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H.Kumeta

Bruker NMR TopSpin v3.2 マニュアル（装置実習コース用）
はじめに
このマニュアルは装置実習コース「蛋白質・基礎」で使用するために作成している．そのため，溶液タン
パク質 NMR 測定に関わる操作方法については，ある程度，詳しく記載している．しかし，その他の用途での NMR 測定，例えば有機化合物やメタボローム解析における溶液 NMR 測定には，一部参考になるかもしれないが最適ではない．また，理解が進むにつれて不要となる文章も数多く含んでいるため，普段使いにもあまり適していない．普段使い用には簡易マニュアルを用意しているので，そちらを参照すると良いだろう．
この実習コースで使用する装置には日頃の装置運用を簡便にするために，ラボ限定スクリプトを多数導入しており，それはこのマニュアル中においても，いくつか使用している．ラボ外にある同種の装置を使用するときには利用できないコマンド等もあるため，その点もあらかじめご留意されたい．
おことわり
このマニュアルは装置実習コース「蛋白質・基礎」で使用するために作成している．複製は自由である
が，これは著作権の放棄を意味しない．営利目的への流用等は禁止である．非営利目的での利用は著者に問い合わせること．また，文章の説明部分において著者のイメージで記載している場合も多く，事実や現実と異なる情報が入っている場合もありえる．あらかじめご留意されたい．
このテキストはバージョン 0.96（１未満）が示す通り，未校正な部分を含んでいる．今後，この装置実習コースが複数回開催されていくに従い，随時更新されていく予定である．
装置の概要
NMR 装置は超伝導磁石(右図，Magnet)，プローブ(Probe)，分光計(Console)，およびコンピュータ(PC)から構成される，極めてデリケー
トで高価な測定機器になっている．
超伝導磁石は，液体ヘリウム（4K）により冷却された超伝導コイルに大電流を封じ込めることにより，極めて強力な磁場を半永久的に維持している．
液体ヘリウムのまわりにはその蒸発を防ぐために液体窒素が満たされている．
プローブは，超伝導磁石内部にあり，高周波パルスを照射し，応答信号を受信する．
分光計は，高周波パルスを制御し，応答信号をコンピュータに送る．
コンピュータは，測定命令を分光計に伝達し，分光計から送られてきた測定データを処理する．
磁石に関する注意事項
1.

鉄（磁性体）の物体，磁気カード類や機械式腕時計をちかづけてはならない．

2.

衝撃を与えたり，装置を揺らしたりしてはならない．

１は、近づけたこれらの物が NMR 装置の強力な磁場により壊れる可能性があるためであり，２は、装置が壊れる可能性があるためである．最近はアクティブシールドと呼ばれる遮蔽磁場の恩恵により，１に関してはあまり気にしなくても良いかもしれない．しかし，用心に越したことはないのでやはり厳守すること．
1

２に関して，NMR で使用する超伝導磁石は床面からの振動，例えば建物の外をトラックが通ったときなどの振動を拾わないように，圧縮空気により少しだけ持ち上げられている．そのため，ほんの少しの力で揺らすことができてしまう．一方で，超伝導コイルは，液体ヘリウムの中で浮いている状態になっている．装置が揺れてしまうと浮いている超伝導コイルが壁部等の電気抵抗がある物質に触れ，超伝導状態がやぶれてしまうことがありえる．超伝導状態がやぶれると磁場が消失する（クエンチする）とともに瞬間的にコイルは発熱し，その熱によって液体ヘリウムが急速に蒸発する．そのとき室内の酸素濃度が瞬時に低下するため，装置に近い位置にいる測定者には窒息の危険が伴う．またクエンチが起きた装置の復旧にはメーカーエンジニア等よる
再立ち上げが必要となり，これはかなりの高額な作業費，材料費（主に液体ヘリウム代金）が必要となる（百〜数百万円規模）．測定者の身の安全確保ももちろん大事だが，安定したラボ運営のためにも絶対にク
エンチはさせないようにすること．
このマニュアルでの表記ルール
コマンド入力は，courier フォントで記載する．
タブやボタンをクリックする場合には，[ ]で括り記載する．
それぞれの章で使用するコマンドを章頭にてリファレンス記載をしておく．
測定までの流れ溶液タンパク質 NMR を測定する際は，どの磁石メーカーの装置においても以下の共通の作業を行う．
サンプルの出し入れ
チューニングロック
シム調整
水消しおよびプロトン観測中心の設定
プロトンパルス幅調整
その他パラメータ調整

現在では装置環境の整備によってかなりの部分が自動化されており，あらゆる測定が数回の操作だけで可能になっている．このマニュアルでは自動化されブラックボックスと化したこれらの作業について何をしている操作なのかを解説していく（つもり）．
ウインドウの説明
lockdisp

Lock Display を表示

Bruker の NMR 装置をコントロールするには TopSpin というソフトウェアを使用する．このソフトウェ
アの起動は，大抵の場合，デスクトップにあるアイコンをクリックする．
TopSpin はデータブラウザ，メインウインドウおよび各種サブウインドウからなる．サブウインドウのうち Lock Display panel は，測定準備中や測定中における作業の目安となるため常に表示させておくこと．
もし表示されていなければ，lockdisp コマンドまたはメインウインドウの下部にある Console conditionsの Lock モニター部分をダブルクリックすると表示される．
メインウインドウの一番下には装置の状態，Console conditions が表示されている．その上にある空欄はCommand line 入力のボックスになっている．コマンドによる操作の場合には，この Command line を一度クリックしてから（縦棒一本の文字入力カーソルが表示される），コマンドを入力する．
Command line で使用した過去のコマンドは，上下の矢印キーで recall することができる．複数のコマン
2

ドを閲覧できるように，右クリックから Resize command line をしておくと良い．コマンドを実行する前に，過去のコマンドが recall されているかもしれない．Delete キーにより過去のコマンドを消去してからコマンド入力をすること．

ファイル管理とデータブラウザ
データブラウザウインドウには過去に測定されたデータ一覧が表示されている．データブラウザの表示モードは Browser / Last50 / Group などがある．
いろいろな人が使用する装置の場合には，ラボ名やグループ名でフォルダを作成し，その下に個人名のフォルダを作って管理することが多いだろう．さらに学外利用者がいる装置や施設の場合にはアカウントを分けて運用していることもありえる．施設や装置によってファイル管理方法が異なるため，それぞれに設定されているルールに従うこと．そのとき，むやみやたらにフォルダを作成することは利用者にとって一時的に便利になるのかもしれないが，管理者にとって迷惑極まりない行為なのでなるべく控えること．
新しくフォルダを作成する場合には，データブラウザの Browser モードから右クリックをし，メニュー
から Add New Data Dir... を選択し作成する．間違って作成してしまった場合には同じくメニューから
Remove Selected Data Dirs...によりデータブラウザの一覧から消去してからハードディスク上のフォルダを消去する．
実験領域の作成／EXPNO／PROCNO
new

Create New Dataset ウインドウの呼び出し（edc も同じ）

実際の測定では個人名のフォルダ等，使用可能なフォルダの下に，サンプルごと（または実験ごと）の実
験領域を作成し管理する．このときの実験領域のフォルダ作成は TopSpin 上で行う． new コマンドによりCreate New Dataset のウインドウを表示させる．

