塩化ベンザルコニウムを有効成分とする手指消毒剤のウイルスに対する有効性
柳曽 聡美 1), 戸部 聖一 2), 山下 知佳 1), 尾谷 明希 1),
古賀 丈一朗 1), 柿澤 恭史 2)
ライオン株式会社

1)

ビューティケア研究所,2)

先進解析科学研究所（〒132-0035 東京都江戸川区平井 7-2-1）

Virucidal Activity of Sanitizers Containing Benzalkonium Chloride
Satomi Yanaso 1, Seiichi Tobe 2, Chika Yamashita 1, Aki Otani 1,Takeichiro Koga 1, Yasushi Kakizawa 2
Abstract

To prevent the infectious disease from spreading, hand hygiene such as hand washing or using
disinfections is one of the most effective ways to cut off the route of transmission. In this study, weevaluated the virucidal activity of benzalkonium chloride solution with and without certain additives. Ourfindings suggested that the inclusion of a specific amount of lauryl amine oxide did not significantly affectthe effectiveness of benzalkonium chloride, unlike polyoxyethylene lauryl ethers and hydrogenated castoroil. It was also demonstrated that commercially available sanitizers containing 0.05 w/v% benzalkonium
chloride showed more than 4 log10 reduction against influenza A virus (H1N1) and SARS-CoV-2 even
without ethanol. As a result, using appropriate disinfection is effective measure to reduce the risk ofinfection.

Keywords：Sanitizer, Influenza, SARS-CoV-2, Benzalkonium chloride, Lauryl amine oxide
Received June 12, 2023; accepted July 3, 2023
1) Beauty Care Research Laboratories, LION Corporation
2) Advanced Analytical Science Research Laboratories, LION Corporation

7-2-1, Hirai, Edogawa-ku, Tokyo, 132-0035, Japan1

１．緒言
近年, 新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）による感染症（COVID-19)が全世界に拡大し 1）, パンデミックが引き起こされた. 新型コロナウ
イルス感染症(COVID-19)は 2023 年 5 月より感染症法上 2 類相当から 5 類への移行されたものの 2), 未だ世界的感染者数が多い状態である 3).
インフルエンザやノロウイルス等によるウイルス性の感染症はこれまでも繰り返し流行しており, これらのウイルスに感染すると高熱や激しい嘔吐, 下痢などの重い症状を発症するため, 感染予防に対する生活者の意識は非常に高い. 感染予防のためには(1)感染源の排除, (2)感染経路の遮断, (3)宿主抵抗力の向上が有効であるが, COVID-19 のように新しい病原体または変異を繰り返すウイルスによる感染症の場合, 短期での免疫形成は困難であり,また特効薬が存在しない. そのため感染拡大を抑えるためには感染経路への対策が重要であり, とくに接触感染リスクを低減するためには手洗いや手指消毒が有効とされている 4).
指定医薬部外品としての外皮消毒剤ではエタノール（76.9-81.4 vol%）または塩化ベンザルコニウム(BC) 0.05 w/v%などが有効成分として認められている 5). 市販の手指消毒剤ではエタノール製剤, または低濃度のエタノールとBC を含む製剤が一般的であり, エンベロープ型ウイルスの不活化効果が確認されている 6-8).
エタノールはアルコール過敏症の人や手に傷がある人にとってはかゆみや痛みを引き起こす原因となることもあり, 手指消毒の習慣化に繋がりにくい. そこでエタノールを含まず,BC のみを有効成分とした製剤について検討した. 一般的に製剤の安定化や使用性確保のために溶剤や高分子, 界面活性剤等が活用される. しかし BC は陽イオン性であるため, 陰イオン性の高分子や界面活性剤が系内に存在す
ると BC の本来の機能を発揮できない場合がある. また非イオン性の界面活性剤の場合であってもミセル内に取り込まれることなどによって同様の影響がある場合があることが分かっている 9,10). そこで今回 BC と種々の非イオン性界面活性剤の組み合わせにおける機能として, インフルエンザウイルス不活化性能を検証した. その結果, 一般的なポリオキシエチレンラウリルエーテルやポリオキシエチレ
ン硬化ヒマシ油と異なり, 中性付近で非イオン性の特徴を示すラウリルアミンオキシドはBC の効果を阻害しないことが分かったため報告する.

