“はかる”ための基礎知識

吸光光度法
釜美

則

る呈色反応の種類について述べ，さらに，個々の試験法

は じ め に

1

谷から呈色条件における注意点などについて解説する。

吸光光度計は高価な分析機器がある中で，比較的安価な装置であり，そのメンテナンス及び取り扱いが容易

2

吸光光度法でよく用いられる用語で，さらに故障が少ないなどの利点がある。また，ある吸光光度法で用いられる用語の定義は，書籍によって特定の波長のみを利用する場合は，分光の必要がなく，幾分異なるところも見られる。そこで，この講座では吸光学フィルターや発光ダイオードを光源としたコンパク

光光度分析通則 JIS K 0115（2004）を参考にして幾つト，且つ安価な装置で定量でき，環境教育でのフィールか解説する。

ド測定などに用いられている。吸光光度計は分析機器の

１ 透過率 T ：ある波長の光が溶液層を通過したと

中で最も普及しており，分析機関にはほとんど備えられき，入射光の強度と透過光の強度の比で表したものであている。

る。ここで，透過前の強度を 1 とした場合の透過後の物質の紫外・可視スペクトルは色々な情報を提供する。例えば，純粋な物質のスペクトルと比較することで強度を透過率 T と呼ぶ。この透過率に 100 をかけた値が透過率パーセント ％T である。

おおよその同定や不純物の存在を知ることができる。ま

２ 吸光度 E ：試料を透過した光の強度（ T ）と，透

た，そのスペクトルから分子の電子状態や立体構造も推過前の光の強度（ T0 ）との比を常用対数で表した数値論できる。一方，特定の波長を使用すると，その吸光度であり，吸光度 E＝－log(T/T0 ）で表すことができる。

は濃度に比例することから，試料中目的成分の濃度を知３ ランバート・ベールの法則：吸光度 E は溶液の厚

さ l（セルの光路長）と溶液の濃度 c に比例する。すなることができる。
吸光光度法では，紫外部から可視部までにわたる波長範囲を取り扱っている。しかし，紫外部は，目的成分以わち，吸光度が光路長に比例することを Lambert の法則と言い，濃度に比例することを Beer の法則という。

きょう ざつ外の 夾 雑物質の吸収による妨害が多いため，通常可視

このことは， E ＝ kcl として示すことができる。実際の部で測定することが多い。可視部での測定では，呈色液測定では，光路長 l が一定であるため，検量線の作成にうまを直接目視することで，検量線が上手くできたか，さらおける吸光度は濃度の一次関数になる。このことから，に目的成分濃度の概略値が分かるなどの利点がある。一検量線が直線性を示すことをベールの法則に従うと言般に，試料中の目的成分には，有色成分がほとんどないう。ベールの法則が成立するためには，表 1 の要件をため，試薬を用いて呈色させ，その吸光度を求めて定量満たす必要がある。

することになる。従って，目的成分の呈色化学反応機構

４ モル吸光係数 e ： E ＝ kcl が成立するとき，光路長を理解しておかないと呈色が不十分となり，満足な結果1 cm ，目的成分の濃度が 1 M 溶液における吸光度がモを得ることができない場合がある。
このように吸光光度法は，機器分析の中で最も化学的知識を必要とする方法である。そこで，本入門講座では，吸光光度法における基礎的な用語を取り上げ，それ表 1 ベールの法則が成立する要件らについて解説する。さらに JIS K 0102（1998）で採(1) 入射光が単色光であること(2) 吸収セルと機器内部での散乱・迷光がないこと

用されている吸光光度法を例にとり，吸光光度法におけ(3) 溶液中に懸濁物による乱反射がないこと

Fundamental Konwledge of Chemical Analysis―Spectro-(4) 呈色成分の濃度が変化しても化学種が変化しないこと

photometry.

