オープンデータを活用した低酸素応答新規パスウェイの探索手法の開発
Development of exploration methods for novel hypoxia response pathways using
open data

小野擁子

2022 年 7 月

1

要旨
生命科学研究には、よく知られている分野や遺伝子ほどよく研究される出版バイアスが存在する。例えば、疾患との関連性の有無などの情報が既知の遺伝子ほど研究対象になりやすい。一方で、昨今のマイクロアレイ技術やハイスループットシーケン
シング技術の発展により、研究者の興味対象の如何に関わらず一度の実験で生体内の数万種類の遺伝子発現プロファイルを網羅的に取得できるようになった。これらの網羅的な遺伝子発現情報を含む論文を投稿する際には、その再現性の担保のため、
オープンデータベースに登録することが論文誌掲載の条件とされているのが一般的である。National Center for Biotechnology Information (NCBI)の gene expression
omnibus（GEO）や European Bioinformatics Institute (EBI)の ArrayExpress に代表されるオープンデータベースには、2022 年現在ヒト遺伝子発現データはおよそ
6 万 6 千を超えるデータシリーズが登録されており、これらの遺伝子発現プロファイルデータを元にしたデータドリブンな解析により、遺伝子の注目度の影響を受けずに知見を見出すことが期待できる。
低酸素刺激応答は好気性生物において生命維持に重要な機能を担う。低酸素刺激下では転写因子である Hypoxia inducible factor -1（HIF-1）が下流の遺伝子発現を制御し、低酸素に対応するための厳密な分子機構が備わっていることが明らかになっている。低酸素に対する生体反応の研究は 1990 年台の HIF-1 の発見により劇的に進み、そのメカニズムを明らかにしたウィリアム・ケリン教授、ピーター・ラトク
リフ教授、グレッグ・セメンザ教授は 2019 年にノーベル生理学・医学賞を受賞している。ノーベル賞を受賞するほどの研究分野であることから公共遺伝子発現データ
ベースへの多くの低酸素刺激関連データの登録が期待できることと、低酸素応答研究においても出版バイアスの存在は否定できないことから、低酸素を研究対象とし低酸素応答新規パスウェイの探索手法の確立を本研究の目的とした。
本研究は新規低酸素応答遺伝子の探索と、non-coding RNA (ncRNA)を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法構築の大きく二つの研究にて構成される。
新規低酸素応答遺伝子の探索では、まずはオープンデータベースである GEO および低酸素に関わる RNA sequencing (RNA-Seq) データのメタデータをマニュアルキ
ュレーションにより精査したのちに解析対象のデータセットを選定し、Sequence
Read Archive (SRA)から配列データを取得した。低酸素, 通常酸素の条件のおよそ500 ペアとなるサンプルの遺伝子発現プロファイルを元に、遺伝子ごとに HypoxiaNormoxia（HN）-score を算出した。高い HN-score を示す上位 100 遺伝子を元に
2

エンリッチメント解析を行い、想定通りに低酸素応答関連遺伝子群が濃縮されている こ と を 確 認 し た 。 加 え て 、 SRA で 公 開 さ れ て い る 既 報 の Chromatin
Immunoprecipitaton sequencing (ChIP-Seq)データを元にした解析ツールである
ChIP-Atlas を用いて、高い HN-score を示す上位 100 遺伝子の発現制御には HIF-1を構成する遺伝子である HIF1A が関与していることを示した。
次に NCBI が提供している gene2pubmed と呼ばれる、gene ID とその遺伝子が研究報告されている PubMed ID が収載されたデータセットを用いて新規低酸素応
答遺伝子を探索した。その結果、G Protein-Coupled Receptor 146 をはじめとする
いくつかの遺伝子が、データドリブンな解析では低酸素応答遺伝子と判定されるにも関わらず今まで低酸素応答遺伝子として注目されていなかったことを明らかにした。
上記の研究では、HN-score の下位 100 遺伝子を元にしたエンリッチメント解析にて ncRNA metabolic process に関わる遺伝子の発現抑制が示された。しかしながら
低酸素条件下での ncRNA metabolic process の詳細メカニズムについては明らかになっていない。新規低酸素応答遺伝子の探索の研究と同様にデータドリブンにncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価をすることが必要と考えた。
エンリッチメント解析に用いられた Gene Ontology を元に精査をしたところ、これらの発現が抑制された遺伝子群は ncRNA metabolic process の中でも ribosomal
RNA (rRNA) processing に関わることが明らかになった。rRNA はリボソームを構成してタンパク質を合成する機能を持つ。リボソームと細胞質 long non-coding RNA(lncRNA)との分解の関係性や、ncRNA が rRNA のサイレンシングに寄与することを示した報告もあることから、ncRNA を含めたリファレンスを活用して転写産物の低酸素応答性を網羅的に評価した。FANTOM CAGE Associated Transcriptome(FANTOM-CAT)は FANTOM5 Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)のデータを用いた信頼性の高い 5’末端をもつヒト lncRNA も含まれている転写産物のカタログである。このカタログをリファレンスとして活用することにより、ヒトのコーディング遺伝子以外も含めた遺伝子発現情報を活用することが可能と考えた。
転写産物の網羅的な低酸素応答性評価の結果、低酸素応答によりミトコンドリア
DNA 由来の転写産物の発現抑制が顕著であること、低酸素応答遺伝子群のアンチセンスに着目した解析では、大半の転写産物は低酸素応答遺伝子群と同様の発現制御
パターンを示す一方で、センス-アンチセンスで異なる発現制御がなされている遺伝子群があることを明らかにした。
3

以上、本研究ではデータドリブンに新規低酸素応答遺伝子を見出し、ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法を提示した。これらの研究は、低酸素応答研究
のみならず新規パスウェイのデータドリブンな探索手法の提示の点で貢献したと考
える。

4

略語
ANKRD37: ankyrin repeat domain 37
AOE: All Of gene Expression
ARNT: aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
ARNTL: aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator like
ASA: American Statistical Association, アメリカ統計協会
BHLHE40-AS1: BHLHE40 antisense RNA 1
CA9: carbonic anhydrase 9
CAGE: Cap Analysis of Gene Expression
ChIP-Seq: Chromatin Immunoprecipitaton sequencing
ChIP: Chromatin Immuno Precipitation, クロマチン免疫沈降法
CREB: cAMP response element-binding protein
EBI: European Bioinformatics Institute
EGLN3: egl-9 family hypoxia inducible factor 3
EPAS1: endothelial PAS domain protein 1
FANTOM-CAT: FANTOM CAGE Associated Transcriptome
FIH-1: factor inhibiting HIF-1
GEA: DDBJ Genomic Expression Archive
GEO: gene expression omnibus
GPCR: G タンパク質共役受容体
GPR146: G protein-coupled receptor 146
GTF: gene feature format
HDAC1: histone deacetylase 1
HIF-1: Hypoxia inducible factor -1
HIF-2α: hypoxia-inducible factor-2α
HIF1A: hypoxia inducible factor 1 subunit alpha5

HN-score: Hypoxia-Normoxia-score
HNf-score: FANTOM-CAT をリファレンスとした転写物の HN-score
HNg-score: GENCODE をリファレンスとしたコーディング遺伝子の HNscore
INSD: International Nucleotide Sequence Database, 国際塩基配列データベース
INSDC:International Nucleotide Sequence Database Collaboration, 国際塩
基配列データベース協力体制
lncRNA: long non-coding RNA
MIAME: The Minimal Information About a Microarray Experiment
MINSEQE: The Minimal Information about a high throughput nucleotide
Sequencing Experiment
MT-ATP8: mitochondrially encoded ATP synthase 8
MT-ND: mitochondrially encoded NADH dehydrogenase
MT-ND2: mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 2
MYC: MYC proto-oncogene, bHLH transcription factor
NCBI: National Center for Biotechnology Information
NCBI, National Center for Biotechnology Information : 米・国立生物工学情報センター
ncRNA: non-coding RNA
NDRG1: N-myc downstream regulated 1
NLM, National Library of Medicine: 米国立医学図書館
PGK1: phosphoglycerate kinase 1
PHD: prolyl hydroxylase
PMC: Pubmed Central
PPP1R3G: sperm-associated antigen 4
PRSS53: transmembrane protein 74B
6

pVHL : von Hippel-Lindau tumor suppressor
RefEx : Reference Expression dataset
RNA-Seq : RNA sequencing
rRNA: ribosomal RNA
SAP30: Sin3A associated protein 30
SRA: Sequence Read Archive
TATA-box binding protein associated factor 9b : TAF9B
TFIID: transcription factor II D
UCSC, University of California Santa Cruse: カリフォルニア大学サンタクルーズ校
VEGF: vascular endothelial growth factor
理研: 国立研究開発法人理化学研究所

7

目次
要旨 ............................................................................................................................. 2
略語 ............................................................................................................................. 5
表目次........................................................................................................................ 10
図目次........................................................................................................................ 11
1 序論 ....................................................................................................................... 13
1.1 出版バイアス ............................................................................................................... 13
1.2 オープンデータ ............................................................................................................ 15
1.3 低酸素 ........................................................................................................................ 18
1.4 本研究の目的 ............................................................................................................. 20

2 方法 ....................................................................................................................... 21
2.1 書誌情報解析 ............................................................................................................. 21
2.1.1 gene2pubmed .................................................................................................................... 21
2.1.2 PMC の FANTOM, GENCODE 記述論文数 ..................................................................... 23

2.2 RNA-seq ..................................................................................................................... 24
2.2.1 データ調査 .......................................................................................................................... 24
2.2.2 データ取得 .......................................................................................................................... 24
2.2.3 リファレンス ......................................................................................................................... 24
2.2.4 定量 ................................................................................................................................... 25
2.2.5 HN-score 計算 .................................................................................................................... 27

2.3 エンリッチメント解析 ..................................................................................................... 28
2.4 ChIP-Atlas 解析 ......................................................................................................... 28
2.5 アンチセンス鎖に着目した解析 .................................................................................... 29
2.6 可視化 ........................................................................................................................ 31

3 結果 ....................................................................................................................... 33
3.1 新規低酸素応答遺伝子の探索 ..................................................................................... 33
3.1.1 解析対象データの要約 ........................................................................................................ 348

3.1.2 HN-score を用いたデータセットの特徴............................................................................ 36
3.1.3 低酸素応答を対象としてビブリオーム解析 ........................................................................... 39
3.1.4 考察 ................................................................................................................................... 41

3.2 ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法の構築 ......................................... 45
3.2.1 エンリッチメント解析の詳細調査 .......................................................................................... 47
3.2.2 FANTOM-CAT と GENCODE の記述のある論文数調査................................................... 50
3.2.3 FANTOM-CAT を用いた転写物の HNf-score の特徴 ....................................................... 51
3.2.4 染色体ごとの HNf-score の要約 ......................................................................................... 51
3.2.5 センス-アンチセンス鎖に着目した調査 ................................................................................. 56
3.2.6 考察 ................................................................................................................................... 60

4 結論 ....................................................................................................................... 66
5 付録 ....................................................................................................................... 67
参考文献 .................................................................................................................. 100
謝辞 ......................................................................................................................... 108

9

表目次

Table 1 ChIP-Atlas でのエンリッチメント解析の結果 ............................................................... 37
Table 2 FANTOM と RNA-seq の記述のある報告数の調査................................................... 50
Table 3 HNf-score の高かったあるいは低かった転写物の上位 25 リスト ....................... 53
Table 4 UP 200, DOWN 200 遺伝子群のアンチセンス鎖に位置する転写物 ................... 58

Supplemental table 1 HNg-score を元に選抜した UP 200 gene および DOWN 200
gene list .............................................................................................................................................. 74
Supplemental table 2 DOWN200 ncRNA metabolic process related group に該当する
遺伝子 ................................................................................................................................................. 92
Supplemental table 3 染色体ごとの HNf-score の要約統計量........................................... 96

10

図目次
Figure 1 ヒト遺伝子の出版数順位 .................................................................................................... 14
Figure 2 公共遺伝子発現データ登録数 ......................................................................................... 17
Figure 3 低酸素応答の模式図 ........................................................................................................... 19
Figure 4 gene2pubmed の内容 ........................................................................................................... 22
Figure 5 RNA-seq パイプライン ikra のワークフロー................................................................. 26
Figure 6 アンチセンス転写物リストの取得 ................................................................................... 30
Figure 7 UCSC genome browser での FANTOM5 のデータの追加設定 .......................... 32
Figure 8 低酸素トランスクリプトームメタ解析の模式図 .......................................................... 33
Figure 9 解析対象データの低酸素条件についての内訳 ....................................................... 35
Figure 10 既知の低酸素刺激関連遺伝子の確認 ..................................................................... 38
Figure 11 新規低酸素応答遺伝子の探索 .................................................................................... 40
Figure 12 ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価のメタ解析 ............................. 46
Figure 13 低酸素刺激応答 ncRNA metabolic process 遺伝子の解析 ............................ 49
Figure 14 FANTOM-CAT を活用した転写物の HN-score 評価 .......................................... 52
Figure 15 アンチセンス鎖側に位置する転写物の HNf-score の調査 .............................. 57
Figure 16 FANTOM-CAT ...................................................................................................................... 61

Supplemental figure 1 “hypoxia”をクエリとした論文情報をもとに作成した Word cloud................................................................................................................................................................ 67
Supplemental figure 2 bibliome 解析における HIF1A との Simpson 係数、Jaccard 係
数の評価 ............................................................................................................................................ 68
Supplemental figure 3 書誌解析における HIF1A,EPAS1, ARNT, ARNTL の Simpson
類似度の評価 .................................................................................................................................. 69
Supplemental figure 4 HN-ratio, HN-score の条件検討 ......................................................... 71
Supplemental figure 5

UP100 gene list の低酸素処置時間別の HN-ratio .................. 72

11

Supplemental figure 6

HN-ratio（底 2 の Log 変換）の層別化解析 ................................. 73

Supplemental figure 7 FANTOM-CAT Robust (縦軸) と Stringent(横軸)の HNf-scoreの評価 ................................................................................................................................................. 91
Supplemental figure 8 HNg-score による UP 200 遺伝子、DOWN200 遺伝子の染色体上の位置の可視化 ........................................................................................................................ 98
Supplemental figure 9 ゲノムリファレンスのバージョンごとの PGK1 と TAF9B の位置................................................................................................................................................................ 99

12

1 序論
1.1 出版バイアス
ゲノム編集技術などの遺伝子工学技術の発展は、生命科学研究において重要な技術である。遺伝子工学技術を用いて、各研究者は仮説を生物実験的に検証可能となった。しかしながら、仮説創出のきっかけは文献調査や各研究者の知識の蓄積に依存することが多く、その傾向には出版バイアスが影響している。例えば、ヒトのタンパク質コーディング遺伝子 2 万個にアノテーションされたおよそ 60
万件の出版物の頻度パターンを評価したところ、約 1 万件の出版物が TP53 をコードする遺伝子に紐づいている一方で、600 件以上の遺伝子は出版物がなかったとの報告がある（Figure 1）(Carter et al. 2019)。
生命科学の知見の蓄積において過去の知見をもとにした仮説検証は重要である。いくつかの重要な研究をきっかけに研究予算が配分され、その研究分野の発展が強化される。しかしながら、条件に恵まれた研究分野がさらに条件に恵まれるマタイ効果の影響は、特定の研究分野の進展に好影響をもたらす反面、着目されにくい遺伝子や、研究分野を生み出し得る(Mihai et al. 2021)。新しい知見を得るには、知見の蓄積の偏りを考慮に入れつつ、オミクスデータなどの社会的なバイアスを排除したデータを中心とした解析手法をもとに研究対象を理解する必要があると考える。
出版バイアスとは、研究の解釈のしやすさが影響してポジティブな結果ほど公表されやすいという偏りのことをいう。例えば、統計学的有意差が示されたことをもとに生物学的な意味もあるとみなして論文を出版する場合も出版バイアスに影響する。
統計学的有意差の判断に用いられる P 値についてはアメリカ統計協会(ASA,
American Statistical Association) が 2016 年に「統計的優位性と P 値に関する声明」を公表している(Wasserstein and Lazar 2016)。この声明の中で、以下のように原則をあげている(佐藤 2018)。
1. P 値はデータと特定の統計モデル（訳注: 仮説も統計モデルの要素のひとつ）が矛盾する程度をしめす指標のひとつである．
2. P 値は調べている仮説が正しい確率や，データが偶然のみでえられた確率を測るものではない．
3. 科学的な結論や，ビジネス，政策における決定は P 値がある値（訳注:13有意水準）を超えたかどうかにのみ基づくべきではない．
4. 適正な推測のためには，すべてを報告する透明性が必要である．
5. P 値や統計的有意性は，効果の大きさや結果の重要性を意味しない．
6. P 値は，それだけでは統計モデルや仮説に関するエビデンスの，よい指標とはならない．
チェリーピッキングは、研究結果や実験結果を全て報告するのではなく、仮説や主張をもっともよく支持する結果を意図的に提示することである(Morse
2010)。すでに出版されている知見は重要なものである一方、研究者それぞれが研究結果の生物学的意義を吟味することが生命科学研究分野において重要であると考える。