3

Name 欄は日付＋サンプル名とすることが望ましい．サンプル名にはラベル情報もあると良い．
例：180720_CN_L7L12_nosalt
これは，2018/7/20 に測定を開始した 13C/15N ラベルされた L7L12 サンプルについての測定で，サンプル
条件として NaCl なしで調整したサンプルであることを表している．測定日付を名称先頭に含めることも
後々の検索に役立つので重要．フォルダ名には長さに制限があるため，その他のサンプルに関する詳細情報，例えば測定温度やサンプル濃度，pH や buffer 組成等については TITLE 欄に記録するとよいだろう．
この TITLE 欄は実験領域をアクティブにしたときの，[ TITLE ]タブによって，あとからでも編集可能である．TITLE に記載した情報はデータブラウザにも表示されるので有効に活用しよう．
EXPNO，PROCNO は，それぞれ 1 とする．
Use current parameters と Experiment はどちらか一方のボタンが選択できる．ここでは，Experimentを選択し，さらに[ Select ]から ZGPR（あれば ZGPR_K）を選択する．[ Select ]で表示される一覧は，測定に必要なパラメータについてそれぞれまとめられている．Bruker が提供する TopSpin に元から含まれているものと，装置管理者を含む利用者が作成するものが存在する．TopSpin がインストールされている場所の下，TopSpin version/exp/stan/nmr/par および TopSpin version/exp/stan/nmr/par/user の下にそれぞれ保存されている．適宜，par フォルダに自身の測定パラメータファイルを保存しておくと便利になるかもしれない．
Options の下にある Set solvent から H2O+D2O を選択し，その他のボタンは OFF にする．
Dir は自分の実験領域を保存する先を選択する．Reciever は 1 とする．
[ OK ]を押して実験領域の作成を終了する．
作成後，データブラウザにおいて Name がフォルダ名として表示される．
データブラウザに表示されるフォルダ構成は以下のようになる．
180720_CN_L7L12_nosalt┗1 zgpr┗1
1 zgpr は EXPNO とパルスシークエンス名である．EXPNO は一つのサンプルについて複数種類のスペクトルを測定するときに，これを分けるために使用する．
4

例： 1 zgpr

水消しパルス付きプロトン１次元測定

2 hsqcetfpf3gpsi[1H-15N] HSQC（２次元）測定

3 noesyhsqcetgpsi3d

13C edited NOESY（３次元）測定

4 hsqcetfpf3gpsi

3 のあとのサンプル確認のための[1H-15N] HSQC（２次元）測定

この EXPNO フォルダには，測定パラメータ，測定生データ（FID データ）が含まれる．一つのEXPNO フォルダには一つの FID データしか含まれない．
パルスプログラムもこのフォルダに保存されている．パルスシークエンスの途中で使用している shaped
pulse も名前は変更されてしまうが同じフォルダに保存されている．そのため，この EXPNO フォルダがあれば，どの Bruker 環境の装置においても同じ測定が再現できる．しかし，核の共鳴周波数やパルス強度
等，装置ごとに異なるパラメータがある（同じ 600 MHz の装置であったとしても装置ごとに共鳴周波数は微妙に異なる）．これら装置依存のパラメータ類を測定装置に揃えるコマンド（paracon）は管理者権限が必要であり，あわせて十分な NMR 装置知識が必須である．他の研究室から新しいパルスプログラムが入ったフォルダをもらって測定をしかけるなどの場合には，管理者に問い合わせてから使用すること．
1 zgpr の下にある 1 は PROCNO である．実験領域をメインウインドウに読み出すときはこの PROCNO
をダブルクリックする． PROCNO は一つの FID データに対して複数のスペクトルデータを作成するときに使い分けることができる．例えば，２次元測定である 2 hsqcetfpf3gpsi について，
2 hsqcetfpf3gpsi
1999
として，1 に２次元スペクトルを，999 に１本目の FID についての１次元スペクトルをそれぞれ保存するといった具合に使用する．３次元測定の場合には例えば，
3 noesyhsqcetgpsi3d
1

３次元スペクトル

13

F1F3 plane の２次元スペクトル23

F2F3 plane の２次元スペクトル999

１次元スペクトル

として，位相合わせやシグナル強度の確認や比較に活用する．
温度（風量／チラー）設定
edte

Temperature control suite ウインドウの呼び出し

プローブ内において NMR サンプル部分の温度の制御は，冷却した乾燥空気を磁石下部より送りプローブ
内のヒーターで加熱することで実現している．edte コマンドで開く Temperature control suite では温度の設定ならびに風量の調整ができる．

5

温度センサーとサンプルの位置は少し離れているため，サンプル位置での温度となるように温度キャリブレーションがされている．風量を変更してしまうとこのキャリブレーションがずれてしまうため，変更しない
ように心がける．止むを得ず変更が必要だった場合には，利用終了時に元の値に戻すこと．
チラー設定は，off / medium / maximum の三種類がある．設定する温度によって使い分けること．講習
で使用する装置での目安は以下のとおり，
0 〜 20℃

maximum

20 〜 30℃

medium30℃ 〜

off

例えば 40℃以上の高温で測定する際にチラー設定を maximum にしないこと．プローブ内部にあるヒー
ターコイルが焼き切れてしまう．heater power を[ Monitoring ]で確認するのも良い．heater maximum
power の 5〜15%になっていることが望ましい．
サンプルの出し入れ
ej

サンプルフローエアーが出る

ij

サンプルフローエアーが止まる

どちらも挿入口にある黒い蓋を外してから操作する
通常，溶液用 NMR サンプル管は直径が 5 mm のものを使用する．サンプル液量が十分にない場合にはシゲミ社製の対照形
ミクロサンプルチューブ（通称，シゲミ管）を用いる．このシ
ゲミ管には複数種類があり，Bruker の装置の場合には Bruker
用（水溶媒用 BMS-005B，上げ底 8 mm）もしくは JEOL 用（BMS-005J，12 mm）を使用すること．Agilent 用（BMS-005V，上げ底 15 mm または 18 mm）は使用しないこと．推奨液量（液高）は，以下のとおり．
Bruker 装置

BMS-005B

300 uL（液高 20 mm）

Bruker 装置

BMS-005J

250 uL（液高 16 mm）

推奨液量を超えるサンプルでも構わない．
シゲミ管の外管に溶液を入れ，真空脱気を行ってから内管を差し込む．内管を差し込んだあと，外管の上げ底と内管の溶液接地部分の間にあるサンプル溶液中に気泡がないこと．脱気操作は，水溶液中における溶存酸素による緩和を抑える効果以外にも長期間の測定中に気泡が発生しないようにするための作業でもある．また，サンプル液部分の上側にある内管と外管に挟まれた部分にも気泡がないこと．内管のくびれた部
分に，液界面がある状態が理想的である．内管のくびれた部分より下に気泡があると，測定中，なにかしらの拍子にサンプル側へと気泡が入ることがありえる．NMR 検出部分に気泡があることは磁場の均一性において非常に不利益となる．測定中にサンプル液部分に気泡が入ると locklevel が大きく落ちる．これは測定前後で lock level をモニターしておくと判断しやすいだろう．
NMR サンプル管を固定するホルダー（スピナーとも言う）には常温域測定用のプラスチック製と高温測定用のセラミック製がある．溶液タンパ
ク質 NMR においては主にプラスチック製のものを使用する．
NMR サンプル管をホルダーに固定するとき，専用のゲージを使用して液部分の中央とゲージのセンターライン位置を合わせること．ゲージ下部にはサンプル管固定位置の下限を意味するストッパーがついている．このストッパーの位置はプローブごとに決まっている．TXI プローブのときにはサンプル中央（center line）から 22 mm，Cryo Probe である CP-TXI
6

