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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）＜平成 27 年度助成＞

魚類主要アレルゲン（パルブアルブミン）のアレルギー反応性の低減化に関する研究小林征洋（東京海洋大学 学術研究院 食品生産科学部門）

背景および目的魚類アレルギーの主な誘起物質（アレルゲン）は、を蓄積することを目的とした。

結果および考察

筋肉に存在するカルシウム結合タンパク質であるパルブアルブミンである。パルブアルブミンはその高20 種魚類の加熱処理による立体構造変化

い耐熱性から、アレルゲン性を低減することは困難および低アレルゲン化の確認であるとされてきた。これは患者の IgE 抗体が認識食用とされる魚類は日本だけでも数百種以上に及するアレルゲンの部位（IgE 結合エピトープ）がアぶにもかかわらず、加熱によるアレルゲン性の低減

レルゲンの一次構造上に存在し、パルブアルブミンを調べた魚種はマサバしかない。 また、日本人患者が熱変性して立体構造が崩れても患者の抗体が結合においては、少なくともマサバのパルブアルブミンできるため、アレルギーが発症すると考えられるかの立体構造変化が IgE 反応性に影響を与えることもらである。これらの知見は 1970 年代にヨーロッパ分かっている。そこで、カルシウム存在下で立体構で報告されており、魚類アレルギー患者は加熱調理造を認識する抗パルブアルブミン抗体を用いて、加により熱変性したパルブアルブミンによって、アレ熱がパルブアルブミンの立体構造に与える影響を調ルギーの感作が成立するものと推定される。一方、

べるとともに、魚類アレルギー患者の血清を用いて、我々は日本人の魚類アレルギー患者が認識するエピ

IgE 抗体に対する 20 魚種の加熱抽出液の反応性をトープが、一次構造上ではなく立体構造上に存在す調べた。20 種魚類を 100℃および 120℃で 60 分間ることを初めて明らかにしている。生食文化のある加熱した粗抽出液を調製し、パルブアルブミンの立

日本では欧米と異なり、未変性のパルブアルブミン体構造を認識するマウスモノクローナル抗体を用いによってアレルギーの感作が起きると考えられる。てウエスタンブロッティングを行った（図示せず）。

そのため、加熱調理によりパルブアルブミンを熱変

その結果、100℃加熱した場合にパルブアルブミン性することができれば、魚類アレルギー患者でも魚のバンドは消失または著しく弱くなり、120℃加熱を摂取することが可能になると考えられる。しかし、の場合には全ての魚種でバンドが消失した。次に、アレルゲン性の低減化に関する知見は乏しく、とり上記の加熱抽出液に対して、パルブアルブミンを原わけ加熱処理に着目した報告はほとんどない。既に因とする魚類アレルギー患者の血清を用いた ELISA

我々は 120℃の長時間加熱、または 140℃の短時間を行ったところ、IgE 反応性は 60 分間加熱で著しく加熱を施した魚肉の IgE 反応性は消失することを見低下し、120℃加熱で消失した（図 1）。これらのこいだしている。そこで本研究では、魚類パルブアルとから、全ての魚種のパルブアルブミンは加熱処理

ブミンについて、加熱処理によるアレルゲン性の挙により立体構造変化が起き、それに伴い IgE 反応性動と低アレルゲン化の機序を明らかにし、アレルゲの低下が生じたものと予想される。

ン性の低減化技術の確立に際して有益な基礎データ

魚類主要アレルゲン（パルブアルブミン）のアレルギー反応性の低減化に関する研究

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図 1. 非加熱ならびに 100℃または 120℃で 60 分間加熱した 20 種魚類抽出液に対するパルブアルブミンアレルギー患者の血清の IgE 反応性 .

