愛媛大学農学部紀要 65 号：27－33（2020）
Bulletin of Faculty of Agriculture, Ehime University, 65: 27－33 (2020)

はだか麦の TILLING スクリーニング系における
CEL I エンドヌクレアーゼ反応の最適化
戸田

寛隆・井上

博・小川

翔也・八丈野孝*

Hirotaka TODA, Hiroshi INOUE, Shoya OGAWA, and Takashi YAENO
Optimization of the CEL I Endonuclease Reaction in the TILLING Screening System of the Hull-less Barley
Abstract
TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) is a reverse genetic method based on the
combination of “generation of the mutant population”, “preparation of genomic DNA library” and “detectionof a gene of interest”. Simultaneous screening of mutations in a huge number of plants can reduce thebreeding time, cost, and space. In addition, mutant strains obtained by TILLING are not genetically modified
organisms and therefore can be grown in the field. In this study, to establish the TILLING-based screening
system in the hull-less barley cultivar ‘Mannenboshi’, we developed a recombinant expression system in
Nicotiana benthamiana for the large-scale synthesis of a mismatch-specific endonuclease, CEL I, which is a
key component of the screening, and optimized the reaction conditions of the recombinant enzyme. As aresult, various single nucleotide polymorphisms could be detected by the recombinant CEL I, and the activity
was higher at 27.5 mM and 50 mM potassium chloride in the reaction buffer. These results demonstrate thatthe recombinant CEL I and the reaction system can be used to screen the mutant population of approximately
8,000 lines that we have already generated.
Key words: barley, Targeting Induced Local Lesions In Genomes (TILLING), breedingとで新品種を作出してきた．しかしこの方法では，多1．緒言

くの系統ごとに形質を確認しながら選抜を行う必要があるため，長い期間と労力がかかることが課題とされオオムギは種子の形態により，実に穎がついたままている．

の皮麦と穎が容易に外れるはだか麦に分けられる．日

TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）

本のはだか麦の主要産地は愛媛県であり，その収穫量は全国の約 35%を占め，34 年連続日本一である．愛媛

は，突然変異集団の中から任意の遺伝子の変異個体を県の主要品種‘マンネンボシ’は，2001 年に奨励品種

スクリーニングするためのハイスループットな逆遺伝に採用された，良質多収で耐倒伏性が強い優良品種で学的な手法である（McCallum et al., 2000）．任意の遺伝ある（兼頭ら 2005）．しかしながら，気象条件や栽培子について多くの個体を同時にスクリーニングするこ

条件によって硝子率が高くなるという問題があり，さとで，時間短縮，コスト削減，省スペース化が可能にらなる品種改良が必要とされている．

なる．また遺伝子組み換えではないため，社会に広く

従来の育種方法では，遺伝的背景の異なる個体同士

受け入れられる技術であり，形質転換が困難な生物種の交雑により多くの系統を作出し，得られた各系統ににも適用できるだけでなく，屋外での大規模栽培が可

ついて形質を評価して，優れた系統のみを選抜するこ能である．実際に TILLING の技術を用いて，低グルテ

2020 年 9 月 7 日受領

ン且つ高リジンのコムギが開発されている（Moehs et2020 年 11 月 21 日受理

al., 2019）．
TILLING は一般的に以下の手順で実施される（図 1*愛媛大学農学部植物病学教育分野（責任著者）

27

図1

はだか麦の TILLING の概要; Kurowska et al., 2011; Wang et al., 2012）．まず，アジ化るために，我々はベンサミアナタバコを用いてリコン

ナトリウム（NaN3）などの変異原を種子に処理して変ビナント CEL I タンパク質の大量合成系を構築してき異を誘発する．その変異原処理した種子を M1 種子とた．多数の集団の中から正確に変異個体を検出するたして播種し，形質を固定させるために自家受粉させてめには CEL Ⅰエンドヌクレアーゼの反応系の最適化

得られた次世代を M2 とする．M2 世代で 1 個体ごとにを行う必要がある．そこで本研究では，数多くの SNP

ゲノム DNA を抽出してゲノム DNA ライブラリーを作が報告されているオオムギの MLO（mildew resistance

製すると共に，1 個体ごとに M3 種子を収穫する．変異

locus O）遺伝子の DNA 断片を反応基質として用いて検出を迅速に行うために 4～8 個体のゲノム DNA をま

反応系の最適化を行った．MLO 遺伝子は 7 回膜貫通型

とめた DNA プールを作製し，これを鋳型に任意の遺タンパク質をコードしている（Devoto et al., 1999）．そ伝子領域を PCR により増幅する．その PCR 産物を熱の機能は未だに判明していないが，MLO 遺伝子に変異変性して一本鎖にした後，徐々に冷やして再び二本鎖が入ることでオオムギの重要病害であるオオムギうどに戻すことでヘテロ鎖を形成させる．そこへミスマッ

