（2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）

フローサイトメーター新規利利⽤用者ガイド  （参考：「FCM の原理理⼊入⾨門講座   サイトメトリードットコム/ベックマンコールター」  http://www.bc-cytometry.com/FCM/fcmprinciple.html）    
   「フローサイトメーター」とは、蛍光標識識した細胞浮遊液を特殊な流流路路に⾼高速で流流し、レーザーを当てることで発⽣生した散乱光や蛍光の強度度を測定し、それによって個々の細胞の性質を迅速かつ⾼高感度度に解析する装置です。  
蛍光を測定する標準的な⽅方法の蛍光顕微鏡と⽐比べて、次のような特徴があります。    

・短時間に多くの細胞数を客観的に測定できる。（⾼高速性、正確性）  ・微弱な光でも測定できる。（⾼高感度度、定量量性）  ・同⼀一条件での測定が可能である。（⾼高再現性）  ・1 回の測定で多くの情報（マルチパラメータ）を取得できる。  
・⽬目的の細胞集団によるクラスター分析が可能である。  
・細胞の分取が可能である。       当部⾨門に設置されているフローサイトメーターは「Cytomics  FC  500」と「MoFlo」の２種類があり、それぞれ次のような違いがあります。  
FC500 セルアナライザー  MoFlo   セルソーター  細胞の分取が⾏行行えない  細胞の分取が⾏行行える  Ar,  HeNe レーザーが搭載されている  Ar,  HeNe,  UV レーザーが搭載されている  ⾼高精度度蛍光補正（ADC）機能がついている         フローサイトメーターで測定可能なサンプルは、⼀一個ずつの状態の細胞や粒粒⼦子などの浮遊液であることが必要です。この条件を満たし、また個々の⼤大きさが 40μm 程度度までの範囲であれば、様々なものの測定が可能です。    

・⾎血球細胞（⽩白⾎血球、⾚赤⾎血球、⾎血⼩小板など）  ・動物細胞（培養細胞、単離離組織など）  ・植物細胞  ・微⽣生物（細菌、原⾍虫など）  ・海洋⽣生物（プランクトンなど）  ・精⼦子、酵⺟母など  ・ラテックスビーズ（マルチプレックスによるサイトカイン定量量解析など）      （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）

フローサイトメトリー解析のおおまかな流流れ    細胞の調製（蛍光標識識、細胞の遊離離、メッシュでの濾濾過等。）        ↓  測定⽤用プロトコルファイルの作成  （ネガコン、各単染⾊色、重染⾊色のサンプルを⽤用いて、測定条件を設定します。     同種のサンプルであれば、次回から設定は不不要になります。）    ディスクリミネーション（余分なデブリのカット）        ↓  感度度調整        ↓  ゲートリージョンの作成（グラフ上で測定したい細胞集団の領領域を選択）        ↓  蛍光補正（コンペンセーション）の設定  （蛍光の漏漏れ込みを補正する）          ↓  測定とリアルタイム解析（測定し解析します。）        ↓  必要ならば再解析（測定データを⽤用いて、あらためて解析する事ができます。
）    フローサイトメーターのしくみ     フローサイトメトリーシステムは、⼀一点に集められたレーザー光をフローセルの中⼼心を通過する細胞に照射し、そこから⽣生じる散乱光と、蛍光を同時に測定します。測定結果は、相関ヒストグラムとして⽰示されます。これらのヒストグラムを解析することによりサンプルの特性を明らかにできます。     そして、これらの特性に基づいて細胞集団を試験管やマルチウェルプレートに分取することもできます。       フローサイトメーターの測定原理理は、以下の 5 つに分けることができます。    

フロー系  ：シースフローを利利⽤用して細胞 1 個ずつの流流れを作る。  

光学検出系  ：流流れる細胞へレーザー照射し、発⽣生した散乱光や蛍光を検出する。  

電気パルス処理理系：検出された電気パルスを回路路で数値化する。  
データ処理理系  ：各種ヒストグラムを作成し、解析する。  

ソーティング系   ：⽬目的細胞の分取をする。    （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）

フロー系           機械にセットされた細胞浮遊液はポンプによって吸われ、機器のチューブを流流れます。  
その後、細胞は内側に細胞浮遊液、外側にシース液といった⼆二層に分かれた特殊な⽔水流流により絞り込まれ、縦⼀一列列に分離離されます。      光学検出系     チューブを流流れる中で細胞ひとつひとつに順番にレーザーが当てられて、個々の細胞の情報が測定されていきます。  
使⽤用するレーザーは使⽤用する蛍光試薬の励起波⻑⾧長に応じて、選択する必要があります。    

（散乱光と蛍光）     細胞にレーザーが当たると「側⽅方散乱光」「前⽅方散乱光」「蛍光」の三種類の光が発⽣生します。それらの光を測定する事によってデータを収集します。    