のときには 20 mm である．装置にサンプル管を挿入したあと、サンプル管のすぐ下には温度センサーがある．ストッパーの位置は，サンプル管がこの温度センサーに当たらないように調整されている．
ホルダーに固定したサンプルを装置に入れるときには，以下の手順で行う．
①

挿入口の蓋を外す②

ej③

サンプルを挿入口に浮かべる

④

ij

⑤

挿入口の蓋をかぶせる

サンプルフローエアーが出る
サンプルフローエアーがゆっくり止まる

挿入口の蓋がされているとき，ej や ij による操作はエラーとなる．サン
プルフローエアーが出ているときにサンプル管＋ホルダーは挿入口に浮く，または浮かせることができる．サンプル管なしのホルダーを挿入口に浮かせようとしないこと．これは浮かせることができない（＝取り出せなくなる）．
チューニング
atma

自動チューニング対応環境での自動チューニング

atmm

自動チューニング対応環境での手動チューニング

wobb

自動チューニング非対応環境での手動チューニング

チューニングには自動と手動がある．自動チューニングはプローブおよびその周辺のハードウェアやソフトウェアなどの測定環境がそれに対応している必要がある．対応している環境で自動チューニングを行う
ときには atma，対応している環境で手動チューニングを行うときには atmm，自動チューニングに対応していない環境では wobb をそれぞれ使用する．講習会で使用する装置はデフォルトで TXI になっているはずなので atma または atmm を使用する．特に違和感が発生しない限り自動チューニング（atma）で良いだろう．
チューニングは，NMR を示す原子核が共鳴する周波数とプローブが出力するパルスの周波数を合わせる行為である．正しく調整できていないと S/N の悪化や必要パルス幅の増加につながる．特にプロトン核
は，高周波数であるために溶媒塩濃度や NMR サンプル管の影響を受けやすく，サンプルごとに調整が必要になってくる．ただし滴定実験などで同じサンプル管／溶媒条件が連続している場合には省略できる．またタンパク質運用に限った測定装置の場合には 13C や 15N 核は，あまり調整値が変化しないため，そのチューニングも必須ではない．しかし，13C，15N を使った緩和解析（r2-dispersion 等）の場合には正確にチューニングした方が良い．
手動チューニングではチューニングコンデンサー（T）とマッチングコンデンサー（M）へのそれぞれへの電気容量を変更し，表示されるスペクトル dip が最小値をとるように調整する．機構の詳細については本
マニュアルでは省略するため，他のマニュアル類を参照されたい．T は dip の位置を，M は dip のシャープさをそれぞれ調整する．手動で調整する場合には，もっともシャープでもっとも中心にあった状態になるよ
うにする．atmm の場合には TopSpin に表示されるサブウインドウで，wobb の場合にはプローブ下部についている T や M のロッドを回すことで調整する．ロッドでの操作の場合，回しすぎに注意すること．端に行き着いたときには，それ以上，回さないこと．
ロック
lock

lock をかけるための溶媒選択画面が現れ，選択後に自動でロックをかける

bsmsdisp

BSMS control suite を表示

通常，NMR サンプルの溶媒中には Deuterium（2H の核）が含まれており，この核を使ってロックをかける．ロックとは，少しずつ変化する磁場強度を補正するための機構であり，かつ、積算ごとの信号周波数7が一定になるようにデジタル補正をかけるために使用する．lock コマンド後に選択する溶媒は H2O+D2Oとする．ここで選択された溶媒種類は，後述のシム調整時にシムの状態をモニターする対象も同時に選択している．今回の選択溶媒，H2O+ D2O の場合には H2O のプロトン（1H）がその対象となっている．
lock コマンドは毎回必要な作業ではない．この操作を行わずともロックがかかれば省略できる．直前の測定者がほぼ同じような環境で測定をしていればサンプルをいれただけでしばしばロックが勝手にかかる．
後述の bsmsdisp にてロックパラメータを調整し適切な lock level になれば次の操作に移行しても良い．
ロックには lock on と lock off の２つの状態がある．lock on 状態では Lock Display panel にて lock levelがモニタリングされ，赤い線と緑色の線で左右に描画されていく．lock off 状態では重水素の FID が同じく赤い線と緑色の線で描画される．手動で lock をかける場合には，この FID を使用する．Lock Display
panel の中央にて左右対称の赤／緑の FID が表示されるように field 値（位置）および lock phase 値（対称性）を調整する．Field 値および Lock phase 値が調整された lock on モードに変更し，赤い線と緑色の線が'安定に'，'ある程度の高さ'の位置で左右に描画されればロックは正常にかかっている．
lock on モードでは lock level の赤い線と緑色の線が'安定に'，'ある程度の高さ'の位置で左右に描画されていく．このときの'ある程度の高さ'は，画面内のやや上部にあることが望ましい．lock level を数値で表示したときに 60-80%程度が適切である（TopSpin 下部に表示されている Lock モニターで Toggle Lock mode で確認できるようになる）．また'安定に'モニターできているかどうかも，lock level がシム調整における目安になるため重要である．lock level が 100 や 50 以下である場合や安定にモニターできていない場合にはlock パラメータの調整が必要である．

ロックをかけている間，溶媒中に多く含まれているロック専用の核（大抵の溶液タンパク質の場合は重水の Deuterium，2H）の NMR シグナルを常に観測している．上記のようにロックの対象核にパルスを当て，出てきた信号を増幅し，位相を合わせて，シグナルを観測しており，lock level 以外にはそれぞれパラ
メータ値が割り振られている．このパラメータ値は lock コマンドによって自動で設定されるが，手動でパラメータの調整を行う場合には，bsmsdisp によって BSMS control suite を呼び出して調整する．同じサンプルについて，同じ装置での再測定が想定されるとき（titration 実験，安定性試験等）には，これらパラメータの値と，シム調整後の lock level を書き留めておくと良い．次回測定時に同じパラメータを設定した
ときに，同じ程度の lock level になればシム環境が同等になっていると判断できる．
シム調整
rsh

保存されたシム値の読み込み

wsh

シム値の保存

topshim gui

自動シム調整（TOPSHIM）を行うためのウインドウを表示

サンプルは NMR 装置にいれた段階で強力な磁場にさらされている．強力なメイン磁場だけではサンプル
内部は均一な磁場環境を実現できておらず，この不均一さはスペクトルにとってかなり大きな影響を与える．メイン磁場以外，超伝導磁石（スーパーシムコイル）による大まかな調整，さらには室温シムと呼ばれ
8

