実験プロトコール 011
抗体固定化ビーズを使用した免疫沈降実験
1. 準備するもの
1.1 抗体固定化ビーズ、タンパク質溶液
・抗体固定化ビーズ
抗体(-)ビーズおよび抗体(+)ビーズ各0.1 mg
条件を検討する場合 (タンパク質濃度、結合・洗浄バッファー塩濃度、など) は、
0.1 mg×条件検討数
・タンパク質溶液
タンパク質濃度5～15 mg/mL (調製上無理な場合はこの限りではない。)
結合・洗浄バッファーにて希釈 (通常、タンパク質濃度1 mg/mL) して使用する。
必要量は200 µL×条件数
1.2 試薬・2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸 (HEPES)
・水酸化ナトリウム (NaOH) ・塩化カリウム (KCl)・塩化マグネシウム (MgCl2)
・塩化カルシウム (CaCl2)・エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) ・グリセロール (グリセリン)
・ノニデットP-40 (NP-40)
・フッ化フェニルメタンスルホニル (PMSF)
・ジメチルスルホキシド
・サンプルバッファー(4×dye)
・グリシン
・トリス (ヒドロキシメタル) アミノメタン (Tris)
・塩酸 (HCl)
・電気泳動 (SDS-PAGE) 用ゲル
・電気泳動用バッファー・銀染色試薬1.3 機器・微量高速冷却遠心分離機
・卓上遠心分離機（スピンダウン用）
・磁石スタンド (多摩川精機TAB4899N12など)
・ローテーター・ヒートブロック・スラブゲル電気泳動装置
2. 方法
2.1 試薬溶液調製
1) 2×150 mM KCl buffer (500 mL)：2.5 M KCl 60 mL、Glycerol 126 g、1 M HEPES-NaOH (pH 7.9) 20 mL、
1 M MgCl2 1 mL、1 M CaCl2 200 µL、0.5 M EDTA (pH 8.0) 400 µL、10%(w/v) NP-40 10 mLを混合し、超純水にて500 mLまでメスアップする。(フィルターろ過後、室温保存)
2) 150 mM KCl buffer：超純水 25 mL、2×150 mM KCl buffer 25 mLを混合する。
※使用前に1 M PMSFを10 µL添加する。
3) 1 M PMSF：PMSFをジメチルスルホキシドに溶かし、1 M溶液作製する。(-20℃保存)
結合・洗浄バッファー（150 mM KCl buffer）の組成
20 mM HEPES-NaOH (pH7.9), 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.2 mM CaCl2, 0.2 mM EDTA,10%(v/v) glycerol, 0.1%(w/v) NP-40, 0.2 mM PMSF
酸溶出バッファーの組成
0.1 M Glycine-HCl (pH 2.5)
中和用バッファーの組成
1 M Tris-HCl (pH 9.0)
4×dye溶液の組成 (和光純薬工業㈱：191-13272)
0.25 M Tris-HCl（pH 6.8）, 0.02% BPB, 8% SDS, 40% glycerol, 20% 2-メルカプトエタノール

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2.2 手順2.2.1 準備
1) 150 mM KCl buffer、0.1 M Glycine-HCl（pH 2.5）を準備し、氷上に置く。
2) 氷上にてタンパク質溶液を150 mM KCl bufferにて目的の濃度（1 mg/mL、3 mg/mL等）に調製する。
3) 1.5 mLマイクロチューブに分注し、遠心分離（15,000 rpm、4℃、30分以上）を行い不溶物を除く。
(遠心分離後のタンパク質溶液の上清を別のチューブへ回収する。)
4) 上記遠心分離中に、抗体固定化ビーズを1.5 mLマイクロチューブへ0.1 mg量りとる。
(ビーズは事前に十分に分散させておき、均一な懸濁液とする。)
5) 150 mM KCl bufferを200 µL加え、ビーズを分散させる。
6) スピンダウン後、磁気分離を行い、上清を廃棄する。(磁気分離は全て5分以上行う)
7) 5)～6)を更に2回繰り返す。（バッファーによるビーズの洗浄を計3回行う）
2.2.2 結合、洗浄
1) 上清を廃棄したビーズの入っている1.5 mLマイクロチューブへ遠心分離後のタンパク質溶液を200 µLずつ添加し、分散させる。
2) 4℃で、ローテーターにて攪拌しながら2時間結合反応を行う。
3) 2時間後、スピンダウンし、磁気分離を行い、上清を廃棄する。
4) 150 mM KCl bufferを200 µL加え、ビーズを分散させる。
5) スピンダウン後、磁気分離を行い、上清を廃棄する。
6) 4)～5)を更に2回繰り返す。(バッファーによるビーズの洗浄を計3回行う)
2.2.3 溶出2.2.3.1 酸溶出する場合
1) 上清を廃棄したビーズへ、0.1 M Glycine-HCl (pH 2.5) を28 µL加え、分散させる。
2) 氷上に5分静置にて溶出させ、スピンダウン後、磁気分離を行う。
3) 上清（酸溶出サンプル）を別の1.5 mLマイクロチューブへ回収する。(ビーズは廃棄する)
4) 酸溶出サンプルに中和用バッファー2 µLを加え中和する。
5) 4×dye溶液を10 µL加え、混合する。
6) 98℃にて5分間加熱を行う。(ヒートブロックを使用する)
2.2.3.2 加熱溶出する場合
1) 上清を廃棄したビーズへ1×dye溶液を40 µL加え、分散させる。
2) 98℃にて5分間加熱を行う。(ヒートブロックを使用する）)
3) ビーズ分散液をスピンダウンし、室温で磁気分離を行う。
4) 上清 (加熱溶出サンプル) を別の1.5 mLマイクロチューブへ回収する。(ビーズは廃棄する)
2.2.4 タンパク質の分析
1) 電気泳動（SDS-PAGE）へ進む。(または-20℃冷凍庫にて保存する)
2) 溶出サンプルをそれぞれ電気泳動（SDS-PAGE）する。（例：各10 µL）。
3) 泳動後のゲルを銀染色し、結果を解析する。
3. 捕足・ビーズの分散は、ガリガリ法にて行うと容易に分散できる。（この際、チューブの蓋が開かないようにキャップロックを用いることが望ましい。）（FGビーズのホームページ：http://fgb.tamagawa-seiki.com/technique/affinity.html に動画あり）

