日本大学歯学部紀要 31, 9―16，2003

クロムイオンが口腔由来上皮細胞株（Ca 9―22）の生細胞数およびサイトカイン産生に及ぼす影響
横瀬勝美

1桑田文幸1，2

Effects of chromium ion on cell viability, IL―1 α and IL―8production by an oral epithelial cell line, Ca 9―22
Katsumi Yokose1 and Fumiyuki Kuwata1,2

Abstract
The present study investigated the effects of chromium ion on cell viability, interleukin（IL）―1 αand IL―8 production by an oral epithelial cell line, Ca 9―22. The cells were maintained in DMEM
supplemented with 10% FBS and antibiotics. The cultures having 100% coufluent cells were serum
starved for 24 h, and then 1 mM of CrCl3 were added for the 10 min, 30 min, 1 h, 3 h or 6 h, respectively. After the incubation for 24 h, the cell viability was assessed by colorimetric assay usinga LDH Cytotoxic Test. And also IL―1 α and IL―8 production by these cells were examined using
specific ELISA kits for IL―1 α and IL―8.
By the addition of 1 mM chromium ion did not alter cell viability within 1 h. However, 1 mM
chromium ion induced cell death more than 6 h. Little effect was observed by the addition ofchromium ion on IL―1 α and IL―8 production of these cells. These results indicate that additionsof 1 mM chromium ion induce epithelial cell death rather than cytokine production.
Key words: chromium ion, cell viability, IL―1 αproduction,IL―8 production, oral epithelial cell緒

し荷重負荷などの各種環境要因に曝露され，こ言

れらの要因によって金属は腐食，分解，摩擦な歯科用金属には様々な金属が使用されているどを引き起こすと考えられる。とくに歯科用金が，それらの多くは合金として歯科用歯冠修復属の腐食によって有害な腐食産物を生じるほ物，矯正用材料等に使われている。合金中の金か，摩擦によって微粒子となる1―4）。このように属の割合は使用される治療部位や治療目的に生体との接触が密接である歯科用金属は，局所よって異なり，近年では，歯科用金属の開発が的為害作用に加え全身的為害作用までに至って進み，多種多様な金属が含有されている。治療いると考えられる。また，ヒト体内で，体液，に使用された歯科用金属は口腔内でいろいろな正常組織，病的組織と接触して使用されるた環境を受け，とくに唾液，血液，リンパ液に接め，生体内環境の影響を受けていると考えら

触し，生体内の pH，体温，酸素分圧，繰り返れ，歯科用金属が生体内動態における為害作用11

日本大学歯学部化学教室
日本大学歯学部総合歯学研究所顎口腔機能研究部門〒101―8310 東京都千代田区神田駿河台 1―8―13（受理：2003 年 9 月 25 日）
2

Department of Chemistry, Nihon University School ofDentistry2
Division of Oral and Craniomaxillofacial Research, Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry
1―8―13 Kanda―Surugadai, Chiyoda―ku, Tokyo 101―8310, Japan― 9 ―日本大学歯学部紀要 31, 9―16，2003とも密接に関係するため，その動態を知ることDMEM（10% FBS および抗生物質を含有）
で培は安全性を考えるうえで不可欠であると思われ養を開始した。細胞が 24 穴プレート内に 100る。本研究で検討を行ったクロムは歯科用金属％コンフルエントに達した培養 3 日目に，それ合金中に含まれており，又ヒト生体内のクロム

ぞれ無血清の DMEM
（抗生物質を含有）に培地は必須微量金属であり，生体内の生理的役割とを交換して 24 時間血清飢餓を行い，その後，して，糖質，脂質，タンパク質代謝や結合組織を 含 む 無 血 清 の DMEM
クロムイオン（CrCl3）5―7）代謝に関与しているといわれている 。と交換した。生細胞へのクロムイオンの経時的著者らは，歯科用金属の金属イオンが口腔軟変化の影響を調べるためにその作用時間をそれ組織，とくに上皮組織におよぼす影響を解明す

ぞ れ 10 分，30 分，1 時 間，3 時 間 お よ び 6 時る第一ステップとして，すでに歯科補綴物の成間とし，培養を行った。なお，培地中に添加し分であるチタンおよびニッケル，歯科修復物のの濃度は 1.0 mM としたクロムイオン（CrCl3）合金中に存在する亜鉛について，ヒト口腔由来た。クロムイオンを作用させた後，培地を無血のコンフルエント後の生上皮細胞株（Ca 9―22）

