鳥取県産業技術センター研究報告 No.22
No.22 (2019)(2019)
鳥取県産業技術センター研究報告

スギ材、マツ材を原材料とする複層木毛セメント板の開発
運動負荷を評価するためのマウス筋細胞の分化誘導と負荷条件の検討
Development of Multilayered Wood Wool Cement Boards made of Sugi and Matsu
Investigation of the Condition of Cell Culture and Induction for Estimating the Exercise Intensity
in Murine Muscle Cell

谷岡晃和＊＊Tanioka ＊＊＊・小谷幸敏＊＊＊＊
内川拓也＊・杉本優子Akikazu
・羽野紗希

Takuya Uchikawa, Yuko Sugimoto, Saki Hano and Yukitoshi Kodani
電子・有機素材研究所＊

食品開発研究所

有機・発酵担当

農産食品・菓子担当、＊＊ 食品開発研究所＊＊

水畜産食品担当、＊＊＊＊

食品開発研究所 旧バイオ技術科、食品開発研究所
スギ材とマツ材と原材料とする複層木毛セメント板の開発に取り組んだ。超速硬セメントを用い、セメントの硬化速度を高めることにより、スギ心材のセメント硬化阻害を抑え、マツ単層木毛セメント板と同様の実験動物を用いた運動負荷試験における評価を簡易・安価に評価できるための細胞培養評価系の開発を目物性と化粧性を備えた三層木毛セント板が完成した。
的の１つとして、マウス由来筋芽細胞を用いた検討を行った。筋原繊維の構成単位であり評価細胞となる筋管細胞への分化誘導化と擬似的運動負荷手法に関する基礎条件について試験を実施した。筋芽細胞に分化誘Multilayered wood wool cement boards made of sugi and matsu were developed. By increasing the hardening speed
導処理を行い、筋管細胞への誘導が認められたが、誘導化された細胞割合が低かったため、誘導化が高い細of the cement using ultra-rapid hardening cement, cement-hardening inhibition of cedar heartwood was suppressed and胞株のクローニングを行った。培養細胞へ擬似的運動負荷を与える手段として、ATP 産生を促す働きがある
three-layer wood wool cement boards with the same physical and decorative properties as single-layer pine wood wool
AMP 活性化プロテインキナーゼ活性剤（AICAR）による化学的負荷を考え、無毒性な AICAR の投与濃度域
cement boards were produced.
について細胞毒性試験を実施した。AICAR 濃度 4mM までの無毒性が確認できた一方で、細胞への負荷状態については有望な生体マーカーの検証と選択作業などが次の検討課題である。
化が進むよう意図したものである。また、原料木材
1. はじめにのアルカリ処理、温水処理等も有効と報告されていている６)。しかしながら、これら試験の実施には高価なる 3、4、5)。これらは、木毛中の硬化阻害物質を前処費用や専用設備の必要性、動物愛護に関する倫理的観理段階で除去しようとするものである。
点の問題もあり、大企業等の限られた事業者しか行う当センターでは、現在使用されているマツ材に代ことができない現状がある。そのため、われわれは動えて、スギ材を原材料とした木毛セメント板の開発

