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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）＜平成 26 年度助成＞

ポリフェノール類のウイルス性子宮頸癌抑制効果
芳賀

猛（東京大学大学院 農学生命科学研究科）

ルの経口摂取で子宮頸部の HPV が排除され病変が1. 背景・目的改善されるという報告もある 8,9）。また、細胞レベル女性で最も多い癌の一つである子宮頸癌の原因がヒトパピローマウイルス（HPV）であることが明らでの増殖抑制の報告もあるが、その機序については不明な点が多い。

かとなり、癌化を誘導しやすい高リスク型 HPV を

こうした背景から、本研究では、代表的なポリフェ標的にした子宮頸癌ワクチンが我が国でも実用化さノール類の一つであるクルクミンを用いて、HPV 感れている。しかしこのワクチンは、HPV 感染後には染により癌化した細胞の増殖抑制を解析する。さら効果がないことや対象となる HPV の型も限定されにその過程において、発癌に関与する因子や細胞のていることなど、課題がある。高リスク型 HPV は、メチル化状態の変化を解析することで、ポリフェ

持続的な感染と、それに伴う癌関連のウイルス蛋白ノール類のウイルス性発癌抑制効果と、その分子生である E6 および E7 の高発現により、上皮細胞の癌物学的メカニズムを探ることを目的とする。

抑制因子の働きを抑えることで発癌を誘導する。しかし疫学的および分子生物学的研究により、悪性化

2. 材料と方法には追加の因子が必要であり、これまで我々もサイトカインや特定の染色体変異が HPV 疾患の悪性化に関与することを示してきた。

2.1. 細胞増殖抑制試験
代表的なヒト子宮頸癌細胞である HeLa（HPV181~3）

近年、エピジェネティックな変化も発癌に関連す型 陽 性 ）、SiHa（HPV16 型 陽 性 ）、CaSKi（HPV16ることが明らかになりつつある 。DNA のメチル化型 陽 性 ）、C33a（HPV 陰 性 ） の 4 株 を 用 い た。 そは最も研究が行われているエピジェネティック修飾の う ち 特 に HeLa 細 胞 を 用 い て、 詳 細 な 解 析 をの一つであり、シトシンとグアニンが隣り合った二行 っ た。 ク ル ク ミ ン 粉 末 [1,7-bis（4-hydroxy塩基配列（CpG）のシトシン塩基に起こる。DNA メ-3-methoxyphenyl）-1E-heptadiene-3, 5-dione]

チル基転移酵素により、シトシン塩基が変換された（Cayman Chemical Company） を DMSO に 溶 解 し、5-メチルシトシンは、遺伝子発現に関与する転写因40 mM のクルクミン DMSO として遮光下で室温保子タンパクが結合する部位を物理的に遮断したり、存した。クルクミンは水溶液中で分解しやすいため、クロマチン構造を変化させて転写を阻害したりする

クルクミン DMSO は使用直前に培養用メディウムにことで、遺伝子発現に重要な影響をもたらす 。子添加した。

4）

5）

宮頸癌においては、メチル化状態が悪性化と相関す

増 殖 抑 制 試 験 は、1.2 × 106 個 の HeLa 細 胞 をるとの知見が蓄積され、バイオマーカーの有力候補

10cm シャーレで 20 時間、前培養を行った後、実。

験に用いた。Control 用シャーレには DMSO を 12.5

一方、ポリフェノール類の抗ウイルス効果や癌抑µL 添加し、他のクルクミン添加の培養液も、同じ制効果についてはよく知られており、ポリフェノーDMSO 濃度となるように調整した。試験開始時と、として注目されている

6,7）

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24 時間および 48 時間後に、control と各クルクミ

従 っ て DNA を Bisulfite 処 理 し た。Bisulfite（ 重 亜ン濃度のシャーレの総細胞数、生細胞数、生存率を、硫酸ナトリウム）を含む CT Conversion Reagent に

全自動より一本鎖 DNA 上のシトシンをスルホン化した後、Trypan Blue（BIO-RAD）染色後に、TC20TMセルカウンター（BIO-RAD）により測定した。

