日化協LRI賞受賞講演_2022. 8.26

メチル水銀による脳内炎症応答を介した毒性発現機構の解析

本発表に関連し、開示すべきCOI関係にある企業等はありません。

ふぁん ぎうく黄基旭

Project TENDR:

Targeting Environmental Neuro-Developmental Risks

These chemicals are commonly found in
our environment as well as in the bodies
of pregnant women, where many cancross the placenta and are often found incord blood or other fetal tissue.
~Source: Health Care Without Harm HP~

化学物質による健康影響が懸念されており、大きな社会問題となっている

メチル水銀 (MeHg)
メチル水銀は水俣病の原因物質として知られ脳組織選択的な障害を引き起こす
中枢神経障害
食物連鎖によるメチル水銀の魚類中への濃縮
プランクトン

小型魚

大型魚

海水15ｘ1031ｘ105

1ｘ107 : 濃縮度

ヒト2016年11月28日掲載

メチル水銀
マグロ過食に注意

妊婦から胎児へ影響、低濃度でも東北大調査（東北地方沿岸地域での調査）

現在、日本においても、メチル水銀が胎児に引き起こす健康影響は大きな社会問題となっている

メチル水銀毒性発現のメカニズムは？
●我々を含め世界中の研究者が毒性発現機構の解明に盛んに取り組んできた●水俣病の発症確認から約70年になる現在も未解明のまま

これまでの謎：
メチル水銀は脳よりも肝臓・腎臓に高濃度に蓄積するが、障害は脳にしか出ない

OMICS技術を応用した網羅的スクリーニング
ユビキチン・プロテアソームシステム
CDC34 (UBC3), UBC2, UBC4,
UBC5, UBC11, UBC13, GRR1,HRT3, UFO1, YLR224W, UBP2,UBP13, RAD23, UFD2 など

Genomeパルミチン酸化AKR1, MEH1, WHI2, EGO3 など

糖およびアミノ酸の代謝

MSN2, ENO2, DLD3, YIL006W,RIP1, MET25 など

サイトカイン類

TNF-a, OSM, IL-6, CCL2, CCL3,CCL4 など

Transcriptome
OMICS

Metabolome
低分子代謝物

プトレシン、ハイポタウリンなど

転写因子

tmRT1, TCF3, NPAS2, HSF1,CRSP3, TEX27, NEUROD6,RELA, STAT5B など

Proteome
細胞内小胞輸送

VPS27, DOA4, UBI4, VPS63,VPS68, VPS45, PEP12, VPS4,VPS28, VPS27, SNF8, VTA1,SRN2, STP22, VPS25, VPS36,
DID4, VAM3, VAM7 など

Effects of MeHg on TNFSF mRNA levels in the brainsof mice
Cerebrum

Methylmercury(25 mg/kg, one shot)

Quantitative PCRCerebellumEffects of MeHg on the levels of TNF-α and CD30L
mRNA in different mouse tissues
TNF-α

Days after the injection

Days after the injection

Days after the injection

Relative CD30L mRNA level

Relative CD30L mRNA levelDays after the injection

Relative CD30L mRNA level

Relative CD30L mRNA level

CD30L

Days after the injection

Days after the injection

Days after the injection

Days after the injection

Days after the injection

Days after the injection

Days after the injection

Mercury concentration

Days after the injection

TNF-α expressing cells in the brains of mice treatedwith MeHg
TNF-α mRNAGFAP & Iba1

GFAP: Astrocyte marker
Iba1: Microglia marker

Effects of MeHg on TNF-α expression in primary
microglia and BV2 cells
Primary microglia

BV2 cellsInvolvement of MAP kinase pathways in MeHg-induced
TNF-α expression in BV2 cells
TAK1

ASK1

Involvement of MAP kinase pathways in MeHg-induced
TNF-α expression in BV2 cells

SP600125 (SP; JNK inhibitor)
SB203580 (SB; p38 inhibitor)
PD98059 (PD; MEK/ERK inhibitor)

Effects of antioxidants on the induction of ROS byMeHg in BV2 cells
Intracellular ROS

Mitochondrial ROS

Trolox: antioxidant
Mito-TEMPO (TEMPO):
mitochondria-targeted antioxidant

Effects of antioxidants on the induction of TNF-α expression
by MeHg via the ASK1/p38 pathway in BV2 cells
Intracellular ROS

Mitochondrial ROS

Trolox: antioxidant
Mito-TEMPO (TEMPO): mitochondria-targeted antioxidant

Involvement of NF-κB activation in MeHg-induced
TNF-α expression in BV2 cells
NF-kB activation

