日大歯学 , 96（1）, 53-62, 2022

原著

TFAP2E の過剰発現が歯肉癌由来株化細胞 Ca9-22 の増殖能と細胞周期に与える影響
酒井嶺

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

応用口腔科学分野

日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座（指導：佐藤秀一教授，藤原恭子准教授）

要旨：
目的：口腔領域の扁平上皮癌（OSCC）の増殖能や細胞周期に，癌抑制遺伝子 transcription factor activator
protein-2ε（TFAP2E）が及ぼす影響を検討した。
方法：TFAP2E の発現ベクターを Ca9-22 に遺伝子導入し，TFAP2E が過剰発現したクローン（pTFAP2E）とベクターのみを導入したコントロールクローン（pN/C）を得た。pTFAP2E と pN/C の増殖能の測定には，WST8 試薬を使用した。細胞周期は，フローサイトメーターによって分析した。二重チミジンブロックによって両クローンの細胞周期を G1 期の終わりに同調させて，周期分布の変化と cyclin B の発現を比較した。さらに，ノコダゾール
処理で両クローンを M 期の直前に同調させて，周期分布の変化の詳細について調べた。
結果：pN/C と比較して pTFAP2E の増殖能は低かったが，生存率には差がなかった。また，pTFAP2E はチミ
ジン除去後，G1 期の増加と G2/M 期の減少，および cyclin B1 の発現上昇が見られる時期が，pN/C と比較して 2
時間程度遅かった。一方，ノコダゾール処理後 3 時間までの両クローンの周期分布に違いはなかった。
結論：TFAP2E による Ca9-22 の増殖能の低下は，G2 期および G2 期から M 期への進行の遅延に起因し，OSCCの増殖を抑制することで，その進展を防いでいる可能性が示唆された。
キーワード：transcription factor activator protein-2ε ，細胞増殖，細胞周期，口腔扁平上皮癌，cyclin B1

Effect of TFAP2E-overexpression in gingival squamous carcinoma cell line,
Ca9-22, on cell proliferation and cell cycle
Ryo Sakai
Nihon University Graduate School of Dentistry Major in Applied Oral Sciences
Department of Periodontology, Nihon University School of Dentistry(Directors: Prof. Shuichi Sato and Assoc. Prof. Kyoko Fujiwara)

Abstract: Purpose: This study aimed to clarify the effect of transcription factor activator protein-2ε(TFAP2E) on the proliferation or cell cycle of oral squamous cell carcinoma (OSCC), using an TFAP2E overexpressed OSCC cell line.
Methods: TFAP2E cDNA was transfected into Ca9-22, and clones overexpressing TFAP2E (pTFAP2E)
and expressing vector (pN/C) were established. Cell proliferation was determined by WST8 reagent, anddistribution of cell cycle was analyzed by flow cytometer. To obtain more information concerning cell-cycle
and cyclin B1 expression, cells were synchronized at the end of G1-phase and the start of M-phase by
double thymidine block and nocodazole treatment, respectively.
Results: Cell proliferation activity of pTFAP2E was lower than pN/C. At 10 to 14 h after thymidine
removal, higher level of G1-phase and lower level of G2/M-phases were detected in pTFAP2E than pN/C.
However, no change in distribution of G1- and G2/M-phases were observed between both clones after
nocodazole removal. Furthermore, cyclin B1 expressed 2-hour later in pTFAP2E than pN/C after thymidine
removal.
Conclusion: It was indicated that pTFAP2E might delay G2-phase and transition from G2- to M-phases,
then leading to low cell proliferation of OSCC.
（受付：令和 4 年 1 月 31 日）
責任著者連絡先：酒井 嶺
日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8107
FAX：03-3219-8349
E-mail：sakai.ryou@nihon-u.ac.jp

53

日大歯学

第 96 巻第 1 号

Keywords: transcription factor activator protein-2ε, cell proliferation, cell cycle，oral squamous carcinoma,
cyclin B1緒

ウス有棘細胞癌の TFAP2E の第 3 イントロンに同定さ言れた CpGi のメチル化は，ヒト大腸癌や胃癌においても頭頸部にみられる扁平上皮癌は悪性腫瘍の中でも発生

観 察 さ れ て い る。 こ の CpGi の メ チ ル 化 に よ っ て

率が比較的高く，2018 年の新規患者数は約 830,000 人，

TFAP2E の発現レベルが減少し，抗癌剤 5- フルオロウ

死者数は約 430,000 人と報告されている 。このうち口ラシル（5-FU）の反応性が低くなる 18,19）。前立腺癌患者の腔領域に発生する扁平上皮癌（OSCC）の発生率が最も高

