17安定同位体トレーサーを利用した動物における脂肪酸の体内動態解析＜平成 22 年度助成＞

安定同位体トレーサーを利用した動物における脂肪酸の体内動態解析
芝原章（大阪府立大学総合リハビリテーション学類栄養療法学専攻）

1.

クセン酸が生成するという、生体酵素系が関与す

はじめにる二重結合の相互変換反応に基づく全く新しい異高度不飽和脂肪酸（PUFA）の栄養特性や機能性化経路の発見 9 -10）に至った。こういった植物を性については，EPA（イコサペンタエン酸、20 : 5

対象とする場合の粗酵素系の実験では，使用する（5, 8, 11, 14, 17）、以下この二重結合位置のも標識体の量はミリグラム単位で充分であったが、のを EPA とする）や DHA（ドコサヘキサエン酸、動物における食餌に基づく脂肪酸の栄養特性や機22 : 6（4, 7, 10, 13, 16, 19）、以下この二重結合位置能性を追求する実験には，グラム単位での標識体のものを DHA とする）などが注目され、ヒトにの調製が必要であり、野田ら 6-7）の方法では大量及ぼす影響に関する重要な知見が集積されつつあ調製に不向きであった。また同法では 200 ℃でる。これらの研究には疫学的な解析研究とともに、

96 時間の加熱を要するため、PUFA の標識化は食餌に由来する、消化・吸収された各脂肪酸それ不可能であった。その後約 20 年間、標識体合成

ぞれの代謝速度や、臓器への移行・蓄積など、そ法を模索し続けた結果、混餌経口投与に充分な量の体内動態を解析する必要があり、従来では放射（10 グラム単位）をそれも飽和脂肪酸から EPA や性同位体標識脂肪酸が汎用されてきた。しかし現

DHA までも含む PUFA の標識体を合成する手法

在では、特別な研究室や特殊な事例を除いて、法を確立した（投稿準備中）。

的規制や実験施設上の制約から安定同位体標識脂[ 2, 2 - 2 H 2 ] 脂肪酸をトレーサーとする利点は、安定同位体（ 13C や 2 H）で ユニフォーム・ラベル

肪酸の利用に限られている。
過去、安定同位体標識脂肪酸の合成法について
1-5）

した脂肪酸に比べて同位体効果が小さく実際のにまとめられ生体内動態を的確に追跡できることである。ま

6-7）

によって

た 1 サイクルでもβ- 酸化を受ければα, β- 脱水

報告された [ 2, 2 - 2 H 2 ] 脂肪酸の合成法である。こ素の段階で標識は消失するので、もはやトレー

れを利用して脂肪酸鎖の 2, 2 位を重水素で標識

サーとしての機能は発揮することができない。1した [ 2, 2 - H 2 ] パルミトレイン酸（cis - 9 - ヘキサ

サイクルのβ- 酸化で生成したアセチル - CoA に

デセン酸）を化学合成し、これをトレーサーとしは重水素が 1 個存在するが、これを再利用した脂て高等植物では未確立であった cis - バクセン酸

肪酸の生成の確率はゼロに等しい。このように（cis - 11- オクタデセン酸 ) の生合成経路（パルミ[ 2, 2 - 2 H 2 ] 脂肪酸をトレーサーとして利用すれトレイン酸からの炭素鎖延長経路 ) を実証 8）した。

ば、投与したトレーサーそのものの体内動態を、さらに cis - バクセン酸の 11 位の二重結合が 9 位

他の要因を排除して、直接追跡することができるに移動してオレイン酸が生成し、またこのオレイので、これが最大の利点となる。本研究は、動物

ン酸の 9 位の二重結合が 11 位に移動して cis - バ

における脂肪酸の体内動態を解析する手始めとしは膨大な報告があり種々の総説てきた。筆者が注目したのは野田ら

2

18

浦上財団研究報告書て企画し、食餌に含まれる [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA なら

Vol.21（2014）

ト方式（スプリット比、1/20）で行った。

びに [ 2, 2 - H 2 ] EPA がマウスの脳脂質にどの程

GC-MS は、GC 部、SHIMADZU GC - 2010 型 ;度取り込まれるかどうかを主目的に調査したもの

MS 部、SHIMADZU GCMS - QP 2010 型 ; デ ー タ

で、他の臓器との比較データも加えて報告する。

処理装置、SHIMADZU GCMS solution ; カラム、2

2.

