ユビキチン類似因子 SUMO-1 による細胞機能変換システム
The analysis of the novel ubiquitin-like protein, SUMO-1, that
regulates cell functions
研究代表者

島根大学生物資源科学部生命工学科

助教授

田中克典

Department of Life and Environmental Science, Shimane University, Associated Professor,
Katsunori Tanaka
要旨
SUMOはユビキチンと構造的に類似した翻訳後修飾因子であり、核機能を制御する多くのタンパク質を修飾することが知られている。ユビキチンが選択的タンパク質分解を誘うための識別分子であるのに対して、SUMOにはタンパク質の分解シグナルとしての機能はこれまで知られていない。我々のこれまでの解析により、分裂酵母ではSUMOが染色体分配やテロメア維持を始めとする核内の多面的機能に重要な役割を果たしている事が明らかとなった。
SUMO 化修飾の生理機能の全貌を明らかにするには、網羅的に SUMO 化基質タンパク質を同定し、その機能を系統的に解析するアプローチが必要である。本研究では、プロテオミクス技術を用いて SUMO 化基質タンパク質を網羅的に解析し、SUMO 化による細胞機能制御機構を明らかにする事を目的とした。その結果として、クロマチン構造制御複合体に関与する重要な因子群が SUMO 化修飾を受けることを見いだした。それらの主なものは、ヒストン脱アセ
チ ル 化 酵 素 Clr6 、 RSC ク ロ マ チ ン リ モ デ リ ン グ 酵 素 複 合 体 構 成 因 子 Rsc1,Rsc8 、FACT(Spt16-Pob3)複合体構成因子 Spt16、ヒストンメチル化転移酵素 Set1、及び DNA トポイソメラーゼ I,II であった。これらのクロマチン構造制御複合体因子の SUMO 化修飾は、クロマチン構造制御複合体のダイナミクスを理解する上で極めて重要であると考えられる。

Abstract
SUMO, a small ubiquitin-related modifier, is known to covalently attach to a number of nuclear regulatory
proteins such as p53, TopII, and PML. Unlike ubiquitin, SUMO has been shown to be more important for posttranslational protein modification than for protein degradation. We have shown that the fission yeast SUMO
pathway is required for a number of nuclear events including the control of telomere length and chromosome
segregation.
To understand how sumoylations regulate these nuclear events, we have tried to identify SUMO substrates infission yeast. We purified SUMO-protein conjugates by TAP method and identified the proteins by MudPIT(Multidimensional Protein Identification Technology) mass spectrometric analysis. We found the peptide masses
that matched those of tryptic fragments predicted for the gene products of top1, top2, rsc1, rsc8, set1, spt16, andclr6 (HDAC1 homolog). The sumoylation of these proteins were confirmed in vivo so far. In view of the facts
that these proteins have been implicated in chromatin organization, our findings suggest that sumoylation could
play an important role in regulating chromatin structure.

１．研究目的の選択的分解の標的分子として働く。一方、タンパク質の翻訳後修飾は、タンパク質合

近年ユビキチンと構造的に類似したユビキチ

成終了後のタンパク質の機能、活性、あるいンファミリータンパク質の存在が明らかとなは局在を変換する重要な機構であり、細胞内ってきた。ユビキチン、SUMO、NEDD8 といっ情報伝達や細胞周期制御においては極めて重たユビキチンファミリーによるタンパク質の要な役割を果たす。ユビキチンはタンパク質

修飾は、ポストゴルジソーティング・核−細-1-

胞質輸送・遺伝子発現・組換え・分配等の細能制御機構の全貌解明を最終目標として、以胞機能発現の基盤となるシグナリングを調節下の 2 点を目的とした。

することで、増殖・発生・再生・老化などの1)分裂酵母をモデル生物に、プロテオミクス様々な生命現象に深く関わっている。現在ま的手法により SUMO の標的タンパク質を網羅での研究から、ユビキチンファミリーによる的に同定する。

修飾の多くは、基質タンパク質を標識化しタ2)同定した基質タンパク質を SUMO 化修飾のンパク質の移動や複合体形成を制御すると考生物学的意義を遺伝学および生化学的に解析えられており、一見異なるように見えるそれすることで、SUMO による細胞機能変換機構のぞれのシステムの制御機構や作用機作に多く普遍性、細胞周期や細胞外環境等との調和、の共通性があることが示唆されている。

