14浦 上 財 団研 究報 告書Vol.6(1998)

肥 満 の分 子 メカ ニズ ム に関す る研究日緒高智美(東 京大学大学院農学生命科学研究科助教授)て はinvivoで言の結果 しかな く,invitroのモデ

ル が必要 であ ったので,い くつかの神 経細胞 株 に
肥満 は,世 間一般 では美容 上の 問題 として捉 え

っ い てNPY遺られ るこ とが 多い。 しか しなが ら,肥 満 は,動 脈

NG108‑15細伝 子 発 現 を指 標 に検 索 を 行 い

硬 化や高 血圧,心 臓病 な どを引 き起 こし,ま た未

mouseneuroblastomaとratgliomaのだに その原因 が明 らかに なって いないII型 糖尿病

であ り,カ テ コール ア ミン産生 ニ ューロ ンのモデ

胞 を選 択 し た。NG108‑15細胞 は雑種 細胞や,同 じ く成 人性疾 患で ある高脂 血症 との関わ り

ル細胞 として使 用 され,多 くの神経伝 達物 質や神も示唆 され てい る重篤 な疾病 で あ り,ア メ リカな

経 栄養因 子の受 容体 な どを有 するた め,そ れ らのどの先進 国で は,社 会 問題 に もなって いる。1994

情 報伝 達機構 の解 析 にも瀕用 され る。 またNPY

年末 の肥 満 遺伝 子(obgene)のク ロー ニ ング1)

は,肥 満の分 子機構 解明 の糸口 とな り,こ の分野の研究 は,現 在急速 に進展 しつ つあ る。の遺伝 子発 現量 が多い ため,NPY遺NG108‑15細肥満 遺伝子 産物 レプチ ンは,脂 肪細胞 由来 の飽伝 子の 転写

調 節機構 の解析 に よ く用い られて いる。

RT‑PCR法

胞 より常法 に よ りRNAを調製しに よ りレプ チン受 容体 遺伝 子 の発現

食因子 として精力 的に研究 され,様 々 な標的器 官を調べ た ところ,ラ ッ ト脳 由来のRNAをにお けるサ イ トカイン としての作 用機構 も明 らか

場 合 に比 べ る と少量 ではあ るが,そ の発現 が確認にな りつつ ある。 レプチ ンは,そ の主 たる作用 とされ た。 そ こでラ ッ トレプ チ ン遺 伝 子cDNAをして,標 的 器官 を視 床下部 とし,食 欲抑 制効果 お

脂肪組 織RNAよよび体 熱生産 効果 を通 じて体脂肪 量 を一定 に保 つ組み込 んで発 現 させ,そ れ を精製 して,組 み替 え

働 き をも つ と考 え られ て い るがi,z),その機 構 にレプ チン を得,血 清 の有無 や レプチン処理 時問等

つい ては未 だ不明 な点が 数多 い。 古 くか ら食欲 増の条件 を変 えてNPY遺進 作 用 を も つ こ とが 知 ら れ る神 経 ペ プ チ ドY

プ ロッ ト法 によ り調 べた。 その結 果NPY遺(NPY)につ いて は,肥 満 遺 伝子 発 見当 初 その発現量 は レプチ ンの 処理 によって減 少 しない こ と標的 として 注 目され た に もか かわ らず3‑5),レ プ

が判 明 した。Fig.1に 代表 的な例 を示 す。 その原

チ ンに よるその遺 伝子発 現の抑制 についての解 明

因 として は,1)レ プチ ン受容 体のactiveformでが進 んで いない。 本研究 で はそのNPY遺あ るOB‑Rbisoformの伝子 発用いたり調製 し大腸 菌発現 ベ クター に伝 子発現 の変 化 をノザ ン
伝子

