⽇本動物実験代替法学会 第36回⼤会

千葉⼤学
2023年11⽉[シンポジウム4]
医療機器分野における動物実験代替法の開発状況と今後の展望

⽪膚感作性試験動物実験代替法の開発
国⽴医薬品⾷品衛⽣研究所 医療機器部︓宮島敦⼦、加藤玲⼦、辻脇直美、⾥⾒理⼦、野村祐介、
岡本悠佑、⻑⾕川千恵、蓜島由⼆、⼭本栄⼀
富⼠フイルム株式会社︓鰐渕彩花、⼭本裕介、笠原利彦
花王株式会社︓⽔町秀之
⺠⽣科学協会︓藤巻⽇出夫

国立医薬品食品衛生研究所 医療機器部

1

筆頭発表者のCOI開示
筆頭発表者氏名：宮島 敦子

な し＊本講演の内容は規制当局等の正式見解ではありません2

本日の講演内容

NIHS

Ø 医療機器の皮膚感作性評価法の国際動向
Ø 皮膚感作性試験動物実験代替法の選定と改変
Ø 動物実験代替法の性能評価

3

本日の講演内容

NIHS

Ø 医療機器の皮膚感作性評価法の国際動向
Ø 皮膚感作性試験動物実験代替法の選定と改変
Ø 動物実験代替法の性能評価

4医療機器の生物学的安全性評価における感作性試験
ISO/TC 194

2021.1

ISO 10993-10:2010
Tests for irritation and skinsensitization• All in vivo tests

2023.8

日本

2012.3 ⇨ 2020.1 改正

ISO 10993-23:2021
Tests for irritation••

In vivo tests : Animal and human
In vitro test : RhE modelISO 10993-10:2021
Tests for skin sensitization
2021.11

NIHS••

動物実験のみIn vivo tests : LLNA, GPMT, Closed-patch
In vitro tests (informative)

DPRA, KeratinoSens, LuSens, SENS-IS, IL-18 RhE Assay,
EpiSensA, SenCee Tox, h-CLAT, U-SENS, IL-8 Luc Assay, GARDISO TS 11796:2023

Requirements for interlaboratory studies to demonstrate
the applicability of validated in vitro methods to assess theskin sensitization of medical devices

医療機器の生物学的安全性試験法ガイダンス
厚生労働省医薬・生活衛生局医療機器審査管理課長通知、薬生機審発0106 第1号

第2部 感作性試験•

In vivo tests : GPMT, A&P test (Scratched skin method), LLNA

動物実験のみ

第5部 刺激性試験••

In vivo tests : Primary skin irritation test, Intracutaneous test
In vitro test : RhE model5

皮膚感作に関する有害性発現経路（AOP）
ChemicalMolecular
Initiating event

Key Event 1
Covalent binding
to skin proteins
DPRA, ADRA,kDPRA, C-SPRA

Cellular
Response

Organ
Response

NIHS

Organism
Response

Key Event 2
Keratinocyte
response
KeratinoSensTM, LuSens, SENS-IS,
IL-18 RhE Assay, EpiSensA, SenCeeTox,
Key Event 3
Activation ofdendritic cells
h-CLAT, U-SENSTM,
IL-8 Luc Assay,
GARDTM

GPMT(in vivo)

Key Event 4
T-cellproliferation
LLNA(in vivo)
Adverse Outcome Pathway (AOP)
Key event 1：Covalent binding between chemicals and cysteine or lysine residues of proteins
Key event 2：Inflammatory response and gene expression by ARE-dependent pathway in keratinocytes
Key event 3：Activation of dendritic cells (expression of specific cell surface markers, production of chemokines and cytokines)
Key event 4：T cell proliferation in lymph nodes6化学物質による皮膚感作Key eventの検出試験系
10993-10:2021
Key event 1 Annex C (1)AOP event

Guideline

Experimental system

NIHS

Application

DPRA(Direct Peptide Reactivity
Assay)

OECD TG Colvalent protein binding, Cys and Lys peptide, 100 mM or 20 mg/mL, HPLC, 220nm (○) acetonitrile, water,
442C
detection
isopropanol, acetone and

ADRA(Amino acid Derivative
Reactivity Assay)

OECD TG Colvalent protein binding, NAC and NAL, 4 mM or 0.5 mg/mL, HPLC, 281nm, Ex/Em
442C
284/333 nm detection(○) acetonitrile, water,acetone andacetonitrile/DMSO.

