日大歯学 , 95（1）, 1-5, 2021

原著

Propiece IL-1α の細胞内の局在と細胞障害による細胞外放出佐々木秀人

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 応用口腔科学分野（指導：浅野正岳 教授）

要旨【目的】 Precursor interleukin-1α（pIL-1α ）は細胞内でカルパインなどの酵素により，N 末端側の propieceIL-1α（ppIL-1α ）と C 末端側の mature IL-1α（mIL-1α ）に切断される。本研究では ppIL-1α の細胞内における核局在を確認し，酸化ストレス下で ppIL-1α が細胞外に放出されるか否かについて検討した。
【方法】 核 局 在 に つ い て は，ppIL-1α に green fluorescence protein（GFP）を 付 加 し た 発 現 ベ ク タ ー をtransfection することにより検討した。また，ppIL-1α の細胞外放出については，ppIL-1α の N 末端に HiBiT 配列を付加し，Promega 社製 Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System を用いて測定した。
【結果】 PpIL-1α は主に核内に局在することを確認した。また，核内の ppIL-1α は酸化ストレスにより一部が細胞外に放出された。ppIL-1α の放出率は mIL-1α に比較して低かったものの，pIL-1α とは同程度を示すことが明らかとなった。
【結論】 PpIL-1α は無刺激の状態では核内に局在し，酸化ストレスなどの細胞障害に応じて細胞外に放出され，alarmin としての性質を有していることが明らかとなった。
キーワード：IL-1α ，alarmin，細胞障害

Cell damage-associated propiece interleukin-1α release
Hideto Sasaki
Nihon University Graduate School of Dentistry,
Major in Applied Oral Sciences(Director: Prof. Masatake Asano)

Abstract[Purpose] The precursor interleukin-1α (pIL-1α ) is cleaved by the protease calpain to generate N-terminal
propiece IL-1α (ppIL-1α ) and C-terminal IL-1α . The purpose of the present study was to confirm the nuclear
localization of ppIL-1α . The release of ppIL-1α under oxidative stress condition was also investigated.
[Methods] Nuclear localization of ppIL-1α was examined by transfecting green fluorescence protein (GFP) tagged ppIL-1α expression vector to HeLa cell. For extracellular release, HiBiT-tag was added to theN-terminus of p, m and ppIL-1α . The released protein was measured by detecting the HiBiT activity with
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System (Promega).
[Results] The GFP-ppIL-1α was mainly localized in the cell nucleus at the resting state. In response tohypoxic stress, ppIL-1α was released extracellular space. The release efficiency was less than that of mIL-1α
but almost identical to pIL-1α .
[Conclusion] The nuclear localization of ppIL-1α in its resting state was confirmed. As ppIL-1α wasreleased to the extracellular space in response to oxidative stress, ppIL-1α was demonstrated to function as
an alarmin.
Keywords: IL-1α , alarmin, cell damage（受付：令和 2 年 12 月 9 日）
責任著者連絡先：浅野正岳
日本大学歯学部病理学講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8124,
FAX：03-3219-8340
E-mail：asano.masatake@nihon-u.ac.jp1

日大歯学緒第 95 巻第 1 号

言材料および方法Interleukin（IL）-1α は IL-1 ファミリー分子群の中で，細胞IL-1βと共に最初に発見された分子である 1）。それぞれ実験にはヘルスサイエンス研究資源バンクより購入し異なる遺伝子によりコードされ ，アミノ酸レベルでのた，ヒト子宮癌由来線維芽細胞である HeLa を用いた。

相同性は僅かに 27% である。しかし，共通したレセプター細胞の培養は 10% ウシ胎児血清を添加した Dulbecco'sを介してシグナル伝達を行い，両者共に細胞内では前駆minimum essential medium にペニシリン・ストレプト体として産生されたのち，酵素的に処理され（図 1），成マイシンを添加したものを用いた。

2）熟型分子として細胞外に分泌され ，さらに，いわゆる
3）発現 plasmid の構築と transfection

leader peptide を持たず，一般的な分泌タンパク質が辿る小胞体 - ゴルジ装置を経由せずに分泌されるなどの共Sata ら 8）に よ り 作 成 さ れ た 発 現 ベ ク タ ー（pcDNA-通点を有している 4）。IL-1βが炎症性サイトカインとし

pIL-1α ，pcDNA-mIL-1α および pcDNA-ppIL-1α vector）てその多彩な機能を発揮するのに対して，IL-1α は細胞を鋳型として，quick change site-directed mutagenesis