Figure 1 ヒト遺伝子の出版数順位

Adrian J.Carter et al. 2019, 24(11)の報告を 2021 年 1 月 4 日に NCBI よりダウンロードした gene2pubmed データをもとにアップデートした。もっともよく報告されている遺伝子はTP53 遺伝子であり、低酸素状態により遺伝子発現が亢進することが知られている VEGFA
は上位４位だった。論文数が 1000 以上の遺伝子数は 532 遺伝子であった。

14

1.2 オープンデータ
オープンデータとは、誰もがアクセス、利用、共有することができるデータのことである。生命科学研究分野においては、文献情報であれば米国立医学図書館（NLM, National Library of Medicine）が運営している文献データベース
PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)や、PubMed の中でも全文がオープン ア ク セ ス と な っ て い る 論 文 を 収 録 し た Pubmed Central(PMC)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)がオープンデータベースとして有名である。1.1 章「出版バイアス」で使用した、米・国立生物工学情報センター（NCBI,
National Center for Biotechnology Information）が提供している gene2pubmed
も

利

用

制

限

の

な

い

オ

ー

プ

ン

デ

ー

タ

で

あ

る

（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/home/about/policies/）。化合物情報であれば欧州バイオインフォマティクス研究所（EBI, European Bioinformatics Institute）の ChEMBL チームにより維持管理されている医薬品および開発化合物のデータベースである ChEMBL(https://www.ebi.ac.uk/chembl/), NCBI により維持管理されている低分子化合物の生物学的活性データベースである
PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)が該当する。また、塩基配列情報に 関 し て は 、 国 際 塩 基 配 列 デ ー タ ベ ー ス 協 力 体 制 （ INSDC, International
Nucleotide Sequence Database Collaboration）を構成している日本 DNA デー
タバンク（DDBJ, DNA Data Bank of Japan）, NCBI, EBI が査定・収集したデータを、広く科学の発展のために再利用されるべき共有知的財産として国際塩基配列データベース(INSD, International Nucleotide Sequence Database) を構築している（https://www.ddbj.nig.ac.jp/about/insdc.html）。この INSD は，各データバンクが公開しているデータの全てを誰でも制限なしで利用できるという統一方針を共有している。
マイクロアレイ技術やハイスループットシーケンシング技術の発展により、一度の実験で生体内の数万種類の遺伝子発現プロファイルを網羅的に取得することができる。これらの網羅的な遺伝子発現情報を含む論文を投稿する際にはその研究結果の再現性の担保のため、NCBI の gene expression omnibus（GEO）やEBI の ArrayExpress、加えて、2018 年に始動した DDBJ Genomic Expression
Archive (GEA) (Kodama et al. 2019)に代表される公共データベースに登録することが論文誌掲載の条件とされている場合が一般的である。The Minimal
Information

About

a

Microarray

Experiment(MIAME)(https://www.fged.org/projects/miame)は 2001 年に出版されたマイクロアレイ
15

実験の結果を明確に解釈し、再現性の担保のために必要な最小限の情報を記述するためのガイドラインである(Brazma et al. 2001)。MIAME に続き、ハイスルー
プットシーケンシング技術への拡張版として The Minimal Information about ahighthroughput

nucleotide

Sequencing

Experiment(MINSEQE)(https://www.fged.org/projects/minseqe/) ガイドラインが 2008 年に提唱された(Rustici et al. 2021)。これらのガイドラインを遵守したデータについてはデータ
横断的な統合解析の難易度を下げ、データのもつ価値の最大化が期待できる。しかしながら、INSD とは異なり、GEO と ArrayExpress の間で相互にデータ共有をしてはいない。かつて ArrayExpress は GEO からデータをインポートしてい
た

が

、

2017

年

に

は

そ

れ

を

停

止

し

て

い

る

（https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/help/GEO_data.html）。GEO のアーカイ
ブデータは ArrayExpress からはまだ利用できるが、GEO にアーカイブされた
新しいデータは ArrayExpress から利用できなくなった。つまりこれらのデータ
ベースは独立してメンテナンスされており、ユーザーは個別に検索する必要がある。この課題に対し、公共遺伝子発現データベースの目次サイトである All Of
gene Expression（AOE）(Bono 2020)は、2014 年に始動した(Figure 2)。AOE
は GEO, ArrayExpress, GEA だけでなく、RNA-seq の配列情報としてのみ
Sequence Read Archive (SRA)に登録されているトランスクリプトームデータもインデックスの対象としている。つまり AOE により遺伝子発現データベースを統合して把握するすることが可能となっている。AOE にて調査したところ、2022
年にはヒト遺伝子発現データはおよそ 6 万 6 千ものデータシリーズが登録されていた。しかしながら、多くの研究で網羅的な遺伝子発現プロファイリングは活用されているが、論文の主題となる遺伝子はそのうちの数遺伝子程度である場合は少なくない。

16

Figure 2 公共遺伝子発現データ登録数

公共遺伝子発現データベースの目次サイト AOE(https://aoe.dbcls.jp/)を用いて 2022 年 6月 19 日に調査した。AOE により異なるデータベース由来の遺伝子発現データの統計情報が把握できる。

171.3 低酸素
好気性生物の呼吸に酸素は必須である。ヒトにおいては外傷性脳損傷、アルツ
ハイマー病、脳卒中など様々な神経疾患では低酸素状態が発生し、それら症状の一因となることが知られている(Zhang and Le 2010; Ghajar 2000; Caplan andHennerici 1998)。酸素は酸化的リン酸化や電子伝達系によって ATP を産生するために使われ、生命維持のエネルギー産生の中心的な働きをする。細胞や組織、生体が必要とする酸素量を供給されていない状態をハイポキシアという。ヒトをはじめとする高等生物の生体組織や細胞は、低酸素刺激による生命維持の危機を回避すべく Hypoxia inducible factor（HIF）に代表される低酸素応答のシステムを有している。HIF はαサブユニット(HIF-α)とβサブユニット(HIF-1β)のヘテロダイマーを形成して機能する転写因子である。また、HIF-αには HIF-1α,
HIF2-α, HIF3-αがある。
低酸素に対する生体反応の研究は、1990 年代の HIF-1 の発見により劇的に進んだ(Semenza and Wang 1992; Wang and Semenza 1995; Wang et al. 1995)。
この仕組みを明らかにしたウィリアム・ケリン教授、ピーター・ラトクリフ教授、
グレッグ・セメンザ教授は 2019 年にノーベル生理学・医学賞を受賞している。
正常酸素状態では、HIF-αの oxygen-dependent degradation ドメインに存在する二つのプロリン残基(P402, P564)は、酸素を補因子とした prolyl hydroxylase(PHD)や factor inhibiting HIF-1 (FIH-1)によって水酸化される(Figure 3)。その後、von Hippel-Lindau tumor suppressor (pVHL)などの E3 ユビキチンリガー
ゼが水酸化されたプロリンを認識し、ユビキチン-プロテアソーム系によって
HIF-αが分解されて、転写活性化が抑制される(Jaakkola et al. 2001; Mahon etal. 2001)。一方で、低酸素状態では PHD や FIH-1 の活性が低下し、HIF は水酸化を免れて aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator（ARNT）や転写コ
ファクターである cAMP response element-binding protein (CREB)結合タンパ
ク質と複合体を形成し、解糖系, 血管新生, 転移促進などに関連する下流の遺伝子発現を制御する(Ebert and Bunn 1998)。 例えば、血管新生に関係のある遺伝子として vascular endothelial growth factor (VEGF)があり、この遺伝子も HIFに よ り 発 現 が 亢 進 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る (Semenza 2003) 。

18

Figure 3 低酸素応答の模式図

通常酸素状態では HIF-1αは分解されるが、低酸素下では分解を免れて遺伝子発現を制
御する。

19

1.4 本研究の目的
序論の 1.1 出版バイアスの章では、知見の蓄積の偏りを考慮に入れつつ、オミ
クスデータなどの社会的なバイアスを排除したデータを中心とした解析手法をもとに研究対象を理解する必要について述べた。また、1.2 オープンデータの章
では、メタ解析が可能な公共データベースには多くの遺伝子発現データが存在していることについて述べた。また、1.3 低酸素の章では、低酸素に対する生体反応の研究はノーベル賞を受賞したほどの知名度があることと、低酸素状況下では、HIF が遺伝子発現の解糖系, 血管新生, 転移促進などに関連する下流の遺伝子発現を誘導することについて述べた。
低酸素に対する生体反応の研究分野は、1990 年代から研究分野として歴史があり、HIF という低酸素応答に関わる代表的な転写因子が存在し、オープンデー
タベースに多くの遺伝子発現データが存在するため、バイアスによって注目されなかった知見をデータドリブンにできるのではないかと考えた。以上より、私は本研究の目的を、「オープンデータを活用した低酸素応答新規パスウェイの探索
手法の開発」とした。

20

2 方法
2.1 書誌情報解析
2.1.1 gene2pubmed
Hypoxia inducible factor 1 subunit alpha (HIF1A)は低酸素応答分野の代表的な遺伝子である(Supplemental figure 1）。NCBI が提供しているデータセットである gene2pubmed (Figure 4)を元にして、HIF1A と各ヒト遺伝子との類似度である Simpson 係数と論文数を算出した。gene2pubmed は、生物種ごとのTaxonomy ID、遺伝子の EntrezID とその遺伝子について言及されている論文のPubMed ID が記載されているデータセットである。Simpson 係数 S は、以下の式を使って算出した。
𝑆(𝑋, 𝑌) =|𝑋 ∩𝑌|
𝑚𝑖𝑛(|𝑋|, |𝑌|)|𝑋 ∩𝑌|は HIF1A と任意の遺伝子のどちらにも該当する PubMed ID の数であり、𝑚𝑖𝑛(|𝑋|, |𝑌|)は HIF1A あるいは任意の遺伝子の PubMed ID の数のうち、小さい方の PubMed ID 数とする。Simpson 係数が 1 に近づくほど、HIF1A と類似であることを意味する。類似度を算出するに際には、Simpson 係数だけでなく、
Jaccard 係数も検討した。Jaccard 係数より Simpson 係数の方が HIF1A と任意の遺伝子 X に該当する論文数の差の大きさによる影響を受けにくく、可視化に適するスコアと判断した（Supplemental figure 2）。
遺伝子ごとの出版物数の算出および Simpson 係数の算出には Python を使って算出した（https://github.com/no85j/hypoxia_code/tree/master/CodingGene）。上記のSimpson

係

数

の

算

出

に

必

要

な

gene2Pubmed(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/gene2pubmed.gz)と Gene
Info (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/DATA/gene_info.gz)は 2021 年 1 月 4 日にダウンロードした。
HIF1A 以外にも、endothelial PAS domain protein 1(EPAS1)や ARNT、arylhydrocarbon receptor nuclear translocator like (ARNTL)といった低酸素との関連性が考えられる遺伝子との Simpson 類似度を任意の遺伝子 X に対し算出した(Supplemental figure 3)。HIF1A が低酸素研究分野の代表的な遺伝子と判断し、新規低酸素応答性遺伝子の探索には HIF1A との類似度を採用した。

21

Figure 4 gene2pubmed の内容

NCBI が提供している gene2pubmed を Jupyter Notebook を用いて内容を確認した。各生物種の遺伝子ごとに、その情報が記載された PubMed の ID が格納されたデータセットとなっている。全生物種で 1 千万レコード以上、ヒトの遺伝子に限定した場合はおよそ 150 万
レコードの情報が含まれていた。

22

2.1.2 PMC の FANTOM, GENCODE 記述論文数
PubMed Central (PMC) 検 索 で は 、「 RNA-Seq の み 」、「 RNA-Seq とGENCODE」、「RNA-Seq と FANTOM」の記載がある論文数の調査のため、以下のクエリを使用した。（2022.4.9 実施）
RNA-Seq : “rna-seq”[MeSH Terms] OR “rna-seq”[All Fields] OR (“rna”[AllFields] AND “seq”[All Fields]) OR “rna seq”[All Fields] 、 RNA-Seq AND
GENCODE : (“rna-seq”[MeSH Terms] OR “rna-seq”[All Fields] OR (“rna”[AllFields] AND “seq”[All Fields]) OR “rna seq”[All Fields]) AND “gencode”[AllFields]、RNA-Seq AND FANTOM : (“rna-seq”[MeSH Terms] OR “rna-seq”[AllFields] OR (“rna”[All Fields] AND “seq”[All Fields]) OR “rna seq”[All Fields])
AND “fantom”[All Fields]
該 当 論 文 情 報 を MEDLINE format に て ダ ウ ン ロ ー ド し 、 DP (Date of
Publication)をもとに各年あたりの出版数を算出した。出版数を算出するためのコマンドは検索結果ごとに以下の通りに実行した。
% grep -E 'DP-'

PMC_result.txt | awk '{print $3}' | sort | uniq -c >output.txt

23

2.2 RNA-seq
2.2.1 データ調査
低酸素に関連する一連の実験データシリーズ一覧を GEO から以下の検索式"hypoxia"[MeSH Terms] OR hypoxia[All Fields]) AND "Homo sapiens"[porgn]
AND "gse"[Filter]で検索し、2020 年 8 月 17 日にダウンロードした。
Python パッケージ pysradb(v 0.11.1)を使って SRA からメタデータをダウンロードし、GEO 内の Series Matrix File(s) 、論文から該当 Series のメタデータを取得し、normoxia と hypoxia の比較可能なサンプルの対（HN-pair）になる
データをマニュアルキュレーションした。キュレーションの条件は、RNA-Seq のデータであることと同一実験セットの中に HN-pair となるサンプルがあることとした。キュレーション後、必要なデータセットを NCBI から prefetch コマン
ドにて収集した。
2.2.2 データ取得
低酸素に関連するデータを調査した後、対応する RUN データを DDBJ FTP
サイト内の SRA からダウンロードした (ftp://ftp.ddbj.nig.ac.jp/)。ダウンロード
し た 配 列 デ ー タ は SRA フ ォ ー マ ッ ト で あ っ た た め 、 SRA Toolkit(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/docs/toolkitsoft/)の fasterq-dump プログラム
を用いて、発現量定量用に FASTQ フォーマットファイルに変換した。シングル
エンドリードとペアエンドリードの両方を解析対象とした。
2.2.3 リファレンス
コーディング遺伝子の解析には GENCODE release 30 をリファレンス配列として使用した。コーディング遺伝子および ncRNA の解析には FANTOM-CAT
をリファレンス配列として使用した。
FANTOM CAGE-associated transcriptome (FANTOM-CAT)は FANTOM5Cap Analysis of Gene Expression (CAGE)のデータを用いて作られた、信頼性の高い 5’ 完全ヒト lncRNA gene のオープンデータである。FANTOM-CAT のデータを使用するにあたり、国立研究開発法人理化学研究所 (理研)のリポジト
リ（https://fantom.gsc.riken.jp/5/suppl/Hon_et_al_2016/data/assembly/lv4_strin
gent/）にて提供されているデータを使用した。GTF ファイルをもとに gffread

24

v0.12.1 プログラムを使って以下のコマンドにて FASTA file を作成し、リファレンスとして使用した。
% gffread FANTOM_CAT.lv4_stringent.gtf -g hg19.fa -w lv4.fa
2.2.4 定量
コーディング遺伝子の発現定量には RNA-seq パイプラインである ikra
(v1.2.3) (https://github.com/yyoshiaki/ikra)を使用した(Figure 5)。
ikra はリードの品質管理（Trim Galore version 0.6.3）や、GENCODE release
30 をリファレンスとした Salmon version 0.14.0(Patro et al. 2017)を使用した
RNA-seq データの解析の自動化を可能にする。本研究では ikra のデフォルトの設定条件で解析した。salmon_tximport の設定では、ライブラリサイズをもとにスケーリングする scaledTPM を採用した。今回のデータセットでは、データ取得と品質管理の工程に 2.4 GHz 8 コア Intel Core i9, 64 GB メモリ搭載のMacBook Pro にて約 1 ヶ月を要した。また、RNA-seq データから処理した転写産物の定量結果は figshare にアップロードし公開されている（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14141252.v1）。

25

Figure 5 RNA-seq パイプライン ikra のワークフロー

図は https://github.com/yyoshiaki/ikra/blob/master/img/ikra_pipeline.png より引用した。
FANTOM-CAT の転写物ごとの解析については Figure 14 A のフローの通りに計算した。
Index 作成、定量の際には、コーディング遺伝子の発現定量の際に用いた ikra の定量条件を揃えるために、Pitagora-cwl（https://github.com/pitagora-network/pitagoracwl/tree/master/tools/salmon）を一部改変し ikra の salmon のバージョンと同様に salmon
0.14.0 を使用した。

