フェムト秒レーザーが発生させる熱弾性応力を利用した生体材料の物理特性改質
奈良先端科学技術大学院大学 先端科学技術研究科
助教 安國 良平
（2019 年度 奨励研究助成（若手研究者枠） AF-2019231-C2）
キーワード：生体材料，ソフトマター，熱弾性応力波，ヤング率，分子透過性

１．研究の目的と背景
フェムト秒レーザーを対物レンズで透明な生体試料へ集光すると，多光子吸収イオン化をはじめとする効率的な分子の非線形イオン化現象が生じ，分子に吸収のない波長

２．研究方法2・1

顕微鏡下におけるハイドロゲルへのフェムト秒レーザー照射とヤング率測定においても低エネルギーのレーザーパルス照射でプラズ

図 1 に倒立顕微鏡上で原子間力顕微鏡(AFM)によるヤマ発生を誘導できる 1)．特にチャープ増幅された低繰り返

ング率測定とフェムト秒レーザー照射を同時に行えるシし・高強度のフェムト秒レーザーパルスを用いると，高繰ステムの概要を示す．フェムト秒チタンサファイア再生増り返し・低強度のフェムト秒レーザーオシレーターを使用

幅器（Spectra-Physics, Solstice-Ref-MT5W）からメカニカルする場合と比較して，熱の蓄積を抑制しながら生体試料をシャッターによって切り出した単発のレーザーパルス

効率よくアブレーション加工できる．その加工特性から，（130 fs, 800 nm）はビームエキスパンダーで径を拡大してフェムト秒レーザーを利用した視力矯正や白内障治療，発倒立顕微鏡（Olympus, IX73）に導入し，対物レンズを用い生生物学分野での細胞や胚のナノ手術などに応用されてて顕微鏡ステージに設置した試料へ集光した．パルスエネ

いる．近年の比較的安価で安定性の高いフェムト秒 Yb（イルギーは ND フィルターで調節し，対物レンズ通過後のエッテルビウム）レーザーの普及に伴い，フェムト秒レーザネルギーをパワーメーターで測定した．

ー加工の生体試料への応用がますます盛んになることが予想される．
また上記の生体試料のアブレーション加工の特徴として，熱拡散よりも短い時間スケールで緩和したプラズマのエネルギーが，集光点における熱弾性応力を急激に上昇させ，衝撃波やキャビテーションバブルの発生を誘導することがあげられる．チャープ増幅された高強度のフェムト秒レーザーパルスの集光点では試料の，熱弾性応力の上昇が顕著となり，ナノ-マイクロ秒の時間スケールで数十マイクロメートルのキャビテーションバブルの膨張収縮が生じる 2)．ゲルのような粘性が大きく柔らかい物質であっても，このような高速な試料の変形には追従できないため，衝撃波やキャビテーションバブルの機械的作用が生体膜の破壊や膜透過性などへ影響を与えることが報告されている 2)．
以上の背景から，フェムト秒レーザー集光点近傍において熱弾性応力の上昇に伴う高速変形によって生体試料に生じる物理特性の変化を明らかにすることは，加工特性の理解に加えてフェムト秒レーザーの新しい利用方法を開拓するという点で有用である．
そこで本稿では生体試料として細胞外基質として細胞図１

顕微フェムト秒レーザー照射・AFM 測定システム

培養などによく使用されるハイドロゲルにフェムト秒レーザーを集光し，集光点近傍で生じる物理特性として試料のヤング率と分子透過性の変化に関して調査した結果を報告する．

AFM（JPK，Nanowizard 4）の QI モードを用いてカンチレバーを試料へ押し込み，その押し込み量に対するカンチ
レバーのたわみ量を試料からの反力として計測した応力-ひずみ曲線（フォースカーブ）を測定し，ヘルツの接触理ン)を用いた．図 3 のように 800 nJ/pulse のフェムト秒レー論に基づいて得られたフォースカーブをフィッティング

ザーパルスを 100 倍対物レンズ(NA 1.25)と通じて 1%アガすることでヤング率 E の値を算出した．

ロースゲル表面に 20 箇所集光し，その後に 2 μM の FITCデキストラン溶液を滴下した．共焦点蛍光観察には 4 倍対

1𝐸𝑅 2342𝑃=
𝛿
3 (1 − 𝑣 2 )物レンズ(NA 0.16)を用いて行った．蛍光分子の励起には波長 488 nm の連続発振 DPSS レーザー(50 μW)を用いた．

