E. coli および Candida に対する抗生物質と天然系抗菌剤の三剤併用効果
田中 昂希, 谷田 育宏, 大澤 敏
金沢工業大学 ゲノム生物工学研究所, 〒924-0838 石川県白山市八束穂 3-1

Three drugs combined effect of antibiotics and natural antimicrobial agentsagainst E. coli and Candida
Koki Tanaka, Ikuhiro Tanida, Satoshi Osawa
Genomu Biotechnology Laboratory, Kanazawa Institute of Technology,
Yatsukaho, Hakusan, Ishikawa, 924-0838
E-mail：b6900980@planet.kanazawa-it.ac.jp

Abstract
The three drugs combined effects of various antibiotics and natural antimicrobial substances, Benzyl
isothiocyanate (BITC), Cinnamaldehyde (CAL) have been investigated against Escherichia coli (E. coli)
and Candida parapsilosis (C. parapsilosis). Antimicrobial activities were determined by minimum
inhibitory concentration (MIC) using micro-dilution method. The combination effect was judged by thefractional inhibitory concentration (FIC) index using the checkerboard method. Microencapsulation wasperformed by a submerged curing coating method in which a mixture of sodium alginate and an antibiotic
or antibacterial agent was reacted with calcium chloride to form capsules by ionic cross-linking. Theresults showed that the combination of Polymyxin B and BITC, CAL had combined effect against E. coli.
The combination of Amphotericin B, BITC and CAL showed combined effects on C. parapsilosis. MIC
value of three drags combination is much lower than that of two drags combination, leading to reductionof antibiotic usage. Furthermore, sustained release of antimicrobial agents from microcapsules wasconformed in vitro experiment.

Keywords：Antibiotics, Natural antimicrobial agent, Combined effect, Microcapsule
Received February 6, 2021; accepted March 1, 2021

21１ 緒言2019 年における全世界の主な死因は, 虚血等の様々な条件設定により, 薬剤の徐放が異な性心疾患や脳卒中, 肺疾患などの非感染症であ剤併用効果を示した抗真菌薬, BITC, CAL をるが, 低所得国の死因 TOP10 のうち, 6 つは感MC 化させ, その薬剤の溶出挙動を検討した.

染症であるる挙動を示すことも知られている. そこで, 三. また, 近年では,薬剤耐性菌の患

1)者数も増加傾向にあり, 対策が求められている.
薬剤耐性菌に対して, 世界的な対応が行われな

2 実験方法
抗生物質として, Ampicillin (ABPC；富士フイ

ければ, 2050 年には世界で, 年間約 1000 万人がルム和光純薬(株)製), Fradiomycin sulfate (FRM；死亡するとの試算が発表されている

これら

東京化成工業(株)製), Polymyxin B sulfate (PL-B；の感染症には, 抗生物質を用いた治療が行われ富士フイルム和光純薬(株)製), Amphotericin B

るが, 抗生物質は様々な副作用を引き起こすこ(AMPH-B ； 富 士 フ イ ル ム 和 光 純 薬 ( 株 ) 製 ),とが知られている 3, 4).

特に, 真菌感染症においItraconazole (ITCZ ；東京化成工 業 (株 )製 ), 5-5)の治療に中Fluorocytosine (5-FC；東京化成工業(株)製)を使心的な役割を果たしている Amphotericin B は,用した. 併用物質として選定した天然系抗菌剤

抗真菌スペクトルは広いものの, 腎毒性が強く,に は , Fig. 1 に 示 し た Benzyl isothiocyanate

低カリウム血症等を引き起こすことが知られ(BITC；東京化成工業(株)製), Cinnamaldehydeている 6, 7). また, 新規抗生物質の開発は, 新規(CAL；富士フイルム和光純薬(株)製)を用いた.

ターゲット分子の探索が困難であり, 開発コス

供試菌株には, Escherichia coli JM109 (E. coli

ト, 収益性といった観点から, 停滞傾向にある

JM109；タカラバイオ(株)), カンジダ属の中かて, 高頻度で発生するカンジダ症8).

2).

そのため, 既存の抗生物質を使用して, 副作

ら ,用を軽減させる治療法が必要である.

Candidaparapsilosis

NBRC1396(C.

parapsilosis NBRC1396；独立行政法人製品評価

本研究では, 抗生物質と, 抗生物質とは異な技術基盤機構)を選定し, 本研究での試験対象る作用機構を有する天然系抗菌剤であるとした. 吸光度の測定に使用した分光光度計は,お よ び(株)日立製作所製 Spectrophotometer UV-Vis U-Benzyl

isothiocyanate(BITC),

3310 にて測定した.

