリヌス菌、

日本細菌学会では感染症法から除外された菌株をブルセラ菌や、炭疽菌はわが国に輸入される食材にレベルダウンし、広く分譲する活動を行っているが、混入することから、実際の菌株を使った教育が必要

感染症法の特定病原体の対象になっていない BSL2になる（表 2）
。しかし感染症法の施行後、特定病の病原細菌でも株をレベルダウンして BSL1 の環境原体に指定された株の保有は一般の教育機関や食品でも取り扱えるようにしてほしいとの要望が多く寄工場での保有は難しい。そこで弱毒株を作成し、せられている。特に食品検査を行う工場に病原体をP1 レベルでも使用できる菌株の供給が必要になっ標準株として導入することは好まれない。学会で公表 2 安全性を高めた教育用弱毒株
JNBP株
弱毒株 Attenuated strains
感染症法特定病原体
JNBP_01002 Bacillus anthracis Davis 株
既に2種除外株
JNBP_01003 Bacillus anthracis 34F2株
既に2種除外株
JNBP_01004 Francisella tularensis subsp. holarctica 株
既に2種除外株
JNBP_01005 Francisella tularensis subsp. tularensis B38株
既に2 種除外株
JNBP_01006 Clostridium botulinum C nontoxic 92-13株
弱毒株（2種）
Not available Yersinia pestis LcrV株
弱毒株（2種）
Not available Clostridium botulinum Toxin negative 株
弱毒株（2種）
Not available Brucella melitensis serovar Abortus RB51株
弱毒株（3種）
Not available Brucella melitensis serovar Melitensis Rev-1株
弱毒株（3種）
JNBP_01011 Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a株
弱毒株
（4種）
, 申請中
JNBP_01012 Salmonella enterica serovar Enteritidis Inv A 欠損株 弱毒株（対象外）
JNBP_01013 Vibrio cholerae O1、CT 欠損株
弱毒株（4種）
JNBP_01014 Vibrio parahaemolyticus TDH/TRH欠損株
弱毒株
（対象外）
JNBP_01015 Shigella flexneri 2a IpaH 欠損株
弱毒株（4種）
JNBP_01016 Shigella sonnei IpaH 欠損株
弱毒株（4種）
JNBP_01017 Shigella boydii IpaH 欠損株
弱毒株
（4 種）
JNBP_01018 Shigella dysenteriae IpaH 欠損株
弱毒株（4種）
JNBP_01019 Corynebacterium diphtheriae Toxin 欠損株
弱毒株
（対象外）
JNBP_01020 Bordetella pertussis Pertactin 欠損株
弱毒株
（対象外）
JNBP_01021 Clostridium tentani Toxin欠損株
弱毒株
（対象外）

特
徴
ワクチン株
ワクチン株
ワクチン株
ワクチン株
btntC Toxin C gene 欠損
Vaccine strain
Botulinum toxin A,B,C,G, F 欠損
ワクチン株
ワクチン株
ワクチン株
Invasion 欠損
CT gene欠損 wild strain
TDH/TRH欠損 wild strain
Invation 欠損（iPaH ）Invation 欠損（iPaH ）
IpaH, Shiga toxin 欠損
IpaH, Shiga toxin 欠損
Diphtheria toxin 欠損
Pertactin 欠損
Tetanospasmin欠損JNBP : Japan National Collection of Bacterial Pathogens

（9）

30

式にレベルダウンした株を作成し、安全を担保した

生化学検査のように多種類の可能性のある病原体株を教育現場や、民間の食品検査業務を実施していを一気にスクリーニングし、臨床材料ごとの多項目る場所に供給する事業も重要な社会貢献だと考えての病原体検査を迅速に決定する医療体制の構築が必いるが、この活動には長い時間がかかる。

要と考えている。その最終的な姿は次のように考え

30, 31）

安全を担保した新鮮な食材を国民に届けるため、ている。病院受付でうがい液を渡し、患者が診察を加工食品の現状の検査方法は時間がかかりすぎるた

待っている間に可能性のある病原体を網羅的にスクめ、これを見直し、網羅的にかつ迅速に実施する検リーニングし、診察室に入った時点ではすでに医師査システムの構築にも取り組んでいる。食品調達がの手には病原体が特定されていて、適切な抗菌剤をグローバル化した日本にとっては重要な課題であ選択できる（図 5）。

