日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 89, 131-138, 2015

子宮筋腫組織を用いた新たな癌の野

本

翔

浸潤モデルの確立
太

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：大木秀郎 教授，小宮山一雄 教授，岩瀬孝志 専任講師）

要 旨： ヒ ト 子 宮 筋 腫 か ら 作 製 し た myoma disk で 3 次 元 器 官 培 養 シ ス テ ム を 確 立 し， 口 腔 癌 の epithelialmesenchymal transition（EMT）について検討した。ヒト口腔癌由来の HSC-3 細胞および Ca9-22 細胞，Ca9-22 細胞の secretory leukocyte protease inhibitor 遺伝子を欠失させた NUSD-1 細胞を，myoma disk 上で 3，7 および14 日間培養した。癌細胞の浸潤・増殖および EMT を組織学的に評価した。また，matrix metalloproteinase（MMP）の発現を RT-PCR と gelatin zymography で調べた。HSC-3 細胞，Ca9-22 細胞および NUSD-1 細胞は，培養 3 日
目で myoma 上に単層の上皮として観察された。しかし，HSC-3 細胞および Ca9-22 細胞は培養 7 日目で小集団を形成し，myoma 内への浸潤を認めた。浸潤細胞は，keratin および vimentin 陽性を示し，活性型 MMP-2 および
MMP-9 の産生を認めた。一方，NUSD-1 細胞は，myoma disk 内への浸潤は示さず，MMP-2 の産生を認めなかった。
その結果，口腔癌浸潤に EMT および MMP の関与が，また myoma disk を用いた 3 次元器官培養モデルが，浸潤・増殖およびメカニズム解明に有用であることが示唆された。
キーワード：

浸潤モデル，口腔癌，子宮筋腫，マトリックスメタロプロテアーゼ，EMT

緒の細胞成分が欠落している。また，多くの腫瘍胞巣では

言

線維芽細胞が間質中で最も多い割合を占め，これらはmyofibroblast としての性格を示し，cancer associated腫瘍の浸潤および転移機構を解明するため，現在までにさまざまなおよび

fibroblast（CAF）と呼ばれる。CAF は ECM をはじめ，で実験モデルの作

製および病理組織学的検索が行われてきた

1-8）

protease，growth factor，chemokine などを産生して。その結果，腫瘍の浸潤・増殖に多大な影響を与えている 12, 13）。

腫瘍細胞の浸潤・増殖時における形態学的変化に始まり，腫瘍細胞へのマクロファージや NK 細胞などの細胞性免本研究では，CAF と同様に myofibroblast が存在する

疫による抗腫瘍反応や，α -SMA や TNF などのサイトカ

ヒト子宮筋腫の組織片を用いて，再現性があり，よりヒイン発現による腫瘍浸潤に対する防御作用などについトの生体内の環境に近い 3 次元器官培養モデルを作製して，組織学的検討が行われ報告されている

9, 10）て口腔癌細胞の浸潤・増殖およびその機構を検討した。

。

実験モデルでは，腫瘍細胞をヌードマウスに移植し，腫口 腔 癌 の 浸 潤・ 増 殖 を 評 価 の す る た め に epithelial-瘍形成能や転移の動態などが検討されている。その結果，mesenchymal transition（EMT）14-18） お よ び matrix

腫瘍の増殖および浸潤は，腫瘍細胞自身の性状によるだ

metalloproteinase（MMP）の 発 現 を 免 疫 組 織 化 学，

けでなく，線維芽細胞および extracellular matrix（ECM）

RT-PCR および gelatin zymography により検討した。

など微小環境の影響を受けていることが示された 8）。一方，材料および方法

実験モデルでは，Alt-Holland らはヒトの腫瘍環境を再現すべく，腫瘍細胞の 2 次元培養モデルに変1.

