高等植物 の液胞 へ の レセ プター依存的な選男1輸 送機構
Receptor― Dependent Vacuolar Sorting Mechanism

in Higher Plants(日 本植 物 生理 学会 推薦 )研究代表者

共 同研究者

京都 大学 大学院 理学研 究科

西村 い く こ

町 OtO Univcrsi″ しGraduatc School of Scicnce

lkuko Hara‐ Nishimura

京都 大学 大学院 理 学研 究科知生

嶋田

Kyoto l」 nivcrsity Graduatc School of Scicncc

京都 大学 大 学院理 学研 究科

ll l田

Kyoto Univcrsitt Graduatc School ofScicncc

Tomoo Shilnada

健志Kcnii Yalnada

研 究 目的登熟期 の種子 は多量 の種子 タ ンパ ク質 を粗面小胞 体で合成 し,タ ンパ ク質蓄
積型 の液胞 に蓄積す る。私達 は ,種 子 タ ンパ ク質 の細胞 内輸送 に 関 わ る新規の小胞 を発 見 し,PAC小 胞 (PrecursOr一 accunltllating vesicles)と 命名 した.

PAC小 胞 は直径約 300 500 nmで ,既 知 の被覆小胞 に比 べ て非常 に大 きい。一般 的に,粗 面小胞体 で合 成 され たタ ンパ ク質は ゴル ジ体 へ運 ばれ た後 に選別され ,液 胞 (動 物細胞 では リソソー ム)へ 輸送 され るか細胞外 へ 分泌 され るとされて い る。 しか し PAC小 胞 を介す るタ ンパ ク質 の輸送経路 は ,ゴ ル ジ体を経 由 しない とい う点 で全 く新 しい輸送系 か らな る。大量 の タンパ ク質 を効
率 よく液胞 へ 輸送す る系 として植物種子 が獲得 して きた機構 と考 え られ る。
本研 究課題では ,こ の新規 の経路 を中心 とした タ ンパ ク質 の集積・ 輸送 の ための分子機構 の解 明を 目指 した。
登熟期 の種子 か ら得 られ た精製度 の高 い PAC小 胞標 品か らユニー クな構 造

The seeds ofhigher plants accullnlllatc large quantitics of storagc

protein,Dllring seed lnaturation,storage protein precllrsors synthesizedon rough endoplasmic reticulum arc sorted to protein storagc vacuoles,
whcrc they are converted into the inature forms and accumulated.
Prcvious attcmpts to dctcrlninc thc sorting machinclγ

for storagc

proteins have not been successi11.Herc we show that a type I

membranc protein,AtVSR1/AtELR of∠ ″ bidΨSお i
sorting receptor lor storage proteins.The

tions as aαsorts"srf mutant rnis―
StOFage proteins by sccreting them froln cells,rcsulting in an cnlargcd
and electron… dense extraccllular space in the seeds.α ttsrf Seeds havedistorted cclls and smdlcr protcin storage vacuoles than do wild―

typesccds.The α卜s″ /seeds abno.11.ally accumulatc the prectlrsors of加 omttOr StOrage proteins,12S globulin and 2S albumin,togethcr with thc
mature fo.11ls ofthese proteins.AtVSRl was found to bind to theC― te.1..inal peptide of 12S globulin in a Ca2+̲dependent marme■ Theseflndings dcmonstrate a rcccptor― rnediated transport of sccd storage
proteins to protcin storage vacuoles in higher plants.

を持 つた膜 タ ンパ ク質 を見 出 し,PV72と 命名 した。本研 究では,PV72の 貯蔵タ ンパ ク質 の選別輸送 レセプ ター として の機能 を分子 レベ ルで 明 らかに し,

PAC小 胞 に よる新規 の輸送 システムの実体 を明 らかにす る こ とを 目標 とした。
これ まで に,貯 蔵 タ ンパ ク質 の レセ プ ター に関す る報告 は皆無 であ り,PV72のホモ ロ グは酵母や動物 には見 出 されて い な い ことか ら,細 胞 内タ ンパ ク質
輸送機構 の研 究 に新展開が期待 され る.

