トピックス
シリアルフェムト秒結晶解析により明らかにした
光化学系 II の反応中間体の構造と酸素発生機構
菅倫寛

岡山大学異分野基礎科学研究所〒7008530 岡山県岡山市北区津島中 311

秋田総理
岡山大学異分野基礎科学研究所〒7008530 岡山県岡山市北区津島中 311

菅原道泰
理化学研究所放射光科学総合研究センター

久保稔

理化学研究所放射光科学総合研究センター

岩田〒6795148 兵庫県佐用郡佐用町光都 111

建仁

岡山大学異分野基礎科学研究所

要 旨〒6795148 兵庫県佐用郡佐用町光都 111

想

理化学研究所放射光科学総合研究センター

沈〒6795148 兵庫県佐用郡佐用町光都 111〒7008530 岡山県岡山市北区津島中 311

光合成は光エネルギーを有用な化学エネルギーに変換する化学反応であり，地球上ほぼ全ての生物の生命活動を支えている。光合成の最初の反応は，二量体の分子量が70万にも及ぶ膜タンパク質複合体である光化学系 II（PSII）
が光エネルギーを利用して行う，水分子の分子状酸素への光酸化（水分解反応）である。この反応は PSII 内の酸素発生複合体（OEC）によって触媒され，S-state サイクルを経て進むことが知られている（Fig. 1 参照）。水分解反応の開始状態に相当する S1 状態の PSII の構造は放射光および X 線自由電子レーザー（XFEL）により，2 Å を超える分解能で解析され，OEC の実体が Mn4CaO5 クラスターであることだけでなく，OEC 内における正確な原子間距離が明らかにされている。しかし，水分解反応の中間体状態に相当する結晶構造は，原子レベルの分解能では解析されておらず，それゆえ反応機構への考察は反応開始状態の結晶構造およびそれらに関連した理論計算や分光学的知見などからの議論に限定されていた。そこで筆者らは PSII の微小結晶を用いて，二閃光照射により励起させてPSII の反応中間体 S3 状態を調製し，XFEL を用いたシリアルフェムト秒結晶解析法により，この構造を2.35 Å 分

解能で決定した。暗黒下で安定な S1 状態との同型差フーリエ電子密度マップにより，光励起によって起こる構造変化を電子供与体側と授与体側の両方で確認した。とりわけ，OEC の周辺で，プロトンの放出およびこれまで基質の候補とされていたオキソ酸素の一つである O5 近辺への新しい水分子 O6 の挿入が確認された。これらの構造変化により S-state サイクル遷移時のプロトン放出の経路，及び O5 と O6 が O＝O 結合を形成する反応機構を提唱した。
これらの結果は水分解の触媒反応の基本原理を明らかにしただけでなく，水分解の人工触媒合成のための設計図ともなり得ると期待される。

光化学系 II（ PSII）により触媒されている。 PSII は 20個

1. はじめにのタンパク質サブユニットと多数の補欠因子から構成さ

光合成は植物や各種の藻類が行う，太陽光を利用してれ，シアノバクテリアでは二量体を形成し，総分子量が

CO2 と水から有機物をつくる化学反応であり，その副産70 万にも及ぶ巨大な膜タンパク質複合体として機能して物である酸素分子はわれわれ人類を含む地球上のすべてのい る 。 PSII の 酸 素 発 生 複 合 体 （ Oxygen-evolving com-

好気性生物の生存をささえている。また，光合成によって

plex, OEC）では基質である水分子が酸素，プロトン，電太陽の光エネルギーは有機物の化学エネルギーの形に変換

子へと分解され，分子状酸素が放出される水分解反応が，され，地球上生物の生存に必要なエネルギーを供給していS-state と呼ばれる 5 つの酸化状態を経て触媒されているる。光合成において最初に起こるのは光エネルギーの吸（ Fig. 1 参照）。 S-state の i （ i ＝ 0 ～ 4 ）は OEC に蓄積され収，一連の電子伝達，水分解反応であり，これらの反応はた酸化数を表しており， PSII 内で光励起した反応中心ク

228 ● 放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5
(C) 2017 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

トピックス ■ シリアルフェムト秒結晶解析により明らかにした光化学系 II の反応中間体の構造と酸素発生機構

存在してなかった。
近年，X 線自由電子レーザー（XFEL）とよばれる新しい技術が生まれたことにより，これまで不可能とされていた結晶構造解析法が芽生えた5)。XFEL は従来の放射光の10 億倍もの高いピーク輝度をもつ X 線を 1 パルスとして試料に照射するので，照射位置の試料は破壊されてしまう
が，1 パルスはわずか数十フェムト秒という短い持続時間のため，ピコ秒単位で起こるといわれている放射線損傷にFig. 1(Color online) S-state cycle (Kok-cycle).
Si-state cycle of the water-oxidation reaction of OEC. hv,
photons.

