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〈総THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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139（ 17 ）説〉―住木・梅澤記念賞受賞後の研究―

ゲノム情報を活用した次世代物質生産系の開発
池田治生
北里大学
（2021 年 1 月 27 日受付）

Streptomyces avermitilis が生産する avermectin はヒトならびに動物の駆虫薬として広く利用されている。20 世紀末に avermectin 生合成遺伝子群の配列解析を完了した
後，生産菌のゲノム解析を行う機会を得た。Streptomyces 属の放線菌は多種多様な生物活性を有する 2 次代謝産物を生産する微生物として，また主要な医薬品などの生産菌として産業上極めて重要な微生物であるため，そのゲノム解析結果は多くの情報が得られるものと期待された。S. avermitilis のゲノムは原核細胞生物の中では極めて大きいこと（9,025,608 塩基対，7,574 の遺伝子），さらに原核細胞生物にもかかわらずその染色体は真核細胞生物と同じ線状構造である。また，ゲノム上には当初の予想を越える数の 2 次代謝産物の生合成遺伝子群（少なくとも 30 種以上）が配置していることが明らかとなったが，これらの多くは休眠状態であった。ゲノム上のそれぞれの遺伝子産物の推定される機能および配置から生育などの必須な遺伝子は線状染色体の中央のおよそ 6.5 Mb の領域に配置しており，染色体の両末端には非必須遺伝子（2 次代謝物質生合成遺伝子群を含む）が配置していることが明らかとなった。本菌はavermectin の工業的な生産菌として利用されており，物質生産のための本質的な機能を有している生物と考えられるため，本菌の物質生成能力を利用した異種の 2 次代謝産物生合成遺伝子群の発現系を構築することを計画した。この目的のため，内在性の主生産物の生合成遺伝子群の除去はもちろんのこと染色体両末端の非必須領域を欠失および編集を行い，野生株のゲノムのおよそ 80% の大きさの組換え株を作製した（S. avermitilis SUKA; Special Use Kitasato Actinomycetales）。得られたゲノム縮小株を用いてこれまで 40 種以上の異種 2 次代謝産物生合成遺伝子群の導入ならびに発現に成功した。多くの場合物質生産が認められ，さらにはそれらの生産量は元株の生産菌よりも多い場合が複数観察された。また，休眠状態の生合成遺伝子群を上記のゲノム縮小株に導入させることによって導入した遺伝子群が覚醒し，物質生産が開始した例も数例確認された。一方，放線菌を含む原核細胞生物からは植物で見出されるテ
ルペン化合物の生産は極めて少ないが，生物情報学的なテルペン合成酵素の解析によって，公的データーベースの原核細胞生物起原から多くのテルペン合成酵素の候補を見出し，最終的に上記のゲノム縮小株を用いて強制的に発現させ，13 種の新規

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な骨格を有するテルペン化合物を発見するに至った。このように上記のゲノム縮小
株は異種 2 次代謝生合成遺伝子群の発現に極めて有用であることが確認されたため，リボソーム翻訳系翻訳後修飾ペプチド（RiPPs）化合物である prethioviridamide についてその生合成遺伝子の編集によって 35 種のアミノ酸置換型誘導体の創製法を開発した。得られたアミノ酸置換体のいくつかは元の化合物よりも生物活性が上昇していた。一方，多様な生物活性を有する大環状ラクトン化合物の生合成遺伝子群はポリケチド合成酵素遺伝子を含むため 60 kbp あるいはそれ以上の大きさからなるものが多い。我々はこのような巨大な生合成遺伝子群を上記のゲノム縮小株に安定に導入
および発現させる系を開発した。この系を用いて rapamycin のポリケチド合成酵素遺伝子の編集を行い，種々の非天然型の誘導体を生産させることに成功した。このように上記のゲノム縮小株を用いた異種発現系は，非天然型の誘導体を創製する新たな革新的技術として有用であることが確認されるとともに今後の創薬展開にも多いに期待されるものと思われる。

住木・梅澤記念賞が授与された。特にその当時ははじめに極めて困難かつ，世界でも数例しか達成されておらず，本邦では 1 例も報告がなかったポリケチド

1980 年代までの抗寄生虫薬のほとんどは合成化合物の生合成遺伝子群の全長約 85 kbp（Fig. 2）

薬を中心に展開されていたが，それらの毒性や抗を決定 10–12）できたことは，その後の生合成研究に

寄生虫スペクトルの狭さなど，解決しなければな

とっても大きな成果であったとともにこの研究領らない問題点が多く残されていた。1970 年代の後域の活性化に多いに貢献できたものと思われる。

半に報告された微生物代謝産物である avermectin

これまでの生化学的な研究方法ではポリケチド化（Fig. 1）の発見

は，その優れた抗寄生虫活性の合物の骨格形成の基本的な機構を理解することはみならず広い抗寄生虫スペクトルおよび毒性の低極めて困難であったが，生合成遺伝子を直接解読さなど，それまでには達成できなかった弱点を解し，その配列からそれぞれの生合成酵素のアミノ決する画期的な抗寄生虫薬の出現であった。この

酸配列，さらに機能ドメインの解析からポリケチ

ことは発見から 40 年近くを過ぎた 2015 年に大村

ド骨格の炭素鎖伸長過程を詳細に理解することが智博士が avermectin の発見とその効果の絶大性かできるようになった。このように生物の設計図でらノーベル生理学・医学賞の受賞に至ったことかある遺伝子配列を解読することは多くの情報をもらも理解できる。さらに現在，世界的な感染が危たらすとともに，その設計図に人為的な改変を加惧されている COVID-19 ウイルスの複製過程にえることによって戦略的な構造改変への途が開か

avermectin が有効であることが示されており，今れるものと期待される。

1）

後の展開が期待されている。1980 年代の後半から
著者は avermectin の生合成の研究，特に遺伝学的Streptomyces 属放線菌のゲノム解析とそれらの成な方法によってその生合成の全貌

2）果から有効な成分の選択的な生産

3–12）

に至る一連

Avermectin の 生 合 成 お よ び そ の 生 合 成 に 関 与の研究を行い，それらの成果に対し，2000 年度の

す る 遺 伝 子 解 析 10–12）の 後，生 産 菌 StreptomycesJune 2021

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141（ 19 ）Fig. 1. Avermectin 生産菌 Streptomyces avermitilis sp. nov. nom. rev. の走査型電子顕微鏡写真とavermectin の構造

Fig. 2. Avermctin 生合成遺伝子群の物理地図

制御遺伝子（橙），ポリケチド合成酵素遺伝子（赤），ポリケチド修飾酵素遺伝子（青），配糖化および糖生合成遺伝子（緑）。

avermitilis MA-4680 （ATCC 31267, NRRL 8165,

極限環境で生育する微生物のゲノム解析が報告さ

NCBI 12804 および JCM 5070）のゲノム解析のチャれはじめた頃であり，工業生産に供されている産ンスを得ることができた。その当時は病原細菌や業微生物ゲノムの解析は達成されておらず，その142（ 20 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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解析は応用のみならず物質生産に関する基礎的な定することができた 14）。しかしながら配列間の背景を知る上でも重要であった。なお大腸菌や枯ギャップ（数 10 〜 100 塩基程度）がまだあり，これ草菌などの一般細菌のゲノムと比べ Streptomyces

らを別の方法によって地道に解読し，最終的に 1 本属の放線菌はそれらの 2 倍程度の大きさであり，かの配列データーとすることができた 15）。配列が解読

つ高 GC 含量であるため通常の配列解析方法ではできてもその配列上にどのような遺伝子が存在する

解析しにくいゲノムであった。したがって，これまかといった機能予測（アノテーション作業）をしな

でこのような配列解析が しにくくかつ，巨大なけ れ ば な ら な い。現 在 の よ う に 米 国 の National

ゲ ノ ム 解 析 は 達 成 さ れ て い な か っ た こ と か ら， Center for Biotechnology Information （NCBI） の多くの困難さが予想されていた。初期のゲノム解Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）解析が析（ヒトなども）はゲノムの断片を cosmid や BAC

充実しているわけではなく，また，読み枠フレーム（Bacterial Artiﬁcial Chromosome）ベクターに連結の 翻 訳 開 始 点 の 判 断 も 十 分 で は な か っ た が，し，それらの中から隣り合った整列クローンを選

9,025,608 bp の線状染色体に 7,582 個のタンパク質

択し，それぞれのクローンを個々に配列解析を

コード領域が配置していることを明らかにした

行 っ て い く 方 法 で あ っ た。一 方，米 国 J. Craig （Fig. 3）。大 腸 菌 や 枯 草 菌 の ゲ ノ ム は お よ そ 4.6

Venter は 20 世 紀 の 後 半 に Haemophilus inﬂuenzae

Mbp の 環 状 染 色 体 に 4,000 個 程 度 の タ ン パ ク 質

Rd のおよそ 1.7 Mbp のゲノム解析を，上記の整列

コード領域が見出されており，これらの一般細菌

クローンを作製せずに，染色体 DNA を物理的にと比べても非常に大きなゲノムを有することが1〜2 kbp の断片に分断化したクローンを整列せず判った。7,582 個のタンパク質コード領域の多くのにランダムに配列を読み取り，その結果をコン

ものは ABC transporter などの細胞内外の物質輸送

ピ ュ ー タ ー で つ な ぎ 合 わ せ る，と い う “shotgunに関わるもの，あるいは遺伝子発現制御に関わる

sequencing” の方法で解読を成功させていた 13）。当

制御タンパク質，さらには分泌型の分解酵素が多（2）の時，我々よりも先行していた S. coelicolor A3

く見出された。Streptomyces 属の生育環境である土ゲノム解析は一般的な方法である「整列クローンを壌中を考慮すると，多様な環境下に即座に対応す

選別し，選別されたクローンを一つ一つ配列解析

ること。また，多様な栄養条件下での生育をサポーする」方法で進行していた。我々は種々の情報を精トさせるため栄養源となる高分子化合物（多糖類や査し，その当時は達成されていなかった 9 Mbp 程タンパク質など）の分解能力など，過酷な環境での度の大きな配列解析を，Venter らが行った “shotgun

