牛乳串来蜜白・ペプチドによる細胞増殖、分化、アポトーシス誘導の母子機構
d凌阜大学医学務生化学教室主教授野薄義則〈要旨)
牛乳は健康食品として浅くより知られており、乳幼児の成長にとって必要警な骨形成に Z霊祭な成分を会むことが知られている。また、栄養食品としてばかりではなく、返さ資自質カぞインやラクトフェワ
ンの分発李登量物は多くの役理活性物質を含み、細菌感染泌氏、免疫隊活、豪語抱増罪責・分化・アボトーシ

1一心。しかし、それらの物質の化学的災体や作}話機構についスに有効であることが報?きされている (ては十分明らかにされていなし言。牛乳成分の有効性の検索には級感レベルでの検討が重要勺あり、本研究では、各緩細胞系を fflいて細胞増殖a

分化・アポト…シス誘導機撲を検討した。 牛乳量長自カゼイン湯来ペプチドは免疫賦活作浴を有することを明らかにし、その務効成分の身主総・精製および間定を行なった。カゼイン E
益事長低分子ペプチドはE責務な免疫絞活作用を立詳し、また、がん幸運JID
滋殖抑制i効果を認めた。さらに、牛乳後合のトリプシン分際物による綴総滋頬・分化・ 7ボド}シス誘導撃を各綴綿総系を用いて主義討し、骨芽事量級終MC3T3必lの全量発議抑制j、分化誘導と、ヒト脅す違宮核;lf球性的江主務総脇然Meg01のアボトーシス誘導事を示奇襲する所見が得られた。これらのま諸施機能多表現に関与する機機愉

を明らか;こするために、言語自愛 1)ン酸化系をゆ心に細胞内'
1
奪事長伝達絡について検討した o(方法)り牛乳由来カザインおよび乳液蚕佐i
質加水分解物の精製と!可定:
牛乳自主長カt!インにトリブシンを添加し、 37'(:でー娩反泌させる。反応後 H∞℃で 10分間加熱処
理をfTい、 10，0∞rp
掃で 1雲寺問主主心し、よ二i毒}時?}を得る。得られたよ?奇麗分をセブアデックス G‑15によるカラムタロ?トグラフィーを行い、 f底分子縁ペプチドを分画した。各滋分の抗体産生還を誤1~し、賞受大産没絡をネナ画分を集め、さらに DEA分セブアデックス A・25 で精製した。 4 つのペプチ

ド関分がぶ‑1こまで精製され、アミノ患を器G5存在了決定し、これらのペプチドを大量に合成した。

o

牛字し由来のぎし湾紙分についても符様にトリブシン分解を行い、約 5，∞ 前後の分子量を食む分薄手渡物を分函した。

2) 抗体正義没後 i
こ対する効果:
マウス腹腔内 i
こ5%
寄生赤血球i
手遂液.0.
5
泌を投与後、 4目隠 4
こ5専E
援を摘泌し E専華議豪語抱浮遊液を議書製する。この浮遊 i
飴こ被草案物質を添加し、 37'(:で24時総法養する。主義警告主主広告に産生されるま手赤血球に対する抗体f
簡を赤血球i
溶必反応、で測定した。

3) ストレス負荷による免疫能低下にまきするカゼイン議官水分解物投与の効薬:

Balb/d
名波マウス;こ308間にわたってカゼ千ン加水分解絡の水溶性溺分(lOrr軍/tne) を与えた後、
‑656‑

各署
手 3J1];を用い、ストレス無負絡事孝とさ容器戸胤球投与 1B前から 2臼後までに 1‑51lilストレス負癒を与えた務について、抗体重室生昔話および議読者中の抗体最;こますする影響撃を検討した。ストレス食事手は、マウスを 1J1];づっ傘縦性の狭いゲージに入れ、 15"Cの水中に滋までさ差して 1時間喜多量した(拘束主主}
浸ストレスα4) がん幸町胞増綴に対するカゼイン加水分解物の影響

