電子線クライオトモグラフィー単粒子解析による T7 様ウイルスのシアノバクテリアへの感染過程の解析
T7-like Viral Infection of Cyanobacteria Visualized
by Electron Cryo-tomography Single Particle Analysis
村田和義ａ，Qinfen Zhang ｂ，Xiangan Liu ｂ，Michael Schmid ｂ，Wah Chiu ｂ
Kazuyoshi Murata, Qinfen Zhang, Xiangan Liu, Michael Schmid and Wah Chiuａ

生理学研究所ｂ

Baylor College of Medicine

要旨

電子線クライオトモグラフィー単粒子解析は，多様な構造変化をもつ同一粒子が互いに混ざり合ったような生体分子試料において，これを区別して解析することができる．我々は，この方法を使って T7 様ウイルス P-SSP7 の海洋シアノバクテリア Prochrolococcus
MED4 への感染過程を構造学的に調べた．その結果，P-SSP7 の細胞への吸着には大きく分けて 3 つのパターンがあり，この過程を通してテール周囲にあるスパイクファイバーの構造が変化し，最後にテールを細胞表面に垂直に結合させてウイルス DNA を細胞内に注入することがわかった．さらに，これを高分解能の単粒子解析の結果と比較することによって，DNA 放出とスパイクファイバーの構造変化との関係を明らかにすることができた．本稿では，この解析手法を中心に解説し，あわせて得られた結果を紹介する．

キーワード：単粒子解析，クライオ電子顕微鏡，トモグラフィー，ウイルス，シアノバクテリア

1.

様ウイルス P-SSP7 の海洋シアノバクテリア Prochrolococcus
はじめにMED4 への感染過程とその構造変化を調べた．その結果，電子顕微鏡の単粒子解析は，結晶化を経ることなくウイル

P-SSP7 は 3 つの過程を経て細胞表面に吸着し，この間にテースなどのタンパク質巨大分子複合体を高分解能で構造解析す

ルの周りのスパイクファイバーの構造を徐々に変化させ，最ることができる 1）．しかし，一枚の電子顕微鏡像に写った様々

後にテールを細胞表面に垂直に結合させてウイルス DNA をな形の投影像を，同一の粒子からの異なる角度の投影像と仮細胞内に注入することがわかった．以下，この解析に使われ定して元の 3 次元像を再構築するため，もし試料中に構造のた画像処理操作を中心に解説し，それによって明らかにされ変化した粒子が混ざっている場合には，正しい立体構造を回た T7 様ファージの感染過程と DNA 放出のメカニズムを紹復することができない．また，その投影像からは，これら構介する．

造が変化したものを区別することもできない．実際，生体分子試料の中では，すべてが同じ構造を保っているものの方が少ない．例えば，細菌に特異的に感染するウイルスであるバ

2. T7 様 ウ イ ル ス P-SSP7 と 海 洋 シ ア ノ バ ク テ リ アProchrolococcus MED4クテリオファージは，宿主細胞に感染する際，本体からスパ

P-SSP7 は，海洋シアノバクテリア Prochrolococcus MED4イクと呼ばれる手のような構造物を伸ばして細胞の表面に吸に特異的に感染するファージとして同定された 3）．この海洋着し，その中心にあるテールを細胞に結合させてウイルス

ファージは，Podoviridae 科に属し，T7 様ウイルスに分類さDNA を細胞内に注入する．しかし，これらの様々な構造変れる．構造的な特徴としては，直径～ 65.5 nm で T = 7 の大化の過程は，粒子がすべて同じ構造をしていると仮定した従きさの正二十面体キャプシドに二本鎖 DNA のウイルスゲノ