研究経 過PV72の 特異抗体 を用 い た解析 か ら,PV72は 登熟期 の種子 に特異的 に発現 し,栄養器 官 には発現 してい ない ことが分 かつた .ま た ,高 圧凍結 ・ 凍結置換法を用 いた免疫電子顕微鏡観 察 よ り,PV72が 貯蔵 タ ンパ ク質 の前駆体 を多量 に含む PAC小 胞 の膜上に存在す る ことを明 らかに した。 この結果 は ,PV72が 種
子貯蔵 タ ンパ ク質 の細胞 内輸送 と深 く関連 してい る ことを示 してい る.

PV72は ,EGF(Epidermal growth factor)様 配列 を含む約 60 kDの ルー メン ドメイ ン,膜 貫通 ドメイ ン,細 胞質 ドメイ ンの 3つ の ドメイ ンか ら構成 されて い る.PV72の ルー メ ン ドメイ ンは小胞 内腔 で リガ ン ドとの結合 ・ 解離 を
担 い ,一 方 ,細 胞質 ドメイ ンは小胞 の 出芽や ター ゲ ッ トオル ガネ ラヘ の融合に関与 してい ると考 え られ る。そ こで ,PV72の ルー メ ン ドメイ ン及 びその EGF
様配列欠失変異体 を昆 虫細胞で大量発 現 させ ,貯 蔵 タ ンパ ク質 2S albumin前駆体 由来 のペ プチ ドとの結合・ 解離様 式 を生体分子間相 互 作用解析装置及 びア フ ィニ テ ィカ ラム ク ロマ トグラフィで詳細 に解析 した。その結果 ,生 体 内で PV72が 貯蔵 タ ンパ ク質 の レセ プ ター として機 能す るのに十分 な親和性 を示す ことが分 かつた.

上記 の PV72と 2S albumin前 駆体 由来 のペ プチ ドとの結合・ 解離 がカル シ

ウムイオ ンよつて制御 されて い るこ とを示す こ とがで きた .一 般 的 に,細 胞内 の選別輸送 レセ プター とリガ ン ドとの結合・ 解離 は コ ンパー トメ ン トの pHに依存 してい る と言 われて いたが ,今 回 の成果 は ,pHの 非依存 生 を示す とともに ,カ ル シ ウム に よる新 規 の制御 系 の存在 を明 らかにす るもので あ る。
一 方 ,PV72の 細胞質側 のチ ロシンモチー フにはアダプチ ンを介 して クラスリンが結合す る可能性 が示 唆 されたが ,特 異抗体 を用 い た解析 では ,PV72の細胞質側 の 同モ チ ー フにはア ダプチ ンや クラス リンは結合 していない こ とが分 かった。即 ち,PV72を 介 した選別輸送 には既知 の もの とは異 な る機構 が働いてい る と考 え られ る。

PV72の 細胞内 での機能 を明 らかにす る 目的で ,PV72の ルー メ ン ドメイ ンに小胞体残留 シグナル を付加 した融合 タ ンパ ク質 を大量発 現 させ た形 質転換 シロイヌナ ズナ を作製 した。 このシ ロイヌナ ズナ の葉 の細胞 では ,小 胞体 内に液胞 タ ンパ ク質 の前駆体 を蓄積す るこ とが分 かつた。即 ち,PV72は 液胞 タン
パ ク質 の前駆 体 を小胞体 か ら液胞 へ 輸送す る とい う働 きを持 つ ことが 明 らかにな つた。

PV72の 生理機能 を in vivoで 証明す る 目的 で ,全 ゲ ノム配列 が決定 され てい るシ ロイ ヌナ ズナ を用 いた 逆遺伝学的手法 を取 り入れ た。シ ロイヌナ ズナには PV72の ホモ ロ グが 7種 類存在 していた。(こ れ らの遺伝子 を Иικ溜 ン と命名 した ).こ れ らの遺伝子 に T― IINAが 挿入 され た変異体 の選抜 を行 い ,7種類 の Иι'V遺伝子破壊株 を得 た。それ らの AtVSR欠 損変異体 の種子貯蔵 タ ン

パ ク質 の分子種 を調 べ た ところ,AtVSRl欠 損株 の種子 の みが貯蔵 タ ンパ ク質の前駆体 を細胞外 に蓄積 していた。 この結果 は ,AtVSRlが 登熟期 の種子 の細胞 にお いて 貯蔵 タ ンパ ク質 の前駆体 を液胞 へ 選別輸送す るため の レセ プ ター
胞 よ り見出 した膜 タ ンパ
であ る こ とが示 してい る.以 上 の結果 か ら,PACだ ヽ
ク質 PV72が 液胞輸送 レセプ ター として機 能 してい る こ とが証明 された.

