乳清タンパク質のマクロファージ泡沫化に及ぼす影響

墨色素為医長聖堀内正公【研究目的】
乳清タンパク質 (WheyProtein) はヒト母乳のタンパク質の 70%以上を占めている。最近の人工ミノレクの研究によれば、手Li管タンパタ質/カゼイン比が高い程、乳児の血中コレステローノレ上昇が抑制される o もし、この抑制作用が乳児及び学童、成人でも同様であれば、乳清タンパク質の摂取によりコレステロール値の上昇を抑制し、動脈硬化に由来する虚血性心疾患の予防に使用できる可能性がある。本研究では、乳清タンパク質の血中コレステローノレ低下メカニズムを明かにするため、粥状動脈硬化症の初期病変と考えられているマクロファージの泡沫化に対する乳清タンパタ質の影響を検討した。具体的には、ラット腹腔マクロファージ (Mrt)をアセチノレ LDLで泡沫化させる invitroの実験系に対する乳清タンパグ質の抑制作用並びに、 HDLの細胞コレステローノレの引き抜き作用に対する効果を検討した。

【実験方法】
乳清タンパク質の抗泡沫化作用の検討
ぴを培養皿(直径 22非刺激ウイスターラットの腹腔から得られる常在腹腔M ゆ3x1mm) に3rc1時間保温し、付着M 世を調製した。個々の培養皿に 1mlのダノレベッコ修飾培養液を加え、 25μ g/mlのアセチル LDLを添加して 16時間 37'Cで保温し、細胞内に蓄積したコレステロールエステノレ (CE)を定量した。抗泡沫化の実験系では、乳清タンパク質をアセチノレ LDLと同時に添加して、24時間保温後に、 FCと CEを同様に0，100μ g/mlの HDLを共存させ、 HDLの抗泡沫化定量した。また、この実験系に 5作用に対する乳清タンパク質の効果も検討した。
乳清タンパク質の作用部位の検討
6上記抗泡沫化系と同様の実験系において、腹腔M 世 (3X10cells)を放射性ヨード‑193ー1) で標識したアセチノレ LDL (5μ g/ml) と37.
Cで 90分 間 保 温 し た 。 実 験 群 で25('は、 5略 /mlの手Lr
青タンパク質を共存させた。保温後、細胞を遠心し、上清をトリクロノル酢酸 (TCAj で沈澱させ、 TCA可溶性の放射活性をライソゾーム内分解の指標として測定した。
乳清タンパク質の脱泡沫化作用の検討
ラット腹腔M ゆ(付着系)を 25μ g/mlのアセチノレ LDL(あるいはアセチノレ LDLの8時間保温し、細胞内コレステロール部分を官ーコレステローノレで標識したもの〉と 1に CEを蓄積させた。これらの泡沫細胞をメディウムで洗浄し、アセチル LDLを除い、あるいは両者と 18時間保温し、細胞内 CEの質量た後に、乳清タンパク質、 HDL(Mass)及び、薄層クロマトグラブィーにより、 CEを分離し、その放射活性を測定し式
こ。

【結果】乳清タンパク質の抗泡沫化作用

25μ g/ml) と24時間保温す
図 lに示すように、ラット腹腔MOをアセチノレ LDL(ると、約 46nmol/略proteinの CEが細胞内に蓄積した。この実験系にアセチノレ LDLと同時に乳清タンパク質をcl‑lOmg/ml) 添加して保温すると、細胞 CE蓄 積 は lmg/mlの乳清タンパク質で約 30%抑制され、 5mg/mlで80%、lOmg/mlでは 90%と極めて著明に抑制された。
図 2に HDLの抗泡沫化作用に対する乳清タンパタ質の効果を示した。 100μg/mlの HDLのみで 24時間保温では CE蓄積を約 35%抑制した。この系に乳清タンパク質を1mg/ml添加しておくと、抑制は 80%以上であった。即ち、乳清タンパク質はそれ自身の抗泡沫化作用のみでなく、 HDLの抗泡沫化作用を促進する作用を有することを意味する。
アセチル LDLはM ゅのスカベンジャーレセプターに結合し、細胞内に取り込まれてライソゾームで分解を受ける。この結果、細胞内 FCが増量し泡沫化が生じる。このアセチノレ LDLによる inv
itroの抗泡沫化系において、 HDLはライソゾーム分解以降に作用している。乳清タンパグ質の場合も(5昭 /ml以下の濃度)放射ヨード標識ア‑194‑

セチノレ LDLのライソゾーム分解に対して、影響を与えなかった。即ち、乳清タンパク質も HDLと同様、ライソゾーム以降に作用点があると思われる。
乳清タンパク質の脱泡沫化作用

