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浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）＜平成 21 年度助成＞

iPS 細胞を用いた食品由来の脱メチル化化合物探索システムの開発福田智一（東北大学大学院農学研究科）

1.

緒

れ、遺伝子発現の低下を招いている。このような言

ゲノムにおけるメチル化の亢進は、細胞増殖を低近年、様々な食品由来の機能性物質が注目を浴びている。一例では赤ワインやピーナッツの皮に下させる腫瘍抑制遺伝子の発現の低下を招き、細胞をがん化に導くと考えられている。

多く含まれるレスベラトロールは寿命の延長、抗近年、ゲノムの脱メチル化を誘導する薬剤が炎症、抗腫瘍効果があるといわれている。このよ開発され、脱メチル化剤と呼ばれている。脱メ

うに食品中には様々な生物活性を持つ天然化合物チル化剤の代表的なものに 5 -aza-deoxycytosineが豊富に存在すると考えられるが効率的に機能を（5 -aza-dC）が挙げられる。この薬剤は多発性骨アッセイする方法がないために、様々な活性物質髄腫に対する抗癌剤として米国で認可されておりを見いだすことが難しい。

（Balch et al., 2 005）、我が国においても有用な抗一方、近年のがんの分子遺伝学的研究の発展は癌剤候補剤である。従って、このゲノムの脱メチ目覚ましいものがあり、細胞ががん化するとゲノル化活性を効率的に探索することが可能となれ

ムの多くの部位でメチル化が亢進することが明ら

ば、抗癌剤のための新規化合物を獲得できると考かになった。ゲノムのメチル化は主に、遺伝子のえられる（図 1 参照）。

発現を調節するプロモーター部位において認めら

図1

我々は近年開発された人工多能性幹細胞（ iPS

本研究の戦略iPS 細胞を用いた食品由来の脱メチル化化合物探索システムの開発

27細胞）の高いゲノムのメチル化能力に着目した。

児由来線維芽細胞を得た。胎児由来線維芽細胞

iPS 細胞へ外来遺伝子を導入すると高頻度にそのは 10 %のウシ胎児血清（FCS）および抗生物質を発現制御領域であるプロモーターがメチル化によ添加した DMEM 細胞培養培地を使用し、37 ℃,り不活性化される（ Nakagawa at al., 2 008）。その5 % CO2 の条件で培養を行った。樹立された初代

不活性化した遺伝子発現を脱メチル化作用によっ培養細胞は液体窒素中に保存し、実験に使用するて発現を回復させる作用のある薬剤を探索すれまで保存を行った。

ば、抗癌剤のシーズ化合物になり得ると考えた。

京都大学の山中伸弥教授の研究グループより、特に我が国において、食品を含めた様々な天然物マウス由来の K l f 4, c-myc, Sox 2 遺伝子を発現す由来の化合物から医薬品のシーズとなる化合物がる pMX ベクターを基本骨格とした組み換えレトロ見いだされている歴史がある。

ウィルスベクターを得た。iPS 細胞を樹立する上で本研究ではマウス由来の胎児性線維芽細胞から最も重要な転写因子とされる Oct 3 に関して、カイ蛍光蛋白質マーカーを導入した iPS 細胞を樹立しアシ由来の蛍光蛋白質である copGFP と融合タン

たこと、脱メチル化を検出する上で効率的な分化パク質を発現するよう、cDNA 配列を化学合成し誘導させるため、無フィーダー状態での維持に成た。この合成遺伝子はマウス由来 Oct 3 と copGFP

功したこと、脱メチル化薬剤の陽性対象物質であのタンパク質の翻訳フレームが連結されており、

る 5 -aza-dC 処理によって導入遺伝子の発現回復

２者のタンパク質の間に自己消化性ペプチドであを検討した結果を報告する。

る T2A 配列が導入されている（ 図 2 参照）。一度、2.

翻訳された Oct 3 -copGFP の融合タンパク質は、翻試料および実験方法

訳後速やかに Oct 3 および蛍光蛋白質 copGFP とし

マウス胎児由来線維芽細胞を妊娠後 13 . 5 日のて切り離されることが期待される。独自に構築し

C57BL6 系統のマウスより樹立した。マウス胎児

た Oct 3 -copGFP 融合遺伝子は pMX レトロウィル

組織を鋏によって細切した。細切された組織は金スベクターへ制限酵素処理およびライゲーション

属メッシュによりさらに小片化され、我々は小片反応によってサブクローニングを行った。

化した胎児組織を初代培養の材料として用い、胎図2

Oct 3 -copGFP 融 合 遺 伝 子、K l f 4, Sox 2, c-myc

導入した遺伝子の構造および細胞の形態変化

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浦上財団研究報告書のそれぞれのレトロウィルスベクターは 293T 細胞へパッケージングプラスミドである pCL10A1

Vol.19（2012）3.

