日大歯学 , 96（1）, 11-18, 2022

原著

セピアプテリンの末梢投与による脳内セロトニン代謝回転の亢進
大 橋 晶 子 1,2
外 木 守 雄 4,7

永
佐
1

2
3

島
藤

利
秀

通 3,4
一 6,8

酒
髙

井
橋

富

嶺 5,6
久 1,2

日本大学歯学部解剖学第Ⅰ講座

日本大学歯学部総合歯学研究所 機能形態学部門

日本大学大学院 歯学研究科 歯学専攻 口腔構造機能学分野
4
5

6
7
8

日本大学歯学部口腔外科第Ⅰ講座

日本大学大学院 歯学研究科歯学専攻 応用口腔科学分野
日本大学歯学部歯科保存学第Ⅲ講座

日本大学歯学部総合歯学研究所 生体防御部門

日本大学歯学部総合歯学研究所 高度先端医療研究部門

要旨：
目的：テトラヒドロビオプテリン（BH4）は，トリプトファン水酸化酵素（TPH）やチロシン水酸化酵素に共通する補酵素である。モノアミン作動性神経細胞内の BH4 濃度の上昇はモノアミンの生合成を促進するが，BH4 を末梢から投与しても脳内のモノアミンの生合成を促進しないため，BH4 は血液脳関門（BBB）を通過しないと言われている。
BH4 のサルベージ経路合成系の基質であるセピアプテリン（SP）は，細胞内に BH 4 を補充する能力が優れていることから，SP の投与によって細胞および脳内のセロトニン（5HT）合成が促進するかどうか検討した。
方法：高速液体クロマトグラフィーと蛍光検出器を使用して，BH4 と SP による in vitro での BBB 透過量と，5HT 産生細胞（RBL2H3）への BH4 補充効率と TPH 活性の上昇効率をそれぞれ比較した。また，SP の末梢投与後，マウス脳内の BH4 と 5HT 量の変化と，それらの代謝産物の経時変化も測定した。
結果：SP の BBB 透過量は BH4 と有意な差がなかったが，RBL2H3 への BH4 補充効率，およびこれに起因するTPH 活性の促進効果は BH4 に比べて約 20 倍も高かった。SP のマウス腹腔内への投与によって，脳内 5HT 量は変化しなかったが，5HT の代謝産物量は約 2 倍上昇した。
結論：SP の末梢投与が非侵襲的に脳内の BH4 レベルを増加させ，セロトニン合成を促進する薬剤となる可能性が示唆された。
キーワード：テトラヒドロビオプテリン，セピアプテリン，抗うつ薬，セロトニン生合成，血液脳関門

Peripheral Administration of Sepiapterin Increases Brain-serotonin Turnover
Akiko Ohashi1,2, Toshimichi Nagashima3,4, Ryo Sakai5,6,Morio Tonogi4,7, Shuichi Satoh6,8, Tomihisa Takahashi1,21Department of Anatomy, Nihon University School of Dentistry2

Division of Functional Morphology, Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry

3

Division of Oral Structural and Functional Biology Nihon University Graduate School of Dentistry4

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Nihon University School of Dentistry
5

Division of Applied Oral Science, Nihon University Graduate School of Dentistry6

Department of Periodontology, Nihon University School of Dentistry

Division of Immunology and Pathobiology, Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry

7
8

Division of Advanced Dental Treatment, Dental Research Center, Nihon University School of Dentistry

Abstract: Purpose: Tetrahydrobiopterin (BH4) is a coenzyme of tryptophan hydroxylase (TPH) and tyrosinehydroxylase involved in aromatic monoamine biosynthesis in monoaminergic neurones. However, peripheral
BH4 administration does not increase monoamine biosynthesis in the brain as it cannot cross the blood–brain
barrier (BBB). As sepiapterin (SP), a substrate required for the BH 4 salvage pathway, can replenish BH4 in（受付：令和 3 年 12 月 10 日）
責任著者連絡先：大橋晶子
日本大学歯学部解剖学第 I 講座
日本大学歯学部総合歯学研究所機能形態部門〒 101-8310 東京都千代田区神田駿河台 1-8-13

