GB1データを用いたNMR解析講習
Written by H. Kumeta 2024/2/27
last update 2024/4/2

目次
使用ソフトウェア
TopSpinSparkyNMRtist
使用データ
ダウンロード
データフォルダ
使用装置
主鎖帰属用
側鎖帰属／構造計算用
配列情報
手順
1. FT on TopSpin
2. Convert to Sparky format
3. Open spectra on Sparky4. Sparky workspace, Projects and Save directory
5. NMRtist input
6. Numbering on HN-HSQC peaks
7. First 3D spectrum, HNCO
8. CA naming, HN(CO)CA and HNCA
9. main-chain assignment, CBCA(CO)NH, HNCACB, C(CO)NH and N-NOESY
10. NMRtist output

1

使用ソフトウェア
TopSpin
TopSpin Academicで検索してダウンロードおよびインストール（Academic free）
Sparkyhttps://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/windows 版をダウンロードして使用するときには、日本語のフォルダ名が挟まらない場
所に置く。例えば、C:¥User¥久米田¥sparky はNG。
NMRtisthttps://nmrtist.org/
使用データ
ダウンロードhttp://protein.pharm.hokudai.ac.jp/~kumeta/2024_GB1/
240206_CN_GB1_main.tgz (605 MB)240206_CN_GB1_other.tgz (1.6 GB) - 今回の講習会では使わない
Sparky_GB1.tgz(438 MB)
Supplemental_PDF.tgz(1 MB)
tools.tgz(1 MB未満)Nhsqc_GB1_ass.save.tgz(1 MB未満) - 主鎖帰属完了Saveファイル
データフォルダ
240206_CN_GB1 - Bruker NMR data (NMR_work/demo の下に置く)
Sparky_GB1- Sparky data (ホームディレクトリの下に置く)
Supplemental_PDF
ChsqcArom.pdf
Cx.pdfGB1.pdf
Hx.pdfdyana_CT_HSQC.pdf
tools（linux専用）(ホームディレクトリの下に置く)
list2save.pl
spx_MC_Nhsqc_save.pl
ucsf2NMRtist.pl
使用装置
Bruker 800MHz AVANCE III HD equipped with CPTCI(F) probe, Corr. 25˚C
Registered at NMF-PF, Hokudai GFC, and Hokudai NMR facility2主鎖帰属用ExpNo

ucsf file name

HN-HSQC

6

Nhsqc.ucsf

HNCO

11

hnco.ucsf

HN(CO)CA15

hncoca.ucsf

HNCA

14

hnca.ucsf

CBCA(CO)NH

17

cbca.ucsf

HNCACB

16

hncacb.ucsf

C(CO)NH

19

cconh.ucsf

N-NOESY

41

nnoe.ucsf

測定名側鎖帰属／構造計算用
ExpNo

ucsf file namectHSQC (Aliph)

4

Chsqc.ucsf

ctHSQC (Arom)

5

ChsqcArom.ucsf

HBHA(CO)NH

18

hbha.ucsf

H(CCO)NH20

hcconh.uicsf

HCCH-TOCSY (Aliph)31hcch.ucsf

HCCH-TOCSY (Arom)

33

hcchArom.ucsf

HbCbCgCdHd

34

CBHD.ucsf

HbCbCgCdCeHe

35

CBHE.ucsf

C-NOESY (Aliph)

42cnoe.ucsf

C-NOESY (Arom)

43

cnoeArom.ucsf

測定名

配列情報
MEYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEHSHHHHHH
HSHHHHHH は精製のためのアーティファクト配列3

帰属用にマーキングした配列情報

4

手順
1. FT on TopSpin
今回用意した測定データはすべて TopSpin にてスペクトルファイルに変換済みである。
よって、この章は文章のみの掲載とし、講習会では説明しない。
3Dの測定データは1D（および2D）を用いて位相補正する。
Echo/Anti-Echo type の 3D FT では 1D での位相補正値 PHC0 に 90 を足す。
efp
1D FT with exponential weighting factor.phPhase correction mode
3D での FT を行う前に、スペクトルの切り抜きをしておく。
切り抜きのためには、STSR や STSI を指定する。
今回の測定の場合、HN-HSQC でのプロトン信号は 6 から11 ppm の範囲にのみ観測されるため、その領域が残るように設定する。
ex.)
STSR 200
STSI 700
測定時の観測幅やSIポイント数に依存するため注意する。
15N や他の軸については折り返し信号があり得るので、基本０とする。
（Sparkyでの解析の都合）3D の FT をする。
3D以上のNUS測定は測定制御PCの上で処理する。
Accadmic varsionのTopSpinでは、NUS処理ができない。
ftnd 0
最初の NUS 処理付き FT は、Mdd_mode を mdd とする。
位相や測定範囲、観測されるべき信号を確認したのちに Mdd_mode を csとして、再度処理する。
3 Mdd_mod cs
ftnd 0
ただし、HCCH-TOCSY は信号数が多いためと思われるが、cs による処理は現実的な時間の終了が見込めない（今回のデータでは、３日ほど処理したが終わらなかった）。このような場合には、mdd までの処理に留める。
HNCACB など 1D での位相補正ができないときは、あらかじめ 2D を NUS ではない方法で測定しておく。その後に 3D を NUS で測定し、2D での位相補正値を用いて 3D の処理を行う。
ex.)td
2048 164
3 FnTYPE traditional(planes)zg
xfb.ph -> nDで保存
td2048 48128
zg

5

2. Convert to Sparky format
TopSpin により FT した２次元や３次元のスペクトルファイル、2rr や 3rrr を Sparky フォーマット
である ucsf ファイルに変換する。
bruk2ucsf を使用する場合（Linux など）
ExpNo のディレクトリに移動し、bruk2ucsf コマンドを使用する。
burk2ucsf は Sparky プログラムに入っている。
ex.) 2Dの場合
cd ~/NMR_work/demo/240206_CN_GB1/6/
bruk2ucsf pdata/1/2rr Nhsqc.ucsfex.) 3Dの場合
cd ~/NMR_work/demo/240206_CN_GB1/11/
bruk2ucsf pdata/1/3rrr hnco.ucsf
bruk2ucsfGui を使用する場合（windows）
https://github.com/oodegard/Bruk2ucsfGui
Code から Download Zip を選択する。
zipファイルを展開し、Bruk2ucsfGui.exe を起動する。
Browse から、2rr や 3rrr を選び convert する。
ファイル名には ucsf の拡張子をつける。
ucsf ファイルは、一箇所にまとめておく。
Sparky のワークスペースに納めておくと管理がしやすい。
ex.)mkdir ~/Sparky/Data
mv ~/NMR_work/demo/240206_CN_GB1/*/*.ucsf ~/Sparky/Data
スペクトルファイルを確認する。
上記のとおりであれば主鎖帰属のためには以下のファイルが揃っている。
Nhsqc.ucsf
hncacb.ucsf

