平成 24 年度 共同利用・共同研究報告2012 Fiscal Year Cooperative Research Program Report
研究課題 ’12－1

な偏性好気性真菌であり , 本菌は , 肺で感染後 , 脳血液クリプトコックスの低酸素ストレス応答機構解析～低酸素応答遺伝子として見出した「転写因子 A」の分子機能解析を中心として～
川本進・清水公徳・大楠美佐子・萩原大祐（千葉大学真菌医学研究センター）

関門を越え脳髄膜へ移行して病原性を発揮して行く際 ,高酸素環境から低酸素環境への酸素欠乏ストレス条件に打ち勝ってはじめて増殖し , 病原性を発揮して行く . す
なわち , 本菌の低酸素環境ストレス応答は , 本菌感染の病原因子の一つと言える . 我々は , 本菌の細胞周期制御機構を研究中 , 低酸素環境条件下では細胞周期制御がflexible になるという , 本菌のユニークな低酸素ストレス

Raclavsky, Vladislav（チェコ・パラツキー大学）
Sipiczki, Matthias（ハンガリー・デブレツェン大学）応答現象を見出した . そして , 我々は , Agrobacerium を用（東京大学大学院薬学系研究科）

これまでに「転写因子 A」を見出して来たが , 平成 24

関水和久・松本靖彦
田村三浦裕（千葉大学大学院医学研究院）
恵・園田智子構築してスクリーニングし , 低酸素応答遺伝子として ,年度には , 「転写因子 A」の分子機能解析を更に詳細に進めた .

（横浜市立大学大学院医学研究科）

畑

いた , ゲノムランダム挿入遺伝子変異体ライブラリーを邦彦（鹿児島大学大学院農学研究科）

C. neoformans の低酸素応答遺伝子「転写因子 A」は ,カルシニューリン応答（Crz1）転写因子 , 及び , PKC1-依存性（Sp1）転写因子とに homologous な分子であり ,Hypoxia signaling analysis of Cryptococcus neoformans

C 末端近くに , いわゆる , Zinc-finger を 3 つ持つ転写因

Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu, Misako
Ohkusu, Daisuke Hagiwara

本菌が G2 arrest 状態に入るために必須な遺伝子として（Chiba University, Medical Mycology Research Center）

Vladislav Raclavsky（Palacky University, Czech）
Matthias Sipiczki（University of Debrecen, Hungary）
Kazuhisa Sekimizu, Yasuhiko Matsumoto

子の一つ「Crz1/Sp1」であった . また , 低酸素環境下 ,同定した本分子は , 低酸素環境下での増殖の slowdownの他 , 本菌の細胞壁の integrity の維持 , 莢膜合成の抑制的な制御 , バイオイルム生成の促進 , フルコナゾール感受性 , カルシウム感受性など , 本菌の感染にも関連した種々の細胞生理機能に重要な役割を持つ分子であるこ（University of Tokyo, Graduate School of Pharmaceuticalとを明らかにした . 真菌の低酸素応答シグナリングに転Yutaka Tamura

我々が C. neoformans で初めて見出し報告したが , 更に ,Satoshi Miura, Tomoko Sonoda

ル伝達下流分子の探索などを行って , C. neoformans の低Sciences）（Chiba University, Graduate School of Medicine）（Yokohama City Univerersity, Graduate School ofMedicine）

Kunihiko Hata

（Kagoshima University, Graduate School of Agriculture）

研究成果
病原酵母 Cryptococcus neoformans は , 生存に酸素が必須

42

千葉大学

写因子「Crz1/Sp1」が重要な役割を担っていることは ,本菌における低酸素応答転写因子「Crz1/Sp1」のシグナ

酸素ストレスに対する環境応答シグナリング機構全体の解明を目指すとともに , 本菌病原性への本分子の寄与を検討 , 考察しつつある .