尿中ゲノム DNA にも，正常成人男性と比較して，メチ

く，2015 年の新規罹患者数は約 300,000 人，死者数は約ル化した TFAP2E が多く検出されている 20）。さらに，

145,000 人 で あ り 1），2018 年 の 新 規 患 者 数 は 約 355,000

神経芽腫患者では，TFAP2E の発現が予後を左右し，そ

人，死者数は約 177,000 人で，明らかに上昇傾向を示しのレベルが低いほど，生存期間が短くなる 21）。OSCC 患ている 2）。癌治療法の進歩に伴い，癌の治癒率は向上し者においても低レベルの TFAP2 E 発現が予後を悪化さているものの，現時点での OSCC の 5 年生存率は 70％せるという見解が得られているが 22），TFAP2E が OSCCに留まっている 3）。OSCC は舌，口唇および口腔底に好の増殖と進行を抑制する詳しい分子メカニズムは明らか発し，喫煙とアルコールの摂取がその発生の主なリスクにされていない。

1）

因子となっている 。その他に，放射線への暴露や高リ

そこで本研究では，OSCC における TFAP2E の役割

スク型パピローマウイルス（HPV）の感染などが，OSCCを解明する一助として，TFAP2E をヒト歯肉癌由来株化の発生率を上昇させている 4）。近年，OSCC のゲノム解細胞 Ca9-22 に過剰発現させることによって，細胞増殖

析によって，発生原因と関連するいくつかの遺伝子変異と細胞周期の変化について検討した。

4）が 同 定 さ れ た。 一 例 と し て， 喫 煙 が 原 因 で 発 生 す る

材料および方法

OSCC は，癌抑制遺伝子の tumor protein p53（TP53）や
cyclin-dependent kinase inhibitor（CDK）2 A の変異が発見されている1． 細胞の培養。しかし，HPV 陽性 OSCC には TP53

ヒト歯肉癌由来株化細胞 Ca9-22 は，国立研究開発法と CDKN2A の変異は確認できていない 7）。したがって

人医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB 細胞バンク（大阪）

これらの知見は OSCC の新規治療標的の同定や，その増から購入した。細胞を，minimal essential medium（ナ殖または進行の機序を解明する上で重要と考えられる。

カ ラ イ テ ス ク， 京 都 ）に 10% 牛 胎 児 血 清（FBS， ニ チ

5-7）Transcription factor activator protein-2ε（TFAP2E）

リ ョ ー， 東 京 ），600 mg/L glutamine，100 IU/mL

は，核内転写因子 activator protein-2 epsilon ε（AP-2）

penicillin（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，をコードする遺伝子で，AP-2 遺伝子ファミリーに属しUSA） と 100 mg/mL streptomycin（Thermo Fisherて い る 8）。 こ の フ ァ ミ リ ー に 含 ま れ る 5 つ の 遺 伝 子Scientific）を添加した培地で，湿度 100%，37 ℃および

T F A P2A，T F A P2B，T F A P2C，T F A P2D お よ び

5% CO2 の条件で培養した。

TFAP2E は，共通した helix-span-helix モチーフと DNA

2． TFAP2 E の過剰発現

結合ドメインの α -helix 構造を有し，初期発生に重要なネオマイシン耐性遺伝子をコードし，CMV プロモー。 す な わ ち， マ ウ ス で は，

ターの下流に TFAP2E の open reading frame が挿入さ

TFAP2 E は主に神経組織にみられ，嗅球や網膜の発生

れ た 発 現 ベ ク タ ー を GenScript （Piscataway，NJ，に関与している

役割を担っている

9,10）。また，ヒトあるいはマウス間葉系

USA）から購入した。またコントロールベクターとして幹細胞の軟骨細胞への分化に伴い TFAP2E 発現が認め

pcDNA3.1（Thermo Fisher Scientific）を 使 用 し た。

られる

。一方，マウス有棘細胞癌において TFAP2E

Ca9-22 を 1×105 細胞 /ml の密度で播種し，24 時間後に遺伝子の第 3 イントロンに多くみられる CpG アイラン

lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）と混合しド（CpGi）にメチル化が生じていることから，TFAP2E

た TFAP2E 発 現 ベ ク タ ー あ る い は コ ン ト ロ ー ル ベ ク

が癌の発生と増殖に何らかの影響を及ぼす遺伝子としてターを培養液に加え遺伝子導入した。その後，50 mg/ml

注目されているの G418 存在下で培養を続け，各ベクターがゲノム DNA

11-13）

14,15）。

16）

最近の研究から，TFAP2E は癌抑制遺伝子として機能に組み込まれたクローンを得た。このうち TFAP2E 過し て い る こ と が 明 ら か に さ れ た。 例 え ば， ヒ ト の剰発現クローン（pTFAP2E）とコントロールベクター導TFAP2E は染色体 1p34 に位置するが，このゲノム領域