kDPRA(Kinetic Direct Peptide
Reactivity Assay)

OECD TG Colvalent protein binding, Cys peptide, time- and concentration dependent manner,
442C
HPLC, 220nm detection(○) acetonitrile, water,
isopropanol, acetone andacetonitrile/DMSO.

acetonitrile/DMSO.

none
C-SPRA(Chromophore-Solid Peptide
Reactivity Assay)

Colvalent protein binding, Cys and Lys peptide resine,elution,(○) polar and non-polar

KeratinoSensTM

OECD TG Activation of epidermal keratinocytes.
442D
ARE of the human AKR1C2 gene, KeratinoSens™ transgenic cell line, luciferase gene

Annex C (3)LuSensOECD TG Activation of epidermal keratinocytes.
442D
ARE of the rat NQO1 gene, LuSens transgenic cell line, luciferase gene induction(○) DMSO, aqueous solvents(×) non-polar solvents

Annex C (4)SENS-ISongoing

Activation of epidermal keratinocytes, RhE models Episkin and SkinEthic RHE.
64 genes expression measured by qRT-PCR(○) polar and non-polar
medical device extracts

Annex C (5)IL-18 RhE Assaynone

Activation of epidermal keratinocytes, RhE models SkinEthic RHE, VUmc-EE, EpiCS, (○) polar and non-polarand EpiDerm, Quantification of IL-18 by ELISA and MTT test
medical device extracts

Annex C (6)

EpiSensA

ongoing

Activation of epidermal keratinocytes, RhE models LabCyte EPI-MODEL 24,
4 marker genes expression measured by RT-PCR(○) saline and sesame oil
extracts

Annex C (7)SenCeeTox

none

Activation of epidermal keratinocytes, RhE models EpiDerm EPI-200 and SkinEthic
RHE, 11 genes expression measured by qRT-PCR(○) polar and non-polar
medical device extracts

h-CLAT

OECD TG Activation of epidermal dendritic cells, THP-1 human monocytic leukaemia cell line,
442E
FACS, expression of CD86 and CD54(○) saline and DMSO
(×) non-polar solvents

U-SENSTM

OECD TG Activation of epidermal dendritic cells, U937, Human histiocytic lymphoma cell line,
442E
FACS, expression of CD86(○) test chemicals that aresoluble or that form a stabledispersion

Annex C (10) IL-8 Luc Assay

OECD TG Activation of epidermal dendritic cells, THP-1-derived IL-8 reporter cell line (THP442E
G8), luciferase gene induction(○) X-VIVO 15 culture
medium, DMSO and water

Annex C (11) GARDOECD TG Activation of dendritic cells, The GARD skin cell line, SenzaCells, human myeloid
442E
origin similar to dendritic cells. Genomic biomarkers (200 genes in the GPS) is(○) polar and non-polar
medical device extracts

Key event 2 Annex C (2)(○) DMSO, aqueous solvents(×) non-polar solvents

induction

Key event 3 Annex C (8)Annex C (9)(Genomic Allergen Rapid
Detection)
ISO 10993-10 AneexC

measured using NanoString platform
Genomic assays

Polar and non-polar

7本日の講演内容

NIHS

Ø 医療機器の皮膚感作性評価法の国際動向
Ø 皮膚感作性試験動物実験代替法の選定と改変
Ø 動物実験代替法の性能評価

8

皮膚感作性AOP KE1の検出試験系

NIHS

DPRA と ADRA は、in chemico の皮膚感作試験で、AOP KE1における タンパク質
への共有結合を評価する。これらのアッセイは、OECD TG No. 442C に収載されて
いる。
Assay
OECD TG442C
Substrate

DPRA (Direct Peptide Reactivity Assay)
2015.2
Cysteine containing peptide(CyP),
Lysine containing peptide (LyP)

ADRA (Amino acid Derivative Reactivity Assay)
2019.6N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L -cysteine(NAC),
α-N -(2-(1-naphthyl)acetyl)-L -lysine(NAL)

Ac-RFAACAA-COOH,
Ac-RFAAKAA-COOH
Solvent
Reaction
Measurement
wavelength
Concentration of test
substance solution
Concentration of test
substance in reaction
solution
Thiol group oxidation
inhibitor
Reaction stop solution