る電磁石コイルによる細かな調整によってサンプル内部の磁場均一性を実現している．この調整をシム調整（またはシム上げ）と呼ぶ．スーパーシムコイルの調整は専用の電極を使った専門的な操作であり，装置管理者ではなくメーカーエンジニアの領分である．また通常時には必要のない作業である．装置使用者による測定においては，室温シムのみを調整する．室温シム調整はサンプル管の品質，溶液の位置や状態などに影響を受けるため，サンプルの出し入れがあった場合には，ほぼ毎回行うことが肝要である．
ここで紹介する室温シムファイルの読み込み方法は，特に事情がない限りは不要の操作である．ただ事情が発生した場合には必須となる作業なので読み込み操作方法は覚えておくこと．室温シム値の読み込みには，装置管理者やエンジニアによって作成されたシムファイルを読み出すと良いだろう．rsh コマンドによってシムファイルの一覧とその読み込みができる．シムファイルは使用するプローブごとに分けて保存されている．適切なファイルを選択すること．
シム調整の良し悪しは lock level および実際のスペクトルによって判断する．lock level は右図のように重水素信号の高さである．シムが悪い状態と良い状態で比較したとき，重水素信号の高さは後者において高くなる．ロックの対象核にあてるパルスの強さ，lock power の値をあげれば lock level は上昇するが，これはシム状態の改善を意味
しない．サンプル中のあらゆる場所において，単一種の信号が同じ化学シフト値を示すようにすることがシム調整である．
またシム調整を行ったあとに，実際のスペクトルにおける線形が悪ければシム状態は悪いままである．もしかするとサンプル管の観測部分に泡があるかもしれないし，溶液の均一性を乱すような固形物の混入があるのかもしれない．そのような場合，lock level を見ながらシム調整をいくらおこなったとしてもスペクトルは改善されない．一度サンプルを取り出して確認することも場合によっては必要である．実際のスペクトルで確認する際には内部標準の DSS や ZG30 など水消しを含まないプロトン１次元測定における水信号が参考になる．どちらもシグナルを拡大したときに左右対称に十分に細い線幅でシングレットのシグナルが観測されていればシム状態が良好であることを意味している．
室温シムの調整は，昨今では，高性能，高機能な自動プログラムを使用しておこなう．topshim gui コマンドにより，専用のウインドウ（TOPSHIM）を呼び出す．SHIM Dimension の 1D または 3D の選択，Use Z6 のチェックオン／オフ，PARAMETERS を必要に応じて変更する．
SHIM の Dimension の 1D では，グラジエントパルスを利用したシム調整が行われる．シム状態が理想的である場合，ひとつのシグナルはサンプル液のどこをとっても同じ化学シフト値になる．これに縦軸方向のグラジエント
パルスを当てると綺麗な台形のスペクトルになる．これを利用している．
3D では，1D のグラジエントパルスによるシム調整に加えてサンプル溶液
部分について MRI のように立体イメージを作成したシム調整が行われる．
さらに 3D では，1D で使用するシム調整のためのマッピングも行われる．このマッピングでは 1D で使用するシムコイルへの電力量とスペクトルの相関をあらかじめ調べている．3D でのシム調整は短くても数分，長ければ３０分程度の時間を必要とする．また，3D でのシム調整は対象とする原子として 1H のみが使用できる．2D 核は緩和時間が長く 3D シム調整に向かない（時間がかかりすぎる）ため使用できない設
定になっている．Use Z6 のチェックオン／オフは，サンプルの液高に依存して決定する．Z 軸方向の室温
シムコイルは次数，Z の後ろにある数字が大きいほどサンプルより遠くなり，一般にコイル長は縦に長くなっていく．コイルのカバーしている領域にサンプル溶液またはシゲミ管のガラス部分が無いと自動調整がうまく機能しない．具体的には Bruker 用シゲミ（上げ底 8 mm）を使用しているときに，液高が 18 mm 以
下になる場合にはこのチェックを外す方が良いだろう．さらに液量が少ない場合，250 uL 程度になりそう
9

なときには JEOL 用のシゲミ管（上げ底 12 mm）を使用すると良い．PARAMETERS は，rga のみ，または rga shigemi が推奨される．粘性が高い場合には，convconf を追記する．それぞれスペースで区切ることで併用が可能である．シゲミ管の場合には shigemi を追記すること．その他の PARAMETERS については TopShim のマニュアルを参照されたい．
[ Start ]ボタンによりシム調整が開始される．このとき TopShim gui 上の[ Report ]タブでシム調整の経過および結果を観察しておくこと．特に，initial B0 と final B0 の値は，どれだけ磁場の均一性が向上した
かの目安になり，その比は improvement として report に表示される．
TOPSHIM によるシム調整では，エラーで停止してしまうことがある．これにはいろいろな理由が考えられるが，主として不適切な lock，かけ離れた初期シム値，サンプルの液量（液高），サンプルの位置，シゲミであればサンプル溶液部分への泡混入が原因として考えられる．安易に管理者に問い合わせる前に自身のサンプルを取り出して確認すること．特に，Z4，Z5，Z6 の絶対値が数万を示している場合にはシム調整がうまくいっていないことが多い．シム調整後にそれぞれの値について確認しておくと良いだろう．
シム調整終了後，しばしば lock level が 100%となっていることがある．その場合にはロックの章で解説
した bsmsdisp によるロックパラメータの調整を行い，lock level の最適化，lock level が 60〜80%程度になるように調整を行うこと．
水消しおよびプロトン観測中心の設定
getprosol

