日大歯学 , 96（1）, 1-9, 2022

原著

転写因子 TFAP2E の発現抑制が誘導する口腔扁平上皮癌細胞の遺伝子発現変化
酒 井
嶺 1,2
清 水 なつ生 1,7
本 吉
満 8,9
1

藤
大
外

恭
晶
守

子 3,4
子 3,4
雄 6,10永 島 利 通 5,6
佐 藤 秀 一 2,7
髙 橋 富 久 3,4

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 応用口腔外科学
2

日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座
3

4
5

原
橋
木

日本大学歯学部解剖学第Ⅰ講座

日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態学部門

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 口腔構造機能学分野
67日本大学歯学部口腔外科学第Ⅰ講座

日本大学歯学部総合歯学研究所高度先端医療研究部門
8

日本大学歯学部歯科矯正学講座

9

日本大学歯学部総合歯学研究所臨床研究部門

10

日本大学歯学部総合歯学研究所生体防御部門

要旨：
目的：転写因子 activator protein-2 epsilon をコードする TFAP2E は，神経系や軟骨の発生に必要な分子であり，また，その一方で癌抑制遺伝子としても注目されている。しかし，TFAP2E の詳しい作用機序はほとんど明らかにされていない。本研究では，TFAP2E の機能を解明するための一助とし，ヒト歯肉癌由来株化細胞 Ca9-22 にTFAP2E shRNA を導入して，得られたクローン（shTFAP2E-1，shTFAP2E-2）とコントロールクローンの間で発現レベルの異なる遺伝子を同定した。
方法：網羅的な遺伝子解析はマイクロアレイで，遺伝子発現については real-time PCR によって検討した。さらに，
enrichment 解析は DAVID functional annotation tool を利用した。
成績：shTFAP2E-1 において 2 倍以上の発現上昇がみられた遺伝子を 110 個，また 171 個の発現が低下した遺伝子を同定した。shTFAP2E-1 で発現低下を示した遺伝子は PI3K-Akt signaling pathway に含まれ，このうち
RERG と CDKN1A を絞り込んだ。どちらも shTFAP2E-1 と shTFAP2E-2 の両方で，顕著な発現低下が認められた。
結論：RERG と CDKN1A が TFAP2E の標的分子であり，TFAP2E の癌抑制遺伝子としての機能と関連している可能性が示された。
キーワード：TFAP2E，口腔扁平上皮癌，RERG，CDKN1A

Effect of TFAP2E knockdown on gene expression in oral squamous cell
carcinoma cells
Ryo Sakai1,2, Kyoko Fujiwara3,4, Toshimichi Nagashima5,6, Natsuo Shimizu1,7, Akiko Ohashi3,4,
Shuichi Sato2,7, Mitsuru Motoyoshi8,9, Morio Tonogi6,10, Tomihisa Takahashi3,4Division of Applied Oral Science, Nihon University Graduate School of Dentistry1

2

Department of Periodontology, Nihon University School of Dentistry3

Department of Anatomy, Nihon University School of Dentistry

Division of Functional Morphology, Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry

4
5

Division of Oral Structural and Functional Biology Nihon University Graduate School of Dentistry
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Nihon University School of Dentistry

6

Division of Advanced Dental Treatment, Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry7

Department of Orthodontics, Nihon University School of Dentistry8（受付：令和 3 年 12 月 10 日）
責任著者連絡先：藤原恭子
日本大学歯学部解剖学第 I 講座
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8120
FAX：03-3219-8318
E-mail：fujiwara.kyoko@nihon-u.ac.jp

1

日大歯学

第 96 巻第 1 号

Division of Clinical Research, Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry

9

Division of Immunology and Pathobiology, Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry10