細胞株および培養

えて，腫瘍細胞を皮膚結合組織細胞上で培養して浸潤能

本研究にはヒト舌扁平上皮癌由来細胞株（HSC-3），ヒを観察する 3 次元培養モデルを作製した 11）。さらに，線ト歯肉扁平上皮癌由来細胞株（Ca9-22）および Ca9-22 細維芽細胞を混入したⅠ型コラーゲンゲル上に腫瘍細胞を胞の secretory leukocyte protease inhibitor（SLPI）発現

播種し，ヒトの間葉組織の mimic とした 3 次元の器官モを欠失させた NUSD-1 細胞 19, 20）を用いた。これらの細胞デルが作製されて腫瘍の初期浸潤の検討が行われの培養には，100 unit/ml ペニシリンと 0.1 mg/ml スト

た4, 6, 10）。腫瘍間質では，線維芽細胞は，腫瘍胞巣の形成，

レプトマイシンを含む 10% FCS 加 RPMI-1640 培地を用腫瘍の進展や制御に深く関与している。しかし，線維芽

いた。細胞は，通法に従って 5% CO2，37℃の環境で培細胞を埋め込んだコラーゲンゲルでは，腫瘍微小環境を養した。

充分に再現しているとはいえず，腫瘍胞巣でみられる他（受付：平成 27 年 1 月 29 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 13

131

2.

間反応させた。各ステップ間では，切片を PBS で 10 分

Myoma disk 調整器官培養に用いる子宮筋腫組織片は，聖母病院産科（東間，3 回洗浄した。発色にはジアミノベンジジンを用いた。

京都新宿区）で治療のため手術により摘出され，供与さ発色後，ヘマトキシリンで核染色を施し，マリノールにれた。なお，本研究は日本大学医学部の倫理委員会の許て封入した。

可（倫許 23-25）を得ている。

4.

Gelatin zymography 法

3 次元器官培養システムの概略を第 1 図に示す。3 次

Ca9-22 細胞および NUSD-1 細胞を FCS 非添加 RPMI-

元器官培養に用いる myoma disk は子宮筋腫組織を生検

1640 培地で一晩培養した後，培養上清を 2000 rpm で 5

ト レ パ ン（KAI）で 直 径 8 mm に く り 抜 き， 作 製 し た。

分間遠心した。得られた培養上清と loading buﬀer（0.125

Myoma disk は 10% DMSO 加 RPMI-1640 培 地 に 浸 漬

M Tris-HCl buﬀer pH6.8, 4% SDS, 10% sucrose, 0.01%

し，使用するまで−70℃で凍結保存した。

bromophenol blue; BPB）
を同体積で混合し，1.0% gelatin
加 10% acrylamide gel を用いて電気泳動を行った。

は じ め に myoma disk を 37℃ の 温 浴 で 解 凍 後，10%
FCS 加 RPMI-1640 培地に 1 時間，室温で浸漬した。次泳動後，ゲルを 50 mM Tris-HCl buﬀer，pH7.4, 2.5%

い で，myoma disk を ト ラ ン ス ウ ェ ル イ ン サ ー ト

Triton X-100, 5 mM CaCl2, 1 mM ZnCl2 で 1 時間洗浄し（Corning）に 入 れ， 培 養 癌 細 胞 を 10% FCS 加 RPMI-て SDS を除去した。再びゲルを蒸留水で洗浄した後，反54

応 溶 液（50 mM Tris-HCl buffer pH7.4, 5 mM CaCl2,

個）を myoma disk 上に播種した。一晩 CO2 インキュベー

1 mM ZnCl2）中で 37℃，一晩反応させた。反応後，ゲルタ ー 内 で myoma disk に 細 胞 を 付 着 さ せ た。 次 い でを 0.5% coomassie brilliant blue G250 で染色後，脱色

1640 培地で 7×10 個 /ml に調整し，その 50μl（3.5×10

myoma disk を取り出し，12 ウェルプレート内に置いたを行い写真撮影した。

ステンレス製グリッド上の無コーティングナイロンメッ

5.

RT-PCR 法

シュ上へ移した。プレート内は myoma disk の基部が浸1） 培養細胞から RNA の抽出

るまで培地を注入し，CO2 インキュベーター内で培養しRNA は RNeasy（Qiagen）を用いて通法に従って抽出した。すなわち，培養細胞を PBS で洗浄した後，350μl

た。培養の期間中，培地を 3 日目ごとに交換した。
3.

