日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 93, 45-50, 2019

胎生期上顎骨における神経提由来細胞の TGF-β1/β2 および BMP2/4 発現
鈴木淑美1

中12

嶋昭 1, 2本吉満 1, 2

日本大学歯学部歯科矯正学講座

日本大学歯学部総合歯学研究所臨床研究部門

要旨：BMP を含む TGF-β family は，骨形成成長のプロセスに非常に重要な働きがあると考えられている。胎生期の骨形成は，頭蓋神経提（CNC）由来細胞の間葉系細胞を含んでいるとされている。本研究の目的は，CNC 由来細胞が胎生期上顎骨の成長発育過程において，TGF-β1/2 および BMP2/4 発現との関連性を Wnt1-Cre/R26 Rマウスを使用し明らかにすることである。試料は，胎生 17 日の Wnt1-Cre/R26 R マウスを観察した。CNC 由来細胞の染色には Wnt1-Cre/R26 R におけるβ-gal 染色，および TGF-β1/β2 および BMP2/4 発現は免疫組織化学染色を行い，二重染色後の組織切片を観察した。その結果，CNC 由来細胞が，上顎骨を含む口蓋棚の間葉組織や骨周囲の間葉組織にも分布していることが明らかとなった。また，TGF-β1，TGF-β2 および BMP2/4 のタンパク発現は，上顎骨の分布と一致し，特に BMP2/4 は，骨周囲に認められた CNC 由来細胞にも発現していた。したがって，本研究結果から，Wnt1-Cre/R26 R マウスを使用し上顎骨の形成を評価することが可能となり，上顎骨および周辺間葉組織に，TGF-β1，TGF-β2 および BMP2/4 発現が強く関与することが明らかとなった。今後，Wnt1Cre/R26 R モデルを使用し，これらの細胞を特徴づけるシグナル伝達ついて骨形成のメカニズムを解明できる可能性が示唆された。
キーワード：TGF-β1/β2，BMP，頭蓋神経堤細胞，Wnt1-Cre/R26R，上顎骨成長緒組織構造の形成の一因となることが知られている 10-15）。

言CNC から派生した細胞は Rhombomere 1-4 の神経外胚

ト ラ ン ス フ ォ ー ミ ン グ 成 長 因 子（Transforming

葉細胞の形成に関与し，神経堤後方から中脳，前後方かgrowth factor, TGF）βおよびその family である骨形成

ら大脳を形成し，器官形成の過程で口蓋，すなわち上顎タンパク質（Bone Morphogenetic Protein, BMP）は，胎の間葉組織から骨に形質変化するのに関与する 10）。これ

生期の成長発育で重要な役割を担っている。TGF-βらの細胞がいくつかの異なる細胞分化し下流の転写制御はサイトカインとして知られ，主に TGF-β1，TGF-β2

因子に合図し様々な成長因子によって制御されることがおよび TGF-β3 の 3 つのアイソフォームが存在する 5）。

明らかにされている 14, 15）。

1-5）

TGF-β1 の conditional knock out mouse は，胎生 2 週

し か し， 胎 生 期 の 成 長 過 程 に お い て，β-gal 陽 性 のに炎症性浸透物による急速な消耗性症候群になり，生後CNC 細 胞 が ど の よ う に 上 顎 骨 を 形 成 し， そ の 過 程 で3-4 週間目に死亡する 6）。TGF-β2 null mutant mouse

TGF-β1，TGF-β2 および BMP1/2 の発現とどのようには周産期死亡し，その表現型は頭蓋および顔面，肺，肢，関与するについては明らかになっていない。したがって，脊柱，目，内耳と尿生殖器を含む広範囲にわたる発達上

本研究の目的は，Wnt1-Cre トランスジェニックモデルの欠陥を示す 7）。BMP も，サイトカインであり，成長因を使用し，β-gal 陽性である CNC 由来細胞が上顎の間葉子でもある

組織における骨成長形成において，どのように TGF-β1，。なかでも BMP2 および BMP4 骨芽細胞

1, 2）および骨細胞に発現しTGF-β2 および BMP2/4 が発現するかについて明らか， さ ら に，BMP2 お よ び1, 2）にすることである。

BMP4 の null mutant mouse は，骨欠損を促進することが明らかとなっている。このように，TGF-βおよび

8, 9）

材料および方法

BMP は，種々な骨形成もしくは破骨において大きな役割を担っていることが知られている 5, 9）。

1.

