植物の葉からの DNA 抽出キット

ISOSPIN Plant DNA
マニュアル（第 1 版）

Code No. 312-08631

NIPPON GENE CO., LTD.

I 製品説明ISOSPIN Plant DNA は、スピンカラムを用いて植物の葉から DNA を抽出・精製するためのキットです。
本キットは、カオトロピックイオン存在下で DNA がシリカへ吸着する原理を応用しており、フェノールやクロロホルムなどの毒性有機溶媒を使用しません。使用するスピンカラムは、
カラム容積を最大限確保しており、内封されたシリカゲル膜は、充分な DNA 吸着容量と高い溶出効率を確保しています。
本キットでは、夾雑物を遠心分離により除去する方法を採用しており、今まで抽出困難であったポリフェノールや粘性物質（多糖類）等を多く含む植物試料からも、約 1 時間で高純度の DNA を容易に得ることができます。

II キット内容
キット内容品
Prewash Buffer（50 回用）備考

30 ml × 1 本

PE1 Buffer

22.5 ml × 1 本

PE2 Buffer

2.5 ml × 1 本

PB Buffer

30 ml × 1 本

エタノール含有PW1 Buffer

40 ml × 1 本

エタノール含有PW2 Buffer

45 ml × 1 本

エタノール含有RNase A (100 mg/ml)

250μl × 1 本

Elution Buffer

3 ml × 1 本

Spin Column

50 本 × 1 袋

組成：10mM Tris-HCl(pH9.0), 0.1 mM EDTA(pH8.0)

上部パーツ：カラム
下部パーツ：Collection Tube

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III 保存
室温保存・ RNase A は室温保存が可能ですが、長期間ご使用にならない場合には、冷蔵保存（2～10℃）もしくは冷凍保存（－20℃）して下さい。
・ PB Buffer、PW1 Buffer、PW2 Buffer にはエタノールが含まれています。ご使用後は蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め、保管して下さい。
・ PB Buffer および PW1 Buffer はボトルの口まわりに白い結晶が析出する場合があります。
DNA 抽出操作には影響ありません。蓋を開ける際に生じる湿度の変化により析出しやす
くなるため、蓋を閉めた後、さらにチャック付き袋等に入れて保管することをおすすめします。

IV 使用上の注意
・ 本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 製品安全性データシート（SDS）につきましては、ニッポンジーンホームページ（http://www.nippongene.com/siyaku/）にてご覧になれます。

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V プロトコール＜キット以外に必要なもの＞
・マイクロピペット
・ピペットチップ・ペッスル（※）
・1.5 ml マイクロチューブ（※）
・遠心分離機（4℃）
・ヒートブロック（65℃）※ 効率よく組織を破砕できるようにチューブの形状に応じたペッスルをご使用下さい。

＜必要に応じて別途用意するもの＞
・液体窒素

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＜使用する試料量の目安＞
最初に使用する試料の量が多すぎると夾雑物の除去が不十分となり、DNA の収量と純度が著しく低下する恐れがあります。少量の試料から検討を始め、段階的に試料の量を増やしてお試しください。
粘性物質などの夾雑物が少ない試料は、抽出プロトコール中のオプション Prewash Buffer 処
理を省略できます。

オプション Prewash Buffer 処理を省略可能な試料例
試

料 （葉）

試料量の目安ホウレンソウ50 mg

シロイヌナズナ

20 mg

キャベツ

100 mg

イネ

50 mg

キク

50 mg

マツ

20 mg

オプション Prewash Buffer 処理を推奨する試料例
試

料 （葉）

試料量の目安

イチゴ

20 mg

バラ

50 mg

サクラ

50 mg

キウイ

20 mg

スギ

10 mg

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＜抽出プロトコール＞①

細断または粉砕した 10 - 100 mg の新鮮な葉または凍結した葉（試料）を
1.5 ml マイクロチューブに入れる。
注）試料の量が多すぎると DNA の収量と純度が著しく低下する恐れがあります。少量の試料から検討を始め、段階的に試料の量を増やしてお試しください。（p.4「使用する試料量の目安」参照）↓
粘性物質などの夾雑物が少ない試料はオプション操作②を省略できます。（p.4「使用する試料量の目安」参照）
オプション

