日大歯学 , 95（1）, 7-12, 2021

原著

Recombinant mouse allograft inflammatory factor-1 の生物学的活性篠崎泰久

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 口腔構造機能学分野（指導：外木守雄 教授，浅野正岳 教授，篠塚啓二 助教）

要旨：Allograft inflammatory factor（AIF）-1 は，慢性拒絶反応が続くラットの移植心に集積するマクロファー
ジにおいて同定された 147 アミノ酸よりなる分子量約 17 kDa のタンパク質であり，その後同定された ionized
calcium-binding adaptor protein（Iba）-1 と同じ分子であることが明らかにされた。また，AIF-1 は Ca2+ -binding
EF-hand と類似した立体構造を有しており，その構造的特徴によって細胞増殖や遊走，炎症細胞の活性化，動脈硬化，線維化などに関与するとされている。しかし，AIF-1 の発現および調節機序等についてはいまだ不明な点が多い。
本研究では，遺伝子組換え技術を用いて recombinant マウス AIF-1（rAIF-1）を作製し，その生物学的活性について検討した。今回，rAIF-1 の精製度を上げるために，N 末端側に Histidine（His）tag を付加したタンパク質として精製した。その結果，得られた 17 kDa のバンドは，isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside により発現が増強されること，抗 Iba-1 抗体および抗 His 抗体に反応したことから His-tag rAIF-1 であることが確認できた。作製された
rAIF-1 をマウスミクログリア細胞である MG6 に作用させ，AIF-1 および interleukin-6 の mRNA 発現について
real-time PCR により検討した。その結果，rAIF-1 作用 1 時間後に両分子の mRNA 発現が増強された。そこでAIF-1 の発現変化をタンパクレベルで確認するために enzyme-linked immunosorbent assay により検討したところ，rAIF-1 刺激により rAIF-1 を作用させないコントロールと比較して有意に AIF-1 分泌が増強された。
以上のように，本研究で作製された rAIF-1 は，生物学的活性を有することが示唆され，その受容体の同定やAIF-1 の細胞外機能の追及などに有用であると考えられた。
キーワード：allograft inflammatory factor-1，recombinant タンパク，ウエスタンブロット，マウス

Biological activities of recombinant mouse allograft inflammatory factor-1
Yasuhisa Shinozaki
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Oral Structural and Functional Biology(Directors: Prof. Morio Tonogi and Prof. Masatake Asano and Assist. Prof. Keiji Shinozuka)

Abstract: Allograft inflammatory factor 1 (AIF-1) is a 147-amino acid protein with a molecular weight ofapproximately 17 kDa, identified in macrophages that accumulate in the transplanted hearts of rats
exhibiting continuous and chronic rejection. It was found to be the same molecule as the ionized calciumbinding adaptor protein (Iba)-1, and it is said to be involved in cell proliferation, migration, activation ofinflammatory cells, arteriosclerosis, and fibrosis. However, the exact mechanism of AIF-1 expression andmodulation remains unclear. In this study, we produced recombinant mouse AIF-1 (rAIF-1) using generecombination technology and studied its biological characteristics; we added a Histidine tag to theN-terminus of rAIF-1 in order to improve the purity of the protein. The resulting 17 kDa-protein wasconfirmed as the His-tag rAIF-1 because its expression enhanced with isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG) use, and it reacted with the anti-Iba-1 antibody and anti-His antibody. The prepared rAIF-1 wasallowed to act on the mouse microglia cell line MG6, and real-time PCR was performed to study the mRNA
expression level of AIF-1 and interleukin-6. The mRNA levels of both molecules increased one hour afterrAIF-1 introduction. We checked the changes in AIF-1 expression at the protein level by an enzyme-linked
immunosorbent assay, and observed significant enhancement of AIF-1 secretion by rAIF-1 stimulation,
relative to the control.
It is thus concluded that the rAIF-1 produced in this study has biological activity, and that it would be
useful to identify its receptor and further analyze the extracellular function of AIF-1.
Keywords: allograft inflammatory factor-1, recombinant protein, western blot, mouse（受付：令和 3 年 1 月 8 日）
責任著者連絡先：篠崎泰久
日本大学歯学部口腔外科学第Ⅰ講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8102
FAX：03-3219-8103
E-mail：deya15019@g.nihon-u.ac.jp

