日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 90, 157-159, 2016

第 68 回日本大学歯学会特別講演寄稿

機能水研究を通じて解ってきたこと―alarmin 分泌促進と創傷治癒浅野正岳

日本大学歯学部 病理学講座

要旨：食塩水を電解して得られる水は，陽極側と陰極側でそれぞれ強酸性または強アルカリ性の水として回収される。このうち，陽極側の水は電解酸性機能水（acid-electrolysed functional water: FW）と呼ばれ，強力な殺菌効果を有している。本研究では，FW の生物学的な機能について実験を行った。培養系上皮細胞を用いたの実験から，FW が短時間刺激でサイトカイン IL-1α の分泌を強力に誘導することが明らかとなった。IL-1α は創傷治癒促進効果があることが報告されていることから，マウスを用いた実験でこの効果について検討した。
その結果，マウスの背部に人為的に作製した創傷に FW を作用させることで，創傷作成 1 日目に，生理食塩水を用いた群と比較して，約 20% の創傷面積の縮小促進効果が認められた。この効果は IL-1α ノックアウトマウスを用いた同様の実験では失われていたことから，FW により誘導される IL-1α が創傷治癒促進に重大な役割を担っていることが示された。本研究の結果は，FW を創傷治癒促進薬として臨床応用し得る可能性を示唆するものであった。
キーワード：電解酸性機能水（FW），創傷治癒，IL-1α ，alarminの効果について検討した。第 1 図に示す通り，HSC3 にはじめにFW または生理食塩水を作用させた後に，細胞培養液を生体を構成する細胞は，種々の刺激に対応する能力を加えることで反応を停止し，さらに 16 時間培養し，培備えている。刺激が軽微な場合は細胞の容積を変化させ養上清中に分泌されたサイトカインの変化についてる（肥大や萎縮）といった程度の対応で充分であるが，極cytokine array という方法を用いて比較した。その結果，めて侵襲の強いものに対しては時として細胞死へと移行

FW 作用群では IL-1α の分泌が顕著に増強されているこする場合もある。最近の研究から，細胞はその死に際しと が 解 っ た（ 第 2 図 ）。 こ の 結 果 を enzyme-linkedて，様々な分子を細胞外に分泌ないし放出することが明

immunosorbent assay（ELISA）法により確認したとこ

らかとなってきた。こうした分子は，周囲の健康な細胞に対して警告を発する役割を担っており，alarmin と呼ばれている 1）。
歯科臨床では，歯科ユニットの水路系をいかに清潔に保つかという問題は極めて重要である。そのためには，次亜塩素酸水を利用することが有効であるとされ，人為的に作製した種々の機能水の効果が検討されてきた。一方で，医科領域では，食塩水を電気分解することにより得られる電解酸性機能水（acid-electrolysed functionalwater: FW）が，創傷治癒促進効果を発揮したなどの報

第1図

ヒト口腔扁平上皮癌由来細胞 HSC3 細胞に生理食塩水または FW を作用させた。

第2図Cytokine array の結果，FW 刺激群で有意な IL-1 α 分泌の亢進が認められた。

告がなされている 2, 3）。これまでの機能水研究は，その抗微生物活性に関するものが大部分を占め 4, 5），生体に対する効果についてはほとんど報告がなかった。そこで
本研究では，FW の生体に対する効果に着目し，どのようなメカニズムで上記のような効果が発揮されるのかという点について研究を行った。

培養細胞を用いた実験

ヒト口腔扁平上皮癌由来培養細胞 HSC3 を用いて FW（受付：平成 28 年 10 月 29 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 13157

IL-1 ra の発現を増強することが明らかとなった。

ろ，経時的に産生増強が認められ，刺激後 3 時間でピークを迎えていることが明らかとなった（第 3 図）。また，創傷治癒促進効果の判定

real-time PCR に よ る 検 索 で は， 刺 激 後 30 分 で IL-1αmRNA の発現がピークに達した。以上の結果は，FW 刺以上の結果から，FW は口腔上皮細胞における IL-1α激が HSC3 における IL-1α の産生・分泌を転写レベルで産生を誘導することにより創傷治癒を促進するのではな増強している可能性を示唆するものであった。

