鳥取県産業技術センター研究報告 No.18 (2015)

大豆由来リポキシゲナーゼによるキチン・キトサンの漂白
Bleaching of Chitin and Chitosan by Soybean Lipoxygenase

吉田晋一＊・寺田直文＊
Shinichi Yoshida and Naofumi Terada＊

電子・有機素材研究所

有機材料科

キチン・キトサン製造工場で行われる漂白工程のために、安全性を考慮して、大豆由来のリポキシゲナーゼを用いた漂白方法を検討した。本法によるキチン・キトサンの漂白の変化と化学構造の変化を調べ、さらに過酸化水素あるいは紫外線（UV）照射による漂白の場合と比較した。キチン・キトサンはどちらも、本酵素の存在下で良好に漂白され、さらに漂白されたキチン・キトサンの赤外線分光（IR）分析と漂白後のキトサンのゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）分析から大きな化学変化が生じていることは示唆されなかった。これらの結果から、本法は、残存していると考えられる色素（アスタキサンチン）を選択的に分解し、キチン・キトサンの化学的な変質への寄与は少ない方法であると考えられた。

1.

はじめに鳥取県で水揚げされ、加工された後に排出される

紫外線照射法が報告された７）が、これらの方法では、ベニズワイガニの殻のうち、脚の部分の大半がキチ漂白処理中にキチン・キトサンの分子量の低下を引ン・キトサンの製造に使われる。キチンは、N-アセ

き起こす７）～１０）。

チルグルコサミンがβ-1,4-結合した糖鎖高分子であ

製紙用パルプの漂白では、セルロースの分子主鎖る。キトサンは、キチンの N-アセチル基を除去するのβ-1,4-結合の開裂だけでなく、分子中のグルコーことにより得られる。キチン・キトサンはどちらもス単位の化学的な分解が生じることが報告されてお種々の生理作用を持つことから、多分野から興味がり１１），１２）、このことは、キチン・キトサンの漂白持たれている。

時にもその分子鎖中の N-アセチルグルコサミンやD-グルコサミン残基も同様な分解反応を受けていキチン・キトサンは、工業的にはカニ殻を原料にして製造されるが、一般的な手順は、①希塩酸水溶ることを示唆している。

液による脱カルシウム処理、②希水酸化ナトリウム

キチン・キトサンはサプリメントや食品添加物等水溶液による脱タンパク処理、③濃水酸化ナトリウとして流通するため、漂白された製品が人体の健康ム水溶液による脱アセチル化処理からなる。製品にに対して何らかの影響を与える可能性は、留意すべ

よっては、キチン・キトサン製品の“色”に対するき点である。

要望もあり、引き続き漂白工程が入れられる場合も

キチン・キトサンの主な残留色素はカロテノイドある。の一種であるアスタキサンチンであるが、同じカロ色素の除去には、過酸化水素、次亜塩素酸ナトリテノイドであるβ-カロテンとルテインは、リノール

ウム、オゾンおよび有機溶剤等が用いられる１）~６）。

酸と酸素の存在下でリポキシゲナーゼによって脱色

一般に、有機溶剤は過酸化水素や次亜塩素酸ナトリされることが報告されている１３），１４）。酵素を用いウム、オゾンと比較して、工業的な規模での漂白にた方法は、キチン・キトサン分子に化学的な変性をは効率的でないと考えられる。新しい方法としては、与えない色素特異的漂白として期待できる。

-17
1 -本稿では、大豆リポキシゲナーゼによるキチン・間吹き込み、さらに 24 時間撹拌を継続した。反応終

キトサンの漂白について検討を加え、過酸化水素あ了後、反応液をろ別し、徹底的に蒸留水で洗浄した。

るいは紫外線（UV）照射処理と比較した結果につい漂白したキチン・キトサンは、暗所下、室温で風乾て報告する。

した。

2.

