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日本家禽学会誌45.･JI‑J8,2008

ニワトリの排卵周期中における血漿と卵黄膜内層中のビテロゲニン(VTG)レベル
武石勝!、小池達大2,＃、西田沙世2．山村奈美子2．石川信幸!、
後藤尚也

・渋井仁志!・土井守3．上吉道治2!日本配合飼料株式会社中央研究所飼料畜産開発センター，栃木県芳賀郡茂木Ⅲ].321‑3621
2岐阜大学農学部，岐阜県岐阜市脚l1戸501‑1193
3岐阜大学応用生物科学部，岐阜県岐阜市柳戸501‑1193
掌故人

ニワトリにおける卵胞の発育は，卵黄前駆物質として肝臓で合成されるビテロゲニン(VTG)などが卵細胞に取り込まれることによって起こることが知られている。しかしながら，卵胞発育に伴うVTGの取り込みの様相については未だ十分には知られていない。

そこで本実験では，約1日のニワトリの排卵周期中において3時間毎に，卵胞重量と共に，血漿中のVTGとVTGが卵細胞に取り込まれる際に必ず通過する卵細胞のすぐ外側の組織である卵黄膜内層中のVTGをillll定することにより，卵胞発育と関連して，卵胞へのVTGの取り込みの様相を知ろうとした。

使用したニワトリは，50週齢の白色レグホーン種産卵鶏で．14時間照明の下で，水と餌は自山に摂取させた。これらのニワトリから，排卵周期の3時間毎に，血液と共に，最大卵胞(F1),3番目(F3)と5番目に大きな卵胞(F5)を採取した。卵胞は重量を測定した後，卵黄膜内層を単離し，血漿と共に,SDS‑PAGEとVTG抗血清を用いたウェスタンプロッ

ト法に供し，得られたVTG特異的なバンドを画像解析ﾌﾟログラム(NIH‑Imagever.1.60)で数値化した。
卵胞重量は，いずれの卵胞においても,F1の排卵19‑20時間前から10‑11時間前に相当する時期にかけて順次増加し，その後はほぼ同じレベルで推移した。血漿VTGレベルは，排卵周期中においてほぼ一定の値で推移した。これに対して卵黄膜内層のVTGレベルは，いずれの卵胞においてもF1の排卵22‑23時間前からIIIH次増加し,F1では排卵13‑14時間前に,F3とF5ではF1の排卵16‑17時間前に相当する時期において最も高いレベルを示した後，急激に減少し，その後は低いレベルで推移した。これらのことから，卵ll何重畠の増加に先立ち，卵黄膜内層中のVTGが増加することが示され，排卵周期中におけるVTGの卵胞への取り込みの様相が明らかとなった。

キーワード：ビテロゲニン，卵黄膜内属排卵周期，ニワトリ

melaal.,2004)によっても卵胞の発育が調整されている可能性

一一一一目

緒

が報告された。しかしながら，卵胞内に拡散した卵黄前駆物質がニワトリの卵胞発育において，卵黄前駆物質として知られるビ卵細胞I莫表面に到達するまでの移行の様相について未だ‑'一分にはテロゲニン(VTG)は，卵胞の卵胞膜外居細胞で生産されるエス

明らかにされてない。

トロジェン(Caicedo"".,1997)の刺激によって肝臓で合成が肝臓から血流を介して卵胞に至ll達したビテロゲニンが卵細胞内促進される(Deeley"".,1975)｡肝臓での合成後に血中に放出に取り込まれるまでの経路については，主に解剖学的な知見を中されたVTGは，血流を介して卵胞に到達し，卵胞内組織を経て，心に以下のように考えられている。排卵前の卵胞は，卵細胞を中

卵細胞膜表面のリポ蛋白質レセフ。ター遺伝子ファミリーに属する

心にして，外側から̲'二皮，結合性外膜外居と内層から成り立つ

多機能なしセフ。ターを介したエンドサイトーシスにより，他の体

卵胞膜基底膜，噸粒膜卵胞膜内層で描成される。このような細胞では前例がないほど効率的に卵細胞に取り込まれる(Barber

構造の卵胞において，卵巣門から卵巣内に侵入した動脈は，最終"".,1991;Bujoeml.,1997)。このように卵胞の発育に卵細胞自的には卵胞茎を経由して基底膜に向かって分枝して細動脈に分か身が直接関与していることは知られているが，最近，卵細胞以外

れ，基底￨￨莫に接触して毛細管血管網を形成し，それよりも内側には血管分布は認められない(Gilbert,1971)。毛細管血管網を形成に穎粒層細胞(Schuster"".,2004)や卵胞膜外居細胞(Hum‑する毛細血管には小孔が存在し，血管外の組織にも赤血球の存在