生育を達成するためにこのような遺伝子を獲得及

sequencing” の方法で挑戦することにした。当時のび 増 加 さ せ て い っ た も の と 推 察 さ れ る。一 方，最新の塩基配列解析装置は 96 キャピラリーシーク

Streptomyces 属の放線菌は複雑な形態分化や多様なエンサーであったが，S. avermitilis の 9 Mbp のゲノ

環境での生育を可能にしているだけでなく，特にムの大きさのおよそ 10 倍量の配列を読む作業に抗生物質をはじめとする複雑かつ多様な 2 次代謝

6 ヶ月程度の月日を要した。前述した整列クローン

産物を生産することが知られており，いくつかのを用いる配列解析では，解析途中から部分的な配列

代謝産物は医薬，動物薬あるいは農薬として利用

情報が正確に得られたが，shotgun sequencing ではされているものも少なくない。我々がゲノム解析

最終段階に差しかからないと正確な配列情報が得らを行った S. avermitilis は抗寄生虫および抗昆虫活（2）のれない。そして先行していた S. coelicolor A3性を有する avermectin の工業的な生産菌として医ゲノム解析よりも早く，ゲノム配列の 99% 以上を決薬品製造に現在も使われている。これまで，漠然とJune 2021

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143（ 21 ）Fig. 3. Streptomyces avermitilis の線状染色体の構造（i）線状染色体の AseI 物理地図，（ii）タンパク質をコードする遺伝子（転写方向：上が +strand，下が−strand），（iii）2 次代謝産物生合成（v）rRNA オペロン，（vi）IS および transposase，（vii）phage あるいは integrated plasmid，（viii）GC % 含量（5遺伝子群，（iv）tRNA，
kb window），（ix）GC skew（50 kb window）。

Streptomyces 属放線菌は抗生物質を生産する能力がerythromycin の 生 産 菌 Saccharopolyspora erythraea

長けているものと思われていた。また，多くの場合

NRRL 2338 のゲノム解析 19）が報告され，これらの1 菌株からは数個の 2 次代謝産物の生産が見出され菌株にも 30 を越える生合成遺伝子群を保有していることが多いため，それらの生合成遺伝子群も数ることが明らかとなった 16）。「Streptomyces 属を初個程度であろうと推察されていた。タンパク質をめとする放線菌が何故，多くの抗生物質を含む 2 次

コードする遺伝子の機能予測を進めて行く上で，2代謝産物を生産することができるか？」といった問

次代謝産物の生合成遺伝子群を詳細に解析したといに対して，「これらの菌株が極めて多くの 2 次代ころ，予想を遙かに超える数の生合成遺伝子群が謝産物生合成遺伝子群を保有している」ということ見出された。当初は 25 数個の生合成遺伝子群と推が 1 つの回答であるかもしれない。それではこのよ

定していたが，その後の解析によって現在では少うに多くの生合成遺伝子群が見出されるが，多くなくとも 38 個の生合成遺伝子群が存在することの場合検出される代謝産物は数個程度であるのは（Table 1），さらに今後様々な遺伝子産物の新たな何故なのか？ 培養条件は極めて重要であること機能の発見などからさらに増加するものと思われは経験上理解されていた。実際に S. avermitilis では（2）とのゲる 16）。解析当初は本菌と S. coelicolor A3

様々な培地で oligomycin の生産は観察されるが，ノム解析 17）だけであったため，他の Streptomyces 属

avermectin の生産は特定の培地条件でのみ観察さおよび放線菌ではどの程度の数の生合成遺伝子群れることが知られている。培養条件の特異性としを保有しているのかは不明であったが，S. coelicolorては鉄のキレーターとして知られている

A3（2）でも 25 個の生合成遺伝子群の存在が推定

siderophore の生産も鉄イオンに影響を受ける。S.

されていたことから，Streptomyces 属を含む放線

avermitilis のゲノム解析から nocardamine の生合成菌では，我々の予想を上回る生合成遺伝子群が染色遺伝子群の存在を推定することができたが，それ。その体に配置しているものと推察された（Fig. 4）まで本菌からの nocardamine の生産は知られていな

後， streptomycin 生産菌 S. griseus IFO 1355018） やかった。鉄イオンを制限した合成培地で培養した

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Table 1. S. avermitilis 染色体上に配置している 2 次代謝産物生合成遺伝子群（推定を含む）

ところ nocardamine の生産が確認されるとともにそ （および hydroxyectoien）の生合成遺伝子群の存在の生産は鉄イオンの添加によって抑制されることがも推定された。通常の培養条件では nocardamine と。さらにゲノム解析から適合溶質として浸同様に生産は観察されないが，高塩濃度あるいは

透圧ストレスなどから生体を保護する物質，ectoine

高濃度のショ糖存在の高浸透圧下で ectoine の蓄積

判った

20）

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145（ 23 ）Fig. 4. Streptomyces 属の線状染色体の比較解析および 2 代謝産物生合成遺伝子群の分布

上：S. coelicolor A3（2），中：avermectin 生産菌 S. avermitilis MA-4680，下：streptomycin 生産菌 S. griseus IFO 13350。

が 観 察 さ れ た 21）。一 方，S. avermitilis の 新 規 なされたものと思われる。また，もう一つの新規なsesquiterpene 化合物である neopentalenoketolactone

sesquiterpene 化合物である avermitilone と avermitilol

は avermectinおよびoligomycin の生合成遺伝子群をの生産に関してはその生合成遺伝子がいかなる条件。これでも全く発現しておらず，強制的に発現できるようプはおそらく avermectin や oligomycin の生合成に前駆ロモーターを入れ換えることによって上記の新規化物質が使われていたが，それら代謝が停止したこ

合物の生産が観察された 23）。この場合は生合成遺伝とで前駆物質が sesquiterpene 化合物の生産に供給

子が休眠状態であると結論できる。その他にも epi-

欠失させた変異株でのみ蓄積が観察される

22）

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Fig. 5. S. avermitilis の生産する 2 次代謝産物

赤で示した代謝産物は新規化合物。Albaﬂavenols, albaﬂavenone, 4β,5β-epoxy-2-epi-zizaan-6β-ol, avermitilol と avermitilone は強制発現
プロモーターによって生合成遺伝子を発現させて生成させた。Tetrahydroxynaphthalene は遺伝子増量効果によって蓄積した。

isozizaene 関連化合物 24）や tetrahydroxylnaphthalene21）

物を生産する生物学的な意義に関しては不明なとなどの生合成遺伝子も休眠状態であることを確認ころが多い。Nocardamine や ectoine のような特定することができた。このように S. avermitilis には非環境下で鉄キレーターとして，あるいは適合溶質

常に多くの 2 次代謝産物生合成遺伝子群が存在すとして機能する物質はそれぞれの目的をもって利るにも関わらず，それらの多くは休眠状態である

用されることからもその生成機構は理解できることが判った（Fig. 5）。このことは他のゲノム解析

が，その他の多くの 2 次代謝産物の生成の意義は（2）や S. griseus IFO13350が行われた S. coelicolor A3

今もって不明である。また，多くの生合成遺伝子でも同様であり（Fig. 4），Streptomyces 属放線菌群を保有することやそれらの多くが休眠状態であでは極めて多くの 2 次代謝産物生合成遺伝子群をることも，その生物学的な意義は今後の研究を待保有するにも関わらず，それらの多くは休眠状態

たなければならない。

であることが再確認された。微生物が 2 次代謝産

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147（ 25 ）ン パ ク 質 と 推 定 さ れ る ortholog が 見 出 さ れ る。

新たな低分子遺伝子発現調節物質の発見

ArpA や BarA に最も相同な結合タンパク質と推定される ORF（AvaR1）をコードする遺伝子の上ゲノム解析の結果は多くの情報をもたらすもの

流には S. griseus や S. virginiae には見出されないである。ゲノム上に配置された遺伝子の産物，即

acyl-CoA oxidase をコードする遺伝子が隣接してちタンパク質の相同性解析や機能予測から作業仮

配 置 し て お り，そ の 遺 伝 子（aco）の 破 壊 は説を構築することが可能である。この場合，あくavermectin の生成の低下を引き起こすこと，さらまでも仮説であるので最終的には実験科学的な証にこの状態に S. avermitilis の野生株の培養物の酢明を行わなければならない。2 次代謝産物の生成

酸エチル抽出物を添加すると avermectin の生成が過程に関する制御機構は未だ不明な点が多い。 回 復 す る こ と が 観 察 さ れ た。ま た，組 み 換 え

S. avermitilis の ゲ ノ ム 解 析 に よ っ て 得 ら れ た

AvaR1 タンパク質と avaR1 の上流領域の配列を含作業仮説から，新たな低分子遺伝子調節物質のむオリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセ

発 見 に つ な が っ た 成 果 を 述 べ る。 S. griseus の

イでは AvaR1 がオリゴヌクレオチドと強固に結合

streptomycin の生成過程では，生合成遺伝子群のし，その結合は野生株の培養液の酢酸エチル抽出

個々の遺伝子の発現は遺伝子群内の調節遺伝子に物を添加によって解離することが観察されていよって制御されているが，その調節遺伝子の発現た。このことは avermectin の生成過程に低分子遺をさらなる上位の制御系によって支配されてい伝子調節物質が関与していることを示唆するものる。その上位の制御遺伝子の発現の引き金が低分であった。一般にγ-butyrolactone 構造は塩基性条件

子遺伝子発現調節物質（A-factor）によって誘導下ではラクトン部分の加水分解を生じることが知。A-factor はられている。実際に A-factor や virginiae butanolide

nM 程度の濃度で，それに特異的なタンパク質を塩基性下で処理すると，その遺伝子発現の調節（ArpA）に結合し，以降の制御遺伝子の転写を活効果が消失する。一方，S. avermitilis の酢酸エチ

性化し，最終的に streptomycin 生合成遺伝子群のル抽出物はγ-butyrolactone とは異なり，塩基性下制御遺伝子の発現を促し，さらに生合成遺伝子のでもその遺伝子発現調節活性は失われない。した転写により生成された生合成酵素複合体ががって，S. avermitilis が生成する低分子遺伝子発streptomycin を生成する。このような機構は他の現調節物質はこれまで報告されたγ-butyrolactone

Streptomyces 属 で も 観 察 さ れ， S. virginiae の構造とは異なる物質であることが示唆された。そvirginiamycin 生成における virginiae butanolideやこ で 上 記 の ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ に よ っ て S.

