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２光子顕微鏡によって、退色のリスクや試料の損傷を最小限に抑えながら、従来の手法よりもより高い深度で生組織や生細胞のイメージングが可能となった。
Laser Quantum社のventeon ultraなどのような超短パルス・広帯域スペクトル帯域幅のフェムト秒レーザ
ーは、励起効率を高めたり、広範囲に亘る蛍光体に対してレーザー光を直接当てることができたり、時間分解能が極めて高いといったように、その効果を最大限に発揮するために、パルス圧縮器やパルス特性評価器に容易に結合することができる。

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多光子（または２光子）顕微鏡は、DenkとWebbらのグループによって1990年に考案されたイメージング技術であり、蛍光信号を得るために平板状の試料内部に空間的に集光させたレーザービームに含まれる２つの光子を同時に吸収することを前提としている。
このレーザービームは、より鮮明な画像や高強度の光子束
図２：測定されたd-scanトレース（左上）と位相回復されたd-scanトレース（左下）測定されたスペクトル、青曲線と位相回復されたを実現するために、高強度かつ短パルスである必要がスペクトル、赤曲線（右上）位相回復された時間的プロファイル、パルス幅：6.4fs ± 0.1fs（FWHM）（右下）あり、それ故に、同じ焦点領域で２つの光子を同時に吸収する確率が高まる（2010年Pestovらによって発表）。 ２光子励起の場合はパルス幅に反比例することがd-scanは、試料上のパルス幅を測定できるだけでなくこのことは、試料の損傷を最小限に抑えるのに十分な多いため、その結果として非線形光学過程における スペクトルの位相情報を直接に取得することができる
低平均電力にて高いピークパワーを持ったパルスを数サイクルパルスの波長変換効率が向上し、生細胞 ので、パルス圧縮器の適合性を分析するのに必要な情生成するモードロック・フェムト秒レーザーを使用するへの悪影響を低減する。
報が得られる。
このことは、開口数が大きく3000fs2以上ことで実現できる。
このモードロック・フェムト秒レーザの群速度分散（GVD）量を有する対物レンズによる補償
しかしながら、２光子顕微鏡で超短パルスを扱う際ーから得られる超短パルスは、広帯域スペクトルを持つの際に特に重要である。
この対物レンズのように群速度に、主な問題点となる点がひとつある。超短パルスために、最も一般的な蛍光体を同時に励起することが分散（GVD）量が3000fs2以上の場合は、試料面においてのパルス幅が、顕微鏡を構成する光学素子によってでき、従って波長チューニング調整の必要性がなくなる
サブ７fsのパルス幅を実現するために最大４次まで補時間的に伸長されてしまうことだ。これは正の群速（2010年Pestovらによって発表）。
償する必要がある。100倍油浸対物レンズ（開口数1.15）
度分散（GVD）によるチャープ（周波数変調）として知を配置した場合のventeon ultraとd-scanの組み合わせられている。つまり、パルス幅の拡がりを補償しフー
Laser Quantum社製venteon ultraは、パルス幅 サブ６た場合の一例を図２に示す。今回、約3600fs2の群速度
リエ限界パルス（最短のパルス幅）を得るために、超フェムト秒の短パルス光を発生させ、240mW超の出力分散（GVD）量を有する開口数の大きい対物レンズを用
短パルスの周波数を予め負の群速度分散で変化（チを発振し、400nm以上（半値全幅/FWHM）という他にはいてこの6.4fsという短いパルス幅を得ることができたのャープ）させる必要がある。
（従って非線形光学過程類を見ない帯域幅を提供することで、上記すべての要件は一番大きな成果といえる。
また、パルス幅の拡がりは、を利用した２光子顕微鏡には高いピークパワーがを上回っている。
63倍対物レンズによってよりも主に３次分散の際の僅か必要となる。
）
このように短パルス光に必要な負分散な位相の不一致によって引き起こされることがd-scanに（チャープ）を得るには、Laser Quantum社製venteon
よってはっきりとわかる。
DCM分散補償ミラーを用いて出力光を複数回反射さኽᛯ≝せる方法がある。

