J. Mass Spectrom. Soc. Jpn.

Vol. 52, No. 3, 2004

COMMENTARY

質量分析法と配列デῌタベῌスを利用する
タンパク質同定法
Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation
by Correlation with Sequence Database
吉野健一῏a), b)῎大城紀子a), b)῎徳永千春a), b)῎米澤一仁a), b)
Ken-ichi YDH=>CD, Noriko OH=>GD, Chiharu TD@JC6<6,
and Kazuyoshi YDC:O6L6(Received April 9, 2004; Accepted April 13, 2004)

The progress in genome sequencing projects of a large number of organisms and the advance in mass
spectrometry of protein analysis have been signiﬁcant driving forces in the formation of the ﬁeld proteomics.
The advance in protein mass spectrometry includes development of computer algorithms that use mass
spectrometric data to identify proteins in sequence databases. The computer algorithms for protein identiﬁcation by correlation with sequence databases rely on the availability of constraining parameters that distinguishspeciﬁc matches from all the other sequences in the database. They can be categorized into three strategies. Oneof strategies is called “peptide mass ﬁngerprinting,” which is based upon correlating measured masses of
peptides derived from digestion of proteins by a residue-speciﬁc protease with theoretically calculated peptide
masses derived from proteins registered in sequence database. Two strategies for protein identiﬁcation using
tandem mass spectrometry (MS/MS) data are distinguished by demand for interpretation of product ion mass
spectra. Product ion mass ﬁngerprinting using uninterpreted MS/MS data of peptides is conceptually similar
approach to peptide mass ﬁngerprinting. SEQEUSTῌ and MS/MS Ions Search in MASCOTῌ are the most widelyused algorithms for protein identiﬁcation by searching sequence database using uninterpreted product ion mass
spectra. Another strategy using MS/MS data employs the search algorithm by using parameters, such as“peptide sequence tag,” found by manual inspection of product ion mass spectra.

Institute for Genomic Research (TIGR) の研究グルῐプ

1. は じ め にであった2), 3)῍ インフルエンザ菌を皮切りにῌ さまざまな生

1995 年 7 月ῌ Science 誌に “Whole-Genome Random

物種のゲノムシῐクエンスプロジェクトが遂行されῌ

Sequencing and Assembly of Haemophilus inﬂuenzae2003 年 4 月 14 日ῌ ヒトゲノム完全解読宣言という一つ

Rd” と題した 1 編の論文が発表された1)῍ この論文にはのマイルストῐンに至った῍ 現在もなお多くの生物種のプ

1.83 Mb のゲノムサイズをもつインフルエンザ菌 ῑインフ

ロジェクトが進行しているがῌ 今日までの多種にわたる多ルエンザウィルスとは異なるῒ のゲノムの全塩基配列を決様な生物種のゲノムシῐクエンスプロジェクトの成果に定したプロジェクトの成果が記されておりῌ 全生物種の中よってῌ 今や我῏は質的にも量的にも飛躍的に充実した配で初めてゲノムの全容が明らかにされた歴史に残る記念す

列デῐタベῐスを利用することが可能となった῍ 現在の生べき業績である῍ この論文を発表したのはῌ 後にῌ 公的機

命科学はῌ ゲノムの塩基配列とその解析によって得られた関による国際共同ヒトゲノムシῐクエンスプロジェクトに膨大な情報を利用しながら研究を進めるポストゲノム

対して競争を挑んだ米国のバイオベンチャῐ企業ῌ セレ

ῑシῐクエンスῒ 時代に突入している῍ラ῎ジェノミクス社の社長を務めた Venter が率いる The῏a) 神戸大学῎バイオシグナル研究センタῐ ῑῌ657῎8501 神
戸市灘区六甲台町 1῎1ῒBiosignal Research Center, Kobe University (1῎1 Rokkodaicho, Nada-ku, Kobe 657῎8051, Japan)b)ῑ独ῒ科学技術振興機構ῌ 戦略的基礎研究推進事業ῌ 領域名
ΐたんぱく質の構造῎機能と発現メカニズム῔ ῑῌ332῎0012
川口市本町 4῎1῎8ῒResearch Area “Protein Structure and Functional Mechanisms” in Core Research for Evolution Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Agency (4῎
1῎8 Honcho, Kawaguchi, Saitama 332῎0012, Japan)

質量分析法はῌ 現在ῌ ポストゲノム時代における生命科
学の重要な研究領域として注目されている ΐプロテオミク
ス῔ の基盤技術として位置づけられている῍ しかしῌ 質量分析法を利用してタンパク質ῌ ペプチドのアミノ酸配列を解析しῌ タンパク質を同定することが可能となったのはῌ
それほど昔のことではない῍ 1 世紀近い質量分析法の歴史の中でῌ ペプチドῌ タンパク質の構造解析に質量分析が汎用され始めたのは 1980 年代に入ってからのことである῍
1980 年以前でもῌ 電子イオン化 (Electron Ionization:
EI) 法や化学イオン化 (Chemical Ionization: CI) 法を用い῍ 106 ῍Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Database

た直接導入による解析やῌ ガスクロマトグラフィ῏質量分

tion: CID) によってペプチドのプロトン化分子を開裂さ析法 (Gas Chromatography/Mass Spectrometry: GC/

せῌ 得られたフラグメント ῑプロダクトῒ イオンマススペ

MS) によってアミノ酸配列を解析することは可能であっクトルを ΐ解読῔ しῌ アミノ酸配列を決定することが必要

た4)ῐ6)῍ しかしῌ EI 法ῌ CI 法を利用する場合ῌ 不揮発性のであった16), 17)῍ エドマン分解処理後やῌ ペプチドのアミノペプチドをイオン化させるためにῌ あらかじめ揮発性の誘末端 ῑN 末端ῒ から逐次アミノ酸を遊離させるアミノペプ

導体に変換する必要がありῌ 誘導体化処理の煩雑さやῌ 処

チダ῏ゼῌ もしくはカルボキシル末端 ῑC 末端ῒ から逐次理過程での測定試料の損失などの問題があった῍ EI 法ῌ CI

アミノ酸を遊離させるカルボキシペプチダ῏ゼを用いて消法はῌ 分子量が 1000 を超える化合物を解析すること自体化を行った後の断片ペプチドを質量分析することによってが難しくῌ またῌ 現在用いられている種῎のソフトイオン

断片の質量差からアミノ酸配列を決定することも可能で化法とは異なりῌ イオン源においてフラグメンテ῏ション

あった15), 18)῍ 現在ῌ 質量分析法を利用するタンパク質同定が起こるイオン化法であるために得られたマススペクトル法の主流となっている質量分析デ῏タをダイレクトに配列からペプチドのような複雑な化合物の構造を解析することデ῏タベ῏ス検索に用いる方法はῌ 原理的にはアミノ酸配は容易ではなかった῍ 以上のようなさまざまな理由からῌ

列を決定することなしにῌ タンパク質を同定しているのに

EI-MS, CI-MS を利用したペプチドの構造解析はῌ 比較的

対しῌ 従来の質量分析法を利用したタンパク質同定法はῌ

低分子量のペプチドでのみ適応可能な方法であった῍ 通常

質量分析デ῏タからアミノ酸配列を決定しῌ その結果に基はῌ 一度の解析でせいぜい 5ῐ6 残基のアミノ酸配列を決づいてタンパク質を同定していた῍ この点でῌ 質量分析法

定することができる程度でῌ 応用範囲は極めて限定されてを利用する従来法のタンパク質同定の基本的なストラテいた῍

ジ῏はῌ 当時ῌ タンパク質 1 次構造解析法の主流であった

1970 年代に汎用された電界脱離 (Field Desorption: FD)

エドマン分解法を利用する方法と同じであった῍ 現在 “deイオン化法はῌ いわゆるソフトイオン化法の黎明期を担っ

novo Sequencing” と呼ばれている質量分析のデ῏タからたイオン化法である ῍ このイオン化法の開発によって分

直接アミノ酸配列を解読する従来法はῌ ペプチドが混合物

子量 2000 程度の大きなῌ しかも不揮発性のペプチド分子であっても解析が可能である点やῌ エドマン分解の進行を

7)をῌ 誘導体化することなくイオン化させることが可能と妨げるアセチル基やピログルタミン酸などの N 末端の修なった῍ ΐソフトイオン化法῔ の名のとおりῌ EI 法や CI 法飾の有無にかかわらずアミノ酸配列の決定が可能である点で観測されるイオン源でのフラグメンテ῏ションは少ななどῌ エドマン分解法に対して優れた点も数多くもっていくῌ 分子量情報の獲得に直接役立つῌ いわゆる分子量関連た῍ しかしῌ アミノ酸配列がプロダクトイオンマススペク

イオンとしてῌ 専らペプチドのプロトン化分子が観測されトルの質に影響することῌ デ῏タの解釈ῌ アミノ酸配列のるマススペクトルを得ることができる῍ この FD-MS を利解読にある程度の経験が必要とされることῌ エドマン分解

ῌ法を利用してペプチドῌ タンパク質のアミノ酸配列分析をFD イオン化法はῌ 試料を塗布するエミッタ῏の取り扱い行うための機器であるプロテインシ῏クエンサ῏に対し8)ῐ10)

用してタンパク質の 1 次構造解析も行われていたがが極めて難しくῌ 加えてエミッタ῏上に塗布された試料のてῌ 質量分析計が高価であったことなどの問題点もありῌ

状態や性質によってῌ さまざまなイオン化モ῏ドによって当時はエドマン分解法を凌駕するまでには至らなかった῍

分子がイオン化されてしまうことなどからῌ 技術的には熟多種多様な生物種を対象としたゲノムシ῏クエンスプロ

練を要する不安定なイオン化法でありῌ 信頼できるデ῏タ

ジェクトの進行に伴う配列デ῏タベ῏スの充実とῌ エレクを得るためには ΐ魔術的῔ と称されるほど相当な技能が必

トロスプレ῏イオン化 (Electrospray Ionization: ESI) 法要とされた11)῍と マ ト リ ッ ク ス 支 援 レ ῏ ザ ῏ 脱 離 イ オ ン 化 (Matrix-

より簡便なソフトイオン化法の開発が待たれていたがῌ

assisted Laser Desorption/Ionization: MALDI) 法の開1981 年ῌ Barber ら が 高 速 原 子 衝 撃 (Fast Atom Bom-発ῌ および飛行時間型質量分析計 (Time-of-ﬂight Massbardment: FAB) イオン化法を開発して以来12), 13)ῌ 質量分

Spectrometer: TOFMS)ῌ イオントラップ型質量分析計

析法を用いたタンパク質ῌ ペプチドの構造解析法の状況が(Ion Trap Mass Spectrometer: ITMS) の発達に牽引され劇的に変化した῍ タンパク質の翻訳後修飾基の解析を中心たプロテインマススペクトロメトリ῏の発展はῌ これまでにῌ タンパク質ῌ ペプチドの 1 次構造解析や遺伝子の塩基のタンパク質の同定法を一変させた19)ῐ24)῍ 生命科学研究

配列から推定されたアミノ酸配列のバリデ῏ションῌ 化学

領域における質量分析法の応用例が急激に増加しῌ 生化学

合成ペプチドやリコンビナントタンパク質の品質管理なや分子生物学を中心とした数多くの生命科学の研究者が質どῌ タンパク質ῌ ペプチドの構造解析に FAB-MS が盛ん

量分析法に対して高い関心を示すようになってきた῍ 現在に利用されるようになりῌ 質量分析法の有用性が多くの生のようにῌ タンパク質を同定する手段として質量分析法が命科学の研究者に認知されるようになった14), 15)῍

