日大歯学 , 96（1）, 35-44, 2022

原著

マウス歯根膜における leptin receptor 陽性細胞の幹細胞性とLRP1 陽性細胞の役割について
中

村

純

基

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻

口腔構造機能学分野

日本大学歯学部歯科矯正学講座（指導：本吉満 教授，二宮禎 准教授）

要旨：
目的：歯根膜幹細胞（PDLSCs）は，歯根膜および骨の再生に重要な細胞である。Leptin receptor（Lepr）は間葉系幹細胞（MSCs）のマーカーの一つで，PDLSCs にもその発現がみられる。本研究では，歯根膜細胞（PDLs）から
Lepr 陽性細胞を分離し，その幹細胞性と多分化能を検証し，また low-density lipoprotein receptor-related
protein1（LRP1）陽性細胞の役割について検討した。
方法：マウス臼歯から PDLs を採取し，Lepr 陽性細胞を分離した。幹細胞マーカーの発現と多分化能は realtime RT-PCR と oil red O 染色によって調べた。また，抜歯窩における PDLSCs と LRP1 の関係は免疫組織化学的に，LRP1 の役割は siRNA を PDLs へ導入することで検討した。
結果：Lepr 陽性細胞は MSCs マーカーを発現し，骨芽細胞と脂肪細胞へ分化した。また，LRP1 陽性の PDLs は抜歯後早期に出現し，その後，骨形成を誘導した。PDLs の LRP1 mRNA を発現抑制すると，bmp-2，bmp-4，
opg の発現減少と rankl の発現増加が認められた。
結論：Lepr 陽性細胞は PDLSCs の特徴をもち，LRP1 は骨形成の調節に関わることが示唆された。
キーワード：歯根膜細胞，幹細胞，骨芽細胞分化，leptin receptor，low-density lipoprotein receptor-related
protein 1

Multipotency of leptin receptor-positive cells and function of LRP1 positive-cells
in the mouse periodontal ligament
Yoshiki Nakamura
Nihon University Graduate School of Dentistry, Major in Oral structural and Functional Biology
Department of Orthodontics, Nihon University School of Dentistry(Directors: Prof. Mitsuru Motoyoshi and Assoc. Prof. Tadashi Ninomiya)

Abstract: Purpose: Periodontal ligament stem cells (PDLSCs), which differentiate into osteoblasts,
cementoblasts and fibroblasts, are included in periodontal ligament cells (PDLs) and play a role in periodontal
tissue regeneration. Leptin receptor (Lepr), a marker of mesenchymal stem cells, is expressed in PDLSCs.
However, the function of Lepr-positive PDLs is not well understood. To investigate the characteristics of
Lepr-positive PDLs, experiments using mouse-derived PDLs were designed in vivo and in vitro.
Methods: Lepr-positive PDLs were isolated from PDLs in mouse molars and analyzed by real-time RT-PCR
and immunohistochemical staining. To define the effect of low-density lipoprotein receptor-related protein 1(LRP1) on PDLs in tooth socket, functional examination was performed using siRNA technique.
Results: Lepr-positive PDLs expressed the stem cell markers and differentiated into osteoblasts andadipocytes. Immunohistochemical staining on tooth socket revealed that LRP1-positive PDLs were firstdetected in the socket at 3 days after tooth extraction, increased in the granulation tissues at 5 days, anddifferentiated into osteoblasts and osteocytes with bone formation at 7 days. Furthermore, the expression of
bmp-2, bmp-4, and opg decreased, whereas rankl expression increased in LRP1 siRNA-introduced PDLs.
Conclusion: Lepr-positive PDLs has multipotency similar to PDLSCs, and LRP1 is involved in boneregeneration in tooth socket by regulating the interaction between osteoblasts and osteoclasts.
（受付：令和 4 年 1 月 15 日）
責任著者連絡先：中村純基
日本大学歯学部歯科矯正学講座〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8105
FAX：03-3219-8312
E-mail：deyo18032@g.nihon-u.ac.jp

35

日大歯学

第 96 巻第 1 号

Keywords: periodontal ligament cells, stem cells, osteoblast differentiation, leptin receptor, low-density
lipoprotein receptor-related protein 1

緒ligand（RANKL）も骨代謝を維持するために欠かせない言サイトカインである。RANKL は骨芽細胞や MSCs から分泌され，前駆破骨細胞の RANK と結合することによっ抜歯窩の修復は，骨折の修復と同様に，炎症期，増殖。炎症期は，炎症性細て，前駆破骨細胞から破骨細胞への分化を誘導する 12,13）。