26

2.2.5 HN-score 計算
低酸素と通常酸素のペアごとに、遺伝子ごとに Hypoxia-normoxia ratio (HNratio), R を以下の式を用いて算出した。
𝑅=

𝑇!"#$%&' + 1
𝑇($)*$%&' + 1

T は各遺伝子や転写物の発現量 scaledTPM を示す。
次に、すべてのペアサンプルの HN-ratio の値を 1.5 倍の閾値によって up、down、unchanged の 3 群に分類した。閾値については 1.5 倍と 2 倍の条件について検討し、本研究には 1.5 倍を採用した。発現亢進したサンプル数から発現低下したサンプル数を引いた値を HN-score とした。これらのデータについては
figshare からアクセス可能である (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14141135.v1)。
HN-ratio の算出の際には、分母が 0 になることを防ぐため、分母と分子にある一定数の値を加算することを事前に検討した。+1 あるいは、どの遺伝子定量結
果よりも小さい値である＋1e-09 を加算した上で HN-score を算出し、その分布を確認した。どちらの結果も大きな違いはなかったが、発現量が非常に低い遺伝
子のわずかな発現値の変動による影響を受けにくくなることを期待して、分母と分子に+1 を足して HN-ratio を算出した結果を採用した。また、HN-score を活用して、薬剤介入などの低酸素以外の実験介入が HN-pair どちらにも加わっている条件群の影響の確認や、当研究室の先行研究でオープンデータから収集済みであった実験サンプルと今回新規に収集したサンプルの HN-score の分布の比較を行った(Supplemental figure 4)。上位下位それぞれ HN-score の大きい順に 100
遺伝子を選抜した。これらの遺伝子をそれぞれ UP 100, DOWN100 gene list とした。
3.1 章 「 新 規 低 酸 素 応 答 遺 伝 子 の 探 索 」 に て 記 載 し て い る HN-score はGENCODE v30 をリファレンスとしたコーディング遺伝子に限定した HN-score
であり、この HN-score は 3.2 章「ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価
方法の構築」においては区別のため HNg-score と表記する。
3.2 章「ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法の構築」では、リファレンス転写物の違いのある二種類の HN-score を使用した。
HNg-score(GENCODE をリファレンスとしたコーディング遺伝子の HNscore)：既報のデータセットの中から、低酸素により 1.5 倍の発現変動のあった27

HN1.5 の値を HNg-score として使用した。このデータはfigshare(https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14141135.v1)にて公開した。
HNf-score (FANTOM-CAT をリファレンスとした転写物の HN-score)：
FANTOM-CAT をリファレンスにした以外は HNg-score の算出方法に従って
HNf-score を算出した。各転写物のアノテーション情報はhttps://fantom.gsc.riken.jp/cat/v1/#/genes から取得した。

2.3 エンリッチメント解析
エンリッチメント解析は、発現が変化した遺伝子群の機能の特徴を把握するための手法である。今回は、HN-score の高かった、あるいは低かった遺伝子群の特 徴 を 把 握 す る た め に 解 析 し た 。 HN-score エ ン リ ッ チ メ ン ト 解 析 に はMetascape (https://metascape.org) (Zhou et al. 2019) とChIP-Atlas(https://chip-atlas.org/)(Oki et al. 2018)を使用した。Metascape では、対象の遺伝子群のリストをもとに、特定の生物学的プロセス、タンパク質の局在などの特徴によって定義された数千の遺伝子セットの情報をもとに解析することで、生物学的な洞察をもたらすことが期待できる。Metascape はデフォルト条件にて使用した。以下に述べる ChIP-Atlas のエンリッチメント解析では、解析対象の遺伝
子群のリストをもとに、それらの遺伝子のゲノム座に結合する転写因子などのタ
ンパク質を予測することが可能となる。ChIP-Atlas での設定では“Select data
set to be compared”の項目を“Refseq coding genes (excluding user data)”とし、それ以外はデフォルトとした。

2.4 ChIP-Atlas 解析
クロマチン免疫沈降法（ChIP, Chromatin Immuno Precipitation）は、DNA
結合タンパク質に結合した DNA 配列を解析する技術である。ハイスループット
シーケンサーを用いて配列解読する方法を ChIP-seq 法と呼ぶ。DNA 結合タン
パク質にはヒストンや転写因子などが挙げられ、これらを認識する抗体を用い免疫沈降で回収した DNA 配列を明らかにすることで、ゲノム上の結合領域を把握することができる。ChIP-seq 解析では MACS2(Model-based Analysis for ChIPSeq 2)プログラムを使って結合サイトを推定する。
UP100 gene list や DOWN 100 gene list の評価のために、SRA にて公開され28ている ChIP-seq データを収集、キュレーションしたデータを対象に解析できる
Web ツールである ChIP-Atlas を活用した。各低酸素関連転写因子と、制御を受ける各遺伝子の転写開始点付近の DNA 配列との結合強度（MACS2 スコア）情報を取得した。ChIP-Atlas の“Target Genes”ツールを用いて、すべての遺伝子の平均 MACS2 スコアを取得した。
対象抗原を HIF1A, hypoxia-inducible factor2α（HIF-2α）としても知られる EPAS1 および ARNT として、転写開始点からの距離を意味する Distance from TSS パラメータを±5k と設定した。各遺伝子のHN-score と MACS2 スコアは、遺伝子名をキーにして結合した。

2.5 アンチセンス鎖に着目した解析
アンチセンス転写産物は、タンパク質コード遺伝子または非タンパク質コード遺伝子のセンス転写産物の反対側の鎖から転写されるものを意味する。今回の解析ではコーディング遺伝子の HN-score である HNg-score の高かった、あるいは低かった 200 遺伝子に対応するアンチセンス転写物に着目した (Figure6)。アンチセンス転写物のリストを取得するために、Bedtools (v2.30.0)のプログラムを使い以下の処理を行った。HNg-score を元に選抜した UP 200 genes,
DOWN 200 genes それぞれの transcript id をもとに、該当遺伝子ごとの全領域
を merge した bed ファイルを作成した。この bed ファイルをもとに、Bedtoolsの intersect コマンドを使って、センス鎖の遺伝子と同じ配列領域がアンチセン
ス鎖に重複している転写物をリストアップし、それぞれの HNf-score と統合
し、表にまとめた。

29

Figure 6 アンチセンス転写物リストの取得

HNg-score が高いあるいは低い値を示した UP 200 コーディング遺伝子, DOWN 200 コー
ディング遺伝子のアンチセンス鎖に位置する転写物をアンチセンス転写物と定義してリストアップした。

30

2.6 可視化
棒グラフや散布図には TIBCO Spotfire Desktop version 11.0.0 および
11.5.0 (TIBCO Spotfire, Inc., Palo Alto, CA, USA)を使用した。Spotfire はビジ
ネス・インテリジェンス（BI）ツールであり、データのサブ集団を取り出した
詳細解析であるドリルダウン解析が可能なことから探索的な可視化に適している。
集合の関係を示す代表的な可視化方法はベン図であるが、複数の集団の関係性を示すのには Upset plot が適している。エンリッチメント解析に使用した
Gene Ontology ごとの該当遺伝子群の関係性を可視化をする際に Upset plot を使用した。Upset plotg は R (version 4.0.3)の UpSetR (1.4.0)パッケージを使用し作成した。
Violin plot とはデータの分布の密度を可視化する際に用いられる方法である。Violin plot の作図には Python(3.8.10)の pandas(1.2.5), matplotlib(3.2.2),
seaborn(0.11.0)パッケージを使用した。
ゲノムブラウザとは、ゲノム上の位置情報に基づいて様々な情報を閲覧した
りダウンロードしたりできるブラウザのことである。ゲノム座標の可視化にはカリフォルニア大学サンタクルーズ校（UCSC, University of California Santa
Cruse）が維持管理している UCSC genome browser（https://genomeasia.ucsc.edu/index.html）を活用した。各種ゲノムのアノテーションのことをTrack と呼ぶ。Track のアノテーション情報を含めこれらの情報はオープンデー
タであり誰でも無料で使用することができる。本解析では、この UCSC
genome browser に“FANTOM5 summary Tracks”を追加して可視化した(Figure 7)。FANTOM-CAT のリファレンス配列を作成する際に使用したゲノム
リファレンス hg19 とバージョンを揃える目的で、可視化に用いたリファレンス
ゲノムのバージョン（UCSC genome browser 上の表記は Human Assembly）
も GRCh37/hg19 を使用した。リファレンスゲノムの違いによる影響がないことを確認するため、GRCh38/hg38 のリファレンスゲノムのバージョンを用いて、PGK1 と TAF9B のゲノム座位を可視化し、二つの遺伝子がセンス-アンチ
センスの位置にあることを確認した。

31

Figure 7 UCSC genome browser での FANTOM5 のデータの追加設定

Track Data Hubs にて Search terms にて”FANTOM5”を検索して Track を追加した。

32

3 結果
3.1 新規低酸素応答遺伝子の探索
本 3.1 章では低酸素刺激応答に着目し、オープンデータベースを元にメタ解析を活用し、出版バイアスにより見えにくくなっている知見を明らかにすることを目的とした。新規低酸素応答遺伝子の探索は大きく３つの工程に分けられる(Figure 8)。Step 1 では公開遺伝子発現データから低酸素刺激に関係する RNAseq データを取得した。GEO よりメタデータを取得し、マニュアルキュレーショ
ン後に該当データセットの遺伝子発現の定量を経て低酸素刺激に関係する UP
100 gene list, DOWN 100 gene list を得た。Step 2 では UP 100 gene list, DOWN
100 gene list のバリデーションを行った。最後に Step 3 で gene2pubmed を用いた HIF1A の Simpson 類似度を低酸素応答研究での着目度の代替指標として用い、新規低酸素刺激応答遺伝子を探索した。

Figure 8 低酸素トランスクリプトームメタ解析の模式図

Step 1．オープンデータベースから低酸素応答性遺伝子のアップレギュレーションとダウン
レギュレーションを評価し、リストアップした。Step 2. 既知の低酸素刺激関連遺伝子が選抜されていることを確認した。Step 3. 新規低酸素応答遺伝子を探索した。

33

3.1.1 解析対象データの要約
は じ め に All Of gene Expression (AOE; https://aoe.dbcls.jp/) (Bono 2020)
を用い、多くの低酸素に関連したデータが登録されていることを確認した。その後、NCBI の GEO から提供されているメタデータを元に解析対象データをキュ
レーションした。キュレーションする際の基準として、Hypoxia と Normoxia の実験条件の検体が同一データシリーズにあり HN-pair を設定できること、ヒトの細胞株あるいは組織検体由来の RNA-seq であることとした。次に既報から提供されている低酸素関連データリストとの統合および重複の排除を経て SRA から 69 データシリーズ、495 の HN pair となるサンプルの SRR numbers を取得した（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14141219.v1）。
解析対象のデータの低酸素条件について 495 サンプルについて要約した(Figure 9)。通常酸素状態については、一部記載のないサンプルも含まれたが一般的には 20% 酸素濃度である一方、低酸素条件は、酸素濃度の情報があるサン
プルについては 0.1 から 5%の濃度、一部には CoCl2 などのケミカルハイポキシ
アも該当した。処置時間は記載のあるものについては最短では 1 時間、最長では 3 ヶ月だった。データセット中、最も多い条件が、低酸素の条件が 1% 酸素
濃度, 24 時間処理だった。全体の 65%ががん由来のサンプルでありその中でも最も多い由来組織は乳がん細胞だった。

34

Figure 9 解析対象データの低酸素条件についての内訳

今回の対象データは、酸素濃度、処置時間、細胞種、由来組織について要約した。1%酸素濃度, 24 時間処置した乳がん細胞の条件が最も多かった。

35

3.1.2 HN-score を用いたデータセットの特徴
HN-score は、低酸素条件下の遺伝子発現変動を定性的に評価するスコアである。
このスコアを用いることにより、RNA-seq にて定量された検体群の低酸素刺激応
答遺伝子の低酸素応答性を評価可能と考えた。例えば VEGFA の場合は 406 UP, 25
DOWN, 64 unchange となり、その HN-score は 381 となる。この HN-score が高い
順から 100 遺伝子、低い順から 100 遺伝子をそれぞれ UP 100 gene list, DOWN 100
gene list とした（Supplemental Table 1）。また、このリストは figshare からもアクセス 可 能 で あ る (UP100 gene list : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14141015.v1,
DOWN 100 gene list : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.14140997.v1）。
上述の UP 100 gene list, DOWN 100 gene list が HIF1A などの低酸素関連調節因子の影響を受けているかを確認すべく、ChIP-Atlas によるエンリッチメント解析を行った。UP 100 gene list では HIF1A, ARNT, EPAS1 などの低酸素関連因子がエンリッチメントされ、DOWN 100 gene list では Sin3A associated protein
30 (SAP30), histone deacetylase 1 (HDAC1)などのエピジェネティックな制御因子や、細胞周期の進行などに関与するがん遺伝子の MYC proto-oncogene,bHLH transcription factor (MYC)がエンリッチメントされた(Table 1)。同様に、
Metascape にてエンリッチメント解析をしたところ、UP 100gene list では、
Hypoxia 関 連 因 子 （ GO:0001666: response to hypoxia, M255: PID HIF1
TFPATHWAY）がエンリッチメントした。
DOWN 100 gene list では GO:0034660:
ncRNA metabolic process が強くエンリッチメントされていた。
（Figure 10 AB）
UP 100 gene list のエンリッチメント解析にて上位にエンリッチメントした
HIF1A, EPAS1, ARNT について平均 MACS2 ピークの散布図をプロットした。
MACS2 ピークの高い遺伝子は HN-score も高かった（Figure 10 C,D）。

36

Table 1 ChIP-Atlas でのエンリッチメント解析の結果

ChIP-Atlas のエンリッチメント解析ではゲノム上の遺伝子座や遺伝子に結合しているタン
パク質を予測した。
UP 100 gene list をインプットとした結果
AntigenID

Log P-val

Log Q-val

Fold Enrichment

HIF1A

SRX4802348-88.8246-84.064

35.6249

ARNT

SRX4802353-76.4303-72.3686

83.3136EPAS1

SRX3051209-73.1987-69.2831

34.9928DOWN 100 gene list をインプットとした結果
AntigenID

Log P-val

Log Q-val

Fold Enrichment

SAP30

SRX116447-34.1844-30.0149

4.96916

MYC

SRX1497384-31.4158-27.5474

2.97453HDAC1

SRX186644-27.4205-24.1541

3.323137

Figure 10 既知の低酸素刺激関連遺伝子の確認(A-B) Metascape を用いたエンリッチメント解析 (A) UP 100 遺伝子をインプットにした結果(B) DOWN 100 遺伝子をインプットにした結果。Figure の紙面の都合上省略した R-HAS163200 の遺伝子セット名は次の通り。R-HAS-163200: respiratory electron transport,
ATP synthesis by chemiosmotic coupling, and heat production by uncoupling proteins。
(C-D) 低酸素関連抗原（HIF1A, ARNT, EPAS1）の ChIP-seq 平均ピークの散布図(C)HIF1A と ARNT の散布図 (D) EPAS1 と ARNT の散布図。色は HN-score による。
38

3.1.3 低酸素応答を対象としてビブリオーム解析
遺伝子と出版物の関係性の情報は gene2pubmed から取得可能である。UP 100
gene list の各遺伝子の出版数と、低酸素関連因子として著名な HIF1A との関係性を gene2pubmed のデータを元に Simpson 係数を算出することで、低酸素関連の研究がどれほどされているかを評価した(Figure 11A)。このような生物学的な出版情報を用いた解析方法をビブリオーム解析と呼ぶ。UP 100 gene list の中で HIF-1 による直接制御が知られている遺伝子群(Hirota and Semenza 2006)
を、出版数と HIF1A との Simpson 係数の散布図で可視化した。HIF-1 による直接 制 御 が 知 ら れ て い る 遺 伝 子 群 の 中 で 興 味 の あ る 遺 伝 子 群 CA9, EGLN3,VEGFA と、今回のメタデータ解析で HN-score の高かった遺伝子群のうちのankyrin repeat domain 37 (ANKRD37), N-myc downstream regulated 1(NDRG1), G protein-coupled receptor 146 (GPR146)の処置時間ごとに log2 変
換した HN-ratio を Box plot にて可視化した。(Figure 11B)

39

Figure 11 新規低酸素応答遺伝子の探索（A）UP 100 gene list における HIF1A との gene2pubmed 情報を元にした Simpson 類似度と論文数 (B) UP 100 gene list の一部の遺伝子についての、低酸素処理時間当たりのHN-ratio を底を 2 とする Log 変換したボックスプロットにて可視化した。

