細胞周期 G2/M 期移行に対する植物ホルモン、オーキシンの働き
Involvement of auxin in cell cycle control during the G2/M phase.

研究代表者

名古屋大学大学院生命農学研究科助教授

伊藤正樹

Department of Regulation of Biological Signals, Graduate School of
Bioagricultural Sciences, Nagoya University, Associate Professor, Masaki Ito

オーキシンは古くから知られる植物ホルモンの一種で、植物細胞の増殖に極めて重要な働きをすることが知られていた。しかし、オーキシンがどのような分子メカニズムによって植物細胞の増殖を制御しているのかについては、ほとんど明らかにされていない。近年、モデル植物であるシロイヌナズナを使った分子遺伝学からオーキシン信号伝達に関わるいくつかの因子が同定された。このようなオーキシン信号伝達に関わる因子をコードする遺伝子の発現に、細胞周期中の分裂期（M 期）で特異的に起きる遺伝子発現制御が関与している可能性を発見した。このことは、オーキシンの信号伝達の一部が分裂期に特異的に活性化することを示唆している。本研究ではこの仮説を検証することにより、オーキシンと増殖を結ぶ分子機構の解明を試みた。
その結果オーキシン誘導的転写に働く因子の一部が M 期依存的制御を受けていることを示した。

Auxin is one of the most important plant hormones that promote proliferation of plant cells in vitro.
Despite a great effort, the mechanisms of auxin action have not been uncovered. Recently, moleculargenetics has identified several genes involved in auxin signaling in Arabidopsis. We found that someof such genes contained promoter motif that is known to direct G2/M phase-specific transcription.
This finding suggested interaction between auxin signaling and transcriptional regulation at theG2/M phase in the cell cycle. We tested promoter activities of these genes during the cell cycle,
and showed that some of them are actually regulated during the cell cycle.

1. 研究目的

NtmybB）のうち NtmybA1 と NtmybA2 は MSA エ

高等植物の細胞周期中で G2/M 期に特異的に発現すレメントに結合し転写を活性化するように働くが、る遺伝子群が知られている。サイクリン B 遺伝子

NtmybB は転写活性化能を持たず、 MSA エレメンなどがこれに含まれるが、これら G2/M 期特異的遺トへの競合的な結合により NtmybA1, NtmybA2 によ伝子のプロモーター領域には共通のシスエレメントる活性化を抑制する転写抑制因子であることがわか(MSA エレメント )が存在し、このエレメントに結っている。これまでに調べた G2/M 期特異的遺伝子合する c-Myb 様の転写因子群の働きによって G2/Mのほとんどのものに、この MSA エレメントが繰り期特異的転写が実現されている。タバコから単離さ返し存在する。そこで、G2/M 期遺伝子の網羅的同れた 3 種類の c-Myb 様転写因子（Ntmyb A1, NtmybA2,定を目指して、全ゲノムの配列が決定されたシロイ

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ヌナズナのゲノム情報を利用し検索を行い、遺伝子ンに応答して転写誘導されることが知られている上流域に MSA エレメントが複数繰り返し存在してAux/IAAファミリーのひとつIAA14が含まれていた。

いる遺伝子群を抽出した。抽出された遺伝子群にはMSA エレメントとオーキシン関連遺伝子の関係が示

M 期に機能を持つと考えられる遺伝子が多数含ま唆されたので、さらにオーキシン関連遺伝群のプロれていたが、興味深いことに植物ホルモンの一つでモーター領域の塩基配列を詳細に検討した。その結あるオーキシンのシグナル伝達に関わる遺伝子群が果、上記の遺伝子に加え、オーキシンの受容体と推含まれていた。オーキシンは植物細胞の増殖を強力定されている ABP1、AXR1 に相同な遺伝子（AXR1L）、に促進する働きを持つことが知られている。植物のAXR1 と複合体形成する ECR1、AXR1 と同様のタンパ

