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リポソーム製剤化した香辛料成分によるアンチエイジング効果の検討＜平成19年度＞

リポソーム製剤化した香辛料成分によるアンチエイジング効果の検討
小暮健太朗

・奥野

貴士

（京都薬科大学）

1.

はじめには，ビタミン E よりも強力な抗酸化活性を有しており，その作用メカニズムも興味深いものであ

老化は，誰しも避けることのできない生命現象ることから，我々が注目してきた抗酸化物質であの一つである。老化の進行メカニズムには諸説ある４）（図 1）。また，ターメリック（うこん）に含るが，それらの中で活性酸素による「エラーカタまれるクルクミンも，高い抗酸化能を有することストロフィー説」も有力な説として知られている。 が知られており，古くから研究がなされている抗すなわち，生体内で発生する活性酸素が細胞や結酸化物質である（図 1）。そのため，これら香辛合組織（コラーゲン）等を攻撃（酸化）すること

料に含まれる抗酸化物質には抗老化作用が期待さで傷害が生じ，それらが蓄積された結果として老れた。しかしながら，これらの抗酸化物質は脂溶化に至る，という説である。活性酸素は，紫外線性を有するため，そのままでは水に溶解することなどを浴びることで皮膚中において産生され，そは困難である。そこで，我々は脂溶性薬物の製剤れが皮膚中の細胞やコラーゲンなど細胞外マトリ化に実際に使用されているリポソームに着目した。

ックスに酸化損傷を誘発することで肌の老化が引

リポソームは，生体膜の構成成分であるリン脂質き起こされると考えられていることはよく知られが二分子膜構造をとっている小胞であり，内水相ている。また，細胞中ではミトコンドリアにおいに水溶性薬物を，脂質膜に脂溶性薬物を封入可能て常に酸素を消費してエネルギー産生（酸化的リである。そのサイズはナノメートル次元であるこン酸化反応）が行われているが，この過程の中でとから，薬物のナノキャリアーとして癌治療なども活性酸素が生じ，それがミトコンドリアなどのに用いられている。我々は，このような利点を有細胞内小器官や細胞膜の酸化損傷を引き起こすことも知られている。そのため，多くの研究者が生体内の活性酸素を消去することによる抗老化研究に取り組んでいる。これまでにも，様々な抗酸化物質を用いた研究がなされているが，特に食物由来の抗酸化物質は，安全が保障されている点において注目されている。
我々もこれまでに様々な天然由来の抗酸化物質による活性酸素消去能力およびその作用メカニズ
ムについて検討を行ってきた 1 〜 9）。中でもカレー等の香辛料に含まれる唐辛子由来のカプサイシン

図1

香辛料成分（カプサイシン，クルクミン）及びビタミン Eの構造

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浦上財団研究報告書するリポソームに，香辛料に含まれる抗酸化物質（カプサイシンとクルクミン）を封入することで，生体内の活性酸素を消去し，抗老化効果を誘導でVol.16（2008）

3. 結果と考察
3. 1

きるのではないかと考え，老化モデルマウスを用いて，リポソーム製剤化した香辛料成分の効果を検討した。
2.

実験方法

活性酸素による細胞毒性に対するリポソーム製剤化香辛料成分の影響

ヒト子宮頸癌由来 HeLa 細胞において，活性酸素（過酸化水素）によってもたらされる細胞毒性に対する香辛料成分（カプサイシンおよびクルクミン）のエタノール溶液およびリポソーム製剤化

香辛料成分（カプサイシンおよびターメリッ

したものの影響を検討した（図 2）。比較として

ク）はエタノールに溶解後，試験管に分取したリ

天然の抗酸化物質として広く知られている ビタン脂質（卵黄ホスファチジルコリン EPC）のク

ミン E を用いた。HeLa 細胞に過酸化水素を添加ロロフォルム溶液に添加し，窒素ガスを吹き付けすると，約 50％の細胞において細胞死が観察さることによって香辛料成分含有脂質薄膜を形成しれた。この系に，天然抗酸化物質であるビタミンた。得られた脂質薄膜に PBS を添加し，超音波E のエタノール溶液およびリポソーム製剤化した槽中で超音波処理することでリポソーム製剤化しものを添加したが，生存率に変化は認められなかた。

った。すなわち，今回の条件においてビタミン E細胞レベル（in vitro）および生体レベル（inは活性酸素による細胞傷害に対して保護効果を示vivo）における活性酸素傷害に対するリポソームすことができないことが示された。また，香辛料製剤化した香辛料成分の抗酸化効果を検討した。

