日大歯学 , 95（1）, 53-59, 2021

原著

終末糖化産物は骨芽細胞の骨形成を低下させ，ERK1/2 のリン酸化を抑制する
酒

井

真

悠

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 口腔健康科学分野（指導：植田耕一郎 教授，鈴木直人 教授，田邉奈津子 准教授，阿部仁子 准教授）

要旨【目的】 過剰な糖とタンパクのメイラード反応によって，終末糖化産物（AGEs）は生成される。AGEs は生体内でも生成され，糖尿病などの高血糖状態でも増加する。また，生体内に蓄積する AGEs は骨の脆弱性に影響を及ぼすことが示されているが，骨芽細胞の石灰化に及ぼす影響についてのメカニズムは不明である。そこで本研究は，AGEs が骨芽細胞の骨形成に及ぼす影響を細胞生物学的に検討することを目的とした。
【方法】 AGEs が，骨芽細胞の runt-related transcription factor 2（Runx2）および osterix，type I collagen（ColI），osteocalcin（OCN）の遺伝子，タンパク発現に及ぼす影響を調べ，また，alkaline phosphatase（ALP）活性およびカルシウム量ついても検討した。さらに，AGEs が，細胞内シグナル伝達因子 extracellular signal-regulated
kinase 1/2（ERK1/2）のリン酸化に及ぼす影響を調べた。
【結果】 AGEs は，Runx2 および osterix，Col Ⅰ，OCN の発現，ALP の活性およびカルシウム量を減少させた。
さらに，AGEs は ERK1/2 のリン酸化を抑制した。
【結論】 AGEs は in vitro において骨芽細胞の分化および石灰化を抑制することが示唆された 。
キーワード：終末糖化産物，骨形成，ERK1/2

Advanced glycation end products depress osteogenesis and inhibit
ERK1/2 phosphorylation in osteoblasts
Mayu Sakai
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Oral Health Sciences（Directors：Prof. Koichiro Ueda，Prof. Naoto Suzuki，Associate Prof. Natsuko Tanabe，Associate Prof. Kimiko Abe）

Abstract:[Purpose] Advanced glycation end products (AGEs), generated by excess sugars and proteins via Maillard
reaction, are obtained from the intake of processed food. AGEs are often increased in hyperglycemic
disorders such as diabetes and possibly associated with bone fragility. However, the role of AGEs inosteogenesis is yet to be understood. This study aimed at examining effects of AGEs on osteogenesis inosteoblasts.
[Methods] Mouse osteoblastic cell line MC3T3-E1 cells treated with AGEs, were cultured for up to 21
days. The effect of AGEs on the mRNA and protein levels of osteoblast differentiation-related transcription
factors, extracellular matrix proteins (ECMPs), extracellular signal-regulated kinases (ERK) 1/2
phosphorylation and alkaline phosphatase (ALP) activity in MC3T3-E1 cells, and calcium content in theextracellular matrix were examined.
[Results] AGEs decreased the mRNA and protein levels of these transcription factors and ECMPs related
to bone formation. AGEs also inhibited ERK1/2 phosphorylation and ALP activity in MC3T3-E1 cells, andthe extracellular matrix calcification.
[Conclusions] These results suggest that AGEs suppress osteogenesis in osteoblast through the inhibition
of ERK1/2 phosphorylation.
Keywords: AGEs, osteogenesis, ERK1/2（受付：令和 3 年 2 月 2 日）
責任著者連絡先：酒井真悠
日本大学大学院歯学研究科摂食機能療法学講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8197
FAX：03-3219-8203
E-mail：sakai.mayu2@nihon-u.ac.jp

53

日大歯学

緒

第 95 巻第 1 号

し て 作 用 し て い る か を 確 認 す る た め に extracellular言signal-regulated kinase 1/2（ERK1/2）のリン酸化に及ぼす影響を調べた。

終 末 糖 化 産 物（advanced glycation end products:
AGEs）は，タンパクと還元糖の非酵素的反応であるメイ

材料および方法

ラード反応によって生成される 1）。生体内で AGEs は，糖尿病などの高血糖状態で生成され，高濃度 AGEs は，

1.