cbca.ucsf
hnco.ucsf

cconh.ucsf
hncoca.ucsf

hnca.ucsf
nnoe.ucsf

6

3. Open spectra on Sparky
Sparky の操作に慣れていればここは省略可能であるが、慣れている人はこの講習を受講しないと思われるため、この章は重点的に解説する。
ダウンロードしたSparky_GB1.tgzを解凍展開すると、Sparky_GB1ができる。これをSparkyと名前を変更し、ホームディレクトリに置く。もし、Sparkyディレクトリがすでにホームディレクトリにある
場合には、名称を変更しておく。
cd ~/Downloads/Sparky_GB1.tgz
tar xvfz Sparky_GB1.tgz
mv Sparky_GB1 ~/.
cd
mv Sparky_GB1 Sparky
同様にtools.tgzも解凍展開しておく。解凍展開されたtoolsディレクトリもホームディレクトリに移動させる。
cd ~/Downloads/
tar xvfz tools.tgz
mv tools ~/.
Sparkyプログラムを起動する（linux） terminal を開き、sparky と入力（windows）
sparky.DATを開く
Sparky では、主にファンクションキーによるポインターモードの変更もしくは２文字コンビネーショ
ンによるショートカットにより操作を行う。
プルダウンメニューからも操作可能であるが、基本的にショートカットを使用する。このマニュアル
ではショートカットで表記する。”” で囲んだものはショートカットである。
ex.) ファイルを開く“fo”
file open
２文字によるコンビネーションであるため、誤入力がありえる。
例）”ov” とするところ、ovv と入力してしまう。
この場合の誤入力、三文字目の v は次のショートカットの１文字目として認識されるので、適宜[Esc] キー により入力をキャンセルする。
また、文字列を入力できる欄が選択されているときにはショートカットが機能しない。この場合、ポインターモードをselectにしてからスペクトルが表示されている領域を選択することによりショート
カット受付可能な状態に移行させる。
スペクトルファイルを開く“fo” （File -> Open）スペクトルファイルを開く。
“fo” を使用してスペクトルをすべて開く。開く順番は、ある程度ルールに則った方があとでわかりやすい。ここでは以下の順で開く。（上段の左から右へ、その後に下段へ）
Nhsqc.ucsf
cbca.ucsf

hnco.ucsf
hncacb.ucsf

hncoca.ucsf
cconh.ucsf

hnca.ucsf
nnoe.ucsf

これは解析を行う順に開いている。３次元の表示方法は次のセクションによる表示変更を実施
し、解析しやすくする。
7

３次元スペクトルの表示変更“ov”（Orthogonal views）は、表示される軸の順番を入れ替える。3Dの場合、w1-w2-w3の表示からw3-w1-w2、w2-w3-w1を作成する。
“xx”（Transpose axes）は、表示平面の縦軸と横軸を入れ替える。
“vd”（View Duplicate）は、表示画面を複製する。複製されたウインドウは同期や重ね合
わせから外れる。主鎖帰属を実践するときによく活用するので記憶しておく。
Bruker フォーマットから直接 ucsf ファイルを作成した場合、軸の順番の都合から解析しづらい面が表示されている（w2 が縦軸と w3 が横軸の平面が表示され、w1 が画面の前後方向になっている）。
HNCO では、13C が縦軸と 1H が横軸の平面が表示され、15N 前後方向であることが解析をする上で望ましい。
右の図は HNCO の３次元立方体表示のイメージである。HNCOでは、H-N-CO の相関信号が三次元
空間中に球として観測される。hnco の解析をするときには、縦軸にCが表示されている状態が解析しやすい。
ex.) hnco を開いているとする“ov” とし、hnco/1、hnco/2を作る。
hnco、hnco/1 をバツ印により閉じる。
hnco/2 上で、”xx” としてから、”vd” とする。（hncoが再度できあがる）
hnco/2 をバツ印により閉じる。
さらに言えば、13C が縦軸で、横軸が15N であるものも用意しておくと良い。GB1は簡単なスペ
クトルであり、これは不要であったため今回は割愛する。
スペクトルの見た目を調整する“ct”（Countor Levels）により等高線表示をコントロールする。
“vt”（View Options）によりスペクトルウインドウをカスタマイズする。
スペクトルの見た目は解析にとって重要である。まず ”ct” によって等高線表示を編集する。View
によって編集対象のスペクトルを選択し、正負のそれぞれについて設定する。Levels は 20、Factor は 1.4 とした。Lowest / Color はスペクトルごとに以下の表のようにした。

Nhsqc
hnco
hncocahnca
cbca
hncacbcconh
nnoe

Lowest
3e+07
5e+06
5e+05
5e+05
6e+05
6e+05
6e+05
3e+05

positive
red
red
red
cyan
coral
blue
gold
red

negative
green
green
green
green
green
maroongreen
green

Aspect(ppm)
6
4
12
12
20
40
20
6

Lowest の値はスペクトルの見た目から判断する。解析初期においてはノイズが見えないぐらいの高さとしておき、解析後半に必要であればノイズがわずかに見えるぐらいまで値を下げる。
Lowest には positive と negative とをそれぞれ指定できる。negative には positive の値にマイナス符号をつけた値を入れるが、negative が不要であるスペクトルの場合には負に大きな値と8する。例えば、hnco では negative を -5e+10 とする。このeを使用した表記は指数を意味するE表記である。6e+06 は、6000000（0が6つ）を意味している。
”ct” の Levels と Factor は、それぞれ等高線数と等高線間隔である。Factor が 1.4 であればLowest である 6e+06 の高さで描画された等高線の次は 1.4 倍の 8.4e+06 の高さに描画される。
Color はスペクトルを視認しやすくするために系統立てて設定する。主にHNの一つ前の残基に由来する信号が観測されるスペクトル（HNCO、HN(CO)CA、CBCA(CO)NH、C(CO)NH）は暖色系（red、coral、gold）、HNと同じ残基に由来するスペクトル（HNCA、HNCACB）は寒色系（cyan、
blue、maloonなど）にした。
また、ピークは表示される等高線が丸に近くなるように ”vt” から aspect を調整する。横軸１に対する縦軸表示を設定する。
軸の同期“yt”（Synchronize）により軸同期の制御を行う。
“yt”により軸の同期を行う。今回使用するスペクトルの 15N と 1H は nnoe の w1 軸を除きすべてを同期する。
13C の軸は適宜、実施する。ここでは、hncoca と hnca、cbca と hncacb と cconh の13C軸をそれぞれ同期する。最終的に以下のようになる。

