装置実習コース「蛋白質・基礎」	
  溶液タンパク質NMRの基本	
v	
  1.7	
  北海道大学 先端生命科学院	
  久米田博之	
  2020.3.10-­‐11	
1	

おことわり	
この発表ファイル（v1.7以降）は複製自由です。	
  ただし、これは著作権放棄を意味しません。	
  営利目的への流用は禁止いたします。	
  非営利目的への流用はご連絡ください。	
  二次配布、改変等による不利益等についても責任を負いかねますのであらかじめご了承ください。	
  またファイル中での用語や名称、タンパク質の機能に関する情報等、内容をわかりやすくするために事実と異なる情報を盛り込んでいる場合もあります。併せてご注意ください。	
2020.3.4	
  
久米田	
2	

溶液タンパク質NMR法の基本	
• 測定を始める前に	  • 主鎖帰属	  • 側鎖帰属	  • 立体構造解析	  • 相互作用解析	
3	

なぜ、NMRを使うのか	• 分解能が原子レベル	  分子内にある原子１つ１つを	  分けて観測できる	

• 動的な解析が可能	
状態変化の追跡ができる	
  （環境応答や相互作用応答）	
この図はイメージです	

4	タンパク質溶液のNMR	

分子量がかなり大きい＝＞シグナルがブロードになる。	
  （上記の図では、さらに13Cによる緩和の影響も含まれている）	
  5	タンパク質溶液のNMR	

タンパク質中には	
  非常に多くの水素原子がある	  （分離観測可能なものが数百個）	
プロトンNMRのみで	  そのすべてを分離することは	
  
不可能	
6	

異種核相関スペクトルで分離する	

タンパク質を13Cや15Nでラベル化（13C,	
  13C/15N標識）する	7	

[1H-­‐15N]	
  HSQCでの信号分離	8	

同位体ラベルのステップアップ	
目的や段階に応じた安定同位体ラベルされたタンパク質サンプルを用意する	
ノンラベル体 	  15Nラベル体 	
  
	
  
	
  
	
  
13C/15Nラベル体

	
  1Hのみを観測	
  	
  1H/15Nを観測→サンプル条件の検討にも活用	
  	
  主要な相互作用解析に使用	
  	
  1H/13C/15Nを観測→主鎖帰属／構造解析に使用	  15Nや13C/15Nラベル体取得には最小培地を用いた組み替え大腸菌培養が一般的	
  ⭐収量がとにかく大事⭐	
  1リットルのM9培地（よく用いられる最小培地）の価格	
  	
  15Nラベル用
	
  3,000円くらい	  	
  13C/15Nラベル用
	  30,000円くらい	  	
  2D/13C/15Nラベル用 	  〜100,000円くらい 	
  （重水が70,000円くらい）	
  〜〜前の段階で十分な検討を行ってから次の段階へ進む〜〜	
その他のラベル体	
  	
  メチル基のみ観測	
  → 	
  特殊ラベル化済みアミノ酸前駆体を用いての	
  
	
  
	
  
	
  メチル選択ラベル	  9		  帰属の手助けにしたい 	
  → 	
  2D/13C/15Nラベル、アミノ酸選択ラベル	  M9培地	
Total	  1	  L	Volume	

10	
  x	
  M9	
  w/o	
  NH4Cl	
 100	
  mL	
NH4Cl	

1	
  g	

10	
  x	
  M9 w/o	
  NH4Cl	

1	  L	

Na2HPO4・12H2O	

171	
  g	

KH2PO4	

30	
  g	

NaCl	

5	
  g	

H2O	

890	
  mL	

2	
  M	
  MgSO4	

1	
  mL	

Vitamin	  Mix	

100	
  mL	

0.1	
  M	
  CaCl2	

1	
  mL	

ビオチン	

100	
  mg	

コリンクロリド	

100	
  mg	

50	
  mM	
  ZnSO4	

1	
  mL	

葉酸	

100	
  mg	

20%	
  Glucose	
  

10	
  mL	
  (2g)	
  
(50	
  mL	
  (10g))	

ナイアシンアミド	

100	
  mg	

D-­‐パントテン酸	

100	
  mg	

Vitamin	  Mix	1	  mL	ピリドキサール	

100	
  mg	

リボフラビン	

10	
  mg	

チアミン	

100	
  mg	

(Celtone)	

(0.2	
  g)	

10	

大腸菌からの目的タンパク質調製	

11	

溶液タンパクNMR用サンプル管	
shigemi管（株式会社シゲミの対称形ミクロサンプルチューブ）	
  
内管と外管から構成され、溶媒の磁化率と一致したガラスを使用	
水溶媒用	
  5mm管	  	
  型番：BMS-­‐005B,J,V	
  
	
  
	
  上げ底長 	  
NMR装置	
  
	
  
	
   	
  
	
  
	
   Bruker 	
   Agilent	
  B: 	
  Bruker社プローブ用
	
  	
  	
  8	
  mm
	
  ○(△)
	
  ×	
  
J: 	
  JEOL（日本電子）
	
  12	
  mm
	
  ○
	
  ○	
  
V: 	
  Varian	
  (Agilent)
	
  15	
  mm
	
  ×
	
  ○	
	
必要液量（サンプル管単価）	
  wilmad 	  600	
  uL (100〜1,000円)	
  shigemi 	  250	
  uL (9,000円)	

左：wilmad管	
  右：shigemi管	
  主鎖帰属／構造解析用の多次元NMR測定を行うためには、	
  0.2	
  mM以上のタンパク質濃度が推奨	
  (10	
  kDaのサンプルでは	
  250	
  uLを用意するのに	
  0.5	
  mg必要)	
  (収率を考えると1リットルのM9で1mgぐらいとれることが必要)	
  12	