木毛セメント板は木材を細長いリボン状に削りだ1した木毛にセメントと水とを混合、圧縮成形したボはじめに
近年、超高齢化社会を向かえた日本では高齢者の加ード状の建築材料である。
齢に伴う身体機能低下は介護の観点からも大きな社会
防火性、吸音性、断熱性に優れ、主に建築物の屋問題となっている１)。都市部への人口集中が進む一方根下地または壁に用いられている 1)。
で、過疎化が進む地域の高齢者に関わる問題はより重木毛セメント板製造事業所では、これまで地域の要な課題である２)。高齢者に限らず、私たちが医療や介マツ材を原材料として生産を行ってきたものの、現護に依存せずに自立した生活を送る、いわゆる健康寿
在、マツ材資源は枯渇し、原材料調達が困難な状況
命、を長く維持していくためには運動習慣は不可欠なとなってきている。そのため、木毛セメント板製造要素して考えられ、適度な運動は働き世代での生活習業においては、マツ材からスギ材への原材料転換が慣病の予防をはじめ、健全な歩行機能の維持や認知機すすめられている状況にある。しかしながら、スギ能の維持に関与していることが報告されている３)2)。し心材がセメントの硬化不良を引き起こすため 、スかし、運動不足や運動習慣が少ない人にとって運動にギ材は木毛セメント板の原材料として使用することよる急な身体への負荷は筋肉や関節など運動器の不調は避けられてきた。これまで、セメントの硬化阻害に繋がり、運動習慣維持の障害要因になる場合がある。
を引き起こす硬化阻害樹種のセメント板への使用に運動機能の強化や補助する働きを持つ機能性成分は関して、木片セメント板では超速硬セメント、硬化いくつか知られており４)、日常の食生活での摂取は運促進剤の使用、蒸気噴射プレスの使用等が検討、報動習慣維持に役立つと考えられている。これら機能性告されている 3)。これらの方法は、木毛中の硬化阻成分の運動機能に対する有効な知見のほとんどは、実害物質がセメントペースト中に溶出するまでに、硬験動物やヒトを対象とした試験において検証がなされ物実験等よりもコストや設備のハードルが低くて取りを行うことを目的として、｢スギ材を原材料とした木組みやすく、近年、技術進歩により実用性が一層高ま毛セメント板の開発｣研究（H24-25）に取り組み、普通ポルトランドセメントに代えて、超速硬セメンっている評価技術手法として細胞培養法に着目した。
トを使用することにより、スギ材を原材料とした木細胞培養による筋肉組織への運動負荷の試みはすでに毛セメント板が製板可能であることを確認し、セメ大学等で研究が進められているが５)、いまだ簡便かつント硬化時間の調整、制御により、スギ材を原材料実用的な評価手法は見出させていない。とした木毛セメント板の製造が可能であることを示
そこで本研究では、実験動物の運動負荷を代替評価唆した。また、スギ心材を煮沸処理、アルカリ処理できる細胞系を基本に考え、マウス由来筋芽細胞 C2C12することにより硬化阻害を抑制することができた 6、7)を用いて、運動機能のうち運動負荷による筋組織にお。
ける筋損傷を対象とした簡易かつ安易な機能性成分の現在、製造工場では、マツ材の不足を補うため、評価が可能な細胞培養系の開発を目的に検討を行った。
マツ材とスギ材を混合して使用するようになってきている。ただし、スギ材を混合すると、セメント板

2 実験方法表面が、スギ心材から滲出する成分により、茶褐色2.1 細胞と培養に変色汚染される。そこで、表面層（化粧面）にマ細胞株は（国研）理化学研究所バイオリソース研究55

2.4 細胞毒性試験

センターより購入したマウス骨格筋由来筋芽細胞
C2C12 株を使用した。培養は 37℃、湿度 95%、5% CO2

培養細胞へ疑似的運動負荷を掛けるために使用するで行った。増殖培地には 10%ウシ胎児血清 Fetal Bovine

化学物質について、適正な投与濃度域を調べるため細Serum（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地

胞毒性試験を行った。試験は WST 法に従い 96-well プ（DMEM 培地）を用い、分化誘導培地には 2%ウマ血レートを用いた系で検討し１０)、被験物質として AMP

清 Horse Serum（HS）を含む DMEM 培地を使用した７)。

活性化プロテインキナーゼ（AMPK）の活性剤である筋芽細胞からの筋管細胞への分化誘導処理は 1 x104

AICAR を使用した。測定にはマイクロプレートリーダ

cells/mL に調製した筋芽細胞 C2C12 株を高グルコースー（TECAN 社、infinite F200）を用いて行った。

（4.5 g/L）の増殖培地で培養し、約 70% コンフルエン
トに達したら分化誘導培地へ交換して 2 日毎に培地交3 結果と考察

換行い、筋管細胞への分化誘導を行った。

3.1 筋管細胞の形成
図 1 に分化誘導処理による筋管細胞への形成変動をNADH-TR 染色で細胞染色図を示す。

2.2 分化誘導細胞の確認
筋管細胞へと分化誘導される細胞の確認方法として、筋細胞における細胞分化マーカーである Myogenin に分化誘導着目し、1 次抗体に抗マウス抗 Myogenin 抗体（Santa
０日目（誘導前）

