JhWdiYh_fj_ed<WYjeh;B?I7i 転写因子の DNA 結合活性測定

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最も引用文献数の多い転写因子解析キット
TransAM™ は哺乳動物組織や細胞抽出物を用いて転写因子の DNA 結合活性を測定できる，高感度な ELISA ベースのアッセイ * です。スタンダードな TransAM™ Kit（比色法）はゲルシフトアッセイよりも 10 倍高感度です。TransAM™ Chemi Kit は化学発光を用いるためさらに高感度で，わずか 40ng の抽出物でも検出することができます（図 6，40 ページ参照）。TransAM™ を使用すると，ラジオアイソトープ不要で，5 時間以内に定量的な結果が得られます。また，ハイスループット対応です。
これまでの転写因子研究は主にゲルシフトアッセイ，ウエスタンブロッティング，レポーター遺伝子アッセイにより行われてきました。しかしいずれの手法も多大な時間を要し，半定量的な結果しか得ることができません。さらに，ハイスループット解析ができず，感度，特異性，再現性に問題があります。TransAM™ にはこのような欠点がないため，転写因子研究のスピードをあげ，より正確な結果が得られます。

転写因子
制御＊ TransAM™ は EAT からライセンシングを取得しています。研究目的用にのみ販売しております。他の目的でご使用の場合には，アクティブ・モティフ社までご連絡下さい。

TransAM™ の概略
TransAM™ Kit は転写因子活性化を迅速，高感度，定量的に測定す多様なレポータープラスミドトランスフェクションに起因する矛盾もなることができる革新的な手法を用いています。オリジナルキットにく， レポーター 遺 伝 子 安 定 発 現 株 の 構 築 の 必 要 もありません。

はコンセンサス結合部位を含むオリゴヌクレオチドが固定された 96TransAM™ は哺乳動物細胞や組織での転写因子活性化を高感度に検ウェルプレートが入っています。Flexi Kit（40 ページ参照）では，96出し，ハイスループット対応です。

ウェルプレートに研究者ご自身が自由にオリゴヌクレオチドを固定することができます。
96 ウェルプレートの各ウェルに細胞抽出物を添加すると，任意の転写TransAM™ の利点

因子がオリゴヌクレオチドと特異的に結合します。その後，目的の転● ゲルシフトアッセイよりも最大で 100 倍高感度です。

写因子に結合する一次抗体，HRP 標識二次抗体，発色試薬を順次加えて反応させ，比色定量または化学発光により高感度に検出します。
TransAM™ Kit は個々の転写因子や転写因子ファミリーなどさまざまな研究に有用です。TransAM™ はクローニング，トランスフェクション，ゲル電気泳動，ラジオアイソトープを使用する必要がありません。また，一次抗体を加える

核抽出物を加える● 5 時間以内に結果が得られます。
● ラジオアイソトープ不要で簡便に定量できます。
● クローニングやトランスフェクションの必要がありません。
● 組織試料も解析可能です● 96 ウェルフォーマットのため，ハイスループット対応です。

HRP 標識二次抗体を加える

発色試薬を加える

オリゴヌクレオチドが固定されたプレート（Flexi kit は任意のオリゴを固定可能）

活性型転写因子を含む
細胞抽出物の調製

図 1：TransAM™ 操作法
核抽出物に含まれる活性化された転写因子が 96 ウェルプレートに固定されたオリゴヌクレオチドと結合する。一次抗体，二次抗体を順次反応させ，活性化された転写因子を定量する。

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感度と正確性
転写因子レベルでは小さな変化でも，その変化は細胞機能では著しい影響を及ぼす可能性があります。そのため，転写因子活性の研究には，高感度の解析法を用いることが重要です。TransAM™ Kit はゲルシフ
トアッセイよりも 10 倍以上高感度で，定量的な結果が得られます。
例として，NFKB p50 の活性化を TransAM™ NFKB p50 および EMSAを使用して比較実験しました（図 2）。このデータから，TransAM™ Kit