Focusing

Light Collection

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FiltersWedge

図１a: Venteon ultra発振器、d-scan system、対物レンズペアによる実験セットアップ。

図１b: 63倍対物レンズを通して得られたパルスの時間的プロファイル（パルス幅：5.5fs ± 0.1fs、FWHM）______________________________________________

超高速レーザーは多くの用途で幅広く使用されており、光学顕微鏡用対物レンズの焦点位置でリアルタイム その中でも２光子顕微鏡技術はとりわけ重要なツールに超短パルスを測定し 予め負分散を与える（プリチャ だ。２光子顕微鏡技術は、特に高解像度でのイメージープ）ことは、難しい課題であろう。
これを解決するの 画像を作り出し、生体組織深部を高感度に画像取得するに適切な装置として、インライン式・コンパクト設計・ ことが重要な生体医学の分野で応用されている。高品質容易な操作方法を特徴とするSphere Ultrafast Phot な画像を取得するのに重要な決め手となるのは、可能な
この装置は、どんな設計onics社製のd-scanがある。
限りパルス幅の短いパルス（7fs以下）を用いることだ。の顕微鏡を使用してもパルス波形の最適化が可能と これらの超高速パルスは求められる要求品質が非常になるように、（内蔵のventeon DCM分散補償ミラーペ 厳しく、超高速パルスをイメージングに使用する前にパアを介して）超短パルスの同時測定と負分散を得るこ ルスの伝播特性を確実なものにするために制御する必とができる。
要がある。
また、どんな生体組織でも可能な限り高い分解能で損傷させることなく測定できることが非常に重要᬴ܱᘺፗ↝⇡⇩⇮⇈⇩⇽↗ย‫ܭ‬ኽௐ
だ。Laser Quantums社製venteon ultraレーザーとSphere Ultrafast Photonics社製d-scan技術の組み合わせは、２光子顕微鏡技術では顕微鏡用対物レンズを使用高解像度の２光子顕微鏡やコヒーレント反ストークスラするが、この対物レンズは約何千fs2という極めて大
マン散乱分光（CARS）と同様に、生物学的プロービング
きな数値の正の群速度分散（GVD）量を有するので、検査や生物学的イメージングのようなアプリケーションそれに応じて短パルス光に予め大きな量の負の分散に対して新しい時代を切り拓いている。
レーザーパルスを与えておく必要がある。
これは非常に難しいが、の時間的プロファイルを低減すると解像度が上がり、venteon DCM分散補償ミラーペアを用いることで可（比較的長いパルスを使用する）時間的プロファイリング能となる。
技術で撮影した画像とはより対照的であることが実証さ（2009年Dantusらによって発表）。特に、２光子
さらには、venteon ultraと特注のd-scanを組み合わ れている
せた簡単なセットアップで（図１a参照）、対物レンズ 顕微鏡は今後、かつてない高解像度で脳をリアルタイム（倍率63倍、開口数0.75）の焦点で非常に短い値であ にイメージングすることのできる神経変性疾患の病態研究に使用されるシステムとしても役立つだろう。
る5.5fsまでパルス圧縮することが可能だ。
（図１b参照）

Acknowledgements: Dr. Rosa Romero, Dr. Helder Crespo and Francisco Silva from Sphere Photonics, Dr. Thomas Binhammer, Andy Wells and Julien Clavereau from Laser Quantum.
References:[2] Pestov, D. et al. (2010), Two-Photon Microscopy with Sub-8fs, Frontiers in Optics/Laser Science XXVI, October 24-28, 2010, Rochester, USA.
[3] Silva, F. (2015), Compression and characterisation of two cycle pulses on the focus of a microscope objective, Sphere Photonics.
[4] Dantus, M. et al. (2009), Better results from ultrafast nonlinear microscopy, BioOptics World, 2, pp. 23-24.

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