成分であるカプサイシンのエタノール溶液およびIn vitro 実験では，ヒト子宮頸癌由来の HeLa

リポソーム製剤化したものでは，予想に反して細細胞を用い，香辛料成分のエタノール溶液および胞の生存率がさらに低下してしまい，細胞毒性を

リ ポ ソ ー ム 化 し た も の を 投 与（ 最 終 濃 度増大させる結果となってしまった。おそらく，今300nM）した後，1 時間後に活性酸素として過酸回の系ではカプサイシンが過酸化水素と直接反応化水素を添加（最終濃度 600nM）し 24 時間暴露することで「プロオキシダント」として作用してす る こ と で 細 胞 傷 害 を 誘 導 し た。 そ の 後，しまったために，このような結果となってしまっ

WST-1 アッセイ法によって細胞生存率を評価したと思われる。一方，クルクミンをエタノール溶た。
In vivo 実験では，老化モデル動物 Klotho マウス（4 週令）に対して香辛料成分のオリーブ油溶液およびリポソーム製剤化したもの（抗酸化物質量：0.133nmol）を腹腔内投与（３日間隔で，４回）し，一定期間毎に体重を測定するとともに血液採取を行った。採取した血液については過酸化脂質量の定量を行った。また脳の老化の目安となる足跡分析も同時に行った。

図2

HeLa 細胞における活性酸素傷害に対する抗酸化物質の影響
Curc：クルクミン，Caps：カプサイシン，VE：ビタミン E

リポソーム製剤化した香辛料成分によるアンチエイジング効果の検討

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液として添加した系では，カプサイシン同様に細胞毒性を増大させてしまったが，リポソーム製剤化したものでは，唯一生存率を増加させた。このことは，溶液状態で添加した場合にはプロオキシダント作用を示すが，脂質膜に埋め込んだ形（リポソーム化）によってアンチオキシダント（抗酸化物質）として作用し，細胞死に対する保護効果を示したことを意味している。おそらく，リポソ
図3

ーム膜に組み込まれたことで，クルクミンが過酸野生型マウスと Klotho マウス（Klotho/Jcl）

化水素と直接作用することなく，細胞に取り込まれ，過酸化水素によって誘導される細胞内活性酸素を消去したことで保護効果を示したのではないかと推察される。データには示していないが，さらに過酸化水素量を増大させ，ほとんどの細胞が死滅するような強力な条件においても，リポソー
ム製剤化クルクミンのみが生存率を向上させた。
これらのことから，おなじ香辛料成分ではあっても，カプサイシンは過酸化水素由来の細胞傷害を悪化させるが，リポソーム製剤化したクルクミンは保護効果を示すことが明らかになり，in vivo

図４投与前後における Klotho マウスの体重変化
EPC-Lipo：EPC リポソーム単独，Curc-Lipo：リポソーム製剤化クルクミン，Caps-Lipo：リポソーム製剤化カプサイシ
ン，Curc：クルクミンのオリーブ油溶液，Caps：カプサイシンのオリーブ油溶液

における老化モデルマウスへの保護効果が期待さよるためか群の全てのマウスが死亡した。しかし，れた。

カプサイシンのオリーブ油溶液，クルクミンのオ老化モデル動物 Klotho マウスに対するリリーブ油溶液，およびリポソーム化クルクミン投

ポソーム製剤化香辛料成分の影響

与群では，そのようなことは観察されなかった。

次に，香辛料成分のオリーブ油溶液およびリポまた，皮膚老化の指標である皮膚萎縮に対しては，ソーム製剤化したものを，老化モデル動物としてすでに入荷時に老化が始まっていたためもあり，広く用いられている Klotho マウスに腹腔内投与有意な変化は認められなかった（結果は示していし，その影響を検討した。Klotho マウス（図 3ない）。

3. 2右）は，4 週令くらいから老化現象が現れ始め，さらに，老化に対する影響を調べるため，足跡約 8 週令で老衰によって死亡する。写真を見ても測定法を行った（図 5）。この方法では，マウスわかるように，野生型に比べて体長も小さく，非の足跡における歩幅を計測し，薬物投与前後での常に脆弱であるため，薬物を投与するだけで死亡変化を調べた。その結果，いずれの系でも投与後，するなど，実験の遂行は困難を極めた。体重変化

時間経過に伴う老化のために平均歩幅の減少が認を追跡したが，すべての投与群において，有意なめられた。クルクミンのオリーブ油溶液投与群お体重変化は認められなかった（図 4）。ただ，リよびリポソーム製剤化クルクミン投与群では，歩ポソーム化カプサイシン投与群において，刺激に幅が減少する傾向があったが，大きな差ではない

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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

シンのオリーブ油溶液を投与した群において，10％程度の低下が認められた。さらに，クルクミンのオリーブ油溶液を投与した群では，約 25％程度の抑制が認められた。驚くべきことに，クルクミンをリポソーム製剤化したものを投与した群では，約 40％もの抑制効果が認められた。この結果は予想を大きく上回るものであり，生体内活性酸素傷害（脂質過酸化反応）に対してクルクミンが高い防御効果を有することを意味している。さ投与前後における Klotho マウスの歩幅変化
上図は実際のマウスの足跡。EPC-Lipo：EPC リポソーム単独，Curc-Lipo：リポソーム製剤化クルクミン，Curc：クルクミンのオリーブ油溶液，Caps：カプサイシンのオリーブ油溶液

