4ーアミノー 5ーヒドロキシー 2 2 7‑
ナフタレンジス 9いホン醗
モノナf‑1J ウ ム 塩 c

細回を用t,ヽそ復帰変異試駿

厚生省生活衡生局委託

財団法人食品薬品安全：セン：ター
秦野罷究・｀所目 次頁
要緒

約—- ‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑ーー・．

erで璽.

‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑・12

材料および試験方法・・・・・・・・・‑・・・・・・・・‑‑・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・‑・・・・・・・・・・・・・・・・・・‑
‑・・・‑
‑
‑
‑・・・ 3

試験結果および考察

・・・‑・・・・‑
・‑・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・‑‑・・・・・・・・・・・・・・‑・・・‑‑・‑‑‑・・・ 7参 考 文 献‑‑‑‑‑‑‑‑••‑‑•‑‑‑‑‑‑‑·—· ‑‑‑・‑‑‑‑‑‑••‑‑• ••••••••••‑••• ••‑‑•• • • •• ‑‑‑‑•‑‑‑‑‑‑•

表1 39要 約

4ーアミノー 5ーヒドロキシ＿ 2,
7‑ナフタレンジスルホン酸モノナトリウム塩の変異原性の有無について、縄菌を用いる復帰変異試験を実施することにより検討した。
検定菌として、 SaL
moneL
Lat沖hi皿riumTAlOO,TA
1535,TA
98,TA1537およびEscherichiacoliWP2uvr
Aを用い、直接試験および代謝活性化試昆金のいずれも、用量設定試験は 505000成／ブVートの用量で、本試験は 312.
55000宛／ブレートの用量で実施した。
その結果、 2回の本試験とも、用いた 5種類の検定菌について、いずれの用量でも復帰変異コロニー数の増加が認められなかったことから、 4ーアミノ＿ 5‑ヒドロキ
シ＿2,7‑ナフタレンジスル＊ン酸モノナトリウム塩は、用いた試験系において変異原性を有しない（陰性）と判定された。

‑・1‑

言緒

OECD既存化学物質安全性点検に係る毒性調査事業の一環として、日本が独自に選定した既存化学物質の 1 つである、 4 ーアミノ— 5 ーとドロキシ＿ 2,7- ナフタレンジ

スルホン酸モノナトリウム塩について、網菌を用いる復帰変異試験をプレート法により実施した。
この試験は、サルモネラ（ネズミチフス菌）におけるとスチジン要求性から非要求性への復帰変呉、ならびに大腸菌におけるトリプトファン要求性から非要求性へ(2)の復帰変異を指模とした変異原の検出系である。
試験は、被験物質をそのまま検定菌に作用させる直接試験と、哺乳動物のもつ薬物代謝酵素 (S9混液）によって産生される被険物蛍の代謝物の変異原性を試験する代謝活性化試験とからなっている。
本試験は、「新規化学物蛍に係る試験の方法について」（昭和62年 3月31日、環保業第237号、薬発第306号、 62基局第303号）および O
E
C
D化学品試験法ガイドライ
ン：471,472に準拠し、化学物蛍GLP （昭和59年3月318, 環保業第39号，薬発第229号， 59基局第85号，改訂昭和63年11月18日，環企研第233号，衛生第38号， 63基局第823号）に基づいて実施した。

‑"―ム材料および試験方法

（検定菌〕

Salmo
旭 Ltat沖hi
皿LYium.TAlO
OS
atmoneu
at沖hi
mu
ri
四lT
A
1535EscherichiacoliW
P2uv
r
A
SaL
moneu
at
yp
hi
1
1
11J.
riu
爪 T
A
98S
at
monguatyph閃iuriu
贋. TA
1537S.typhimu.
riumの 4菌株は 1
975年10月31日にアメリカ合衆国、から分与を受けた。

E.coliWP2uvr
A株は 1979年5月 9日にから分与を受けた。
検定菌は、 ‑80℃以下で凍結保存した。
試験に際して、 0.
5％塩化ナトリウム添加ニュートリエントプロス (Difco) を入れた L字型試験管に種菌を接種し、 37℃、 10時間往復振とう培委したものを検定菌液とした。

〔被験物質〕
4ーアミノ -5 ーヒドロキシ— 2,7ーナフタレンジスルホン酸モノナトリウム塩 (GAS No.