んこ病菌（Blumeria graminis f. sp. hordei）に対して，レ

チ特異的エンドヌクレアーゼ CEL I を反応させてアガース非特異的な侵入抵抗性が発揮されることが知られロースゲル電気泳動でヘテロ二本鎖の切断の有無を調ている（Jørgensen, 1992）．mlo は変異箇所によって MLO

べ，任意の遺伝子の変異個体の存在を検出する．最終

タンパク質の蓄積量が異なり，オオムギうどんこ病菌

的にそれぞれの個体ごとにシーケンス解析等を行うこに対する抵抗性の強さに違いが見られることが報告さとで，変異個体の単離が可能になる．

れている（Reinstadler et al, 2010）．本研究では，484 番

TILLING における変異の検出には CEL I を用いて行

目のチミン（T）がアデニン（A）に変異している mlo-1

うことが多い．CEL I はセロリ（Apium graveolens）で（T484→A）に加え，mlo-12（C720→A），mlo-13（T89→

発見された，塩基のミスマッチを特異的に認識して切A），mlo-26（T809→A），mlo-27（G953→A），mlo-28（C665

断するエンドヌクレアーゼであり，一塩基多型（SNP）→T），mlo-29（C1001 →T），mlo-41（G626 →A），mlo-42の検出にも使われている．この CEL I を大量に抽出す（C560→T）を解析対象とした．

28

表1

C で 30 分間反応させた後，2%アガロースゲルにロー

本研究に用いた pGEM-MLO プラスミド

プラスミド名mlo 変異箇所

ドして電気泳動し，エチジウムブロマイド（EtBr）溶pGEM-MLO

野生型

液を用いて染色することでミスマッチの切断を確認し

pGEM-mlo-1

T484→A

た．

pGEM-mlo-12

C720→A

pGEM-mlo-13

T89→A

pGEM-mlo-26

T809→A

pGEM-mlo-27

G953→A

pGEM-mlo-28

C665→T

pGEM-mlo-29

C1001→T

pGEM-mlo-41

G626→A

pGEM-mlo-42

C560→T

2. 材料および方法
図2

ヘテロ鎖及びホモ鎖の作製に用いたサイクル

2.1. リコンビナント CEL I タンパク質を用いた塩基のミスマッチの検出
3. 結果

pGEM-MLO 及び pGEM-mlo プラスミド（表 1）をテンプレートに，DNA Polymerase（タカラバイオ株式会

pGEM-MLO 及び pGEM-mlo-1 を鋳型として，MLO

社，Prime STAR Max もしくは TaKaRa Ex Taq）を用いあるいは mlo を増幅し，精製して得られた DNA 断片て PCR を行った．図 3，4 では，プライマーAcs1_MLO-F

を用いて調査した（図 3）．mlo-1 は 484 番目のチミン

及び MLO_Not1-R のセット，図 5，6，7 ではプライマ（T）がアデニン（A）に置換したアレル（T484→A）

ーcaccMLO-F 及び MLOmorex-R のセットを使用したであり，ヘテロ鎖がミスマッチ特異的に切断された場（表 2）．PCR 産物をアガロースゲル電気泳動した後，合 495 bp と 1129 bp のバンドが見られる．リコンビナ目的のバンドを切り出し，FastGene Gel/PCR Extraction

ント CEL I タンパク質を反応させたホモ鎖では MLO 遺（日本ジェネティクス株式会社）を用いて MLO（mlo）

伝子の DNA 断片（1624 bp）だけが見られた．一方，遺伝子の DNA 断片を精製した．サーマルサイクラー

ヘテロ鎖にリコンビナント CEL I タンパク質を反応さ（Gene Touch，日本ジェネティクス株式会社）を用いせると，MLO（mlo）遺伝子の DNA 断片以外に，切断て，図 2 のサイクルで熱変性及びアニーリングを行い，されてできた 2 本のバンドが想定された位置に見られヘテロ鎖及びホモ鎖を作製した．