来の単粒子解析では調べることができない．

ムを格納し，12 ヶ所ある 5 回対称軸頂点の一つに収縮しな電子線クライオトモグラフィー単粒子解析は，三次元トモ

い短いテールを持つ（図 1）．テールの周囲には 6 本のスパグラムから粒子像を切り出し，このサブトモグラムを分類してイクファイバーと呼ばれる細い繊維状の構造体があり，これ平均化することで，試料中に含まれる粒子の構造変化を区別がテールの基部からキャプシド表面に沿って放射状に伸びて2）して解析することができる ．我々は，この方法を用いて T7いる．感染では，このテールを細胞表面に結合させ，まずその先端からコアタンパク質を放出して，細胞質まで貫くａ〒 444–8585 愛知県岡崎市明大寺町西郷中 38
2010 年 3 月 1 日受付114

DNA のチャネルを形成し，そのあとウイルス DNA を宿主に注入すると考えられている 4）．T7 様ウイルスは，強力な顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

27.8 k × で記録し，IMOD ソフトウエア 8） を使用して，試料に混ぜた金コロイドを位置マーカーとしてアライメントし，荷重逆投影法によって 3 次元トモグラムを計算した（図 3）．
4.

サブトモグラムのアライメント

細胞表面に吸着した P-SSP7 の構造を調べるため，細胞表面を含む粒子像を元のトモグラムから 360 ピクセル幅の立方体（5 Å/pixel）で切り出し，平均化のためのアライメントを行った．サブトモグラムのアライメントは，試料の形態学的性質を事前に知っていればかなり効率よく行うことができる．P-SSP7 の場合，2 本鎖 DNA が正二十面体のキャプシドで覆われていて，その五回対称軸頂点の一つに DNA を放出するためのテールをもつ．そこで，まず正二十面体の幾何学
図 1 T7 様ウイルスの構造．T7 様ウイルスは，二本鎖 DNA をT = 7 の正二十面体キャプシドの中に格納し，5 回対称軸頂点の一つに伸縮しない短いテールをもつ．テールの周囲には 6 本のスパイクファイバーがキャプシド表面に沿って放射状に伸びている．T7 様ウイルスは，感染する際，テールを宿主表面に結合させて，まずテールの先端からコアタンパク質を放出して，細胞外膜（OM），グリカン層（PG），内膜（IM）を貫く DNA の通り道を形成する．そして，ウイルス DNA を宿主細胞質に注入する．

モデルをコンピュータ上に作製して，これを使って最初のキャプシド部分のアライメントを行った（図 4）．まずこの前準備として，サブトモグラムのキャプシド部分を 192 ピク
セル幅の立方体でクリップした後，これに球形のマスクをかけ，適当なビンニングとローパスフィルターをかけた．そして，対称ユニット内で 3 つのオイラー角を変えて正二十面体モデルに対して相互相関係数を計算し，（x, y, z）の位置のズレも加えた 6 次元のアライメントサーチを，EMAN ver1.9

RNA ポリメラーゼを持ち，分子生物学の初期から多く研究ソフトウエアの中の tomohunter.py 9）を使って行った（図 4）．

材料として用いられてきた．しかし，この宿主への感染過程

2 回目以降は，アライメント操作後のサブトモグラムを平均の構造的な知見は少ない．一方，宿主の海洋シアノバクテリ化して次の参照像とし，オイラー角，ビンニング，ローパス

アは，植物性ピコプランクトンの一種で，温暖な海域に広くフィルターの幅を変えながら，画像解像度のほぼ限界のとこ生息し，地球上で最も多く存在する最も小型の光合成生物でろまでの精度でキャプシド部分のアライメントを行った．次ある．特に Prochrolococcus MED4 は，大きさが 0.6 μm 程度に，正二十面体の 5 回対称軸頂点に位置するテールスパイク5）

し か な く， わ ず か 約 1,800 の ゲ ノ ム で 構 成 さ れ て い る ．の向きを，対称操作によって揃え，その平均化した像を次のP-SSP7 は，この MED4 に感染することにより，シアノバク参照像として，テールスパイクも入れた全体像のアライメン

6）テリアの形質転換および遺伝的多様性に貢献している ．本トを同様の方法で繰り返し行った．その結果，合計 12 個の研究では，この MED4 に感染する P-SSP7 の系を使い，T7

トモグラムから 171 個の DNA の詰まった P-SSP7 粒子を切様ウイルス感染過程を構造的に調べた．

り出して平均化し，対称性を仮定せずに 44 Å 分解能の像を得ることができた．平均像の分解能は，単粒子解析による

3.

