日大歯学 , 95（1）, 37-43, 2021

原著

propiece IL-1α の核局在様式
武元智子

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 口腔構造機能学分野（指導：本吉満 教授，浅野正岳 教授）

要旨【目的】 precursor interleukin-1α（IL-1α ）の酵素的切断により生じる propiece IL-1α（ppIL-1α ）の細胞内局在様式について検討した。
【方法】 ppIL-1α に green fluorescence protein（GFP）を付加した発現ベクター（wild type ppIL-1α vector）および nuclear localization sequence（NLS）を欠失させたΔNLS mutant vector を構築した。両タンパク質の発現は
western blot により確認した。核内での存在様式は wild type ppIL-1α vector transfectant を triton X-100 溶液で氷上処理することにより検討した。エネルギー依存性に NLS が機能するか否かの確認は，氷上で PBS によって反応させ検討した。
【結果】 Wild type ppIL-1α およびΔNLS mutant は，共に 48 kDa のバンドとして検出された。ppIL-1α は核内に，またΔNLS mutant は細胞質内に diffuse に拡散して存在した。核内の GFP-wild type ppIL-1α 蛍光は，氷上での triton X-100 溶液 5 分間処理により完全に消失した。また，ppIL-1α の NLS はエネルギー依存性に機能していた。
【結論】 ppIL-1α は細胞核内において浮遊状態で存在していると考えられた。また，ppIL-1α の NLS はエネルギー依存性に機能を発揮する可能性が考えられた。
キーワード：propiece interleukin-1α , nuclear localization sequence, alarmin

Nuclear localization mode of propiece IL-1α
Tomoko TakemotoNihon University Graduate School of Dentistry, Major in Oral Structural and Functional Biology(Directors: Prof. Mitsuru Motoyoshi and Prof. Masatake Asano)

Abstract[Purpose] Precursor interleukin-1α（pIL-1α ）is intracellularly converted to propiece IL-1α（ppIL-1α ;N-terminal portion）and mature IL-1α（mIL-1α ; C-terminal portion）by enzymes such as calpain. In this study, I
investigated the mode of localization of ppIL-1α in the nucleus.
[Method] The intracellular localization was examined by transfection with an expression vector wild typeppIL-1α vector in which green fluorescence protein was added to ppIL-1α . The nuclear localization
sequence（NLS）-deleted mutant（ΔNLS）vector was constructed by site-directed mutagenesis. The mode ofexistence in the nucleus was confirmed by treating the transfectant with a triton X-100 solution on ice. Theenergy-dependent nuclear localization was examined by incubating the transfectants with PBS on ice.
[Results] In the wild type ppIL-1α vector transfectant and ΔNLS mutant vector transfectant, each protein
was expressed as a single band at the position of 41 kDa by western blot. In the untreated state, ppIL-1α
was localized in the nucleus, but the ΔNLS mutant was diffusely distributed in the cytoplasm. Treatment ofthe wild type ppIL-1α vector transfectant on ice for 5 minutes with triton X-100 solution, but with PBS,
completely abolished the fluorescence in the nucleus.
[Conclusion] It was clarified that ppIL-1α does not exist in the cell nucleus by strongly binding to otherproteins. In addition, it was considered that NLS of ppIL-1α may exert its function in an energy-dependent
manner.
Keywords: propiece interleukin-1α , nuclear localization sequence, alarmin（受付：令和 3 年 1 月 27 日）
責任著者連絡先：武元智子
日本大学歯学部歯科矯正学講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8105
FAX：03-3219-8105
E-mail：o.takemoto.tomoko@gmail.com

37

日大歯学

緒

第 95 巻第 1 号

により人為的に強制発現された細胞内で証明されたもの言であり 7），内在性分子に関して証明されたわけではない。

Interleukin（IL）-1α は多くの種類の細胞で，分子量約また，ppIL-1α の有する NLS 配列は，動物種間で高い相34 kDa の前駆体（precursor IL-1α ; pIL-1α ）として産生同性を有する 7 残基のアミノ酸により構成されておされ，生体内ではユビキタスに存在する分子とされていり 11, 12），転写調節の効果は，pIL-1α よりも強いとされる 。pIL-1α は細胞質内で Caている。しかし，細胞内在性の ppIL-1α の本来の機能に1）酵素であるカルパイン2+依存性タンパク質分解ついては不明なままである。

