NMR データ処理／解析
1st draft 2016.7.19
Last update 2021.2.1

NMR データの処理／解析

ver.1.5.1

はじめに
昨今，どのメーカーの NMR 装置であっても測定した NMR の生データは FID（Free Induction
Decay）であり，スペクトルデータとして解析するには FT（フーリエ変換）をする必要がある．
NMR データの FT は測定装置の制御 PC 上でも行うことができるが，FT 処理に必要な計算時間が長い場合があり，NMR 測定作業の障害となることが十分にありえる．そのため FID データから先の作業は，別途に用意した解析用のパソコン上で行うことが望ましい．また，その後の NMR スペ
クトルの帰属操作や緩和解析，構造計算には各種のソフトウェアを使用するが，その多くは Linux
環境上で動作する．そのため処理／解析のためには Linux パソコンを用意することが望ましい．
今回の講習ではあらかじめ用意された Linux 上にて行う．個々人で同じ環境を準備する方のために，第１章にて今回用意した NMR 解析のための Linux について簡単に記しておく．必要がなければこの章は読み飛ばして構わない．
第１章 NMR 解析のための Linux について
１−１．Linux のインストール
１−２．各種環境設定
１−３．NMR ソフトウェアのインストール
以降の章では以下のソフトウェアごとにわけて NMR データの処理および解析手順について記述する．
第２章 NMRPipe
２−１．FID フォーマット変換
２−２．各種 FT スクリプト
２−３．Tips
第３章 Sparky３−１．フォーマット変換
３−２．基本的な操作方法
３−３．主鎖帰属チュートリアル
３−４．側鎖帰属チュートリアル
３−５．相互作用解析

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NMR データ処理／解析
３−６．Tips
３−７．コマンドリファレンス
第４章 CYANA による構造計算
４−１．基本的な使用方法
４−２．入力ファイル
４−３．出力ファイル
４−４．Sparky との連携
４−５．構造計算の精密化作業チュートリアル
４−６．Tips
本講習で使用するデータは Agilent (旧 Varian)の装置で測定した．本施設には Bruker の装置もあり，こちらについては別原稿にてまとめる．
また，NMRPipe／Sparky／CYANA 以外にも NMR データの処理／解析するためのソフトウェ
アは多数ある（NMRView, CARA，Olivia 等）が，ここでは割愛させていただく．また，例えばBruker の TopSpin を主として使用している環境では，第２章の NMRPipe による行程を省き，すぐさま Sparky などによるスペクトル解析を行うこともできる．Sparky 以外にも多機能な解析ソ
フトウェアは種々存在しているが，ここでは無料で使い勝手が良いと判断された Sparky を採用した．

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NMR データ処理／解析
第１章 NMR 解析のための Linux についてLinux は基本無料の OS（オペレーティングシステム）で，NMR 解析を行う上でのソフトウェ
アの大半はこの OS 上で動作する（一部のソフトウェアは Mac や windows でも動作する）．Linuxは UNIX と同じように基本操作が CUI（Command User Interface）であり，その操作習得はやや難易度が高いものになっている．ただ，この操作に慣れてしまうと他の OS では面倒であった作業も迅速に行えるようになり，その気になれば作業の自動化，プログラム作成まで行うことができる
ようになる．できれば，この機会に Linux や CUI について理解し，活用いただくことを推奨する．
本稿では主に CUI で Linux を操作していく．CUI では端末（または terminal）を開いて，コマンドを打ち込んでパソコンを操作するが，コマンドを打ち込む行頭は，
kumeta@kumelin: ~$のように表示されている．これをコマンドプロンプトと言う．Ubuntu の bash 環境のデフォルト
設定ではユーザー名やログインしているパソコンの名前（ホスト名）も記載されているが，他の環境／設定では表示方法が異なる．以下では$のように，コマンドプロンプトを表記する．コマンド入力する際には，このプロンプト以降の文字列を入力する．また root 権限（後述）でのコマンドプロンプトは，#で表記する．
Linux で使用する主要なコマンドについては別途に良いテキストがあるので，それを紹介する．

覚えておきたい必須コマンド３０

また，テキストファイルの編集には，vi を主に使用している．vi はコマンドベースのテキストエ
ディタなので，初級者には難しいかもしれない．vi 使用方法のテキストについてはこちらが良いだ
ろう．

vi はじめました

どちらも雑誌の付録であるが短い文量のわりに，内容の範囲や読み手の理解度の範囲が広く適切と思われる．また、vi 以外にもテキスト編集ができるソフトウェアは数多く存在しており，emacs
や Kate が扱いやすいかもしれない．本章の操作が終了したあとで，# apt-get install emacsとすれば emacs がインストールできる．
$ emacs text.txt
で，emacs にて text.txt ファイルを開くことができる．

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NMR データ処理／解析
１−１．Linux のインストール
Linux にはソフトウェアパッケージや基本 OS からなる様々なディストリビューションが存在する．本稿では比較的扱いやすく，また多くの人が使用している Ubuntu Linux（以下、Ubuntu）
を使用することにする．

https://www.ubuntulinux.jp/
から，iso イメージファイルをダウンロードし，DVD-R に書き込みを行う．LTS タイプ（Long term
support タイプ）を推奨する．
（OS によって DVD-R の書き込み方法が異なるので，"iso イメージ DVD-R 書き込み"などで検索すること）
本稿では ubuntu-20.04.1-desktop-amd64.iso をそれぞれ使用した．
書き込みが完了した DVD-R を用いて，Ubuntu をインストールする PC について光学ドライブ
からのブートを行う．Ubuntu のインストール作業は，質問形式になっており，それに従って作業を行う．
途中，管理者ユーザーの名前とパスワードを設定する．また，Ubuntu は基本的にインターネッ
トに接続された環境のパソコンであることを前提にデザインされている．それぞれのネットワーク
環境に従ってあらかじめ準備されたい．
インストール作業が終了し，DVD-R を取り出して PC を再起動すると，Ubuntu が立ち上がる．

4NMR データ処理／解析
１−２．Linux 各種環境設定
Linux 環境をより快適にするために各種設定やパッケージインストールを行う．このとき，コマンドとして apt-get を利用している．これは Ubuntu のインターネット上にあるパッケージサーバ
ーから該当するパッケージをダウンロードおよびインストールするためのコマンドであるため，イ
ンターネットに接続されていることが必須となる．

１−２−１．スーパーユーザー（root）パスワードの設定
Linux のスーパーユーザー、root はそのパソコンに関するすべてのことを行うことができる権限を持っている．そのため，普段の操作には使用しないが，種々のソフトウェアインストール等のときに使用する．Ubuntu には管理者ユーザーが存在しており，それは root に準じた権限を持っているが，一部使用できない権限があり別途設定しておく必要がある．
$ sudo passwd root
管理者ユーザーのパスワードを入力したのちに，root アカウントのパスワードの設定を行う．以下、
root になっての操作のコマンドプロンプトは#で記載する．terminal 上で root になるときは，$ suとして，root 権限のパスワードを打ち込む．root を抜けるときは，# exitとする．

１−２−４．tcsh のインストール
NMRPipe を含めいくつかのソフトウェアは tcsh 環境での動作のみサポートされている．自分で環境設定ファイルを書き換えることができるのであれば不要だが，充分に慣れていない方は下記に従ってインストールとシェルの変更を推奨する．
# apt-get install tcsh
一般ユーザーのシェルを tcsh に変更する方法$ chsh hogehoge –s /usr/bin/tcsh
hogehoge は一般ユーザーのログイン名．このコマンドを実行したのちに再起動を行うとシェルが tcsh に変更される．

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１−３．NMR ソフトウェアのインストール
各種ソフトウェアのインストールは/usr/local の下に行うことにする．

１−３−１．NMRPipe のインストール
https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html
から，NMRPipeX.tZ、install.com、binval.com、talos.tZ、dyn.tZ
をダウンロードする．NMRPipe は基本 32bit 環境でのみ動作するが 64bit 環境で動作させるために追加でいくつかのパッケージをインストールする．
# dpkg --add-architecture i386
# apt-get update# apt-get install libc6:i386# apt-get install libstdc++6:i386# apt-get install libx11-6:i386# apt-get install libxext6:i386# apt-get install xfonts-75dpi# apt-get install msttcorefonts# apt-get install default-jre# apt-get install default-jdk
nmrPipew インストールする場所を作成し，インストールする# mkdir /usr/local/nmrpipe# cd /home/hogehoge/ダウンロード# mv NMRPipeX.tZ install.com binval.com talos.tZ dyn.tZ /usr/local/nmrpipe# cd /usr/local/nmrpipe# chmod +x install.com# ./install.com +type linux
インストールが正常に終了すればディスプレイテストのための小ウィンドウが開く．確認後，Doneを押してウィンドウを閉じる．

１−３−２．NMRPipe の動作テストと環境ファイルの設定
一般ユーザーでログインし，$ echo $SHELL
で，tcsh であることを確認する．その後，$ sourse /usr/local/nmrpipe/com/nmrInit.linux9.com$ sourse /usr/local/nmrpipe/com/font.com$ nmrDraw

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NMR データ処理／解析
nmrDraw が起動すれば，成功．メニューより File を”右クリック”し，Q) Quit the Program を選択して，nmrDraw を終了する．
nmrDraw の動作が確認できたら，環境ファイルを編集する．
$ vi ~/.tcshrc
vi エディターを使用して編集を行い（慣れていない方は emacs 等の他のテキストエディタを使用しても構わない），下記の２行を追記し保存する．
source /usr/local/nmrpipe/com/nmrInit.linux9.com
source /usr/local/nmrpipe/com/font.com
FT のための雛形ファイルを置く．
# cd /usr/local/# tar xvfz /home/hogehoge/ダウンロード/pipescripts_160712.tgz
数字は更新日付なので，最新版を使用すること．また，このファイルはスクリプト作者からもらうこと．
解凍展開後，/usr/local に pipescripts のディレクトリが出来上がる．

１−３−３．Sparky のインストール
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/から，32-bit Linux 用をダウンロードする．
（sparky-linux2.6.tar.gz）# cd /usr/local/# tar xvfz /home/hogehoge/ダウンロード/sparky-linux2.6.tar.gz

１−３−４．Sparky の動作テストと環境ファイル設定$ /usr/local/sparky/bin/sparky
Sparky が起動すれば，成功．Sparky のメインウィンドウ，Pointer Mode ウィンドウ，Questionと書かれたダイアログウィンドウが開くはず．この Question ダイアログは，Sparky のためのワー
クスペースをホームディレクトリに作成しても良いかどうかを聞いている．Yes でワークスペースを作成する．Sparky のメインウィンドウのメニューより File を左クリックし，Quit qt を選択して終了する．
動作確認が終了したら，環境ファイルを編集する．
$ vi .~/tcshrc
にて，下記の１行を追記し保存する．
set path = ( . $path /usr/local/sparky/bin )１−３−５．解析用自作ツール類のインストールと設定# cd /usr/local/

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NMR データ処理／解析# tar xvfz cyana_tools*.tgz
cyana_tools.tgz は著者作成のツール類をまとめたファイルであり，*印部分はバージョン名が入っている．展開後，cyana_tools のディレクトリができあがるので，そこに path を通しておく．
$ vi ~/.tcshrc
set path = ( $path /usr/local/cyana_tools )１−３−６．PyMOL のインストールと動作確認
PDB ファイルの閲覧，図の作成等に使用するソフトウェア．
# apt-get install pymol
動作確認．
$ pymol
１−３−７．CYANA v2.1 のインストール
構造計算ソフトウェアの CYANA をインストールする．CYANA は有償ソフトウェアであるため
LA システムズから購入する．また，現在 v3 が開発中であり，LA システムズから v2.1 のライセンスを購入後，作者（Güntert）に依頼をすれば開発段階の v3 を貰える．
# cd /usr/local/# cp /hogehoge/cyana-2.1bin.tar.gz .
# tar xvfz cyana-2.1bin.tar.gz# cd /usr/local/bin# ln -s /usr/local/cyana-2.1/cyana* .

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第２章 NMRPipe
NMRPipe は，得られた FID データを処理し，スペクトルファイルに変換できるプログラムである．UNIX や Linux 上で連続した処理をコマンドライン上で行うときに使用するメタキャラクタ
ー（特別な意味を持つ文字のこと）である｜（パイプ）を名前の由来としている． 溶液タン

パク質 NMR を含め NMR 解析を行う非常に多くの研究者がこのソフトウェアを使用している．
NMRPipe パッケージには，FID からスペクトルへのフーリエ変換を含む各種処理を行うためのプログラム nmrPipe，
スペクトルを閲覧するための nmrDraw，
主鎖二面角予測ソフトウェア talos+等が含まれている．2016 年現在はフリーウェアとしてウェブ上に公開されている．使用し，研究論文等で発表する際には，F. Delaglio, S. Grzesiek, G. W. Vuister, G. Zhu, J. Pfeifer and A. Bax
NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes.
J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).

を参考文献として引用する．

NMRPipe パッケージに含まれる nmrDraw は，FT からスペクトルを表示までグラフィカルに操作できるソフトである．メニューにある File ボタン操作などが他の一般的ソフトと異なり，マウスの"右ドラッグ"であることを留意願いたい．また，メニューからのマウス操作でも各種項目は選択だが，便利なショートカットキーが付いている．例えば，File -> m) Macro Edit の操作は，ス
ペクトル画面を選択した状態で，m を押すだけで選択される（項目最初の文字が割り振られたショ
ートカットキー．大文字と小文字は区別される）．慣れないうちはメニューから選択するようにし，慣れてきたらショートカットキーでの操作に乗り換えることを推奨する．
各スペクトルデータの NMRPipe による処理を行うために，専用のワークスペースを作成した．
$ mkdir ~/NMR_workとした．
$ cd ~/NMR_work/$ scp –r vnmr1@192.168.254.243:~/pegasusj600/data/kumeta/LC3_demo ./LC3
として，本講習前に測定した各データについてコピーした．なお，この scp の行は，本施設環境でのみ使用可能な方法である．他の施設等での測定については，usb メモリ等を使用して適宜デー
タ移送／コピーをされたい．LC3 は本講習で取り扱うサンプルのタンパク質名である．このサブディレクトリの下に，本講習前に測定した各データが入っている．測定済みデータディレクトリとそ
れぞれのスペクトル名は以下の通り．

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サブディレクトリ名

スペクトル名

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_gChsqc_pegasusj.fid/[1H-13C] HSQC

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_gNhsqcHD_pegasusj.fid/[1H-15N] HSQC

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_gcbcaconh_pegasusj.fid/

CBCA(CO)NH

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghbhaconh_pegasusj.fid/

HBHA(CO)NH

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghnca_pegasusj.fid/

HNCA

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghncacb_pegasusj.fid/

HNCACB

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghncahaR_pegasusj.fid/

HN(CA)HA

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghnco_pegasusj.fid/

HNCO

160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghncoca_pegasusj.fid/

HN(CO)CA10

NMR データ処理／解析
２−１．FID フォーマットの変換
Varian フォーマットの FID ファイルを nmrPipe で処理できるようにフォーマットの変換を行う．
２−１−１．[1H-15N] HSQC の処理
測定データディレクトリに移動する．
$ cd ~/NMR_work/LC3/160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_gNhsqcHD_pegasusj.fid
ディレクトリ内部を確認する．
$ ls
fid log procpar textの４種類のファイルが存在している．fid は Varian フォーマットの FID ファイルであり，procpar
が Varian フォーマットのパラメータファイルである．log は測定の開始と終了時刻，ならびに測定中に発生したエラーについて記載される．text は，VNMR 上で任意に text コマンドによって設定するコメント用のファイルである．fid と procpar が以下の作業には必須となる．
$ varianにて，fid を NMRPipe フォーマットの FID ファイルに変換するためのウィンドウを立ち上げる．

その後，以下の手順で操作する．
１．Read Parameters により，procpar ファイルからパラメータを読み取る．
２．それぞれの軸（x-axis, y-axis）に関して，パラメータを変更する．
３．Save Script により，変換スクリプト（fid.com）を保存する．
４．Execute Script により，fid.com による処理を実行する．
２で変更するパラメータは各軸の Acquisition Mode および Observe Freq MHz である．変更はパラメータ横の三角印を左クリックし，プルダウンメニューから選択する．Observe Freq MHz は核の種類（H1, C13, N15）から選択する．また Observe Freq MHz に連動して，Center Position PPMが変動するので，それを確認する．いくつかの測定において Axis Label も変更する必要がある．
次ページに，測定ごとの変更箇所について記載する．Center Position PPM は参照値であり，測定11

NMR データ処理／解析
温度や測定時に意図的な変更があれば，異なる値となる．また，Acquisition Mode は装置メーカ
ー，測定方法によっても左右されるのであらかじめご留意されたい．
ここでは[1H-15N] HSQC の測定データについて処理を行うため，上記ウィンドウより Read
Parameter ボタンでパラメータを読み込んだあと（上記１の操作）に，y-axis について Acquition
Mode を Rance-Kay，Observe Freq MHz を N15 とし（同２），Save Script（同３），Execute Script（同４）ボタンの順に押す．Execute Script のときに新しいウィンドウが表示され，フォーマット
変換処理が行われる．終了後，Quit ボタンを押して上記ウィンドウを閉じる．

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NMR データ処理／解析

x-axisy-axisz-axisAcquisition Mode

Acquisition Mode

Acquisition Mode

Observe Freq MHz

Observe Freq MHz

Observe Freq MHz(Center Position(Center Position(Center Position

PPM)

PPM)

PPM)

ComplexRance-Kay

H1 (4.78)

N15 (118)

HNCO /

Complex

ComplexRance-Kay(HCA)CO(CA)NH

H1 (4.78)

C13 (174)

N15 (118)

HN(CO)CA /Complex

ComplexRance-Kay

HNCA

H1 (4.78)

C13 (56)

N15 (118)

CBCA(CO)NH /Complex

ComplexRance-Kay

HNCACB / C(CO)NH

H1 (4.78)

C13 (40)

N15 (118)

HBHA(CO)NH /Complex

ComplexRance-Kay

HN(CA)HA /H1 (4.78)

H1 (4.78)

N15 (118)[1H-13C] HSQC

Complex

Complex(Aliph / Arom)

H1 (4.78)

C13 (40 / 125)

HCCH-TOCSY

Complex

Complex

Complex(Aliph / Arom)

H1 (4.78)

H1 (4.78)

C13 (40 / 125)(H)CCH-TOCSY

Complex

Complex

Complex(Aliph / Arom)

H1 (4.78)

C13 (40 / 125)

C13 (40 / 125)

13C-edited NOESY

Complex

ComplexRance-Kay(Aliph)H1 (4.78)

H1 (4.78)

C13 (40)

13C-edited NOESY

Complex

Complex

Complex(Arom)

H1 (4.78)

H1 (4.78)

