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浦上財団研究報告書

Vol.29（2022）＜平成 29 年度助成＞

多様な放射線損傷ヌクレオシドを指標とする新たな照射食品検知法の開発
高取聡 1) ・ 福 井直 樹 1) ・ 北 川陽 子 1) ・ 古 田雅 一 2)（ 1) 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所 衛生化学部、 2) 大阪府立大学 研究推進機構放射線研究センター）

１．研究背景および目的であると考えられた。本研究では、植物性食品にも適用できる DNA 抽出工程を確立し、さらに DHdThd

食品の放射線照射（以下、照射）は、加熱や薬品以外の損傷ヌクレオシドについて検知指標に加えによらず殺菌・殺虫等が可能であり、食品の品質をて、多様な食品に適用可能な新たな検知法の開発を殆ど損なうことがない。このため世界的には食肉等目指した。の動物性食品あるいは香辛料等の植物性食品の殺菌・殺虫・芽止め等に広く適用されている。しかし、

２．実験方法

国内では馬鈴薯の芽止めを目的とした照射が例外的に認められているにすぎない。照射を適正に管理す試料は、凍結条件（-17 ～ -20℃）下でγ線またるためには、その照射履歴の検知が不可欠である。

は電子線（10 MeV）照射した。試料からの DNA 抽

厚生労働省は、照射履歴の検知法として、熱ルミ出には、Genomic-tip（G-tip；QIAGEN）およびこれネッセンス法、アルキルシクロブタノン法および電に対応する緩衝液（G2、QBT、QC および QF 緩衝液）

子スピン共鳴法の三種類の方法を通知している。各を用いる方法を確立した。粉末状でない香辛料等は、検知法の適用の可否は食品の組成に左右されるた

予めマルチビーズショッカー（安井器械）で粉砕しめ、食品によって使い分ける必要がある。DNA は多た。試料（2 ～ 6 g）に G2 緩衝液を 20 mL 添加し、様な食品に含まれるため、その構成要素であるデオホモジナイズした。Proteinase K、RNase A およびキシリボヌクレオシドが照射を受けることによってセルラーゼを加えて 50℃で 1 時間インキュベート生じる損傷ヌクレオシドを検知指標とすることで多した。遠心分離後、上清を QBT 緩衝液で平衡化した様な食品に適用できる検知法が開発できると期待さG-tip 100/G カラムに全量負荷した。流出液は捨て、れる。我々は、チミジン（dThd）残基から生成するカラムを QC 緩衝液 7.5 mL で 3 回洗浄し、洗浄液

損 傷 ヌ ク レ オ シ ド の ひ と つ で あ る 5,6-dihydro-2’-を捨てた。カラムに QF 緩衝液 6 mL 負荷し、DNAdeoxythymidine（DHdThd）を指標とする新たな検を溶出させた。DNA はイソプロパノール沈殿により。本法は、フェノール・クロロホ回収し、洗浄および減圧乾燥後、滅菌水に溶解してルム抽出法で食品から DNA を抽出し、この DNA を吸光度を測定した。本研究では、図 1 に示す損傷ヌヌクレオシドに分解して得られた試験液中の dThdクレオシドを対象とし、LC-MS/MS での測定条件をに対する DHdThd の存在比（DHdThd/dThd）をタ確立した。DNA 中の損傷ヌクレオシドの測定では、ンデム型質量分析計付液体クロマトグラフ（LC-MS/既報 2) に準じて DNA をヌクレオシドに酵素分解し、MS）で測定する。本法は、牛レバーを含む食肉およ

LC-MS/MS で分析した。

知法を開発した

1, 2)

びエビの照射履歴の検知が可能であるが、香辛料等の植物性食品へ適用し、十分な感度を達成するためには DNA の抽出法等において、さらなる検討が必要

多様な放射線損傷ヌクレオシドを指標とする新たな照射食品検知法の開発

図1

損傷ヌクレオシドの構造

３．結果および考察
3.1．多様な食品への適用
DNA 抽出工程に G-tip を用いることで食肉および魚介類等の動物性食品に加えて、香辛料等の植物性試料にも本法を適用することが可能となった 3)。レ
バー等の動物性食品には、より迅速なヨウ化ナトリウム法を用いる工程も併せて確立した。図 2 に G-tipで必要量の DNA（約 80μg）が抽出できる食品に対して、γ線または電子線照射した際の 1 kGy あたりの DHdThd/dThd を比較した結果を示した。食肉類
では、照射線量 1 kGy あたりの DHdThd/dThd は、
概ね 20 × 10-6 ～ 30 × 10-6 であった。魚介類では、マグロが食肉類と類似した値であったが、ホタテ貝柱およびタラコ等では、食肉類よりも高値であった。
DHdThd は、間接作用によって生成するため、食肉類よりも水分含量が高い魚介類で DHdThd の生成効率が高いことが示唆された。一方、乾燥シイタケおよび粉末大麦若葉における照射線量 1 kGy あたりのDHdThd/dThd は、低い傾向であった。
図 3 にトウガラシを照射した際の DHdThd/dThd