158(5) 入射光の波長幅が目的の成分の吸収波長より狭いこと
ぶんせき  表2

感度表示例（光路長 1 cm)

名称

くなり再現性が悪くなる。また，材質はガラス製，石英製，プラスチック製がある。可視部の測定では，通常ガ条件(濃度，吸光度)表示法(1) モル吸光係数

1 mol/L

吸光度一定のはずであるが，そのばらつきがあることに注意し(2) 比感度

1 mg/L

吸光度てもらいたい。このため，幾つかのセルを用いて実験す

濃度 1％

吸光度

る場合は，セル補正を行ってから使用すべきである。セ

吸光度 0.001

濃度(mg/L)

ル補正とは，最も透過率の良いセルを基準にして他のセ(3)1％感度（E 11％cm)(4) 感度指標（サンデル感度)ラス製が使用されている。ガラス製のセルは，光路長がルの透過率を測定する。その中で透過率が近いセルをより分けて使用すると良い。また，透過率の近いセルはマッチングセルとして市販されている。吸光度測定におル吸光係数 e で示される。モル吸光係数は，分子吸光係いて良好な精度を得るには，同じセルを共洗いし，さら数とも言う。このモル吸光係数は，純粋な物質のモル濃にいつもセルの向きが同じ方向になるようにセットして度から求めることができ，逆にモル吸光係数が既知なら測るようにすると良い。試料が少ない場合は，ブラック

ば吸光度を求めることで物質の濃度を求めることができマイクロセルを用いると便利である。
セルは透過面を手で触ると汚れるので，触ってはいける。
モル吸光係数は，最終呈色液中の目的成分濃度をモルない。セルに溶液を入れる場合は，こぼれないように注濃度とした検量線の傾きに相当する。実際の吸光光度法

意が必要で，もしこぼれた場合は，洗ったガーゼやキムでは，呈色成分の生成率やその構造が不明なものが多いワイプなどでふき取る。セルの洗浄は，透過面を傷つけため，純粋な目的呈色成分を測っていると言えない。

ないように，セル洗浄用器具や楊枝に脱脂綿を巻いたも従って，傾きのモル吸光係数は，みかけのモル吸光係数のを用い，中性洗剤で洗浄する。と呼ぶのがふさわしい。モル吸光係数の大きさは，呈色試薬の感度比較に用いられている。モル吸光係数が 13･ 2万を超えるものは，感度の高い試薬と言われており，最アナログ型の吸光光度計では，測定前に純水または空もモル吸光係数の大きいものには 50 万近いものがあ

試験溶液を吸収セルに入れ，シャッターを閉じて透過率装置の取り扱いり，その呈色試薬は，重金属イオン測定でのポルフィリを 0％ に合わせ，次にシャッターを開いて透過率を 100ン化合物である。

％ に合わせる。この操作を 0 100 調整という。この調

５ 空試験値：検量線の作成において目的成分のみを

整は，他の波長に変えるごとに繰り返さなければならな含まない操作で得られる吸光度が空試験値（ブランク値）い。デジタルタイプの吸光光度計では，装置の電源を入である。検量線の作成では，このブランク値を差し引くれて起動させると自動的に透過率の 0 合わせが行われ場合もあるが，この空試験値がいくつなのか知っておきており，次にオートゼロを行うこと透過率の場合の 100たい。通常，空試験値は小さいほど良く，大きい場合で合わせが行われる。

も 0.2 以下の吸光度になるのが望ましい。
６ 迷光：モノクロメーターで取り出された光の中で，目的とする波長以外の光のことを言う。
７ 感度表示：吸光光度法で感度比較するには，モル4

検出下限と定量下限

透 過 率 の 読 み に よ る 誤 差 に つ い て は ， Twyman 

Lothian の誤差曲線が知られている。この誤差曲線で誤吸光係数の大きさで表現する場合が多い。しかし，目的差が最も小さい吸光度は 0.434 である。一方，吸光度を成分の原子量または分子量がはっきりしていない場合直接測定できる装置では，実用的な吸光度の測定範囲はは，比感度や 1 ％ 感度で表示している。感度表示例を

0.05 から 1.5 である。吸光度が 1.5 以上になってくる

表 2 に示す。ここでの感度表示例は，光路長が 1 cm のと，迷光の影響が強く出て誤差の要因となる。

場合での特定の濃度や吸光度における吸光度または濃度を意味している。

3セルと装置の取り扱い

3･ 1セルの取り扱い

吸光度を測定するには，セルが必要である。セルには，試験管型と角型があり，通常角型が用いられてい検量線を作成して実試料の分析を行うことになるが，その場合，検出下限と定量下限は一般に以下のようにして求めることができる。
検出下限は，ブランクでの吸光度の標準偏差を 3 倍にした吸光度に相当する濃度になる。一方，定量下限はブランクの標準偏差を 10 倍した吸光度に相当する濃度になる。

