Eco-Engineering, 19（2）, 89-94, 2007

原著論文

蛍光計測を用いた Amphidinium sp.の濃度測定―培養時の光質が増殖速度に及ぼす影響―
Measurement of Amphidinium sp. Cell
Concentration by Fluorometric Method― Effects of Light Quality on Growth Rate ―小西充洋 1、大政謙次 1＊、林正雄 1、増田篤稔 2、小澤知子 2、津田正史 3
Atsumi Konishi 1, Kenji Omasa1＊, Masao Hayashi 1, Atsunori Masuda 2, Tomoko Ozawa 2, and Masashi Tsuda3

1 東京大学大学院農学生命科学研究科 〒 113-8657 東京都文京区弥生 1-1-1

The University of Tokyo, Graduate School of Agricultural and Life Science,1-1-1 Yayoi Bunkyo, Tokyo 113-8657, Japan
2 ヤンマー株式会社環境事業開発部マリンファーム 〒 873-0421 大分県国東市武蔵町糸原 3286
Environmental Plant Engineering Dept., Marine Farm, Yanmar Co., Ltd.,
3286 Itohara, Musashi-Cho, Kunisaki-City, Oita 873-0421, Japan
3 北海道大学大学院薬学研究院 〒 060-0812 札幌市北区北 12 条西 6 丁目
Hokkaido University, Graduate School of Pharmaceutical Science, North
12th, West 6th, Kita, Sapporo-City, Hokkaido 060-0812, Japan（2006 年 11 月 9 日受付、2007 年 3 月 12 日受理）

ABSTRACTIn this study, a convenient and stable measurement method of cell concentration of Amphidinium sp. growing inculture solution was developed and it was applied to investigation of effects of different light property on growth rates ofthe algae. As cell clusters of the algae were observed when the concentration was high, the cell concentration measured
with a conventional hemocytometry was underestimated. However, high linear relationships were observed between cellconcentration and chlorophyll fluorescence intensity excited at 470 nm light and measured at 680 nm in spite of highconcentrations. The relationships were represented as the two regression lines. The one belonged to the algae in thewhite, blue and red-blue light LED conditions and the other belonged to it in the red light LED conditions. The growthrate of the algae cultured under blue light was much larger than that under red light, and that under red-blue light（red:blue = 4:1）was larger than that under blue light. These results imply that blue lights are necessary for the algae toproliferate rapidly, and even a bit of blue light has the effect of propagate the algae, and chlorophyll fluorescencemeasurement could be applied to estimation of normally-developed algae cell concentration.

Key words : Amphidinium sp., Fluorescence, Growth rate, Light quality*Corresponding author : Phone: +81-3-5841-5342, Fax: +81-3-5841-8175, E-mail: aomasa@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp© The Society of Eco-Engineering（9）89

助色素としてペリディニンを有し、Chl a および Chl c をも1.

はじめにつ（Papagiannakis et al., 2005）。培養時の光質の違いがこ

海棲性微細藻の一種である渦鞭毛藻（Amphidinium sp.）

れらの色素生成等に影響すると、励起−蛍光マトリックの一部は、抗腫瘍性マクロリド化合物（Amphidinolide）スが変化し、蛍光計測による藻体濃度の測定の際に、誤を産生する（Kobayashi and Tsuda, 2004）。この化合物は単差要因となることが懸念される。

離され、化学構造が解明されつつあり（Tsuda et al., 2003）、そこで本研究では、まず、Amphidinium sp.の培養状態の新しい作用機序をもつ抗がん剤のリード化合物への利用簡便なモニタリング手法を確立するため、白色蛍光灯下が期待されている。現在、マクロリド化合物生産効率ので培養した Amphidinium sp.の励起−蛍光マトリックスを高い種の分子細胞学的なスクリーニングが進められてい調べ、藻体濃度の測定に適した波長の選定を行い、従来るが（Iwamoto et al., 2005）、いまだに Amphidinium sp.のマの血球計算盤を用いた計数法と比較した。次に、培養時クロリド化合物の生産効率は十分でないため、創薬にはの光質が蛍光計測による藻体濃度測定に与える影響を明大量培養の必要がある。Amphidinium sp.は、光合成を行っらかにするため、LED を用いて、赤色光、青色光、赤青て増殖するため、光合成速度や分裂速度を大きくする培混合光を照射する試験区をそれぞれ設け、Amphidinium sp.