図2

多様な食品における照射線量 1 kGy あたりのDHdThd/dThd の比較 3) より許可を得て転載

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図3Vol.29（2022）

トウガラシ試料（a ～ d）における DHdThd/dThd の線量依存曲線の線量依存曲線を示した。トウガラシの種類によら結条件下でγ線照射した結果を示した（図 4）。dThd

ず線量依存曲線は概ね重なることが認められた。ま

水 溶 液 か ら は DHdThd, thymidine glycol（dThd-G）

た、照射履歴の検知において線源（γ線または電子および 5-formyl-2’-deoxyuridine（CHO-dUrd）等が線）の影響は認められなかった。なお、検知下限は検出され、デオキシシチジン（dCyd）水溶液からは0.5 kGy 以上であった。

5,6-dihydro-2’-deoxyuridine（DHdUrd）が検出された。これらは概ね線量依存的に生成していたが、生3.2．DHdThd/dThd による照射線量推定

成効率および照射特異性の観点で DHdThd が最も照射線量 1 kGy あたりの DHdThd/dThd は、魚介優れていた。デオキシアデノシン水溶液からは 8-類を除く食肉あるいは植物性食品間では近似しておhydroxy-2’-deoxyadenosine（8-HO-dAdo）が検出さり、さらに同一食品間では、より近似した値を示しれ、11 kGy で生成量が急増した。デオキシグアノシた。これに基づき、既知の線量を照射した試料におン水溶液では、8-hydroxy-2’-deoxyguanosine の生成いて DHdThd/dThd の線量依存曲線を作成し、このが示唆されたが、照射前の水溶液にも含まれており、線量依存曲線と未知試料の DHdThd/dThd と比較す照射による生成と分別することは困難であった。サることで、照射線量を推定可能であると考えられた。

ケ精巣由来 DNA にγ線を照射し、損傷ヌクレオシ

これについては、照射した牛レバーを試料として実ドの生成を検証した結果、DHdThd および DHdUrd証することに成功した 。また、DHdThd/dThd は、は 照 射 特 異 的 か つ 線 量 依 存 的 に 生 成 し て い た。

凍結下での長期保存および加熱処理においても安定

DHdUrd の生成量は、DHdThd の約 1/3 ～ 1/2 であであった。

り、DHdThd の補完的指標として有用であると考え4)られた。一方で、他の損傷ヌクレオシドの顕著な生3.3．照射による損傷ヌクレオシドの生成デオキシリボヌクレオシド水溶液（1 mg/mL）を凍成は認められなかった。
γ線を照射したトウガラシから抽出した DNA を

多様な放射線損傷ヌクレオシドを指標とする新たな照射食品検知法の開発

図447

γ線照射時におけるデオキシリボヌクレオシド水溶液からの損傷ヌクレオシドの生成

図5

γ線（7.5 kGy）を照射したトウガラシの分析結果（SRM クロマトグラム）

酵素分解し、LC-MS/MS で分析した結果、DHdThd

精巣由来 DNA と同様に DHdThd および DHdUrd 以および DHdUrd の生成が認められた（図 5）。サケ

外に検知指標として有用な損傷ヌクレオシドは認め

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Vol.29（2022）られなかった。これらの結果から食品の照射履歴の検知には、DHdThd が最も優れており（第一検知指標：DHdThd/dThd）、DHdUrd がその補完的な指標（第二検知指標：DHdUrd/dCyd）として活用できると考えられた。

3.4．香辛料等への適用
香辛料等の植物性食品から G-tip を用いて DNA を抽出した結果を示した（表 1）。大麦若葉、トウガラ
シ、パセリおよびクミン等では必要量の DNA を抽出することが可能であった（ⅠおよびⅡ）。一方、胡椒、ウコンおよびナツメグ等については、本法の適用が可能となる質および量を満たした DNA の抽出が困難であり、抽出対象とする試料部位、出発試料量あるいは精製カラムの選択において、さらなる改良が求められた（ⅢおよびⅣ）。
表1

香辛料等の植物性食品からの DNA 抽出量（試料 1 g あたり）

図 6 非照射およびγ線（3.4 または 7.8 kGy）を照射した植物性試料中の(A) DHdThd/dThd および (B) DHdUrd/dCyd

分類 *

試料

Ⅰ

大麦若葉、トウガラシ、パプリカ、ハバネロ、パセリ、バジル、クミン、山椒、花椒Ⅱ

ローズマリー、オールスパイス、ジンジャー、シイタケ、スプラウト、ニンニク本研究では、動物性食品から香辛料等の植物性食Ⅲシナモン、ウコン、コリアンダー、クローブ品まで多様な食品の照射履歴を検知可能な方法を開Ⅳ

胡椒、ナツメグ、カルダモン、タイム、オレガノない試料については、DNA 抽出効率の向上および精* Ⅰ, 100μg/g 以上；
Ⅲ, 10 〜 40μg/g；

Ⅱ, 40 〜 100μg/g；
Ⅳ, 10μg/g 未満

４．まとめ・今後の展望発した。一方で DNA 抽出効率が本法の適用に及ば製カラムの検討等が今後の課題とされた。また、新たな検知指標として DHdUrd/dCyd（第二検知指標）

