日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 94, 21-26, 2020

顔面皮膚の痒み刺激は三叉神経節内に macrophage を誘導する
大槻克彦

日本大学大学院歯学研究科歯学専攻（指導：岩田幸一 教授，篠田雅路 准教授）

要旨：生理的食塩液および histamine の口ひげ部皮下への注入によって，第Ⅰ枝領域に多くの Iba1 陽性細胞を認めた。Iba1 陽性細胞の単位面積当たりで陽性細胞が占める領域を計測した結果， histamine 注入群の方が生理的食塩液注入群よりも有意に広い領域を占めていた（ ＜ 0.01）。第Ⅱ枝領域で検出された Iba1 陽性細胞も第Ⅰ枝領域で認められた Iba1 陽性細胞と同様に様々な形態を有しており，分布も神経節細胞と神経線維の間に挟まれたような分布を示していた。第Ⅱ枝領域における Iba1 陽性細胞が占める面積の割合は，histamine 注入群の方が生理的食塩液注入群よりも有意に広い面積を占めていた（ ＜ 0.01）。第Ⅲ枝領域においても，第Ⅰ枝および第Ⅱ枝領域で検出された Iba1 陽性細胞と同様の分布を認めた。また，この領域で観察された Iba1 陽性細胞の形態も他の領域で観察されたものと同様，様々な形態を有していた。Histamine 注入群と生理的食塩液注入群における Iba1 陽性細胞が 占 め る 面 積 を 比 較 す る と， 両 者 に 有 意 な 違 い は 認 め ら れ な か っ た（ ＞ 0.05）。 ま た， 衛 星 細 胞 の 活 性 化 もhistamine の口ひげ部への注入によって，わずかではあるが，神経節細胞を取り囲むように，活性型衛星細胞が検出された。以上の結果から，histamine 注入により顔面皮膚に発症する痒みには三叉神経節に出現する macrophageの集積が重要な働きを有する可能性が示された。
キーワード：macrophage，Iba1 陽性細胞，痒み，三叉神経節，hisatamine

緒らは様々な分子が放出され，神経節細胞周囲に存在する言

satellite cell の活性化や，macrophage の遊走が促され

痒みは様々な原因で引き起こされることが報告されてる 13,14）。三叉神経系においては，三叉神経の損傷や口腔いるが，その詳細なメカニズムについては不明な点が多

顔 面 の 炎 症 に よ り， 三 叉 神 経 節 内 に お い て 多 く のく残されている 1,2）。従来の研究では痒みは痛みを起こさmacrophage が集積することが報告されている 15-17）。三叉ない程度の弱い刺激によって C 線維が活性化することに神経節内に集積した macrophage からは種々の cytokine

よって引き起こされる感覚で，痛み感覚の一種と考えらが放出され，これによって三叉神経節細胞活動が変調されていた 3-5）。しかし，C 線維の中には histamine に対しれると報告されている 17）。このような背景から，著者はて，特異的に反応するものが存在することが報告され，痛覚だけでなく痒みの発症機構に関しても，macrophage

痒みが痛覚の一種ではないことが証明された 6）。

が関与する可能性があるという仮説を立てた。

従来の研究で，C 線維の末梢端は自由神経終末の形態

そこで，本研究では痒みを誘発することが知られていをなしており，特殊な受容器を持たないと報告されている histamine を顔面皮下に投与することによって Iba1 をる 7）。自由神経終末の膜表面には histamine, serotonin

マーカーとして用い macrophage の三叉神経節におけるあるいは bradykinin などに対する受容体，Transient分布様式を検索し，痒み感覚情報処理機構に対する役割

Receptor Potential Vanilloid 1（TRPV1）channel,の一端を明らかにすることを目的とした。

sodium channel または ATP 受容体など，様々な受容体材料および方法が存在することが知られている 8,9）。これらの受容体のほとんどは侵害情報処理に関係するといわれ，多くの研究がなされてきた本研究は，日本大学歯学部動物実験委員会の許可（承10,11）。これらの受容体の中で，histamine

認番号：AP17 D038）を得，同委員会の指針および国際疼受容体は痒みの発症に重要な働きを有することが明らか

痛学会の基準に従って行われた 18）。実験には Sprague-にされてきた12）

Dawley 系雄性ラット 10 頭を用いた。

。

1.