S. lavendulae の青色色素（indigoidine）生成におけavermitilis の野生株の培養液（1,000 L）から目的のる IM-2 等のγ-butyrolactone 構造を有する低分子遺低分子遺伝子発現調節物質の単離を試みた。培養

伝子調節物質が関与していることが報告されてい液を HP-20 に吸着，溶出，有機溶媒による分別抽。これらはそれぞれに特異的に結合する結合

出，シリカゲルによるクロマトグラフィー，そしてタンパク質（BarA あるいは FarA）を介して遺伝子最終的に逆相分取 HPLC を 2 回繰り返すことで，お制御が行われる。したがって，これらの菌にはよそ 1.2 mg の目的物質を単離することができた 28）。

γ-butyrolactone 合成酵素と結合タンパク質の遺伝

各種スペクトルデーターから平面構造を推定する子を保有しているものと推察される。S. avermitilis

こ と が で き avenolide と 命 名 し た。Avenolide はγのゲノム上にはいくつかのγ-butyrolactone 結合タbutyrolactone 骨格ではなく，全く新規な butenolide

されることが明らかにされている

25）

26）

る

27）

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Fig. 6. Avenolide の 1H および 13C NMR による構造解析

赤両矢印で示した C-11 と C-13 の間の cross peak が観察されたこと，また青矢印で示した HMBC が観察されないことから 1 の構造が強く示唆された。

構造を有する化合物であった（Fig. 6）。平面構造

よって avermectin の生成は完全に回復した 28）。

には 2 箇所の不斉点（4, 10 位）があり，立体構造を確認することはできなかった。そこで，これらの立体化合物をすべて全合成することとした。な

異種発現系による 2 次代謝産物の生成系の開発お，butenolide 部分の 4 位の立体はこの部分の合成品の CD スペクトルを比較することによって 4S

S. avermitilis のゲノム解析の後，本菌のゲノムであることが明らかとなったが結合活性の比較を

情報をいかに有効に利用することは重要な課題で兼ねて 3 種（4S-10R, 4S-10S, 4R-10R）の化合物をある。休眠状態の 2 次代謝産物生合成遺伝子群を合成した。最終合成品をキラルカラムで分析した

人為的に強制発現させることによって新規な化合ところ 4S,10R 体が培養液から単離した avenolide

物の蓄積が期待できる。また，特定の 2 次代謝産と一致した

物生合成遺伝子群の各遺伝子の解析などを行う上。それぞれの立体は結合活性に非常

29）に 重 要 で， 4S,10S 体 は 4S,10R 体 の 50% 程 度， でも，異種発現が達成できる系は非常に有用であ

4R,10R 体では 4% 程度に低下した。このように極ると考えられる。これらの解析には遺伝子の導入

めて正確な立体構造を認識して AvaR1 タンパク質や遺伝子破壊などの分子遺伝学的な方法が必須で。なと結合していることが明らかとなった（Fig. 7）

あるが，多くの微生物は大腸菌や枯草菌のようにお，合成品の 4S,10R 体を S. avermitilis の aco 欠失

効率良く DNA を導入することが可能ではない。

株に添加培養（最小有効濃度 4 nM）することにStreptomyces 属のいくつかの種では DNA の導入

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149（ 27 ）Fig. 7. Avenolide の立体異性体および関連誘導体の組み換え AvaR1 結合タンパク質との結合の比較

SCB1 は S. coelicolor A3（2）の生産する低分子遺伝子発現調節物質。

すら出来ないことが多々ある。幸いなことに S.

る。したがって，異種発現系では宿主の内在性のavermitilis は遺伝子の導入や遺伝子破壊などの分2 次代謝産物生合成遺伝子群を欠失させて代謝産

子遺伝学的解析が可能な数少ない Streptomyces 属物の生成を停止させ，外来性の異種生合成遺伝子

放線菌の一つである。また，異種の 2 次代謝産物

群によって転写・翻訳されて生成する生合成酵素

生合成遺伝子群を発現させるとき，内在性の 2 次によって効率よく前駆体が利用されることが望ま

代謝産物が同時に生成されるような場合，前駆物

しい（Fig. 8）。S. avermitilis のゲノム上の各遺伝質の競合や生産物の解析のための分離など不都合

子にコードされているタンパク質の機能予測の解が生じることが懸念される。実際に，S. avermitilis

析から，ゲノムの左末端からおよそ 2 Mbp から右の 内 在 性 の ポ リ ケ チ ド 化 合 物 の avermectin と末端からおよそ 0.5 Mbp までの約 6.5 Mbp の領域

oligomycin の生産は，avermectin が生産される条は他の Streptomyces 属の放線菌のゲノムと非常に件では少量の oligomycin の蓄積が観察される。こ相同性が高く，かつ複製，転写，翻訳や 1 次代謝の条件下，avermectin の生成を停止させるようなに関与する遺伝子がすべてこの 6.5 Mbp のコア領

欠失変異株では oligomcyin の蓄積が 25 倍以上も域に配置していることが確認された（Fig. 4）。一上昇する。これは，avermectin 生合成に利用され方，2 次代謝産物生合成遺伝子群の半数以上は上ていた前駆物質（malonyl-CoA や methylmalonyl-

記のゲノムの左末端から 2 Mbp および右末端かCoA な ど の ポ リ ケ チ ド 化 合 物 の 前 駆 物 質）が

ら 0.5 Mbp の領域に配置していることが確認され

avermectin の生合成が停止したため，それらがるとともに，この領域には多くの転移因子も存在

oligomycin 生合成に流れていったものと推察されしていることが明らかとなった。即ち，この領域150（ 28 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Fig. 8. 最適な異種 2 次代謝産物生合成遺伝子群発現および代謝産物の生産

は水平伝播によって色々な遺伝子が転移したもの

S. avermitilis では遺伝子破壊の系が効率良く実施と推察される。なお，avermectin や同じくポリケできるので，その方法に習って 1.5 Mbp の欠失をチド化合物である ﬁlipin の生合成遺伝子群も左末検討した 30）。一般に遺伝子破壊などの欠失を行う

端から 0.5 Mbp の領域に配置している。一方，S.

には欠失させたい部分の上流および下流の領域，

avermitilis は現在も avermectin の工業生産のためそれぞれ 1.5 kbp〜2.0 kbp をクローン化しておきの産業微生物として利用されている。したがっその間に選択マーカーを連結し，それを直接欠失て，本菌は工業生産のための本質的な機能を有しさせる菌株に形質転換によって導入する。通常，た菌株であると結論することができる。おそら

遺 伝 子 破 壊 な ど の 欠 失 は 数 kbp 程 度 で あ る がく，生合成遺伝子群の発現が効率良く行われるこ

1 Mbp 以上の領域を一度に欠失させた例は殆ど無とと，それらの生合成に利用される前駆物質の供い。選択培地で欠失体を選択し，そのゲノムを調給が効率良いゲノム構成であると推察される。効べてみたところ，ほとんどの欠失体は目的の部分

率良い前駆物質の供給と物質生成に利用されるエの欠失体ではなく，欠失領域の小さい不特定の領ネルギーや補酵素は 1 次代謝系によって供給され域で組み換えたものが多かったが，その中から数る。したがって，本菌は物質生産過程におけるクローン，目的の領域が欠失した株を得ることが1 次代謝と 2 次代謝との連携が極めて効率良く稼できた 30）。この方法では非常に効率が悪いことが働している菌株であると思われる。そこで，内在予想されていたので，もう一つ別の方法を平行し

性 2 次代謝産物生合成遺伝子群のほとんどを欠失て行った。大腸菌の P1 ファージのゲノム DNA がさせること（発現していない休眠状態の生合成遺ファージの頭部コートタンパク質に収納されると伝子群は除く）。複製，転写，翻訳および 1 次代謝

き，ファージゲノム上の特異的な 2 箇所の配列に関与する遺伝子はすべてそのまま残しておく， （loxP）間で P1 ファージにコードされている部位というコンセプトで S. avermitilis のゲノムの再構

特異的組換え酵素 Cre によって収納できる大きさ成を計画した。先にも述べたようにゲノムの左末に編集される。この機構を利用し，欠失させたい

端からおよそ 2 Mbp には必至な遺伝子は存在し領域の上流と下流にそれぞれ loxP 配列を導入しない。また，この領域には内在性の 2 次代謝産物て お い た。こ の 組 み 換 え 体 に cre 遺 伝 子 をの生合成遺伝子群が多数配置していることから， Streptomyces 属で発現出来るようなプロモーター
最 初 に こ の 領 域 1.5 Mbp の 欠 失 を 試 み た。 の支配に連結させ，上記の組換え体に導入させJune 2021

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151（ 29 ）Fig. 9. S. avermitilis の大規模欠失株（SUKA 株；Special Use of Kitasato Actinomycetales）

る。このことによって loxP-loxP 間に夾まれる領りも若干旺盛になった。また，生育が若干早く域が Cre によって部位特異的な組換えによって切なったことと定常期における菌体量の増加が観察

り出される。この方法は非常に効率良く達成でされた 31）。なお。増殖の変化と欠失させた遺伝子

き，ほぼ確実に目的の欠失体を得ることができの関連性に関してはいまのところ不明ではあるた。以後はこの方法を用いてその他の領域の欠失が，菌体量の増加は物質生産にとっても好都合でを行った 30）。内在性の 2 次代謝産物生合成遺伝子

あるかも知れない。このような組み換え体を生産の中には上記で述べた 6.5 Mbp のコア領域に配置

培地で培養し，培養物を HPLC に供しても代謝産しているものもいくつかあり，正確に目的の領域

物のピークは確認することはできない（内在性ののみを欠失させることができるので近傍の 1 次代

2 次代謝産物の生合成遺伝子群を欠失させている謝に関与する遺伝子などに影響なく行えた。現在ため）。この状態に異種の 2 次代謝産物生合成遺までにいろいろな組み換え体を取得しているが， 伝子群を発現させ，代謝物が生成した場合，確認
野生株のゲノムのおよそ 80% 程度まで切り縮めされる化合物は導入した生合成遺伝子によって翻た欠失株を利用している（Fig. 9）。ゲノムが 80%訳された生合成酵素によって生成された代謝物で程度になったことによって，形態分化が野生株よあると結論することができる。また，内在性の 2