発表論文1 ）Moráňová Z, Virtudazo EV, Pospíšilová K, Ohkusu M,Kawamoto S, Husičková V, Raclavský V: The CRZ1 /真菌医学研究センター報告

第 17 巻2013

SP1 -like gene links survival under limited aeration, cell型転写因子 AtrR を世界で初めて見出し , A. fumigatus にCryptococcus neoformans. Biomedical Papers, Publishedていることを明らかにした . A. fumigatus の atrR 破壊株

integrity and biofilm formation in the pathogenic yeast

online 22 April 2013（DOI: 10.5507/bp.2013.024）.の RNA-seq 解析を行ったところ , AtrR はトランスポー

ター遺伝子だけでなく , エルゴステロール生合成酵素遺伝子の発現にも関わっていることが示された . 非常に研究課題 ’12－2

興味深いことに , AtrR 制御下のエルゴステロール生合新規抗真菌薬開発を目指したアスペルギルス
属糸状菌の薬剤耐性機構とシグナル伝達機構の解析
五味勝也・阿部敬悦（東北大学大学院農学研究科）
川本

おいてもこのオーソログが同様にアゾール耐性に関与し進・清水公徳・萩原大祐

成酵素遺伝子は , すでに報告のある bHLH 型転写因子

SrbA 制御下のものと一致していたことから , エルゴス
テロール生合成酵素の発現は AtrR と SrbA の 2 種類の転写因子によって協調的に制御されている可能性が強く示唆された . また , アゾール系薬剤耐性に関与していると考えられる ABC トランスポーター（AbcC/Cdr1B）の遺伝子は SrbA 制御下になく , AtrR 単独による制御を（千葉大学真菌医学研究センター）

小山泰二（野田産業科学研究所（現キッコーマン））

Molecular analyses of mechanisms of drug
resistance and signal transduction leading tonovel antifungal drug discovery in Aspergillus
fungi
Katsuya Gomi, Keietsu Abe

受けていると考えられた .

一方 , A. nidulans の二成分性情報伝達系の生育必須因子であるリン酸基中間因子遺伝子 ypdA の発現制御株（CypdA）と , 下流 response regulator 遺伝子 sskA および srrAの欠損を加えた CypdAsskAΔ , CypdAsrrAΔ , CypdAsskAΔ

srrAΔ 株を育種した . ypdA の発現抑制により , ypdA の転写量と蛋白質発現量が野生株比 5％以下となった . ypdAの発現抑制は , フルジオキソニル処理と類似する致死をもたらしたが , sskAΔ , srrAΔ の導入は生育を部分的に回（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku

復させ , sskAΔ srrAΔ の導入は生育を完全に回復させた .

Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu, Daisuke
Hagiwara

なる sskAΔ 変異の形質を残していた .

University）

CypdAsskAΔ srrAΔ の生育は回復したが , 隔壁間長が長く（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Yasuji Koyama（Noda Institute for Scientific Research）

研究成果
A. fumigatus の薬剤耐性化機構については , 薬剤の標的分子や排出系の変異によることが示唆されているものの , 遺伝子レベルでの詳細な解析がほとんどなされていない . 一方 , A. fumigatus はヒト粘膜上での感染と生育を示すことから , このような固相表面における生育に関わる環境応答系が重要な機能を持っていると考えられる .

そこで , 本研究では A. fumigatus に対する効果的な新規創薬開発に資するため , 薬剤耐性化の分子機構の解明ならびに浸透圧シグナル伝達系の機構解明を目指した .

我々は麹菌においてアゾール系薬剤の排出に関与するABC トランスポーターの発現を制御する新規 Zn2Cys6

千葉大学真菌医学研究センター報告

第 17 巻201343

研究課題 ’
12－3の餌にテトラサイクリンを添加することによって Tet 株

新規性の高い抗真菌薬標的の探索と阻害剤のアッセイ系の開発中の当該遺伝子の発現を抑制することができた . 最終的に抗真菌薬の標的として 5 つに絞ることができた . 今後

これらの株を用いてマウスを用いた感染実験検証 , 組換えタンパク等を用いて阻害剤のアッセイ系を開発して行知花博治（千葉大学真菌医学研究センター）
吉田 稔・松山晃久（理化学研究所）
青山俊弘（鈴鹿工業高等専門学校）

Searching for anti-fungal drug targets having
high novelty and developing of an assay system
for screening the repressors
Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Minoru Yoshida, Akihisa Matsuyama

きたい .