及び生理学的意義を明らかにする。

クロマチン・染色体、核膜そして様々な核ドメインは、増殖と分化のプロセスの中でダ２．研究経過

イナミックに遷移する分子集合体として定義

2-1 プロテオミクス法による SUMO 基質候補タできる。近年、こうした核関連の分子集合体

ンパク質の同定２）の中に SUMO の基質、あるいは SUMO 化・脱 SUMO

多彩な SUMO 修飾システムの全貌を理解す化調節因子の存在を示す事例が多数報告される事を最終目標として、分裂酵母をモデル生るようになってきた。リン酸化、メチル化、物に TAP タグ法による SUMO タンパク質の精アセチル化といった化学修飾に関わる酵素群製、および多次元質量分析(MudPIT 法)によるも核関連の複合体中に多く認められる。よっSUMO 化基質タンパク質の同定を行なった。そて、SUMO 化修飾は複数の修飾酵素群、そしての結果、クロマチン構造制御複合体に関与す細胞外的・内的（エピジェネティック）なシる重要な因子群が SUMO 修飾を受けることをグナルと協調的に働く核構造・機能調節のた見いだした。それらの主なものは、ヒストンめの重要な支援システムの一つと考えられる脱アセチル化酵素 Clr6、RSC クロマチンリモ

ようになってきた。

デリング酵素複合体構成因子 Rsc1, Rsc8、

我々のこれまでの遺伝学的解析により、分FACT(Spt16-Pob3)複合体構成因子 Spt16、ヒ

裂酵母において SUMO が染色体分配やテロメストンメチル化転移酵素 Set1、および DNA ト

ア維持を始めとする細胞の核内を中心としたポイソメラーゼ I,II であった。

多面的機能に重要な役割を果たしている事が2-2 ヒストン脱アセチル化酵素 Clr6 の SUMO

明らかとなった 1）。SUMO 化を受ける基質タン化修飾３）

パク質は幾つか同定され、SUMO 修飾の生理機

まず、ヒストン H3 の 9 番目のリジンに特能が推測されつつあるが、基質同定は場当た異的な脱アセチル化酵素として機能する Clr6り的なアプローチしかなされていないのが現の SUMO 化修飾に着目し、その修飾の生物学状である。本研究では、SUMO 化による細胞機的意義を明らかにすることを試みた。分裂酵-2-母染色体ゲノム上で Clr6 に抗体タグを付加

質と SUMO 化修飾を受けていない Clr6 タンパし、分裂酵母細胞内で実際に SUMO 化修飾をク質の質的な違いを、Clr6 タンパク質のヒス受けるかどうか検証した。その結果、分裂酵トン脱アセチル化酵素活性等を指標とした詳母細胞抽出液中で Clr6 の SUMO 化修飾の可能細な解析を行なっている。

性を示すバンドを確認する事ができ、そのバ

2-3RSC クロマチンリモデリング酵素複合体

ンドは SUMO 破壊株では検出されなかった。

構成因子の SUMO 化修飾

次に、SUMO 化修飾の有無による Clr6 タン

出芽酵母クロマチンリモデリング

パク質の質的な変化を検証するために、SUMORSC(remodelingthestructureofchromatin)化修飾部位の同定を試みた。その結果、Clr6複合体は SWI2/SNF2 との相同性により出芽酵の 397 番目のリジン残基が SUMO 化修飾部位

母から同定された複合体で、15 個のサブユニである事がわかった。

ットからなり成育に必須である。我々は上述

さらに、大腸菌を宿主とした invivo 分裂の SUMO 化を受けるタンパク質の精製・同定

酵母 SUMO 化反応再構成系および invitro 分により、RSC 複合体の構成因子 Rsc1 および裂酵母 SUMO 化反応再構成系（横浜市大・岩Rsc8 の分裂酵母ホモログ SpRsc1,SpRsc8 が崎助教授より材料分与）を構築し、Clr6 タン