7日大歯学緒第 95 巻第 1 号

reaction（PCR）にて増幅した。使用したプライマーを表言

1 に 示 す。 得 ら れ た 増 幅 産 物 を pTrc-His-TOPO TAAllograft inflammatory factor（AIF）-1 は，ラットのExpression Kits（Invitrogen, Carlsbad, CA,USA）を用い異所性心移植モデルにおいて，冠動脈周囲に浸潤したマて，TA cloning により lacIq promoter と Histidine（His）

クロファージに発現するタンパク質として発見された。

Tag を有する pTrc-His-TOPO ベクターに挿入し，大腸147 ア ミ ノ 酸 よ り な る 約 17 kDa の ポ リ ペ プ チ ド で，菌 DH5α（タカラバイオ，草津）に transformation した

Ca -binding EF-hand を有している 。Interferon-γな（図 1）。得られた plasmid の DNA シークエンス解析をどによって発現制御される 2）が，マクロファージ以外に行い，塩基配列を確認した後，タンパク質発現用の大腸もリンパ球や線維芽細胞，脂肪細胞などからも産生され菌である BL21（ タカラバイオ）に transformation した。

ることが確認されている 3）。マウスでは，精巣や脾臓，なお，本研究は日本大学遺伝子組換え実験安全委員会のリンパ節，肝臓，胸腺などでも発現が認められ ，哺乳承認を得ている（許可番号：2019 歯 004-1）。

類間で高い相同性を示す

2.

2+1）

4）。その後の研究で，ionized-5, 6）

rAIF-1 の発現誘導と精製calcium binding adapter protein（Iba）-1 7）や microglia

得 ら れ た transformation 後 の 大 腸 菌 を LB 培 地 でresponse factor-1 8）などがクローニングされ，これらは37℃，18 時 間 振 盪 培 養 し た 後，1 mM isopropyl-β-D-AIF-1 と同じ分子であることが明らかとなり，その他のthiogalactopyranoside（IPTG）を作用させ，さらに 18 時類縁タンパク質と共に現在では AIF-1 family と呼ばれる間発現誘導した。培養後，大腸菌を回収し（10,000 × g，分子群を構成している 9）。AIF-1 は，細胞増殖や細胞遊走，5 分 ）， 上 清 を 捨 て た 後，urea buffer（8 M Urea，サイトカイン，ケモカインの分泌，動脈硬化，内分泌系，

100 mM NaH2PO4，10 mM Tris-HCl，pH6.3）に溶解した。

線維化などへの関与が報告されている 1）が，その本質的溶解液を 30 秒間，5 回，氷上で sonication した後，4℃な機能についてはいまだ不明な点が多い。本研究では，

で 10,000 × g，5 分間遠心し，上清を 15 ml チューブに遺伝子組換え技術を用いて recombinant マウス AIF-1

回 収 し た。 こ れ に，Ni2+ -NTA- ア ガ ロ ー ス ビ ー ズ（rAIF-1）を作製し，その生物学的活性の有無について検（QIAGEN）を添加し，4℃で 18 時間ビーズと溶解液を混討することを目的とした。

合 し た。 反 応 液 を 遠 心 し て， ビ ー ズ を 回 収 し，ureabuffer で 4℃にて 5 回洗浄した。洗浄後，ビーズの一部材料および方法
1.

を sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis（SDS-PAGE）（ゲル濃度 15％）,に供した。

発現ベクターの構築と大腸菌への transformation
AIF-1 の full length cDNA はマウスのマクロファージ泳動後のゲルを通法に従い，Coomassie Brilliant Blue

系培養細胞株 RAW264.7 細胞から total RNA を抽出し，（CBB）で染色し，rAIF-1 の存在を確認した。rAIF-1 のcomplementary DNA を作成した後，polymerase chain

精製は，Ni2+-NTA- アガロースビーズを urea buffer で 5回 洗 浄 し た 後，elution buffer（500 mM imidazole inurea buffer）により抽出した。抽出液中の rAIF-1 濃度はprotein assay kit（Bio-Rad）により測定した。
3.

