日大歯学 , 96（1）, 19-24, 2022

原著

終末糖化産物と LPS が骨芽細胞の PGE2 産生に及ぼす影響
富田景子

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

応用口腔科学分野

日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座（指導：佐藤秀一 教授，鈴木直人 教授，田邉奈津子 准教授）

要旨：
目的：歯周病は，歯周病原菌の感染と内毒素であるリポ多糖（LPS）が惹起する炎症によって，歯槽骨が吸収される疾患である。終末糖化産物（AGEs）は，生体内では高血糖状態で増加し，糖尿病の発症に関連する。また，糖尿病における AGEs の蓄積は，歯周炎の進行に関与する可能性があることが示唆されている。そこで，本研究では，
LPS と AGEs の共刺激が骨芽細胞における PGE2 産生に及ぼす影響を調べることを目的とした。
方法：マウス頭蓋冠由来株化骨芽細胞株を播種し，LPS（100 ng/mL）と AGEs（100μg/mL）を細胞培養液に添加して，最大 14 日間培養した。AGEs の受容体である RAGE，COX-1 および COX-2 の遺伝子発現は real-time PCR法で，COX-2 のタンパク発現は Western blotting 法で調べた。細胞培養液中の PGE2 量は，ELISA 法で調べた。
結果：骨芽細胞の RAGE と COX-2 の遺伝子発現，COX-2 のタンパク発現および PGE2 産生量は，無刺激またはLPS 単独刺激に比べて LPS と AGEs の共刺激で増加した。COX-1 は LPS と AGEs の共刺激で変化しなかった。
結論：LPS と AGEs は，COX-2 発現と PGE2 産生を増加させることで，歯周病における歯槽骨の破壊に関与する可能性が示唆された。
キーワード：終末糖化産物，リポ多糖，シクロオキシゲナーゼ -2，プロスタグランジン E2Effects of advanced glycation end products and LPS on PGE2 productionin osteoblasts
Keiko Tomita
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Applied Oral Sciences
Department of Periodontology, Nihon University School of Dentistry(Directors : Prof. Shuichi Sato, Prof. Naoto Suzuki, Associate Prof. Natsuko Tanabe)

Abstract: Purpose: Periodontal disease is characterized by alveolar bone resorption with inflammationinduced by periodontal pathogens and their endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). Advanced glycation end
products (AGEs) increase in vivo under hyperglycemic conditions and are associated with the developmentof diabetes. The accumulation of AGEs in diabetes mellitus may be involved in the progression ofperiodontitis. Therefore, this study aimed to investigate the effects of AGEs stimulation on prostaglandin E 2(PGE2), an inflammatory bioactive substance in osteoblasts stimulated by LPS.
Methods: MC3T3-E1 cells, the cell line of osteoblasts derived from the calvarial bone of mice, were seeded
and incubated with LPS (100 ng/mL) and AGEs (100μg/mL) for up to 14 days. The effects of AGEs on themRNA expression of cyclooxygenase (COX)-1, -2, and RAGE, the receptor of AGEs were examined by realtime PCR. The protein expression of COX-2 was examined by Western blotting and the production of PGE 2
was determined by ELISA.
Results: AGEs increased the mRNA expression of RAGE and COX-2, the protein expression of COX-2, andthe production of PGE2 production in LPS-stimulated osteoblasts.
Conclusion: These results suggested that AGEs may induce alveolar bone resorption by increasing PGE2
production via COX-2 in osteoblasts stimulated by LPS.
Keywords: advanced glycation end products, lipopolysaccharide, cyclooxygenase-2, prostaglandin E2（受付：令和 4 年 1 月 11 日）
責任著者連絡先：富田景子
日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8107
FAX：03-3219-8349
E-mail：deke18031@g.nihon-u.ac.jp

19日大歯学緒第 96 巻第 1 号

ヒドを除去したものを AGEs として実験に使用した。

言

2.