2007年9月12日受付,2007年11月15日受理
連絡者：武石勝が認められ(PerryaaZ.,1978a),さらに直径20‑30nmの脂質蛋
白質と思われる粒子が基底膜や卵黄膜内層に多数存在する〒321‑3621栃木県芳賀郡茂木町大字天子451(Wyburnaaj.,1965;Wyburngral.,1966;Ito"".,2003)。まTel:0285‑63‑1121
Fax：0285‑63‑ll20

た，頼粒膜を構成する頼粒層細胞には明らかな細胞間隙が存在

E‑mail:masaru・takeishi@nippai.co.jp

し，この細胞間隙にも脂質蛋白質の粒子が認められており
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日本家禽学会誌45巻J1号(2008)(Wyburnaα1.,1965;Wyburn"".,1966;PerryandGilbert,を採取した。重量測定後，速やかにGilbertら(1977)の方法によ1979),さらに卵細胞の細胞膜表層には被膜に被われた直径250‑り卵黄膜内層を含む卵胞組織を分離し，それをKurOkiとMori

350nmの多数の小胞が見出されている(Perryaal.,1978b;(1997)の方法に従って蒸留水で処理することにより，頼粒膜を形

PerryandGilbert,1979)。これらのことから，肝臓から血流に成する穎粒層細Ilaを破壊し，基底膜と卵黄￨￨塊￨ﾉ1層とに分離した

よって卵胞に運ばれた卵黄前駆物質は，卵胞膜内居で毛細血管の後，卵黄膜内層に比べて淡い白色であり,I危い基底膜を取り除く

小孔から卵胞組織内に拡散し，基底膜の結合組織間順粒膜の細ことにより卵胞膜内層を採取した。卵黄膜内層は組織の湿重畠を胞間隙，卵黄膜内居を通過して卵細胞膜にfll達すると考えられて測定し，滉軍畠の4倍量の0.1Mトリス‑0.25Mスクロースバッ

ファー(pl‑I7.4)を加えて超音波破砕機(PowerSonicModel50;

いる。

ヤマト科学株式会社）でホモジェナイズした後，液体窒素下（‑

このように，毛細血管から放出された卵黄前駆物質が卵細胞膜

196℃）で急速凍結し，電気泳動まで‑80℃で保存した。

に到達するまでには多くの組織を通過する。これらの組織の中で卵黄膜内層の単離方法に関する予備実験も穎粒層細胞によって橘成される穎粒膜は構造的な変化が著し

本実験では卵￨￨包膜内層の単離に関して，以下の2点を確認する

く，鳥類では未成熟な卵胞では多層描造を示し，成熟するに従って単層化する(PerrygI(z/.,1978b)｡しかし，卵胞内における卵胞

予備的な実験を行った。

単位表面積当たりの卵黄前駆物質の移動率は卵胞が成熟するにまず,Gilbertら(1977)の方法により採取した卵黄膜内層を含従って低くなる(Smith,1959;WarrenandConrad,1939)。これ

む卵胞組織を蒸留水処理することにより卵黄膜内層の単離が可能

らのことは卵黄前駆物質の順粒膜の細胞￨Ⅱ]隙における移動が細胞かどうかを確認するために，採取したF1,F3,F5の卵胞組織を，層の構築状態のみに依存していないことを示唆しているが，卵黄それぞれ眼科ハサミで2つにﾘjり分け，一方はKurokiとMori

前駆物質の取り込みとの関連は明確ではない。卵黄前駆物質の取(1997)の方法に従って蒸留水処理を実施し，残りは蒸留水処理のり込みは，卵細胞膜のエンドサイトーシスによる調節機構

代わりに生理的食塩水で洗浄した。これら処理の異なる2つの組(Perry"".,1978b;PerryandGilbert,1979)が知られているも織をブアン固定液で固定し，パラフィン切片の作成とヘマトキシのの，排ﾘ￨燗期中におけるエンドサイトーシスの動態についての￨ノン・エオジン(HE)染色を常法に従って行い，光学顕微鏡下で報告は少なく，卵細胞膜における超低密度リポタンパク(VLDL)

1000倍の拡大倍率にて観察した。

次に蒸留水処理の際に，卵黄膜内層に含まれるVTGが溶け出の結合量が排卵0‑2時間前よりも排卵14‑16時間前の方が高いこす可能性があるか否かを確認するために，単離に用いた蒸留水をと(Baba"",2002)が報告されているに過ぎない。