40

3.1.4 考察
GEO に登録されている遺伝子発現データのうち、低酸素に関連する 69 データ
シリーズを解析対象とし、既報の約４倍となる 495 の HN-pair のデータを SRAから取得した。集めた遺伝子発現データの 65％ががん細胞由来であった。がん細胞由来の検体が多い理由には、低酸素に関係するがん研究が多くあることと、低酸素処置実験においてがん細胞株は実験に供しやすいことなどが考えられる。このデータセットは生体内の全てをバランスよく網羅しているわけではなく、デー
タセットに偏りがあると考えられる。このキュレーションされたデータセットのサンプルの多くはがん細胞由来であるため、HN-score はがん細胞をメインに低酸素刺激反応を評価していることになる。
Up100 gene list を使った Metascape および ChIP-Atlas の解析結果で、想定通り Hypoxia 関連の gene set のエンリッチメントが確認できたことから、HNscore が想定通り低酸素刺激応答遺伝子を選抜できていると判断した（Table 1,
Figure 10）
Metascape や ChIP-Atlas のエンリッチメント解析結果で up100 gene list でHypoxia 関連の gene set がエンリッチメントされていたことから、以降の解析では UP100 gene list をメインに解析を進める方針とした。一方の DOWN 100
gene list では MYC がエンリッチメントされていた。HIF による MYC の抑制についてはいくつか報告がある。HIF による MYC の制御には MYC のタンパク質
複合体形成のアンタゴニスティックな結合阻害(Gordan et al. 2007), DNA 結合部位の競合による MYC の転写活性の直接阻害(Koshiji et al. 2004), MYC のプロ
テアソーム分解促進(Zhang et al. 2007; Wong et al. 2013)を介したものが知られてることから、それらの HIF による間接的な影響が DOWN 100 gene list に反映していると考える。
DOWN 100gene list をインプットとした Metascape のエンリッチメント解析
では ncRNA metabolic process との関連が示唆されていた。この結果は MYC による影響が関係している可能性があるが、詳細は明らかになっていない。そのため、ncRNA metabolic process に関係する研究は 3.2 章「ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法の構築」にて検討することとした。
Reference Expression dataset（RefEx）(https://refex.dbcls.jp/）は、正常な組織や細胞などの大規模な遺伝子発現データを収集し、EST, GeneChip, CAGE,
RNA-seq と異なる４つの実験手法で得られた発現値を並列に比較を可能とする
41

ウ ェ ブ ツ ー ル で あ る 。 RefEx で 検 索 さ れ た 遺 伝 子 の 表 示 順 の 決 定 に は
gene2pubmed が利用されている(Ono et al. 2017)。その活用を参考に、よく知られていない遺伝子を評価するために gene2pubmed を用いた。gene2pubmed を用いて二つの変数を作成した。一つ目は遺伝子ごとの出版数と、２つ目は HIF1Aとの類似度を Simpson 係数である。Simpson 係数は、HIF1A と関連のある
PubMed ID とある遺伝子と関連のある PubMed ID の共起する頻度の強さを示す類似度として使用した。Simpson 係数が 1 に近ければ HIF1A との関連が強いと推定されるが、比較される一方の PubMed ID の数が極端に少ない場合は、必ずしも関係性が強いと判断できない場合がある。
上記の理由により可視化して確認することが重要と考え、これらの出版数、Simpson 係数と、UP 100 遺伝子群の中で、HIF1A の制御を受けることがすでに知られている遺伝子群(Hirota and Semenza 2006)がどこにプロットされるかを可視化した（Figure 11A）。出版数が多い場合は Simpson 係数が低くなったが、それは研究される機会が増えたことにより関係が明らかになった遺伝子数が増え、その結果、Simpson 係数が過小評価されやすくなるためと考えられる。2006
年に報告された HIF1A によって制御されることが知られている遺伝子群は、論文数が多いにもかかわらず、Simpson 係数で高い値を示し、回帰直線上にプロットされた。一方、論文数が少ない遺伝子、例えば、少数ではあるが既に低酸素との関係が報告されている ANKRD37(Peng et al. 2018; Deng et al. 2020)などが回帰線の上にプロットされていた。そこで、回帰線の下にプロットされた spermassociated antigen 4 (SPAG4), GPR146, protein phosphatase 1 regulatory
subunit 3G (PPP1R3G), transmembrane protein 74B (TMEM74B) and serine
protease 53 (PRSS53)などの遺伝子が、新規の低酸素応答性遺伝子の候補になるのではないかと考えた。PubMed や NCBI gene をはじめとする検索の結果、
SPAG4 と低酸素に関係する報告はすでにあった(Knaup et al. 2014; Shoji et al.
2013)が、それ以外のこれらの遺伝子については該当文献はなかった。
Log2 変換した HN-ratio をボックスプロットにて可視化した (Figure 11B) 。
着目した遺伝子は、HIF-1 による直接制御が知られている遺伝子群から carbonic
anhydrase 9 (CA9), egl-9 family hypoxia inducible factor 3 (EGLN3), VEGFAと、今回のメタデータ解析で HN-score の高かった遺伝子群のうちの ANKRD37,

NDRG1, GPR146 とした。ANKRD37, NDRG1 は本研究室の以前の研究(Bonoand Hirota 2020)でも高い HN-score だった。これらの遺伝子は、40h などの一部の検体を除いて、低酸素応答が知られている遺伝子と同様に正の値の HN-ratio42を示していた。低酸素処置時間ごとの log2 変換した HN-ratio の結果では、40hで遺伝子発現変動が小さいか低下した。この処置時間の検体は全て NK 細胞由来
で酸素濃度は 1%だった。検体数が３と少なく、NK 細胞由来の検体はこの３つ以外にはなかった。これは 40h 処理での影響よりむしろ NK 細胞ではこれらの遺伝子の低酸素応答は見られない可能性を示しているが、詳細については不明である。UP 100 遺伝子群の時間別の HN-ratio については Supplemental figure 5にて可視化した。また、CA9, VEGFA, GPR146 については Supplemental figure
6 にて細胞の条件ごとに可視化した。
G タンパク質共役受容体(GPCR)にはクラス A, B,C の分類がある。クラス A はロドプシン型とも呼ばれ、脂溶性の低分子リガンドやカテコラミンに結合する。
クラス B はペプチドホルモンと結合し、N 末端に 100 から 300 アミノ酸残基の領域を持つ。クラス C は N 末端におよそ 300 アミノ酸残基の領域を持ち、グルタミン酸に代表されるアミノ酸などを結合する。GPR146 遺伝子は クラス A に属する GPCR である G protein-coupled receptor 146 タンパク質をコードする。
Figure 11A の散布図では、GPR146 は出版数と、HIF1A との Simpson 係数との散布図では回帰線の下側にプロットされ、他の既知低酸素刺激応答遺伝子と同様に遺伝子発現亢進が確認された。一方で、PubMed や NCBI gene をはじめとする検索では、”hypoxia” “GPR146”をクエリとして文献調査したところ GPR146
は hypoxia との報告はされてはいなかったことから、GPR146 は今まで着目されて い な い 重 要 な 低 酸 素 応 答 遺 伝 子 で あ る と 考 え て い る(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=GPR146+hypoxia)。
網羅的な遺伝子発現データを用いた低酸素研究で、低酸素刺激によって発現亢
進した遺伝子リストの中に GPR146 は含まれる(Qi et al. 2010; Labrecque et al.
2016)。しかしながら、今までの報告の内容では、GPR 146 は多くの低酸素刺激関連遺伝子群の中のただの一つの遺伝子にすぎない。GPR146 の抑制がコレステ
ロールの低下に関与していたこと(Yu et al. 2019)や、Class A オーファン GPCRとは考えられているものの GPR146 のリガンド候補として考えられている C ペ
プチドが、赤血球の低酸素誘導 ATP 放出に抑制的に働いたこと(Richards et al.
2014)などが報告されており、GPR146 の生物学的機能解明はますます今後発展していくと考えられる。

PPP1R3G 遺伝子は G サブユニットである protein phosphatase 1 regulatory
subunit 3 G をコードする。PPP1R3G は肝臓における食後のグルコースと脂質

43

のホメオスタシスに相関している(Zhang et al. 2014)。3T3L1 細胞では、
PPP1R3G を過剰発現させるとグリコーゲンおよびトリグリセリドのレベルが上昇したとの報告があり、また PPP1R3G を全身で欠損させたマウスに高脂肪食を与えたところ、野生型と比較して体重及び脂肪組成が有意に減少したとのことだった。PPP1R3G を欠損すると酸素消費量および二酸化炭素生成量から測定される代謝速度が加速したとの報告がある(Zhang et al. 2017)。これらの結果を鑑み
るに、低酸素応答により PPP1R3G の HN-score が高かった今回の結果は、低酸素状況下での生体内での代謝の速度を抑制する機構の可能性を示唆すると考える。

TMEM74B 遺伝子は transmembrane protein 74B をコードする遺伝子であり、C20orf46 という別名を持つ。論文報告数は少なく、乳がん細胞株と乳がん患者のコピー数変異（CNV）プロファイリングの結果、腫瘍のステージと関連する遺伝子として C20orf46 が提示されていた(Fatima et al. 2017)。低酸素との関係性については不明であるが、今回の研究に用いられたサンプルは乳がん由来のサンプルが多かったことから乳がんにおける TMEM74B の機能解析については今後の研究の発展が期待される。

PRSS53 遺伝子は serine protease 53 をコードする遺伝子である。頭髪および顔面の毛髪についてのラテンアメリカ人を対象にした genome-wide association
scan の結果、髪の毛の形に影響を与えるとして PRSS53 の遺伝子座（Q30R）が同定されたとの報告がある(Adhikari et al. 2016)。しかしながら低酸素との関係性については未だ明らかにされていない。
今回の解析では ncRNA metabolic process が DOWN 100 gene list で顕著に
エンリッチメントされていた(Figure 10B)。これは低酸素刺激が ncRNA の発現
変動にも影響を及ぼしている可能性を示唆する。 今回の解析は GENCODE のタンパク質コーディング遺伝子のみを定量解析対象としたので、ncRNA の発現
変動については解析の対象外となっている。低酸素刺激による ncRNA の遺伝子発現変動への影響については、さらなる研究が必要と考えたため、3.2 章「ncRNAを含めた転写産物の低酸素応答の評価方法の構築」にてその詳細を述べる。
本研究では低酸素応答に着目して、gene2pubmed データを元に各遺伝子の研究報告数を算出し可視化した。研究者の興味の如何に関わらず取得が可能な、数万の遺伝子発現情報を含む公共データを用いることにより、新規知見を明らかにすることを試みた。この研究によって、公共データベースを元にしたメタデータ
44解析によるデータドリブンな解析により、多くの低酸素刺激実験においてGPR146 遺伝子の発現亢進が認められることを見出した。

3.2 ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法の構築
3.1 章「新規低酸素応答遺伝子の探索」を進める中で、低酸素状況下ではncRNA の代謝に関連のある遺伝子群の発現が低下していたことを明らかにした。しかしながらそれらの遺伝子群がどのように ncRNA の代謝に影響を与えるかについて詳細は不明なことが多く、コーディング遺伝子と比較して ncRNA についての知見は少ない。そこで、本研究の第 3.2 章では、ncRNA も含めた転写物に対しデータドリブンに低酸素刺激応答性を評価することを目的とした。
本章では、3.1 章で収集しキュレーションした、遺伝子発現オープンデータベース由来の低酸素刺激に関わるデータセットをもとに、二つのリファレンス配列を元に低酸素応答遺伝子や転写物を評価した(Figure 12)。一つはコーディン
グ遺伝子にのみ着目し、GENCODE release 30 をもとにした遺伝子発現解析
で、もう一つは FANTOM-CAT をリファレンスとし、コーディング遺伝子とncRNA に対する発現定量データを用いた解析である。どちらの解析でも HNscore を算出したが、区別のため GENCODE を元に HN-score を算出した場合
は HNg-score, FANTOM-CAT を元に HN-score を算出した場合は HNf-score と表記する。
コーディング遺伝子にのみ着目した解析では、低酸素刺激により ncRNA
metabolic process、中でも ribosomal RNA (rRNA)に関与する遺伝子が抑制されていることを示した。次にコーディング遺伝子と ncRNA について視野を広げ、FANTOM-CAT を元に網羅的に低酸素による転写物への影響を評価し、染色体ごとの HNf-score の可視化やセンス-アンチセンス鎖に着目して解析した。

45

Figure 12 ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価のメタ解析

ヒトの低酸素 RNA-seq データを使用し、二つのリファレンスをもとに大きく二つの解析を行った。コーディング遺伝子のみに着目した解析では、GENCODE をリファレンスに使用した。低酸素による発現低下遺伝子が rRNA に関わる遺伝子がエンリッチメントされていた。
コーディング遺伝子と ncRNA に着目した解析では、FANTOM-CAT をリファレンスに資料した。低酸素刺激下では、ミトコンドリア DNA 由来の転写物が低下していた。アンチセンスの解析では遺伝子発現制御（PGK1 と TAF9B）の関係性が示唆された。

46

3.2.1 エンリッチメント解析の詳細調査
3.1 章「新規低酸素応答遺伝子の探索」のコーディング遺伝子にのみ着目した
エンリッチメント解析では、低酸素による影響されやすさの指標である HNgscore の上位 200 の遺伝子では低酸素応答関連の gene set がエンリッチメントされた（Figure 13A）。一方で HNg-score 下位 200 の遺伝子のエンリッチメント解
析では、ncRNA metabolic process 関連遺伝子の発現抑制が明らかになった（Figure 13B）。そこで、まずは ncRNA metabolic process に関わる遺伝子群を精査するために、エンリッチメント解析で得られたこれらの遺伝子の詳細を調査することとした。
GO:0034660 ncRNA metabolic process について、より細分化したカテゴリの中では以下の項目 (ncRNA processing, ribosome biogenesis, ribonucleoprotein
complex biogenesis, rRNA processing, rRNA metabolic process など) が含まれた（Supplemental table 2）。GO network 解析（Figure 13C）と Upset plot の可視化（Figure 13D）により、ncRNA metabolic process に該当する遺伝子はrRNA に関わる遺伝子群で構成されていることを示した。

47

48

Figure 13 低酸素刺激応答 ncRNA metabolic process 遺伝子の解析(A,B) Metascape によるエンリッチメント解析 (A) DOWN 200 gene list をインプットとしたエンリッチメント解析結果を示す。紙面の都合上省略した R-HAS-163200 の遺伝子セット名
は以下の通り R-HAS-163200: respiratory electron transport, ATP synthesis bychemiosmotic coupling, and heat production by uncoupling proteins。(B) UP 200 gene list
をインプットとしたエンリッチメント解析 (C,D) ncRNA metabolic process に類似している遺伝子セットの調査 (C) DOWN 200 gene set をインプットとしたエンリッチメント解析を元にした GO network 解析による ncRNA metabolic process と類似した遺伝子セットを可視化した。(D) ncRNA metabolic process と rRNA 関連遺伝子セットの集合の重複具合を Upset
plot にて示した。

49

3.2.2 FANTOM-CAT と GENCODE の記述のある論文数調査
FANTOM-CAT や GENCODE を使用した RNA-seq 研究がどの程度なされているかを確認するために PMC にて検索した。PMC にはアブストラクトだけでなく論文全文が収録されており、Material and Method に記載されていることが想定されるリファレンスの情報も検索対象になる。そこで PMC を検索対象として、GENCODE, FANTOM と RNA-seq の記載のあった論文数を年毎に算出した。RNA-seq の記述のあった論文数は 2021 年には 4 万を超えていた一方で、
FANTOM と RNA-seq 両者の記述がある論文はその 0.5%で、GENCODE のお
よそ 10 分の 1 だった（Table 2）。

Table 2 FANTOM と RNA-seq の記述のある報告数の調査“RNA-seq” &”GENCODE”“RNA-seq” &”FANTOM”

(%)

(%)

17373

769 (4.4%)

123 (0.7%)

2018

20400

996 (4.9%)

127 (0.6%)

2019

25668

1254 (4.9%)130 (0.5%)

2020

33607

1593 (4.7%)

176 (0.5%)

2021

40757

1976 (4.8%)

210 (0.5%)

2022

9420

406 (4.3%)

39 (0.4%)

year“RNA-seq”