IC
R系総マウス(6還童全) ~こ、 i カぞイン潟水分解物の水溶性爾分 (10宣車/泌)を l 滋濁与えた時
点1
ずがん継目撃{サルコ ‑7180総君主) 1x1ぴ綴をソケイ総皮下に移植し、 さらにカゼイン加水分解物の水i容を生関分を与え 2 .ì!霊間後に~形態事蓄を摘/l:\し重量を iP.U定した。

5)骨芽機級胞MC3T
3‑Elの今季L
蛋白書E
水分島等号舎の彩撃事:MC3τ
ぢ‑E1細胞(1XlO')在十MEM〆lO%FBS竣議委主主中'
100mmテヂイァシュで 2fH
塁主義養後、 FBSブ')…の g み絞M培地に変換して24時間培養した。 FBS フリー泌総に各緩工F~U豪邸分解援物 (5101理/必)を添加し、 24待問格設撃した。形態の変化およびシグナル伝達系稼業活伎の変化を言問べる e6)ヒト誉総反核祭主主性自立里線級施Meg‑01の午!f
H華街加水分線車舎の影響:
協g‑OH立武田製薬品調飽工学研究所より購入した。露首樹立20%FBSを念 UDM酬で培養し、 5xl
Q'個/泌を 5%FBS を舎かDMEM に移し、不幸l~霊闘賞分毒事総務を添加して、アポト…シス誘導を観察する。アボト}シスの変化は、撲を特契約に染色するヘキスト 33258を用いて姻彪を染色し、蛍光顕微鏡で緩祭した。

7) ウエスタンブロ 7デイングによる滋若者蛋白質量設の変化:

MC3T3‑
El細胞をキ乳言語白分解雇主物で処理したものと、安善処瑳細胞を ly
制 作uffer (トリス緩衝液、災17.
4、1%Tri
斡 nX‑1∞、 1%SDS、 1 %コー 11/護費、 20μgノm801'ベプチン、 1m MPMSF) ~こ怒

潟し、超t若者支で細胞を号室主義ずる。畿自交の一定震 (50‑100μ 臨)を SDSサンヅル緩衝読まで処主要した
後、 SDSポワアクリルアミドグル電気泳道 (SDS‑PAOE) を行ない言語自然を分灘撃した。分縦した潔真に絞移後、各種抗体と反応、きせた後、アルカリホスファタ…ゼ結合のま完ウサギ二次
白質は PVDFH
検出試薬を F書いて X‑線フィルム上に感光さぺせた。
抗体と反応させECLioぷad試薬を用いて、 B
radfordの1iままに従って行った。
議El質のま包震は B(結果/考察)牛筑由来カゼイン加水分解毒事の主主体E
量
生
量
告にJ.
，Zi
ます膨撃事

F

Eド撃し由来カゼインのトザプシンによる加水分解き撃は、セフアデァクス 0‑15を 闘いたカラムクロマ

要された低分子ペプチド (300‑3，線的爾
トグラブイーを行ない、いくつかの磁分に分離した。分5車/m8)について抗体産主主総を測定したところ、高い抗体室長主住吉きをjjCす s
つの闘争分を得た分(lrセファデックスん25カヅムクロマト(I刻1)。後も高い抗体主主主主総を示したFr.4舎、さらにD韮AE事/m8)について抗体重量生音量を社制定したところ、米吸養護議グラフィーで綴裂を行った。各滋分(ln分に賞受も蕊い効主性が認められた(隠 2)。

‑657‑

3

今︐. 4・・
起 A時﹂T殺り品獲物帆(古川矧制閣 44結。
1345 信分闘森喜雪

8

関1.セブアヅデックス G・15に よ る 各 蘭 分 の 抗体産生能
lmglm
りを添加し縛繊細線浮遊液に各頭分 (24時間活養後、培養液中に援さをされる抗体援を澱定した。産生された抗体選はま表滋球溶血定し、対照に対する比で演し反応、により誤qた。
ヰ旬︒内445