M ゆを 25μ g/mlアセチノレ LDLと18時 間 保 温 し 、 泡 沫 化 す る と 25nmol/mgg/mlの乳清タンパク質と 18時間保温
proteinの CE量が蓄積した。この泡沫細胞を 1m5%減少した。即ち、乳清タンパク質は脱泡沫化作用を有する
すると、細胞 CEは約 200μ g/mlの HDLを共存させると、脱泡沫化作用は有意ことを意味する。この系に 1に増強した。
有効因子の同定の試み

nvitroの実験により、乳清タン以上、 Mゆを用いた抗泡沫化系および脱泡沫化系の iパグ質が抗泡沫化作用のみならず、脱泡沫化作用も有することが判明した a 現在、乳清タンパグ質をゲノレ漉過法やイオン交換カラムにて分離中であり、抗泡沫化および脱泡沫化作用を発揮する有効因子の同定を試みている。

【考察】
粥状動脈硬化は高脂血症を基盤とする成人病であるが、病変は既に小児期から発症し、漸次進展するものと考えられる。従って、成人の血中コレステローノレ値とともに、小児の血中コレステローノレの管理は、21世紀を担う若者に対する我々の重要な責務と考えられる。 M世の泡沫化系を用いた本研究によって、乳清タンパク質のコレステロール低下作用のメカニズム一端が明確にされたロ即ち、手Ll青タンパク質は細胞コレステローノレ引き抜きの効率的なアクセプターとして作用していると考えられる。今後、乳清タンパク質の中からこの因子を同定する必要があるが、本現象の発見は社会的には 2つの意義があると考えられる。第 lに、乳清タンパク質を機能食品として一般食生活に導入し、食事性の高脂血症、特に高コレステロール血症に対して予防的に使用することが可能である。第 2には、 HDLの抗泡沫化・脱泡沫化作用に対して、乳清タンパク質の促進作用には注目するものがあり、成人の抗動脈硬化剤、あるいはその補助薬剤としての期待が出来ると考えられる。

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【謝辞】

本研究は全国牛乳普及協会の平成 3年度研究委託に基づいて行われた研究であり、ここに全国牛乳普及協会に深謝するものである。

【関連文献】[l]宮崎章、坂本裕一郎、篠原守継、森野能昌、堀内正公~泡沫化および脱泡沫化現象における HDLの役割』動脈硬化発生:進展の解明〔住吉昭信・斎藤康編〉
共立出版

107‑
119.
1991.

[2J Ohta，T.，Hattori，
S.，Mural
四 mi，M.，Horiu
chi，S.，Nishiyama，
S.，& Matsuda，
I.:!
sol
口 0
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poproteins by immunoaffin
ity.
l C口i
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ca
chromatography using a lormylated der
iv
ativ
e 0
1 cellulose ge
79， 183‑190.1
989.
Chimica.Acta， 1K.
， Fukuda，S.，Naito，M.，Horiuchi，
S.，Takata，
K.& Morino，Y.
:Endoc[3J Takahashi，Ipoproteinv
iaatrans‑
Golgi system inr
atyti
c pathway 01hig
hdensityi，
1 270‑
277.1
989.
peritonealmacrophages.LaboratoryInv
estigation， 6. M. A.，Miyazaki，A.
， Morino，Y.& Horiuchi，S.Biochemical[4J Rahim，A. Tdemonstration01endocytosi
sandsubsequentresecretion01highdensitylipopr
082，195oteinbyratperitoneal macrophages.BiochimicaBiophysicaActa， 1203.1
991.，Rahim，A. T. M. A.
， Araki，S.，Morino，Y. and Horiuchi，S[5JMiyazaki，AChemicalc
ross‑linkingalters HDL to be recognized ascavengerreceptorin082， 143‑15，1 1
991ratperitonealmacrophages.Biochim.Biophys.Acta， 1日[JShinohara，M.，Miyazaki， A.， Shichiri，M.，Morino，Y. and Horiuchi， SIpoprotein
Exposure01ratper
itonealmacrophagest
oacetylate
dlowd
ensityiresultsi
nrelease01plasmamembranec
holesterol; anefficientsusbstrateloresterification by acyl‑CoAcholesterolacyltranslerase.Jouranl01Biological

67，1603‑
1608，1992.
Chemistry， 2
A.，Rahim，A.T.M. A.，Ohta，T.，Morino，Y.& Horiuch，i S. :High[7JMiyazaki，‑196densitylipoprotein mediats sholesteryleelectiv
ereductio
nm csters frommacrophagefoamc
ells.BiochimicaB
ioph
ysic
aActa， 1
126，73‑80，1992

図1
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図2
H D Lの抗泡沫化作用に友ぼす乳清タンパク質の影響
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