TEL：03-3219-8120
FAX：03-3219-8318
E-mail：oohashi.akiko@nihon-u.ac.jp

11

日大歯学

第 96 巻第 1 号

various cell types, we investigated whether SP can promote the BBB permeability and increase serotonin(5-hydroxytryptamine, 5-HT) synthesis in the brain.
Methods: High-performance liquid chromatography and fluorescence analyses were performed to determine
the BBB permeability, BH 4 replenishment efficiency and TPH enzyme activity in 5-HT-producing RBL2H3
cells treated with BH 4 or SP. Time-dependent changes in the levels of BH 4 and 5-HT as well as their
metabolites were also examined in mice peripherally administered SP.
Results: In contrast to the extremely weak BBB permeability of SP in our in vitro model, the BH 4
replenishment efficiency and TPH activity in SP-treated RBL2H3 cells were increased by approximately
20-fold compared to cells treated with BH 4. Furthermore, intraperitoneal administration of SP approximately
doubled the levels of 5-HT-derived metabolites compared to those of BH4.
Conclusion: The results of this study suggested that SP has therapeutic potential for increasing BH4 levels
and serotonin synthesis in the brain.
Keywords: tetrahydrobiopterin, sepiapterin, antidepressant, serotonin biosynthesis, blood-brain barrier緒

らかになっている 12,13）。

言

一般的にこれらの疾患に対しては，希少疾病用医薬品

グアノシン三リン酸から新生合成される複素環化合物

として BH4 製剤（塩酸サプロプテリン，第一三共，東京）であるテトラヒドロビオプテリン（BH4）は，芳香族アミが投与される 13）。しかし，一日の BH4 排出量から算出でノ酸水酸化酵素であるトリプトファン水酸化酵素（TPH）

きる BH4 必要量に比べて過剰量の BH4 を投与しなけれやチロシン水酸化酵素（TH）の補酵素として働き，一酸

ば，BH4 によるフェニルアラニン低下効果が得られない。

化窒素合成酵素（NOS）の補因子でもある 1）。このほか，

また，BH4 の薬価は高額であるため，高血圧や糖尿病，

BH4 は T 細胞の増殖や神経細胞からのモノアミン放出の脂質異常症などに起因する内皮型血管機能障害に対して促進など，多くの細胞機能の維持に関与することが知ら

BH4 を使用することは経済的な観点から現実的ではなれているが，その作用メカニズムは十分に解明されていい。中枢神経系のモノアミン不足や血管障害のようにない 2-4）。BH4 がドーパミンやノルアドレナリン，およびBH4 補充療法の効果が期待される疾患は多岐にわたる。

セロトニン（5HT）などのモノアミンの生合成を律速する

特に，中枢性の神経疾患の治療に BH4 の補充療法を適用ために働く TPH や TH の補酵素であることが明らかにさせるには，BBB を通過して脳内に BH4 を補充するこなって以降，モノアミン性神経伝達物質のレベル低下にとが必要である。

よって発症する中枢性の精神疾患や運動疾患の治療法のこのようなことを背景に，我々は末梢から投与した一つとして，末梢から BH4 を投与してモノアミン作動性

BH4 の体内動態について研究を行ってきた。その結果，1）の 神 経 細 胞 内 に BH4 を 補 充 す る と い う 試 み が 行 わ れ

経口的に投与した BH4 の他に，BH4 のサルベージ経路前

た 5）。

駆 体 の ジ ヒ ド ロ ビ オ プ テ リ ン（BH2）と セ ピ ア プ テ リ ン

この治療法は，脳内の BH4 量を増加させることで，モ（SP）が小腸から効率よく吸収されること 14,15），2）小腸とノアミン生合成を促し，モノアミン性神経伝達物質の低腎臓の吸収上皮細胞によって BH4，BH2，および SP が経下が原因の中枢疾患を完治させるという考えに基づいて細胞性に輸送されること 16-18），さらに 3）BH4 投与によっ立案された。実際に，実験動物を使用した脳への BH4 のて体内に著しく上昇した血液中の BH4 は，腎臓における直接投与によって TPH と TH の酵素活性が上昇するこ

糸球体濾過と尿細管の分泌排出によって，大部分がすみとから，これら酵素の補酵素として働く内因性の BH4 のやかに尿中に排出されることを明らかにした 18,19）。これ濃度は決して過剰ではなく，ヒトへの応用が可能である

