バイオ実験キット

Dr.ジーンシリーズ

取扱説明書

株式会社ニッポンジーン
富士フイルム和光純薬株式会社

第2版

目次

1．本キットについて······················································································· 22．キット内容
1) キット構成（6 班分）········································································ 42) キット以外に必要なもの····································································· 5

3．使用上の注意····························································································· 6

4．「遺伝子組換え生物等規制法」について
5．実験プロトコルについて······························································· 7················································································· 10

6．実験準備 （実験方法 1・2 共通）
1) 前日までの準備（大腸菌培養用プレートの作製）
2) 当日の準備
7．実験の流れ···································11····················································································· 16······························································································ 17

8．実験方法 1 / 実験プロトコル············································································· 181) 実験をはじめる前に＜実験方法 1＞···················································· 192) 実験操作＜実験方法 1＞形質転換実験················································· 20

9．実験方法 2 / 実験プロトコル············································································· 291) 実験をはじめる前に＜実験方法 2＞···················································· 302) 実験操作＜実験方法 2：1 日目＞マスタープレートの作製
3) 実験操作＜実験方法 2：2 日目＞形質転換実験······················· 31······································ 35

10．データの解析························································································· 44

11．廃棄物の処理·························································································· 48

11． 本キットについて
本キットは、遺伝子組換え実験に汎用されるプラスミド DNA と、そのプラスミド
DNA に新たに遺伝子を導入した DNA の二種類の DNA を大腸菌 JM109 株に導入するキットです。形質転換を中心とした遺伝子組換え実験を体験・理解することができます。
実験操作は簡単で、オートクレーブ以外の特別な設備を必要としません。（オートクレーブの代用として圧力釜が使用できます。）
遺伝子工学における形質転換とは、新たな遺伝子により生物の性質が変化することであり、生物の性質を人為的に変えるためにその生物へ遺伝子を導入することを意味しています。生物の細胞内へ新たな遺伝子を含む DNA が取り込まれると、この新しい遺伝情報がしばしばその生物へ新たな性質を与えることがあります。
本キットでは、「大腸菌を寒天プレートで培養」、「大腸菌の細胞膜を変化させてプラ
スミドと呼ばれる小さな環状 DNA を細胞の中に取り込める状態にする（コンピテント
セルの作製）」、「プラスミド DNA を大腸菌に導入（形質転換）」、「形質転換により新たな性質を獲得した大腸菌を観察する」という遺伝子組換え実験を行います。
本キットで使用するプラスミド DNA に導入した新たな遺伝子は、2008 年にノーベル化学賞の受賞対象となった GFP 遺伝子です。この遺伝子を導入した DNA を取り込んだ大腸菌は、UV ライトの照射により緑色の蛍光を発します。GFP（緑色蛍光タンパ
ク質, Green Fluorescent Protein）とは、オワンクラゲ（Aequorea victoria）より単離されたタンパク質です。GFP は、生命科学や医学などの研究分野においてもマーカー(目印用のタンパク質)として幅広く利用され、iPS 細胞の研究にも利用されています。
本キットでは２通りの方法で形質転換実験を行うことができます。
詳細は、5. 実験プロトコルについてをご参照ください。
実験方法１：キット添付の大腸菌を用いてコンピテントセルを作製し、プラスミド DNA を導入して形質転換実験を行います。約 90 分で実験が終了します。
実験方法 2：キット添付の大腸菌を寒天プレートで培養し、成長したコロニーを用いてコン
ピテントセルを作製します。形質転換実験は実験方法 1 と同様です。形質転換実験（約 90 分）に加え、大腸菌を寒天プレートで培養する時間（一晩）が増えますが、大腸菌を扱う際の基本操作を習得できます。

2

本キットで使用するプラスミド DNA について

プラスミド pUC18

プラスミド pUC18-GFP

大腸菌には自己のゲノム DNA の他に小さな環状 DNA を持っているものがあります。
この環状 DNA をプラスミド DNA といいます。プラスミド DNA は大腸菌内で自己複製し増殖します。
pUC18 は、抗生物質アンピシリンに対する薬剤耐性遺伝子を持ったプラスミド DNAです。このプラスミドが大腸菌内に取り込まれると、アンピシリン耐性遺伝子によりβ-ラクタマーゼというアンピシリン分解タンパク質が発現し、大腸菌はアンピシリン存在下でも生育できます。
（アンピシリンプレートでコロニーの確認ができます。）
pUC18-GFP は、pUC18 の中に GFP というタンパク質の遺伝子を組み込んであります。
このプラスミドは、pUC18 同様にアンピシリン存在下でも生育できます。さらに、GFP
遺伝子の発現により、UV ライトの照射により緑色に光るコロニーを観察することができます。
本実験では、pUC18、および pUC18-GFP を取り込んだ大腸菌を作製します。

3

2． キット内容
1) キット構成（6 班分）
内容

容量

pUC18 DNA

15 µl

pUC18-GFP DNA

保存

チェック

6 本（透明チューブ）

-20℃

□

15 µl

6 本（黄色チューブ）

-20℃

□

大腸菌 JM109

100 µl12 本（緑色チューブ）-80℃(-20℃)

□

IPTG

150 µl6 本（透明チューブ）

-20℃

□

塩化カルシウム

500 µl6 本（水色チューブ）

-20℃

□

SOC 培地

1 ml

6 本（スクリューチューブ） 室温暗所□

アンピシリン500 µl1 本（スクリューチューブ）

-20℃

□

IPTG

150 µl6 本（透明チューブ）

-20℃

□

LB 寒天培地

―

7袋

室温

□

滅菌済みシャーレ

―

80 枚

室温

□

1.5 ml チューブ（透明）

5本

室温

□

1.5 ml チューブ（黄色）

5本

室温

□

1.5 ml チューブ（水色）

3本

室温

□

コンラージ棒

5本

8袋

室温

□

マイクロループ

10 本

7袋

室温

□

チューブ立て

―

12 個

室温

□

フロート

―

6個

室温

□

※

数量

13 本×6 袋

本キットは保存温度の異なる試薬で構成されています。必ずそれぞれ指定の温度で保管してください。特に大腸菌 JM109 は低温フリーザー(-80℃)での保存をお勧めします。無い場合は冷凍庫の奥など温度変化が極力小さい場所に保管
し、実験を行うまで溶けないようご注意ください。一度溶けると形質転換効率が著しく低下します。

※

プラスチック器具類は必要数より多めに入っています。

※

1.5 ml チューブ、コンラージ棒、滅菌済みシャーレ、およびマイクロループは滅菌済みです。

42) キット以外に必要なもの
器具、装置など

補足

チェック

マイクロピペット～20 µl 用（P20）、～200 µl 用（P200）□

マイクロピペット用チップ

オートクレーブ滅菌済が望ましいです。

□

500 ml 三角フラスコ 2 本

実験準備（前日までの準備）で使用します。

□

500 ml メスシリンダー 1 本

実験準備（前日までの準備）で使用します。

□

ガスバーナー・ライター類

クリーンベンチ内・実験台どちらでも構いません。

アルミホイル

実験準備（前日までの準備）で使用します。

ビニールテープ

LB 寒天培地の蓋が不本意に開くのを防ぎま
す。

□
□
□

温度計

ウォーターバスの温度を測ります。

□

ウォーターバス

42℃で使用します。*1)□

エアインキュベーター

37℃で使用します。

□

オートクレーブ

実験準備（前日までの準備）で使用します。
圧力釜での代用が可能です。

UV ライトまたは、ブラックライト
UV ライト防護用ゴーグル等

コロニーの蛍光観察に使用します。

□□

UV ライトから目を守ります。コロニーの蛍光観察の際に必要に応じて準備してくださ

□

い。
カウンター

結果を観察する際に使用します。無くても問題はありません。

□

氷、及び氷を入れる容器

各班 1 つ以上あると便利です。

□

油性ペン

極細が便利です。記名に使用します。

□

滅菌用エタノール（70%程度） 実験台を拭く際に使用します。
廃棄チップ入れ□廃棄チップはオートクレーブ等で滅菌後廃棄します。対応できるもの（ビーカーなど）□をご用意ください。
手袋

実験に使用した培地を廃棄する際に、着用をお勧めします。
*1)□

発泡スチロールの箱で代用できます。本キット輸送用の箱の利用が便利です。

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3． 使用上の注意


本品は試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用できません。
また、試薬についての基本的な知識を十分に理解した上で使用してください。



本品の取り扱いは、マニュアルの記載通りに行ってください。マニュアルの記載内
容と異なった取り扱いによるトラブル、事故につきましては、弊社では責任を負い
かねます。



本品の仕様は、ご使用になったお客様のご意見等を参考に予告なく変更されることがあります。



本キットは二種類の実験方法のうちどちらかで実習を行うことができます。実験
方法 1（大腸菌 JM109 から直接コンピテントセルを作製し、形質転換する方法）と実験方法 2（一度大腸菌 JM109 のマスタープレートを作製し、生じたコロニーからコンピテントを作製、形質転換する方法）では、実験操作や使用する器具の数、実験に要する時間が異なります。

