日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 92, 43-50, 2018

眼窩下神経損傷モデルラットにおける神経障害性疼痛の発症機構
佐

藤

有

華

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：今村佳樹教授 , 岩田幸一教授 , 岡田明子准教授）

要旨：ラットの眼窩下神経（infraorbital nerve: ION）を半結紮した IONI 群の神経障害性疼痛の発症機構を調べることを目的とした。IONI 群の口髭部における機械刺激に対する頭部逃避反応閾値および Vc における pERK とAMPA 受容体のサブユニットである GluR1 のリン酸化（pGluR1）の相互作用を調べた。その結果，IONI 群において機械刺激に対する痛覚過敏が発症し，ERK のリン酸化阻害で有意に抑制された。Vc における pERK 陽性細胞数は有意な増加を認め，侵害受容ニューロンが活性化していることがわかった。また，Vc における pERK 陽性細胞
は pGluR1 と共発現しており，pERK と pGluR1 は機能的に関連する可能性が示された。pGluR1 タンパク発現量は増加傾向を認め，ERK のリン酸化阻害により減少する傾向を認めたが，GluR1 タンパク発現量は変化を認めなかった。以上より，ION の傷害により ERK のリン酸化が亢進し，続いて GluR1 がリン酸化され，AMPA 受容体を介した Vc ニューロンの感受性が増大することで機械痛覚過敏が発症すると推察された。ION 損傷による機械痛覚過敏には ERK のリン酸化と GluR1 のリン酸化が重要な役割を担っていると考えられる。
キーワード：pGluR1，pERK，神経障害性疼痛，眼窩下神経

緒（AMPA）受容体と結合することによって成立するといわ言れている。末梢に加わった侵害刺激によって一次ニュー抜歯や外科的矯正手術などの口腔外科的処置により三ロン終末からグルタミン酸の放出が持続すると，AMPA

叉神経が傷害されると，口腔粘膜や顔面皮膚に痛覚過敏受容体はリン酸化され，これにより細胞内に多くの Na＋や感覚異常などが引き起こされることがある 1）。その症や Ca2＋流入が生じ，Vc ニューロンの興奮性を増強する。

状は難治性で，治療に苦慮することが多く，このような

特に，興奮性シナプス伝達の長期増強（LTP）に関しては難治性の異常疼痛の適切な診断および治療法を確立する

AMPA 受容体の trafficking が注目されており，その中ためにはその発症のメカニズムを解明することが非常にで AMPA 受容体の細胞膜への挿入には ERK が重要な役重要である。

割を果たしているとの報告がある 10, 11）。LTP の発現に

三叉神経脊髄路核尾側亜核（Vc）は口腔顔面領域の侵害

は，AMPA 受容体サブユニットの一つである GluR1 が情報を中継する代表的な核として知られており 2），口腔

リン酸化された phosphorylated GluR1（pGluR1）が必要

顔面の炎症や三叉神経傷害モデル動物では，Vc ニューであることが分かっている 12）。また，神経障害性疼痛モ

ロンにおいて様々な分子の発現変化が生じていることがデルにおいては，pGluR1 が中枢神経で増加しており，。たとえば，口腔顔面領域に侵害刺激疼痛発症に関与している可能性が報告されている 13, 14）。

が加わると，数分以内に Vc ニューロンに extracellular

以上より，三叉神経損傷後に生じる口腔顔面領域の異常

signal-regulated kinase（ERK）のリン酸化が生じ，リン疼痛には，Vc の侵害受容ニューロンにおける pERK と

酸化 ERK（pERK）陽性細胞が検出される。pERK 陽性細pGluR1 間の機能的な相互作用が関与することが推察さ

胞数は機械刺激や熱刺激の強度に依存して増加すれる。

報告されている3,4）

る 5, 6, 7）。異常疼痛の原因と考えられている中枢感作やワ本研究では，ラットの三叉神経第二枝の枝である眼窩

インドアップ現象にも pERK が関与していると報告され下神経（infraorbital nerve：ION）の傷害による異常疼痛8, 9）。 こ れ ら の 知 見 は Vc ニ ュ ー ロ ン に お け る