入クローン（pN/C）の各 1 つを選び実験に供した。

は前癌病変の結腸直腸腺腫で欠失している 17）。また，マ54

歯肉癌細胞における TFAP2E の過剰発現効果

令和 4 年 6 月

細胞周期の変化を調べた。

3． 細胞増殖能と生存率の測定

5． Quantitative real-time RT-PCR（qPCR）

1×104 個 /ml の細胞を 96 well plate に播種し，1 〜 5
日目までの経日的な増殖能を WST8 試薬（ナカライテス

RNA の抽出は RNeasy mini kit（Qiagen，Valencia，

ク）で測定した。1 日ごとにウェルから培地を除去し，1/10

CA，USA）を，RNA か ら cDNA の 合 成 は，iScript

濃度の WST8 試薬を含む 100μl の培地を加え，1 時間の

cDNA synthesis kit（Bio-Rad laboratories，Hercules，

培 養 後， プ レ ー ト リ ー ダ ー の SpectraMax ABS Plus

CA，USA）を 使 用 し た。TFAP2E と 18 S rRNA の（Molecular Devices，San Jose，CA，USA）を使用して

qPCR は TaqMan プ ロ ー ブ 法 25）で，cyclin B1 とβ-2波長 450 nm の吸光度を計測した。なお，バックグラウ

microglobulin（B2M）はインターカレーター法 26）によっンドとして細胞が播種されていないウェルを使用し，計て 行 な っ た。TFAP2E の 検 出 プ ラ イ マ ー は，測した吸光度からバックグラウンドの値を引いた数値をHs00698734_m1（Thermo Fisher Scientific）を，18 S

増殖能として評価した。

rRNA は Hs99999901_s1（Thermo Fisher Scientific）を

また，抗癌剤のシスプラチン（CDDP，Sigma-Aldrich,

使 用 し た。 そ れ ぞ れ の プ ラ イ マ ー は cDNA と と も に

St. Louis，MO，USA）を加えたときの生存率も調べた。

Premix ExTaq Perfect Real Time（タカラバイオ，草津）

5×10 個 /ml の細胞を 96 well plate に播種し，24 時間の 反 応 液 中 で，95 ℃，30 秒 の 前 処 理 後，95 ℃，5 秒 お

後に 1μM あるいは 5μM の CDDP を投与し，3 日目によ び 60 ℃，30 秒 の 反 応 を 40 回 繰 り 返 し た。 ま た，

100μl の WST8 試薬を含む培地と交換し，1 時間の培養

cyclin B1 の検出はプライマー 5’-CAG TCA GAC CAA

後に 450 nm の吸光度を測定した。CDDP に対する細胞

AAT ACC TAC TGG GT-3’ と，5’ -ACA CCA ACC

4の生存率は，CDDP 非投与で得られた吸光度を 100% とAGC TGC AGC ATC TTC TT-3’を，B2 M は 5’-ATG

して算出した。全ての測定は 1 条件につき 4 ウェルずつ

TCT CGC TCC GTG GCC TTA-3’と，5’-ATC TTG

行った。

GGC TGT GAC AAA GTC-3’（ユーロフィンジェノミク

4． 細胞周期の検討

ス，東京）を使用した。Cyclin B1 のプライマーと cDNA

2×10 個 /ml の細胞を直径 60 mm の培養シャーレには SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（タカラバイオ）の反応液中播種し，72 時間後，浮遊細胞と付着細胞を含むすべてので，95 ℃，30 秒の前処理後，95 ℃，5 秒と 58 ℃，30 秒

細胞を一緒に回収し，phosphate buffer saline（PBS）でを 40 回繰り返して cyclin B1 遺伝子を増幅した。同じく，洗浄後，70% エタノール中に浮遊させた。4 ℃で 24 時間

B2 M プ ラ イ マ ー と cDNA を 95 ℃，30 秒 の 前 処 理 後，のインキュベート後，0.1% ウシ血清アルブミン，25 mg/

95 ℃，5 秒，55 ℃，10 秒 お よ び 72 ℃，30 秒 を 40 回 繰

ml propidium iodide，および 200 mg/ml RNase A を含り返し B2M 遺伝子の増幅を行なった。サーマルサイク

む PBS で細胞を 15 分間懸濁させ，フローサイトメータ

ラーは CFX Maestro（Bio-Rad laboratories）を利用し，（FACSCalibur，BD Biosciences，Franklin Lakes，

