高等真核生物の新しい環境変化への適応能力の獲得
機構~クロマチン・コンフォメーション・チェンジ・コー
ド説 (Chromatin conformation change code (4C)
theory: 4C theory) ~メタデータ

言語: Japanese
出版者:
公開日: 2020-06-21
キーワード (Ja):
キーワード (En):作成者: 中山, 建男, 中山, 雅美
メールアドレス:所属:

URL

http://hdl.handle.net/10458/6615

  ⾼高等真核⽣生物の環境変化への新たな適応能⼒力の獲得機構 ~クロマチン･コンフォメーション･チ
ェンジ･コード説 (Chromatin conformation change code (4C) theory: 4C theory)＊ ~  サブタイトル：  ⾼高等真核⽣生物が新しい環境変化に適応するために、多世代を通してエピジェネティック修飾による転写因⼦子やクロマチン修飾酵素遺伝⼦子などの 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出することで、プログラム化されていない新規の細胞機能を獲得するバイオ･システム  中⼭山建男、中⼭山雅美

宮崎⼤大学･医学部･フロンティア科学実験総合センター

脚注：＊本総説は Ref. 116 の改訂版である。

  

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要約：

   本総説は多世代を通してクロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出することによって、プログラム化されていない新規の細胞機能を獲得する⾼高等真核⽣生物の環境適応能⼒力に関するレビューである。最初に、具体的な例として、ニワトリの HDAC2(-/-) DT40 mutants で HDAC2 遺伝⼦子の⽋欠損に起因して劇的に蓄積した⼤大量の IgM H-chain と L-chain が⻑⾧長期の連続培養期間に劇的に減少する多彩な⽅方法のメカニズムを提⽰示する。引き続いて、これらの具体例に基づいて、異常で不快で不利益な環境変化に⾃自らを適応させるために、⾼高等真核⽣生物がプログラム化されていない新たな細胞機能を獲得する能⼒力に関する⼀一般的な仮説的概念を提⽰示する。ニワトリの DT40
野⽣生株では、HDAC2 はスーパーバイザーとして、Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 と Ikaros, E2A などの転写因⼦子の遺伝⼦子発現を逆⽅方向（促進的及び抑制的）に制御することを介して、IgM H-chainと L-chain の遺伝⼦子発現を間接的に制御する。HDAC2 遺伝⼦子の⽋欠損に伴って、IgM H-chain とL-chain の mRNAs と蛋⽩白質の劇的な蓄積が急速に誘導される。
その後、これらの蓄積した mRNAsと蛋⽩白質の量は、同⼀一条件下での単純な⻑⾧長期の連続培養期間に、全ての HDAC2(-/-) individualclones でほぼ同じ変化パターンで劇的に減少する。⼀一⽅方、Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 の遺伝⼦子発現は、連続培養期間に、個々の HDAC2(-/-) individual clones で著しく異なるパターンで変化する。
培養の後期ステージでは、IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現に関して、調べた６個のHDAC2(-/-) individual clones は少なくとも OBF1-依存性、Pax5, Aiolos-依存性、Pax5, Aiolos, EBF1依存性の 3 つの異なるタイプに分類分け出来る。個々の HDAC2(-/-) individual clones における
Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 の遺伝⼦子発現パターンの複雑な変化は、連続培養期間のこれら遺伝⼦子の 5’-近傍上流クロマチン領域でのヒストン H3 の特定 Lys 残基のアセチル化及び脱アセチル化
レベルの多種多様な変化に基づいた多様な不可逆的なクロマチン･コンフォメーション（構造）変化に起因している。これらの結果に基づいて、⾼高等真核⽣生物が、多世代を通して、エピジェ
ネティック修飾によるクロマチン構造の可塑性の不可逆的創出を介して、プログラム化されていない新たな細胞機能を獲得するバイオ･システムを、クロマチン･コンフォメーション･チェン
ジ･コード説 (chromatin conformation change (structure) code theory: 4C theory)と命名した。
   ⾼高等真核⽣生物の⽣生命維持と細胞タイプの決定にとって最も基本的で重要な⽅方法の 1 つと考えられる 4C theory の具体的な内容は次の通りである。1) ⾼高等真核⽣生物の体細胞は、その⽣生涯で初めて新しい環境変化に遭遇した時、その変化に適応するかまたは克服するために、プログラム化されていない新規の細胞機能を獲得するための柔軟で順応的で多能的な能⼒力を有している。
2) 細胞のこの柔軟で順応的で多能的な能⼒力は基本的にはクロマチン構造の柔軟性･順応性･多能性に基づいている。3) 体細胞は、多世代（多数の細胞分裂）を通して、特定の転写因⼦子やクロマチン修飾酵素の遺伝⼦子の 5’-近傍上流域のクロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出することによって、環境変化に適応または排除するためのプログラム化されていない新たな細胞機能を

  

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獲得する能⼒力を有す。4) クロマチン構造（緩いフォームから硬いフォームまたはその逆）の可塑性は、多世代を通したエピジェネティック修飾によるクロマチン･コンフォメーション･チェ
ンジに基づいて、連続的･不可逆的に創出される。5) 同じタイプの個々の細胞におけるクロマチン構造の可塑性の多様性は、環境変化への⾃自発的で不均衡な対応によって引き起され、その後の多世代を通した連続的･集中的･選択的な対応によって成し遂げられる。6) クロマチン構造の可塑性の不可逆的創出は、体細胞のそれまでの履歴と環境変化への連続的対応に主に依存する。
7) クロマチン構造の可塑性の不可逆的創出は、⼦子孫世代の細胞で起り、環境変化に最初に遭遇した細胞では起らない。8) クロマチン構造の可塑性の不可逆的創出は、合⽬目的的･必然的に起り、偶然または中⽴立的に起るのではない。9) 環境変化は環境変化認識受容体/部位(environmentchange recognition receptor/site: ECRR/ECRS)によって認識される。10) クロマチン構造の可塑性はクロマチン･コンフォメーション･チェンジ･コンプレックス装置(chromatin conformation change
complex machinery: 4C machinery)によって直接的･不可逆的に創出される。11) 特定の遺伝⼦子（群）の 5’-近傍上流のクロマチン構造は、動的で変化可能な三次元構造（コンフォメーション）として、環境変化のシグナルを受け取る。12) 特定の遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン構造（緩いフォームまたは硬いフォーム）は当該遺伝⼦子の潜在的な発現能⼒力のスイッチ（オンまたはオフ）を指令する。13) 特定の遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン構造は、構造的側⾯面からは「クロマチンの刻み⽬目(notch of chromatin)」とみなすことができ、機能的側⾯面からは「遺伝⼦子発現のディレクター(director of gene expression)」とみなすことができる。14) ⾼高等真核⽣生物の複雑で多彩な細胞機能や多種多様な細胞タイプを決定する 4C theory におけるコード数は、恐らく特異的な候補遺伝⼦子数とこれら遺伝⼦子それぞれのコード数（多分、2）の組合せに基づいて決まる。

序論：

   細胞は⽣生物の基本単位であり、遺伝情報を主に担う核酸 (デオキシリボ核酸：DNA)、細胞機能を主に担う蛋⽩白質、糖、脂質、別の核酸 (リボ核酸：RNA) などの⾼高分⼦子物質や多種多様な低分⼦子物質などを主要な構成成分として成り⽴立っている。単⼀一の細胞で成り⽴立つ単細胞⽣生物と多数の細胞で構成される多細胞⽣生物に分かれる。単細胞⽣生物には核を持たない原核（無核）細胞（⼤大腸菌などの真正細菌、古細菌、シアノバクテリアなど）や核を持つ下等真核（有核）細胞（酵⺟母、アメーバ、かびなど）があり、⼀一個の細胞のみで⼀一つの個体として⽣生命を維持する。
⼀一⽅方、多細胞⽣生物には動物や植物などがあり、核を持つ多種多様な⾼高等真核細胞が集合し、互いに機能を分担し協調して⼀一つの個体として⽣生命を維持する。さらに、ウィルスは⽣生物かどうかと⾔言う⽣生命の定義についての議論が現在でも⾏行われている。このような細胞の分類や⽣生物と⽣生命の定義に関する専⾨門書や啓蒙書などは膨⼤大な数があり、これらの成書を参照して欲しい。
原核細胞の DNA は基本的には⼀一個の環状構造であり、裸の形で核様物質として細胞質に存在

  

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する。下等及び⾼高等真核細胞の DNA はいずれも数種のヒストンや他の多種多様な蛋⽩白質と結合した複合体が複数の染⾊色質（クロマチン）として細胞核の中に存在する。真核細胞のクロマチ
ンは細胞分裂時に棒状構造の染⾊色体（クロモソーム）になる。例えば、染⾊色体数(2n)は酵⺟母では6 対の染⾊色体で 12、ヒトでは 22 対の常染⾊色体と 1 対の性染⾊色体で 46 存在する。なお、本総説で研究対象とするニワトリの染⾊色体数(2n)は 78 で、その核型は特異的でサイズが⼤大きく異なる
マクロ染⾊色体と多数のマイクロ染⾊色体で構成されている。性染⾊色体は ZW 型でその組合せと性決定との関係は哺乳類とは逆で、ZZ がオス、ZW がメスである雌ヘテロ型である。染⾊色質と染⾊色体は同義語として⽤用いられることが多い。なお、染⾊色質と命名されたのは、細胞核の中に分散していて塩基性⾊色素で染まり易い物質として、最初に観察されたことに由来する。
   原核⽣生物、真核⽣生物の細胞はいずれも細胞分裂時に複雑な過程（細胞周期）を経て、DNA の担っている遺伝情報を正確に次世代の細胞（娘細胞）へ伝達する。もちろん、原核⽣生物、真核⽣生物はいずれも細胞内で遺伝情報に基づいて直接及び間接的に産⽣生される⾼高分⼦子物質、低分⼦子物質そして細胞外から取り込んだ化学物質などの協働作業によって、ある⼀一定期間（寿命）⽣生命を維持する。さらに、原核⽣生物、真核⽣生物はいずれも⽣生活環境の変化に対応するプログラム化されている多彩な能⼒力を備えており、それぞれの適応能⼒力の範囲内で⽣生命を維持し⽣生きて⾏行
くことができる。
   ⽣生物（細胞）は細胞内外の環境変化にどのような⽅方法で対応･適応し⽣生きて⾏行くのであろうか。
⽣生物（細胞）の環境適応能⼒力に関しては幾つかの可能性があり、典型的な対応･適応⽅方法としては次の 4 つが考えられる。１）極端に過酷な環境変化の場合には、細胞（原核細胞と下等真核細胞を含む）がすでに⻑⾧長期間かけて獲得している環境適応能⼒力を超えているため、対応･適応できずに死滅する。極端に過酷な環境（例えば、極端な⾼高温など）になった場合、細胞内化学反応の触媒作⽤用を持つ酵素蛋⽩白質などの⽴立体（３次元）構造が壊れて活性を失い（これを失活と⾔言う）、その結果、最終的に細胞は死滅する。もちろん、⾼高温、⾼高圧など過酷な環境下でも⽣生存可能な単細胞⽣生物（好熱細菌など）は多数存在する。２）かなり過酷な環境変化の場合には、細胞（原核細胞と下等真核細胞を含む）は遺伝情報を担う DNA 分⼦子の塩基配列の変化（例えば、特定の DNA 断⽚片の挿⼊入、⽋欠失、重複あるいは点突然変異など）によって、遺伝⼦子産物である蛋⽩白質などの⼀一次構造（アミノ酸配列）が劇的あるいは微妙に変化しその⽣生理機能（作⽤用）が変化して、環境変化に適応する。この⽅方法は⽣生物進化の 1 つの要因の説明になる。３）温和な環
境変化の場合には、細胞（⾼高等真核細胞のみであるが）は遺伝情報を担う DNA 分⼦子の塩基配列の変化を伴わず、クロマチン構造の可塑性が多世代に渡って不可逆的に変化し、遺伝⼦子の発現パターンが多彩に変化することを介して、遺伝⼦子産物である蛋⽩白質などの種類が劇的あるいは微妙に変化することによって、環境変化に適応する。この⽅方法は細胞の発⽣生と分化の 1 つの要因の説明になる。４）極めて温和な環境変化の場合には、細胞（原核細胞と下等真核細胞を含

  

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む）は、すでに進化の過程で⻑⾧長期間かけて獲得している環境適応能⼒力がこの環境変化を超えているため、これらの環境適応能⼒力を駆使して環境変化に即座に適応する。なお、⽣生命の起源、
⽣生物の進化及び分化等に関しては膨⼤大な数の専⾨門書や啓蒙書などの成書があり、これらの成書を参照して欲しい。本総説では著者らのデータに基づいて、⾼高等真核細胞のクロマチンの構造変化を介した環境適応能⼒力の獲得⽅方法（すなわち上記の 3 つ⽬目の⽅方法）にのみ焦点を絞って話を進める。

クロマチンの構造：

   真核細胞のクロマチン･クロモソーム･ヌクレオソーム･ヒストンなどの構造と機能に関しては、ここ数⼗十年間で膨⼤大な研究の蓄積がある。最初に、本総説の主題に⼊入る前に、真核細胞のクロマチン構造などについて、簡単な概説のみを記す[1-9]。クロマチンを構成する基本単位はヌクレオソームである。ヌクレオソームは塩基性蛋⽩白質であるコアヒストンのサブタイプ H2A,
H2B, H3, H4 の各２分⼦子が集合したヒストン 8 量体と約 200 塩基対の DNA の複合体である。さらに、ヒストン 8 量体を約 146 塩基対の DNA 鎖が約 1.8 回転巻き付いたヌクレオソームコアと巻き付いていないリンカーDNA（平均 0 ~ 80 塩基対の⻑⾧長さ）の複合体であり、直径が約 10 nm、厚さが約 5 nm の円盤型をしている。⾼高等真核細胞では、リンカーヒストン H1（あるいは H5）がヒストン 8 量体と DNA が解離しないように外側に結合して、ヌクレオソーム構造を安定に保つ働きをしていると考えられている。このヌクレオソーム単位は、クロマチンを脱凝縮した後に電⼦子顕微鏡で観察すると⽷糸で通した数珠⽟玉（ビーズ）状に⾒見える。⽣生殖細胞である精⼦子などにはヒストンの代わりに同族のプロタミンが存在する。  
   クロマチンを構成する蛋⽩白質としては、ヒストンの他に多種多様な⾮非ヒストン蛋⽩白質が存在する。⻑⾧長い DNA 分⼦子（ヒト核型の 23 対の染⾊色体を１本に繋ぐと約 1.6 m の⻑⾧長さになる）は、コ
アヒストンの他にヒストン H1 や⾮非ヒストン蛋⽩白質の助けを借りて規則的に折りたたまれ、より⾼高次の規則正しいクロマチン構造として、狭い核（ヒトでは直径が約 5 μm）の中にパッケー
ジング（収納）される。まず、約 10 nm の細い繊維状ヌクレオソームが並んで、6 個のヌクレオソームで 1 回転する螺旋様の 30 nm クロマチン繊維（ソレノイド構造）になる。次に、この 30 nm
クロマチン繊維は 2 万〜～10 万塩基対から成るループ状ドメイン構造（平均サイズが約 0.5 μm）を形成する。さらに、このループ状構造は螺旋状に巻いて凝縮し、円筒状ソレノイド（直径が約 0.8 μm）を形成する。これは有⽷糸分裂中期の姉妹染⾊色分体に相当する。DNA がヌクレオソームを形成する段階は詳細に調べられて明⽩白だが、それより⾼高次の階層性の構築についてはいまだ不明な点が多い。
   ヒストンは塩基性アミノ酸であるリシン(Lys)やアルギニン(Arg) 残基に富んだ⽐比較的分⼦子量の⼩小さい塩基性蛋⽩白質である。原核細胞には存在せず真核細胞にのみ存在するため、この⼆二種

  

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類の細胞を区別する最有⼒力蛋⽩白質の１つである。さらに、ヒストンはクロマチンの構造を構成し維持するための最重要蛋⽩白質であるため、次の 2 つの⼤大きな特徴を持っている。１）そのア
ミノ酸配列は⽣生物の進化過程で極めて安定的に保存されている。例えば、ヒストン H4 のアミノ酸配列はウシとエンドウ⾖豆では 102 個のアミノ酸残基の中で僅か 2 残基しか置換していない。
ヒストンの中ではリンカー･ヒストン H1 のアミノ酸配列は⽣生物種間で保存性が⽐比較的低い。さらに、ヒストン H1 は下等真核細胞には存在せず⾼高等真核細胞のみ存在するため、この 2 つを区別する最有⼒力蛋⽩白質の１つである。２）各ヒストンサブタイプは細胞分裂に際して迅速かつ⼤大量に必要なため、それぞれの遺伝⼦子は多コピー存在する。酵⺟母ではそれぞれ 2 コピー存在するのみであるが、⽣生物種によっては、合計で数⼗十〜～数千コピー存在する。多コピー存在する各ヒ
ストンサブタイプの遺伝⼦子の塩基配列は同⼀一ではなく多少異なっている。その結果、⽣生合成されたヒストンのアミノ酸配列は同じサブタイプでも僅かに異なっていることがあり、これをヒストン･バリアントと⾔言う。例えば、後述するニワトリのヒストンに関しては、H1, H2A, H2B, H3,
H4 それぞれの遺伝⼦子は 6, 10, 8, 11, 8 コピー存在し、バリアントとしては 6, 3, 4, 2, 1 種存在する。
この事実はヒストン･バリアントが上記のクロマチン構造維持機能と後で詳述するクロマチン
構造変化を介した重要な細胞機能発現の制御機能などの他にも、バリアント⾃自体が遺伝⼦子発現制御機能などを持っていることを⽰示している。上述のように、クロマチン･クロモソーム･ヌク
レオソーム･ヒストンなどの詳細な構造と機能に関しては膨⼤大な数の成書があり、これらを参照
されたい。

クロマチンの構造変化：

   次に、正常な細胞機能発現に関わるクロマチン構造変化の重要性について概説する。1964 年、アセチル基やメチル基によるヒストン分⼦子の化学修飾が RNA 合成（転写）の制御に深く関与するという事が初めて提唱されて以来[1]、クロマチン･トポロジー（構造）のモジュレーション（調節）は真核細胞の正常な細胞機能発現の制御にとって最も重要かつ基本的なイベント（⽅方式）の１つであると考えられてきた。以来、アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、スモイル化や ADP-リボシル化などの化学的な翻訳後修飾によるクロマチン構造変化の調節は⽣生命科学の様々な分野で継続して集中的に研究されている。これらのクロマチン構造のエピジェネ
ティック（後成的）な翻訳後修飾（及び DNA の修飾）の中で、コアヒストン H2A, H2B, H3, H4の特定の Lys 残基のアセチル化とデアセチル（脱アセチル）化はクロマチン修飾酵素であるヒス
トンアセチル化酵素(HATs)とヒストン脱アセチル化酵素(HDACs)によって協調的に調節され、最も重要な制御⽅方式の１つである[11-36]。従って、ここ数⼗十年の間、アセチル化や脱アセチル化（他のエピジェネティックな化学修飾も含めて）に関する数え切れない研究が、より幅広い⽣生命科学の研究分野（遺伝⼦子発現、DNA の複製、修復、組み換え、発⽣生、分化、記憶、多能性、臨床

  

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医学、その他）で不断なく⾏行われ、その成果が蓄積されている[37-48]。当然、周知のように、クロマチン構造変化がリンパ球の発⽣生と分化にも深く係わっていることも多くの研究者によって報告されている[49-55]。また、Ikaros, PU.1, E2A, GATA-3, EBF, Pax5 などの転写因⼦子がこのリンパ球の発⽣生と分化に関与していることが明らかになっている[56-65]。さらに、IgM H-chain の遺伝⼦子発現制御に USF, TFEB, Ig/EBP, NF-IL6, OCA-b などのプロモーター結合蛋⽩白質や Ig/EBP,
NF-IL6, YY-1, E2A, PU.1 などのイントロン･エンハンサー結合蛋⽩白質が寄与していることも明らかにされている。
   このようなクロマチン構造のエピジェネティックな化学的翻訳後修飾による細胞機能の発現制御についての膨⼤大な研究を踏まえて、次のような第⼆二の遺伝暗号とも称される仮説が提唱されている[21, 23, 25]。上述と⼀一部重なる記述があるがその概略は次の通りである。コアヒストン
H2A, H2B, H3, H4 の各 2 分⼦子が会合した 8 量体に DNA が巻き付いて、クロマチン構造の基本構
成単位であるヌクレオソームが形成される。ヒストンはこのような DNA を核内にパッケージン
グする第⼀一義的な役割に加え，様々な因⼦子の DNA へのアクセシビリティを調節することで、遺伝⼦子発現制御においても重要な役割を果たす。ヒストンのメチル化やアセチル化などの様々な
翻訳後修飾により，DNA や他の核蛋⽩白質との相互作⽤用が制御され，可逆的な遺伝⼦子発現に影響を及ぼす。ヒストンのアミノ酸配列のどの部位の残基（主に Lys あるいは Arg）が化学修飾を受けるかによって，修飾されたクロモソーム近傍の遺伝⼦子発現は活性化されるか抑制される。このようなヒストンの翻訳後修飾部位の組み合わせと遺伝⼦子発現への影響をヒストン･コード仮説と⾔言い、本仮説の詳細についても多くの成書があり、これらを参照されたい。
   ⼀一⽅方、遺伝暗号 (コード：genetic code)とは、タンパク質（ペプチド）を構成する 20 種類のアミノ酸配列を決める核酸 (DNA, mRNA) の塩基配列（４種類のヌクレオチドの並ビ⽅方：特にmRNA の塩基配列）のことであり、⽣生体内で遺伝情報がタンパク質のアミノ酸配列へ翻訳(translation) される段階で、各アミノ酸に対応する 3 つの連続した塩基配列（トリプレット：
triplet）をコドン (codon) と⾔言う。DNA の⼆二重らせん構造と共に、遺伝暗号は⽣生命科学分野における最も基本的で重要な概念である。当然、この２つの概念に関しては、発⾒見以来、膨⼤大な数の専⾨門書や啓蒙書がある。これらの成書や他の重要な多くの概念に関する上述の成書などを併せて紐解いて、 ⽣生物（細胞）を構成する分⼦子的基盤を理解し、神秘的でさえある精緻な⽣生命現象の不可思議さ･美しさ･素晴らしさの拠って⽴立つ科学的基盤を知って頂きたい。

ニワトリ DT40 細胞株におけるジーン･ターゲッティング法：

   私共は、ニワトリ B リンパ球由来の細胞株であり、ホモロガス･リコンビネーション（相同組み換え）を⾼高頻度に起す DT40 株を⽤用い、ジーン･ターゲッティング法（ジーン･ノックアウト法、
遺伝⼦子破壊法）[66-68]を駆使して、ヒストン、ヒストン･シャペロン、HATs、HDACs、転写因⼦子

  

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ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子の⽋欠損変異株を系統的に多数作製した。得られた⽋欠損変異株
をそれぞれ解析して、各メンバー（蛋⽩白質･酵素･因⼦子）の機能を明らかにした。具体的な遺伝
⼦子破壊法や機能解析法などについては、本総説の⽂文献として引⽤用した私共のオリジナル論⽂文を参照されたい。ここからは順次、得られた結果を詳細に記述する。

ニワトリ DT40 細胞株を⽤用いたヒストン及びヒストン･シャペロンの機能解析：

   上述したように、ニワトリのヒストン H1, H2A, H2B, H3, H4 それぞれの遺伝⼦子は 6, 10, 8, 11, 8
コピー、バリアントは 6, 3, 4, 2, 1 種存在する。このヒストン遺伝⼦子の中、39 個は約 110 kb の 1
つのクラスターの中に局在している[9]。最初に、私共は、このニワトリ DT40 株を⽤用いた遺伝
⼦子破壊法で、ヒストン及びヒストン･シャペロン遺伝⼦子の⽋欠損変異株を多数作製し、それぞれの機能を 2D-PAGE（⼆二次元電気泳動法）など様々な実験⼿手法で解析して、次のような結果を明らかにした[69-76]。
   1) 特定のヒストン遺伝⼦子が⽋欠損しても、同じサブタイプの他の遺伝⼦子の発現量が増加し、そのサブタイプのヒストン量を⼀一定に保つ⾃自⼰己補償機能がある。2) 特定のコアヒストン･バリアン
トが⽋欠損すると、ある種の細胞内蛋⽩白質の量が変化する。3) クラスターの約半分が⽋欠損しても、⽣生存には影響しないが幾つかの細胞内蛋⽩白質の量が変化する。4) クラスターの 1 本のアリルが⽋欠損しても、⽣生存にも細胞内蛋⽩白質の量にも影響しない。5) 5 コピーのヒストン H1 遺伝⼦子が⽋欠損しても、⽣生存には影響しないが多種類の細胞内蛋⽩白質の量が変化する。6) 6 コピーのヒストン
H1 遺伝⼦子のそれぞれが⽋欠損すると、別々の細胞内蛋⽩白質の量が変化する。7) 全ヒストン H1 遺伝⼦子が⽋欠損すると、変則的なヌクレオソームを形成する。8) 特定のヒストン･バリアントがホモ
ロガス･リコンビネーションや DNA 損傷の修復に関与していることなどが⽰示された。これらの結果は各ヒストン･バリアントはクロマチン構造の構築の他に、遺伝⼦子発現の制御などにも直接的に深く関与していることを⽰示唆している。
   同様に、遺伝⼦子破壊法を⽤用いて、クロマチンのアセンブリー（会合）に関与する 4 種類のヒ
ストン･シャペロン(CAF-1, ASF1, HIRA, HAT1)遺伝⼦子の⽋欠損変異株を作製して、それぞれの機能を調べた。1) 細胞の⽣生存に必須であること、2) 細胞分裂時や DNA 複製時にヌクレオソームやクロマチンの素早いアセンブリーに関与すること、3) 細胞周期を調節すること、4) DNA 損傷の回復やヒストン H3-H4 複合体の保持に関与することなどを明らかにした。これらヒストン･シャ
ペロンの機能の詳細な結果に関しては、私共のオリジナル論⽂文を参照されたい[75, 76]。

ニワトリ DT40 細胞株を⽤用いた HATs と HDACs の各メンバーの機能解析：

   クロマチン構造のエピジェネティックな翻訳後修飾は、上記のように多種多様であり、これらの化学修飾に関与する多種類のクロマチン修飾酵素が様々な⽣生物種で多数存在し、それぞれ

  

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多彩な機能を発揮する。コアヒストンの特定の Lys 残基のアセチル化と脱アセチル化を触媒する
HATs と HDACs のメンバーも多数存在する。私共は DT40 株で遺伝⼦子破壊法を⽤用い、HAT ファ
ミリーと HDAC ファミリー（いずれも更にサブファミリーに分類される）の各メンバーの遺伝
⼦子を⽋欠損した変異株を系統的に作製し、各遺伝⼦子の詳細な機能を種々の実験⼿手法を⽤用いて調べた[77-93]。これらの結果の要約は次の通りである。HAT ファミリーに関しては、1) GCN5 は多種 多 様 な 機 能 を 持 っ て お り 、 細 胞 周 期 、 ア ポ ト ー シ ス 、 PI3K/Atk survival pathway,
superoxide-generating system, 紫外線照射･抵抗性、Blimp-1 合成、プロテイン･キナーゼ合成、⼩小胞体ストレス、IgM H-chain 合成などに、それぞれに係わる遺伝⼦子の発現を制御することを介して関与している。2) PCAF は Bcl-6 や Pax5 などの転写因⼦子の遺伝⼦子発現や分泌型免疫グロブリ
ン合成の制御に関与している。3) TIP60 は細胞の⽣生存に必須である。4) HAT1 は上記のようにヒストン H3-H4 複合体を保持する機能を持つ。HDAC ファミリーに関しては、1) HDAC2 は IgM
H-chain と L-chain の遺伝⼦子の発現制御に深く関与しており、その詳細については後述する。2)
HDAC3 は細胞の⽣生存に必須であり、アポトーシスの進⾏行に関与している。3) SIRT1/2 はストレス･トレランスに関与している。ニワトリの他の HAT 及び HDAC メンバーの機能は作製済の⽋欠損変異株の解析が進んでいないため、まだ不明である。多くの⽣生物種の多数のクロマチン修飾
酵素の機能については膨⼤大な数の研究があり、他の専⾨門書などの成書を参照されたい。

