日本化学工業協会
日本毒性学会第5回LRI賞受賞講演

化学物質神経毒性の分子基盤解明と毒性評価指標の開発

2019. 8. 30 (Fri.)
広島大学大学院医系科学研究科
古武 弥一郎1

Outline
１．有機スズによるGluR2/GluA2減少を介した神経脆弱化

２． GluR2/GluA2減少を指標にした神経毒性評価

2

Outline
１．有機スズによるGluR2/GluA2減少を介した神経脆弱化

２． GluR2/GluA2減少を指標にした神経毒性評価

3

トリブチルスズ（TBT）

+

Sn

Cl
tributyltin chloride（TBT chloride）

・

船底や魚網の防汚剤として広く使用されてきた環境汚染化学物質

・

海洋中の無脊椎動物の雄化現象（内分泌かく乱作用）

・

特定化学物質・内分泌撹乱作用に加えてさまざまな毒性がある

・

脂溶性が高く、脳移行する・

有機スズ化合物は野生生物脳中やヒト血液中から数nMで検出される

・

生体内濃度と毒性発現濃度が非常に近い4TBTに関して我々が明らかにしたこと
500 nM TBTによりグルタミン酸放出が促進され、過剰なグルタミン酸受容体の活性化を介して神経細胞死が惹起される
Toxicol. Sci. (2006)
TBTによるグルタミン酸放出メカニズムにAMP-activated protein
kinase (AMPK) が関与している
Toxicol. Appl. Pharmacol. (2008)
TBTの濃度により細胞死メカニズムが異なる
Toxicol. Sci. (2007)5低濃度でのみ起こる「毒性につながる現象」

6

Neuronal cell death induced by exposure of TBT for 9 days

Number of MAP-2 positive cells(% of control)120
1008060Cont***

40200Cont

15102050
TBT concentration (nM)

DIV 1 DIV 20.1 % DMSO or TBT50 nM TBT
DIV 10Assay7Expression (% of control)

Change of mRNA expression of AMPA receptor subunits

400350*300** **250200*50** ** **

1 nM
5 nM
10 nM
20 nM

150100Cont***P<0.05 vs Cont

0**P<0.01 vs Cont

GluR1

GluR2

GluR3

GluR4

***P<0.001 vs Cont

Nakatsu, Kotake et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 240, 292-298 (2009).

8

Decrease of GluR2/GluA2 protein caused by chronic exposure of TBTGluR2

Surface GluR2

-actinN-cadherinCont.

5 nM

20 nM

50 nM

Cont. 20 nMTBTTBTCont

1 nM

5 nM

10 nM

20 nM

Nakatsu, Kotake et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 240, 292-298 (2009).

9

Time course of GluR2 mRNA and protein

10

11

Ca2+ permeability of AMPA receptors

Liu and Zukin, Trends Neurosci. 30, 126-134 (2007).

12

Effects of chronic exposure of TBT on intracellular Ca2+increase and cell death caused by glutamate

Viability (% of control)

Ratio (340 nm/380 nm)

6Cont
TBT

5432Glu 50 M

1005Time (min)10120***100DMSOTBT

8060
4020001050Glu (M)

100***P<0.001 vs Cont

Nakatsu, Kotake et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 240, 292-298 (2009).

13

N

GluR1 Na+ Ca2+GluR2

GluR1Na+ Ca2+ GluR3

NNN

20 nM
TBT
Q+Q

R

Q

C C

C
Ca2+-impermeable

C
Ca2+-permeable
Basal intracellular Ca2+
Sensitive to toxicity

14

TBTによるGluR2発現減少は
核呼吸因子-1 (NRF-1) 活性低下による

PGC
1α

NRF‐1
PGC
1α

NRF‐1

GluR2 promoter

×

GluR2 mRNA ↓Nucleus

Neuronal vulnerability↓Cytoplasm

GluR2 ↓Outline
１．有機スズによるGluR2/GluA2減少を介した神経脆弱化

２． GluR2/GluA2減少を指標にした神経毒性評価

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従来の神経毒性試験
一般毒性試験において神経毒性が疑われる物質について運動機能試験
記憶・学習試験
組織学的形態異常を調べる試験

が中心

大量の実験動物と莫大なコスト、時間、労力が必要
重篤な毒性がないと検出されない

神経毒性を検出できる優れた指標を見出せれば初期スクリーニングに利用できるのではないか？
17

In vitro神経毒性評価指標
これからは、in vitroあるいはin silicoの毒性評価系が重要になってくる(National Research Council of the USA, Toxicity testing in the 21st century:a vision and strategy)

BDNF (brain-derived neurotrophic factor) などの栄養因子
ニューロペプチド
細胞外マトリックスタンパク質
各種miRNA など

これまでに知られている毒性評価指標については、毒性が発現してはじめて変化するものが多く、早期に変動する高感度評価指標が望まれている(Costa and Pellacani, Central nervous system toxicity biomarkers.
Biomarkers in Toxicology (2014))
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PFOS 投与ラットにおける神経特異的 GluR2 発現減少

Cont.

Hippocampal CA1

2 mg/kg PFOS

2 mg/kg PFOSCont.

Cerebral Cortex

MAP2: Microtubule Associated Protein 神経細胞マーカー

19

PFOS 投与ラットにおける神経脆弱性評価

Ishida et al., Arch. Toxicol. 91, 885-895 (2017).

20

GluR2 サブユニットを欠損させるとIn vivo

In vitro

GluR2 ノックアウトマウス

GluR2 ノックアウト神経細胞

⾏動異常・記憶障害を⽰す

弱いアゴニスト刺激で細胞死が起きる

Mead et al., Behav. Neurosci., 120, 241-248, (2006).

Iihara et al., J. Neurosci., 21, 2224-2239 (2001).

GluR2 発現減少は神経細胞にダメージを与える
21Synergistic action of GluR2 antisense and sublethal global ischemia

Oguro et al., J. Neurosci. 19, 9218-9227 (1999).

22既知神経細胞ダメージの主なメカニズム

Glu過剰放出DAMPs
炎症性サイトカイン

Ca2+異常流入

神経細胞死あるいは重篤なダメージ23毒性指標の概念図

24

GluR2発現簡便評価系の構築
140

western blotting(% of control)

120
100
8060
40

y = 0.9987x - 6.256
R² = 0.73

200050100

150AlphaLISA (% of control)

Sugiyama, Kotake et al.
Toxicol. Rep. 2, 450-460 (2015).
25

Western blottingによるGluR2減少化学物質の評価

まとめ上流下流

GluR2発現減少を惹起する原因の解明
核呼吸因子-1 or ?

TBTによるGluR2発現減少

持続的GluR2発現減少が及ぼすin vivo
神経毒性評価GluR2発現減少を惹起する
他の化学物質の探索

化学物質の新規高感度神経毒性評価系の構築
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謝辞

広島大学薬学部生体機能分子動態学研究室
摂南大学理工学部
木村 朋紀

太田 茂
佐能 正剛
中津 祐介
瀧下 智子
青木 香織
宮良 政嗣
津山 由美

石田 慶士
杉山 千尋
梅田 香苗
徳永 航
桑原 由佳
齋木 崇史
渡辺 南海子国立衛研薬理部
諫田 泰成

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広島大学薬学部生体機能分子動態学研究室

生体機能分子動態学29