C13 (25)

HACAN

Complex

ComplexRance-Kay

H1 (4.78)

N15 (123)

C13 (56)

HbCbCgCdHd /Complex

Complex

HbCbCgCdCeHe

H1 (4.78)

C13 (35)

測定名[1H-15N] HSQC

H(CCO)NH /15N-edited NOESY

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NMR データ処理／解析
ここまでの作業が終了した段階で，作業ディレクトリには，
fid.com，temp.fidが追加されている．temp.fid が NMRPipe フォーマットの FID ファイルとなる．追加されていれ
ば，フォーマット変換は終了となる．

２−１−２．HNCO の処理
測定データディレクトリに移動する．
$ cd ~/NMR_work/LC3/160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghnco_pegasusj.fid$ ls
fid log procpar text
ファイル構成を確認し，$ varian
コマンドによって，FID フォーマット変換のためのウィンドウを立ち上げる．前ページを参照し，各パラメータの再設定を行ってから，Save Script，Execute Script の操作を行う．新しくウィン
ドウが表示され，３次元のデータの場合，Z 軸のデータポイントごとの XY 平面としてフォーマッ
ト変換処理が行われる（Z 軸１番目の XY 平面 FID，２番目の XY 平面 FID... のように分割される）．
作業ディレクトリには，
fid.com, data（ディレクトリ）が作成され，data ディレクトリの下にフォーマット変換されたファイルが通し番号つきで収納されている（test001.fid, test002.fid, ...）．

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NMR データ処理／解析
２−２．各種 FT スクリプト
FID からスペクトルファイルを作成するためには，フーリエ変換（Fourier Transform）を含む処理（以下 FT）を行う．その際，綺麗な線形のスペクトルとするための apodization（ウインドウ
関数）の調整や位相補正，ベースライン補正など様々な処理について調整を行う必要がある．本講
習ではもっとも重要で基本的な位相補正についてのみ調整する（他は調整済み）．
測定スペクトルごとに FT を行うためのファイル（FT スクリプト）の雛形を作成している．適宜，そのファイルをコピー／編集し使用する．

２−２−１．[1H-15N] HSQC の FT 処理[1H-15N] HSQC 用の FT スクリプトをコピーし，実行する．
$ cd ~/NMR_work/LC3/160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_gNhsqcHD_pegasusj.fid$ cp /usr/local/pipescripts/Nhsqc.com .
$ ./Nhsqc.com
FT のログが表示され，コマンドプロンプトに戻る．作業ディレクトリには新しく Nhsqc.ft2 のファイルができている．これを nmrDraw にて開く．
$ nmrDraw Nhsqc.ft2

上記のようにスペクトルが表示される．このスペクトルは青が正の信号，赤が負の信号として表示されている．また，それぞれの軸に HN ppm Y，N15 ppm X とラベルされており，２−１．FID フォーマット変換での x-axis，y-axis とは逆の記号が割り振られている．これは，どのスペクトルを表示させていても（３次元の xz 平面を見る場合においても）nmrDraw では，縦軸を X，横軸を Yとしているためである．以下では画面について指定するときには縦軸，横軸と表記し，測定軸を特定する場合には x-axis を X 軸のように表記することとする．ご注意願いたい．上記メニュバーよ

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NMR データ処理／解析
り File を”右クリック”し，プルダウンメニューを開き，m) Macro Edit を開く．開いた Macro Edit
上の水色の部分を”右クリック”していき，File -> Open を選択する（下図は，File -> Open を選択する寸前の画面）．

新しく開いたウィンドウから，Nhsqc.com を選択し，Open ボタンを押す．

Macro Editor の水色の部分に，Nhsqc.com のファイル内容が表示される．この Macro Editor の上で編集を行い，Macro Editor 上部にある，Save と Execute を使用し，再度 FT を行う．
FT スクリプトの中身を編集するにあたり，各行頭にある | や ＼ はそれぞれ，パイプ，バックスラッシュ記号であり，メタキャラクター（意味のある文字列）となっている．重要な意味を

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NMR データ処理／解析
持っているので，削除したり＼の後ろにスペースや他の文字列を入れたりしないよう注意する．

Nhsqc.com を開いたら，まず Macro Name: について修正する．nmrproc.com となっているところを Nhsqc.com に変更する．

Nhsqc.com の中身について記載する．記号 ｜ は直前のコマンドでの出力を直後のコマンドに受け渡す記号であり，＼はその行のコマンドを終了させず次の行にも続かせる記号である（通常のコマンドは行末の改行によって処理が終了する）．nmrPipe コマンドは，-fn オプションにより様々な機能を指定し処理を行っている．画像の次に，それぞれの行について解説する（次表．表中では｜や＼は省略する）．

#!/bin/csh

csh スクリプトである宣言文

nmrPipe -in test.fid

test.fid を入力ファイルとする

nmrPipe -fn SOL

solvent filter をかけてスペクトル上の水消しをデジタルに行う

nmrPipe -fn SP -off 0.4 -end 0.9 -pow 2 -c 0.5

Appodization を sine-bell 関数で行っている．数値は各係数（ここでは X 軸＝1H 軸について）

nmrPipe -fn ZF -auto（ FT 前 に ） デ ー タ の 無 い 部 分 に つ い てZERO-fill を行う（X 軸）

nmrPipe -fn FT

FT (フーリエ変換)を行う（X 軸）

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NMR データ処理／解析
nmrPipe -fn PS -p0 0.0 -p1 0.0 -di

位相補正を行う（X 軸）

nmrPipe -fn EXT -left -sw -verb

スペクトルを左半分（水信号より低磁場側）だ
けにする

nmrPipe -fn TP

X 軸と Y 軸を反転させる
ここから先は Y 軸（15N 軸）について処理を進めている

nmrPipe -fn SP -off 0.4 -end 0.9 -pow 1 -c 0.8

Appodization を sine-bell 関数で行っている．数値は各係数（ここでは Y 軸＝15N 軸について）

nmrPipe -fn ZF -auto

ZERO-fill を行う（Y 軸）

nmrPipe -fn FT

FT (フーリエ変換)を行う（Y 軸）

nmrPipe -fn PS -p0 0.0 -p1 0.0 -di

位相補正を行う（Y 軸）-verb -ov -out Nhsqc.ft2

Nhsqc.ft2 のファイル名で出力する_/_/_/ Apodization 補足 _/_/_/NMR の 生 デ ー タ で あ る FID （ freeinduction decay）は，測定開始点から徐々に減衰する（右図）．しかしすべてのデータ
点にはデジタルノイズが乗っており，本来のデータ点に対するノイズの影響は後半に行くほど大きい．そのために，Apodization
を行ってデータの有効係数を時間軸に沿って変更する．NMRPipe では，各種の Apodization 用の Sine，Exponential，Gaussian 関数が用意されている．上記の例では Sine 関数のみを使用している（SP の行．SP は SPecifying processing
parameters を意味する）．
-off は offset であり，0 から 0.5 を使用する．それぞれ 0π，0.5πなので，0˚と 90˚を指しており開始点になる．
0.5 付近を使用し，開始点付近の有効係数は高い状態にする．-end は終了点で 1 以下の値を使用する（もちろん，offset よりも大きい値とする）．-pow は，sine 関数の乗数を示す．乗数の sine カーブは次の図の通り（青，赤，緑，
紫の順に，１〜４乗）乗数が高いほど後半がなだらかになっている．-end の値は-pow に依存して変更するのが良いだろう．-c は，最初のデータ点の有効係数で 0 から 1 までを使用する．測定する
ときのパルスシークエンス条件にも依存するが，最初のデータ点が最後の矩形パルス直後からの場
合，実データが乱されることがありこれはベースラインの歪みを生じる．適宜に変更する．

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NMR データ処理／解析
ここでの例で使用したスペクトルは，15N の軸について half dwell での測定を行っているので，
Y 軸の位相補正の基準値には以下の値が入る．
nmrPipe -fn PS -p0 -90.0 -p1 180.0 -di
数字部分について変更し，Macro Name が Nhsqc.com であることを再度確認したのちに，Save,
Execute ボタンを押す．Execute ボタンのあとに，nmrTerm -e csh Nhsqc.com と表示され，Continue または Cancel のダイアログが表示される．Continue を押し，処理を実行する．処理が終了したら Done を押して，Macro Edit ウィンドウを閉じる．その後，nmrDraw のメニューから
File -> S) Select File を選択する．
Nhsqc.ft2 を選択し，一番下の Read/Draw ボタンを押す．スペクトルが表示されたら，Done を押して，FileSelect のウィンドウを閉じる．
横軸（X 軸）についての位相補正を行う．メニューのMouse より h) 1D Horizontal を選択し，スライスを表示させる．スペクトル描画部分の紫色の線がスライス位置であり，マウス左ドラッグで移動ができる．青線および黄色線にてスライスされたスペクトルが表示されている．縦軸のメモリ位置にてマウス真ん中ドラッグの上下でスペクトルの縮尺を，右ドラッグの上下でベースラ
イン位置（青線）を変更できる．大きめの信号について，
そのスライスを表示させている状態にする．

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NMR データ処理／解析

P0: および P1: の横にあるスライダーで位相補正を行う．大小二種類のスライダーはそれぞれ，
coarse（大まか）と fine（細やか）に位相補正を行う．ここでの例では P0 のみを使用し，位相補正する．P0 に 166.0 を入れたときに，スペクトルが吸収波形（上向きのみの信号形状）となる．
再度，Macro Edit を開き（File -> m) Macro Edit），X 軸の位相補正値を入力する．
nmrPipe -fn PS -p0 166.0 -p1 0.0 -di
Save, Execute を行い FT する．

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NMR データ処理／解析

処理が終了したら，再度 File -> s) Select File により Nhsqc.ft2 を選択し，Read/Draw をする．

少しだけノイズが見えるくらいまで等高線の最初の描画点を下げる．First に 50000 と入力し，メニューの Draw を"左クリック"する．

21

NMR データ処理／解析

正しく位相補正ができたスペクトルが表示される．
スペクトル画面右上にある，N15=105 ppm，HN=5.35 ppm の青い点や，N15=101.5 ppm，
HN=6.45, 6.90 ppm にある赤い点は，このサンプル由来の信号である．すべての信号が吸収波形となることが確認できれば，FT 処理は終了となる．File から Q) Quit the Program を選択し，nmrDraw を終了する．
２−２−２．HNCO の FT
HNCO 用の雛形スクリプトをコピーする．
$ cd ~/NMR_work/LC3/160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghnco_pegasusj.fid$ cp /usr/local/pipescripts/hnco_*.com .
hnco_xy.com, hnco_xz.com, hnco_xyz.com の三種類のファイルがコピーされる．それぞれ，最初のxy 平面の２次元，最初の xz 平面の２次元，３次元用の FT スクリプトになっている．
hnco_xy.com，
hnco_xz.com を使用し，それぞれの軸に対する位相補正値を決定し，求められたその値を使用して
hnco_xyz.com による３次元 FT を行う．
この HNCO の測定は，２−２−１での[1H-15N] HSQC と連続して測定を行った．そのため，X 軸（H1 の軸）について同じ位相補正値が入る．なので X 軸についての位相補正値は，nmrPipe -fn PS -p0 166.0 -p1 0.0 -diとなる．
nmrDraw を開き，Macro Edit によって hnco_xy.com の X 軸について上記を入力し，Macro
Name: hnco_xy.com と変更し，Save，Execute を行い FT する．hnco_xz.com についても同様に行う．

22

NMR データ処理／解析
hnco_xy.com

hnco_xz.com

両 FT スクリプトともにほとんど[1H-15N] HSQC の FT スクリプトと同じであるが，入力ファイルについて異なっている．hnco_xy.com では，Z 軸 1 番目の XY 平面を読み込んでいる．hnco_xz.com
では，各 Z 軸の最初の FID（Y 軸１番目のみ）を集めて xz001.fid を作成（$NMRTXT/ext.xz.com

23

NMR データ処理／解析
data/test%03d.fid xz.fid の行）し，それを読み込んでいる．
また solvent filter の次の行に polynominal base line 補正を導入できるようにしている（#|
nmrPipe -fn POLY -time）．主に水信号によるベースラインの歪み等を補正するための処理であるが，今回は必要がなかったので，コメントアウト（行頭に#記号を付与）している．solvent filter
処理のある／なしや、polynominal base line 補正処理のある／なしを設定し，出力結果のスペク
トルをみるのも良いだろう．この処理を行わないときのコメントアウト（行頭に#記号）は
hnco_xyz.com による処理時にも登場する．
xy.ft2 および xz.ft2 について確認を行う．File -> S) Select File から選んで確認を行う．
xy.ft224

NMR データ処理／解析
xz.ft2xz.ft2 において，ときどき，のように，位相の合わせられないスペクトルになることがある．これは fid.com による FID フォー
マットファイルの変換処理において，z-axis の Acquisition mode がまちがっていることに起因す
る．fid.com の中身を確認し，z-axis が Complex になっていれば Rance-Kay に，Rance-Kay であれば Complex に変更し，再度フォーマット変換を行う．
xy.ft2 や xz.ft2 により各軸の位相を確認したのちに，
hnco_xyz.com による３次元 FT 処理に入る．
各軸の位相補正値をまとめておく．

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NMR データ処理／解析
x 軸：nmrPipe -fn PS -p0 166.0 -p1 0.0 -diy 軸：nmrPipe -fn PS -p0 0.0 -p1 0.0 -di
z 軸：nmrPipe -fn PS -p0 0.0 -p1 0.0 -di
File -> m) Macro Edit から hnco_xyz.com を開き，各軸について位相補正値を入力し，Save，
Execute を行う．

hnco_xyz.com では，TP を使用せず，X 軸，Y 軸，Z 軸のそれぞれについて軸方向を指定しての読み込み（xyz2pipe -in data/test%03d.ft -x -verb）と書き込み（pipe2xyz -out ft/test%03d.ft -x -ov）を行っている．
nmrDraw 上で FT された３次元スペクトルを確認する．まずは３次元スペクトルが入っている
ディレクトリ，ft/ に移動する．File -> S) Select File から，一番下の欄にある，Directories.
Double-Click for New Lists の項目から ft を選択し，ダブルクリックする．

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NMR データ処理／解析

ウィンドウ上側にある Files. Double-Click to Read 1D/2D に test001.ft に始まる多数のファイルが，中ほどにある Template. Double-Click to Read 3D/4D に test%03d.ft 1 64 が表示される．

Template のところにある test%03d.ft 1 64 を選択し，Read/Draw ボタンを押すと HNCO の３次

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NMR データ処理／解析
元スペクトルが読み込まれ，最初の Z 軸（N15 軸）における XY 平面（HN, C13 による平面）が表示される．Z 軸の異なるプレーンに移動するときには，Z:1 となっているところに適当な数字（1-64）を打ち込んでから Enter を押すか，その横にある上下の三角ボタンを押して移動する．
適当な大きな信号が表示されている平面に移動する．ここでは Z 軸 34 番目（N=115.699 ppm のXY 平面）に移動し表示させた．

画面中央やや右より（HN で 7.8〜7.9ppm，C13 で 175 ppm 付近）にある信号を使って，縦軸の細かい位相補正を行う．メニューより Mouse -> v) 1D Vertical を選択し縦方向のスライスを表示させる．紫の縦線について，マウス左ドラッグで目的とする信号のおよそ中心に移動させる．
[1H-15N] HSQC の処理時に横軸について行った操作と同様に，P0: の横にあるスライダーを使用して位相補正する（スペクトルスライス表示の縮尺は C13 ppm のあたりを真ん中ドラッグで変更する）．
P0: 2 のときに補正されたスペクトル（吸収スペクトル）になった．再度，File -> m) Macro Edit
により，hnco_xyz.com を修正する．Y 軸の位相補正値について，
nmrPipe -fn PS -p0 2.0 -p1 0.0 -di
として，Save，Execute により FT 処理を行う．処理終了後，nmrDraw の File -> S) Select Fileから Template の test%03d.ft 1 64 を再度読み込む（Read/Draw）．

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NMR データ処理／解析

読み込まれたスペクトル上で，Z 軸を移動し，ほとんどすべての信号について位相があっていることを確認する．
参考までに Z 軸方向のスライスはメニューより Mouse -> Z) 1D Z-Axis を選択後，描画されているスペクトル平面の適当な場所（表示されているピーク等）を左クリックする．また h) 1D
Horizontal，v) 1D Vertical，Z) 1D Z-Axis などの位相補正のモードを解除し，スライスを消去す
るには Mouse -> e) Exit Mode を選択する．
３次元スペクトルの位相補正が終了したら，次は Linear Prediction 処理（以下，LP）を行う．
これは分解能の足りない軸について，数点の実測 FID 値よりデータ点予測を行い，FID を補完することでデジタル分解能を向上させる作業である．hnco_xyz.com の Z 軸に対しての処理において，#| nmrPipe -fn LP -ps0-0のコメントアウト（#記号）を取り除き，Save，Execute を行う．LP を含む FT 処理はこれまでに比べ大きく処理時間が延びることに注意されたい．
処理終了後，
nmrDraw のメニューから File -> S) Select File を選択すると，
Template の部分が，test%03d.ft 1 128になり，読み込むと Z 軸について枚数が増えている（128 枚の XY 平面）．
LP の効果を知るために，xz.ft2 について，hnco_xz.com の Z 軸に LP をかけた状態とすると以下のようなスペクトルになる．

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NMR データ処理／解析

先ほどの xz.ft2 に比べ，N15 軸（縦軸）方向に対して各信号がシャープになっていることがわかる．
LP については，FID データ点を予測する処理なため，シグナル強度や形状の信頼性が下がる．
NOESY 測定や緩和解析等のシグナル強度を求める場合には一般に使用しない．今回のように主鎖帰属に使用する３次元測定の場合など，化学シフト値情報をより正確にもとめたい場合に使用する．
また LP のオプションには-ps0-0 の他に-ps90-180 や-fb があり，測定方法やパルスシークエンス，
データポイント数に依存して使用すべきオプションが決まっている．pipescript の雛形やその説明に従って，十分に注意して使用することが望ましい．今回の講習では主鎖帰属用の Z 軸（N15 軸）に限って LP を行っているので，-ps0-0 以外は登場しない．
LP は全体の処理時間が長くなり，各信号の形状が歪むことがある．そのため，位相補正のときには LP はかけない．また，今回は Z 軸のみに LP をかけたが，Y 軸にも LP 処理は可能である．
ただし，LP の対象軸以外はスペクトルデータになっていなければならず，例えば hnco_xyz.comの Y 軸処理に入った段階に LP 処理を導入しても Z 軸がまだ FID データであるため，間違った LP処理となる（とんでもないスペクトルになる）．Y 軸に LP 処理をかける場合には，hnco_xyz.comの処理が終わったあとで，Y 軸について FID に戻し（Hilbert Transform 処理，以下 HT），そこか
ら LP 処理にてデジタル分解能を上昇させたのちに，再度 FT を行う．しかし，Z 軸にのみ LP を行った場合に比べ，HT を伴うことによってさらに信号形状があやしくなるため， ３次元測定の Y
軸 に つ い て は 特 に 必 要 で も な い 限 り LP は お す す め し な い ． 今 回 扱 わ な い が ， ４ 次 元 のHCCH-TOCSY など，測定時間の都合からデータポイント数が極端に少ない測定では各軸に対してLP を使用する．

