日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 92, 33-38, 2018

低分子量および高分子量 basic ﬁbroblast growth factor の生物活性の比較本澤慶子

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：清水典佳 教授，浅野正岳 教授）

要旨：電解酸性機能水（acid-electrolyzed functional water : FW）は食塩水を電気分解することによって陽極側に回収される水であり，高い殺菌効果を有している。FW の生物学的機能について検討することを目的として，
FW を子宮頸癌由来線維芽細胞（HeLa 細胞）に作用させ産生されるサイトカインの変化について調べたところ，
basic ﬁbroblast growth factor（bFGF）の分泌が促進されることが明らかとなった。 そこで immunoprecipitation（IP）-Western blot 法によりさらに検索したところ，18 kDa の bFGF に加え 34，24，22，20 kDa isoform も同時に分泌されることが明らかとなった。
そこで分泌が確認された全ての bFGF isoform のうち，nuclear localizing signal（NLS）が N 末端に存在する
high molecular weight（HMW）isoform（34，24，22，20 kDa）の一種である 34 kDa isoform に着目し，成熟型である low molecular weight（LMW）18 kDa isoform との生物活性の違いについて比較を行った。両 isoform をtranscription/translation kit を用いて作製した。作製したそれぞれの isoform は，SDS-PAGE により適正な位置に泳動され，enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）による定量の結果 18 kDa isoform は 6.78 ng/ml,
34 kDa isoform は 6.92 ng/ml であることが解った。これを用いて HeLa 細胞を刺激し，血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor : VEGF）の産生誘導能について比較検討した。その結果，両 isoform による刺激により HeLa 細胞において VEGF の有意な分泌増加を認めた。
これらの結果より，HMW bFGF は成熟型 bFGF と同様に VEGF 分泌誘導については，同様の生物活性を有していることが明らかとなった。
キーワード：HMW bFGF, LMW bFGF, VEGF, HeLa 細胞 , 電解酸性機能水緒

bFGF および HMW bFGF を強制発現した実験では，そ言れぞれ異なる標的遺伝子を誘導することから 10），機能的食塩水を電気分解することによって得られる電解酸性な違いがあるものと推定されている。一方，bFGF のす機能水（acid-electrolyzed functional water：FW）には高べての isoform は signal peptide を持っておらず 7），いい殺菌効果があり，臨床において消毒剤として広く使用

わゆる endoplasmic reticulum（ER）-Golgi 経路を経ずにされている 1-3）。FW の生物学的な機能については，FW分泌されるなど共通する性質も有しているが，その分泌が HeLa 細胞に対して basic fibroblast growth factor

メカニズムは依然として解明されていない 11, 12）。

（bFGF）分 泌 を 有 意 に 増 加 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い

また，FW 刺激後の細胞損傷の程度を確認するために，

4）る 。bFGF は多様な生物活性を有する 18 kDa のタンパ

培養上清中の lactate dehydrogenase（LDH）放出量を計ク質である 5, 6）。bFGF 遺伝子の塩基配列の分析により，測したところ，HeLa 細胞において LDH 放出量は有意に18 kDa bFGF の上流に定型的な translation initiation

増加していた 4）。さらに，bFGF はストレス環境下で分codon である ATG ではなく，非定型的な CTG codon か泌されることが報告されているため 13），FW 刺激によるら翻訳される high molecular weight（HMW）bFGF の存

bFGF 分泌誘導は細胞障害に対する応答の結果である可在が明らかとなり，これらは分子量 34，24，22，20 kDa能性が考えられる。損傷した細胞によって分泌される分

7）を 示 す こ と が 明 ら か に さ れ て い る 。Low molecular子は alarmin と総称され 14），免疫機能の賦活化やシグナweight（LMW）bFGF で あ る 18 kDa bFGF と HMW

ル配列を持たないなどの機能的・構造的類似性を有して

bFGF を 比 較 す る と，HMW bFGF の N 末 端 側 に はいる。bFGF はこれらの特徴を有していることから一種

nuclear localizing signal（NLS）が存在する点が構造上大の alarmin であると考えられている。本研究では，FWき く 異 な る。 こ の た め 両 者 の 細 胞 内 局 在 が 異 な り，

