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食品用乳化剤の新たな利用法：MRI 増感剤内包ナノカプセルの合成＜平成19年度＞

食品用乳化剤の新たな利用法：MRI 増感剤内包ナノカプセルの合成
豊田太郎（千葉大学大学院工学研究科共生応用化学専攻）

1. 本研究の背景と目的るが，多糖類カプセルは酸化鉄ナノ粒子を分散包埋することになり，MRI のコントラスト比を下生体内の組織・器官を，生体に対してより低負げることが問題となる。そこで本研究では両親媒荷で画像化する技術は，ヒトの病理診断・健康管性分子を用いることとした。両親媒性分子は水中理のための技術として期待が高まっており，研究で自発的に会合してカプセル膜を形成する。したが盛んに行われている。中でも核磁気共鳴画像法

がって，内包する酸化鉄ナノ粒子の MRI でのコ（MRI）は，磁場に応答する原子核の反応の時間ントラスト比を下げないよう，膜厚をナノメートが周辺の影響を受け変化することを利用し，人体ルに抑えたカプセルの形成法が重要である。とこにおいて着目する元素の原子核について非侵襲でろが，分子は水中で自発的に会合してカプセル構画像化できる方法 1） であり，すでに臨床の現場造を形成するため，従来法によって自己会合させで用いられている。従来の MRI は，水の水素原ると膜が多重膜化する。これは，本研究の目指す子核に着目していたため，神経系の磨耗や水を多カプセルの膜の厚みを制御するには適切でないたく含む組織・器官の形状変化という，健康管理のめ，新しい両親媒性分子のカプセル製法が必要で用途ではその威力を発揮するものの，細胞や組織ある。本研究では，両親媒性分子の膜で覆われたへの特異性がないことから組織病変の検出には限油中水滴エマルションをつくり，それにもう一つ界があった。近年この問題を解決するため，着目の両親媒性分子の膜を外から貼り合わせる製法 3）する元素を造影剤として体内に導入してコントラでこの問題を解決する。この製法は原理上，遠心ストを上げて造影する手法が望まれている。特に， 沈降によって水滴からカプセルを形成するため，超常磁性を示す酸化鉄ナノ粒子は，MRI におい

カプセルの膜は 1 枚となり，分子長の約 2 倍の膜て周囲の磁場をゆがませることで高いコントラス厚，つまりナノメートルの膜厚のカプセルを形成ト比を示す造影剤 2） であるが，体内滞留時間にできる。以上より，本研究の目的は，両親媒性分改善の余地が残されている。このような造影剤を， 子を用いて酸化鉄ナノ粒子を含むカプセル合成法
長時間体内に滞留させるための生体適合性カプセルの製法開発は急務である。
そこで本研究は，酸化鉄ナノ粒子のカプセル形の確立とした。
2.

実験方法

成剤として，生体適合性の高い食品用乳化剤に着カプセルを構成する両親媒性分子として，食品眼した。食品用乳化剤には，多糖類と両親媒性分用乳化剤である卵黄レシチンを用いた。卵黄レシ子（親水性部位と疎水性部位を併せ持った分子で， チンにはフォスファチジルグリセロールおよびコ水にも油にも可溶である性質をもつ）に大別されレステロールを 9：1：1（モル比）で配合し，流46

浦上財団研究報告書

動パラフィンに溶解させた。また，酸化鉄ナノ粒子である MRI 造影剤リゾビスト ®（バイエル薬

Vol.17（2009）3.

酸化鉄ナノ粒子カプセルの構造評価品）に対し，トリス塩酸緩衝液（0.1 mol L − 1，酸化鉄ナノ粒子を含む油中水滴エマルションのpH 7.6），塩化ナトリウム（0.1 mol L − 1）を溶解

水滴を遠心沈降して，下層のトリス塩酸緩衝液にさせた。このリゾビスト分散液を，両親媒性分子沈降させる場合，膜の流動性が高ければ，水滴どが溶解した流動パラフィンに添加し，機械的攪拌うしが合一して，カプセルは形成しない。膜の流によって，油中水滴エマルションを得た。1.5 mL

動性が低ければ，水滴をくるむ両親媒性分子の膜プラスチックチューブに，スクロースと塩化ナトが破裂して，カプセルは形成しにくい。流動パラリウム（0.1 mol L − 1）を溶解したトリス塩酸緩フィンに対して，溶解する両親媒性分子を卵黄レ衝液（0.1 M，pH 7.6）を 800 nL だけとり，これシチンのみとすると，カプセルはほとんど得られに 500 nL のエマルションを静かに重層した後，なかった。そこで，流動パラフィンに溶解する両卓上型遠心機によって４℃，14000 rpm で 30 分

親媒性分子として，卵黄レシチンに，水滴どうし間遠心沈降させた（図 1）。チューブ底面に形成の合一を抑制するためのアニオン性両親媒性分子されたペレットを底面から抜き取り，再分散させであるフォスファチジルグリセロールと，膜の流た後に光学顕微鏡で観測した。