BPX90（100 m × 0.25 mm i.d., 0.25μm df ）; カ

実験方法

ラム温度、120 ℃（ 2 min hold）- 2℃ /min- 250 ℃ ;2-1. マウスの飼育

キャリヤーガス、ヘリウム（ 流 速、20.0 cm/sec）;

体重 17 - 19 g の ICR 系雄性マウス 4 週齢を用い注入方法、スプリット方式（スプリット比、1/20）、た。実験食は、無脂肪 AIN - 93M 標準飼料（大豆油

気化室温度、250 ℃ ; イオン源温度、200 ℃ ; イン無添加）に [ 2, 2 - H 2 ] DHA エチルが食餌中 4 ％とターフェース温度、250 ℃ ; イオン化電圧、70 eV;なるように混合し、これを 4 週間自由摂食させた

検出器電圧、1.0 kV ; スキャン範囲、70 - 390 m/z（DHA 投与群）。同様に [ 2, 2 - 2 H 2 ] EPA エチルを含で運転した。イオン化方式は、イソブタンを試薬む実験食を 4 週間自由摂食させた（EPA 投与群）。

反応ガスとする化学イオン化法（CI）を用いた。

2-2. 臓器の摘出と脂質の抽出、ならびに脂肪酸メチルの調製

3.

2

DHA 投与群、EPA 投与群、コントロール群の結果と考察

3-1. GC-CI/MS 測定上の問題

マウス（各群 5 匹、その中から 3 匹）を、ネンブター

GC - CI/MS 分析で得た非標識 DHA メチル（標ル麻酔下で冷却生理食塩水約 20 mL を用いて心臓準品）のマススペクトルを図 1（A）に示す。DHA

灌流法により脱血し、脳、心臓、肝臓、腎臓を摘

メチルの擬似分子イオン（QM +）が m/z343 に出出した。各臓器から Folch ら 11）の方法で総脂質現するとともに、QM + + 1 である m/z344、ならを抽出し、ヘキサン / エーテル / 酢酸（70/30/1）

びに QM + + 2 である m/z345 のイオンピークが確を展開溶媒とする薄層クロマトグラフィーで複認できる。これら QM + + 1 と QM + + 2 のイオンピー

合脂質画分を分取した。次に 5 ％塩酸 / メタノー

クは脂肪酸の構成元素となる炭素、水素、酸素のルを加えて 98 ℃で一晩加熱し、メタノリシスに

自然界に存在する質量数の異なる同位体ピークでより生成した脂肪酸メチルを回収した。次に無水ある。図 1（A）に示すマススペクトル上で QM + ：硫酸ナトリウムとエクストレルートを充填したミQM + + 1：QM + + 2 のイオンピーク相対強度比は、ニカラムで脱水し、さらにシリカゲルを充填した

DHA メチルの分子式より計算した天然同位体

ミニカラムで精製してガスクロマトグラフィー

ピーク比（理論値）に一致するはずである。しか（GC）とガスクロマトグラフィー・マススペクト

し日常の GC - CI/MS 分析で取得するマススペク

ロメトリー（GC - MS）用の検体とした。

トルにおける相対強度比は、なかなか理論値に一2-3. GC と GC-MS

致しない。その原因を種々検討した結果、イオン

脂肪酸組成を測定するキャピラリー GC は、機化室の汚れなど機器の整備上の問題、あるいはコ種、SHIMADZU GC - 2010 型（水素炎イオン化検ンピュータ処理上の問題よりも、むしろ GC - CI/出器付）; カラム、BPX90（100 m × 0.25 mm i.d.,