発表論文1 ）Nagi M, Tanabe K, Ueno K, Nakayama H, Aoyama T,Chibana H, Yamagoe S, Umeyama T, Oura T, Ohno
H, Kajiwara S, Miyazaki Y: The Candida glabratasterol scavenging mechanism, mediated by the ATPbinding cassette transporter Aus1p, is regulated by ironlimitation, Mol Microbiol. 88: 371-81, 2013.

（Chemical Genomics Research Group, RIKEN）

研究課題 ’12－4（Suzuka National College of Technology）

真菌感染防御における IL-17 産生機構に関する研究

Toshihiro Aoyama

研究成果
Saccharomyces cerevisiae, C. albicans, Aspergillus fumigatus,Cryptococcus neoformans の真菌類およびヒトゲノムのデー

岩倉洋一郎に相同性がないか , あるいは極めて低いこと , 2 ）ゲノ

西城

タベースを用いて , 最適な標的の条件として 1 ）ヒト（東京大学医科学研究所・システム疾患モデル研究センター・細胞機能研究分野）

忍（千葉大学真菌医学研究センター）

ム配列が公開されている病原真菌に高く保存されていること , 3 ）in vivo で必須であること , 以上の 3 点に条件として薬剤標的に探索を進めている . まず , 条件 1 ）と 2 ）を満たす遺伝子を Candida glabrata のゲノムから抽Studies on the production of IL-17 in immune
responses against fungal infection

出した . C. glabrata は , 病原真菌の中で遺伝子操作が最Yoichiro Iwakura

生物と位置づけ , ゲノムワイドな遺伝子機能解析を進めTokyo）

も容易であるため , 我々は本菌を病原真菌の実験モデルている . C. glabrata のゲノムから抽出した遺伝子のうち100 遺伝子について Tet 株を構築することができた . Tet株は , テトラサイクリンを添加した培地において , Tet（The Institute of Medical Science, The University ofShinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

がって , Tet 株が , テトラサイクリンに対して高い感受研究成果
IL-17A は主に活性化 CD4＋ T 細胞から産生され , 細必須か否かを判定することができる . さらに標的分子あおいて中心的な役割を担っている . 申請者らは , マウであることを検証することは標的分子を絞り込む上で極albicans）で刺激し , その培養上清が naïve T 細胞を Th17

promoter が挿入された遺伝子の転写が抑制される . した性を示すことを基準にすることにより各遺伝子が生育にるいはその遺伝子が感染時に C. glabrata にとって必須めて重要である . Tet 株を感染させた場合には , 蚕幼虫

44

千葉大学

胞外寄生菌に対する感染防御や自己免疫疾患の発症にス 骨 髄 由 来 樹 状 細 胞（BMDC） を Candida albicans（C.
細胞に分化させることを見出した . 一方 , IL-17A ノッ

真菌医学研究センター報告

第 17 巻2013

ク ア ウ ト マ ウ ス に C. albicans を 感 染 さ せ る と 野 生 型（WT）マウスと比較し生存率が有意に低下することを＋研究成果
気道や腸管上皮 , また , 皮膚表皮では , 細胞と細胞の明らかにした . しかし最近 , CD4 細胞以外にも IL-17A間が様々な接着分子を介して連結され（tight junction）,胞との機能の違いが注目されている .

破 壊 に , 外 来 お よ び 内 在 性 の protease が 関 与 し て いを産生する細胞が見出され , Th17 と他の IL-17 産生細そこで , まずマウスに C. albicans を感染させ in vivo で外 来 抗 原 の 侵 入 を 防 い で い る . そ の tight junction のることが示されつつある . 真菌 Aspergillus による肺炎も IL-17A が産生されるかどうかを検討したところ , 感は , Aspergillus 自体の感染による免疫応答だけでなく ,なった . 今後は , ノックアウトマウスやノックインマウ破壊が発症及び症状の重症化に関わっている可能性が強染後比較的早期に IL-17A が産生されることが明らかとスと細胞移植の系などを組み合わせ , どの細胞から分泌される IL-17A が感染防御に重要な役割を担っているのかを明らかにする予定である .

