愛媛大学農学部紀要 65 号：1－6（2020）
Bulletin of Faculty of Agriculture, Ehime University, 65: 1－6 (2020)

学会賞受賞研究水生生物を用いた毒性評価（バイオアッセイ）とその水環境評価・管理への応用に関する研究
鑪迫典久*

Norihisa TATRAZAKO:The Toxicity Evaluation Using Aquatic Organisms (Bioassay) and Its Application Studyto the Evaluation and Management of Water Environment
Abstract
The amount and variety of chemical substances daily used and discharged in the wastewater from industry
and sewage treatment plants are increasing year by year. Since there is a limit to regulate individually a huge
number of chemical substances, it is needed to manage the wastewater including those chemicals as “awhole”.
"Management method for industrial wastewater and treated sewage water using biological response” hasalready been implemented among Western countries and South Korea. The introduction of those method toJapan had been approached from various angles by the Ministry of the Environment since 2009, and decided
to adopt it as a voluntary of each company for management method rather to enforce it as legal regulation.
Even though industrial wastewater and treated sewage water are strictly controlled by effective laws inJapan, 30% of wastewater we investigated had biological effects and discharged into the environment. Thoseshould be improved. Because of the shortage of researchers in the field of bioassays by aquatic organisms inJapan, basic research is behind and the method is not much adopted. I believe the effective application ofbioassay for the evaluation of wastewater will maintain the ecosystems healthy.
Key words: whole effluent toxicity (WET), toxicity reduction evaluation (TRE), toxicity identification evaluation (TIE)

いては，筆者らが考案した内分泌かく乱化学物質の検1. 日本水環境学会学術賞受賞の経緯

出法のいくつかが OECD テストガイドラインにも採用

2019 年 6 月 18 日に開かれた総会において日本水環されている．後半のバイオアッセイによる水環境への境学会 2018 年度学術賞を受賞した．受賞題目は，「水影響評価手法は，その基本となる研究は既に 1970 年代

生生物を用いた毒性評価（バイオアッセイ）とその水後半から欧米で盛んに行われている．筆者は海外のや環境評価・管理への応用に関する研究」であり，対象り方を日本の環境に適用するように改良し，その手法となった研究内容は，内分泌かく乱化学物質，ナノ粒の国内での普及および制度化を，民間企業および国立子，環境中医薬品等のいわゆる新興環境汚染物質に対環境研究所の環境リスク研究センターリファレンスラする評価方法の開発，ならびに魚類，甲殻類，藻類なボ勤務時に行ってきた．ここでは主に生物応答を用いど水生生物のバイオアッセイを用いた事業所排水や公た事業所排水の管理手法について紹介したい．

共用水等の環境評価・管理への応用である．前半につ2. 生物応答を用いた排水管理手法の開発

2020 年 12 月 9 日受領

2.1. 背景2020 年 12 月 9 日受理*愛媛大学農学部環境計測学教育分野（責任著者）

1

科学技術の発展に伴い化学物質の種類と量が増加しことを指す．生態毒性試験，生物応答試験，または単ており，それらは我々の生活の質を向上させていると同時に事業所排水または家庭から下水処理場等を通じ組織，細胞，遺伝子て環境中に放出されている．その管理について，現状の変化の水質汚濁防止法に定められる排水基準項目（および個体の変化

低水質環境基準項目）では，人の健康保護を目的とした

明確

高

生死の判断：急性毒性試験

水銀やカドミウム，鉛，PCB，トリクロロエチレンな繁殖，成長段階の判断：慢性毒性試験(*2
生態系との関連性
生物個体群の変化

どを含む 28 種類（環境基準は 27 種類）と，生活環境模擬生態系実験の保全を目的とした pH や BOD，SS，亜鉛，窒素，リンなど 15 項目（水生生物保全のための 3 項目を含む，不明確

