平成28年度 共同利用・共同研究報告2016 Fiscal Year Cooperative Research Program Report
研究課題

’16－１

スセンサータンパク質が発現誘導される . RLRs はウイル

遺伝子サイレンシングと自然免疫反応のクロストーク機構の解析

ス RNA を認識すると , インターフェロン誘導を伴う抗ウイルス反応を引き起こす . RLRs は RNA ヘリカーゼタンパク質であり , RIG-I, MDA5, LGP2の３つが知られている .

RNA サイレンシングも抗ウイルス反応もともに二本

程久美子

鎖 RNA による機構であり , 両経路はクロストークして（東京大学大学院理学系研究科）

いる可能性が考えられる . 我々は , 特定の種類のウイル

高橋朋子

ス感染により抗ウイルス反応が誘導されると , RNA サイ（東京大学大学院理学系研究科）

レンシングにおける主要な因子である TAR-RNA binding

米山光俊

protein（TRBP）と LGP2が直接相互作用し , RNA サイ（千葉大学真菌医学研究センター）

レンシングを抑制することを見出し , 現在 , その詳細

尾野本浩司

な分子機構を解析している . さらに , TRBP は限られた（千葉大学真菌医学研究センター）

miRNA 群の機能を制御し , ゲノムワイドな遺伝子発現調

Molecular interaction between gene silencing
and innate immune response
Kumiko Ui-Tei（Graduate School of Science, The University of Tokyo）

Tomoko Takahashi

節が起こると想定される . 抗ウイルス反応は哺乳類に保存された機構であり , 両経路のクロストーク機構を明らかにすることで , 哺乳類特異的なウイルス感染に伴う生命現象の作用機序の解明に結びつくと期待できる .

なお , 本研究成果の一部は , 現在論文投稿中である .

学会発表（Graduate School of Science, The University of Tokyo）

１）高橋朋子 , 中野悠子 , 尾野本浩司 , 小森千晶 , 米山光（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

ヒト細胞における , RNA サイレンシングと抗ウイル

Mitsutoshi Yoneyama
Koji Onomoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
近年のトランスクリプトーム解析から , 多くのタン

俊 , 程久美子

ス反応のクロストーク

Crosstalk mechanism between RNA silencing and antiviral
response in human cells

第39回日本分子生物学会年会（2016.11.30）横浜（優秀ポスター賞受賞）

パク質をコードしないノンコーディング RNA の存在が２）Takahashi T., Nakano Y., Onomoto K., Komori C.,

small interfering RNA（siRNA）や microRNA（miRNA）な

Mutual regulation between RNA silencing and anti-virus

明らかになってきた . ノンコーディング RNA の中でもどの小分子二本鎖 RNA は , RNA サイレンシングという塩基配列特異的な遺伝子抑制機構によって , 広く多様な遺伝子機能を制御している . 一方 , ウイルスは , ほぼすべての生物に感染する病原体である . 哺乳類細胞では , ウ

Yoneyama M., Ui-Tei K
defense system.

Cell Symposia Functional RNAs（2016.11.7-8）Langham

Place Hotel, Guangzhou, China

イルスなどの外来性 RNA が侵入すると , 米山らにより発見された RIG-I like receptors（RLRs）と呼ばれるウイル

42

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

研究課題

’16－２

なかった .

Dectin-1シグナル伝達系を標的にした新規難治性疼痛制御法の開発
栗原

以上の結果から , dectin-1は末梢感覚神経終末において皮膚感覚（機械）受容調節 , すなわち , dectin-1刺激は機械的感覚を鈍麻させる方向に調節することが示唆された .

研究課題

崇

’16－３

（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科生体情報薬理

感染に応答した自然免疫誘導の分子機構の解析

学分野）

西城

忍・米山光俊藤田尚志（千葉大学真菌医学研究センター）（京都大学ウイルス・再生医学研究所）

Development of a new treating strategy for
intractable pain by controlling dectin-1 signaling
pathway

加藤博己（京都大学ウイルス・再生医学研究所）

米山光俊（千葉大学真菌医学研究センター）

尾野本浩司

Takashi Kurihara（Graduate School of Medical and Dental Sciences,

Kagoshima University）

Shinobu Saijyo, Mitsutoshi Yoneyama（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（千葉大学真菌医学研究センター）

Innate immune responses against pathogen
infection

研究成果
C 型レクチン受容体ファミリーに属する dectin-1は , 自Takashi Fujita

担っているが , 慢性炎症や神経障害に伴う疼痛など , 難（Institute for Virus Research, Kyoto University）

然免疫受容体として真菌感染等の防御に重要な役割を（Institute for Virus Research, Kyoto University）

Hiroki Kato

治性疼痛発症との関連を検討した報告はなされていない .

Mitsutoshi Yoneyama

肢の機械的刺激に対する逃避閾値を測定したところ , 野Koji Onomoto

申請者らはまず , dectin-1遺伝子欠損マウスを用い , 後

生型に比べ雌雄ともに有意な閾値低下（過敏行動）を示した . さらに , 完全フロインドアジュバンド後肢皮下投（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）, あるいは第４／第５脊髄与（遷延性炎症性疼痛モデル）

研究成果

ことで後肢の機械的刺激に対する逃避閾値に与える影響

然免疫において重要な役割を担うウイルス感染センサーを検討したところ , 野生型に比べ欠損マウスにおいては ,である RIG-I-like 受容体（RLR）に着目し , それらによ神経結紮手術（末梢神経障害性疼痛モデル）を適用する

本共同研究では , 高等脊椎動物における抗ウイルス自両モデルとも逃避閾値のさらなる低下が誘発された .

るウイルス RNA 検知の分子機構と生理機能について継（10〜100 µg/ml）
をアジュバント後肢皮下投与後72時間目 ,顆粒（SG）の形成を介した RLR 活性化の分子機構につそこで dectin-1作動薬として使用される zymosan depleted

および末梢神経障害後５週間目に（共に野生型マウスに, 処置側後肢に皮下投与すると , 有意な機械的閾
対して）値の上昇（すなわち , 鎮痛効果）が観察された . しかし ,zymosan depleted（100 µg/ml）を野生型正常マウスに同様に皮下投与しても , 有意な機械的閾値の上昇は観察され

千葉大学

続して解析を行っている . 特に近年は , 細胞内ストレス

いて解析しており , これまでに Pumilio の機能解析など複数の報告を行ってきた（PLoS Pathogens, 2016, 2014; Curr

Opin Immunol, 2015）. 本年度は , SG に局在する新たなRNA 結合タンパク質（RBP）の同定とそれについての機能解析を実施した . その結果 , この新規 RBP は , ウイ

真菌医学研究センター報告

第 21 巻201743

ルス感染に応答して SG に局在すること , 遺伝子破壊細研究課題

フェロン（IFN）遺伝子誘導などの抗ウイルス応答が顕IL-17により制御される好中球依存性Candida
albicans 感染防御機構の解明

胞において RNA ウイルス感染に応答したⅠ型インター著に減弱していたこと , さらに強制発現した細胞ではⅠ

型 IFN 遺伝子の発現誘導が増強していたことなどから ,’16－４

この分子が SG 局在を介して抗ウイルス自然免疫誘導を

若林正一郎・岩澤真里・松岡悠美

この分子は , ウイルス非感染細胞で RLR の一つである

西城

正に制御する因子であることが強く示唆された . さらに

LGP2と構成的に会合していることを見出した . これまでに LGP2は抗ウイルスシグナル活性化をウイルス種の違いで正あるいは負の制御因子として機能することは報告されているものの , その分子メカニズムはほとんど明らかになっておらず , 本研究から得られた知見は , 新たなウイルス検知制御機構の一端を示唆している可能性がある . 今後 , この分子のノックアウトマウスの解析を通じて生理的な機能解析へとつなげる計画である .

学会発表
１）Narita R, Takahasi K, Murakami E, Hirano E,
Yamamoto SP, Yoneyama M, Kato H, Fujita T. A
novel fuction of human pumilio proteins innate immune
responses. International Congress of Immunology, Aug.
21-26, 2016, Melbourne, Australia.

（千葉大学大学院医学研究院皮膚科学）

忍（千葉大学真菌医学研究センター）

Analysis of neutrophil-dependent protective
mechanisms of Candida albicans regulated by IL17.
Seiichiro Wakabayashi, Mari Iwasawa, Yuumi
Nakamura（Dermatology, Chiba University）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
ヒトの皮膚における感染防御機構において Th17細胞が重要な役割を持つことが慢性皮膚粘膜カンジダ症などによって示されている . Il17af-/-

マウスに Candida albicansを感染させると , 野生型マウスと比較して感染の感受性が亢進することや , 宿主の抗原提示細胞上に存在する

Dectin-1, Dectin-2が真菌細胞壁成分を認識することでTh17細胞の分化に必要なサイトカインを誘導することか

ら , Th17型免疫応答が真菌感染防御に強く関わっていることが示唆されている . これまでに我々は野生型マウス ,Il17af -/- マウスそれぞれの骨髄から分離した好中球と C.

albicans の菌糸を共培養し , 貪食・排除する機能に差があることを発見した . この結果に着目し , RNA シークエンスに基づいた遺伝子解析や , Live imaging による C. albicans
に対する好中球の反応について解析・検討を行った .
野生型マウス , Il17af-/-

マウスの骨髄から分離した好中球について RNA シークエンスを行い , 両者間の mRNA

発現を比較したが , 明らかな有意差は見られなかった .