サンプル条件の推奨目安	
項目	

主鎖帰属／構造解析	

タンパク質濃度	

0.2	
  mM以上	  （相互作用解析時は0.05	
  mM以上）	

pH	

7.5未満	  （アミドプロトンを観測するため）	
  

塩濃度	

200	
  mM程度以下	  （Cryogenic	
  Probeのときは低いほど良い）	

重水	

5〜20%	
  （重水素ロック用）	

標準物質	

DSS	
  (	
  5	
  mg/ml	
  を1	
  ul）やDioxane	
  なくても良い	

緩衝系	

できればリン酸バッファーやD化バッファーなどプロトンを含まないもの	
13	

解析のためのアミノ酸配列の準備	
NifU1A

http://192.168.254.191/~kumeta/aa̲counter/index.php

seq name：NifU1A
2529) 4: L:2 :75 29L):)20) 4::7212L )5 L209017 0 7
72 105 :)L): 5:9 1 9L 2

(LLLL LL)
2 I 2 (LLL LL0
G (LLLL) (LLLL LL: : (LLL
0 (LLLL LL H (LLL

)GC 4 (LLLL LL C
)GE (LLLL LL I

(LLLL
(LLLL

5FD 5 (LLLL LL F

(LLLL LL9 F 9 (LLL

5
9FE

(LLLL
(LLLL

(LLLL LL9 F(LLLL LL AG

2 G 1 (LLLL LL)F 7 (LLLL

2529) 4: K:2 :75 29K):)20) 4::7212K )5 K209017 0 7
72 105 :)K): 5:9 1 9K 22529) 4: K:2 :75 29K):)20) 4::7212K )5 K209017 0 7
72 105 :)K): 5:9 1 9K 2

NMR測定を開始する前に	
  配列情報について整理しておく	
アミノ酸の個数情報は、	
  全体の数はNラベル体での検証時から、	
  個別の個数は側鎖帰属のときに活用される	
  （アーティファクト配列も含める）	
  
主鎖帰属で目安となりやすい、	  Gly(G),Ala(A),Thr(T),Ser(S)、	
  
HNを持たないPro(P)についてマーク	  一番下は主鎖帰属／側鎖帰属の撃墜マーク用。帰属できた残基を蛍光マーカーなどで染める	  14	

15Nラベル体（[1H-­‐15N]	
  HSQC）を用いて検証	

unpublished data	

・信号はしっかり分散しているか、シグナル強度は均一か	
  ・アミノ酸の個数分くらい信号が観測されているか	
  ・日持ちは良いか（信号強度は下がらないか、余計な信号は増えないか）	
  15	

安定性テストで信号が増えた場合	
15N標識したサンプルを用いて	
  安定性をテストした	
主鎖帰属や構造決定を目的とした	  タンパク質のNMR測定には	  非常に長い時間を要する	  （１〜２週間、１ヶ月程度）	
  	
  左のHSQCのように、５日経過	
  したときに分解物由来信号が	出現するようではNG	  この場合、	
  精製条件等を再検討する	
16	

溶液タンパク質NMR法の基本	
• 測定を始める前に	  • 主鎖帰属	  • 側鎖帰属	  • 立体構造解析	  • 相互作用解析	
17	

NMR解析で使用する原子の名前	

ギリシャ文字ではPC上での作業が困難なため対応するラテン文字に置き換える	
磁気的に等価な原子、例えばメチル基のプロトンは	  Pseudo	  atomとして表記する(QB)	

18	

帰属するということ	
タンパク質を構成する1H,	
  13C,	
  15N原子にはそれぞれ固有の化学シフト値があり、	
  その化学シフト値を求めること。	

[1H-­‐15N]	
  HSQCなど、スペクトル上にアミノ酸情報を入れる	
帰属の一覧テキスト（テーブル）を作成する	
19	

主鎖帰属の基本,	
  [1H-­‐15N]	
  HSQC	
直接結合する1Hと15Nの交差信号が観測されるスペクトル	

各信号がおよそアミノ酸残基１個に相当	
主鎖帰属＝[1H-­‐15N]	
  HSQCの各信号がどの残基に由来するのかを決定する	

20	

主鎖帰属用測定	
複数の３次元スペクトルを測定し、連鎖帰属をする	
  大部分の主鎖帰属用測定はHN-­‐detect	

主鎖連鎖帰属	H-­‐Nから次のH-­‐Nまでの間にある	  原子（Cα,	
  Cβ,	
  C’,	
  Hα）の	  化学シフト値で連鎖するように帰属する	

例）HNCA	
  /	
  HN(CO)CA	H-­‐NとH-­‐Nの間にある	  Cαの化学シフト値で連鎖する	21	

主鎖帰属用測定の名前	
例）HNCA	
  /	
  HN(CO)CA	

スペクトル（パルスシークエンス）名がそのまま観測する原子を指す	
（）で括られている原子は磁化移動に使用するが観測しない（されない）	
22	

主鎖帰属用測定セットの例	
間にある原子ごとに、２つのスペクトルを使用して連鎖する	

観測対象原子	スペクトル名（残基内	
  /	
  直前の残基）	

Cα	

HNCA	
  /	
  HN(CO)CA	C’	(HCA)CO(CA)NH	
  /	
  HNCO	CαとCβ	

HNCACB	
  /	
  CBCA(CO)NH	Hα（とHβ）	

HN(CA)HA	
  /	
  HBHA(CO)NH	スペクトル名を見て何が観測できるのか	
  イメージできる。	
23	

３次元スペクトルのイメージ	
スペクトルのイメージ	  • ３次元空間に信号が浮いている	  • HNCOでは、[1H-­‐15N]	
  HSQCの信号の位置の上に１個の信号が観測される。	
  • スペクトルの種類によって複数の信号が観測されることもある	

strip（短冊）で図示する	

24	

HNCA	  /	  HN(CO)CAとCBCA(CO)NH	
  /	
  HNCACB	
スペクトル名（残基内	
  /	
  直前の残基）	

観測対象原子	

HNCA	
  /	
  HN(CO)CA	Cα	HNCACB	
  /	
  CBCA(CO)NH	CαとCβ	

HN(CO)CAやHNCAは、CBCA(CO)NHや	  HNCACBに比べ感度と分解能が高い	  	
  目安として分子量10kDa以上なら	
  測定した方が良い	