細胞培養

終 末 糖 化 産 物（advanced glycation end products：

MC3T3-E1 細胞を 6-well プレートに 2.0×104 cells/cm2

AGEs）は，タンパクと還元糖（グルコースなど）が結合すの 密 度 で 播 種 し，10％ ウ シ 胎 児 血 清（FBS；Hyclone，1）

るメイラード反応によって非酵素的に生成される 。

Logan，UT，USA），1％ペニシリン / ストレプトマイシ

AGEs は，生体内では高血糖状態で増加し，糖尿病とそン / アンホテリシン B（富士フィルム和光純薬）を添加しの合併症の発症に関連すると報告されている 2,3）。AGEs

た α modified Eagle’s medium（富士フィルム和光純薬）

は生体内に蓄積することが知られており 2），歯肉組織中を細胞培養液として用い，37 ℃，5％ CO2 存在下で 24 時の AGEs は，健常者と比較して糖尿病患者で多いことが間培養した。細胞の生着を確認した後，100 ng/mL LPS

示 さ れ て い る 4）。 こ れ ら の 知 見 か ら， 糖 尿 病 に お け る（Escherichia. coli 由来，Sigma-Aldrich）および 100μg/AGEs の蓄積は，糖尿病患者における歯周炎の進行に関mL AGEs を添加して 3，7 および 14 日間培養した。なお，与する可能性が考えられる。

細胞培養液の交換は 3 日ごとに行った。
3.

歯周組織の炎症は歯周病原菌によって惹起される。歯Real-time polymerase chain reaction（real-time PCR）

周病原菌内毒素の１つであるリポ多糖（LPS）
は，歯周組織細胞から RNeasy Mini Ki（t QIAGEN，Venlo，における炎症性サイトカイン産生を誘導し，歯槽骨吸収をNetherlands）を 用 い て 全 RNA を 抽 出 し， 分 光 光 度 計

促進する 5）。また，歯周組織の破壊は，prostaglandin E2

NanoDrop 1000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，（PGE2）によっても進行する 6,7）。PGE2 は，cyclooxygenase

MA，USA）で RNA 濃度を測定した。Complementary（COX）によって，アラキドン酸から産生されるケミカルDNA（cDNA）は，500 ng/mL の RNA から Prime Script

メディエーターの 1 つであり 8），COX のアイソザイムでRT Master Mix（タカラバイオ，草津）を用いて逆転写反ある COX-2 は炎症時に増加する 。一方，COX-1 の発応させ作成し，インターカレーター法による real-time

現は恒常的に認められ，血圧の調整や胃粘膜保護などのPCR を行った 13）。すなわち，表 1 に示すプライマーを含作用に関与している。歯周炎患者では歯肉組織の COX-2

む TB Green Premix EX Taq Ⅱ（タカラバイオ）溶液

8）の 発 現 と PGE2 産 生 が 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い

23μL に cDNA 溶液 2μL を加え，Thermal Cycler Dice

る 6,7）。また，ラットの歯周炎モデルでは，COX-2 を阻Real-Time System（タカラバイオ）を用いて反応させた。

害すると歯槽骨吸収が抑制されることが明らかにされて反応は，95 ℃で 5 秒間および 60 ℃で 30 秒からなるサイいる 9,10）。

クルを 35 回繰り返した。PCR 産物の特異性は，融 解 曲

これまでに，AGEs あるいは AGEs と LPS の共刺激に線分析を Thermal Cycler Dice Real-Time

よって骨芽細胞の石灰化物形成能が抑制されることが先System に付属するソフトウェアで分析・確認した。遺行研究で示されている 11）。しかし，AGEs と LPS の刺激伝子の増幅量をΔΔC T 法で求め，ハウスキーピング遺伝が骨芽細胞のケミカルメディエーター産生に及ぼす影響子であるβ-actin の増幅量で補正した。に つ い て は， 不 明 な 点 が 多 い。 そ こ で， 本 研 究 で は，4.