MS への検体注入量（重量）に大きく依存すること

0.25μm df ）; カ ラ ム 温 度、120 ℃（ 2 min hold）

が判明した。これは同一検体を濃度を変えて繰り- 3 ℃ /min - 260 ℃（37 min hold ）; キ ャ リ ヤ ー ガ

返し分析し、マスクロマトグラフィーで測定したス、水素（流速、20.0 cm/sec）; 注入方法、スプリッ

QM + の面積を横軸にプロットし、QM + + 1 の面

19

安定同位体トレーサーを利用した動物における脂肪酸の体内動態解析

積を縦軸にプロットすれば，直線性を示す検量線
2

メチルが混在する検体のマススペクトルを示（y=0.2603x，R =0.9996）が成り立つことで確認す。m/z343 は 非 標 識 DHA メ チ ル の QM + で あした。また QM + + 2 の面積を縦軸にプロットしたり、m/z345 は非標識 DHA メチルの QM + + 2 と検量線（y=0.054x，R 2=0.9161）も直線性を示す。

[ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA メチルの QM + が共存したイオン

多数の検体を対象とする日常分析で、その検体注

ピークである。

入量（重量）を厳密に揃えることは不可能に近い。

本研究はトレーサーとして用いた [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA

これらの検量線を用いることで検体注入量（重量）をマウスの臓器脂質中に検出・定量することをの上限・下限が設定され，通常の GC - CI/MS 分

目的としている。その臓器脂質にはマウス自身析を行う適正感度内で検体測定が終了すれば、測が生合成した非標識体とともに、食餌に由来す

定値はすべて有効となり利用価値は大きい。

る標識体が混在している。この混在する検体か

図 1（B）には、非標識 DHA メチル、[2 - H] 22 : 6

ら標識体を定量するには（ 図 2 参照 ）、マスクロ

メチル（後述、3 - 2. 項）、ならびに [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA

マトグラフィーで測定した非標識 DHA メチルの

2

(A)

(B)

図1

DHA メチルのマススペクトル（化学イオン化）（A）：非標識体,（B）：非標識体と標識体が混在

	
 
	
 
	
 
	
 

図2
	
 
	
 
	
 

天然同位体の補正	 20

浦上財団研究報告書

m/z343（QM +）の面積から、前述の検量線で非+Vol.21（2014）

ドン酸の割合が減少する傾向が見られ（7.4 ％か

標識 DHA メチルの m/z345（QM + 2）の面積をら 4.3 ％）、EPA が DHA 投与群にのみ検出され算出する。この面積を、マスクロマトグラフィー

た（0.3 ％）。しかし、飽和脂肪酸、モノエン脂肪で測定した m/z345 の面積から差し引くことで、酸、全 PUFA の割合は両群に大きな差はなかっ

図 2 の a に相当する [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA の面積が求めた。DHA 投与群のマウスは、いわば“DHA 過剰食”

られる。また食餌に由来する重水素 1 個が入ったで 4 週間も飼育されている。それにもかかわらず、[ 2 - H ] 22 : 6 の真の面積が求められる。目的とす

DHA の割合は大幅に増加せず、また全 PUFA のる [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA の真の面積 c は、[ 2 - 2 H] 22 : 6

割合もほぼ一定に保たれていた。このことからマ（QM + は m/z344）の QM + + 1 と な る m/z345 のウス脳複合脂質の脂肪酸組成は、食餌脂質の脂肪面積 b を同様にして作成した検量線から求め、そ

酸組成、言い換えれば体外から供給される脂肪酸れを差し引くことで求められる。

の量による影響をほとんど受けずに、独自の組成2

このように本研究で採用する安定同位体トレーを維持する機構、すなわち DHA に関しては組成サー法では、日常分析で使用される通常の GC -

値の上限閾値が厳密に定められていることを意味

CI/MS 整備状態で分析が可能となる。

している。しかし閾値内で存在する DHA は、そ3-2. マウス脳複 合 脂 質 に 取 り 込 ま れ た[2, 2- 2H 2] DHAの約半量が食餌に由来する外因性の DHA で置き換わっていた。その根拠は以下のとおりである。

図 3 に示すガスクロマトグラムは、DHA 投与

図 4 は、 図 3 に示した検体を GC - CI/MS 分析

群のマウス脳複合脂質構成脂肪酸を分析した 1にかけて得られたマスクロマトグラムである。

例（1 匹分）である。DHA 投与群 3 匹それぞれかm/z345，344，343 それぞれに応答があり、標識体

ら得た脂肪酸組成に個体差はなく、ほぼ一定でと非標識体を容易に判別できる。それぞれのピーあった。コントロール群と比較すると、DHA のクトップには若干のずれがあり、これは分子内

