厚生労働科学研究費補助金	
 	
 地球規模保健課題解決推進のための研究事業	
 （H25-地球規模-指定-008）	
 	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築	
 に関する研究	 平成 25,26 年度	
  総合研究報告書	
 研究代表者	
  新見伸吾	 	 平成 27(2015)年 3 月

平成 25,26 年度	
  厚生労働科学研究費補助金	
 地球規模保健課題解決推進のための研究事業（H25-地球規模-指定-008）	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究目	
  次Ⅰ．総合総括研究報告書	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（新見伸吾）	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 #	
 
	
 
	
 
Ⅱ．総合分担研究報告書	 (1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究（中岡竜介）	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に	 	  	 関する研究（大熊一夫）	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究（蓜島由二）	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
	
 
	
 
Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料	
 (1)一覧表	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(2)セラミックス,48(10):819-823	
 (2013)	
 	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(3)Dental	
 Materials	
 Journal,32:959-969	
 (2013)	
 	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(4)Orthod	
 Waves,72:77-85	
 (2013)	
 	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(5)Orthod	
 Waves,	
 72:87-98	
 (2013)	
 	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(6)Dental	
 Materials	
 Journal,33:422-429	
 (2014)	
 	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(7)J.	 Electr.	
 Electron	
 Syst.,	
 3:118	 (2014)	
 	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(8)J.	 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:721-728	
 (2014)	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  ##	
 
(9)J.	 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:1809-1816	
 (2014)	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(10)生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バイオマテリアル	
 
	
  	
 	
 の設計・開発戦略	
  	
  	
 	
 	
 	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(11)バイオマテリアル−生体材料,33(1):56-63	
 (2015)	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 ##	
 
(12)J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.,	
 in	
 press	 (2015)	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
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研究班名簿	
 
	
 
	
 
	
 
研究代表者：新見伸吾	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 	
 研究分担者：蓜島由二	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  中岡竜介	  国立医薬品食品衛生研究所	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  大熊一夫	
  日本歯科大学	
 	
 研究協力者：	 野村祐介	
  	  国立医薬品食品衛生研究所	
 

山﨑佳世	
  	
  民生科学協会	
 

福井千恵	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

新藤智子	
  	
  食品薬品安全センター	
 

小園	
  知	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

神谷正己	
  	
  日本画像医療システム工業会	
 

河上強志	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

野田	
  穆	
  	
  日本歯科商工協会	
 伊佐間和郎	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

鈴木数広	
  	
  日本医療機器テクノロジー協会	
 

吉田	
  緑	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

中村義一	
  	
  株式会社リボミック	
 

井上	
  薫	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

宮川	
  伸	
  	
  株式会社リボミック	
 

森川朋美	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

金	
  	
  玲	
  	
  株式会社リボミック	
 

市村亮平	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

柚場俊康	
  	
  川澄化学工業株式会社	
 

前田	
  潤	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

坂口圭介	
  	
  テルモ株式会社	
 

高橋美和	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

谷川隆洋	
  	
  テルモ株式会社	 小川久美子	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

杉山知子	
  	
  テルモ株式会社	
 

熊田秀文	
  	
  神奈川歯科大学	
 

犬飼香織	
  	
  テルモ株式会社	
 

浜田信城	
  	
  神奈川歯科大学	
 竹ノ内美香	
  テルモ株式会社	
 

藤澤彩乃	
  	
  東京大学	
 

蛯原善則	
  	
 	
 株式会社ジーシー	
 

鄭	
  雄一	
  	
  東京大学	 Somchai	
 Urapepon	  マヒドン大学	
 	 Ⅰ．総合総括研究報告書

	 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究	
 
	
 
新見伸吾	
 
国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 総合総括研究報告書
平成 25,26 年度厚生科学研究費補助金/地球規模保健課題解決推進のための研究事業	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25-地球規模-指定-008）	
 	
 研究代表者	
  	
  新見	
 伸吾	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 研究分担者	
  	
  蓜島	
 由二	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  中岡	
 竜介	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  大熊	
 一夫	
  	
  日本歯科大学新潟生命歯学部歯科理工学講座	
 	
 研究協力者	
 野村祐介	  	  国立医薬品食品衛生研究所	
 
福井千恵	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
小園	
  知	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
河上強志	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 伊佐間和郎	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
吉田	
  緑	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
井上	
  薫	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
森川朋美	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
市村亮平	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
前田	
  潤	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
高橋美和	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 小川久美子	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
熊田秀文	
  	
  神奈川歯科大学	
 
浜田信城	
  	
  神奈川歯科大学	
 
藤澤彩乃	
  	
  東京大学	
 
鄭	
  雄一	
  	
  東京大学	
 

	
 

山﨑佳世	
  	
  民生科学協会	
 
新藤智子	
  	
  食品薬品安全センター	
 
神谷正己	
  	
  日本画像医療システム工業会	
 
野田	
  穆	
  	
  日本歯科商工協会	
 
鈴木数広	
  	
  日本医療機器テクノロジー協会	
 
中村義一	
  	
  株式会社リボミック	
 
宮川	
  伸	
  	
  株式会社リボミック	
 
金	
  	
  玲	
  	
  株式会社リボミック	
 
柚場俊康	
  	
  川澄化学工業株式会社	
 
坂口圭介	
  	
  テルモ株式会社	
 
谷川隆洋	
  	
  テルモ株式会社	
 
杉山知子	
  	
  テルモ株式会社	
 
犬飼香織	
  	
  テルモ株式会社	 竹ノ内美香	
  テルモ株式会社	
 
蛯原善則	
  	
 	
 株式会社ジーシー	
 Somchai	
 Urapepon	  マヒドン大学	
 	
 A.研究要旨	 	  本研究では、「国際標準化機構（ISO）及び国際電気標準会議（IEC）における医療機器の各種国際規格の策定に関する研究（H23-地球規模-指定-003）」において策定した「医療機器規格・基準の国際標準化戦略に係る政策的提言」を具体的に実行する体制の構築に資する施策として、幾つかの ISO/TC の活動をサポートする窓口を試験的に開設し、その実用可能性を検証すると共に、国際標準に関する世界情勢を周知する啓蒙活動を行った。また、新規規格の提案や国際規格の改定作業を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集することを目的として、材料開発分野、試験法分野及び歯科分野においてケーススタディを実施した。	
 	
  国際標準化戦略窓口の試験的設立については、「再生医療等製品」及び「医療機器ソフトウェア」の国
際標準化活動を行っている ISO/IEC の TC 国内委員会等に参加して情報収集を行い、それらの活動状況を取りまとめた。収集した情報は、医療機器部サーバー内にホームページを開設して可能な限り一般に発信した。初年度に実施したアンケート調査の結果、医療機器分野の国際標準化活発化のためには、企業上層部を中心に医療機器関連企業の意識改革を目的とした啓蒙活動を行う必要が明らかになったことから、講演会の開催や各種発表を通じて医療機器の国際標準化の重要性を可能な限り周知した。	
 	
  試験法分野のケーススタディでは、ISO/TC194/WG9 において実施されている溶血性試験国際ラウンドロ
ビンテストを支援するため、2 種類の弱陽性対照材料 Genapol	
 X-080 含有 PVC シート（Y-2,	
 Y-3）をミニ試験及び本試験用標準品として提供した。Y-2 及び Y-3 は本試験においても良好な溶血特性を示し、その性能が世界的に確認されたことから、今後、ISO/TC194/WG12 に国際標準品として新規提案する。	
 	
  材料開発分野におけるケーススタディでは、ISO/TC194/WG11 における代替可塑剤の安全性評価に関する規格作成に対応するため、我が国が開発を進めている新規血液バッグの代替可塑剤である DOTP のラッ
ト亜慢性毒性試験を実施した。その結果、DOTP はいずれの臓器に対しても顕著な影響を与えず、その無毒性量は 300	
 mg/kg	 body	
 weight/day 以上と判定された。また、機能性蛋白質を選択的に捕捉する RNA

アプタマーを用いた革新的医用材料の開発に関するケーススタディにおいて、bFGF 捕捉型 RNA アプタマー（1p01）固定化表面は細胞増殖促進機能を有することが確認されたことから、RNA アプタマーを利用することにより、医用材料に意図した機能を付与できることが明らかとなった。また、BMP2 捕捉型 RNA ア
プタマー候補の選定を行った結果、B10 と B24 が有力な候補となることが判明した。	
 	
  歯科分野におけるケーススタディでは、歯科用 CAD/CAM に関する規格を ISO/TC106/SC9 に日本から新規提案し、CD 化に至るまでの情報を収集した。平成 26 年 9 月に開催された ISO/TC106/SC9/WG5	
 ベルリ
ン会議では、Convener として、5 ヵ国によるインターラボラトリーテストの結果報告及び各国から提出されたコメントに対応した。また、本 CD に新たな CMM 及びソフトウェアを追加することが提案され、2nd	
 CD へステージアップした。	
 B.研究目的	 	  近年、国際市場の拡大に伴い、医療機器に関する各国の法規制を整合化する動きが活発化している。
IMDRF ではグローバルな整合作業が進められており、その他、ISO や IEC では医療機器の性能や試験法等、有効性と安全性に関する各種規格・基準の国際整合化が行われている。医療機器については、品質維持の観点から国内法規への適合が求められると共に、主に通商上の観点から国際規格への適合も要求される。すなわち、我が国の優れた製品を世界的に流通させるためには、日本の国内法規における要求事項を反映した国際規格を作成し、運用することが最適と言える。また、日本は医療機器開発において先進的な技術力を持つことから、国際的な優位性を確立することが可能な状況にある。例えば、製品や材料の性能評価等に関する技術については、差別化による高付加価値化を狙い、新たな市場を開拓していく
ことが重要である。このため、研究開発段階から標準化を視野に入れたプロジェクトを推進すると共に、国際標準策定に必要なデータ取得、ラウンドロビンテスト等を産業界と一体となり推進することが必要
である。	
 
	
  医療機器産業は急成長しており、世界的競争が激化しているが、国内で使用されている医療機器は輸入が年々拡大している。2010 年では 0.6 兆円の貿易赤字となっているのが現状であり、日本のモノづくりの力が生かされていない。米国・FDA/ANSI、ドイツ・DIN、フランス・AFNOR、英国・BSI 等、主要国には国内・国際規格に関与する国家機関が存在し、基礎データの収集や保持も行っている。日本にはJISC/JSA があるが、諸外国の関連機関と比較して実質的に対等の機能を果たしていないと思われる。また、デファクト標準に頼っていた我が国の医療機器関連企業はデジュール標準の時代が到来していることを認識する必要がある等、我が国における国際標準化に係る環境や意識は他国と比較して立ち後れているのが現状である（図 1）。	
 	
  このような背景の中、現在までに国内の医療機器の評価手法、必要な基準の策定、国際的な整合等に関する研究や活動は行われてきているが、日本発の良質な医療機器を障壁なく国際的に進出させる環境を整備する戦略的な研究は実施されていなかったため、平成 23,24 年度厚生労働科学研究費補助金（地球規模保健課題推進）研究事業「国際標準化機構（ISO）及び国際電気標準会議（IEC）における医療機
器の各種国際規格の策定に関する研究（H23-地球規模-指定-003）」において、国際的に提案できる基準の選別や原案策定過程への提案を含めて、国際標準化活動を国家的にサポートする体制の構築や戦略的な考え方等を取りまとめた「医療機器規格・基準の国際標準化戦略に係る政策的提言」を策定した。	
 本研究では、この政策的提言を具体的に実行する体制の構築に資する施策として、幾つかの ISO/TC の活動をサポートする窓口を試験的に開設し、その実用可能性を検証すると共に、国際標準に関する世界情勢を周知する啓蒙活動を行った。また、新規規格の提案や国際規格の改定作業を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集することを目的として、材料開発分野、試験法分野及び歯科分野においてケーススタディを立ち上げ、検証データ等を収集した（図 1）。	
 
	
  本研究においては、以下に示した 3 件の分担研究課題を実施した。各課題の方法、結果及び考察の詳細については該当する分担研究報告書、図表については平成 25 年度及び平成 26 年度総括・分担研究報
告書を参照していただきたい。	
 	 <サポート窓口の開設と啓蒙活動>	
 ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究（中岡、蓜島）	 <歯科分野ケーススタディ>	
 歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究（大熊）	
 	
 <試験法･材料開発分野ケーススタディ>	
 医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究（蓜島）	
 	
 C.研究方法	 (1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究	
 1-1.ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 	
  本研究における調査対象として、医薬品医療機器法の施行により医薬品、医療機器と並んで個別分野となる「再生医療等製品」と、Stand	
 alone 製品であっても医療機器として扱われることになる「医療機器ソフトウェア」を選択した。その後、それぞれの分野における国際標準化活動を行っている ISO/IECの TC の国内審議団体を介してそれぞれの国内委員会に委員、オブザーバー等で参加し、情報収集を行っ
た。	
 
	
 
1-2.国際標準化に対する医療機器関連企業の意識調査及び啓蒙活動	
 	
  平成 25 年度は、（一社）日本画像医療システム工業会、（一社）日本歯科商工協会及び（一社）日本医療機器テクノロジー協会の協力を得て、医療機器関連企業を対象とした意識調査をアンケート形式で行い、その結果から企業における国際標準化活動の現状把握と考察を行った。	
 	
  平成 26 年度は、初年度のアンケート結果から、改めて必要と判断された啓蒙活動の一環として、本事業の紹介と医療機器分野における国際標準化の重要性に関する講演や医療機器関連単行本や学会誌への総説・解説等の寄稿を行った。	
 	 (2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	
 2-1.インターラボラトリーテスト	 	  新規規格に記載した寸法の 1 級インレー用、2 級インレー用、クラウン用及びブリッジ用金型から三次元データを取得し、切削用三次元データに変換し、半焼結ジルコニアセラミックブロックから CAD/CAM
マシンを用いて修復物を作製した。作製した修復物を金型に装着し、金型と修復物の変位量を測定し、修復物の精度の評価を行った。	
 	
 2-2.測定のための印記	 	
  最初の測定点を 0°とし、修復物と金型との変位量を測定した。同様に、45°、90°、135°、180°、
225°、270°、315°毎に試料を回転させ、計 8 点における修復物と金型との変位量を測定した。	
 	
 2-3.CAD/CAM 材料の被切削面	
 	
  ジルコニア未焼結の加工は Dry 条件下、加工ピッチ 0.1mm、仕上げ代 0.1mm、ジルコニア用ダイヤコー
ト、送り速度 500mm/min、工具回転数 2500min-1 で行い、ジルコニア本焼結、コンポジットレジン及びチタンにおいても同一の加工条件で切削した。加工状態は被切削面を観察することにより評価した。	
 	
 2-4.ISO/TC106/SC9/WG5 ベルリン会議	
  	
  	
 
	
  WG5（Machined	
 devices）に Convener として出席し、日本からの新規提案規格である「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-	
 aided	 milling	
 machine	 – Test	 methods」について討議した。	
 	 (3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 3-1.ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	
 3-1-1.溶血性試験用弱陽性対照材料の調製と溶血性試験ラウンドロビンテスト	 	  100 パーツの PVC に対して、DEHP	
 55 パーツ、ESBO	
 8 パーツ、ステアリン酸カルシウム及びステアリン
酸亜鉛 0.05 パーツのほか、1.0 及び 1.5 パーツの Genapol	
 X-080 を含有する 2 種類の可塑化 PVC パウダ
ーを調製した。Genapol	
 X-080 含有 PVC シート（Y-2 及び Y-3：厚さ 0.4	 mm）は同パウダーを利用してヒートプレス法（180℃）により作製し、本試験用標準品として WG9 に提供した。	
 ISO/TC194/WG9 から配布された 6 種類（Polyethylene:	
 PE,	
 Nitrile	 glove:	 NG,	
 Latex	 glove:	 LG,	
 Buna	 

rubber:	
 BR,	
 Y-2,	 Y-3）の材料を使用した。各試験法のインキュベーション時間は、ラウンドロビンテ
スト用プロトコルに従い、ASTM 法（直接接触及び抽出液法）：3 時間、NIH 法（直接接触法）：1 時間、MHLW
法（抽出液法）：4 時間とした。血液試料としては、ウサギ血液及びヒト血液を使用した。国内からは、テルモ株式会社と食品薬品安全センターの 2 施設が参画し、それぞれ独立して試験を実施した。なお、海外からは 11 施設が参画した。	
 	
 3-1-2.倫理面への配慮	 	
  動物血液の採取については、所属機関が規定する動物実験指針に従い、動物に対する苦痛が最小となるよう務めた（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団/動物実験実施施設認証認定番号：食品薬品安全センター/12-005、テルモ/12-030）。動物実験にあたっては、動物実験倫理委員会の承認を得て実施した（食品薬品安全センター/承認番号 1120331A	
 ・114002A、テルモ/承認番号 120163・140070）。食品薬品
安全センターにおいて実施したヒト血液を使用した試験は同センター倫理審査委員会の承認を得て行った（承認番号：H2014-01A）。テルモはヒト血液を使用した製品評価（血液適合性評価）を実施するにあたり、社内倫理委員会による審査を必要としない。	
 	
 3-2.代替可塑剤の安全性評価/DOTH のラット亜慢性毒性試験	
 3-2-1.動物実験及び病理解析	
 訓化した 5 週齢の SD 系雄ラット（8 匹/群）に DEHP（5000	
 ppm）及び種々の量の DOTH（0,	
 5,	
 50,	
 500,	
 5000	 ppm）を 13 週間混餌投与した。イソフルラン麻酔下、BD 社製バキュティナ採血管（16	
 mm	
 SST 採血管血清分離剤入）に断頭採血し、放血殺後の動物を用いて、全身諸臓器の詳細な病理肉眼的検査を実施した。脳、胸腺、心臓、脾臓、肝臓、副腎(両側)、腎臓(両側)、精巣(片側)、精巣上体(片側)及び前立
腺副葉については重量測定を行い、絶対及び体重値に対する相対重量を算出した。	
 病理肉眼的検査後、精巣(片側)及び眼球(両側)を除く以下の臓器を 10%中性緩衝ホルマリン液により固定した。精巣はブアン液、眼球はダビットソン液を用いて固定した。固定後の各臓器は、切り出し後、常法に従って脱水、パラフィン包埋して薄切し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を施して、光学顕微鏡にて病理組織学的検索を行った。	
 	
 3-2-2.精子数及び血中ホルモン測定	 	  ラット右精巣上体を採取後、PBS（4.5	
 mL）中で細切し、37%ホルマリンを 0.5	 mL 加えて固定化した。
同溶液 10	
 µL に 20	 µM	 Hoechst	
 33258 含有 PBS（90	 µL）を添加し、室温下 15 分間放置して細胞核を蛍光染色した後、キーエンス社製 BZ-9000 を利用して細胞数を計測した（測定波長：Ex	 360	
 nm／Em	 460	 nm）。	 	  採取血液を室温下 30 分間放置後、遠心分離して調製した血清を試料として、テストステロン、エスト
ラジオール E2、卵胞刺激ホルモン（FSH）甲状腺ホルモン（TSH）を ELISA により定量した。テストステロン、FSH 及び TSH は Endocrine	 Technologies 社製キット、エストラジオール E2 は Enzo	 Life	
 Sciences
社製キットを用いて測定した。	
 	
 3-2-3.倫理面への配慮	 	
  国立医薬品食品衛生研究所が規定する動物実験に関する指針に従い、動物に対する苦痛が最小となるよう務めた。動物実験にあたっては、動物実験倫理委員会の承認を得て実施した（承認番号 434）。	
 	
 3-3.RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 3-3-1.bFGF 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 すでに得られている bFGF に特異的に結合する RNA 配列の中から、10 種の RNA アプタマー候補（1p01,	
 1p02,	
 1p03,	
 1p07,	
 1p41,	
 2p03,	
 2p04,	
 2p05,	
 2p10,	
 2p11）を選定し、合成した。また、陽性対照として、bFGF と結合し、その生理活性を阻害する bFGF	
 Aptamer(bFA)と、結合活性の無いランダム配列である 40N も同様に合成した。RNA 合成においては、3ʹ′末端に 16	
 nt の Poly	
 A が付加されるようにデザインした。RNA アプタマー/bFGF/FGFR1 三者複合体形成能は、BIAcore	 2000 を用いた表面プラズモン共鳴法（SPR）によって評価した。センサーチップとしては、ストレプトアビジン固定化チップ（SA チップ）を用いた。同チップに 5ʹ′末端ビオチン標識 Poly	
 dT（pdT）を結合させた後、リガンドとなる RNA の 3ʹ′末端に存在する Poly	 A と pdT の塩基対形成により SA チップに候補アプタマーを固定化した。本 SA チップを利用して、RNA アプタマー候補と bFGF との結合能を評価した後、FGFR1 を添加して三者複合体形成能を評価した。	 
	
  BIAcore 解析において、bFGF との複合体形成能を有することが認められた候補アプタマーと bFGF を添加した培地を用いて、マウス線維芽細胞（NIH3T3）を培養した。刺激開始から 30 分後に細胞を回収し、ウェスタンブロッティング法により FRS2 及び ERK のリン酸化状況を観察した。抗体としては、P-FRS2 及び P-ERK に対する特異的抗体を用いた。	
 	
  両末端にそれぞれ SH 基とカルボキシル基を有するポリエチレングリコール 5000（PEG5k）を常法に従って、金コートしたガラス板上に固定化した後、カルボジイミド法により、1p01 及び pdT を結合させた。
同材料上でヒト間葉系幹細胞（hMSC）及び NIH3T3 を培養した。培地は DMEM 及び MSCGM、血清は 5%ヒト
血清（HS）及びウシ胎児血清（FBS）を用いた。染色には Hoechst	
 33258 を用い、BZ-9000 を用いて核数を計測することで細胞増殖能を評価した。	
 	
 3-3-2.BMP2 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 BMP2 に対する RNA アプタマーの選定は SELEX 法によって行なった。RNA にヌクレアーゼ耐性を付与するため、ピリミジン残基のリボースに 2ʹ′F 修飾を施した dNTP を取り込める変異体酵素を用い、転写反応を行なった。SELEX は各種金属イオン（Ca2+,	
 Mg2+,	
 Na+及び K+イオン）を共存させた条件で行ない、得られた配列のシークエンス解析を行なった。解析結果を ClustalW によってグルーピングし、各グループの配列に対して、プログラム Mfold 及び RNAfold を用いて二次構造解析を行ない、BMP2 結合に必要な構造
モチーフを検索した。	
 	  SELEX 法によって得られた RNA アプタマー候補と BMP2 の結合能を電気泳動移動度シフトアッセイ法（EMSA）及び SPR によって評価した。EMSA では二価のイオンの有無の違いによる影響を調査するために、泳動用緩衝液は Mg2+イオン存在下及び非存在下の 2 条件で行なった。SPR による相互作用解析では、
BIAcore3000 を用い、bFGF のケースと同様に SA チップ及びビオチン標識した pdT を用いて評価した。	
 	
 D.研究結果	 (1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究	
 1-1.ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 	
  本研究では、調査結果等を広く発信することが、医療機器業界における国際標準化活動を充実するために必要と考え、医療機器部のサーバーシステムを利用し、本研究を紹介するホームページを開設し、適宜更新を行い最新の状況を一般公開した（http://dmd.nihs.go.jp/chikyukibo/index.html）。	
 	
 1-1-1.再生医療等製品	
 
	
  TC	
 150/SC	
 7 においては、再生軟骨におけるグリコサミノグリカン（sGAG）の染色による定量評価方法の標準化提案が 2015 年に正式に採択され、標準化に向けた作業が開始された。骨組織再生評価方法は、
細胞ソースがラットの初代間葉系幹細胞であったことから、動物愛護の観点から不採択となった。
「用語」
や「一般的要求事項」に関する標準化に関しては、予備的作業が Web 会議ベースで進んでいる。日本提案で作成が始まった「MRI を用いた軟骨再生評価方法」に関する文書が、2014 年に Technical	
 Report として発行されている。	
 
	
  TC	
 194 及び TC	 194/SC	
 1 では、平成 26 年度総会/WG15 において、再生医療等製品の標準化状況に関する情報が共有された。ISO における唯一の再生医療等製品関連標準である SC	
 1 文書「ISO	 13022	
 “Medical	
 products	
 containing	 viable	 human	 cells	 — 	 Application	
 of	
 risk	 management	
 and	
 requirements	
 for	
 processing	 practices”」の定期見直しは見送られたが、SC	
 1 が活動再開を検討していることも判明しており、今後の活動状況を追跡する必要があることも明らかとなった。	
 
	
  TC	
 198/WG	
 9 では細胞を含む製品を対象とした「無菌操作」に関する国際標準化文書の作成が進んでおり、2015 年中に当該文書が発行される可能性があることが判明した。	
 
	
  TC	
 276/WG	
 4“Bioprocessing”は、日本の再生医療イノベーションフォーラムを中心に再生医療等製品の製造プロセスに関連した標準化を目指して作業を進めていることが明らかとなった。WG	
 1 では、各国で定義されているバイオテクノロジー関連用語を収集・整理した「辞書」の作成に取りかかっており、その用語対象の中に再生医療等製品に関連するものが含まれていることが判明した。	
 	 1-1-2.医療機器ソフトウェア	 	
  「医療機器の品質管理（QMS）」に関する国際規格（ISO	 13485）の改訂作業が ISO/TC	
 210 で進んでいるが、その改訂は停滞しており、2015 年中に二度目の DIS 投票を行うべく再改訂案の作成が行われている。この規格では参照文書としてソフトウェアの製品及びプロセス規格が明記されることになり、医療機器ソフトウェアが QMS の対象となり得ると共に、非常に多くのソフトウェア関連規格が QMS に取り込まれることになっている。	
 	
  QMS に引用される各種規格は IEC 単独ではなく、ソフトウェア関連の IEC/TC と ISO/TC との合同ワーキ
ンググループ（joint	 WG）で作成されていること、医療機器関連の規格となるにも拘わらず、ISO 側から
は医療情報を中心に取り扱っており、情報系の専門家が多数参加している TC	
 215 が関わっているケースが多いこと、TC	 215 が参加する JWG	
 7 において、本来、Software	
 for	
 Medical	
 Device における設計・
開発（ライフサイクル）プロセスのための規格であった IEC	
 62304 を Health	
 software	
 全般を対象にした改訂版（第 2 版）作成が開始されたこと等が明らかとなった。	
 	
 1-2.国際標準化に対する医療機器関連企業の意識調査及び啓蒙活動	
 	
  医療機器業界団体を介して企業の国際標準化に対する意識を確認するためのアンケート調査を行った
結果、企業における国際標準化活動を活発化させて国際市場における日本企業の優位性を確保するためには、企業上層部の理解が不可欠であることが改めて明らかとなった。これを解決する一つの手段として、国による啓蒙が必須であると考えられたため、主に企業を対象とした講演会を平成 26 年 2 月に開催
し、平成 26 年 5 月には日本生体医工学会において主にアカデミアを対象としたオーガナイズドセッションを企画した。その他、平成 26 年度には学会等における発表・講演を 4 回行い、医療機器における国際標準化の現状報告とその重要性を啓蒙した。	
 	 (2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	
 2-1.インターラボラトリーテスト	 	  インターラボラトリーテストには米国、タイ、ドイツ、スウェーデン及び日本の 5 ヵ国が参加したが、ベルリン会議までに作業が完了し、結果の報告に至った国はタイと日本のみであった。タイのクラウンと金型の変位量の測定結果は、ジルコニアセラミックスで平均＋0.08mm、コンポジットレジンで+0.50mm、ワックスで+0.08mm であった。日本のジルコニアセラミックスで作製した精度は+0.005mm であった。この差は変位量の測定機器の限界によるものである。加工精度は、被切削材料に影響されるが、日本から提案した方法により評価できることが確認された。	
 	
 2-2.測定のための印記	 	
  Ⅰ級インレーと金型との変位量の平均は+0.962mm であり、クラウンの場合は+0.422mm となった。Ⅰ級
インレーとクラウンの標準偏差は、それぞれ 0.074 及び 0.024 であり、変位量平均値の 1/10 程度の小さい値であった。また、測定回数（この場合角度が大きくなる）が多くなるほど、修復物と金型の変位量が減少する傾向が認められた。これらの成績から、測定のための印記は必要性ないことが確認された。	
 	
 2-3.CAD/CAM 材料の被切削面	
 	
  同一加工条件下におけるジルコニア未焼結とジルコニア本焼結の被切削面を比較すると、ジルコニア
本焼結の被切削面の中心部に十字用の大きな工具による痕が残ると共に、切削加工中に工具が破損する等、適正な加工条件でないことが判明した。一方、ジルコニア未焼結は切削工具の痕が認められず、適正な被切削面であることが確認された。同様に、コンポジットレジンは適正な被切削面、純チタンは不適正な被切削面であることが確認され、被切削面から適切な切削加工条件を評価できることが判明した。	
 	
 2-4.ISO/TC106/SC9/WG5 ベルリン会議	  	 	
  6 月に CD の投票が始まり、8 月に CD 投票が締め切られた。その結果、賛成 9 カ国、反対 3 カ国（オーストラリア、ブラジル及びスウェーデン）、棄権 2 カ国をもって、本 CD は採択された。	
 	
  反対票を投じたオーストラリアとスウェーデンは本 CD が「加工機の精度に特定した評価法」であることを理解しておらず、「システム全体」の評価法として誤認している可能性が考えられたため、事前の国内委員会において、「序文及び適用範囲」を修正した。国際会議にあたり、本修正版を事前に各国エキスパートへ回付した。	
 	  ベルリン会議は各国から寄せられたコメントに対する回答で始まった。会議中、概ね日本の提案については合意が得られたが、日本提案の金型を用いた測定方法でなく、CMM	
 (Coordinate	
 Measuring	
 Machine:
三次元測定機)及び三次元の元データと CAD/CAM で作製したセラミック修復物の三次元データの変位量の差を求めるソフトウェア法が米国から提案された。この結果、これらの項目を追加した 2nd	 CD にステー
ジアップすることになった。	
 	 (3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 3-1.ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	
 3-1-1.Genapol	
 X-080 含有 PVC シートの性能評価	
 	  Genapol	
 X-080 含量の異なる 3 種の PVC シートを作製し、その溶血誘導能を評価した結果、直接接触法を利用した ASTM 法及び NIH 法では、Genapol	
 X-080 添加量に比例して溶血率が増加した。抽出液法を利用した場合、1.5 及び 10 パーツ添加標品は ASTM 法及び MHLW 法ともに完全溶血を惹起したが、1.0 パー
ツ添加標品の溶血率はそれぞれ 86.8%及び 49.9%であり、1.5 及び 10 パーツ添加標品と比較して溶血性が低いことが確認された。	
 	
 3-1-2.溶血性試験国際ラウンドロビンテスト	
 	  陰性対照材料である PE は、ヒト血液及びウサギ血液を利用した評価系ともに、全ての試験法において溶血能を示さなかった。強陽性対照材料である NG は、ヒト血液及びウサギ血液を用いた評価系において、
ASTM/直接接触法及び ASTM/抽出液法ともに、ほぼ 100%の溶血率を示した。一方、NG の溶血特性を MHLW/
抽出液法により評価した時の溶血率は、それぞれ 6.6%及び 2.0%であった。主に直接接触法において弱陽性反応を示す LG 及び BR の溶血特性は、抽出液法による試験では検出できなかった。一方、我々が提供した弱陽性対象材料である Y-2 及び Y-3 は直接接触法のほか、抽出液法においても理論的な溶血特性を示すことが確認された。	
 	
 3-2.代替可塑剤の安全性評価/DOTH のラット亜慢性毒性試験	
 	
  投与期間中の発育状況は全群ともに良好であり、体重推移及び摂餌量については各実験群間に有意差が認められなかった。	
 DOTP 投与群は、対照群（DOTP	 0	 ppm）と比較して、全群ともに各臓器の絶対重量及び相対重量に有意な変動を示さなかった。一方、DEHP 投与群では、相対重量において、肝臓と腎臓にそれぞれ 18%及び 14%程度の軽度な増加が観察された。	
 	
  病理組織学的検査において、DEHP 投与群の肝臓に軽度なびまん性肝細胞肥大が 8 例中 7 例認められた。
この肝細胞肥大は統計学的に有意な増加であった。また、肝細胞肥大を示す肝細胞は、やや顆粒状で好酸性を呈していた。対照群（DOTP	 0	 ppm）及び DOTP	
 5000	
 ppm 投与群においては異常が認められなかった。精巣については、いずれの群においても正常な精子形成像が認められ、精子形成ステージの構成細胞にも投与による異常は認められなかった。精巣上体については、精巣上体管腔内に細胞残差が散見される個体が観察されたが、対照群と比較して有意な変化ではないことが確認された。腎臓については、皮質及び髄質いずれの部位においても投与による変化は認められなかった。比較的発生頻度の高かった
病理組織学的変化として、小葉周辺性の肝細胞脂肪化等が観察されたが、いずれも対照群と同程度の発生であり有意差は認められなかった。その他、精子数及び血中ホルモン量にも対照群を含めた各実験群に有意差は認められなかった。	
 	
 3-3.RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 3-3-1.bFGF 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 BIAcore を用いて bFA 及び RNA アプタマー候補と bFGF との相互作用を解析した結果、bFA 及び RNA ア
プタマー候補の全てが bFGF に結合することが確認された。さらに FGFR1 を添加して三者複合体形成状況を検討した結果、bFA では FGFR1 添加による RU 値の影響は観察されなかったが、RNA アプタマー候補では FGFR1 添加により、RU 値の低下が観測された。	
 	
  BIAcore を用いた bFGF/FGFR1 結合能解析結果に基づいて、bFA、40N、1p01、1p02、1p07、2p03、2p05
及び 2p11 の bFGF 細胞刺激阻害能の評価を行なった。その結果、bFA、1p07、2p05 及び 2p11 では P-FRS2

抗体と P-ERK 抗体を用いたウエスタンブロットによりバンドが確認されなかったが、40N、1p01、1p02 及び 2p03 では FRS2 と ERK のリン酸化体が検出された。これらの結果から、1p01、1p02 及び 2p03 は、bFGFの生理活性を保った状態で bFGF を補足する RNA アプタマーであることが判明した。	
 生理活性を損なうことなく bFGF を補足する RNA アプタマー1p01 及び陰性対照の pdT をコートした材料
上で細胞培養を行なった結果、5%	
 HS 条件下では NIH3T3 並びに hMSC ともに、1p01 コートした材料表面
上で細胞数が多く観測された。また、5%	
 FBS/DMEM 培地条件下で hMSC を培養した場合には同様に 1p01 コ
ート材料の方が pdT コート材料よりも細胞数が多く観測されたが、同細胞を 5%	
 FBS/MSCGM 培地で培養した場合では 1p01 コート材料及び pdT コート材料ともに、ほぼ同じ細胞数であった。	
 	
 3-3-2.BMP2 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 BMP2 に結合する RNA 候補を SELEX 法によって選定し、72 クローンの配列解析を行ない、それらについて ClustalW を用いたグルーピング解析を行なった結果、5 種類の配列に収束していることが明らかとなった。これら 5 種類の配列（B10,	
 B20,	
 B24,	
 B32 及び B37）についてプログラム Mfold 及び RNAfold を用い、二次構造解析を行なった結果、それぞれが異なった構造を形成していることが予測された。	
 	
  SELEX 法によって得られた 5 種類の配列と BMP2 の結合能について、EMSA により評価した結果、二価のイオンが存在していない条件下では、BMP2 が加わるとスメアな複合体バンドが観測された。一方、Mg2+
イオン存在下で EMSA を行なった結果、B10 及び B24 において、明瞭な複合体のバンドが確認できた。また、SPR による解析の結果では、すべての RNA アプタマー候補が同程度で BMP2 に結合することが確認さ
れた。	
 
	
 