ファージ感染過程の試料作製と傾斜シリーズの撮影精製した P-SSP7 を宿主の MED4 と 40：1 の割合で混ぜてP-SSP7 の 9 Å マップ 10） と比較して，その 0.5 フーリエシェ
ルコリレーションから求めた．

培養し，5 分おきに分取して，位置合わせ用の金コロイドと混ぜてマイクログリッド上に氷包埋した．そして，この凍結

5.

ファージの宿主への吸着過程

試料を，クライオ電子顕微鏡 JEM3200FSC（日本電子製）に宿主周辺に集まった P-SSP7 のサブトモグラムを，細胞表専用のクライオトランスファー装置を使って装填し，加速電面への吸着の仕方で分類して平均化すると，P-SSP7 の宿主

圧 300 kV の電解放射型電子銃とインカラムエネルギーフィ

表面への吸着には 3 つのパターンのあることがわかった

ルターを使って，エネルギー幅 20 eV のゼロロス TEM 像を（図 5）．1 つ目は，テールを細胞表面と平行にして，キャプ観察した．その結果，培養 15 分以降のサンプルから宿主のシド表面で細胞と接触していた．2 つ目は，テールを細胞表周辺に P-SSP7 が集まっている様子が観察され，50 分後には面に対して斜めに向けて，テール先端とキャプシドの一部でDNA を放出した後のファージが見られた．そして，60 分後吸着していた．3 つ目は，テールを細胞表面に対して垂直にからは溶菌した細胞断片も現れ始めた（図 2）．ファージ感染向けて，テール先端で結合していた．この 3 つのパターンを過程の解析には，まず，60 分前後の試料から，SerialEM ソ

そ の 様 子 か ら，“Sleeping”，“Waking-up”，“Standing” と 名フトウエア 7）を使い，総電子線照射量を 100 e−/Å2 以下にして，付けた．そして，これらの割合は，それぞれ 52，29，19％±62°，2° 間隔の傾斜シリーズを自動で撮影した．画像はで あ っ た． つ ま り， 宿 主 に 吸 着 し た P-SSP7 の 約 半 分 は，4 k × 4 k ピクセルの Gatan Ultrascan CCD カメラに検出器倍率“Sleeping”の状態にあることがわかった．P-SSP7 は宿主表講座

電子線クライオトモグラフィー単粒子解析による T7 様ウイルスのシアノバクテリアへの感染過程の解析

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図 2 海洋シアノバクテリア Prochrolococcus MED4 とこれに感染させた T7 様ウイルス P-SSP7 のクライオ電子顕微鏡像．試料は，P-SSP7を MED4 と 40：1 の割合で混ぜて培養し，5 分ごとに取り出して急速凍結して氷包埋した．試料を混ぜて 20 分後に，P-SSP7 が宿主細胞の周りに集まるのが見られ，50 分後には，DNA を放出した空のキャプシドをもつファージが現れた（矢印）．そして，60 分後には，溶菌した細胞が観察された．

面にたどり着いた後，このようにテールを平行にして，そのには，この感染過程において，テールの周りから放射状に伸場所に留まるか，あるいは細胞表面を移動して受容体の位置

びた 6 本のスパイクファイバーの構造が変化しているようにを探していると考えられた．そして，感染する位置を決めた

見えた（図 5 矢印）．
“Sleeping”のファージでは，スパイクファ後，テールを細胞表面に接触させ，最後はテールを垂直に突イバーの基部がキャプシド表面に沿って折り畳まれているよ

き立ててウイルス DNA を細胞内に注入する．興味深いこと

うに見えるが，“Standing”ではテールと垂直に伸びているように見えた．そこで，次にこのスパイクファイバーの構造変化をサブトモグラムの多変量解析によって分類してみた．
6.

