NMR法による構造計算（15N標識Cups7の場合）

1st draft 2021.12.7
last update 2021.12.15
H. Kumeta

講習会内容1. 測定セットa. 211030_N_Cryj7b. 211110_N_Cryj7① 測定データの管理
2. 測定後の処理① TopSpin② Sparkyフォーマットへの変換
3. 解析① Sparkyの使い⽅② 主鎖帰属③ 側鎖帰属（紹介のみで解説しない）④ 構造計算2

3-③. 側鎖帰属

主鎖帰属で帰属した原⼦以外の側鎖の原⼦についての帰属をする

3

3-③. 側鎖帰属のためのスペクトルa. 211030_N_Cryj7 (a set)
1: zgpr2: [1H-15N] HSQC (wg)
3: HNCA
4: [1H-15N] HSQC (wgHD)
5: HNCA
6: 15N-NOESY (mixing time 100 msec)7: 15N-TOCSY (mixing time 70 msec)
b. 211110_N_Cryj7 (b set)
1: zgpr2: [1H-15N] HSQC (wgHD)
3: NOESY_Ndec
4: TOCSY_Ndec
5: [1H-13C] HSQC (Echo/Anti-echo)
6: [1H-13C] HSQC (Echo/Anti-echo, matched sweep)
7: HNCO
8: 13C-NOESY (mixing time 100 msec)

hnca.ucsf
Nhsqc.ucsf
nnoe.ucsf
ntoc.ucsf

noe2D.ucsf
toc2D.ucsf
Chsqc.ucsf
hnco.ucsf
cnoe.ucsf
4

3-③. 側鎖帰属？(HNCO)TALOS+のために、COも帰属する

TALOS+は、主鎖⼆⾯⾓（φ、ψ⾓）を化学シフト値から予測するソフトウェア。
予測された⼆⾯⾓情報は、構造計算に含めることができる。(k1⾓も予測するが精度が低い)
RCI=randum coil index
Berjanskii and Wishart, JBNMR, 2008, 40, 31-48

主鎖⾻格構造が与える化学シフト値への影響度は、Cα、Hα、COが⼤きい。
⾔い換えれば、 Cα、Hα、COが揃っているほど主鎖⼆⾯⾓予測は正確になる。
5

3-③. 側鎖帰属(Chsqc)
matched sweepを使⽤したので
CH3, CHは正、CH2は負の信号として観測できる

CN標識体の場合には、constant time evolutionを使⽤する

6

3-④. 構造計算
NMR法による⽴体構造計算と⾔った場合、⼤抵はNOE法のことを意味する• NOE信号情報からプロトン原⼦間距離情報を求める• 距離情報により焼きなまし法を⽤いて⽴体構造を計算する• 得られた⽴体構造が正しいかを評価しつつ、最終構造を決定する
NOE法における⽴体構造計算のおおまかな流れ

ここら辺の作業
7NOEの原理
NOEによる⽴体構造解析ではプロトン原⼦間NOEから得られる距離情報を使⽤する

磁気的に相関する位置関係にある場合，（互いの距離が近い場合）交差緩和により磁化が移動する．
回転相関時間が⻑い場合（⽴体構造を形成するほぼ全てのタンパク質が該当する），対⾓信号と同符号の交差信号（負のNOE信号）が得られる．
また，そのときの信号強度は原⼦間距離の６乗に反⽐例する．
プロトン間NOEが観測される相関距離は 5 Åまで．

8

NOESYスペクトル
◀交差信号
◀交差信号
◀対⾓信号

◀交差信号

距離の６乗に反⽐例した（近いほど強い）強度で交差信号が観測される。
9

焼きなまし法（Simulated Annealing）

エネルギーが低いほど矛盾のない構造
RMSDが⼩さいほど束縛条件の良い構造

10タンパク質中でのNOE信号の検出距離
プロトンのNOE範囲は 5 Å以内（⾮常に短距離の情報）
Type III AFP(7kDa)

Helixの⼀巻きが 5.4 Å

２残基以上離れた残基間の束縛情報を表⽰（⻩⾊の線，1084本）

精密なタンパク質⽴体構造解析のために必要なNOE信号数は数千個（双⽅向のNOE信号は組み合わせ１個につき１個の束縛情報にしかならない）（構造計算には重要ではない残基内プロトン間NOE信号が多数観測される）