ニワトリ DT40 細胞株での IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現制御：

   上記のように、私共はクロマチンのエピジェネティック化学修飾の中で、最も重要なヒスト
ンのアセチル化と脱アセチル化を触媒する HAT と HDAC ファミリーの各メンバーの機能を、ニ
ワトリ DT40 細胞株で遺伝⼦子破壊法を駆使して、それぞれの遺伝⼦子の⽋欠損変異株を系統的に作製し、様々な実験⼿手法(2D-PAGE, RT-PCR, Northern blotting, Western blotting, FACS analysis, RNase
protection assay など)を駆使して解析した。最初に、HDAC1 と HDAC2 の各⽋欠損変異株（以後HDAC1(-/-)と HDAC2(-/-)と記す）と DT40 野⽣生株の全細胞内蛋⽩白質を 2D-PAGE で⽐比較･分析した[77]。HDAC1(-/-)と DT40 のメジャーな細胞内蛋⽩白質の泳動パターンに⼤大差がなかった。⼀一⽅方、HDAC2(-/-)と DT40 のメジャーな細胞内蛋⽩白質の泳動パターンに⼤大きな違いが認められた。
HDAC2(-/-)では分⼦子量の⼤大きな 1 つの蛋⽩白質スポットと分⼦子量の⼩小さな 2 つの蛋⽩白質スポットが劇的に増加していた。変化したこれらの蛋⽩白質のアミノ酸配列決定の結果から、分⼦子量の⼤大きい蛋⽩白質は IgM H-chain、分⼦子量の⼩小さい 2 つの蛋⽩白質は IgM L-chain であることが判明した。
この結果は Western blotting でも確認できた。すでに他のグループにより、IgM H-chain mRNA（メッセンジャー RNA）は、まず pre-mRNA（前駆体 mRNA）として転写され、引き続いて、alternative
splicing（選択的スプライシング）の過程を経て、secreted form（分泌型）と membrane-bound form
（膜結合型：BCR）の 2 つの mature（成熟型）な IgM H-chain mRNAs に成ることは明らかにな

  

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っていた。HDAC2(-/-)の全 RNAs を Northern blotting や RNase protection assay で調べた結果、
HDAC2 は IgM H-chain 量を転写と選択的スプライシングの 2 つのステップで抑制的に制御していることを明らかにした。
   次に、HAT と HDAC ファミリーの他のメンバーの IgM H-chain と L-chain 遺伝⼦子発現への影響を調べた[84]。これら２つの遺伝⼦子発現は GCN5(-/-)では僅かに減少し、PCAF(-/-)では僅かに増加していた。⼀一⽅方、HDAC3(-/-), HDAC4(-/-), HDAC7(-/-), HDAC4(-/-)/7(-/-), SIRT1(-/-), SIRT2(-/-),
HAT1(-/-), MOZ(-/-), MORF(-/-), MOZ(-/-)/MORF(-/-), TIP60(-/-)などでは変化が認められなかった。
これらのデータは、HDAC2 が IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現を主に制御していることを強く⽰示している。
   引き続いて、HDAC2(-/-)の幾つかの性質を検討した[84]。HDAC2 ⽋欠損に伴って増加した IgMH-chain と L-chain は互いに結合した⾼高分⼦子複合体を形成して存在し、その量が分泌能⼒力をはるかに超えるため、HDAC2(-/-)の⼩小胞体に蓄積していた。また、コアヒストンの Lys (K)残基のアセチル化レベルを調べた。DT40 と⽐比べて、
HDAC2(-/-)では、
K7/H2A は約 140%に増加し、K16/H2B
は約 50%に減少し、K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 はそれぞれ約 290%, 285%, 185%,
240%, 165%に増加し、K5/H4 は約 170%に増加していた。
   さらに、ヒストン、HAT、HDAC、転写因⼦子の各メンバーの遺伝⼦子発現量を DT40 と HDAC2(-/-)
で調べた[84]。コアヒストンに関しては、H2A, H2B, H3, H4 の遺伝⼦子発現は変化なく、HATs に関しては、PCAF の遺伝⼦子発現は劇的に増加し、HDACs に関しては、HDAC4 と HDAC5 の遺伝
⼦子発現は増加し、HDAC7 の遺伝⼦子発現は低下していた。転写因⼦子に関しては、E2A の遺伝⼦子発
現は増加し、Pax5, EBF1, Aiolos, Ikaros の遺伝⼦子発現は低下していた。これらのデータは、上述の HDAC2 以外の HAT と HDAC メンバーは IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現に深くは関わっていないというデータと併せて、転写因⼦子 Pax5, EBF1, E2A, Aiolos, Ikaros などが、2 つの免疫グ
ロブリン遺伝⼦子の発現制御に重要であることを強く⽰示唆している。
   これらの結果に基づいて、各転写因⼦子の IgM H-chain と L-chain 遺伝⼦子の発現制御への関与を調べるために、各遺伝⼦子の ⽋欠損変異株、Pax5(-), EBF1(-/-), E2A(-/-), Aiolos(-/-), Helios(-/-),
Ikaros(-/-/+)などを作製した[84, 94-98]。上述のように、ニワトリの Pax5 遺伝⼦子はモノソミーの Z
sex chromosome に存在するので、one allele をノック･アウトしただけでホモ⽋欠損変異株が作製でき、Ikaros 遺伝⼦子はトリソミーの chromosome 2 に存在するので、two alleles をノック･アウトしてもヘテロ⽋欠損変異株しか作製できなかった[99, 100]。Helios(-/-)では IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現に変化がなかった。Pax5(-), Aiolos(-/-), EBF1(-/-), Ikalos(-/-/+)では程度の差はあっても、IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現は増加した（図-1E）。⼀一⽅方、E2A(-/-)では IgM H-chain と L-chainの遺伝⼦子発現は減少した。これらのデータは Pax5, Aiolos, EBF1, Ikaros は IgM H-chain と L-chainの遺伝⼦子発現を抑制すること、逆に、E2A はこの 2 つの遺伝⼦子発現を促進することを⽰示してい

  

10  

  

る。また、私共は別の実験で OBF1 が免疫グロブリン遺伝⼦子の発現を促進することも明らかにした[101]。さらに、HDAC2(-/-), Pax5(-), EBF1(-/-), E2A(-/-), Aiolos(-/-), Ikaros(-/-/+) 以外の私共が作製した HAT、HDAC、ヒストン、ヒストン･シャペロンそれぞれのファミリーの各メンバーの⽋欠損変異株（約 30 種）では IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現と蛋⽩白質レベルに変化が認められなかった。
   以上の結果から、DT40 野⽣生株では、HDAC2 はスーパーバイザーとして、Pax5, Aiolos, EBF1,
Ikaros の遺伝⼦子発現の抑制と E2A, OBF1 の遺伝⼦子発現の促進という逆⽅方向の 2 つの制御機構を介して、IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現を包括的に制御していることが明らかになった（図1-W）[84]。

転写因⼦子 E2A, Aiolos, Helios, EBF1, Pax5 の機能解析：

   転写因⼦子はほぼ全ての⽣生物種で多種多様に存在し、それぞれ単独または協調して、様々な遺伝⼦子の発現をポジティブまたはネガティブに制御し、⽣生命活動を維持している。E2A, Aiolos,
Helios, EBF1, Pax5 の機能を上記の各⽋欠損変異株 E2A(-/-), Aiolos(-/-), Helios(-/-), EBF1(-/-), Pax5(-)
を⽤用いて調べて、次のような結果を得た[84, 94-98]。E2A は survivin, IAP2, caspase-8 の遺伝⼦子発現を制御することを介して、BCR シグナリングが介在する immature B 細胞(DT40)のアポトーシ
スを微調節する。Aiolos ⽋欠損はチトクローム c の遊離を促進することを介して、BCR シグナリ
ングが介在する immature B 細胞のアポトーシスを加速する。Helios は protein kinase Cs の遺伝⼦子発現を制御することを介して、immature B 細胞の機能を調節する。EBF1 は immature B 細胞でBlimp-1 遺伝⼦子発現の強⼒力な repressor として機能する。
さらに、
EBF1 は immature B 細胞で protein
kinase Cθの遺伝⼦子発現を GCN5 とは逆⽅方向に制御する。
Pax5 には A タイプと B タイプがあり、この 2 つは immature  B 細胞で B  cell  development-‑related  genes の遺伝⼦子発現制御において異なる作⽤用をする。  
   E2A,  Aiolos,  Helios,  EBF1,  Pax5 は DT40 株で他の遺伝⼦子の発現にも関わっており、さらに他の細胞や⽣生物種においても多くの遺伝⼦子の発現制御に関与していることは当然である。もちろん、多種類存在する転写因⼦子はあらゆる細胞や⽣生物種で多種多様な遺伝⼦子の発現を多彩に制御する機能を持っている。転写因⼦子に関しては、膨⼤大な数の研究が⾏行われており、多くの成書があり、これらを参照されたい。  
  HDAC2(-‑/-‑)  DT40 変異株での HDAC2 遺伝⼦子の再発現実験の試み：     IgM  H-‑chain と L-‑chain 遺伝⼦子の発現制御における、HDAC2 の役割をさらに詳細に解析する
ために、再発現（再構成）実験を試みた。HDAC2(-‑/-‑)   DT40 変異株に tetracycline-‑   (tet-‑)  repressive  HDAC2  cDNA を導⼊入して、内在性の(endogenous)  HDAC2 の two  alleles を⽋欠失し、

  

11  

  

tet-‑repressive  HDAC2  cDNA を持つ HDAC2(-‑/-‑)tetHDAC2(+)変異株を作製した。この変異株においては、tetracycline 存在下で HDAC2  cDNA の転写は抑制されるため、HDAC2 酵素は存在しない。⼀一⽅方、tetracycline ⾮非存在下では HDAC2  cDNA が転写されるため、HDAC2 酵素が存在する。したがって、この HDAC2(-‑/-‑)tetHDAC2(+)では、tetracycline 存在下では、
HDAC2(-‑/-‑)   と同様に、IgM  H-‑chain と L-‑chain 遺伝⼦子が発現し、tetracycline ⾮非存在下では、
DT40 と同様に、IgM  H-‑chain と L-‑chain 遺伝⼦子の発現が抑制されることが想定される。ところが、私共の予想に反して、HDAC2(-‑/-‑)tetHDAC2(+)において、野⽣生株 DT40 及び tetracycline
⾮非存在下で HDAC2 酵素が存在する場合と同様に、tetracycline 存在下で HDAC2 酵素が存在しない場合も、IgM  H-‑chain と L-‑chain 遺伝⼦子の発現は抑制されていた。すなわち、HDAC2 酵素の存在･⾮非存在に関わらず、HDAC2(-‑/-‑)tetHDAC2(+)において、IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現はほぼ認められなかった。  
  培養を繰り返した HDAC2(-‑/-‑)  DT40 変異株での IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量の低下：     常法にしたがって、作製した種々の遺伝⼦子の⽋欠損 DT40 変異株は次の実験まで液体窒素（あるいは   -‑80  ℃）で保存した。ある実験に⽤用いた DT40 変異株の⼀一部は次の実験まで保存操作を繰り返し⾏行った。培養を数回繰り返した後、HDAC2(-‑/-‑)の全細胞内蛋⽩白質を 2D-‑PAGE で分析した。予想に反して、IgM   H-‑chain と L-‑chain のスポットは DT40 野⽣生株とほぼ同じレベルまで減少していた。この結果は、HDAC2(-‑/-‑)の全 RNAs を RT-‑PCR で分析して得られた IgM  H-‑chain と L-‑chain のバンドが減少した結果とも⼀一致した。⼀一⽅方、培養を繰り返していない別のHDAC2(-‑/-‑)   clones の全蛋⽩白質と全 RNAs を 2D-‑PAGE と RT-‑PCR で分析したところ、IgM  H-‑chain と L-‑chain のスポットとバンドは減少しないことが確認できた。この結果は、HDAC2(-‑/-‑)を⻑⾧長期間培養すると IgM  H-‑chain と L-‑chain 遺伝⼦子の発現が低下することを⽰示すと
共に、上記の HDAC2(-‑/-‑)tetHDAC2(+)では、HDAC2 の有無に関わらず、IgM   H-‑chain とL-‑chain 遺伝⼦子の発現が抑制されるのは、この DT40 変異株の作製時に⻑⾧長期間培養したためであることを⽰示唆する。  
   上記の私共の結果から、HDAC2 はスーパーバイザーとして、Pax5,  EBF1,  Aiolos,  Ikaros,  E2A,  OBF1 などの遺伝⼦子発現をポジティブまたはネガティブに調節することによって、IgM  H-‑chainと L-‑chain 遺伝⼦子の発現を制御することが明らかになった[84]。
さらに、この結果はHDAC2(-‑/-‑)
を⻑⾧長期間培養すると、何らかの重要な未知のメカニズムによって、蓄積した⼤大量の IgM  H-‑chainと L-‑chain が劇的に減少することも強く⽰示唆している。  
   ここから、⾼高等真核細胞が温和な環境変化に初めて遭遇した時に、多世代を通じてエピジェ
ネティックな化学修飾によってクロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出することによって、この環境変化に適応するかまたは克服するために、プログラム化されていない新たな細胞機能

  

12  

  

を獲得するバイオ･システムに関する本総説の主題に移る[102-‑111]。  
  HDAC2(-‑/-‑)   DT40 変異株を⻑⾧長期間培養すると IgM   H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現(mRNA)
レベルと蓄積した蛋⽩白質量は多世代を通して劇的に減少する：     前述のように、HDAC2(-‑/-‑)の培養を数回繰り返すと、細胞内に蓄積した⼤大量の IgM  H-‑chainと L-‑chain 量は劇的に減少する。このデータは定性的ではあるが、極めて興味深い現象である。
したがって、このデータの確認も兼ねて、⻑⾧長期連続培養期間に HDAC2(-‑/-‑)の諸性質が変化するかどうかを調べた。  
   最初に、HDAC2(-‑/-‑)の細胞内蛋⽩白質レベルが⻑⾧長期培養期間に変化するかどうかを調べた。培
養期間の初期（~∼10 ⽇日⽬目）(E;  early)、中期（~∼30 ⽇日⽬目）(M;  middle)、後期（~∼60 ⽇日⽬目）(L;  later)
ステージの HDAC2(-‑/-‑)から全蛋⽩白質を単離し、コントロールの野⽣生株 DT40 の全蛋⽩白質と2D-‑PAGE を⽤用いて⽐比較した（図-‑2）[102,  103]。初期ステージでは、前述の結果と同様に、IgM  H-‑chain（分⼦子量の⼤大きなスポット）と L-‑chain（分⼦子量の⼩小さな 2 スポット）は劇的に増加していた。中期ステージでは、この 2 つの免疫グロブリンの蛋⽩白質量はかなり減少していた。後
期ステージでは、IgM  H-‑chain と L-‑chain 量はさらに減少し、DT40 株とほぼ同じレベルであった。⼀一⽅方、⻑⾧長期培養期間を通して、他のほとんどのメジャーな細胞内蛋⽩白質のレベルに変化は認められなかった。さらに、別の HDAC2(-‑/-‑)   clones でも同様の結果が得られた。これらの結果は、HDAC2 ⽋欠損に伴って蛋⽩白質量が増加すること及び HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間で減少することは、IgM  H-‑chain と L-‑chain に特徴的な現象であることを⽰示している。  
   次に、⻑⾧長期培養期間（~∼56 ⽇日まで）の任意の数ステージの HDAC2(-‑/-‑)から単離した全細胞
内蛋⽩白質を IgM  L-‑chain の特異抗体(IgM  H-‑chain とも交叉反応する)を⽤用いた Western  blotting
で分析した（図-‑3）[102,  103]。初期ステージでは、IgM  H-‑chain（分⼦子量の⼤大きな 1 つのバンド）と L-‑chain（分⼦子量の⼩小さな 2 つのバンド）の量は DT40 株の量と⽐比較べて劇的に増加していた。培養期間が⻑⾧長くなるに伴って、各ステージでの 2 つの蛋⽩白質量は徐々に減少し、後期ステージ（~∼56 ⽇日⽬目）では、DT40 株とほぼ同じレベルになった。この結果も別の HDAC2(-‑/-‑)  clones でも確認できた。  
   さらに、初期と後期ステージでの HDAC2(-‑/-‑)を IgM   H-‑chain の特異抗体を⽤用いた免疫組織
化学的⼿手法で調べた。電⼦子顕微鏡観察で、IgM  H-‑chain  (electron-‑dense  materials として)は、初期ステージの⼩小胞体のみに局在が認められ、後期ステージでは DT40 株と同様に認められなかった。また、免疫電⼦子顕微鏡観察で、IgM  H-‑chain  (colloidal  gold  immune-‑labeling として)は、同様に初期ステージの⼩小胞体のみで蓄積が認められ、蓄積した IgM   H-‑chain は後期ステージでは、DT40 株とほぼ同じレベルまで減少していた（図-‑4）[102,  103]。  
   以上の結果は、IgM  H-‑chain と L-‑chain は HDAC2(-‑/-‑)の培養の初期ステージでは劇的に蓄積

  

13  

  

し、この蓄積した 2 つの免疫グロブリンは⻑⾧長期培養期間を通して漸次減少し、後期ステージでは DT40 株とほぼ同レベルになることを⽰示している。さらに、蓄積した IgM  H-‑chain と L-‑chainは可溶性で互いに結合した⾼高分⼦子複合体を形成して⼩小胞体に存在することも⽰示している。  
   次に、HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間における IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現パターンの変化を調べた。⻑⾧長期培養の初期（~∼20 ⽇日⽬目）、中期（~∼40 ⽇日⽬目）、後期（~∼60 ⽇日⽬目）ステージでの 3 つの HDAC2(-‑/-‑)  clones と DT40 株から全 RNAs を単離した。IgM  H-‑chain  mRNA の完全型(whole  form),   分泌型(secreted  form),   膜結合型(membrane-‑bound  form)と L-‑chain  mRNA に特異的なプライマー(primers)を⽤用いた RT-‑PCR で分析した（図-‑5）[102,   103]。明らかに、完全型と分泌型 IgM  H-‑chain  mRNA は初期ステージで増加し、中期を経て後期ステージで劇的に減少していた。膜結合型 IgM  H-‑chain  mRNA と L-‑chain  mRNA の変化は僅かであった。  
   以上の結果は、HDAC2 ⽋欠損による IgM  H-‑chain と L-‑chain 量の劇的な増加は、その遺伝⼦子発現の促進に基づくこと、さらに、HDAC2(-‑/-‑)の連続培養期間に IgM  H-‑chain と L-‑chain 量が減少するのは、これらの遺伝⼦子発現が多世代を通して抑制されることに基づくことを⽰示している。
    HDAC2(-‑/-‑)   DT40 変異株の⻑⾧長期培養期間のヒストン、HAT、HDAC、転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現パターンの変化：     引き続いて、HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間におけるコアヒストン、HAT、HDAC、転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現パターンの変化を調べた[102,  103]。上記の実験と同じ培
養初期、中期、後期ステージの HDAC2(-‑/-‑)と DT40 の全 RNAs を各メンバーに特異的なプラ
イマーを⽤用いた RT-‑PCR で分析した。その結果、コアヒストン H2A,  H2B,  H3,  H4 の遺伝⼦子発
現は、HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間を通して変化が認められなかった（図-‑5）。HATs と HDACs
に関しては次の通りであった（図-‑6A）。PCAF の遺伝⼦子発現は初期から後期ステージまで劇的に増加した。HDAC7 の遺伝⼦子発現は初期ステージで幾らか減少し、その後は後期ステージまで変化しなかった。HDAC9（以前の HDAC5）の遺伝⼦子発現は初期から中期ステージまでは劇的に増加し、後期ステージでは幾らか減少した。転写因⼦子に関しては次の通りであった（図-‑6B）。
E2A の遺伝⼦子発現は初期ステージで幾らか増加し、その後、中期と後期ステージではほぼ変化しなかった。EBF1 の遺伝⼦子発現は初期ステージでほぼ完全に消失し、その後、中期と後期ステージでは全く変化しなかった。Aiolos の遺伝⼦子発現は初期ステージで少し減少し、その後も、中期から後期ステージまで僅かに減少した。極めて興味深いことに、Pax5 の遺伝⼦子発現は初期ステージでかなり減少し、その後は、中期を経て後期ステージまで明らかに増加した。⼀一⽅方、分析した他のメンバーの遺伝⼦子発現パターンに⼤大きな変化は認められなかった。  
   以上の結果は、HDAC2 ⽋欠損に伴って、HAT,  HDAC、転写因⼦子ファミリーの数種の特定メン
バーの遺伝⼦子発現は変化すること、さらに、これらの遺伝⼦子発現は、HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期連続培

  

14  

  

養期間の多世代を通して、増加したり、減少したり、変化しなかったりと極めて複雑であることを⽰示している。  
  HDAC2(-‑/-‑)   DT40 変異株の⻑⾧長期培養期間のコアヒストンの Lys 残基のバルクのアセチル化レ
ベルの変化：     HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間のコアヒストン H2A,   H2B,   H3,   H4 の多数の Lys(K)残基のバルク(bulk)のアセチル化レベルの変化を、培養の初期（~∼20 ⽇日⽬目）、中期（~∼40 ⽇日⽬目）、後期（~∼60
⽇日⽬目）ステージにおける 3 つの HDAC2(-‑/-‑)  clones と DT40 から全 RNAs を単離し、多数のアセチル化とメチル化 Lys 残基の特異抗体(~∼18 種)を⽤用いた immuno-‑blotting で⽐比較した（図-‑7）[102,   103]。H2A に関しては、K7/H2A のアセチル化レベルは HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間に僅かに変化した。H2B に関しては、K16/H2B のアセチル化レベルは初期ステージで明らかに減少し、その後、後期ステージまで変化しなかった。H3 に関しては、K9/H3,  K14/H3,  K18/H3,  K23/H3,   K27/H3 のアセチル化レベルは初期ステージから中期を経て後期ステージまで劇的に増加した。H4 に関しては、K5/H4 のアセチル化レベルは初期ステージで増加し、その後、後期
ステージまで変化しなかった。⼀一⽅方、分析した他の Lys 残基のアセチル化とメチル化レベルには⼤大きな変化は認められなかった。これらの結果は、脱アセチル化活性を持つ HDAC2 の⽋欠損にも関わらず、変化した Lys 残基の中で、K16/H2B 以外はアセチル化レベルが予想に反して増加したことを⽰示しており、その理由は極めて興味深いが未だ不明である。  
  ニワトリ Pax5 遺伝⼦子の~∼4.9  kb  5ʼ’-‑近傍上流断⽚片(proximal  ~∼4.9  kb  5ʼ’-‑upstream  fragment)のクローニング：     上述のように、HDAC2 は、Pax5,  EBF1,  Aiolos,  Ikaros,  E2A,  OBF1 などの遺伝⼦子発現をポジ
ティブ⼜又はネガティブに調節することを介して、IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現を間接的に⼀一括して制御する。さらに、上記及び後記するように、Pax5(-‑)でこの 2 つの免疫グロブリン
遺伝⼦子の発現が劇的に増⼤大することは、これらの転写因⼦子の中で、Pax5 が IgM   H-‑chain とL-‑chain 遺伝⼦子の発現制御に最も重要な役割を担っていることを⽰示している。従って、Pax5 遺伝⼦子の発現制御機構を明らかにすることは極めて重要であり、そのためには 5ʼ’-‑近傍上流域の塩基配列やクロマチン構造に関する情報は必須である。しかし、私共が本研究を開始した時に、ニワトリの EBF1,  Aiolos,  Ikaros,  E2A,  OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑上流域の塩基配列は決定済であったが、Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑上流域の塩基配列の情報は明らかでなかったので、まず Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍
上流域断⽚片のクローニングを⾏行った。  
   常法に従って、最初に、ニワトリの染⾊色体 DNA ライブラリー(genomic   DNA   library)をスク
リーニングして、Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流域断⽚片のクローニングを数回試みたが、いずれも成

  

15  

  

功しなかった。ライブラリーからのクローニングの不成功とそれまで Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑上流域の塩基配列が未決定だった理由としては、他の chromosomes に存在する Pax5 ホモログの 5ʼ’-‑上流域の塩基配列は決定済だったのに、
Pax5 遺伝⼦子はモノソミーの Z  sex  chromosome に存在し、コピー数が少ないためと考えられる。次に、サザン･ブロッティング、コロニー･ハイブリダイ
ジェーション、サブクローニング(Southern  blotting,  colony  hybridization,  sub-‑cloning)などを⽤用いた独⾃自の染⾊色体ウォーキング（歩⾏行）法(gene  walking  techniques)を駆使して、DT40 染⾊色体
DNA  (DT40  genomic  DNA)   から、Pax5 遺伝⼦子の~∼4.9  kb  5ʼ’-‑近傍上流域断⽚片(proximal  ~∼4.9  kb  5ʼ’-‑upstream   fragment)を直接クローニングすることに成功した。その塩基配列を決定し、Pax5  5ʼ’-‑近傍上流域断⽚片が   4950  bp  5ʼ’-‑upstream  fragment と 241  bp  open  reading  frame を含むことを明らかにした(GenBank  accession  number:  LC060666)。  
   次に、この Pax5  proximal  ~∼4.9  kb  5ʼ’-‑upstream  fragment の 5ʼ’-‑⽋欠失変異ベクターと 3ʼ’-‑⽋欠失変
異ベクター(5ʼ’-‑deletion  and  3ʼ’-‑deletion  mutant  vectors)を多数作製し、DT40 と Hela 細胞でルシフェラーゼ･アッサイ(Dual-‑luciferase  assay)を⽤用いて、発現制御部位の有無を調べた。定性的データではあるが、少なくとも 1.6   kb   5ʼ’-‑近傍上流域までに Pax5 遺伝⼦子の発現制御に関わる２つの部位が存在することが⽰示唆された。  
  HDAC2(-‑/-‑)   DT40 変異株の⻑⾧長期培養期間の Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流クロマチン領域における K9/H3 のアセチル化レベルの変化：     ⼀一般的に、特定の遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流域のクロマチン構造(proximal   5ʼ’-‑upstream   chromatin  structure)は、その領域内に転写制御部位の存在･⾮非存在に関わらず、当該遺伝⼦子の発現に直接的かつ密接に関与する。また、上記のように、Pax5 遺伝⼦子の少なくとも~∼1.6   kb   5ʼ’-‑近傍上流域のクロマチン構造は Pax5 遺伝⼦子の発現制御に関与していることが⽰示唆された。さらに、
HDAC2(-‑/-‑)の培養の初期ステージで Pax5 遺伝⼦子の発現は劇的に低下し、その後、後期ステー
ジまで劇的に増加することを明らかにした。  
   Pax5 遺伝⼦子の発現制御に関連して、HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間に、Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍
上流域のクロマチン構造が変化するかどうかを、アセチル化 K9/H3 の特異抗体と Pax5 遺伝⼦子の~∼2.0  kb  5ʼ’-‑近傍上流域を短い断⽚片に増幅できる多数のプライマーを⽤用いて、クロマチン免疫沈殿法(chromatin  immuno-‑precipitation  assay:  ChIP)で調べた[102,  103]。ChIP アッセイ法の詳細については後述するが、初期と後期ステージでの 3 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones のクロマチンを分析した（図-‑8）。HDAC2(-‑/-‑)では、Pax5 遺伝⼦子の proximal   ~∼2.0   kb   5ʼ’-‑upstream  chromatin  region の K9/H3 のアセチル化レベルは初期ステージで減少し、後期ステージで増加していた。このデータは HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間の Pax5 遺伝⼦子の発現パターンの変化とほぼ⼀一致した。  