主流となった大きな要因はῌ 質量分析計自身の発達もさる

現在のようにタンパク質や核酸の配列デ῏タベ῏スが充ことながらῌ タンパク質や核酸の配列デ῏タベ῏スが充実

実していなかった当時ῌ 質量分析法を用いたタンパク質ῌ

したことῌ さらにそれを利用する検索ソフトウェアの発達

ペプチドのアミノ酸配列の決定やῌ タンパク質の同定を行によってῌ 質量分析のデ῏タからアミノ酸配列を解読する

うためにはῌ 衝突誘起解離 (Collision-induced Dissocia-

ことなくῌ タンパク質を同定することが可能となったため

ῌ 107 ῌ

K. Yoshino et al.

である῍ 本稿ではῌ 現在プロテオミクスに代表されるタンデ῎タベ῎スを利用するタンパク質同定法の方法論として

パク質を基盤とした生命科学においてタンパク質同定法のはῌ 3 種のカテゴリ῎に区分することができる (Fig. 1)῍

主流となっているῌ 質量分析法と配列デ῎タベ῎スを利用するタンパク質同定法を概説する῍
2. 概まず MS/MS を利用するかῌ 利用しないかで二分することができる῍ MS/MS を利用しない場合 ῐῌῑ がῌ Peptide
Mass Fingerprinting (PMF) 法である25)῏29)῍

要一方ῌ MS/MS を利用する方法はさらにῌ デ῎タベ῎ス

現在ῌ 質量分析法と配列デ῎タベ῎スを利用してタンパ

検索の前にῌ 観測されたプロダクトイオンマススペクトル

ク質を同定するために用いられている一般的なスキ῎ムはの解読を行うかῌ 行わないかで二分することができる῍ こ

以下のとおりである῍の場合のプロダクトイオンマススペクトルはῌ MALDI-

1) アミノ酸残基特異的なタンパク質分解酵素 ῐプロテ2)

TOFMS を用いたポストソ῎ス分解 (Post-source Decay:

ア῎ゼῑ を用いてタンパク質を消化しῌ 断片化する῍PSD) によって得られたプロダクトイオンマススペクトルプロテア῎ゼ消化物を ZipTipῌ などの逆相高速液を含んでいる῎1῍ プロダクトイオンマススペクトルの解読

体クロマトグラフィ῎用のカラム充填剤が先端に固はῌ 主としてペプチドの部分アミノ酸配列を de novo で解定されたピペットチップを用いて脱塩ῌ 濃縮を行

析することῌ すなわちデ῎タベ῎スに依存せずにペプチドう῍ ῐ逆相高速ῑ 液体クロマトグラフィ῎ (Liquidの部分アミノ酸配列を ῒ新規に (de novo)ΐ 読み解きῌ 決定

Chromatography: LC) と質量分析法を直結させたすることを指している῍
MS/MS を利用しῌ デ῎タベ῎ス検索の前にプロダクト

LC/MS 法によって解析する場合はこの過程を省略できる῍

イオンマススペクトルを解読しない方法 ῐ῍ῑ はῌ 現在ῌ

3) 消化後の断片ペプチド混合物のマススペクトルを測

LC/MS/MS を利用するタンパク質の同定において最も頻定する῍ またはῌ タンデム質量分析法 (Tandem

用されている方法である῍ 代表的なソフトウェアの名前をMass Spectrometry, Mass Spectrometry/Mass

挙げるとῌ Yates らが開発した SEQUESTῌ 30) や Cottrell

Spectrometry: MS/MS) によって断片ペプチド由らが開発した MS/MS Ions Search (MASCOTῌ)31), 32) が来のイオンを開裂させῌ プロダクトイオンマススペ

このカテゴリ῎に含まれる῍ このカテゴリ῎に含まれるア

クトルを測定する῍

ルゴリズムは現在ῌ かなり汎用されている方法であるにも

4) 得られたマススペクトルデ῎タを用いてῌ タンパクかかわらずῌ 驚くべきことにῌ PMF (Peptide Mass Finger-

質や核酸の配列デ῎タベ῎スに対して検索を行いῌ

printing) 法のようにῌ 同じカテゴリ῎に含まれるすべて

デ῎タベ῎スに登録されているタンパク質 ῐ核酸ῑのアルゴリズムを包括する一般的な総称が定着していなの中でマススペクトルデ῎タと最も適合するアミノい῍ このカテゴリ῎の基本原理はῌ プロダクトイオンマス

酸配列を探し出しῌ タンパク質を同定する῍スペクトルを解読することなくῌ プロダクトイオンマスリ

上記のスキ῎ムに従ってタンパク質を同定するためにストの情報を直接デ῎タベ῎スに対して検索しῌ タンパクはῌ デ῎タベ῎ス検索を行うソフトウェアῌ すなわちサ῎

質を同定することにある῍ 筆者らは最近ῌ “Methods in

チエンジンが必要となる῍ そのためῌ 現在の質量分析法を

Molecular Biology” シリ῎ズの成書に掲載したプロト

利用するタンパク質同定法の方法論はῌ サ῎チエンジンのコ῎ルの中でῌ このカテゴリ῎に含まれる方法を “Prod-

アルゴリズムに大きく依存している῍ これまで数多くの研

uct Ion Mass Fingerprinting” 法という総称を与えて紹介究者によってῌ 独自のアルゴリズムを用いたさまざまなした33)῍サ῎チエンジンが開発されてきたがῌ 質量分析法と配列

もう一つのカテゴリ῎はῌ MS/MS を利用しῌ デ῎タ
ベ῎ス検索を実施する前にῌ 実測されたプロダクトイオン
マススペクトルを解読することによって得た情報を検索に利用する方法 ῐ῎ῑ である῍ プロダクトイオンマススペク
トルからのペプチドの部分アミノ酸配列の解読ῌ いわゆるde novo Sequencing によって得た情報やῌ 低質量領域に観測されるインモニウムイオンの情報からペプチドに含まれるアミノ酸残基の種類を解読しῌ プリカ῎サ῎イオンのFig. 1.

῎1 PSD 法はῌ MALDI 法においてῌ レ῎ザ῎照射によって生成されたイオンがῌ イオン源の加速場領域を離れて検出器に到達する間にῌ 主としてイオン自身がもつ過剰な内部エネル
ギ῎によって分解する現象である῍ MALDI-TOFMS を用いῌ この現象を利用してプロダクトイオンマススペクトルを得ることは可能であるがῌ 2 台の質量分離部を用いていない点やῌ 解析可能なプロダクトイオンマススペクトルを得るた
めには測定試料に高い純度が求められる点などからῌ 原理的には通常の MS/MS のカテゴリ῎には入らない῍ PSD とMS/MS を混同してはいけない῍Three categories of algorithms for mass spectrometry-based protein identiﬁcation by correlation with sequence database.
῍ 108 ῍Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Database

Fig. 2.

First page of the MASCOT῍ search engine (Ver. 1.9).

実測質量に加えてῌ これらの解読結果を用いて検索が行わ

cus M497-1 株が産生するプロテア῎ゼῌ Achromobacterれる῍ de novo Sequencing はῌ マニュアルで行わなくてもProtease I はῌ ポリペプチド鎖中のリジン残基のカルボキ

de novo Sequencing 用のソフトウェアを用いてペプチド

シル基側においてのみペプチド結合の加水分解を触媒すの部分アミノ酸配列を推定することは可能である῍ このカる37), 38)῍ 同様にῌ 脊椎動物の十二指腸でのタンパク質の消テゴリ῎に含まれる方法はῌ デ῎タベ῎ス検索の前にῌ プ

化に重要な役割を担っているトリプシンはῌ ポリペプチド

ロダクトイオンマススペクトルの解読が必要という点でῌ

鎖中のリジン残基もしくはアルギニン残基のカルボキシル

マススペクトルのデ῎タを直接使用する PMF 法や Prod-

基側のペプチド結合の加水分解だけを触媒する῍ 一方ῌ ト

uct Ion Mass Fingerprinting 法とは明確に異なる方法でリプシンと同じ消化酵素であってもῌ 脊椎動物の胃内のタある῍ 当然ながらハイスル῎プットな方法ではない῍ この

ンパク質消化を担うプロテア῎ゼῌ ペプシンはῌ トリプシ

カテゴリ῎に含まれる代表的な方法はῌ Mann と Wilm にンのような高い基質特異性はなくῌ かなり広い基質特異性

よって考案された Peptide Sequence Tag (PST) 法であを有している῍ これまでに数多くのプロテア῎ゼが報告さる34)῍

れているがῌ その中でῌ トリプシンや Achromobacter Pro-

英国 Matrix Science 社が開発した検索エンジンパッ
῍ 35)tease I に代表されるῌ ペプチド鎖中の特定のアミノ酸残基

ῌ および米国カリフォルニア大学サを認識しῌ 特異的に当該アミノ酸残基が関与するペプチド

ンフランシスコ校 (UCSF) が開発したツ῎ルパッケ῎ジ結合の加水分解を触媒するプロテア῎ゼ (Table 1) を用い

ケ῎ジ MASCOT

ProteinProspector36) を用いればῌ この 3 種のカテゴリ῎てタンパク質を消化した場合ῌ ランダムに断片ペプチドがに属するそれぞれのアルゴリズムを個別に採用している 3生成されるわけではない῍ 例えばῌ 上述の Achromobacter

種類のソフトウェアを利用することができる῍ カテゴリ῎Protease I (Lysyl Endopeptidase῍: LEP) を用いた場合ῌ

῍

分類の理解を助けるためにῌ MASCOT 検索を利用する生成される断片ペプチドの C 末端はῌ タンパク質本来の C際の初期画面を Fig. 2 に示した῍

末端ペプチドを除いてῌ 理論的にはすべてリジン残基とな

3.

る῍ 逆にῌ 一部の例外を除いてῌ リジン残基が断片ペプチ

Peptide Mass Fingerprinting (PMF) 法によるドの C 末端以外の場所を占めることはない῍ それゆえῌ タ

タンパク質の同定

ンパク質のアミノ酸配列が既知であればῌ 消化によって生

3.1 アミノ酸残基特異的タンパク質分解酵素を用いた成されるすべての断片ペプチドのアミノ酸配列を理論的に知ることができる῍タンパク質の断片化
大阪府箕面市の土壌から分離された Achromobacter lyti-

῎ 109 ῎以 下ῌ ヒ ト 由 来 の プ ロ テ イ ン キ ナ ῎ ゼ C ῌ a タ イ プ

K. Yoshino et al.

Table 1.

Amino Acid Residue-speciﬁc Endoproteases That Are Commercially Available

Name of enzyme

Speciﬁcity

SourceEC-number

Trypsin

Lys-X, Arg-X

Bovine or Porcine Pancreas

EC 3.4.21.4

Achromobacter Protease I(Lysyl Endopeptidaseῌ)

Lys-X

Achromobacter lyticus M497-1 strain

EC 3.4.21.50

Endoproteinase Lys-C

Lys-X

Lysobacter enzymogens

EC 3.4.21.50

Endoproteinase Asp-N

X-Asp

Pseudomonas fragi mutant

EC 3.4.24.2

Staphylococcus aureus Protease(V8 Protease, Endoproteinase Glu-C)

Glu-X, Asp-Xa)

Staphylococcus aureus V8 strain

EC 3.4.21.19

Arginylendopeptidase(Mouse submandibular protease)

Arg-X

Murine Submaxillary Gland

Unregistered

Endoproteinase Arg-C

Arg-X

Clostridium histolyticum

EC 3.4.22.8

Asparaginylendopeptidase

Asn-X

Jack Bean

Unregistered

Proline Speciﬁc Endopeptidase

Pro-X

Flavobacterium meningosepticum

EC 3.4.21.26

a)Speciﬁcity for Glu-X is achieved in ammonium bicarbonate bu#er (pH 7.8) or ammonium acetate (pH 4.0).

Table 3.

Fig. 3.

Amino acid sequence of N-terminal region (1῎158) of PKCa.

Table 2.

Fragment(residue
Nos.)