好中球の認識機構（Dectin-1, 2）や殺菌能（S100a7, 8, 9）に関わる遺伝子の発現について qPCR を用いて確認したが , やはり有意差は見られなかった . 最後にそれぞれのマウスの好中球を C. albicans の酵母 , 菌糸と共培養し Live

44

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻2017

imaging で解析した . どちらのマウスの好中球も酵母に対として , 本年度 CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編

しては反応しなかったが , 野生型マウスの好中球は菌糸集により , ２種類について作製に成功した . 現在キチン

マウスの好中球では遊走 , 貪食ができず , 菌糸の胞集積や炎症関連遺伝子の発現を中心に解析を行っていに対して遊走 , 貪食し , 菌糸の伸長を抑制した . 対して
Il17af-/-

伸長を抑制できなかったが , リコンビナント IL-17を添加することで野生型とほぼ同等の能力を獲得したことから ,IL-17による直接制御であることが示唆された . 今後 , 両マ

ウスの好中球の蛋白発現レベルでの解析を予定している .

学会発表
１）岩澤真理 IL −17にによる皮膚カンジダ排除機構

第60回日本医真菌学会総会・学術集会 シンポジウ
ム12真菌感染防御と糖鎖認識（招待講演） 2017年
10月２日東京都立産業貿易センター（東京）

研究課題

投与後の自然免疫応答について , 肺胞洗浄液中の免疫細る段階である . また , これら６種類の蛋白質については発現ベクターを構築し , HEK293細胞内へと過剰発現し ,NF-κB や IRF ファミリーの活性化誘導をレポーターアッセイにより検討したが , 有為な上昇は認められなかった .

今後 , リガンド刺激後の活性化に影響を与えるか検討が必要である . さらに , キチン粒子とこれら遺伝子を発現する細胞の可溶化物を混合し , キチンとこれらファミ

リー分子との結合を検討したところ , ３つの分子について LysM ドメイン依存的なキチンとの結合を認めた . 今

後 , これら３つを中心に , 遺伝子欠損マウスを用いてさらに解析を継続していく .

’16－５

真菌成分認識に関わる新たな自然免疫受容体の解析
河合太郎（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研
究科）

関連論文
１）Kawasaki T, Ito K, Miyata H, Akira S, Kawai T. Deletionof PIKfyve alters alveolar macrophage populations andexacerbates allergic inflammation in mice. EMBO J. 2017
May 22. pii: e201695528. doi: 10.15252/embj.201695528.

２）Ori D, Murase M, Kawai T. Cytosolic nucleic acidsensors and innate immune regulation. Int Rev Immunol.

米山光俊

2017 Mar 4; 36（2）: 74-88.

（千葉大学真菌医学研究センター）

３）Kitai Y, Kawasaki T, Sueyoshi T, Kobiyama K, Ishii KJ,

Studies on innate immune responses to thefungal cell wall component
Taro Kawai（Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute

Zou J, Akira S, Matsuda T, Kawai T. DNA-containing

exosomes derived from cancer cells treated with Topotecan
activate a STING-dependent pathway and reinforce

antitumor immunity. J Immunol. 2017 Feb 15; 198（4）:1649-1659.

of Science and Technology）

Mitsutoshi Yoneyama（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
植物のキチン受容体の一つである CERK1受容体のキチン認識モチーフである Lysine motif（LysM）と相同性を示すヒト及びマウスの蛋白質をデータベース検索から６種類見つけ出した . これらの中にはキチンに対する自然免疫応答を制御するものが含まれる可能性があることから , 遺伝子欠損マウスの樹立を行うことを目的の一つ

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

45

研究課題

’16－６

SNARE タンパク質 , ヒストン結合タンパク質が欠損してショウジョウバエを用いた真菌病原性発現機
構と宿主自然免疫応答の解析

作用点として知られている . したがって , ショウジョウ

バエでの網羅的感染実験系を用いて同定した宿主体内での増殖能が低下する系統を調べることで , 新たな抗真菌倉田祥一朗

剤の標的が同定できる可能性を指摘できた .

（東北大学大学院薬学研究科）

知花博治・高橋いた . 葉酸合成経路は , 抗真菌作用を示すサルファ剤の

学会発表

梓

（千葉大学真菌医学研究センター）

１）知花博治 , 高橋（中口）梓 , 佐藤（岡本）美智代 , 渡

Analysis of fungal virulence mechanism and host
innate immune responses using Drosophila

辺 亮 , 倉石貴透 , 倉田祥一郎 , 宇野 潤：Candida
glabrata の体系的全遺伝子組換体を用いた病原性と抗真菌薬の研究 . 東京 , 2016年10月

Shoichiro Kurata

研究課題

Hiroji Chibana, Azusa Takahashi-Nakaguchi

Candida glabrata 細胞壁構築関連遺伝子欠損
が菌体の性質に及ぼす影響（Graduate School of Pharmaceutical Sciences）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果

’16－７

柴田信之・佐々木雅人・伊藤文恵・田中

日和見感染症に代表される感染症を引き起こす病原真菌の病原性発現機構は , 依然として不明であり , 大きな脅威となっている . 真菌医学研究センター知花准教授は ,Candida glabrata を用いて , 5, 150遺伝子を組換えた変異体

ライブラリーを作成している . このリソースを用いると ,病原性の発現に関わる遺伝子をゲノムワイドに探索できる . しかしながら , マウスなどの哺乳動物を宿主として用いて網羅的に解析することは , 現実的に不可能である .
一方 , 自然免疫研究によく利用されているショウジョウ

バエは , 生活環が短く網羅的解析に優れている . そこで ,本研究では , センターの有する真菌のリソースを利用した , ショウジョウバエでの解析から病原真菌の病原性発現機構の解明と新たな抗真菌薬の標的に迫ることにした .
そのために , 平成26年度に確立したショウジョウバエ

大（東北医科薬科大学）

知花博治・山口正規・川本進（千葉大学真菌医学研究センター）

Analysis of the mutant set involving the cell wall
integrity of Candida glabrataNobuyuki Shibata, Masato Sasaki, Fumie Ito,
Yutaka Tanaka（Tohoku Medical and Pharmaceutical University）

Hiroji Chibana, Masaki Yamaguchi, Susumu
Kawamoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）, 平成27
網羅的感染実験系を用いて（採択番号14−11）

研究成果欠損した変異体2, 026系統を解析し , 病原性が低下したから成る多層構造を形成しており , それぞれヒト病原性

れらの病原性が低下した系統の宿主体内での増殖を調べ

年 , C. glabrata において , 環境ストレス応答をきっかけに

年度に通常の培養条件では生育に必須ではない遺伝子を. 今年度は , こ
系統を57系統同定した（採択番号15−13）
た . 宿主体内での増殖能が低下していた11系統では , 二つのアデニン合成酵素とそれらの遺伝子発現を制御する
転写因子 , 二つの葉酸合成酵素 , ウラシル合成酵素 , チ

ロシン合成酵素 , 二つのミトコンドリア関連タンパク質 ,

46

千葉大学

病原性酵母 Candida glabrata の細胞壁は , 複数種の多糖

あるいは薬剤ストレス抵抗性に関わる分子である . 近生じる細胞壁のヘテロ再構築が , 既存の抗真菌薬耐性や致死的な環境ストレスに対して有利に働くことが相次いで報告された . このことは , 細胞壁構造最適化（Cell Wall

Integrity：CWI）の仕組みと病原性・抗真菌薬耐性との真菌医学研究センター報告

第 21 巻2017

あいだに密接な関わりがあることを示唆している . 今回

２）Yutaka Tanaka, Masato Sasaki, Fumie Ito, Toshio

た変異株ライブラリを用いて , 特に ① 小胞体−ゴルジ体

Nakaguchi, Hiroji Chibana, Nobuyuki Shibata:

我々は , C. glabrata CBS 138株の全遺伝子について作製し局在型糖転移酵素をコードする遺伝子 , ② 糖タンパク質の品質管理に関わるシャペロン群あるいはストレス耐性

遺伝子の欠損株を中心に , 細胞壁糖鎖構造構築と環境ス

トレス応答能 , および CWI に及ぼす影響を解析した .

KRE5および CNE1は小胞体局在するタンパク質である

kre5p および cne1p をそれぞれコードしており , 糖タンパ

ク質品質管理を担うカルネキシンシャペロンサイクルを形成している . KRE5遺伝子の発現抑制株 , および CNE1
遺伝子欠損株の細胞壁を解析した結果 , いずれの株においても , β1-6グルカン含量の減少と , 細胞壁キチン含量の増加が認められた . このとき , 小胞体ストレスマー

カーである KAR2や BAG7の mRNA 転写活性化も同時に認められた . 興味深いことに , カルシニューリン阻害剤

FK-506で処理したところ , これら変異株における細胞

壁キチン含量はさらに増大し , かつ CWI を司る MAP キ
ナーゼである Slt2p のリン酸化が極端に亢進することがAoyama, Michiyo Sato-Okamoto, Azusa Takahashi-

Cooperation between ER stress and calcineurin signaling

requires maintaining the cell wall integrity in Candida
glabrata, Fungal Biology（Under review）

３）Fumie Itoh, Shizuka Takahashi, Yutaka Tanaka, Atsushi

Kudoh, Masato Sasaki, Michiyo Okamoto, Azusa

Takahashi-Nakaguchi, Masashi Yamaguchi, Kazuyoshi

Kawakami, Hiroji Chibana and Nobuyuki Shibata:Glycosyltransferase Alg6 is required for cell wall integrity

and virulence of Candida glabrata, FEBS Journal（Under
review）

学会発表
１）伊藤文恵 , 田中

大 , 佐々木雅人 , 工藤

敦 , 高橋

梓 , 山口正規 , 知花博治 , 柴田信之 , Candida glabrata
糖鎖合成酵素関連遺伝子欠損株 alg6∆ の性質 , 日本医真菌学会 , 東京 , 2016年10月わかった . 加えて , 各変異株は野生株に比べて（生育は２）伊藤文恵 , 高橋静香 , 田中 大 , 工藤 敦 , 佐々木雅

FK-506を処理した変異株は細胞周期の停止および細胞野大樹 , 横山 隣 , 川上和義 , 知花博治 , 柴田信之 ,

遅いものの）細胞死はほとんど見られなかったのに対し ,人 , 岡本美智代 , 高橋 梓 , 山口正規 , 山本秀輝 , 丹

死と異形細胞凝集像が観察された . 以上のことから , ①

Candida glabrata 細胞壁糖鎖合成酵素遺伝子欠損株

小胞体ストレスが惹起されること , ② カルシニューリン

３月

KRE5や CNE1の変異により CWI が誘導されるとともに

alg6∆ 及び mnn2∆の性質 , 日本薬学会 , 仙台 , 2017年

経路を介した小胞体ストレス応答を阻害することで , 深
刻な細胞壁ダメージと細胞死をもたらすことが明らかになった . これらのことは , カルシニューリン経路を介した小胞体ストレス応答が , CWI 誘導を調節する因子として機能している可能性を示唆している . 現在 , 小胞体糖

タンパク質品質管理に関わる他の遺伝子 , あるいはゴルジ体や分泌経路に関わる遺伝子の欠損株についても同様に解析を実施しており , 小胞体ストレス応答と CWI との関連をより詳細に調べていく予定である .