これらの受容体に対するリガンドの結合や温・熱・冷Histamine 投与

あるいは機械刺激によって自由神経終末に活動電位が発2％ isoflurane に て 麻 酔 し， さ ら に 三 種 混 合 麻 酔 薬

生すると，発生した活動電位は三叉神経節へと伝達され（butorphanol（2.5 mg/kg）, medetomidine（0.375 mg/る。特に，末梢神経系の興奮性が高いと，神経節細胞かkg），midazolam（2.0 mg/kg）, i.p.）で深く麻酔したラッ（受付：令和 2 年 1 月 17 日）〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 1321

トを保温パッド上に仰臥位にした状態で，0.9％生理的食浸漬し，0.01 M PBS にて 10 分間の洗浄を 3 回行った。

塩液に溶解した histamine 溶液（10μl, 5μg/μl）を左側

次いで，切片を二次抗体である biotinylated goat anti-口ひげ部皮下に静かに注入した。また，vehicle として

rabbit IgG（H+L）（1：500，Vector Labs，Burlingame

0.9％生理的食塩液を同量，同部位に注入し，コントローCA，USA）に室温で 2 時間浸漬した。その後 ABC kit

ルとした。Histamine 溶液あるいは vehicle 溶液を注入（Vector Labs，Burlingame CA，USA）を用いて室温でしてから 5 分後に 500 ml 生理的食塩液にて脱血後，0.1 M

1 時間，反応させた。0.01 M PBS による 10 分間の洗浄

phosphate buffer にて希釈した 4％ paraformaldehyde

を 3 回繰り返した後， 0.01％ H2O2 加 DAB を用いて反応溶液（pH7.4, 4℃）500 ml を用いて灌流固定を行った。灌産物を可視化した。次いで，切片を 0.01 M PBS にて洗流固定終了後に三叉神経節を摘出し，同様の固定液で 4℃浄し，室温にて乾燥させた後，アルコールとキシレンににて 2 日間，後固定を行った。

より脱水および透徹を行い，封入した。また，Iba1 陽性

2.

抗 Iba1 抗体および抗 GFAP 抗体を用いた免疫染色

細胞を DAB 反応させた切片を光学顕微鏡下で観察し，取り出した三叉神経節を 0.01 M phosphate buffered

三 叉 神 経 節 領 域 の 顕 微 鏡 写 真 を 撮 影 し，Image Jsaline（PBS）に て 希 釈 し た 20％ ス ク ロ ー ス 溶 液（w/v,software（Research Services Branch National Institute4℃）に 2 日間浸漬した。その後，三叉神経節を O.C.T.

of Health, Bethesda, MD, USA）を用いて Iba1 陽性細胞compound（Sakura Finetek USA，Torrance，CA，密度の解析を行った。

USA）で包埋してドライアイスで凍結し，三叉神経節の3.

連続切片標本（厚さ 13μm）を作製して MAS-GP でコー

統計学的解析
デ ー タ は 平 均 ± 標 準 誤 差 で 表 し， 有 意 差 検 定 に はトしたスライドガラス（Matsunami，東京）に貼り付け，Mann-Whitney U test を用いた。また， ＜ 0.05 を有意以下の方法によって nickel-cobalt 加 3.3ʼ-diaminobenzidineありと判定した。

tetra hydrochloride（DAB， Sigma Aldrich，St Louis，結MO，USA）染色を施した。まず，切片を 0.3％ H2O2 加果

0.01 M PBS に 30 分間浸漬し，内因性ペルオキシダーゼ

口 ひ げ 部 に histamine を 投 与 す る こ と に よ っ て，を不活性化した後，0.01 M PBS にて 5 分間の洗浄を 3Fig. 1 に示したように三叉神経第Ⅰ枝から第Ⅲ枝にかけ

回 行 っ た。 洗 浄 終 了 後， 0.3％ Triton X 100 加 0.01 Mて広い領域に多くの Iba1 陽性細胞を認めた。Iba1 陽性PBS で希釈した 5％ normal goat serum（NGS）に 1 時間細胞は弱拡大顕微鏡写真では黒色に染色されたドットと浸漬し，ブロッキングを行った。その後，macrophageして観察されたが，強拡大像をみると一つひとつのドッの マ ー カ ー と し て rabbit anti-rat Iba1 antibody（1：トは三叉神経節細胞を取り囲むように存在していた。

1000，Cell Signaling Technology, Danvers，MA，1.