Amino Acid Sequences and Monoisotopic
Mass Values of the Theoretical LEP Fragments of PKCa (1῎158)a)

Amino acid sequence

1῎ 28 MADVFPGNDSTASQDVANRFARK
24῎ 29 GALRQK
30῎ 35 NVHEVK
36῎ 38 DHK
39῎ 45 FIARFFK
46῎ 62 QPTFCSHCTDFIWGFGK
63῎ 76 QGFQCQVCCFVVHK
77῎ 91 RCHEFVTFSCPGADK
92῎101 GPDTDDPRSK
102῎103 HK
104῎105 FK
106῎131 IHTYGSPTFCDHCGSLLYGLIHQGMK
132῎141 CDTCDMNVHK
142῎158 QCVINVPSLCGMDHTEKa)

Monoisotopic
mass value(MHῑ)
2497.19672.41725.39399.20928.542087.91
1796.80
1810.801087.50
284.17294.182992.39
1279.49
1987.90

Monoisotopic Mass Values of Genetically
Coded 20 Amino Acid Residues

3-Letter Code

1-Letter CodeMonoisotopic Mass

Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Trp
Tyr

A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y

71.04
103.01115.03129.04147.0757.02
137.06113.08128.09113.08131.04114.0497.05
128.06156.1087.03
101.0599.07
186.08163.06

ボ῎ルエステルやジアシルグリセロ῎ルの結合部位を含む
N 末端側 158 残基までの領域を例にあげる῍ PKCa (1῎158) には Lys158 を含めて 14 のリジン残基が含まれているが (Fig. 3)ῌ LEP を用いて消化した場合ῌ 14 の断片ペプチドが生成される (Table 2)῍
3.2 ペプチドマスリスト

アミノ酸 ῏残基ῐ はそれぞれ固有の質量を有している(Table 3)῍ 断片ペプチドの質量もῌ アミノ酸組成が異なればῌ それぞれ固有の質量を有する῍All cysteine residues (C) are modiﬁed by carbamidomethyl group.

PKCa (1῎158) の LEP フラグメント (24῎29), GALRQK

を例に挙げて説明する῍ この断片ペプチドを構成するアミノ 酸 残 基 の 残 基 質 量 ῏単 一 同 位 体 質 量 monoisotopic(PKCa) (accession No. P17252) を例に挙げて説明するがῌ

massῐ はῌ N 末端からῌ グリシン (G) が 57.02ῌ つづいて

ヒトの PKCa は 672 残基からなるタンパク質でありῌ 図

アラニン (A) が 71.04ῌ ロイシン (L) が 113.08ῌ アルギニ

や表が複雑になることからῌ 簡略化するためにῌ フォル

ン (R) が 156.10ῌ グルタミン (Q) が 128.06ῌ リジン (K) が῍ 110 ῍Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Database

128.09 である῍ したがってῌ この断片ペプチドのプロトン化分子 MH῔ の理論質量 ῐ単一同位体質量ῑ はこれらの残基質量の和にῌ 水 1 分子分のモノアイソトピック質量
18.01 とῌ プロトンの質量 1.01 を加えた 672.41 となる῍

この方法でῌ GALRQK のアミノ酸配列 ῐアミノ酸組成ῑ を数値化することが可能となる῍ 同様にῌ 他の消化断片もア
ミノ酸配列 ῐ組成ῑ に従って数値化することができる῍ このようにῌ 任意のタンパク質を任意のアミノ酸残基特異的なプロテア῏ゼを用いて消化した際に生成されるすべての断片ペプチドについてこの作業を行えばῌ 当該タンパク質から生成される特異的な断片ペプチド群の理論質量のリス
トῌ ペプチドマスリストを作成することができる῍ Table
2 の右側のカラムがῌ PKCa (1῍158) を LEP 消化した際に得られる断片ペプチド群の理論ペプチドマスリストとなる῍ この理論ペプチドマスリストを理論的なマススペクト
ルとして表すことができる῍ PKCa (1῍158) を LEP 消化した際に得られる断片ペプチド群の理論マススペクトルをFig. 4 に示した῍タンパク質は 1 次構造ῌ すなわちアミノ酸配列に独自性がありῌ 異なるタンパク質はῌ 当然のことながら異なるアミノ酸配列を有している῍ したがってῌ アミノ酸残基特異的なプロテア῏ゼを用いて消化した際に得られる断片ペプ
Fig. 5.

チド群のアミノ酸配列の組み合わせはタンパク質に固有のものとなる῍ 断片ペプチド群を構成する個῎のペプチドのPrinciple of protein identiﬁcation by peptide
mass ﬁngerprinting.

アミノ酸配列 ῐ正確にはアミノ酸組成ῑ が異なればῌ その質量も異なることからῌ アミノ酸残基特異的なプロテア῏

我῎人間がもつ目に見える形質の中でῌ 個人に固有なもゼを用いて消化した際に得られる断片ペプチド群の質量ののの一つに指紋がある῍ 同じゲノムを有する一卵性双生児

組み合わせはタンパク質に固有のものとなる῍ この断片ペでも異なるほど極めて独自性の高い形質である῍ 指紋と言プチド群の質量の組み合わせがペプチドマスリストであえば犯罪捜査に用いられるイメ῏ジが強いがῌ 最近ではῌ

る῍ したがってῌ アミノ酸配列が異なればῌ ペプチドマス

放射性同位元素使用施設などの種῎の管理区域への入退室

リストもタンパク質に固有のものとなる῍ さらにῌ このペやῌ パソコンのログオンの際に必要な個人認証システムにプチドマスリストをスペクトル表記したものῌ すなわち断も使用されている῍ タンパク質の場合ῌ ペプチドマスリス

片ペプチド群の理論マススペクトルもタンパク質に固有のトはタンパク質に固有のものでありῌ これをスペクトル表ものとなる (Fig. 5)῍

記したものがῌ 正しくタンパク質を識別するための ῒ指紋(Fingerprint)ΐῌ すなわち “Peptide Mass Fingerprint” である῍ これまでは 1 例としてῌ PKCa (1῍158) の LEP 消化によって得られる断片ペプチドの理論ペプチドマスリスト(Table 2) に基づきῌ Peptide Mass Fingerprint (Fig. 4) を作成する過程を説明してきたがῌ 配列デ῏タベ῏ス上に存在するすべてのタンパク質について同様の作業を行えばῌ
タンパク質の指紋である Peptide Mass Fingerprint のデ῏タベ῏スを作成することができる῍
3.3 デῌタベῌス検索

ある未知のタンパク質をῌ あるアミノ酸残基特異的なプ
ロテア῏ゼを用いて消化しῌ それぞれの断片を分離することなく消化物をそのまま質量分析することによってῌ その
未知タンパク質の Peptide Mass Fingerprint を得ることができる῍ この実験的に得られた未知タンパク質の PepFig. 4.

Theoretical peptide mass list of PKCa (1῍158),
which is obtained by digestion with LEP, andthe corresponding theoretical peptide massﬁngerprint.

tide Mass Fingerprint がῌ 配列デ῏タベ῏ス上のすべてのタンパク質を理論的に断片化した Peptide Mass Fingerprint の中でῌ どれに一番適合するかを検索すればῌ 統
ῌ 111 ῌ

K. Yoshino et al.

Fig. 6.

A schematic illustration of the concept of protein identiﬁcation by peptide mass ﬁngerprinting.

(A)

(B)

Fig. 7.

Comparison of an acquired peptide mass ﬁngerprint of unknown protein with theoretical peptide massﬁngerprints of unmatch (A) and the closest match (B).

計的に最も可能性の高いタンパク質を示すことが可能とな質の Peptide Mass Fingerprint との比較を行う῍ 正にῌ 犯る (Fig. 6)῍ Fig. 7A 上はῌ ある未知タンパク質を LEP 消行現場から採取された犯人の指紋とῌ デ῎タベ῎スに登録化しῌ 消化物を質量分析して得たマススペクトルῌ すなわ

されている膨大な指紋デ῎タとを照合する作業と同じであち Peptide Mass Fingerprint である῍ 次にῌ 配列デ῎タ

る῍ 測定された未知タンパク質の Peptide Mass Finger-

ベ῎ス中のすべてのタンパク質をコンピュ῎タ῎上でバ῎print はῌ デ῎タベ῎スに登録されているほとんどのタン

チャルに LEP 消化しῌ 得られた仮想断片ペプチドの配列

パク質の理論 Peptide Mass Fingerprint とは合致しないから理論的な Peptide Mass Fingerprint を作成する῍

(Fig. 7A)῍ 検索に用いたデ῎タベ῎スに ῏未知ῐ タンパクデ῎タベ῎スに 30 万種類のタンパク質がエントリ῎され質の配列情報が登録されているならばῌ 理想的にはῌ ῏未ていればῌ すべてのタンパク質についてこのバ῎チャルな知ῐ タンパク質の Peptide Mass Fingerprint と合致する

酵素消化を行う῍ この作業によって得られたすべての理論

理論 Peptide Mass Fingerprint が存在するはずであるがῌPeptide Mass Fingerprint とῌ 測定された未知タンパク

実際にはさまざまな理由から ῏未知ῐ タンパク質の Pep-

ῌ 112 ῌ

Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Databasetide Mass Fingerprint と全く同じ理論 Peptide Mass

高いがῌ 逆に溶出効率が低いためにῌ 充填剤に保持さFingerprint を探し出すことはまず不可能である῍ したれ続けῌ 通常の溶出条件で充填剤から溶出させることがってῌ 実際の同定ではῌ 測定された Peptide Mass Fin-が難しい῍ したがってῌ この前処理を施した後の試料

gerprint に最も似ている理論的な Peptide Mass Finger-

はῌ 親水性や疎水性の高い断片ペプチドを失った状態

print を探している (Fig. 7B)῍ ここではῌ 理解を助けるたでありῌ 質量分析計に導入される前段階ですべての断めにῌ 画像としてのマススペクトルを比較させているがῌ

片ペプチドが含まれていない試料となっている῍ ま

コンピュ῏タ῏によって行われる実際の検索ではῌ 当然なたῌ 充填剤から溶出される断片ペプチドもῌ ペプチドがらῌ 画像どうしの比較ではなくῌ 数値どうしの比較が行の疎水性によって溶出効率が異なるのでῌ すべてのペわれている῍

プチドが均等に溶出されるわけではない῍

Fig. 8 にῌ 実測された 6 種類のタンパク質の Peptide
Mass Fingerprint ῐLEP 消化ῑ を示した῍ A と B はいずれ

も血清アルブミンであるがῌ ウシ (Fig. 8A) とヒト (Fig.

2) すべての断片ペプチドが同じイオン生成効率をもっていない῍
現在用いられている質量分析計はῌ 電荷をもったイ

8B) の違いである῍ 同じ種類のタンパク質であっても生物オンの質量を測定するための分析機器でῌ 電荷をもた種が異なることによってアミノ酸配列も異なりῌ その結果ない電気的に中性の分子の質量を測定することはでき

Peptide Mass Fingerprint も異なっていることが明確にない῍ したがってῌ 測定試料中の分子はῌ 質量分離部

わかる῍ 残りの 4 種の Peptide Mass Fingerprint はすべに 導 入 さ れ る 前 にῌ イ オ ン 源 に お い てῌ ESI 法 やてヒト由来のタンパク質である῍ 違いがわかりやすいもの

MALDI 法などのイオン化法によってイオン化されなを故意に選んだわけではないにもかかわらずῌ タンパク質ければならない῍ ペプチド分子のイオン生成効率はῌ

の種類が異なることで Peptide Mass Fingerprint も明確

等電点や質量等のペプチドの物理的化学的性質に依存に異なることがῌ ほんの 6 種のタンパク質の実測デ῏タをしている῍ アミノ酸配列が異なればῌ このような物理比較しただけでも実感できる῍

的化学的性質も異なることからῌ 消化後の断片ペプチ

Peptide Mass Fingerprint 実測デῌタの特徴

ドのイオン生成効率は千差万別でありῌ 同じモル数の実際の解析においてῌ 理論 Peptide Mass Fingerprint

断片ペプチドが存在していても個῎のペプチドのイオと全く同じものを実測デ῏タとして得ることができない理

ン生成効率を反映してῌ 観測されるイオンの強度が異

3.4

由には二つの要因がある῍ 一つ目の要因はῌ マススペクト

なってくる῍ 生成効率の低いペプチドはイオン強度がル上に観測されたピ῏クの横軸のずれである῍ これはῌ 質

微弱であるかῌ 観測されないことも多い῍ イオン生成

量分析の際の測定誤差に起因するものでありῌ 測定精度を効率に差がある化合物を混合して測定する場合ῌ この上げる努力をすればῌ この点に関しては理論値と全く同一差が拡大するという ῒサプレッション効果ΐ も知られのデ῏タを得ることはできないまでもῌ 限りなく近似したておりῌ 測定試料中に存在しているすべてのペプチド