Abstract: Purpose: Transcription factor AP-2 epsilon (TFAP2E), a member of the AP2 transcription factor
family, plays pivotal roles in regulation of early development of the nervous system and chondrocytes.
Recent studies strongly suggested that it acts as a tumour suppressor in several types of cancer cells.
Recently, we established shTFAP2E-1 and shTFAP2E-2 clones by stably transducing a TFAP2E short
harpin RNA (shRNA) expressing vector into the human gingival carcinoma-derived Ca9-22 cells. To identify
target genes of TFAP2E and elucidate the molecular mechanisms underlying its tumor suppressor function,
we conducted global gene expression analysis to compare gene expression pattern between shTFAP2 E-1
and shN/C-1.
Methods: Global gene expression was examined by microarray analysis. Gene expression analyses in theclones were performed by real-time PCR (qPCR), and enrichment analysis was performed using the DAVID
functional annotation tool.
Results: Microarray analysis identified 110 and 171 genes showed > 2-fold up- or downregulation in
shTFAP2E-1 compared to the control clone, shN/C-1, respectively. qPCR and enrichment analysis
demonstrated downregulation of RERG and CDKN1A, which are components of the PI3K-Akt signalling
pathway, in shTFAP2E-1 and shTFAP2E-2 compared to the control clones, shN/C-1 and shN/C-2.
Conclusions: This study suggested that the tumour suppressive function of TFAP2E is mediated byregulation of RERG and CDKN1A transcription.
Keywords: TFAP2E，oral squamous cell carcinoma，RERG，CDKN1A

緒も低下している 9）。このゲノム領域のメチル化は，ヒト

言

大腸癌や胃癌での抗癌剤耐性と関係しており，この領域

Activator protein-2（AP-2）ファミリーに属する転写因が高メチル化するほど，TFAP2E の発現レベルが低下し，子は，胚発生や発癌に関連する多くの遺伝子の発現を調

5-フルオロウラシル（5-FU）への反応性が鈍くなる 10,11）。

節 す る 1,2）。AP-2 遺 伝 子 フ ァ ミ リ ー は TFAP2A，また，神経芽腫患者では，腫瘍組織の TFAP2E の発現

TFAP2B，TFAP2C，TFAP2D および TFAP2E の 5 つ

レベルが低いほど生存期間が短いことや，神経芽腫由来のメンバーで構成され，各メンバーは二量体形成に必要

株化細胞における TFAP2E の発現抑制はシスプラチン

な C 末 端 側 の helix-span-helix モ チ ー フ や， 中 央 部 のや放射線照射などで生じる DNA 損傷や，それにともな

DNA 結合ドメインにみられる α -helix 構造等，高度に保う細胞死を阻害することが報告されている 12）。これらの存された共通配列をもつ 。AP-2 ファミリーメンバーの報告は，TFAP2E が癌抑制遺伝子として機能しているこ一つである TFAP2E は，マウス胚発生の過程で，中枢とを示すものであるが，その詳細な作用機序については神経系に発現する遺伝子として同定されている 3）。さら不明な点が多い。

1）に詳細な解析の結果，発生過程のマウス網膜のアマクリ

我々は，舌，口唇，口腔底に好発する口腔扁平上皮癌

ン細胞に発現することや 4），マウスの嗅球の発生におい（OSCC）13）にみられる TFAP2E の発現を shRNA によって 必 須 の 遺 伝 子 で あ る 5）こ と が 判 明 し た。 ま た，て 抑 制 す る こ と で，OSCC の 発 生 や 悪 性 化 に お け る

TFAP2E はマウスおよびヒトの軟骨分化の過程でも発現

TFAP2E の役割について検討している。OSCC の罹患率

し，軟骨の形成において重要な働きをもつインテグリンと死亡率は年々上昇傾向にあり，2019 年の統計では日本

α 10 の発現制御に関与することが報告されている 。すで 1 年 間 に 約 7,000 人 が 死 亡 し て い る 14）。 一 般 的 に，なわち，TFAP2E をノックアウトしたマウスでは関節軟

OSCC の治療は外科的な切除が主体であり，病期や部位，

6）骨の matrix metalloproteinase 13 の発現が亢進し，人

組織型あるいは患者の健康状態等に応じて，放射線治療

為的に誘導した変形性関節症の重症度が野生型マウスとあるいは抗癌剤治療が術後の補助療法として選択され比較して亢進していた 。

る 15）。しかし，口腔やその周辺領域の外科的治療は，咀嚼，

7）

これらの報告に加え，TFAP2E はヒト染色体の 1p34

嚥下，構音等の機能や顔貌に大きな変化をもたらすため，に位置するが，このゲノム領域が多くの癌で欠失してい温存療法が強く求められている。そのため，近年では放ること 8）から TFAP2 E が癌抑制遺伝子として機能する

