サリドマイド催奇性を引き起こすタンパク質の発見－

サリドマイドによる副作用のメカニズムを提唱－

このたび、愛媛大学プロテオサイエンスセンター 山中聡士特定研究員、澤崎達也教授、東北大学大学院生命科学研究科 田村宏治教授、名古屋大学大学院生命農学研
究科 鈴木孝幸准教授、 名 古 屋 工 業 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 柴 田 哲 男 教 授 ら の研究グループは、サリドマイド催奇性の分子メカニズムを明らかにしました。
サリドマイドやサリドマイド誘導体は、多発性骨髄腫などの血液がんを中心として世界中で年間約 1 兆円の規模で使用されている低分子薬剤です。しかしながら、妊婦が服用した場合、胎児の四 肢発生に重篤な副 作用を示 すことが大 きな問題 点です。本 研究では、コムギ無細胞系を用いた網羅的な相互作用解析からサリドマイド催奇性に関わるタンパク質として新たに PLZF を見出しました。サリドマイドやサリドマイド誘導体の投与は細胞内において PLZF のタンパク質分解を引き起こし、四肢発生に悪影響を与えることが示されました。さらに、本研究では生物種間のサリドマイドに対する感受性の差異のメカニズムを提唱しました。PLZF の発見によって、現在、世界中で盛んに行われている副作用を軽減した新たなサリドマイド誘導体の開発への大きな貢献が期待できます。
この研究成果に関する論文は、令和 3 年 1 月 20 日付けで THE EMBO JOURNAL 誌に掲載されました。

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1.背景
サリドマイド 1) は半世紀以上前に妊婦における睡眠導⼊剤として世界中で使⽤された薬剤ですが、服⽤した妊婦から⽣まれた胎児の四肢に重篤な催奇性 2) を⽰したことから、サリドマイド薬禍といわれるほどの世界規模の薬害問題を引き起こしました。その後、ハンセン病や多発性⾻髄腫に対する薬効が認められ、現在、サリドマイドやサリドマイド誘導体 (レナリドミド及びポマリドミド) は厳格な安全管理のもと、多発性⾻髄腫などの⾎液がんに対する治療薬として年間約 1 兆円の規模で使⽤されている⾮常に有効な薬剤です。サリドマイドやサリドマイド誘導体(Immunomodulatory drug /IMiD 3) )は、タンパク質分解酵素である E3 ユビキチンリガーゼ 4) の構成因⼦のひとつであるセレブロン（CRBN）へ結合することにより、様々なタンパク質の分解を誘導し、その結果、多様な薬理作⽤および副作⽤を⽰すことが明らかとなっています。
これまでに、胎児の四肢発⽣に重要な役割を果たすタンパク質 SALL4 (Sal-like protein 4)が、IMiD 依存的に CRBN によって分解誘導されることが報告されていました。また、最近我々はサリドマイドが体内で代謝されて⽣じる⽔酸化体（5 位⽔酸化サリドマイド）5) が、サリドマイドよりも効率的に SALL4 に作⽤するメカニズムを構造解析によって明らかにしました（参考⽂献１）。
しかしながら、サリドマイドやサリドマイド誘導体によって引き起こされる催奇性のメカニズムに関しては未解明な点が多く残されており、SALL4 以外の原因タンパク質の存在が⽰唆されていました。
２.研究成果本 研 究 で は 、 サ リ ド マ イ ド 催 奇 性 に 関 わ る タ ン パ ク 質 と し て 新 た に PLZF (promyelocyticleukemia zinc finger) を⾒出し、サリドマイド催奇性の分⼦メカニズムを明らかにしました。コ
ムギ無細胞タンパク質合成系と AlphaScreen 法 6) を組み合わせることによって、サリドマイド依存的に CRBN と相互作⽤するタンパク質を検出する⽅法を構築しました (図 1, 左)。コムギ無細胞タンパク質合成系によって構築された 1,118 種類から成るヒトの転写因⼦プロテインアレイを対象にした網羅的な探索の結果、サリドマイド依存的に CRBN と相互作⽤するタンパク質としてPLZF を⾒出しました (図 1, 右)。また、培養細胞を⽤いた解析の結果、PLZF はサリドマイドやサリドマイド誘導体、そして 5 位⽔酸化サリドマイドによって CRBN 依存的に分解されることが明らかとなりました。次に、サリドマイド感受性の動物種であるニワトリ胚を対象に PLZF の遺伝⼦ノックダウン実験 7) を⾏なった結果、ニワトリ胚の四肢発達において PLZF は重要な役割を果たすことが⽰されました (図２, 左) 。さらに、ニワトリ胚へサリドマイドや 5 位⽔酸化サリドマイドを投与することによって、ニワトリ胚の肢芽において PLZF が減少している⼀⽅で、SALL4 は減少しないことが確認されました (図２, 右)。最後に、ニワトリ胚へ PLZF を過剰発現することによって、サリドマイド投与に伴って引き起こされる繊維芽細胞増殖因⼦の Fgf8 や Fgf10 の発現減少が、回復することが明らかとなりました (図３)。今回の発⾒は、CRBN によるサリドマイド依存的な PLZF の分解がサリドマイド催奇性に直接関与していることを⽰しており、ヒトやサル、ウサギのようなサリドマイドに対して感受性の⾼い⽣物種においてはサリドマイドが体内の代謝酵素により 5 位⽔酸化サリドマイドへ代謝されることと、SALL4 と PLZF の両⽅のタンパク2質が分解されることによって、重篤な催奇性が引き起こされることを強く⽰唆しています(図４)。