  ・側⽅方散乱光（SS）は細胞の内部で散乱される光で内部構造の複雑さを反映しています。  
・前⽅方散乱光（FS）は細胞の周縁で散乱される光で細胞のサイズを反映しています。  
・蛍光（FL）は標識識に使われた蛍光⾊色素に応じた特定のスペクトルが発⽣生します。  （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）
（フィルタと検出器）  レーザーによって発⽣生した散乱光と蛍光は、特定の範囲の波⻑⾧長の光のみを通す特殊なフィルタによって分解され、個々の検出機で検出されます。      LP:ロングパスフィルタ（ある波⻑⾧長よりも⻑⾧長い波⻑⾧長の光を透過させる）  DLP:   ダイクロイックロングパスフィルタ（ある波⻑⾧長以下は反射し、それ以上の波⻑⾧長は透過させる）  SP:ショートパスフィルタ（ある波⻑⾧長よりも短い波⻑⾧長の光を透過させる）  DSP:ダイクロイックショートパスフィルタ（ある波⻑⾧長以上は反射し、それ以下の波⻑⾧長は透過させる）  BP:バンドパスフィルタ（指定した波⻑⾧長を中⼼心に±15〜～20nm の光のみを透過させる）  FS:前⽅方散乱光検出器  SS:側⽅方散乱光検出器  FL:蛍光検出器       例例として FC500 には FL1~∼5 までの５種類の蛍光検出器が搭載されており、通常は  上図のように、それぞれ   [525]  [575]  [620]  [675]  [755]nm の波⻑⾧長の光が届く様にフィルタが設定されています。（※実際には±15〜～20nm 程度度の波⻑⾧長も通します）  フィルタの設定は、使⽤用する蛍光試薬に応じて最適な物にしてある事が望ましいです。     これにより FC500 では最⼤大で同時に 5 カラーまでの多重染⾊色した蛍光の解析を⾏行行う事ができます。    
（検出感度度）  検出器に⼊入った光は、光電⼦子増倍管(PMT)で電⼦子に変換され、電圧をかけて増幅されます。  
PMT 電圧の⼤大きさを変える事で検出器の感度度を調製します。  
PMT 電圧（検出感度度）はサンプルに応じて調製する必要があります。  （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）

パルス処理理系  検出器からの電流流は電圧パルスに変換されます。  
この電圧パルスは検出器が受け取った光の強度度と PMT に加えた電圧に⽐比例例します。    
（パルスの増幅）     検出器から発⽣生する電圧パルスが⼩小さいとき、増幅しなければならないことがあります。
その場合、Lin と Log の 2 つの増幅する⽅方法があります。    

Lin：全てのパルスを設定した Gain に基づき、⼀一定の割合に増幅します。  
Log：⼩小さなパルスはより多く、⼤大きなパルスは少しだけ増幅する対数増幅を⾏行行います。    
免疫蛍光のような強度度差の⼤大きな情報を取得する場合は Log を使⽤用し、細胞サイズや  DNA 量量の解析のような強度度差が⼩小さく直線性のある情報を取得する場合は Lin を使⽤用  します。    
（ディスクリミネーション）     ディスクリミネーションとは、検出された電圧パルスと、ある電圧レベルを⽐比較し、それ以下の電圧パルスをすべてカットするプロセスのことです。  
これは実際の測定結果からノイズあるいはデブリ(細胞⽚片)を除外するのに使われます。    
   通常は、前⽅方散乱光（FS）だけでディスクリミネータレベルを設定し、残りのディスクリミネータはオフにします。  
こうすることにより、ある細胞サイズで⾜足切切りをかけ、それより⼤大きい細胞に関してだけデータを取ることになります。                            （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）
（蛍光補正）     蛍光⾊色素は、⻑⾧長分布（スペクトル）を持つため、光学フィルタで波⻑⾧長域別に分離離しても、各検出器には⽬目的以外の蛍光⾊色素からの蛍光が漏漏れ込むことがあります。    

  サンプルを多重染⾊色し、複数の蛍光のマルチカラー測定を⾏行行う際には、この漏漏れ込みがデータに影響するため、漏漏れ込んだ分を差し引いて、⽬目的の蛍光⾊色素からのみのデータになるよう補正を加える必要があります。これを蛍光補正（コンペンセーション）と呼びます。     具体的には、あらかじめ単染⾊色したサンプルを流流し、グラフを⾒見見ながら⼀一つ⼀一つ⼿手動で調製を⾏行行い、⼀一定以下の強度度の蛍光をカットできる様に調製していきます。          （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）  データ処理理系  （ヒストグラム）  個々の細胞の測定パラメータをチャンネル値に従ってチャンネル軸上にプロットしてゆくと、細胞数頻度度分布が形成されます。このようなグラフをドットプロットと呼びます。  
例例として FS と SS の 2 パラメータのドットプロットをとると、⼤大きさと内部の複雑さ  （顆粒粒）からヒト末梢⾎血⽩白⾎血球をリンパ球、単球、顆粒粒球の集団に分けることができます。      パラメータ軸にはログスケール（Log、対数）とリニアスケール（Linear、線形）が選択できます。
免疫蛍光のような強度度差の⼤大きな情報を取得する
場合はログスケールを使⽤用し、細胞周期の解析のような強度度差が⼩小さく直線性のある情報を取得する場合はリニアスケールを使⽤用します。      （ゲーティング）  実際にデータを取得するサンプルの中にはデータに必要のない細胞やデブリが⼊入っていることがあります。その中の⽬目的とする細胞集団に着⽬目した解析（クラスター分析）を⾏行行う
ためには、データを絞り込む必要があります。    
このデータの絞り込みをゲート解析と呼びます。絞り込み条件は、ゲートリージョン（Gate  Region）と呼ばれる領領域指定を⽤用いた条件式のような形で設定します。ゲート条件が設定されたヒストグラムには、⽬目的の細胞だけがプロットされます。    