Western blot 法得られた rAIF-1 を段階的に希釈し，SDS‐PAGE（ゲル濃度 15％）に供した。通法に従いナイロン膜に泳動タン パ ク を transfer し た 後 に 1％ BSA-PBST（0.2％図1Tween-20/PBS）によりブロッキングを行った。1 次抗体

発現ベクターの構築
Full length AIF-1 の open reading frame を大腸菌発現ベクターである pTrc-His vector に subcloning した。

表1は，ウサギ抗マウス Iba-1 モノクローナル抗体（Abcam；ab178846）またはマウス抗 His モノクローナル抗体（医学mouse AIF-1 プライマー8

遺伝子組換えマウス AIF-1 の活性

令和 3 年 6 月

生物学研究所，東京）を 1% BSA-PBST で 1,000 倍に希収した。回収した培養上清を遠心機で 12,000 × g，3 分釈したものを用いた。2 次抗体は horseradish peroxidase

間 遠 心 し サ ン プ ル と し た。AIF-1 の 定 量 は ELISA kit（HRP）標識ヤギ抗ウサギ IgG（H+L）抗体（Abcam）また（MyBioSource, San Diego, CA, USA）を用いて製造社指は HRP 標 識 ヤ ギ 抗 マ ウ ス IgG（H+L）抗 体 を 1% BSA-示に従い，行った。

PBST で 10,000 倍希釈したものを用いた。バンドは ECL

7.

4.

変化，また，AIF-1 タンパク質レベルでの産生変化に関MG6 の培養と rAIF-1 による刺激する統計学的解析は等分散検定の Paired t-test を用いて

rAIF-1 の生物学的活性の評価にはマウスミクログリア由来細胞株 MG 6

統計学的解析
rAIF-1 刺激による AIF-1 および IL-6 mRNA の発現kit（GE Healthcare）を用いて検出した。

有意差検定を行った。なお，p<0.05 を有意差ありとした。

を用いた。細胞の培養は 10% ウシ10,11）

胎 児 血 清 を 添 加 し た Dulbecco's minimum essential

結medium にペニシリン・ストレプトマイシンを加えたもの を 用 い た。 培 養 プ レ ー ト（24-well）に 細 胞 を 1×105/

果

1． IPTG による rAIF-1 発現増強

well で播種し，rAIF-1（10 ng/ml に調整）で刺激した。

Transformation により得られた大腸菌 BL21 を 1 mM

また，未刺激での培養をコントロールとした。Enzyme-IPTG 存在下または非存在下に培養し，rAIF-1 の誘導のlinked immuno sorbent assay（ELISA）に用いた上清サ有無について検討した。Ni2+ -NTA- アガロースビーズにンプルは，rAIF-1 での刺激 1 時間後に rAFI-1 を含まな吸着させた rAIF-1 を電気泳動し，CBB 染色により確認い培地に交換し，さらに 18 時間培養したものを用いた。

を 行 っ た。 そ の 結 果， 図 2 に 示 し た 通 り，rAIF-1 は

5.

IPTG 存在下で明瞭に発現増強され，17 kDa の位置に泳Real-time polymerase chain reaction（Real-timePCR）

動された。

細胞を刺激し，1 時間後に total RNA を RNeasy mini

2． Western blot における rAIF-1 の確認kit（QIAGEN）を用いて抽出し，Superscript Ⅲ Reverse

IPTG で発現誘導されたタンパクが rAIF-1 であることTranscriptase（Invitrogen）を用いて cDNA を作成した。

を western blot により確認した。得られた rAIF-1 を段PCR は TB Green Premix Ex Taq

Ⅱ（Tli RNaseH

階的に希釈し，western blot を行ったところ，用いた抗Plus，タカラバイオ）を用いて行い，Thermal Cycler

Iba-1 抗体と反応したバンドは，CBB 染色で確認されたDice Real Time System TP800（タカラバイオ）によりバンドと同じ 17 kDa の位置に認められ，検出限界は約解析した。House keeping 遺伝子として glyceraldehyde

60 pg であった（図 3，上段）。また，作製した rAIF-1 は3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）を用いた。Realtime PCR に用いた primer はタカラバイオより購入した。
6.

