~

イゾシアヌル酸のチャイニーズ・ハムスター培養細胞を用いる染色体異常試験

厚生省生活術生局委託

財団法人食品薬品安全;セ:た穿E
秦野研爆!;琵

[目次]

頁
要約

一一一一一一一一一一一一一一一一一一

緒言

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一‑ 2

材料と方法

一一一一一一一一一一一一一一一
一一一一一一一一一一一一一ーー…一一一一一一一一一一一一一一一一 3

1 細胞

2 被験物質および陽性対照物質

3 S9反応液一一一一一一一一一一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一 34 細胞増殖抑制試験

一一一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一一一 45 染色体異常試験

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 46 染色体分析

結果

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一‑ 3

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 5

一一一一一一一一一一一一一一一一…一一一一一一一一一一一一一一一一一一 6

特記事項

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 6

参考文献

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 6

Figure1
Tables1and2

[要約]イソシアヌル酸 (ICA)は、 CHL/IU細胞(チャイニーズ・ハムスター、肺)に染色体異常を誘発しなかった。

ICAは CHL/IU細胞に対して、連続処理(新鮮培地中で 24時間処理)および短時間処理のS9mix存在下および非存在下(それぞれ S9反応液およびNfEM培地中で 6時間処理後18時間の回復時間)で、最高処理濃度である 1.
3mglml(10l1uv1) においても 50%を越える増殖1!
P制は認められなかった。

24時間および 48時間処理)および
このことから染色体異常試験において、連続処理 (S9mix存在下および非存在下)ともに1.3mglml(10mM)を最高処理濃度
短時間処理 (glml(10仙 の の 濃とし、公比 2で各濃度を設定した。染色体分析は、全ての系列で1.3m度合む 3濃度群を観察対象とした。

ICAはいずれの処理条件下においても、染色体の構造異常および倍数性細胞を誘発しなかった。

[緒言]

化学物質の遺伝毒性を評価するための短期検索法のーっとして、 H市乳動物培養細胞を用いる染色体異常試験がある。化学物質によって誘発される染色体異常には、大別して構造異常(ギャップ、切断、交換)と数的異常(倍数性細胞、異数性細胞)があり、前者はDNA傷害、後者は細胞の分裂機構の異常などを反映している。本試験で用いた CHL/IU細胞は、染色体数が少なく、一般的に化学物質に対して染色体異常の検出感度が高いため、染色体異常試験によく用いられる。
OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として、 ICAの細胞遺伝学的影響を評価するため、 CHL/IU細胞を用いる染色体異常試験を実施した。なお本試験は、「新規化学物質に係る試験の方法について J (昭和 62年 3月 31日、環保業第 237号、薬発第 306号、 62基局第 303号)および iOECD毒性試験ガイドライン:473J に準拠し、「化学物質 GLP基準 J (昭和 59年 3月 31日、環保業第 39号、薬発第 229号
、 59基局第 85号、3年 11月 18日、環企研‑第 233号、衛生第 38号、 63基局第 823号)に基づいて実改訂昭和 6施した。

‑2‑

[材料と方法]

1 細胞
CHLIIU細胞 (JCRB細 胞 パ ン ク よ り 入 手 ) は 、 牛 胎 児 血 清 (CanseraInternational、ロッ605420) を 10%含 む イ ー グ ル 阻M 培地(日水製薬)を用い、 C02インキュベー
ト番号:2
ター (5%C02、37t) 内で培養した。また、解.凍後継代 10代以内で試験に用いた(親株988年 2月に入手した時点で 4代、現在は 12代)。の継代数は、 12 被験物質および陽性対照物質

CASNo.108・80・5) の物理化学的性状等は Appendix1に示した。
被験物質である ICA (ICAはから提供された後、室温で保管し、使用のつどジメチルスルホキシド(DMSO、和光純築工業、ロット番号:ESJ4625) に溶解して希釈した。
陽性対照物質として用いたシクロホスフアミド (CPA、SigmaChemical、ロット番号:73H0846) およびマイトマイシン C (MC、協和醗酵工業、ロット番号:051AEG) は、注
射用蒸留水(大塚製薬工場、ロット番号:K5H71) に溶かし、用時調製して用いた。