SUMO 化修飾を受ける可能性を見いだした。

パク質の SUMO 化修飾について詳細に解析した。

分裂酵母染色体ゲノム上で Rsc1,Rsc8 に抗体タグを付加し、分裂酵母内で両因子が実際に SUMO 化修飾を受けるかどうか検証した。
その結果、Rsc1,Rsc8 の SUMO 化修飾の可能性を示すバンドを分裂酵母細胞抽出液に対するウエスタン解析により確認する事ができた。
さらに、これらのバンドは SUMO 破壊株では検出されなかった。以上のことから、RSC 複合体の構成因子 Rsc1 および Rsc8 が、分裂酵母において SUMO 化修飾を受けることがわか

図 invitroSUMO 化反応再構成系による Clr6 タンった。
次に、SUMO 化修飾の有無による Rsc1 タン

パク質の SUMO 化の検証

パク質の質的な変化を検証するために、SUMO
その結果、invivo および invitro のいずれの再構成系においても、Clr6 が 397 番目のリジン残基部位で実際に SUMO 化修飾を受けることを示す結果が得られた（図）。
現在、SUMO 化修飾を受けた Clr6 タンパク化修飾部位の同定を試みた。その結果、Rsc1の 160 番目のリジン残基が主な SUMO 化修飾部位である事がわかった。
現在、Rsc1 の全 SUMO化修飾部位の同定および SUMO 化修飾の生物学的的意義について解析を進めている。

-3-

また、大腸菌を宿主とした invivo 分裂酵のタンパク質と直接あるいは間接的に相互作

母 SUMO 化反応再構成系および invitro 分裂用する因子の多くが SUMO 化されている例が

酵母 SUMO 化反応再構成系により、Rsc8 タン幾つかある。従って、核ダイナミクスと SUMOパク質の SUMO 化修飾について詳細に解析し化の関連を考える場合も、ある特定の因子のた。その結果、invivo および invitro のいSUMO 化を念頭に置くだけでなく、それが含ずれの再構成系においても、Rsc8 が実際にまれる複合体全体の SUMO 化状態を考慮するSUMO 化修飾を受けることを示す結果が得られ必要がある。今回、研究対象としている SUMOた。

基質候補タンパク質の幾つかにも、お互いに相互作用する可能性が報告されているものも３．研究成果ある。よって、このような観点からの解析は、SUMO 化を受ける基質タンパク質は幾つか同SUMO 化修飾によるクロマチン構造制御複合定され、SUMO 化修飾の生理機能が推測されつ体のダイナミクス制御もメカニズムを解明すつある。しかし、基質同定は場当たり的なアる上で重要なものになると思われる。

プローチしかなされていない。我々は多彩なSUMO 化修飾システムの全容を理解する事を最５．発表論文リスト

終目標として、分裂酵母をモデル生物にプロ

1. Characterization of a fission yeast SUMO-1

テオミクス的手法による SUMO 化基質タンパ

homologue,

Pmt3p,

ク質を同定に挑戦してきた。その結果、クロnuclear

マチン構造制御複合体に関与する重要な因子

telomere length and chromosome segregation.

events,requiredincludingforthemultiplecontrolof

Tanaka K., Nishide J., Okazaki K., Kato H.,

群が SUMO 化修飾を受ける可能性を見いだしNiwa

た。それらの主なものは、ヒストン脱アセチ

O.,Nakagawa

T.,

MatsudaH.,

Kawamukai M., and Murakami Y. Mol. Cell

ル化酵素 Clr6、RSC クロマチンリモデリング

Biol. 1999, 19, 8660-8672

酵素複合体構成因子 Rsc1,Rsc8、FACT(Spt16-

2. Proteomic analysis of sumoylated proteins inPob3)複合体構成因子 Spt16、ヒストンメチル

fission yeast. Fujise T., McDonald H., Yate 3rd化転移酵素 Set1、及び DNA トポイソメラーゼ

J., and Tanaka K. （投稿準備中）

I,II であった。これらのクロマチン構造制御

3.Fission yeast histone deacetylase Clr6 is複合体因子の SUMO 化修飾は、クロマチン構

modified by SUMO. Iwase H., McDonald H.,

造制御複合体のダイナミクスを理解する上でYate 3rd J., and Tanaka K. （投稿準備中）

極めて重要であると考えられる。

４．今後の課題と発展あるタンパク質が SUMO 化される場合、そ-4-