ELISA による AIF-1 の定量
rAIF-1 で MG 6 を刺激し，18 時間後に培養上清を回図3

図2

CBB 染色による rAIF-1 の発現確認
1 mM IPTG の存在下または非存在下で 18 時間発現誘導させた 後， 大 腸 菌 を urea buffer に 溶 解 し た。 溶 解 液 を Ni2+ NTA- アガロースビーズに吸着させ，洗浄，SDS-PAGE（ゲル濃度 15%）後，CBB 染色した。

9Western blot による rAIF-1 の確認
上段：Ni2+ -NTA- アガロースビーズにより精製した rAIF-1
を imidazol に よ り 溶 出 さ せ， 段 階 的 に 希 釈 し た 後，SDSPAGE（ゲル濃度 15%）を行った。泳動後，ナイロン膜に転写し抗 Iba-1 抗体により western blot を行った。
下 段：IPTG 存 在 下 ま た は 非 存 在 下 で 得 た 細 菌 溶 解 液 を，Ni2+ -NTA- アガロースビーズに吸着させ精製し，抗 His 抗体を用いて western blot を行った。

日大歯学

第 95 巻第 1 号

N 末端に histidine-tag を付加していることから，抗 His考抗体を用いて同様に western blot を行った。その結果，抗 Iba-1 抗体と同様に 17 kDa の位置にバンドが検出され察

今回の実験では，大腸菌を用いて rAIF-1 の精製を行った（図 3，下段）。

た。実験的に，タンパク質の精製を行った場合，市販の3． rAIF-1 の生物学的活性の判定

recombinant タンパク質とは異なり，濃度や量が不安定

得 ら れ た rAIF-1 の 生 物 学 的 活 性 を 判 定 す る た め にに な り や す い。 ま た， 他 の タ ン パ ク 質 の 混 入

MG 6 を rAIF-1 に よ っ て 刺 激 し，AIF-1 お よ び IL-6（contamination）や，精製過程で混入する共存物質によっmRNA の発現変化について検討した。その結果，刺激 1て正確な定量分析が困難となるなどの問題がある 12）。そ時 間 後 に，AIF-1 は コ ン ト ロ ー ル に 比 較 し て 1.49 倍，こで，今回は，rAIF-1 の精製度を上げるために，N 末端

IL-6 は 1.62 倍に発現が増強された（図 4）。

側に His-tag を付加したタンパク質として精製すること

rAIF-1 刺激による AIF-1 mRNA 発現増強をタンパクにした。His-tag は，6 ～ 10 残基の His からなり，タグ質 レ ベ ル で 確 認 し た。 刺 激 18 時 間 後 の 培 養 上 清 中 の部分の分子量が小さいために目的タンパク質の活性や構AIF-1 タンパクを ELISA により測定したところ，コン造への影響が少ないうえ，Ni イオンに対して高いアフィトロール群では 6.2 ± 0.2 pg/ml であったのに対し，刺ニティーを有する 13）。さらに精製方法がほぼ確立されて激群では 16.1 ± 5.1 pg/ml に発現が上昇した（図 5）。

いることから，組換えタンパク質の精製と検出に広く用いられている方法である。本研究では，Ni-NAT アガロー
スゲルと結合したタンパクは，CBB で染色される SDSPAGE 像で 17 kDa の位置に泳動され，さらにこのタンパクバンドは IPTG 添加で発現の増加が確認された。本研究で用いた plasmid ベクターは，クローニングサイトの 前 に lacIq プ ロ モ ー タ ー を 有 す る（ 図 1）こ と か ら，
IPTG で発現が増加したタンパクは rAFI-1 である可能性が考えられた。次に，AFI-1 と同じ分子であることが報告されている Iba-1 に対する抗体または His-tag に対する抗体で western blot を行った結果，17 kDa のタンパ
クはこれらの抗体と反応したことから，His-rAIF-1 であることが確認された。
次に，得られた rAIF-1 の生物学的活性を検証するために，マウスミクログリア由来細胞 MG 6 を rAIF-1 に