25	

HNCA,	
  HN(CA)HA,	
  (HCA)CO(CA)NHおよびHNCACBは	
  一個前の残基の原子も弱く観測される	
HNCAでは、	
  一個前のCαが弱く	
  観測される	  	
  HN(CA)HAや	  (HCA)CO(CA)NHも	
  同様に一個前の	  HαやC’が弱く	
  観測される	
HNCACBでは、	
  一個前のCα,Cβが	  弱く観測される	  	
  CβはCαと正負反対	
  に観測される	
26	

HN(CA)HA,	
  (HCA)CO(CA)NHはGlyを観測できない	
α位がメチン（プロトンが一個、CH）であることを前提としているため、	
  ここがメチレン(CH2)であるGlyは信号を観測ができない（またはしづらい）。	

残基内原子を見たい測定であるにもかかわらず、	  一つ前の残基由来の信号が観測されていることに注意する。	

27	

CBCA(CO)NHとHN(CO)CACB	CBCA(CO)NHは、実はHBやHAからパルスを入れるのでCNラベルに限定される	
  HN(CO)CACBのCβはCαと正負反対に観測される	
  測定感度は	  
低分子量の場合にはCBCA(CO)NHの方が、	
  高分子量の場合にはHN(CO)CACBの方が良い	
28	

主鎖帰属／連鎖帰属の実践手順	

連鎖する残基それぞれのHN間にある原子	
  （Cα、Cβ、Hα、C’）の化学
シフトは一致する	  連鎖する残基、kとjの信号について	
29	

主鎖帰属／連鎖帰属の実践手順	

すべての通し番号をつけた信号についてアミノ酸配列情報に置き換える	  ＝主鎖帰属完了	
30	

各アミノ酸のカーボン化学シフト	

Gly,	
  Ala,	
  Ser,	
  Thrが特徴的な化学シフトをもつ	

original data from BMRB web site	31	その他、主鎖帰属の助けになる測定	
スペクトル名	

観測される原子（i番目の主鎖H-­‐N信号から）	

C(CO)NH	

i-­‐1のAliphagcのカーボン	

15N-­‐edited	
  NOESY	HNに近い（5Å以内）プロトン	

32	付録：特殊な主鎖帰属用測定	スペクトル名	対になるスペクトル名	

HCACO	HCA(N)CO	HCA(CO)N	HCAN	

Ogura et al., 2010, JBNMR	HNに頼らない主鎖帰属用測定	
  （代わりにCα-­‐Hαを使用）	
  	
  重水、高pH、連続したProなど
HNが利用できない条件のときに使用する	

33	

[1H-­‐15N]	
  HSQC上で観測される主鎖以外の信号	
側鎖中にあるH-­‐N由来の信号も[1H-­‐15N]	
  HSQC上で観測される	  上記で()で括られている信号が側鎖由来	  (Q119	
  Nε2やW156	
  Nε1、R121	
  Nεなど）	

unpublished data	

34	

Asn	
  (N)/Gln	
  (Q)の側鎖NH由来信号	

・NH2（プロトンが２個）なため、同じNの化学シフト値に２つの信号が並ぶ	
  ・溶媒中の重水とNH2の片方のプロトンが交換すると（NDHの状態になると（水色の四角））、	
  Nは高磁場シフト（化学シフト値の小さい方向へシフト、左図の上方向）する	
  ・NH2からは、大抵の主鎖３次元スペクトル上に信号は観測されない（NDHのときには観測される）	
  ・HNCOにおいて、Asn	
  (N)	
  側鎖NDHからはCγ、Gln	
  (Q)側鎖NDHからはCδが観測される。	
  ・CBCA(CO)NHにおいて、Asn	
  (N)	
  側鎖NDHからはCβ、Cα（CB,CA）が、	
  Gln	
  (Q)	
  側鎖NDHからはCγ、Cβ(CG,CB)が観測される	
  15・ N-­‐edited	
  NOESYでほとんど同じパターンになる（NOESYはNH2でもNDHでも観測される）	

35	

Arg	
  (R)/Lys	
  (K)の側鎖NH由来信号	Arg	
  (R) のNε-­‐Hε	
  (NE-­‐HE)	
  ・HNCOではCζ（CZ）が観測される	
  ・HNCAでは、Cδ（CD）が観測される	
  （Cδは40〜45ppmなのでGly	
  (G)	
  と間違える）	
  ・HN(CO)CAでは信号が観測されない	
  ・Nε（NE）は80〜90	
  ppmの化学シフト値	

Lys	
  (K)	
  のNζ-­‐Hζ	
  (NZ-­‐HZ)、Arg	
  (R)	
  のNη-­‐Hη	
  (NH-­‐HH)	
  ・ほとんど場合、交換が速くHSQCにおいて信号観測できない	
  ・NOESY以外の３次元スペクトルにおいてもは交換が速いためにほとんど信号観測できない	
  ・Lys	
  (K)	
  のNζは30〜40	
  ppm、Arg	
  (R)	
  のNηは60〜70	
  ppmの化学シフト値を持ち、主鎖のアミドプロト
ン観測中心（120前後）から大きく離れている＝通常の３次元測定で信号は観測されない	
36	

