フェムト秒レーザプロセシングによる単細胞操作チップの開発
奈良先端科学技術大学院大学 先端科学技術研究科教授 細川 陽一郎（平成 28 年度 一般研究開発助成 AF-2016225）
キーワード：バイオ応用，マイクロ流体チップ，ガラス加工，セルソーター

１．研究の目的と背景

図 1 にそのシステム構成を示す．マイクロ流体デバイ

近年のバイオイメージング技術の発展に伴い，その対象ス内のマイクロ流路上に細胞検出用のレーザと細胞操作は細胞集団から 1 細胞となり，細胞ごとの構造や機能の理のための外力を発生するためのフェムト秒レーザが導入解が進んできている．動物細胞の典型的なサイズは 10 m

されている．マイクロ流路は分岐を持ち，標的細胞が検出程度であり，現在，その空間スケールのマイクロ流体チッされた際，フェムト秒レーザ誘起衝撃力により，回収用のプの中で細胞を自在に配列制御し，操作できる技術がバイ流路（図中の Collection）に誘導される．このようなマイオ研究者から望まれている．細胞は主に，プラスチック（ポクロ流体デバイス中での高精度な細胞操作を実現するたリスチレン）もしくはガラスなどの細胞培養基板で培養さめには，流路内で細胞を如何に整列させるかがキーテクノれる．顕微鏡下で集光したフェムト秒レーザを用いることロジーとなる．本研究では，フェムト秒レーザによりガラにより，これらの透明材料を 3 次元的に，かつ比熱的に加ス製流路の下面に付加加工を施し，細胞を流路の特定位置工できる．
我々は薄膜ガラスをフェムト秒レーザにより，に収束させる方法を検討した．

加工してマイクロ流体チップを形成する方法を提案してきている(1-4)．さらには，細胞培養基板上にポリマーや単分子膜を塗布し，フェムト秒レーザにより改質することで，基板上での細胞の遊走や細胞間相互作用を制御できることを示してきている(5)．本研究では，上記の背景を鑑み，フェムト秒レーザプロセスを駆使した新規なマイクロ流体チップの開発を推進した．
特に近年，1 細胞を対象としたセルソーターにマイクロ流体チップ技術を応用しようとする試みが注目されてい図 1 フェムト秒レーザ誘起衝撃力を用いた細胞分取の概略図

る．セルソーターにおける効果的かつ高スループットな細胞選別は，生物学，医療工学，ヘルスケア工学および臨床応用における単細胞分析の重要な技術となっている．これまでに，蛍光活性化セルソーティング（FACS）(6) や磁気活２．実験方法性化セルソーティング（MACS）(7,8) などがあるが，これらマイクロ流路を加工するためのフェムト秒レーザ実験の手法は細胞に標識を付けたり，多量な試薬，及び試薬汚システムを図 2 に示す．レーザ光源として，再生増幅器付染のリスクなどの問題点があり，その解決策として，マイきフェムト秒チタンサファイアレーザシステム（Solstice,クロ流体デバイスを用いた細胞分取が注目されている(9)．

Spectra-Physics, 100fs，800 nm, 1 kHz）を用いた．ガラス基

マイクロ流体チップ中のマイクロ流路内で細胞を操作

板を倒立顕微鏡（IX71, Olympus）の電動ステージ上に配（分離）する方法は，大きく 2 種類に大別され，流路の形状置し，フェムト秒レーザを 10 倍の対物レンズ（NA. 0.25）を工夫して流路内の流れを制御し細胞を操作する方法

により流路の下面に集光して加工した．電動ステージと機（Passive method）と，流路に外力作用させて細胞を操作す械式シャッターをコンピューターにより制御し，流路の下る方法（Active method）がある．Passive method は大量の面に任意の溝パターンを形成した．ガラス基板（スライド細胞を高速に分離できるが，個々の細胞の複雑な操作は難ガラス）を電動ステージに乗せ，100 µm/s の速度でスキしい．Active method は，外部制御により柔軟に一つずつャンし，1.0 µJ/pulse, 1.4 µJ/pulse, 2.8 µJ/pulse のレーザパルの細胞を操作でき，特にサンプル中の希少な細胞の操作にスエネルギーで溝構造の加工条件を検討した．

