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浦上財団研究報告書

Vol.29（2022）＜平成 29 年度助成＞

受容体を介したクルクミンの新規作用機構に関する研究
奥山真衣・原田直樹（大阪府立大学 生命環境科学研究科）

は 95% air、5% CO2、98% 湿度、37℃のインキュ

1．背景・目的

ベーター内で行った。細胞の継代は、PBS（−）で洗食品成分は様々な生理作用を発揮するが、多くの浄した後、0.25% トリプシンと 0.02% EDTA を含む場合、その詳細な作用メカニズムは不明である。ウPBS（−）で処理して細胞を剥がし、新鮮な培地に懸コン（Curcuma longa ）に含まれるクルクミンは、濁することにより行った。

動物レベルでの生理作用に関する多くの報告がある。糖尿病予防作用においては、複数のランダム化

2．
2．GPCR 発現ベクターの作製比較試験を統合したメタアナリシスにおいても有益

ヒ ト GPCR cDNA が 組 み 込 ま れ た entry clone性が示されている 。一方で、in vitro 試験において（258 種類）は、国立研究開発法人 産業技術総合研

クルクミンが疑似陽性の反応を示す可能性のある物究所の五島直樹先生から分与いただいた。Gateway、クルクシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いて GPCR

ミンの健康作用に関するメカニズムの詳細は混沌とをコードする cDNA を entry clone から destination

した状況である。我々は、クルクミンが作用する標vector（pcDNA3.2/V5-DEST）にサブクローニング的分子が明確でないことが、このような議論を生じして、哺乳類 GPCR 発現ベクターを得た。

1)質であると注意喚起する論文が報告され

2, 3)させる 1 つの要因となっているではないかと推測する。

2．
3．トランスフェクション

ヒトに約 800 種類存在する G タンパク質共役型

HEK293FT 細胞を、2%FBS を含み抗生物質を含ま受容体（GPCR）は、それぞれのリガンドと結合後ない DMEM 培地に懸濁し、48 well プレートに播種にシグナル伝達を活性化することで、血糖調節を含して 24 時間培養した。Opti-MEM（Thermo Fisher

む様々な生理作用調節に関係する。本研究では、クScientific）に、p4xCRE-TATA-Luc2P 4)、p3xSRE-TATA-

ルクミンの生理作用発現メカニズムを解明すること

Luc2P または p4xCRE-3xSRE-TATA-Luc2P（p4xCRE-を目的に、クルクミンによって活性化する GPCR が

TATA-Luc2P ベクターの CRE サイトの下流に血清応存在するかスクリーニングを行った。

答配列を 3 つタンデムに含む）のいずれかを 0.075µg と 0.05 µg の pGL4.74[hRluc /TK]（Promega）お2．方法

よ び 0.075 µg の GPCR 発 現 ベ ク タ ー を 混 合 し た
DNA 混合液を調製し、トランスフェクション用に調2．
1．細胞培養製した polyethylenimine（0.4 µL）を加えた。このHEK293FT 細胞の培養には、10% ウシ胎児血清混合液を用いて 24 時間後トランスフェクションを（FBS）および 100 units/mL ペニシリン G、100 µg/

行 っ た 後、 ク ル ク ミ ン や 関 連 化 合 物 を 添 加 し て

mL ス ト レ プ ト マ イ シ ン 硫 酸 塩 を 含 む Dulbecco′s（DMSO 終濃度 0.1%）、さらに 4 時間培養した。

modified Eagle′s medium（DMEM）を用いた。培養

受容体を介したクルクミンの新規作用機構に関する研究

25の両方のシスエレメントをもつレポーターベクター

2．
4．ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ル シ フ ェ ラ ー ゼ レ ポ ー タ ー ア ッ セ イ は、Dual-と GPCR 発現ベクターを HEK293FT 細胞に高発現さLuciferase Reporter Assay System Kit（Promega）

せて、ルシフェラーゼレポーターアッセイによるスと 20/20n Luminometer（Promega）を用いて行った。

クリーニングを行った。そして、応答が見られた

firefly ルシフェラーゼ活性の値を Renilla ルシフェ

GPCR については、CRE または SRE の一方のみをもラーゼ活性の値で割った値を相対化したものをつレポーターベクターを用いて検証した。その結果、

relative light units とし、グラフ化した。

ある GPCR（curGPCR とする）の高発現下でクルクミン依存的に SRE を介したレポーター活性の上昇が認められた（図 2）。

2．
5．統計解析
統計解析には JMP statistical software version 8.0.1

curGPCR と既知リガンドの結合に重要であると報（SAS Institute）を用いた。データの平均値は± SD

告されている Lys および Glu サイトを Ala に置換しで表した。Student′s t-test（2 群比較）または Tukey′sた変異体 curGPCR（K/A）、curGPCR（E/A）高発現test（多重比較）を用いて解析した。p < 0.05 をもっ下でクルクミンを添加し、ルシフェラーゼ活性を検て統計学的有意とした。