よる構造変化が開始する前に X 線回折データ収集が可能となる。この“壊れる前に回折が完結する”（ DiŠraction
before destruction ）の原理に基づくタンパク質構造決定法のひとつであるシリアルフェムト秒結晶構造解析法を用
ロロフィルの電子が電子授与体である QB キノンまで伝達いれば，放射線損傷の影響を排除して，駆動する酵素反応

されたことにより生じる正孔を OEC が補う事により逐次をフェムト秒の時間分解能で捕らえることが可能である。

増加していく。反応開始状態である S1 状態から反応遷移

PSII は光照射によって S 状態が遷移するため，レーザー状態である S4 状態へ達すると，OEC に蓄積された酸化力

照射による光励起とシリアルフェムト秒結晶学を組み合わ

は，水分子の酸化，分子状酸素の発生を引き起こし， S0

せたポンプープローブ実験によって反応中間体の回折デー

状態へターンオーバーさせる。この水分解反応の機構を詳

タ取得が可能となる。

細に理解することは光合成のメカニズムを解明するのに不これまで，米国の XFEL 施設 LCLS が稼動を始めて以可欠なだけでなく，再生可能でクリーンなエネルギーを作

来，その重要性から PSII の反応中間体構造は米国の研究

り出す人工光合成研究への応用にも期待されており，エネ

グループから次々と報告されていたが68)，いずれも分解

ルギー問題がクローズアップされている昨今において注目能が4.5 Å 程度に止まり，反応機構の核心に迫ることがでが高まっている。

きなかった。このため，高分解能での PSII 反応中間体のこれまでに PSII の結晶構造解析により， OEC の S1 状構造解析が待ち望まれていた。

態に相当する構造は1.9 Å 分解能で決定され，その正体がMn4CaO5 の組成を持った“歪んだイス”のような形であることが明らかになった1,2)。さらに X 線損傷を受けていない 1.95 Å 分解能の構造から， OEC の“歪んだイス”を

2. PSIIの反応中間体構造の捕捉を目的とした
時間分解シリアルフェムト秒結晶構造解析構成する Mn 原子の価数と各原子間の正確な距離が明ら

筆者らは好熱性ラン藻 Thermosynechococcus vulcanus かかとなったが3,4) ，水分解反応の機構への考察はこれら反ら単離した PSII を結晶化し，わが国の XFEL 施設である

応開始状態の立体構造およびそれらに関連した理論計算やSACLA にて時分割シリアルフェムト秒結晶構造解析を行

分光学的知見などから導き出されたものに過ぎなかった。

った。光励起効率を良くするため， 100 mm 以下のサイズ（ PSII の 1.9 Å 分解能での結晶構造解析の詳細および 1.95の微小結晶を実験に用いた。微小な結晶サイズは溶液組成

Å 分解能での無損傷結晶構造解析の詳細については本誌

や温度などの変化による品質劣化が起こり易く，また，結に掲載された解説記事2,4)をそれぞれ参照されたい。）特に晶サイズが小さくなる事で X 線回折に寄与する結晶体積

OEC 内の O5 と呼ばれるオキソ酸素は周囲の Mn 原子とも減るため，高い分解能の回折斑点を与える結晶を調製すの結合距離が他のオキソ酸素と比べて長く，ゆえに反応性ることに苦労した。結晶化方法，結晶化の後に用いる溶液に富む環境にあると推定されることから， O5 が酸素発生の組成と処理方法などの検討に加え，シリアルフェムト秒の基質のひとつとなる反応機構が提唱されていたが，その結晶解析法に使用する結晶輸送媒体9)を検討した（次項参ような反応機構が実際に存在するのかは不明であった。も照）。その結果， 2 Å 分解能まで回折し，かつ，レーザー