養条件の確立と、そのための培養状態のモニタリング手の培養を行い、各区における蛍光強度と藻体濃度の関係法が求められる。

を調べた。併せて、培養時の光質の違いによる最適培養条件を確立するためには、Amphidinium sp.の増Amphidinium sp.の増殖速度を比較した。

殖速度を調べる必要がある。一般に、微細藻類の増殖速2. 材料および方法度を調べるためには、血球計算盤による顕微鏡下での直接計数が用いられるが、この方法は非常に労力を要する供試材料上に、サンプリングの仕方によって誤差が生じやすい。

供試材料には、北海道大学大学院薬学研究科で継代培

そのため、簡便で安定した藻体濃度の測定手法が求めら養された Amphidinium sp.を用いた。培養液にはオートクれる。また、非接触で藻体濃度が計測できれば、実際のレーヴ済みの海水に P-ES 培地 1 ％を加えたものを用いた。

培養時に培養槽の外から増殖速度をモニタリングできる

200 ml 三角フラスコ内に、調製した培養液および種となシステムを構築することが可能となる。このような非接る Amphidinium sp.を入れ、シリコ栓で蓋をした。培養時

触計測手法の一つとして、蛍光計測がある。の光合成有効光量子束密度（PPFD: Photosynthetic photon

蛍光計測手法の一つである励起−蛍光マトリックス計

flux density）は 50 μmol m-2 s-1 とし、明期は 16 時間で 25.5測では、多数の励起波長および蛍光波長における蛍光強℃に保ち、暗期は 8 時間で 24.5 ℃とした。

度が網羅的に調べられるため、未知の情報を検出するの血球計算盤による直接計数と蛍光計測の比較に適している。このため、海水中に含まれる様々な有機本実験には、白色蛍光灯下で 30 日間培養した物の検出などに用いられているが（Kowalczuk et al., 2005）、Amphidinium sp.を用いた。培養した Amphidinium sp.の懸濁藻体濃度の測定に適した波長の選定にも利用できると考液を液体培地によって希釈し、濃度の異なる試料を調製えられる。

した。用意した試料の濃度は、希釈前の原液の濃度を 100

一方、光合成能力や分裂速度に影響を及ぼし、増殖速％として、50 ％、33 ％、25 ％、20 ％、14 ％、および 10度を変化させる可能性がある要素の一つとして、培養時％とした。これらの試料に含まれる藻体濃度を Burker-の光質があげられる。実際、珪藻を用いた研究では、異Turk 型の血球計算盤を用いて顕微鏡下で計数した。計数

なる光質条件下で増殖速度を比較したところ、強光照射時の顕微画像の撮像には CCD（Charge-Coupled Device）

時には光質による差異が見られないが、弱光照射時にはカメラ（SONY, XC-999）を用いた。計数は各濃度の試料青色光照射による増殖促進効果があることが報告されてに対し 6 回ずつ行った。この計数によって得られた藻体濃いる（Mouget et al., 2005）。さらに、青色の弱光照射に度と試料濃度との関係を調べた。

よって、Chl a、Chl c およびフコキサンチン等のカロテノ

励起−蛍光マトリックス計測には、3 次元分光蛍光光度イド類が増加することなども知られている（Mouget et al.,計（HITACHI, F-4500）を用いた。励起波長は 10 nm 刻み

2004）。しかしながら、培養時の光質が Amphidinium sp.のに 300 nm から 800 nm とし、蛍光波長は 10 nm 刻みに 350

増殖速度や色素量に与える影響については調べられていnm から 850 nm とした。蛍光波長 500 nm 以上の計測時にない。また、Amphidinium sp.は細胞壁をもたず、光合成補は、励起光の 2 倍光、3 倍光の影響を防ぐために、黄色の90（10）Eco-Engineeringロングパスフィルター（HOYA, Y-48）を用いた。計測は体濃度に高い相関が見られた。これは、上述の塊の影響各濃度の希釈試料ごとに 3 回ずつ行った。Amphidinium sp.