鋭的い絞り時緩和帆ハ WM
閉鎖念総器

1

ま345s

分函番号

悶2.DEAE
セファデックス A251
こよる各函分の圃抗体援~能牌臓細胞深遊液に各閣分 (lmglml)を添加し
24
時問機幾後、培養液中に産生される抗体長置を測定した。

この"@分をさらに精製し、 4つの縁… f
J:ペプチドを得た (cP.
・1、之、 ‑3、‑4)。これらのペプチドのアミノ援配列を決定した。各会主党ペプチド仕立車/me) の抗体重量殺絡を ìJllJ定したところ、 cp-2~こ一品5
喜一2
語い抗体重量生佐官事が認められた(図 3)。

ま>
Qt株

主賞
U1.
5墜

1貢~1語教主。t:m:I:
l1ttttm

長二;三 4123合成ペプチド
鴎3.カゼイン加水分解物Ei1来合成ペプチドの抗体産生能
牌鵜締胞浮遊液に各薗分 (lmg/mりな添加し24
待問培養後、培養液中に霊養生される抗体最後測定した。

ストレスを負荷することにより、免疫官官が低下することが知られている。マウスに拘束水浸スト
こ対するカゼイン泌水分解物投与の効薬について検討した。 1
車線級施さきたレスを与え、免疫能低下 i
りのまえ体産生盤に対するストレス主主衡の影響は少なく、*を与えた?ウス群との務』こ大妥は認めら)、ストレス予宅街を 5回以上かけると、水摂駁番手では 62.
0%に低下したのに対して、れないが(図 400%に緩まり、ストレスによる抗体凌主主総の低下がカゼイン加
カゼイン鑓水分解物のま笑双群では 8水分解物により豪華滅した。また、*摂取群では、ストレス負荷の回数に応じて血清中の抗体ままは強1%まで低下した。一立子、カゼイン加水分発事型軽の摂取哲学では、ストレス食事普波数 2
い影響を受けて 4綴まではぬど低下せず、むしろ政務中1})抗体量は土議鎖した(関 5)。このように、ストレスの関数土低下するが、水摂取鮮によ乙ベ切らかに強いまま抗性をぶした。
を得力日すると抗体霊 i80
カゼイン加水分解物投与によるがん綴号室増殖の影響を検討した。マウス;こ移織したサルコーマ 1綴砲のま器調査速度i、主 5
雲形1
重主審議室長の謹g定によってま主笈{むした0*

摂取群は閲形E
重量義援援が1.73:1:0.97
ω患であったのに対して、カゼイン加水分議事務摂取群では 0.
36土 0.
29gと切らかにがん綴絡の増殖が締約された。したがって、カゼイン主主*分解物を与えることによ号、主主体内の免疫援が賦活され、その総3裂がん綴奇襲の増殖がt締約されたものと怒われる。

‑659…

0.
3重量

奪0.2
輔

副酬。
説1唯指書Q。

1 2 4

5

ストレス回数

醤4.ストレスによる抗体産生態低下に対する苧
カゼイン泌水分解物投与の影響
マウスに 30日間カゼイン加水分解物水溶液(
10mg/ml)を与え、 0，ストレス無負荷;上学赤血球投与 1日前に 1回ストレス負荷; 2，1日前と問日の 2凶負荷 ;4，1目前、悶目、 1日後及び2日後の4間ストレス負荷;5， 1日前、!湾問、 1日後、 2日後及び3日後の 5凹ストレス後負荷し牌繊細胞当たりの抗体量を測定した。

容器事
語

首級
制 30
帯主H
減H'I
I:
‑ 20H
:

燃内側抑止
9B

1 2 45ストレス関数態5.ストレスによる抗体霊祭集能低下に対するカゼイン加水分解物投与の影響
認14の言語号患と j
弓緩めY
守主までマウスにストレスを負荷した後邸液を篠取し、 i
主i
淡ゅのま先手本鐙を沸i定した。

…660‑

各芸F様綴5室
主主C3τ3
引 における牛乳蛋自分解寺舎による喜多襲撃およびシグナル伝言霊系(f)変童書
T3‑
1
誌の増菜室
牛乳由来蛋白笈{カゼイン磁分と乳祷妥協笈額分}の務素分解号事の脅芽主義幸謀総MC3および分化誘導作潟について検討した o
カゼイン加水分解物の細胞犠頬に対する影響を検討するために、 MC3T
3必1細胞に組カゼイン加水分解ペプチドを添加し、 ('H) チミジンの細胞への取り込みの時間経過を翻ぺた。カゼイン加水[g/meでは隊機の程度は僅かであるが、 5rr
翠/
meで12時間処唆すると完全に ('H) チミ分解物は 1高Jli
撃の季筆頭をはFBSの濃度に依存して減少し、 10%
回 S存在下ジンの取ち込みを綴怒した(図 6)0 s喧〆me) による滋3警は見られなかった。したがって、低濃度FBS培地

ではカゼイン加水分発平総 (5nではカゼイン加水分解ペプチドは脅茅綴胞の犠英霊を抑制する効采がある

長10%F除S

官1%FBSoτ

15械とが叙された。

3.
0必安:

猛然 108話

e入 s入
:

1.
5一一一『幅一山蛍た82認容に4102030

1.
050 04010203040

器8

インキュベーション{雲寺総}間6:骨芽様締胞 MC3す みElの [3H]チミジンの絞り込みに対するカゼイン加水分解ペプチドの影響

MC3T3‑
E1細胞を 1%および 109志向Sを含む培地で 24時開埼議後、カゼイン力量水分3H]チ解ペプチドを添加して 2日開インキユベーシ沼ンした。得時間における [ミジン (2μ Ci/ml)6n
寺闘の取り込みをiIIY定した。
O 対s@
A カゼイン加水分解ベブチド (lmglml)
E カゼイン加水分解ペプチド (5mgl思 1)

1

一方、 M
C3T
3‑El主題君主は守への分化 i
こ伴い、アルカワホスファターゼ活性が増泌することがま去られている(5)。カゼイン加水分解物のMC3T3‑E1紹胞の営への分化誘導終について義理べた。カゼイ耳/me) を 1%FBS培地に添加し、アルカリホスファターゼ浴{践を測定しン加水分解ペプチド(5nた。ます熊細胞は 1%FBS培地で48時間主音幾すると、 アルカリホスファターゼ活性が約 2俗世首加する
時間では事事務滋伎の低下がが、カゼイン加水分解ペプチド処滋による影響は克られず、むしろ、 48
ぎイン加水分解ペプチドはMC3T3‑El細胞の脅への分化誘導に認められた{機打。したがって、カ 4i立労務しないものと窓われる。

nhulpu錯ぬお{gagamwEEEt法 酬なC}

組漣pihmtnhd円vwmr夜︑ ‑トh40Mmm

15'1020304050インキニエベーション{時間)

図 7.骨芽様級抱 MC3T3・El綿織におけるアルカリホスファタ…ぜ活性に対するカゼイン加水分解ペプチドの影響Mζ:31
吉 右1縄線(5友1051ml)を1
寺
島F
BSを含む αMEM
築地で24的関培養f
妻、カゼイン泌水分解ベプチドの有無でインキュベーシぉンし、各終問で細胞を採取し静索活A:した。
性を調I
O 対照
4静カゼイン加水分解ペプチド (5田gfmIl)添加MC3T3ε工事毒殺は牛乳カぞインや乳液3
まお加水分解物 (5霊草/mt) により、獲しい形態変化を示した。費予滋変化の霊堂話事は無血清総長主において顕著であ号、血清の会議室を増加するにつれて軽減した。

