タ イ産お よ び中 国産 食用 ハ ーブ 類 にお け る抗 ア レルギ ー成 分 の探 索

33

〈平成15年度〉

タイ産 お よび中国 産食 用ハ ー ブ類 にお ける
抗 ア レルギ ー成 分 の探索
園

山

慶(北海道大学大学院農学研究科応用生命科学専攻)

1.はじ め にて,抗 ア レルギ ー作用 に関連 した薬効が 伝承 され
てい るタイ産お よび中 国産食用 ハーブ類 に着 目 し近年,わ が国 にお ける ア レルギ ー性疾患 患者数た。約80種 のハ ーブ類 の抽出液 につい て,肥 満細は増加 の一 途をた どって いる。 アレルギ ーは1〜

胞 のモデ ル細胞 として ラ ット好塩 基球 白血病細 胞IV型の4つ に分類 され,そ の主た る もの は1型 ア株(RBL‑2H3細レル ギーで ある。1型 ア レルギー の機序 として,ミン等 と共に放 出され るβ一ヘ キソサ ミニダー ゼ

肥 満細 胞膜 上 の高親和 性受 容体 に結 合 したlgE抗遊離 量 を脱穎粒の 指標 とした簡便 なス クリーニ ン胞)を 用 い,脱 穎 粒の際 にヒ スタ

体 に アレル ゲンが結合 す るこ とが刺 激 となって肥グ法 に よって抗 アレルギ ー作用 を評価 し,活 性 の満 細胞 の脱穎 粒が起 こ り,ヒ ス タミ ンや新 たに生

高 い植物抽 出物 よ り抗 アレルギ ー物 質の単 離 ・同成 され るロ イコ トリエ ン等 の脂質 メデ ィエ ー タが定 を行っ た。更 にマウス を用い た受身皮膚 アナ フ

放 出 され て 炎症 が惹 起 され る こ とが 知 られ ていィラキ シー(PCA)試る。 また脱穎粒 に ともなっ て肥満細 胞か ら放 出 さ効果 も評価 した。

れ る様 々な炎症 性サ イ トカイ ンが好 酸球等 を活性化 させ,ア レルゲ ン暴 露か ら数時 間以上経過 した

2.実

験 に よ り,invivoに おけ る

験材料 および 方法

後 に発現 す る炎 症を引 き起 こすこ とも知 られてい2.1ハる。 したがっ て,肥 満細 胞 はア レルギー予 防 ・治

風 乾 したハーブ81種 を破 砕 した のち,乾 燥 重量ーブ類 抽出液 の調製

療 の重要 な標 的のひ とつ とな りう る。 実際,脱 穎の10倍 量(v/w)の50%メ

粒抑 制薬 はア レルギー に対す る医薬 品の主要 な もで一 晩放置 した。抽 出液 を減圧濾過 して得 られ た

タノール を加 えて室温の であ り,こ の 中で クロモ グリク酸 ナ トリウム,濾液 の一部 を濃縮乾 固 し,50%ジ

トラニ ラス ト,ア ンレキサ ノクス などは天然物 かシ ド(DMSO)にら単 離 された成 分を リー ド化合 物 として創製 されこ こで植物体0.lg由来 の抽 出物が 溶媒1mlに 溶解

メチル スルポ キ溶 解 し,こ れ を被験溶 液 とした。

た 医薬品 であ る。最 近 ではキ ク科植物 由来 フラボ

して いる時の濃 度 を1抽 出単 位(1n)とノイ ド類 および シ ョウ ガ科 植物 由来 フェニ ルプロ

この単 位 を用 いた。 被験溶 液は0.Ol,0.1,lnとパ ノイ ド類 の脱穎粒 抑制効 果が 確認 され,今 後 さる ように溶解 した。

し,以 下らなる詳細 な構造活 性相 関や作 用機序 の解明 など

2.2細を経 て 医薬 品へ 応 用 され る ことが 期待 されて いRBL‑2H3細 胞 は10%ウ シ胎 児血 清 添加DMEMるL㌔な胞培 養お よびinvitro脱穎粒 阻害試 験を基本培 地 として37℃,5%CO2環