射線治療と抗癌剤治療が並行しておこなわれ，寛解した

ことが知られている。また，マウス皮膚有棘細胞癌では，場合は外科治療を回避することも選択されるようになっ

TFAP2E の第 3 イントロンに位置する CpG island が，た 15）。また，根治治療後の OSCC の再発に際しては，さ正常皮膚と比べて高メチル化しており，TFAP2E の発現

らに放射線治療と抗癌剤治療との比重が高くなる 15）。し2

TFAP2E の発現抑制効果

たがって，有効かつ安全性の高い抗腫瘍薬の開発を行う

養した。

た め に，OSCC の 新 規 治 療 標 的 と な る 分 子 を 同 定 し，2.

令和 4 年 6 月

網羅的遺伝子発現解析
shTFAP2E-1 と shC/N-1 の間で発現レベルが異なる

OSCC の発生または悪性化の機序を解明することが極め遺伝子を同定するため，マイクロアレイを利用した。各て重要となる。
本 研 究 で は，OSCC に 発 現 し て い る 癌 抑 制 遺 伝 子 の細胞を 5×103 個 /mL の密度で直径 10 cm の培養皿に 3

TFAP2E の 機 能 を 解 明 す る た め の 一 助 と す る た め，枚ずつ播種し，24 時間後に細胞から全 RNA を抽出した。

TFAP2E shRNA 発現ベクターを導入したヒト歯肉癌由抽 出 に は RNeasy mini kit（Qiagen，Valencia，CA，来株化細胞 Ca9-22 において特異的に発現している遺伝USA）を 使 用 し， カ ラ ム に RNA を 吸 着 さ せ た 状 態 で子を網羅的にスクリーニングし，TFAP2E の標的候補と

DNase I 処理をおこない，付属バッファーで洗浄後，超して可能性の高い分子の同定を試みた。

純水によって溶出した。抽出した RNA のマイクロアレ
イ解析は，マクロジェン社に委託した。マイクロアレイ

材料および方法は Clariom S Assay Human（Thermo Fisher Scientific）
を使用し，各細胞からの RNA を 3 サンプルずつ実験に

1． shRNA の導入と細胞の培養
TFAP2E mRNA を標的とした shRNA または，特定供 し た。 得 ら れ た デ ー タ は，affymetrix power toolsの標的を持たないコントロール shRNA をコードする二（APT；affymetrix-power-tools.html）と R 3.3.3（https://

本 鎖 オ リ ゴ DNA を pLV-H1-EF1 a-puro ベ ク タ ー

www.r-project.org/）で解析した。全てのデータは signal（Biosettia，San Diego，CA，USA）に挿入した。これら

space transformation-robust multichip analysis（SST-のベクターはウイルス・パッケージング・ベクター・ミッ

RMA）アルゴリズムによって標準化したのち，有意差検

クス pLV-PACK 500（Biosettia）とともに 293 T 細胞へ定を実施した。

導入し，shRNA ベクターを内包するレンチウイルスを

3.

Enrichment 解析得た。Ca9-22 を 1×105 細胞 /ml の密度で播種し，24 時

マイクロアレイによって，shTFAP2E-1 と shC/N-1 の間後に shRNA 含有レンチウイルスを 6μg/mL のポリブ

間で 2 倍以上の発現差を認めた遺伝子を対象に，DAVID

レン存在下で細胞に感染させた。その後，1μg/mL のfunctional annotation tool （https://david.ncifcrf.gov/

ピ ュ ー ロ マ イ シ ン 存 在 下 で 培 養 す る こ と に よ っ て，

home.jsp）を利用して，enrichment 解析を実施した。なshRNA ベクターが導入された細胞を選択し，いくつか

お，P value が 0.05 以下を統計的有意とした。この解析のクローンを得た。このうち TFAP2E shRNA ベクター

で 有 意 差 の あ っ た 遺 伝 子 カ テ ゴ リ ー の う ち，Kyoto

導 入 ク ロ ー ン（shTFAP2E-1，shTFAP2E-2）と コ ン ト

encyclopedia of genes and genomes（KEGG）pathway

ロール shRNA ベクター導入クローン（shC/N-，shC/N-2）に属するものを絞り込んだ。

を本研究に使用した。

4.

