日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 92, 27-31, 2018

酸性電解機能水は EMMPRIN 分泌を誘導する
楠正

文

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：佐藤秀一 教授，浅野正岳 教授）

要旨：ヒト口腔扁平上皮癌由来株化細胞（HSC3）を酸性電解機能水（acid-electrolyzed functional water：FW）で刺激することによって，extracellular matrix metalloproteinase inducer（EMMPRIN）の分泌が増強された。この現象はヒト子宮頸がん由来線維芽細胞（HeLa）においても同様に確認された。また，刺激を与えた細胞の培養上清および細胞溶解液中における，EMMPRIN 濃度の測定および遺伝子発現の比較を行った結果，この増強は遺伝子の転写促進に依存したものではなく，あらかじめ細胞内に貯蔵されている EMMPRIN が刺激に応じて細胞外へ放出されたものであることが明らかとなった。さらに，分泌された EMMPRIN の生物活性について検索したところ，
ヒト単球性白血病由来株化細胞（THP-1）に対して各種の matrix metalloproteinase（MMP）の発現を誘導することがわかった。一方で vascular endothelial growth factor（VEGF）については発現を抑制することがわかった。本研究の結果より，FW 刺激は EMMPRIN の分泌を介して創傷治癒の促進に関与する可能性が示された。また，一般に細胞死に際して放出される物質を alarmin と総称するが，本研究の結果は，EMMPRIN が alarmin の一種である可能性を示唆するものであった。
キーワード：EMMPRIN，酸性電解機能水，MMP

緒

用が強く皮膚や粘膜に対する為害性がないことから臨床

言領域で広く使用されている 9）。近年は，生体に対する直癌細胞は，matrix metalloproteinase（MMP）によって接的な FW の効果について注目されており，ヒト子宮頸周囲の組織を分解することで自身の浸潤性増殖を可能にがん由来線維芽細胞（HeLa）において basic fibroblast1）

する 。これまで MMP は腫瘍細胞によって産生される

growth factor の分泌を増強することが明らかになってと考えられていたが，免疫組織学的検索の結果，主に間いる 10）。しかし，口腔扁平上皮細胞に対する FW の影響

質線維芽細胞によって産生されることが明らかになっは不明な点が多いのが現状である。そこで本研究では，

た 2）。 一 方， 腫 瘍 細 胞 は MMP の 発 現 を 誘 導 す る

FW の歯科領域における臨床応用を目的とし，創傷治癒

extracellular matrix metalloproteinase inducer

促進作用を有する EMMPRIN に着目して，ヒト口腔扁（EMMPRIN）を産生するとされており，EMMPRIN を介

平上皮癌由来株化細胞の EMMPRIN 分泌に及ぼす FWする腫瘍細胞と間質との相互作用は，腫瘍の進展においの効果および EMMPRIN を介する細胞間相互作用につ3）いて検討を行った。て極めて重要な役割を有していると考えられる 。
EMMPRIN は，187 ア ミ ノ 酸 残 基（amino acid

材料および方法

residue：aa）の細胞外ドメイン，膜貫通ドメイン（24 aa）
お よ び 細 胞 質 ド メ イ ン（40 aa）か ら な る， 分 子 質 量28 kDa の膜貫通型糖タンパク質である

1.

4-6）

細胞培養および FW 刺激。また，免疫本研究には，ヘルスサイエンス研究資源バンクより購

グロブリンスーパーファミリーに属し，細胞外領域には入した，ヒト口腔扁平上皮癌由来株化細胞である HSC3，2 つの免疫グロブリンドメインと 3 つの- グリコシル化

ヒト子宮頸がん由来線維芽細胞である HeLa およびヒト部位が存在する 7）。EMMPRIN 分子はグリコシル化の程単球性白血病由来株化細胞である THP-1 を用いた。細

度に応じて分子量が異なり，分子種の違いにより多様な胞 は Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI6, 8）。これ1640；Thermo Fisher Scientific）ま た は Dulbeccoʼsまでの研究によると，EMMPRIN は，腫瘍の進展におけModified Eagle Medium（DMEM；Thermo Fisher