11

タンパク質のNOESY測定
13

C，15N標識による３次元NOESYを使⽤する．

数百個程度のNOE信号情報が分離・取得可能（分離不能な領域が多い）

数千個程度のNOE信号情報が分離・取得可能

３次元NOESYを⽤いて，より多くのNOE信号情報を取得する．

12

⾃動NOE帰属付き構造計算ソフト
数千個程度のNOE信号情報

各原⼦の化学シフト値

NOE信号の帰属と⾃動NOE信号帰属と距離情報への変換
距離情報への変換

構造計算

⽴体構造をベースとしてNOE信号を再帰属サイクルを複数回繰り返す事でNOE信号帰属と構造が収斂される

CYANA: 優秀な帰属アルゴリズムを持っているため、初期構造を得やすい
lNetwork Anchoring近傍原⼦間を積極的にNOE信号を帰属する
lConstraint Combination
少し構造をゆがめてNOE信号を帰属する(Guntert, Prog NMR, 2003)

13

CYANAによる⾃動帰属の実⼒
同じ⼊⼒情報を⽤いてCYANAとCYANAアルゴリズムがないソフトで⽐較

CYANAによる⾃動構造アルゴリズムは⾮常に優秀

14

CYANA構造計算に必要なもの• 正確で⼗分量の化学シフト値情報（90%以上）• ノイズを含まないNOESY信号情報• 綺麗なスペクトルを取得する• ピークピックに努⼒と⼯夫をする• 配列情報や明らかになっている構造情報• S-S結合や配位⾦属など

7 kDa

15 kDa20 kDa15

綺麗なNOESYスペクトルを得るために• 測定時TD多め／RG低め／ns多め／NUS禁⽌• 適切なmixing time (d8)、構造計算に⽤いる場合は75~100msecぐらい• FT時のLP禁⽌

N-NOESYの場合
F2: N軸、信号の個数や位置関係に依存
F1: indirect 1H軸（NOE信号が出る軸）
F1のポイント数は256ぐらいが適切

16

綺麗なNOESYスペクトルを得るために• 測定時TD多め／RG低め／ns多め／NUS禁⽌• 適切なmixing time (d8)、構造計算に⽤いる場合は75~100msecぐらい• FT時のLP禁⽌⻑すぎるmixing timeは、NOE連鎖によるspin diﬀusionを引き起こす。
本来、NOE信号が観測されないはずの信号が観測されたり、実際の距離よりも強く信号が観測されたりする。
右図は、ΩAからのNOESYについてのNOE連鎖例
本来、観測されるはずのない距離にあるA-C間のNOEが、Bを介したNOE連鎖によって観測されている。

17

綺麗なNOESYスペクトルを得るために• 測定時TD多め／RG低め／ns多め／NUS禁⽌• 適切なmixing time (d8)、構造計算に⽤いる場合は75~100msecぐらい• FT時のLP禁⽌
実測ではないFIDを構築するNUS、LPは正しい距離情報にならないので使⽤禁⽌

Rovnyak et al., JMR, 2004, 170, 15-21
NUS測定データポイント
間引かれたFIDは他のFIDから推測する距離情報とするNOESYには、NUS (non-uniform_sampling)は使⽤禁⽌
18Appendix for LP-1. 3次元の測定時間(d1+0.2) sec * ns * td(F1) * td(F2) =d1=1sec, ns=8, td(F1)=64, td(F2)=128のとき、22時間程度である。
（このポイント数が測定時間の都合によるHNCOの現実的な上限）（HNCOは、td（F2）が15Nの軸、td（F1）は13Cʼの軸）もし、td(F2)を256まで上げると、測定時間は４倍の88時間となる。
主鎖帰属等のとき、３次元を複数セットで測定するためこれは⾮現実的。
19

Appendix for LP-2. td(F1)=64のときの分解能td(F1)=64(Agilentのniだと32)で測定した[1H-15N] HSQCtd(F1)=512で測定した[1H-15N] HSQC
当たり前だが、分解能が悪い。シグナルが⼀部で分離できていない

20

Appendix for LP-3. LP (linear prediction) を利⽤する

途中でtruncateしてしまったFID(15N軸)に対して、LP（linear prediction=線形予測）をFIDの後ろにかける。
FIDの波形が伸びて、デジタル分解能が上がる。

21

Appendix for LP-4. LP (linear prediction) 前後⽐較

LPにより予測した領域を含むFIDデータを使って、FTをする。
デジタル分解能が向上して、シグナルの分離が良くなっている。

22

Appendix for LP-5. LP vs 実測

実測データと遜⾊ない分解能！
23Appendix for LP-7. LPとdata height

LPをかけると、信号の多い領域に実測値との信号強度差が⽣じる

24

綺麗なNOESYスペクトルを得るために• 測定時TD多め／RG低め／ns多め／NUS禁⽌• 適切なmixing time (d8)、構造計算に⽤いる場合は75~100msecぐらい• FT時のLP禁⽌
実測ではないFIDを構築するNUS、LPは正しい距離情報にならないので使⽤禁⽌