また、1 つのグラフに複数のゲートをかけたり、⼀一度度ゲートで絞り込んだものをさらにゲートで絞り込む階層的ゲーティングという⼿手法をとることもできます。  （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）
（アナリシス）  ヒストグラム上にリージョンを作成すると、そのリージョン内にある細胞に関する統計データを得ることができます。ヒストグラム上にある全細胞の何％がリージョンの中に含まれるか、リージョン内の細胞の数・平均値・CV 値（ばらつき）等を表⽰示します。  
測定細胞数(⽬目的細胞集団)が多いと、ばらつきの少ない⾼高い精度度の統計データを得ることが出来ます。また、精度度は陽性率率率により異異なります。陽性率率率が 2％の場合、CV 値で 5％の精度度が必要ならば、⽬目的細胞を少なくとも 8,000 個は測定する必要があります。    
（リストモードデータ（LMD））     測定された情報はリストモードデータ（拡張⼦子   .LMD）として保存されます。  
リストモードデータとは、『1 つ 1 つの細胞について、取得したすべてのパラメータの各々の値』を⽰示すデータです。初期のフローサイトメーターは、この⽅方法でデータを取得し、後から解析を⾏行行っていました。     コンピュータの進歩と共に、データ解析は測定終了了後ではなく、測定中にも⾏行行えるようになりました。しかし現在でもリストモードデータは再解析をするのに⽤用いられています。     すでに測定し取得されているリストモードデータを⽤用いれば、各軸のパラメータの組み合わせの変更更や、ゲートの領領域の変更更を⾃自由に何度度も⾏行行い、測定時とは異異なった⾓角度度から検討したヒストグラムを得る事が可能です。    

ソーティング系  フローサイトメーターには、細胞を分取する機能（ソーティング系）を有したセルソーターと呼ばれる装置もあり、当部⾨門では MoFlo がそれに該当します。              ●⽬目的の細胞を含む液滴  ●⽬目的外の細胞を含む液滴    ○ 空の液滴    セルソーティングの基本原理理は、まず細胞が含まれる液滴を⽣生成して、解析結果に基づいて⽬目的の細胞が含まれる液滴を選択的に荷電します。  
これに電場をかけることで⽬目的の液滴を偏向落落下させ、⽬目的の細胞を分取します。  （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）

＜付録＞  （蛍光試薬、励起レーザー、蛍光波⻑⾧長   対応⼀一覧表）      （2015/5/1	  分子医学部門	  幸丸純貴	  作成）⼀一般的なマルチカラー解析の蛍光⾊色素   組み合わせ例例  (FC500)  レーザー  検出器  検出波⻑⾧長  蛍光⾊色素（例例）  アルゴンレーザー  FL1  525nm  (BP)  FITC,  EGFP,  Alexa488  （488nm）  FL2  575nm  (BP)  PE  FL3  620nm  (BP)  ECD,  PI  FL4  675nm  (BP)  FL5  755nm  (BP)  PC7  (PE-‐‑‒Cy7)  FL4  675nm  (BP)  APC,  Cy5  FL5  755nm  (BP)  APC-‐‑‒Cy7  ヘリウムネオンレーザー  （633nm）  PC5  (PE-‐‑‒Cy5),  7AAD    (MoFlo)  レーザー  検出器  検出波⻑⾧長  蛍光⾊色素（例例）  アルゴンレーザー  FL1  530nm  (BP)  FITC,  EGFP,  Alexa488  （488nm）  FL2  580nm  (BP)  PE  FL3  670nm  (BP)  PC5  (PE-‐‑‒Cy5)  FL4  740nm~∼  (LP)  PC7  (PE-‐‑‒Cy7)  UV レーザー  FL5  630nm  (BP)    （333~∼364nm）  FL6  405nm  (BP)  Indo-‐‑‒1  ヘリウムネオンレーザー  FL7  670nm  (BP)  APC,  Cy5  FL8  740nm~∼  (LP)  APC-‐‑‒Cy7  （633nm）