Real-time RT-PCR（qPCR）
細 胞 を 5×10 3 個 /mL の 密 度 で 直 径 6 cm の 培 養 皿 に

培養は α -minimal essential medium（ナカライテスク，
京 都 ）に 10% 牛 胎 児 血 清（FBS； ニ チ リ ョ ー， 東 京 ），播種し，24 時間後に RNeasy mini kit を使用して細胞か600 mg/L のグルタミン，1 ng/mL のピューロマイシン

ら全 RNA を抽出した。cDNA の合成は，iScript cDNA

（富士フィルム和光純薬，大阪），100 IU/mL のペニシリ

synthesis kit （Bio-Rad laboratories, Hercules, CA，ン（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）

USA）を利用した。TB Green Premix Ex Taq（タカラと 100 mg/mL のストレプトマイシン（Thermo Fisher

バイオ，草津）で増幅することで，各遺伝子の発現レベ

Scientific）を添加した培地を使用した。全ての細胞は湿ルを qPCR によって調べた。使用したプライマーを表 1

度 100％，37 ℃，5%CO2 に設定したインキュベータで培に示す。qPCR はサーマルサイクラーの CFX Maestro

表1

Gene

プライマーの配列

Forward (5' - 3')

Reverse (5' - 3')

MMP13

CCTTGATGCCATTACCAGTCTCC

AAACAGCTCCGCATCAACCTGCTNFRSF9TCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGGAAATCGGCAGCTACAGCCASMARCA1
PTPRB

MMP10
RERG

TNFRSF10DFBXO32

CDKN1A

AACCTGGCAAGTGCTGATGTGG

TCTTCCCGACAAGTGGTTGTGG
TCCAGGCTGTATGAAGGAGAGGCAACCTACCGACACCAAGCAAC

CTGCTGGTTCCAGTGAATGACG

CACTGGTCCAAAGAGTCGGCAA

AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG

3

CAGTGTTGTCAGTGATGAGACGGAGCCAGGAAACGCTGAGGTAGTGGTAGGCATGAGCCAAACTGTG
TGTCGTAGACCAGCACAAAGCC

TTTTCGGAGCCCACCAGTTGGTGCACAAAGGCAGGTCAGTGAAGTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG日大歯学

第 96 巻第 1 号（Bio-Rad laboratories）を使用し，95 ℃で 30 秒間反応さに確認した。プライマーが問題なく合成でき，再現性のせた後，95 ℃，5 秒間と 60 ℃，30 秒間の反応を 40 回繰

高いデータが得られた遺伝子の解析結果を図 1 に示す。

り 返 し た。 測 定 は す べ て 3 回 ず つ 実 施 し た。 な お，

マ イ ク ロ ア レ イ で 示 さ れ た 通 り， こ れ ら の 遺 伝 子 がCa9-22 から抽出した RNA を鋳型に合成した cDNA の段

shN/C-1 よりも shTFAP2E-1 で高い発現を示したこと

階希釈液から，各遺伝子の標準曲線を算出した。Student

は，qPCR でも確認できた。また，解析した遺伝子の中で，t 検 定 は， 統 計 解 析 ソ フ ト JMP バ ー ジ ョ ン 11.2（SASras-related and estrogen-regulated growth inhibitor

Institute Inc，Cary，NC，USA）を利用した。

（RERG）の み が，shTFAP2E-1 と shTFAP2E-2 の 両 ク

結1.

ローンにおいて低い発現を示した。

果2.

shTFAP2E で発現低下した遺伝子群の特徴
shTFAP2E-1 と shN/C-1 の間で有意な発現差がみら

shTFAP2E と shN/C の間で発現レベルが異なる遺れた遺伝子の中で，機能的に共通した特徴をもつ遺伝子

伝子のスクリーニング
マイクロアレイによって，shTFAP2E-1 と shN/C-1 のグループが存在するかどうかを，enrichment 解析によっ間で発現レベルの異なる遺伝子を網羅的に解析した。そて調べた。shN/C-1 と shTFAP2E-1 の間で 2 倍以上のの結果，shN/C-1 と比較して shTFAP2E-1 で 2 倍以上有意な発現差がみられた遺伝子の中で，統計的に有意な高い発現レベルを示した遺伝子が 110 個，逆に 171 個の遺伝子カテゴリーを抽出し，KEGG pathway に属するも2 倍以上発現が低下した遺伝子が確認できた。これらののを絞り込んだ。その結果，shTFAP2E-1 で発現が低下