た（図 3）．そのため，リコンビナント CEL I タンパク

ヘテロ鎖及びホモ鎖をそれぞれ別々の 200 μL チュ

質がミスマッチを特異的に認識して切断するエンドヌーブへ入れた．そこへ 10x CEL I 反応バッファー2 μL，クレアーゼ活性を有することが示された．

リコンビナント CEL I タンパク質を加え，dH2O で全量

次に T→A 以外の塩基置換，及び T484→A 以外の箇を 20 μL にした．10x 反応バッファーの組成は 200 mM

所での T→A 塩基置換の検出が可能かどうかを検証しHEPES pH 7.5，100 mM KCl，30 mM MgCl2 であり，反た（図 4）．作製した pGEM-MLO 及び pGEM-mlo（表 1）

応バッファーの組成の検証の際には，適宜組成を変更

を鋳型に MLO あるいは mlo 断片を増幅し，精製して得して同様の手順でミスマッチ特異的エンドヌクレアー

られた DNA 断片を用いた．リコンビナント CEL I タン

ゼ活性を調査した．サーマルサイクラーを用いて 45°

パク質によって，mlo-12（C720→A）（図 4A），mlo-26（T809→A）（図 4B），mlo-27（G953→A）（図 4B），mlo-28

表2
プライマー

本研究に用いたプライマー（C665→T）（図 4C），mlo-42（C560→T）（図 4D）のヘ配列（5’→3’）

テロ鎖の切断を明確に確認できたが，mlo-29（C1001→T）

caccMLOmorex-F

CACCATGTCGGACAAAAAAGGGGT（図 4C），mlo-41（G626→A）（図 4D）では切断が起こ

MLOmorex-R

TCATCCCTGGCTGAAGGAAAAATCっているように見られるがバンドの検出が難しく，

Ascl_MLO-F

ctaggcgcgccATGTCGGACAAAAAAGGGGT

mlo-13（T89→A）（図 4A）では切断を確認することがMLO_Notl-R

ctagcggccgcTCATCCCTGGCTGAAGGAAAAATC

できなかった．

29

図3

リコンビナント CEL I タンパク質のミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ活性A，本実験に用いた MLO 遺伝子断片の塩基配列． は塩基置換の箇所，矢印の先のアルファベットは変異体の塩基を示す．B，pGEM-MLO 及び pGEM-mlo-1 を鋳型にプライマーAcsl_MLO-F 及び MLO_Not l-R で PCR した後に精製したMLO（mlo-1）断片（1624 bp）を用いた．全量 20 µL の系でリコンビナント CEL I タンパク質を 45℃で 30 分間反応させた．M は分子量マーカー，矢頭は切断された DNA 断片を示す．hm はホモ鎖，ht はヘテロ鎖を示す．

CEL I エンドヌクレアーゼについての報告は複数存

よってヘテロ鎖を切断することができ，その程度に差在するが，CEL I を反応させる際に用いる反応バッフは見られなかった．

ァーの組成は様々である．そこで本研究では，緩衝剤，CEL I 反応バッファー中の KCl 終濃度を 10 mM とし

KCl 濃度，金属イオンについて CEL I 活性が高まる最ている報告（Yang et al., 2000; Pimkin et al., 2007）と，適な反応条件の検討を行った．セロリから粗抽出した

25 mM としている報告（Oleykowski et al., 1998）があ

CEL I を用いる場合，反応バッファー中の緩衝剤としる．最適な KCl 濃度を調査するため，CEL I 反応バッて HEPES が用いられている（Colbert et al., 2001; Till et

ファー中の終濃度を 0 mM，10 mM，25 mM，50 mM，al., 2004; Till et al., 2006; Zolala et al., 2009; Jiang et al.,

100 mM にして，リコンビナント CEL I タンパク質のミ

2013）．一方，ゲルろ過精製した CEL I やリコンビナン

スマッチ特異的エンドヌクレアーゼ活性を調査した

ト CEL I タンパク質では，反応バッファーの緩衝剤と（図 6）．本研究では KCl 濃度 50 mM を含むホモ鎖断して Tris が用いられることがある（Oleykowski et al.,

片及びヘテロ鎖断片の溶液をそれぞれ 2 μL 用いたた

1998）．我々が以前作製したリコンビナント CEL I タン

め，リコンビナント CEL I タンパク質反応系全体としパク質の反応において，両者の間に違いが見られるかての KCl 濃度は，それぞれ 5 mM，14 mM，27.5 mM，否かを調査した（図 5，6，7）．結果として，いずれの50 mM，95 mM となっている．CEL I 反応バッファー