刺激によって放出される bFGF の分子形態を解明すると

8）

LMW bFGF は主に細胞質に ，HMW bFGF は核に存

共に，これらの isoform の機能的な相違について検討す

在 す る と さ れ て い る 9）。Transfection に よ っ て LMWることを目的とした。

（受付：平成 30 年 1 月 15 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1333

第1表

プライマーの配列

Systems（Promega）を用いて転写 / 翻訳反応を行った。

材料および方法
1.

pcDNA-18 kDa，pcDNA-34 kDa（GCG）発現ベクターをXba I digestion により直鎖化した。それぞれのベクター細胞培養

1μg を T NT master mix 80μl と 1 mm メチオニン 2μl

本研究にはヒト子宮頸癌由来細胞株 HeLa 細胞（ヘルスサイエンス研究資源バンク）を用いた。10% ウシ胎児に混和し，30℃において 90 分間反応した。

血清（Fetal calf serum：FCS）および 1% ペニシリン - ス

4.

ELISA

ト レ プ ト マ イ シ ン（Sigma-Aldrich）を Dulbeccoʼstranscription/translation 反応にて得たサン

Modiﬁed Eagle Medium（DMEM；Gibco）に添加し（10%プ ル の bFGF 濃 度 は，ELISA Development SystemFCS-DMEM），37℃，5% CO2 存 在 下 に て 培 養 し た。

（R&D Systems）を用いて定量した。また，HeLa 細胞を

HeLa 細胞は 35 mm Dish（Falcon）に 5×105 cells/well

35 mm Dish（Falcon）に 5×105 cells/well となるようにとなるように播種し，12 時間後に実験に使用した。

播種したものに，2.

応により得たサンプルの bFGF 濃度をそれぞれ 100 pg/FW 刺激

transcription/translation 反HeLa 細胞を PBS で 2 回洗浄後，FW（pH2.2-2.7，有効ml に統一し作用させ，12 時間後に回収した培養上清中

塩素濃度 20~30 ppm；三浦電子社）1.0 ml を添加し 30 秒の VEGF 濃 度 を ELISA Development System（R&D

間刺激後に 10% FCS-DMEM 1.0 ml を添加し FW 刺激Systems）を用いて定量した。

を停止した。この溶液を吸引除去後，新たに 10% FCS-5.

DMEM 1.0 ml を添加し 3 時間培養した。その後，培養

Immunoprecipitation（IP）-Western blot 法
FW 刺激後の HeLa 細胞の培養上清を Amicon Ultra

上 清 を 回 収 し 遠 心 分 離 に よ り 細 胞 残 渣 を 除 去 し た 後，遠心式限外ろ過フィルター（Merck Millipore）を用いてimmunoprecipitation（IP）に供した。

約 6 倍に濃縮した。抗 FGF2 抗体（Abcam）を添加し，4℃

3.

発現ベクターの構築および recombinant 蛋白の作製で 12 時 間 ロ ー テ ー シ ョ ン を 行 っ た。 さ ら に Protein

34 kDa bFGF の full length cDNA は HeLa 細胞由来G-Sepharose（GE Healthcare）を添加し，さらに 1 時間，の cDNA をもとに Polymerase Chain reaction（PCR）法

4℃でローテーションを行った。反応後のサンプルを氷にて増幅した。使用したプライマーは第 1 表に示す。こ冷した phosphate buffered saline（PBS）で 5 回洗浄しの 断 片 を 発 現 ベ ク タ ー で あ る pcDNA3.1 の EcoR Ⅰ と12% SDS-PAGE に供した。通法に従い transfer した後，Hind Ⅲ site（Promega）に subcloning した。この plasmid

1% BSA-PBST（0.2% tween-20/PBS）によりブロッキンを テ ン プ レ ー ト と し て quick change site-directedグを行った。一次抗体はマウス抗ヒト bFGF モノクロー

mutagenesis kit（Agilent Technologies）を 用 い てナル抗体（FB-8；Abcam）を 1% BSA-PBST で 1,000 倍希translation initiation codon である CTG を ATG に変

釈 し た も の を 用 い た。 二 次 抗 体 は ヤ ギ 抗 マ ウ ス IgG換，さらに 18 kDa bFGF の translation initiation codon（H+L）抗体（Abcam）を 1% BSA-PBST で 10,000 倍希釈である ATG を GCG に変換したものを pcDNA-34 kDaしたものを用いた。バンドは ECL kit（GE Healthcare）ベクターとした。この pcDNA-34 kDa ベクターをテンプを用いて検出した。

レ ー ト と し て 成 熟 型 18 kDa bFGF を 設 計 し pcDNA-

6.