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NMR データ処理／解析

hnco_xyz.com 処理後に Y 軸について LP をかけるためのスクリプト（hnco_xyz_YLP.com）と処
理後のスペクトルの一部．信号周囲にノイズが発生しているのがわかる．

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NMR データ処理／解析
２−３．Tips
nmrDraw での上記以外によく使う機能について．

２−３−１．１次位相補正
広い範囲について測定したスペクトルや低濃度サンプルなどにおいて，１次位相補正が必要な場
合がある．特に [1H-13C] HSQC の FT 処理において１次位相補正は必須の作業となる．視覚的に１次位相補正を行うためには，どこか適切な信号を支点（pivot）として設定し，支点信号の位相が変わらないように他の信号について１次位相補正を行う．nmrPipe での１次位相補正値は-p1 であり，nmrDraw 上では P1 になる．pivot を使用した状態で P1 スライダーを動かすと pivot を打った箇所の位相が変わらないように P0 の値が自動で変動する．
[1H-13C] HSQC について１次位相補正を使用した FT を行う．
$ cd ~/NMR_work/LC3/160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_gChsqc_pegasusj.fid
FID フォーマット変換を行う（２−１−１を参照）．

Read Parameters，
パラメータの確認（y-axis の Acquisition Mode），
Save Script，
Execute Scriptを行い，終了後 Quit でこのウィンドウを閉じる．ウインドウを閉じたあと，[1H-13C] HSQC の FT
用雛形ファイルをコピーし，実行する．
$ cp /usr/local/pipescripts/Chsqc.com .
$ ./Chsqc.com
nmrDraw にて xy.ft2 を開き，First を 30000 に設定し，Draw を押しスペクトルを確認する．
高磁場側にある信号（ここでは C13=8ppm，H1=-1ppm の信号とする）について，まずは P0 のみで位相を補正する．
x 軸：nmrPipe -fn PS -p0 -145 -p1 0.0 -di
File -> m) Macro Edit を選択して Chsqc.com の編集を行う．Macro Name に注意し，Save，
Execute を行う．X 軸終了後，同じ信号を用いて Y 軸についても補正を行う．
y 軸：nmrPipe -fn PS -p0 -14.0 -p1 0.0 -di

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NMR データ処理／解析
再度，Chsqc.com の編集から Execute までを行う．
X 軸，Y 軸の両方に１次位相補正をかけるが，まずは X 軸について行う．nmrDraw 上にて Mouse-> h) 1D horizontal により，スライスを表示させて先ほど P0 での位相補正に使用した信号についてスライスを表示させる．ピークの中央部分に pivot を打つ．横軸の化学シフト値が表示されているあたりで左クリックするとスペクトル上に青い矢印が表示される．化学シフト値で-1 ppm 付近に右ドラッグで移動させる．これが pivot の位置になる．

次に，pivot が打たれた状態のまま，他の信号について P1 のスライダーを使用して位相補正を行なう．このときなるべく低磁場側の信号（ここでは C13=69 ppm，H1=3.8 ppm の信号とする）を使って位相補正する．また，該当信号が拡大されていることが作業を行う上で望ましいので，メニューより Mouse -> z) 2D Zoom を選択する．画面中央に紫色の四角が表示される．この四角の角または辺の近くを左ドラッグすることで大きさを変更できる．また真ん中ドラッグにより四角の位置を移動できる．
目的とする信号を囲むように四角の大きさを変える．

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NMR データ処理／解析

この状態のまま，右クリックをすることで，囲んだ領域が拡大表示される．この拡大表示はメニュ
ーから Draw -> f) 2D full によって全領域の表示ができる．拡大された状態でメニューより Mouse-> e) Exit Mode によって 2D Zoom の状態のみを解除する（紫色の四角が消える）．拡大された信号を使用し，P1 スライダーを使用して，位相補正する．このとき，P0 の値も P1 に連動して変動することを確認する．この信号は負の信号なのでスライスで下向きの信号となる．

P0 に-101.9，P1 に 115.0 が入った状態で位相が揃った．File -> m) Macro Edit より Chsqc.com を編集する．すでに X 軸については，
x 軸：nmrPipe -fn PS -p0 -145 -p1 0.0 -diが入力されているので，p0 に-101.9，p1 に 115.0 を足して入力する．

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NMR データ処理／解析
x 軸：nmrPipe -fn PS -p0 -246.9 -p1 115.0 -di
Save，Execute を行い，再度 FT を行う．終了後，nmrDraw にて File -> S) Select File を選択し，xy.ft2 について Read/Draw を行う．拡大された状態のまま表示されるので，Draw -> f) 2D Fullを選択し，全領域を表示させる．すべての信号について，横軸方向には位相が揃っている（[1H-13C]
HSQC は constant time evolution を使用した 13C 軸の展開を行っているので，正負両方の信号が混在する）ことを確認する．

縦軸についても同様に P1 を使用した位相補正を行う．高磁場側の信号を用いて，すでに P0 の補正が終了しているため，Mouse -> v) 1D Vertical で縦軸のスライスを表示させて，その信号まで移動させる．その後，今度は縦軸の化学シフト値位置での左クリックにより pivot を打つ（C13=8ppm
くらい）．Mouse -> z) 2D Zoom で低磁場側の信号（先ほどと同じ信号で構わない）を拡大表示させる．2D Zoom Mode を Mouse -> e) Exit Mode で抜けて P1 スライダーを使用して位相補正する．
P0 に 19.1，P1 に-21 が入った状態で位相が揃うので，File -> m) Macro Edit 上の Chsqc.com に
おいて，すでに Y 軸に対して入力されている
y 軸：nmrPipe -fn PS -p0 -14.0 -p1 0.0 -diにそれぞれを足して，
y 軸：nmrPipe -fn PS -p0 5.1 -p1 -21.0 -di
として，再度，Save，Execute を行う．nmrDraw 上で xy.ft2 を再度開き，縦軸についても位相補正ができていることを確認する．
縦軸，横軸両方の位相補正が終了したので，LP をかけて FT する．ところで，この Chsqc.com
では，LP について
nmrPipe -fn LP -ps0-0 -ord 32となっている．通常，LP -ps0-0 は前後８点の FID データ点を使用して中間点のデータ予測を行

35

NMR データ処理／解析
うが，[1H-13C] HSQC の測定では 13C 軸の測定データポイント数を多くして測定しているため，より多くの FID データ点を使用しての LP になるようにしている．

！注意！

１次位相補正を行う際，後述の CS や EXT による処理が行われているスペクトルでは正しく補正ができない．そのため，CS や EXT の行について行頭コメントアウト（#記号）を付加した FTを行ったスペクトルを用いて，１次位相補正を行わなければならない．１次位相補正が終了したの
ちに CS や EXT のコメントアウトの#記号を削る．
２−３−２．Circular Shift
HBHA(CO)NH の HB や HA が観測される軸（Y 軸）や，Aliphatic 用の HCCH-TOCSY，
CCH-TOCSY，13C-edited NOESY などの Z 軸（C の軸）はわざと領域を狭くした測定を行い，分解能の向上を行っている．測定範囲外にある信号は折り返し信号として観測される．この折り返
し信号について解析を行う前に circular shift 処理（以下、CS）によって本来の位置に戻して解析するほうが望ましい．
HBHA(CO)NH の測定を例に進める．この測定では，Y 軸について 6 ppm 幅に狭めて測定している．中心は水の 4.78 ppm なので，1.78 から 7.78 ppm で測定し，範囲外の信号は折り返して測定される．
$ cd ~/NMR_work/LC3/160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghbhaconh_pegasusj.fid
FID フォーマット変換を行う（２−１−１を参照）．

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NMR データ処理／解析

Read Parameters，
パラメータの確認（y-axis の Acquisition Mode），
Save Script，
Execute Scriptを行い，終了後 Quit でこのウィンドウを閉じる．ウインドウを閉じたあと，HBHA(CO)NH の FT
スクリプトをコピーし，hbha_xy.com について実行する．
$ cp /usr/local/pipescripts/hbha_*.com .
nmrDraw を起動し，File -> m) Macro Edit から hbha_xy.com を開き位相補正を行う．今回のサンプルでは，
x 軸：nmrPipe -fn PS -p0 166.0 -p1 0.0 -diy 軸：nmrPipe -fn PS -p0 0.0 -p1 0.0 -di
z 軸：nmrPipe -fn PS -p0 0.0 -p1 0.0 -diが入るので，x 軸についてのみ修正し，Save，Execute を行う．

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NMR データ処理／解析

処理後，nmrDraw の File -> S) Select File で xy.ft2 を開く．First を 50000 とし，Draw する．

縦軸 7.7 ppm，横軸 8.4 ppm 付近に信号があるが，これは本来高磁場側に位置する信号が折り返して観測されている．再度，File -> m) Macro Edit を開き，コメントアウトされている CS の行，

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NMR データ処理／解析#|nmrPipe -fn CS -ls 2ppm -swから#記号を消去し，Save，Execute を行う．

縦軸（Y 軸）に対して CS を行ったことで，先ほどの折り返し信号が正しい化学シフト位置（縦軸の 1.7 ppm 付近）に表示されている．
適切な CS の移動幅（2ppm で指定されている部分）や方向（-ls が左方向＝高磁場側への移動．
低磁場側方向への移動は-2ppm とするか，-ls を-rs（-rs は右方向への移動）とするかのどちらか）は，測定時の設定で変わる．測定段階からこれらに注意してパラメータの設定を行うこと．
２−３−３．Estimate Noise
スペクトルにおいて S/N 比は重要な意味を持っている．微弱な信号が多数あるようなスペクトル（緩和解析や NOESY のピークピック等）において，信号として扱うか否かは noise レベルを基準とする（例えば，ノイズレベルの何倍以上の強度があるものは信号，それ以下はノイズとする．など）．nmrDraw 上でノイズレベルを計算するときには，メニューから Peak -> T) Estimate Noiseを選択する．
Noise Esitemate: 数字のように表示され，この数字がノイズレベルとなる．
この Estimate Noise の操作を行うと，First の値が自動的にノイズレベルの６倍に設定され，割と適切なシグナル強度でのスペクトルを閲覧することができる．スペクトルを開いた直後にこの操作を行うと良いかもしれない．
２−３−４．Extract (EXT)この EXT については，すでに[1H-15N] HSQC の FT 処理時から登場しているが，より細かく紹39

NMR データ処理／解析介する．
[1H-15N] HSQC をメインとする主鎖帰属用測定は，アミドプロトンを最終的に観測する．アミド
プロトンは一般的に５〜１１ppm 付近に観測されるため，水信号（4.78 ppm）より低磁場側のみに観測される．水信号より高磁場側は不要になるため，データファイルサイズを縮小するために，
nmrPipe -EXT -left -sw -verb
として，水信号より高磁場側を削っている．
いくつかのタンパク質サンプルにおいて，水信号より高磁場側に信号が観測されることがある．
その場合，上記の EXT の行を削る，またはコメントアウトすることで，スペクトルファイル上に信号を残すことができる．
この EXT について，化学シフト値を明示する方法もある．
nmrPipe -EXT -x1 5.5ppm -xn 11ppm -di -sw -verbのように指定する．
これは 5.5ppm から 11ppm だけを抜き出してスペクトルファイルとしている．

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NMR データ処理／解析
第３章 Sparky
Sparky は NMR スペクトルを描画し，解析するためのソフトウェアであり，非常に多くの溶液
タンパク質 NMR 解析を行う研究者によって利用されている．無料で使用でき，使い勝手が良いのと拡張性が高いことが主な要因と思われる．
NMR スペクトルの解析操作には，信号の帰属（各原子の化学シフト値の決定），ピーク強度の算出等がある．帰属や信号強度のデータは，その後に構造計算ソフトや計算ソフトに移行し，解析操作を進める．Sparky format の出力ファイルは，それら後続するソフトウェアにおいてよくサポートされている．
Sparky パッケージは，各種フォーマットのスペクトルファイルについて，Sparky フォーマット
のスペクトルファイル（ucsf ファイル）に変換するスクリプトと ucsf ファイルを描画するためのプログラムファイル本体，各種のライブラリーファイルなどで構成されている．また，Sparky はWindows，MacOS，Linux 等の幅広い OS 上で動作し，それぞれの互換性も良い．
Sparky を使用し，研究論文等で発表する際には，T. D. Goddard and D. G. Kneller, SPARKY 3,
University of California, San Francisco

として引用し，必要であれば，URL（https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/）を記載すること．

Sparky の操作を始める前にワークスペースを作成する．最初に，$ sparky
として起動したときに，と表示される．ここで Yes とすれば，ホームディレクトリ（上記の/home/kumeta/）に Sparky ディレクトリが作成され，その下には，
Lists Projects Save

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NMR データ処理／解析のサブディレクトリが作成される．
Sparky ワークスペースが自動作成されたあとに，ここでは，さらに ucsf ファイルをまとめて入れるためのディレクトリ，Data を作成しておく．
$ mkdir ~/Sparky/Data
各サブディレクトリの役割などついては，以下のようになっている．
Lists

Sparky 上での操作により出力されたファイル等が入るディレクトリ
化学シフトファイルや画像出力ファイル（Postscript ファイル）がここに入る

Projects

複数のスペクトルをまとめて管理するときに使用する Project ファイルがここに入る．複数のスペクトル間での同期や重ね合わせ，複数スペクトルにまたがった化学
シフトの統計値などは Project ファイルに記載されている
例えば，LC3.proj や LC3_Atg4B_Ctail1_titration.proj など

Saveucsf ファイルに関する情報は ucsf ファイルとは別に Save ファイルとして，このディレクトリに保存される
Save ファイルには ucsf ファイルの場所，描画情報（等高線の数や色など）や各信号のピーク情報（化学シフト値，オーナメント情報等）が記載されている
Nhsqc.save や hnco.save など

Data

ucsf ファイルをまとめておくためのディレクトリ
Nhsqc.ucsf や hnco.ucsf など

Sparky で取り扱う ucsf ファイルの名前は，基本そのまま Save ファイル名になる（Nhsqc.ucsf
は Nhsqc.save）．主鎖帰属や滴定実験の解析作業では多くのスペクトルファイルを取り扱うため，互いに名称がかぶらないように工夫すること．また，スペクトルごとに個別にウィンドウが開く．
このとき，ウィンドウ上部に Save ファイル名が表示される．多数のウィンドウを並べて表示していると，このウィンドウ上部のファイル名表示が短くなる．そのため，短いウィンドウ幅でも Save
ファイル名が識別できるように，Save ファイル名はできるだけ短い名前にしておくことをお勧めする．
以下は，本稿で使用するファイル名の例である（ただし，使用しないスペクトルも含まれている）．

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NMR データ処理／解析

スペクトル名ucsf ファイル名

スペクトル名ucsf ファイル名[1H-15N] HSQC

Nhsqc

[1H-13C] HSQC Aliphatic

Chsqc[1H-13C] HSQC Aromatic

Chsqc_Arom

HNCO

hnco

HN(CO)CA

hncocaHNCA

hnca

CBCA(CO)NH

cbca

HNCACBhncacbHBHA(CO)NHhbha

HN(CA)HA

hncahaC(CO)NH

cconh

H(CCO)NH

hcconh(HCA)CO(CA)NH

hcacocanh15

N-edited NOESY

nnoe

13

cnoe /

13

C-edited NOESY Aromatic

cnoeArom

C-edited NOESY Aliphatic

cnoeA / cnoeB
HCCH-TOCSY Aliphatichcch /

CCH-TOCSY AliphatichcchA / hcchB

cch /cchA / cchB

HCCH-TOCSY Aromatic

hcchArom

CCH-TOCSY Aromatic

cchArom

HbCbCgCdHd

CBHD

HbCbCgCdCeHe

CBHE

Steady State NOE (on/off)

ssNOE_on /titration (0.0 - 3.0 eq)

tit_00... tit_30

ssNOE_off

13C-edited NOESY Aliphatic，HCCH-TOCSY Aliphatic，CCH-TOCSY Aliphatic は分解能向上のため，13C 軸について折り返し測定を行うことがある．Sparky 上での折り返した信号の解析には，
Alias Peak または Fold Spectrum を使用する．Fold Spectrum は軸の化学シフト値を軸の幅にて折り返して描画させることができるが，例えば HCCH-TOCSY どうし（折り返し前のスペクトルと折り返し後のスペクトル）を比較する必要が出てくるため，この Fold Spectrum の機能を使用すると比較ができない．そのため，これを使用せず全領域をカバーできるように nmrPipe の CS
（circular shift）を使用してスペクトルファイルを２種類用意するようにしている．この２種類の同じスペクトルを基にした ucsf ファイルについて，hcchA，hcchB のようにした．

43

NMR データ処理／解析
３−１．フォーマット変換
Agilent（旧 Varian）の VNMR，Bruker の TopSpin など各装置付属のソフトウェア上で FT されたスペクトルファイルや nmrPipe で処理されたスペクトルファイルなどを Sparky フォーマッ
トのスペクトルファイル（ucsf ファイル）に変換する．

３−１−１．nmrPipe ファイルからのフォーマット変換
nmrPipe フォーマットのスペクトルファイルは，第２章のとおりに処理していると２次元は一つのファイル，３次元以上は複数のファイルに分かれている．ucsf ファイルを作成するときには，複数に分かれているファイルは一つにまとめてから，作成する必要がある．
２次元の nmrPipe スペクトルファイルとして，[1H-15N] HSQC を例とする．
nmrPipe による FT 済み（２−１−１や２−２−１が終了していること）の測定データディレクトリに移動し，pipe2ucsf を使用してフォーマットの変換を行う．
$ cd ~/NMR_work/LC3/160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_gNhsqcHD_pegasusj.fid$ pipe2ucsf Nhsqc.ft2 ~/Sparky/Data/Nhsqc.ucsf
３次元の nmrPipe スペクトルファイルとして，HNCO を例とする．
nmrPipe による FT 済み（２−１−２や２−２−２が終了していること）の測定データディレクトリに移動し，xyz2pipe での単一ファイルへの変換を行い，つづけて pipe2ucsf によるフォーマットの変換を行う．
$ cd ~/NMR_work/LC3/160624_CN_LC3_1.6mM_pH7_ghnco_pegasusj.fid$ xyz2pipe -in ft/test%03d.ft -x > hnco.pipe$ pipe2ucsf -123 hnco.pipe ~/Sparky/Data/hnco.ucsf
pipe2ucsf コマンドのオプション，-123 は ucsf 化した際の軸の順番変更を指定している．-123
は順番を変更しない．順番を変更しないのであれば，このオプションは省略できる．一方で，HCCH-TOCSY は-132 のように X 軸と Y 軸を入れ替えた方が解析を行いやすい．
nmrPipe フォーマットのスペクトルファイルのヘッダー領域には測定のときの次元数が書かれている．３次元の測定について処理を行った際の途中のファイル（例えば HNCO での xy.ft2 や
ft/test001.ft）を Sparky で確認するなどの場合，$ pipe2ucsf xy.ft2 hnco_xyft2.ucsf
としても，xy.ft2 のファイルサイズが計算値より小さいため処理できない旨が表示され処理されない．そのためヘッダー領域を書き換える処理を行ってから，pipe2ucsf を行う．
$ sethdr xy.ft2 -ndim 2$ pipe2ucsf xy.ft2 hnco_xyft2.ucsf
擬似的な三次元測定方法を採用している R2 dispersion にも同様の処理が必要となる．