る。角型には，光路長が 1 mm～100 mm が市販されているが，光路長 10 mm が一般的である。濁った試料を測定する場合は，光路長が長いほど散乱光の影響が大き
ぶんせき  sB ＝∑(Xi － X̃ )2n－1159

sB：ブランクの標準偏差

硫化物イオンはメチレンブルー，アンモニアはインド

Xi ：各吸光度

フェノール青を生成し，適当な言葉が見当たらなかったX̃ ：各吸光度の平均値ので，ここでは色素生成法として分類した。

n ：吸光度の測定回数

次に，これらの呈色反応の分類について説明する。

ただし，検量線は定量下限付近では，濃度に対して直線性が得られないケースが多く見られる。このような場げると定量しやすくなる。

分析対象物は，無色またはわずかに色のついたものもあるが，これに反対電荷を持つ有色イオンを加えるとイ吸光光度法に用いられる呈色反応と反応分

5Ａ イオン会合生成

た合は，目的成分を一定量加え，下駄をはかせるようにす類

オン会合体を生成するので，これを抽出すると分析対象成分に比例して有機相が呈色する。すなわち，イオン会合とは配位結合によらない陽イオンと陰イオンの結合で吸光光度法では，試料中の分析対象物の吸光度を直接あり，生成物はイオン会合体と呼ばれる。また，イオン測定して決定するのはまれである。このため，なんらか会合体はイオン対と同義に用いられることもある。イオの化学反応を駆使して分析対象物を呈色する必要があ

ン会合体の抽出率は，イオン会合体生成にかかわる陽イる。呈色反応には，一段階によるものや多段階によるもオンおよび陰イオンが，それぞれ抽出溶媒に溶けやすのなど多岐にわたっている。

く，さらにイオンの電荷が低く，分子半径が大きいほど吸光光度法における呈色反応は，表 3 の要件を満たすことが好ましい。

高い。
金属イオンと試薬との錯体が電荷を帯びている場合，

しかし，これをすべて満足させる呈色反応は少ないたそのままでは抽出できないが，この反対電荷を持つイオ

め，目的成分の呈色反応についてあらかじめ下調べをンを加えてイオン会合体を生成させることで抽出されや行ってから実験することが必要になってくる。

すくなる。特に金属イオンの抽出定量においては，金属呈色反応には，様々なものがある。そこで， JIS Kのハロゲン錯体と陽イオン染料とのイオン会合による抽0102 に採用されている吸光光度法の例から呈色反応を出例が多い。また，陽イオンの対イオンとしてキサンテ分類し，表 4 にまとめてみた。

ン系染料，トリフェニルメタン系染料などが多く用いられている。これに対しての陰イオン染料を対イオンとして用いる例は少ない。

表3

吸光光度法における好ましい要件(1) 分析対象成分と選択的な反応であること

例えば，陰イオン界面活性剤は陽イオン色素であるエチルバイオレットとイオン会合体を生成し，トルエンの(2) 目的の測定濃度を満たす感度であること溶媒に抽出される。また，アンチモンの定量では，アン(3) 呈色の繰り返し精度が良いこと

チモンをクロロ錯体の陰イオンとしてから，これと陽イ(4) 呈色がすみやかに起こること

オン色素であるローダミン B とのイオン会合体をジイ(5) 呈色体の経時変化が少ないこと(6) 温度， pH，試薬濃度などのパラメーターに影響されないことソプロピルエーテルで溶媒抽出する（図 1 参照）。
このようなイオン会合体の抽出吸光光度法では，対イオンである色素の種類によって抽出溶媒が決定される場(7) 呈色体の吸光度が濃度に比例すること(8) 空試験の吸光度が小さいこと合が多い。一般にイオン会合体の生成によって激的に抽出挙動が変化する場合は少ない。このため，対イオンの表 4 JIS K 0102 に採用されている吸光光度法の例