境 下で培 養 し

本研 究で は,ア レルギ ー疾患 治療薬 のリー ド化た。コ ンフルエ ン ト前の 細胞 を24ウ ェル 平底 プ レ合物 の 開拓 お よび機 能性 食 品へ の 応用 を志 向 しー トに8×105cells/wellず つ播 種 し,24時 間培 養

34

浦 上財 団 研究 報告 書Vo1.13(2005)

し た 後,以下 に述べ る脱穎粒 阻害試験 に用 いた。

す な わ ち,抗腹腔 ある いは経 口投 与 した。経 口投与す る場 合には一夜 絶 食 し,ま た被験物 質 は0.3%カ ルボキ シメ

ジ ニ ト ロ フ ェ ノ ー ル(DNP)‑lgEモノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 培 地 に 加 え(50ng/ml),2時

チ ルセル ロース溶 液に溶解 して投 与 した。採取 し間 イ ン キ ュ ベ ー ト後,細胞 を500,ulのた耳 殻 は0.7m1の1M水ー ド緩 衝 液(MT)で2回洗 浄 し た 。 次 に500,ulのMTおよ び10,ulのュ ベ ー ト し,抗て30分

変法 タ イロ被 験 液 を 加 え10分

間プ レイ ンキ原(DNP‑HAS,50ng/ml)を

加 え

間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後,上た 。 一 方,細清 を採 取 し

胞 は0.1%TritonX‑100/MTを添加 し酸 化 カリウ ム中で37℃ で

一 晩イ ンキュベ ー トして溶解 後,0 .6Nリ ン酸:アセ トン(5:13)の混 合溶媒 を9.3ml加えた。 激 しく撹 拝 した後 に遠 心分離 を行 い,そ の上清 の吸光度(620nm)を3.結

測 定 した。

果 および 考察て 溶 解 し た 。 培 養 上 清 な ら び に 細 胞 溶 解 液50,ulを96ウ

ェ ル 平 底 マ イ ク ロ プ レー トに 移 し,β一 ヘ

RBL‑2H3細 胞の脱穎 粒阻害 ア ッセ イの結 果,食キ ソ サ ミ ニ ダ ー ゼ 活 性 を 測 定 し た 。 す な わ ち,

用ハー ブ81種 の うちArecacatechu種 子 が強 い阻害

100ulの効果 を示 した(Tablel)。A.catechu種

N一基 質 溶 液(3.3mMp一

ア セ チ ル ー β一D一エ ン 酸 緩 衝 液pH4.5)を

ニ ト ロ フ ェ ニ ルー
グ ル コ サ ミニ ド/0.1Mク
間 イ ン

成熟種子 で ある。駆 虫薬 として用 い られ,抗 酸化

リシン緩衝 液効果,抗 変異 原性効 果,抗 うつ病効 果,血 圧降下

イクロプ レー ト

作用 な ど生 体で の様 々な機 能性 が報 告 され て い

吸光 度を測 定 した。以下 の式る3 61。含有 成分 と して はarecolineなどの アル カ

加 え て37℃

キ ュ ベ ー ト し た 後,100,ulの2Mグ
pH10.4を加 え て 反 応 を停 止 し,マリ ー ダ ー で405nmの子 は生薬名槙榔子(ビ ンロウ ジ)と い い,シ ュロ科の 橿榔 ので30分

ロ イ ドや縮 合 タンニ ン,一 種 の紅 色素 などが知 らに よ り遊 離 率 を 求 め た。

れ てい る3。 イン ド,東 南 ア ジア諸 国で は檀榔子の切 片に石 灰,阿 仙 薬時 には ショウズ クを混ぜ こ

β一 ヘ キ ソサ ミニ ダ ー ゼ 遊 離 率(%)=
刺激で遊離したaヘキソサ ミニダーゼ量一自然遊離量れ をキ ンマ の葉で 包み ガムの ように噛 む咀噛性 嗜X100

好 品と して賞用 されてい る。本研 究で はこの もの

細胞内全β一ヘキソサミニダーゼ量一自然遊離量に含 まれ る肥満細 胞脱穎粒 阻害 成分 を追 求 した。
2.3マ

ウス を用 いた受 身皮 膚 アナ フ ィラキ シー試 験BALB/cマ

ウス に抗DNP‑IgEモ ノ クロー ナル抗体(2μg/頭)を

A.catechu種 子乾 燥物(50g)を50%メ

タノール

で抽 出 し,抽 出物 を減圧乾 固 して50%メ タノール

静 脈投与す る ことに よ り受動免抽 出物(15。9g)を 得た。 これ を水 と酢酸 エチ ルで振 盟分配 して水可 溶性画 分(15.38)と 酢 酸エ チル