がなくなったためと考えられる。濃度 100 ％の試料を撹の沈降の影響を軽減するために、マイクロピペットを用拌しただけでは塊はなくならなかったことから、試料のいてセル内で十分に撹拌した後、速やかに計測した。励希釈により多糖類が溶解した可能性が考えられる。これ

起−蛍光マトリックスから得られた各波長における蛍光らのことから、血球計算盤を用いて Amphidinium sp.の藻強度と試料濃度との相関を調べ、その決定係数のマト体濃度を計数するには、増殖に伴って形成される塊を破リックスを算出した。

壊するか、塊部分とそれ以外の部分が平均化されるのに異なる光質下における培養十分な回数だけ計数する必要があるといえる。

培 養 室 内 に 、 赤 色 お よ び 青 色 の LED（ IMAC, IDB-

Fig. 2 に、蛍光灯下で培養された Amphidinium sp.試料のC27/34R, B）を設置することで、赤区、青区、赤青混合区

励起−蛍光マトリックスの経時変化を示す。励起波長 300を設けた。これら 3 区において、培養フラスコの中心のnm から 400 nm、蛍光波長 350 nm から 500 nm に蛍光強度

PPFD が 50 μmol m-2 s-1 となるように LED からの出力およの大きい領域が見られた。また、この領域における蛍光びフラスコと LED との距離を調節した。赤青混合区の強度のピークは励起波長 320 nm、蛍光波長 380 nm であっ

PPFD 比は赤：青＝ 4 ： 1 とした。培養は株分け後から 30た。さらに、この領域の蛍光は培養開始後 0 日目から見ら日間行い、3 日ごとに励起−蛍光マトリックス計測を行っれ、その強度は培養時間に伴い増加した。そのため、こた。1 つのフラスコにつき 3 回ずつ励起−蛍光マトリックの領域の蛍光は、P-ES 培地および海水に含まれていた物

ス計測を行い、その平均値をそのフラスコ内で培養され質、または、Amphidinium sp.の増殖に伴い生成された物質

た Amphidinium sp.の励起−蛍光マトリックスとした。まから発せられたと考えられる。この蛍光を発する物質がた、1 つの区につき 3 つの培養フラスコを用意し、同一区藻体内に存在するか、藻体外に存在するか確かめるためにおける蛍光強度のばらつきを確認した（n=3）。蛍光強に 、 試 料 を 孔 径 0.20 μm の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー

度と藻体濃度の換算には、血球計算盤によって計数可能な濃度範囲の試料を用いて予め算出した検量線を用いた。

3.

結果および考察

血球計算盤による直接計数と蛍光計測の比較
Fig. 1 に、試料の希釈後の濃度と血球計算盤によって計数された藻体濃度の関係、および、試料濃度 100 ％の計数時における血球計算盤の画像を示す（Fig. 1-B, C）。回
帰直線および決定係数は、試料濃度 100 ％のときの計数値を除いたものから算出したものを示す。希釈後の濃度が 50 ％以下のときには、希釈濃度と藻体濃度の間にほぼ直線的な関係がみられたが、濃度 100 ％の計数値は回帰直線から予想される値より小さかった（Fig. 1-A）。濃度100 ％のとき、血球計算盤上に Amphidinium sp.が散らばって見られる場合（Fig. 1-B）と、数十個の個体からなる塊が見られる場合（Fig. 1-C）があった。
Amphidinium sp.は増殖に伴い、粘性のある多糖類を合成することで、培養瓶の底などに定着する。Amphidinium sp.の塊は、この粘性多糖類によってできたと考えられる。
塊が形成されると、それ以外の部分では藻体濃度が小さくなる。濃度 100 ％の計数値が回帰直線から予想される値より小さかったのは、塊部分とそれ以外の部分が平均化されるには計数回数が不十分だったためと考えられる。
一方で、希釈後の濃度が 50 ％以下の時に、相対濃度と藻Eco-Engineering

Fig. 1 A relationship between relative density (dilution ratio) of
Amphidinium sp. culture solution and cell concentration of thealgae measured with a hemocytometer (A). Microscopic
images of the cell cluster in relative density of 100 % (B andC).