胞が抜歯窩に浸潤し，血管内皮細胞や未熟な線維芽細胞

興味深いことに，低密度リポタンパク受容体ファミリーとともに肉芽組織を形成する。その後，増殖期に移行し，に属する膜タンパクの low-density lipoprotein receptor-

幹細胞から分化した骨芽細胞によって幼弱な骨がつくら

related protein 1（LRP1）を 欠 失 し た 骨 芽 細 胞 で は，れる。そして，骨形成期では骨芽細胞と破骨細胞の相互RANKL 産生が増加し，破骨細胞分化が促進する 14）。こ作用による骨のリモデリングが繰り返され，抜歯窩は成の LRP1 は，transforming growth factor-βや platelet-

熟した骨によって埋められるようになる。

derived growth factor などの多くのリガンドと結合す

期および骨形成期の過程を辿る

1,2）

抜歯窩修復の分子メカニズムを解明するには，歯根膜ることで，受容体依存型エンドサイトーシスにおいて機細胞（PDLs）に含まれる歯根膜幹細胞（PDLSCs）の特性を能し，細胞遊走，細胞内タンパク輸送，細胞分化などを調べる必要がある。これまでに，Hosoya ら は，green

調節している 15）。また，前駆破骨細胞にみられる LRP1

fluorescent protein（GFP）で標識したラット臼歯を野生の発現抑制は，破骨細胞分化を阻害することから，LRP1型ラット背部へ皮下移植した結果，GFP 標識 PDLs が骨は骨代謝および骨再生を調節する重要な因子の一つであ芽細胞に分化し，骨組織を形成することを示した。また，ると考えられている 16）。しかし，抜歯窩の骨再生に関与

Seo ら 4）は，PDLs に存在する CD146 と Stro-1 陽性の細する PDLSCs に発現している LRP1 の役割については不胞がセメント芽細胞，骨芽細胞および線維芽細胞に分化

明な点が多い。そこで，本研究では，抜歯窩での LRP1することを明らかにしている。Yuan ら も，Wnt に反陽性細胞の動態を調べるとともに，LRP1 の発現抑制が応する PDLs が抜歯窩修復の骨再生に関与することを報

骨形成関連因子へ及ぼす影響についても検討を加えた。

3）

5）

告 し て い る。 こ れ ら の 研 究 成 果 は，PDLs に 含 ま れ る

材料および方法

PDLSCs が歯槽骨の形成に重要な役割を演じていることを示すものである。

1.

実験動物

PDLSCs の特性を詳細に解明するには，PDLSCs の分

雄性 ddy マウス（6 週齢，日本エスエルシー，浜松）は，

離 な ら び に 解 析 が 必 須 で あ る。PDLSCs は，CD29，

12 時間の明暗サイクルを調整できる恒温室（23 ℃）で飼

CD44，CD73，CD90，CD105，CD146，CD166 お よ び

育した。また，飼育期間は，ラット・マウス MF 固形飼

Stro-1 などの間葉系幹細胞（MSCs）と同じ細胞膜抗原を料（オリエンタル酵母工業，東京）と水を自由に摂取させもつことが知られている

4-6）。近年，leptin シグナルがた。本研究は，日本大学歯学部動物実験委員会の承認（承MSCs の細胞分化を制御することが報告され 7），また，

認番号：AP18DEN037-3）を得て，米国国立予防衛生研究

骨髄にみられる leptin receptor（Lepr）陽性細胞が骨芽細所および国際疼痛学会のガイドライン 17）に従って，動物胞， 脂 肪 細 胞 お よ び 軟 骨 細 胞 へ の 分 化 能 を も つ こ と，の処置を行い，全ての実験において，実験動物の苦痛軽PDLs に存在する Lepr 陽性細胞が抜歯窩の骨再生に関減と使用動物数の低減に努めた。

与することが明らかになった

2.

。これらの研究は，Lepr

8,9）

PDLs の調製
5% isoflurane（ 大日本住友製薬，大阪）吸入および 5が PDLSCs の分離において有望な細胞膜抗原であることを示唆している。そこで，本研究では，まず，この Lepr

mg/kg butorphanol tartrate（Meiji Seika ファルマ，東に注目して歯根膜組織から Lepr 陽性細胞を分離し，そ京）を使用し，深麻酔下で心臓からの全採血によって安れらの幹細胞性と分化能を検証することとした。