5460‑09‑3、以下 AHNSと略）は、分子量度87.
4％のもの（ロット番号：319.
31の淡褐色粉末である。純）をから供与された。被験物妥は、使用時まで室温で遮光して保存した。

AHNSは、ジメチルスル＊キシド（ロット番号： DSL5887、和光純薬、以下DMSOと略）を用いて 50昭／叫になるように調製した後、同溶媒で更に公比 2ないし 3で希釈したものを、速やかに試験に用いた。なお、詞製にあたって、純度換算は行わなかった。
試験の開始に先立って、秦野研究所において AHNSのOMSO溶液中での安定性試験を行った。本試験における最高瀑度 (50mg／叫）および最低濃度 (3mg/m￡) の 2‑3‑瀑度について、室温遮光条件下で実施した。その結果、調製後 3時間における各 3サンプルの平均含量は、それぞれ初窮値の平均(0時間）に対して、 96.
1および101％であった。これらの値は、当研究所の標準操作手順書の基準（初回の測定平均値の 90％以上）を満たしていた (Appendix1)。
また、本試験に用いた調製検体について、含量測定試駿を行った結果、 50mg／咸溶液の含量は既定濃度に対し、 98.4 101%、3.
125mg／咸溶液は、 103108％であった。これらの値も当研究所の標準揉作手順書の基準（平均含量は添加量の 85%以上）を満たしていた {Appendix2)。
以上の結果から、 AHNSはDMS
O溶液中では安定であり、また調製液中の被験物質の含量は所定の値の範囲内にあることが確認された。

（隔性対照物蛍〕
用いた陽性対照物質およびその溶媒は以下のとおりである。

AF‑
2:フリルフラマイド（上野製薬閥
n
ット番号 46,
SA :アジ化ナトリウム（和光純薬工業濶 nット番号 TL
N5556,
9‑A
A:9ーアミノアクリジン（東京化成工業閥 ロット番号 AM01,2‑A
A:2ーアミノアントラセン（和光純薬工業閥 n9卜番号 EDE7881,純度99.
9%)
純度＞90%)
純度＞98%)
純度＞90%)

AF‑2,9‑AA,2‑A
Aは DMSO （和光純薬工業閥ロット番号 DSL5887およびECJ7001)に、S
Aは蒸留水に溶解して試験に用いた。

（培地および S9混液の組成）

1) トップアガー (TA菌株用）
下記の水溶液 (A) および (B) を容量比 10:1の割合で混合した。
＊(A) 1\クト・ガ— (Difeo) 0.6%
塩化tトリウL

0.5%(B)L‑tスチジン 0.
5mM
ビオチン

0.5mM

*:WP2用には、 0.5mMLートリプトファン水溶液を用いた。
‑4‑2) 合成培地

培地は、日清製粉株式会社製の最少寒天培地（用萱設定試験においてはロット番号： DJ050GG,199
1年 7月 9日製造、本試験においては、ロット番号： DJ070JG,1991年 10月21日製造）を用いた。なお、培地 1g,あたりの組成は下記のとおりである。

硫酸マグネシウム・ 7水和物

0.2g

1Jン酸水素 7‘庄ニウムナトリウム •4水和物 3.5 g

ク
エン酸・1水和物

2g グm‑ス

20g

リン酸水素ニカリウム

10g

15g}
iク
ト・
アガー (Difco)

径 90D のシャーレ 1枚あたり 30誠を流して固めてある。

3) S9混液 (1叫中下記の成分を含む）**
S90.
1戒NADH4μmole

塩化マグネシウ L

8μmole

NADPH4μmole

塩化カリウム33μmoleグルコース •6 リン酸

5μmole0.2
M TJン酸緩衝液(pH7.4) 0.
5戒** :7週齢の Sprague‑Dawley系雄ラットをフェノバルビタール (PB)および 5 、 6—ベンゾフラポン (BF) の併用投与で酵素誘導して作製した S9（キッコーマン閥、ロット番号 RAA‑
258、 1991年 8月23日製造）を用いた。 PBおよびBFの投与量は 1日目 P
B30mg/k、g 2日目 P
B60mg/k、g 3日目 P
B60mg/kgおよび ~F 80mg/k、
g 4日目 P
B60mg/kgであり、いずれも腹腔内投与したものである。

〔試験方法〕
プレート法により直接試験および代謝活性化試験を行った。
小試験管中にトップアガー 2叫、被験物委調製液 0.
1戒、リン酸緩衝液 0.5m.
l（代謝活性化試験においては S9混液 0.
5叫）、検定菌液 0.
1mR,を混合したのち合成培地平板上に流して固めた。また、対照群として被禁物蛍詞製液の代わりに‑5‑

DMSO、または数種の隔性対照物妥溶液を用いた。各検定菌ごとの隔性対照物妥の名称および用量は表中に示した。培養は37℃で 48時間行い、生じた復帰変異コロニー数を算定した。用いた平板は用量設定試験においては、陰性および陽性対照群では3枚ずつ、各用量については 1枚ずつとした。また、本試験においては両対照群および各用量につき、3枚ずつを用い、それぞれその平均値と標準偏差を求めた。用量設定試験は 1回、本試験は同ー用量について 2回実施し、再現性の確認を行った。

