25・ヒドロキシビタミン 0‑1αー水酸化酵素のク口ーニングと発現調節
昭和大学歯学部生化学教室教授須田 立雄

はじめに抗クル病因子として発見されたビタミン Dは、その後の研究によって肝臓と腎臓で 2段階の水酸化25(OH)，D3Jによって、その作用が発現することが明らかにを受けて生成する活性型ビタミン D[la，α，25(OH)，
D3の作用は細胞内に存在する特異的結合タンパク質(受容体)との結合を介してなった。 l25(OH)2D3発現することから、現在ではステロイドホルモンの一種と考えられている。従って、 la，の作用は内分泌器官である腎臓での合成と、その標的器官に存在する受容体との結合という 2段階で位を水酸化するピタミ作用の調節がされている。これまでに、ビタミンDの代謝酵素として側鎖の 25，ン D25-水酸化酵素と 2~トヒドロキシビタミン D[25(OH)D3J 、ならび、に lα ， 25(OH) D3の24f
立を水酸化α，L!
5(OH)，D3‑
24‑水酸化酵素が精製する l

クローニングされているが、活性型ビタミンDの合成に関αー水酸化酵素は、細胞内含量が極めて低いことから精製が困難とされてして最も重要な 25(OH)D31
同‑
25‑水酸化酵素ならびに la，25(OH)2D3
きた。我々は、これまでにクローニングされているビタミン D‑
24‑水酸化酵素が、共にミトコンドリア型シトクロム P450であることに着目して、遺伝子工学の手法‑1日目水酸化酵素遺伝子をクローニングし、その発現調節機構を明らかにしたのでを用いて 25(OH)D3報告する。

I. ビタミン D代謝の概要
高等動物の血清Caレベルは、ビタミン D、副甲状腺ホルモン (PTH)、およびカルシトニン (CT)とい臼ng/dl(2.5mM)というう3種のカルシウム代謝調節ホルモンが、小腸、骨組織およぴ腎臓に働いて l正常値を巧妙に維持している。
食物として摂取されたビタミン Dと皮膚で生合成されたビタミン D3は、まず肝臓に運ばれて側鎖の25位が水酸化され25四ヒドロキシビタミン D3[25(OH)D3Jとなる。 25(OH)D3は次いで=腎臓に運ばれ、α位または 24f立が水酸化され、それぞ血中カルシウム代謝調節ホルモンやカルシウムの濃度に応じて 1α，25(OH)，
D3あるいは 24，25'ジヒドロキシビタミン D3[24，25(OH)2D3Jに変換される。腎臓で合れ125(OH)2D3である。近年、成されるこれらの代謝産物の内、ビタミン Dの活性を示す代謝産物は la，位ならびに 24位の水酸化反応を司る酵素が精製され、それらの遺伝子もクローニング
ピタミン Dの25‑25‑水酸化酵素 (CYP27)された。そして、これらの水酸化酵素の cDNAを用いた研究から、ビタミン Dは肝臓L孔外にも、腎臓、十二指腸、牌蔵、副腎、肺等の組織でも発現していることが明らかとなり、
白水酸化酵素ピタミンDの25‑水酸化反応は種々の組織で起こっている可能性が示唆された。また、 25‑283ーはビタミン Dの25‑水酸化反応の外にコレステロールから胆汁酸への合成過程の 5s‑コレスタン :3α，7α，，12aートリオールの 26(27)位の水酸化も触媒することからピタミン Dの活性化における生理的役割の重要性は考えられていない。の2CYP24)の役割は、腎臓で 1，臼25(OH)ZD3合成の前駆体である 25(OH)D34
一方、 M 水酸化酵素 (位を水酸化して活性の弱い 24，25(OH)，
D3に変換することにより、 1a，25(OH)ZD3の過剰生成を防ぐ

4司水酸化酵素の役割も再検討され、ことが本来の役割と考えられていた。しかし、遺伝子発現の面から 2，日25(OH)，
D3によって発現が誘導さ今日では、本酵素がビタミン Dのすべての標的細胞で共通して 15(OH)D3に比べ 1a，25(OH)2D3を良い基質とすることが明らかになり、れること、ならびに本酵素は 2D3の過剰反応を防止するため、 1a，25(OH)2D3をlα，24，本来の役割は標的器官におけるほ， 25(OH)225(OH)，D3に異化するために誘導される酵素であるとする考えが有力となっている。