（11）91

Fig. 2 Changes in excitation-emission matrices (EEM) of Amphidinium sp. culture solution measured with the spectrofluorometer. A, B and C
represent respectively the EEMs of Amphidinium sp. cultured for 9, 21 and 30 days after the dividing into the culture flasks under the whitefluorescent light.

（Advantec Toyo Kaisha, Ltd., DISMIC-25CS）で濾過し、そ決定係数が 0.96 以上を示す領域がみられた。前者は藻体の濾液の蛍光計測を行ったところ、この蛍光は濾過前後外の物質から発せられた蛍光波長の範囲、後者は藻体内でほとんど変化が見られなかった。このことから、本領の Chl a から発せられた蛍光波長の範囲である。上述の通域に発する蛍光は、藻体外に含まれる物質から発せられり、Chl a は藻体内のみに含まれていたため、藻体濃度のたと考えられる。

推定には Chl a 蛍光の計測がより適しているといえる。血

また、培養開始後 30 日目の試料の励起−蛍光マトリッ

球計算盤による計数では過小評価された濃度範囲を含め、クスには、励起波長 300 nm から 670 nm において、蛍光波

Chl a 蛍光強度と藻体濃度に高い相関が見られたのは、励長 680 nm をピークとする蛍光強度の大きい領域がみられ起−蛍光マトリックス計測が一定の計測領域の平均値をた。この領域の蛍光は、培養開始後 9 日目まではほとんど算出する計測法であり、試料内に塊が形成された場合も見られなかったが、その後徐々に増加した。この領域に平均化して計測できたためと考えられる。

おける蛍光強度のピークは、励起波長 480 nm、蛍光波長異なる光質下における培養680 nm であった。一般に、常温における Chl a 蛍光のピー

Fig. 4 に、白区、赤区、青区、赤青混合区における蛍光ク は 680 nm お よ び 740 nm 付 近 に 見 ら れ る た め

強度と藻体濃度の関係を示す。蛍光強度は、いずれも励（Govindjee, 1995, Lichtenthaler et al., 1996）、この領域は Chla 蛍光と考えられる。ピークが 680 nm にしか見られなかったのは、Chl a 濃度が比較的低かったため、蛍光の再吸収の影響が小さく、740 nm の蛍光が相対的に小さくなったことによると考えられる（Hak et al., 1990）。励起波
長域 300 nm から 670 nm において連続的に Chl a 蛍光がみられたのは、Chl c やペリディニン等に吸収された光エネルギーも、最終的に Chl a に伝達されたためと考えられる。
また、試料をメンブレンフィルターで濾過すると、この領域における蛍光は見られなくなった。このことから、
Chl a は藻体内のみに含まれていたといえる。
Fig. 3 に、蛍光強度と、試料濃度との決定係数の励起−蛍光マトリックスを示す。励起波長 300 nm から 550 nm、蛍光波長 350 nm から 420 nm の範囲、および励起波長 300nm から 690 nm、蛍光波長 630 nm から 780 nm の範囲に、

92（12）

Fig. 3 Coefficients of determination between fluorescence intensity
and cell concentration of Amphidinium sp. culture solution.

Eco-Engineering

計算盤による計数値は、藻体濃度が大きくなるにつれてばらつきが大きくなったが（Fig. 5-A）、Chl a 蛍光計測による計数値は比較的ばらつきが小さかった（Fig. 5-B）
。このことから、実際の培養時においても、血球計算盤より蛍光計測を用いた方が安定した藻体濃度測定ができたといえる。また、高濃度時の過小評価は、青区よりも赤青混合区のほうで顕著だった。これは、増殖に伴って塊を構成する藻体数が徐々に多くなったという観察結果から、青区よりも増殖速度の大きかった赤青混合区では、比較的早期に塊が形成されたためと考えられる。
Fig. 5-B において、赤青混合区の藻体濃度は、株分け後
Fig. 4 Relationships between fluorescence intensity and cellconcentration of Amphidinium sp. solution cultured for 30days under red, blue, red-blue LED and white fluorescentlight. R2 represents the coefficient of determination.