の細胞溶解液を加え，シリンジと注射針で DNA を機械

組織学的および免疫組織化学的検索
培養 3，7 および 14 日目に myoma disk を，10% 中性的に切断した。次いで，同量の 70% エタノールを加え，緩衝ホルマリンで固定し，パラフィンに包埋した。連続

RNeasy column に入れて 10,000 rpm で 1 分間遠心した。

切片を 5μm の厚さで作製して組織学的検索に供した。

添付の buﬀer で column を 3 回洗浄した後，30μl の蒸留

組織学的検索には H-E 染色を施し，免疫組織化学的検索

水 で RNA を 溶 出 し た。 得 ら れ た RNA は 使 用 時 まには抗 cytokeratin AE1/AE3（DAKO），抗 vimentin（ニで−80℃で保存した。

チレイバイオサイエンス）の各一次抗体を用いた。切片

2） RT-PCR 法

を脱パラフィン後，0.3% H2O2 加メタノールで 30 分間反

上記で得られた RNA 1μg を，65℃で 5 分間加熱した

応させて内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止した。続い

後，5 分 間 静 置 し， こ れ に RNase inhibitor（Takara）て，切片を 0.01 M クエン酸バッファー（pH6.0）中で 98℃

1 u n i t，10× R T b u f f e r 1 μl，25 m M d N T P 2 μl，または 121℃で 20 分間加熱して抗原を賦活化した。非特random primer および RAV-2 reverse transcriptase

異的反応のブロッキングは，切片に 10% 正常ブタ血清 /0.5 U を含む混合液に加え，滅菌蒸留水で 10μl に調整し，PBS を加え，30 分間反応を行った。次いで，一次抗体を42℃で 1 時間反応させた。その後，94℃で 5 分間加熱し切片に加え，室温で 60 分間あるいは 4℃で一晩反応させて反応を停止し，cDNA を得た。得られた cDNA 溶液

た。二次抗体は EnVision（DAKO）を用い，室温で 60 分

1μl に 対 し て，10×PCR buffer 10μl，sense お よ び

第1図

口腔癌器官培養システムの概略

132

子宮筋腫組織を用いた癌の浸潤モデル

Ca9-22 細胞および NUSD-1 細胞は，myoma disk 培養

antisense primer 100 pmol，2.5 mM dNTP 16μl およびTaq DNA polymerase（Takara）2.5 units を加え，滅菌

3 日目には，disk 表層に連続する一層の細胞が生着してい蒸留水で 100μl に調整した後，サーマルサイクラーを用た（第 2 図 A, D）。Myoma disk 培養 7 日目には，Ca9-22

い増幅した。PCR は denature：94℃ 1 分間，annealing：

細胞は disk 表層にほぼ連続して配列するようになり，一部

55℃または 60℃ 2 分間，extension：72℃ 3 分間のサイで 2 〜 6 層程度の細胞の重層化がみられた（第 2 図 B，E）。

ク ル を 25 ま た は 35 回 行 っ た。PCR-product は，1.6%

しかし，上皮表層が口腔粘膜のような錯角化や正角化を

agarose gel（Bio-Rad）で電気泳動を行い，エチジウムブ

示すような像は認めなかった。また，重層化部に顆粒細ロマイドで染色後，写真撮影した。

胞も出現していなかった。Ca9-22 細胞は数十個の小集団を形成して，disk 深部へ浸潤増殖する像を多数認めた（第本 研 究 に 用 い た 各 primer の シ ー ク エ ン ス お よ び

2 図 B）。Myoma disk 培養 14 日目には，Ca9-22 細胞のproduct size を第 1 表に示す。

結1.

disk 深部への浸潤は，表層から連続性あるいは不連続性

果に 浸 潤・ 増 殖 像 が 観 察 さ れ た（ 第 2 図 C）。 一 方，
NUSD-1 細胞は myoma disk 培養 7 日目には，Ca9-22 細Myoma disk 器官培養モデルの組織学的所見
Myoma disk には，組織学的に錯綜する筋線維芽細胞胞とは異なった組織所見を示した。NUSD-1 細胞は disk

