オートファジー；形態学と分子生物学の融合

電子線トモグラフィーによるオートファジーの解析
Electron Tomographic Analysis of Autophagosome Formation
西野―林美都子

Mitsuko Hayashi-Nishino
大阪大学産業科学研究所
要旨

オートファジーは，真核生物に普遍的に備わっている細胞内消化機構であり，様々な生理機構や病気の発症に関与している．オー
トファジーを担うオートファゴソームの膜の起源については，長年謎のままであった．筆者等は，オートファジーに重要な遺伝子を変異させた細胞では，膜が途中で成長を止め，その近くには常に小胞体が存在することを明らかにした．さらに，電子線トモグラフィーを用いて解析した結果，小胞体の一部から膜が延びてオートファゴソーム膜になっていることが明らかとなった．小胞体に抱かれてオートファゴソーム膜が成長していることから，小胞体が成長する膜の“ゆりかご”の役割も果たしていると考えられる．

キーワード：オートファジー，隔離膜，小胞体，電子線トモグラフィー

病気の発症に関与していることが明らかにされた 4,5）．
1.

はじめに

しかしながら，分子生物学の進展にもかかわらず，オートオートファジーは，真核生物に普遍的に備わっている細胞ファジーを担う膜の起源については，長年謎のままであった．

内消化機構であり，様々な生理機構や病気の発症に関与してオートファジーが起ると，まず，細胞質に隔離膜（isolationいる．オートファジーを担うオートファゴソームの膜の起源

membrane; IM）と呼ばれる 2 重膜構造をした膜区画が現れる．

については，長年謎のままであった．筆者等は，電子線トモ

そして，隔離膜は細胞質やオルガネラを取り込みつつ進展し，グラフィーを用いて，小胞体がオートファゴソーム膜の起源

最後にその先端が融合して直径約 1 μm のオートファゴソー

1）となっていることを明らかにした ．本稿では，オートファムが形成される．隔離膜の起源については，様々な説が提出

ゴソーム膜の起源に関する研究の背景を解説した後，筆者等されていた．第 1 は，既存の膜が変形して形成されるとする

が電子線トモグラフィーを用いて得た最近の研究成果を紹介

説 で， 小 胞 体 説 が 有 力 で あ っ た 6 ～ 8）． し か し， 隔 離 膜 にする．

P-450 などの小胞体膜タンパク質が検出されないことから，小胞体からそのまま隔離膜が形成される説は否定され 9），結2.

オートファゴソーム膜はどこから来るのか？

オートファジーは，真核生物に普遍的に備わっている細胞

果，第 2 の説として，膜成分が供給され新たに隔離膜が形成されるとする新生説が提唱されていた 6,10）．

内消化機構であり，特に細胞が栄養飢餓の状態になった時に誘導され，自らの組織を分解して栄養源にする．オートファ3.

ジー研究の歴史は古く，およそ半世紀前には電子顕微鏡下で筆者等は，培養細胞を栄養飢餓にし，電子顕微鏡下で隔離

2）

隔離膜と小胞体の関係観察されていた ．さらに，1990 年代に大隅良典博士（現・膜を観察した．その結果，隔離膜は粗面小胞体の近傍で形成東京工業大学）らにより出芽酵母のオートファジー不能変異されており，しばしば粗面小胞体に挟まれるようにして伸展株群・ATG が同定されたのをきっかけに，分子レベルでのしていることを見いだした（図 1A）1）．筆者等はこの構造を3）

解析が飛躍的に進展した ．多数の ATG 遺伝子群が酵母や小 胞 体・ 隔 離 膜 複 合 体（ER-IM complex） と 名 づ け た．

動物細胞で同定されるとともにその分子機構が解明され，NIH3T3 細胞など線維芽細胞由来の細胞では，この ER-IMオートファジーは，栄養飢餓に対処するだけでなく，異常タcomplex がとくによく観察された．免疫電子顕微鏡法により，ンパク質や傷害を受けたオルガネラ，感染菌などを分解し，隔離膜のマーカーである Atg16L1 が ER-IM complex の隔離

