バイオフィルムとラクトフェリン（その１）安藤邦雄
半世紀前の筆者は新しい抗生物質を探索する研究者でした。抗生物質と言っても抗菌性抗生物質ではありません。抗ウイルス、抗ガン、免疫抑制などの活性を示す新しい抗生物質

H2N

SNOです。抗生物質と言えば抗菌性抗生物質を思い浮CH3かべますが、その頃でも、新しい系統の抗菌性抗CH3

生物質に巡り会うチャンスはほとんどなくなっていたからです。当時、ペニシリンおよびセファロ

COOH

スポリンなどのβラクタム系抗生物質とニューキ6－アミノペニシラン酸ノロン系合成抗菌剤の両系統は発展途上にありまS

H2N
ONしたが、これら二系統は効力と安全性の両面で圧OCOCH3
COOH

７－アミノセファロスポラン酸

図１．βラクタム系抗生物質の基本骨格倒的に優れていたからです。すでに実用化されていたテトラサイクリン系、マクロライド系およびアミノ配糖体系の抗生物質は、脇役として隅に押しやられてしまいました。1950 年代、一世を風靡したクロラムフェにコールに至っては、まったく使われなくなりました。
抗生物質捜しの活路は、新しい酵素阻害剤、抗ガン性あるいは免疫抑制性抗生物質の発見にあり、この面ではスタチン系化合物、マイトマイシン、アドリアマイシン、シクロスポリン A、タクロリムス、ミコフェノール酸等が発見され医療に貢献しています。特に、わが国で発見された HMG-CoA 還元酵素の阻害剤、スタチン系のコンパクチンは、血清総コレステロールを低下させる作用があり、リード化合物として医療に与えたインパクトは絶大でした。微生物代謝産

R2

R1

N

N

R3

物のなかに新しい生理活性を持ったリード化合物

Fを求める研究は、地味で労力の割に報われない仕事です。研究の 3K（汚い、きつい、厳しい）と言ったところでしょうか、米国や西欧ではほとんど放棄COOH
O

図２．ニューキノロン系抗菌剤の基本骨格されています。それでも細々と研究は続いており、日本の貢献が大きい分野です。人間の頭脳のはたらきには限界があります。X 線回折法によりタンパク質の活性部位にフィットする化学構造を割り出したところで、コンピューターが考えた化合物を有機化学の技法で合成できるとは限りません。さらに、合成できても、期待どおりの活性を示す保証もありません。やはりランダムスクリーニングで天然有機化合物のなかから生理活性物質を探索するほうが、特異性と活性の両面で優れたリード化合物が発見できるチャンスが多いからだろうと思います。

抗生物質の研究者だった当時、どう考えても解けない謎がありました。それは各種の病原菌に対し in vitro で圧倒的な抗菌活性を示す抗生物質が、なぜ医療現場の感染症に対し期待するほどの効果がないのだろうかと云うことです。医療現場で使われる抗生物質は、緑膿菌とか霊菌等の特殊な例外はありますが、ほとんどの病原菌の生育を 0.1～0.01 g/ml 以下で阻止します。患者に投与した際における抗生物質の血中濃度は、in vitro における最少阻止濃度をはるかに越えていますから、感染症で亡くなる方は大幅に減少するはずです。
しかし、今もって医療現場ではそうなっていないのです。この謎が解け始めたのはごく最近になってでした。免疫能が低下した人々に侵入して感染症を起こす日和見病原菌は、生体内でもバイオフィルムに包まれて生き長らえており、免疫的に排除できないばかりか抗生物質はほとんど効果がなくなることがわかったからです。それではバイオフィルムとは何でしょうか。
１．バイオフィルムとは自然界に棲息する微生物は、人工的な培地で生育させた場合のように浮遊した状態（planktonic cells）で生活しているのではありません。ほとんどの場合、粘質多糖のバイオフィルムで細胞を覆い何かの表面に付着して、粘質物の内部で数種の微生物と共同生活を営んでいます。表面とは何かというご質問があるでしょう。われわれの身体で云えば歯、口腔、鼻腔、気道、尿路、腸管などの粘膜、器物
では台所の流し台、水道管さらには自然界では川のなかの石塊等々、表面であれば何でもよいのです。図３にコンタクトレンズの表面に生じた緑膿菌バイオフィルムの電子顕微鏡写真を示します。菌体が糸状の粘質多糖にくるまれて図３．コンタクトレンズ表面に生じたバイオフィルムいるのか観察できます。ところで、これら表面には一つの共通点があります。どれをとっても微生物が付着しているという事実です。自然界では付着した微生物は単独で存在しているのではなく、特徴ある構造の中で、他の微生物と生活共同体「バイオフィルム」を形成しています。われわれの周りは種々の表面であふれていますから、そこには様々なバイオフィルムが見られます。このバイオフィルムは、人間に有益に働くかと思えば、逆に、慢性感染症を引き起こしたり、食品汚染の原因ともなります。バイオフィルムは、その普遍性ならびに重要性から近年関心が高まり、その科学的解明が急速に進んできました。このような普遍的な存在であるバイオフィルムを正しく理解するには、次の二つの側面でから微生物観を修正する必要があります。
1） 微生物はバイオフィルムに付着して生活している。
2） これら微生物は単独ではなく複数の種が共同体を形成している。

