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日本家禽学会誌48:J6‑J13, 20"

IPSn＜技術報告＞

験JapanPouItryScienceAssocia血､

地鶏や野鶏等の貴重家禽から分離した始原生殖細胞(PGCs)の凍結保存の試み
伊藤なつき」 ・川越雄太! ・斎藤靖史｣ ・佐藤直人2 ・斉藤美緒3 ・力丸宗弘4 ．辻本恒徳5 ．齋藤文也6 ．松原和衛！
！岩手大学大学院農学研究科，岩手県盛岡市上田3 18‑8020‑8550
2岩手県畜産研究所，岩手県滝沢村砂込737‑1 029‑0173
3福島県畜産研究所，福島県福島市荒井189602156
1秋田県農林水産センター畜産試験場秋田県大仙市神宮寺字海草沼谷地'3‑3019 1701
5盛岡市動物公園岩手県盛岡市新庄60‑18020‑0803
i小岩井農牧株式会社小岩井農場技術研究センター，岩手県雫石町丸谷地36‑1 020‑0507

卵細胞の長期保存が困難なニワトリにおいて，始原生殖細胞(PrimordialGermCells ;PGCs)は遺伝資源の保存のための有効な細胞である。本研究では， ニワトリで確立されたPGCs凍結保存技術とキメラ作出技術が，東北地域で飼養されている地鶏や動物園で展示されている野鶏等の貴重種に対して有効か否かを検討した。凍結・融解したPGCsを含む各
鶏種の細胞集団は生存率を解析した後，培養を行って細胞の増殖の確認とPGCsの同定を行った。また, PGCsを採取した際に保存した体細胞からDNAによる性判別を実施した。さらに，凍結したPGCsを含む細胞集団が生殖系キメラ作出のためにレシピエント胚に移植可能かを検討するため, PKH‑26で標識したドナーPGCsの追跡を試みた。
DNAによる性判別はすべての個体で正常に解析され, PGCsは当研究室の液体窒素に半永久的に保存するとともに，性別データ等はコンピューターに記録保存した。凍結・融解におけるPGCsを含む懸濁液の細胞生存率は65.6〜80.9%であり，培養後には細胞の増殖が観察された。培養された細胞は, PAS染色，抗SSEA‑1,抗PGC‑IgGに陽性であり, PGCsを含むことを確認した。また, PKH‑26標識ドナーPGCsを移植した白色レグホン(WL)の生殖腺を凍結切片にして蛍光顕微鏡下で観察したところ, PKH‑26の蛍光を発するPGCsが確認された。
したがって，本研究で凍結保存したPGCsは生殖巣への移動能を有しており， トリインフルエンザ等の有事にはWL等を用いて貴重な品種を復元することが可能であることが示唆された。 また, PGCsの性別を明らかにしてPGCsバンクのデータとして保存することにより， 同性キメラの作成が容易になり， キメラ作出の際にキメリズムの向上が期待できる。
キーワード:PGCs,遺伝資源，貴重家禽, PGCsバンク

Perry (1988)は卵割の始まっていないl細胞期のニワトリ胚

一一一宮

緒

や，卵管子宮部から採取した16〜64細胞期のニワトリ胚の体外
トリインフルエンザ， 口蹄疫等家畜の集団感染が危倶される培養法を開発し，人工的に孵化させることに成功した。その後，現代において，家畜はもちろん希少動物の保護や増殖，遺伝資源

Naito"czJ. (1990)はPerryの手法を改良し，孵化率を7%からの保存は重要な課題である。受精卵や精子，卵子の凍結保存，胚移植やクローン技術等のバイオテクノロジーは主に哺乳類で発達34.4％まで向上させた。また, NaitoandPerry(1978)は放卵直後の胚（ステージX)の培養法を確立し，孵化率が50.0〜62.5%

しており，鳥類ではその発生学的特異性から遅れをとっている。

であったことを報告した。これらの技術の発達によって，鳥類では卵子が他の動物種と比較して大きく ，多量の卵黄を含み

リ受精卵の体外培養が可能となり，細胞および遺伝子レベルの胚もろいこと，発生の大半が卵殼内で進行するなどの理由から，哺乳類で確立された技術を応用することができず，独自の技術が開操作に応用されるようになった。一方，哺乳類では精子や卵子，