一部を切り取りオーキシンで処理すると未分化細胞ク質分解系に働くと考えられている RCE1（ユビキからなるカルスが形成され、また植物細胞の液体培チン付加酵素）の他、Aux/IAA ファミリー遺伝子の養には必須な成分である。しかしながら、オーキシ

IAA5 と IAA17、オーキシン誘導的転写に働く転写因ンが細胞周期中のどの時期にどのようなメカニズム子ファミリー（ARFファミリー）に属するARF9とARF9で作用するのかは全く不明であった。オーキシン関に構造的に類似する二つの遺伝子（ここではARF9L1,連遺伝子の上流域に MSA 様の配列が存在するといARF9L2 と呼ぶ）が新たに同定された。

う発見は、オーキシン信号伝達の少なくとも一部がG2/M 期に活性化されることを示唆している。本研

2.2 転写開始点の決定

究では MSA 様の配列が存在するオーキシン関連遺MSA エレメントにより G2/M 期特異的な転写制御を伝子のプロモーターを解析することにより、上記の受けている遺伝子は、上流域の転写開始点近傍に仮説の検証を行った。

MSA エレメントが存在する。これまで調べた中では例外なく転写開始点より上流-500 以内に存在して2. 研究経過いた。したがって MSA エレメントが働くには特定の2.1 遺伝子上流域に MSA エレメントをもつ遺伝子プロモーター中の位置に存在する必要があると考えの同定られる。そこで上記のオーキシン関連遺伝子群のプこれまでの私たちの研究から、細胞周期中で G2/Mロモーターがこの条件を満たすかどうかを検討する

期に発現する遺伝子の多くはプロモーター領域にため、転写開始点の決定を行った。オリゴキャッピ

MSA エレメントが複数回繰り返し存在することを明ング法と 5’ RACE 法を用いて得られた cDNA 断片のらかにしていた。そこで同様の制御を受け G2/M 期

塩基配列を決定することにより転写開始点を特定しに発現する遺伝子の網羅的同定を目的に全塩基配列た（Figure 1）。その結果、ユビキチンタンパク質が決定されたシロイヌナズナのゲノム情報を用い解分解系に関わる遺伝子群（AXR1、AXR1L、ABP1、ECR1、析を行った。遺伝子の上領域に繰り返し MSA エレメ

RCE1、TIR1）では、MSA エレメントが転写開始点かントをもつ遺伝子群を抽出した結果、G2/M 期に機ら 500 bp 以上離れて存在することがわかり、これ能を持つと考えられる cdc20 様の遺伝子、サイクリら遺伝子のプロモーターの働きが G2/M 期依存的にン B 遺伝子などの他、オーキシン信号伝達に必要な制御されている可能性はきわめて低いと判断し、以タンパク質分解系に働くとされている AXR1（ユビ下の解析からこれらの遺伝子を除外した。一方、オキチン活性化酵素）、TIR1（ユビキチンリガーゼ複ーキシン誘導的に発現する Aux/IAA ファミリーに属合体を構成する F ボックスタンパク質）やオーキシする遺伝子（IAA5、IAA14、IAA17）やオーキシン誘2

導的転写に関わる転写因子 ARF ファミリーの遺伝子伝子（LUC）を用いた。IAA5、IAA14、IAA17、ARF9、（ARF9、ARF9L1、ARF9L2）のプロモーターでは、決ARF9L1、ARF9L2 の遺伝子上流域約 1 kb を LUC の上定した転写開始点のごく近傍に MSA エレメントが存流につなぎ、アグロバクテリアを介したバイナリー在していたため、これら以降の研究に用いた（Figre法によりタバコ培養細胞 BY2 に導入した。得られた1）。

