日大歯学 , 95（1）, 45-51, 2021

原著

デュアルキュア型覆髄剤におけるデンティンブリッジ形成能
および osteocalcin 産生誘導能西原安那

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 口腔構造機能学分野（指導：浅野正岳 教授，米原啓之 教授，金子忠良 教授）

要旨【目的】 直接覆髄剤である mineral trioxide aggregate（MTA）の改良を目的として，多くの関連材料が開発されてきた。本研究ではこれらの関連製品の硬組織形成誘導能の差異について検討した。
【方法】 実験には，ProRoot MTA，TheraCal PT，NEX MTA セメント，およびエンドセム MTA premixedを用いた。ラットの上顎第一臼歯に露髄面を形成し，各種覆髄剤を貼付後，スーパーボンドで封鎖した。処置後 1，2 および 4 週後に，パラフィン切片を作製し，デンティンブリッジの形成について観察した。また TheraCal PT
では，osteocalcin（OC）の形成について免疫組織学的に観察した。加えて，ProRoot MTA と TheraCal PT をマウス頭蓋冠由来株化骨芽細胞 MC3T3-E1 に作用させ，OC 産生について免疫組織学的に検討した。
【結果】 各種覆髄剤間でデンティンブリッジの形成に差異は認めなかった。TheraCal PT では，形成されたデンティンブリッジ周囲の間質部に，抗 OC 抗体の陽性反応が認められた。また，MC3T3-E1 細胞における OC の産生は，ProRoot MTA よりも TheraCal PT を添加した際に顕著な上昇を示した。
【結論】 4 種類の覆髄剤はいずれも同程度のデンティンブリッジ形成誘導能を有していた。また，TheraCal PTは，ProRoot MTA に比較して OC の顕著な産生誘導を示した。
キーワード：デュアルキュア型覆髄剤，bioactive dental material，osteocalcin

Dentin bridge forming ability and osteocalcin production inducing abilityin dual-cured pulp-capping materialAnna Nishihara
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Applied Oral Sciences(Directors: Prof. Masatake Asano, Prof. Hiroyuki Yonehara, Prof. Tadayoshi Kaneko)

Abstract[Purpose] Up to date, various mineral trioxide aggregate (MTA)-based dental pulp-capping materials havebeen developed. The purpose of the present study was to compare the ability of dentin bridge formationand osteocalcin (OC) induction using four different MTA cements.
[Methods] ProRoot MTA, TheraCal PT, NEX MTA cement, and Endocem MTA premixed were applied tothe exposed dental pulp on the first maxillary molar of Wister rats. The dentin bridge formation wasexamined by hematoxylin-eosin staining. The OC induction of TheraCal PT was examined byimmunohistochemistry. In addition, ProRoot MTA and TheraCal PT were applied to the osteoblast-like cellline, MC3T3-E1, and OC induction was also examined by the immunocytochemical method.
[Results] There was no difference in the formation of dentin bridges among the MTA cements tested. In
TheraCal PT, a positive anti-OC antibody reaction was observed in the stromal area around the formeddentin bridge. In addition, OC production in MC3T3-E1 cells was most markedly increased by TheraCal PT.
[Conclusion] All four MTA cements had the same ability to induce dentin bridge formation. In addition,
TheraCal PT showed remarkable OC production compared to ProRoot MTA.
Keywords: dual-cured pulp capping material, bioactive dental material, osteocalcin（受付：令和 3 年 1 月 29 日）
責任著者連絡先：西原安那
日本大学歯学部口腔外科学第Ⅱ講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8355
FAX：03-3219-8312
E-mail：mahumohu10005@gmail.com

45

日大歯学緒第 95 巻第 1 号

以上のように，種々の利便性を特徴として開発が進め

言られている MTA 系材料であるが，それぞれの硬組織形象牙質の再石灰化を誘導し，これによって歯髄の保存成能を比較した報告はみられない。本研究では，ラットを目指す治療法は，近年の歯科保存学領域の重要な課題

露 髄 面 に 対 し て 各 種 BDM を 用 い て 覆 髄 し た 際 の デ ンであり，この目的を達成するために様々な材料が開発さティンブリッジ形成の差異について検討するとともに，れ て い る 1）。 な か で も mineral trioxide aggregate

ProRoot MTA および TheraCal PT については in vitro（MTA）は，いわゆる bioactive dental material（BDM）