らの結果によって，経口投与された BH4 の急速な尿中排ことが示唆された。しかし，BH4 の末梢からの投与に出が BH4 の投与量を必要量以上に増やす原因であること

よ っ て 脳 内 の BH4 濃 度 が 上 昇 し た と い う 報 告 は な く，を明らかにした。しかし，投与された BH4 の排泄を抑制「BH4 は血液脳関門（BBB）を通過しない」ことが定説とするための有効な解決策はいまだに見出されていない。

なっている 7-11）。そのため，現在に至っても脳内の BH4

一方，BH4 の動態研究を行う中で，SP の末梢投与は組レベルを上昇させることを目的とした BH4 の末梢投与は織中の BH4 を増加させることが可能であり，その能力は行われていない。一方，BH4 の末梢からの投与は，先天BH4 を直接投与するよりも顕著に優れていることが明ら

性 BH4 欠損症や BH4 反応性フェニルケトン尿症に起因かになった 14,20）。もともと SP に生理活性はないが，細する高フェニルアラニン血症の治療に有効であり，血液胞に取り込まれると BH4 サルベージ経路によって補酵素

中のフェニルアラニン濃度を顕著に低下させることが明

活性を有する BH4 に還元される 14,21,22）。したがって，SP

2,6）

12

脳内への BH4 補充

令和 4 年 6 月

を末梢から投与すれば，非侵襲的に脳内のセロトニン生

BBB 検定モデルの BBBKit（RBT-24；ファーマコセル，

合成を促進できると考えられる。末梢から投与された SP長崎）を使用した。キットは，24 ウェルプレートと多孔が中枢効果を示すためには，BBB を通過し，モノアミン性膜インサート（#PISP 12 R 48）から構成される立体細作動性の神経細胞に取り込まれた後，サルベージ経路に

胞培養装置を使用して，ラット脳毛細血管内皮細胞，周よって BH4 に変換され，TPH や TH の補酵素として利皮細胞，および星状神経膠細胞（アストログリア）を共培用される必要がある。

養 す る こ と で， 生 体 内 の BBB に 近 似 し た モ デ ル を in

そこで本研究では，1）脳内血管壁モデルを使用して SP

vitro で構築した。キットの解凍と培養はマニュアルにが BBB を通過できるかどうかを観察し，2）5HT 産生細従って行い，血管内皮細胞層のバリア機能は，EVOM

胞における SP の TPH 活性の促進効果を検討した。さらresistance meter（World Precision Instruments，に，3）SP の末梢投与が脳内 5HT の合成と分解に影響をSarasota，FL，USA）で，経内皮電気抵抗（TEER）を測与えるかどうかを脳内 5HT 量とその代謝産物の 5- ヒド

定することで評価した。実験には，TEER が 150 Ω･cm

ロキシインドール酢酸（5HIAA）を定量することで検討し以上に達した細胞（通常，解凍 5 日後の細胞）を使用した。

た。

SP，BH4 および 5HTP の輸送実験は，アストログリアを含まない 24 ウェルプレートに内皮細胞の密着したメン

材料および方法1.

ブレンインサートを移しておこなった。実験は，ジチオ
スレイトール（DTT，1 mM）を含むハンクス平衡塩溶液

試薬
テトラヒドロビオプテリン（BH4）はサントリー（現第を使用して，インサート（血液側；Luminal）に SP，BH4

一三共，東京）から提供された。セピアプテリン（SP）はまたは 5HTP（それぞれ 100μM）を添加し，30 分間にイ

Schircks Laboratories（Jona SG，Switzerland），5-ヒド

ンサートの外側（脳側；Abluminal）に移行した量，すな

ロ キシ-L-ト リ プ ト フ ァ ン（5HTP），5HT，5HIAA お よわちインサートをセットした 24 ウェルプレート内の溶び 3-ヒ ド ロ キ シ ベ ン ジ ル ヒ ド ラ ジ ン（NSD-1015）は液に含まれる SP，BH4，5HTP 量を定量した。BBB の透

Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入した。

過度を示す透過係数（Papp）は以下の式で算出した。

2.

