Issue 9
June, 2016

Isolation of drug target protein (4)Biotin-Streptavidin Binding assay 【Biotinylated MTX】
Introduction
ストレプトアビジンはビオチンと非常に強いアフィニティで結合するタンパク質であり、ビオチンは化合物、タンパク質、核酸などに簡便で効果的にラベルとして導入できる低分子化合物として利用されています。このことから、ビオチン化リガンドのストレプトアビジンビーズへの固定化と、それを用いた標的物質の精製実験は、幅広い研究分野で行われています。
ケミカルプルダウンを行なう際、リガンドとなる化合物にビオチンを導入しておけば、ストレプトアビジンビーズによる実験系が可能となります。ケミカルプ
ルダウンにおけるリガンド化合物のビオチン化には、化学反応を利用するリガンドとビーズの固定化とは異なり、ワンステップで簡便にそれらを固定化できる点や、間接法(後付け法)によるプルダウン操作(ライセートにビオチン化リガンドのみを先に添加して反応させ、ビオチン化リガンドとその結合物質の複合体を、後からストレプトアビジンビーズを添加することにより回収する方法)が選択可能となる点などがメリットとなります。
今回は、MTX(メトトレキサート)によるDHFRのケミカルプルダウンを、ビオチン化MTXとストレプトアビジンビーズを用いて行いました。他社ビーズとの性能比較に加え、MTXとビオチンを結ぶスペーサーアームの長さの重要性についても示しています。ストレプトアビジンが立体障害となり、リガンドと標的タンパク質の結合が妨げられることがあるためです。

Resultスペーサーアームの長さが異なるビオチン化MTXを、それぞれストレプトアビジンビーズに固定化し、HeLa細胞破砕液からDHFRのアフィニティ精製を行ないました。なお、コントロールとして、MTXアミノ基誘導体(ビオチン化無し)をNHSビーズに固定化したものについても同様の操作を行なっています。
下図の2つから、以下の点を確認できます。
・他社ビーズよりもFGビーズの方が非特異的吸着が少ない。
・約20ÅのスペーサーアームではDHFRが回収できず、約30Åの場合に回収ができた。このことから、低分子化合物をビオチン化する際は、スペーサーアームの長さを約30Å以上に設定することが良いと確認できた。

Biotinylated MTX (Spacer arm Length : about 20Å)

Biotinylated MTX (Spacer arm Length : about 30Å)

BiotinMTXMTX

Streptavdin beads

NHS beads
FG beads

(kDa)
200

M

In-+

FG beads

Competitor--+

BiotinSpacer arm

Spacer arm+Beads
Production
Immobilize MTX

Streptavdin beads

NHS beads

(kDa)
200

116
97.4

116
97.4

65

65

45

45

3131M

InFG beads

FG beads

Competitor---+++Beads
Production
Immobilize MTX

DHFR

DHFR

21.5

21.5
14.4

Streptavidin

6.5

14.4

Streptavidin6.5
Silver staining

TAMAGAWA SEIKI CO., LTD.

Silver staining

http://www.FGbeads.com

Materials
aterials and method
Mand method■Materials■FG beads® information

1. Streptavidine beads
2. Biotinylated MTX
3. PBS(-)(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4・12H2O,1.5mM KH2PO4)
4. Wash buffer (10mM HEPES-NaOH(pH7.9), 50mM KCl,0.2mM EDTA, 10% glycerol)
5. HeLa cell extracts (cytosolic fraction) ― 3mg/ml
6. 100mM KCl buffer (20mM HEPES-NaOH(pH7.9), 100mM KCl,
1mM MgCl2, 0.2mM CaCl2, 0.2mM EDTA, 10% glycerol,0.1% NP-40, 1mM DTT, 0.2mM PMSF)
7.SDS sample buffer (62.5mM Tris-HCl(pH6.8), 0.005% BPB,2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercapto ethanol)

Product nameStreptavidin beads

Product number

TAS8848N1170

Storage temperature

2-8oC

Storage buffer

10mM HEPES(pH7.9), 50mM KCl,1mM EDTA, 10%glycerol

Size of beads

190nm ± 20 nm
Free biotion >1200pmol

Binding capacity(for 1mg of beads)

Biotinylated Antibody >13ug
Biotinilated ssDNA (50mer) >13ug
Biotinylated BSA >3ug

■ Method 2 (Affinity Purification)■ Method 1 (Immobilize biotinylated MTX)
1. Immobilize biotinylated MTX on beads
Transfer 0.5mg beads to a tube, and wash beads with PBS(-)
3times at 4oC.
Add 0.1mM biotinylated MTX diluted in 200ul PBS(-) to beads,
and 200ul PBS(-) to another beads (Control beads).
Mix for 2hour at 4oC.
2. Wash
Wash biotinylated MTX immobilized beads and Control beads
with Wash buffer 3 times at 4oC, and storage with 200ul Wash
buffer.

1. Beads equilibration
Wash 0.5mg of each MTX immobilized beads with100mM KCl buffer 3 times at 4oC.
2. Reaction
Add 200ul HeLa cell extract and resuspend beads.
Incubate with rotation for 2hour at 4oC.
3. Wash
Separate magnetically and remove supernatant .
Wash beads with 100mM KCl buffer 3 times at 4oC.
4. Elution
Add 40ul of SDS sample buffer and resusupend beads.
Boil for 5min at 98oC, and remove beads.
5. Analyze the samples by SDS-PAGE and silver stainning.

■ Influence of Spacer Lengh on Steric hindrance
Short Spacer

BiotinMTXLong Spacer

Biotin×Streptavidin

DHFR

MTX has no accessibility for DHFRTAMAGAWA
SEIKI
CO.,
LTD.
TAMAGAWA
SEIKI
CO.,
LTD.

MTX ○
Streptavidin

DHFR

MTX has accessibility for DHFR

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