細胞培養

糖尿病性合併症の発症に関連していることが報告されてMC3T3-E1 細 胞 を 96 ま た は 6-well プ レ ー ト に 2.0×

いる 2,3）。また，AGEs は，生体の全ての組織および体液

104 cells/cm2 の密度で播種し，10% ウシ胎児血清（FBS；

で生成され，生体内に蓄積する 2）。生体内での AGEs のHyclone，Logman），1% ペニシリン / ストレプトマイ

メイラード反応は，生体外で生じるメイラード反応より

シン / アンホテリシン B（富士フィルム和光純薬）を添加も低い温度で進む 。加えて，生体内での AGEs の蓄積した alpha modified Eagle’s medium（α -MEM；富士フィは，インスリン抵抗性上昇に起因する糖尿病の増加に関

ルム和光純薬）を培地として用い，37℃，5%CO2 存在下連していると報告されている 3）。また，高度な糖化は数で 24 時間培養し，細胞の生着を確認した。なお，培地週間にわたって起こり，生成された AGEs はコラーゲンの交換は 3 日ごとに行った。

の生合成に影響を及ぼすと考えられている 1,4,5）。AGEs

2.

2）

AGEs の作製の一つであるペントシジン（PEN）とカルボキシメチルリ

AGEs の作製は先行研究に準じて行った 19）。10 g ウシ

ジンが有するリジンおよびアルギニン残基は，それぞれ

血清アルブミン（50 mg/mL，BSA；富士フイルム和光純

酵素的および非酵素的にコラーゲン線維に架橋すること薬 ）と 1.8 g DL- グ リ セ ル ア ル デ ヒ ド（0.1 M，Sigma-が報告されている 6）。PEN などの AGEs が増加すると，

Aldrich）に，0.4 g ジエチレントリアミンペンタメトリッ

骨 の 強 度 が 低 下 す る こ と が ex vivo で 報 告 さ れ て いク酸（5 mM，DTPA；ナカライテスク）を含む 200 mL リ

る 7-10）。また，血清および尿中の PEN 濃度の増加は，1

ン酸緩衝生理食塩水（0.2 M，PBS：pH7.4）を加え，滅菌型糖尿病（T1D）および 2 型糖尿病（T2D）患者の骨折リス

条件下，37℃，回転数 250 rpm に設定して 7 日間インキュクの増加と関連していることが横断的および前向きコ

ベーターシェーカー（Marshal Scientific）で振盪させて作

ホート研究から報告されている 11-13）。これらの知見から，製 し た。 次 に，PD-10 カ ラ ム（GE Healthcare Bio-

糖尿病における AGEs の蓄積は，骨の脆弱性に影響を与sciences AB）を用いて，低分子量反応物とアルデヒドをえることが示唆されている。

除去した。
3.

骨リモデリングは，骨芽細胞による骨形成と破骨細胞

細胞増殖による骨吸収が動的平衡を保つことで維持されている。

AGEs を 0，50，100 および 200μg/mL となるように骨芽細胞は，細胞分化を促進させる様々な転写因子や石調整した細胞培養培地で 1，3，5，7，10 および 14 日間

灰化物形成に関与する細胞外マトリックスタンパク

培養し，細胞数を計測した。細胞数を cell-counting kit-8（extracellular matrix proteins: ECMPs）を産生するこ（同仁化学）を用いて計測した。

とで骨形成を調節している。runt-related transcription

4.

factor 2（Runx2）とその下流の osterix は，骨芽細胞の分PCR）Real-time polymerase chain reaction（real-time

化に必須な master regulator である 14）。また，type I

MC3T3-E1 細 胞 を 100μg/mL の AGEs で 刺 激 し，collagen（Col I）と osteocalcin（OCN）は，骨芽細胞の分real-time PCR のサンプルとして 3，7 および 14 日目に化に関連する重要な ECMPs である。T1D と T2D では，