楽死させたマウス上下顎の臼歯を抜歯し，3.75 mg/ml
kanamycin sulfate solution（Meiji Seika ファルマ，東京）

一方，抜歯窩治癒過程を理解するには，骨形成関連因子に関する知見も不可欠である。Bone morphogenetic protein-2に 4 ℃，2 時 間 浸 漬 し た。 そ の 後，phosphate buffer（BMP-2）は，転写因子の runt-related transcription factor

saline（PBS）で洗浄し，2 mg/ml collagenase（富士フィ2（Runx2）と osterix の発現を介して PDLSCs の骨芽細胞

ル ム 和 光 純 薬， 大 阪 ）と 0.25% trypsin（Invitrogen，分化を促進する 10）。また，前駆骨芽細胞や PDLSCs から

Waltham，MA，USA）を含んだ血清非添加 α -minimal

分泌された BMP-2 は，オートクリンに作用し，これら

essential medium（α -MEM）で，37 ℃，20 分間インキュの細胞から骨芽細胞への分化を促す

ベートした後，PDLs を回収した。この操作は 4 回繰り。

11）

返 さ れ， 毎 回 の 酵 素 処 理 後 に 採 取 し た PDLs は， 培 養BMP-2 と 同 様 に receptor activator of the NF-κB

36

歯根膜における LRP1 の役割について

令和 4 年 6 月

シ ャ ー レ へ 播 種 し，10% fetal bovine serum（FBS，草 津 ）を 使 用 し た。10μg の RNA を 鋳 型 に し て，

PAN Biotech GmbH，Aidenbach，Germany） と 1%

PrimeScript reverse transcriptase（タカラバイオ）と反応

antibiotic-antimycotic（Invitrogen）を含む α -MEM を用

さ せ，cDNA を 合 成 し た。Real-time RT-PCR は，TB

い て，37 ℃，5% 炭 酸 ガ ス 存 在 下 で 培 養 し た。 な お，

Green Premix Ex Taq Ⅱ（タカラバイオ）と CFX connect

PDLs は凍結保存することなく，その都度抜去臼歯からsystem（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）
を採取・調製し実験に供した。

使 用 し た。95 ℃，30 秒 間 の 前 処 理 後，95 ℃，5 秒 と

3.

60 ℃，30 秒のサイクルを 40 回繰り返すことで，DNA を

Lepr 強発現細胞（Lepr PDLs）の分離
hi

培養した PDLs を 0.05% trypsin 処理によってシャー増幅した。測定データは，
CFX maestro software（Bio-Rad

レから回収した後，PBS に懸濁させ，ウサギ抗 Lepr ポ

Laboratories）
を利用して，2-ΔΔCT 法によって解析した 18）。

リクロナール抗体（100 倍希釈，プロテインテック・ジャ

使用したプライマーの塩基配列を表 1 に示す。

パ ン， 東 京 ）で，4 ℃，30 分 間， イ ン キ ュ ベ ー ト し た。
その後，PBS で洗浄し，ヤギ抗ウサギ IgG マイクロビー

表1ズ（5 倍 希 釈，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，

Real-time RT-PCR に使用したプライマーの塩基配列

Name

Germany）を加えて，4 ℃，30 分間の反応を行い，細胞

actinを磁気ビーズで標識した。PBS で洗浄後，細胞浮遊液は
磁 石 に 設 置 し た 分 離 カ ラ ム（MACS MS，Miltenyi

lepr

Biotec）へ ア プ ラ イ し，PDLs に 含 ま れ る Lepr 強 発 現PDLs（Lepr

hiPDLs）をカラムに吸着させた。分離カラム

を PBS で洗浄後，磁石から取り外し，吸着した Lepr

cd29

hi

cd44

PDLs をシリンジで押し出し回収した。また，分離カラムに吸着しなかった flow through も同時に回収し Lepr

ft

cd73

PDLs と し て， 比 較 対 象 に し た。 回 収 さ れ た Lepr hi
PDLs と Lepr ft PDLs は培養シャーレで，7 日間培養しcd90てから実験に供した。
4.

Leprhi PDLs と Leprft PDLs の分化能

cd105

Lepr hi PDLs と Lepr ft PDLs をそれぞれ 48-well plateに播種し（5×10 cells/well），10%FBS を含む α -MEM で
4

cd106

16 時間培養した後，100 ng/ml BMP-2（R&D systems，

cd146

Minneapolis，MN，USA）を添加し，骨芽細胞へ分化させた。培地交換は 2 〜 3 日毎に実施し，7 日目に RNA をcd166抽出した。得られた RNA から cDNA を合成し，alkaline
phosphatase（alp），osterix（osx），osteocalcin（ocn）の遺伝

alp

子発現について検討した。
同 様 に，24-well plate に 播 種 し た Lepr hi PDLs と

osx

Lepr ft PDLs（1×105 cells/well）を 48 時間培養した後，脂肪細胞分化因子（0.5 mM isobutyl-1-methyl xanthine，ocn

