Guide of Gene Editing Related Products

ゲノム編集製品ガイド

2021年9月版

本ガイドを見ればCRISPR/Casで必要な製品やお役立ち製品が分かる！

✔ ゲノム編集とは？ ゲノム編集実験フロー✔ CRISPR/Cas9に必須なCas9とsgRNA導入システム✔ ゲノム編集の効率アップにつながるサポートツール✔ ゲノム編集よくあるご質問

本ガイドを読んで、ゲノム編集を始めてみませんか？

本ガイドの関連情報はこちらから！

ゲノム編集について
ゲノム編集とは？
ゲノム編集は、ゲノム上の任意の箇所に対し、ノックアウトやノックインを“自由自在”にしかも効率よく行うことができるため、今やライフサイエンス分野においてなくてはならない技術となっています。
ゲノム編集はゲノム上の改変を行いたい箇所をピンポイントで切断することからスタートし、生物が持つ修復システムをうまく利用することでノックアウトおよびノックインを行います。
ゲノム編集に利用される修復システムは、主に2つあります。
一つが、非相同末端結合（non-homologous end joining：NHEJ）と呼ばれる修復です。この修復が起こる際にある一定の割合で、切断箇所を中心に塩基の欠失や挿入など、いわゆるInDelと呼ばれる修復エラーが発生します。このInDelが起こると、フレームシフトが起きてコドンの読み枠がずれ、その遺伝子がコードするタンパク質が正常に作られなくなり機能を失うことで、ノックアウト状態となります。
もう一つが、ノックインの場合に利用される相同組換（homology-directed repair：HDR）という修復システムです。挿入したいフラグメント配列の左右に 、ゲノム上のノックインしたい部分と相同な配列を付加 した“ドナーDNA”を反応系に加えておくと、切断後、ドナーDNAの相同配列を参照しながら修復を行うため、結果、狙った箇所に新規フラグメントがノックインされます。

切断システムによる切断

NHEJ（非相同末端結合）
ノックアウトゲノムDNA

DNA二本鎖切断（DSB）

HDR（相同組換）
ドナーDNA

ノックイン

実験フロー ～培養細胞の場合～
ガイドRNA設計

標的細胞へのCas9/sgRNAの導入

1標的あたり4～5個のsgRNA設計を推奨

目的に応じた導入法を選び、細胞へ導入

シングルセルクローニング

目的変異導入細胞の取得

ゲノム編集効率チェック

培養細胞集団におけるゲノム編集効率の確認

ゲノム編集効率が低い場合の検討項目
1． 設計した候補sgRNAのin vitroでの活性測定
2． 導入条件の至適化や導入方法の検討

細胞を希釈し、プレートに播種-1-｜ ゲノム編集製品ガイド

各クローンのシーケンス解析3． Cas9抗体による細胞内Cas9発現量の確認

本ガイドでご紹介する製品
タカラバイオでは、CRISPR/Cas9用のゲノム編集関連製品 Guide-it™シリーズを取り扱っており、ゲノム編集の上流から下流まで手厚くサポートいたします。
本ガイドでは、ゲノム編集に必須なCas9/sgRNAの導入システムと、ゲノム編集の効率をアップさせるサポート
ツールをご紹介します。

● ゲノム編集には必須！ Cas9/sgRNAの導入システム
まずは最適な導入システム選びから！
タカラバイオがおススメする4つのシステムとsgRNA調製キットをご紹介します。

システム1：Cas9タンパク質導入システム☑ Guide-it™ Recombinant Cas9シリーズ

p.3～4

オフターゲットのリスクが低く変異導入効率は高い、一番おススメの導入システム☑ Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit

p.5～6

高品質なsgRNAを簡便に効率よく調製できるキット

システム2：プラスミドベクターシステム☑ Guide-it™ CRISPR/Cas9 System (Green) / (Red)p.7

sgRNAをクローニングするだけ！ 初心者の方にもおススメのプラスミドベクターシステム

システム3：エキソソーム様小胞によるシステム☑ Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System

p.8

導入効率が低い細胞に！ エキソソーム様小胞（Gesicle）を利用したシステム

システム4：ウイルスベクターシステム☑ AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free Systemシリーズ

p.9～10アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターによる導入システム● ゲノム編集の効率をさらにアップさせるサポートツール
上記の導入システムと組み合わせれば、ゲノム編集の成功率や効率がさらにアップ！

☑ Guide-it™ Complete sgRNA Screening System

p.11～12

sgRNAの調製から切断効率のチェックまでできるオールインワンキット☑ Guide-it™ Mutation Detection Kit

p.13～14

PCRと電気泳動で簡単に変異導入効率をチェック！

☑ Guide-it™ Long ssDNA Production System v2

p.15～16長い一本鎖ノックインドナー用DNAを簡単に調製☑ Guide-it™ Cas9 Polyclonal / Monoclonal Antibody

p.17

組換えCas9タンパク質を高感度に検出できる抗体☑ Guide-it™ CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System

p.17

関連遺伝子をゲノムワイドにスクリーニング● 関連製品☑ CRE Recombinase Gesicles

裏表紙

エキソソーム様小胞を利用してCreリコンビナーゼを細胞に直接導入-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 2 -● Cas9タンパク質導入システム
オフターゲットのリスクが低く変異導入効率は高い、一番おススメの導入システム☑ Guide-it™ Recombinant Cas9シリーズ
NLS（核移行シグナル）付きなので、効率的な変異導入が可能です。
◆ エレクトロポレーションによる導入に最適なCas9タンパク質溶液◆ ベクター導入システムに比べて、オフターゲット効果を抑制◆ C末端にNLS（核移行シグナル）を付加。導入後速やかに核へ移行◆ 高濃度（10 µg/µl）と低濃度（3 μg/μl）の2種類の製品をご用意

Cas9タンパク質を用いるゲノム編集の流れ① Cas9とsgRNA※を用意

Cas9タンパク質② Cas9タンパク質とsgRNAの複合体（RNP）を形成③ RNPを導入&ターゲット遺伝子を切断

エレクトロポレーション
orトランスフェクション

sgRNA

細胞（株化、初代、iPS、ES etc.）、
組織、受精卵 など・・・※sgRNAの調製にはGuide-it sgRNA In Vitro Transcription
Kit （製品コード 632635、5～6ページ掲載）をお使いください。

★ Cas9タンパク質を使用するメリット－プラスミドやウイルスによるCas9遺伝子導入法と比較して－✔ 遺伝子を使わないため継続的なCas9の発現がなく、オフターゲットを抑制✔ 対象生物ごとにプロモーターやコドンの最適化不要✔ 導入するCas9タンパク量をコントロールし、ゲノム編集効率を至適化✔ “転写・翻訳”のタイムラグがないので、迅速・効率的な変異導入が可能
遺伝子改変動物作製においてモザイク変異のリスクが低いため、受精卵への使用例（★）が増えています！
★ 使用文献の一例
Hashimoto M, Yamashita Y and Takemoto T, Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear
zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Dev Biol. 2016 Oct 1; 418(1): 1-9.