基本パラメータの読み出し

gs

実 FID を観測しながらのパラメータを調整するモード

rga

レシーバーゲインの自動調整

rg

レシーバーゲインのパラメータ値の表示／変更

zg

測定開始

efp

FID のフーリエ変換を行い，スペクトルを表示

zgefp

zg 後に efp を行う

new コマンドにより ZGPR など Experiment を選択した初期状態においては，安全設計のために全てのパルス強度は０に設定されている．このままではシグナル検出できないため，基準となる初期値をgetprosol によって読み出す．この getprosol は後述の pulsecal 内部にも含まれている。
getprosol コマンドはオプションにより核種ごと，例えば 1H のパルス幅を明示した初期値設定も可能である．今回，これは使用しないが必要に応じて使用する．
例：getprosol 1H 7.5 -10dB
このとき，1H の矩形ハードパルスを 7.5 usec の長さ，-10dB の強さで指定している．パルス強度の指定には dB と W があり単位をつけて指定する．dB の場合には，単位を省略できる．
ZGPR では presaturation 法により水信号の消去を行なっている．これは強度を弱めたパルスを照射すると出力中心周波数にのみ選択的なパルスを照射できることを利用している（溶液タンパク質 NMR の場合，
水信号を中心にほぼ左右対称に観測したい信号があることも関係している）．観測中心を水信号の位置として設定し，水信号のみに選択的なパルスを照射することで，その磁化を飽和状態として観測できない状態とする方法である．他の水信号消去法には 3-9-19 法や Excitation sculpting 法などがあり，これらを使用したプロトン１次元測定もある（それぞれ P3919GP，ZGESGP）．また観測中心以外に presaturation を行う
zgf2pr もあるが、これらはこの講習会では省略する．
gs コマンドによる実 FID を観測しながらのパラメータ調整するモードを使用して，観測中心を調整し水信号の消去を行う．FID をリアルタイムで確認しながら観測中心の位置，O1 値を決定する．O1 値の変更
は[ Offset ]タブで行う．観測されている FID のうち最も大きな物が水の FID である．これが最小になるよ
うに O1 の値を変更する．過去の同様の測定において決定された値（溶液タンパク質サンプルであれば，おおよそ同じ値）を参照するのも良いだろう．ここではおおよそ消去されていれば良い（次の操作で微調整を10行う）．おおよそ大きな FID が消去された時点で[ Save ] する．[ Stop ]により gs モードを終了する．
次に実際の水信号を観測し，O1 の値を微調整する．rga を行い，レシーバーゲインの調整を行う．rga
はレシーバーゲインのパラメータ値，rg を自動で調整している．これには１分程度かかる．rga の自動処
理が終了後に表示される rg 値，もしくは rg コマンドで表示される数値を書き留めるか記憶にとどめておくこと．その後，zg によって測定を開始する．測定後は efp コマンドによりスペクトルを表示する．１次
元測定の場合には，測定後にスペクトルを確認することが多いため，これらを単一コマンドとした zgefpを活用すると良い．zgefp では，zg 後に自動で efp が実行され，スペクトルを表示してくれる．
efp コマンドは Exponential window function をかけたフーリエ変換コマンドである．window functionの設定や調整方法についてはここでは省略するが，Exponential window function が信号の SN 比を重視した関数であることを記憶しておくと良いだろう．window function を用いないフーリエ変換は fp で行えるが通常使用においてはあまり使わない．
スペクトルの位相補正と観測中心の微調整.ph位相補正モードへの移行.ret / .sret 各種モードから通常モードへの回帰.ret は保存せず戻る .sret は保存して戻る
o1

O1 パラメータ値の表示／変更.all

すべてのシグナルが画面内に収まるように全領域を再表示する

フーリエ変換後のスペクトルは位相補正を行う必要がある．NMR スペクトルは通常，吸収波形（Absorption line shape）となるように位相補正を行ってから解析に用いる．大抵の場合，測定後にそのま
まフーリエ変換したスペクトルは分散波形（Dispersion line shape）になっている．これが吸収波形になるように位相の補正を行う．位相補正には０
次補正と１次補正とがある．右にベクトルモデルでFT-NMR を簡単に図示した．x 方向に倒した磁化ベク
トルが z 軸方向（静磁場方向）に戻る際，回転しながら戻る．そのときのベクトルが示す x 成分の変化について，横軸を時間としてプロットしたものが FID であるとする．この FID をフーリエ変換（Fourier Transform，以下，FT)
するとスペクトルになる．このとき x 成分が最大値，x 軸に沿った状態から開始していないときスペクトルは分散波形になる．通常の測定データにおいてはこれが常にずれているため，０次補正が必須となっている．
また，周波数依存的にベクトルの方向がずれることもある．
右図にそれを模した．０次位相補正により中央のシグナルについて吸収スペクトルになるようにしたとき，右側のシグナルは
右に負の部分がある分散スペクトル，左側のシグナルは左に負の部分がある分散スペクトルになっている．このとき周波数に依存した位相のズレがある．これを補正することが１次補正である．
周波数依存の位相ズレは，ハードウェアやパラメータ調整等で補正することもできる．これらが適切に補正されていれば，
11

大概の場合に１次位相補正は不要となる．ただ 13C のような広幅な範囲の場合にはハードウェア補正が難しい場合があり，やはり１次位相補正の習熟は必須だろう．
ピリオドで始まる.ph コマンドにより位相補正モードとする．位相補正モードで表示されているスペクト
ルを見ながら，左上の[ 0 ]のところを左ドラッグしつつ上下にマウスを動かすことで０次補正ができる．およそスペクトル全体が吸収波形となるように補正する．
１次補正を行う場合には，まず基準とするシグナルを決める．右図では，０ppm のところにある DSS のシグナルとした．全体に０次補正を行ったのち，この DSSのシグナルについて０次補正のみで微調整を行う．このとき DSS より左側にあるシグナルがやや分散波形になる．これを吸収波形へと補正するのが１次補正となる．
基準とした DSS に対して，右クリックをし，set pivotを設定する．赤い縦線が表示され，ここが基準となる．
この状態で左上の[ 1 ] のところを左ドラッグしつつ上下にマウスを動かすことで１次補正ができる．スペクトル上のすべてのシグナルが吸収波形となるように補正する．
補正終了後，.sret コマンドにより位相補正値を保存しつつ位相補正モードを終了する．位相補正モード以前の状態に戻す場合には.ret コマンドにより位相補正値を保存しないで終了する．
位相補正作業の終了後，O1 値の最適化を行う．水信号の消え残りを使用して O1 の値を最適化すると良いだ
ろう．水信号（4.7 ppm 付近の大きな信号）の左側から右側に向かって左ドラッグすると囲んだ範囲について拡大することができる．拡大された水信号についてピーク
トップの周波数（Hz）値を読み取り，o1 コマンドによって O1 値に修正入力する．拡大されたスペクトルを戻す場合には，スペクトル全体が画面内に全て表示される.all コマンドを使用すると良いだろう．
プロトンパルス幅調整
pulsecal

プロトンパルス幅の自動調整

プロトンの最適なパルス幅は，サンプルの溶媒条件等に依存する．特にチューニング精度，サンプル塩濃度や塩の種類はその影
響度が大きい．また，影響度は小さいながらも温度，pH，サンプ
ル濃度，サンプル管形状もプロトンパルス幅に関与している．この操作もサンプルが変わるごとに必須な操作である．
pulsecal によるプロトンパルス幅の自動探索では矩形ハード
パルスにおけるプロトンの 90˚パルス幅が決定される（右上図，-10.8dB でのパルス幅 10.96 us＝マイクロ秒）．この値は２次元の測定などにおいて大きな影響を及ぼす．特に溶液タンパク質 NMR で使用する多くの実験において，この 90˚パルス幅は正確に調整されている必要がある．
高出力時のプロトンパルス幅は 5〜15 usec 程度であることが望ましい（装置導入時に装置エンジニアは
およそ 10 usec となるようにパルスパワー出力調整を行なっている）．これを大きく逸脱するような値である場合，よほどの高塩濃度であるかチューニングが正しく調整できていないことが考えられる．そのままの状態で測定することは装置を壊すことにもつながるのでチューニング状況等を確認すること．場合によってはサンプルを再調整すること．20 usec を超えてくるような場合には，長時間測定を開始してはいけない．
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その他パラメータ調整
eda