２．試料と方法
2.1 モデル水溶液のインフルエンザウイル
ス不活化試験
2.1.1 試料
インフルエンザウイルス Influenza A virus
A/PR/8/34 (H1N1) ATCC VR-1469 および培養細胞 Madin-Darby canine kidney cell (MDCK 細胞) ATCC CCL-34 はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手した. 牛血清由来アルブミン(BSA)は富士フィルム和光純薬社のフラクション V を用い, その 0.3 g を 9.7 mLの水に溶解して 3% 溶液とした. 培養液の EMEM は富士フィルム和光純薬社より入手し,シグマアルドリッチ社のペニシリンストレプトマイシン溶液を 1/100 量添加して使用した.
(a)(b)
n=50(c)

a+b+c+x+y+z=40

a+b+c+x+y+z=40(d)Fig. 1 Molecular structure of surfactants. (a)Benzalkonium chloride, (b) Polyoxyethylene
lauryl ethers, (c) PEG-40 hydrogenated castoroil, (d) Lauryl amine oxide2

2.2 製剤のウイルス不活化試験
2.2.1 試料
製剤のウイルス不活化試験は一般財団法人
日本繊維製品品質技術センターにて実施した.
インフルエンザウイルスと宿主細胞は 2.1.1と 同 様 の も の を 使 用 し た . Severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2 （SARSCoV-2） NIID 分離株；JPN/TY/WK-521 は国立感 染 症 研 究 所 よ り , 宿 主 細 胞 VeroE6/TMPRSS2 は JCRB 細胞バンクより入手した.
牛血清由来アルブミン (BSA) フラクション V及び培養液の E-MEM, D-MEM はシグマアルド
リッチ社より入手した. 市販手指消毒剤（いずれも指定医薬部外品, 有効成分 0.05 w/v%BC）には製剤Ａ：ライオン薬用ハンドジェル,製剤Ｂ：ライオン薬用消毒ハンドスプレー,製剤Ｃ：ハセコールミスト, 製剤Ｄ：ライオン薬用消毒ハンドジェルプラスを用いた.

BC はナカライ社の試薬を使用した. ラウリル
アミンオキシドはグローバル・アミンズ・ジャパン社より, ポリオキシエチレンラウリルエーテルはエチレンオキサイド平均付加モル数50 となる EMALEX 750 を日本エマルジョン社より, ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油はエチレンオキサイド平均付加モル数 40 となるユニオックス HC-40 を日油社より入手し, 滅菌水で希釈して各試料を調製した. 各界面活性剤の化学構造式を Fig.1 に示す.

2.1.2 試験方法
インフルエンザウイルス液の調製および不活化の評価は SARS-CoV-2 に対する各界面活性剤の不活化効果を評価した製品評価技術基盤
機構 (nite) の試験法 11)に準じて次のとおり実施した. MDCK 細胞にインフルエンザウイルスを播種して培養し, インフルエンザウイルスの分散する培養液を遠心分離して上清を分取してポアサイズ 0.2 ミクロンのフィルターでろ過し, -80℃ で保存した. 解凍後に EMEM を 0～9 倍量および BSA 3% 溶液を 0～9倍量添加して反応に供した. 試料の対照は EMEM とした. 反応は試料 0.27 mL に対してウイルス液を 0.03 mL 混合して室温で 30 秒静置し, その 0.05 mL を SCDLP 培地 0.45 mLに添加して反応を停止し, さらに E-MEM にて順次 10 倍希釈した (n=3). 試料と SCDLP 培地を予め混合した後にウイルス液を添加してTCID50 法にて感染価を測定したところ細胞毒性の影響を受けずにウイルス感染が認められたことから本法を用いて各反応後の感染価を測定した. ウイルス不活化の指標となる ⊿log 値は次のとおりとし, 検出限界となる ⊿log 値の最大を 4.3 とした.

2.2.2 試験方法
製剤のウイルス不活化効果試験は
EN14476:2013+A2:201913）及び ASTM E1052-2014）に準じて次のとおり実施した. E-MEM で懸濁したウイルス液に 0.3% BSA を含有させたものと試験サンプルを 1:9 で混合し, 十分に撹拌したのちに 25℃で 30 秒静置したものを試験液とした. インフルエンザウイルスの場合はその 0.5 mL を SCDLP 培地 4.5 mL に添加して反応を停止, E-MEM で 10 倍希釈系列を作製し、試験液 1 mL あたりのウイルス感染価を算出した (n=3). SARS-CoV-2 の 場 合 は 停 止 液 に
SCDLP 培地を 2% FBS 含有 D-MEM で 10 倍希釈した溶液を用い, 10 倍希釈系列は 2% FBS 含有 D-MEM にて作製した. 試料の対照は滅菌超純水とした. 試料と停止液を予め混合した後にウイルス液を添加してプラークアッセイ法にて感染価を測定したところ, 細胞毒性の影響を受けずにウイルス感染が認められたことから本法を用いて各反応後の感染価を測定した. ウイルス不活化の指標となる ⊿ log 値
は, 2.1.2 に記載の式と同様に算出した.