環境基準は 12 項目）に留まっている．ほかにも水質環原因

生物相調査
生態系の変化生物多様性調査

境基準の要監視項目（26 項目）や要調査項目（208 項目），水道法による水道水質基準（51 項目）など存在

図1

するが，合わせても約 300 種類に留まる．しかし実際生態影響評価に利用するバイオアッセイの種類と考え方の排水中には数百から数千種類の化学物質が存在すると言われており，その中には新規化学物質も含まれてに生物試験ともいう．図 1 に示すように，広義では細いる．さらにそれらの環境中での分解物や反応副生成胞，遺伝子等を用いるインビトロ試験（左上）から，物などについては把握，対処が難しい上に，化学物質マイクロコズム（模擬生態系）など（右下）も含まれ間の組み合わせによる複合反応（相乗・相殺・相加）る．左上側に行くほど生化学反応が重視され，化学物も考慮すると，個別に化学物質を管理するには限界が質との因果関係は強くなるが実際の生態系へのインパあることが予想できる．よって今後化学物質が起因とクトは分からない場合が多い．逆に，右下方は，複雑なって発生するかもしれない，または既に起きている系で時間とコストがかかるうえ，再現性が悪く，化学かもしれない水質問題に対して，規制法令は追い付い物質との因果関係を明らかにするには向かないが，よていないのが現状である．そこで，安全・安心な水環り実生態系の変化を捉えることができる．排水管理に境を確保し，化学物質に起因する人や水生生物への悪は，中間にある生物個体または個体群の変化を測定す

影響を未然かつ効率的に防止するために，排水中の多るバイオアッセイが用いられている．これらは化学物様な化学物質の影響を“総合的に管理”する新たな手質の環境生物への有害影響予測とその有害原因物質を法の必要性が考慮されていた．そのような中，筆者が予測し低減する両方の方策に適用できる（新野および

2006 年に環境省の若手勉強会で“生物応答（バイオア斎藤，2009）．

ッセイ）を用いた管理手法”手法を紹介する機会があ

一方，バイオアッセイは再現性確保のために管理さり，それをきっかけとして，翌年度からの検討準備委れた一定条件下で行われる，よって有害化学物質が含員会を経て，2009 年から正式に「生物応答を利用したまれている排水の放流先に生息する生物への影響を正排水管理手法」の日本への導入の検討委員会が立ち上確に調べるためには，個別化学の分析や野外での生態がった（環境省，2009）．筆者は民間企業での勤務時代調査を同時に実施することも必要であるとされているにスウェーデン環境研究所（IVL Swedish Environmental○毒性把握Research Institute）とカナダ環境省の研究所○未知物質に対応

×ヒト健康保護（Environment Canada）から直接手法を学び，米国の手×環境中での残留・蓄積性

バイオアッセイ法に準じて 1993 年より全国数十か所の製紙・パルプ工場排水の水質調査を行っていた．その経験を活かして環境省の検討会の中で日本の現状に最適化すべく日本

個別化学物質分析版ガイドラインの作成に貢献した．

生態系調査

2.2. “バイオアッセイを利用した排水管理手法”○ヒト健康保護○実際の影響測定

2.2.1. バイオアッセイとは○規制値○未知発生源の影響検知△毒性の作用機序×物理的要因との区別

×生物利用可能性

×因果関係の同定

バイオアッセイとは，ここでは，生態系を構築する生物（藻類，甲殻類，魚類など）を利用して，化学物質に因るその生物個体の変化を捉えるインビボ試験の

図2

2

生態系保全のための総合的アプローチ（板津ら，2015）．図 2 に示すように，手法がお互いム，マレーシアなどのアジア諸国でも導入が検討されに長短所を補完しあって生態系を保全することが望まている（新野，2014）．

しい．

2.3. 日本版 WET システムの特徴

国内でバイオアッセイを環境評価に用いたのは，米国 WET を参考にして日本版のシステム案が作ら1970 年頃に瀬戸内海西部の工場排水にメダカやウニのれたが，幾つかの違いがある．その一つに魚類，甲殻胚を適用した浮田ら（浮田ら，1978）のほか，1980 ～類の短期慢性毒性試験の採用がある．短期慢性毒性試