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次代謝産物を生成しないため，前駆物質が目的のは cephem 系の抗菌薬が最も良く使用されている。

代謝物の生合成に効率良く取り込まれること，さStreptomyces 属放線菌が生産するβ-lactam 系抗生らに培養物から効率良く目的代謝物を分離精製す物質としてS. clavuligerusが生産するcephamycin C

ることも可能である。なお，異種発現に関してはは 7 位のメトキシ基の存在によってβ-lactamase に生合成遺伝子のみならず有用な変換酵素の遺伝子

抵抗性示す優れた抗菌薬である。Cephamycin C

も評価ができるように S. avermitilis の反応性の高の生合成遺伝子群は 1 つの NRPS の遺伝子を含む

いシトクロム P450 の遺伝子のいくつかも欠失させ全長およそ 34 kbp の領域に配置している。この領た系列も作製した。特に S. avermitilis の CYP105D7域を含む cosmid クローンを S. avermitilis SUKA 株

は多くの化合物の酸素添加反応を触媒するため， に導入したところ，cephamycin C を生産し菌体外
このような酵素の遺伝子の欠失は異種の変換酵素に排出することが確認された 30）。したがって，S.

反応を評価する上でも有用である。

avermitilis では NRPS によって生成される代謝産物の生成にはなんら問題無いことが判った。前述

異種 2 次代謝産物生合成遺伝子（群）の発現による物質生産した 2 つの抗生物質の生合成遺伝子群には遺伝子群全体の発現を調節する制御遺伝子が配置しているが，それよりも上位の制御遺伝子によってさら上記で作製した異種遺伝子（群）発現のためのに制御されていることが明らかにされた数少ない組み換え体を用いて，異種の 2 次代謝産物生合成

生 産 菌 で あ る。 S. avermitilis に お い て も遺伝子（群）を導入し，目的の代謝産物を生成す

streptomycin の 生 合 成 遺 伝 子 群 の 制 御 遺 伝 子ることができるのかを確認した。1944 年に S. A. （strR）を制御する遺伝子は AraC-family に属する

Waksman が S. griseus か ら 見 出 し た 抗 結 核 薬

制御遺伝子であることが明らかとなっている。S.

streptomycin の生合成遺伝子群はおよそ 33 kbp のavermitilis においても同様な AraC-family の制御領域に 28 個の遺伝子が配置している。この領域全遺伝子が streptomycin 生合成遺伝子群の制御遺伝体を含む cosmid クローンを S. avermitilis SUKA4子（strR）の発現を調節していることが確認されあるいは SUKA5 に効率良く導入することができた 30）。一方，cephamycin C の生合成遺伝子群を制た 30）。S. avermitilis は通常，streptomycin に感受性

御する遺伝子（ccaR）の発現は anti-sigma 因子とを示すが，上記の生合成遺伝子群を導入した形質

anti-sigma antagonist によって調節されていること

転 換 体 は streptomycin に 耐 性 を 示 す と と も にが明らかにされている。S. avermitilis でも同様な

streptomycin を生産し，菌体外に排出しているこ

ortholog 遺伝子が配置しており，これらの遺伝子のとが確認された。一方，S. avermitilis には少なく欠失の結果は S. clavuligerus での解析結果と一致

とも 8 種の非リボソーム型ペプチド合成酵素

した 29）。このように，それぞれの 2 次代謝産物生

（NRPS）の遺伝子を含む遺伝子群の存在が確認さ合成遺伝子群内の制御遺伝子の上位の制御系は生れていたが，いずれの培養条件でも NRPS から合産菌が異なっても同様な制御遺伝子が存在すれば成されるペプチド化合物は見出すことはできな

元株と同様に，代謝産物を生成することが可能でかった。したがって，本菌は NRPS 由来のペプチあった。一方，上位の制御系が存在しない場合もド化合物の生合成を行うことができない可能性も予想される。Avermectin と同様なポリケチド化合示唆されていた。抗菌薬の中で最も使用されてい物 pladienolide はマクロライド骨格を有する，極る抗生物質はβ-lactam 系の抗菌薬である。本邦でめて特異な作用機構（真核細胞の splicing 阻害）を

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153（ 31 ）有する 12 員環マクロライド化合物である。ポリ （pldR）を S. avermitilis で発現が確認されているプ
ケチド化合物はラクトン型のマクロライドのよう

ロモーターに連結して，上記の形質転換体に導入な大環状ラクトン構造を有する一群である。これしたところ，著量の pladienolide の生産を確認す

らの化合物の生合成は I 型ポリケチド合成酵素

ることができた 30）。

（type I PKS）によってラクトン部分が生成され多くの 2 次代謝産物は生産菌の生育が定常期にる。また，ラクトン骨格は低級脂肪酸が縮合し，β-差しかかる直前あたりから開始されることが多位のカルボニルの還元様式によって多様な構造がい。このことは生合成遺伝子群全体の発現を調節形成される。また，縮合には基本モジュール構造

する制御遺伝子はその遺伝子群内に配置しているを有するユニット毎に行われるため，縮合回数分ことが即座に対応するには都合が良い。おそらくのモジュール構成が酵素分子の中に配置している

このような制御タンパク質は生合成遺伝子群の各多機能酵素である。したがって，その酵素は巨大オペロンの上流領域に作用して転写を活性化するで，その遺伝子も非常に大きい。例えば avermectin

様式で生合成遺伝子全体の転写を開始させるもののラクトン骨格を形成する type I PKS をコードすと思われる。一方，生育とともに細胞内環境の変る領域はおよそ 65 kbp である。Pladienolide のラク化に対応して 2 次代謝産物生合成のマスタース

トン部分の合成をおこなう type I PKS の遺伝子のイッチを「オン」にするには生合成遺伝子群全体

領域もおよそ 60 kbp 程度の大きさであった。 を調節する制御遺伝子の発現を上位で調節すると

32）

このような巨大な DNA は cosmid ベクターでク

いった，単純な方法が最も効率良く細胞内環境のローン化することは不可能である。したがって， 変化に対応できる方法であると推察される。しか我々は pladienolide 生合成遺伝子群全体を BAC ベ

しながらこのような各 2 次代謝産物生合成遺伝子

クターでクローン化することにした。Pladienolide

群の制御遺伝子を上位で調節する機構は全てが理

生合成遺伝子群を含むおよそ 70 kbp の DNA 断片

解されているわけではなく，むしろ理解されていを含む BAC クローンを S. avermitilis SUKA 株にる例のほうが極めて少ない。したがって，異種発導入を試みた。S. avermitilis への cosmid クローン

現ではこのように上位の制御系は不明であるが，のような 45 kbp 程度までの形質転換は問題無く

それと同様の ortholog 遺伝子が配置していること行うことができたが，BAC クローン級の巨大なを期待するか，あるいはそのような ortholog 遺伝

DNA ではそのような効率で導入することはでき子が存在しない場合は，pladienolide 生合成遺伝

なかったが，非常に効率は悪かったが目的クロー

子群の発現のように，生合成遺伝子群内の制御遺ンを得ることができた。しかしながら，得られた伝子を強制発現させることによって異種発現を達

形質転換体の培養物から pladienolide を検出するこ

成させることが可能である。また，生合成遺伝子と は で き な か っ た。詳 細 に 調 べ た と こ ろ， 群内に遺伝子群全体を制御する制御遺伝子が存在

pladienolide 生合成遺伝子群内の遺伝子群全体を調しない場合も稀ではあるがいくつかそのような生節する制御遺伝子が発現していないことが明らか

合成遺伝子群も見受けられる。このような場合，となった。この場合，streptomycin や cephamycin C

当該遺伝子群内のオペロンを強制的に発現させるの生合成遺伝子群とは異なり，生合成遺伝子群のことが第一の選択である（オペロン構造が複雑で

制 御 遺 伝 子 を 調 節 す る 上 位 の 制 御 遺 伝 子 が S.

あると導入するプロモーターの箇所が多数となる

avermitilis には存在しないことが示唆された。そため）。プロテアソームの特異的な阻害剤である

こで，pladienolide 生合成遺伝子群の制御遺伝子

lactacystin は NRPS-PKS hybrid 構造を有する化合154（ 32 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Fig. 10. S. avermitilis SUKA 株で異種発現が達成された代謝産物

藍色：糖質経路，赤色：ポリケチド経路，橙色：シキミ酸経路，青色：ペプチド経路，緑色：メバロン酸経路あるいは MEP 経路由来の代謝産物。

物であり，その生合成遺伝子群は type I PKS とでの異種発現は DNA を抽出した元株の生産菌 S.

NRPS 遺 伝 子 の 両 者 を 含 む。幸 い な こ と にgriseus と比べて 3 倍程度高く，一方 S. clavuligerus のlactacystin は 5 つの遺伝子によって生合成される

cephamycin C の生産は元株の 2 〜 3 倍程度高かっこと，さらにこれらの遺伝子の全てが同一方向にた 30）。また， S. venezualae の chloranphenicol の S.

転写される 1 つのオペロンを形成していることがavermitilis SUKA 株での生産は非常に効率良く，明らかとなった。したがって，生合成遺伝子群の元株のおよそ 10 倍程度も効率であった。なお S.

