日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 93, 19-23, 2019

脳虚血モデルラットにおける全身諸臓器のhigh mobility group box protein 1 発現の変化
植木

皓

介

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：外木守雄 教授，篠塚啓二 助教，浅野正岳 教授）

要旨：細胞が障害されると DAMPs と呼ばれる物質を放出し，脳組織内では炎症性細胞であるマイクログリアの活性化に関与している。DAMPs の一種である HMGB1 は障害に際して核内から細胞外へ放出され，HMGB1 は炎症反応を増強するため，様々な病態との関係が注目されている。脳梗塞における HMGB1 の機能が着目され，脳梗塞発症時の全身諸臓器における HMGB1 発現の報告はない。そこで本研究は脳虚血モデルラットの全身諸臓器ならびに末梢血中 HMGB1 発現変化の検索を目的とした。右側総頚動脈の 30 分間結紮後，結紮を解除し脳虚血モデルとした。術後 24 時間で脳を摘出し，マイクログリアの特異的マーカーの抗 Iba1 抗体による蛍光染色の結果，対照群と比較して結紮群ではマイクログリアが膨化していた。HE 染色による観察では間質部血管拡張を認めたが，リンパ球浸潤等は認めなかった。各臓器の HMGB1 発現を検討した結果，結紮群では，脈絡叢，心筋線維間，肝細胞細胞質，肺胞マクロファージ，尿細管上皮およびボウマン嚢上皮に HMGB1 陽性細胞が認められ，脾臓ではリンパ濾胞周囲に HMGB1 陽性細胞数が増加していた。ELISA による末梢血中 HMGB1 濃度に測定を行った結果，対照群では 20 ± 20 pg/ml であった HMGB1 濃度は，脳虚血後 72 時間で顕著に増加し，120 時間で 120 ± 20 pg/mlの最高濃度に達し，その後はわずかに減少した。脳虚血モデルにおける HMGB1 発現は脳のみならず全身諸臓器においても変化し，これらは脳虚血に随伴する病態の発症に何らかの関連があると考えられた。
キーワード：脳虚血，DAMPs，HMGB1，マイクログリア

緒告が蓄積しつつあり，その機能的な役割が注目されてい言る 5,6）。

日本人の死因の第 3 位は脳血管疾患であり，その多く

DAMPs の 一 種 で あ る high mobility group boxは脳梗塞である。脳梗塞の予後は患者の年齢や性別，基protein 1（HMGB1）は，本来核内に存在する非ヒストン

礎疾患の有無など，多くの因子により左右される。現在

DNA 結合タンパク質であり，遺伝子構造の維持に関係

ま で の と こ ろ， 脳 梗 塞 に 対 す る 治 療 は tissueする分子である 7）。興味深いことに HMGB1 は，細胞のplasminogen activator などが主体であり ，予後向上の壊死に伴って細胞外に放出される DAMPs の一種である

ためには発症後に脳内で生じる組織学的変化などについことが明らかにされ 8），HMGB1 の病態との関係が注目て詳細に解析する必要がある。一般に生体内の細胞が障されてきた。しかし，脳梗塞に際して全身諸臓器におけ害 さ れ， こ れ に 応 じ て 細 胞 外 に 放 出 さ れ る 物 質 をる HMGB1 の発現状況について比較した報告はない。そdamage-associated molecular patterns（DAMPs）と呼こで本研究では，ラット総頚動脈結紮による脳虚血モデぶ 。DAMPs の放出は障害の状況を周囲の細胞・組織ルにおいて全身諸臓器で HMGB1 発現がどのように変化に伝達する役割があると考えられ，この放出が障害因子しているか検討した。

1）2）の 除 去 と 組 織 の 修 復 を 目 的 と し た 炎 症 を 惹 起 さ せ る。

材料および方法

従って障害部位における炎症は生体にとって必要不可欠なものと考えられる。脳梗塞では低酸素状態に置かれた

1.

実験動物

神経細胞などが障害され，脳梗塞巣においても炎症が起実験には，体重 200 ～ 300 g の Wistar 系雌性ラット（5こるが，正常脳組織内に存在する炎症性細胞はマイクロ～ 6 週齢）を用いた。ラットは，12 時間の明暗サイクルグリアと呼ばれるマクロファージ系の細胞であり，脳梗の環境下，恒温室（23℃）で自由に食物および水分摂取が塞においてはマイクログリアが活性化され形態変化を起できる状態で飼育した。本研究は，日本大学歯学部動物

こすことが知られている実験委員会の承認（AP16 D026）を受け，国際疼痛学会の。近年，脳梗塞におけるマイ3,4）ガイドラインに従って行った。

クログリアの活性化に DAMPs が関与しているとする報（受付：平成 31 年 1 月 28 日）〒 101‒8310 東京都千代田区神田駿河台 1‒8‒13192.