加水脱アミノ化反応し、引き続き脱スルホン化することでウラシルに変換した。

2.2. 定量 RT-PCR
HeLa 細 胞 か ら 抽 出 し た RNA を 用 い て、Prime

2.4. RAR βのメチル化特異的 PCR 解析

RT reagent Kit（TaKaRa）のプロトコール

クルクミンで変化が見られたとの報告があるヒトに従い、オリゴプライマーによる cDNA 合成を行っ

癌抑制遺伝子 RAR βのメチル化状態 13）を調べるた

た。解析に用いたプライマーは表１に示す。プライめ、メチル化特異的 PCR を行った。解析に用いたプマー 18E6_F/R 10）により HPV18 型 E6、プライマーライマーは表２に示す 13）。まず、HeLa 細胞、SiHa

18E7_F/R 10）により HPV18 型 E7、また、プライマー細胞、CaSKi 細胞、C33a 細胞の４種の細胞をそれにより、ヒトの癌抑制遺伝子である

ぞれ 10 cm シャーレで培養した後、QIAamp DNA

RAR βの cDNA を増幅した。内因性コントロール

Mini Kit（QIAGEN）にて DNA を抽出した。Bisulfite

として、ヒトβアクチンの cDNA を増幅するプライ処理をした DNA を用いて、メチル化特異的プライを使用した。定マーあるいは非メチル化特異的プライマーにより

量 PCR は、Thermal Cycler Dice Real Time System

PCR を行い、それぞれの産物の量を電気泳動後のバTP800（TaKaRa）で解析した。

ンドで確認をした。

2.3. Bisulfite 処理

2.5. HPV の URR についての PCR 解析

ScriptTM

RAR β _F/R

11）

マー、Human β -actin_184F/R

12）

HeLa 細 胞、SiHa 細 胞、CaSKi 細 胞、C33a 細 胞解析に用いたプライマーは表３に示す 6）。Bisulfiteの ４ 種 の 細 胞 か ら 抽 出 し、EZ DNA Methylation-処理をしていない DNA、ならびに Bisulfite 処理をKit（ZYMO RESEARCH）のプロトコールに行った DNA について、それぞれ至適な条件で PCR

DirectTM

表１：定量 PCR プライマー情報

表２：メチル化特異的 PCR プライマー情報

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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）

表３：PCR プライマー情報

を 行 っ た。PCR 産 物 を ク ロ ー ニ ン グ 後、DH5 α

3. 結果に ト ラ ン ス フ ォ ー ム し、 増 殖 し た プ ラ ス ミ ド を
NucleoSpin Plasmid QuickPure（TaKaRa Bio） で 精製した。

3.1 細胞増殖抑制試験
Fig. 1 に細胞増殖抑制試験の結果を示す。クルクミン濃度 50µM で、24 時間後（P<0.05）および 48

2.6. シークエンス解析時間後（P<0.01）に有意な増殖抑制がみられた。ク

BigDye（Thermo）の反応液を用いてシークエン

ルクミン濃度 10µM、20µM では、48 時間後（10ス 反 応 を 行 い、 シ ー ク エ ン サ ー（3130xl GeneticµM：P<0.01、20µM：P<0.05） に 細 胞 の 有 意 な 増Analyzer, Applied Biosystems）にて塩基配列を解析

殖抑制がみられた（Fig. 1 A）。生存率は 50µM で、した。

24 時 間 後（P<0.05） お よ び 48 時 間 後（P<0.05）に有意に低下した（Fig. 1 B）。細胞の形態は 20µMＡ）細胞増殖曲線

Ｃ）形態変化Ｂ）生存率の推移

Fig. 1：細胞増殖抑制試験：control（クルクミン 0µM）, クルクミン 10µM, 20µM, 50µM での HeLa 細胞の培養
A) 細胞増殖曲線、B) 生存率の推移、C) 細胞形態の変化

ポリフェノール類のウイルス性子宮頸癌抑制効果

45以下では変化がなく、50µM では 24 時間後および48 時間後に細胞の円形化と収縮がみられた（Fig. 1C）。

3.2. 癌関連遺伝子発現の解析
クルクミン添加後の HeLa 細胞における癌関連遺伝子の発現量を、β - アクチンを内部対照としたmRNA の相対量で測定した。HeLa 細胞における E6および E7 の mRNA 量は、クルクミン 50µM を添加してから 24 時間後（E6：P<0.01、E7：P<0.01）および 48 時間後（E6：P<0.01、E7：P<0.01）に、クルクミン添加前に比べて有意に減少したが、RAR βの mRNA 量に有意な変化はみられなかった（Fig. 2）。