デ῏タを得ることは可能である῍

分子がマススペクトル上に観測されるわけではない῍

二つ目の要因はῌ 酵素消化によって生成された断片ペプ

ペプチド分子のイオン生成効率はῌ 用いるイオン化法

チドの一部がイオンとして検出されないことである῍ 上述

によっても異なってくるのでῌ 同じ試料を測定してもの測定誤差の問題はῌ 検出された ῐ存在しているῑ イオン

ESI 法と MALDI 法で同じマススペクトルが得られるの測定値と理論値との間に差が生じているという問題であことはほとんどない῍

るがῌ この場合ῌ バ῏チャルな酵素消化によって理論的には生成されるはずの断片ペプチドに由来するイオンの一部

3) 質量分析計の質量分離部はすべてのイオンを同じ効率で通過させてῌ 検出器に到達させてはいない῍

がマススペクトル (Peptide Mass Fingerprint) 上に存在

プロテインマススペクトロメトリ῏の分野ではῌしていないという測定精度以前の問題である῍ その理由にITMS やῌ 静電界ミラ῏ ῐリフレクタ῏ῑ を備えたは下記のことが考えられる῍

TOFMS が汎用されているがῌ いずれの分析計もῌ す

1) 試料の前処理の過程でῌ すべての断片ペプチドが同べての質量範囲のイオンを同じ効率で質量分離部の中を 通 過 さ せ て は い な い῍ リ フ レ ク タ ῏ を 備 え た

じ収率で回収されない῍
タンパク質のプロテア῏ゼ消化物のマススペクトルTOFMS を用いた場合はῌ 高質量になればなるほど観を測定する前にはῌ 必ず無機塩などのイオン化を阻害

測されるイオン量が低下する῍ ITMS の場合はῌ 一度する夾雑物を除くために前処理 ῐ脱塩処理ῑ を行う῍

イオンをトラップする関係上ῌ 設定したトラップ効率

多くの場合ῌ 逆相高速液体クロマトグラフィ῏用のカの最も高い m/z ῐ質量電荷比ῑ から離れれば離れるほ

ラム充填剤を用いて行われるが ῐ上述ῌ ῒ2. 概要ΐ 参

どトラップ効率は低下するのでῌ 高質量領域に加え照ῑῌ 充填剤に対する吸着 ῐ保持ῑ 効率や溶出効率はペてῌ 低質量領域のイオン量も減少する῍ リニア῏型のプチド分子の疎水性に依存する῍ 親水性の高いペプチ

TOFMS はῌ 広い質量領域にわたるイオンを分離する

ドは吸着効率が低くῌ 充填剤に吸着 ῐ保持ῑ されずにことができるうえῌ 原理的にはῌ ペプチド程度の質量

洗浄の過程で無機塩類とともに洗い流されてしまう῍をもつイオンであればすべてのイオンを同じ効率で通一方ῌ 疎水性の高いペプチドは充填剤への吸着効率は

過させῌ 検出することが可能である῍ この点では理想

ῌ 113 ῌ

K. Yoshino et al.

(A)

(B)

(C)

ῌ 114 ῌ

Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Database

(D)

(E)

(F)

Fig. 8.

Observed peptide mass ﬁngerprints of bovine serum albumin [accession No.: P02769] (A), human serum albumin[accession No.: P02768] (B), human aldehyde dehydrogenase [accession No.: P00352] (C), mammalian target of
rapamycin (mTOR) of human [accession No.: P42345] (D), human transketolase [accession No.: P29401] (E), andheat shock cognate 71 kDa protein of human [accession No.: XPῌ377283] (F).
ῌ 115 ῌ

K. Yoshino et al.

的な分析計ではある῍ しかしῌ 用いるイオン化法にも同定ῒ を防ぐために Threshold ῑ閾値ῒ の見極めῌ すなわ

依存するがῌ 分解能が低いことが難点である῍ちῌ 有意な信号として考えῌ マスリストに加えるイオン強上述した三つの理由のうちῌ 酵素消化によって生成され度とῌ ノイズとして考えῌ マスリストには加えないイオン

たすべての断片ペプチドがマススペクトル上に観測されな強度との境界値の設定に留意しなければならない῍ またῌいことに最も大きく影響している要因はῌ 1) でありῌ 次に

PMF 法において利用するデ῏タはすべてペプチドマスῌ

2) である῍ 3) の影響は相対的には少ない῍

すなわち断片ペプチドの質量の値という 1 種類の情報の一つのタンパク質分子からアミノ酸配列の異なる特異的みであることからῌ 検索結果の信頼度は実測値の精度に大な断片ペプチドが生成する性質を原理的に利用している

きく依存する῍ 測定には質量精度の優れた分析計を用いる

PMF 法であるがῌ 断片ペプチドのアミノ酸配列が異なることは言うまでもなくῌ 測定の際には常に厳密な質量較正

がゆえにῌ 前処理の過程で断片ペプチドの一部を損失しῌを行う必要がある῍ 筆者らは通常外部標準法で 30ῐ50

またイオン生成効率が異なるというジレンマがある῍ 実際

ppm の精度を確保した条件で測定したデ῏タを用いての解析ではῌ 理論的に生成するすべての断片ペプチドが検PMF 法を行っている῍ 内部標準法によってさらに精度を出されることは皆無に近くῌ タンパク質の分子量にもよる

上げることも可能である῍ 測定精度の高いデ῏タを用いれがῌ 十分量の試料を用いても半数以上の断片が検出される

ばῌ 検索ῌ 同定結果の信頼度が上昇しῌ 検索結果そのものことも極めてまれなケ῏スである῍ しかしῌ タンパク質のに悩む必要はなくなることから同定プロセスにおけるト῏

アミノ酸配列や測定精度にも依存するがῌ 10 種にも満たタルのスル῏プットも上昇する῍
PMF 法用のソフトウェア ῌ検索エンジン῍ない断片ペプチドからなる部分的なペプチドマスリストで

3.6

あってもῌ PMF 法によってタンパク質を同定することはPMF 法によってタンパク質を同定するためには検索の可能である῍ためのソフトウェアῌ サ῏チエンジンが必要となる῍ これまでに異なる検索アルゴリズムを用いた数῎のソフトウェ

3.5 ペプチドマスリスト作成時の留意点

上述したようにῌ 理論的に生成されるすべての断片ペプアが開発されているがῌ その多くはインタ῏ネット上で公チドが観測されるわけではなくῌ また検出されてもその相開されておりῌ オンラインで検索することが可能である῍

対的なイオン強度が異なることからῌ PMF 法を利用する

PMF 法用のサ῏チエンジンを利用することが可能なウェ検索に必要なデ῏タはῌ ペプチドマスリストῌ すなわちイヴサイトを Table 4 に示した῍ ほとんどのソフトウェアはオンの観測質量 ῑ多くの場合は MHΐῒ のリストでありῌ イ

ライセンスを取得することによって in-house のサ῏バ῏オンの強度デ῏タは用いられない῍ したがってῌ 検索の際を構築することが可能である῍にはῌ イオン強度の強いイオンに由来するデ῏タとῌ ノイ

4.

ズレベル付近の微弱なイオンに由来するデ῏タとは全く同

MS/MS によるタンパク質の同定

じ条件で扱われるのでῌ 実測されたマススペクトルからペ4.1

プチドマスリストを作成する際にはῌ False Positive ῑ偽MS/MS を利用してタンパク質を同定する際ῌ 従来はTable 4.
Search engine

MS/MS を利用したタンパク質同定法の発展

Search Engines for Protein Identiﬁcation by PMF on the Internet (as of March 2004)
Resource

Uniform Resource Locators (URL)

Peptide Mass
Fingerprint(MASCOTῌ)Matrix Science

http://www.matrixscience.com/cgi/search῍form.pl?FORMVER῔2&
SEARCH῔PMF

MS-ﬁt(ProteinProspector)

University of California,
San Francisco (UCSF)

http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msﬁt.htm

ProFound(PROWL)

Rockefeller University

http://prowl.rockefeller.edu/profound῍bin/WebProFound.exe

ProFoundTM(KnexusTM)

ProteoMetrics(Genomic Solutions)

http://65.219.84.5/service/prowl/profound.html

PeptideSearch(Protein identiﬁcation
by peptide mass data)

European Molecular
Biology Laboratory(EMBL)

http://www.narrador.embl-heidelberg.de/GroupPages/PageLink/
peptidesearchpage.html

PeptIdent(ExPASy)

Swiss Institute of
Bioinformatics (SIB)

http://us.expasy.org/tools/peptident.html

PepMAPPER

University of Manchester
Institute of Science andTechnology

http://wolf.bms.umist.ac.uk/mapper/

MassSearch

Eidgenössische
Technische Hochschule(ETH) Zürich

http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/ServerBooklet/MassSearchEx.html#ex
MassSearch

῍ 116 ῍Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Database

CID ῑもしくは PSDῒ によって得たプロダクトイオンマス(A)

ス ペ ク ト ル を ΐ解 読῔ す る 必 要 が あ っ た῍ BLAST やFASTA などの相同性検索プログラムを用いῌ 解読したアミノ酸配列と相同な配列を有するタンパク質を検索することによってタンパク質の同定が行われてきた῍ 現在ではῌ
配列デῐタベῐスが充実したことに加えῌ 同定のための
種῏のアルゴリズムが開発されたことからῌ 対象となるタ
ンパク質が配列デῐタベῐスに登録されている場合はῌ
PMF 法と同様にῌ 観測されたプロダクトイオンマススペ(B)

クトルから得た情報を用いるデῐタベῐス検索によってῌ
迅速にタンパク質の同定を行うことが可能となっている῍
4.2

MS/MS を利用する 2 種類の検索アルゴリズムῌ
Product Ion Mass Fingerprinting 法と Peptide
Sequence Tag (PST) 法ῌ

上述したように ῑΐ2. 概要῔ 参照ῒῌ 配列デῐタベῐスとMS/MS 解析によって得たデῐタを利用してタンパク質の同定を行うためのアルゴリズムはῌ 大きく 2 種類のカテゴ
Fig. 9.

リῐに分類することができる῍ 一つはデῐタベῐス検索を行う前にῌ 得られたプロダクトイオンマススペクトルの解

Peptide fragmentation. (A) Peptide backbone;(B) Three types of fragmentation of peptide
backbone.

読を全く行わずにῌ プロダクトイオンマススペクトルのデῐタ ῑプロダクトイオンマスリストῒ を数値デῐタとして直接デῐタベῐス検索に用いるアルゴリズムでῌ 1994

トイオンもῌ ペプチド分子を構成する種῏の原子間の結合

年ῌ 当時ῌ 米国῎シアトルの University of Washington

がランダムに切断されて生成されるわけではない῍ ペプチに所属していた Yates ら30) の研究グルῐプによって提唱

ドのフラグメンテῐションはῌ 主としてペプチドの主鎖骨された原理ῌ アルゴリズムから発展したものである῍

格を形成する結合が開裂する῍ ペプチドの主鎖骨格を構成

Yates らが開発したアルゴリズムはῌ 現在 SEQUESTῌ とする結合にはプロリンが関与する結合を除いては下記の 3名づけられた検索エンジンのベῐスになっている῍ 筆者ら

種類の結合が存在する (Fig. 9A)῍

はこのカテゴリῐに属するタンパク質同定法を Productῌa 炭素原子とカルボニル基 (CO) 間の結合

Ion Mass Fingerprinting 法と称している῍῍カルボニル基とイミノ基 (NH) 間ῌ いわゆるペプチド

もう一つのアプロῐチはῌ 部分的ではあるがプロダクト

結合

イオンマススペクトルの解読を必要とする方法でῌ 同じく

῎イミノ基と a 炭素原子間の結合

1994 年ῌ 当時ῌ ドイツ ῎ ハイデルベルクの European

したがってῌ ペプチド主鎖の結合が開裂したプロダクトイ

Molecular Biology Laboratory (EMBL) に所属していた

オンは N 末端側が 3 種類ῌ C 末端側が 3 種類ῌ 計 6 種類のMann らの研究グルῐプによって提唱された PST (Pep-

イオンに分類することができる (Fig. 9B)39)῍ ῌの結合が開tide Sequence Tag) 法がその代表的なアルゴリズムであ裂した場合の N 末端側のイオンは a タイプῌ C 末端側のる34)῍

イオンは x タイプと呼ばれている (Fig. 10A)῍ ῍の結合ῌ

5.