討した。その結果、野生型 curGPCR 高発現下で見られたクルクミンによる SRE レポーター活性の上昇は、K/A、E/A 高発現下では見られなかった（図 3）。

3．結果

curGPCR の活性化に及ぼすクルクミン関連化合物
GPCR を介したシグナル伝達は、GPCR が共役す

活性をレポーターアッセイで評価した結果、クルクる Gαサブユニットの種類によって異なる（図 1）。

ミンによる作用が最も強く、ビスデメトキシクルク

また、複数の経路を活性化する GPCR も存在する。

ミンにも活性化作用が認められた（図 4）。一方で、そこで、クルクミンによって活性化される GPCR をテトラヒドロクルクミンとフェルラ酸には活性促進探索するために、プロモーター領域に CRE と SRE作用は認められなかった。

図1

GPCR スクリーニング概要

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浦上財団研究報告書

図2

curGPCR 高発現下でクルクミンがSRE レポーター活性に与える影響

図4Vol.29（2022）

図3

GPR55 変異体高発現下でクルクミンがSRE レポーター活性に与える影響

クルクミン関連化合物が SRE レポーター活性に与える影響た。curGPCR は、膵β細胞や腸管 L 細胞で発現して4．考察と今後の展望機能するという報告も存在することから、クルクミン が curGPCR を 活 性 化 す る こ と で イ ン ス リ ン や本研究では、クルクミンが GPCR を介して生理作GLP-1 の分泌が増加して、2 型糖尿病予防作用を発用を発揮するか否かを明らかにするために、GPCR揮するという機構が考えられる。既知リガンドとのを高発現させたエクスプレッションスクリーニング

相互作用に必要な curGPCR のアミノ酸を置換した場のシステムを構築した。そして、スクリーニングに合、クルクミンは変異体 curGPCR を活性化させなよりクルクミンによって活性される GPCR を見出しかった。この結果は、クルクミンが直接 curGPCR の受容体を介したクルクミンの新規作用機構に関する研究

27リガンドとして作用する可能性を強く示唆する。ま参考文献

た、クルクミンが生体内で代謝されて産生するフェ1) Melo ISV, Santos AFD, Bueno NB. Curcumin orcombined curcuminoids are effective in lowering thefasting blood glucose concentrations of individuals
with dysglycemia: Systematic review and metaanalysis of randomized controlled trials. Pharmacol .
Res ., 128, 137-144, 2018.
2) Nelson KM, Dahlin JL, Bisson J, Graham J, Pauli GF,
Walters MA. The essential medicinal chemistry ofcurcumin. J . Med . Chem ., 60, 1620-1637, 2017.
3) Baker M. Deceptive curcumin offers cautionary talefor chemists. Nature , 541, 144-145, 2017.
4) Horiuchi H, Usami A, Shirai R, Harada N, Ikushiro S,
Sakaki T, et al. S -Equol activates cAMP signaling at
the plasma membrane of INS-1 pancreatic beta-cells
and protects ag ainst streptozoto cin-induced
hyperglycemia by increasing beta-cell function inmale mice. J . Nutr ., 147, 1631-1639, 2017.

ルラ酸やテトラヒドロクルクミンは curGPCR を活性化させなかったこと、類縁体であるビスデメトキシクルクミンよりもクルクミンによる活性化作用が強かったことについては、リガンドとしての結合にケト−エノール互変異性による構造変化が関係する可能性も考えられる。
謝

辞
本研究にご支援をいただきました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に深謝いたします。また、
GPCR の cDNA が組み込まれた entry clone を分与いただきました国立研究開発法人 産業技術総合研究所の五島直樹先生に厚く御礼を申し上げます。

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浦上財団研究報告書

Vol.29（2022）

Novel G-protein-coupled receptor mechanism underlying
the action of curcumin
Mai OKUYAMA, and Naoki HARADA
Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture UniversityAbstract
C u r c u m i n , a t u r m e r i c (C u r c u m a l o n g a ) c o m p o u n d , e x e r t s m u l t i p l ep h y s i o l o g i c a l a c t i o n s i n h u m a n s . H o w e v e r, t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m sunderlying the action of curcumin remain to be elucidated. In the present study,
we identified a G-protein-coupled receptor (GPCR) that is activated by curcumin.
By using a luciferase reporter assay, we performed expression screening of 258
human GPCR expression vectors, following transfection of HEK293FT cells withthe vectors and a luciferase reporter vector containing both cAMP-response
elements and serum response elements. The cells were then stimulated withcurcumin, and the resulting luciferase activity was determined. Luciferase
activity was induced by curcumin when curGPCR was overexpressed, indicatingthat curcumin activated curGPCR. Luciferase activation involved the activationof serum response elements. In addition, curGPCR with point mutations at
putative ligand-binding sites was not activated by curcumin. Curcumin activatedcurGPCR more strongly than bisdemetoxycurcumin. The curcumin metabolites,
tetrahydrocurcumin and ferric acid did not activate curGPCR. These results
strongly suggest that curcumin activates curGPCR as a ligand.