Acetonitrile, water, isopropanol, Acetonitrile, water, acetone,
acetone, DMSO/Acetonitrile
DMSO/Acetonitrile
25°C, 24 hr
25°C, 24 hr
220 nm
281 nm (Low co-elution),
Ex/Em 284/333 nm
100 mM
4 mM
Cysteine :5 mM
Lysine :25 mM

1 mM

No

Yes

No

Yes

Ø ADRAは、強いUV吸収及び蛍光をもつナフタレン環にシ
ステインまたはリジンを導入したNACとNALを基質として利用している。
Ø ADRA は、極性および非極性の溶媒抽出物に適用でき、試験溶液の濃度は DPRAの 1/25である。
Ø ADRA は、蛍光検出が可能なので、共溶出がほとんど出ない。
以上より、ADRA は、医療機器抽出物の評価に役立つ可能性が高い。

ISO 10993-10 Annex C

9

皮膚感作性AOP KE2の検出試験系
Name of test system

Guideline

Principle of the test

NIHS

Time of
Experimental system
exposure
48hKeratinoSens™ transgenic cell line, luciferase
gene induction

KeratinoSensTM

OECD 442D

Activation of epidermal
keratinocytes.
ARE of the human AKR1C2 gene

LuSensOECD 442D

Activation of epidermal
keratinocytes.
ARE of the rat NQO1 gene

48hLuSens transgenic cell line,
luciferase gene induction

IL-18 RhE Assaynone

Activation of epidermal
keratinocytes.
IL-18 release24h

RhE models SkinEthic RHE, VUmc-EE, EpiCS,
and EpiDerm, Quantification of IL-18 by
ELISA and MTT test

Application

Polar

Non-polar

○

X

○

X

○

○

ISO 10993-10 AneexCØ OECD TG No.442Dに収載されている、ケラチノサイトラインレポーターアッセイであるKeratinoSens及びLuSensは、極性溶媒にのみ適用可能である。そのため、医療機器の評価への適用は難しいと考えられる。
Ø IL-18 RhE Assayは、RhEモデルを用いており、極性溶媒及び非極性溶媒に適用可能である。本法は、いくつかのRhEモデルにおいて報告されている。また、RhEモデルを用いたin vitro刺激性試験（ISO 10993-23）とプロトコルが一部共通である。
我々は、RhEモデル LabCyte EPI-MODEL 24 (J-TEC) を用いて、培養上清中の
IL-18を測定した。7種の感作性物質、3種の非感作生物質を用いて検証を行なったが、予想された結果は得られなかった。暴露時間などシステムの改良を含めたさらなる検討が必要であると結論づけた。
10

皮膚感作性AOP KE2の検出試験系
Assay
OECD TG442D
Experiment
systemNIHS

SENS-ISongoing
Activation of epidermal keratinocytes.
Gene expression of 64 genes (two groups)

EpiSensA
SenCeeTox
ongoingnone
Activation of epidermal
Activation of epidermal
keratinocytes.
keratinocytes.
Gene expression of 4 genes
Gene expression of 11 genes
RhE model
RhE models Episkin and SkinEthic RHE
RhE models LabCyte EPI-MODEL 24 RhE models EpiDerm EPI-200(EPISKIN)(MatTek) and SkinEthic RHE(J-TEC)(EPISKIN)
Exposure
15min (6 h after wash)
6h
24 h
Exposure volume 30 uL
5 uL
100 uL
Measurement
64 genes expression (REDOX group
4 marker genes (two inflammatory 11 genes (eight Nrf2/ARE, one(related antioxidant responsive element
genes related P2X7 and two
AhR/XRE and two Nrf1/MRE
and the redox protective signals) and SENS- cytoprotective responses genes
controlled gene) expression
IS group (related inflammation, danger
related Nrf2) expression measured measured by qRT-PCR
signals and cell migration)) measured by by qRT-PCR
ISO
10993-10 AneexC
ISO 10993-10 AneexC
ISO 10993-10 AneexC
qRT-PCRØ SENS-IS、EpiSensA、SenCeeTox などのRhEモデルアッセイは、極性溶媒及び非極性溶媒に適用可能で、医療機器の評価にも有用と思われる。
Ø これらのアッセイは、異なるRhEモデルを使用し、プロトコル（曝露時間、曝露量、検出遺伝子など）も異なっている。
Ø これらのアッセイシステムは、OECD TG収載に向けて、検証が進められている。
医療機器の評価に適用するためには、システムの改良と検証が必要とされる。
11