形質転換 BY2 に DNA 合成阻害剤であるアフィディコリンを用いた方法により同調培養を誘導した。24時間のアフィディコリン処理により細胞は S 期直前に蓄積し、アフィディコリンを除去すると阻害が解除され同調的に S 期→G2 期→M 期→G1 期と細胞周期が進行する。アフィディコリン除去後、1 時間ごとに細胞を収穫し、分裂指数（mitotic index）とLUC 活性を決定し、細胞周期中の変化を求めた。分裂指数のピークは同調培養開始後 6-7 時間目に見られこの時期に細胞が M 期にあることを示した。コントロールとして用いたサイクリン B−LUC の形質転換体では 5-9 時間目に LUC 活性の上昇が見られた。
これは G2/M 期特異的なサイクリン B 遺伝子プロモーターの働きを反映する結果である。ARF9、ARF9L1、
ARF9L2 の場合にはいずれもサイクリン B と似かよった LUC 活性の変動パターンを示した。また IAA17も同様の変動を示したが IAA5、IAA17 ではパターンは顕著に異なっており、LUC 活性の大きな変動は認められなかった（データは示していない）。これらの結果は ARF9、ARF9L1、ARF9L2、IAA17 が MSA エレ
メントを介した G2/M 期特異的転写制御を受けていFigure 1. Position and orientation of
MSA-like motifs in promoter regions ofArabidopsis genes involved in auxin
signaling. MSA-like motifs are shown astriangles. Transcription start sites areindicated by +1. Hatched boxes show theprotein cording regions.

ることを示している。

2.4 まとめ
MSA エレメントの存在を指標に解析を進めた結果、オーキシン誘導的転写に働く ARF ファミリーに属する遺伝子、ARF9、ARF9L1、ARF9L2

2.3 プロモーター活性の細胞周期依存性が細胞周期中でG2/M 期特異的な転写制御を受けていることが明ら

転写開始点近傍に複数回繰り返し MSA エレメントがかになった。これら 3 つの因子は ARF ファミリーの存在することが明らかになった上記のオーキシン関

中でも、構造的にお互いに類似した因子群であるこ連遺伝子について、遺伝子上流域のプロモーター活性が細胞周期中でどのように変化するのかを調べた。
レポーター遺伝子としてホタルのルシフェラーゼ遺3とがわかった。

3. 研究成果が見いだされると期待される。

オーキシン作用に関するこれまでの考えはオーキシン→細胞増殖というように、オーキシン信号が常に

5. 発表論文

上流に位置し、下流の事象として存在する細胞増殖

Cell-cycleを制御するというものであった。この研究は ARF フ

response factor 9 gene and two relatedァミリーの一部が G2/M 期特異的に働くことを示唆

genes. (投稿準備中)するものであり、これによりオーキシンが遺伝子発現を制御する仕組み自体が細胞周期制御されている可能性を示した。つまり、細胞周期→オーキシン信号伝達という経路の存在を示唆しており、オーキシンと細胞増殖の関係を一方向的なものではなく、双方向的なものであることを指示している。

4. 今後の課題と発展
オーキシンは細胞増殖の促進の他、重力屈性、頂芽優性、細胞分化など多面的な作用を持つ極めて重要な植物ホルモンである。このオーキシンはおそらく受容体、その後の情報伝達を経て最終的には遺伝子発現を変化させることにより作用すると考えられている。この遺伝子発現の制御に重要な働きをすると考えられているのが ARF ファミリー因子群である。
ARF ファミリーの因子はオーキシン応答配列 AuxREに結合することにより遺伝子の転写を活性化、あるいは抑制する。シロイヌナズナでは ARF ファミリーは 23 個の遺伝子からなるが、本研究により G2/M 期依存的制御を受けていることが明らかにされたのはARF9とそれによく類似する2つの遺伝子であった。
分子系統樹上では ARF9 を含むこれら 3 個の遺伝子は独立した枝を構成することから、これらは共通の機能を持ち、他の ARF ファミリーの遺伝子とは異なる働きを持つと推定される。これら ARF9 サブファミリー遺伝子が共通に MSA エレメントによる細胞周期制御を受けていることから、オーキシンと細胞増殖を繋ぐ特有の機能を担っていると推定できる。これら ARF9 サブファミリーの働きを明らかにすれば、オーキシンによる細胞増殖制御のメカニズムの糸口

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