発表論文
１）Yutaka Tanaka, Masato Sasaki, Fumie Ito, Toshio
Aoyama, Michiyo Sato-Okamoto, Azusa TakahashiNakaguchi, Hiroji Chibana, Nobuyuki Shibata: KRE5
Suppression Induces Cell Wall Stress and Alternative
ER Stress Response Required for Maintaining Cell Wall
Integrity in Candida glabrata, PLOS ONE, pone. 0161371

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

47

研究課題

’16－８

研究課題

薬剤標的開発を目指したパン酵母とカンジダ・
グラブラータの生育必須遺伝子多様性解析

Aiming drug targets development, analysis ofgene diversity for growth essential between the
baker s yeast and the Candida glabrata
Erwin Lamping（Sir John Walsh Research Institute, University of Otago,

New Zealand）

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
実験モデル生物のパン酵母では , 遺伝学的解析により生育に必須な遺伝子が約1, 200同定されており , 抗真菌薬

’16－９

Antifungal drug resistance in Candida
glabrata from transcriptional control to drug
extr usion:aiming improved diagnosis andtherapeutics
Miguel C Teixeira（Institute for Bioengineering and Biosciences, Instituto

Superior Técnico/Bioengineering Department）

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
深在性真菌症適応薬の一つである5-FC（5-flucytosine）

は , 他の抗真菌薬と比較し耐性株の出現率が高いが , その耐性化機序については , 明らかにされていない . 今回 ,病原真菌カンジダ・グラブラータに対して5-FC に暴露の標的開発の際に極めて重要な情報源となっているが ,による iTRAQ（タンパク質の網羅的解析）のアプローチ

タの相同遺伝子について解析を行ったところ , パン酵母

果 , 細胞壁構成成分 , 脂質代謝 , アミノ酸とヌクレオチド

真菌医学研究センターの知花らがカンジダ・グラブラー
では生育に必須でありながら , カンジダ・グラブラータ

では必須ではない , またその逆のケースがそれぞれ約200を使用した細胞膜プロテオーム解析を実施した . その結
代謝 , リボゾーム成分 , ミトコンドリア機能 , 糖代謝 , 薬剤排出など , 合計32のタンパク質に顕著な発現量の変化

遺伝子存在することが示唆された . パン酵母とカンジダ・が確認された . これらのタンパク質の中から特に薬剤耐遺伝子重複の相違について比較したところ , 約３割の遺並びに CgFlr2に着目した . これら遺伝子の欠損株では ,の遺伝子の多様性の原因については , 現在検討中である .

ことから , CgFlr1並びに CgFlr2は5-FC を細胞外へ排出す

グラブラータにおける生育必須遺伝子の多様化について ,伝子について遺伝子重複の相違点が示された . 残る７割

今後 , カンジダ・グラブラータにおける生育必須遺伝子

情報が加味されることよって効率的な抗真菌薬標的開発性との関連が示唆されたプロトンアンチポーターCgFlr1

5-FC の細胞内蓄積が増加していることが示された . このる機能を有していると考えられた . したがって , プロト

ンアンチポーターCgFlr1並びに CgFlr2の活性を阻害する薬剤の開発によって , 5-FC の薬効を増強もしくは耐性菌を進めていくことが期待できる .

の出現を抑制することが期待できる .

学会発表
１）知花博治：カンジダ・グラブラータの体系的且つ網
羅的遺伝子組換体コレクションを用いた病原性研究と抗真菌薬の開発 , 日本微生物資源学会第23回大会 ,千葉市千葉大学けやき会館 . 2016. 招待講演

発表論文
１）Pais P, Pires C, Costa C, Okamoto M, Chibana H,
Teixeira MC. Membrane proteomics analysis of the
Candida glabrata response to 5-flucytosine: unveiling therole and regulation of the drug efflux transporters CgFlr1

and CgFlr2. Frontiers in Microbiology. 21; 7: 2045. 2016.

12.

48

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

研究課題

’16－10と抗真菌薬の開発 , 日本微生物資源学会第23回大会 ,千葉大学が保有するオリジナル化合物ライブ
ラリーを用いた抗真菌薬シーズの開発（千葉大学大学院理学研究科）

潤・高橋

研究課題

’16－11

病原真菌における一酸化窒素の合成制御機構と生理機能の解明

荒井孝義
知花博治・宇野千葉市千葉大学けやき会館 . 2016. 招待講演

梓高木博史

（千葉大学真菌医学研究センター）（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研

Development of the antifungal seeds from theoriginal compound library in Chiba University
Takayoshi Arai

（Graduate School of Science, Chiba University）

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Jun Uno（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Azusa Takahashi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
当研究室が保有する1, 000種類のオリジナル合成化合物のうち , 平成26年度は450種類 , 平成27年度は , 残る550種

究科）

知花博治・高橋

梓・宇野

潤・川本

進

（千葉大学真菌医学研究センター）

Analysis of synthetic regulatory mechanismand physiological function of nitric oxide inpathogenic fungus
Hiroshi Takagi（Graduate School of Biological Sciences, Nara Instituteof Science and Technology）

Hiroji Chibana, Azusa Takahashi, Jun Uno, Susumu
Kawamoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

類の化合物について Candida glabrata を用いて生育阻害活

研究成果

種類の化合物について Candida albicans, Aspergillus fumigatus,

広い生命現象に関与している . 高木らは酵母 Saccharomyces

害活性が確認された . 次にこれらの化合物について , マ

Mpr1およびフラボタンパク質 Tah18依存的にアルギニン

性物質の一次スクリーニングを終了した . その結果 , ６

Cryptococcus neoformans 等の主要な病原真菌に対して生育阻

ウスの培養細胞を用いて呼吸阻害活性を指標とした細胞毒性を測定したところ , ５種類の化合物に細胞毒性が確

一酸化窒素（NO）はシグナル分子として , 哺乳類の幅

cerevisiae において , NO がアセチルトランスフェラーゼから合成され , 酸化ストレス耐性に寄与することを見出した . また , Tah18と複合体を形成する Dre2タンパク質が認されず , 抗真菌薬「シーズ候補」とした . これらの実酸化ストレスセンサーとして働き , Tah18依存的な NO 合

きた . さらに , AMED の創薬総合支援事業「創薬ブース

感染する際 , 温度・低酸素などのストレスに応答して耐シーズ候補のスクリーニングを進めると共に , 化合物のや病原性に関与する可能性がある .

績に基づき , 製薬企業との共同研究を開始することがでター」に申請中である . 平成29年度はこれまでと同様に ,作用機序の解明に取組んで行くことにした .

性を獲得し , 病原性を示すことから , NO がストレス耐性
本 研 究 で は , S. cerevisiae と 同 様 の NO 合 成 経 路 の 存

在 が 示 唆 さ れ る 病 原 真 菌（Candida glabrata, Cryptococcus

学会発表１）知花博治：カンジダ・グラブラータの体系的且つ網
羅的遺伝子組換体コレクションを用いた病原性研究

千葉大学

成を制御する機構を提唱した . 一方 , 病原真菌はヒトに

neoformans, Aspergillus fumigatus）について , NO と増殖・感染・病原性との関連性を解析する . 平成28年度には , 以
下の研究成果が得られた .

真菌医学研究センター報告

第 21 巻201749１）C. glabrata：カイコ幼虫のテトラサイクリン転写抑制系を用いて , NO 代謝との関連が予想される S. cerevisiaeの 遺 伝 子（DRE2, YHB1, SFA1, NCP1, MET10, CYT1,

COX9, YNO1, RIB1など）のオルソログ遺伝子について研究代表者：高木博史
研究分担者：渡辺大輔 , 那須野亮 , 知花博治 ,川本 進 , 萩原大祐 .

カイコ感染実験を行った . その結果 , 生育に必須とされ研究課題ていたことから , NO 代謝（合成・分解など）との関連

Aspergillus fumigatus の病原性におけるガラ
クトフラノース糖鎖の機能解析

る遺伝子については , 転写を抑制すると感染性が低下し性が明確な遺伝子は見出せなかった .

２）C. neoformans：アルギニン代謝系に着目し , 各酵素’16－12（Mpr1, Arg7, Car1, Car2など）のオルソログ遺伝子の破岡に対する表現型などの解析を試みている .

