Issue 7
December, 2015

Immunoprecipitation (3)Introduction
細胞内のタンパク質の分解には、UPS(ユビキチン-プロテアソームシステムプロテアソームシステム)などのシステムが機能しており、多数のタンパク質が複雑に関与していることが知られています。これまでに、UPSのメカニズム解明に向けたプロテオミクス解析が精力的に行われており、多くの成果が出てきています。のメカニズム解明に向けたプロテオミクス解析が精力的に行われており、多くの成果が出てきています。
プロテアソームはユビキチン化されたタンパク質の加水分解を行う巨大な酵素複合体であり、プロテアソームのサブユニットであるRpt2は、出芽酵母をプロテアソームはユビキチン化されたタンパク質の加水分解を行う巨大な酵素複合体であり、プロテアソームのサブユニットである含めた多くの真核生物でN-ミリストイル化修飾を受けていることが知られています。最近の研究により、ミリストイル化修飾を受けていることが知られています。最近の研究により、Rpt2のN-ミリストイル化はプロテアソームの核と細胞質での局在をダイナミックに変化させ、それが細胞内局所でのUPSUPSに複雑に影響することが明らかになってきました。
Rpt2のN-ミリストイル化がUPSに及ぼす現象を調べるため、出芽酵母プロテアソームのに及ぼす現象を調べるため、出芽酵母プロテアソームのRpt2において、N-ミリストイル化部位の変異有り(Rpt2-G2A、Rpt2-G2∆) および変異無し(Rpt2-WT)の株を用い、質量分析法による網羅的なユビキチンプロテオーム解析を行ったところ、細胞質のミスフォールドタの株を用い、質量分析法による網羅的なユビキチンプロテオーム解析を行ったところ、細胞質のミスフォールドタ
ンパク質の核内への輸送に関わるHsp70ファミリー、Ssa1とSse1では、変異株において有意にユビキチン化増加を示すデータが得られました。そこで、では、変異株において有意にユビキチン化増加を示すデータが得られました。そこで、野生株と2種の変異株のSsa1のユビキチン化について、Anti-Ssa1抗体と抗体とAnti-ubiquitin抗体によるIP-WBでの評価を行いました。

Result0.25ugのAnti-Ssa1抗体と出芽酵母ライセートを反応させ、そこに25ul25ulの各社プロテインGビーズを加えて抗原-抗体コンプレックスの回収を行い、SDS-PAGE後にウエスタンブロッティングを行いました。
ウエスタンブロッティングの結果から、質量分析での結果と同様に、野生株と比べて2種両方の変異株において、Ssa1のユビキチン化が上昇している
ウエスタンブロッティングの結果から、質量分析での結果と同様に、野生株と比べてことが確認できました。また、3種の酵母株において、質量分析とウエスタンブロッティングによりライセート中に含まれる種の酵母株において、質量分析とウエスタンブロッティングによりライセート中に含まれるSsa1の量を調べたところ、3種間において有意な差の無いことが確認されています。
このことから、Rpt2のN-ミリストイル化の阻害は、Ssa1のユビキチン化を上昇させる効果があることが確認されました。のユビキチン化を上昇させる効果があることが確認されました。
また、FGビーズと他社ビーズについて、以下の点が確認できます。
☆他社ビーズではSsa1およびユビキチン化Ssa1が回収できていないが、が回収できていないが、FGビーズでは高回収量で回収できている。
(+)と(-)のS/N比が高い。
☆他社では(+)画分と(-)画分が同じ構成であるが、FGビーズでは(+)

FG beads

Beads:

IP

Sample:123

Anti-Ssa1:+++Competitor
1-12

3+++

1-Sample
1: Wild type
2: Mutant (Rpt2-G2A)
3: Mutant (Rpt2-G2∆)

(kDa)
250
Ubiquitinated Ssa1
150
10075

Ssa150
参考文献：
A. Kimura et al.
journal of proteomics 1 (130):33-41 (2016)
doi:10.1016/j.jprot.2015.08.021

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Western blotting : Anti-ubiquitin
Anti

TAMAGAWA SEIKI CO., LTD.

