染色プロトコル
Ueda, 1995 JulyX-gal 染色法（embryo) v2.0
準備

①採卵②固定液作成：
1% glutaraldehyde in 0.1M Cacodylate buffer (pH7.3)*1
500ml/tube
heptane
500ml/tube
glutaraldehydeとheptaneを混ぜた後、激しくふって飽和させる

コリオン膜除去（以下の操作は断らない限り室温で行う）
2.5% 次亜塩素酸ソーダ 2min→染色壷中で↓ナイロンメッシュにあけて水道水で水洗↓
ティッシュで余分な水気を切り、メッシュを鋏でカットして三角にする↓
固定
heptaneで卵をEPチューブに流し込む
30min→duck roterで撹拌↓
卵黄膜除去
heptaneと一緒に卵をホールスライドに移す
heptaneを捨て（ついてきた固定液も）、残りも息をかけて揮発させる
乾燥しないようにすみやかにPBT (0.3% Ttiton-X in PBS*2) を加える
卵黄膜をピンセットとタングステン針ではぐ（1hr 以内、時間とともに剥がれにくくなる）
embryoをPBTとともにEPチューブに移す↓PBTで洗う
液を捨て、新しいPBTを500ml加える→duck roterで撹拌
3〜4回繰り返す 各10 min↓
染色37℃に温めた staining solution*3 1ml にX-gal（ 8% in DMSO, -20℃ 保存）を 25ml 加える
16,000rpm で 20mim 遠心して結晶を取り除く
各チューブに200mlの上清を使い embryo を染色する (37℃ 2hr ˜ over night)
適当なところで液をPBTに交換し、反応を止める↓
脱水と封入
EtOHシリーズで脱水
20%、40%、70%、90%、100%EtOH（2回）、500ml各10min
Xylene、2回、各10min
カバーグラスにBioliteを1滴、滴下し、microdispencerでembryoを中に流し込み、カバーグラスをかけて封入する-1-溶液の組成*10.1M Cacodylate buffer (pH7.3)
1.07g Na-Cacodylate
25ml
D.D.water↓←35ml conc HCl
50mlにメスアップ

*2PBS

*3

staining solution (pH7.2)
150mM NaCl
7mM Na2HPO4 2H2O
3mM NaH2PO4 H2O
1.0mM MgCl2 H2O
3.1mM K4〔Fe(CN)6〕
3.1mM K3〔Fe(CN)6〕
0.3% Triton X-100

130mM NaCl
7mM Na2HPO4 2H2O
3mM NaH2PO4 H2O-2-胚の抗体染色法

v4.0 (931119)

MAb22C10
ABC kit Eliteを使用
準備①採卵②固定液作成： 4% paraformaldehyde in 0.1M PBS(PBS)
500ml/tube
heptane
500ml/tube
4% paraformaldehydeは65℃で2ml/mlの1N NaOHを加え溶かす
paraformaldehydeとheptanを混ぜた後、激しくふって飽和させる

コリオン膜除去（以下の操作は断らない限り室温で行う）
2.5% 次亜塩素酸ソーダ 2min→染色壷中で↓ナイロンメッシュにあけて水道水で水洗↓
ティッシュで余分な水気を切り、メッシュを鋏でカットして三角にする↓
固定
heptaneで卵をEPチューブに流し込む
30min→duck roterで撹拌
↓
卵黄膜除去
固定液（下層）を捨てる
100% MetOHを600ml加え振る 2〜3sec→voltexで激しく！
下に沈んだembryoを少量のMetOHとともに新しいEPチューブに移す↓
MetOHで洗う→MetOHを捨て、新しいMetOH 500mlを加る↓
PBTで洗うMetOHを捨て、PBT(0.3% Triton-X in PBS)を200ml加える→duck roterで撹拌
3〜4回繰り返す 各10 min↓blocking
10% FBS, PBT 100ml 15 min→duck roterで撹拌
↓１次抗体処理各チューブに5mlのa b-gal mAbを加える（希釈率 1:500）
1 hr （あるいは4℃ over night）→duck roterで撹拌
↓PBTで洗う１次抗体溶液を回収し（4℃保存、数回使用）PBTを200ml加える
3〜4回繰り返す 各10 min→duck roterで撹拌
↓blocking
blocking serum（黄ラベル）をEPチューブに1滴とり、サンプル数 x 1.5ml を
サンプル数 x 100ml のPBTに加えまぜる（残りは4℃保存）-3-