  

16  

  

  
Pax5(-‑)  DT40 変異株の⻑⾧長期培養期間の IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現と蛋⽩白質レベルの変化：     上記のように、Pax5 は HDAC2 による IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現制御機構に関与する最も重要な転写因⼦子である。Pax5(-‑)の⻑⾧長期培養期間において、IgM   H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現と蛋⽩白質レベルがどのように変化するかを調べた。最初に、培養の最初期(~∼4 ⽇日⽬目)(F;   first)、初期(~∼8 ⽇日⽬目)、中期(~∼13 ⽇日⽬目)、後期(~∼20 ⽇日⽬目)の各ステージ（これらのステー
ジ名は HDAC2(-‑/-‑)のケースより短い）での３つの Pax5(-‑)  individual  clones から全 RNAs を単離し、IgM   H-‑chain と L-‑chain 遺伝⼦子に特異的なプライマーを⽤用いた RT-‑PCR で分析した（図-‑9）[102,  104]。完全型(whole  form)と分泌型(secreted  form)の IgM  H-‑chain  mRNAs は最初期ステージで劇的に増⼤大し、初期と中期ステージを通して減少し、後期ステージでは DT40 とほぼ同レベルまで減少した。膜結合型(membrane-‑bound   form)   IgM   H-‑chain   mRNA と IgM  L-‑chain  mRNA は最初期ステージでかなり増⼤大し、その後、初期と中期ステージを通して僅かに減少し、後期ステージで DT40 とほぼ同じレベルまで減少した。  
   次に、初期、中期と後期ステージでの Pax5(-‑)から全細胞内蛋⽩白質を単離し、IgM  H-‑chain とL-‑chain の特異抗体を⽤用いた Western  blotting で分析した（図-‑10）[102,  104]。IgM  H-‑chain とL-‑chain  (2   バンド)は初期ステージで劇的に増⼤大し、中期を経て後期ステージでは DT40 とほぼ同レベルまで減少した。電⼦子顕微鏡観察の結果、IgM  H-‑chain  (electron-‑dense  materials として)は初期ステージの⼩小胞体のみに局在し、後期ステージ及び DT40 株では認められなかった。同様に、免疫電⼦子顕微鏡観察の結果、IgM  H-‑chain  (colloidal  gold  immune-‑labeling として)は、初期ステージの⼩小胞体のみに蓄積し、後期ステージでは DT40 株とほぼ同レベルまで減少していた。これらの結果は 2D-‑PAGE でも確認できた。また、初期ステージの Pax5(-‑)の⼀一部の形態は成熟型リンパ細胞様として観察され、後期ステージでは DT40 と同様の通常型形態に変化したように観察された。さらに、初期と後期ステージの Pax5(-‑)は、後述する HDAC2(-‑/-‑)とは異なって、DT40 と同じ様に分散した形態で存在していた（図-‑11）[102,  104]。  
  Pax5(-‑)  DT40 変異株の⻑⾧長期培養期間の HAT,  HDAC、転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝
⼦子発現レベルの変化：     引き続いて、Pax5(-‑)の⻑⾧長期培養期間の HAT、HDAC、転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現パターンの変化を調べた（図-‑12）[102,   104]。上記の実験と同じ培養の最初期、初期、中期、後期ステージの Pax5(-‑)と DT40 の全 RNAs を各メンバーに特異的なプライマーを⽤用いた RT-‑PCR で分析した。
HAT と HDAC の各メンバーに関しては（図-‑12A）、PCAF と HDAC9の遺伝⼦子発現は培養の最初期ステージから増⼤大し始め、初期と中期ステージを経て、後期ステ

  

17  

  

ージで劇的に増⼤大した。⼀一⽅方、HDAC7 の遺伝⼦子発現は最初期ステージで減少し、その後は漸次増加して、後期ステージで DT40 とほぼ同レベルまで増加した。転写因⼦子の各メンバーに関しては（図-‑12B）、Aiolos と OBF1 の遺伝⼦子発現は最初期ステージから減少し、初期と中期を経て、後期ステージで DT40 と同じように検出できないレベルまで減少した。Ikaros,  E2A,  Blimp-‑1 の遺伝⼦子発現は最初期ステージで劇的に増⼤大し、初期と中期ステージで漸次減少し、後期ステー
ジで DT40 と同レベルまで減少した。EBF1 の遺伝⼦子発現は最初期ステージで劇的に減少し検出できないレベルになり、その後は、初期、中期と後期ステージで変化しなかった。PU.1 の遺伝
⼦子発現は最初期ステージで劇的に減少し、初期と中期ステージを通して漸次増加し、後期ステージで DT40 より⾼高いレベルまで増加していた。  
   以上の Pax5(-‑)の⻑⾧長期培養期間の IgM  H-‑chain と L-‑chain や HAT,  HDAC、転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現パターンの変化は、HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間のそれぞれの発現パターンの変化よりも明らかに早く起きていた。この結果は、種々の遺伝⼦子発現制御の過程で、Pax5 や他の転写因⼦子は、HDAC2 や他のクロマチン修飾酵素よりも下流で関与していることに基づくことを⽰示している。さらに、HDAC2(-‑/-‑)と Pax5(-‑)では多数のクロマチン修飾酵素や転写因⼦子の遺伝⼦子発現パターンが異なっており、この 2 つの変異株の様々な性質や機能が明らかに異なることも⽰示している。  
   ここからは、HDAC2(-‑/-‑)   DT40 変異株の各クローン(individual   clones)において、HDAC2
⽋欠損に伴って劇的に増⼤大した IgM  H-‑chain と L-‑chain が、⻑⾧長期連続培養期間の多世代を通して、それぞれ異なる⽅方法で劇的に減少する想定外の極めて興味深い話題に移る。  
  HDAC2(-‑/-‑)  DT40 変異株の再度の作製：     上記の HDAC2(-‑/-‑)の⻑⾧長期培養期間（特に初期ステージ）における、IgM  H-‑chain と L-‑chainの遺伝⼦子発現や蛋⽩白質レベル及びクロマチン修飾酵素や転写因⼦子の遺伝⼦子発現の変化などの実験データには、かなりの曖昧さ･不確実さが存在する。その最⼤大の理由は、異なる期間培養した
HDAC2(-‑/-‑)をそれぞれ種々のタイムコース実験に⽤用いたため、各ステージ（特に初期ステージ）にばらつきがあって⼀一定していないためである。従って、上記の極めて興味深い諸々の現象をさらに詳細に解析することにした。多種多様なタイムコース実験に⽤用いる HDAC2(-‑/-‑)としては、培養期間の同じステージの⼤大量の細胞数が必要であること、可能な限り早い初期ステージの細胞が必要であること、多くの独⽴立したクローン(independent  clones)が必要であることなどである。そこで、常法に従って、前回とは異なる 2 つのターゲティング･ベクターを⽤用いた遺伝
⼦子破壊法を新たに実施した（図-‑13）[102,  105,  108,  109]。ニワトリ HDAC2 の genomic  DNAは 16 エクソン(exons)（以前の論⽂文では 14 エクソンと報告）で構成されていた。Southern  blotting,  Western   blotting,  RT-‑PCR などで調べた結果、28 個の独⽴立した HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones

  

18  

  

が作製できたことを確認した。ここから後は、28 個の individual  clonnes から無作為に選んだ６個の HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  (cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6)の様々な性質の⻑⾧長期培養期間の変化パターンの詳細な解析結果を記す。  
  HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones の⻑⾧長期培養期間の IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量及びmRNA 量の変化：     最初に、上記の 6 個の HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones の IgM   H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量が⻑⾧長期培養期間に変化するかどうかを⼤大まかに検討した（図-‑13C）[102,  105,  108,  109]。培養の初期（E:  ~∼3 ⽇日⽬目）、中期（M:  ~∼29 ⽇日⽬目）、後期（L:  ~∼53 ⽇日⽬目）ステージの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6 と野⽣生株 DT40(W)から全細胞内蛋⽩白質を単離し、IgM  L-‑chain の特異抗体(H-‑chain とも交叉反応する)を⽤用いた Western  blotting で分析した（詳細は後述）。初期ステージの 6 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones で、IgM  H-‑chain の蛋⽩白質量
は DT40 と⽐比べて明らかに増⼤大し、2 種の L-‑chain（2 つのバンド）の蛋⽩白質量も DT40 と⽐比べて増⼤大した。培養を続けると、全ての individual  clones で、IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量は中期を経て後期ステージで DT40 とほぼ同じレベルまで減少した。  
   次に、HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones で IgM  H-‑chain と L-‑chain   の mRNA 量が⻑⾧長期培養期間に変化するかどうかを⼤大まかに検討した（図-‑13D）[102,  105,  108,  109]。培養の初期（~∼7 ⽇日⽬目）、
中期（~∼33 ⽇日⽬目）、後期（~∼64 ⽇日⽬目）ステージの 6 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones と DT40
から全 RNAs を単離し、IgM   H-‑chain 及び L-‑chain の特異的プライマーを⽤用いた RT-‑PCR で分析した。完全型(whole  form)と分泌型(secreted  form)の IgM  H-‑chain  mRNA 量は初期ステージ
で増⼤大し、中期を経て後期ステージで DT40 とほぼ同じレベルまで減少した。膜結合型(membrane-‑bound  form)の   IgM  H-‑chain  mRNA 量は、clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6では、培養期間に明らかな変化はなく、clone  cl.2-‑1 では、中期を経て後期ステージで約 50%まで減少した。6 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones の IgM  L-‑chain  mRNA 量は、培養の全ステー
ジを通して僅かに変化するかあるいは変化しなかった。  
   新たに作製した全ての HDAC2(-‑/-‑)   clones で、⻑⾧長期培養期間の初期ステージで増加した IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量及び mRNA 量が中期を経て後期ステージまで減少したという上記のデータは、最初に作製した HDAC2(-‑/-‑)の既述のデータと⼤大筋で⼀一致した。この結果を踏
まえて、新たに作製した HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones の⻑⾧長期培養期間における、IgM  H-‑chainと L-‑chain の蛋⽩白質量及び遺伝⼦子発現レベルの他に、HAT,  HDAC,   転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現やその他の様々な性質の変化パターンを順次詳細に解析した。  
  全ての HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones で IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質レベルは⻑⾧長期培

  

19  

  

養期間にほぼ同じパターンで減少する：     最初に、⻑⾧長期培養期間に、HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones で IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質
レベルが変化するかどうかを詳細に調べた（図-‑14）[102,  105,  108,  109]。培養の初期（~∼3 ⽇日⽬目）、
中期（~∼29 ⽇日⽬目）、後期（~∼53 ⽇日⽬目）ステージの他、幾つかの中間ステージにおける 6 個のHDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6 と野⽣生株 DT40 から全細胞内蛋⽩白質を単離した。IgM  L-‑chain 特異抗体(H-‑chain とも交叉反応する)と H-‑chain 特異抗体の 2 つを⽤用いた Western  blotting で順次分析した。上記のように、IgM  H-‑chain は分⼦子量の⼤大きな 1 種類の蛋⽩白質として存在するが、2 つの特異抗体と反応するので、同じ IgM   H-‑chain 蛋⽩白質を別々の感度で検出できる。⼀一⽅方、IgM  L-‑chain は分⼦子量の⼩小さい 2 種類の蛋⽩白質として存在するので、その特異抗体で分⼦子量の⼩小さい接近した 2 バンドとして検出できる。  
   培養の初期ステージで、HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,   cl.2-‑3,   cl.2-‑4,   cl.2-‑5,  cl.2-‑6 全てにおいて、分⼦子量の⼤大きな IgM  H-‑chain（2 つのバンドで⽰示した）の蛋⽩白質レベルは、
DT40 と⽐比較して劇的に増⼤大した。⼀一⽅方、全ての HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones において、2 種類の L-‑chain（2 つのバンド）の蛋⽩白質レベルは、DT40 と⽐比較してかなり増⼤大した。予想通り
であるが極めて興味深いことは、培養を続けると、6 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones 全てに
おいて、増⼤大した IgM   H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質レベルは、中期を含めた中間の各ステージ
を通して漸次減少し、最終的に、後期ステージで DT40 とほぼ同じレベルまで減少した。この結果は、HDAC2 ⽋欠損に伴って初期ステージで劇的に増⼤大した IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量は、6 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones 全てにおいて、ほぼ同じ変化パターンで減少し、最終的には野⽣生型 DT40 とほぼ同じレベルに落ち着くことを⽰示している。  
  HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones のクロマチン修飾酵素(HATs,  HDACs)及び転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現レベルは⻑⾧長期培養期間に異なるパターンで変化する：     次に、⻑⾧長期培養期間に、6 個の HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones で HAT,   HDAC 及び転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現が変化するかどうかを詳細に調べた（図-‑15）。培養の初期（~∼7 ⽇日⽬目）、中期（~∼33 ⽇日⽬目）、後期（~∼64 ⽇日⽬目）ステージの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6 と野⽣生株 DT40 から全 RNAs を単離した。HAT,  HDAC 及び
転写因⼦子の各メンバーに特異的なプライマーを⽤用いた RT-‑PCR で分析した[102,  105,  108,  109]。
HATs と HDACs に関しては（図-‑15A）、⻑⾧長期培養期間、これら 6 つの HDAC2(-‑/-‑)   individual  clones で、PCAF,  HDAC7,  HDAC9 の各 mRNA レベルは劇的に変化した。他の多くのメンバーの mRNA レベルは変化しないか僅かに変化したのみであった。転写因⼦子に関しては（図-‑15B）、
⻑⾧長期培養期間、これら 6 つの HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones の 1 つあるいは複数の clones で、
Pax5,  Aiolos,  EBF1,  E2A,  PU.1,  Blimp1,  OBF1 の各 mRNA レベルは明らかに変化した。他の多

  

20  

  

くのメンバーの mRNA レベルに明⽩白な変化は認められなかった。  
   興味深いのは、変化した HAT,  HDAC 及び転写因⼦子の各メンバーの遺伝⼦子発現パターンの違いに基づいて、これら 6 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones は 3 つの異なるタイプ、すなわち、
clone  cl.2-‑1 と clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5 と clone  cl.2-‑6 に分類分けできることである。上記のように、clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5 は幾つかの性質が極めて類似しているため、以後は、6 つのHDAC2(-‑/-‑)  individual  clones の中で、clones  cl.2-‑3,  cl.2-‑5 を除いた４つの clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 の種々の細胞の性質を更に詳細に調べた。  
  HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones の形態の⻑⾧長期培養期間の変化：     まず、4 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 の形態を電⼦子顕微鏡で観察した（図-‑16:上図）[102,  105,  108,  109]。いずれの clones も⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは幾らか歪な形(distorted   form)をしており、後期ステージでは、野⽣生株 DT40 と同様に滑らかな形(smooth   form)をしていた。⼤大量の IgM   H-‑chain と L-‑chain の存在による濃い細胞質画分(dense   cytoplasmic   fractions)は初期ステージのみで観察され、後期ステージでは DT40 と同様に観察されなかった。さらに、HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 を IgM  H-‑chain の特異抗体を⽤用いた免疫電⼦子顕微鏡観察を⾏行った（図-‑16:下図）。蓄積した IgM  H-‑chain  (colloidal  gold  immune-‑labeling として)は初期ステージの⼩小胞体のみに存在し、後期ステージでは蓄積した IgM   H-‑chain のほとんどは、DT40 とほぼ同レベルまで減少していた。これらの結果は最初に作製した HDAC2(-‑/-‑)で得られた既述の結果とも合致した。  
   引き続いて、培養の初期及び後期ステージの HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,  cl.2-‑4,   cl.2-‑6 と DT40 の形態を顕微鏡で観察した（図-‑17）[102,   105,   108,   109]。4 つ全ての
HDAC2(-‑/-‑)   clones は、初期ステージでは凝集した形態(aggregative   form)で存在し、後期ステージでは DT40 や Pax5(-‑)と同様に１個ずつ分散した形態(dispersive  form)で存在していた。  
  全ての HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones で IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現レベルは⻑⾧長
期培養期間にほぼ同じパターンで減少する：     上記のように、
⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージで調べて結果、
IgM  H-‑chain と L-‑chainの蛋⽩白質と mRNA レベルの他、PCAF,   HDAC7,   HDAC9,   Pax5,   Aiolos,   EBF1,   E2A,   PU.1,  Blimp1,  OBF1 などの mRNA レベルも 6 つ全ての HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones で変化していた。そこで、変化したこれら IgM   H-‑chain と L-‑chain 及びクロマチン修飾酵素と転写因⼦子（その他に Ikaros,  XBP-‑1）の遺伝⼦子発現の変化パターンを、培養の初期（~∼7 ⽇日⽬目）、中期（~∼33 ⽇日⽬目）、後期（~∼64 ⽇日⽬目）ステージの他、さらに短い間隔の幾つかの中間ステージの 4 つのHDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 と野⽣生株 DT40 から全 RNAs を単離し

  

21  

  

て詳細に解析した。  
   最初に、IgM   H-‑chain   mRNA の完全型(whole   form),   分泌型(secreted   form),   膜結合型
(membrane-‑bound  form)と L-‑chain  mRNA の特異的なプライマー(primers)を⽤用いた RT-‑PCR で分析した（図-‑18）[102,  105,  108,  109]。完全型と分泌型 IgM  H-‑chain  mRNAs は初期ステージ
で劇的に増加し、中期ステージ及びその他の中間ステージを通して漸次減少し、最終的に後期ステージで DT40 とほぼ同じレベルまで減少した。
初期ステージで確かに増加した膜結合型 IgM  H-‑chain  mRNA は培養期間を通じて明らかに減少した。この減少の程度は、clone  cl.2-‑1 では僅
かに⼤大きく、clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 では僅かに⼩小さかった。4 つ全ての HDAC2(-‑/-‑)  clones
で、初期ステージで僅かに増加した IgM  L-‑chain  mRNA は培養期間を通じて緩やかに減少した。
これらの結果は、全ての HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones において、HDAC2 ⽋欠損に伴って劇的に増加した IgM   H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現レベルは、⻑⾧長期培養期間を通して全体的にほぼ同じパターンで減少し、最終的に、野⽣生株 DT40 と同じレベルになることを⽰示している。また、
上述の IgM   H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質レベルの減少パターンとも合致していることを⽰示している。  
  HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones で PCAF,  HDAC7,  HDAC9 の遺伝⼦子発現レベルは⻑⾧長期培
養期間にそれぞれ異なるパターンで変化する：     次に、PCAF,  HDAC7,  HDAC9 の特異的なプライマーを⽤用いた RT-‑PCR で分析を⾏行った（図-‑18）[102,  105,  108,  109]。⻑⾧長期培養期間に、4 つの HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 全てで PCAF,  HDAC7,  HDAC9 の遺伝⼦子発現パターンは次のように明らかに異なっていた。PCAF   mRNA レベルは DT40 で極めて低いが、4 つ全ての HDAC2(-‑/-‑)   individual  clones で中間ステージ(~∼17-‑22 ⽇日⽬目)まで劇的に増加した。その後、増加した PCAF  mRNA レベ
ルは clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4 で変化しなかったが、clone  cl.2-‑6 で劇的に減少した。なお、後期ステージの PCAF  mRNA レベルは clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4 では DT40 と⽐比べて⾼高く、clone  cl.2-‑6 では DT40 とほぼ同じであった。HDAC7   mRNA レベルは DT40 で⾼高いが、⻑⾧長期培養期
間に、4 つ全ての HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones でほぼ同じパターンで変化した。すなわち、
HDAC7  mRNA レベルは初期ステージで明らかに減少し、逆に中間ステージ(~∼17-‑27 ⽇日⽬目)まで
明らかに増加し、さらにその後は変化しないかあるいは緩やかに減少した。全培養ステージを通して HDAC2(-‑/-‑)の HDAC7  mRNA レベルは DT40 に⽐比べて低かった。HDAC9  mRNA レベ
ルは DT40 で検出できないほど低いが、全ての HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,  cl.2-‑4,   cl.2-‑6 で中間ステージ(~∼17-‑22 ⽇日⽬目)まで明らかに増加した。その後、増加した HDAC9  mRNA レベルは⻑⾧長期培養期間に徐々に減少した。最終的に後期ステージで、HDAC9  mRNA レ
ベルは clone  cl.2-‑1 では DT40 と⽐比べて⾮非常に⾼高く、clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 では DT40 とほ

  

22  

  

ぼ同じであった。  
     HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones で Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1,  Blimp1,  Ikaros,  E2A,  PU.1の遺伝⼦子発現レベルはそれぞれ⻑⾧長期培養期間に劇的あるいは適度に異なるパターンで変化する：     上記のように、野⽣生株 DT40 で Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1,  Ikaros,  E2A,  PU.1 などの遺伝⼦子は⼗十分あるいはかなり⾼高いレベルで発現しているが、Blimp1 の遺伝⼦子はほとんど発現していない。
引き続いて、これらの転写因⼦子の特異的なプライマーを⽤用いた RT-‑PCR で詳細に分析した。⻑⾧長
期培養期間に、HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 で、これら各遺伝⼦子の発現パターンは次のように複雑かつ多彩に変化することを明らかにした（図-‑18）[102,  105,  108,  109]。     Pax5 と Aiolos   の mRNA レベルの⻑⾧長期培養期間の変化パターンは、同じ HDAC2(-‑/-‑)   clone
では極めて似ていたが、HDAC2(-‑/-‑)  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 の間ではかなり異なっていた。clone   cl.2-‑1 では、Pax5 と Aiolos の mRNA レベルは初期ステージでほぼ完全に減少し、その後は後期ステージまで変化しないかあるいは極めて僅かに増加した。特筆すべきは、残りの clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 では、Pax5 と Aiolos の mRNA レベルは初期ステージでほぼ完全に減少したが、その後は減少したこれらの mRNA レベルは⻑⾧長期培養期間に劇的に増加した。なお、後期ステージの Pax5 と Aiolos の mRNA レベルは、clones   cl.2-‑2,   cl.2-‑4 では初期ステージのレベルの約 20-‑40 倍であり DT40 と⽐比べて低く、clone  cl.2-‑6 では初期ステージのレベルの約80-‑120 倍であり DT40 とほぼ同じであった。  
   EBF1  mRNA レベルは、HDAC2(-‑/-‑)  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 の初期ステージでほぼ完全に減少したが、その後、clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,   cl.2-‑4 ではほぼ同じパターンで変化し、clone  cl.2-‑6 では⾮非常に異なるパターンで変化した。すなわち、初期ステージで減少した EBF1  mRNA
レベルは、clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4 では後期ステージまで検出できないかあるいは DT40 の約1%より低いままであった。⼀一⽅方、clone   cl.2-‑6 では後期ステージで DT40 の約 60%まで劇的に増加した。     OBF1   mRNA レベルは、⻑⾧長期培養期間に、clones   cl.2-‑2,   cl.2-‑4,   cl.2-‑6 ではほぼ同じパターン
で変化し、clone  cl.2-‑1 ではこの 3  clones とは明らかに異なるパターンで変化した。すなわち、
clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 では、OBF1  mRNA レベルは初期ステージで DT40 の約 30-‑40%に減
少し、その後は後期ステージで DT40 の約 60-‑100%まで緩やかに増加した。⼀一⽅方、clone  cl.2-‑1
では、OBF1  mRNA レベルは⻑⾧長期培養期間に減少を続け、後期ステージでは DT40 の約 10%以下まで劇的に減少した。  
   Blimp1  mRNA レベルは、DT40 では極めて低いが、clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 の初期

  

23  

  

ステージで劇的に増加した。その後は後期ステージの clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,   cl.2-‑4 では、増加した Blimp1  mRNA レベルの約 50%まで緩やかに減少し、clone  cl.2-‑6 では DT40 と同じく検出できないレベルまで劇的に減少した。Ikaros  mRNA レベルは、clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,   cl.2-‑4 では初期ステージで DT40 の約 150-‑200%まで僅かに増加し、その後は後期ステージまで変化しなかった。clone  cl.2-‑6 では⻑⾧長期培養期間に余り変化しなかった。E2A  mRNA レベルは、clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 で、初期ステージで DT40 の約 200-‑300%まで増加し、その後は後期ステー
ジで DT40 の約 100-‑200%まで緩やかに減少した。PU.1  mRNA レベルは、clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 で、初期ステージで DT40 の約 30-‑50%まで減少し、その後は後期ステージで、clone  cl.2-‑1 で DT40 の約 150%まで増加し、clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 で DT40 の約 60%まで減少した。XBP-‑1  mRNA レベルは、clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 で⻑⾧長期培養期間に変化しなかった。  
  HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones の増殖速度はそれぞれ異なる：     細胞の諸性質の変化がほぼ安定した状態の⻑⾧長期培養期間の後期ステージにおいて基本的な性質である増殖速度を調べた（図-‑19）[102,  105,  108,  109]。HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl-‑2-‑4（多分、cl.2-‑2,  cl.2-‑5 も）の増殖速度は、僅かではあるが確かに DT40 の増殖速度と異なり、clone  cl.2-‑6 の増殖速度は DT40 の増殖速度とほぼ⼀一致した。この結果は、後期ステージにおける IgM  H-‑chain と L-‑chain はもちろん、HAT,  HDAC,   転写因⼦子ファミリーの多くのメンバーの遺伝⼦子発現パターンが、clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4 ではそれぞれが DT40 とかなり異なり、
clone  cl.2-‑6 では DT40 と極めて類似していた前述の結果と概ね合致する。  
  HDAC2 ⽋欠損による IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現の増加によって蓄積した IgM  H-‑chainと L-‑chain の蛋⽩白質量は各 HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones  (クローン)において、⻑⾧長期培養
期間の多世代を通して特定の転写因⼦子の遺伝⼦子発現が変化することに基づいて異なる⽅方法で劇的に減少する：     上記のように、新たに作製した 28 個の独⽴立した HDAC2(-‑/-‑)⽋欠損変異株から無作為に選んだ
6 個の individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6 を解析して得られた主な結果は次の通りである。
1)  6 つ全ての clones で、IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質と遺伝⼦子発現(mRNA)
レベルは、培養の初期ステージで劇的に増加し、その後は⻑⾧長期培養期間を通してほぼ同じパターンで減少し、最終的に後期ステージで野⽣生株 DT40 とほぼ同等レベルに達する。2)   6 つ全ての clones で、転写因⼦子やクロマチン修飾酵素(HATs,  HDACs)ファミリーの種々のメンバーの遺伝⼦子発現レベルは、⻑⾧長期培養期間にそれぞれ異なるパターンで変化する。3）clone   cl.2-‑1 では、
Pax5,  Aiolos,  EBF1 の遺伝⼦子発現レベルは初期ステージでほぼ完全に減少し、その後は⻑⾧長期培養

  