実験方法

2.4

2.1

原材料

未漂白キチン・キトサンの過酸化水素処理

未漂白キチン・キトサン（50 mg）を試験管に入

未漂白キチン及び未漂白キトサンは、（有）宝水れ、30%過酸化水素水溶液（5 mL）を加え、未漂白産（鳥取県境港市、現、（株）オーク）から提供してキチンの場合は室温で 24 時間、未漂白キトサンの頂いた。これらの未漂白キチン・キトサン試料は約場合は室温で 40 分間撹拌した（未漂白キトサンを5 mm 角の大きさにカットし、以後の実験に用いた。

30%過酸化水素水溶液で 24 時間処理した場合、完全に溶解し固形分が残存しないため）。反応終了後、

2.2

ろ別しさらに徹底的に蒸留水で洗浄を行い、暗所下、大豆リポキシゲナーゼによるアスタキサンチ室温で風乾した。

ンの酸化アスタキサンチン（2 mg）を 2 mL のクロロホルムに溶解し、次いで Tween 80（80 µL）を添加した。

2.5

未漂白キチン・キトサンの紫外線照射処理混合したのち、エバポレーターによりクロロホルム未漂白キチン・キトサン（50 ㎎）を時計皿に入を除去し、残渣を 0.25％の EDTA・2Na 水溶液（w/v）

れ、0.1 mL の蒸留水で湿らした。クリスタル製のシに再溶解した（溶液 A）。別に、リノール酸（32.8 µL）、ートで覆いをしたのち、UV ランプ（東芝 G15、253.7

Tween 80（65.6 µL）と 0.2 M ホウ酸緩衝液（pH 9.0）

nm、15 W）で、高さ 60 cm のところから一定時間照68 mL に蒸留水を加え、全量を 100 mL としたもの射した。照射終了後、漂白したキチン・キトサンをを調製した（溶液 B）。アスタキサンチンの酸化反応

徹底的に蒸留水で洗浄し、暗所下、室温で風乾した。

は、溶液Ａ（0.2 mL）と溶液Ｂ（2.795 mL）を UV

2.6

色の変化の測定セルに入れた後、酸素ガスを 30 秒間吹き込み、大豆色の変化は、分光測色計（ミノルタ CM2600d）をリポキシゲナーゼ（Sigma、Type V）0.018 mg 分を、a*（赤味（＋用いて測定した。結果は、L*（明度）添加することで開始した。この時、セル内の溶液量値の場合）～緑味（－値の場合）、b*（黄色味（＋値は、最終濃度 3 mL となるように調整した。反応時の場合）～青味（－値の場合））で報告した。の吸収スペクトルの変化は、紫外可視分光光度計（日立 U-3300）を用いて、25℃で経時的に追跡した。

2.7分子量分布

分子量分布は、ゲル浸透クロマトグラフィー
2.3（GPC）を用いて以下の条件により測定した。

未漂白キチン・キトサンのリポキシゲナーゼ〔カラム, TOSOH TSKgel GMPWXL（φ7.8 mm×30処理cm）2 本連結; 測定温度, 30℃; 溶出液, 0.5 M 酢酸＋未漂白キチン・キトサン（50 mg）を試験管に入れ、2.2 で述べた溶液 B（2.95 mL）を加えた。酸素

0.5 M 酢酸ナトリウム; 流速, 1.0 mL/分〕

ガスを 1 分間吹き込んだのち、大豆リポキシゲナー
ゼを 0.18 mg 分添加し反応を開始し、25℃で撹拌し3.

結果と考察た。24 時間後、リノール酸（0.5 µL）とリポキシゲ

3.1

漂白処理後の色の変化について

リポキシゲナーゼは、cis,cis-1,4-ペンタジエン系をナーゼ（0.18 mg）を追加し、さらに酸素ガスを 1 分-182-含む長鎖不飽和脂肪酸とそのエステル類の酸化を触化について検討を加えた。すでに報告のある過酸化媒する１５）。カロテノイドは、リポキシゲナーゼによ水素もしくは UV 照射処理をした漂白物との比較もって生じるヒドロパーオキシ脂肪酸ラジカルの作用行った。その結果、未漂白キチンとキトサンどちらにより無色の化合物へと酸化される１４）。大豆は、特も、リノール酸と酸素の存在下でのリポキシゲナーにリポキシゲナーゼの良い原料として知られ、そのゼ処理により、L*値が増加し、a*と b*値については粉体は小麦の漂白を助けるために広く用いられてい減少した（表１）。酵素処理後のこれらの値は、市販

