オートファジー；形態学と分子生物学の融合

人工ビーズを用いてオートファジーを視る
Artificial Induction of Autophagy around Polystyrene Microbeads
小林昇平，原口徳子

Shouhei Kobayashi and Tokuko Haraguchi（独）情報通信研究機構神戸研究所未来ICT研究センター
要旨

オートファジーが起こる瞬間を顕微鏡で捉えるのはかなり難しい．それが細胞内のいつどこで起こるか分からないからである．我々は，その問題を解決する方法として，細胞内に入れたプラスチックビーズを用いて，その周辺にオートファジーを誘導する方法を確立した．生きた細胞に導入したビーズを，蛍光顕微鏡を用いて経時的に観察することによって，オートファジーの開始から完了までのダイナミックな過程を追跡することが可能になった．蛍光観察した同じビーズを電子顕微鏡観察することで，オートファゴソーム形成に特徴的な膜構造を見分けることも可能である．本稿では，細胞内に導入した人工ビーズを用いてオートファジーを視る方法として，生細胞蛍光顕微鏡と電子顕微鏡法とを組み合わせた Live CLEM 法を紹介すると共に，この方法を使って新たに分かってきたオートファジーの過程について解説する．

キーワード：蛍光顕微鏡法，電子顕微鏡法，live CLEM 法，ポリスチレンビーズ，オートファジー

1.

はじめに

2.

Live CLEM 法

オートファジー（マクロオートファジー）は，細胞質におCorrelative light and electron microscopy（CLEM）とは，蛍ける隔離膜の出現と伸長，オートファゴソーム形成，リソソー

光顕微鏡で観察したのと同じ場所を電子顕微鏡で観察し，ムとの融合によるオートリソソーム形成といった，複雑な一2 つの方法から得られた観察画像を比較し相関をとることで連の出来事によって特徴づけられる．この一連の出来事に分子特異的な局在を解析する方法である．蛍光観察法と電子伴って，膜構造はダイナミックに変化していく．しかも，こ顕微鏡法の組み合わせ方や，用いるプローブの種類などにのような反応は，細胞内の 1 箇所に限定されているわけではよって，様々な CLEM が開発されている 2）．このうち，生細なく，様々な場所で独立に（同時ではない時間に）起こる

胞蛍光観察と組み合わせた CLEM を，筆者らは Correlative1）（図 1） ．いつどこで起こるか分からない，このような現象

light and electron microscopy after live cell imaging（liveを顕微鏡で捉えるためには，視るべき目標ポイントを人工的CLEM 法）と呼んでいる 3）．Live CLEM 法では，特定の目的に設定できると都合がよい．また，ダイナミックな構造変化

分子に対して生細胞蛍光観察を行った後，望みのタイミングを生きた細胞で捉えておいて，「今だ」と思う瞬間の局所的で細胞を化学固定し，細胞内の微細構造を電子顕微鏡で観察な膜構造を調べることができたら，オートファジーの理解にする（図 2a，（1）～（3））．その後，一揃いの光学切片像と電有用な方法となると考えられる．このような考えに基づき，

子顕微鏡像とを比較して，蛍光像と電子顕微鏡像の対応付け

我々は，細胞内に人工的ビーズを導入することによって，そを行う（図 2a，（4））．この対応付けを実現するための手段の周辺でオートファジーを誘導できる方法を確立した．さらとして，筆者らは番地付きガラスボトムディッシュを用いてに，この方法で誘導したオートファジーを，live CLEM 法でいる（図 2b）．サンプル固定後，樹脂の入ったカップを倒立観察することによって，オートファジーで起こる現象を可視させて置き，そのまま樹脂を重合させる（図 2c；矢印）．重化することに成功した．Live CLEM 法は，生きた細胞で目合後，樹脂をカップごとガラスボトムディッシュから剥がす的の細胞の特定の分子を蛍光観察した後に，同じ細胞を電子ことで，細胞と共に，番地情報を芋版の要領で樹脂側へ写し顕微鏡観察する方法である．これらの方法を使ったオート取ることができる（図 2d；矢印）．