発 現 が他 のisoformに

現調 節を 中心 にレプチ ンの神経 にお ける作用 機構

比べ て少な いた めに拮抗的 に レプチ ンの刺 激が細を検 討 した。

胞内 に伝達 されな い可能性,2)レ プチ ンが受容体

1.神経 細胞株NG108・15にレプチ ンに よるNPY遺おけ る解析

伝 子発 現の抑 制 についに結 合後 にお こる細 胞内情報 伝達 に関わ る因子群に欠 けて いる もの が存在 する可能性,等 が考 え ら
れ た。

15

肥満の分子メカニズムに関する研究
NPY遺伝 子 プロモ ーター領 域 を導入 した ルシ フェ ラーゼ ア ッセ イ用 コ ンス トラク トを作製 し,ル
シ フェ ラー ゼア ッセイ法 によ りNPY遺伝 子転写

活性 の変 化 を測 定 した。 その 結果,NG108‑15‑
C2細 胞 にお いて もNPY遺伝子 発 現お よ び転写

活性 が レプチ ンによ り抑制 され ない ことが判明 した。 従 って,NG108‑15細Fig.lEffectoficvleptinonNG108‑15cells
NG108‑15cellsweretreatedwith50nMleptinfor36
hoursor‑18hoursandNorthernblotanalysisofNPYgeneexpressionwasperformed.

胞 で は,NPY遺く示 唆 され た。以上 の結果 よ り培 養神経細 胞系 にお いて はレプチ ンに よるNPY遺2.レ

プチ ン受容体遣 伝子導 入細胞 に おけ る
レプチ ン投 与動物 を用 いた検討 を行 うこ とに した。

発現 量が 少 な い可能 性 に つい て検討 す る ため に,
OB‑Rb遺伝子 導入細 胞 の作製 を行 った。動 物細胞 用発現 ベ クターに,ラ ッ ト脳RNAか伝 子発現 抑制 とい う現象 がモデ ル化で きない と判 断 されたた め,
解析
1の 結果 よ り考 え られたOB‑Rbisoformの伝子発現 抑制 に関わ る因子が 欠落 して い る可能 性が強3.レ

プチ ン脳 内投与 ラッ トを用い た解 析

レプチ ン投与 による摂食 量の減 少お よび視床下部 にお けるNPY遺伝 子発現抑 制 は投与後 最低10ら調 製 し

時間 はか かる とい う報告 が多 く,そ の転 写調節 はたOB‑RbcDNAコー ド領域 全長3.6kbを 導入 し,タンパ ク質合成 を介 して行わ れる と推 測 されていそれをNG108‑15細胞 に リポ フェク シ ョン法 に よる。 また レプチン による食欲抑 制機構 は飢餓 状態

り トラ ンス フェク トした。耐性 マー カーで ある ピ

ではNPYのューロマ イ シンに より遺伝子 導入細胞 を選択 し,(melanin‑stimulatinghormone)お減 少 を介 し,逆 に通 常時 に はMSH

10種 類の 単一 クロー ン由来細胞 株 を得 た。 それ ら(melanin・concentratinghormone)受よびMCH
容体 系を細胞 株 につい てノザ ンプ ロッ ト法 によ りレプチ ン

介 す る とい う仮 説が 一般 的 で あ る61)。さ らに,

受 容体mRNAのNG108‑15細発現 を比 較 し,そ の 中か ら レプ

チン受容 体 の発現 の上 昇 したNG108‑15‑C2株を胞 を脱 分 極 させ て細 胞 内 へ のCa2+の流入 を増加 させ るとNPY遺伝 子の転 写活 性が選 び,以 降 の実験 に用い る こ とに した。NG108‑

Cat+/calmodulindependentkinaseII(CaM

15‑C2細 胞 の細胞 質可溶性 画分 を調製 し,イ ム ノ

KIDのブロ ッ ト法 によ りレプチ ン受容 体量 お よびその チる8・9)。
これ らの こ とか ら 「飢餓 状 態 で は視床 下

ロシ ンリン酸化 量を調 べた とこ ろ,用 い た抗 レプ

部 弓 状核(ARC)に多 数 存在 す るNPY生産性

チ ン受 容 体抗 体 に反 応 す るレプ チ ン受容 体 量 は

ニュー ロ ンが興 奮 し脱 分極 を起 こしNPY遺伝子

1.5倍 程度 に しか上 昇 して いなか った が,レ プ チの発現 を上昇 させ る。 しか し,血 中 レプ チン濃度

ン存在下 での そのチ ロシ ンリン酸化量 は2倍 程度が 一定値 以上 に高 い動物 の場 合に は,恒 常 的な レに上昇 して お り,activetypeのレプ チ ン受 容体