３−１−２．VNMR からのフォーマット変換

44

NMR データ処理／解析
VNMR からのフォーマット変換には VNMR が入っている PC（通常は NMR 測定を制御するための PC）に Sparky がインストールされていると便利である．装置管理者（または PC 管理者）にインストールの許可をとるか，インストールしていただくことを推奨する．
VNMR 上でスペクトルを表示する途中に生成されるテンポラリーなファイルを使用して ucsf ファイルを作成する．そのため，VNMR 上で FT をしたあとスペクトル描画をさせないで ucsf ファ
イルを作成する．以下の手順で行う．
・VNMR 上にて，見栄えのよいスペクトルになるように位相補正等を行う．
・VNMR 上にて，FT のコマンドを実行する．
trace='f1' f full dconi flush
・この状態のまま，Terminal を開き，FT した exp ディレクトリに移動し，以下のコマンドによって ucsf ファイルを作成する．
$ cd ~/vnmrsys/exp3$ vnmr2ucsf procpar datdir/phasefile Nhsqc.ucsf N H
vnmr2ucsf 行の最後にある，N，H は軸のラベルである．適宜指定すること．
もし VNMR が入っている PC に Sparky をインストールできない（または，させてもらえない）
場合には，この phasefile ができている状態（trace コマンドの行の直後）で exp ディレクトリごと Sparky が入っている PC までコピーし vnmr2ucsf のコマンドによる処理を行う必要がある．

３−１−３．Bruker フォーマットからの変換
Bruker 装置での TopSpin 等のソフトウェア上で FT されたファイルは，プロセス番号ディレク
トリの下に保存されている．２次元スペクトルは 2rr，３次元スペクトルは 3rr のように保存されている．プロセス番号を１としていたときには，以下のように処理する．
$ bruk2ucsf 1/pdata/1/2rr Nhsqc.ucsf
このとき，パラメータファイルとして，1/acqus ファイル等が読み込まれているので注意する．

３−１−４．ucsf ファイルヘッダーの編集
ucsf ファイルのヘッダー領域にはスペクトルの情報が記載されている．このヘッダー領域は元のスペクトルファイルから自動で読み込まれるが，FT 時のミス等や特殊な測定方法を行った場合には，ヘッダー領域を書き換える必要がある．例えば，Non-Linear Sampling 測定をし，rnmrtk による再構成を行った場合には軸ラベル情報が間違えられるため，$ ucsfdata -a1 15N -a2 13C -a3 1H hncaS.ucsfのように ucsfdata コマンドを使用して軸ラベルの修正を行う．
ヘッダー情報を確認するときには，$ ucsfdata Nhsqc.ucsfのようにする．

45

NMR データ処理／解析
３−２．基本的な操作方法
Sparky では，２文字コンビネーションによるショートカットによる操作，ならびにマウスの各種ポインターモードによって解析を行う．この２文字によるショートカットは，Linux の日本語文
字などの２バイト文字入力環境とコンフリクトするため，例えば Mozc などが起動しているとSparky 上での２文字ショートカットが行うことができない．Sparky を起動する前に，Mozc などが起動していれば終了しておくこと（Ubuntu の GNOME fallback では画面右上にあるキーボー
ドのアイコンから終了できる）．
２文字ショートカットを使用する場合には，ダブルクオーテーション，"で囲んで表記する（例，"fo"）．pointer mode を変更するときには，割り当てられた Function キーとともに表記する（例，select (F1)）．
また，今回は 13C/15N ラベル nfe11 を用いて 600 MHz NMR で測定し，NMRPipe で処理をした
以下のデータセットを用いる．
Nhsqc.ucsf[1H-15N] HSQC

hnco.ucsf

HNCO

hncoca.ucsf

HN(CO)CA

hnca.ucsf

HNCA

cbca.ucsf

CBCA(CO)NH

cconh.ucsf

C(CO)NHhbha.ucsf

HBHA(CO)NH

nnoe.ucsf

15

nnoe_arg.ucsf

15

Chsqc.ucsf[1H-13C] HSQC

N-edited NOESY(for Arg NE-HE)
hcch.ucsf

hcch-tocsy(Aliphatic)
cnoe.ucsf(Aliphatic)
ChsqcArom.ucsf[1H-13C] HSQC

N-edited NOESY

13

C-edited NOESY(Aliphatic, 2D)
cnoeArom2D.ucsf(Aromatic)

13

C-edited NOESY(Aromatic, 2D)

nnoe_arg.ucsf は Arg の Nε-Hε由来信号からの 15N-edited NOESY 信号を参照するために
nmrPipe で CS 処理し，高磁場側にシフトさせたスペクトルファイルである．

３−２−１．Sparky の起動／終了と２次元ファイルの閲覧$ sparkyによって Sparky は起動する．
Sparky は起動したときに，Main window と Pointer Mode window が開く．
終了させるときには，"qt"とする．

"fo"にて Open File ダイアログを開く．最初に開いたときには Directory が Sparky ワークスペースの Save ディレクトリになっている．Data ディレクトリに移動し，Nhsqc.ucsf を Open する．

46

NMR データ処理／解析

ノイズレベルの５倍の高さで等高線が１本ずつ正負それぞれ赤と緑の線で表示されている．縦軸はw1（15N の軸），横軸は w2（1H の軸）となっている．
"ct"として Contour dialog を開き，適切な見栄えの良いスペクトルとする．

Positive，Negative の Lowest にそれぞれ 200000，-200000（2e+05，-2e+05 としても同じ意味になる）を，Levels には両方 20 を入力し，Apply ボタンを押す．等高線が正負それぞれ 20 本ず
つ表示される．等高線の間隔は前の高さの 1.4 倍位置に次の等高線を描画するように設定されている．
"vt"によって View Setting dialog を開き，Aspect (ppm)を 6.00 に変更する．
この View Setting ではその他に，スライス１D を表示させたり（"vS"），帰属済みの原子について表示させたり（"vR"）できる．

47

NMR データ処理／解析"zi"，"zo"でズームイン、ズームアウトができる．ウインドウ右端や下端にあるスライダーで表示されているスペクトルの移動ができる．
Pointer Mode を find/add peak (F8) に変更し，ピークがある領域を取り囲むとピークピックされる．また囲まずに特定の位置をクリックしたときには，その場所がピークピックされる．

ピークピックされた情報は，"lt"で表示される Spectrum Peaks ウインドウで確認ができる．

48

NMR データ処理／解析

帰属の情報（帰属していないので？−？で表示される）および w1 の軸（15N の軸）と w2 の軸（1H の軸）ごとの化学シフト情報が表示されている．Options をクリックすることで表示について変更ができる．

例えば，ピーク強度の表示（Data height や Volume）や帰属情報の表示順番の変更（Sort by: ），表示フォーマットの変更（Assignment Format: ）ができる．
各信号について帰属を行うためには"at"として Assignment dialog を開く．

49

NMR データ処理／解析

w1，w2 の軸それぞれに，Group 名と Atom 名をつけることができる．Group 名を一文字表記のアミノ酸と残基番号，Atom 名は CYANA 書式の原子名とする．例えば，N=118.217，H=7.799 にある信号が Leu40 の主鎖アミドであれば，Pointer mode を select (F1)とし，その信号をクリック
または囲むことで選択した状態にする（そのピークピックのみが四角で囲まれている状態）．
Assignment dialog に，
Axis

Group

Atom

w1

15N

L40

N

w2

1H

L40

HN

と入力する．Atom 名は CYANA 書式とした．N は主鎖アミドの窒素原子，HN は主鎖アミドの水
素原子を意味する．Apply を押す．するとスペクトル上に，

50

NMR データ処理／解析のように表示される．このスペクトル上に表示されている L40N-HN のことをオーナメント（ornament）と呼ぶ．
このオーナメントは Pointer Mode を select (F1)とした状態でのマウスドラッグにより自由に移動させることができる．オーナメント以外にも，ピークピックや grid 線（add grid horz (F4)などで追加できる線）なども同じく Pointer Mode を select (F1)として移動させることができる．"ot"として Ornament Properties dialog を開き，色や大きさを変更することができる．表示のフォー
マットは"vt"の View Settings dialog の Assignment format:で指定ができる．
オーナメント，ピークピック，grid 線などは選択したのちに Del キーによって消去することができる．直前の操作についてやり直しをする場合には，"eu"とする．ただし，この"eu"は一つ前の操作のみやり直しすることができる．二つより前の操作については戻すことができないので注意が必要である．

３−２−２．３次元スペクトルの閲覧と重ね合わせ／Nhsqc とのシンクロ"fo"から hnco.ucsf を開く．"ct"や"vt"により，見栄えの良いスペクトルにする．

ここでは Lowest は 1e+06／-1e+06，Levels はどちらも 20 とし，Aspect (ppm)は 6.00 とした．
hnco のスペクトルは，w2（13C の軸），w3（1H の軸）の平面が w1（15N の軸）ごとに表示されるようになっている．ウインドウ下端に表示している平面の w1 化学シフト値，さらに移動のた
めのスライダーが表示されている．このスライダーを移動させる以外にも，化学シフト値を直接入力しその平面へ移動したり，"zd"，"zu"によって一枚下または上の w2，w3 平面へ移動することができる．
hnco で表示されている平面（w3/w2 平面）以外を表示させる．

51

NMR データ処理／解析
Pointer Mode を find/add peaks (F8)とし，hnco 上で一つの信号を囲む．"lt"として Spectrum
Peaks ウインドウにて hnco スペクトル上で一つの信号だけが選択されていることを確認する．
"ov"
によって hnco/1，hnco/2 を表示させる．

hnco/2 はウインドウのバツ印を押して閉じ，hnco/1 上で"xx"とする．hnco/1 上で"vt"としてAspect を 0.6 とする．

52

NMR データ処理／解析"ov"は，３次元以上のスペクトルについて，軸の交換を行う．"ov"コマンド直後には，
hnco は縦軸 w2（13C の軸），横軸 w3（1H の軸），奥行き w1（15N の軸）で表示されていた．
hnco/1 は縦軸 w1（13C の軸），横軸 w2（1H の軸），奥行き w3（15N の軸）で表示されていた．
hnco/2 は縦軸 w3（13C の軸），横軸 w1（1H の軸），奥行き w2（15N の軸）で表示されていた．
"xx"コマンドは，表示されている２次元の縦軸と横軸を交換する．そのため，上記一連の操作を行うと，hnco は縦軸 w2（13C の軸），横軸 w3（1H の軸），奥行き w1（15N の軸）とhnco/1 は縦軸 w2（13C の軸），横軸 w1（15N の軸），奥行き w3（1H の軸）になる．
”yt"として Synchronize views dialog を開く．Nhsqc の 15N と hnco の 15N a を選択し，Synchronize ボタンを押す．続けて，Nhsqc の 1H と hnco の 1H c を選択し，Synchronize ボタン
を押す．

53

NMR データ処理／解析
Synchronize ボタンを押した後，Nhsqc の 15N が 15N a に，1H が 1H c になる．小文字の a〜
c はそれぞれシンクロさせている軸を表している．シンクロを解除したい時には，解除したい軸が選択されている状態で Unsynchronize ボタンを押す．
Nhsqc 上で"lt"により，ピークリストを表示させる．そのうちの一つについてダブルクリックする．ここでは先ほどの L40N-HN をダブルクリックする．

L40N-HN の信号とシンクロした hnco および hnco/1 上に３次元信号が一つ観測されている．このとき，Nhsqc 上の信号付近にカーソルをあわせると hnco や hnco/1 上に縦線が表示される．それ
ぞれの軸についてカーソル位置と同じ化学シフト値に縦線が引かれる．これをクロスヘア（crosshair）と呼ぶ．
ここまでの操作によって，Nhsqc の信号一つに対して，hnco，hnco/1 によってそれぞれ，HN-Cのスライス平面（w3/w2 平面）および N-C'のスライス平面（w1/w2 平面）によって３次元スペク
トルが確認できる状態になっている．

54

NMR データ処理／解析
hnco と同様に"fo"によって hncoca と hnca を開く．"ct"によって，どちらも lowest を 5e+05／-5e+05 とし，levels はすべて 20 とする．"vt"によって Aspect を 12.0 とする．hnca についてはPositive の Color を Cyan とする．"yt"で Nhsqc とのシンクロを行う．このとき hncoca と hncaの 13C の軸もシンクロを行う（hnco の 13C 軸とはシンクロさせない）．L40N-HN について表示
させる．

hncoca では Nhsqc 上の主鎖アミド信号から一つ前の残基の Cα由来の信号が観測される．hnca
では同じ残基内の Cα信号が観測されるが，一つ前の残基についても Cα信号が観測される（残基内 Cαよりは弱い信号）．"ol"によって View Overlays dialog を開く．From View:を hncoca とし，Onto View: を hnca として add ボタンを押す．hnca に hncoca が重ねられた状態で表示される（スペクトルの重ね合わせ）．

重ねられているスペクトルは描画のみであり，Pointer Mode を add/find peak (F8)としてもピーク

55

NMR データ処理／解析
ピックされない（ただし上記の場合にはその下にある hnca の信号（cyan）
がピークピックされる）．

複数のスペクトルを開いた状態では，帰属操作がやりづらい場合がある．そのため，解析に使用しないスペクトルを非表示にしておくと良いだろう．"pv"にて View List dialog を表示させ，非表示にしたいスペクトルを選択し，Hide ボタンを押す．

行頭にプラス記号がついているものが表示中，マイナス記号が非表示中を示している．
この View List には Peaks や Assignment として帰属状況が確認できる．Peaks はピークピック
した数であり，Assignments は以降の仮帰属を含め"at"から名前をつけた数である．
３−２−３． Project の保存，読み込み
それぞれのスペクトルファイルについて，ピークピックの情報を保存するときには，Save ファ
イルが作成される．"fs"で保存，または"fa"で名前をつけて保存となる．通常の解析時には複数のスペクトルが同時に開かれており，それらをまとめて保存する．このときには Project ファイルを使用する．"js"または"ja"として保存する．この Project 保存では，シンクロや重ね合わせの情報および帰属の統計値が保存される．ただし，最初に Project 保存するときに，"js"では Project Save 名が noname.proj になっており，これは保存されない．そのため"ja"として名前をつけて保存する．
主鎖帰属や構造解析ではタンパク質名.proj，titration 等ではタンパク質名_Ligand 名.proj が良いだろう．
Project ファイルの中には，化学シフト値の情報が記載されている．Sparky 上にて，この化学シ
フト値を確認するためには，"rl"として Resonance List ウインドウを表示させる．また，このResonance List ウインドウ上の一つをクリックすると Resonance Peaks ウインドウが開かれ，帰属に使用しているスペクトルのリストが表示される．

56

NMR データ処理／解析

画像では Resonance List や Resonance Peaks の表示をわかりやすくするために R39 の C, CA,
L40 の CA についても帰属を追加した状態で表示している（帰属に使用したスペクトルはResonance Peaks の Spectrum 欄に表示されている）．Resonance List では帰属に使用された数がAssignment として表示され，その標準偏差値が SDev として表示される．Resonance List にて
L40 の N を選択すると，Resonance Peaks にて L40N の帰属に使用されたピークピック情報の一覧が表示される．表示された一覧から一つを選択し，ダブルクリックすると，その信号を中心としてスペクトルが表示される．
Resonance List の下部に Load のボタンがある．これは外部より化学シフト値情報を読み込むためのボタンであり，BMRB などから入手した化学シフト値情報を Sparky format に変換してから読み込むことができる．読み込んだ化学シフト値はまだ帰属されていない原子は Assignment が 0として登録される．すでに帰属されている原子については読み込みが無視される．
Sparky を終了したあとに Project を再開するには，"jo"として Project file を読み込む．

57

NMR データ処理／解析
３−３．主鎖帰属チュートリアル
主鎖帰属では， Nhsqc 上に観測された主鎖アミド信号についてどの残基に由来するのかを決定する．Nhsqc では側鎖アミド信号も観測されるため，それを除外して解析する必要がある．
帰属手順は，３−３−１）Nhsqc に通し番号をつける（仮帰属）．３−３−２）３次元の解析をしつつ，側鎖由来信号を見分ける．３−３−３，３−３−４）２残基連鎖を多数作成する．３−３−５）２残基連鎖から連鎖クラスターを構築して，アミノ酸配列との一致領域を探し，通し番号から正しい名前に変更する．すべての Nhsqc 信号について帰属できるまで繰り返す．から構成される．
今回チュートリアルに使用する nfe11 のアミノ酸配列情報は以下の通り．

58

NMR データ処理／解析
N 末端の Met 残基はクローニングアーティファクト配列であり，残基番号は 0 とする．全 67 残基であり，Pro が 7 残基ある．Nhsqc では N 末端主鎖アミドは交換が速く観測されないため，理論
上，67-7-1 の 59 個の主鎖アミド由来信号が観測されるはずである．
主鎖帰属や構造解析に用いる溶液タンパク質サンプルにおいて，残基数，Pro 残基の数，Asn/Glnの数等は，とても重要な要素であるので，あらかじめ準備しておく（できれば測定を開始する前から）．
主鎖帰属を含め帰属作業には CYANA 原子名を用いる．主鎖を構成し NMR 解析対象になる各原子はそれぞれ，N，HN，CA，C，HA として Cβおよび Hβは CB，HB として帰属する．詳細およびその他の側鎖に関しては別添えの CYANA 書式の原子名を参照されたい．