LPS と AGEs の共刺激が骨芽細胞における PGE2 産生にと Western blotting

SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）

及ぼす影響を調べることを目的とし，マウス骨芽細胞様培養 14 日目の細胞を回収後，超音波で破砕して得ら細胞（MC3T3-E1 細胞）を AGEs と LPS を加えた細胞培れた細胞溶解液の総タンパク量 20-40μg 相当量を SDS-養 液 で 培 養 し，AGEs の 受 容 体 で あ る receptor ofPAGE の試料とした。10％ポリアクリルアミドゲル（Bio-advanced glycation end products（RAGE）と COX-1 おRad Laboratories，Hercules，CA，USA）で電気泳動後，よび COX-2 の発現，ならびに PGE2 産生量を調べた。

ゲル上のタンパクを PVDF 膜（Bio-Rad Laboratories）に転写した 14）。Western blotting では，1 次抗体として抗材料および方法
1.

C O X - 2 ウ サ ギ 抗 体（ C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y ，AGEs の作製

表1

AGEs の作製は先行研究に準じて行った 12）。50 mg/mL ウシ血清アルブミン（富士フィルム和光純薬，大阪），
0.1 M DL- グ リ セ ル ア ル デ ヒ ド（Sigma-Aldrich，St.
Louis，MO，USA），および 5 mM ジエチレントリアミ
ンペンタメトリック酸（ナカライテスク，京都）を含む
0.2 M リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水（pH7.4）を 濾 過 滅 菌 後，
37 ℃で 7 日間振盪した。PD-10 カラム（GE Healthcare，Chicago，IL，USA）を用いて，低分子量反応物とアルデ20

プライマーの配列

AGEs は骨芽細胞の COX-2 発現と PGE2 産生を増加させる

令和 4 年 6 月

Danvers，MA，USA：希釈倍率 1：1000）または抗β-actinに示す。RAGE の遺伝子発現は，刺激の有無にかかわらマウス抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，ず，すべての培養日数で認められた。また，培養 3 日目

CA，USA：希釈倍率 1：500），2 次抗体としてそれぞれ

で は，control と 比 較 し て LPS と AGEs の 共 刺 激 でビ オ チ ン 標 識 の ウ サ ギ ま た は マ ウ ス 抗 体（ThermoRAGE の遺伝子発現は有意に増加した。

Fisher Scientific：希釈倍率 1：5000）を用いた。さらに，

COX-1 と COX-2 の遺伝子発現をそれぞれ図 2 と図 3

ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン 溶 液（Seraに示す。COX-1 と COX-2 の遺伝子発現は，刺激の有無

Care Life Sciences，Milford，MA，USA）を加えた後，にかかわらず，すべての培養日数で認められた。COX-1

ECL prime reagents（GE Healthcare）で発光反応を行の遺伝子発現に LPS と AGEs の影響は認められなかっい，Chemidoc XRS（Bio-Rad Laboratories）で PVDF 膜

た 一 方 で， 培 養 14 日 目 の COX-2 の 遺 伝 子 発 現 は，を撮影した。バンドで示される発現の強さは Image J ソ

control と LPS 単独刺激に比べて LPS と AGEs の共刺激

フトウェアで数値化した。なお，COX-2 のタンパク発現で有意に増加した。

量は，β-actin のタンパク発現量で補正した。

2.

5.

LPS と AGEs が COX-2 のタンパク発現に及ぼす影響
培養 14 日目の COX-2 のタンパク発現を図 4 に示す。

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）

COX-2 のタンパク発現は，control と LPS 単独刺激に比培養 14 日目（COX-2）に FBS を含まない細胞培養液にべて LPS と AGEs の共刺激で有意に増加した。

交換し 24 時間培養後，培養上清を回収した。PGE2 産生量は，ELISA kit（Cayman CHEMICAL，Ann Arbor，MI，USA）を用いて定量した。
6.

