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PDXモデルの利活用に向けた調査研究古賀宣勝

国立がん研究センタ ー
先端医療開発センタ ー 研究企画推進部門
がん薬物療法の発展にはがん患者由来のがん細胞（細胞株）と、 それらのがん細胞株をヌ ー ドマウスなどの免疫不全マウスヘ移植したCDX (cell line-derived xenograft) モデルによるものが大きい。 しかし、 継代数を重ね本来の生物学的特性を失った細胞株が使用されたりCDXモデルはがん細胞が豊富でがん間質細胞が少なかったりするため、 臨床試験結果の予測には不向きなモデルと考えられている。

一方で、 がん組織全体を免疫不全マウスヘ移植しヒトのがん微小環境を再現したPDX (patient-derived xenograft) モデルの重要性が増している。 多くの期待が寄せられ、メリットがあると思われているPDXモデルは基礎的な論文でも散見され 一 般化されつつあるが、 品質管理や品質保証については 一 定の基準がなく貴重なPDXモデルが医薬品開発に利活用されるための課題や問題点は明らかとなっていない。 そこで日本医 療 研究開発機構(AMED) の医薬品等規制調和・評価研究事業「Patient-derived xenograft (PDX) モデルの利活用に向けた課題整理に関する調査研究 (AMED-PDX調査研究）」の研究プロジェクトの 一 環として、 「Patient-derived xenograft (PDX) モデルに関するアンケ ー ト調査」を実施した。 アンケ ー ト結果を踏まえて抗がん剤開発においてPDXモデルが利活用されるためには、 以下の提案を行う。
a) 免疫不全マウスに未知の微生物感染があるかもしれない患者由来組織を移植したPDXモデルでは、 微生物学的にコントロ ー ルされたSPF環境下でありながら排気側にHEPAフィルターを設置した陰圧管理の飼育ラックでの管理を推奨する。 ただし、感染陰性が確認されれば、 ヒトがん細胞を移植したCDXモデルと同程度の管理で構わない。
b) PDXモデル作製に際し、 標準作業手順書を作成し、 最低でも記録すべき情報を適切に管理できるような休制が必要である。
C) 病理組織学的特徴など品質管理が適切に実施されれば 一 般的には 10継代以降のPDXモデルも使用可能である。
d) PBMCやHSCを移入されたヒト化PDXモデルは、 免疫関連抗がん剤の開発など 一 部の抗がん剤開発においては有望なモデルである。 ただし、 硯状のヒト化PDXモデルだけでは不十分な部分もあり、 今後の開発改良を期待したい。
e ) 抗がん剤開発におけるPDXモデルは薬効薬理試験がメインであるが、 創薬標的分子の同定や発症メカニズムなど墓礎的な研究にも応用可能である。
f ) 研究者が使用可能な日本人由来PDXライブラリが将来に渡って安定的に供給できる体制を構築することが重要であり、 樹立 や頒布に係わる資金のサポ ー トが必須である。