心不全，糖尿病，癌，アルツハイマー病など，生命の維持や膜に局在していることが確認された（図 1B）1）．また，小胞〒 567–0047 大阪府茨木市美穂ヶ丘 8–1
TEL: 06–6879–8546; FAX: 06–6879–8549
E-mail: mnishino@sanken.osaka-u.ac.jp
2010 年 2 月 12 日受付

特集

電子線トモグラフィーによるオートファジーの解析

体内腔酵素である PDI は隔離膜を包む小胞体に局在する一方で，隔離膜には局在しなかった（図 1B）．この結果は，これまでの報告と同様に，小胞体と隔離膜が同一の膜構造体でないことを示唆する 9）．Atg4B は，酵母 Atg8 ホモログであ75【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

オルガネラの 3 次元的解析がされ，これらの空間的関係やダイナミズムが明らかにされた 13,14）．
筆者等は，栄養飢餓にした NIH3T3 細胞から 200 nm または 1 μm 厚さの切片を作成し，試料傾斜装置を装着した電子顕微鏡（加速電圧 120 kV，200 kV，2000 kV のいずれか）を用い，切片を ±60 度の範囲で傾斜させ連続傾斜像を取得した 1）．その後，像欠落を補うため，垂直方向に試料を回転させ，同様の作業を行い，2 軸方向での連続傾斜像を取得した 15）．
コンピュータ演算により断層像を構築し，最後に，小胞体や隔離膜など，解析対象のオルガネラの輪郭抽出を行い，3 次元像を再構築した 16）．
図 2 で 3 つの異なる ER-IM complex の 3 次元構築像を示した（A–C）．3 枚の 200 nm 厚さの連続切片から 3 次元構築した結果，小胞体（青色）サブドメインが ER-IM complexを形成していることが明らかとなった（図 2A）1）．小胞体サブドメインが湾曲してゆりかご状の構造を作り，隔離膜（黄色）はその“ゆりかご”に抱かれるようにして伸展していた
C74A（図 2A）．また，ER-IM complex の近傍にはしばしば小胞体

図 1 ER-IM complex の 電 子 顕 微 鏡 像．
（A）Atg4B
発現NIH3T3 細胞に蓄積した ER-IM complex．矢頭は隔離膜（IM），矢印は粗面小胞体（ER）を示す．隔離膜が粗面小胞体に挟まれて伸展している様子がわかる．白矢印は完成したオートファ
ゴソーム，白矢頭は VTC を示す．
（B）ER-IM complex の免疫
電子顕微鏡．ATG16L1 は隔離膜（矢頭）に局在し，小胞体（矢印）には見られない．一方 PDI は小胞体内腔に検出されるが，隔離膜には見られない．Bars = 200 nm．文献 1 より転載．

から生じる VTC（vesicular tubular clusters；白色）が観察された．さらに，1 μm 厚さの切片から構築した 3 次元像より，隔離膜が 2 枚の小胞体（青色，赤色）に挟まれて伸展していることが示唆された（図 2B）．
5.

隔離膜と小胞体は繋がっている

次に，筆者等は ER-IM complex の隔離膜と小胞体が連続る LC3 の C 末端アミノ酸残基を切断するシステインプロテしているか否かについて検討した．その結果，図 2C–E で示アーゼであり，その結果生じた LC3-I の一部がさらに修飾をす ER-IM complex の 3 次元像において，隔離膜と小胞体が11）．

細い管状の膜（赤矢頭）を介してつながっていることが明ら

Atg4B の変異体（Atg4BC74A）を過剰発現させると，LC3 のプかになった．8 個の ER-IM complex を解析した結果，5 個でロセシングが阻害される結果，隔離膜の先端が融合してオー小胞体と隔離膜の連結がみられた 1）．興味深いことに，小胞トファゴソームが形成される過程が阻害され，隔離膜（口の体と隔離膜の連結が 2 個以上のものは見られなかった．隔離11）

あ い た オ ー ト フ ァ ゴ ソ ー ム ） が 蓄 積 す る（ 図 1A） ．

膜と小胞体の連続性については，筆者等の報告とほぼ同時にAtg4BC74A 発現 NIH3T3 細胞では，ER-IM complex の割合がEskelinen らのグループによってもされている 17）．

受け LC3-II となり，オートファゴソーム膜に結合する顕著に増加したことから，ER-IM complex 形成は，オートファゴソーム形成の初期過程に重要な意味を持つと考えられた 1）．オートファゴソームが完成すると ER-IM complex は解

6.