mt) を添加し、 24時総後に彩主要の変化を綬察したところ、立す支署長証渚培地に分麗した各随分(l立軍/関細胞と比べて、カゼイン 110*分解物Fr.
l、精製ペヅチドCP‑4、および乳淡後白質加水分解蕗分のF
r.lOによる形態後化が認められた{留針。とくに乳液祭El加水分握手額分Fr.
10による顕著な形態変イとが認められた。
MC3T3ふE1の形態変化に{辛う総胞 F付降雪孝義伝達;震の変化について検討した。乳清主苦闘加水分解ベブ
1tiチロシンリン酸化 (J)影響襲安調べるために、宇Li青薮自加水分解物 (5rr翠/泌)を添
チドによる芸者自 j
4時間格事委後、抗ホスホチロシン抗体を汚いてウエスタンプロッテイングをおした現在血清培地で24持荷主審議することにより幾つかの主資自質のチロシンリン酸化か溜められた行った。き普段済培地で2初 回a、70k胸、 88ゆa、100回 a、125油 a、130ゅ心(図 9)。学Li禽蛋白加水分解ベブ

ドを処理主、55ゆ傘、 58kDa，1
ωゅ a
蛋白望者のチロシンリン酸化の土寝泊が認められ、逆することによ号、88kDa

25山 北7
依 Da
資自交のチロシンリン室主化の減少が鍛空襲された。 125kDa
凌白質パンドはFAKであに1きままパンドの附まをは今後の繰話題である。
ることが増設えられたが、イ也の蚤 E‑662‑

ControlFr.1F仁 10CP‑4

図8.骨芽様細胞絞り T3・Elの牛乳彊自分解物による形態変化
MC3T3 脱線痴を O.3%BSAを含む総地でお待問機事豊後、カゼイン初主主分解ベプチド〈鈴.
1)，乳液蛋肉寿喜水Fr.
10)および合成ベプチド:
CP‑4)5mglmlをそ
分解毒毎(れぞれ言動5し、 24
時隠後の形態変イロについて後然添加の対照翻綴と比較した。

Cont
rolFι10Mr(kDa)
206‑

120‑

図 9俗骨芽様細胞 MC3T3必 1の畿自質チロシンリン酸化に対する乳清蚤自分解物の影響

事章一暢蜘

主4αT3‑El紛胞をO.3%BSA
校舎む生きま匙で 24時閣培養
Fr.!
Q)
5mglmlを添加し、 24
後 、 乳 液 凝 加水分解物(
時間後の主袋路実チロシンリン霊堂化についてを主主ホスホチロシン抗体を潟いたウエスタンプロッティングにより検討した。

Bit
ぬ4it

事母一輔
醸時 同 点‑663‑

MC3T3戸E1細胞の彩室長変化に伴うブロテインキナ}ゼ C (PKC) の変動について、若手種PKCァイソ
必l継総i
こは苦手緩PKCアイソザイザイムの抗体を用いてウエスタンブロテイングを行った。 MC3τ3ムが孝子夜し、 PKCa， βI、 p荘 、 ト ム e、と、 8が検出された G ぎし清議自分解物F
r10で24待理

問処理することにより PKCε の特妻宅約なき護少が綬察された{闘 10)。さらに縮胞機菜室、分化、アポトーシスには MAPKファミリーの活性化が関与することが紛られている (6)0MAPKファミ，)̲の、p38MAPK、JN
K'の活性裂のみをき金泌する抗体を弱いて検討した c 無血液凝地で24時活性化は巴RK
間 培 養 し た 刷 機3
きでは、 E隠とp38MAPKのチロシンリン機化のJi;1!Iiがえられたが、まLi吾蚤自分翼手物処理霊細胞では阿衰の 1)ン費量化は完全に消失していた(関 11)。

