分子シャペロンを利用した機能性動的ナノ空間の開発
Fabricationofdynamicfunctionalnanospaceusingchaperonproteins
研究代表者

東京大学大学院工学系研究科

講師

金原

数

Lecturer,SchoolofEngineering,TheUniversityofTokyo
和文アブストラクト
分子シャペロンと呼ばれる一群のたんぱく質は，中心に直径 4~5nm ほどの円筒状の空孔を有しており，この空孔内で変性タンパク質のリフォールディングを行ない，ATP の作用により空孔の構造を変化させることで，リフォールディングされたタンパク質を放出することが知られている。本研究は，分子シャペロンの特徴的な空孔と ATP 応答性に着目し、これらの特性を利用した新しい概念のナノデバイスの構築を目標としている。具体的には、１）分子シャペロンに発光性の半導体ナノクラスターを導入し、ATP の添加により半導体ナノクラスターを放出することで消光する，刺激応答性のナノデバイスの構築、２）分子シャペロンの空孔に化学的処理により触媒活性部位を導入し、分子シャペロンの卓越した基質取込み能と ATP 応答性を利用して化学反応を制御する、高活性「分子シャペロン触媒」の構築を目指し検討を行った。
AbstractA family of proteins called molecular chaperons are known to havecylindricalstructureswithnano-scalecavities,andtoassistrefoldingofthedenaturedproteinsthroughtheconformationalchangeofthecavitypromotedbyATP. The refoldedproteinsare readilyreleasedfromthe cavity.The
objectsofthisresearchare(1)fabricationofstimuli-resonsivenanodevicesby introducing luminescent semiconductor nanoparticles into the cavity ofchaperonin,and (2)fabrication of highlyactive “chaperonincatalysts” byintroducingcatalyticactivesitesintothecavityofchaperoninbychemicalmodification.
１．研究目的状タンパクは ATP の存在下細胞中で変性

分子シャペロンと呼ばれる一群の筒タンパクのリフォールディングを促すこ-1-とが知られている。本研究は，この分子必須である。そこで今回、シャペロニンシャペロンのゲスト取り込み能およびの化学修飾による機能化を試みた。

ATP 応答性を利用し，これまでに前例のない刺激に応答するナノデバイスを構築

２．研究経過することを目的としている。これまでに、

２．１グルタルアルデヒドによるシャ量子サイズ効果によって特異な物性を示

ペロニンの安定化すことが知られている半導体ナノクラス

まず、グルタルアルデヒドによる架橋ターを分子シャペロンに取り込ませるこ反応を利用したシャペロニンの安定化をとにより，分子シャペロン・ナノクラス試みた。グルタルアルデヒドは、Lys のターハイブリッドを形成させ，その動的アミノ基とシッフ塩基を形成することがな機能を活かして，新規ナノデバイスを知られており、これを利用してタンパク構築することに成功している。の高次構造の固定化に利用されている。

シャペロニンは、サブユニットの１４

実際、シャペロニンを固定化した例も知量体であり、化学的刺激により、それらられていたが 2、詳細な検討はされていが解離・変性してしまう。このため、シなかった。そこで、まず GroEL について、ャペロニンをさらに機能性材料として利グルタルアルデヒドによる安定化を検討用するためには、化学的安定性の向上がした。
R1

NH24.6+OHC

CHO+

H2N

R1N

R2N

R2nm
4.5

図２nm

グルタルアルデヒドによる架橋反応。
架橋反応は、SEC によって精製した

14.6

GroEL の TEA バッファー水溶液中にグルnmタルアルデヒドを添加し、３７℃で２時間おくことで行なった。未反応のホルミル基をクエンチするために過剰量のグリ

Chaperonin GroEL

図１シンを添加し、SEC によって精製を行なシャペロニン GroEL の結晶構うことで、架橋された GroEL（Gluta-造 1。

-2-では、ある程度変性を抑えられることが-Gro
EL

アルデヒドによる架橋がシャペロニンのluta安定化に大きく寄与することが分かった。

GwM

Marke
Grro
EL

分かった。これらの結果から、グルタル

Abs

Abs

GroEL

70 ºC, 40 min
05101520
Elution Volume / mL

05101520
Elution Volume / mL

05101520
Elution Volume / mL

Abs

Abs

Gluta-GroEL

70 ºC, 40 min

No GroEL
Subunits

0

図４5101520
Elution Volume / mL

GroEL および Gluta-GroEL の加熱処理前後の SEC クロマトグラム。
図３

GroEL および Gluta-GroEL の SDS-２．２水溶性架橋剤の開発

PAGE。

前述したグルタルアルデヒドの問題点
として、架橋反応により、GroEL が凝集GroEL）を得ることができた。

してしまうことが分かった。このため、架橋後の GroEL について、SDS-PAGE

Gluta-GroEL の化学収率はあまり高くなにより分析を行ったところ、サブユニッかった。そこで、架橋による凝集を防ぐ

トには解離せず、１４量体と思われる位ことを目的として、親水性の架橋剤の開置にフラグメントが確認された。このこ発を目指した。とから、グルタルアルデヒドにより Lys間を架橋することで、、SDS-PAGE というOHC

強力な変性条件下でも GroEL の高次構造

OOOOOCHOを維持できることが示唆された。さらに、
図５

Gluta-GroEL は耐熱性も GroEL より向上

PEG-型親水性架橋剤していることが分かった。GroEL では、
７０℃で４０分加熱すると、ほとんどが図５に示すような親水性の架橋剤を合変性してしまうのに対し、Gluta-GroEL成し、GroEL の化学修飾を試みた。その-3-

結果、グルタルアルデヒドを用いた場合触媒機能を付与する段階には至らなかっとは対照的に、架橋反応の過程でほとんたが、その前段階である、高次構造の安ど凝集を起こさないことが分かった。

定化については極めて有用な知見を得る

また、興味深いことに、架橋後のことに成功した。PEG 型の架橋剤を用いGroEL(PEG-GroEL)が ATPase 活性を維持ると、ATPase 活性を維持できることがしていることが分かった。Gluta-GroEL大きな成果の一つである。シャペロニン

はほとんど ATPase 活性を示さないことを初めとする ATP 加水分解性タンパク質が報告されており、PEG 型架橋剤の大きの多くは、機械的な運動を通して生体機な特徴の一つと言える。

能を実現していることが知られている。
このようなタンパク質の生物学的機能を

表

GroEL および修飾体の ATPase 活性利用する上で、今回の架橋剤が重要な役割を果たすことが期待される。

ATPaseActivity(mmol•mg-1•min-1)
GroEL

0.1

５．発表論文リスト

PEG-GroEL

0.1

Gluta-GroEL

˜021.Chaperoninsmediatedstabilizationand ATP-triggered release ofsemiconductor nanoparticles, D.
Ishii, K. Kinbara, Y. Ishida, N.
Ishii,M.Okochi,M.Yohda,andT.
Aida,Nature2003,423,628-632

３．研究成果以上のように、化学的にやや不安定である分子シャペロンを、アルデヒド型の架橋剤で安定化できることが分かった。
特に、親水性の高い PEG 型の架橋剤では、架橋処理中にタンパクの凝集が起こらないため、高い収率で目的とする修飾シャペロニンが得られることが分かった。さらに、修飾後のシャペロニンが ATPase活性を維持していることが明らかになった。
４．今後の課題と発展
今回、シャペロニンの化学修飾により、

-4-

参考文献
1.BraigK.etal.Nature1994,371,578.
2.A.Azemetal.,Biochemistry1994,
33,6671.