先頭の遺伝子の上流に S. avermitilis で発現が確認

avermitilis SUKA 株での異種発現はすべてが良好されているプロモーターを配置することによってなわけではなく，ribostamycin や tetracycline の異S. avermitilis SUKA 株で安定に lactacystin を生産

種発現は元株よりは低いものであった 31）。

することを確認することができた 30）。これまでに40 種を越える異種発現を行い，多くの場合その遺休眠遺伝子の覚醒による物質生産

伝子群を導入することよって蓄積する代謝産物を確認することができた（Fig. 10）21,30,31）。
ところで異種発現では代謝産物の生産性は元株と前述したように Streptomyces 属放線菌は，一菌株のゲノムに少なくとも 20 以上の 2 次代謝産物比べていかなるものであるかも興味の 1 つであった。 生合成遺伝子群を保有していること。さらにそれ先にも述べた，streptomycin の S. avermitilis SUKA 株らの多くは休眠状態であることがこれまでのJune 2021

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155（ 33 ）Fig. 11. Shinorine の生合成経路および Cyanobacteria 門（Anabaena varibilis 及び Nostoc punctiforme）と Actinomycetales 目（Actinosynnema mirum 及び Pseudonocardia sp.）の生合成遺伝子群

Streptomyces 属放線菌のゲノムから共通した解析しており，S. avermitilis の neopentalenoketolactone

結果であった。したがって，このような休眠状態の生成と同様，主生産物の生成が停止することにの生合成遺伝子群を確実に，かつ再現性良く覚醒

よ っ て，前 駆 物 質 が 他 の 生 合 成 へ 供 給 さ れさせることができれば新規な構造を有する代謝産

holomycin が生成されたものと思われる。一方，S.

物の探索に貢献できることが期待される。特に異clavuligerus には glycolipid 系化合物の生合成遺伝

種発現によって休眠遺伝子が覚醒させることが可子群と推定されるおよそ 26 kbp の領域の存在が能 で あ れ ば 非 常 に 興 味 深 い。 S. clavuligerus の確認された。しかしながら，過去の文献を検索しcephamycin C に異種発現の検討を行うにあたり， ても本菌から glycolipid 化合物の生成に関する記
本菌の cosmid ライブラリーを構築し全てを保存

述は一切無く，実際に菌を培養しても当該化合物してあった。その後，オランダのグループから本の生産はいずれの培地でも観察されなかった。

菌のゲノム解析の論文および配列データーが報告

Cosmid クローンから当該領域を含むクローンをされた。本菌も極めて多くの 2 次代謝産物生合成

選抜し，さらにこれから生合成遺伝子群の最小単遺伝子群を保有しており，かつて cephamycin C

位を再クローン化し，S. avermitilis SUKA 株に導や clavulanic acid が 非 生 産 に な っ た 変 異 株 か ら入した。得られた形質転換体を適当な培地で培養

holomycin の生成が確認されていた。事実，ゲノし，その培養液を解析した結果，glycolipid 系化合ム配列上には holomycin の生合成遺伝子群が配置物である pholipomycin を生成していることが明ら

156（ 34 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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かとなった 31）。これは休眠遺伝子群を異種発現系

avermitilis は過去に 2-MIB を生成していたがそのに導入させることによって休眠状態だった生合成

後，水平伝播などによって IS が転移し，その 1 つ遺伝子群が発現し，さらにそれらの遺伝子産物かが 2-MIB の構造遺伝子領域に挿入し，さらに欠失らの生合成によって代謝産物を生成させた初めてが起こり現在に至ったものと推察される。

の例であった。このような異種発現用の菌株に導入するだけで代謝産物を生成する例は極めて少な

休眠遺伝子の強制発現による物質生産

いが，我々は最近，この方法によって thioamide を含むペプチド化合物 neothioviridamide の生成に成功した。これらの例は恐らく，元菌では生合成

33）1. Mycosporine 様アミノ酸
2 次 代 謝 産 物 の 生 成 は Actinobacteria 門 の遺伝子群を転写する時期に最適な sigma 因子が， Actinomycetales 目の菌株では旺盛であることが知あるいは転写活性化因子が発現していない，ある

られており，その中でも Streptomyces 属は生産量もいはゲノムにそのような因子の遺伝子が存在しな

効率的であるため，医薬品などの生産用の産業用のいため，生合成遺伝子群は休眠状態のままである

微生物として利用されている。一方，真正細菌の中と推定できる。一方，S. avermitilis SUKA 株にはでも Cyanobacteria 門あるいは Deltaproteobacteria

これらの遺伝子群の転写のための sigma 因子あるい網に属する微生物の一群も 2 次代謝産物の生成が確

は転写活性化因子の遺伝子が配置および発現する

認されているが，種類および生産量は Streptomyces

ことでこれらの生合成遺伝子群を転写・翻訳し， 属には及ばず，工業的な生産菌としての用途はほ生合成酵素群が形成されそれぞれの化合物が生

とんど無い。これらのうち，Cyanobacteria 門の合成されたものと思われる。このことは休眠遺Anabaena 属や Nostoc 属は紫外線吸収物質である

伝子（群）の多くは遺伝子が壊れているのではな

shinorine を 生 産 す る こ と が 知 ら れ て い る。

く転写することができないため休眠状態である

Shinorine は Cyanobactria 門などの原核細胞生物

ものと推察される。実際に生合成遺伝子が壊れのみならず，糸状菌や微細藻類あるいは海藻からているため（欠失その他によって）発現していも生成が確認されており，実際に海藻から抽出しない遺伝子は S. avermitilis の monoterpene 化合物

た shinorine が化粧品に使用されている。これま2-methylisoborneol（2-MIB）合成遺伝子が唯一ので，Actinomycetales 目の放線菌から shinorine 生産

例である。2-MIB は geranyl diphosphate（GPP） の詳細な報告はなく，学会発表の抄録のようなも

34）

を GPP methyltransferase によって methyl GPP を生のに記載があるが詳細は全く不明であった。上記

成し，それを脱二リン酸化および環化を触媒するの よ う に Cyanobacteria 門 や Deltaproteobacteria

2-MIB 合成酵素によって生成する。我々は世界に先網，さらには糸状菌，微細藻類や海藻で生産が確

駆けて，2-MIB の生合成遺伝子を同定することがで認されているにも関わらず，放線菌からの生産の。その過程で S. avermitilis のゲノムを詳細に詳細な報告例が無いので Actinomycetales 目の放解析した結果，ゲノムの左末端から 1.25 Mbp の領線菌では shinorine 生合成遺伝子群が休眠状態で

きた

34）

域に GPP methyltransferase の 完 全 長 の 遺 伝 子 を， あると推察されていた。そこで我々は生物情報学
さらにその隣（上流側）に IS（挿入配列）挿入す的な検索を Actinomycetales 目の放線菌で行ったると共に 2-MIB 合成酵素の C- 末端側の Mg 結合

結果， Actinosynnema mirumi DSM 43827 とモチーフ以降をコードしている領域が欠失した遺Pseudonocardia sp. P1 の 2 菌株で shinorine の生合

伝 子 配 列 を 見 出 す こ と が で き た。即 ち， S.

成遺伝子群と推察される領域を見出した。解析が2+

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157（ 35 ）

完了した同時期に米国の Walsh らから Anabaena

菌体あたりで比較），10 倍以上も効率良く生成す属などの Cyanobacteria 門からの生合成遺伝子のることが判った。また，上記の生産量は合成培地，さらにその解析結果の論文が発表され（Fig. 11）での生産量であり，その後培地および培養検討に中の記述に放線菌（A. mirum DSM 43827）にも同

よってさらに蓄積量が上昇している。

様な ortholog があるらしい，との記述があった 35）。
我々は直ちにこれらの菌株を培養し shinorine の生2. 細菌由来の terpene 化合物の分布および新規成を各種の培養条件で確認した。A. mirum DSM

terpene 化合物の生産

43827 はいかなる培養条件でも shinorine を蓄積し多くの 2 次代謝産物の中で，mevolonate pathway

なかったので当該遺伝子群は本菌で休眠状態でああるいはMEP（MethylErythol-4-Phosphate）pathway

ると結論された。一方，Pseudonocardia sp. P1 は高から生成される isoprenyl diphosphate（IPP）およ

窒素源の培養条件でのみ極めて少量の shinorine をび dimethylallyl diphosphate が 縮 合 し た prenyl

蓄積したが Anabaena 属の生成量よりも遙かに少diphosphate から生成する terpene 化合物は，植物量であった。そこで A. mirum DSM 43827 およびなどの精油成分に含まれるものが多く，さらに医Pseudonocardia sp. P1 株から shinorine 生合成遺伝

薬品（menthol, taxol や artemisinin）として利用さ子群（およそ 5.5 kbp）と推定される領域をそれぞれている代謝産物も少なくない。一般的にこれられ菌の染色体から in vivo cloning で取得した。幸の terpene 化合物は植物や菌類特有の代謝産物といなことに両菌の生合成遺伝子群は Nostoc 属とし て 知 ら れ て お り，放 線 菌 を 含 む 細 菌 か ら のは異なり 4 つの遺伝子がすべて同一方向にオペロ

terpene 化合物の生産は非常に稀であり，異臭物質ンを形成していた。そこで，S. avermitilis SUKAの geosmin や前述した 2-MIB 程度が知られている株での安定な発現を期待して，同菌株で転写が確に過ぎなかった。しかしながら，我々が世界で初認されているプロモーターを同オペロンの先頭にめて 2-MIB 合成酵素の遺伝子を同定したとき，細挿入したものも作製した。A. mirum DSM 43827

菌の terpene 合成酵素と植物由来の同酵素のアミおよび Pseudonocardia sp. P1 から得た生合成遺伝

ノ酸配列の間には相関性は極めて低く，さらに植子群をそのまま S. avermitilis SUKA 株に導入して物の terpene 合成酵素は N- 末端側のアミノ酸配列

も shinorine の生成は確認することができなかった。 に 特 徴 が あ り，こ の 領 域 が 多 く の 植 物 由 来 の
一 方，プ ロ モ ー タ ー を 連 結 し た ク ロ ー ン で は

terpene 合 成 酵 素 で 高 い 相 同 性 を 有 す る た め，

shinorine の生成が確認することができ，特に A.