実中研樹立CIEA-PDXPDXモデ ル の頒 布

鈴木雅実
実験動物中央研究所
トランスレー ショナルリサ ー チ部門

公益財団法人実 験 動物研究所（実中研、 CIEA)のCIEA-PDXの樹立は、 SPF／無菌動物の飼育・生産方法の確立に基づくヌ ー ドマウスの導入と量産化に成功した 1970年代に開始された。 さまざまながん種について多数の臨床材料をヌ ー ドマウスに移植し、 現在、 人を対象とする生命科学・医学系研究に関する倫理指針(2022年3月改訂）に適応し、 アカデミア、 企業などで創薬研究を含む腫瘍研究領域に活用できる頒布可能な株として205株をライブラリ ー 化している。
CIEA-PDXライブラリ ーは、 呼吸器系、 消化器系、 泌尿器系、中枢神経系、生殖器系、 内分泌系、皮膚・外表系、 造血器系、 骨・筋肉系、 軟部組織、 ならびに、 小児腫瘍など多岐に渡るがん種で構成されている。 また、 各がん種においてもさまざまな組織型を保有しており、 例えば肺癌では、 小細胞肺癌、 ならびに、 非小細胞肺癌として腺癌、 扁平上皮癌、 大細胞癌・巨細胞癌などを保有している。
近年、 腫瘍研究は遺伝学的・分子生物学的な視点から進められており、 抗がん剤研究開発においても腫瘍の分子生物学的解析に基づく分子標的創薬が主体となり、 創薬モダリティ ー 、 作用機序も多様化している。 一方、 CIEA-PDXライブラリ ーはPDX研究黎明期に収集されたため、ゲノミクス解析、 トランスクリプトミクス解析など遺伝学的・分子生物学的な情報などが充分に整備されていない状況であった。 現在、 この状況を改善するために、 CIEA-PDXのレシピエントをヒト化マウスでの研究が可能なNOGマウスに変更し、 移植腫瘍での各種ゲノミクス解析情報を取得するとともに、 病理組織型、 増殖曲線などについてデ ー タを再取得し、 デ ー タベ ー ス化を進めている。
抗がん剤創薬研究では、 細胞障害性抗がん剤から分子標的抗がん剤への移行に伴い、 腫瘍細胞が恒常的・均 ー に増殖するモデルから、 腫瘍の多様性・複雑性を反映し、 標的分子を発現するモデルヘと、 腫瘍モデルに求められる要件が変化してきている。 PDXは、 腫瘍の多様性・複雑性を反映するモデルと位置付けられ、 創薬研究に有用かつ軍要なツ ー ルと位置付けられている。 CIEA-PDXの創薬研究へのさらなる活用に向け、 CIEA-PDXと次世代NOGマウスを組みわせた免疫チェックポイント阻害薬評価系の構築を試みており、 これらの取り組みについても紹介する。

福島医薬品関連産業支援拠点化事業で開発したPatient-derived xenograftモデルである
F-PDX®のご紹介
POXモデ ル の頒 布高木基樹
福島県立医科大学
医療産業トランスレ ーショナルリサ ー チセンタ ー
福島医大トランスレ ー ショナルリサ ー チ機構
医療ー産業トランスレ ーショナルリサ ー チセンタ ーで実施している福島医薬品関連産業支援拠点化
事業は、 生体試料を収集・保存し、 それらをそのまま研究機関等に提供する「バイオバンク事業」とは異なり、 希少かつ微量な生体試料を、 1)情報に変換する、 2)加工して増やす、 3)極微量試料の解析技術を開発する、 ことにより最大限に活用してきた。 さらに、 これらの情報、生体由来加工試料、 解析技術等を利用し、 化合物の薬効・毒性評価システム開発や疾患マ ー カー探索にも取り組んでいる。

本事業の 一 環として、 患者のがん組織を活用し、 がん組織の状態を反映した抗がん剤評価モデルの開発を目指した patient-derived tumor xenograft (PDX) モデル、 さらには長期培養が可能な‘‘’

patient-derived tumor organoid (PDQ) の作製を行ってきた。 本事業におけるPDXの 樹立 'とは、生曽や維持が可能であることに加えて、 網羅的遺伝子発現解析により元のがん組織と作製したモデルの遺伝子発現プロファイルの類似性の高さを指標に、 樹立の可否を判断している。 現在までに、 PDX モデルは 200 系統以上の樹立している。 本事業で樹立したPDX を、 F-PDX ®と名付けた。 本講演では、 F-PDX®の樹立方法と特性解析、 F-PDX®を用いた抗がん剤の評価、 提供方法等について紹介する。
［参考文献l1. Tamura H, et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristi­cally similar to source tissues. Oncol Rep. 40, 635-646 (2018)
2. 土橋悠ら、 複合型免疫不全マウスを用いたPDX モデルの作製、 実験動物技術 54、 55-62 (2019)
3. 片平清昭ら、 PDX (Patient-derived xenograft) モデル作製のための実験施設、 実験動物技術 54、63-70 (2019)
4. 士橋悠、 片平清昭、 福島 PDX コレクション、 実験医学別冊「患者由来がんモデルを用いたがん研究実践ガイド」、 236-243 (2019)
5. Takahashi N, et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agentsand cancer immunotherapy. Oncol Lett. 406. (2021)