E.考	
  察	
 
(1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究	
 1-1.ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 	
  再生医療等製品の実用化を加速するための環境整備が必要であると共に、「再生医療等製品」の特性を理解し、その種類を明確にしておく必要があると思われる。また、再生医療研究に携わる全てのジャンルの研究者が密に情報交換や共同研究を行わなければ、再生医療等製品の迅速な実用化、さらには各種団体における関連技術の国際標準化は進まないと考えられる。ISO の複数の TC、SC で再生医療のstakeholder らが集まり国際規格の作成を行っていることは、将来の海外展開を見据えた戦略を準備している国や企業があることを示唆している。現在、国策として推進されている健康・医療戦略において、医療分野における規制に利用可能な国際標準化の作成推進が掲げられていることを鑑みると、今後、関連学会同士の密な連携の構築等、何らかの対策を講じて上述した問題を解決する方法を模索していく必要がある。現在、我々は、再生医療等製品と関連した標準化作業を行っている TC	 150/SC	
 7、TC	
 194/SC	
 1、
TC	
 198、TC	
 276 国内委員会関係者及び関係省庁関係者との間で、再生医療等製品に関する国際標準化に関して統一した方向性と連動性を共有するための連携体制構築に、非公式ながら取り組み始めている。
この活動が今後の再生医療等製品関連の国際標準作成を戦略的な All	 JAPAN 体制で行うための土台となることを我々は期待している。	
 	
  医療機器ソフトウェアの標準化については、米国が主導権を握ってその作成を行っていることが示唆される調査結果を得た。しかしながら、医療機器としての標準化にも拘わらず、ISO 側では主に情報系専門家で形成される TC	
 215 が関わっており、医療機器の特性を考慮しない規格が作成されるのではないかとの点が危惧された。国内では、医薬品医療機器法が施行されたことに伴い、QMS 省令も修正され現行のISO	
 13485 との整合性が高められたばかりである。上記改正が成立した場合、近い将来、QMS の国際整合の再考慮が課題となる可能性があるため、医療機器ソフトウェアのみならず、医療機器分野全体の課題
として ISO	
 13485 の改訂内容を注視していかなければならないと考える。また、現在改訂中の IEC	
 62304を中心とした医療機器ソフトウェア関連国際規格が規制においても重要になることは明らかであり、我が国も産官学共同でこれらの規格作成に積極的に関与しなければならない状況になっていることが示唆されている。	
 	
 1-2.国際標準化に対する啓蒙活動	
 	
  平成 26 年度に行った講演は、それぞれ研究センター、学会、標準化関連団体、ISO 活動支援団体が主催したものである。国際標準化に関する興味の度合いは異なるが、講演後に多数の質疑を受けたことか

ら、その重要性を相応に啓蒙することができたと思われる。本年度は企業を対象とした講演を実施できなかったことから、今後、企業上層部に直接国際標準化の必要性を周知する活動を実施する予定である。	
 	 (2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	 	  インターラボラトリーテストにおいて使用した 2 級インレーの治具では、咬合面と側方の両方から 50Nの荷重を同時に加えることができるようになり、測定精度が格段に向上した。今回行った実験において、試料を 45°毎に回転させて計 8 点の各金型との変位量を測定する場合、一定の小さい定点に定荷重を加えることが可能であり、精度の高い測定結果を得ることができた。また、測定精度の向上及び測定時間の短縮を図ることを目的として作製したレーザ計測を応用した測定機は修復物と金型の変位量を随時測定することが可能であり、精度の高い測定結果を得ることができた。	
 	  ベルリン会議を通じて、国際標準化作業を円滑に進めるためには、国際会議における丁寧な説明、会議資料の提供や各国エキスパートに対するロビー活動が非常に重要であることを再確認した。	
 	 (3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 3-1.ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	 	  ラウンドロビンテストのプロトコルは、医療機器の溶血性試験のために国際的に広く用いられている
ASTM 法、NIH 法及び MHLW 法の 3 法から構成されている。NG は強陽性対照材料であるが、MHLW/抽出液法の検出感度は、その他の試験法と比較して大きく劣ることが確認された。LG 及び BR は主に直接接触法における弱陽性対照材料として配布された試料であり、本試験においても、その溶血特性が明瞭に示された。
これらの現象は、事前に行ったパイロット試験においても確認されている。	
 	
  一方、我々が提供した Y-2 及び Y-3 は、直接接触法及び抽出液法のいずれにおいても弱陽性対照材料として利用することが可能であり、試験法に応じて、両者を使い分けることにより、試験系の評価を行うことができることが判明した。	
 	  ウサギ血液とヒト血液は多くの試験法において、ほぼ同等の感度を示した。しかし、NIH/直接接触法では、ウサギ血液を用いた試験系の方が感度的に優れていることが確認された。	
 	
 3-2.代替可塑剤の安全性評価/DOTH のラット亜慢性毒性試験	
 SD 系雄ラットを用いて DOTH 及び DEHP を 13 週間混餌投与した結果、投与による影響は、肝臓の相対重量の増加、びまん性の肝細胞肥大として DEHP 群にのみ観察された。対照群及び DOTH 投与群には同様の変化は認められなかったが、飼料に起因すると思われる肝臓脂肪化が観察された。今回の実験では、DEHP
及び DOTH 投与群ともに、精巣及び精巣上体における病理組織学的変化は観察されなかった。また、その他の各臓器に認められた病理組織学的変化については、対照群と同程度であり有意差は認められなかったことから、DOTH は比較的安全性の高い代替可塑剤となり得ることが判明した。	
 	
  我が国において定められた DEHP の経口摂取 TDI 値は 40-140	
 µg/kg/day であり、その上限値と下限値はそれぞれ Poon ら及び Lamb らの報告に基づいて決定された。本研究は Poon らの報告に準拠して実施したが、DEHP が精巣/生殖毒性を発現する用量は報告毎に異なっているため、今後実施する代替可塑剤の毒性試験においては、Lamb らの報告に従って投与量を設定する。	
 	
 3-3.RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 医用材料として利用する bFGF 捕捉型 RNA アプタマーは、RNA アプタマー/bFGF/FGFR1 三者複合体を形成することが理想的であるが、RNA アプタマー候補/bFGF 複合体は、FGFR1 添加に伴い FGF/FGFR1 複合体
が優位に形成され、bFGF が RNA アプタマーから解離する成績が得られた。しかし、RNA アプタマー固定化材料表面に捕捉された bFGF が、細胞膜上に存在する FGFR1 と結合した後に RNA アプタマーから解離した場合でも、bFGF シグナル伝達が正常に稼働する環境であれば機能性材料としての性能は確保される。
NIH3T3 細胞に対する bFGF の細胞刺激阻害試験を行なった結果、1p01、1p02 及び 2p03 は bFGF の生理活性を阻害しないことが確認されたことから、3 種類の RNA アプタマー候補から 1p01 を選定し、機能性材料の開発を進めた。RNA アプタマー1p01 及び陰性対照の pdT を材料表面上に固定化し、同材料上で細胞培養を行なった。その結果、ほぼ全ての条件下で陰性対照である pdT に比べて、1p01 コート材料は細胞増殖促進効果を有することが認められ、意図した機能を発揮していることが示唆された。今後、同材料
表面上の吸着蛋白質解析等を進めると共に、本 RNA アプタマーとコラーゲンとの複合材料を作成し、ラット埋植試験等を行ない、RNA アプタマー材料の有効性及び安全性を評価することにより、革新的医用材料として提案するための検証データを収集する。	
 BMP2 に対する RNA アプタマーを用いた材料開発のため、SELEX 法により、BMP2 に結合する RNA アプタ
マー候補を選定した。得られた RNA について配列解析を行なった結果、アプタマー候補は 5 種類の配列に収束しており、それら RNA アプタマー候補の二次構造上に共通の構造モチーフが保持されていないことから、それぞれが特有の構造を形成していることが示唆された。これらの RNA アプタマー候補と BMP2の相互作用を EMSA によって評価した結果、B10 及び B24 は Mg2+イオン存在下において明瞭な複合体のバンドが見られたことから、この 2 つの RNA と BMP2 と結合については Mg2+イオンが重要な役割を果たしていることが明らかである。ヒト IgG に対する RNA アプタマーにおいては複合体形成に Mg2+もしくは Ca2+
イオンが必要であることから、B10 及び B24 の RNA アプタマー候補においても、Mg2+イオンが BMP2 との複合体形成に必要であることが示唆された。一方、SPR による相互作用解析では、いずれの RNA アプタマー
候補ともにランダム配列よりも強い結合を示した。本研究における SPR 及び SELEX の条件下では、Mg2+,	
 Ca2+,	
 K+及び Na+イオンが共存するため、B10、B24 以外の RNA アプタマー候補については、Mg2+イオンとは別のイオンに依存した構造形成能を持つ可能性が示唆された。今回得られた 5 種類の RNA アプタマー候補は、二次構造予測の結果から共通の構造モチーフが見られず、相互作用解析での挙動が同じではないことから、それぞれが異なった機構で BMP2 と結合していると考えられた。今後、5 種類全ての RNA を用いてシグナル伝達阻害等の評価を行う。また、二次構造予測の結果に基づいて短鎖化した RNA についても同様の解析を行うと共に、金属イオン依存性についても検討する。	
 
	
 
F.結	
  論	
 
(1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究
1-1.ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 	
  再生医療等製品では製品開発に先行して「デジュール」規格の作成が始まっており、複数の ISO/TC で関連技術の国際標準化作成作業が活発化していることが判明した。医療機器ソフトウェア分野における標準化は QMS をも巻き込み複雑化している。前者においては、我が国が主導権を握れる分野であり、製品カテゴリーの明確化や All	 JAPAN 体制を構築して戦略的な活動を実施しなければならないことが明らかになった。後者においては、ISO	
 13485 の改訂が我が国における QMS 省令へも影響を及ぼす可能性があると共に、ソフトウェア関連国際標準をどのように規制に取り入れていくかを検討している段階である
ことから、今後、我が国も積極的にその作成に関与していかなければならないことが示唆された。	
 	
 1-2.国際標準化に対する医療機器関連企業の意識調査	 	
  医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙する目的で、計４回、医療機器関連団体等を対象に研究発表、講演を行った。その結果、医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙することができた。
	 (2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	 	  インターラボラトリーテストの結果、CAD/CAM により作成されたセラミック修復物の加工精度は、日本が提案した CD「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-aided	
 milling	
 machine	 – Test	 methods」により正しく評価できることが確認された。また、ベルリン会議（平成 26 年 9 月）における討議の結果、本提案規格に CMM とソフトウェアを追加して 2nd	 CD ステージに進めることとした。	
 	
  国際会議では、会議前の丁寧な説明及び会議資料の提供により、各国からの信頼を得ることが重要である。また、日本から提案した医療技術を国際標準化する一つの道は、WG の Convener を獲得することで
ある。	
 
	
 
(3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 3-1.ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	 	
  我々が開発した弱陽性対照材料（Y-2 及び Y-3）は、直接接触法及び抽出液法のいずれにおいても弱陽性対照材料として利用することが可能であり、試験法に応じて、両者を使い分けることにより、試験系の評価を行うことができることが判明した。Y-2 及び Y-3 の対照材料としての性能が世界的に確認されたことから、今後、強陽性対照材料である Y-4 と合わせて、ISO/TC194/WG12 に国際標準品として新規提案

する。	
 
	
 
3-2.代替可塑剤の安全性評価/DOTH のラット亜慢性毒性試験	
 代替可塑剤の安全性を評価する一環として、SD 系雄ラットを用いて DOTH 及び DEHP を 13 週間混餌投与した結果、投与による影響は、DEHP 投与群の肝臓にのみ観察された。DOTP については、いずれの臓器においても投与による影響は認められず、その無毒性量は 300	
 mg/kg	 body	
 weight/day 以上と判定された。
	
 3-3.RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	 	
  bFGF 捕捉型 RNA アプタマー1p01 は、細胞増殖促進機能を有することが確認されたことから、新規医用材料の開発において有益なツールになることが示唆された。また、BMP2 に結合する RNA アプタマー候補として、5 種類の有力な配列を選定することができた。
	 
G.健康危険情報	 	  特になし。	
 	
 H.研究発表	 <誌上発表>	 	 1)中岡竜介．ISO/TC	
 150/SC	
 7 の現状と課題．セラミックス，48(10):819-823	
 (2013)．	
 	 2)Kameda	
 T,	
 Ohkuma	
 K,	
 Oda	
 H,	
 Sano	 N,	 Batbayar	
 N,	
 Terashima	
 Y.	
 Magnetic	
 fields	
 from	
 electric	 toothbrushes	
 promote	 corrosion	
 in	
 orthodontic	
 stainless	
 steel	 appliances	
 but	
 not	
 in	
 titanium	 appliances.	
 Dent	 Mater	
 J,	
 32:959-969	
 (2013).	
 	 3)Kameda	
 T,	
 Ohkuma	
 K,	
 Sano	 N,	 Terada	 K.	
 Electric	
 current	
 induced	 in	
 teeth	 by	 electromagnetic	 fields	 from	
 electric	
 toothbrushes	
 and	
 curing	 lights.	
 Orthod	
 Waves,	
 72:77-85	
 (2013).	
 	 4)Kameda	
 T,	
 Ohkuma	
 K,	
 Sano	 N,	 Shin	 Y,	 Terada	 K.	
 Modification	
 of	
 metallic	
 materials	
 for	
 a	
 white	 appearance	
 without	 coating	
 and	
 plating.	
 Orthod	
 Waves,	
 72:87-98	
 (2013).	
 	 5)Koide	
 M,	
 Ohkuma	
 K,	
 Ogura	 H,	
 Miyagawa	
 Y.	
 A	
 new	
 method	
 for	
 fabricating	 zirconia	
 copings	
 using	 a	
 Nd:YVO4.	
 Dental	 Materials	
 Journal,33:422-429	
 (2014).	
 	 6)Kameda	
 T,	
 Ohkuma	
 K.	
 Electromagnetic	
 fields	
 from	
 dental	 devices	
 and	
 their	 effects	
 on	
 human	 health.	
 J	 Electr.	
 Electron	
 Syst,	
 3:118	 (2014).	
 	 7)Haishima	
 Y,	
 Hasegawa	
 C,	
 Nomura	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Yuba	 T,	 Shindo	
 T,	
 Sakaguchi	
 K,	
 Tanigawa	 T,	
 Inukai	 K,	
 Takenouchi	
 M,	
 Isama	 K,	
 Matsuoka	
 A,	
 Niimi	 S.	
 	 Development	
 and	
 perfor-	 mance	 evaluation	
 of	
 
a	
  positive	  reference	  material	  for	
  hemolysis	  testing.	
  	
  J.	
  Biomed.	
  Mater.	
  Res.	
  Part	  B,	 102B:1809-1816	
 (2014).	
 	 8)Haishima	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Hasegawa	
 C,	
 Tanoue	
 A,	
 Yuba	 T,	 Isama	 K,	
 Matsuoka	
 A,	
 Niimi	 S.	
 	 Screening	 study	 on	
 hemolysis	
 suppression	 effect	
 of	
 an	
 alternative	 plasticizer	
 for	
 the	
 development	
 of	
 
a	
 novel	 blood	 con-	
 tainer	 made	 of	
 polyvinyl	
 chloride.	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:	
 721-728	
 (2014).	
 	 9)蓜島由二．第 1 部：医療機器市場の拡大と新規製品の開発：開発，上市化，市場確保において留意すべきポイント．生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バイオマテリアルの設計・開発戦略（監修：田中	 賢）．サイエンス＆テクノロジー，pp.3-21	
 (2014)．	
 10)中岡竜介，蓜島由二，新見伸吾．医療機器・材料の国際標準化動向．バイオマテリアル-生体材料，
33(1):56-63	
 (2015)．	
 11)Haishima	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Fukui	
 C,	
 Tanoue	
 A,	
 Yuba	 T,	 Ozono	 S,	
 Kumada	 H,	
 Inoue	 K,	
 Morikawa	
 T,	
 Takahashi	
 M,	
 Fujisawa	
 A,	
 Yamasaki	
 K,	
 Nomura	 Y,	
 Isama	 K,	
 Chung	 U,	
 Ogawa	
 K,	
 Niimi	
 S,	
 Yoshida	
 M.	
  Characterization	  of	  alternative	  plasticizers	  in	  polyvinyl	  chloride	
  sheets	  for	
  blood	 containers.	
 	
 J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.,	
 in	
 press	 (2015).	
 	
 <学会発表>	
 	 1)Nakaoka	
  R.	
  Activities	  of	  standardi-	  zation	  for	
  tissue-engineered	  medical	  products	  in	
 International	
 Organization	
 for	
 Standardization	
 (ISO),	
 Termis-AP	 2013	 Annual	
 Conference,	
 Wuzhen,	 China	 (2013.10).	
 	 2)中岡竜介．再生医療分野における国際標準化の現状とその展望について．第 13 回日本再生医療学会
総会（2014 年 3 月・京都）．	
 	 3)中岡竜介、蓜島由二、新見伸吾．橋渡し研究及び国際標準化の行政的支援．第 53 回日本生体医工学会大会（2014 年 6 月・仙台）	
 	 4)中岡竜介．医療機器に関連した国際標準化状況について：ISO/TC	
 150（外科用インプラント）を中心に．「ISO/TC	
 150（外科用インプラント）とバイオセラミックスの国際標準化の状況」講演会（2015
年 1 月・東京）	
 	 5)中岡竜介．国際幹事経験談及び医療機器分野国際標準化の現状について．平成 26 年度第 2 回 ISO 国
際標準化研修	 ―	
 上級編（実践コース）（2015 年 1 月・東京）	
 	 6)小出未来,	
 大熊一夫,	
 小倉英夫,	
 宮川行男 Nd:YVO4 レーザを用いたジルコニアコーピングの新しい加工法	
  被照射面の熱処理後のラマン分光分析.	
 	
 日本歯科理工学会第 63 回春季学術講演会（2014 年 4月・千葉）.	
 	 7)赫多	 清,	 大熊一夫,	
 宮川行男．陶材の咬合摩耗に及ぼす試験片支持材料の影響.	
 日本歯科理工学会
第 64 回周期学術講演会（2014 年 10 月・広島）.	
 	 8)小出未来，大熊一夫，蛯原善則，三吉	
 愛，小倉英夫.	
 Nd-YVO4 レーザーを用いたジルコニアコーピン
グの新しい加工法－プログラム修正した時の加工精度－.第	 61	
 回春期日本歯科理工学会学術講演会（2013 年 4 月・東京）．	
 	 9)小出未来，大熊一夫，蛯原善則，小倉英夫.	
 Nd-YVO4 レーザーを用いたジルコニア焼結体からコーピン
グを直接製作する方法.	
 日本補綴歯科学会設立 80 周年記念第 122 回学術大会（2013 年 5 月・福岡）．	
 10)亀田	
 剛，織田洋武，大熊一夫，佐野奈都貴，寺嶋縁里，佐藤	
 聡，寺田員人.	
 電動歯ブラシが発生する低周波磁界はマルチブラケット装置内に電流を誘導し，装置を腐食させる.	
 第 72 回日本矯正歯科学会（2013 年 10 月・松本）．	
 11)小出未来，大熊一夫，小倉英夫，宮川行男.	
 Nd:YVO4 ナノ秒レーザーを用いたジルコニアコーピングの新しい加工法.	
 第	 62	
 回秋期日本歯科理工学会学術講演会（2013 年 10 月・新潟）．	
 12)野村祐介，福井千恵，戸井田	
 瞳，新見伸吾，宮川	
 伸，金	  玲，中村義一，蓜島由二．RNA アプタマーを用いた新規医用材料の開発．第 36 回日本バイオマテリアル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 13)野村祐介，福井千恵，柚場俊康，新藤智子，坂口圭介，谷川隆洋，杉山知子，竹ノ内美香，新見伸吾，
蓜島由二．簡易溶血性試験法の性能評価と公定法との比較検証．第 36 回日本バイオマテリアル学会
大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 14)蓜島由二，福井千恵，山﨑佳世，野村祐介，小園	
 知，熊田秀文，藤澤彩乃，井上	
 薫，森川朋美，市村亮平，前田	 潤，高橋美和，河上強志，伊佐間和郎，柚場俊康，鄭	
 雄一，小川久美子，新見伸吾，
吉田	
 緑．新規血液バッグ用代替可塑剤 DOTH のラット亜慢性毒性試験．第 36 回日本バイオマテリア
ル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 15)蓜島由二，河上強志，福井千恵，田上昭人，柚場俊康，向井智和，野村祐介，伊佐間和郎 1，新見伸吾．新規血液バッグ素材 DOTH/DINCH 配合 PVC シートの性能評価．第 36 回日本バイオマテリアル学会
大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 16)蓜島由二，福井千恵、山﨑佳世、野村祐介、小園	
 知、熊田秀文，藤澤彩乃，井上	
 薫，森川朋美，市村亮平，前田	 潤，高橋美和，河上強志，伊佐間和郎，柚場俊康，浜田信城，鄭	
 雄一，小川久美子，
新見伸吾，吉田	
 緑．DEHP 代替可塑剤を利用した新規血液バッグの開発：ラット精巣に及ぼす DOTP の影響評価．日本薬学会第 134 年会（2014 年 3 月・熊本）．	
 17)野村祐介，河上強志，福井千恵，柚場俊康，新藤智子，坂口圭介，谷川隆洋，犬飼香織，竹ノ内美香，
伊佐間和郎，松岡厚子，新見伸吾，蓜島由二．溶血性試験用陽性対照材料 Genapol	
 X-080 含有 PVC シートの性能評価．第 35 回日本バイオマテリアル学会大会（2013 年 11 月・船堀）．	
 	
 参照資料：特になし	
 	 Ⅱ．総合分担研究報告書①	 ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究	
 
	
 
中岡竜介	
 
国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 総合分担研究報告書	 	
 平成 25,26 年度厚生科学研究費補助金/地球規模保健課題解決推進のための研究事業	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25-地球規模-指定-008）	
 
	
 
	
 
分担研究課題名	 ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究	 	
 研究分担者	
  中岡	
 竜介	  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 	
 協力研究者	
 ＜平成 25 年度＞	 神谷正己	  日本画像医療システム工業会	
 
野田	
  穆	
  日本歯科商工協会	
 鈴木数広	
  日本医療機器テクノロジー協会	
 ＜平成 25,26 年度＞	 蓜島由二	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

	
 

	
 
A.研究要旨	 	  本研究では、平成 23,24 年度に行った厚生労働科学研究費補助金／地球規模保健課題推進事業において作成した「医療機器規格・基準の国際標準化戦略に係る政策的提言」を具体的に実行する体制の構築に資する施策として、医療機器関連の ISO/TC 状況を収集するとともにその活動をサポートする窓口を試験的に開設した。現在のニーズや社会的背景等を考慮して「再生医療等製品分野」と「医療機器ソフトウェア
分野」を本研究の対象分野とし、それらに関連する ISO 及び IEC の関連 TC	
 国内委員会に参加することで各々の TC における活動状況及び国際標準化対象を調査し、その結果を取りまとめた後、今後、日本発の国際標準を作成するための戦略を考察した。調査の結果、前者では、製品開発に先行した「デジュール」
規格の作成取り組みが ISO において活発化していること、主導権を握れる可能性が高いことから国策として戦略的且つ統一的に再生医療等製品の国際標準化に取り組んでいかなければならないことが明確となった。そのため、TC	
 150/SC	
 7、TC	
 194/SC	
 1、TC	
 198、TC	
 276 国内委員会関係者及び関係省庁関係者との間で討議を行い、再生医療等製品に関する国際標準化活動のための All	 JAPAN 連携体制構築と、その体制による戦略的な国際標準化への取り組みとを試みることとなった。後者においては、現在、米国が主導権を握ってその作成を行っていることが明らかとなった。また、医療機器としての標準化にも関わらず、その標準化作業には情報系専門家で形成される TC	
 215 が携わっているため、医療機器の特性を考慮しない規格が作成される危険性があること、そのため、医療機器業界から TC	
 215、あるいは joint	
 WG への参画が始まっていることが明らかとなった。加えて、ISO	
 13485 の改訂が医療機器ソフトウェアにも影響を及ぼすことが明確となり、医薬品医療機器等法の施行による影響も鑑みた我が国規制当局の国際規格作成への積極的関の必要性が示唆された。	
 	
  本研究では、今回取りまとめた調査結果等を発信することが、医療機器業界における国際標準化活動を充実するためには必要と考え、医療機器部のサーバーシステムを利用し、本研究を紹介するホームページ
を開設し、適宜更新を行い最新の状況を一般公開した（http://dmd.nihs.go.jp/chikyukibo/index.html）。	
 	
  一方、「政策的提言」では、我が国が国際標準化において戦略的に活動しその主導権を握るために、まず、企業において国際標準化に関する現在の状況とその重要性を認識してもらうことが重要であることが示されている。そのためには、医療機器関連企業における国際標準化の認識状況を把握することが必須と考えたため、初年度にいくつかの医療機器関連企業団体を介して、国際標準化の意識調査をアンケート形式で実施した。その結果、国際標準化に積極的な企業はあまり多くないこと、国際標準化に積極的に参画している企業であっても目に見える形で担当者を評価している企業は少ないことを示唆された。これらのことから、医療機器分野の国際標準化活発化のためには、企業上層部を中心に医療機器関連企業の意識改革を目的とした啓蒙活動を行う必要が明らかとなった。そこで、2 年度は啓蒙活動として、関連学会や団体において医療機器に関連する人材を対象とした講演を実施するとともに、医療機器関連の雑誌及び単行本に本事業を紹介するための総説・解説を寄稿した。	
 	
 B.研究目的	 	  近年の国際市場拡大により、法的規制を国際的に整合化する動きが活発になっている。同時に、医療機器の性能や試験法等、有効性と安全性に関する各種規格・基準の国際整合化が ISO や IEC で行われている。
これらの規格・基準は各国における法的規制にも使用されている。これらの状況を鑑みると、今後、医療機器の許認可においては、その国内法規への適合のみならず各種国際規格への適合も要求されることになる。	
 	  我が国においては医療機器の国内規格として JIS が存在し、それらは許認可における技術基準・規格として数多く利用されている。近年、JIS 規格は ISO/IEC 等の関連国際規格を医療機器業界が翻訳して作成
していることが非常に多いため、元の国際規格を日本が先導して作成することが、国際市場において日本の医療機器業界が優位に立つ上で重要になってきていることになる。しかしながら、国内において医療機器の評価手法、必要な基準の策定、国際的な整合等に関する研究や活動は行われて来ているものの、日本発の良質な医療機器を障壁なく国際的に進出させる環境を整備するために国際標準化を戦略的に利用するための研究は実施されていなかった。	
 	  そこで、本研究においては、平成 23,24 年度厚生労働科学研究費補助金／地球規模保健課題推進事業「国際標準化機構（ISO）及び国際電気標準会議（IEC）における医療機器の各種国際規格の策定に関する研究（H23-地球規模-指定-003）」において作成された「医療機器規格・基準の国際標準化戦略に係る政策的提言」を受けて、国際標準化活動を分野毎に取りまとめ、一元的且つ戦略的に実施・サポートするための試験的窓口を立ち上げ、医療機器分野における国際標準化に関する情報収集及び発信を行うこととなった。
本研究では、現在のニーズや社会的背景等を考慮して「再生医療等製品分野」と「医療機器ソフトウェア
分野」を最初の対象分野とし、それらに関連する ISO/IEC 技術委員会（TC）の国内委員会に参加して各々の TC における活動状況及び国際標準化対象を調査し、その結果を取りまとめた後、今後、日本発の国際標準を作成するための戦略を考察した。	
 	
  一方、国際標準化を戦略的に進めて行くためには、医療機器業界の積極的関与も必須であることが前述した提言にも挙げられていた。そのためには、企業として国際標準化活動に参画し、エキスパートの貢献が正当に評価される環境を整えるため、医療機器関連企業、特にそれらの会社経営者層を対象として国際標準に関する世界情勢とその重要性を周知する啓蒙活動を行う必要がある。そこで、医療機器業界団体を介して、医療機器関連企業を対象とした国際標準化に関する意識調査及び現状に関するアンケートを行い、現在、国際標準化に対して企業がどのような姿勢をとっているのか調査を行い、今後の課題や啓蒙活動の必要性等についての考察を行った。その結果、医療機器分野の国際標準化活性化のためには、国を挙げてのサポートだけではなく、企業上層部の意識改革を目的とした啓蒙活動を行う必要が示唆されたことから、本事業の紹介を兼ねた医療機器国際標準化の重要性に関する啓蒙のための講演や寄稿を行った。	
 	
 C.研究方法	 (1)	
 ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 	
  本研究における調査対象として、医薬品医療機器等法の施行により医薬品、医療機器と並んで個別分
野となる「再生医療等製品」と、Stand	
 alone 製品であっても医療機器として扱われることになる「医療機器ソフトウェア」を選択した。その後、それぞれの分野における国際標準化活動を行っている ISO/IECの TC の国内審議団体を介してそれぞれの国内委員会に委員、オブザーバー等で参加し、情報収集を行った。以下に参加した TC を記す。	
 	
 ＜再生医療等製品＞	
 ・ISO/TC	
 150/SC	
 7「再生医療機器」（国際幹事）	
 ・ISO/TC	
 194「医療機器の生物学的及び臨床評価」（国内委員）	
 ・ISO/TC	
 194/SC	
 1「組織由来製品の安全性」（国内委員）	
 ・ISO/TC	
 198/WG	
 9「無菌処理」（オブザーバー）	
 ・ISO/TC	
 276「バイオテクノロジー」（ミーティング）	
 	 ＜医療機器ソフトウェア＞	
 ・ISO/TC	
 210「医療機器の品質管理と関連する一般事項」（オブザーバー）	
 ・IEC/TC	
 62「医用電気機器」（オブザーバー）	
 ・IEC/TC	
 62/SC	 62A「医用電気機器の共通事項」（オブザーバー）	
 ・IEC/TC	
 62/SC	 62D「医用電子機器」（オブザーバー）	
 	 	  なお、ISO 全体の活動を実質的に管理する Technical	
 management	
 board（TMB）に日本がメンバーとして参加していることから、TMB における審議を補助する目的で ISO 上層対応委員会が設立されている。今回、その委員会にもメンバーとして参加し、ISO 本体における最新の医療分野の標準化動向の調査も行った。	
 	
  収集した情報を元に、両分野における国際標準化の動向を取りまとめ、今後の展開に関する考察を行った。また、取りまとめた動向等に関する情報発信用ホームページの立ち上げを開始した。	
 
	
 
(2)	
 国際標準化に対する医療機器関連企業の意識調査及び啓蒙活動	
 	
  「政策的提言」では、我が国が国際標準化において戦略的に活動しその主導権を握るために、まず、企業において国際標準化に関する現在の状況とその重要性を認識してもらうことが重要であることが示されている。そこで、企業上層部への啓蒙活動を行う前に、初年度は医療機器関連企業を対象とした意
識調査を、（一社）日本画像医療システム工業会、（一社）日本歯科商工協会及び（一社）日本医療機器テクノロジー協会の協力を得て、アンケート形式で行い、その結果から企業における国際標準化活動の現状把握と考察を行った。	
 	
  ２年度は、初年度のアンケート結果から、改めて必要と判断された啓蒙活動の一環として、本事業の紹介と医療機器分野における国際標準化の重要性に関する講演や医療機器関連単行本や学会誌への総説・解説等の寄稿を行った。	
 	
 D.研究結果	 (1)	
 ISO/TC 共通窓口の試験的開設	 	
  「再生医療等製品」及び「医療機器ソフトウェア」を対象に国際標準化活動状況に関する調査を行い、得られた情報を以下に示す。	
 	
 「再生医療等製品」	
 	
  現在、当該製品に関する標準化のために活動している ISO/TC 等の状況を、図１に示す。現在、活動が確認されている ISO/TC は 4 つ、また、ISO 以外に American	
 Society	 for	
 Testing	
 and	
 Materials	 International	 (ASTMi)、British	
 Standards	
 Institution	
 (BSI)、International	
 Alliance	
 for	
 Biological	 Standardization	
 (IABS)が再生医療等製品に関連した標準化活動を行っていることが明らかとなっている。	
 	  ISO における標準化活動状況を以下に記す。TC	 150/SC	
 7 においては、再生軟骨におけるグリコサミノ
グリカン（sGAG）の染色による定量評価方法の標準化提案が 2015 年に正式に採択され、標準化に向けた作業が始まった。一方、かねてから提案されていた骨組織再生評価方法は、評価に用いる細胞ソースがラットの初代間葉系幹細胞であったことから、動物愛護の観点からの反対票が多くなり、結果、不採択となった。一方、「用語」や「一般的要求事項」に関する標準化の取り組みに関しては、予備的作業が Web
会議ベースで進んでいる。なお、日本提案で作成が始まった「MRI を用いた軟骨再生評価方法」に関する文書が、2014 年に Technical	
 Report として発行されている。	
 
	
  TC	
 194 及び TC	 194/SC	
 1 では、現在、再生医療等製品に関連した標準化作業は行われていないものの、
4 月に三島市で開催された総会での WG	
 15 会議では再生医療等製品の標準化状況に関する情報共有が為された。また、SC	
 1 で発行された、ISO における唯一の再生医療等製品関連標準である ISO	
 13022	
 “Medical	
 products	
 containing	 viable	 human	 cells	 — 	 Application	
 of	
 risk	 management	
 and	
 requirements	
 for	
 processing	 practices”の定期見直しが 2015 年に行われる予定であったが、ISO のルール改訂が行われたため、その実施は不透明な状況であることも判明した。しかしながら、2015 年現在、SC	
 1 が活動再開を検討していることも判明しており、今後の活動状況を追跡しなければならないことも明らかとなった。	
 
	
  TC	
 198/WG	
 9 では細胞を含む製品を対象とした「無菌操作」に関する国際標準化文書の作成が進んでおり、既に DIS（Draft	 International	
 Standard）投票を 2 回終え、オーストラリアとドイツから、非常に多くのコメントが寄せられていることが確認された。しかしながら、投票国全てが賛成票を投じていたことから、その標準化文書発行のための条件は満たされていること、2015 年中に当該文書が発行される可能性があることが判明した。	
 
	
  TC	
 276 では「医療産業は業務範囲から除外する」ことになっているものの、WG	
 4“Bioprocessing”で、日本の再生医療イノベーションフォーラム（FIRM）を中心に再生医療等製品も含めたバイオテクノロジ
ー製品の製造プロセスに関連した標準化を目指した作業を進めていることが明らかとなった。また、WG	
 1
では、各国で定義されているバイオテクノロジー関連用語を収集・整理した「辞書」の作成に取りかかっているが、その用語対象の中に、再生医療等製品に関連するものが含まれていることが判明した。	
 図１．再生医療等製品関連の国際標準化状況	
 	
 「医療機器ソフトウェア」	
 	
  「医療機器ソフトウェア」に関しては、医療機器とソフトウェアとの異なる視点を統合して標準化を行わなければならないため、非常に複雑な状況となっていることが、初年度には明らかとなっている。
その中で、最も重要且つ影響度の大きい「医療機器の品質管理（QMS）」に関する国際規格（ISO	 13485）の改訂作業が ISO/TC	
 210 で進んでいるが、その改訂は医療機器全般に影響を及ぼすため予定よりも時間を要しており、2015 年中に二度目の DIS 投票を行うべく再改訂案（2nd	 DIS）の作成が行われている。この規格では参照文書としてソフトウェアの製品及びプロセス規格が明記されることになり、医療機器ソフトウェアが QMS の対象となりうること、それ以外に、図 2 に示したように、非常に多くのソフトウェ
ア関連規格が QMS に取り込まれることになっている。	
 	  また、QMS に引用される各種規格は IEC 単独ではなく、ソフトウェア関連の IEC/TC と ISO/TC との合同
ワーキンググループ（joint	 WG）で作成されていること、医療機器関連の規格となるにも拘わらず、ISO側からは医療情報を中心に取り扱っており、情報系の専門家が多数参加している TC	
 215 が関わっているケースが多いこと、TC	
 215 が参加する JWG	
 7 において、本来、Software	
 for	
 Medical	
 Device における設計・開発（ライフサイクル）プロセスのための規格であった IEC	
 62304 を Health	
 software	
 全般を対象にした改訂版（第 2 版）作成が開始されたこと等が明らかとなった。	
 図２．医療機器ソフトウェア関連の国際標準化状況	
 
	
 