発症メカニズムを明らかにするため，眼窩下神経部分結ERK のリン酸化が侵害受容ニューロンの興奮性増強に関紮（IONI）ラットを用いて侵害刺激に対する頭部逃避反射

与していることを示している。

閾値（HWT）を測定するとともに , 延髄のニューロンにおている

ける pERK と pGluR1 の発現変化を免疫組織化学的手法

Vc に お け る 三 叉 神 経 の 一 次 ニ ュ ー ロ ン か ら 二 次

および Western blot 法を用いて解析した。

ニューロンへのシナプス伝達は，グルタミン酸が alphaamino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid

（受付：平成 30 年 1 月 18 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1343

薬 物 を Vc 領 域 の 大 槽 内 に 投 与 開 始 し て か ら 3 日 後 に材料および方法

IONI 処置を行い，機械刺激に対する HWT を測定した。
5.

1． 実験動物

免疫組織化学的解析

本研究は，日本大学歯学部動物実験委員会の承認（承IONI ま た は sham 処 置 後 3 日 目 の IONI 群（n ＝ 5），

認番号 AP15 D008）を得て，また動物の処置は国際疼痛

Sham 群（n ＝ 5），PD 群（n ＝ 6），Vehicle 群（n ＝ 6）にお学 会 の ガ イ ド ラ イ ン に 従 っ て 行 わ れ た 15）。 実 験 に はいて免疫組織化学的解析を行った。三種混合麻酔下にSprague-Dawley 系雄性ラット（Japan SLC）を用い，恒フォンフライヘアを用いて口髭部に侵害機械刺激（強度：

温，恒湿（24±1℃，55±5%）の環境下で 12 時間の明暗サ

60 g，持続時間：10 分，間隔：1 秒，刺激回数：600 回）

イクルを保ち , 感染防止策を施した施設で飼育した。さを加え，5 分後に灌流を行った。生理食塩液に次いで 4%らに，苦痛を最小限にとどめ , 頭数の削減に努めた。

パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド /0.1 M リ ン 酸 緩 衝 溶 液（pH7.4,

2． IONI ラットの作製PFA）を用いて灌流固定を行い，延髄を摘出した。次に4% PFA 溶 液 で 48 時 間 後 固 定 し，20% ス ク ロ ー ス 加

塩酸メデトミジン 0.15 mg/kg，ミダゾラム 2 mg/kgと酒石酸ブトルファノール 2.5 mg/kg を混合した三種混

0.01 M TBS に 24 時間浸漬した。その後，ミクロトーム

合麻酔下でラットの左側上顎臼歯部歯肉頬移行部に 1（Leica SM2000 R，Leica Microsystems） に て 厚 さcm の縦切開を施し , 三叉神経第二枝である ION を剖出

30μm の前額断の連続切片を作製し，4 枚毎に 1 切片をして神経束の腹側半分に糸を通して結紮した後 , 切開部

取り出して 0.01 M PBS 中に保存した。 抗 pERK 抗体を縫合し，これを IONI 群とした。また神経の結紮は行

染 色 の た め に， 浮 遊 切 片 を 室 温 で 2 時 間，0.3%Triton

わ ず， 神 経 の 剖 出 だ け を 行 っ た 後 に 縫 合 し た も の を

X-100/3% normal goat serum 加 0.01 M PBS に浸漬

Sham 群とした。

し，ブロッキングを行った。次に，4℃で 72 時間 rabbit

3.

anti-phospho-p44/42 MAPK（Thr202/Tyr204） 抗 体

ERK リン酸化阻害薬の大槽内持続投与（1:1000；Cell Signaling）と反応させた。その後 0.01 M

大槽内へのカテーテル挿入は先行研究と同様の方法を用いて行った 3）。IONI または Sham 処置の 3 日前にラッ

PBS に て 洗 浄 し， 室 温 で 2 時 間 goat anti-rabbit IgG

トを三種混合麻酔薬で麻酔し，脳定位固定装置に固定後，（1:600；Vector Laboratories）と 反 応 さ せ た。 そ の 後後頭骨を露出し，小穴をあけ，長さ約 5 mm のポリエチ