Cruz Biotechnology 社）を用いた細胞染色観察およびウエスタンブロットによる測定を行った８)。2 抗体抗体には 抗 ヤ ギ 抗 マ ウ ス IgG （ H + L ） Alexa Fluor 546

分化誘導（－）

分化誘導（＋）（Invitrogen 社）を使用した。分化誘導によって形成される筋管細胞を、NADH-Tetrazolium reductase（TR）法

２日目による細胞染色を行い９)、分化誘導具合を観察した。

2.3 高誘導細胞株のクローニング
４日目

高い割合で分化誘導する細胞株を得るために細胞のクローニングを行った。培養した C2C12 株を 10 cell/mLに調製し、96-well プレートに 100 µL ずつ接種し細胞 1個からの培養を行った。増殖した各細胞株を 24-well プ

６日目

レートで増殖させた後にφ35 mm デッシュ 3 枚に移して培養・分化誘導処理を行って、分化誘導状態をNADH-TR 染色法による細胞染色観察から調べた９)。分

８日目

化誘導化が高い細胞株の選抜は 2 段階で行い、24-wellプレートで増殖した細胞のうち、有望な細胞を一次選

図１ 分化誘導処理による筋芽細胞から筋管細胞の形成抜し、選抜された細胞株を再度、35 mm デッシュに開始細胞密度 1 x 104 cells/mL で培養・分化誘導を行い、分化誘導処理を行って培養 4 日目より筋芽細胞が融細胞染色観察より 2 次選抜を行った。選抜した細胞株合・多核化して形成される筋管細胞が観察された。当は培養液にジメチルスルフォオキシド（DMSO）を添加

初は分化誘導され細胞の確認手段として、筋芽細胞の混和し、-80℃にて保存した。

56

分化初期から中期に発現するタンパク質 Myogenin に

今回、筋分化マーカーが観察できなかった要因につ着目し、Myogenin 抗体を用いた細胞免疫染色による確いて、特に 2 つの可能性が考えられた。1 つは培養にお認を試みた。誘導 2－4 日目に高い Myogenin の発現をける細胞の分化誘導が正常にできておらず Myogenin予測したが、本実験において細胞観察からは分化誘導がほとんど発現していない可能性、2 つめは分化誘導処理による Myogenin 発現を観察できなかった（図 2）。

処理によって Myogenin がタンパク質発現しているが他の確認手段として、分化誘導処理した細胞を回収し発現量が少なく検出できていない可能性がある。未染てタンパク質抽出を行い、SDS-PAGE に供したのち、色状態での細胞観察においても細長い筋管細胞の形状

抗 Myogenin 抗体を用いたウエスタンブロット法（WBはあまり認められなかったことから、培養した筋芽細法）による Myogenin タンパク質の発現確認を行った。

胞自体の分化能が低い可能性が考えられた。購入した

しかしながら、WB 法においても分化誘導処理による基準細胞株においても、各細胞によって細胞の分化能明確な Myogenin 発現の変化は認められなかった（デーに潜在的なバラツキがあることも推測されるため、次タ未掲載）。骨格筋への筋細胞分化は、サテライト細胞に高い分化能を有する筋管細胞株のクローニングを試→ 筋芽細胞 → 筋細胞 → 筋管細胞 → 筋原みた。

繊維 という形成過程で進んでいき、特異的に発現する因子として６つのタンパク質が知られている１１）。こ

3.2 高い筋分化能を有する細胞株の選抜のうち、Myogenin は筋芽細胞から筋管細胞の分化形成

前述 2. 3 の方法に従い、購入した筋芽細胞 C2C12 株の時期に特異的に発現するため、発現の一時的な増加を中から、高い割合で筋分化する細胞のクローニングを過ぎた後は筋管細胞の形成過程に移行していることが行った。単離培養した 167 種類の細胞株より 29 株を 1期待される１２）。本研究と同じく C2C12 細胞を用いた報次選抜し、さらに 2 次選抜にて最終的に 3 つの細胞株

告において、分化誘導処理による筋管細胞形成に 3~を選び、-80℃で保管した。選抜前の細胞での筋分化状

14 日のばらつきがあり、細胞状態や細かな条件によっ態（図 1）に比べるとかなり分化状態がよい細胞株が得られた（図 3）。この株を用いて筋分化した筋管細胞を７）、１２）、１３）て大きく変動していることも考えられる。

