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浦上財団研究報告書

Vol.29（2022）＜平成 30 年度助成＞

抗酸化物質の摂食ががんモデルマウスの腸管免疫に及ぼす影響
増田潤子（東京女子医科大学 医学部）

研究目的

３．抗体および測定セット
抗マウス CD3ε（145-2C11）、CD8（53-6.7）およがんによる免疫機能の抑制はがんの特徴の一つとび CD11b（M1/70）抗体を BD バイオサイエンス社

して考えられている。さらに、がん細胞は腫瘍微小より購入した。抗マウス CD25（PC61.5）、CD16/環境のみならず、脾臓における免疫機能に影響する

CD32（93）、および Gr-1（RB6-8C5）抗体を e バイことが示唆されている。しかしながら、がん細胞がオサイエンス社より購入した。抗マウス CD4（RM4-

腸内の免疫系に与える影響については未だ解明され5）、CD11c（N418） お よ び Foxp3（3G3） 抗 体 をていない。本研究では腸炎の治療および大腸がん予

トンボバイオサイエンス社より購入した。IFN-γ、防に効果のある化合物の免疫学的検討をするためのIL-4 および IL-10 測定セットを BD バイオサイエン

初期段階として、多くのヒト乳がんと同様に、骨、ス社より購入した。

肺、肝臓および脳などの遠隔臓器に転移する性質をもつ BALB/c 系統由来乳がん細胞株 4T1 細胞を同種

４．担がん原発巣モデル動物の作製移植したがんモデルマウスを用いて、脾臓および腸１週間訓化後（6 週齢）にマウス 1 匹当たり200 µL

間膜リンパ節における免疫細胞の質的変化および機の PBS（sham）、あるいは PBS に懸濁した 4T1-luc能変化を対照群と比較し、がんによる全身性免疫抑株（4T1）を皮下に移植した。

制の機構を明らかにすることを目的とした。

５．腸管免疫能の評価
研究手法

マウスを安楽死させ、無菌的に摘出した腸間膜リンパ節から免疫細胞を単離した。腸間膜リンパ節の１．マウス

骨髄由来抑制細胞（MDSCs）、ヘルパー（CD4 陽性）

5 週齢 BALB/c 系統雌マウスを、チャールス・リ

T 細胞（Th）、細胞傷害性（CD8 陽性）T 細胞（CTL）、バー社より購入し、岡山大学動物資源部門津島北施

CD4 陽性 Foxp3 陽性制御性 T 細胞（Tregs）の各サ設で飼育した。

ブセットを、蛍光染色細胞解析装置（AccuriC6、BDバイオサイエンス社）と FlowJo ソフトウェア（ツ２．細胞培養
マ ウ ス 腸 間 膜 リ ン パ 節 か ら 免 疫 細 胞 を 抽 出 し、リースター社）を用いたフローサイトメーター法（FCM 法）により測定した。

10% ウシ胎児血清および 50 µM 2-メルカプトエタ

また、5 µg/ml で抗 CsD3ε抗体が固相化されたノール（ナカライテスク社）含有 RPMI-1640 培地

96 穴プレート上で、腸間膜リンパ節の免疫細胞（穴で培養した。ウォータージャケットインキュベー

当たり 40 万細胞）を 48 時間培養し、培養上清中にター（APC-30D；アステック社）を用い、摂氏 37 度、放出された IFN-γ、IL-4 および IL-10 の濃度を、酵5％ CO2、湿度 100％条件下で細胞を培養した。

素結合免疫吸着法（ELISA 法）にて各セット（BD抗酸化物質の摂食ががんモデルマウスの腸管免疫に及ぼす影響

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OptEIATM ELISA Sets、BD バイオサイエンス社）の同種皮下移植したマウスの脾臓および腸間膜リンパ説明書に従って測定した。

節では、有意な MDSC 数の増加が報告されている。
そこで本実験で作製した 4T1 担がんマウスは、mPAC

６．統計解析

担がんマウスと同様に腸間膜リンパ節の MDSC が増

標準誤差算出と有意差検定は、GraphPad Prism

加するか確認するために、4T1 担がんマウスの腸間version 9 software package（GraphPad Software 社）

膜リンパ節に存在する MDSC 割合を測定し、対照群で 行 っ た。 統 計 解 析 は ス チ ュ ー デ ン ト の t 検 定、と比較した。マウス MDSC は、Gr-1hi CD11b＋を示す

ウ ェ ル チ の t 検 定 ま た は 1-way ANOVA で 解 析 を顆粒系（G-MDSC）と Gr-1intermediate を示す CD11b＋単球行った。グラフ値は平均値±標準誤差で示した。P系（M-MDSC）のサブセットからなる亜集団である

