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浦上財団研究報告書

Vol.29（2022）＜平成 30 年度助成＞

ヒト正常細胞の恒常性と変化を司る栄養源依存的な遺伝子発現制御機構―ヒストンH4K20me1メチル化の役割と複製開始複合体 MCMタンパク質の制御
林

陽子（大阪大学大学院 生命機能研究科）

要

旨

序論

細胞の恒常性と変化は、ヒストン修飾を始めとし遺伝子発現は、細胞固有の性質を維持しつつ、栄た後天的遺伝子制御によって制御される。ヒストン

養条件を含めた外界の環境に大きく影響される。

修飾は、ヒストンタンパク質の様々なアミノ酸残基DNA が巻き付いているヒストンタンパク質は、遺伝に、メチル化やアセチル化などが導入され、修飾に子発現の制御の役割を持ち、遺伝子発現が活性化す

よって遺伝子発現の活性化や抑制化が促されるととる領域、抑制される領域にそれぞれ特徴的な修飾がもに、細胞周期に応じて大きく変化する。本研究で導入される。例えばアセチル化修飾が多く見られるは、まずヒト細胞へのグルコース投与によるヒスト領域は、DNA が緩んでいるために遺伝子が発現されン修飾の変化を調べた。その結果、遺伝子発現に関やすく、また、ある種のメチル化修飾が多い領域で係する修飾だけでなく、細胞周期に応じて変化するは DNA が密になるために、遺伝子の発現は低い。

ヒストン修飾（H4K20me1）も大きく変化すること

つまりヒストン修飾は、遺伝子の発現しやすさを大が分かった。そこで、H4K20me1 の役割を調べた雑把に定めていると言える。また申請者らは、ヒスと こ ろ、 複 製 開 始 複 合 体 MCM（minichromosomeトン修飾が細胞周期依存的に変化することが見出しmaintenance）タンパク質のゲノム領域への集積とた 1)。遺伝子発現が大きく変化する分化や老化、癌よく似ていることを突き止めた。MCM タンパク質化は、いずれも細胞周期に伴う過程であり、ヒストは、複製期に DNA を解く働きがあり、複製期前まン修飾はダイナミックな変化を示す。

でに複製開始起点である DNA 領域に結合する必要

実際に遺伝子発現制御は、細胞周期とも深く関わがある。免疫染色の結果から、H4K20me1 と MCMることが分かってきた。一般に、複製期において早タンパク質の共局在はほとんど認められず、両者はく複製される領域は遺伝子発現が活性化領域であ排他的であることが確認できた。さらに、MCM タり、複製が後期に起こる領域は遺伝子発現が抑制さンパク質の DNA への段階的な結合に H4K20 メチルれる領域である。したがって、遺伝子発現機構を明化が関わっていることが分かった。したがって、グらかにするためには、複製タイミングのメカニズムル コ ー ス な ど の 細 胞 へ の 取 り 込 み 量 に よ っ て、を理解する必要がある。

H4K20 メチル化のレベルが調節され、これが複製開増殖中の細胞の細胞周期には、DNA 複製の準備段始複合体の DNA への結合に影響が及ぼすことで、

階の G1 期、DNA を複製する複製期、細胞分裂の準細胞周期が遅延し、引いては遺伝子発現に影響する備をする G2 期、細胞が分裂する分裂期という 4 つことが示唆された。の過程がある。一方、ヒトの多くの細胞は、自身の細胞の運命に従って、あるいは周りの環境変化に応じて、細胞周期の活動が見かけ上、休止した G0 期あるいは非常に長い G1 期にある。つまり、次の細ヒト正常細胞の恒常性と変化を司る栄養源依存的な遺伝子発現制御機構―ヒストン H4K20me1 メチル化の役割と複製開始複合体 MCM タンパク質の制御

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胞周期を進行するかどうかは、複製期に入る前のG1 期までに決定されると考えられ、G1 期は細胞周期の進行を決める時期とも言える。
複製期に入ると、複製開始起点に結合した複製開始複合体 MCM タンパク質が、DNA ヘリケースとして両方向に向かって DNA を解き、複製が進行する。
したがって、細胞が増殖する場合は、複製期が始まる前までに MCM タンパク質複合体が複製起点へ結合することが必須である（図 1）が、ヒト細胞においてその結合機構は不明であった。本研究では、G1期における細胞周期進行の決定がヒストン修飾と