細胞

Papp(c m /s) =ラット好塩基球性白血病由来株化細胞の RBL2H3 は，
JCRB 細胞バンク（医薬基盤・健康・栄養研究所，茨木）から購入し，10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イー

5.

Δ[C ]Abluminal
0.9c m 3
×× 106
2
0.33c m × [C ]Luminal Δt (m i n) × 60s

培養細胞（生細胞）における TPH 活性の測定

グル培地（DMEM）で，通法に従って 5% CO2，37 ℃の環

TPH 活 性 は，Carlsson ら 24）の 方 法 に 従 っ た。NSD-

境下で単層培養した。実験には，あらかじめ TPH を活性

1015 を加えて芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（AADC）活性化させた細胞を使用した。すなわち，96 ウェル培養プを阻害し，5HTP から 5HT の産生を停止させることで，レートに 1 ウェルあたり 1×105 個になるように RBL2H3

一定時間に蓄積した 5HTP 量を測定した。実際は，活性を播種し，18 時間培養した後，A23187（30 nM）を含む化させた細胞に BH（0〜14mM）または SP（0〜50μM）をDMEM で細胞を 2 時間培養し，さらに A23187 を除い

30 分間取り込ませた後，細胞外の BH4 または SP を除去て 4 時間培養することで細胞の TPH を活性化した。

し，NSD-1015（400μM）を含む DMEM に交換すること

3.

で AADC の阻害を開始した 25）。5HTP を 30 分間蓄積さ23）

マウスへの BH4 または SP の投与
動物実験は帝京科学大学実験動物委員会の許可を得せた後，DTT（1 mM）と過塩素酸（PCA，6%）を加えて（B-08005）た後，同委員会の「動物実験実施規定」および

TPH を失活させ，5HTP の蓄積量を測定した。

日本薬理学会の「動物実験に関する日本薬理学会指針」に

6.

BH4 関連化合物の定量従って行った。実験には日本エスエルシーから購入した細胞内の BH4 定量は TPH 代謝アッセイ終了後，またNZB/NSlc マウスと NZW/NSlc マウスとの交雑 F1 マウ

組織中の BH4 の定量は，組織重量の 5 倍の塩酸（0.1 M）

ス（以下，BWF1）を使用した。マウスは室温 21〜24 ℃，

で 組 織 を 破 砕 し た 後 に 実 施 し た。BH4 は 主 に，

湿度 40〜60％で，明期 12 時間，暗期 12 時間の明暗サイ

Fukushima & Nixon 法に従って酸性 / アルカリ性分別

クル下で飼育した。BWF1 マウスに BH4 または SP をそ

酸化によって定量した 14,26）。細胞あるいは組織破砕液にれぞれ腹腔内投与し（10 mg/kg），所定時間に安楽死させ

酸性ヨード溶液（2％ I2, 3％ KI/0.1 M HCl）またはアルカて，血液，脳，および肝臓を採取した。採取した組織

リ性ヨード溶液（2％ I2, 3％ KI/0.2 M NaOH）を加え，室を氷冷した生理食塩水で洗浄した後，余分な水分を除去

温で 1 時間の酸化反応をおこなった。その後，ヨード溶

し秤量し，液体窒素で凍結後，−80 ℃で保存した。

液と等量のアスコルビン酸（4％）を含む PCA（0.4 M）を加

4.

in vitro BBB 再構成系モデルを使用した透過度測定

えて反応を終了した。反応液を遠心（14,000 rpm，4 ℃，

SP と BH4 の BBB 透 過 性 の 評 価 は， ラ ッ ト in vitro

10 min）し，得られた上清を高速液体クロマトグラフィー

15）

13

日大歯学

第 96 巻第 1 号（HPLC）／蛍光検出器によって分析した。HPLC の固定（n＝8）であった。TPH 活性は，加えたプテリン濃度の相は Finepak SIL C18T-5（ 日本分光，八王子），移動相増加に伴い飽和状態まで増加した。TPH 活性を 1.26〜

は 7% メタノールを使用した。蛍光検出器（FP-920，日

1.28 倍 に 増 加 さ せ る の に 必 要 な BH4 濃 度 は 3μM で あ本分光）は励起光 350 nm と蛍光 450 nm に設定した。なり，SP 濃度は 0.1μM であった。また，BH4 と SP を同お，培養細胞あるいは組織にみられる総ビオプテリン量

じ濃度で加えた場合，SP を与えたほうが BH4 を与える

（BH2 と BH4 の 合 計 ）に 対 す る BH4 の 割 合 は， す べ て

よ り も 有 意 に TPH 活 性 が 上 昇 し た（Student t- 検 定，

90％以上であった。

1 μM ， P ＝0 . 0 1 2 ； 1 0 μM ， P ＝0 . 0 0 1 ； 3 0 μM ， P ＝

7.