図 1. コムギ無細胞系によって合成されたタンパク質を⽤いた相互作⽤解析 (左)およびヒト転写因⼦プロテインアレイを⽤いた網羅的な相互作⽤解析の結果 (右)図２. ニワトリ胚における PLZF のノックダウン結果 (左) およびサリドマイド投与によるニワトリ肢芽における PLZF の分解 (右)3図３. サリドマイドによって減少する遺伝⼦に対する PLZF 過剰発現による回復実験(⻩⾊⽮尻; Fgf10 の発現領域、ピンク⾊⽮尻; Fgf8 の発現領域)

図４.サリドマイドが、何故、ヒトに対して⾼い感受性を⽰すか、を⽰すモデル
ヒトなどのサリドマイドに対して⾼い感受性を⽰す⽣物種においては、サリドマイドと 5 位⽔酸化サリドマイドの両⽅が、四肢形成に必須な PLZF と SALL4 の 2 種類のタンパク質分解が引き起こされることにより、強⼒な催奇性が引き起こされる。

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3. 波及効果
サリドマイドやサリドマイド誘導体は、世界中で年間約 1 兆円の規模で使⽤されている低分⼦医薬品であり、標的タンパク質を分解するというその強⼒な薬効から近年⾮常に注⽬を集めています。実際に、様々な疾患を対象に新たなサリドマイド誘導体の開発や臨床研究が活発に⾏われています。したがって、新たなサリドマイド誘導体の開発を⾏う上で催奇性を回避することは重要な課題となっています。本研究のサリドマイド催奇性に関与するタンパク質としての PLZF の発⾒は、今後の SALL4 および PLZF への作⽤を軽減した新たなサリドマイド誘導体を開発する上で重要な位置付けになることが予想されます。

4.研究体制と⽀援について
本研究は、愛媛⼤学 プロテオサイエンスセンター、東北⼤学⼤学院⽣命科学研究科、名古屋⼤学⼤学院⽣命農学研究科、名古屋⼯業⼤学⼤学院⼯学研究科との共同研究として⾏われました。
また、研究の実施にあたっては、⽇本学術振興会(JSPS) 科学研究費助成事業、新学術領域研究「数理解析に基づく⽣体シグナル伝達システムの統合的理解」、武⽥科学振興財団、⽇本医療研究開発機構 （AMED）創薬等ライフサイエンス研究⽀援基盤事業 （BINDS）「コムギ無細胞系による構造解析に適した複合体タンパク質⽣産・調製技術と低分⼦抗体作製技術の創出」の⽀援を受けました。
5.論⽂タイトルと著者
タイトル: Thalidomide and its metabolite 5-hydroxythalidomide induce teratogenicity
via the cereblon neosubstrate PLZF
( 和 訳 ) サリドマイドとその代謝物 5 位⽔酸化サリドマイドは CRBN ネオ基質 PLZF を介して催奇性を引き起こす著

者︓⼭中 聡⼠（愛媛⼤学）, 村井 英隆（東北⼤学）, 斎藤 ⼤介（東北⼤学

現︓九州⼤学）, 阿部 ⽞武（東北⼤学）, 徳永 恵津⼦（名古屋⼯業⼤学）, 岩崎 隆宏（愛媛⼤学）, ⾼橋 宏隆（愛媛⼤学）, ⽵⽥ 浩之（愛媛⼤学）, 鈴⽊ 孝幸（名古屋⼤学）, 柴⽥ 哲男（名古屋⼯業⼤学）, ⽥村 宏治（東北⼤学）, 澤崎 達也（愛媛⼤学）
掲 載 誌 : THE EMBO JOURNAL
Journal link: https://www.embopress.org/doi/10.15252/embj.2020105375
掲 載 ⽇︓2021 年 1 ⽉ 20 ⽇（⽔）

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⽤語説明

１） サリドマイド
睡眠作⽤および免疫調整作⽤を持つ低分⼦薬剤であり、多発性⾻髄腫などの⾎液がんやハンセン病による 2 型らい反応に対する治療薬として利⽤されている。

ONO
NHOO

図 5.サリドマイドの化学構造
２） 催奇性薬剤などのある種の物質が⽣物の正常な発⽣を阻害して奇形を⽣じさせる性質や作⽤のことで、催奇形性と同義で使われる。

３） Immunomodulatory drug /IMiD
サリドマイドやその誘導体の総称であり免疫調整薬とも呼ばれる。イカロスやアイオロスと呼ばれるタンパク質の分解を引き起こし、多発性⾻髄腫などの⾎液がんに対する治療薬として世界中で使⽤されている。

４） E3 ユビキチンリガーゼ
タンパク質のユビキチン化を引き起こす酵素。細胞内でユビキチン化されたタンパク質はプロテアソームによって分解される。

５） 5 位⽔酸化サリドマイド
サリドマイドが投与されたヒトやウサギを含む様々な動物種において、代謝酵素 CYP450s によって⽣体内で⽣成されるサリドマイド代謝物。

ONO
NHHOO

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図 6. 5 位⽔酸化サリドマイドの化学構造
６） AlphaScreen 法
PerkinElmer 社より販売されている相互作⽤解析技術。2 種類のビーズを⽤いて各ビーズが結合した 2 種類のタンパク質が相互作⽤することにより、2 種類のビーズが近接し、化学発光シグナルが得られる。

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７） 遺伝⼦ノックダウン実験
特定の遺伝⼦のメッセンジャーRNA の量を減少させることによって、標的のタンパク質の発現量を減少させる⼿法。

参考⽂献１
Hirotake Furihata, Satoshi Yamanaka, Toshiaki Honda, Yumiko Miyauchi, Atsuko Asano,
Norio Shibata, Masaru Tanokura, Tatsuya Sawasaki, Takuya Miyakawa (2020) Structuralbases of IMiD selectivity that emerges by 5-hydroxythalidomide Nat Commun 11: 4578

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