土壌 DNA 抽出キット

ISOIL for Beads Beating
マニュアル（第 3 版）

Code No.319-06201

NIPPON GENE CO., LTD.

ISOIL for Beads Beating マニュアル（第 3 版）
0408MO:1805

目 次Ⅰ

製品説明

1Ⅱキット内容

1

Ⅲ保存

2

Ⅳ使用上の注意

2

Ⅴプロトコル

2

Ⅵ＜本品以外に必要な試薬、機器など＞

2＜標準プロトコル＞

3＜最大収量を得るためのプロトコル＞

4
5

データ集
１．各種土壌サンプルからの DNA 抽出

5２．土壌 DNA の吸収スペクトル

5

３．PCR による系統群の検出

6４．土壌 DNA の制限酵素消化6５．Beads Beating 後の 65℃でのインキュベート時間と土壌 DNA の収量

7６．土壌 DNA の PCR-DGGE 解析

7

Ⅶトラブルシューティング

8

Ⅷ

関連製品

10

ISOIL for Beads Beating マニュアル（第 3 版）
0408MO:1805

Ⅰ 製品説明ISOIL for Beads Beating は土壌サンプルから DNA を抽出するためのキットです。
特別な組成の抽出液により、非火山灰土壌はもちろん、これまで困難とされてきた火山灰土壌からも DNA の抽出が可能です。
ISOIL for Beads Beating は DNA の抽出方法として界面活性剤による化学的な溶菌と Beads
Beating による物理的な菌体破砕の併用を採用しています。これによって、強固な細胞壁を持つ微生物からも DNA を抽出することができ、実際の土壌微生物群集構造を反映した土壌DNA を得ることができます。したがって、抽出した土壌 DNA は PCR-DGGE 解析等を用いた土壌微生物の群集構造解析や土壌診断、土壌 DNA の定量による土壌バイオマスの推定等に適しています。
ただし、ISOIL for Beads Beating で抽出した DNA は Beads Beating によって物理的せん断を受けている可能性がありますので、あらかじめご了承ください。
土壌 DNA を遺伝子資源として利用したい場合等、高分子土壌 DNA の抽出が必要な場合には ISOIL をご使用ください。

Ⅱ キット内容Beads Tube

50 本

Lysis Solution BB

50 ml × 1 本

Lysis Solution 20S＊

1.25 ml × 2 本＊Purification Solution

20 ml × 1 本

Precipitation Solution

40 ml × 1 本

Wash Solution

50 ml × 1 本TE（pH8.0）

5 ml × 1 本

Ethachinmate

100μl × 1 本

マニュアル

1部

＊ Lysis Solution 20S および Purification Solution 中に結晶が析出する場合がありますが、品質、性能に問題はありません。このような場合には、容器ごと 65℃程度でインキュベートし（ときおり混和する）、結晶を完全に溶解させてからご使用ください。

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ISOIL for Beads Beating マニュアル（第 3 版）
0408MO:1805

Ⅲ 保存
ISOIL for Beads Beating に含まれる試薬はすべて室温保存が可能です。
ただし、Precipitation Solution、Wash Solution、Ethachinmate については、使用時のコンタミネーション（カビや雑菌等の混入）に十分注意し、開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。

Ⅳ 使用上の注意
・

本品は試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。

・

試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないでください。

・

本品のお取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行ってください。

・

マニュアル記載内容と異なったお取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。

・

本品は、東京大学 TLO が所有する特許のライセンスを受けて製造販売しております。

Ⅴ プロトコル＜本品以外に必要な試薬、機器など＞
・ビーズ式破砕装置（2 ml チューブ対応のもの）
・70%エタノール
・クロロホルム・マイクロピペット
・ピペットチップ・2 ml マイクロチューブ
・インキュベーター
・マイクロ遠心機
・ボルテックスミキサー-2ISOIL for Beads Beating マニュアル（第 3 版）
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＜標準プロトコル＞①