(2)	
 国際標準化に対する医療機器関連企業の意識調査及び啓蒙活動	
 	
  初年度、医療機器業界団体を介して企業の国際標準化に対する意識を確認するためのアンケート調査を行い、得られた回答から企業の国際標準化に関する理解、姿勢等の現状について確認された主な事項を以下に示す。	
 	 ・	  「デジュール」標準が主流となっていることは理解している	 ・	  海外において国際標準化への取り組みが活発化していることは把握している	 ・	
  実際に、国際標準化に関わっている企業は少数である可能性が明らかとなった	 ・	
  上記企業においても、その取り組み度合いに大きな温度差があること、多くの企業で国際標準化に携わる人材への補助等を行っていないこと等が明らかとなった	 ・	
  国際標準化に取り組んでいない企業が挙げるその理由の多くが人材不足であった	 	 	  アンケートの結果から、企業からの国際標準化活動参加を活発化させて国際市場における日本企業の優位性を確保するためには、企業上層部の理解は不可欠であることが改めて明らかとなった。よって、これを解決する一つの手段として、国、具体的には経済産業省、厚生労働省や関係機関による企業上層部への啓蒙活動が考えられた。このことを受けて、法人や学会等で医療機器業界関係者や国際標準化に取り組んでいる関係者を対象に、初年度には講演会を開催、2 年度には学会等における発表・講演を 4 回行い、医療機器における国際標準化の現状報告とその重要性の啓蒙を行った。また、本事業を紹介する
総説・解説を医療機器関連の学会誌に寄稿した。	
 
	
 
E.考	
  察	
 
	
  国内外において上市されている再生医療等製品は数えるほどであり、且つ海外展開を行っている企業は存在しない（なお、欧州医薬局の審査により製造販売承認を得た ChondroCelect は EU 内の複数国で使用が認められているが、これは一般的な「海外展開」とは異なると判断した）。米国においても自家培養
表皮、自家培養軟骨が 1997 年に製造販売承認を得てから、新規の製品として実用化に至った例は数える程である。我が国では、J-TEC が 2007 年に自家培養表皮、2012 年に自家培養軟骨の製造販売承認を取得
したが、それ以外の製品は未だ上市されていない。培養表皮に関する研究が 1970 年代に開始されたことを鑑みると、我が国におけるその実用化には約 30 年を要したことになる。また、軟骨に関しても、実用化に繋がった研究が開始してから承認取得まで 20 年以上の時間を要していることから、再生医療等製品の実用化を加速するための規制や標準化等を含んだ環境整備を行う必要があると思われる。そのためには、まず、「再生医療等製品」の特性を理解し、その種類を明確にしておく必要がある。	
 	
  「再生医療」には大きく分けて 2 つのジャンルが存在する。一つが、細胞と人工物（Scaffold）、増殖因子等を組み合わせて、組織再生を試みる「組織工学」、もう一方が細胞のみを用いて組織再生を行う「細胞治療」である。それぞれの品質、安全性及び有効性を考慮するためには、両者を明確に区別した上で、両者に適用可能な各種評価方法の開発に加え、各々の製造工程や特性を鑑みた評価方法の開発と評価シ
ステムの構築が必要となる。これらを進めていくためには、今後、再生医療研究に携わっている全てのジャンルの研究者が垣根を越えて密に情報交換や共同研究を行い、必要な関連技術の開発や規制への取り込み、さらにはそれらの国際標準化を進めていくための組織構築が必要となる。	
 	
  現在、ISO の複数の TC、SC で再生医療の stakeholder らが集まり国際規格の作成を進めているという事実は、上記した「組織構築」の重要性を理解しつつ将来の海外展開を見据えた戦略を準備している国や企業があることを示唆している。現在、我が国における国策として推進されている健康・医療戦略において、医療分野における規制に利用可能な国際標準化の作成推進が掲げられていることを鑑みると、
今後、関連学会同士の密な連携の構築等、何らかの対策を講じて上述した問題を解決する方法を模索していく必要がある。	
 	
  作成された国際規格が実際に規制当局に利用されるか否かは別に議論しなければならないが、再生医療の実用化促進も上記戦略に挙げられていることから、我が国はこの分野で主導権を握っていく必要がある。そのためには stakeholder 間で情報及び認識を共有しつつ、上述した問題を解決し、戦略的且つ統一的に再生医療等製品の国際標準化に取り組んでいかなければならないことが明確となった。また、そのために、限られた human	 resource の有効活用、ISO/TC における標準化業務の集約化が重要課題であることが考えられた。	
 	
  現在、我々は、再生医療等製品と関連した標準化作業を行っている TC	 150/SC	
 7、TC	
 194/SC	
 1、TC	 198、TC	 276 国内委員会関係者及び関係省庁関係者との間で、再生医療等製品に関する国際標準化に関して統一した方向性と連動性を共有するための連携体制構築に、非公式ながら取り組み始めている。この活動が、今後の再生医療等製品関連の国際標準作成を戦略的な All	 JAPAN 体制で行うための土台となることを、我々は期待している。	
 	
  医療機器ソフトウェアの標準化も、現在、米国が主導権を握ってその作成を行っていることが示される調査結果を得た。しかしながら、医療機器としての標準化にも関わらず、ISO 側では主に情報系専門家で形成される TC	
 215 が関わっており、医療機器の特性を考慮しない規格が作成されるのではないかとの点が医療機器業界で危惧されていることが判明した。そのため、TC	
 215、あるいは joint	
 WG に医療機器業界からメンバーを送り込んでいる実態が明らかとなった。	
 	  ISO	
 13485 の改訂に伴い医療機器ソフトウェアが QMS の対象となりうること、その際の引用規格が非常に多くなることから医療機器ソフトウェアの製造工程管理が非常に複雑化する可能性が示唆された。しかしながら、ISO	
 13485 の改訂は、その作業が予定よりも遅れて進んでいることが明らかとなった。この遅れは、親規格である ISO	
 9001 の改訂版が 2015 年中に発行される可能性があること等、様々な懸念が存在しているためである。今後の改訂作業によっては、最終的に発行される改訂版における「医療機器ソフトウェア」関連の内容も改訂される可能性も存在する。	
 	  国内では、医薬品医療機器等法が施行されたことに伴い、QMS 省令も修正され現行の ISO	
 13485 との整合性が高められたばかりである。よって、ISO	
 13485 の改正が成立した場合、国内における QMS 省令の国際整合を再考慮しなければならない可能性がある。よって、医療機器ソフトウェアのみならず、医療機器分野全体の課題として ISO	
 13485 の改訂状況を注視していかなければならない。	
 	
  医薬品医療機器等法の施行に先立って、医療機器の基本要件基準も改正され、将来、医療機器ソフト
ウェアに関する国際標準を何らかの形で規制に取り込むことが示唆されている。よって、現在改訂中のIEC	
 62304 を中心とした医療機器ソフトウェア関連国際規格も規制において重要になることは明らかであり、我が国も産官学共同でこれらの規格作成に積極的に関与しなければならない状況になっていることが示唆されている。	
 	
  初年度、実施したアンケート結果で、医療機器企業関係者への啓蒙活動が必要であることが明らかとなったことから、医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙する目的で、講演会を１回、発表・講演を 4 回行った。行った講演は、それぞれ研究センター、学会、標準化関連団体、ISO 活動支援団体が主催したものであり、それぞれ国際標準化に関する興味の度合いは異なるものの、講演後の質疑で多数の質問が出たことから、その重要性を啓蒙することができたと思われる。	
 	
  企業内にも潜在的には国際標準化の重要性を感じている方々が多いことがアンケート結果から示唆されていたことから、企業を対象とした講演を実施できなかった面で啓蒙活動は十分ではなかったと思われる。よって、医療機器産業界を対象に同様の取り組みを行い、関係者、特に、企業上層部に直接国際標準化の必要性を訴えていく等の活動を実施することが、今後の課題である。	
 
	
 
F.結	
  論	
 
	
  「再生医療等製品」と「医療機器ソフトウェア」にテーマを絞り込み、現在行われている国際標準化
活動状況を取りまとめた。その結果、前者では製品開発に先行して「デジュール」規格の作成が始まっており、複数の ISO/TC で関連技術の国際標準化作成作業が活発化いること、後者においてはその標準化が QMS をも巻き込み複雑化しているが、その鍵となる ISO	
 13485 の改訂が滞っていることが明らかとなった。前者においては、我が国が主導権を握れる分野であり、製品の実用化に先立った「デジュール」
規格作成が活発化していることから、製品カテゴリーの明確化や All	 JAPAN 体制を構築し戦略的な活動を実施しなければならないことが明らかになった。後者においては、ソフトウェアを内包する医療機器も含め、その規制が厳しくなる可能性があることも示唆されたが、鍵となる ISO	
 13485 の改訂が遅れていること、それに伴いその内容に変更が生じる可能性が示唆された。ISO	
 13485 の改訂は、我が国における QMS 省令へも影響を及ぼす可能性があること、ソフトウェア関連国際標準をどのように規制に取り入れていくかを検討している段階であることから、今後、我が国も積極的にその作成に関与していかなけ
ればならないことが示唆された。	
 	
  医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙する目的で、国際標準化に対する企業の意識調査を
アンケートにより実施した。その結果、国際標準化に積極的な企業はあまり多くないことが明らかとなった。また、国際標準化に積極的に参画している企業であっても、目に見える形で担当者を評価している企業は少なく、担当者のモチベーション低下が危惧された。これらのことから、医療機器分野の国際標準化活発化のためには、国を挙げてのサポートだけではなく、企業上層部の意識改革を目的とした啓蒙活動を行う必要が示唆された。そこで、医療機器業界関係者及び団体等を対象に講演会を 1 回、研究
発表、講演を６回、学会誌への寄稿（総説 2 報）を行った。その結果、医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙することができた。	
 	
 G.健康危険情報	 	  特になし。	
 	
 H.研究発表	 1) 中岡竜介．ISO/TC	
 150/SC	
 7 の現状と課題．セラミックス，48(10):819-823	
 (2013)．	
 2) 中岡竜介、蓜島由二、新見伸吾．医療機器・材料の国際標準化動向．バイオマテリアル-生体材料，
33(1):56-63	
 (2015)．	
 3) Nakaoka	
  R.	
  Activities	  of	  standardi-	  zation	  for	
  tissue-engineered	  medical	  products	  in	
 International	  Organization	  for	
  Standardization	  (ISO),	
  Termis-AP	  2013	
  Annual	  Conference,	
 

4)
5)
6)

7)

Wuzhen,	
 China	 (2013.10).	
 中岡竜介．再生医療分野における国際標準化の現状とその展望について．第 13 回日本再生医療学会
総会（2014 年 3 月・京都）	
 中岡竜介、蓜島由二、新見伸吾．橋渡し研究及び国際標準化の行政的支援．第 53 回日本生体医工学会大会（2014 年 6 月・仙台）	
 中岡竜介．医療機器に関連した国際標準化状況について：ISO/TC	
 150（外科用インプラント）を中心に．「ISO/TC	
 150（外科用インプラント）とバイオセラミックスの国際標準化の状況」講演会（2015
年 1 月・東京）	
 中岡竜介．国際幹事経験談及び医療機器分野国際標準化の現状について．平成 26 年度第 2 回 ISO 国
際標準化研修	 ―	
 上級編（実践コース）（2015 年 1 月・東京）	
 	
 参照資料：特になし	
 	 Ⅱ．総合分担研究報告書②

	 歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	
 
	
 

大熊一夫	
 
日本歯科大学新潟生命歯学部	
 歯科理工学講座	
 総合分担研究報告書	 	
 平成 25,26 年度厚生科学研究費補助金/地球規模保健課題解決推進のための研究事業	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25-地球規模-指定-008）	
 
	
 
	
 
分担研究課題名	 歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	 	
 研究分担者	
  大熊	
 一夫	
  日本歯科大学新潟生命歯学部	
 歯科理工学講座	
 	
 研究協力者	
  蓜島	
 由二	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  蛯原	
 善則	
  株式会社ジーシー	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 Somchai	
 Urapepon	  マヒドン大学（タイ）	
 
	
 

	
 
A.研究要旨	 	  本研究では、「国際標準化機構(ISO)及び国際電気標準会議(IEC)における医療器機の各種国際規格の策定に関する研究(H23-地球規模-指定-003)	
 」において策定した「医療機器規格•基準の国際標準化戦略に係る政策的提言」を具体的に実行する一環として、新規規格の提案を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集するため、歯科分野におけるケーススタディを実施した。	
 	
  歯科界で注目されている医療器機である歯科用 CAD/CAM に関する規格を ISO/TC106/SC9 に日本から新規提案し、CD 化に至るまでの情報を収集した。本規格は、平成 25 年度 ISO/TC106 総会（インチョン会議）における新規提案を経て、平成 26 年 6 月に CD 案「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-aided	
 milling	 machines	
 –Test	 methods」の投票が行われ、賛成 9 カ国及び反対 3 カ国の結果をもって採択された。同年 9 月に開催された ISO/TC106/SC9/WG5	
 ベルリン会議では、Convener として、5 ヵ国によるインターラ
ボラトリーテストの結果報告及び各国から提出されたコメントに対応した。また、本 CD に新たな CMM 及びソフトウェアを追加することが提案され、2nd	
 CD へステージを進めた。	
 	
 B.研究目的	 	  従来、歯科分野において使用される殆どの修復物の材質は金属であった。これに変わる優良な修復材
料がセラミックスであり、ジルコニアセラミックスが開発された。ジルコニアセラミックスをコア材として用い、従来のセラミックスの強度を補強したセラミック修復物であるオールセラミッククラウンを作製するのに不可欠な機械が CAD/CAM である。歯科用 CAD/CAM は、1985 年にスイス・チューリッヒ大学のグループが、シーメンス社と共同で開発して世に送り出した CEREC システムが世界初であった。日本
国内では、通産省／NEDO（新エネルギー・産業技術総合開発機構）傘下のプロジェクトが開設される等、世界的にも、歯科界においても最も注目されているのが歯科用 CAD/CAM である。国内に眼を向けても、
平成 26 年 4 月に、コンポジットレジン冠として CAD/CAM が歯科診療報酬に採択された。近未来に歯科界のリーダーシップを獲得するため、平成 24 年度に開催された ISO/TC106/SC9 パリ会議において、日本からの新提案規格である「ISO/CD	 18845	
 Machining	 accuracy	
 od	
 computer-aided	
 milling	
 machine	
 –Test	 methods」の概要を説明した。平成 25 年度のインチョン会議を Ad-hoc	
 5 として開催し、平成 26 年度のベルリン会議を SC9/WG5 として開催した。ベルリン会議では各国から提出された CD に対するコメントに回答し、標準化を目指して活動した。	
 	
  本研究では、新規規格の提案を通じて国際標準化に必要な戦略を収集するため、歯科分野におけるケーススタディとして、日本からの新規提案規格である「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-aided	
 milling	 machine	 –Test	 methods」の国際標準化を目指して活動した（この規格のタイトルは CD 化に至る過程において変更された）。	
 	 C.研究方法	 	 	 	 (1)インターラボラトリーテスト	 	  平成 25 年度 ISO/TC106/WG5 会議（インチョン会議）において、タイと日本で実施した新規規格に準じて行った実験結果を報告し、実現可能な規格であることを報告した。そこで、CAD/CAM で作製したセラミック修復物の精度の評価方法の理解や改善のため、米国、タイ、ドイツ、スウェーデン及び日本の 5 カ国でインターラボラトリーテストを行うことになった。新規規格に記載した寸法の 1 級インレー用、2 級
インレー用、クラウン用及びブリッジ用金型から三次元データを取得し、切削用三次元データに変換し、半焼結ジルコニアセラミックブロックから CAD/	 CAM マシンを用いて修復物を作製した。作製した修復物
を金型に装着し、金型と修復物の変位量を測定し、修復物の精度の評価を行った。	
 	 (2)測定のための印記	 	  インチョン会議において、1 級インレー及びクラウンのような上面像が正対称の修復物の場合、測定を行う上で試料に印記する必要性が話題となった。そこで、最初の測定点を 0°とし、修復物と金型との変位量を測定した。同様に、45°、90°、135°、180°、225°、270°、315°毎に試料を回転させ、計 8点における修復物と金型との変位量を測定した	
 	 (3)CAD/CAM 材料の被切削面	
 	
  一定加工条件下における 4 種類の修復物材料（ジルコニア未焼結、ジルコニア本焼結、コンポジット
レジン及び純チタン）の被切削表面の画像を取得し、加工痕を評価した。通常、表面粗さの評価には表面粗さ計を用いるが、国際標準としての利用価値を高めるため、容易にデータを取得できる画像による解析法を採用した。ジルコニア未焼結の加工は Dry 条件下、加工ピッチ 0.1mm、仕上げ代 0.1mm、ジルコ
ニア用ダイヤコート、送り速度 500mm/min、工具回転数 2500min-1 で行い、ジルコニア本焼結、コンポジ
ットレジン及びチタンにおいても同一の加工条件で切削した。加工状態は被切削面を観察することにより評価した。	
 	 (4)ISO/TC106/SC9/WG5 ベルリン会議	
  	
  	
 
	
  平成 25 年インチョン会議では暫定 Convener であったが、平成 26 年ベルリン会議には Convener として出席し、CD 投票時に各国から寄せられたコメントに対して回答する等、会議を円滑に運営した。	
 	 D.研究結果	 (1)インターラボラトリーテスト	 	  インターラボラトリーテストには米国、タイ、ドイツ、スウェーデン及び日本の 5 ヵ国が参加したが、ベルリン会議までに作業が完了し、結果の報告に至った国はタイと日本のみであった。タイのクラウンと金型の変位量の測定結果は、ジルコニアセラミックスで平均＋0.08mm、コンポジットレジンで+0.50mm、ワックスで+0.08mm であった。日本のジルコニアセラミックスで作製した精度は+0.005mm であった。この差は変位量の測定機器の限界によるものである。加工精度は、被切削材料に影響されるが、日本から提案した方法により評価できることが確認された。	
 
	
 
(2)	
 測定のための印記	 	
  Ⅰ級インレーと金型との変位量の平均は+0.962mm であり、クラウンの場合は+0.422mm となった。Ⅰ級
インレーとクラウンの標準偏差は、それぞれ 0.074 及び 0.024 であり、変位量平均値の 1/10 程度の小さい値であった。また、測定回数（この場合角度が大きくなる）が多くなるほど、修復物と金型の変位量が減少する傾向が認められた。これらの成績から、測定のための印記は必要性ないことが確認された。	
 	 (3)CAD/CAM 材料の被切削面	
 	
  同一加工条件下におけるジルコニア未焼結とジルコニア本焼結の被切削面を比較すると、ジルコニア
本焼結の被切削面の中心部に十字用の大きな工具による痕が残ると共に、切削加工中に工具が破損する等、適正な加工条件でないことが判明した。一方、ジルコニア未焼結は切削工具の痕が認められず、適正な被切削面であることが確認された。同様に、コンポジットレジンは適正な被切削面、純チタンは不適正な被切削面であることが確認され、被切削面から適切な切削加工条件を評価できることが判明した。	
 	 (4)ISO/TC106/SC9/WG5 ベルリン会議	  	 	
  6 月に CD の投票が始まり、8 月に CD 投票が締め切られた。その結果、賛成 9 カ国、反対 3 カ国（オーストラリア、ブラジル及びスウェーデン）、棄権 2 カ国をもって、本 CD は採択された。	
 	
  反対票を投じたオーストラリアとスウェーデンは本 CD が「加工機の精度に特定した評価法」であることを理解しておらず、「システム全体」の評価法として誤認している可能性が考えられたため、事前の国内委員会において、「序文及び適用範囲」を修正した。国際会議にあたり、本修正版を事前に各国エキスパートへ回付した。	
 	  ベルリン会議は各国から寄せられたコメントに対する回答で始まった。会議中、概ね日本の提案については合意が得られたが、日本提案の金型を用いた測定方法でなく、CMM	
 (Coordinate	
 Measuring	
 Machine:
三次元測定機)及び三次元の元データと CAD/CAM で作製したセラミック修復物の三次元データの変位量の差を求めるソフトウェア法が米国から提案された。この結果、これらの項目を追加した 2nd	 CD にステー
ジアップすることになった。	
 
	
 
Ｄ．考	
  察	
 
	
  平成 22 年に開催された ISO/TC106	
 （リオデジャネイロ会議）におけるロビー活動の一環として、前Convener（故小倉英夫）がドイツ及び米国の代表者に歯科用 CAD/CAM の必要性及び重要性について説明
し、各国から内諾を得た。翌平成 23 年に開催された Plenary（フェニックス会議）において、新 SC（ISO/	 TC106/SC9：CAD/CAM	
 systems）の設立を日本が提案した。平成 24 年に新しい SC が開設され、昨年から高橋英和（東京医科歯科大学）がこの SC9 の暫定議長を務め、今年から 6 年間の任期で SC9 の議長に任命された。また、平成 24 年に開催された ISO/TC106（パリ会議）において、日本から提案した新たな規格である「Accuracy	
 evaluation	
 of	
 machined	
 dental	 restorations	
 using	 CAD/CAM」の概要を説明した。
日本から医療機器・技術・手法の新規提案を行う場合、内容や原文も重要であるが、それ以前のロビー活動が成功のための大きな因子であることを再確認した。	
 	  ISO/TC106 国際会議の進行は、投票の結果報告、各国からのコメントの回答の流れになる。TC106 の場
合、各国からのコメントに対する回答は、会議において初めて報告される事例が多い。しかし、今回はスムーズに会議を進行させると共に、日本からの提案に対する承認を得るため、コメントに従って内容を修正した規格案を会議前に各国エキスパートに会議資料として事前に回付した。また、米国代表団長
が議事録作成等を引き受けるに至るまでの信頼関係を築けたことも、会議がスムーズに進んだ要因である。ベルリン会議では、日本が提案した金型を用いる精度の測定方法のほか、CMM 及び三次元データの変位量を求めるソフトウェアを利用する方法が米国から提案されたため、これらの項目を追加した 2nd	 CDへステージを進めることになった。	
 	
  インターラボラトリーテストにも、大きな変化が生じてきた。以前ならば、インターラボラトリーテ
ストに参加表明した場合、全員（国）が結果を提出した。今回の場合、インターラボラトリーテストに参加表明したのは 5 ヵ国であったが、金型を日本から提供したにもかかわらず、実験結果を提出したのは 2 ヵ国（タイ及び日本）のみだった。タイの積極的な協力を得られた要因としては、実験担当者が個人的な知人であったことが挙げられる。一方、スウェーデンの様に測定を実施せず、代案を提出することなく、規格案に反対する国も存在するが、国際標準化を成功させるためには、このようなハードルも越えていかなくてはならない。	
 
	
 	
 	
 	
  最近では、ISO 事務局における作業の遅延が多いことから、作業早期進捗（3 年ルール）を公式な報告書に明示した。具体的には、1)投票結果が会議直前に判明し、資料の準備が不充分な状態で WG 会議を行うケース、2)投票結果の発表が会議に間に合わず、投票結果が未判明の状態で WG 会議を行うケース、3)
新たな提案を行う際、討議のベースとなる文書が準備されていないケース等、ISO 事務局から幾つか指導されている。これを受けて、WG レベルでの事前審議が活発化されることが予想される。今後、討議の場は WG 会議のみに留まらず、e-Committee を活用して文書を電子メールにて回付し、期限付きで各国エキ
スパートにコメントを求める等、迅速に作業を進める環境が急速に整備されることが容易に予測されるため、国内の審議態勢を整えることが急務である。	
 	
  日本から提案した医療技術を国際標準化するには、WG の Convener を獲得することが一つの近道である。
国際会議においては、様々な企業、研究者及び各国の規制当局が多種多様な意見を発信するが、Convener
はこれらの意見を取りまとめ、最終決定を下す権限を持っていることがその理由である。Convener を獲得する方法として、1)卓越したアイディアのもとに新しい WG を設立する、2)Convener の交代時期に相応の担当者を育成しておくことが挙げられる。国際標準化に関与する人材、特に Convener を養成するためには 5-10 年の歳月を要する。そのためには、政府、大学及び企業の多大な助成が必要であり、国家的なサポート体制を構築することが重要である。	
 
	
  	
 
F.結	
  論	
 
	
  インターラボラトリーテストの結果、CAD/CAM により作成されたセラミック修復物の加工精度は、日本が提案した CD「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-aided	
 milling	
 machine	
 –Test	 methods」により正しく評価できることが確認された。また、ベルリン会議（平成 26 年 9 月）における討議の結果、本提案規格に CMM とソフトウェアを追加して 2nd	 CD ステージに進めることとした。	
 	
  国際会議では、会議前の丁寧な説明及び会議資料の提供により、各国からの信頼を得ることが重要である。また、日本から提案した医療技術を国際標準化する一つの道は、WG の Convener を獲得することで
ある。	
 
	
 
G.健康危険情報	 	  特になし。	
 	
 H.研究発表	 	 1)Kameda	
 T,	
 Ohkuma	
 K,	
 Oda	
 H,	
 Sano	 N,	 Batbayar	
 N,	
 Terashima	
 Y.	
 Magnetic	
 fields	
 from	
 electric	 toothbrushes	
 promote	 corrosion	
 in	
 orthodontic	
 stainless	
 steel	 appliances	
 but	
 not	
 in	
 titanium	 appliances.	
 Dent	 Mater	
 J,	
 33:959-969	
 (2013).	
 	 2)Kameda	
 T,	
 Ohkuma	
 K,	
 Sano	 N,	 Terada	 K.	
 Electric	
 current	
 induced	 in	
 teeth	 by	 electromagnetic	 fields	 from	
 electric	
 toothbrushes	
 and	
 curing	 lights.	
 Orthod	
 Waves,	
 72:77-85	
 (2013).	
 	 3)Kameda	
 T,	
 Ohkuma	
 K,	
 Sano	 N,	 Shin	 Y,	 Terada	 K.	
 Modification	
 of	
 metallic	
 materials	
 for	
 a	
 white	 appearance	
 without	 coating	
 and	
 plating.	
 Orthod	
 Waves,	
 72:87-98	
 (2013).	
 	 4)Kameda	
 T,	
 Ohkuma	
 K.	
 Electromagnetic	
 fields	
 from	
 dental	 devices	
 and	
 their	 effects	
 on	
 human	 health.	
 J	 Electr	
 Electron	
 Syst,	
 3:118	 (2014).	
 	 5)小出未来，大熊一夫，蛯原善則，三吉	
 愛，小倉英夫.	
 Nd-YVO4 レーザーを用いたジルコニアコーピン
グの新しい加工法－プログラム修正した時の加工精度－.第	 61	
 回春期日本歯科理工学会学術講演会（2013 年 4 月・東京）．	
 	 6)小出未来，大熊一夫，蛯原善則，小倉英夫.	
 Nd-YVO4 レーザーを用いたジルコニア焼結体からコーピン
グを直接製作する方法.	
 日本補綴歯科学会設立 80 周年記念第 122 回学術大会（2013 年 5 月・福岡）．	
 	 7)亀田	
 剛，織田洋武，大熊一夫，佐野奈都貴，寺嶋縁里，佐藤	
 聡，寺田員人.	
 電動歯ブラシが発生する低周波磁界はマルチブラケット装置内に電流を誘導し，装置を腐食させる.	
 第 72 回日本矯正歯科学会（2013 年 10 月・松本）．	
 	 8)小出未来，大熊一夫，小倉英夫，宮川行男.	
 Nd:YVO4 ナノ秒レーザーを用いたジルコニアコーピングの新しい加工法.	
 第	 62	
 回秋期日本歯科理工学会学術講演会（2013 年 10 月・新潟）．	
 	 9)小出未来,	
 大熊一夫,	
 小倉英夫,	
 宮川行男 Nd:YVO4 レーザーを用いたジルコニアコーピングの新しい加工法	
  被照射面の熱処理後のラマン分光分析．日本歯科理工学会第 63 回春季学術講演会（2014 年
4 月・千葉）.	
 10)Koide	
 M,	
 Ohkuma	
 K,	
 Ogura	 H,	
 Miyagawa	
 Y.	
 A	
 new	
 method	
 for	
 fabricating	 zirconia	
 copings	
 using	 a	
 Nd:YVO4.	
 Dental	 Materials	
 Journal,33:422-429	
 (2014).	
 11)赫多	 清,	 大熊一夫,	
 宮川行男	
 陶材の咬合摩耗に及ぼす試験片支持材料の影響.第 64 回秋期日本歯科理工学会学術講演会（2014 年 10 月・広島）.	
 
	
 
参照資料	
 
	
 1)第 49 回 ISO/TC106 インチョン会議報告書．2013 年（通巻 34 号），日本歯科材料器械研究協議会，	
 2014．	
 	 2)第 50 回 ISO/TC106 ベルリン会議報告書．2014 年(通巻 35 号),日本歯科材料器械研究協議会，2015.	
 	
 Ⅱ．総合分担研究報告書③

	
 医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 
	
 
蓜島由二	
 
国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 総合分担研究報告書
平成 25,26 年度厚生科学研究費補助金/地球規模保健課題解決推進のための研究事業	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25-地球規模-指定-008）	
 
	
 
	
 
分担研究課題名	 医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	 研究分担者	
  蓜島	
 由二	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 	
 協力研究者	
 野村祐介	  	  国立医薬品食品衛生研究所	
 

金	
  	
  玲	
  	
  株式会社リボミック	
 

福井千恵	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

山﨑佳世	
  	
  民生科学協会	
 

小園	
  知	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

熊田秀文	
  	
  神奈川歯科大学	
 

河上強志	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

浜田信城	
  	
  神奈川歯科大学	
 伊佐間和郎	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

藤澤彩乃	
  	
  東京大学	
 

吉田	
  緑	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

鄭	
  雄一	
  	
  東京大学	
 

井上	
  薫	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

柚場俊康	
  	
  川澄化学工業株式会社	
 

森川朋美	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

坂口圭介	
  	
  テルモ株式会社	
 

市村亮平	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

谷川隆洋	
  	
  テルモ株式会社	
 

前田	
  潤	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

杉山知子	
  	
  テルモ株式会社	
 

高橋美和	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

犬飼香織	
  	
  テルモ株式会社	 小川久美子	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 竹ノ内美香	
  テルモ株式会社	
 

中村義一	
  	
  株式会社リボミック	
 

新藤智子	
  	
  食品薬品安全センター	
 

宮川	
  伸	
  	
  株式会社リボミック	
 

	
 
	
 
A.研究要旨	 	  本研究では、新規規格の提案や国際規格の改定作業を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集することを目的として、試験法及び材料開発分野において 3 件のケーススタディを実施した。	
 	
  試験法分野のケーススタディでは、ISO/TC194/WG9 において実施されている溶血性試験ラウンドロビン
テストを支援し、我が国の試験法を ISO10993-4 に取り込むように努力するため、処方を改良した溶血性試験用陽性対照材料 Genapol	
 X-080 含有 PVC シートを新たに作製し、その基本性能を検証した後、ラウンドロビン試験用標準品として提供した。本陽性対照材料の性能は良好であり、今後、ISO/TC194/WG12に国際標準品として新規提案する予定である。	
 	
  材料開発分野におけるケーススタディでは、ISO/TC194/WG11 における代替可塑剤の安全性評価に関する規格作成に対応するため、我が国が開発を進めている新規血液バッグの代替可塑剤である DOTP のラッ
ト亜慢性毒性試験を実施した。その結果、DOTP はいずれの臓器に対しても顕著な影響を与えず、その無毒性量は 300	
 mg/kg	 body	
 weight/day 以上と判定された。また、機能性蛋白質を選択的に捕捉する RNA
アプタマーを用いた革新的医用材料の開発研究においては、蛋白質間相互作用解析及び細胞内シグナル伝達解析により、生理活性を保持した状態で bFGF を補足する 3 種の RNA アプタマー（1p01、1p02 及び2p03）を選定したと共に、材料表面への固定化法を最適化した。bFGF 捕捉型 RNA アプタマー（1p01）固定化表面は細胞増殖促進機能を有することが確認されたことから、RNA アプタマーを利用することにより、医用材料に意図した機能を付与できることが明らかとなった。また、BMP2 捕捉型 RNA アプタマー候補の選定を行った結果、B10 と B24 が有力な候補となることが判明した。	
 	
 B.研究目的	 	  本研究では、新規規格の提案や国際規格の改定作業を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集することを目的として、医療機器関連業界と連携のもと、試験法分野及び材料開発分野において 3 件のケーススタディを実施した。	
 	
  試験法分野のケーススタディでは、ISO/TC194/WG9 が実施している溶血性試験に関する多施設国際共同
検証試験（ラウンドロビンテスト）を支援した。血液に接触する医療機器には安全性上の不具合を生じないよう、ISO	
 10993-4 において規定される血液適合性評価が求められているが、具体的且つ標準化された試験法が明記されていない点が大きな課題となっている。ISO	
 10993-4 文書としては、2002 年及び 2006
年に本体と Amendment がそれぞれ発行されたが、現在、ISO/TC194「医療機器の生物学的評価」技術委員
会では、WG9 が主体となって同文書の改訂作業を行っており、日本も積極的に参画している。溶血性試験の国際ラウンドロビンテストは、その一環として行われており、パイロット試験、ミニ試験を経て、総計 13 施設（海外 11 施設、国内 2 施設）が参画した本試験が完了した。	
 	
  材料開発分野におけるケーススタディとしては、代替可塑剤の安全性評価に関する研究を実施した。
現在、ISO/TC194/WG11 では、PVC 製医療機器の製造に利用される代表的な可塑剤である DEHP の毒性、化学分析法及び耐用摂取用量を取りまとめた ISO/PDTS	
 29741：Biological	
 evaluation	
 of	
 medical	 devices	 – 	
 Development	
 of	
 tolerable	
 intake	
 values	 for	
 Di(2-ethylhexyl)	
 phthalate	 (DEHP)文書の改訂作業を行っている。その一方、DEHP の使用についてはリスク回避の観点から欧州を中心に規制が強化される
方向にあり、特にフランスでは 2015 年から DEHP の使用が禁止される。日本の医療機器分野においてもリスク患者群の治療にあたっては代替機器又は代替可塑剤を利用した製品への切り替えが推奨されている。このような背景のもと、諸外国では安全性に優れた代替可塑剤を利用した PVC 製品の開発研究が活発に進められているため、PDTS	
 29741 文書の改訂作業が完了次第、代替可塑剤の安全性に関する議論がISO/TC194/	
 WG11 において開始されることが容易に予測される。そこで、我が国が開発を進めている新規
血液バッグの代替可塑剤である DOTH の安全性評価を通じて代替可塑剤に関する国際規格の作成に寄与することを目的として、同可塑剤のラット亜慢性毒性試験を実施した。	
 材料開発分野においては、RNA アプタマーを利用した革新的医用材料の開発研究も実施した。生体内に埋植される医用材料は材料表面に吸着する蛋白質層を介して細胞と相互作用するため、同蛋白質は材料の機能発現や生体適合性に大きく関与すると考えられている。それ故、成長因子や抗体等を固定化し、特定の機能を付与した材料表面も開発されているが、新しい医用材料として実用化には至っていない。
一方、核酸医薬分野では特定の蛋白質を特異的に捕捉し、その生理活性を阻害する RNA アプタマーが医薬品として上市化されている。SELEX 法により RNA アプタマー候補を選定する際に、その生理活性を保持した状態で標的蛋白質を特異的に捕捉する RNA アプタマーが多数ヒットする。すなわち、適切な RNA ア
プタマーを医用材料上に固定化することにより、特定の蛋白質を特異的且つ能動的に材料表面に捕捉し、その機能を制御できる可能性が非常に高い。そこで本ケーススタディでは、RNA アプタマーを用いた革新
的医用材料の創製を目指し、生理活性を保持した状態で bFGF 並びに BMP2 を特異的に捕捉する RNA アプ
タマーを選定すると共に、その機能を解析し、同アプタマーを固定化した材料表面上で細胞培養を行な
うことにより、RNA アプタマー材料の機能を評価した。	
 	
 C.研究方法	 (1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	
 1-1.溶血性試験用弱陽性対照材料の調製	
 	
  100 パーツの PVC に対して、DEHP	
 55 パーツ、ESBO	
 8 パーツ、ステアリン酸カルシウム及びステアリン
酸亜鉛 0.05 パーツのほか、1.0 及び 1.5 パーツの Genapol	
 X-080 を含有する 2 種類の可塑化 PVC パウダ
ーを調製した。Genapol	
 X-080 含有 PVC シート（Y-2 及び Y-3：厚さ 0.4	 mm）は同パウダーを利用してヒートプレス法（180℃）により作製し、本試験用標準品として WG9 に提供した。	
 	