作成し、疑似的運動負荷の検討を行うこととした。
誘導 2日目

誘導 3日目選抜した細胞株①

誘導 4日目選抜した細胞株②選抜した細胞株③染色：NADH-TR法による筋繊維染色
時期： 分化誘導4日目

筋分化マーカー：Myogenin（赤色）核：DAPI（青色）

図３ 選抜した細胞株を用いた分化誘導処理による筋管細胞形成

図２ 免疫抗体染色による.筋分化マーカーの発現確認

57

培養細胞に AICAR を投与した研究は、糖尿病に関係

3.3 AICAR による細胞毒性への影響
培養細胞に疑似的運動負荷を与える手段として、した因子やエネルギー代謝に関するものが多く、投与

AMPK 活性の誘導を介して ATP 産生を促す働きがあ

濃度は 1 mM までの濃度域である１４）－１６）。本研究ではり、糖尿病治療にも用いられている AICAR に着目し運動負荷に近い状態を想定しているため、より高濃度た。AMPK 活性は運動時の骨格筋において、組織内にの AICAR 投与によって細胞への負荷強度を高めるこ産生される活性酸素種（ROS）に起因して活性誘導さとが可能かを検討したいと考えた。そのため、実際にれることが知られている１４）。マウスを用いた実験にお使用する培養細胞株を用いて、AICAR による細胞へのいて、AICAR 投与は主に速筋に特異的に AMPK 活性毒性を検討し、使用可能な濃度域を調べた。試験は前を増加誘導させ、運動時と同様に核内受容体であるペ述 2. 4 の方法に従い、被験物質の最終濃度を 0, 0.25, 0.5,ルオキシソーム増殖剤応答性受容体 g（PPARγ）を介し1, 2, 4 mM の 6 段階に設定して曝露 6 時間で行った。まて細胞の活動能が高い状態にすることができる１４）。

た、筋芽細胞の細胞数を 4 段階に設定して試験を実施した。培養した筋芽細胞の生存率から、試験最高濃度4mM までの濃度域では毒性は認められなかった（図 4）。

5x105 cells/mL開始140より高い濃度域や投与手段の違いによる影響など、

120

AICAR 投与に関して更にいくつか検討を行う必要性

生存率、%10080

AICAR (mM)

600.000.25400.50

1.00202.004.000012345Time (hr)Time(h)6があると考えられる。また、AICAR 以外の擬似的運動負荷を与える手段として、心筋の心拍増加に用いられ7るβ作動薬や筋収縮を増大させる作用を有するホスソ

1x105cells/mL開始

140

ジエステラーゼⅢ阻害剤などの薬剤投与も候補として生存率、％120考えたが、試薬コストもあり、AICAR 処理を第一候補

1008040200に選定した。また薬物的負荷とは異なる擬似的運動負AICAR (mM)

60012340.00

0.25

0.50

1.00

2.00

4.00

56

荷の手段として、低酸素状態や ROS の添加、ヒートショックによる方法を調査した。このうち、低酸素を作

7Time (hr)Time(h)

り出す手段には塩化コバルトを培地中に添加する方法

5x104cells/mL開始

140があり、筋芽細胞において ROS 負荷を誘導させている

120

報告がある１７）。しかし細胞負荷指標への検証が少なく、生存率、%

10080

AICAR (mM)

600.000.25

400.501.00

202.004.00

00123456投与濃度も 150 または 200 M だけなので、この手法を採用する場合にも細胞毒性試験が必要と考えられる
１７）。細胞実験において、薬剤による代謝活性の人為的7Time (hr)Time(h)誘導は生物個体の運動時の細胞状態に近づける有望な

1x104cells/mL開始

140

手段であることから、他の薬剤との組み合わせについ生存率、％120
10080

AICAR (mM)

60ても調査・検討を進めていきたいと考える。また使用

0.00

0.25

400.501.00

202.004.00

00123456

条件として、細胞に悪影響が出ない範囲での負荷誘導が必須条件となることから、細胞毒性試験は候補物質
7Time (hr)Time(h)を選定した際に最初に実施しなければならない試験であると考える。

図４ C2C12 細胞株 の AICAR に対する影響

58

7) Terruzzi I, et al.; Ranolazine promotes muscle diff-eren-

4. おわりにtiation and reduces oxidative stress in C2C12 skeletal

今回実施した試験において、筋管細胞への分化誘導

muscle cells, Endocrine, 58, p.33-45(2017).

