鳥取県産業技術センター研究報告 No.22 (2019)

薬剤耐性を利用した特徴ある清酒酵母変異株の選抜手法の検討
スギ材、マツ材を原材料とする複層木毛セメント板の開発
Developmentof Multilayered
Wood
Wool Cement
made of utilizing
Sugi andDrug
Matsu
Investigation
on Selection
Techniques for
Characteristic
SakeBoards
Yeast Mutants
Resistance

谷岡晃和
西尾 昭

Akikazu Tanioka
Akira Nishio
電子・有機素材研究所 有機・発酵担当
電子・有機素材研究所

スギ材とマツ材と原材料とする複層木毛セメント板の開発に取り組んだ。超速硬セメントを用い、セメン変異処理後の薬剤耐性を利用した酢酸イソアミル高生産酵母の取得を目的に条件検討を行った。その結トの硬化速度を高めることにより、スギ心材のセメント硬化阻害を抑え、マツ単層木毛セメント板と同様の果、有効な薬剤と変異処理時間の組合せを見出すことができた。薬剤としては、カナバニン、オーレオバ
物性と化粧性を備えた三層木毛セント板が完成した。
シジンＡを用いた時に目的とする高生産株を取得することができた。
Multilayered wood wool cement boards made of sugi and matsu were developed. By increasing the hardening speed
2.2 使用薬剤
はじめに
of the cement using ultra-rapid hardening cement, cement-hardening inhibition of cedar heartwood was suppressed and
県内酒造会社から特徴ある酵母開発の要望は高変異処理には、エチルメタンスルホン酸（以下、three-layer wood wool cement boards with the same physical and decorative properties as single-layer pine wood wool
く、現在も継続して取り組んでいるところであるが、EMS、Sigma 社製）を使用した。耐性薬剤には、カcement boards were produced.
新たに、バナナ様の香りである酢酸イソアミル高生
ナバニン（Sigma 社製）、オーレオバシジンＡ（TaKaRa1.

産酵母開発の要望が寄せられ育種を検討することと1.

社製）、プレグネノロン（Sigma 社製）、ハイグロマ化が進むよう意図したものである。また、原料木材
イシンＢ（和光純薬製）を使用した。のアルカリ処理、温水処理等も有効と報告されてい2.3 変異処理
る 3、4、5)。これらは、木毛中の硬化阻害物質を前処変異処理は常法どおり行った。すなわち、K901
理段階で除去しようとするものである。
を YPD 液体培地 5ml（1％酵母エキス、2％ポリペプ
当センターでは、現在使用されているマツ材に代トン、2％グルコース）
中、30℃で一晩振とう培養後、えて、スギ材を原材料とした木毛セメント板の開発菌体を集菌し、滅菌水 5ml で洗浄した。その後、0.1Mを行うことを目的として、｢スギ材を原材料とした木リン酸バッファー（pH7.0）に懸濁させ、EMS 0.15ml
毛セメント板の開発｣研究（H24-25）に取り組み、（濃度 3％）を加え、30℃で穏やかに振とうさせ変
普通ポルトランドセメントに代えて、超速硬セメン異処理を行った。処理時間は、0分（無処理）、30
トを使用することにより、スギ材を原材料とした木はじめにした。酵母の育種方法として、優良な性質を掛け合木毛セメント板は木材を細長いリボン状に削りだわせる交雑法と突然変異を起こさせる変異法があるした木毛にセメントと水とを混合、圧縮成形したボが、今回は特徴ある親株がないため変異法で行うこード状の建築材料である。ととした。
防火性、吸音性、断熱性に優れ、主に建築物の屋
変異処理を利用した酢酸イソアミル高生産酵母
根下地または壁に用いられている 1)。の育種法では、薬剤耐性を利用した方法がいくつか
木毛セメント板製造事業所では、これまで地域の報告されているが１）～４）、今回用いる親株にどの方
マツ材を原材料として生産を行ってきたものの、現法が適しているか不明であった。
また、変異条件も、在、マツ材資源は枯渇し、原材料調達が困難な状況目的とする性質が得られると同時に発酵能が劣るなとなってきている。そのため、木毛セメント板製造
ど本来有する優良な性質が損なわれないような最適業においては、マツ材からスギ材への原材料転換が条件を見つける必要があった。
すすめられている状況にある。しかしながら、スギ
そこで本研究は、薬剤耐性を利用して最適な酢酸心材がセメントの硬化不良を引き起こすため 2)、スイソアミル高生産酵母の選抜手法を見出すことを目
ギ材は木毛セメント板の原材料として使用すること的に行った。
は避けられてきた。これまで、セメントの硬化阻害分、40 分、60 分で行った。処理後、菌体を集菌し、毛セメント板が製板可能であることを確認し、セメ
ント硬化時間の調整、制御により、スギ材を原材料5％チオ硫酸ナトリウム 5ml で洗浄し、さらに滅菌とした木毛セメント板の製造が可能であることを示
水 5ml で 2 回洗浄した。
唆した。また、スギ心材を煮沸処理、アルカリ処理
2.4 変異株の選択することにより硬化阻害を抑制することができた 6、2.4.1 カナバニン耐性変異株
7)。
秋田の方法１）に従って行った。すなわち、滅菌水
現在、製造工場では、マツ材の不足を補うため、で洗浄した酵母菌体に 5ml の滅菌水を加えて懸濁し、マツ材とスギ材を混合して使用するようになってき
10ppm カナバニンプレート（0.67％イーストナイトている。ただし、スギ材を混合すると、セメント板
ロジェンベース w/o アミノ酸、2％グルコース、表面が、スギ心材から滲出する成分により、茶褐色
10ppm L-カナバニン、2％寒天）に 100μL 塗布した。に変色汚染される。そこで、表面層（化粧面）にマ25℃で 5～7 日培養し、生育したコロニーを耐性株とを引き起こす硬化阻害樹種のセメント板への使用に