３−３−１．Nhsqc 信号に通し番号をつける
Nhsqc にて，帰属された信号が一つもない状態で，すべての信号をピークピックする．３−２の基本的な操作方法を行っているのであれば，"pa"（Select all peaks）によってすべての信号を選択
し，Del キーによって信号の消去を行ってから，あらためて Nhsqc の信号をピークピックする．"ct"の lowest が 2e+05/-2e+05 のままであれば，83 個のピークピックが行われるはずである．"js"でProject 保存し，"qt"で Sparky を終了する．
Sparky/Save の下にある Nhsqc.save ファイルを参照して，すべての信号に通し番号をつける．
$ cd ~/Sparky/Save$ spx_MC_Nhsqc_save.pl
これにより，Nhsqc.save を読み込み，Nhsqc_kume.save ファイルが作成される．
Sparky を起動し，"jo"にて nfe11.proj を再開したのちに，"fo"で新しくできたファイル，
Nhsqc_kume.save を開く．Nhsqc/1 上ですべての信号に MCxN-HN（x は通し番号）がついていることを確認する．元にした Nhsqc 上のすべての信号を消去（"pa"から Del キー）し，Nhsqc/1
上の MC がついたすべての信号をコピー／ペーストする（Nhsqc/1 上で”pa"，"oc"（Ornament copy），
Nhsqc 上で"op"（Ornament paste））．Nhsqc 上にすべてペーストが完了後，Nhsqc/1 は必要ない
のでウインドウを閉じる．この仮の通し番号を用いて解析することを仮帰属と呼ぶことにする．
のちの作業により，どの残基由来の信号であるのか確定したときには，一文字表記のアミノ酸と残基番号にて帰属する．例えば，Asn1 であれば N1 とする．アミノ酸の種類だけ特定できたが残基番号が不明な場合には三文字表記のアミノ酸と通し番号により仮帰属する．Arg であれば，Arg1，
Arg2 のように仮帰属する．

59

NMR データ処理／解析

３−３−２．hnco を使用した SC 判断"kr"（Restricted peak pick）を使用して hnco 上のピークピックを行う．

"kr"で表示される Restricted Peak Pick dialog にて，Find peaks in を hnco に，Using peaks inを Nhsqc として，Axis match tolerances (ppm)は 15N を.1 に 1H を.01 に設定し，Pick peaks ボ
タンを押す．hnco の"ct"にて Lowest がそれぞれ 1e+06／-1e+06 であれば合計 80 個の信号がピー
クピックされる．hnco で"lt"として Spectrum Peaks hnco を表示し，それぞれについて通し番号に従った名前をつけていく．
MC3 の信号は，MC4 の Multi form 由来信号なので，Nhsqc，hnco の信号を消去しておく．
また，hnco 上で小さな負の信号にピークピックされていることがある．これは近くにある大きな信号由来のリップルノイズなので，これも消去しておく．

60

NMR データ処理／解析

hnco では主鎖アミドの N や H に対して，直前の残基由来の C'原子が観測されるので，MCx の一
つ前の残基を MCx-i として仮帰属する．CYANA 書式の C'原子は C なので
Axis

Group

Atom

w1

15N

MC1

N

w2

13C

MC1-i

C

w3

1H

MC1

HN

とする．
15N や 1H の軸については仮帰属情報を入力しなくても良い（画像中では入力していない）．
MC28N-HN については hnco 上に信号が観測されない．この信号は Arg 側鎖 Nε-Hε由来信号
２個が重なった信号である．Arg 側鎖 Nεは，80〜90 ppm に化学シフト値を持っている．Nhsqcを測定したときに 15N 軸を 100〜136 ppm の幅で測定をしたため折り返した位置に信号が観測されている．hnco は少し幅を狭めて 102.5〜134.5 ppm で測定したため，異なる位置に折り返して観測されている．
Nhsqc 上で"F1"（F1 キーではない）として 15N 軸を高磁場側に Fold させる．hnco も同様に"F1"とする．Nhsqc の w1 軸スライダーを上方向に移動させて，84 ppm 付近を表示させる．MC28N-HNの信号を選択し一度消去する．改めてピークピックを行うが，これは重なった２つの Arg 側鎖 N
ε-Hε由来信号が重なっているので，手動で２つピークピックする（pointer mode を find/add
peaks (F8)としてピークのないところでピックをし，移動させて二つとする）．同様に hnco 上でも２つピークピックする．

61

NMR データ処理／解析

Arg 側鎖 Nε-Hεから hnco 上に同じ残基内の Cζ(CZ)が観測される．
Nhsqc 上の Arg 側鎖 Nε-H
εは
Axis

Group

Atom

w1

15N

Arg1

NE

w2

1H

Arg1

HE

のように，仮帰属する．hnco では，
Axis

Group

Atom

w1

15N

Arg1

NE

w2

13C

Arg1

CZ

w3

1H

Arg1

HE

とする．
Arg 側鎖 Nε-Hεの信号仮帰属が終了したら，Nhsqc，hnco ともに"f1"として 15N 軸を低磁場側に Fold させて元に戻す．
MC36 は Nhsqc 上にて二つの主鎖アミド由来信号が重なっている．Nhsqc 上に２つピークピッ
クを行い，Nhsqc 上信号の左下側を MC36N-HN，右上側を MC136N-HN とする．それぞれについて hnco 上で仮帰属する．

62

NMR データ処理／解析

画面には表示されていないが，hnco の w2 の軸で 177.0 と 177.5 ppm の間にある信号がMC136N-HN 由来の信号．crosshair を確認しながら仮帰属すること．
MC47，MC48，MC52，MC53 は Asn または Gln の側鎖由来の信号である．Asn/Gln の側鎖はNH2 であり，MC47，MC48 は H が両方ともプロトン（N1H1H）の状態，MC52，MC53 は片方のプロトンが溶媒中の 2D2O と交換し，N2D1H の状態である． 2D と結合している N は高磁場シフトする．また，hnco を含む大部分の３次元スペクトルは N1H1H では観測されず，N2D1H で観測
される．

63

NMR データ処理／解析
同じ残基内の側鎖由来信号であるため，SC1 として仮帰属名の付け直しを行う．このとき，"rr"による Rename Resonances dialog を使用する．

From に変更前，To に変更後の Group や Atom をそれぞれ入力し，Rename ボタンを押すと仮帰属名の付け直しができる．"at"による Assignment dialog でも同じような操作ができるが，変更
前の MC が Assignments 0 として残ってしまう．Assignments 0 の帰属情報は後々の操作で邪魔になるので，消しておくことが望ましい．"rl"にて Resonance List を確認し，Assignments が 0の MC が無いことを確認せよ．消去するときは"rr"にて From の Group 名に対象とする MC を入力し，他を空欄として Rename ボタンを押す．

SC は Asn または Gln の側鎖由来を意味する（side-chain）．この時点で Asn と Gln の区別がついていないため，原子の名前も不明となる．ここでは不明な原子として NX および HX1，HX2 を

64

NMR データ処理／解析
使用することにする．また，NDH のときの N は他の３次元スペクトル解析の便宜上，NXg とする．同様に hnco で観測される信号も原子が不明なので CX とする．よって，Nhsqc 上では，
Axis

Group

Atom

Axis

Group

Atom

w1

15N

SC1

NXg

w1

15N

SC1

NXg

w2

1H

SC1

HX1

w2

1H

SC1

HX2

Group

Atom

Axis

Group

Atom

Axis
w1

15N

SC1

NX

w1

15N

SC1

NX

w2

1H

SC1

HX1

w2

1H

SC1

HX2

Group

Atom

となり，hnco 上では，
Axis

Group

Atom

Axis

w1

15N

SC1

NXg

w1

15N

SC1

NXg

w2

1H

SC1

CX

w2

1C

SC1

CX

w3

1H

SC1

HX1

w3

1H

SC1

HX2

となる．HX1 と HX2 については高磁場側を HX1 とした．
nfe11 には Asn３残基，Gln３残基があり，合計で６組の SC ができる．
SC1

MC47,48,52,53

SC2

MC50,51,55,57

SC3

MC59,60,65,66

SC4

MC68,69,70,71

SC5MC73,74,76,77

SC6

MC78,MC80

SC6 は NH2 の２つの 1H が同じ化学シフト値を持つため，1H 軸は Pseudoatom（QX）として仮帰属する．
ここまでの操作によって Nhsqc 上には 82 個の信号が仮帰属されている（MC: 58，SC: 22，Arg:
2）．58 個の MC とつけた信号について，以下の操作を行う．
３−３−３．hncoca と hbha を使用して Chsqc 上に MCx-i の CA-HA 仮帰属"fo"により，まだ開いていないスペクトル（cbca.ucsf，cconh.ucsf，hbha.ucsf，nnoe.ucsf，
nnoe_arg.ucsf，Chsqc.ucsf，hcch.ucsf，cnoe.ucsf，ChsqcArom，cnoeArom2D）を順に開く．"pv"で確認する．

65

NMR データ処理／解析"yt"によってシンクロの設定を行う．ここでは以下のように設定した．

各スペクトルについて適宜，"ct"から等高線の高さ等，"vt"から Aspect: を調整し，見栄えの良いスペクトルとした．
"pv"から，Nhsqc，hncoca，hbha，Chsqc のみ表示させる．Nhsqc 上で"lt"として Specrum Peaks

66

NMR データ処理／解析
Nhsqc を表示させ，MC1N-HN をダブルクリックする．hncoca と hbha が MC1N-HN 由来の信号を表示するので，それぞれのスペクトル上の Cαまたは Hαの信号について，w2 軸のスライダーを使用して表示の中心に移動させる．

Chsqc の w1 の軸が hncoca の w2 の軸と，Chsqc の w2 の軸が hbha の w2 の軸とそれぞれシン
クロしているので，Chsqc スペクトルの中心に，MC1 の一つ前の残基にある Cα-Hαの信号が表示される．画面では MC1-i CA-HA が近くにある信号と重なりあっているため，hncoca と hbhaに表示されている crosshair を確認しながら，ピーク中心をとる位置に手動でピークピックをする．
hbha は一つ前の残基の Hαと Hβの信号が観測される．Hαは一般に Hβよりも低磁場側（ppmの大きい方）に観測される．また，hbha では Hβよりも Hαが強く観測される．迷ったときには
hbha 上で"vS"としてスライスを表示させてシグナル強度を確認すると良いだろう．
ピークピックした信号について，
Axis

Group

Atom

w1

13C

MC1-i

CA

w2

1H

MC1-i

HA

として仮帰属する．これを全ての MC について行う．
MC9-i は Cαの化学シフト値が 44.8 ppm であり，Gly となる．Gly はα位がメチレン（CH2）であるため，1H の軸の原子名（Atom）は HA1 と HA2 となる．また，HA2 が Chsqc 上の水由来
信号の下に隠れている．この場合は，Chsqc 上の何もないところにピークピックを行い，仮帰属する．

67

NMR データ処理／解析

同様に，MC25-i CA-HA，MC35-i CA-HA も水信号に隠れるため，Chsqc スペクトル上の何もないところに仮帰属する．いずれの場合も hncoca と hbha に表示される crosshair に従ってピークピックすること．
MC27-i，MC31-i，MC41-i も Gly であるため HA1，HA2 を使用し仮帰属する．
ここまでで，Chsqc 上に 62 個が仮帰属された状態となる．"pv"で個数を確認せよ．また，"lt"
で名前の付け間違いがないことを確認すること（特に Gly でない残基について HA1 や HA2 と仮帰属したり，その逆の間違いが多い）．
MC2-i CA-HA，MC14-i CA-HA，MC13-i CA-HA はほぼ同じ位置に信号が観測される．crosshairで hncoca と hbha を確認しながら注意深くピークピックすること．
３−３−４．hnca と nnoe，cnoe を使用して MCx の CA-HA 仮帰属と２残基連鎖
今回の測定セットには HN(CA)HA が含まれていない．そのため，MC について残基内の Hα信号の化学シフト値が直接にはわからない．そのため，hnca を用いて Cαを定め，nnoe 上の信号がある位置で Hαを Chsqc 上にて探す．
nnoe は HN に近接するプロトン信号を観測する測定であり，残基内 Hαはほぼ間違いなく観測される．
CA-HA 仮帰属候補が見つかったら，その位置からの cnoe
にて MC の HN が観測されていることを確認する．cnoe は HC に近接するプロトン信号を観測するため，Hαから HN が観測されていることを確認できる．

68

NMR データ処理／解析

画像では MC1 の HN 化学シフト値について Nhsqc 上に縦線を，cnoe 上に横線を引いている（cyan）．これを全ての MC について繰り返す．
MC2 にて，MC12-i CA-HA と同じ信号位置に MC2 CA-HA が仮帰属される．このとき，仮帰属
を，
Axis

Group

Atom

w1

13C

MC2

CA

w2

1H

MC12-iHAとする．

この一つの信号について２つの MC 由来の仮帰属を行う操作が２残基連鎖である．今回の測定セ
ットには含まれていないが hncacb がある場合，cbca と hncacb を駆使して Cβの化学シフト値が一致していることを確認すること．hcacocanh がある場合も同様とする．

69

NMR データ処理／解析
MC12 の CA-HA は，水信号の近くにあるため Chsqc も cnoe も確認しづらい．Chsqc 上にカーソルを合わせ，hnca と nnoe で信号の中心にくるように手動でピークピックする．

MC2-i CA-HA，MC14-i CA-HA，MC13-i CA-HA はほぼ同じ位置に信号が観測されている．同
じ位置に MC14 CA-HA，MC22 CA-HA，MC31 CA-HA が来るため２残基連鎖を作成するのが難しい．とりあえず，その位置に信号が集中していることを示すためすべてを別々の信号としてピー
クピックする．

それぞれの MC N-HN からの nnoe を比較して，２残基連鎖を行う．
Nhsqc 上で"vd" (View Duplicate)によって Nhsqc/1 と Nhsqc/2 を作成し，nnoe 上でも同様に"vd"によって nnoe/1 と nnoe/2 を作成する．Nhsqc/1 と nnoe/1，Nhsqc/2 と nnoe/2 がそれぞれシンク
ロするように設定する（"yt"）．

70

NMR データ処理／解析

Nhsqc/1 上で MC31 を表示させた状態とし，Nhsqc/2 上で MC2，MC13，MC14 をそれぞれ表示
させて，nnoe/1 と nnoe/2 の比較を行う．

MC31 の nnoe（nnoe/1）上に，MC14 HN の位置に信号があり，MC14 の nnoe（nnoe/2）上に，
MC31 HN の位置に信号があることがわかる．MC2 や MC13 ではこのような相互に信号は観測されなかった．連鎖する２残基はそれぞれの NH が近いため，それぞれの nnoe 上でお互いの信号が観測されることが多い．よって MC31 と MC14 は MC31-MC14 の順番で連鎖することがわかった
ので，Chsqc 上で二つを一つに減らして上で MC31 CA- MC14-i HA となるように仮帰属する．
同様に nnoe を用いて他の組み合わせも検証する．MC14，MC22 のそれぞれと MC2，MC13 は
互いの HN は判別できなかったため，このままとする．

71

NMR データ処理／解析
判別が難しい領域についての nnoe 比較が終了したら，Nhsqc/1，Nhsqc/2，nnoe/1，nnoe/2 は不要なので，ウインドウを閉じる．

３−３−５．連鎖クラスターの作成と連鎖帰属
Chsqc 上に作成した２残基連鎖の情報をもとに連鎖クラスターを作成する．Chsqc 上で"lt"として Spectrum Peaks を表示し，Save ボタンによってファイル（ファイル名：Chsqc.list）として保存する．ターミナルを開き，$ lpr ~/Sparky/Lists/Chsqc.list
として，プリントする．
Assignment

w1

w2

MC1CA-HA

59.206

4.560

MC2CA-MC12-iHA

55.1154.297

MC2-iCA-HA

63.306

4.125

MC4CA-HA

53.9153.964

MC4-iCA-HA

62.708

4.248

MC5CA-HA

59.3994.531

MC6CA-MC81-iHA

52.767

4.094

MC7CA-HA

49.461

4.426

MC8CA-MC64-iHA

58.118

4.122

MC9CA-HA

61.220

3.964

MC10CA-MC15-iHA

50.696

4.264

MC11CA-MC6-iHA

53.011

4.439

MC12CA-HA

51.056

5.040

MC13CA-MC11-iHA

59.337

4.510

MC13-iCA-HA

63.424

4.148のようにプリントされている．ここから長めのクラスターを探す．MC13-i CA-HA のように MCx-iのみで構成されるところから始めるのが良いだろう．
MC

-i

MC13

MC11

MC6

MC81

MC26

MC1

CA/CB
Group
cbca と cconh を使用し，アミノ酸の種類または Cα/Cβの化学シフト値を書き出す．

72

NMR データ処理／解析

MC

-i

MC13

MC11

MC6

MC81

MC26

MC1

CA/CB

V

VL

A

A

VL

VL

59/-

Group
アミノ酸配列中で，上記の配列が当てはまる部分を探す．特に AA の並びは特徴的なので見つけやすいだろう．V5〜I11 だけがこれに相当する．
MC

-i

MC13

MC11

MC6

MC81

MC26

MC1

CA/CB

V

VL

A

A

VL

VL

59/-

Group

V5

V6

A7

A8

V9

L10

I11

"rr"によって仮帰属を本帰属に名前の変更をする．このとき MC13-i など，MCx-i についても忘れずに変更する（MC13-i は V5，MC11-i は V6...のように変更する）．
今回の nfe11 では cconh にて信号が分離／強度ともに良好に観測されたため，上記の例でアミノ酸種類まで特定できているが，大概の場合ここまでの特定はできない．その場合は Cα，Cβ（場合によっては Cαのみ）の化学シフト値を記入すること．
同様に他のクラスターについても化学シフトまたはアミノ酸種の特定，ならびに名前の変更を行
う．
MC

-i

MC19

MC56

MC31

MC14

CA/CB

P

EQM

G

T

63.3/-

Group

P50

M51

G52

T53

T54

MC

-i

MC21

MC46

MC38

MC25

CA/CB

P

A

EQ

DNFY

63.4/-

Group

P33

A34

E35

D36

I37

MC

-i

MC23

MC44

MC43

MC10

MC15

MC58

MC30

MC83

CA/CB

P

I

DNFY

T

A

L

T

V

G

Group

P12

I13

N14

T15

A16

L17

T18

V19

G20

MC

MC41

MC42

MC35

MC72

MC32

MC16

MC20

MC45

CA/CB

MHW

MEQ

ST

T

R

V

V

54.8/-

Group

M21

M22

T23

T24

R25

V26

V27

S28

MC

-i

MC29

MC17

MC136

MC22

CA/CB

DNFY

EQ

EQ

ST

63.4/-

Group

N1

Q2

E3

S4

V5

73

NMR データ処理／解析

MC

-i

MC54

MC37

MC49

MC24

MC18

MC36

MC75

MC33

CA/CB

P

R

L

I

S

EQM

EQM

VL

DNFY

Group

P38

R39

L40

I41

S42

M43

Q44

V45

N46

MC

MC67

MC34

MC5

CA/CB

EQMHW

V

59.4/-

Group

Q47

V48

V49

MC

-i

MC61

MC82

MC9

CA/CB

P

T

G

61.2/-

Group

P29

T30

G31

I32

MC

-i

MC79

MC40

MC39

MC8

MC64

MC27

MC7

CA/CB

P

DNFY

EQM

LV

K

G

DNFY

49.5/-

Group

P57

D58

M59

V60

K61

G62

Y63

A64

ここまで終了した時点で，残る MC は MC2，MC4，MC12 であり，MC2-MC12 は連鎖している．
アミノ酸配列上に，Nhsqc 上で帰属できた残基についてマーキングする．