疫 した 。24時 間後 に,ア セ トン:オ リー ブオ イル

可 溶性画 分(0.6g)に(1:1)にについて 阻害活性 試験 を行っ た結果,水 可溶性 画溶解 した0.15%2.4一 ジニ トロフ ルオ分画 した。 それぞ れの 画分

ロベ ンゼ ン25ｵ1を 耳殻 に 塗布 す るこ とに よ り皮分 に強 い活性が 認め られたの で,Schemelに膚ア ナフ ィラキ シーを惹起 した。惹 起1時 間後 にた よ う に この 画 分 か らDiaionHP20お0,5%エ バ ンスブ ルー/PBS(0.5ml/頭)をHPLCに尾静 脈投与 し,そ の30分 後にエ ーテル麻 酔下で 頸椎脱 臼よ り活性 成分 を 単離 し,FAB‑mass分

お よびNMR低示しよ び逆 相析

温 測 定 に よ りプ ロ シ アニ ジ ンB1に よ り屠殺 し,耳 殻 を採取 して滲 出 したエバ ンス(PBI)と 同 定 した(Fig.1)。

ブ ルー量 を定量 した。被験 物質 は惹起1時 間前 にによ り2〜8量

さ らに同様 の分画体の プロ シアニジ ンを確認 し,こタイ 産お よび 中 国産 食用 ハー ブ類 にお ける 抗 ア レルギ ー成 分の 探索

TablelRBL‑2H3細35

胞における食川ハーブ類抽出物のβ一ヘキソサ ミニダーゼ遊離 阻害効果

1nは0.lgの乾燥試料をlmlの溶媒で抽 出した ときの濃度

れ らがA.catechu種 子 抽 出物 の脱 穎粒 阻害 活性 にい る。A.catechu種 子 の成分 として もす でに5量

大 き く寄与 して いるこ とが明 らかに なった。

体 までのプ ロシアニ ジ ンが確 認 されてお り7'81,そプロ シアニ ジンは縮合 タ ンニ ンの一種 で,カ テ

れに加 えて本研 究で新 た に6〜8量体 も確認 され たキ ン類 を構 成単 位 と して4β一8,あ るい は4β一6でこ とになる。 近年,プ ロ シアニ ジンの機能性 に 関結 合 した オ リゴマ ーお よびポ リマ ー か ら構成 さして抗 鶴 蝕 作 用 田,血 圧 降下 作 用61,抗 酸 化作

れ,リ ンゴ,ブ ドウ,ブ ルーベ リー など多 くの高用1°"11,育毛 作用'21などの報 告がな されて いる。 ま等植 物に広 く見 出され ている。 食品 中では苦 味,た,抗 ア レルギー作用 に関 して は,プ ロシアニ ジ

収敏 性 を与 え,色 素に も寄与す る ことが知 られてン2〜15量 体 を主成 分 とす る リンゴ由来 の縮合 タ

36

浦上 財 団研 究報 告書VoLl3(2005)

SchemelA.catechu種

Procyanidin61

Procyanidins(n=0‐5)

Fig.lA.catechu種

ンニ ンが 細 胞内 への子抽出物の分画

子抽 に含 まれ る プ ロ シ ア ニ ジ ン類 の 構 造〉̲Ca一
流入 を制 御す る こ とににプ ロ シアニ ジン2量 体で あ るPB1,PB2においより肥 満細胞 の脱穎 粒 を抑 制す るこ とが報 告 されてはPBIの 方 が活性 が強 いこ とか ら,重 合度 の違お り正3,本研 究の結果 と合致 する。