BLAST などの配列の相同検索などで植物などか

mirum DSM 43827 から得た生合成遺伝子群を強制

ら容易に新たな terpene 合成酵素を見つけ出すこ

発 現 さ せ た 形 質 転 換 体 か ら は 154 mg/L 以 上 のとが可能であった。このような背景で植物由来のshinorine の生成が確認された 36）。なお，同じプロ

terpene 合成酵素の研究は進展していった。一方，モーターを使用した Pseudonocardia sp. P1 からの放線菌を含む細菌由来の terpene 合成酵素は全体

生合成遺伝子群から得た形質転換体では非常に少的に相同性が低く，さらに植物由来の terpene 合なく，0.38 mg/L 程度の shinorine を検出した。なお， 成酵素に見出される N- 末端側の特徴ある配列はA. mirum DSM 43827 から得た生合成遺伝子群の存在しないため，一般的な配列相同性で検索する

強制発現株の shinorine 生産量は Cyanobacteria 門

BLAST 解析では新たな terpene 合成酵素を見出す

や実際に化粧品の製造のために抽出に使われていことが出来なかった。これが細菌での terpene 化る海藻と比較した場合（海藻との比較なので乾燥合物研究の進展を遅らせた要因であった。タンパ

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ク質の機能解析を行う場合，相同性で検索する方トを行い，その結果から系統樹を作製した。その法以外にモチーフ配列の相同性などを検索する方

結果，細菌の terpene 合成酵素は，大きく geosmin/法もあるが，これらにも限界がある。一方，互い

germacradienol, 2-MIB, pentalenene,（+）-caryolan-に相同性が低い配列同士を比べるときに統計モデ

1-ol および epi-cubenol 合成酵素に分けることがルを用いた隠れマルコフモデルによる検索方法はでき，かつこれらの分岐群（clade）に当てはまら非常に有効な場合が多い。我々は 2-MIB 合成酵素

ない合成酵素の多くは新たな環化反応を触媒するを細菌から見つけだすため，その当時アミノ酸配ものと推察された。上記の分岐群に属さない 29

列が決定されていた数少ない細菌由来の terpene

種を選択し，それぞれを PCR で増幅あるいはコド合 成 酵 素（pentalenene synthase, geosmin お よ び

ンを Streptomyces 属の使用頻度に最適化した人工epi-isozizaene synthases）の ア ミ ノ 酸 配 列 か ら， 遺伝子を作製した後，上流に S. avermitilis で発現
Mg2+ 結合領域と下流の高度に保存された 3 つの可能なプロモーターと prenyl diphosphate synthase

アミノ酸を含む配列（NSE triad）までのアミノ酸 （geranyl diphosphate, farnesyl diphosphate あ る い
配列から統計モデルを作製し，それを当時（2007は geranylgeranyl diphosphate synthase）遺伝子を年）の NCBI に登録されていた細菌のゲノムデー

配置したベクターに連結してオペロンを形成させ

ターのタンパク質（1,922,990 タンパク質）に対したカセットを S. avermitilis SUKA22 に導入した。

て検索を行ったところ，41 個のタンパク質が選択得られた培養物を解析したところ多くの場合，植され，その中から 2-MIB 合成酵素を見つけだし， 物から報告されている terpene 化合物を見出すこ
最終的に実験科学的に証明することができた 34）。 とができたが，13 種の新規な骨格の terpene 化合物
先にも述べたように，この成果から S. avermitilisを得ることができた 39）。なおこれらの新規 terpeneの新規 terpene 合成酵素遺伝子を見出し，強制発化合物の単離および構造解析の論文は 2018 年度の現によって avermitilone および avermitilol の発見

The Journal of Antibiotics, Ō mura Awards forにつながった 23）。一方，これらの成果から細菌に

excellence に選定された。このように terpene 化合

も terpene 合成酵素が広く分布していること推察

物は植物や菌類特有の代謝産物と認知されていたされたため，さらに精度の良いモデルを上記の 41が，ゲノム解析と S. avermitilis を用いた異種発現

種の細菌由来の terpene 合成酵素と推定された配系によって，細菌にも terpene 化合物の合成酵素

列から作製した。新たに作製した細菌 terpene 合遺伝子が広く存在していることが明らかになっ成酵素の隠れマルコフモデル（2 version）を用いた。日々ゲノム解析データーは蓄積しており，最て再度，細菌のタンパク質を検索したところ 140

近のタンパク質データーを検索することによって種のタンパク質の配列が選択された 37）。得られた更なる新規骨格を有する terpene 化合物およびそ140 種のタンパク質の配列のアラインメントを行の合成酵素を見出すことが期待できる。

nd

い，さらに上記の保存された領域間のアミノ酸配。こ
列を集め，再度モデルを作製した（3rd version）のモデルを用いて，その当時 NCBI に登録されて遺伝子編集による生物活性の改変のための非天然型誘導体の創製

いた細菌のタンパク質（8,759,463 個）を用いて検索を行ったところ，262 種の terpene 合成酵素と推

生物活性を有する化合物が医薬品などとして用定されたタンパク質が得られた（Fig. 12） 。得ら

いられるようになると，さらなる効果の増強，副れたタンパク質のアミノ酸配列からアラインメン

作用の軽減，生物活性スペクトルの拡大など天然

38）

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159（ 37 ）Fig. 12. 細菌のタンパク質データーベースから隠れマルコフモデルを用いた統計解析によって選別された推定 terpene 合成酵素アミノ酸配列からの系統分類

緑色：monoterpene 合成酵素，青色：sesquiterpene 合成酵素，赤色：diterpene 合成酵素，紫色の分岐束はグラム陰性菌由来の terpene
合成酵素 . なお，Firmicutes 門および始原菌界の微生物からのタンパク質データーからは得られなかった。

物の作用を越える誘導体の創製が試みられる。極C 結合を改変する合成は極めて困難な有機合成をめて単純な構造修飾で生物活性が改変できれば効展開しなければならない。また，ペプチド化合物で率的ではあるが，多くの場合，単純な構造改変ではアミノ酸残基の交換も極めて困難な場合もあり，は期待される生物活性の改変は困難な場合が多全合成を行う工程数が要求されることが多く，容い。また，天然物は構造が複雑なことから，有機

易にそのような構造変換は達成できていない。こ合成で構造修飾を行う過程で反応性の高い官能基

れまで述べてきたように，S. avermitilis SUKA 株の修飾，さらにそれらの脱保護といった複雑な化を宿主とする異種生合成遺伝子群の発現は極めて学反応を必要とする。また，ポリケチド化合物のポ

効率良く達成できることが多く，さらに type I

リケチド骨格の炭素鎖の伸長あるいは縮小など C–

PKS に よ っ て 生 成 さ れ る ポ リ ケ チ ド 化 合 物 や

160（ 38 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Fig. 13. 細菌由来の terpene 合成酵素遺伝子を強制発現によって得た新規 terpene 化合物

Isohirsut-1-ene と isohirsut-4-ene は sesquiterpene 化合物，その他は diterpene 化合物。

NRPS によって生成されるペプチド化合物の再現から構成されている。したがって，その基本骨格

性ある異種発現は我々の異種発現系以外は報告例のペプチド部分をコードする遺伝子にアミノ酸置が無い。前述したように S. avermitilis SUKA 株は換変異を導入し，その遺伝子を単独発現させるこ

多くの異種生合成遺伝子群の発現が効率良く達成とによって基本骨格部分を大量供給することにできる。したがって，生産菌から取得した完全長

よって，新規なアミノ酸置換型の非天然型ペプチの当該生合成遺伝子群を我々の異種発現用のベク

ド化合物の創製が容易に行えるものと当初思われ

ターに連結し，さらに試験管内で遺伝子編集したた。しかしながら基本骨格ペプチドの構造遺伝子後，S. avermitilis SUKA 株に導入し，生成物の解は骨格のアミノ酸をコードしているだけの単純構

析を行うことを計画した。

造ではなく，leader peptide などが C 端末側あるいペプチド化合物の生合成に関しては 21 世紀には N 末端側に連結している precursor peptide としなって，NRPS によるアミノ酸の活性化によるペて翻訳され生成されることが明らかとなった。さプチド結合の形成以外に ribosome で翻訳された短ら に precursor peptide を コ ー ド す る 構 造 遺 伝 子

いペプチドを基質として修飾，そして最終的にを，構造修飾などを行う遺伝子を含む生合成遺伝

signal peptide 部分の切断によって代謝産物が生成

子群とは別に発現させることによって precursorする機構が明らかにされた（これらは Ribosomally

peptide を供給することの試みは極めて効率が悪

synthethized and Post-translationall modiﬁed Peptides;

いことが明らかになった。おそらく，precursor

RiPPs と呼ばれる）。かつて本邦で飼料添加薬とし

peptide の よ う な 小 分 子 の ペ プ チ ド は 内 在 性 のて利用されていた thiopeptine や nosiheptide はこ

peptidase な ど で 速 や か に 分 解 さ れ る よ う で，のような生合成機構によって生成されることが， precursor peptide が生成すると同時に同じ生合成
今世紀になって明らかになった。これらの化合物

遺伝子群内にコードされている修飾酵素によっての基本骨格は数アミノ酸から 10 数アミノ酸残基修飾されることによって内在性の peptidase からJune 2021

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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161（ 39 ）Fig. 14. Prethioviridamide 及び neothioviridamide の構造およびそれらの生合成遺伝子群

それぞれの遺伝子のハッチパターンは同一機能を有する遺伝子産物をコードする遺伝子を示す。

の分解を防いでいると思われる。したがって，改それぞれの菌株からクローン化され詳細な配列解

変 precursor peptide 遺伝子は正確に元の生合成遺析が行われてた（Fig. 14）。さらにそれぞれの遺伝

伝子群の正しい位置に再構成させなければならな

子産物の機能からその生合成過程が推定されていい。RiPPs の生合成遺伝子群は NRPS と異なり，そる（Fig. 15）。通常，遺伝子の特定のアミノ酸置換れほど巨大でなく，cosmid ベクターで収納できるは部位特異的変異導入によって行われる。しか大きさである。前述したように我々は休眠状態のし，この方法では一度に隣接した複数箇所のアミ

thioamide を有する neothioviridamide の生合成遺伝

ノ酸置換を行う場合は極めて効率が悪い。また，子群の異種発現に成功している。これと類似のprecursor peptide のアミノ酸 75 残基のうち，構造

prethioviridamide は thioamide 結合を有する非常にに反映している残基（core peptide）は 12 残基であ強力な殺細胞活性を有する化合物である。これらる。この precursor peptide 遺伝子断片（後の Gibsonの化合物の生合成遺伝子群は既に S. olivoviridis

assemble を行うため start codon および stop codon

OM-13ならびにStreptomyces sp. MSB090213SC12からそれぞれ上流および下流の配列を含む）に

162（ 40 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Fig. 15. Prethioviridamide の推定生合成経路