および筋細胞と，細胞周囲に太いコラーゲン線維や好酸表層で 3 層から 7 層の重層を示し，一部で上皮突起のよ性マトリックスの形成がみられた。しかし，生細胞はみ

うに disk 内へ突出する像を認めたが，浸潤増殖する所見られなかった。

は観察できなかった。また，NUSD-1 細胞は表層で粘膜上皮のように細胞が扁平化する像をみたが，錯角化や正角化は示さなかった。また，厚く重層化した部において

第1表

基底層の形成や棘細胞のような豊富な細胞質などはみら

本研究に使用した primer 配列れなかった（第 2 図 E）。Myoma disk 培養 14 日目には，両細胞ともに 7 日目とほぼ同様な挙動を示したが，時間の経過とともに細胞層はより重層化がみられた（第 2 図F）。なお，HSC-3 細胞は，Ca9-22 細胞とほぼ同様な浸潤増殖像を示した（データ示さず）。
免 疫 組 織 化 学 に お い て，myoma disk へ 浸 潤 性 のCa9-22 細胞と非浸潤性の NUSD-1 細胞は keratin 強陽性を示し，扁平上皮癌細胞であることが確認できた（第 3第2図

ヒト口腔癌器官培養システムを用いた Ca9-22 細胞と NUSD-1 細胞
矢印は disk 深部へ不連続性に浸潤する腫瘍細胞を示す。

133図）。癌細胞が，既存の脈管腔を介して浸潤する可能性

bp として確認されたが，NUSD-1 細胞では認められなも 考 え ら れ た こ と か ら， 連 続 切 片 を 用 い た keratin とか っ た。 ま た，MMP-9 遺 伝 子 発 現 は Ca9-22 お よ び

vimentin の免疫組織化学で検討した。その結果，keratin

NUSD-1 細胞の両方で PCR 増幅産物 359 bp として認め陽性細胞の周囲には vimentin 陽性像を認めないことかられた（第 6 図）。

ら，HSC-3 細胞は脈管腔を介さずに浸潤していることを

MMP-2 の gelatin zymography では，RT-PCR 法によ確認した（第 4 図）。また，一部の胞巣では，HSC-3 細胞る解析と同様に，Ca9-22 細胞培養上清でサイズ 62 kDa

自身が上皮間葉転換の指標である vimentin 陽性と細胞に MMP-2 活性バンドを認めたが，NUSD-1 細胞では活形態が多角形ないし紡錘形を示していた（第 5 図）。

性 バ ン ド を 認 め な か っ た（ 第 7 図 ）。MMP-9 の 活 性 は2.

Ca9-22 細 胞 培 養 上 清 で 活 性 型 MMP-9 を 認 め た が，

Ca9-22 細胞および NUSD-1 細胞における MMP の発現

NUSD-1 細胞では非活性型のみであった。

MMP-2 遺伝子発現は Ca9-22 細胞で PCR 増幅産物 368

第3図

培養 7 日目の Ca9-22 細胞と NUSD-1 細胞の HE 染色と keratin 染色

第4図

HSC-3 細胞の myoma disk 内浸潤細胞の免疫染色
Myoma disk 内に keratin 陽性細胞の浸潤を認めるが（矢印），同部位の浸潤細胞周囲には vimentin 陽性像を認めない（矢印）。

134

子宮筋腫組織を用いた癌の浸潤モデル

考察

癌 は， わ が 国 の 死 亡 原 因 の 第 1 位 を 占 め る 疾 病 で ある 21）。癌細胞には高い浸潤能および転移能があり，これらは予後を決定する重要な因子となっている。癌細胞の浸潤と転移についてこれまで数多くの研究が行われてきた 1-8, 10-18, 22）。本研究では口腔癌の初期浸潤のメカニズムを明らかにするために，ヒト myoma 組織を母床とした3 次元器官培養法を試みた。その結果，培養 3 日目には
ヒト myoma disk 上で口腔癌細胞が生着し，培養 7 日目には myoma 組織内へ浸潤・増殖する像がみられ，本実験モデルが癌浸潤と転移のモデルとして有用であることが示された。
これまでに，腫瘍の転移・浸潤機構を検索する方法には，基底膜成分をコートしたメンブレンを用いて癌細胞を培養し，メンブレンを通過した細胞数から細胞浸潤能を測る方法や 23），コラーゲンゲル上に癌細胞を播種し浸潤・増殖を観察する方法が用いられてきた 4, 24）。
しかし，これらの方法で用いられる基質はラットなどの動物から分離精製された純粋なコラーゲンのみであり，より正常組織に近い検索条件の必要性が求められていた。また，cadaver の皮膚組織から線維芽細胞を分離
してコラーゲンゲルに埋め込んだ母床を用いて 3 次元培養を行い，口腔癌の浸潤を検討した報告もある 7）。これ
らはに近い環境での 3 次元的な細胞の挙動，分化，治療薬の効果，細胞とマトリックスの相互作用をで検索する方法として用いられている。しかし，ヒト腫瘍の微小環境を再現しているとはいえず，より生体に近い 3 次元器官培養モデルの開発が求められている。
Nurmenniemi ら 6）はこのような 3 次元器官培養法の欠第6図