が障害を受けた時に分泌される分子として知られていkit（Agilent，Santa Clara，CA，USA）を用いて N 末端る。こうした分子は alarmin と総称され 5），周囲の細胞・に HiBiT 配列を付加した。この発現ベクターを HiBiT-組織に，自身の置かれた危機的状況を知らしめる分子と

pIL-1α ，HiBiT-mIL-1α および HiBiT-ppIL-1α vector

されている。

（図 2）として 3 種のヒト IL-1α 分子の細胞外放出についIL-1α は約 34 kDa の前駆体（precursor IL-1α；pIL-1α ）て検討する実験に用いた。また，pEGFP vector およびとして産生され，Ca2+ 依存性タンパク質分解酵素である

pEGFP-ppIL-1α vector 8）は細胞内局在を検討するためカルパインにより分子のほぼ中央部分を切断され，N 末の実験に用いた。

端側の propiece IL-1α（ppIL-1α ）と C 末端側の mature

T r a n s f e c t i o n は，L i p o f e c t a m i n e 3000（T h e r m oIL-1α（mIL-1）に 分 離 す る 。 ま た pIL-1α は natural

Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）を用いて行った。

6）

killer cell や好中球などが有する granzyme B（GzmB）なす な わ ち， そ れ ぞ れ の plasmid 125 ng を OPTI-MEM

どによっても分解されることが明らかとなっている 7）。

（25μL）（Thermo Fisher Scientific）に 溶 解 し，3000

このようにして産生された mIL-1α は，細胞外に分泌さReagent（1μL）（Thermo Fisher Scientifi c）と混和した。

れ サ イ ト カ イ ン と し て 機 能 す る が，ppIL-1α お よ び

一 方，Lipofectamine 3000（0.75μL） を OPTI-MEM

pIL-1α は分子内に存在する nuclear localizing sequence（25μL）に溶解した。両溶液を混合し，室温で 15 分間反（NLS）（ 図 1）のために，核内に局在するとされている 3）。

応させた。反応後培養液に添加し，細胞と共に 18 時間

IL-1α 分子内の NLS の 7 アミノ酸配列は，動物種間で高培養した。

い相同性を有している。
本研究では IL-1α の 3 種類の分子種のうち ppIL-1α に着目し，その分子の核内局在を確認するとともに，酸化ストレスによる細胞障害に際して，細胞外に放出されるか否かという点について検討した。

図1

IL-1α の構造
IL-1α は pIL-1α として細胞内で産生されたのち，カルパインなどにより分子のほぼ中央部を酵素的に切断され，N 末端側の ppIL-1α と C 末端側の mIL-1α に分離される。図中の数字はアミノ酸の位置を示す。黒バーは NLS を示す。

図22

実験に用いた発現 vector
哺 乳 動 物 の 発 現 ベ ク タ ー で あ る pcDNA に a）pIL-1α ，b）mIL-1α および c）IL-1α を挿入した。それぞれの N 末端部に quick change site-directed mutagenesis kit を用いてHiBiT 配列を添加し，細胞外放出実験に用いた。

propiece IL-1 α の細胞外放出

ppIL-1α の核局在の確認

令和 3 年 6 月

結

24-well plate に 直 径 10 mm の cover slip を 入 れ，HeLa 細胞を 5 × 104/well にて播種した。Transfection1.

果

ppIL-1α の細胞内局在後，cover slip 上の細胞を phosphate buffer saline（PBS）

ppIL-1α の細胞内局在について N 末端に GFP を付加により洗浄した後，4% パラホルムアルデヒド溶液に浸し た plasmid を 用 い て 検 討 し た。 そ の 結 果，pEGFP-

漬 し， 室 温 で 10 分 間 固 定 し た。PBS に よ り 洗 浄 後，

ppIL-1α を transfection した細胞では，核内に強い蛍光DAPI-fluoromount-G（SouthernBiotech，Birmingham，が検出された（図 3，上段）。すなわち ppIL-1α の発現は，AL，USA）を用いて封入した。Transfectant の観察およ