Il.活性型ビタミン Dの 生 合 成 に 影 響 を 友 ぼ す 因 子
1.副甲状腺ホルモンとカルシトニン

1971年、 Boyleらは、低Ca血症の際には腎臓で25(OH)D3から主として lα，25(OH)ZD3が合成される血症の際には Ca上昇作用の弱い 24，25(OH)，D3が合成されることを見いのに対し、正常あるいは高Ca

977年、堀内らは、甲状腺と副甲状腺を摘出 (TPTX)したラットを用いて腎におけ出した。その後、 1処置により低下したる25(OH)D3の代謝に対する PTHとCTの効果を詳細に検討した。その結果、 TPTX25(OH)D3から lα，25(OH)2
D3への変換は、昨日あるいは cAMPの持続注入によってτ?
医前のレベル血症に伴う 1a，25(OH)，D3産生の充進は、低 Caにまで回復することが明らかになった。従って、低Ca血症の刺激が直接 l臼ー水酸化酵素の誘導に関与するのではなく、血清Caの低下に伴う国j甲状腺からのPTHの分泌充進を介して腎の 25(OH)D，‑lα，水酸化酵素が賦活化された結果起こることが明らかになっfこ。
一方、 CTの1a，25(OH)2D
3産生に対する作用も同様の実験系で検討され、 CTも腎の lαー水酸化反応
日ー水酸化酵素の促進効果は PTHあるいはcAMPの促進効果と相加性を示すこを賦活するが、 CTによる 1α，25(OH)2D
3産生に対する CTの効果は PTHの作用とは異なり、 cAMPをセカンドメッとから、腎の lの作用機序の相違は、センジャーとしない別の作用機序によって起こると考えられた。この PTHとCT
ネフ E ンにおける町H応答性のアデニル酸シクラーゼの局在は、 lαー水酸化酵素および'24‑水酸化酵素

応、答性のアテ矛ニル酸シクラーゼは腎の局在部位(近位尿細管直部と近位尿細管曲部)と一致するが、 CT皮質のへンレー上行脚と遠位曲尿細管に局在して、 la‑水酸化酵素の局在とは異なる川嶋らの結果からも示唆される。

284III.1
α 水酸化酵素のク口一ニング
ピタミンD代謝酵素の発現調節機構を分子レベルで解明するためには、 25‑水酸化酵素、 24‑水酸化酵素ならびにlαー水酸化酵素の遺伝子のクローニングが必須である。これまでに広島大学のグループによって25‑水酸化酵素と 24‑水酸化酵素が精製され、その遺伝子の構造も明らかとなった。特に、 24‑水酸化酵素の発現調節に関しては l，臼 25(OH)2D，によって特異的に発現が促進される機序、ならぴに24‑水酸化酵素の生理的意義についてもほぼ完全に解明されたと考えられる。しかし、ビタミンDの代謝酵素の内で最も重要な25(OH)D，‑1αー水酸化酵素に関しては、これまでに国内外の多くの研究者が単離を試み、数施設から精製に関する論文が発表された。しかし、採られた蛋白質の性質ならびに比活性の函から lαー水酸化酵素とは考えにくい点が多かった。我々は、これまでにクローニングされたピタミンD同水酸化酵素 (CYP27及びCYP24)がミトコンドリア型シトクロム P450であり、 la‑水酸化酵素もこれまでの酵素学的な解析からミトコンドリア型P450であること、シトクロム P450はファミリーを形成しており特にへムおよびブエレドキシン結合部位の相向性は高く共通した配列を有していることに着目し、遺伝子工学的な手法を用いてlαー水酸化酵素をクローニングをすることを計画した。 CYP27ならびに CYP24は共にミトコンドリア型P450であり全配列においては約30%の相向性であるが、ミトコンドリア型P450の特徴であるフェレドキシン結合部位ならびにへム結合部位は約60%の高い相向性を有することが明らかになっている。そこで、我々はCYP27とCYP24のフェレドキシン結合部位ならびにヘム結合部位から degenerateprimerを作製し、 RT‑PCR;
法によってl臼ー水酸化酵素の部分DNAをクローニングすることにした。
RNAはla‑水酸化酵素活性が著しく元進しているビタミンD欠乏ラットの腎臓、ならびに最も強い活性を有する活性型ビタミンDの誘導体である 26，27‑F6‑1α，25(OH)，Dsを試料採取前に投与して、完全図1. Degenerateprimerを用いて行った PCR産物の電気泳動による解析。