LP は leader peptide を示す。TvaA アミノ酸配列中の黒で示した 62 個のアミノ酸部分。

silent mutation を導入し，prethioviridamide の core

伝子のみを除去した prethioviridamide 生合成遺伝

peptide に対応する遺伝子の部分に新たな制限酵子群を含んだ染色体組込型 plasmid とを試験管内

素切断部位を付加した。このことによって core

で Gibson assemble を利用してシームレスに両断

peptide 部分の 12 アミノ酸残基に相当する部分だ片を連結した後，S. avermitilis SUKA 株に導入しけをオリゴヌクレオチド（+/−鎖による 2 重鎖オ

た（Fig. 16）。上記の方法によって 42 種の非天然

リゴヌクレオチド）で入れ替えることによってア型 prethioviridaminde を設計し，その内 35 種からミノ酸置換が可能となり，効率的にアミノ酸置換

代謝産物の生成を確認した（生産量 0.56 〜106

（複 数 の 隣 接 置 換 を 含 む）が 行 え る。さ ら にmg/L）。これらの非天然型 prethioviridamide の殺

prethioviridamide の 生 合 成 遺 伝 子 群 の precursor

細胞活性を各種の培養細胞を用いて比較した結peptide 遺伝子部分を正確に切断し，人工的にこの果，2 番目の Met, 6 番目の Ala, 9 番目の Ala あるい部分のみを切断する制限酵素切断部位を導入しは 10 番目の Leu を他のアミノ酸に変換した誘導

た。上記のアミノ酸置換を施した core peptide 部

体 は 天 然 型 の prethioviridamide よ り も 高 活 性 で分をコードする DNA 断片と precursor peptide 遺あった。特に 2 番目の Met を分枝アミノ酸に変換

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163（ 41 ）Fig. 16. Prethioviridamide のアミノ酸置換変異体の作製方法

syn は silent mutation によって precursor peptide 遺伝子 tvaA に新たに BamHI と NheI 切断部位を導入。tvaA（syn）遺伝子を BamHI/NheI
で切断後，40-mer からなるオリゴヌクレオチドの +strand/−strand をアニールさせた変異断片と連結させる。変異を導入した tvaA
（mutant）遺伝子は PCR で増幅した後 EcoRI/HindIII で切断する。一方，完全長の prethioviridamide 生合成遺伝子群の tvaA 遺伝子部分をaph（アミノグリコシドリン酸化酵素遺伝子）と交換した組換え plasmid を BstZ17I で切断し aph を除去後，変異を導入し増幅・制限酵素処理した tvaA（mutant）断片と混合した後，Gibson assemble の方法で連結させた。
＊ prethioviridamide のアミノ酸置換体を作製するための人工 precursor peptide 遺伝子（tvaA syn）の骨格部分の配列。

した誘導体はいずれも天然型の prethioviridamide

vector を構築してきた 30,41）。特に BAC ベクターはの活性を越えていた（Table 2）。一方，高活性と100 kbp を超える DNA 断片を収納することがでなったアミノ酸置換を統合した場合は期待される

き，cosmid ベクターではクローン化できない巨大相乗効果は認められなかったが，いずれも天然型

な生合成遺伝子群を完全長でクローン化すること。

が可能である。これまで我々は，マクロライドなど

我々は S. avermitilis SUKA 株での異種発現系をの type I PKS によって生成されるポリケチド化合物構築する過程でバクテリオファージの integrase

や NRPS によって生成されるペプチド化合物などいによる部位特異的組換えによって Streptomyces のずれも全長 100 kb 程度あるいは quinolidomicin のよ

染 色 体 上 に 組 み 込 ま れ る cosmid お よ び BAC

うに全長 200 kbp の生合成遺伝子群を完全長でよりも高活性を示した

40）

164（ 42 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Table 2. 非天然型 prethioviridamide 誘導体の殺細胞活性 a

BAC ベクターにクローン化し，さらに異種発現ることは極めて困難である。したがって，type I。特にPKS を有する生合成遺伝子群の改変は，BAC ベ

ポリケチド化合物の生合成遺伝子群は type I PKS

クターなどでクローン化した完全長の生合成遺伝をコードするため巨大である。また，アシル側鎖子群を含む DNA 断片を，試験管内で相同的組換伸長反応に関与する各モジュールから構成されるえを利用せずに改変編集し，それを異種発現系にため，特に縮合反応の機能ドメインの DNA 配列

導入し，評価する方法が現実的であると考えられは互いに相同性が極めて高い。このことによってる。そこで遺伝子編集で利用される「特定の配列生産菌の type I PKS 領域を分子遺伝学的な方法でを正確に切断するエンドヌクレアーゼ」である

ある相同的組換えによって改変することは極めて

CRISPR/Cas9 のシステムを用いて，編集したい領難しい。実際に，このような相同組み換えは目的域の特定の部位を正確に切断し，さらに切断断片の部分のみならず相同性の高い他の部分と容易にを Gibson assemble の方法によってシームレスに組み換わることが多く，目的の改変体を確実に得繋ぎ合わせる一連の方法を試験管内で行った。最によって代謝産物の生成を達成してきた42）

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165（ 43 ）終的に我々が構築した異種発現用の宿主に導入しルが関与している。それぞれのモジュールにはて目的の代謝産物を生産させる系を構築した。なAT ドメインによって決まった長さの低級脂肪酸

お Streptomyces 属は原核細胞生物であるため真核の CoA エステルが取り込まれ，C–C 結合（KS に細 胞 性 で 利 用 さ れ て い る よ う な in vivo で の 切

よる縮合反応）によってアシル側鎖を伸長してい断・結 合 が で き な い（真 核 細 胞 生 物 に は non-

く。また，縮合時に生成するβ- 位のカルボニルはhomologous end joining の機構によって切断 DNA

モジュール内の修飾ドメイン，KR, DH あるいは断片を連結することが可能である）こと，またER，によって修飾される。このような反応を経てtype I PKS はモジュール単位の縮合に関与する領

rapamycin の基本骨格は形成されるが，それぞれ域は極めて高い相同性を有するため，相同組換えのモジュール内に配置されている機能ドメインをによる連結が in vivo では不可能であるためであ

人為的に交換，欠失あるいは挿入を行うことにる。このような方法で type I PKS によって生合成

よって rapamycin の基本骨格の改変が期待できされる rapamycin をモデルに各種の非天然型のる。例えば，モジュール内の AT の基質特異性のrapamycin の 創 製 を 試 み た 43）。 Rapamycin は S.

異なる AT の入れ替え，β- 位のカルボニルの修飾

hygroscopicus あるいは S. rapamycinicus によってに関与する KR, DH, ER ドメインの入れ替え，欠生産される 31 員環ラクトン並びにラクタム構造

失あるいは挿入によって基本骨格の改変が可能とを有する化合物であり，発見当初は抗真菌活性をなる。また，モジュール単位を欠失あるいは挿入有する化合物として開発された。その後，本化合することで形成される員環数を変化させることも物が mammalian Target of Rapamycin（mTOR）阻期待できる。このような改変には 1 塩基の読み枠

害能を有することから，強力な免疫抑制作用と抗のズレなどを生じることなく設計しなければなら増殖作用を示すことが発見された。したがって， ない。何故ならば，type I PKS は多機能酵素であrapamycin は抗真菌薬としてではなく，tacrolimus

るので酵素遺伝子の塩基のフレームずれは翻訳さと同様に免疫抑制薬として，さらに抗増殖作用かれるポリペプチドに大きな影響を及ぼすことになら 抗 悪 性 腫 瘍 薬 と し て 近 年 使 用 さ れ て い る。 る。また，type I PKS 遺伝子の決められた部位をRapamycin の生合成遺伝子群は非常に大きく，全正確に切断し，さらに切断後には新たに調製した

長 110 kbp を越す領域に 26 遺伝子からなる遺伝子

改変 DNA 断片を翻訳フレームのズレを生じない群を構成している。さらに rapamycin の基本骨格

ように連結させなければならない。このような目である 31 員環骨格の生成には少なくとも 4 つの的には rapamycin 生合成遺伝子群の全長を含む

遺伝子産物 RapA, RapB, RapC および RapD が関BAC クローンを in vitro で sgRNA と Cas9 ヌクレ

与していることが明らかにされている。なおこの

ア ー ゼ を 用 い て，sgRNA 配 列 の 一 部 と 相 補 な

基本骨格の生成のため 4 つの酵素遺伝子は生合成

BAC clone の 特 定 の 位 置 で 切 断 す る（2 種 類 の遺伝子群の 70% 以上を占めている（Fig. 17）。ポsgRNA を使い，2 箇所で切断）。切断した断片は反リケチド合成酵素はアシル側鎖の伸長並びにβ- 位

応ドメインを改変したモジュールをコードする

カルボニルの修飾反応（還元反応）によって構造

DNA 断片を加え，T5 exonuclease を用いた 5′ 側のの多様性が示される。また，アシル側鎖伸長は基消化による Gibson assemble によって連結する。

本反応である伸長回数分の伸長ユニット（修飾も連結した BAC クローンは一度大腸菌で増やし，含むのでモジュールと呼ばれる）が配置してお最終的に S. avermitilis SUKA 株に導入して生産物

り，rapamycin の基本骨格形成には 14 のモジューを解析する（Fig. 18）。Rapamycin の基本骨格の生166（ 44 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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Fig. 17. Rapamycin 生合成遺伝子群の構造（上段）および type I PKS による rapamycin 骨格の形
成様式（下段）遺伝子群の構造の中で，赤で示した遺伝子領域は type I PKS をコードしている。青で示した遺伝子は骨格修飾に関与している酵素をコードしている。緑で示した遺伝子は pipecolinate（下図の緑で示した部分構造）の生成並びに取り込みに関与する酵素をコードしている。
○は機能ドメインを示す。●のドメインは機能が失われているか，ポリケチド伸長反応にあずからなドメイン。赤で示した AT ドメインはmalonyl-CoA を取り込む。青で示した AT ドメインは methylmalonyl-CoA を取り込む。