未変性パルブアルブミンの精製および～ 140 ℃ で 10 分 間 加 熱 し、 魚 類 ア レ ル ギ ー 患 者

加熱によるアレルゲン性の変化の IgE 抗体との反応性を調べた（図 2）。その結果、上記の実験から、加熱処理がパルブアルブミンのIgE 反応性は 4℃～ 100℃までは穏やかに低下したIgE 反応性を低減できることが判明した。しかし、が、120℃および 140℃加熱で IgE 反応性が消失し上記は抽出液を用いた検討であり、抽出液中のパルた。上記のウエスタンブロッティングの結果と併せブアルブミン以外の成分が、IgE 反応性に影響を及ると、100℃加熱では熱変性が大きくは起きていなぼした可能性は否定できない。そこで、精製したパルブアルブミンを用いて、加熱処理の IgE 反応性に対する影響を調べる必要がある。しかし、パルブア
ルブミンの精製方法は、加熱により夾雑物を除いた後に液体クロマトグラフィーを行うのが一般的である。そこで、加熱処理を伴わない精製方法を確立した後に、加熱処理の IgE 反応性に対する影響を調べた。まず、魚肉抽出液を硫酸アンモニウム塩析に供してタンパク質を分画した後、ハイドロキシアパタ
イトクロマトグラフィーを行って未変性パルブアルブミンを精製した。精製パルブアルブミンを 20℃

図 2. 20℃から 140℃で 10 分間加熱した精製マサバパルブアルブミンに対するパルブアルブミンアレルギー患者の血清の IgE 反応性 .

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Vol.25（2018）

い、もしくは変性は大きく起きるものの IgE 反応性

これらのことから、パルブアルブミンは 100℃以上に影響を与えるほどのものではない、のいずれかでの加熱で熱変性が生じることが考えられる。

あることが考えられる。

パルブアルブミンは、分子表面に露出している疎水性アミノ酸が存在するが、フェニルアラニンをパルブアルブミンの変性の確認はじめとする様々な疎水性アミノ酸は相対的に分立体構造の変化を詳細に調べるため、パルブアル子内部に配置しているものが多い。そのため、加ブミン分子の内部に埋没しているフェニルアラニン

熱変性が進行すればそれらの疎水性アミノ酸は分を指標とし、加熱処理により内部のフェニルアラニ子表面に露出するものと予想される。そこで、疎ンが分子表面に露出するかを検討した。精製パルブ

水性物質に結合すると蛍光を発する蛍光指示薬

アルブミンを 4℃または 100℃で 60 分間保温後、8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid（1,8-ANS） を蛍光アミノ酸であるフェニルアラニン由来の蛍光発用いて、パルブアルブミンの分子内部に配置されて光から変性の度合いを調べた（図 3A）。 その結果、いるフェニルアラニンをはじめとする疎水性アミノ100℃加熱は 4℃保温より強い蛍光を示した。そこ

酸が、立体構造の崩壊により分子外部へ露出するかで、40℃から 140℃で 10 分間加熱後、20℃加熱のを検討した。まず、1,8-ANS を精製パルブアルブミ

フェニルアラニン由来の蛍光と比較した（図 3B）。

ンと混合し、4℃または 100℃で 60 分間保温した後その結果、80℃までは蛍光強度に変化はなかったが、に蛍光強度を調べた（図 4A）。その結果、100℃加100℃以上の加熱では温度上昇依存的にフェニルア

熱は 4℃保温したものよりも強い蛍光を発した。次ラニン由来の蛍光発光が強まることが確認された。に、40 ～ 140℃で加熱し、20℃保温のパルブアル

図 3. 4℃または 100℃で 60 分間保温した精製マサバパルブアルブミンのフェニルアラニン由来の蛍光発光（A）. 各温度で加熱した精製マサ
バパルブアルブミンのフェニルアラニン由来の蛍光強度から 20℃保温の蛍光強度を差し引いた値（⊿ FI; B）.

図 4. 4℃または 100℃で 60 分間保温した精製マサバパルブアルブミンに結合した 1,8-ANS 由来の蛍光発光（A）. 各温度で加熱した精製マサ
バパルブアルブミンに結合した 1,8-ANS の蛍光強度から 20℃保温の蛍光強度を差し引いた値（⊿ FI; B）.

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ブミンの蛍光強度と比較した（図 4B）。その結果、全ての温度帯で温度上昇依存的に蛍光発光が強くなった。IgE 反応性、フェニルアラニン由来の蛍光および 1,8-ANS の蛍光を測定した実験から、下記のことが考えられる。①パルブアルブミンの熱変性は40℃以上で生じ、その程度は少なくとも 140℃まで温度が上昇するにつれて増大する。②パルブアルブミンのフェニルアラニンは 80℃までは分子内部に埋没しているが、100℃以上になると分子表面に露出するようになる。③患者血清の IgE 反応性は 100℃までの熱変性では影響を受けないが、120℃以上の図 5. 4℃または 100℃で 60 分間保温した精製マサバパルブアルブミンが 保持しているカルシウムの検出 .