適していると考えられる．我々は，Active method による細胞操作の外力として，フェムト秒レーザ誘起衝撃力とマイクロ流体デバイスを組み合わせたシステムに注目し，これまで研究開発を進めている(10-12)．

３．２

マイクロ流路の溝パターンの検討

流路内で細胞を収束させるための溝パターンとして，流路（幅 50 µm，高さ 10 µm）内に 1 m の間隔で，連続した「く」の字パターンを作製した．

図 2 フェムト秒レーザによる構造作製のための実験系

３．実験成果３．１

図 4 フェムト秒レーザで加工したパターン（くの字）の模式図

ガラス基板のフェムト秒レーザ加工作製した溝構造の形状を電子顕微鏡（SEM）で観察し，加工溝の幅と深さを測定した．パルスエネルギーごとの加工溝の幅と深さの測定結果を図 3（a）に，溝の断面の SEM

図 4 に示すように，「く」の字パターンは，流路の進行像を図 3（b）に示す．図 3（a）に示すように，加工溝の方向に対して，30 度，45 度，60 度と角度を変え，それぞ幅はそれぞれの条件で約 3 µm であり，レーザパルスエネれの角度に対し，異なる間隔のパターンを三つ用意した．

ルギーにほとんど依存しなかった．深さは 1.0 µJ/pulse でパターン形成後，加工時に発生したデブリなどを除去する

約 3 µm，2.8 µJ/pulse で約 10 µm であった．2.8 µJ/pulse のために，エタノール，窒素フローを吹きかけ洗浄し，電気時，1.0 µJ/pulse の時の約 3 倍となった．この結果は，パ炉により 580 度で約 5 時間のアニール処理を行った．

ルスエネルギーに依存する自己集束効果により，溝の深さを調節できることを示唆している．

作製した各パターンの全長は 1 mm であり，その中での溝間隔を 5 µm，10 µm，20 µm に調整し，さらに角度，深さ，流速の異なる「く」の字パターン構造をもつ試料を準備した．またレーザパルスエネルギーを 1.0 µJ/pulse と 2.8µJ/pulse で加工し，溝パターンの深さを調整した．これらの「く」の字パターン構造を通過する前後のポリマー微小球（直径 20 µm）の挙動を図 5 に示す実験系により観察し，評価した．

図 3 フェムト秒レーザによるガラスの溝加工．（a）
左図はエネルギーごとの加工溝の幅の比較，右図は深さの比較を示す．各 N 数：20．（b）加工溝の断面のSEM 像（1500 倍）．

図5

加工されたマイクロ流体デバイスを流れる微小球の挙動観察のための実験概略図作製した各パターンの全長は 1 mm であり，その中での３．３マイクロ流路内の微細構造による細胞操作

溝間隔を 5 µm，10 µm，20 µm に調整し，さらに角度，深図 5 のシステムに，集束傾向の高い深さ 10 µm の 30 度

さ，流速の異なる「く」の字パターン構造をもつ試料を準の「く」の字パターン（溝間隔 5 µm と 10 µm）を加工し備した．またレーザパルスエネルギーを 1.0 µJ/pulse と 2.8たマイクロ流体デバイスを配置し，細胞を用いた実験をおµJ/pulse で加工し，溝パターンの深さを調整した．これらこなった．細胞として，直径 2-10 µm の藻類細胞であるクの「く」の字パターン構造を通過する前後のポリマー微小ロレラを用いた．流速 6 mm/s で，クロレラ含む試料溶液球（直径 20 µm）の挙動を図 5 に示す実験系により観察し，をデバイスに導入した結果を図 7 に示す．「く」の字パタ評価した．