田中

ランスクリプトーム解析を RNA-seq によって行った . そ亀井克彦・渡辺壊株を用い , NO 産生量 , アルギニン含量 , 各種ストレス

３）A. fumigatus：NO ドナー（SNAP）を添加した際のトの結果 , S. cerevisiae で見出された銅代謝（銅イオンの還元 ,拓二（崇城大学・応用微生物工学科）

大・柴田信之（東北薬科大学・感染生体防御学研究室）

哲・萩原大祐（千葉大学真菌医学研究センター）

取込みなど）や酸化ストレス応答に関与する遺伝子の発現には影響がなかったが , オルニチンから合成されるシ

デロフォア（鉄キレート物質）の合成系遺伝子の発現が低下していた . 一方で , NO により A. fumigatus の病原性に関与する二次代謝が活性化される可能性が示された（糸.
状菌では報告例なし）

Funct ional anal y sis of g alactofur anosecontaining oligosaccharides in the pathogenicityof Aspergillus fumigatus
Takuji Oka

発表論文以外の特筆すべき成果
高木らは , これまでに出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）

および分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）で得られた研究成果を中心に , 下記の総説を執筆した . 今後 , 病原真菌における NO の生理的役割を解析する上で有益な情報となる .

１）Rika Indri Astuti*, Ryo Nasuno*, Hiroshi Takagi: Nitricoxide signaling in yeast.

* These authors contributed equally to this work. Appl.
Microbiol. Biotech., 100, 9483-9497（2016）.

２）高木博史：酵母における一酸化窒素の分子機能と応（Department of Applied Microbial Technology, Sojo

University）

Yutaka Tanaka, Nobuyuki Shibata（Department of Infection and Host Defense, Tohoku

Medical and Pharmaceutical University）

Katsuhiko Kamei, Akira Watanabe, Daisuke
Hagiwara（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
病 原 性 糸 状 菌 Aspergillus fumigatus 由 来 の GfsA に 関 する機能解析を進め , 本酵素が β1, 5- ガラクトフラノース

用 . バイオサイエンスとインダストリー , 75, 214（Gal f ）転移酵素であることを示す確固たる証拠を得た .

３）那須野亮 , 吉川雄樹 , 高木博史：酵母に見出した一

え GfsA を UDP-Gal f とともに反応させることで新規に合.
218（2017）

酸化窒素（NO）の合成制御機構と生理機能 . 化学と生物 , 印刷中 .

研究費の取得
基盤研究（A）, H27−29. 真菌における一酸化窒素の合成制御機構と生理機能の解明

50

千葉大学

pNP-β-Gal f と大腸菌を用いて発現および精製した組換成された化合物Ａを精製し , LC-MS, 1H-NMR およびメ

チル化分析に供した . その結果 , 化合物Ａの構造は Gal f
β1, 5Gal f -β-pNP であった . 以上より , GfsA は , UDP-Gal f

β-Gal f : β1, 5- ガラクトフラノース転移酵素であることが明らかになった . 一方で , gfsA 破壊株より抽出した真菌型

ガラクトマンナンの構造を1H-NMR, 13C-NMR およびメ

真菌医学研究センター報告

第 21 巻2017

チル化分析によって解析したところ , gfsA 破壊株では , 真

研究課題 ’16－13

少していることが示された . これは , GfsA が真菌型ガラ

アスペルギルス症原因菌が産生する環状ペプ
チドの宿主免疫応答反応への影響

菌型ガラクトマンナン中の Gal f β1, 5-Gal f 結合が顕著に減
クトマンナン中の Gal f β1, 5-Gal f 結合の生合成を担っていることを示す初めての証拠となった . さらに , パラログ

である GfsC の解析についても進めた結果 , GfsA と GfsC

梅村舞子

Gal f 結合が全て消失することを明らかにした . すなわち ,亀井克彦・渡辺の二重破壊株では真菌型ガラクトマンナン中の Gal f β1, 5-

GfsA と GfsC が協調的にはたらくことで A. fumigatus 内のGal f β1, 5-Gal f - 結合を生合成していることを明らかにすることができた . さらに , gfsC 破壊株 , gfsAC 破壊株についてマウスを用いた病原性試験を実施した . その結果 ,gfsC 破壊株や gfsAC 破壊株の病原性は親株と比較して有意（産業技術総合研究所）

哲・萩原大祐（千葉大学真菌医学研究センター）

Effect of cyclic peptides produced by pathogenic
Aspergillus species on host immune responseに差は認められなかった .

Maiko Umemura

発表論文
１）Katafuchi Y, Li Q, Tanaka Y, Shinozuka S, Kawamitsu
Y, Izumi M, Ekino K, Mizuki K, Takegawa K, Shibata
N, Goto M, Nomura Y, Ohta K, Oka T: GfsA is a β1, 5-

Katsuhiko Kamei, Akira Watanabe, Daisuke
Hagiwaragalactofuranosyltransferase involved in the biosynthesis of
the galactofuran side chain of fungal-type galactomannan
in Aspergillus fumigatus. Glycobiology 27: 568-581, 2017

（National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
ア ス ペ ル ギ ル ス 症 の 原 因 菌 で あ る 糸 状 菌 Aspergillus

flavus において , 近年 , 強い微小管重合阻害活性を有する

環状ペプチド ustiloxin の産生が申請者らによって見出された . 微小管重合は宿主のインフラマソーム形成に必須なため , 本化合物が宿主の正常な免疫反応を抑制する可能性が高い . そこで本研究では , ustiloxin と同種の経路（ust-RiPS 経路）で生合成される環状ペプチドが本菌の新規病原因子として機能するかを , 当該経路遺伝子破壊株を用いた動物細胞感染実験等から検証した .

Aspergillus fumigatus Af 293 株 は , ust-RiPS 経 路 に お ける前駆体ペプチドと考えられる遺伝子を２つ保有する. 前実験では , これら２つの遺（rps1a および rps2a と呼称）

伝子は YGMM 培地上でアクチン比３〜７倍と高発現していた . そこでこれらをそれぞれ欠失させた遺伝子破壊株∆ rps1a および∆ rps2a を用いて , Transwell システムによるヒト肺上皮細胞（Calu-3）への侵入試験 , ヒト肺上皮細胞（A549）を用いた細胞障害性試験 , コルチコステロ

イド免疫抑制マウスおよび好中球減少マウスに対する感染実験等を行った . 結果 , ∆ rps2a 株において , 細胞侵入活性が有意に低く , またマウス肺内増殖率が低い傾向が見られた（Umemura et al., 7th Advances Against Aspergillosis

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻2017

51

（2016, Manchester, UK）にて発表）. このように本研究で特にアスペルギローマ（菌球）の菌糸塊に見られる菌糸して機能している可能性が示唆された . 今後は結果をまようなバイオフィルムを形成する状態では , いくつかのは , A. fumigatus において ust-RiPS 経路が新規病原因子ととめるとともに , A. fumigatus に比べてより多くの ust-RiPS

経路を保有する A. flavus を用いて , 同様に同経路の病原性への影響を調べる予定である .

発表論文
１）Myco Umemura, Nozomi Nagano, Daisuke Hagiwara,
Lea Gregson, Margherita Bertuzzi, Elaine Bignell,
Effect of A. fumigatus RiPS precursor-like genes in pH

response and pathogenicity , Proceedings of the 7th Advances
Against Aspergillosis, pp.80, 2016.

研究課題

周囲には厚い細胞外マトリクスが観察されている . この
抗真菌薬に対する感受性が低下する現象が示され , 難治性の原因の１つになっていると考えられる . しかしながら , バイオフィルム形成 , および , それによる抗真菌薬

耐性の詳細な分子メカニズムは不明な点が多い . 本研究では , バイオフィルム形成に関わる新規遺伝子を同定し ,抗真菌薬耐性との関連性を明らかにすることを目的とす

る . 平成28年度では , Cas9/CRISPR ゲノム編集技術を A.

fumigatus に応用し , 血清存在下での生育に必須な遺伝子群の探索を行った .

幅広い生物種で用いられている Cas9/CRISPR ゲノム

編集技術を A. fumigatus で利用可能にし , 遺伝子スクリー’16－14

ニングを行った . ランダムな20塩基を含む sgRNA と Cas9
蛋白質を導入するためのプラスミドライブラリを大腸菌

アスぺルギルスのバイオフィルム形成および抗真菌薬耐性に関連する新規遺伝子群の探索
梅山

において作製した . A. fumigatus にプラスミドライブラリ

DNA を形質転換し , 形質転換体の分生子ライブラリを得た . 変異が導入されると予想される分生子ライブラリを隆

血清存在下・非存在下で培養し , DNA を抽出後 , PCR に（国立感染症研究所）

より増幅した20塩基の配列を次世代シーケンサにより解宮﨑義継

析を行い , 血清存在下でコピー数が減少している配列か（国立感染症研究所）

ら候補遺伝子を26種類抽出できた . これらの26種類の遺亀井克彦

伝子は , 血清存在下での生育に必須であることが予想さ（千葉大学真菌医学研究センター）

れ , 今後 , 個々の遺伝子についての解析を行うことによ

Screening of novel genes involved in biofilm
formation and antifungal resistance in Aspergillus
fumigatus

発表論文・学会発表
１）犬飼達也 , 梅山 隆 , 山越 智 , 中村茂樹 , 名木 稔 ,田辺公一 , 大野秀明 , 宮﨑義継 . Aspergillus fumigatus のバイオフィルム形成と抗真菌薬感受性に関与する真Takashi Umeyama（National Institute of Infectious Diseases）

菌側因子の制御に向けた検討 . 第64回日本化学療法
学会総会 . ６月９日−11日 , 2016年 , 神戸 .

Yoshitsugu Miyazaki（National Institute of Infectious Diseases）

２）梅山

Katsuhiko Kamei（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
深在性真菌症の中でも Aspergillus fumigatus を主要病原菌とするアスペルギルス症は増加傾向にあり , 予後が非常に悪い . 近年 , アスペルギルスのバイオフィルム形成がアスペルギルス感染に関与することが示唆されている .

52

り , 血清刺激に応答する新しい遺伝子群を同定したい .