統計学的分析
統計処理は，結果の正規性を Shapiro-Wilk の正規性検定，等分散を Bartlett 検定で確認した後，一元配置分散分析後 Tukey の多重比較を行い，危険率 5％未満を統計学的有意差とした。箱ひげ図は上から最大値，第 3 四分位，第 2 四分位，第 1 四分位および最小値を示す。これら の 統 計 学 的 分 析 に は EZR ソ フ ト ウ ェ ア（EZR 1.23：
Jichi Medical University Saitama Medical Center）を用いた 15）。

成1.

績LPS と AGEs が RAGE，COX-1 および COX-2 の遺伝子発現に及ぼす影響

図2

MC3T3-E1 細胞の COX-1 発現に対する AGEs の影響
培 養 3, 7 お よ び 14 日 目 の COX-1 の 遺 伝 子 発 現 レ ベ ル をreal-time PCR 法で調べた（n＝5）。

図3

MC3T3-E1 細胞の COX-2 発現に対する AGEs の影響
培 養 3, 7 お よ び 14 日 目 の COX-2 の 遺 伝 子 発 現 レ ベ ル をreal-time PCR 法で調べた。
＊P ＜ 0.05, one-way ANOVA followed by Tukey's multiple
comparison test,（n＝5）.

培養 3，7 および 14 日目の RAGE の遺伝子発現を図 1

図1

MC3T3-E1 細胞の RAGE 発現に対する AGEs の影響
培 養 3, 7 お よ び 14 日 目 の RAGE の 遺 伝 子 発 現 レ ベ ル をreal-time PCR 法で調べた。
＊P ＜ 0.05, one-way ANOVA followed by Tukey's multiplecomparison test,（n＝5）.

21日大歯学3.

第 96 巻第 1 号て細胞内に伝達される 17）。過去の報告では，歯周病患者

LPS と AGEs が PGE2 産生に及ぼす影響
培養 14 日目の PGE2 産生量を図 5 に示す。培養液中のの歯肉に RAGE の発現が認められ，糖尿病を有する歯周PGE2 は，control と LPS 単独刺激に比べて LPS と AGEs

病患者では RAGE の発現が高いことが明らかにされていの共刺激で有意に増加した。

る 18,19）。また，糖尿病モデルマウスに歯周病原菌である

考Porphyromonas gingivalis を 感 染 さ せ た 研 究 で は，察RAGE の阻害剤によって歯槽骨吸収の抑制が認められて本研究では，糖尿病患者で歯周病が増悪する要因としいる 20）。さらに，グラム陰性菌体内毒素の LPS が骨芽て，AGEs と骨芽細胞に着目した。AGEs が骨芽細胞に細 胞 や 線 維 芽 細 胞 に お け る PGE2 の 産 生 を 誘 導 す る こ

及ぼす影響については，これまでに主に骨芽細胞の分化と 21-23）から，本研究では，まず，LPS と AGEs の刺激が，と 骨 形 成 能 に つ い て 調 べ ら れ て お り， 酒 井

MC3T3-E1 細胞の RAGE と COX の発現に及ぼす影響をは，

11）調べた。

MC3T3-E1 細胞を AGEs で刺激すると，骨芽細胞の分化関連因子である Runx2 と Osterix の発現が減少するととそ の 結 果，MC3T3-E1 細 胞 は RAGE，COX-1 お よ び

もに，骨基質タンパクである osteocalcin 産生と alkaline

COX-2 の 遺 伝 子 を 発 現 し，LPS と AGEs の 共 刺 激 でphosphatase 活性も AGEs によって低下し，石灰化物形RAGE の発現は増加した。また，LPS と AGEs 刺激の影

成 が 抑 制 さ れ る こ と を 明 ら か に し て い る。 ま た，

響 は， 恒 常 的 に 発 現 す る COX-1 と 炎 症 時 に 増 加 す る

Sakamoto らは，ラットの骨髄細胞を AGEs と LPS でCOX-2 の発現で異なっていた。すなわち，COX-1 の遺共刺激すると，それぞれの単独刺激に比べて石灰化物形

伝 子 発 現 に LPS と AGEs に よ る 刺 激 の 影 響 を 認 め ず，成 が 減 少 す る 一 方 で， 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る