受精卵の凍結保存技術が確立されているが，鳥類では精子の凍結発されてきた。

保存(Hammerstedt, 2009 ;LakeandStewart, 1978)以外は確

ニワト

立されていない。近年，生殖細胞の長期保存技術として始原生殖2010年12月9日受付, 2010年12月27日受理

細胞(PrimordialGermCells;PGCs)を凍結保存し，そのPGCs

連絡者：松原和衛

を用いて生殖系キメラ個体を作出することが試みられている〒020‑855O岩手県盛岡市上田3−l8‑8
岩手大学大学院農学研究科(Naito"", 1994 ;Naito, 2003 ;Tajima""., 1998;吉田ら，

Tel : 019‑621 6160

2006;Kuwana"". , 2006;Nakamura""., 2010)｡PGCsとは

Fax:019621‑6160

生殖細胞の前駆体であり，鳥類では胚の発生とともにPGCsが形

E‑mail :kazuei@iwate‑u・ac・Jp

態を変えながら移動するという独自の性質を有する (Hamburg‑J6伊藤ら：貴重家禽のPGCsの凍結保存
gPGCsの同定を行った。

erandHamilton, 1957;Kuwana, 1993;Karagenc"". , 1996;

菊地ら, 2000 ;Tsunekawa"". , 2000;Nakamura""., 2007)。

2.

この性質を利用することで,除去なDNAの抽出はWalsheml. (1991)の方法に従って，胚凍結組

どの様々な操作を行うことができる(Aige‑gilandSimkiss, 1991 ;

織片約3mm3を1.5m/のマイクロチューブに入れ5%(wt/vol)Naito""., 1994;Naitoergj., 2004)｡本研究では, PGCsが孵卵

Polystyrene‑divinylbenzeneiminodiacetate(ChelexlOO :Bio‑

6日目において生殖隆起(GerminalRidge;GR)

Rad)/MQ懸濁液を混和して8分間煮沸した後,

PGCsに対して分離や移植，に定着する特PCR法によるドナー胚の性判別

12,000rpmで3性を利用し, GRからgonadalPGCs (gPGCs)を採取した。

分間遠心分離し，上清をDNAサンプルとして用いた。PCRは

Naito""(1999)は，

Itoh""l. (2001)の方法に従って行った。PCR反応液，

ドナーとレシピエントの性を一致させた

プライ

マーおよびPCR条件は表lの通りである。

場合， キメリズムが向上することを報告している。 したがって，

PCR産物は電気泳動によって確認した。 05%TBE(1×TBE：

性判別のデータとともにPGCsを長期保存することは，希少鳥類

0.086MTris, 0.089Mホウ酸,

はもちろん，飼育地域の限られる家禽の遺伝資源を集団感染等かファーとし,

ら守るために有効と考えられる。

0.002MEDTA(pH8.0))をバッ

1.5%アガロース(SeaAgLEagarose:BMBio)/

0.5%TBEケルで，電気泳動装置Mupid‑3 (コスモ・バイオ）を以上のことから本研究では，主に東北地方に現存する地鶏（岩手地鶏，岩手大型ロード，南部かしわ基礎鶏純系会津地鶏，比使用して100Vで約1時間電気泳動を行った。泳動終了後．

内鶏）や動物園で展示されている野鶏（赤色野鶏，金鶏銀鶏）

ジウムブロマイド(EtBr)で染色し，紫外線下（波長312nm)でを用いて,バンドを確認し写真に記録した。

(1)PGCsの凍結保存,(2)ドナー胚の性判別,

(3)凍結

3．

PGCsを用いた生殖系キメラ作出の可能性を検討した。

凍結・融解PGCsのレシピエント胚への移植

PKH‑26赤色蛍光リンカーキット (SIGMA,Cat.No.58HO427)

材料と方法
1．

エチ

で凍結後融解したRJ, GPならびにLAPのgPGCsを含むGR細胞を標識した。 この標識した細胞を培地に浮遊させ，顕微鏡下

希少鶏種の胚i胖牛殖巣細胞の採取と凍結保存

ドナーPGCsは，岩手地鶏（赤笹:JR,白笹:JW),岩手大型

でgPGCsをマイクロピペットによって選択的に採取し，放卵直ロード(R),南部かしわ基礎鶏(CJ),純系会津地鶏(AJ),比内

後の白色レグホン(WL)胚（ステージX)の胚盤下腔へ50〜100

鶏(H),赤色野鶏(RJ),金鶏(GP),銀鶏(LAP)の4種から個ずつ移植した。なお，宿キH不の内在性PGCsを除去するため，採取した。岩手地鶏2品種，岩手大型ロード，南部かしわ基礎鶏