千葉大学

隆 , 壇辻百合香 , 犬飼達也 , 中村茂樹 , 山越

智 , 名木 稔 , 田辺公一 , 大野秀明 , 宮﨑義継 . 次世

代シーケンサーを用いた Aspergillus fumigatus 近縁種の網羅的ゲノム解析による抗真菌薬耐性の原因解明 . 第64回日本化学療法学会総会 . ６月９日−11日 ,2016年 , 神戸 .

３）犬飼達也 , 梅山
浩伸 , 名木隆 , 山越智 , 青山俊弘 , 中山

稔 , 田辺公一 , 中村茂樹 , 宮﨑義継 ,Aspergillus fumigatus の血清存在下における菌糸生育に

真菌医学研究センター報告

第 21 巻2017関連する因子の同定 , 第60回日本医真菌学会総会・学術集会 , 10月１−２日 , 2016, 東京 .

４）梅山 隆 , 犬飼達也 , 山越 智 , 名木 稔 , 中村茂樹 ,宮﨑義継 , 今話題のアスペルギルス基礎研究は？, 第60回日本医真菌学会総会・学術集会 , 10月１−２日 ,研究課題’16－15Aspergillus fumigatus リボソーム標的薬剤耐性株における二次代謝活性化機構の解明

2016, 東京 .

浅井禎吾

田辺公一 , 大野秀明 , 宮崎義継 , Aspergillus fumigatus の亀井克彦

血清存在下でのバイオフィルム形成に関与する真菌（千葉大学真菌医学研究センター）

側因子の制御に向けた検討 , 第65回日本感染症学会

渡辺

東日本地方会学術集会／第63回日本化学療法学会東（千葉大学真菌医学研究センター）

日本支部総会 , 10月26−28日 , 2016, 新潟 .

萩原大祐

越 智 , 名木 稔 , 田辺公一 , 大野秀明 , 宮﨑義継 ,矢口貴志

５）犬飼達也 , 梅山 隆 , 山越 智 , 中村茂樹 , 名木 稔 ,６）梅山

隆 , 壇辻百合香 , 犬飼達也 , 中村茂樹 , 山Aspergillus fumigatus 隠蔽種の NGS 解析による抗真菌薬
耐性の原因解明 , 第65回日本感染症学会東日本地方

会学術集会／第63回日本化学療法学会東日本支部総会 , 10月26−28日 , 2016, 新潟 .

（東京大学大学院総合文化研究科）

哲（千葉大学真菌医学研究センター）（千葉大学真菌医学研究センター）

Ac t i v a t i o n o f s e c o n d a r y m e t a b o l i s m i nAspergillus fumigatus strains with resistance toribosome-targeting chemicals
Teigo Asai

（Graduate School of Arts and Sciences, The Universityof Tokyo）

Katsuhiko Kamei（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Akira Watanabe（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Daisuke Hagiwara（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Takashi Yaguchi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
化学変異源の種類や濃度 , 処理時間などを検討することで , Aspergillus fumigatus のハイグロマイシンＢ耐性株を作製した . その中に顕著に二次代謝が活性化した変異株を数多く見出した . 活性化される二次代謝物は変異株ごとにいくつかのタイプが存在することも見出した . 二次代謝活性化のタイプ毎に , それぞれ２から３株ずつピックアップし , 次世代シーケンサーを用いて二次代謝活性型変異株と野生株の mRNA を網羅的に比較解析した . 現

在詳細な解析中である . また , それら変異株についてゲ

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻201753

ノムシーケンスを行った . 当初の予想よりはるかに多く産物が予測されていた . そこで , 本クラスターのユニーの変異が導入されていたが , 株間に共通する変異を指標

クな領域での転写産物を明らかとすることを目的として ,現在 , これらの変異について , 野生株に一塩基変異の導リプトーム解析を行った .

に探索を行うことで , いくつかの候補遺伝子を見出した .

入もしくは変異型タンパク質の過剰発現により , 二次代謝活性化やハイグロマイシンＢ耐性に関わる変異の特定

このクラスターを持つ A. flavus IFM58503株のトランスク

トランスクリプトーム解析の結果 , 予測どおり新規転写産物が確認され , 新たな構成を持って機能しているクを目指している . 以上のように , 二次代謝が活性されたラスターと強く推測された . この遺伝子は Ankyrin repeat

ることに成功し , また次世代シーケンサーを用いて , 二

ある A. parasiticus や A. bombycis の遺伝子が相同性の高い遺Aspergillus fumigatus のハイグロマイシンＢ耐性株を作成す

次代謝活性型変異株と野生株の網羅的な発現比較や変異株のゲノムシーケンスなど , メカニズム解明への基礎的を持つタンパク質をコードしていた . 他の Aspergillus 種で伝子として見いだされてきたが , これらの相同性も50％以下に留まっていた . このデータを含めて , 現在論文投な知見を得る事ができた .

稿の最終段階にある . 関連する報告をこれまでにマイコ

研究課題

してきており , 本成果も今後のマイコトキシン学会で発トキシン国際シンポジウム ISMYCO2016などで共同発表’16－16

臨床分離Aspergillus flavus の新規二次代謝産物生合成クラスター構成遺伝子の発現解析

表予定である . また , 今後の詳細な解析により , この菌株

により産生される新たな二次代謝産物の発見につなげていきたいと考えている .

さらに , 本研究の成果としては A. flavus IFM58503株の豊留孝仁

網羅的なトランスクリプトームデータが得られている .

（帯広畜産大学）

詳細に検討することによって他の IFM58503株ユニーク亀井克彦

な領域の遺伝子発現のみならず , A. flavus に共通する遺伝（千葉大学真菌医学研究センター）子の発現に関する新たな情報が得られると期待して , 解Transcriptome analysis of a novel secondary
metabolite biosynthesis cluster in a clinicalisolate of Aspergillus flavus
Takahito Toyotome（Obihiro University of Agriculture and Veterinary

Medicine）

析を進めている .

学会発表
１）Yamaguchi S, Takino M, Kamei K, Toyotome T:
Production of aflatoxin and the biosynthetic cluster inclinical isolates of Aspergillus flavus. マイコトキシン国
際シンポジウム ISMYCO2016 abstracts PS06.

Katsuhiko Kamei（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
Aspergillus flavus はアスペルギルス症の重要な原因菌種の一つであるが , いまだ十分な知見が積み上げられていない . 我々はこれまでに10株の臨床分離 A. flavus のドラフ
トゲノム解析を行った . その結果 , これまでに A. flavus やA. oryzae で報告のない新たな構成の二次代謝産物生合成

遺伝子クラスターの存在を10株中３株で見いだした . ゲ
ノム解析株である A. flavus NRRL3357や A. oryzae RIB40には認められない配列が存在し , この領域には一つの転写

54

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

研究課題

’16－17

本真菌の重要な病原因子である莢膜の主要な多糖成分

新興強毒性真菌Cryptococcus gattii の高病原性機序の免疫学的解析

し免疫応答への影響を比較したところ , H99由来の GXM

は樹状細胞からの炎症性サイトカイン産生を誘導したのに対して , R265由来の GXM ではそのような活性がみら

川上和義・石井恵子

れなかった . これまでに我々は , C. neoformans による樹状（東北大学大学院医学系研究科）

亀井克彦・川本

グルクロノキシロマンナン（GXM）を両菌株から精製

細胞からのサイトカイン産生に Dectin-2が必須なことを

進明らかにしていたことから , 両真菌由来 GXM の Dectin-2（千葉大学真菌医学研究センター）への作用について解析を行った . H99 GXM は Dectin-2-

Immunological analysis of a mechanism for highpathogenicity of Cryptococcus gattii
Kazuyoshi Kawakami, Keiko Ishii（Tohoku University Graduate School of Medicine）

Katsuhiko Kamei, Susumu Kawamoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
1999年にカナダのバンクーバー島で Cryptococcus gattii によるクリプトコックス症のアウトブレイクが発生し , そヒ ト IgG 融 合 タ ン パ ク に 結 合 し , Dectin-2レ ポ ー タ ー

アッセイで明らかな刺激活性を示したのに対して , R265

GXM ではそのような活性はみられなかった .

以 上 の 結 果 か ら , C. gattii と C. neoformans は TLR9や

Dectin-2への異なる刺激活性を示すことで , その後の免疫応答が大きく異なり , このことが両真菌の病原性の違いに関与する可能性が示唆された . 今後は , 両真菌のTLR9, Dectin-2に対する PAMPs の構造の違いとの関連性についてさらに詳細な解析を進める予定である . これらの成果は , 第45回日本免疫学会学術集会 , 第91回日本感染症学会総会・学術講演会にて報告した .

C. gattii によるクリプトコックス症例が報告され , その後

学会発表
１）Kotone Kawamura, Tong Zong, Akiho Oniyama, Keiko
Ishii, Kazuyoshi Kawakami. Effect of Cryptococcus

プトコックス症と異なり , 健常者でも中枢神経感染症を

mice. 第45回日本免疫学会学術集会 . 沖縄 . 2016年12の後アメリカ合衆国の北西沿岸地域を中心に拡大しつつある . 2007年には , わが国でも国内感染と考えられるも症例が増加している . 通常の C. neoformans によるクリ発症し , その高い致死率から高病原性クリプトコックス

neoformans and C. gattii on helper T cell response in OT-II
月５日〜７日 .

症とも呼ばれており , 今後新興感染症として重要な問題

２）Akiho Oniyama, Anna Miyahara, Kotone Kawamura,neoformans に対する免疫応答性を比較することで , 本感染

effector helper T cells in response to Cryptococcus neoformansに発展することが懸念される . 本研究では , C. gattii と C.

症の病態解明の手掛かりを探ることを目的とした .

Keiko Ishii, Kazuyoshi Kawakami. Differentiation of
and C. gattii in transgenic mice expressing T cell receptor

これまでの我々の研究で , C. neoformans に対する Th1免for 98kD mannoprotein. 第45回日本免疫学会学術集会 .