■ 製品リスト

高濃度、低濃度の2種類をご用意！
製 品 名Guide-it™ Recombinant Cas9 (10 μg/μl)

Guide-it™ Recombinant Cas9 (3 μg/μl)

関連製品

容 量

製品コード

価格（税別）

200 μg632678¥55,000

500 μg632679¥101,000

100 μg632641¥28,000

100 μg×3

632640¥67,000

Cas9タンパク質OK！ トランスフェクション試薬

培養細胞の場合、Cas9タンパク質とsgRNAの複合体（RNP）の導入にトランスフェクション試薬が有効な場合があります。タカラバイオではRNPの導入にも使用できるトランスフェクション試薬をご用意しています。ぜひお試しください！
製 品 名TransIT-X2® Dynamic Delivery System-3-｜ ゲノム編集製品ガイド

容 量

製品コード

価格（税別）

0.3 mlMIR6003¥31,000

0.75 ml

MIR6004¥77,000

1.5 mlMIR6000¥124,000

■ 変異導入効率の比較

プラスミドDNA vs Cas9タンパク質 & sgRNA複合体（RNP）

サーモフィッシャーサイエンティフィック社のエレクトロポレーション装置Neonを使用して、プラスミドDNAもしくはGuide-it™
Recombinant Cas9 (3 μg/μl) とsgRNAの複合体（RNP）をZsGreen1低発現細胞（iPS細胞および293T細胞）に導入し、点変異導入（ノックイン）実験を行った。ZsGreen1低発現細胞は、開始コドンに変異を入れてZsGreen1の発現レベルを抑えており、点変異導入実験は開始コドン領域をターゲットとして発現レベルの回復を目的とした。
フローサイトメーターによりZsGreen1発現回復細胞をカウントし、ノックイン効率を解析した。

iPS細胞

ノックイン効率（%）

ノックイン効率（%）

293T細胞Plasmid
DNA

RNP

Plasmid
DNA

RNP

プラスミドDNAより、Cas9タンパク質 & sgRNA複合体（RNP）を使用した方が高いノックイン
効率を示しました。

■ 他社Cas9タンパク質との変異導入効率の比較
N EC Ta C1 C2 C3
CCR5

Guide-it™ Recombinant Cas9 (3 μg/µl) とGuide-it™ sgRNAIn Vitro Transcription Kit（製品コード 632635）を用いて作製したsgRNAをエレクトロポレーション でヒトiPS細胞に導入し、各ターゲット遺伝子のゲノム編集実験を行った。
変異導入効率の確認にはGuide-it™ Mutation Detection Kit（製品コード 631448）を使用し、各%は切断効率を示している。
（TB USA社比較データ）

C4BPB

CYP2E1

N： Negative Control
EC： エレクトロポレーション用コントロール
Ta： Guide-it™ Recombinant Cas9 (3 µg/µl)
C1： A社製品
C2： B社製品
C3： C社製品

CTLA4

Guide-it™ Recombinant Cas9は、試したすべての遺伝子について効率的な変異導入を行うことができました。

-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 4 -● sgRNAの設計・調製
高品質なsgRNAを簡便に効率よく調製☑ Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit■ sgRNAの調製フロー① Forward primerの設計② PCRによる鋳型DNAの調製

Target specific
crRNA（20 nt）

T7 promoter 領域（21～23 nt）①のForward primer

sgRNA コーディング領域

Reverse primer ★
（Scaffold Templateとプレミックス）

Homology to
Scaffold
Template（15 nt）

ご自身で設計したターゲット
配 列 に 、 T7 promoter 領 域 とScaffold Template相同領域を付加した形で、Forward primer
を合成してください。

Scaffold Template（tracrRNA） ★

③ in vitro transcriptionによるsgRNAの合成

PCR （PrimeSTAR® Max ★）鋳型DNA

sgRNAの完成！
T7★は本システムに添付しています。

TargetSpecific
crRNA

tracrRNAsgRNA設計のポイント① ターゲット配列以外に完全一致配列を持つものは×。他と相同配列部分が少ないものを選ぶ
オフターゲットの抑制➁ 1遺伝子につき複数のsgRNAを設計する（3つ以上が望ましい）
効率の良いsgRNAを選択する➂ できるだけ変異導入箇所に近いPAM配列を選ぶ（特にノックインの場合）★ マニュアルでのsgRNA設計手順① PAM配列（5’-NGG-3’）を標的遺伝子から探す② 標的遺伝子の逆鎖から探す（5’-CCN-3’）

標的配列からPAM配列を検索

標的配列からPAM配列を検索

PAM上流20塩基の確認

PAM上流20塩基の確認

PAM上流の20塩基（赤字）PAM上流の20塩基（赤字）5’ G AAC CGG TGC CTA GAG AAG G 3’

5’ G CGC CAC CTT CTC TAG GCA C 3’

★ Online toolを用いたsgRNA設計
比較的よく使われるオンライン設計ツールと特徴
 CHOPCHOP： 候補となるsgRNAのランキング化。ゲノム配列上の類似配列の数をリスト化

 CRISPRdirect ： 標的配列に特異的、かつゲノム上の類似配列が少ない候補sgRNAをハイライトで表示
 GGGenome-5-： 短い配列の相同検索が得意｜ ゲノム編集製品ガイド

■ 他社キットとの合成sgRNAの品質比較
Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kitで調製したsgRNAと他社キットで調製したsgRNAを比較した。
（TB USA社比較データ）

他社キット

本キット

Target gene

Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kitで調製したsgRNAは全てシングルバンドとなっており、他社キットに比べて高品質でした。
■ sgRNAの収量と品質
Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit を用いてsgRNAを調製（反応条件： 20 μl、37℃、4時間）し、NanoDrop
spectrophotometerでsgRNAの収量を調べた（パネルA）。
また、Agilent Bioanalyzer を用いてsgRNAの品質を調べた（パネルB）。
B