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期間に変化しないで検出できないままである。OBF1 の遺伝⼦子発現レベルは後期ステージまで劇的に減少する。4）clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5 では、Pax5,  Aiolos,  EBF1 の遺伝⼦子発現レ
ベルは初期ステージでほぼ完全に減少し、その後は後期ステージまで、Pax5,  Aiolos の遺伝⼦子発
現レベルは増加し、EBF1 の遺伝⼦子発現レベルは変化しないままである。5）clone   cl.2-‑6 では、
Pax5,  Aiolos,  EBF1 の遺伝⼦子発現レベルは初期ステージでほぼ完全に減少し、その後は後期ステージまで劇的に増加する。6）初期ステージであっても、⽤用いた HDAC2(-‑/-‑)  clones は遺伝⼦子破壊法で作製してから約 15-‑16 ⽇日後の細胞群であり、DT40 の倍加時間(doubling   times)は約 12時間であるため、約 30-‑32 世代の細胞群に相当し、作製（誕⽣生）直後の⽋欠損変異株の種々の細胞機能（性質）の変化はもっと劇的だったと想定される。7）上記の結果から、IgM  H-‑chain とL-‑chain の遺伝⼦子発現パターンに関して、6 つの HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6 は 3 つのタイプに分類分けできる。すなわち、clone  cl.2-‑1 は OBF1-‑
依存タイプ、   clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5 は Pax5,  Aiolos-‑依存タイプ、clone  cl.2-‑6 は Pax5,  Aiolos,  EBF1-‑依存タイプである。8）以上をまとめると、HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones は多世
代を経る間に、それぞれ異なる⽅方法で特定の転写因⼦子の発現パターンを変化させ、この変化を介して IgM   H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現レベルを減少させ、その結果として蓄積した IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量を減少させる能⼒力を獲得することが明らかになった（図-‑20）[102,  105,  108,  109]。  
   HDAC2 ⽋欠損で増⼤大した IgM   H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現レベルは、⻑⾧長期培養期間にHDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6 でほぼ同じパターンで劇的に減少する。⼀一⽅方、Pax5,  Aiolos,  Ikaros,  EBF1,  E2A,  PU.1,  Blimp1,  XBP-‑1,  OBF1 など特定の転写因⼦子の遺伝⼦子発現レベルは、⻑⾧長期培養期間に、これら６つの HDAC2(-‑/-‑)   clones でそれぞれ固有のパターンで変化する。特に、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 の遺伝⼦子発現の変化パターンは、
HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5,  cl.2-‑6 の 1 つあるいは複数で、IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現の変化パターンと並⾏行または逆並⾏行である。さらに、前述したように、Pax5,  Aiolos,  EBF1 は DT40 細胞で IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現を抑制的に制御し、OBF1 は NIH3T3 細胞でこれら 2 つの遺伝⼦子発現を促進的に制御する。このような事実から、上記の変化した多数の転写因⼦子群の中で、Pax5,   Aiolos,   EBF1,   OBF1 は、個々のHDAC2(-‑/-‑)  individual  clones の⻑⾧長期培養期間での IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現レベルの減少に関与する最も有⼒力な候補であると想定される。  
   したがって、個々の HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones において⻑⾧長期培養期間の多世代を通して、
IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現レベルを劇的に減少させる異なる⽅方法を明らかにするためには、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 の遺伝⼦子発現を変化させる⽅方法を解明することが最も重要である。以後、⻑⾧長期培養期間の多世代を通じて、HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  

  

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cl.2-‑6 において、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 及び PCAF の遺伝⼦子発現を促進的及び抑制的に制御する詳細な⽅方法について記述する。  
  Neighboring  overlapping  tiling  chromatin  immuno-‑precipitation  (NotchIP)  assay:   ⻑⾧長期の連続培養期間の HDAC2(-‑/-‑)  DT40  individual  clones における、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1,  PCAF 遺伝
⼦子の隣接する 5ʼ’-‑近傍上流領域のクロマチン構造の変化を解析する新しい⽅方法：     HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 が⻑⾧長期培養期間の多世代を通して、
Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1,  PCAF の遺伝⼦子発現の異なる⽅方法を、いかに個別に獲得するかを明らかにすることは極めて重要であり、独⾃自の分析法を⽤用いて調べた。前述のように、遺伝⼦子の 5ʼ’-‑
近傍上流(proximal  5ʼ’-‑upstream  region)のクロマチン構造は転写制御領域（配列）（プロモーター、
オペレーター、リプレッサー、エンハンサーなど）の有無に関わらず、当該遺伝⼦子の発現制御に直接的かつ密接に関与する。Pax5,   Aiolos,   EBF1,   OBF1,   PCAF 遺伝⼦子の proximal   ~∼2.0   kb  5ʼ’-‑upstream,  distal  5ʼ’-‑upstream,  open  reading  frame  (coding:  ORF)  regions（5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流、転写部位）のクロマチン領域の DNA 塩基配列に基づいてデザイン（設計）･作製したプライマーを⽤用いて、chromatin  immuno-‑precipitation  (ChIP)  assay（クロマチン･免疫沈降法）を実施した。特に、proximal  ~∼2.0  kb  5ʼ’-‑upstream  region  (notch  of  chromatin：クロマチンの刻
み⽬目/V 字形の切れ⽬目と名付けた)については、多数の分割した short  segments（短いセグメント）に対応するプライマーは、クロマチン･免疫沈降法での polymerase  chain  reaction  (PCR)で増幅される全ての DNA   fragments（フラグメント：断⽚片）が、両隣のフラグメントと互いに⼀一部重なり合うように設計した。したがって、遺伝⼦子の proximal  ~∼2.0  kb  5ʼ’-‑upstream  region（5ʼ’-‑近傍
上流領域）のクロマチン構造の変化を解析するこの新しい⽅方法を neighboring  overlapping  tiling  chromatin   immuno-‑precipitation   (NotchIP   or  Notch-‑IP)   assay と名付けた。略語の NotchIP は
notch  of  chromatin についての immuno-‑precipitation  (IP)をも意味する[102,  106,  108,  110]。  
   ⻑⾧長期培養期間の初期(~∼3 ⽇日⽬目)、中期(~∼33 ⽇日⽬目)、後期(~∼58 ⽇日⽬目)ステージにおけるHDAC2(-‑/-‑)  individual  clones  cl.2-‑1,  cl.2-‑2,  cl.2-‑4,  cl.2-‑6 と野⽣生株 DT40 の Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1,  PCAF 遺伝⼦子のクロマチン領域について NotchIP  assay（アッセイ）を⾏行った。上述のよ
うに、ヒストン H3 の Lys-‑9,   Lys-‑14,   Lys-‑18,  Lys-‑23,  Lys-‑27 残基のバルクのアセチル化レベル(bulk  acetylation  levels)が、⻑⾧長期培養期間に変化していたので、全ての NotchIP  assay を通して、アセチル化された K9/H3,  K14/H3,  K18/H3,  K23/H3,  K27/H3 に対する５つの部位特異抗体を⽤用いた。ただし、clone  cl.2-‑2 の Pax5 遺伝⼦子に関しては、本アッセイの最初の試みだったので、初期及び後期ステージの K9/H3,   K14/H3,   K18/H3,   K27/H3 の特異抗体のみを⽤用いたデータである。  
   ヒストン H3 の N-‑末端部位の Lys 残基(K9/H3,  K14/H3,  K18/H3,  K23/H3,  K27/H3)のアセチ

  

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ル化レベルが⾼高いか低いかの程度に基づいて、ヒストン H3（または該当する Lys 残基、結果としてヌクレオソーム）の DNA との binding  ability（結合能）、それに続くクロマチン構造の形状（フォーム）や遺伝⼦子発現レベルなどの諸性質の程度を⼀一応次のように仮定した。ただし、この結合にどの Lys 残基が真にあるいは主に寄与しているかは不明である。上記 5 つの Lys 残基の 1 つまたは幾つかの残基のアセチル化レベル(acetylation   levels)が、hyper   (high：⾼高い)、considerably  hyper（かなり⾼高い）、somewhat  hyper（幾らか⾼高い）、hypo  (low  or  no：低い)の場
合は、ヒストン H3 と DNA の binding  ability（結合能）は no（無）、weak（弱い）、less（低い）、full（⾼高い）レベルであるとみなす。この 4 つの結合能レベルはそれぞれ、クロマチン構造を loose  (open：緩い),  considerably  loose（かなり緩い）,  somewhat  loose（幾らか緩い）、tight  (closed：
硬い)   forms に変化させる。クロマチン構造のこの 4 つの forms（フォーム：形状）は、最終的に、high（⾼高い）、considerably  high（かなり⾼高い）、somewhat  high（幾らか⾼高い）、low  (no)（低い）レベルの gene  expression/transcription  (mRNA)（遺伝⼦子発現⼜又は転写）を惹起する。  
   Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1,  PCAF 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域での K9/H3,  K14/H3,  K18/H3,  K23/H3,  K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化についての NotchIP  assay による詳細な解析データは、既報のオリジナルやレビュー論⽂文にすでに発表済である[102,   106,   108,   110]。従って、本稿では記述を簡潔にするため、Pax5,   Aiolos,   EBF1,  OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン領域における、主に K9/H3 と K27/H3 のアセチル化
レベルに関する解析データのみを記した後、他のデータも併せて説明する。  
  ⻑⾧長期連続培養期間の初期、中期、後期ステージにおける HDAC2(-‑/-‑)   DT40   individual   clones  cl.2-‑1,   cl.2-‑2,   cl.2-‑4,   cl.2-‑6 の Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域での K9/H3,  K14/H3,  K18/H3,  K23/H3,  K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化：     上記のように、各 HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones における Pax5 遺伝⼦子の発現は⻑⾧長期培養期間でそれぞれ異なるパターンで変化する。従って、⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-‑/-‑)   clones   cl.2-‑1,  cl.2-‑2,   cl.2-‑4,   cl.2-‑6 と DT40 の Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域での K9/H3,  K14/H3,  K18/H3,  K23/H3,  K27/H3 のアセチル化レベルを各アセ
チル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いた NotchIP  assay で調べた（図-‑21）[102,  106,  108,  110]。5ʼ’-‑
近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流及び転写部位のプライマーは、私共がクローニングした Pax5 遺伝⼦子のproximal   ~∼4.9   kb   5ʼ’-‑upstream   region とデータベースから得られる ORF の塩基配列に基づいて設計した。5ʼ’-‑近傍上流(proximal  5ʼ’-‑upstream  region:  positions  -‑1923  ~∼  +30)に関しては、隣同⼠士が重なり合う 12 個のセグメント(segments   1-‑12)を、5ʼ’-‑遠隔上流(distal   5ʼ’-‑upstream   region:  position   -‑4390   ~∼   -‑4235)に関しては、1 個のセグメント(segment   a)を、転写部位(ORF:   +55   ~∼  +201,  +223  ~∼  +391,  +490  ~∼  +588)に関しては、3 個のセグメント(segments  b,  c,  d)を、それぞ

  

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れ増幅できるプライマーを⽤用いた。転写部位のプライマーはデータベースに基づくため、セグメントの塩基番号は 5ʼ’-‑近傍上流と 5ʼ’-‑遠隔上流のセグメントの塩基番号とは連続していない。  
Pax5/clone  cl.2-‑1:     ⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone  cl.2-‑1 と DT40 の Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域の 5 つの N-‑末端 Lys 残基のアセチル化レベルの変化パターンを、5 つのアセチル化 K9/H3,   K14/H3,  K18/H3,   K23/H3,   K27/H3 の特異抗体と
上記プライマーを⽤用いた NotchIP  assay で調べた（図-‑21-‑cl.2-‑1）[102,  106,  108,  110]。Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流と 5ʼ’-‑遠隔上流のクロマチン領域(proximal   and  distal  5ʼ’-‑upstream   chromatin  regions:   segments   a   and   1-‑12)の K9/H3 のアセチル化レベルは DT40 で⾼高いレベル(high   or  hyper-‑acetylation  levels)である。驚くべきことに、HDAC2 ⽋欠損にも拘らず、K9/H3 のアセチル化レベルは、clone   cl.2-‑1 の初期ステージでほぼ完全に減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しない。⼀一⽅方、3 つの転写部位のクロマチン領域(ORF:  segments  b-‑d)の K9/H3 のア
セチル化レベルは DT40 では⾮非常に低い(hypo-‑acetylation  levels)が、clone  cl.2-‑1 では培養の全期間を通して、1 つのセグメント(segment  c)でのごく僅かな変化を除いて、さらに減少する。  
   Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流のクロマチン領域(proximal and distal 5’-upstream
chromatin regions: segments a and 1-12) の K27/H3 のア セチル化レベ ル は DT40 では ⾼高い(hyper-acetylation levels)。驚くべきことに、K9/H3 の変化パターンと⾮非常に似て、K27/H3 のアセチル化レベルも、clone cl.2-1 の初期ステージでほぼ完全に減少し、その後は僅かに変化するセグ
メント-8 (segment 8: positions -958 ~ -679)を除いて、ほとんどの 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流のクロマチン領域 (segments  a,  1-‑7,  9-‑12)で、中期を経て後期ステージまで変化しない。⼀一⽅方、3 つの転写部位のクロマチン領域(ORF: segments b-d)の K27/H3 のアセチル化レベルは DT40 で⾮非常に低いが、clone cl.2-1 で⻑⾧長期培養の全期間を通して変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、以下のことを⽰示す。DT40 では、Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流 (proximal 5’-upstream region: positions -1923 ~ +30)の
ク ロ マ チ ン 領 域 の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の ⾼高 い ア セ チ ル 化 レ ベ ル(hyper-acetylation levels)に基づいて、ヒストン H3（または 5 つの Lys 残基）は DNA との結合能をほとんど持たない(no binding ability)。特筆すべきは、clone cl.2-1 では⻑⾧長期培養期間の全ステー
ジを通して、Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン領域の主に K9/H3, K14/H3, K18/H3, K27/H3の低いアセチル化レベル(hypo-acetylation levels)に基づいて、ヒストン H3（またはこれら 4 つのLys 残基）は DNA と極めて強い結合能(full binding ability)を持つことである。
   これらの結果は、Pax5 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流領域(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造（約 10 個のヌクレオソームで構成される）は、
DT40 では緩いフォーム(loose form)
であり、clone cl.2-1 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、その後

  

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は後期ステージまで変化しない状態であることを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体
内反応の結果から、Pax5 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-1では培養の初期ステージで劇的に減少し、その後は⻑⾧長期培養期間を通して後期ステージまで変化しないことが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-1 における Pax5 遺伝⼦子の発現の変化パターンに関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
Pax5/clone cl. 2-2:
   ⻑⾧長期培養期間の初期と後期ステージの clone cl.2-2 と DT40 の Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンを、この 4 つのアセチル化 Lys 残基の特異抗体と特定のプライマーを⽤用いた
NotchIP assay で調べた（前述のように、実際はこれが最初の実験である）（図-21-cl.2-2）[102, 106,108, 110]。Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化レ
ベルは、clone cl.2-2 の初期ステージでほぼ完全に減少する。極めて驚くべきは、減少した K9/H3のアセチル化レベルは後期ステージで劇的に増加し DT40 とほぼ同じレベルになることである。
⼀一⽅方、2 つの ORF のクロマチン領域(segments b and d)の K9/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-2の初期ステージで DT40 よりさらに減少し、その後は後期ステージで増加し DT40 とほぼ同じレベルになる。残り 1 つの ORF のクロマチン領域(segment c)ではごく僅かに変化する。
   Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流のクロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは、
clone cl.2-2 の初期ステージでほぼ完全に減少する。驚くべきことに、減少したアセチル化レベル
は、後期ステージで劇的に増加し DT40 とほぼ同じレベルになる。しかし、3 つの ORF のクロ
マチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-2 でも全培養期間を通して変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、K14/H3, K18/H3 の結果と併せて、以下のことを⽰示す。clone
cl.2-2 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、
Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン領域の K9/H3,
K14/H3, K18/H3, K27/H3 の低いアセチル化レベル(hypo-acetylation levels)に基づいて、ヒストン
H3（または 4 つの Lys 残基）は DNA と極めて強い結合能(full binding ability)を持つ。特筆すべ
きは、ヒストン H3（あるいは 4 つの Lys 残基）の DNA との結合能は、⻑⾧長期培養期間に減少して、後期ステージでは⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)に基づいて、ほとんどなくなることである(no binding ability)。
   これらの結果は、DT40 では緩いフォーム(loose form)である Pax5 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流
領域のクロマチン構造は、clone cl.2-2 の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、特筆すべきことは、
その後は⻑⾧長期培養期間を通して逆に変化して、後期ステージで緩いフォーム(looseform)になることを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、DT40 で⾼高いレベル(high level)である Pax5 遺伝⼦子の発現は、clone cl.2-2 では⻑⾧長期培養の初期ステージで劇的に減少し、その後は⻑⾧長期培養期間を通して増加し、後期ステージで DT40 とほぼ同じレベルにな

  

29  

  

ることが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-2 での Pax5 遺伝⼦子の発現の変化パターンに関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
Pax5/clone cl.2-4:
   さらに、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-4 と DT40 の Pax5 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3,
K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンを、この 5 つのアセチル化 Lys 残基の特異抗体と特定のプライマーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-21-cl.2-4）[102, 106, 108, 110]。Pax5 遺伝⼦子の 5’-遠隔上流(segment a)と 5’-近傍上流(segments 1-12)のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化
レベルは、clone cl.2-4 の初期ステージでほぼ完全に減少する。ある程度予想されるが極めて驚くべきことに、減少した K9/H3 のアセチル化レベルは中期を経て後期ステージまで劇的に増加し、最終的に DT40 とほぼ同じになる。⼀一⽅方、⻑⾧長期培養期間に、clone cl.2-4 の K9/H3 のアセチル化
レベルは、1 つの ORF のクロマチン領域(segment b)では 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流とほぼ同じパターンで変化し、残り 2 つの ORF のクロマチン領域(segments c and d)ではほとんど変化しない。
   Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(segments 1-12)のクロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは、
clone cl.2-4 の初期ステージでほぼ完全に減少するが、5’-遠隔上流(segment a)のクロマチン領域では僅かに減少する。減少した K27/H3 のアセチル化レベルは中期を経て後期ステージまで劇的に増加し、最終的に DT40 とほぼ同じレベルになる。しかし、3 つの ORF(segments b-d)のクロマチ
ン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-4 では⻑⾧長期培養期間を通して後期ステージまで変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、以下のことを⽰示す。clone cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン領
域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の低いアセチル化レベル(hypo-acetylation levels)に基づいて、ヒストン H3（または 5 つの Lys 残基）は DNA と極めて強い結合能(full binding ability)を持つ。特筆すべきは、これら 5 つの Lys 残基（またはヒストン H3）の DNA との結合能は、
⻑⾧長 期 培 養 期 間 を 通 し て 減 少 し 、 最 終 的 に 後 期 ス テ ー ジ で は ⾼高 い ア セ チ ル 化 レ ベ ル(hyper-acetylation levels)に基づいて、ほとんどなくなる(no binding ability)。
   これらの結果は、DT40 では緩いフォーム(loose form)である Pax5 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流
領域のクロマチン構造は、clone cl.2-4 の初期ステージでは硬いフォーム(tight form)に変化し、驚くべきことに、その後は⻑⾧長期培養期間の多世代を経て変化し、後期ステージでは緩いフォーム(loose form)になることを⽰示す。このような clone cl.2-4 でのクロマチンの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、Pax5 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-4 の培養の初期ステージで劇的に減少し、その後は⻑⾧長期培養期間を通して増加し、後期ステージでは DT40 とほぼ同じレベルになることが容易に推察される。
このことは RT-PCR による clone cl.2-4 での Pax5

  

30  

  

遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
Pax5/clone cl.2-6:
   最後に、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-6 と DT40 の Pax5 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域(segments a and 1-12)の K9/H3, K14/H3,
K18/H3, K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンを、この 5 つのアセチル化 Lys 残基の特異抗体と特定のプライマーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-21-cl.2-6）[102, 106, 108, 110]。
Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化レベルは、
clone
cl.2-6 の初期ステージでほぼ完全に減少する。ある程度予想されることであるが極めて驚くべきことに、減少した K9/H3 のアセチル化レベルは中期を経て後期ステージまで劇的に増加し、最終的に DT40 とほぼ同じレベルになる。⼀一⽅方、clone cl.2-6 では、3 つの ORF 領域(segments b-d)の K9/H3 のアセチル化レベルは、初期ステージで僅かに減少し、その後は中期を経て後期ステージまで増加し DT40 とほぼ同じレベルになる。
   Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流のクロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは、
clone cl.2-6 の初期ステージでほぼ完全に減少する。その後、減少した K27/H3 のアセチル化レベ
ルは中期を経て後期ステージまで劇的に増加し、最終的に DT40 とほぼ同じレベルになる。しかし、clone cl.2-6 の 3 つの ORF のクロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは後期ステージまで変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、以下のことを⽰示す。clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン領
域の主に K9/H3, K14/H3, K18/H3, K27/H3 の低いアセチル化レベル(hypo-acetylation levels)に基づいて、ヒストン H3（または 4 つの Lys 残基）は DNA との極めて強い結合能(full binding ability)を持つ。特筆すべきは、これら 4 つの Lys 残基（あるいはヒストン H3）の DNA との結合能は
⻑⾧長期培養期間に漸次減少し、後期ステージでは、⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)に基づいて、ほとんどなくなることである(no binding ability)。
   これらの結果は、DT40 では緩いフォーム(loose form)である Pax5 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流
領域のクロマチン構造は、clone cl.2-6 の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、特筆すべきことに、その後は⻑⾧長期培養期間の多世代を経て変化し、後期ステージで緩いフォーム(looseform)になることを⽰示す。このような clone cl.2-6 でのクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、DT40 で⾼高いレベル(high level)である Pax5 遺伝⼦子の発現は、clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養の初期ステージで劇的に減少し、その後は⻑⾧長期培養期間を通して増加し、後期ステージで DT40 とほぼ同じレベルになることが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-6 での Pax5 遺伝
⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。

  

31  

  

⻑⾧長期連続培養期間の初期、中期、後期ステージにおける HDAC2(-/-) DT40 individual clones cl.2-1,

cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6 の Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化：      前述のように、各 HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones での Aiolos 遺伝⼦子の発現は⻑⾧長期培養期間にそれぞれ異なるパターンで変化する。⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-‑/-‑)   clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,   cl.2-‑4,  cl.2-‑6 と DT40 の Aiolos 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域でのK9/H3,  K14/H3,   K18/H3,   K23/H3,   K27/H3 のアセチル化レベルを各アセチル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いた NotchIP  assay で調べた（図-‑22）[102,  106,  108,  110]。5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位の各プライマーは、データベースの塩基配列を確認後、それに基づいて設計した。5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region: positions -2250 ~ +145)に関しては、隣同⼠士重なり合う 14 個のセグメント(segments 1-14)を、5’-遠隔上流(distal 5’-upstream region: positions -3524 ~-3367, -2735 ~ -2528)に関しては、2 個のセグメント(segments a and b)を、転写部位(ORF: +212 ~+361, +1265 ~ +1417)に関しては、2 個のセグメント(segments c and d)を増幅できるプライマーを合成した。
Aiolos/clone cl.2-1:
   最初に、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-1 と DT40 の Aiolos 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3,
K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンを、これら５つのアセチル化 Lys 残基の特異抗体と
上記プライマーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-22-cl.2-1）[102, 106, 108, 110]。DT40 では、
Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流のクロマチン領域(proximal and distal 5’-upstream
chromatin regions: segments a, b and 1-14)と 2 つの ORF 部位のクロマチン領域(segments c and d)の全てにおいて、K9/H3 のアセチル化レベルは⾼高い(hyper-acetylatin levels)状態である。注⽬目すべきは、これらの K9/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-1 の初期ステージで劇的に減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しないことである。
   Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流、ORF のクロマチン領域(proximal and distal 5’-upstream,
ORF chromatin regions)の K27/H3 のアセチル化レベルは DT40 で⾼高い(hyper-acetylation levels)状態である。⼀一⽅方、全体的に、これらの K27/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-1 の初期ステージ
で僅かに減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
DT40 では、Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region: positions -2250 ~ +145)のクロ
マチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylationlevels)に基づいて、ヒストン H3（または 5 つの Lys 残基）は DNA と極めて弱い結合能(no binding
ability)しか持たない。しかし、clone cl.2-1 では、⻑⾧長期培養期間の全ステージで、K23/H3 を除い

  

32  

  

て、K9/H3, K14/H3, K18/H3, K27/H3 の低いかまたは幾らか⾼高いアセチル化レベル(hypo- orsomewhat hyper-acetylation levels)に基づいて、ヒストン H3（または 4 つの Lys 残基）は DNA と極めて強いかまたは低い結合能(full or less binding ability)を持つ。
   これらの結果は、Aiolos 遺伝⼦子の~2.3 kb 5’-近傍上流領域(proximal ~2.3 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造（約 11 個のヌクレオソームで構成される）は、DT40 では緩いフォーム(looseform)であり、clone cl.2-1 の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、その後は後期ステージまで変化しない状態であることを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、Aiolos 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-1 では培養の初期ステージで劇的に減少し、その後は⻑⾧長期培養期間を通して後期ステージまで変化しないままであることが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-1 における Aiolos 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
Aiolos/clone cl.2-2:
   Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流(proximal and distal 5’-upstream regions: segments a, b
and 1-14)と 2 つの ORF 部位(segments c and d)のクロマチン領域での K9/H3 のアセチル化レベル
は DT40 では⾼高い(hyper-acetylation levels)状態である（図-22-cl.2-2）[102, 106, 108, 110]。注⽬目すべきは、これらの K9/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-2 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで明らかに減少し、全体的にその後は中期を経て後期ステージまで徐々に増加する。
   Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流、ORF 部位のクロマチン領域での K27/H3 のアセチ
ル化レベルは、clone cl.2-2 の⻑⾧長期培養の初期ステージで確かに減少する。その後は全体的に中期を経て後期ステージまで僅かに増加するかまたは変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
clone cl.2-2 の初期、中期ステージでは、Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン領域(proximal
5’-upstream chromatin region)で、主に K9/H3, K27/H3（多分 K18/H3, K23/H3 も）の DNA との結合能は、その低いかあるいは幾らか⾼高いアセチル化レベル(hypo- or slight hyper-acetylation levels)に基づいて低くなる。その後は後期ステージで、主に K9/H3（多分 K27/H3 も）の DNA との結合能は、その⾼高いかまたはかなり⾼高いアセチル化レベル(hyper- or considerable hyper-acetylationlevels)に基づいてほぼ完全に消失する。
   これらの結果は、Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流領域(proximal ~2.3 kb 5’-upstream region)のクロマ
チン構造は、DT40 での緩いフォーム(loose form)から、clone cl.2-2 の初期と中期ステージでは硬いフォーム(tight form)に変化し、その後は後期ステージで緩いかあるいはかなり緩いフォーム(loose or considerably loose form)になることを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、Aiolos 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-2 では
⻑⾧長期培養の初期ステージで劇的に減少し、その後は⻑⾧長期培養期間を通して後期ステージまで明

  

33  

  

らかに増加することが容易に推察される。
このことは RT-PCR による clone cl.2-2 における Aiolos
遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
Aiolos/clone cl.2-4:
   Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流のクロマチン領域(proximal and distal 5’-upstream
chromatin regions: segments a, b and 1-14)と 1 つの ORF のクロマチン領域(segment d)での K9/H3 のアセチル化レベルは DT40 では⾼高い(hyper-acetylation levels)状態にある（図-22-cl.2-4）[102, 106,108, 110]。注⽬目すべきは、これらの K9/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで明らかにに減少する。全体的に、その後は中期を経て後期ステージまで確かに増加する。しかし、残り 1 つの ORF のクロマチン領域(segment c)ではほとんど変化しない。
   Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流のクロマチン領域での K27/H3 のアセチル化レベル
は、clone cl.2-4 の⻑⾧長期培養の初期ステージでごく僅かに減少する。その後は全体的に、中期を経て後期ステージまで僅かに増加するかあるいは変化しない。しかし、2 つの ORF 領域(segments c
and d)での K27/H3 のアセチル化レベルは⻑⾧長期培養期間を通して変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
clone cl.2-4 の初期、中期ステージでは、Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン領域(proximal
5’-upstream chromatin region)の、主に K9/H3（多分 K18/H3, K27/H3 も）の DNA との結合能は、その低いかあるいは幾らか⾼高いアセチル化レベル(hypo- or slight hyper-acetylation levels)に基づいて低くなる。その後は後期ステージで、主に K9/H3（多分 K27/H3 も）の DNA との結合能は、その⾼高いかあるいはかなり⾼高いアセチル化レベル(hyper- or considerable hyper-acetylation levels)に基づいて、ほぼ完全に減少する。
   これらの結果は、Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流領域(proximal ~2.3 kb 5’-upstrem region)のクロマ
チン構造は、DT40 での緩いフォーム(loose form)から、clone cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間の初期と中期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、その後は後期ステージで緩いかあるいはかなり緩いフォーム(loose or considerably loose form)に変化することを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、Aiolos 遺伝⼦子の発現は DT40 での⾼高いレベル(high level)から、clone
cl.2-4 では培養の初期ステージで明らかに減少し、その後は⻑⾧長期培養期間を通して後期ステージまで確かに増加することが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-4 におけるAiolos 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
Aiolos/clone cl.2-6:
   Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流(proximal and distal 5’-upstream regions: segments a, b
and 1-14)と 2 つの ORF 部位(segments c and d)のクロマチン領域での K9/H3 のアセチル化レベル
は、DT40 で⾼高いレベル(hyper-acetylation levels)である（図-22-cl.2-6）[102, 106, 108, 110]。注⽬目すべきは、clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは明らかに減少する。全体的に、その後は