かにしており , 前年度の研究では , C. gattii（R265株）の３）川村琴音 , 宗 童 , 石井恵子 , 川上和義 . Cryptococcus

TLR9に依存した IL-12産生 , そして抗原特異的な Th1細いとその機序の解析 . 第91回日本感染症学会総会・疫応答に TLR9を介した DNA 認識が重要なことを明ら

DNA が , C. neoformans（H99株）に比べ , 樹状細胞からの胞誘導活性が弱いことを見出した . 今年度は , その機序に迫るために , 両菌株の全ゲノム DNA における TLR9認

沖縄 . 2016年12月５日〜７日 .

neoformans と C. gattii 由来 DNA による免疫活性化の違

学術講演会 . 東京 . 2017年４月６日〜８日 .

識モチーフの頻度 , さらに TLR9刺激活性を低下させる

ことが知られている認識モチーフのメチル化の有無について解析を行ったところ , 明らかな違いを見出すことはできなかった .

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

55

研究課題

’16－18出された Aspergillus 培養陽性151株を遺伝子解析による菌

Aspergillus 呼吸器検体臨床分離株の菌種同定・薬剤感受性の検討

で , A. fumigatus の隠蔽種であるA. udagawaeとA. lentulusは各１例づつ同定された . その他 , A. niger ３例 , A. tubingensis

10例 , A. welwitschiae 19例 , A. flavus ４ 例 , A. nomius １例 ,武田啓太
（国立病院機構東京病院呼吸器センター）

鈴木純子（国立病院機構東京病院呼吸器センター）萩原大祐

A. terreus ４例であった . 形態学的に A. niger と診断された 呼 吸 器 臨 床 分 離 株 の う ち 実 際 は A. welwitschiae と A.
tubingensis が大半を占め , Aspergillus section Nigri では菌種により MIC 値に差を認めた .

A. fumigatus108株中では４株（3. 7％）が ITCZ 耐性でう（千葉大学真菌医学研究センター）

渡辺

種の同定 , 抗真菌薬耐性を検討した . 108株が A. fumigatus

ち２例は VRCZ も耐性であった . 108株中アゾール使用歴

哲があったものは28株で , アゾール使用歴がある株での耐（千葉大学真菌医学研究センター）性率は14. 3％（４／28株）であった . 現在2016年以降の亀井克彦

菌株についても検討を続けており , 同一患者からの再検（千葉大学真菌医学研究センター

出株などについても検討を行っている .

S tudy of species identification and dr ug
susceptibility of Aspergillus clinical isolates in
respiratory specimen
Keita Takeda（Center for Pulmonary Diseases, National Hospital

Organization Tokyo National Hospital）

Junko Suzuki（Center for Pulmonary Diseases, National Hospital

Organization Tokyo National Hospital）

Daisuke Hagiwara（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Akira Watanabe（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Katsuhiko Kamei（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
肺真菌症の病原真菌となる Aspergillus 属菌では , 複数の遺伝子解析からアゾール系抗真菌薬などの感受性が低いその亜種（隠蔽種）が報告されており , 治療上菌種の同定は重要である . また , 慢性肺アスペルギルス症（CPA）では抗真菌薬による治療が長期に及ぶため , 治療

過程で薬剤獲得耐性が生じるとの懸念があるが , 我が国における実際の臨床分離株でのデータは少ない . 本研究では2012年から2015年まで東京病院で呼吸器検体から検

56

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

研究課題

’16－19エンザ菌の莢膜血清型別が可能かどうかの検討を行っ

質量分析計を用いたインフルエンザ菌莢膜型別に関する研究佐藤

た . 方法としてエタノール・ギ酸抽出法にて質量スペクトルを得た Hib ６株 , Hie ６株 , Hif ６株 , NTHi ６株を

MALDI Biotyper（Bruker）の市販データベースに追加登録した . この home-brewed database を用いて , インフルエ守（千葉大学医学部附属病院・マススペクトロメト

ンザ菌全79株（Hib 22株 , Hie 10株 , Hif 11株 , NTHi 36株）を同定し莢膜型を決定し , 凝集法による莢膜型を対照とし感度 , 特異度を求めた . 検討した結果 , 検査対象株

リー検査診断学）

土田祥央（千葉大学医学部附属病院・マススペクトロメト

は全てインフルエンザ菌と同定された . 各株２回の測定における血清型別の感度 , 特異度の平均はそれぞれ Hibが100 ％ , 95. 5 ％ , Hie が100 ％ , 99. 1 ％ , Hif が95. 4 ％ ,リー検査診断学）

野村文夫（千葉大学医学部附属病院・マススペクトロメト
リー検査診断学）

100％ , NTHi が91. 6％ , 98. 8％であった . 本研究により ,MALDI-TOF MS は Hi の莢膜型別決定に有用であり , 凝集法に比べて簡便に莢膜型決定が可能であることを明ら

石和田稔彦

かにした .

（千葉大学真菌医学研究センター）

学会発表等

Identification of Haemophilus influenzae capsular
serotyping by use of matrix-associated laser
desorption isonization-time of flight mass
spectrometry１）竹内典子 , 石和田稔彦 , 大楠美佐子 , 瀬川俊介 , 村田

Mamoru Satoh, Sachio Tsuchida, Fumio Nomura

２）Takeuchi N, Segawa S, Ishiwada N, Ohkusu M,（Division of Clinical Mass Spectrometry, Chiba

University Hospital）

Naruhiko Ishiwada（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
インフルエンザ菌はａ〜ｆの莢膜血清型と無莢膜株

正太 , 土田祥央 , 佐藤

守 , 野村文夫 . 質量分析計（MALDI-TOF-MS）を用いた Haemophilus influenzae の
莢膜型決定法の検討 . 第28回日本臨床微生物学会総会・学術集会 2017年１月22日 長崎 .

Tsuchida S, Satoh M, Matsushita K, Nomura F.
Capsular serotyping of Haemophilus influenzae by using

matrix-associated laser desorption ionization-time offlight mass spectrometry. J Infect Chemother. 2018
Mar 10. pii: S1341-321X（18）30062-X. doi: 10.1016/
j.jiac.2018.02.007.

（NTHi）に分類される . 小児へのインフルエンザ菌ｂ型（Hib）ワクチン普及後 , 本邦でも Hib 侵襲性感染症は激減した . 一方で , 相対的に NTHi による侵襲感染症が増加し , ｅ型（Hie）やｆ型（Hif ）による侵襲性感染症も認められるようになってきている . また , インフ

ルエンザ菌は鼻咽腔に常在し , その多くは NTHi であると考えられているが , 非侵襲性感染症において , 血清型

解析はほとんど実施されていない . 血清型分布を確実に把握することはインフルエンザ菌による感染症の動向

および病原性を把握する上で極めて重要であるが , 従来の凝集法や PCR 法による解析法は煩雑で時間も要す

る . そこで我々は MALDI-TOF MS を利用し , インフル

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

57

研究課題

’16－20莢膜株と比較し , 特徴は認められなかったが , 莢膜株が侵襲性感染症由来インフルエンザ菌の病原因子に関する研究保有する特異的な塩基配列である IS1016を10. 7％の株が保有していた . MLST 解析において28株中26株が異なる

ST 型を示した . 本研究により , 国内で分離される侵襲性感染症由来 , インフルエンザ菌無莢膜株は多様性に富む

西順一郎

ことを明らかにした . Hib ワクチン普及後 , 日本における（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科）

侵襲性インフルエンザ菌感染症の原因菌の主体は無莢膜

藺牟田直子株に変化しており , 今後もその病原性解析を進めていく（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科）

必要がある .

徳田浩一
（鹿児島大学病院 感染制御部門）

菱木はるか（千葉大学大学院医学研究院小児病態学）

石和田稔彦（千葉大学真菌医学研究センター）

学会発表等
１）Naruhiko Ishiwada: Clinical and bacteriological analysis of
non-typeable Haemophilus influenzae isolated from bloodin pediatric patients. US-Japan ARI panel meeting 13rd
Jan 2016 Washington DC, USA.

Pathogenesis of Haemophilus influenzae isolated

from patients with invasive disease２）内藤幸子 , 石和田稔彦 , 菱木はるか , 竹内典子 , 大楠
美佐子 , 西順一郎 , 藺牟田直子 , 佐々木裕子 , 下条直
樹：小児侵襲性感染症由来インフルエンザ菌無莢膜株に関する細菌学的検討 . 第120回日本小児科学会学

Junichiro Nishi（Kagoshima University Graduate School of Medical and

Dental Sciences）

Naoko Imuta（Kagoshima University Graduate School of Medical and

Dental Sciences）

術講演会 2018年４月14日 東京 .

３）Naito S, Takeuchi N, Ohkusu M, Takahashi-Nakaguchi

A, Takahashi H, Imuta N, Nishi J, Shibayama K,
Matsuoka M, Sasaki Y, Ishiwada N. Clinical andbacteriologic analysis of nontypeable Haemophilus

influenzae strains isolated from children with invasive

diseases, Japan, 2008-2015. J Clin Microbiol 2018 May 2.

Koichi Tokuda（Kagoshima University Hospital）

pii: JCM.00141-18. doi: 10.1128/JCM.00141-18.

Haruka Hishiki（Chiba University Graduate School of Medicine）

Naruhiko Ishiwada（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
インフルエンザ菌ｂ型（Hib）ワクチン導入後に発症した小児侵襲性感染症の血液・髄液等無菌部位から分離されたインフルエンザ菌28株に関して病原因子の解析を行った . 血清型に関しては , 全株 , PCR 法で無莢膜株と同定された . 生物型はⅡ型とⅢ型が多かった . 薬剤感受性に関しては , 19株にペニシリン結合蛋白に変異を認め ,うち２株は β ラクタマーゼ産生アモキシシリン／クラブ

ラン酸耐性株であった . 接着因子の有無 , バイオフィル

ム産生能に関しては , 呼吸器由来のインフルエンザ菌無

58

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

研究課題

’16－21

新規抗真菌剤の合成および活性評価研究椎名勇（東京理科大学理学部第一部応用化学科）

亀井克彦

発表論文
１）Takayuki Tonoi, Ryo Kawahara, Takehiko Inohana
and Isamu Shiina: Enantioselective total synthesis ofnaturally occurring eushearilide and evaluation of its
antifungal activity: The Journal of Antibiotics 69, 697-701（September 2016）（doi:10.1038/ja.2015.146）.