HMGB1 ELISA Kit Ⅱ（シノテスト）を用いて測定した。

脳虚血モデルラットの作成

吸光度の測定は 3550 型 micro plate reader（Bio-Rad）を

5% イソフルラン吸入による麻酔導入後，三種混合麻酔薬（塩酸メデトミジン 0.15 mg/kg ＋ミタゾラム 2 mg/用いた。

kg ＋酒石酸ブトルファノール 2.5 mg/kg）を腹腔内注射

5.

統計学的処理し 全 身 麻 酔 を 施 し た。 麻 酔 施 行 後， 尾 静 脈 よ り 採 血

統計分析は Mann-Whitney U-test を用いて行った。結（~500μl）を行った。頸部の剃毛後，メスにより正中部

果は平均値± SD で示した。P 値が 0.05 未満を有意差あを約 1.5 cm 切開し気管を露出させた。気管後背面に位置りとした。

する右側総頚動脈を剖出し，4-0 ナイロン絹糸を用いて結結紮し，30 分間血流を遮断した（図 1）。処置後，結紮を解除し創部を縫合後，ラットをケージに戻し再び飼育し1.

果

脳虚血におけるマイクログリア細胞の形態変化た。虚血再灌流後 24，72，120 および 168 時間において，虚血再灌流後 24 時間の凍結切片を用いた抗 Iba1 抗体

上記と同様の方法で全身麻酔を施し，尾静脈より採血をによる染色の結果，対照群では細胞体から突出した細い行った。さらに開胸し，経心的に生理食塩水を灌流させ細胞突起が見られたのに対し（図 2 A），結紮群では細胞脱血により安楽死させた後，4% パラホルムアルデヒドおよび突起が共に顕著に膨化していた（図 2 B）。HE 染色を用いて灌流固定を行った。灌流固定後，全身の緒臓器による観察では間質部の血管拡張を認めたが，顕著なリを摘出し，同様の固定液で室温にて 2 日間の固定を行っンパ球浸潤などは認められなかった（図 2 C）。

た。固定後の組織は半割し，一方を 20% ショ糖溶液に2.

48 時間浸漬し凍結切片を，また他方を以下の方法に従っ

各臓器における HMGB1 の発現変化
免疫染色により各臓器における HMGB1 の染色性につてパラフィン切片を作製した。

いて検討した。その結果，脳では，結紮群では脈絡叢に3.

HGB1 陽性反応が認められた（図 3 A）。心臓においては免疫組織染色
灌流固定後の脳，心臓，肝臓，肺，腎臓，脾臓をパラフィ心筋線維間の間質に強い陽性反応が認められた（図 3 B）。

ン包埋し，ミクロトームにより厚さ 4μm の切片を作成

肝臓では，肝細胞の細胞質に弱い陽性反応を認め，このした。キシレンによる脱パラフィンとこれに続く透徹の反応は広範囲にわたっていた（図 3 C）。肺においては，後，内因性ペルオキシダーゼの活性を 3%H2O2-メタノー

肺胞上皮に極めて弱い陽性反応を見るが，肺胞マクロルにより不活化した。切片を流水により洗浄し，1% ウファージの一部に極めて強い陽性反応が認められた（図シ 血 清 ア ル ブ ミ ン 加 リ ン 酸 緩 衝 液（1% bovine serum3 D）。また，腎臓においては尿細管上皮とボウマン嚢上albumin-phosphate buffered saline; 1% BSA-PBS）に室皮の一部に極めて強い陽性反応が認められた（図 3 E）。

