山梨大学

生 命 環 境 学 域
生

命農学
写真貼付
カラー

氏名・職名

久本 雅嗣

キーワード

食品化学

ホームページ

http://www.les.yamanashi.ac.jp/modules/kenkyu/index.php?content_id=22

所属学会

日本農芸化学会、日本ブドウ・ワイン学会
American Society of Enology and Viticulture
アメリカ化学会、日本食品科学工学会、日本栄養・食糧学会

研究者から
一言

系

准教授

インタビュー
時写真撮影

食品（製品）の成分分析は特定の既知の化合物を定量分析する方法が主流です。しかしながら、製品に含まれる未知成分や想定外の成分が含まれるとき、またそれによる影響を総合的に捉えることは従来の方法では困難です。食品の品質やその評価に対する要求が高まる市場環境の中で、食品に含まれる成分による品質への影響や、製品間の差異や類似性を示している成分や要因を迅速に特定することが求められています。本研究では食品中の多くの成分を一度に網羅的に定性・定量分析し、その中から複数の試料群の差異や品質評価を行うツールとして、メタボローム解析を利用したUPLC-TOFMS（超高速液体クロマトグラフィー－飛行時間型質量分析装置）と多変量解析を組み合わせた食品の分析方法を提案します。

メタボローム解析を利用したUPLC-TOFMSと多変量解析を組み合わせた食品の分析方法
ピーク抽出・全ピーク情報のテーブル化

測定試料・条件
 2000～2009年に山梨大学ワイン科学研究センターで製造したカベルネ・ソー
ヴィニヨン (CS)とマスカット・ベリーA(MBA)のワインを使用
 UPLC-DAD-TOFMSによる測定はそれぞれのワインに内部標準としてgenisteinを2 mg/L加え、0.45 µmのPTFEフィルターで通液し、2009年から1年毎に3年測定した

UPLC条件
使用機器： ACQUITY UPLC®システム
カラム： ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 m, 2.1×100 mm, Waters)
移動相： 0.1％HCOOH-CH3CN gradient
流速： 0.2 mL/min
注入量： 5 L
カラム温度： 40℃
DAD部： 200-600 nm

TOFMS条件

CSワイン
Abs. 280 nm

TIC (Total Ion Current)
Positive mode

使用機器： Waters Micromass LCT PremierTM XE
イオン化： ESI Positive/Negative
検出レンジ： m/z 100-2000
キャピラリー電圧： 2800 V/pos, 2800 V/neg
コーン電圧： 60 V
スキャンタイム： 0.2 sec
リファレンス： Leucine Enkephalin 25 fmol/mL

データ処理はMassLynxTM XS
統計処理は MarkerLynxTM XS（ともにWaters）を使用

UPLCで高速分離し、TOFMSから高速フルスキャンで精密質量が一斉に取得
40分で赤ワイン中の10,000以上の検出ピークの精密質量と保持時間、並びに強度データをリスト化

ワインの熟成に重要なマーカーの探索

ＯＰＬＳ－ＤＡで検出した成分 （アントシアニン・ピラノアントシアニン）
No.

t R [min]123456789101112131415
16
17
18
19
20
21
22
23

15.01
15.05
18.30
19.20
20.80
21.56
22.98
24.60
24.98
25.22
25.48
27.07
27.61
29.28
29.40
30.16
31.10
31.20
31.56
32.06
32.83
33.00
33.72

Experimental Theoreticalm /z [M+H]+ m /z [M+H]+
625.1794
625.1769
655.1879
655.1874
463.1256
463.1240
493.1378
493.1346
531.1196
531.1139561.1255
561.1244
603.2546
603.1350
535.1451
535.1452
809.2389
809.2293801.2278
801.2242
771.2159
771.2136
707.1603
707.1612
655.1879
655.1663
639.1752
639.1714
805.2021
805.1980
625.1588
625.1557
677.1998
677.1506
805.2001
805.1980
609.1619
609.1608
639.1708
639.1714
651.1753
651.1714
771.1920
771.1925
755.2006
755.1976

Experimental fragment ionsm /z [M+H]+
301.0761
463.1274
331.0871
493.1395
301.0768
331.0853
369.0636
399.0777
399.0745
331.0856
493.1286
331.0883
331.0963
493.1363 639.1797
301.0756
463.1252 609.1602
399.0759
561.1466
331.0790
493.1187
331.0907
493.1494
643.1479
463.1177
301.0557
463.1098
643.1487
447.1134
477.1246
447.1121
463.0834447.1132
609.2082

FormulaC28H33O16
C29H35O17
C22H23O11
C23H25O12
C25H23O13
C26H25O14
C28H27O15
C25H27O13
C40H41O18
C38H41O19
C37H39O18
C35H31O16
C32H31O15
C32H31O14
C40H37O18
C31H29O14
C34H29O15
C40H37O18
C31H29O13
C32H31O14
C33H31O14
C40H35O16
C40H35O15