図 6 にγ線照射したトウガラシ、クミン、パプリを見出した。第一検知指標とする DHdThd/dThd は、

カ お よ び バ ジ ル に つ い て、DHdThd/dThd お よ び

試料の保存および加熱処理にも安定な指標であり、DHdUrd/dCyd を分析した結果を示した。これら試同一食品では未知試料の照射線量の推定にも活用で

料 中 で は、 概 ね 照 射 特 異 的 か つ 線 量 依 存 的 なきることを明らかにした。

DHdThd/dThd お よ び DHdUrd/dCyd の 上 昇 が 認 め

本法は、多様な食品に適用可能であり、照射履歴ら れ た。 一 方 で 非 照 射 試 料 に お い て も、 微 量 のの検知のみならず、照射線量の推定もできる。さら

DHdThd および DHdUrd が検出された。香辛料等にに、本法の DNA 抽出工程は簡便であり、LC-MS/MSは、殺菌を目的として概ね 5 ～ 10 kGy の線量が照があれば実施可能であることから広く普及すること射される。非照射試料からの検出される DHdThd のも期待できる。これは既存の照射食品検知法にない量は、7.8 kGy を照射した試料の 10% 未満であり、本法の特長であり、今後、本法の実用性を一層高め殺菌を目的とした照射履歴を検知するうえで大きなていく予定である。

支障にはならないと考えられた。

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謝辞本研究の遂行に多大なご支援を賜りました公益財

団法人 浦上食品・食文化振興財団および関係者の皆様に深く感謝申し上げます。

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参考文献

1) Fukui, N., Takatori, S., Kitagawa, Y., Okihashi, M.,
Ishikawa, E., Fujiyama, T., Kajimura, K., Furuta, M.,
Obana, H.; Determination of irradiation histories ofraw beef livers using liquid chromatography-tandem
mass spectrometry of 5,6-dihydrothymidine. Food
Chem ., 216, 186 (2017).
2) Fukui, N., Takatori, S., Kitagawa, Y., Fujiwara, T.,Ishikawa, E., Fujiyama, T., Kajimura, K., Furuta, M.,
Obana, H.; Rapid and reliable method for determining
irradiation histories of ground beef and prawns bymeasuring 5,6-dihydrothymidine. J. Agricul. Food
Chem ., 65, 9342 (2017).
3) 高取聡，福井直樹，藤原拓也，北川陽子，梶村計志，石川悦子，古田雅一；放射線損傷ヌクレオシドであるジヒドロチミジンを指標として照射食品を検知す
る，放射線と産業 ，146, 30 (2019).
4) Fujiwara, T., Fukui, N., Kitagawa, Y., Kajimura, K.,
Obana, H., Ishikawa, E., Furuta, M., Takatori, S.;
Estimation of irradiation doses of raw beef liver
samples using 5,6-dihydrothymidine as an irradiation
marker. ACS Omega , 4, 12325 (2019).

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Vol.29（2022）

Detection of the irradiation history of foodsby measurement of modified nucleosides
Satoshi TAKATORI1), Naoki FUKUI1), Yoko KITAGAWA1), and Masakazu FURUTA2)
1)
Division of Hygienic Chemistry, Osaka Institute of Public Health2)
Radiation Research Center, Osaka Prefecture University
A method has been developed for detecting the irradiation histories of plant
and animal-based foods, using liquid chromatography-tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS) to measure 5,6-dihydrothymidine (DHdThd) and5,6-dihydro-2’-deoxyuridine (DHdUrd). DHdThd and DHdUrd are modified
nucleosides formed by gamma irradiation from the 2’-deoxythymidine (dThd)
and 2’-deoxycytidine (dCyd) moieties of DNA, respectively, in foods. DNA wasextracted from foods using a buffer containing chaotropic ions, proteinase K,
RNase A, and cellulase, before being purified using a negative-ion exchange
column (Genomic-tip; QIAGEN). The resulting DNA was enzymatically digested
to form nucleosides and purified with an ultrafiltration membrane to prepare
solutions for analysis by LC-MS/MS. DHdThd and DHdUrd were radiospecifically formed, and the ratios of DHdThd/dThd and DHdUrd/dCyd in thetest solutions increased in a dose-dependent manner in the irradiated samples.
These ratios were suitable to allow the detection of the irradiation history of
the samples. The amount of DHdUrd/dCyd was approximately one-tenth that of
DHdThd/dThd in the irradiated samples. Thus, DHdUrd/dCyd was an auxiliaryindicator of DHdThd/dThd. DHdThd/dThd was found to be robust to long-term
storage by freezing and to heating in irradiated beef liver samples. Irradiation
doses of beef liver samples were estimated using dose-response curves of total
DHdThd/dThd developed from the other irradiated samples. The irradiation
history of foods of animal (meat, fish, shrimp, and fish roe) and plant (cayenne
pepper, paprika powder, cumin, basil, young leaves of barley, parsley, andmushrooms) origins can, therefore, successfully be detected using this method,
indicating that this protocol possesses a potential for this type of analysis in avariety of foods.