みでもわずかに溶媒に抽出される必要がある。有機溶媒による抽出吸光光度法では，目的の有機相を水相から分呈色の分類

測定成分

呈色試薬

離する際，水滴が有機相に混入する場合があるので，分イオン会合生成 陰イオン界面活性剤 エチルバイオレット
イオン会合生成 アンチモン

ローダミン B

キレート生成銅イオン

ジエチルジチオカルバ
ミン酸

キレート生成鉄イオン

1,10 フェナントロリン

色素生成法

硫化物イオンN,N ジメチルp フェニレンジアミン

色素生成法

アンモニア

ナトリウムフェノキシド

無機錯体生成リン酸イオン

モリブデン酸とアスコルビン酸

無機錯体生成モリブデン

チオシアン酸160

図1

イオン会合に使用する色素
ぶんせき  図2

図4

硫化物イオンのメチレンブルー生成反応

図5

アンモニアのインドフェノール生成反応

キレートのイメージ図

一方，銅の定量に用いられるジエチルジチオカルバミン酸（DDTC）は酸によって分解しやすい。このため，この試薬は 2 週間以上経過したものを用いないように
図3

鉄(II）と 銅(II）の呈色試薬すると良い。また，この試薬は多くの金属元素と反応するが，鉄，ニッケル，コバルト錯体のように DDTC で有色となる金属イオンは， EDTA 溶液の添加でマスキ液漏斗の分相操作を慎重に行う必要がある。もし有機相ングする必要がある（図 3 参照）。に水滴が少しある場合は，無水硫酸ナトリウムで脱水すると良い。また，分相操作において乾燥したa紙を切りＣ 色素生成法
取り，これを伝わらせてセルに移すか，分液漏斗の脚部

金属イオンの吸光光度法は，キレート試薬を始め，多に脱脂綿を詰めたものを用いて水滴を取っても良い。

くの呈色試薬が知られている。これに対して，陰イオンの呈色試薬の種類は少ない。硫化物イオンの定量では，

Ｂ キレート生成

図 4 で示したように，N,N ジメチル p フェニレンジ

金属イオンの吸光光度法では，キレート試薬を反応さアミンが鉄(III）イオン存在下で，メチレンブルーを生せる方法がよく用いられている。キレート（ chelate ）成する。また，メチル基をエチル基にかえると感度がとは，ギリシャ語でカニのはさみを意味する言葉で，配1.5 倍以上増加する。一方，アンモニアは，図 5 で示し位子のドナー原子が中心金属イオンをはさみこむ形がカたように，次亜塩素酸イオンの共存下でフェノールと反えさニの餌をつかむ形に類似することに由来している（図 2

応してインドフェノール青を生成する。これら両者の呈参照）。

色反応においては，メスフラスコをあまり激しく振らなキレート試薬には多くの試薬が知られており，カニのいようにすることが必要である。この理由は，前者の硫はさみの部分，すなわち配位子のドナー部分が O,O 型，化物イオンの定量では，硫化水素が，後者のアンモニアO,N 型，N,N 型，S,S 型に分類できる。代表的な例としの定量ではアンモニアやクロラミンが気相中へ逃げてして，鉄と銅の呈色反応について次に述べる。

まうおそれがあるためである。

鉄の 1,10 フェナントリンによる定量では，結合のタイプが N,N 型になっている。鉄イオンの定量では， 2Ｄ 無機錯体生成

価イオンに還元してから 1,10 フェナントロリンとキリン酸イオンの定量は，ヘテロポリ酸の生成後，これレートを生成させる。この呈色反応では，試薬の添加順を還元してモリブデン青にして測定する。この方法は，序によって呈色に時間がかかるとか，呈色が不完全にな硫酸濃度とモリブデン酸濃度に応じて呈色領域が存在する場合があるので注意する必要がある。すなわち，試薬ることが知られている。混合試薬は，調製後 5 時間以の添加順序としては，酸性条件で塩化ヒドロキシルアミ内に使用することが望ましく，モリブデン酸アンモニウンと 1,10 フェナントロリンを加えてから，最後に緩衝ム溶液の保存は，ガラス容器でなくポリ容器が適してい溶液（pH 7）を加える必要がある。この理由は，鉄(III）る。また，還元剤によってモリブデン青の吸収極大波長のクロロ錯体として還元すると，1,10 フェナントロリが異なることが知られている。還元剤としてアスコルビンとのキレート生成が迅速になる。もし，鉄(III）溶液

ン酸あるいはスズ(II）を用いると，モリブデン青の波に緩衝溶液（ pH 7 ）を加えると水酸化物ができ，これ長はそれぞれ， 880 nm, 700 nm となっており，この違が塩化ヒドロキシルアミンで還元されにくくなる。

いは還元時でスズが呈色体の中に混入するためと言われぶんせき  161

法に携わる初心者に対し，いくらかでもお役に立つことができれば幸いである。
図6

リン酸イオンのモリブデン青生成反応

参考資料
洋書では，キレート試薬に関するものとして， K.