Product Ion Mass Fingerprinting 法ῌプロダクト

イオンマスリストを用いたデῌタベῌス検索ῌ

すなわちペプチド結合が開裂した結果生成されるプロダク
トイオンはῌ N 末端側が b type, C 末端側が y タイプと呼ばれている (Fig. 10B)῍ ῎の結合が開裂した N 末端側のプ

5.1 プロダクトイオンマスリスト

ロダクトイオンは c タイプῌ C 末端側のプロダクトイオン

PMF 法ではῌ デῐタベῐス検索に供する質量分析のは z タイプと呼ばれている (Fig. 10C)῍ 異なるペプチド主

デῐタはῌ タンパク質をアミノ酸残基特異的なプロテアῐ

鎖の結合が開裂した同じタイプの一連のプロダクトイオン

ゼを用いて消化した際に得られる断片ペプチドの質量のリの質量差からペプチドのアミノ酸配列 ῑシῐクエンスῒ をストῌ ペプチドマスリストである῍ これに対しῌ Product

読み取ることができることからῌ a, b, c, x, y, z の 6 タイプ

Ion Mass Fingerprinting 法の場合はῌ 断片ペプチドののプロダクトイオンは特にシῐクエンスイオンと呼ばれてMS/MS 解析によって得たプロダクトイオン ῑフラグメンいる῍ 観測されるプロダクトイオン ῑシῐクエンスイオンῒ

トイオンῒ の質量のリストである῍ タンパク質をアミノ酸の種類はフラグメンテῐションを誘起する条件や用いる質

残基特異的なプロテアῐゼを用いて断片化した場合ῌ 切断

量分析計によって異なるがῌ 例えば LC/MS/MS に汎用さされる部位が特異的に規定されていることから断片ペプチ

れている ESI-ITMS や ESI-Q-TOFMS の場合 ῑQ は Quad-

ドはランダムには生じない῍ 同様にῌ MS/MS の場合ῌ CID

rupole: 四重極の略ῒῌ ペプチド主鎖を構成する 3 種の結によるフラグメンテῐションによって生成されるプロダク

合の中ではῌ 専らペプチド結合が開裂して生じたプロダク

῍ 117 ῍

K. Yoshino et al.

(A)

(A)

(B)

(B)

(C)

Fig. 10.

Nomenclature of product ion (fragment ion, orsequence ion) for the most common positive Nand C-terminal ions observed in peptide fragmentation. (A) a- and x-types; (B) b- and ytypes; (C) c- and z-types.

(C)

トイオンῌ すなわち b タイプと y タイプが観測される῍ 生
成されるプロダクトイオンの質量はアミノ酸配列に依存するのでῌ アミノ酸配列が既知であればῌ 観測されるプロダ
クトイオンマススペクトルを予測することが可能である῍
例えばῌ PKCa (1῍158) を LEP 消化した際に得られるペプ

Fig. 11.

チドのうちῌ 30ΐ35 残基目に位置するヘキサペプチド
NVHEVK からはῌ 理想的には CID によって 5 種類の b
type プロダクトイオンと 5 種類の y type のプロダクトイ

オンῌ 計 10 種類の断片が生じる (Fig. 11A)῍ これらのプロダクトイオンの質量は理論的に計算することが可能でありῌ この理論質量のリストがῌ ヘキサペプチド NVHEVK

Calculated product ion mass list and spectrumof a hexapeptide NVHEVK obtained by digestion of PKCa with LEP.
(A) Five b-type
product ions and ﬁve y-type product ionsobserved in theoretical fragmentation of thepeptide NVHEVK; (B) The calculated production mass list of the peptide; (C) The calculated
product ion mass spectrum.

の理論プロダクトイオンマスリストとなる (Fig. 11B)῍ この理論プロダクトイオンマスリストをマススペクトルとしとなる῍ 個῎のプロダクトイオンのアミノ酸配列が異なれて表すことができる (Fig. 11C)῍ばῌ イオンの質量も異なることからῌ フラグメンテ῏ショペプチドは 1 次構造ῌ すなわちアミノ酸配列に独自性がンによって生じるプロダクトイオン群の質量の組み合わせありῌ 異なるペプチドはῌ 当然のことながら異なるアミノはペプチドに固有のものとなる῍ このプロダクトイオン群

酸配列を有している῍ したがってῌ ペプチドのアミノ酸配の質量の組み合わせが ῐプロダクトイオンマスリストῑ で列が異なればῌ フラグメンテ῏ションによって生じるプロ

ある῍ したがってῌ このプロダクトイオンマスリストをス

ダクトイオン群のアミノ酸配列の組み合わせが固有のもの

ペクトル表記したものῌ すなわちプロダクトイオンマスス

ῌ 118 ῌ

Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Databaseて解析しῌ プロダクトイオンマススペクトルを測定する῍ これによって断片ペプチドのプロダクトイオ
ンマスリストを得る῍3) 配列デ῎タベ῎スに登録されているすべてのタンパ

ク質をῌ 未知タンパク質の消化に使用したプロテ
ア῎ゼの特異性に従いバ῎チャルな酵素消化を行いῌ 生成されるすべての断片ペプチドの理論質量を計算する῍4) プロダクトイオンマススペクトルが測定された断片

ペプチド ῏プリカ῎サ῎イオンῐ の測定値と設定した誤差範囲内で一致する理論質量をもつバ῎チャル
な断片ペプチドを探索しῌ リストアップする῍5) リストアップされたすべての仮想断片ペプチドについてῌ 理論的なプロダクトイオンマスリストを作成する῍
6)作成された理論プロダクトイオンマスリストの中でῌ 実測されたプロダクトイオンマスリストに最も適合するものを検索する῍7) 有意に適合した仮想断片ペプチドが由来するタンパ

ク質を提示する῍
Fig. 12.

Product Ion Mass Fingerprinting 法によるタンパク質

Principle of identiﬁcation of peptide by production mass ﬁngerprinting.

同定においてῌ プロダクトイオンマスリストの情報から直接特定されるものはタンパク質ではなくῌ 断片ペプチドのペクトルもペプチドに固有のものとなり (Fig. 12)ῌ ペプチ

アミノ酸配列である῍ LC/ESI-MS/MS 法や MALDI-MS/

ドのプロダクトイオンマススペクトルはῌ 正に ῑペプチド

MS を用いてある未知タンパク質の同定を試みる場合ῌ 通の指紋 (Fingerprint)ῒ とも言うべき特徴である῍常は複数のプロダクトイオンマススペクトルを得ることがアミノ酸残基特異的なプロテア῎ゼを用いて消化した際できる῍ 得られた複数のプロダクトイオンマスリストはῌに得られる任意の断片ペプチドのアミノ酸配列がῌ 当該タ

それぞれ個別に上述のアルゴリズムに従ってデ῎タベ῎ス

ンパク質に固有のものであればῌ その断片ペプチドを検索が行われῌ 互いにその検索結果に依存することなくῌ

MS/MS 解析した際に得られるプロダクトイオンマススペ

個別にペプチドのアミノ酸配列の同定が行われる῍ 複数のクトルもタンパク質に固有のものとなりῌ 原理的にはῌ 1

断片ペプチドがῌ 同じタンパク質に由来するものであれ種類の断片ペプチドのプロダクトイオンマススペクトルかばῌ デ῎タベ῎ス検索の結果マッチしたアミノ酸配列はῌ

ら 1 種類のタンパク質分子を一義的に特定することが可

当然ながらすべて同じタンパク質に由来することとなる῍

能となる῍ すべての断片ペプチドがῌ それぞれのタンパク

タンパク質の同定精度はῌ マッチしたプロダクトイオンマ

質に固有の配列をもっているとは限らないのでῌ 必ずしもススペクトルの数に応じて相加的に上昇する῍

1 種類の断片ペプチドのプロダクトイオンマススペクトル5.3

PMF 法との比較ῌ 同定原理の類似点

から 1 種類のタンパク質を一義的に特定できないことも

Product Ion Mass Fingerprinting 法によるタンパク質

あるがῌ 多くの場合ῌ 1 種類の断片ペプチドからの情報にの同定原理もῌ その基本は PMF 法と同様である῍ PMF 法

よってῌ ある程度のタンパク質の種類を特定することは可の場合はῌ 消化断片のペプチドマスリストを検索用のデ῎

能である῍ またタンパク質を消化した際にはῌ 同一の試料

タ ῏マスリストῐ として用いているのに対し (Fig. 13A),に複数の断片ペプチドが含まれていることからῌ 他の断片

Product Ion Mass Fingerprinting 法 の 場 合 はῌ CID

ペプチドから得たプロダクトイオンマススペクトルの情報(PSD) によって生成されたプロダクトイオンのマスリスト

によってさらに詳細にタンパク質分子を限定することが可

を検索に用いている (Fig. 13B)῍ 断片化 (Fragmentation)

能となりῌ 断片ペプチドからの情報が増えれば増えるほどの手段がῌ 液相反応の酵素消化かῌ 気相反応の CID (PSD)

同定の精度は上昇する῍

かの違いである῍ ペプチド由来のイオンを開裂させて得たProduct Ion Mass Fingerprinting 法の基本手順

プロダクトイオンマススペクトル ῏プロダクトイオンマス

Product Ion Mass Fingerprinting 法の基本的な手順はリストῐ がῌ ペプチドの指紋 (Fingerprint) でありῌ この指5.2

次のとおりである῍

紋を照合してペプチド ῏タンパク質ῐ を同定する作業は正1) アミノ酸残基特異的なプロテア῎ゼを用いて未知タ
2)

しく Fingerprinting ῏指紋鑑定ῐ そのものである῍ それゆ

ンパク質を消化しῌ 断片ペプチドを得る῍えῌ 筆者らはῌ このカテゴリ῎に含まれるすべてのアルゴ

一つ以上の任意の断片ペプチドを MS/MS によっ

リズムを包括する総称として “Product Ion Mass Finger-ῌ 119 ῌ

K. Yoshino et al.

(A)

(B)

Fig. 13.

Comparison between peptide mass ﬁngerprinting and product ion mass ﬁngerprinting in principle of protein
identiﬁcation. Schematic illustrations of protein identiﬁcation by peptide mass ﬁngerprinting (A) and production mass ﬁngerprinting (B).
ῌ 120 ῌ

Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Databaseprinting” 法という名称を与えた PMF が ペプチドマ

ス (Peptide Mass) のリストを用いた Fingerprinting 指紋鑑定 であるのに対し このカテゴリに含まれる同定法は プロダクトイオンマス (Product Ion Mass) のリ
ストを用いた Fingerprinting である ただし ProductIon Mass Fingerprinting 法は フラグメント プロダク

トイオン のマスリストに加えて プリカサイオンの質量の情報も検索に用いられる 性質の異なる 2 種類の情報による検索であることから 1 種類の情報だけで検索を行う PMF 法に比べて Product Ion Mass Fingerprinting

Fig. 14.

An example of DTA ﬁle format.

Fig. 15.

An example of PKL ﬁle format.