100 nM dexamethasone，0.1 mM indomethacin，10μg/
adiponectin

ml insulin）を添加することで脂肪細胞へ分化させた。培
地交換は 2 ～ 3 日毎に実施し，21 日目に 10% 中性ホルマ

c/ebp

リン溶液によって細胞を固定し，oil red O 溶液で染色した。染色後の細胞は 1 ml isopropanol を加えて，色素をbmp2

溶出させ，マイクロプレート吸光分光光度計（SpectraMax
ABS Plus, モレキュラーデバイスジャパン，東京）を利

bmp4

用して，波長 492 nm の吸光度を計測した。さらに，培養 21 日目の細胞から RNA を抽出し，cDNA の合成後，

opg

adiponectin と c/ebp の遺伝子発現について調べた。
5.

RNA 抽出と real-time RT-PCR

rankl

RNA の抽出は，NucleoSpin RNA Plus（タカラバイオ，

37

Primer sequence
Forward

5’-TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’

Reverse5’-AAGAAGGAAGGCTGGAAAAGAG-3’

Forward5’-TCAGAATTTTGGGTGGAAAA-3’

Reverse5’-GTCCAGGTGAGGAGCAAGAG-3’

Forward

5’-TGGCAACAATGAAGCTATCG-3’

Reverse5’-ATGTCGGGACCAGTAGGACA-3’

Forward5’-CTCCTTCTTTATCCGGAGCAC-3’

Reverse5’-TGGCTTTTTGAGTGCACAGT-3’

Forward5’-ATGAACATCCTGGGCTACGA-3’

Reverse5’-GTCCTTCCACACCGTTATCAA-3’

Forward5’-AACTCTTGGCACCATGAACC-3’

Reverse5’-TCGGGACACCTGCAAGAC-3’

Forward5’-CATTGCACTTGGCCTACGA-3’

Reverse5’-GATGTTGACTCTTGGCTGTCC-3’

Forward5’-TCTTACCTGTGCGCTGTGAC-3’

Reverse5’-ACTGGATCTTCAGGGAATGAGT-3’

Forward5’-AAACTGGTGTGCGTCTTCTTG-3’

Reverse5’-CTTTTCCTCTCCTGGCACAC-3’

Forward5’-CTTCAGTGTTTGGGGAATGG-3’

Reverse5’-TTATGCCTTCAGGCTGTCCT-3’

Forward5’-CGGATCCTGACCAAAAACC-3’

Reverse5’-TCATGATGTCCGTGGTCAAT-3’

Forward5’-AGAGATCTGAGCTGGGTAGAGG-3’

Reverse5’-AAGAGAGCCTGGCAAGAGG-3’

Forward5’-AGACTCCGGCGCTACCTT-3’

Reverse5’-CTCGTCACAAGCAGGGTTAAG-3’

Forward5’-GGAGAGAAAGGAGATGCAGGT-3’

Reverse5’-CTTTCCTGCCAGGGGTTC-3’

Forward5’-AAACAACGCAACGTGGAGA-3’

Reverse5’-GCGGTCATTGTCACTGGTC-3’

Forward5’-CGGACTGCGGTCTCCTAA-3’

Reverse5’-GGGGAAGCAGCAACACTAGA-3’

Forward5’-GAGGAGTTTCCATCACGAAGA-3’

Reverse5’-GCTCTGCCGAGGAGATCA-3’

Forward5’-GTTTCCCGAGGACCACAAT-3’

Reverse5’-CCATTCAATGATGTCCAGGAG-3’

Forward5’-AGCCATTTGCACACCTCAC-3’

Reverse5’-CGTGGTACCAAGAGGACAGAGT-3’

日大歯学

6.

第 96 巻第 1 号

藤化学，東京）で対比染色を施した。スライドは水洗後，マウス臼歯の抜歯と組織切片作成
2% isoflurane 吸 入 お よ び 5 mg/kg butorphanol

上昇エタノールに浸漬させることで脱水し，キシレンでtartrate（Meiji Seika ファルマ，東京）により，マウスを透徹後，標本用封入剤（MGK-S，松浪硝子工業，大阪）で麻酔し，上顎第一臼歯を鉗子によって抜歯した。抜歯後，封入した。

1，3，5，7 お よ び 10 日 目 に 上 顎 骨 を 摘 出 し，4%9.

siRNA を使用した LRP1 発現の抑制
PDLs を 6-well plate に播種（7×104 cells/well）した

paraformaldehyde で 4 ℃，16 時間固定した。採取した上顎骨は 10% EDTA 溶液に 4 週間浸漬して脱灰後，パ後，Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent

ラフィン包埋し，厚さ約 4μm の切片を作成した。

（ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA）と7.