6

4． 「遺伝子組換え生物等規制法」について
遺伝子組換え実験では本来自然界に存在しない組み合わせの遺伝子を容易に作り出すことが可能です。したがって、その有用性と共に自然界に対する予測できない危険性を含んでいることを十分理解しておく必要があります。
遺伝子組換え実験を安全に行うために、平成 16 年 2 月に「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（いわゆるカルタヘナ法または遺伝子組換え
生物等規制法）」が施行されました。日本国内で遺伝子組換え実験を行うすべての研究者は、
この法律の定めに従って実験を計画し、行わなくてはなりません。本キットを使って実験を行う前にも、この法律に目を通して内容を理解し、学生にもその趣旨と内容を理解させてください。
カルタヘナ法（遺伝子組換え生物規制法）につきましては、文部科学省ホームページにわ
かりやすく記述されています。たいへん参考になりますので、必ずご一読願います。
文部科学省ホームページ
http://www.lifescience.mext.go.jp/bioethics/anzen.html#kumikae
拡散防止措置とは
遺伝子組換え実験においては、組換え体を実験室内に封じ込め、外部に拡散させないような「拡散防止措置」を取らなくてはなりません。扱う生物や遺伝子の危険度に合わせて P1～P4 までの区分があります。Dr.ジーンシリーズで使われている材料はすべて安全性が高く、「P1」レベルの拡散防止措置を執ることで外部への拡散を防ぐことができます。
一般的な学校の理科室であれば「P1」の要件を満たしています。
以下の記述は文部科学省ホームページ中の「高等学校などで遺伝子組換え実験を行う皆様へ」と題されたリーフレットより抜粋した内容になっています。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
・ルール①

遺伝子組換え実験中の拡散防止措置をしっかりとること！

遺伝子組換え実験を行う上で最も大事なことは、実験に用いる遺伝子組換え生物を実験室の外へ拡散させないことです。この拡散を防ぐため、カルタヘナ法（遺伝子組換え生物規制法）では、実験の種類に応じた「拡散防止措置」をとるよう定めています。
しかしながら、通常の教育目的の遺伝子組換え実験であれば、この拡散防止措置は「P1」と呼ばれるものとなります。下記の「P1」チェックリストを参考に、遺伝子組換え実験を始める前に、これらの内容を全て満たすかどうかについてチェックしましょう。

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「P1」チェックリスト
拡散防止措置の内容① 実験室が、通常の生物の実験室としての構造及び設備を有すること。
② 遺伝子組換え生物等を含む廃棄物（大腸菌などの菌液、廃液を含む。
）について
は、廃棄の前に遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講ずること。
（具体例：オートクレーブ装置を用いた滅菌。70%アルコールによる殺菌）③ 遺伝子組換え生物等が付着した設備、機器及び器具については、廃棄又は再使用（あらかじめ洗浄を行う場合にあっては、当該洗浄。）の前に②と同様に遺伝
子組換え生物等を不活化するための措置を講ずること。
④ 実験台については、実験を行った日における実験の終了後、及び遺伝子組換え生物等が付着したときは直ちに、遺伝子組換え生物等不活化するための措置を講ずること。
（具体例：70%アルコールによる拭浄）⑤ 実験室の扉については閉じておくこと（実験室に出入りするときを除く。）。
⑥ 実験室の窓等については、昆虫等の侵入を防ぐため、閉じておく等の必要な措置を講ずること。
⑦ すべての操作において、エアロゾルの発生を最小限にとどめること。
（具体例：白金耳を菌のついた状態で焼かないこと（焼く前に 70%アルコールに浸すと良い）。）⑧ 実験室以外の場所で遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講じようとするときなど、実験の過程において遺伝子組換え生物等を実験室から持ち出す
ときは、遺伝子組換え生物等の漏出や、拡散が起こらない構造の容器に入れること。
⑨ 遺伝子組換え生物等が付着し、又は感染することを防止するため、遺伝子組換え生物等の取扱い後における手洗い等の必要な措置を講ずること。
（具体例：実験の前後の手洗い、実験中に髪をさわらない）⑩ 実験の内容を知らない者が、みだりに実験室に立ち入らないための措置を講ずること。
（具体例：「遺伝子組換え実験中につき関係者以外立入禁止」などの表示）

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ﾁｪｯｸ欄

・ルール②

保管中の拡散防止措置をしっかりとること！

数週間にわたって実験を行う場合、作製した遺伝子組換え生物を保管する必要があります
が、この場合には、A．遺伝子組換え生物が漏出しない容器に入れ、容器に遺伝子組換え生物である旨の表示をすること、B．冷蔵庫など決められた場所に保管し、見やすい箇所に遺伝子組換え生物である旨の表示をすること（つまり、A と B の 2 カ所の表示をしなければなりません）、を守る必要があります。

・ルール③体制を整備すること！

カルタヘナ法（遺伝子組換え生物規制法）では、遺伝子組換え実験を行う際に、その安全な取扱いについて検討する委員会を設置し、検討を行うように求めているところですが、通常の教育目的の実験であれば、安全管理が容易なことから、こうした委員会の設置は必須ではありません。
しかしながら、遺伝子組換え実験の内容や安全管理の方法などを組織として十分に把握した上で、実験を行うことが必要であると考えられています。また、実験を指導する方々は、
遺伝子組換え生物等の取扱いについて十分な経験を有していることが望まれます。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊

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5． 実験プロトコルについて
本キットでは、2 通りの実験方法が行えます

実験方法 1
キット添付の大腸菌 JM109 を直接処理し、実験に使用するコンピテントセルを作製します。実験方法 2 と比べ簡単に短時間で形質転換実験を行うことができます。

実験方法 2キット添付の大腸菌 JM109 を一度プレート上で培養します。その後生じた大腸菌
JM109 コロニーを用いてコンピテントセルを作製し、形質転換の実験を行います。実験
方法 1 と比べ作業は多くなり時間がかかりますが、大腸菌を扱う基本操作（プレート上での培養）を習得できます。

3 日前

LB プレートの作製

2 日前

前日

実習当日

翌日

予備実験
形質転換および

実験方法 1

非形質転換実験

LB プレートの作製

予備実験
マスタープレートの作製

実習

形質転換および
非形質転換実験
マスタープレートの作製

実験方法２

実習

実習の始まる前に、あらかじめ予備実験を行っておくことをお勧めします。
予備実験はスケジュール表の通りに行う必要はなく、実習前のいつ行ってもかまいません。
ただし、本キットには予備実験のための試薬等は含まれておりません。予備実験の際には本キットの一部を使用して行っていただくことになります。
キットに含まれる大腸菌 JM109 は凍結融解を行うと形質転換効率が著しく低下します。
予備実験の際は必要な分だけ取り出し、他の大腸菌を溶かさないよう注意してください。

10

6． 実験準備（実験方法 1・2 共通）
以下の操作はあらかじめ実験を指導する方が行ってください。
時間に余裕がある場合は学生が行っても構いません。

1）前日までの準備（大腸菌培養用プレートの作製）
大腸菌培養用プレートは実習の前日までに作製してください。
（一週間前からの作製が可能です。
）
作製したプレートは 4℃(冷蔵庫)で保存し、実習の前日の夕方に実験台の上に出し、プ
レートの表面を少し乾かします。この時プレートの蓋は絶対に開けないでください。
プレートを乾かすことで大腸菌液が培地中にスムーズに吸収され、実験が行いやすく
なります。
フラスコ

水

LB 寒天培

アンピシリンシャーレ

地－

アンピシリン無プレート(Amp )500 ml 容量

300 ml

3袋

―

30 枚

アンピシリン有プレート(Amp＋)

500 ml 容量

400 ml4袋

400 l40 枚「Amp」：アンピシリン(Ampicillin)と呼ばれる抗生物質を示します。
「Amp－」は、Amp を培地に添加していない状態を示しています。

手順

注意点

500 ml の三角フラスコを 2 本とメスシリンダーを用意します。

300 ml の培地はアンピシリン

一本の三角フラスコに 300 ml の水を入れます。

無プレート(Amp－)、400 ml

もう一方の三角フラスコに 400 ml の水を入れます。

の培地はアンピシリン有プレ

この時使用する水は、できート(Amp＋)を作ります。

培地の調製・滅菌

1.

ればイオン交換水か蒸留水を使用してください。無け

水

れば、水道水でも構いません。

2.

300 ml400 ml

付属の「LB 寒天培地」を加え撹拌します。
水 300 ml の三角フラスコには
3 袋添加します。
水 400 ml の三角フラスコには
4 袋添加します。

300 ml11

400 ml3.