12 日目から 21 日目まで急激に増加し、その後はほぼ一定値を示した。また、青区の藻体濃度は、株分け後 18 日目から藻体濃度のほぼ直線的な増加がみられた。一方、30日目には赤青混合区の藻体濃度とほぼ一致した。一方、赤区では、藻体濃度にほとんど変化は見られなかった。

起波長 470 nm、蛍光波長 680 nm における値を用いた。こFig.4 において、例外的に別の回帰直線で表された赤区でれは、Chl a 蛍光強度のピークであった。また、藻体濃度培養した Amphidinium sp.の増殖速度は、その他の区に比は、各区において予め求めておいた血球計算盤による計べ著しく小さかった。このことから、異常な培養状態で数値と試料濃度の検量線から算出した。なお、このときなければ、蛍光計測による濃度測定において、一つの回用いた検量線は、血球計算盤上に Amphidinium sp.の塊が帰直線が適用可能であることが示唆された。

できない濃度範囲で求めた。全ての区において、蛍光強微細藻類である珪藻の研究において、青色光照射に度と藻体濃度の間に高い相関が見られた。また、白区、よって Chl およびカロテノイド類の色素量が増加し青区、および赤青混合区における蛍光強度と藻体濃度の（Mouget et al., 2004）、さらに、増殖速度が大きくなったと関係は一つの回帰式で表されたが、赤区におけるその関いう報告がある（Mouget et al., 2005）。Fig. 4 から、赤区よ係は別の回帰式で表された。さらに、赤区の回帰直線の傾きは他の区の回帰直線の傾きのおよそ 2 倍となった。これは、赤区で培養された藻体一個当たりの蛍光強度がその他の区で培養された藻体一個あたりの蛍光強度のおよそ 2 分の 1 となったことを示している。一般に、暗条件に置いた植物に光を照射すると、Chl a 蛍光の経時変化が見られる（Govindjee, 1995）。しかしながら、励起−蛍光マトリックス計測の励起光は微弱であるため、蛍光クエンチングはほとんどなく、Chl a 蛍光の経時変化もほとんどないと考えられる。したがって、Chl a 蛍光強度の違いは、Chl a およびその他の光合成色素量の違いによる可能性が高い。このことから、赤区で培養された Amphidinium sp.
は、他の区で培養されたものよりも、藻体一個あたりの光合成色素量がおよそ 2 分の 1 であったことが推察される。
Fig. 5 に赤区、青区、赤青混合区において、血球計算盤による直接計数から得られた藻体濃度の経時変化、および、励起波長 470 nm、蛍光波長 680 nm における Chl a 蛍
光強度から換算された藻体濃度の経時変化を示す。血球

Eco-Engineering

Fig. 5 Changes in cell concentration of Amphidinium sp. solution
cultured under red, blue and red-blue LED measured by thehemocytometry (A) and by fluorometory (B). The vertical bars
represent the width form minimal to maximal values.

（13）93

りもその他の区で培養された Amphidinium sp.に光合成色素量が多く含まれたことが示唆され、Fig. 5 から、赤区よ引用文献

りも青区および赤青混合区で培養された Amphidinium sp.

Govindjee, 1995 : 63 years since Kautsky - Chlorophyll-aの藻体濃度増殖速度は、顕著に大きかった。このことか

fluorescence, Austral. J. Plant Physiol, 22, 131-160.

ら、Amphidinium sp.においても、青色光照射が藻体内の色

Hak R., Lichtenthaler H. K. and Rinderle U., 1990 : Decrease of the

素量を増やし、増殖速度を大きくする効果がある可能性

chlorophyll fluorescence ratio F690/F730 during greening andが示唆された。さらに、青区に比べ、赤区における増殖

development of leaves radiation and development of leaves, Radi.