結果（Imugenex）とともに、リポフェクション法にてiPS 細胞を誘導する組み換えウィルスを得るた導入を行った。293T 細胞へ 48 時間導入を行っ

め に、293T 細 胞 へ Oct 3 -copGFP 融 合 遺 伝 子、た後に、通常の 10 % FCS-DMEM 培地に交換し、

K l f 4, Sox 2, c-myc のそれぞれの cDNA を持った

さらに 48 時間後に組み換えウィルス液を回収しpMX レトロウィルスベクターをパッケージングた。回収した組み換えウィルス液にポリエチレンプラスミドとともに導入を行った。その後、得らグリコールを基本組成とする濃縮試薬（Retro-X

れた組み換えウィルスをマウス胎児由来線維芽Concentrator: Clontech）を 使 用 し、30 倍 に 濃 縮細胞に感染させたが、感染後に線維芽細胞はほぼを 行 っ た。 濃 縮 さ れ た Oct 3 -copGFP 融 合 遺 伝

100 %の頻度で蛍光を発し、高い遺伝子の導入効

子、K l f 4, Sox 2, c-myc 組み換えウィルスは混合率が確認された（図 3 参照）。ウィルスの感染後、し、3.5 cm ディッシュあたり 1X10 5 細胞の密度

約２週間後に周辺の線維芽細胞とは明らかに形態で播種されたマウス胎児由来線維芽細胞に 48 時が異なるコロニーが出現した（図 2 参照）。このコ間感染した。感染された細胞は 15 % Knockout

ロニーは幹細胞のマーカーであるアルカリフォス

Serum Replacement（KSR）（Invitrogen）を含んだファターゼ染色に陽性を示し、ドーム状の形態をDMEM 培地で 2 – 3 週間の間、培養を行った。

示した（図 4 参照）。このコロニーを実体顕微鏡下その後出現した iPS 細胞コロニーは実体顕微鏡下でピックアップし、マイトマイシン処理により不にて、26 G 注射針で分離し、48 穴細胞培養ウェル活性化したフィーダー細胞上に継代を行った。そに予めマイトマイシン処理によって不活性化したマの後、フィーダー上にマウスの胎性幹細胞（ESウス胎児由来フィーダー細胞上に、0.05 %トリプシ細胞）の形態を示すコロニーが出現した。このコンにより細胞分散後、播種した。48 穴細胞培養ウェロニーはフィーダー上に安定的に 10 世代以上維ルで形成された iPS 細胞コロニーは、再度 0.05 %ト持できることが明らかとなり、加えて幹細胞特有リプシンによって分散後、3.5 cm ディッシュ上に用の遺伝子産物である Nanog 蛋白質の発現を蛍光意したフィーダー細胞上へ播種を行った。

免疫染色にて検出した（図 5 参照）。以上の状況か樹立された iPS 細胞の生物学的性質を明らかにら、我々は蛍光マーカーを導入した Oct 3 遺伝子するために、幹細胞のマーカーのひとつであるアによってマウス iPS 細胞を樹立したと結論した。

ルカリホスファターゼ活性を FastRed を基質と我々が樹立したマウス由来 iPS 細胞は 20 株をした酵素染色によって検出を行なった。加えて超え、Oct 3 -copGFP 融合遺伝子を用いて安定的iPS 細胞化したマーカーとして Nanog タンパク質に iPS 細胞を樹立できることが明らかになった。の発現を免疫蛍光染色法によって検出した。

現在、マウスの iPS 細胞に関して理化学研究所の脱メチル化活性を持つことが知られている

バイオリソースセンターを通じて基礎的な学術目

5 -aza-dC 処理を樹立した iPS 細胞に対して行っ的であるならば、分与を受けることが可能となった。5 -aza-dC を iPS 細胞の培地に添加し、5μM,ている。しかし iPS 細胞の場合は ES 細胞と比較

10μM, 100μM の各濃度で約 48 時間の処理を行っしてその性質にばらつきが大きく、研究の発展のた。脱メチル化活性の検出を iPS 細胞の樹立の過ためには数多くの研究材料が利用できることが望程で不活性化した蛍光蛋白質の発現を蛍光顕微鏡ましい。我々が樹立したマウス iPS 細胞は東北大にて観察を行い、検出を行なった。

学加齢医学研究所、医用細胞資源センターに細胞

iPS 細胞を用いた食品由来の脱メチル化化合物探索システムの開発

A および B：遺伝子導入しない場合の通常顕微鏡および蛍光観察像。
C および D：遺伝子導入した場合の通常および蛍光観察像。強い蛍光が検出され、高い効率での遺伝子導入が認められる。
図3