2.

実験方法

関して、木片セメント板では超速硬セメント、硬化2.1 使用菌株促進剤の使用、蒸気噴射プレスの使用等が検討、報酵母は、清酒酵母協会 901 号（以下、K901）を使告されている 3)。これらの方法は、木毛中の硬化阻用した。
害物質がセメントペースト中に溶出するまでに、硬272.7して選抜した。
2.4.2

分析方法

酸度、アミノ酸度は国税庁所定分析法注解５）に従オーレオバシジンＡ耐性変異株

い、還元糖はフェーリング法により分析した。

大原らの方法２）に従って行った。すなわち、変異アルコール分、日本酒度は振動式密度計（DA-105 、処理後、滅菌水で洗浄した酵母菌体に YPD 液体培

京都電子工業製）を使用して測定した。

地 5ml を加えて懸濁し、オーレオバシジンＡプレー
ト（1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グルコー

香気成分はガスクロマトグラフ質量分析計

ス、1ppm オーレオバシジンＡ、2％寒天）に 100μL（GCMS-QP2010plus、島津製作所製）を使用し、ヘ塗布した。30℃で 5～7 日培養し、生育したコロニー

ッドスペース法により分析した。

を耐性株として選抜した。
2.4.3

プレグネノロン耐性変異株

堤らの方法３）に従って行った。すなわち、変異処

3.

結果と考察

3.1

変異処理条件の検討

理後、滅菌水で洗浄した酵母菌体に YPD 液体培地

耐性薬剤には、カナバニン、オーレオバシジンＡ、5ml を 加 えて 懸濁し、プ レグネノロ ンプレート

プレグネノロン及びハイグロマイシンＢを使用した（0.67％イーストナイトロジェンベース、2％グリセが、これらはオフフレーバーであるイソアミルアル

ロール、15ppm プレグネノロン、2％寒天）に 100

コールの生成が少なく、酢酸イソアミル／イソアミμL 塗布した。30℃で 5～7 日培養し、生育したコロルアルコールの濃度比率（Ｅ／Ａ比）が高い酵母のニーを耐性株として選抜した。

選抜が期待されるものである。

2.4.4

各薬剤プレートでの各処理時間における大きなハイグロマイシンＢ耐性変異株

コロニーの出現数を示す（表 1）。

井上らの方法４）に従って行った。すなわち、変異処理後、滅菌水で洗浄した酵母菌体に YPD 液体培

表１地 5ml を加えて懸濁し、ハイグロマイシンＢプレー

各薬剤プレートにおける出現コロニー数（個／４プレート）
薬剤濃度304532---0106015 ppm

0000

500 ppm

0000

ト（1％酵母エキス、2％ポリペプトン、2％グリセロ

カナバニン

10 ppmール、500ppm ハイグロマイシンＢ、2％寒天）に 100

オーレオバシジンＡ

1 ppmμL 塗布した。30℃で 5～7 日培養し、生育したコロ

プレグネノロンハイグロマイシンＢ

ニーを耐性株として選抜した。
2.5

変異処理時間（分）0（無処理）

60

カナバニンは、ＥＭＳ処理無し（0 分）で耐性株

発酵試験

麹汁培地（pH5、Brix10）30ml を 50ml 遠心チューが出現したことから、その後のＥＭＳ処理は行わなブに分注し、オートクレーブ後、乾燥麹（1-60）10gかった。
その他の薬剤についてはＥＭＳ処理を行い、と酵母 2ml（麹汁培地で 2 日間前培養）を添加し、オーレオバシジンＡは、30 分および 45 分処理した15℃で 2 週間発酵させた。発酵終了後、遠心分離時にコロニーが出現した。プレグネノロン、ハイグ（4,000rpm、10 分）を行いアルコール分および香気