Yield（µg）

A

Target gene

Target gene

高品質なsgRNAを高収量で調製できるGuide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kitを一度お試しください！
■ 製品リスト製 品 名Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit

容 量

製品コード

価格（税別）

50回

632635¥166,000※ 本キットはGuide-it Complete sgRNA Screening System（製品コード 632636、11～12ページ掲載）にも含まれています。

-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 6 -Cas9 Proteinを用いたゲノム編集● プラスミドベクターを用いた導入システム
とにかく簡単に変異導入実験をしたいときにおススメのプラスミドベクターシステム☑ Guide-it™ CRISPR/Cas9 System (Green) / (Red)sgRNA配列をベクターにクローニングするだけで、すぐに変異導入実験が開始できます。
◆ Cas9とsgRNAを同時に発現できる便利なワンベクタータイプ◆ 予めベクターが線状化されているので、sgRNA発現用オリゴDNAのクローニングも簡単◆ 蛍光タンパク質（ZsGreen1またはtdTomato）を搭載し、導入効率のモニタリングが可能

pGuide-it Vectorの構造■ さまざまな細胞に対する編集効率の比較
A

HEK293HeLa

U2OS

HT1080B

HEK293HeLa

U2OS HT1080

‐

‐

‐

＋

＋

＋

‐

＋

Plasmid

CCR5
94
54

56
32

31
12

79 Transfection（%）
30 Indel（%）

98
42

57
40

34
14

77 Transfection（%）
34 Indel（%）

C4BPB

EMX1
12ウェルプレートに各細胞を1×105個播種して16時間培養後、Xfect™ Transfection Reagentを使用してpGuide-it-ZsGreen1
98
56
39
72 Transfection（%）
plasmidを導入した。pGuide-it-ZsGreen1 plasmidは、CCR5、
37
32
16
25 Indel（%）
C4BPB、EMX1を標的遺伝子とするsgRNA配列をpGuide-itZsGreen1 Vectorにクローニングして作製し、各2.5 μgを使用した。トランスフェクションから48時間後にZsGreen1の蛍光を蛍光顕微鏡で確認（パネルA）し、フローサイトメーターでトランス
フェクション効率（パネルB、Transfection %）を測定した。ゲノ
Guide-it™ CRISPR/Cas9 Systemを使うこと
ムDNAへの変異導入効率の測定には、Guide-it™ Mutation
で、トランスフェクション効率のモニタリングを
Detection Kit（製品コード 631448）を用いた。アガロースゲル
電気泳動を行い、デンシトメーターで変異導入の割合（パネルB、 蛍光タンパク質で行いました。また、試したすべての細胞に対して、変異導入を確認できました。
Indel %）を求めた。

■ 製品リスト
製 品 名

-7-

容 量

製品コード

価格（税別）

Guide-it™ CRISPR/Cas9 System (Green)

1 Kit

632601¥81,000

Guide-it™ CRISPR/Cas9 System (Red)

1 Kit

632602¥81,000｜ ゲノム編集製品ガイド

● エキソソーム様小胞（Gesicle）を用いた導入システム
トランスフェクション効率が低い細胞（初代細胞、iPS細胞・幹細胞など）でも効率よくゲノム編集が可能☑ Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System
エキソソーム様小胞を用いてCas9タンパク質／sgRNA複合体を細胞に直接導入します。
CRISPR/Cas9 Gesicle とは?
◆ 細胞膜に親和性を持つエキソソーム様小胞 “Gesicle”にCas9/sgRNA複合体を封入◆ プラスミドベクターでは導入効率の悪い細胞に最適◆ Cas9タンパク質を直接導入するので、オフターゲット効果が低い◆ 表面にCherryPicker™赤色蛍光タンパク質がついており、蛍光によるGesicleの産生および導入効率のモニターが可能Cas9/sgRNA Gesicleの細胞内での動き

1 標的細胞へGesicleを添加する“Gesicle”の作製方法
本 シ ス テ ム 付 属 の pGuide-it-sgRNA1
Vectorに標的配列（20塩基）をクローニン
グして添付のPackaging Mixと混ぜ、専用の293T細胞にトランスフェクションする。細胞を48～72時間培養し、培養上清に産出されたGesicleを回収

CherryPicker

3 Cas9/sgRNAが細胞内へ放出される

4

Cas9/sgRNAが核へ移行する

CherryPickerによる標的細胞の蛍光を観察

5 Cas9は細胞内で分解・代謝される

sgRNA
Cas9タンパク

2 Gesicleが細胞膜に
融合する

標的細胞
（any cell type）■ さまざまな細胞におけるノックアウト効率の比較

ZsGreen1発現ユニットをゲノム上に1コピー挿入したさまざまな細胞株を樹立し、Cas9/sgRNA Gesicleによるゲノム編集（遺伝子ノックアウト）を行った。ZsGreen1を標的として設計したCas9/sgRNA Gesicle（それぞれ10 μl、20 μl、30 μl添加）、
または比較としてCas9/sgRNAを発現するプラスミドで処理し、フローサイトメーターによりノックアウト（KO）効率を評価した。

特にプラスミドベクターではノックアウト効率の悪い細胞について、Gesicleでは改善が見られました。
■ 製品リスト
製 品 名

容 量

製品コード

価格（税別）

Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System

1 Kit

632613¥166,000

Gesicle Producer 293T Cell Line ※1 ml

632617¥67,000※ Gesicleの作製には、専用の293T Cell（本製品）の使用を推奨しています。

-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 8 -● アデノ随伴ウイルスベクターを用いた導入システム
Cas9タンパク質やプラスミドベクターで入りづらい場合におススメのシステム☑ AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free Systemシリーズ
ウイルスの感染力を利用した、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターによるCas9 & sgRNAの導入システムです。
特にプラスミドベクターでは編集効率の低い細胞におススメです。
◆ AAVベクターを用いてCas9、sgRNAを導入◆ Cas9のゲノムへの組み込みによる持続的なCas9の発現を排除し、細胞毒性やオフターゲットの影響を軽減◆ AAV CRISPR/Cas9の生成に必要な全てのコンポーネントを含んだAll-in-One システム

AAVベクターの特長✔ P1レベルの施設で取扱いが可能✔ 増殖／非増殖のいずれの細胞にも遺伝子導入が可能✔ 非増殖細胞では長期間の発現が可能✔ 免疫原性が低く、動物個体への遺伝子導入にも最適✔ 宿主域の広いAAV2ベクターは広範囲の細胞・動物組織に導入可能