Knockdown effectInvolvement of NF-κB in MeHg-induced TNF-αexpression via p38 in BV2 cells
NF-kB activation

SB203580(SB; p38 inhibitor)

Knockdown effectMorphology of microglia in the cerebral cortices ofadult mice and the brain slice cultures

Role of microglial activation in MeHg-induced neuronalcell death using the brain slice cultures
TNF-α inhibitor

Microglia removal

Role of p38 activation in MeHg-induced neuronal cell
death using the brain slice cultures
Microglia removal

p38 inhibitor

Summary_1

Effects of tmRT1 knockdown on the induction ofoncostatin M expression by MeHg
Oncostatin M (OSM): interleukin (IL)-6 family cytokine
tmRT1: TNF-α related methylmercury-responsive transcription factor 1* p < 0.05 vs. control, ** p < 0.01 vs. control† p < 0.05 vs. control siRNA, †† p < 0.01 vs. control siRNA

Oncostatin M expressing cells in the brains of micetreated with MeHg
In situ hybridizationand immunostaining: OSM: Iba1

OSM & Iba1

（Microglia Marker）● マウス脳内でのメチル水銀によるOSMの発現誘導に主に免疫細胞であるミクログリアが関与しているEffects of oncostatin M knockdown on cytotoxicity
caused by MeHg
Oncostatin M (OSM): interleukin (IL)-6 family cytokine

生存率発現抑制の確認

Toyama T. et al., Cells, 2019

* p < 0.05 vs. control siRNA, ** p < 0.01 vs. control siRNARole of oncostatin M in MeHg toxicity
Oncostatin M (OSM): interleukin (IL)-6 family cytokine

培地に放出された
OSM量生存率（OSM中和抗体）* p < 0.05 vs. control siRNA, ** p < 0.01 vs. control siRNA† p < 0.05 vs. MeHgCl-treated control siRNA†† p < 0.01 vs. MeHgCl-treated OSM siRNA. N.D. indicates not detected.

Mechanisms involved in oncostatin M-mediated MeHgtoxicity

MeHg
Receptor (?)①activation

tmRT1④Toxicity③② induction
OSM: Oncostatin M

TNFR3: TNF receptor 3＊ メチル水銀は、OSMのCys105に結合する● メチル水銀は、OSMのCys105に結合することでTNFR3との結合を促進する

Effects of mutation of cysteine 105 in oncostatin M
on binding to TNFR3
C105A: システインをアラニンに置換した変異体
C105S: システインをセリンに置換した変異体
C105M: システインをメチオニンに置換した変異体

C
MeHgCl (nM)00

C: Control
WT: Wild-type
WT

C105S

C105A

C105M

0.25 2.5 250 0.25 2.5 25

0 0.25 2.5 2500.25

2.525

Anti-OSMAnti-V5(TNFR3-V5)

OSM

N
31Cys

74Cys

105CysSH

152Cys192CysC
TNFR3OSMN
31Cys

74Cys

C105SOH

152Cys192CysTNFR3CEffects of addition of OSM cysteine mutants to theculture medium on cell proliferation
C105A: システインをアラニンに置換した変異体
C105S: システインをセリンに置換した変異体
C105M: システインをメチオニンに置換した変異体

WT: Wild-type

Cell viability (%)

120

メチル水銀非存在下Control siRNATNFR3 siRNA

10080
60
40200OSM

OSM

Effects of addition of OSM cysteine mutants to theculture medium on cell proliferation
C105A: システインをアラニンに置換した変異体
C105S: システインをセリンに置換した変異体
C105M: システインをメチオニンに置換した変異体

WT: Wild-type

Cell viability (%)

120

メチル水銀非存在下Control siRNATNFR3 siRNA

100806040200

OSMOSMEffects of MeHg on TNFR3 expression in the brainsof mice
大脳皮質
頭頂部内側

DAPI

NueN

大脳皮質頭頂部
内側TNFR3

Marge

Vehicle100 μm

DAPI

NueN

TNFR3

Marge

MeHg
100 μm

DAPI: nuclear staining NeuN: neuronal marker

Summary_2
OSM: oncostatin M
TNFR3: TNF receptor 3

発現上昇

謝東北大学

大学院薬学研究科
名 誉 教 授 永沼 章
講師 外山喬士
大学院生および学部生

辞東北医科薬科大学

環境衛生学教室の皆さん国立環境研究所

環境リスク・健康領域
主任研究員 岩井美幸

東京薬科大学

公衆衛生学教室
講師 高橋 勉

2022.7.8