0.01 M PBS にて切片を洗浄し，室温で 1 時間 ABC（1：レンチューブ（直径 0.8 mm，Natsume）の先端が大槽へ

100；Vector Laboratories）で酵素抗体反応を行った。さ到達するように設置した。チューブは後頭骨に接着剤でらに，0.01 M PBS にて洗浄後，0.05 M Tris buﬀer（TB）

固定した後 , 頭蓋骨に立てたスクリューピンとともに歯で 10 分 間 洗 浄 し，0.035% 3.3ʼ-diaminobenzidine-tera

科用レジンで固定した。チューブは浸透圧ミニポンプ

HCl（DAB，Sigma-Aldrich），0.2% nickel ammonium（Alzet model 2001，Durect Corporation）に接続し，ラッ

sulfate，そして 0.05 M TB（pH 7.4）に 0.05% H 2O2 で発トの背部皮下に埋入し縫合した。ERK リン酸化阻害薬で色させた。切片は 0.01 M PBS で洗浄し，スライドガラ

ある PD98059（1μg/μL，DMSO に溶解：PD 群），またス（Matsunami）に貼り付け，乾燥させ，一連のアルコー

はその溶媒である 10%DMSO（Vehicle 群）で浸透圧ポン

ル（50-100%）とキシレンで脱水および脱脂し，カバーガプを満たし，薬物を 1μL/hour の速度で 7 日間持続投与

ラスと封入剤（Eukitt, O. Kindler）を用いて封入した。光した。

学顕微鏡下に均質で灰 - 黒色の点状の構造物を有する

4.

pERK 陽性細胞を確認した。切片を 4 枚毎に 1 枚抽出し，三叉神経第二枝支配領域への機械刺激に対する

HWT の測定

各切片に発現した pERK 陽性細胞数をカウントし，3 枚

逃避行動観察は先行研究と同様の方法を用いて行っ分の切片に発現した pERK 陽性細胞数を平均し , 吻尾方た 6）。まず，ラットの馴化を 1 週間かけて行った。ラッ向における pERK 陽性細胞数について解析を行った。

トを小窓のあるプラスチックケージに入れ，20 分間以上

二重蛍光免疫組織化学的解析では，上記と同様にして小窓から顔面を突出して静止することができるように訓

ブロッキングを行い，rabbit anti-phospho-AMPA 受容練した。さらに，左側口髭部中央にフォンフライヘア

体（GluR1, Ser845）抗体（1:300, Cell Signaling），mouse（Stoelting）を用いて機械刺激を加え , 痛みを伴わない刺anti-phospho-p44/42 MAPK（Thr202/Tyr204）抗体（1：激に対しては逃避反応を示さないように訓練した。この300, Cell Signaling）または mouse anti-NeuN（1：1000；

ように馴化してから機械刺激に対する HWT の測定を行Millipore）抗 体 に 4℃，3 日 間 反 応 さ せ た。Goat anti-

い，この値をコントロール値とした。その後，免疫組織

rabbit Alexa Fluor 568 IgG（1：200；Invitrogen）と化学的解析に合わせて，IONI 後 3 日目に HWT を測定

g o a t a n t i - m o u s e A l e x a F l u o r 488 I g G（1：200；

した（n ＝ 6）。HWT は 3 回測定し，その中央値を求めた。

Invitrogen）に．暗室において室温で 2 時間反応させ，そまた PD 群（n ＝ 7）と Vehicle 群（n ＝ 8）ではそれぞれのの後 0.01 M PBS で 10 分ずつ 3 回洗浄し，PermaFluor

44

眼窩下神経損傷後の神経障害性疼痛発症機構（Thermo Fisher scientiﬁc）を用いて封入した。次いで，

叉神経第二枝領域に多く認められた（第 1 図 Aa）。しか標本を共焦点レーザー顕微鏡（LSM510，Carl Zeiss）と蛍

し，Sham 群では同部に少数の発現が認められただけで光顕微鏡（BZ9000，Keyence）を用いて観察した。

あ り（ 第 1 図 Ab）， 尾 側 2400μm に お け る IONI 群 の6.

pERK 陽性細胞数は，Sham 群と比較して有意に多かっWestern blot 法

た（第 1 図 B）。

IONI による GluR1 と pGluR1 のタンパク発現量の変3.