における osteocalcin（OC）産生誘導能についても検討をの代表的な材料であり 2），現在これらを用いた直接覆髄加えた。

法が盛んに行われ，歯髄保存療法にとって有用な材料と材料および方法されている 3）。MTA の主成分はケイ酸カルシウムであり，これが組織液と接触することによってマトリックス

1． 実験動物が形成され，水中で加水分解して水酸化カルシウムとケ実験には，Wistar 系雄性ラット（6-7 週齢）を用いた。

イ酸カルシウム水和物が形成される。この形成された水ラットは，12 時間の明暗サイクルの環境下，恒温室（23℃）

和物からのカルシウム，ケイ酸，アルミニウムあるいはで自由に食物および水分摂取ができる状態で飼育した。

ビスマスイオンが徐放することで石灰化を促進するとさ本 研 究 は， 日 本 大 学 歯 学 部 動 物 実 験 委 員 会 の 承 認れている（AP19 DEN033-2）を受け，国際疼痛学会のガイドライ。我が国においては，2007 年から ProRoot

4,5）

MTA（Dentsply Tulsa, OK, USA）が市販された。一方，

ン 13）に準拠して行った。

MTA1 は硬化に比較的長い時間を要し，そのため硬化初2． 覆髄剤期段階では充分な封鎖性が得られないことが問題点とされてきた

本 実 験 に は 直 接 覆 髄 剤 と し て，ProRoot MTA，
TheraCal PT，NEX MTA セメント，およびエンドセ。この点を克服すべく，これまでに多くの

6,7）

ム MTA premixed を用いた（表 1）。

MTA 関連の BDM が開発されてきている。

3． ラット上顎第一臼歯に対する覆髄剤貼付

TheraCal LC（Bisco, Schaumburg, IL, USA）は，遅延型アレルギー反応を惹起するとされる 2-hydroxyethyl

5% イソフルラン吸入による麻酔導入後，三種混合麻methacrylate（HEMA）8-10）を含まない BDM である。そ酔薬（塩酸メデトミジン 0.15 mg/kg ＋ミタゾラム 2 mg/の特徴として光照射によって硬化し，高い密閉性を得る

kg ＋酒石酸ブトルファノール 2.5 mg/kg）を腹腔内注射ことができる。また，製造者によればこの製品は，象牙し全身麻酔を施した。麻酔の奏功を確認した後，開口器細管に浸透しやすい親水性モノマーを含んでいるものの，を用いて開口させ，両側上顎第一臼歯をラバーダム防湿水に難溶性であることなどの利点を有している。一方，し，術野を隔離した（図 1 a）。近心小窩付近のエナメル

TheraCal LC の重合深度は 1.7 mm であり，製造者指質を滅菌したダイヤモンドポイント（MI-F06 P，松風，示条件でも 1 mm 以下で積層するよう指示されている。

京 都 ）で 削 除 し た 後， 滅 菌 さ れ た ＃ 1/2 ラ ウ ン ド バ ー11）

光重合型製品が有する重合特性という欠点を補う目的（ISO#006，松風，京都）を用い，直径約 0.7 mm の露髄で開発された覆髄剤が TheraCal PT（Bisco）である。こ面を有する窩洞を形成した（図 1 b）。回転切削器具操作の製品は，光重合に加えて化学重合により重合反応する，は軽圧注水下で熟練した術者が行った。窩洞を滅菌生理

いわゆるデュアルキュアを採用しており，光線が到達し食塩水で洗浄し，止血を確認した後，露髓面に各覆髄剤ない深部は，化学重合により硬化することが期待できる。

を各製造者指示条件に従って貼付した。TheraCal PT にまた，TheraCal LC で用いられている親水性モノマーを

お い て は， 可 視 光 線 照 射 器（ ブ ラ イ ト 5, Medicode

含有することで，Ca2+ をはじめとした各種イオンを徐放

Techonolgy, New Taipeicity, Taiwan）を用いて 10 秒間することを可能とした覆髄剤である。

光照射し，硬化させた（図 1 c）。覆髄剤が硬化している

NEX MTA セメント（ジーシー，東京）は，MTA の主ことを探針を用いて確認した後，窩洞を製造者指示条件成分であるポルトランドセメントに，二水石膏が配合さでスーパーボンド（C&B セット，サンメディカル，守山）れた覆髄剤である。焼成後の粉末化のための粉砕工程で，を用いて筆積み法によって封鎖し，咬合による影響を避大粒径・小粒径の割合をコントロールし，練和性およびけるため対合歯咬合面を削合した。