90 年代にかけて富山県内事業所排水に魚類，ミジンコ，

験とは，慢性毒性試験相当の結果（繁殖への影響など）藻類ほかの急性試験を適用した楠井ら（楠井ら，1996）を短期間で得られるように工夫してあり，最近ではカなどが知られているが，事業場排水を評価・管理したナダや米国の多くの州でも採用・運用されている．

例は非常に少なく，しかも急性毒性試験に基づくもの

1990 年代米国の WET システム開始時期は，個体のに限られていた．筆者らは製紙・パルプ工場排水に短生死をエンドポイントとした急性毒性試験が使用され期慢性毒性試験を適用しその一部を報告している（鑪ていた．当時の米国の河川水は大変汚れており，“燃え迫，2001）．

る川”として有名なカヤホガ川（オハイオ州）に象徴

2.2.2. WET（Whole Effluent Toxicity）システムのされるように生物が全く棲息できないレベルの河川が概要多数存在していたため，まず急性毒性を下げることがWET システムとは，1995 年から米国で施行されて急務であった．韓国でも WET 施行前に，下水処理場いる排水管理の手法（USEPA，2020，最新版）で，バ放流水で予備調査を行った結果，約半数の処理場でミイオアッセイを用いて原因物質の特定を必須とせずに，ジンコ急性毒性が検出されたため急性毒性試験から導対象となる排水（事業所排水，下水処理水，農業排水入することに決定している．環境省の検討委員会では，など）または環境水（河川，湖沼水等）が有する生物

水質事故の際の事後確認方法としての利用可能性，技影響を総括的に評価し，その影響自体を削減する方策

術的な難度，コスト面等から，韓国と同様に甲殻類のを提案することにより，結果としてより良い水環境の急性試験のみを先行導入すべきという意見も一部にあ保全を図る仕組みである（鑪迫，2006；OSPARった．しかしながら，WET の検討を始めた 2009 年当commission，2007；鑪迫ら，2012；鑪迫，2014）．

時に筆者らがいくつかの日本の事業所排水や下水処理最初に，対象となる排水や環境水に対して，数種類水を予備調査したところ，魚類や甲殻類の急性毒性をの生物（藻類，甲殻類，魚類など）によるバイオアッ示した例はほとんどなかった．一方で，藻類の慢性影セイが実施される．その時の供試排水は総体（Whole

響や魚類，甲殻類の短期慢性影響は 2 割以上の事業所Effluent）として取り扱われ，希釈はしてもよいが，含で検出された．つまり，我が国では急性毒性を示すよ

まれている成分が失われる可能性がある濃縮，抽出，うな排水が放流されているとは考えられないことや，濾過などはおこなわれない．もし，試験結果が決めら生物の繁殖影響を指標としているため急性毒性より高れた値を超えた場合には，影響の再現性を確認した後，感度で環境健全性を評価できる短期慢性毒性試験の方

毒性同定評価/毒性削減評価（TIE：Toxicity Identificationが日本の環境評価には適していると考えられた（山本Evaluation/TRE：Toxicity Reduction Evaluation）手法等

ら，2015a）．そこで日本の現状に合わせて短期慢性毒（Norberberg-King ら，2005；新野，2011；Diamond，性試験を基本とした排水試験方法案が 2013 年（20152014）の実施により，適切に生物影響が削減される．

年に改定）に環境省から公示された（国立環境研究所・

上記と同様の考え方は，カナダ（EEM：Environmental

環境省，2015）．

Effect Monitoring），英国（DTA：Direct Toxicity

以下に日本版 WET で用いられる 3 種類のバイオアAssessment），ドイツ（ICE：Integrated Controlling ofッセイについての簡単な説明と，それを日本の排水にEffluent），フランス（WEA：Whole Effluent Assessment），適用した結果を示す．