清の DMEM にそれぞれ交換し，24 時間培養細胞数および DNA 合成能におよぼす影響につし，上清を回収をした。回収した上清は 3000

8，9）

いて報告した 。そこで本研究では，矯正用ワ（WAKO）
rpm，5 分遠心し，LDH―Cytotoxic Test

イヤーや歯冠修復の金属合金として使用され，を用いて比色測定し，細胞障害率を算出した。

ヒト生体内の必須微量元素であるクロムについ本研究で使用した 24 穴プレートは，上皮細胞て生細胞への経時的変化を調べ，さらに，インの成長因子に対する反応性がマトリックス依存10）

お よ び IL―8 の 2
タ ー ロ イ キ ン―1 α（IL―1 α）性であるという報告15）を参考にして，!型コ種類のサイトカイン産生に及ぼすクロムイオンラーゲンがコートされたものを用いた。また，の経時的変化も併せて検討した。

実験は 3 連で行い，結果は平均値で示した。ク
ロムイオンの経時的変化を比較するため，クロ材料および方法

ムイオン無添加の場合をコントロールとした。

1．細胞培養またクロムイオン作用時間ごとの細胞形態を観実験にはヒューマンサイエンス資源バンク（大阪）から供与されたヒト歯肉癌由来細胞株察し，写真撮影した（図 2〜7）。
3．IL―1 α および IL―8 産生11―14）を 使 用 し た。Ca 9―22
Ca 9―22（JCRB 0625）

材料および方法の 2．と同様に，!型コラー細胞は，Dullbecco’s modified Eagle medium

ゲンをコートした 24 穴プレートに Ca 9―22 細（DMEM，旭テクノグラス）に，10％ ウシ胎児胞を播種し，100％ コンフルエントに達した培血清（FBS，旭テクノグラス），50 U/ml ペニシ

養 3 日目に 24 時間血清飢餓を行った後，クロリ ン お よ び 50μg/ml ス ト レ プ ト マ イ シ ンの濃度，1.0 mM を含む無血清ムイオン（CrCl3）（Sigma）を加えた培地を用い，37℃，5% CO2 のの DMEM と交 換 し，10 分，30 分，1 時 間，3湿潤条件下で培養を行った。

時間および 6 時間作用させ培養を行った。その2．細胞障害率（経時的変化）後，それぞれ新たに無血清の DMEM と 交 換生細胞へのクロムイオンによる経時的変化のし，さらに 24 時間培養後，培養上清を回収し影響を調べるために，!型コラーゲンをコートおて，IL―1 α 定量用 ELISA キット（BioSource）

した 24 穴プレート（住友ベークライト）に Ca 9を
よ び IL―8 定 量 用 ELISA キ ッ ト（BioSource）―22 細 胞 1×105 個／cm2 を 播 種 し，500μl の用いて上清中のサイトカイン産生量をそれぞれ― 10 ―

クロムイオンが口腔由来上皮細胞株（Ca 9―22）の生細胞数およびサイトカイン産生に及ぼす影響定量した。

成績

1．細胞障害率（経時変化）
100％ コンフルエントに達した後の Ca 9―22
1 mM 濃度細胞に及ぼすクロムイオン（CrCl3）の経時的変化の影響を調べた結果を第 1 図に示した。
濃度 1 mM，作用時間 0クロムイオン（CrCl3）
分，10 分，30 分，1 時間，3 時間および 6 時間
として培養を行った結果，細胞障害率は作用時間に依存して増加した。コントロール（作用時

第 3 図 クロムイオン 1 mM 10 分間作用させたときの細胞形態間 0 分）と比較して，クロム作用時間 10 分間で＋2%，30 分 間 で＋2.9%，1 時 間 で＋3.7%，3 時