測定条件パラメータ設定ウインドウを呼び出す

ns

積算回数の表示／変更

eda コマンドまたは[ AcquPars ]のタブにより測定パラメータの編集が可能である．サンプルのタンパク質濃度が低い，綺麗なスペクトルが欲しいなどの理由で積算回数を増やした測定をしたいことがある．パラ
メータ設定ウインドウを表示させ ns の欄に新しい値を入力することで可能となる．もしくは ns コマンドによって ns パラメータの設定のためのサブウインドウを呼び出しても良い．この欄は簡単な四則演算が可能なため，
例：ns [ 8 ] -> ns [ 8*4 ]のように入力することで，積算回数を４倍にできる．
スペクトルにおけるシグナル強度比，S/N（signal / noise）は積算回数の平方根に比例する．積算回数を４倍することで２倍の S/N となる．サンプル濃度は単純に比例なので，２倍の濃度になれば同じ積算回数
でおよそ２倍の S/N となる．これは，とかく測定感度が問題になりがちな溶液タンパク質 NMR にとって非常に重要である．できるだけ高濃度に調整したサンプルは，後々の測定や解析にとって非常に有効である．NMR マシンタイムも装置維持費等でお金に換算できるため，サンプル調整のお金を惜しんで測定のためのマシンタイムを長大にすると，かえって損をすることになるので十分に留意すること．
通常のタンパク質においては積算回数である ns 以外のパラメータは，ほぼ変更の必要がない．ただ，もしかすると測定範囲外にプロトンシグナルがでるサンプルの場合があるかもしれない（例，heme 鉄を有す
る酸化型 CytC）．その場合には，eda で表示される測定パラメータの SW，Spectral width（観測幅）を変更する．
[1H-15N] HSQC の測定
new

新しい EXPNO の作成と Use Current parameters によるパラメータ引継ぎ

nhsqc[1H-15N] HSQC 測定のためのパルスシークエンス読み出し等（ラボ限定）

td

測定のポイント数設定

expt

測定時間の計測

efp

テスト１次元測定のフーリエ変換

xfb

２次元のフーリエ変換[1H-15N] HSQC は溶液タンパク質 NMR にとって基本となるスペクトルである．TopSpin では非常に多くのパルスシークエンスがインストールされている（TopSpin のバージョンにもよるが[1H-15N] HSQC だ
けでも十数種類）．そのうち大部分は過去の測定を再現させるための古いパルスシークエンスであり，新規サンプルでの測定に使用すべきものは数種類しかない．ラボ限定ではあるが，これらを簡素化するためのス
クリプトを作成してある．このスクリプトの使用手順は以下の手順で行う①

ZGPR で基本パラメータを設定②

new

新しい EXPNO の作成と Use Current parameters によるパラメータ引継ぎ

③

nhsqc

測定したいスクリプト名を入力

nhsqc コマンド後は，数回の質問に答える形で測定パラメータの設定が行える．使用できるラボ限定のスクリプト類は，TopSpin がインストールされている場所の下，TopSpin version/exp/stan/nmr/py/user の下にある．これらのスクリプトはテキストファイルなので自由に編集可能だが，編集する場合には管理者やスクリプト作成者の許可を得ること．
nhsqc コマンド後の最初に出てくるダイアログはプロトン 90˚ハードパルス幅，そのときのパルス強度，
観測中心のそれぞれの設定値の確認である．適切な値であることが確認できたら[ OK ]とする．次のダイア
ログではパルスシークエンスタイプを選択する．今回は[ echo/antiecho ]タイプを選択する．
選択後，テストの１次元測定を行う．td コマンドにより F1 軸のポイント数を１とする．サンプル濃度
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が十分に高い場合にはテストを１次元ではなく２次元で行っても良い（積算２回，15N の TD を 64 ぐらい）．今回の[1H-15N] HSQC などの２次元パルスにおける td コマンドでは F2 軸と F1 軸が表示される．左から F2，F1 軸であるため，右側のみ１とする．左側の F2 軸はそのままとすること（2048 か 1024 が入っている）．F1 軸は，[1H-15N] HSQC の場合 15N 軸のポイント数である．１のときは１次元測定，１以外の正の整数を入力した場合には２次元測定となる．F1 軸のポイント数を１としたあと，zgefp コマンドにより測定を実行する．測定完了後，FID 番号と PROCNO を尋ねられる．ここではそれぞれ 1，999 とする．
PROCNO 999 に FID１番の１次元スペクトルが保存され，それが表示される．
データブラウザをリフレッシュする（実験フォルダを一度閉じて開く）と PROCNO 1 以外に 999 が追加されている．必要であれば，積算回数，ns を変更し十分な信号強度でスペクトルが得られる条件を探索す
る．
積算回数は基本的に偶数とする．また，４，８の倍数といった使用できる数字に制限があるパルスシーク
エンスも存在する．[ PulseProg ]のタブで表示されるパルスシークエンスプログラムのテキストファイル文
末に記載されている注意書きを確認するか，[ AcquPars ]の ns 欄の右側に表示されている注釈を参照して決定すること．
積算回数を決定後，２次元測定へと移行する．td コマンドにより，F1 軸のポイント数を増やす．[1H15N] HSQCの場合には 128 / 256 / 512 などが適当である．数字が大きいほど，15N 軸のシグナル分解能が上がり信号がシャープになる．ただ 512 を超える値を設定してもシグナル分解能は上がらず， S/N 悪化のみを引き起こし意味をなさないので設定しないこと．また[1H-15N] HSQC の td で F1 軸に入力できる数字は偶数のみである．
もし測定前から信号の出現位置がわかっている場合には，観測域の設定を行うと良いだろう．観測域の設
定には観測幅と観測中心のぞれぞれの設定があり，それぞれ sw と o1p で設定ができる．直接観測軸である
F2 軸，1H の軸についての観測中心は移動できないが，間接観測軸である F1 軸，15N の軸は観測中心が変更可能である．[1H-15N] HSQC で nhsqc コマンドを使用した場合，15N 軸の観測幅は 36 ppm，観測中心
は 118 ppm で設定されている．つまり 100 ppm から 136 ppm が観測域である．
２次元に限った話ではないが，測定をしかける前には必ず測定にかかる時間を調べておく．expt コマン
ドにより測定時間が表示される．２次元以上の高次測定では zgefp コマンドは使用せず zg コマンドを使用する．測定終了後またはその経過について xfb コマンドによって，その時点での２次元スペクトルを確認できる．xfb コマンドは２次元のフーリエ変換を行うコマンドであり，[1H-15N] HSQC であればそのま
ま２次元スペクトルが表示される．
２次元スペクトルにおいても ZGPR での１次元測定と同様に位相補正モード（.ph コマンド）により位相補正を行う．２次元スペクトルでの位相補正は，.ph コマンドで表示される２次元スペクトルのシグナルの位置で右クリックをし，Add を選択する．このとき，複数のシグナルの位置を選択できる．選択後，左上の[ R ]で横方向（[1H-15N] HSQC の場合は 1H の軸），[ C ]で縦方向（同，15N の軸）について位相補正ができる．
nhsqc コマンドで選択できるパルスプログラムはいくつか用意してある．主に水消しの方法が異なるパルスシークエンスになっているため，テスト測定等で水消えが良くない場合には他のパルスプログラムを選択することも良いだろう．watergate タイプは[1H-15N] HSQC 以外の Bruker パルスプログラムにおいて広く用いられているため，これを選択するのも良いだろう．また，HD の追記があるパルスプログラムは特定の軸について half dwell 展開を用いている．これは 15N 軸の観測幅範囲外にある信号について正負反転した信号として観測できるように改変している．[1H-15N] HSQC では Arg 側鎖の信号がこれに該当することが多い．もしマシンタイムに余裕があるようであれば，この HD 付きの測定を試してみるのも良いだろう．