反応性を最適化したとされる材料である。

4． 組織学的観察

エンドセム MTA premixed（Maruchi, Gangwon-do,イソフルラン吸入による麻酔導入後，三種混合麻酔薬

South Korea）は，水溶性シリカを配合することで，緻密を腹腔内注射し全身麻酔を施行した。麻酔の奏功を確認化が促進するため，充填作業が短時間で行える利点を有した後，0.9％生理的食塩水（500 ml）を用いて経心的に脱し，硬化後も強アルカリ性が持続されることにより強い血し安楽死させた。その後，phosphate buffered saline

抗菌特性を発揮するとされている 12）。

（PBS）に溶解した 4% paraform aldehide（pH7.4）を用い

46

デュアルキュア型覆髄剤の石灰化誘導能

令和 3 年 6 月

5． 細胞培養および覆髄剤刺激て灌流固定を行った。固定後，ラット上顎骨を摘出し，4% paraform aldehide に浸漬し，24 時間固定した。組ProRoot MTA および TheraCal PT において，生物織片を PBS で洗浄した後，迅速脱灰液（K-CX，ファルマ，活性について検討を行った。マウス頭蓋冠由来株化骨芽東京）により室温で 48 時間脱灰を行った。脱灰後，透徹細胞 MC3T3-E1（ 理化学研究所バイオリソース研究センし，パラフィンに包埋した。ミクロトーム（LS-113，大タ ー， つ く ば ）は，α -minimum essential medium

和光機工業，朝霞）を用いて 4μm の薄切切片を作製し，（α -MEM；富士フィルム和光純薬，大阪）に 10% ウシ胎

ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行った。

児 血 清 お よ び 1% ペ ニ シ リ ン‐ ス ト レ プ ト マ イ シ ン

TheraCal PT 貼付検体の免疫組織染色においては，切（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA）を添加したも片を室温で 0.3% 過酸化水素加メタノール中に浸漬し 20の（10% FCS α -MEM）により 37℃，5% CO2 存在下で培分間反応させ，内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化さ養した。MC3 T3-E1 細胞は 6 穴プレート（AGC テクノグ

せ た。 ブ ロ ッ キ ン グ は，1% bovine serum albumin

ラス，榛原郡吉田町）に 3 × 105 cells/well となるよう播（BSA）-PBS 中で 1 時間反応させた。その後，1% BSA-種し，18 時間後に培養液を，10 nM β-glycerophosphate

PBS で 100 倍に希釈した抗 OC 抗体を作用させて室温で（富士フィルム和光純薬）および 50μg/mL L-ascorbic

24 時間反応させた。ネガティブコントロールには抗 OCacid（ 富士フィルム和光純薬）を添加した骨形成誘導培地

抗体を含まない 1% BSA-PBS を用いた。次いで，horseに交換した。ProRoot MTA を練和後，内径 3 mm，厚radish peroxidase（HRP）標識 IgG 抗体（500 倍に希釈）をさ 1 mm の円形の型に填塞し，室温で 24 時間放置して室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た。PBS を 用 い て 洗 浄 後，硬化させたものを，プレート上部のインサート（ポアサdiaminobenzidine（DAB）発色させ，ヘマトキシリンによイズ 3μm，クラボウ，大阪）に設置し，細胞に 72 時間る核染色後封入し，顕微鏡観察を行った。観察はオール作用させた。また，TheraCal PT は，ProRoot MTA 同インワン顕微鏡（BZ-X810，キーエンス，大阪）を用いて様にディスク紙片を作製し，培養液に 24 時間浸漬した行った。

後，同様に細胞に 72 時間作用させた。その後，細胞を図1

ラット上顎第一臼歯に対する覆髄剤貼薬
a. ラバーダム防湿による術野の隔離
b. 露髄面（直径 0.7 mm）を有する窩洞形成c. 露髄面への覆髄剤（TheraCal PT）の貼付
表1

実験に用いた覆髄剤とその組成

47

日大歯学

第 95 巻第 1 号

PBS で洗浄し，4% paraform aldehide で固定した後，見られたため，周辺の象牙芽細胞様細胞の集積について

抗 OC 抗体により免疫組織染色を行った。

免疫組織学的に検討した。本実験に用いた 4 種類の覆髄結剤においてデンティンブリッジの形成に大きな差が認め果られなかったことから，TheraCal PT に着目して検討したところ，形成されたデンティンブリッジの周囲に抗1． 各種覆髄剤の比較
ラット第一臼歯に人為的に作製した露髄面に 4 種の覆OC 抗 体 に 対 す る 陽 性 反 応 が 見 ら れ た（ 図 3）。 し か し，髄剤を貼付し，貼付 1，2 および 4 週後に歯髄の石灰化明瞭な抗 OC 抗体陽性反応を示す細胞構造は確認されなおよびデンティンブリッジの形成状況について組織学的かった。一方，覆髄剤の貼付を行わなかった露髄面には，に観察した。その結果，貼付 1 週後にすべての覆髄剤で抗 OC 抗体陽性反応は確認されなかった。