Micro-CT 撮影

10 nM の LRP1 siRNA（終濃度：8 pmol/well，Qiagen，

抜歯後 5，7 および 10 日目に，2% isoflurane 吸入およ

Hilden，Germany）を添加し，3 日間培養した。使用したび 5 mg/kg butorphanol tartrate（Meiji Seika ファルマ，

L R P1 s i R N A 1 〜 4 と n e g a t i v e c o n t r o l s i R N A

東京）により，マウスを麻酔し，上顎第一臼歯の抜歯窩（Qiagen）の塩基配列を表 2 に示す。LRP1 siRNA 1 ～ 4を micro-CT（R_mCT，リガク，東京）で撮影した。撮影を導入した PDLs をそれぞれ siPDL1 ～ 4 とし，negative

条件は，管電圧 100 kV，管電流 160μA，撮影時間 2 分

control siRNA を cPDL，また siRNA 非処理の PDLs をおよび撮影倍率 10 倍とした。撮影データの解析は，画iPDL とした。

像処理ソフトの i-VIEW（モリタ，東京）を使用した。

10. Western blot8.

免疫組織化学siPDL1 〜 4，iPDL，cPDL は細胞溶解液（0.1% NP-40

PDLs を 35 mm glass base dish（イワキ，東京）に播種し

l y s i s b u f f e r ， 2 0 m M T r i s （ p H 7 . 5 ）， 5 0 m M（1×103 cells/dish），16 時間の培養後，4% paraformaldehyde

β-glycerophosphate，150 mM NaCl，1 mM EDTA，で固定し，0.2% triton-X 100 で透過処理を施した。PBS

25 mM NaF，1 mM Na3VO4，セリン / システイン / ア

で洗浄後，ヤギ抗マウス Lepr ポリクロナール抗体（100スパラギン酸 / サーモリシン様プロテアーゼ阻害剤

倍希釈，R&D system）で，4 ℃，16 時間の反応を行い，（Sigma Aldrich））でそれぞれ処理し，14,000×g，15 分

PBS で洗浄後，二次抗体の alexa fluor 555 標識ロバ抗間の遠心分離によって，上清を回収した。得られた上清ヤギ IgG（Invitrogen）と室温で，1 時間反応させた。PBSのタンパク量は，protein assay rapid kit Wako Ⅱ（富士で 洗 浄 後，Hoechst 33342 溶 液（Sigma Aldrich，St.

フィルム和光純薬）によって定量した。30μg のタンパクLouis，MO，USA）で核染色を行った後，蛍光顕微鏡（オを含むそれぞれの上清は SDS sample buffer と混和後，リンパス，東京）で観察した。

95 ℃で 5 分間加熱し，12% polyacrylamide gel（Bio-Rad

パラフィン切片は，キシレンで脱パラフィン後，下降

Laboratories）へアプライし，電気泳動で分画した。泳動エタノールに浸漬させて親水性にした。0.3% 過酸化水素

終了後，nitrocellulose membrane（GE Healthcare Life

水で，内因性ペルオキシターゼを失活させ，PBS で洗浄

Sciences，Little Chalfont，UK） に 転 写 し，PVDF

後，3% bovine serum albumin（富士フィルム和光純薬）

blocking reagent（東洋紡，大阪）に浸漬させることで非によって室温で 1 時間のブロッキングを行った。ウサギ

特 異 的 反 応 の ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た。PBS で 洗 浄 後，

抗 LRP1 ポ リ ク ロ ナ ー ル 抗 体（100 倍 希 釈，Abcam，

membrane はウサギ抗 LRP1 ポリクロナール抗体（2,000

Cambridge，UK）で，4 ℃，16 時間の反応後，PBS で洗

倍希釈，Abcam）または，マウス抗β-actin 抗体（10,000

浄し，ヒストファインシンプルステインマウス MAX-PO

倍希釈，Sigma Aldrich）と混和した Can Get Signal 溶（ニチレイバイオサイエンス，東京）を滴下して，さらに液（ 東 洋 紡 ）で，4 ℃，16 時 間 反 応 さ せ た。 洗 浄 後，

室温で 1 時間，静置した。PBS で洗浄後，ヒストファイ

membrane は，HRP 標識 2 次抗体（Bio-Rad Laboratories）

ン DAB 基質キット（ニチレイバイオサイエンス）を用いと混和した Can Get Signal 溶液中に室温で 1 時間反応て，LRP1 の局在を可視化し，hematoxylin solution（武させてから，ECL 溶液（GE Healthcare Life Sciences）に浸し，その発光を ChemiDoc XRS System（Bio-Rad