そこで木実験では，卵￨￨世重量を測定すると共に，卵戯前駆物質

後述するVTG抗血清を用いたウェスタンフ､ロット解析に供しの中でもVTGに注目し，排卵周期中の血漿中のVTGと，卵細た。この際の比i皎サンプルは，無処理の産卵鶏の血漿，エストラ胞に取り込まれるVTGが必ず通過する卵細胞のすぐ、外IMIIの繊維

ジオール17B(E2)を体重lkgあたり1mg投与して6時間後に性の膜である卵黄膜内層I‑PのVTGを測定することにより，卵細採取した血漿,F1,F3,F5の各卵胞から採取した卵黄膜内層の胞におけるエンドサイ￨､一シス以外による卵黄前駆物質の取り込

ホモジェネートとした。

み調節機椛の可能性を検討した。

VTGの測定血漿および卵黄膜内居中のVTGは,SDSポリアクリルアミド

材料と方法

ゲル電気泳動法(SDS‑PAGE,Laemmli,1970)とウサギ抗ニワト

供試鶏

リVTG抗血清(SekimotocI(JI.,1990)を川いたウェスタンプ

本実験に使用したニワトリは白色レグホーン種の雌鶏(50週齢ロット法により測定した。血漿は0.1Mトリス‑0.25Mスクローのハイラインマリア）である。ニワトリはll皮阜大学農学部付属農スバッファー(pH7.4)で50倍希釈したものにLaemmli(1970)

場無窓鶏舎内で点灯開始を5時とする14時間照明:10II寺間暗黒のサンプルバッファーの2倍濃縮液(125mMトリス塩酸pH6.8,の明暗周期のもと，飼料と水を自山に摂取させて飼育した。これ

4%SDS,20%グリセロール,10%2−メルカプトエタノール,

らのニワトリの産卵記録を4週間以￨記録し,1クラッチの長さ

0.02%ブロモフェノールブルー）を等量加えて最終的に100倍希が4から7で，比較的規則正しくクラッチを繰り返し，クラッチ釈とした。卵黄膜内層をホモジェナイズした懸濁液はLowry法

間の休産LIが1日である個体を供試した。

で総蛋白質濃度を測定し,0.1Mトリス‑0.25Mスクロースバッ

試料の採取

ファー(pH7.4)で総蛋白質を20mg/mlに調製したものにクラッチ第2卵の排卵推定時刻直前のいろいろなll寺間にニワト

Laemmli(1970)のサンプルバッファーの2倍濃縮液を等量り￨IZ

リを屠殺して排卵の有無を確認した予備実験の結果から，本実験て最終的に総蛋白質をl0mg/mZとした。調製したサンプル溶液

飼育条件下でクラッチ第2卵の排卵は午前8時前後に起こること

は沸騰水中に3分間入れて変性させた。SDS‑PAGEは7.5%の分を確認した。そこで，午前8時を排卵0時間とし，クラッチ第2離ゲルを用い，サンプルは泳動ゲルlレーンあたり10"I添加し，卵排卵におけるl周期中において3時間毎にlH寺期に7から10

卵黄膜内層についてはlレーンあたりの総蛋白質は0.1mgとし羽ずつ供試し，血液と卵胞を採取した。血液は予めヘパリンで湿た。SDS‑PAGEで分子量マーカー(High‑range;Bio‑Rad)ととらせた注射筒で翼下静脈より採取し，遠心分離(3,000×9,10min,

もに分離した蛋白質は,PVDF膜(Immobilon;Millipore)に転4℃）後に血漿を得た。卵胞は，断頭屠殺後直ちに開腹して最大卵写し，5％のスキムミルクを含むTBS‑T(0.1%Tween20‑20mM

胞(F1),3番目に大きな卵胞(F3),5悉｢1に大きな卵ll包(F5)トリス‑137mMNaCl,pH7.6)でプロ､ソキングした後,5%スキ
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武石ら：排卵周期中の卵黄膜内層VTGレベル
17

ムミルクを含むTBS‑Tで10万倍に希釈したVTG抗血清に4．CCで一晩培養した。その後,PVDF膜はTBS‑Tで3回洗浄し，
16

TBS‑Tで10万倍に希釈したビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG(LifeTechnologies)に室温で1時間培養した。最後にPVDF膜
15はアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを用いた発色反応(AmplifiedAlkalinePhosphatasGImmun‑BIotAssay