測定は全て 3 回ずつ実施した。なお，Ca9-22 の RNA か

NJ，USA）によって細胞周期を分析した。

ら合成した cDNA を段階希釈したものから標準曲線を作

4

G1 期の終わりに細胞周期を同調させるため，二重チミ成し，各遺伝子の相対的な発現レベルを求めた。また，

ジンブロックを利用した 23）。2×104 個 /ml の細胞を直径

TaqMan プローブ法では 18S rRNA の値を，インターカ

60 mm の培養シャーレに播種し，24 時間後に 2 mM のレーター法では B2M の値を内因性コントロールとしてチミジンを添加した。培養 18 時間後に培地を除去して用いた。

PBS で 3 回洗浄し，今度はチミジンを含まない培地に置

6． Western blot

換した。そこから 9 時間培養を続け，再度 2 mM のチミ

pN/C と pTFA2 E は，プロテアーゼ阻害剤（ナカライ

ジンを添加した。さらに 18 時間の培養後，培地を除去テスク）とフォスファターゼ阻害剤（ナカライテスク）をして PBS で 3 回洗浄し，再度チミジンを含まない培地を含む RIPA buffer（Thermo Fisher Scientific）で溶解加えた。この時点を培養 0 時間とし，その後，14 時間まし，−80 ℃で一度凍結した。解凍後，27 G の針をつけで，2 時間ごとに細胞を回収し，フローサイトメーター

た 1 ml の注射筒に複数回出し入れすることで，DNA をで細胞周期を分析した。

断 片 化 し た。 そ の 後，Bio-Rad DC kit（Bio-Rad

細胞周期を M 期のはじめに同調させるために，ノコダ

laboratories）によってタンパク量を計測した。10μg のゾールを使用した。5×104 個 /ml の細胞を直径 100 mm

タンパクを含む細胞溶解液は 4-12% SDS ポリアクリルの培養シャーレに播種し，24 時間後に 100 ng/ml のノコ

アミドゲル電気泳動で分画後，Immobilon-P メンブレン

ダゾールを添加した。12 時間の培養後，G2/M 期に入り（Millipore，Billerica，MA，USA） へ 転 写 し た。

球形をした細胞を mitotic-shake off 法 24）によって回収し，Blocking one（ナカライテスク）中，4 ℃で 24 時間メンブ

ノコダゾールを含まない培地に置換した。この時点を培

レンを浸漬し，1 次抗体と反応させた。1 次抗体は，ウ

養 0 時間として 1 時間ごとに細胞を回収し，3 時間まで

サ ギ 抗 ヒ ト TFAP2 E 抗 体（ProSci，Poway，CA，

55

日大歯学

第 96 巻第 1 号

USA）， マ ウ ス 抗 ヒ ト cyclin B1 抗 体（Santa Cruzの平均値± standard deviation（SD）で表し，P 値 0.05 以

Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA），ウサギ抗ヒ下を統計学的に有意とした。

ト GAPDH 抗体（Abcam，Cambridge，UK），マウス抗結ヒトβ-actin 抗体（Sigma-Aldrich）を使用した。メンブレ

果ン は，CanGet Signal（ ナ カ ラ イ テ ス ク ）で 500 倍 か ら

1． TFAP2E が Ca9-22 の増殖能と生存率に与える影響

1,000 倍に希釈した 1 次抗体と，4 ℃で 24 時間反応させTFAP2E の mRNA とタンパクの発現レベルを pN/C

た後，0.1% tween 20 を含む tris-buffered saline（TBS-T）と pTFAP2E で比較した。pN/C は TFAP2E の mRNA

で洗浄し，2 次抗体と室温で 1 時間反応させた。2 次抗と タ ン パ ク の 発 現 を ほ と ん ど 検 出 で き な か っ た が，

体は horseradish peroxidase で標識した抗マウス IgG まpTFAP2E ではどちらも強い発現が確認できた（図 1 A，

た は 抗 ウ サ ギ IgG（GE Healthcare Life Sciences，B）。

Buckinghamshire，UK）を 使 用 し，Chemi-Lumi-One

pN/C と pTFAP2 の増殖能を調べた結果，両クローン

Super（ ナ カ ラ イ テ ス ク ）に よ っ て 化 学 発 光 さ せ，と も に 培 養 5 日 目 ま で 経 日 的 な 増 加 を 示 し た が，