化を Western blot 法を用いて検討した。

PD98059 投与による HWT と ERK のリン酸化

IONI ま た は sham 処 置 後 3 日 目 の ラ ッ ト（IONI 群：

Vehicle 群の HWT は，IONI 前と比較し，結紮 1 日目

n ＝ 6，Sham 群：n ＝ 6，PD 群：n ＝ 6）を三種混合麻酔から 21 日目において有意に低下したが，PD 群の HWT

下に生理食塩液で灌流し，Vc を含む延髄領域を取り出

では，IONI 前と比較して有意な閾値の低下は認められなした。また未処置のラット（Naïve 群：n ＝ 6）についてもかった。また，ION 結紮 1 日目から 21 日目においては，同様に延髄を摘出した。各組織を 4℃の lysis buﬀer に溶PD 群の HWT は，Vehicle 群と比較し，有意な上昇が認解し，さらに Laemmli sample buffer（Bio-Rad）に溶解

め ら れ た（ 第 2 図 A）。 さ ら に，obex より 尾 側 2400μm

した。95℃，5 分間熱処理した後，10% TGX gels（Bio-付近の Vc 表層において，IONI 群の口髭部への機械刺激Rad） に て 電 気 泳 動（200 V，30 分 間 ） し た 後，により多数の pERK 陽性細胞が認められた（第 1 図 A）のpolyvinylidene diﬂuoride membrane（Bio-Rad）に転写しに対し，PD 群では pERK 陽性細胞は少なかった（第 2 図

た。転写膜を 0.1% Tween20 を含む 0.01 M TBS（TBST）

Ba）。しかし，Vehicle 群では，IONI 群と同様，Vc 表層

で 30 分 間 洗 浄 し た 後，3% bovine serum albuminに多数の pERK 陽性細胞が認められた（図 2 Bb）。Obex

blocking solution 中で , 室温にて 1 時間ブロッキングしより 2400μm 尾 側 に お け る PD 群 の pERK 陽 性 細 胞 数た。その後，rabbit anti-phospho-GluR1 抗体（1：1000，

は，Vehicle 群と比較して著しく少なかった（第 2 図 Bc）。

Abcam） ま た は rabbit anti-GluR1 抗 体（1：1000，
Abcam）に対して 4℃で 12 時間反応させた。TBST で洗浄した後，anti-rabbit IgG-HRP（1：5000，Santa Cruz
Biotechnology）に 室 温 で 2 時 間 作 用 さ せ，WesternLightning ECL Pro（Perkin Elmer） で 処 理 し た。
ChemiDoc MP system（Bio-Rad）にて可視化し，画像ソフト（Image J, NIH）を用いて発現タンパク量の解析を行った。タンパク発現量は Naïve 群に対する各群の発現量で表した。
7.

統計学的解析
機 械 刺 激 に 対 す る HWT の 結 果 お よ び Vehicle 群 とPD 群の HWT の結果は二元配置分散分析（ANOVA）を行った後に Tukey test の多重比較を行った。IONI 群とSham 群，および PD 群と Vehicle 群の pERK 陽性細胞数 の 解 析 に は Studentʼs -test を 使 用 し た。Naïve 群，
Sham 群，IONI 群，PD 群におけるタンパク発現量の比
較には，一元配置分散分析（ANOVA）を使用し，その後の検定として Tukey test を使用した。統計学的解析後，＜ 0.05 を有意差ありと判定し，各データは平均値 ±SEM として示した。

結
1.

果

機械刺激に対する HWTIONI 後 3 日目における口髭部への機械刺激に対する

HWT は，IONI 群では，処置前と比較して 13.7% まで低
下し，Sham 群と比較して 17.0% まで低下した（ ＜ 0.01）
。
2.

第1図

Vc における pERK 陽性細胞数の比較
IONI 群の口髭部への機械刺激により発現した pERK

陽性細胞は，obex より尾側 2400μm 付近の Vc 表層の三45

IONI 後の Vc における pERK 陽性細胞発現
A：Vc の pERK 免疫組織染色像。
a：IONI 後 3 日目，b：Sham 処置後 3 日目。
B：Vc における pERK 陽性細胞数の平均。**： ＜ 0.01

4.