14

３１
０
１

Kit;BiO‑Rad)で分子量約240kDaのVTG抗血清反応物質のバンドを検出した。このようにして検出したバンドは，イメージス

キャナーで画像データとして保存し，マツキントッシュの画像解３刺佃呈壹能を用いて数値化した。血漿VTGレベルは，排卵19‑20時間前
における一個体の測定値を，また卵黄膜内層VTGレベルは同じ個体のF1から採取した卵黄膜内層の測定値を，それぞれ100として比較した相対値（％）として表した。また，泳動ゲル間の誤差は，全てのゲルに同一のサンプル(1羽の産卵鶏のF1から採取した卵黄膜￨ﾉ1層のホモジェネート）を泳動して得られた測定値によって補正した。
統計処理

データの統計処理は一元配置の分散分析後，平均値間の有意差の検定はDuncansnewmultiplerangetestで危険率が5%以下

J
l
l
口

F3

（

C

F5

になった場合に有意な差があるものとした。
糸士

９８７６４３２１

析ﾌﾟログラム(NIH‑Imagev.1.60)のGelPlottingMacrosの機杲

約1日の周期であるニワトリの排卵周期'.￨｣において3時間毎に測定した卵胞重量の測定結果を図lに示した｡卵￨￨句頭呈は,F1,

F3およびF5のいずれの卵胞においても,F1の排卵19‑20時間

前から排卵10‑11時間前に相当する時則lにかけてlllil次増力￨1し．そ

0の後はほぼ同じレベルで推移した。

22‑2319‑2016−1713‑1410‑1107−0804‑0501‑02

卵黄膜内層の単離方法に関する予備実験で，蒸留水処理により排卵前の時間卵黄膜内層が単離可能かどうかを確認した結果をIXI2に示した。
図1

KurokiとMori(1997)の方法で蒸留水で処理することにより穎

排卵周期中における最大卵胞(F1),三番目に大きな卵胞(F3)および五番目に大きな卵胞(F5)の重量
各点は7‑101>lの平均値±標準誤差
異符号間に5％水準の危険率で有意差あり

粒層細胞は破壊され，単離した卵黄膜内層のHE染色像には，

F1,F3およびF5の全てにおいて，光学顕微鏡下では卵黄などの付着は認められなかった。尚，図2のCに示したGilbertら(1977)の方法で採取したF3の卵胞組織の写真には,A(F1)｣P
E(F5)とは異なり，基底膜が欠落し，卵黄膜￨ﾉ1層と順粒膜のみと出されなかった。これらの結果から，本実験の方法により，卵黄なっている。これは,Gilbertら(1977)の方法で採取した卵胞組

膜内層を単離可能で，しかもVTGの溶出はほとんど認められ織は非常に薄い膜であり，パラフィン切j'1を卵白グリセリンを用ず，この方法で川l定した卵黄膜内居LI‑]のVTGレベルはニワトリ

いてスライドグラスに接着後にHE染色を実施の際に，スライド体￨ﾉ1での状態を反映していると考えられた。

グラスから基底膜だけが剥がれ落ちてしまったためである。

排卵周期!'1における血漿中のVTGレベルの測定結果を図4に血漿および卵黄膜内層のVTG抗血清を用いたウェスタンプ

示した。血漿VTGレベルは，測定した各時間の間において有意ロット解析の写真を図3に示した。血漿および卵黄膜内層の両方な差は認められなかった(P>0.05)。

において分子量が約240kDaのVTG抗血清反応物質が検出さ

F1,F3およびF5の卵胞において，卵黄膜内層中のVTGレベ

れ，血漿中における量はE2投与により増加した。また先に示しルを測定した結果は､一定蛋白質あたりのVTGレベルの相対値

た通り，本実験における卵黄膜内層の採取方法は，卵胞から単離として￨Xl5に示した。卵黄膜内居のVTGレベルは，いずれの卵した順粒膜層を蒸留水で処理することによって順粒膜細胞を破壊

胞においても,F1の排卵22‑23時間前からIIIH次増加し,F1ではし，基底膜と卵黄膜内層を分離したが，この過程で卵黄膜内層に

排卵13‑14IIJFMIiijに,F3とF5においてはF1の排卵16‑17時間

含まれるVTGが溶け出す可能性が考えられた。そこで卵黄膜内

前にﾈ￨]当する時期に最も高いレベルを示した後,F1の排卵10−11層の分離に用いた蒸留水について,VTG抗血清を用いたウェス

時間前に相当する時期にかけて急激に減少し，その後は低いレベ

タンプロット解析を実施したところ,VTG抗I111情反応物質は検ルで推移した。
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３