割合は若干増加し（13.9 ％から 16.1％）、アラキに重水素の数が多いほど GC 上の溶出時間が早い

図3

マウス（DHA 投与群）の脳複合脂質構成脂肪酸のキャピラリーガスクロマトグラム

1 = 16 : 0, 2 = 16 : 1（n-7）, 3 = 18 : 0, 4 = 18 : 1（n-9）, 5 = 18 : 1（n-7）, 6 = 18 : 2（n-6）, 7 = 20 : 0, 8 = 20 : 1（n-9）,	 9 = 22 : 0, 10 = 20 : 4（n-6）, 11 = 20 : 5（n-3）, 12 = 22 : 4（n-6）, 13 = 22 : 5（n-3）, 14 = 22 : 6（n-3）

	
 
	
 
	
 
	
 

21

安定同位体トレーサーを利用した動物における脂肪酸の体内動態解析という同位体効果によるものである。m/z345 のピークは、前述したように、[ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA メ
チルの QM + と非標識 DHA メチルの QM + + 2 が合算されたものである。さらに、図 2 に記載した
m/z344 に相当する [ 2 - 2 H] 22 : 6 に由来する天然同位体ピークもこの合算に関与している。これら
を 3-1. 項の方法で補正後、22 : 6 ピークに相当す
る非標識体と標識体を百分率で示したものを表 1にまとめた。
DHA 投与群では 3 匹のマウスとも、脳複合脂質を構成する DHA の約半量が食餌に由来する[ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA に置き換わっていた。以上のこ

図4と か ら、 消 化・吸 収 さ れ た [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA は、あるいは少なくともその一部は、β- 酸化や再合成などの代謝を受けることなくそのままの形で血液脳関門を通過し、脳の複合脂質へ取り込まれた、と結論づけられる。
なお 図 4 と 表 1 に記載した [ 2 - 2 H] 22 : 6 とは、[ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA のβ- 酸化で EPA が生じる過程

1 22 : 6 ピークにおける非標識体と標識体の百分率
表1表22:6ピークにおける非標識体と標識体の百分率

DHA投与群
マウス-1

マウス-2

の中間体、[ 2 - H ] 22 : 6（3, 7, 10, 13, 16, 19）ある2

い は [ 2 - H] 22 : 6（t 2, 7, 10, 13, 16, 19）、で は な
2

マウス（DHA 投与群）の脳複合脂質
構成脂肪酸のマスクロマトグラム

マウス-3

いかと推定しているが構造確定には至っていな
い。[ 2, 2 - H 2 ] DHA の 1 サイクルのβ- 酸化から
2

平均

EPA が生成する過程を以下に示す。

	
 標識体
非標識体

2

2

[2- H]22:6[2,2- H2]DHA

26.9

24.3

48.8

(4.5)

(4.0)

(8.1)

26.6

25.5

47.9

(4.1)

(4.0)

(7.5)

26.5

25.0

48.5

(4.3)

(4.0)

(7.8)

26.7

24.9

48.4

(4.3)

(4.0)

(8.3)

[ 2, 2 - 2 H 2 ] 22 : 6（4, 7, 10, 13, 16, 19）（= [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA

本研究で検出した m/z344 に相当するピーク（ 図 4、表 1）は、炭素数が 22 で二重結合が 6 つあ↓
[ 2 - 2 H] 22 : 7（t 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19）

り、重水素が 1 個入った脂肪酸であることは確実である。

↓[ 2 - H] 22 : 6（3, 7, 10, 13, 16, 19）2

従来、放射性同位体トレーサー法を利用することで行われていたこのような実験が、通常の実験↓[ 2 - 2 H] 22 : 6（t 2, 7, 10, 13, 16, 19）↓）は総脂肪酸に占める割合（wt%）↓