アルミホイルで蓋をし、フラスコを手で軽く撹拌してください。

アルミホイルを四つ折りにし、二重の状態でフラスコにかぶかぶせる

せ、密封してください。

アルミホイル

4.

5.

撹拌後、オートクレーブに移し、121℃、15 分間滅菌します。

滅菌後のフラスコは大変熱く

オートクレーブがない場合は、市販の圧力鍋を使用しても構いません。

なっています。火傷に気をつけ

時間は 20 分間程度です。十分な滅菌効果を確認しています。

てください。

オートクレーブが終了したら、しばらく放置し、少し温度が下がってから軽く撹拌して培地を混ぜてください。オートクレーブが終了して直ぐに培地を撹拌すると突沸してやけどをすることがあります。

培地の入ったフラスコを室温に放置し、手で持てるぐらいまで（約50℃）冷まします。培地温度が下がると固まってしまうので注意してください。（*１）

アンピシリン無プレート(Amp－)の作製
300 ml の培地が入ったフラスコを用意し、手順 6 へ
アンピシリン有プレート(Amp＋)の作製
400 ml の培地が入ったフラスコを用意し、手順 7 へ(*1)

オートクレーブの中などで保温しておき、培地の温度が 50℃以下にならないようにしてください。
固まってしまった場合はもう一度オートクレーブへ入れて溶かしてください。この場合は溶かすことだけが目的です。121℃まで温度が上昇したらすぐにオートクレーブを止めて圧力が下がるのを待ちます。この時、培地の色が多少濃くなりますが実験には影響ありません。

12アンピシリン無プレート(Amp－)の作製

6.

この操作はクリーンベンチや安全キャビネット内で行います。無い場合＜シャーレ 30 枚＞

は実験台の上でも構いませんが、できるだけガスバーナーの近くで行っ12 枚（必要数）てください。実験室の窓および扉を締め切り、実験台の上を 70%エタ・コントロール実験用
6 枚(1 枚×6 班分)

ノールでペーパータオル等を用いて拭いておきます。

・マスタープレート用
6 枚(1 枚×6 班分)(1)

18 枚（予備)

ガスバーナーの火をつけます。
以降の操作はガスバーナーの火の周囲で行ってください。
空気中からの細菌の落下を少なくし、火傷には十分注意してくださ

無菌に近い状態を作ることができます。

い。ガスバーナーは空気を少なくしてオレンジ色の炎が見え(2)

300 ml の培地が入った三角フラスコを用意します。

るようにしてください。

フラスコ上部のアルミホイルを取り、口のところをガスバーナーの火で軽くあぶります。片手で一番下のシャーレの蓋とともに上のシャーレを

シャーレの袋はクリーンベン

一緒に真上に持ち上げます。もう一方の手で培地の入った三角フラスコ

チ内で開けます。（クリーンベを持ち、シャーレに約 10 ml ずつ（シャーレの半分くらいの高さまで） ンチがない場合は、培地をプレ培地を注ぎ込みます。

ートに注ぐ直前まで、シャーレの蓋は開けないでください。）

シャーレを 1 枚ずつ横にならべて培地を注いでも大丈夫で出来るだけ素早く培地を注いでください。

す。

（培地が冷えて固まることがあります。）(3)

培地が固まったら、シャーレの底面に Amp－（マイナス）と油性ペンで書いてシャーレを積み重ね
ます。

(4)

蓋ではなく、培地の入っている

Amp-

方に記入します。

プレートをすぐに使用しない場

ビニールテープは、予期せず蓋合は、プレートをビニールテーが開くのを防ぐために使用しプで止め、逆さにした状態でビています。

ニール袋に入れて冷蔵庫に保存

Amp－

します。

13

アンピシリン有プレート(Amp＋)の作製

7.

この操作はクリーンベンチや安全キャビネット内で行います。無い場合＜シャーレ 40 枚＞は実験台の上でも構いませんが、できるだけガスバーナーの近くで行っ18 枚（必要数）てください。実験室の窓および扉を締め切り、実験台の上を 70%エタ

・形質転換実験用

ノールでペーパータオル等を用いて拭いておきます。

12 枚(2 枚×6 班分)
・コントロール実験用
6 枚(1 枚×6 班分)
22 枚（予備)(1)

ガスバーナーの火をつけます。
以降の操作はガスバーナーの火の周囲で行ってください。
空気中からの細菌の落下を少なくし、火傷には十分注意してくださ

無菌に近い状態を作ることができます。

い。ガスバーナーは空気を少なくしてオレンジ色の炎が見えるようにしてください。

(2)

400 ml の培地が入った三角フラスコを用意します。
三角フラスコが手で持てるぐらいまで（約 50℃）冷めていることを再度確認します。フラスコの上部のアル

400 μlミホイルを取り、ピペットを使ってキット添付のアンピシリン（スクリューチューブ）を 400 µl 加え、フラスコを振って混ぜます。(*2)(*2)

50℃以上の培地にアンピシリンを加えるとアンピシリンが分解し、抗菌作用を示さなくなる恐れがあります。また、温度が下がりすぎると培地が固まってしまうので注意してください。アンピ
シリン添加後に培地が固まり、再びオートクレーブなどで温めた場合、再度アンピシリンを添加しなければなりません。本キットには、アンピシリンは一度添加する分(400 l＋100 l)しか入っていません。注意してください。

14

(3)

口のところをガスバーナーの火で軽くあぶります。片手で一番下のシャシャーレの袋はクリーンベンーレの蓋とともに上のシャーレを一緒に真上に持ち上げます。もう一方

チ内で開けます。（クリーンベの手で培地の入った三角フラスコを持ち、シャーレに約 10 ml ずつ（シンチがない場合は、培地をプレ

ャーレの半分ぐらいの高さまで）培地を注ぎ込みます。

ートに注ぐ直前まで、シャーレの蓋は開けないでください。）

シャーレを 1 枚ずつ横にならべて培地を注いでも大丈夫です。

出来るだけ素早く培地を注いでください。
（培地が冷えて固まることがあります。）(4)

培地が固まったら、シャーレの底面に Amp+

蓋ではなく、培地の入っている（プラス）と油性ペンで書いてシャーレを方に記入します。

積み重ねます。

Amp+(5)

プレートをすぐに使用しない場

ビニールテープは、予期せず蓋合は、プレートをビニールテーが開くのを防ぐために使用しプで止め、逆さにした状態でビています。

ニール袋に入れて冷蔵庫に保存

Amp＋

します。

15

2) 当日の準備
以下の準備は実験直前に準備してください。

① 氷の準備可能であれば各班の分を準備します。
氷が大きい場合は氷中にチューブを差し込むことができるサイズに砕いてください。
氷水を作ります。氷が少量しか用意できない場合
は、水を多くし、フロートでチューブを浮かべて使用してください。
実験中に氷が溶けないように注意してください。

② ウォーターバス、インキュベーターの準備
42℃（形質転換）用としてウォーターバス、
37℃（回復培養、およびプレート培養）用として、エアインキュベーターを用意します。
ウォーターバスが無い場合は発泡スチロール箱に 42℃の湯水を作ります。
温度変化には充分注意してください。
湯水は少し高めに用意し、使用直前に水を加えて微調整すると操作が簡単です。

③チューブの準備と試薬の融解
ラベル

保存

実験が始まる前に左表のチューブを冷凍庫からと

pUC18 DNA氷上

りだし、①で準備した氷水上に浮かべます。

pUC18-GFP DNA

氷上

IPTG

氷上

塩化カルシウムは室温で融解させ、使用直前に氷

塩化カルシウム

氷上上におき、よく冷やしてください。

SOC 培地室温

SOC 培地は室温においておきます。

チューブの蓋や側面に試薬が飛び散り、チューブの底にない場合があります。
卓上遠心機を使用し、チューブの底へ集めてください。卓上遠心機がない場合は、手で振って落としても構いません。実験中にもチューブの底に試薬があるか注意してください。
大腸菌 JM109 は、実験の途中で冷凍庫から取り出し、使用するまで絶対に融解させないでください。

④大腸菌培養用プレート
アンピシリン無プレート(Amp－)、アンピシリン有プレート(Amp+)を冷蔵庫から取り出し、室温におきます。

16

7． 実験の流れ

大腸菌 JM109 は薬剤耐性遺伝子を持たないため、抗生物質であるアンピシリン存在下(Amp+)では生育できません。（コントロール実験で確認を行います。）
pUC18 は、アンピシリン耐性遺伝子を持つプラスミド DNA です。このプラスミドが大腸菌内に取り込まれると、アンピシリン分解タンパク質が合成されるため大腸菌はアンピシリン存在下でも生育できるようになります。
pUC18-GFP は、アンピシリン耐性遺伝子を持つ pUC18 プラスミドの中に緑色蛍光タン
パク質（GFP）の遺伝子が組み込まれています。このプラスミドが取り込まれた大腸菌は、
pUC18 同様にアンピシリン存在下でも生育できます。さらに、GFP 遺伝子の発現により、
pUC18 とは形質の異なるコロニーが確認されます。
遺伝子組換え実験後、pUC18 と pUC18-GFP のコロニーの違いを観察してみましょう。
17