（判定基準）
被験物質を含有する平板上における復帰変異コロニー数が、陰性対照のそれに比べて 2倍以上に増加し、かつ、その増加に再現性あるいは用量依存性が認められた場合に、当該被験物妥は本試験系において変異原性を有する（隔性）と判定することとした。

‑6‑

試験結果および考察

試験の全過程を通して、信頼性に悪影響を及ぼすおそれのある予期し涅なかった
事態および試験計画書からの逸脱はなかった。

〔用量設定試験）
結果を表 1に示した。 505000瞑／iv
ートの範囲で試験を実施したところ、すべての検定菌の直接試験および代謝活性化試験において抗菌性は認められなかった。
したがって、本試験における最高用量を、すぺての検定菌で、直接試験および代謝活性化試験ともに 5000pg／ブIr‑トとし、公比 2で 5用量を設定することとした。

（本試験〕結果を表 2、 3に示した。 AHNSについて 312.
55000殴／ivートの範囲で試験を実施した。

2回の試験を通して、用いた 5種類の検定菌の直接試験、代謝活性化試験のいずれにおいても、用量依存性のある変異コロニー数の増加は認められなかった。また、すべての検定菌において抗菌性は認められなかった。
用量設定試験において、 W
P2の最低用量、 50μg／九ートで陰性対照の 2倍以上の変異コロニーが認められたが、本試験では 2回とも、 W
P2において変異コロニー数の増加は認められなかった。以上から、 W
P2の用量設定試験における変異コロニー数の増加は偶発的なものと考えられた。

AHNSについて実施した試験において、陽性対照群では、いずれの検定菌においても変異コロニー数の増加が認められ、陰性対照群とも計測された変異コロニー数はヒストリカルコントロール値の範囲内であったことから、本試験に用いた各検定菌の感受性および各隔性対照物妥の変異原活性についての安定性が確認された。

‑7‑

以上の結果に基づき、 AHNSは、用いた試験系において変異原性を有しないもの（陰性）と判定した。

‑8-•

参考文献

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)ElsevierSciencePubli
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.1
61‑
187.

‑9‑

用量設定試験結果表

表 1
襴 ：4‑
アミノ‑5‑ヒドロキシ＆ 7‑J‑フタレンジス日オ萎匂ナトリウA裏体 s

検物

度

質 濃

塩の媒

対

照¥l潤(1381位士

一50検媒

対

照検対

置換

T
A
1
5354(121士
3 晶繋2) 1

コロニ→泣／プレート

異変型

フレームシフト型

ewrA↑2(111士
5fl)

T
Alお723（お お土望6)

7( 8士
7151，

161512150一13111151412500‑ 立315151551500

一B8121629，5000一1お

1510

10，

＼＋

138(
13914士
650＋

148

1
533

3
112

150＋

1291
51
130

13団O＋

1
お

12

1522，1咽＋

1
5912

1620

12団＋

1
1618

刃

14，

体

溶

基TAlOO佃卜） 有 無溶

帰復M‑91‑188

体

名称

陽 必要と 濃(99/九ート）

滋をlf。
）

11(15埜SA0.
5

既 0.
0
1

しないも性 の対 滋を

コ：
プレっート
名

669(66969土9翌。
）

306(31931
土3晶

16(151土7既0.
01晶

38(393
土6脱0.
1名）

10(11土，i!
7)

晶

叫 80

13
1 1
翌 問，） 556(56154
土8 詈詈8)(1395)1945四 203土2 翌8)

称九ート）
必要と 濃度（m／

叫 1

叫 2

759(79885士
7士
8図2) 汲8(24523

照 するもD
コ：
フレっート

叫

10姻
519(49850
土56.
1)

訥A0.
5

狐 20: 詈2)閃7) 196(18920士1 島 171(1822fI

表 釦 暉 ：4‑アミノ＋ヒドロキペ公 7ナフタレンジ』唇雌啓』息菖試験結果表体 躙ix

検物の塩佃ガレト） 有 無TAlO
O質 濃溶媒

対

照溶媒

対

照度

対

置変換祀習5)22(181
土7し56)

3
12.5

168(
16017
土6璧7)

26(17土8M‑91‑l88

コロニ→挽／プレート

異型

TA
1535146(131l'
士
Zl＿

フレームシフト型

A，(131士3TA98し65)

TAlお7214.6)(221土810(91士0ぶ）

625一144(13914土0閉。
）

13(151土4四一以(11711土5竪7)