LAS4000（ 富士フィルム，東京）で撮影した。バンドのシpTFAP2E の増殖能は pN/C に比べて低かった（図 2 A）。

グナル強度は，Image （J NIH, Bethesda, MD, USA）を

pTFAP2E の増殖能の減少が，細胞の生存率と関係して用いて数値化した 27）。

いるか検討するために，異なる濃度（1 および 5μM）の7． 統計解析

CDDP を pN/C と pTFAP2E に加えて培養した。CDDP

2 群間の有意差検定は Student-t 検定を，また複数グは濃度依存的な細胞死を誘導し，5μM の CDDP によっ

ループ間の有意差検定は two-way ANOVA と Turkeyて pN/C と pTFAP2 E の生存率は約 35% まで減少した。

検定で行なった。全ての統計解析は，統計解析ソフト

しかし，両クローン間の生存率の違いについては有意差

JMP バージョン 11.2（SAS Institute，Cary，NC，USA）
を用いた。データは，全て 3 回あるいはそれ以上の実験

図1

遺伝子導入クローンにおける TFAP2E の発現
Ca9-22 に TFAP2E の 発 現 ベ ク タ ー を 導 入 し た ク ロ ー ン（pTFAP2E）とベクターのみを導入したコントロールクローン（pN/C）を樹立した。
（A）各クローンの TFAP2E mRNA の発 現 を qPCR で 調 べ た。 測 定 値 は，3 回 の 結 果 の 平 均 値 ±SD で表した。**P ＜ 0.01（B）各クローンの TFAP2E タンパクの発現を Western blot によって調べ，（C）バンドのシグナル
強度を ImageJ を用いて計測した。結果は 3 回の計測値の平均値± SD で表した。**P ＜ 0.01

図256

細胞の増殖能と生存率
pTFAP2E（実線）と pN/C（破線）の増殖能と生存率を計測した。
（A）1 〜 5 日 間 の 増 殖 能 の 変 化 を 表 し た。
（B）pTFAP2E（実線）と pN/C（破線）の培養系に 1 または 5μM の CDDP を加え，72 時間後の生存率を計測した。測定値は平均値± SDで示した。**P ＜ 0.01

歯肉癌細胞における TFAP2E の過剰発現効果

令和 4 年 6 月は認められなかった（図 2 B）。

および pTFAP2 E は G1 期 36.25%，S 期 22.64%，G2/M

2． TFAP2E の過剰発現が細胞周期の分布に与える影響

期 21.58% を示し，48，72 時間もほぼ同じ周期の分布だっ

pTFAP2E の増殖能を減少させた原因を探るため，培養た。死細胞が含まれる sub-G1 画分は，24 時間の pN/C

24，48 および 72 時間の pN/C と pTFAP2 の細胞周期ので 3.35%，pTFAP2 E で は 2.08% と い う 値 を 示 し，48，

分布と死細胞の割合を調べた。24 時間の細胞周期をみる

72 時間も同様の傾向を示した（図 3）。

と，pN/C は G1 期 42.4%，S 期 12.63%，G2/M 期 24.62%，

図3

フローサイトメーターによる細胞周期の分析
pN/C-1 と pTFAP2E-1 を播種後，24，48，72 時間の細胞周期を示す。死細胞は sub-G1 で表した。

57

日大歯学

第 96 巻第 1 号

3． 二重チミジンブロックによる細胞周期の時系列的な

pTFAP2E 15.3%，G2/M 期：pN/C 3.2% ＜ pTFAP2E

変化7.0%）。しかし，チミジン除去後 4 時間をみると，0 およ

二重チミジンブロックによって pN/C と pTFAP2E のび 2 時間と比較して両クローンの G1 期が大きく減少し，細 胞 周 期 を G1 期 の 終 わ り に 同 調 さ せ，G1 期，S 期，

S 期 の 増 加 が み ら れ た。 た だ し，4 時 間 の pN/C とG2/M 期の割合を 0 から 14 時間まで，2 時間ごとに比較

pTFAP2E を比較した場合，pTFAP2E は S 期の割合がした（図 4，表 1）。その結果，pN/C の 0 時間と 12 時間

低く（pN/C 83.7% ＞ pTFAP2E 63.1%），G2/M 期の割合の細胞周期の分布パターンがほぼ同じことから，Ca9-22が高かった（pN/C 2.8% ＜ pTFAP2 22.5%）。その後，6，はチミジン除去後，約 12 時間で 1 回の細胞周期が完結