ロマイシンＢは条件を変えて数回実験を行ったが、成分を分析した。

今回の条件では耐性株の取得はできなかった。

2.63.2

小仕込み試験

カナバニン耐性変異株

総米 130g の小仕込み試験を、次の仕込配合（α出現した 32 コロニーを 70ppm カナバニンプレー

米（AA60）100g、乾燥麹（1-60）30g、90％乳酸 0.2ml、トに接種し、25℃で 1 週間培養し、生育してきた 15

水 225ml、酵母 10ml）により 15℃で行った。発酵終株を選抜した。その 15 株を再度 70ppm カナバニン

了後、遠心分離（5,000rpm、20 分）を行い、成分分プレートに接種、培養し、生育が良好な 4 株（No.3、析に供した。

20、26、30）を選抜した。

28

選抜した 4 株を発酵試験に供した結果、アルコー

4.

おわりに

ル発酵が盛んで、酢酸イソアミル生成が良好な 2 株

変異処理後の薬剤耐性を利用した酢酸イソアミ（No.3、20）が得られ（データ非掲載）、小仕込み試ル高生産酵母の取得を目的に条件検討を行った。そ験に供した。の結果、有効な薬剤と変異処理時間の組合せを見出

小仕込み試験の結果、アルコール生成能は親株とすことができた。薬剤としては、カナバニン、オー同等で、酢酸イソアミル、Ｅ／Ａ比が親株の 1.7 倍

レオバシジンＡを用いた時に目的とする高生産株を高い 1 株（No.20）を選抜した（表 2）。

取得することができた。
今後、スケールアップした試験醸造を行い、選抜

表２ カナバニン耐性株による小仕込製成酒の分析結果

９０１（親株）

No.３

No.２０

エタノール（%）

18.7

18.7

18.3

日本酒度-7.7

-7.3

-10.1

酸度（ml）

2.80

2.80

3.00

アミノ酸度（ml）

1.55

1.60

1.45

イソアミルアルコール

11.04

1.06

酢酸イソアミル

11.06

1.77

E/A比

11.02

1.67

した酵母の酢酸イソアミル高生産能を確認する予定
である。

文献
1)

得法，醸協，84，p.96-99（1989）2)※イソアミルアルコール、酢酸イソアミル、E/A 比は、901（親株）を 1 として表示

3.3

秋田修；カナバニン耐性を利用した優良酵母取Toshinari Takahashi, Yusuke Ohara, Michiyo
Sawatari, and Kazuo Sueno,; Journal of Bioscienceand Bioengineering, 123, p.71-77（2017）

オーレオバシジンＡ耐性変異株出現した 16 コロニー（変異処理時間 30 分 10 コロニー、45 分 6 コロニー）を再度オーレオバシジンA プレートに接種し、生育してきた 9 株（30 分 6 株、45 分 3 株）を選抜した。
選抜した 9 株を発酵試験に供した結果、アルコール生成の良好な 5 株が得られ、香気分析を行った。
それらのうち酢酸イソアミル生成が良好な 2 株（No.30-2、30-8）を選抜し（データ非掲載）、小仕込み試験に供した。
小仕込み試験の結果、アルコール生成能は親株とほぼ同等で、酢酸イソアミル、Ｅ／Ａ比が親株の 1.3～1.4 倍高い 1 株（No.30-2）を選抜した（表 3）。
表３ オーレオバシジンＡ耐性株による小仕込製成酒の分析結果

９０１（親株）

No.３０-２

No.３０-８エタノール（%）

18.9

17.918.6

日本酒度-0.5-10.2-3.0

酸度（ml）

2.90

3.15

3.30

アミノ酸度（ml）

1.65

1.65

1.75

イソアミルアルコール

10.91

0.82

酢酸イソアミル

11.28

1.07

E/A比

11.411.31※イソアミルアルコール、酢酸イソアミル、E/A 比は、901（親株）を 1 として表示

293)

堤浩子；特開 2002-191355

4)井上豊久；特開 2007-89455

5)

第四回改正国税庁所定分析法注解（1993）