Nhsqc
hnco
hncocahnca
cbca
hncacb
cconh
nnoe

w1
15N a
13C
13C c
13C c
13C d
13C d
13C d
1H

w2
1H b
15N a
15N a
15N a
15N a
15N a
15N a
15N a

w3
1H b
1H b
1H b
1H b
1H b
1H b
1H b

小文字の添字（a~d）は、同期されている軸を意味する。
a~dの順番が一致していなくても構わない。

スペクトルの重ね合わせ“ol”（Overlay Views）によりスペクトルの重ね合わせ制御を行う。
HNCA は、HN と同じ残基の CA 以外にも一つ前の残基の CA が弱く観測される。弱く観測される一つ前の残基のCAは、HN(CO)CA でも観測されそれは同じ位置にある。HNCA に
HN(CO)CA を重ねることで、これを瞬時に見分けることができる。
“ol” によってスペクトルの重ね合わせを行う。重ねに用いたスペクトルは表示のみでありピーク
ピックなどができない。ここでは、以下のように重ねる。
Fromhncocahncocahnca
hncoca
cbca

Onto
hnca
cbca
hncacb
cconh
cconh

9

スペクトルの表示／非表示とレイアウト“pv”（View List）によりスペクトルの表示／非表示を制御する。
解析作業をするとき、解析に使用しないスペクトルは邪魔にならないよう隠しておく。ウインドウのバツ印により消してしまうと、これまで設定した同期や重ね合わせが消去されてしまう。”pv” によるスペクトル表示の Hide は、同期や重ね合わせの設定はそのままに、スペクトルウインドウを非表示にできる。解析の段階に応じて必要なスペクトルだけが表示されるようにする。
また、ウインドウのレイアウトは解析作業にとって非常に重要である。解析前にレイアウトを重視
して調整すること。これは NMRスペクトル解析のみに限らず普段の整理整頓能力も同時に問われる。
化学シフト値の補正“st”（Spectrum）は、スペクトル情報を制御する。
測定制御の都合から Bruker デフォルトのままの測定においては、どの測定環境下にあっても D
溶媒の化学シフト値を固定値として扱う。水溶媒（90% H2O / 10% D2O など）溶液タンパク質が対象である場合、D2O を4.7 ppm としている。これは BMRB 登録や SSP 解析などの二次構造予測において適切な化学シフト値ではない。内部標準として加えた DSS や水信号（直接軸の観測中心）と測定温度から正しい化学シフト値に補正されるべきである。
今回のスペクトルセットでは、1H は 0.072、15N は 0.077、13C は 2.72 が補正値である。
Sparky上で補正する。”st”によってスペクトル情報を開き、shiftの欄に補正値を入力する。
1H
15N
13C

0.072
0.077
2.72

これらの値のうち1Hは水信号および測定温度（25˚C）から求めた。15N や 13C は、IUPACの計
算式に基づいて、プロトンの化学シフト値から求めた。
スペクトルデータの一括保存“ja”（Project Save as）にて名前をつけてプロジェクトを保存する
ここまでの操作で複数のスペクトルデータが開かれており、同期や重ね合わせを実施してきた。
スペクトルの解析情報も含めて一括に保存するときには、プロジェクトによって一括保存を行う。
最初の一回は、”ja”として名前をつける。今回は以下の名前にて保存する。
GB1.proj
このプロジェクトファイルから再開するときには、”jo”にてこのファイルを指定する。以降、上書き保存をするときには、”js”を用いる。
“jo”（Project Open）プロジェクトを開く“js”（Project Save）プロジェクトを保存する
プロジェクトから開始しない場合、テンポラリーに noname.proj がプロジェクトのファイル名として割り当てられているが、これは ”js” によって保存されない。
スペクトルデータの確認
F2キー（Pointer mode: center）
後半の作業にて NMRtist による自動帰属や自動構造計算を実施する。NMRtistを実行する前に、化学シフト値補正が正しく実施されていることを確認する必要がある。Nhsqc 上に観測される
10

信号をスペクトル表示の中心になるようにする。F2キーによって、pointer mode を center としてから信号の中心を左クリックすると良い。Nhsqc の N 軸と H 軸と同期されているスペクトルは、その部分について表示している。例えば HNCO では、N と H が Nhsqc の中心値と同じ中心置にあり、C の信号を確認することができるはずである。
これをすべてのスペクトルについて複数の Nhsqc 上の信号、できればNhsqc上で離れた位置にあるものについて確認しておく。スベクトルによっては複数の信号が観測される。また、一部の
Nhsqc 信号は３次元スペクトルにおいて信号が観測されないことがある。例えば Asn/Gln のside-chain NH2 からは N-NOESY を除いてほぼ観測されない。これらに留意して確認しておく。