細 胞 を 回 収 し た。AGEs 非 存 在 下 の MC3T3-E1 細 胞

骨代謝マーカーの発現が抑制されている 15）。糖尿病に関（0μg/mL AGEs）は，コントロール群として使用した。

連した AGEs の蓄積が骨の脆弱性と骨リモデリングに影細胞から RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて全 RNA

響を与えていることは in vivo や ex vivo および臨床的研を抽出し，分光光度計 NanoDrop 1000（Thermo Fisher

究から明らかにされている。 し か し，AGEs がScientific,）で RNA 濃度を測定した。Prime Script RT

in vitro において骨芽細胞の骨形成に及ぼすメカニズム

Master Mix（タカラバイオ）を用いて 500 ng/mL の RNAの詳細は不明な点が多い。そこで，本研究は，AGEs が，か ら complementary DNA（cDNA）を 作 成 し，SYBR

骨芽細胞の石灰化およびシグナル伝達経路に及ぼす影響

Green （I タ カ ラ バ イ オ ）に よ る real-time PCR を 行 っを検討した。具体的には，MC3T3-E1 細胞を AGEs で刺た 20）。すなわち，cDNA 溶液 2μL と表 1 に示すプライ

激し，骨芽細胞分化に関与する転写因子および ECMPs

マ ー を 含 む SYBR Premix Taq（ タ カ ラ バ イ オ ）溶 液の 遺 伝 子 お よ び タ ン パ ク 発 現，alkaline phosphatase

23μL で，Thermal Cycler Dice Real-Time System（タ（ALP）活性および細胞外マトリックス（ECM）のカルシ

カラバイオ）を用いて PCR 反応を行った。反応は，95℃

ウム量を調べた。加えて AGEs が骨芽細胞へリガンドとで 5 秒間および 60℃で 30 秒からなるサイクルを 35 回繰

7,16-18）54

骨芽細胞の骨形成に対する AGEs の影響り返した。PCR 産物の特異性は融解曲線分析を Thermal

6.

Cycler Dice Real-Time System のソフトウェアで行っ

ALP 染色令和 3 年 6 月

細胞外マトリックス（ECM）のカルシウム量およびた。その結果から 2ΔΔ Ct 法で遺伝子の増幅量を求め，

MC3T3-E1 細胞を 100μg/mL AGEs，50μg/mL アス

ハウスキーピング遺伝子であるβ-actin の増幅量で補正

コルビン酸，5 mM β- グリセロリン酸および 1×10 -8 Mした値を遺伝子発現量とした。

デキサメタゾンとともに 21 日間培養した 22）。その後，

5.

300μL の 0.5 M HCl を各 well に添加し，ECM を脱灰しSDS- ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動（SDS-

PAGE）および Western blottingてカルシウムを溶出させた。カルシウム量は，カルシウ

MC3T3-E1 細胞を 100μg/mL の AGEs で刺激し，培ム E テストキット（富士フイルム和光純薬）を使用して測

養 3 日目（Runx2，I 型プロコラーゲン：pro Col I および定した 23）。ALP 染色は，細胞を 10% パラホルムアルデ

Ⅰ型コラーゲン分子：mature Col Ⅰ；m Col Ⅰ），7 日

ヒ ド 溶 液（ 富 士 フ イ ル ム 和 光 純 薬 ）で 20 分 間 固 定 し，目（osterix）および 14 日目（OCN）に細胞を回収した。さALP 染色液（NBT/BCIP ready-to-use tables；Roche

らに，MC3T3-E1 細胞を 100μg/mL の AGEs で 5 分間

Diagnostics GmbH）を 30 分間反応させた 24）。

刺激し，ERK1/2 および phospho-ERK1/2（p-ERK1/2）の

7.