デフォルト設定ではLPが⼊っているので注意！
25

ピークピックに努⼒と⼯夫をする• ノイズをピックしないようにする• 出現が予測される信号をあらかじめピックしておく（残基内等）

久⽶⽥, 稲垣, ⽣化学テクニカルノート, 2007, 79, 1, 55-60

A：予測信号をピックしてから短冊状にピークピックする
B：信号形状を判定し、ノイズは除去する

26

CYANA動作環境
LAシステムズから購⼊できる（研究室単位）
https://www.las.jp/products/s08_cyana/index.html

北キャンパスのクラスター環境
node31-40 (Pentium D 2.8GHz dual core x 10=20 cpu)
SUSE linux 10 (64 bit)intel fortran compiler 8.1.021
lam 7.0.6 / MPI 2
CYANA 2.1
node31にSSHログインして使⽤する（実演）27

CYANA input ﬁle例
init.cyalibrary情報、ファイル名の指定
既知構造情報（SSやω⾓、⾦属配位など）

CALC.cya

NOESYピークファイル指定、外部束縛情報指定（talos+の結果やhand.upl）
SA条件やサイクル構造の指定など

N_Cups7.seq

配列情報ファイル

N_Cups7.prot

化学シフト値情報ファイル

n.peaks

NOESYピークテーブル

dihed.aco, hand.upl

外部束縛情報ファイル

28

init.cya / CALC.cya
name:=N_Cups7
dyanalib
read seq $name.seq
ssbond 5-30
ssbond 9-26
ssbond 13-22
ssbond 29-62
ssbond 33-49
ssbond 35-47# Combined automatic NOE assignment and structure calculation
peaks:= nprot:= N_Cups7
constraints := hand.upl,dihed.aco
tolerance:= 0.03,0.02,0.3
calibration :=structures := 100,20
steps:= 10000
rmsdrange:= 2..62
seed:= 210003# names of peak lists# names of chemical shift lists# additional (non-NOE) constraints# chemical shift tolerances# NOE calibration parameters# number of initial, final structures# number of torsion angle dynamics steps# residue range for RMSD calculation# randum number generator seednoeassign peaks=$peaks prot=$prot #confine=1.5 combination=0

libraryは、デフォルトのdyana.libを読み込む
S-S結合のペアは、この残基ペアで６ヶ所
NOESYピークリストは、n.peaksのみを使う
化学シフトテーブルは、N_Cups.prot
外部束縛として、hand.uplとdihed.acoを使う
100個計算して、20個抜き出してcycleする
SAは10000段階で計算する
構造計算プロトコルは、noeassignで⾏う（オプションでautoacoも使うこともある）

29

N_Cups7.seq / N_Cups7.prot
ALA 1GLN
ILE
ASP
CYSS
ASP
LYS
GLU
CYSS
::

1
2
3
4
5
67
8
9

173.600 0.000
51.755 0.000
19.416 0.000
4.152 0.008
1.574 0.000
175.559 0.000
55.581 0.000
29.838 0.003
33.672 0.000
::

C 1
CA 1
CB 1
HA 1
QB 1C 2
CA 2
CB 2CG 2

配列ファイルは３⽂字表記っぽいものSSを作るCYSは、CYSSで表記
残基番号は、最初の⾏に必須
化学シフトテーブルはDYANA / XEASY書式
通し番号, 化学シフト値, SDev, 核名, 残基番号
Sparkyフォーマットの化学シフトテーブルから作成する（後述）30

n.peaks# Number of dimensions 3#FORMAT xeasy3D#INAME 1 N#INAME 2 H#INAME 3 HN#CYANAFORMAT NhH
1 106.478 7.158 8.437
2 106.526 1.243 8.437
3 106.526 1.634 8.437
4 106.526 2.013 8.437
5 106.526 2.348 8.437
6 106.526 3.111 8.4377 106.526 3.215 8.437
8 106.526 3.770 8.437
9 106.526 3.977 8.437
10 106.526 4.229 8.437
11 106.526 4.423 8.437
12 106.526 6.318 8.437
:
:

1 U
1 U
1 U
1 U
1 U
1 U
1 U
1 U
1 U
1 U
1 U
1 U

1.71e+05
3.59e+04
5.88e+04
4.23e+05
3.01e+05
1.50e+05
1.42e+05
2.73e+04
1.40e+06
6.80e+05
1.69e+06
2.16e+05

0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 0
0 e 000
0000000000000000000000000000000000

header領域で、indirect 1Hの軸なのか、direct 1Hの軸かを指定
Hがindirect 1H、HNがdirect 1HNhHでも指定。⼩⽂字のhがindirect 1H（作成⽅法は後述）
31

CYANAの実⾏準備１
init.cya / CALC.cya
雛形ファイルからテキスト編集で作成（cyana-2.1/demo/autoの下に雛形がある）
N_Cups7.seq
⼀⽂字書式のアミノ酸配列から作る
localhost> one2three.pl N_Cups7_one.seq > N_Cups7.seq