8. 実験方法 1 / 実験プロトコル

内容

温度

時間

実験準備
□

必要なものがそろっているか確認□

チューブ、プレートへの記名、準備

□

試薬の分注

室温
氷水上

5分
5分
10 分

コンピテントセルの作製□

塩化カルシウム溶液を JM109 へ添加

□

氷冷

氷水上

5分
5分

形質転換
□

作製したコンピテントセルと DNA を混合

□

氷冷

□

熱処理により DNA を導入、氷冷

□

回復培養

氷水上

5分
10 分

42℃→氷水上

3分

37℃

10 分

培養・観察
□

DNA を導入した大腸菌をプレート培地にまく

室温

10 分

□

37℃で一晩、培養

37℃

一晩(約 16 時間)□

プレートの観察、コロニーの計測

室温

―

室温

―

形質転換効率の算出・考察※時間は目安です。実験に慣れた人であれば短くなります。
※下線部分については、時間を厳守してください。

18

1) 実験をはじめる前に＜実験方法 1＞
実験を行う際は、実験室の窓および扉は閉めておいてください。
①石鹸で手を洗います。
②ティッシュペーパーやペーパータオル等に滅菌用 70%エタノールを含ませ、実験台を拭きます。
③以下の試薬が実験台にあるか確認してください。（一つの班に必要な試薬です。
）
一つの班で、pUC18 と pUC18-GFP の２種類の形質転換実験を行います。
【実験方法 1】
内容

容量

数量

保存

チェック

pUC18 DNA

15 µl

1本

氷水上

□

pUC18-GFP DNA

15 µl

1本

氷水上

□

大腸菌 JM109

100 µl

2本

冷凍庫

□

IPTG

150 µl1本

氷水上□

塩化カルシウム

500 µl1本

氷水上□

SOC 培地

1 ml

1本

室温

□

アンピシリン有プレート(Amp+)*1)

―

3枚

室温

□

アンピシリン無プレート(Amp-)*1)

―

1枚

室温

□

1.5 ml チューブ（透明）

5本

室温

□

1.5 ml チューブ（黄色）

5本

室温

□

1.5 ml チューブ（青色）

3本

室温

□

コンラージ棒*1)

5本

1 袋(4 本使用)

室温□

チューブ立て

―

2個

室温

□

フロート

―

1個

室温

□

マイクロループ*1)

10 本

1 袋(1 本使用)

室温

□

1袋

*1) 実験台上でシャーレの蓋や袋を開けないでください。使用直前にクリーンベンチ、またはガスバーナーを点火した状態で蓋や袋を開けるようにします。

実験操作における注意点
チップは使い捨てです。
一度チューブ内へ入れたチップは捨て、毎回新しいチップを使用してください。
コンタミネーションを防止します。
コンタミネーションとは、不必要なものが混入することを意味します。
pUC18 DNA と pUC18-GFP DNA が混ざると予想される結果と異なる結果となります。
192) 実験操作＜実験方法 1＞

形質転換実験

実験手順

注意点＜実験の準備＞
各チューブ・プレートにラベル名を記入する

1.

1.5ml チューブ（透明）2 本の蓋にそれぞれ「pUC18」、「pUC IPTG」、 自分のチューブが分かるよう
1.5 ml チューブ（黄色）2 本にそれぞれ「GFP」、「GFP IPTG」、

記名してください。

1.5 ml チューブ（水色）1 本に”C”と油性ペンで記入します(*1)。

pUC
18

ｐUC
IPTG

GFP

GFP
IPTG

C

後で使用するアンピシリン無プレート(Amp－)、アンピシリン有プレー

シャーレの蓋は開けないでくト(Amp+)にも記入します。

ださい。

アンピシリン有プレート（Amp+）（2 枚）：
pUC18 用 1 枚、pUC18-GFP 用 1 枚、計 2 枚の底面に小さくそれぞれ

形質転換実験用として使用しのサンプル名を油性ペンで記入します。

ます。

底面→

ｐUC18－GFP
Amp+

ｐUC18
Amp+

アンピシリン有プレート（Amp+）（1 枚）、
アンピシリン無プレート（Amp－）（1 枚）：

コントロール実験用として使アンピシリン有プレート（Amp+）を 1 枚、アンピシリン無プレート
（Amp

用します。

）を 1 枚、計 2 枚の底面に小さくそれぞれ「プラスミド－」と記入し－ます。(*2)底面→(*1)

プラスミドAmp+

プラスミドAmp-「C」とは、コントロール実験を意味しています。今回の形質転換実験の対照実験(Control)として、形質転換をしていない大腸菌 JM109 が、アンピシリンを添加したプレート（Amp+）で生育できないことを確認するための実験です。

(*2)

プラスミド－(マイナス)：プラスミド DNA を導入していないことを示しています。形質転換実験（pUC18、pUC18-GFP の導入）と区別するために記入しています。

20

実験手順

注意点

＜実験の準備＞
試薬の分注（1 で記入したチューブへ）2.

マイクロピペット（P20）を使います。

pUC18、pUC18-GFP 溶液はプラスミド DNA を 5 µl ずつ分注します。

チューブへ分ける前に数回ピ

pUC18（白色シール）を「pUC18」と書いた 1.5 ml チューブ（透明）ペッティング(*3)して溶液をへ、pUC18-GFP（黄色シール）を「GFP」と書いた 1.5 ml チューブ（黄混合し、溶液はできるだけチュ色）へ、それぞれ 5 µl ずつ入れます。

ーブの底の方へ入れてくださ

5 l 入れた 1.5 ml チューブは氷水上へ立てておきます。(*4)

5 μl

pUC18

3.

い。

5 μl

pUC
18

pUC18－GFP
GFP

マイクロピペットを使い、IPTG を 30 µl ずつ分注します。
IPTG を、「pUC IPTG」(透明)、「GFP IPTG」(黄色)と書いた 1.5 ml
チューブへ 30 µl ずつ入れます。
入れた後はチューブ立てに立てて実験手順 12. まで室温に置いておき
ます。

30 μl

ｐUC
IPTG

IPTG

GFP
IPTG

確認

(*3)

pUC
18

ｐUC
IPTG

5μl

30μl 5μl

氷水上

室温 氷水上 室温

GFP

GFP
IPTG

C

30μl (空)室温

ピペッティング：マイクロピペットを用いて液をゆっくり出し入れすることです。この時できるだ
け気泡ができないよう注意してください。
ピペッティングの代わりにタッピング(チューブの底を手で軽くはじき、中の溶液を混合する操作）
で混合しても良いです。しかし、タッピングを行った場合、チューブ内の溶液がチューブの壁に飛び散るため、卓上遠心機を用いてチューブの底へ溶液を集めてから次の実験操作を行ってください。
21

＜コンピテントセルの作製＞
塩化カルシウムを大腸菌 JM109 へ添加し、氷水上でインキュベートする

4.

大腸菌 JM109 を冷凍庫から取り出し、氷水上で溶かします。

形質転換効率を上げるため、塩

塩化カルシウムは数回ピペッティングして溶液を混合してから大腸菌 JM109 に化カルシウムを加えた後、でき添加してください。大腸菌 JM109 が溶けたら、マイクロピペットを使い、 るだけチューブを冷えた状態

塩化カルシウム（水色チューブ）を大腸菌 JM109（緑色チューブ）へにすることが重要です。

100 µl 加え、3〜4 回ピペッティングして混合し氷水上に置きます。
（*4）

100 μl

塩化カルシウム

大腸菌 JM109

5.
塩化カルシウムを入れたチューブをフロートに差し、氷水上で 5 分間放置します。
（氷水上に置く時間は多少長くなっても構いません。）(*5)

5 分間

氷水

(*4)

DNA は比較的安定な物質のため、氷上に放置していても問題ありません。しかし大腸菌 JM109 は使用する直前まで溶かさずにフリーザーに入れておいてください。融解したまま長時間放置すると形質転換効率が下がり、十分なコロニー数が得られない場合があります。

(*5)

氷だけでは冷却効率がよくない場合がありますので、氷に水を入れて氷水を作り、フロートにチューブを差して氷水に浮かせて冷やしてください。

22

＜形質転換：プラスミド DNA(pUC18, pUC18-GFP)の導入＞
コンピテントセルとプラスミド DNA を混合し、熱処理にて DNA を大腸菌内に導入する

6.