作 用 を介 して上 昇 す る とい う報 告が あ

プチ ン刺 激 によ りNPYニ

ュー ロンの 細胞体 内の量 の比率 が上昇 して いる ことが確認 され た。次 に,

CaMKII関

この細胞 を レプチ ンで処理 しNPY遺時 の脱 分極が抑 制 される。 その結 果NPY遺伝子発 現量の変化 をノザ ンプ ロ ッ ト法 に よ り調べ た。 また連 因子 の状 態 が 変化 して お り,絶 食伝子の発現上 昇が抑 制 され る。」 とい う仮説 を考 えた。

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浦 上財 団研 究報 告 書Vol.6(1998)

この仮説 を証明 する ために,レ プ チンの脳 内投与の実験 を行 った。7週 齢 のWistar系

雄 ラ ッ トを投与 ラ ッ トの場 合はそ の上昇が観 察 されな いこ とを 見 い 出 し た(Fig.3A)。
CaMKIIのkinase活ン6.6μg/1μ1PBSをか を調 べ るた めにCaMKIIに次 に こ の現 象 が約6時 間 絶食後,脳 定 位固定 装置 を用いて レプチ
マ イ クロ ポ ン プ に よ り0.1μ1/minの 速 度でARC直上部 に投与 し,さ ら に基 質 をARC抽性 の違 い に よる ものか ど う
特異 的 なペ プ チ ド

出液 と反応 させ,CaMKII特異的

12時 間絶 食 を続 けたの ちに断 頭 し直ち にARCをなkinase活 性 を測定 した。 その結果CaMKIIに摘 出す る とい う実験 を行 った。対照 群の ラッ トに

特 異 的 なkinase活 性 は レプ チ ン投 与 群 とPBS

はPBSを

投 与 群 で ほ とん ど変 化 しな い こ とが 示 され た

等液量 投与 した。

まず,レ プ チンの効 果 を確認 す るた め にARC
断 片 よ りRNAを
NPYmRNA量調 製 しRT‑PCR法
を β一actinmRNA量に よ りをコン トロ(Fig.3B)。 さ らにphosphataseの活性 が変 化 してい る 可能 性 を考 え,Ser/Thrphosphataseの中で特 にPP2Aある い はPP1の 阻 害剤 で あ るオー ル と して 測定 した。 レ プチ ン投 与 群 のNPY

カダ酸 を存在 させて,抽 出液 内部基 質へ の[γ 一32mRNA量P]ATPのinvitroでは,従 来 の報告 と同様 に,PBS投与群の取 り込 み を測定 した が,の約70%に 低 下 してお り,レ プ チンの投与 効果が変 化 は認 め られ な か っ た(Fig.3c)。

確認 された(Fig.2)。

PP2Aあ次 に,ARC断片 よ り細 胞可 溶性 画 分抽 出液 を

従 っ て,る いはPP1の 関 与 は 否定 され た。以 上の結果 か ら,レ プチ ン投 与 ラ ッ トにお いてCa2+/

調製 し,外 来 基質 の非存在下 で の抽 出液 内部基質

calmodulin依

へ の[γ 一32P]ATPのinvitroで原 因 として,脳 内 に多量 に存 在 し てい るCa2+/の 取 り込 み を測定 し1°・11),ARC抽 出液 のkinase/phosphatasecalmodulin依の状 態 を評価 した。 その結 果,PBS投ー リン(CN与ラット

よ り調 製 したARC抽

出液 を用 い た場 合,反 応 系にCa2+/calmodulinを

添 加 す る と[γ 一32P]

