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シートラマン顕微鏡： 高速顕微分光イメージング技術
Israel Rocha-Mendoza1,2, Jacob Licea-Rodriguez1,3, Monica Marro1, Omar E. Olarte1,4, Emilio J. Gualda1, and, Pablo
Loza-Alvarez1*
1 ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, Spain
2CICESE; 3Cátedras CONACYT-CICESE, Ensenada, México; 4 Universidad ECCI, Bogotá, Colombia*email: pablo.loza@icfo.eu
ラマン分光は、材料や細胞、組織に関する化学組成情報を収集するための手法である。ラマン過程は、試料に含まれる分子の振動に伴う励起光の散乱によってもたらされ、生物化学的成分を豊富に含んだ試料から分子固有の振動状態に関するコントラスト像をラベルフリー（蛍光標識不要）で観察することができる。このように、試料に適合する分子の分布状態に関する２次元情報を取得することができるのは、生物医科学の分野にとって非常に魅力的なことである。しかし、ラマン散乱過程における効率は極めて低く、それゆえ、単一２次元画像を取得するのに時間（数分から数時間）がかかる。このため、ラマンイメージングによるin vivo（生体内）研究や容量分析による情報の取得は、実質上、不可能だ。本アプ
リケーションノートでは、干渉計チューナブルフィルタ及びCobolt製小型MLD 638nmレーザーを用いたデジタルスキャン光シート顕微鏡（DSLM）をベースにした高速2次元ラマンイメージング法[1]に対するアプローチ（近刊）について紹介する。

図１：光シート型ラマン顕微分光（LiShMS）の配置図
GM：XY軸ガルボミラー / EO：励起用対物レンズ / CO：集光用対物レンズ /SL：走査レンズ / TL：チューブレンズ / TF：波長可変フィルタ

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分光器を使用しないラマンイメージング
デジタルスキャン光シート顕微鏡（DSLM）システムは、ラマン過程でデジタルスキャンされた光の平面（図１参照）を用いて試料の単一平面を励起するというものである。顕微鏡に取り付けられた集光用のアーム部を介したCMOSカメラで、ラマン画像として生成された2次元情報を撮像する。システムを全く修正しないと、このようなシステムは、各画素が統合されたラマン情報をスペクトル分解能をもたずに反映する画像を記録してしまう。ラマン情報をスペクトル分解するためには、干渉計チューナブルフィルタ（TF）を用いる。
チューナブルフィルタの角度方向を変えることで、鋭いピーク特性をもつ波長の遷移を連続的にシフトすることができる。

図２：光シート型ラマン顕微分光（LiShMS）によるイメージング。Cobolt製638nmレーザー（出力：20mW）を用いて、異なる種類の有機溶媒中で解析を行った。
a)ナイフエッジ式プロファイラによるスキャン方法
でのスペクトルの計測
b)微分処理を行った後のラマンスペクトルc)共焦点顕微ラマン分光システムでの測定で得た上記と同じ種類の有機溶媒中におけるラマンスペクトル※ Rocha-Mendozaほか著 Biomedical Optics Express
第６巻９号 3449-3461頁(2015)より転載
これにより、チューナブルフィルタの角度の位置を変える際に、分子振動を示すラマンバンドの強度分布を

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その後、ラマンスペクトルを回復するために、簡単な微分演算を画像に適用する（図２b参照）。この手順は、画像全体に対して画素ごとに行われるので、被照射面に対するスペクトル的に分解された３次元ラマンマッピングが可能となり、得られるラマンスペクトルは共焦点顕微ラマン分光システムでの測定で得られるスペクトルとよく一致している（図２c参照）。

高速３Dハイパースペクトルラマン画像の取得
C-H伸縮モードのピークが現れる領域にて、寒天に浸漬させたポリスチレンビーズ（PS）と脂肪滴（LF）のラマンスペク
トルを分解するためにCobolt製の小型CWレーザー（638nm）を用いて、固体試料を３次元画像化するための技術を実現する可能性を明らかにした（図3とその説明を参照）。
さらに、線虫C.elegansを使って、生きたままの生物試料を研究するための技術を用いる可能性をも示された（図4）。
このような全ての３Dラマン情報（300 x 300 x 180 μm3）を抽出するのに要した時間が約５分であったことは言及に値する。

図３：線虫C.elegansの光シート型３次元ラマン顕微分光a) ラマンバンドをマーカーとして同定するのに用いられる標準試料ポリスチレン（PS）ビーズの明視野像b) 同じくポリスチレン（PS）ビーズの統合ラマン画像c) 2910cm-1においてスペクトル分解したC.elegansのラマン画像（３次元直交座標系で表示）d) 2960cm-1においてスペクトル分解したC.elegansのラマン画像（３次元直交座標系で表示）縮尺：100 μm※ Rocha-Mendozaほか著 Biomedical Optics Express
第６巻９号 3449-3461頁(2015)からの引用

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おわり に小型のCob olt製レ ーザーを 用いた光シート 手法
により 、試料のC-H伸縮モード のピ ーク が現れる
領域にてスペクト ル分解さ れた高速２ 次元及び３ 次元ラ マン イメ ージングを 行っ た。本レ ーザーの画像取得の速度は、共焦点顕微ラ マン 分光システムの速度より も 最大４ 倍と なる [1]。

参考文献
1. I Rocha-M en d oza, J. Licea-Rod rig uez, M . M arro,
O.E. Olarte, M . Plata-San chez, P. Loza-Alvarez『 CW レ ーザーと 波長可変フィ ルタ を 用いた光シート型自発ラ マン 顕微鏡』Biom ed ical Op tics Exp ress誌
第６ 巻９ 号 3449-3461頁(2015).

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