二つの事実を、われわれは先ずしっかりと認識し、そして、これら事実に基づいて、微生物に関してわれわれが知っていることを謙虚に振り返る必要があります。われわれはフラスコ中で微生物を液体培養し、その諸特性を知ることはできます。しかし、これら諸特性が付着状態にある微生物のものと同じであると確信できるでしょうか？あるいは、ある微生物が自分と同じ種に属する仲間と一緒にいる場合と、その微生物とは別種の微生物と共同生活を営む場合の挙動は、はたして同じでしょうか？バイオフィルムは、これまでの微生物学に根元的な問いかけを発している様に思えます。極論すれば、純粋培養された浮遊状態の微生物に関してわれわれが蓄えてきた知見は、付着し共同体を形成しているバイオフィルム中の微生物には通用しないかも知れないのです。
微生物の宝庫とされる土壌を例にとってみましょう。新規抗生物質の探索者達は、決まって土壌の微生物を分離し、それらが生産する代謝産物のなかに新規抗生物質を求めてきHOHOました。微生物による二次代謝産物の多様性
OH
OH

CH3HO

は目を見はるばかりで、合成抗菌剤の独壇場ON

OCH3CH3CH3CH3CH3と思われているキノロン系の抗菌物質さえ生産するほどなのです（1）。分離培地をいろいろに変え、極寒の南極、土壌の温度が100℃にも達する温泉地、極端な酸性とアルカリ性土壌、高圧の深海に至るまで、できるだけ多種の土壌を採取し、微生物の単離をこころみられてきました。しかし、今日では土壌の DNA 分析から人工培地に分離できた微生物は 1%にも満たなかったことがわかっています。苦心して分離した微生物が抗生物質の産生能を持っていても、三つに一つは人工

図４．フニクロシンの X 線回折像
上はフニクロシンの化学構造。下の図はクロシンが微細な針状結晶で X 線回折に不適当だったので、測定に適した結晶を得るため還元した。

培地上で継代できずに死滅するのです。したがって、混合したままで培養した方が、微生物が持っている潜在力を充分に活用できるかもしれないのです。筆者の乏しい経験でも培地に土壌を直接投入する混合培養の方が、土壌微生物を単離してから培養するより、抗菌物質の出現頻度がはるかに高く、多様性に富んでいました。
バイオフィルムはステンレスパイプさえ腐食させ、産業に甚大な被害を与えます。水道
水には微生物の栄養になる有機物は、ほとんど含まれていません。しかし、われわれが水道水は極端に栄養が乏しいと勝手に思い込んでいるだけで、自然界の多様な微生物のなかには水道水の含まれるミネラルを栄養源として増殖し、管壁にバイオフィルムをつくる微生物がいるのです。いったん、バイオフィルムが形成されると、他種の微生物も次々に粘着して相互に栄養物を分け合って共生するようになり、最終的には金属パイプさえ腐食さバイオフィルム感染症

強毒菌の感染症

日和見病原菌感染症
増殖

浮遊菌

侵入・増殖

浮遊菌せるほどの有機酸をつくるようになります。いわば、バイオフィル
ムは、微生物の自然状態における生活様式で、彼らにとって住み心地がよいアパートのようなもので増殖阻止

エスケープ環境好転

攻撃す。医療分野でもバイオフィルム
はペースメーカー、腎透析器、血死滅

管内カテーテル、副鼻腔、気道、球菌桿菌

バイオフィルム内
静かな増殖
感染防御系
抗菌剤

図５．強毒菌の感染症とバイオフィルム感染症との違い尿路、歯溝、舌面に形成され、難治性感染症の原因(2)になります。
とりわけ、体内に形成されたバイオフィルムは、病原菌が鎧を着ているようなものですから健康にとって脅威です。図 5 に強毒菌の感染症とバイオフィルム感染症とを対比して示しました。炭ソ菌、肺炎球菌など強毒菌の感染症は、感染防御系と抗菌剤により治癒させることができます。治癒すると感染症の記憶は残りますから、パスツールが定義したように再感染しても免疫系により迅速に排除されるので「感染症は二度ない」のです。ところが、バイオフィルム感染症の方は、何度でも感染症を繰り返し、終末像は敗血症とか多臓器不全です。いったん、体内に日和見病原菌のバイオフィルムが生ずると、手の施しようがないと思われるかもしれません。しかし、少なくとも二つの物質がバイオフィルム形成を阻害することがわかっています。そのうちの一つ LF は、バイオフィルム形成を阻害する重要な因子であることがわかってきました。