し仮に存在したとしても O5 近くには酸素発生に必要なも照射によって S3 状態までの励起が十分な微小結晶を与え

うひとつの基質水分子を許容できるだけの空間がないため，る条件を見出した。

S1 状態の立体構造のみからでは反応機構をうまく説明でPSII の時分割シリアルフェムト秒結晶解析法では大量きない。このため，O5 とは異なる部位で分子状酸素が形のサンプルを必要とする。600 L の細胞培養から得られた

成される反応機構も複数提案され，多くの議論がなされて1 g の PSII タンパク質を用いて実験を行い，光励起していた。さらに，水分解反応では水分子から引き抜かれたプ

いない S1 状態の PSII と二閃光照射によって励起されたロトンを放出しなければならないが，そのための経路がどS3 状態の PSII から合計68万枚の回折イメージを集め，最こであるか，また，どうして放出されたプロトンは逆流し終 的 に 両 デ ー タ セ ッ ト と も 2.35 Å 分 解 能 で 構 造 解 析 しないのか，といった疑問に対する実験的な証拠はほとんどた10)。

放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5 ● 229

3. シリアルフェムト秒結晶学のための結晶供給手法

で，S3 状態の回折イメージを取得した。ただし PSII は多数の発色団を含み結晶内部は励起されにくいので，本研究では光励起効率を上げるために，結晶サイズのほか閃光照シリアルフェムト秒結晶構造解析では，フレッシュなタ射の面積や強度を最適化し，さらに二回の閃光とも二方向

ンパク質結晶を連続して X 線照射位置に送る必要があ（すなわち微結晶の表面裏面）から照射できる励起光学

り，特にその時分割実験ではサンプルストリームを乱すこ系を開発した14,15)。

となく，一定速度で結晶を吐出しなければならない。これ

閃光照射による PSII 微結晶の反応効率は，フーリエ変まで，シリアルフェムト秒結晶構造解析では結晶を含む液

換赤外分光法（FTIR）により評価した。一閃光目照射，状試料をそのまま吐出する液体ジェットインジェクターが二閃光目照射による FTIR のスペクトル変化には，それ

用 い ら れ て い た が （ 液 体 ジ ェ ッ ト 法 ）， そ の 速 い 流 速

ぞれ S1 → S2 遷移， S2 → S3 遷移に特徴的なピークが現れ（～10 m/sec）によりストリームは安定するが，大量のサる。それらのピーク強度から反応効率を計算した結果，十ンプルを消費するため膜タンパク質などの試料の量が限ら分な強度の閃光照射下では各状態遷移確率は 0.6を超え，れるサンプルには不向きである。そこで SACLA では結微結晶中でも 0.46 の占有率で S3 状態を生成できることが晶を高粘度環境下で吐出できる高粘度試料用インジェク示唆された。この S3 占有率を達成するためには， on-site

ターを開発した。例えば，ゲル状の様な高粘度媒体を用いで実験直前に微結晶をプレフラッシュ1 し，閃光照射前のれば，液体ジェット法と比べて低速で試料を押し出すこと

PSII を S1 状態に揃えた。

が可能になり，その結果，サンプル消費量を大幅に低減できる。この高粘度試料用インジェクターをサンプルチャン
バー，各種サンプルインジェクター，および multi-port
charge-coupled device (MPCCD) 検出器により構成されapplication

上述した二閃光照射により励起した微小結晶は FTIR

platform for hard X-ray diŠraction in SACLA)11)に導入しにより約半分の PSII が S3 状態を占めていることなどかた。ここで，LCLS では空気散乱を防ぐために真空サンプ

ら，観測された構造は水分子分解の直前の状態を反映して

ルチャンバーを導入しているのに対し， DAPHNIS のサいると考えられる。ただし，遷移効率2 は完全ではないの

ンプルチャンバー内は大気圧ヘリウム雰囲気環境下のたで S2 状態や S1 状態の混入があることを踏まえ，ここではめ，迅速，かつ容易に測定試料を交換することができる。