サブトモグラムの多変量解析

テールスパイクにおけるサブトモグラムの多変量解析を，最新の EMAN2 ソフトウエア 11） を使って行った．まず，粒子を含むサブトモグラムからテールスパイクの部分を切り出し，6 回回転平均してスパイクファイバーの構造を強調する．
次に，これを hdf フォーマットで一つのスタックファイルにし，このスタックファイルから e2msa.py を使って適当な数の固有画像を求めた．そして，特徴的な固有画像を選んで，e2basis.py でその固有空間のなかに元の画像を投影し，1 次元の画像スタックとして保存した．最後に e2classifykmeans.pyを使って，K- 平均法により適当な数に元画像をクラス分けした．その結果，P-SSP7 の吸着過程のスパイクファイバーは，
図 3 3 次元トモグラムのセンタースライス．P-SSP7 を感染させた MED4 の ±62°，2° 間隔の傾斜シリーズを撮影し，そのトモグラムを荷重逆投影法により計算した．

116

3 つの形に分類された（図 6）．一つは，スパイクファイバーの基部がテールに沿って折り畳まれたもの，もう一つは，スパイクファイバーの基部がテールと垂直方向に伸びたもので顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 4 P-SSP7 サブトモグラムのアライメント．P-SSP7 を含むサブトモグラムでは，最初，正二十面体モデルを参照像とし，次からは得られた像の平均像を参照像として，球形マスクを用いてキャプシドのアライメントが行われた．アライメントは 3 段階で行われ，60 Å のローパスフィルタ（LP）と 6° 間隔の角度サーチから初めて，最終的に 30 Å の LP と 1.5° 間隔の角度サーチで行われた．そして，テールの位置をそろえた後，さらに粒子平均像から作った粒子形マスクをかけて，そのテールも含めた全体の平均像に対して全構造がアライメントされた．
アライメントは，最終的に 30 Å の LP と 1° 間隔の角度サーチで行われた．

図 5 P-SSP7 の宿主表面への吸着パターン．P-SSP7 を含むサブトモグラムは，宿主表面との吸着の仕方によって 3 つのパター
ン に 分 類 さ れ た． そ し て， こ れ を そ の 形 態 か ら，“Sleeping”，“Waking-up”，“Standing”と名付けた．矢印はそれぞれスパイクファイバーの位置を示す．下のグラフは，テールの宿主表面に対する角度分布．

図 6 テールスパイクの多変量解析．粒子サブトモグラムから テ ー ル ス パ イ ク の 部 分 を 切 り 出 し， 多 変 量 解 析 し て 分 類し た 後， そ れ ぞ れ の ク ラ ス 平 均 像 を 得 た． 結 果， テ ー ル ス
パ イ ク は 主 に 3 種 類 に 分 類 で き た． 一 つ は， ス パ イ ク フ ァ
イバーの基部がキャプシド表面に沿って折り畳まれたもの（Folded fibers）， も う 一 つ は， ス パ イ ク フ ァ イ バ ー の 基 部が テ ー ル と 水 平 方 向 に 伸 び た も の（Extended fibers）．そして，3 つ 目 は そ れ ら の 中 間 型（Intermediate fibers） で あ る．
* は，それぞれのスパイクファイバーの基部先端位置を示す．

ある．そして，最後にその中間的な形のものである．この中7. P-SSP7 の吸着過程におけるスパイクファイバーの構間型は，折り畳まれたものと伸びたものが混在し，これが回転平均操作によってそれらが平均化されてしまったもの考えられた．

造変化の解析
多変量解析によって分類された伸びたスパイクファイバーの割合を，細胞表面から離れたフリーの P-SSP7 と，先に述．その結果，べた 3 つの吸着パターンについて調べた（図 7）