，natural killer cell（NK）や好2, 3）

中球などが有する granzyme B（GzmB）4），トロンビン 5）

NLS 配列は様々な核内タンパク質が有する配列であるなどによって分子のほぼ中央部分を切断され，N 末端側が，その配列は様々であり 13, 14），核内の DNA に強固にの propiece IL-1α（ppIL-1α ）と C 末端側の mature IL-1α結合するものや，核質内に浮遊して存在するものなど多（mIL-1）に分離する 。mIL-1 は細胞外に分泌されサイ様である 15）。そこで本研究では，ppIL-1α の有する NLS6）トカインとして機能する。一方，酵素的切断により産生が機能的であるか否か，また，ppIL-1α は核内で DNA

さ れ た ppIL-1α の 機 能 に つ い て は， 分 子 内 に nuclear

や他のタンパク質と結合しているか否かについて検討すlocalizing sequence（NLS）を有していること 1），このたることとした。

めに核内に局在し，ある種の遺伝子発現に関与している

材料および方法こと 7），血管内皮細胞の migration に関係していること 8）などが明らかにされている。pIL-1α を切断する酵素とし細胞て最初に同定されたカルパインは，pIL-1α と同様にユビ

実験にはヒト子宮癌由来線維芽細胞である HeLa を用キタスに存在するが，カルパインを有する細胞は同時にいた。細胞の培養は 10% 牛血清アルブミンを添加した

その阻害物質であるカルパスタチンを発現しており，こDulbecco's minimum essential medium（10% FCS-のため pIL-1α の切断は抑制されている 3）。しかし，マDMEM）に ペ ニ シ リ ン・ ス ト レ プ ト マ イ シ ン（Sigma-クロファージなどでは，細胞外刺激に応じてカルパインAldrich, St. Louis, MO, USA）を添加したものを用いた。

が活性化され，結果として mIL-1α の産生と分泌が亢進
発現 plasmid の構築と transfection

するとされている 9, 10）。また，ppIL-1α は，実際に細胞内に存在するのか，細胞外に放出される可能性はあるの

Sata ら 16）により作成された発現ベクターwild type ppIL-1α

か，またどのような状況で放出されるのかなど，その生

vector は，ppIL-1α の N 末 端 に green fluorescence

物学的機能とともに多くの未解決な問題が残されていprotein（GFP）を結合させたものである（図 1）。NLS 欠失る。ppIL-1α の遺伝子発現調節については，transfection

mutant vector は，wild type ppIL-1α vector を鋳型と

図1IL-1α および発現ベクターの構造
pIL-1α 分子のほぼ中央に酵素的切断部位が存在し，N 末端側の ppIL-1α と C 末端側のmIL-1α に分離される。黒いバーは NLS を示し，ΔNLS mutant vector では核移行シグナ
ルを除去している。数字はアミノ酸の位置を示す。

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propiece IL-1 α の細胞外放出

令和 3 年 6 月

して，quick change site-directed mutagenesis kit（タAL, USA）を 用 い て 封 入 し た。Transfection 後 の 細 胞カラバイオ，東京）を用いて作製し，NLS 7 残基アミノ（Transfectant）の観察および画像の撮影はオールインワン酸に相当する DNA 配列を欠失させた。この発現ベクター

蛍光顕微鏡（BZ-X810，キーエンス，大阪）を用いて行った。

をΔNLS mutant vector として実験に供した。蛍光色素
Western blot（WB）

mCherry を結合したヒストン H2B を発現するベクター（H2B-mCherry）は Addgene 社から購入したものを用いTransfection 後， 細 胞 を PBS で 洗 浄 し た。 洗 浄 後，た。また，コントロールとして GFP のみを発現するベ