二回閃光照射した状態（2F 状態）と呼ぶことにする。

る汎用的実験システム DAPHNIS( diverse

5. 光励起，S3 状態遷移に伴って起こる PSIIの構造変化

SACLA では，膜タンパク質を含む様々なタンパク質の結2F 状態の PSII の全体構造は S1 状態とほとんど同じで晶を結晶輸送媒体としてのグリースと混ぜて高粘度化するあり，構造全体の RMSD は僅か 0.10 Å である。 2F 状態

ことにより，低速で高粘度試料用インジェクターから吐出と S1 状態の回折データを用いて計算した同型差フーリエする手法を開発し（グリースマトリックス法)9,12) ，従来

電子密度マップ3 に注目すると，Si状態遷移による構造変の液体ジェット法と比べ 1 / 10 ～ 1 / 100 のサンプル消費量

化 が OEC と QB キ ノ ン の 周 囲 に 局 在 し て い た 。 す な わ

での構造決定が可能になった。しかしながら，これまで鉱物油ベース等のグリースを用いていたが，そのグリースに由来するバックグランド散乱ノイズは無視できなかった。
そこで本研究では，従来グリースと比較して低いバック
グランド散乱のグリース13) を導入した。その結果，チャンバー内温度約 26 °C の環境下，二閃光照射時においては
5.3 mm / sec （ 5.6 ml / min ），また光励起なしの測定時では2.6 mm / sec （ 2.8 ml / min ）の流速でサイズ 100 mm 以下のPSII 結晶含有グリースを内径150 mm のインジェクターノ

ズルから安定に吐出し，良質の回折イメージを収集することができた。

4. 閃光照射による PSII の光励起
PSII 微結晶の二閃光照射には，波長532 nm のナノ秒パルスレーザー二台を使用した。それら二台のレーザーを
XFEL と同期させ，一閃光目照射の10 ms 後に二閃光目を照射し，そのさらに 10 ms 後に XFEL 光を照射すること230 ● 放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5

1

プレフラッシュ
本稿のように光励起させたサンプルの解析では励起前のサンプルの状態が均一に揃っている必要がある。暗黒下で静置した PSII サンプルは S1 状態に揃うことが分かっているが，サンプル調製時の顕微鏡や蛍光灯などの光に励起されて Si 状態の混入が起きたり，反応中心に電子供与が可能な還元型 YD（ D2 サブユニット内のチロシン 160 ）が生じたりする可能性がある。これらの影響を排除するため実験の直前に PSII サ
ンプルを閃光照射して S1 状態に揃えた。
2 遷移効率
PSII の結晶は PSII が高濃度の状態であるため，励起光を照射しても全ての PSII の反応中心が励起されない（この光による励起が起こる効率を本稿では光励起効率としている）。
さらに励起された PSII の全てが次の Si 状態に遷移するとは限らない。光励起により次状態に遷移される効率を遷移効率とよぶ。
3 同型差フーリエ電子密度マップ
光励起による PSII の構造変化は PSII 内部の限られた場所で起こり，PSII 全体の構造はほとんど変化しない。つまり光励起する前の状態とよく似ている（同型である）ので，光励起した状態と励起前の状態の差の電子密度を計算して同型差フーリエ電子密度マップを計算し僅かな構造変化を可視化している。

トピックス ■ シリアルフェムト秒結晶解析により明らかにした光化学系 II の反応中間体の構造と酸素発生機構

ち，期待したとおりに光励起による S3 状態への遷移が起している Asn266, Asn267 を含むループ領域部分が 0.8 Å

こり，その結果，電子供与側と授与側で起きた酸化還元反程度構造変化し， QB キノンが PSII の外部に出て行くた応とプロトン移動を構造変化として観察することに成功しめのルートが開かれる。加えて， QB キノンをプロトン化たと考えられた。

するためのプロトンは Tyr246 や Glu244, D2-Lys264 を含めた経路を通ること， QB キノン近くに位置する重炭酸イ

6. 電子授与体まわりの S3 状態遷移による構
造変化
PSII の電子授与体である QB キノンは 2 つの電子とプロトンを受け取ったのち，チラコイド膜中の酸化型プラス
トキノンと置き換わることが知られている。 QB キノンはオンもプロトン移動に関与している可能性があることなど
が構造解析から明らかになった。