Cinnamaldehyde (CAL)との三剤併用による抗生物質の使用量削減を試みた. WHO が新規抗菌薬として緊急に必要な細菌に選定したものの中から 9), 腸内細菌である E. coli, また, Candida
spp.の中でも, Candida albicans に次ぐ死亡率を示す Candida parapsilosis10)に対する効果を調べた. これまでに, 二剤併用効果を示す報告はFig. 1 Chemical structures of BITC (left)
and CAL (right)

多くなされている 6, 11, 12)が, 二剤の併用では抗生物質の使用量削減には限度がある. そのため,三剤併用により, さらなる抗生物質の使用量削

2.2 最小発育阻止濃度測定試験
本研究の抗菌性評価は, Clinical and Laboratory減を検討した.
さらに, 薬剤の副作用を軽減させるアプロー

Standards Institute (CLSI)および日本化学療法学

チとして, 薬剤のマイクロカプセル (MC)化を会の試験法を参考に, 併用試験のプロトコルを検討した. MC 化により, 薬剤が徐放能を示す考案し, 微量液体希釈法により, 最小発育阻止ことが知られており, また, 材料, 濃度, 製法

濃度 (Minimum inhibitory concentration：MIC)を
22測定した 13, 14).

5 µL 接種し, 恒温槽にて 35℃, 24 h の条件で培養後, 各ウェル中のなかで, 菌の発育が認めら

2.2.1 培地
E. coli JM109 では, 滅菌済み Mueller-Hinton

れない最小濃度を MIC とした.

Broth に, ろ過滅菌した 25 mg/L の Mg2+および2.4 併用効果の判定
併用効果を測定した MIC 値を用いて, 併用効果の有無を判定する FIC index を算出した 15).
下記に示す計算式により, 算出値が≦0.5 を相乗作用, 0.5＜ ~ ≦1.0 を相加作用, 1.0＜ ~ ≦2.0 を不関, ＞2.0 を拮抗作用とした. なお, 相乗作用および相加作用となる FIC index 1.0 以下を示したものを併用効果有りとした.

50 mg/L の Ca を添加し, 2 mol/L の NaOH 水溶2+液で pH 7.3 に調整した Cation-adjusted MuellerHinton Broth (CAMHB)培地を使用した.
C. parapsilosis NBRC1396 に 対 し て は , Lgulutamine 添加 RPMI 1640 培地 (ナカライテス
ク ( 株 ) 製 ) に , 3-(N-morpholino) propanesulfonicacid (MOPS；ナカライテスク(株)製)を 0.165

2.5 マイクロカプセルの作製
Table 1 の組成に従い, 薬剤添加 1.0 wt % アルギン酸ナトリウム水溶液 (Na-Alg；ナカライテスク(株)製)をシリンジにいれ, 注射針 (内径0.70 mm; テルモ(株))を通じて, 液面からの高さ 5 cm より, スターラー撹拌下にある 1.0 wt %または 5.0 wt % 塩化カルシウム(富士フイルム和光純薬(株)製)水溶液中へ滴下させ, アルギン酸カルシウム (Ca-Alg) ゲルとする粒径約 2mm の各薬剤を添加した MC をそれぞれ作製した. MC 形成後, ガラスフィルターを用いて, 塩化カルシウムと MC を分離し, MC を回収した.

mol/L となるように加えたものを, 2 mol/L のNaOH 水溶液で pH 7.0 に調整し, ろ過滅菌したものを用いた.

2.2.2 接種薬剤の調製
薬剤の力価も考慮したうえで秤量し, 水溶性の抗生物質は蒸留水, 非水溶性の抗生物質および BITC, CAL は DMSO (富士フイルム和光純薬(株)製)を, それぞれ目的濃度となるように加え,ボルテックスミキサーを用いて撹拌, 溶解させた後, ろ過滅菌したものを使用した. その後,

Table 1 Composition of antimicrobial agents
encapsulated Na-Alg aq

調製した培地を用いて, 薬剤の 2 倍希釈系列を作製し, VIORAMO 製丸底 96 well plate の各ウ

Amount (g)ェルに, 全量が 100 µL となるように接種した.
なお, 本実験の濃度では, 薬剤を混合した際の薬剤の析出は確認されなかった.