あらかじめWL胚に1cmの距離から60秒間UVを照射したの種卵は岩手県畜産研究所から，純系会津地鶏は福島県畜産研究(Keyence社UV‑400,365nm,1600mW/cm2)｡Perry(1988)と所から，比内鶏は秋田県農林水産センター畜産試験場から，野鶏

Naito""J. (1990)の方法に従って種卵を操作した。 レシピエン

これらの種卵を6日間孵卵

トは378℃，湿度55〜60％，転卵角度90。 （片面45｡),転卵回数し，実体顕微鏡下でGRを採取した。それぞれl.5mJチューブに3.75分/回の条件にて， 48〜52時間孵卵した（システムII)。続い

移し,て，胚を二黄卵殼に移して塩化ビニルラップで切断面を覆い，転3種は盛岡市動物公園から入手した。

Trypsin‑EDTA(0.25%Trypsin, 1mMEDTA・4Na：

GIBCO)を100"j加え,

37℃で2分間インキュベー卜した。

ペッティングにより細胞を解離し，卵角度30｡,転卵回数30分/回に設定した転卵器(P‑008(B)型バ

ピ

イオ仕様昭#￨ 1フランキ研究所）で3〜6日間孵卵した（システム

ペニシリン・ストレプトマイ

III)｡

シン(10,0001U/mJ, 10mg/m/ :SIGMA) 100浬/を含む10%ニヮ
トリヒナ血清（自家製）添加DMEM(SIGMA)培地をlmj加えドナーPGCsを移植したレシピエント胚からGRを採取してて反応を停止させた。遠心して上渭を取り除き，上記した培地でPBSで洗浄した後，ベースモールド（アズワン,M475‑2)に移し

2回洗浄してTrypsin‑EDTAを除去したo

た。サンプルの上部から十分にTISSUEFREEZINGMEDIUM

gPGCsを含む細胞懸濁液に血清入り（コンパウンド :Polysciences)をかぶせて包埋し，液体窒素中でのセルバンカー（日本全薬工業株式会社, Cat.No.08‑001‑002)を凍結した。組織はクリオスタットで4〜6〃mの厚さに薄切し，蛍500"j加え,光顕微鏡(OLIMPAS,AX‑80)でPKH‑26由来の蛍光を観察しTrypsin‑EDTA処理後,

1.2mjセラムチューブに移した。セラムチューブはた。

‑80℃で一晩凍結した後，液体窒素に移し保存した。

なお，本研究は岩手大学動物実験委員会の許可(A201091)を7日以上凍結保存した細胞懸濁液を37℃のウォーターバスで5受け，倫理規定に従って実施した。

分間融解し， ただちに上述した培地を加えて遠心分離後上清を除去した後，上記の培地で2回洗浄することにより，セルバンカー

結を除去した。細胞懸濁液30 をエッペンドルフチューブに移し，同量のトリパンブルー溶液と混合し，

1.

ノイバウエル血球計算盤で

果

PGCsの凍結成績

PGCsを含む細胞懸濁液を凍結保存し，細胞生存率を計測した。なお，細胞数の計測は各鶏種3個体ずつ

そのうち各鶏種3個体行った。残った懸濁液は4ウエル培養プレートに入れ, 5%CO2,

分をランダムに融解してトリパンブルーにより生存率を計測し37｡Cに設定したCO2インキュベーターで7日間培養した。そのた。凍結した各鶏種のgPGCsの生存率は65.6〜80.9%であった

後, PAS染色（アスカ純薬, Cat.No.395B‑lKT),抗SSEA‑lモ(表2)。融解後に培養したgPGCsは，凍結せずに培養した場合とノクローナル抗体(MAB,Cat.No. 4301),

FITC‑RabbitAnti‑

同様に繊維芽細胞上に確認された。これらのgPGCsはすべてMouse 12.5dpcPGCs lgG(Mayanagi""., 2003)によってPAS陽性，抗SSEA‑l陽性，抗PGC‑IgG陽性であった（図1)。
J7日本家禽学会誌48巻J1号(2011)
表1.