MC4 は cconh から手前の残基が Pro である．上記のうち未帰属で手前が Pro であるのは Ala66
のみである．また MC4 の CA が 53.9 であり Ala の Cα範囲に収まるので，MC4 を A66 と名前の変更を行う（MC4-i は P65 とする）．
MC2 は MC12N-HN からの cconh で Leu である．２残基連続して帰属されていない領域はLeu55-Met56 である．また MC2-i CA-HA は２残基連鎖を保留した信号でもある．T54 CA-HA の信号について Chsqc 上で確認する．

74

NMR データ処理／解析

T54 CA-HA の信号と MC2-i CA-HA がほぼ同じ位置に観測されており，他の候補が存在しない．
よって，MC2-i は T54，MC2 および MC12-i は L55，MC12 は M56 として名前の変更を行う．
Chsqc 上で V5 CA-HA と T54 CA-HA がそれぞれ二つピークピックされた状態となっているので，どちらか一方を消去する（V5 CA-HA，T54 CA-HA がそれぞれ一つずつになるようにする）．
ここまでで Nhsqc 上の主鎖アミド由来信号すべてについて帰属が完了した．Asn1 の主鎖アミドは観測できていなかったことがわかる．

75

NMR データ処理／解析
３−４．側鎖帰属チュートリアル
側鎖帰属では，Chsqc 上に観測された CH の交差信号を主として，観測可能な全ての信号について帰属を行う．
まずは脂肪族側鎖（Aliphatic 側鎖）について帰属する．前項の主鎖帰属チュートリアルが終了
した時点で，Chsqc 上には，CA-HA の帰属がほぼ全て入っている状態から始まる．クローニング
アーティファクトである M0 は主鎖および側鎖が一つも帰属できていないが，これは Aliphatic 帰属が終了してから CH について帰属する．
この作業を行う際に，別紙の Alipatic カーボンの化学シフト値はかなりの頻度で使用する．作業
する画面の近くに貼り出す等，すぐに参照できる状態にしておくことをお勧めする．

３−４−１．閲覧するスペクトルの整理
側鎖帰属操作では閲覧するべきスペクトルがかなり多くなるため，帰属操作を始める前に使用するスペクトルを整理しておくと雑多な画面にならず良いだろう．主鎖帰属で使用した HN-detectのスペクトルについて C 情報をまとめたスペクトルと H 情報をまとめたスペクトルをそれぞれ用意する．具体的には，cconh に cbca を重ね cconh のみを表示，nnoe に hbha を重ね nnoe のみを表示させる．同時に，Chsqc について hcch と cnoe とシンクロさせる．また，HN-detect の C 軸と間接観測軸側 H 軸を Chsqc の C 軸，H 軸とシンクロさせておくと解析が楽になる．

76

NMR データ処理／解析

３−４−２．CB-HB,HB2,HB3,QB の帰属
cconh と nnoe を使用して CB-HB,HB2,HB3,QB の帰属を行なっていく．N 末端側から始めるものとする．
Nhsqc で Q2N-HN を，Chsqc で N1CA-HA をそれぞれ表示させる（"lt"からダブルクリックで選択する）．cconh では N1 の CA が，nnoe では N1 の HA がスペクトル中心に表示されている．
cconh と nnoe を縦に移動し，それぞれ N1 の CB，HB（HB2,3 か QB）が表示されているスペ
クトルの中央になるようにする．シンクロによって Chsqc の画面中央に N1 CB-HB が正の信号として観測されるはずである．
Chsqc 上で横に少し延びた正の信号が観測されている．cnoe を見ると少し横に split しているので，強引に二つの信号にわけて，N1 CB-HB2, N1 CB-HB3 として帰属する．プロトンが高磁場側にある信号を HB2，もう一方を HB3 とした．

77

NMR データ処理／解析

これを Nhsqc で帰属できた主鎖 HN から帰属できる全ての CB-HB,HB2,HB3,QB について繰り返す．
Chsqc での信号の正負および原子の名前には十分に注意すること（N1 CB-HB や A7 CB-HB2は正しい名前としては存在しない）．各アミノ酸の側鎖の形，名前の付け方，およその C 化学シフ
ト値が頭に入っていないのであれば，N 末端側から順番にではなく，アミノ酸の種類ごとに帰属を進めた方が良いかもしれない．特に CB までで Aliphatic 側鎖の帰属が終了する，Ala (A), Cys (C),Asn (N), Asp (D), Ser (S)は解析が簡単だろう．Phe (F), Tyr (Y), Trp (W), His (H)も Aliphatic 側鎖が CB までなので簡単な部類だが，Chsqc 上での信号が出ないことがあるので hcch や cnoe で確認しながら帰属する．
S4 N-HN, Q44 N-HN は Nhsqc 上で重なった信号であるため HN-detect 系での E3 および M43の CB や HB がわかりづらい．E3 の CB-HB2,3 からは HA の信号が hcch で観測されるはずなので，そこから探す．Chsqc 上で E3 の CB 付近に移動し，hcch の縦軸を E3 の HA（4.290 ppm）
付近が表示されるようにする．E3 の HA が観測されている箇所を E3 CB-HB2, E3 CB-HB3 として帰属する．同様に M43 CB-HB2, M43 CB-HB3 を M43 の HA（4.444 ppm）が hcch 上で観測されていることを指標として帰属する．

78

NMR データ処理／解析

M43 N-HN から観測される S42 の CB は CA と化学シフト値が近く cconh で分離できていない．
hbha でも HB の一方が HA と同じ化学シフト値のためわかりづらい．注意して Chsqc や hcch,cnoe を使用しながら，S42 CB-HB2, S43 CB-HB3 を帰属する．

79

NMR データ処理／解析
Y63 CB-HB2,3 は Chsqc 上での信号強度がかなり低い．hcch や cnoe を使用しながら帰属する．

Pro の直前にある残基（I11, S28, I32, I37, V49, M56, A64）や C 末端（A66）については，cconhが参考にならない．hncacb があれば CB の化学シフト値が使用できるが，今回のデータセットには含まれていない．それぞれの Chsqc 上の CA-HA からの hcch を参照し CB-HB を探す．
Nhsqc の I11 N-HN および Chsqc の I11 CA-HA をスペクトルの中心に表示させる．hcch を"vd"として，duplicate させる（hcch/1）．hcch/1 上で 1.98 ppm 付近に信号が観測されている．nnoe
を参照し，1.98 ppm に信号が観測されていることを確認する．Chsqc 上の 1H 軸の 1.98 ppm 付近に縦線を引き，Ile の CB が観測される C 領域（35〜42 ppm）で正の信号で観測されている信号を探す．C: 39.591, H: 1.982 に信号がある．そこから cnoe を確認し I11 の HN（9.171 ppm）が観測されていること，hcch で I11 の HA（4.560 ppm）が観測されていることを確認し，I11 CB-HBを帰属する．帰属できたら duplicate させた hcch/1 は邪魔なので x 印で消去する．

80

NMR データ処理／解析

I11, I32, V49, M56 は HB 以外にも Aliphatic のプロトンがあるので，hcch 上で HB 以外の信号も観測される．C の化学シフト値や Chsqc 上での正負に注意して CB-HB を帰属する必要がある．
また CB-HB からも HA や HB 以外の Aliphatic プロトンが観測されるので，CA-HA からの hcch
（hcch/1）と CB-HB からの hcch のプロトンパターンは一致するはずなので，それらを指標にすることもできる．
３−４−３．Aliphatic CG 以降の帰属
Val (V), Leu (L), Ile (I), Met (M), Gln (Q), Glu (E), Pro (P), Thr (T), Lys (K), Arg (R)には CG 以
降の Aliphatic C-H（CG, CD, CE 等）がある．側鎖の形状によって原子の名前が違うので十分に注意すること．
Nhsqc で E3 N-HN，Chsqc で Q2 CA-HA をそれぞれ表示させる．CA-HA からの hcch を”vd"する（hcch/1）．続けて Chsqc で Q2 CB-HB2 を表示させて，CB-HB2, CB-HB3 からの hcch を”vd"する（hcch/2）．hcch/1 と hcch/2 で 2.23 ppm, 2.39 ppm に信号が確認できる．cconh で CG の信号がスペクトルの中央になるようにする．Chsqc のプロトン軸で 2.23 ppm，2.39 ppm，cconh での CG 化学シフト値に一致する位置の信号がある．hcch を確認し，Q2 の HA（4.318 ppm）が観測されていることを確認し，Q2 CG-HG2, Q2 CG-HG3 の帰属を行う．また，Q2 CG-HG2, Q2
CG-HG3 からの hcch が Q2 CA-HA や Q2 CB-HB2, Q2 CB-HB3 の hcch（hcch/1 と hcch/2）とプ
ロトンパターンが一致することも確認しておく．帰属ができたら，duplicate の hcch（hcch/1 とhcch/2）は消去する．

81

NMR データ処理／解析

これを繰り返し行う．
Pro の直前にある残基（I11, I32, I37, V49, M56）や C 末端残基は CB-HB のときと同様に hcch
や cnoe を使用して帰属をする．
ここまで hcch で観測された信号は帰属していない．信号数が多く重なっている箇所も多いため，それぞれに帰属を入れることは他のスペクトルに帰属を追加するよりも非常に手間を要する．スペクトル上に表示されている crosshair を使用して確認をおこなうのみとし，帰属は Chsqc 上に行う．
これは例えば帰属の間違いなどがあったときに，修正が容易に行えるようにする意味合いもある．
Val (V)や Leu (L)には，メチル基が二つある．それぞれ CG1-QG1，CG2-QG2 や CD1-QD1，
CD2-QD2 で帰属するが，数字は一致していること（Val で CG1-QG2 は NG）．また，便宜上プロトンの化学シフト値が小さい方を CG1-QG1 または CD1-QD1 とした．
Leu（L）や Ile（I）には側鎖の先端部分にメチル基がありその手前にはメチン（CH）やメチレン（CH2）がある．メチル基はプロトン３個が磁気的に等価に存在するなどの理由から，Chsqc やhcch で強度よく観測される．Aliphatic 側鎖の帰属では主鎖に近い側から帰属（CA, CB, CG...の順）
する必要はないので，先にメチル基を帰属すると進めやすいかもしれない．同様に，メチレン側鎖の Arg (R)と Pro (P)の Cδ，Lys の Cε（場合によっては Cγも）は，他の残基と異なる C の化学
シフト値であり，hcch のスペクトルがすっきりしていて解析が簡単なことがある．先にそれらのプロトン化学シフト値を求め，側鎖途中にある原子からの hcch 上でそれらのプロトンを見つけると帰属がやりやすくなるかもしれない（例えば，Arg (R)の CG を帰属するまえに，CD-HD2,
CD-HD3 の帰属を行い，その HD2, HD3 の化学シフト位置に hcch 信号をもつ CG-HG2, CG-HG3を探す）．帰属の状況やタンパク質中に含まれている残基の個数によっては，側鎖の先端から帰属

82

NMR データ処理／解析を始めることすら可能である．もっとも，サンプルの純度やスペクトルの質が十分に高いことが前提ではあるが．
ここまで帰属が終了したら，一度，帰属のミスがないかを確認しておくと良いだろう．"rl"にて，
化学シフト値情報を表示し，[Save...]によって化学シフトテーブルファイルを~/Sparky/Lists にファイル名：shifts として作成する．ターミナルを開き，$ cd ~/Sparky/Lists$ spx_assign_check.pl shifts
で，帰属について確認をする．もし間違いがあればエラーが表示される．エラーは，ピークピッ
クの無い帰属情報があった場合，帰属の標準偏差（SDev）が大きい場合，同じ残基番号で異なる
アミノ酸表記があった場合は画面に表示される．特に，同じ残基番号で異なるアミノ酸表記があった場合は画面に表示されるときは，確認の途中で終了する．修正作業を行い，shifts ファイルのアップデート，spx_assign_check.pl でのチェックにてエラーが出なくなるようにする．また，原子名だけの間違いは spx_assign_check.pl を実行したあとに作成される check リストにて確認ができる．
この perl スクリプトは構造計算ソフト CYANA で使用する化学シフトテーブルを作成するためのもので，CYANA 用の化学シフトテーブルは cyana.plot として自動作成／上書き保存される．このとき，check.list で==>で表示されている誤った原子名での帰属は cyana.plot には含まれない．
３文字で表記したアミノ酸や通し番号用の MC や SC は無視されるようになっている．
３−４−４．側鎖 NH の帰属
Nhsqc 上で仮の帰属としていた，SC1〜6 や Arg (R)の帰属を行う．今回のサンプル中には含まれていないが Trp の NE1-HE1 や His の ND2-HD2，NE1-HE1 は Aromatic 帰属の過程で帰属す
る．
SC1〜6 について，Asn (N) / Gln (Q)の判定を行う．Nhsqc 上の各 SC の NXg から cbca を確認し判定する．Asn (N)の場合には CB と CA が，Gln (Q)の場合には CG と CB が観測されるため容易に判定できる．また同時に SC の NXg からの hbha や NX からの nnoe を用いて，どの残基なのかを特定する．
SC1 は NXg からの cbca によって Asn (N)であり，NXg の hbha や NX の nnoe によって N14であることがわかる．"rr"によって SC1 を N14 の側鎖であるように名前を修正する．
SC1

NXg

N14

ND2g

NX

ND2

HX1

HD21

HX2

HD22

CX

CG

同様に SC2=Q2, SC3=N1, SC4=Q47, SC5=Q44, SC6=N46 となる．Asn (N)と Gln (Q)で側鎖 NH

83

NMR データ処理／解析の名前が違うことに注意して"rr"を行う．
Arg1, Arg2 の NE-HE は，hnca での CD の化学シフト値や nnoe で観測できる HD2,3 の化学シフト値から決定する．このサンプルには Arg (R)残基は２個あり，Nhsqc 上で仮帰属した Arg (R)の NE-HE は２つあることから，すべての NE-HE 信号が観測されていることになる．
hnca や nnoe
から Arg1=R25, Arg2=R39 であることがわかる．

３−４−５．M0 の帰属
クローニングアーティファクトの M0 は Chsqc 上の CG-QG からが探しやすい．
M56 CG-HG2,3の近くに，未帰属で信号強度の高い正の信号があり，これが M0 CG-QG となる．hcch を使用し，
CB-QB, CA-HA を探す．

84

NMR データ処理／解析
３−４−６．Met CE-QE の帰属
Met (M)の CE-QE は，Chsqc 上で負のメチル基信号として観測される．CG と CE の間に SD（硫黄原子）があるため運動性が高いことが多く，その信号強度は高い場合が多い．Chsqc 上の C: 17
ppm 付近，H: 2 ppm 付近の負の信号を Met の残基数分（７個）見つけ，通し番号をつける（Met1
CE-QE〜Met7 CE-QE）．帰属はそれぞれの CE-QE の NOESY から行う．N 末端などの運動性の高い領域を除き，Met の CE-QE の NOESY からは残基内の HG2,3, HB2,3, HA, HN などが観測される．
M21, M22, M43 のそれぞれの CE-QE は容易に見つけることができる．M56, M59 は残基内 HAの信号から帰属ができる．M0 と M51 の帰属となる二つの信号はそれぞれ NOESY 上に信号がほ
とんど観測できず帰属が難しい．構造計算の結果や構造既知からわかることだが，どちらの残基も分子表面に側鎖が露出しているため運動性が高く NOESY 信号が観測されないことが推測できる．
M51 CE-QE の NOESY からわずかに HA（3.332 ppm）
，HB2（1.670 ppm）が観測されているので，それに従い帰属する．

85

NMR データ処理／解析
３−４−７．Aromatic 側鎖の帰属
このサンプルには Aromatic 側鎖を持つアミノ酸が Y63 しかない．
したがって，
ct-[1H-13C] HSQC
（ Aromatic) を 測 定 す る だ け で 帰 属 が 完 了 す る ． HbCbCgCdHd (CBHD) ， HbCbCgCdCeHe(CBHE)や HCCH-TOCSY (Aromatic)は測定する必要がない．
ct-[1H-13C] HSQC (Aromatic)での信号観測位置から Y63 CD1-QD, Y63 CE1-QE を帰属する．

３−４−８．帰属の最終確認
ここまでで，ほぼ全ての帰属が完了した（NOESY と構造精密化の過程でのみ帰属できる原子が存在する）．化学シフトテーブルに間違いがないか，最終確認をする．
"rl"にて，化学シフト値情報を表示し，[Save...]によって化学シフトテーブルファイルを~/Sparky/Lists にファイル名：shifts として作成する．ターミナルを開き，$ cd ~/Sparky/Lists$ spx_assign_check.pl shifts
エラーが出ないことを確認したのち，check.list を確認する．
check.list 中で，Asn (N) / Gln (Q)の ND2g や NE2g の行頭に==>がついている．この化学シフ
ト値は，側鎖の NH2 が NDH となっているときの N の化学シフト値で構造計算等には使用しない
ためコメントアウトしている．

86

NMR データ処理／解析
３−５．相互作用解析
NMR 法による相互作用解析の実例として，Atg8 タンパク質に対する Atg19 の C 末端ペプチド
22 残基の結合面について，[1H-15N] HSQC 信号を使用した化学シフト摂動法（Chemical shift
perturbation，CSP 法）を用いて明らかにした手法を紹介する．ここではすでにタンパク質側のNhsqc 上での帰属（主鎖帰属）が終わっている段階から始める．

３−５−１．titration 実験と信号の帰属
15N ラベル Atg8 タンパク質に Atg19 の C 末端ペプチド 22 残基を滴下した．
0.0，0.2，0.4，0.6，

0.8，1.0，1.5，2.0 モル等量の Atg19 peptide を加え，それぞれ[1H-15N] HSQC を測定した．それ
ぞれの測定データについて ucsf ファイルにした．
0.0 モル等量：Atg19_tit_00.ucsf 〜 2.0 モル等量：Atg19_tit_20.ucsf
Atg8 の主鎖帰属データを用いて 0.0 モル等量時の各[1H-15N] HSQC 上の信号に帰属を行う．このとき，側鎖信号については不要なため除外する．