る。加工食品を市場に出荷する前に微生物検査を終

現在、多項目検査は原則としてわが国の医療現場了し、安全を担保した食材を消費者に届ける社会基では認められていない。肺炎、下痢、STD、髄膜炎

盤を構築することは細菌学者の重要な社会的義務とと臨床材料ごとに多項目スクリーニングにかけ、病認識している。

原体を迅速に特定することは患者側からも行政から

32, 33）

も医療費を削減できる重要な手段である。欧米ではⅥ. 今後の感染症医療への展望

すでに遺伝子検査を多項目でスクリーニングする方法が承認され実用化されている。最新の分類学の知

欧米では感染症の診断は時間がかかる培養法から見を効率よく遺伝子検査のスクリーニングに活用

遺伝子検査によるスクリーニング法に向かっている。

し、初診外来、あるいは在宅患者の診断に利用する

遺伝子検査の最大の利点は迅速性にある。遺伝子検

検査体制は人への伝播が懸念される感染症医療に査機器の改良が進み、遺伝子検査試薬も 10 ～ 20 分

とって特に重要な課題であるで標的遺伝子を百万倍に増幅できるようになってき

間は最後のエネルギーを絞り出して、この仕事に励た。そこに増幅した核酸を識別する新しい核酸クロ

む覚悟でいる。

。引退まで 2 年

34 ～ 38）

マト法を併用し、目視で増幅産物を識別する方法におわりにも力を注いでいる（図 4）。これを使って開業医レベルで遺伝子検査ができるような環境を構築できる。
患者症状から可能性の高い細菌検査を発注し、数日伝統ある小島三郎記念文化賞をいただき、身の引後に答えを受け取り、検査結果を再診療時に患者にき締まる思いで後輩と学生の指導にあたっていま

伝える現状の医療体制は時代遅れだと感じている。

す。無芽胞嫌気性菌の研究で第 7 回目の小島三郎記

市中肺炎を起こす病原体
Mycoplasma pneumoniae

診察室に入れば検査結果がすでに医師の手元にある

Legionella spp.
Bacillus anthracis-cereus
位置マーカ

Yersina pestis
Chlamidophila pneumonia-psittasi

増幅ライン

Burkholderia mallei-pseudomallei

上澄みを遺伝子増幅（30nim）

Francisella tularensis

外来で30分の待機

Brucella melitensis group

迅速PCR
（30分）

Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae

核酸クロマトで増幅産物の判定を目視（5min）

煮沸で殺菌と菌体破砕（3min）

カクテル
プライマー

うがい液を受付で提出
核酸クロマト（5-10分）うがい液を受け取る（2min）

図 5 初診外来で感染症診断する医療体制

図 4 市中肺炎・バイオテロのスクリーニング
カクテルと核酸クロマト（全部を対象とした場合核酸クロマトは 2 枚必要）

（ 10 ）

31

念文化賞をいただいた恩師鈴木祥一郎先生・上野一恵先生、私の分類学に対する気持ちに火をつけてい
ただいた藪内英子先生、アフリカで感染症医療の機会を与えていただいた小澤敦先生、その他、刺激と意欲を与えてくださった多くの同胞に深く感謝いた
します。