0.001）。

5HT 関連化合物の定量
脳 内 の 5HT と 5HIAA は， 組 織 の 破 砕 液 に DTT

SP および BH4 の添加によって増加した TPH 活性が，（1 mM）を含む PCA（6%）を加え，遠心（14,000 rpm，4 ℃，

細胞内 BH4 量の増加と相関しているかどうかを確かめ

10 分）し，得られた上清を HPLC/ 蛍光検出器によってた。その結果，細胞内 BH4 量に対する TPH 活性の二重定量した。HPLC の固定相は Finepak SIL C18 T-5（日逆プロットから得られた近似式が一次関数［図 3 e の破本分光），移動相は 40 mM 酢酸ナトリウム（pH3.5）：メ

線；y（SP）＝0.0944 x＋0.0199（R²＝0.815），図 3 g の破線；

タノール：アセトニトリルの割合が 100：5：7 の溶液をy（BH4）＝0.112 x＋0.0156（R²＝0.861）］で あ る こ と か ら，

使用した。蛍光検出器（FP-920；日本分光）の設定は，励ミカエリスメンテン式を使用して回帰曲線を求めた（図起光 302 nm と蛍光 350 nm とした

3 f の破線；R2＝0.852，図 3 h の破線；R2＝0.914）。得ら

8.

27）

。

23）

統計学的分析

れ た 回 帰 曲 線 か ら 算 出 され た 酵 素 パ ラメーター（Km，有意差検定は，統計解析ソフト Pharmaco Basic, ver.

Vmax）
は，SP 添加と BH4 添加とでほぼ等しかった（SP 添

14（ヒューマンライフ，東京）を用いて，Student t- 検定，

加では Km＝3.46 pmol/ ウェル，Vmax＝44.6 pmol/30 min/

Tukey 検定あるいは Dunnett 検定を行った。個別デー

ウェル，BH4 添 加では Km＝3.73 pmol/ ウェル，Vmax＝

タ群の近似曲線は，Microsoft Excel 16.55 の機能によっ

46.1 pmol/30 min/ ウェル）
。

て得た。

3.

結
1.

末梢投与された SP の各組織中 BH4 レベルに与える影響

果末梢から投与された SP が，脳の 5HT 合成を促進するかどうかを検討するために，血液，肝臓，および脳内の脳血管壁モデルを利用した SP の BBB 透過性につい

BH4 量を定量した結果を図 3 に示す。プテリン投与前のての検討
BBB キットによって SP，BH4，および 5HTP のラッBWF1 マウスの血液，肝臓，脳内の BH4 量はそれぞれ，

ト脳血管内皮細胞層の透過性を検討した結果を図 1 に示

0.485±0.031 nmol/mL，5.38±0.314 nmol/g，0.537±

す。SP の透過係数は，BH4 および 5HTP よりも有意に0.017 nmol/g であった。BH4 または SP の投与によって

大 き か っ た の に 対 し て（Tukey 検 定，SP vs BH4 P＝血液中の BH4 量は上昇し，その後，速やかに減少した（図0.0121，SP vs 5HTP P＝0.0443），BH4 と 5HTP の透過3 a）。肝臓にみられる BH4 量の経時変化は，概ね血流中係数は差が認められなかった。

の BH4 量の変化と同じであった（図 3 b）。一方，SP 投与

2.