AAVベクター作製の実験フローと対応製品
トランスフェクション

抽出

AAVpro 293T
Cell Line

目的遺伝子のクローニングパッケージング

抽出

AAVpro® Helper Free System

精製

力価測定

精製・濃縮

AAVpro® Purification Kit(All Serotypes)

力価測定

ゲノム編集

標的細胞・組織へ感染

AAVpro® Titration Kit(for Real Time PCR) Ver.2■ 製品リスト
製 品 名

容 量

製品コード

価格（税別）

AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2)

1 Kit

632608¥166,000

AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2)

1 Kit

632619¥166,000

AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector System

1 Kit

632618¥100,000

1 ml

632273¥81,000

ゲノム編集のためのAAVベクター調製システム （詳細は次ページ）

AAV産生に最適化した293T細胞

AAVpro® 293T Cell Line
さまざまな血清型のAAVベクターに適用できる高効率な精製キット

T225フラスコ5本相当の産生細胞からAAVベクターを精製するために必要なバッファー、濃縮カラムが4回分含まれています。

AAVpro® Purification Kit Maxi (All Serotypes)

4回

6666

¥146,000

さまざまなAAVベクターの力価測定が可能
AAV2由来のITRをターゲットとしてベクターゲノム量を定量します。ウイルス粒子内に封入されているベクターゲノムのITR領域がAAV2由来であれば、血清型に関わらず本製品を使用できます。

AAVpro® Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2-9-｜ ゲノム編集製品ガイド

100反応分

6233¥92,000

AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2)

2ベクタータイプ

遺伝子サイズが4.1 kbと大きいCas9（Staphylococcus pyogenes由来：SpCas9）遺伝子を2つのベクターに分割すること
で、AAVベクターによるCas9導入を可能にしました。

■ AAVpro® CRISPR/Cas9 System（※）とプラスミドベクターのゲノム編集効率の比較
HEK293T
HepG2
MCF7
12ウェルプレートに1×105 個の細胞を播種して一晩培養
後、CCR5遺伝子をターゲットとしてゲノム編集を行うため、
Non
Pla AAV Non Pla AAV Non Pla AAV
AAV2-Upおよび-Downベクターをそれぞれ1×105タイター
分（ベクターゲノム定量法）感染させた。72時間後に細胞を CCR5
回 収 し 、 ゲ ノ ム DNA へ の 変 異 導 入 効 率 を Guide-it™
Mutation Detection Kit（製品コード 631448）を用いて測定した（アガロースゲル電気泳動後、デンシトメーターで変異導入の割合を測定）。 比較実験として、pGuide-it- Indel （%）
29
59
3
17
4
25
ZsGreen1プラスミドベクターをXfect™トランスフェクション
試薬を用いて導入した（Pla； 2.5 μg）。
※SpCas9 を用いた2ベクタータイプのAAVウイルスベクターシステム※通常のPAM配列（NGG）を用いてsgRNAを設計

プラスミドベクターではゲノム編集効率が低い細胞株（HepG2、MCF7）でも、AAVベクターシス
テムでは高い変異導入効率が得られました。

AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System(AAV2)

1ベクタータイプ

遺伝子サイズが3.3 kbと小さいSaCas9 （Staphylococcus aureus由来：SaCas9）の遺伝子を採用することで、1つのAAVベクターでのゲノム編集が可能となりました。

小さなCas9 “SaCas9”を用いたAAVpro® CRISPR/SaCas9 System☑ 1つのAAVベクターでSaCas9遺伝子とsgRNAの発現が可能に！

☑ SpCas9とは異なるPAM配列 NNGRR（T）を認識
SaCas9のPAM配列

NNGRR（T）
R=A/G

5’ITR

Cleavage site
pAAV-Guide-it-1
Vector (Linear)

20～22塩基の標的配列
5’3’-

NLS

PAM

NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNGRR（T）| | | | | | | | | | | | | | | | | | | |NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNCYY（A）| | | | | | | | | | | | | | | | | | | |5’- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
|||||

-3’
-5’
|||

||||

3’-

DYKDDDK tag

1 つ の AAV ベ ク タ ー 内 に 、 SaCas9 遺 伝 子 とsgRNAの搭載が可能になりました。in vitroおよびin vivoでさまざまな細胞に対するゲノム編集を行うことができます。

|||||||

PAM配列としてNNGRR（T）を認識し、その3塩基上流を切断します。 （Nはどの塩基でもよく、RはAまたはG。（T）はできるだけ考慮することを推奨します。）★ sgRNAは、オンライン設計ツールで設計可能です。

■ AAVベクターを用いたSaCas9とSpCas9のゲノム編集効率の比較
SpCas9 SaCas9
M

－

①

②

①

②

27

16

15

21

MCF7

Indel （%）

HepG2

Indel （%）

30

15

13

25

AAVpro® CRISPR/Cas9 System （ 2 ベ ク タ ー タ イ プ ： SpCas9 ） な ら び に
AAVpro® CRISPR/SaCas9 System（1ベクタータイプ：SaCas9）を用いて、CYP2遺伝子Exon1の2か所の配列（①、②）を標的としてsgRNAを設計し、それぞれAAVベクターを作製した。
12ウェルプレートに1×105個の細胞を播種して一晩培養後、SpCas9の2ベ
クター、またはSaCas9のAAVベクターをそれぞれ1×105 MOI（ベクターゲノ
ム定量法）で感染させた。ゲノムDNAへの変異導入効率（Indel％） は、
Guide-it™ Mutation Detection Kit（製品コード 631448）により比較した。

SpCas9を用いた2ベクタータイプとSaCas9を用いた1ベク
タータイプのAAVベクターで実施したゲノム編集では、同程度の変異導入効率が得られました。
-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 10 -ウイルスベクターを用いた導入システム● sgRNAの切断効率の確認
ワークしないsgRNAを使ってしまうリスクを減らし、CRISPR/Cas9の成功率をUp☑ Guide-it™ Complete sgRNA Screening System
実サンプルを使わずにin vitroでsgRNAのスクリーニングを行うことができるキットです。
◆ in vitroでCRISPR/Cas9を模擬的に再現し、sgRNAの切断効率をダイレクトに確認◆ 組換えCas9タンパク質とsgRNA調製用キットが入ったAll-in-One キット◆ 調製したsgRNAはそのまま本番実験に使用可能■ 切断効率の確認フロー① 切断確認用ターゲットDNAを
PCR（Terra™ PCR Mix ★）で調製➁ sgRNAとCas9によるターゲットDNAの切断➂ 電気泳動による切断確認