USA）ま た は 活 性 化 し た 衛 星 細 胞 の マ ー カ ー と し ての形態と分布

三叉神経第Ⅰ枝領域から検出された Iba1 陽性細胞

mouse anti-rat GFAP monoclonal antibody（1：1000，Fig. 2 A および B は口ひげ部への生理的食塩液あるいMerck Millipore, Billerica，MA，USA）に 4℃で 3 日間は histamine 注入後三叉神経節の第Ⅰ枝領域で検出された Iba1 陽性細胞の組織写真を示している。生理的食塩液および histamine の口ひげ部皮下への注入によって，多くの Iba1 陽性細胞を認めた。検出された Iba1 陽性細胞は様々な形態を有し，神経節細胞および神経線維の間に挟まれ多様な分布様式を示していた。また，単位面積当たりの Iba1 陽性細胞が占める領域を計測した結果，
histamine 注入群は 0.56 ± 0.05％，生理的食塩液注入群は 0.25 ± 0.03％であり，histamine 注入群の方が生理的食塩液注入群よりも有意に広い領域を占めていた（ ＜0.01，Fig. 2 B）。
2.

三叉神経第Ⅱ枝領域における Iba1 陽性細胞の分布
Fig. 3 には三叉神経第Ⅱ枝領域における Iba1 陽性細胞の出現様式を示している。第Ⅱ枝領域で検出された Iba1
Fig. 1 Histamine の顔面皮膚投与により三叉神経節において観察された Iba1 陽性細胞の組織標本写真
A：Iba1 陽性細胞の強拡大像，＊：三叉神経節細胞，Ⅰ：三叉神経第Ⅰ枝領域，Ⅱ：三叉神経第Ⅱ枝領域，Ⅲ：三叉神経第Ⅲ枝領域

陽性細胞も第Ⅰ枝領域で認められた Iba1 陽性細胞と同様に様々な形態を有しており，神経節細胞と神経線維の間に挟まれた領域に分布をしていた（Fig. 3 A および B）。第Ⅱ枝 領 域 に お け る Iba1 陽 性 細 胞 が 占 め る 面 積 の 割 合 は22

macrophage による顔面皮膚の痒み

histamine 注入群が 0.97 ± 0.09％，生理的食塩液注入群

叉神経節の第Ⅰ枝およびⅡ枝領域においては histamineが 0.28 ± 0.07％であり，histamine 注入群の方が生理的食注 入 群 で 有 意 に 多 く の Iba1 陽 性 細 胞 を 認 め た。 ま た，

塩液注入群よりも有意に広い面積を占めていた（ ＜ 0.01）。

histamine 注入によってわずかではあるが衛星細胞の活3.

性化も認められた。

三叉神経第Ⅲ枝領域における Iba1 陽性細胞の分布1． 痒みと macrophage の集積様式

従来の研究では痒みは痛みに達しない感覚としてとら第Ⅲ枝領域においても，第Ⅰ枝および第Ⅱ枝領域で検出された Iba 陽性細胞と同様の分布を認めた。また，この領域で観察された Iba1 陽性細胞も他の領域で観察されたものと同様，様々な形態を有していた（Fig. 4 A および B）。Histamine 注入群と生理的食塩液注入群における Iba1 陽性細胞が占める面積を比較すると，histamine
注入群が 0.31 ± 0.04％であるのに対し，生理的食塩液注入群では 0.19 ± 0.06％で，両者に有意な違いは認められなかった（ ＞ 0.05）。
4． 三叉神経第Ⅱ枝領域における GFAP 陽性細胞の分布
本研究では macrophage だけでなく，神経節細胞の周囲に多く見られる衛星細胞についても活性化の有無について検索した。Fig. 5 の矢印で示したように，histamineの口ひげ部への注入によって，わずかではあるが，神経節細胞を取り囲むように，活性型衛星細胞が検出された。