発表論文1 ）Ikeda S., Saijo, S., Murayama MA, Shimizu K., AkitsuA., and Iwakura, Y. Excess IL-1 signaling enhances thedevelopment of Th17 cells by downregulating TGF-binduced Foxp3 expression. J. Immunol., in press.

く示唆されている . 実際に , マウスに Aspergillus 由来のprotease を吸入させると , 組織破壊と好中球の浸潤を伴う強い気道炎症が認められた . さらに , 各種欠損マウスを用いた結果 , Aspergillus protease による好中球性気道炎症は , T 細胞 , B 細胞 , NKT 細胞 , マスト細胞非依存的であることが明らかになった . Aspergillus protease による

好中球性気道炎症局所では , IL-17, IL-17F, IL-21, IL23, IL-6, TNF といった Th17 型サイトカインおよび誘導因子の発現の亢進が認められ , これらサイトカインが好中球性気道炎症の誘導に関与することが期待された .

しかしながら , これらのサイトカイン欠損マウスでも研究課題 ’12－5

Aspergillus protease による好中球性気道炎症は正常マウスと同程度に誘導されることが明らかになった . 現在 , こ

真菌性肺炎の発症機序の解明
中江Aspergillus が産生する protease による宿主の気道上皮のれらサイトカイン以外に , 好中球性気道炎症の誘導に関わる因子の同定を進めている .

進（東京大学医科学研究所・システム疾患モデル研究センター・システムズバイオロジー研究分野）

新江
西城賢（杏林大学保健学部・免疫学教室）
忍（千葉大学真菌医学研究センター）

Studies on the pathogenesis of fungal pneumonia
Susumu Nakae（Laboratory of Systems Biology, The Institute ofMedical Science, The University of Tokyo）

Ken Arae（Department of Immunology, Faculty of HealthSciences, Kyorin University）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

千葉大学

真菌医学研究センター報告第 17 巻

201345

研究課題 ’12－6

特異的 IgE 陽性であることが明らかとなった . SC 特異的抗体陽性喘息患者はアスペルギルスにも感作されてい真 菌 に よ る 重 症 喘 息 発 症 機 構 の 解 明:
Schizophyllum commune 応答を中心としてる傾向が見出されたが , SC 特異的抗体価はアスペルギ

ルス特異的抗体価との相関性は認められなかった . これ
らの結果から喘息患者の一部は SC に感作が成立してい廣瀬晃一（千葉大学大学院医学研究院）
渡邉 哲（千葉大学医学部附属病院）
中島裕史（千葉大学大学院医学研究院）
亀井克彦・豊留孝仁

ることが明らかとなった .

研究課題 ’12－7（千葉大学真菌医学研究センター）

病原性担子菌酵母糖タンパク質糖鎖の構造解析

Roles of Fungi in the Development of Severe
Asthma: Possible roles of the immune responses
against Schizophyllum commune
Koich Hirose（Department of Allergy and Clinical Immunology,Graduate School of Medicine, Chiba University）

Akira Watanabe

大橋貴生・藤山和仁（大阪大学生物工学国際交流センター）

五ノ井透（千葉大学真菌医学研究センター）

Structural analysis of glycoprotein sugar chainsin pathogenic Basidiomycete yeast.