2.2.3 接種菌液の調製および培養時間
E. coli JM109 はニュートリエント寒天培地, C.
parapsilosis NBRC1396 は, ポテトデキストロー

AMPH-B, 5-FC0.1

ITCZ

0.02

BITC, CAL

1.0

5 wt% Na-Alg aq

3.0DMSO

2.5

Distilled water

9.5

ス寒天培地上において, 35℃, 24 h の条件で前培養した. 前培養した菌体を 0. 85 %生理食塩水中に懸濁させ, ボルテックスミキサーを用いて菌体を生理食塩水中に分散させた. その後, 懸濁液を McFarland 0.5 に調整後, 最終接種菌数が E.
coli JM109：約 5.0×104 cells/well, C. parapsilosis
NBRC1396：約 5×10 ~ 2.5×102 cells/well となる
Fig. 2
Photographmicrocapsulesように調整した. その後, 96 well plate に菌液を23of

theprepared値は, 単剤 : 0.125 µg/mL から, BITC との二剤併用 : 0.0625 µg/mL, BITC と CAL との三剤併
用 : 0.0313 µg/mL へと低下し, PL-B の使用量は単剤と比較すると, 三剤併用では 1/4 に抑えられた. また, Fig. 3 に示した FIC index の算出結果より, BITC との二剤併用, BITC と CAL との三剤併用では, 相加効果（FIC index≦1.0）を示すことが分かった. PL-B は, グラム陰性菌の細菌細胞膜に作用する薬剤である 16). また, BITC
および CAL の詳細な抗菌メカニズムは明らかとされていないが, イソチオシアネート(ITC)類は, 細菌の非特異的な酵素の不活化, 呼吸系の作用障害に加え, タンパク質の改変による細菌細胞膜損傷等が報告されている 17, 18). また,ITC 類の抗菌メカニズムは, β-ラクタム系抗生物質よりペプチド系抗生物質である PL-B などに類似しているとの報告もある 19). CAL の抗菌メカニズムは, 主に細菌細胞壁に損傷を与える20)ため, BITC, CAL が E. coli の外膜構造等に損傷を与えたことにより, 細菌細胞膜に作用点をもつ PL-B が作用しやすくなったことが要因となり, 相加効果を示したと考えられる.
ABPC, FRM は二剤併用, 三剤併用ともに併用効果は確認されなかった. ABPC は細胞壁ペプチドグリカンに作用するが, BITC と作用メカニズムが異なる 19)ため, 併用効果を示さなかったと考えられる. また, FRM などのアミノグリコシド系抗生物質は, カチオン性のアミノ基を多数有する構造である. そのため, 細菌外膜のリポ多糖の Mg2+を排除することで, 自らリポ多糖と結合し, 外膜構造を破壊することで,リボソームに到達して作用することで抗菌性を示す 21). しかし, FRM 単剤での MIC 値以下2.6 マイクロカプセルの薬剤溶出試験
内包する薬剤の特徴的な吸収波長, すなわちAMPH-B, ITCZ, 5-FC (385, 262, 234 nm), BITC,CAL (243, 292 nm)における吸光度を, アセトニトリル(MeCN；富士フイルム和光純薬(株)製))0.9%生理食塩水 (Saline) [6:4, v/v]に溶解させて測定し, 検量線を作成した. 作製した薬剤内包MC 1.0 g を, 50 mM のクエン酸三ナトリウム(富士フイルム和光純薬(株)製)を溶解させた 0.9 %生理食塩水 50 mL 中に浮遊・懸濁させ, 37℃, 140rpm, 30 min の条件で振とうし, MC を完全に溶解させた. この溶液をシリンジフィルターでろ過した後, 吸光度を測定し, 検量線の値からMC の薬剤内包量を算出した.
溶出試験は, 生理食塩水 50 mL を加えた 100mL エルレンマイヤーフラスコに, MC 1.0 g を浮遊させ, 37℃, 100 rpm の条件で振とうした. 1h 毎に溶出液のみを 500 µL 分取し, その都度,新しい生理食塩水を 500 µL 加える操作を, 振とう開始から 6 h 経過まで, 経時的に繰り返した. 分取した溶出液を MeCN-Saline [6:4, v/v] に溶解させて吸光度を測定し, 内包量をもとに,MC の薬剤溶出率を算出した.
3 実験結果および考察
3.1 併用物質の抗菌性および抗真菌性評価
Table 2 に, BITC, CAL 単剤の E. coli JM109 および C. parapsilosis NBRC1396 に対する MIC 測定試験結果を示す. 供試菌株に対して, Table 2の濃度で抗菌性を示すことが確認された. また,
Table 2 より, CAL の C. parapsilosis に対する抗真菌性は特に強いことが確認された.
Table 2 MIC for BITC and CAL of microbialstrains
Microbial strain