実験動物および組織切片

一方，頭蓋神経堤（Cranial  neural crest，CNC）細胞は，本研究には，Wnt1-Cre＋/－ マウス 16）および R26 R＋/－頭蓋および顔面の鰓弓に存在し，腹部へ移動する 10）。こ

マウス 17）を交配させた Wnt1-Cre/R26 R トランスジェ

れらの CNC 細胞は，各々の鰓弓から migration し，外ニ ッ ク マ ウ ス を 使 用 し た 18, 19）。Wnt1-Cre マ ウ ス と胚葉性の細胞形成に関与している 11）。さらに，これらのR26 R マウスについては，PCR にて遺伝子型の判定をCNC 細胞が移動して，頭部と頸部において広範囲に間葉行った 16, 17）。胎生 16 日から 17 日で口蓋の間葉組織から（受付：平成 31 年 4 月 17 日）〒 101‒8310 東京都千代田区神田駿河台 1‒8‒1345骨様組織の上顎骨の形成されることから，胎生 17 日目を行い比較した。CNC 由来細胞はβ-gal 陽性間葉組織細の凍結切片を作製し，染色を行い光学顕微鏡検査によっ胞として青色に染色されており，口蓋の間葉組織に存在て観察を行った。

した（図 1 A，C，E：矢印）。胎生 17 日の前方口蓋棚（図2.

1 A，B：矢印）では，上顎の間葉組織および骨周辺にβ-gal

Wnt1-Cre/R26 R モデルにおけるβ-galactosidase陽性細胞存在することが観察された。口蓋中央部（図 1（β-gal）染色Wnt1-Cre/R26 R を使用しβ-galactosidase（β-gal）染C, D：矢印）では中央部および側方部に骨様組織を認め，色 の 組 織 学 的 分 析 は， 上 記 の 理 由 に よ り 胎 生 17 日 の間葉組織および骨周辺に青色の強い発現を認めた。口蓋Sample を使用した。染色に使用した Sample は，β-gal

後方部分（図 1 E, F：矢印）においても間葉組織および骨活動のために凍結切片とし染色を行った。Hank’s周辺の細胞がβ-gal 陽性であった。上顎骨の骨形成活性solution（Gibuco）にて dissection を行い，その後，0.2%については，β-gal 陽性細胞を認めた同部位に ALP のGlutaraldehyde 溶 液 に 固 定 し， そ の 後 10% Sucrose-

強い発現を示した（図 1 B，D，F：矢印）。したがって，PBS，30% Sucrose-PBS の順に Soak し，OCT compound

上顎骨形成部位および周囲の細胞におけるβ-gal 陽性細に包埋した。組織切片は，Cryostat を用いて 10μm の胞は，ALP も強い発現を示していたことが明らかとなっ厚 さ で 凍 結 切 片 を 作 製 し た。 染 色 は 0.005% のた。

NP-40/0.01% のナトリウム・デオキシコール酸塩で洗っ

2． CNC 由来細胞における TGF-β1 発現18, 19）

たあと，β-gal 染色溶液（5 mM のフェリシアン化カリウ

図 2 に Wnt1-Cre/R26 R トランスジェニックマウスに

ム，5 mM の フ ェ ロ シ ア ン 化 カ リ ウ ム，2 mM MgCl，

お け るβ-gal 染 色 お よ び TGF-β1 発 現 を 示 し た（ 図 24% の X-galactosidase（Sigma））にて着色を行った 18, 19）。

A-D）。上顎骨には，CNC 由来細胞のβ-gal 陽細胞が存染色後，3.7% のホルムアルデヒドで後固定した。

在し，TGF-β1 発現も認められた（図 2 C，D）。しかし，

3.