D(‑):ビヲミンD欠乏のラットの腎臓より調製したmRNAを元に、 l，25D:ピ5<ミンD欠乏ラットに実験48時間前に活性裂ビ歩ミンDを投与したラットより調製したmRNAを用いて RT‑PCRを行った。

D(‑) 1，25DD(帽)ω出q︐Uに10:‑水酸化酵素活性を抑制したラットの腎臓から調製した。その後、逆転写酵素によって相補的 DNA(cDNA)を調製し、ヘム結合部位とフェレドキシン結合部位から作製した degenera
脂 pnmerを用いてPCRを行った。その結果、ビタミン D欠乏ラットの腎臓に特異的に発現する約250塩基長のバンドか検出された(図1)。
ベクターにクローニングして塩基配列を決定した後、 3'‑
rapidamplificationofcDNA
この DNAをTA‑end(3'‑RACE)法を用いて、1.2kb長の遺伝子をクローニングした。ここで、採取した1.2kbのcDNAを用いてビタミン D欠乏ラットの腎臓より調製した ZAP‑cDNAライブラリィーをスクリーニングして、01個のアミノ酸をコ}ドし、 P450に特徴的なフェ全長2469bpのcDNAを単離した。単離した遺伝子は 5レドキンンならびにへム結合領域を含む蛋白質で、ホモロジー検索の結果これまでに報告されていな450であることが明らかになった。また、会長cDNAを発現ベクターに組み込み COS‑7細胞にい新規1'臼ー水酸化酵素で、あることが確認された。ま
移入して 25(OH)D3の代謝を調べた結果から、本遺伝子がlた、ホモロジー検索の結果から、最も高い相向性を有するのはミトコンドリア型 P450である CYP27で
α 水酸化酵素は CYP27サブファミリーに属すると考えられ CYP27B1と命名された。次いで、あり、 ]0;‑水酸化酵素cDNAをプローブしてヒト腎臓より採取した mRNAから調製した cDNAライブ
ラットの 19bp，508個のアミノ酸をコードするヒト lαー水酸化酵素をクラリィーをスクリーニングし、会長246ローニングした。また、カナダの St‑Amaudらはラット CYP24のへム結合領域をプロープにして、ビタミン])欠乏ラットの腎臓より調製した cDNAライブラリィーを緩和な条件でスクリーニングして、司ーの遺伝子をクローニングしている。東大分生研の加藤らも、先に作製したビタミン D受容
我々と i体ノックアウトマウスの血中 lα，25(OH)2])'濃度が高いことに着目して、ノックアウトマウスの腎臓
α 水酸化酵素のクローニングに成功していより調製した c])NAの中から発現クローニング法を用いて lαー水酸化酵素を強く発現していることに着目して、る。 Fuらもケラチノサイトが酵素活性の実験から 1egeneratePCR法でクローニングした。従って、 1997
年に米国、カナダならびに日本の我々と同様の d4施設でほぼ同時期に遺伝子工学の手法によって 1
αー水酸化酵素がクローニングされたことになる。

α司水酸化酵素の部分精製に成功しており、今後、完全精製
また、宮崎医科大学のグループもラット l0;‑水酸化酵素と活性を指標に精製された蛋白質との比の暁には遺伝子工学の手法によって採られた 1較によって、ミトコンドリアへの移行シグナル等の詳細な解析が可能となることが期待される。

N. 1Ct‑水酸化酵素の発現とその調節

10;‑水酸化酵素は 25(OH)D3から活性型ビタミン Dである 1，
臼 25(OH)2D，を合成する酵素であり、 1，;025(OH)2D，の作用が小腸からのカルシウム吸収の促進ならびに骨からの骨塩動員促進によって生体のカルシウム恒常性を保つことであるから、血清カルシウムが低下した状態ならびにピタミンDが欠乏した状態の腎臓でその発現の促進が起こることが、代謝実験から報告されている。そこで我々は、ビαー水酸化酵素活タミンD欠乏食あるいはビタミン Dを含む低カルシウムならびに低リン食で飼育し、 l286‑性の尤進じたモデル動物を作製して、腎臓における本酵素のmRNAの発現を Nothernblot法により解析した。その結果、ビタミン D欠乏食で飼育することにより la‑水酸化酵素 mRNAの発現が増強し、本発，日 25(OH)2D3の投与により完全に抑制されることが明らかとなった。一方、 24‑水酸化酵素の現は 1mRNAの発現は la‑水酸化酵素の発現と逆相関して変化することも明らかになった(図 2)。また、低カルシウム食ならびに低リン食による 1日ー水酸化酵素mRNAの発現は、飼育期間に伴って増加することが明らかになった(図 3)。
a‑水酸化酵素は主として近位尿細管に局在することが報告されている。そこで、マイクロ腎臓の l