SP と BH4 がモノアミン産生細胞内の TPH 活性に与または BH4 投与による脳内の BH4 量の増加は，末梢組織

える影響に比べて比較的小さかったが，SP の投与によって，1 時

SP と BH4 がモノアミン産生細胞に取り込まれ，補酵

間 後 ま で の BH4 量 が 定 常 値 に 比 べ て 有 意 に 高 か っ た

素として TPH 活性を促進するかどうかを比較した結果（Dunnett 検定，0 hr vs 0.5 hr；P ＜ 0.001，0 hr vs 1を図 2 に示す。細胞内の BH4 量は，投与した SP，およhr；P＝0.015，図 3 c）。SP 投与 30 分後の脳内 BH4 の平び BH4 の濃度の増加に伴って上昇した（図 2 a，線形表示；

均値は，プテリン投与前の平均値よりも約 2.5 倍，BH4

図 2 b，片対数表示）。細胞内 BH4 量を添加したプテリン

投 与 で は 約 1.5 倍 増 加 し た（Dunnett 検 定，BH4；P ＜濃度の関数として求めた近似式は，それぞれ，BH（SP）
4＝

0.001）。なお，摘出された脳に残留する血液量は，脳組0.541x＋3.53（n＝47，R2＝0.995）と BH（BH
44）＝0.0216x＋

織 重 量 の 約 1.3% ほ ど で あ っ た。 脳 採 取 時 の 血 液 中 の3.92（n＝48，R ＝0.937）であり，その結果，SP は BH4 の

BH4 量（図 3 a）と脳組織中に残留する血液量から，血液25 倍効率よく細胞内に BH4 を蓄積させた。

中の BH4 量を算出した結果，脳組織で観察された BH4 増

2次 に，SP ま た は BH4 を 加 え て 培 養 し た RBL2H3 の加分の約 15％程度が残留血液のものだった。

TPH 活性の変化を評価したところ（図 2 c，線形表示；図

そ こ で， 脳 内 の 5HT お よ び そ の 代 謝 産 物 で あ る

2 d，片対数表示），SP または BH4 を加えない場合の細5HIAA を定量し，5HT 合成と分解の速度（5HT 代謝回

胞 内 BH4 量 は 3.23±0.285 pmol/ ウ ェ ル（n＝8）で あ り，転）を 5HIAA/5HT で評価した。その結果，プテリン投

このときの TPH 活性は 18.4±1.11 pmol/30 min/ ウェル

与前の脳内 5HT，および 5HIAA 量はそれぞれ，4.37±

14脳内への BH4 補充

令和 4 年 6 月

0.272 nmol/g，1.62±0.145 nmol/g であった。SP およびが蓄積する 20）。しかし，投与された BH4 は，細胞内外のBH4 のどちらを投与しても，脳内の 5HT 量に有意な変濃度勾配が平衡に達した時点で，その輸送は停止するの

化 は 認 め ら れ な か っ た。 こ れ に 対 し て，SP 投 与 で は，
5HIAA レベルの顕著な上昇が観察でき，投与 1〜14 時
間後までの 5HIAA/5HT が SP 投与前の値に比べて有意に高かった（Dunnett 検定，0 hr vs 1, 2, 6, 14 hr；P＝0.006，P ＜ 0.001，P ＜ 0.001，P ＜ 0.001， 図 3 d）。 し か
し BH4 投与は，5HIAA/5HT を有意に増加させなかった。

考察

哺乳動物において，BH4 は新生合成経路 28）とサルベー
ジ 経 路 29）に よ っ て 生 合 成 さ れ る。 サ ル ベ ー ジ 経 路 は，BH4 の新生合成経路における中間代謝産物の酸化によって生じた SP から BH2 を経由して BH4 を再生する経路である。つまりサルベージ経路の基質となる SP や BH2 を投与した方が，BH4 を投与した場合よりも細胞内の BH4の蓄積効率が上昇する 14,21,22）。すなわち，通常，細胞内の SP 濃度は検出限界以下のため，SP 投与直後は細胞内外で生じる SP の濃度勾配は著しく高い。この濃度勾配に従い細胞内に SP が取り込まれるが，細胞内外の SP 濃度が平衡に達すると取り込みは停止する。細胞内に取り込 ま れ た SP は サ ル ベ ー ジ 経 路 の 働 き に よ っ て 直 ち に
BH4 に還元されるため，細胞内の SP 濃度は上昇しない。
したがって細胞内外の SP の濃度勾配は常に高い状態のままで維持され，細胞内に SP が取り込まれ続け，BH4