1% triton X-100/10 mM Tris-HCL（pH8.0）により溶解

クター 16）を用いた。

し，14,000×g，2 分 間 遠 心 分 離 を 行 い， 上 清 を 新 し い

24-well plate に 直 径 10 mm の cover slip を 入 れ，チューブに回収した。タンパク質濃度を protein assay

HeLa（5×104/well）
を播種した。Transfection は，それぞkit（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）により測定し，100μg

れの plasmid 125 ng を OPTI-MEM 25μL（GE Healthcare,の total protein を WB に供した。Sample を SDS sampleChicago, IL, USA）に溶解し，3000 reagent 1μL と混和

buffer と混和し，95℃，3 分間反応させた後，10% SDS-し た。 一 方，Lipofectamine 3000（0.75μL）を OPTI-PAGE により電気泳動した。泳動後，ナイロン膜に転写

MEM 25μL に溶解した。両溶液を混合し，室温で 15 分し，1% BSA-PBS により非特異的反応のブロッキングを間反応させた。反応後培養液に添加し，細胞と共に 18行った。1 次抗体としてマウス抗 GFP 抗体（×500 倍希時 間 培 養 し transfection し た。Transfection 後 cover釈）（Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA），2slip を 37℃に加温した phosphate buffer saline（ PBS）

次抗体として horse radish peroxidase（HRP）標識ヤギに よ り 洗 浄 し た 後，4% パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液 に抗 マ ウ ス IgG 抗 体（×5,000 倍 希 釈 ）（Jackson Immuno

浸 漬 し， 室 温 で 10 分 間 固 定 し た。PBS に よ り 洗 浄 後，Research, West Grove, PA, USA）を用いて反応させ，DAPI-fluoromount-G（Southern Biotech, Birmingham,ECL kit（GE Healthcare）により発光させた。画像の取り込みは ChemiDoc（Bio-Rad）を用いて行った。
Transfectant の処理
ppIL-1α の核内での存在様式について検討するために，細胞を 0.1% Triton X-100/PBS 溶液により処理した。この処理により，核内に浮遊状態で存在しているタンパク質は，完全に除去され，核の蛍光は消失することが予測される 17）（図 2）。Wild type ppIL-1α vector transfectant
を 37℃に加温した PBS により洗浄後，細胞を氷上に移した。PBS を吸引除去したのち，0.1% Triton X-100/PBS溶液を作用と 1，2，3，5 および 10 分間氷上で反応させた。
反応後 PBS により静かに洗浄後，4% パラホルムアルデヒドで固定した。一方，ppIL-1α の核移行がエネルギー依存性であるか否かについて検討するために，transfectantを PBS により氷上で 10 分間反応させた。これによりエネ
ルギー非依存性に核移行するタンパク質は自由拡散により拡散し，核の蛍光は消失すると考えられる。

成
1.

績

wild type ppIL-1α およびΔNLS mutant の発現確認作製した plasmid を用いて transfection した後，それぞれのタンパク質発現を，WB により確認した（図 3）。
その結果，wild type ppIL-1α およびΔNLS mutant ともに分子量 48 kDa の単一バンドとして検出された。一図2

方，GFP 発 現 plasmid を transfection し た 細 胞 で は，Transfectant の処理
Transfectant を 0.1％ Triton X-100/PBS 溶液により処理することにより，核内に浮遊状態で存在しているタンパク質は，完全に除去され，核の蛍光は消失する。

28 kDa の位置に単一バンドが検出された（図 3）。また，細胞内における局在について確認したところ，wild typeppIL-1α については核内に限局して存在することが確認

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日大歯学

2.