室で何ら制約を受けることなく行えるということは、今後の学問の進歩に大きく貢献するものと期2↓ [ 2 - H ] 22 : 5（7, 10, 13, 16, 19）待できる。本研究ではマウスの全脳を用いた。脳↓↓を細分化し脳各部位における DHA の取り込みの20 : 5（5, 8, 11, 14, 17）= E PA

度合いや、蓄積の時間経過などを追跡することも可能である。また脳複合脂質は、さらに各種脂質

4

22

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

クラスに細分化して分析することも今後必要となら調製した脂肪酸メチルのマスクロマトグラムをろう。

示す。また表 2 には、20 : 5 ピークに相当する非標

3-3. マウス脳複 合 脂 質 に 取 り 込 ま れ た[2, 2- 2H 2] EPA

識体と標識体の百分率を示す。20 : 5 ピークの総

本研究のコントロール群マウスでは、脳複合脂脂肪酸に占める割合は、GC により約 0.6 ％と定量されている。

質構成脂肪酸として EPA は検出されなかった。

m/z319 は [ 2, 2 - 2H 2 ] EPA の QM + であり（ 図 5）、

哺乳類の脳脂質に存在する EPA については、全

20 : 5 ピークの 40 - 50 ％（ 表 2）が食餌に由来するく検出されないとする論文と、微量に存在すると[ 2, 2 - 2 H 2 ] EPA そのものであった。これらの結果記載する論文の両方が発表されている。本研究では、EPA が血液脳関門を通過できることがほぼ

は [ 2, 2 - H 2 ] DHA の投与と全く同一の飼育条件確実であることを示唆している。ただし本研究でと分析条件で、[ 2, 2 - H 2 ] EPA が血液脳関門を通の EPA 投与群マウスは、DHA 投与群の場合と同過するかどうかを検証してみた。

様に、いわば“ EPA 過剰食 ”で 4 週間も飼育され

22

図 5 には、EPA 投与群マウスの脳複合脂質かている。マウス体内の EPA プールにどの程度のEPA が存在すれば、血液脳関門を通過して、脳複合脂質に取り込まれるかについては現在のところ不明である。
前 述 し た が（3 -2. 項 の 図 3）、EPA は DHA
投 与 群 に 検 出（0.3 ％）さ れ た。Ouellet ら 12）は、Control diet で飼育したマウスの脳には EPA が検出されず、High-DHA diet で飼育したマウスの脳に 0.2 ％検出したと報告した。過剰な DHA 摂取が、脳複合脂質における EPA の存在に関与していることに間違いはなさそうである。EPA と
DHA は脂肪酸代謝の上で密接に関係している。

図5
表2

動物の生存にとって最も重要な臓器とされる脳マウス（EPA 投与群）の脳複合脂質
構成脂肪酸のマスクロマトグラムの、それも脳機能に関与する複合脂質に、なぜ本

20 : 5 ピークにおける非標識体と標識体の百分率

表2 20:5ピークにおける非標識体と標識体の百分率
非標識体

マウス-1

マウス-2

マウス-3

平均

（

れているのかについては、今後追求しなければ

	
 標識体

EPA投与群

来必要ではない脂肪酸がアシル基として取り込ま[2- H]EPA[2,2- H2]EPA

ならない大きな課題である。脳の高度機能化を

17.7

30.7

51.7

DHA が担っているのであれば、逆に、EPA の存

(0.1)

(0.2)

(0.4)

在が脳の高度機能化を阻害する可能性は否めな

23.6

34.8

41.6

(0.2)

(0.2)

(0.3)

い。なお、本研究とは別に行った安定同位体で標

20.8

35.4

43.8

(0.1)

(0.2)

(0.3)

20.7

33.6

45.7

(0.1)

(0.2)

(0.3)

2

）は総脂肪酸に占める割合（wt%）

2

識したトランス脂肪酸の投与実験から、トランス脂肪酸は血液脳関門を通過しないという結論を得ている。
図 5 と 表 2 に記載した [ 2 - 2 H ] EPA の由来は、以下に示す経路 13）により [ 4 - 2 H ] DHA へ変換後、