8 時間の両クローンの細胞周期は，ほぼ同じパターンをすることが分かった。チミジン除去直後（0 時間）の pN/

示し，4 時間と比較すると S 期の割合が減少し，G2/M

C は G1 期 91.8%，S 期 3.2%，G2/M 期 4.9%，pTFAP2E期の割合が増加した。このうち 6 時間をみると pN/C には G1 期 81.8%，S 期 6.0%，G2/M 期 12.2% で，両クロー

比 べ て pTFAP2E の S 期 の 割 合 が 高 く（pN/C 12.1% ＜ンの間に大きな違いは認められなかった。チミジン除去

pTFAP2E 20.9%），G2/M 期 の 割 合 が 低 か っ た（pN/C

後 2 時間では，pN/C に比べて pTFAP2E の G1 期の割

79.3% ＞ pTFAP2E 66.3%）。 チ ミ ジ ン 除 去 後，10，12，

合が低く（pN/C 94.3% ＞ pTFAP2E 77.6%），S 期の割合

14 時間は，8 時間に比べて両クローンともに G1 期が急と G2/M 期 の 割 合 が 高 か っ た（S 期：pN/C 2.5% ＜激 に 増 加 し，G2/M 期 が 減 少 し た。 し か し，pN/C と
pTFAP2E を比較した場合，pTFAP2E は，それぞれの

表1

時間で G1 期が低く，S 期および G2/M 期が高い結果と二重チミジンブロック後の細胞周期の時系列的な変化 
































なった。なお，10，12 および 14 時間の両クローンの周期分布の割合を表 1 に示した。



 



 

 



 

 

 

4． ノコダゾール処理による細胞周期の時系列的な変化





 

 





 

 

 







 



 

  

 

 

ノコダゾールを培養系に加えて pN/C と pTFAP2E の



























































 

 





 


1 時間ごとに比較した（図 5）。なお，ノコダゾール除去直

後（0 時間）の pN/C の細胞周期が図 4 の 8 時間とほぼ同等













なパターンを示すことから，今回は 3 時間までの周期分布

 

 

 



 

 

 



 

 

 

  

 

を 計 測 し た。0 時 間 の pN/C は G1 期 12.3%，S 期 9.2%，



 



 

 

 

 













各周期に分布する細胞の割合（%）を表示する。


図4



細胞周期を M 期のはじめに同調させ，周期分布の変化を

G2/M 期 78.5％ で あ り，pTFAP2E は G1 期 20.8%，S 期
7.2%，G2/M 期 72.0％となり，両クローンの周期間には大きな変化はなかった。その後，3 時間まで両クローンの周二重チミジンブロック後の細胞周期の時系列的な変化
pN/C（a）と pTFAP2E（b）を二重チミジンブロックによって G1 期の終わりに同調させ，0〜 14 時間までの細胞周期の変化について 2 時間ごとに調べた。
58

歯肉癌細胞における TFAP2E の過剰発現効果

令和 4 年 6 月

期分布には顕著な差は認められず，ほぼ一定の割合の S

べて弱いことから，この時間での G2 期から M 期への遅期と経時的な G1 期の増加と G2/M 期の減少が確認でき延したことが明らかになった。一方，タンパク発現とはた。両クローンの周期分布の割合を表 2 に示した。

異なり，cyclin B1 の遺伝子発現は違いが認められなかっ5． pTFAP2 E の cyclin B1 の発現た（図 6 B）。

pN/C と pTFAP2E を二重チミジンブロックによって

考G1 期の終わりに同調させ，G2 期から M 期の初めに高発察現することが知られている cyclin B128）のタンパク発現

pTFAP2E の増殖能の低下は，TFAP2E の過剰発現にを 継 時 的 に 比 較 し た（ 図 6 A）。pN/C は 0 時 間 か ら

よる細胞周期の遅延や細胞死の誘導，あるいは細胞に加cyclin B1 の発現が検出でき，8 時間で強くなり，その後わるストレス抵抗性の低下などによるものと考えられ

10 時間でピークに達し，12 時間で急激に減少した。一方，る。そこで，細胞に加わるストレスに着目し，CDDP を

pTFAP2E は 4 時間から弱い発現が検出でき，10 時間で

pTFAP2E に作用させることによって，その生存率に及pN/C とほぼ同じレベルになり，12 時間では pN/C と同ぼす影響について pN/C と比較した。

じレベルまで減少した。特に，8 時間の pTFAP2E で発

その結果，CDDP によって pN/C と pTFAP2E の多く現している cyclin B1 の遺伝子発現レベルが pN/C と比は 死 滅 し た が， 両 ク ロ ー ン の 間 の 生 存 率 に 差 は な く，
pN/C と pTAFAP2E のストレスに対する抵抗性は同程