上顎骨周囲間葉組織のβ-gal 陽性細胞には，TGF-β1 のアルカリホスファターゼ（ALP）染色
ALP 染色に使用するサンプルは，4% のパラホルムア発現は認められなかった（図 4 F）。したがって，主に骨ルデヒドにて固定し，OCT compound 包埋を行った後，細胞へ形質変換後の CNC 由来細胞について TGF-β1 のCryostat を用いて組織切片を作製した。切片は同様に発現を認めたことが明らかとなった。

10μm の厚さの凍結切片を使用し，PBS で洗浄後，アル3． CNC 由来細胞における TGF-β2 発現コールにより脱水を行った。その後，切片は 4% のパラ

Wnt1-Cre/R26 R トランスジェニックにおける CNCホルムアルデヒドにて固定し，1 時間 Blocking buffer

由来細胞のβ-gal 陽性の標識化および TGF-β2 の免疫染（Roche）を行った後，30 分間 NTMT（Roche）で処理後，色法による標識化の結果を図 3 A-D に示した。その結果，30 分の間 ALP 染色を行った 20）。

上顎骨に認められたβ-gal 陽性細胞の CNC 由来細胞は，4.

強い TGF-β2 を認めた（図 3 C，D）。上顎骨周囲の間葉

β-gal および FITC 蛍光免疫染色の二重染色組織よりはβ-gal 陽性を示し，上顎骨への発現が強い傾

Wnt1-Cre/R26 R トランスジェニックマウスを使用したβ-gal および FITC 蛍光免疫染色の二重染色法につい向を示した（図 3 C，D）。て以下に記す 21）。前述と同様に，β-gal 染色を行った後，4.

CNC 由来細胞における BMP2/4 発現

クエン酸塩 buffer（2% のクエン酸溶液，8% のクエン酸

Wnt1-Cre/R26 R トランスジェニックマウスを使用し，ナトリウム溶液；pH6.0）で 30 秒処理を行った後，PBS

CNC 由来細胞を標識するβ-gal 染色および BMP2/4 のにて洗浄し，1 次抗体（anti-TGF-β1, anti-TGF-β2, anti-

蛍光免疫染色の結果を図 4 A-D に示した。CNC 由来のBMP2/4（Santa Cruz biotechnology）を反応させ，FITCβ-gal 陽 性 細 胞 は， 上 顎 骨 を 含 む 間 葉組 織 に 認 め ら れの 2 次 抗 体 に て 発 色 し た。 抗 体 は 520 nm の 波 長 の（図 4 A，B），二重染色の結果では，β-gal 陽性 CNC 由Filter の蛍光顕微鏡を使用し観察を行った。なお，β-gal来細胞に強い BMP2/4 を認めた（図 4 C，D）。TGF-β1/2

染色は白色光にて撮影を行い，蛍光免疫染色の画像と重と比較すると BMP2/4 の発現は上顎骨全体に分布し強いね合わせを行い CNC 由来細胞の TGF-β1, TGF-β2 お発現を示した（図 2-4 E, F）。

よび BMP2/4 発現の観察を行った。

結1.

考果

察

胎 生 期 上 顎 骨 の 成 長 過 程 に お い て，CNC 細 胞 のmigration 分布および機能を明らかにするため，β-gal

胎生期上顎骨における CNC 由来細胞の分布
胎生 17 日目の上顎骨の骨発達は，CNC 由来細胞を特染 色 お よ び ALP 染 色， さ ら に TGF-β1，TGF-β2，定するため Wnt1-Cre/R26 R 染色（図 1 A：前方部，C：BMP2/4 の免疫組織化学染色を行い観察した。本研究結中央部，E：後方部）および骨形成の活性化を標識するた果により，上顎における間葉細胞の多くは CNC 細胞由め ALP 染色（図 1 B；前方部，D：中央部，F：後方部）