安定同位体トレーサーを利用した動物における脂肪酸の体内動態解析[ 2, 2 - 2 H 2 ] 20 : 5（5, 8, 11, 14, 17）23

この実験をもし放射性同位体トレーサーである2= [ 2, 2 - H 2 ] EPA[ 1 -14 C ] EPA を用いて行ったとすると、[ 1-14 C] -↓EPA は EPA → DHA → EPA の系を経てもその[ 4, 4 - 2 H 2 ] 22 : 5（7, 10, 13, 16, 19）↓

代謝を受けたかどうかは判別できない。しかし本

[ 6, 6 - H 2 ] 24 : 5（9, 12, 15, 18, 21）2

研究で用いた [ 2, 2 - 2 H 2 ] EPA は、EPA → DHA→ EPA の系を経れば [ 2 - 2 H ] EPA となるので、↓[ 6 - 2 H] 24 : 6（6, 9, 12, 15, 18, 21)↓

まま [ 1 -14 C ] EPA の形で検出されるので、生体内そのままの形である [ 2, 2 - 2 H 2 ] EPA と明瞭に区↓別できる。本研究で検出したマウス脳複合脂質[ 4 - H] 22 : 6（4, 7, 10, 13, 16, 19）に存在する標識された EPA は、食餌に由来する= [ 4 - H] DHA

EPA そのものと、再合成された EPA という 2 種

22

以下に示すように 1 サイクルのβ- 酸化を受けて生成したと考えている。

類の標識体で構成されていることが分かる。
デ ー タ 表 示 は 省 略 し た が、EPA 投 与 群 マ[ 4 - H] 22 : 6（4, 7, 10, 13, 16, 19）

ウ ス の 脳 複 合 脂 質 に は 重 水 素 2 個 が 入 っ た [ 4,= [ 4 - H] DHA

4 - 2 H 2 ] 22 : 5（7, 10, 13, 16, 19）と、重水素 1 個が↓入った [ 4 - 2 H ] 22 : 5（7, 10, 13, 16, 19）と [ 4 - 2 H] -22

[ 4 - 2 H] 22 : 7（ t 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19）↓19）は DPA と 略 さ れ、 慣 用 名 と な っ た EPA、

[ 4 - H] 22 : 6（3, 7, 10, 13, 16, 19）2↓

DHA と と も に、n - 3 系 PUFA の 相 互 変 換 に 関
与する重要な脂肪酸となっている。血液脳関門[ 4 - 2 H] 22 : 6（t 2, 7, 10, 13, 16, 19）↓

DHA も検出・定量している。22 : 5（7, 10, 13, 16,が関与する脳内への PUFA の取り込みや、脳内での PUFA のβ- 酸化など、ここ 3 - 4 年間の成↓↓ [ 4 - 2 H ] 22 : 5（7, 10, 13, 16, 19）

果 12,14-18）は著しい。

↓

3-4.

↓

[ 2 - 2 H] 20 : 5（5, 8, 11, 14, 17）= [ 2 - 2 H ] EPA

図6

マウス各臓器複合脂質に存在する標識体

食餌に由来する [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA ならびに [ 2, 2 -マウス各臓器の複合脂質に存在する標識体（wt%）
A : DHA 投与群， B : EPA 投与群

242

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

H 2 ] EPA は、そのままの形、あるいは代謝され博士、ならびに共同研究を行って頂きました富山て別の脂肪酸となり、マウス各臓器の複合脂質に

大学和漢医薬学総合研究所の浜崎智仁先生、長澤存在した。図 6 では、各臓器の複合脂質を構成す

哲郎先生、富山大学医学部の浜崎

る総脂肪酸を 100 ％とし、重水素が 2 個入った脂タ解析を担当された本学大学院博士前期課程修了

肪酸のみを標識体として割り振りしている。これ

生の吉田有里氏に厚くお礼申し上げます。

景先生、デーによると、DHA 投与群マウスの心臓では、複合脂質を構成する総脂肪酸の 30 ％以上が食餌に由文来する [ 2, 2 - 2 H 2 ] DHA に置き換わっていた。ま1) Dinh-Nguyên N, Raal A (1978) Perdeuteriated normal-chain
saturated mono- and dicarboxylic acids and methyl esters.
Prog Chem Fats Other Lipids, 16:195-206.