11

4. Sparky Workspace, Projects and Save directory
講習会においては唯一のサンプル、GB1 についてのみ取り扱うため、読み飛ばしても構わない。また、講習会において、この章の解説は省略する。ただ、講習会以外のケースを実施する、
すなわち講習会後に自身のサンプルでの解析を進めていく上での大事なこと、記憶に留めておくべきことを記述しているため、一読しておくことをオススメする。
はじめにSparkyを起動したときに、Workspace の作成について聞かれる。これを OK とすると、ホームディレクトリ（Linux）やマイドキュメントなど（Windows）に、「Sparky」というディレクトリ（もしくはフォルダ）が作成される。これが Sparky の Workspace になる。もし複数のタンパク質サンプ
ルを扱う場合には、Workspace ごとディレクトリ名を変更すると良いだろう。例えば、Ub と GB1の２種類が解析対象であるとする。解析対象を Ub から GB1 に変更するとき、前に解析対象としていた Ub のための Workspace、「Sparky」を「Sparky_Ub」に変更する。GB1 を解析後に、再度 Ub の解析をするときには、「Sparky_Ub」を「Sparky」に変更してから解析を再開する。
タンパク質のNMR解析では非常に多くのスペクトルを相手にする。今回の GB1 主鎖帰属に限った場合でも、８つのスペクトルファイルが対象である。例えば、他に考えうる案としては、タンパク質名を含めたucsfファイルを作成し、それらを同じフォルダに入れ続けた上で Projects による棲み分けも可能ではある。しかし、構造計算や dynamics 解析まで進む場合、さらにスペクトルファ
イルは増え、ややこしくなることこの上ないため、これはあまりオススメできない。
Projects ディレクトリには、スペクトルセットを一括管理する .proj ファイルが保存される。主鎖帰属および構造解析の .proj や動的解析や滴定実験の .proj ファイルが適当である。この .proj
ファイルには、制御下にあるスペクトルの Save ファイルや ucsf ファイルの所在、同期や重ね合わせの情報、さらには複数スペクトルに跨っている化学シフト値の統計値（平均値や標準偏差値）が記述されている。BMRB などから手に入れた化学シフト値情報を読み込んだときなども、帰属が０の状態でこのファイルに記述されている。帰属０の化学シフト値を消去したいときには、”rr” コマンドによって一つ一つ消去する。あまりに数が多い場合には、このファイルを直接編集して一括に消去することがある。ただ、ファイルの構成様式を壊してしまうと、開けなくなる（coredump で Sparky ソフトウェアが落ちる）こともあるため、十分に注意が必要である。
Save ディレクトリには、スペクトルごとの解析結果が .save ファイルとして保存される。ピークピッ
クした情報、帰属情報はもちろん、”st” による化学シフト値補正や molecule、condition 情報なども、このファイルに保存される。
間違った .proj の使い方として、解析の途中段階をバックアップするために、.proj ファイルをGB1_2024_2_28.proj などとして保存しておくことが考えられる。解析を進めると制御下にあるス
ペクトルの.saveファイルが更新されてしまうため、これは意味がない。解析の途中段階でバックアップをとっておきたいときには、Save ディレクトリごとバックアップしておくのが良いだろう。
ex.)
Sparky_GB1/
Projects/
GB1.proj
t1t2noe.proj
Save/
Save_240305/ <- バックアップ
Lists/
Data/ or Spectra/

r2disp.proj

Lists ディレクトリは、Sparky の出力ファイル保存先である。スペクトルの画像ファイルや化学シフトが書かれたテキストファイルなどが入る。必要であれば、PDB ファイルや seqファイルを入れておくと良いだろう。
12

5. NMRtist input
NMRtist は、配列情報とスペクトルデータから構造計算までを全て自動で行ってくれるWebサービスである。現時点の NMRtist では、スペクトルのピークピック、主鎖帰属、構造計算までの３段階を指定できる。後者は前者の内容を含んでいる。スペクトルデータの入力ファイルとしてSparky フォーマットが対応している。講習会では、これまでの操作の対象とした主鎖帰属データのみを用いて、NMRtist による自動主鎖帰属を実施する。時間があれば、側鎖帰属を含めた構造計算までを実施する。
化学シフト値補正済みucsfファイルの作成（Linux限定）
ucsf2NMRtist.pl
ucsfdata を用いた化学シフト値補正のための自作ツール
以前の NMRtist は、化学シフト値補正済みのスペクトルデータが必要であった。そのときに作成したツールを用いて NMRtist アップロード用のスペクトルデータを作成する（現在は、NMRtist の
ウェブサイト上でも化学シフト値補正ができるため、必須ではない）。
以下のファイル構成であることを確認する。
Data/ もしくは Spectra/
Nhsqc.ucsf
hncacb.ucsf
Save/
Nhsqc.save
hncacb.save

cbca.ucsf
hnco.ucsf

cconh.ucsf
hncoca.ucsf

hnca.ucsf
nnoe.ucsf

cbca.savehnco.savecconh.save
hncoca.save

hnca.savennoe.save

save ファイルは、”st” にて化学シフト値を補正後に ”js” や ”ja” により保存したファイルであること。この中に補正値が記載されている。ツールではこの save ファイル内の補正値を引用した
ucsfdata により、新しい ucsf ファイルを作成する。Dataディレクトリに移動し、ucsf2NMRtist.plを実行する。
cd ~/Sparky/Data~/tools/ucsf2NMRtist.pl
最後の行にてツールを実行する。実行後には output/ ディレクトリが作成されており、その下にアップロード用の ucsfファイルがある。
NMRtistウェブサイトでの操作
https://nmrtist.org/
NMRtist にて、New Project を作成する。Project 名はタンパク質名や目的が書かれていると良いだろう。今回は GB1 とする。Project を作成するときには同時にアミノ酸配列の入力も必要である。このとき１文字表記とし、改行やスペースがないものとする。また、ドメイン切り出しなどにより残基番号が途中から始まる場合は、Sequence offset を指定する。
Projectを作成したあとは、そのプロジェクトをOpen状態とする。
Upload data を開き、Spectra を開く。先の output ディレクトリの下にあるすべての ucsfファイル
を upload する。upload が完了するまで、しばらく待つ。
Uploadしたスペクトルファイルについて、Spectrum type（どのような信号が観測されるのか）やAxis label（軸の順番と原子の相関）、Tags（正の信号のみであるのか、Aliphatic なのかなどのタグ付け）を設定する。左にある Opend project にあるメニューから、Summaryを開く。先の作業で13

アップロードしたスペクトル一覧が表示されている。デフォルトでは、Spectrum type などが設定されていない。以下のように設定する。
File nameSpectrum type