CompoundPn-3,5-diglc
Mv-3,5-diglc
Pn-3-glc
Mv-3-glc
A-type vitisin of Pn-3-glc
Vitisin A
A-type vitisin of Mv-3-(6-acetyl)-glc
Mv-3-(6-acetyl)glc
Mv-3-glc-Catechin ethylbridge
Mv-3-(6-p -coumaroyl)-glc-5-glc
Pn-3-(6-p -coumaroyl)-glc-5-glc
A-type vitisin of Mv-3-(6-p -coumaroyl)-glc
Mv-3-(6-caffeoyl)-glc
Mv-3-(6-p -coumaroyl)-glc
Mv-3-glc-4-vinylcatechin
Mv-3-glc-4-vinylcatecholPn-(6-p -coumaroyl)-glc
Mv-3-glc-4-vinylepicatechin
Mv-3-glc-4-vinylphenol
Mv-3-glc-4-vinylguaiacol
Mv-3-(6-acetyl)-glc-4-vinylphenol
Mv-3-(6-p -coumaroyl)-glc-4-vinylcatechol
Mv-3-(6-p -coumaroyl)-glc-4-vinylphenol

OPLS-DA (Orthogonal Partial Least Squares Discriminate analysis)
グループ間の分離に最も寄与した重要な成分候補

1年間瓶熟成したワイン

熟成前のワイン

高い信頼性
熟成前のワインに大きく寄与する成分

高い信頼性

Score Plot

1年間瓶熟成したワインに大きく寄与する成分

Loading plot (S-Plot)

実際に医薬分野においては疾患と関連した代謝成分（バイオマーカー）の探索、化学工業（有機材料）では競合製品の成分比較分析や品質要因分析に用いられています。その他に農作物の産地判別や品質判定など多岐にわたる分野で浸透しつつあり、食品に限らずいろいろな分野での利用が可能。

赤ワインに含まれる色素成分のメタボローム解析
Metabolomic Analysis of Pigments in Red Wines
ワインの赤色は、ブドウ果皮から溶出するアントシアニンに由来し、熟成するにつれて、アントシアニンが変化し、ワインの色調が赤色から赤褐色へ変化する発酵や熟成中での安定な色素体の量や生成過程については不明なところが多い。

熟成によって増える主要化合物
ピラノアントシアニン
OCH3OHHO 79O3O HO

45O

赤ワイン中の色素成分の経年変動を観測するため、2000年～2009年に山梨大学ワイン科学研究センターで製造したカベルネ・ソーヴィニヨン（CS)とマスカット・ベリーA(MBA)のワインを試験試料とし、メタボローム解析を利用したUPLC-TOFMSと多変量解析を組み合わせ分析した。

OCH3OHO

OCH3OH
HOOH
OH

COOH

O

OCH3OH

O HOO

O
COOH

Vitisin A of Mv-3g

O
O HO
O

OH
OH

O

Vitisin A Mv3-(6-p-coumaroyl)-g

OCH3OH
HOOH
O

OH

OCH3OHHO

OCH3OH
OH
O
OH

O
O HO
O

4-vinylcatechol-adduct of Mv3g

OCH3OHO

OH
OH

4-vinylphenol-adduct of Mv3g
OH

CS, MBAワインの経年変化
CSのアントシアニン量

MBAのアントシアニン量左 2009年測定中 2010年測定
右 2011年測定• ワインの熟成年数が経つにつれて、Polymerの占める割合が増えていく。
• Pyranoanthocyaninsの残存も確認された。

１年ごとに３年間、分光光学的パラメータ及び超高速液体クロマトグラフィー－飛行時間型質量分
析装置（UPLC-TOFMS）で測定を行った。UPLC-TOFMSで検出されたピークは、MarkerLynx
XSTM（Waters）を使用して、代謝プロファイリングを行い、熟成による赤ワインの色素成分の影響を解析した。
アントシアニン‐タンニン高分子複合体の分画色素重合体の中でも、ピラノアントシアワイン（CS‘01）
ODS カラムクロマトグラフィー
ニンはアルコール発酵中に生成し、熟Atrata C18-E (55µm、70A) 20g/60mL
0.1％ギ酸-アセトニトリル
成するとアントシアニン－タンニン高分・・・・子複合体が増えてくることがわかった。
50%アセトニトリル
0-30%アセトニトリル
溶出画分
特に熟成が進んだワインは、アントシア溶出画分
ニン－タンニン高分子複合体の占める40%アセトニトリル溶出画分割合が多かった。また、精製したアント
Toyopearl HW-40 カラム
55%エタノール水溶液で溶出
シアニン－タンニン高分子複合体は、赤褐色を呈していることから、この高分子モノマー色素画分複合体が熟成した赤ワインの色調に大60%アセトン水溶液で溶出ポリマーモノマーきく影響を及ぼしていることが考えられ色素画分
色素画分た。
ポリマー色素画分（CS 2002） (CS 2002)

シーズについてのお問合せ、ご相談先
Email: renkei-as@yamanashi.ac.jp
Tel：055-220-8758 Fax：055-220-8757