DAPI 陽性の細胞核に見られ，merge 像では青緑色の蛍び画像の撮影はオールインワン蛍光顕微鏡（BZ-X810，光として確認された。また，ppIL-1α は細胞質内にも弱キーエンス，大阪）を用いて行った。

く diffuse に認められた（図 3，上段）。一方，GFP のみを発現させた細胞では，細胞質全体に蛍光が観察され，3 種の IL-1α の細胞外放出

核のみに局在する様な所見は見られなかった（図 3，下段）。

48-well plate に播種した HeLa 細胞（5 × 104/well）に2.

3 種の IL-1α 発現 plasmid を transfection した後，1μM

酸化ストレスが ppIL-1α の局在に及ぼす影響

H2O2 存在下または非存在下（コントロール）に 3 時間培養

ppIL-1α の細胞内局在が，酸化ストレスによる細胞障した。培養後，培養上清を回収した。培養 dish 上の細胞害 で ど の よ う に 変 化 す る か を 検 討 し た。 す な わ ちを PBS に よ り 洗 浄 し， 細 胞 溶 解 液（50 mM Tris-HCl,transfectant を 1μM の H2O2 で処理し，処理前後におけpH7.5, 150 mM NaCl，0.5% TritonX-100）を加え，氷上る 蛍 光 の 変 化 に つ い て 観 察 し た。 そ の 結 果，pEGFP-で 3 分間反応させた後回収した。それぞれのサンプル中

ppIL-α transfectant において，DAPI の蛍光強度には変の蛍光活性を Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System化が認められなかったが，GFP の蛍光はほぼ完全に消失（Promega，Madison，WI，USA）により測定した。蛍した（図 4）。

光の測定にはルミノメーター（GloMax 20/20，Promega）

3.

を用いた。

酸化ストレスが IL-1α の放出率に及ぼす影響
H2O2 処理による酸化ストレスにより GFP-ppIL-1α が細胞外に放出されることが示されたため，細胞外に放出統計学的解析される ppIL-1α の定量をした。すなわち，図 2 に示した放出率は，［ 培養上清中の HiBiT 活性 /（ 細胞溶解液中plasmid を用いて ppIL-1α の放出率を算出し，pIL-1α おの HiBiT 活性 + 培養上清中の HiBiT 活性）］× 100 としよび mIL-1α の放出率と比較した。その結果，図 5 に示て算出し，H2O2 処理の有無における放出率の有意差はし た 通 り，ppIL-1α は 54.1 ± 23.5％，pIL-1α は 52.5 ±χ² 検定を使用した。p ＜ 0.05 を有意差ありとした。

9.7%，mIL-1α は 68.4 ± 18.8％であったが，これら 3 種

図4
図3ppIL-1α の細胞内局在
pEGFP-ppIL-1α（ 上 段 ）vector お よ び pEGFP（ 下 段 ）をtransfection し，細胞内局在について検討した。ppIL-1α は核に局在している。
スケール：20μm

3酸化ストレス下での ppIL-1α の細胞内局在の変化
pEGFP-ppIL-1α vector を transfection し た 後， 細 胞 を1μM の H2O2 存在下（＋）または非存在下（－）で培養し，細胞内局在の変化について検討した。核内の蛍光強度は酸化ストレスを加えることにより消失した。
スケール：10μm日大歯学

第 95 巻第 1 号の IL-1α 放出率には有意な差は認められなかった。一方，

究 で は ppIL-1α に GFP を 結 合 さ せ た plasmid をいずれの放出率もコントロールと比較して，酸化ストレtransfection することにより細胞内局在について検討し，スによる有意な上昇が認められた（図 5）。

考ppIL-1α が核内に局在することを確認した。また，H2O2に よ る 酸 化 ス ト レ ス 下 で は， 核 内 に 局 在 し て い た

察ppIL-1α の 大 部 分 が 消 失 し た。 こ の こ と は IL-1α が細胞が障害を受けたときに細胞外に放出される物質はalarmin として機能しており，その N 末端部分を構成す

alarmin と呼ばれ，IL-1α や high mobility group box-1

る ppIL-1α も同様に alarmin として機能することを示すなど様々な分子がある 5）。これらは，分子内に DNA 結も の で あ っ た。 ま た，ppIL-1α の 細 胞 外 放 出 率 を，合領域を有すること，細胞内で precursor として産生さ