ファジー解析法を紹介し，そこから得られた結果を解説する．

Live CLEM の利点は，1）静的な情報である電子顕微鏡像を解釈する際に，そこに至るまでの時間経過という動的な情

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2010 年 3 月 2 日受付
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報を付与できること，2）膜透過処理を行わないため，蛍光標識した特定分子の局在と細胞構造との関係をより正確に把握することができることである．次節では，live CLEM 法の顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

誕生から終焉までの運命を経時観察することは困難であった．これらの問題を解決する手段として，筆者らは，GFPLC3 を安定発現する HeLa 細胞に非分解性のビーズを導入し，その周囲に人為的にオートファゴソーム形成を誘導する（2））5）．その方法を述べると，まず，方法を開発した（図 3a，カチオン性脂質を含む市販のトランスフェクション試薬（Effectene など）をビーズ表面にまぶし（単に両者を混ぜる），次に，それを細胞に振りかけて 1 ～ 3 時間程度培養する．この方法を使うと，直径 1 μm 以上の大きさのビーズでも，エンドサイトーシスによって HeLa 細胞内に入れることができる．また，ビーズを振りかけてから 3 時間後には，細胞内に入ったビーズのうち約 50％が GFP-LC3 陽性となった．この
図1

マクロオートファジーの概要．詳細は本文参照．

LC3 陽性ビーズでは，10 分間程度で GFP-LC3 がビーズ全体を包み込むのが観察された．この時間は，これまでに報告さこのような利点を活かして，非貪食細胞である HeLa 細胞にれているオートファゴソーム形成時間 6）と一致している．こプラスチックビーズ（以下，ビーズ）を取り込ませた際にビーのことから，ビーズ周辺で起こった GFP-LC3 の集積は，オーズ周囲で起こる現象を解析した結果を示す．

トファゴソーム形成を視ているものと考えられた（図 3b）．
そのことを確かめるために，GFP-LC3 陽性ビーズに対して，3.

非貪食細胞へのビーズ導入とオートファジー誘導

live CLEM 法を用いて膜構造を検討したところ，GFP-LC3

哺乳類細胞におけるオートファゴソーム形成の解析は，栄の蛍光と対応する位置に，オートファジーに典型的な膜構造

養飢餓誘導時における LC3（オートファゴソームマーカー）4）が観察された（図 3c）．これらの解析によって，ビーズ周囲の蓄積（※英語でいう「puncta」の増加）を指標に行われてへの GFP-LC3 の集積は，単に GFP-LC3 自身がビーズ周辺できた（図 3a，（1））．しかし，オートファゴソーム形成が細凝集しているのではなく，オートファゴソーム形成を反映し胞質のどこで始まるかを予測することは難しく，また，形成ていることを明らかにすることができた．この方法では，観されたオートファゴソームは細胞内を移動して最終的にリソ察対象領域をビーズ周囲に限定することができるため，蛍光ソームと融合してしまうため，単一のオートファゴソームの観察であっても電子顕微鏡観察であっても，そこだけを視る

図2

特集

Correlative light and electron microscopy after live cell imaging（live CLEM）の概要．詳細は本文参照．

人工ビーズを用いてオートファジーを視る

79【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 3 人工ビーズを用いたオートファジー誘導法．
a．ビーズを用いたオートファジー誘導法の利点．従来法（上段）の場合，細胞質のどこにいつ隔離膜が形成されはじめるかわからず（観察対象領域が不特定），時間と共に観察対象が変化（場合によっては消失）してしまうため経時間観察が困難である．一方，非分解性のビーズを用いる方法（下段）では，観察対象領域をビーズ周囲に限定し，単一のオートファゴソームの運命を経時観察できる．b．HeLa/GFP-LC3 細胞に導入した NH2- ビーズ（直径 3 μm）の周囲における GFP-LC3 のタイムラプス観察像．細胞にビーズを振りかけてから 1 時間 25 分が経過した時点を時間ゼロ（0 min）とし，そこからの観察像を示す．
2 つあるビーズ（白矢印）のうち，下側のビーズは観察開始時点ですでに GFP-LC3 陽性である．一方，上側のビーズは時間経過とともに周囲に GFP-LC3 のシグナルが集積していくことがわかる（矢尻）．スケールバーは 5 μm．c．HeLa/GFP-LC3 細胞に導入した NH2- ビーズ（直径 3 μm）の live CLEM 像．生きた細胞で GFP-LC3 の蛍光を経時観察し，ビーズが GFP-LC3 陽性となったことを確認してから細胞を化学固定し，そのビーズを光学顕微鏡（蛍光像と明視野像）および電子顕微鏡の両者で順次観察した結果を示した．矢印は，GFP-LC3 の蛍光像と電子顕微鏡像が一致する細胞構造を示している．スケールバーは2 μm（光学顕微鏡像）および 500 nm（電子顕微鏡像）．