考察

macrophage の出現様式の解析を行った。その結果，三Fig. 3 生理的食塩液あるいは histamine の口ひげ部皮膚投与により三叉神経第Ⅱ枝領域において観察された Iba1 陽性細胞の組織標本写真および Iba1 陽性細胞が占める領域の割合
A：生理的食塩液の口ひげ部皮膚投与後，三叉神経節で観察された Iba1 陽性細胞の組織標本写真，B：Histamine の口ひげ部皮膚投与後に観察された Iba1 陽性細胞の組織標本
写真，C：Iba1 陽性細胞の占める領域の割合を示したグラフ。
**： ＜ 0.01

Fig. 2 生理的食塩液あるいは histamine の顔面皮膚投与により三叉神経第Ⅰ枝領域において観察された Iba1 陽性細胞の組織標本写真および Iba1 陽性細胞が占める領域の割合
A: 口ひげ部皮膚に生理的食塩液を注入したラットの三叉神経節に出現した Iba1 陽性細胞，B：Hisatamine を注入したラットの三叉神経節，C：Iba1 陽性細胞の占める領域の割合を示したグラフ。**： ＜ 0.01

Fig. 4 生理的食塩液あるいは histamine の口ひげ部皮膚投与により三叉神経第Ⅲ枝領域において観察された Iba1 陽性細胞の組織標本写真および Iba1 陽性細胞が占める領域の割合
A：生理的食塩液の口ひげ部皮膚投与後，三叉神経節で観察された Iba1 陽性細胞の組織標本写真，B：Histamine の口ひげ部皮膚投与後に観察された Iba1 陽性細胞の組織標本写真，C：Iba1 陽性細胞の占める領域の割合を示したグラフ。

本研究は顔面皮膚に引き起こされる痒みの神経機構を解明するため，発痒物質である histamine を口ひげ部皮膚に注入することによって早期に出現する macrophageの痒み感覚発症に対する役割を明らかにすることを目的に，免疫組織学的手法を用いて，三叉神経節における23えられ，痛みと同様の神経機構によって受容されると考通って脊髄後角に送られ，この領域に存在するニューロ。しかし，近年，histamine 刺激に対しン活動を亢進させると報告されている 6）。従来の報告かて特異的に反応を示す脊髄視床路に軸索を持つニューロ

ら，神経節細胞の興奮性が長期間にわたって増強すると，ンが同定され，痒みと痛覚とは異なるメカニズムで発症

一次ニューロンは感作され，サイトカインや神経ペプチ

えられてきた3-5）

6）

することが明かにされた 。Histamine の受容体には，ドあるいは ATP 等，様々な物質の合成が進み神経節細H1 〜 H4 の四種類のサブタイプが知られており，これら胞から放出される。これらの物質の働きにより神経節周9）は自由神経終末に存在することが知られている 。

囲には多くの macrophage が集積することが知られていHistamine による痒みは H1 遮断薬によって抑制されるる 17）。おそらく本研究で観察された多くの macrophage

ことから，H1 受容体は histamine 投与による急性の痒みも，同様のメカニズムで集積されたものと考えられる。

発症に関与すると考えられている 19）。Histamine が受容集積した macrophage においても，様々な分子の合成が体に結合すると，自由神経終末を支配する無髄の C 線維促進し放出され，ニューロンの興奮性はさらに増強し，の活動性が上昇する 20）。発生した活動電位は神経節を強い痒みが発症するものと考えられる。

Fig. 5 生理的食塩液および histamine の口ひげ部皮膚投与により三叉神経第Ⅱ枝領域において観察された GFAP 陽性細胞の組織標本写真
A：生理的食塩液投与，B：Histamine 投与，矢印は GFAP 陽性細胞