18 kDa ベクターとした。

統計学的分析
Studentʼs -test をすべての統計分析に使用した。結果構築した 18 kDa および 34 kDa 発現ベクターを用いては平均 ± 標準偏差（standard deviation：SD）として示し

T NT Q u i c k C o u p l e d T r a n s c r i p t i o n / T r a n s l a t i o n

た。P 値が 0.05 未満を統計的に有意差ありとした。

34

高分子量 basic ﬁbroblast growth factor の生物活性結
1.

transcription/translation を 行 っ た。 反 応 後 の 溶 液 の果bFGF を 定 量 し た と こ ろ（ 第 4 図 ），mock vector で はbFGF の 発 現 は 認 め ら れ な か っ た も の の，pcDNA-

FW 刺激により分泌促進される bFGF の分子量FW 刺激により分泌促進される bFGF の分子量につい18 kDa および pcDNA-34 kDa を用いた反応系ではそれて，IP-Western blot 法により観察したところ，刺激 3

ぞれ 6.78 ng/ml，6.92 ng/ml の bFGF の産生が確認され時間後の培養上清中に 34，24，22，20 および 18 kDa のた。そこでそれぞれの産物の分子量を確認するために，bFGF が確認された（第 1 図）。

反応溶液を IP-Western blot 法により検討した。その結2.

果，それぞれの反応液中に当該分子量の bFGF の単一バ

HMW および LMW bFGF の相違ンドが確認された（第 5 図）。

HMW bFGF の中で 34 kDa の分子に着目し，18 kDa

4.

bFGF との構造的な違いについて調べた（第 2 図）。また，

HeLa 細胞における VEGF 産生誘導

今回新たに構築した 34 kDa bFGF の pcDNA ベクター得られた 18 kDa および 34 kDa bFGF を用いて HeLaを第 3 図に示す。これを pcDNA-34 kDa と命名し以下の細胞の刺激を行った。その結果，第 6 図に示した通りコ実験に供した。

ン ト ロ ー ル と 比 較 し，18 kDa bFGF で は 約 1.7 倍，3.

34 kDa bFGF では約 2.0 倍の VEGF の有意な産生増加

transcription/translationを認めた。

作 製 し た そ れ ぞ れ の ベ ク タ ー を 用 い て，考察

本研究の結果，FW は HeLa 細胞に作用してすべてのisoform の bFGF の分泌を促進することが明らかとなった。LMW bFGF と HMW bFGF の違いは，後者が NLS

第3図

第1図

FW 刺激により分泌促進される bFGF の分子量FW 未刺激（-）および 30 秒間刺激（+）の HeLa 細胞を 3 時間培養し，得られた培養上清を用いて IP-Western blot 法を行った。図の右側に bFGF isoform の分子量を示す。

第2図

18 kDa bFGF および 34 kDa bFGF の構造の相違
NLS：nuclear localizing signal

35

pcDNA-34 kDa ベクター
34 kDa bFGF の 効 率 的 な 発 現 の た め に translation
initiation codon で あ る CTG を ATG に 変 換， さ ら に
18 kDa bFGF の発現を除去するために 34 kDa bFGF の中 間 に 存 在 す る 18 kDa bFGF の translation initiation
codon で あ る ATG を GCG に 変 換 し た も の を pcDNA34 kDa ベクターとした。

第4図

18 kDa および 34 kDa の bFGF 産生
pcDNA-18 kDa, pcDNA-34 kDa お よ び mock vector を 用 い てtranscription/translation を行った。産生された recombinant bFGF を ELISA により定量した。
* ＜ 0.05
データは 3 つの独立した実験の平均 ±SD 値を示す。
N.D.：not detected

bFGF の産生効率が極めて低かった。そこで代替え法としてtranscription/translation を 行 っ た が，

34 kDa bFGF の translation initiation codon CTG をATG に変換しないと 18 kDa bFGF のみが産生されてしまい，また 18 kDa bFGF の ATG を CTG に変換しないと 34 kDa と 18 kDa の両分子がほぼ同等の効率で産生されてしまうことが解った（データは示していない）。また，transfection にあたり数種類の細胞を用いたが，細胞間で大きな違いは認められなかった。生体内で CTG codonからなぜ bFGF の translation が開始されるのかという
第5図