文

献

1 ）Johnson, J.L. Nucleic acid in Bacterial Classification In
Bergey’s manual of Systematic Bacteriology, Vol1. Krieg,
N.R, and Holt, J.G.（Ed）. pp5- 8, 1984. Williams & Wilkins,
Baltimore/London.
2 ）De Ley J, Cattoir H, Reynaerts A, The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates.
Eur J Biochem. 12 : 133 -142, 1970.
3 ）Ezaki, T., Y. Hashimoto, and E. Yabuuchi.. Fluorometricdeoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid hybridization in microdilution wells as an alternative to membranefilter hybridization in which radioisotopes are used to determine genetic relatedness. Int. J. Syst. Bacteriol. 39 :224 -229, 1987.
4 ）Ezaki T, Hashimoto Y, Yamamoto H, Lucida ML, Liu SL,
Kusunoki S, Asano K, Yabuuchi E, Evaluation of the microplate hybridization method for rapid identification of
Legionella species. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 9 :213 -217, 1990.
5 ）Ezaki, T., Y. Hashimoto, N. Takeuchi, H. Yamamoto, S.L.
Liu, H. Miura, K. Matsui and E.Yabuuchi. Simple genetic
method to identify viridans group streptococci by colorimetric dot hybridization and fluorometric hybridization in
microdilution wells fluorometric hybridization in microdilution wells. J. Clin. Microbiol. 26 : 1708 -1713, 1988.
6 ）Yabuuchi, E., Y. Kosako, H. Oyaizu, I. Yano, H. Hotta, Y.
Hashimoto, T. Ezaki, and M. Arakawa Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of thegenus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia（Palleroni
and Holmes 1981）comb. nov. Microbiol. Immunol. 36 :
1251-1275, 1992.
7 ）Yabuuchi, E., Y. Kosako, H. Oyaizu, I. Yano, H. Hotta, Y.
Hashimoto, T. Ezaki, and M. Arakawa. 1993. Validation
List. No.45. Int. J. Syst. Bacteriol., 43 : 398-399, 1993.
8 ）Woese CR, Bacterial evolution. Microbiol Rev., 51 : 221271, 1987.
9 ）Stackebrandt E, Goebel BM, Taxonomic note : a place for
DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int J
Syst Bacteriol., 44 : 846 -849, 1994.
10）Goris J, Konstantinidis KT, Klappenbach JA, Coenye T,
Vandamme P, Tiedje JM. DNA-DNA hybridization values
and their relationship to whole-genome sequence similarities. Int. J Syst. Evol. Microbiol. 57 : 81- 91, 2007.

11）江崎孝行 . 三原一優 . 石油汚染対策におけるバイオレメヂーエーションの生態系影響評価法 . 産業と環境 4 巻：
87- 89, 2006.
12）Ruiting Lan and Peter R. Reeves. When does a clone deserve a name? A perspective on bacterial species basedon population genetics TRENDS in Microbiology 9 : 419 424, 2001.
13）Lan R, Reeves PR, Escherichia coli in disguise : molecular origins of Shigella. Microbes Infect., 4 : 1125 -1132,
2002.
14）Lan R, Alles MC, Donohoe K, Martinez MB, Reeves PR,
Molecular evolutionary relationships of enteroinvasive
Escherichia coli and Shigella spp. Infect Immun., 72 :
5080 -5088, 2004.
15）Jian Yang, Huan Nie, Lihong Chen, Xiaobing Zhang, FanYang, Xingye Xu, Yafang Zhu, Jun Yu, Qi Jin, Revisiting
the Molecular Evolutionary History of Shigella spp. J Mol
Evol., 64 : 71- 79, 2007.
16）Verger, J.M., Grimont, F., Grimont, P.A.D and Grayon,
M. Brucella, a monospecific genus as shown by deoxyribonucleic acid hybridization. Int. J. Syst. Bacteriol., 35 :292-295, 1985
17）Osterman, B., and Moriyon, I. International Committee
on Systematics of Prokaryotes Subcommittee on the taxonomy of Brucella. Minutes of the meeting, 17 September
2003, Pamplona, Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 56 :1173 -1175, 2006.
18）Nhung PH, Hata H, Ohkusu K, Noda M, Shah MM, Goto
K, Ezaki T, Use of the novel phylogenetic marker dnaJand DNA-DNA hybridization to clarify interrelationships
within the genus Aeromonas. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 57 : 1232-1237, 2007.
19）Yamada-Noda M, Ohkusu K, Hata H, Shah MM, Nhung
PH, Sun XS, Hayashi M, Ezaki T, Mycobacterium species
identification--a new approach via dnaJ gene sequencing.
Syst Appl Microbiol. 30 : 53-62, 2007.
20）Nhung PH, Ohkusu K, Mishima N, Noda M, Shah MM,
Sun X, Hayashi M, Ezaki T. Phylogeny and species identification of the family Enterobacteriaceae based on dnaJ sequences. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease
58 : 153 -161, 2007.
21）Nhung PH, Shah MM, Ohkusu K, Noda M, Hata H, Sun
XS, Iihara H, Goto K, Masaki T, Miyasaka J, Ezaki T, The
dnaJ gene as a novel phylogenetic marker for identification of Vibrio species. Syst. Appl. Microbiol., 30 : 309 -315,2007.
22）Toıdi Adékambi, Complete rpoB gene sequencing as asuitable supplement to DNA - DNA hybridization for bacterial species and genus delineation. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol., 58 : 1807-1814, 2008.
23）Osterman,B., and Moriyon, I. International Committee on
Systematics of Prokaryotes Subcommittee on the taxonomy of Brucella. Minutes of the meeting, 17 September
2003, Pamplona, Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 56 :1173-1175, 2006.