 
1-2.溶血性試験ラウンドロビンテスト	 1-2-1.試験材料及び方法	
 ISO/TC194/WG9 から配布された 6 種類（Polyethylene:	
 PE,	
 Nitrile	 glove:	 NG,	
 Latex	 glove:	 LG,	
 Buna	 rubber:	
 BR,	
 Y-2,	 Y-3）の材料を使用した。各試験法のインキュベーション時間は、ラウンドロビンテ

スト用プロトコルに従い、ASTM 法（直接接触及び抽出液法）：3 時間、NIH 法（直接接触法）：1 時間、MHLW
法（抽出液法）：4 時間とした。血液試料としては、ウサギ血液及びヒト血液を使用した。国内からは、テルモ株式会社と食品薬品安全センターの 2 施設が参画し、それぞれ独立して試験を実施した。なお、海外からは 11 施設が参画した。	
 	
 1-2-2.倫理面への配慮	 	
  動物血液の採取については、所属機関が規定する動物実験指針に従い、動物に対する苦痛が最小となるよう務めた（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団/動物実験実施施設認証認定番号：食品薬品安全センター/12-005、テルモ/12-030）。動物実験にあたっては、動物実験倫理委員会の承認を得て実施した（食品薬品安全センター/承認番号 1120331A	
 ・114002A、テルモ/承認番号 120163・140070）。食品薬品
安全センターにおいて実施したヒト血液を使用した試験は同センター倫理審査委員会の承認を得て行った（承認番号：H2014-01A）。テルモはヒト血液を使用した製品評価（血液適合性評価）を実施するにあたり、社内倫理委員会による審査を必要としない。	
 	 (2)ケーススタディ 2：代替可塑剤の安全性評価/DOTH のラット亜慢性毒性試験	
 2-1.動物実験及び病理解析	
 訓化した 5 週齢の SD 系雄ラット（8 匹/群）に DEHP（5000	
 ppm）及び種々の量の DOTH（0,	
 5,	
 50,	
 500,	
 5000	 ppm）を 13 週間混餌投与した。イソフルラン麻酔下、BD 社製バキュティナ採血管（16	
 mm	
 SST 採血管血清分離剤入）に断頭採血し、放血殺後の動物を用いて、全身諸臓器の詳細な病理肉眼的検査を実施した。脳、胸腺、心臓、脾臓、肝臓、副腎(両側)、腎臓(両側)、精巣(片側)、精巣上体(片側)及び前立
腺副葉については重量測定を行い、絶対及び体重値に対する相対重量を算出した。	
 病理肉眼的検査後、精巣(片側)及び眼球(両側)を除く以下の臓器を 10%中性緩衝ホルマリン液により固定した。精巣はブアン液、眼球はダビットソン液を用いて固定した。固定後の各臓器は、切り出し後、常法に従って脱水、パラフィン包埋して薄切し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を施して、光学顕微鏡にて病理組織学的検索を行った。	
 	
 2-2.精子数測定	 	  ラット右精巣上体を採取後、PBS（4.5	
 mL）中で細切し、37%ホルマリンを 0.5	 mL 加えて固定化した。
同溶液 10	
 µL に 20	 µM	 Hoechst	
 33258 含有 PBS（90	 µL）を添加し、室温下 15 分間放置して細胞核を蛍光染色した後、キーエンス社製 BZ-9000 を利用して細胞数を計測した（測定波長：Ex	 360	
 nm／Em	 460	 nm）。	 	
 2-3.ホルモン測定	 	
  採取血液を室温下 30 分間放置後、遠心分離して調製した血清を試料として、テストステロン、エスト
ラジオール E2、卵胞刺激ホルモン（FSH）甲状腺ホルモン（TSH）を ELISA により定量した。テストステロン、FSH 及び TSH は Endocrine	 Technologies 社製キット、エストラジオール E2 は Enzo	 Life	
 Sciences
社製キットを利用して測定した。	
 	
 2-3.倫理面への配慮	 	
  国立医薬品食品衛生研究所が規定する動物実験に関する指針に従い、動物に対する苦痛が最小となるよう務めた。動物実験にあたっては、動物実験倫理委員会の承認を得て実施した（承認番号 434）。	
 	 (3)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 3-1.bFGF 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 3-1-1.RNA アプタマー/bFGF/FGFR1 三者複合体形成能の評価	
 すでに得られている bFGF に特異的に結合する RNA 配列の中から、10 種の RNA アプタマー候補（1p01,	
 1p02,	
 1p03,	
 1p07,	
 1p41,	
 2p03,	
 2p04,	
 2p05,	
 2p10,	
 2p11）を選定し、合成した。また、陽性対照として、bFGF と結合し、その生理活性を阻害する bFGF	
 Aptamer(bFA)と、結合活性の無いランダム配列である 40N も同様に合成した。RNA 合成においては、3ʹ′末端に 16	
 nt の Poly	
 A が付加されるようにデザインした。RNA アプタマー/bFGF/FGFR1 三者複合体形成能は、BIAcore	 2000 を用いた表面プラズモン共鳴法（SPR）によって評価した。センサーチップとしては、ストレプトアビジン固定化チップ（SA チップ）を用いた。同チップに 5ʹ′末端ビオチン標識 Poly	
 dT（pdT）を結合させた後、リガンドとなる RNA の 3ʹ′末端に存在する Poly	 A と pdT の塩基対形成により SA チップに候補アプタマーを固定化した。本 SA チップを利用して、RNA アプタマー候補と bFGF との結合能を評価した後、FGFR1 を添加して三者複合体形成能を評価した。	 	
 3-1-2.bFGF の生理活性に及ぼす RNA アプタマーの影響評価	
 	
  BIAcore 解析において、bFGF との複合体形成能を有することが認められた候補アプタマーと bFGF を添加した培地を利用して、マウス線維芽細胞（NIH3T3）を培養した。刺激開始から 30 分後に細胞を回収し、ウェスタンブロッティング法により FRS2 及び ERK のリン酸化状況を観察した。抗体としては、P-FRS2 及び P-ERK に対する特異的抗体を利用した。	
 	
 3-1-3.RNA アプタマー固定化材料の機能評価	 	
  両末端にそれぞれ SH 基とカルボキシル基を有するポリエチレングリコール 5000（PEG5k）を常法に従って、金コートしたガラス板上に固定化した後、カルボジイミド法により、1p01 及び pdT を結合させた。
同材料上でヒト間葉系幹細胞（hMSC）及び NIH3T3 を培養した。培地は DMEM 及び MSCGM、血清は 5%ヒト
血清（HS）及びウシ胎児血清（FBS）を用いた。染色には Hoechst	
 33258 を用い、BZ-9000 を用いて核数を計測することで細胞増殖能を評価した。	
 	
 3-2.BMP2 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 3-2-1.RNA アプタマー候補の選定	
 BMP2 に対する RNA アプタマーの選定は SELEX 法によって行なった。RNA にヌクレアーゼ耐性を付与するため、ピリミジン残基のリボースに 2ʹ′F 修飾を施した dNTP を取り込める変異体酵素を用い、転写反応を行なった。SELEX は各種金属イオン（Ca,	
 Mg,	
 Na 及び K イオン）を共存させた条件で行ない、得られた配列のシークエンス解析を行なった。解析結果を ClustalW によってグルーピングし、各グループの配列に対して、プログラム Mfold 及び RNAfold を用いて二次構造解析を行ない、BMP2 結合に必要な構造モ
チーフを検索した。	
 	
 3-2-2.RNA アプタマー候補の BMP2 結合能評価	
 SELEX 法によって得られた RNA アプタマー候補と BMP2 の結合能を電気泳動移動度シフトアッセイ法（EMSA）及び SPR によって評価した。EMSA では二価のイオンの有無の違いによる影響を調査するために、泳動用緩衝液は Mg イオン存在下及び非存在下の 2 条件で行なった。SPR による相互作用解析では、
BIAcore3000 を用い、bFGF のケースと同様に SA チップ及びビオチン標識した pdT を用いて評価した。	
 	
 D.研究結果	 (1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	
 1-1.Genapol	
 X-080 含有 PVC シートの性能評価	
 	  Genapol	
 X-080 含量の異なる 3 種の PVC シートを作製し、その溶血誘導能を評価した結果、直接接触法を利用した ASTM 法及び NIH 法では、Genapol	
 X-080 添加量に比例して溶血率が増加した。抽出液法を利用した場合、1.5 及び 10 パーツ添加標品は ASTM 法及び MHLW 法ともに完全溶血を惹起したが、1.0 パー
ツ添加標品の溶血率はそれぞれ 86.8%及び 49.9%であり、1.5 及び 10 パーツ添加標品と比較して溶血性が低いことが確認された。	
 	
 1-2.溶血性試験国際ラウンドロビンテスト	 	  パイロット試験及びミニ試験を経て、平成 26 年度に本試験を実施した。総計 13 施設において試験を実施したが、集計が完了していないため、国内 2 施設が行った試験結果を示す。	
 	
 1-2-1.陰性対照及び強陽性対照の試験結果	
 	
  陰性対照材料である PE は、ヒト血液及びウサギ血液を利用した評価系ともに、全ての試験法において溶血能を示さなかった。強陽性対照材料である NG は、ヒト血液及びウサギ血液を利用した評価系において、ASTM/直接接触法及び ASTM/抽出液法ともに、ほぼ 100%の溶血率を示した。NIH/直接接触法の場合、

ウサギ血液を利用した評価では完全溶血が観察されたが、ヒト血液を使用した試験系の溶血率は若干低
く、51.4%であった。一方、NG の溶血特性をウサギ血液及びヒト血液を利用した MHLW/抽出液法により評価した時の溶血率は、それぞれ 6.6%及び 2.0%であった。	
 	
 1-2-2.弱陽性対照材料の試験結果	
 	
  LG の溶血特性を最も感度良く検出できる試験法は NIH/直接接収法であり、ウサギ血液及びヒト血液を利用した試験系における溶血率は、それぞれ 30.5%及び 13.5%に達した。LG の溶血特性は ASTM/直接接触法においても探知可能であった（ウサギ血液：7.6%，ヒト血液：7.7%）。一方、抽出液法は LG の溶血特性を十分探知できず、ASTM/抽出液法及び MHLW/抽出液法において観察された溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、それぞれ 2.6%/0.5%及び 0.6%/0.3%であった。	
 	  BR の溶血特性は ASTM/直接接種法において最も感度良く検出された（ウサギ血液：6.9%，ヒト血液：4.9%）。ASTM/抽出液法、NIH/直接接触法及び MHLW/抽出液法における溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、それぞれ 2.3%/0.9%、3.4%/1.1%及び 0.5%/0.5%）であった。	
 	
  ASTM 法は Y-2 の溶血特性を感度良く検出することが可能であり、直接接種法及び抽出液法における溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、それぞれ 9.3%/8.8%及び 13.1%/12.7%であった。NIH/直接接種法と MHLW/
抽出液法の感度は、ほぼ同等であり、両試験法において観察された溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、それぞれ 3.0%/3.0%及び 1.0%/2.5%であった。	
 	
  Y-3 は ASTM/抽出液法及び MHLW/抽出液法において強溶血を示し、両試験法における溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、それぞれ 94.5%/95.1%及び 86.3%/86.6%に達した。直接接触法による検出感度は抽出液法と比較して低く、ASTM/直接接触法及び NIH/直接接触法における溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、それぞれ 49.7%/39.9%及び 15.6%/11.9%であった。	
 	 (2)ケーススタディ 2：代替可塑剤の安全性評価/DOTH のラット亜慢性毒性試験	
 2-1.体重及び摂餌量の変動	
 	
  投与期間中の発育状況は全群ともに良好であり、体重推移及び摂餌量については各実験群間に有意差が認められなかった。なお、DOTH	
 5000	
 ppm 投与群の DOTH 平均摂取量は 300	
 mg/kg	 body	
 weight/day で
あった。	
 
	
 
2-2.臓器重量	 DOTH 投与群は、対照群（DOTH	 0	 ppm）と比較して、全群ともに各臓器の絶対重量及び相対重量に有意な変動を示さなかった。DEHP 投与群では、いずれの臓器も絶対重量に有意差は認められなかったが、相対重量において、肝臓では 18%、腎臓では 14%程度の軽度な増加が観察された。	
 	
 2-3.病理肉眼的検査	
 投与による病理肉眼所見はいずれの臓器ともに認められなかったが、脂肪肝を示す個体が対照群を含む
いずれの群においても散見された。	
 	
 2-4.病理組織学検査	
 病理組織学的検査において、DEHP 投与群の肝臓に軽度なびまん性肝細胞肥大が 8 例中 7 例認められた。
この肝細胞肥大は統計学的に有意な増加であった。また、肝細胞肥大を示す肝細胞は、やや顆粒状で好酸性を呈していた。対照群（DOTH	 0	 ppm）及び DOTH	
 5000	
 ppm 投与群においては異常が認められなかっ
た。	
 
DOTH	
 5000	
 ppm 投与群の精巣については、いずれの個体ともに正常な精子形成像が認められ、精子形成ステージの構成細胞にも投与による異常は認められなかった。精巣上体については、精巣上体管腔内に細胞残差が散見される個体が観察された。DEHP 群では 3 例であったが、対照群においても 2 例認められた。また、変化の程度は、いずれも管内に数個以下と軽度であった。この細胞残差は正常でも 1 個程度は認められた。	
 
相対重量で有意な増加が認められた腎臓については、皮質及び髄質いずれの部位においても投与による変化は認められなかった。その他、比較的発生頻度の高かった病理組織学的変化として、小葉周辺性の肝細胞脂肪化、肝臓のマクロファージやリンパ球を主とする単核球浸潤、前立腺のびまん性/限局性リンパ球浸潤、限局性心筋炎がいずれの群にも認められた。しかし、いずれも対照群と同程度の発生であり有意差は認められなかった。	
 	
 2-5.精子数及びホルモン変動	
 	  右精巣上体中に存在する精子数を計測した結果、個体毎のばらつきが大きく、各実験群間に有意差は認められなかった。また、血清中に存在するテストステロン、エストラジオール E2、FSH 及び TSH 量を
ELISA により定量した結果、実験群を問わず、いずれのホルモンともに大きな変動は観察されなかった。	
 	 (3)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 3-1.bFGF 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 3-1-1.RNA アプタマー/bFGF/FGFR1 三者複合体形成能の評価	
 BIAcore を用いて bFA 及び RNA アプタマー候補と bFGF との相互作用を解析した結果、bFA 及び RNA ア
プタマー候補の全てが bFGF に結合することが確認された。さらに FGFR1 を添加して三者複合体形成状況を検討した結果、bFA では FGFR1 添加による RU 値の影響は観察されなかったが、RNA アプタマー候補では FGFR1 添加により、RU 値の低下が観測された。	
 	
 3-1-2.bFGF の生理活性に及ぼす RNA アプタマーの影響評価	
 	
  BIAcore を利用した bFGF/FGFR1 結合能解析結果に基づいて、bFA、40N、1p01、1p02、1p07、2p03、2p05
及び 2p11 の bFGF 細胞刺激阻害能の評価を行なった。その結果、bFA、1p07、2p05 及び 2p11 では P-FRS2
抗体と P-ERK 抗体を用いたウエスタンブロットによりバンドが確認されなかったが、40N、1p01、1p02 及び 2p03 では FRS2 と ERK のリン酸化体が検出された。これらの結果から、1p01、1p02 及び 2p03 は、bFGFの生理活性を保った状態で bFGF を補足する RNA アプタマーであることが判明した。	
 	
 3-1-3.RNA アプタマー固定化材料の機能評価	
 生理活性を損なうことなく bFGF を補足する RNA アプタマー1p01 及び陰性対照の pdT をコートした材料
上で細胞培養を行なった結果、5%	
 HS 条件下では NIH3T3 並びに hMSC ともに、1p01 コートした材料表面
上で細胞数が多く観測された。また、5%	
 FBS/DMEM 培地条件下で hMSC を培養した場合には同様に 1p01 コ
ート材料の方が pdT コート材料よりも細胞数が多く観測されたが、同細胞を 5%	
 FBS/MSCGM 培地で培養した場合では 1p01 コート材料及び pdT コート材料ともに、ほぼ同じ細胞数であった。	
 
	
 
3-2.	
 BMP2 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 3-2-1.RNA アプタマー候補の選定	
 BMP2 に結合する RNA 候補を SELEX 法によって選定し、72 クローンの配列解析を行ない、それらについて ClustalW を用いたグルーピング解析を行なった結果、5 種類の配列に収束していることが明らかとなった。これら 5 種類の配列（B10,	
 B20,	
 B24,	
 B32 及び B37）についてプログラム Mfold 及び RNAfold を用い、二次構造解析を行なった結果、それぞれが異なった構造を形成していることが予測された。	
 	
 3-2-2.RNA アプタマー候補の BMP2 結合能評価	
 	
  SELEX 法によって得られた 5 種類の配列と BMP2 の結合能について、EMSA により評価した結果、二価のイオンが存在していない条件下では、BMP2 が加わるとスメアな複合体バンドが観測された。一方、Mg2+
イオン存在下で EMSA を行なった結果、B10 及び B24 において、明瞭な複合体のバンドが確認できた。また、SPR による解析の結果では、すべての RNA アプタマー候補が同程度で BMP2 に結合することが確認さ
れた。	
 
	
 
E.考	
  察	
 
(1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	 	  ラウンドロビンテストのプロトコルは、医療機器の溶血性試験のために国際的に広く用いられている
ASTM 法、NIH 法及び MHLW 法の 3 法から構成されている。NG は強陽性対照材料であるが、MHLW/抽出液法の検出感度は、その他の試験法と比較して大きく劣ることが確認された。LG 及び BR は主に直接接触法における弱陽性対照材料として配布された試料であり、本試験においても、その溶血特性が明瞭に示された。

これらの現象は、事前に行ったパイロット試験においても確認されている。	
 	
  一方、我々が提供した Y-2 及び Y-3 は、直接接触法及び抽出液法のいずれにおいても弱陽性対照材料として利用することが可能であり、試験法に応じて、両者を使い分けることにより、試験系の評価を行うことができることが判明した。	
 	  ウサギ血液とヒト血液は多くの試験法において、ほぼ同等の感度を示した。しかし、NIH/直接接触法では、ウサギ血液を利用した試験系の方が感度的に優れていることが確認された。	
 	 (2)ケーススタディ 2：代替可塑剤の安全性評価/DOTH のラット亜慢性毒性試験	
 SD 系雄ラットを用いて DOTH 及び DEHP を 13 週間混餌投与した結果、投与による影響は、肝臓における相対重量の増加、びまん性の肝細胞肥大として DEHP 群にのみ観察された。DOTH 投与群には同様の変化は認められなかった。同変化は、肝細胞が顆粒状/好酸性でびまん性に肥大していると共に、DEHP が PPAR
α作用を有することが明らかになっていることから、Peroxisome の増加に起因することが示唆された。
小葉周辺性の肝細胞脂肪化は、本試験において使用した SD 系ラットの雄で体重増加及び加齢により増加する変化である。対照群及び DOTH 群のみに認められた脂肪化は、通常の 13 週間反復投与毒性試験の背景値と比較して若干進行していると考えられた。肝細胞脂肪化は、高脂肪食や高カロリー摂取で観察されることから、この脂肪化は飼料に起因する可能性が示唆された。また、DEHP 群では脂肪化が殆ど認められなかったが、これは上記のとおり、投与による肝肥大が誘発されているためと考えられた。	
 
本試験では、DEHP 及び DOTH 投与群ともに、精巣における病理組織学的変化は観察されなかった。精巣
上体管腔は、軽度な精子形成異常や精細管変性が生じた場合、変性した精上皮細胞が腔内に増加することから、精巣毒性を検出する鋭敏な部位とされているが、今回いずれの投与群においても精巣上体に精巣への影響を示唆する所見は認められなかった。これらの結果から、今回の投与条件下では、DOTH 及び
DEHP ともに精巣への影響は認められないと結論した。我が国において定められた DEHP の経口摂取 TDI 値
は 40-140	
 µg/kg/day であり、その上限値と下限値はそれぞれ Poon ら及び Lamb らの報告に基づいて決定された。本研究は Poon らの報告に準拠して実施したが、DEHP が精巣/生殖毒性を発現する用量は報告毎に異なっているため、今後実施する代替可塑剤の毒性試験においては、Lamb らの報告に従って投与量を設定する。	
 その他の各臓器に認められた病理組織学的変化については、対照群と同程度であり有意差は認められなかったことから、投与に関連した増加とは考えられなかった。肝細胞脂肪は肉眼的な脂肪肝に対応す
る変化と考えられた。	
 	 (3)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 本研究では、RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製を目指し、生理活性を保持した状態で bFGF
及び BMP2 を補足する RNA アプタマーを選定し、新規医用材料としての有用性を評価した。	
 bFGF に結合する RNA アプタマー候補と bFGF、FGFR1 との相互作用を BIAcore により解析した結果、RNAアプタマー/bFGF 複合体形成が観測された。同複合体に FGFR1 を添加した際、bFA/bFGF の場合では RU 値に変化が観測されなかったことから、同複合体に FGFR1 が結合できないことが確認された。これは、bFGFの FGFR1 結合部位に bFA が強く結合するため、FGFR1 が結合できないことに由来すると思われる。一方、RNA アプタマー候補と bFGF の複合体の場合では、FGFR1 添加に伴い RU 値が低下したことから、bFGF/FGFR1
複合体が優位に形成され、bFGF が RNA アプタマーから解離したことを示唆している。本来の目的として、
RNA アプタマー固定化材料表面に捕捉された bFGF が、細胞膜上に存在する FGFR1 と結合した後に RNA ア
プタマーから解離した場合でも、bFGF シグナル伝達が正常に稼働する環境であれば機能性材料としての性能は確保される。NIH3T3 細胞に対する bFGF の細胞刺激阻害試験を行なった結果、1p01、1p02 及び 2p03
は bFGF の生理活性を阻害しないことが確認された。この結果は BIAcore 解析において得られた成績とも一致していることから、この 3 種類の RNA アプタマーの中から 1p01 を選定し、機能性材料の開発を進めた。RNA アプタマー1p01 及び陰性対照の pdT を材料表面上に固定化し、同材料上で細胞培養を行なった。
その結果、ほぼ全ての条件下で陰性対照である pdT に比べて、1p01 コート材料は細胞増殖促進効果を有することが認められ、意図した機能を発揮していることが示唆された。今後、同材料表面上の吸着蛋白質解析等を進めると共に、本 RNA アプタマーとコラーゲンとの複合材料を作成し、ラット埋植試験等を行ない、RNA アプタマー材料の有効性及び安全性を評価することにより、革新的医用材料として提案する
ための検証データを収集する。	
 BMP2 に対する RNA アプタマーを用いた材料開発のため、SELEX 法により、BMP2 に結合する RNA アプタ
マー候補を選定した。得られた RNA について配列解析を行なった結果、アプタマー候補は 5 種類の配列に収束しており、それら RNA アプタマー候補の二次構造上に共通の構造モチーフが保持されていないことから、それぞれが特有の構造を形成していることが示唆された。これらの RNA アプタマー候補と BMP2の相互作用を EMSA によって評価した結果、B10 及び B24 は Mg2+イオン存在下において明瞭な複合体のバンドが見られたことから、この 2 つの RNA と BMP2 と結合については Mg2+イオンが重要な役割を果たしていることが明らかである。ヒト IgG に対する RNA アプタマーにおいては複合体形成に Mg2+もしくは Ca2+
イオンが必要であることから、B10 及び B24 の RNA アプタマー候補においても、Mg2+イオンが BMP2 との複合体形成に必要であることが示唆された。一方、SPR による相互作用解析では、いずれの RNA アプタマー
候補ともにランダム配列よりも強い結合を示した。本研究における SPR 及び SELEX の条件下では、Mg2+,	
 Ca2+,	
 K+及び Na+イオンが共存するため、B10、B24 以外の RNA アプタマー候補については、Mg2+イオンとは別のイオンに依存した構造形成能を持つ可能性が示唆された。今回得られた 5 種類の RNA アプタマー候補は、二次構造予測の結果から共通の構造モチーフが見られず、相互作用解析での挙動が同じではないことから、それぞれが異なった機構で BMP2 と結合していると考えられた。今後、5 種類全ての RNA を用いてシグナル伝達阻害等の評価を行う。また、二次構造予測の結果に基づいて短鎖化した RNA についても同様の解析を行うと共に、金属イオン依存性についても検討する。	
 
	
 
F.結	
  論	
 
(1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	 	
  我々が開発した弱陽性対照材料（Y-2 及び Y-3）は、直接接触法及び抽出液法のいずれにおいても弱陽性対照材料として利用することが可能であり、試験法に応じて、両者を使い分けることにより、試験系の評価を行うことができることが判明した。Y-2 及び Y-3 の対照材料としての性能が世界的に確認されたことから、今後、強陽性対照材料である Y-4 と合わせて、ISO/TC194/WG12 に国際標準品として新規提案
する。	
 
	
 
(2)ケーススタディ 2：代替可塑剤の安全性評価/DOTH のラット亜慢性毒性試験	
 代替可塑剤の安全性を評価する一環として、SD 系雄ラットを用いて DOTH 及び DEHP を 13 週間混餌投与した結果、投与による影響は、DEHP 投与群の肝臓にのみ観察された。DOTH については、いずれの臓器においても投与による影響は認められず、その無毒性量は 300	
 mg/kg	 body	
 weight/day 以上と判定された。
	 (3)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	 	
  bFGF 捕捉型 RNA アプタマー1p01 は、細胞増殖促進機能を有することが確認されたことから、新規医用材料の開発において有益なツールになることが示唆された。また、BMP2 に結合する RNA アプタマー候補として、5 種類の有力な配列を選定することができた。
	 
G.健康危険情報	 	  特になし。	
 	
 H.研究発表	 1)Haishima	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Fukui	
 C,	
 Tanoue	
 A,	
 Yuba	 T,	 Ozono	 S,	
 Kumada	 H,	
 Inoue	 K,	
 Morikawa	
 T,	
 Takahashi	
 M,	
 Fujisawa	
 A,	
 Yamasaki	
 K,	
 Nomura	 Y,	
 Isama	 K,	
 Chung	 U,	
 Ogawa	
 K,	
 Niimi	
 S,	
 Yoshida	
 M.	
  Characterization	  of	  alternative	  plasticizers	  in	  polyvinyl	  chloride	
  sheets	  for	
  blood	 containers.	
 	
 J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.,	
 in	
 press	 (2015).	
 	 2)Haishima	
 Y,	
 Hasegawa	
 C,	
 Nomura	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Yuba	 T,	 Shindo	
 T,	
 Sakaguchi	
 K,	
 Tanigawa	 T,	
 Inukai	 K,	
 Takenouchi	
 M,	
 Isama	 K,	
 Matsuoka	
 A,	
 Niimi	 S.	
 	 Development	
 and	
 performance	
 evaluation	
 of	
 a	
 
positive	 reference	
 material	
 for	
 hemolysis	 testing.	
 	 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:1809-	
 1816	
 (2014).	
 	 3)Haishima	  Y,	  Kawakami	  T,	  Hasegawa	  C,	  Tanoue	  A,	  Yuba	  T,	  Isama	
  K,	  Matsuoka	  A,	  and	
  Niimi	  S.	
 	 Screening	  study	
  on	
  hemolysis	  suppression	  effect	
  of	
  an	
  alternative	  plasticizer	
  for	
  the	
 development	
 of	
 a	
 novel	 blood	 container	 made	 of	
 polyvinyl	
 chloride.	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	 B,	 102B:721-728	
 (2014).	
 	 4)蓜島由二．第 1 部：医療機器市場の拡大と新規製品の開発：開発，上市化，市場確保において留意すべきポイント．生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バイオマテリアルの設計・開発戦略（監修：田中	 賢）．サイエンス＆テクノロジー，pp.3-21	
 (2014)．	
 	 5)中岡竜介，蓜島由二，新見伸吾．医療機器・材料の国際標準化動向．バイオマテリアル-生体材料，
33(1):56-63	
 (2015)．	
 	 6)野村祐介，福井千恵，戸井田	
 瞳，新見伸吾，宮川	
 伸，金	  玲，中村義一，蓜島由二．RNA アプタマーを用いた新規医用材料の開発．第 36 回日本バイオマテリアル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 	 7)野村祐介，福井千恵，柚場俊康，新藤智子，坂口圭介，谷川隆洋，杉山知子，竹ノ内美香，新見伸吾，
蓜島由二．簡易溶血性試験法の性能評価と公定法との比較検証．第 36 回日本バイオマテリアル学会
大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 	 8)蓜島由二，福井千恵，山﨑佳世，野村祐介，小園	
 知，熊田秀文，藤澤彩乃，井上	
 薫，森川朋美，市村亮平，前田	 潤，高橋美和，河上強志，伊佐間和郎，柚場俊康，鄭	
 雄一，小川久美子，新見伸吾，
吉田	
 緑．新規血液バッグ用代替可塑剤 DOTH のラット亜慢性毒性試験．第 36 回日本バイオマテリア
ル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 	 9)蓜島由二，河上強志，福井千恵，田上昭人，柚場俊康，向井智和，野村祐介，伊佐間和郎 1，新見伸吾．新規血液バッグ素材 DOTH/DINCH 配合 PVC シートの性能評価．第 36 回日本バイオマテリアル学会
大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 10)中岡竜介，蓜島由二，新見伸吾．橋渡し研究及び国際標準化の行政的支援．第 53 回日本生体医工学会大会（2014 年 6 月・仙台）．	
 11)蓜島由二，福井千恵、山﨑佳世、野村祐介、小園	
 知、熊田秀文，藤澤彩乃，井上	
 薫，森川朋美，市村亮平，前田	 潤，高橋美和，河上強志，伊佐間和郎，柚場俊康，浜田信城，鄭	
 雄一，小川久美子，
新見伸吾，吉田	
 緑．DEHP 代替可塑剤を利用した新規血液バッグの開発：ラット精巣に及ぼす DOTP の影響評価．日本薬学会第 134 年会（2014 年 3 月・熊本）．	
 12)野村祐介，河上強志，福井千恵，柚場俊康，新藤智子，坂口圭介，谷川隆洋，犬飼香織，竹ノ内美香，
伊佐間和郎，松岡厚子，新見伸吾，蓜島由二．溶血性試験用陽性対照材料 Genapol	
 X-080 含有 PVC シートの性能評価．第 35 回日本バイオマテリアル学会大会（2013 年 11 月・船堀）．	
 13)特願 2013-104082（平成 25 年 5 月 16 日）「血液バッグ」．発明者：蓜島由二,河上強志,福井千恵,田上昭人,伊佐間和郎,松岡厚子,柚場俊康．	
 
	
 
	
 

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料①

	
 
一覧表	
 

（別添５）

研究成果の刊行に関する一覧表	
 

	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
	
 
	
 
	
 雑	
 誌	
 
	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
発表者氏名	
  論文タイトル名	
 
発表誌名	
 
巻	
 号	
  ページ	
  出版年	
 中岡竜介	 ISO/TC	 150/SC	
 7 の現状と課題	
 セラミックス	 48(10)	
  819-823	
 

2013	
 

Magnetic	
 fields	
 from	
 electric	 Kameda	 T,	
 toothbrushes	 Ohkuma	 K,	
 promote	 corrosion	
 
Oda	
 H,	
 
Dental	 Materials	
 in	
 orthodontic	
 
Sano	
 N,	
 
Journal	 stainless	
 steel	 Batbayar	
 N,	
 appliances	 but	
 Terashima	
 Y	
 
not	
 in	
 titanium	 appliances.	
 

32	
 

959-969	
 

2013	
 

Electric	
 current	 induced	 in	
 teeth	 Kameda	
 T,	
 
by	
 
Ohkuma	 K,	
  electromagnetic	
 
Sano	
 N,	
 
fields	 from	 Terada	 K	 electric	 toothbrushes	
 and	
 curing	 lights.	
 Orthod	 Waves	 72	
 77-85	 2013	
 Modification	
 of	
 Kameda	 T,	
 metallic	 Ohkuma	 K,	
 materials	
 for	
 a	
 
Sano	
 N,	
 
white	
 appearance	
 
Shin	
 Y,	
 
without	
 coating	 Terada	 K	 and	
 plating.	
 Orthod	 Waves	 72	
 87-98	
 

2013	
 

33	
 

422-429	
 

2014	
 

Koide	
 M,	
  A	
 new	
 method	 for	
 Ohkuma	 K,	
 fabricating	 Dental	 Materials	
 Ogura	 H,	  zirconia	
 copings	
 Journal	 Miyagawa	
 Y	
  using	 a	
 Nd:YVO4	 Electromagnetic	 fields	 from	
 Kameda	 T,	
 J	
 Electr.	
 dental	 devices	 Ohkuma	 K	
 Electron	
 Syst.	
 and	
 their	 effects	 on	
 human	 health.	
 

3	
 

118	
 

2014	
 

721-728	
 

2014	
 

Haishima	
 Y,	
 Hasegawa	
 C,	
 Nomura	 Y,	
 Development	
 and	
 Kawakami	
 T,	
 performance	
 
Yuba	
 T,	
 
evaluation	
 of	
 a	
 
Shindo	 T,	 positive	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Sakaguchi	
 K,	
 
102B	
  1809-1816	
 reference	
 Res.	
 Part	 B	
 Tanigawa	
 T,	
 material	
 for	
 Inukai	 K,	
 hemolysis	 Takenouchi	 testing.	
 M,	
 Isama	 K,	
 Matsuoka	 A,	 Niimi	
 S	
 

2014	
 

Screening	 study	 on	
 hemolysis	 Haishima	
 Y,	
 suppression	 Kawakami	 T,	 effect	 of	 an	
 Hasegawa	
 C,	
 alternative	 Tanoue	 A,	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 plasticizer	
 for	
 
102B	
 
Yuba	
 T,	
 
Res.	
 Part	 B	
 the	
 development	 Isama	
 K,	
 
of	
 a	
 novel	 blood	 Matsuoka	 A,	 container	 made	 of	
 Niimi	 S	
 polyvinyl	
 chloride	
 

蓜島由二	
 

第 1 部：医療機器市場の拡大と新規製品の開発：開発，上市化，市場確保において留意すべきポイント	 生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バ
イオマテリアルの設計・開発戦略（
監修：田中	 賢）．
サイエンス＆テク
ノロジー	
 

	
 

中岡竜介,	
 医療機器・材料の バイオマテリアル
蓜島由二,	
 33(1)	
 国際標準化動向	
 
-生体材料	
 
新見伸吾	
 

3-21	
 

2014	
 

56-63	 2015	
 Haishima	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Fukui	 C,	 Tanoue	
 A,	
 
Yuba	
 T,	
 
Ozono	 S,	 Characterization	
 Kumada	 H,	
 of	
 alternative	 Inoue	 K,	 plasticizers	
 in	
 Morikawa	
 T,	
 polyvinyl	 Takahashi	
 M,	
 chloride	 sheets	 Fujisawa	
 A,	
 
for	
 blood	 Yamasaki	
 K,	
 containers.	
 Nomura	 Y,	
 Isama	 K,	 Chung	 U,	 Ogawa	 K,	 Niimi	 S,	 Yoshida	
 M	
 
	
 
	
 
	
 

J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.	
 