２．緑膿菌のバイオフィルムとラクトフェリン嚢胞性線維症（Csytic Fibrosis(CF)）は、白人に多発する遺伝性疾患で、米国では出生児のうち白人で 1/3,300，黒人で 1/15,300，そしてアジア人-米国人の混血では 1/32,000 の割合で発症する難病です。患者の 50％は肺症状を呈し，通常は再発性または慢性の肺感染により慢性の咳をともないます。患者の肺に感染する緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、肺にバイオフィルムをつくって定着します。Rogan 等(3)は緑膿菌が肺に感染している患者の喀痰は、LF を完全に断片化させるカテプシンを含むことを見いだしました。喀痰は LFを含んでいますが、緑膿菌が感染していない CF 患者の喀痰を in vitro でしらべると、緑膿菌が感染した CF 患者の喀痰より LF 濃度が高く（バイオフィルムの合成阻害能が強い）、感染している患者でも、増悪期の喀痰は沈静期と比べカテプシン活性が高く、LF 含量が低いことを報告しました。これは LF が緑膿菌によるバイオフィルム合成を直接阻止してことを示した最初の発見です。
シン等(4)は LF が緑膿菌によるバイオフィルム形成を阻害することを見いだしました。図６
Colony-forming units/ml

4 hr

24 hr

24 hrのように LF を培

108

地に 100 g/ml 添

106

加すれば増殖を阻Control
Lf 10 g/ml
Lf 30 g/ml
Lf 100 g/ml

104

止 し ま す が 、 30g/ml では緑膿菌

102
10

Lf 20 g/ml

4 hrの生育を阻害しま
1020304050Time (hr)

図６．LF による緑膿菌の増殖阻害せん。しかし、図７の右側に示すよ

3 days3 daysう に 緑 膿 菌 は20g/ml の LF 存

在すると、個々の細胞はせわしなく動き回りガ

7days

7 daysラス表面に薄い一層の膜をつくるだけで、対照のように時間の経過とともにキノコ型のバイオフィルムを成長させません。つまり、LF は緑膿

図７．LF 存在下における緑膿菌のバイオフィルム形成菌に対し殺菌的に作用することはないが、緑膿顕微鏡下に緑膿菌懸濁液を循環させ、液下に菌のバイオフィルム形成を阻害するのです。細

バイオフィルムが形成される様子を観察し菌、真菌および植物は、鉄が不足する環境ではた。右は対照、左は LF を 20g/ml 含む懸濁鉄キレーターを合成し、環境から鉄を集めよう液。右は 24 時間、3 日および 7 日と時間の経過にともに緑色のバイオフィルムが形成されとします。図８は鳥類における LF 相当蛋白であるが、LF 含有の懸濁液はバイオフィルムがるコンアルブミンと殺菌物質の相乗的な殺菌効形成されない。

果を示します。左図の○に示すように緑膿菌感染症に汎用されるトブラマイシンは、培地

に 1000 g/ml 添加されても生菌数はほとんど減少しません。この系にコンアルブミン 20g/ml を添加しても、トブラマイシン濃度が 100 g/ml 以上で生菌数を 1/100 程度に減らすだけです。ところが、40 g/ml のコンアルブミンと共存すると、トブラマイシンが 100 g/ml
で生菌数は 1/105、1000 mg/ml で 0 に減少させる強い殺菌効果を発揮するようになります。
また、単独では殺菌効果がない過酸化水素も、コンアルブミンが共存すると緑膿菌に対し強い殺菌効果を発揮します。つまり、緑膿菌はバイオフィルムを合成して身にまとえば抗菌剤に対し強い抵抗性を発揮するが、鉄のキレート作用がある LF あるいはコンアルブミンが存在すると、バイオフィルムを合成できなくなるのです。緑膿菌も独自の鉄キレーターを合成しますが、Log (colony-forming units)

9Greeberg 等(5)は鉄キ7

レーター生産能が変異5した緑膿菌を分離し、3鉄がバイオフィルム産生に必須であることを10証明しました。
010100

トブラマイシン(g/ml)
Conalbumin 20 g/ml

10000550500

過酸化水素(mM)

