分子マーカーから探る大脳新皮質の発生・進化におけるサブプレートニューロンの役割の解明
The role of subplate neurons in the development and evolution of the neocortex
explored by molecular markers（日本発生生物学会推薦）

代表研究者 公益財団法人東京都医学総合研究所 丸山 千秋
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
協同研究者 オックスフォード大学

Chiaki OHTAKA-MARUYAMA

ゾルタン モルナー The University of Oxford

Zoltan MOLNAR

How is the neocortical layered structure formed? For this elaborate structure to be created within the limited
developmental time of the fetal period, phenomena such as the neogenesis and migration of neurons and the formation ofneural circuits by axonal projections must proceed simultaneously and in synchrony. Subplate neurons (SpNs), the firstneurons to be born during cerebral development and disappear after birth, have been shown to control the timing ofmigration mode conversion of newborn neurons by their neural activity. We explore the function of the SP throughmolecular markers and consider which regulatory mechanisms were necessary during the neocortical evolution. The SPlayer is particularly thickened in primates and may have contributed to the development of complex brains. But why isthe primate SP layer so thick? The reasons for this are unclear. To tackle this question, we analysed Visium spatial gene
expression using common marmoset and human fetal brain sections. As a result, we have identified several candidate
genes that may contribute to the SP layer's expansion during evolution.

研究目的

るが、最近その神経活動が新生移動ニューロンの移

哺乳類の大脳新皮質は、後から生まれたニューロ動モード変換のタイミングを制御することが明らか

ンが先に生まれたニューロン層を乗り越えて上へ上になった。
（Ohtaka-Maruyama et al., Science, 2018)。サへと層を積み上げていく、いわゆるインサイドアウ

ブプレート層(SP 層)は SP ニューロンの他に豊富なトの 6 層構造を持つ。この極めて特異な脳構造の獲細胞外基質から成り、細胞の形態や移動モードの変得により哺乳類は膨大な数のニューロンを整然と配換のための様々なシグナルを移動ニューロンへ送っ置させ、高度な情報処理や創造性を持つヒト脳へのていることが予想される。SP 層もまた哺乳類独特の飛躍的な進化を遂げてきた。この大脳新皮質の層構構造であることから、大脳新皮質の発達にとって司造はどのようにしてできるのだろうか？胎児期とい令塔的な役割を果たしていることが示唆される。実う限られた発生時間のなかで、この精巧な構造がで際に SP ニューロンの減少率が少ないことと自閉症きるには、ニューロンの新生や移動、軸索投射によとの関連を示唆する報告もあり、SP ニューロンと精る神経回路形成等の現象が同時進行、かつ互いに同神疾患との関連も高いことが予想される。そこで本調して進行する必要がある。しかしながらその総合研究は、SP の機能を分子マーカーを通して探ること的な制御メカニズムは未解明のままである。サブプで、どのような制御機構が哺乳類大脳新皮質の構築レート(SP)ニューロンは大脳発生期において最初期過程およびその進化に重要であったのかを考察し、に誕生し、生後は消失する一過的なニューロンであ限定された時間軸の中で脳構築が正確に行われるメカニズムの解明を目的とする。SP ニューロンの分子ブリダイゼーション(ISH)法と、高感度の ISH 法であマーカーとしては、CTGF や Nurr1 等複数の遺伝子がる RNAScope 法を用いて発現細胞を詳細に確認し、サ知られているが 胎生期の SP ニューロンの分子マブタイプの同定を試みた。その結果 SP ニューロンにーカーはほとんど同定されていない。従ってまずはは分子発現パターンの特徴から７種類程度のサブタ

SP ニューロンの胎生期の分子マーカーを同定し、そイプが存在することがわかった。

れを手がかりに発生・進化的起源について解析を進めていく。また、霊長類脳では特に胎児期に SP 層がマウスに比べて厚く発達していることが知られている。この SP 層拡大の脳進化における意義とは何か？
また、なぜヒトは脳進化のトレードオフとして精神疾患のリスクを背負ったのか？これらの謎を解くた
めにも霊長類脳における SP 層に特異的に発現している遺伝子の同定も進める。
研究経過① シングルセル RNA シーケンスによる SP ニューロンのサブポピュレーションの同定

SP ニューロンは、分子マーカーの発現パターンからサブポピュレーションの存在が示唆されていた。
しかし明確なグループ分けはされていない。そこで、

図 1 マウス胎生 17 日大脳の SP ニューロンから同定した分子マーカー遺伝子
Fig.1 Molecular marker genes identified from SP
neuronsof mouse E17 cortex

SP ニューロンをシングルセルに単離し各細胞でのRNA シーケンスを行うことで、サブポピュレーションの分子レベルでの特徴を明確にする。SP の一部が② 脳進化におけるサブプレート層の発達と分子メカニズム解明