来 し， こ の 間 葉 組 織 の 一 部 は TGF-β1，TGF-β2，46

神経提由来細胞の TGF-βおよび BMP 発現

BMP2/4 の発現により，上顎骨の形成が行われることがは表現型として口蓋裂をはじめ免疫機能，心臓と肺につ明らかとなった。

いての形成不全を示す 6）。TGF-β2 は口蓋上皮および間Wnt1-Cre/R26 R トランスジェニックマウスの口蓋に葉組織に発現を認め，骨形成にも関与していることが明認められたβ-gal 陽性間葉組織細胞は，CNC 由来細胞をらかになっており，TGF-β2 knock out mouse におい

標識している。胎生 17 日目の上顎骨を形成する口て，細胞成長，extracellular matrix の生産と組織リモ

蓋 は， こ れ ら のβ-gal 陽 性 CNC 由 来 細 胞 が， 前 方 部，デリングについて negative な影響を示し，四肢，脊柱，中央部，および後方部のすべての部分で骨組織周囲の間尿生殖器，目，内耳と頭蓋および顔面の欠陥を表現型と葉細胞で，強い ALP 活性があったことから，骨周囲のして生じる 7）。BMP には胎生期の器官形成に重要とさ間葉組織から骨細胞組織へ形質変換されていることが示

れ 1, 2），骨における mineralization 機能があることが知唆された。

られている 22, 23）。BMP2-/- マウスは，wild type のマウ

18, 19）TGF-β1 は，口蓋棚における上皮および間葉組織両方スより脆弱な皮質骨であることが明らかとなっている 8）。に発現され，上皮―間葉の interaction に関与しているこ

また，BMP は骨芽細胞の分化とその骨形成作用を増強とが明らかになっている 22）。TGF-β1 knock out mouse

し，軟骨細胞への分化を促進するとされている 22-25）。し

図1β-gal/ALP
胎生 17 日における Wnt1-Cre/R26 R トランスジェニックマウスの上顎骨を含む口蓋間葉組織に認められたβ-gal 染色および ALP 活性についての観察（A-F）。口蓋棚における上顎の前方部（A：β-gal 染色，B：ALP 染色），中央部（C：β-gal 染色，D：ALP 染色），後 方 部（E：β-gal 染 色，F：ALP 染 色 ）を 示 し た。 上 顎 骨 お よ び 骨 周 囲 の 間 葉 組 織 はβ-gal 陽性細胞を示し（A，C，E：矢印），CNC 由来のβ-gal 陽性細胞は ALP 活性を有することが示された（B，D，F：矢印）（Scale bar：50μm）。

47

図2

TGF-β1 expressions
胎生 17 日の上顎骨を含む口蓋棚におけるβ-gal 染色および TGF-β1 発現（A-D）。上顎骨には，CNC 由来細胞のβ-gal 陽細胞が存在し（A，B），二重染色の結果，β-gal 陽細胞はTGF-β1 発現を認めた（C，D）。上顎骨周囲間葉組織のβ-gal 陽性細胞には，TGF-β1 の発現を認めなかった（D）（Scale bar：50μm）。

図3

TGF-β2 expressions
胎生 17 日の上顎骨を含む口蓋棚におけるβ-gal 染色および TGF-β2 発現（A-D）。Wnt1Cre/R26 R トランスジェニックにおける CNC 由来細胞のβ-gal 陽性細胞は上顎骨および骨周辺の間葉組織に認められ（A，B），二重染色の結果，β-gal 陽性細胞は強い TGF-β2発現を認めた（C，D）。上顎骨周囲の間葉組織よりはβ-gal 陽性を示し，TGF-β2 発現は上顎骨組織のみに認められた（C，D）（Scale bar：50μm）。

48

神経提由来細胞の TGF-βおよび BMP 発現

図4BMP expressions
胎生 17 日の上顎骨を含む口蓋棚におけるβ-gal 染色および BMP2/4 発現（A-D）。CNC由来細胞を標識するβ-gal 染色および BMP2/4 の蛍光免疫染色の結果を A-D に示した。
CNC 由来のβ-gal 陽性細胞は，口蓋棚の上顎骨を含めた間葉組織に認められ（A，B），二重染色の結果，β-gal 陽性 CNC 由来細胞には強い BMP2/4 発現を認めた（C，D）（Scalebar：50μm）。