1

B,:息駕ゞ；A

一.津、§､‑
夢熟鈴,屯聡錯蝉鍵義

A B F l F 3 F 5kDa

一 一
一 滝 哩 ■ 悪一

一色−−−VTG

1■■■■■■

C

2 0 0 ･ ■ 。 ＝ ． 一 一 一，

図3．ビテロゲニン抗血清を用いたウェスタンプロット解析写真嬢泰澱嚇謬奉零リ

l:血漿(100倍希釈,A:無処理の産卵鶏B:エス
トラジオール17B(E2)を体重1kgあたり1mg投与した産卵鶏)，2：卵黄膜内層のホモジェネート（総蛋白質0.1mg/レーン,F1:最大卵胞,F3:三番
目に大きな卵胞,F5:五番目に大きな卵胞),3:911
黄膜内層を単雛する際に用いた蒸留水（原液を使用し，液中の総蛋白質含量は調整していない)。
SDS‑PAGEは7.5%の分離ゲルを用いて実施し，
PVDF膜に転写後に10万倍に希釈したビテロゲニ■■■■■l■■

ー

E

F
⁝崎

一

、 、 一

図2

2

排卵周lWl中における最大卵胞(F1),三番目に大きな卵￨￨包(F3)および五番'三￨に大きな卵胞（肥､5)の組
織像
Gilbertら(1977)の方法で採取した基底膜順粒
膜および卵黄膜内層を含む卵胞組織(A,C,E)と，
KurokiとMori(1997)の方法に従って採取した卵
黄膜内居(B,D,F)のヘマトキシリン・エオジン(HE)染色像。AとBはF1,CとDはF3,EとFはF5の組織を示している。尚,Cに示したF3の卵胞組織の写真には,A(F1)｣PE(F5)とは異なり，基底膜が欠落し，卵黄膜内層と穎粒膜の2層のン(VTG)杭Ⅲl清を反応させ，材料と方法に記した

１

００６
０
４

力.法でVTG抗血清反応物質を検出した。分子量マーカーの泳動位置は左側に示した。

実施の際に，スライドグラスから基底膜だけが乗l1が１︵ま︶当て△・冥三○トシ鑿三

みとなっている。これは,Gilbertら(1977)の方法で採取した卵胞組織は非常に薄い膜であり，パラ
フィン切片をスライドグラスに接着後にHE染色をれ落ちてしまったためである。写真の撮影倍率は1000倍であり，各写真中のスケールバーは10"m

22‑2319‑2016‑1713‑1410‑1107‑0804‑0501‑02である。

排卵前の時間図4．排卵周期中における血漿中ビテロケニンレベル
各点は7‑10羽の平均値±標準誤差

考 察

異符号間に5％水準の危険率で有意差あり

本実験では，排卵周期中において，卵llt庫量はF1の排卵19‑20
時間前から排卵10‑11時間前にかけて順次増加し，その後の時期
においては有意な増"Ⅱは認められなかった。この卵胞重量の増加

層のみを単離したとは言い切れないかも知れない。しかし，卵黄が認められた時期は，排卵周期中にF1とF2について，卵I句壺呈膜内層に卵黄球の付着や噸粒層細胞の残留は認められなかったのを測定したlll村ら(2001)の結果と一致し，また，放射性32Pの卵で，本実験で測定した卵黄膜内層'‑￨]のVTGレベルには，卵黄の黄内への取り込みを排卵周1り1中で検討したKamiyoshiら(1977)

内容物の洗い残しなどに由来するVTGが測定される確率は低の結果とも相応している。これらのことから，約1日の周期であく，卵胞へのVTG取り込み状況を十分に観察できていると判断るニワトリの排卵周期中においてはこの時間帯に卵黄前駆物質がした。

取り込まれて卵胞発育が促されていると考えられる。

VTG測定の予備実験において，検体中の蛋白質をSDS‑PAGE

卵黄膜内層の単離方法についての予備実験において,Gilbert

で分離した後,VTG抗血清を用いたウェスタンプロット法によら（1977）の方法により分離した組織をKurokiとMori(1997)

りVTGを検出したところ，血漿と卵黄膜内層の両方で分子量の方法に従って蒸留水処理することにより,F1,F3およびF5の240kDaのVTG抗血清反応物質が検出された。ニワトリの血中全てにおいて，穎粒層細胞が完全に破壊されて，光学顕微鏡下ににおけるVTGは450‑500kDaであり,240kDaのサブユニット

よる観察では卵黄膜内層しか確認できなかった。光学顕微鏡ではからなる2量体で存在するが(Deeley"".,1975),電気泳動に卵細胞膜の観察は困難であり，卵黄膜内層に卵細胞膜が付着して供すると240kDaのVTG単量体に分かれることが知られているいるか否かについては確認できなかったので，厳密には卵黄膜内(Deeley"".,1975;Wanggj".,1983)。それ故に，本研究で検J4