0.5 g の土壌サンプルを Beads Tube に入れる。

②

950μl の Lysis Solution BB と 50μl の Lysis Solution 20S を添加する（注１）。

③

Beads Beat（4～6 m / 秒間または 4,200～6,800 rpm で 30～45 秒間）する（注２）。

④

遠心（12,000 × g , 1 分間 , 室温）する。

⑤

上清 600μl を新しいチューブに移し、400μl の Purification Solution を添加し、十分に混合する。

⑥

600μl のクロロホルムを添加し、15 秒間ボルテックスした後、遠心（12,000×g, 15 分間,室温）する。

⑦

中間層を入れないように注意しながら水層 800μl を新しいチューブに移し、800μl のPrecipitation Solution を添加して十分に混合し、遠心（20,000×g, 15 分間, 4℃）する（注３）。

⑧

上清を捨て、Wash Solution を 1ml 加えて数回転倒混和し、遠心（20,000×g, 10 分間, 4℃）する（注４）。

⑨

上清を捨て、1 ml の 70%エタノールと 2μl の Ethachinmate を加えてボルテックスした後、遠心（20,000×g, 5 分間, 4℃）する（注３）、（注５）。

⑩

上清を捨て、風乾した後、沈殿を 100μl の TE（pH8.0）に溶解する。

（注1） アロフェン質を非常に多く含む土壌から DNA を抽出する場合は、Lysis Solution BBの代わりに Lysis Solution BB SP1（別売り：Code No. 313-06221）を用いて抽出操作を行ってください。Lysis Solution BB SP1 はアロフェン質を非常に多く含む土壌からの DNA 抽出用に開発された ISOIL for Beads Beating 専用のオプション溶液です。
（注2） Beads Tube の蓋がしっかり閉まっていることを確認してください。蓋のゆるみはBeads Beating 中の液漏れの原因となります。
（注3） ご使用の遠心機の最大遠心力が 20,000×g よりも小さい場合は、遠心機の最大遠心力（だたし 12,000×g 以上）で遠心してください。
（注4） できるだけ上清を取り除いて下さい。上清に含まれる着色物質（腐植物質）は PCRを阻害することが知られています。また、腐植物質のコンタミネーションが少ない場合（クロロホルム処理後の水層の着色が少ない場合）は、⑧の操作を省略しても構いません。
（注5） 70%エタノールに Ethachinmate を加えることで、土壌 DNA を安定して回収することができます。ただし、Ethachinmate を添加しない場合は、ボルテックスを避け、転倒混和によって穏やかに沈殿を洗浄してください。
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＜最大収量を得るためのプロトコル＞
このプロトコルは、ISOIL for Beads Beating で最大収量を得るためのプロトコルです。土壌
DNA の定量による土壌バイオマスの推定等、土壌 DNA の抽出収量が重要な場合に行ってください。
①

0.5 g の土壌サンプルを Beads Tube に入れる。

②

あらかじめ 65℃に加温した 950μl の Lysis Solution BB と 50μl の Lysis Solution 20S を添加する。

③

Beads Beat（4～6 m / 秒間または 4,200～6,800 rpm で 30～45 秒間）した後、65℃で 30分～1 時間インキュベートする。

④

遠心（12,000×g, 1 分間, 室温）する。

⑤以下は標準プロトコル⑤～⑩に同じ。

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Ⅵ データ集

１．各種土壌サンプルからの DNA 抽出
本キットを用いて 3 種類の土壌から DNA 抽出を行った結果、いずれの土壌からも DNA を抽出することができた。
12

34
Lane 1. OneSTEP Marker 1（λ/ HindⅢ digest）
Lane 2. 東大弥生圃場対照区土壌（アロフェン質黒ボク土 / 火山灰土壌）
Lane 3. 埼玉農試畑土壌

（灰色低地土 / 非火山灰土壌）

Lane 4. 兵庫農試森林土壌（褐色森林土 / 非火山灰土壌）

0.5g の土壌から抽出した DNA の 1 / 20 量を 1% Agarose S で電気泳動した。

２．土壌 DNA の吸収スペクトル本キットを用いて抽出した東大弥生圃場対照区土壌の DNA と高純度に精製された Lambda
DNA（Code No.318-00414）の吸収スペクトルを比較した。
0.4
ISOIL for Beads Beating で抽出した土壌 DNA
0.3