7. OEC まわりの S3 状態遷移による構造変化

PSII の内部ではピンと伸びたオタマジャクシのような構2F 状態と S1 状態の同型差フーリエ電子密度マップおよ造 を と っ て お り ， キ ノ ン 頭 部 は D1 サ ブ ユ ニ ッ ト のびそれぞれの原子構造を比較すると少なくとも以下の 6

His215 と Ser264 と水素結合を形成し，尾部に相当する

つの顕著な構造変化が OEC 周囲に見られ，それらは水分

イ ソ プ レ ノ イ ド 鎖 は D1 の Phe211,

Phe255,解の反応機構をうまく説明するものである（Fig. 2(b)参照）。

Phe265, Phe274, D2フェオフィチン，脂質分子などに囲

1） Mn4 がわずかに OEC のキュバン部分から離れるようMet214,

まれた疎水的環境にある。これまでに報告された S1 状態

外側に動き，Mn4 と Mn1 との距離は0.1
0.2 Å 長くなる。

の結晶構造中の QB キノンは熱振動の指標となる温度因子2）キュバン部分を構成する Ca2＋ が Mn4 から離れるようの値が高いことから，プロトン化状態の異なるものが存在に動く。 3 ）新規の基質の水に相当する O6 の強い電子密している可能性や QB キノンが動き易い環境にあることが度が O5 近くに現れる（Fig. 3 参照）。4）Glu189 がキュバ推定されていた。今回得られた 2F 状態と S1 状態の電子ン部分から遠ざかり，O5 と Mn1 の間に O6 を収容できる密度および結晶構造を比較すると電子授与体まわりの光励

スペースが現れる。 5） W665 と呼ばれる水分子の移動性

起による構造変化を以下のように説明できる（Fig. 2(a)参が増すことで，オキソ原子 O4 を基点とする 15 Å にも及照）。はじめに QB キノンが還元されたことによりキノン

ぶ長い水素結合ネットワークが遮断される。 6）以上 5 点

頭 部 は ベ ン ゼ ン 環 に 垂 直 な 軸 方 向 に 約 10 度 回 転 し ，の 構 造 変 化 に と も な い ， OEC の 配 位 子 で あ る Asp61,

His215 と Ser264 と の水素 結合が 強化さ れて 0.1 ～ 0.2 Å

Asp170, His332, Ala344 がわずかに動く。

短くなり，キノン頭部は安定化して温度因子が減少する。
この水素結合強化によるキノン頭部の安定化はイソプレノ
イド鎖をよじらせる構造変化を誘引し，それに適応するた

8. 水分解と酸素発生の反応機構

めにイソプレノイド鎖の周囲にある疎水的環境はわずかに

上記の OEC まわりの構造変化のうち，特に W665 の移構造を変える。そしてこれらの疎水的環境が変化すること動性の増加および O6 の挿入について水分解反応機構の観により，S1 状態では QB キノンを周囲の溶媒環境から遮蔽

点から述べる（Fig. 4 参照）。W665 の移動性の増加によりFig. 2(Color online) Light-induced structural changes around the QB binding site (a), and around OEC (b). The arrows indicate the light induced structural changes. The structure in the S1 state is shown with faded colors. Lightdark balls labeled 24 represent Mn ions; green and magenta balls labeled 16 represent oxygen atoms. Modiˆed
from Nature 543, 131135 (2017).

放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5 ● 231

W665 と W567 の間の水素結合が無くなり，W567 はもう

新しい水 O6 は，基質の候補とされている O5 から1.5 Å

一方で水素結合している O4 へと 0.1 0.2 Å 近づく。このの位置に挿入され，O＝O 結合を作るのに適した位置に挿とき W567 と O4 の距離は 2 つの PSII 単量体の平均で2.3入される。これは O5 と O6 が酸素発生のサイトであるこÅ となり，通常の水素結合よりもずっと短くなる。これとを強く印象付けるものである。筆者らは S1 状態から 2F