	
 

in	
 
press	
 

	
 

2015	
 

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料②

	 セラミックス,48(10):819-823	
 (2013)

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料③

	 Dental	 Materials	
 Journal,	
 32:819-823	
 (2013)

960

Dental Materials Journal 2013; 32(6): 959–969

                             
Takashi KAMEDA1, Kazuo OHKUMA2, Hirotake ODA3, Natsuki SANO1, Nomintsetseg BATBAYAR1,
Yukari TERASHIMA1, Soh SATO3 and Kazuto TERADA1
Department of Orthodontics, Nippon Dental University, School of Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku, Niigata City, Niigata 951-8580,
Japan
Department of Dental Materials Science, Nippon Dental University, School of Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku, Niigata City, Niigata
951-8580, Japan3
Department of Periodontology, Nippon Dental University, School of Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku, Niigata City, Niigata 951-8580,
Japan
Corresponding author, Takashi KAMEDA; E-mail: tkameda@ngt.ndu.ac.jp
12

?86GE<6GBBG;5EHF;8F4E8J<78?LHF874A7G;8<E8?86GE<6@BGBEF;4I8588AE8CBEG87GBCEB7H68?BJ9E8DH8A6L8?86GEB@4:A8G<6W8?7F
that induced electric currents in metallic objects worn by the users. In this study, we showed that electric toothbrushes generated?BJ9E8DH8A6L@4:A8G<6W8?7F&F4A7<A7H6878?86GE<66HEE8AGF<ABEG;B7BAG<64CC?<4A68F<A4EG<W6<4?F4?<I4,J;<6;4668?8E4G87
6BEEBF<BA<AFG4<A?8FFFG88?,.,4CC?<4A68F5HGABG<AG<G4A<H@-<4CC?<4A68FG;86BEEBF<BAJ4F8I4?H4G875LHF<A:4A<A7H6G<I8?L
6BHC?87C?4F@4BCG<64?8@<FF<BAFC86GEB@8G8E4A74G;E887<@8AF<BA4??4F8E6BA9B64?@<6EBF6BC8 -;8C!B9,HF879BE4CC?<4A68
<@@8EF<BA7<7ABG6;4A:87HE<A:BE49G8E&8KCBFHE8 -;8F8E8FH?GFFH::8FG87G;4G&<A7H6876HEE8AGF9EB@8?86GE<6GBBG;5EHF;8F
6BH?78EB78,.,4CC?<4A68F5HGABG-<4CC?<4A68F5864HF8B9G;8<E;<:;6BEEBF<BACBG8AG<4?F HEG;8EFGH7<8F4E8E8DH<E87GB6?4E<9L
G;8@86;4A<F@FB9@8G4??<66BEEBF<BA5L<A7H6876HEE8AGF<A78AG4?W8?7FJ;<6;@4LGE<::8E@8G4?4??8E:<8F<AC4G<8AGF

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969,HCC?L"A6 -B>LB#4C4AG<G4A<H@-<-< &B
3E ,A11) 8A74??BL +B6>L &BHAG4<A &BE<G4 "A6 -B>LB #4C4A 4A7 A<6>8?G<G4A<H@ '<-< ,8AG4??BLTomy International Inc., Tokyo, Japan). The crossF86G<BA4? F<M8F B9 G;8F8 J<E8F J8E8 4CCEBK<@4G8?LY  @@ Y <A6;8F  ,G4<A?8FF FG88?
,., BEG;B7BAG<6 5E46>8GF ,.,  ,HC8E&8F;
Bracket medium twin bondable for mandible incisors,
Tomy International Inc., Tokyo, Japan) were also
CE8C4E87  864HF8 846; ,., BEG;B7BAG<6 5E46>8G J4FQ
 : n=5) when weighed with an electronic
54?4A68 &8GG?8E GLC8   , ,<58E "A6  3HE<6;
,J<GM8E?4A7 J<G; E84745<?<GL B9
 @: C?4687 BA 4
FH<G45?8 @BHAG<A: /<5EB5FBE5<A: &BHAG /&"&HE4>4@< $B>< "A6  (F4>4 #4C4A G;8 ,., J<E8
length was determined to be 3.0 cm by having the same
J8<:;G 4F G;8 5E46>8GF  Q
 : n=5). Based onthese results, the wires made from the other materials
J8E8 HF87 <A   6@ ?8A:G;F -Ti wire: 0.046±0.002 g:'<-< J<E8
Q : n=5). Each orthodontic wire
was tied to the brackets with elastomeric modules
CB?LHE8G;4A8 8?4FG<6 ?<:4GHE8 G<8 ,;B9H "A6  -B>LB#4C4A -;8FB?HG<BAHF879BE<@@8EF<BAJ4FHF4L4@4

&8L8E4EG<W6<4?F4?<I4,J<G;6BAG8AG4F9B??BJF : B9 $?  : B9 '4?  : B9 4?2P !2O, 0.78 g
B9 '4!)(4P !2( : B9 '42,P!2O, and 1 g of'!2('!2 4?? E84:8AGF J8E8 CHE6;4F87 9EB@ 04>B)HE8;8@<64?"A7HFGE<8F"A6 -B>LB#4C4A<A %B9
78<BA<M877<FG<??87J4G8E0J<G;C!B9 12).
BE 8KCBFHE8 B9 G;8 BEG;B7BAG<6 4CC?<4A68F GB G;8&F B9 G;8 8?86GE<6 GBBG;5EHF;8F J8 6E84G87 WI8
8KC8E<@8AG4? F8GF 9BE G;8 WI8 CE8C4E87 8?86GE<6
GBBG;5EHF;8F<:   086E84G8746EL?<6FG4:8FC?4FG8E
tube racks and silicon toothbrush racks with the same
F;4C8F4A7F<M8F5LHF<A:F<?<6BA6BHAG8E7<8F -HEAG45?8F
54GG8EL GLC8 GHEAG45?8 && $B5B "A6  ,;<MHB>4
Japan) driven by a single AAA battery were used forthe rotation of the electric toothbrushes at 5×102 !MEC@ -;88?86GEB@4:A8G<6W8?7F9EB@G;8GHEAG45?8F
could not be detected at the positions of the
BEG;B7BAG<64CC?<4A68F74G4ABGF;BJA;8E8
Measurement of MFs generated by electric toothbrushes-;8 &F CEB7H687 5L G;8 8?86GE<6 GBBG;5EHF;8F 4A7their frequencies were detected and evaluated using a
FC86GEH@ 4A4?LM8E ,)-+' '  4EBA<4 

Keywords%BJ9E8DH8A6L@4:A8G<6W8?7"A7H6876HEE8AG&8G4??<68?HG<BA,HE9468EBH:;A8FF

INTRODUCTION
Electric toothbrushes are widely used because of theirconvenience. However, they have also been reported
GB CEB7H68 ?BJ9E8DH8A6L 8?86GEB@4:A8G<6 W8?7F
which could cause problems, e.g. interference withpacemakers1,2) "A?BJ9E8DH8A6L@4:A8G<6W8?7F&Fthe strength of the induced electric current is thoughtGB58@BE8<@CBEG4AGG;4AG;8FGE8A:G;B9G;8&<GF8?9
in affecting the health of living bodies3)  &4AL ;B@8
8?86GE<64? 4CC?<4A68F :8A8E4G8 ?BJ9E8DH8A6L &F G;4G
could induce electric currents in the human body andwithin any metallic objects or devices worn in or on thebody2,4) )E8I<BHFE8CBEGFF;BJ87G;4G&F9EB@8?86GE<6
toothbrushes could induce alternating electric currents
in metallic dental appliances and teeth5,6). Electric
currents in oral appliances, e.g. galvanic currents,
could cause discomfort for the user and corrosion of
metallic dental appliances7,8). Induced currents byelectric toothbrushes were also thought to cause someproblems in the oral condition of patients. However,the currents induced by the toothbrushes are unlike
galvanic currents4). Galvanic currents, which are
7<E86G 6HEE8AGF 8K;<5<G87 ;<:; IB?G4:8F F8I8E4? G8AF
GB ;HA7E87F B9 @/ J<G; ?BJ 6HEE8AGF F8I8E4? G8AF GB
hundreds of nA), whereas the electric currents induced
by electric toothbrushes were of the order of µA to mA
with a voltage range of µV to mV5)  -;8F8 WA7<A:FB?BEW:HE8F64A58I<8J87<AG;8BA?<A8<FFH8J;<6;<F4I4<?
45?84G#,- +868<I87#H? 
668CG87,8C 
7B< 
7@= #("#,- #,-  7@= 

seemed to indicate that the galvanic currents were oneof the causes of metal corrosion, whereas the electric
currents induced in dental appliances should not be adirect cause of metal corrosion. However, there weresome reports about metallic corrosion caused by induced
4?G8EA4G<A: 6HEE8AG   +4C<7 :8B@4:A8G<6 I4E<4G<BA
was known to induce electric currents in power lines andpipelines, which could lead to the destruction of powertransmission systems and the corrosion of pipelines9). In
stray-current corrosion caused by alternating currents,
the induced current occurred in embedded metal
B5=86GFC4E4??8?GB;<:;IB?G4:8CBJ8E?<A8FBEGBG;8
transportation routes of alternating current electricrailways, which caused corrosion of the embedded metal
objects10). We show here that the currents induced in@8G4??<678AG4?4CC?<4A68F5L&8KCBFHE89EB@8?86GE<6
toothbrushes corroded stainless steel appliances but nottitanium appliances.

MATERIALS AND METHODS
Materials
<I8 <78AG<64? 8?86GE<6 GBBG;5EHF;8F );<?<CF ,BA<64E8
HX9340/02, Philips Oral Healthcare Inc., Botthell,0.,4??9EB@%BGAB      
46G<A: 4F G;8 @4:A8G<6 W8?7 & FBHE68F J8E8
prepared for this investigation based on the results ofprevious reports5,6).
We also prepared three orthodontic wire materials
,.,  ,HMH>< FG4<A?8FF FG88? J<E8 &<GFH54 (EG;B<:  ,6;8@4G<6 E8CE8F8AG4G<BA 4A7 G<@8 F6;87H?8F B9 8KC8E<@8AGF 9BE 8KCBFHE8 B9
BEG;B7BAG<64CC?<4A68FGB&F

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969
Inc., Euscheid, Germany)5,6)  08 8FG<@4G87 G;8 &F
J<G;<AG;8 U
!M9E8DH8A6LE4A:8<A>88C<A:J<G;
the preliminary study and with the previous literature,
which stated that this was the appropriate range tomonitor2,5,6) -;8&FJ8E88FG<@4G874G 6@7<FG4A68F
from the front, back, and right and left sides of activatedor inactive electric toothbrushes5).
Measurement of electric currents induced in dental
appliances by electric toothbrushes
The electric currents induced in dental appliances
J8E8 8FG<@4G87 HF<A: 4 7<:<G4? @H?G<@8G8E     BECBE4G<BA -B>LB #4C4A <A  @B78 i.e.
IB?G4:8/2/2)1/2 4A7 6HEE8AG"2"2)1/2).
Because the electric current induced by electric
toothbrushes was ostensibly known to be alternating
current from the results of previous studies4,5), its value
J;8A @84FHE87 <A G;8  @B78 J4F CE46G<64??L<78AG<64? GB G;4G <A G;8  @B78  -;8 <A7H687 8?86GE<6
current was estimated for a distance of 2 cm between
the front of the toothbrush and the appliance immersed<A , <A C?4FG<6 6H?GHE8 7<F;8F  08 4?FB 8FG<@4G87 G;8electric current induced between only the connecting
4AB78 4A7 G;8 64G;B78 <A G;8 , i.e. with no
BEG;B7BAG<64CC?<4A684A76BAWE@87G;4GAB8?86GE<6<GL
was detected from electric toothbrushes at a distanceB9  6@ 74G4 ABG F;BJA ;8E8  -;8 <A7H687 8?86GE<6
voltages and currents in the appliance that were8FG<@4G87<AG;<FFGH7L4E8F;BJA<A<: MF exposure of orthodontic wires combined withorthodontic brackets immersed in AS
BE8KCBFHE8B9BEG;B7BAG<64CC?<4A68FGBG;8&F9EB@
8?86GE<6GBBG;5EHF;8F9BHEFC86<@8AF<@@8EF87<A@%
B9 , FB?HG<BAF <A  @% C?4FG<6 GH58F J8E8 F8G <A G;8
plaster tube racks on each acrylic stage. Each electric
toothbrush was set in the silicon toothbrush racks on
G;8 8?86GE<6 GHEAG45?8 <:    HE<A: 8KCBFHE8 GB G;8&F9EB@G;88?86GE<6GBBG;5EHF;8FG;8GHEAG45?8FJ8E8<:  


961

962

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969

rotated at 5×102!M -;8FC86<@8AFJ8E88KCBF87GBG;8
& 9EB@ 846; 8?86GE<6 GBBG;5EHF; 9BE  @<A 74L 4A7
4GBG4?B9
@<A8KCBFHE89EB@G;8WI8GBBG;5EHF;8F @<A846;J4F466B@C?<F;875LWI874L8KCBFHE89BE
each specimen. In a questionnaire survey of the tooth
5EHF;<A: ;45<GF B9  #4C4A8F8 C8BC?8   @4?8F
and 600 females, aged from teens to sixties), 52.5% of
respondents cleaned their teeth twice a day, and 48%of them had brushing times of 1–3 min13)  EB@ G;8F8
reports, the average Japanese person’s brushing time
9BE BA8 @BAG; J4F 8FG<@4G87 GB 58
 @<A   @<AY 
times/day×30 days). We thus deduced that the
8KCBFHE8 G<@8 B9 FC86<@8AF GB &F 9EB@ G;8 8?86GE<6
toothbrushes was a total of 120 min, e.g. 24 min/day×5
G<@8F74LF
Measurement of pH of AS after immersion of orthodontic
appliances
Immersion solutions containing metal appliances that;47588A8KCBF87GB&F9EB@8?86GE<6GBBG;5EHF;8F4A7
G;4G ;47 588A <A6H54G87 4G O <A 4<E J8E8 6B??86G87
<:   4A7 G;8<E C! I4?H8F J8E8 @84FHE87 J<G; 4
C!@8G8E !BE<54"A6 $LBGB#4C4A 89BE8G;8
measurements were taken, the pH meter was calibratedusing three types of standard pH solution, e.g. pH4, 7
4A7  FB?HG<BAF &#)! &#)! &#)!  ,4GB
,;BH=<"A6 $4A4:4J4#4C4A 
Detection of metallic elution from orthodontic appliances
using the inductively coupled plasma-optical emission
spectrometer (ICP-OES)")(, @84FHE8@8AGF ")(, @B78? <)  
HB -;8E@B <F;8E ,6<8AG<W6 04?G;4@ & .,
9BEFC86<@8AF 6B??86G87 4F F;BJA<A <:   J8E8 G4>8A 
E<8XL,FB?HG<BAF6BAG4<A<A:@8G4?4CC?<4A68FJ8E8
<A6H54G874GO9BE;74L BE9BE ;74LF U<A4<E4A78KCBF87GBG;8&9BE @<A 9G8EG;4GG;8FB?HG<BAFJ8E86B??86G879BEG;8")(,@84FHE8@8AGF -;8 ")(, <AFGEH@8AG J4F BCG<@<M87 589BE8 G;8

?86GE<6 6HEE8AG <A7H687 <A BEG;B7BAG<6 4CC?<4A68 <@@8EF87 <A , 5L G;8 ,BA<64E8
HX9340/02 at a distance of 2 cm between the electric toothbrush and the appliance.
4 "A7H687IB?G4:85 <A7H6876HEE8AG-45?8  8G86G<BA 4A7 78G8E@<A4G<BA ?<@<GF 4G 846;
78G86G<BA J4I8?8A:G; 9BE 846; 8?8@8AG <A , 5L
")(,

<: 



&84FHE8@8AG4E844A7?<A8FB95E46>8GF4A7J<E8F
9BE FHE9468 EBH:;A8FF @84FHE8@8AG 5L  ?4F8E
confocal microscope.
.CC8E ?89G  ?4F8E 6BA9B64? @<6EB:E4C; B9 J<A:
B9 BEG;B7BAG<6 5E46>8G HCC8E E<:;G  ?4F8E
6BA9B64? @<6EB:E4C; B9 ,., J<E8 4G 4 7<FG4A68 B9 @@9EB@G;868AG8EB9G;85E46>8G4A7?BJ8E
C;BGB:E4C;B9BEG;B7BAG<64CC?<4A685E46>8G6@
B9 J<E88?4FGB@8E<6 @B7H?8 HF87 <A G;<F FGH7L 
The area surrounded by the dotted line was the@84FHE8@8AG 4E84 4A7 G;8 ;BE<MBAG4? FB?<7 ?<A8
was the measurement line for evaluation of thesurface roughness of the appliance. White lines in
the micrographs represented 100 µm.

@84FHE8@8AGCEB68FF5LHF<A:FG4A74E7FB?HG<BAFB9E
8 '< ,A 4A7 -< ABE@4??L HF87 <A 4GB@<6 45FBECG<BA
FC86GEB@8GEL$4AGB;8@<64?B %G7 -B>LB#4C4A
and was operated according to the manufacturers’
instructions. The spectrometer was used with the
9B??BJ<A: C4E4@8G8EF E47<B9E8DH8A6L + CBJ8E B9
>09E8DH8A6LB9  &!M478@BHAG45?8DH4EGM
GBE6;6BAG4<A<A:E E EC?4F@4:4FEXBJB9  
% @<A14HK<?<4EL:4FEXBJB9 % @<A1A85H?<M8E
:4F E XBJ B9  % @<A1 A85H?<M8E CE8FFHE8 B9&)44:?4FFFCE4L6;4@58E466BE7<A:GBG;8@8G;B7B9
,6BGG6L6?BA86;4@58E<F;8E,6<8AG<W6"A6 04?G;4@&.,J<G;4F4@C?8CH@CXBJE4G8B9 @% @<A1,
4A<AG8:E4G<BAG<@8FE8C?<64G<BA64C45<?<GLG<@8F
4A7G;8J4I8?8A:G;E4A:8B94@BAB6;EB@4GBE UA@ <EFGFG4A74E76HEI8F9BEG;8,J<G;BEJ<G;BHG
E8'<,A4A7-<J8E86E84G874A7G;8A846;B9G;8
78G86G<BA ?<@<GF  /slope) and determination limits 2 F?BC8 J8E8 B5G4<A87 -45?8 14). The elution
volumes of the metallic ions in the immersion solutions
J8E8F;BJA4F6BA68AGE4G<BAFCC5 CC@FBG;4GG;8F8
I4?H8F6BH?7586BAI8EG87GBG;88?HG87@8G4?J8<:;GR:
9BE84F<8EHA78EFG4A7<A:-45?8  ,8?86G87@8G4?<BAF
J8E8 @84FHE87 4G J4I8?8A:G;F B9    A@ 9BE E   A@ 9BE 8   A@ 9BE '<   A@ 9BE

8G86G<BA
J4I8?8A:G;A@8G86G<BA?<@<GR:

8G8E@<A4G<BA?<@<GR:

E

205.552

0.011

0.047

8

239.562

0.017

0.071

'<

216.556

0.028

0.118

,A

189.989

0.033

0.141

Ti

308.802

0.006

0.026

,A 4A7     A@ 9BE -< 9EB@ G;8 E8FH?GF B9 846;
FG4A74E7 6HEI8 -45?8   -;8 @8G4??<6 8?HG<BA I4?H8F
J8E8F;BJA4F6BAI8EG87I4?H8Fdetermination limit),
78G86G<BA I4?H8Fvalues<determination limit) orU78G86G<BA?<@<G-45?8F  ??E84:8AGFHF87J8E8
of analytical and spectral purity grade.
Detection of surface roughness of orthodontic appliancesby three-dimensional laser confocal microscope
The surface roughnesses of the appliances were
@84FHE87 HF<A: 4  ?4F8E 6BA9B64? @<6EBF6BC8 %1-(%,
 (?L@CHF "A6  -B>LB #4C4A 4A7 8FG<@4G87
4F +4 G;8 4E<G;@8G<6 4I8E4:8 B9 G;8 45FB?HG8 I4?H8
+4A1SN2<N< n))15)+MG;8;<:;8FGC84>F+C4A7
?BJ8FG I4??8LF +I BI8E G;8 8AG<E8 F4@C?<A: ?8A:G;
+M+C+I 4A7 ,4 G;8 4E<G;@8G<6 4I8E4:8 B9 G;8 
EBH:;A8FF 4E84? EBH:;A8FF 5L G;8 %8KG FB9GJ4E8
C46>4:8 (?L@CHF "A6  BA 4 JBE>FG4G<BA 6B@CHG8E
&) 10,&BHF8B@CHG8E"A6 -B>LB#4C4A 
Preparation of the specimens for surface roughness
estimation was performed as follows: 1) discard<@@8EF<BA ,  J4F; 4CC?<4A68F GJ<68 J<G; 7<FG<??87
J4G8E 0  H?GE4FBA<64G8 4CC?<4A68F <A 0 9BE @<A GJ<68  J4F; 4CC?<4A68F GJ<68 J<G; 0 4A7 
dry the appliances in air. Estimation of the surface
roughness was performed about the labial surfaces
B9G;8J<E8F4G47<FG4A68B9@@9EB@G;8;BE<MBAG4?
68AGE4? CB<AG B9 G;8 5E46>8GF G;8   R@ @8F<B7<FG4?
line of the center of the wires, and the 200×500 µm area
B9G;8J<E8FHE9468F4A7G;8?45<4?X4GC4EGB9G;8J<A:
FHE9468FB9G;85E46>8GG;8 R@@8F<B7<FG4??<A84A7
G;8 Y R@4E84B9G;8X4GFHE9468F<:  
Experimental conditions, data and statistical analysis
All experiments were performed in the laboratory,
J;<6; J4F @4<AG4<A87 4G 4 G8@C8E4GHE8 B9 Q O 
4G4J8E8B5G4<A879EB@846;8KC8E<@8AG4A7F<K74G4
out of a total of eight data were used, which meantthat the maximum and minimum data were removed.
These six data were calculated and represented as@84AFQFG4A74E7 78I<4G<BAF  -;8 74G4 J8E8 4A4?LM87
5L &4AA0;<GA8LVF . G8FG GB 78G8E@<A8 J;<6; B9 G;8
7<998E8A68FJ8E8FG4G<FG<64??LF<:A<W64AG

963

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969

964

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969-45?8  ?HG<BA4@BHAGB9846;8?8@8AGR:9EB@G;84CC?<4A68F5E46>8GJ<E88?4FGB@8E<6@B7H?8GB,
,.,

'<-<

-Ti

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E



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

80.20±0.012

1.39±0.067*

0.12±0.011**

0.80±0.044***0.11±0.014**

0.70±0.067***

'<



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

,A

na

na





na

na

Ti

na

na









n9BE846;8KC8E<@8AG4?6BA7<G<BA ,.,FG4<A?8FFFG88?J<E8-Ti: G<G4A<H@J<E8'<-<A<6>8?G<G4A<H@J<E8&@4:A8G<6
W8?778G86G<BAI4?H8FI4?H8F78G8E@<A4G<BA?<@<GI4?H8F78G86G<BA?<@<G4A7A4ABG4I4<?45?8 4G4J8E84A4?LM875L
&4AA0;<GA8LVF.G8FGGB78WA8G;87<998E8A68FG;4GJ8E8FG4G<FG<64??LF<:A<W64AG ,HC8EF6E<CG4FG8E<F>F78ABG8FG4G<FG<64??L
F<:A<W64AG7<998E8A68Fp J<G;<A846;4CC?<4A686B@C4E87GB&4A7J<G;<A846;&8KCBFHE86B@C4E87GB,.,
and ***-Ti.

-45?8 ?HG<BA 4@BHAG B9 846; 8?8@8AG R: 9EB@ G;8
5E46>8GFGB,&)&

E





8

0.11±0.018

0.71±0.082*

'<





,A





Ti





n 9BE 846; 8KC8E<@8AG4? 6BA7<G<BA  & @4:A8G<6 W8?7
 78G86G<BA I4?H8F I4?H8F78G8E@<A4G<BA ?<@<G 4A7 :
I4?H8F78G86G<BA ?<@<G  4G4 J8E8 4A4?LM87 5L &4AA
0;<GA8LVF . G8FG GB 78WA8 G;8 7<998E8A68F G;4G J8E8
FG4G<FG<64??L F<:A<W64AG  ,HC8EF6E<CG 4FG8E<F>F 78ABG8
FG4G<FG<64??LF<:A<W64AG7<998E8A68Fp<0.05) within each row
6B@C4E87GB&).

RESULTSElectric current induced in orthodontic appliances by
low-frequency MFs from electric toothbrushes"AG;<FFGH7L8?86GE<6GBBG;5EHF;8F46G<A:4F&FBHE68F
were set on a turntable rotating at 5×102 !M FB G;4G
G;84CC?<4A68FJ8E88KCBF87GBG;8&F9EB@8I8ELF<78
B9 G;8 GBBG;5EHF;8F <:    <EFG G;8 &F 9EB@ G;8
front, right, left and back sides of the toothbrushes were8FG<@4G87  -LC<64? & CEBW?8F 9EB@ 8I8EL F<78 B9 G;8
GBBG;5EHF;8F 8K;<5<G87 G;8 F4@8 C4GG8EA ;BJ8I8E G;8
E4A><A:BE78EB9G;8F8W8?7FJ4FE<:;G?89G546>9EBAG
F<78<: 
The results for the currents induced in applianceswith a distance of 2 cm between the front of the
GBBG;5EHF;4A7G;84CC?<4A68<@@8EF87<A,<AC?4FG<6
6H?GHE8 7<F;8F 4E8 F;BJA <A <:    -;8 IB?G4:8 4A7current in each appliance that faced toward the electric

toothbrush, which was switched off, when immersed in
, J8E8
Q @/ 4A7Q
 @ <A G;8 ,.,J<E8,., 5E46>8G
Q
 @/ 4A7Q
 @in the -< J<E8,., 5E46>8G 4A7Q
 @/ 4A7Q
@<AG;8'<-<J<E8,.,5E46>8GE8FC86G<I8?L -;8 <A7H687 IB?G4:8F 4@BA: G;8 ,., -< 4A7 '<-<
J<E8:EBHCF8K;<5<G874?@BFGG;8F4@8I4?H8F;BJ8I8E
the currents were dramatically different between
G;8 ,., 4A7 G<G4A<H@ :EBHCF  -;8 E4A><A: BE78E B9
G;8 <A7H687 6HEE8AGF <F 9BE ,., 5E46>8GF J<G; J<E8F
6B@CBF87B9'<-<-<,.,4FF;BJA<A<:  

<: 


%BJ9E8DH8A6L&FCEB7H6875LG;88?86GE<6GBBG;5EHF;&F U 
!MCEB7H6875LG;8,BA<64E8!1
J8E88FG<@4G87
at a distance of 2 cm between the electric toothbrush and the front/
E<:;G ?89G 546>F<78FB9G;84CC?<4A68J<G;4FC86GEH@4A4?LM8E

Measurement of pH of AS after immersion of orthodontic
appliances-;8C!6;4A:8F<AG;8<@@8EF<BA,F4@C?8F4E8F;BJA
<A <:    -;8 C! B9 <A6H54G87 , F4@C?8F 6BAG4<A<A:
4CC?<4A68FF;BJ87?BJ8EI4?H8FG;4AG;4GB9,J<G;BHG
4CC?<4A68F  'B C! 7<998E8A68F 58GJ88A G;8 ABA &
8KCBF874A7&8KCBF87:EBHCFJ8E8B5F8EI87
Metallic elution from orthodontic appliances by MF
exposure from electric toothbrushes
<EFG G;8 FG4A74E7 6HEI8F B9 , J<G; 4A7 J<G;BHG
metallic elements, e.g. E 8 '< ,A 4A7 -< J8E8
created, and then the detection limit, the determination
limit and the appropriate wavelength for the detection
B9 846; 8?8@8AG J8E8 B5G4<A87 -45?8   -;8 8?HG<BAIB?H@8F B9 G;8 @8G4??<6 <BAF <A , J8E8 F;BJA 4F
6BA68AGE4G<BAFCC5 CC@FBG;4GG;8F8I4?H8F6BH?758
6BAI8EG87 <AGB 8?HG87 @8G4? J8<:;G 4CC?<4A68 R: 9BE84F<8E HA78EFG4A7<A: -45?8   8 J4F 78G86G87 <A ,
J<G; AB & 8KCBFHE8 9BE 846; 6B@5<A4G<BA -45?8  "AG;8G<G4A<H@J<E8F6B@5<A87J<G;G;8,.,5E46>8GF
G;88?HG<BA4@BHAGFB98J8E84CCEBK<@4G8?L;4?9G;4GB9 G;8 ,., J<E8F J<G; G;8 ,., 5E46>8G :EBHC <A 5BG;
G;8 &8KCBF87 4A7 HA8KCBF87 :EBHCF  ?HG<BA B9 G;8
8?8@8AGF <A G;8 ,., 5E46>8GF J<G;BHG 4AL J<E8F J4F4?FB <AI8FG<:4G87 -45?8   -;8 8 8?HG<BA 4@BHAGF <A
the bracket-only group were approximately half theI4?H8F 9BE G;8 ,., J<E8F J<G; ,., 5E46>8GF :EBHC<: 5

Electric voltage and current induced in
BEG;B7BAG<64CC?<4A68F<@@8EF87<A,5L8?86GE<6
toothbrushes.
n 9BE 846; 8KC8E<@8AG4? 6BA7<G<BA  E 5E46>8G
,., FG4<A?8FF FG88? J<E8 -Ti: G<G4A<H@ J<E8'<-< A<6>8?G<G4A<H@ J<E8 / <A7H687 IB?G4:8
4A7  <A7H687 6HEE8AG  -;8 74G4 J8E8 4A4?LM87
5L&4AA0;<GA8LVF.G8FGGB78WA8G;87<998E8A68F
G;4GJ8E8FG4G<FG<64??LF<:A<W64AG FG8E<F>F78ABG8
G;8 FG4G<FG<64??L F<:A<W64AG 7<998E8A68F p<0.05)
within the induced voltages or current comparedGBE,.,J<E84A7E-Ti wire.

<: 

C!6;4A:8F<A,HF87GB<@@8EF8G;84CC?<4A68F
J<G; BE J<G;BHG 8KCBFHE8 GB &F 9EB@ 8?86GE<6
toothbrushes.
n9BE846;8KC8E<@8AG4?6BA7<G<BA ABA4EG<W6<4?
F4?<I4 J<G; AB 4CC?<4A68F E 5E46>8G ,.,
FG4<A?8FF FG88? J<E8 -Ti: G<G4A<H@ J<E8 '<-<
A<6>8?G<G4A<H@J<E84A7&@4:A8G<6W8?7 -;8
74G4 J8E8 4A4?LM87 5L &4AA0;<GA8LVF . G8FG
GB 78WA8 G;8 7<998E8A68F G;4G J8E8 FG4G<FG<64??L
F<:A<W64AG  FG8E<F>F 78ABG8 G;8 FG4G<FG<64??L
F<:A<W64AG 7<998E8A68F p<0.05) within the groups
J<G; 4CC?<4A68F 6B@C4E87 GB ABA E,.,
E-< 4A7 J<G;<A 846; 4CC?<4A68 J;8A
6B@C4E87GB&).

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969<A 5BG; G;8 &8KCBF87 4A7 G;8 HA8KCBF87 :EBHCF -;8 8 8?HG<BA 4@BHAG <A G;8 5E46>8GBA?L :EBHC 4?FB
showed almost the same values as those of the titanium
J<E8F J<G; ,., 5E46>8GF :EBHCF <A 5BG; G;8 &
8KCBF87 4A7 HA8KCBF87 :EBHCF -45?8F  4A7   &
8KCBFHE8 7E4@4G<64??L <A6E84F87 8 8?HG<BA 9EB@ G;8
4CC?<4A68F-45?8  E4A7'<J8E84?FB78G86G87<AG;8
&8KCBF87:EBHCF9BE846;4CC?<4A68 -<6BH?7ABG58
78G86G87 49G8E & 8KCBFHE8 B9 G;8 :EBHCF B9 G<G4A<H@
J<E8FJ<G;,.,5E46>8GF-45?8  
Surface roughness of orthodontic appliances caused byexposure to MFs from electric toothbrushes-;8  ?4F8E 6BA9B64? @<6EB:E4C;F B9 G;8 FHE9468F B9
the wires and the brackets in each combination were

965

966

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969

E8CE8F8AG87 <A <:F   4A7   -;8 FHE9468 EBH:;A8FF8F
B9G;84CC?<4A68F4F@84FHE874A764?6H?4G875LG;8
?4F8E 6BA9B64? @<6EBF6BC8 4F +4 4E<G;@8G<6 4I8E4:8 B9
G;845FB?HG8I4?H8+M;<:;8FGC84>F4A7?BJ8FGI4??8LF
BI8EG;88AG<E8F4@C?<A:?8A:G;4A7,4G;84E<G;@8G<6
4I8E4:8B9G;8EBH:;A8FF4E8F;BJA<A<:  -;8F8
E8FH?GFE8I84?87G;4G&8KCBFHE8@478G;8FHE9468FB9
G;8,.,J<E8F4A7G;8,.,5E46>8GFHA8I8A;BJ8I8E
?<GG?8 BE AB 89986G J4F B5F8EI87 9EB@ G;8 & 8KCBFHE8
B9 G;8 FHE9468F B9 G;8 G<G4A<H@ J<E8F <:    "A G;8
micrographs, the surfaces of the intact appliances wereseen not to be entirely smooth, so that the surface
6;4A:8F 4A7 EBH:;A8FF 64HF87 5L & 8KCBFHE8 J8E8
7<9W6H?GGB=H7:88FC86<4??L<AG;8G<G4A<H@J<E8F<:F 
7 and 8).

<: 

?4F8E6BA9B64?@<6EB:E4C;FB9G;85E46>8GFHE9468F<@@8EF87<A,J<G;BEJ<G;BHG
8KCBFHE8GBG;8&F9EB@8?86GE<6GBBG;5EHF;8FY 
White lines in the micrographs represented 200 µm.

DISCUSSION<: 

?4F8E6BA9B64?@<6EB:E4C;FB9G;8J<E8FHE9468F<@@8EF87<A,J<G;BEJ<G;BHG
8KCBFHE8GBG;8&F9EB@8?86GE<6GBBG;5EHF;8FY 
White lines in the micrographs represented 100 µm.

There has been considerable recent interest in the89986GF B9 8?86GEB@4:A8G<6 W8?7F FH6; 4F G;BF8 A84E
electrical transmission lines, on human health, andG;8 "AG8EA4G<BA4? :8A6L 9BE +8F84E6; BA 4A68E
"+G;8"AG8EA4G<BA4?B@@<FF<BABA'BA"BA<M<A:
+47<4G<BA )EBG86G<BA "'"+) 4A7 G;8 0BE?7 !84?G;
(E:4A<M4G<BA 0!( ;4I8 846; 8FG45?<F;87 :H<78?<A8F
4A7 6E<G8E<4 BHG?<A<A: G;8 EB?8F 4A7 E<F>F B9 &F <A
carcinogenesis16-18). Previous studies have demonstrated
that alternating electric currents can be induced not
BA?L <A WK87 78AG4? 4CC?<4A68F <A6?H7<A: BEG;B7BAG<6
appliances), but also in human teeth by electromagnetic
W8?7F :8A8E4G87 5L 8?86GE<6 GBBG;5EHF;8F 4A7 6HE<A:
lights5,6). Galvanic corrosion caused by weak galvanic

currents, which are direct currents, can occur in various
combinations of dental materials, and can cause various
human health problems, including metal allergies andpoisoning7,8) ,B@8E8CBEGF;4I84?FB78F6E<587@8G4??<6
6BEEBF<BA 64HF87 5L 8?86GEB@4:A8G<6 W8?7<A7H687
15,16). Alternating electric currents induced in dental
4CC?<4A68F5L8?86GEB@4:A8G<6W8?7F@4LG;8E89BE84?FB
affect the corrosion of these appliances.
-;8 &F 9EB@ G;8 9EBAG E<:;G ?89G 4A7 546> F<78F
B9 GBBG;5EHF;8F J8E8 9BHA7 GB ;4I8 G;8 F4@8 CEBW?8F
<AWI8<78AG<64?8?86GE<6GBBG;5EHF;8FJ<G;G;8F4@8?BG
AH@58E -;8&F9EB@8I8ELF<78B9G;8F8GBBG;5EHF;8F
showed the same patterns with the ranked order of
E<:;G?89G546>9EBAG F<78 <:    -;8F8 7<998E8A68F
<A &F @4L 58 64HF87 5L G;8 FGEH6GHE8 <A6?H7<A: G;8electrical circuits, of the electric toothbrush. Induced

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969

<: 

967,HE9468EBH:;A8FF8FB95E46>8GF4A7J<E8F<@@8EF87<A,J<G;BEJ<G;BHG8KCBFHE8
GB&F9EB@8?86GE<6GBBG;5EHF;8Fn9BE846;8KC8E<@8AG4?6BA7<G<BA E5E46>8G,.,FG4<A?8FFFG88?-Ti: G<G4A<H@'<-<A<6>8?G<G4A<H@4A7&@4:A8G<6W8?7 +4E8CE8F8AGFG;84E<G;@8G<64I8E4:8
B9 G;8 45FB?HG8 I4?H8 +M E8CE8F8AGF G;8 ;<:;8FG C84>F 4A7 ?BJ8FG I4??8LF BI8E G;8
8AG<E8F4@C?<A:?8A:G;4A7,4E8CE8F8AGFG;84E<G;@8G<64I8E4:8B9G;8EBH:;A8FF
4E84? EBH:;A8FF  -;8 74G4 J8E8 4A4?LM87 5L &4AA0;<GA8LVF . G8FG GB 78WA8 G;8
7<998E8A68F G;4G J8E8 FG4G<FG<64??L F<:A<W64AG  FG8E<F>F 78ABG8 G;8 FG4G<FG<64??L
F<:A<W64AG 7<998E8A68F p<0.05) within each measurement item of each appliance:EBHCJ;8A6B@C4E87GBABA4A7&).