加熱による熱変性によって、著しく低下する。
パルブアルブミン分子全体の熱変性は温度上昇にかであること、上記の実験で 100℃加熱をしたパルほぼ比例しているが、一部の構造は 100℃を境に著

ブアルブミンの IgE 反応性は、4℃と比較して著ししく変化するものと予想される。おそらく、100℃い低下が見られなかったことを考慮すると、100℃を境に大きな構造変化が生じる箇所に、パルブアル加熱による熱変性は限定的であり、120℃以上の場ブミンの IgE 結合エピトープが存在するのではない

合に特に IgE 結合エピトープの構造変化が大きく見かと考えられる。パルブアルブミンはカルシウム結られるものと考えられる。

合タンパク質であり、カルシウムが結合している場
合のみ IgE 反応性を示すことが分かっている。また、カルシウムの有無で立体構造は変化することも明ら結論かになっている。そのため、100℃を境にカルシウ加熱処理によるパルブアルブミンのアレルゲン性ムの保持ができなくなり、フェニルアラニンを含むの低下は、熱変性による IgE 結合エピトープの構造一部の立体構造は変化するとともに、IgE 反応性が変化に起因するものと結論付けられる。今回の研究消失したものと考えられる。しかし、その際の立体成果が、アレルゲン性の低減化技術の基礎的知見に構造の変化は、パルブアルブミン分子全体としてはなり、これまで医療機関で推奨されてこなかった減僅かであるため、1,8-ANS における蛍光強度は大き感作療法による食物アレルギーの根本治療に役立つく変化しなかったものと考えられる。

ことを期待したい。そのためにも今後、さらに加熱した際のパルブアルブミンのアレルゲン性の挙動

パルブアルブミンのカルシウムイオンのと、低アレルゲン化の機序を明らかにする必要があ保持の確認る。

パルブアルブミンの立体構造保持にはカルシウムの結合が重要である。そこで精製パルブアルブミン

謝辞を 4℃または 100℃で保温後、カルシウム結合性蛍研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公益

光試薬を用いて、蛍光強度からカルシウム保持の有財団法人 浦上食品・食文化振興財団ならびに関係者無を調べた（図 5）。その結果、100℃加熱をしたパの皆様に篤く御礼申し上げます。

ルブアルブミンの蛍光強度は 4℃保温と比較して弱く、加熱した場合にカルシウムの結合能が弱まっていることが判明した。カルシウム結合能の低下は僅

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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）

Reduction in allergenicity of the major fish allergen, parvalbumin
Yukihiro Kobayashi
Department of Marine Biosciences,
Tokyo University of Marine Science and Technology.
Parvalbumin is a major fish allergen, which is reported to be highly
thermostable. However, our previous study found a reduct ion in the IgEreactivity of Pacific mackerel parvalbumin by heat treatment above 100 ℃ . In
this study, the thermostabilities of 20 fish parvalbumins contained in extracts
were first examined by subjecting the heated muscle extracts to western blotting
and ELISA. As a result, an anti-parvalbumin monoclonal antibody recognizing thestereoscopic structure indicated that conformational changes in the parvalbumins
accompanied heating at 100 ℃ or 120 ℃ , along with heating-related reductionsin the IgE reactivities of 20 fish parvalbumins determined by ELISA using patientsera. Heating treatments at various temperatures supportively reduced the IgEreactivities of Purified Pacific mackerel parvalbumin. Denaturation of purified
Pacific mackerel parvalbumin was observed by monitoring the fluorescencederived from phenylalanine and probe to identify hydrophobic sites on themolecule surface. In addition to denaturation, Ca 2+ binding ability was attenuatedby heat treatment, as determined using a fluorescent calcium indicator. This
study showed that the allergenicity of parvalbumin of various fish can be reducedby heat treatment at temperatures above 100℃ , at least in Japanese fish-allergicpatients recognizing parvalbumin.