 表2度であると推測できた。Ca9-22 は，変異型 TP53 を持つ

ノコダゾール処理後の細胞周期の時系列的な変化 









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 （%）を表示する。

各周期に分布する細胞の割合ことが知られている 29）。野生型の TP53 は，CDKN1 A
や growth arrest and DNA damage inducible 45（GADD45）の発現を活性化することで，細胞死を誘導す







図6

図5

ノコダゾール処理後の細胞周期の時系列的な変化
pN/C（a）と pTFAP2E（b）をノコダゾールによって M 期のはじめに同調させ，0 〜 3 時間の細胞周期の変化について，1
時間ごとに調べた。

59

Cyclin B1 の遺伝子・タンパク発現
A：pTFAP2E と pN/C を二重チミジンブロックで G1 期の終わりに同調させ，0 〜 14 時間までの cyclin B1 の発現をWestern blot に よ っ て 検 出 し た。B： 同 じ く pN/C（a）とpTFAP2E（b）の cyclin B1 の発現レベルを qPCR によって 2
時間ごとに調べた。qPCR の測定値は，3 回の測定結果の平均値± SD で表した。

日大歯学

第 96 巻第 1 号

る が， 変 異 型 TP53 で は こ れ ら の 機 能 が 減 弱 し て い

い は pTFAP2E で は S 期 6%，G2/M 期 12.5% が 含 ま れた 30）。今回，Ca9-22 において TFAP2E を過剰発現させており全ての細胞を G1 期に合わせることはできなかっても，CDDP に対する抵抗性がコントロール細胞と同程た。その原因の一つとして，チミジンの取り込み量が細度であったことは，変異型 TP53 が影響している可能性

胞間で均一ではないことが考えられた。チミジンの取りがある。TFAP2E と TP53 との関係は，今後の検討が必

込み量は細胞の種類によって異なるため 35），全ての細胞要であるが，pTFAP2E の増殖能の低下は，ストレスにを G1 期に同調させることは難しく，一般的に G1 期の細起因するものでなく，細胞周期の遅延や細胞死が原因で

胞 の 割 合 が 70 ～ 80％ で あ れ ば 実 験 に 使 用 さ れ て いある可能性が示唆された。

る 36,37）。 ま た， チ ミ ジ ン 除 去 後 4 時 間 で pN/C としかし，pN/C と pTFAP2E の細胞周期を比較した結pTFAP2E の S 期の割合が一過性上昇した。同じような果，G1 期，S 期，G2/M 期の比率には大きな変化は認め現象が Hela やヒト肝細胞癌由来株化細胞の Sk-Hep-1 でられず，全細胞中に占める死細胞の割合もほぼ同じでも観察されており 33,37），チミジン除去後，2 〜 3 時間で S

あ っ た。 細 胞 周 期 は DNA 合 成 準 備 期 の G1 期 か ら，期の割合が増加している。しかし，4 時間みられた S 期

DNA 複製期の S 期，そして細胞分裂準備期の G2 から細の急激な増加が Ca9-22 の特性と判断するには，より細か

胞分裂期の M 期に進行し，再度，G1 期へ戻る 28）。このい時間間隔での周期分布の計測が必要と考えられる。
TFAP2E が，Ca9-22 の細胞周期の遅延を誘導する時

一回の周期に費やす時間は，細胞の種類によって大きく，大腸期を詳しく特定するため，ノコダゾール処理によって癌細胞株 HCT116 では 18 時間 32），および子宮頸癌細胞

pN/C と pTFAP2E を M 期の直前に同調させ，周期の進

株 Hela は 11 時間

異なる。例えば，正常線維芽細胞では 52 時間

31）と報告されている。また，図 4 の結行を検討した。その結果，両クローンの間の G1 期，S 期，

果 か ら Ca9-22 の 1 回 の 周 期 が 12 時 間 で あ っ た。

G2/M 期の割合に大きな違いは認められなかった。すな

pTFAP2E では，増殖能が低下していたものの，pN/C

わち，TFAP2E は「M 期の進行」と「M 期から G1 期へのと pTFAP2E の死細胞の割合に違いなかったことから，

移 行 」で は な く，
「G2 期 」ま た は「G2 期 か ら M 期 の は じ

pTFAP2E は細胞周期の進行が遅れている可能性が考えめ」に作用し，その進行を遅延させることが明らかとなっられた。しかし，図 3 に示したような細胞周期が同調した。この時期は，DNA の複製が終了して細胞分裂が開ていない細胞集団を調べる方法では，進行の遅れを検出始する段階であり，DNA の損傷や DNA 複製エラーあるすることが難しいと考え，pN/C と pTFAP2E を一定のいは紡錘体の形成不が認められる 38,39）。細胞分裂時のエ周期に同調させ，時系列的な周期分布の変化について検ラーを防ぐために，細胞には細胞周期チェックポイント