遺伝子は表 2，3 に列記した。このうち TFAP2E の標的した遺伝子群の中に，24 種類の KEGG pathway が含ま遺伝子が存在するか確認するため，マイクロアレイにれていることが確認できた（表 4）。一方，shTFAP2E-1

よって解析したクローン（shTFAP2E-1，shN/C-1），おにおいて発現が上昇していた遺伝子群の中には，有意によびマイクロアレイ解析を実施しなかったクローン

多く含まれる KEGG pathway は認められなかった。

（shTFAP2E-2，shN/C-2）にみられる遺伝子の発現パター

shTFAP2E-1 で発現が低下した遺伝子群に特徴的なンを qPCR によってそれぞれ比較検討した。TFAP2E の24 種類の pathway の特徴について調べたところ，8 種発現抑制によって発現レベルが低下した遺伝子は類が細菌やウイルスの感染に関わるもの，別の 8 種類がTFAP2E の 直 接 的 な 標 的 で あ る 可 能 性 が 高 い た め，

免疫系の反応に関わるものであった。shTFAP2E-1 は

shTFAP2E-1 で 発 現 低 下 を 示 し た 遺 伝 子 群（ 表 3）の う

shN/C-1 と比べて高い生存率を示すことがわかっている

ち，特に shN/C-1 との差が大きかったものについて詳細が，得られた 24 種類の pathway のうち，細胞増殖や細表2

shTFAP2E-1 で発現が上昇していた遺伝子

Gene Symbol
Description
CPA4
carboxypeptidase A4
IFI44
interferon-induced protein 44
CXCL16chemokine (C-X-C motif) ligand 16
GALNT10polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 10
EGR1
early growth response 1
EPAS1
endothelial PAS domain protein 1
PLCB4
phospholipase C, beta 4
SLC9A3R2 solute carrier family 9, subfamily A (NHE3, cation proton antiporter 3),
member 3 regulator 2
DDX60
DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 60
ADAM12
ADAM metallopeptidase domain 12
PRKAG2protein kinase, AMP-activated, gamma 2 non-catalytic subunit
ZNF850zinc finger protein 850
TIMM17A
translocase of inner mitochondrial membrane 17 homolog A (yeast)
RAB7B
RAB7B, member RAS oncogene family
ITGB2
integrin, beta 2 (complement component 3 receptor 3 and 4 subunit)
SEMA3Bsema domain, immunoglobulin domain (Ig), short basic domain, secreted,(semaphorin) 3B
ZNF385B
zinc finger protein 385B
EZH2
enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit
SLC31A2
solute carrier family 31 (copper transporter), member 2

4Fold change
6.173
6.125
6.022
4.621
4.404
4.231
4.199
4.114

p value
0.E+000.E+000.E+000.E+000.E+000.E+000.E+000.E+00

3.811
3.697
3.460
3.408
3.296
3.237
3.228
3.196

0.E+001.E-120.E+003.E-130.E+002.E-07
1.E-06
4.E-06

3.188
3.141
3.001

0.E+000.E+000.E+00TFAP2E の発現抑制効果

令和 4 年 6 月

胞 死 に 関 連 す る も の と し て hsa04151（PI3 K-Akt

伝子を，マイクロアレイによって同定した。発現差の大signaling pathway）が含まれていた。shTFAP2E-1 におきい幾つかの遺伝子について，それらの発現レベルを比い て 有 意 に 発 現 が 低 下 し た 遺 伝 子 が，PI3 K-Akt較 し た 結 果，shN/C-1 お よ び shN/C-2 に 比 べ て，signaling pathway のどこに位置するかを図 2 に示した。

shTFAP2E-1 および shTFAP2E-2 の両方で，RERG の発現低下がみられた各遺伝子は，この pathway 中に広く発現が低いことが判明した。RERG は，低分子 GTPase

分布していた。このうち，CDKN1A（p21）は細胞周期のの RAS スーパーファミリーに属する遺伝子であり，広抑制に働くことが知られている。そこで，qPCR によっ