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[1H-15N] HSQC の測定後処理
edp

プロセスパラメータウインドウの表示

xfb

２次元スペクトルへの FT

stsr

FT 後のスペクトル表示範囲設定，開始点

stsi

FT 後のスペクトル表示範囲設定，開始点からの範囲.all

FT 後のスペクトルを全ての領域で画面内に収まるように表示.md

複数スペクトルの重ね合わせ描画モード

位相補正値など測定後の処理パラメータ（プロセスパラメータ）は，edp コマンドまたは[ ProcPars ]のタブによって確認ができる．フーリエ変換時のウインドウ関数設定もここで行える．処理パラメータはいくら変更しても生の測定データには一切影響しない．そのため元の値さえ覚えておけばスペクトルデータは再現が可能である．
位相補正値は Phase correction の項にまとめられている．位相補正をやり直すときには全てを０とする
ことで可能となる．位相補正値を変更後に，efp コマンドや xfb コマンドにより再度の FT を行うことでスペクトルが更新される．
[1H-15N] HSQC は通常，水よりも左側（低磁場側，化学シフト値が大きい側）にのみ信号が観測される．そのため，全体のスペクトルを表示しても右側半分は不要なデータである．FT のたびに左半分のスペクトルのみが表示されるよう，処理パラメータの画面にて F2 軸の STSR を 0，STSI を SI や TD の半分
値，今回は 1024 を入力し，xfb をする．するとスペクトル全体を表示する.all コマンドにおいても水よ
りも左側のスペクトルのみが表示されるようになる．
[1H-15N] HSQC は滴定実験などでも使用されるように，スペクトルを重ねて表示することが解析等において有用になる．スペクトルを重ね合わせて描画する.md コマンドを使いこなすと便利になるだろう．
その他の通常パルスシークエンスに関して
hnco

HNCO 測定のためのパルスシークエンス読み出し等（ラボ限定）

td

測定のポイント数設定

xfb

３次元以上の測定である場合，plane を選択しての FT.s3d

３次元 PROCNO への位相補正値反映

ft3d

３次元の FTタンパク質 NMR 測定では，多種類のパルスシークエンスを用いる．その大部分に関しては，ラボ限定のスクリプトファイルが対応している．その場合にはフォルダ（TopSpin version/exp/stan/nmr/py/user）を確認し，適切なコマンドを入力することになる．基本的な使用方法は上記の[1H-15N] HSQC と同じである．例えば，HNCO を測定したい場合，①

ZGPR で基本パラメータを設定②

new

新しい EXPNO の作成と Use Current parameters によるパラメータ引継ぎ

③

hnco

測定したいスクリプト名を入力とする．hnco スクリプトでは，[ watergate ]，[ echo/antiecho ]，[ trosy ]が選択できる．それぞれのサン
プルに適したものを使用する．わからない場合には先達の測定者に指示を仰ぐか，実際のスペクトルをみて判断するのが良い．目安として，低分子量のタンパク質，20 kDa 以下の場合には[ watergate ]もしくは[ echo/antiecho ]を使用し，高分子量のタンパク質，20 kDa 以上や 2D/13C/15N ラベルされたタンパク質の場合には[ trosy ]を使用するのが良いだろう．[ watergate ]と[ echo/antiecho ]は水消しの方法に違いがある．D 化されていない Tris や HEPES などの緩衝剤などや DTT，DPC など，水以外に 1H を持った低分子化合物が溶液中に大量に含まれている場合には[ echo/antiecho ]が良いだろう．
hnco の３次元測定の場合には，２次元のときと同様にテスト１次元測定によりシグナルの強度から積算
回数，ns を決定する．マシンタイムに余裕があれば，２次元について２種類測定し，信号の分散度合い，
15観測される領域，それぞれの信号強度を確認するとさらに良いだろう．hnco などの３次元測定の場合には，td コマンドによって F3 軸，F2 軸，F1 軸のそれぞれのデータポイント数について設定できる．F3 軸は 1H，F2 軸は 15N，F1 軸は 13C の軸である．テストの１次元の場合には，F2 軸と F1 軸を 1 とする．テスト２次元の場合には，F2 軸か F1 軸のどちらかを１とする．F3 軸はそのままとし，１を入力しない方のF2 軸または F1 軸は 64 程度で良いだろう．
TD の入力数値例） テスト１次元

2048，1，1

F2F3 plane のテスト２次元

2048，64，1

F1F3 plane のテスト２次元

2048，1，64

テスト１次元の場合には，efp として，PROCNO 999 を，テスト２次元の場合には，xfb として，
PROCNO は 213（テスト２次元の F1F3 plane を意味する）や 223 をそれぞれ使用すると良いだろう．信号が観測される領域については，15N 軸は，すでに[1H-15N] HSQC を測定していればそこでわかる．13C 軸は， F1F3 plane のスペクトルで判断する．
テスト測定後に３次元測定を行う．３次元測定の適切なポイント数はシグナル個数等による．20 kDa に届かないような溶液 NMR で扱う一般的なタンパク質での hnco の場合には，F2 軸（15N 軸）は 64，F1 軸
は 128（13C 軸）程度を上限とするのが良いだろう．F2 軸，F1 軸のポイント数には偶数のみ入れることができる．あまりに大きな数字は積算回数にもよるが膨大な測定時間が必要となる．設定後，zg コマンドにて測定を開始する前に必ず expt コマンドにより測定時間を確認すること．
hnco などの３次元測定において３次元の FT を行うには ft3d コマンドを使用する．ft3d コマンドを実行する前に xfb コマンドにより，位相補正を行う．xfb とすると，plane 選択と FID 番号を問われる．それぞれ 23，1 と入力する．その後，PROCNO を問われるので，わかりやすくするために F2-F3 plane を意味するように 23 とする．PROCNO 23 のスペクトルを使って位相補正を行う．やり方は２次元スペクトルのときと同じである．echo/antiecho タイプの HNCO の場合，efp コマンドによる１次元スペクトルでの位相補正値は，F2-F3 plane の２次元スペクトルや３次元スペクトルの F3 軸，1H の軸の位相補正値は 90˚
ずれている．90˚ずれているので，efp での１次元スペクトルの位相補正値に 90 を足しても良い．決定した
位相補正値について，３次元を処理するための PROCNO（通常、１）に反映させる．23 plase の位相補正
モード（.ph）において，位相補正後に.s3d とするか，直接[ ProcPars ] の Phase correction 項に入力する．反映後，ft3d コマンドにより３次元の FT を行う．
一部の SOFAST 測定について
sofastsofast パルスシークエンスの選択と読み出し（ラボ限定）

SOFAST 測定は測定高速化技術の一つである．SOFAST 測定では，1H に対して当てるパルスについて，周波数選択的な shaped
pulse を用いている．選択的にパルスをあてていることで，パルスが照射された 1H を取り囲む周辺環境には静磁場方向を向いたままの
1H が数多く存在することになる．パルスが当

たった 1H は，その周辺にある 1H との緩和効
果により縦磁化の回復時間が短くなる．縦磁化の回復時間が短くなるため，FID を取得したあとの待ち時間，d1 を短く設定できる．d1
は通常の測定では，1 秒程度が設定されているが，SOFAST では 0.2 から 0.5 秒程度に抑えられる．一度の scan 時間を大幅に短縮することができ，これによって測定時間を１／５から１／２程度に短縮することができる．
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一部の SOFAST パルスシークエンスについては sofast コマンドによってまとめられている．このコマンドによって測定できるスペクトル類については，TopSpin version/exp/stan/nmr/py/user の下にある sofast.pdf ファイ
ルなどを参照すること．
参考文献) Rossi et al., (2016), JBNMR, 66, 259-271