PAM配列

Uncleaved

Cas9 ★

sgRNA

Cleaved

目的遺伝子切断が見られないもしくは切断バンドが薄い
場合は、sgRNAの再設計をお勧めします。

★は本システムに添付しています。

■ Guide-it™ Complete sgRNA Screening Systemを使用したin vitroとin vivoの相関結果
HeLa細胞のCXCR4を標的とした4つの異なるsgRNAの切断活性を、in vitro とin vivo で比較した。in vivo でのKO効率の測定は、CXCR4を特異的に認識するFITC標識抗体を用いたフローサイトメーターに供したときのCXCR4のKnock Outの割合で示した。

in vitro 切断アッセイ
sgRNA1 sgRNA2 sgRNA3 sgRNA4

KO効率（in vivo）

NC

in vivo knock-out実験

KO効率（in vivo）
切断活性（in vitro）
sgRNA1 sgRNA2 sgRNA3 sgRNA4

in vitroでの切断効率が最も悪かったNo.3のsgRNAは、in vivoのKO効率も一番悪く、相関した結果となりました。このような効率のよくないsgRNAを大事な本番実験で使ってしまわないためにも、本キットを使用し事前に有効性をご確認ください！
■ 製品リスト
製 品 名

容 量

製品コード

価格（税別）

Guide-it™ Complete sgRNA Screening System

50回

632636¥199,000

Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit

50回

632635¥166,000※1

Guide-it™ sgRNA Screening Kit

※1

50回

632639¥87,000

Guide-it™ IVT RNA Clean-Up Kit

※2

50回

632638¥81,000※1はGuide-it Complete sgRNA Screening Systemの構成品です。※2はScreening SystemおよびIn Vitro Transcription Kitに含まれます。

- 11 -｜ ゲノム編集製品ガイド

ユーザー様実施例

gRNAの有効性事前確認キットの使用で、変異導入を確かなものに
理化学研究所 脳神経科学研究センター 豊島学 様gRNA（ガイドRNA）の有効性をin vitroで事前確認するキット Guide-it™ Complete sgRNA Screening System（製品コード 632636） を使用した実施例を、理化学研究所 豊島学様にご提供いただきました。
豊島様の詳しいご研究内容やCRISPR/Casに関するお話をお聞かせいただきましたので、是非ご一読ください。
◆ 実験の背景
私の研究室では、統合失調症や発達障害の治療や予防のために、疾患メカニズムの解明を行っている。患者由来のiPS細胞から疾患モデル細胞株の樹立を目指し、そのため に ゲ ノ ム 編 集 技 術 （ CRISPR/Cas ） を 使 用し て い る 。
ヒトiPS細胞でターゲット遺伝子Aのノックアウトを行う際に、より有効なgRNAを選択することで本番実験での失敗リス
クを軽減するために、タカラバイオのGuide-it™ Complete
sgRNA Screening SystemでgRNAの切断効率の事前チェックを行った。切断効率のよかったgRNAをヒトiPS細胞でのゲノム編集に使った。
◆ 実験内容および結果
ヒトiPS細胞のターゲット遺伝子Aのノックアウトを目的として5つのgRNAを設計し 、Guide-it™ Complete sgRNA
Screening Systemでin vitroでの切断効率の確認を行った（パネルA）。その結果から、切断効率のよかったgRNA
2種類（No.2と4）を選択し、ヒトiPS細胞でのノックアウト実
験 に 供 し た 。 変 異 導 入 効 率 を Guide-it™ Mutation
Detection Kit（製品コード 631448/631443）で確認したところ、いずれのgRNAを使用した場合も変異導入が見られ（パネルB）、シーケンスでもDeletionが起こっていることが確認できた。

豊島様のご研究内容についてお教えください。
統合失調症の病因・病態解明を行っています。具体的には発達障害仮説というものがあり、赤ちゃんが母親のお腹の中にいるときに起こる何かしらの要因によって、頭の中の神経系の発達がおかしくなり、統合失調症になるのではと考えられています。以前からネズミではこの仮説はよく研究されておりますが、ヒト神経細胞を用いた発達障害仮説の研究は、ここ数年で始まったばかりです。我々のところでは、統合失調症の患者様由来の皮膚細胞から
iPS細胞を作って神経系細胞に分化させてモデル細胞を樹立し、発達異常が起こるかどうか、そして起こる場合の仕組みはどうなっているのかなどの研究をしています。

ゲノム編集を行う目的は何でしょうか。
統合失調症患者様で同定された遺伝子変異が、本当に統合失調症に関わっているのかを明らかにするためです。
健常人由来細胞の特定の遺伝子をゲノム編集でノックアウトして異常が起こるかどうかを見ています。また逆に、患者様由来細胞の遺伝子変異を修復することで異常が直るかどうかも見たいと考えており、ノックインも検討中です。

弊社のゲノム編集関連製品をお知りになったきっかけは
何ですか。
元々、iPS細胞の培地を探しているときに、タカラバイオ
が扱っているフィーダーフリー用培地のDEF-CSを見つけました。そしてタカラバイオ主催の技術セミナーに参加し、そこでタカラバイオのゲノム編集関連製品を知りました。
A Guide-it Complete sgRNA Screening Systemによるin vitroでのsgRNAの切断効率の確認

他にも、実際にお使いになっているタカラバイオのゲノム編集
関連製品はありますか？
ゲ ノ ム 編 集 後 の 変 異 導 入 効 率 の 確 認 に はGuide-it™
Mutation Detection Kit（製品コード 631448）を使っています。Cas9/gRNAの導入に最初はプラスミドベクターを使っていたのですが、最近はタカラバイオのCas9タンパク質 Guide-it™ Recombinant Cas9 (3 μg/μl) （製品コード
632641）を使っており、以前使っていた他社Cas9タンパク質よりうまくいっています。
B ヒトiPS細胞での変異導入効率の確認結果
ありがとうございました。

-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 12 -

● ゲノム編集効率をざっくり簡単にチェック
変異導入効率をざっくり簡単に確認し、次の詳細な解析に進むかどうかの当たりをつけるキット☑ Guide-it™ Mutation Detection Kit
CRISPR/Cas9、ZFNs、TALENsなどによる変異導入効率を簡単＆迅速に確認できるキットです。
◆ PCRと電気泳動という簡単な手法で変異導入効率を確認◆ 他社同タイプキットより高感度アッセイが可能◆ 阻害物質に強いPCR酵素付きで、動植物組織からの直接PCRが可能◆ 実験系が問題ないか確認できるポジティブコントロール付き■ Guide-it™ Mutation Detection Kitの操作フロー① 細胞ライセートからTerra™ PCR Direct② 変性＆再アニーリングしてGuide-it™ Resolvase
Polymerase Mixを用いて標的配列を直接増幅で処理Guide-it Resolvaseがミスマッチ領域を切断