ここで P は試料からの反力，ν はポアソン比，R は先端半径，σ は試料の押し込み量である．用いたカンチレバー（Nanosensors, TL-CONT）は平均的に表 1 に示すような特性を有しており，柔らかいハイドロゲルへカンチレバー先端が突き刺さることを防ぐためにチップレスのカンチレ
バー先端に直径 40 μm のガラスビーズを接着剤で接着し

図 3

た．

ースゲル中の FITC-デキストラン透過性評価の概要

フェムト秒レーザー照射に伴って変化するアガロ

ハイドロゲルとしてはガラスベースディッシュ底面のガラス部に作製した厚さ数百マイクロメートルの 5%アガロースゲル及び 3%コラーゲンゲルを使用した．

３．研究成果3・1

フェムト秒レーザー照射に伴うアガロースおよびコラーゲンゲルのヤング率変化

図 2(a)フェムト秒レーザー集光点におけるアガロースゲルのフォースカーブ測定の概要, (b)40 μm のガラスビーズを接着した AFM カンチレバー, (c)フォースカーブ測定の概要．カンチレバーを試料へ押し込み，試料からの反力によるカンチレバーのたわみ量を AFM の光てこを用いて計測する．

表 1 AFM カンチレバーの代表的な仕様
AFM probe
TL-CONTShapeBeam
Length (μm)
450
Spring constant (N/m)
0.2Frequency (kHz)
13Width (μm)
50
Thickness (μm)
2MaterialSilicon

図 4

フェムト秒レーザー照射前後におけるアガロースゲル表面のヤング率マッピング．像の 1 辺は 10 μm.
250 nJ/pulse のフェムト秒レーザーパルスを 5%のアガ2・2ハイドロゲルの分子透過性の評価

ロースゲル表面に照射し，レーザー照射前後で，集光点をハイドロゲルの分子透過性は，その上に滴下した蛍光性中心とした 10 x 10 μm の領域のフォースマッピングを実分子の 3 次元空間分布をレーザー走査型共焦点蛍光顕微施した代表的な結果を図 4 に示す．得られたヤング率分布鏡(Olympus, FV-300)で観測することで評価した．分子にはを比較した結果，レーザー集光点で特に大きなヤング率の蛍光性分子であるフルオロセイン(λ ex = 490 nm, λ em =増減は観測されなかった．マッピングを行った 100 点の平520 nm)を標識した 2 MDa の糖鎖高分子(FITC-デキストラ

図5

フェムト秒レーザー照射後，2 μM の FITC-デキストランを滴下前(a)および滴下後(b)の共焦点蛍光像と透過像均値ではレーザー照射前は平均ヤング率が 47.4 ± 3.68 kPa

図 5 に 100 倍の対物レンズを用いてフェムト秒レーザであったのに対し照射後では 45 ± 4.08 kPa となった．こーを照射した後，FITC-デキストランをゲル表面に滴下すのようにレーザーパルス照射後にアガロースゲルの顕著る前後の共焦点蛍光像および透過像を示す．図 5(a)の透過なヤング率変化は生じなかった．またパルスエネルギーを像にはレーザー集光後アガロースゲル表面に，アブレーシ

500 nJ/pulse とした場合でも平均ヤング率の減少量に大きョンによって生じた直径 1 μm 程度の小孔が観察される．

な差は見られなかった．しかしながら複数回の実験におい一方で蛍光像にはアブレーションで生じた小孔の位置にて平均ヤング率が 5%程度減少する傾向が得られている．

何も観測されないことから，アガロースゲルによる光散乱同様の実験を 3%コラーゲンゲルで行った場合，レーザーや光化学反応による発光性分子の生成などが蛍光像に影照射前は 294 ± 33.0 kPa であった平均ヤング率が 260 ±響しないことがわかる．

32.7 kPa へと 10%程度減少した．以上の結果より実験の誤次に 2 μM の FITC-デキストラン溶液をアガロースゲル差は大きいもののフェムト秒レーザー照射に伴ってハイ上に滴下して，滴下前と同じ条件で共焦点蛍光観察を行う

ドロゲルのヤング率は減少する傾向にあると言える．と，図 5(b)の蛍光像のように液中の FITC からの蛍光によ

これらの実験でフォースカーブと同時に測定した試料って像全体の輝度が上昇していることがわかる．さらにレの高さ情報からはレーザー照射によって試料の表面形状

ーザー集光点近傍ではゲル表面に生じた小孔のサイズよが変化する様子は観察されなかったことから，先端球の接りも大きい直径 10 μm 程度の領域で蛍光強度の顕著な増触状態はレーザー照射後に変化していない．従って，レー加が観測された．

