線虫の寿命・脂質代謝を制御するインスリン様ペプチドの作用機序
M ode ofaction ofC.elegans insulin-like peptides w hichm edidate the longevity and fatm etabolism
研究代表者

鳥取大学農学部生産環境化学講座

助教授

河野

強

A ssociate Professor,D epartm entofBiologicaland Environm entalChem istry,TottoriU niversity,
TsuyoshiK aw ano
共同研究者

東京女子医科大学生理学講座

助教授

三谷昌平

A ssociate Professor, D epartm ent of physiology,Tokyo W om en s M edical U niversity School ofM edicine,ShoheiM itani
和文アブストラクト
線虫の寿命・休眠・脂質代謝はインスリンシグナル伝達系で制御されることが知られている。ゲノムプロジェクト情報の解析から, 線虫のインスリン様遺伝子は３９種存在することが示唆されているが, その生理機能の解析は殆ど進んでいないのが現状である。インスリン様遺伝子の機能解析を行うには, RN A 干渉法による機能破壊に加えて, 遺伝子破壊線虫の解析が必須となる。また, 個々のペプチドの構造と生理機能（寿命・休眠・脂質代謝）との関連付け極めて重要な課題として存在する。今回, 我々が先んじて同定したインスリン様ペプチド Ceinsulin-1および-2の高次構造解析を行い, さらに, 遺伝子破壊線虫の作出および解析を行った。また, 受容体との結合実験を行うことを目的として, 遺伝子工学による Ceinsulin-3 の大量発現を行った。
A bstract
The insulin-signaling in the nem atode Caenorhabditis elegans regulates the longevity,
diapause and fatm etabolism .The C.elegans genom e projectrevealed the existence of39 inslinlike genes. H ow ever, little is know n about physiological function of the genes. To elicit thephysiological function of each gene,gene-knock-out is inevitable as w ell as gene-knock-dow nby the RN A i. O f im portance is to connect structure of each peptide to its ow n physiological
function (longevity,diapause or fatm etabolism ).In this study,w e elicitthe tertiary structures of
the Ceinsuiln-1 and —2 peptides identified previously, In addition, w e established the anim alslacking the corresponding gene and analyzed them .W e also expressed the Ceinsulin-3 peptide
in a large scale using the recom binant technique to perform binding of the peptide to thereceptorprotein.

-1-２. 研究経過

1. 研究目的
線虫 Caenorhabditis elegans は, 生育環

2. 1

境の悪化に応答して一時的に生育を停止

較

予想高次構造と受容体認識面の比し耐性幼虫を形成することにより休眠す構造と生理機能の関連づけを行うことる。この耐性幼虫形成はインスリンシグを目的として, Ceinsulin-1 —2 の予想高次ナル伝達系によって制御されることが知構造の解析を行った。D iscoverIII/InsightIIられている。最近, このインスリンシグを用いて高次構造を予想し, 哺乳動物のナル伝達系は線虫の寿命・脂質代謝をもインスリンおよびインスリン様成長因子-制御することが判明した。ごく最近, マI (IG F-I)のものと比較した。インスリンウス, ショウジョウバエの寿命も同様のと同様に, Ceinsulin-1, -2 はＢドメインにインスリンシグナル伝達系により制御さ２つのα-へリックスを有するが, 特徴的れることが明らかとなった。よって, イな３アミノ酸 残基（-Pro-Pro-G ly-）の挿ンスリンシグナル伝達系による寿命制御入によりα-へリックスの１つが拡張しては動物種に共通であると考えられる。

いると予想された。また, 全体的な構造はインスリンおよび IG F-I と大まかに一寿命を制御する線虫のインスリンシグ致していると考えられた（図１-１）。

ナル伝達系に関する研究はインスリン受容体以降のシグナル伝達を中心に展開されており, リガンド分子であるインスリン様分子を基点とした研究展開は緒についたばかりである。ゲノムプロジェクト
情報の解析などから, 線虫では 39 種のイ

図１-１. 高次構造の比較

ンスリン様分子の存在が示唆されており,

左から IG F-I, Ceinsulin-1, Ceinsulin-2, insulin

多種のリガンド分子による複雑な制御機を示す。それぞれの３対のジスルフィド結合構が存在するものと考えられる。

を表記してある。

本研究では, 我々が世界に先駆けて同そこで, 哺乳動物との交差活性の可能性定したインスリン様ペプチド Ceinsulin-1,を検証するために受容体認識面の比較を-2, -3 に関して, 遺伝子破壊線虫を用いた行った。受容体認識に重要な役割を果た

in vivo の解析ならびに in vitro での受容体

す「分子疎水面」の形状を比較したとことの相互作用の解析を行うことにより,ろ, Ceinsulin-1, -2 とインスリンの間で異多種のリガンド分子によって制御されるなることから交差活性の可能性は極めてインスリンシグナル伝達系の「入力」機低いと考えた。また, Ceinsulin-1, -2 の分構の解明に迫ることを目的とした。

子疎水面の形状はよく一致しているが,-2-

酸性および塩基性アミノ酸の配置に違い野性株と同様に全く耐性幼虫を形成しなが認められた（図１-２）。

かった。そこで, 耐性幼虫形成誘導フェロモン存在下での耐性幼虫形成率を観察した。高濃度のフェロモン存在下では,tm 339 は対照区と同様の耐性幼虫形成率を示したが, tm 790 では耐性幼虫形成率が低下した。さらに, 低濃度のフェロモン存在下では, tm 339 は耐性幼虫形成率の上