皮膚感作性AOP KE3の検出試験系
Name of test system

Guideline

Principle of the test

NIHS

Time of
Experimental system
exposure
24h
THP-1 human monocytic leukaemia cellline, FACS,
expression of CD86 and CD54

Application

Polar

Non-polar○

X

h-CLAT

OECD 442E Activation of epidermal dendritic
cells,
CD86 and CD54 expression

U-SENSTM

OECD 442E Activation of epidermal dendritic
cells,
CD86 expression

45±3h

U937, Human histiocytic lymphoma cellline, FACS,
expression of CD86○

X

IL-8 Luc Assay

OECD 442E Activation of epidermal dendritic
cells,
IL-8 and GAPDH expression

16h

THP-1-derived IL-8 reporter cell line
(THP-G8),
luciferase gene induction

○

X

GARD

OECD 442E Activation of dendritic cells.
24h
GARD prediction signature (GPS)○○(Genomic Allergen Rapid
Detection)

ISO 10993-10 AneexC

The GARD skin cell line, SenzaCells,
human myeloid origin similar to dendritic
cells. Genomic biomarkers (200 genes in
the GPS) is measured using NanoString
platform
Genomic assays

Ø OECD TG No.442Eに収載されている h-CLAT、U-SENS、IL-8 Luc Assayは、
THP-1やU937を用いた試験であり、極性溶媒にのみ適用可能である。そのため、医療機器の評価への適用は難しいと考えられる。
Ø GARDは、極性溶媒及び非極性溶媒に適用可能であるが、プラットフォームを用いた200遺伝子の発現解析であり、通常の実験室での実施は容易ではない。
以上を踏まえ、ADRA, EpiSensA, h-CLATについて、医療機器の感作性評価に向けて試験法の改変を試みた。
12

DPRA, ADRAの医療機器の評価に向けた改変

NIHS

医療機器抽出物への適用を考慮し、抽出溶媒として水及びアセトニトリルを用い、100% 抽出液を用いて評価を実施した。

Assay

DPRA

ADRA

(Direct Peptide Reactivity(Amino acid Derivative

Assay)

Substrate

Modified DPRA-MD

Reactivity Assay)

Cysteine containing

N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L

Cysteine containing

N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L

peptide (CyP),-cysteine (NAC),

peptide (CyP),-cysteine (NAC),

Lysine containing

α-N -(2-(1-Lysine containing

α-N -(2-(1-peptide(LyP)

naphthyl)acetyl)-L -lysine

peptide(LyP)

naphthyl)acetyl)-L -lysine(NAL)
Acetonitrile, H2O,
Solvent

Modified ADRA-MD

isopropanol, acetone,
DMSO/Acetonitrile(NAL)

Acetonitrile, H2 O, acetone,
DMSO/Acetonitrile

Extraction

H2 O, Acetonitrile

H2 O, Acetonitrile

Reaction

25℃, 24 hr

25℃, 24 hr

25℃, 24 hr

25℃, 24 hr

Measurement

220 nm

281 nm (Low co-elution),

220 nm

281 nm (Low co-elution),

wavelength
Concentration

Ex/Em 284/333 nm

Ex/Em 284/333 nm

100 mM

4 mM

100%

100%

Concentration

Cysteine :5 mM

1 mM

Cysteine :5 %25%

of testLysine :25 mMof testsubstance
Lysine :25 %substance inreaction solution

13

EpiSensAの医療機器の評価に向けた改変

NIHS

1) 暴露溶媒の検討
オリジナルの方法では，溶媒としてアセトン/オリーブ油（AOO）（4:1）を用いるのが一般的であるが、医療機器抽出物への適用を考慮し、極性溶媒及び非極性溶媒抽出物での暴露について検討した。
2) 暴露量の検討
オリジナルの方法では、5μL を暴露しているが、医療機器抽出物への適用を考慮し、暴露量の増加が細胞応答の検出感度に与える影響について検討した。

Solvent

EpiSensA

Modified EpisSensA-MD

AOO (4:1), Water, 50% EtOH

Polar (Saline)
Non-polar (Sesame oil)

Exposure volume

5 uL

100 uL

Exposure

6h

6h

4 marker genes expression

4 marker genes expression

measured by qRT-PCR

measured by qRT-PCR

≥ 80%

≥ 80%

Measurement

Viability for judge 80%
Positive control

0.78% Clotrimazole/AOO
0.10% 4-Nitrobenzylbromide/AOO

Extraction method ?

