2020年

日化協LRI研究報告会
2020年8月21日

ヒト幹細胞試験による迅速・正確・低コストの化学物質ハザードAI評価法の開発

京都大学iPS細胞研究所
山根順子・藤渕航

30物質でのRT-qPCRを用いた予測システム

各種化合物によるIC10決定化合物曝露対応分析による
特徴遺伝⼦抽出ライブラリー調整・
シークエンス

予測システムを
RT‐qPCR実施

⽤いた毒性予測30物質でのRT-qPCRを用いた予測システム

各種化合物によるIC10決定化合物曝露対応分析による
特徴遺伝⼦抽出ライブラリー調整・シークエンス

予測システムを
RT‐qPCR実施

⽤いた毒性予測

肝毒性物質 10 chemicalsのリスト・曝露濃度
肝毒性物質は日化協と合同で選定
DILI rank

Dose 1

Amiodarone

DILI: 80.01

Cyclosporin A

DILI: 7

Atorvastatin

Dose 2(uM)

Dose 3

Dose 4

Dose 5

Dose 6

Dose 7

Dose 8

Dose 9Dose 100.020.05

0.1

0.4

1.2

3.7

11.1

33.3

100

0.003

0.008

0.02

0.07

0.2

0.6

1.8

5.6

16.7

50

DILI: 50.001

0.002

0.005

0.01

0.04

0.12

0.37

1.1

3.3

10

Clotrimazole

DILI: 3

0.003

0.008

0.02

0.07

0.2

0.6

1.8

5.6

16.7

50

Ibuprofen

DILI: 3

0.04

1.1

3.2

9.6

28.8

86.4

259

7772333

7000

Chlorpromazine

DILI: 2

0.02

0.05

0.1

0.4

1.2

3.7

11.1

33.3

100300

Aspirin

DILI: 012

51441123370

11113333

10000

Chlorpheniramine

DILI: 00.10.20.5

1.4

4.1

12.337111333

1000

Carbon Tetrachloride

Group2B 1382368205

615

18445533

16600

2,4-DNTGroup2B 0.01

0.03

0.090.20.8

2.4

7.4

22.2

66.6

200

ATP assay:公比3で10濃度検討 N=4で実施
MTT assay:公比3で8濃度検討 N=4で実施

最高曝露濃度(Dose 10)は最大可溶量を適用
溶媒は全てDMSO
Controlとして0.01% DMSO添加

MTT/ ATP assayの実施条件
MTT assay

ATP assay

KhES-3細胞（男性株）

KhES-3細胞（男性株）StemFit medium/ i-Matrix-511

Essential 8 medium/ VTN-N

化合物曝露時間

48 hrs48 hrsAssay reagent kit

Cell Counting Kit-8(Dojindo)

CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay(Promega)

測定機器

PE Envision 2104 Multilabel Reader1(PerkinElmer)
吸光度(450nm)測定

PE Envision 2104 Multilabel Reader1(PerkinElmer)
発光測定

IC10決定ソフトウェアR package “drc” from CRAN
model. LL4 (4 parameters log-logistic)

R package “drc” from CRAN
model. LL4 (4 parameters log-logistic)

R version 3.6.3 (2020-02-29)

R version 3.6.3 (2020-02-29)

細胞種
培地/コーティング剤

IC10計算式

IC10<- 1/b＊log ((d-c)/(0.9-c)-1)+log (e) IC10<- 1/b＊log ((d-c)/(0.9-c)-1)+log (e)IC10<- exp (IC10)
IC10<- exp (IC10)b<- coefficients (model. LL4)c<- coefficients (model. LL4)d<- coefficients (model. LL4)e<- coefficients (model. LL4)b<- coefficients (model. LL4)c<- coefficients (model. LL4)d<- coefficients (model. LL4)e<- coefficients (model. LL4)

KhES-3 cell

MTT/ATP assayによるIC10決定
Amiodarone (DILI: 8)
4.1 uMATP assay

Growth relative to control

Growth relative to control

MTT assay

0.99 uM

Chlorpheniramine
IC10: 81 uM
Growth relative to control

Atorvastatin
IC10: 2.3 uM

Growth relative to control

Aspirin
IC10: 1995 uM
Growth relative to control

Cyclosporin A
IC10: 3.2 uM

Growth relative to control

Chlorpromazine
IC10: 10.3 uM
Growth relative to control

Growth relative to control

Growth relative to control

Amiodarone
IC10: 4.1 uM

Growth relative to control

Growth relative to control

Growth relative to control

MTT assay IC10 results
Clotrimazole
IC10: 7.2 uM
Ibuprofen
IC10: 759 uM

Carbon Tetrachloride
IC10: NA
2,4-DNT
IC10: 33 uM

ATP assay IC10 results

Chlorpheniramine
IC10: 40.5 uM

Growth relative to control
Growth relative to control

Carbon Tetrachloride
IC10: 5385 uM
Growth relative to control

Growth relative to control

Ibuprofen
IC10: 50 uM

Clotrimazole
IC10: 0.17 uM
Growth relative to control

Growth relative to control

Aspirin
IC10: 974 uM
Growth relative to control

Chlorpromazine
IC10: 1.78 uM
Growth relative to control

Atorvastatin
IC10: 0.05 uM

Cyclosporin A
IC10: 1.45 uM
Growth relative to control

Growth relative to control

Amiodarone
IC10: 0.99 uM

2,4-DNT
IC10: 16 uM予測プロトタイプシステムの候補物質
肝毒性

腎毒性

神経毒性

Amiodarone

DILI:8Axitinib

Valproic acid

Cyclosporine A

DILI:7

Pamidronate

Phenytoin

Atorvastatin

DILI:5

Gentamicin

Acrylamide

Clotrimazole

DILI:3

Cisplatin

Hexanedione

Ibuprofen

DILI:3

Cyclosporine A

Cyclopamine

Chlorpromazine

DILI:2

Aspirin

DILI:0Chlorpheniramine

DILI:0Carbon Tetrachloride

Group2B

2,4-DNTGroup2B

肝毒性物質の対照被験物質として使用

ヒトESCからiPSCへの移行の取り組み
ESC

使用するにあたり倫理問題の存在

iPSC

•••

倫理問題の回避個人差の評価
年齢、性別、種差の評価

ESC IC10(nM)