ニュージーランド（AEE：Assessment of Environmental

・淡水藻類を用いる生長阻害試験（慢性毒性試験）

Effect），デンマーク（WWA：Whole Effluent Assessment），試験生物は単細胞緑藻のムレミカヅキモが推奨されスウェーデン（CID：Characterisation of Industrialている．排水を含む培地で藻類を 3 日間培養して生長Discharge）など，呼称と細かな内容は異なるが，既に速度（細胞数の増加）を調べる．排水で試験した結果様々な国に存在している（Environmental CANADA，と対照区の結果を比較し，藻類の増殖が阻害されなく1999；Power および Boumpherey，2004；山本および新なるまで希釈されたときの排水濃度を求める（対照野，2015）．隣の韓国では 2011 年に導入され，ベトナ

3

区：試験結果を検証するための比較対象．試験溶液と響濃度にするために必要な排水の希釈倍率”に相当す

して排水を含まない培地または飼育水）（OECD，1998）．

る．筆者らは排水の改善対策が必要とされる目安とし・ミジンコの繁殖試験（短期慢性毒性試験）て，TU=10 を推奨していたが，事業所や業界ごとに目試験生物は甲殻類の一種であるニセネコゼミジンコ標値を定めてよい．TU＝10 とは，排水を 10 倍希釈しが推奨されている．排水を含む飼育水で生後 24 時間以たら無影響濃度になることを意味する．TU＝10 の根拠

内のミジンコの幼体を最大 8 日間飼育し，死亡数と成は，排水基準値と環境基準値の間に 10 倍の差がある

長したミジンコが産んだ幼体の数を観察する．3 日で（亜鉛以外）ことによる．筆者らが行った延べ 91 の事

成熟して産仔を開始する．排水で試験した結果と対照業場，下水処理場排水試験結果の一部を図 3 に示す．

区の結果を比較し，ミジンコ類の繁殖に対して影響がTU が 10 を超える排水は，魚類，ミジンコ，藻類でそない排水濃度を求める（USEPA，1994；日本環境毒性

れぞれ 9％，29％，15％に相当する．逆に約 7 割の排学会編，2003；Environmental Canada，2007；新野ら，

水は生物影響が殆どないことが分かる（渡部ら，2015）．

2015）．

・毒性削減対策と原因物質探求（TIE/TRE）・胚・仔魚期の魚類を用いる短期慢性毒性試験

いずれかのバイオアッセイの TU が基準値（例えば試験生物はゼブラフィッシュ（シマヒメハヤ）また10）を超えた場合，その影響の再現性を確認した後にはメダカが推奨されている．排水を含む飼育水で受精生物影響ありと判定し，前出の TIE/TRE を行う．米国

後 4 時間以内の受精卵(胚)から曝露を開始して，ふ化EPA（環境庁）の TIE/TRE 実施手順書（USEPA，1999）から 5 日後 (ばく露開始からだとゼブラフィッシュでは参考になるが，結果として生物影響が削減されるな

は 8～10 日間，メダカでは 13～16 日間)までの生残数，らばその手段は問われない．米国 EPA の手順を図４にふ化率等を観察する．排水で試験した結果と対照区の示す．1 から 6 段階まで存在する．1，2 段階は，事業結果を比較し，胚期から仔魚期の魚類に対して影響が場の操業状況，処理設備の確認および化学物質の知識ない排水濃度を求める（OECD，2013）．

で解決でき，筆者の経験上ではここまでで問題解決す各試験の対照区に対して有意な差がない最大無影響る場合が多い．3 段階は，実験室内で排水に何らかの濃度（NOEC：単位％）を求めるには，藻類およびミ物理・化学的処理をしたのちに生物試験を行い，そのジンコ試験は，まず等分散性の検定（Bartlett の検定な排水の影響が変化するかを調べる．例えば凝集沈殿でど）を行い，データが等分散の場合 Dunnett の多重比影響が削減されれば，沈殿部に影響物質が含まれてい較検定，不等分散の場合 Steel の多重比較検定を行う．