1) Dose finding study (4-foldMethoddilution, 5-7 slope)

2-fold dilution, 3-7 slope ?

2) Main study (2-fold dilution from

Judge ≥ 80% of viability< 80% , 3-5 slope)14

h-CLATの医療機器の評価に向けた改変

NIHS

細胞毒性試験における抽出法に倣い、h-CLATにおいても血清含有培地を用いて抽出を行い、血清含有培地にて抽出液の希釈系列を作製して評価を実施した。

h-CLAT

Modified h-CLAT-MD
6

Cells

THP-1 cells, 1.0×10 cells /well

Solvent

Saline, Medium, DMSOExtraction

6

THP-1 cells, 1.0×10 cells /well
10% FBS-Medium

Exposure volume

1.0 ｍL

1.0 ｍL

Exposure

24 h

24 h

Expression of CD86 and CD54

Expression of CD86 and CD54

cell surface markers

cell surface markers

≥ 75%

≥ 75%

Measurement

Viability for judge 80%

Positive control

4 ug/mL DNCB

Method1) Dose finding study (2-fold

Extraction method ?

dilution, 8 slope)

2-fold dilution, 8 slope ?

2) Main study (1.2-fold dilution

Judge ≥ 75% of viability

from < 80%, 8 slope), 3 runs
Applicability

The negative results with test
chemicals with a Log Kow greater?

than 3.5 should not be considered.

15

本日の講演内容

NIHS

Ø 医療機器の皮膚感作性評価法の国際動向
Ø 皮膚感作性試験動物実験代替法の選定と改変
Ø 動物実験代替法の性能評価

16

感作性物質を含有するPUシートの作製

NIHS

Confidential

Ø LLNA Potency Categoryを考慮して、感作性物質を含有する Polyurethane（PU）シートを作製し、性能検証に用いた。
Ø 現行の感作性試験（GPMT）と医療機器の評価用に改良したin vitro試験の性能を比較検証することにより、in vitro感作性試験の有用性と適用限界を明らかにする。

17

Modified DPRA-MD及びModified ADRA-MDによる感作性物質
含有PUシートの評価

NIHS

Confidential

Ø 6種類のPUシートは、 Modified DPRA-MD及びModified ADRA-MDの両試験法において、陽性と判定された。また、 MBTにおいては、Modified ADRA-MDの方が、感度が高かった。
18

Modified EpiSensA-MD による感作性物質含有PUシートの評価

NIHS

Confidential

Gene expression is not determined if survival is less than 80%, following the rules of EpiSensA.

Ø 6種類のPUシートは、4つのマーカー遺伝子のうち少なくとも1つがそれぞれのカット
オフ値を超え、陽性と判定された。

19

Modified h-CLAT-MD による感作性物質含有PUシートの評価

NIHS

Confidential

Ø 6種類のPUシートは、 CD86とCD54の発現量のうち、少なくとも1つがそれぞれのカットオフ値を超え、陽性と判定された。

20

感作性物質含有PUシートのin vitro感作性試験による評価
のまとめ

NIHS

Confidential

Ø 感作性物質を含む6種類のPUシートを、各溶媒抽出物を用いたin vitro試験（Modified ADRA-MD, Modified EpiSensA-MD，Modified h-CLAT-MD）により評価し、すべての試験系で陽性と判定された。また、同シートを用いてGPMTを実施した結果、6種類のPUシート共に陽性と判定された。
21

まとめ

NIHS

in vivo sensitization test
GPMT（Saline, Sesame oil extraction）

in vitro sensitization test package
Key event 1

Modified ADRA-MD(H2O, AcCN extraction）

Key event 2

Modified EpiSensA-MD(Saline, Sesame oil extraction)

Key event 3

Modified h-CLAT-MD(10% FBS-Medium extraction)

Ø 医療機器の感作性試験動物実験代替法として、医療機器用に改変した各KEに対する Modified ADRA-MD, Modified EpiSensA-MD，Modified h-CLAT-MDが、試験パッケージの候補となると考えられた。
Ø 今後は上記試験を中心に、開発した試験法の性能、再現性・頑健性を検証し、ISO/TC194/WG8に逐次情報提供すると共に、国内ガイダンスへの反映を目指す。
22

終わりに

NIHS

ご清聴ありがとうございました

国立医薬品食品衛生研究所 医療機器部
宮島 敦子
miyajima@nihs.go.jp
23