MIC (µg/mL)
BITCCALE. coli JM109200400C. parapsilosis NBRC1396

20050

A：ABPC + BITC B：ABPC + CAL C：ABPC + BITC + CAL
D：FRM + BITC E：FRM + CAL F：FRM + BITC + CAL
G：PL-B + BITC H：PL-B + CAL I：PL-B + BITC + CAL

3.2 E. coli JM109 に対する併用試験
Table 3 に, E. coli JM109 に対する薬剤併用試
験の結果を, Fig. 3 に併用試験での MIC 値をもとに算出した FIC index の結果を示す. Table 3 より, PL-B では三剤併用効果を示し, PL-B の MIC

Fig. 3 FIC indices of combinations consistingof antibiotics, natural antimicrobial agentsin E. coli JM10924Table 3 MICs for single, double and triple combinations of antibiotics, BITC and CAL against E. coli
JM109

Combinations of antibacterial agents

Antibiotics

BITCCALdouble

triple

ABPC

0.5

—

——

—

ABPC + BITC

0.5200—1—

ABPC + CAL

0.5

—

400

1—

TripleABPC + BITC + CAL

0.5200400—

1SingleFRM0.25

—

—

—

—

FRM + BITC

0.25

200

—

1—

FRM + CAL

0.25—

400

1—

Triple

FRM + BITC + CAL

0.25200

400—

1Single

PL-B

0.125

—

—

——

PL-B + BITC

0.0625

100

—

1/2—

PL-B + CAL

0.125—

4001—

PL-B + BITC + CAL

0.0313100100—

1/4Single
ABPC

FRM

PL-B

Ratio※MIC (µg/mL )DoubleDoubleDoubleTriple※ Ratio : Ratio of [MIC of antibiotics when Combined use of double or triple] to [MIC of antibiotics alone],that is, ratio of decrease in antibiotics usage.
FIC index (2 drugs) =MIC of Antibiotics in combined MIC of (BITC / CAL) in combined+MIC of Antibiotics alone
MIC of (BITC / CAL) alone

FIC index (3 drugs) = (MIC of Antibiotics in combined MIC of BITC in combined MIC of CAL in combined++) / 1.5
MIC of Antibiotics alone
MIC of BITC alone
MIC of CAL alone

では, リポ多糖の遊離作用が低かったことで,併用効果を示さなかったと考えられる.

用物質である BITC, CAL の MIC 値も, 三剤併

3.3 C. parapsilosis NBRC1396 に対する併用試験
Table 4 に, C. parapsilosis NBRC1396 に対する三剤併用試験結果を, Fig. 4 に FIC index の算出
結果を示す. 選定した全ての抗生物質, すなわ
ち AMPH-B, ITCZ, 5-FC と CAL の二剤併用では抗生物質の MIC 値が 1/4 ~ 1/2 に, さらにBITC を加えた三剤併用では, 1/8 ~ 1/4 に減少し,抗生物質の使用量が二剤併用時よりも減少することが分かった. また, Fig. 4 に示す FIC indexの値より, ITCZ, 5-FC と CAL との二剤併用においては, 相加効果（FIC index≦1.0)を示し, さらに, 三剤併用試験においては, 全ての組み合わせで相加効果を示し, 抗生物質だけではなく併C. parapsilosis に対する BITC および CAL の用により低くなった.
抗菌メカニズムに関しても, 詳しくは解明されていないものの, BITC は真菌細胞壁に損傷を与え, 代謝酵素を阻害することが知られている22).

また, CAL は真菌細胞壁への損傷に加え,細胞壁合成酵素への阻害, 真菌中のミトコンドリアおよび真菌細胞膜に損傷を与えるといった抗菌メカニズムが報告されている 23~25). また,本研究により, CAL の C. parapsilosis に対するMIC は, 細菌である E. coli よりも低い傾向(Table 2) にある.
本研究では真菌細胞膜に作用する AMPH-B,ITCZ, 真菌の核酸合成を阻害する 5-FC を選定した 16). これらの薬剤は, 全て真菌細胞壁内部
25

Table 4 MICs for single, double and triple combinations of antibiotics, BITC and CAL against C.
parapsilosis NBRC1396