本研究で行ったDNAによる性判別のう°ライマー配列およびPCR条件

プライマー

配列(5' to3')

性判別ﾌﾟライマー
コントロールプライマー

USPl

CTATGCCTACCACATTCCTATTTG(

USP3

AGCTGGACTTCAGACCATCTTCT

CPE15F

AAGCATAGAAACAATGTGGGAC

CPE15R

AACTCTGTCTGGAAGGACTT

液量("z)

５２２１１１１２９

プライマーNo.

５５

試薬名
DNAサンプル

IO×PCRBuffer (10mMMgCl2)
2.5mMdNTPs

性判別プライマー(10"M)

USPl
USP3

コントロールプライマー(10"M)

CPE15F
CPE15R

0.5units/"TaqDNApolymerase

最終濃度

lmM
O､2，M

0．4ﾒ4M
0.4"M() .4〃M
0.4"M

MQ
Total

2．

25

Predenaturation

Denaturation

Annealing

Elongation

CyclesPostelongation

95℃,3min

95℃,80sec

59℃, 90sec

72℃,60sec

35

72℃,3min

性判別結果ず，雌性生殖細胞の長期保存技術の確立が必要である。

GR採取後のドナー胚は,しかし，80｡Cで凍結保存し， その胚の組織

鳥類の卵細胞の特性から，現在の技術では卵子をそのまま凍結保を用いてDNAによる性判別を行った。エラーを防ぐため，性判存することはできないため，精子および卵子の前駆細胞である

別はすべての胚において2回ずつ行い，明確な結果が出たものを

PGCsを保存する試みが行われている(Naito,2003)｡本研究は，判定に使用した。250bp付近のバンドがZ染色体由来のバンドで東北地方に生存する貴重家禽；地鶏や野鶏等のgPGCsを凍結・あり， このバンドのみ検出されたものを雄と判定した（図2)。ま融解し，た, 250bpに加えてW染色体由来の370bpのバンドが検出されその生存率と機能性を明らかにした。

GR細胞の凍結保存試験では，液体窒素中で7日以上凍結保存たものを雌と判定した。ほとんどの個体で正常にバンドが検出さし，融解後における生存率はいずれの種においても7割程度でれ，性判別が可能であった。

あった。また，3．

凍結gPGCsの移植試験

融解後培養したドナーgPGCs(RJ,GP,LAP)をPKH‑26で標識し,これらの細胞を試験管内で培養した結果，各種

PGCsマーカーに対して陽性の細胞が観察されたことから，

UV照射したWLの胚盤に直接移植し，PGCsとしての特性を保持しているものと推察された。当研究室

孵卵6〜9日後にでは，本研究と同様の手順にて凍結・融解したgPGCsをドナー

レシピエント胚のGRを採取して観察を行った。なお，宿主胚40細胞として用いて生殖系キメラの作出に成功したことから（未発個へドナーPGCsを移植した結果,表)，今回凍結したgPGCsも生殖系キメラの作出に利用可能と考14個が6〜9日齢まで生存した。その結果, PKH‑26標識PGCsが確認された胚の割合は平均察される。

75.2％と高確率であった（図3，表3)。

また, GRを採取した胎児の組織から抽出したDNAによる性

なお，本研究では将来の復元に備えて，胚ごとにデータをまと判別を行った。その結果，地鶏と野鶏においても,WLなどのコ

めるとともに（表2)，凍結したPGCsを含むGR細胞は1胚ずつマーシャル鶏の性判別と同様の手法を用いてPCRによるDNA

保存番号をつけてセラムチューブに入れ，液体窒素保管器で保存の増幅が可能であり，すべての胚の性を半l1別することができた。

した。

Naitoemj. (1999)は，

考

ドナーとレシピエントの性別を一致させることで生殖系キメリズムが向上することを報告している。 した塞がって，本実験のように凍結保存したPGCsの性別を明らかにし貴重種に危愼される問題点として，野生種では近親交配によるておくことは，生殖系キメラ作出，

近交退化地鶏では飼育域が限られるため集団感染のリスクが高あるいは種の復元において有効と思われる。

くなる点があげられる。ニワトリ精子の凍結保存技術(Hummer.

