2005 年 4 月作成

研究用試薬

ヒストファイン シンプルステイン AP(R)
ＨＩＳＴＯＦＩＮＥ 免疫組織化学染色試薬

貯法 2−8℃保存

包装 ： 170 テスト（17mL×1 本）
Code ： 414251
有効期間 ： 製造後 1 年６ヶ月
製造販売元

株式会社ニチレイバイオサイエンス〒104−8402
東 京 都 中 央 区 築 地 6 − 19 − 20
TEL.03（3248）2208 FAX.03（3248）2243

１．内容

アミノ酸ポリマーに、アルカリフォスファターゼとＦａｂ’にした抗ウサギＩｇ（動物種：ヤギ）を結合させた標識ポリマー。
液状。安定化タンパク質と抗菌剤を含むＭＯＰＳ（3-Morpholinopropanesulfonic acid）緩衝液（pH 6.5）にて即時使用可能な濃度に調製済み。

２．用途及び原理
ウサギ第一抗体に用いる免疫組織化学染色用試薬。組織切片上の抗原に結合したウサギ第一抗体に反応させることで、抗原・抗体・ポリマー・酵素の複合体を形成することができる。この複合体の酵素活性を利用し、基質を発色させることで、抗原部位を染色することが可能である。

３．製法

１.免疫した動物血清より精製したＩｇＧフラクションを消化し、Ｆ（ａｂ’）2 を作製する。
２.抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーで抗原特異的なＦ（ａｂ’）2 を精製する。
３.固相化したヒト血清タンパク質による吸収操作を行う。
４.アルカリフォスファターゼとアミノ酸ポリマーを結合させ、それにＦ（ａｂ’）2 を還元して得たＦａｂ’を結合させる。

４．操作方法■ 必要な試薬、器具
キシレン●

100％エタノール●

EDTA 入り採血管

95％エタノール●

対比染色試薬●

リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.6±0.2）●●

カバーガラス

●

光学顕微鏡

●

精製水

●
●

湿潤箱
封入剤

ＮａＣｌ7.75g●

K2HPO41.50g●

KH2PO40.20g

タイマー

精製水１Ｌ

組織切片用接着剤（0.02％poly-L-lysine、シランなど）

●

洗浄用容器

●

ティッシュペーパー●●

ドライヤー（冷風用）

0.01M トリス塩酸緩衝液生理食塩水（TBS）(pH7.5)●（1）トリス 12.11 ｇを精製水に溶かし塩酸でｐＨ 7.5 に調整後、精製水で全量を 1 Ｌとする（A 液）。
（2）NaCl 87.66 ｇを精製水に溶かし、精製水で全量を 1 Ｌとする（B 液）。
（3）A 液と B 液をそれぞれ 100mL ずつとり、精製水で全量を 1 Ｌとする。
●

基質溶液（ヒストファイン ニューフクシン基質キット、ファーストブルー基質キットあるいはファーストレッド基質キット）

Buffered Formalin Acetone(BFA)
Na2HPO415mg
左記容量の試薬を精製水に溶解し、調整する。
KH2PO4120mg注）第一抗体として CD20 を使用する場合は、最終アセトン濃度が精製水30mL40％になるように調整する。
アセトン45mL
ホルマリン 25mL●