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武石ら：排卵周期1.￨‑1の卵黄ll"Iﾉ1層VTGレベル
140のではないかと考えられる。

F1

すでに述べたように，卵黄膜内居に到着した卵黄前駆物質は卵細胞￨￨莫の表IAIでエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる（ことが知られているが，最近，卵細胞膜に到達する以前の経路に100

おいて卵黄前駆物質の移動を調節する仕組みが存在する可能性が卵胞膜内層に散在する毛細管血管網から拡散したVTGなどの卵黄前駆物質は基底膜の間隙を透過した後，穎粒膜の細胞間隙を１通過して卵細胞の外側の卵黄膜内層に到達する。卵黄膜内層は複F3雑な構造を持たない非細胞性の繊維で構成され，さまざまな蛋白e

質を自由に通過させる(Jordanov"(zZ.,1966)ことから，卵黄前駆物質の取り込みには積極的に関与している可能性は少ないと考b１︵ま︶︑一ワ︑︑二至善○号戸茎三雲塙言

０
６０
４００
６０
４

示唆されている。

えられている（森,1993)｡Hummelら(2004)は．ニワトリの卵胞の成長に関して，細胞外マトリックスとしてのパールカン(perlecan)蛋白が卵胞膜外居細胞で生産され，卵胞膜外居に局在的に存在することを見出し，しかもこのタンパクが卵黄成分とし１て知られる低密度リポタンパク（LDL）やVLDLと結合可能なことから，パールカンが卵胞へのリポ蛋白の取り込みに関与している可能性を示唆している。しかし，この報告では，パールカンの存在は卵黄前駆物質の卵細胞への移動経路となる基底膜穎粒

a層と卵胞膜内層においては認められていない。

100

また,Schusterら(2004)は，頼粒層細胞の表層に，細胞間の密着結合(Tightjunction)に関与する蛋白質であるオクルディン(Occludin)が存在し，その量は，急速発育相に入った黄色卵
胞よりもまだ急速な卵胞発育が認められない白色卵胞においての60

22‑2319‑2016‑1713‑1410‑1107‑0804‑0501‑02

方が多く存在し，しかも穎粒層細胞を腕〃"γoで培養した実験に排卵前の時間図5

おいて卵胞発育の主な調節因子と考えられている卵胞刺激ホルモン(FSH)とアクチビンA(activinA)とにより増加することを排卵周期中における最大卵胞(F1),三番目に大きな卵胞(F3)および五番目に大きな卵胞(F5)の卵
黄膜内層中ビテロケニンレベル
各点は7‑10羽の平均値士標準誤差
異符号間に5％水準の危険率で有意差あり見出した。これらのことから，彼らは，卵胞が成長するに伴い頼粒層細胞におけるFSHとアクチビンAに対する反応性が低下することによりオクルディン量が減少して密着結合が弱まり，結果として卵黄成分の移行能力が高まって卵胞が急速成長するようになるのではないかと推察している。すなわち,FSHが卵胞発育に出された約240kDaのVTG抗血清反応物質は,2量体からなる関与するとしても，その作用が弱まることが卵胞の発育を促進す

VTGの単量体部分であると考えられる。このVTG抗Ⅲl情反応

ると推察している。
一方，粗製ニワトリFSH剤やFSH用作用を示すことが知られ物質の検出量と試料の希釈との間で相関関係が認められ，さらに肝臓でVTG合成を促すことが知られているエストラジオールーている妊馬血清性腺刺激ホルモン(PMSG)を投与すると卵細胞

176(E2)を体重1kgあたり1mg投与した61]寺間後にⅢl漿中のへの卵胞前駆物質の取り込みが増加する(Imai,1973;Mitchell,

検出量が増加したこと（図3）から，本実験で使用したSDS‐

1970)ことから，ほ乳類と同様に鳥類においても,FSHは卵胞発

PAGEとVTG抗血清を用いたウェスタンプロット法によりニワ育を刺激するとも考えられている。本実験において，卵黄膜内層

トリの血漿と卵黄膜内居におけるVTGレベルを半定量的に測定におけるVTGレベルが増加することが見出された時期は，本実できることが示された。

験と同じ飼育条件で飼育したニワトリにおいて，排卵周期中の血本実験では排卵周期中において，血中VTGレベルはほぼ一定

中FSHレベルを測定した山村ら(2001)の報告における血中のレベルで維持されていた。排卵周期中の血中VTGレベルの変

FSHレベルの高い時期と相応し，また,Scanesら(1977)によっ

動はこれまでに報告された例は見当たらないが，肝臓からのて報告された排卵周期中において卵胞のFSH結合能の高い時期

VTG放出はE2の刺激を受けた直後の15‑20分で起こりとも相応している。さらに,Yamamuraら(2001)により，顯粒(Clemens,1974),VTGのmRNA合成は3日後まで持続する層細胞におけるFSH受容体mRNAレベルが排卵周期中に測定(Wiskocileml.,1980;Deeley"",1977)ことから，血中E2レされているが，そのレベルは本研究で卵黄膜内層のVTGレベル