緩衝剤を用いてもリコンビナント CEL I タンパク質に中の KCl 濃度が 25 mM 及び 50 mM，すなわち，反応

30

図4

リコンビナント CEL I タンパク質を用いた様々な塩基置換の検出

pGEM-MLO 及び pGEM-mlo を鋳型にプライマーAscl_MLO-F 及び MLO-Notl-R を用いて PCR した後に精製した MLO（mlo）
断片（1624 bp）を使用し，全量 20 µL の系でリコンビナント CEL I タンパク質を 45℃，30 分間反応させた．A，ミスマッチ箇所で切断された場合，mlo-12 は 731 bp と 893 bp，mlo-13 は 100 bp と 1524 bp のバンドが見られる．B，ミスマッチ箇所で切断された場合，mlo-26 は 820 bp と 804 bp，mlo-27 は 964 bp と 660 bp のバンドが見られる。C，ミスマッチ箇所で切断された場合，mlo-28 は 676 bp と 948 bp，mlo-29 は 1012 bp と 612 bp のバンドが見られる．D，ミスマッチ箇所で切断された場
合，mlo-41 は 637 bp と 987 bp，mlo-42 は 571 bp と 1053 bp のバンドが見られるようになる．M は分子量マーカー，矢頭は切断された DNA 断片を示す．hm はホモ鎖，ht はヘテロ鎖を示す．

図5

リコンビナント CEL I タンパク質の反応バッファーにおける緩衝剤の検証

pGEM-MLO 及び pGEM-mlo-1 を鋳型にプライマーcaccMLO-F 及びMLOmorex-R を用いて，PCR した後に精製した MLO（mlo-1）断片（1606 bp）を使用した．ヘテロ鎖及びホモ鎖 2 µL，1×PCR buffer 8 µLに CEL I 反応バッファー（20 mM HEPES pH 7.5/20 mM Tris-HCl pH
7.5，10 mM KCl，3 mM MgCl2）を 2 µL 加え，全量 20 µL の系でリコンビナント CEL I タンパク質を 45℃，30 分間反応させた．M は
分子量マーカー，矢頭は切断された DNA 断片を示す．hm はホモ鎖，
ht はヘテロ鎖を示す．

図6

リコンビナント CEL I タンパク質の反応バッファーにおける KCl 濃度の検証

pGEM-MLO 及び pGEM-mlo-1 を鋳型にプライマーcaccMLO-F 及びMLOmorex-R を用いて，PCR した後に精製した MLO（mlo-1）断片（1606 bp）を使用した．A，HEPES バッファー及び B，Tris バッフ
ァー．ヘテロ鎖及びホモ鎖 2 µL，1×PCR buffer 8 µL に CEL I 反応バッファー中の HEPES 及び Tris の終濃度を 20 mM に MgCl2 の終濃度を 3 mM，KCl の終濃度を 0，10，25，50，100 mM として，全量 20µL の系でリコンビナント CEL I タンパク質を 45℃，30 分間反応させた．M は分子量マーカー，矢頭は切断された DNA 断片を示す．
hm はホモ鎖，ht はヘテロ鎖を示す．

系全体の KCl 濃度が 27.5 mM 及び 50 mM でヘテロ鎖の切断が明確に見られた．
セロリ由来の CEL II は，CEL I 同様ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼであり，反応バッファー中の金属イオンを Ca2+や Sr2+に替えることで活性が上昇する
ことが報告されている（Mon et al., 2013）．ことが報告されている（Mon et al., 2013）．そこで，反応バッファ
ー中の金属イオンとして Mg2+，Ca2+，Sr2+を用いて，

31

きた G→A の変異や mlo-28 と mlo-42 で検出できた
C→T の変異を，それぞれ同じ塩基置換を有する mlo-41，
mlo-29 で検出することは難しかった．そのため，塩基置換の周辺の配列がリコンビナント CEL I タンパク質の活性に影響を与える可能性が考えられた．また，
mlo-13（T98→A）ではミスマッチの切断を確認することができなかった．mlo-13 は変異箇所で切断された場
合にできる断片がおおよそ 100 bp 及び 1500 bp であり，
図7

リコンビナント CEL I タンパク質の反応バッファーに

100 bp ほどの短い断片を検出するために，より多くのおける金属イオンの検証

切断された DNA 断片が必要である．1500 bp 付近のバ

pGEM-MLO 及び pGEM-mlo-1 を鋳型にプライマーcaccMLO-F 及びMLOmorex-R を用いて，PCR した後に精製した MLO（mlo-1）断片（1606 bp）を使用した．ヘテロ鎖及びホモ鎖 2 µL，10×CEL I 反応
バッファー（200 mM HEPES pH 7.5/200 mM Tris-HCl pH 7.5，500 mM
KCl，30 mM MgCl2，CaCl2，SrCl2）2 µL 加え，全量 20 µL の系でリコンビナント CEL I タンパク質を 45℃，30 分間反応させた．M は
分子量マーカー，矢頭は切断された DNA 断片を示す．hm はホモ鎖，
ht はヘテロ鎖を示す．