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・磁気分離は、氷上に・磁気分離は、氷上に磁石スタンドを置いて行スタンドを置いて行スタンドを置いて行う。

磁気分離前

磁気分離後

磁石スタンド・タンパク質溶液はタンパク質溶液はタンパク質溶液はDignam法にて調製した細胞質画分法にて調製した細胞質画分 (または核画分または核画分、膜画分)、膜画分) を使用することを推奨を使用することを推奨するする。(参考文献：
参考文献：J.D.Dignam,
J.D.Dignam, R.M.Lebovitz, and R.G.Roeder, Nucleic Acids Res
Res. 11, 1475 (19831983))
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但し、
但し、Dignam法は細胞数が非常に多く法は細胞数が非常に多く（法は細胞数が非常に多く（>10 Cells））必要となる。
。小スケールで実施の場合は、小スケールで実施の場合は、NP-40
小スケールで実施の場合は、 40
lysis
lysis法、市販の細胞抽出液調製試薬も法、市販の細胞抽出液調製試薬も使用可能
法、市販の細胞抽出液調製試薬も使用可能。
4. 注意事項
・ビーズへ混合する前の細胞抽出液の遠心分離は必ず行
・ビーズへ混合する前の細胞抽出液の遠心分離は必ず行う。遠心分離を行わないと、凍結融解等により。遠心分離を行わないと、凍結融解等により生じた不溶性画分が生じた不溶性画分が系中に残存残存し、バックグラウンドの原因とし、バックグラウンドの原因となるし、バックグラウンドの原因となる。
・ビーズは遠心分離でなく、磁気分離で回収・ビーズは遠心分離でなく、磁気分離で回収する。遠心分離を行うと、反応中に生じたタンパク質の不。遠心分離を行うと、反応中に生じたタンパク質の不溶性画分も溶性画分もビーズとビーズと一緒に回収し一緒に回収してしまいてしまい、バックグラウンドの原因となる、バックグラウンドの原因となる。
、バックグラウンドの原因となる。
・洗浄、溶出等で洗浄、溶出等でビーズを分散させる際は塊が無いことを確認
ビーズを分散させる際は塊が無いことを確認
ビーズを分散させる際は塊が無いことを確認するする。確実に分散していないと。確実に分散していないと洗浄が不。確実に分散していないと洗浄が不十分となり、十分となり、非特異的なバンドが非特異的なバンドが出現しやすくな非特異的なバンドが出現しやすくなる。
。
・ケラチンのコンタミ・ケラチンのコンタミを防ぐため、手袋を着用して実験を行を防ぐため、手袋を着用して実験を行を防ぐため、手袋を着用して実験を行う。
5. 製品情報
下記製品
下記製品をご使用頂くとバッファー調製の手間を削減できます。
をご使用頂くとバッファー調製の手間を削減できます。
製品名容量型式
IP Buffer Kit
1KitTAB1200N0320
150 mM KCl buffer, PMSF(-)
PMSF( 1)75 mL
0.1 M Glycine-HCl
Glycine HCl (pH2.5)
1.5 mL1 M Tris--HCl （pHpH 9.0）
9.0
0.1 mLm1)
150 mM KCl buffer, PMSF (-)(100 mL
TAB1200N0321
0.1 M Glycine
Glycine-HCl
HCl (pH2.5)
100 mLTAB1200N0322
1 M Tris
Tris-HCl
HCl （pH 9.0）
100 mLTAB1200N0323
1 M HEPES
HEPES-NaOH
NaOH (pH7.9)
50 mL
TAB1200N0911
2.5 M KCl
100 mLTAB1200N0912
1 M MgCl2
100 mLTAB1200N0913
1 M CaCl2100 mL
TAB1200N0914
10%(w/v) NP
NP--40100 mLTAB1200N0915
1)使用時に、最終濃度が使用時に、最終濃度が使用時に、最終濃度が0.2mMとなるようにとなるようにPMSF
PMSFを添加してください。
を添加してください。

以上

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