Axes label

tags

cbca_out

CBCAcoNH

C,N,HN@POS

cconh_out

CcoNH

C,N,HN@POS

hnca_out

HNCA

C,N,HN@POS

hncacb_out

CBCANH

C,N,HN

hnco_out

HNCO

C,N,HN@POS

hncoca_out

HNcoCA

C,N,HN@POS

Nhsqc_out

N15HSQC

N,HN

@POS

nnoe_out

N15NOESY

H,N,HN@POS

Spectrum type はプルダウンメニューになっており、適切なものを選択する。Axes label も同様にプルダウンメニューである。ucsf ファイルに記載されている軸の核種に一致するものが緑色で表示されている。nnoe_out 以外は迷うところがないだろう。nnoe_out は、二つの軸がプロトンになっている。緑色で表示されているのは、「H,N,HN」と「HN,N,H」である。ここでのHとHNはそれ
ぞれ、NOE 相関信号が観測されるプロトン軸と N に直接結合しているプロトン軸である。アップロードされたスペクトルの軸順序は、Sparky の軸順序（w1-w2-w3）と同じであるため、ここでは「
H,N,HN」となる。tags には、HNCACB を除きすべてが正の信号のみが正しく観測された信号であるため、@POS を使用する。HNCACB は、正と負のそれぞれに信号観測されるため、ここでは tag による指定はしない。
tagsの指定には他に、@ALI, @ARO, @NEG, wA,B がある。ucsf2NMRtist.pl を使用せずに、
NMRtist上で化学シフト値補正をする場合には、wA,Bを使用する。例えば、w1,0.072 のように、「軸の名前,補正値」で入力する。複数の tags を入力する際にはカンマで繋ぐ。
今回の主鎖帰属では登場していないが、折り返しがあるような場合には、unfolding を設定する。
例えば、C軸を折り返した HCCH-TOCSY があり、その Axes が HC,C,H である場合には、
unfolding に ω2, +- を選択する。
一つのスペクトルについて上記の表に従って設定を行い、Save ボタンをクリックする。すべてのスペクトルについて設定を行っていたとしても Save をクリックした以外のスペクトルは、元の状態に戻る。
すべてのスペクトルファイルについて設定が終了したあとに、Applications を開く。
Applications には、ARTINA peak picking、ARTINA shift assignment、そしてARTINA structure
determination がある。それぞれピークピック、帰属、構造計算である。今回は帰属（ARTINA
shift assignment）を選択する。ARTINA shift assignment の run application をクリックする。
Application call name を適宜設定する。ここでは GB1main とする。Use as app input にて、
select all とし、アップロードしたスペクトルをすべて対象に設定する。その後、最下部にある
Submit JOB をクリックする。
NMRtist の Results にて計算状況が確認できる。Status の表示が waiting / running / finish と変わっていく。計算に使用されているサーバの空き状況や分子量（分子サイズ）、スペクトルの質
14

に左右されるが２時間から４０時間程度で自動解析が終了する。
NMRtist では、スペクトルファイルの代わりにピークリストのファイルも入力可能である。また、化学シフトテーブルや PDB ファイルも入力可能である。これらは例えば主鎖帰属においてスペクト
ルのみを情報ソースとしたときには解析できなかった場合に活用できる。NMRtist の出力には各スペクトルのピークピックされた情報が含まれている。これをローカルにてスペクトルを見ながら修正を行い、そのピークリストで再実行するなどである。また構造計算までを対象とした NMRtistの実行時には reference となる PDB（例えば Alpha fold 2 での予測構造）を入力ファイルとしてアップロードしておくことで、よりよい構造計算が望める。

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6. Numbering on HN-HSQC peaks
この講習会では Sparky を用いた手動での主鎖帰属についてデモンストレーションを行う。主鎖
帰属とは主鎖を構成する原子について帰属する（化学シフト値を決定する）ことを意味するが、大概の場合、HN-HSQC 上で観測された信号の帰属を意味している。今回使用するすべてのスペクトルは、HN-HSQC をベースとしている。
Nhsqcの全領域をピークピック“zi”（zoom in）“zo”（zoom out）
F8キー（Ponter mode: find/add peak）“qt”（Quit）
HN-HSQC である Nhsqc についてのみ ”pv” で表示する（他のスペクトルは hide する）。すべての信号が画面内に入るようにウインドウ表示を ”zi”、”zo” も使用して調整する。F8キーで Pontermode を find/add peak としてスペクトル全体を左ドラッグにより囲む。68個の信号がピークピック
される。
次の作業では、Nhsqc 上に観測された信号について、解析の準備として通し番号をつける。手作業で一つ一つにつけても良いが、講習会では自作のツールを使用する。これはピークピックされた信号について通し番号をつけるものである。Sparky の帰属では、それぞれの軸につきGroup および Atom の名前を入れることができる。主鎖帰属の最終形では、Groupにアミノ酸＋残基番号、Atom に原子名が入る。例えば、Gly9 の主鎖アミドを構成する原子に由来する
Nhsqc 上の信号であれば、

15N
1HGroup Atom
G9
N
G9
HN

が入力される。主鎖帰属情報が未知である解析の初期段階において、アミノ酸および残基番号は不明である。その場合、不明な信号については通し番号をつけておく。Nhsqc で観測される信号は15N と 1H が直接結合している信号であり、その大部分が主鎖のアミドに由来している。ただ一部はTrpやHis、Asn や Gln、Arg や Lys の側鎖にある N-H の組み合わせに由来する。通し
番号をつけるときには、主鎖に由来するものと仮定しておき、MC（Main chainの意味）を用いて、15N
1HGroup Atom
MC1 N
MC1 HNのように名前をつけておく。数字が異なれば違う残基であることを意味している。解析により側鎖であることやアミノ酸種類が特定されたときには、これを変更する。例えば Trp の側鎖であれば、

15N
1HGroup Atom
Trp1 NE1
Trp1 HE1である。また、Asn / Gln の側鎖であれば、側鎖由来であることを示すようにSCを使用する（SC =side chain）。

16

15N
1H

Group Atom
SC1 NXSC1 HX1 or HX2である。帰属に使用する最終的な原子名は CYANA 書式などの決まった書式に従って命名する。CYANA 書式では、主鎖アミドは N および HN（最近の CYANA 書式ではアミドプロトンは Hとしているが、ここでは混乱を避けるため HN で統一する）であり、αカーボンは CA、カルボニル
カーボンは C である。
“js” によりプロジェクトを保存して ”qt” により Sparky を終了する。
spx_MC_Nhsqc_save.pl（linux限定）
cd ~/Sparky/Save~/tools/spx_MC_Nhsqc_save.pl
mv Nhsqc_kume.save Nhsqc.save
前の作業にて、簡単に触れたように Nhsqc で観測される信号について通し番号をつける。
spx_MC_Nhsqc_save.pl は、既存の Nhsqc.save ファイルを参照し、新しく通し番号のついた
save ファイル、Nhsqc_kume.save を作成する。作成された Nhsqc_kume.save をNhsqc.saveに上書きする。

17

7. First 3D spectrum, HNCO
HNCO は、数ある主鎖帰属用３次元測定のうち、もっとも高感度／高分解能な測定であり、また得られる信号数も少なく解析が容易である。一つの残基について、主鎖アミドの N-HN からは、
一つのカルボニルカーボンだけが観測される。２次元である HN-HSQC では分離できなかった
信号を３次元に展開することで分離できるようになる。また、Trp の側鎖や Asn / Gln の側鎖に由来するHN-HSQC上の信号について HNCO では特徴的な信号が観測される。よってこれらを区別することもできる。
HNCO で観測される主鎖アミドに由来する信号からは、HN を構成している残基の一つ前の残基に由来している。例えばG9の主鎖アミドH-Nから観測されるHNCO上の信号は、N8のCである。HNCOで観測された信号の最終的な帰属は、

13C
15N
1H

Group Atom
N8
C
G9
N
G9
HN

である。N や HN については、すでに Nhsqc 上にて帰属しているため、HNCO では省略する（ただしこの講習会の範囲外になるが、sparky の連鎖帰属情報を表示するための”sg”（spin graph）
を使用する場合には省略できない）。MC による通し番号をつけている段階では残基番号は不明である。ここでは、一つ前の残基であることを意味するようにGroup 名をMCn-i としておく。