15 min→duck roterで撹拌
↓２次抗体処理anti mouse IgG（青ラベル）をEPチューブに1滴とり、上記サンプルに 0.5ml を加えまぜる（各サンプルよりblocking液を集め IgGを加えた後、再分配）（残りは4℃保存）
1 hr→duck roterで撹拌
↓PBTで洗う、およびABC reagentの準備（下項参照）
２次抗体溶液を回収し（4℃保存、数回使用）、PBTを200ml加える
3〜4回繰り返す 各10 min↓
ABC reagent 処理
reagent A
20ml
reagent B
20ml
PBT
1ml
混合（注 使用30分前につくる、100ml／各チューブ）
30min→duck roterで撹拌
↓PBTで洗う溶液を捨てPBTを200ml加える
3〜4回繰り返す 各10 min→duck roterで撹拌
↓発色（溶液は翌日も使用可）
0.02% H2O2
1.5ml（H2O 1.5ml + conc H2O2 1ml）
0.1%DAB in 0.1M Tris buffer (pH7.2)
1.5ml
混合
ホールスライドにサンプルを取り、PBTを捨てる
DAB溶液を200mlぐらい加え発色させる
適当なところで液をPBTに交換し、反応を止める↓
脱水と封入
EtOHシリーズで脱水
20%、40%、70%、90%、100%EtOH（2回）、500ml各10min
Xylene、2回、各10min
カバーグラスにBioliteを1滴、滴下し、microdispencerでembryoを中に流し込み、カバーグラスをかけて封入する

（注）
１）固定液
4% paraformaldehydeはneuronのcell bodyを良く染める。1% glutaraldehyde (cacodylate buffer) はそれに比べて繊維を強く染める。glutaraldehydeはhand peelでもMetOHでも染色性は変わらない。

-4-

成虫原基におけるb-galactosidaseの抗体染色法
ABC kit Eliteを使用

v.2

0.1M PBS(PBS)で幼虫、蛹を洗う↓
解剖 2ml PBS/Falcon 1008 dish＠幼虫を裏返しにしたままだと、discの裏側（基部）が染色されないので、できるだけばらばらにした方がよい↓
固定 Nunc ４well dishに移す
4% paraformaldehyde in 0.1M PIPES, 2mM MgSO4, 1mM EDTA 500ml/well 30min＠paraformaldehydeは65℃で2ml/mlの1N NaOHを加え溶かす↓
wash
固定液を捨てPBT(0.1% Triton-X in PBS)を500ml加える
数回繰り返す total 30min↓
EP tubeに移す（2mlのEP tubeの下を切ったもの）
blocking
10% FBS in PBT 100ml 15min↓
１次抗体
1:200 anti b-galactosidase Ab in blocking solution 100ml 室温 1hr（あるいは、blocking液を別のEP tubeに取り、Ab を 0.5ml 加え、撹拌後戻す）↓
wash
溶液を回収し、PBTを100ml加える
数回繰り返す total 30min↓
blocking
blocking serum ストック（黄ラベル）
1.5ml
PBS
100ml15min↓
２次抗体
anti mouse IgG（青ラベル）を0.5ml 加える（blocking液を別のEP tubeに取り、Ab を 0.5ml 加え、撹拌後戻す）
1hr↓
wash
溶液を回収し4℃にストック。PBSを100ml加える
数回繰り返す total 30min↓-5-ABC reagent 処理
reagent A
reagent B

2ml2mlPBS
100ml（注 使用前30分につくる）
30min
↓wash
溶液を捨てPBSを100ml加える
数回繰り返す total 30min↓発色0.02% H2O2 （H2O 1.5ml + conc H2O2 1ml) 50ml
0.1%DAB in 0.1M Tris buffer (pH7.2)
50ml-6-