5 分経ったら、塩化カルシウムを加えた大腸菌（コンピテントセル、緑

残ったコンピテントセル（塩化色チューブ）をピペッティングして混合します。

カルシウム処理した大腸菌）はpUC18 が入った「pUC18」チューブ（透明）に 50 µl 入れ、3～4 回ピ

氷上に置いておきます。

ペッティングして混合し氷水上に置きます。

後の、コントロール実験（非形同様に pUC18-GFP を入れた「GFP」チューブ（黄色）についても 50 µl

質転換大腸菌の培養実験）に使のコンピテントセルを加え、ピペッティングで混合し氷水上に置きま

用します。

す。

50 μl

大腸菌 JM109（コンピテントセル）

7.

pUC
18

GFP

実験操作 6.でコンピテントセルを入れた 2 つのチューブをフロートのチューブが氷に良く接してい穴に入れ、氷水上で 10 分間放置します。

るか確認してください。

氷水
ウォーターバス、あるいは発泡

次の熱処理に 42℃のお湯を使用します。

スチロール箱にお湯をはって実験前に準備したお湯が 42℃になっているか確認してください。

準備します。

準備ができるまでチューブは氷水につけておいてください。
（氷水上に置く時間は長くなっても構いません。）

23

8.

タイマーを用意します。

42℃、1 分間が重要。

実験操作 7.の 2 つのチューブをフロートごと、42℃の水浴に浮かべて 1

この操作をヒートショックと分間放置します。

いいます。

1 分経ったら、すぐに氷水上にチューブを移し 2 分間放置してください。 これにより DNA の導入効率が（氷水中に置く時間は多少長くなっても構いません。）
実験操作 7.

実験操作 8.

高くなります。この処理時間と温度は厳守してください。

チューブをフロートにしっかり差し込んで、42℃の水浴に

氷水

42℃

氷水

必ず接するようにしてくださ

10 分間

1 分間

2 分間

い。

回復培養

9.

2 分経ったらそれぞれのチューブに SOC 培地（スクリューチューブ）を 200 µl ずつ加え、数回穏やかにピペッティングして混合します。(*6)
入れた後はチューブ立てに立てておきます。

200 μl

SOC 培地

10.

pUC
18

GFP

37℃のエアインキュベーター内（あるいは 37℃の水浴中）で 10 分間
インキュベートします。(*7)（このインキュベートは多少長くなっても構いません。）(*6）

SOC 培地を加えることで熱処理や DNA を取り込んだ際の大腸菌のダメージを回復し、形質転換効率を高めます。

(*7)

エアインキュベーター：機器内を一定の温度に維持でき、大腸菌の生育に最も適した 37℃に保温して大腸菌を培養します。

24

＜コントロール実験＞

11.

インキュベート中にコントロール実験の用意をします。
実験操作 6.で氷水上に置いておいた残りのコンピテントセル（緑色チューブ）を実験用の「C」と書いたチューブ（水色）に 50 l 入れます。
（*8）

50 μl

C

＜培養・データ処理＞

12.

実験操作 3.で IPTG 溶液を入れた 2 つのチューブ、「pUC IPTG」（透明）、「GFP IPTG」（黄色）を用います。
10 分後、実験操作 10.の 2 つのチューブ「pUC18」と「GFP」をイン
キュベーターから取り出し、室温で数回穏やかにピペッティングして混合します。
pUC18 形質転換大腸菌「pUC18」を IPTG 溶液の入ったチューブ「pUC
IPTG」へ 100 µl 加え、数回ピッペティングし混合します。同様に、
pUC18-GFP 形質転換大腸菌「GFP」を IPTG 溶液の入ったチューブ「GFP IPTG」へ 100 µl 加え混合します。

100 μl(*8)

100 μl「コントロール実験」を分りやすくするため、あえて分注しています。

25

13.

ガスバーナーの火をつけます。

ガスバーナーはオレンジ色の以下の操作はガスバーナーの近くで行うようにしてください。

炎が見えるように空気量を調火傷に注意してください。

節してください。

（クリーンベンチ内で操作しない場合、ガスバーナーの近くであれば実験台の上で操作しても問題はありません。空気中からの細菌の落下を少なくし、無菌に近い状態を作ることができます。ガスバーナーの火に近づけようとし、空中で操作することは絶対にしないでください。
火傷の恐れがあります。）

実験台上○
チップ、コンラージ棒はプレー
トごとに新しいものを使用し14.

実験操作 1.で準備したアンピシリン有プレート「pUC18「pUC18-GFP(1)

Amp+ 」、 てください。

Amp+」の 2 枚を用意します。

実験操作 12.で IPTG と混合した大腸菌液を塗布し、添付のコンラージ

キット添付のコンラージ棒は棒を用いて、プレート表面にできるだけ均一になるように大腸菌を塗布

プラスチック製です。ガスバー

します。

ナーの火を近づけないでくだ

アンピシリン有プレート「pUC18

Amp+」に IPTG 混合 pUC18 形質転換大腸菌「pUC IPTG」を全量（およそ 130 µl）塗布します。
ア ン ピ シ リ ン 有 プ レ ー ト 「 pUC18-GFP Amp+ 」 ) に IPTG 混 合pUC18-GFP 形質転換大腸菌「GFP IPTG」を全量（およそ 130 µl）塗布します。
ほぼ全体にひろげたら、蓋をして表面の水分が培地に吸収されるのを待
ちます。

pUC
IPTG

全量

全量

pUC18
Amp+

GFP
IPTG

pUC18-GFP
Amp+

26

さい。

(2)

コントロール
実験操作 1.で準備したアンピシリン無プレート「プラスミド－ Amp－」
1 枚、アンピシリン有プレート「プラスミド－ Amp＋」1 枚を用意します。
実験操作 11.で分注したコンピテントセルの入った「C」チューブ（水色）に、マイクロループの先を付けます。
大腸菌の付着したマイクロループで、まずアンピシリン無プレート（Amp－）培地表面を撫でるようにジグザグの線を一定の方向に向かって引きます。(*9)
マイクロループを新しいものと交換し、同様の方法でアンピシリン有プ
レート（Amp+）へも大腸菌をひろげます。(*9)

①

C

(*9)

②

プラスミドーAmp－

プラスミドー
Amp+

このような画線培養は大腸菌のような細菌を扱った実験には良く使われる基本的な操作です。一般
的にはこのようにジグザグにプレートへひろげることが多いですが、この実習ではとくにジグザグに線を引くことにこだわる必要はありません。大腸菌の付いたマイクロループでアンピシリン無プ
レート(Amp－)に絵や文字を書くと、翌日にはその形に大腸菌が増殖してきます。

27

15.

塗布した大腸菌液の水分が培地に吸収され、表面が乾いたら 2 枚のプレプレート横の周囲全体にテーートを重ねて一部をビニールテープなどでとめてください。プレートをプ等を巻かないでください。

逆さ（蓋が下にくるよう）にして、翌日まで 37℃インキュベーター中(*10)

で培養します。
培養時間 16 時間を目安にコロ
ニーの大きさが 1 mm になるまで培養します。

実験終了後、実験台の上を滅菌用エタノールで拭き、実験室を出る前に必ず石鹸等で手を洗ってください。

16.

翌日の朝、プレートをインキュベーターから取り出し、観察するまで冷蔵庫で保存します。

(*10)

大腸菌の成長には空気が必要です。テープ等で完全に密封するとガス交換ができなくなり大腸菌は生育できません。テープは予期せず蓋が開くのを防ぐために使用しています。逆さまにして置くのは、培養中に蒸発した培地の水蒸気が蓋の裏に付き、水滴がプレートの培地表面に流れることを防ぐためです。

28

9．実験方法 2 / 実験プロトコル

内容

温度

時間（分）

＜1 日目＞
マスタープレートの作製□

プレートにラベル名を記載□

シングルコロニープレートの作製

室温

5分
15 分

＜2 日目＞
実験準備□

必要なものがそろっているか確認□

チューブ、プレートへの記名、準備

□

試薬の分注

室温
氷水上

5分
5分
10 分

コンピテントセルの作製□

塩化カルシウム溶液を JM109 へ添加

□

氷冷

氷水上

5分
5分

形質転換
□

作製したコンピテントセルと DNA を混合

□

氷冷

□

熱処理により DNA を導入、氷冷

□

回復培養

氷水上

5分
10 分

42℃→氷水上

6分

37℃

10 分

培養・観察
□

DNA を導入した大腸菌をプレート培地にまく

室温

10 分

□

37℃で一晩、培養

37℃

一晩（約 16 時間）□

プレートの観察、コロニーの計測

室温

―

室温

―

形質転換効率の算出・考察※時間は目安です。実験に慣れた人であれば短くなります。
※下線部分については、時間を厳守してください。

29

1) 実験をはじめる前に＜実験方法 2＞
実験を行う際は、実験室の窓および扉は閉めておいてください。
①石鹸で手を洗います。
②ティッシュペーパーやペーパータオル等に滅菌用 70%エタノールを含ませ、実験台を拭きます。
③以下の試薬が実験台にあるか確認してください。（一つの班に必要な試薬です。
）
一つの班で、pUC18 と pUC18-GFP の２種類の形質転換実験を行います。
【実験方法 2】
＜1 日目＞
内容