法の同定精度は高くなる
5.4

Product Ion Mass Fingerprinting 法用のソフト

ウェア ῍検索エンジン῎
Product Ion Mass Fingerprinting 法によってタンパク質を同定するためには PMF 法と同様 検索エンジンが必要である SEQUESTῌ が開発されて以来 異なる検索
アルゴリズムを用いた数のソフトウェアが開発されているが その多くはインタネット上で公開されており オ
ンラインで検索することも可能である Product Ion Mass
Fingerprinting 法用の検索エンジンを利用することができるウェヴサイトを Table 5 に示した PMF 法 (Table 4)と同様 ライセンスを取得すれば in-house のサバを構築することが可能なソフトウェアも含まれている 残念ながら SEQUESTῌ (TurboSEQUESTTM) はインタ

MASCOTῌ (MS/MS Ions Search) を用いた検索の際に使ネット上には公開されておらず サモエレクトロン社よ用するプロダクトイオンマスリストのファイル形式 DTAり供給されているﬁle format の 1 例 を Fig. 14 に 示 す Micromassῌ

5.5

検索に用いられるプロダクトイオンマスリスト

Waters 社 の 解 析 用 ソ フ ト ウ ェ ア MassLinxTM

デῌタ(ProteinLinxTM) によって作成される PKL ﬁle format もPMF 法に供するペプチドマスリストには イオンの強DTA ﬁle format とほぼ同様で 1 行目に表示されるプリ

度のデタは使用されないが Product Ion Mass Finger-カサイオンの情報の表記形式だけが異なる (Fig. 15)printing 法による同定の場合は プロダクトイオンの測定

DTA ﬁle format の場合は プリカサイオンの測定値

質量に加え 強度デタを求められることが多い Pep-

は MH の値で表記され 次にスペスが挿入されてイオ

Frag と MS-Tag Simple では必要ない 当然ながら プ

ンの価数が表記される PKL ﬁle format の場合は 1 行目

リカサイオンの測定質量は プロダクトイオンマスリにマススペクトル上に観測されているプリカサイオン

ストを比較させる断片ペプチドをリストアップする際に必の m/z の実測値が表記され スペスの後に続いてプリ

要な情報である SEQUESTῌ (TurboSEQUESTTM) やカサイオンの強度デタ そして同じくスペスの後Table 5.

Search Engines for Protein Identiﬁcation by Product Ion Mass Fingerprinting on the Internet (as of March 2004)

Search engine

Resource

Uniform Resource Locators (URL)

MS/MS Ions Search(MASCOTῌ)Matrix Science

http://www.matrixscience.com/cgi/search῍form.pl?FORMVERSEARCH MIS

MS-Tag(ProteinProspector)

UCSF

http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/mstag.htm

MS-Tag Simple(ProteinProspector)

UCSF

http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/mstagfd.htm

PepFrag(PROWL)

Rockefeller University

http://prowl.rockefeller.edu/prowl/pepfragch.html

Sonor ms/msTM(KnexusTM)

ProteoMetrics(Genomic Solutions)

http://65.219.84.5/service/prowl/sonar.html

Cocoozo

National Institute ofAdvanced Industorial
Science and Technology

http://www.cbrc.jp/cocoozo/input.do

῍ 121 ῍2&

K. Yoshino et al.

処理能力によってはῌ 長い処理時間が必要となる῍
5.6

Product Ion Mass Fingerprinting 法の特徴

Product Ion Mass Fingerprinting 法ではῌ 同一の試料中に混在する複数の断片ペプチドに由来する個῎のプロダ
クトイオンマスリストはῌ それぞれが全く独立して非依存的にデ῏タベ῏ス検索が行われῌ 個別にマッチするアミノ酸配列 ῑ断片ペプチドῒ が同定される῍ したがってῌ 理論
的にはῌ 同一の試料中に多数のタンパク質が混在している
複雑な混合物を測定した場合にもῌ 原理的にはそれぞれのFig. 16.

タンパク質を同定することは可能である῍ PMF 法を用い

An example of MGF format.

た場合ῌ 原理的にはῌ 2ῐ3 種類の混合物であっても何の問題もなくタンパク質を同定することは可能ではあるがῌ あにプリカ῏サ῏イオンの価数が表記される῍ MASCOTῌ

まり複雑な混合物を解析することには適していない῍

(MS/MS Ions Search) に用いられる Mascot generic ﬁleあるタンパク質をプロテア῏ゼ消化した場合ῌ ある程度(MGF) format ῑ拡張子は mgfῒ も基本的な入力情報は上記の試料量があれば通常は同一タンパク質に由来する複数の2 種の形式とほぼ同じでῌ 一つのプリカ῏サ῏イオンに由異なる断片ペプチドのプロダクトイオンマスリストが 1

来するプロダクトイオンマスリストデ῏タセットの始めと回の解析で得られる῍ その場合ῌ それぞれのプロダクトイ

終わりを “BIGIN IONS” と “END IONS” とそれぞれ明記

オンマスリストの検索はῌ 非依存的に行われるがῌ 結果としている点やῌ TITLE を挿入できる点ῌ またプリカ῏サ῏してῌ いずれのプロダクトイオンマスリストの検索においイオンの m/z の実測値や価数をそれぞれ “PEPMASS῔”ても同一のタンパク質が有意な候補として提示される῍ しや “CHARGE῔” の後に記載する点でファイル形式がわかたがってῌ それぞれのプロダクトイオンマスリストの検索

りやすくなっている (Fig. 16)῍

結果についての確認ῌ 検証を相互に行うことが可能とな

ここではῌ すべてプリカ῏サ῏イオンの価数を 2 価としる῍ 理論的には 1 種類の断片ペプチドのプロダクトイオン

た場合の例を示した῍ プリカ῏サ῏イオンの価数の値はῌマスリストからタンパク質を同定することは可能である

プリカ῏サ῏イオンの m/z 値からῌ MHΐ の値を計算するがῌ Product Ion Mass Fingerprinting 法はῌ 上記のよう

際 に 使 わ れ る の み な ら ず ῑPKL ﬁle format や MGFに任意のプロダクトイオンマスリストの解析結果をῌ 別のformat の場合ῒῌ プロダクトイオンの価数の最大値を規定

解析結果によって確認ῌ 検証することが可能となる auto-

している値でもある῍ MALDI 法では問題にならないがῌ

conﬁrmatory な方法である40)῍

ESI 法を用いてペプチドをイオン化した場合ῌ 多くの場

これらの理由からῌ Product Ion Mass Fingerprinting合ῌ 1 分子のペプチドに複数のプロトンが付加して生成さ法は特に LC/MS/MS を利用したタンパク質の同定に適れた多価イオンからのプロダクトイオンマススペクトルがした方法である῍

得られる῍ プリカ῏サ῏イオンが 2 価であった場合にはῌ

6.

プロダクトイオンマススペクトルには 2 価と 1 価のプロ
ダクトイオンが混在することになる῍ プロダクトイオンマ

6.1

Peptide Sequence Tag (PST) 法

Peptide Sequence Tag

スリストに表記される数値は m/z の値でありῌ この数値

MS/MS 法によって取得したデ῏タを利用してῌ 配列

だけでそれぞれのプロダクトイオンの価数は判断できなデ῏タベ῏ス検索を行いタンパク質の同定を行うためのもい῍ したがってῌ デ῏タベ῏ス検索を行う際にはῌ 1 価のう一つのカテゴリ῏はῌ 部分的ではあるがプロダクトイオ

プロダクトイオンの m/z とῌ 2 価のプロダクトイオンのンマススペクトルの解読を必要とする方法である῍ この方

m/z の 2 種類のリストが混在した理論プロダクトイオン法の代表的なアルゴリズムが Peptide Sequence Tag

マスリストが作成されῌ 実測されたプロダクトイオンマス(PST) 法である῍

リストとの比較が行われている῍

ペプチドの MS/MS 解析によって得たプロダクトイオ分解能の高い分析計を用いてプロダクトイオンマススペ

ンマススペクトルから de novo Sequencing によってアミクトルを取得した場合ῌ デ῏タ解析用のソフトウェアを利ノ酸配列の決定を試みてもῌ 必ずしもペプチドのアミノ酸用してῌ イオンの価数を判別しῌ 多価のイオンから 1 価の配列を完全に決定するために必要なすべてのプロダクトイ

イオンに変換しῌ 多価イオンが混在するプロダクトイオン

オン ῑシ῏クエンスイオンῒ が観測されるわけではない῍

マススペクトルからすべてのイオンが 1 価のイオンにプロダクトイオンの種類とその強度はῌ ペプチドのアミノよって構成されるプロダクトイオンマススペクトルに変換

酸配列に大きく依存しῌ プロダクトイオンマススペクトルすることも可能である῍ 当然ῌ この処理を施した方が精度の質はプリカ῏サ῏イオンのイオン量にも依存している῍の高い同定が可能となるがῌ この処理はコンピュ῏タ῏に試料の量が十分に確保できる市販品や合成ペプチドを用い負担を強いるプロセスでありῌ LC/MS/MS によって取得た解析とは異なりῌ 試料の量が限られた生体由来のタンパされた大量のデ῏タを変換する際にはῌ コンピュ῏タ῏のク質ῌ ペプチドを解析する場合ῌ 測定されたプロダクトイ

῍ 122 ῍Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Database

オンマススペクトル上に完全なアミノ酸配列を決定するために必要な最小限のプロダクトイオンが観測されるケ῎ス
はまれである῍ しかしῌ ペプチドの全配列を決定することはできなくてもῌ 数残基程度の部分配列を決定することが可能なプロダクトイオンが観測されるケ῎スは多い῍ 観測されたプロダクトイオンの情報だけではῌ 全アミノ酸配列が決定できない場合ῌ BLAST や FASTA などの相同性検
索プログラムを用いῌ 配列デ῎タベ῎スから解読した部分
アミノ酸配列と相同な配列を検索しῌ その結果得られた相同性の高いアミノ酸配列の前後の配列情報を利用することによって解析したいペプチドの全アミノ酸配列を類推ῌ 決定することも行われていた41)῍

Fig. 17.

de novo sequencing of a trypic peptide fromhuman PKCa. All ions observed in the production mass spectrum are a complete set of b-typesequence ions enough to determine the complete amino acid sequence.

Fig. 18.

An example of product ion mass spectrum inwhich observed product ions are not enough todetermine the complete amino acid sequence.

しかしながらῌ FASTA や BLAST などの相同性検索を行うためにはῌ 部分アミノ酸配列とはいえῌ ある程度の長さのアミノ酸配列が必要とされる῍ したがってῌ プロダク
トイオンマススペクトルから 2, 3 残基分の配列しか解読できない場合にはῌ 上述の方法を利用してペプチドの全ア
ミノ酸配列を解析しῌ タンパク質を同定することはできなかった῍ Mann と Wilm はῌ 2, 3 残基の部分配列しか解読できない場合であってもῌ ῑ解読した数残基の部分配列ῒῌ
ῑその部分配列を解読する際に用いたプロダクトイオンの質量ῒῌ および ῑプリカ῎サ῎イオンの質量ῒ の 3 種の情報を用いてデ῎タベ῎ス検索を行うことによってῌ 断片ペプ
チドのアミノ酸配列を特定しῌ タンパク質を同定するためのアルゴリズムを考案した34)῍ 彼らは 2, 3 残基の部分配列しか解読できないようなプロダクトイオンマススペクトル
からでも読み取ることができる上述の 3 種の情報によって規定できる配列情報 ῏タグῐ を “Peptide Sequence Tag”と呼んだ34)῍
Fig. 17 に PKCa をトリプシンを用いて消化した際に得られたヘキサペプチド NVHEVK を MS/MS 解析した際ῌ

き る῍ し か し な が らῌ プ ロ ダ ク ト イ オ ン m/z 214.12,

b タイプのシ῎クエンスイオンがすべて観測された場合の351.18, 481.22 の観測質量の情報だけではこれらのイオン

プロダクトイオンマススペクトルを示した῍ 同一シリ῎ズ

が b タイプであるか y タイプであるかというシ῎クエンのすべてのシ῎クエンスイオンが観測されればῌ その観測

スイオンの種類を判別することはできないのでῌ この 2 種

質量に基づき断片ペプチドのアミノ酸配列を完全に解読すのアミノ酸残基の配列順序は確定できない῍ すなわちῌ 従ることが可能である῍ しかしながらῌ 前述したようにῌ 試