統計学的分析

タンパク発現を調べるために細胞を回収した。総タンパ

統計処理は，結果の正規性は Shapiro-Wilk の正規性検

ク量 40-80μg 相当を含む細胞培養液を SDS-PAGE の試定，等分散は F 検定または Bartlett 検定で確認した後，料とした。SDS-PAGE は 10% ポリアクリルアミドゲル

二元配置分散分析後 Tukey の多重比較，またはノンパ（Bio-Rad Laboratories）を用いて行い，電気泳動後，ゲ

ラメトリック検定として Wilcoxon signed-rank test 検定

ル上のタンパクを PVDF 膜（Bio-Rad Laboratories）に転を行い，危険率 5% 未満を統計学的有意差とした。なお，

写した 21）。

棒グラフの図中のバーは標準偏差，箱ひげ図は上から最Western blotting においては，1 次抗体として抗 ERK1/2 抗体

大値，第 3 四分位，第 2 四分位，第 1 四分位および最小（Cell Signaling Technology），抗 p-ERK1/2 抗体（Cell Signaling

値を示す。これらの統計学的分析は EZR ソフトウェア

Technology），抗 Runx2 抗体（Santa Cruz Biotechnology），（EZR 1.23：自治医科大学附属さいたま医療センター）を

抗 osterix 抗体（Santa Cruz Biotechnology），抗 Col I

用いた 25）。

抗体（Santa Cruz Biotechnology），抗 OCN 抗体（Santa結

Cruz Biotechnology）および抗β-actin 抗体（Santa Cruz
Biotechnology），また 2 次抗体としてビオチン標識の抗1.

果AGEs が MC3T3-E1 細胞の細胞増殖に及ぼす影響

ウサギ IgG 抗体（Santa Cruz Biotechnology）または抗マ200μg/mL AGEs 刺激群では，コントロール群と比較

ウス IgG 抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いた。さして，培養 5，7 および 10 日目において細胞数の有意ならに，ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液を減少が認められた（図 1）。そこで，細胞数に影響を及ぼ加えた後 ECL prime reagents（GE Healthcare）で発光さなかった 100μg/mL AGEs を以後用いた。

反応を行い，Chemidoc XRS（Bio-Rad Laboratories）でPVDF 膜を撮影し，それぞれのタンパク発現を調べた。
バンドで示される発現の強さは Image J ソフトウェア（National Institutes of Health）で数値化し，β-actin 量で補正した値をタンパク定量に使用した。

表1

プライマーの配列

図1

55

MC3T3-E1 細胞の細胞増殖に対する AGEs の影響
培 養 1，3，5，7，10 お よ び 14 日 目 の 細 胞 数。*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01，two-way ANOVA with Tukey's multiple
comparison test，AGEs vs. untreated control，n=6

日大歯学

第 95 巻第 1 号

2． AGEs が MC3T3-E1 細胞の骨芽細胞分化促進関連転目で AGEs 刺激は，OCN の遺伝子発現を有意に減少さ

写因子と ECMPs に及ぼす影響せた（図 2 F）。また，AGEs 刺激は培養 14 日目に OCN

AGEs 刺激は，培養 3 日目の Runx2，培養 7 および 14の タ ン パ ク 発 現 を 有 意 に 減 少 さ せ た（ 図 2 I）。 一 方，

日 目 の osterix の 遺 伝 子 発 現 を 有 意 に 減 少 さ せ た

Col Ⅰの遺伝子発現には，AGEs 刺激の影響は認められ（ 図 2 A，B）。 ま た，AGEs 刺 激 は， 培 養 3 日 目 のなかった（図 2 E）。しかし，AGEs 刺激は，培養 3 日目にRunx2 および培養 7 日目の osterix のタンパク発現を有m Col Ⅰタンパク発現を有意に減少させたが，pro Col Ⅰ

意に減少させた（図 2 C，D）。培養の 3，7 および 14 日には影響を及ぼさなかった（図 2 G，H）。

図2

MC3T3-E1 細胞の骨芽細胞分化促進関連転写因子と ECMPs 発現に対する AGEs の影響
Runx2（A），osterix（B），Col I（E）お よ び OCN（F）の 遺 伝 子 発 現。*P ＜ 0.05，
Wilcoxon signed-rank test，AGEs vs. untreated control，n=6Runx2（C），osterix（D），pro Col （G）
I，m Col Ⅰ（H）および OCN（I）のタンパク発現。
*P ＜ 0.05，Wilcoxon signed-rank test，AGEs vs. untreated control，n=356