Fig. 3：RAR βメチル化特異的 PCR A) 代表的な子宮頸癌４細胞株における比較：メチル化の頻度は、高い方から HeLa, CaSki, SiHa, C33aの順で、低くなっていた。B) クルクミン 50µM 添加 HeLa 細胞における経時的変化：培養後、24 時間、48 時間で大きな変化はみられなかった。

Fig. 2：クルクミン添加後の HeLa 細胞における癌関連遺伝子の発現量変化： β - アクチンと比較した mRNA の相対量。HPV の癌遺伝子タンパクである E6, E7 は、24 時間後、48 時間後で、コントロール（培養開始時）と比較し、有意に発現量が低下（P<0.01）したのに対し、RAR β の発現量は、有意な変化はみられなかった。

3.4. HPV18 URR（L1 3’ part）におけるメチル化解析
HeLa 細胞の HPV18 URR（L1 3’ part）において、メチル化可能な 11 箇所（HPV の複製起点 ori を 1

3.3. メチル化特異的 PCR による RAR βのメチル化解析と し た 塩 基 番 号 6870, 6916, 7011, 7038, 7041,7062, 7068, 7090, 7110, 7116, 7122）のシトシン

代表的な子宮頸癌４細胞株において、RAR βの（CpG）におけるメチル化状態を、各サンプルのバメチル状態を比較した。その結果、メチル化の頻度

イスルファイト処理後のクローンをシークエンスすは、高い方から HeLa, CaSki, SiHa, C33a の順で、低ることにより解析した。培養前、クルクミン 50uMくなっていた（Fig. 3A）。次に、クルクミン 50µM

添加 24 時間後、48 時間後の各箇所のメチル化状態

添加 HeLa 細胞において、添加前、添加後 24 時間、の解析（Fig. 4A）の結果、各箇所のメチル化の割合

48 時間の解析を行ったが、RAR βのメチル化状態は、培養時間別に比較しても、大きな変化はみられに大きな変化はみられなかった。（Fig. 3B）なかった（Fig. 4B）。

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Vol.25（2018）

Fig. 4：HeLa 細胞の HPV18URR（L1 3’ part）におけるメチル化可能な 11 箇所（塩基番号 6870, 6916,7011,7038,7041,7062,7068,7090,7110,7116,7122）のシトシン（CpG）におけるメチル化状態。A) クルクミン 50µM で培養 0, 24, 48 時間後の各箇所のメチル化状態。B) 各箇所のメチル化の割合をク
ルクミン 50µM での培養時間別に比較。

よる癌細胞増殖抑制の機序につながるデータは得ら

4. 考察と今後の展望れず、今後さらなる解析が必要である。
HeLa 細胞をクルクミン 50µM の濃度で培養する

クルクミンを食品中の成分として考えた場合、口ことにより、細胞増殖の抑制ならびに生存率の低下

腔内では、比較的高濃度のクルクミンに暴露されるが観察された。この機序を解析するために、HPV のことが想定できる。HPV は、口腔癌との関連も指摘

癌関連タンパクである E6, E7、および細胞の癌関連されてきている。高リスク型 HPV の関与する口腔タンパク RAR βの mRNA 発現を解析したところ、癌は、性行動の多様化によってアメリカでは増加しRAR βの発現量は変化がなかったのに対し、E6, E7ており、ワクチンの対象拡大にもつながっている。の発現は低下しており、これが細胞増殖抑制に関与

今回の知見は、口腔内での HPV 感染細胞においても、していることが示唆された。クルクミンはメチル化同様にクルクミンが E6 や E7 といった HPV 由来の転移酵素阻害効果があると考えられ、クルクミン処発癌因子を抑制する可能性も示唆する 13）ことから、理により RAR βプロモーター領域のメチル化状態の今後、口腔内細胞を用いた効果を検討する価値があ変化や発現量変化が報告されている

13）

が、HeLa 細ると思われる。

胞を用いた本研究では、観察できなかった。また、本研究によって、食品成分として古くから使われHPV 遺伝子発現に影響する可能性がある、HPV のてきたクルクミンが、HPV の癌関連タンパク E6 やURR でのメチル化状態を解析したが、特に変化は認