来の de novo Sequencing ではῌ Fig. 18 に示したプロダク

料の量が限られている生体由来のタンパク質から得た断片

トイオンマススペクトルの情報からではῌ このペプチド中

ペプチドを解析した際にはῌ Fig. 17 のように完全なアミにῌ His-Glu もしくは Glu-His の配列が存在していること

ノ酸配列を解読できる質をもったプロダクトイオンマスス

だけしか解読することができない῍ 5 種のシ῎クエンスイ

ペクトルが得られることはまれである῍ シ῎クエンスイオ

オンのうちῌ たった 2 種が観測されなかっただけで 6 残基

ンシリ῎ズが部分的にしか観測されないプロダクトイオンからなるアミノ酸配列のうちῌ 4 残基分の配列が決定でき

マススペクトルが得られた場合を例に挙げる῍ Fig. 18 になくなりῌ さらに残りの 2 残基の順序すら決定できなく示したプロダクトイオンマススペクトルはῌ Fig. 17 と同なってしまうのである῍ このような例は実際の解析においじペプチドを解析した際に得られたものである῍ ここではて決してまれなケ῎スではない῍b2, b3, b4 のシ῎クエンスイオンが観測されているがῌ b1

Mann と Wilm はῌ de novo Sequencing によって数残と b5 のイオンは観測されていない῍ このプロダクトイオ基程度の部分アミノ酸配列しか解析できないプロダクトイ

ンマススペクトルで観測されている m/z 480.22 のイオン

オンマススペクトルにおいてもῌ 3 種類の ῑ部分配列ῒῌ すと m/z 351.18 のイオンとの測定値の差 129.04 からグル

なわちῌ [Region 1], [Region 2], [Region 3] の質量の情

タ ミ ン 酸 残 基 がῌ 加 え て m / z 351.18 の イ オ ン と m/z

報を読み取ることができると考えた (Fig. 19)῍ どのような214.12 のイオンとの測定値の差 137.06 からヒスチジン残ペプチドであってもῌ そのアミノ酸配列は [Region 1]ΐ

基がこのペプチドに存在していることを読み取ることがで[Region 2]ΐ[Region 3] と表すことができῌ [Region 1],

ῌ 123 ῌ

K. Yoshino et al.

値である῍

(A)

Mann と Wilm はῌ プロダクトイオンマススペクトルから読み取ることのできる [m1]ΐ[partial sequence]ΐ[m3]からなる情報を “Peptide Sequence Tag” と名づけῌ デ῎
タベ῎ス検索によって断片ペプチドのアミノ酸配列を特定しῌ タンパク質を同定するための特異的な指標になることを示した34)῍
6.2

PST 法によるタンパク質同定の基本手順

PST 法によってタンパク質を同定する際にῌ プロダク

トイオンマスリストの情報から読み取ったタグ情報 PSTによって直接特定されるものはタンパク質ではなくῌ 断片(B)ペプチドのアミノ酸配列である῍ プロダクトイオンマスス
ペクトルの情報からペプチドのアミノ酸配列を特定しῌ 特
定されたアミノ酸配列に基づいてタンパク質を同定するアプロ῎チはῌ Product Ion Mass Fingerprinting 法によるタンパク質同定と同じである῍ したがってῌ PST 法によるタンパク質同定の基本手順はῌ Product Ion Mass Fingerprinting 法の手順とほぼ同じとなる῍ PST 法の場合はῌ プ

ロダクトイオンマススペクトルを解読してῌ PST を読み取る必要があるがῌ Product Ion Mass Fingerprinting 法の場合はῌ スペクトルを解読する必要がないことはῌ これ
まで幾度となく述べてきた῍ PST 法によるタンパク質同Fig. 19.

(A) Schematic diagram of “peptide sequence tag”
deﬁned by Mann and Wilm. (B) Decipherment ofa “peptide sequence tag” from the product ion
mass spectrum shown in Fig. 18, in whichobserved product ions are not enough todetermine the complete amino acid sequence.

定の基本手順は次のとおりである῍1) アミノ酸残基特異的なプロテア῎ゼを用いて未知タ

ンパク質を消化しῌ 断片ペプチドを得る῍
2)

一つ以上の任意の断片ペプチドを MS/MS によって解析しῌ プロダクトイオンマススペクトルを測定する῍

3) 測定されたプロダクトイオンマススペクトルから部

分アミノ酸配列を解読しῌ その結果に基づきタグ情[Region 2], [Region 3] の質量をそれぞれ [m1], [m2], [m3]とした場合ῌ ペプチドの質量 M は [m1]ΐ[m2]ΐ[m3] とな

報 PST を読み取る῍る (Fig. 19A)῍ これらの 3 種類の ῑ部分配列ῒ の情報はῌ

4) 配列デ῎タベ῎ス上のすべてのタンパク質をῌ 未知それぞれῌ プロダクトイオンマススペクトルを解読するこタンパク質の消化に使用したプロテア῎ゼの特異性とによって得た [m1], [partial sequence (m2)], [m3] の質量に従いバ῎チャルな酵素消化を行いῌ 生成されるす情報から規定することができる῍

べての断片ペプチドの理論質量を計算する῍[m1] は de novo Sequencing によって部分配列 [partial

5) プロダクトイオンマススペクトルが測定された断片

sequence] を読み解く際に利用したシ῎クエンスイオンのペプチド ῏プリカ῎サ῎イオンῐ の測定値と設定しうちῌ シ῎クエンスイオンが b シリ῎ズであるならばῌ 最

た誤差範囲内で一致する理論質量をもつバ῎チャル

も低質量のイオンの実測値と 0 との差 ῏῔実測値ῐ でῌ こ

な断片ペプチドを探索しῌ リストアップする῍の質量は読み解いた部分配列 [Partial Sequence] の N 末

6) 設定誤差条件を満たすすべての仮想断片ペプチドの端側の部分アミノ酸配列 [Region 1] を規定する数値であ中でῌ 実測されたプロダクトイオンマススペクトルる῍

から読み取った PST によって規定される条件を満[Partial Sequence] は正にῌ de novo Sequencing によったすアミノ酸配列をもつ断片ペプチドを検索する῍て読み解いた部分配列である῍7) 有意に適合した仮想断片ペプチドが由来するタンパ

ク質を提示する῍[m3] は de novo Sequencing によって部分配列 [Partial

6.3 検索に供する PST デῌタ入力方法

Sequence] を読み解く際に利用したシ῎クエンスイオンのうちῌ シ῎クエンスイオンが b シリ῎ズであるならばῌ

PST 法によってタンパク質を同定するためにはῌ デ῎

最も高質量のイオンの実測値と断片ペプチドの実測質量

タベ῎ス検索を行う前に de novo Sequencing によって部(M ) との差で ῏プロトン化分子の質量 MHΐ との差ではな

分アミノ酸配列を読み解く必要がある῍ この際ῌ C 末端かいῐῌ この質量は読み解いた部分配列 [partial sequence]らῌ もしくは N 末端からアミノ酸配列を逐次読み取るこの C 末端側の部分アミノ酸配列 [Region 3] を規定する数とができない場合ῌ ῏PST 法が有効なのはこうした場合でῌ 124 ῌ

Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Database

(A)

(B)

Fig. 20.

(A) Schematic diagram of the syntax form of “peptide sequence tag” for protein identiﬁcation by using“PeptideSearch” and “Sequence Query/MASCOTῌ” programs. (B) Search form of “Peptide Search” program forprotein identiﬁcation by peptide sequence tags.

あるが῏ 観測された複数のプロダクトイオンの質量の差かい場合が多い῍ しかしῌ b シリ῎ズか y シリ῎ズかを判断らアミノ酸残基を特定しῌ 部分的なアミノ酸配列を読み解しなくても PST 法を利用してタンパク質同定を行うこと

くことは可能であってもῌ このアミノ酸配列が b シリ῎ズ

は可能である῍ Mann らが開発した PST 法用のサ῎チエのシ῎クエンスイオンから読み取ったものかῌ y シリ῎ズ

ンジン PeptideSearch を用いてデ῎タベ῎ス検索する際のシ῎クエンスイオンから読み取ったものかを判断できなの PST デ῎タの入力形式はῌ (Start Mass) Partial Se-

῍ 125 ῍

K. Yoshino et al.

quence (End Mass) である (Fig. 20). Start Mass はῌ deい῍ Product Ion Mass Fingerprinting 法はῌ プロ

novo Sequencing によって部分配列 [Partial Sequence]

ダクトイオンマススペクトルからアミノ酸配列の解を読み解く際に利用したシ῎クエンスイオンのうちῌ 最も読を行う必要は一切ない῍

低質量のイオンの実測値である῍ Fig. 20A の例の場合ῌ

2)

PST 法はῌ 検索に供するプロダクトイオンの質量

Start Mass は 214.12 である῍ 一方ῌ End Mass はῌ de

情報 ῏Fig. 20A の入力形式では Start Mass と End

novo Sequencing によって部分配列 [Partial Sequence]

Mass に入力する質量情報ῐ はῌ すべて同じシ῎ク

を読み解く際に利用したシ῎クエンスイオンのうちῌ 最も

エンスイオンシリ῎ズに属するプロダクトイオンの

高質量のイオンの実測値である῍ Fig. 20A の例の場合ῌ

情報である必要がある῍ 一方ῌ Product Ion Mass

End Mass は 480.22 である῍ イオンの質量の高低はῌ シ῎Fingerprinting 法はῌ 検索に供するプロダクトイ

クエンスイオンが b シリ῎ズか y シリ῎ズかであるかにオンの質量情報はῌ 同じシ῎クエンスイオンシリ῎

依存することではない῍ 一方ῌ Partial Sequence はῌ 部分

ズに属するプロダクトイオン由来である必要はな

配列を読み取ったシ῎クエンスイオンが b シリ῎ズでい῍ 通常はῌ 複数のシリ῎ズ ῏タイプῐ のシ῎クエ

あっても y シリ῎ズであってもῌ 必ず低質量側から高質量

ンスイオンが混在しているマスリストを利用してい側に向かって読み取った配列を入力する῍ もしῌ 部分配列

る῍を読み取ったイオンが y シリ῎ズであった場合はῌ 結果的

PST 法はῌ プロダクトイオンマススペクトルを解読しῌには通常とは逆の C 末ΐN 末方向の配列を入力すること

部分アミノ酸配列を読み取る作業が必要でありῌ 迅速な検になる῍ 部分配列はῌ 必ずしも N 末ΐC 末方向に入力する索は困難である῍ 近年は de novo Sequencing 用のソフト必要はなくῌ 低質量ΐ高質量方向で入力する῍ このようにῌ

ウェアも発達してきてはいるがῌ 数残基程度の部分アミノ

PST デ῎タの入力形式にはῌ シ῎クエンス ῏プロダクトῐ

酸配列だけしか読み取ることのできないような情報の少な

イオンが b シリ῎ズであるか y シリ῎ズかであるかの情

いプロダクトイオンマススペクトルの場合ῌ de novo Se-

報 を 加 え る 必 要 は な い῍ 検 索 を 始 め る 前 にῌ “Pattern

quencing 用のソフトウェアでこの部分アミノ酸配列を正Match: Search by:” のところでῌ Y-type sequence ions

確に読み取ることは難しいように思われる῍ したがってῌもしくは B-type sequence ions を選択する必要があるが多くの場合ῌ マニュアルで部分アミノ酸配列を読み取る必῏Fig. 20B に表示されている一番下のパラメ῎タ῎ῐῌ

要がある῍ この作業はある程度の経験が必要とされῌ 解読

Y-typeῌ B-type の 2 パタ῎ンの検索を試してみれば問題

結果に個人差が生じる部分でもある῍ しかしながらῌ 正確のないことである῍ 多くの場合ῌ 結果的に異なるパラメ῎な解読が行われればῌ 少ない情報でもῌ 正確に同定するこタ῎を選択した方ではῌ 有意なペプチドが同定されることとが可能な有用な方法である῍
PST 法はῌ Yates らが SEQUSETῌ の基本となったア