第 1 図 Ca 9―22 細胞の細胞障害率に及ぼすクロムイオンの影響

第 4 図 クロムイオン 1 mM 30 分間作用させたときの細胞形態

第 2 図 Ca 9―22 細胞 control 形能（クロムイオン作用時間，0 分）

第 5 図 クロムイオン 1 mM 1 時間作用させたときの細胞形態― 11 ―

日本大学歯学部紀要 31, 9―16，2003

第 6 図 クロムイオン 1 mM 3 時間作用させたときの細胞形態

第 7 図 クロムイオン 1 mM 6 時間作用させたときの細胞形態間で＋6.4%，6 時間で＋18.1％ の細胞障害率の増加がみられた。また，クロム作用時間（0 分，10 分，30 分，1 時 間，3 時 間，6 時 間）ごとの細胞形態を観察した（第 2 図〜第 7 図）
。1 時間までは細胞の形態にクロムの影響がみられないが，3 時間作用させた場合，細胞の萎縮がみられ，6 時間ではその萎縮が広がって行く傾向がみられた。
2．IL―1 α 産生
コンフルエントに達した後の Ca 9―22 細胞の第 8 図 Ca 9―22 細胞の IL―1 α の産生に及ぼすクロムイオンの影響

1 mM
IL―1 α 産生に及ぼすクロムイオン（CrCl3）濃度の経時的変化の影響を調べた結果を第 1 表産生量は増加した。10 分間クロムイオン作用させた場合，9.3 pg/ml であり，30 分間で 10.6および第 8 図に示した。
クロムイオンの作用時間とともに IL―1 α のpg/ml，1 時 間 で 9.2 pg/ml，3 時 間 で 18.3 pg/ml，6 時間で 34.6 pg/ml であった。

第 1 表 Ca 9―22 細胞の IL―1 α の産生に及ぼすクロ3．IL―8 産生
コンフルエントに達した後の Ca 9―22 細胞のムイオンの影響
平均 pg/ml

作用時間

1 mM
IL―8 産生に及ぼすクロムイオン（CrCl3）

0分

＊

＊

＊

＊

濃度の経時的変化の影響を調べた結果を第 2 表

10 分

10.8

10.96.159.3

および第 9 図に示した。

30 分

10.2

9.3

12.210.6

クロム作用時間とともに IL―8 の産生量は増

1 時間

9.38

10.1

8.19.2加した。コンフルエントに達した後の Ca 9―223 時間

17.817.8

19.4

18.3

細胞の IL―8 産生量はコントロールでは 19.6 pg

6 時間

33.835.834.234.6

濃 度 1 mM 10 分 間/ml，ク ロ ム イ オ ン（CrCl3）＊検出限界以下

作用させ培養した場合 29.2 pg/ml，30 分間で― 12 ―

クロムイオンが口腔由来上皮細胞株（Ca 9―22）の生細胞数およびサイトカイン産生に及ぼす影響

第 2 表 Ca 9―22 細胞の IL―8 産生に及ぼすクロムイオンの影響なって Schwarz と Melz に よ っ て GTF の 活 性
成分は 3 価クロムであり，3 価クロム化合物が平均 pg/ml

グルコース耐性障害を回復させるのに十分効果

0分

20.4

1820.319.6のあることが示された。しかし GTF の構造は

10 分

29.3

27.6

30.629.2

未だ決定されておらず，クロムのほかにニコチ

30 分

34.7

33.3

33.9

34.0

ン酸やグリシン，グルタミン酸，システイン残1 時間

34.2

32.5

35.6

34.1基を含んでいる。また，厳しいクロム欠乏症条

3 時間

49.5

47.2

48.2

48.3

6 時間

61.2

59.261.160.5

作用時間件下では，高血糖や糖尿の症状がラットやネズミで観察されるが，飲料水中に 2 または 5 ppmのクロムを加えることにより，これらの症状は急速に回復する。これらのことからクロム欠乏により動物では成長障害，短命，糖質，脂質，タンパク質代謝異常，角膜疾患（視力障害，角膜混濁，虹彩血管のうっ滞）等が起き，クロム欠乏による耐糖能低下には 3 価のクロム含有グルコース耐性因子（GTF）が関与している。すな
わち，クロムは生理的役割として，糖質，脂質，タンパク質代謝および結合組織代謝に関与して第 9 図 Ca 9―22 細胞の IL―8 産生に及ぼすクロムイオンの影響いるといわれている4―7）。
ヒトのクロム欠乏による疾患として，糖尿病または耐糖能異常，高コレステロール血症，ア