Fig. 6 顔面皮膚の histamine 刺激によって引き起こされる痒み発症の末梢神経機構を示した模式図
Histamine 投与によって三叉神経に高頻度の活動電位が誘導され，それに伴って三叉神経節内に多くの macrophage が集積する。また，少数ではあるが衛星細胞の活性化が誘導され，最終的に顔面皮膚に痒みが引き起こされる。

24

macrophage による顔面皮膚の痒み症する痒みには三叉神経節に出現する macrophage の集

2． 三叉神経の各枝領域における macrophage 出現の違い積が重要な働きを有する可能性が示された。

本研究では，口ひげ部に histamine を注入することによって，第Ⅱ枝および第Ⅲ枝領域に有意に多くの Iba1

本論文の作成にあたり，日本大学歯学部生理学講座岩田幸一教授および篠田雅路准教授にご指導をいただきましたことに対して深く感謝いたします。また，実際に実験を推進するにあたって，多くのご助言とご指導をいただきました生理学講座の諸先生方および渋田郁子専修研究員に心から感謝の意を表します。
本論文に関して申告すべき利益相反はありません。

陽性細胞すなわち macrophage の集積が観察された。これに対し，第Ⅲ枝領域では有意な macrophage を観察することができなかった。これは，ラットの三叉神経節細胞の解剖学的配列が原因であると考えられる。つまり，Fig. 1 に示したように，ラットの三叉神経節では，第Ⅰ枝と第Ⅱ枝領域の神経節細胞が混在しているのに対し，

文

第Ⅲ枝領域は独立した領域に細胞体が密集した構造を

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持っている。このような解剖学的構造から，第Ⅰ枝および第Ⅱ枝領域においてはニューロン同士の機能連関が密に 行 わ れ， そ の 結 果 と し て， こ れ ら 両 領 域 に お け る
macrophage の集積が第Ⅱ枝支配領域である口ひげ部への histamine 注入によって有意に増加したものと推察される。
3． 痒み発症に対する衛星細胞の関与
これまでの多くの研究により，口腔顔面領域の炎症や三叉神経損傷によって，三叉神経節細胞周囲に存在する多くの衛星細胞が活性化されることが報告されている 13,15,16）。活性型の衛星細胞からはサイトカインや神経ペプチドなど様々な物質が合成され放出されることが知られている 15,16）。これらの物質により神経節細胞の活動
性 は さ ら に 亢 進 す る。 本 研 究 で は わ ず か で は あ る が，histamine 注入によって GFAP 陽性細胞すなわち活性型衛星細胞を認めた。Histamine 注入後 5 分という短時間で活性型衛星細胞の出現を認めたことから，より長い時間経過を経るとより多くの衛星細胞の活性化が誘導され，痒み感覚が亢進する可能性があると考えられる。

結献論

生理的食塩液および histamine の口ひげ部皮下への注入によって，多くの Iba1 陽性細胞出現を認めた。また，単位面積当たりで Iba1 陽性細胞が占める領域を計測した結果，histamine 注入群の方が生理的食塩液注入群よりも有意に広い領域を占めていた。第Ⅱ枝領域における
Iba1 陽性細胞が占める面積の割合は，histamine 注入群の方が生理的食塩液注入群よりも有意に広い面積を占めていた（ ＜ 0.01）。第Ⅲ枝領域においても，第Ⅰ枝および第Ⅱ枝領域で検出された Iba1 陽性細胞と同様の分布を認めた。Histamine 注入群と生理的食塩液注入群におけ る Iba1 陽 性 細 胞 が 占 め る 面 積 を 比 較 す る と，histamine 注入群と生理的食塩液注入群では，両者に有意 な 違 い は 認 め ら れ な か っ た（ ＞ 0.05）。 ま た，
histamine の口ひげ部への注入によって，わずかではあるが，神経節細胞を取り囲むように，活性型衛星細胞が検出された。
以上の結果から，histamine 注入により顔面皮膚に発25

Macrophages in trigeminal ganglion contribute toectopic mechanical hypersensitivity following inferior
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