  

34  

  

中期を経て後期ステージまで漸次増加し、最終的に DT40 より明らかに⾼高いレベルになる。
   Aiolos 遺伝⼦子の position -1230 より上流の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流(segments a, b and 1-6)のク
ロマチン領域での K27/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-6 の初期ステージで変化しないままである。その後は中期を経て後期ステージまで漸次増加し、最終的に DT40 より⾼高いレベルになる。⼀一⽅方、Aiolos 遺伝⼦子の position -1232 より下流の 5’-近傍上流(segments 7-14)のクロマチン領
域での K27/H3 のアセチル化レベルは、
全体的に、clone cl.2-6 の初期ステージで僅かに減少する。
その後は中期を経て後期ステージまで急速に増加し、最終的に DT40 とほぼ同じレベルになる。
2 つの ORF 部位のクロマチン領域での K27/H3 のアセチル化レベルは、⻑⾧長期培養期間を通してほとんど変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流のクロマチン領域(proximal 5’-upstream chromatin region)における、主に K9/H3, K27/H3 の DNA との結合能は、低いかあるいは幾らか⾼高いアセチル化レベル(hypo- or slight hyper-acetylation levels)に基づいて低くなる。その後、K9/H3, K27/H3（多分 K14/H3, K18/H3 も）は DNA との結合能を徐々に失い、最終的に、中期から後期ステージにかけて、これらの結合能はその⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)に基づいて、ほぼ完全に消失する(almost no binding ability)。clone cl.2-6の中期と後期ステージでのアセチル化レベルが DT40 より⾼高いため、2 つのステージでの低い結合能(no binding ability)の程度は DT40 よりさらに低いと考えられる。
   これらの結果は、DT40 での緩いフォーム(loose form)の Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流領域(proximal ~2.3 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造は、clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、その後は中期を経て後期ステージで緩いフォーム(loose form)に変化することを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、
DT40 で⾼高いレベル(high level)の Aiolos 遺伝⼦子の発現は、clone cl.2-6 では⻑⾧長期培養の初期ステー
ジで明らかに減少し、その後は⻑⾧長期培養期間を通して後期ステージまで確かに増加することが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-6 における Aiolos 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。

⻑⾧長期連続培養期間の初期、中期、後期ステージにおける HDAC2(-/-) DT40 individual clones cl.2-1,

cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6 の EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化：

   前述のように、HDAC2(-/-) individual clones での EBF1 遺伝⼦子の発現は⻑⾧長期培養期間にそれぞれ異なるパターンで変化する。⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) clones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6 とDT40 の EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域での K9/H3,

  

35  

  

K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベルを各アセチル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-23）[102, 106, 108, 110]。5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位の各プライマーは、データベースの塩基配列を確認し、それに基づいて設計した。5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region: positions -2031 ~ +200)に関しては、隣同⼠士重なり合う 14 個のセグメント(segments 1-14)を、5’-遠隔上流(distal 5’-upstream region: positions -3996 ~ -3770, -2888 ~ -2730)
に関しては、2 個のセグメント(segments a and b)を、転写部位(ORF: +179 ~ +291, +649 ~ +768, +787
~ +900)に関しては、3 個のセグメント(segments c, d and e)を、それぞれ増幅できるプライマーを合成した。
EBF1/clone cl.2-1:
   最初に、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージにおける clone cl.2-1 と DT40 の EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3,
K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンをこれらのアセチル化 Lys 残基の特異抗体と上記プライマーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-23-cl.2-1）[102, 106, 108, 110]。EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 5’-遠隔上流(proximal and distal 5’-upstream regions: segments a, b and 1-14)と 1
つの ORF 部位(segment c)のクロマチン領域での K9/H3 のアセチル化レベルは DT40 で⾼高い
(hyper-acetylation levels)状態である。注⽬目すべきは、全体的に、これらの K9/H3 のアセチル化レ
ベルは、clone cl.2-1 の初期ステージで劇的に減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しない。⼀一⽅方、残り 2 つの ORF のクロマチン領域(segments d and e)では、K9/H3 のアセチル化レ
ベルは DT40 で極めて低い(hypo-acetylation levels)が、
clone cl.2-1 の初期ステージで僅かに減少し、その後は逆に中期を経て後期ステージまで僅かに増加する。
   DT40 の EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流(proximal and distal 5’-upstream regions:segments a, b and 1-14)と 1 つの ORF 部位(segent c)のクロマチン領域では、K27/H3 のアセチル化
レベルはかなり⾼高いが、残り 2 つの ORF 部位(segments d and e)のクロマチン領域では⽐比較的低い。
clone cl.2-1 の初期ステージでは、下流側の 5’-近傍上流(segments 7-14: positions -1037 ~ +200)とORF 部位(segent c)のクロマチン領域での K27/H3 のアセチル化レベルは確かに減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しない。⼀一⽅方、K27/H3 のアセチル化レベルは、残りの 5’-近傍
上流、5’-遠隔上流、ORF 部位のクロマチン領域では⻑⾧長期培養期間を通して余り変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
DT40 では、EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region: positions -2031 ~ +200)のクロ
マチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylationlevels)に基づいて、ヒストン H3（または 5 つの Lys 残基）は DNA と極めて弱い結合能(no binding
ability)しか持たない。
しかし、
clone cl.2-1 では、
⻑⾧長期培養期間の全ステージで、
特に K9/H3, K18/H3,
K27/H3 は、低いかあるいは幾らか⾼高いアセチル化レベル(hypo- or somewhat hyper-acetylation

  

36  

  

levels)に基づいて、ヒストン H3（または 3 つの Lys 残基）は DNA との強い結合能(full binding
ability)を持つ。
   これらの結果は、EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流領域(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造（約 10 個のヌクレオソームで構成される）は、DT40 では緩いフォーム(loose form)
であり、clone cl.2-1 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、その後は後期ステージまで変化しないことを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、EBF1 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-1 では⻑⾧長期
培養期間の初期ステージでほぼ完全に減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しないことが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-1 における EBF1 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
EBF1/clone cl.2-2:
   次に、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-2 と DT40 の EBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3,
K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンを、これらのアセチル化 Lys 残基の特異抗体と上記
プライマーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-23-cl.2-2）[102, 106, 108, 110]。EBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流と 5’-遠隔上流(proximal and distal 5’-upstream regions: segments a, b and 1-14)と 1 つのORF 部位(segment c)のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化レベルは DT40 では⾼高いが、clone
cl.2-2 の初期ステージで劇的に減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しない。
⼀一⽅方、
残り 2 つの ORF(segments d and e)のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-2の初期ステージで僅かに減少し、その後は中期を経て後期ステージまで逆に僅かに増加する。
   DT40 では、EBF1 遺伝⼦子の position -762 より上流側の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流(proximal anddistal 5’-upstream regions: segments a, b and 1-8)のクロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルはかなり低い。clone cl.2-2 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、2 つの 5’-近傍上流(proximal
5’-upstream regions: segments 3 and 4: positions -1826 ~ -1363 and segments 7-14: positions -1037 ~+200)と 1 つの ORF 部位(segment c: positions +179 ~ +291)のクロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは、初期ステージで劇的に（あるいはほぼ完全に）減少し、その後は中期を経て後期
ステージまで変化しない。⼀一⽅方、残りの 5’-近傍上流、5’-遠隔上流、ORF 部位のクロマチン領域
では、K27/H3 のアセチル化レベルは⻑⾧長期培養期間を通して僅かに変化する。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
clone cl.2-2 の⻑⾧長期培養期間の全ステージを通して、EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal
5’-upstream region: positions -2031 ~ +200)のクロマチン領域で、主に K9/H3, K14/H3, K18/H3,
K27/H3 は、その低い（あるいは幾らか⾼高い）アセチル化レベル(hypo- or slight hyper-acetylationlevels)に基づいて、ヒストン H3（または 4 の Lys 残基）は DNA との極めて⾼高い（強い）結合能

  

37  

  

(full binding ability)を持つ。
   これらの結果は、DT40 では緩いフォーム(loose form)の EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流領域(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造は、clone cl.2-2 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しないことを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、EBF1 遺伝⼦子の発現は DT40
では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-2 では⻑⾧長期培養期間の初期ステージでほぼ完全に減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しないことが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-2 における EBF1 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
EBF1/clone cl.2-4:
   引き続いて、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-4 と DT40 の EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3,
K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンを各アセチル化 Lys 残基の特異抗体と上記
プライマーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-23-cl.2-4）[102, 106, 108, 110]。EBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流と 5’-遠隔上流(proximal and distal 5’-upstream regions: segments a, b and 1-14)と 1 つのORF 部位(segment c)のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化レベルは DT40 では⾼高いが、clone
cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで劇的（あるいはほぼ完全に）に減少する。その後は中期を経て後期ステージまで、2 つの 5’-遠隔上流(segments a and b)のクロマチン領域では僅かに増加
するが、5’-近傍上流と 1 つの ORF 部位(segment c)のクロマチン領域では変化しない。⼀一⽅方、残り 2 つの ORF 部位(segments d and e)のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化レベルは、clone
cl.2-4 では⻑⾧長期培養期間を通して変化しない。
   EBF1 遺伝⼦子の下流側の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream regions: segments 7-14)と 1 つの ORF
部位(segment c)のクロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで劇的に（あるいはかなり）減少し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しない。⼀一⽅方、残りの 5’-近傍上流、5’-遠隔上流、ORF 部位のクロマチン領域では、K27/H3のアセチル化レベルは⻑⾧長期培養期間に僅かに減少するかあるいは極めて僅かに変化する。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
clone cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間の全ステージを通して、EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal
5’-upstream region: positions -2031 ~ +200)のクロマチン領域で、主に K9/H3, K27/H3（多分 K14/H3,
K18/H3 も）は、低い（あるいは幾らか⾼高い）アセチル化レベル(hypo- or slight hyper-acetylationlevels)に基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA との⾼高い（強い）結合能(fullbinding ability)を持つ。
   これらの結果は、DT40 では緩いフォーム(loose form)である EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流

  

38  

  

領域(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造は、clone cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しないことを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、EBF1 遺伝⼦子の発現はDT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-4 では⻑⾧長期培養期間の初期ステージではほぼ完全に消失し、その後は中期を経て後期ステージまで変化しないことが容易に推察される。
このことは RT-PCR による clone cl.2-4 における EBF1 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
EBF1/clone cl.2-6:
   最後に、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-6 と DT40 の EBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3,
K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンを各アセチル化 Lys 残基の特異抗体と上記プライマ
ーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-23-cl.2-6）[102, 106, 108, 110]。EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流と 1 つの 5’-遠隔上流(proximal and distal 5’-upstream regions: segments b and 1-14)と 1 つの ORF
部位(segment c)のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化レベルは DT40 では⾼高いが、clone cl.2-6の⻑⾧長期培養期間の初期ステージではほぼ完全（あるいは劇的）に減少する。興味深いことに、減少したアセチル化レベルは、その後は中期を経て後期ステージまで劇的に増加し、最終的にDT40 とほぼ同じレベルになる。⼀一⽅方、EBF1 遺伝⼦子の 5’-遠隔上流の 1 つのセグメント(segment a)と 2 つの ORF 部位(segments d and e)のクロマチン領域の K9/H3 のアセチル化レベルは、clone
cl.2-6 では⻑⾧長期培養期間の全ステージを通して変化しない。
   EBF1 遺伝⼦子の下流側の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream regions: segments 8-14)と 1 つの ORF
部位(segment c)のクロマチン領域での K27/H3 のアセチル化レベルは、clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期
間の初期ステージで劇的に減少する。その後は中期を経て後期ステージまで劇的に増加し、DT40とほぼ同じレベルになる。⼀一⽅方、残りの 5’-近傍上流、5’-遠隔上流、ORF 部位のクロマチン領域
では、K27/H3 のアセチル化レベルは clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間を通してほとんど変化しない。
   K9/H3 と K27/H3 のこれら結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream
region: positions -2031 ~ +200)のクロマチン領域では、主に K9/H3, K27/H3（多分 K14/H3, K18/H3
も）は、低い（あるいは幾らか⾼高い）アセチル化レベル(hypo- or slight hyper-acetylation levels)に基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA との強い（⾼高い）結合能(full binding
ability)を持つ。しかし、その後は、興味深いことに、中期と後期ステージを通して結合能を徐々に消失し、最終的に⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)に基づいて、ほとんど結合能を失った状態になる。
   これらの結果は、DT40 では緩いフォーム(loose form)である EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流

  

39  

  

領域(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造は、clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージで硬いフォーム(tight form)に変化し、その後は中期を経て後期ステージまで漸次逆⽅方向に変化して、最終的に緩いフォーム(loose form)になることを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、EBF1 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-6 では⻑⾧長期培養期間の初期ステージではほぼ完全に消失し、その後は中期を経て後期ステージまで徐々に増加し、最終的に DT40 とほぼ同じレベルになることが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-6 における EBF1 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既報の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。

⻑⾧長期連続培養期間の初期、中期、後期ステージにおける HDAC2(-/-) DT40 individual clones cl.2-1,

cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6 の OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流及び転写部位のクロマチン領域での K9/H3,
K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化：
   前述のように、各 HDAC2(-/-) individual clones での OBF1 遺伝⼦子の発現は⻑⾧長期培養期間にそれぞれ異なるパターンで変化する。⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) clones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6と DT40 で、OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流及び転写部位のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3,
K18/H3, K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベルを各アセチル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いた
NotchIP assay で調べた（図-24）[102, 106, 108, 110]。5’-近傍上流及び転写部位の各プライマーは、
データベースの塩基配列を確認後、それに基づいて設計した。5’-近傍上流(proximal 5’-upstream
region: positions -2138 ~ +164)に関しては、隣同⼠士重なり合う 14 個のセグメント(segments 1-14)
を、転写部位(ORF: positions +17 ~ +131, +776 ~ +937)に関しては、
2 個のセグメント(segments a andb)を、それぞれ増幅できるプライマーを合成した。
OBF1/clone cl.2-1:
   最初に、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-1 と DT40 の OBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 のア
セチル化レベルの変化パターンをこれらのアセチル化 Lys 残基の特異抗体と上記プライマーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-24-cl.2-1）[102, 106, 108, 110]。OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region: segments 1-14)と 2 つの ORF 部位(segments a and b)のクロマチン領域
での K9/H3 のアセチル化レベルは DT40 で⾼高い(hyper-acetylation levels)。全体的に、この K9/H3のアセチル化レベルは、clone cl.2-1 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは明らかに減少する。注⽬目
すべきは、減少した K9/H3 のアセチル化レベルは、中期ステージでは検出できないレベルまでさらに減少し、その後は後期ステージまで変化しない。
   OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region)と 2 つの ORF 部位(segments a and b)のクロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは DT40 ではかなり⾼高い。clone cl.2-1 の⻑⾧長期培養

  

40  

  

期間の初期ステージでは、この K27/H3 のアセチル化レベルは、positions -1493 ~ -1068 の 5’-近傍
上流(proximal 5’-upstream region: segments 5 and 6)のクロマチン領域ではほとんど減少しないが、その他の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region: segments 1-4 and 7-14)と 2 つの ORF 部位(segments a and b)のクロマチン領域では僅かに減少する。この減少した K27/H3 のアセチル化レ
ベルは中期でさらに減少し、その後は後期ステージまで変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
DT40 では、OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region: positions -2138 ~ +164)のクロ
マチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylationlevels)に基づいて、
ヒストン H3（または 5 つの Lys 残基）
は DNA との極めて弱い結合能(no binding
ability)しか持たない。⼀一⽅方、clone cl.2-1 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、特に K9/H3, K27/H3（多分 K23/H3 も）のかなり⾼高いアセチル化レベル(considerable hyper-acetylation levels)に基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA との弱い結合能(weak binding ability)を持つ。
さらに、主に K9/H3, K27/H3 の弱い結合能は、中期ステージでは低いアセチル化レベル(hypo-acetylation levels)に基づいて、強い結合能(full binding ability)まで劇的に増加し、その後は
後期ステージまで変化しない。
   これらの結果は、DT40 では、OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流領域(proximal ~2.0 kb
5’-upstream region)のクロマチン構造（約 10 個のヌクレオソームで構成される）は緩いフォーム(loose form)であることを⽰示す。⼀一⽅方、clone cl.2-1 では、このクロマチン構造は⻑⾧長期培養期間の初期ステージでかなり緩いフォーム(considerably loose form)に変化し、その後は中期を経て後期ステージまで硬いフォーム(tight form)に変化することを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、OBF1 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone
cl.2-1 では⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは明らかに減少し、さらにその後は中期を経て後期ステージまで劇的に減少することが容易に推察される。このことは RT-PCR による clone cl.2-1 における OBF1 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106,108-110]。
OBF1/clone cl.2-2:
   次に、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-2 と DT40 の OBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 のア
セチル化レベルの変化パターンを各アセチル化 Lys 残基の特異抗体と上記プライマーを⽤用いた
NotchIP assay で調べた（図-24-cl.2-2）[102, 106, 108, 110]。OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal
5’-upstream region: segments 1-14)と 2 つの ORF 部位(segments a and b)のクロマチン領域でのK9/H3 のアセチル化レベルは、DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、全体的に、clone cl.2-2の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは劇的に減少する。注⽬目すべきは、減少した K9/H3 のアセチ

  

41  

  

ル化レベルは中期ステージでは変化しないが、その後は後期ステージでは明らかに増加する。
この増加したアセチル化レベルは全体的に DT40 より低い。
   OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region)と 2 つの ORF 部位(segments a and b)のクロマチン領域での K27/H3 のアセチル化レベルは、DT40 ではかなり⾼高いが、clone cl.2-2 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージではかなり減少する。中期ステージではさらに減少し、その後は逆に後期ステージまで明らかに増加する。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
clone cl.2-2 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream
region)のクロマチン領域の K9/H3 と K27/H3 の低いかあるいは幾らか⾼高いアセチル化レベル(hypo- or slight hyper-acetylation levels)に基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は、明らかに DNA との強いかあるいは低い結合能(full or less binding ability)を持つ。中期ステージでは、K9/H3 の強い結合能(full binding ability)は変化せず、K27/H3 の低い結合能(less binding ability)
は、その低いアセチル化レベルに基づいて、強い結合能(full binding ability)までさらに増加する。
その後は後期ステージでは、K9/H3 と K27/H3 のこの強い結合能(full binding ability)は、⾼高いアセ
チル化レベル(hyper-acetylation levels)に基づいて、結合能がない状態(no binding ability)まで明らかに減少する。後期ステージの clone cl.2-2 での結合能は、アセチル化レベルが DT40 より低いために DT40 より⾼高いと想定される。
   これらの結果は、⻑⾧長期培養期間の初期と中期ステージでの clone cl.2-2 の OBF1 遺伝⼦子の~2.0
kb 5’-近傍上流領域(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造は、DT40 での緩いフォーム(loose form)から硬いかあるいは幾らか緩いフォーム(tight or slight loose form)に変化することを⽰示す。さらに、クロマチン構造の硬いフォーム(tightened chromatin structure)は、後期ステー
ジで緩いフォーム(loose form)に変化することを⽰示す。後期ステージのその程度は DT40 より少し硬いと考えられる。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、OBF1 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-2 では⻑⾧長期培養期間の初期ステージで明らかに減少し,その後は中期を経て後期ステージまで確かに増加することが容易に推察される。
このことは RT-PCR による clone cl.2-2 における OBF1 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105, 106, 108-110]。
OBF1/clone cl.2-4:
   引き続いて、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-4 と DT40 の OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3,
K27/H3 のアセチル化レベルの変化パターンを各アセチル化 Lys 残基の特異抗体と上記プライマ
ーを⽤用いた NotchIP assay で調べた（図-24-cl.2-4）[102, 106, 108, 110]。OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region: segments 1-14)と 2 つの ORF 部位(segments a and b)のクロマチン領

  

42  

  

域の K9/H3 のアセチル化レベルは、DT40 では⾼高い(high level)が、clone cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは劇的に減少する。注⽬目すべきは、減少した K9/H3 のアセチル化レベルは中期ステージでは変化しないが、その後は後期ステージでは明らかに増加する。この増加したアセチル化レベルの程度は DT40 より低いと考えられる。
   OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region)と 2 つの ORF 部位(segents a and b)のク
ロマチン領域の K27/H3 のアセチル化レベルは DT40 ではかなり⾼高いレベルであるが、clone cl.2-4の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは僅かに減少し、全体的に、中期ステージでは変化せず、その後は後期ステージでは僅かに増加する。しかし、5’-近傍上流のクロマチン領域の幾つかのセグメントでは変化しない。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、
K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
⻑⾧長期培養期間の初期ステージの clone cl.2-4 の OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream
region)のクロマチン領域では、特に K9/H3（多分 K27/H3 も）のかなり⾼高いかまたは幾らか⾼高い
アセチル化レベル(considerable or slight hyper-acetylation levels)に基づいて、K9/H3（多分 K27/H3
も）（またはヒストン H3）と DNA の結合能は弱い（低い）程度(week or less binding ability)まで僅かに増加する。この弱い（低い）結合能(week or less binding ability)は中期ステージでは変化しないが、後期ステージでは⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)に基づいて、結合能がない程度(no binding ability)まで明らかに減少する。この後期ステージでの clone cl.2-4 の結合能の程度は、アセチル化レベルが DT40 より低いために、DT40 より⾼高いと推察される。
   これらの結果は、⻑⾧長期培養期間の初期と中期ステージでは、clone cl.2-4 の OBF1 遺伝⼦子の~2.0
kb 5’-近傍上流領域(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造は、DT40 での緩いフォーム(loose form)から、幾らか緩いフォーム(somewhat loose form)に変化することを⽰示す。さらに、その後の後期ステージでは DT40 とほぼ同じ程度の緩いフォーム(loose form)になることを⽰示す。
このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、OBF1 遺伝⼦子の発現は DT40 で⾼高いレベル(high level)であるが、clone cl.2-4 では⻑⾧長期培養期間の初期、中期ステージでは確かに減少し,後期ステージでは逆に明らかに増加することが容易に推察される。このことは RT-PCR による
clone cl.2-4 における OBF1 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105,
106, 108-110]。
OBF1/clone cl.2-6:
   最後に、⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージの clone cl.2-6 と DT40 の OBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流及び転写部位(ORF)のクロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 のア
セチル化レベルの変化パターンを各アセチル化 Lys 残基の特異抗体と上記プライマーを⽤用いた
NotchIP assay で調べた（図-24-cl.2-6）[102, 106, 108, 110]。OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流 (proximal
5’-upstream region: segments 1-14)と 2 つの ORF 部位(segments a and b)のクロマチン領域の K9/H3

  

43  

  

のアセチル化レベルは、DT40 では⾼高い(high level)が、clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは明らかに減少する。減少した K9/H3 のアセチル化レベルは中期を経て後期ステージまで
逆に漸次増加し、最終的に DT40 とほぼ同じになる。
   OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream region)と 2 つの ORF 部位(segents a and b)のク
ロマチン領域での K27/H3 のアセチル化レベルは、DT40 ではかなり⾼高いレベルであるが、clone
cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは明らかに減少し、中期ステージでは変化しない。その後は明らかに漸次増加して、後期ステージでは DT40 とほぼ同じか僅かに⾼高いレベルになる。
   上記の K9/H3 と K27/H3 の結果は、K14/H3, K18/H3, K23/H3 の結果と併せて、次のことを⽰示す。
⻑⾧長期培養期間の初期ステージでの clone cl.2-6 の OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流(proximal 5’-upstream
region)のクロマチン領域で、特に K9/H3 と K27/H3（多分 K23/H3 も）の低いかあるいは幾らか
⾼高いアセチル化レベル(hypo- or slight hyper-acetylation levels)に基づいて、K9/H3 と K27/H3（多分K23/H3 も）（またはヒストン H3）は強いかあるいは低い DNA との結合能(full or less binding
ability)を持つ。この強いか低い結合能は中期ステージでは僅かに減少し、その後は後期ステージ
ではさらに⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)に基づいて、結合能がない程度(nobinding ability)まで明らかに減少する。
   これらの結果は、⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、clone cl.2-6 の OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’近傍上流領域(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン構造は、DT40 での緩いフォーム(loose form)から、硬いフォーム(tight form)に変化することを⽰示す。さらにその後、中期を経て後期ステージでは DT40 とほぼ同じ程度の緩いフォーム(loose form)になることを⽰示す。このようなクロマチンでの⼀一連の⽣生体内反応の結果から、OBF1 遺伝⼦子の発現は DT40 では⾼高いレベル(highlevel)であるが、clone cl.2-6 では⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは明らかに減少し、その後は中期を経て後期ステージでは確かに増加することが容易に推察される。このことは RT-PCR による
clone cl.2-6 における OBF1 遺伝⼦子の発現パターンの変化に関する既述の結果と合致する[102, 105,
106, 108-110]。
   Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 に関して、上記した⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 ホモ変異株の 4つのクローン(cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)における、5’-近傍上流クロマチン領域での K9/H3,
K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベル、5’-近傍上流クロマチン構造のフォーム、
遺伝⼦子発現(mRNA)レベルの変化を模式的にまとめて⽰示した（図-25）[102, 106, 108, 110]。
  劇的に増加した⼤大量の IgM  H-‑chain と L-‑chain 蛋⽩白質の⼀一部は HDAC2(-‑/-‑)   DT40   mutants の核周囲腔(peri-‑nuclear  space)に局在する：     HDAC2 ⽋欠損によって劇的に増⼤大した IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現に基づいて合成された⼤大量のこれらの免疫グロブリン蛋⽩白質は、DT40 株の細胞外への分泌能⼒力をはるかに超える

  

44  

  

ため、IgM  H-‑chain と L-‑chain 蛋⽩白質は互いに⾼高分⼦子複合体を形成して⼩小胞体に蓄積される。しかし、その⼀一部は、⻑⾧長期培養期間の初期から後期ステージを通して、核膜(nuclear   envelope)へ輸送されて核周囲腔(peri-‑nuclear  space)に留まる（図-‑26,  27）[102,  103,  105,  107-‑109,  111]。  