る１６），１７）。コストの点から、大豆のリポキシゲナで販売されているキチン・キトサンと同程度のものーゼは工業スケールでのキチン・キトサンの漂白にである。また、リポキシゲナーゼ処理後のキトサン対する触媒として可能性を秘めている。の L*値については、UV 照射７）により漂白されたもまず、紫外可視分光光度計を用いて、大豆リポキのよりも高かった。酵素を添加しない対照実験でもシゲナーゼのアスタキサンチンに対する反応性を調

L*は増加し、a*と b*については減少する結果となっべた。アスタキサンチンの最大吸収は 482 nm に現たが、その変化の程度は、酵素が存在する系よりもれるが、リノール酸と酸素の存在下でリポキシゲナ小さかった。この結果は、リノール酸と酸素だけでーゼの作用によりこの吸収は経時的に減少し、本条も 48 時間以内にわずかな漂白反応が起きるが、リポ件下では 40 分以内で完全に消失した（図１b）。酵素

キシゲナーゼの存在で漂白度が高められることを示を含まない対照実験では、この吸収の減少は観察さしている。また、過去の報告通り、UV 照射はキチれなかった（図１a）。これらの結果は、大豆リポキ

ン・キトサンの漂白には効果的であった７）が、本条

シゲナーゼが、未漂白キチン・キトサンに残存して件下では b*値が依然として高く、まだ黄色系化合物いる色素であるアスタキサンチンを漂白できることが残存していることを示した。過酸化水素処理も L*を示唆している。

値を増加させ、a*と b*を減少させる結果となり、市販品とほぼ同程度まで漂白されたが、リポキシゲナ

O

アスタキサンチンOHーゼ処理に比べて、L*値が依然として低かった。
HO1.0

表１482nmO

a0h0.820min
40min

0.6

L*

吸光度

0.0

b0min
2.0min0.6

3.5min5.0min9.5min0.420min
40min

0.2

キチン
a*

1. リポキシゲナーゼ
酵素あり
0時間
58.2 24.0
48時間後
91.9 -0.3
酵素なし
0時間59.9 26.4
48時間後
85.5 4.7
2. UV 照射0時間
64.0 25.5
32時間（乾燥） 87.0 3.8
32時間（湿潤） 89.8 -0.2
3. 30% H2O2a
85.5a -0.2a
4. コントロールb
87.1 -2.1

0.2

0.8

b*

L*

キトサン
a*
b*

28.9
9.9

69.2
84.3

8.9
-0.7

20.2
7.2

28.9
21.5

71.1
81.5

10.9
-0.3

30.2
14.9

31.1
16.8
14.1
6.9a
9.2

68.2
75.2
83.2
85.8b
91.5

15.7
7.4
-0.4
-0.9b-0.7

29.4
24.9
13.5
8.0
7.2

a キチンに対しては24時間の処理後、キトサンについては40分の処理後に測定．

400

500
波長（nm）

600700b 市販で入手できる漂白キチン・キトサン．

3.2
図１L* a* b* 値

処理方法0.40.0300

大豆リポキシゲナーゼ、紫外線照射、過酸化水素処理により漂白されたキチン・キトサンの L* a* b* 値

大豆リポキシゲナーゼによるアスタキサンチンの酸化

漂白処理後の化学構造変化についての考察

漂白キチン・キトサンは、サプリメントや食品添

a 対照実験、 b リポキシゲナーゼあり加物として主に使われている。漂白処理過程に起き続いて、リポキシゲナーゼによる漂白物の色の変ると予想されるキチン・キトサンの化学変化は、人-193-体の健康に対して何らかの影響を与える可能性を有る可能性は依然として残っており、この点を解明すしていると考えられる。そのため、この様な化学変るためにも、漂白処理後の化学変化についてモデル化について知見を得ることは重要である。キチンの化合物などを用いて詳細な検討を進める必要がある

IR 分析では、漂白処理前後に変化は見られなかったと考えられる。

（図２上）。このことは、リポキシゲナーゼ処理では4.