3 S9反応液S9 (キッコーマン、ロット番号:RAA‑333、 1995年 明 製 造 ) は 、 7週 齢 の 雄 Sprague‑‑ベンゾフラボンを投与して肝臓から調製しDawley系ラットにフェノパルピタールと 5，6‑リン酸 (G・6‑P、 Sigmaたものを購入し、使用時まで ‑80Cに保管した。グルコース 60Chemical) 、βニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(酸化型、 βNADP+，オリエンタル酵母)および KClを蒸留水に溶かし、混合液として ‑80t:に保管し、使用時はこれに S9、MgCl2および HEPESを加え、 S9mixとした。 S9mix存在下で短時間処理する場、2倍濃度 MEM培地(耐青不合で S9mixと 等 量 ) お よ び 阻M培地(血清不含)合、 S9凶 x、.
83mMG・6‑P、0.
67mMs‑NADP+ 0.
83m MMgC1を混和して S9反応、液とした (5%S9、02，"

5.
5m MKCL 0.
67mMHEPES) 。一方、 S9mix非存在下で短時間処理する場合は、 S9反応、液の代わりに MEM培地を使用した。

‑3‑

4 細胞増殖抑制試験

染色体異常試験に用いる被験物質の処理濃度を決定するため、被験物質の細胞増殖にお3よほす影響を調べた。 CHL/IU細胞を 0.25%トリプシンを用いて単離した後、 4X10個Imlの細胞懸濁液とし、その 5ml (2X10相)をプラスチックディッシュ(直径 6cm、Corning)に播種して 3日間培養した。
連続処理では、新鮮培地 5mlと培地交換した後、被験物質調製液を 50μlずつ添加し 24時間処理した。
S9mix存在下における短時間処理では、 S9反応液 3mlと培地交換した後、被験物質調22製液を 30μ1ずつ添加し 6時間処理した。リン酸緩衝塩類溶液 CCa+ および Mg+ を含む)で洗浄後、新鮮培地 5mlに交換し、さらに 18時間培養した。一方、 S9mix非存在下の処理群においては、 S9反応液の代わりに MEM培地を用いた以外の操作は、 S9mix存在下の処理群と同様に行った。

3mg!
ml(10mM)の濃度範囲で処理した。培連続および短時間処理ともに、 0.
041‑‑‑‑1.
養終了後、 10%ホルマリン溶液で回定し、 0.
1%クリスタルバイオレット液で染色した。

Monocellater別、オリンパス光学工業)を用い、溶媒対照群と比較し単層培養細胞密度計 (た各処理群の相対増殖率を計測した。 1濃度あたり 2枚のディッシュを用いた。

5 染色体異常試験!
ml
細胞増殖抑制試験の結果、連続および短時間処理において、最高処理濃度の 1.
3mg(10mM)においても増殖抑制は示さなかった (Fig.1)。
このことから染色体異常試験において、連続および短時間処理の全ての処理群で)3mglml (10mM)を最高処理濃度とし、公比 2で 3濃度 (0.
33、0.
65、1.
3mglml) を設1.
定した。
染色体異常試験においては 1濃度あたり 4枚のディッシュを用い、そのうちの 2枚は染色体標本を作製し、別の 2枚については単層培養細胞密度計により細胞増殖率を測定した。
試験操作は、細胞増殖抑制試験とほぼ同様に行った。連続処理では 24時間と 48時間の被験物質処理群に溶媒対照群と陽性対照群および無処理対照群(新鮮培地と交換)を設け、短時間処理では、被験物質を S9mix存在下と非存在下で 6時間処理した。なお、処理群の他、溶媒対照群、陽性対照群および、無処理対照群を設けた。
‑4‑

陽性対照群については、 M Cを新鮮培地 5mlに最終濃度が 0.
105μg/mlとなるように添加/mlとなるように添加し、また CPAを S9反応液および h伍 M 培地 3mlに最終濃度が 5μgした。
m1となるように添加した。培養培養終了の 2時間前に、コルセミドを最終濃度が 0.1μgl
22+ および Mg+ を含終了後、培地を除き、 0.02%EDTA含 有 リ ン 酸 緩 衝 塩 類 溶 液 (Ca0mlの遠沈管に集め遠沈した (1000.
.
.
̲1200rpm、5分)。
まない)により細胞をはがし、 1.
075MKCl水溶液 3mlを加え、 30分間低張処理を行っ
上清を捨てた後、沈殿した細胞に 0/v) を 6ml加 え 遠 沈 し た 後 、 上た。低張処理後、固定液(メタノール:氷酢酸=3:1v

清を除き、再び新‑鮮な回定液を加えて遠沈した。回定液の交換を数回行った後、少量の固定液で細胞を懸潟し、その少量をスライドグラス(あらかじめフロスト部分に試験系識別番号、コード番号およびスライド番号を記入)上に滴下し、そのまま風乾した。 1ディッ
シュあたり 6枚のスライド標本を作製した。
3%ギムザ液 (pH6.8 の 1/15M リン酸緩衝液で希釈調製)でスライド標本を染色後、水ですすいで風乾した。試縦十四番号および標本作製の日付を明示したスライドケースに、スライド標本をコード番号順に入れて保存した。
染色体分析に先立つて、細胞増殖率測定の結果と分裂指数により、 20%以上の相対増殖率で、かつ 2ディッシュともに 0.5%以上の分裂指数を示した最も高い濃度を、観察対象の最高濃度群とし、観察対象の 3濃度群を決定した。