ザー照射に伴うアガロースゲル及びコラーゲンゲルに見今回使用した 1%アガロースゲルはゲル電気泳動などでられた 5%から 10%程度のヤング率減少は，衝撃波がハイも標準的に使用される濃度であり，2 MDa の大きさを有す

ドロゲル中を伝搬 3)，またはキャビテーションバブルの膨る高分子は通常ゲルの中には拡散しない．またゲル表面に張に伴う高速変形によって，ハイドロゲルのドメイン構造窪みなどは透過像では全く観察されないことに加え，前節やネットワーク構造が変化したことに起因すると考えらの AFM 測定でもレーザー集光点近傍の領域でアガロースれる．

ゲル表面が窪むような挙動が観測されていないことから，しかしながら，ヤング率の測定値はカンチレバーの先端形状，フォースカーブ測定における押し込み量のようなパ蛍光強度が増加した領域で生じた凹みに FITC-デキスト
ランが入っているとは考えにくい．

ラメーターなど多くの要素にも依存するため，定量的な評したがって，蛍光強度の増加はフェムト秒レーザー照射価を行うことが難しい．またハイドロゲルは粘弾性体としに伴う熱弾性応力によってアガロースゲルのネットワーての特性が強いため，ヤング率以外にその機械特性を評価ク構造が破壊され，2 MDa の高分子の透過性が増加したこしていくことが必要となる．その他レーザー照射条件に関とに起因すると考えられる．蛍光強度が周辺と比べてよりしてもパルスエネルギーやパルス数を変え今後の課題と大きいのは，ゲル中の分子透過性が上昇した部分では分子なる．の拡散速度が溶液中より低下することで局所的に FITCデキストランの濃度が増加したためと考えられる．

3・2

フェムト秒レーザー照射に伴うアガロースゲルの分子透過性変化

さらに FITC-デキストランがレーザー集光点近傍に保持されるかどうかを確認するために，FITC-デキストラン

前節の結果より，フェムト秒レーザー照射に伴う集光点溶液を滴下後に再び蛍光分子を含まない溶液へと置換しでの熱弾性応力の上昇に起因する機械的作用によって，レて蛍光像を取得したところ，集光点近傍で輝度の高い領域ーザー集光点近傍でハイドロゲルの構造が変化しているは消失したため，今回使用した 2 MDa 程度の分子サイズ可能性が示された．そこでそのような構造変化の指標としの分子はゲル内に強く保持されず拡散速度は早いと考えて分子透過性を測定した．

られる．

４．結言

謝

辞

本研究ではフェムト秒レーザー照射によって生じる熱本研究の遂行にあたりご支援いただきました公益財団

弾性応力の機械的作用がハイドロゲルに与える影響に関法人天田財団に厚くお礼申し上げます．また実験に協力をして，ヤング率と分子透過性の観点から検証を行った．そいただきました奈良先端科学技術大学院大学・物質創成科の結果，フェムト秒レーザー集光点近傍ではハイドロゲル学領域の山田荘平博士，岡野和宣博士，高尾晃平君，Ridhoのマクロな構造変化が生じ，数%のヤング率減少や分子透Priyo 君に感謝いたします．

過性の向上が起きることが示唆された．
本稿で報告した成果以外にも実施した，フェムト秒レー

参考文献

ザー穿孔法による単一植物細胞への分子導入実験では，高1） A. Vogel J. Noack, G. Hüttman and G. Paltauf: Appl. Phys.

強度のフェムト秒レーザーパルスを単発照射したタバコ
BY-2 細胞の細胞壁・細胞膜の分子透過性が上昇すること

B 81 (2005) 1015.
2） 角井泰之・川内聡子・寺川光洋・佐藤俊一：レーザー研究, 709-713(2017), 45.

で，レーザー穿孔法による分子導入効率が改善する可能性を報じている 4)．
既存の研究の中でハイドロゲルのパターニングを行う技術は多数報告されているが，ハイドロゲルの機械特性を

3）

R. Yasukuni, D. Minamino, T. Iino, T. Araki, K. Takao, S.
Yamada, Y. Bessho, T. Matsui, and Yoichiroh Hosokawa:
Biomed. Opt. Express 12 (2021) 1366.

部分的に変化させる方法はあまりない． 近赤外フェムト4） T. I. Rukmana, G. Moran, R. Méallet-Renault, G. Clavier,秒レーザーの三次元空間選択性を生かし，細胞外基質や生T. Kunieda, M. Ohtani, T. Demura, R. Yasukuni, Y.

体膜の機械特性をナノ・マイクロメートルスケールで局所

Hosokawa: APL Photonics 5 (2020) 066104.

的に改質することで，これまでにない機能性生体材料の開発へつながることが期待される．