ことによって，オートファジーの時間変化と細胞構造を明ら定発現する HeLa 細胞に取り込ませることで，オートファかにすることができる．

ジーが起こる前後のビーズ周囲の pH 環境が酸性か否かを測

4. 蛍光発色性 pH センサーを用いたビーズ表面の pH 測定定した（図 4）．pHrodo および GFP-LC3 の蛍光タイムラプ
ス観察の結果，まずビーズ周囲に pHrodo の蛍光シグナルが～ビーズのエンドソーム脱出とリソソームへの輸送の検 出 さ れ 始 め， そ の 強 度 は 時 間 の 経 過 と 共 に 増 加 し た

観察～（図 4a，～ 9 min）．これは，ビーズが存在するエンドソーム

次に筆者らは，オートファジーによる個々のビーズの捕捉内の pH が徐々に酸性化していること，すなわち酸性エンドが，いつ，何をきっかけにして始まるかを live CLEM 法でソーム内に存在することを意味する．同一ビーズの電子顕微検討した．ビーズは，先に述べたように，エンドサイトーシ鏡観察でも，酸性ビーズは膜に覆われており，エンドソームスによって細胞内に入る．一般に，エンドサイトーシスによ内に存在することが明らかである（図 4b，ビーズ 1）．酸性ビーる物質取り込み過程では，エンドソーム内の pH は，時間とズの蛍光観察を続けると，pHrodo の蛍光は短時間で急激に共に徐々に酸性化すると言われている．そこで，ビーズ周囲減少（消失）した（図 4a，9 ～ 12 min）．このビーズを電子の pH 環境を調べることにより，ビーズが酸性エンドソーム顕微鏡観察すると，取り囲んでいる膜の一部が破れているこ内に存在するかどうかを知ることができる．その目的のためとが観察できた（図 4b，ビーズ 2）．この結果は，エンドソーに，pH 応答性の蛍光色素“pHrodo”を用いた．この色素は，ム膜が破れてビーズが細胞質に露出し pH が急速に中性化し中性環境下ではほぼ無蛍光であるが，酸性環境下では，そのたことを示している．一方，GFP-LC3 の蛍光シグナルは，

7）

酸性度につれて強い赤色蛍光を発するようになる ．この色

pHrodo のシグナルが消失した後に，ビーズ周囲に集積し始素を結合させたビーズ（pHrodo ビーズ）を，GFP-LC3 を安めることがわかった（図 4a，12 min ～）．pHrodo の蛍光の80

顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 4 Live CLEM 法による pH ビーズのエンドソーム脱出過程の可視化．
a．HeLa/GFP-LC3 に導入した pHrodo ビーズの周囲における pHrodo および GFP-LC3 のタイムラプス観察像．細胞にビーズを振りかけてから 1 時間 25 分が経過した時点を時間ゼロ（0 min）とし，そこからの観察像を示す．スケールバーは 2 μm．b．
Live CLEM 像．pHrodo の蛍光が観察されている状態で固定液を添加したサンプル（ビーズ①），pHrodo の蛍光が消失した直後に固定液を添加したサンプル（ビーズ②）の観察像を示す．スケールバーは 2 μm（光学顕微鏡像）および 500 nm（電子顕微鏡像）．（文献 ref. 3 の図 4 を一部改変して掲載．）