DT40 野⽣生株と⻑⾧長期培養期間の初期、中期、後期ステージにおける HDAC2(-/-) DT40 individualclones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6 それぞれの諸性質の多様な変化のまとめ：
DT40:
   DT40 野⽣生株における IgM H-chain と L-chain の蛋⽩白質量は、この 2 つの遺伝⼦子の発現（転写）と IgM H-chain pre-mRNA の選択的スプライシングの 2 つのステップでコントロールされる[77]。
IgM H-chain と L-chain 遺伝⼦子の発現は、Pax5, Aiolos, EBF1, Ikaros によって抑制的（ネガティブ）に、E2A, OBF1 によって促進的（ポジティブ）に制御される。HDAC2 は、スーパーバイザーとして、Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 の遺伝⼦子発現をポジティブに、Ikaros, E2A の遺伝⼦子発現をネガ
ティブに制御することを介して、IgM H-chain と L-chain 遺伝⼦子の発現を包括的に制御する[84]。
   この 2 つの免疫グロブリン遺伝⼦子の発現を直接的に制御する Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 などの遺伝⼦子発現制御の基盤となるのは、それぞれのクロマチン構造の変化である。DT40 の Pax5,
Aiolos, EBF1, OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流(proximal ~2.0 kb 5’-upstream region)のクロマチン
領域では、ヒストン H3 の N-末端部位の特定 Lys 残基(K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3)の 1 つまたは複数は⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)である。この⾼高いアセチル化
レベルに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）の DNA との結合能はほとんど無くなり(no binding ability)、5’-近傍上流領域のクロマチン構造は緩い形状（フォーム）(loose form)を形成する。結果として、DT40 では、Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 遺伝⼦子の発現は⾼高いレベル(highlevels)である[77, 84, 102, 103, 105, 106, 108-110]]。
   このような HDAC2 の制御下にある Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 などによる抑制的･促進的な逆⽅方向の多彩な制御メカニズムの包括的結果として、DT40 野⽣生株では IgM H-chain と L-chain の遺伝
⼦子発現は強く抑制され、その蛋⽩白質量は極めて低いレベル(low levels)である。
clone cl.2-1:
   clone cl.2-1 の⻑⾧長期培養期間に上記の諸性質は次のように変動する（図-28）[102, 103, 105, 106,108-110]。Pax5, Aiolos, EBF1 に関しては次の通りである（図-28-Pax5, Aiolos, EBF1）。初期ステー
ジでは、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流(proximal ~2.0 kb 5’-upstream regions)のク
ロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の 1 つまたは複数の Lys 残基は極めて低いアセチル化レベル(no, low or hypo-acetylation levels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA と強い結合能(full binding ability)を持つ。したがって、Pax5,
Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン構造は硬いフォーム(tight form)になる。結

  

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果として、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の発現は劇的に減少して極めて低いレベル(no or low levels)になる。Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の発現も含めて上記の諸性質は、⻑⾧長期培養期間を通して変化
せず後期ステージでも初期ステージとほぼ同じである。
   ⼀一⽅方、OBF1 に関しては次の通りである（図-28-OBF1）。⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、
OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3の 1 つまたは複数の Lys 残基は⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA と弱い結合能(weak binding ability)を持つ。したがって、OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流クロマチン構造はかなり緩いフォーム(considerable loose form)になる。結果として、OBF1 遺伝⼦子の発現は明らかに減少して、かなり⾼高
いレベル(considerable high level)になる。その後は⻑⾧長期培養期間に劇的に変化して、後期ステージ
では、1 つまたは複数の Lys 残基は極めて低いアセチル化レベル(hypo-acetylation levels)になる。
これに基づいて、
ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA と強い結合能(full binding ability)を持つ。したがって、OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン構造は硬いフォーム(tightform)になる。結果として、OBF1 遺伝⼦子の発現は後期ステージでは劇的に減少して、極めて低い
レベル(no or low level)になる。
   このような clone  cl.2-‑1 での多彩な⽣生体反応の包括的制御機構の結果、⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、抑制的因⼦子である Pax5,   Aiolos,   EBF1 などの遺伝⼦子発現の劇的な減少によって、IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現は劇的に増加し、それに伴って蛋⽩白質量も劇的に増加する。
その後は⻑⾧長期培養期間を通して、Pax5,  Aiolos,  EBF1 などの遺伝⼦子発現は減少したままであるが、促進的因⼦子である OBF1 の遺伝⼦子発現が劇的に減少し、これに伴って、IgM  H-‑chain と L-‑chainの遺伝⼦子発現と蛋⽩白質量は、OBF1-‑依存的に劇的に減少し、最終的に後期ステージでは DT40とほぼ同じレベルになる。  
clones  cl.2-‑2  and  cl.2-‑4:     clones cl.2-2 と cl.2-4 の⻑⾧長期培養期間に上記の諸性質は次のように変動する（図-29, 30）[102, 103,
105, 106, 108-110]。Pax5, Aiolos, EBF1 に関しては次の通りである（図-29-Pax5, Aiolos, EBF1 と図-30-Pax5, Aiolos, EBF1）。初期ステージでは、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のク
ロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の 1 つまたは複数の Lys 残基は極めて低いアセチル化レベル(no, low or hypo-acetylation levels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA と強い結合能(full binding ability)を持つ。したがって、Pax5,
Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン構造は硬いフォーム(tight form)になる。結果として、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の発現は極めて低いレベル(no or low levels)になる。
   その後は後期ステージまで、Pax5, Aiolos 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン領域のK9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の 1 つまたは複数の Lys 残基は⾼高いアセチル化レベル

  

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(hyper-acetylation levels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）はDNA と極めて弱い結合能(no binding ability)を持つ。したがって、Pax5, Aiolos 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’近傍上流のクロマチン構造は緩いフォーム(loose form)になる。結果として、Pax5, Aiolos 遺伝⼦子の発現は明らかに⾼高いレベル(high levels)になる。しかし、後期ステージまで、EBF1 遺伝⼦子の~2.0
kb 5’-近傍上流のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の 1 つまたは複数の
Lys 残基は極めて低いアセチル化レベル(hypo-acetylation levels)である。これに基づいて、ヒスト
ン H3（またはこれらの Lys 残基）と DNA との結合能も強いままである(full binding ability)。したがって、EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン構造は硬いフォーム(tight form)である。
結果として、EBF1 遺伝⼦子の発現は明らかに低いレベル(low level)のままである。
   ⼀一⽅方、OBF1 に関しては次の通りである（図-29-OBF1 と図 30-OBF1）。⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3,
K23/H3, K27/H3 の 1 つ ま た は 複 数 の Lys 残 基 は 幾 ら か ⾼高 い ア セ チ ル 化 レ ベ ル (slight
hyper-acetylation levels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNAと弱い結合能(less binding ability)を持つ。したがって、OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン構造は幾らか緩いフォーム(somewhat loose form)になる。結果として、OBF1 遺伝⼦子の発現は少し減少して幾らか⾼高いレベル(somewhat high level)になる。その後は後期ステージまで、OBF1
遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の 1 つ
または複数の Lys 残基は⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)になる。
これに基づいて、
ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA と強い結合能(full binding ability)を持つ。したがって、EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン構造は緩いフォーム(loose form)になる。
結果として、OBF1 遺伝⼦子の発現は少し増加して⾼高いレベル(high level)になる。
   このような clones   cl.2-‑2 と   cl.2-‑4（多分 cl-‑2-‑3,   2-‑5 も）での多彩な⽣生体反応の包括的制御機
構の結果、⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、抑制的な転写因⼦子である Pax5,  Aiolos,  EBF1 などの遺伝⼦子発現の劇的な減少によって、IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現は劇的に増加し、それに伴ってこれら２つの蛋⽩白質量も劇的に増加する。その後は⻑⾧長期培養期間を通して、EBF1 の遺伝⼦子発現は減少したままであるが、Pax5,  Aiolos の遺伝⼦子発現は劇的に増加し、これに伴って、IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現と蛋⽩白質量は、Pax5,  Aiolos-‑依存的に劇的に減少し、最終的に⻑⾧長期培養期間の後期ステージでは DT40 とほぼ同じレベルになる。  
clone cl.2-6:
   clone cl.2-6 の⻑⾧長期培養期間に上記の諸性質は次のように変動する（図-31）[102, 103, 105, 106,108-110]。Pax5, Aiolos, EBF1 に関しては次の通りである（図-31-Pax5, Aiolos, EBF1）。⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン領域のK9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の 1 つまたは複数の Lys 残基は極めて低いアセチル化レ

  

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ベル(hypo-acetylation levels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）
は DNA と強い結合能(full binding ability)を持つ。したがって、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb
5’-近傍上流のクロマチン構造は硬いフォーム(tight form)になる。結果として、Pax5, Aiolos, EBF1
遺伝⼦子の発現は劇的に減少し、極めて低いレベル(no or low levels)になる。その後は後期ステー
ジまで、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3,
K18/H3, K23/H3, K27/H3 の 1 つまたは複数の Lys 残基は⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylationlevels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）と DNA の結合能はほとんど無くなる(no binding ability)。したがって、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン構造は緩いフォーム(loose form)になる。結果として、Pax5, Aiolos, EBF1 遺伝⼦子の発現は劇的に増加し、明らかに⾼高いレベル(high levels)になる。
   ⼀一⽅方、OBF1 に関しては次の通りである（図-31-OBF1）。⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、
OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3の 1 つまたは複数の Lys 残基は極めて低いアセチル化レベル(hypo-acetylation levels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）は DNA と強い結合能(full binding ability)を持つ。したがって、OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン構造は硬いフォーム(tightform)になる。結果として、OBF1 遺伝⼦子の発現は少し減少して、幾らか⾼高いレベル(somewhat highlevel)になる。その後は後期ステージまで、OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍上流のクロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 の 1 つまたは複数の Lys 残基は⾼高いアセチル化レベル(hyper-acetylation levels)になる。これに基づいて、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）はDNA と極めて弱い結合能(no binding ability)を持つ。したがって、OBF1 遺伝⼦子の~2.0 kb 5’-近傍
上流のクロマチン構造は緩いフォーム(loose form)になる。結果として、OBF1 遺伝⼦子の発現は明らかに増加し、⾼高いレベル(high level)になる。
   このような clone  cl.2-‑6 での多彩な⽣生体反応の包括的制御機構の結果、⻑⾧長期培養期間の初期ステージでは、抑制的な転写因⼦子である Pax5,  Aiolos,  EBF1 などの遺伝⼦子発現の劇的な減少によって、IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現は劇的に増加し、それに伴ってこの２つの蛋⽩白質量も劇的に増加する。その後は⻑⾧長期培養期間を通して、Pax5,  Aiolos,  EBF1 の遺伝⼦子発現が劇的に増加し、これに伴って、IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現と蛋⽩白質量は、Pax5,  Aiolos,  EBF1-‑
依存的に劇的に減少し、最終的に後期ステージでは DT40 とほぼ同じレベルになる。  
  ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローン(cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)における多種多様な性質の多彩な変化に関するまとめ：

   DT40 野⽣生株と⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の 4 つのクローン(cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4,
cl.2-6)の Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 に関して、遺伝⼦子の 5’-近傍上流クロマチン領域の K9/H3,

  

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K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベルとクロマチン構造のフォーム及び遺伝⼦子発現(mRNA)レベル、さらに IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現(mRNA)と蛋⽩白質レベルなどの変化について、今までに得られた結果を再度模式的･包括的にまとめた（図-32）[102, 107, 108, 111]。

HDAC2(-‑/-‑)  DT40  mutants の多様性：

   蓄積した⼤大量の IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質は、HDAC2(-‑/-‑)  DT40  mutants ⾃自⾝身にとっては異常で不必要で苦痛な予期しない新たに変化した環境である。2 度⽬目の作製で得られた 28
個の HDAC2(-‑/-‑)  individual  mutant  clones から無作為に選んで調べた 6 個は、⻑⾧長期培養期間にIgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現と蛋⽩白質量を減少させる⽅方法（機構）に関して、clone  cl.2-‑1
は OBF1-‑依存性、clones  cl.2-‑2,  cl.2-‑3,  cl.2-‑4,  cl.2-‑5 は Pax5,  Aiolos-‑依存性、clone  cl.2-‑6 は Pax5,  Aiolos,   EBF1-‑依存性の 3 つの異なるタイプに分類分け出来る。残りの individual   clones を解析
すると、これら 3 つとは異なる別のタイプが存在する可能性は⼤大である。このように、
HDAC2(-‑/-‑)  individual  mutants は、ゲノムタイプが同⼀一であっても、蓄積した IgM  H-‑chain とL-‑chain の蛋⽩白質量を減少させるために、様々な異なる⽅方法を持つ多くの細胞タイプに変化する
多様性を持つ。  
   さらに、これら 3 つのタイプにおいてさえ、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1,  E2A の他に、Blimp1,  PCAF,  HDAC7,  HDAC9 などの遺伝⼦子発現が、⻑⾧長期培養期間に増加したり、減少したり、途中で逆転したりなどと劇的かつ複雑に変化する。他のクロマチン修飾酵素や転写因⼦子の遺伝⼦子発
現も変化していることは容易に想定できる。細胞機能を正常に発揮するために重要な役割を担っているこれらの遺伝⼦子発現の変化は、IgM  H-‑chain と L-‑chain 量の減少の他にも、
HDAC2(-‑/-‑)  DT40  mutants の individual  clones の様々な性質（機能）が⼤大幅に変化していることを強く⽰示唆する[102,  107,  108,  111]。  
    HDAC2(-‑/-‑)  DT40 変異株の各クローンは、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流域の異なるクロマチン構造の可塑性を、⻑⾧長期培養期間にエピジェネティック修飾で不可逆的に創出することを介して、蓄積した⼤大量の IgM   H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量を減らすためのプログラム化されていない新規で多様な細胞機能を獲得する：     上述の結果などを踏まえて、⼤大量に蓄積した IgM   H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量を減ずるた
めに、⻑⾧長期培養期間を通して、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流の異なるクロマ
チン構造の可塑性をエピジェネティック修飾で不可逆的に創出することを介して、HDAC2(-‑/-‑)の各クローンが、プログラム化されていない新たな多様な細胞機能を獲得する仮説的な包括的⽅方法（機構）は次の通りである（図-‑33）[102,  107,  108,  111]。  
   最 初 に 、 環 境 変 化 認 識 受 容 体 / 部 位 (environment   change   recognition   receptor/site:  

  

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ECRR/ECRS)とクロマチン構造変換複合体装置(chromatin   conformation   (structure)   change  complex   machinery:   4C   machinery)の 2 つの重要な機能体の存在を仮定する（図-‑32,   33）
。
ECRR/ECRS は核周囲腔(peri-‑nuclear  space)に蓄積した⼤大量の IgM  H-‑chains と L-‑chains を異常で不都合な環境変化(abnormal   and   unfavorable   environment   change)として認識する役割を担う。当然、ECRR/ECRS は IgM   H-‑chain と L-‑chain 蛋⽩白質の蓄積に関するシグナルのクロマチンへの伝達にも⼀一部関与する可能性もある。⼀一⽅方、4C   machinery は構成員として HATs とHDACs の特定メンバーや他の多くの因⼦子を含む多様な複合体であり、上記４つの転写因⼦子の遺伝⼦子などの 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造の可塑性を直接的かつ不可逆的に創出する役割を担う。
また、上記のシグナル伝達にも⼀一部関与している可能性もある。ECRR/ECRS、4C   machineryや他の多くの因⼦子などが関与して、異常に蓄積した IgM   H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質量を除去するための応答反応が下記のように連鎖的に起る。  
   HAT と HDAC ファミリーの多くのメンバーの遺伝⼦子が⾼高いレベルで発現している DT40 野
⽣生株では、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 遺伝⼦子それぞれに対する 4C  machinery は   HDAC 活性として HDAC2、HAT 活性として特定の HAT メンバー（例えば、GCN5）や他の多数の因⼦子で構成されている。⼀一⽅方、遺伝⼦子破壊法(gene   targeting   techniques)で作製直後の HDAC2(-‑/-‑)  DT40 変異株の各クローンでは、HDAC2 ⽋欠損に伴って、4C   machinery の全体的な構造(bulk  
conformation)が劇的に変化して、既存の構成員であった特定の HAT メンバーも脱離するかまたはその活性が著しく低下する。上記過程とその後に続く⻑⾧長期培養期間を通して、4C  machinery
は新たに HDACs の他の特定メンバー、HATs の特定メンバー（同じか異なるメンバー）や他の多数の因⼦子を構成因⼦子として含むようになり、多種多様な形状になる。  
   核周囲腔(peri-‑nuclear   space)に⼤大量に蓄積した IgM   H-‑chains と L-‑chains は、核内膜(inner  nuclear   membrane)（多分、ヘテロ･クロマチンも結合している）に局在している ECRR/ECRSに結合する。ECRR/ECRS が IgM  H-‑chain と L-‑chain の蛋⽩白質の蓄積を異常で不必要(abnormal  and  unnecessary)な環境変化として認識した後、この環境変化のシグナルは、転写因⼦子、クロマ
チン修飾酵素、他の関連因⼦子や酵素などの多数の遺伝⼦子（多分、多くの異なるクロモソームに存在する）の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造へゲノム･ワイド(genome-‑widely)に伝達される。最初のシグナル伝達に続いて、この異常な環境変化への⾃自発的･不均衡な応答が、HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones の Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 や他の遺伝⼦子などの 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン領
域へ、別々に連続して集中的に起る。これらの転写因⼦子の遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流域のクロマチン
構造変化の多様性は、多彩な 4C  machinery の構成因⼦子である HATs と HDACs の特定メンバーの共同作業によるヒストン H3 の N-‑末端部位の 5 つの特異的 Lys 残基の 1 つまたは複数の多様なアセチル化･脱アセチル化レベルに基本的に基づいている。このような K9/H3 と K27/H3（多分 K14/H3,  K18/H3,  K23/H3 も）のアセチル基によるエピジェネティック修飾によって、Pax5,  

  

50  

  

Aiolos,   EBF1,   OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造の可塑性は不可逆的に創出される。
⼀一般的に、これらの 1 つまたは複数の Lys 残基が⾼高いアセチル化レベル(hyper-‑acetylation  levels)
である 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造は、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）と DNA との結合能がないこと(no  binding  ability)に基づいて、緩いフォーム(loose  or  open  form)になる。⼀一⽅方、これらの 1 つまたは複数の Lys 残基が低いアセチル化レベル(hypo-‑acetylation  levels)である
5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造は、ヒストン H3（またはこれらの Lys 残基）と DNA との強い結合能(full   binding   ability)に基づいて、硬いフォーム(tight   or   closed   form)になる。しかし、4C  machinery は上記の転写因⼦子の遺伝⼦子などの転写領域（読み取り枠）(open  reading  frame,  coding  region:  ORF)のクロマチン構造の変化にはほとんど関与しない。  
   必要が⽣生じた時に、転写因⼦子複合体装置(transcription   factor   complex   machinery:   TFC  machinery)（構成メンバーとして RNA ポリメラーゼ、適当な転写因⼦子、HAT,  HDAC の各メン
バー、他の因⼦子など）は、Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 遺伝⼦子などの 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構
造の緩いフォーム(loose   form)（潜在的に活性化状態になっている）内のプロモーター部位(promoter  elements  or  regions)上に結合することが出来、これらの転写因⼦子などの遺伝⼦子発現が開始される。  
   具体的な結果の 1 つは次の通りである。独⽴立した各 HDAC2(-‑/-‑)クローン(individual   clones)
は、同じ条件下での単純な⻑⾧長期連続培養期間に、Pax5,  Aiolos,  EBF1 または OBF1 の遺伝⼦子発現を異なる⽅方法で促進的または抑制的に制御することを介して、増⼤大した IgM   H-‑chain,   L-‑chainの遺伝⼦子発現（結果的にこの２つの蛋⽩白質レベルが減少する）をほぼ同じパターンで減らすた
めに、プログラム化されていない新しい細胞機能を獲得する。このような異なる⽅方法（機構）は、基本的には⻑⾧長期連続培養期間の特異的なエピジェネティック修飾（ここでは、アセチル化と脱アセチル化）による Pax5,  Aiolos,  EBF1 または OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流領域の異なるク
ロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出することに基づく。  
   特筆すべきは、解析した 6 つの HDAC2(-‑/-‑)   individual   clones   cl.2-‑1,   cl.2-‑2,   cl.2-‑3,   cl.2-‑4,  cl.2-‑5,   cl.2-‑6 は、連続⻑⾧長期培養期間の後期ステージで、転写因⼦子やクロマチン修飾酵素である
Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1,  Blimp1,  PCAF,  HDAC9 などの遺伝⼦子発現に関して 3 つの異なる⽅方法（機構）が存在することに基づいて、上記のように異なる細胞機能を持つ 3 つの細胞タイプに分類分け出来ることである。さらに、これら 6   クローンの 1 つまたは複数において、Pax5,  Aiolos,   EBF1,   E2A,  PU.1,   Blimp1 などの遺伝⼦子発現パターンの⽅方向性は連続⻑⾧長期培養期間の初期から後期ステージを通して同じであるが、PCAF,  HDAC7,  HDAC9,  Ikaros,  OBF1 などの遺伝
⼦子発現パターンの⽅方向性は単純な連続⻑⾧長期培養期間にも関わらず、途中で⾃自発的かつ複雑に逆転する。当然   、変化したこれらの転写因⼦子とクロマチン修飾酵素は IgM   H-‑chain   and   L-‑chain
遺 伝 ⼦子 の 他に 種 々の 多 く の遺 伝 ⼦子の 発 現 制御 にも 深 く 関 与し て いる 事 か ら、 こ れら の

  

51  

  

HDAC2(-‑/-‑)   individual   mutant   clones はそれぞれ異なる多彩な性質を有している事は容易に想定できる。また、他の HDAC2(-‑/-‑)  individual  clones を解析すると、さらに異なる細胞タイプが存在する可能性は⼤大である。  
   これらの複雑な⽣生体内化学反応の統括的な結果として、HDAC2(-‑/-‑)   DT40   mutants のindividual  clones はそれぞれ、異常な環境変化に適応するためのみならず、本来は同じ細胞タイプ（更に樹⽴立された細胞株）であるにも関わらず、多様な性質･機能を持つ多彩な類似の細胞タイプに分岐するための柔軟で順応性ある多能的な能⼒力を獲得する。  
   このような⻑⾧長期連続培養期間の多世代を通して、HDAC2(-/-) DT40 mutants が、⼤大量の蓄積した IgM H-chain and L-chain の蛋⽩白質量を劇的に減少させる新たな機能を獲得する能⼒力（すなわち、新規の環境適応能⼒力）は、よく知られている⼩小胞体ストレス応答/異常タンパク応答（endoplasmic
reticulum (ER) stress response/unfolded protein response）等とは明らかに異なるバイオ･システムである。
  クロマチン･コンフォメーション･チェンジ･コード説(Chromatin   conformation   change   code  (4C)   theory:   4C   theory)   〜～⾼高等真核⽣生物における多世代を通してのエピジェネティック修飾による特定の転写因⼦子とクロマチン修飾酵素遺伝⼦子群のクロマチン構造の多様な可塑性の不可逆的創出を介したプログラム化されていない新規の細胞機能を獲得する仮説的な⼀一般的⽅方法（機構）〜～：  

   ⼤大量の蓄積した IgM   H-‑chain と L-‑chain 蛋⽩白質量の排除に関する上記の仮説的⽅方法（機構）を、⾼高等真核⽣生物における多世代（多くの細胞分裂）を通してのエピジェネティック修飾による特定の転写因⼦子とクロマチン修飾酵素遺伝⼦子群のクロマチン構造の多種多様な可塑性の不可逆的創出を介した、プログラム化されていない新しい細胞機能を獲得する仮説的な⼀一般的⽅方法（機構）へ拡張した（図-‑34）。⾼高等真核細胞は、⽣生涯で初めて細胞内外の新しい環境変化に遭遇した時、多世代を通して徐々に、その環境変化に⾃自らを適応させる能⼒力または異常な環境変化の場合にはそれを排除する能⼒力を獲得するようになる。この新しいバイオ・システムをクロマ
チン・コンフォメーション・チェンジ・コード説（chromatin  conformation  change  code  theory:  4C  theory）と命名した[102,  107,  108,  111]。⾼高等真核⽣生物は 4C  theory に基づいて、
ECRR/ECRS、
4C  machinery や他の多数の因⼦子などを駆使して、新しい環境変化に対する連鎖的応答反応を下記のように起し、新たな適応能⼒力を獲得する。  
   新しい環境変化は、最初に核-‑細胞質関⾨門(nucleus-‑cytoplasm   barrier)である核膜(nuclear  membrane)（多分、ヘテロ･クロマチンが結合する核内膜(inner   nuclear  membrane)）近辺に局在している ECRR/ECRS によって認識される。新しい環境変化を認識するこのステップで、中間センサーとして特定の別の分⼦子が関与する可能性は⼤大いにある。引き続いて、この環境変化

  

52  

  

に関するシグナルは、多世代（多くの細胞分裂）を通して、核内のクロマチンへとゲノム･ワイド(genome-‑widely)に伝達される（図-‑35）。最初のシグナルを受け取った後、4C  machinery は、
エピジェネティック修飾によって、転写因⼦子、クロマチン修飾酵素や他の関連因⼦子と酵素などをコードする多くの遺伝⼦子群のクロマチン構造を僅かに変化させる。新しい環境変化に関する
シグナル伝達と⾃自発的で不均衡な応答は、上記の因⼦子や酵素遺伝⼦子群の中の幾つかの特定メン
バーの 5ʼ’-‑近傍上流の限定されたクロマチン構造に連続的･選択的に繰り返し集中する。最後に、この新たな環境変化に関する連続的なシグナル伝達を受けて、多様な 4C  machinery は、アセチ
ル基、メチル基、リン酸基、ユビキチン基、ADP-‑リボース基などによって、上記の特定遺伝⼦子群の限定されたクロマチン構造領域のヒストンや DNA 分⼦子の多種多様なエピジェネティック
修飾を引き起す。  
   このような多種多様なエピジェネティック修飾の中で、コア･ヒストン H2A,  H2B,  H3,  H4 のN-‑末端部位の幾つかの特異的 Lys 残基のアセチル化と脱アセチル化は最も主要な化学修飾の 1つである。HATs と HDACs の特定メンバーや他の因⼦子などで構成される 4C  machinery は、上記の多種多様なエピジェネティック修飾の中のアセチル化と脱アセチル化に優先的に関与する。
関与するコア･ヒストンの種類と Lys 残基の位置は多様である。例えば、上記の DT40 での IgM  H-‑chain と L-‑chain の遺伝⼦子発現のケースでは、ヒストン H3 の Lys-‑9,  Lys-‑14,  Lys-‑18,  Lys-‑23,  Lys-‑27 残基が重要かつ優先的である。このようにして、特定の標的遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造領域で、ヒストン H3 のこれらの Lys 残基の 1 つまたは複数のエピジェネティック修飾は多世代を通して変化する。このアセチル化と脱アセチル化に関与する 4C  machinery の多彩な機能の違いは、構成因⼦子である HATs と HDACs のメンバーの複雑な組み合せに主に依存する。⼀一⽅方、この多彩な 4C  machinery は、該当する各遺伝⼦子の転写領域(ORF)近辺のクロマチン
構造の変化にはほとんど関与しない。  
   ヒストン H3 の N-‑末端部位の DNA との結合能に、どの Lys 残基が真にまたは主に関与して
いるかはまだ不明であるが、上記の特異的な Lys 残基の 1 つまたは複数のアセチル化レベルに基づいて仮に決めた定性的能⼒力は次の通りである。すなわち、⾼高いかまたは低いアセチル化レベル(hyper-‑  (high)  or  hypo-‑  (no  or  low)  acetylation  levels)は、それぞれ極めて弱いかまたは強い結合能(no  or  full  binding  ability)を引き起こすベースであり、その結果、クロマチン構造は緩いかまたは硬いフォーム(loose  (open)  or  tight  (closed)  form)になる。このように、クロマチン構
造の可塑性は、エピジェネティック修飾による連続的なコンフォメーション変化に基づいて、不可逆的に創出される。多世代を通して徐々に緩やかに、プログラム化されていない新しい細胞機能を獲得するためにクロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出するバイオ･システムである 4C  theory は、⻑⾧長い進化の過程で既に獲得済のプログラム化されている通常の細胞機能を発現するためにクロマチンのコンフォメーション変化を直ちに即座に引き起す様々なバイオ･シス

  