2017

50

3.2.3 FANTOM-CAT を用いた転写物の HNf-score の特徴
FANTON-CAT では、transcription initiation evidence score (TIEScore)と呼ばれるスコアを元に FANTOM-CAT 遺伝子を評価している。TIEScore の閾値ごとに遺伝子を permissive (n = 124,245), robust (n = 59,110), stringent (n =31,520)に分類している。
公開されている FANTOM-CAT の GTF ファイルをもとに各 FASTA ファイル
（raw, permissive, robust, stringent）を作成し、これをリファレンス配列として低酸素-通常酸素状態の 495 ペアの実験データセットの転写産物を定量し、FANTOM-CAT をリファレンスとした Hypoxia-Normoxia score (HNf-score)を算出した(Figure 14A)。Robust と stringent のリファレンス配列を用いて、低酸素 条 件 に よ り 発 現 が 亢 進 す る こ と が 知 ら れ て い る lncRNA で あ る
MIR210HG(Ho et al. 2022)の HNf-score が正の値を示していたことを確認した（Supplemental figure 7）。また Robust と stringent も同様の HNf-score 分布
であることを確認し、以降の解析では最も厳しい条件の TIEScore の閾値が使われた stringent の FANTOM-CAT のデータセットを活用することとした。
HNf-score の上位下位に含まれている転写物にどのようなものが含まれているかを精査した(Figure 14B, Table 3)。高い HNf-score を示す低酸素応答転写物の中には、高 HNg-score の遺伝子のアンチセンス鎖に位置している転写物がいくつかあった（BHLHE40-AS1, SLC2A1-AS1）。一方、低 HN-score の転写物はミトコンドリア遺伝子が多かった(MT-ND2, MT-ATP8)。

3.2.4 染色体ごとの HNf-score の要約
上位下位 25 のトランスクリプトの HNf-score について、Table 3 に掲載する。
全 デ ー タ に つ い て は

figshareに 登 録 済 み で あ る（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.19679493.v1）。染色体ごとに HNf-scoreを可視化した結果では、他の染色体とは異なりミトコンドリア DNA 由来の転写
物では HNf-score の中央値は負の値を示した(Figure 14C, Supplemental table3)。低酸素応答による染色体ごとの違いについて詳細解析を行ったが、今回の解析では染色体ごとの特徴的な影響は見出されなかった（Supplemental figure 8）。

51

Figure 14 FANTOM-CAT を活用した転写物の HN-score 評価(A)FANTOM-CAT をリファレンスにした HNf-score 算出手順 (B)FANTOM-CAT の転写物
ごとの HNf-score 分布 （C）染色体ごとの HNf-score バイオリンプロット

52

Table 3 HNf-score の高かったあるいは低かった転写物の上位 25 リスト

高 HNf-score の転写物には BHLHE40 のアンチセンス鎖に位置する BHLHE40-AS1 な
ど、AS (antisense)が遺伝子名に含まれていた。一方、低い HNf-score の転写物にはミトコ
ンドリア由来の転写物がリストアップされた。
Transcript id
UP 25 of
all

HNf

Chr

gene namegene classantisense
AS_VEGFA1

ENST00000607600.1

321

chr6

RP1-261G23.7

short ncRNAs

2

ENST00000481651.1

309

chr7

RP11-61L23.2

pseudogenes

3

ENST00000307365.3

301

chr10

DDIT4

protein coding mRNAs

4

FTMT21000000269.1

300

chr3

BHLHE40-AS1

lncRNA, intergenic

5

ENST00000368636.4

289

chr10

BNIP3

protein coding mRNAs

6

ENST00000335174.4

275

chr4

ANKRD37

protein coding mRNAs

7

ENST00000290573.2

272

chr2

HK2

protein coding mRNAs

8

FTMT24300004891.1

267

chr11

LDHA

protein coding mRNAs

9

HBMT00000242044.1

265

chr11

SBF2

protein coding mRNAs

AS_ADM

10

FTMT24200000803.1

265

chr11

CATG00000004979.1

lncRNA, antisense

AS_LDHA11

ENST00000380629.2

265

chr8

BNIP3Lprotein coding mRNAs

12

ENCT00000004975.1

263

chr1

SLC2A1-AS1

lncRNA, divergent

13

ENST00000543445.1

257

chr11

LDHA

protein coding mRNAs

14

ENST00000378357.4

257

chr9

CA9

protein coding mRNAs

15

ENST00000453116.1

254

chr10

MXI1

protein coding mRNAs

16

ENST00000471240.1

253

chr10

DDIT4

protein coding mRNAs

17

ENST00000460806.1

251

chr3

BHLHE40protein coding mRNAs

18

FTMT20200001505.1

250

chr1

SLC2A1protein coding mRNAs

19

HBMT00000734702.1

250

chr19

CATG00000040757.1

lncRNA, divergent

20

FTMT21100041760.1

249

chr3

BHLHE40protein coding mRNAs

transcripts

AS_BHLHE40

AS_SLC2A1

AS_GPI53

DOWN 25of all21

ENST00000250457.3

246

chr14

EGLN3

protein coding mRNAs

22

HBMT00000734730.1

245

chr19

CATG00000040757.1

lncRNA, divergent

23

ENST00000426263.3

243

chr1

SLC2A1protein coding mRNAs

24

HBMT00000727478.1

242

chr19

RAB11B-AS1

lncRNA, divergent

25

ENST00000534464.1

241

chr11

ADM

protein coding mRNAs

1

ENST00000320270.2

-248

chr8

RRS1

protein coding mRNAs

2

ENST00000368232.4

-246

chr1

GPATCH4

protein coding mRNAs

3

ENST00000361453.3

-245

chrM

MT-ND2protein coding mRNAs

4

ENST00000361851.1

-230

chrM

MT-ATP8

protein coding mRNAs

5

ENST00000361227.2

-221

chrM

MT-ND3protein coding mRNAs

6

ENST00000361390.2

-215

chrM

MT-ND1protein coding mRNAs

7

ENCT00000264196.1

-200

chr20

IDH3B

protein coding mRNAs

8

ENST00000362079.2

-194

chrM

MT-CO3protein coding mRNAs

9

FTMT30000000001.1

-193

chrM

MT-ND5protein coding mRNAs

10

ENCT00000020267.1

-188

chr1

CATG00000042732.1

lncRNA, divergent

11

FTMT20300078215.1

-188

chr1

APOA1BPprotein coding mRNAs

12

FTMT26100009680.1

-188

chr16

POLR3K

protein coding mRNAs

13

FTMT24100001922.1

-187

chr11

H2AFX

protein coding mRNAs

14

MICT00000370386.1

-185

chrM

MT-TA

structural RNAs

AS_GPI

AS_ANGPTL4transcripts

AS_NOP56

AS_MT-ND6

AS_GPATCH4

AS_HMBS
AS_MT-ATP6
etc

15

ENST00000416718.2

-177

chr1

RP5-857K21.11

pseudogenes

16

HBMT00000533809.1

-176

chr16

ALG1

protein coding mRNAs

17

FTMT22300045607.1

-176

chr6

SRSF3

protein coding mRNAs

18

ENST00000585075.1

-175

chr17

RP11-649A18.12

lncRNA, divergent

19

ENST00000295304.4

-175

chr2

CHAC2

protein coding mRNAs

AS_EEF2KMT

AS_SLC25A19

54

AS_MT-ATP6
20

MICT00000370388.1

-175

chrM

MT-TA

structural RNAs
etc

21

ENST00000361899.2

-175

chrM

MT-ATP6

protein coding mRNAs

22

ENST00000458605.1

-174

chr22

RRP7B

pseudogenes

23

HBMT00000611042.1

-172

chr17

METTL23

protein coding mRNAs

24

ENST00000371538.3

-170

chr1

SELRC1protein coding mRNAs

25

ENST00000293860.5

-169

chr16

POLR3K

protein coding mRNAs

55

3.2.5 センス-アンチセンス鎖に着目した調査
低酸素応答コーディング遺伝子 UP, DOWN 各 200 のアンチセンス（ncRNA含む）の遺伝子発現の挙動ごとに４つのカテゴリに分類した（Figure 15A, Table4）。センス鎖側の遺伝子と同様の挙動を示すアンチセンス鎖の転写物がおよそ3/4 を占めていたが、逆向きの HNf-score を示したセンス-アンチセンス鎖ペアも存在した。UP200 gene set のアンチセンス鎖に対応する Top10 の転写物では
short ncRNAs や lncRNA が該当し、Bottom10 では“protein coding mRNA”が多かった。Top10 では phosphoglycerate kinase 1 (PGK1)が低酸素によって発現抑制のあった TAF9B (TATA-box binding protein associated factor 9b)のアン
チセンス側に該当した。
センス-アンチセンス鎖ペアの中で、TAF9B と PGK1 について着目し、UCSC
ゲノムブラウザでその染色体上の位置と、遺伝子レベルでの HNg-score を確認した（Figure 15B, C）。UCSC genes や GENCODE の遺伝子情報ではこの二つの遺伝子は sense-antisense の関係とはならないが、FANTOM-CAT をもとにした解析ではこの二つの転写物は sense-antisense の位置に存在することが明らか
となった。

56

A

B

C

Figure 15 アンチセンス鎖側に位置する転写物の HNf-score の調査（A）UP200, DOWN200 それぞれの遺伝子のアンチセンス鎖に位置する転写物リストの取得と HNf-score の分布（B）GRCh38/hg38 のリファレンスゲノムのバージョンを用いて
UCSC ゲノムブラウザによる PGK1 と TAF9B の座標の可視化 (C) PGK1 と TAF9B 遺伝
子の HNg-score の可視化
57

Table 4 UP 200, DOWN 200 遺伝子群のアンチセンス鎖に位置する転写物

DOWN200 gene list 中の HNf-score Top10 では PGK1 が低酸素によって発現抑制のあった TAF9B ア
ンチセンス側に該当した。
Transcript id
Top10Antisense

HNfgene namegene classantisense

1

ENST00000607600.1

321

RP1-261G23.7

short ncRNAs

AS_VEGFA2

FTMT21000000269.1

300

BHLHE40-AS1

lncRNA, intergenic

AS_BHLHE40

3

HBMT00000242044.1

265

SBF2

protein coding mRNAs

AS_ADM

4

FTMT24200000803.1

265

CATG00000004979.1

lncRNA, antisense

AS_LDHA5

ENCT00000004975.1

263

SLC2A1-AS1

lncRNA, divergent

AS_SLC2A1

6

HBMT00000734702.1

250

CATG00000040757.1

lncRNA, divergent

AS_GPI7

HBMT00000734730.1

245

CATG00000040757.1

lncRNA, divergent

AS_GPI8

HBMT00000727478.1

242

RAB11B-AS1

lncRNA, divergent

AS_ANGPTL4

9

ENCT00000211059.1

241

RAB11B-AS1

lncRNA, divergent

AS_ANGPTL4

10

HBMT00000734676.1

234

CATG00000040757.1

lncRNA, divergent

AS_GPI1

ENCT00000244163.1-152

RP11-259N19.1

lncRNA, divergent

AS_HK2

2

HBMT00000507967.1-124

CATG00000025826.1

protein coding mRNAs

AS_ISG20

3

ENST00000309424.3-115

CD3EAP

protein coding mRNAs

AS_PPP1R13L

4

FTMT21900007493.1-111

SRFBP1protein coding mRNAs

AS_LOX

5

ENST00000524270.1

-94

SPSB2

protein coding mRNAs

AS_TPI1

6

ENST00000357429.6-87

C7orf50protein coding mRNAs

AS_GPR146

7

ENST00000462901.1-81

CGGBP1protein coding mRNAs

AS_ZNF654

8

ENST00000439489.1-81

DIABLO

protein coding mRNAs

AS_B3GNT4

9

MICT00000230070.1

-80

PPIL2

protein coding mRNAs

AS_YPEL1

10

ENST00000422285.2

-79

PDHA1

protein coding mRNAs

AS_MAP3K15

1

MICT00000376640.1

175

PGK1

protein coding mRNAs

AS_TAF9B

transcripts
of UP200
gene list

Bottom10

Top10

58

2

ENCT00000468735.1

145

PGK1

protein coding mRNAs

AS_TAF9B

3

ENST00000229270.4

128

TPI1

protein coding mRNAs

AS_SPSB2

4

FTMT29100015042.1

120

PGK1

protein coding mRNAs

AS_TAF9B

5

ENST00000566326.1

114

MAP2K1protein coding mRNAs

AS_SNAPC56

ENST00000329078.3

99

SPNS2

protein coding mRNAs

AS_MYBBP1A

7

ENST00000222256.4

87

RAB3A

protein coding mRNAs

AS_MPV17L2

8

ENCT00000059259.1

76

PDZD7

protein coding mRNAs

AS_TWNK

9

MICT00000139943.1

71

SPNS2

protein coding mRNAs

AS_MYBBP1A

10

FTMT25300024476.1

70

ZBTB25protein coding mRNAs

AS_MTHFD1

1

ENCT00000264196.1

-200

IDH3B

protein coding mRNAs

AS_NOP56

DOWN200

2

FTMT30000000001.1-193

MT-ND5protein coding mRNAs

AS_MT-ND6

gene list

3

FTMT20300078215.1-188

APOA1BPprotein coding mRNAs

AS_GPATCH4

4

FTMT24100001922.1

-187

H2AFX

protein coding mRNAs

AS_HMBS5

MICT00000370386.1

-185

MT-TA

structural RNAs

AS_MT-ATP6

6

MICT00000370386.1

-185

MT-TA

structural RNAs

AS_MT-ATP8

7

MICT00000370386.1

-185

MT-TA

structural RNAs

AS_MT-CO3

8

MICT00000370386.1

-185

MT-TA

structural RNAs

AS_MT-ND1

9

MICT00000370386.1

-185

MT-TA

structural RNAs

AS_MT-ND2

10

MICT00000370386.1

-185

MT-TA

structural RNAs

AS_MT-ND3

Antisensetranscripts
Bottom10
of59

3.2.6 考察
ヒト遺伝子の研究は、過去によく研究されている遺伝子を中心に研究されて、知見の少ない遺伝子を研究対象にすることはあまりないことが知られている(Stoeger and Amaral 2022)。一方で、データドリブンな研究ができるようになった昨今は、知見を先人たちの論文からだけではなく、先人たちが取得したデータセットからも取得することができるようになった。第 3.1 章にて、低酸素応答による遺伝子発現変動について、出版バイアスがあることを示し、今まで見逃されていた低酸素応答遺伝子群を明らかにした(Ono and Bono 2021)。しかしながら、
低酸素応答により遺伝子発現が抑制された”ncRNA metabolic process”関連遺伝
子の詳細については不明である。
第 3.2 章の研究では、低酸素応答性をさらに明らかにする試みとして、二つのアプローチをとった。一つはコーディング遺伝子に着目した”ncRNA metabolic
process“遺伝子の詳細調査、もう一つは ncRNA の情報も網羅した FANTOMCAT をリファレンスした低酸素応答遺伝子の評価である（Figure 12）。
GENCODE を用いてコーディング遺伝子に着目して算出した HNg-score の上
位下位の 200 遺伝子を対象としたエンリッチメント解析では、上位 200 遺伝子
では低酸素応答関連 Gene set が該当した一方で、下位 200 遺伝子では ncRNA
metabolic process がエンリッチメントされた（Figure 13 AB）。GO network 解
析では ncRNA metabolic process と rRNA processing に関わるオントロジーが
同 様 の 遺 伝 子 群 で 構 成 さ れ て い た （ Figure

13

CD ）

(https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GTerm?id=GO:0034660)。つまり ncRNA の中でも rRNA processing に関わる遺伝子群への影響が大きいことが示された。
rRNA はリボソームを構成してタンパク質合成機能を持つ。リボソームと結合
して細胞質に存在する lncRNA が分解されたとの報告があり(Carlevaro-Fita etal. 2016)、加えて ncRNA が rRNA をサイレンシングしたという報告もある(Schmitz et al. 2010)。
第 3.1 章の解析ではコーディング遺伝子のみに着目していたため、ncRNA も含めた網羅的な転写物への低酸素による影響については不明瞭であった。そこで、
次に FANTOM-CAT を活用し ncRNA も含めた転写物の HNf-score を網羅的に算出することとした。
GENCODE グループは、ヒトとマウスのゲノムの機能アノテーションを行い、60そのデータを提供している。この遺伝子セットは、ENCODE コンソーシアムや他の多くのプロジェクト(eg. Genotype-Tissue Expression (GTEx), The Cancer
Genome Atlas (TCGA), International Cancer Genome Consortium (ICGC),NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium, Blueprint Epigenome
Project, Exome Aggregation Consortium (EXAC), Genome Aggregation
Database (gnomAD), 1000 Genomes Project and the Human Cell Atlas (HCA))に活用されている（https://www.gencodegenes.org/pages/gencode.html）。
FANTOM は、理研のマウスゲノム百科事典プロジェクトで収集された完全長
cDNA のアノテーションを行うことを目的として 2000 年に結成された国際研究
コンソーシアムであり、その役割はマウスだけに留まらず哺乳類ゲノム, プロモ
ーター, エンハンサー, ncRNA, マイクロ RNA など遺伝子発現に関わる分野を軸に拡大している。その中のプロジェクトのうちの一つである FANTOM5 プロ
ジェクトは、トランスクリプトーム評価に信頼性の高い 5'ヒト lncRNA データセットである FANTOM-CAT データセットを設計、提供している(Figure 16)。
FANTOM-CAT には、およそ 28,000 の human lncRNA genes with highconfidence 5′ ends、機能を持つ可能性のあるおよそ 20,000 の lncRNA の情報がある。GENCODE の情報よりも豊富であり FANTOM-CAT を活用することで、ヒトのコーディング遺伝子以外も含めた遺伝子発現情報をもとに遺伝子発現を定量することが可能となる。