Atg19_tit_02 から Atg19_tit_20 までを開き，"ct"で各スペクトルの等高線色をそれぞれ違う色とする．Atg_tit_00 を"vd"で duplicate し，それに Atg19_tit_02 から Atg19_tit_20 までを"ol"にて
重ね合わせる．すべてのスペクトルについて"yt"にてシンクロさせる．

87

NMR データ処理／解析

Atg19_tit_00 上 に あ る 各 主 鎖 ア ミ ド 信 号 に つ い て ， 測 定 点 ご と の 信 号 移 動 を 追 い な が ら
Atg19_tit_20 上にある滴定後の信号を帰属する．信号の重なりや消失等で摂動が追えない信号については Atg19_tit_00，Atg19_tit_20 ともに帰属を消去する．
滴下途中の信号の移動が追跡できることから，この摂動は fast exchange であることがわかる．

３−５−２．Δppm の計算
Atg19_tit_00 および Atg19_tit_20 のピークリストを出力する．このとき，Peaks list の Options
ボタンを押し，Assignment Format について指定する．

88

NMR データ処理／解析
Peaks List は例えば，
K48N-HN のように Group 名および Atom 名で表記されている．
Assignment
Format が空欄となっているとき，すべての情報が表記されるように，２次元測定であれば，Assignment Format は%a1-%a2 と設定されている．これを%g1 と指定することで，w1 の軸のGroup 名だけの表示となる．
Peaks list の Assignment が M1 のように表示されているのを確認してから Save ボタンによってファイルとして保存する（Atg19_tit_00.list、Atg19_tit_20.list）．
この二つの list ファイルについて Excel 等の表計算ソフトで処理を行う．Ubuntu には Officesuite の Libre office がインストールされており，今回はこれを使用する．Ubuntu のメニューより
アプリケーション -> オフィス -> LibreOffice Calc を起動する．起動後，LibreOffice Calc のメニューより，ファイル -> 開くを選択し，Atg19_tit_00.list を選択する．テキストのインポートダイ
アログが開くので，区切りのオプションを固定幅とし，第 1 行の Assignment，w1，w2 および下にある各項目が別のセルに入るように設定する．B1 セル（w1）を N_00，C1 セル（w2）を HN_00とする．同様に Atg19_tit_20.list についてもファイル -> 開く，区切りの設定，B1，C1 セルの変更（N_20，HN_20）とし，B，C 列について Atg19_tit_00.list の D，E 列にコピーペーストする．
F 列を使用してΔppm を計算する．Δppm は[1H-15N] HSQC 上でのピーク摂動について，1H 軸，
15N 軸を均した変化量である．1H と 15N の化学シフトは周波数でおよそ 1:10 となる（1H 1 ppm は周波数で揃えるとおよそ 15N 10 ppm）
．しかし，HN と N では相互作用によって受ける化学シフト
変化量が異なる（HN の方がより敏感に相互作用の影響を受ける）ために，均すときに 15N の化学
シフト変化量を 10 で割ることが正しいとも言い切れない．そのため，1H，15N それぞれについて
摂動距離の平均を求め，その比を持って均す手法も取られる．ここでは簡便に 15N 変化量を５で割る手法をとる．この５という数字には具体的な意味がなく，論文化する際に Editor 等に指摘されることもあるので，今回のΔppm 算出方法はあくまで簡易的なものであることに注意する．
Δppm の計算式は以下のとおり．

Δppm = ((DNppm/5) 2 + (DHNppm) 2) 1/2
DNppm，DHNppm はそれぞれ，N，HN の化学シフト変化量を指す．
F1 には dppm と入力し，F3 以下には計算式を入れる．
F3 に =SQRT(((B3-D3)/5)^2+(C3-E3)^2) と入力し，G116 の行までコピーする．
titration 過程で追えなかった信号および未帰属または Pro 残基について列を挿入する
（Y9，
P10，
R14，P30，P42，R47，P52，P71，P72，P85，P86）
列 A，列 F について Control キーを押しながら両方選択し，ツールバーより円グラフのアイコン（グラフ作成のアイコン）をクリックする．グラフウィザードが表示される．そのまま完了ボタン
をおす．

89

NMR データ処理／解析

３−６−３．PyMOL で PDB 上に MappingAtg8，Atg19 ペプチドの複合体は X 線構造が解かれている（PDB ID: 2ZPN）．2zpn.pdb をダウンロードし，PyMOL で開く（2zpn.pdb 中，Atg8，Atg19 は４分子ずつ存在しているので，分子
A と分子 E を使用することにする）．Atg8 は cartoon，Atg19 は stick で表示した．
Δppm の大きさに閾値を設け，それぞれについて色分けした．
閾値

色

残基

Δppm > 0.6

red

K48

0.6 > Δppm > 0.4

orangeK46, K49, L50

0.4 > Δppm > 0.2

yellow

D23, V31, I44, V51, F60, Y62, V63, I64, F104

0.2 > Δppm

white

other

閾値は任意である．見た目がよくかつ適度に粗い範囲指定であること（0.01 刻みで色を変えるのは細かすぎ）．これはΔppm の大きさに具体的な意味がないためである．
PyMOL 上で描画し出力する．

90

NMR データ処理／解析

Atg8 の構造上の Atg19 ペプチドが結合している面付近にΔppm が集中していることがわかる．

91

NMR データ処理／解析
３−６．Tips
３−６−１．Ornament の書式を指定する[1H-15N] HSQC を論文等で図示する際に，帰属情報を付与することがある．特に主鎖帰属の証拠となるので，構造解析論文等では必須の図となる．
"vt"で View Setting ダイアログを開き，Assingment fomat: %a1-%a2 となっているところ
を，%g1 とする．

３−６−２．ピック（バツ印）と選択（四角）の間隔を小さく調整する[1H-13C] HSQC，HCCH-TOCSY や 13C-edited NOESY など多くの信号が観測されている場合，
ピークピックの記号と選択されていることを示す四角記号が大きく，ピックを増やしたり操作した
りする．バツ印のサイズやオーナメントのサイズは"oz"で表示される Ornament Sizes dialog で編集ができる．しかし，一定値以下に設定した場合，ピックのバツ印に対する選択の四角が大きく，
ピークピックやオーナメントの移動操作等の障害となることがある．これを変更するためには
Save ファイルを直接編集する必要がある．
ornament.selectsize 0.500000
ornament.pointersize 0.500000
ornament.lineendsize 0.500000
を，それぞれ 0.1 に設定する．直接 Save ファイルを編集するため，この操作は熟練者のみの方が良いだろう．

３−６−３．スペクトルの Strip 表示
連鎖帰属ができているかの確認の際に，スペクトルの Strip plot が使用できる．"sp"として Strip
Plot を開き，Show から Select strip spectra を選択する．hncoca を選択してから hnca を選択す
る．このとき，選択する順番が残基ごとの表示順になっているので注意する．OK を押す．Showから All assigned strips を選択すると帰属済みのスペクトルが strip になって残基ごとに表示される．ただし w1 の軸に使用した残基番号（数字部分）に従って並ぶため，w1 に帰属が入っていることが必要．

３−６−４．帰属０の帰属情報について消去する
帰属操作のミス（残基番号を間違えた，原子名を間違えたなど）によって，"rl"で表示される化
学シフト値情報に間違った情報が残ることがある．スペクトル上でピークピックの情報を消去しても，Assignment 0 として"rl"の Resonance List に残る．
数個程度であれば，"rr"を用いて消去できる．"rr"で開いた Rename Resonance dialog で Fromの Group 名を消去したい情報の Group 名，To の Group 名を空欄として Rename を行う．
あまりに多くの消去対象がある場合には，Project ファイルを編集して消去するのが良いかもし92

NMR データ処理／解析
れない．Project ファイルを編集するため，この操作を行うためには，Sparky を終了させた状態で行うこと．
Project ファイル中，各原子の化学シフト値の情報は<resonances>から<end resonances>の間に記 録 さ れ て い る ． こ の <resonances> か ら <end resonances> の 間 に あ る 行 を す べ て 消 去 し（<resonances>や<end resonances>は消去しない），再度 Project ファイルを Sparky 上で開く．
Project ファイルの対象となっている Save ファイル中に登場するすべての帰属情報が再度，
Resonance List ("rl"）に集計されるので，Assignment 0 の情報は消去される．Project ファイルを直接編集するため，この操作は熟練者のみが行うほうが良いだろう．
この Resonance List における Assignment 0 の情報は帰属操作のミスによるゴミが原因でも発生するが，例えば，すでに化学シフト値情報が BMRB などに登録されているなど，外部から読み込んだときにも発生する．外部からの読み込みのときは，Sparky のフォーマットに変換した化学
シフト値情報ファイルを Resonance List の Load ボタンによって行う．このときもスペクトル上に帰属はないため，Assingment は 0 となる．
３−６−５．ピーク強度情報を使用した Peak List の出力
交差飽和系の実験（CS，TCS）や Steady State NOE 実験などでピーク強度比を算出する場合には，Volume や Data height を付加した Peak List の出力が必要となる．
"lt"で表示した Peak List から Options を選択し，Volume や Data height のチェックを入れてApply ボタンを押すことで，それぞれの値を表示させることができる． Volume は各信号を積分して算出する．積分させたい信号について Pointer Mode を integrate（F10 キー）として取り囲むことで積分が行われる．しかし，重なり合っている信号では正しく積分がなされないため，重なりが多いスペクトルについて強度比を求めるときには，Data height を代用することが多い．
また，Data height の信頼性はそのスペクトルにおけるシグナル強度比に依存する．スペクトルのノイズレベルは"st"として表示される Spectrum dialog に Estimated noise として表示される．
また，"lt"のオプションにおいて Signal / Noise のチェックがある．これを入れることで，S/N 比を含んだ状態の Peak List を出力することができる．特に強度比を算出する際にはエラーバーが不可欠であり，多くは S/N から算出する．また，シグナルかどうかの基準について「ノイズレベルの３倍以上を信号とした」とすることも多い．

93

NMR データ処理／解析
３−７．コマンドリファレンス
これまでに出てきたショートカットについて，登場順に書き出しておく．
qt

Sparky の終了

fo

スペクトルファイル（ucsf フォーマット）や Save file を開く．

ct

Contour dialog を表示する．等高線の最低位の高さ設定，色，本数などを変更する．

vt

View Setting dialog を表示する．スペクトルの縦横比（ppm 単位で指定）や，オーナ
メント，スライスなどの表示／非表示，オーナメントの書式等が設定できる．

vS

スライスを表示／非表示する．

vR

Resonance（化学シフト値の位置に原子名）を表示する．範囲外も fold にて表示する．

zi / zozoom in / zoom out 見えているスペクトル平面を拡大縮小する．

lt

Spectrum Peaks（スペクトルのピークリスト）を表示する．Options で Data Height等を追加したリストの出力ができる．

at

Assignment dialog を表示する．ピックされた信号について軸ごとに Group およびAtom の情報を入力できる．

eu

Edit Undo．直前の操作を取り消す．

zu / zd

Up plane と Down plane．３次元スペクトルの奥行き方向への移動．

ov

３次元スペクトルにおいて，横軸 w3，縦軸 w2，奥行き w1 で表示されているスペク
トルについて，横軸 w2，縦軸 w1，奥行き w3 と横軸 w1，縦軸 w3，奥行き w2 でス
ペクトルを表示させるコマンド．次の xx コマンドと併用して，３次元スペクトルの異なる面からのスペクトル形状を表示させるために使用する．

xx

描画されている２次元の横軸と縦軸を入れ替えるコマンド．

yt

Synchronize views を表示する．軸移動のシンクロを設定できる．

ol

スペクトルの重ね合わせ．オーナメントは重ね合わせない．

pv

View List を表示する．各スペクトルのピークピック数，帰属数がわかる．それぞれ
表示／非表示を設定できる．

fs / fa

Save ファイルの保存（fs）または名前をつけて保存(fa）．

js / ja

Project ファイルの保存（js）または名前をつけて保存（ja）．

rl

化学シフト値の統計情報を表示する．それぞれの化学シフト値から算出元になったス
ペクトルまで辿ることができる．

jo

Project ファイルの読み込み．

pa

Select all peaks．スペクトル上のすべての信号を選択する．

oc

Ornament copy．オーナメントをコピーする．

op

Ornament paste．オーナメントをペーストする．

kr

Restricted peak pick．短冊上にピークピックするなどに使用する．範囲を指定したピ

94

NMR データ処理／解析
ークピックができる．
F1, F2..

Substract w1 (w2) sweepwidth．w1（w2）軸について観測幅分を減少する方向へと
fold させる．
（例：100-136 ppm -> 64-100 ppm とする）

f1, f2..

Substract w1 (w2) sweepwidth．w1（w2）軸について観測幅分を増加する方向へと
fold させる．
（例：100-136 ppm -> 100-136 ppm とする）

rr

Rename Resonance dialog を表示する．仮の帰属名を正規な帰属名に変更したり，未帰属な原子の化学シフト情報について消去するのに使用する．

vd

View duplicate．いま表示されているスペクトルを分割表示する．新しい分割表示ス
ペクトルはシンクロおよび重ね合わせが無い状態になる．

oz

Ornament Sizes dialog．オーナメントのサイズ等を変更できる．"ot"は Ornament
properties dialog で色などを変更できる．

sp

Strip plot．３次元以上のスペクトルについて短冊表示ができる．

95

NMR データ処理／解析
第４章 CYANACYANA は立体構造計算ソフトウェアの一つであり，プロトン間 NOE による距離情報などを用いた焼きなまし法（Simulated annealing 法）による立体構造計算を行える．他の NMR 立体構造計算に用いられているソフトウェアには X-PLOR, CNS, ARIA/CNS などがある．CYANA ではア
ミノ酸の情報を主に角度制限に絞って（torsion angle dynamics, C-H や N-H などの距離は一定とした）構造計算を行うため，高速に構造計算が可能になったと言われている（実際は，コンパイラ
や CPU 等の PC 環境に依存するので一概に速いとは言えない）．そのため，X-PLOR, CNS,
ARIA/CNS を用いた論文等での構造のエネルギー評価値（ΔE など）が存在せず，CYANA ローカ
ルの評価値，Target function によって構造のクオリティーを評価している．
CYANA には優れた帰属アルゴリズムをもった NOE 信号の自動帰属が実装されており，非常に簡単に立体構造を取得することができる．また未帰属である原子の化学シフト値についても
NOESY をベースとして帰属することもできるが，あまり有用ではない．

４−１．基本的な使用方法
CYANA はコマンドのみの入力で動作するプログラムで，対話式に動作させる CYANA 用プロン
プトおよび各種スクリプトによって動作させる．CYANA プロンプトの起動は，$ cyana
で，起動する．CYANA プロンプトでは専用のコマンドを使用する．
cyana> q
によって CYANA プロンプトを終了できる．また，CYANA をバックグラウンドで実行するためには，$ cyanajob CALC
として，cyanajob のあとに実行マクロを指定する．
CYANA プロンプトでの一例をあげる．
CYANA プロンプトコマンド

効果cyana> q または，cyana> exit

CYANA プロンプトの終了

cyana> help

CYANA のヘルプを表示．CYANA コマンドの一覧が表示されるので，help の後ろにそのコマンドをつなげるとコマンドのヘルプが表示される．

cyana> CALC

カレントディレクトリのマクロファイル，CALC.cya について実行する．

cyana> read pdb final.pdb

PDB フォーマットのファイル final.pdb を読み込みます

４−２．入力ファイル
CYANA の 入 力 フ ァ イ ル 例 は ， cyana-2.1 パ ッ ケ ー ジ の demo の 下 に あ る （ こ こ で は ，96

NMR データ処理／解析/usr/local/cyana-2.1/demo/の下）．auto, auto-nmrview, basic, details, formats, manual があり，
ここでは NOE 自動帰属付き構造計算用の入力ファイルである auto について記載する．auto での構造計算は CALC.cya に書かれている noeassign が主体であり，これは NOE の帰属と焼きなまし法による構造計算を７回繰り返し，その後に stereo specific assign を加えた最終構造計算サイクル
をもって終了とする．それぞれ cycle1 から cycle7，final となっている．

４−２−１．init.cya
cyana を起動したときに読み込まれるファイル．配列ファイル等の基本的な情報が含まれている．

name:=demo
rmsdrange:=10..100
cyanalib
read seq demo.seq

タンパク質名などを表す name 変数にて demo を指定している．rmsdrange は構造計算のあとに RMSD を計算するときに収束させる領域を残基番号で指定している．二箇所にわかれている場
合はカンマ（,)で繋ぐ（例：10..30,50..100）．cyanalib で構造計算に使用するアミノ酸や塩基の原
子名や結合情報について記載されているライブラリーファイル（lib ファイル）を指定している．
cyanalib とした場合，ここでは/usr/local/cyana-2.1/lib/cyana.lib を参照する．特殊なアミノ酸やligand との複合体など常用しない残基を構造計算に含める場合には，この cyana.lib 等を構造計算
ディレクトリ内にコピーしてから編集し，init.cya にて，./cyana.lib のように指定する．read seq
demo.seq で配列情報を読み込んでいる．