E7 の発現抑制や HPV 関連癌細胞の増殖抑制を示すめられなかった。近年、これらの領域のメチル化は、基礎データが得られた。社会的に意義のある情報をHPV に起因する子宮頸癌の悪性度を見るためのバイ提供できたと考えている。

オマーカーとして注目されているが、クルクミンにポリフェノール類のウイルス性子宮頸癌抑制効果

謝辞
本研究の実施にあたり、研究助成をいただきました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に深く感謝いたします。また、当研究に従事していただいた
東京大学獣医学専修 大川愛絵さん、ならびにご協力いただいた感染制御学研究室 上間亜希子特任助教はじめ、獣医微生物学研究室 堀本泰介教授、村上晋助
教、獣医病理学研究室 内田和幸准教授、チェンバーズ ジェームズ助教、原稿に有意義なコメントをいた
だいた感染制御学研究室 島倉秀勝特任研究員に、心より感謝申し上げます。

47参考文献1 ）Haga, T., et al., Papillomavirus Research, 2017.
3: p. 1-6.
2 ）Haga, T., et al., J Acquir Immune Defic Syndr,
2001. 26(3): p. 256-62.
3 ）Haga, T., et al., Apoptosis, 2008. 13: p. 97-108.
4 ）Steenbergen, R.D., et al., Nat Rev Cancer, 2014.
14(6): p. 395-405.
5 ）Herman, J.G. and S.B. Baylin, N Engl J Med,2003. 349(21): p. 2042-54.
6 ）Turan, T., et al., Virology, 2006. 349(1): p. 17583.
7 ）Clarke, M.A., et al., Cancer Epidemiol
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8 ）Basu, P., et al., Asian Pac J Cancer Prev, 2013.
14(10): p. 5753-9.
9 ）Thomasset, S.C., et al., Int J Cancer, 2007.
120(3): p. 451-8.
10）Paulraj, F., et al., Molecules, 2015. 20(7):p. 11830-60.
11）Albino-Sanchez, M.E., et al., Exp Cell Res, 2016.
346(1): p. 40-52.
12）Wang, S., et al., Cell Death Dis, 2013. 4: p. e556.
13）Jiang, A., et al., Phytother Res, 2015. 29(8):p. 1237-45.
14）Mishra, A., et al., Ecancermedicalscience, 2015. 9:p. 525.

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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）

Inhibitory effect of polyphenol on humanpapillomavirus-associated cervical cancer
Takeshi Haga
Graduate School of Agriculture and Life Science, The University of Tokyo
The aim of this study is to investigate the inhibitory effect of curcumin, oneof the polyphenols, on HPV positive cervical cancer cells, and to analyze theexpression of cancer-related genes, as well as their methylation status in orderto obtain a further understanding of its mechanism.
Curcumin exhibited an inhibitory effect on the growth of HPV-positive HeLa
cells at 50 μ M [24 hours post incubation (hpi) (p < 0.05) and 48 hpi (p < 0.01)].
A real-time RT-PCR analysis revealed that the expressions of E6 and E7, major
HPV oncoproteins, were down-regulated after 24 hpi and 48 hpi with 50 μ
M curcumin (p < 0.01). Retinoic acid receptor β (RAR β ), one of the cellulartumor suppressors, was previously reported to be up-regulated after exposure
to curcumin; however, the expression level of RAR β remained unchanged, in
this study.
Methylation status was analyzed at the Upstream Regulatory Region (URR) ofHPV18 in HeLa cells via sequencing after bisulfite treatment of the extracted
DNA. No clear differences were observed in methylation status at the 11
potential sites. These results suggest that the inhibitory effect of curcumin on
HeLa cell growth is associated with the down-regulation of E6 and E7, but notwith RAR β expression or the methylation status of HPV18 URR.
Considering curcumin as a food containment, the oral cavity may be exposed
to high concentrations of curcumin. As the possible involvement of HPV in oral
cancer has recently been addressed, the need for an evaluation of the effect ofcurcumin on HPV-related oral cancer is indicated. Further studies are required
to elucidate such possibilities, as well as the mechanism underlying the downregulation of E6 and E7 by curcumin.