点を補う方法として子宮筋腫の切除組織を用いた方法を報告している。子宮筋腫は良性腫瘍であり，1 検体から

第5図

RT-PCR 法による MMP-2 および MMP-9 の発現
M：φx174
Ⅲ 1：NUSD-1 細胞 2：Ca9-22 細胞
3：HSC-3 細胞

HSC-3 細胞の myoma disk 内浸潤細胞の免疫染色
Myoma disk 内に浸潤した少数の keratin 陽性 HSC-3 細胞に vimentin 陽性を認める（矢印）。

135

第 7 図 Gelatin zymograhy による MMP-2 の発現
Pro MMP-2 : 非活性型 MMP-2 (72 kDa)
Act MMP-2 : 活性型 MMP-2 (62 kDa)
Pro MMP-9 : 非活性型 MMP-2 (92 kDa)
Act MMP-9 : 活性型 MMP-2 (83 kDa)
M : marker

多くの培養用 disk が得られる。また，筋腫組織には平滑浸潤する癌細胞では EMT が起きているものと考えられ筋由来の腫瘍細胞の他，多量のⅠ，Ⅱ，ⅢおよびⅣ型コた。これらの結果から，本 myoma disk モデルを用いてラーゲン，ラミニン，α -SMA，vimentin やマクロファー

簡便に癌細胞の EMT を 3 次元的に捉えることができた

ジが存在することから，悪性腫瘍の転移機構を解明する

ことは意味深く，今後さらに詳細な検討が必要である。

方法として非常に有用な方法であると考えられる。しか癌の転移の初期過程は，胞巣を構成する細胞同士の結しながら，本方法を用いた報告はほとんどなく，また，合を解除することから始まる。E-cadherin は catenin と実験条件の厳密性が求められる。

複合体を形成することで上皮細胞間接着の機能を果たし

今回の実験に用いた口腔癌細胞株 HSC-3 細胞およびている。本来，癌細胞間は E-cadherin などの働きにより

Ca9-22 細胞は，myoma disk 上で多層化し，myoma 組

強固に結合しており，容易には解離しないが，E-cadherin

織内への浸潤を示した。この結果は，今後このモデルをまたは catenin に変化が起こると細胞接着能が低下し，応用して癌浸潤の促進因子あるいは抑制因子の解明や，癌細胞が解離すると報告されている 28）。この作用を高め治療応用への基礎的検討に役立つと考えられた。

る因子としては，TGF-βがよく知られている 12）。近年，癌細胞が周囲組織への浸潤・増殖する際の癌細胞の生

乳癌由来の培養細胞や卵巣癌由来などの培養細胞を用い物学的性状については，古くから検索されてきた。今日，て，SLPI に よ る 転 移 機 構 へ の 影 響 が 検 討 さ れ て い

組織の分化・成熟に関与する EMT の，癌細胞の増殖・る 29-31）。Rosso ら 31）は乳癌由来 F3 II 細胞の培地に SLPI

転移への関与が注目されている

13-17, 25-27）。癌細胞が脱分を添加することで，同細胞の E-cadherin の発現低下や化し，間葉系の性質を得て遊走性を獲得した後に臓器へ

β-catenin の核への移動などの局在変化を報告している。

転移すると，癌細胞が転移しない表現型へと変換して局

さらに卵巣癌由来 SKOV3 細胞や胃癌由来 SNU638 細胞所へ定着すると考えられている。本研究で，myoma 組の検索では，SLPI により MMP-2 および MMP-9 発現の織 内 へ 浸 潤 す る 紡 錘 形 を 示 す 癌 細 胞 に keratin と増加が報告され 29, 30），EMT における TGF-βと同様な

vimentin の共発現をみたことから，本モデルにおいても作用があることが知られている 32）。本検索で SLPI の発136

子宮筋腫組織を用いた癌の浸潤モデル

3.