ダイセクション法によって得た近位曲尿細管から RNAを調製後、 RT‑PCR法によって l
目白水酸化酵素

CYP24P
4501α

D(・)1，25D

D(・) 1，25D

図 2. 25(OH)D，‑1臼ー水酸化酵素 (P4501日)ならびに la，25(OH)，D，‑24水酸化酵素 (Cyp24)mRNA発現に対する 1α，25(OH)，
D3の効果。
RNAはビ 9ミン D欠乏低カルシウム食で 3週間飼育したラットの腎臓O(ー)、あるいは実験48時間前に 1μgの1α，25(OH)，D，を静脈内投与したラットの腎臓より調製した。

¥%、もら、'丸
九 九'G'合らQ、2Neeks

AlQゐ詞

3weeks医J3.ラット腎臓における 25(OH)D3‑
1a‑
水酸化醇素 mRNAの発現に対する低カルシウ
ムならびに低リン食飼育の効果。
3週齢のラットをビ合ミン Dを含む 1.2%Ca，O.6%P(Norma司)
lO.03%Ca，O.6%P(0(+λLowCa)司1.2%Ca，O.1%P(0(+)，Lowp)食で 2ないし 3週間飼育した。 mRNAの発現は Northernblot法で調べた。
287mRNAの局在を検討した。その結果、 la水酸化酵素の発現充進モデルである、ピタミンD含有低カルシウムならびにビタミン D欠乏低カルシウム食飼育ラットの近位曲尿細管で、 la‑水酸化酵素のmRNAの発現充進が確認された(図 4)。一方、 24水酸化酵素は 1αー水酸化酵素と発現が逆相関して変化することが示された。

4噂 ‑CYP24

̲P4501αうぞ<k.()~~存'"J'O.A
7干f、 ノノ
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Qザ ママ"ft.

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0. C
ザ ザ医14. ラット腎臓における 25(OH)D3・1αー水酸化酵素ならびに 24‑
水 酸 化 酵 素 mRNAの 発
現に対する低カルシウム食飼育の効果。
3週鈴のラットをピ空ミン D欠乏あるいはビ空ミン Dを含む低カルシウム飼料 (0.03%Ca.O.6%P)で2退問飼育した。 Normal:ビ女ミン Dを含む1.2%Ca 0.6%P飼料で、 0(+).LowCa:ビヲミン Dを含む 0.03%Ca.0.6%P飼料で、 O(一入 LowCa:ピ空ミン Dを欠乏させた O.03%Ca.O.6%P錦料でそれぞれ飼育した。 CYP24:1
肌 25.(OH)，0，‑24‑:水酸化欝素、 p4501α:25(OH)O，‑la水酸化酵素。
左の 3レーンは P
4501αに、右の 3レーンは CYP24に対するプライマーを用いて R丁目 PCR在行った。
咽V. 1αー 水 酸 化 酵 素 の 発 現 促 進 機 構 の 解 析l日a

こで、 PTHがどのようにして laαm寸1水t酸化酵素の発現を促進するのか、分子レベルで調べることにした。
我々は、ラットの la水酸化酵素cDNAを用いてマウスのゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、 5'ー上流1.7kbpをクローニングした。この1.7kbpをルシフエラーゼレポーター遺伝子に繋いで、 LLC‑PKl細胞に PTH受容体を強制発現させた細胞 (AOK‑B50)に移入して PTHによる転写活性を調べた。その結果、 PTHは容量依存的に 1日水酸化酵素遺伝子の転写を促進させることが明らかとなった(図 5)。また、本細胞をアデニレートシクラーゼの活性化剤であるフォルスコリンで処理した場合にも PTHと同様に la‑水酸化酵素の転写が促進されたことから、 PTHはcAMPをセカンドメッセンジャーとして l研水酸化酵素の転写を促進していることが明らかになった。1.冗bpの上流領域には典型的な CREが 3カ所に存在することから、細胞内で合成された cAMPがC胞を介して転写を促進していると考えられる。しかし、 3個の C胞 が 1日ー水酸化酵素の転写に必須であるのか、どのC胞 がla‑水酸‑288