討することにした。

が備わっており，細胞周期の進行を遅延または停止させ

33）

そ こ で， 二 重 チ ミ ジ ン ブ ロ ッ ク に よ っ て，pN/C とることで，エラーを修復し，変異が蓄積するとともに，

pTFAP2E の細胞周期を G1 期の終わりに同調させ，2 時

拡大することを防いでいる。しかし，CDDP によって両間ごとに各周期の割合を検討した。その結果，10，12，

クローンの生存率に違いがなかったことから，pTFAP2

14 時間で pTFAP2E の G1 期の割合が pN/C と比べて低は G2/M 期のチェックポイントに影響を及ぼさず，エく，G2/M 期の割合が多かった。また，8 時間以前の細ラーを起こした細胞は pN/C と同じ割合で死滅するもの

胞周期の進行は pTFAP2E と pN/C の間で大きな違いがと考えられた。

見られなかったことから，pTFAP2E は「G2 期」「G2 期かCyclin B1 は G2 期に多く合成され，CDK1 との複合体

ら M 期」，「M 期の進行」，そして「M 期から G1 期への移を形成することで CDK1 を脱リン酸化し，細胞は G2 期行」のどこかで遅延が生じている可能性が考えられた。

から M 期へ進行する 40,41）。今回，Western blot によっ

TFAP2E と同じように細胞周期の進行に影響を及ぼすて検出できた pTFAP2E の cyclin B1 の発現は pN/C よ癌 抑 制 遺 伝 子 が い く つ か 報 告 さ れ て い る。 例 え ば，りも，2 時間ほど遅れて，10 時間で急激に増加してピー

14-3-3σを悪性黒色腫細胞に過剰発現させると，G2/M 期クに達した。つまり，pTFAP2E は pN/C よりも，G2 期が増加し，増殖能が減少する。また，ヒト子宮頸癌由から M 期への進行が 2 時間ほど遅延していることが示

来株化細胞 Hela の adenosine monophosphate-activated

された。また，両クローンにおける cyclin B1 の発現変

protein kinase α 2 の発現を抑制した場合，S 期から G2/化は二重チミジンブロックとノコダゾール処理によってM 期への進行が遅れる 33）。本実験の結果は，TFAP2E得られた結果，すなわち TFAP2E が「G2 期」または「G2が Ca9-22 の細胞周期の進行を遅延させ，細胞の増殖能期から M 期のはじめ」に影響を及ぼすことを裏付ける一を低下させることを示した最初の報告と言える。

つの根拠となったと考えられる。一方，タンパク発現と34）

チミジンブロックによって pN/C と pTFAP2 の細胞周は異なり，cyclin B1 mRNA の発現レベルに差はなかっ

期を G1 期のはじめに同調させたものの，チミジン除去た。実際に，cyclin B1 は，転写量が同じでもユビキチ

直後（0 時間）の pN/C は S 期 3.2%，G2/M 期 4.9%，ある

ンプロテアソーム系の活性化によってタンパクとして翻60

歯肉癌細胞における TFAP2E の過剰発現効果

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B1 タンパクの翻訳や安定化に TFAP2E がどのように影響しているのか，今後の検討の必要性が考えられた。

結論

OSCC において癌抑制遺伝子として働く TFAP2E の作用メカニズムを明らかにするため，ヒト歯肉癌由来株
化細胞 Ca9-22 に TFAP2E を過剰発現させた結果，以下の結論を得た。
1.

TFAP2E は Ca9-22 の細胞増殖を抑制した。

2.

TFAP2E は Ca9-22 のシスプラチンに対する抵抗性に影響を及ぼさなかった。

3.

TFAP2E は Ca9-22 の「G2 期 」ま た は「G2 期 か ら M
期のはじめ」の進行を遅らせた。
以上のことから，TFAP2E は OSCC の G2/M 期に作用し，細胞増殖を抑制することで，癌の進展を防いでいる可能性が考えられた。
本研究を進めるにあたり，フローサイトメーターを利用させていただきました日本大学医学部研究支援部門に心よりお礼申し上げます。また，終始多大なるご協力とご指導を賜りました本学部
歯科保存学第Ⅲ講座及び解剖学Ⅰ講座の皆様に深く感謝いたします。
本論文に関して，開示すべき利益相反はありません。
文

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