ベルの高い排卵周期中のニワトリの肝臓では常にVTGの合成とが低く維持された時期に減少しており，この時期にはFSHの穎放出が起こり，血中VTGは高いレベルで一定に維持されている

粒層細胞に対する作用は低下していることを示唆している。これ
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らのことから，本実験で卵胞重量の増加に先立ち見出された卵黄

BujoH,HermalmM,LindstedtKA,NimpfJandSchneider

膜内層VTGレベルの増力￨IはFSHの刺激により促されていると

WJ.Lowdensitylipoproteinreceptorgenefamilymembers
mediateyolkdeposition.JournalofNLltriti()n,127:801S‑804

推察される。

S.1997.

ニワトリの頼粒層細胞にはFSH受容体mRNAの存ｲ[が報告CaicedoRE,KawashimaMandKamiyoshiMSteroido‑

されている(Yamamura"""2001)ことから,FSHが順粒層細genesisinthecacellsofchickenfollicleinresponsetoovine

胞に作用することは明らかであるが，この順粒居細胞には，不活

gonadotropins.JapanesePoultryScience,34:36‑44.1997.

性化酵素のプラスミノーゲン(plasminogen)を繊維素分解酵素

ClemensMJ.Theregulationofeggyolkproteinsynthesisby

であるプラズミン(plasmin)に変換するフ･ラズミノーゲン・ア

steroidhormones.ProgressinBiophysicsandMolecular
Biology,28:71‑107．1974.

クチベター(plasminogenactivator:PA)が存在する(Tilly

DeeleyRG,MullinixKP,WetekamW,KronenbergHM,

andJohnson,1987)ことがfⅡられ,PAが頼粒層細胞層の再椛築

MeyersM,EldridgeJDandGoldbergerRF.Vitellogeninに関与すると考えられている(Polltis""/.,1990)。我々が知る限

synthesisintheavianliver.VitellogeninistheprecLIrsorof

りニワトリにおける報告は見当たらないが，ほ乳類の噸粒層細￨￨世

theeggyolkphosphoproteins.JournalofBIologicalChem‑

においてはPA活性がFSHにより刺激されることが報告されてistry,250:9060‑9066.1975.

DeeleyRG,UdellDS,BurnsAT,GordonJIandGoldberger

いる(MartinatandCombamous,1983)｡これらのことから，ニRF.KineticsofavianvitellogeninmessengerRNAinduc‑

ワトリにおいても,FSHの刺激によりPA活性が高まり，繊維素

tion.Comparisonbetweenprimaryandsecondaryresponseを分解するプラズミンが生成されることによって，頼粒層細胞間toestrogen.JournalofBiologicalChemistry,252:7913‑

隙が疎となり，結果として卵黄膜内層へのVTGの移行が促進さ

7915．1977．

GilbertAB.Theovary.In:Physiologyandbiochemistryof

れるのではないかと推察される。

thedomesticfowl.(BellDJandFrccmとlnBMeds.),Vol､3.pp．

以上述べてきたように，木実験では，排卵周期中において採取

l163‑1208.AcademicPress.London.1971.

したF1,F2,F3の全ての卵胞において，卵胞重量の増加に先立

GilbertAB,EvansAJ,PerryMMandDavidsonMH.A

ち卵黄膜内層VTGレベルが増加し，卵胞重量の増加がほとんど

methodforseparatingthegranulosacells,thebasallamina

認められなくなったF1の排卵10時間前頃から排卵時までの時

andthethecaofthepreovulatoryovarianfollicleofthe

期には卵胞膜内層TVGは低いレベルで推移することが明らかと

domesticfowl(Gallusdomesticus).JoumalofReproduction
andFertilitv.50:179‑181.1977.