ク 発 現 の 差 は 認 め ら れ な か っ た（ 第 4 図 B）。 一 方，

Vc ニューロンにおける GluR1 のリン酸化
次に，IONI ラットの Vc 背側に局在する pERK 陽性

pGluR1 タンパクにおいては，Naïve 群，Sham 群，PD 群細胞において GluR1 がリン酸化されるか否かを検討しに対し，IONI 群で発現量が多い傾向にあった（第 4 図 B）。

た。IONI 後 3 日目には，Vc 領域の細胞に pGluR1 発現考が認められ，その多くが pERK 陽性を示した（第 3 図 A）。

察

また，pGluR1 陽性細胞のほとんどは NeuN 陽性であり，

本研究では，三叉神経第二枝の枝である ION を部分結

pGluR1 陽性細胞がニューロンであることが示された（第紮することによって口髭部に生じる機械痛覚過敏の発症

3 図 B）。

機構について検討した。その結果，Vc ニューロンにお

IONI 群の Vc 細胞の多くは pGluR1 陽性であったが，ける ERK のリン酸化および GluR1 のリン酸化が重要な

Sham 群ではほとんど認められなかった（第 4 図 A）。さら役割を担っている可能性が示された。

に，Western blot 法を用いた解析では，Naïve 群，Sham

1.

群，IONI 群，PD 群とも Vc 領域における GluR1 タンパ

第2図

HWT 低下に対する ERK リン酸化の関与
口腔顔面領域の侵害刺激により，Vc 領域や上部頸髄

HWT および pERK 陽性細胞の発現に対する PD98059 の効果
A：口髭部における機械刺激に対する HWT。実線が Vehicle 群，破線が PD 群。
#： ＜ 0.05，##： ＜ 0.01，pre との比較。*： ＜ 0.05，**： ＜ 0.01，PD 群との比較。
B：IONI 後 3 日 目 の Vc に お け る pERK 陽 性 細 胞 発 現。 a：PD 群，b：
Vehicle 群，c：pERK 陽性細胞数の比較。**： ＜ 0.01。

46

眼窩下神経損傷後の神経障害性疼痛発症機構

第3図

第4図

Vc における pERK，pGluR1，NeuN の免疫染色蛍光画像
A：IONI 後 3 日目の Vc における pERK（a）と pGluR1 陽性細胞（b）
および重ね合わせ画像（c）。挿入図は点線で囲んだ部位の強拡大像。
B：IONI 後 3 日目の Vc における NeuN（a）と pGluR1 陽性細胞（b）
および重ね合わせ画像（c）。矢印は pGluR1 のみ陽性の細胞。矢頭はpERK と pGluR1 陽 性 細 胞（A）お よ び pGluR1 と NeuN 陽 性 細 胞（B）。

Vc における pGluR1 と GluR1 の発現
A：IONI 群（a）と Sham 群（b）における pGluR1 免疫染色蛍光画像。
B：Western blot 法による GluR1 と pGluR1 タンパク発現（a）と発現量の比較 （b，c）。

47

れている。それ以外にも NMDA 受容体の活性化に関連

後角のニューロンにおいて ERK のリン酸化が誘導され16,17）。ERK のリン酸化は侵害刺激

してカルシウム / カルモジュリン依存性タンパクキナー

を 与 え て 数 分 以 内 に 生 じ， 侵 害 刺 激 強 度 に 依 存 し てゼⅡが賦活化されて AMPA 受容体の膜への trafficking

ることが知られている

8）

pERK 陽性細胞数が増加する 。また，脊髄後角侵害受が生じるとの報告がある 21）。これらの知見は IONI ラッ

容ニューロンのワインドアップ現象にも ERK のリン酸トにおいて，GluR1 リン酸化と NMDA 受容体の活性化，化が関与すると報告されている 8）。これらの知見は二次それに引き続いて ERK のリン酸化が誘導される可能性

ニューロンにおける ERK のリン酸化が侵害受容ニューも示唆しており，本研究で示したメカニズムの他にもロンの活性化を示す信頼性の高いマーカーであることを様々な機構が機械的痛覚過敏の発症に関わっていると考示している。本研究では，HWT が最も低下した IONIえられる。