34.0 pg/ml，1 時間で 34.1 pg/ml，3 時間で 48.3

テローム性動脈硬化症の可能性が高いと考えらpg/ml，6 時間で 60.5 pg/ml まで増加した。

れている5）。また，クロムはウシの肝臓から抽考出された RNA 中に高濃度で存在することが報察

告されており，核酸の分子構造を維持するためクロムは歯科用金属に含有されている金属のにクロムはなんらかの役割を果たすであろうと一つであるため，口腔内の様々な環境の影響をいう報告もある6）。通常 6 価クロム化合物は生受けるとともに生体との接触は密接であり，局体膜を容易に通過し，細胞内でグルタチオンや所的為害作用に加え全身的為害作用までに至っアスコルビン酸などにより 5 価，4 価を経て最ていると考えられる。すなわちヒト体内で，体終的には 3 価クロムとなり，そのほとんどが低液，正常組織，病的組織と接触して使用される分子タンパク質と特異的に結合し，毒性は低下ため，生体内環境の影響を受けていると考えらして，腎臓から速やかに排出される。3 価クロれる。しかしクロムは生体において必須微量元

ム化合物や金属クロムの発癌性は IARC（Inter-素であり，特定組織や器官に多いということはnational Agency for Research on Cancer）の最なく，低濃度で広く分布している。ラットのグ近の評価でも認められていない。しかし，DNAルコース耐性障害はグルコース耐性因子（glu-に結合した 3 価のクロムが，DNA 複製過程にcose torelance factor:GTF）と呼ばれる新しい栄おいて誤りを生じさせる可能性を報告してい養素の欠如によると提唱されたが，1959 年にる7）。さらに細胞内で 4 価クロムはフリーヒド― 13 ―

日本大学歯学部紀要 31, 9―16，2003

ロキシルイオンおよび DNA 損傷の可能性が報

1 時間，3 時間，6 時間）に伴う細胞形態の観察

告されている16―20）。このようにクロムは生体内では，1 時間までは細胞形態に変化がないが，で様々な作用をしていると考えられる。

3 時間作用させた場合，細胞の萎縮が見られ，

本研究ではヒト生体内必須微量元素であるク

6 時間ではその萎縮が広がって行く傾向が観察

ロムイオンについて口腔粘膜由来上皮細胞の生された。1 時間までは細胞の形態変化は見られ細胞数への経時的変化について調べた。前報8，9）

ないが，それを超えると，クロムの細胞毒性ににおいて亜鉛の検討を行ったが，亜鉛濃度をよる細胞死の誘導を引き起こすと考えられた。

0，0.01，0.1，1 mM とし作用時間 を 各 濃 度 1

次でサイトカイン産生に及ぼすクロムイオン時間，6 時間，24 時間とした場合，低濃度（0.01，の経時的変化を検討した。インターロイキン―10.1 mM）
では時間による生細胞数に変化が少な

は創傷治癒において重要な役割を果
α（IL―1 α）

く，高濃度（1 mM）
では 6 時間作用させると生たしており，皮膚の創傷治癒においても，活性細胞数が減少した。そこで本研究では，クロム化されたケラチノサイトから IL―1 α が放出さイオン濃度を 1 mM にして，その作用時間をれる。そして，それらが線維芽細胞やケラチノ

8，9）

前報 より短時間（10 分，30 分，1 時間，3 時サイトの増殖，線維芽細胞のコラーゲン合成お間，6 時間）に設定した。本測定の LDH―Cyto-

よびケラチノサイトのケモタキシスを促進させtoxic Test は細胞毒性を簡便に測定できるばかることが報告されている21）。クロムイオンが Caりでなく，細胞が細胞膜に障害を受けて細胞か9―22 細胞の IL―1 α の産生量を促進するかどうら遊離した LDH
（乳酸脱水素酵素）
活性を測定

かを調べるため，クロムイオン濃度を高濃度のすることから，生理活性物質による細胞障害や1 mM にし，作用時間を前報8，9）より短時間で検細胞性免疫による細胞障害，補体依存性細胞障討した。クロムイオン 1 mM の濃度で，作用害，抗体依存性細胞障害の他，細胞の生存率に時間 10〜60 分では，IL―1 α の 産 生 量 は 9〜10も利用できるため，この方法を用いて生細胞障pg/ml であり（表 1），作用時間 1 時間以内ではIL―1 α の産生にはクロムイオンが影響してい害率を測定した。
コントロールはクロムイオンを作用させていないことがわかった。クロムイオンを 3〜6 時ないが，クロムイオンを作用させた細胞と同間作用させた場合，IL―1 α 産生量が増加し，6様，血清飢餓状態 24 時間後，新たに無血清培