■ 検体の準備［血液塗抹標本］(1)採血後、ただちに EDTA を加え、抗凝固処理を行い、スライドに塗抹する。
(2)ドライヤー(冷風)等で十分に乾燥する（20−30 分）。この乾燥が十分に行われないと標本の薄利などの原因となる。
(3)BFA で固定する（4℃、30 秒間）。
(4)流水洗する(30−60 秒間)。
(5)余分な液を振り払い、PBS に 5 分間浸す。
［パラフィン包埋切片］(1)高濃度の固定液にさらしたり、長時間の固定を行うと、組織崩壊や抗原変性を生じさせることがある。従って、組織形態や抗原活性を維持した最適固定を得るため、できるだけ新鮮で小さな組織切片（約 1cm×1cm×0.5cm）の使用と、下表の固定液の使用を勧める。
固定液
固定時間
10％（緩衝）ホルマリン
24−48 時間20％ホルマリン
12−24 時間
(2)切片を 3−6μｍに薄切し、スライドに付着させる。もし、熱による抗原賦活化処理やトリプシン処理を行う場合は、0.02％poly-L-lysine あるいはシランなどの組織切片用接着剤を使用する。
(3)脱パラフィン
１.キシレン処理① スライドをキシレンに 3 分間浸す。
② 余分な液を振り払い、別のキシレンに 3 分間浸す。
③ さらに、もう 1 つ別のキシレンで、上記ステップ１. ①の操作をする。
２.エタノール処理① 100％エタノールに 3 分間浸す。
② 余分な液を振り払い、別の 100％エタノールに 3 分間浸す。
③ さらに、95％アルコールで、上記のように 2 回処理する。
３.洗浄
余分な液を振り払い、PBS でよくすすぐ。（5 分間ずつ容器をかえるか、または洗浄ビンを使用する。）［凍結切片およびその他の標本］
不安定な抗原の場合、凍結切片標本を用いる。
(1)組織は液体窒素あるいはドライアイス-アセトンで冷やした n-ヘキサン中で急速凍結し、包埋には O.C.T.コンパウンドあるいは類似の包埋剤を使用する。
（2）新しく切り出した切片は、あらかじめ 0.02%poly-L-lysine 水溶液などの組織切片用接着剤で被膜し空気乾燥したスライドに付着させ、ドライヤー(冷風)等で十分に乾燥する（20−30 分）。
この乾燥が十分に行われないと標本の薄利などの原因となる。
(3)100%アセトンあるいは、4%パラホルムアルデヒド−PBS で 4℃、10 分間、固定する。
(4)余分な液を振り払い、PBS でよくすすぐ。（5 分間ずつ容器をかえるか、または洗浄ビンを使用する。）
スライドは直ちに染色する。もし直ちに使用しない場合は、-80℃で保存することができるが、切片を冷凍庫で、長く保存しすぎると染色強度が落ちることがある。
［対照スライドの準備］
検査の行程管理として、検体標本スライドと同じ方法により、陽性対照スライド、陰性対照スライドおよび試薬対照スライドを各 1 つずつ用意し、検体標本スライドと平行して、検体の準備から染色処理、検鏡までの全行程を行う。
■ 染色手順1.第一抗体の添加・反応(1) スライド上の標本周辺を注意深く拭く。
(2) 標本が完全に被われるように第一抗体 2 滴を各標本スライド、陽性対照スライドおよび陰性対照スライドに滴下する。
(3) 試薬対照スライドには、第一抗体のかわりにネガティブコントロ−ル（正常血清）2 滴を滴下する。
(4) 常温あるいは 4℃で反応させる（各第一抗体についている添付書のインキュベーション時間を守る）。
(5) PBS でよくすすぐ。
2.シンプルステイン AP(R)の添加・反応(1) スライド上の標本周辺を注意深く拭く。
(2) 標本が完全に被われるようにシンプルステイン AP(R) 2 滴をすべてのスライドに滴下 す る 。
常温で 30 分間反応させる。
(3) PBS でよくすすぐ。
(4) TBS ですすぐ。
3.基質溶液の添加・反応(1) スライド上の標本周辺を注意深く拭く。
(2) 標本が完全に被われるように基質溶液 2 滴を滴下する。常温で 5−20 分間反応させる。
(3) 精製水でよくすすぐ。
4.対比染色(1) 対比染色試薬にスライドを浸す。
(2) 流水洗する。
5.封入
ファーストブルー基質キット、ファーストレッド基質キットを使用する場合水溶性封入剤で封入する。ニューフクシン基質キットを使用する場合には水溶性封入剤で封入するか、乾燥による脱水の後、キシレンに数秒間浸して透徹し、非水溶性封入剤で封入して永久標本とする。
■ 判定
１.検鏡光学顕微鏡によって陽性反応を観察する。
染色結果の判定は、3 種類の対照スライドとの比較により行う必要がある。
● 陽性対照スライド
検体と同じ方法で作製した、目的抗原を含む標本。
● 陰性対照スライド
検体と同じ方法で作製した、目的抗原を含んでいない標本。
● 試薬対照スライド
検体と同じスライドをもう 1 枚準備し、第一抗体のかわりにネガティブコントロールを使って同様の染色操作を行う。このスライドが染色されれば、非特異的なタンパク結合などによる非特異的反応が考えられる。

５．妨害物質と問題対策
問題点考えられる原因

その対策①標本が乾燥している。

①標本を湿潤させた後は、湿潤箱などを用いて乾燥標本スライド②包埋剤が不適当あるいはパラフィン包②適当な包埋剤を選択する。また、包埋組織から、の染色が認め埋組織からのパラフィン除去が不完全でられない、あある。

○陽性対照ス

させない。

ライドおよびるいは弱い。

③酵素や抗体反応が不十分。

パラフィンを完全に除去する。
②キシレン、エタノール溶液を取り替える。
③古い基質溶液を取り替える。
③各ステップでの、水分の拭き取りを完全にする。
③抗体との反応時間を十分にする。特に、第一抗体では添付書のインキュベーション時間 を守る。

○陽性対照ス
ライドは染色①抗原が固定あるいは包埋過程で変性したり、マスクされている。

されるが、標ので、穏やかな固定剤を使用し固定時間を短縮する。

本スライドは① 場合によっては、染色前に抗原を露出させるた

染色されなめ、い。

熱による抗原賦活化処理あるいはトリプシンなど②自己消化により抗原が破壊されている。のタンパク分解酵素処理を行う。

③組織に存在する抗原が少ない。

②可能な限り、生検あるいは外科組織を使用する。

① 内因性アルカリフォスファターゼの活性③インキュベーション時間を長くする。

○全ての染色を不活性化するための処理が行われてスライドのバッいない。

クグラウンド②非特異結合成分がブロックされていない。

が強く染色さ

③自己消化の結果、組織液に遊離した抗れる。

①抗原の中には、固定や包埋に敏感なものがある原が過剰に存在する。

①基質・色素混合液の中にレバミゾールを添加する。
(精製水の代わりに 1mM レバミゾール溶液を使用する。)②ブロッキング試薬の操作を確実に行う。
③可能ならば、新鮮な組織を包埋する。

④不完全なパラフィン除去。
⑤不十分な抗体の洗浄。

④キシレン、エタノール溶液を取り替える。

⑥室温が高すぎて、酵素反応が早すぎる。

⑤抗体の洗浄を十分に行う。

①抗原によってはその同定のために、熱に⑥常温（15−25℃）にコントロールする。

○反応中に組よる抗原賦活化処理あるいは第一抗体⑥反応時間を短縮する。

織切片がスラとの長時間の反応を必要とする。このよ①0.02％poly-L-lysine、シランなどの組織切片用接イドからはがうな場合には、はがれ易くなる。

れてしまう。

着剤を使用する。

６．使用上又は取扱い上の注意
１.試薬は冷暗所（2−8℃）に保存する。
２.有効期間の過ぎた試薬は使用しない。

７．貯法および有効期間冷暗所（2−8℃）で保存。 有効期間は製造後 1 年６ヶ月。

文献請求先株式会社ニチレイバイオサイエンス 営業部
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