創薬開発研究におけるJ-PDXライブラリ ー の利活用
PDXモデ ル の頒 布柳下薫寛国立がん研究センタ ー 研究所
分子薬理研究分野
抗がん薬の開発成功率は5 ％程度と低く、 前臨床段階でのProof of conceptの取得の難しさが 一因である。 近年、 患者由来の腫瘍組織を免疫不全マウスヘ移植する患者腫瘍移植 (PDX) モデルが新たな薬効評価基盤として注目を浴びている。 PDXモデルは患者腫瘍の不均環境、 遺伝子 情報が維持され、 元患者とPDXの薬効の一一性や腫瘍微小致率が50~80％と非常に高いことが報告されており、 既に抗がん薬開発ではPDXモデルを用いた評価が主流となりつつある。
国立がん研究センタ ー では、 国立 研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)の支援のもと、進行・再発期で抗がん薬耐性となったがん患者を中心に、 がん種横断的な日本人由来のPDXライブラリ ー (J-PDXライブラリ ー）を構築した（「がん医療推進のための日本人がん患者由来PDXライブラリ ー 整備事業」）。 2022年10月現在、 1,678件の登録と515株の生着が確認されており、 生検検休からの作成が約3割、 何らかの抗がん剤治療歴を有する患者からの検体が約4割を占める。
J-PDXライブラリ ー では創薬開発研究への利活用を念頭に、 臨床情報と紐付けた利用を進めており、 患者さんの情報とPDXにおける結果の対比、 臨床情報に基づくPDXを選択したPDXバスケット試験、 治験や臨床試験に並行したCo-clinical studyなどの方法を提案している。

一方で、PDXが必ずしも臨床効果と 一 致するわけではないことも認識しており、 PDXの創薬開発研究への利活用のためには非臨床試験の実施方法の標準化が必要と考えられる。
本シンポジウムではJ-PDXライブラリ ーのご紹介と、 創薬開発研究への利活用の方法や現状、 課題について取りまとめる。

がんに対するワクチン•T細胞療法の開発におけるPDXの利用
中面哲也
国立がん研究センタ ー
先端医療開発センタ ー 免疫療法開発分野
我々の研究室では、 がんの再発予防や予防を目指したペプチドワクチン、 mRNAワクチン、 ペプ
PDXモデ ル の使 用

チドパルス樹状細胞ワクチンといったがんワクチンの開発、 及び、 進行 ・ 再発がんの治療を目指したCAR-T、TCR-T、個別化T細胞療法といったT細胞療法の開発を行っている。これらのT細胞、あるいは、 ワクチンで誘導された細胞傷害性T細胞(CTL)、 またはそれらのTCRを遺伝子導入したTCR-T細胞のがん細胞傷害性の有効性を腫瘍縮小などの見た目でわかりやすく示すためには、PDXモデルに対する治療実験は極めて有効な手段である。 ただ、 実際は、 免疫 がないマウスなので、 ヒトに ワクチンやT細胞を投与した場合のがん細胞傷害による二次免疫応答の効果が期待できず、 ヒトに投与するよりも不利な状況であり、 単にin vitroでの細胞傷害性試験をマウスの体を借りてやっている実験であるということは考慮しておかないといけない。
我々の 研究室では、 国 立 がん研究 センタ ー 東病院の外科や病理の先生方と連携して、 2014 年
11月から肺がんのPDX、 2016年 8月から肝がん ・ 胆道がん ・ 大腸がん肝転移のPDX、 2021年1月からは口腔がん ・ 冑がんのPDXの作製に取り組んできた。 マウスはNSGマウス、 SCID-Beigeマウスを使用、 手技としては皮下移植と腎被膜下移植を使用してきたが、 マウス間、 手技間に成功率の差はないように思われる。 一方で、 がん種によって、 成功確率は明らかに異なり、 ロ腔がん（扁平上皮がん）は5割と高率に成功し、 大腸がん肝転移や肝内胆管がんを含む胆道がん、 肉腫様肝がん、 胃がん、 肺扁平上皮がんでは3割程度で成功するものの、 肝細胞がんはl割未満、 肺腺がんはすべて失敗というこれまでの成績である。 また、 冑がんで2例、 口腔がんで1例、 B細胞リンパ腫ができた例も経験した。 今後、 移植前にマウスに全身照射することも検討しているが、 本シンポジウムに参加している皆様に教えを乞うて、 今後成功確率を上げていきたいと考えている。
現在、 CAR-T細胞療法の有効性を見る実験を実施しているが、 今後は、 TCR-T細胞療法や、 がんワクチンで誘導されたCTL、 またはそれらのTCRを遺伝子導入したTCR-T細胞の有効性を見る実験を行っていく予定である。