た EPA 投与群マウスの心臓では、肝臓や腎臓に比べて [ 2, 2 - 2 H 2 ] EPA の占める割合は低いが（10 ％以下）、[ 2, 2 - H 2 ] EPA に由来する代謝産2物（標識された EPA，DPA，DHA）を加算すると総脂肪酸に占める割合は 30 ％近くにもなる。従ってマウスの心臓複合脂質構成脂肪酸は、肝臓や腎臓のそれに比べて、食餌に由来する PUFA の影
響を受けやすいと言えるであろう。
本研究では、マウスはいずれも“ DHA 過剰食 ”
あるいは“ EPA 過剰食”で飼育されたものである。
[ 2, 2 - 2 H 2 ] 脂肪酸を任意の割合で配合した通常の脂肪酸組成をもつ食餌を作成し、それでマウスを飼育するコントロール実験も、“ 過剰食 ”投与の対象として行うことが可能である。
1. 項で述べたように、飽和脂肪酸はもとより、モノエン脂肪酸、ジエン脂肪酸、そして最も不飽和度が高いヘキサエン酸までを対象として、その標識体を合成する手法は確立された。さらに 10グラム単位での標識体調製も容易に行える。今後、動物における脂肪酸の栄養特性や機能性を追求する研究には、[ 2, 2 - 2 H 2 ] 脂肪酸を用いる安定同位体トレーサー法が強力な武器になるものと思わ
れる。
謝

辞
本研究は、
（公財）浦上食品・食文化振興財団の研究助成なしでは遂行できなかったことを記して、同財団へ深謝の意を表します。また筆者の長
年にわたる共同研究者である本学准教授山本公平

献2) Tulloch AP (1979) Synthesis of deuterium and carbon-13
labelled lipids. Chem Phys Lipids, 24:391-406.
3) Rakoff H (1982) Preparation of fatty acids and esters
containing deuterium. Prog Lipid Res, 21:225-254.
4) Tulloch AP (1983) Synthesis, analysis and application of
specifically deuterated lipids. Prog Lipid Res, 22:235-256.
5) Rohwedder WK (1985) Mass spectrometry of lipids labeledwith stable isotopes. Prog Lipid Res, 24:1-18.
6) 野田万次郎, 三宅宏二 (1982) 2, 2 - 重水素化脂肪酸メチ
ルエステルの合成とそのプロトン核磁気共鳴スペクト
ル. 油化学, 31:154-158.
7) 野田万次郎, 稲津宜彦 (1985) GC-MS による 2, 2 - 重水素
標識脂肪酸の検出と定量. 油化学, 34:42-47.
8) Shibahara A, Yamamoto K, Takeoka M, Kinoshita A,
Kajimoto G, Nakayama T, Noda M (1989) Application of a
GC-MS method using deuterated fatty acids for tracing cisvaccenic acid biosynthesis in kaki pulp. Lipids, 24:488-493.
9) Shibahara A, Yamamoto K, Takeoka M, Kinoshita A,
Kajimoto G, Nakayama T, Noda M (1990) Novel pathwaysof oleic and cis-vaccenic acid biosynthesis by an enzymatic
double-bond shifting reaction in higher plants. FEBS Lett,
264:228-230.
10) Shibahara A (1993) Novel pathways of oleic, cis-vaccenic
and n-5 monoenoic acid biosynthesis by an enzymatic double-bond shifting reaction in higher plants, “Biochemistry
and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids ofPlants” (Murata N, Somerville C, editors), The American
Society of Plant Physiologists, Rockville, pp.33-39.
11) Folch J, Lees M, Sloane-Stanley GH (1957) A simple
method for the isolation and purification of total lipides
from animal tissues. J Biol Chem, 226:497-509.
12) Ouellet M, Emond V, Chen CT, Julien C, Bourasset F,
Oddo S, LaFerla F, Bazinet RP, Calon F (2009) Diffusionof docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids throughthe blood-brain barrier: an in situ cerebral perfusion study.
Neurochem Int, 55:476-482.
13) Sprecher H (2000) Metabolism of highly unsaturated n-3
and n-6 fatty acids. Biochim Biophys Acta, 1486:219-231.