変異導入部分

③ Guide-it™ Resolvaseによって切断された
ミスマッチDNA

Uncleaved④ アガロースゲル電気泳動による切断フラグメントの確認（切断＝変異導入あり）

Cleavedfragment A←Uncleaved fragment←Cleaved fragment A←Cleaved fragment B

Cleavedfragment B

切断が見られない、もしくは切断バンドが薄い場合は、
変異導入実験の再試行をお勧めします

こんな場合におススメです！

★ 細胞をクローン化しシーケンスする前にゲノム編集効率を確認し、次に進むかどうか
当たりをつけたい

目的の変異導入が起こったかどうかは、例えば細胞であればクローン化し、最終的にシーケンスで確認する必要があります。しかし、そもそも変異導入が全く起こっていない、もしくは効率が著しく低ければどうでしょうか？ クローン化の手間やシーケンスの手間の多くが無駄になってしまいます。
本キットを使えば、ざっくり簡単に変異導入効率が確認できますので、クローン化やシーケンス解析に進むかどうか、それとも最初からやり直すかの判断ができ、効率Upにつながります！
■ 製品リスト製 品 名Guide-it™ Mutation Detection Kit- 13 -｜ ゲノム編集製品ガイド

容 量

製品コード

価格（税別）

25回

631448¥34,000

100回

631443¥98,000

■ Guide-it™ Mutation Detection Kitと他社キットとの比較

Guide-it™

他社キット

Uncleaved
fragment
Cleavedfragment
Cleavedfragment

Cas9 を 発 現 す る プ ラ ス ミ ド と
AAVS1 locusに特異的なsgRNAをコードするプラスミドをトランス
フェクションして48時間培養した293T細胞と、トランスフェクション
していない細胞とを6段階の比率で混合した後、変異検出を行った。
Terra™ PCR Polymerase Mix
を用いてターゲットとなるAAVS1
locusを含む領域を増幅し、PCR
産 物 を 精 製 後 、 Guide-it™
Resolvaseまたは他社キット中の酵素で切断し、電気泳動に供した。
（TB USA社比較データ）

Guide-it™ Mutation Detection Kitの電気泳動パターンはクリアでしたが、他社製品ではスメアを呈しました。
これはミスマッチDNA切断酵素（Guide-it™ Resolvase）の性能差に起因すると考えられます。
この違いが5倍以上の検出感度の差を生み出します！

Q&A
Q1

Guide-it™ Resolvaseは、SNP（1塩基変異）にも働きますか？

A1

Guide-it™ Resolvaseはミスマッチ部分の構造の違いを認識して切断する酵素で、1塩基変異は構造変化が少ないため切断できません。1塩基挿入や1塩基欠失は検出可能です。SNPの検出にはGuideit™ Knockin Screening Kit（製品コード 632659）の使用をお勧めします。

Q2

クローン化した細胞の変異導入の判定に使用できますか？

A2

クローン化した細胞に対して本キットを使用した場合、片アレル変異の場合や、両アレル変異でも異なる変異が入った場合は切断されますが、両アレルに同じ変異が入ったクローンと野生型は切断されません。
本キットはゲノム編集後の細胞集団に変異が含まれるかどうかを確認するためのキットで、クローン化した細胞に使用はお勧めできません。
クローン化した細胞の同定にはGuide-it™ Genotype Confirmation Kit（製品コード 632611）の使用をお勧めいたします。

Q3

キットに含まれるGuide-it™ Resolvaseの別売はありますか？

A3

別売はありません。

Q4

PCR産物を精製した場合、 Guide-it™ Resolvaseの反応はそのまま使用できますか？

A4

PCR産物を精製した場合は、Guide-it™ Resolvase反応時にサンプルに等量の2×Terra PCR Direct
Bufferを加えてご使用ください。

Q5細胞をExtaction Bufferで溶解した抽出液を、保存することはできますか。

A5

Extraction Buffer 1およびExtraction Buffer 2で抽出してPCR-grade waterを加えた抽出液は、－20℃で約6か月保存可能です。

-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 14 -

● 長い一本鎖ノックインドナー用DNA（Long ssDNA）調製キット
CRISPR/Cas9での長鎖ノックイン実験の効率をUp☑ Guide-it™ Long ssDNA Production System v2
PCRと酵素（Strandase）処理という簡単な操作で長い一本鎖DNAが調製できます。
◆ CRISPR/Cas9のノックインドナー用長鎖ssDNA調製キット◆ 0.5～5 kbまでのssDNAが調製可能◆ 独自技術の「Strandase処理」で二本鎖を一本鎖化◆ クローニング操作、ゲル抜き精製不要の簡単プロトコール◆ 10 μgのdsDNAから2～4 μgのssDNAを調製

CRISPR/Cas9で効率よく長鎖ノックイン実験を行うためのポイントの一つは、ドナーDNAを一本鎖DNA（ssDNA）で用意すること（★）です。本キットを使用すると、簡単な操作で0.5～5 kbの長鎖ssDNAが調製できます。
蛍光・薬剤マーカー、loxPサイト、発現カセット、プロモーターなど長鎖DNAのノックイン効率を少しでもUpしたい方はぜひ
お使いください！

★ ssDNAを使うメリットは？
二本鎖DNA（dsDNA）に比べて・・・✔ ランダムインテグレーションが起きにくい。
✔ 特にプラスミドと比べて細胞毒性が低く、ノックイン効率が高い。
✔ バックグラウンドが低い。

プロトコールの概要

P① クローニングやfusion PCRでdsDNAテンプレートを調製➁ リン酸化プライマー（※1）でPCRを行い、鋳型DNAを
増幅 （リン酸化プライマー
は片側のみ）③ Strandase A & B （※2）
で片鎖を消化し一本鎖化※1 別途リン酸化プライマーをご準備いただく必要があります。