いだけ でな く構 成単位 の立体構 造 も活性 に影響 す

本研 究で は更 にプロ シアニ ジン類の重 合度 と活性の 関係に ついて の知見 を得 るため,(+)カるこ とが 示唆 された。

テ以上 の よ うにA.catechu種 子抽 出物 がinvitroに

キ ン,(一)一 エ ピカテ キ ン,プ ロシアニ ジン2,3おけ る肥 満細胞 脱穎粒 阻害成 分を含 むこ とが 明 ら

量体 および よ り重合 度の高 い プロシア ニジ ン多量か となったの で,こ の もの がinvivoに おい ても有体 の混 合物 をRBL‑2H3細 胞の 脱 穎粒 阻害 試 験 に

効 で あ るか否 か につ いて マ ウス のPCA試 験 に よ供 した。そ の結果,重 合 度が高 くなる ほど活性 がり評価 した。Fig.2Aに 示 した よ うに,A.catechu

強 くなる傾 向が認 め られ た(Table2)。

種 子抽 出物水可 溶性部 を腹腔投 与 した群は,溶 媒

また,共タイ 産お よび 中国 産 食用 ハ ーブ 類 にお け る抗 ア レルギ ー成 分 の探索

Table2TRBL‑2113細II包Fig.2A.catechu種r抽(PBS)をにお け る プ ロ シ ア ニ ジ ン オ リゴ マ ー のa一37

ヘ キ ソサ ミニ ダ ー ゼ 阻くi効 果

出物がマウスの受身皮膚アナ フィラキシー(血 管透過性充進)に 及ぼす影響

腹腔 投与 した陰性 対照群 に比 べて有 意

到達 し大腸 フロー ラによっ て様々 な芳香族有 機酸に低値 を示 し,ま たその抑 制効果 は濃 度依存 的でに分解 され これ らが生 体内 で様々 な機能性 を示す

あ り,更 に陽性対 照 として用い たケ トチフ ェンよとい う見方 が一般 的の よ うであ るis.z°1。
これ らのり も 抑 制 効 果 が 高 か っ た。 し た が っ て,A.

こ とを考 慮す る と,A.catechu種 子抽 出物 を 経 口catechu種子 抽 出物 は生 体 内で も肥 満細 胞 の脱 穎投 与 した場合 には プロシア ニジ ン多 量体が生 体内

粒 を抑 制す る ことが示唆 された。 一方,経 口投 与に吸収 され て肥 満細胞 の脱穎 粒に影 響を及 ぼす とした場 合 にはや は り脱穎粒 を抑制 す る傾 向が見 らは考 え に く く,経 口投 与 したA.catechu種 子 抽 出れ たものの,統 計 的な有 意差は認 め られなか った物が有 効で ある とす れば,腸 内細菌 に よる代 謝産(Fig.2B)。 プロ シアニ ジン単量体,す なわ ちカ

物が そ の効 果 を担 って いる と考 え るべ きで あ ろ

テ キ ンは小 腸で吸収 され,そ れ 自体お よびそ のメう。今 後,プ ロシ アニジ ンの生体 内への吸収 ・代

チ ル化体 が尿 中で確認 されてい る'↓'51。
プ ロシア

謝の動 態が よ り詳細 に明 らかに される ことが期待

ニ ジ ン2量 体 につ い て も,コ コ ア のPB2お よびされ る。

PB5が ラ ッ トの 小腸で 少量で はあ るが吸 収 されるとい う報 告 や'61,PB2も し くは それ を含 む ココア

本研 究 を遂 行す るにあた り,研 究 助成金 を賜 り

飲料 を摂取 した場合 の ヒ トお よびラ ッ トの血 中おま した浦上食 品 ・食 文化振 興財団 に心 より感謝 申

よび尿中 に低い レベルで確 認 された とい う報告 がし上 げます。

な されて い る'7〜'91。
そ れに対 し,プ ロ シアニ ジ ン
3量 体以上 で はinvivoで吸収 が確 認 されて いる例
は ほとん どない。摂 取 した高分子 プ ロシア ニジ ン
は小 腸で はほ とんど吸収 されず,大 部 分が大腸 に文

献1)Matsuda.H.,Morikawa.T.,Leda.K.,Managi,H.,andYoshikawa,M.(2002)BiooYg.Med.Chem.10:3123‑3128.