16(12士8寧一136(13813土8誓。
）

18埜
(16晶 12(151士8 む） 26(~2士1 む 4( 5土6 1.
62)
士'
2晶 12(111士0 晶 20(202晶 8( 9土， 贔3(13士
151(14塁 晶 7よ10) 1t。
) 1( 7土8.
l55)
晶 8(121土7 晶 17(191土7 晶 6( 8土8 1.
95)

5000一133(14014土8閉5)

16(151土2ゼ3)

15(141土021i62)(1812 む 2(45 ぶ）

I¥

163(
13712士5嬰2)

15(121土3＆）

19(171
土945よ49)(424土5312.5 ＋

1$(
15515
土8＋

6251250体

検基

帰￨¥

体

検

復

2
500
5000

滋ixを＋＋＋t

149(1:ti13
土2
109(12915土6163（立10土9141(14014±5既 0.
0
1しないも対 滋をむ）

10(10土，}.
10)

46(3.
9'l土l晶4( 7土6晶嬰。
）

8(101土011L5)3l(151
土3l17)(302土5忽4)

8( 6土4;1)岳3)

7(111土2f2)

13(11土9晶 訂(26訂土冠6(71土02.
63)

嬰4)

15(12土，贔 12(141土321(263
土1ぎ。
）

7( 5土52.
25)

咀6) 13(121土6 ふ 12(121土2 晶 28(293土0門。
）

3(61土03.
65)

SA0.
5

蹴（お61土2

的7防(18419土441.l) 1

狐 1

叫 2コブ？
レート名t。
)

土ぶ）

称

名

陽 必要と 濃度 (99／九ート）

性 の129(151土5(141土5 晶 1舟6)

土既 0.
0
1

既 0.
1S4A80土8
恥 1泣(119哩 恥 796(78074311335土1l'詈。
） 刃 (303961.
11)

称

/九ート）
必要と 濃 （9g四ヽ•ヽヽ するもの
コフブ
しート

田1(1暉105土1 15鴎2.7) お1(2031土$

叫 10品 細（臨即土叫 0.5閉，）

463（打234土5糾A298（幻5磁士閏3) 119118.0)

復頌変異試験結果表I[ノナトリウ4量

表 3M‑91‑188

楓： 4-アミノ→—ヒト’ロキジ＆ 7‑+
フタレンジス心k

体 S9tix

検物の塩佃心） 有 無TAlOO度

質 濃溶

媒対照検¥媒対照lf2)

625一150(137四土1250一四2500一

曲5000一l38(138土E習5)¥＋155(15413土8晶体

晒を置

対21(161土5A↑A98＂

18(21土ゼ1)

t40)

z(292士8凶(253土1↑Al537開。
）

16(13士14贔ぎ7)

13( 9土？

3.
82)~2)lo)

23(242土95i
1(672)

土屯9)

14(172士0灼）

7{ 6土4L7)7む 勾(161土4 晶 17(212土3ぎ8)

8( 9土7晶

19(161土3贔 11(15塁t。
)

2(21泊土阿2)

6( 7土[7)15(16土8fS)

16(141土4•晶

33(32お土を。
）

14(131土3晶

B6(1311位
土6(141士4 晶
紺7) 118(171土7}:5)41(38土を5)8(141土8137:(181土8閉7) zfS)

21(171土5f2)

26(23ぉ土晶

10(111土0晶拐忠）

17(151土2閉5)

泌(161土5舟1)を3)

7( 8土7む）(111土4晶

15(171土8(13113士
3lfS}(1(013土410(131土1閉6)

息1)10(12土lD＋1250＋2500＋E6（以 1凹土閏。
）

11(12f。
)

15(16勾土晶

5000＋115（以12土8児2)勾(141土0晶

19(171土2t。
)（直12土4137（図13土8g

25('l13
土3'll(28泌
土26(24'土llr5)，，

む 14(141土2t55)

称

名

コ：ブレー
っト
名

コロー→知勺レート
フレームシフト型

祀p2)

異型

も 14(131土4 む 16(151士5翫 お(191土9 贔 16(121士3A
F
l0.
01~0.
5しないも91ixを対 S

換625

陽 必要と 濃度（ ／九ート）

性 の変↑Al蕊四312.5 ＋

検145(135土基

312.5 一体溶

159（以15土6一帰復653(67067土584(15915土4詈5) 1

APl0.
01A
F
20.
1

叫

80851693碑 263土8 2
7605.
81)
望5) 106(10610土5 陪6) 而 (80478土1 41.0)2

称

必要と 濃度 (9ヽ／九—卜）叫

1沿2照 するむD
コプ？
レート

1001( 29'土l
1町(l'rllf
土iO詈3) 1狐10士7毘7) 748（霞74糾A0.
5(20520土2笹5) 勾1汎A22r)
7 157(1821塁警5)