Arg	
  (R)/Lys	
  (K)の側鎖NH由来信号	

LysのNζ-­‐Hζ、ArgのNη-­‐Hη	
  N軸観測幅をかなり広く測定した[1H-­‐15N]	
  HSQC	  LysのNζ-­‐Hζ（NZ-­‐HZ）、ArgのNη-­‐Hη（NH-­‐HH）がそれぞれ観測されている稀なケース	
  	
  このスペクトルでは、Lysよりも高磁場側（化学
シフト値の小さい側）にHisのNε2-­‐Hε2も観測されている。しかしこれは本来、低磁場側（150	
  ppm付近）にあった信号が折り返し、この位置に観測されている	
  Kumeta et al., 2010, JBNMR	
37	

His	
  (H)/Trp	
  (W)の側鎖NH由来信号	
His : HHis	
  (H)のNδ1-­‐Hδ1	
  (ND1-­‐HD1)、Nε2-­‐Hε2	
  (NE2-­‐HE2)	
  ・His	
  (H)	
  側鎖NHは環境に応じてプロトン状態が多様に存在する	
  （溶媒のpHや活性中心、金属イオン配位等で変化）	
  ・Nδ1、Nε2ともに140〜170	
  ppmに観測される	
  ・NOESY以外の通常の３次元測定では、信号は観測されない	  Trp	
  (W)のNε1-­‐Hε1	
  (NE1-­‐HE1)	
  ・Nε1は120〜135	
  ppmに観測される	
  ・NOESY以外の通常の３次元測定では、基本的に信号は観測されないが、HNCOでだけ	  Cδ1の化学シフト値がC’のそれと微妙に近いため、	
  （HNCOの通常測定域は165〜182	
  ppmくらいで、Cδ1は120〜130	
  ppm）折り返した弱い信号として観
38	
測される	
  

折り返し信号	
一部の側鎖NH由来信号（Arg / Lys / Hisの側鎖NH）は[1H-15N] HSQC上で主鎖由来信号（100〜
136 ppm）より大きく離れた位置に観測される
主鎖由来信号を主に観測できるように観測幅を100〜136 ppmに設定するとその範囲外にある信号は折り返して観測される(折り返し信号)折り返し信号は、観測幅を変更することで判別できる（100〜136 → 90〜146）
測定方法を工夫すると、折り返し信号を安易に判別することができる (half dwell測定)39	[1H-­‐15N]	
  HSQCのhalf	
  dwell測定	
折り返し回数が奇数回の信号が正負反転する	
  unpublished data	

赤が正の信号、緑が負の信号	  Arg	
  (R)のNε-­‐HεやHis	
  (H)のNε2-­‐Hε2の信号が負の信号として観測される	
40	

[1H-­‐15N]	
  HSQC上信号の重なり	[1H-­‐15N]	
  HSQC上で同じ位置に２つ以上のHN信号がたまたま同じ位置に観測されることがある（下の例ではkとmの主鎖HN由来信号が同じ位置に観測される）	
  HNCOやHN(CO)CAなど３次元スペクトル上で一つのHNに対して一個だけ信号が観測される	
  41	
スペクトルを使用して、重なっているかどうかを判断する	

主鎖帰属／連鎖帰属の実践手順	

側鎖由来信号は主鎖帰属の対象から除外する	
  重なっている信号は取り扱いに十分注意する	
42	

主鎖帰属が大変な例(Type	
  I	
  AFP)	

unpublished data	

アミノ酸組成に極端な偏りがあったり、繰り返し配列がある場合、解析はとても困難	
43	

主鎖帰属が大変な例（FGFR1）	

Kobashigawa et al., 2015, GtC	

分子量が大きく（35	
  kDa）、残基数が多いために信号個数が多い	  [1H-­‐15N]	
  HSQC上での信号重複が著しい	
  
測定感度向上のために2D/13C/15Nラベル体での測定が必要	

44	

2D/13C/15Nラベル体での測定	

高分子量（over	
  20	
  kDa）のタンパク質はDCNラベルを用いないと	  
主鎖帰属測定で信号を観測できないことも多い	  	
  13C-­‐1Hから13C-­‐2Dにすることで、13Cの横緩和時間が長くなる。	
  => シグナルがシャープになって、S/Nが良くなる。	
  =>	
  三次元測定の感度が向上する。	
45	

2D/13C/15Nラベル体測定セットの例	
スペクトル名（残基内	
  /	
  直前の残基）	

観測対象原子	

HNCA	
  /	
  HN(CO)CA	Cα	(HCA)CO(CA)NH	  HN(CA)CO	  /	
  HNCO	C’	

HNCACB	
  /	
  CBCA(CO)NH	  HN(CO)CACB	CαとCβ	HN(CA)HA	
  /	
  HBHA(CO)NH	Hα（とHβ）	

H-­‐C（HAなど）を使用する測定は使用できない。	
  CBCA(CO)NHも、HBやHAからパルスを入れるので使用できない。	
  	
  TROSY（Transverse	
  relaxagon	
  opgmized	
  spectroscopy）測定にも良い効果	  DCNラベル+TROSY測定は高分子量（over	
  30	
  kDa）のタンパク質では	  
よく見かける測定方法	
46	

内在性N-­‐D/H交換	

D化サンプルの調整は、培地のH2OをD2Oに置換したM9培地を用いる。	
  作られたタンパク質はD化されており、アミドもN-­‐Dになっている。	
  精製過程中にN-­‐Hに置き換わるが、内在性のN-­‐Dはそのまま。	
  47	