成には malonyl-CoA あるいは methylmalonyl-CoA

CoA を取り込むモジュールの AT を malonyl-CoAが利用されている。また，それぞれの CoA エステを取り込む AT と交換した場合，鎖長が 1 炭素短

ルの内どちらを取り込むかはモジュール内の AT

くなった骨格が形成された。反対に malonyl-CoA

によって決定されている。したがって，この ATを取り込む AT を methylmalonyl-CoA を取り込むの基質特異性を異なる AT と交換することによっ

AT と交換したな場合は 1 炭素伸長した骨格が形て，側鎖の炭素鎖長を変化させることが期待でき成された。一方，特定のモジュールを欠失させたる。Fig. 18-1 に示した構造はそれぞれモジュール

場合，最終的な伸長反応の回数が減少し，それに内の AT を異なる基質特異性の AT と交換した時伴い骨格の員環数が 1 モジュール当たり 2 減少すに生成する化合物である。例えば methylmalonyl-ると推察される。Rapamycin は 31 員環骨格を有し

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167（ 45 ）Fig. 18. Rapamycin PKS 遺伝子の遺伝子編集方法および各種遺伝子編集によって生成された非天然型 rapamycin の構造ているが 1 モジュールの欠失は 29 員環骨格を形に –DH–KR– で構成されているモジュールに ER成する。また，欠失させるモジュールの位置にを付加することによって DH–KR で形成された

よって，最終的な骨格はそれぞれ異なっていた

2 重結合が ER によって還元され sp3 混成軌道の（Fig. 18-2）。また 2 モジュールを欠失させた場合， C–C 結合が形成された。またモジュール内の KR

27 員環骨格が，反対に 1 モジュール付加した場

はβ-カルボニルを還元して水酸基を形成するが，合， 33 員 環 骨 格 が 形 成 さ れ た（Fig. 18-2）。モ

この水酸基は KR の種類によって立体の異なる方

ジュール内にはアシル側鎖伸長に関わる機能ドメ

向に水酸基を形成することが知られている。S 配

インの他にβ- 位のカルボニルの修飾（還元反応） 位の水酸基を形成する KR を R 配位の水酸基を形に関わるドメインが配置している。これらの修飾

成する KR と交換した場合，生成される骨格は天ドメインの構成を改変すると，それに対応して骨然型の配位とは逆の配位の骨格が形成された。ま格 の 構 成 も 変 化 し た。 –ER–DH–KR– の 修 飾 にた，これらは組み合わせによる改変も可能であっよって炭素骨格は完全に還元され sp 混成軌道のた（Fig. 18-3）。

3

C–C 結合が形成される。この ER を消失させた場

以上のように type I PKS 遺伝子の正確な改変が合，–KR–DH– で形成された 2 重結合の還元が起

in vitro で の CRISPR/Cas9 に よ る 切 断，並 び に

こらず 2 重結合が残った骨格が形成された。反対

Gibson assemble を用いたシームレスな切断断片168（ 46 ）THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

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June 2021の修復結合によって，骨格変換を実現させることする。このようなライブラリーには培養可能な微ができた。なお，遺伝子編集によって全ての骨格生物はもちろんのこと，培養不可能な微生物のゲ変換に成功したわけではない。いくつかの遺伝子

ノムも含まれると考えられる。そして得られたラ編集による異種発現では，おそらく PKS 内での伸イブラリーから，目的の生合成遺伝子（群）を取得

長反応にとって都合の悪い構造となる場合もある

するという方法が期待される。この場合，DNA の分ものと推察される。今後，他のポリケチド化合物

解が少なく長鎖 DNA を単離する方法が重要であでの生合成に関与する type I PKS の遺伝子を用いる。また，このようなライブラリーの評価は目的のて上記と同様な遺伝子編集を行うことは重要であ生合成遺伝子群が効率良く発現させることのできる。ま た， CRISPR/Cas9 と Gibson assemble を inる宿主の整備が必須である。また，異種発現においvitro で 組 み 合 わ せ た 遺 伝 子 編 集 方 法 は，type Iては種の障壁などが考えられるため，複数の異種発

PKS 遺伝子のみならず，NRPS 遺伝子にも適用可

現用の宿主を準備することも重要である。我々は土能である。いずれの場合もこれらポリケチドやペ壌 に 広 く 生 息 し て い る Actinomycetales 目 のプチド化合物生合成遺伝子群の完全長クローンをStreptomyces 属で異種発現用の宿主を構築した

S. avermitilis SUKA 株で異種発現に利用できるこが，グラム陰性細菌のいくつかの属も 2 次代謝産とが確認されることが重要である。

物の生産が比較的多いので，グラム陰性菌においても異種発現系の宿主の構築が望まれる。なお，

終わりにグラム陰性菌の大腸菌は遺伝子操作が最も整備された菌株ではあるが，type I PKS や NRPS の翻訳

これまで微生物は一般的に培養が可能であると後修飾（phosphopantetheinyl transferase）の系がの理解がされてきたが，実際は極めて多くの培養十分でない。また 2 次代謝産物の生合成にはシト

不可能な微生物が環境中に生息していることが明

クロム P450 による酸素添加反応が多いが大腸菌

らかになってきた。近年，このような培養不可能

はシトクロム P450 の遺伝子を保持していないたな微生物による物質生産が注目されてきている。 め，この反応に必須な電子供与体（ferredoxin およ
海洋生物などから見出される生物活性物質の多く

び ferredoxin reductase）が十分でないため異種シは培養が不可能な共生微生物が生産していること

トクロム P450 遺伝子の発現にはこれらの電子供が明らかとなってきた。一説では「我々は地表な与体を導入しなければならない。したがって，物どに生育している微生物の 1％も培養することが質生産の旺盛な上記の問題を解決できるようなグできてないのでは？」とも言われている。このよ

ラム陰性菌から異種発現用の宿主を開発すること

うな微生物は現時点では，単離して純粋培養させが重要と思われる。このようにいずれの種の遺伝ることができないので生産菌のゲノム DNA を純子も包括的に発現できるように，複数の宿主で異粋に取り出すことができない。したがって，目的

種発現系を構築していくことが重要であろう。

代謝産物の生合成遺伝子（群）の解析などが行え

S. avermitilis のゲノム解析結果から染色体の欠ないため以降の研究が進展しない。そこで，この失および再構成によって異種 2 次代謝産物生合成

ような培養不可能な微生物が生息していると考え

遺伝子（群）発現系を開発し，その後多くの 2 次られる環境の試料から直接 DNA を抽出し，得ら

代謝産物の生合成遺伝子群のクローニング，そしれ た DNA を cosmid あ る い は BAC ベ ク タ ー をてそれらの異種発現，さらには遺伝子編集による使って比較的長鎖の DNA のライブラリーを構築

非天然型の代謝産物の誘導体化に関する一連の研June 2021

THE JAPANESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS

究は 2006 年度住木・梅澤記念賞を受賞された新家一男博士との共同研究によって達成された成果である。新家博士との共同研究によって極めて有用な成果を得ること並びに革新的な物質生産系の技術を開発することができたことに関して改めて同博士に感謝を申し上げたい。

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74―2

June 2021

Development of the next-generation system for the productionof secondary metabolites using heterologous expressionof genes encoding secondary metabolite biosynthesis
Haruo Ikeda
Kitasato University
After analysis of gene cluster for avermectin（used as a group of antiparasitic agents in humanand veterinary medicine）biosynthesis was completed, we got the chance to analyze the genome ofavermectin-producing Streptomyces avermitilis. Species of the genus Streptomyces（order
Actinomycetales）of major pharmaceutical interest because they synthesized a variety of bioactive
secondary metabolites. The linear chromosome of S. avermitilis contains 9,025,608 bases and 7,574
potential open reading frames. Furthermore, more than thirty gene clusters related to secondary
metabolite biosynthesis were identiﬁed, but almost gene clusters were cryptic state. Comparison
with a couple of Streptomyces genomes revealed that an internal 6.5-Mb region in the S. avermitilis
genome was highly conserved with respect to gene order and content, and contained all known
essential genes, but the terminal regions in both ends were not conserved and preferentiallycontained nonessential genes, including genes concerning secondary metabolite biosynthesis. In
consideration of the genome information, S. avermitilis was constructed as a versatile model hostfor heterologous expression of genes encoding secondary metabolite biosynthesis. More than fortyof the entire biosynthetic gene clusters for secondary metabolites were successively cloned andintroduced into an engineered versatile host of S. avermitilis SUKA（Special Use of Kitasato
Actinomytales）series. The production of metabolites in some transformants containing exogenous
biosynthetic gene clusters was higher than that of the original producers, and some cryptic
biosynthetic gene clusters in the original producer were also expressed in an engineered host SUKA
strains. By using our versatile host and bioinformatics of enzymes, many terpene synthases werediscovered from bacterial origin and 13 previously unidentiﬁed cyclic sesquiterpenes and diterpenes
were isolated. Our innovative system concerning an engineered host and a couple of useful vectors
was applied to create a new technology for the derivatization of peptide products（ribosomallysynthesized and modiﬁed by post-translationally）and polyketide compounds synthesized by type I
modular polyketide synthases（PKSs）. Heterologous expression of many constructs in anengineered host SUKA strain gave 35 designed prethioviridamide derivatives, along with several
unprecedented analogues. Cytotoxicity assay revealed that several derivatives showed more potent
activities than those of natural product. The strategy can become one of the potential ways to
produce supreme unnatural products. Although intense studies have established various
methodologies for protein engineering of type I modular PKSs, the accurate targeting of desired
regions in the PKS gene is still challenging due to the high sequence similarity between its modules.
We developed an innovative technique to edit a target region of the gene encoding type I modular
PKS. Proof-of-concept experiments using rapamycin PKS as a template showed that heterologous
expression of edited biosynthetic gene clusters produced almost all the desired derivatives. Our
technique will provide a platform to generate rationally designed natural product derivatives for
future drug development.