考察胞 の発本研 究 の動機 は ,種 子貯蔵 タ ンパ ク質 の液胞 へ の輸送 に関わ る PACガ ヽ
胞依存的な タ ンパ ク質 の輸送経路 は これ までに知 ら
見 であ つ た。 この PAC月 ヽ
れて い る液胞輸送経路 とは全 く異 な るシ ステ ム であ る点で非常 に興味深 い.

PAC小 胞 (PrecursOr accumulating vesicles)は ,そ の名 前 の通 り,貯 蔵 タ
ンパ ク質 の前駆体分子 を多量 に蓄積 してい る小胞であるが ,そ の膜上 に ,貯蔵 タ ンパ ク質 2S albumin前 駆体 と親和性 を示す膜 タ ンパ ク質 を見出 した ことが ,本 研 究 の端緒 とな つてい る。本研究 では ,こ の膜 タンパ ク質 の選別輸送
レセ プ ター として の機能 を分子 レベ ル で明 らかに し,PAC月 ヽ胞 に よる新規 の輸 送 システムの実体 を明 らかにす る ことがで きた 。
高等植 物 の種子 は ,限 られた時期 に ,限 られ た種類 の貯蔵 タ ンパ ク質 を多量 に合成 し,タ ンパ ク質蓄積型 の液胞 に蓄積す る。液胞 タ ンパ ク質 の細胞 内輸送機構 の研 究は これ までに も盛 んにな され て きた が ,従 来 の研 究は酵母 の
液胞 タ ンパ ク質や動物 の リソソー ム タ ンパ ク質 の輸送 系な どのアナ ロジーから進 め られて きた ものが殆 どである.貯 蔵 タ ンパ ク質 の輸送 レセ プターの報
告 は本研 究 が 最初 である.今 回 の レセプ ター の研 究 は,植 物細胞 の選別輸送
システ ムの解明 のための重要 な鍵 とな る.PAC小 胞依存的 な輸送 システ ム は,大量 の タ ンパ ク質 を効率 よ く液胞 へ 輸送す る系 として高等植 物種子 が獲得 して きた機構 と考 え られ る。 この新規 の液胞選別輸送 システ ムの全貌 を分子 レベ ル で解 く鍵 が本研究 に よつて得 られ た。

研究発表
口頭発表
渡辺悦子 ,鳴 田知生 ,黒 柳美和 ,田 村謙太郎 ,西 村幹夫 ,西 村 い くこ :液 胞輸送 レセ プ ターPV72の 過剰発現 シ ロイ ヌナ ズナの解析 。 日本植物生理学会年会 ,岡 山,2002年 3月
片岡未裕希 ,嶋 田知生 ,山 田健志 ,西 村幹夫 ,西 村 い く こ :種 子貯蔵 タ ンパ
ク質 のプ ロセ シ ングに異常 を示す シ ロイ ヌナ ズナ変具体 の解析 .日 本植物生理学会年会 ,岡 山,2002年 3月
西村 い くこ,嶋 田知生 ,松 島良 :高 等植物 の細胞 内膜系 の機能分化 , 日本植物学会大会 シンポジ ウム 細胞 の 中を観 て生 存戦略 を探 る",京 都 ,2002
年 9月(オ ーガナ イザ ー )嶋 田知生 ,李 立新 ,河 本恭子 ,近 藤真紀 ,西 村幹夫 ,西 村 い く こ :種 子貯蔵
タンパ ク質 の前駆体 を蓄積す るシ ロイヌナ ズナ変 具体 の 単離 と解析 , 日本植物学会大会 ,京 都 ,2002年 9月
冨 士健太郎 ,嶋 田知生 ,近 藤真紀 ,西 村幹夫 ,西 村 い く こ :液 胞 タ ンパ ク質の選別輸送 に関わ る レセ プターの遺伝子破壊株 の解析 , 日本植物学会大会 ,京 都 ,2002年 9月
林博 士 ,河 本恭子 ,嶋 田知生 ,林 誠 ,西 村幹夫 ,西 村 い く こ :小 胞体 由来 の新規輸送小胞 の 単離 とプ ロテオ ーム解析 .日 本植 物学会大会 ,京 都 ,2002年 9月
西村 い く こ,鳴 田知生 ,松 島良 :細 胞 内膜 系 の分化 と多様性 , 日本分子生物学会 ワー クシ ョ ップ ,横 浜 ,2002年 12月(招 待講演 )Hara― Nishimura,I.,R.Matsushima,K.Yamada,E.Watanabe,T.Shilnada,YHayashi and NII.Nishimura:ER― derived organelles ill higher plants.Plant