く様々な正常組織で発現が認められる 16）。一方，乳癌やて CDKN1A の発現レベルを調べた結果，shTFAP2E-1

卵巣癌，腎癌，大腸癌など，多くの悪性腫瘍組織ではと shTFAP2E-2 の両方のクローンで，CDKN1A の発現

RERG の発現が低下していることが知られている 17）。さが低かった（図 3）。

らに，RERG を過剰発現させることで乳癌細胞株 16）や上考

咽頭癌細胞株 18）の細胞増殖能が低下する報告があるた

察

め，RERG は癌抑制遺伝子として機能している可能性がOSCC に発現している TFAP2E の機能を解明するた高い。今回の研究から，RERG が TFAP2E の標的遺伝

め，歯肉癌由来株化細胞 Ca9-22 に TFAP2E shRNA を子の 1 つであり，TFAP2E mRNA の発現抑制によって導 入 し た ク ロ ー ン の shTFAP2E-1 と コ ン ト ロ ー ル ク

RERG の発現が低下した可能性が考えられる。
次に，shTFAP2E-1 で発現が低下した遺伝子に特徴的ローンの shN/C-1 の間で発現レベルに差が認められた遺表3

shTFAP2E-1 で発現が低下していた遺伝子

Gene Symbol
Description
MMP13
matrix metallopeptidase 13
SMARCA1 SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator ofchromatin, subfamily a, member 1
TNFRSF9
tumor necrosis factor receptor superfamily, member 9
CHAC1
ChaC glutathione-specific gamma-glutamylcyclotransferase 1
SLITRK6
SLIT and NTRK-like family, member 6
ADAM28ADAM metallopeptidase domain 28
HAS2
hyaluronan synthase 2
PTPRB
protein tyrosine phosphatase, receptor type, B
MMP10
matrix metallopeptidase 10
DUSP10dual specificity phosphatase 10
RERG
RAS-like, estrogen-regulated, growth inhibitor
EMP3epithelial membrane protein 3
PTHLH
parathyroid hormone-like hormone
ALDH1A3
aldehyde dehydrogenase 1 family, member A3
MMP16
matrix metallopeptidase 16 (membrane-inserted)TNFRSF10D tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10d, decoy withtruncated death domain
FBXO32
F-box protein 32
MMP1
matrix metallopeptidase 1
C16orf62
chromosome 16 open reading frame 62
HGSNAT
heparan-alpha-glucosaminide N-acetyltransferase
C3complement component 3
ITGB8
integrin beta 8
CLUclusterin
TNC
tenascin C
CTNND1catenin (cadherin-associated protein), delta 1
HERPUD1
homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible,
ubiquitin-like domain member 1
DDIT4
DNA damage inducible transcript 4
OCRL
Transcript Identified by AceView, Entrez Gene ID(s) 4952
SLC7A11solute carrier family 7 (anionic amino acid transporter light chain, xcsystem), member 11
ASNS
asparagine synthetase (glutamine-hydrolyzing)

5

Fold change-10.345-9.036p value
1.E-65
1.E-40-8.795-8.759-8.460-6.218-4.896-4.726-4.665-4.664-4.602-4.496-4.484-4.403-4.372-4.044

4.E-57
2.E-92
6.E-34
5.E-198.E-49
1.E-14
5.E-13
3.E-41
3.E-199.E-24
2.E-398.E-72
2.E-12
1.E-10-3.928-3.908-3.823-3.474-3.401-3.379-3.267-3.213-3.177-3.144

5.E-23
4.E-51
1.E-16
1.E-47
5.E-13
5.E-17
5.E-19
1.E-29
1.E-33
4.E-35-3.100-3.068-3.052

1.E-46
3.E-05
5.E-33-3.045

6.E-32

日大歯学

第 96 巻第 1 号

な分子経路を enrichment 解析によって絞り込んだ。そshTFAP2E-1 と shTFAP2E-2 の両方で，CDKN1A の発の結果，細胞増殖や細胞死と関連する pathway として，現レベルが有意に低かった。この結果は，TFAP2E の発

