新規ペプチドＮＭＵによる生体時計調節作用
Regulation of circadian oscillator by the novel peptide, neuromedin U (NMU)
中原桂子 宮崎大学農学部獣医生理 助教授
Keiko Nakahara: Department of veterinary physiology, Faculty of Agriculture,
Miyazaki University
和文要旨
新規ペプチド、ニューロメジンＵ（NMU）, の生体時計および反射機能におよぼす役割について検討した。NMU の中枢での存在部位を免疫組織化学的に検索したところ、生体時計部位である視交叉上核に認められた。NMU mRNA 発現は視交叉上核内で概日リズムを示し、そのピークはＣＴ４−８時であった。ＮＭＵを脳室へ投与すると、投与時刻依存性に行動リズムの位相変位をおこし、また視交叉上核において Fos 蛋白質の発現と時計関連遺伝子 per1mRNA 発現量の増加をおこした。これらの結果は NMU が時計機構に局所的に作用し、時計を調節していることを示唆している。次に、NMU ノックアウト（NMU‑KO）マウスにおいて痛みや熱に対する反射を調べた結果、反射機能の低下が認められた。一方、NMU の脳室内投与は投与量依存的にこれらの反射を亢進した。NMU 投与後、Fos 発現が反射に係わる脊髄、延髄弧束核および視床下部に認められた。これらのことから、NMU が反射機能に重要な役割を演じていると推測された。

Abstract
We investigated the role of novel peptide, neuromedin U (NMU), for circadian clock and reflex
function. Immunohistochemical analysis revealed the presence of a gut-brain peptide, neuromedin U(NMU), in the suprachiasmatic nucleus (SCN), which is the site of the master circadian oscillator.
The expression of NMU mRNA exhibited a circadian rhythm, with the peak expression in the SCN
occurring at CT4–8 h. Icv injection of NMU induced the expression of Fos protein in the SCN andcaused a phase-dependent phase shift of the circadian locomotor activity rhythm. Furthermore, ICV
injection of NMU increased the expression of Per1, but not Per2 in the SCN. These results indicatethat NMU may play some important role in the circadian oscillator by exerting an autocrine orparacrine action in the SCN. Next, we compared nociceptive reflexes in NMU KO and wild-type
mice. Hot plate and formalin tests revealed that reflexes to heat and pain were significantly
decreased in NMU KO mice. Conversely, icv injection of NMU into wild-type mice stimulated
nociceptive reflexes in a dose-dependent manner. After NMU injection, increased c-Fos expression
was observed in a wide range of locations in hypothalamus, brainstem and spinal cord. These results
suggest that endogenous NMU may be involved in reflexes.

研究目的

よびＦＭ４はそれぞれニューロメジンＵ受

近年 GPR66(FM3)および FM4 の内因性容体１（ＮＭＵＲ１），２（ＮＭＵＲ２）とリガンドとして２３個のアミノ酸からなる命名された。我々を含め、ＮＭＵを内因性ニューロメジンＵ（ＮＭＵ）が我々を含めリガンドとして同定した幾つかのグループて３つのグループから同時に同定された。

は、このホルモンが摂食抑制ホルモンであこの発見により、ＧＲＰ６６（ＦＭ３）おることを報告した。しかし、ＮＭＵの作用-1-部位を検討するため、神経活性化の指標と射は 1%ホルマリン溶液 20μl を右後肢のパなる cFos の発現をＮＭＵ投与後に調べたッド部分に投与し、投与後 1 時間までに肢結果、視交叉上核(体内時計部位)あるいは脊をなめる時間を計測した。脳および脊髄を髄や延髄弧束核（これらは反射、あるいはは投与後、c‑Fos 免疫染色に供した。別に、迷走神経支配などに関する）に多く発現し側脳室に NMU あるいは生理食塩水を投与していることから、ＮＭＵの作用が単に摂食て、温熱や痛覚刺激に対する反応を評価し抑制に留まらない可能性が推測された。そた。