ATPの取 り込み が有意 に上 昇 するが,レ プチ ン

CNは存的 リン酸化 の上 昇が起 こ らない存的脱 リン酸 化酵 素の カル シ ニ ュ,PP2B)12)の

関 与 が 考 え ら れ た。

その 触媒 サ ブユ ニ ッ トCN‑Aとユニ ッ トCN‑Bか調節サブらな り,Ca2+/calmodulin存

在 下 では その活 性 はCN‑Aの量 に依 存 して い ると考 え られ る。 そ こで,各 処 理 群 のARCより

RNAを調 製 しRT‑PCR法

mRNA量を測 定 した。 その結 果,レ プチ ン投与

群 で はPBS投約2倍に よ りCN‑A

与 群 に比べ てCN‑AmRNA量がに増 加 し て い る こ とが 明 ら か と な っ た(Fig.4)13)。
対照 と して,NG108‑15‑C2細胞 を レプ チ ン存

在 下 あ る い は非 存在 下 で12時 間 培 養後,50mM
KCl存 在 下 で6時 間培 養 し細 胞 を脱 分極 さ せ た
のち にRNAをFig.2EffectoficvleptinonNPYmRNAinratARC
RT‑PCRanalysisofNPYandβ

一actintranscriptsin

mRNA量調製 しRT‑PCR法によ りCN‑Aを測 定 した。 その結 果,NG108‑15‑C2

PBSandleptin‑treatedARCwasperformed.Relative¥PI'mR¥AleaelcomparedtoQ‑actinmRl¥Alerelin

細 胞 にお い て は レ プチ ン処 理 に よ っ てCN‑A

eachsample≪‑ascalculated.Dataareexpressedasmeans±S.E.M.(n=3foreachgroup).

mRNA量は変化 しない ことが判明 した。

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肥満の分子メカニズムに関する研究

Fig.3EffectoficvleptinonCaM‑dependentproteinphosphorylation/dephosphorylationinratARC
ARCextractsfromindividualratwereusedtoestimate(A)totalkinase/phosphataseactivity(incorporationofradioactiv‑
ityof[γ一32P]ATPintoendogenoussubstrate),(B)phosphorylationofCaMKIIspecificsubstrate,(dataaremeans±S.

E.M.,n=3foreachgroup),(C)totalkinase/phosphataseactivitywithor、vithout10nMokadaicacid(Wako,Japan)(n=1,buttheresultwasconfirmedbyrepeatedexperiments).

以上 の結 果か ら,レ プチ ンは視床 下部ARCにお いてCN‑A遺伝子 発現 を増加 させ る ことが 明

らか にな った。 またNPY遺伝子 発現 抑制 に関 して レプチ ン応答性 の 無いNGIO8‑15‑C2細CN‑A遺胞では

伝 子発 現 もレプチ ン処 理 に よっ て変 化

しな い ことか ら,NPY遺伝 子発 現抑制 とCN‑A遺 伝子発 現充進 には関連 性が ある ことが示唆 された 。.
以上,本 研究 では,肥 満遺伝 子産物 レプ チンの作 用機 構 を明 らか にす るた め,NPYを産 生 する

神 経細胞 お よびレプチ ン脳内投 与動物 を用 いて解析 を行 った。 その結果,レ プチン投与 動物 において はARCのCa2+/calmodulin応答性が見掛け上 変化 して いる ことが 明 らか とな った。 また,レプ チ ンに よ るNPY遺Ca2+/calmodulin応伝 子 の転 写制 御 機 構 には答性Ser/Thrphosphatase

であ るカル シニュー リンが関 与す る可能性 がある
こ とを見出 した。

本研 究 を遂 行す るにあた り,多 大 な研究助 成金を賜 り ました浦上食 品 ・食文 化振興 財団 に深 く感

Fig.4EffectoficvleptinonCN‑AmRNAinratARC
RT‑PCRanalysisofCN‑Aand/3‑actintranscriptsin

謝致 し ます。

PBSandleptin‑treated:SRCwasperformed.Relative
CN‑AmRNAlevelcomparedtoβ

一actinmRNAIevel

NG108‑15‑C2細胞 を ご供 与 いた だ きま した新ineachsamplewascalculated.Dataareexpressedasmeans±S.E.v1.(n=3foreachgroup).