化酵素遺伝子の発現に最も重要な役割を果たしているのか等は、今後の研究の進展を待たなければならない。

=。
u=ロa v

唱
同J= 10ー同唱。てち同o 0.1

1.010100PTHtreated(nM)。

10Forskolintreated(μM)

図5. 25(OH)D，.
la水酸化醇素遺伝子の転写活性に対する副甲状腺ホルモンの効果。

25(OH)
D，‑1αー水酸化酵素遺伝子の転写開始点上流 1.
7kbをJレシフェラ ゼ遺伝子につなぎ、PTH受容体を強制発現させた腎臓の近位尿細管細胞A
OK‑B50に移入して転写活性を調べた。
右図はアデニル酸シクラ ゼの活性化剤であるフォルスコリンを処理して同様に調べた。

VI. ビタミン D依存性クル病 I型の疾患原因
ビタミン D依存性クル病 I裂は、腎臓における活性型ビタミン Dの合成過程に異常があることによって発症するクル病で、ビタミン Dの投与では治癒しないが生理量の活性型ビタミン Dの投与によって容易にクル病症状が改善することが知られている。このことから、本疾患は 1αー水酸化酵素の遺伝子発現あるいは蛋白質への翻訳の過程に何らかの障害があると考えられていた。ヒト lαー水酸化酵素は全長6kbに亙る 9個のエクソンによってコードされ、 508個のアミノ酸からなる P450遺伝子であり、本遺伝子のクローニングは I型クル病の発症機序を分子レベルで明らかにすることを可能にした。また、
ヒト la‑水酸化酵素の cDNAを用いて l日ー水酸化酵素の発現を調べたところ、腎臓以外にも姉、脳、精巣ならびに皮膚のケラチノサイトで発現していることが判明している。我々は、ビタミン D依存性クル病 n盟の患者の末梢血を用いて l臼ー水酸化酵素の遺伝子に異常があるか否かを調べた。その結果、
本酵素遺伝子の翻訳領域(エキソン 2)に l塩基の脱落があり、その結果フレームシフトが起こり蛋白質への翻訳の過程で途中にストップコドンが生じるため、活性を有する完全な蛋白質が出来ない障害、あるいはエキソン 8に 7塩基の挿入が起こり活性に必要なフェレドキシン結合、ならびにへム結合部位以前で蛋白質への翻訳が停止してしまうことが原因でクル病が発症する変異の存在することが明らかになった。また、本疾患が1αー水酸化酵素遺伝子の翻訳領域にフレームシフトを起こし、 lα，25(OH)2D，の合成療筈が起こったことが原因でクル病が発症していたことは、 lα，25(OH)2D，の投与によって容易に治癒する臨床成績からも支持される。さらに、 l
白血水酸化酵素遺伝子の局在は他の遺伝子との289‑関連性で調べた結果から、第 12染色体に位置することが予想されていたが、 1a‑水酸化酵素の遺伝子
luorescenceinsituhybridiz
ation(FISH)法を用いて詳細な検討がながクローニングされたことによって f2染色体の長腕(l2q13.
1‑q13.
3)に局在することも証明された。
され、第 1おわりに25(OH)D3‑1a‑水酸化酵素遺伝子のクローニングと発現調節について概説したが、ピタミン Dの代謝酵素が全てクローニングされたことにより、代謝調節機構の全容が分子レベルで明らかにされる日もa‑水酸化酵素遺伝子のクローニングの成功は、ビタミン D依存性クル病の発症機近いと予想される。 1序を明快に説明したに留まらず、腎外性1日ー水酸化酵素が腎臓の酵素と向ーであることも明らかにし

a‑水酸化酵素の遺伝子発現は、 cAMPの合成促進た。また、本遺伝子の上流解析によって PTHによる 1の結果、 CREを介して転写が起こる機序を説明した。更に、 1a水酸化酵素と 24叩水酸化酵素は同ーのa‑ネフロンに局在するにも拘わらず、両酵素が同時に発現することは確認されない。この原因も、 1水酸化酵素が発現している腎臓では 24白水酸化酵素の発現に必須の因子である VDRが消失しているこ

αm水酸化酵素が発現している腎臓のとから、説明できる段階になったと考えられる。特に今後は、 1a‑水酸化酵素の遺伝子発現との関連性が近位尿細管で VDRが特異的に発現の抑制が起こる機序と、 1明らかとなることを期待する。

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