Ueno らによる ``Handbook of Organic Analytical Reagents 2nd Edition'', CRC Press (1992）が詳しい。陽イ
図 7 モリブデン(V）の呈色反応

オ ン の 吸 光 光 度 法 は ， Z. Marczenko ら の ``Spec-

trophotometric determination of elements'', John Wiley& Sons. Inc (1976）がある。無機陰イオンの吸光光度法には，W. J. Williams らによる ``Handbook of anion de-ている。
一方，モリブデンの定量では，Mo(V）に還元された

termination'', Butterworths (1979）がある。

モリブデンとチオシアン酸イオンの錯体が生成する。こ

国内では，JIS の解説書として並木による“詳細工場の錯体は，酸，試薬濃度，温度などの条件で大きく影響排水試験方法［改定 3 版］”，日本規格協会（ 1999 ）がされるので，反応条件を厳密に一定にする必要がある。

ある。また，各種金属イオンの比色分析では，6 巻から以上の分類以外にも，呈色反応には，酸化還元反応なる“無機応用比色分析”，無機応用比色分析編集委員

系，置換反応系，三元錯体生成法，接触反応法などがあ会編，共立出版（1973 1979）などがある。

る。

釜谷美則（Minori KAMAYA）

6お わ り に工学院大学工学部（〒192 0015 東京都八王子市中野町 2665 1 ）。工学院大学大学

誰でも気軽に利用できる吸光光度法は，化学を専攻した人にとって非常に親しみやすい分析法である。本講では，吸光光度法の用語，さらに呈色反応例を JIS から抜院工学研究科修士課程修了。博士（工学）。
≪現在の研究テーマ≫簡易分析法の開発，バイオアッセイ。≪趣味≫散策。
E mail : bt74290＠ns.kogakuin.ac.jp

き出し，それらの呈色反応を分類しながら呈色操作での注意点についても述べてみた。最後に，本講が吸光光度

6 ．大地， 7 ．地球， 8 ．食物， 9 ．室内， 10 ．健康， 11 ．免疫，12 ．リサイクル の 12 の章から成っている。各章をほぼ 5 ～ 7の項目に分け，一つの項目を二つか三つのキーワードで 10 行以内で説明している。これらの解説は，偶数ページ 1 ページにまとめられており，見開きの奇数ページはすべて，大きく簡環境

明なイラスト，図などに用いられている。文章は見やすい大き―ここがポイント―な文字でイラストの補助説明程度に抑えられているため，理齋藤勝裕 著

科，化学に知識，興味を持たない読者でも抵抗なく，全文を読み通すことができる。環境を理解するために最低限必要な化学

これまでも多くの入門書を執筆している著者により，“環境”

物質，化学式なども示されているが，読み通すための抵抗にはについて初心者，一般読者に分かりやすく，簡明に書かれた啓ならない。生活に密着した項目も含め，非常に広い領域を限ら蒙書である。本書は生活と環境の関係を示そうとするのが目的れた紙面で解説しているため，取り上げたキーワードの数，まであり，環境を知るために必要な，「地球とは，水圏とは，気たその解説の深さは十分とは言えない部分もあるかと思うが，圏とはどのようなものか？」，「そこにある物質はどのような性

環境問題に興味を覚えた人，環境をこれから理解して行こうと質を持っているのか？」，「そして新しく作られた物質の性質はする人にとっては，格好の入門書として奨められる。

どのようなものなのか？」の問いに答えている。全体で，“環（ISBN 978 4 7827 0551 3・B5 判・192 ページ・2,300 円＋税・境”と 1．公害，2．化学物質，3．エネルギー，4．水，5．大気，162

2007 年刊・三共出版）

ぶんせき  