温で 1 時間浸漬した。その後，1 次抗体としてウサギ抗いずれの臓器においても対照群では明瞭な陽性反応は認

ラット HMGB1 抗体（100 倍希釈，abcam）により 24 時められなかった。脾臓においても同様の検討を行ったが，間反応させた。反応後，切片を PBS により洗浄し，2 次結紮群では顕著に HMGB1 陽性細胞数が増加していた抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ IgG 抗体（図 3 F，G）。同細胞は正常脾臓においても若干数観察さ（500 倍希釈，Thermo Fisher Scientific）を 1 時間反応されたが，結紮群において濾胞周囲における陽性細胞数のせ た。PBS に よ る 洗 浄 の 後，Envision system antimouse and rabbit（Dako）を室温で 10 分間反応させ発色を行った。蛍光染色は凍結切片を用いて行った。切片を流水により洗浄した後，1% BSA-PBS に室温で 1 時間浸漬した。1 次抗体としてウサギ抗ラット Iba-1 抗体（100倍希釈，abcam）により 24 時間反応させた。反応後，切片 を PBS に よ り 洗 浄 し，2 次 抗 体 と し て green
fluorescence protein（GFP）標識ヤギ抗ウサギ IgG 抗体（100 倍希釈，Thermo Fisher Scientific）を 1 時間反応させた。切片を封入後，蛍光顕微鏡（KEYENCE）により組織像を観察した。
4.

Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）
採血した血液は 25℃で 30 分間静置したのち，4℃にて24 時 間 反 応 さ せ た。 反 応 後，4℃ で 3500 × G，10 分 間
遠心分離し，上清を新しいエッペンドルフチューブに採図1

取 し， 血 清 サンプルとした。血清中の HMGB1 濃 度 は20総頸動脈をナイロン糸で結紮した脳虚血モデルラット
矢印は右側総頸動脈を示す

脳虚血時の全身臓器における HMGB1 発現増加は明らかであった。
3.

末梢血における HMGB1 濃度の変化
末梢血中の HMGB1 濃度について ELISA による測定を行った。その結果，図 4 に示すように対照群の血清においては 20 ± 20 pg/ml の濃度を示したが，脳虚血後は時間経過とともに HMGB1 濃度は上昇する傾向にあった（図 4）。脳虚血後 120 時間で 120 ± 20 pg/ml の最高濃度に達し，168 時間後には若干減少するものの，同レベルに維持されていた。

考察

マイクログリアは突起をシナプス部に伸展させることによるシナプス監視 9），損傷を受けた運動神経でシナプス終末を引きはがす synaptic stripping 10），また神経回路の pruning 11）などの多彩な作用を有する。こうした作用の中でマイクログリアはその形態を変化させることが知られており 3,4），これは正常脳の 2 光子励起顕微鏡によ

図3

図2

脳虚血モデルラットの組織学的観察標本
A：対照群
マイクログリア細胞体とその拡大像を示す
B：結紮群
マイクログリア細胞体とその拡大像を示す
C：モデルラットの脳における HE 染色像
矢印は間質部の拡張した血管を示す

21

免疫組織染色による各臓器における HMGB1 の発現
A：脳
矢印は側脳室脈絡叢における代表的な HMGB1 陽性細胞を示す
B：心臓
矢印①は HMGB1 陽性を認めた代表的な心筋間線維を示す
矢印②は HMGB1 陽性を認めた代表的な毛細血管内皮細胞を示す
C：肝臓
矢印は HMGB1 陽性を示した代表的な肝細胞を示す
D：肺
矢印は HMGB1 陽性を示した代表的な肺胞マクロファー
ジを示す
E：腎臓
矢印①は HMGB1 陽性を認めた代表的な尿細管上皮を示す
矢印②は HMGB1 陽性を認めた代表的なボウマン嚢上皮を示す
F：脾臓
G：濾胞構造強拡大像
矢印は濾胞構造周辺に出現した代表的な HMGB1 陽性細胞を示す

る観察から明らかにされている 12,13）。本研究では，脳虚色による観察を行ったが，リンパ球などの浸潤は顕著に血再灌流障害と言われる病態を想定し，ラット片側総頚は認められなかった。一般的に，脳梗塞においては脳血動脈を 30 分間結紮することにより脳虚血状態とした後，液関門が破壊され，脾臓などからのリンパ球の流入によ結紮を解除するモデルを用いた。再灌流後，マイクログ

り，脾臓の縮小が観察される 18）。本モデルにおいても脾

リアの特異的マーカーである抗 Iba1 抗体を用いた免疫臓のリンパ球数の減少が認められたが，脳血液関門の構染色から，突起および細胞体の膨化が観察された。これ造が一定程度維持され，脳外部からのこれら炎症性細胞は本モデルによってマイクログリアが活性化されているの浸潤を防いでいる可能性が考えられた。