NUS（Non-uniform sampling）測定に関して
FnTYPE

traditional か non-uniform sampling を選択する（はじめに traditional でテスト１次元を測定し位相補正をする）

NusAMOUNTNUS で残すデータポイントの割合

ftnd

NUS 処理を行う

NUS（Non-uniform sampling）測定もまた測定
高速化技術の１つである．大部分の２次元以上の多次元 NMR 測定において，NUS を利用した測定時間の短縮が可能である．間接観測軸について通常では uniform sampling，すなわち等間隔の時間展開になっており，測定されるデータ点は敷き詰められた状態（右図 A）になっている．NUS 測定ではそ
れらのデータ点を間引いて測定を行う（右図 B）．これによって，後述にもあるが測定時間を 1/8 や 1/4 に短縮することができる．ただし，NUS 測定で得られる間引かれた FID データはそのまま FT することができない．間引かれた FID データから間引いた分の FID を再構築し，補完された FID を用いてはじめて FTを行うことができる（これを NUS 処理とする）．FID の再構築には一般的に MDD 法が用いられている．
MDD 法でははじめに間引いた FID から観測される信号位置を予測する．予測された信号位置について
FID が満たされているかどうか，複数回検証を行い，ある程度満たされた段階で，その信号位置から FIDを再構築する．再構築された FID では信号位置，すなわち周波数（＝化学シフト値）はかなりの確度で再現できるものの，信号強度は不確かなものとなりがちである．信号強度が重要となる測定，緩和解析測定や構造計算のための NOESY 測定に NUS は基本的に使用してはいけない．また信号強度にバラツキがあるよ
うな測定の場合，強度の強い信号については再現よく再構築できるが弱い信号については無視されることもありえる．これらも十分に考慮し使用すること．
スペクトルごとの間接観測軸の展開方法や，間接観測核の緩和時間と最大展開時間の関係性により，NUS による FID の間引きにおいて，どの領域の FID を優先的に取得する（残す）べきか，予測を立てる
ことができる．取得するデータポイントを選択することをスケジューリングと呼ぶ．右上の図 B では下方に密，13C 軸について短い展開時間点における FID を多めに測定するよう設定されている．それぞれのサン
プルや測定内容ごとに最適なスケジューリングを行うことは可能だが，これは主に，信号強度について再現性の良いスペクトルを得ることにおいて有用となる手法である．しかし前述のように，定量的な NMR 測定，信号強度を重要視するような緩和測定などであれば，そもそも NUS は使用するべきではない．一方
で，定性的な３次元測定，例えば主鎖帰属用の測定においては，スケジューリング手法の違いによる信号強度の強弱は解析結果に大きな影響を与えないだろう．言い換えれば定性的な NMR 測定に NUS を適用する
場合には，スケジューリングの方法はランダムとして構わない．
NUS 測定を実行する前に，同じパルスシークエンスでの通常測定を行い位相補正値の決定を行う．間接
観測軸の TD を全て 1 とし zgefp によりテスト１次元測定を行う．PROCNO は 999 とする．得られた１次元スペクトルデータについて位相補正を行う．この値を元の PROCNO 1 に反映させる． echo / antiecho17タイプの測定であれば，90 を足すこと．その後，それぞれの TD を設定し FnTYPE を nonuniform_sampling とする．NUS に関わるパラメータは[ AcquPars ]の NUS の項にまとめられている．
NusAMOUNT を 25%とすれば，データポイントを 1/4 に間引いた測定となる．観測されるシグナル個数にもよるが 25％程度とする．信号が少ない場合，例えば３次元で１００個程度の信号個数であれば，12.5％（1/8）くらいまで下げることができる．測定する FID 数を少なくするとスペクトル上にノイズが出やすくなる．決定されたスケジューリングは，EXPNO の下，nuslist ファイルに記載されている．また NUS 項の[ Show ] ボタンで確認することもできる．
NUS の測定後処理には専用のコマンド，ftnd を使用する．これは FID の再構築，FT を自動で行う．処理には長い時間，数分から１時間程度がかかる．処理を行うのは他の作業をしていない時間が良いだろう．
参考文献）Rovnyak et al., (2004), JMR, 2004, 170, 15-21.
ADC overflow
測定中に ADC overflow を含むメッセージが表示されることがある．これは測定した FID が reciever の能力を超えて信号が観測されている場合であり，得られた FID は単純な減衰になっていない．結果として
FT を行った際，乱れたスペクトルになり解析等には使用できない．また，この ADC overflow は装置を壊す原因にもなり得る．表示が確認された時点で測定を中断し，対処すること．他の測定者による測定であっても，表示が確認できた時点で測定を中断すること．ADC overflow のメッセージが表示されていたために測定を中断したことを測定者に伝えること．
対処方法としては rg 値を下げること，shigemi であればサンプル溶液部分に泡の発生などがないかを確認することなどがあげられる．ごく稀に，装置のハードウェアトラブルの可能性もあるので，個人の対処で改善されない場合には装置管理者に連絡すること．
ログブック
bsmsdisp

BSMS control suite を表示する（ヘリウム残量の確認）

装置の安定運用や過去の測定データに関する情報をまとめておくために，それぞれの装置にはログブックが設置されている．ログブックへの記述フォーマットは装置ごとに異なっているため，それぞれに従って記述すること．また，測定時に気付いたことやトラブルが発生した場合には，ログブックにその旨を記載し，必要に応じて装置管理者に連絡すること．
また最近の Bruker 装置では，ヘリウム残量を TopSpin 上で確認する．そのためログブックには大抵，ヘリウム残量を記録する欄がある．忘れずに記録しておくこと．ヘリウム残量は，bsmsdisp コマンドによって呼び出す BSMS control suite 上で確認することができる．
ヘリウム残量の表示には[ Last Read ]と[ Measure ]とがあり，[ Last Read ]が良い．[ Last Read ]は定期的に測定している最終更新値を表示し，現時点での残量は測定していない．一方で[ Measure ]は現時点での残量を測定する．ヘリウム残量の測定は，微量ではあるがヘリウム蒸発を伴うため，頻繁に行わない方が良い．
利用する上での重要な注意事項
複数の利用者が一つのユーザーアカウントで測定できる環境にある場合，データブラウザで他人のデータを自由に閲覧することができる．そのとき，間違って他人の測定データに上書き測定してしまうことがあり得る．例えば他人の測定データがアクティブな状態で zg コマンドを行ってしまうと，即座に他人の測定データの FID ファイルが消去される．消去されてしまうことへの予防策として，測定終了後はすみやかに測
定者個人のデータストレージ（できればパソコンなど）に保存すること．また，測定をしかけた後は、Main window に表示されているすべてのウインドウを消去しておくと良い．
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もし万が一にも他人の測定データを消去してしまった場合には、必ず元データの所有者に連絡すること．
もしこれを怠るようでは，装置の利用停止措置などを管理者より申し渡されても文句は言えない．

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