表2

Laboratories）で撮影した。取り込んだ画像は ImageJ

LRP1 の発現抑制に使用した siRNA の塩基配列

Name

Target sequence

Negative control

5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’

siLRP1 1

5’-CACGTTGGTTATGCACATGAA-3’

siLRP1 2

5’-CTGCCGGGTGTACAAATGTAA-3’

siLRP1 3

5’-TGGCAGATGTATTAACATCAA-3’

siLRP1 4

5’-CGGAGTCACTTACATCAATAA-3’（National Institute of Health，Bethesda，MD，USA）
を利用し，LRP1 およびβ-actin のバンドのデンシトメト
リー処理から得たグラフの面積を計算することで，タンパクの発現強度を解析した。
11. 統計学的解析得られたデータの統計分析には，GraphPad Prism 8（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）を用いた。

38

歯根膜における LRP1 の役割について

令和 4 年 6 月

2 つのグループ間の比較は unpaired Student t-test，ま歯の抜歯窩を micro-CT を利用して経日的に撮影した。

た複数のグループ間の比較は，一元配置分散分析を行っ

抜歯後 5 日目の抜歯窩に不透過像は認められなかった

た後に，post hoc テストとして Tukey 検定を行った。実が，7 日目になると抜歯窩の辺縁に骨組織と思われる不験は，3 回繰り返し，得られた結果を平均値と標準偏差

透 過 像 が 出 現 し，10 日 目 に は 抜 歯 窩 全 体 を 占 め たで示すとともに，有意水準を 0.05 とした。

（図 3 A）。抜歯窩の骨再生過程にみられる LRP1 陽性細結
1.

胞の存在を調べるために，LRP1 を免疫組織化学的に染果色した。抜歯後 1 日目は，抜歯窩内の細胞は乏しかったが，3 日目になると抜歯窩全体は肉芽組織によって覆わ

Lepr 強発現細胞の幹細胞性について培養した PDLs に対する Lepr 抗体の特異性を免疫組れ，わずかに LRP1 陽性細胞が確認できた（図 3 B）。5 日

織化学的に調べた結果，PDLs の一部に Lepr 陽性細胞の目になると，抜歯窩には未熟な骨組織の形成が始まり，

存 在 が 確 認 で き た（ 図 1）。MACS に よ っ て 分 離 し た

LRP1 陽性細胞が窩内の広範囲に認められた（図 3 B）。7

Lepr

PDLs に み ら れ る Lepr の 発 現 レ ベ ル を，real

日目の抜歯窩は骨組織によってほとんど置換され，LRP1

time RT-PCR で検討した。その結果，Leprhi PDLs は分の発現も再生骨周辺の骨芽細胞や骨小腔内の骨細胞に確

離カラムに吸着しなかった Lepr

hi

PDLs よりも約 1.8 倍認できた（図 3 B）。しかし，10 日目になると，LRP1 の高い Lepr 遺伝子発現を示した（図 2 A）。また，Lepr hi

発現は弱まり，一部の骨芽細胞や骨細胞のみに発現がみ

PDLs で は，MSCs の 細 胞 膜 抗 原 で あ る cd44，cd73，られた（図 3 B）。

cd90，cd105，cd146 の発現が Lepr ft PDLs と比べて強3.

ft

LRP1 の PDLs における役割

PDLs の培養系

Lepr 陽性細胞に発現している LRP1 の機能を明らかにに加えて骨芽細胞へ分化誘導した結果，Leprhi PDLs は，

す る た め，PDLs に siRNA（siLRP1 1 〜 4）を 導 入 し て

骨芽細胞マーカーである alp，osx，ocn の発現が Lepr ft

LRP1 mRNA の発現を抑制した。その結果，siLRP1 1，2，

PDLs よりも強かった（図 2 C）。同様に，脂肪細胞分化

4 を導入した PDLs で，LRP1 の発現レベルがコントロー

誘導因子を Lepr

ル（cPDL）と比較して，顕著に低かった（図 4 A，B）。特かった（図 2 B）。次に，BMP-2 を Leprhihi

PDLs の培養系に加えて，脂肪細胞へ
PDLs とに LRP1 の発現抑制が確認できた siPDL1 と siPDL4 かPDLs のどちらにも oil red O 陽性細胞が観察でら RNA を抽出して，骨代謝関連因子の発現について調の 分 化 能 に つ い て 調 べ た。 そ の 結 果，Lepr
Lepr

ft

hi

PDLs では成熟脂肪細胞の特徴である脂べた。その結果，siPDL1 と siPDL4 は，コントロール

肪滴（図 2 D）と脂肪細胞マーカーの adiponectin と c/ebp（cPDL）と比較して，bmp-2，bmp-4，opg の発現が少なく，の発現が強かった（図 2 E）。

rankl の発現が多かった（図 4 C）。

きたが，Lepr2.