endomeコ obranes:Blogenesis,trafrlc a,d dynamics,Oct.2001 Shonan,Japan.
(招 待 講 演 )Shimada,T,E.Watanabe,Y Hayashi,M.Nishimura and I.Hara¨ Nishimura:PV72
色腱ctions as a sorting receptor for pro2S albumin im pumpkin seeds.P二 ant

endomeIILbranes:Blogenesis,trafrlc and dynanlics,Oct.2001 Shonan,Japan.
(招 待 講 演 )Nishimura,M.,N.

litsuhashi and I.Hara¨ Nishimura:PAC― vesiclc mediatedtransport of storage proteins and membrane proteins to protc菫

l StOrage vacuolcs.

Plant endomeIIlbranes:Blogellesis,trafflc and dynalnics,Oct.2001 Shonan,
Japan。

(招 待 講 演 )Watanabe,E.,T Shimada,卜 1.Kuroyanagi,M.Nishimura and I.Hara¨ Nishillnllra:
Calcium‐ mediated association ofa sorting reccptor(PV72)and a StOrageprotein.Plallt endomembranes:Blogenesis,trafrlc and dyllamics,Oct.2001Shonall,Japan.
I.NiShimura and I.Hara‐ Nishilllura:

Watanabe,E.,T Shimada,NII.Kuroyanagi,Calciuln‑lnediated association ofa putative vacuolar sorting receptor PV72 witha propeptide of2S albmin.Plant Biology 2002,August 2002,Colorado,USA.
Hara― Nishimura,1.,Watanabe,E。 ,■ Shimada,M.Kuroyanagi,and M.Nishimura:
Calciuln‐ mediated association ofa propeptide of2S albunlin with a putativevacuolar sorting receptor PV72 found in thc lnembrane ofthe PAC vesicles.

Millisymposium ̀̀Membrane Trarlcking"Phllt Blology 2002,August2002,Colorado,USA。

(招 待 講 演 )誌 上発 表1.PIlitsuhashi,N.,Y Hayashi,■ l Koumolo,η R ShiIElada,lR Fukasawa‐ Akada,Pl.

Nishimura and I.Hara― Nishimura。 (2001)A novel membrane protein thatis transported to protein¨ storage vacuoles via precursor― accumulating vcsicles.

Plallt Cell,13,2361‑2372.

6

2.Yanlada,KI,Ro MIatsushima,M.Nishimura and I.Hara¨ Nishimura.(2001)A
slow lnaturation ofa cysteine protease with aεranulin domain in the vacuoles

ofsenescing Arabidopsis ieaves.Plant Physiol.,127,1626‐ 1634.

3.Kuroyanagi,M。 ,Mo Nishimura and I.Hara‐ Nishimura。 ● 002)Activation of
Arabidopsis vacuolar pЮ ccssing enzyme by self― catalytic removal ofan
auto‐ inhibitory domain ofthe C‐ terlninal propcptide.Plant Cell Physiol。

,43,

143‑151.
4.ShiIIlada,■ 1,Eo Watanabe,■ ■Tamura,lι IIayashi,Mo NishiIIlura and I.
Hara‐ Nishimura。 (2002)A vacuolar sorting receptor PV72 on the membraneofvesicles that acculnultte precursors ofseed storage protcins(PAC vesiclcs).

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5 Watanabe,E.,]R Shilnada,M.Kuroyallagi,Mo Nishilnura alld I.
eHara‐ Nishimura。 (2002)Calcitlm̲mediated association of a putat

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Chem。 ,277,8708‑8715.

6.Shilnada,]R,Itt Yamada,]4.Kataoka,S.Nakaulle,Y Koumoto,】.

Kuroyanagi,S.Tabata,]R Kato,K.Shinozaki,PI.Seki,Ⅳ I.Kobayashi,Ⅳ l.
Kondo,M.Nishimura and I.Hara― Nishimura。 (2003)Vacu01ar processinge̲es are esselltial for proper processlng ofseed storage proteins in
αJjα 4α .J:Blol.Chem。 ,278,32292‑32299.

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