（Department of Control and Treatment of Infectious

Takao Ohashi, Kazuhito Fujiyama

Hiroshi Nakajima

Gonoi Toru

Diseases, Chiba University Hospital）（Department of Allergy and Clinical Immunology,Graduate School of Medicine, Chiba University）

Katsuhiko Kamei, Takahito Toyotome（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
真菌への暴露 , 感作は喘息の重症化に関与することが知られている . スエヒロタケ（SC）は喘息 , アレルギー性気管支肺真菌症（ABPM）の発症に関与することが報告されている真菌だが , これまでに SC 特異的抗体の効（International Center for Biotechnology, Osaka University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
病原性担子菌酵母を含む真核生物において多くのタンパク質には糖鎖が付加しており , その糖鎖構造は多様である . 非病原性モデル子嚢菌酵母である出芽酵母や分裂酵母では糖鎖構造および糖鎖生合成関連遺伝子が報告されている . また , 病原性子嚢菌酵母である Candida

albicans および Aspergillus fumigatus では糖鎖生合成関連遺伝子の機能不全変異により病原性の低下が報告され率的なスクリーニング方法の報告は無く , 喘息患者におている . 一方 , 病原性担子菌酵母においては Cryptococcus

よる SC 特異的抗体のスクリーニング方法を確立し , 喘

ろか , 糖鎖構造情報はほとんど蓄積されていない . 前年

ける SC 感作率は不明である . 本研究では ELISA 法に息患者における SC 感作率を検討するとともに , 喘息重neoformans を除いて , 糖鎖生合成関連遺伝子の解析どこ度までに代表的な病原性担子菌酵母である C. neoformans,症度との相関を明らかにすることを目的とした .

Rhodotorula mucilaginosa および Malassezia furfur の糖鎖構探索・同定した . この主要抗原を用いて SC 特異的抗を得ていた . 本年度はさらに上述の 3 種の病原性担子菌

まず SC による ABPM 患者血清を用いて主要抗原を造解析に着手し , 特に O- 結合型糖鎖について構造情報体測定 ELISA 法を確立し , 喘息患者における感作率を酵母の N- 結合型糖鎖の構造解析を行った .

Step4 12 名）中 , 4 名が SC 特異的 IgG 陽性 , 6 名が SC

ジルアミノ化法を用いて , ピリジルアミノ化糖鎖を調検討した . 47 名の喘息患者（Step2 6 名 , Step3 29 名 ,46

千葉大学

各病原性担子菌酵母を培養後 , ヒドラジン分解－ピリ

真菌医学研究センター報告

第 17 巻2013

製後 , サイズ分画 HPLC, 逆相 HPLC および MALDI-TOF-MS による解析を行った . その結果 , C. neoformans

においては Hex7-9PentGlcNAc2 の糖鎖が主要な糖鎖として検出された . R. mucilagionsa については , サイズ分画 HPLC による分析が終了し , Hex5-7GlcNAc2 の糖鎖がDevelopment of method for classification andidentification of fungi based on the profilingof ribosomal proteins as obser ved by massspectrometry

主要な糖鎖として検出された . M. furfur についても同

Takashi Yaguchi, Reiko Tanaka

ミノ化糖鎖の分画を行い精製糖鎖を得た後 , LC-ESI-

Hiroaki Sato, Masaki Torimura

様にサイズ分画 HPLC, 逆相 HPLC によるピリジルア

MS/MS による分析を行った . 主要な糖鎖について , 標

準糖鎖と両 HPLC にて溶出位置が一致する糖鎖が検出され , LC-ESI-MS/MS の結果を考慮し以下の様に構造（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology）

決定することができた ; Manα1,2Manα1,6（Manα1,3）

研究成果

β1 , 4 GlcNAc（ M 8 A ）, Manα1 , 2 Manα1 , 6（ Manαめ , A. fumigatus 基準株（IFM 47795＝ Af293）の精製リ

β1 , 4 GlcNAc（ M 7 A ）, Manα1 , 2 Manα1 , 6（ Manαソームタンパク質の正確な分子量リストを作成すること

1,4GlcNAcβ1,4GlcNAc（M8B）, Manα1,2Manα1,6（Man（真菌医学研究センター所有）を用いてリボソームを抽Manα1,6（Manα1,2Manα1,2Manα1,3）Manβ1,4GlcNAc
1 , 3）Manα1 , 6（ Manα1 , 2 Manα1 , 3）Manβ1 , 4 GlcNAc

