2015年日化協LRI研究報告会 2015年8月28日

核内受容体の肝毒性発現への寄与と毒性予測への応用

吉成 浩一
静岡県立大学薬学部
衛生分子毒性学分野

Contentsü イントロダクション：核内受容体とは？
ü 肝発がんと核内受容体：分子機序の考察
ü 肝毒性の予測に向けた取り組み：・インビボ毒性試験データベースと核内受容体アッセイを利用した試み

Contentsü イントロダクション：核内受容体とは？
ü 肝発がんと核内受容体：分子機序の考察
ü 肝毒性の予測に向けた取り組み：・インビボ毒性試験データベースと核内受容体アッセイを利用した試み

核内受容体nuclear receptor (NR)の構造と作用機序

低分子化合物(リガンド)

核内受容体

標的遺伝子ーCNー
DNA結合

リガンド結合
転写活性化

核内受容体は、低分子化合物に応答して種々遺伝子の発現を変化させることで細胞機能を制御している。

NRs: members and functions

VDR
・・・CARPXRGRGRERER

ER

Hormone action
target gene
Hormone action
target gene

VDR
RXR

Xenobioticcompounds• Drugs• Pesticides• Foods• Industrial chemicals• Environmentalpollutants• etc.

GRTarget gene

Vitamin action
target gene

CAR
RXR

Endogenouscompounds• Steroid hormones• Fatty acids• Lipophilic vitamins• Thyroid hormones• etc.

NR

Xenobiotic disposition
Carcinogenesistarget gene

PXR
RXR

LigandXenobiotic disposition
Energy metabolism
target gene

There are 48 members identified in human NR superfamily.

Chemical activation of nuclear receptors

VDR・・・CAR
PXR

GRGRERER

ER

Hormone action
target gene
Hormone action
target geneVDRRXR

Xenobiotic
Endocrine
compounds• Drugs
disruptors�
• Pesticides• Foods• Industrial chemicals• Environmental
pollutants• etc.

GR

Target gene

Vitamin action
target gene

CAR
RXR

Endogenouscompounds• Steroid hormones• Fatty acids• Lipophilic vitamins• Thyroid hormones• etc.

NR

Xenobiotic disposition
Carcinogenesistarget gene

PXR
RXR

LigandXenobiotic disposition
Energy metabolism
target geneChemical activation of nuclear receptors

VDR・・・CAR
PXR

GRGRERER

ER

Hormone action
target gene
Hormone action
target gene

VDR
RXR

Xenobioticcompounds• Drugs• Pesticides• Foods• Industrial chemicals• Environmental
pollutants• etc.

GR

Target gene

Vitamin action
target gene

CAR
RXR

Endogenouscompounds• Steroid hormones• Fatty acids• Lipophilic vitamins• Thyroid hormones• etc.

NR

Xenobiotic disposition
Carcinogenesistarget gene

PXR
RXR

LigandXenobiotic disposition
Energy metabolism
target gene

NRs have broad, overlapping but distinct ligand specificity.

Chemical activation of nuclear receptors

VDR・・・CAR
PXR

GRGRERERER

Hormone action
target gene
Hormone action
target gene

VDR
RXR

Xenobioticcompounds• Drugs• Pesticides• Foods• Industrial chemicals• Environmental
pollutants• etc.

GR

Target gene

Vitamin action
target gene

CAR
RXR

Endogenouscompounds• Steroid hormones• Fatty acids• Lipophilic vitamins• Thyroid hormones• etc.

NR

Xenobiotic disposition
Carcinogenesistarget gene

PXR
RXR

LigandXenobiotic disposition
Energy metabolism
target gene

NRs have broad, overlapping but distinct ligand specificity.

