Issue 4
October, 2014

Isolation of drug target protein (3)Histone Deacetylase Inhibitor【Vorinostat】
Inhibitor
Summary
ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) とはクロマチン構造における主要な構成因子である主要な構成因子であるヒストンの脱アセチル化を行う酵素であり、Vorinostat (SAHA) はHDAC阻害剤のひとつとして知られています。
阻害剤のひとつとして知られています。

O

H
N

今回、ある条件下におけるVorinostatのターゲットタンパク質を分離する実験を行ったので紹介します。のターゲットタンパク質を分離する実験を行ったので紹介します。

OHN
H

本実験ではFGビーズ(NHSビーズ) へVorinostatアミノ化誘導体を固定化し、アミノ化誘導体を固定化し、HeLa細胞抽出液からO結合タンパク質をアフィニティ精製しました。
その結果、いくつかの結合タンパク質が精製され、ウェスタンブロッティングによりその結果、いくつかの結合タンパク質が精製され、ウェスタンブロッティングにより4種類のHDACが、

Vorinostat

MS解析によりECHS1 (Enoyl CoA hydratase, short chain 1) が同定されました。
FG beadsに固定化する化合物量によって精製される結合タンパク質の種類や量は変化するので、に固定化する化合物量によって精製される結合タンパク質の種類や量は変化するので、条件を変えながら検討することが必要となります。

Experimental Information
VorinostatはFGビーズに固定化するのに有効な官能基を持たないため、ビーズに固定化するのに有効な官能基を持たないため、Vorinostatアミノ化誘導体を合成しました。
誘導体を合成する場合は、化合物の活性に重要でない位置に新たに官能基を導入したものを合成します。
OHN
H
NOHO

N
H

O

NHS beads

Vorinostat immobilized beads

Vorinostat amino derivativeFig.1 Immobilization of Vorinostat amino derivative on NHS beads

Result(kDa)
1．FGビーズを使用して幾つかの結合タンパク質が回収されました。
Vorinostatで競合溶出させることによって回収されるタンパク質は、200

それらのタンパク質が特異的にVorinostatと結合することを示して

116
97.4います。
ウェスタンブロッティングを実施したところ、右図の4種類のHDACが確認が確認

66できました。更にMS解析を実施したところ、ECHS1が同定できました。
が同定できました。
4531

M

In

-+ + : Immobilized Vorinostat- + : Vorinostat Elution

HDAC1
HDAC2
HDAC3
HDAC8

ECHS1

21.5
14.4
6.5

TAMAGAWA SEIKI CO., LTD.
TAMAGAWATAMAGAWA SEIKI
SEIKI CO., LTD.

http://www.FGbeads.com
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Isolation of drug target protein
aterials and method
MMaterials and method■Materials
1. Vorinostat amino derivative
2. NHS beads
3. HeLa cell extracts (cytosolic fraction) – 3mg/ml
4. Binding &Washing Buffer (20mM HEPES-NaOH(pH7.9), 100mM KCl,
1mM MgCl2, 0.2mM CaCl2, 0.2mM EDTA, 10%(v/v) glycerol,
0.1% NP-40, 1mM DTT, 0.2mM PMSF)
5. Elution Buffer (0.0625M Tris-HCl (pH6.8), 0.005% BPB, 2% SDS,
10% glycerol, 5% 2-mercapto ethanol)
6. Vorinostat
7. Rabbit polyclonal anti-HDAC1 (from Santa Cruz Biotechnology)
8. Rabbit polyclonal anti-HDAC2 (from Santa Cruz Biotechnology)
9. Rabbit polyclonal anti-HDAC3 (from Santa Cruz Biotechnology)
10. Rabbit polyclonal anti-HDAC8 (from Santa Cruz Biotechnology)
11. Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (from GE Healthcare)
12. Starting Block™ (TBS) Blocking Buffer (from Thermo scientific)
13. TBS-T buffer (137mM NaCl, 2.68mM KCl, 25mM Tris-HCl, pH7.4,0.1w/v% Tween-20)■Methods 1 (Immobilization)
1. Apply
0.5mg NHS beads and 0.3mM vorinostat amino derivativein 100ul DMF
0.5mg NHS beads and NO vorinostat amino derivativein 100ul DMF (Negative Control)
2. Reaction
1) Immobilization
70minat r.t.
2) Masking
Inactivate unreacted NHS according to recommended conditions.

beads information■■FGProduct name

NHS beads

Product number

TAS8848N1141

Storage temperature-20℃

Storage buffer

Isopropyl alcohol

Size of beads

190nm ± 20nm

Functional groups

200 - 300nmol/mg

3 (Western blotting)■■Methods
1. Perform SDS-PAGE and transfer the protein to a PVDF membrane.
2. Block the membrane with the blocking buffer for 15min at room
temperature.
3. Dilute the anti-HDAC antibody with the blocking buffer to 1/200.
4. Incubate for 60min at room temperature.
5. Dilute the secondary antibody with the TBS-T buffer to 1/1000.
6. Incubate for 60min at room temperature.
7. Wash the membrane with TBS-T buffer three times.
8. Detect with a chemiluminescence substrate.

■Methods 2 (Affinity purification)
1. Wash
Wash beads with washing buffer 3 times at 4oC (on ice).
2. Add sample solution
Add 1000ul HeLa cell extracts to beads.
3. Reaction
Incubate for 240min at 4oC.
4. WashRemove sample solution.
Wash beads with washing buffer 3 times at 4oC (on ice).
5. Elution
Vorinostat elution : Add 40ul elution buffer and resuspend beads.
Boil for 5min at 98oC and remove beads.
Vorinostat elution : +Add 30ul of 25mM vorinostat in washing buffer and resuspendbeads.
Place the tube on ice for an hour to allow bound proteinsto elute by tapping at intervals.
After spin down, separate magnetically.
Transfer the supernatant to a new clean tube.
Add 10ul of 4×elution buffer to the tube.
Boil for 5min at 98oC.
6. Analyze the samples by SDS-PAGE and silver stainingTAMAGAWA
SEIKI
CO.,
LTD.
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SEIKI
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LTD.

4 (MS)■■Methods
1. Excising the bands from the gel.
2. Wash the band pieces, then dry the band pieces.
3. Add 500ul/band of 10mM DTT/25mM NH4HCO3.
4. Incubate for 60min at 56℃.
5. Add 500ul/band of 55mM iodeacetamide/25mM NH4HCO3.
6. Incubate for 60min at room temperature.
7. Wash the band pieces with 200ul of 25mM NH4HCO3 for 10min.
8. Wash the band pieces with 500ul of 25mM CH3CN/NH4HCO3(50:50 v/v) for 10min.
9. Dry the band pieces.
10. Add 10ul/band of 10ug/ml trypsin in 25mM NH4HCO3.
11. Incubate overnight at 37℃.
12. Add 50ul/band of 25mM CH3CN/trifluoroacetic acid/ultrapure
water (50:5:45 v/v).
13. Incubate for 30min at room temperature.
14. Transfer supernatant to a new clean tube.
15. Dry the peptides in the tube.
16. Injection on the MS.

http://www.FGbeads.com
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