転写因子
制御を使用すると，従来の EMSA のようなアッセイよりも高感度で定量的な結果が得られることが分かります。
さらに，TransAM™ Kit 実験の結果の直線性から，従来法よりも正確な測定が行うことができることが分かります。そのため，正確な結果を得るために複数の解析をする必要がありません。TransAM™ Kit の感度と正確性により，転写因子解析研究が飛躍的に改善されます。
図 2：TransAM™ Kit およびゲルシフトアッセイの感度比較

特異性の証明転写因子活性化を正確に解析するために，目的の転写因子のどのアイ

ヒト 線 維 芽 細 胞 W I -38 細 胞を I L-1A で 30 分 間 処 理した， それぞれの 細 胞 抽 出 物 量で，TransAM™ NFKB p50 Kit（A）とゲルシフトアッセイ（B）で解析した。TransAM™ はゲルシフト法よりも感受性が高く，定量的であることが分かる。

ソフォームが制御経路に関わるのかを特定することは重要です。すべての TransAM™ Kit は野生型もしくは変異型コンセンサス結合部位を含むオリゴヌクレオチド存在下で解析することにより，特異性が検証されています（図 3）。この競合実験により検出された転写因子が，TransAM™ Kit の 96 ウェルプレートに固定されたプローブと特異的に結合することが証明されています。また，キット中の抗体は類似するファミリーメンバーとの交差性も検証済のため，目的のアイソフォームのみを検出することができます。

TransAM™ Family Kit ーNFKB, AP1, STAT, GATA, HNF & MAPK
転写因子ファミリーは一般的にホモおよびヘテロダイマーサブユニッ
トの様々なグループで構成されます。そして細胞刺激や疾患状態により，細胞内でそれぞれ異なる制御を受けています。従って，細胞制御にどの転写因子ファミリーメンバーが関わっているかを解析することは大変有益な情報をもたらし，疾患のターゲットを同定するのに有用です。しかし，ゲルシフトアッセイやウエスタンブロッティング，レポーターアッセイを用いて全ての転写因子ファミリーを解析するに

図 3：TransAM™ Kit の特異性
野生型もしくは変異型コンセンサス結合部位を含むオリゴヌクレオチド存在下で，TransAM™を用いて解析した。IL-1A 処理 30 分 / 非処理のヒト線維芽細胞 WI-38 細胞から細胞抽出物を調製し，その細胞抽出物を 10μg/well 使用した（A）。TNF-A で 0 分間，10 分間，30 分間，2 時間処理した HeLa 細胞から細胞抽出物を調製し，その抽出液を 5μg/well 使用した（B）。

は，時間も費用もかかります。TransAM™ Family Kit はキットで 5 時間以内に様々な転写因子ファミリーメンバーを解析することができる画期的なキットです。NFKB（図 4），AP-1，STAT，GATA ファミリーのメンバーは共通のコンセンサス結合部位を共有するため，それぞれの TransAM™ FamilyKit の 96 ウェルプレートのウェルには単一のコンセンサス結合部位のオリゴヌクレオチドが固定されています。一方，
HNF および MAPK は共通のコンセンサス結合部位を共有しないため，これらの TransAM™ FamilyKit の 96 ウェルプレートには複数のオリゴヌクレオチド配列が固定されています。
図 4：種々の細胞株における NFKB の DNA への結合活性解析
TNF-A 処理 / 未処理の HeLa 細胞，TPA および calcium ionophore(CI) 処理 / 未処理の Jurkat 細胞，Raji 細胞の核抽出物を調製した。それぞれの核抽出物を 10μg/well 使用し，TransAM™ NFKBFamily Kit を用いて p65, p50, c-Rel, p52, RelB 活性を解析した。