Lambda DNAAbs

0.20.1

その結果、本キットで抽出0した土壌 DNA が高純度であることがわかった。

-0.1
220

240

260

280300

320

340

-5-

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Wavelength in nm３．PCR による系統群の検出
系統群検出用プライマーを用いて、本キットで抽出した土壌 DNA の PCR 解析を行った結果、様々な系統群由来の DNA 断片が検出された。
12345671234567123456

東大弥生圃場対照区土壌

埼玉農試畑土壌

兵庫農試森林土壌

アロフェン質黒ボク土

灰色低地土

褐色森林土

7

Lane 1. OneSTEP Ladder 100
Lane 2. Bacteria（723 bp）
Lane 3. Bacillus species and relatives（600 bp）
Lane 4. High-G+C gram-positive bacteria（542 bp）
Lane 5. Streptomyces species and related taxa（1,243 bp）
Lane 6. Fungi, protists, and green algae（555 bp）
Lane 7. Plants（597 bp）
PCR 産物の一部を 2% Agarose S で電気泳動。
プライマー参考文献：
Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Sporesin Soil.
Kuske CR, Banton KL, Adorada DL, Stark PC, Hill KK, Jackson PJ.
Appl Environ Microbiol. 1998 Jul 1;64(7):2463-72.

４．土壌 DNA の制限酵素消化
本キットで抽出した土壌 DNA を制限酵素 EcoRⅠで消化した。
1234567Lane 1. OneSTEP Marker 1（λ/ HindⅢ digest）
Lane 2. 東大弥生圃場対照区土壌 DNA intact
Lane 3. 東大弥生圃場対照区土壌 DNA / EcoRⅠ
Lane 4. 埼玉農試畑土壌 DNA intact
Lane 5. 埼玉農試畑土壌 DNA / EcoRⅠ
Lane 6. 兵庫農試森林土壌 DNA intact
Lane 7. 兵庫農試森林土壌 DNA / EcoRⅠ-6-

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５．Beads Beating 後の 65℃でのインキュベート時間と土壌 DNA の収量
Beads Beating 後の 65℃でのインキュベート時間と土壌 DNA の収量について検討した結果、65℃でインキュベートすることによって土壌 DNA の収量が増す場合があることがわかった。

12千葉農試森林土壌（アロフェン質黒ボク土壌）

収量（ μg-DNA/g-soil ）10埼玉農試畑土壌（灰色低地土）
兵庫農試森林土壌（褐色森林土）

86420015304560

インキュベート時間（分）６．土壌 DNA の PCR-DGGE 解析
本キットで抽出した土壌 DNA を用いて PCR-DGGE 解析を行った。
123456
Lane 1. 東大弥生圃場対照区土壌
Lane 2. 東大田無農場牧草地土壌
Lane 3. 千葉農試森林土壌
Lane 4. 草地試験場永年採草地土壌
Lane 5. 埼玉農試畑土壌
Lane 6. 兵庫農試森林土壌
データ提供：
東京大学大学院 農学生命科学研究科 応用生命化学専攻
頼泰樹 博士-7-

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Ⅶ トラブルシューティング

問題

考えられる原因考えられる対策
できるだけ新鮮な土壌を使用してください。ま土 壌 微 生 物 が 少 た、Beads Beating 後に 65℃で 30 分～1 時間インない。

キュベートすることで DNA 収量が増す場合があります（データ集 5 参照）。
プロトコルステップ⑨では DNA の沈殿が剥がれやすい状態になっています。70%エタノールと共DNA の沈殿が流 に付属の Ethachinmate を使用してください。ま土壌 DNA の収量が れている。