6HEE8AGF<A4CC?<4A68F<A,J;8A8KCBF87GBG;845BI8&FJ8E878G86G87<:  -;8<A7H687IB?G4:8F4@BA:
G;8 ,., -< 4A7 '<-< J<E8 :EBHCF ;47 4?@BFG G;8
F4@8 I4?H8F ;BJ8I8E G;8 6HEE8AG F;BJ87 7E4@4G<6
7<998E8A68F58GJ88AG;8,.,4A7G<G4A<H@J<E8:EBHCF
<:    -;8F8 I4?H8F J8E8 ABG <A CEBCBEG<BA GB G;8<E
8?86GE<64?E8F<FG<I<GLJ;<6;J8E8 U T@9BE,., 
4A7  U T@ 9BE '<-<  (A8 B9 G;8 E84FBAF 9BE G;<F
C;8AB@8ABA@<:;G58G;86B@5<A4G<BAB9G;8'<-<J<E8
J<G; G;8 ,., 5E46>8G  EB@ G;8 @84FHE87 E8FH?GF 9BE
the induced voltage and current in each appliance in

,J;8A946<A:4A8?86GE<6GBBG;5EHF;G;4G<FFJ<G6;87
B99G;8:4?I4A<66HEE8AG58GJ88A,.,4A7'<-<J;<6;
could not be detected, must have no relationship to thisphenomenon.
&8G4??<68?HG<BA9EB@BEG;B7BAG<64CC?<4A68FHA78E
& 8KCBFHE8 9EB@ 8?86GE<6 GBBG;5EHF;8F J4F 78G86G87
5L G;8 ")(,  -;8 B5G4<A87 8?8@8AG 6BA68AGE4G<BAF
<A G;8 , CC5 CC@ J8E8 6BAI8EG87 <AGB 8?HG87 @8G4?
J8<:;G 4CC?<4A68 R: 9BE 84F<8E HA78EFG4A7<A: -45?8  EB@ G;8 E8FH?GF B9 G;8 FG4A74E7 6HEI8F 9BE ,
with or without additional elements, the detection

968

Dent Mater J 2013; 32(6): 959–969?<@<G   F?BC8 G;8 78G8E@<A4G<BA ?<@<G  
2/slope)
and the appropriate wavelength were obtained for
846; 8?8@8AG -45?8   A 4CCEBK<@4G8?L F8I8A9B?7
<A6E84F876BA68AGE4G<BAB98J4F78G86G87<A,49G8E
& 8KCBFHE8 9BE 846; 6B@5<A4G<BA J;8A 6B@C4E87 GB
846; B9 G;8 AB&8KCBFHE8 :EBHC -45?8   "A 846;
&8KCBFHE8:EBHCE4A7'<J8E84?FB78G86G87J<G;
values that varied between the detection values and thedetermination limit. In titanium wires combined with,.,5E46>8GFG;888?HG<BA4@BHAGJ4F4CCEBK<@4G8?L
;4?9 G;4G B9 G;8 ,., J<E8F J<G; ,., 5E46>8G :EBHC <A
5BG; G;8 &8KCBF87 4A7 ABA&8KCBF87 :EBHCF
which almost matched the values of the bracket-only:EBHC -;8F8E8FH?GFFH::8FG87G;4GG;8'<8?HG875L&
8KCBFHE8 6BH?7 58 78E<I87 9EB@ G;8 ,., 5E46>8GF 5HGABG 9EB@ G;8 '<-< J<E8F -45?8F  4A7   "A G<G4A<H@
J<E8F6B@5<A87J<G;G;8,.,5E46>8GF<A,HA78E&
8KCBFHE8-<4A7,A6BH?7ABG5878G86G87<A7<64G<A:4
strong resistance against corrosion by electric current
9BEG;8G<G4A<H@4??BL<A6B@C4E<FBAGB,., The surface roughness of each wire and bracket@84FHE87 5L G;8  ?4F8E 6BA9B64? @<6EBF6BC8 4F +4+M4A7,4FHCCBEG87G;8@8G4??<68?HG<BA@84FHE8@8AG
E8FH?GF <:    & 8KCBFHE8 @478 G;8 FHE9468F B9 G;8,., J<E8F 4A7 ,., 5E46>8GF HA8I8A ;BJ8I8E ?<GG?8
BE AB 89986GF B9 & 8KCBFHE8 BA G;8 FHE9468F B9 G;8
G<G4A<H@J<E8F6BH?7589BHA7<:  FG;8FHE9468F
of the intact appliances were not completely smooth, theFHE94686;4A:8F64HF875L&8KCBFHE8J8E87<9W6H?GGB
see, but the roughness, including corrosion pits, could
589BHA75L78G4<?87B5F8EI4G<BA<:F 4A7 -;8F8
changes are likely to be caused by the small amount ofmetallic elution, which was approximately 1/1000 of theJ8<:;GB9G;84CC?<4A68F-45?8F 4A7
In contrast to the evidence of the surface roughness
for the occurrence of metallic elution, no pH differences
J8E8 B5F8EI87 58GJ88A G;8 ABA&8KCBF87 4A7 &
8KCBF87:EBHCF<:  -;8C!I4?H8FJ8E8?BJ8E875L
G;8<@@8EF<BAB9846;B9G;84CC?<4A68F;BJ8I8EG;8F8
pH values, which did not reach the depassivation pH,
could not have eroded these alloys19,20). These results
FH::8FG87G;4GC!6;4A:8F<AG;8,;4I8ABE8?4G<BAGB
G;8&<A7H687,.,6BEEBF<BA 
In this study, we have shown that the low-frequency&F <A7H687 5L 8?86GE<6 GBBG;5EHF;8F CEB@BG8 G;8
6BEEBF<BA B9 BEG;B7BAG<6 ,., 4CC?<4A68F J<G;BHG C!
changes by inducing electric currents through anevaluation of the metallic elution when the appliances
4E8 <@@8EF87 <A , 4A7 9EB@ G;8 EBH:;A8FF B9 G;8
metal surfaces. These results suggested the possibility
G;4G ?BJ9E8DH8A6L &F 4EBHA7 G;8 BE4? 64I<GL G;4G
originated from electronic equipment such as electric
toothbrushes induce electric currents in intraorally<AFG4??87 @8G4?F 8FC86<4??L <A ,., CEBFG;8F8F 4A7appliances, and promote metallic elution which is likely
to be one of the causes of metallic allergies. We must
be careful when using electric toothbrushes, especiallywhen metal prostheses and/or appliances are worn in
BHE @BHG;F  !BJ8I8E <G <F I8EL 7<9W6H?G GB CEBG86GBHEF8?I8F 9EB@ ?BJ9E8DH8A6L &F 5864HF8 G;8L 64Apass through human tissues and most other materials,
including glass, plastics, metals and concrete21). The
only viable way to limit exposure to low-frequency
8?86GEB@4:A8G<6 W8?7F <F G;BH:;G GB 58 G;8 8?<@<A4G<BA
of their generation by home electrical appliances and
78AG4?78I<68F HEG;8EFGH7<8F4E8A868FF4ELGB6?4E<9L
exactly how they affect human oral health, and whether
6BHAG8E@84FHE8F <A6?H7<A: FG4A74E7<M4G<BA 64A 58
developed to negate their effects.

CONCLUSION
We examined the possibility of metallic corrosion caused
5L 8KCBFHE8 GB G;8 &F 9EB@ 8?86GE<6 GBBG;5EHF;8F via
induced currents. The results obtained in this study are
as follows: KCBFHE8B9BEG;B7BAG<64CC?<4A68FGB&F9EB@electric toothbrushes induced currents in the
4CC?<4A68FJ;8AG;8LJ8E8<@@8EF87<A, ,.,4CC?<4A68FJ8E86BEEB7875L8KCBFHE8GBG;8
&F9EB@8?86GE<6GBBG;5EHF;8F  &8G4? 8?HG<BA 64HF87 5L 8KCBFHE8 GB G;8 &Ffrom electric toothbrushes could not be detected
in two types of titanium wire.
4. The pH values of the solutions used for the<@@8EF<BA J<G; BE J<G;BHG & 8KCBFHE8
8K;<5<G87ABFG4G<FG<64?F<:A<W64A68 
086BA6?H787G;4G6BEEBF<BAB9,.,4CC?<4A68F5HGABG
G<G4A<H@ 4CC?<4A68F B66HEE87 HA78E 8KCBFHE8 GB &Ffrom electric toothbrushes via induced currents, but not
through pH changes.

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W8?7F &HG4G+8F    $4@<@HE4 2 24@474 2 >HGFH -  "A7H687 6HEE8AG <AF<78
G;8;H@4A;847<AG;8I<6<A<GLB94A8?86GE<6F;4I8E &#  EG<6?8<A#4C4A8F8 $4@874-(;>H@4$"F;<<',4AB'(:HE4!-8E474$ 
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+8F84E6;%45BE4GBEL   H=<<- &8G4?6BEEBF<BA  FG87 HF<A8FF-86;AB?B:L4<?L'8JF"A6 
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 0BE?7!84?G;(E:4A<M4G<BAAI<EBA@8AG4?!84?G;E<G8E<4
&4:A8G<6<8?7F 8A8I4  
 '4F;$$8??L+ ;4E46G8E<M4G<BAB9G;86E8I<68FB?HG<BA
6;8@<FGELB9 FG4<A?8FFFG88? BEEBF,6<  
 ,6;<99 ' EBF:B:84G  %<FF46 & 4?4E7   "AXH8A68
B9 XHBE<78 6BAG8AG 4A7 C! BA G;8 6BEEBF<BA E8F<FG4A68 B9
G<G4A<H@4A7<GF4??BLF <B@4G8E<4?F   &4:A8G<6 <8?7F KCBFHE8 4A7 4A68E *H8FG<BAF 4A7Answers, ;GGC JJJ 64A68E :BI 64A68EGBC<6F 946GF;88G +<F>
@4:A8G<6W8?7F '4G<BA4? 4A68E "AFG<GHG8 4G G;8 '4G<BA4?
Institutes of Health.

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料④

	 Orthod	 Waves,	
 72:959-969	
 (2013)orthodontic waves 72 (2013) 77–85

78

Available online at www.sciencedirect.com

human health problems including metal allergy and poisoning. Electric current induced in dental appliances by electromagnetic fields may therefore also influence human health[10].
Many electric home appliances and dental devices generatemagnetic fields [13,14]. In this study, we first estimated thelow-frequency magnetic fields (1–2000 Hz) generated by threecommercially available light units used for curing photoactivated resins. We then examined whether magnetic fields
from these and electric toothbrushes induced electric current
and thermal elevation in teeth bonded (or not) to a stainlesssteel (SUS) or zirconia (ZrO2) bracket. We show here that thesedevices do induce electric current in tooth tissue without
thermal changes, irrespective of whether these teeth arebonded to SUS or ZrO2 brackets, which may cause pain anddiscomfort and therefore represents a significant health risk.

journal homepage: www.elsevier.com/locate/odw

Research paper

Electric current induced in teeth by electromagnetic fields
from electric toothbrushes and curing lights
Takashi Kameda a,*, Kazuo Ohkuma b, Natsuki Sano a, Kazuto Terada aorthodontic waves 72 (2013) 77–85

aDepartment of Orthodontics, Nippon Dental University School of Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku, Niigata 951-8580, Japan
Department of Dental Materials Science, Nippon Dental University School of Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku,
Niigata 951-8580, Japanb

article info

abstract

Article history:

Purpose: The purpose of this study was to examine the electric current induced in teeth andReceived 3 July 2012

tooth-bonded brackets by electromagnetic fields from electric toothbrushes and the curing

Received in revised form

lights used for photo-activating light-cured resins.

8 January 2013

Materials and methods: Curing lights-generated low-frequency magnetic fields (1–2000 Hz)

Accepted 22 March 2013

were measured with a spectrum analyzer. Temperature changes induced in the enamel andPublished on line 17 April 2013

pulpal dentin surface of extracted upper premolar teeth (with or without a stainless steel orzirconia bracket) by electric toothbrushes and curing lights were estimated using an infrared

Keywords:

thermometer. Electric current induced in these extracted teeth by electric appliances was

Electromagnetic

estimated using a digital multimeter.

Voltage

Results: Curing lights generated low-frequency magnetic fields. Irradiation of the tooth

Current

surface by curing lights elevated the temperature of the enamel and pulpal dentin surfaces,

Surface temperature

but there were no differences between curing lights. About electric current induced in

Tooth–bracket couple

extracted teeth (with or without a bracket) by electric toothbrushes and curing lights, thehighest current was induced in teeth to which a zirconia bracket was bonded, whereas thelowest current was in unmodified teeth. Intermediate currents were generated in teeth
bonded to stainless steel brackets.
Conclusion: The low-frequency magnetic fields induced by electric toothbrushes and lightcuring units induce electric current in tooth tissue, irrespective of whether these teeth arebonded to stainless steel or zirconia brackets.
# 2013 Published by Elsevier Ltd.

1.

Introduction

The role of low-frequency electromagnetic fields in carcinogenesis, especially the development of leukemia and central
nervous system tumors, has been well-documented [1–6]. The
International Agency for Research on Cancer (IARC), theInternational Commission on Non-Ionizing Radiation

Protection (ICNIRP) and the World Health Organization(WHO) have all defined the roles and risks of magnetic fields
in carcinogenesis [7–9]. Previous study has demonstrated thatelectric current can be induced in fixed dental appliances(including orthodontic appliances) by electromagnetic fields
generated by electric toothbrushes [10]. Galvanic corrosion
caused by weak galvanic currents can occur in various
combinations of dental materials [11,12] and causes various* Corresponding author. Tel.: +81 25 267 1500x303; fax: +81 25 267 1622.
E-mail address: tkameda@ngt.ndu.ac.jp (T. Kameda).
1344-0241/$ – see front matter # 2013 Published by Elsevier Ltd.
http://dx.doi.org/10.1016/j.odw.2013.03.002

2.

Materials and methods

2.1.

Materials

The five electric toothbrushes used in this study were: Braun
Oral-B (P&G Inc., Ohio, USA); GC PRINIA Slim (GC Inc., Tokyo,
Japan, but produced by Panasonic Inc., Osaka, Japan), Lion
VibrateCare Dental ExSystema (Lion Inc., Tokyo, Japan, but
produced by OMRON Inc., Kyoto, Japan), Philips Sonicare
HX6100 (Royale Philips Electronics Inc., Amsterdam, The
Netherlands), and Philips Sonicare HX9100 (Philips Oral
Healthcare Inc., WA, USA). Three curing lights were used:
Lightel-II (Morita Inc., Tokyo, Japan), OPTILUX500 (Kerr Inc.,
WA, USA), and G-Light Prima (GC Inc., Tokyo, Japan).
For experiments investigating the surface temperature andinduction of electric current, 129 human maxillary premolar
teeth were collected following extraction from patients
undergoing orthodontic treatment. Soft tissue was removed
and the teeth were cleaned with tooth brushes and immersedin physiological salt solution (Otsuka normal saline (0.9%(154 mM) NaCl solution), Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.,Tokyo, Japan) in a sealed container until testing. The saline
was changed weekly to prevent the growth of bacteria and/or
fungi. To qualify for selection, the teeth had to have intact
enamel with no cracks and no caries. The brackets used in thisstudy were KBT stainless steel (SUS630) and zirconia (ZrO2)
brackets (Rocky Mountain Morita Inc., Tokyo, Japan) developed by Kameda, T., as the latest modified Begg multibracket
system. These brackets had identical shapes and dimensions(width ! height ! depth: 32 mm ! 32 mm ! 24 mm) and werebonded to the enamel surface of extracted premolars using
adhesive (Light Bond, Reliance Orthodontic Products Inc., IL,
USA) according to the manufacturer’s instructions.

2.2.
lightsMeasurement of magnetic fields generated by curing

Detection of magnetic fields generated by curing lights and themeasurement of their frequencies was achieved using aspectrum analyzer (SPECTRAN NF-5035, Aaronia AB Inc.,
Euscheid, Germany). Published literature [13,15] and ourown preliminary studies showed that the appropriate range

Fig. 1 – Schematic representation of experiments for
estimating electromagnetic fields generated by curing
lights using a spectrum analyzer.

of magnetic field frequencies to monitor was 1–2000 Hz,
because preliminary experiments indicated that all curing
lights generated very weak magnetic fields, but not at
frequencies above 2000 Hz. Magnetic fields were tested at
1 cm from the tips of the light guides for 40 s (Fig. 1). [13].

2.3.
Measurement of temperature changes in enamel andpulpal dentin surfaces
To evaluate temperature changes in the enamel and pulpal
dentin surfaces of our sample teeth, we used an infrared
thermometer (IT-550S, Horiba Inc., Kyoto, Japan). The palatal
half of the premolar crown was dissected to allow estimationof the pulpal dentin surface temperature (Fig. 2). Literaturesuggests that the emissivity of enamel and dentin is 0.91
[16,17], so this value was used to calibrate our infrared
thermometer prior to temperature measurement.

2.4.

Measurement of electric current in tooth tissue

Electric current induced in the tooth tissue was estimatedusing a digital multimeter (7351 A/E, ADC Corporation, Tokyo,
Japan) in AC + DC mode (i.e. voltage = (ACV2 + DCV2)1/2 andcurrent = (ACI2 + DCI2)1/2). The positions of the electrodes andstimulating device (i.e. electric toothbrush/curing light) relative to the teeth are shown in Fig. 1. The mesial and distal sidesof each tooth were drilled down to dentin using diamondpoints in an air turbine. Silver electrodes were then set into

orthodontic waves 72 (2013) 77–85

7980

orthodontic waves 72 (2013) 77–85

Fig. 2 – Schematic representation of experiments for
estimating temperature of pulpal dentin of tooth after
exposure of magnetic fields from electric toothbrushes
and irradiation of curing lights.

this exposed dentin. Induced electric current was estimatedwith a separation of 1, 3 or 5 cm between the front of the
toothbrush and the enamel surface (Fig. 3A) or with a 1-cm
separation between the tip of the curing unit light guide andthe enamel surface of a tooth in an acrylic jig (Fig. 3B). We also
estimated the electric current induced between the anode andcathode in the absence of a tooth and confirmed that noelectricity was detected from electric toothbrushes and curing
lights at a distance of 1, 3 or 5 cm. Electric voltage and current
were estimated as shown in Fig. 4.

2.5.

Experimental conditions, data and statistical analysis

All experiments were performed in a laboratory environment
maintained at 22 " 1 8C without magnetic shielding. Eachexperiment was repeated seven times independently, with the
maximum and minimum values in each data set being
removed before calculation of mean values. Data are given
as the mean " standard deviation. The statistical significanceof the differences within and between groups was determinedwith two-way ANOVA Bonferroni’s post-test comparing allcolumns. Statistical significance was accepted at p < 0.05.

3.
3.1.
lightsFig. 3 – Schematic representation of experiments for
estimating induced electric currents. (A) Electric
toothbrushes. Left; tooth only, right; tooth with a stainlesssteel or a zirconia bracket. (B) Curing lights. Left upper; acuring light drived by rechargeable battery (with noelectric wire), left lower; tooth with stainless steel ofzirconia bracket, right upper; a curing light consisted of a
handpiece and a control box with an electric wire. Arrows
indicate the positions of electrodes for estimation ofvoltage and current by a digital multimeter.

Results
Low-frequency magnetic fields produced by curing

Preliminary experiments indicated that curing lights generated very weak low-frequency magnetic fields. We therefore
measured the magnetic fields generated by three different

curing lights (Lightel-II, OPTILUX500 and G-Light Prima) at 1–2000 Hz (Fig. 5).
A common profile of the magnetic field generated byLightel-II and G-Light Prima curing units was typified by aweak magnetic field with no peaks (Fig. 5A and C). In contrast,
the OPTILUX500 unit generated many strong peaks at 50–
2000 Hz (Fig. 5B).

3.2.

Temperature changes in enamel and pulpal surfaces

We used an infrared thermometer to estimate the temperature changes induced by electric toothbrushes and light curing
units in the enamel and pulpal dentin surfaces of teeth bonded(or not) to a stainless steel or zirconia bracket. A 1-min
exposure to the magnetic field generated by the electric
toothbrushes did not alter the tooth surface temperature ineither the presence or absence of a bracket (Table 1). Curing
lights are known to have an elevated temperature at the tips oftheir light guides and this is transferred to the exposed enamelsurface [18,19]. Indeed, temperature in both enamel and pulpal

Fig. 4 – Electric current induced in tooth with a zirconia bracket. (A) Electric current induced by Phillips Sonicare HX9100 at a
distance of 1 cm between the electric toothbrush and the enamel surface. (B) Electric current induced by OPTLUX500 at a
distance of 1 cm between the tip of light guide of a curing light and the enamel surface.

dentin surfaces was elevated by a 20-s exposure to the curing
light. However, no statistically significant difference between
the different units was observed (Table 2).

3.3.
Electric current induced in teeth by electric
toothbrushes and curing lights
The results of our experiments demonstrating the induction ofelectric current in tooth tissue by electric toothbrushes andcuring lights are shown in Tables 3–6. No voltage or current

was induced when the devices were switched off and placed at
a distance of 1 cm from the tooth (induced voltage and current
were 0 " 0 mV and 0 " 0 mA, respectively). Current induced byelectric toothbrushes was inversely related to the distance
between the brush and the tooth (Tables 3 and 4). Current
induced by curing lights was detected whenever the curing
lights were connected to power, irrespective of whether they
were irradiating (Tables 5 and 6), although the current
increased when the light was irradiating. Each device
stimulated its highest current in teeth with zirconia brackets.

Table 1 – Temperature increase after exposure of magnetic field from electric toothbrushes.
Surfacetemperature (8C)
Tooth
Tooth + ZrO2
bracketTooth + SUS
bracket

EnamalPulpal dentin
EnamelPulpal dentin
EnamelPulpal dentin

Brown OralB

GC PRINIA

Lion
VibrateCare

Philips Sonicare
HX6100Philips Sonicare
HX91000.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0

0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0

0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0

0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0

0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0
0.0 " 0.0

Tooth tissue (enamel or dentin) was exposed to magnetic field from electric toothbrushes for 1 min and the change in temperature measured
using an infrared thermometer with emissivity of enamel and dentin fixed at 0.91. Experiments were repeated five times independently.

orthodontic waves 72 (2013) 77–85

81

82

orthodontic waves 72 (2013) 77–85

Table 3 – Electric voltage induced in tooth tissue by various electric toothbrushes.
A. Induced voltage
Induced voltage
(mV)
Tooth

Tooth + ZrO2 bracket

Tooth + SUS bracket

Distance
(cm)

Brown
OralB

GC PRINIA

Lion
VibrateCare

Philips Sonicare
HX6100Philips Sonicare
HX9100

1
3
5
1
3
5
1
3
5

1.7 " 0.1
1.5 " 0.1
1.0 " 0.1
2.5 " 0.1
1.9 " 0.1
1.5 " 0.1
2.2 " 0.1
1.4 " 0.1
1.0 " 0.1

1.5 " 0.1
1.0 " 0.2 a
0.6 " 0.1 a
2.1 " 0.1 a
1.6 " 0.1 a
1.0 " 0.2 a
1.8 " 0.1 a
1.4 " 0.1
0.8 " 0.2

1.6 " 0.1
1.3 " 0.1
1.0 " 0.1 b
2.6 " 0.2 b
2.2 " 0.2 b
1.7 " 0.1 b
1.8 " 0.2
1.4 " 0.1
1.2 " 0.1 b

2.3 " 0.1a,b,c
1.6 " 0.1b,c
1.0 " 0.1 b
3.7 " 0.3a,b,c
2.4 " 0.3a,b
1.7 " 0.2 b
2.2 " 0.2 b
1.5 " 0.2
0.8 " 0.2

2.7 " 0.2a,b,c,d
2.1 " 0.2a,b,c,d
1.3 " 0.2 b
4.3 " 0.2a,b,c,d
2.7 " 0.3a,b
1.9 " 0.3 b
2.7 " 0.2a,b,c,d
1.6 " 0.2
1.1 " 0.2

B. Induced voltage: distances vs bracket materials
Induced voltage
(mV)

1 cm

Tooth
Tooth + ZrO2 bracket
Tooth + SUS bracket

3 cm

5 cm
a

1.9 " 0.3
3.0 " 0.7 *2.1 " 0.1 **

1.5 " 0.1
2.2 " 0.2a,*
1.5 " 0.1a,**

1.0 " 0.1a,b
1.6 " 0.1a,b,*
1.0 " 0.1a,b,**C. Induced voltage: electric toothbrushes vs distances
Induced voltage
(mV)
1 cm
3 cm
5 cm

Fig. 5 – Low frequency magnetic fields produced by curing lights for light curing resin. (A) Lightel-II; (B) OPTLUX500; (C) G-Light
Prima. Black line indicates the magnetic fields by curing lights under irradiation. The dotted line indicates magnetic fields bycuring lights switched on with no irradiation. The gray line denotes magnetic fields measured by curing lights switched off.

The current in teeth with stainless steel brackets was
somewhat lower, but still higher than in teeth with nobrackets (Tables 3–6).
We also measured, under identical conditions, the current
induced in the stainless steel and zirconia brackets

themselves. Current was detected in the stainless steel
brackets, but not in the zirconia ones. Furthermore, the teeth
exposed only to bonding adhesive (no bracket) experienced
similar currents to those in teeth with no adhesive. Finally, inteeth bonded to an acrylic bracket (of the same shape and size

Table 2 – Temperature increase after irradiation by curing light units.

Tooth tissue (enamel or dentin) was exposed to irradiation by light curing units for 20 s and the change in temperature measured using an
infrared thermometer with emissivity of enamel and dentin fixed at 0.91. Experiments were repeated five times independently. NS denotes nostatistically significant difference, as determined by one-way ANOVA followed by Dunnett’s post-test (P < 0.05), n = 5.

Brown OralB

GC PRINIA

Lion VibrateCare

Philips Sonicare
HX6100Philips Sonicare
HX91002.1 " 0.1
1.6 " 0.1 *
1.2 " 0.1b,*

1.8 " 0.1 a
1.3 " 0.1a,*
0.8 " 0.1a,*,**

2.0 " 0.2 b
1.6 " 0.2b,*
1.3 " 0.1b,*,**

2.7 " 0.5a,b,c
1.9 " 0.2a,b,*
1.2 " 0.2b,*,**

3.2 " 0.6a,b,c,d
2.1 " 0.3a,b,c,*
1.4 " 0.2b,*,**

n = 5 for each experimental condition.
n = 25 for each experimental condition.
n = 15 for each experimental condition.
Data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni’s post-test to define which differences were statistically significant. Superscript
letters denote statistically significant differences ( p < 0.05). (A) Within each row compared to (a) Braun OralB; (b) GC Prinia; (c) Lion VibrateCare;(d) Philips Sonicare HX6100, (B) within each row compared to (a) 1 cm; (b) 3 cm, and within each column compared to *tooth; **tooth + ZrO2
bracket, (C) within each row compared to (a) Braun OralB; (b) GC Prinia; (c) Lion VibrateCare; (d) Philips Sonicare HX6100, and within eachcolumn compared to *1 cm; **3 cm.

as the steel and zirconia ones), the induced current was
similar to that in teeth that had not been bonded to any
bracket.

4.

Discussion

There has been much recent interest in the effect ofelectromagnetic fields (such as those near electricity transmission lines) on human health, especially their potential toeffect the development of leukemia and central nervous
system tumors. An elevated risk of leukemia following
exposure to electromagnetic fields has been demonstrated[1,2], and the IARC, the ICNIRP and the WHO have eachestablished guidelines and criteria outlining the roles and risks
of magnetic fields in carcinogenesis [7–9]. However, otherreports have found no significant correlation between exposure to electromagnetic fields and leukemia [3,4]. Results fromstudies into the correlation between electromagnetic fields
and the risk of central nervous system tumors are also
equivocal [2,4]. These findings about the risks of electromagnetic fields on leukemia and central nervous system tumors
should be depended on the exposure conditions, e.g. intensityand exposure time, of electromagnetic fields [5,6].

In this study, we observed weak magnetic field with no peaks
when using the Lightel-II and G-Light Prima curing units, butwith many strong peaks between 50 and 2000 Hz when using
the OPTILUX500 unit (Fig. 5). This might be due to its electricity
consumption of the power and the light unit, e.g. OPTILUX500;
200 W (halogen light unit), Lightel-II; 120 W (halogen light unit),
G-Light Prima; 10 W (LED light unit). Compared with themagnitude of magnetic fields induced by electric toothbrushes
in our previous report [10], the fields generated here were very
weak. However, in terms of influencing the health of anorganism, the strength of the electric current is more important
than that of the low-frequency magnetic field itself [20]. Many
dental devices and electric home appliances generate lowfrequency magnetic fields [10,13] that could induce electric
current in the human body and within metallic objects such as
dental appliances or devices worn in or on the body [15]. Electric
current in oral and dental appliances (i.e. galvanic current) is
known to induce pain, discomfort and corrosion of metallic
dental appliances [13,14]. We have shown here (Tables 3 and 4)
that such currents in teeth can be generated by electric
toothbrushes and curing lights. Electrical conductivity can be
influenced by the temperature of an object. However, we foundthat although the curing lights elevated the tooth surface
temperature slightly (Table 4), there was no thermal effect83

orthodontic waves 72 (2013) 77–85

Table 4 – Electric current induced in tooth tissue by various electric toothbrushes.

Tooth

Tooth + ZrO2 bracket

Tooth + SUS bracket

A. Induced voltage
Distance(cm)

Brown OralB

GC PRINIA

Lion
VibrateCare

Philips Sonicare
HX6100Philips Sonicare
HX9100

1
3
5
1
3
5
1
3
5

1.5 " 0.2
0.9 " 0.1
0.7 " 0.1
2.0 " 0.1
1.5 " 0.1
1.0 " 0.2
1.8 " 0.1
1.3 " 0.1
0.9 " 0.3

1.3 " 0.1
0.9 " 0.2
0.6 " 0.1
1.7 " 0.2
1.3 " 0.1
0.7 " 0.1
1.5 " 0.1
1.2 " 0.2
0.8 " 0.2

1.6 " 0.1
1.2 " 0.1
0.7 " 0.1
2.3 " 0.2
1.8 " 0.3
1.0 " 0.1
1.7 " 0.1
1.3 " 0.3
0.9 " 0.1

2.0 " 0.2a,b,c
1.4 " 0.1a,b
1.0 " 0.2 b
2.4 " 0.2a,b
1.9 " 0.2a,b
1.0 " 0.1
2.2 " 0.2a,b,c
1.5 " 0.1
1.1 " 0.2

2.0 " 0.2a,b,c
1.5 " 0.2a,b
0.9 " 0.3
2.5 " 0.2a,b
2.0 " 0.2a,b
1.5 " 0.1a,b,c,d
2.1 " 0.3b,c
1.6 " 0.2 b
1.1 " 0.3

Induced current (mA)

1 cm

Tooth
Tooth + ZrO2 bracket
Tooth + SUS bracket

3 cm

Tooth + ZrO2 bracket
Tooth + SUS bracket

1.7 " 0.1
2.2 " 0.1 *1.9 " 0.1 **

1.2 " 0.1
1.7 " 0.1 a,*
1.4 " 0.1 a,**a,b0.8 " 0.1
1.0 " 0.1 a,b
0.9 " 0.1 a,b

Brown OralB

GC PRINIA

Lion VibrateCare

Philips Sonicare
HX6100Philips Sonicare
HX91001.8 " 0.1
1.2 " 0.1 *0.8 " 0.1*,**

1.5 " 0.1 a
1.1 " 0.1 *0.7 " 0.1*,**

1.9 " 0.1 b
1.4 " 0.1b,*
0.9 " 0.1*,**

2.2 " 0.1a,b,c
1.6 " 0.1a,b,*
1.0 " 0.1b,*,**

2.2 " 0.1a,b,c
1.7 " 0.1a,b,c,*
1.2 " 0.1a,b,c,*,**

n = 5 for each experimental condition.
n = 25 for each experimental condition.
n = 15 for each experimental condition.
Data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni’s post-test to define which differences were statistically significant. Superscript
letters denote statistically significant differences ( p < 0.05). (A) Within each row compared to (a) Braun OralB; (b) GC Prinia; (c) Lion VibrateCare;(d) Philips Sonicare HX6100, (B) within each row compared to (a) 1 cm; (b) 3 cm, and within each column compared to *tooth; **tooth + ZrO2
bracket, (C) within each row compared to (a) Braun OralB; (b) GC Prinia; (c) Lion VibrateCare; (d) Philips Sonicare HX6100, and within eachcolumn compared to *1 cm; **3 cm.

associated with electric toothbrushes (Tables 1 and 3). In
addition, temperature of enamel surface was higher than that of
pulpal dentin in the curing light group (Table 2). These results
suggested that magnetic field-induced current in teeth generated by these devices did not play important roles intemperature elevation of tooth surface. We concluded that
thermal changes in the tooth or dental appliance induced bydevices emitting a low-frequency magnetic field are negligible,
and that induction heating of the tooth is unlikely to be
sufficient to cause significant adverse effects.
Electric current induced in tooth tissue by electric toothbrushes was inversely related to the distance between the brushand the tooth (Table 3A and B), consistent with findings in ourprevious study [10]. However, we found that the voltages
induced in the tooth were higher (102–103 mV) than thosemeasured previously in dental appliances (101–102 mV) [10]. In
contrast, the current induced by electric toothbrushes in ourstudy were lower (#101 mA) than those measured previously indental appliances (101–103 mA) [8]. This difference could relate todisparities in the electrical resistivity of tooth tissue (#103 V m)
and metal (stainless steel = #10$8 V m) [21,22]. When tooth
surfaces were irradiated by curing lights, the current induced
was greater than when the (powered) unit was held in proximity
to the tooth but without irradiating, consistent with ourmagnetic field findings (Table 4A and B). The rank orders inwhich electric toothbrushes generated electric voltage and

1
1
1
1
1
1

Irradiation(switch:ON)

Lightel-II by
MoritaOPTILUX500
by KERR

G-Light Primaby GC

0.8 " 0.1
1.0 " 0.1
0.8 " 0.1
1.5 " 0.1
1.0 " 0.1
1.3 " 0.2

1.3 " 0.1 a
1.5 " 0.1 a
1.3 " 0.1 a
2.4 " 0.1 a
1.2 " 0.2
2.0 " 0.2 a

0.0 " 0.0a,b
0.3 " 0.1a,b
0.0 " 0.0a,b
0.6 " 0.1a,b
0.0 " 0.0a,b
0.4 " 0.1a,b

No
Yes
No
Yes
No
Yes

B. Induced voltage: irradiation vs bracket materials

C. Induced current: electric toothbrushess vs distances

1 cm
3 cm
5 cm

Distance(cm)

Induced voltage (mV)

5 cm
aInduced voltage(mV)
Tooth only

B. Induced current: distances vs bracket materials

Induced current(mA)

orthodontic waves 72 (2013) 77–85

Table 5 – Electric voltage induced in teeth by light curing units used for photo-activating light-cured resins.