なった。この卵黄膜内層VTGレベルの増加が認められた時期にHummelS,OsangerA,BajariTM,BalasubramaniM,Halfter

は卵胞刺激ホルモンとして知られるFSHの血中レベルが高く，W,NimpfJandSchneiderWJ.Extracellularmatricesofthe

しかも卵胞のFSH結合能が高く，また卵黄膜￨ﾉ1層VTGレベル

avianovariとlnfollicle.Molecularcharactarizationofchick‑が低く維持された時期には細粒膜細胞におけるFSH受容体

enperlccan.JournalofBiologicalChemistry,279:23486‑
23494.2004．

mRNAレベルが減少すると報告されている。さらに，順粒膜細胞

ImaiK,Effectsofavianandmammalianpituitaryprepara‑には細胞層の再構築に関与することが知られているプラズミノー

tionsoninductionofovulationinthedomesticfowl,Gallus

ケン・アクチベーターが存在し，しかもこの活性がほ乳類では

domesticus.JoumalofReproductionandFertility.33:91‑

FSHにより刺激されることから，卵細胞への卵黄前駆物質の取98．1973．

り込みが頼粒盾細胞におけるう.ラズミン・プラズミノーゲンアク

ItoY,KiharaM,NakamuraE,YonezawaSandYoshizakiN.

チベター系を介した機構によっても稠節されている可能性が推察

Vitellogenmtransportandyolkformationinquailovary.

される。しかしながら，これらの推察には更なる検討が必要であ

Zoologicalscience,20:717‑726.2003.

JordanovJ,GeorgiGvlandBoyadjieva‑MihailovaA.Physi‑

る。

cochemicalandelectron‑microscopicalinvestigationsoll

thevitellinemembraneofhen'seggwithaviewtoitsper‑

謝 辞meabilitytomacromolecules.Comptesrenddusdel'Acad‑

実験遂行にあたり懇意なる御指導を賜り,VTG抗血清を提供

emiebulgaredesSciences,19:153‑157.1966.
KamiyoshiM,TanakaKandSakaidaMChangesinradioac‑

して頂いた群馬大学医学部生理活性分析センターおよび終始実験

tivephosphorusuptakebytheovarianfollicularyolkofに協力頂いた日本配合飼料株式会社中央研究所の所員一同に感謝

laynghenduringanovulatolycycle.JapanesePoultry

致します。

Science,14:196‑198.1977.

KurokiMandMoriM.Bindingofspermatozoatotheperi‑

引 用 文 献vitellinelayel･inthepresencGofaproteaseinhibitor.Poul‑

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receptorforyolklipoproteindepositioninthechicken

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VitellogeninLevlesinPlasmaandPerivitellineMembrane
DuringHenOvulatoryCycle
MasaruTakeishi',TatuhiroKoike2#,SayoNishida2,NamikoYamamura2,
Nobuyukilshikawa',HisayaGoto',HitoshiShibui',
OsamuDoi3andMichiharuKamivoshi2'LabOratoryofNipponFormulaFeedMfg.Co.,Ltd.Tochigi321‑3621
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#Deceased

VitellOgenin(VTG)isaneggyolkprecursorproteinthatissynthesizedinandsecretedfromliver.Itistransportedrr()mlivertooocyteswithinovarianfolliclesoflayinghens.ThemechanismthatcontrolsVTG
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Inthisstudy,plasmaandfbllicleswerecollectedfromlayinghensat3‑hintervalsfo1･24h.Theperivitelline
membrane,whichimmediatelysurroundstheoocytemembrane,wasisolatedfromthelargest(F1),thirdlargest(F3),andnfthlargest(F5)preovulatoryfolliclesaftermeasurementoffollicularweight.VTGinplasmaandthe
perivitellinemembranewasseparatedbySDS‑PAGEanddetectedbyWesternblotanalysisusingananti‑VTG
antibody.BandswerequantifiedusingNIHImagever.1.60software.
Follicularweightincreasedgraduallyfroml9‑20tolO−11hbefbreFIovulation,andthenremainedconstant.
PlasmaVTGdidnotshowsignincantchangesduringtheovulatorycycle.TheVTGlevelinperivitellinemem‑
braneincreasedfrom22‑23hbeforeF1ovulationinallfbllicles,andthendecreasedrapidlyafterattainingthe
higheStvalueatl3−14hinFlandatl6‑17hinF3andF5.

TheseresultsindicatethatVTGintheperivitellinemembraneincreasedbefbretheincreaseinfollicularweight,therebysuggestingthatthemechanismthatcontrolsVTGtransporttofolliclesexistsbesidestheoocyte.
(JtIpα"eseJO"γ /Q/Po"/"ys℃/e"ce,45:"‑J8,2008)
Keywords:vitellogenin,perivitellinemembrane,ovulatorycycle,chicken

J8