HiBiT 法により定量したところ，mIL-1α よりは低いもれること，また多くの細胞に恒常的に産生されることなのの，pIL-1α とは有意な差が認められなかった。前述のどの共通点を持っている 。

とおり，ppIL-1α は細胞外でも生じる可能性があり，こ5）IL-1α は細胞内で分子量約 34 kDa の前駆体として産生の結果と考え合わせると，ppIL-1α の細胞外機能の検討されたのち，酵素的に分解され，ppIL-1α と mIL-1α には 極 め て 重 要 で あ る と 考 え る。Sata ら 8）は， ヒ ト

分離する 3）。mIL-1α はサイトカインとして細胞外で機ppIL-1α の N 末端にヒスチジン tag を付したリコンビナ能するが，pIL-1α も細胞の壊死などに伴って細胞外に放ントタンパク（His-ppIL-1α ）を作製し，これで免疫する

出され，ともに共通のレセプターに結合し，IL-6 などのことにより ppIL-1α を認識する抗体を得ている。ここでサイトカイン産生を誘導することが明らかになってい用いた His-ppIL-1α を種々の培養細胞に作用させ，サイる 。しかし，酵素的切断後に生じる ppIL-1α の機能に

ト カ イ ン 産 生 の 有 無 を 網 羅 的 に 解 析 す る こ と に よ り，ついては全く報告がない。IL-1α を切断する酵素はカルppIL-1α の細胞外機能の検討が可能であると考えてい9）パイン や GzmB など がある。このうち GzmB は好中る。本研究では，酸化ストレス下での ppIL-1α の放出に球などで産生され，細胞外に分泌されることが明らかについて検討したが，この他に細胞に障害を与える刺激となっており，細胞外に放出された pIL-1α が GzmB などしては，温熱刺激，低酸素状態などがある。これらの刺と会合し，細胞外で ppIL-1α が産生される可能性もある。

激に対する放出率を比較することは，IL-1α の 3 分子種

6）7）pIL-1α および ppIL-1α は NLS を有しており，このたの個別の機能解析のために有用であると考える。
Cohen らは 10）細胞障害によって DNA 損傷が生じたとめ細胞内では主に核内に存在するとされている 。本研
3）

きに，pIL-1α が損傷を受けた染色体 DNA 上に集積し，さらに細胞外に放出されることにより alarmin としての機能を果たすとしている。このことから，pIL-1α をストレスに伴って放出される分子であるとし，stressorin という用語を用いることを提唱している 11）。本研究では，酸化ストレス下で ppIL-1α が核内の特定部位に集積するような結果は得られなかった。
本 研 究 の 結 果， 細 胞 障 害 に よ り pIL-1α と 同 様 に
ppIL-1α も細胞外に放出され，その放出率も pIL-1α に匹敵するものであることが判明した。ppIL-1α の細胞外機能の追究は，alarmin の制御を可能にし，これを様々な病態の改善に応用できる可能性があり，意義深いものと考える。

結図5ppIL-1α の細胞外放出率
HeLa 細胞に HiBiT-mIL-1α（m），HiBiT-ppIL-1α（pp）および HiBiT-pIL-1α（p）vector を transfection した後，細胞を1μM の H2O2 存在下（黒バー）または非存在下（白バー）で 3 時間培養した。培養後，上清と細胞溶解液を回収し，Nano-Glo
HiBiT Lytic Detection System を用いて放出率を定量化した。独立した実験を 5 回行い，結果は平均値±標準偏差により表した。
χ ² 検定により統計処理を行い，p ＜ 0.05 を有意差ありと判定した（*）。

論

酸化ストレスのない状態では核内に局在する ppIL-1αは，酸化ストレスによって細胞外に放出されることが明らかになった。このことから，ppIL-1α は alarmin として機能すると推測された。
本研究の推進にあたり，日本大学歯学部病理学講座 浅野正岳教授および講座員の皆様にご指導頂いた。ここに深甚なる感謝の意を表する。本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

4propiece IL-1 α の細胞外放出文

令和 3 年 6 月

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