PDX由来細胞株を用いたオルガノイドの特徴とその活用
川合重人
中外製薬株式会社
トランスレ ー ショナルリサ ー チ本部

医科学薬理部

PDXモデルは臨床癌のヘテロジェネイティを保持するin vivoモデルであり、 in vitro 3D培養モデル
PDXモデ ル の使 用も同様にヘテロジェネイティを再現する有効なツ ー ルと考えられている。 癌のヘテロジェネイテ
ィや治療抵抗性の一 因として、 癌幹細胞と呼ばれる未分化な癌細胞を起点とした分化階層性の存在が知られている。 この分化階層性は癌微小環境により制御されている。 そこで癌微小環境が癌細胞の分化に及ぼす影響について詳細に解析することは、 癌のバイオロジー を理解するとともに、 新たな創薬標的分子を探索するために有効と考えられる。 癌微小環境には間質細胞や細胞外マトリクス、 酸素分圧や栄養供給など様々な要因が関与するため、 in vivo癌組織の解析が有効である。

一方、 in vitro培養モデルはメカニスティックな解析や化合物の薬効評価に活用しやすい。 そこで我々はPDXモデルからin vitro細胞株を樹立、 この細胞株から作製した分化階層性を再現するxenograftモデルとin vitro 3D 培養モデルを組み合わせることで、 癌微小環境による癌細胞の分化制御について解析を行った。 解析対象には分化型の大腸癌ならびに肺扁平上皮癌を選択した。 大腸癌モデルでは、 xenograftの腫瘍形成過程を詳細に病理解析し、 癌幹細胞マ ーカ ー LGR5 陽性細胞からなるsmall cluster構造 (sCL) を見出した。 sCLは癌ーホスト境界面に多く存在し、 その形成には線維芽細胞が関わっていることがin vitroモデルから明らかとなった。 次にxenograftの肺、 肝転移巣を指標にし、 培養環境を調節することで、 未分化な細胞からなるstem cancer organoid (stemCO) 、 ならびに分化した管腔構造を有するdiff cancerorganoid (diffCO) の二つのin vitroモデルを樹立した。 これらのモデルの創薬利用のモデルケ ースとして、 管腔形成におけるNotch シグナルの寄与を示した。 次に肺扁平上皮癌ではinvitroモデルで角化像を再現した。 細胞周期をイメ ー ジングできるFUCCI システムを用い、 細胞分裂の停止に引き続いて分化が誘導されることを確認した。 最後にNotch シグナル阻害により分化階層性が変化し、 未分化層と分化層の間の中 間層が顕著に減少することが見出された。 以上の結果から、 PDXモデルからin vitro細胞株を樹立し、 xenograftモデルとin vitro 3D培養モデルを組み合わせて解析することで、 癌組織の分化階層性を理解し、 創薬標的探索に応用できる可能性が示された。 現在我々はこれらのモデルを用い、 癌の治療抵抗性を克服するための研究を進めている。