1 , 2 Manα1 , 3）Manα1 , 6（ Manα1 , 2 Manα1 , 3）Manβ

生物種の同定・分類は基準株との比較で行われるたボソームタンパク質の質量分析を行い , 基準株のリボを目的とした . 試料菌株をビーズ破砕し , 超遠心分離機

α1,2Manα1,3）Manα1,6（Manα1,2Manα1,2Manα1,3）

出し , マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析

より , 本 3 種病原性担子菌酵母糖鎖の基礎情報が取得でムタンパク質のマススペクトルを観測した . 各リボソー

素遺伝子の同定 , 本酵素の阻害剤の探索の効率化が達成列から計算される分子量との差異を比較して翻訳後修飾

Manβ1,4GlcNAcβ1,4GlcNAc（M9A）. 本研究の結果にきた . これらの情報を元に将来的には糖鎖生合成関連酵され , 効果的な抗真菌剤の開発へと発展することが期待される .

ムタンパク質の正確な分子量を解析し , 翻訳アミノ酸配の有無を明らかにした . その結果 , 全ゲノム解読された

A. fumigatus および類縁の Neosartorya fischeri の計 3 株について , 分類の基準となるリボソームタンパク質の正しい分子量リストを作成した . さらに , ゲノム解読株間で ,研究課題 ’
12－8

一部のリボソームタンパク質に変異が生じていることをリボソームタンパク質をバイオマーカーとした質量分析法による真菌類の同定・分類法の開発
矢口貴志（千葉大学真菌医学研究センター）
佐藤浩昭・鳥村政基（（独）産業技術総合研究所

計（MALDI-TOFMS, 産総研所有）を用いて各リボソー環境管理技術研究部実証し , A. fumigatus 類縁菌の同定及び株レベルでの識別が , 本法によって可能であることを見出した .

今後 , DNA 解析法で得られた分類結果や形態および薬剤耐性などの特徴と比較することによって , 本法の妥当性を実証するとともに , 得られたマススペクトルをデータベース化し , 真菌の新しい分類指標を提示することが期待できる .

門）

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 17 巻201347

平成 24 年度 共同利用・共同研究研究会報告2012 Fiscal Year Cooperative Research Meetings Report
研究会－1

薬学部 , 附属病院 , 融合科学研究科などに数多くの研究者がおり , それぞれが活発に研究を進めている . しかし

千葉大学感染症研究ネットワーク
第 1 回研究会

それらの連携は意外なほど少なく , ネットワーク化が期待されていた . そこで , これら千葉大学の学内各部局における感染症研究の統合 , さらには活性化を進めること

山本友子・高屋明子・佐藤慶治を目的として今年度から本センターの共同利用・共同研（千葉大学大学院薬学研究院）

米山光俊・川本究会として「千葉大学感染症研究ネットワーク」を企画

進・亀井克彦した . 第 1 回目となる今回は平成 24 年 6 月 23 日（土）（千葉大学真菌医学研究センター）に千葉大学薬学部大会議室（医薬系総合研究棟Ⅱ地下

北潔（東京大学大学院医学研究科）1 階）にて開催した . 学内の感染症研究グループから計

Chiba University Research Network on Infectious
Diseases授（東大医学研究科）から「感染症研究が結ぶ世界のTomoko Yamamoto, Akiko Takaya, Yoshiharu Sato

（Department of Microbiology and Molecular Genetics,

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, ChibaUniversity）

Mitsutoshi Yoneyama, Susumu Kawamoto, KatsuhikoKamei（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

8 題の一般演題が発表され , これに引き続き , 北

絆」と題した特別講演をいただいた . この種の学内ネットワークを目指した会合は今回が初めての試みであったが , 参加者は 63 名に達した .
全体を通じて非常に活発な議論が行われ , 学内各部局における感染症研究の統合 , 活性化という目的は十分に達成されたものと考えられた。今後更に発展させるべく計画を進めている .

Kiyoshi Kita

（Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine,The University of Tokyo）

研究成果
千葉大学の学内には , 感染症研究にかかわる医学部 ,48

千葉大学

潔教

真菌医学研究センター報告

第 17 巻2013