現を欠失した NUSD-1 細胞は，myoma の表層で重層しCa9-22 細胞は，組織を破壊して myoma disk 内へ浸潤した。

て myoma 内 へ の 浸 潤・ 増 殖 は 認 め な か っ た。 一 方，
4.

SLPI を発現する Ca9-22 細胞や HSC-3 細胞では myoma

Ca9-22 細 胞 の 浸 潤・ 増 殖 に は，MMP-2 と MMP-9の関与が示唆された。

内への浸潤・増殖が認められ，これらの報告を裏付ける

以上の結果から，myoma disk を用いる 3 次元器官培ものと考えられた。

養法は，口腔癌の浸潤・増殖のメカニズム解析に有用で

ヒト口腔癌において，粘膜下結合組織に浸潤増殖するあることが示唆された。

ためには，上皮と結合組織との境界である基底膜を破壊しなくてはならない 33）。基底膜は，Ⅳ型コラーゲンとラ本研究遂行にあたり，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本
大学歯学部口腔外科学講座の大木秀郎教授，同学部病理学講座の小宮山一雄教授に謹んで心より感謝申し上げます。
また，本研究を通じ多大なるご協力と助言を賜りました本学部
病理学講座の岩瀬孝志専任講師を始め，同講座の皆様に深く感謝いたします。

ミニンやヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを基本構造と し て い る。Sato ら

34）

は 癌 の 浸 潤 増 殖 に 際 し て は，

MMP-2 の他，MMP-9 および MMP-13 が活性化され，Ⅰ，
Ⅱ，ⅢおよびⅣ型コラーゲン，ラミニン，フィブロネク
チンなどの細胞外マトリックスなどの構成成分の破壊をす る こ と を 示 し た。 ま た， 臨 床 研 究 の 結 果 か ら も本研究の一部は，JSPS 科研費 24593066 および日本大学歯学部
佐藤研究費（平成 25，26 年度）によってなされた。

MMP-2 の活性化と癌の浸潤・転移とが，正の相関を示すことが認められている

35）。

今回用いた myoma disk モデルにおいて，基底膜Ⅳ型

文

コラーゲンを分解するとされる MMP-2 と MMP-9 の関

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与を検討するために，Ca9-22 細胞と NUSD-1 細胞における両プロテアーゼの産生を遺伝子発現レベルで検討した。 興 味 深 い こ と に myoma 組 織 へ 浸 潤 増 殖 を 示 し た
Ca9-22 細胞と非浸潤の NUSD-1 細胞とでは MMP 発現パターンに差がみられた。また確認のために行った細胞
培養上清の gelatin zymograph においても，Ca9-22 細胞と NUSD-1 細胞では遺伝子発現と同様に活性型 MMP 産
生に差があることが確認できた。
以上の結果から，myoma disk を用いる口腔癌 3 次元
器官培養法は，線維芽細胞とコラーゲンゲルを用いた母床による従来の 3 次元器官培養法に比べ，よりヒトの腫瘍環境を反映しており，癌の浸潤増殖のメカニズムの解析 に 有 用 で あ る と 考 え ら れ た。 な お， 今 後 は tissue
inhibitor of metalloproteinase（TIMP）の発現を調べるな
ど，詳細な検討が必要である。

結論

口腔癌の浸潤・増殖機構について，ヒト子宮筋腫組織から作製した myoma disk を用いて HSC-3 細胞，Ca9-22細胞および NUSD-1 細胞を用いて 3 次元器官培養を行い，その有用性を病理組織学，免疫組織化学，RT-PCR
および gelatin zymography を用いて検討した。
Myoma disk を用いた検索により，以下の結果および結論が得られた。
1.

HSC-3 細 胞 お よ び Ca9-22 細 胞 は， 培 養 7 日 目 に
myoma disk 深部に連続あるいは不連続に浸潤・増殖した。一方，NUSD-1 細胞は表層で重層化するが，培養 14 日目でも浸潤はしなかった。

2.

献HSC-3 細胞の myoma disk 内への浸潤には EMT が関与していた。

137

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