PKH‑26で標識したRJ, GPならびにLAPのgPGCsをUV

stedt,2009;LakeandStewart, 1978)は既に開発されているが，照射したWLの胚盤へ直接移植し，雄性生殖細胞の保存だけでは品種や系統を保存することはできした。凍結切片を作製し，蛍光顕微鏡下で観察した結果，培養6〜J8

孵卵6〜9日目でGRを採取

伊藤ら：貴重家禽のPGCsの凍結保存

O70130−No
O70130−No
070130‑No
O70130−No
O70130−No
O70130−No
O70206‑No
O70206‑No070130-No.04
070130-No.05
070130‑No．06
070130‑No．07
070130‑No.09
070130‑No． lO
070202‑No. 01
070202‑No.02
070202‑No．O3
070202‑No.04
070202‑No．05
070202‑No.06
070202‑No． 07

JW(70.3%)

070202‑No. 08

071226-No.01

071226‑No.03

071226‑No. 06
071226‑No．09
071226‑No． lO
O71226−No、 11
071226‑No. 12080722‑No、 01
080722‑No.02
080722‑No．03
080722‑No.04

080722‑No. 07
080722‑No. 08
080723‑No.02
080723‑No.03
080723‑No.04

070131-No.06
081112-No.01
081112-No. 02
081112-No. 03

081112-No.06
081112-No.07

081112-No. 08
021113-No. 01
021113-No. 02
021113-No.03
021113−No．04
021113‑No.05
021113−No、 06

081114‑No. 02
081114‑No.03

081114−No．06
081114‑No. 07
081114−No． 08
081114‑No． 09
081114−No． lO
081222‑No.01
081222−No､02081222‑No.03
081222‑No．04

AJ(67.1%)
080221‑No． Ol

軍

080221‑No.02
080221‑No．O3
080221‑No.04
080221‑No． 05
080221‑No． O6
080221‑No. 07
080221‑No．08
080221‑No．09
080221‑No. 10
O80221−No， 11

081112-No.04
081112-No.05

081114‑No,05

声刀080221‑No. 12080221‑No． 13
080221‑No． 14
080221‑No. 15
080221‑No. 16
080221‑No． 17
080221‑No． 18
080221‑No. 19

081219‑No．01
081219−No．02
081219−No． 03
081219‑No． 04

081114‑No.04

081219−No･ O9
081219−No・ lO
O81219−No・ ll
081219‑No. 12
081219‑No. 13
081219−No， l4
081219−No、 15
081219‑No. 16
081219‑No． 17
081218‑No.01
081218−No・O2
081218‑No.03

080228‑No.01

H(70.1%)081219−No． O8081218−No．04
081218‑No. 05
081218−No． 07
081218‑No.08
081218−No、 11081218‑No． l2
081218‑No・ l3
081218‑No. 14
081218‑No. 15
081218‑No. 16
081218‑No. 17
081218‑No. 18
081218−No， 19

RJ(75.2%)
6-18-RJ
6-19-RJ
6-20-RJa

6-20-RJb
6-21-RJ

GP(65.6%)

LAP(80.9%)

早翻￥O70130−No､02

早忽

070130‑No．Ol

070131-No.05

081114‑No. 01

080723‑No. 08

CJ(70,3%)070131-No.04

081114−No．O4

十忽Ｊ鼎

080723‑No．07

070131-No. 03

081114‑No.03

081219−No． 07

毎Ｊ

080723‑No．06

070131-No.01

081114‑No.02

081219‑No． 06

ＰＰ
ＧＧ
０２
２
２
６６

080723‑No．05

R(75.0%)081114−No・Ol

081219‑No．05

6-18-LAPa
6-18-LAPb
6-23-LAP

JR:岩手地鶏赤笹， JW:岩手地鶏白笹, CJ:南部かしわ基礎鶏R:岩手大型ロート
AJ:純系会津地鶏， H:比内鶏RJ:赤色野鶏GP:金鶏LAP:銀鶏
各鶏種の略号の横の （ ）内は細胞生存率を示す