hi

抜歯窩の骨再生と LRP1 陽性細胞の動態

考

抜歯窩の骨再生を観察するために，マウス上顎第一臼

察

本研究によって，PDLs から分離した Lepr hi PDLs が幹細胞としての細胞膜抗原マーカーを発現していること，また誘導培地によって Lepr hi PDLs が骨芽細胞および脂肪細胞へ分化することが示された。すなわち，歯根膜の Lepr 陽性細胞は多分化能を有する幹細胞であること を 実 験 的 に 検 証 す る こ と が で き た。 具 体 的 に は，Lepr hi PDLs において，Lepr ft PDLs よりも有意に高い
cd44，cd73，cd90，cd105 および cd146 の発現が認められた。これらの細胞膜抗原は，骨髄由来の MSCs だけ
でなく，PDLSCs でも高い発現レベルを示すことが報告
さ れ て お り 6,19,20）， な か で も CD73，CD90，CD105 は，MSCs として同定するために必要な細胞膜抗原とされている 20）。
多分化能については，PDLSCs がセメント芽細胞，脂肪細胞，そして線維芽細胞へ分化することを Seo ら 4）が報告して以降，PDLSCs の同定において，間葉系細胞への分化能を実際に示すことが求められるようになった。
図1

このため，PDLs の side population や限界希釈によって

PDLs の免疫組織化学による Lepr 陽性細胞の同定
矢印は Lepr 陽性細胞を示す（スケールバー：30μm）。

得られたクローンについても，MSCs の細胞膜抗原を発

39

日大歯学

A

第 96 巻第 1 号

B

C

D

E

図2

Leprhi PDLs の幹細胞性の検討
A：Lepr 強発現 PDLs（Lepr hi PDLs）と flow through PDLs（Lepr ft PDLs）における Lepr の遺伝子発現，B：Lepr hi PDLs と Lepr ft
PDLs の細胞膜抗原（幹細胞抗原）の遺伝子発現，C：Leprhi PDLs と Leprft PDLs の骨芽細胞マーカーの遺伝子発現，D：Oil red O 染色による Leprhi PDLs と Leprft PDLs の脂肪細胞分化能の評価（スケールバー：100μm），E：Leprhi PDLs と Leprft PDLs の脂肪細胞マーカーの遺伝子発現，*p ＜ 0.01，統計学解析は A と B では unpaired Student t-test を，C と D では一元配置分散分析と Tukey 検定を使用した（n＝3）。

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歯根膜における LRP1 の役割について

令和 4 年 6 月

現し，かつ骨芽細胞と脂肪細胞へ分化するということかした可能性もある。本研究の結果が示すように，Lepr は，ら PDLSCs と認知されるに至っている 11,21）。本研究では，

PDLSCs の分離に有用であるが，他の細胞膜抗原との組

BMP-2 で刺激した Lepr

合わせで用いることも検討することも必要と考えられ

hi

PDLs では alp，osx，ocn の強る。

い発現が認められ，脂肪細胞への分化誘導によって脂肪滴をみる成熟脂肪細胞への分化が生じることを示した。

本研究は，LRP1 陽性細胞が抜歯後 3 日目に抜歯窩内

これらの結果は，Lepr hi PDLs が骨芽細胞と脂肪細胞のに現れ，その後，抜歯窩内の骨再生に関わることを明ら

そ れ ぞ れ に 分 化 で き る 能 力 を も ち，Lepr hi PDLs がかにした。PDLSCs として考えられている Lepr 陽性細PDLSCs であることを明確に支持する知見だと考えられ胞や axin2 陽性細胞もまた，抜歯後 3 日で，窩内に動員る。

されて骨組織を再生する細胞として働く 5,9）。LRP1 陽性

本研究では，抗 Lepr 抗体による分取で flow throughとした Lepr

細胞は，Lepr 陽性細胞および axin2 陽性細胞と類似した

PDLs よりも有出現パターンや分布 5）を示したことから，PDLSCs であ意に低レベルだが，骨芽細胞と脂肪細胞の分化マーカー

り，かつ，LRP1 の発現が PDLSCs の細胞分化および抜が検出された。培養 PDLs には，弱い Lepr 陽性を示す

歯窩再生に関わっている可能性がある。しかし，本研究細胞が散見されたことから，使用した抗 Lepr 抗体に対では，LRP1 陽性細胞が PDLSCs である所見を得ておらして affinity の低い Lepr 陽性細胞が flow through に含ず，この仮説を立証するためには，さらなる検討が必要