骨芽細胞の骨形成に対する AGEs の影響

令和 3 年 6 月

3． AGEs が ECM のカルシウム量および ALP 染色に及そこで本研究は，AGEs が ECM における石灰化およびぼす影響

骨芽細胞のシグナル伝達経路に及ぼす影響を調べた。

コントロール群における ECM のカルシウム量は，培Runx2 は未分化間葉細胞から骨芽細胞への分化誘導す

養日数依存的に増加したが，AGEs 刺激群では，培養 14

る master regulator で，発現を抑制させると骨芽細胞のおよび 21 日目で有意に減少した（図 3 A）。また，AGEs

分化は抑制する 16）。Runx2 ヘテロ欠損マウスでは，鎖骨刺激群では，全ての培養日数でコントロール群と比較し頭蓋異形成症と呼ばれる骨格異形成症が発生し，これはて ALP 染色性が低下していた（図 3 B）。

骨 芽 細 胞 の 分 化 の 遅 延 が 起 因 と な っ て い る。 さ ら に，

4． AGEs が MC3T3-E1 細 胞 の ERK1/2 の リ ン 酸 化 に

Runx2 ホモ欠損マウスは出生直後に死亡し，骨芽細胞が及ぼす影響

未成熟であるため骨形成が全く認められないことから，

AGEs 刺激 5 分後でコントロール群と比較し，ERK1/2

Runx2 のホモ欠損が膜内骨化プロセスと軟骨内骨化プロのリン酸化が低下した（図 4）。

考セスの両方を完全にブロックすることを示唆している 29）。osterix は，Runx2 の下流に存在する転写因子で，察

Runx2 と同様に骨芽細胞の分化を調節している。本研究

糖尿病では，骨粗鬆症および骨折のリスクが高いこと

では，AGEs が Runx2 と osterix の発現を抑制することがこれまでの研究で報告されている。T1D は T2D と比が示された。この結果から，AGEs が Runx2 と osterix

較して骨密度が低く，股関節骨折のリスクが高い。一方で，発現を減少させることで骨芽細胞の分化を抑制している

T2D は，骨密度が正常であるにもかかわらず，股関節骨可能性が示唆された。次に ECMPs の遺伝子発現とタン折のリスクは上昇することが示されており，糖尿病と骨パク発現に対する AGEs の影響を検討した。
Col I の 重 合 体 で あ る コ ラ ー ゲ ン 線 維 は， 主 要 なの脆弱性についての詳細は，十分には解明されていな。なかでも，骨の脆弱性を引き起こす要因の 1 つ

ECMPs であり，骨の無機成分の主体であるヒドロキシと考えられている AGEs は，糖尿病に起因する高血糖状アパタイト（HA）の結晶核形成のための足場として機能

態によって生体内で生成される。しかし，AGEs が骨している 30）。コラーゲン分子形成過程で Col I の 3 本の芽細胞の骨形成に及ぼす影響については不明な点が多い。

α 鎖ポリペプチドは細胞内で三重らせん構造となるプロ

い26,27）

図3

28）

MC3T3-E1 細胞の ECM のカルシウム量および ALP 染色に対する AGEs の影響
AGEs 存在（100μg/mL）または非存在下で ECM のカルシウ
ム 量（A）お よ び ALP 染 色 像（B）を 図 で 示 す。*P ＜ 0.05，
Wilcoxon signed-rank test，AGEs vs. untreated control，
n=6

図4

57

MC3T3-E1 細胞の ERK1/2 およびリン酸化 ERK1/2 のリン酸化に対する AGEs の影響
リ ン 酸 化 ERK1/2 の タ ン パ ク 発 現。*P ＜ 0.05，Wilcoxon
signed-rank test，AGEs vs. untreated control，n=3

日大歯学

第 95 巻第 1 号

3.