④ カラム精製（※2）
を行い、ssDNAが完成！
※2 本キットに含まれます。

PCRエラーが気になる？

いいえ、大丈夫です。キット添付のPCR酵素「PrimeSTAR® Max」は、50万塩基あたりエラーは
わずか10数塩基の高正確性酵素です。ほとんどエラーを心配する必要はありません！
■ Cellartis® hiPSC18を用いたノックイン実験でのdsDNAおよびssDNAドナーテンプレートの細胞毒性比較
Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit（製品コード632635）で合成したsgRNAを、Guide-it™
Recombinant Cas9 (3 μg/μl) （製品コード 632641）と複合体（RNP）を形成させ、エレクトロポレーションで
ヒトiPS細胞にドナーテンプレート添加・非添加条件で導入した。48時間後、細胞毒性を観察した。
dsDNAドナーを用いた場合は、Cas9存在下・非存在下に拘わらず顕著な細胞毒性が認められました。

■ 製品リスト製 品 名Guide-it™ Long ssDNA Production System v2※ センス鎖25回、アンチセンス鎖25回分- 15 -｜ ゲノム編集製品ガイド

容 量

製品コード

価格（税別）

50回 ※632666¥87,000

■ AcGFP1遺伝子のノックインによる目的タンパク質の蛍光タグ付け
A

Promoterless

GAPDH exon 8領域へのAcGFP1遺伝子ノックインを目的として、Guide-it™ Long ssDNA
Production SystemによりドナーssDNAを調製した（パネルA）。

AcGFP1 (～700 nt)

Cas9/sgRNA

B
Negative
control

ssDNA（sense） ssDNA（antisense）

dsDNA

Cas9 & sgRNAなし

変異導入後のHEK293細胞をフローサ
イトメーターで解析した結果、センス、
アンチセンスともssDNAドナーを使用した場合は蛍光が観察された。
一 方 、 dsDNA を 使 用 し た 場 合 は 、Cas9とsgRNAの非存在下でも蛍光が観察され、バックグラウンドが高い問題点が示された（パネルB）。

Cas9 & sgRNAあり

Guide-it™ Long ssDNA Production Systemで調製したssDNAを用いて、蛍光タンパク質によるタグ付けができました。バックグラウンドもほとんどないので、効率のよい目的クローンの取得が可能です！
■ 本製品（v2）と従来製品（v1：終売）とのssDNA作製効率の比較#1

従 来 製 品 Guide-it™ Long ssDNA
Production System （v1）では高純度のssDNAの調製が困難だったいくつかのdsDNAテンプレート（#1～#5）について、本製品（v2）を使用してssDNAを調製し、電気泳動で比較した。

#2

AS

SS

#3

#4

SS

AS

AS

SS

1,500
1,000
500

#5
AS

SS

1. 二本鎖DNA（dsDNA）
2. 従来製品（v1）3. 本製品（v2）
AS：アンチセンス鎖
SS：センス鎖

1,500
1,000
500

すべてのケースにおいて、Guide-it™ Long ssDNA Production System v2では、従来製品に比べて目的外の産物の少ないクリアなssDNAのバンドが確認でき、より完全で均一な選択的分解ができていることが示唆されました。

-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 16 -

● Cas9タンパク質用抗体／ゲノムワイドスクリーニングシステム
組換えCas9タンパク質の高感度検出が可能な抗体☑ Guide-it™ Cas9 Polyclonal / Monoclonal Antibody
CRISPR/Cas9に用いるStreptococcus pyogenes由来の組換えCas9タンパク質を検出できます。
◆ 組換えCas9タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体／マウスモノクローナル抗体◆ ポリクローナル抗体はwild-type Cas9だけでなくバリアントも認識◆ 高感度：ウェスタンブロッティングにより、わずか 0.5～1 ngの組換えCas9が検出可能■ Guide-it™ Cas9 Polyclonal Antibodyを用いたrCasタンパク質の検出 〔ウェスタンブロッティング〕
kD

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10

250
150
100

レーン 1： HT1080細胞ライセート（3.5×104 cells）
2： HEK293細胞ライセート（3.5×104 cells）
3： rCas9 protein 0.15 ng
7： rCas9 protein
4： rCas9 protein 0.30 ng
8： rCas9 protein
5： rCas9 protein 0.625 ng
9： rCas9 protein
6： rCas9 protein 1.25 ng
10： rCas9 protein

75

50
Untransfected
cell lysate

0.15～20 ngの組換えCas9（rCas9）タンパク質を電気泳動後、ブロッティング
し、Guide-it™ Cas9 Polyclonal Antibody（1:1,000 希釈）を用いて検出した。
二次抗体はHRP-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody（1:5,000希釈）を使用し、ECL試薬で検出した。ネガティブコントロールにはHT1080、HEK293細胞の細胞ライセートを用いた。

2.5 ng5.0 ng10.0 ng20.0 ng

rCas9

製 品 名

容 量

製品コード

価格（税別）

Guide-it™ Cas9 Polyclonal Antibody

100 μl632607¥45,000

Guide-it™ Cas9 Monoclonal Antibody (Clone TG8C1)

100 μg632628¥45,000

ヒト細胞株で表現型の変化に関連する遺伝子をゲノムワイドにスクリーニングできるシステム☑ Guide-it™ CRISPR Genome-Wide sgRNA Library System◆ CRISPR/Casのノックアウトを利用した関連遺伝子特定のためのスクリーニングシステム◆ Cas9とsgRNAの導入にレンチウイルスを使用しており、幅広い細胞で効率の良い導入が可能◆ プール型なので簡単に網羅的な解析が可能◆ 約19,000種類の遺伝子に対し、オフターゲットを考慮した4種類のsgRNA（約76,000種類）が設計済み■ スクリーニングのフロー
Cas9-レンチウイルス感染
スクリーニング（ex. 抗がん剤処理）目的細胞

Cas9-sgRNA導入細胞

ゲノム抽出・ライブラリー調製

生き残った細胞sgRNA-レンチウイルス感染（蛍光タンパク質mCherry遺伝子を含む）

製 品 名

容 量

製品コード

価格（税別）

Guide-it™ CRISPR Genome-Wide sgRNA Library
System

5スクリーニング

632646¥550,000

Guide-it™ CRISPR Genome-Wide sgRNA Library
NGS Analysis Kit ※10回

632647¥111,000※ NGS用ライブラリー調製のために必要です。

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イルミナ社次世代シーケンサー
で細胞ゲノム上に残ったsgRNA
配列を解析し、ノックアウト遺伝
子（関連遺伝子）を特定｜ ゲノム編集製品ガイド