Figure 16 FANTOM-CAT

理研で開発された CAGE(Cap Analysis of Gene Expression)技術、複数の RNA-seq データを使って、ヒト long non-coding RNA の正確な 5’末端をもつ FANTOM-CAT データセットが61

作られた。この図は FANTOM-CAT のサイト(https://fantom.gsc.riken.jp/cat/)より引用した。
FANTOM-CAT のデータセットを活用することにより、ヒトのコーディング遺伝子以外も含めた遺伝子発現情報を定量することが可能である。13 のがん種に着目して遺伝子発現解析を行いがんの病因と進行に関与する可能性のある新規
ノンコーディング遺伝子を同定した報告(Imada et al. 2020)や、原発性前立腺がんの進展に関係する可能性のある lncRNA を見出した報告(Imada et al. 2021)、
FANTOM6 コ ン ソ ー シ ア ム に よ る 新 規 lncRNA 解 析 に も 活 用 さ れ て い る(Ramilowski et al. 2020)。
しかしながら、FANTOM-CAT はオリジナルサイトではゲノムアノテーション
記述ファイルの gene feature format (GTF)形式のみで公開されており、FASTA
フォーマットでは公開されていない。そのため RNA-seq のためのリファレンス
配列としては頻繁には使用されていないことが推察された。そこで、PubMed
Central を対象として”RNA-seq”と”FANTOM”両者が記載されている論文数を調査した。比較のため、”RNA-seq”のみが記載されている論文数と、”RNA-seq”と“GENCODE”両者が記載されている論文数も調査した。
”RNA-seq”と”FANTOM”両者を持つ論文数は FANTOM-CAT の論文が発表された 2017 年以降であっても“RNA-seq”の記述のある論文の 1%を下回る結果だった(Table 2)。つまりデータからも FANTOM-CAT をリファレンスとした遺伝子発現定量の報告はわずかであることが示された。よく知られているものほどよく研究され、見逃されている知見が残されていることは第 3.1 章で示したが、同様のことがリファレンスの活用状況にも反映されているのではないかと考えた。つまり FANTOM-CAT を用いた定量により新知見が得られることが期待で切ると考えた。
ncRNA を含めた網羅的な解析をするには FANTOM-CAT を活用して低酸素応
答の評価は検討する価値があると考え、以下の解析をすることとした。FANTOMCAT の GTF ファイルをもとに FASTA ファイルを作成し HNf-score を付加した（Figure 14 A）。GTF ファイルは TIEScore の閾値ごとに分類された lv1 raw,
lv2 permissive, lv3 robust, lv4 stringent の４種類があり、本研究では lv3 robustと lv4 stringent の二つを用いて HNf-score を算出した。lv3 robust と lv4
stringent の二つのリファレンス配列で同様の HNf-score が算出できたことを確認した後に、lv4 stringent 由来の HNf-score で詳細解析を進めることとした
62

（Supplemental figure 7）。
HNf-score の下位 25 の遺伝子はミトコンドリア DNA 由来の転写物が多かったことから、次に染色体ごとの遺伝子発現制御を可視化した（Figure 14C, Table3）。ミトコンドリア遺伝子に対する影響が他の染色体よりも顕著であることを示した。低酸素刺激による mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 2 (MT-ND2), mitochondrially encoded ATP synthase 8 (MT-ATP8), mitochondrially
encoded NADH dehydrogenase (MT-ND)などのミトコンドリア遺伝子の発現低下はすでに知られており(Arnaiz et al. 2021)、これらの結果と矛盾しない。加えて、ミトコンドリアオートファジーが低酸素によって誘導されること、このプロセスには HIF-1 存在下での BNIP3 の発現が必要なことが報告(Zhang et al.
2008)されており、その結果も今回の結果をサポートする。
一方、HNf-score の上位 25 の転写物の遺伝子名には、BHLHE40 antisense
RNA 1 (BHLHE40-AS1)などの Antisense と関わりのある名前の遺伝子があった(Table 3)。遺伝子名の派生元の BHLHE40 は低酸素応答遺伝子として知られている遺伝子である。加えて、もっとも HNf-score の高かった RP1-261G23.7 は低酸素応答遺伝子として有名な VEGFA のアンチセンス鎖に位置した shortncRNA である。この short ncRNA は、低酸素時の VEGFA の転写調節に機能的に関与するとの報告がある(Nieminen et al. 2018)。これらより、低酸素応答遺伝
子のアンチセンスにある転写物についてさらなる調査をする価値があると考えた。
アンチセンスの転写物とは、コーディング遺伝子やノンコーディング遺伝子の反対側の相補的なアンチセンス鎖から転写される転写物のことを意味する。ヒト(Ozsolak et al. 2010)とマウス(Katayama et al. 2005)ではおよそ 30%の転写物
がアンチセンス鎖に転写物を有している。コーディング遺伝子の低酸素応答指標である HNg-score をもとに低酸素応答遺伝子を UP,DOWN それぞれ 200 遺伝子を選抜し、その遺伝子のアンチセンスの転写物の HNf-score を評価した。その結果、UP, DOWN それぞれのアンチセンス転写物の 3/4 はセンス鎖の遺伝子と同様の発現変動をすることが示された。一方で、逆向きの発現制御となる結果の転写物も存在した（Figure 15A）。
DOWN 200 位遺伝子群のアンチセンス鎖に位置する HNf-score の低い転写物には、HNf-score の低かった転写物の上位 25 リスト (Table 3)と同様にミトコン
ドリア DNA 由来の転写物が多かった。DOWN200 gene list の Top10 では興味63

深いことに PGK1 が低酸素によって発現抑制のあった TAF9B アンチセンス側に該当した（Figure 15B）。PGK1 遺伝子は phosphoglycerate kinase 1 をコードする遺伝子である。PGK1 は解糖系において 1,3 -diphosphoglycerate から 3phosphoglycerate への可逆的変換を触媒して 1ATP を生成する(Valentin et al.
1998)。PGK1 は HIF1A の制御の元、低酸素刺激により遺伝子発現が亢進することが 20 年以上前から知られている(Li et al. 1996)。
TAF9B は transcription factor II D (TFIID)を構成するタンパク質の一つであり、転写開始において重要な役割を果たす(Tora 2002; Frontini et al. 2005, 9)。
また、TAF9B は HIF1A のノックダウンで発現上昇、低酸素状況下で発現抑制があることが報告されている(Mathieu et al. 2011)。
FANTOM-CAT を用いることにより、PGK1 と TAF9B の関係がセンスアンチ
センスペアになることが示された。これは UCSC gene や GENCODE ではその限りではない(Figure 4C)。また、PGK1 と TAF9B の位置は GRCh38/hg38 や
T2T においても同様の位置関係であることを確認した（Supplemental figure 9）。
アンチセンス転写物による遺伝子の制御は研究されて おり(Pelechano andSteinmetz 2013; Katayama et al. 2005; Okada et al. 2008)、重なっているセン
ス鎖とアンチセンス鎖の転写物がお互いの方向に向かって同時に転写が開始される場合は転写に関わる因子の衝突が起こり、遺伝子発現を抑制することが考えられる。これらの結果は、PGK1 の 3'末端が伸長によって TAF9B の発現に影響を及ぼしている可能性を示している。
今回のデータ解析は Strand-specific RNA sequencing 由来に限定していない。
Strand-specific RNA-seq ではない場合、誤ってセンス-アンチセンスの配列が区別されないまま定量されている可能性がある。今回着目した PGK1 と TAF9B のHNf-score の変化は、増加と低下であり逆向きの変化である。そのため、Strandspecific sequencing に限定していないこの解析であっても、同じ HNf-score に着目した場合と比較してその影響は小さいと考えている。しかしながら、さらなる研究には Strand-specific RNA sequencing といった strand specific な実験や、
knock down や knock out 実験等にて低酸素応答にまつわる新たな知見が蓄積されることを期待する。このデータセットや解析アプローチを活用することは更なる低酸素応答メカニズムの仮説の提示や解明の一助になると考える。
3.2 章「ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法の構築」では、低酸
素応答転写物の特徴をさらに把握するために FANTOM-CAT をはじめとするオ64

ープンデータを活用して探索解析した。低酸素刺激により ribosomal RNA に関与する遺伝子群の発現低下が生じ、ミトコンドリア DNA 由来の転写物の発現量が低下することと、低酸素応答遺伝子群のアンチセンスに位置する転写物の低酸
素応答性を HNf-score にて算出して提示した。

65

4 結論
遺伝子の注目度にはバイアスがあり、よく知られている遺伝子ほどよく理解される。昨今ではコンピュータの処理能力が向上し、活用できるデータ量も増えた。
知見の少ない遺伝子についてはデータドリブンに解析する必要があると考える。
本研究ではデータドリブンに新規低酸素応答遺伝子を見出し、ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法を提示した。大規模な遺伝子発現データ解析
を起点とする仮説の創出は、必要以上の実験操作を省略することが期待できる。
特に以下の条件を満たす解析については検討の価値があると考える。(1)低酸素刺激応答の研究分野における HIF1A のような、当該研究分野での代表的な転写因子があること、(2)Gene Ontology にカテゴライズされる程よく研究されている研究分野であること、(3)遺伝子発現データを取得しやすい分野であることである。
本研究については計算したデータは全て figshare にて誰でも利用可能な状態に て 共 有 し て い る 3.1 章 「 新 規 低 酸 素 応 答 遺 伝 子 の 探 索 」 に つ い て は 、
https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5323769.v1 にデータを登録しており、オープンアクセスなジャーナルに論文投稿済み(Ono and Bono 2021)である。および 3.2 章「ncRNA を含めた転写産物の低酸素応答の評価方法の構築」のデータ
は https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5971218.v2からアクセス可能であり、こちらは bioRxiv にプレプリントを投稿済みである(Ono and Bono 2022)。この解析手法は、この研究に限らずヒト RNA-Seq 解析において応用可能である。これらの研究は、低酸素応答研究のみならず新規パスウェイのデータドリブンな探索手法の提示の点で貢献したと考える。

66

5 付録

Supplemental figure 1 “hypoxia”をクエリとした論文情報をもとに作成した Word cloud

低酸素研究分野の代表的な遺伝子の評価には、word cloud による PubMed の 500 報のアブストラクトの可視化結果を参考とした。Biopython パッケージ (version 1.78)、scispacy
パッケージ(version 0.4.0), spacy パッケージ (version 2.2.4), en-core-sci-sm-0.4.0 モデル
を使用し、“hypoxia”をクエリとして頻出する単語を可視化した。解析は 2021 年 4 月 11 日に実行した。その結果、HIF 1αが唯一遺伝子名として表記された。解析の仕様上、コードを実行させるごとに可視化結果が変わるが、複数回検討したが同様に HIF 1αのみが遺伝子として表示された。低酸素を代表する遺伝子としてその Gene symbol である HIF1A を
採用した。

67

Supplemental figure 2 bibliome 解析における HIF1A との Simpson 係数、Jaccard 係数の評価

類似度を算出するに際には、Simpson 係数だけでなく、Jaccard 係数も検討した。Jaccard
係数は、比較対象の二つの集団の和集合を分母に持つため、今回のデータセットの場合は比較対象の HIF1A の遺伝子数の多さが影響して類似度全体の値が小さくなりすぎたた
め、可視化による選抜に適さないと判断した。Simpson 係数は各集合の共通要素を重視した類似度である。Jaccard 係数より Simpson 係数の方が HIF1A と任意の遺伝子 X に該当する論文数の差の大きさによる影響を受けにくく、可視化に適するスコアと判断した。

68Supplemental figure 3 書誌解析における HIF1A,EPAS1, ARNT, ARNTL の Simpson 類似
度の評価

HIF1A 以外にも、EPAS1 や ARNT、ARNTL といった低酸素との関連性が知られている遺伝子との Simpson 類似度を任意の遺伝子 X に対し算出した。縦軸に各遺伝子の論文数、横軸に各類似度を示した。いずれも同様の結果を示したが、HIF1A が低酸素研究分野の代表的な遺伝子であることから、新規低酸素応答性遺伝子の探索には HIF1A との類似度を採用した。（左上：HIF1A, 右上：EPAS1, 左下:ARNT, 右下:ARNTL）

69

A

B

C

70

D

Supplemental figure 4 HN-ratio, HN-score の条件検討(A)遺伝子発現変動比の閾値（1.5 倍, 2 倍）の比較、（B）HN-ratio 算出の際の分母と分子に加算する値（＋1, ＋1e-09）の HN-score に対する影響の評価の結果を示す。（C）薬剤処置などの低酸素条件以外の実験介入の影響の評価。縦軸 HN1.5woEx は低酸素条件以外の実験介入がないサンプルの HN-score の各遺伝子の分布、横軸 HN1.5Exp は通常
酸素条件、低酸素条件どちらのサンプルにも同様に薬剤処置などの実験介入があったサ
ンプルの HN-score の各遺伝子の分布を示した。(D) 先行研究で蓄積されていたサンプル
データ (横軸, 127 HN-pairs)と、今回マニュアルキュレーションで新たに収集したサンプル
データ(縦軸, 368 HN-pairs)を元に算出した HN-score の分布の評価。A, B ではほぼ違いが見られないこと、C, D では異なるサンプル由来の HN-paird であるにもかかわらず同様のパターンであることを確認した。可視化には Jupyter-notebook を用いた。

71Supplemental figure 5

UP100 gene list の低酸素処置時間別の HN-ratio

低酸素処置時間の記載があるサンプルに限定して、平均 HN-ratio 順に上段左から右に並べて表示した。HN-ratio は底 2 の Log 変換したものを使用した。

72

A

CA9

B

VEGFA

C

GPR146

Supplemental figure 6

HN-ratio（底 2 の Log 変換）の層別化解析（A）CA9, (B) VGEFA, (B)GPR146 のがん由来、非がん由来の違いと、実験介入あり（experimental）, 実験介入の中でも HIFs の抑制実験(HIFs_suppression)、実験介入なし（Empty）ごとの HN-ratio を可視化した。

