染色体均等分配を保障する動原体構成因子の探求
Search for kinetochore components ensuring equal chromosome segregation

研究代表者

久留米大学分子生命科学研究所

細胞工学研究部門

助手

齋藤成昭

Department of Cell Biology, Institute of Life Science, Kurume University,
assistant professor, Shigeaki Saitoh
要旨
複製された染色体は、有糸分裂期に紡錘体装置によって姉妹細胞へと均等に分配されます。動
原体は、染色体の特定部位に形成される DNA—タンパク質複合体ですが、紡錘体に沿って染色体を動かす「駆動エンジン」であると共に、染色体分配の均等性を保障する高度な制御機構を備えています。しかしながら、その制御メカニズムについては、未だに不明の部分が多く残されています。我々は、本研究において、Mix1 と名付けた動原体構成因子を同定しました。Mix1は、動原体構成タンパク Mis6 とともに巨大な分子複合体を形成し、染色体均等分配に必須な機能を果たしていました。Mis6-Mix1 複合体は、細胞周期進行と染色体分配を協調させる M 期チェックポイントタンパク質 Mad2 の動原体局在化に必要でした。さらに Mis6 の N 末断片はMad2 と物理的に結合し得ること、および紡錘体とも相互作用し得ることを示しました。Mis6Mix1 は、動原体と紡錘体の結合状態を監視し、Mad2 の局在を制御しているのかもしれません。
Abstract
Replicated chromosomes are segregated equally to sister cells during mitosis. A kinetochore is a proteinDNA complex formed at a certain position of each chromosome, and is an “engine” to move thechromosome along the mitotic spindle. The kinetochore is equipped with sophisticated controllingmechanisms ensuring equal chromosome segregation. Much about this mechanisms remains unknown,
however. In this study, we found a new kinetochore component designated as Mix1. Mix1 forms a large
molecular complex containing another kinotochore protein, Mis6, and plays an essential role for the equal
segregation of the chromosomes. The Mis6-Mix1 complex is required for the accumulation of Mad2 tokinetochores. Mad2 is a component of the M-phase checkpoint pathway, which coordinates cell cycle
progression and chromosome segregation. It is revealed that an N-terminal fragment of Mis6 physicallybinds to both Mad2 and the spindles. The Mis6-Mix1 complex may monitor the state of attachment
between kinetochores and spindles, and may regulate the localization of Mad2.

1. 研究目的製され、有糸分裂期（M 期）に姉妹細胞遺伝情報を次世代へと伝える「乗り物」へと均等に分配されます。有糸分裂時にと言える染色体は、複製期（S 期）に複は、紡錘体と呼ばれる「レール構造」が-1-形成され、それに沿って染色体は移動しク質を見いだし、報告しています。これます。その際、複製された姉妹染色体は、らと物理的に結合するタンパク質を網羅必ずお互いに逆方向へと移動します。姉的に精製し、それらの正体を同定するこ妹染色体が逆方向へと移動すること、すとを試みました。

なわち「二方 向性(biorientation)」は、染

具体的には、まず TAP（tandem affinity

色体に乗った遺伝情報を均等に分配するpurification）
tag と呼ばれる分子標識を Mis6ために必要な「交通整理」ですが、どのと融合した改変遺伝子を作製し、ゲノムような分子メカニズムによってそれが保中の本来の mis6 遺伝子を改変遺伝子で置障されているのか、未だに明らかではあ換しました。mis6-TAP 遺伝子をもつ酵母りません。

株は、野生株と同様に生育しましたので動原体は、染色体上の特定領域に形成

TAPtag が Mis6 の分子機能を阻害しないされた DNA-タンパク複合体であり、紡と結論しました。融合タンパク質の発現

錘体と結合して染色体を引き動かす「駆を確認した後、定法に従い、Mis6 タンパ動エンジン」です。それはモーター機能ク質複合体の精製を試みました。しかしのみならず、姉妹動原体間の移動を調整ながら十分な純度は達成できず、精製条して「二方向性」を保障し、またあるい件の詳細な検討が必要であると判断しまは染色体分離と細胞周期進行を連動させした。現在、FLAG エピトープなどの別るような高度な制御機構を備えているこの分子標識の利用も視野に入れ、精製法とが多くの研究によって示唆されていまを検討しています。

す。それゆえ動原体の分子構成を明らか

CENP-A に関しては、タンパク質 C 末にし、その精巧な分子機械の全容を明ら端への TAPtag 付加が、その分子機能を損かにすることは、染色体分配の均等性となうことが明らかとなりました。そこで、いう生命の根幹的現象を理解する上で極N 末側への付加を行い、改変遺伝子を多めて意義深いことです。

コピープラスミドベクターに乗せ、酵母

上述のような背景をふまえ、本研究で細胞へと導入しました。この形質転換酵は、遺伝的・分子生物学的取り扱いが可母株を利用して、CENP-A 複合体精製の能な分裂酵母を用い、新たな動原体構成条件を検討中です。

因子を網羅的にとらえ、それらの分子機

2-2. Mis6 結合タンパク Mix1 の同定
先に述べた生化学的アプローチは難航

能を解明することを目指しました。

2. 研究経過することが予想されましたので、同時に2-1. 動原体タンパク複合体の精製の試み

遺伝学的なアプローチによる Mis6 結合タ

我々のグループはすでに、分裂酵母 Mis6、ンパク質の同定を試みました。mis6-302

CENP-A という二つの動原体構成タンパ

温度感受性致死変異体の生育を回復させ-2-

る多コピー抑制遺伝子をスクリーニング

じく、不均等な染色体分配が高頻度で観したところ、Mix1 と名付けた 30kd のタ察されました。すなわち、sim4 遺伝子はンパク質をコードする mix1 遺伝子が得ら姉妹染色体を均等に分配するために必須れました。Mix1 は coiled-coil モチーフにな機能を果たしていると考えられます。