http://www.FGbeads.com

Materials
aterials and method
Mand method■Materials
1. Protein G beads
2. S.cerevisiae lysate
3. Lysis buffer (20mM HEPES(pH8.0) , 9M Urea)
4. Protease inhibitor cocktail (from Nacalai Tesque)
5. PR-619 (Life Technologies)
6. Triton buffer (1% Triton-X100, 20mM Tris-HCl(pH7.4), 150mM NaCl,2mM EDTA)
7. Anti-Ssa1 antibody (from Santa Cruz)
8. SDS sample buffer
9. Anti-mono- and polyubiquitinylated conjugates antibody (FK2H) HRPconjugate (from Enzo Life Sciences)
10. PBS-T buffer (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4・12H2O,1.5mM KH2PO4, 0.1% Tween 20)
11. Blocking buffer (5% skim milk in PBS-T buffer)■Method 1 (Lysate Preparation)
1. Yeast culture
Culture yeast for 3 days at 30oC in synthetic complete
medium lacking leucine (SC-Leu).
2. Harvest and homogenize
Centrifuge at 3000×g for 10min, wash twice in sterilewater, and resuspende in lysis buffer with proteaseinhibitor cocktail and 50uM PR-619.
Vortex with glass beads and centrifuge to obtain lysate.

■Method 2 (Immunoprecipitation)

beads® information■■FGProduct nameProtein G beads

Product number

TAS8848N1173

Storage temperature

2-8oC

Storage buffer

10mM HEPES(pH7.9), 50mM KCl,
1mM EDTA, 10%glycerol

Size of beads

190nm ± 20 nm

IgG binding capacity>100ug mouse IgG /mg of beads

3 (Western blotting)■■Methods
1. Perform SDS-PAGE.
2. Transfer the protein from the gel to a PVDF membrane using
Trans-Blot® Turbo TM.
3. Block the membrane with the Blocking buffer for 120min atroom temperature.
4. Dilute the Anti-ubiquitine antibody with the Blocking buffer to1/1000.
5. Incubate the membrane for 120min at room temperature.
6. Wash the membrane with PBS-T buffer 3 times.
7. Detect with a chemiluminescence substrate.

1. Lysate dilution
Add 9 volume of Triton buffer to lysate.
2. Reaction
Incubate lysate containing 125ug of total protein and 0.25ug
of Anti-Ssa1 antibody at room temperature for 60min on
microtube mixer.
3. Collect antigen-antibody complex
Add 25ul of Protein G beads, incubate at room temperaturefor 60min on microtube mixer.
4. Wash
Separate magnetically and remove supernatant.
Wash beads with Triton buffer 5 times.
Separate magnetically and remove supernatant.
5. Elution
Add SDS sample buffer and resuspend beads.
Incubate for 10min at 70oC and remove the beads.

データ提供
横浜市立大学 先端医科学研究センター 木村鮎子先生
私たちの研究室では、タンパク質の機能をダイナミックに制御する、リン酸化・アセチル化・ユビキチン化などの翻訳後修飾について、質量分析や電気泳動を用いた網羅的な検出や、これらの修飾の機能・疾患との関連を調べる研究を行っています。私は、多数のタンパク質サブユニットから構成され、翻訳後修飾による精密な機能制御を受けると考えられるプロテアソームの翻訳後修飾に着目し、その中でも唯一の脂質修飾であり、真核生物で広く保存されていることから重要な機能をもつことが予測される、り、真核生物で広く保存されていることから重要な機能をもつことが予測される、N-ミリストイル化の研究を進めています。これまでに、本修飾部
位に変異導入した酵母を用いた研究により、Ｎ-ミリストイル化がプロテアソームの細胞内局在制御を介して、核や細胞質内でのタンパク質分解ミリストイル化がプロテアソームの細胞内局在制御を介して、核や細胞質内でのタンパク質分解を制御することが明らかになっています。今後、ヒト培養細胞などを用いて、さらに本修飾の生理機能解明を進めていきたいと考えています。

TAMAGAWA
SEIKI
CO.,
LTD.
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http://www.FGbeads.com
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