⊿ log 値：対照の感染価の対数値 － 試料の感染価の対数値
ラウリルアミンオキシドの臨界ミセル濃度(cmc) は MicroCal 社の等温滴定型カロリメ
ータ VP-ITC システム (ITC) を用いて 50 mM
リン酸緩衝液 (pH7.0) 中で求めた 12).
3

３．結果
BC 0.05 w/v% の示す不活化効果は Table 1 のとおりで, BSA を含まないウイルス液に BC
0.05 w/v% を反応させた場合の ⊿ log 値は2.8 を示した.
Table 1. Virucidal effect of BC solutions. Eachsample included Influenza A virus (H1N1) wasincubated for 0.5 min at room temperature. BC:
benzalkonium chloride, BSA: bovine serum
albumin.

Fig. 2 Virucidal effect of BC solutions with eachsurfactant. 〇: Lauryl amine oxide, ◇: BC, □:polyoxyethylene
laurylethers,△ :hydrogenated castor oil. Each sample included
Influenza A virus (H1N1) was incubated with
0.03 w/v% BSA for 0.5 min at roomtemperature.

Table 2. Virucidal effect of various surfactantsolutions. Each sample included Influenza Avirus (H1N1) was incubated with 0.03 w/v%
BSA for 0.5 min at room temperature. LE:
Polyoxyethylene
laurylethers,
HCO:
hydrogenated castor oil, AO: Lauryl amineoxide.

そこで ⊿ log 値の検出限界値 4.3 を鑑みてより幅広い強度の不活化効果を把握するために, 不活化効果を抑制する BSA を添加した.
その結果, BSA の濃度が高まるほど ⊿ log値は低下した. 今回の評価においては BSA を0.03 w/v% 添加した ⊿ log 値 1.5 が基準値として適切と判断し, 以降の各界面活性剤の評価は BSA 0.03 w/v% を添加して実施した.
その結果, Fig. 2 に示すとおり BC 0.05w/v% に同界面活性剤を 0.01～0.03 w/v% 上乗せしても ⊿ log 値は同等の数値を示した.
同様にポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を混合したところ混合濃度が高まるほど ⊿ log値は低下し, 0.03 w/v% 混合した場合は 0.67および 0.83 まで低下した.

一方でラウリルアミンオキシドを混合した場合には ⊿ log

測定結果より約 0.04 w/v%値の低下は認められなかった. ポリオキシエ

もられた.

(1.7 mM) と見積

チレンラウリルエーテル, ポリオキシエチレ

以上より、ラウリルアミンオキシドは他の非ン硬化ヒマシ油, およびラウリルアミンオキ

イオン性界面活性剤と異なり, BC の不活化効

シドのみ 0.01～0.03 w/v% の濃度で評価した果を阻害しないことが判明した. そこでエタ

ところ Table 2 に示すとおり ⊿ log 値は 1

ノールを抜去しラウリルアミンオキシドを添以下であった.

加した製剤Ｄのウイルス試験を実施した. BCとエタノールを含有した製剤Ａ～Ｃ及びエタ

ラウリルアミンオキシドの cmc は ITC の4

Table 3. Virucidal effect of hand sanitizers against Influenza A virus (H1N1) and SARS-CoV-2. Tested in Japan
Textile Products Quality and Technology Center (QTEC), each sample was incubated with 0.03 w/v% BSA
for 0.5 min at 25℃.

ノール非含有の製剤Ｄについて, エンベローの濃度が高まるほど ⊿ log 値は低下する傾プ型ウイルスであるインフルエンザ A 及び向を示した. ノニオン界面活性剤はその cmc

SARS-CoV-2 に対するウイルス不活化試験結果

以上で BC の殺傷効果を抑制することが知らを Table 3 に示す. BC 0.05 w/v% 及びエタノ

れている 9,10). 例えば BC の殺菌および抗ウイール 40～68 vol% を含有する製剤Ａ～Ｃは両ルス効果の反応を停止させる SCDLP 培地にはウイルスに対して ⊿ 4 log 以上の高い不活化ノニオン界面活性剤であるポリソルベート 80効果を示した. 一方エタノールを含有しないが 5 mM (0.7 w/v%)となる様に配合されている

製剤Ｄにおいてもインフルエンザ A ウイルスに17)

対して 5.4 以上, SARS-CoV-2 に対して 4.1 以

れる 0.012 mM 付近 18) より高濃度となる 5上と高い ⊿ log 値を示すことが明らかとな

mM の濃度として添加されると BC の殺菌効果った.