る役割に加えて，発生，再生および創傷治癒など多面的Scientific）に，10% ウ シ 胎 児 血 清（fetal calf serum：な機能を有することが報告されている 3）。

FCS）および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン（Sigma

生物学的機能を有するものと考えられている

低濃度の食塩水を電気分解して得られる酸性電解機能Aldrich）を添加した 10% FCS-RPMI および 10% FCS-水（acid-electrolyzed functional water：FW）は，殺菌作DMEM を用いて，5% CO2，37℃の条件下で培養した。

（受付：平成 30 年 1 月 15 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1327

HSC3 および HeLa は，24-well plate（IWAKI）上に 1×結105 cells/well になるよう播種し，16 時間培養したものを実験に供した。FW 刺激は，播種した細胞をリン酸緩1.

果FW 刺激により EMMPRIN 分泌は促進される

衝生理食塩水（phosphate buffered saline：PBS）で 2 回はじめに HSC3 を FW 刺激した後のサイトカイン分泌洗浄した後，FW（pH2.7，酸化還元電位 1,100 mV 以上，の変化をサイトカインアレイにより検索した。その結果，遊離有効塩素濃度 30 ppm；三浦電子社製）で 30 秒間刺EMMPRIN の分泌が顕著に増強されることがわかった

激することで行った。刺激後は，直ちに 10% FCS-RPMI（第 1 図）。そこで，この結果を ELISA により確認したを添加することによって作用を停止させ，溶液を吸引除ところ，刺激後 1 時間で 1.7 ng/ml に達する有意な分泌去後，新しい培養液に交換し，さらに一定時間培養した。

が認められ，時間経過とともに暫時増加する傾向を示し2.

た（第 2 図）。一方，細胞溶解液中の EMMPRIN は刺激

サイトカインアレイ
6

HSC3 を 1×10 cells/10 cm dish と な る よ う 播 種 し，

後 1 時間で 1.8 ng/ml にまで有意に減少し，未刺激群の約 57% に達した。

前述の方法で刺激し，18 時間培養した。その後培養上清を 回 収 し，Human XL Cytokine Array kit（R&DHeLa においても FW 刺激により EMMPRIN 分泌が促systems）を用いてサイトカインアレイ実験を行った。画進されるか否かについて検討した。その結果，上皮系細像は ChemiDoc XRS（BioRad）を用いて撮影した。

胞である HSC3 と同様に，刺激後 1 時間で有意な分泌増3.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）

強が認められ，時間経過とともに分泌量は増加した（第 3HSC3 に対し，前述の方法で FW 刺激を与えた後，1，図）。一方，細胞溶解液中の EMMPRIN 量は有意に減少

6 および 12 時間培養を行い，培養上清を回収した。細胞し，HSC3 と同様の傾向を示した。

溶 解 液 は 細 胞 を PBS で 洗 浄 後， 細 胞 溶 解 用 緩 衝 液

2.

EMMPRIN の分泌増強は転写非依存的である（10 mM Tris-HCl，pH7.5，150 mM NaCl，1% Triton

FW 刺激による EMMPRIN 分泌促進が転写レベルでX-100）で懸濁し，4℃，15,000×g で 3 分間遠心分離を行調節されているか確認するため real-time PCR により遺い，上清を回収することで調整した。EMMPRIN 濃度は，伝子発現レベルの変化について検討した。HSC3 を FW

DuoSet ELISA Development System（R&D Systems）

で 30 秒 間 刺 激 し た 後， 第 4 図 に 示 し た 時 間 に totalを用い，製造元のプロトコールに従って測定した。また，RNA を回収し検索した。その結果，EMMPRIN mRNA

HeLa に対しても同様の実験を行った。の発現は刺激の有無で大きな変化はなかった（第 4 図）。

4.

3.

Real-time PCR分泌された EMMPRIN の生物活性

Total RNA は RNeasy mini kit（QIAGEN）
を用いて抽FW により分泌誘導された EMMPRIN が生物学的活出した。Complementary DNA は Superscript Ⅲ reverse

性 を 有 し て い る か 否 か に つ い て 検 討 し た。 す な わ ち，transcriptase（Invitrogen）を用いて作製し，real-time
PCR の試料とした 11）。Real-time PCR は，SYBR Green（TaKaRa）を用いて CFX96-Real-Time-System（BioRad）

第1表を用いて，95℃ 3 分（1 サイクル）の加熱後，95℃ 60 秒，60℃ 30 秒および 72℃ 60 秒（30 サイクル）の条件で行った。発現の強度はハウスキーピング遺伝子である β-actinの増幅量で補正し，相対的な比率として求めた。この研究で使用したプライマーを第 1 表に示す。
5.