容量

数量

保存

チェック

大腸菌 JM109

100 µl1本

冷凍庫□

アンピシリン無プレート(Amp-)*1)

―

1枚

室温

□

マイクロループ*1)

10 本

1 袋(1 本使用)

室温

□

内容

容量

数量

保存

チェック

プラスミド DNA(pUC18)

15 µl

1本

氷水上

□

プラスミド DNA(pUC18-GFP)

15 µl

1本

氷水上

□

マスタープレート（1 日目に作製）

―

1枚

室温

□

IPTG

150 µl1本

氷水上□

塩化カルシウム

500 µl1本

氷水上□

SOC 培地

1 ml

1本

室温

□

アンピシリン有プレート(Amp+)*1)

―

3枚

室温

□

アンピシリン無プレート(Amp-)*1)

―

1枚

室温

□

1.5 ml チューブ（透明）

5本

室温

□

1.5 ml チューブ（黄色）

5本

室温

□

1.5 ml チューブ（青色）

3本

室温

□

コンラージ棒*1)

5本

1 袋(4 本使用)

室温□

チューブ立て

―

2個

室温

□

フロート

―

1個

室温

□

マイクロループ

10 本

1 袋(1 本使用)

室温□

＜2 日目＞

1袋*1) 実験台上でシャーレの蓋や袋を開けないでください。使用直前にクリーンベンチ、またはガスバーナーを点火した状態で蓋や袋を開けるようにします。

実験操作における注意点
チップは使い捨てです。
一度チューブ内へ入れたチップは捨て、毎回新しいチップを使用してください。
コンタミネーションを防止します。
コンタミネーションとは、不必要なものが混入することを意味します。
30
pUC18 DNA と pUC18-GFP DNA が混ざると予想される結果と異なる結果となります。

2) 実験操作＜実験方法 2 : １日目＞※

マスタープレートの作製

JM109 コンピテントセル用マスタープレートの作製は、実験方法 2 のみで実施します。
実験方法 1 では必要ありません。

コンピテントセルを作製するための大腸菌マスタープレートをあらかじめ準備します。
大腸菌はできるだけ新しいものを使用したほうが形質転換効率は高くなります。したがって、JM109 コンピテントセル用マスタープレートはなるべく実習の前日に作製してください。前日に作製できない場合は、2〜3 日前であればマスタープレートを冷蔵庫（4℃）に保存して使用することもできます。
プレートの作製の際には 37℃で一晩放置して大腸菌を培養しますが、この培養時間の目
安は 16 時間程度です。前日の夕方 5 時頃に培養を開始すると、翌朝の 9 時頃に大腸菌が適当な大きさになっていることになります。
マスタープレートの作製を行う際は、実験室の窓及び扉は閉めておいてください。

31

実験手順

注意点

＜マスタープレートの作製＞
1.

アンピシリン無プレート（Amp－）を室温に出します。プレート表面の露が無くなり、室温に戻ったらプレートの底面に小さく「JM109 マス
タープレート」と油性ペンで書いておきます。

シャーレの蓋は開けないでください。

形質転換実験で使用するマス
タープレートの必要数だけ、プレートを用意してください2.

ガスバーナーの火をつけます。

6 班の場合は、6 枚アンピシリ

以下の操作はガスバーナーの近くで行うようにしてください。

ン無プレート(Amp － )が必要

火傷に注意してください。

です。

（クリーンベンチ内で操作しない場合、ガスバーナーの近くであれば実験台の上で操作しても問題はありません。空気中からの細菌の落下を少ガスバーナーはオレンジ色のなくし、無菌に近い状態を作ることができます。ガスバーナーの火に近炎が見えるように空気量を調づけようとし、空中で操作することは絶対にしないでください。火傷の節してください。

恐れがあります。）

実験台上○

32

3.

大腸菌 JM109（緑色チューブ）を冷凍庫から取り出し、氷水上で溶かキット添付のマイクロループ

します。チューブの蓋を開け、マイクロループを菌液中にさし込みます。 はプラスチック製です。ガス
ループを菌液中に一度差し込み、引き抜くだけで、ループに大腸菌が付バーナーの火に近づけないで

着します。

ください。

大腸菌 JM109（緑色チューブ）
1 本で、充分な枚数分のプレー
トの作製が可能です。

4.

マイクロループを毎回かえる必要はありません。ジグザグの線を書くようにプレートの培地表面を撫で一定の方向に画線します。次に、プレートをマイクロループを使用しない

左に 90 度回転させ最初に引いた線に触れた後、またジグザグに線を引時は先端が実験台等に触れな

いていきます。さらに、プレートを左に 90 度回転させた後、2 番目にいよう、プレートの培地上に画線した線からジグザグに線を引いていきます。(*1)

置いてください。
先端が手や実験台などに触れ90°回転てしまった場合は、新しいものと交換してください。

90°回転

マイクロループを強く培地表面に押し当て画線すると、培地に穴が開いてしまいます。培地表面を撫でるように画線して下さい。
ループの先だけをつける
×
○
ループの円
全体をつける(*1)

ジグザグに大腸菌を広げることを画線培養と呼びます。一度画線した部分に触れた後、また線を引くことで大腸菌液が引き伸ばされ、最終的に菌体が一つずつ離れている状態になります。この菌体が１つの点の状態をコロニーと呼びます。このコロニーを得るために画線培養を行います。

33

5.

蓋をして表面が乾くのを待ちます。表面が乾いたら、プレートを重ね、プレート横の周囲全体にテー一部をビニールテープなどでとめてください。プレートを逆さ（蓋が下プ等を巻かないでください。

にくるよう）にして、翌日まで 37℃のエアインキュベーター内に入れテープは予期せず蓋が開くのて培養します。(*2)

を防ぐために使用しています。(*3)

培養時間 16 時間を目安に、コ
ロニーの大きさが 1 mm にな

6.

実験終了後、実験台の上を滅菌用エタノールで拭き、実験室を出る前にるまで培養してください。(*4)

必ず石鹸等で手を洗ってください。
翌日の朝、プレートをインキュベーターから取り出し、形質転換実験を行うまで冷蔵庫で保存します。

(*2)

逆さまにして置くのは、培養中に蒸発した培地の水蒸気が蓋の裏に付き、水滴がプレートの培地表面に流れることを防ぐためです。
エアインキュベーター：機器内を一定の温度に維持でき、大腸菌の生育に最も適した 37℃に保温して大腸菌を培養します。

(*3)

大腸菌の成長には空気が必要です。テープ等で完全に密封するとガス交換ができなくなり大腸菌は生育できません。逆さまにして置くのは、培養中に蒸発した培地の水蒸気が蓋の裏に付き、水滴がプレートの培地表面に流れることを防ぐためです。

(*4)

コロニーが小さすぎると次に行う形質転換で使用する大腸菌の数が少なくなり、十分な形質転換効率が得られません。また培養しすぎても大腸菌の増殖能力が弱くなり、形質転換に影響が出ることがあります。

34

3) 実験操作＜実験方法 2：2 日目＞

形質転換実験

実験手順

注意点＜実験の準備＞
各チューブ・プレートにラベル名を記入する

1.

1.5ml チューブ（透明）2 本の蓋にそれぞれ「pUC18」、「pUC IPTG」、 自分のチューブが分かるよう
1.5 ml チューブ（黄色）2 本にそれぞれ「GFP」、「GFP IPTG」、

記名してください。

1.5 ml チューブ（水色）1 本に「C」と油性ペンで記入します(*1)。

pUC
18

ｐUC
IPTG

GFP
IPTG

GFP

C

後で使用するアンピシリン無プレート(Amp－)、アンピシリン有プレー

シャーレの蓋は開けないでくト(Amp+)にも先に記入します。

ださい。

アンピシリン有プレート（Amp+）（2 枚）：
pUC18 用 1 枚、pUC18-GFP 用 1 枚、計 2 枚の底面に小さくそれぞれ

形質転換実験用として使用しにサンプル名を油性ペンで記入します。

ます。

底面→

プラスミドAmp+

プラスミドAmp-

アンピシリン有プレート（Amp+）（1 枚）、
アンピシリン無プレート（Amp－）（1 枚）：

コントロール実験用として使アンピシリン有プレート（Amp+）を 1 枚、アンピシリン無プレート
（Amp

用します。

）を 1 枚、計 2 枚の底面に小さくそれぞれ“プラスミド－”と記入し－ます。(*2)

底面→
(*1)

ｐUC18
Amp+

ｐUC18－GFP
Amp+「C」とは、コントロール実験を意味しています。今回の形質転換実験の対照実験(Control)として、形質転換をしていない大腸菌 JM109 が、アンピシリンを添加したプレート（Amp+）で生育できないことを確認するための実験です。

(*2)

プラスミド－(マイナス)：プラスミド DNA を導入していないことを示しています。形質転換実験（pUC18、pUC18-GFP の導入）と区別するために記入します。

35

実験手順

注意点

＜実験の準備＞
試薬の分注（1 で記入したチューブへ）2.