た が っ て， 本 研 究 結 果 に お い て，CNC 由 来 細 胞 が遺伝子発現マーカーの二重染色により発育過程の間葉細migration を行い，上顎骨において，主要な骨モデリン胞の機能と遺伝子発現分布を識別するのに用い TGF-β1

グ を 行 う 過 程 で TGF-β お よ び BMP の 発 現 が あ り，および BMP のシグナル伝達を明らかにできる可能性が

TGF-β1/2 は主に骨形成後の成長過程の骨リモデリング示唆された。に関与していることが示唆された。BMP2/4 については，上顎に認められる口蓋間葉組織，上顎骨周囲の間葉組織

稿 を 終 え る に あ た り， 本 研 究 に 対 し ジ ャ ク ソ ン 研 究 所 にWnt1-Cre マウスと R26 R-Cre マウス（ジャクソン研究所よりライセンス許可）を提供していただいた事に対し感謝いたします。
また，本研究に使用した Wnt1-Cre/R26 R マウスは，南カリフォ
ルニア大学動物倫理委員会で承認されたマウスであり，同大学のYang Chai 教授および Charles F Shuler 教授，ならびに南カリ
フォルニア大学 Center for craniofacial molecular biology，日本
大学歯学部歯科矯正学講座の皆様に深く感謝の意を表します。なお，本研究の一部は，文部科学省科学研究費（C）16592055 によって行われました。
本研究に関して利益相反はありません。

および骨に広く分布し，主に骨形成に関与していることが示唆された。したがって，これらの CNC 由来の間葉組織が，TGF-βおよび BMP 発現を有し成長過程で重要な役割があることが明らかとなった。本研究結果は，神経堤から誘導された CNC 由来の細胞についても TGFβ/BMP のシグナル伝達があることを示唆し，さらにTGF-β/BMP 発現が CNC 由来の細胞が骨形成分化に強い役割を担っている可能性が示唆された。
本研究は，上顎骨に存在する細胞および口蓋間葉組織における骨周囲の CNC 由来細胞の分布を明らかにし，文

Wnt1-Cre/R26 R トランスジェニックモデルを用いて，
β-gal 陽 性 細 胞 と TGF-β1，TGF-β2 お よ び BMP2/4

献1）Graff JM, Thies RS, Song JJ, Celeste AJ, Melton DA(1994) Studies with a Xenopus BMP receptor suggestthat ventral mesoderm-inducing signals override dorsal
signals in vivo. Cell 79, 169-179.
2）Graham A, Francis-WP, Brickell P, Lumsden A (1994)
The signaling molecule BMP4 mediates apoptosis in therhombencephalic neural crest. Nature 372, 684-686.

発現とを重ね合わせ観察した結果，上顎の間葉組織および骨を囲む間葉組織および上顎骨は TGF-β1，TGF-β2および BMP2/4 の発現を有しており，CNC 由来細胞の分化に深く関与している可能性が示唆された。今後は，
Cre-lox システムで示された恒久的な細胞のマーカーと49