消失から GFP-LC3 の蛍光の集積開始までのタイムラグは，5.0 ± 2.6 min（n = 19）であった．GFP-LC3 陽性に転じたビーズを電子顕微鏡観察したところ，オートファジー膜が近接しているのが観察された．これらの結果は，ビーズが酸性エンドソームを脱出した後に，オートファジーによって認識され，捕捉されていることを明確に示すものである．
オートファジーに捕捉されたビーズが，その後，リソソームへと運ばれるかどうかについても同様の方法で解析した．
その結果，pHrodo の蛍光の消失および GFP-LC3 シグナルの集積を経たビーズの周囲に，再び pHrodo の蛍光シグナルが回復する様子が観察された（図 5a）．そのビーズを電子顕微鏡観察したところ，ビーズは細胞内成分の分解産物と思われる物質と共に，一重膜で覆われた小胞内に存在していた（図 5b）．この結果は，オートファジーに捕捉されたビーズが，その後，リソソームへと運ばれたことを示している．従来まで，膜のトポロジーを調べる方法として，細胞膜は壊すが小胞体などの内部膜系は壊さないような界面活性剤（ジギトニンなど）を利用した方法が使われてきたが，今回筆者らが開発した手法では，生細胞内で時間変化を伴ってダイナミックに起こる現象をより直接的に可視化することが可能である．
特集

人工ビーズを用いてオートファジーを視る

図 5 pH ビーズを用いた単一オートファゴソームの経時観
察．a．HeLa/GFP-LC3 に導入した pHrodo ビーズの周囲における pHrodo および GFP-LC3 のタイムラプス観察像．図 3a と同様の方法で，より長時間観察を行った結果を示す．スケール
バーは 2 μm．b．a の 90 min の時点で細胞を固定し，ビーズ周囲を電子顕微鏡下で観察した結果．スケールバーはいずれも500 nm．
（文献 ref. 3 の図 5 を一部改変して掲載．
）
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文

5. おわりに細胞内に入れた人工ビーズがオートファジーを誘導することを，live CLEM 法を使うことによって明らかにした．人工ビーズと live CLEM 法を併用することにより，目的の膜構造を高い分解能で観察するだけでなく，時間変化を伴っておこる細胞内の出来事を秒～分程度の時間分解能で解析できる．ビーズの大きさや表面修飾は自在に変更できるので，ある大きさのバクテリアや異物が細胞内へ侵入・感染する時の細胞応答を調べる目的にも有用と思われる．また，pH 環境変化に耐性を持つ新しい蛍光プローブの開発や，蛍光像と電子顕微鏡像とをより正確に対応させる手法の開発などが進むことにより，光学顕微鏡あるいは電子顕微鏡単独では観察が難しかった新たなオートファジー像が見えてくると思われる．

献1）Mizushima, N.: Genes Dev., 21, 2861–2873 (2007)
2）Sosinsky, G.E., Giepmans, B.N., Deerinck, T.J., Gaietta, G.M. andEllisman, M.H.: Methods Cell Biol., 79, 575–591 (2007)
3）Haraguchi, T., Kojidani, T., Koujin, T., Shimi, T., Osakada, H., Mori,C., Yamamoto, A. and Hiraoka, Y.: J. Cell Sci., 121, 2540–2554(2008)
4）Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T., Yamamoto, A., Kirisako, T.,Noda, T., Kominami, E., Ohsumi, Y. and Yoshimori, T.: EMBO J.,
19, 5720–5728 (2000)
5）Kobayashi, S., Kojidani, T., Osakada, H., Yamamoto, A., Yoshimori, T.,
Hiraoka, Y. and Haraguchi, T.: Autophagy, 6, 36–45 (2010)6）Mizushima, N., Yamamoto, A., Hatano, M., Kobayashi, Y., Kabeya,Y., Suzuki, K., et al.: Dissection of autophagosome formation using
Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. J. Cell Biol., 152,657–668 (2001)
7）Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K.G. and Wang, P.: A
novel method to determine the engulfment of apoptotic cells bymacrophages using pHrodo succinimidyl ester. J. Immunol. Methods,
342, 71–77 (2009)82

顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】