13C

Group Atom
MC1-i CHNCO の解析作業は、HN-HSQC で観測されたすべての信号について行う。Nhsqc 上で、”lt” としピークリストを表示する。ピークリストの一つをダブルクリックすると、Pointer mode に依存せずにスペクトル画面にて中央にそのピークが表示される。当然、HNCO も同期された表示がされる。
“lt”（Peak list）ピークリストを表示する。
解析パソコンのディスプレイ上にて表示されているレイアウトは、解析作業にとって重要であるため、調整する。右下の画像はその一例である。
同期表示された HNCO のスペクトル上で、信号を探索する。探索された信号についてF8キーにより Pointer mode を
find/add peaks として、ピークピックを行う。カーソルで囲むか、ピーク上でクリッ
クし、”pc” によってピークの中心にピックを移動する。
“pc”（Center peak）選択された
ピックをピークの中心に移動する。
HNCO上にて帰属を行う。帰属するときには ”at” により Assignment dialog を表示し、Group Atom
18

13C

MC1-i Cの要領で入力し、Apply する。
“at”（Assign）帰属のためのダイアログを表示する。
もし一つの Nhsqc 上の信号に対して、２つ以上の HNCO 信号が観測されていればそのNhsqc
上の信号は２つの残基に由来する信号が重なっている可能性がある。
HNCO の解析を進めていく過程で、Trp の側鎖であることがわかったときには”rr”を用いる。
“rr”（Rename resonances）帰属名を Rename／Merge／Swap する。
MC2 の信号が Trp の信号であるとする。ここでは残基番号が確定していない場合には３文字表
記のアミノ酸＋通し番号としている。この場合、Group Atom
From MC2 N
To
Trp1 NE1のように入力し、Rename する。同様にHNもHE1とする。
GB1 に Trp残基は W43 しかないため、これはさらに、Group Atom
From Trp1
To
W43
とする。
Rename dialog において、Atom に空欄を用いると同じ Group 名としているすべてが対象となった Rename／Merge／Swap ができる。また、Group を空欄とした場合には同じ Atom 名すべてを対象とした変更も同様に可能である。
Asn / Gln の側鎖にある NH は、NH2 である。この場合、HNCO に交差信号は観測されない。こ
こにあげている N-NOESY を除くすべての３次元スペクトルにおいて、これは共通である。ただし溶媒中には一定量のD2Oが存在しており、これはアミドプロトンと化学交換する。 含有率に応じて NDH の状態が存在している。このときには HNCO の信号が観測される。NDH であるときに、Nの化学シフト値は高磁場シフトするため、NH2 の信号よりも高磁場側に信号が観測される。
NDHに由来する信号の強度は、添加されている D2O の比率に依存する。大抵の場合、5~10%程度であるため、強度も 1/20〜1/10 程度である。Nhsqc のLowest (Positive) 値をさげること（
3e+06にする）でこれは確認できる。
Asn / Gln の側鎖由来信号である場合には、以下のように Rename する。
Group Atom
From MC47 N
To
SC1 NX
この時点では、Asn なのか Gln なのかは判断できない。そのため、どちらかの side chain であることを示すために SC を使用する。原子名は Asn / Gln で異なっているためNXとしておく。同様に HN も Rename するが、二つの HN であるため、HX1 と HX2 を用いる。
SC はAsn / Gln の残基数分の組み合わせが観測される。GB1にはAsnが３残基、Glnが１残基であるため、SCは１〜４の通し番号がつけられる。

19

ところで、MC57, MC58 はノイズであるため、これは消去する必要がある。Nhsqc のピークリスト
で選択をし、Delete キーによって削除をする。ただ、このままでは帰属０の情報として残ってしまう。ここでも ”rr” を使用する。
Group Atom
From MC57
Toのように、消去したい Group 名のみ入力し、To の欄は空欄として Rename をすると帰属情報を消去することができる。
以降の操作では、HNCO の解析によって主鎖信号として残った MC についてのみ解析をしていく。SC の帰属については主鎖帰属の範囲には含まない。

20

8 CA naming, HN(CO)CA and HNCA
HNCOの解析により、最初の通し番号をつけたMCからTrpやSCを分別した。次の解析では、
HN(CO)CAとHNCAについて、NhsqcのピークリストからMCの信号に由来する信号を解析していく。
“pv” を活用しつつ、レイアウトを変更する。くどいようだが、レイアウトは手際良い解析にとって重要である。右はその一例である。hncoca と hnca を横に並べて表示している。
hncoca は MC の一つ前の残基に由来する CA、hnca は同じ残基に由来する
CA について帰属する。
hncoca では、

13C

Group Atom
MC1-i CAhnca では、

13C

Group Atom
MC1 CAの要領である。
hnca には hncoca が重ね表示されている。この重ねられた hncoca の信号は表示のみである。
hnca では、同じ残基由来以外にも、一つ前の残基が弱く観測されるため、これを峻別するために重ねている。ただ、たまたま一つ前と同じ残基の CA がほぼ同じ化学シフト値であることがありえる。MC21 や MC27 がそうである。
GB1 には Arg 残基が存在しない。Arg が含まれているタンパク質の場合には、Nhsqc 上にてNε-Hε に由来する信号が観測されることがある。これは 15N の化学シフト値に特徴がある（80-90ppm）。今回の GB1 での測定のように 15N 軸を 100-136 ppm の範囲で測定した場合、折り返し信号として観測される。折り返し信号の正負を反転させる half dwell 測定や観測幅を変更した
測定との比較により峻別できる。また、HNCO によって、Cz が観測される。Arg の Nε-Hε からは
HNCA で Cδ が観測されるが、HN(CO)CA では信号が観測されない。
hnco、hncoca、hnca の解析が終了した段階で、間違いがないか確認をする。”pv” で表示される
Peaks / Assingment の個数が３つのスペクトルで一致していること、”lt” で表示されるピークリス
トに間違いがないこと、”rl”で表示される Resonance List に、おかしな帰属がないことを確認しておく。あれば適宜修正する。
この確認作業は、間違いを起こしやすい解析初心者にとって非常に重要である。