らに，リポソーム製剤化することで，オリーブ油と思われる。カプサイシンのオリーブ油溶液投与

力が増強されたことを示しており，リポソーム製群においても，時間経過による歩幅の減少はあっ剤化がクルクミンの効果を高める方法として有効たが，コントロールと大きな差はなかった。これであることが示唆された。この結果は，HeLa 細らのことから，クルクミンおよびカプサイシン投胞（in vitro）における過酸化水素誘導の細胞傷与による脳の老化への抗老化効果は認められない害に対して，リポソーム製剤化クルクミンが保護ことが明らかとなった。

効果を示した結果と一致するものである。このこ

図５溶液よりも高い抑制効果を示したことは，リポソーム膜中に存在することでクルクミンの抗酸化能

さらに，当初の仮説のように，リポソーム製剤とから，リポソーム製剤化クルクミンが生体内に化した香辛料成分が生体内での活性酸素傷害に対おいて生じた活性酸素を消去することで，その産して防御効果を示すか否かを調べるために，投与物である過酸化脂質の産生が抑制されたことが示前後に採取した血漿中の過酸化脂質（活性酸素に唆される。

よって酸化傷害を受けた脂質）量を測定し，そのカプサイシンとクルクミンは，両者ともに抗酸変化量を比較した（図 6）。その結果，カプサイ化物質であり，構造が似ているにもかかわらず，

図６

投与前後における血漿中過酸化脂質量の変化
EPC-Lipo：EPC リポソーム単独，Curc-Lipo：リポソーム製剤化クルクミン，Curc：クルクミンのオリーブ油溶液，Caps：カプサイシンのオリーブ油溶液

リポソーム製剤化した香辛料成分によるアンチエイジング効果の検討

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異なる効果を示したのは興味深い。またクルクミ

伴う血中過酸化脂質の増加に対して強力な抑制効

ンの場合，リポソーム製剤化したものが，溶液に果を示した。これらの結果から，香辛料成分に含溶かしたものよりも強力な効果を示したことも興まれるクルクミンは，高い抗酸化効果を有してお味深い。今後詳細な検討を行うことで，その理由り，老化や様々な疾患に関与すると考えられる活を明らかにできると考えているが，可能性として性酸素や血中過酸化脂質量の抑制に有効であるこは，クルクミンが安定なエノール型とケト型とのとが示唆された。そのため，香辛料成分をリポソ間で互変異性を行うことと，リポソーム膜中に固ームとして採取することで動脈硬化症やアルツハ定されることとに関係があるのではないかと考えイマー病の予防につながることが期待される。ている。もしかしたら，リポソーム製剤化によって，活性の高い構造に固定されるため，効率よく謝活性酸素と反応できるのかもしれない。

本研究は，浦上食品・食文化振興財団の研究助

辞図 6 で測定した血液中の過酸化脂質は，生体内成による支援に基づいており，この場をお借りし脂質（血液中の脂質や細胞膜など）が活性酸素にて厚く御礼申し上げる。研究遂行に当たっては，よって攻撃され生じたものであると考えられ，老平成 20 年 4 月より研究室に加わって下さった濱化の進行だけでなく，血栓虚血後の血液再還流傷進助教，および大学院生（板倉祥子，小笹愛弓，害，動脈硬化症，アルツハイマー病などの重篤な綛谷哲也，佐伯健，首藤弘樹，藤岡準平）のご努疾患の原因の一つとしても考えられている。その力に負うところが大きく，この場を借りて彼らのため，血液中の過酸化脂質量を抑制することがでご尽力に感謝の意を表したい。

きたリポソーム製剤化クルクミンは，老化の進行遅延だけでなく，様々な疾患の予防にも有効であ文ることが期待される。今回，老化マウスを用いて

１） Kogure K., Goto S., Abe K., Ohiwa C., Akasu M.,

行った実験において，リポソーム製剤化クルクミ

Terada H. Potent antiperoxidation activity of theン処理群のマウスの様々な臓器を凍結保存してい献bisbenzylisoquinoline alkaloid cepharanthine: The aminemoiety is responsible for its pH-dependent radical

るので，今後これらの臓器における遺伝子発現レ

scavenge activity. Biochim. Biophys. Acta, 1426, 133-142

ベルを解析し，血液中の過酸化脂質量の減少によ（1999）.