HSC3 由来の培養上清による THP-1 培養
FW 刺激または未刺激の HSC3 の培養上清を培養 3 時

間 後 に 回 収 し た。 こ の 上 清 を そ れ ぞ れ conditioned
medium（CM）＋および CM−とした。THP-1（1×106）をCM＋および CM−で 24 時間培養後細胞を回収し，totalRNA を抽出した。Real-time PCR は 4. で示した方法で行った。
6.

統計処理
結果は平均値と標準誤差（standard error：SE）で示した。2 群間の比較は Stundentʼs -test，多群間の比較には二元配置分散分析を行った後，Bonferroni 法を用いて有意差の検定を行った。なお，有意水準は ＜ 0.05 とした。

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使用した各プライマーの塩基配列

酸性電解機能水の EMMPRIN 誘導

HSC3 由来の CM−および CM＋で THP-1 を培養し，各種 MMP 分子の発現増強について real-time PCR により検索した。その結果，CM−と比較して CM＋では有意にMMP1，2，8，9，13，14 の発現が増強された（第 5 図）。
ま た， 同 様 に 処 理 し た サ ン プ ル に お け る vascularendothelial growth factor（VEGF）発現について検討したところ，VEGF の発現は有意に減少した（第 5 図）。

考察FW 刺激により，HSC3 および HeLa による培養上清第1図

中への EMMPRIN 分泌が有意に増強された。これに反して細胞溶解液中での EMMPRIN は有意に減少したことから，分泌された EMMPRIN は細胞内に貯蔵されていたものが FW 刺激により放出されたものであると予想

FW 刺激によるサイトカイン発現の網羅的な解析
HSC3 を PBS（ 対照群）または FW（FW 刺激群）で 30 秒間刺激した。10% FCS-RPMI で作用を停止させ，18 時間培
養後に上清を回収し，サイトカインアレイ実験を行った。
図上の囲みは EMMPRIN を示す。

第2図

HSC3 における FW 刺激による EMMPRIN タンパク発現量の経時的変化
HSC3 を PBS または FW で 30 秒間刺激した。10% FCS-RPMI で作用を停止させ，1，6，12 時間培養後に細胞上清（A）および細胞溶解液（B）を回収し，ELISA を行った。
（** ＜ 0.01）

第3図

HeLa における FW 刺激による EMMPRIN タンパク発現量の経時的変化
HeLa を PBS または FW で 30 秒間刺激した。10% FCS-RPMI で作用を停止させ，1，6，12 時間培養後に細胞上清（A）および細胞溶解液（B）を回収し，ELISA を行った。
（** ＜ 0.01）

29

された。このことは，FW 刺激後の EMMPRIN mRNAられる。一般的に，膜貫通型タンパク質を溶出するには，の発現増強が real-time PCR による検索で認められな界面活性剤の存在が不可欠であり，たとえ界面活性剤をかったことにより裏付けられた。EMMPRIN 分子は I 型用いてもすべての膜貫通型タンパク質は溶出されないと