講座

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図 7 P-SSP7 の宿主表面への吸着過程における，伸びたスパイクファイバーの割合．テールスパイクの多変量解析の結果，伸びたスパイクファイバーの割合は，宿主表面から離れたフリーの P-SSP7 で は 15 ％ で あ る が，3 つ の 吸 着 過 程 の“Sleeping”，“Waking-up”，“Standing”では，それぞれ 16％，30％，70％であった．つまり，P-SSP7 の宿主表面への吸着過程が進むにつれて，徐々にスパイクファイバーの基部が折り畳まれた状態から伸びた状態へと変化することがわかった．

図 8 高分解能単粒子解析による DNA 有無 P-SSP7 の構造解析．a）
P-SSP7 のクライオ電子顕微鏡像．暗い粒子が DNA 有り，明るい粒子が DNA 無しの P-SSP7．b）DNA 有りのもの（左）と無しのもの（右）のセンタースライス像．DNA 有り P-SSP7 では，スパイクファイバーの基部がキャプシド表面に沿って折り畳まれ，それに隣接したテール内のゲート状構造で DNA の放出が止められている．DNA 無し P-SSP7 では，スパイクファイバーの基部がテールと垂直に伸びていて，それに隣接したテールの内部のゲート構造は消失している．

フリーの P-SSP7 では，スパイクファイバーの基部の伸びたとができた．電子線クライオトモグラフィー単粒子解析は，も の の 割 合 が 15 ％ で あ っ た が， こ れ が“Sleeping”，傾斜シリーズの撮影に 100 e−/Å2 近くの電子線量が必要なた“Waking-up”，“Standing”ではそれぞれ 16％，30％，70％とめ，高分解能の構造解析には向かないが，本研究のように，順に増加した．つまり，P-SSP7 の吸着過程が進むにつれ，生理条件下における生体分子の機能と構造変化を解析する新スパイクファイバーの基部が徐々に折り畳まれた状態から伸しい方法として期待される．

びた状態に変化していくことがわかった．
謝8.

スパイクファイバーの構造変化と DNA 放出

図 8a は，精製した P-SSP7 の氷包埋像である．キャプシ
ドに DNA が詰まった完全な P-SSP7 の中に，DNA を放出し辞

本研究は，マサチューセッツ工科大学の Sallie W. Chisholm研究室との共同研究であり，NIH P41RR02250，NSF，Moore
Foundation からの研究費支援により行われました．

た後の空のキャプシドをもつものが混ざって見られた．それぞれの電子顕微鏡像を従来の単粒子解析によって 3 次元再構
成 し た（ 図 8b）． 感 染 前 の DNA が 詰 ま っ た P-SSP7 で は，スパイクファイバーの基部がキャプシドに沿って折り畳まれているが，DNA を放出した後の P-SSP7 では，スパイクファイバーの基部がテールと垂直方向に伸びていた．また，DNAが詰まった P-SSP7 には，スパイクファイバーの基部と隣接した位置に，DNA の放出を防ぐゲート状の構造が見られるが，DNA を放出したファージではこのゲートがなくなり，テール内部の DNA の通り道が完全に開いた状態になっていた．このことから，細胞表面におけるスパイクファイバーの構造変化が，これと隣接した DNA ゲートの開閉に関係していることが示唆された．
9.

おわりに

電子線クライオトモグラフィー単粒子解析は，様々に構造変化した試料を分類して解析することができる．本研究では，この方法を使って，ファージの宿主表面への吸着過程における構造変化を調べた．その結果，ファージがスパイクファイバーの構造を変化させながら，徐々に細胞表面に吸着し，ウイルス DNA を細胞内に注入することがわかった．また，高分解能単粒子解析の結果と比較することで，スパイクファイバーの構造変化による DNA の放出メカニズムを推定するこ118

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