Mean ± SE. n=6Conalbumin 40 g/ml

図８．コンアルブミンとトブラマイシンおよび過酸化水素との相乗的な殺菌作用
コンアルブミンは卵白蛋白の 10%を占めるラクトフェリン・トランスフェリ

細菌がバイオフィルムを形成するには、増殖に必要とされる量を数倍上回る鉄が必要とされています。LF が細菌によるバイオフィン群に属するタンパク質で、ラクトフェリンの相当する鳥類の生体防御蛋白ル形成を阻害するのは、と考えられている。

強力な鉄キレーターである LF が微少環境からバイオフィルム形成に必要な鉄を奪うためであろうと思われます。
緑膿菌は免疫能が低下した患者に感染する代表的な病原菌です。鉄イオンを強力にキレートすることによる LF のバイオフィルム合成阻害効果は、免疫能低下により引き起こされる日和見感染症の治療と予防に大きな効果を発揮することが期待されます。
終わりにLF は驚くほど多岐にわたる作用を示します。筆者のように半世紀近く西洋医薬の研究開発に携わってきた者にとっても、これはにわかに信じ難いことです。それには二つの理由があるからではないかと思われます。一つはラクトフェリンが乳由来だと言うことです。
乳は単に栄養を充足するだけではなく、生理活性があります。育児用調製粉乳の組成が年ごとに母乳に近づいているにもかかわらず、母乳保育児と調製粉乳保育児とのあいだには、罹病率と死亡率で大差があります。ヒトの新生児は他の哺乳動物と比べ非常に未熟な状態で産まれてきます。母乳のラクトフェリンはカゼインに次いで多量に含まれるタンパク質

ですから、いろいろの生理活性を持っていても何ら不思議ではありません。
今一つの理由は、ラクトフェリンが鉄をはじめとし、銅などの遷移金属イオンを強くキレ
アレルギー感染症治療予防
ﾊﾞｲｵﾌｨﾙﾑ形成阻害

腸内整備

細胞性免疫優位へ誘導

ラクトフェリンの生理活性オピオイド増強だからです。鉄はヘモグロビン、ミエロパーオキシダーゼ、チトク

血管新生阻害

舌苔正常化

上皮細胞正常化

美肌・美容

異物認識
強化

ートするタンパク質

自己免疫

癌転移
動脈硬化
自己免疫

ロームＣなどの構成要素であり生存に必須ですが、繰り返し説明したように、遊離の遷移金属イオンは、毒酸化ストレス緩和

性が強いハイドロパ
癌治療

抗加齢眼疾患痴呆疼痛

精神障害

図９．ラクトフェリンの生理作用ーオキサイドを連鎖反応で生成させる触媒です。ラクトフェリンが、過剰にハイドロパーオキサイドが生成しないよう身体を護るはたらきを持っているのも当然です。
最近、Banin 等はキレート剤 EDTA が緑膿菌のバイオフィルム合成を LF と同様に阻害することを報告しました（6）。EDTA によるバイオフィルム合成阻害は、鉄イオンの他にカルシウムとマグネシウムの両イオンにより解除されるようです。バイオフィルムと慢性感染症に関する研究は、未だ始まったばかりです。筆者が 50 年前に抱いた疑問「抗生物質は各種の病原菌に対し in vitro で圧倒的な抗菌活性を示すが、なぜ現場の感染症に対し期待するほどの効果がないのだろう」に対する回答も間もなく得られるだろうと期待しています。

引用文献
(1)

Ando K, Matsuura I, Nawata Y, Endo H, Sasaki H, Okytomi T, Saehi T, Tamura G.
Funiculosin, a new antibiotic. II. Structure elucidation and antifungal activity.

J Antibiot (Tokyo). 1978; 31:533-8.
(2)Hentzer M, Givskov M.
Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterialinfections. J Clin Invest. 2003;112:1300-7. Review.
(3) Rogan MP, Taggart CC, Greene CM, Murphy PG, O'Neill SJ, McElvaney NG.
Loss of microbicidal activity and increased formation of biofilm due to decreased
lactoferrin activity in patients with cystic fibrosis.

J Infect Dis. 2004;190:1245-53.
(4) Singh PK, Parsek MR, Greenberg EP, Welsh MJ. A component of innate immunity
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(5) Banin E, Vasil ML, Greenberg EP. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm
formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 2;102(31):11076-81.
(6) Banin E, Brady KM, Greenberg EP.
Chelator-induced dispersal and killing of Pseudomonas aeruginosa cells in a biofilm.
Appl Environ Microbiol. 2006;72:2064-9.