され（図 4），GFP の蛍光は H2B-mCherry および核を染

第 95 巻第 1 号

Triton X-100 処理による GFP 蛍光発現の変化

色 す る DAPI の 青 色 の 蛍 光 と overlap し た。 一 方，次に，wild type ppIL-1α の核内での存在様式を検討

ΔNLS mutant は細胞質内に diffuse に拡散し，核に蛍光した。Transfectant を triton X-100 溶液によって処理しが集積することはなく，H2B-mCherry および DAPI とた と こ ろ， 未 処 理 群 で 核 内 に 局 在 し て い た 蛍 光 は，は発現部位が異なっていた（図 4）。

triton X-100 溶液による 10 分間の処理によりほぼ完全に消失した（図 5）。次に，triton X-100 溶液による処理時間と核内の蛍光消失の関係を調べるため，transfectantを 1，2，3，および 5 分間処理した後に固定し観察した。
その結果，処理 1 分後では，コントロールと比較して若干 GFP 蛍光を発する細胞数が減少した。GFP 蛍光を発する細胞の数は時間経過とともに減少し，処理 3 分後には GFP 陽性細胞数はほとんど消失した（図 6）。
3.

エネルギー依存性の核移行
Wild type ppIL-1α の核内移行がエネルギー依存性で

図3

あ る か 否 か に つ い て 検 討 し た。 す な わ ち，wild type

タンパク質発現の確認
wild type ppIL-1α ，ΔNLS mutant および GFP 発現 plasmid
を HeLa に transfection し，細胞溶解液を調整した。総タン
パク量 100μg を 10％ SDS-PAGE に泳動・展開し，WB を行った。1 次抗体としてマウス抗 GFP 抗体（×500 倍希釈），2 次抗体として HRP 標識ヤギ抗マウス IgG 抗体（×5,000 倍希釈）を用いた。

ppIL-1α の NLS がエネルギー非依存性に機能するのであれば，transfectant を氷上で反応させることにより自由拡散し，核局在が消失するはずである。この可能性について検討したところ，氷上での 10 分間の反応は核内の蛍光を消失させることはなかった（図 7）。

図4

細胞内における ppIL-1α の局在Wild type ppIL-1α およびΔNLS mutant 発現ベクターを HeLa に transfection し，GFP 蛍光の細胞内局在について観察した。それぞれの発現ベクターは，H2B-mCherry と co-transfection し，DAPI 含有の封入剤で封入した。スケール：10μm

図5Triton X-100 処理による GFP 蛍光の消失
Wild type ppIL-1α 発現ベクターを HeLa に transfection した後，氷上で Triton X-100 溶液により 10 分
間 イ ン キ ュ ベ ー ト し， そ の 後 GFP 蛍 光 の 細 胞 内 局 在 の 変 化 に つ い て 観 察 し た。 図 3 と 同 様 に H2BmCherry と co-transfection し，DAPI 含有の封入剤で封入した。スケール：10μm40

propiece IL-1 α の細胞外放出

図6

図7

令和 3 年 6 月

処理時間依存的な核内蛍光の消失
Wild type ppIL-1α transfection に Triton X-100 溶液を作用させて，氷上で 0，1，3，および 5 分間反応させた。
反応後の細胞を 4％パラホルムアルデヒドで固定し，蛍光顕微鏡により撮影した。図中 0，1，3，および 5 min は対物レンズ× 10 による画像。0 min × 20 は対物レンズ× 20 の画像。矢印および矢頭は，GFP-ppIL-1α ，H2B-mCherry および DAPI の 3 色が重なった部分を示す。スケール 50μm
赤色；H2B-mCherry
緑色；wild type GFP-ppIL-1α青色；DAPI

エネルギー依存性の核移行
Wild type ppIL-1α を HeLa に transfection した後，氷上で PBS 中で 10 分間インキュベートした。GFP 蛍光の細胞内局在の変化について観察した。図 3 と同様に H2B-mCherry と co-transfection し，DAPI 含有の封入剤で封入した。スケール：
10μm

41

日大歯学

考

第 95 巻第 1 号を報告しており，IL-1α の機能に対して stressorin とい察う用語を用いることを提唱している。しかし，ppIL-1α

pIL-1α は 34 kDa のタンパク質として産生された後，と mIL-1α の機能的な違いにまでは言及していない。酵

種々の酵素によって切断され，ppIL-1α と mIL-1α に分素的切断により産生される ppIL-1α に関しては，この分断される。pIL-1α および ppIL-1α には NLS が存在する子に対するモノクローナル抗体を作製し，これを用いてことから，核内で何らかの機能を発揮していることが考flow cytometry により間接的に検出を試みた報告があえ ら れ て き た 。Luheshi らは，IL-1α が small Gる 27）。しかしこの報告においても，明確に ppIL-1α とprotein である Ran に依存して核内に移行することを示