条件を決定でき、クローニングによって高い割合で分8) Cell Signaling Technology; A guide to successful West-化誘導する細胞株を得ることが出来た。また、擬似的

ern Blotting, p.13(2013).

運動負荷については化学的処理による手法として

9) 西野一三; 総説筋病理の基本, 51(9), p.669-676

AICAR に着目し、細胞毒性試験から投与濃度域の細胞(2011).

への安全性を確認することが出来た。しかしながら、

10) 同人化学研究所; DOJINDO 2018/2019 プロトコル

本研究において重要な検証項目である細胞への疑似的

31st Edition, p.1-6(2018).

運動負荷状態などの検討については未だ着手できておらず、負荷状態を判定する生体指標の選定や、他の手

11) Cervelli M, et al.; Skeletal Muscle Pathophysiology: The段による負荷状態の作成など多くの検討課題を残してEmerging Role of Spermine Oxidase and Spermidine,

いる。すでに調査を行い別の負荷処理候補についてもMed. Sci., 14;6(1), e14(2018).

研究を進める中で、複数の負荷条件を組み合わせるこ12) Horie M, et al.; Cytoprotective Role of Nrf2 in Electricalとで、より運動時の細胞状態近い疑似的運動負荷を作

Pulse Stimulated C2C12 Myotube, PLoS One, 14;10(12),り出せる可能性も予測される。最初の大きな到達点とe0144835(2015).

考えられる評価系の構築までには、疑似的運動負荷状

13) Maarman GJ, et al.; Melatonin protects against uric acid-態の作成条件を作成した後にも、実際に既知食品成分induced mitochondrial dysfunction, oxidative stress, andでの確認検証などの検討課題が想定される。これらのtriglyceride accumulation in C2C12 myotubes, J. Appl.

課題を解決した先に、ようやく実用的な評価系として

Physiol., 122(4), p.1003-1010(2017).

利用できる段階に近づけると想定され、まだ多く残る

14) Sasaki T, et al.; Role of AMPK and PPARγ1 in exercise-

検討課題を早くクリアできるように努めていきたい。

induced lipoprotein lipase in skeletal muscle, Am. J.
Physiol. Endocrinol. Metab., 306(9), e1085-1092(2014).
15) Kurauti MA, et al.; Acute Exercise Improves Insulin

文 献Clearance and Increases the Expression of Insulin-De-1) 牧迫飛雄馬; 老化とフレイル, 理学療法の歩み,

grading Enzyme in the Liver and Skeletal Muscle of10(1), p.3-10(2017).

Swiss Mice, PLoS One, 11(7), e0160239(2016).

2) 范翔ら; 過疎地域に在住する高齢女性と身体特性,

16) Troy L. Merry, et al.; Nuclear factor erythroid‐derived

生活習慣ならびに社会的特性との関係, 生涯スポ

2‐like 2 (NFE2L2, Nrf2) mediates exercise‐induced

ーツ学研究, 28(1), p.21-30(2014).

mitochondrial biogenesis and the anti‐oxidant response3) 小原史郎、松下智之; 運動・スポーツの習慣化・継in mice, J. Physiol., 594(18), p.5195–5207(2016).

続化に関する調査研究, 愛知工業大学研究報告, 50,17) Rui Chen, , et al.; Necrostatin-1 protects C2C12 myo-p.58-70(2015).

tubes from CoCl2-induced hypoxia, Int. J. Mol. Med.,

4) 佐藤隆一郎; ロコモーション機能向上に寄与する

41(5), p.2565–2572(2018).

食品の開発, 生物工学会誌, 95(5), p.252-253(2017).
5) 中尾誠ら; 培養骨格筋のバイオアクチュエータへの応用, 生体医工学, 47(6), p.560-565(2009).
6) Langone F, et al.; Metformin protects skeletal muscle
from cardiotoxin induced degeneration, PLoS One. 9,
e114018 (2014).

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