値が 0.05 以下の時に有意差があると判断した。

が既報と異なり、BALB/c 系統マウスの腸間膜リンパ節に MDSC はほぼ存在せず、4T1 担がんマウスに結果おいても存在しなかった（図 1）。この結果は、BALB/c 系統マウスにおいて、腫瘍に伴って増加する MDSC

１．4T1 担がんマウス腸間膜リンパ節にMDSC は存在しないが腸管免疫を制御するメカニズムがほぼ存在しないことを示唆した。

間膜リンパ節（mLN）は腸管に侵入した抗原を捉え遊走した DC が、ナイーブ T 細胞と自然免疫および適応免疫を開始させる二次リンパ組織である。腸２．4T1 担がんマウス腸間膜リンパ節に見られる T 細胞依存的炎症

管上皮は比較的硬い組織で、腸管上皮および粘膜固最後に、4T1 担がんマウスの腸管免疫状態を総合有層から免疫細胞を抽出するには多くの時間を要的に判断するため、腸間膜リンパ節に存在する T 細し、得られる細胞数も極めて少ない。一方、腸間膜胞を、抗 CD3εmAb によって刺激した時のサイトカリンパ節は容易に摘出することができ、簡単に多くイン量を測定した。の免疫細胞を抽出することができる。そこで本研究腸炎時に、炎症性サイトカインである IFN-γは有では、4T1 担がんマウスの mLN に存在する免疫細意な増加を認めるが、4T1 担がんマウスの腸間膜リ胞について解析を行った。

ンパ節由来リンパ球刺激後の培養上清中に含まれる膵臓がん細胞株 mPAC を C57BL/6 系統マウスにIFN-γ量は、対照群と比べて有意に増加した（図 2）。

図 1 4T1 担がんマウス腸間膜リンパ節（mLN）に MDSC は存在しない。5 × 105 個の 4T1 細胞をマウスの右脇腹に皮下移植し 14 日後に腸間膜リンパ節からリンパ球を抽出し、MDSC をフローサイトメトリーにて解析し、対照群（Sham）と比較した。Gr-1hi CD11b＋は顆粒系 MDSC（G-MDSC）を示し、Gr-1intermediate CD11b＋は単球系 MDSC（M-MDSC）を示す。

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浦上財団研究報告書

図2Vol.29（2022）

4T1 担がんマウスに見られる抗腫瘍活性の減弱。5 × 105 個の 4T1 細胞をマウスの右脇腹に皮下移植し 14 日後に脾細胞を抽出し、抗 CD3εmAb 固相化プレートにて 48 時間培養した後、培養上清を回収した。

抗炎症性サイトカインである IL-4 は、IL-10 と共謝

辞に腸炎抑制を担うが、4T1 担がんマウスの腸間膜リ

本研究は、公益財団法人 浦上食品・食文化振興財

ンパ節由来リンパ球刺激後の培養上清中に含まれる団による研究助成により遂行された。ここに深く感IL-4 量は、対照群と変わらなかった（図 2）。

謝いたします。

考察

本研究において、転移能をもつ乳がん細胞株 4T1を皮下注射することで作製した担がんマウスの腸管の免疫細胞の質的および量的変化を調べた。腸間膜リンパ節では T 細胞の IFN-γ産生能は有意に増加し、炎症状態が亢進していた。がんは局所だけでなく全身の免疫系に影響を与えるが、非常に初期の段階から腸管の免疫系においても、がん局所や全身とは異なる何らかの免疫的機能が存在する可能性が示唆された。

Effects of antioxidants on intestinal immunity in cancer model mice

Effects of antioxidants on intestinal immunityin cancer model mice
Junko MASUDATokyo Women’s Medical University
Abstract
Suppression of immune functions is one of the characteristics of cancer.
Furthermore, it has been suggested that cancer cells affect not only the tumor
microenvironment, but also the immune functions in the spleen. However,
the effects of cancer cells on the intest inal immune system have not yet
been elucidated. In this study, as in many human breast cancers, metastases
to distant organs such as bones, lungs, the liver, and the brain can serve as
initial steps in immunologically investigating compounds that may be effectivein treating enteritis and preventing colon cancer. Using cancer model micesyngenically transplanted with BALB/c strain-derived breast cancer cell line
4T1 cells, the qualitative and functional changes of immunological cells in the
spleen and mesenteric lymph nodes were compared with those of the control
group. The purpose of this study was to clarify the mechanism of systemic
immunosuppression caused by cancer progression.

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