まれている可能性があり，また，その Lepr 陽性細胞と

である。

ft

PDLs においても，Leprhi

陰性細胞の存在比がマーカー発現量の検出に影響を及ぼ

PDLSCs の細胞分化は，BMP シグナルによって調節

A

B

図3

抜歯窩の骨再生と LRP1 発現の経日的観察
A：Micro-CT による抜歯窩の経日的観察，矢印は抜歯窩を示す。B：免疫組織化学による抜歯窩の LRP1 陽性細胞，下段は上段の囲線の拡大像，矢印は LRP1 陽性細胞を示す。スケールバー：200μm（上段），50μm（下段）

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日大歯学

第 96 巻第 1 号

されており 22），Katagiri ら 23）は，BMP-2 とレチノイン

している。これまでの報告によれば，PDLSCs は BMP-2

酸 の 共 刺 激 が， マ ウ ス 多 分 化 性 細 胞 株 C3H10T1/2 のを 分 泌 す る こ と に よ っ て， 自 ら の 骨 芽 細 胞 分 化 を 促

ALP 発現を誘導することを報告した。その後，脊椎動物

し 11,26），また MSCs の RANKL 発現は前駆破骨細胞の破の四肢形成に関わる BMP-4 も，前駆骨芽細胞の骨芽細骨細胞分化を誘導する 26）と考えられている。

胞への分化を誘導する因子として報告された 24,25）。本研

本研究で得られた結果から，PDLSCs は，エンドサイ

究において，LRP1 siRNA の PDLs への導入は，bmp-2

トーシス型の受容体膜タンパク LRP1 の関与のもとに，と bmp-4 および RANKL のデコイレセプターである opg

BMP-2 や RANKL， さ ら に は BMP-4 や OPG を 産 生 しの発現レベルを抑制し，破骨細胞分化に必要な rankl のて，オートクリンおよびパラクリン的な作用によって，発現を促進した。これらの結果は，PDLs に発現してい骨芽細胞および破骨細胞の分化を調節している可能性がる LRP1 が，PDLSCs の骨芽細胞分化を誘導するとともあることが示唆された。

に，その一方で，PDLSCs の OPG の発現増加を介して前駆破骨細胞の破骨細胞への分化を阻害することを意味

A

B

C

図4

PDLs における LRP1 の発現抑制と遺伝子発現
A：siRNA による LRP1 の発現抑制，Western blot によって LRP1 の発現レベルを調べた。siLRP1 1 〜 4 を導入した PDLs をそれぞれ，
siPDL1，2，3，4 とした。また，control として siRNA 非処理の PDLs を iPDL とし，negative control siRNA を導入した PDLs を
cPDL と表した。B：LRP1 の発現，C：siLRP1 1 と 4 をそれぞれ導入した siPDL1 と 4 の bmp-2，bmp-4，opg，および rankl 発現，
real-time RT-PCR によって，それぞれの遺伝子発現を調べた。#p ＜ 0.05，*p ＜ 0.01，統計学解析は一元配置分散分析の後，Tukey 検定を行った（n＝3）。

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歯根膜における LRP1 の役割について

結論

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本研究では，PDLs にみられる Lepr 陽性細胞の幹細胞性と LRP1 陽性細胞の機能について検討し，その結果，
以下の結論を得た。
1.

PDLs に Lepr 陽性細胞の存在を確認した。

2.

Lepr hi PDLs に 幹 細 胞 マ ー カ ー の cd44，cd73，
cd90，cd105 お よ び cd146 の 発 現 を 認 め， 骨 芽 細胞および成熟脂肪細胞への分化能を示した。

3.

LRP1 陽性細胞は，抜歯後 3 日の窩内にみられ，骨芽細胞に分化して，抜歯窩の骨再生を誘導した。

4.

LRP1 の発現抑制によって，PDLs の bmp-2，bmp-4
および opg の発現が抑制され，rankl の発現が亢進した。

本研究遂行にあたり，格別たるご指導およびご校閲を賜りました日本大学歯学部歯科矯正学講座 本吉 満 教授，日本大学歯学部解剖学第Ⅰ講座 二宮 禎 准教授に謹んで深く感謝を申し上げます。また，本研究を通じ，多大なるご協力を賜りました日本大学歯学部歯科矯正学講座および日本大学解剖学第Ⅰ講座の皆様に感謝申し上げます。
なお，本研究では開示すべき利益相反はない。
文

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