る遺伝子発現変動への影響を評価する予定であり，リポソーム製剤化クルクミンによる効果を分子レベルで明らかにしたいと考えている。

２） Chikawa T., Ikata T., Katoh S., Hamada Y., Kogure K.,
Fukuzawa K. Preventive effects of lecithinized superoxide
dismutase and methylprednisolone on spinal cord injury
in rats: Transcriptional regulation of inflammatory andneurotrophic genes. J. Neurotrauma 18, 93-103（2001）
.

4.

おわりに

３） Goto S., Kogure K., Abe K., Kimata Y., Kitahama K.,
Yamashita E., Terada H. Efﬁcient radical trapping at the

本研究では，香辛料成分であるカプサイシンおsurface and inside the phospholipid membrane is

よびクルクミンをリポソーム製剤化し，培養細胞

responsible for highly potent antiperoxidative activity of

および老化モデル動物における活性酸素に由来す

the carotenoid astaxanthin. Biochim. Biophys. Acta 1512,

る傷害に対する影響を検討した。その結果，クル251-258（2001）.
４） Kogure K., Goto S., Nishimura M., Yasumoto M., Abe

クミンをリポソーム製剤化したものが，培養細胞

K., Ohiwa C., Sassa H., Kusumi T., Terada H. Mechanism

における過酸化水素誘導の細胞傷害および老化にof potent antioxidative effect of capsaicin. Biochim.

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浦上財団研究報告書

Biophys. Acta 1573, 84-92（2002）.

Vol.16（2008）（Phyllostachys edulis）. Phytochemistry 64, 991-996（2003）.

５） Kogure K., Tsuchiya K., Abe K., Akasu M., Tamaki T.,

８） Kogure K., Yamauchi I., Tokumura A., Kondou K.,

Fukuzawa K., Terada H. Direct radical scavenging by theTanaka N, Takaishi Y., Fukuzawa K. Novel antioxidants

bisbenzylisoquinoline alkaloid cepharanthine. Biochim.

isolated from Ferula, Inula, Prangos and Rheum plants

Biophys. Acta 1622, 1-5（2003）.

collected in Uzbekistan. Phytomedicine 11, 645-651（2004）.

６） Ochi T., Takaishi Y., Kogure K., Yamauti I. Antioxidant

９） Okasaka M., Takaishi Y., Kogure K., Fukuzawa K.,

activity of a new capsaicin derivative from capsicum

Shibata H., Highti T., Honda G., Ito M., Kodzhimatov O.K.,

annuum. J. Nat. Prod. 66, 1094-1096（2003）.

Ashurmetov O. Neq stilbene derivatives from Calligonum７） Suga A., Takaishi Y., Goto S., Munakata T., YamauchiI., Kogure K. Two lignan dimers from bamboo stems

leucocladum. J. Nat. Prod. 67, 1044-1046（2004）.

Effects of antioxidative components of spice, capsaicin and curcumin, incorporated in liposomes on aging

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Effects of antioxidative components of spice, capsaicin and curcumin,
incorporated in liposomes on aging
Kentaro Kogure and Takashi Okuno（Kyoto Pharmaceutical University）

Oxidative damage is considered to be one major factor of aging. Thus, effects of various
antioxidants on aging have been investigated by many researchers. In spice, many
antioxidative components are contained, especially capsaicin and curcumin are well knownas potent antioxidants against various oxidative damages. Based on this, we hypothesizedthat the antioxidative components of spice, capsaicin and curcumin, can show anti-aging
effect by their potent antioxidative properties. However, since capsaicin and curcumin are
lipophilic compounds, it is difﬁcult to use as solution. To solve this problem, we consideredthat capsaicin and curcumin can be incorporated into liposomes. In the present study, we
examined the effects of capsaicin and curcumin incorporated in liposomes on cytotoxic
damage of cultured cells induced by active oxygen（hydroperoxide）. The liposomes
containing curcumin inhibited cytotoxic effect of hydroperoxide, although ethanolic solutionof crucumin, ethanolic solution of capsaicin and liposomes containing capsaicin did not show
any preventive effect. Furthermore, we examined the effects of capsaicin and curcuminincorporated in liposomes on aging of klotho mice, which are known as the model of aging.
The liposomes or olive oil solution of capsaicin and curcumin were administered intraperitoneally to 4 weeks old klotho mice. The administrations of the antioxidants did notchange their body weight. Length of footstep was also measured as a marker of aging. The
liposomes containing curcumin and crucumin solved in olive oil slightly reduced the lengthof footstep, on the other hand capsaicin did not show any effect. Interestingly, the liposomes
containing curcumin markedly decreased the amount of plasma lipidperoxide, which isconsidered to be related to aging arteriosclerosis and Alzherimers disease. Curcumin solvedin olive oil also decreased plasma lipidperoxide. However, the antioxidative effect ofliposomal curcumin is more potent than curcumin solution. Therefore, liposomalization ofcurcumin, which is antioxidative component of spice, is suggested to be useful for anti-aging.