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TransAM™ Flexi ーさまざまな DNA 配列への結合性を解析可能
オリジナルの TransAM™ フォーマットでは，簡便にコンセンサス部位における転写因子の結合を解析することができます。しかし，このフォーマッ
トは異なる結合部位に関する解析ができません。対照的に TransAM™
Flexi Kit はオリジナルフォーマットと同様，高品質の抗体，コントロールおよびバッファー類が含まれますが，様々なプロモーターまたは変異部位における目的転写因子の結合性を解析するのに適しています。
TransAM™ Flexi では，研究者ご自身でビオチン標識したオリゴヌクレ転写因子制
御オチドまたは転写因子結合部位を含む PCR 産物を合成します。刺激を与えた核抽出物に，このビオチン標識したオリゴヌクレオチドを混合し，ストレプトアビジンでコートされた 96 ウェルプレートに添加します。
目的の転写因子に特異的な一次抗体，二次抗体，発色試薬を順番に加え，比色法により簡便に測定します（図 5）。TransAM™ Flexi Kit は現在，NFKB p50，p65 および NFKB Family Kit をご用意しています。

TransAM™ Chemi Kit

図 5：異なる部位における NFKB p65 結合の解析

高感度な解析が必要な場合および試料の量が限られている場合には，TransAM™ Chemi Kit をお勧めします。化学発光検出では，40ng の細TNF-A 処理 / 非処理の HeLa 細胞の核抽出物を 5μg 使用して，NFKB と 4 種のビオチン標識した
50 塩基のオリゴヌクレオチドとの結合親和性をそれぞれ解析した。3 種のオリゴヌクレオチド (IgK,IL-8, uPA) は NFKB に制御されるプロモーターの野生型結合部位を含む配列である。これら 3 種とTransAM™ Flexi Kit に含まれるコンセンサス結合部位コントロールオリゴヌクレオチドとの結合親和性を比較した。

胞抽出物でも転写因子活性が測定できます（図 6A）。これは TransAM™
Chemi Kit がゲルシフトアッセイよりも 100 倍感度が高いためです。
TransAM™ Chemi Kit はまた，比色法よりも検出範囲が広く（図 6B），転写活性のわずかな変化でも検出することが可能です。この 2 つの特長を兼ね備えた TransAM™ Chemi Kit を用いれば，組織からの抽出物のような貴重な試料を無駄にすることがなく，複数の試料を保存する必要もありません。
TransAM™ Chemi Kit は比色法の TransAM™ Kit と同じプロトコルを使用します。ただし，Chemi Kit はマイクロプレートルミノメータもしくは，CCD カメラ付属の画像システムが必要となるため，発色試薬は異なります。また比色法を用いたキットとは異なり，化学発光シグナルは数時間以上安定なため，複数解析が可能です。

推奨される試料調製法
TransAM™ で最良の結果を得るために，別売りの Nuclear Extract Kit（65ページ参照）を使用して，核，細胞質，全細胞抽出物を調製することをお勧め致します。このキットには TransAM™で使用する試料の調製に最適な試薬が含まれています。Nuclear Extract Kit は細胞および組織試料のどちらにも使用できます。また Prostain™ Kit（66 ページ参照）を使用して細胞抽出物のタンパク質濃度を高感度に測定することができます。

図 6：TransAM™ NFKB p50 Chemi Kit の感度および検出範囲
TPA および calcium ionophore (CI) 処理 / 未処理の Jurkat 細胞の核抽出物を調製した。その抽出物を 0.005 〜 2.5μg/well 使用して TransAM™ NFKB p50 Chemi Kit により NFKB p50 活性を解析した。結果を棒グラフ (A) と薬剤未処理データを省いた両対数グラフ (B) で示した。

組換えタンパク質
転写因子活性の解析に使用できる組換え転写因子タンパク質を作製する使用した検量線と比較することにより，細胞試料中の転写因子レベルのことは困難です。アクティブ･モティフ社では，TransAM™ Kitでスタンダー定量が可能となります。現在，TransAM™ での使用に適している組換ドとして使用できる，機能的に活性のある組換えタンパク質を提供していえ タ ン パ ク 質 として，c-Fos，c-Jun，c-Myc，CREB，NFKB p50，ます。

NFKB p65，p53，Sp1 があります。全ての組換えタンパク質のリストはTransAM™ Kit とこれらのタンパク質を使用すると，組換えタンパク質をwww.activemotif.jp をご覧下さい。

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