19

毎早３旱？

080722‑No. 06

070202‑No. 11

千￥忽伊〃記〃〃￥？￥〃平080722‑No． 05

070202‑No． lO忽早早早旱部３忽列

071226‑No． 04

070202‑No．09

021113−No・O6

忽翻早早３忽砂早忽早〃旱〃毎砂早〃旱早〃O71226−No,02

千忽忽晶早部Ｊ子罰早部早早早伊忽Ｊ旱早砂Ｊ認早〃O70206‑No

021113‑No. 05

早忽早早早〃早早早早毎早早早伊早子忽Ｊ翌ＪＪ〃早毎忽Ｊ忽早︲O70130‑No

070130-No.03

Ｊ旱忽早〃早早早砂子平部伊早子牛O70130−No？？早早￥旱早〃早︲￥伊部刀

O70130−No

１０
２０
３０
４０
５０
６０
８０
９１
０１
１０
２０
３０
４
０

JR(75.8%)
O70130−No

本研究で凍結保存した貴重鶏種のPGCsバンクデータ

子早早早忽早忽忽早毎￥〃早忽早忽翌

表2．

日本家禽学会誌48巻J1号(2011)
9日目のいずれの胚においてもPKH‑26標識細胞が観察された。

の生殖系キメラの作出が可能になれば，将来的にあらゆる鳥類をしかし，本研究で凍結したgPGCsがWLの生殖巣内において機産卵能力が高い家禽から再生することが期待できる｡Nakamura

能的な配偶子へ分化することができるか否かは，今後検討する必aaL

要がある。本研究で観察されたPKH‑26のシグナルはやや微弱でPGCsを除去することにより，ああったが，

産するキメラニワトリの作出に成功しており，希少種のより効率

これはドナーとレシピエントの種の違いによる拒絶があったためか，あるいはPGCsの分裂とともにPKH‑26のシグ

ナル強度が減退したためかは定かではない。今後，(2010)

はブスルファンを用いてレシピエント胚の内在性ドナー由来の配偶子を高確率で生的な再生法が着実に発達している。

レシピエント

しかし，

このような技術の確立を待つことなく絶滅の危機に脅かされる鳥類にとって，遺伝資の生殖巣における異種由来のPGCsの発生分化を明らかにする

源を半永久的に保存することが可能なPGCsバンクの設立（図ため，持続性の高い蛍光標識を用いた異種山来PGCsの追跡試験

4）は技術確立までの一H寺的な保存という面からも有効と考えらを行う必要がある。

れる。さらに，絶滅危倶種であるアホウドリやイヌワシなどの今後さらにキメラ作製技術が向上して，科や目の異なる鳥類間PGCsが保存できれば, PGCsバンクは野生動物保護の観点からも重要となる。本研究で試みたPGCsバンクは家禽産業のみならず，野生動物保護の観点からも重要性が増すものと思われる。

、,坪

雛

，

』

§ ＜一

。←

砥薙

試験管内で7日間培養したGR細胞中におけるPGCs

早早伊
234

↑↑

図1.

蕊︾伊９

↓

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掛←抄

・蟻識

息

織懸 伊６

蛍

獅

蕊罷

f

瀞←

に等鞘

←
蛾

鴬鋒鍵蟻鋳嬢１Cの同定

A:PASおよびSSEA‑lによる二重染色で確認され

図2

たPGCs,B:PAS染色陽性のPGCs, C, D:FITC‑PGCIgGによる反応(C:光学顕微鏡, D:蛍光像),

l :マーカー, 2‑9 :個体No.RO81112‑1〜8のDNA

バンドパターン, 250bp: Z染色体特異的バンド(雌雄共通), 370bp:W染色体特異的バンド(雌のみ）

スケールバーは100"mである、

鱸
B←

←麓←電

図3

DNAによる凍結個体の性半ll別

蝋

レシピエント胚の生殖腺へ移住した異種'二'二￨来gPGCs
A:光学顕微鏡, B:蛍光顕微鏡(Aと同視野), C:AとBを合成した写真，
矢印はPKH‑26標識陽性細胞
J10伊藤ら：貴重家禽のPGCsの凍結保存
表3．
レシビエント