４−２−２．CALC.cya
構造計算を行うためのマクロファイル．NOESY ピーク情報，化学シフトテーブルファイル，構造計算の条件等が記載されている．

peaks:= c13.peaks,n15.peaks,aro.peaks # names of NOESY peak lists

prot:= demo# names of chemical shift lists

constraints := demo.aco# additional (non-NOE) constraints

tolerance# chemical shift tolerances:= 0.040,0.030,0.45

calibration :=# NOE calibration parameters

structures := 100,20# number of initial, final structures

steps:= 10000# number of torsion angle dynamics steps

rmsdrange:= 10..100# residue range for RMSD calculation

97

NMR データ処理／解析
randomseed := 434726# random number generator seednoeassign peaks=$peaks prot=$prot autoaco

peaks によって，NOESY ピークテーブルファイルを指定している．拡張子の.peaks は省略でいる．prot によって，化学シフトテーブルファイルを指定している．constraints によって NOE 情報以外の束縛情報について指定している．ここでは主鎖二面角，phi, psi の制限ファイルとしてdemo.aco を指定している．tolerance は indirect 軸のプロトン，direct 軸のプロトン，重原子（Cや N）軸のそれぞれについて，誤差許容範囲を指定している．calibration は，peaks で指定した
NOESY ピークテーブルの有効度合いの比重を指定できる．ただ，これは自動で行ってくれるため
通常は空欄としておき，使用しない．structures, steps は焼きなまし法の計算個数と冷やす段階数
をそれぞれ指定している．structures の 100,20 では 100 個構造計算を行い，エネルギー評価値の低い 20 個について，
次の cycle の前の NOE 帰属や final での最終構造として使用する．
rmsdrange
は init.cya でも指定したが，こちらでも指定できる．randomseed は計算の繰り返し要素を持たせるために適宜変更して指定する．noeassign が自動構造計算のための CYANA コマンド．最後のautoaco は主鎖二面角が Ramachandran plot になるべく従うように補正をかけている．
４−２−３．demo.aco, demo.prot, demo.seq
demo.aco は主鎖二面角（phi, psi）の制限情報が記載されている．拡張子（.aco）は CYANA フォーマットの角度制限ファイルを意味している．demo.prot は XEASY / CYANA フォーマットの化学シフトテーブルファイル，demo.seq は配列ファイルである．

demo.aco# Angle restraints from TALOS
11 LYS

PHI-121.8-47.5

11 LYS

PSI

88.7

184.4

17 LEU

PHI

-78.0

-43.2

17 LEU

PSI

-60.1

-3.7

19 TYR

PHI-145.9-69.5

19 TYR

PSI

62.5

169.9

23 ILE

PHI-138.2-45.3

23 ILE

PSI

99.5

166.2

0.000 N7

demo.plot
65 110.120

98NMR データ処理／解析
66

8.426

0.000 H767 43.458

0.000 CA7

68 999.000

0.000 HA2

7

69 999.000

0.000 HA3

7

70

3.928

0.000 QA

7

71 999.000

0.000 C7

72 999.000

0.000 O7

73 121.235

0.000 N

8

74

8.255

0.000 H875 55.666

0.000 CA

8

帰属情報の ID, 化学シフト値，標準偏差，原子名，残基番号の順．それぞれスペースで区切られている．化学シフト値が 999.000 になっている原子は化学シフト値が決まっていない（＝未帰属の）原子である．

demo.seq
GLY
SER
SER
GLY
SER
SER

３文字表記（場合によって４文字で表記）のアミノ酸を１残基につき１行で表記している．残基
名はライブラリーファイル中の該当する残基を読み込んでくるため，表記には注意が必要である．
例えば，SS 結合している CYS は CYSS と表記する．残基名の後ろにスペースを空けて残基番号を記載することもできる．このファイルは残基番号１から開始するため，記載する必要がないが，コンストラクション等により途中の残基番号から始まる場合には，指定が必要．また，指定した次の行の残基番号を未指定にした場合，残基番号は前の行の番号に１追加される．途中で残基番号を変えたい場合には，その都度，残基名の後ろにスペースを空けて残基番号を指定する．

４−２−４．n15.peaks, c13.peaks, aro.peaks
それぞれのスペクトルから作成した NOESY ピークテーブルで，それぞれの信号の化学シフト値
情報や信号の強さや帰属情報が記載されている．

99

NMR データ処理／解析# Number of dimensions 3#FORMAT xeasy3D#INAME 1 HN#INAME 2 H#INAME 3 N#CYANAFORMAT HhN
0 10.177 10.178 131.337 1 U

9.360E+03 0.000E+00 e 0

0

0

0

1 10.178

7.314 131.340 1 U

1.963E+03 0.000E+00 e 0

0

0

0

2 10.178

5.893 131.355 1 U

2.659E+01 0.000E+00 e 0

0

0

0

3 10.178 -0.038 131.323 1 U

1.338E+02 0.000E+00 e 0

0

0

0

4 10.178 -0.157 131.328 1 U

2.534E+02 0.000E+00 e 0

0

0

0

シャープ（#）で始まっている部分はヘッダー領域で，CYANA がスペクトル情報を参照するために使用する．最初の行で NOESY の次元数を表記している．FORMAT は XEASY フォーマット
なので xeasy3D としている．INAME 1〜3 は下のテーブルで使用されている原子の情報をそれぞれ指定しており，INAME 1 HN は N に直接結合したプロトンが１列目，INAME 2 H は直接間接に寄らないプロトンが２列目，INAME 3 N は窒素が３列目に記載されていることを意味している．
CYANAFORMAT HhN は，INAME とほぼ同じ意味になる．H が直接結合するプロトン，h は直接間接に寄らないプロトンを意味しており，左から１列目，２列目，３列目を意味している．
シャープ（#）で始まっていない部分が NOESY ピーク情報になる．左から，ピーク ID, それぞれの化学シフト値（３列），peak color code, spectrum type, 信号強度，信号強度のエラー範囲，
積分コード，integer, 帰属情報（３列）を表記している．peak color code, spectrum type, 積分コード，integer は CYANA では使用しない．帰属情報は，化学シフトテーブルの ID が使用され，0は未帰属を意味する．

４−３．出力ファイル
auto での構造計算で出力されるファイルについて記載する．構造計算は，$ cyanajob CALC
として，バックグラウンドで実行したものとする（バックグラウンドで実行すると計算のログがCALC.out として保存される）．CALC.cya に記載されている noeassign では，NOE 信号帰属と構造計算のサイクル（cycle1〜7）と stereo specific assign 後の最終計算（final）が行われる．構造計算サイクルに入る前の束縛情報（cycle0.upl，直鎖状のペプチドを作成するために使用）それぞれの計算過程における出力ファイル（.noa, .upl, .pdb, .ovw）と最終構造計算における NOESY ピ
ークテーブルファイルの帰属情報が書かれたファイル（-cycle7.peaks），final での stereo specificassign された原子の一覧（finalsereo.cya）とそれが反映された化学シフトテーブルファイル

100

NMR データ処理／解析（-final.prot）, final の stereo specific assign により追加された角度制限（final.aco）, final.pdb
での Ramachandran plot のファイル（rama.ps）, autoaco により ramachandran force がかかっている時の各 cycle で使用される角度制限ファイル（cycle.aco）が出力される．
また，CYANA による構造計算の結果について，得られた構造や途中の経過が信頼できるものなのか評価する必要がある．構造計算が終了した段階で，各サイクルでの ovw をまとめて一覧化す
るスクリプト cyanatable を，$ cyanatable > output.tblのように実行して，ファイル出力する．

４−３−１．cycle1〜7.noa
それぞれの cycle における NOE 信号の帰属について，帰属候補や判断基準，最終的な選択の情報が書かれている．

Peak 0 from c13.peaks (4.45, 4.45, 70.30 ppm; diagonal):
1 out of 1 assignment used, quality = 1.00:
HB

THR

96 + HB

THR

96 OK

100

100

- 100

Peak 1 from c13.peaks (4.31, 4.45, 70.31 ppm; 3.87 A):
1 out of 3 assignments used, quality = 0.99:
HA

THR

96 + HB

THR

96 OK

99

99 100 100 2.4-2.8

HA

PRO

94 - HB

THR

96 far0

97

0- 6.7-7.9

HA

ARG

60 - HB

THR

96 far0

59

0- 8.3-11.5

3.0=100

Violated in 0 structures by 0.00 A.

Peak 2 from c13.peaks (1.08, 4.45, 70.28 ppm; 3.80 A):
1 out of 3 assignments used, quality = 0.99:
QG2

THR

96 + HB

THR

96 OK

99

99 100 100 2.1-2.1

HB

VAL 101 - HB

THR

96 far15

99 15- 4.9-7.5

THR

96 far083- 8.5-13.2

HG13 ILE

63 - HB0

2.1=100

Violated in 0 structures by 0.00 A.

４−３−２．cycle0.upl, cycle1〜7.upl, final.upl
それぞれの cycle で使用する noa ファイルから作成された距離束縛情報のファイル．

81 ILE HB

82 PRO HA

5.19

#peak

17 #SUP 0.98 #QF 0.59

101

NMR データ処理／解析
28 VAL HA

32 LEU QD1

5.30

#peak

31 #SUP 0.95 #QF 0.75

81 ILE HA

84 LEU HB3

3.96

#peak

34 #SUP 0.93 #QF 0.93

81 ILE HA

84 LEU HB2

4.47

#peak

36 #SUP 0.99 #QF 0.99

81 ILE HA

81 ILE QG2

3.46

#peak

37 #SUP 1.00

81 ILE HA

81 ILE HG12

3.77

#peak

38 #SUP 0.99 #QF 0.99

81 ILE HA

81 ILE HG13

3.77

#peak

39 #SUP 1.00

28 VAL HA

31 LEU HB2

4.42

#peak

42 #SUP 0.98 #QF 0.93

28 VAL HA

39 LEU QD1

4.82

#peak

42 #SUP 0.98 #QF 0.93

28 VAL HA

31 LEU QD1

3.37

#peak

43 #SUP 0.99 #QF 0.63

28 VAL HA

39 LEU QD2

4.93

#peak

44 #SUP 0.57 #QF 0.57

28 VAL HA

28 VAL QG1

3.52

#peak

48 #SUP 0.88 #QF 0.71

28 VAL HA

28 VAL QG2

3.52

#peak

48 #SUP 0.88 #QF 0.71

左から残基番号，残基名，原子名，もう一方の残基番号，残基名，原子名，距離上限となっている．
#peak より左はコメントであり，
peak の ID，
複数の帰属候補があった場合には信頼割合（#SUP）と信頼評価値（#QF）が表記されている．

４−３−３．cycle1〜7.pdb，final.pdb
計算結果から得られた各サイクルの PDB フォーマットの構造ファイル．複数個抜き出している
ときは，全体が最小の RMSD となるように fitting している（rmsdrange で指定した領域でないことに注意する）．

４−３−４．cycle1〜7.ovw，final.ovw
各構造計算サイクルでの violation やエネルギー評価値，Target function，
rmsdrange での RMSD
値が記載されている．

Structural statistics:

strtargetfunction

upper limits#rms

van der Waals

torsion angles

max

#

sum

#

max

rms

max

1

1.59

5 0.0064 0.32

4

5.6 0.35

0 0.3521 2.70

2

1.63

5 0.0065 0.30

6

5.9 0.34

0 0.3077 2.29

3

1.66

5 0.0066 0.29

6

5.9 0.33

0 0.3019 2.09

4

1.66

3 0.0061 0.32

6

5.7 0.35

0 0.2841 1.95

5

1.70

5 0.0064 0.27

6

6.2 0.34

0 0.2546 1.34

102

NMR データ処理／解析
6

1.71

3 0.0064 0.32

6

5.6 0.35

0 0.4041 3.00

7

1.72

4 0.0061 0.28

6

6.0 0.34

0 0.3520 2.67

8

1.73

6 0.0061 0.26

6

6.1 0.34

0 0.2743 1.50

9

1.73

3 0.0062 0.25

6

6.2 0.35

0 0.2472 1.48

10

1.74

4 0.0062 0.26

5

6.1 0.34

0 0.3540 1.82

11

1.78

9 0.0070 0.27

6

6.3 0.34

0 0.2364 1.56

12

1.79

5 0.0070 0.30

6

6.5 0.33

0 0.3625 2.23

13

1.82

4 0.0061 0.28

6

6.0 0.35

0 0.2395 1.70

14

1.82

6 0.0071 0.29

8

6.4 0.33

0 0.3133 1.96

15

1.86

6 0.0067 0.29

9

6.3 0.34

0 0.3398 1.95

16

1.87 13 0.0082 0.31

5

6.2 0.34

0 0.4737 3.59

17

1.90

5 0.0065 0.26

7

6.6 0.34

0 0.2963 1.85

18

1.91

7 0.0068 0.28

9

6.2 0.33

0 0.3146 1.72

19

1.92

7 0.0081 0.30

6

6.7 0.35

0 0.4161 3.47

20

1.94

9 0.0069 0.26

9

6.9 0.33

0 0.3173 1.77

Ave

1.77

6 0.0067 0.29

6

6.2 0.34

0 0.3221 2.13

+/-

0.10

2 0.0006 0.02

1

0.3 0.01

0 0.0603 0.63

Min

1.59

3 0.0061 0.25

4

5.6 0.33

0 0.2364 1.34

Max

1.94 13 0.0082 0.32

9

6.9 0.35

0 0.4737 3.59

Cut

0.10

0.20

5.00

Constraints violated in 6 or more structures:#meanmax. 1

5

10

15

20

Upper HPHE

38 - QG1

VAL

53

5.50 200.28

0.32 +++*++++++++++++++++ peak 707

Upper HD2

PHE

38 - QQG

VAL

53

4.35 11

0.10

0.14

Upper QG2

VAL

50 - H

SER

52

5.23

7

0.09

0.18 ++

Upper HA

PHE

78 - HG

LEU

83

5.50 110.10

0.14 ++*++++ + +++ peak 2978

Upper QD1

ILE

85 - H

LEU

89

5.50

6

0.04

0.12

+ ++ ++ * peak 509

Upper QD1

LEU

88 - HB2

LEU

89

5.50

7

0.10

0.17

++ +++* + peak 949

Upper HLEU

89 - HG

LEU

89

4.19

7

0.08

0.23

Upper HA

ALA 106 - HB

VAL 1075.50 20

0.18

0.20 ++++++++++++*+++++++ peak 692

VdW

N

LEU

39 - CD1

LEU

39

3.05 200.22

0.25 ++++++++++++*+++++++

VdW

CD2

LEU

39 - C

LEU

39

3.10

9

0.20

0.21

VdW

N

VAL

50 - CG2VAL

50

2.85 120.15

0.25 ++++ ++++ * ++++
++

++ ++

peak 148+ + *peak 180+ + ++++*+ + ++

peak 516++ +*++ +*+ ++103

NMR データ処理／解析
VdW

CG1

VAL

50 - C

VAL

50

2.90

8

0.11

0.33

VdW

CG2

VAL

53 - C

VAL

53

2.90 16

0.21

0.23

VdW

N

ILE

81 - CDPRO

82

3.05 20

0.26

0.27 ++++++++++++++++++*+

VdW

N

ILE

81 - HD2PRO

82

2.45 200.34

0.35 ++++++++++++++++++*+

VdW

CG2

ILE

81 - CILE

81

2.90 10

0.20

0.22

VdW

CG2

ILE

85 - C

ILE

85

2.90

0.09

0.26

7

+ *+++ ++ +++ + ++++++*++ ++++*+ ++ +++++ +++ *+ ++ +8 violated distance constraints.
0 violated angle constraints.

RMSDs for residues 10..100:
Average backbone RMSD to mean:

0.40 +/- 0.06 A (0.28..0.52 A; 20 structures)

Average heavy atom RMSD to mean :0.83 +/- 0.07 A (0.67..0.99 A; 20 structures)

４−３−４．n15-cycle7.peaks, c13-cycle7.peaks, aro-cycle7.peaks
noeassign により帰属された NOE 信号について，
NOESY ピークテーブルに追記したファイル．

# Number of dimensions 3#FORMAT xeasy3D#INAME 1 H#INAME 2 h#INAME 3 N#CYANAFORMAT HhN
0 10.177 10.178 131.337 3 U

9.360E+03 0.000E+00 e 0

1 10.178

1.963E+03 0.000E+00 e 07.314 131.340 3 U

293
293

293
289

288 #QU 0.990 #SUP 0.99
288 #VC 0.58684 #QU 0.996 #SUP 1.00

293

296

288 #VC 0.41316 #QU 0.661 #SUP

1.00
2 10.178

5.893 131.355 3 U

2.659E+01 0.000E+00 e 0

293

276

288 #QU 0.990 #SUP 0.99

3 10.178 -0.038 131.323 3 U

1.338E+02 0.000E+00 e 0

293

238

288 #QU 0.951 #SUP 0.95

4 10.178 -0.157 131.328 3 U

2.534E+02 0.000E+00 e 0

293 1540

288 #QU 0.978 #SUP 0.98

元になった，n15.peaks, c13.peaks, aro.peaks の帰属情報部分に数字が入っている．この数字は最終的な化学シフトテーブルファイル（-final.prot）の ID が使用される．また，帰属情報より右には，その帰属の信頼度等がコメントとして追加されている．

４−３−５．rama.ps

104

NMR データ処理／解析
final.pdb での Ramachandran.plot の postscript ファイル．Linux 上では，
$ ghostscript rama.ps
で閲覧が可能であり，$ ps2pdf rama.ps
によって，PDF ファイルにすることもできる．

４−３−６．output.tbl
ovw ファイルをまとめる cyanatable の出力ファイルである output.tbl はその構造計算が信頼できるものであったのかを評価するのに使用する．

Program version: CYANA 2.1 (intel-lam)Start time: 31-12 月-2001 13:02:25

End time: 31-12 月-2001 13:29:38

Computation time: 27.18 min

105

NMR データ処理／解析
Directory: node31:/home_nis/kumeta/CYANA_runs/demo/auto

Cycle

:

1

2

3

4

5

6

7

:

4732

4732

4732

4732

4732

4732

4732

in c13.peaks

:

2979

2979

2979

2979

2979

2979

2979

in n15.peaks

:

1313

1313

1313

1313

1313

1313

1313

in aro.peaks

:

440

440

440

440

440

440

440

assigned

:

4568

4609

4589

4602

4598

4585

4569

unassigned

:

164

123

143

130

134

147

163

in c13.peaks

:

68

69

78

73

71

76

79

in n15.peaks

:

46

23

26

24

27

32

36

in aro.peaks

:

50

31

39

33

36

39

48

:

495

495

495

495

495

495

495

with off-diagonal assignment

:

4073

4114

4094

4107

4103

4090

4074

with unique assignment

:

1533

2789

3061

3158

3339

3437

3437

|i-j|<=1:

2800

2756

2717

2705

2677

2663

2655

with medium-range assignment 1<|i-j|<5 :

466

430

417

417

415

407

403

with long-range assignment|i-j|>=5:

807

928

960

985

1011

1020

1016

total

:

2674

2446

2346

2323

2271

2226

2240

2266

short-range, |i-j|<=1

:

1436

1247

1173

1135

1092

1064

985

1011

medium-range, 1<|i-j|<5

:

753

649

367

366

359

347

358

356

long-range, |i-j|>=5

:

485

550

806

822

820

815

897

899

Average assignments/constraint

:

4.15

2.23

1.38

1.35

1.27

1.23

1.00

1.00

:

36.15

14.86

27.96

4.15

3.64

2.48

4.03

1.77

Average backbone RMSD to mean

:

1.24

0.85

0.48

0.52

0.54

0.58

0.47

0.40

Average heavy atom RMSD to mean

:

1.82

1.42

0.98

1.00

1.02

1.09

0.92

0.83

Peaks:
selected

with diagonal assignment
Cross peaks:

with short-range assignment

Upper distance limits:

Average target function value

RMSD (residues 10..100):

この構造計算がある程度正しく行われたのかの条件として，

106

NMR データ処理／解析
unassigned がすべての cycle で 20%以下
cycle1 での target function が 250 以下
final での target function が 10 以下
cycle1 での RMSD が 3.0 以下
cycle1 と final の RMSD が 3.0 以下がある．もちろん，おおよその立体構造を得る程度であればこれらの条件が満たされていれば良いが，論文に載せる等の構造品質とするにはさらに厳しい条件を満たすことが望ましい．そのためには，より正確な化学シフトテーブル，NOESY ピークテーブルや構造計算の補正が必要になってくる．

４−４．Sparky との連携
under construction

４−５．構造計算の精密化作業チュートリアル
under construction

４−６．Tips
under construction107