主鎖帰属が大変な例（FGFR1）	
コンストラクションデザイン（loopの切除、
homo-­‐dimer面変異体の探索／作成）	

DCNラベル体を用いた測定で帰属できない領域があった（左図、緑の領域）	
  DCN体作成後、N-­‐2DからN-­‐1Hへの交換ができなかったことが原因	
CNラベル体でのHN(CO)CAとHNCA、15N-­‐
edited	  NOESYを用いて帰属を補完した	

48	

溶液タンパク質NMR法の基本	
• 測定を始める前に	  • 主鎖帰属	  • 側鎖帰属	  • 立体構造解析	  • 相互作用解析	
49	

シグナル帰属	• 主鎖帰属 ー [1H-­‐15N]	
  HSQCの信号を帰属	
  • 側鎖帰属 ー [1H-­‐13C]	
  HSQCの信号を帰属	
  – 脂肪族側鎖（Aliphagc側鎖）帰属	  （13Cが0〜80	
  ppm）	
  – 芳香族側鎖（Aromagc側鎖）帰属	  （13Cが110〜140	
  ppm）	
  
観測域がAliphagcとAromagcで大きく異なるため、	
  通常は分割して測定を行う	
50	

アミノ酸側鎖の帰属	
主鎖帰属で帰属した原子以外の	  側鎖の原子についての帰属をする	

51	

側鎖帰属の基本 CT-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC	

Kumeta et al., 2013, JBNMR	H-­‐Cの組み合わせの分だけ信号が観測される	
  constant	
  gme	
  evolugon（CT）を使用してC軸の分解能を向上	
  観測原子ごとに信号の正負がある（赤＝正、青＝負）	
  52	

側鎖帰属用の特殊な原子名（Pseudo	
  atom）	

[1H-­‐13C]	
  HSQC上で同じ位置に観測される	
  pseudo	  atomとして取り扱う（どちらも、QBまたはHB#など）	
53	

側鎖の原子名	CYANA書式の原子名（プログラムごとに名前が違うので注意が必要）	

54	

側鎖帰属に使用するスペクトル	
• Aliphagc	  – ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC	  (Aliphagc)	
  – C(CO)NHとH(CCO)NH	  – HCCH-­‐TOCSY	  (Aliphagc)（と(H)CCH-­‐TOCSY	  (Aliphagc)）	
  – 15N-­‐edited	
  NOESYと13C-­‐edited	
  NOESY	
  (Aliphagc)	
  • Aromagc	
  – ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC	  (Aromagc)	
  – HbCbCgCdHdとHbCbCgCdCeHe	  – HCCH-­‐TOCSY	
  (Aromagc)（と(H)CCH-­‐TOCSY	
  (Aromagc)）	
  – 15N-­‐edited	
  NOESYと13C-­‐edited	
  NOESY	  TOCSYや13C-­‐NOESYはAliphagcとAromagcを分けて測定する	
  近距離の1H情報が得られるNOESYスペクトルも参考にしながら帰属する	55	

（一般的な）HCCH-­‐TOCSY	H-­‐C-­‐(C)n-­‐C-­‐Hで繋がるプロトンが観測される（CA-­‐HAからHB2,3,	
  HG2,3...が観測）	
  Cの観測域が異なるAliphagc/Aromagcは互いに観測できない	  直接観測軸に観測対象のプロトンが並ぶ	
  間接観測軸のシグナル分解能が低いため、信号が分離されないことがある	
56	

Aliphagc側鎖帰属の方法-­‐1	
ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上でCA-­‐HAの帰属を行う	

HN(CO)CAとHNCA、HBHA(CO)NHとHN(CA)HAをそれぞれ重ねて表示させている	
  一つ前の残基を見るスペクトルを赤で、残基内を見るスペクトルを青で表示した	i-­‐1（赤）とi（青）のそれぞれのCAとHAの化学シフト位置で	
  ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上に観測されている信号を探して、帰属する	
57	

Aliphagc側鎖帰属の方法-­‐2	
ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上でCB-­‐HB,HB2,HB3,QBの帰属を行う	

CBCA(CO)NHとHBHA(CO)NHから帰属する	  CA-­‐HAからのHCCH-­‐TOCSYから帰属する	  	
CB-­‐HB,HB2,HB3,QBは、アミノ酸の種類によってct-­‐HSQC上での正負が異なる。	
58	

Aliphagc側鎖帰属の方法-­‐3	
ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上でCG以降について帰属する	  （Gln	
  (Q),Glu	
  (E),Met	
  (M),Arg	
  (R),Lys	
  (K),Pro	
  (P),Val	
  (V),Leu	
  (L),Ile	
  (I)）	

C(CO)NHなどを使用してCG,CD,CEの化学シフト値を求める	  HCCH-­‐TOCSYからHの位置を確認する（HG,HD,HEはわからない）	
  ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上にCG,CD,CEの線を引き、Hの位置に線を引く	
  CG,CD,CE平面のHCCH-­‐TOCSYからHのパターンが一致する箇所を見つける	  ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上に帰属をする	  59	

Aliphagc側鎖帰属の方法-­‐4	
ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上でメチル基（CH3）を帰属するときはNOESYも確認する	

C(CO)NHなどを使用してCG,CDの化学シフト値を求める	  ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上にCG,CDの線を引く	
  13C-­‐NOESYを参照する	
  13C-­‐NOESYで、残基内（i-­‐1）のプロトン、次の残基（i）のHNを確認する	
  ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上に帰属をする	
  60	