動性を抑制するためのコレステロールを添加し，これを血球計算盤で数密度を計測した後に，アその配合比を検討したところ，モル比で 9：1：1

ク リ ル セ ル に 導 入 し， ７ Tesla の MRI 装 置で平均粒径が約 10 nm のカプセルを得ることが（Bruker）で観測した。さらに，レーザー散乱型できた。両親媒性分子にローダミン６ G という粒度分布計測によってサイズ分布を得ることで，蛍光色素を混ぜることで，両親媒性分子が自発的酸化鉄ナノ粒子内包カプセルのサイズと MRI 造に会合してカプセルが形成したのではなく，エマ影効果について検討した。

ルションが鋳型となってカプセルを形成したこと

図１

遠心沈降による油中水滴エマルションからカプセルを合成する手法の模式図

食品用乳化剤の新たな利用法：MRI 増感剤内包ナノカプセルの合成

47を示した（図 2）。フリーズフラクチャー法によかった。これは，遠心沈降する粒子にかかる力がり透過型電子顕微鏡像で，このカプセルの膜の多その密度に依存することから，酸化鉄ナノ粒子を重度と厚みを求めたところ，カプセル膜は 1 枚で， 内包することでカプセルが重くなり，沈降中に膜その厚みは約 10 nm であることが明らかになっが崩壊してしまったり，またカプセル膜自体が半た。

透膜の性質を有することから，酸化鉄ナノ粒子を次に，リゾビスト ® を内包させ油中水滴エマル内包することで内部が高張となり，水が急激に浸ションを得，遠心沈降によりカプセルを形成させ透して破裂してしまったものと考察した。そこで，たところ，カプセルはほとんど得られず，また下エマルションの下層のトリス塩酸緩衝液とカプセ層のトリス塩酸緩衝液全体に酸化鉄ナノ粒子が漏ル内部との密度差や浸透圧差を調整するために，出して拡散したことが光学顕微鏡観測によってわ

トリス塩酸緩衝液にスクロースを添加してカプセ

図２

リゾビスト® を内包したカプセルの光学顕微鏡像。

ルを形成した。光学顕微鏡で観測された限りでは，スクロースが 1.0 M の条件で酸化鉄ナノ粒子が緩衝液全体に漏出することなく，平均粒径が約 8nm のカプセルを得ることができた（図 3）。
4. カプセル内鉄濃度測定
酸化鉄ナノ粒子は数密度が高いほど MRI でコントラスト比が強くなる造影剤であるので，リゾビスト ® と同程度の数密度で酸化鉄ナノ粒子がカプセルに内包されていなければならない。酸化図３

静的レーザー光散乱計測によって求められたカプセルの粒度
分布

鉄ナノ粒子を透過型電子顕微鏡などで 1 つ 1 つカ48

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Vol.17（2009）

ウントすることは現実的に困難であるので，鉄濃ス塩酸緩衝液よりも比重が大きいため，コイル近度に換算して，このようにして得られたカプセル傍のセル底面に沈降する。したがって，セル底面が，通常のリゾビスト ® と同等の造影能があるかをカプセルが埋め尽くさないよう，カプセルの数を調べた。

密度を調整し，光学顕微鏡で観測されるカプセル血球計算盤およびレーザー散乱型粒度分布測定と MRI で観測される黒点とが一致する条件を見により，カプセルの数密度と平均粒径を求めた。

出した。MR イメージングの前では球形で分散しカプセル分散液 100 nL をとり，酸でカプセルとていたカプセルは，イメージング後に光学顕微鏡酸化鉄を完全に溶解させた後，JIS 法に従って鉄で観測したところ，凝集し変形が認められた（図の定量分析を行った。また，カプセル分散液を4）。これは，MRI における傾斜磁場によって，15℃，14000 rpm で遠心沈降させ，その上澄み酸化鉄ナノ粒子を含むカプセル内部にひずみの力

100 nL についても同様に鉄を定量し，その差分がかかり，その結果セル底面でひきずられるようから，カプセル内の鉄濃度を求めた。これによっに変形，凝集したもの 4） と考えられる。このカて，カプセル内の鉄濃度は 32 ± 9 mg mL-1 と求プセルの凝集体について，光学顕微鏡では断面積まった。リゾビスト-1が 2.8 × 10-9 m2，MRI の造影面積は 1.4 × 10-6 m2の鉄が含まれていることから，本質的には，リゾと求まったことから，このカプセルは約 480 倍

ビストそのものの MRI 造影能と遜色ないことがもの面積で造影効果をもたらすことがわかった。

示唆された。

また，MRI のピクセルあたりの輝度のプロファ®

そのものは，25 mg mL

5. In vitro での酸化鉄ナノ粒子カプセルのMRI

イルから，カプセルの造影の分解能を求めたとこ
ろ，350 nm であった。これにより，カプセル内であっても，通常とほぼ同様の空間領域で酸化鉄形成された酸化鉄ナノ粒子カプセルについて，ナノ粒子が MRI で造影されることが明らかにな

７ Tesla の MRI 電磁コイルを用いて MR イメーった。また，粒子径が 20 nm 程度であれば MRI

ジ ン グ を 行 っ た。 こ の と き， 底 面 が 1 cm × 1

で一つ一つのカプセルの挙動を観測できることがcm のプラスチックセルを用いコイル近傍のカプ示唆された。

セルを MR イメージングした。カプセルはトリ

図４

酸化鉄ナノ粒子内包型カプセルの MR 画像と微分干渉顕微鏡像の比較

食品用乳化剤の新たな利用法：MRI 増感剤内包ナノカプセルの合成

6.