は O4 が基質であり， O＝ O 結合のための準備段階を見て状態への遷移に伴い， O6 の挿入により OEC は Mn4CaO5いる可能性が考えられるが，結晶構造解析での原子間距離から Mn4CaO6 クラスター構造へと変化して酸素が発生すの誤差を考慮すると， S3 状態遷移に伴うプロトン放出のると結論した。この反応機構モデルは S1 状態の結晶構造過程を見ていると筆者らは考えている。そして，W665 のや無損傷構造で発見された“歪んだイス”内の O5 の特異移動性の増加による水素結合ネットワークの分断こそが放な環境に基づいて提案された反応機構1,3) を実証しただけ出されたプロトンの逆流を防ぐ理由である。なお，このプ

でなく，理論計算18) や電子スピン共鳴19) による提案とも

ロトン放出経路は理論計算によっても予測されてお大方で一致する。

り16,17)，今回の実験結果と大方で一致する。

9. 今後の展望
本稿で解説した筆者らの研究は PSII における水分解
酸素発生反応の基本原理を明らかにしたといえる。すでに天然の触媒の立体構造を模倣した Mn4Ca クラスター合成の報告もなされている20) 。今後は筆者らが明らかとした
触媒反応の基本原理や立体構造情報をモデルテンプレートとした人工光合成研究が加速されることが期待される。また反応機構の全貌を明らかにするには残された反応中間体
Fig. 3(Color online) Structure of the Mn4CaO6 cluster after 2F illumination (a), and position of the newly inserted oxygen
atom O6 relative to its nearby atoms (b). Light dark balls labeled 14 represent Mn ions; red and cyan balls labeled 16
represent oxygen atoms. Modiˆed from Nature 543, 131135(2017).

の構造解析や高い時間分解能での構造解析が必要となる。
これらの研究においても XFEL は大きく貢献すると期待される。
謝辞
本研究は岡山大学の中島芳樹氏，中林誠氏，梅名泰史
氏，山根卓大氏，中野貴光氏，米倉慎一郎氏，Long-Jiang
Yu 氏，坂本共洋氏，本村大樹氏， Jing-Hua Chen 氏，東京大学の中根崇智氏，井上茂之氏，濡木理氏，大阪大学の鈴木守氏，京都大学の桝田哲哉氏，名古屋大学の加藤祐樹
氏，野口巧氏，理化学研究所の山下恵太郎氏，木村哲就
氏，野村高志氏，登野健介氏，城地保昌氏，亀島敬氏，初井宇記氏，南後恵理子氏，田中里枝氏，内藤久志氏，松浦
祥悟氏，山下鮎美氏，山本雅貴氏，矢橋牧名氏，石川哲也
氏らとの共同研究であり，この場を借りてお礼を申し上げる。本研究は科学研究費特別推進研究，若手(A)，新学術
領域公募研究及び X 線自由電子レーザー重点戦略研究課
題等の支援を受けて行われた。

参考文献
1)
2)
Fig. 4

Possible mechanism of O＝O bond formation and protontransfer pathways from OEC. The dotted circle indicates displacement of the water molecule (W665) next to the water(W567) H bonded to O4. Possible pathways for protontransfer and the possible site of O＝O bond formation are
represented by the dashed circles. Modiˆed from Nature 543,
131135 (2017).

232 ● 放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5

3)
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トピックス ■ シリアルフェムト秒結晶解析により明らかにした光化学系 II の反応中間体の構造と酸素発生機構

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菅原道泰，登野健介，南後恵理子，岩田 想放射光学会

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著者紹介
菅

倫寛

国立大学法人岡山大学異分野基礎科学研究
所 准教授
E-mail: msuga＠okayama-u.ac.jp
専門構造生物学，蛋白質結晶学［略歴］
2009 年 大 阪 大 学 理 学 研 究 科 修 了 ， 博 士（理学）。米国オレゴン健康科学大学博士研究員，岡山大学助教を経て， 2017 年より
現職。

秋田総理
国立大学法人岡山大学異分野基礎科学研究
所 助教
E-mail: fusamichi_a＠okayama-u.ac.jp
専門構造生物学，蛋白質結晶学［略歴］
2007 年大阪大学理学研究科修了，博士(理学）。中央農業総合研究所，産業技術総合研究所博士研究員を経て， 2016 年より現職。

菅原道泰
国立大学法人京都大学大学院医学研究科
特定研究員
特定国立研究開発法人理化学研究所放射光科学総合研究センター 客員研究員
E-mail: msuga＠spring8.or.jp
専門構造生物学［略歴］
2000 年 大 阪 大 学 工 学 研 究 科 修 了 ， 博 士（工学）。米国リーハイ大学化学科博士研究員，理化学研究所研究員などを経て，2017年 4 月より現職。