図4

図5

遺伝子の導入効率得られたマウス iPS 細胞の性質

ライン化されたマウス iPS 細胞の性質

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浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）

材料としてデポジットする予定である。東北大学

殖と分化能力の維持に有効と報告されている２種を含めた多くの研究者に研究資源として利用して類の低分子阻害剤（PD0325901, CHIR99021）を頂く予定である。

使用した。その結果、我々が樹立した iPS 細胞はiPS 細胞は全身の組織に分化できる全能性を維

フィーダーが存在しない条件においても、効率よ持するため、通常はフィーダー細胞の上で培養さ。
く細胞増殖することが明らかになった（図 6 参照）れることが通例である。しかしこのフィーダーの脱メチル化活性を持つことが知られている

存在は、iPS 細胞を分化誘導する際には逆に障害

5 -aza-dC を 5μM, 10μM, 100μM の各濃度で約となる。本研究では脱メチル化活性を検出するバ

48 時 間 の 処 理 を 行 っ た。100 μM で は 5 -aza-dC

イオアッセイ系を構築する上で iPS 細胞を効率よの細胞毒性が観察され、iPS 細胞コロニーに数がく分化誘導することが必要である。未分化な状態1/10 程度に低下した。10μM では無処理群の約ではレトロウィルスのプロモーターに結合する転半分程度のコロニーが認められたが、蛍光遺伝子写因子遺伝子の発現がオフであり、この転写因子の発現が回復したコロニーは蛍光顕微鏡下では検遺伝子の発現を回復させるには一度、iPS 細胞を出されなかった。未分化な状態ではレトロウィル分化させなければならない。そこで、樹立したマスのプロモーターに結合する転写因子遺伝子の発ウス iPS 細胞をフィーダー細胞のない培養条件で現がオフであり、この転写因子遺伝子の発現を回維持できるか検討を行った。マウス ES 細胞は従復させるには一度、iPS 細胞を分化する必要が考来、特殊無血清培地を使用することで、フィーダーえられる。現在、樹立した無フィーダー培養系をなしで効率よく細胞増殖することが知られている。

使用し、レチノイン酸を用いて神経細胞へ分化誘

我々はこの培地を iPS 細胞に使用したところ、数導する実験を進行している。

日間は効率よく iPS 細胞の増殖が生じるが、やがてコロニーの形が崩れ始め、iPS 細胞の増殖が低4．考察。そこで我々は下することが判明した（図 6 参照）

我々は脱メチル化活性を検出するバイオアッ

従来の研究において ES 細胞および iPS 細胞の増セイ系としてマウス iPS 細胞を利用することを

A：ESF-C 培地のみで培養したマウス iPS 細胞の形態。B：ESF-C 培地のみで培養したアルカリフォスファターゼ活性。C：ESF-C 培地に低分子阻害剤を添加して培養した場合のマウス iPS 細胞の形態。D：ESF-C 培地に低分子量阻害剤を添加し培養した場合のアルカリフォスファターゼ活性
図6

無血清、無フィーダー状態でマウス iPS 細胞の維持

iPS 細胞を用いた食品由来の脱メチル化化合物探索システムの開発

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発案し、導入する Oct 3 遺伝子産物と融合蛋白ととが明らかになった。通常、このように幹細胞のしてカイアシ由来の蛍光蛋白質である copGFP性質を保ったまま、大きく培養条件を変更するたを発現する実験系を構築した。Oct 3 遺伝子産物

めに、数ヶ月の長期に渡る細胞の馴化が必要であと copGFP はひとつの融合蛋白質として翻訳さる。しかし我々の考案した低分子阻害剤を添加しれるが、その後２つの遺伝子産物の間に存在すた条件では馴化の期間を全く必要とせずに、そのる T2A の自己消化ペプチドの存在により、２つままフィーダーなしの培養が可能であった。の蛋白質に自動的に切り離される。この Oct 3 の

我々の樹立した iPS 細胞をフィーダーのない条発現系は蛍光蛋白質の発現が消失することで、導件で脱メチル化化合物の処理を行った。しかし脱入された遺伝子のサイレンシングを蛍光によってメチル化活性によるマーカー遺伝子の発現の回復モニタリングすることが出来る。実際に本レトロは、iPS 細胞が未分化状態では検出されなかった。

ウィルスの感染後のマウス胎児由来線維芽細胞は今後は iPS 細胞を効率よく分化させる実験系と脱ほぼ 100 %の頻度で蛍光を発した一方、樹立されメチル化剤処理の組み合わせにより、ゲノムの脱た iPS 細胞は全く蛍光蛋白質の発現が消失していメチル化活性を効率よく検出する実験系が樹立でた。このことは iPS 細胞において高い効率で導入きると期待される。