6 染色体分析
細 胞 増 殖 率 の 測 定 結 果 (Table1、 2) と 分 裂 指 数 に よ り 、 連 続 お よ び 短 時 間 処 理.
3mg/ml (10mM) の濃度を観察対象とした。の す べ て の 処 理 群 で 0.33、 0.65、 1

染色体分析は、日本環境変異原学会、目前乳動物試験(1¥仏1S) 研 究 会1) による分類法に基づいて行った。よく広がり、かつ染色体が散逸していない分裂中期像を観察した。各群ごとに、観察細胞数、染色体型および染色分体型の構造異常の種類と数、倍数性細胞の数を記録用紙に記入した。また、異常を有する細胞は、スライド上のその位置を顕微鏡のステージの位置で表し、記録用紙に記録した。ディッシュ l枚から得られたスライド標本 4枚を、4人の観察者がそれぞれ処理条件が分からない状態で分析した。構造異常は 1群 200個、倍群 800個の分裂中期細胞を分析した。
数性細胞は 1‑5‑

溶媒の背景データ (Appendix2) と被験物質処理群問で、フイツシャーの直接確率法2)
により、 familywiseの有意水準を 5%として有意差検定を実施した。直接確率法で有意差がある場合、用量依存性の有無をコクラン・アーミテツジの傾向性検定説(p<0.
05)により判定した。両検定でともに有意差が認められた場合を陽性とし、直接確率法でのみ有意差が認められた場合は疑陽性とした。

[結果]
ICAは連続処理および短時間処理した場合、処理限界濃度の 1.
3mglml (10mM)を含むいずれの処理濃度においても、染色体の構造異常および倍数性細胞を誘発しなかった(
Table1、2) 。
一方、陽性対照物質として用いた M Cは、連続処理において染色体の構造異常を誘発し(Table1) 、CPAは短時間処理の S9n1ix存在下において染色体の構造異常を誘発した(
Table2) 。これらの陽性対照物質の結果より、本実験系の成立が確認された。

[特記事項]
本試験の実施にあたり、試験の信頼性に悪影響を及ぼす疑いのある予期し得なかった事
態および試験計画書:からの逸脱は無かった。

[参考文献]
1) 日本環境変異原学会・附乳動物試験分科会編: i
化学物質による染色体異常アトラス J，88)
朝倉書庖，東京(192) 吉村

功編: i
毒性・薬効データの統計解析、事例研究によるアプローチ J，サイエン1987)
テイスト社，東京 (3) 吉村功，大橋靖夫編: i
毒性試験講座 14、毒性試験データの統計解析J，地人書館，東

1992)
京(‑6‑

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言 00 0恥 4(一50

園 田 . 圃 圃‑nunuーベ〉ー
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ith89mixtreatedfor6hw
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600.
801.
001.
20Concentration(mg/ml)

Fig.
1 GrowthinhibitionofCHUIUcellstreatedwithisocyanur
icacidTabl
e1 αlfomosomea
nalys
iso
f
αlinesehamstercells(CHL/lU)continuously訂'eatedwithi
socyanurica
cid(ICA)*w
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( 0.5) 0 ( 0.0)
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00 5huConcen‑ TimeofNo.of
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6
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500.
250.
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380.
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1
30.
38NT NTNT NTap:chromatidgapan
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ap，ctb:chromatidb
reak，c
民: chromatidexchange，csb:chromosomeb
reak，
Abbrev
iations，gcse:
chromosomee
xchange(dicentricandring)，mul:
multipleaberrations，TAG:
totalnO.
ofcellsw
ithaberrations，TA:
totalno.ofcell
sw
ithaberration
sexceptg
ap，
SA:structuralaberration，NA:numer
icalaberration，MC:mitomycinC，
NT:nottested.
1)Dimet
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05)byFisher'sexacttest.6)Cellconf1uency，representin
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9.
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3%)andurea(0.
2%)werecont
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0
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95.
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5100.
0101.
5100.
0109.
0Table2 αlfomosomea
Inesehamstercells(CHL/lU)treatedw
ithisocyanu
ricacid(ICA)キ wi出 andw
ithou
tS9mixnalysisofαlφab

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reak，Abbrev
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ap，ccse:chromosomeexchange(dicentri
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NT:nottested.
t. 2)Morethan民 naberrationsinacellweres
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lfoxidewasu
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