382)Matsuda.H..Morikawa。T.,Managi,H..andYoshikawa.
N.1.(2003)Bioorg.ノfiled.Che〃z.L6#.13:3197‑3202.
3)Wang.C.K,andLee,W.H.(1996)/ノAgri'̀.F∂oゴChe〃2.
44:2014‑2019.
4)Dar,A.andKhatoon.S.(2000)Pharmacol.Biochem.
Behay.65:1‑6.
5)Dar.A.andKhatoon.S.(1997)PhytotheyRes.15:174‑176.
6)Inokuchi.J.,Okabe.H.,Yamauchi.T..Nagamatsu.a.,
Nonaka.G.andNishioka,1.(1986>LifeSci.38:1375‑1382.
7)Ma.Y.T..Hsu,F.L..Lan.S.J.andChen.C.F.(1996)J.
Chin.Chem.Soc.43:77‑81.
8)Nonaka.G.,Hsu.F.L.andNishioka.1.(1981)J.Chem.
Soc.Chem.Commun.781‑783.
9)Yanagida,A.。Kanda,T.,Tanabe,M.,Matsudaira,F.andCordeiro,J.G.0.(2000)J.Agric.FoodChem.48:X666‑671.
10)Koga.T..¥Toro.K..¥akamori,K.,Yamakoshi,J.,
Hosoyama.H..Kataoka,S.andAriga.T.(1999)J.Agric.Food
Chem.47:1892‑1897.
11)Gaulejac,N.S.C,Vivas,N,Freitas,V.andBourgeois,G.
(1999)J.Sci.FoodAgric.79:1081‑1090.
12)Takahashi,T..Kamiya.T.andYokoo.Y.(1998)Acta
Derm.Venereol.78:428‑432.

浦上 財団 研究 報 告書VoLl3(2005)

13)Kanda.T.,Akiyama.H.,Yanagida.A..Tanabe.M.,Goda.
Y..Tovoda.M.,Teshima.R..andSaito.Y.(1998)Biosci.
Biotechnol.Biochem.62:1284‑1289.
14)Gonthier,NI.P.,Chetnier,V.,Donovan,J.L,Manach.C.,
Morand,C.,Mila,1.,Lapierre,C.,Remesy.C.andScalbert,A.
(2003)J.Nutr.133:461‑467.
15)Gonthier,M.P.,Donovan.J.L,Texier,0.,Felgines,C.,
Remesy,C.andScalbert.A.(2003)FreeRad.Biol.Med.35:837‑844.
16)Soencer.J.P.E.,Schroeter,H..Shenoy.B.,Kaila.S.S..
Debnam.E.S.andRice,E.C.(?001)Biochem.Biophys.Res.
Commun.285:588‑593.
17)Steinberg,F.M.,Holt.R.R.,Schmitz,H.H.andKeen.C.
L.(2002)J.NutrBiochem.13:645‑652.
18)Baba.S..Osakabe.N..Natsume.M.andTerao.J.(2002)
FyeeRad.Biol.Med.33:142‑148.
19)Holt.R.R..Lazarus.S.a..Cameron.S.Vii..Zhu.Q.1'..
Schramm.D.D.,Hammerstone.J.F.,Fraga.C.G..Schmitz.
H.H.andKeen。C.L.(2002)ノ1解.J・Clin.ハ20)Deprez,S.,Brezillon,C.,Rabot,S..Philippe.C..Mila.L.
Lapierre.C.andScalbert,A.(2000)J.Nutr.130:2733‑2738.

物彪76:798‑804.

Studiesonanti‑allergiccompoundsinThaiandChineseedibleherbes

39

Studiesonanti‑allergiccompoundsinThaiandChineseedibleherbes

KeiSonoyama(GraduateSchoolofAgriculture,HokkaidoUniversity)

Water‑solublefractionof50%aqueous‑methanolextractofArecacatechuseed,aThai
edibleplant,wasfoundtoinhibitreleaseofβ

一hexosaminidase,amarkerofantigen‑IgE‑

mediateddegranulation,inRBL‑2H3.Fromtheactivefraction,procyanidinBIwasisolatedas
anactivecompound.Inaddition,procyanidinoligomerswerefoundtocontributetothe
inhibitoryaction.Intraperitonealinjectionofthewater‑solublefractionofA.catechuseed
extractsuppressedthepassivecutaneousanaphylaxisinmice,suggestingthattheextract
inhibitsthedegranulationofmastcellsinvivo.Howeveritremainsdebatablewhetheroral
administrationoftheextractisalsoeffective.