73

Supplemental table 1 HNg-score を元に選抜した UP 200 gene および DOWN 200 gene list

UP 100 gene list および DOWN 100 gene list はこのリストの上位 100 位を採用した。
UP 200 gene list
HNgSymbol

description
score

1

ANKRD37

ankyrin repeat domain 37

415

2

NDRG1

N-myc downstream regulated 1

410

3

P4HA1

prolyl 4-hydroxylase subunit alpha 1

389

4

BNIP3LBCL2 interacting protein 3 like383

5

BHLHE40

basic helix-loop-helix family member e40

383

6

BNIP3

BCL2 interacting protein 3

382

7

VEGFA

vascular endothelial growth factor A

381

8

DDIT4

DNA damage inducible transcript 4

380

9

PPFIA4PTPRF interacting protein alpha 4

379

10

SLC2A3solute carrier family 2 member 3

377

11

ENO2

enolase 2

376

12

ADM

adrenomedullin

373

13

HK2

hexokinase 2

372

14

ANGPTL4

angiopoietin like 4

369

15

C4orf47

chromosome 4 open reading frame 47

367

16

SLC2A1solute carrier family 2 member 1

366

17

ALDOC

aldolase, fructose-bisphosphate C

365

18

EGLN3

egl-9 family hypoxia inducible factor 3

365

19

PFKFB46-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4

364

20

KDM3A

lysine demethylase 3A

356

74

21

PLOD2

procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2

353

22

MXI1

MAX interactor 1, dimerization protein

351

23

AK4

adenylate kinase 4

350

24

TMEM45A

transmembrane protein 45A

349

25

CA9

carbonic anhydrase 9

343

26

CCNG2

cyclin G2

339

27

EGLN1

egl-9 family hypoxia inducible factor 1

339

28

PDK1

pyruvate dehydrogenase kinase 1

336

29

STC1

stanniocalcin 1

335

30

LDHA

lactate dehydrogenase A

334

31

EFNA3

ephrin A3

329

32

INSIG2

insulin induced gene 2

328

33

FUT11

fucosyltransferase 11

328

34

SPAG4

sperm associated antigen 4

326

35

TCAF2

TRPM8 channel associated factor 2

326

36

FAM162A

family with sequence similarity 162 member A

323

37

NFIL3

nuclear factor, interleukin 3 regulated

322

38

PGK1

phosphoglycerate kinase 1

322

39

P4HA2

prolyl 4-hydroxylase subunit alpha 2

322

40

ERO1A

endoplasmic reticulum oxidoreductase 1 alpha

321

41

GPR146

G protein-coupled receptor 146

321

42

ALDOA

aldolase, fructose-bisphosphate A

319

43

ARRDC3arrestin domain containing 3

317

44

ANKZF1ankyrin repeat and zinc finger peptidyl tRNA hydrolase 1

316

45

SH3D21SH3 domain containing 21

316

75

46

C4orf3

chromosome 4 open reading frame 3

314

47

ERRFI1ERBB receptor feedback inhibitor 1

312

48

GBE1

1,4-alpha-glucan branching enzyme 1

311

49

ZNF395zinc finger protein 395

311

50

C8orf58

chromosome 8 open reading frame 58

307

51

LOX

lysyl oxidase

306

52

VLDLR

very low density lipoprotein receptor

303

53

HILPDAhypoxia inducible lipid droplet associated

301

54

ANG

angiogenin

298

55

KCTD11

potassium channel tetramerization domain containing 11

297

56

CXCR4

C-X-C motif chemokine receptor 4

293

57

PNRC1

proline rich nuclear receptor coactivator 1

293

58

IGFBP3insulin like growth factor binding protein 3

291

59

PPP1R3G

protein phosphatase 1 regulatory subunit 3G

291

60

RIMKLAribosomal modification protein rimK like family member A

287

61

STC2

stanniocalcin 2

286

62

PGM1

phosphoglucomutase 1

285

63

MAFF

MAF bZIP transcription factor F

285

64

PFKP

phosphofructokinase, platelet

283

65

SLC16A3

solute carrier family 16 member 3

281

66

KDM4B

lysine demethylase 4B

280

67

LRP1

LDL receptor related protein 1

279

68

ZNF292zinc finger protein 292

279

69

FGF11

fibroblast growth factor 11

278

70

RNF122ring finger protein 122

277

76

71

GPI

glucose-6-phosphate isomerase

276

72

TNIP1

TNFAIP3 interacting protein 1

275

73

FOSL2

FOS like 2, AP-1 transcription factor subunit

274

74

LOXL2

lysyl oxidase like 2

274

75

ZNF160zinc finger protein 160

274

76

WSB1

WD repeat and SOCS box containing 1

273

77

WDR54

WD repeat domain 54

273

78

EFCAB3EF-hand calcium binding domain 3

273

79

PPP1R3C

protein phosphatase 1 regulatory subunit 3C

272

80

PFKFB36-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3

270

81

PLOD1

procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1

270

82

TMEM74B

transmembrane protein 74B

267

83

DUSP1

dual specificity phosphatase 1

266

84

GAPDH

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

266

85

TCP11L2

t-complex 11 like 2

264

86

TPI1

triosephosphate isomerase 1

262

87

BTG1

BTG anti-proliferation factor 1

260

88

RORA

RAR related orphan receptor A

260

89

SEMA4B

semaphorin 4B

256

90

RLF

RLF zinc finger

255

91

PPP2R5B

protein phosphatase 2 regulatory subunit B'beta

254

92

PPP1R3B

protein phosphatase 1 regulatory subunit 3B

253

93

PDK3

pyruvate dehydrogenase kinase 3

251

94

EFEMP2

EGF containing fibulin extracellular matrix protein 2

251

95

ZNF654zinc finger protein 654

251

77

96

ENO1

enolase 1

249

97

RAB20

RAB20, member RAS oncogene family

248

98

PGAM1

phosphoglycerate mutase 1

246

99

PRSS53serine protease 53

245

100

GYS1

glycogen synthase 1

243

101

B3GNT4

UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 4

242

102

YEATS2YEATS domain containing 2

239

103

PLEKHA2

pleckstrin homology domain containing A2

239

104

WFDC3

WAP four-disulfide core domain 3

239

105

PTPRH

protein tyrosine phosphatase receptor type H

238

106

STBD1

starch binding domain 1

237

107

UPK1A

uroplakin 1A

237

108

LRP2BPLRP2 binding protein

237

109

APLN

apelin

235

110

CIART

circadian associated repressor of transcription

235

FAM47E-STBD1 readthrough235

FAM47E111
STBD1
112

JUN

Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit

234

113

ISG20

interferon stimulated exonuclease gene 20

233

114

PAM

peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase

232

115

VKORC1

vitamin K epoxide reductase complex subunit 1

232

116

FANK1

fibronectin type III and ankyrin repeat domains 1

232

117

AHNAK2

AHNAK nucleoprotein 2

232

118

NOG

noggin231

119

SEC61G

SEC61 translocon subunit gamma

231

78

120

NCKIPSD

NCK interacting protein with SH3 domain

231

121

FOS

Fos proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit

229

122

SPRY1

sprouty RTK signaling antagonist 1

229

123

VPS37D

VPS37D subunit of ESCRT-I

229

124

BHLHE41

basic helix-loop-helix family member e41

228

125

KDM7A

lysine demethylase 7A

228

126

SERPINE1

serpin family E member 1

227

127

BMT2

base methyltransferase of 25S rRNA 2 homolog

227

128

ACAP1

ArfGAP with coiled-coil, ankyrin repeat and PH domains 1

226

129

ARFGEF3

ARFGEF family member 3

226

130

RRAGD

Ras related GTP binding D

226

131

RBPJ

recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region

225

132

CDKN1C

cyclin dependent kinase inhibitor 1C

224

133

CSRNP1cysteine and serine rich nuclear protein 1

224

134

LNPK

lunapark, ER junction formation factor

224

135

AMPD3

adenosine monophosphate deaminase 3

223

136

PRTN3

proteinase 3

223

137

YPEL1

yippee like 1

223

138

NYAP1

neuronal tyrosine phosphorylated phosphoinositide-3-kinase adaptor 1

223

139

SAP30

Sin3A associated protein 30

222

140

PPP1R13L

protein phosphatase 1 regulatory subunit 13 like

220

141

PTPRN

protein tyrosine phosphatase receptor type N

219

142

RNASE4ribonuclease A family member 4

217

143

THAP8

THAP domain containing 8

217

144

CSRP2

cysteine and glycine rich protein 2

216

79

145

GPRC5AG protein-coupled receptor class C group 5 member A

215

146

BCKDHA

branched chain keto acid dehydrogenase E1 subunit alpha

214

147

GNRH1

gonadotropin releasing hormone 1

214

148

SFXN3

sideroflexin 3

214

149

ITGA5

integrin subunit alpha 5

213

150

MPI

mannose phosphate isomerase

213

151

DPYSL4

dihydropyrimidinase like 4

213

152

NARF

nuclear prelamin A recognition factor

213

153

CREBRF

CREB3 regulatory factor

213

154

C2orf72

chromosome 2 open reading frame 72

213

155

PKM

pyruvate kinase M1/2

212

156

FAM13A

family with sequence similarity 13 member A

212

157

PFKL

phosphofructokinase, liver type

211

158

HERC3

HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 3

211

159

RNF24

ring finger protein 24

211

160

TRIM9

tripartite motif containing 9

211

161

PLIN2

perilipin 2

209

162

HSF4

heat shock transcription factor 4

209

163

KDM4C

lysine demethylase 4C

209

164

KDM6B

lysine demethylase 6B

209

165

SNX33

sorting nexin 33

209

166

DPCD

deleted in primary ciliary dyskinesia homolog (mouse)

208

167

GALNT18

polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 18

208

168

FOXD1

forkhead box D1

207

169

TNFRSF10D

TNF receptor superfamily member 10d

207

80

170

ARHGEF37

Rho guanine nucleotide exchange factor 37

207

171

RASSF7

Ras association domain family member 7

206

172

FAM110C

family with sequence similarity 110 member C

206

173

IER3

immediate early response 3

204

174

DNAJB2

DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member B2

203

175

PTGS1

prostaglandin-endoperoxide synthase 1

203

176

S1PR4

sphingosine-1-phosphate receptor 4

203

177

ISM2

isthmin 2

203

178

ATF3

activating transcription factor 3

202

179

ALKBH5alkB homolog 5, RNA demethylase

201

180

PNCK

pregnancy up-regulated nonubiquitous CaM kinase

200

181

MAP3K15

mitogen-activated protein kinase kinase kinase 15

200

182

S100A10

S100 calcium binding protein A10

199

183

RIOK3

RIO kinase 3

198

184

FAM210A

family with sequence similarity 210 member A

198

185

RCOR2

REST corepressor 2

197

186

DSP

desmoplakin

195

187

INHA

inhibin subunit alpha

195

188

PIK3IP1

phosphoinositide-3-kinase interacting protein 1

195

189

PRELID2

PRELI domain containing 2

195

190

NIM1K

NIM1 serine/threonine protein kinase

195

191

TMEM91transmembrane protein 91

195

192

CLK3

CDC like kinase 3

194

193

QSOX1

quiescin sulfhydryl oxidase 1

194

194

TMEM158

transmembrane protein 158

194

81

195

CLK1

CDC like kinase 1

193

196

PHF21APHD finger protein 21A

193

197

NDUFA4L2

NDUFA4 mitochondrial complex associated like 2

193

198

ANGPTL6

angiopoietin like 6

193

199

TBC1D3L

TBC1 domain family member 3L

193

200

RSBN1

round spermatid basic protein 1

192

DOWN 200 gene list
HNgSymbol

description
score

1

RRS1

ribosome biogenesis regulator 1 homolog

-272

2

CHAC2

ChaC glutathione specific gamma-glutamylcyclotransferase 2

-271

3

GPATCH4

G-patch domain containing 4

-257

4

MT-ND2

mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 2

-247

5

SFXN2

sideroflexin 2

-244

6

NOL6

nucleolar protein 6

-238

7

MARS2

methionyl-tRNA synthetase 2, mitochondrial

-237

8

MT-ATP8

mitochondrially encoded ATP synthase 8

-235

9

COA7

cytochrome c oxidase assembly factor 7

-234

10

MT-ND6

mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6

-232

11

TAF9B

TATA-box binding protein associated factor 9b

-230

12

DDX28

DEAD-box helicase 28

-227

13

SLC25A35

solute carrier family 25 member 35

-225

14

MON1A

MON1 homolog A, secretory trafficking associated

-225

15

CTU2

cytosolic thiouridylase subunit 2

-224

82

16

POP1

POP1 homolog, ribonuclease P/MRP subunit

-223

17

MPV17L2

MPV17 mitochondrial inner membrane protein like 2

-221

18

NOP2

NOP2 nucleolar protein

-221

19

RTN4IP1

reticulon 4 interacting protein 1

-220

20

MT-ND1

mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 1

-219

21

TOR3A

torsin family 3 member A

-219

22

PNO1

partner of NOB1 homolog

-216

23

RRP9

ribosomal RNA processing 9, U3 small nucleolar RNA binding protein

-216

24

POLE2

DNA polymerase epsilon 2, accessory subunit

-215

25

CD3EAP

RNA polymerase I subunit G

-215

26

CTPS1

CTP synthase 1

-215

27

PRMT3

protein arginine methyltransferase 3

-213

28

TAP2

transporter 2, ATP binding cassette subfamily B member

-213

29

URB2

URB2 ribosome biogenesis homolog

-213

30

LTV1

LTV1 ribosome biogenesis factor

-213

31

POLR3K

RNA polymerase III subunit K

-212

32

HPDL

4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase like

-212

33

NOL12

nucleolar protein 12

-210

34

PNPT1

polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1

-210

35

FDXACB1

ferredoxin-fold anticodon binding domain containing 1

-210

36

NOP16

NOP16 nucleolar protein

-209

37

PYCR3

pyrroline-5-carboxylate reductase 3

-209

38

SCLY

selenocysteine lyase

-209

39

TMEM138transmembrane protein 138

-209

40

TOE1

target of EGR1, exonuclease

-209

83

41

WDR77

WD repeat domain 77

-209

42

UTP15

UTP15 small subunit processome component

-208

43

CDC25Acell division cycle 25A

-208

44

FAM86C1

family with sequence similarity 86 member C1, pseudogene

-208

45

SLC5A6solute carrier family 5 member 6

-207

46

TIPIN

TIMELESS interacting protein

-207

47

WDR4

WD repeat domain 4

-207

48

NDUFAF4

NADH:ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 4

-206

49

DOLK

dolichol kinase

-206

50

PSEN2

presenilin 2

-205

51

SNAPC5small nuclear RNA activating complex polypeptide 5

-205

52

COQ3

coenzyme Q3, methyltransferase

-205

53

DCTPP1dCTP pyrophosphatase 1

-205

54

EEF2KMTeukaryotic elongation factor 2 lysine methyltransferase

-205

55

MT-CO3

mitochondrially encoded cytochrome c oxidase III

-204

56

METTL1

methyltransferase like 1

-204

57

MYBBP1A

MYB binding protein 1a

-203

58

GRWD1

glutamate rich WD repeat containing 1

-203

59

EIF2B3eukaryotic translation initiation factor 2B subunit gamma

-202

60

MT-ATP6

mitochondrially encoded ATP synthase 6

-199

61

SLC43A2

solute carrier family 43 member 2

-198

62

NIP7

nucleolar pre-rRNA processing protein NIP7

-197

63

SCFD2

sec1 family domain containing 2

-196

64

ABCF2

ATP binding cassette subfamily F member 2

-196

65

HGH1

HGH1 homolog

-196

84

66

PDSS1

decaprenyl diphosphate synthase subunit 1

-195

67

PSME3

proteasome activator subunit 3

-195

68

UTP20

UTP20 small subunit processome component

-195

69

FARSB

phenylalanyl-tRNA synthetase subunit beta

-195

70

MT-ND3

mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 3

-194

71

RIOX1

ribosomal oxygenase 1

-194

72

RRP7A

ribosomal RNA processing 7 homolog A

-194

73

NOP56

NOP56 ribonucleoprotein

-193

74

RPP40

ribonuclease P/MRP subunit p40

-193

75

GINS3

GINS complex subunit 3

-193

76

ATAD3A

ATPase family AAA domain containing 3A

-192

77

PPIL1

peptidylprolyl isomerase like 1

-192

78

PUS1

pseudouridine synthase 1

-192

79

ZNF689zinc finger protein 689

-192

80

POLR1BRNA polymerase I subunit B

-191

81

LSM10

LSM10, U7 small nuclear RNA associated

-191

82

PRMT6

protein arginine methyltransferase 6

-190

83

TPK1

thiamin pyrophosphokinase 1

-190

84

ZNHIT2zinc finger HIT-type containing 2

-190

85

EXOSC4

exosome component 4

-190

86

PAK1IP1

PAK1 interacting protein 1

-189

87

PGAM5

PGAM family member 5, mitochondrial serine/threonine protein phosphatase

-189

88

SLC27A4

solute carrier family 27 member 4

-189

89

MCM10

minichromosome maintenance 10 replication initiation factor

-189

90

TMEM177transmembrane protein 177

-188

85

91

DSCC1

DNA replication and sister chromatid cohesion 1

-188

92

ATP5MC1ATP synthase membrane subunit c locus 1

-187

93

AUNIP

aurora kinase A and ninein interacting protein

-187

94

UFSP1

UFM1 specific peptidase 1 (inactive)

-187

95

ODC1

ornithine decarboxylase 1

-186

96

TMEM201transmembrane protein 201

-186

97

DIMT1

DIMT1 rRNA methyltransferase and ribosome maturation factor

-186

98

ELAC2

elaC ribonuclease Z 2

-186

99

PSMG1

proteasome assembly chaperone 1

-185

100

RUVBL1

RuvB like AAA ATPase 1

-185

101

SRM

spermidine synthase

-185

102

UBIAD1

UbiA prenyltransferase domain containing 1

-185

103

NOLC1

nucleolar and coiled-body phosphoprotein 1

-184

104

DAGLA

diacylglycerol lipase alpha

-184

105

GFM1

G elongation factor mitochondrial 1

-184

106

RFC3

replication factor C subunit 3

-183

107

TEDC2

tubulin epsilon and delta complex 2

-183

108

TOMM40L

translocase of outer mitochondrial membrane 40 like

-183

109

ZNF30

zinc finger protein 30

-183

110

E2F2

E2F transcription factor 2

-183

111

AIMP2

aminoacyl tRNA synthetase complex interacting multifunctional protein 2

-183

112

MCIDAS

multiciliate differentiation and DNA synthesis associated cell cycle protein

-182

113

CHRNA5cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit

-181

114

DPH2

diphthamide biosynthesis 2

-181

115

ALDH1B1

aldehyde dehydrogenase 1 family member B1

-181

86

116

FLAD1

flavin adenine dinucleotide synthetase 1

-181

117

DDX21

DExD-box helicase 21

-180

118

GTF2H2

general transcription factor IIH subunit 2

-180

119

PFAS

phosphoribosylformylglycinamidine synthase

-179

120

PIGW

phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class W

-179

121

TELO2

telomere maintenance 2

-179

122

CDCA7

cell division cycle associated 7

-179

123

LYSMD2

LysM domain containing 2

-179

124

MAK16

MAK16 homolog

-179

125

MRPL20

mitochondrial ribosomal protein L20

-178

126

MRPL4

mitochondrial ribosomal protein L4

-178

127

TIMM8Atranslocase of inner mitochondrial membrane 8A

-178

128

HERC6

HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase family member
-178
6
129