図１-２. 受容体認識面の比較昇を示し, tm 790 は耐性幼虫形成率の著し

左から insulin, Ceinsulin-1, Ceinsulin-2 を示す。緑, 黄, 赤, 青はそれぞれ疎水性, 親水性,い低下を示した（図２）。受容体 D A F-2

酸性, 塩基性アミノ酸を表す。の機能欠損により構成的に耐性幼虫を形成することを考慮すると, Ceinsulin-1 はインスリン様遺伝子破壊線虫の作アゴニストとして機能し, Ceinsulin-2 は出と表現型の観察アンタゴニストとして機能すると考えら

Ceinsulin-1, -2 の機能解析を行うことをれる。

目的として遺伝子破壊線虫の作出を行った。変異剤 TM P 存在下 U V 照射を行う

100
耐性幼虫形成率 (%)

ことにより染色体上にランダムに欠失変
異 を誘 発 し, PCR によ っ て増 幅 され る
D N A 断片の大きさを指標として, 目的の遺伝子に欠失変異を有する線虫を選別し806040た。その結果, Ceinsulin-1 遺伝子欠失株

20tm 339 お よび Ceinsulin-2 遺 伝子 欠失 株

0高濃度フェロモン存在下
耐性幼虫形成率 ( %)

2. 2

100
806040200

daf-22 tm 339 tm 790(n=145)(n=94 (n=155tm 790 を得た。tm 339, tm 790 はそれぞれ２つのエクソン部位に欠失を有すること

低 濃 度 フェ ロ モ ン 存 在 下

daf-22 tm 339 tm 790(n=102)(n=98) (n=97

図２. フェロモン存在下での遺伝子欠損株から, Ceinsulin-1, -2 の産生は不能であるの耐性幼虫形成率と考えられる。繰り返し戻し交雑を行い,対照区にフェロモン合成不全変異株 daf-22 を純化を行った後, 表現型の観察を行った。

用いた。培養液より粗精製したものをフェロ

tm 339 は僅かながら寿命の延長が認めモン試料として用いた。
。

られたが, tm 790 は野性株と同様の寿命曲2.3 遺伝子工学による大量発現線を示した。これは, RN A 干渉実験結果とよく一致した。次いで, 通常の生育環遺伝子破壊線虫などを用いた in vivo の境下で耐性幼虫形成を観察したところ,研究結果を分子レベルで検証するには,-3-リガンドと受容体の結合実験など in vitroた。これまで内因性のホルモンがアンタの研究が必要となる。そこで, リガンドゴニストとして機能する例は知られてい分子の調製を目的として, Ceinsulin-3 にないことから, 本研究は極めて重要な発関して遺伝子工学による大量発現を行っ見をもたらしたと考えている。また, 遺た。マルトース結合タンパクとの融合タ

伝子工学による Ceinsulin-3 の大量発現にンパクとして大腸菌内で発現し, アフィ成功した。これにより, Ceinsulins と受容ニティー精製後, プロテアーゼにより体 D A F-2 との結合実験が可能となった。

Ceinsulin-3 部位を遊離させ, 逆相 H PLC
４. 今後の課題と発展を用いて最終精製を行った。アミノ酸配列分析で構造を確認後, M A LD I-TO F-M S

今後は, Ceinsulins アミノ酸置換体の作による分子量測定を行った。その結果, ３出などにより、生理機能を規定するアミ対のジスルフィド結合が形成されているノ酸残基の同定が重要となる (in vivo)。

ことが判明した。

その結果を受容体との結合実験等で検証し、分子レベルでのインスリン情報伝達

0.50系の「入力機構」を明らかにしたい (in11分 子 量 7,203.

vitro)。本研究が動物種に共通する休眠・吸光度寿命制御機構の解明につながることを期
0.25

待したい。
CH3C N 濃度(%)
50５. 発表論文リスト

30(1) K aw ano, T., Takuw a, K ., Ishigura, M .,N akajim a, T., and K im ura, Y. Cloning andcharacterization of a Caenorhabditis eleganscD N A encoding a new insulin/IG F-like peptide.
Biosci. Biotechnol. Biochem ., 67, 2678-2682,(2003).

100010203040(min保持時間

図３. 最終精製の逆相 H PLC プロファイル(2) K aw ano,T.,K ataoka,N .,K im ura,Y.,G engyoA ndo, K ., and M itani, S. D isruption of theCaenothabditis eleganas insulin-like genes
Ceinsulin-1 and —2,and analyses of physiologicalfunctions.（投稿準備中）

３. 研究成果
予想高次構造の解析から, Ceinsulin-1, 2 は同様の構造をとり, 同一の受容体を(3)K aw ano, T., K ataoka, N ., M asuda, K ., andK im ura, Y. Expression of a C. elegans IG F-likepeptide. Peptide Science 2003: M . U eda (Ed.),
223-226, Protein Research Foundation, O saka(2004).

認識すると推定した。また, 受容体認識面には僅かな相違が認められた。さらに,
遺伝 子破 壊線虫 の解析 から , Ceinsulin-1
はアゴニストとして働き, Ceinsulin-2 はアンタゴニストとして働く可能性を示し-4-