研究課題（千葉大学真菌医学研究センター）’16－22

石和田稔彦（千葉大学真菌医学研究センター）

Enantioselective synthesis of new antibacterial andantifungal agents and evaluation of its activity
Isamu Shiina（Department of Applied Chemistry, Faculty of Science,

Tokyo University of Science）

Katsuhiko Kamei

Molecular biological analysis of Cryptococcus andCandida species from selected Counties in Kenya
Christine Bii（KEMRI, Center for Microbiology Research）

Olga Mashedi（KEMRI, Center for Microbiology Research）

Abdi Mohamed（KEMRI, Center for Microbiology Research）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Tohru Gonoi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Takashi Yaguchi

Naruhiko Ishiwada
研究成果

東京理科大学理学部応用化学科 椎名研究室（以下 , 椎名研）にて , 2006年に Eupenicillium shearii より単離・構造決定されたユーシェアリライド天然物（24員環マクロライド）の全合成方法を確立した . また , 独自の不斉合成技術によりユーシェアリライド類縁体（光学異性体およびジアステレオマー）のライブラリーを構築している .

平成28年度の共同研究では , カンジダやクリプトコッカ（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
ケニア国内で採集した穀物試料（トオモロコシ , 小麦 ,

コメ , 稗）の50％以上が , アフラトキシン , デオキシニバ

レノール , オクラトキシン , フモニシンなどの何らかのカビ毒により高度に（西洋諸国 , 日本の基準値を超えて）汚染されていることが判明した . また２種以上のカビ毒に同時に汚染されている試料も多数見つかった . さらにスなどの真菌と MRSA などの多剤耐性グラム陽性菌に対研究を進めると , 現地で冠婚葬祭に頻繁に用いられる地止効果試験を実施したが , 天然物よりも抗真菌活性と抗乳もアフラトキシン M1に西洋諸国の基準値を超えて汚とが出来た .

文として発表するとともに , 現地の新聞 , インターネッ

するユーシェアリライド立体異性体（８種類）の発育阻
細菌活性ともに高い立体異性体があることを確認するこ

ビールも高濃度のアフラトキシン（B1, G1）に , また牛染されていることが判明した . これらの結果は , 学術論

また , 母骨格である炭素骨格の不飽和度や官能基の異ト・ホームページを通じて公表し , 現地の人々に対し注施した . その結果 , 特に官能基について明瞭な構造活性

また , ケニアに滞在する米国人医師と協力し , ケニ

なるユーシェアリライド類縁体の発育阻止効果試験を実相関が確認され , 標的に対するユーシェアリライド類縁体の作用部位について示唆を得た .

意を喚起した .

アのエイズ患者に感染し , 直接の死因となる真菌クリ

プトコッカス属菌について研究・解析した . MultiLocus

Sequence Typing と呼ばれる分子系統学手法を用いて解析したところ , 行き来の無い遠方に住む患者にも分子系統

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻201759

学的に同種・同型の菌が感染していることが明らかとな
り , ヒトに感染し易い菌の種類がいることが示唆された .

さらに , これらの研究過程で , 新種の黒色アスペルギ

行った .

その結果 , Aspergillus niger に対して抗真菌活性（MIC,

4 µg/mL）を 示 す 新 規 環 状 ヘ プ タペ プ チド Stylissamide

ルス属菌４種を発見し , 論文を作成している . また , 関連

Ⅰ をStylissa 属 の 海 綿 か ら 単 離 , 構 造 決 定 し た . ま た ,日本国内で分子生物学的 , 生理・生化学的 , 形態学的解

対して抗真菌活性（MIC, 16 µg/mL, 16 µg/mL, and 2 µg/

ヒト病原真菌（アスペルギルス属菌等糸状菌）について ,析を進め , 病原因子 , 病原因子発現機構 , 薬剤耐性機構に関する発見を行った .

発表論文
１）Gla dys Langat, Tetsuhiro Matsusawa, Tohru Gonoi,
V ivienne Matiru, Christine Bii. Aflatoxin M 1
Contamination of Milk and Its Products in Bomet County,
Kenya. Advance in Microbibology, Vol.6: 528-536（2016）.

研究課題’16－23Aspergillus niger, Candida albicans, Cryptococcus neoformans にmL, respectively）を示す新規マンザミンアルカロイド

Zamamidine D を Amphimedon 属の海綿から単離 , 構造決定

した . 今後も , 深在性真菌症の原因真菌に対して抗真菌活性を示す新たな天然物の探索を継続して行う予定である .

発表論文
１）Kubota T, Nakamura K, Kurimoto S, Sakai K, Fromont
J, Gonoi T, Kobayashi J: Stylissamide I, a new cyclic
heptapeptide from an Okinawan marine sponge Stylissa sp.
Heterocycles. 95, 799-806, 2017.

未利用微生物を素材とした深在性真菌症治療
薬シード化合物の探索

２）Kubota T, Nakamura K, Kurimoto S, Sakai K, Fromont

J, Gonoi T, Kobayashi J: Zamamidine D, a manzamine
alkaloid from an Okinawan Amphimedon sp. marine

sponge. J Nat Prod. 80: 1196-1199, 2017.

久保田高明（昭和薬科大学）

五ノ井透（千葉大学真菌医学研究センター）

The search for seed compounds of antifungal
drugs for deep-seated mycosis from unutilized
microorganisms.
Takaaki Kubota（Showa Pharmaceutical University）

Tohru Gonoi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
海綿動物からは多くの生物活性天然物が単離 , 構造決

定されており , それらをもとに新たな医薬品が開発されている . 近年 , メタゲノム解析により , これら生物活性天

然物の真の生産者は海綿動物に共生する難培養性微生物であることが明らかになってきた . 今回 , 沖縄で採取した数種の海綿動物を対象に , 深在性真菌症の原因真菌に対して抗真菌活性を示す新たな生物活性天然物の探索を

60

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

研究課題

’16－24スに対する A. fumigatus の病原性を抑制するそれぞれ４本

ヒト病原性真菌に対する植物病原菌マイコウ
イルスタンパク質の生育阻害効果の解析とその医療素材としての開発

出し , 新規抗真菌薬としての応用を目指して研究を行ってきた . ウイルスフリーの A. fumigatus（KU 株）にウイル

スゲノムの ORF をそれぞれ強制発現させた株 , protoplast

fusion 法によりウイルスを導入した株それぞれにおいて ,森山裕充

宿主の形態 , 生育速度 , ストレス耐性 , および二次代謝（東京農工大学大学院農学研究院）

五ノ井透・川本

鎖 , ５本鎖 dsRNA ゲノムをもつマイコウイルス２種を見産物生産能などの表現型を比較した . その結果 , ４本鎖進dsRNA マイコウイルスの ORFc, ５本鎖 dsRNA マイコウ

（千葉大学真菌医学研究センター）

イルスの ORFb, c の強制発現株で糸状菌生育抑制が観察

Evaluation of anti-fungal proteins of
mycoviruses infecting in plant pathogenic fungiand development of effective proteins derived
from the mycoviruses
Hiromitsu Moriyama（Graduate School of Agriculture, Tokyo University ofAgriculture and Technology）

Susumu Kawamoto, Tohru Gonoi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
我々はイネいもち病菌に感染するマイコウイルス

Magnaporthe oryzae chrysovirus, MoCV1-A が 宿 主 菌 に 対して , 菌糸生育抑制 , 異常な色素沈着や分生子形成抑制などの生育阻害現象をもたらすことを見出しており ,MoCV1-A ウイルスの遺伝子がコードするタンパク質のうち , パン酵母 Saccharomyces cerevisiae の遺伝子発現系の利用により ORF4が抗菌性タンパク質をコードすることを明らかにしてきた . MoCV1-A の ORF4タンパク質の部分された . さらに , これらの株を用いてマウス感染実験を行い , 肺の CFU を比較した . ４本鎖 dsRNA マイコウイル

スの ORFc 強制発現株 , ウイルス導入株 , ５本鎖 dsRNA
マイコウイルスの ORFb, d, e 強制発現株で他の株よりコロニー数が減少する傾向が見られ , これらの遺伝子が A.

fumigatus の病原性を抑制していることが示唆された . ま
たイネいもち病菌マイコウイルス MoCV1-A の ORF4をウイルスフリーの A. fumigatus（KU 株）に発現させた場

合においても糸状菌生育抑制が観察された .

学会発表
１）Hiromitsu Moriyama 1, Syun-Ichi Urayama 1, 2, Yuri
Kimura1, Toshiyuki Fukuhara1, Akio Toh-e3, Susumu
Kawamoto3
Functional analyses of novel proteins of mycoviruses

infecting phytopathogenic fungi using heterologous
expression system in Saccharomyces cerevisiae

１. Graduate School of Agriculture, Tokyo University ofAgriculture and Technology, Research and Development
Center for Marine Biosciences, ２. Japan Agency for

Marine-Earth Science and Technology（JAMSTEC）,

領域をパン酵母に発現させることで , 抗菌活性領域を調

３. Division of Molecular Biology, Medical Mycology

高い , 中央部の領域（SUa 領域）に活性があることが確

ICY2016: 14th International Congress on Yeasts. 平成29

査したところ , MoCV1-A の近縁ウイルス間で保存性の認された . これまでにピキア酵母を利用した発現系を検討してきたが , 本研究においては , タンパク質発現量多Research Center, Chiba University.