る．同様に排水を酸素曝気して生物影響が減れば，原魚類試験の場合，データの性質上，等分散性を仮定で因物質は酸化されやすいと想定され，pH を下げて影響きないことから，すべてノンパラメトリックの Steelが減れば原因物質は酸沈殿または酸分解し易いと想像検定を用いる．さらに，毒性量単位として，TU（Toxicityできる．最も生物影響の低減に効果のあった処理方法

Unit）を算出する．TU とは 100/NOEC で示し，“無影図3

平成 20～25 年度，延べ 91 排水試料の各生物試験
図4に対する TU の内訳（%）

4

WET 試験における毒性削減評価方法（TRE）の概要

が取りも直さず生物に有害な化学物質（群，種）を除バイオアッセイは行政各省および民間企業において，く効果的な方法であると考えられ，それが即ち事業所

環境管理だけではなく化審法，農取法，薬事法等規制の排水プラントの改善に役立つ．複合影響や未知物質への対応や新たな製品の開発・安全性評価等に利用さが存在していても，化学物質の数に比べて処理方法はれているにもかかわらず，国内の大学でインビボ試験有限であるから，総体として最も効率よく影響を下げを研究しているところが少なく，新卒人材の不足，基る処理を見つければよい．複雑系の排水に対して，迅礎研究の脆弱化が懸念される．筆者は，バイオアッセ

速・安価な生物影響削減の方法を考えるのは，物理化イに興味を持つ本学の卒業生が将来この分野で活躍し学，生化学，排水処理技術の知識を有する研究者の努てくれることを期待している．

力と経験に頼るところが大きいが，逆に研究者にとっ最後に，長年にわたり多大なるご指導を頂いた諸先てはやりがいもある．4 段階は 3 段階で得られた想定

生方，環境省の大気水環境課および化審室，地方環境される物質が排水中に入っているかを分析して確認す

研究所の皆様，排水サンプルを提供して頂いた企業のる作業であり，選ばれた処理方法が正しいかどうかの皆様に感謝いたします．

確認になるが，省略しても構わない．5，6 段階では，排水プラントの改善を，原因物質を発生源でカットす

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認する．筆者らは上記手法を参考にして，製紙排水，化学メーカー排水や下水処理水の TRE を行ってきた（富川ら，2015；藤原ら，2015；山本ら，2015b）．
このように WET システムは，排水の検査，診断，治療を行い，健全性（健康）を保つという点でヒトの健康診断と似ている．

3. まとめ環境省では 2019 年に本手法を罰則規制を伴う法令ではなく，事業所の自主管理として用いることとして推奨した．各事業所が自らの排水が生物影響をもつ化
学物質を流さないように管理すれば，生態系への負荷が削減され，結果として健全な生態系の保全につながる．しかしその“企業の動機”を支持し，監視するためには社会全体の協力体制が必要である．
筆者らは国立環境研究所のレファレンスラボで，実際にバイオアッセイに興味がある地方環境研究所，大学教員，学生，民間企業やコンサルタント他を対象に試験法の実習セミナーを 2011 年から毎年 2 回開催し，WET システムの解説とバイオアッセイ技術の普及・啓発を行っていた．排水基準をクリアしているのに生物影響を有している排水がいまだに存在するという日本の現状は殆ど世間に認知されておらず，諸外国の普及状況を鑑みても国内は遅れていると言える．バイオアッセイ自体の市民への認知度が高くないわが国では，生物影響が数値化されることも知られておらず，それを下げることの意義も市民に伝わりにくいため，企業としても CSR の効果が弱い．バイオアッセイの研究者が少ないため，自社内での TIE/TRE の実行が困難であることも背景にある．

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