その他のAliphagc側鎖の帰属	
• Met	
  (M)	
  CE-­‐QE（CG,CE間にS原子（SD）があってTOCSYが通らない）	
  – ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上で負の強い信号	
  – 13C-­‐edited	
  NOESYで残基内HG2,3,HB2,3,HA,HNを探す	  • Asn	
  (N)/	
  Gln(Q)の側鎖アミド	  – HN(CO)CAでCB(Asn	
  (N)),	
  CG(Gln	
  (Q))を探す（但し、折り返しに注意）	
  – 15N-­‐edited	
  NOESYで残基内の近くにあるプロトン原子の信号から探す	  • Arg	
  (R)の側鎖アミド	  – NE-­‐HEからはHNCAでCDを探す	  – 15N-­‐edited	
  NOESYで残基内の近くにあるプロトン原子の信号から探す	  • Lys	
  (K)の側鎖アミド	

– 15N-­‐edited	
  NOESYで残基内の近くにあるプロトン原子の信号から探す	  61	

HbCbCgCdHdとHbCbCgCdCeHe	
HbCbCgCdHd(以下、CBHD)やHbCbCgCdCeHe(以下、CBHE)

CBHDスペクトルの例
CBとHDの交差信号が観測できる２次元
Phe (F)やTyr (Y)のHD1,2やHE1,2はそれぞれ同じ化学シフト値であることが多い（QD,QE）
但し、測定感度がかなり低いので２日から３日程度の積算が必要な場合もある
信号が観測できない場合もあるので留意する
62	

ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC	  (Aromagc)	
Aromatic側鎖原子はct-[1H-13C] HSQCでの観測位置がおおよそ決まっている

Trp (W)のCD1-HD1,
His (H)のCD2-HD2は負の信号として観測される
最初にAromatic側鎖帰属の足がかりとなる
CD-HDについて帰属する
Phe (F),Tyr (Y), Trp (W)は
HCCH-TOCSY (Aromatic)で繋がるので、同じ残基内由来の信号を仮帰属しておき、その後に最終帰属をする

63	

Aromagc側鎖帰属の方法-­‐1	

CBHD、CB-­‐HB2,3からのNOESYを使用し、QDを決定	
ct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上にCD1-­‐QDを探す。NOESYでHB2,3が見えていること	CD1-­‐QDからHCCH-­‐TOCSYで他のプロトン化学シフト値を求め、仮帰属する	
仮帰属について、CBHEを参照し、QEとHZを決定して帰属する	

64	

Aromagc側鎖帰属の方法-­‐2	
CBHDとNOESYでCD1-­‐HD1をct-­‐[1H-­‐13C]	
  HSQC上に帰属する	
HCCH-­‐TOCSYで残基内の信号を仮帰属する（CX1-­‐HX1〜CX4-­‐HX4）	
観測された位置からCZ2-­‐HZ2,	
  CE3-­‐HE3を帰属する	

[1H-­‐15N]	
  HSQC上で、NOESYを確認しながらNE1-­‐HE1を探して帰属する	
CZ2-­‐HZ2,	
  CE3-­‐HE3の13C-­‐NOESYを間を空けて並べる	  仮帰属していたCX1,	
  CX2についてNOESYを使いながら隣会うように並ばせる	
  CH2-­‐HH2,	
  CZ3-­‐HZ3について帰属する	
  65	

溶液タンパク質NMR法の基本	
• 測定を始める前に	  • 主鎖帰属	  • 側鎖帰属	  • 立体構造解析	  • 相互作用解析	
66	

NOE法による構造計算	
• NOE信号情報からプロトン原子間距離情報を求める	  • 距離情報により焼きなまし法を用いて立体構造を計算する	  • 得られた立体構造が正しいかを評価しつつ、最終構造を決定する	  67	

NOE法による立体構造解析	
構造決定までのおおまかな流れ	

NOESYから得られるプロトン原子間距離情報を用いて立体構造を計算する	

68	

NOEの原理	
NOEによる立体構造解析ではプロトン原子間NOEから得られる距離情報を使用する	

磁気的に相関する位置関係にある場合，（互いの距離が近い場合）
交差緩和により磁化が移動する．	
回転相関時間が長い場合（立体構造を形成するほぼ全てのタンパク質が該当する），
ダイアゴナル信号と同符号の交差信号（負のNOE信号）が得られる．
また，そのときの信号強度は原子間距離の６乗に反比例する．
プロトン間NOEが観測される相関距離は 5 Åまで．	
69	

NOESYスペクトル	
◀交差信号	
◀交差信号	
◀対角信号	

◀交差信号	

距離の６乗に反比例した（近いほど強い）強度で交差信号が観測される。	
70	

焼きなまし法（simulated	
  annealing）	

エネルギーが低いほど矛盾のない構造
RMSDが小さいほど束縛条件の良い構造	

71	

タンパク質中でのプロトンNOEの距離	
プロトンのNOE範囲は 5 Å以内（非常に短距離の情報）	
Type III AFP (7kDa)

Helixの一巻きが 5.4 Å	

２残基以上離れた残基間の束縛情報を表示（黄色の線，1084本）

精密なタンパク質立体構造解析のために必要なNOE信号数は数千個（双方向のNOE信号は組み合わせ１個につき１個の束縛情報にしかならない）（構造計算には重要ではない残基内プロトン間NOE信号が多数観測される）

72	

タンパク質のNOESYスペクトル	
13C，15N標識による３次元NOESYを使用する．	

数百個程度のNOE信号情報が分離・取得可能（分離不能な領域が多い）	

数千個程度のNOE信号情報が分離・取得可能

３次元NOESYを用いて，より多くのNOE信号情報を取得する．	

73	

自動NOE帰属付き構造計算ソフトウェア	

数千個程度のNOE信号情報

NOE信号の帰属と自動NOE信号帰属と距離情報への変換
距離情報への変換

構造計算	
  

各原子の
化学シフト値
立体構造をベースとしてNOE信号を再帰属
サイクルを複数回繰り返す事でNOE信号帰属と構造が収斂される	

CYANA: 優秀な帰属アルゴリズムを持っているため、初期構造を得やすい	
lNetwork Anchoring
近傍原子間を積極的にNOE信号を帰属する
lConstraint Combination
少し構造をゆがめてNOE信号を帰属する 	
(Guntert,	
  Prog	
  NMR,	
  2003)	
  74	