図4

図5rAIF-1 による AIF-1 および IL-6 mRNA 発現誘導
マウスミクログリア細胞 MG 6 を rAIF-1（10 ng/ml）によって 刺 激 し，AIF-1 お よ び IL-6 mRNA の 発 現 変 化 に つ い て
real-time PCR により検討した。*P ＜ 0.05（n=3）

10ELISA による AIF-1 産生誘導の確認
図 4 と同様に MG 6 を rAIF-1 存在下および非存在下で刺激し，18 時間後に培養上清を回収した。上清中の AIF-1 濃度を ELISA により測定した。*P ＜ 0.05（n=4）

遺伝子組換えマウス AIF-1 の活性

学部口腔外科学第Ⅰ講座の外木守雄教授に心より感謝申し上げます。 本研究をご指導およびご校閲賜りました日本大学歯学部病理学講座の浅野正岳教授に謹んで深く感謝申し上げます。最後に本研究を通じ多大なるご協力とご助言を賜りました，日本大学歯学部口腔外科学第Ⅰ講座の篠塚啓二助教を始め，日本大学歯学部口腔外科学第Ⅰ講座また日本大学歯学部病理学講座の皆様に感謝いたします。
本研究に関して，開示すべき利益相反はありません。

より刺激したところ，AIF-1 および IL-6 mRNA の発現が増強された。これまで，AIF-1 がマクロファージ系細胞である RAW264.1 細胞において IL-6 発現を誘導することが報告されているが 14），AIF-1 自体の発現誘導を示した報告は見当たらない。この結果を確認するために
ELISA により AIF-1 分泌量を確認したところ rAIF-1 刺激群において AIF-1 産生が増強されていることが明らかとなった。このことは，AIF-1 産生細胞であるミクログ

文リアに対して，AIF-1 が作用し，オートクラインにより
AIF-1 自体の発現を誘導する可能性を示唆したものであ要がある。また，前述の RAW264.7 細胞は MG6 とともにマクロファージ系細胞ではあるが，近年マクロファージやミクログリアにも機能的な違いから数種類の細胞系
統 が あ る こ と が 示 さ れ て い る 15）。 本 研 究 の 結 果 は，
AIF-1 の標的となるミクログリアがどの系統に属する細胞であるかを確認する一助になりうると考える。
AIF-1 は様々な病態において血中濃度が上昇することが知られている 4）。しかし，AIF-1 の血中濃度の上昇が生体にとってどのような意味を有するのかについては充分に解明されていない。AIF-1 の機能は前述の通り多彩であるが，AIF-1 の受容体はいまだにクローニングされておらず，従ってそのシグナル伝達経路についても不明な点が多い。本研究で作製された rAIF-1 は，生物学的機能を発揮しうるものであったことに加え，その受容体の同定や AIF-1 の細胞外機能の追及などに有用であると考えられた。

論

本研究では，遺伝子組換え技術を用いて rAIF-1 をより高精度に精製するために，N 末端側に His tag を付加したタンパク質として作製し，その生物学的活性について検討した。その結果，以下の結論を得た。
1.

rAIF-1 は IPTG 存 在 下 で 明 瞭 に 発 現 増 強 さ れ，17 kDa の位置に泳動されることが明らかとなった。

2.

rAIF-1 は，抗 Iba-1 抗体および抗 His 抗体に反応したことから，His-tag rAIF-1 であることが確認できた。

3.

得られた rAIF-1 でマウスミクログリア由来細胞株
MG 6 を刺激したところ，AIF-1 および IL-6 mRNAの発現増強が認められた。

4.

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り，その分子メカニズムの詳細は今後さらに検討する必結令和 3 年 6 月

rAIF-1 刺激による AIF-1 の発現増強はタンパク質レベルでも確認された。
以上より，得られた rAIF-1 は生物学的活性を有しており，その受容体の同定や AIF-1 の細胞外機能の追及などに有用であると考えられた。
本研究遂行にあたり，格別なるご指導を賜りました日本大学歯11日大歯学

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