後 3 日目に，ラットの口髭部に機械的侵害刺激を与えると，Vc 表層のニューロンに限局して多くの pERK 陽性

結細胞発現を認めたが，Sham 群ではこの細胞発現が認め論られなかった。この発現部位は，以前の解剖学的 , 電気

今回の研究結果から考えられる仮説を第 5 図にまとめ

生理学的研究により三叉神経第二枝領域から入力を受けた。ION の結紮により一次求心性ニューロンの活動性がる侵害受容ニューロンが存在する部位に相当する 16）。し増大し，Vc 二次ニューロンの ERK のリン酸化が亢進すたがって，Vc 表層における pERK 陽性細胞の発現は，る。それに引き続いて GluR1 がリン酸化され ,AMPA 受

ION 損傷によって Vc に存在する侵害受容ニューロンが容体を介した二次ニューロンの活動性が増大する結果，活動して生じたもので，その結果，機械痛覚過敏を惹起

口髭部における機械痛覚過敏が発症すると考えられた。

した可能性を示している。
2.

稿を終えるあたりに，本研究遂行に格別なご指導ご鞭撻を賜りました日本大学歯学部歯科口腔診断学講座の今村佳樹教授に謹ん
で心より感謝申し上げます。
また，本研究を通じ多大なるご協力とご助言を賜りました，生理学講座の岩田幸一教授，口腔診断学講座の岡田明子准教授をはじめ，生理学講座，口腔診断学講座の皆様に深く感謝いたします。
なお，本研究は，平成 27 〜 29 年度総合歯学研究所研究費（B）
によってなされました。
本研究に関して，開示すべき利益相反はありません。

Vc ニューロン感作における GluR1 リン酸化の関与
AMPA 受容体のサブユニットである GluR1 のリン酸化は末梢神経傷害や炎症に続いて生じ，脊髄後角における侵害受容ニューロンの感作に関与すると報告されている 18）。また，GluR1 のリン酸化を抑制することにより，足底の炎症モデルラットの疼痛反応行動が抑制され，脊髄後角における ERK のリン酸化や Fos の発現が抑制されるといわれている 19）。しかし，侵害受容ニューロンにおける GluR1 のリン酸化と pERK の相互関係に関する文

報告はほとんどみられない。中谷らは，口腔乾燥モデル

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ラットを用いて，舌乾燥により発症する舌の機械痛覚過
敏には Vc 侵害受容ニューロンにおける ERK のリン酸化に続く GluR1 のリン酸化が関与する可能性を示した 9）。
本研究では，IONI 後 3 日目の Vc において，GluR1 タン
パクの発現量は，Naïve，Sham 処置群と同程度であった。
ERK のリン酸化阻害薬である PD98059 の持続投与でもGluR1 タンパク発現に変化は認められなかった。一方，
pGluR1 タンパク発現は，有意差は認められなかったもの の，IONI 後 に 増 大 す る 傾 向 が 認 め ら れ た。 さ ら に
PD98059 の持続投与により，IONI 後の pGluR1 発現が減少する傾向が認められたことから，ERK のリン酸化抑制によって GluR1 のリン酸化も抑制される可能性が示された。
ところで，侵害受容性疼痛の発症には NMDA 受容体
を 介 し た ERK の リ ン 酸 化 の 関 与 も 知 ら れ て お り，NMDA 受容体のブロックによって，足の侵害刺激で生じた ERK のリン酸化が脊髄後角ニューロンで抑制されると報告されている 20）。pGluR1 を含む AMPA 受容体のtraﬃcking に pERK が関与し，LTP が生じることが知ら48

眼窩下神経損傷後の神経障害性疼痛発症機構

第5図

IONI による機械的痛覚過敏発症における Vc 侵害受容ニューロンの ERK-GluR1 カスケード
ION 損傷後（①），Vc 侵害受容ニューロン内にて ERK がリン酸化され（②），細胞膜に存在する AMPA 型グルタミン酸受容体（GluR1）がリン酸化される（③）ことで細胞内に Na ＋ とCa2＋が流入して，ニューロンが活性化され，機械的痛覚過敏が生じる。

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