おわりに

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については放射線医学総合研究所分子イメージン
グ研究センターの青木伊知男博士，菅野巌グルー

本研究は，食品用乳化剤である卵黄レシチンをプリーダーにご協力いただいた。ここに謝意を表主成分であるカプセルに MRI 造影剤である酸化します。また本研究を遂行するにあたり，貴重な鉄ナノ粒子を内包する製法の確立を目的とした。

研究助成を賜りました財団法人浦上食品・食文化

遠心沈降を利用するための膜配合や比重を調整す振興財団ならびに関係者各位に心より感謝いたしることで，カプセル膜を 1 枚とし，厚みを約 10ます。

nm に抑えた粒径約 8 nm の酸化鉄ナノ粒子内包カプセルを作製することができた。In vitro での研究成果発表

MRI により，このカプセルが通常市販されてい

１） 大栗直人，豊田太郎，米山操，藤浪眞紀，小熊幸一，菅るものと同程度の造影能をもつことがわかったた

野巌，青木伊知男：酸化鉄ナノ粒子内包型ジャイアント・め，モデル動物をつかった In vivo での試験が今後の課題である。本研究で作製されたカプセルがベシクルの作製と MRI への利用，第 69 回分析化学討論会（名古屋），2008 年 5 月。

長い体内滞留時間で MR イメージングされれば，

文カプセル内に薬物を同時内包して，ドラッグデリ

１） 巨瀬勝美，NMR イメージング，共立出版（2004）.

バリーシステムにおける薬物放出過程をカプセル

２） E. M. Shapiro, S. Skrtic，K. Sharer, J. M. Hill, C. E.

一つ一つのレベルで可視化する要素技術への応用などが期待される。

献

Dunbar, A. P. Koretsky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,10901-10906（2004）.
３） S. Pautot, B. J. Frisken，D. A. Weitz, Proc Natl Acad
Sci USA 100, 10718‒10721（2003）.

謝辞

本研究は，本学大学院工学研究科の細井智浩氏，大栗直人氏の実験研究によっている。また，MRI

４） C. Ménager, D. Guemghar, R. Perzynski, S. Lesieur, V.
Cabuil, Langmuir 24, 4968-4974（2008）.

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URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.17（2009）

Development on Preparation Method of Lipid Membrane Capsules
Encapsulating MRI Contrast Agents
Taro Toyota（Department of Applied Chemistry and Biotechnology,Graduate School of Engineering, Chiba University）

The present study aimed at the development of the method of making a supramolecular
capsule encapsulating nuclear magnetic resonance imaging（MRI）contrast agents using
emulsifying additives for food. MRI enables us nondestructive and non-invading observation
about the inside of the body by three dimensions and it is widely used as a clinicalmeasurement instrument. Recently, in order to improve the accuracy of clinical judgement
for tumors by MRI, MRI contrast agents have drawn much attention. Among the MRI
contrast agents, iron oxide nanoparticles encapsulated in lipid membrane capsules（whichare called as vesicles）are one of the attention-getting contrast agents, since the vesicles
can let the iron oxide nanoparticles accumulate and stay for longer time in the organs thanthe bare iron oxide nanoparticles do. The uniformness of vesicles is important for thereproducibility of the MRI measurement. However, it is difﬁcult to control the uniformnessof membrane lamellarity and inner structure of vesicles, since the vesicles are formed by
the autonomous self-assembly of lipid in the conventional methods. In present study, we
propose a new method to prepare the MRI contrast agents of iron oxide nanoparticles
encapsulated in uniform vesicles. The inner and outer leaﬂets are prepared separately byusing the water-in-oil emulsion and water-oil interface. The centrifugation of the water-in-oil
emulsion toward the water-oil interface affords the sticking of these leaflets, providing
formation of spherical bilayer membranes, i. e. vesicles. Lecithin that is one of theemulsifying additives for food was dissolved to the oil phase, and the iron oxide nanoparticle
dispersion was mixed to the oil phase and the water-in-oil emulsion was obtained. The
emulsion was poured on the aqueous phase in a microtube and then the layered water-in-oilemulsion was centrifuged to form vesicles. The vesicles encapsulating the iron oxide
nanoparticles had single membrane and the diameters in the range of 1‒15 nm, judged fromthe optical microscope observation and the static laser scattering measurement. Theaggregated body of the vesicles which had the diameter of 60 nm was corresponded to be a
black spot of MRI in a phantom body composed of pectin gel. It will be expected that theresult of the present study contributes to the research and development of new imaging
techniques for tracing the effect of the drug delivery system with MRI in the future.