化学物質の毒性発現に対する核内受容体の寄与
化学物質

NRNR
相互作用

代謝・排泄

ホメオスタシス	

維持機構
撹乱・破綻
平衡の変化

解毒

毒性発現	

NR		

ホメオスタシス	

維持機構	

撹乱・破綻

毒性発現

Contentsü イントロダクション：核内受容体とは？
ü 肝発がんと核内受容体：分子機序の考察
ü 肝毒性の予測に向けた取り組み：・インビボ毒性試験データベースと核内受容体アッセイを利用した試み

化学物質による発がん
化学物質（発がん物質）イニシエーター

がん
正常細胞

プロモーター

変異細胞発がん性試験

がん
DNA傷害

細胞増殖

悪性化

イニシエーション

プロモーション

プログレッション• 長期発がん試験（ラット、マウス）• Ames試験• 小核試験
• コメットアッセイ• 染色体異常試験• 二段階発がん試験

核内受容体と肝化学発がん
Dioxins
PCBsAHR

肝細胞の増殖亢進

PhenobarbitalCAR

アポトーシス抑制

Fibrates
Phthalates

PPARα???

肝がん共通機序？
ü 肝がんプロモータによる発がんには、核内受容体の活性化が関与することが知られている。
ü しかし、その詳細な分子機序は明確になっていない。

発がん予測モデル
非発がん物質

発がん物質

短期間曝露

学習用化学物
質の選択に、機序が考慮されていない。

ラット・マウス（肝）の網羅的遺伝子発現解析

発がん物質曝露に伴い特異的に発現変動する遺伝子群の同定
分子機序の考察などによる選別

機械学習モデルの構築（SVMなど）

発がん予測モデル

機序を考慮した発がん性予測
AOP1

代謝活性化、DNA損傷
ROS産生

AOP2

発がん物
質

肝への分
布AHR

AOP3
AOP4

PPARα

AOP5X�

AOP6
AOP7がん化CARY�Z�

AOPの同定は、精度の高い（動物を用いた）発がん予測モデルおよびインビトロインシリコ発がん予測モデルの構築、ヒト外挿性評価に必須である。

核内受容体を介した肝化学発がんの種差	
フェノバル
ビタール

げっ歯動物
肝臓 フィブラート

ヒト肝臓CAR

発がん
PPARα	

フェノバル
ビタール

CAR

フィブラートPPARα	

発がんü フェノバルビタールやフィブラートによるげっ歯動物の肝発がんには、核内受容体CARとPPARαが必要である。
ü これら化学物質は、ヒトとげっ歯動物のCARとPPARαを共に活性化するが、ヒトでは肝がんを引き起こさないと考えられている。

CAR機能の種差を生じる２つの要因：
活性化物質の種類と機能発現機構

種差１

種差２
CAR

PB

ヒト

マウス

CITCO

CYP2B6CAR

Gene BTCPOBOP

CAR

PB

CAR

CITCO
TCPOBOP

Gene C

Cyp2b10CAR

CAR
Gene B

Gene Cヒト・マウスに共通のCAR活性化物質であるフェノバルビタールを投与した際にマウスで認められるCAR依存的な転写は、必ずしもヒトで認められるとは限らない。

CAR機能の種差の原因は？
CAR

PB

ヒト

CITCO

CYP2B6CARCAR

TCPOBOPマウス

この差が発がん性のPB
種差の原因？
CITCOTCPOBOP

Gene B

Gene CCAR
Cyp2b10CAR

CAR
Gene B

Gene Cヒト・マウスに共通のCAR活性化物質であるフェノバルビタールを投与した際にマウスで認められるCAR依存的な転写は、必ずしもヒトで認められるとは限らない。

Contentsü イントロダクション：核内受容体とは？
ü 肝発がんと核内受容体：分子機序の考察
ü 肝毒性の予測に向けた取り組み：・インビボ毒性試験データベースと核内受容体アッセイを利用した試み

Use of in vitro assays for the biological/toxicologicalcharacterization of chemical compounds(Q)SAR approach• Defines physicochemical properties (e.g. descriptors), basedon the whole and/or partial chemical structure (2D/3D).
• Tries to find out the association between physicochemical
properties and toxicity.
Our working hypothesis• The biological property (ability to interact with cellularmacromolecules) may not be defined comprehensively onlyby chemical structures.
• The biological (toxicological) property of chemicals may be
defined by in vitro assay using cells and/or biomolecules.