PI3 K-Akt signaling pathway が含まれていることがわ

現低下が癌細胞の抗癌剤に対する耐性獲得につながるこ

かった。PI3 K-Akt signaling pathway は，細胞増殖をと を 示 し た 報 告 10-12）と 一 致 し て お り，CDKN1A が促進するために働くため，癌化はこの経路を活性化す

TFAP2E の標的分子の 1 つであると考えられた。

る 19）。また，多くの癌腫で，TFAP2E の発現低下は抗今 回，TFAP2E の 標 的 候 補 分 子 と し て，RERG と癌剤効果の細胞死を阻害し，細胞の生存を維持するた

CDKN1A を同定したが，TFAP2E の発現抑制によってめ 10-12），shTFAP2E-1 に お い て PI3 K-Akt signaling

確 認 で き た RERG と CDKN1A の 発 現 減 少 が， 実 際 に

pathway 遺伝子群の発現低下は，一見矛盾しているよう

OSCC の生存率の上昇に直接繋がっているか検討する必に思われた。一方，この pathway の中に位置する p21

要がある。具体的には，1）OSCC にみられる RERG や（CDKN1A）は，細胞周期の進行を抑制する機能をもつこ

CDKN1A の発現を抑制することで，OSCC の細胞増殖とがよく知られている。そこで，CDKN1A の発現レ能が亢進するか，2）OSCC に TFAP2E を過剰発現させベルを各クローンの間で比較した結果，コントロールク

る こ と に よ っ て RERG と CDKN1A の 発 現 が 促 進 す る

ロ ー ン の shN/C-1 あ る い は shN/C-2 と 比 較 し て，か， さ ら に，3）TFAP2E が RERG あ る い は CDKN1A

図1

20）

マイクロアレイ解析によって得られた候補遺伝子の解析
マイクロアレイによって shN/C-1 と比較して shTFAP2E-1 で有意な発現低下を示した遺伝子の発現レベ
ルを，qPCR によって検討した。shTFAP2E-1，shTFAP2E-2，shN/C-1，shN/C-2 の 4 クローンにおける各遺伝子の発現レベルは，それぞれ 3 回測定し，その結果を平均値± SD で表した。 ＊， ＊＊ は shN/C-1，#，## は shN/C-2 との有意差を示す。＊，#P ＜ 0.05，＊＊，##P ＜ 0.01。

6

TFAP2E の発現抑制効果

令和 4 年 6 月の遺伝子のプロモーターに直接結合することができるか

1． shTFAP2E-1 で有意に 2 倍以上に発現が上昇した遺を，今後の課題としたい。ところで，shTFAP2E-1 で有伝子を 110 個，逆に発現が低下した 171 個の遺伝子を同定した。

意 に 発 現 低 下 を 示 し た 遺 伝 子 群 が 属 す る 24 種 類 のpathway の大半は，感染または免疫反応に関係するもの

2． これらの遺伝子のうち，RERG の発現は，shN/C-1

であったが，これらの遺伝子リストの中には主要組織適と shN/C-2 と比較して TFAP2E-1 と TFAP2E-2 の合性抗原をコードする HLA-DRB5 と HLA-DOB も含ま

どちらも低かった。

れていた。この二つの分子は，細胞増殖や細胞死に関連

3． shTFAP2E-1 で発現が低かった 171 個の遺伝子に特する機能はほとんどもっていない。shTFAP2E-1 におい

徴的な pathway を enrichment 解析によって絞り込て HLA-DRB5 と HLA-DOB の遺伝子発現が低下していんだ結果，PI3 K-Akt signaling pathway が該当したことが，細胞機能の維持にどのような影響を与えるのた。PI3 K-Akt signaling pathway に 含 ま れ るかは不明であるが，今後，検討を加える必要がある。

CDKN1A の遺伝子発現は，shN/C-1 と shN/C に比結較 し て，TFAP2E-1 と TFAP2E-2 の 両 方 で 低 か っ論た。

ヒ ト 歯 肉 癌 由 来 株 化 細 胞 の Ca9-22 へ TFAP2E
shRNA を導入し，TFAP2E の発現が持続的に低下した

なお，本研究の一部は，日本大学総合歯学研究所研究費（B），
日本大学歯学部佐藤研究費，および JSPS 科研費 20 K09999 によって行なわれた。
本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