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テムとは明らかに異なる。  
   必要が⽣生じた際に、転写因⼦子複合体装置(TFC   machinery)は、特定の標的遺伝⼦子群   (target  genes)の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造の緩いフォーム(loose   form)（潜在的に活性化状態である）内のプロモーター部位(promoter  elements  or  regions)に結合することが出来、それによって、これら標的遺伝⼦子群の発現が開始される。⼀一⽅方、この TFC   machinery は、⾮非標的遺伝⼦子群  (un-‑target  genes)の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造の硬いフォーム(tight  form)（潜在的にも不活性化状態である）内のプロモーター部位には結合出来ず、これら⾮非標的遺伝⼦子の発現を開始することが出来ない。  
   結果として、5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造の緩いかまたは硬いフォームは、当該遺伝⼦子の発
現を⾼高いかまたは極めて低いレベルになるように指令し、その最終産物であるタンパク質合成も⾼高いかまたは極めて低いレベルに⽣生じさせる。特筆すべきは、新しい環境変化とそのシグナ
ルが同じタイプの細胞全てに共通であっても、クロマチン構造の可塑性の不可逆的創出⽅方法は、個々の細胞間でそれぞれ異なる可能性が⼤大きいことである。すなわち、プログラム化されていない新しい細胞機能を獲得するために、同じタイプの個々の細胞は、多数の特異的遺伝⼦子の 5ʼ’-‑
近傍上流のクロマチン構造を複雑かつ多様に変化させる能⼒力のみならず、ある 1 つの遺伝⼦子の同じ 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造を別々に様々なフォームに変化させる能⼒力をも有している。
このように、同じ環境変化にも関わらず、同⼀一のゲノムタイプの個々の細胞間でも多世代を通して、多数の特異的な転写因⼦子やクロマチン修飾酵素の遺伝⼦子発現は多種多様に変化する。1 つの結果として、同じタイプの個々の細胞は、新しい環境変化に⾃自らを適応させるために、同じかまたは異なるプログラム化されていない新しい細胞機能（性質）を別々のバイオ･システムで新たに獲得する適応能⼒力を有す。  
  包括的な結論･議論･展望：     ⾼高等真核⽣生物は、その⼀一⽣生涯において異常で不快な予期しない不必要で不利益な環境変化あるいは有益な環境変化にさえ最初に遭遇した時に、これらの環境変化に対処し克服するかある
いは適応するために、特筆すべき能⼒力を獲得する。すなわち、多世代（または多数の細胞分裂）を通して、クロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出することによって、プログラム化されていない新規の細胞機能を獲得するバイオ･システムである。  
   このプログラム化されていない新しい細胞機能を獲得するためのバイオ･システムの創出⽅方法の基盤として、⾼高等真核⽣生物の体細胞は柔軟的･順応的･多能的な能⼒力を持つ   [102,   107,   108,  111]。これらの能⼒力はいずれも基本的にはクロマチン構造の柔軟性･順応性･多能性に基づいている。細胞内外の環境変化に適応するために、個々の体細胞は、エピジェネティック修飾で多様なクロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出することを介して、同じかまたは異なるプログ

  

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ラム化されていない新たな細胞機能を異なる⽅方法（機構）で獲得する能⼒力を有している。すな
わち、特異的な転写因⼦子やクロマチン修飾酵素の遺伝⼦子群の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造が、緩いフォームから硬いフォーム、逆に、硬いフォームから緩いフォームへと変換することを介して獲得する。5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造の緩いフォームまたは硬いフォームは、当該遺伝⼦子の発現に関して潜在的に活性状態または不活性状態である。もちろん、単に 5ʼ’-‑近傍上流域の塩基配列のみではほぼ全ての遺伝⼦子が担っているゲノム機能発現に不活性（サイレント）な状態である。     個々の体細胞における多様なクロマチン構造の可塑性は、細胞が環境変化に最初に遭遇した時に、それに対する⾃自発的･不均衡な応答によってまず惹起された後、不均衡な応答が多世代を通して連続的･集中的に起ることによって不可逆的に創出される。体細胞での多様なクロマチン
構造の可塑性を創出する様々な⽅方法（機構）は、当該細胞のそれまでの履歴に明らかに依存する。さらに、クロマチン構造の可塑性は、その創出が完了済か進⾏行中であるかに関わらず、多くの世代（細胞分裂）を通して更なる構造変化を伴わないかあるいは伴って、⼦子孫の世代に受け継がれる。特筆すべきは、⻑⾧長い進化の過程で獲得された通常の遺伝⼦子発現や酵素反応などの可逆的な制御機構は、シグナルを受け取った細胞それ⾃自体の中で起るが、クロマチン構造の可
塑性の不可逆的な創出は⼦子孫細胞で起り、環境変化のシグナルを最初に受け取った細胞では起らないことである（図-‑35）。多分、クロマチン構造の可塑性の不可逆的創出は、偶然または中⽴立的に起るのではなく、環境変化に適応するかそれを克服するという⽬目的を持って必然的に起ると考えられる。  
   5ʼ’-‑近傍上流クロマチン領域は、緩いかまたは硬いフォーム(loose  or  tight  form)として、それ⾃自体の可塑性を不可逆的に創出することによって、当該遺伝⼦子の潜在的転写能⼒力のスイッチのオンまたはオフ(on  or  off)を指令する。したがって、5ʼ’-‑近傍上流クロマチン領域は、上記した構
造的側⾯面からの「クロマチンの刻み⽬目(notch  of   chromatin)」と⾒見なすことが出来ると共に、機能的側⾯面からは「遺伝⼦子発現のディレクター(director  of  gene  expression)」と⾒見なすことが出来る。当然、このクロマチンの刻み⽬目（またはディレクター）は、プロモーター、オペレーター、
エンハンサーなどの転写部位（要素）などの特異的塩基配列も含んでいる。注⽬目すべきは、環境変化に関するシグナルの真の受け取り⼿手は、緩いフォームと硬いフォームの間で⾃自律的に変化し得る動的なクロマチン構造それ⾃自体であり、静的で変化し得ないクロモソーム（またはクロマチン）ではないことである。換⾔言すると、5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造（刻み⽬目またはディ レ ク タ ー） は 、動 的 で 変換 可 能な 三 次 元の コン フ ォ メ ーシ ョ ンと し て ⾃自⼰己 変 換能 ⼒力  (self-‑reforming   ability)を有し、次の 2 つの基本的で重要な能⼒力を持つ。すなわち、１）細胞内外の環境変化のシグナルを受け取る能⼒力と、２）そのシグナルへの応答による不可逆的なクロマチンのコンフォメーション変化を介して、当該遺伝⼦子の潜在的転写活性のスイッチ（オンま

  

55  

  

たはオフ）を指令する能⼒力である。もちろん、ここで⾔言う⾼高等真核⽣生物における the 4C theoryに基づくクロマチンの⾃自⼰己変換能⼒力 (self-reforming ability) とは、３次元クロマチン構造の可塑性を不可逆的に変換させる能⼒力であり、DNA 構造（塩基配列）それ⾃自体を変化させる周知の抗体遺伝⼦子の再編成 (rearrangement (recombination) of antibody genes) 能⼒力やその他の体細胞でのDNA 再構成 (somatic recombination) 能⼒力等とは明らかに異なる。しかし、このアイデアをサポートする具体的データはまだ充分ではない。このような複雑な⼀一連の⽣生物的出来事の結果として、⾼高等真核⽣生物は、細胞内外の新しい環境変化に⾃自らを順応させるためあるいはそれを克服するために、同じゲノム･タイプの体細胞から多彩な性質（機能）を持つ多種多様な類似の細胞タイプを異なる⽅方法で創出するための多能的･弾⼒力的･柔軟性ある能⼒力を獲得する。また、同じ
細胞タイプに由来する隣接する細胞さえも、互いに細胞外環境とみなされる場合もあり得る。
さらに、⾼高等真核⽣生物では多種多様なタイプの体細胞は互いに重要な⽣生命維持機能を分担し協働して発現する。周知の⼀一例を挙げれば、恒常性（ホメオスタシス）維持のために、脳の視床下部では CRH,  GHRH,  LHRH,  TRH など、下垂体前葉では GH,  LH,  ACTH,  FSH など、下垂体後葉では vasopressin,  OT,  ADH などが産⽣生されて機能分担する。更に、膵臓のランゲルハンス
島の A   (α),   B   (β),   D   (δ)と PP の各細胞では、それぞれ glucagon,   insulin,   somatostatin,  pancreatic  polypeptide などが産⽣生されて、恒常性が維持される。  
   最後に、前述したように、⾼高等真核⽣生物で細胞タイプの決定と⽣生命維持にとって最も重要で基本的な⽅方法（機構）の 1 つである、エピジェネティック修飾によるクロマチン構造の不可逆的創出を介したプログラム化されていない新しい細胞機能を獲得するバイオ･システムをクロマチン･コンフォメーション･チェンジ･コード説(chromatin   conformation   change   code   theory:  4C   theory)   と命名した。ところで、前述の説明と⼀一部重複するが、遺伝⼦子発現を含むクロマチン (または DNA) の機能発現に関する genetic code, histone code, the 4C theory の３つのコード説が拠って⽴立つ分⼦子的基盤の概略は下記の通りである。まず、genetic code theory は遺伝⼦子発現の翻訳段階 (translation) で mRNA 上の codon が⽔水素結合によって塩基対 (base pair) を形成することを介して、アミノ酸を活性化したアミノアシル tRNA (aminoacyl-tRNA)を呼び寄せること（または aminoacyl-tRNA が codon を認識してアクセスすること）が基盤となる。次に、histone code
theory は histone が種々の化学残基で翻訳後修飾され、これらの複数の組み合わせがマーク（指標）となり、それぞれが特異的な遺伝⼦子発現制御をコードする情報として機能し、酵素等の多種多様な因⼦子群を呼び寄せること（またはこれらの多様な因⼦子群がこのマーク（指標）を認識
してアクセスすること）が基盤となる。最後に、the 4C theory は 5’-近傍上流域クロマチン構造の可塑性がエピジェネチック修飾で不可逆的に形成されて、緩いフォーム (loose/open form) or
硬いフォーム (tight/closed form) になり、多彩なクロマチン機能発現に関与する多種多様な因⼦子群を呼び寄せるか逆に拒否すること（またはこれらの多種多様な因⼦子群が loose (open) or tight

  

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(closed) form を認識してアクセスするか逆に認識できずにアクセスできないこと）が基盤となる。
多分、4C  theory において考え得るコード数（⾼高等真核細胞の複雑で多種多様な性質（機能）を決定するコード数）は、候補遺伝⼦子数とこれら遺伝⼦子のコード数の組み合わせに基づいて概略決まる。最も有⼒力な候補は、⾼高等真核⽣生物の多種多様な細胞の機能と特異性を獲得するのに必要な転写因⼦子･クロマチン修飾酵素･関連因⼦子や酵素などをコードする様々な特異遺伝⼦子群である。また、各候補遺伝⼦子のコード数は 2 である。その理由は、5ʼ’-‑近傍上流クロマチン領域は、
緩いかまたは硬いフォームとして、当該遺伝⼦子の発現のスイッチのオンまたはオフを指令するからである。したがって、4C  theory は⾼高等真核⽣生物の体細胞の特質に関する既知の⼀一般的概念を刷新することができ、さらにプログラム化されていない新しい細胞機能を獲得ための扉を開けることもできる。⼀一⽅方、⻑⾧長い進化の過程で獲得され、すでにプログラム化されている複雑で多種多様な細胞機能は細胞の発⽣生と分化過程を通して秩序正しく系統的に発現される。もちろん、4C  theory は⾼高等真核⽣生物の発⽣生と分化過程（及びいわゆるロバストネス）の説明の 1 つとしても適切である。何故なら、4C  theory で想定される環境変化のシグナルの挙動は、上記の 2
つの基本的な⽣生命現象における細胞-‑細胞、組織-‑組織、器官-‑器官などの相互作⽤用（コミュニケーション）で作動するプレイヤー（ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質など）の挙動とかなり似ているためである。
本総説の最終チェックの段階になって、⻑⾧長期培養及び⻑⾧長期飼育期間に⽣生物の形質変化に関する幾つかの古典的で実証的な先⾏行実験の報告がある事を次のような２次資料等によって気付いた。例えば、同⼀一条件下での⻑⾧長期培養期間の約 5 万世代に渡る⼤大腸菌の形質変化がゲノム情報
変化（突然変異）に基づいて⽣生じたという実験的進化に関する報告がある[112]。更に、ゲノム情報変化かクロマチン構造変化のいずれに基づくかは不明であるが、年間気温の異なる２地域のキイロショウジョウバエの⾃自然集団を約１年間同じ温度環境で飼育して、発育･⽣生存率･寿命などを調べると、両集団の温度適応性に明らかな違いが認められた報告[113]、⾼高温や低温で飼育したショウジョウバエは約 120 世代でそれぞれの温度に耐える能⼒力に違いがある⼀一群の変種が⽣生じたという報告[114]などがある。もちろん、4C   theory は、前記の環境変化に対応する 2
番⽬目の⽅方法であるゲノム情報変化（突然変異）(genome  information  change,  mutation)と類似した同⼀一条件下での⻑⾧長期培養期間や飼育期間でのこれらの現象とは明らかに異なる。更に、4C  theory は夏季と冬季におけるカンジキウサギの⽑毛⾊色の変化や雷⿃鳥の⽻羽⾊色の変化などの周知の現象とも明らかに異なる。その理由は、この様な⾊色の変化に関与するゲノム情報は変化しないこ
れらの現象は他のほぼ全ての現象と同様に環境変化に適応するすでにプログラム化された機能であるからである。  
   HDAC2(-‑/-‑)  DT40  mutants で劇的に蓄積した⼤大量の IgM  H-‑chains と L-‑chains の排除に関する上述の 4C   theory において、解決すべき幾つかの問題点は以下の通りである[102,   107,   108,  

  

57  

  

111,  115-‑117]。1)   何故、HDAC2 ⽋欠損にも関わらず、Pax5,  Aiolos,  EBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン領域(~∼10 ヌクレオソームで構成される)のヒストン H3 の K9,  K14,  K18,  K23,  K27残基の 1 つまたは複数のアセチル化レベルは、⻑⾧長期培養期間の初期ステージで減少するのか？  
2)   何故、これら 3 つの遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流クロマチン領域の上記の 1 つまたは複数の Lys 残
基の減少したアセチル化レベルは、⻑⾧長期培養期間に増加するのか？   3)   何故、OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑
近傍上流のクロマチン領域(~∼10 ヌクレオソームで構成される)の上記の 1 つまたは複数の Lys
残基のアセチル化レベルは、⻑⾧長期培養期間に減少するのか？   4)  Pax5,  Aiolos,  EBF1,  OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン領域におけるヒストン H3（あるいは上記の５つの Lys 残基）とDNA との結合に、５つの Lys 残基のどれが主に関与するかを明らかにする必要がある。5)   こ
れら 4 つの遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流クロマチン領域の緩いフォームと硬いフォーム（上記の 1 つまたは複数の Lys 残基のアセチル化レベルに基づく）の間での機能的･⽴立体構造的な違いをさらに詳細に解明する必要がある。6)   何故、同じ 1 つの転写因⼦子の遺伝⼦子の上記 Lys 残基のアセチル化レベルの変化パターンは、⻑⾧長期培養期間に個々の mutant   clones 間で異なるのか？   7)   何故、これら 4 つの転写因⼦子の遺伝⼦子の上記 Lys 残基のアセチル化レベルの変化パターンは、⻑⾧長期培
養期間に同じ 1 つの mutant  clone で異なるのか？   8)  TFC  machinery（当該遺伝⼦子の ORF を転写する）は既知の転写装置と同じであるのに、4C   machinery（5ʼ’-‑近傍上流のクロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出する）は既知のクロマチン修飾装置とどのように異なるのか？   9)   4C  theory を確実に証明するためには、環境変化を認識するファースト･プレイヤーである
ECRR/ECRS とクロマチン構造の可塑性を直接的･不可逆的に創出するファイナル･プレイヤーである 4C   machinery の存在を実証することが必須である。10)   4C   theory を⼀一般化する具体的⽅方法としては、例えば、樹⽴立細胞株の多世代間およびモデル⽣生物（線⾍虫、ショウジョウバエ、
アフリカツメガエル、マウス、ラットなど）の発⽣生･分化過程における、プログラム化されていない新しい細胞機能を獲得する能⼒力への温度･気圧･栄養源などの影響を明らかにすることが、⾮非常に有効かつ重要である。その理由は、上述したように、分⼦子レベルの機構には⾄至ってないが、ショウジョウバエにおける先⾏行実験が既に実施されている事などから判断して、これらの影響は多くの研究グループによって、多種多様な条件下で⽐比較的簡単に研究できるからである。
  
  
謝辞：  

   電⼦子顕微鏡観察及び免疫電⼦子顕微鏡観察を⾏行って頂いた菅沼⿓龍夫博⼠士と澤⼝口朗博⼠士に深謝します。本研究の⼀一部をサポートして頂いた⾼高⾒見恭成博⼠士と菊池秀彦博⼠士に感謝します。さらに、本研究に先⽴立つ私の研究に携わって頂いた全ての共同研究者に感謝します。本研究に先⽴立つ私の研究は多くの科学研究費等の⽀支援を受けて実施しました。  
  

  

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Nakayama, T. and Nakayama, M.

  (Eds.), pp. 1-303, 2018.

The revised retirement commemorative monograph (the original

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during continuous cultivations. In: Chromatin Conformation Change Code (4C) Theory on Gain of
Un-programmed and New Cell Functions by Means of Irreversible Creation of Chromatin Structure
Plasticity with Epigenetic Modifications through Various Generations, Nakayama, T. and Nakayama, M.
(Eds.), pp. 11-44, 2018. The revised retirement commemorative monograph is available from following
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DT40 mutants are rapidly and dramatically reduced through various generations during continuous
cultivation. pp. 1-28, 2018. The revised article (the original paper was uploaded in 2017 and isavailable from following URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10145176) is available fromfollowing URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10170947
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Nakayama, M. and Nakayama, T.: Generation of Pax5-deficient DT40 mutants, Pax5(-), and protein andmRNA levels of IgM H- and L-chains artificially accumulated in Pax5(-) are rapidly and dramaticallyreduced through various generations during continuous cultivation. In: Chromatin Conformation Change
Code (4C) Theory on Gain of Un-programmed and New Cell Functions by Means of Irreversible

  

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Creation of Chromatin Structure Plasticity with Epigenetic Modifications through Various Generations,Nakayama, T. and Nakayama, M. (Eds.), pp. 45-71, 2018. The revised retirement commemorative
monograph is available from following URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10169365[105] Nakayama, M. and Nakayama, T.: IgM H- and L-chains artificially and excessively accumulated in
HDAC2(-/-) DT40 mutants are gradually and dramatically reduced in distinct ways in individual mutant
clones through various generations during continuous cultivation. pp. 1-38, 2018. The revised article(theoriginal

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and Nakayama, T.: IgM H- and L-chains accumulated artificially and excessively in HDAC2(-/-) DT40
mutants are dramatically reduced in distinct ways in individual mutant clones through various generations
during continuous cultivations. In: Chromatin Conformation Change Code (4C) Theory on Gain of
Un-programmed and New Cell Functions by Means of Irreversible Creation of Chromatin Structure
Plasticity with Epigenetic Modifications through Various Generations, Nakayama, T. and Nakayama, M.
(Eds.), pp. 72-104, 2018.

The revised retirement commemorative monograph is available fromfollowing URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10169365[106] Nakayama, M. and Nakayama, T.: Fundamental and distinct ways for irreversible creation ofchromatin structure plasticity of proximal 5’-upstream regions of Pax5, Aiolos, EBF1 and OBF1 genes
with epigenetic modifications for gain of new cell function to exclude accumulated IgM H- and L-chainsin individual clones of HDAC2(-/-) DT40 mutants through various generations during continuous
cultivation. pp. 1-70, 2018. The revised article (the original paper was uploaded in 2017 and isavailable from following URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10145181) is available fromfollowing URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10170993
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follows: Nakayama, M. and Nakayama, T.: A fundamental way for irreversible creation of chromatin
structure plasticity with epigenetic modifications for gaining new cell function to exclude IgM H- andL-chains accumulated in HDAC2(-/-) DT40 mutants through various generations during continuous
cultivation. In: Chromatin Conformation Change Code (4C) Theory on Gain of Un-programmed and New

  

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Cell Functions by Means of Irreversible Creation of Chromatin Structure Plasticity with Epigenetic
Modifications through Various Generations, Nakayama, T. and Nakayama, M. (Eds.), pp. 105-167, 2018.
The

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for gaining un-programmed and new cell functions by means of irreversible creation of chromatin
structure plasticity with epigenetic modifications through various generations.
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un-programmed and new cell functions by means of irreversible creation of chromatin structure plasticity
with epigenetic modifications through various generations. In: Chromatin Conformation Change Code(4C) Theory on Gain of Un-programmed and New Cell Functions by Means of Irreversible Creation of
Chromatin Structure Plasticity with Epigenetic Modifications through Various Generations, Nakayama, T.
and Nakayama, M. (Eds.), pp. 168-202, 2018.

The revised retirement commemorative monograph isavailable from following URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10169365[108] Nakayama, T. and Nakayama, M.: An all-inclusive review: Chromatin conformation change code(4C) theory on a bio-system to gain un-programmed and new cell functions by means of irreversible
creation of chromatin structure plasticity with epigenetic modifications through various generations inhigher eukaryotes.

pp. 1-75, 2018. The revised article (the original paper was published in 2017 and isavailable from a following URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10146006) is available
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The revised article is also the modified version of Chapter 7 of the revised retirement commemorative
monograph (the original self-publishing retirement commemorative monograph published in 2015 and isavailable from following URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10123995) as follows:
Nakayama, T. and Nakayama, M.: All-inclusive review and history on the chromatin conformation
change code (4C) theory: A bio-system for gaining un-programmed and new cell functions by means ofirreversible creation of chromatin structure plasticity with epigenetic modifications through various
generations. In: Chromatin Conformation Change Code (4C) Theory on Gain of Un-programmed and

  

68  

  

New Cell Functions by Means of Irreversible Creation of Chromatin Structure Plasticity with Epigenetic
Modifications through Various Generations, Nakayama, T. and Nakayama, M. (Eds.), pp. 203-260, 2018.
The

revisedretirement

commemorative

monographisavailablefromfollowing

URL:

http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10169365[109] Nakayama, M. and Nakayama, T.: IgM H- and L-chains accumulated excessively in HDAC2(-/-)
DT40 mutants are dramatically reduced in distinct ways in individual mutant clones through various
generations during continuous cultivation. Current Topics in Biochemical Research. 18, 11-25, 2017.
The article is available from following website and URL:
http://www.researchtrends.net/tia/title_issue.asp?id=40&in=0&vn=18&type=3
and http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10168788[110] Nakayama, M. and Nakayama, T.: Irreversible creation of chromatin structure plasticity of proximal
5’-upstream regions of Pax5, Aiolos, EBF1 and OBF1 genes with epigenetic modifications to exclude
IgM H- and L-chains accumulated in individual clones of HDAC2(-/-) DT40 mutants through various
generations during continuous cultivation. Current Topics in Biochemical Research. 18, 33-56, 2017.
The article is available from following website and URL:
http://www.researchtrends.net/tia/title_issue.asp?id=40&in=0&vn=18&type=3
and http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10168794[111] Nakayama, T. and Nakayama, M.: Chromatin conformation change code (4C) theory: A bio-system
to gain un-programmed and new cell functions by means of irreversible creation of chromatin structure
plasticity with epigenetic modifications through various generations. Current Topics in Biochemical
Research. 18, 65-86, 2017. The article is available from following website and URL:
http://www.researchtrends.net/tia/title_issue.asp?id=40&in=0&vn=18&type=3
and http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10168800[112] Cooper, V. S. and Lenski, R. E.: The population genetics of ecological specialization in evolving
Escherichia coli populations. Nature, 407, 736-739, 2000.
[113] 河⻄西正興：キイロショウジョウバエの温度感受性、昆⾍虫、44, 530-536, 1976.
[114] Gribbin, J.: In search of double helix: Quantum physics and life, McGraw Hill (1985).
[115] Nakayama, T. and Nakayama, M.: A comprehensive review on the chromatin conformation change
code (4C) theory: A bio-system for gaining un-programmed and new cell functions by means ofirreversible creation of chromatin structure plasticity with epigenetic modifications through various
generations in higher eukaryotes. pp.1-76, 2019. The third article (the original and second articles
published

in

2017

and

2018

are

ttp://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10146006

  

69  

availablefromfollowing

URLs:
and

  

http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10171009) is available from following URL:
http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10174272
The third article is also the modified version of Chapter 7 of the revised retirement commemorative
monograph (the original self-publishing retirement commemorative monograph published in 2015 isavailable from following URL: http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10123995) as follows:
Nakayama, T. and Nakayama, M.: All-inclusive review and history on the chromatin conformation
change code (4C) theory: A bio-system for gaining un-programmed and new cell functions by means ofirreversible creation of chromatin structure plasticity with epigenetic modifications through various
generations. In: Chromatin Conformation Change Code (4C) Theory on Gain of Un-programmed and
New Cell Functions by Means of Irreversible Creation of Chromatin Structure Plasticity with Epigenetic
Modifications through Various Generations, Nakayama, T. and Nakayama, M. (Eds.), pp. 203-260, 2018.
The second edition of the retirement commemorative monograph is available from following URL:
http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10169365[116] 中⼭山建男、中⼭山雅美: ⾼高等真核⽣生物の新しい環境変化への適応能⼒力の獲得機構 ~クロマチン･コンフォメーション･チェンジ･コード説 (Chromatin conformation change code (4C) theory: 4C
theory) ~：サブタイトル：⾼高等真核⽣生物が新たな環境変化に適応するために、多世代を通してエ
ピジェネティック修飾による転写因⼦子やクロマチン修飾酵素遺伝⼦子などの 5’-近傍上流のクロマチン構造の可塑性を不可逆的に創出することで、プログラム化されていない新しい細胞機能を獲 得す るバイ オ･ システ ム.

pp. 1-77, 2019.

The article is available from following URL:

http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10174562[117] Nakayama, T. and Nakayama, M.:

A comprehensive and detailed review on the

ttp://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10174562conformation change code (4C) theory: A theory
on ways to gain un-programmed and new cell functions by means of irreversible creation of chromatin
structure plasticity with epigenetic modifications through numerous generations in higher eukaryotes. In
preparation.

The article is the forth revised version of Chapter 7 of the revised retirement

commemorative monograph (the original self-publishing retirement commemorative monographpublished

in

2015

is

availablefromfollowing

URL:

http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10123995) as follows: Nakayama, T. and Nakayama, M.:
All-inclusive review and history on the chromatin conformation change code (4C) theory: A bio-system
for gaining un-programmed and new cell functions by means of irreversible creation of chromatin
structure plasticity with epigenetic modifications through various generations. In: Chromatin
Conformation Change Code (4C) Theory on Gain of Un-programmed and New Cell Functions by Meansof Irreversible Creation of Chromatin Structure Plasticity with Epigenetic Modifications through Various

  

70  

  

Generations, Nakayama, T. and Nakayama, M. (Eds.), pp. 203-260, 2018. This second edition of theretirement

commemorative

monographisavailablefromfollowing

URL:

http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10169365
The forth revised article (the original, second and third revised articles published in 2017, 2018 and 2019are available from following URLs: ttp://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10146006 andhttp://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10171009
http://opac2.lib.miyazaki-u.ac.jp/webopac/TC10174272 may be published in 2020.