開Ca

備晴樹轟PKCsI 智略銅側'PKCsII

r .噂

PKCo
PKCe
PKCe

図 10移管芽様綴胞 MC3T3‑ElのPKCに対する乳清姻融制帽、明・陶臨

輔‑険蛋自分解物の影響M岱 τ'3‑El紙胞を 0.
39も"BSAを含む潟地で 24袴閲Ij:ま養後、 事L
浴室産自主百水分隊物 .
Fr.
l0)
5mg/mlを添加 L、24時
間後の細胞について、著書緩PKC
アイソザイムの抗体安局いたウエスタンブロッティシグによち後討した。

⁝包時

Fr.10
φ議毛密11.骨努様細胞 MC3T3必 1のMAPKファミリ…の活性化に対する乳鴻蛋白分解物の影響
MC3T3‑
E
l締胞 'Ii:0.
3%陪 Aを苦言む ti
雪地で24符閑壊護憲Fr.10)5mg/ml
添加し、 241時
後、事し浴後自殺水分解物(限後の MAPKファミリーの綴性化について銃りン駿伶
MAPKファミリ…抗体を用いたウエスタンプロッテイングにより検討した。

吾64‑

以上の幸吉呆より、乳液3妥協湖水分鱗E産物 i
ま骨芽縁細胞MC3τ'3‑E1細胞の形態変化をもたらし、車部胞増殖の低下を引き起こした。また、土器綴悶害警はMAPKファミリーのERK1 (p42MAPK)、p38MAPKの活性化の阻客、 PKC.の特終的減少が関渡しているものと思われる。

l白血病細胞Meg心 1はホルボールミリステ千トアセテイト (PMA) 処五郎こ
一方、骨髄医核芥球tより血小板に分化することが知られている(7)。本細胞を乳清蛋白加水分解物Fr.lO処王壊すると、2)。濃度依存的な形態変化を主主じ、車部隊数の減急速な形態変化を引き起こすことを見出した(阪 13)。へ"fスト 3358
染色による核クロマチン分解が観察され、アボトーシス少を引き起こした(1Zl1誘導が示唆された。最近、牛乳3菱自後ラクトフェリシンB函来ペプチドは、ヒト白血病幸運目撃也601こ
対してアポトーシスを誘導することが害援をきされている{針。牛乳上清蛋白質の加水分解援物もが1
むには、脅緩巨核芸子支ま性自盗薬毒幸運滋
ん綴胞に立すして同様な効果を示すことが唆 dました。また、長.

F主4e
喜一01の芭核王まおよび血小板への分化促ま撃作 詩も護憲められ、互主小まま増加との関連牲においても興味ある物資を含んでいる。さらに言葉義務貨の本体を紛らか Lこするとともに、言季綴な、分化およびアポト}シス誘導のメカニズんを解明することが今後の盗事警な言薬草重である。
なお、本研究において牛乳カゼイン加水分解ペプチドの総重症および免疫獄活作用に関する研究 i
立、
絞阜県衛生研究所の渡辺豊博士ととの共同級'先によるものである。

Control

ドr.10，

関12・E核芽球性白血病細胞 Meg01の乳清後自欄

分解物による形態変化i¥
1cg心 1細胞を 0.3%BSAを含むDMEMT
昔地で 24時闘
機議後、事し生蛋白加水分解物(Fr.1O)
5mglml寄添加
し、 6時間後の細胞形態について無添加の対照縦総t比車交した。

‑665‑

5.
0

さ1
語S3.5&
25抑制露呈呂顛

2.0~んo t2

3 4 5ドr.10(mg/ml)

国1
3.自核芽球性白血病細胞Me器心 1における乳務蛋自分解物による細胞数減少の濃度依存性
Meg‑Ol細胞を 5%陪 Sを含ま!DMEM
主義士
患で 24時間培養後、著書濃度の乳清蛍自分解聖持者E添加し、 6時間後に繍脇数の変化を測定した。

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