図2
図1

SP，BH4，および 5HTP の脳血管壁モデル透過性
多孔性膜上にラット脳血管内皮細胞を単層培養（主に 5 日間）
し， 電 気 抵 抗 が 150 Ω・cm2 に 達 し た 細 胞 シ ー ト を 用 い た。
BBB キ ッ ト の イ ン サ ー ト（ 血 液 側 ）に SP，BH4， お よ び
5HTP（それぞれ 100μM）添加し，脳側に移行した量を定量し，算出した透過係数を示した。SP の BBB 透過性は BH4 と
5HTP に比べて有意に高かった。各データは平均値±標準偏差で表した。SP vs BH4，SP vs 5HTP，BH4 vs 5HTP，† P ＜0.05，†† P ＜ 0.01（Tukey 検定，n＝4~6）15

SP と BH4 の細胞内 BH4 補充効率と TPH の活性促進効果の比較
4
添加後の細胞内 BH4 量（a；線形表示，
SP（●），および BH（○）
b；片対数表示）と TPH の活性（c；線形表示，d；片対数表示）を 示 し た。
（a）と（c）は 個 別 デ ー タ を 示 し，（b）と（d）は 平 均
値±標準偏差で表した（n＝4）。細胞内 BH4 と TPH 活性二重逆プロット（e，g）とミカエリスメンテン式を使用して細胞内BH4 量に対する TPH 活性の回帰曲線を示した（f，h）。SP 添
加の TPH 活性 vs BH4 添加の TPH 活性 ＊ P ＜ 0.05， ＊＊ P ＜0.01（Student t- 検定，n＝4）

日大歯学

第 96 巻第 1 号

で，SP 投与に比べて BH4 補充効率が著しく低い 20）。一方，

ン作動性神経細胞の取り込み量にも依存すると考えられビオプテリン化合物の細胞膜輸送において，平衡型核酸た。

輸送体 1（ENT1）と ENT2 が関与し，それらの基質親和5HT 産生細胞に取り込まれた SP からサルベージ経路

性は BH4 より SP の方が高いことが報告されている 30）。

によって変換された外因性の BH4 が，TPH 活性を促進

これは細胞内の BH4 補充に関して，SP は BH4 よりも効するかどうかを検討した結果，BH4 を投与した場合より率的に細胞内へ取り込まれることを裏づけるものであもはるかに低い濃度の SP によって細胞内 TPH 活性が促る。これらの報告から，SP が代謝されるサルベージ経

進することが確認できた。この事実は，SP が BH4 より路と ENT の基質親和性が細胞内の BH4 補充における優も効率良く細胞内の BH4 量を蓄積できることを裏付け

位性を決定していると考えられる。ENT1 と ENT2 は脳た。また，本研究から生細胞（RBL2H3）内の BH4 濃度とにおいても発現し 31），また脳内でもサルベージ経路が機それに対応する TPH 活性が初めて明らかになった。今能することから回， 生 細 胞 に お い て 測 定 さ れ た TPH 活 性 の Km 値 は，脳内への BH4 補充に関しては SP を32）

3.46 pmol/ ウェルであり，この値は RBL2H3 の内因性（プ投与した方が，より効率的に働くと考えられる。
末梢投与された SP が中枢の 5HT 生合成を促進するにテリンを与えない場合）BH4 量とほぼ同程度であった。

は，BBB を 通 過 し た 後，5HT 産 生 細 胞 に 取 り 込 ま れ，また，測定された最大活性（Vmax）は 44.6 pmol/30 min/

細胞内で還元された BH4 が TPH を活性化する必要があ

ウェルであり，内因性の TPH（18.4±1.11 pmol/30 min/る 。そこで最初の関門である BBB を SP が透過できるウェル）の約 2 倍であった。これは RBL2H3 のもつ内因かどうかを in vitro 脳血管壁モデルを使用して検討し性の BH4 濃度が TPH の Km と近似していることを意味

1）た。その結果，SP，BH4，および 5HTP の BBB 透過量は，している。さらにこの値は，ラットの脳への BH4 の直接

脳血管内皮細胞をほとんど通過しない水溶性化合物であ投与した報告と 2），脳スライスに BH4 を浸漬させた報るスクロースとほぼ等しかった（1.05×10−6 cm/sec）33）こ