こで、本研究ではＮＭＵの新たな生理作用研究成果能性について検討した。
脳の視交叉上核でＮＭＵ陽性細胞が認められた(図 1a) 。また、この視交叉上核にＮ研究経過
ＭＵの受容体１および２のｍＲＮＡの発現も認められた。それらの発現量を経時的に実験１）ＮＭＵの生体時計機構への関与調べた結果、ＮＭＵと受容体１のｍＲＮＡについては明期に相当する時刻に増加し、暗期に相ＮＭＵが生体時計機構へどのように関当する時刻には低下することが(図１ b,与しているかを調べるために、まずＮＭＵc) 、受容体２のｍＲＮＡは暗期相当時刻にの視交叉上核における発現を免疫組織化学的に検索した。用いた抗体は、合成ＮＭＵ増加し、明期相当時刻に減少することが判を抗原にウサギ免疫で作成したものである。 明した(図１ｃ)。さらに、ニューロメジン
次に、視交叉上核内におけるＮＭＵ受容体Ｕを脳室内投与するとＦｏｓ蛋白質が視交mRNA の発現およびＮＭＵmRNA の発現に概叉上核において発現した。ＮＭＵを恒常暗日リズムが存在するか否かを、恒常暗下飼下で自由継続リズムを示すラットに投与す
育ラットにおいて経時的に視交叉上核を取ると、投与時刻依存性に、行動リズムの前り出し、リアルタイム PCR で測定した。さ進や後退が認められた(図２a)。時刻依存性
らに、ＮＭＵの脳室内投与が時計のリズム位相反応をプロットしてみると、に影響をおよぼすか否かを行動リズムを指non‑photic 型の位相反応であることが判明標に検討した。また、ＮＭＵの投与においした(図２ｂ)。特にサーカディアン時刻(Ｃて視交叉上核中のどのような遺伝子が影響Ｔ)６時の投与は位相前進を起こしたので、を受けているのかを調べるため、マイクロ
この時刻の投与により、どのような遺伝子アレイで検索し、有意な変化が認められたが変化したのかをマイクロアレイとリアル遺伝子ｍＲＮＡについて、さらにリアルタ
タイムＰＣＲで検討した結果、時計関連遺イム PCR で定量化した。
伝子の転写因子と目される、幾つかの遺伝
実験２）ＮＭＵノックアウトマウスとワ子ｍＲＮＡが増加していること、さらに時計関連遺伝子 per1 のｍＲＮＡが増加した
イルドマウスの熱や痛み反射の比較
ＮＭＵのノックアウトマウスを作成し(児ことが判明した。以上の結果は、ニューロ島ら)、58 度の温熱に対する反射およびホメジンＵが、視交叉上核内において、オールマリン接種に対する痛み反射をワイルド
トクラインあるいはパラクライン的に時計マウスと比較した。温熱反射はカットオフ遺伝子に作用していることを示唆している。
タイムを 30 秒間に設定し、ジャンプもしく
このように直接時計の遺伝子に作用できるは後肢をなめる反応が最初に見られるまで蛋白質は極めて珍しい。の時間を反射開始として判定した。痛覚反ＮＭＵノックアウトマウス（ＮＭＵ−Ｋとして、生体時計や反射機能への役割の可-2-Ｏ）は熱反射機能が低下していることが判

温熱反射機能が低下していることが見出さ明した(図３a)。次にホルマリンテストによれた。逆にＮＭＵを投与するとこれらの反る痛み反射を調べると、第２相(１０分後か射機能が亢進した。このことは、ＮＭＵがらの反応)の慢性的痛みに対する反応が低反射機構に関与していることを示唆してい下していることが判明した(図 3b)。逆に、る。免疫組織学的にもＮＭＵの投与によっワイルドマウスで、ＮＭＵを脳室内に投与て反射に関わる脊髄や弧束核において Fos

すると、熱反射も痛み反射も通常より亢進が発現したのもこれを支持する。老齢化にすることが示された(図４aｂ)。そこで、ニ伴う反射能力の低下がＮＭＵに関連していューロメジンＵ投与後の神経活性化の指標るのか？あるいは、治療にＮＭＵが適用でとしてＦｏｓ蛋白質の発現部位を調べてみきるのか？が今後の極めて重要な課題であると、弧束核や脊髄後核（ラミナエⅡ）なる。

どに発現が認められた(図 4ｃ)。また、ホルマリンによる痛みを与えた後、脊髄のニ今回の有意義な研究に多大な援助を頂きまューロメジンＵｍＲＮＡの増加が認められした日産科学振興財団に深謝いたします。

た。以上の結果は、ニューロメジンＵが熱発表論文リストや痛みの反射機能に関わっていること、そK.Nakahara, Y. Egi, M.Kojima, R. Hanada,
T.Ida,
M.
Miyazato,
K.Kangawa,N.Murakami
Neuromedin U is involved in nociceptivereflexes and adaptation to environmental
stimuli in mice
Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 323:615-620, 2004
K. Nakahara, R. Hanada, N. Murakami, H.
Teranishi, H. Ohgusu, N. Fukushima, M.
Moriyama, T. Ida, K. Kangawa, M.
KojimaThe gut-brain peptide neuromedin U isinvolved in the mammalian circadianoscillator system
Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 318:156-161,2004
K Nakahara, K Fukui, N Murakami
Involvement of thalamic paraventricular
nucleus in the anticipatory reaction underfood restriction in the rat
J.V.M.S. 66:1297-1300,2004
村上 昇、中原桂子、寒川賢治：「グレリンと胎児・新生児」日本臨床 「臨床分子内分泌学」2004の部位は恐らく脊髄の可能性を強く示唆している。

今後の課題と発展
体内時計の中枢は視交叉上核に存在していることが広く知られている。今回、新規
蛋白質ＮＭＵが時計部位に局在して存在し、その受容体も同居していること、またＮＭ
Ｕの投与で実際に視交叉上核に Fos が発現したことから、ＮＭＵが視交叉上核に作用していることが証明された。ＮＭＵの投与がリズムを変化させ、時計関連遺伝子のmRNA の発現量を変化させたことから、ＮＭＵが時計に重要な役割を演じていることは間違いない。最近、ＮＭＵのノックアウトマウスで、リズムの異常が発見された（未発表）こともこの仮説を支持している。今後、ＮＭＵがどのように時計を調節しているのか、あるいは、リズム障害の治療に応用できるのかが重要な研究課題である。一方、ＮＭＵノックアウトマウスで、痛みや-3-

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