ンドは切断前の DNA 断片の近傍にあるために，確認が難しかったと考えられる．これらを検出するためには反応条件だけでなく，アガロースゲル電気泳動の条件を検討する必要があるだろう．
最適な CEL I 反応バッファーについて検討するために，緩衝剤の種類，KCl 濃度，金属イオンの種類について調査した（図 5，6，7）．CEL I 反応バッファーのそれぞれで CEL I のミスマッチ特異的エンドヌクレア

緩衝剤として HEPES と Tris を比較したが，両者の間にーゼ活性を調査した（図 7）．その結果，全ての条件に明確な差は見られなかった（図 5，6，7）．一般的に，

おいてエンドヌクレアーゼ活性を示したことから，反HEPES は pH 6.8～8.2 の範囲で緩衝能があり，Tris は

応バッファー中の金属イオンの種類によって，CEL I

pH 7.2～9.2 の範囲で有効な緩衝能を発揮することが知活性に明確な差が生じないことが示唆された．

られている．両方の緩衝能がある範囲に CEL I が高い

4．考察活性を示す pH の範囲が収まっている（Kulinski et al.,2000）ことから，リコンビナント CEL I タンパク質の種々の変異を持つ MLO 遺伝子領域の DNA 断片を用活性に違いが見られなかったと考えられる．リコンビ

いることで，リコンビナント CEL I タンパク質がミス

ナント CEL I タンパク質の反応系における最適な KCl

マッチ特異的エンドヌクレアーゼ活性を有することが終濃度について調査した結果，25 mM 及び 50 mM で特強く示唆された（図 3，4）．しかしながら，リコンビに活性が見られることが明らかになった（図 6）．それナント CEL I タンパク質を反応させるとホモ鎖，ヘテよりも多い 100 mM では，反応液中の KCl 濃度が過剰

ロ鎖に関わらず非特異的な切断によるスメアが見られとなり，リコンビナント CEL I タンパク質の活性が阻た．そのため，切断された DNA 断片のバンドを検出

害され，切断しづらくなったと考えられる．一方，0 mM，できず，変異を見逃してしまう恐れがある．さらに，

10 mM では KCl 濃度が低すぎるため，リコンビナント

本実験では MLO と mlo-1 の DNA 断片を 1：1 の割合で

CEL I タンパク質の特異性が低くなり，切断された断混合して作製したヘテロ鎖を用いているが，実際の片が見づらく，スメアが見られるようになったと考え

TILLING では 4 系統ごとにゲノム DNA を混合する予られる．KCl 終濃度は，CEL I 反応系に入れる PCR 産定であり，多くても 3:1 の割合でしか変異が含まれな物の量によって若干変化してしまう．例えば，CEL I

いため，本実験よりも少ない割合の変異を検出する必反応バッファー中の KCl 終濃度を 10 mM にして全量要がある．そのため CEL I 反応バッファーや CEL I タ

20 μL の反応系にしたところに，KCl 濃度 50 mM の PCR

ンパク質の量などの反応条件をさらに最適化する必要

産物が 10 μL 入ると，KCl 終濃度は 30 mM となる．一がある．

方で PCR 産物が 2 μL 入ると，KCl 終濃度は 14 mM と484

→A）以外の塩基置換や，置換箇所が異なる．そのため，実際に TILLING を行う際は，任意のなる mlo アレルを用いて，リコンビナント CEL I タン

遺伝子領域を安定的に増幅し，CEL I 反応系に入れる

パク質の活性についてさらに調査した．その結果 T→APCR 産物の量をなるべく一定にして，反応系全体のだけでなく，G→A，C→T の塩基置換を検出できるこ

KCl 終濃度を 27.5 mM から 50 mM の間に収まるようにとが明らかになった（図 4）．しかし，mlo-27 で検出でする必要がある．CEL I 反応バッファーの 2 価の金属

mlo-1（T32

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イオンを Mg2+から Ca2+及び Sr2+に替えて，リコンビナ
ント CEL I タンパク質を反応させたが，活性に違いは見られなかった（図 7）．本研究では CEL I 反応バッフ
ァーにおける金属イオンの最適濃度については検証していない．しかし，膨大な量の集団の中から迅速かつ正確に変異個体を特定するためには最適な反応系を構築することが必須であるため，金属イオンの最適濃度についても今後検証を行う．

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