iPC IC10(nM)

iPSC/ESC
IC10RT150100.2RT23010026RT35x103

1x1030.2

ESC: KhES-3RT415200

13.3

iPSC: アジア人女性、単球由来

RT51.5x106

1x1060.67

NT12x103

3x104

15NT22x103

5x103

2.5NT32x103

3x103

1.5NT41x104

1.5x105

15NT52x103

2x105

100

RT: 腎毒性物質
NT: 神経毒性物質

ESCとiPSCでは化合物に対する細胞反応の差が存在
iPSCをESCのような高感受性に近づけられないか？

ナイーブ化の手法は完全には確立されていない：改良YAP法を暫定使用
Primed

Naïve

多能性状態

着床後着床前形態

Flat型

Dome型

bFGF,
TGF-beta

LIF,
4or 5 inhibitors/ Activin

維持に必要なsupplement

維持コンディション Non-hypoxia

Hypoxia
Takashima et al.を一部改変
It is known that iPSCs can be cultured
in spheroids without differentiation2014 Theunissen et al.

YAP:
ERK1/2i (PD0325901 0.5 μM)
GSK3βi (CHIR99021 3 μM)
LIF (10 ng/ml)
cAMP, AMPK activator (Forskolin 10 μM)
YAP activator (LPA 10 μM)
In N2B27 medium

5iLA:
ERK1/2i (PD0325901 1 μM)
GSK3βi (IM‐12 1 μM)
LIF (10 ng/ml)
B‐Raf kinase i (SB590885 0.5 μM)
Src i (WH4023 1 μM)
ROCKi (Y‐27632 10 μM)
Activin (20 ng/ml)
In N2B27 medium

My medium and method is based on 3
methods in
Key components:‐ ROCK kinase and E‐cadherin activation(ROCK is necessary for E‐cad)‐ epithelial‐to‐mesenchymal transition isimpeded by E‐cadherin, leading to failure
to generate germ layers inside spheroids –i.e. differentiation is inhibited‐ Soft surface facilitates spheroid formation

ナイーブ化細胞構築マーカーとしてEOS（Early transposon, Oct-4, Sox2）システムを使用
Seed cells in atleast 3cm dishTransfection*

Puromycin
selection**

Normally only 2‐
3 cells remain

Colonyナイーブマーカー
での発現確認Day 1Day 2

Days 3‐6*Extremely importantto have high efficiency** Will explain separately

Grow for 7 days

piggyBac principle
Transfection principle

EOS GFPTransgene

Transposase

Transgene

SUSD2Transgene

RIKEN2A‐EOS‐YAP

細胞のナイーブ化による感受性の増加

1RIKEN2A‐EOS‐YAP‐P2
1.2

0.9
10.8
0.7

0.8

0.6
0.5

0.6

0.4

1.2

0.3

10.2

0.4
0.2

0.1

0.800Dose Dose Dose Dose Dose Dose Dose Dose
87654321Dose Dose Dose Dose Dose Dose Dose Dose
876543210.6
0.40.2

RIKEN2A‐EOS‐YAP‐P50Dose 9Dose 8Dose 7

Dose 6Amiodarone
Atorvastatin

Dose 5Dose 4Dose 3Dose 2

Dose 1

Aspirin
Clotrimazole

iPS細胞（RIKEN-2A:男性株）での肝毒性ATPアッセイ

RIKEN2A‐EOS‐YAP‐P10

1.2

1.2

110.8

0.8

0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2

00Dose Dose Dose Dose Dose Dose Dose Dose
87654321Dose Dose Dose Dose Dose Dose Dose Dose
87654321

将来の展望肝毒性

Amiodarone

DILI:8Cyclosporine A

DILI:7

Atorvastatin

DILI:5

Clotrimazole

DILI:3

Ibuprofen

DILI:3ChlorpromazineDILI:2

Aspirin

DILI:0

リセットiPS細胞

マイiPS細胞毒性試験に使用するための標準iPS細胞を作成

ナイーブ化

Chlorpheniramine

DILI:0Carbon Tetrachloride

Group2B

2,4-DNTGroup2B

腎毒性

神経毒性

Axitinib

Valproic acid

Pamidronate

Phenytoin

Gentamicin

Acrylamide

Cisplatin

Hexanedione

Cyclosporine A

Cyclopamine

毒性検査を可能に

ヒトES細胞での曝露
遺伝子発現データベース
プロトタイプ
作成

ESC（DB）とiPSC（試験対象）のブリッジング

bisphenol-A

予測システム ・肝毒性 ・心毒性
・腎毒性 ・非遺伝的発ガン性
作成
・神経毒性・抗ウイルス薬

hESTからhiPSTへの発展
等