PDXを用いたがんー間質相互作用の標的探索 ー
石川俊平
東京大学医学部・大学院医学系研究科
衛生学教室
患者由来のPDXモデルは、 癌細胞の組織構築や腫瘍微小環境をよく再現し、 薬物介入実験が可PDXモデ ル の使 用能であることから、 がんー間質相互作用の治療標的探索に適した研究ツ ールと考えられる。 我々は、 神奈川県立がんセンタ ー および実験動物中央研究所の協力のもと、 多様ながん種からなる70 検体由来のPDX モデルを樹立しトランスクリプト ー ムシ ー クエンスを行った。 ヒトとマウスのタンパクをコ ー ドする領域のオ ー ソログ配列の差は平均15％とされ、 がん細胞（ヒト）と間質細胞（マウス）由来のシ ー ケンスリ ー ドを配列の差に基づいてインシリコで分離し、 がん細胞や間質細胞ごとに発現プロファイルを作成することが可能である。 このデ ー タを用いて、 がんー間質相互作用における重要な標的分子を同定するため様々な解析を行った。 PDX 組織が臨床がん組織の腫瘍と間質細胞の比率を反映していることが確認できた。 また、 様々ながん種の腫瘍と間質の発現プロファイルを比較した結果、 がん細胞だけでなく間質細胞のシグナルもがん種によって多様であることが明らかになりました。 特に、 腎細胞癌の間質は、 線維性間質を生成する大腸癌、 肺癌、 膵臓癌と比較して特徴的であり、 癌細胞の低酸素シグナルが明瞭で血管内皮が増加することが明らかになった。 腎細胞癌間質の特徴的な遺伝子発現を支配する上流制御因子シグナル伝達経路と、 それを誘導するがん細胞側からのシグナルの統合解析により血管新生に関わる可溶性因子としてAPELINを同定した。 腎細胞癌のPDXマウスと特異的阻害剤を用いてAPELINシグナルに介入することで、 この可溶性因子が腎臓癌の生曽に関与し治療標的となりえることを確認した。 これら 一 連の解析と実験から、 PDXモデルのトランスクリプト ー ム解析は、 がんー間質相互作用の解析において、 分子標的を特定する有望なアプロ ー チであることが示唆された。

悪性脳腫瘍のprecision medicineの実現を支援するPDXライブラリ ー 構築：
関西中枢神経腫瘍分子診断ネットワ ー クの試み
金村米博
大阪医療 センタ ー 臨床研究センタ ー先進医療研究開発部
頭蓋内原発性の悪性脳腫瘍は希少癌の 一 つであり、 その代表であるglioblastomaを含む高悪性度グリオ ー マは、 中間生存期間12-15 ヶ月程度の予後不良の難治性疾患である。 診断および治呂アル の使 用苓療法の進歩によって、 その予後に 一 定の改善は認められているが、 脳実質内に広範囲に浸潤する生物学的特性を有する腫瘍であり、 神経症状應化を回避しての外科的全摘出には限度があり、 その予後向上のためには、 新たな治療戦略の開発が強く求められている。
近年のゲノム科学に基づく大規模研究の結果から、 悪性脳腫瘍の分子遺伝学的特性に関する数多くの知見が報告され、 これら特徴に基づく新たな分子分類の概念が提唱されている。 最新のWHO脳腫瘍分類第 5 版 (2021) では、 従来までの病理組織学的所見に加えて、 様々な分子遺伝学的指標が診断基準に組み込まれる大きな改定がなされた。 今後はこれら分子遺伝学的特性に基づき、 precision medicineを実現するための研究開発が精力的に進められると予測される。
悪性脳腫瘍の研究開発における 一 つの課題として、 適切なモデル系構築の重要性が挙げられる。 現在に至るまで悪性脳腫瘍モデル細胞として汎用されてきた各種株化細胞は、 各腫瘍のinvivoにおけるナイ ー ブな特性を十分に反映していないという問題点が認識されている。 よりオリジナルに近い特性を保持し得る病態モデル系として、 無血清培養系で樹立された初代培養細胞や Patient-derivedxenograft (PDX) モデルの利活用が強く推奨されており、 その樹立と研究リソ ー スとしての標準化の必要性が指摘されている。
一方で、 希少癌である悪性脳腫瘍のPDXモデルの樹立とその標準リソ ー ス化は単 一 施設で実施することは容易ではなく、 私たちは関西地区を中心とした約70施設の 医療機関で関西中枢神経腫瘍分子診断ネットワ ー クを構築し、 脳腫瘍分子診断の中央化と患者由来腫瘍組織検体ライブラリ ー構築、 それを活用した初代細胞株とPDX モデル樹立を試みている。 本発表では、 関西
中枢神経腫瘍分子診断ネットワ ー クのPDXライブラリ ー構築に向けた活動を紹介し、 悪性脳腫瘍の precision medicineの実現におけるPDXモデルの電要性を考察する。