速度が極端に小さかったこと、また、赤青混合区の PPFD

Environ. Biophysics, 29, 329-336.

比が赤：青＝ 4 ： 1 と、青色光割合が小さかったにもかかIwamoto R., Kobayashi J., Horiguchi T. and Tsuda, M., 2005 : The

わらず、青区よりも赤青混合区で培養した Amphidinium

discrimination of marine Amphidinium species(Dinophyta)thatsp.の増殖速度が大きかったことから、青色光強度は小さ

producing cytotoxic macrolides using hybridization methods,

くても Amphidinium sp.の増殖には大きな影響があると考Phycologia, 44, Supplement, 104

えられた。

Kim, M., McMurtrey J., Mulchi C., Doughty C., Chappelle E. W. andChen Y., 2001 : Steady-state multispectral fluorescence imaging

4.

おわりに

system for plant leaves, Applied Optics, 40, 157-166.

本研究では、励起−蛍光マトリックス計測を用いて、Kobayashi J. and Tsuda M., 2004 : Amphidinolides, bioactive

Amphidinium sp.懸濁液の濃度測定に Chl a 蛍光計測が適し

macrolides from symbiotic marine dinoflagellates, Nat. Prod. Rep.,ていることを示した。Chl a 蛍光計測を用いると、増殖に21, 77-93.

伴い形成される塊を破壊する処理を必要とせず、簡便か

Kowalczuk P., Ston-Egiert J., Cooper W. J., Whitehead R. F. and

つ安定した藻体濃度測定が可能となる。また、Chl a 蛍光

Durako M. J., 2005 : Characterization of chromophoric dissolved

計測は原理的に培養槽の外側から増殖速度を把握するこorganic matter(CDOM)in the Baltic Sea by excitation emissionとが可能であり、工場などでの実際の培養時にも適用可

matrix fluorescence spectroscopy, Marine Chem., 96, 273-292.

能と考えられる。将来的には、LED やレーザーなどを励

Lichtenthaler, H. K., Lang M, Sowinska M., Heisel F. and Miehe J.

起光源として、Chl a 蛍光を計測することにより、藻体濃A., 1996 : Detection of vegetation stress via a new high-resolution

度を計測することで、培養状態の管理に用いることがでfluorescence imaging system, J. Plant Physiol., 148, 599-612.

きると考えられる。また、Amphidinium sp.の光合成色素量

Mouget J. L., Rosa P. and Tremblin G., 2004 : Acclimation of Hasleaの増加や増殖に青色光照射が不可欠であること、さらに、

ostrearia to light of different spectral qualities - confirmation of

その青色光強度は小さくても、Amphidinium sp.の増殖速度‘chromatic adaptation’ in diatoms, J. Photchem. Photobiol. B, 75,に及ぼす効果は大きいことが示唆された。光強度ではな

1-11.

く、光質によって藻類の増殖を制御することは、電力コストの削減等につながると期待される。

Mouget J. L., Rosa P., Vachoux C. and Tremblin G., 2005 :Enhancement of marennine production by blue light in the diatom
Haslea ostrearia, J. Appl. Phycol., 17, 437-445.

謝辞

Papagiannakis E., Stokkum I. H. M., Fey H., Büchel C. and Grondelle

本研究を遂行するにあたり、藻類の培養および蛍光計

R., 2005 : Spectroscopic characterization of the excitation energy

測に関する貴重なご意見、ご協力を頂いた遠藤良輔氏

transfer in the fucoxanthin-chlorophyll protein of diatoms,（日本大学大学院総合科学研究科）に深甚な謝意を表する。

Photosyn. Res., 86, 241-250.
Tsuda M., Izui N., Shimbo K., Sato M., Fukushi E., Kawabata J. andKobayashi J., 2003 : Amphidinolide Y, a novel 17-memberedmacrolide from dinoflagellate Amphidinium sp.: Plausible
Biogenetic precursor of Amphidinolide X, J. Org. Chem., 68,9109-9112.

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