ーンを通過する前後のクロレラの位置を高速カメラで撮

図 6 にまとめられるように，角度の小さい，溝の深さの影した結果，溝間隔が 5 µm のとき，流路の中央付近へ，深い，流体の流速の低いパターンで，集束効果が高い傾向クロレラが導かれる様子が確認できた．溝間隔が 10 µmが示された．これらの結果から，マイクロ流路内を流れるのとき，集束が見られなかった．クロレラのサイズは，図 7

微小球の挙動は，流路内の「く」の字溝構造パターンの角で検討した微小球のよりも小さく，密度の高い構造でのみ度，深さ，流体の流速により影響されることが示された．

集束効果がみられたと考えらえる．

図 7 溝パターン通過前後のクロレラの位置を示す
高速カメラ像４．結言
本研究では，フェムト秒レーザ誘起衝撃力とマイクロ流体デバイスを用いた細胞分取システムの性能向上を目指し，既存の整列手法と組み合わせることが可能である流路内微細加工による配列手法を提案し，検討した．流路内をフェムト秒レーザ付加加工したマイクロ流体デバイスを作製し，微小球とクロレラの挙動について観察した結果，流路内の溝構造によりこれらを集束させることができる可能性を見出した．
本研究では，ガラス製のマイクロ流体デバイスに，フェ
図 6 微小球の集束効果の角度，溝深さ，流速依存性(a) 流速 6 mm/s，深さ 10 µm，間隔 10 µm で角度依存性．
(b) 流速 6 mm/s，30 度の「く」の字パターン，溝間隔 10µm で深さでの依存性．(c) 30 度の「く」の字パターン，深さ 10 µm，間隔 10 µm での流速依存性．

ムト秒レーザにより加工を施したが，ガラス材料およびその加工プロセスをさらに検討することにより，その性能向上が見込まれる．例えば，HF や HNO3 に用いて，加工しきい値以下のフェムト秒レーザをガラス材料に照射し，ウェットエッチングを行った場合，レーザ照射により物性変化が生じた個所が速くエッチングされることが知られている．さらに，この現象を用いて直径数 μm のマイクロチ
ャネルを３次元的に加工できることが報告されている．

既存マイクロ流体デバイスの作製ではフェムト秒レー

6)

H. R. Hulett, W. A. Bonner, R. G. Sweet, and L. A.

ザ加工技術は補足的な加工手法であり，マイクロ流体デバ

Herzenberg: Development and Application of a Rapid Cell

イス自身の作製に向いてない．しかし，既存手法で作成しSorter, Clinical Chemistry, 19, (1973), 813–816.

たマイクロ流体デバイスに簡便かつ迅速に付加加工を行7)う方法としては有効である．今後，さらなる性能向上に向Gradient

けたフェムト秒レーザを利用した，マイクロ流体デバイスの付加加工プロセスの検討を進めていく．

S. Miltenyi, W. Müller, W. Weichel, A. Radbruch:
MagneticCell

Separation

WithHighMACS,Cytometry, 11, (1990), 231-238,8)

T. M. Said, A. Agarwal, S. Grunewald, M. Rasch, H.-J.
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following annexin V magnetic-activated cell sorting

謝 辞
本研究は，公益財団法人天田財団の一般研究開発助成

separation, RBMO, 13, (2016), 336-339.
9)

Y. Shen, Y. Yalikun, Y. Tanaka: Recent advances inAF-2016225 によっておこなわれたものであり，ここに感microfluidic cell sorting systems, Sens. Actuators B Chem,謝の意を表します．本研究の実施にあたり，ご協力いただ

282, (2019),.268-281,

きました Yalikun Yaxiaer 先生，岡野和宣先生，研究室学生の名本美寿氏, 方超穎氏に感謝申し上げます．

10) N. Nitta, T. Sugimura, A. Isozaki, H. Mikami, K. Hiraki, S.
Sakuma, T. Iino, F. Arai, T. Endo, Y. Fujiwaki, H.
Fukuzawa, M. Hase, T. Hayakawa, K. Hiramatsu, Y.

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