久保稔

特定国立研究開発法人理化学研究所放射光科学総合研究センター 専任研究員
E-mail: minoru.kubo＠riken.jp
専門時間分解ラマン赤外分光［略歴］
2003 年 北 海 道 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 修了，博士（理学）。岡崎統合バイオサイエ
ンスセンター IMS フェロー，JSPS 海外特別研究員（ノースイースタン大学），兵庫
県立大学特任准教授などを経て，2014年 4月より現職。

岩田想

国立大学法人京都大学大学院医学研究科
教授
E-mail: s.iwata＠spring8.or.jp
専門X 線結晶学，膜タンパク質構造生物学［略歴］
1991 年東京大学大学院農学系研究科博士課程修了，農学博士。インペリアルカレッ
ジロンドン生命科学科(イギリス）教授，
ダイヤモンド放射光実験施設(イギリス）
ダイヤモンドフェローなどを経て， 2007
年 3 月より現職。 2012 年 6 月より特定国立研究開発法人理化学研究所放射光科学総合研究センターグループディレクター兼
任。

沈

建仁

国立大学法人岡山大学異分野基礎科学研究
所 教授副所長
E-mail: shen＠okayama-u.ac.jp
専門生化学植物生理学［略歴］
1990 年東京大学大学院理学研究科修了，博士（理学）。理化学研究所基礎科学特別研究員，研究員，先任研究員を経て，2003 年より岡山大学大学院自然科学研究科教授，2016年 4 月より現職。

放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5 ● 233

Intermediate structure and oxygen-evolving
mechanism of photosystem II revealed by serial
femtosecond crystallography
Michihiro SUGA

Research Institute for Interdisciplinary Science, Okayama University
311 Tsushina Naka, Okayama, 7008530, Japan

Fusamichi AKITA

Research Institute for Interdisciplinary Science, Okayama University
311 Tsushina Naka, Okayama, 7008530, Japan

Michihiro SUGAHARARIKEN SPring-8 Center,111, Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo 6795148, Japan

Minoru KUBO

RIKEN SPring-8 Center,111, Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo 6795148, JapanSo IWATARIKEN SPring-8 Center,111, Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo 6795148, Japan

Jian-Ren SHEN

Research Institute for Interdisciplinary Science, Okayama University
311 Tsushina Naka, Okayama, 7008530, Japan

Abstract

Photosynthesis converts light energy into biologically useful chemical energy vital to life on Earth.
The initial reaction of photosynthesis takes place in photosystem II (PSII), a 700 kDa dimeric
membrane protein complex that catalyzes photo-oxidation of water into dioxygen through an Sstate cycle of the oxygen evolving complex (OEC). The structure of PSII has been analyzed at
resolutions higher than 2.0 Å by using X-ray diŠraction (XRD) as well as X-ray free-electron lasers(XFEL), which revealed that the OEC is a Mn4CaO5 cluster with its accurately determined interatomic distances. The mechanism of O＝O bond formation, however, remains obscure owing to
the lack of intermediate-state structures determined at atomic resolution, thereby has been discussed extensively from the results of theoretical calculations based on the S1 state structure andspectroscopic analyses. We prepared PSII in the S3 state by providing two-‰ash illumination into
micro-sized crystals at room temperature and determined the structure at 2.35 Å resolution by using time-resolved serial femtosecond crystallography with an XFEL. An isomorphous diŠerence
Fourier map between the two-‰ash-illuminated and dark-adapted states revealed apparent structural changes in both regions around the electron donor and acceptor. Among them, the insertionof a new oxygen atom O6 close to the putative substrate oxo-bridge O5, and structural changes
related with possible proton release around OEC were observed. These structural changes allowed us to propose the proton exit path used when the S-state advances and the mechanism of
O＝O bond formation between O5 and O6. These ˆndings provide a structural basis for themechanism of oxygen evolution, and we expect that the structure will provide a blueprint for thedesign of artiˆcial catalysts for water oxidation.

234 ● 放射光 Sept. 2017 Vol.30 No.5