COX-2 の 遺 伝 子 発 現 も LPS の 単 独 刺 激 で は 変 化 し なinterleukin-1βの遺伝子発現が増加すると報告している。

かったが，LPS と AGEs の共刺激で増加した。そこで，

16）

しかし，これら骨芽細胞を用いた先行研究では，骨代謝細胞培養液中の PGE2 量を調べた結果，未刺激と LPS 単や炎症に関係するケミカルメディエーターである PGE2独刺激に比べて LPS と AGEs の共刺激で PGE2 の増加がについては報告されていない。

認められた。本研究では，LPS が骨芽細胞の COX-2 発
現と PGE2 産生に及ぼす影響を調べた先行研究 24）と同様

AGEs の刺激は，細胞表面に存在する RAGE と結合しに E. coli 由来の LPS で細胞を刺激したが，その濃度は先行研究の 10μg/mL よりも低い 100 ng/mL とした。この先行研究 24）の知見と本研究結果から，COX-2 発現に影響しない低濃度の LPS も AGEs の存在下ではその発現

図4

MC3T3-E1 細胞の COX-2 のタンパク発現に対する AGEs の影響
培 養 14 日 目 の COX-2 の タ ン パ ク 発 現 レ ベ ル を WesternBlotting 法で調べた。
＊＊
P ＜ 0.01, ＊＊＊ P ＜ 0.001, one-way ANOVA followed by
Tukey's multiple comparison test,（n＝5）.

図522

MC3T3-E1 細胞の PGE2 産生量に対する AGEs の影響
培養 14 日目の PGE2 産生量を ELISA 法で調べた。
＊＊
P ＜ 0.01, ＊＊＊ P ＜ 0.001, one-way ANOVA followed by
Tukey's multiple comparison test,（n＝5）.

AGEs は骨芽細胞の COX-2 発現と PGE2 産生を増加させる

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PGE2 の刺激を受けた骨芽細胞や歯根膜細胞では，破骨細胞分化促進因子である receptor activator of
NF-kappa B ligand（RANKL）の産生が増加することから 26,27），PGE2 は，これらの細胞を介して破骨細胞性骨吸収を促進すると考えられている。また，健常者と比較して歯周病罹患者の歯肉溝滲出液中では，RANKL のおとり受容体である osteoprotegerin に対して RANKL の相対比が高く，プロービングポケットの深さやクリニカルアタッチメントレベルと正の相関が認められている 28）。
これらの知見と本研究の結果から，糖尿病患者で歯周病が悪化する一因に，AGEs による LPS 誘導性の PGE2 産生促進が関与する可能性が示唆された。

結論

本 研 究 で は，AGEs と LPS を 加 え た 細 胞 培 養 液 でMC3T3-E1 細胞を刺激し，RAGE，COX-1 および COX-2発現，ならびに PGE2 産生に及ぼす影響を検討した。その結果，以下の結論が得られた。
1.

AGEs と LPS に よ る 共 刺 激 で，MC3T3-E1 細 胞 のRAGE の発現が増加した。

2.

AGEs と LPS は，MC3T3-E1 細胞の COX-1 の遺伝子発現に影響を及ぼさなかった。

3.

COX-2 発 現 と PGE2 産 生 は AGEs と LPS の 共 刺 激で増加した。
以上の結論から，LPS と AGEs は，骨芽細胞の COX-2

発現と PGE2 産生を増加させることで，歯周病における歯槽骨の破壊に関与する可能性が示唆された。
稿を終えるにあたり，本研究遂行に，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本大学歯学部保存学教室歯周病学講座の佐藤秀一教授，生化学講座の鈴木直人教授に謹んで心より感謝申し上げます。
また，本研究を通じ多大なるご協力とご助言を賜りました本学部
生化学講座の田邉奈津子准教授，歯周病学講座の間中総一郎助教を始め，歯周病学講座および生化学講座の皆様に深く感謝致します。
本論文に関して，開示すべき利益相反はありません。
文令和 4 年 6 月

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