ことを示している。一般にマイクログリアの活性化に

本研究では，全身諸臓器の免疫染色を行い HMGB1 の伴った形態変化は ATP やグルタミン酸の濃度などに応局在について観察を行ったが，脳では脳室を裏装する脈じて変化すると報告されている 3,4,13）。本研究で観察され絡叢において HMGB1 陽性反応を認めた。また，全身諸たマイクログリアの形態変化とこれらの物質との関連に臓器においては心筋線維間，肝細胞，肺胞マクロファーついては今後さらに検討が必要と考えられる。

ジ， 尿 細 管 上 皮 細 胞 お よ び ボ ウ マ ン 嚢 上 皮 な ど に

脳虚血では alarmin の一種である HMGB1 が増加する

HMGB1 の陽性反応が認められた。また，脾臓におけることが報告されており ，この分子が梗塞巣の範囲やマ陽性細胞数の増加は極めて顕著であり，この細胞の性質イクログリアの活性化を調節しているとされていについては今後の検討課題である。陽性反応が見られたる7）。本研究でも末梢血中の HMGB1 濃度は虚血再灌部位にはマクロファージ系の細胞が存在していたが，脳流後 72 時間以降で顕著に増加していた。この結果は脳で放出され，血流により末梢に移行した HMGB1 が，マ虚血により放出された HMGB1 は，脳においては濃度がクロファージ系の細胞に貪食された結果であると考えら減少し末梢に移行するとした報告 15）と一致するものでれる。脳における炎症は一定期間の後に終息される必要あった。

があり，本研究で観察された各臓器における HMGB1 の14,15）

局在はこうした現象を裏づけるものであると考えられ

HMGB1 の細胞外放出には active secretion と passiveる。

release がある。前者では lipopolysaccharide 刺激などに応じて分泌が促進されるのに対し，後者では壊死に陥る結細胞から放出されることが明らかとなっている 7）。また，論

興味深いことにアポトーシスによって死滅する細胞から本研究では，ラット総頚動脈結紮による脳虚血（脳虚は放出されない 7）。脳虚血において HMGB1 を放出する

血再灌流障害）モデルを作成し，脳，心臓，肝臓，肺，細胞については神経細胞が主体と考えられるが，虚血に腎臓，脾臓の各臓器ならびに血中の DAMPs の一種であよる神経細胞壊死の結果，放出された HMGB1 は標的細る HMGB1 発現変化について検討した。その結果，以下胞の膜上に表出されている toll-like receptor 4 に結合の結論を得た。

し，その後の炎症反応を拡大していくものと考えられて

1.

いる

脳虚血後再灌流することによって，マイクログリアが活性化することが確認でき，脳内の炎症反応の可。本研究では脳における炎症像について HE 染16,17）能性が示唆された。
2.

各臓器における HMGB1 の発現について免疫染色により検討したところ，脳では脳室を裏装する脈絡叢の細胞に陽性反応を認めた。その他の臓器においては心筋間質，肝細胞，肺胞マクロファージ，尿細管上皮細胞，ボウマン嚢上皮などに陽性反応が認められた。また，脾臓における濾胞周囲の陽性細胞数の増加は極めて顕著であった。

3.

結紮群における ELISA による末梢血液中 HMGB1濃度は脳虚血再灌流後 72 時間で有意に上昇し，120時間で最高濃度に達し，168 時間後にはわずかに減少したものの，同水準に維持されていた。
以上より，脳虚血モデルにおける HMGB1 発現は脳のみならず全身諸臓器において変化する事が明らかとなった。
図4

稿を終えるにあたり，格別なるご指導を賜りました日本大学歯学部口腔外科学講座の外木守雄教授に心より感謝申し上げます。

ELISA による末梢血中 HMGB1 濃度測定結果*P ＜ 0.0522脳虚血時の全身臓器における HMGB1 発現

本研究をご指導およびご校閲賜りました日本大学歯学部病理学講座の浅野正岳教授に謹んで深く感謝申し上げます。 最後に本研究を通じ多大なるご協力とご助言を賜りました，日本大学歯学部口腔外科学講座の篠塚啓二助教を始め，日本大学歯学部口腔外科学講座また日本大学歯学部病理学講座の皆様に感謝いたします。
本研究の一部は平成 28，29 年度日本大学歯学部佐藤研究費および平成 28，29 年度総合歯学研究所研究費（B）の助成によって行われた。
なお，本研究では開示すべき利益相反はない。

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