マイクロピペット（P20）を使います。

pUC18、pUC18-GFP 溶液はプラスミド DNA を 5 µl ずつ分注します。

チューブへ分ける前に数回ピ

pUC18（白色シール）を「pUC18」と書いた 1.5 ml チューブ（透明）ペッティング(*3)して溶液をへ、pUC18-GFP（黄色シール）を「GFP」と書いた 1.5 ml チューブ（黄混合し、できるだけチューブの色）へ、それぞれ 5 µl ずつ入れます。

底の方へ入れてください。

5 l ずつ入れた 1.5 ml チューブは氷水上におきます。(*4)

5 μl

5 μl

pUC18

3.

pUC
18

pUC18－GFP
GFP

マイクロピペット（P200）を使い、IPTG を 30 µl ずつ分注します。
IPTG を「pUC IPTG」(透明)、「GFP IPTG」(黄色)と書いた 1.5 ml チ
ューブへ 30 µl ずつ入れます。
入れた後はチューブ立てに立てて実験手順 12. まで室温に置いておき
ます。

30 μl

ｐUC
IPTG

IPTG

GFP
IPTG

確認

pUC
18

ｐUC
IPTG

GFP

5μl 30μl 5μl
氷水上 室温
(*3)

GFP
IPTG

C

30μl (空)氷水上 室温室温

ピペッティング：マイクロピペットを用いて液をゆっくり出し入れすることです。この時できるだ
け気泡ができないよう注意してください。
ピペッティングの代わりにタッピング(チューブの底を手で軽くはじき、中の溶液を混合する操作）
で混合しても良いです。しかし、タッピングを行った場合、チューブ内の溶液がチューブの壁に飛び散るため、卓上遠心機を用いてチューブの底へ溶液を集めてから次の実験操作を行ってください。
36

＜コンピテントセルの作製＞
塩化カルシウムと大腸菌 JM109 を混合し、氷水上でインキュベートする。

4.

塩化カルシウム（水色チューブ）を「C」（水色チューブ）へ 200 µl 加

形質転換効率を高くするためえます。次に、大腸菌マスタープレートを用意します。大腸菌マスターには、塩化カルシウムを加えた

プレートよりマイクロループを用いてコロニーをかきとり、「C」（水色

後も、できるだけチューブを冷チューブ）に懸濁し、氷水中に置きます。(*4)

えた状態にすることが重要です。

200 μl

塩化カルシウムは数回ピペッ
ティングして溶液を混合してから大腸菌 JM109 に添加して塩化カルシウム溶液ください。

大腸菌 JM109（コンピテントセル）

5.

コロニーを懸濁したチューブをフロートに差して、氷水中で 5 分間放置します。（氷水中に置く時間は多少長くなっても構いません。）(*5)

氷水

(*4)

DNA は比較的安定な物質のため、氷上に放置していても問題ありません。しかし大腸菌 JM109 は使用する直前まで溶かさずにフリーザーに入れておいてください。融解したまま長時間放置すると形質転換効率が下がり、十分なコロニー数が得られない場合があります。

(*5)

氷だけでは冷却効率がよくない場合がありますので、氷に水を入れて氷水を作り、フロートにチューブを差して氷水に浮かせて冷やしてください。

37

＜形質転換：プラスミド DNA(pUC18, pUC18-GFP)の導入＞
コンピテントセルとプラスミド DNA を混合し、熱処理にて DNA を大腸菌内に導入する

6.

5 分経ったら、塩化カルシウムを加えた大腸菌「C」（コンピテントセル、 残ったコンピテントセル（塩化水色チューブ）をピペッティングして軽く混合します。

カルシウム処理した大腸菌）はpUC18 が入った「pUC18」チューブ（透明）に 50 µl 入れ、3～4 回ピ

氷上に置いておきます。

ペッティングして混ぜて氷水上に置きます。

後の、コントロール実験（非形同様に pUC18-GFP を入れた「GFP」チューブ（黄色）にも 50 µl のコ質転換大腸菌の培養実験）に使

ンピテントセルを加え、ピペッティングで混ぜて氷水上に置きます。

用します。

50 μl

pUC
18

C
7.

GFP

実験操作 6.でコンピテントセルを入れた 2 つのチューブをフロートの穴に入れて、氷水上で 10 分間放置します。
チューブが氷に良く接しているか確認してください。

氷水

次の熱処理に 42℃の水を使用します。
実験前に準備したお湯が 42℃になっているか確認してください。

ウォーターバス、あるいは発泡準備ができるまでチューブは氷水につけておいてください。

スチロール箱にお湯をはって（氷水上に置く時間は多少長くなっても構いません。
）

準備します。

38

8.

タイマーを用意します。

42℃、1 分間が重要。

実験操作 7.の 2 つのチューブをフロートごと、42℃の水浴に浮かべて 1

この操作をヒートショックと分間放置します。

いいます。

1 分経ったら、すぐに氷水上にチューブを移し 5 分間放置してください。 これにより DNA の導入効率が（氷水中に置く時間は多少長くなっても構いません。）
実験操作 7.

実験操作 8.

高くなります。この処理時間と温度は厳守してください。

チューブをフロートにしっかり差し込んで、42℃の水浴に

氷水

42℃

氷水

必ず接するようにしてくださ

10 分間

1 分間

5 分間

い。

回復培養

9.

2 分経ったらそれぞれのチューブに SOC 培地（スクリューチューブ）を 200 µl ずつ加え、数回穏やかにピペッティングして混合します。(*6)
入れた後はチューブ立てに立てておきます。

200 μl

SOC 培地

10.

pUC
18

GFP

37℃のエアインキュベーター内（あるいは 37℃の水浴中）で 10 分間
インキュベートします。(*7)（このインキュベートは多少長くなっても構いません。）(*6）

SOC 培地を加えることで熱処理や DNA を取り込んだ際の大腸菌のダメージを回復し、形質転換効率を高めます。

(*7)

エアインキュベーター：機器内を一定の温度に維持でき、大腸菌の生育に最も適した 37℃に保温して大腸菌を培養します。

39

＜コントロール実験＞

11.

インキュベート中に次の実験操作＜培養＞で使用するチューブを確認します。(*8)

pUC
18

GFP

250μl

250μl

37℃

37℃

pUC
IPTG

GFP
IPTG

C

30μl
室温

30μl
室温

100μl
氷上

＜培養・データ処理＞

12.

実験操作 3.で IPTG 溶液を入れた 2 つのチューブ、「pUC IPTG」（透明）、「GFP IPTG」（黄色）を使用します。
10 分後、実験操作 10.の 2 つのチューブ「pUC18」と「GFP」をイン
キュベーターから取り出し、室温で数回穏やかにピペッティングして混合します。
pUC18 形質転換大腸菌「pUC18」を IPTG 溶液の入ったチューブ「pUC
IPTG」へ 100 µl 加え、数回ピッペティングし混合します。同様に、
pUC18-GFP 形質転換大腸菌「GFP」を IPTG 溶液の入ったチューブ「GFP IPTG」へ 100 µl 加え混合します。

100 μl(*8）

100 μl「コントロール実験」をわかりやすくするため、あえて確認作業をしています。

40

13.

ガスバーナーの火をつけます。

ガスバーナーはオレンジ色の以下の操作はガスバーナーの近くで行うようにしてください。

炎が見えるように空気量を調火傷に注意してください。

節してください。

（クリーンベンチ内で操作しない場合、ガスバーナーの近くであれば実験台の上で操作しても問題はありません。空気中からの細菌の落下を少なくし、無菌に近い状態を作ることができます。ガスバーナーの火に近づけようとし、空中で操作することは絶対にしないでください。
火傷の恐れがあります。）

実験台上○

14.