A. Induced current
Induced current
(mA)

84

current in tooth tissue are: Sonicare HX9100 > Sonicare
HX6100 > VibrateCare % OralB > PRINIA (voltage) and Sonicare
HX9100 % Sonicare
HX6100 > VibrateCare % OralB % PRINIA(current). These orders were almost identical to our previous
results demonstrating magnetic field generation by thesedevices [10]. The rank orders in which curing light units
generated electric voltage and current in tooth tissue were:
OPTILUX500 > Lightel-II > G-Light Prima (voltage) and OPTILUX500 & Lightel-II > G-Light Prima (current), consistent with
our results here describing magnetic field generation by theseunits (Fig. 5). These orders were almost identical to the results
demonstrating magnetic field generation by these devices andtheir electricity consumption of the power unit (Fig. 5).
We predicted that the rank order in which currents could be
induced in different materials would be tooth + stainless steel
bracket > tooth + zirconia bracket & tooth, based on theirelectrical resistivity (tooth, 103 V m; stainless steel,
10$8 V m; ZrO2, 1010–1012 V cm; resin (acrylic), 1013–1014 V m)
[23,24]. However, we found that the actual rank order was
tooth + zirconia bracket > tooth + stainless steel bracket > tooth. The reason for this unexpected result is unclear.
The presence of adhesive appears not to be a factor because
the induced current was comparable with and withoutadhesive (no bracket). The resistivity of bracket materials also
appears to be insignificant because the current was greater inteeth attached to ZrO2 or stainless steel brackets than in teeth

Irradiation-off

Irradiation-on

0.7 " 0.3
0.7 " 0.3
0.8 " 0.1

0.9 " 0.3
1.5 " 0.6 a
1.2 " 0.5

Tooth
Tooth + ZrO2 bracket
Tooth + SUS bracket

C. Induced voltage: curing light units vs irradiation
Induced voltage (mV)Lightel-II by Morita

OPTILUX500 by KERR

G-Light Prima By GC

0.9 " 0.1
1.3 " 0.1 *1.3 " 0.1 a
2.0 " 0.2a,*

0.0 " 0.0a,b
0.4 " 0.1a,b,*

Irradiation-off
Irradiation-on

n = 5 for each experimental condition.
n = 15 for each experimental condition.
n = 15 for each experimental condition.
Data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni’s post-test to define which differences were statistically significant. Superscript
letters denote statistically significant differences ( p < 0.05). (A) Within each row compared to (a) Lightel-II; (b) OPTILUX500, B. within each row
compared to a) irradiation-off, and within each column compared to *tooth; **tooth + ZrO2 bracket, (C) within each row compared to (a) LightelII; (b) OPTILUX500, and within each column compared to *irradiation-off.

Table 6 – Electric current induced in teeth by light curing units used for photo-activating light-cured resins.
A. Induced current
Induced current(mA)
Tooth only
Tooth + ZrO2 bracket
Tooth + SUS bracket

Distance
(cm)
1
1
1
1
1
1

Irradiation(switch: ON)

Lightel-IIby Morita

OPTILUX500
by KERR

G-Light Prima
by GC

No
Yes
No
Yes
No
Yes

1.0 " 0.1
1.3 " 0.2
1.2 " 0.2
1.8 " 0.1
1.2 " 0.2
1.5 " 0.2

1.1 " 0.2
1.4 " 0.2
1.2 " 0.2
2.2 " 0.3
1.2 " 0.2
1.8 " 0.2

0.0 " 0.0a,b
0.4 " 0.2a,b
0.0 " 0.0a,b
0.9 " 0.1a,b
0.0 " 0.0a,b
0.7 " 0.2a,b

B. Induced voltage: irradiation vs bracket materials
Induced current (mA)
Tooth
Tooth + ZrO2 bracket
Tooth + SUS bracket

Irradiation-off

Irradiation-on

0.7 " 0.3
0.8 " 0.4
0.8 " 0.4

1.0 " 0.2
1.7 " 0.4a,*
1.4 " 0.3

C. Induced voltage: curing light units vs irradiation
Induced current (mA)
Irradiation-off
Irradiation-on

Lightel-II by Morita

OPTILUX500 by KERR

G-Light Prima by GC

1.1 " 0.1
1.6 " 0.1 *

1.2 " 0.1
1.8 " 0.2 *0.0 " 0.0a,b
0.7 " 0.1a,b,*n = 5 for each experimental condition.
n = 15 for each experimental condition.
n = 15 for each experimental condition.
Data were analyzed by two-way ANOVA with Bonferroni’s post-test to define which differences were statistically significant. Superscript
letters denote statistically significant differences ( p < 0.05). (A) Within each row compared to (a) Lightel-II; (b) OPTILUX500, (B) within each row
compared to a) irradiation-off, and within each column compared to *tooth; **tooth + ZrO2 bracket, (C) within each row compared to (a) LightelII; (b) OPTILUX500, and within each column compared to *irradiation-off.

orthodontic waves 72 (2013) 77–85

bonded to identically shaped acrylic brackets (data not shown).
Despite great efforts, we have been unable to correlate theseresults with any specific material property. However, there
might be possibility that tooth + zirconia bracket mimics theceramic capacitor [25,26]. When the capacitors are electrified,magnetic fields are generated around them [27]. These
generated magnetic fields could induce the electric current,
and might amplified the current level in tooth. It is likely that
unexpected rank order of induced current is due to combinationof tooth and material properties of the appliance components
other than their materials and resistivity themselves.
In this study, we have shown that the low-frequency
magnetic fields induced by electric toothbrushes and lightcuring units induce electric current in tooth tissue, irrespectiveof whether these teeth are bonded to SUS or ZrO2 brackets. We
have also shown that thermal effects of the curing lights totooth surface could not be due to their magnetic field-induced
current in teeth, and ceramic appliances combined with teeth
mimic capacitors when exposed to magnetic fields. It is very
difficult to protect ourselves from low-frequency magnetic
fields as they can pass through human tissue and most othermaterials, including glass, plastic, metals and concrete [19]. The
only viable way to limit exposure to low-frequency electromagnetic fields is thought to be elimination of their generation byelectrical home appliances and dental devices. We conclude
that the currents generated in teeth by these devices issignificant, and that further study is necessary to clarify exactly
how they impact on human oral health and whether countermeasures can be developed to negate their effects.

Acknowledgment
The authors are grateful to Associate Prof. Nozomu Ishii,
Department of Biocybernetics, Faculty of Engineering, Niigata
University, for providing valuable advice.

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Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑤

	 Orthod	 Waves,	
 72:87-98	
 (2013)orthodontic waves 72 (2013) 87–98

88

Available online at www.sciencedirect.com

toughness, metals were widely used in many fields, including
the clinical dental field. Recently, patients have tended todemand that more attention be paid to the appearance ofdental materials as well as their satisfactory performance,
which has led to dental materials being based on whitecolored materials, i.e. plastic resins and ceramics. However,they do not possess the toughness associated with metals.
Ceramics are easy to break by application of external forces,
i.e. biting forces, and could not be readily bent because of theirbrittleness [2]. Plastic resins could be bent a little; however,this quality was easily affected by degradation in the oral
environment [2]. This contradiction between patient demands
and the physical properties of dental materials could be
resolved if we could make bendable ceramics, non-degradable
plastic resins or white-colored metals. Literature search of theword ‘‘white’’ and ‘‘metal/alloy’’ revealed some papers [3,4].
Anodic oxidation of titanium makes titanium dioxide on thesurface of that for improvement of corrosion resistance, andcould color the titanium [5–8]. However, metallic luster oftitanium could not be diminished [8]. Therefore, we developed
two methods of making white-colored metal without coating
and plating for compatible, both excellent mechanicalcharacteristics and esthetics as orthodontic appliances. One
method is for injection moldings especially for prevention of
crushing of ceramics when combined with them. This led us
make non-crushing ceramic orthodontic appliances and metal
bonded crowns in a rapid manner, i.e. making tooth-coloredcrowns/bridges during chair-time or on the day of the first
medical examination (patent pending). The other method
concerns white-colored surface preparation for titanium
dental appliances, including orthodontic appliances (patentpending). In this paper we show the methods of making whitecolored metals without any plating and coating.

journal homepage: www.elsevier.com/locate/odw

Research paper

Modification of metallic materials for a white appearance
without coating and plating
Takashi Kameda a,*, Kazuo Ohkuma b, Natsuki Sano a, Yoshiharu Shin c, Kazuto Terada aaDepartments of Orthodontics, Nippon Dental University School of Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku, Niigata City, Niigata 9518580, Japanb
Departments of Dental Materials Science, Nippon Dental University School of Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku, Niigata City,
Niigata 951-8580, Japanc
Yamahachi Dental Mfg., Co., 54-1 Nishiura-cho Ohtsuka, Gamagoori City, Aichi 443-0105, Japan

article info

abstract

Article history:

Purpose: The purpose of this study was to develop white-colored metals for metal injection

Received 17 October 2012

moldings, and white-colored surface preparation for metals to satisfy the esthetic demands

Received in revised formof patients.

30 January 2013

Materials and methods: Two methods for white coloration of metals were developed for two

Accepted 7 March 2013

kinds of metals. For white-colored silver metal, silver powder was baked at 700 8C for 15 min

Available online 6 April 2013

with or without the alumina plate. For white-colored surface preparation, titanium wire,

Keywords:

white-colored specimens were used for evaluation of coloration, mechanical strength andorthodontic brackets and dental implants were baked at 1000 8C for 15 min. Two kinds ofWhite-colored metal

the components.

Mechanical characteristics

Results: Treated silver metal was visually white, and closed to the color of white porcelain

Component analysis

panel evaluated by a colorimeter. From the results of load-deflection tests, the mechanicalColor difference

strength of white-colored silver metal was almost same as that of non-treated one. Surface

orthodontic waves 72 (2013) 87–98

2.

Materials and methods

2.1.

Materials

prepared titanium objects were also visually white, and closed to the color of white
porcelain, and thickness of white color layer was 10–50 mm. Load-deflection tests revealed
that white-colored titanium metal was fragile compared to non-treated one. The component of white-colored silver metal was approximately 100% Ag. On the other side, thesurface component of white-colored titanium metal was titanium dioxide.
Conclusion: Two methods of white coloration for metals were developed. One method is useof injection molding especially for prevention of crushing of ceramics when combined withthem. The other is a white-colored surface preparation for dental appliances, including
orthodontic appliances.
# 2013 Elsevier Ltd and the Japanese Orthodontic Society. All rights reserved.

1.

Introduction

When the metal is transformed, the atomic bond is maintained by free electrons even if the position of the atomic bondis changed. This is why metals can be changed and processed
without breaking by application of external forces, in contrast
to the easy breaking of ceramics by relatively small forces. The
metal surface of free electrons reflects all visible wavelengths
and maintains its silver metallic luster [1,2]. Because of their* Corresponding author at: Department of Orthodontics, Nippon Dental University School of Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuoku, Niigata City, Niigata 951-8580, Japan. Tel.: +81 25 267 1500x303; fax: +81 25 267 1622.
E-mail address: tkameda@ngt.ndu.ac.jp (T. Kameda).
1344-0241/$ – see front matter # 2013 Elsevier Ltd and the Japanese Orthodontic Society. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.odw.2013.03.001

Preliminary experiments for making ‘‘white-colored metal’’
were carried out using various kinds of metals by a range of
methods. The color of metal was judged by visual observationsin these screening experiments. From the results of theseexperiments, it was possible that silver and titanium could be
rendered white-colored without any coating and plating, sothat silver powder (Ag-HWQ 2.5 mm, Fukuda Metal Foil &Powder Co. Ltd., Kyoto, Japan), and ingots (10 mm w ! 15 mm)
or 1 mm thickness discs of titanium (T-Alloy M, GC Co. Ltd.,Tokyo, Japan) were used for these experiments. Discs oftitanium were prepared by cutting ingots with a diamond discsaw (Isomet low speed saw model no. 11-1280-170 with
Buehler wafering blades, Buehler Inc., IL, USA). We consideredusing silver as a lining metal in ceramic dental appliances toprevent breaking in the oral environment, because silver
powder could be used like silver clay as a filling material.
Therefore, we used not only silver itself for the white-colored
metal, but also baked on alumina ceramic plates (Asuzac Co.
Ltd., Nagano, Japan). Titanium was used as a white-colored
metal by white-colored surface preparation for dental
appliances.

2.2.
Representation of objects made of white-colored metal
by injection molding, and prepared by white surface coloring
To represent the white-colored objects, we made a whitecolored metal bonded crown by molding using silver powder.
A zirconia crown was milled using a CAD/CAM millingmachine (Cadim, Advance Co. Ltd., Tokyo, Japan). The zirconia
crown was then filled by gray-color silver powder mixed withhydrogen peroxide solution, and pressed onto an artificial
tooth prepared by using a cutting tool with a diamond point.
After removal of surplus silver clay, the material was baked at
700 8C for 15 min in a furnace (KDF009G, Denken Co. Ltd.,
Kyoto, Japan). For objects with white-colored surface preparation, we used orthodontic brackets (Rematitan titanium
bracket, Dentaurum, Ispringen, Germany) and one piece typedental implants (m-one, Yamahachi Dental Mfg. Co., Aichi,
Japan) made of pure titanium. They were baked at 1000 8C for
15 min in a furnace for white color preparation.

2.3.

Measurement of color

To measure the color of white-colored metal discs (silver;
10 mm ! 10 mm ! 2 mm, baked at 700 8C for 15 min, titanium;
10 mm w ! 1 mm, 1000 8C for 15 min), we used a colorimeter(CR-100, Minolta Co. Ltd., Tokyo, Japan). The colorimeter wascalibrated by the standard white porcelain plate, an accessoryof the instrument, before estimation of the color value of thesamples. We also estimated the color of intact silver andtitanium plate compared to white-colored metals.
We measured L* (lightness of color, L* = 0 yields black andL* = 100 indicates diffuse white), a* (position between red/magenta and green, negative values indicate green while
positive values indicate magenta) and b* (position between
yellow and blue, negative values indicate blue and positive
values indicate yellow) and calculated DE * ab (DE) using
CIELAB [9,10]. Color differences between white porcelain plateand intact metal/white-colored metal were exhibited as DE,
which was calculated by the following equation:
DE " ab ¼ ½ðDL"Þ2 þ ðDa"Þ2 þ ðDb"Þ2(1=2The color difference value (DE) was defined by the NBS unit
(National Bureau of Standards, National Institute of Standards
and Technology, MD, USA) as follows: 0–0.5; trace, 0.5–1.5;
slight, 1.5–3.0; noticeable, 3.0–6.0; appreciable, 6.0–12.0; much,
12.0–; Very much. Comparing the value of DE of intact metal
and white-colored metal, we could establish whether the colorof white-colored metals was close to that of white porcelain
plate.

2.4.

Thickness of white color layer on the titanium surface

To estimate the thickness of white color layer of titanium
surfaces, dental implants were used, because they contained
two different polished surfaces (mirror polished and sandblasted surfaces) and screw shaped part. First, white colortreated dental implant was embedded in acrylic resin using
embedding machine (PNEUMET II mounting press, Buehler
Inc., IL, USA). After embedding, specimen was cut longitudinally by a diamond disc saw. Observation and thickness
estimation of white color layer of the dental implant wasorthodontic waves 72 (2013) 87–98

performed with a metallurgical microscope (BX51, Olympus
Co., Tokyo, Japan). Observation and estimating point of crosssection of the dental implant was three points, i.e. mirror
polished abutment part, sand blasting of the deepest part ofthe screw thread of fixture part, and sand blasting of the top
part of the screw thread of fixture part.

2.5.
Three-point bending tests and mechanicalcharacteristics
To confirm the flexibility, especially the bending ability of thewhite-colored metal, we performed three-point bending tests
using a universal testing machine (AG-I, Shimadzu Co. Ltd.,
Kyoto, Japan) with 20 mm support span. For this experiment,
intact and white-colored metals were prepared, i.e. silver
plates (metal colored one and white one which baked at 700 8C
for 15 min after mixture of silver powder and distilled water,
5 mm ! 5 mm ! 35 mm) and titanium wires (one untreated
one and one white surface prepared by baking at 1000 8C for
15 min, 1 mm w ! 35 mm) as test pieces. Cast and mold oftitanium was difficult, and silver plates could not be made in
the same size as titanium wires, because of their low strength,
and shrinking and deformation during baking. This is thereason why silver and titanium specimens were of different
size.
Moreover, samples combined with intact/white-colored
metal and ceramics were also prepared. Silver clay was coatedonto an alumina ceramic plate (3 mm ! 0.5 mm ! 50 mm)
with 1 mm thickness using a mixture of silver powder anddistilled water or hydrogen peroxide solution (approximately
30% hydrogen peroxide solution, Wako Co. Ltd.), and then they
were baked at 700 8C for 15 min in a furnace. This thickness of
silver metal on alumina plate was decided considering theclearances between abutment tooth and opposing tooth, andthickness of parts of ceramic made orthodontic appliances.
To investigate the mechanical characteristics of whitecolored silver metal, plates were prepared (5 mm ! 5 mm !
35 mm, baked at 700 8C for 15 min). We calculated thecoefficient of volume contraction, porosity and bending
strength by means of the following equations [2]:(A) Volume contraction (%)!
"
volume before baking ) volume after baking! 100
volume before baking(B) Porosity (%)
2
3density of porous
Density" of silverð¼ 10:5Þ )6
white-cloured metal7
4
5 ! 100
Density of silver*
Density (g/cm3) = weight after baking/volume after baking.

3!maximum load!support span:
2!width of sample!height of sample2(C) Bending strength (MPa)89metal using an electron probe microanalyzer (EPMA; JXA-8100,
JEOL Co. LTD., Tokyo, Japan) [11]. For this analysis, we preparedsilver discs (a metal colored one and white one which baked at
700 8C for 15 min, 10 mm ! 10 mm ! 2 mm) and titanium
ingots (non-treated one and white-colored surface prepared
one which baked at 1000 8C for 15 min, 10 mm w ! 15 mm) as
test pieces. To investigate the oxide on the surface of thetitanium disc, Raman spectroscopy was performed to clarify
whether titanium oxide on the disc was rutile or anatase usinga laser Raman spectrometer (NRS-3100, JASCO Co. Ltd., Tokyo,
Japan) [12]. For this analysis, we prepared the white-coloredsurface prepared titanium ingots (10 mm w ! 15 mm, baked at1000 8C for 15 min) as a test piece. These analyses were
performed at the Industrial Research Institute of the Niigata
Prefecture as a trusted third party. Each analysis was
conducted according to the standard protocol [13].

2.7.

orthodontic waves 72 (2013) 87–98

Fig. 1 – Representation of white-colored metal. (A, left) metal-colored silver plate; right: white-colored silver plate made fromsilver clay for filling materials. White bar indicates 1 cm (B, left) an intact titanium ingot; right: white color-preparedtitanium ingot. White bar indicates 5 mm, and (C) high magnification of ‘‘C’’ (10T). Black bar indicates 1 mm

Data and statistical analysis

From the data of each experiment 8 out of 10 data points wereobtained, which meant that the maximum and minimum data
were removed. These 8 data were calculated and represented
as means * standard deviations. The statistical significance ofdifferences between group means was determined by meansof a t-test.

3.

90

Fig. 2 – White-colored silver metal and metal-supported zirconia crown. (A) Mass of baked silver clay. Left: white-coloredsolid sample; right: white-colored foamed sample, (B) white solid metal-supported crown, and (C) a crown supported bywhite foamed metal made from silver clay with 30% hydrogen peroxide.

Results

3.1.
Representation of objects made of white-colored metal
by injection molding, and prepared by white-colored surface
preparation
We tried to make white color metals and/or white-coloredsurface preparation for metals by many methods andmaterials, and found that silver metal and titanium metal
could be changed from metallic color to white.
Silver metal exhibited a white color by injection molding
using silver clay consisting of silver powder and binder(solution) (Fig. 1A and 2). This phenomena could be foundwhen silver clay was baked at 650–720 8C for 10–20 min We
thus decided that the experimental condition was baking ofsilver clay at 700 8C for 15 min.
Titanium metal could exhibit a white color as a result of
surface heat treatment (Fig. 1B and C). To clarify the heatcondition for the white-colored treatment of titanium, we firstexamined the experimental conditions. Appropriate conditions for white treatment were 1000 8C for 5–15 min and1100 8C for 2.5–5 min (Fig. 3). In the case of insufficient heating
conditions, the surface of titanium exhibited a gray color. In
contrast, excess heating turned the titanium surface yellow
and also resulting in peeling. From this results, we decided
that the experimental condition was baking of titanium at1000 8C for 15 min White color treatment of titanium products
are represented in Fig. 4.

2.6.
Component analysis by electron probe microanalysis
and laser Raman spectrometry

3.2.

We performed component analysis of the white-colored silver
metal and white-colored surface preparation of titanium

We estimated the color of white-colored metals by thecolorimeter. In silver metals, the colors were close to that of

the standard white porcelain panel, whereas, metallic coloredsilver was not close to this value (Table 1A).
In titanium metals, values of color differences (DE) of whitecolor-treated titanium metals were close to the standard
porcelain panel compared to intact titanium metals (Table 1B).

For titanium, the bending strength of the white sample wasalmost identical to that of the metallic one in the elastic
region. In the plastic region of bending strength the whitetitanium was increased, but fragile compared to the metallic
titanium specimen (Fig. 5B).

3.3.

3.4.

Three-point bending tests of white-colored metals

The bending strength of white silver was almost same as thatof the metallic one in the elastic region, however, the bending
strength of the white sample was lower than that of themetallic one in the plastic region (Fig. 5A).

White silver metals for injection molding

We considered using white-colored metals for injection
molding as the materials for orthodontic appliances, but
found that silver was too low in strength for this application.
For this reason, we decided to use them for prevention of

Measurement of color differences

Fig. 3 – Baking conditions for making white-color prepared titanium metal. Black bar indicates 2 mm

91

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orthodontic waves 72 (2013) 87–98

non-foamed metals had become detached in the region ofalumina fracture point and 5 mm from that point. (Fig. 10A and
B). After white-colored silver metal heated at 700 8C on
zirconia plate, solid metal could detached from ziriconia plate
easily, however, strong force was needed to peel the porous
metal from zironia plate with remaining of porous one, which
exhibited white color (Fig. 6).

Fig. 4 – White color preparation for dental implants and orthodontic brackets. (A) Dental implants. Left: non treatment; right:
white color treatment. White bar indicates 5 mm (B) orthodontic brackets upper: non-treatment, lower: white color
treatment. White bar indicates 2 mm

Fig. 6 – Detached white-colored silver metal heated at
700 8C on zirconia plate. Left: solid metal; right: porous
metal made from silver clay with 30% hydrogen peroxide.
Solid metal could detached from ziriconia plate easily (A),however, strong force was needed to detach the porous
one from zironia plate with remaining of porous one (B).
Black bar indicates 1 cm

Table 1 – Color differences (DE) between intact and white colored-metals.

A. Silver metalStandard white porcelain panel
SilverWhite-colored silver metal
B. Titanium metalStandard white porcelain panel
Titanium
White-color prepared titanium metal

L*

a*

b*

DE*ab

97.88 * 0.18
70.92 * 0.74
95.92 * 0.53

0.42 * 0.00
0.32 * 0.00
0.41 * 0.00

)0.38 * 0.00
)0.28 * 0.00
)0.36 * 0.00

26.97 * 0.74
1.97 * 0.53

97.9 * 0.1
62.4 * 4.1
78.9 * 1.7

0.40 * 0.00
1.00 * 0.26
)0.70 * 0.46

)0.37 * 0.06
3.67 * 1.10
4.47 * 0.42

35.8 * 4.3
19.6 * 1.6

n = 8.

crushing of the ceramic orthodontic appliances by lining ofwhite colored metals. For this experiment, we used ceramiccrown caps with white colored metal lining. First, solid silver
clay was used for lining of CAD/CAM-made ceramic crowncaps, but the cap and white-colored metal liner were found tohave separated after baking by shrinkage of the white-colored
metal (Fig. 2B). We tried to suppress the shrinkage of the silver
clay by baking with porosity, using hydrogen peroxide solution(Fig. 2A and C). After baking ceramics with porous silver clay,
they attached strongly (Fig. 2C and 6).

In this step, we needed to investigate appropriate concentration of hydrogen peroxide for silver clay and the effects ofporosity on the characteristics of white silver metal. Surface
and color differences of porous white silver are represented inFig. 7 and Table 2, respectively. Then we examined themechanical characteristics of porous white silver (Fig. 8). Fromthese results, silver clay with 3% of H2O2 exhibited the highest
porosity and was the weakest in terms of mechanical strength.
In contrast, silver clay with 30% of H2O2 exhibited the lowest
porosity and highest mechanical strength with low shrinkage

during baking (Fig. 8). Silver clay with distilled water (0% of
H2O2) exhibited 7–8% of porosity.
Next, we estimated the mechanical strength of a combination of ceramics and white silver metals (Figs. 9 and 10). The
lining of silver metal to the alumina ceramic plate increased
the breaking point (Fig. 9A). In addition, the resilience of the
combination of ceramics and metal exhibited a high value
compared with that of the ceramic alone (Fig. 9B). Lining of
porous metals to ceramics led to strengthened mechanicalcharacteristics compared with the lining of non-porous
samples (Fig. 9).
From the observation of testing samples after breaking,porous metals still adhered to the ceramic plates, whereas

3.5.
White color treatment for titanium metals andthickness of their white color layer
We tried to make titanium dental products, i.e. dental
implants and orthodontic brackets with a white color by thismethod and found that both of them exhibited a white color(Fig. 4A and B). This method changed only the surface oftitanium and we estimated the vertical slot sizes of metallic
and white color brackets. Both bracket slot sizes were almost
same and exhibited no statistically significant differences(Table 3).
We evaluate the thickness of white color layer in crosssection of dental implant at three points, i.e. mirror polishedabutment part, sand blasting of the deepest part of the screw
thread of fixture part, and sand blasting of the top part of thescrew thread of fixture part (Fig. 11A). About mirror polishedabutment part of dental implant, thickness of white color layer
was 40.0–53.3 mm (average * SD; 44.5 * 5.6 mm) (Fig. 11B and
Table 4). Sand blasting of the deepest and top part of the screw
thread of fixture part was exhibited 10.7–16.0 mm (average * SD; 13.9 * 2.2 mm) and 26.7–36.0 mm (average * SD;
31.7 * 3.7 mm), respectively (Fig. 11C and D; Table 4). Rankorder of thickness of white color layer on the dental implant
was mirror polished abutment part > sand blasting of the top

Table 2 – Color differences (DE) between foamed and non-foamed white colored silver generated from silver clay with 30%
hydrogen peroxide.

Standard white porcelain panel
SilverWhite-colored silver metal
White-colored foamed silver metal

L*

a*

b*

DE*ab

97.78 * 0.57
70.92 * 0.74
95.93 * 0.55
90.95 * 1.15

0.42 * 0.01
0.32 * 0.01
0.41 * 0.01
0.36 * 0.02

)0.37 * 0.01
)0.29 * 0.01
)0.36 * 0.01
)0.36 * 0.01

26.87 * 0.74
1.85 * 0.55
6.83 * 1.15

n = 8.

Fig. 5 – Stress–strain curves of white-colored metals. (A) silver metal (5 mm T 5 mm T 35 mm), (B) titanium metal(1 mm w T 35 mm). Solid lines indicate the results of conventional metals, and dotted lines indicated those of white colored
metals. Support spans were 20 mm

Fig. 7 – Surface of white-colored silver metal made from silver clay with various concentrations of hydrogen peroxide (20T).
Black bar indicates 0.5 mm

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could be observed (Fig. 12 B and C). However, components ofthem were almost same, i.e. more than 98 mass% and 93 at%of them were silver (Table 5).
In titanium metals, surface conditions were also different
between metallic and white color samples as seen fromscanning electron micrographs (1000!) (Fig. 13A and B). In
white color sample, scanning electron micrographs revealedoxides covered the titanium surface (Fig. 13B). From thecomponent analysis, the white color of the titanium surface
was due to titanium dioxide (Table 6). We then examined thetype of this titanium dioxide by a laser Raman spectroscopy,
which revealed that white-colored surface was rutile typetitanium dioxide (Fig. 14).

Fig. 8 – Effects of concentration of solution for increase ofporosity (H2O2) on mechanical characteristics of whitecolored silver metal.

part of the screw thread of fixture part > sand blasting of the
deepest part of the screw thread of fixture part. White color
layer covered all titanium surface of the dental implant(Fig. 11)

3.6.
Component analysis by electron probe microanalysis
and laser Raman spectrometry
To clarify the causes of this white color of metals, we
performed component analysis using an electron probe
microanalyzer. For silver metals, surface conditions werequite different between metallic (baked silver clay at 900 8C for
15 min) and white-colored ones (baked silver clay at 700 8C for
15 min) from scanning electron micrographs (1000!) (Fig. 12A–
C). In white-colored silver groups, no significant differences inscanning electron micrographs between solid and porous ones

4.

Discussion

Recently there has been a growing tendency of patients todemand that dental treatments involve an acceptable appearance as well as sound dental properties. However, the metal
surface of free electrons reflects all visible spectra and it keeps
its silver metallic luster. This property is due to the metallic
bond [1,2]. When the metal is transformed, the atomic bond ismaintained by free electrons even if the position of the atomic
bond is changed, so that metals can be changed and processed
without breakage and widely used in dental field [1,2]. This
contradiction between patients’ demands and physical properties of dental materials could be resolved by the making of
bendable ceramics, non-degradable plastic resins or whitecolored metals. There are some papers whose titles include
the word ‘‘white’’ and ‘‘metal/alloy’’ [3,4]. Anodic oxidation oftitanium could also color the titanium [8]. However, their‘‘white’’ is not white but silver metallic luster observed by the
naked eye. Therefore, we developed two methods of making
white-colored metal without coating and plating as describedin this paper. From our trial to make white-colored metals
and/or white-colored surface preparations for metals by many

Fig. 10 – Conditions of testing samples after three-point bending tests. (A) alumina plate, (S) silver metal. White bar indicates
1 mmmethods and materials, silver and titanium metal were foundto change their metallic color to white.
Silver metal exhibited white color after baking a silver clay
comprising silver powder and binder solution. We consideredusing white color metals for injection molding as the materials
for orthodontic appliances, i.e. brackets and molar tubes, but
found that silver metal was too low in strength for suchapplications. For this reason, we elected to use them forprevention of crushing in ceramic appliances and metalbonded crowns lining the ceramic crown caps. However,white-colored metal became detached from the ceramic plates
during the baking process, because of their high shrinkage(Fig. 2B). Thus we selected creation of porous metals in order todecrease this shrinkage, using hydrogen peroxide. Appropriate concentration of hydrogen peroxide for silver clay wasinvestigated and it was found that a suitable concentration
was 30%. The concentration of undiluted solutions of hydrogen peroxide on the market was approximately 30%. To
examine the effects of porosity on the characteristics of whitesilver metal, we found interesting results. Silver clay with 3%
H2O2 exhibited the highest porosity and was the weakest interms of mechanical strength. In contrast, silver clay with 30%
H2O2 exhibited the lowest porosity and highest mechanical

Table 3 – Vertical slot sizes of non- and white colortreated orthodontic brackets.

Fig. 9 – Mechanical characteristics of alumina ceramic plate lining with white-colored silver metal. (A) Load-deflection curve.
Dotted line; alumina plate (0.5 mm thickness), semi-dotted line: alumina ceramic plate (0.5 mm thickness) with solid silver(1.0 mm thickness), solid line; alumina ceramic plate (0.5 mm thickness) with porous silver (1.0 mm thickness). (B)Resilience of alumina ceramic plate lining with or without white-colored metal. S.M., solid silver; P.M., porous silver.
*P < 0.01, statistical analysis by t-test.

Center of slot size (mm)Non-treatedbracketWhite color-treatedbracket0.534 * 0.002

0.533 * 0.001an = 8.
a
Not statistically significant between non-treated and whitecolored bracket.

strength with low shrinkage on baking (Fig. 8). Mechanicalstrength of porous silver metal was almost same as that ofsolid silver metal, whereas volume contraction of porous one
was lower than that of solid one (Fig. 5A and 8). The reason forthis could be due to their porosity. In 30% H2O2-treatedsamples, large bubbles were diminished and small ones
remained (Fig. 7). In contrast, large bubbles remained in themetal with 3% of H2O2 (Fig. 7). Though distilled water (DW) did
not contain any foaming agents, silver clay with distilled water(0% of H2O2) exhibited 7–8% of porosity (Fig. 8). These bubble
might appear in boiling of DW during baking silver clay and/or
get into silver clay when mixture of silver powder and DW.
Using this porous white metal, we could make metal-lined
ceramic crowns within only 30 min, if ceramic crown caps
were prepared as ready made goods. This suggests thepossibility that esthetic prosthesis instead of temporary
prosthesis should be made by chair side immediately after
removal of orthodontic appliances. The results of experiments
probing the mechanical strength of combinations of ceramics
and white-colored silver metals showed that a lining of silver
metal applied to an alumina ceramic plate made the breaking
point and resilience higher (Fig. 9A and B). Lining porous
metals on ceramics showed strengthened mechanical characteristics compared to the lining non-porous samples. The
reason for this should be the adherence of porous metals toceramic plates after breaking of ceramic plates even in theregion of 5 mm from the alumina fracture point, in contrast to
the situation found with non-porous metals, which became
detached (Fig. 10). After white-colored silver metal heated at
700 8C on zirconia plate, solid metal could detached fromziriconia plate easily, however, strong force was needed todetach the porous one from the ceramic plate with remainingof porous one (Fig. 6). These results suggested that this metalcombined ceramics could be used for reinforcement andprevention of crushing of the ceramic orthodontic appliances.

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Table 4 – Thickness of three part of white part in thedental implant.
Thickness (mm)abc44.5 * 5.6
13.9 * 2.2
31.7 * 3.7‘‘a’’, ‘‘b’’ and ‘‘c’’ correspond to the parts of ‘a’’, ‘‘b’’ and ‘‘c’’ of thedental implant in Fig. 11A, respectively. a, mirror polishing part; b,sand blasting of the deepest part of the screw thread; c, sandblasting of the top part of the screw thread.
n = 5.

To clarify the causes of this white coloration of the metals,
we performed component analysis using an electron probe
microanalyzer. We had considered that the reason for thiswhite color was due to the oxidation of the metals; however,surprisingly no oxide was found in white silver metal (Table 5).
Carbon, phosphorus and calcium are the result of somecontamination (Table 6). Their contamination into the white
metal could be prevented using a single purpose furnace undermore restricted condition. From this result, we could not say
anything about the mechanisms of white coloration of silver
metal except in terms of micro-diffused reflection. In titanium
metals, the white color of the titanium surface was due torutile titanium dioxide (Table 6; Fig. 14). Anatase titanium
dioxide could be created by baking titanium at 400–600 8C,
besides rutile titanium dioxide could be created by baking at
more than 800 8C [16]. Between 600 and 800 8C, titanium oxide
was in an anatase and rutile mixed phase [16]. It is reasonable
that our white titanium dioxide was rutile titanium dioxide.
Anodic oxidation of titanium make titanium dioxide on thesurface of titanium for improvement of corrosion resistance,

Fig. 11 – Cross sectional photos of white colored dental implant. (A) Observation part of cross sectional photo of dental
implant. (a) Mirror polished abutment part, (b) sand blasting of the deepest part of the screw thread of fixture part, (c) sandblasting of the top part of the screw thread of fixture part. (B) High magnification (100T) of ‘‘a’’ part of ‘‘A’’. (C) Highmagnification (100T) of ‘‘b’’ part of ‘‘A’’. (D) High magnification (100T) of ‘‘c’’ part of ‘‘A’’. T, titanium of the dental implant;
W, white color part of the dental implant; Ac, acrylic resin for embedding of the dental implant; in B–D. White bars in B–D
indicated 100 mm.

For the use of white-colored metals for dental appliances
including orthodontic appliances, we developed a whitecolored surface preparation method for titanium metal. Fig. 4
represents the white color prepared dental products. Evaluation of thickness of white color layer of dental implantrevealed that rank order of thickness was mirror polishedabutment part > sand blasting of the top part of the screw
thread of fixture part > sand blasting of the deepest part of thescrew thread of fixture part. This results indicated that whitecolor layer could be created on any condition of titanium
metal, and their thickness was 10–50 mm which was enoughfor white appearance recognized by naked eyes (Fig. 11; Table4). However, there were two problems with this method.
One was the difficulty of setting appropriate conditions ofwhite preparation, because if the conditions strayed fromthe appropriate conditions, the white-colored surface could
be worn off by the external forces. However, if we could findappropriate conditions, the white-colored surface should not
be worn off by vigorous scratching and strong external forces(data not shown). Another problem was that the whitecolored surface became higher strength but fragile during its
preparation (Fig. 5B). This could be due to the heat treatment.
Titanium changes from the alpha phase (hexagonal closepacked structure) to beta phase (body-centered cubic lattice)at 885 8C [14]. In this change of structure, mechanical strengthof titanium could be decreased. However, this methodchanged only the surface of titanium, so that the sizesof objects were not altered (Table 3). This should be one of
the biggest advantage of this white-colored preparation
method.