4-6），通常は細胞外領域が酵

さ れ て い る。FW に よ る 30 秒 間 の 刺 激 に よ り

素的に切断されて分泌されるものと考えられる。本研究

EMMPRIN が培養上清中に放出されたという事実は極めでの FW 刺激時間は 30 秒間と極めて短時間であり，酵て特異な現象であり興味深い。の膜貫通型タンパク質であり細胞傷害や壊死に際して細胞から放出される分子は素的切断を想定するには時間的にあまりにも短いと考えalarmin と総称され，周囲に自身の置かれた危機的状況を周知することで迅速な免疫応答を促す役割を演じているとされている 12）。本研究の結果は，FW の刺激に応じて細胞外に放出された EMMPRIN が周囲の細胞や組織に危機的状況を知らしめるという alarmin の機能を有しており 12），EMMPRIN は alarmin の一種である可能性が示唆された。典型的な alarmin である IL-1 α は，細胞膜に結合していることが報告されている 12）。これは細胞膜上に存在するレクチン様分子と IL-1 α 分子の糖鎖に存在するマンノースが結合することによるものであるが 13），EMMPRIN 分子がグリコシル化の程度によって種々の分子種を有すること，また FW 刺激後の培養上清中に大量に分泌されることを考え併せると，EMMPRINの細胞内局在についても今後検討する必要がある。
EMMPRIN の最も重要な機能は，MMP の産生を誘導
第4図

HSC3 における FW 刺激による EMMPRIN mRNA 発現の経時的変化
HSC3 を PBS または FW で 30 秒間刺激した。10% FCSRPMI で 作 用 を 停 止 さ せ，0.5，1，6，12 時 間 培 養 後 に
total RNA を抽出し，real-time PCR を行った。

第5図することである 4）。FW 刺激後に放出された EMMPRINが機能的であるかどうかを調べるために，FW 刺激または未刺激の HSC3 由来の培養上清を用いて THP-1 を培養したところ，THP-1 における MMP の発現を顕著に誘

THP-1 における FW で分泌誘導された EMMPRIN による遺伝子発現の変化
THP-1 を CM ＋または CM −で 24 時間処理し，total RNA を抽出後，real-time PCR を行った。各標的遺伝子の基礎発現レベルを 1 とし，β-actin に対する相対発現レベルを fold-induction として示した。
（* ＜ 0.05，** ＜ 0.01）30酸性電解機能水の EMMPRIN 誘導

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導した。すなわち分泌増強された EMMPRIN は生物学的活性を維持しており，創傷治癒を促進する可能性が示された。しかし一方で，血管新生因子である VEGF 発現は抑制され，この結果は従来の報告とは相いれないものであった 14, 15）。EMMPRIN の機能はその受容体である
receptor for advanced glycation end product または
toll-like receptor 4 に結合することにより発揮されるが 3），本研究で用いた THP-1 におけるこれらレセプターの発現またはその下流のシグナル伝達系がこれまでの報告で用いられてきた細胞とは異なっていることが VEGF
発 現 減 少 の 原 因 で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ る。 ま た，
EMMPRIN は肺癌において骨髄由来免疫細胞の癌領域への遊走を促進するとされており 14），癌細胞の増殖抑制に関与している可能性が指摘されている。VEGF はその血管新生作用により癌の進展に寄与するとされているが，
EMMPRIN の作用によりその発現が抑制されるのであれば，癌の進展を抑制する可能性があり極めて興味深い。

結論

本研究では，上皮細胞と線維芽細胞の EMMPRIN 発
現 に 及 ぼ す FW の 影 響 お よ び 上 皮 細 胞 が 分 泌 す る
EMMPRIN が単球細胞の MMP と VEGF 発現に及ぼす影響について検討を行った。その結果以下の結論を得た。
1.

HSC3 および HeLa では FW 刺激により培養上清中の EMMPRIN 分泌は有意に増加し，細胞溶解液中の EMMPRIN 濃度は有意に減少した。

2.

EMMPRIN の発現増強は転写非依存的であった。

3.

FW によって HSC3 から分泌された EMMPRIN はTHP-1 の MMP1，2，8，9，13 お よ び 14 の 発 現 を有意に増強させ，VEGF の発現を有意に減少させた。
以上のことから，FW 刺激は上皮および線維芽細胞から EMMPRIN を放出させ，さらに単球に対し MMP 発現を誘導することにより，創傷治癒促進に関与する可能性が示された。また，EMMPRIN は，周囲細胞や組織に危険を知らせる分子群である alarmin のひとつである可能性も示唆された。
本研究遂行にあたり，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座 佐藤秀一教授ならびに同学部病理学講座 浅野正岳教授に謹んで心より感謝申し上げます。また，
本研究に対して多大なご協力を頂いた歯周病学講座員ならびに病理学講座員に深く感謝の意を表します。
本論文に関して，開示すべき利益相反はありません。
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