時 間 で 34.6 pg/ml で，IL―1 α 産 生 量 は，ク ロ

地を交換したのち，24 時間培養後上清を回収

ムイオン作用時間 10 分の約 4 倍の産生量を示した。LDH 活性測定において，コントロールした。

でも 6.7％ の障害率を示している。これは 48

外来の異物の侵入に対して，創傷部位には多時間無血清で培養しているためであると考えら数の好中球が遊走する。活性化上皮細胞によっれる。クロムを 10 分作用させるとコントローて産生される IL―8 は，好中球に対する主要なルと比較して，＋2％ であり，30 分で＋2.9%，走化 性 因 子（ケ モ カ イ ン）の 一 つ で あ る21，22）た

1 時間で＋3.7%，3 時間で＋6.4%，6 時間で＋18.1

め，クロムイオンが Ca 9―22 細胞の IL―8 産生％細胞障害率であった。これらのことから作用を促進するかどうかを調べた。その結果，コン時間が長くなれば細胞障害率も大になるが，作フルエントに達した後の Ca 9―22 細胞の IL―8

用時間 1 時間まではクロムイオンが細胞に対し産生量は，コントロールでは 19.6 pg/ml，クロてこの条件下では大きな影響がなかったと考え

濃 度 1 mM 作 用 時 間 10 分 で
ム イ オ ン（CrCl3）られる。クロムイオンの作用時間（10 分，30 分，29.2 pg/ml，30 分 で 34.0 pg/ml，1 時 間 で 34.1

― 14 ―クロムイオンが口腔由来上皮細胞株（Ca 9―22）の生細胞数およびサイトカイン産生に及ぼす影響

pg/ml，3 時間で 48.46 pg/ml，6 時間で 60.2 pg

８）横瀬勝美，桑田文幸：口腔由来細胞株（Ca 9―/ml と増加した。これらのことから，クロムイ22）の生細胞数および DNA 合成能に及ぼす金オンは上皮細胞の IL―8 産生量を促進させ，好属イオンの影響；研究紀要 日本大学歯学部（一般教養），29, 37―44, 2001.

中球の遊走を促して異物の侵入に対処できる可能性が示唆された。しかしながら炎症性サイト

９）横瀬勝美，桑田文幸：亜鉛イオンが口腔由来上皮細胞株（Ca 9―22）の生細胞数，DNA 合 成

カインである IL―1 α 産生量と IL―8 産生量では能およびサイトカイン産生に及ぼす影響；研クロムイオンの作用時間によって産生量の増加

究紀要 日本大学歯学部（一般教養），30, 49―が異なり，その詳細を検討しなければならない。

58, 2002.
10）Li.J., Ireland, G. W., Farthing, P. M. and Thorn-

以上のことから，修復および歯科補綴物の金hill, M.H. : Epidermal and oral keratinocytes

属由来のクロムイオンによる歯肉上皮細胞へのare induced to produce RANTES and IL―8 by

影響は，サイトカイン産生量を増加させ，細胞cytokine stimulation; J. Invest. Dermatol., 106,661―666,1996.

死への誘導を左右する因子の一つであることが判明した。とくに，細胞増殖期に対する高濃度，

11）堀越 勝，木村義孝，名倉英明，小野富昭，
伊藤秀夫：人の歯肉癌由来の株細胞の樹立第短時間で影響が大であったことから，歯肉や口腔粘膜上皮の創傷治癒時にみられる上皮細胞の一報）；日口腔外科会誌， 20, 100―106, 1974.
12）Gamou,S. and Shimizu,N. : Change in meta-増殖に対して抑制的に作用する可能性が示唆さ

bolic turnover is an alternate mechanism in-

れた。

creasing cell surface epidermal growth factor

本研究の一部は，平成 15 年度日本大学歯学部佐recept or levels in tumor cells ; J. Biol. chem.,

藤研究費によって行われたことを付記する。

262, 6708―6713, 1987.
13）Hirai , M . ,文献Gamou , S . ,Minoshima , S .

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14）Hirai,M.and Shimizu,N. : Purification of two

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distinct proteins of approximate Mr 80000

４）John, C. W. : Biocompatibility of dental castingfrom human epithelial cells and indentification

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52―

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日本大学歯学部紀要 31, 9―16，2003

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