おわりに

本研究により，筆者等はオートファゴソーム形成初期の構造（ER-IM complex）について，その形態学的詳細を明らか離した（図 1A，白矢印）．にした．今回得られた結果はオートファゴソーム膜が小胞体4.

電子線トモグラフィーによる 3 次元的解析以外のオルガネラにも起源する可能性を完全に排除するもの

ER-IM complex が小胞体サブドメインから生じているのではないが，筆者等はオートファゴソーム形成について第 3か，それとも独立した構造体であるのか，隔離膜は小胞体かのモデルを提示した（図 2F）1）．すなわち，隔離膜は，第 1ら生じているのかが重要な問題となった．通常の電子顕微鏡の説のように小胞体からそのまま作られるのでもなく，第 2観察では，深さ方向（Z 軸）において高い解像度が得られず，の説のように小胞体から全く独立して作られるのでもなく，これらについて明確な結論は見いだせなかった．そこで，筆小胞体からリン脂質等の膜材料が連続した膜として供給さ者等は，電子線トモグラフィーを用いて解析することにした．

れ，そこに小胞体とは異なるタンパク質が付加されて新しい

電子線トモグラフィーは電子顕微鏡像について CT（コン膜として形成されると考えられる（step 1）．そして，隔離膜ピュータートモグラフィー）を行う技術であり，数 nm の高は小胞体に包まれ，または挟まれて伸展し（step 2），最後に，い解像度で細胞内膜構造の 3 次元像を得ることができる

12）．

これまでに，ゴルジ体や小胞体，シナプス小胞など，様々な76その先端が融合しオートファゴソームが完成すると考えられる（step 3）．
顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 電子線トモグラフィーにより再構築した ER-IM complex の 3 次元像．（A）120 kV 加速電圧の透過型電子顕微鏡（H-7600，日立）を用い，3 枚の 200 nm 厚の連続切片から 3 次元構築した ER-IM complex．小胞体（青色）のサブドメインが隔離膜（黄色）のゆりかごとなっている．隔離膜の近傍に VTC（白色）が観察される．（B）1 μm 厚の切片を，超高圧電子顕微鏡（H-3000，日立）を用い加速電圧 2000 kV で撮影した．隔離膜をはさんで，小胞体が外側（青色）と内側（赤色）に存在する．
（C–E）小胞体と隔離膜のコネクション．200 kV 加速電圧の透過型電子顕微鏡（JEM-2100，日本電子）を用い，2 枚の 200 nm 厚の連続切片から再構築した．細管状の膜（赤矢頭）で小胞体膜（青色）と隔離膜（黄色）がつながっている．D は C の白枠部分を拡大し，異なるオリエンテーションで示した．E は C の白枠部分の断層像．数字は断層像の深さを示す．（F）オートファゴソーム形成モデル．Bars = 200 nm (A), 100 nm (B) and (C), 50 nm (D) and (E)．文献 1 より転載．

謝辞

長浜バイオ大学の山本章嗣教授，大阪大学の吉森保教授をはじめとする共同研究者の皆様と，電子線トモグラフィーの撮影でお世話になった大阪大学・超高圧電子顕微鏡センターの梶村直子氏，日本電子株式会社の西岡秀夫氏に深くお礼申し上げます．
文献1）Hayashi-Nishino, M., Fujita, N., Noda, T., Yamaguchi, A., Yoshimori,T. and Yamamoto, A.: Nat. Cell Biol., 11, 1433–1437 (2009)2）De Duve, C. and Wattiaux, R.: Annu. Rev. Physiol., 28, 435–492(1966)
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特集

電子線トモグラフィーによるオートファジーの解析

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