CYANAのアルゴリズムの実力	
同じ入力情報を用いてCYANAとCYANAアルゴリズムがないソフトで比較	

CYANAによる自動構造アルゴリズムは非常に優秀	
  75	

CYANAでの構造計算に必要なもの	
• 正確で十分量の化学シフト値情報（90%以上）	
  • ノイズを含まないNOESY信号情報	
  – 綺麗なスペクトルを取得する	
  – ピークピックに努力と工夫をする	
  • 配列情報や明らかになっている構造情報	  – S-­‐S結合や配位金属など	
  76	

構造計算の精密化	
CYANAの自動構造計算だけでは不十分	

RIG-I like receptor CTD構造	 LC3 X線結晶構造	
 Sugawara	
  et	
  al.,	
  Gene.	
  Cell,	
  2004	
  	
  

Cui	
  et	
  al.,	
  Mol.	
  Cell,	
  2008	
  	
  自動構造計算ではα１ヘリックスの位置がX線構造と異なっていた．	
  （Ubドメインから離れている）	

ホモログ構造と比較したときにループの構造が異なっていた	

構造を基盤とした機能解析を行うためには，構造計算の精密化作業が必要	77	

LC3のエラー構造の原因	
I34のγメチル基からのNOE自動帰属結果がおかしい	
CYANAによりY110-HB3とのNOE信号であると帰属されているが，Y110HB2の位置に信号が観測されていない．

I34とY110はβシート上で隣り合うストランド上の残基．
ネットワークアンカリングが入りやすい．

本来はF7のHB#との信号（α１とUbドメインとの間に観測されたNOEの数が少ない
ため帰属されなかった）CYANAの自動帰属ではNOEの数が少ない
二次構造間NOE信号は正しく帰属されにくい	
78	

精密化作業	CYANAによる帰属を
NOESYスペクトル上に反映	
エラーの原因となった
NOE信号（未帰属のことが多い）	
手動帰属した信号を
原子間の距離情報に変換
手動で帰属を行う	
手動束縛情報CYANAによる自動構造計算サイクル

NOE信号情報

NOE信号の帰属と距離情報への変換

構造計算
・制限を追加したことによるエネルギー的エラーがでない
・手動帰属がCYANAの自動帰属と同じ観測された全てのNOE信号が帰属され，構造計算に含まれるまで繰り返す

79	

精密化作業の成果-­‐1	
正しくフォールドする／精密な構造が得られる

Protein Glutaminase	

LC3	

LGP2
CTD	
Kumeta	  et	
  al.,	
  JBNMR,	
  2010	  Takahasi	
  et	
  al.,	
  JBC,	
  2009	  

精密化により機能との相関を議論できる立体構造になる	  80	

Protein	
  Glutaminaseでの精密化の効果	

81	

精密化作業の成果-­‐2-­‐1	
NOESYでしか帰属できない原子について帰属できる	

これらは通常，中性付近のpHでは溶媒との交換性が高く，観測されない．
（構造的束縛があると観測される）

Kumeta	  et	
  al.,	
  2013,	
  JBNMR	  活性型のみThr18のOH基プロトンが観測された精密化作業によって機能に直接関与する情報も得られる	
  82	

精密化作業の成果-­‐2-­‐2	

83	

NOE法を使用するメリット	
X線結晶構造解析法との比較	
  （得られる構造の精密さでは、X線法に到底及ばない）	

	
  l プロトン原子を直接観測する	
  l 機能に直接関係する情報が得られることがある	
  l 試料の結晶化を必要としない	  l より生体に近い条件での構造解析	
  l 溶液条件を変化させての構造情報	  	
  l 過渡的な状態の構造情報を取得できる	
  l 弱い相互作用による複合体の構造解析	
  84	

X線構造では不明だった状態の構造解析	
Atg7	
  C-­‐term.とAtg8の複合体構造解析	

Atg8（基質）のC末端がAtg7（酵素）の活性中
心adenylagon	
  siteに刺さっている立体構造	
  Atg7-­‐Atg8の結合およびadenylagon活性に
Atg7	
  C-­‐term.は必須	
  上記のX線構造からは説明がつかない	
  

Noda	
  et	
  al.,	
  2011,	
  Mol.	
  Cell	  Atg7	
  C-­‐term.とAtg8による過渡的な複合体構造を明らかにした	
  85	

構造計算に使用できるNOE以外の束縛情報	
TALOS	  (TALOS+)	

主鎖の化学シフト情報から主鎖二面角を予測する。phi角は正解率が高いが、psi角はイマイチ	

RDC	

Residual	
  Dipolar	
  coupling	
  配向媒体を加えて測定する手法。	
  弱く静磁場に対して配向させたタンパク質中に残っている
双極子相互作用を利用し、	
  主としてN-­‐Hベクトルの静磁場に対する角度がわかる	

PRE/PCS	Paramagnegc	
  relaxagon	
  enhancement	
  Pseudo	  contact	
  shiy	  常磁性体（ラジカル／磁性金属など）を用いた距離および角度の情報が得られる	
  86	

