Issue 5
December, 2014

Immunoprecipitation (1)Summary®

FGビーズ はケミカルバイオロジーなどの様々な用途で使用されますが、免疫沈降においても優れた性能を発揮します。
®

FGビーズ に抗体を固定化する方法としては、NHSビーズなどの、活性化された官能基を利用して抗体とビーズを直接固定化する方法や、プロテイビーズなどの、活性化された官能基を利用して抗体とビーズを直接固定化する方法や、プロテインAやプロテインGなどのタンパク質機能を利用する方法などがあります。などのタンパク質機能を利用する方法などがあります。NHSビーズは抗体を直接共有結合で固定化するため、抗体の溶出が少なく、また、プロテインAやプロテインGに起因する非特異的吸着がないため、バックグラウンドを最小限に抑えられます。プロテインＡビーズやプロテイに起因する非特異的吸着がないため、バックグラウンドを最小限に抑えられます。プロテインＡビーズやプロテインＧビーズでは、少ない実験操作で簡便に行えるというメリットがあります。
そこで、今回は多くの動物種とそのサブクラスに強い親和性があるプロテイン
そこで、今回は多くの動物種とそのサブクラスに強い親和性があるプロテインGビーズを用いて、‘回収量が多い’というFGビーズの特徴を示します。

Result1.同じビーズ量での実験2.同じ抗原回収量を得るための実験®

FGビーズ は0.1mg当たり10ug以上の抗体結合能があり、0.1mgのビーズ量で免疫沈降で一般に使用される抗体量を十分に固定化することができます。

次に、5ugの抗HSA抗体を用いて同じ抗原量を回収するために、ビーズ量を振って免疫沈降を行いました。
その結果、下記条件において抗原の回収量は同じとなりました。

®

そこで、FGビーズ を含めた3社のビーズで、0.1mgのビーズと5ugの抗HSA抗体を用いて、抗原回収量比較を行いました。
®

その結果、FGビーズ で最も多い回収量を得ることができました。
Competitor

Boil elution(kDa)

MInFGA

このことにより、5ugの抗体を用いて免疫沈降を行って同じ抗原回収量を®
得る場合は、FGビーズ はA社の1/15、B社の1/2.5のビーズ使用量で良いことが確認されました。
Competitor

Boil elution(kDa)

B

200
116
97.4

MInFGA

B

200
116
97.4

66

66

HSA
Heavy chain

HSAHeavy chain

4545

31

31

Light chain

Light chain
21.5

21.5

14.4

14.4

6.5

6.5
Condition

Condition

Beads

Antibody

FG beads®

0.1mg

5ug

5ug

A1.5mg

5ug

5ug

B

0.25mg

5ug

Beads

Antibody

FG beads®

0.1mg

5ug

A0.1mg

B0.1mg※各社推奨プロトコールに準じて実施しました。

TAMAGAWA SEIKI CO., LTD.

http://www.FGbeads.com

Isolation of drug target protein
Materials
aterials and methodMand method
FG beads® information■FG■Materials
1. Anti-HSA (Human Serum Albumin) (from Hytest)
2. HSA (from nacalai tesque)
3. HeLa cell extracts (cytosolic fraction) – 3mg/ml
4. Protein G beads
5. PBS(-) (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4・12H2O,
1.5mM KH2PO4)
6. Wash Buffer A (10mM HEPES-NaOH(pH7.9), 50mM KCl,
0.2mM EDTA, 10%(v/v) glycerol)
7. Wash Buffer B (20mM HEPES-NaOH(pH7.9), 150mM KCl,
1mM MgCl2, 0.2mM CaCl2, 0.2mM EDTA, 10%(v/v) glycerol,
0.1% NP-40, 0.2mM PMSF)
8. Elution Buffer (0.1M glycine-HCl pH2.5)
9. Neutralization Buffer (1M Tris-HCl pH9.0)
10. SDS sample buffer (62.5mM Tris-HCl (pH6.8), 0.005% BPB,
2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercapto ethanol)

Product nameProtein G beads

Product number

TAS8848N1173

Storage temperature

2-8oC

Storage buffer

10mM HEPES(pH7.9), 50mM KCl,
1mM EDTA, 10%glycerol

Size of beads

190nm ± 20nm

IgG binding capacity>100ug mouse IgG /mg of beads

Method 2 (Immunoprecipitation)(Immunoprecipitation■Method■Method 1 (Binding Antibody)
1. WashTransfer each amount of beads to a tube.
Wash beads with 200ul PBS(-) 2 times at 4oC.
2. Bind Antibody
Add antibody (5ug) diluted in 200ul PBS(-) to beads.
3. Reaction
Mix for 30min at room temperature.
4. Wash
Wash antibody binding beads with Wash buffer A
2 times at 4oC.

1. Add sample solution
Add 200ul HeLa cell extracts containing HSA to theantibody binding beads.
2. Reaction
Resuspend beads and incubate with rotation for 120min at 4oC.
3. Wash
Separate magnetically and remove supernatant.
Wash beads with Wash buffer B 3 times at 4oC.
Transfer 100ul resuspended solution to new tube to perform
2 elution pattern.
Separate magnetically and remove supernatant.
4. Elution
Acid elution
Add 28ul Elution buffer and resusupend beads.
Stand for 5min at 4oC, separate magnetically.
Transfer the supernatant to new clean tube and add 2ul
Neutralization buffer, and 10ul 4×SDS sample buffer.
Boil elution
Add 40ul 1×SDS sample buffer and resuspend beads.
Boil for 5min and remove the beads.
5. Analyze the samples by SDS-PAGE
SDS
and silver staining

Result (2)1. Experiment with the same amount of beads
Competitor

Acid elution
(kDa)

MInFG

A

2. Experiment to obtain the same recovery amounta of antigens
(kDa)

B

200

HSA
Heavy chain

66

InFG AB

HSA
Heavy chain

4545

31

M

200
116
97.4

116
97.4
66

Competitor

Acid elution

31

Light chain

Light chain

21.5

21.5

14.4

14.4

6.5

6.5

Acid elution samples show similar band pattern to Boil elution samples.

TAMAGAWA
SEIKI
CO.,
LTD.
TAMAGAWA
SEIKI
CO.,
LTD.

http://www.FGbeads.com
http://www.FGbeads.com