貼付部位に一致した歯髄腔内に少量の石灰化物の形成が3． MC3T3-E1 細胞に対する作用見られた（図 2 ab，上段）。貼付 2 週後からは石灰化物内ProRoot MTA と TheraCal PT の生物活性についてに線維様の構造が出現するとともに，石灰化物の量が増培養細胞を用いて比較を行った。MC3T3-E1 細胞にそれ加した（図 2 ab，中段）。貼付 4 週後には図中矢印に示しぞれの覆髄剤を作用させ，免疫組織染色により OC の発たように，細管構造が明瞭に認められるデンティンブ現を確認した。その結果，図 4 に示したように培養 72リッジの形成を確認することが出来た（図 2 ab，下段）。

時間後に，ネガティブコントロールと比較して TheraCal

組織学的にはこれらの変化は 4 種類の覆髄剤で同程度にPT 作用群では顕著に OC の発現が上昇していることが観察され，材料間で顕著な違いは見られなかった。また，確認された。この反応は，主として細胞外基質に認めらすべての覆髄剤において，貼付 2 週後までは歯髄腔内にれ，細胞質内には一部で陽性反応を認めるのみであった

炎症性細胞浸潤や歯髄充血等が確認されたが，貼付 4 週（ 図 4， 下 図 ）。 一 方，ProRoot MTA で は，TheraCal

後には炎症反応はほぼ消失していた。

PT と比較して OC の産生は微弱で，細胞内及び細胞外2． 免疫組織学的観察

基質における陽性反応はほとんど観察されなかった（図4，中央）。

貼付 4 週間後に明らかなデンティンブリッジの形成が

図 2a 各覆髄剤を貼付したラット上顎第一臼歯の HE 染色像
各種覆髄剤貼付 1，2 及び 4 週後にラットを灌流固定し，第一臼歯を含む上顎骨を摘出した。脱灰後，パラフィン切片を作製し，HE 染色によりデンティンブリッジの形成状況について観察した（n=7）。
スケール：100μm

図 2b 各覆髄剤を貼付したラット上顎第一臼歯の HE 染色像
各種覆髄剤貼付 1，2 及び 4 週後にラットを灌流固定し，第一臼歯を含む上顎骨を摘出した。脱灰後，パラフィン切片を作製し，HE 染色によりデンティンブリッジの形成状況について観察した（n=7）。
スケール：100μm48

デュアルキュア型覆髄剤の石灰化誘導能考

令和 3 年 6 月

は細胞外基質に OC を蓄積する効果があることが示され察た（図 4）。MTA による直接覆髄による，デンティンブ

本研究では，ラット上顎第一臼歯の咬合面に人為的リッジの形成については様々な動物種で検討されてきに露髄面を作製し，これに対して 4 種類の BDM を作用た 14-18）。その結果，齧歯類を用いた組織学的な評価では，させ，デンティンブリッジ形成効果の差異について検討

BDM 貼付後 1 週間で象牙質基質が形成され，3 ～ 4 週間した。その結果，組織学的にはいずれの材料も，ほぼ同で象牙細管を伴う象牙質形成が見られるとされてお程度のデンティンブリッジ形成能を有すると共に，形態り 19,20），本研究の結果と一致した。

学的に象牙細管を伴う明瞭なデンティンブリッジが，貼ProRoot MTA は硬化時間が長く，硬化初期段階で緊付 後 4 週 間 で 形 成 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た。

密な封鎖性が得られないという欠点が指摘されていTheraCal PT における抗 OC 抗体に対する免疫組織染色る 21）。また，覆髄時の pH が 12 程度であり，この性質では，陽性反応は細胞外基質に対するものであると考えが細菌の感染を抑制するとされる 22）。一方，MTA はそられた（図 3）。また，培養細胞においても TheraCal PTの硬化初期においては，組織に対する為害性を有するこ

図3

抗 OC 抗体を用いた TheraCal PT 貼付 4 週の免疫組織染色
TheraCal PT 貼付 4 週のパラフィン切片を用いて，抗 OC 抗体による免疫染色を行った（右下図：形成されたデンティンブリッジの周囲に抗 OC 抗体に対する陽性反応（矢印））。
上段：× 40 顕微鏡像，下段× 100 顕微鏡像 スケール：100μm