ドナー種名

操作胚数

陽性胚割合2）

陽性胚数

（％）

７

５４
００
０
８
１

PKH‑26

（％）

６２２

発牛率

５
３０
５０
２

７５２

RJ
GP

発生胚数'）

０
２０
１０
１

ＬＬＬ
ＷＷＷ

品種名

キメラ発生成績

LAP
「Ota］

40

10

14
33．3

Average75．2')発生胚数は剖検（孵卵6〜9日）時点で発生していた胚数, 2)発生胚数に対して陽性細胞を持っていた胚の割合

コ
飛

に蕊

貴重鳥類

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ク壊染減
ス破感者
リ境団育

サ
絶滅回避

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＃Ｉ

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I
■

飼育分散

●●●●

｡

●

●

●

■

PGCsバンク
●

●

●

●

●

●

巳

●

■

●

fowl (KurekoDori) usingthegermlinechimeras trans‑

●

衛生管理

・
●

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図4．

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伊藤ら：貴重家禽のPGCsの凍結保存

AttemptofCryopreservationofPrimordialGermCells(PGCs)Isolated
fifomValuableChickens;NativeChickenandJungleFowletc.
Natsukilto',YutaKawagoe',YasushiSaitoh',NaotoSato2,MioSaito3,KazuhiroRikimaru4,
TsunenoriTsujimoto5,FumiyaSaito6andKazueiMatsubara!
IGraduateschoolofAgriculture, IwateUniversity,Morioka, IwateO208550
21wateAnimalResearchlnstimte,Takizawa,IwateO29‑0173

3FukushimaAgriculturalTechnologyCentreLivestocklndustryResearchCentre,Fukushima,Fukushima960‑2156
4LivestockExperimentalStationAkitaPrefecturalAgricultureForestryandFisheriesResearchCenter,Daisen,AkitaO19‑1701
5MoriokaZoologicalPark,Morioka,IwateO20‑0803
6TechnicalReSearchCenter,KoiwaifarmCo.Ltd.,Shizukuishi,IwateO200507

Technique fbrfreezingovaisnotenable inbirds ;however, cryopreservationofprimordialgermcells(PGCs)mayoHEraneHbctivealternative.Thepresentstudywasinitiatedtodeterminewhetherthecryopreserva‑
tionisapplicabletodomesticatedchickenstrainsandtowildchickenspecies.PGCscollectedfromDomesticfbwl,

Junglefbwl,GoldenPheasantandLadyAmherst'sPheasantwerecryopreservedinliquidnitrogen.AfterafEw
days, thecellswerethawedandstainedwithtrypanbluetoanalyzetheirviability. ThePGCswereculturedin
DMEMsupplementedwithchickserumtochecktheirretentionofgrowthability,andtheirsexwasdetermined
byaDNAanalysis・Then,thecellswerestainedwithPKH‑26andtransferredintotheembrVonicdiskoffbrtilized

eggs(WhiteLeghornstrain)inordertoinvestigatewhetherthecellshadtheabilitytomigratetothehostgonads.
Sexdeterminationwasdonecompletelyinallsamples.ThesePGCswerepreservedinourlaboratory'sliquid
nitrogenandsexinfbrmationskeptrecordsasthedataofPGCsBank.Wefoundthat65.6‑80.9%ofthecells

recoveredaftercryopreservationwereviable,andcouldproliferatei"vilﾉo. Theculturedcellsshowedpositive
stainingwithPAS，anti‑SSEA‑landanti‑PGCIgG.

Furthermore, thecellsthatweremarkedwithPKH‑26andtransfbrredintorecipientembryoswereabletomigratetothehost'sgonads・ Thus, thepresentstudyhasconlirmedthat itisfeasibletocryopreservePGCsand
thatthesecellretaintheabilitytomigrateintorecipientgonads. Thesecryopreservedcellstherefbrehavethe
potentialtobeusedingeneratinggermlinechimeras､OurresultssuggestthatPGCscouldbeusedtorestorevalu‑
ableavianpopulationsandspeciesfollowingtheirlossinapandemic.TheinfbrmationonthesexofthePGCswill

makeitsimplertoproducesame‑sexchimeras,whichshouldexpecttoimprovegermlinetransmissionrate. In
conclusion, thepreservationofPGCs inaproperlyconstructedPGCsBankwillbeaneHEctivemeansof
conservinggeneticresourcesinthechicken.

(Jtzpα"eseJひ"r"α/QfPo"/"Scie"ce,48:J5‑"3,20")
Keywords :gameticresources,PGCs,PGCsBank,preciouschicken

J13