HMBS

hydroxymethylbilane synthase

-178

130

ADAT1

adenosine deaminase tRNA specific 1

-177

131

DTD2

D-aminoacyl-tRNA deacylase 2

-177

132

FOXRED2

FAD dependent oxidoreductase domain containing 2

-177

133

ABCG2

ATP binding cassette subfamily G member 2 (Junior blood group)

-177

134

METTL8methyltransferase like 8

-177

135

SPSB2

splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 2

-176

136

BRIX1

biogenesis of ribosomes BRX1

-176

137

TWNK

twinkle mtDNA helicase

-176

138

CDC45

cell division cycle 45

-176

139

JMJD4

jumonji domain containing 4

-176

87

140

LETM1

leucine zipper and EF-hand containing transmembrane protein 1

-176

141

POP5

POP5 homolog, ribonuclease P/MRP subunit

-175

142

BEND3

BEN domain containing 3

-175

143

SLC25A19

solute carrier family 25 member 19

-175

144

UTP14AUTP14A small subunit processome component

-175

145

WDR62

WD repeat domain 62

-174

146

EXOG

exo/endonuclease G

-174

147

MRPL12

mitochondrial ribosomal protein L12

-173

148

ARMC7

armadillo repeat containing 7

-173

149

BAG2

BAG cochaperone 2

-173

150

SPRTN

SprT-like N-terminal domain

-173

151

KTI12

KTI12 chromatin associated homolog

-173

152

PTRH1

peptidyl-tRNA hydrolase 1 homolog

-172

153

TIMM10translocase of inner mitochondrial membrane 10

-172

154

ACTRT3actin related protein T3

-172

155

DHRS11dehydrogenase/reductase 11

-172

156

MRPS12

mitochondrial ribosomal protein S12

-171

157

MRTO4

MRT4 homolog, ribosome maturation factor

-171

158

SLC35G1

solute carrier family 35 member G1

-171

159

EEF1E1eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1

-171

160

ALDH4A1

aldehyde dehydrogenase 4 family member A1

-171

161

GINS1

GINS complex subunit 1

-171

162

HNRNPABheterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B

-171

163

MTHFD1

methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, cyclohydrolase and-170
formyltetrahydrofolate synthetase 1

88

164

PPARGC1BPPARG coactivator 1 beta

-170

165

SLC19A1

solute carrier family 19 member 1

-170

166

TRMT61A

tRNA methyltransferase 61A

-170

167

ZNF239zinc finger protein 239

-170

168

ADCK1

aarF domain containing kinase 1

-170

169

NSMCE4A

NSE4 homolog A, SMC5-SMC6 complex component

-169

170

C11orf98

chromosome 11 open reading frame 98

-169

171

CENPM

centromere protein M

-169

172

ANAPC7anaphase promoting complex subunit 7

-169

173

PCNA

proliferating cell nuclear antigen

-168

174

RPS6KL1

ribosomal protein S6 kinase like 1

-168

175

RRP15

ribosomal RNA processing 15 homolog

-168

176

SPOUT1SPOUT domain containing methyltransferase 1

-168

177

WDR46

WD repeat domain 46

-168

178

HSPBAP1

HSPB1 associated protein 1

-168

179

IMP4

IMP U3 small nucleolar ribonucleoprotein 4

-168

180

NPM3

nucleophosmin/nucleoplasmin 3

-167

181

POLR3HRNA polymerase III subunit H

-167

182

RRP36

ribosomal RNA processing 36

-167

183

SFXN4

sideroflexin 4

-167

184

CLUH

clustered mitochondria homolog

-167

185

DKC1

dyskerin pseudouridine synthase 1

-167

186

LRR1

leucine rich repeat protein 1

-167

187

NOC4L

nucleolar complex associated 4 homolog

-166

188

OGFOD12-oxoglutarate and iron dependent oxygenase domain containing 1

-166

89

189

RCL1

RNA terminal phosphate cyclase like 1

-166

190

CCDC86

coiled-coil domain containing 86

-166

191

LYAR

Ly1 antibody reactive

-166

192

MRM1

mitochondrial rRNA methyltransferase 1

-165

193

POLR3BRNA polymerase III subunit B

-165

194

WDR35

WD repeat domain 35

-165

195

ZNF593zinc finger protein 593

-165

196

DUS1L

dihydrouridine synthase 1 like

-165

197

ELOVL6ELOVL fatty acid elongase 6

-165

198

GEMIN5

gem nuclear organelle associated protein 5

-165

199

LCMT2

leucine carboxyl methyltransferase 2

-165

200

MCM6

minichromosome maintenance complex component 6

-165

90

Supplemental figure 7 FANTOM-CAT Robust (縦軸) と Stringent(横軸)の HNf-score の評価

MIR210HG のプロットについてラベルと色を強調して可視化した。いずれも HNf-score が正の値を示していること、各 HNf-score の分布が lv4 Robust と lv3 Stringent で大きく変わらないことを確認した。

91Supplemental table 2 DOWN200 ncRNA metabolic process related group に該当する遺伝子Metascape によるエンリッチメント解析結果を元に表を作成した。GO:0034660 ncRNA
metabolic process を構成する member の Term の詳細を記した。
GroupID

Category

Term

Description

InTerm_InList

Symbols

1_SummaryGO

GO:0034660

ncRNA metabolic

46/470

DKC1, METTL1, NOP2, RRP9,

Biologicalprocess

DDX21, NOLC1, WDR46, LCMT2,

Processes

FARSB, RCL1, NPM3, NOP56, WDR4,
RPP40, UTP14A, POP1, RRS1,
ADAT1, DIMT1, UTP20, RRP7A,
RRP15, MRTO4, POP5, POLR3K,
EXOSC4, BRIX1, LYAR, ELAC2,
DUS1L, NOL6, NOC4L, METTL8,
MRM1, PUS1, UTP15, MAK16,
RRP36, FDXACB1, IMP4, MARS2,
DTD2, KTI12, TOE1, TRMT61A,
CTU2, URB2, MYBBP1A, NIP7,
NOP16, PAK1IP1, MRPL20, DDX28,
MPV17L2, LTV1, RUVBL1, GEMIN5,GTF2H2, PSME3, PPIL1, PNO1,
WDR77, NOL12, LSM10

1_MemberGO
Biological
Processes

GO:0034660

ncRNA metabolic
process

46/470

DKC1, METTL1, NOP2, RRP9,
DDX21, NOLC1, WDR46, LCMT2,FARSB, RCL1, NPM3, NOP56, WDR4,
RPP40, UTP14A, POP1, RRS1,
ADAT1, DIMT1, UTP20, RRP7A,
RRP15, MRTO4, POP5, POLR3K,
EXOSC4, BRIX1, LYAR, ELAC2,
DUS1L, NOL6, NOC4L, METTL8,
MRM1, PUS1, UTP15, MAK16,
RRP36, FDXACB1, IMP4, MARS2,

92

DTD2, KTI12, TOE1, TRMT61A,
CTU2

1_MemberGO

GO:0034470

BiologicalncRNA

43/384processing

DKC1, METTL1, NOP2, RRP9,
DDX21, NOLC1, WDR46, LCMT2,

Processes

RCL1, NPM3, NOP56, WDR4, RPP40,
UTP14A, POP1, RRS1, ADAT1,
DIMT1, UTP20, RRP7A, RRP15,
MRTO4, POP5, POLR3K, EXOSC4,
BRIX1, LYAR, ELAC2, DUS1L, NOL6,
NOC4L, METTL8, MRM1, PUS1,
UTP15, MAK16, RRP36, FDXACB1,
IMP4, KTI12, TOE1, TRMT61A, CTU2

1_MemberGO

GO:0042254

Biologicalribosome

38/293biogenesis

DKC1, NOP2, RRP9, DDX21, NOLC1,
WDR46, URB2, RCL1, NPM3,

Processes

MYBBP1A, NOP56, RPP40, UTP14A,
RRS1, DIMT1, UTP20, RRP7A,
RRP15, MRTO4, POP5, NIP7,
NOP16, EXOSC4, PAK1IP1, MRPL20,
BRIX1, LYAR, DDX28, NOL6, NOC4L,
MRM1, UTP15, MAK16, MPV17L2,
LTV1, RRP36, FDXACB1, IMP4

1_MemberGO

GO:0022613

ribonucleoprotein

40/444

DKC1, NOP2, RUVBL1, RRP9,

Biologicalcomplex

DDX21, NOLC1, WDR46, URB2,

Processes

biogenesis

RCL1, NPM3, MYBBP1A, NOP56,
RPP40, UTP14A, RRS1, GEMIN5,
DIMT1, UTP20, RRP7A, RRP15,
MRTO4, POP5, NIP7, NOP16,
EXOSC4, PAK1IP1, MRPL20, BRIX1,

93

LYAR, DDX28, NOL6, NOC4L, MRM1,
UTP15, MAK16, MPV17L2, LTV1,
RRP36, FDXACB1, IMP4

1_MemberGO

GO:0006364

rRNA processing

29/218

DKC1, NOP2, RRP9, DDX21, NOLC1,

Biological

WDR46, RCL1, NPM3, NOP56,

Processes

RPP40, UTP14A, RRS1, DIMT1,
UTP20, RRP7A, RRP15, MRTO4,
POP5, EXOSC4, BRIX1, LYAR,
NOL6, NOC4L, MRM1, UTP15,
MAK16, RRP36, FDXACB1, IMP4

1_MemberGO

GO:0016072

BiologicalrRNA metabolic

29/229process

DKC1, NOP2, RRP9, DDX21, NOLC1,
WDR46, RCL1, NPM3, NOP56,

Processes

RPP40, UTP14A, RRS1, DIMT1,
UTP20, RRP7A, RRP15, MRTO4,
POP5, EXOSC4, BRIX1, LYAR,
NOL6, NOC4L, MRM1, UTP15,
MAK16, RRP36, FDXACB1, IMP4

1_MemberReactome

R-HSA-

Metabolism ofGene8953854

RNA

39/673

DKC1, GTF2H2, METTL1, NOP2,
RRP9, DDX21, WDR46, LCMT2,

Sets

RCL1, PSME3, NOP56, WDR4,
RPP40, UTP14A, POP1, ADAT1,GEMIN5, DIMT1, UTP20, RRP7A,
POP5, NIP7, PPIL1, EXOSC4, PNO1,
ELAC2, NOL6, NOC4L, WDR77,
NOL12, MRM1, PUS1, UTP15, LTV1,
LSM10, RRP36, IMP4, TRMT61A,
CTU2

1_MemberReactome

R-HSA-

Gene

72312

Sets

rRNA processing

24/204

DKC1, NOP2, RRP9, DDX21, WDR46,
RCL1, NOP56, RPP40, UTP14A,
DIMT1, UTP20, RRP7A, NIP7,

94

EXOSC4, PNO1, ELAC2, NOL6,
NOC4L, NOL12, MRM1, UTP15,
LTV1, RRP36, IMP4
1_MemberReactome

R-HSA-

rRNA

Gene

6790901

modification in

NOP56, UTP14A, DIMT1, UTP20,

the nucleus and

RRP7A, PNO1, NOL6, NOC4L,

cytosol

UTP15, RRP36, IMP4

Sets

1_Member

16/61

Reactome

R-HSA-rRNA processing

Gene8868773in the nucleus

RCL1, NOP56, RPP40, UTP14A,

and cytosol

DIMT1, UTP20, RRP7A, NIP7,

Sets

22/194

DKC1, NOP2, RRP9, WDR46, RCL1,

DKC1, NOP2, RRP9, DDX21, WDR46,

EXOSC4, PNO1, NOL6, NOC4L,
NOL12, UTP15, LTV1, RRP36, IMP4
1_MemberReactome

R-HSA-

Major pathway ofGene

6791226

rRNA processing

NOP56, RPP40, UTP14A, UTP20,in the nucleolus

RRP7A, NIP7, EXOSC4, PNO1,

and cytosol

NOL6, NOC4L, NOL12, UTP15,

Sets

19/184

RRP9, DDX21, WDR46, RCL1,

LTV1, RRP36, IMP4
1_Member

KEGG
Pathwayhsa03008

Ribosome

11/109

DKC1, RCL1, NOP56, RPP40,

biogenesis in

UTP14A, POP1, RRP7A, POP5,

eukaryotes

NOL6, UTP15, IMP495

Supplemental table 3 染色体ごとの HNf-score の要約統計量

HNf-score はミトコンドリア DNA 由来の転写物において低値を示した。
Avg

StdDev

Max

Min

UniqueCount

UniqueCount(HNf1.5)(HNf1.5)(HNf1.5)(HNf1.5)(transcript)(gene)

Chr

chr1

-4.36

28.41

263

-246

25737

3080

chr2

-3.2

27.44

272

-175

19941

2183

chr3

-3.64

27.66

300

-156

16450

1723

chr4

-3.14

26.11

275

-157

10762

1265

chr5

-3.74

28

220

-169

12744

1533

chr6

-2.52

26.78

321

-176

14168

1778

chr7

-4.27

27.75

309

-149

12723

1516

chr8

-2.79

28.6

265

-248

9983

1171

chr9

-3.71

27.61

257

-148

10124

1218

chr10

-1.98

29.77

301

-149

10457

1244

chr11

-3.85

27.92

267

-187

16230

1664

chr12

-4

27.96

238

-147

15532

1643

chr13

-4.15

24.77

161

-136

4748

631

chr14

-4.14

26.69

246

-140

9596

1141

chr15

-3.4

26.94

175

-148

8819

988

chr16

-6.86

29.79

233

-188

11596

1267

chr17

-5.07

29.86

237

-175

16322

1746

chr18

-2.81

23.96

135

-132

4417

509

chr19

-2.28

27.48

250

-157

17788

1983

chr20

-3.69

28.15

195

-200

6810

888

chr21

-1.25

28.46

168

-160

3167

378

96

chr22

-4.51

28.38

194

-174

6064

729

chrX

-2.15

24.92

228

-151

8276

1057

chrY

-0.61

12.98

51

-63

269

47

chrM

-98.18

64.55

68

-245

54

34

(Empty)-13.66

33.47

49

-128

76

0

97

Supplemental figure 8 HNg-score による UP 200 遺伝子、DOWN200 遺伝子の染色体上の位置の可視化

13 番染色体、18 番染色体には該当遺伝子がなかったが、この二つの染色体にはもともと遺伝子数が少ない（Supplemental table2 参照）ため、低酸素応答性による特徴とは考えにくい。Python の Bio パッケージをもとに可視化した。

98

A

B

C

Supplemental figure 9 ゲノムリファレンスのバージョンごとの PGK1 と TAF9B の位置

UCSC ゲノムブラウザを用いて PGK1 と TAF9B の位置関係を確認した。異なるゲノムリフ
ァレンスにおいても PGK1 と TAF9B は同様の位置関係にあった。 (A) GRCh37/hg19 (B)GRCh38/hg38 (C) T2T-CHM13 v2.0

99

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謝辞

本研究の遂行にあたり指導教員であった広島大学大学院統合生命科学研究科ゲノム情報科学研究室特任教授 坊農秀雅先生に深謝いたします。また、統合生命科学研
究科の井川武助教、今村拓也教授、浮穴和義教授、医系科学研究科谷本圭司准教授（順不同）には本論文の作成にあたり適切なご助言を賜りました。感謝申し上げます。
理化学研究所 生命医科学研究センター 生命医科学大容量データ技術研究チーム 粕
川雄也先生 森岡勝樹先生には研究内容についてのご相談に親身なご対応を賜りました。感謝申し上げます。
また、コロナ禍のなか、リモートでの講義受講を可能としてくださった広島大学の皆様に感謝申し上げます。
サイエンスの議論や解析技術の研鑽を通じて基礎力を育ててくださった三島創薬
勉強会 Mishima.syk コミュニティの皆さま、BioHackathon BH21.8 や
SPARQLthon の関係者の皆さま、Bonohulab のラボメンバーの皆さまに厚く御礼申し上げます。
働きながらの学位取得を応援してくださった協和キリン株式会社の皆さまに御礼申し上げます。
多くのオープンデータやオープンソースソフトウェアの活用無くして本研究を遂行することは不可能でした。貴重なデータやソースコードを管理・公開してくださっている全てのオープンサイエンスコミュニティに感謝申し上げます。

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