遺伝子のサイレンシングとゲノムのリプログラミングが生じたことを示している。

謝辞

レトロウィルスには導入遺伝子のプロモーター

本研究は浦上食品・食文化振興財団の研究助成と な る LTR（Long Terminal Repeat）配 列 が 存を受け、遂行したことをご報告、厚く御礼申し上在する。ES および iPS 細胞においては、この遺げます。本研究の遂行中に私どもの所属する東北伝子発現を制御する LTR 配列が高頻度にメチル

大学は 2 011 年 3 月に発生しました東北・東日本

化し、遺伝子発現が不活性かすることが知られて大震災により多大な被害を受けました。我々が樹いる。加えて未分化状態の ES および iPS 細胞で立した iPS 細胞も多くが死滅することになりましはこの LTR プロモーターの転写活性を上昇させたが、今一度以前より優れた研究成果を得ることる転写因子遺伝子の遺伝子発現がオフになってを目指し鋭意努力しております。皆様のご支援といることが近年の研究によって明らかになった

御指導に心から御礼申し上げます。

（Matsui et al. 2 010）。このことは ES および iPS細胞の未分化な状態では、例えプロモーター部位が脱メチル化したとしても遺伝子発現が回復しないことを示す。脱メチル化によって遺伝子発現が回復することを検出するためには iPS 細胞を分化誘導する必要がある。
そこで本研究では iPS 細胞を効率よく分化誘導するために、フィーダーなしで維持するための培養条件を検討した。我々の樹立したマウス iPS細胞は、低分子阻害剤である PD0325901 およびCHIR99021 を添加した培地によって、フィーダー細胞が存在しない状態でも効率よく維持できるこ文

献Balch C, Yan P, Craft T, Young S, Skalnik DG, Huang TH,
et al. 2005. Antimitogenic and chemosensitizing effects ofthe methylation inhibitor zebularine in ovarian cancer. MolCancer Ther 4(10): 1505-1514.
Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka
T, Aoi T, et al. 2008. Generation of induced pluripotent stem
cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat
Biotechnol 26 (1) : 101-106.
Matsui T, Leung D, Miyashita H, Maksakova IA, Miyachi
H, Kimura H, et al. 2010. Proviral silencing in embryonicstem cells requires the histone methyltransferase ESET.
Nature 464 (7290) : 927-931.

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浦上財団研究報告書

Vol.19（2012）

The establishment of bioassay system withinduced pluripotent stem (iPS) cell for the screening ofthe de-methylating activity of the genome
Tomokazu Fukuda
Graduate School of Agricultural Sciences, Tohoku University
The various food-derived functional compounds, such as resveratrol, have the potential
to contribute to the prevention of the human cancers. These anti-tumorigenic compounds
are expected to involve within the various types of foods, however, it is difficult to discover
the new compounds, due to the difficulty of the bioassay for the anti-tumorigenic activity.
The recent progress of the cancer research explored that the increased methylationof the genome is commonly observed in the malignant cancers. The methylation of thegenome is obviously observed in the promoter region, which regulates the gene expression.
The increased level of the methylation in the promoter region is known to result in theinactivation of the transcription of the genes. The inactivation of the anti-oncogenicprotein, such as p53, is expected to induce the more malignant cancers. The low molecularcompounds, which have the biological activity to induce the de-methylation of thegenome is called as de-methylating reagents. As one of the representative de-methylating
reagents, 5-aza-2’-deoxycitidine (5-aza-dC) is frequently used. To be noted, 5-aza-dC wasreported to have strong anti-tumorgenic effect to the Multiple Myeloma, and 5-aza-dC
was authorized as anti-cancer drug by Food and Drug Administration (FDA) in the UnitedStates. Therefore, if we screened the unknown low molecular compounds based on the demethylating activity, the new candidate low molecular compounds for the anti-cancer drug
would be obtained from the natural derived mixtures.
In this study, we focused on the high methylating activity of the iPS cells. When weintroduced the exogenous gene and promoter into the iPS cell, the introduced exogenous
promoter is commonly inactivated due to the methylation in the iPS cell. The screening of
the low molecular compounds, which induces the recovery of the inactivated genes during
the establishment of iPS cells, will enable us to identify the new leading chemicals for thede-methylating activity of the geneome. We established the induced pluripotent stem cells,
which have the fluorescence marker. Furthermore, we found out the combination of thedifferentiation inhibitors (PD0325901 and CHIR99021) allows us to efficiently maintainthe iPS cell without the adaptation of the cells. In addition, we obtained the preliminary
data after the treatment of demethylating compound, 5-aza-dC. Our results suggested thatthe combination of the efficeint differentiation system of iPS cell and the treatment of thedemethylating compounds enables us to screen the leading conpounds for the anti-cancer
drugs.