は抑制されて生菌数 (log CFU/mL) は初発の. Fig.3 に示すとおり, その cmc と想定さ状態を維持している. そのメカニズムとして

４．考察
BC はインフルエンザウイルスや SARS-CoV-2をはじめとしたエンベロープ型のウイルスに対して不活化効果を示すことが知られている
6,15,16). 本実験条件においても BC のインフルエンザウイルス不活化効果は認められ, BC0.05 w/v% の不活化効果は BSA を含まない反応条件で ⊿ log 値として 2 以上を示した.
BC の不活化効果は BSA をはじめとして有機物の存在によって抑制されることが知られている 11,13). 本評価では BSA を 0.03 w/v% 添加することによって範囲幅の広い不活化効果を把握することができた.
BC にノニオン界面活性剤である ポ リ オ キ
シエチレンラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を混合した場合, そノニオン界面活性剤のミセル中に BC が抱合されて菌体への吸着が抑制されることが挙げ

Fig. 3 Bactericidal effect of BC solutions with
polysorbate 8010). BC concentration 〇: 4.5μM,△: 13.5μM, ◇: 22.5μM. E. coli was incubatedfor 10 min at 25℃.

5

られている. ポリオキシエチレンラウリルエ

しない製剤ＤにおいてもＡ～Ｃと同様に高いーテルおよびポリオキシエチレン硬化ヒマシ不活化効果が認められ, エタノールを含有し油の cmc は 0.01 w/v% 付近と見積もられるない製剤の開発に成功した.

19,20). BC の cmc はその主成分となるアルキル

５．結言
本研究では BC を含有する液剤に対してインフルエンザウイルス不活化効果を検証した.
また市販消毒剤においても, インフルエンザウイルス及び SARS-CoV-2 に対して高い効果を確認し, とくにエタノールを含有しない製剤においても高い不活化効果が認められた. エタノールはアルコール過敏症の人や手に傷がある人にとってはかゆみや痛みを引き起こす原因となることもある. このような有訴者にとって, エタノール非含有であっても高いウイルス不活化効果を有する本製剤は, 手指の衛生を保つ習慣づくりに繋がり, 非常に有用であると考えられる.

炭素数 12 における知見から 0.09 w/v% 付近と見積もられる19). 本評価における BC の濃度は 0.05 w/v%であって cmc 以下となることから, ポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油を0.01～0.03 w/v% 添加するとそれらノニオン界面活性剤のミセルに BC が抱合されて不活化効果の抑制が生じたと考えられる. BC の殺菌効果を抑制する現象はエチレンオキシド付加モル数が大きくなるほど顕著である. 本評
価に用いたノニオン界面活性剤のそれぞれのエチレンオキシド平均付加モル数は 40 及び 50であり, 同様の現象が大きく現れたと考えられる.
一方, 本評価系はウイルス液となる E-MEM謝辞
本論文の作成におきましては, 一般財団法人日本繊維製品品質技術センターのご協力のもとで, 製剤のウイルス試験を実施しました.
厚く御礼申し上げます.の緩衝作用によって pH 7～7.5 でありラウリルアミンオキシドは非イオン性を示すにも関わらず, ラウリルアミンオキシドを混合した
場合 BC の不活化効果は生じなかった 21). ラ
ウリルアミンオキシドの cmc は 0.04 w/v%付近と見積もられた. その結果から Fig.2 お

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日:2023 年 5 月 1 日).
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https://www.mhlw.go.jp/stf/covid-19/kenkouiryousoudan.html l#yobou, ( ア ク セ ス

よび Table 2 におけるラウリルアミンオキシドの濃度は cmc 以下となる.
ラウリルアミンオキシドは 0.05 w/v% におけるウイルス不活化効果が知られている 11).
ラウリルアミンオキシド 0.01～0.03 w/v% ではウイルス不活化効果はほとんど示されなかった. ラウリルアミンオキシド自体のウイル
ス不活化効果は cmc 以上において生成したミセルがウイルス表面のリン脂質で構成されているエンベロープを可溶化してウイルスを破壊するなどのメカニズムが働いているのではないかと考えられる.
市販消毒剤Ａ～Ｄは全て ⊿ 4 log 以上の高い不活化効果を示した (Table 3). これまで
40 v/v% 以上のエタノール及び BC 0.05 w/v%と低濃度エタノールの組み合わせがエンベロ
ープ型ウイルスに対して効果があることは知られていたが 6), 本研究ではエタノールを含有
6

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