実験操作 1.で準備したアンピシリン有プレート「pUC18 Amp+ 」、 チップ、コンラージ棒はプレー(1)「pUC18-GFP Amp+」の 2 枚を用意します。

トごとに新しいものを使用し実験操作 12.で IPTG と混合した大腸菌液を塗布し、添付のコンラージてください。

棒を用いて、プレート表面にできるだけ均一になるように大腸菌を塗布します。

キット添付のコンラージ棒はアンピシリン有プレート「pUC18 Amp+」に IPTG 混合 pUC18 形質転プラスチック製です。ガスバー

換大腸菌「pUC IPTG」を全量（およそ 130 µl）塗布します。

ナーの火を近づけないでくだ

ア ン ピ シ リ ン 有 プ レ ー ト 「 pUC18-GFP Amp+ 」 に IPTG 混 合さい。

pUC18-GFP 形質転換大腸菌「GFP IPTG」を全量（およそ 130 µl）塗布します。
全体にひろげたら、蓋をして表面の水分が培地に吸収されるのを少し待
ちます。

全量

pUC
IPTG

全量

pUC18
Amp+

GFP
IPTG

pUC18-GFP
Amp+

41

(2)

コントロール
実験操作 1.で準備したアンピシリン無プレート「プラスミド－ Amp－」
1 枚、アンピシリン有プレート「プラスミド－ Amp＋」1 枚を用意します。(Amp+)
実験操作 11.で分注したコンピテントセルの入った「C」チューブ（水色）に、マイクロループの先を付けます。
大腸菌の付着したマイクロループで、まずアンピシリン無プレート（Amp－）培地表面を撫でるようにジグザグの線を一定の方向に向かって引きます。(*9)
マイクロループを新しいものと交換し、同様の方法でアンピシリン有プ
レート（Amp+）へも大腸菌をひろげます。(*9)

①

C

(*9)

②

プラスミドーAmp－

プラスミドー
Amp+

このような画線培養は大腸菌のような細菌を扱った実験には良く使われる基本的な操作です。一般
的にはこのようにジグザグにプレートへひろげることが多いですが、この実習ではとくにジグザグに線を引くことにこだわる必要はありません。大腸菌の付いたマイクロループでアンピシリン無プ
レート(Amp－)に絵や文字を書くと、翌日にはその形に大腸菌が増殖してきます。

42

15.

塗布した大腸菌液の水分が培地に吸収され、表面が乾いたら 2 枚のプレプレート横の周囲全体にテーートを重ねて一部をビニールテープなどでとめてください。プレートをプ等を巻かないでください。

逆さ（蓋が下にくるよう）にして、翌日まで 37℃インキュベーター中(*10)

で培養します。
培養時間 16 時間を目安にコロ
ニーの大きさが 1 mm になるまで培養します。

実験終了後、実験台の上を滅菌用エタノールで拭き、実験室を出る前に必ず石鹸等で手を洗ってください。

16.

翌日の朝、プレートをインキュベーターから取り出し、観察するまで冷蔵庫で保存します。

(*10)

大腸菌の成長には空気が必要です。テープ等で完全に密封するとガス交換ができなくなり大腸菌は生育できません。テープは予期せず蓋が開くのを防ぐために使用しています。逆さまにして置くのは、培養中に蒸発した培地の水蒸気が蓋の裏に付き、水滴がプレートの培地表面に流れることを防ぐためです。

43

10.データの解析
プレートの観察
プレートに生育してきた大腸菌（コロニー）を観察します。
1)

コロニーの計数

油性ペンなどでシャーレの蓋の上からコロニーに印（点）をつけながら数えると、二重に数えることを防ぐことができ正確に計数できます。
コロニー数が多い場合は、計数カウンターを使用するか、プレートにペンで線を引いて面積を 4 等分（あるいは 8 等分）してその中にあるコロニーを数えてから、4 倍（8倍）して全体のコロニー数を出してください。
2)

コロニーの蛍光の観察

pUC18-GFP DNA を導入した大腸菌に UV ライトを照射すると緑色に光って見えます。
UV ライトがない場合は、暗くした部屋やプレートの周りを段ボール等で囲って暗くした中で市販のブラックライトを照射することで蛍光を観察できます。
※

UV ライトやブラックライトを直接目で見ないでください。必要に応じて目や皮膚を保護するためゴーグル等の防護器具を使用してください。
＜UV ライト照射時のコロニー＞

pUC18 DNA 導入大腸菌

pUC18-GFP DNA 導入大腸菌

次ページのフォームに、コロニー数、光っているコロニー数、その他気が付いた点について記載してください。

44

＜実験結果＞
１）大腸菌形質転換実験
pUC18 DNA 形質転換プレート（pUC18 Amp+）
コロニー数
光っているコロニーの数気づいた点など

pUC18-GFP DNA 形質転換プレート（pUC18-GFP Amp+）
コロニー数
光っているコロニーの数気づいた点など

２）非形質転換大腸菌の培養実験（コロニーの様子を写真に撮るかスケッチしてください）
JM109Amp－プレート（プラスミド－ Amp－）
気づいた点など

JM109Amp＋プレート（プラスミド－ Amp＋）
気づいた点など

45

考察
1： アンピシリン－（マイナス）プレートとアンピシリン＋（プラス）プレートに播いた大腸菌 JM109株を比較してその違いと、その結果から JM109 株の性質について分かることは何ですか。
解答例：
抗生物質アンピシリン－（マイナス）プレート上では大腸菌 JM109 はコロニーを形成し生育しているが、抗生物質アンピシリン＋（プラス）のプレート上では大腸菌
JM109 は全く生育していない。つまり大腸菌 JM109 株が本来アンピシリンに対する抵抗性を持っていない。

2： pUC18 形質転換プレート（Amp+）と非形質転換 JM109（Amp+）プレートを比較して、異なっている点とその理由について説明してください。
解答例：

非形質転換 JM109 株は抗生物質アンピシリン(＋)のプレート上で生育していないが、
pUC18 形質転換プレート上では白いコロニーを形成して生育している。
これは導入された pUC18 によって、大腸菌 JM109 が抗生物質アンピシリンに対して耐性を持つ性質が加えられたためと考えられる。つまり、pUC18 の持つアンピシリン
耐性遺伝子が菌体内で発現していることを示している。

3： pUC18 形質転換プレートと pUC18-GFP 形質転換プレートを比較してその違いと、そこから考えられることは何ですか。
解答例：
pUC18 で形質転換した大腸菌 JM109 、pUC18-GFP で形質転換した大腸菌 JM109
はともにアンピシリン(+)のプレート上で白いコロニーを形成して生育している。つまり、pUC18 のもつアンピシリン耐性遺伝子が菌体内で発現している。
次に、両プレートに UV を照射し比較する。pUC18 で形質転換した大腸菌 JM109 に変化は見られないが、pUC18-GFP で形質転換した大腸菌 JM109 は緑色の蛍光を発色する。これは、pUC18-GFP がもつ GFP 遺伝子が菌体内で発現し、緑色蛍光物質 GFP
を菌体内で作る性質が加えられたことを示している。

46

大腸菌形質転換効率の計算
A： 形質転換効率について
形質転換効率とは、1µg の DNA を形質転換したときに生じるコロニー数のことを指します。したがって、形質転換効率は下記のような式で表すことができます。
形質転換効率（cfu /µg）＝

プレートに生えたコロニー数（個）
プレートに播いた DNA 量（µg)

cfu：colony forming unit（コロニー形成単位）の略

すなわち、形質転換効率を算出するには、①「コロニー数を計測する」、②「プレートに播いた DNA 量を算出する」ことが必要となります。
B： 形質転換効率の算出例
濃度 2ng/µl の pUC18 DNA 5µl にコンピテントセル 50µl を加え、ヒートショック操作を行った。その後、SOC 培地 200µl を添加し 37℃で 10 分培養した。培養後、IPTG が30µl 入ったチューブへ培養した大腸菌液 100µl を添加し、アンピシリンプレートへ 130µl
全量を塗布した。プレートを 37℃で一晩培養した。翌朝、プレートにはコロニーが 200個生えていた。
上記の結果が得られた時の形質転換効率を求めてください。
①コロニー数：200 個②プレートに播いた DNA 量
初めの DNA 量のうち、実際に播いた DNA 量はどれだけかを計算します。初めのDNA 全量を播いていないことに注意して下さい。全体の体積（µl）とプレートへ使用した体積の割合から DNA 量を求めることができます。
2 (ng /µl) × 5 (µl)
初めの DNA 量×100 (µl)÷

プレートへ播いた量255 (µl)≒

チューブ内の量プレートへ播いた割合
したがって、3.9ng の DNA をプレート上へ播いたことになります。

47

3.9 (ng)

11．廃棄物の処理
1） 実験後の培地、器具等の廃棄について実験に使用した培地、器具は必ずオートクレーブ、あるいは消毒液などで滅菌してから廃棄します。
プレートはゴム手袋などをはめて、プレートから培地を取り除き、シャーレと培地に分け、それぞれをオートクレーブ専用の袋に入れます。
（取り扱い方によってはオートクレーブの袋が破けてしまう恐れもあります。念のため二重にすることをお勧めいたします。）
オートクレーブ滅菌は 121℃で 20 分間行います。
オートクレーブ後の廃棄については、各々の施設の規則、各自治体の指示に従い捨ててください。
オートクレーブが無い場合、あるいはオートクレーブが使用できない器具はヒビテンなどの消毒液で十分滅菌してから廃棄、あるいは洗浄します。

製品についてのお問い合わせ先
富士フイルム和光純薬株式会社
ﾌﾘｰﾀﾞｲﾔﾙ: 0120-052-099
ﾌﾘｰﾌｧｯｸｽ: 0120-052-806

株式会社ニッポンジーン
TEL: 076-451-6548
FAX: 076-451-6547
ホームページ: https://www.nippongene.com/siyaku/

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