富むタンパク質で、ヒト CENP-H とも弱sim4 遺伝子の発現を遮断した細胞では、い配列類似性を示します。GFP 融合によMis12、Nuf2 あるいは CENP-C といったりその細胞内局在を調べたところ、細胞他の動原体タンパクは依然として動原体周期を通じて動原体に局在化していまし

領 域 に 局 在 化 し て い ま し た が 、 Mis6 、た。また、免疫沈降実験により、予想通CENP-A は動原体に局在化出来なくなっり Mis6 タンパク質と Mix1 タンパク質がていました。したがって Sim4 は Mis6、細胞内で強固に結合していることを見い

CENP-A の動原体局在化に必要であるとだしました。ゲル濾過クロマトグラフィ

いえます。反対に mis6-302 変異体中ではーにより、Mis6-Mix1 が分子量約 500kD

Sim4 が動原体に局在化出来なくなっていの巨大複合体を形成していることが明らたので、Sim4-Mis6 は、その動原体局在かとなりました。Mix1 は複合体中で二量化能に関して、相互依存的であるようで体として存在しているようでした。デー

す。sim4 遺伝子発現を遮断した細胞中でタベース検索の結果、mix1 は、動原体中も、Mis12 等のタンパク質は依然として央部の遺伝子サイレンシングに必要だと動原体に局在し続けたことから推論する

報告されている sim4 遺伝子と同一であると、動原体構成タンパク質群は、機能的ことが判明しました。に互いに関連しあいながらも物理的には

2-3. sim4/mix1 遺伝子機能の探索

独立したいくつかのサブモジュールを形

sim4/mix1 遺伝子の機能を探るため、プ成している可能性が示唆されました。

ロモーターを改変し、培地へのビタミン2-4. Mis6-Sim４４の新たな分子機能

B1 添加により sim4/mix1 遺伝子発現の有Sim4-shut-off 株、mis6 変異株でおこる

無 を 任 意 に 調 節 で き る 株 （ sim4-shut-off

染色体不均等分配の様子を詳細に検討し株）を作製しました。この細胞株の培養たところ、これらの変異体では M 期チェ液中にビタミン B1 を添加すると sim4 遺ックポイントが正常に機能していないの伝子の発現が遮断されます（shut-off）。sim4ではないかという可能性が示唆されまし遺伝子の発現を遮断された細胞は生育すた。M 期チェックポイントは、すべてのることが出来ませんでした。その時、死染色体が「二方向性」を確立するまで細細胞での核分裂の様子を観察したところ、胞周期の進行を抑制する制御機構であり、mis6 や cnp1（=CENP-A タンパク質をコ染色体の均等分配を保障する上で重要なードする遺伝子）の機能欠損変異体と同役割を果たしています。M 期チェックポ-3-

イントに関与するタンパク質のうち Mad2明らかになりました。これらの結果によと呼ばれる進化的に保存されたタンパクり、M 期チェックポイント経路において質は、有糸分裂期初期に、紡錘体と未結果たす Mis6-Sim4 複合体の新たな機能が合の動原体上に集積します。Sim4 の発現浮かびあがってきました。Mis6-Sim4 複を遮断した細胞あるいは mis6 変異細胞中合体は、動原体と紡錘体の結合状態を監での Mad2 の挙動を観察したところ、両視し、Mad2 の動原体局在化を制御してい変異体では Mad2 の動原体集積が起こらるのかもしれません。

ないことが明らかとなりました。薬剤に4. 今後の課題と発展

よって紡錘体形成を阻害し、動原体と紡精製条件の検討を進め、動原体構成タ錘体が結合できなくすると、野生株細胞ンパクの生化学的同定を進展させる必要

では M 期チェックポイントが発動します。

があります。Mis6-Sim4 が果たすチェッ

しかしながら mis6 変異細胞では、紡錘体クポイント機能についての解析は、より形成が阻害されてもチェックポイントは詳細な分子メカニズムの解明が必要とな活性化しませんでした。これらの結果かると考えています。Mad2 と結合する Mis6

ら、Mis6-Sim4 は、Mad2 の動原体集積をN 末断片が紡錘体に結合するという点は、通じて、M 期チェックポイント機構に深非常に興味深い結果です。ヒト細胞を用く関与していることが考えられました。

いて同様の結果が得られるのかどうか検さらに、免疫沈降より、Mad2 と Mis6証していきたいと考えています。M 期チが物理的に結合し得ること、および Mis6ェックポイントは、脊椎動物においては、の N 末部分断片が紡錘体に結合し得るこ発ガンとの関連性が指摘されています。とを示す証拠が得られました。

本研究が、抗ガン治療の基礎的知見の解

3. 研究成果

明へと結びつくかもしれません。

5. 発表論文リスト

Mis6 動原体タンパク質と物理的に結合する因子として Sim4/Mix1 タンパクを同

S.Saitoh et al. “A Novel Role of Mis6定しました。Mis6-Sim4 複合体には、さKinetochore

らに未知の構成因子が含まれており、約Mitotic Spindles with the Mad2-related

500kＤの巨大分子複合体を形成している

Checkpoint” 投稿準備中

ようです。Mis6-Mix1 複合体は、動原体特異的ヒストン H3（CENP-A）およびチェックポイントタンパク質 Mad2 の動原体局在化に必要であることが明らかとなりました。さらに Mis6 N 末部分断片は紡錘体と Mad2 の両方に結合し得ることが-4-

Subcomplex

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