②

600μl の Prewash Buffer を加え、20 秒間以上ボルテックスで撹拌する。遠心（13,000×g、10 分間、4℃）して植物試料をペレットにした後で上清をすべて除去する。
注）硬い葉や粘性物質の除去が困難な試料の場合（例：スギ）、Prewash Buffer が組織に浸透するようボルテックスの代わりにペッスルで軽くすり潰す。

↓
試料に 450μl の PE1 Buffer を加え、ペッスルですり潰し、均一な懸濁状態③にする。
注）懸濁液中に試料の塊が残っていると収量は低くなるので、念入りにすり潰す。チューブを光にかざすと懸濁液中の塊が確認しやすい。

④

5μl の RNase A を加え、ボルテックスでよく撹拌する。65℃で 10 分間加温する。加温中、3 分おきに 20 秒間以上ボルテックスで撹拌する。

⑤

50μl の PE2 Buffer を加え、20 秒間以上ボルテックスで撹拌する。遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、上清を新しいマイクロチューブに回収する。
注）沈殿物や液表面の膜上の析出物をなるべく取らないように上清を回収する。
注）回収した上清に析出物が多く含まれる場合、再度遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、析出物をペレットにしてから上清を回収する。

⑥

上清に対して等量の PB Buffer を加え、均質になるまで転倒混和する。遠心（13,000×g、30 秒間、4℃）し、沈殿物がある場合はできるだけ取らない
ように上清（混合液）を新しいマイクロチューブに回収する。
例）上清 450μl の場合は、PB Buffer 450μl を添加するため、混合液は 900μl になる。

↓

5

メンブレンに DNA を吸着させるため、900μl の混合液を Spin Column に添⑦加する。
注）混合液量が 900μl より多い場合はステップ⑦～⑧を繰り返して、1 本の Spin Column に全量を添加して下さい。

⑧

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）し、Spin Column のカラムを外して Collection
Tube にたまったろ液を捨てる。カラムを同じ Collection Tube の上に戻す。
↓
700μl の PW1 Buffer を Spin Column に添加し、遠心（13,000×g、1 分間、⑨

4℃）する。ろ液を捨てて、カラムを Collection Tube に再度戻す。
⑩

500μl の PW2 Buffer を Spin Column に添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。

⑪

300μl の PW2 Buffer を Spin Column に添加し、遠心（13,000×g、2 分間、4℃）する。ろ液と Collection Tube を捨てる。
注）PW2 Buffer による 2 回目の洗浄では、添加量と遠心時間が異なる。

↓⑫

Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に重ねる。

⑬

DNA を溶出させるため、50μl の Elution Buffer をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
注）Elution Buffer（10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA）の代わりに Nuclease フリー水も溶出液として使用できる。

⑭

遠心（13,000×g、2 分間、4℃）する。

⑮

DNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される。

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＜簡易プロトコール＞※ 試料のスタート量およびオプション処理を推奨する試料の例は p.4「使用する試料量の目安」参照