図4

覆髄剤刺激下にて 72 時間培養後 MC3T3-E1 への抗 OC 抗体を用いた免疫染色
MC3 T3-E1 を覆髄剤の非存在下（左図），ProRootMTA 存在下（中央），または TheraCal PT 存在下（右図）で 72 時間培養後，抗 OC 抗体により免疫染色を行った。
スケール：20μm49日大歯学

第 95 巻第 1 号とが指摘されている 23）。そこで本研究における in vitroて OC 産生が顕著であり OC は細胞外基質に蓄積するこ実 験 で は，ProRoot MTA を 硬 化 さ せ た 後 に， ま たとが明らかとなった。

TheraCal PT は光照射後，硬化体を細胞培養液に浸漬した後に MC3T3-E1 細胞に作用させた。その結果，両覆髄稿を終えるにあたり，格別なるご指導およびご校閲を賜りました日本大学歯学部口腔外科学第Ⅱ講座 米原啓之教授，金子忠良教授および病理学講座 浅野正岳教授に心より感謝申し上げます。
また，本研究の遂行に際し，多大なるご協力とご支援を頂いた日
本大学歯学部口腔外科学第Ⅱ講座および病理学講座の皆様に厚く御礼申し上げます。
本研究の一部は平成 29 年度日本大学歯学部上村研究費およびJSPS 科研費 JP20K16342 の助成を受けて行われた。
なお，本研究では開示すべき利益相反はない。

剤とも，培養細胞に対する為害性は極めて低く，培養 24時間後の細胞生存率は 90% 以上に保たれていた。
ラット歯髄細胞を用いた実験では，ProRoot MTA は為害性を示さないばかりでなく，骨形成を促進する bonemorphogenetic protein-2 や dentin sialoprotein の産生を誘導するとされ 24,25），生体活性効果も期待できると考えられている。本研究においても，マウス骨芽細胞系培養細胞 MC3T3-E1 細胞における OC 産生誘導について検文討を行った。硬組織産生誘導の指標として OC を用いたが，OC は骨芽細胞により産生分泌される 5.6 kDa のタンパク質であり，様々な生体活性能を有する

26,27）

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牙芽細胞のマーカー分子としては Lhx6 の存在が知られているが 28），OC は象牙芽細胞でも強い発現が確認されているところから 29），象牙質基質産生を促進するものと考えられる。そこで，本研究では OC について免疫組織学的に検討した。その結果，TheraCal PT による 24 時間培養後の細胞外基質に極めて強い反応が観察され，これは硬組織形成が誘導された結果，細胞外基質内に OCが蓄積したためと考えられた。TheraCal PT 貼付 4 週間
後の組織における免疫組織染色では，細胞外基質において 抗 OC 抗 体 に 対 し て 陽 性 反 応 が 観 察 さ れ た こ と は，in vitro 実験の結果とも一致するものであった。
本研究では，ProRoot MTA に比較して，TheraCalPT でより強い OC 誘導能が確認された。デュアルキュアによって硬化する TheraCal PT は，その組成としてはレジンモノマーを含有していることから，持続的にCa2+ などのイオンの徐放性が ProRoot MTA と比較して低く，ProRoot MTA ではさらにイオン徐放性が高いも の と 考 え ら れ る。 本 研 究 の 予 備 実 験 で は，ProRoot
MTA を未硬化の状態で，また TheraCal PT は光照射直後に MC3T3-E1 細胞に作用させたが，培養 24 時間後にはほぼすべての細胞が死滅した。そこで，本研究では光重合させた後に細胞に作用させたことが TheraCal PTからの適切な Ca2+ イオンなどの徐放につながった可能性が考えられた。さらに今後 OC 遺伝子の発現は転写因子 Runx2 により調節されているため 30），TheraCal PTによる OC 産生増強が転写レベルで調節されているのかについても検討が必要と考えられた。

結献論

本実験の結果から，本研究で用いた覆髄剤はいずれもほぼ同程度のデンティンブリッジ形成能を有することがわかった。また in vivo 実験および MC3T3-E1 細胞を用いた実験から TheraCal PT は ProRoot MTA と比較し50

デュアルキュア型覆髄剤の石灰化誘導能

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promoter occupancy of basal transcription regulatorsand gradual recruitment of the 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 receptor-SRC-I coactivator complex. J Cell
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