pIL-1α を区別していない。pIL-1α を切断する酵素としした。しかし，タンパク質の核内移行にはアダプター分て最近報告されたトロンビンは，免疫システムと血液凝子である importin family protein の結合が必須であり，固 系 の 関 連 を 指 摘 し た 論 文 と し て 注 目 さ れ て い る が，IL-1α に関してどのような分子が会合しているのか，詳

pIL-1α は細胞膜画分にも局在していることが知られてお細な研究はない。ppIL-1α が核内で遺伝子の転写や ，り 28, 29），この報告ではマクロファージや血小板の表面に細胞の形質転換に関わっているという研究結果

局在する pIL-1α がトロンビンにより切断され免疫系が1）

18）

7）

，また，19）種々の転写因子の活性化を介してリンパ腫由来の細胞の賦 活 化 さ れ て い る と し て お り， こ れ は ppIL-1α と増殖を助長する 20）などの報告は，ppIL-1α が核内で機能mIL-1α が同時に細胞外で産生される可能性を示唆するすることを裏付けるものである。実際，核内で pIL-1αものである。
以上のように，ppIL-1α の機能については多くの点がと 結 合 す る も の と し て は HS1-associated protein X-1（HAX1）などが知られており，その機能未解決のままである。しかし，免疫系の賦活化に対しては多岐にわたっている。しかし，核に移行した ppIL-1αppIL-1α が果たす役割を解明することは，生体内におけが，どのような様式で核に存在するのかという点についる多くの免疫現象や疾患の根本的理解を深化させるためて は， マ ウ ス の マ ク ロ フ ァ ー ジ を 用 い た 実 験 に よ り，に極めて重要であると考えている。

や necdin21, 22）

Lamacchia ら23）がクロマチンと結合して存在することを

24）

結報告しているのみであり，その詳細は不明である。一方，

論

IL-1α は，細胞が障害を受けた時に分泌される分子とし未刺激の細胞において，ppIL-1α は NLS 依存性に核内て 知 ら れ て い る。 こ う し た 分 子 は alarmin と 総 称 さに局在している。しかし，ppIL-1α は核内では HAX1 やれ 25），周囲の細胞・組織に，自身の置かれた危機的状況

necdin などの特定のタンパク質や DNA などに強固に結を知らしめる分子とされている。こうした機能を発揮す合したものではなく，核質内に浮遊して存在している可る た め に は， 細 胞 外 に 放 出 さ れ る こ と が 重 要 で あ り，能性が示唆された。

ppIL-1α が核内でクロマチンに強固に結合しているとalarmin としての機能を果たすための障害となるのでは

本研究は日本大学歯学部佐藤研究費により行った。研究の推進にあたり，日本大学歯学部歯科矯正学講座 本吉 満教授および同学部病理学講座 浅野正岳教授にご指導頂いた。ここに深甚なる感謝の意を表する。また，本研究に対して多大なご協力を頂いた歯科矯正学講座ならびに病理学講座の皆様に心より感謝申し上げる。
本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

ないかと考える。本研究では，ppIL-1α の核内局在に，ppIL-1α 中の NLS が有効に機能していることが明らかとなった。また，0.1% Triton X-100 溶液の作用により，わずか 1 分間の処理で，核内の GFP-ppIL-1α の蛍光強度 が 劇 的 に 減 弱 し，DAPI や H2B-mCherry の 蛍 光 とmerge する細胞数が減少した。そして 5 分間の処理で，

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ま た， マ ウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ に お い て は ク ロ マ チ ン
DNA と結合しているとする報告 24）があり，本研究の結果はこれらの報告と矛盾している。こうした矛盾点については今後さらに検討する必要があるものと考える。
Cohen ら 26）は，細胞質内に存在する IL-1α が，DNAに加わった障害を認識するセンサーであるとするデータ

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propiece IL-1 α の細胞外放出

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