はまれである῍
6.4

PST 法と Product Ion Mass Fingerprinting 法

ルゴリズムを発表した年と同じ 1994 年に発表された方法の相違点であるがῌ 上記のような理由でῌ 自動化も難しくῌ 作業もこ の カ テ ゴ リ ῎ に 含 ま れ る 方 法 はῌ SEQUESTῌ

やや難解で繁雑でもありῌ スル῎プットも低いことからῌ

(TurboSEQUESTTM) や MS/MS Ions Search/MASCOTῌ

PMF 法や Product Ion Mass Fingerprinting 法と比較しに代表される Product Ion Mass Fingerprinting 法と同じて利用頻度は少ない῍

MS/MS によって得たプロダクトイオンマススペクトルを6.5利用する同定法ではあるがῌ 基本的な検索アルゴリズムは下記の点で明確に異なる῍
1)

PST 法用のソフトウェア ῌ検索エンジン῍

PST 法 はῌ プ ロ ダ ク ト イ オ ン マ ス ス ペ ク ト ル か らMann と Wilm が定義した PST を読み取りῌ このタグ情PST 法ではῌ デ῎タベ῎ス検索の際ῌ プロダクトイ

報を入力しῌ 検索する方法である῍ この方法によってアミオンとプリカ῎サ῎イオンの質量情報以外にῌ de

ノ酸配列およびタンパク質を同定するための検索エンジン

novo Sequencing によって部分アミノ酸配列を読に はῌ Mann ら の 開 発 し た PeptideSearch が あ る῍ Se-

み解くなどῌ 得られたプロダクトイオンマススペク

quence Query (MASCOTῌ) を用いて PST 法によるデ῎

トルを解読した結果を検索に利用しなければならな

タベ῎スサ῎チを行うことも可能である῍ タグ情報の入力

Table 6.

Search Engines for Protein Identiﬁcation by PST on the Internet (as of March 2004)

Search engine

Resource

Uniform Resource Locators (URL)

PeptideSearch(Protein identiﬁcation by
peptide sequence tags)

EMBL

http://www.narrador.emblheidelberg.de/GroupPages/PageLink/
peptidesearchpage.html

Sequence Query(MASCOTῌ)Matrix Science

http://www.matrixscience.com/cgi/search῍form.pl?FORMVERῑ2&
SEARCHῑSQ

MS-Seq(ProteinProspector)

UCSF

http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msseq.htm

῍ 126 ῍Mass Spectrometry-Based Protein Identiﬁcation by Correlation with Sequence Database

方法は PeptideSearch と同じであるがῌ シ῏クエンスイ

でῌ 今や質量分析法は不可欠な基盤技術に成長した῍ 質量

オンのタイプを指定する必要はなくῌ また複数の断片ペプ分析計が普及すること自体はたいへん好ましいことであチドのタグ情報を入力することも可能である῍ MS-Seq

る῍ 質量分析計の操作法も簡便になりῌ 配列デ῏タベ῏ス(ProteinProspector) はῌ タグ情報の入力方法が Peptideも充実しῌ 各種のソフトウェアも発達したことからῌ タンῌSearch や Sequence Query (MASCOT ) とは異なっていパク質のプロテア῏ゼ消化物を質量分析しῌ タンパク質をる῍ オンラインで検索することが可能なサ῏チエンジンを同定するという作業はῌ すでに一部の専門家だけが行うもTable 6 に示した῍のではなくなっている῍ 機器の維持管理さえしっかり行われていればῌ 同定までの一連の作業自体は決して難しいも

7. お わ り にのではない῍ マニュアル書も数多く出版されておりῌ ある

本稿はῌ 質量分析法と配列デ῏タベ῏スを利用してタン程度の質をもった結果であればῌ 比較的簡単に出すことがパク質の同定を行う方法についてῌ 本誌 ῒ解説 (Commen-

可能となっている῍ それゆえかῌ マススペクトルの測定やtary)ΐ の投稿規定ῌ ῒ質量分析の分野でῌ 比較的一般性のあデ῏タベ῏ス検索の作業をブラックボックスの中に閉じ込る特定の主題についてῌ 専門分野外の読者を対象として解めてしまいがちになっている῍ しかしῌ これでは科学とは説する῍ 学生会員にも理解できるような内容と表現になる

言えない῍ 観えるべきものも観えてはこない῍ デ῏タベ῏ような配慮が必要である῍ΐ に沿った形で解説した῍ 専門家

ス検索用のソフトウェアはῌ 質量分析のデ῏タをῌ アミノ

にとっては常識であることに対してもῌ 初歩的な説明を加酸配列やタンパク質の名前に変換するだけのものでありῌえῌ またなるべく一般化した説明を心がけたためῌ 単純に

マススペクトルの質の悪さをカバ῏するものではない῍ ま

記述しすぎる箇所やῌ 簡易すぎて冗長な部分があることをしてやῌ タンパク質の同定を行う人間の犯したミスをカお許しいただきたい῍ 筆者らは数年前から学部学生の実習

バ῏するものでもない῍ ディスプレイに映し出されるタンに ῒPMF によるタンパク質の同定ΐ を導入している῍ 図もパク質の同定結果の質はῌ 解析に供したタンパク質試料のふんだんに盛り込ませていただきῌ 本稿を実習の副読本と質ῌ 質量分析のデ῏タの質ῌ ソフトウェアを利用する人間

して利用することも念頭に置いた῍の知識や経験の質を越えることは決してない῍ タンパク質

本稿で紹介したソフトウェアῌ 検索エンジンはῌ イン

を解析し同定する作業はῌ プロテオミクスや他の生命科学

タ῏ネット上に公開されていてῌ 誰もが気軽に試すことの研究を進める過程においてῌ 多くの場合ῌ 研究の初期段階

できるものにとどめῌ 特定の機器メ῏カ῏の解析ソフトに行われる過程である῍ したがってῌ タンパク質の同定結ウェアに付属しているツ῏ルやῌ ベンチャ῏企業が販売し果はῌ その後の研究の成否を左右する極めて重要な結果でているソフトウェアなどῌ ライセンスを取得してのみ使用あることを認識しなければならない῍ 不幸にも誤って真実が許されるソフトウェアの名前は必要がない限り割愛しとは異なるタンパク質を同定した場合ῌ その誤った同定結た῍ このようなソフトウェアにも優れたものが多いのでῌ

果に基づいて行われた機能解析などの実験結果が全く無意

別の機会に紹介させていただきたい῍ また本稿ではῌ 方法

味なものとなる῍ このような ῒ誤認逮捕ΐ や ῒ冤罪ΐ を未論を一般化して説明するためにῌ 各῎のソフトウェアの特然に防止するためにはῌ タンパク質の試料を調製する過程

徴に関してはほとんど触れてはいないがῌ どれ一つ同じソからῌ マススペクトルの測定ῌ ソフトウェアを用いたデ῏

フトウェアはなくῌ すべてのソフトウェアは開発者の意図

タベ῏ス検索までのすべての過程においてῌ より質の高いを反映した独自の特徴をもっている῍

結果を得るための努力を惜しまずῌ 常に細心の注意を払い

プロテオミクスや昨今のプロテインマススペクトロメト

作業を行わなければならない῍ 特にῌ タンパク質の指紋

リ῏はῌ 多くの点で情報科学といえる要素をもっておりῌ(Fingerprint) を採取する過程ῌ すなわちタンパク質のプより高い同定精度を目指して既存のアルゴリズムも改良さ

ロテア῏ゼ消化物を質量分析する過程においてῌ 高精度ῌれῌ 進歩し続けている῍ またῌ 新しいアルゴリズムも考案

高感度ῌ 高分解能のマススペクトルを得ることは最も大切されῌ そのアルゴリズムに基づき新しいソフトウェアもである῍ 事件の犯行現場に残された犯人の指紋の採取方法

次῎に開発されている῍ 最近ではῌ 米国ハ῏バ῏ド大学のῐ質量分析ῑ やῌ 指紋の照合方法 ῐデ῏タベ῏ス検索ῑ が適Gygi らがῌ ペプチドの MS/MS 解析において生成された切でない場合ῌ 犯人 ῐタンパク質ῑ を特定できないかῌ もプロダクトイオンの強度比とアミノ酸配列との相関をソフ

しくは無実の人 ῐ無関係のタンパク質ῑ を逮捕 ῐ同定ῑ しトウェア自らが学習しῌ プロダクトイオンの質量に加えてしまうことになる῍ 質量分析やデ῏タベ῏ス検索をブてῌ 強度比デ῏タも利用したマススペクトルの照合を行う

ラックボックスの中に入れてしまうことはたいへん危険なことによって断片ペプチドのアミノ酸配列を特定しῌ タンことである῍ マススペクトルの生デ῏タやデ῏タベ῏ス検

パク質を同定する検索アルゴリズムを考案した42)῍ 検索ア索の結果の検証を常に心がけることを勧める῍

ルゴリズムの開発の歴史やῌ 最近開発された有用な検索ア

インフルエンザ菌ゲノムの全塩基配列を決定した

ルゴリズムの紹介ῌ これまでに開発された検索エンジンのVenter がῌ この業績を成就させた舞台となった TIGR を比較など各論的な解説も別の機会に譲りたい῍

設立したのは 1992 年でありῌ 翌 1993 年ῌ インフルエン

近年ῌ 多くの研究機関に質量分析計が設置されῌ 身近なザ菌のゲノムシ῏クエンスプロジェクトを開始してい分析機器の一つになった῍ 生命科学研究を推進するうえる43)῍ このプロジェクトはῌ 全生物種の中で初めてゲノム

῍ 127 ῍

K. Yoshino et al.

の全塩基配列を決定したという意義に加え 後にセレラ
9)

ジェノミクス社がヒトゲノムのシクエンスプロジェクトに採用した Whole Genome Shotgun Sequencing 法を利用して初めてゲノムの全塩基配列を決定したという意義も

10)

忘れてはならない このプロジェクトの成果発表は 1995
年まで待たなくてはならないが Venter らがこのプロ

11)

ジェクトを開始した 1993 年 五つの研究グルプが 独
自に PMF 法の原理を発表した25)29) 翌 1994 年 Yates
らは Product Ion Mass Fingerprinting 法の原理
SEQUESTTM の基盤となったアルゴリズムを発表し30) 同

12)
13)

年 Mann と Wilm は PST 法を発表している  そして34)

同じく 1994 年 イタリアのシエナで開催された The 1st
Siena 2D Electrophoresis Meeting でオストラリアの

14)
15)

Wilkins が “Proteome” の概念を初めて提唱している44)

プロテオミクスが注目され始めてからも久しく 2004 年
3 月現在で “Proteomics,” “Molecular & Cellular Proteomics,” “Journal of Proteome Research,” “Proteome Science”

16)
17)

とプロテオミクス プロテオムを冠した 4 誌の専門誌が発行されている 現在 質量分析法を利用してタンパク質18)の同定を行う際のイオン化法としては 専ら MALDI 法とESI 法の 2 種類のイオン化法が使われているが この 2 種のイオン化法の開発に大きく貢献した 2 名の研究者に2002 年ノベル化学賞が授与されるに至った24) Venter

19)
20)

らがインフルエンザ菌のゲノムシクエンスプロジェクトを開始してから そして Mann25), Henzel26), Yates27),

21)

Pappin28), James29) らが PMF 法の原理を発表してから

ちょうど 10 年目のことであった 今や プロテオミクス
は大きな樹に成長し 生命科学の主要な研究領域の一役を

22)
23)

担っているが 若い研究者たちによってこのプロテオミク
スという巨樹の 種 がまかれたのは ほんの十数年前の24)ことだったのである PMF 法の考案者の一人 Henzel
は この時期の一連の 発見 を “Mass Spectrometry
25)

Evolves, 1992” と表現している45)

文
1)

2)

3)
4)

5)
6)

7)
8)

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Keywords: Peptide mass ﬁngerprinting, Protein identiﬁcation, Database search, MS/MS, Peptide sequence tag, Production mass ﬁngerprinting

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