18 kDa および 34 kDa の分子量の bFGF
IP-Western blot 法にてtranscription/translation
で作製した pcDNA-18 kDa ベクターと pcDNA-34 kDa ベ
ク タ ー の 分 子 量 を 確 認 を し た と こ ろ，18 kDa お よ び
34 kDa bFGF が認められた。

問題は今後さらに検討する必要があると考えている。
NLS を有する 34 kDa bFGF は主に核内に存在するが，FW 刺激に対応してどのようなメカニズムで分泌されてくるかは明らかにされていない。一般に，細胞が壊死に陥る際には細胞核の中から様々な分子が放出されることを有していることである。すなわち NLS の存在によりが報告されている 9）。これらの分子は alarmin と総称さ9）

HMW bFGF は主に核内に局在すると考えられている 。

れ，interleukin-1 α や high mobility group box-1 など

これまで HMW bFGF を強制発現させると，細胞の増殖が知られている 19）。これらの分子も N 末端側に NLS を速度が上昇するという報告 15-18）はあるものの，両者の生有しており，bFGF と共通している。またこれら以外に，物活性の本質的な違いについては不明な点が多かった。

最近では核にしか存在しないとされていたヒストンが細そこで本研究ではtranscription/translation を胞外に放出され，核内とは全く異なった機能を有してい用いて recombinant bFGF を作製し，LMW bFGF でこることが報告されている 20）。上記の alarmin は，いわゆ

れまで報告のあった 4）VEGF 誘導能について比較検討しる signal peptide を持たず，典型的なタンパク質分泌経た。

路である ER-Golgi 経路を経由しないことが解っている

当 初 は 培 養 細 胞 に transfection を 行 い 発 現 さ せ たが，bFGF も signal peptide を有していない。これらの

bFGF を用いて検討することにしていたが，この方法で共通点がどのような生物学的意味を持つのか今後さらなは 18 kDa bFGF の み が 効 率 的 に 産 生 さ れ，34 kDa

る研究が必要である。

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高分子量 basic ﬁbroblast growth factor の生物活性第6図HeLa 細胞における VEGF 産生に及ぼす影響
transcription/translation で作製した 18 kDa および 34 kDa bFGF を HeLa細胞に作用させ，12 時間後に回収した培養上清中の VEGF を ELISA により定量した。
* ＜ 0.05
データは 3 つの独立した実験の平均 ±SD 値を示す。

本実験により，NLS が存在するにもかかわらず HMW

文 献

bFGF は LMW bFGF と同様に VEGF 誘導能を有してい

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結論

本研究では recombinant bFGF を用いて，HMW とLMW bFGF の生物活性の違いについて検討を行った。
その結果，以下の結論を得た。
1.

HeLa 細 胞 に お け る FW 刺 激 は 全 て の bFGF
isoform の分泌を促進させた。

2.

HeLa 細胞において，HMW bFGF と LMW bFGF
はともに VEGF の分泌を誘導した。
以上のことから，HMW bFGF は NLS が存在するにもかかわらず LMW bFGF と同様に VEGF 誘導能を有していることが明らかとなった。
稿を終えるにあたり，懇切なるご指導を賜りました日本大学歯学部歯科矯正学講座の清水典佳教授に謹んで感謝申し上げます。
本研究を格別なるご指導およびご校閲賜りました日本大学歯学部病理学講座の浅野正岳教授に心より深く感謝申し上げます。
また本研究の遂行を始終支援して下さいました日本大学歯学部歯科矯正学講座の本吉満准教授に深謝いたします。
最後に，本研究に関し多大なるご協力およびご助言を賜りました，日本大学歯学部歯科矯正学講座および日本大学歯学部病理学講座の皆様に感謝いたします。
なお，本論文に関して開示すべき利益相反はない。

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