Issue 3
September, 2014

Isolation of drug target protein (2)Protein kinase inhibitors【Bisindolylmaleimide】
inhibitors
Summary
プロテインキナーゼはリン酸基を他分子に付加する（リン酸化する）酵素です。
今回、ある条件下におけるビスインドリルマレイミドⅧ (Bis Ⅷ) のターゲットタンパク質を分離する実験を行ったので紹介します。
ビスインドリルマレイミドは、プロテインキナーゼC (PKC) の強力な阻害剤として報告されましたが、その後GSK3α/β1)、CDK22)、 Rsk3) などの他キナーゼに対しても阻害活性があることが報告されています。
本実験ではFGビーズへBis Ⅷを固定化し、TPA等の処理をしていないHeLa
HeLa細胞抽出液から結合タンパク質をアフィニティ精製しました。
その結果、いくつかの結合タンパク質が精製され、その中でBis Ⅷの主要結合タンパク質としての主要結合タンパク質としてGSK3α/β
Bisindolylmaleimide ⅧがウェスタンブロッティングおよびMS解析により同定されました。
精製される主要タンパク質の種類はFG beadsに固定化する化合物量によって変化によって変化します。

Result1．FGビーズと他社磁性ビーズAを使用して幾つかの結合タンパク質が回収されました。
を使用して幾つかの結合タンパク質が回収されました。
ビーズとの反応前に前にHeLa細胞抽出液へフリーのBisⅧを添加すると、幾つかのタンパク質の回収量が減少しました。これはそれらのを添加すると、幾つかのタンパク質の回収量が減少しました。これはそれらのタンパク質が特異的にBisⅧと結合することを示しています。
バンドの濃さから、回収量が一番多い結合タンパク質を選択し、その分子量から文献バンドの濃さから、回収量が一番多い結合タンパク質を選択し、その分子量から文献2を参考にGSK3α/βと予測し、ウェスタンブロッティングにより確認しました。
更に質量分析により、 GSK3α/βであることが確認できました。
2．他社磁性ビーズとの比較も実施しました。
FGビーズが極めてバックグラウンドが低いということが確認できました。
ビーズが極めてバックグラウンドが低いということが確認できました。
FG(kDa)M

InCompetitor A－ ＋ ＋－ ＋ : Immobilized Bis Ⅷ－ － ＋－ － : Bis Ⅷ Competition

20011697.466
GSK3α/β4531

21.5
14.46.5
文献1)
1) Nihar R, Jena. Journal of Molecular Modeling 18 (2012) 631-644
631
文献2)2) Brehmer, D., Godl, K., Zech, B., Wissing, J., and Daub, H. Molecular & Cellular Proteomics 3.5 (2004) 490-500490
文献3)3) Roberts, NA., Haworth, RS., Avkiran, M., J Pharmacol. 145(4) (2005) 477-489
477

TAMAGAWA SEIKI CO., LTD.
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http://www.FGbeads.com
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Isolation of drug target protein
aterials and method
MMaterials and method■Materials
1. Bisindolylmaleimide Ⅷ
2. NHS beads
3. HeLa cell extracts (cytosolic fraction) – 3mg/ml
4. Binding &Washing Buffer (20mM HEPES-NaOH(pH7.9), 100mM KCl,
1mM MgCl2, 0.2mM CaCl2, 0.2mM EDTA, 10%(v/v) glycerol,
0.1% NP-40, 1mM DTT, 0.2mM PMSF)
5. Elution Buffer (0.0625M Tris-HCl (pH6.8), 0.005% BPB, 2% SDS, 10%glycerol, 5% 2-mercapto ethanol)
6. Mouse monoclonal anti-GSK3α/β (from Santa Cruz Biotechnology)
7. Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (from GE Healthcare)
8. Starting Block™ (TBS) Blocking Buffer (from Thermo scientific)
9. TBS-T buffer (137mM NaCl, 2.68mM KCl, 25mM Tris-HCl, pH7.4,0.1w/v% Tween-20)

beads information■■FG
Product name

NHS beads

Product number

TAS8848N1141

Storage temperature-20℃

Storage buffer

Isopropyl alcohol

Size of beads

190nm ± 20nm

Functional groups

200 - 300nmol/mg■Methods 1 (Immobilization)
1. Apply
FG beads
0.5mg NHS beads and 0.1mM Bis Ⅷ in 100ul DMF
0.5mg NHS beads and NO Bis Ⅷ in 100ul DMF (Negative Control)
Competitor A
0.5mg NHS beads and 1mM Bis Ⅷ in 100ul DMF
0.5mg NHS beads and NO Bis Ⅷ in 100ul DMF (Negative Control)
2. Reaction
1) Immobilization
70minat r.t.
2) Masking
Inactivate unreacted NHS according to recommended conditions ofeach beads.

NHS beads

Bis Ⅷ■Methods 2 (Affinity purification)
1. Wash
Wash beads with washing buffer 3 times at 4oC (on ice).
2. Add sample solution
Add 1000ul HeLa cell extracts (Bis Ⅷ Competition : －) or Bis Ⅷ
added HeLa cell extracts (Bis Ⅷ Competition : ＋) to beads.
(0.1mM Bisindolylmaleimide Ⅷ is added to HeLa cell extracts andpreincubated for 120min before incubation with the beads.)
3. Reaction
Incubate for 240min at 4oC.
4. WashRemove sample solution.
Wash beads with washing buffer 3 times at 4oC (on ice).
5. Elution
Add 40ul elution buffer and resuspend beads.
Boil for 5min at 98oC and remove beads.

Bis Ⅷ immobilized beads

Fig.1 Immobilization of Bis Ⅷ on NHS beads

4 (MS)■■Methods

Excising the bands from the gel.
Wash the band pieces, then dry the band pieces.
Add 500ul/band of 10mM DTT/25mM NH4HCO3.
Incubate for 60min at 56℃.
Add 500ul/band of 55mM iodeacetamide/25mM NH4HCO3.
Analyze the samples by SDS-PAGE and silver staining.
Incubate for 60min at room temperature.
Wash the band pieces with 200ul of 25mM NH4HCO3 for 10min.
■Methods 3 (Western blotting)
Wash the band pieces with 500ul of 25mM CH3CN/NH4HCO3(50:50 v/v) for 10min.
Perform SDS-PAGE and transfer the protein to a PVDF membrane.
Block the membrane with the blocking buffer for 15min at room temperature. Dry the band pieces.
Add 10ul/band of 10ug/ml trypsin in 25mM NH4HCO3.
Dilute the anti-GSK3α/β antibody with the blocking buffer to 1/200.
Incubate overnight at 37℃.
Incubate for 60min at room temperature.
Add 50ul/band of 25mM CH3CN/trifluoroacetic acid/ultrapurewater
Dilute the secondary antibody with the TBS-T buffer to 1/1000.
(50:5:45 v/v).
Incubate for 60min at room temperature.
Incubate for 30min at room temperature.
Wash the membrane with TBS-T buffer three times.
Transfer supernatant to a new clean tube.
Detect with a chemiluminescence substrate.
Dry the peptides in the tube.
Injection on the MS.

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SEIKI
CO.,
LTD.
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