年９月12日〜15日 淡路国際夢舞台会議場（兵庫県淡路島市）

い大腸菌を利用して SUa の生産を試みた . その結果 , 不２）森山裕充 酵母異種発現系によるマイコウイルスタ

産生が確認された . 今後 , 可溶化タグなどを付加する事

成28年11月４日（金） 会場：産総研：臨海副都心セ

溶性画分ではあるが , 高い産生効率で SUa タンパク質のにより , 可溶性画分における調製方法を確立していく .

病原真菌 Aspergillus fumigatus はアスペルギルス症の主な原因菌である . 五ノ井教授の研究グループにより , マウ

千葉大学

ンパク質の機能探索 新産業酵母研究会 日時：平ンター３）宍戸絵里香 1, 高橋 梓 2, 酒井香奈江 3, 萩原大祐 2, 森
山裕充 3, 五ノ井透 2 病原真菌 Aspergillus fumigatus を

真菌医学研究センター報告

第 21 巻201761

弱毒化するマイコウイルス遺伝子の発現量と機能解析 （１. 千葉大 ･ 医学薬学府 , ２. 千葉大 ･ 真菌センター, ３. 農工大） 平成28年11月17日−18日（金）場所：宇治おうばくプラザ

研究課題’16－25体末端を伸長する酵素であるテロメラーゼの触媒サブユ

ニット CnEST2の欠損細胞が , 一倍体で致死性を示すこと
損は直ちには致死とはならないことから , この違いが C.

neoformans 特異的な治療戦略として利用できる可能性が考えられる .

そこで , 既知のヒトテロメラーゼ阻害剤を増殖中の C.

neoformans に投与したところ , CnEST2遺伝子のコピー数と相関して増殖の低下がみられることが明らかになった .

彰・久保田俊介

さらに , 薬剤添加時の遺伝子発現変化を RNA-Seq によ（千葉大学大学院融合科学研究科）

亀井克彦・川本

学的手法を用いて解析をしており , 我々が同定した染色を見出した . 他の多くの生物種では , テロメラーゼの欠Cryptococcus neoformans の感染サイクルにおけるゲノム再編成の分子機構とそれを標的とした新規治療戦略の開発に向けて
松浦

る C. neoformans 特有の現象を主として遺伝学的 , 分子生物進・東江昭夫・高橋弘喜（千葉大学真菌医学研究センター）

り調べたところ , テロメラーゼ阻害と増殖抑制とを繋ぐ ,未知の経路の存在が示唆された .

今後は , テロメラーゼ阻害により引き起こされる C.

Towards development of novel therapeuticstrategies targeting the mechanism of specificgenome rearrangement during infection cycle of
Cryptococcus neoformans

neoformans 特有の増殖阻害現象のメカニズムの分子機構 ,その感染サイクルにおける生理的意義を解析しつつ , C.
neoformans テロメラーゼ活性をより特異的に阻害する化合物の探索を行う予定である .

学会発表

Akira Matsuura, Shunsuke Kubota（Graduate School of Advanced Integration Science,

Chiba University）

Katsuhiko Kamei, Susumu Kawamoto, Akio Toh-e,
Hiroki Takahashi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
Cryptococcus neoformans は環境に常在する担子菌酵母で１）久保田俊介 , 高田実里 , 今成百合子 , 東江昭夫 , 高橋

弘喜 , 川本 進 , 亀井克彦 , 松浦 彰 . C. neofoemans
におけるテロメア維持機構の解析

２）Shunsuke Kubota, Hideki Takahashi, and Akira Matsuura.

Unique response to telomerase inhibition in the humanpathogenic fungus Cryptococcus neoformans. The Second
Symposium of Chiral Materials Science, Chiba, March2017

あり , 主に免疫機能の低下した人に感染し重篤なクリプ

トコックス症を引き起こす日和見感染真菌として知られている . 本菌は , 環状プラスミドが維持できない , 遺伝子ターゲティングの効率が悪く , 導入された直鎖状DNA 断片の末端に高頻度でテロメア反復配列が付加される , など DNA 修復に関連するユニークな性質をもつこ. 本研究では , C.とが明らかにされている（Edman, 1992）
neoformans 染色体末端近傍でのゲノム変化に注目し , テロ

メア末端および DNA 損傷末端で作用する分子の機能とゲノム変化 , 感染サイクルとの関連を明らかにするとともに , それを標的とした新規治療戦略の開発を目指す .

これまでに , DNA 末端を維持・修復する過程に関す

62

千葉大学

酵母遺伝学

フォーラム第49回大会 , 神戸 , 2016年９月

真菌医学研究センター報告

第 21 巻

2017

研究課題

’16－26感受性はコントロール株に比べ８〜512倍低く , 上記17

臨床検体から分離されたテルビナフィン低感
受性（耐性）白癬菌株における耐性化メカニ
ズムの解明に向けた遺伝子工学的アプローチ
の導入
山田

剛

（帝京大学医真菌研究センター）

白癬菌株の TBF 感受性低下の主原因がSQLE 遺伝子内のSNP であることが判明した .

発表論文
１）Yamada T, Maeda M, Alshahni MM, Tanaka R, Yaguchi
T, Bontems O, Karine Salamin K, Fratti M, Monod
M.: Terbinafine resistance of Trichophyton clinical isolatescaused by specific point mutations in the squalene epoxidase

矢口貴志

gene. Antimicrob Agents Chemother, doi:10. 1128/（千葉大学真菌医学研究センター）

AAC.00115-17, 2017.

田中玲子（千葉大学真菌医学研究センター）

研究課題

Terbinafine resistance of Trichophyton clinicalisolates caused by specific point mutations in thesqualene epoxidase gene

薬剤耐性および感受性Aspergillus fumigatus
株の代謝産物のメタボローム解析

Tsuyoshi Yamada

細江智夫

Takashi Yaguchi

武田

Reiko Tanaka

若菜大悟（Teikyo University Institute of Medical Mycology）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果’16－27（星薬科大学 薬化学教室）

尚（星薬科大学 薬化学教室）（星薬科大学 薬化学教室）

矢口貴志（千葉大学真菌医学研究センター）

世界各地の臨床現場で白癬の治療に使用されている
テルビナフィン（TBF）は耐性株の分離に関する報告が少ない . 申請者らとスイス・ローザンヌにある Centre

Hospitalier Universitaire vaudois（CHUV）の共同研究グルー

Metabolomics between drug-resistance anddrug-sensitive Aspergillus fumigatus

プは , 2013年〜2016年にかけて CHUV を拠点に収集した

Tomoo Hosoe

含むサブローデキストロース寒天培地を用いた簡易培養

Hisashi Takeda

臨床分離白癬菌2, 056株を対象に , TBF（0. 2 µg/ml）を試験を行い , 約１％にあたる17株の培養陽性株を見出し（Department of Organic chemistry, Hoshi University）（Department of Organic chemistry, Hoshi University）

た . これらの TBF 低感受性株について , 薬剤の作用標的

Daigo Wakana

伝子の塩基配列を解析したところ , ORF 内にアミノ酸のTakashi Yaguchi

であるスクワレンエポキシダーゼをコードする SQLE 遺置換を生じる幾つかの点変異（SNP）が認められた . そこで TBF に感受性の白癬菌 Arthroderma vanbreuseghemii の（Department of Organic chemistry, Hoshi University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

遺伝子操作を行い , 内在性のSQLE 遺伝子に同様の SNP

研究成果

た SQLE 変異株の TBF 感受性を解析した結果 , 変異株のス症の主たる原因菌である . その治療薬にはアゾール系 ,を導入した変異株を作出した . CLSI 法を用いて , 作出し千葉大学

Aspergillus fumigatus は深在性真菌症であるアスペルギル

真菌医学研究センター報告

第 21 巻201763

キャンディン系 , ポリエン系抗菌薬などが存在する . 近

スコアプロットから耐性株群と感受性株群の２群が観測

薬剤耐性を示す A. fumigatus が発生し , 原因菌の薬剤耐性

トから , 感受性株には共通して6. 6−7 .0 ppm を示す芳香成分の観点から AMPH 耐性及び感受性株の違いを見出は1 .5−5 .1 ppm を示す多数の物質の存在が示唆された .

いて網羅的に解析可能なメタボロミクスの手法を用い ,族化合物の存在が示唆されたが , 化学シフト値から25 ℃

千葉大学真菌医学研究センターよりご供与いただいた

なった . 一方 , 耐性株は2 .4−3 .7 ppm 及び4 .0−4 .6 ppm に

年 , 深在性真菌症治療薬 amphotericin B（AMPH）に対し ,に応じた治療薬の選択が重要となっている . 我々は化学すことが可能ではないかと考え , 各菌株の代謝産物につ両者の分類を検討した .

AMPH 耐性及び感受性 A. fumigatus 株を PDB 培地を用い ,25 ℃（自然条件下）及び37 ℃（５％ CO2 条件下）の異なる２種の条件での培養を行い , 各菌株の代謝産物の1

H-NMR スペクトルデータを用いてメタボローム解析を行った . その結果 , 両培養条件において OPLS-DA 解析の

64

千葉大学

された . 25 ℃（自然条件下）培養時のローディングプロッ

族化合物が存在することが示唆された . また , 耐性株に37℃（５％ CO2 条件下）での培養では , 感受性株は芳香培養時とは異なる物質が産生されていることが明らかとピークを持つ物質が存在し , 有機酸やアミノ酸が多く存
在することが明らかとなった .

以上の結果から , 耐性株群と感受性株群は産生成分が異なることが明らかとなったため , 今後はより詳細な解析を行い , 両者を分類する成分の特定を試みる予定である .

真菌医学研究センター報告

第 21 巻2017