いかと考え次の実験を行った。マウスの背部に皮膚トレパンという器具を使って直径 6 mm の円形の創傷を作成

IL-1α の創傷治癒促進効果した。これに FW または生理食塩水を作用させ，経日的

IL-1α は，これまでに皮膚における創傷治癒を促進すに創傷面積を測定した。その結果，FW 作用群ではコンることが報告されている 2）。そこで，FW によって誘導トロール群に比較して，作用後 1 日目に約 20% の面積縮される IL-1α は，歯肉線維芽細胞に対して，皮膚におけ小率の増加が認められた（第 4 図）。そこでこの効果が，るのと同様な方法で治癒促進効果を発揮するのではないFW によって誘導された IL-1α によるものであることをかと考え，次の実験を行った。FW および生理食塩水で確認するために，IL-1α knockout mouse を用いて同様刺激した HSC3 の培養上清を回収し，これを歯肉由来のの実験を行った。すると FW 作用後 1 日目に見られた創線 維 芽 細 胞 に 作 用 さ せ た。 ま た 同 様 に，recombinant

傷面積の縮小率の増加は消失した（第 5 図）。さらに，マIL-1α（rIL-1α ）を作用させ，反応の違いについて検討しウスの皮膚組織を用いて行った real-time PCR の結果，た。その結果，FW で刺激した HSC3 の培養上清およびFW 作用群では有意に IL-1α mRNA の発現増強が確認

rIL-1α では，皮膚線維芽細胞と同様に PPARγおよびされた。

第3図

第4図

HSC3 を FW で 刺 激 し， 培 養 上 清 中 の IL-1 α 濃 度 をELISA により測定した。

Wild type マウスの背部に人為的に作製した創傷に，FWまたは生理食塩水を作用させ，創傷の面積を経日的に測定した。FW 群では作用後 1 日目に約 20% の縮小促進が認められた（図中 *）。

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第5図

図４と同様の実験を IL-1 α knockout mouse を用いて行った。作用後 1 日目に見られた創傷の縮小促進は相殺された。

第6図

HSC3 を FW で 0, 10, 30, 60 120, 180 秒間刺激した後の培
養上清中の IL-1 α 濃度を測定した。わずか 10 秒間の刺激で充分量の IL-1 α 分泌が誘導された。

電解酸性機能水の創傷治癒促進効果

いる 8）。

IL-1α の分泌様式

本 研 究 か ら，FW に よ る 極 め て 短 時 間 の 刺 激 に よ りFW による IL-1α の分泌誘導にはどの程度の刺激時間

HSC3 から alarmin である IL-1α が分泌されることが明が必要なのだろうか。この点について，HSC3 を用いてらかとなった。今後は分泌された IL-1α の分子量の同定実験を行った。すると，第 6 図に示す通り，わずか 10や，創傷治癒促進のさらなるメカニズムの解明を進めて秒刺激しただけで IL-1α の分泌が増強されることが解っいきたいと考えている。

た。10 秒という刺激時間は，IL-1α の産生増強が転写レ

文ベルで制御されると考えるにはあまりにも短く，細胞内にあらかじめ蓄積されていた IL-1α が放出されたと考え

1）Oppenheim JJ, Yang D (2005) Alarmins: chemotactic
activators of immune responses. Curr Opin Immunol 17,359-365.
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る方が合理的である。そこで同様の実験を行い，培養上清および細胞溶解液を回収し IL-1α の濃度を測定した。
その結果，FW 作用群では，培養上清中の IL-1α が増加していたのに対し，細胞質中の IL-1α は減少していることが明らかとなった（第 7 図）。
以上のように，FW は上皮細胞に IL-1α 分泌を誘導することで創傷治癒を促進する可能性が示唆された。IL-1αは細胞内で前駆体（precursor IL-1α : pIL-1α ）として産生されたのちにカルパインなどのカルシウム依存性のタンパク質分解酵素により N 末端側が切断され，C 末端のみが成熟した IL-1α 分子（mature IL-1α : mIL-1α ）として細胞外に分泌される 6）。しかし，mIL-1α に加え，pIL-1αも同様の生物活性を有している。また，いわゆるシグナルペプチドを持たず，一般的なタンパク産生経路である小胞体―ゴルジ体を経由することなく産生される。さらに，pIL-1α は細胞核内にも存在し，ある種の遺伝子発現に影響を及ぼすことも報告されている。こうした性質は，代表的な alarmin である high molecular group box 1（HMGB1）などと 7）共通しており，細胞死に際して放出される IL-1α は核内に存在する p IL-1α であるとされて第7図

献HSC3 を FW で 30 秒間刺激した後，細胞溶解液および培養上清を回収し IL-1 α 濃度を測定した。培養上清中ではIL-1 α 濃度が増加したのに対し，細胞溶解液中の IL-1 α濃度は減少した。

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