蛍光標識された Tg マウス(Lpar1-EGFP)の胚脳を用SP 層は全ての哺乳類脳に存在するが、特に霊長類いた。また、D1B-Cre-ERT2 マウスを td-Tomato のリ

では肥厚化し、複雑脳への進化・発達に寄与した可ポーター系統（Ai14）と交配し、胎生 10 日目でタモ能性がある。そこで、マウスに比べ、なぜ霊長類脳キシフェン投与することで SP ニューロンの一部がでは SP 層が厚いのか、そのメカニズムと精神疾患とTomato 陽性になる。これらの標識 SP 細胞を FACS での関連を調べるために、コモンマーモセットとヒトソーティングして単離した。シングルセル解析は、の胎児脳切片を用いて Visium 空間的遺伝子発現解フリューダイム C1 システムで一度に 800 細胞まで析を行った。同時に既存のシングルセル解析データ解析可能である。得られたデータを解析し、分子のも用いて霊長類のサブプレートに高発現している遺発現によるグループ分けを行った。Zoltan Molnar 研

伝子の同定を試みた。その結果、転写因子 ST18、レで以前に得られている、切り出した SP 層でのプロフチノイン酸分解酵素 CYP26A1、およびヒアルロン酸ァイリングデータも用いて今回のデータと比較検討

合成酵素 HAS3 等の候補遺伝子が同定できた。いずれした。さらに、以前得られている Visium 空間的遺伝もマウスのサブプレートではほとんど発現していな

子発現解析の E17 脳切片のデータとの統合解析も行いのに対し、マーモセットとヒトのサブプレートでなった。その結果、SP 層で発現し、胎生期の SP 層マは発現が見られた。ST18 についてはマウスの SP 層ーカーとなり得る候補遺伝子が複数同定できた。そで強制発現させることで SP 層の構築に何かしらのの結果、最終的に 33 遺伝子が候補として同定できた。 影響を与えるかどうかを確認するために E10 において子宮内電気穿孔法を用いて早生まれの SP ニュー
そのうち 1 遺伝子は Molnar 研で以前同定された遺伝子であったが、残りは新規に同定された遺伝子でロンに ST18 を過剰発現させた。
E18 にて脳を回収し、あった。また、候補遺伝子のうち 8 遺伝子は自閉症

サブプレート層構築への影響を解析した。その結果、関連遺伝子として報告されている遺伝子であった。

ST18 過剰発現脳では、E10 で標識されるサブプレー

これらの候補遺伝子について、従来の in situ ハイトニューロンが、コントロールと比べて、接着性が増したような細胞塊状になっている様子が観察でき中央付近の細胞密度の高い細胞層で CYP26A1 遺伝子た。また、Cyp26A1 遺伝子については、サブプレートが特異的に高発現していることを見出した。レチノの中でも特に細胞密度の濃い一過性に現れるバンドイン酸は脳表付近の髄膜細胞あたりに局在し、その状の薄い細胞層(Cell Dense Band)に強く発現して付近の細胞によって産生されているという報告はあいることが明らかとなった。Cyp26A1 遺伝子はレチるが、分解酵素についての局在の報告はこれまでなノイン酸分解酵素をコードする遺伝子で、SP 層の中かった。今回 Visium 解析によりヒト胎児脳でも SP央にこの酵素が発現していることで、ヒト（霊長類）層で高発現していることがわかった。さらにマーモ

大脳皮質の頂底軸に沿ってレチノイン酸の濃度勾配

セット胎児脳でも、ヒトよりは低レベルではあるが、が存在する可能性が示唆された。

SP 層で特異的発現が見られた。それに対しマウス脳では CYP26A1 遺伝子の SP 層での発現は見られない。

考察

この解析結果は、霊長類脳においては、前後軸のみ以上のような解析から得られた結果から、まず、ならず、脳表から脳室帯への頂底軸方向にもレチノ

SP ニューロンは胎生期でも複数のサブタイプが存在イン酸の濃度勾配が存在し、それが SP 層拡大とそれし、おそらく何かしらの機能分担を行なっているこに伴う大脳新皮質の発達に寄与した可能性を示唆しとが予想された。例えば、胎生中期に盛んに行われている。そしてこの SP 層の拡大こそ、哺乳類の中でている放射状神経細胞移動においてその移動モードも進化の過程で、爆発的な大脳新皮質のニューロン変換を促すためにシナプス伝達を行なっている SP層の発達が起こった霊長類、さらにはヒト脳への進ニューロン、視床から大脳皮質に進入してくる軸索化に重要な役割を果たしたのではないかと考えるこ（TCA）が最初にシナプスを形成する SP ニューロン、とができる。今後は、大脳新皮質の層構造においてまた生後も残存して生体脳神経回路に組み込まれてレチノイン酸の濃度勾配が実際に存在するのかどう機能する SP ニューロンといった、グループごとに異かについて、質量分析イメージング（MALDI イメーなる役割を持つサブタイプに分かれている可能性がジング）等の手法を用いて解析を行う予定である。