（ 11 ）

3224）Goris J, Konstantinidis KT, Klappenbach JA, Coenye T,
Vandamme P, Tiedje JM, DNA- DNA hybridization values
and their relationship to whole-genome sequence similarities. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 57 : 81-91, 2007.
25）Stackebrandt E, Frederiksen W, Garrity GM, Grimont
PA, Kämpfer P, Maiden MC, Nesme X, Rosselló-Mora R,
Swings J, Trüper HG, Vauterin L, Ward AC, Whitman
WB. Report of the ad hoc committee for the re-evaluationof the species definition in bacteriology.Int J Syst Evol
Microbiol., 52 : 1043 -1047, 2002.
26）Adékambi T, Drancourt M.. Dissection of phylogenetic
relationships among 19 rapidly growing Mycobacterium
species by 16S rRNA, hsp65, sodA, recA and rpoB genesequencing. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54 : 2095 -2105,
2004.
27）Yamamoto S, Bouvet PJ, Harayama S., Phylogenetic
structures of the genus Acinetobacter based on gyrB sequences : comparison with the grouping by DNA - DNA
hybridization. Int. J. Syst. Bacteriol. 49 : 87- 95, 1999.
28）江崎孝行 , 微生物の開放系利用に係る評価手法マニュア
ル. 団法人バイオインダストリー協会 , 2000.
29）江崎孝行, Real time PCR と系統アレイを用いた微生物相の網羅的解析方法 , 団法人バイオインダストリー協会 ,2003.
30）Takayuki Ezaki, Masahiro Hayashi, Jiwei Zhang, Takuya
Mizuno, Tatsuya, Natori, and Kiyofumi Ohkusu. Role ofCulture Collections in Disasters. Disaster Research. 7 :768 -774, 2012.

31）Zhao, L., Kawamura, Y. and Ezaki, T. Construction of virulent defective mutants of Salmonella typhi and their phenotypic description as candidates for educational purposes. Microbiol. Cult. Coll. 17 : 13- 21, 2001.
32）江崎孝行 , 食中毒細菌の検出・同定システムの新展開−
カクテル増幅法を使った食品中の生きた菌の網羅的な
遺 伝 子 検 査 法−日 本 食 品 微 生 物 学 会 雑 誌）
: 150 -151,
2009.
33）Hayashi M, Kubota-Hayashi S, Natori T, Mizuno T, Miyata M, Yoshida S, Zhang J, Kawamoto K, Ohkusu K,
Makino S, Ezaki T. Use of blood-free enrichment broth in
the development of a rapid protocol to detect Campylobacter in twenty-five grams of chicken meat. Int. J. Food
Microbiol. 163（1）: 41- 461, 2013.
34）江崎孝行 , 大楠清文 . 外来で利用可能な STD の網羅的遺伝子診断法を求めて . 泌尿器外科 18 : 798 -804, 2005.
35）大楠清文 , 江崎孝行 , 遺伝子解析技術の新たな潮流と感染制御への適応 . 日本化学療法学雑誌 59巻：441- 453,
2011.
36）江崎孝行 , Yuing Li, 大楠清文 , 河村好章 , 呼吸器感染症の網羅的診断に向けて , 分子呼吸器病 8 : 341- 344, 2004.
37）江崎孝行 , 腔プロバイオテイクス・アンチバイオテイク
ス−検査から始まる細菌の新しいコントロール法−鴨井久一編著、永末書店 , 2013.
38）江崎孝行 , 発熱外来のバイオセーフティ, バイオセーフ
ティ指 針 , 岡 田 淳（編）
、 医 歯 薬 出 版、pp99 -150. 東 京.
2010.

（ 12 ）