21

“rl”（Resonance List）化学シフト一覧を表示する。
Resonance list では、帰属された化学シフト一覧を確認することができる。Assignment が０のものや、SDev に大きな数字が入っている場合に修正が必要である。Assignment が０のものは“rr” で消去する。修正が必要な Resonance List の行を左クリックすることで Resonance Peaksが表示され帰属されている一覧が表示される。さらに Resonance Peaks の行をダブルクリックすることで該当箇所のスペクトルが表示される。
確認が終了したら、次の作業ではいよいよ主鎖帰属を行う。主鎖帰属を間違えてもこの段階に、戻れるように Save ディレクトリはバックアップしておこう。
cd ~/Sparky
cp -r Save Save_bkup

22

9. main-chain assignment, CBCA(CO)NH, HNCACB, C(CO)NH and N-NOESY
主鎖帰属は、１）連鎖する MC の組み合わせを見つける、２）残基の種類を特定する、３）アミノ酸
配列に当てはめる が一つのルーチンになっている。どのような手法をたどっても最終的に正解に辿り着ければよく、その手法は様々かもしれない。ここでの操作は、数ある手法のうちの一例だと捉えていただきたい。
連鎖の組み合わせについて
ペプチド結合により連鎖する２つの残基について考えてみる。前側にある残基の HN に始まり、Cα および Cβ や付随するプロトン、カルボニル、うしろにある残基の HN が連なっている。ここまでの解析で MC とつけた信号は主鎖アミドを構成する HN-N の組み合わせであり、hnco や hncoca、hncaで帰属してきた CA や C は、HN の共有結合的に近くにある Cα やカルボニルカー
ボンである。
HNCA と HN(CO)CA で観測される信号はそれぞれ、HN の同じ残基にある Cα と一つ前の残基にある Cα である。連続している HN からは、異なるスペクトルによって同じ Cα を観測することになる。これが連鎖を見つける情報源となる。Cα だけではたまたま同じ化学シフト値にある場合に区別できないため、他の信号情報も使用する。この講習会では、Cβ の信号情報を使用するた
め、HNCACB と CBCA(CO)NH を用いている。他にもプロトンによる連鎖やカルボニルカーボン
による連鎖がある。プロトンであるHα 連鎖には、HN(CA)HA や N-TOCSYとHBHA(CO)NHを用いる。
パルスシークエンスの名前から、観測されるべき信号は判断ができる。ここでパルスシークエン
ス名による対応例を表にまとめておく。
主として観測する原子

同じ残基

一つ前の残基CαHNCA

HN(CO)CACα,Cβ

HNCACB

CBCA(CO)NH
HN(CO)CACBHαHN(CA)HA
N-TOCSYHBHA(CO)NHC’(HCA)CO(CA)NHHN(CA)CO

HNCO

パルスシークエンス名は磁化移動に使用する順番で表記され観測される原子が表記されている。また、パルスシークエンス名のルールとして、()で表記されている原子は、磁化移動にのみ使用するため観測されない。もちろん、ここに記載されていないパルスシークエンスも多数存在する。

23

残基の種類を特定する
アミノ酸は側鎖によってその種類が分けられる。例えば、側鎖 R が H の場合にはグリシン（Gly）
であり、CH3であればアラニン（Ala）である（アミノ酸側鎖の名称および側鎖構造は後述の
CYANA書式を参照されたい）。化学シフト値は、その周囲の環境により変化するため、当然アミノ酸の種類ごとにある程度、観測される範囲が決まっている。特に Cα やCβ の化学シフト値は特徴的である。Gly の Cα は、他のアミノ酸と違い 45 ppm付近に観測される。Ala の Cβ は 20
ppm 付近に観測され、Ser / Thr の Cβ は Cαと同程度か低磁場側（化学シフトの数字が大きい方）に観測される。これら４種類の残基は、Cβ までの解析で特定することができる。他のアミノ酸についても Cβ までの解析で、アミノ酸種の特定はできずとも、限定は可能である。
次の図は、典型的なタンパク質におけるアミノ酸の Aliphatic カーボンの化学シフト値である。

24

よほどのことがない限り（たとえば活性中心にヘムなどの磁性体が存在しているなど）、この範囲にて観測される。同様に Aliphatic プロトンについても示すが、こちらは範囲外に観測されることも多いため、参考程度とする。

25

Phe / His / Trp / Tyr には、この表に掲載されていない原子がある。これらは Aromatic に分類される。 Aromaticを構成するカーボンの化学シフト値は上記のAliphaticと大きく異なっており、主26

鎖帰属においては、使用しない。ここでは、とあるタンパク質の ct-HC HSQC（Aromatic）のスペ
クトルおよび Aromatic を構成している原子の観測場所について記載するに留める。

Aromatic 側鎖の観測位置について記述したが、ここでの原子名記述はCYANA書式に従っている。CYANA書式についても次に示しておく。

27

28

アミノ酸配列に当てはめる
ここまでの情報を踏まえた上で、解析を実践する。例によってレイアウトから整える。

Nhsqc、hnca、cbca、hncacbのみを表示している。
hnca と hncoca については、”st” によって condition を ca としている。また、”zi” を繰り返して画
面いっぱいに信号が表示されるようにしている。さらに、”vt” から Resonance Panels (vR) をOnの状態にしている（”vt” を介さず、直接 “vR” でも良い）。
Resonance Panels には、CA の帰属情報が掲載されている。ここから CA による連鎖情報が得られる。Resonance Panels にて MC19-i CA と MC44 CAが近くに来ているということは、MC44- MC19 の順番で連鎖できる可能性が高いということを意味している。
これについて、CBによる連鎖確認をする。MC44 の hncacb と MC19 の cbca において、CB の信号位置が同じであれば連鎖が確認されたことになる。
Nhsqc で、MC44 N-HN を選択し表示させる。表示された hncacb を ”vd” で duplicate する（hncacb/1 ができる）。次に Nhsqc で MC19 N-HN を選択し表示させる。cbca と CB と、
hncacb/1 の CB を確認し、同じ位置に信号が観測されていることを確認する。
29

確認された連鎖の情報を紙面にメモする。
-i

MC44 MC19

このときに、CA / CB の化学シフト値情報、特定できるようであればアミノ酸種を付記する。
-iAla

MC44 MC19
S/T
Ala

確認に使用した duplicate されたスペクトル、hncacb/1 は不要であるため消去する。
MC19 の次の残基を探すとき、まずMC19 CAの信号を hnca の中心付近に表示させる。このときの Resonance Panels に表示される MC19 CA の近くにある -i がついている CA が連鎖の候補である。MC19 CA の近くに MC42-i CA がある。これも同様にCBについて連鎖を確認する。
複数の候補がある場合には、hncacb/1とcbcaのCBの位置が一致するものが連鎖する。
この操作を繰り返していく。
-iAla