クローン（TFAP2E-1 と TFAP2E-2）とコントロールク
ローン（shN/C-1 と shN/C-2）との間で，発現レベルに違いがある遺伝子をマイクロアレイによって同定した結果，以下の結論を得た。
表4

shTFAP2E-1 で発現が低下していた遺伝子に特徴的な KEGG pathway

Pathwayhsa05140:Leishmaniasis

Count
8

%
5.0

PValue7.27E-06

Genes
IRAK1, HLA-DRB5, PTGS2, HLA-DOB, C3

hsa05164:Influenza A

11

6.9

1.01E-05

hsa04514:Cell adhesion molecules (CAMs)

9

5.7

9.61E-05

hsa05150:Staphylococcus aureus infection

6

3.8

2.17E-04

HLA-DRB5, TNFRSF10D, PIK3CD, NXT2, IKBKE,
IRF9, HLA-DOB
NEGR1, HLA-DRB5, CNTN1, ITGB8, CDH2, HLADOB
HLA-DRB5, HLA-DOB, C3

hsa05310:Asthma

5

3.1

2.33E-04

HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa05169:Epstein-Barr virus infection

8

5.0

2.41E-04

IRAK1, HLA-DRB5, PIK3CD, CDKN1A, TNFAIP3

hsa05416:Viral myocarditis

6

3.8

2.80E-04

SGCB, HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa05332:Graft-versus-host disease

5

3.1

3.40E-04

HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa05330:Allograft rejection

53.1

5.32E-04

HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa04940:Type I diabetes mellitus

5

3.1

8.68E-04

HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa04672:Intestinal immune network for IgA
production
hsa05320:Autoimmune thyroid disease53.1

0.0013299 HLA-DRB5, HLA-DOB

5

3.1

0.0019418 HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa05323:Rheumatoid arthritis

6

3.8

0.0020496 MMP1, HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa05168:Herpes simplex infection

8

5.0

0.0026587 HLA-DRB5, IKBKE, IRF9, HLA-DOB, C3

hsa05321:Inflammatory bowel disease (IBD)

53.1

0.0041534 HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa05412:Arrhythmogenic right ventricularcardiomyopathy (ARVC)
hsa05145:Toxoplasmosis

5

3.1

0.0048958 ITGB6, SGCB, ITGB8, DSC2, CDH263.80.0053775 IRAK1, HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa04612:Antigen processing and presentation

5

3.1

0.0076458 HLA-DRB5, HLA-DOB

hsa05152:Tuberculosis

7

4.4

0.0095784 IRAK1, HLA-DRB5, HLA-DOB, C3

hsa05322:Systemic lupus erythematosus

6

3.8

0.0121339 HLA-DRB5, HLA-DOB, C3

hsa05166:HTLV-I infection

8

5.0

0.0153089 HLA-DRB5, LCK, PIK3CD, CDKN1A, HLA-DOB

hsa04145:Phagosome

6

3.8

0.0189555 HLA-DRB5, HLA-DOB, C3

hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway

9

5.7

hsa04650:Natural killer cell mediated cytotoxicity

53.1

0.0249399 ITGB6, TNC, SPP1, EIF4EBP1, ITGB8, CREB5,PIK3CD, CDKN1A, DDIT4
0.0368217 TNFRSF10D, LCK, PIK3CD, PTK2B

7

日大歯学

図2

第 96 巻第 1 号

shTFAP2E-1 で低発現を示した遺伝子の PI3K-Akt signaling pathway 上での分布
マイクロアレイによって shN/C-1 と比較して shTFAP2E-1 で 2 倍以上の発現低下を示した遺伝子のうち，KEGG pathway および
hsa04151（PI3 K-Akt signaling pathway）に属するものを青色で示した。表 4 のリストの名前を赤字で表した。

文

図3

献

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CDKN1A の発現レベルの解析
shTFAP2E-1，shTFAP2E-2，shN/C-1，shN/C-2 の 4 クローンにみられる CDKN1A の発現レベルを qPCR で調べた。それ ぞ れ 3 回測定し，その結果を平均値± SD で 表 し た。 ＊，＊＊は shN/C-1，#，## は shN/C-2 と の 有 意 差 を 示 す。 ＊，#P ＜ 0.05，**，##P ＜ 0.01。

8

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9