溶液タンパク質NMR法の基本	
• 測定を始める前に	  • 主鎖帰属	  • 側鎖帰属	  • 立体構造解析	  • 相互作用解析	
87	

タンパク質ーリガンド間相互作用解析のためのNMR測定方法	
• リガンドベース（リガンドの信号を使用する）	
  – STD	
  (Saturagon	
  Transfer	
  Diﬀerence)	
  – waterLOGSY	  • タンパク質ベース（タンパク質の信号を使用する）	
  – CSP	  (Chemical	
  Shiy	  Perturbagon)	
  – CS/TCS	
  (cross-­‐saturagon	
  /	
  transfer	
  cross-­‐saturagon)	
  88	

STD（Saturagon	
  Transfer	
  Diﬀerence）法	
タンパク質に飽和パルスを照射し、相互作用のあるリガンドを検出する方法	

半沢、滝沢 薬学雑誌(2010)	
89	

CSP(Chemical	
  shiy	  perturbagon)法	  化学シフト摂動法	
リガンドを加えることで相互作用面の磁気的環境が変化し、化学シフト値が変化する	

[1H-­‐15N]	
  HSQC（主鎖のアミド信号）を用いるCSP法が一般的	

90	

fast	
  exchange	
  /	
  slow	
  exchange	[1H-­‐15N]	
  HSQC信号のFree	
  stateからComplex	  stateに至るまで中間における挙動は結合の強さによって変化する	弱い結合（高いKd）であれば、fast	
  や	
  intermediate	
  exchange	  強い結合（低いKd）であれば、slow	
  exchange	  91	

fast	
  exchangeの例	
Atg8(116AA)のAtg19c22ペプチド(22AA)相互作用面解析	

0.2から2モル等量のAtg19c22を	
  加えたときの15NラベルされたAtg8について	  [1H-­‐15N]	
  HSQCをそれぞれ測定	  信号が滴加量に応じて移動	  ＝fast	  (intermediate) exchange	

Noda	
  et	
  al.,	
  2008,	
  Genes	  to	
  Cell	  92	

slow	
  exchangeの例	
LC3（120AA）とp62ペプチド(16AA)の例	

0.2から1モル等量のp62ペプチド	
  0.2や0.4モル等量添加時に、非結合状態と	
  結合状態の二つの信号が観測	
  ＝slow	
  exchange	

Noda	
  et	
  al.,	
  2008,	
  Genes	  to	
  Cell	  93	

CSP法に必要なもの（必須と推奨）	
• 主鎖帰属データと15Nラベルされたタンパク質	• なるべく高濃度に調製したリガンド	  – 結合の強さに依存するが数倍等量〜数十倍等量必要	  – リガンドを滴下しつつ、[1H-­‐15N]	
  HSQCを測定するので、もともとのタ
ンパク質濃度をなるべく下げないためにリガンドをできるだけ高濃度にしておく		  CSP法の注意点	

• 結合によって構造変化した場合、正しく結合面の情報が取得できない	
  • 結合状態の信号が観測できないと使用できない	  94	

Ligandが高分子である場合	
複合体形成時の信号が	  広幅化してしまい観測できない	free	
  stateのpeak減衰比率で	  代用することもある	
  cross-­‐saturagon法や	  Transfer	
  cross-­‐saturagon法を	  利用することで正しく相互作
用面を解析できる	  95	

CS（cross-­‐saturagon）法	
  交差飽和法	
結合相手（ligand、下記ではtarget）に選択的な飽和パルスを照射し、	  タンパク質側に磁化飽和を伝搬させる手法	
  結合面からの距離に応じて信号が飽和（減衰）する	

飽和パルスのOn/Oﬀなので、構造変化の影響を受けない	

96	

CS法のためのサンプル調整	
結合相手（Target）のみにパルスがあたるようにする	Nラベルされているので[1H-­‐15N]	
  HSQCで観測できる	
高純度に2DラベルされたProbeタンパク質が必要	

97	

TCS（Transfer	
  cross-­‐saturagon）法	  転移交差飽和法	
高分子量の結合相手の場合に適用	

この乖離した状態の	  Probeを観測する	98	

TCS法の例（KmAtg10(17kDa)のKmAtg5(30kDa)結合面）	

A:	
  CSP	  B,C:CSPのマッピング	
  D:	
  TCS	
  E,F:TCSのマッピング	
  
	

99	
 	
Yamaguchi et al., Structure (2012)

TCS法での留意点	
• 結合の強さ	
  結合が弱い組み合わせの方が検出しやすい	
  （乖離した状態の信号を検出するため）	
  	
  • 飽和させたProbe表面の水素原子から溶媒中の軽水を介して飽和が移動することがある	
  – 90%	
  D2Oを使用することで回避	  – そのためHNのアミド信号強度は１／１０	
  100	

STD/CSP/TCS法の特徴まとめ	
ラベル体の準備	
 得られる情報	

およその測定時間	

STD	

必要なし	

結合するligand	

1D測定（１０分〜程
度）	

CSP	

15Nラベルされたタンパク質側の相互作用面（すこしアバウト）	

2D測定（４０分〜２
時間x測定点数）	

TCS	

2D15Nラベルされタンパク質	たタンパク質	  90%	
  D2O溶媒	
  （とても高額）	

タンパク質側の相互作用面	
 2D測定（半日から二日を飽和On/Oﬀの
二点）	

101	

参考になる資料	
• STDについて	  Flagment-­‐Based	
  Drug	  DiscoveryのためのNMRスクリーニング	  半沢宏之,	
  滝沢剛 薬学雑誌 130,325-­‐333,2010	  • TCSについて	
  	
  NMRによるソフトな分子間相互作用解析法の開発と	
  	
  光合成明反応電子移動タンパク質間相互作用への応用	  	
  松本昌彦,	  上田卓見,	
  嶋田一夫 生化学	  80巻,10号,959-­‐971,2008	

102