MC44 MC19 MC42 MC43
S/T
Ala
60/30 60/32

GB1 配列において、これが当てはまる箇所は A24-T25-A26-E27-K28 の一箇所しかない。
“rr” を用いて正しい帰属に修正していく。
30

Group Atom
From MC44-i
To
A24Group Atom
From MC44To
T25Group Atom
From MC19-i
To
T25の要領で Rename していく。Atom の欄は空欄である。空欄の場合、一致するすべてが対象である。MCn-i の Rename も忘れずに実施する。
この繰り返しによって、Nhsqc 上では T25 から H57 まで帰属できる。
N末方向に連鎖を進めるときには、T25 N-HN から決定された A24 の CA を hnca スペクトルの中央に表示し、Resonance Panels にある -i が付与されていないMCの中から候補を選択する。
cbca を dupilicate しておき、候補先の hncacb と比較する。大事なことは、それぞれのスペクト
ルが何を観測できるのか把握しておくことである。これにはある程度の熟練度が必要である。
この繰り返しによって、E2 から A24 も帰属できる。また、MC12 が連鎖できない信号としてあまる。
タンパク質N末端のアミド基は、溶媒との交換が速く大概は観測不能である。よって、GB1 のNhsqc においては M1 N-HN は帰属されない。また、C末端にある S58 以降も信号観測されなかったため帰属できなかった。連鎖できなかった MC12 は、このC末端にある S58 以降のHis-tag を構成している残基のどれかと思われるが、帰属できない。
GB1 には、Pro 残基がないため、E2 から H57 までが連鎖帰属できた。Pro 残基にはアミドプロ
トンが無いため Nhsqc 上で観測されない。つまり、実際の解析サンプルにおいて Pro がある場
合には連鎖帰属はそこで止まる。
今回、cconh を使用していない。側鎖帰属に有用であるこの測定は主鎖帰属にとっても有用である。長い Aliphatic 側鎖がある残基、Ile, Leu, Val, Lys, Arg, Pro などを、このスペクトルだけで判断することができる。連鎖情報からアミノ酸種類を特定する段階において、この情報はとても有用である。ただ、C(CO)NH は感度がそれほど高い測定ではないため正しく信号観測ができない
ケースがあることも考慮に入れる必要がある。どのように観測されるか、今回の GB1 スペクトルで確認しておくと良いだろう。
同様に、nnoe も使用していない。GB1 を用いた解析では無用になったが、他のサンプルでの測定においては有用になることが多い。Nhsqc 上で強度が弱い信号がある場合や高分子量サンプ
ルにおいては、CB の信号が観測できずに連鎖確認できないことがある。N-NOESY はとても感度の良い測定であるため、代用として使うことができる。ただ観測できる信号数が多いため、活用には熟練度が必要かもしれない。やはり、これについても GB1 で確認をしておくと良いだろう。

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今回、cbca や hncacb についてはスペクトルを眺めるだけにとどめた。もちろん、スペクトル上にCB についての帰属を追加しても良いし、本来はその方が正しい。cconh についても同様である。CG、CD などの帰属が追加されるだろう。帰属されたカーボンの化学シフト値が、一般的な化
学シフト値の範囲内に収まっているかは先に示した図表を使用する、もしくは Sparky 上にて、”cs”（Chemical shift plot）を使うと良いだろう。
すべての主鎖帰属が完了した段階で、最終確認をする。”rl” で表示される Resonance List にて、帰属不能とした MC12 や MC12-i を除く MC が残っていないことを確認する。

32

10. NMRtist output
NMRtist による解析が終了した時には、status が finished になっており、Results についてOpen できるようになっている。ウェブ上で、その結果を閲覧することができ、また結果出力の全てをまとめたzipファイルを、results.zip としてダウンロードできる。今回は、スペクトルデータを開始データとして、ARTINA shift assigment を実行した。この場合、ARTINA peak picking およびARTINA shift assignment の２つが実行される。results.zip には、２つの結果がそれぞれフォル
ダ分けされて含まれている。ARTINA shift assignment の中にpeak picking の情報も含まれているので、ここでは ARTINA shift assignment の結果について検証していく。
Output files
results/
ARTINA_chemical_shift_assignment/
ARTINA_peak_picking/application_input_files.json
ARTINA_chemical_shift_assignment には、それぞれのスペクトルごとの .list ファイル、.nef ファ
イル、.peaks ファイルがある。拡張子 .list、.nef、.peaks のファイルはそれぞれSparkyフォーマット、star フォーマット、XEASY フォーマットであり、情報については同一である。スペクトル個別のファイル以外に、スペクトル全体での帰属情報をまとめた shift.nef、shift.prot、shift-strong.nef、
shift-strong.prot ファイルがある。strong が付与されたファイルは確度の高いもののみを抜き出したファイルである。また帰属の状況をまとめた flya_plot.jpg、
chemical_shift_assignment_plot.jpg などがある。
list2save.pl
上記の .list ファイルから saveファイルを作成する自作ツール
list2save.pl
NMRtist による帰属結果を Sparky 上で確認する。自作ツール list2save.pl を使用する。
ARTINA_chemical_shift_assignment フォルダを Sparky/Save/ の下にコピーする。
cp -r ARTINA_chemical_shift_assignment/ ~/Sparky/Save
ARTINA_chemical_shift_assignmentの下に移動し、ツールを実行する。ここでは、Nhsqcについてのみ紹介する。
cd ~/Sparky/SaveARTINA_chemical_shift_assignment/~/tools/list2save.pl ../Nhsqc.save N15HSQC_*.list > ../Nhsqc_ART.save
作成されたsaveファイルは、Sparky 上で開くことができる。
Verification
Sparky上で、Nhsqc_ART.saveを開く。”st” により、Rename を Nhsqc_ART とし、同時にcondition を ARTINAとする。”yt”, “ct” を駆使して比較閲覧できるようにする。ここでは、
Nhsqc_ART のスペクトル表示色を cyan とし、Nhsqc と同じ軸どうしを同期した。
list2save.pl では、Save ファイル作成時に shifts-strong.prot を参照し、その帰属状況に応じてピークの色が変わる。HN-HSQCでは２種類の原子核、15N核と1H核についての帰属がある。帰属状況の３つのパターンに応じて色が変わるようにした。両方ともにある場合、どちらかが（３次
元スペクトルではどれか一つでも）ある場合、どちらもない場合である。以下に Nhsqc_ART.saveの一部を表示している。
33

帰属がすべてある場合片方が欠けている場合どちらも見つからない場合
未帰属

黄色
オレンジ
赤
白

HN-HSQC 上で黄色に表示されている信号、すなわち全てが Strong として評価された帰属は手動帰属の結果と一致していた。

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