What kind of assays are good for such a strategy?

How much in vitro information do we need?
ü Big data (by a large set of assays) will give us valuable
information on chemicals’ biological/toxicologicalcharacteristics that we cannot obtain in silico analysis(descriptors, (Q)SAR).
ü Japan is far behind USA in terms of in vitro big data collection(e.g. ToxCast by USEPA)
Our hypothesis and project:Ø There are Japan-made good database available (e.g. HESS,TG-GATEs) .
Ø We may be able to predict in vivo toxicity with small data by
selected/targeted assays in combination with such database.
Ø Nuclear receptor/P450 assays seem good as “startup/firstchoice” assays for a such strategy in the evaluation andprediction of chemical toxicity.

Why nuclear receptors?
ü Nuclear receptors (NRs) are activated by a wide variety ofchemical compounds, acting as “xeno-sensors” and “toxicitytargets” in the body.
ü NRs show broad, overlapping, but distinct, ligand specificity.
ü NR-activating ability of chemical compounds is easily
determined by easy-to-handle, high-throughput in vitro
assays.
ü NR assays show “high-positive rate”.
ü P450s are major drug metabolizing enzymes showing broad
substrate specificities and work as “xeno-sensors”. (e.g.
human CYP3A4 metabolizes ~50% of clinically used drugs)
NR/P450 assays may be used as in vitro chemical profilers.

Toxicity prediction using NR-activating profiles andin vivo toxicity database: on-going LRI projectNR-activating profile
Compounds
NR assays(with chemical properties)
from DB(+P450s)

Non-toxic

Toxic

C1
C2
C3.
.
.
.

C51
C52
C53.
.
.
.

CX
New compound

CAR
PXR
LXR
PPAR
FXR
GR.
.
.
.

Performing
assaysC1
C2
C3Toxic.
.
.
.

C51
C52
C53.
.
.
.

CX

Nontoxic

Toxicity prediction using NR-activating profiles andin vivo toxicity database: on-going LRI project
Prediction:
NR-activating profile
Compounds
NR assays
chemicalproperties)
from DBCx(withexhibits
C3-liketoxicity.
(+P450s)

Non-toxic

Toxic

C1
C2
C3.
.
.
.

C51
C52
C53.
.
.
.

CAR
PXR
LXR
PPAR
FXR
GR.
.
.
.

C1
C2Toxic

C3.
.
.
.

C51

Nontoxic

C52
C53.
.
.
.

Comparison
CX
New compound

Performing
assaysCX

まとめと将来展望
Ø 核内受容体は、生体内「異物センサー」として機能しており、化学物質による毒性発現の作用点となりうる。
Ø 作用機序（AOP/MOA）の把握は、毒性予測モデルの構築、種差の理解に重要である。
Ø 化学物質応答性核内受容体のリガンド選択性は低く、その活性化作用評価試験は、陽性率の高いインビトロ試験である。
このため、化学物質の生物学的・毒性学的特徴付け（プロファイリング）に利用可能である。
Ø これら試験と、インビボ毒性試験データベース及びインシリコ解析（記述子計算）の統合により、複雑な毒性の予測に有用な試験系を構築できる可能性がある。
Ø 代謝（体内動態）情報の利用が、インビボ毒性とインビトロ試験をつなぐために重要と思われる。

謝辞
静岡県立大学薬学部
中山 知恵
増田 茜
増田 雅美
東北大学大学院薬学研究科
中島 宏之
野表 知世
飯塚 薫
杉本 雄一
山添 康
製品評価技術基盤機構(NITE)
山田 隆志
櫻谷 祐企
山田 隼

北海道立衛生研究所
小島 弘幸
産業技術総合研究所
竹下 潤一
Funding
日本化学工業協会（LRI）
内閣府食品安全委員会
経済産業省
マンダム・動物実験代替法学会

Thank you for your kind attention.!