Combinations of antifungal agents

Antibiotics

BITC

CAL

doubletriple

AMPH-B

0.5————

AMPH-B + BITC

0.5200—1—

AMPH-B + CAL

0.125

—

501/4—

Triple

AMPH-B + BITC + CAL

0.062510025—

1/8Single

ITCZ

0.5————ITCZ + BITC

0.5200—1—ITCZ + CAL

0.25—

251/2—

Triple

ITCZ + BITC + CAL

0.062510025—

1/8Single

5-FC0.125————5-FC + BITC

0.125

200

—

1—

5-FC + CAL

0.0625

—

251/2

—

5-FC + BITC + CAL

0.0313

50

25—

1/4

Single
AMPH-B

ITCZ

5-FC

Ratio※MIC (µg/mL )DoubleDoubleDoubleTriple※ Ratio : See footnote to Table 3.

対する機能阻害等の多様な抗菌メカニズムにより, C. parapsilosis に損傷を与えたことで, 抗生物質が真菌細胞壁内部への取り込みが促進され, 二剤併用時よりもさらに MIC 値が低くなったと考えられる．

3.4 マイクロカプセルの薬剤溶出試験
Fig. 5 に薬剤添加 MC の薬剤溶出挙動を示す.
薬剤を MC 化することで, 薬剤が徐放能を有することが明らかとなり, 塩化カルシウム濃度が高いものほど, また, 分子量が大きいものほど溶出速度が遅い傾向にあった. 本研究では,Alg-Na と塩化カルシウム中の Ca2+のイオン架橋により Ca-Alg ゲルとなる液中硬化被膜法により MC を作製した. Ca-Alg は, 1 価金属塩水溶液中において, Ca-Alg ゲル中の Ca2+と, 1 価金属イオン間でのイオン交換反応により, Ca-Algの一部が Na-Alg となることで, Ca-Alg の架橋密度が低下し, MC の弾性率を弱めることが知られている. そのため, 1 価金属塩水溶液中では,MC の高分子網目内に多くの水を含んだ構造体となる 26). 以上の点から, Ca-Alg と溶出液間に

a：AMPH-B + BITC b：AMPH-B + CAL c：AMPH-B + BITC + CAL
d：ITCZ + BITC e：ITCZ + CAL f：ITCZ + BITC + CAL
g：5-FC + BITC h：5-FC + CAL i : 5-FC + BITC + CAL

Fig. 4 FIC indices of combinations consisting ofantibiotics, natural antimicrobial agents in C.
parapsilosis NBRC1396に 作 用 点 を も つ た め , 二 剤 併 用 で は , C.
parapsilosis に対して, 抗生物質と CAL の強力な抗真菌作用により, 抗生物質の使用量が削減されたと考えられる. また, CAL との二剤に加え, さらに BITC を加えた三剤併用では, BITCおよび CAL が真菌細胞壁などの真菌外膜構造への損傷に加え, 酵素阻害, ミトコンドリアに
26

Fig. 5 Comparison of elution rates of MC containing various antimicrobial agents at 37℃ in saline
stirring at 100 rpm; microencapsulated with 1 wt % (●), 5 wt % (■) CaCl 2 aqueous solution, nonmicroencapsulation (▲)

おいて, 薬剤の溶出が可能となり MC は徐放

4 結言能を示し, また, 5 wt %塩化カルシウム水溶液で作製した MC は, 1 wt %で作製したものと比本研究では, 臨床現場において使用される抗生物質と, 植物由来の抗菌成分である BITC,CAL を併用させた三剤併用試験を行った. その結果, PL-B および AMPH-B, ITCZ, 5-FC とBITC, CAL との三剤併用により, 単剤, 二剤併用時と比較して抗生物質の MIC 値が小さくなる傾向にあり, 抗生物質の使用量がさらに削減できることが示された. また, 薬剤内包 MC は,その架橋強度により薬剤徐放能を制御でき, 三剤併用と合わせて抗生物質の使用量削減に有効であると結論した.

較すると, Ca-Alg の架橋密度がある程度維持されたことにより, 徐放速度が 1 wt %のものより遅くなったと考えられる.
Ca-Alg の膜透過性には, 溶質分子である薬剤の分子サイズが関係しており, 分子量の大小だけではなく, 分子構造が関係することも明らかとなっている 26). そのため, 分子量の大小, 分子構造の違い, および Ca-Alg と各薬剤間との親和性の違い, 分配係数などにより, 薬剤の溶出挙動が異なることが示唆された.
27

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