潟大学 医学部 教授樋 口宗史先 生,金 沢大学 医学部

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浦上 財 団研 究報 告 書Vo1.6(1998)

教授 三木正 直先 生に感 謝致 します。
本研究 は東京 大学大 学院農 学生命 科学研 究科博士課 程 ・森下猛 彦氏 の博士論 文の一 部で ある ことを付 記 します。

LowellB.,Maratos‑FlierE.,andFlier,J.S.(1996)
Nature382,250‑252.
5)MercerJ.G.,MoarK.M.,RaynerV.,TrayhurnP.,
andHoggardN.(1997)FEBSLett.402,185‑188.
6)Friedman,J.M.(1997)Nature385,119‑120.
7)Gura,T.(1997)Science275,752‑753.

文8)Higuchi,H.,Isawa.A.,Yoshida,H.,andMiki,N.

献1)Zhang,Y.,Proenca,R.,Maffei,M.,Barone,M.,
Leopold,L.,andFriedman,J.M.(1994)Nature372,425‑431.
2)Caro,J.F.,Sinha,M.K.,Kolaczynski,J.W.,Zhang,P.
L.,andConsidine,R.V.(1996)Diabetes5,1455‑1462.

(1990)Mol.Pharmacol.38,614‑623.
9)Higuchi,H.,Nakano,K.,Kim,C.‑H.,Li,B.‑S.,Kuo,C.
‑H .,Taira,E.,andMiki,N.(1996)J.Neurochem.66,1802‑1809.
10)Fukunaga,K.,Stoppins,L.,Miyamoto,E.,andMuller,D.(1993)J.Biol.Chem.268,%863‑786%.

3)Stephens,T.W.,Basinski,M.,Bristow,P.K.,Bue‑Valleske}・,J.M.,Burgett,S.G.,Craft,L.,Hale,」.,Hoff‑mann,J.,Hsiung,H.M.,Kriauciunas,A.,Mackellar,W.,
RosteckJr.,P.R.,Schoner,B.,Smith,D.,Tinsley,F.C.,
Zhang,X.‑Y.,andHeiman,M.,(1995)Nature377,530‑532.

4)Ahima,R.S.,Parabakaran,D.,Mantzoros,C.,Qu,D.,‑‑)Pearson,R.B.,Woodgett,J.R.,Cohen,P.,andKemp,
B.E.(1985)J.Biol.Chem.269,11471‑14476.
12)Santella,L.,andCarafoli,E.(1997)FASEBJ.11,1091‑1109.
13)Morishita,T.,Hidaka.T.,Sugahara,K.,andMoguchi,
T.LigeScience,inpress.

Studiesonmolecularmechamismsofobesity‐ChangesinCat+/Calmodulin‑DependentResponsein
RatHypothalamusbyLeptinaiatheUp‑regulationofCalcineurinGeneExpression19

Studiesonmolecularmechamismsofobesity‐ChangesinCat+/Calmodulin‑
DependentResponseinRatHypothalamusbyLeptinviatheUp‑regulationofCalcineurinGeneExpression

TomomiHidaka(DepartmentofAppliedBiologicalChemistry,GraduateSchoolof
AgriculturalandLifeSciences,UniversityofTokyo)

ItisknownthatLeptindown‑regulatesneuropeptideY(NPY)geneexpressionin
hypothalamicNPYneuronsandNPYgenetranscriptionisactivatedbyC,az+/calmodulin(CaM)‑dependentmannerinneuralcells.UnderthehypothesisthattheCaM‑dependent
eventsaftermembranedepolarizationofNPYneuronsismodulatedbyleptin,theeffectofleptinadministratedintracerebroventricularlyontheCaM‑dependentphosphorylation/dephosphorylationinratarcuatenucleus(ARC)wasinvestigated.Thephosphorylation
inARCextractspreparedfromfastedratsincreasedbyCaM‑dependentmanner,butnot
inthatofleptintreatedrats.AlthoughCaM‑dependentproteinkinaseII(CaMKII)
activitywasnotaffected,theexpressionofcalcineurinwassignificantlyincreasedby
leptininARC.Theseresultssuggestthatleptinactioninfeedingbehaviormightexhibit
throughthechangesinCaM‑dependentresponsesinappetiterelatedneurons.