ある。これを確かめるためにも、各サブタイプのマそして、もし濃度勾配があるとわかった場合には、ーカー遺伝子を用いて遺伝子改変マウスを作製してそれをマウス脳に適用した場合に SP 層の肥厚化がその影響を解析するといった実験が今後必要となる。 起こるのか、また、大脳新皮質の層構造の構築にど次に、霊長類での SP 層拡大化に関与した分子メカのような影響があるのかについて解析を進める。

ニズムの解明に関しては、転写因子 ST18 が有力な候補遺伝子として同定された。マウスの SP ニューロン

以上のような解析を進めることにより、SP 層の進での ST18 の過剰発現脳では、SP 層の拡大とも取れ化の分子機構について理解を深めることで、脳構築る表現型が観察できた。この結果は、脳進化の過程の原理を理解し、その知見をもとに、将来的には自で、ST18 が転写因子として発生期の霊長類脳の SP ニ

閉症等の精神疾患発症のメカニズムの理解に繋げてューロンを発現するようになり、それが SP ニューロいきたいと考えている。

ンの増殖または挙動に何かしらの影響を与えた可能性が示唆される。今後は、本転写因子の下流標的遺研究の発表

伝子を同定し、霊長類 SP 層の拡大の分子メカニズム

口頭発表
1. Ohtaka-Maruyama C 「Role of subplate neurons
in neocortical development and evolution」CorticalDevelopment Conference 2022「Neural Stem Cells
to Neural Circuits」2022 年 5 月 30 日,Milazzo,シチリア島,イタリア
2. Ohtaka-Maruyama C,「Identification of embryonicmolecular markers of mouse subplate neurons andsearch for their developmental origins」第 45 回日本神経科学大会 (NEURO2022)「Formation ofthe earliest cortical neuronal circuits orchestrated
by subplate neural activity」シンポジウム「サブを解明してゆきたい。一方 Cyp26A1 遺伝子は、レチノイン酸を分解する活性を持つ酵素をコードする遺伝子である。これまでの報告で、霊長類の前頭葉ではレチノイン酸濃度が高く、前後軸に沿って後方に行くほど低いという濃度勾配があることが報告されている。しかしマウスでは濃度勾配がほとんどない。
このことから、霊長類、特にヒトにおける前頭葉の発達にはレチノイン酸シグナルが関与していることが示唆されている。今回我々の解析により、SP 層のプレート神経活動のダイナミズムによる脳神経回路の発達機」2022 年 6 月 30 日 沖縄コンベンションセンター
3. Ohtaka-Maruyama C,「Analysis of thedevelopmental and evolutionary origins of SpNs
and their role in cerebral development」
International Symposium on Neural Developmentand Diseases(新学術領域研究「発生時計と場の連携」2023 国際シンポジウム) 2023 年 3 月
16 日 京都大学医学部芝蘭会館
誌上発表
1. Hara Y, Kumamoto T, Yoshizawa-Sugata N, Hirai
K, Song X, Kawaji H, Ohtaka-Maruyama C.
Spatial transcriptome of developmental mousebrain reveals temporal dynamics of gene
expressions and heterogeneity of the claustrum
bioRxiv (2023) DOI:
https://doi.org/10.1101/2023.04.12.536360
2. Hirai S, Miwa H, Shimbo H, Nakajima K, Kondo
M, Tanaka T, Ohtaka-Maruyama C, Hirai S,Okado H. The mouse model of intellectual
disability by ZBTB18/RP58 haploinsufficiency
shows cognitive dysfunction with synaptic
impairment. Mol Psychiatry, (2023) Feb 1. DOI:
10.1038/s41380-023-01941-3
3. Kaneko N, Hirai K, Oshima M, Yura K, Hattori
M, Maeda N, Ohtaka-Maruyama C. ADAMTS2
regulates radial neuronal migration by activating
TGF-b signaling at the subplate layer. of thedeveloping neocortex bioRxiv (2022)
DOI:https://doi.org/10.1101/2022.08.07.502954
4. Takigawa-Imamura H, Hirano S, Watanabe C,
Ohtaka-Maruyama C, Ema M, Mizutani K.
Computational Model Exploring Characteristic
Pattern Regulation in Periventricular Vessels. Life,12, 2069 (2022) DOI: 10.3390/life12122069
5. Kumamoto T, Ohtaka-Maruyama C. Visualizing
Cortical Development and Evolution: A Toolkit
Update Front Neurosci., 16,876406 (2022) DOI:
10.3389/fnins.2022.876406