た、Ethachinmate により沈殿は可視化されますの少ない。

で、沈殿を流してしまわないように目で確認しながら注意深く上清を取り除いてください。
Lysis Solution BB の代わりに Lysis Solution BB
土壌中のアロフェン質が非常に多い。

SP1（別売り：Code No. 313-06221）を用いて抽出操作を行ってください。Lysis Solution BB SP1 はアロフェン質を非常に多く含む土壌からの DNA抽出用に開発された ISOIL for Beads Beating 専用のオプション溶液です。

Beads Beating の土壌 DNA の分子量 物 理 的 衝 撃 に よが小さい。

り DNA がせん断されている。

高分子土壌 DNA を抽出したい場合には界面活性剤下での加熱抽出法を採用している ISOIL を使用してください。

Lysis Solution 20S 低 温 に よ っ て 試 37～65℃程度でインキュベートし、結晶を完全に中に白い結晶が折 薬 が 析 出 し て い 溶解させてからご使用ください。品質、性能には出している。

る。

問題ありません。

Purification Solution 低 温 に よ っ て 試 37～65℃程度でインキュベートし、結晶を完全に中に白い結晶が析 薬 が 析 出 し て い 溶解させてからご使用ください。品質、性能には出している。

る。

問題ありません。
新しいキットをご購入ください。

Precipitation
Solution 中に浮遊物が見られる。

カビ等のコンタミが起きている。

本溶液はカビ等が繁殖しやすい溶液組成となっていますので、使用時のコンタミネーションには十分注意し、開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。

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問題考えられる原因考えられる対策
新しいキットをご購入ください。
ただし、腐植物質のコンタミネーションが少ない場合はプロトコルステップ⑧は省略しても構

Wash Solution 中に カ ビ 等 の コ ン タ
浮遊物が見られる。 ミが起きている。

いませんので、その場合には Wash Solution は必要ありません。
また、本溶液はカビ等が繁殖しやすい溶液組成となっていますので、使用時のコンタミネーシ
ョンには十分注意し、開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。
新しい Ethachinmate をご購入ください。
ただし、DNA の収量を特に気にしない場合にはEthachinmate 中 に カ ビ 等 の コ ン タ Ethachinmate は必要ありません。
浮遊物が見られる。 ミが起きている。 また、使用時のコンタミネーションには十分注意し、開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。
Beads Tube か ら
Lysis Solution が溢れる。

土壌の空隙体積が大きい。

土壌サンプルの使用量を 0.5g より減らしてください。

土壌は様々な鉱物、粘土などの無機物、様々な植物および植物遺体、腐植物質をはじめとする土壌有機物、そしてそこに生息する多様な微生物から成り立っています。そのため、一つとして同じ土壌はないと言えます。
本キットは現在までの試験の結果、日本の数十種類の様々なタイプの土壌から DNA が抽出できることを確認していますが、土壌は極めて多様なサンプルであることから、土壌の種類や状態によっては収量が上がらない可能性があります。
本キットで抽出した土壌 DNA の収量が少ない場合、試薬や操作上の問題だけでなく、土壌サンプルが他にはない特異な性質を有している可能性も考慮してください。

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Ⅷ 関連製品

コード No.

製品名

包装単位

316-06211

ISOIL

50 回用

313-06221

Lysis Solution BB SP1

50 ml

312-06791

ISOIL Large for Beads ver.2

8 回用

318-06271

ISOFECAL

50 回用

315-06281

ISOFECAL for Beads Beating

50 回用

312-01791

Ethachinmate

0.2 ml

310-05251

OneSTEP Marker 1（λ/ HindⅢ digest）

313-05241

OneSTEP Ladder 100（0.1-2.0 kbp）

312-01193

Agarose S

100 g

319-01201

Agarose H

10 g

318-03231

Gene Taq NT

1,500 μl
500 μl

250 units

マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課

TEL 076 - 451 - 6548
www.nippongene.com
お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております

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