3）Chai Y, Ito Y, Han J (2003) TGF-β signaling and its
functional significance in regulating the fate of cranial
neural crest cells. Crit Rev Oral Biol Med 14, 78-88.  
4）Ito Y, Yeo JY, Chytil A, Han J, Bringas P Jr, Nakajima
A, Shuler CF, Moses HL, Chai Y (2003) Conditional
inactivation of Tgfbr2 in cranial neural crest causes
cleft palate and calvaria defects. Development 130, 52695280.
5）Nakajima A, F Shuler C, Gulka AOD, Hanai JI (2018)
T G F -β s i g n a l i n g a n d t h e e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a ltransition during palatal fusion. Int J Mol Sci 19, E3638.
6）Kulkarni AB, Ward JM, Yaswen L, Mackall CL, Bauer
SR, Huh CG, Gress RE, Karlsson S (1995) Transformingg r o w t h f a c t o r -β1 n u l l m i c e . A n a n i m a l m o d e l f o r
inflammatory disorders. Am J Pathol 146, 264-275.
7）Sanford LP, Ormsby I, Gittenberger-de Groot AC, Sariola
H, Friedman R, Boivin GP, Cardell EL, Doetschman T(1997) T G F b e t a2 k n o c k o u t m i c e h a v e m u l t i p l edevelopmental defects that are non-overlapping withother TGFbeta knockout phenotypes. Development 124,2659-2670.
8）Nie X, Luukko K, Kettunen P (2006) BMP signalling incraniofacial development. Int J Dev Biol 50, 511-521.
9）M c B r i d e - G a g y i S H , M c K e n z i e J A , B u e t t m a n n E G ,Gardner MJ, Silva MJ (2015) Bmp2 conditional knockoutin osteoblasts and endothelial cells does not impair boneformation after injury or mechanical loading in adultmice. Bone 81, 533-543.
10）Osumi-Yamashita N, Noji S, Nohno T, Koyama E, Doi H,Eto K, Taniguchi S (1990) Expression of retinoic acidreceptor genes in neural crest-derived cells during
mouse facial development. FEBS Lett 264, 71-74.
11）N o d e n D M (1983) T h e r o l e o f t h e n e u r a l c r e s t i npatterning of avian cranial skeletal, connective, andmuscle tissues. Dev Biol 96, 144-165.
12）Serbedzija GN, Bronner-Fraser M, Fraser SE (1992) Vital
dye analysis of cranial neural crest cell migration in themouse embryo. Development 116, 297-307.  
13）Bronner-Fraser M (1993) Mechanisms of neural crest
migration. Bio Essays 15, 221-230.

14）Selleck MAJ, Scherson TY, Bronner-Fraser M (1993)
Origins of neural crest cell diversity, Dev Biol 159, 1-11.
15）Lumsden A, Krumlauf R (1996) Patterning the verbrateneuraxis. Science 274, 1109-1115.
16）Danielian PS, Muccino D, Rowitch DH, Michael SK,McMahon AP (1998) Modification of gene activity inmouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible formof Cre recombinase. Curr Biol 8, 1323-1326.
17）Soriano P (1999) Generalized lacZ expression with theROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet 21, 70-71.
18）Jiang X, Rowitch DH, Soriano P, McMahon AP, Sucov
HM (2000) Fate of mammalian cardiac neural crest.
Development 127, 1607-1616.
19）Chai Y, Jiang X, Ito Y, Breingas P, Han J, Rowitch DH,Soriano P, McMahon AP, Sucov HM (2000) Fate of themammalian cranial neural crest during tooth andmandibular morphogenesis. Development 127, 1671-1679.  
20）Fishman WH (1990) Alkaline phosphatase isozymes:
Recent progress. Clin Biochem 23:99-104.
21）Nakajima A, Tanaka E, Ito Y, Maeno M, Iwata K,Shimizu N, Shuler CF (2010) The expression of TGF-β3for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE inpalatogenesis. J Mol Histol 41, 343-355.
22）Wu M, Chen G, Li YP (2016) TGF-β and BMP signalingin osteoblast, skeletal development, and bone formation,
homeostasis and disease. Bone Res 26, 4:16009.
23）Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, Bauduy M, CordesP, Harada T, Israel DI, Hewick RM, Kerns KM, LaPan P(1990) Recombinant human bone morphogenetic protein
induces bone formation. Proc Nat Acad Sci U S A 87,2220-2224.
24）Engstrand T, Daluiski A, Bahamonde ME, Melhus H,L y o n s K M (2000) T r a n s i e n t p r o d u c t i o n o f b o n emorphogenetic protein 2 by allogeneic transplanted
transduced cells induces bone formation. Hum Gene
Ther 11, 205-211.
25）Kanzler B, Foreman RK, Labosky PA, Mallo M (2000)
BMP signaling is essential for development ofskeletogenic and neurogenic cranial neural crest.
Development 127, 1095-1104.

50