告 6）からそれぞれ得られた TPH の BH4 における Km 値とから，これらの水溶性化合物の BBB を通過する能力とほぼ一致した。これらの結果は，生細胞における TPH

は，著しく低いことが明らかになった。しかし，脳内の活性は，細胞内の BH4 量の増加に依存すること，および

5HT 不足の治療ために末梢投与される 5HTP は，脳内添加した SP または BH4 によって細胞内に増加した外因の 5HT レベルを上昇させる 13）。これは投与した 5HTP

性の BH4 も内因性の BH4 と同様に補酵素として利用さが僅かではあるが，BBB を通過して脳内のモノアミン産れることを示した。つまり，SP は細胞内 BH4 量を効率生細胞に取り込まれ，細胞内の AADC によって 5HT に的に増加させることで，TPH 活性を顕著に上昇させるこ変換されたことを意味する。これに対して，BH4 の末梢とが明らかになった。

投与は，脳内のモノアミン生合成を促進しない 7-11）こと

マウスに SP を腹腔内投与し，末梢組織と脳内の BH 4から，たとえ僅かに BBB を通過できたとしても，BH4

量の変化を観察した結果，末梢組織における SP 投与まはモノアミン産生細胞内には取り込まれず，5HT の合成

たは BH4 投与による BH4 量の経時変化は，系統の異なる

活 性 も 促 進 し な い と 考 え ら れ る。 す な わ ち，5HTP とマウス（C57 BL/6 J）を用いたこれまでの報告 14）と矛盾は

BH4 の中枢作用の有無は BBB 透過性の他に，モノアミなかった。一方，脳内の BH4 量の増加は，末梢組織の

図3

SP または BH4 投与後の末梢組織と脳内の BH4 量，および脳内 5HT 代謝の経時変化
4の投与後の血液（a），肝臓（b），脳（c）内の BH4 量，および脳内の 5HT と 5HIAA 量とその比率（5HIAA/5HT）（d）
SP（●），および BH（◯）の経時変化を示した ｡ それぞれの値は平均値±標準誤差で表した（n＝4〜8）。脳内 BH4 量；0 hr（ 非投与）vs 0.5，1，2，6，14 hr，脳内5HIAA/5HT；0 hr（非投与）vs 0.5，1，2，6，14 hr，‡ P ＜ 0.05，‡‡ P ＜ 0.01（Dunnett 検定）

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BH4 増加に比べてその変化は甚だ小さかったが，脳においても BH4 の増加が示された。SP 投与と BH4 投与の両方で，脳における BH4 の有意な増加が確認できたことは，
従来，BBB の存在で無効と考えられていた BH4 の末梢投与でも脳内 BH4 濃度を上昇させることを示すものである。一方，末梢から SP を投与しても脳内の 5HT 量の有
意な増加は認められなかったが，5HT の分解産物である
5HIAA 量が増加し，5HT の合成と分解の速度（代謝回転）を示す 5HIAA/5HT が持続的に高いレベルを保っていた。5HT の分解量に依存する 5HIAA 量が増加したにもか か わ ら ず，5HT が 減 少 し な か っ た こ と は， 脳 内 の5HT 合成が促進したためと推測される。

結

令和 4 年 6 月

論

SP を細胞およびマウス腹腔へ投与して，BH4 の増加と，それに伴う 5HT の代謝促進作用を検討し，以下の結論を得た。
1． SP の BBB 透過性は低く，BH4 と同程度であった。
2． SP は 5HT 産生細胞内に BH4 を補充する効率が優れており，BH4 を投与した場合よりもはるかに低い濃度で細胞内 TPH 活性を促進できた。
3． 末 梢 投 与 し た SP が 脳 内 5HT 合 成 を 促 進 し，5HT
代謝回転を亢進することを明確にした。
以上のことから，SP の末梢投与による脳内のモノアミン生合成の促進は，モノアミン神経伝達物質の低下に伴う神経疾患患者に有効となる可能性が示唆された。
なお，本研究の一部は，日本大学総合歯学研究所研究費（B），
日 本 大 学 歯 学 部 佐 藤 研 究 費，JSPS 科 研 費 JP19K10079 お よ び
JSPS 科研費 JP20K09999 によってなされた。
本論文に関して，開示すべき利益相反はない。
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