図 1 複製期における MCM タンパク質
MCM タンパク質は複製期に DNA を解く働きを持つ。DNA 複製は両方向に向かって進んでいくため、複製期が始まる前（G1期）までに複製起点に 2 つ DNA に結合しなくてはならない。
しかしながら、哺乳類の細胞でどのようなタイミングで MCMタンパク質が結合するかは不明であった。

MCM タンパク質に関係するのではないかと考え、飾（H3K9ac）は、低グルコース条件下で修飾レベ研究を進めた。

ルが減少することが分かった。グルコースは栄養源として細胞に取り込まれることから、高グルコース結下では遺伝子発現が活性化されていると考えられ果た。一方で、これまでに遺伝子発現の抑制に働く修本研究ではまず、低グルコース環境下と高グル飾と考えられていたヒストン H4 の 20 番目のモノコース環境下で、細胞のヒストン修飾がどのようにメチル化修飾（H4K20me1）が、H3K9ac と同様に、変化するかを調べた（図 2）。その結果、遺伝子発現グルコース濃度が低下するとその修飾量が減少するの抑制マーカーであるヒストン H3 の 9 番目のトリことが分かった。しかしながら H4K20me1 は生体メチル化修飾（H3K9me3）にはグルコース濃度に内でどのような役割を持つのかは不明であった。

よる効果は認められなかったが、遺伝子発現活性化

そこで、H4K20me1 修飾がヒトゲノム中でどのよのマーカー、ヒストン H3 の 9 番目のアセチル化修

うな場所に局在するのかを調べた（図 3）。その結果、

図 2 グルコース環境におけるヒストン修飾の変化
ヒト細胞を高グルコース濃度（4g/L）で培養したのち、低グルコース濃度（1g/L）で一週間培養したときのヒストン修飾レベルを示す。各グラフの右側は高グルコース濃度、左は低グルコース濃度。H3K9ac（右）、H3K9me3（真ん中）、H4K20me1（左）。

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図 3 ヒトゲノムにおけるヒストン修飾の局在染色体 20 番 q11.21 からの 17mb を示した。上から H3K9me3（IMR90, GSM1528890）、H3K9ac（U87, GSM4796183）、H4K20me1（HeLa-S, GSM733689）および MCM3（本実験）の局在を示す。

図 4 MCM タンパク質とヒストン H4K20me1 修飾の局在
核染色のための Hoechst および複製期のマーカーである EdU と共に、MCM タンパク質と H4K20me1 修飾の共染色を行った。
MCM タンパク質が強く染まる細胞（黄色い矢印）では H4K20me1 はほとんど認められず、H4K20me1 が強く染まる細胞（白い矢印）では MCM タンパク質がほとんど認められない。Bar, 10µm。

メチル化修飾であることから遺伝子不活性領域に局まり重ならないことが分かった。免疫染色の輝度を在すると考えられていた H4K20me1 が、むしろ遺定量化してグラフ化したところ、図 5 の H4K20me1

伝子活性化マーカーである H3K9ac の局在に似ていの量が多い細胞（水色）では MCM タンパク質のることが分かった。さらにこれまでの研究から 、DNA 結合量は少なく、図 5 の MCM タンパク質のH4K20me1 は細胞周期において大きく変化すること

DNA 結合量が多い細胞（ピンク色）では H4K20me1から、細胞周期と関係する因子との関連を調べたとが低いという排他的な関係にあることが分かった。

こ ろ、 複 製 開 始 起 点 に 集 積 す る 複 製 開 始 複 合 体

さらに、ヒストン H4K20me1 から me2/me3 へのMCM タンパク質のゲノム領域への局在とも似ていメチル化転移酵素を欠損させると、MCM タンパクることを突き止めた（図 3）。

質が低いレベル（図 5 の MCM の水色のレベル）で1)