AGEs は，OCN の遺伝子発現およびタンパク発現をコラーゲンとなり，細胞外に分泌された後，N 末および減少させた。

C 末 ポ リ ペ プ チ ド が 切 断 さ れ， コ ラ ー ゲ ン 分 子 と な。本研究では，AGEs は Col Ⅰの遺伝子発現に影響

4.

AGEs は，ALP 活性を低下させた。

を及ぼさなかった。一方，AGEs は m Col Ⅰ発現を抑制

5.

AGEs は，ECM のカルシウム沈着量を減少させた。

したが，pro Col Ⅰ発現には影響を及ぼさなかった。こ

6.

る

31）

AGEs は，ERK1/2 のリン酸化を抑制した。

れらの結果は，AGEs が，コラーゲン分子からコラーゲ

以上の結果から，AGEs が骨芽細胞の分化を抑制する

ン線維を形成するプロセスに影響を及ぼす可能性を示し

ことで石灰化に対しても抑制的に作用することが示唆さ

ている。

れた。

OCN は，骨に含まれる非コラーゲン性タンパクの約15% を占め，γ-カルボキシグルタミン酸残基を持つ低分

稿を終えるに，本研究遂行にあたり，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本大学歯学部摂食機能療法学講座の植田耕一郎教授，生化学講座教授の鈴木直人教授に謹んで心より感謝申し上げます。
また，本研究を通じ多大なるご協力とご助言を賜りました本学
部生化学講座の田邉奈津子准教授，摂食機能療法学講座の阿部仁子准教授を始め，摂食機能療法学講座および生化学講座の皆様に深く感謝致します。
本論文に関して，開示すべき利益相反はない。

子量のタンパクである。OCN は石灰化開始後の骨芽細胞分化後期に発現し，石灰化を抑制する 32）。本研究では，AGEs によって骨芽細胞分化が抑制されることにより石灰化が開始しないため，骨芽細胞での OCN 発現が生じないと考えられた。
石灰化は，骨芽細胞由来の細胞膜近くの基質小胞内でHA 結晶の核が形成されることで開始する。HA 結晶は基質小胞を破って成長し，やがて HA の沈着が生じる。

文 献

また，ピロリン酸は，HA 結晶の成長を阻害する 33）。骨芽細胞の高い ALP 活性は，石灰化に必要な局所におけ

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るリン酸濃度の上昇と，ピロリン酸の分解を介して骨芽細 胞 の 石 灰 化 を 上 昇 さ せ る と 報 告 さ れ て い る 33）。
Gerstenfeld ら 34）は，石灰化開始時期に高い ALP 活性を維持することは，骨芽細胞性の石灰化において重要であること示している。本研究では，AGEs は ALP 活性を減少させ，ECM のカルシウム量を抑制した。これらの結果は，AGEs が in vitro において骨芽細胞性の石灰化を抑制することを示唆するものである。
E R K1/2 は，m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e（MAPK）スーパーファミリーの 1 つで，骨芽細胞の分化に関連する ECMPs，fibroblast growth factors およびbone morphogenetic protein などが関与するさまざまな分子によってリン酸化される 35,36）。本研究では，AGEs
が 骨 芽 細 胞 に ligand と し て の 作 用 を 確 認 す る た め に，AGEs が ERK1/2 のリン酸化に及ぼす影響を調べた。その結果，AGEs は ERK1/2 のリン酸化を抑制したことから，AGEs が 骨 芽 細 胞 に 発 現 す る 受 容 体（receptor of
AGEs：RAGE）を介して直接作用していることが明らか
になった。

結

論

本研究は，AGEs（100μg/mL）を加えた細胞培養培地
で MC3T3-E1 細胞を刺激し，その影響を検討した。その結果，以下のことが示された。
1.

AGEs は，Runx2 および osterix の遺伝子およびタ
ンパク発現を減少させた。

2.

AGEs は，Col Ⅰの遺伝子発現には影響を及ぼさなかった一方で，m Col Ⅰのタンパク発現を減少させた。

58

骨芽細胞の骨形成に対する AGEs の影響

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