マクロなレベルでキチンの化学構造に変化が起きていないことを示している。

おわりに

大豆リポキシゲナーゼによりキチン・キトサンの漂白が可能であることが分かった。また、本法はキキチン

チン・キトサン分子への影響が少ない方法であるこ未漂白
リポキシゲナーゼ （48ｈ）とが示唆された。

UV（湿潤, 32ｈ）
%T

H2O2（24ｈ）

文献

未漂白

1)

キトサン

リポキシゲナーゼ （48ｈ）

species and method of preparation. Comp. Biochem.

UV（湿潤, 32ｈ）

Physiol., 69B, p. 283-286 (1981).
2)

H2O2（40分）
4000

図２3200

2400

1800
1400
cm-1

Brine, C.J., and Austin, P.R.; Chitin variability with1000

600 450

Moorjani, M.N., et al.; Parameters affecting theviscosity of chitosan from prawn waste. J. Food Sci.

種々の方法により未漂白および漂白されたキチン・キトサ

Technol., 12 (4), p. 187-189 (1975).

ンの IR スペクトル3)

同様に、キトサンの場合でも、リポキシゲナーゼ

No, H.K., and Lee, M.Y.; Isolation of chitin fromcrab shell waste. J. Korean. Soc. Food Nutr., 24 (1),

処理による IR スペクトルの変化は観察されなかっ

p. 105-113 (1995).

た（図２下）。また、漂白処理によってキチン・キト4)サンの分子量の低下が予想されるが、一般にキチン

No, H.K., and Meyers, S.P.; Preparation andは溶解性が悪いため分子量の測定は難しいが、キト

characterization of chitin and chitosan. J. Aquat.

サンはキチンと異なり弱酸溶液に溶解するため、Food Product Technol., 4 (2), p. 27-52 (1995).
5)GPC による分子量評価が可能である。そこで、キト

No, H.K., et al.;.Isolation and characterization ofchitin from crawfish waste. J. Agric. Food. Chem.,

サンをリポキシゲナーゼで 48 時間漂白処理した重37 (3), p. 575-579 (1989).

量平均分子量を測定したところ、未漂白では 1.8×106、漂白後は 1.9×106 であった。これらの結果は、

6)

Seo, S., et al.; Simultaneous depolymerization and

分子量低下はなく、リポキシゲナーゼ処理によるキ

decolorization of chitosan by ozone treatment. J.

トサンのマクロな化学的変化はないものと考えられFood Sci., 72 (9), p. C522-C526 (2007).
7)た。過酸化水素と UV 照射による処理では、キトサ

Youn, D.K., et al.; Decoloration of chitosan by UVirradiation. Carbohydr. Polym., 73 (3), p. 384-389

ンの分子量が低下することが報告されている。本研(2008).

究でも、23 時間の UV 照射で、重量平均分子量の若8)干の低下が確認された（未漂白：1.8×106、漂白：Kabal’nova, N.N., et al.; Oxidative destruction ofchitosan under the effect of ozone and hydrogen

1.4×106）。

peroxide. J. Appl. Polym. Sci., 81 (4), p. 875-881

リポキシゲナーゼの触媒機構１４）を考えると、キ(2001).

チン・キトサン分子が何らかの化学変化を受けてい9)-204-Wang, S.-M., et al.; Study on the synergeticdegradation of chitosan with ultraviolet light andhydrogen peroxide. Carbohydr. Res., 340 (6), p.
1143-1147 (2005).
10) Tian, F., et al.; Study of the depolymerization
behavior of chitosan by hydrogen peroxide.
Carbohydr. Polym., 57 (1), p. 31-37 (2004).
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Polysaccharide

modifications

occurring in bleaching, Carbonyl glycosides:formation and properties. Tappi, 48 (2), p. 105-110(1965).
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