細断または粉砕した植物の葉（10 - 100 mg）※
600μl の Prewash Buffer を加え、ボルテックスで混和

オプション ※

遠心（13,000×g, 10 分間, 4℃）、上清を捨てる450μl の PE1 Buffer を加え、ペッスルですり潰し、均一な懸濁状態にする
5μl の RNase A を加え、ボルテックスで混和
65℃で 10 分間加温（3 分おきに 20 秒間以上ボルテックスで混和）50μl の PE2 Buffer を加え、ボルテックスで 20 秒間以上混和
遠心（13,000×g, 10 分間, 4℃）
上清を新しいマイクロチューブに回収
上清に対して等量の PB Buffer を加え、均質になるまで転倒混和
遠心（13,000×g, 30 秒間, 4℃）
混合液（沈殿物がある場合、上清のみ）を新しいマイクロチューブに回収
Spin Columnに 900μlの混合液を添加
遠心（13,000×g, 1 分間, 4℃）、ろ液を捨てる
混合液の残り（全量）をカラムに添加し、同様に遠心してろ液を捨てる
700μl の PW1 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 1 分間, 4℃）、ろ液を捨てる500μl の PW2 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 1 分間, 4℃）
300μl の PW2 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 2 分間, 4℃）、ろ液を捨てる
Spin Columnのカラムを新しい 1.5 mlマイクロチューブの上に移す
50μl の Elution Buffer をメンブレン中央に滴下
室温静置 3 分間
遠心（13,000×g, 2 分間, 4℃）
DNA溶液

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VI トラブルシューティング
トラブル

予想される原因

対策・ 新鮮な試料を用いる。
DNA が分解している。

・ 試料採取後、すぐに DNA 抽出プロトコールを行うか、速やかに凍結させる。

オプション洗浄中に試 ・ Prewash Buffer 中のボルテックスは長時間料を過度に破砕すると、行わない。

Prewash Buffer 中 に ・ ペッスルですり潰す場合は、葉の組織（繊低収量維）が残る程度にする。

DNA が溶出する。

・ PE1 Buffer 中でペッスルを用いて試料をよくすり潰す。試料の塊がなくなり、均一
PE1 Buffer 中の試料のホモジナイズが不十分。

な懸濁状態になるまですり潰す。
・ チューブ形状に適したペッスルを用いる。
丸底チューブには丸底チューブ用のペッスルを使用。空のチューブにペッスルをはめて、隙間がないか確認する。

粘性物質を含む多糖類 ・ Prewash Buffer 中に植物試料中の夾雑物をなどの夾雑物が多い試

溶出させるオプション洗浄（ステップ②）

料である。

を行う。
・ 硬い葉などの場合は、ボルテックスではな

Prewash Buffer による

く、ペッスルを用いて植物組織に Prewash

洗浄が不十分。

Buffer が浸透するように軽くすり潰す。
・ 植物試料量を半分以上減らす。

低純度

・ 試料によって目視で分かりづらいゲル状の沈殿物を形成することがあるので、上の方PB Buffer 添加後の遠心から慎重に上清を 800μl 取って新しいチで生じた沈殿（夾雑物）

ューブに移し、残りの上清を先の細いチッが持ち込まれた。

プで回収する。沈殿があると吸引しにくくなるので、上清と沈殿の判別ができる。
・ 上記「低純度」の対策を行う。

ス ピ ン カ ラ ム の 夾雑物が取り除かれて
目詰まり

・ そのまま操作を続けたい場合は、カラムから溶液がぬけるまで遠心時間を 2 倍程度にいない。

延長する。ただし、得られた DNA 溶液の純度は低くなることが多い。

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VII データ＜製品性能＞DNA 吸着容量

20μg

カラム容量

900μl

＜DNA 収量の目安＞
試

料 （葉）

DNA 収量の目安

ホウレンソウ

40 ng DNA/mg tissue

シロイヌナズナ

80 ng DNA/mg tissue

キャベツ

50 ng DNA/mg tissue

イネ

90 ng DNA/mg tissue

キク

100 ng DNA/mg tissue

マツ

150 ng DNA/mg tissue

イチゴ

30 ng DNA/mg tissue

バラ

30 ng DNA/mg tissue

サクラ

30 ng DNA/mg tissue

キウイ

40 ng DNA/mg tissue

スギ

30 ng DNA/mg tissue9

10

マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課
TEL
URL

076 - 451 - 6548
http://www.nippongene.com/siyaku/

お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。

ISOSPIN Plant DNA マニュアル（第 1 版）201709

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