よくあるご質問集

ゲノム編集実験に関してよくご質問いただく内容を、「Q&A」
としてまとめました。ぜひご一読ください！
Q1. Cas9タンパク質によるゲノム編集はメリットが多いが、プラスミドベクターでの導入にメリットはないの？
A1. いいえ、Cas9タンパク質の導入は難しくてもプラスミドなら入るケースはありますし、sgRNA配列さえクローニング
すれば1ベクターでCas9、sgRNA両方の導入ができるというお手軽さも魅力です。タカラバイオでは、1ベクターでCas9とsgRNAの両方を発現でき、さらに蛍光マーカーを搭載したプラスミドGuide-it™ CRISPR/Cas9 System (Green) / (Red)（製品コード 632601 / 632602）をご用意しています。 とにかく簡単にまずはやってみたいときには、プラスミドの使用をおススメします。

Q2. オフターゲットによる変異が入ったかどうかの確認はどうすればいいの？
A2. 全ゲノムに対して、オフターゲット変異が入ったかどうかを正しく評価することは非常に困難です。ゲノム編集後にオンターゲット配列以外に変異が入っていたとしても、突然変異に因る可能性もあるからです。ゲノム編集を医療に応用する場合はオフターゲットリスクをシビアに検証する必要がありますが、そうでない場合、予めターゲット配列と相同性の高い領域をピックアップしておき、そこに変異が入っていなければオフターゲット変異が入った可能性は低いと判断することが多いようです。
少し話が変わりますが、変異導入実験を行って得られた表現型の変化がオフターゲットに因るものかどうかを確認するには、同一ターゲット遺伝子に対して複数のsgRNAを設計して変異導入実験を行い、同じ表現型が得られればオフター
ゲットに起因する可能性は低いと考えられます。

Q3. 各アレルにきちんと変異が入ったかどうかを調べるにはどうしたらいいの？
A3. 培養細胞を使ってゲノム編集を行う場合、細胞1個1個に対して独立して変異が入りますが、さらに各アレルへの変異導入も独立して起こります。つまり、2倍体であれば変異無し／変異無し、変異有り／変異無し、変異有り／変異有りのパターンが生じる可能性があります。どのパターンかを調べるためには、細胞をシングルクローン化した後に、TAク
ローニングなどで片アレル由来のフラグメントが入ったプラスミドを調製・クローン化し、シーケンス解析を行います。経験的に、1アレル当たり4プラスミドクローンをシーケンスすれば十分な場合が多く、2倍体であれば8プラスミドクローンをシーケンスすれば、その細胞のアレルパターン情報が得られると考えています。

Q4. 色々試したが、CRISPR/Casでなかなか変異がうまく入らない。どうすればいい？

A4.

CRISPR/Casは非常にシンプルなシステムですが、変異導入がうまくいかない原因として、色々なファクターが考えられます。そこでまずお勧めするのは、変異導入がちゃんと行える系を構築することです。sgRNA配列は変異導入がうまくいくかどうかの重要なファクターの一つですが、いきなりご自身のターゲット配列用にsgRNA設計をして実験を行うのではなく、文献等でノックアウトが起こった実績のあるsgRNA配列を使用して実験を行います。これで宿主のターゲット配列に対して変異導入が起こればワークする系が構築できたことになりますし、変異導入が起こらなければ、実験手法に問題がある可能性が非常に高いということになります。ワークする系が構築できた上で、ご自身が設計した
sgRNA配列を使用して実験を行い変異が入らなければ、sgRNA配列に問題があることが考えられます。このようにワークする系を構築しておけば、うまくいかなかった場合の原因を特定しやすくなります。
また、ノックインはノックアウトに比べて成功率が低い場合が多いので、特にいきなりご自身のターゲットに対して実験を行うのではなく、ワークする系を構築されることを推奨いたします。

-2-｜ ゲノム編集製品ガイド - 18 -

● 関連製品
エキソソーム様小胞を利用してCreリコンビナーゼを細胞に直接導入☑ CRE Recombinase Gesicles◆ プラスミドやウイルスベクターを用いた遺伝子導入より簡単◆ 高活性のCreリコンビナーゼを確実、効率的に導入

CRE Recombinase Gesicleとは？
CRE Recombinase Gesicleは、その内部に高濃度のCreリコンビナーゼ
酵素タンパク質を包含したエキソソーム様小胞です。
■ 原理① 293T細胞の細胞膜上にグリコプロテインが生成すると細胞内からエキソソーム様小胞の形成が誘導され、Gesiclesが放出されます。
② iDimerize技術によりCreリコンビナーゼは赤色蛍
光タンパク質CherryPickerと結合し、Gesicles内に包含されます。
③ 細胞からGesicleを取り出し、哺乳類の培養細胞に加えると、Gesiclesは細胞膜と融合し、Creリコ
ンビナーゼを細胞内に放出します。
④ Creリコンビナーゼは核移行シグナルを持っているため核に輸送され、細胞ゲノム上でloxPサイト
間の組換えを起こすことが可能となります。
さ らに 、 Cre リ コ ン ビ ナー ゼの 細 胞 へ の 導 入 を
mCherryの 蛍光によ りモ ニ ターすることも 可能です。
＊CherryPicker蛍光タンパク質：赤色蛍光タンパク質mCherryとトランスフェリンレセプター膜アンカードメインの融合タンパク質■ さまざまな細胞におけるCRE Recombinase GesicleによるZsGreen1 レポーターアッセイの実験例
A ZsGreen1 Reporter Assay for Cre Recombinase Activity

B

HepG2
0 µl

製 品 名

CRE Recombinase Gesicles

20 µl

pLVX-LoxP-ZsGreen1は、loxPで挟まれたストップ
コドンカセットによりZsGreen1 cDNAとEF1αプロ
モーターが分断されており、Creリコンビナーゼによってストップコドンカセットが取り除かれると、
ZsGreen1が高発現する（パネルA）。
HepG2細胞にpLVX-LoxP-ZsGreen1を導入し、蛍光顕微鏡によりZsGreen1の発現を観察した（パネ
ルB）。
容 量

製品コード

価格（税別）

200 μl

631449¥92,000

・イルミナ社とは、Illumina, Inc.（本社：米国カリフォルニア州サンディエゴ）の日本法人であるイルミナ株式会社（本社：東京都港区）をいいます。
・本パンフレットで紹介した製品はすべて研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。
・ライセンスなどに関する最新の情報は弊社ウェブサイトをご覧ください。
・本パンフレットに記載されている会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みもしくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。
・本パンフレット記載の価格は2023年12月1日現在の希望小売価格です。価格に消費税は含まれておりません。

2023年12月修正N

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