  

71  

and

  

図の説明：

図-1.   DT40 野⽣生株及び HDAC2(-/-) DT40 変異株の⻑⾧長期培養期間の初期ステージでの全クローンと後期ステージでの各クローンにおける、Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 及びその他の遺伝⼦子発現制御を介した、IgM H-chain と L-chain の遺伝⼦子発現制御の⽅方法。
(W) DT40 では、HDAC2 は Pax5, Aiolos, EBF1 と Ikaros, E2A の遺伝⼦子発現を逆⽅方向に制御することを介して IgM H-chain, L-chain の遺伝⼦子発現を間接的に制御する。
(E) 培養の初期ステージの HDAC2(-/-)の全クローンでは、Pax5, Aiolos, EBF1 の遺伝⼦子発現の劇的な減少に基づいて、IgM H-chain, L-chain の遺伝⼦子発現は劇的に増加し、結果的に、これら 2
つの蛋⽩白質量は劇的に増加する。
(L) 培養の後期ステージの HDAC2(-/-)の各クローン（2 回⽬目の作製）では、Pax5, Aiolos, EBF1
あるいは OBF1 の遺伝⼦子発現の異なる⽅方法による劇的な増加あるいは減少に基づいて、蓄積したIgM H-chain, L-chain はほぼ同じ変化パターンで劇的に減少する。IgM H-chain, L-chain の遺伝⼦子発現に関して、clone cl.2-1 は OBF1-依存性、clones cl.2-2, cl.2-3, cl.2-4, cl.2-5 は Pax5, Aiolos-依存性、clone cl.2-6 は Pax5, Ailos, EBF1-依存性である。
   Ref. 102 の Figs. 4-8, 4-9, 4-10 のセットで、Suppl. Fig. 6-S1 と Fig. 7-1 と同じ。さらに、Ref, 105の Figs. 8, 9, 10 のセットで、Ref. 107 の Suppl. Fig. S1 と Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 1 及び Ref. 109の Fig. 6 と同じ。Ref. 116 の図-1 と同じ。

図-2. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株における IgM H-chain, L-chain 蛋⽩白質レベルの変化。
DT40(W)及び培養の初期ステージ(E)と後期ステージ(L)の HDAC2(-/-) から単離した全蛋⽩白質を
⼆二次元電気泳動法(2D-PAGE)で解析した。H と L はそれぞれ IgM H-chain と L-chain を⽰示す。
   Ref. 102 の Fig. 2-1 と Ref. 103 の Fig. 1 及び Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 2 と同じ。Ref. 116 の図-2 と同じ。

図-3. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株における IgM H-chain, L-chain 蛋⽩白質レベルの変化。
DT40(W)及び⻑⾧長期培養期間の様々な時期の HDAC2(-/-) から単離した全蛋⽩白質を、IgM L-chain
抗体(IgM H-chain と交叉反応する)を⽤用いた Western blotting で解析した。IgM H-chain, L-chain 蛋
⽩白質量の相対レベルを下に⽰示す。H と L はそれぞれ IgM H-chain と L-chain を⽰示す。
   Ref. 102 の Fig. 2-2 及び Ref. 103 の Fig. 2 と同じ。Ref. 116 の図-3 同じ。

図-4. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株における IgM H-chain 蛋⽩白質レベルの変化。
DT40(W)及び培養の初期ステージ(E)と後期ステージ(L)の HDAC2(-/-)を IgM H-chain 特異抗体を

  

72  

  

⽤用いた免疫電⼦子顕微鏡で観察した。(A)は広い視野の多数の細胞の写真、(B)は(A)の⽮矢印で⽰示した⼀一個の細胞の写真。蓄積した⼤大量の IgM H-chain は培養の初期ステージの HDAC2(-/-)のみで観察された。
   Ref. 102 の Fig. 2-3、Fig. 7-3 及び Ref. 103 の Fg. 4 と同じ。Ref. 116 の図-4 同じ。

図-5. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株における IgM H-chain, L-chain とコアヒストンの遺伝⼦子発現の変化。
DT40(W)及び培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージでの 3 つの HDAC2(-/-)クローンから全RNAs を単離し、RT-PCR を実施した。IgM H-chain の完全型(whole form), 分泌型(secreted form),
膜結合型(membrane-bound form) mRNAs と L-chain mRNA 及び各コアヒストン mRNAs に特異的なプライマー(primers)を⽤用いた。
   Ref. 102 の Fig. 2-4、Fig. 7-4 及び Ref. 103 の Fig. 5 と同じ。Ref. 116 の図-5 同じ。

図-6. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株における HDACs, HATs, 転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現の変化。
HDACs と HATs (A)及び転写因⼦子(B)の各メンバーの mRNAs に特異的なプライマーと図-5 と同じ
全 RNAs を⽤用いて RT-PCR を実施した。
   Ref. 102 の Fig. 2-5 及び Ref. 103 の Fig. 6 と同じ。Ref. 116 の図-6 同じ。

図-7. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株におけるヒストン H3 の Lys 残基のバルクのアセチル化及びメチル化レベルの変化。
DT40(W)及び培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージでの 3 つの HDAC2(-/-) クローンから全蛋⽩白質を単離した。コアヒストン H2A, H2B, H3, H4 の種々の特異的な Lys 残基のバルクのアセチル化レベルを、それぞれのアセチル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いたイムノ･ブロッティング(immunoblotting)で調べた。K9/H3 のバルクのメチル化レベルはメチル化 K9/H3 特異抗体を⽤用いて調べた。
   Ref. 102 の Fig. 2-6 及び Ref. 103 の Fig. 7 と同じ。Ref. 116 の図-7 同じ。

図-8. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株における Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流クロマチン領域のヒストン H3 の Lys-9 残基のアセチル化レベルの変化。
DT40(W)及び培養の初期(E)と後期(L)ステージの 3 つの HDAC2(-/-) クローンで免疫沈降(ChIP)
アッセイを実施した。アセチル化 K9/H3 特異抗体と Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流を幾つかの断⽚片として PCR で増幅できる特異的なプライマーを⽤用いた。

  

73  

  

   Ref. 102 の Fig. 2-7 及び Ref. 103 の Fig. 9 と同じ。Ref. 116 の図-8 同じ。

図-9. ⻑⾧長期培養期間の Pax5(-) DT40 変異株での IgM H-chain, L-chain の遺伝⼦子発現の変化。
DT40(W)及び培養の最初期(F)、初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージにおける 3 つの Pax5(-) ク
ローンから全 RNAs を単離して RT-PCR を実施した。IgM H-chain の完全型(whole form), 分泌型(secreted form), 膜結合型(membrane-bound form) mRNAs 及び L-chain mRNA に特異的なプライマ
ーを⽤用いた。
   Ref. 102 の Fig. 3-5、Fig. 7-7 と Ref. 104 の Fig. 6 及び Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 7 と同じ。
Ref. 116 の図-9 と同じ。

図-10. ⻑⾧長期培養期間の Pax5(-) DT40 変異株での IgM H-chain, L-chain の蛋⽩白質レベルの変化。
DT40(W)及び培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージにおける 3 つの Pax5(-) クローンから単離した全蛋⽩白質を IgM L-chain 抗体(IgM H-chain とも交叉反応する)を⽤用いた Western blotting で解析した。
IgM H-chain, L-chain 蛋⽩白質量の相対レベルを下に⽰示す。
H と L はそれぞれ IgM H-chainと L-chain を⽰示す。
   Ref. 102 の Fig. 3-3、Fig. 7-5 と Ref. 104 の Fig. 3 及び Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 5 と同じ。
Ref. 116 の図-10 と同じ。

図-11. ⻑⾧長期培養期間の Pax5(-) DT40 変異株の形態。
DT40(W)及び培養の初期(E)と後期(L)ステージにおける Pax5(-)を広い視野（左側写真）と異なる狭い視野（右側の 3 つの写真）で顕微鏡観察した。
   Ref. 102 の Suppl. Fig. 3-S1、Fig. 7-6 と Ref. 104 の Fig. 5 及び Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 6 と同じ。Ref. 116 の図-11 と同じ。

図-12. ⻑⾧長期培養期間の Pax5(-) DT40 変異株での HDACs, HATs と転写因⼦子ファミリーの各メンバ
ーの遺伝⼦子発現の変化。
HDACs と HATs (A)及び転写因⼦子(B)の各メンバーの mRNAs に特異的なプライマーと図-9 と同じ
全 RNAs を⽤用いて RT-PCR を実施した。
   Ref. 102 の Fig. 3-6 及び Ref. 104 の Fig. 7 と同じ。Ref. 116 の図-12 と同じ。

図-13. ニワトリ HDAC2 遺伝⼦子のゲノム構成、HDAC2(-/-) DT40 変異株の作製及び⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) 変異株の各クローンにおける IgM H-chain, L-chain の蛋⽩白質レベルと mRNA レベ
ルの変化。

  

74  

  

(A) ニワトリ HDAC2 遺伝⼦子のゲノム領域（上）、標的領域の拡⼤大図（中）と 2 つの標的アリル（下 2 つ）の模式図。エクソン 1~16 の位置を縦棒で⽰示す。薬剤耐性遺伝⼦子を⽩白抜きボックスで⽰示す。プローブ HDAC2 を灰⾊色ボックスで⽰示す。BamH1 と EcoRV 断⽚片をその⻑⾧長さと共に⽰示す。
(B) 相同組換えのサザン分析(Southern blotting)。ゲノム DNA を DT40, 1 個のヘテロ変異株、6 個のホモ変異株から単離した。BamH1 と EcoRV 断⽚片をプローブ HDAC2 で分析した。
(C) ウエスタン分析(Western blotting)。DT40 (W)と培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージの6 つの HDAC2(-/-) clones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-3, cl.2-4, cl.2-5, cl.2-6 から全蛋⽩白質を単離した。IgM
H-chain と L-chain の 2 つの特異抗体を⽤用いて Western blotting を実施した。H と L はそれぞれ IgMH-chain と L-chain（2 つのバンド）を⽰示す。
(D) RT-PCR。DT40 (W)と培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージの 6 つの HDAC2(-/-)クロー
ンから全 RNAs を単離した。IgM H-chain の完全型(whole form), 分泌型(secreted form), 膜結合型
(membrane-bound form) mRNAs 及び L-chain mRNA に特異的なプライマーを⽤用いた。
   Ref. 102 の Fig. 4-1、Fig. 7-8 と Ref. 105 の Fig. 1 と Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 8 及び Ref. 109の Fig. 1 と同じ。Ref. 116 の図-13 と同じ。

図-14. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンでの IgM H-chain, L-chain の蛋⽩白質
レベルの変化。
DT40 (W)及び培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージを含む幾つかの時期における 6 つのHDAC2(-/-)クローン(clones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-3, cl.2-4, cl.2-5, cl.2-6)から全蛋⽩白質を単離した。IgM
L-chain 抗体 (IgM H-chain とも交叉反応する)と IgM H-chain 抗体の 2 つを⽤用いて Western blotting
で順次解析した。IgM H と L はそれぞれ IgM H-chain と L-chain を⽰示す。
   Ref. 102 の Fig. 4-2、Suppl. Fig. 6-S4、Fig. 7-9 及び Fig. 8-3 と同じ。さらに、Ref. 105 の Fig. 2と Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 9 と Ref. 109 の Fig. 2 及び Ref. 111 の Fig. 2 と同じ。Ref. 116 の図-14 と同じ。

図-15. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンでの HDACs, HATs,転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現の変化。
HDACs と HATs (A)及び転写因⼦子(B)の各メンバーの mRNAs に特異的なプライマーと図-13D と同じ 6 つの HDAC2(-/-)クローン(clones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-3, cl.2-4, cl.2-5, cl.2-6)の全 RNAs を⽤用いて RT-PCR を実施した。
   Ref. 102 の Fig. 4-3 と Ref. 105 の Fig. 3 及び Ref. 109 の Fig. 3 と同じ。Ref. 116 の図-15 と同じ。

図-16. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンでの IgM H-chain の蛋⽩白質レベルの

  

75  

  

変化。
DT40 及び培養の初期(E)と後期(L)ステージにおける HDAC2(-/-)の 4 つのクローン(clones cl.2-1,
cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)を電⼦子顕微鏡（上図）と IgM H-chain の特異抗体を⽤用いた免疫電⼦子顕微鏡（下図）で観察した。蓄積した IgM H-chain に基づく濃い細胞質画分は HDAC2(-/-)の 4 つのクローンの培養の初期ステージのみで認められた（上図の E）。IgM H-chain に基づくシグナルは
HDAC2(-/-)の 4 つのクローンの培養の初期ステージのみで認められた（下図の E）。
   Ref. 102 の Fig. 4-4、Fig. 7-11 と Ref. 105 の Fig. 4 及び Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 11 と同じ。
Ref. 116 の図-16 と同じ。

図-17. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンの形態変化。
DT40 及び培養の初期(E)と後期(L)ステージにおける HDAC2(-/-)の 4 つのクローン(clones cl.2-1,
cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)を顕微鏡で観察した。多数の異なる視野の写真の中の 2 つを⽰示した。
HDAC2(-/-)の凝集性のフォームは培養の初期ステージのみで認められ、後期ステージでは DT40と同様に分散性のフォームに変化していた。
   Ref. 102 の Fig. 4-5、Fig. 7-12 と Ref. 105 の Fig. 5 及び Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 12 と同じ。
Ref. 116 の図-17 と同じ。

図-18. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンでの IgM H-chain, L-chain 及び
HATs, HDACs と転写因⼦子ファミリーの各メンバーの遺伝⼦子発現の変化。
DT40 (W) 及 び 培養 の 初 期 (E), 中 期 (M) と 後 期 (L)ス テ ー ジ を 含 む 幾 つ か の 時 期 に お け る
HDAC2(-/-)の 4 つのクローン(clones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)から全 RNAs を単離した。IgM
H-chain の完全型(whole form), 分泌型(secreted form), 膜結合型(membrane-bound form) mRNAs とL-chain mRNA 及び図-13D と図-15 で変化した HATs, HDACs と転写因⼦子ファミリーの各メンバーの mRNAs に特異的なプライマーを⽤用いて RT-PCR を実施した。
   Ref. 102 の Fig. 4-6、Fig. 6-S5、Fig. 7-10、Fig. 8-4 と Ref. 105 の Fig. 6 と Ref. 107 の Fig. Suppl. Fig.
S5 と Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 10 と Ref. 109 の Fig. 4 及び Ref. 111 の Fig. 3 と同じ。Ref. 116の図-18 と同じ。

図-19. HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンの増殖速度。
HDAC2(-/-)の 3 つのクローン(cl.2-1, cl.2-4, cl.2-6)と DT40 (WT)を培養し、表⽰示した時期で細胞数を計測し増殖速度を決定した。
   Ref. 102 の Fig. 4-7 と Ref. 105 の Fig. 7 及び Ref. 109 の Fig. 5 と同じ。Ref. 116 の図-19 と同じ。

  

76  

  

図-20. HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンで蓄積した⼤大量の IgM H-chains, L-chains を除去する
⽅方法に関するモデル。
   Ref. 102 の Fig. 4-11 と Ref. 105 の Fig. 11 及び Ref. 109 の Fig. 7 と同じ。Ref. 116 の図-20 と同じ。

図-21. ⻑⾧長期連続培養期間における HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンでの Pax5 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域でのヒストン H3 の特定 Lys 残基のアセチ
ル化レベルの変化。
DT40(W)と連続培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージにおける HDAC2(-/-)の各クローン(clones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)での Pax5 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のク
ロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化を
NotchIP アッセイ法で調べた。Pax5 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流、転写部位の DNA 塩基
配列に基づいてデザインしたプライマーと各アセチル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いた。
ただし、
clone   cl.2-‑2 に関しては、初期(E)と後期(L)ステージのみでアセチル化 K9/H3, K14/H3, K18/H3,
K27/H3 抗体のみを⽤用いた。
   Ref. 102 の Figs. 5-1 ~ 5-4 のセットで、Fig. 8-6 と同じ。さらに、Ref. 106 の Figs. 1 ~ 4 のセットで、Ref. 110 の Fig. 1 と同じ。Ref. 116 の図-21 と同じ。

図-22. ⻑⾧長期連続培養期間における HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンでの Aiolos 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域でのヒストン H3 の特定 Lys 残基のアセチ
ル化レベルの変化。
DT40(W)と連続培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージにおける HDAC2(-/-)の各クローン(clones cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)での Aiolos 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のク
ロマチン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化を
NotchIP アッセイ法で調べた。Aiolos 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流、転写部位の DNA 塩
基配列に基づいてデザインしたプライマーと各アセチル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いた。  
   Ref. 102 の Figs. 5-5 ~ 5-8 のセットで、Fig. 8-7 と同じ。さらに、Ref. 106 の Figs. 5 ~ 8 のセッ
トで、Ref. 110 の Fig. 2 と同じ。Ref. 116 の図-22 と同じ。

図-23. ⻑⾧長期連続培養期間における HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンでの EBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域でのヒストン H3 の特定 Lys 残基のアセチ
ル化レベルの変化。
DT40(W)と連続培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージにおける HDAC2(-/-)の各クローン

  

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(cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)での EBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチ
ン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化を NotchIP アッ
セイ法で調べた。EBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流、転写部位の DNA 塩基配列に基づいてデザインしたプライマーと各アセチル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いた。  
   Ref. 102 の Figs. 5-9 ~ 5-12 のセットで、Fig. 8-8 と同じ。さらに、Ref. 106 の Figs. 9 ~ 12 のセットで、Ref. 110 の Fig. 3 と同じ。Ref. 116 の図-23 と同じ。

図-24. ⻑⾧長期連続培養期間における HDAC2(-/-) DT40 変異株の各クローンでの OBF1 遺伝⼦子の 5’近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチン領域でのヒストン H3 の特定 Lys 残基のアセチ
ル化レベルの変化。
DT40(W)と連続培養の初期(E)、中期(M)と後期(L)ステージにおける HDAC2(-/-)の各クローン(cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)での OBF1 遺伝⼦子の 5’-近傍上流、5’-遠隔上流及び転写部位のクロマチ
ン領域の K9/H3, K14/H3, K18/H3, K23/H3, K27/H3 残基のアセチル化レベルの変化を NotchIP アッ
セイ法で調べた。OBF1 遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流、5ʼ’-‑遠隔上流、転写部位の DNA 塩基配列に基づいてデザインしたプライマーと各アセチル化 Lys 残基の特異抗体を⽤用いた。  
   Ref. 102 の Figs. 5-13 ~ 5-16 のセットで、Fig. 8-9 と同じ。さらに、Ref. 106 の Figs. 13 ~ 16 のセットで、Ref. 110 の Fig. 4 と同じ。Ref. 116 の図-24 と同じ。

図-25. Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 に関する、⻑⾧長期連続培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の 4 つのクローン(cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)における、5’-近傍上流クロマチン領域の K9/H3, K14/H3,
K18/H3, K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベル(hyper- or hypo-acetylation levels)、クロマチン構造のフォーム(loose or tight form)、遺伝⼦子発現(mRNA)レベル(high or low level)の変化のまとめ。
   Ref. 102 の Fig. 5-21 と同じで、Suppl. Fig. 6-S10 と Fig. 7-16 の改変版。さらに、Ref. 106 の Fig.
21 と Ref. 107 の Suppl. Fig. S10 と Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 17 及び Ref. 110 の Fig. 5 と同じ。
Ref. 116 の図-25 と同じ。

図-26. IgM H-chain は HDAC2(-/-) DT40 変異株の核周囲腔(peri-nuclear space)、⼩小胞体(endoplasmic
reticulum), 細胞表⾯面(cell surface)に局在する。
HDAC2(-/-) をサポニン(saponin)で未処理(A)と処理(B-E)後、IgM H-chain の特異抗体を⽤用いた免
疫電⼦子顕微鏡観察を実施した。⽮矢印の P, E. S はそれぞれ、核周囲腔(peri-nuclear space)、⼩小胞体(endoplasmic reticulum), 細胞表⾯面(cell surface)に局在する IgM H-chain のポジティブ･シグナルを⽰示す。
   Ref. 102 の Fig. 6-1、Fig. 7-18、Fig. 8-11 と同じ。さらに、Ref. 107 の Fig. 1 と Refs. 108, 115 and117

  

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の Fig. 18 及び Ref. 111 の Fig. 8 と同じ。Ref. 116 の図-26 と同じ。

図-27. IgM H-chainは⻑⾧長期培養期間の初期(E)と後期(L)ステージの HDAC2(-/-) DT40 変異株の核周囲腔(peri-nuclear space)に局在する。
培養の初期(E)と後期(L)ステージの HDAC2(-/-)を IgM H-chain の特異抗体を⽤用いた免疫電⼦子顕微鏡で観察した。(A)は初期ステージの HDAC2(-/-)の 1 つのクローンの写真、(B), (C)はそれぞれ(A)の⽮矢印 b、c で⽰示した部位の拡⼤大版。(D), (G), (J)は後期ステージの HDAC2(-/-)の 3 つのクローンの写真、(E), (F), (H), (I), (K)はそれぞれ(D), (G), (J)の⽮矢印 e, f, h, i で⽰示した部位の拡⼤大版。蓄積した IgM H-chainは初期と後期ステージの全ての HDAC2(-/-)の核周囲腔(peri-nuclear space)に局在する。
   Ref. 102 の Fig. 6-3、Fig. 7-19 と同じ。さらに、Ref. 107 の Fig. 3 及び Refs. 108, 115 and 117 のFig. 19 と同じ。Ref. 116 の図-27 と同じ。

図-28. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の clone cl.2-1 における Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1
遺伝⼦子の各 5’-近傍上流クロマチン領域におけるヒストン H3 の 5 つの特定の Lys 残基 (K9/H3,
K14/H3, K18/H3, K23/H3 and K27/H3)のアセチル化レベルの変化。
   Ref. 102 の Figs. 5-1, 5-5, 5-9, 5-13 のセットで、Fig. 6-S6 と Fig. 7-13 の改変版。さらに、Ref. 107の Suppl. Fig. S6 及び Ref. 111 の Fig. 4 と同じ。Ref. 116 の図-28 と同じ。

図-29. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の clone cl.2-2 における Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1
遺伝⼦子の各 5’-近傍上流クロマチン領域におけるヒストン H3 の 5 つの特定の Lys 残基 (K9/H3,
K14/H3, K18/H3, K23/H3 and K27/H3)のアセチル化レベルの変化。
   Ref. 102 の Figs. 5-2, 5-6, 5-10, 5-14 のセットで、Fig. 6-S7 と Fig. 7-14 の改変版。さらに、Ref. 107の Suppl. Fig. S7 及び Ref. 111 の Fig. 5 と同じ。Ref. 116 の図-29 と同じ。

図-30. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の clone cl.2-4 における Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1
遺伝⼦子の各 5’-近傍上流クロマチン領域におけるヒストン H3 の 5 つの特定の Lys 残基 (K9/H3,
K14/H3, K18/H3, K23/H3 and K27/H3)のアセチル化レベルの変化。
   Ref. 102 の Figs. 5-3, 5-7, 5-11, 5-15 のセットで、Fig. 6-S8 と Fig. 7-15 の改変版。さらに、Ref. 107の Suppl. Fig. S8 及び Ref. 111 の Fig. 6 と同じ。Ref. 116 の図-30 と同じ。

図-31. 培養期間中の HDAC2(-/-) DT40 変異株の clone cl.2-6 における Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 遺伝⼦子の各 5’-近傍上流クロマチン領域におけるヒストン H3 の 5 つの特定の Lys 残基 (K9/H3,

  

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K14/H3, K18/H3, K23/H3 and K27/H3)のアセチル化レベルの変化。
   Ref. 102 の Figs. 5-4, 5-8, 5-12, 5-16 のセットで、Fig. 6-S9 と Fig. 7-16 の改変版。さらに、Ref. 107の Suppl. Fig. S9 及び Ref. 111 の Fig. 7 と同じ。Ref. 116 の図-31 と同じ。

図-32. ⻑⾧長期培養期間の HDAC2(-/-) DT40 変異株の 4 つのクローン(cl.2-1, cl.2-2, cl.2-4, cl.2-6)における Pax5, Aiolos, EBF1, OBF1 に関する、
5’-近傍上流クロマチン領域での K9/H3, K14/H3, K18/H3,
K23/H3, K27/H3 のアセチル化レベル(hyper- or hypo-acetylation levels)、クロマチン構造のフォー
ム(loose or tight form)、遺伝⼦子発現(mRNA)レベル(high or low level)の変化。
   Ref. 102 の Figs. 6-5, 7-21、8-10 と同じ。さらに、Ref. 107 の Fig. 5 及び Refs. 108, 115 and 117の Fig. 21 及び Ref. 111 と Fig. 10 と同じ。Ref. 116 の図-32 と同じ。

図-33. 核周囲腔(peri-nuclear space)での IgM H-chain の局在及び HDAC2(-/-) DT40 変異株における蓄積した IgM H-chain に関するシグナルのクロマチン構造への伝達機構のモデル。
左図）HDAC2(-/-)の IgM H-chain が蓄積している核周囲腔(peri-nuclear space)の⼀一部分（図 26-Cの下部の⽮矢印 P で⽰示した）を反転して拡⼤大した写真。
右図）蓄積した IgM H-chain のクロマチン構造へのシグナル伝達機構のモデル。HDAC2(-/-)の核周囲腔(peri-nuclear space)で蓄積した IgM H-chain についてのシグナルは、個々の変異株クローン
でクロマチン構造へ繰り返し伝達され、このシグナルに対する不均衡な応答と集中とが引き続いて起る。ECRR/ECRS:  environment   change   recognition   receptor/site（環境変化認識受容体/部位）；4C  machinery:  chromatin  conformation  (structure)  change  complex  machinery（クロマ
チン構造変化複合体装置）。  
   Ref. 102 の Fig. 6-4, Fig. 7-20、Fig. 12 と同じ。さらに、Ref. 107 の Fig. 4 と Refs. 108, 115 and117の Fig. 20 及び Ref. 111 の Fig. 9 と同じ。Ref. 116 の図-33 と同じ。

図-‑34.   多世代を通してのエピジェネティック修飾によるクロマチン構造の可塑性の不可逆的創出を介したプログラム化されていない新しい細胞機能獲得に関する chromatin   conformation  change  code  theory  (4C  theory)のモデル。  
エピジェネティック修飾によるクロマチン構造の可塑性の不可逆的創出は、多世代を通して、特定の遺伝⼦子の ORF(open   reading   frame)ではなくて、5ʼ’-‑近傍上流(proximal   5ʼ’-‑upstream  chromatin  region:  notch  of  chromatin:クロマチンの刻み⽬目)で起る。クロマチン構造の硬いかあ
るいは緩いフォーム(tight  or  loose  form)は、ヒストン H3 の特定の Lys 残基の低いかあるいは⾼高いアセチル化レベル(hypo-‑  or  hyper-‑acetylation  levels)に基づいており、遺伝⼦子発現（転写）のスイッチ(off  or  on)を指令して転写産物   (mRNAs)の低いかあるいは⾼高いレベルを引き起す。  

  

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   Ref. 102 の Fig. 6-6, Fig. 7-23、Fig. 8-14 と Ref. 107 の Fig. 6 と Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 23
及び Ref. 111 と Fig. 11 と同じ。Ref. 116 の図-34 と同じ。

図-‑35.   ⼦子孫世代の細胞におけるエピジェネティック修飾による 5ʼ’-‑近傍上流領域のクロマチン
構造の可塑性の不可逆的創出及び適当なシグナルを受け取った細胞における通常の遺伝⼦子発現と酵素反応の可逆的制御。  
上図）エピジェネティック修飾による特定の遺伝⼦子の 5ʼ’-‑近傍上流領域のクロマチン構造の可塑性の不可逆的創出は多世代を通して⼦子孫世代の細胞で緩やかに起り、環境変化のシグナルを最初に受け取った当該細胞では起らない。Ac,  Ac/2,  Ac/10 はそれぞれ、コアヒストン（例えば、ヒストン H3）の特定の Lys  (K)残基の⾼高い、かなり⾼高い、幾らか⾼高いアセチル化レベル(hyper-‑,  considerably  hyper-‑  and  somewhat  hyper-‑acetylation  levels)を定性的に表す。  
中間図と下図）通常の遺伝⼦子発現（中間図：転写調節領域における）と酵素反応（下図）の制
御は適当なシグナルを受け取った当該細胞で即効的･可逆的に起る。Ac と P はそれぞれ、アセ
チル化、リン酸化、その他の化学修飾を表す。  
   Ref. 102 の Fig. 6-7, Fig. 7-22、Fig. 8-13 と Ref. 107 の Fig. 7 と Refs. 108, 115 and 117 の Fig. 22
及び Ref. 111 の Fig. 12 と同じ。Ref. 116 の図-35 と同じ。

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