安定同位体トレーサーを利用した動物における脂肪酸の体内動態解析
14) Chen CT, Liu Z, Ouellet M, Calon F, Bazinet RP (2009)
Rapid β-oxidation of eicosapentaenoic acid in mouse brain:
an in situ study. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids,
80:157-163.
15) Gao F, Kiesewetter D, Chang L, Ma K, Rapoport SI,
Igarashi M (2009) Whole-body synthesis secretion of
docosahexaenoic acid from circulating eicosapentaenoic
acid in unanesthetized rats. J Lipid Res, 50:2463-2470.
16) Rapoport SI, Ramadan E, Basselin M (2011) Docosahexaenoic acid (DHA) incorporation into the brain from25

plasma, as an in vivo biomarker of brain DHA metabolism
and neurotransmission. Prostaglandins Other Lipid Mediat,96:109-113.
17) Igarashi M, Kim H-W, Chang L, Ma K, Rapoport SI (2012)
Dietary n-6 polyunsaturated fatty acid deprivation increases
docosahexaenoic acid metabolism in rat brain. J Neurochem,
120:985-997.
18) Rapoport SI (2013) Translational studies on regulation ofbrain docosahexaenoic acid (DHA) metabolism in vivo.
Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 88:79-85.

26

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

Analysis of fatty acid metabolism in animals using
stable isotope-labeled tracers
Akira Shibahara
Department of Clinical Nutrition, Osaka Prefecture University
Elucidation of the metabolism of dietary polyunsaturated fatty acids, such as DHA
and EPA, is vital in understanding their functions. This study traced the incorporation of
dietary DHA and EPA in the compound lipids of mouse organs, especially in the brain.
We implemented our recently developed, safe, stable isotope-labeled tracer technique andsuccessfully monitored the metabolism of dietary DHA and EPA.
For four weeks, mice were fed a diet containing stable isotope-labeled tracers: either[2,2-2 H 2 ]DHA (ethyl ester form) or [2,2-2 H 2 ]EPA (ethyl ester form). After perfusion oforgans with saline under anesthesia, the four organs (brain, heart, kidney and liver) were
removed. Each organ was homogenized with a chloroform/methanol mixture to extract
the total lipids. The total lipids were separated by thin layer chromatography into eachlipid class, and then the compound lipids were converted to fatty acid methyl esters
by methanolysis using a hydrogen chloride/methanol reagent. The fatty acid methyl
esters were simultaneously analyzed by capillary gas chromatography (GC) and gas
chromatography-chemical ionization mass spectrometry (GC-CI/MS). In GC-CI/MS
analysis, the [2,2-2 H 2 ]DHA and [2,2-2 H 2 ]EPA were detected by the quasi molecular ionswhich shifted 2 mass units from those of the corresponding unlabeled DHA and EPA: theiramounts were determined by mass chromatography in which the amounts of naturally
occurring isotopes were subtracted.
In mice fed a diet containing [2,2-2 H 2 ]DHA, simultaneous analysis by GC and GCCI/MS showed that 48.4% of DHA was [2,2-2H 2]DHA and [2,2-2H 2]DHA made up 8.3%of the total fatty acids in the compound lipids of the brain. Consequently, it is clear that
our method could easily detect the dietary [2,2-2H 2]DHA passing through the blood-brain
barrier.
In the heart, [2,2-2H 2]DHA amounted to ca. 70% of the total amount of DHA and to
more than 30% of the total fatty acids. This indicates that dietary DHA readily influences
the fatty acid profile of heart lipids. Our data demonstrate that dietary DHA influences
heart lipids more than it influences lipids of the brain, kidney and liver.
We did not detect any EPA in the brain compound lipids of mice fed a standard diet.
In contrast, [2,2-2 H 2 ]EPA was detected in the brain compound lipids of mice fed a dietcontaining [2,2-2H 2]EPA. The content was merely 0.3% of the total fatty acids, however, it
is very likely that dietary [2,2-2H 2]EPA directly passes through the blood-brain barrier andbecomes a constituent of the brain compound lipids.