次に H4K20me1 と MCM タンパク質の関係を調停止してしまうことが分かった。つまり、ヒストンべるために免疫染色を行った。その結果、MCM タ

H4K20 メチル化修飾が複製期の開始に深く関与してンパク質と H4K20me1 の局在はほとんど一致しないることが明らかになった。

いことが分かった（図 4）。つまり、ゲノム領域においさらにこの結果と生化学的実験を比較したところ 2)、てはほぼ同じ領域に局在するものの、時期的にはあMCM 複合体は、G1 期の初期には DNA にひとつしヒト正常細胞の恒常性と変化を司る栄養源依存的な遺伝子発現制御機構―ヒストン H4K20me1 メチル化の役割と複製開始複合体 MCM タンパク質の制御

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図 5 排他的な MCM タンパク質とヒストン H4K20me1 修飾の局在
免疫染色の輝度をグラフ化するシングルセルプロット解析 1) を用いて、細胞周期における MCM タンパク質と H4K20me1 の輝度値が高い時期を調べた。ひとつひとつのドットはひとつの細胞の輝度値を示す。また、横軸 Hoechst の値が 1 では G1 期、2 ではG2/M 期、その中間は複製期を示す。ここでは特に G1 期の細胞（Hoechst=1）に着目し、H4K20me1 の高い細胞を水色、MCM の高い細胞をピンク色で示した。

か結合しておらず、複製期が始まる 3 ～ 4 時間前に謝辞なって初めて二つ目の MCM 複合体が DNA に結合す

本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公ることが分かった。また MCM タンパク質が DNA に益財団法人 浦上食品・食文化振興財団と財団関係者ひとつの状態で結合する時間の長さは、前の細胞周の皆様に深く感謝いたします。また、本研究に従事期の複製期から G2 期に細胞がどの程度栄養源などし、精力的に研究を推進してくださった大阪大学大を取り込むかに依存することが示唆された。すなわ学院生命機能研究科 平岡泰教授および平岡研究室のち、増殖中の細胞や癌細胞の場合は、複製期に栄養皆様に心より感謝いたします。

を十分に取り込むことで、ヒストン H4K20me1 修
飾が G2 期から分裂期に大きく上昇し G1 期には速参考文献

やかに減少し、MCM タンパク質のゲノム領域への

1) Hayashi-Takanaka et al., Histone modification dynamics
as revealed by multicolor immunofluorescence-based
single-cell analysis. J Cell Sci . 2020 Jul 15; 133(14):2) Hayashi-Takanaka et al., Chromatin loading of MCM
hexamers is associated with di-/tri-methylation ofhistone H4K20 toward S phase entry. bioRxiv, doi:
https://doi.org/10.1101/2021.05.14.443718

結合を促すと考えられた。

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The progression of MCM complex formation and histone H4K20
methylation levels mediates the cell proliferation-quiescencedecision in the G1 phase.
Yoko HAYASHI
Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University
Post-translational modifications of histones can be stable epigenetic marks
and transient signals that occur in response to internal and external stimuli.
Levels of histone modifications fluctuate during the cell cycle and vary acrossdifferent cell types. In this study, we analyzed the dynamics of histone H3 andH4 modifications under culture conditions, in the presence of high or low
g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s . T h e l e ve l s o f h i s t o n e H 4 K 2 0 m o n o m e t h y l a t i o n(H4K20me1), as well as active markers such as histone H3K9 acetylation,
decreased under low glucose concentration. Since H4K20me1 exhibits uniquebehavior during the cell cycle (Hayashi-Takanaka, et al ., JCS 2020), theaccumulation of H4K20me1 in the genome was compared with those ofproteins involved in cell cycle regulation. The genome localization of MCM
protein, which is one of the pre-replication complexes (pre-RC) and works as aDNA helicase during the S-phase, was quite similar to that of H4K20me1.
Immunostaining and biochemical analysis (Hayashi-Takanaka, et al ., bioRxiv2021) revealed that the levels of H4K20me1 changed in relat ion to theformation of MCM complexes, which act as a switch for cell proliferation. The
conversion of H4K20me1 to H4K20me2/me3 was required for MCM complexes
to funct ion as a DNA helicase, and appears to be an important factor indetermining S-phase progression. This finding will provide new insights into
the mechanisms through which cell proliferat ion is regulated by pre-RC
formation and histone modification.