N_Cups7.seqを編集する
dihed.aco
talos+.tclの出⼒ファイル、pred.tabからdihed.tblを作成する
localhost> talos2cns2.pl 30 > dihed.tbl

dihed.tblをcyanaに読み込ませ、dihed.acoにて出⼒する
localhost> cyana
cyana> read xplor dihed.tbl
cyana> write aco dihed.aco

できあがったファイルは、CYANA_runs/N_Cups7/run00の下に置く
32

CYANAの実⾏準備２
化学シフトテーブル保存
rl -> update -> save (shifts)
NOESYピーク情報を保存
lt -> update -> save (nnoe_pre.list)
Sparkyを保存して終了
js -> qt
localhost> pre.sh

NOESYピークテーブルを保存
xe -> nnoe_pre、チェックボックス三つをonShow peak heights instead of volumes? / Include unintegrated peaks? / Include unassigned peaks?

-> Update -> Write Peaks (nnoe.peaks)
Sparkyを保存して終了
js -> qt
localhost> noe.sh33

pre.sh#!/bin/bash
spx_assign_check.pl shifts ;¥spx_pre2sparky.pl nnoe_pre.list > nnoe_p2.save ;¥spx_hand.pl *_hand.upl > hand.upl ;¥mv *_p2.save ../Save/. ;¥cd ../Save/ ;¥./spx_cat_sh.pl -p ;¥cd ../Lists ;¥noe.sh#!/bin/bash
export RUN_NAME=N_Cups7 ;¥spx_noe_cyana.pl -n nnoe.peaks 0 > ~/CYANA_runs/$RUN_NAME/run00/n.peaks ;¥cp cyana.prot ~/CYANA_runs/$RUN_NAME/run00/$RUN_NAME.prot ;¥cp hand.upl ~/CYANA_runs/$RUN_NAME/run00/. ;¥34

CYANAの実⾏
localhost> ssh kumeta@node31
node31> cd CYANA_runs/N_Cups7
node31> cp –r run00 run01
node31> cd run01
node31> cyanajob2 CALC

run00は随時、最新の⼊⼒ファイルが更新されていく場所
計算は、run01、run02...として、過去の計算結果も保存しておく
cyanajob2は、バックグラウンドでcyanaを実⾏するコマンド
そのため、画⾯上には計算経過が表⽰されないクラスターによる構造計算は10分から30分（普通は200分から600分）

計算途中では、.logや.angファイルが作成される（計算終了後、消える（たまに残る））
ﬁnal.ovwやﬁnal.pdbができていれば終了している。

35

CYANAの計算結果出⼒
CALC.out構造計算のログファイル

cycle1-7.noa

サイクルに⼊る前のNOE帰属情報

cycle0-7.upl
final.upl

noaをベースに作成した距離束縛情報（upper limit）
cycle0.uplは配列情報だけからの制限

cycle1-7.pdb
final.pdb

構造計算結果の抜き出された構造（default 20個）

cycle1-7.ovw
final.ovw

サイクルごとの計算結果の概要
violationやRMSDが記載されている

n-cycle7.peaks

cycle7（NOE帰属の最終サイクル）における帰属結果をピークテーブルに付記したもの

rama.ps

ラマチャンドランプロット

36

CYANAの計算出⼒の判定
計算過程を確認する
node31> cyanatable | tee output.tbl

最低条件

1. cycle 1 での平均 target function が 250 A2 以下
2. 最終構造での平均 target function が 10 A2 以下
3. 未帰属のNOE（without assignment）が 20% 以下
4. 不要になったlong range NOEが 20% 以下
5. cycle 1 での RMSD が 3 A以下
6. cycle 1 と cycle 7 での平均構造同⼠の RMSD が 3 A以下

この条件は古いバージョン⽤（CYANA v1.1⽤）なので、参考程度に。
4は、CYANA v2以降から不要になった条件。

37

CYANAの計算結果をSparky上で確認する
node31> c2s.sh
node31> cd ~/Sparky/Save
node31> spx_cat_sh.pl -c

Sparky上にて、nnoe_cya.saveを開く

c2s.sh#!/bin/bash
export RUN_NAME=N_Cups7 ;¥cyana2sparky.pl $RUN_NAME n-cycle7.peaks> ~/Sparky/Save/nnoe_c2.save ;¥38

CYANA tipscyana> qquit

cyana> readdata final.upl
cyana> seqplot
cyana> dcostat

seqplot.ps、dcostat.psの作成

cyana> read pdb final.pdb
cyana> read upl final.upl
cyana> read aco dihed.aco
cyana> cut_upl=0.3
cyana> cut_aco=1
cyana> structure violate 1

violationカウント

cyana> read upl final.upl
cyana> print $ndcdis(0)cyana> print $ndcdis(1)intra(0)とsequential(1)のカウント

39