Fig. 12 – Scanning electron micrographs of silver and white-colored silver metal. (A) metal-colored silver, (B) white-coloredsolid silver metal, and (C) white-colored porous silver metal.

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Table 5 – Components of white-colored silver metal.
Components

Solid silver(mass%)

Colored(at%)

Solidwhite(mass%)

Colored(at%)

Foamed white(mass%)

Colored
(at%)

Ag
C
P
Ca

99.3190.681––

94.1965.804––

98.817
0.531
0.328
0.324

93.582
4.509
1.081
0.828

99.3720.628––

94.633
5.367
–
–

Total

100.000

100.000

100.000

100.000

100.000

100.000

Fig. 14 – A laser Raman spectrum, (A) Raman spectrum of the rutile type of titanium dioxide. Data were obtained fromRASMIN web (http://riodb.ibase.aist.go.jp/rasmin), (B) Raman spectrum of white color-prepared titanium. White-coloredsurface of titanium was rutile type titanium dioxide.

5.

Conclusions

We examined the possibility of making of white-colored metal
for dental appliances. The results obtained in this study are as
follows:+ Molding of a silver clay can generate white-colored metals
by baking.
+ White-colored surface preparation for titanium involved
oxidation of the surface of titanium, and the oxide
possessed the rutile structure.
These methods should cope with both esthetics andmechanical strength including the strength of dental devices
including orthodontic appliances.

Fig. 13 – Scanning electron micrographs of non- and white color-treated titanium metal, (A) non-treated titanium metal, (B)white color-prepared titanium metal.

which contained anatase titanium dioxide [5–8,15]. Anodic
oxidation of titanium also color the titanium surface [8].
These results and reports suggested that method in thispaper, i.e. atmospheric oxidation, might be different way ofoxidation from anodic oxidation, and change the metal top
surface into metallic oxides which could be recognizedwhite color appearances by naked eyes. In this process, thephotorefractive effect should be involved, which is anonlinear optical effect seen in the certain crystals and othermaterials that respond to light by altering their refractive
index [17].
We have described the possibility of making white-colored
metals for dental appliances in this paper. Further studies
should be undertaken for practical applications; however they
could be ‘‘win-win’’ solutions in reconciling the demands ofboth patients and doctors.

Table 6 – Components of white-color prepared titanium metal.
Components

Non (mass%)

Treated (at%)

White color (mass%)

Prepared (at%)

Ti
O
C
Na

96.592
2.820
0.588
–

89.955
7.860
2.185
–

47.27750.1260.567
2.030

23.19473.622
1.109
2.075

Total

100.000

100.000

100.000

100.000

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Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑥

	 Dental	 Materials	
 Journal,	
 33-422-429	
 (2014)

! Dental Materials Journal 2014; 33(3): 422–429!

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429

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Table 1!

A new method for fabricating zirconia copings using a Nd:YVO4 nanosecond
laser
Miku KAZAMA-KOIDE1, Kazuo OHKUMA2, Hideo OGURA3 and Yukio MIYAGAWA1,2
Developmental Science of Oral Biomaterials, The Nippon Dental University Graduate School of Life Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuoku, Niigata 951-8580, Japan
Department of Dental Materials Science, The Nippon Dental University School of Life Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku, Niigata
951-8580, Japan
3
The Nippon Dental University, 1-9-20 Fujimi, Chiyoda-ku, Tokyo 102-8159, Japan
Corresponding author, Miku KAZAMA-KOIDE; E-mail: miku@ngt.ndu.ac.jp!

!
!

The purpose of this work was to fabricate zirconia copings from fully sintered Y-TZP blocks using a Nd:YVO4 nanosecond laser inorder to avoid complicated procedures using conventional CAD/CAM systems. To determine the most appropriate power level of a
Nd:YVO4 laser, cuboid fully sintered Y-TZP specimens were irradiated at six different average power levels. One-way ANOVAs for the
average surface roughness and laser machining depth revealed that an average power level of 7.5 W generated a smooth machined
surface with high machining efficiency. Y-TZP copings were then machined using the proposed method with the most appropriate
power level. As the number of machining iterations increased, the convergence angles decreased significantly (p<0.01). The accuracyof the machined copings was judged to be good based on 3D measurements and traditional metal die methods. The proposed method
using the nanosecond laser was demonstrated to be useful for fabricating copings from fully sintered Y-TZP.

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!

INTRODUCTION
Recently, dentists and patients have become interested
in all-ceramic restorations, which do not contain metals,
which block light transmission, and better resemble thenatural tooth appearance than any other restorative
option1). In addition, all-ceramic restorations do notcause metal allergy problems. The clinical shortcomingsof ceramic materials, such as brittleness, low tensile
strength, and marginal inaccuracy, continue tolimit their use compared to porcelain-fused-to-metalcrowns2,3). Nevertheless, patients’ demand for improved
esthetics has driven the development of ceramic
restorations. The use of all-ceramic restorations has
spread as a result of the application of high-strength
ceramics, such as zirconia, to the coping materials.
Zirconia ceramics for dental restorations havehigh strength and high toughness, which allows thesematerials to be used as all-ceramic coping materials forlong-span bridges. However, machining fully sinteredzirconia by milling is very difficult because of its highhardness. The coping is fabricated with an establishedmethod using a CAD/CAM system in which a partiallysintered zirconia block is milled and subsequently
sintered in a furnace. A linear shrinkage of 15 to 30%
occurs due to sintering4). The increased milling efficiencyof the softer partially sintered block has the tradeoff of a potentially poorer fit caused by the sintering
shrinkage, the scanning process, compensatory software
design, and milling5). In order to avoid these complicatedprocedures, we have devised a new simple method bywhich to machine high-hardness zirconia using a laser.
A range of lasers is now available in dentistry. The
Received Dec 13, 2013: Accepted Mar 12, 2014
doi:10.4012/dmj.2013-348 JOI JST.JSTAGE/dmj/2013-348

Nd:YAG laser can be used in the dental laboratory for
laser welding. Metal parts such as frameworks can bejoined by self-welding of the parts with combustible
acrylic denture base resins and artificial composite teeth,
which would be burned by conventional soldering6).
Noda et al. conducted an experiment involving theirradiation of zirconia using this Nd:YAG laser andexamined the possibility of welding zirconia7). They
reported that laser irradiation induced cracking on thesurfaces of zirconia so Nd:YAG dental laser welding
should not be performed on zirconia7). Nd:YAG dental
laser irradiation, which produced a millisecond-orderpulse width, generated thermal effects on zirconia8).
Therefore, we devised a new method by which tomachine zirconia copings using an industrial Nd:YVO4
Q-switched nanosecond laser, which had a smaller pulse
width and a power density that was several hundred
times higher than that of the conventional Nd:YAG
dental laser. The purpose of the present study was todemonstrate the possibility of Nd:YVO4 Q-switchednanosecond laser machining of zirconia copings.

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MATERIALS AND METHODS

Nd:YVO4 laser machine
In the present study, fully sintered yttria-stabilized
tetragonal zirconia polycrystal (Y-TZP) specimens weremachined using a Q-switched Nd:YVO4 (Neodymium
Doped Yttrium Vanadate) laser machine (Lasertec 40,
DMG, Berlin, Germany, Fig. 1) for fabricating the Y-TZP
copings of all-ceramic restorations. This nanosecond
laser machine generated a power density of 2.26×104(kW/mm3), which is several hundred times higher than

Wave length

1,064 nm
18 ns
Q switched pulse

Scan speed

500 mm/s

Peak power

16 kW

Pulse frequency

50 kHz

Focus diameter

30 µm

Track distance

10 µm

!
!

!

!

Nd:YVO4 crystal!

!

Keywords: Y-TZP, CAD/CAM, Zirconia, Laser, Nd:YVO4

Description

Laser typeOperation mode2!

Specifications of the laser machine
Specification

Pulse width

1

2

!

Fig. 1

Nd:YVO4 laser machine.

a dental Nd:YAG laser with a millisecond pulse. The
fundamental parameters of the Nd:YVO4 laser machine
are listed in Table 1.
Fully sintered yttria-stabilized tetragonal zirconia
polycrystals (Y-TZP)
Two types of fully sintered Y-TZP specimens wereprepared as follows. The discs of partially sintered
Y-TZP (height: 25 mm, diameter: 98.5 mm, Aadva Zr
disk, GC, Tokyo, Japan) were milled and subsequently
sintered at 1,550°C for 18.5 h in a furnace using adental CAD/CAM system (GM-1000, GC, Tokyo, Japan).
Partially sintered Y-TZP consisted of >91 wt% ZrO2, 5
wt% Y2O3, <3 wt% HfO2, and <1 wt% Al2O3.
One cuboid (13 mm×13 mm×17 mm) fully
sintered Y-TZP specimen was used to determine themost appropriate power level of the Nd:YVO4 laser
irradiation condition for fully sintered Y-TZP andanother specimen (height: 7 mm, baseline: 10.6 mm), as
shown in Fig. 2, was machined to form a Y-TZP coping
on an abutment tooth of an imitation lower first molar.
Determination of the most appropriate power level of the
Nd:YVO4 laser
In order to determine the most appropriate power levelof the Nd:YVO4 laser, a cuboid fully sintered Y-TZP
specimen was irradiated at six different average power
levels (3, 6, 7.5, 9, 12, and 14 W). The irradiated surface
area was square (2 mm×2 mm). The specimen was
cleaned in distilled water using an ultrasonic cleaner.
The machining depth and the calculated averageroughness (Ra in µm) at each of the six power levels
were evaluated. The machining depth was measured
using a measuring microscope (STM6, OLYMPUS,!

Fig. 2!
!
!

Dimensions of the fully sintered Y-TZP specimen
simulating a lower first molar, and 3D-CAD for
laser machining to fabricate zirconia coping.

Tokyo, Japan). The calculated average roughness was
also measured using a laser microscope (VK-8500,
KEYENCE, Osaka, Japan) with a cut off value of 0.8
mm. One-way ANOVA and Tukey’s multiple comparison
test were used to analyze the data.

!

Machining Y-TZP copings using the Nd:YVO4 laser
machineMachining 3D-CAD data of a Y-TZP coping wereconstructed using CAD software (Rhinoceros4.0, Robert
McNeel & Associates, WA, USA). Y-TZP copings weremachined in order to create the final form with aconvergence angle of 11°, a cervical width of 10.6 mm,
and a shoulder part width of 0.5 mm using 3D-CAD data
(Fig. 2). The part that touched the abutment tooth, asshown in Fig. 2, was machined. Y-TZP copings were
fabricated from fully sintered blocks using the Nd:YVO4
laser machine with an optimal machining condition

! 424

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429

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!
!

425

!
(n=6). Machining each coping required eight hours.
Y-TZP copings were machined in 100-µm increments,
as measured using calipers integrated into the laser
machine for depth control. At first machining, themachining residue in the width direction of Y-TZP coping
occurred on the inner surface so that the convergenceangle of coping was greater than 11°, as designed basedon machining 3D-CAD data. Therefore, the coping wasmachined two, three, or four times until the machining
residue disappeared (Fig. 3).
Machining accuracy
1. Evaluation of machining accuracy by 3D measurement
Machined Y-TZP copings were measured using a nondestructive industrial 3D scanner (ATOS I 2M, GOM
mbH, Brunswick, Germany) at every machining, and
3D-CAD data of copings were constructed. Dimensional!

differences in the height direction and width direction
between the 3D-CAD data for machined Y-TZP copings
and the target 3D-CAD data of Y-TZP copings were
inspected using inspection software (GOM inspect, GOM
mbH, Brunswick, Germany). Twelve measurement
points were set in the width direction: 0, 0.5, 1, 1.5, 2,
2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, and 5.5 mm away from the inner
cervical line of the Y-TZP coping (Fig. 4). In the height
direction, six measurement points were set: −3, −2,−1, 0, 1, 2, and 3 mm away from the occlusal center of
Y-TZP coping (Fig. 4). The results for the dimensional
differences in the width direction and the machining
frequency were analyzed by two-way repeated-measures
ANOVA and Sidak’s multiple comparison test. Oneway repeated-measures ANOVA and Sidak’s multiple
comparison test were used to analyze the results forthe dimensional differences in the height direction. The
convergence angle of the inner coping was measured ateach machining. One-way repeated measures ANOVA
and Sidak’s multiple comparison test were used foranalyzing the results of the convergence angle of innermachined copings.

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Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429!

Fig. 3

Method of fabricating a zirconia coping having an
inner taper of 11° and a cervical width of 9.6 mm.

2. Evaluation of machining accuracy using metal dies
Machined copings at the fourth machining were
measured using dies having different cervical widthsof 9.60 mm (Abutment 1), 9.58 mm (Abutment 2), and9.56 mm (Abutment 3). The convergence angle of eachdie was 11°. Y-TZP copings were placed on the metaldie (Fig. 5) without cementation, and the marginal
discrepancy (L-L1) was measured using a measuring
microscope (STM6, OLYMPUS, Tokyo, Japan). Negativevalues for L-L1 indicate that copings were machinedsmaller than the machining CAD, whereas positive
numbers indicate that the copings were machinedlarger than the machining CAD (Fig. 5). One-way
ANOVA and Sidak’s multiple comparison test were used
to analyze the results for the goodness of fit.

RESULTS
Determination of the most appropriate power level of the
Nd:YVO4 laser
The means and standard deviations (SD) of thecalculated average roughnesses (Ra) and the machining
depths of the irradiated Y-TZP surfaces are shown in
Table 2 and Fig. 6.
The values of Ra for average powers of 6 W, 7.5 W,
and 9 W were smaller than those for average powers of
3 W and 12 W, and the values of Ra for average powersof 6 W and 7.5 W were smaller than that for an average
power of 14 W (p<0.05). Therefore, the Y-TZP surface wasmachined to be the smoothest at 6 W and 7.5 W using
the Nd:YVO4 laser. As the average power increased, theTable 2Average roughness and machining depth perpulse after nanosecond laser irradiation of fully
sintered Y-TZP

Average power
(W)
!
!
!

Average roughness(Ra, µm)

Machining depth(µm)

Mean (SD)

Mean (SD)3

0.63 (0.11)

1.9 (1.4)

6

0.37 (0.06)

3.7 (0.4)

7.5

0.40 (0.05)

4.8 (0.5)!

90.43 (0.02)

5.5 (0.6)

12

0.67 (0.07)

5.9 (0.6)

14

0.62 (0.07)

4.7 (0.2)!

!
!

machining depth tended to increase, but became smallerfrom 12 W to 14 W. The machining depths per pulse foraverage powers of 7.5 W, 9 W, 12 W, and 14 W weregreater than that for an average power of 3 W (p<0.05),
and machining depth per pulse for an average powerof 12 W was greater than that for an average power of
6 W (p<0.05). When the above analysis results for the
calculated average roughness and the machining depth
were put together, the average power level of 7.5 W, atwhich the smoothest Y-TZP surface could be obtainedwith high machining efficiency, was decided to be themost appropriate power level.

!

Machining Y-TZP copings using the Nd:YVO4 laser
machineAn optimal machining condition with an average powerof 7.5 W was used to machine Y-TZP copings from fully
sintered specimens. At first machining, machining
residue was deposited in the width direction on the
inner surface of the Y-TZP copings, so that theconvergence angle was greater than 11°, which were
designed as the machining 3D-CAD data (Fig. 3). The
machining residue of Y-TZP copings was measured using
an industrial 3D scanner, and the machining data werereacquired. The Y-TZP copings were then machined
again using the new data. This process was repeated forthe same Y-TZP coping until the fourth machining.

!

Machining accuracy
1) Machining accuracy using 3D measurement
Figure 7 and Table 3 show the dimensional differencein the height direction for a certain section between
the CAD data of the machined Y-TZP copings and thetarget CAD data for the coping obtained through 3D
measurement. The average dimensional difference inthe height direction was 73.6 µm. Figure 8 and Table 4
show the dimensional difference in the width direction
obtained using 3D measurement. Two-way repeated-

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!

!

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!

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Fig. 4

Schematic diagrams of 3D measurement formachining accuracy.
The dimensional differences between (a) and(b) were inspected using inspection software. (c)Measurement points in the height and width
directions.

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!

Fig. 5

Schematic diagrams of a metal die having a taperof 11° used to evaluate machining accuracy.

Fig. 6Means and standard deviations of calculated
average roughnesses (Ra) and machining depthsof irradiated Y-TZP surfaces for different average
power levels.
The six average power levels were statisticallydivided into three subgroups (a, b, and c) withrespect to average roughness and three subgroups(A, B, and C) with respect to machining depth.
Means with different letters are significantly
different (p<0.05).

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Fig. 7

Means and standard deviations of dimensional
differences in the height direction.
The asterisk (*) indicates a significant difference at
p<0.05.

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Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429!
Table 3

Dimensional difference in the height direction ateach measurement point

Distance from
occlusal center (mm)!
!

Dimensional difference (µm)
Mean

(SD)

−3.0

55.0

(37.3)−2.0

51.7(26.4)−1.0

61.7(17.2)

0.0−1.7(14.7)

1.0

131.7(58.8)

2.0

95.0(130.9)

3.0

121.7

(63.7)!

measures ANOVA revealed that both main effects weresignificant (p<0.01). As shown in Fig. 8, the dimensional
difference in the width direction decreased as thenumber of machining iterations increased and as the
distance from the cervical line decreased, although theinteraction between the two primary effects was alsosignificant (p<0.05). The simple primary effect of the
distance from the cervical line was not significant at thethird or fourth machining (p<0.05). The dimensional
difference in the width direction at the fourth machining
was at most approximately 20 µm.
Figure 9 shows the inner convergence angle ofmachined copings of particular cross sections. The
means and standard deviations, which are shown inparentheses, of the inner surface convergence angle were!

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Fig. 9Fig. 8Means and standard deviations of dimensional
differences in the width direction.

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Means and standard deviations of convergenceangles of inner machined copings.
Means labeled with different letters (a, b, c, and d)
are statistically different from each other (p<0.01).

!

!

Table 4!

Dimensional difference in the width direction at each measurement point!

Distance from cervical line(mm)

Dimensional difference (µm)!

First machining

Second machining

Third machining

Fourth machining

0.0

−30.1

(14.8)

−6.5

(3.0)

15.1

(12.0)

17.2

(5.0)

0.5

−107.5

(2.9)

−31.0

(4.7)

−1.9

(3.0)

7.6

(0.6)

1.0

−132.6

(4.6)

−36.3

(6.1)

−3.1

(4.4)

14.0

(2.8)

1.5

−161.9

(9.0)

−44.7

(8.3)

−6.0

(5.5)

18.2

(2.7)

2.0

−192.2(10.9)

−55.3

(9.3)

−10.8

(8.0)

20.0

(2.4)

2.5

−229.2(16.3)−68.0(10.4)

−16.7

(8.7)

19.1

(3.9)

3.0

−265.0(21.4)−81.1(12.7)−23.5(12.0)

16.5

(4.2)

3.5

−305.6(21.8)−102.6(10.3)−30.0(12.2)

17.8

(4.5)

4.0

−369.4(40.1)−110.6(15.7)−39.0(14.1)

14.3

(5.8)

4.5

−481.8(127.6)−125.0(16.4)−48.2(15.8)

11.5

(5.7)

5.0

−649.0(274.6)−143.9(16.8)−58.2(19.4)

6.8

(6.9)

5.5

−926.4(536.0)−162.8(17.9)−70.6(20.5)

1.8(5.1)

average power level of 7.5 W belonged to both subgroupa (smallest average roughness) and subgroup A(greatest machining depth). Therefore, the average
power level of 7.5 W, at which the smoothest Y-TZP
surface could be obtained with high machining efficiency,
was considered to be the most appropriate power level
for the Nd:YVO4 laser. High machining efficiency
reduces the machining time.

!

!

!

427

!

!

!
!

Fig. 10

Machining accuracy using three metal dies having
convergence angles of 11° and different cervicalwidths; Abutment 1: 9.60 mm, Abutment 2:
9.58 mm, and Abutment 3: 9.56 mm. Significant
differences are indicated by asterisks ‘**’(p<0.01).

determined to be as follows: 18.5° (0.86°) for the firstmachining, 13.9° (0.47°) for the second machining, 12.1°(0.34°) for the third machining, and 10.9° (0.18°) for the
fourth machining. One-way repeated-measures ANOVA
revealed that the number of machinings significantly
affected the inner convergence angle of Y-TZP coping.
As the number of machining iterations increased, theconvergence angle decreased significantly (p<0.01).
At the fourth machining, the convergence angle wascomparable to the target 3D-CAD data.
2) Machining accuracy using the metal dies
The marginal fits of the Y-TZP copings that weremachined four times were measured using metal dies.
The means and standard deviations, which are shownin parentheses, of L-L1 were −80.2 (40.0) µm, 4.8 (32.6)µm, and 77.0 (42.0) µm using Abutments 1, 2, and 3,
respectively. The larger the cervical width, the smaller
the value of L-L1 (Fig. 10). The copings fit accurately on
Abutment 2.

DISCUSSION
Determination of the most appropriate power level of the
Nd:YVO4 laser
The average roughness and machining depth were
measured in order to determine the most appropriate
average power level (W) of the Nd:YVO4 laser on fully
sintered Y-TZP. Excellent lasing performance on Y-TZP,
which has high machining efficiency and provides asmooth surface, is most important. As shown in Fig.
6, the six average power levels considered herein were
statistically divided into three subgroups (a, b, and c)with respect to average roughness and three subgroups(A, B, and C) with respect to machining depth. The

Machining accuracy of Y-TZP copings
The copings, which were extracoronal restorations, wereable to be machined from fully sintered Y-TZP using thenanosecond laser. Figure 7 shows that the dimensional
difference in the height direction was not uniform. Air
was blown from three directions on the Y-TZP coping inorder to avoid reattachment of fine particles. However,locational differences were thought to occur as a resultof the air being blown non-uniformly against the copings.
Controlling the depth direction in machining (Z-axis)
using a focused laser beam is generally difficult.
Therefore, the copings were machined using an improved
method for the depth control. In this experiment, thedimensional difference in the height direction was
at most 132 µm for the planned 6.5 mm in the height
direction based on machining CAD data, which gives
an error of only 2.0%. In the width direction, thedimensional difference was at most 20 µm. The meanand standard deviation of the convergence angles of theinner copings were 10.9° and 0.18°, respectively.
In addition, the inside of the coping might be slightly
oval-shaped. Therefore, in order to clinically evaluate
the precision, a traditional experiment was conductedin which the dimensional accuracy was evaluated using
a die method. We prepared three metal dies having
different cervical widths. Since the machining 3D-CAD
data (Fig. 2) did not take into account the cement layeror the coefficient of friction, the marginal discrepancy at
the cervical line could not be obtained using Abutment
1, the cervical width of which was the same as in themachining 3D-CAD data. Therefore, dies having smaller
cervical widths had to be used to measure the marginal
discrepancy. The results revealed that the copings fit
accurately on the die. The aforementioned discrepancies
could be further improved by a slight modificationof the design program of the CAD system. Marginal
discrepancies of less than 120 µm have been reported
to be clinically acceptable9). Thus, accurate machiningof zirconia coping for clinical use using the Nd:YVO4
laser is possible.

!

Laser machining of Y-TZPAt present, Y-TZP copings are fabricated using a dental
CAD/CAM system in which a partially sintered Y-TZP
block (12 HV) is milled and subsequently sintered ina furnace. Machining design can compensate for theapproximately 20% volume shrinkage that occurs later
during sintering of the zirconia blocks. Therefore, we
devised a new method by which to machine a Y-TZP
coping directly from a fully sintered Y-TZP blockusing an industrial Nd:YVO4 Q-switched nanosecond! 428Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429

!

429

!

!
laser. The use of lasers to machine ceramics presents
a number of advantages over the other methods. Laser
machining is a noncontact technique that allows highprecision machining of numerous types of ceramics andeliminates tooling costs, which are expensive.
Generally, the material properties of Y-TZP,
specifically its high thermal expansion coefficient(11×10−6/°C) and low thermal conductivity (2 W/mK)10),
make laser machining of this material difficult. Due tothe strong thermal nature of the laser beam-materialinteraction, especially in the case of long pulse widths,
microcracks are generated by dental lasers, which
generate millisecond-order pulse widths, as a resultof thermal damage. In the present study, we used ananosecond pulsed laser, which could significantly
reduce thermal damage. The formation of cracks in theirradiated surface was seldom observed when using
the nanosecond laser, and cracks that observed were
extremely small, having depths of approximately 3 µm.
Thus, the use of an ultrashort pulse laser that producesa picosecond pulsed laser or a femtosecond pulsed
laser can significantly reduce the above-mentioned
thermal effects, such as thermal damage or microcracks.
However, such lasers require too much machining time
to be adapted for practical application. Therefore, thepotential of nanosecond laser machining on Y-TZP
was demonstrated herein. Approximately 90% of thematerial removed through the proposed laser machining
is a result of the interaction between the laser beam andthe surface of the Y-TZP workpiece being machined. The
nanosecond laser used is thus suitable for use in themachining of dental restorations.
The laser machine used herein provided three-axis
machining, in which a Y-TZP specimen was irradiatedfrom one direction (Z-axis). In addition, machining a holewith a convergence angle by condensing a laser beam
has certain limitations because a focused laser produces
a tapered hole. Accurately machined copings for clinicaluse were obtained after the fourth machining. On theother hand, a five-axis laser machine can instantly
machine a taper-less hole because the laser beam canirradiate vertically with respect to the work piece11).
In other words, a five-axis machine would provide the
Y-TZP copings with improved retention and accuracy forclinical use and reduce costs by reducing the machining
and finishing times.
Figure 11 shows a crown coping that was machined
at an average power of 7.5 W. A dental restoration more
complicated than the simple abutment coping shown in
Fig. 2 was successfully machined from a fully sintered
Y-TZP block, as shown in Fig. 11.
In comparison with a Nd:YAG laser, the Nd:YVO4
laser has advantages such as the ability to produce
more compact systems, because the Nd:YVO4 crystal
has 5 times higher absorption coefficient than Nd:YAG
crystal. In addition to this, the laser has a higher
efficiency thanks to a high stimulated emission crosssection. A Nd:YVO4 single crystal can be used forcompact, high-efficiency machining, as compared with a
Nd:YAG single crystal12,13).

!

Fig. 11!
!

A crown coping machined at an average power of
7.5 W.
The crown coping was successfully fabricated in aclinical form.

!

Darkening of the machined Y-TZP surface andcorresponding countermeasures
After ultrasonic cleaning, the machined Y-TZP surface
was dark gray. Darkening of Y-TZP irradiated by ananosecond laser should be a result of oxygen vacancies
that were generated at high temperatures due to therelease of oxygen atoms after substoichiometric dioxide
formation, in which ZrO2 became ZrO2-X14,15) . Noda et al.
reported that a surface irradiated by a Nd:YAG laser
became darkened and that the oxygen concentration
clearly decreased, whereas the zirconium concentration
increased7). Irradiated Y-TZP disks heated at 1,000°C
for 5 min in air retuned to their original white color.
Applying the above reduction reaction to the present
study, Y-TZP was heated in the atmosphere to reabsorb
oxygen. After heating, the Y-TZP became white again.
The high temperature allows oxygen to diffuse backto vacancies in the irradiated surface, rebuilding the
crystalline structure and recovering the white color of
Y-TZP. This heating is thought not to have an adverse
clinical effect because the porcelain is sintered on Y-TZP
at higher than 1,000°C. Matysiak et al. reported a similar
result in which blackening occurred within holes on
zirconia irradiated using a HeNe laser16). After heating
at 1,350°C, the sample became white again, and there
was no significant variation after the heat treatment.
The recovery of the white color of the surface enables
the fabrication of esthetic dental prostheses without
opaquing using Y-TZP machined with a Nd:YVO4 laser.
The effect of the nanosecond laser on the machined
Y-TZP surface was small, and we assume that themechanical properties will not be adversely affected toa significant degree.

!

Future development
The primary problems associated with the laser
machining of Y-TZP reported herein are a longmachining time and high cost. Fabrication of the innersurface of the Y-TZP coping required approximately
eight hours. However, sintering a partially sinteredzirconia coping fabricated by a CAD/CAM system
requires up to 18 h. Moreover, the long machining timerequired when using the laser can be shortened byusing a prefabricated coping of fully sintered Y-TZP.

!

!
!

A nanosecond laser machine that can machine a highthermal-expansion, low-thermal-conductivity material,
such as Y-TZP, will also be able to machine other dental
materials, such as resins and metals. If the machine isminiaturized and becomes widely used, the cost may be
reduced considerably.
The toughness and high strength of Y-TZP are
similar to the characteristics of metallic materials.
For this reason, Y-TZP has been used in numerous
applications in which previously only metals were
believed to be suitable, such as moving parts of engines,
valve components, milling and cutting tools, wiredrawing dies, and scissors8). Y-TZP is also a popularmaterial for use in bio-medical applications due to its
outstanding mechanical properties, reliability, andexcellent biocompatibility. The ability to carry out
accurate laser machining of Y-TZP would allow its
properties to be more widely exploited, in particular
for applications in which uniquely shaped, intricately
structured components are required, not only in industry
but also in dentistry.

CONCLUSIONSA Y-TZP coping was fabricated using a CAD/CAM
system in which a partially sintered Y-TZP block
was milled and subsequently sintered in a furnace,because fully sintered Y-TZP is too difficult to machineusing milling techniques. Furthermore, the designcompensates for the volume shrinkage that occurs
during sintering of Y-TZP blocks. Thus, we devised a
new method by which to machine Y-TZP copings using
an industrial Nd:YVO4 Q-switched nanosecond laser.
The following conclusions were obtained based on the
results of the present study.
1. An average power of 7.5 W was determined tobe the optimal lasing condition because thiscondition provided the smoothest surface withhigh machining efficiency.
2. The convergence angle of the inner coping obtainedat the first machining did not adequately agreewith the provided machining 3D-CAD data. At
the fourth machining, however, the convergenceangle of the inner coping was 10.9° (SD=0.18°),
which is approximately the same as the provided
machining 3D-CAD data.
3. The dimensional difference in the height
direction was at most 132 µm (SD=59 µm), andthe dimensional difference in the width direction
at the fourth machining was at most 20 µm(SD=2.4 µm).
4. The machined copings fit accurately on the metal

!

!
!

die.
5. The proposed method using a nanosecond
Nd:YVO4 laser machine was demonstrated to be
useful for fabricating a coping directly from fully
sintered Y-TZP.

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Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑦

	 J.	
 Electr.	
 Electron	
 Syst.,	
 3:118	 (2014)

Electrical & Electronic Systems

Kameda and Ohkuma, J Electr Electron Syst 2014, 3:1
htp://dx.doi.org/10.4172/2332-0796.1000118

Review Article
Research
ArticleTakashi Kameda1* and Kazuo Ohkuma2
2

Department of Orthodontics, Nippon Dental University, Niigata, Japan
Department of Dental Materials Science, Nippon Dental University, Niigata, Japan

Abstract
0DJQHWLF¿HOGVFDQFDXVHKXPDQKHDOWKSUREOHPV/RZIUHTXHQF\HOHFWURPDJQHWLF¿HOGVDUHVRPHWLPHVLQGXFHG
E\ HOHFWULF FXUUHQWV LQ PHWDOOLF REMHFWV WKDW DUH ZRUQ RU XVHG LQ RU RQ WKH ERG\ DQG DUH XQOLNH WKH KLJKIUHTXHQF\
HOHFWURPDJQHWLF¿HOGVWKDWSURGXFHKHDW,QORZIUHTXHQF\PDJQHWLF¿HOGVWKHVWUHQJWKRIWKHLQGXFHGHOHFWULFFXUUHQW
LV EHOLHYHG WR EH PRUH LPSRUWDQW WKDQ WKH PDJQHWLF ¿HOG VWUHQJWK LQ WHUPV RI HIIHFWV RQ WKH KHDOWK RI OLYLQJ ERGLHV
Electrically powered dental devices, including personal devices such as electric toothbrushes and professional devices
such as curing lights for light-cured dental resins, are widely used because of their convenience, but the electric circuits
DQG PRWRUV WKDW SRZHU WKHP SURGXFH ORZIUHTXHQF\ HOHFWURPDJQHWLF ZDYHV 7KHVH PDJQHWLF ¿HOGV LQGXFH HOHFWULF
currents in teeth and in metallic appliances that are set in the oral cavity. The effects of these induced currents on human
KHDOWK PXVW WKHUHIRUH EH FRQVLGHUHG ,QYHVWLJDWLRQV RI WKLV LVVXH UHYHDOHG WKDW PDJQHWLF ¿HOGV IURP GHQWDO GHYLFHV
promoted the corrosion of intraoral metallic appliances via the induced currents, and this is likely to cause metallic
DOOHUJLHV$OPRVWDOOUHSRUWVRQWKHHIIHFWVRIPDJQHWLF¿HOGH[SRVXUHLQFOXGLQJWKLVFRUURVLRQSKHQRPHQRQGHVFULEHKDUPIXOHIIHFWVRQKXPDQKHDOWK+RZHYHUWKHUHPD\EHVRPHHIIHFWLYHXVHVRIWKHPDJQHWLF¿HOGVJHQHUDWHGE\GHQWDO
devices for human health promotion. Oral bacteria were found to corrode orthodontic stainless steel appliances, but
PDJQHWLF¿HOGLQGXFHGFXUUHQWVLQWKHVHDSSOLDQFHVFRXOGSURYLGHUHPDUNDEOHSURWHFWLRQHIIHFWVDJDLQVWWKLVPLFURELDOO\LQGXFHGFRUURVLRQ,QWKLVUHYLHZZHGLVFXVVWKHUHVXOWVDQGFRQFOXVLRQVRIWKHVHLQYHVWLJDWLRQVHVSHFLDOO\DERXWQRYHOZD\V RI KDUPIXO HIIHFWV DQG HIIHFWLYH XVH RI PDJQHWLF ¿HOGV IURP GHQWDO GHYLFHV DQG FRQFOXGH WKDW IXUWKHU GHWDLOHG
VWXGLHVDUHUHTXLUHGWRFODULI\WKHLUGHWDLOHGPHFKDQLVPVDQGWRGHYHORSFRXQWHUPHDVXUHVIRUSURWHFWLRQIURPRUHIIHFWLYH
XVHRIWKHVH¿HOGV

Keywords: Low frequency; Induced current; Corrosion; Electric
toothbrushes; Curing lights; Dental appliances; Tooth; Microbiologically
influenced corrosion; Protection against corrosion

Introduction
There has been considerable recent interest in the effects ofelectromagnetic fields (such as those near electricity transmission
lines) on human health, and particularly in their potential to effectthe development of leukemia and central nervous system tumors. An
elevated risk of leukemia following exposure to electromagnetic fields
has been demonstrated [1,2], and the International Agency for Research
on Cancer (IARC), the International Commission on Non-Ionizing
Radiation Protection (ICNIRP) and the World Health Organization(WHO) have each established guidelines and criteria to outline the roles
and risks of magnetic fields (MFs) in carcinogenesis [3-5]. However, otherreports in the literature have found no significant correlation between
exposure to electromagnetic fields and leukemia [6,7]. The results fromstudies of the correlation between electromagnetic field exposure andthe risks of central nervous system tumors are also inconclusive [2,7].
These findings with regard to the risks of electromagnetic fields inducing
leukemia or central nervous system tumors should be considered interms of dependence on the electromagnetic field exposure conditions,such as field intensity and exposure time [8,9].
Many home electrical appliances, including personal dental devices,
generate MFs [10,11]. In the dental field, the effects of MFs on humanhealth are thought to be more serious when compared with many othermedical fields, because the MF-generating devices are used near the
craniocervical area. In a study of dental clinics, electromagnetic fields
were detected, and each professional dental device that was set up in
the clinics was reported to generate MFs [12]. However, exposure to
MFs from professional dental devices for use in dental clinics might beconsidered to have little effect on the patients, because of the limited
J Electr Electron Syst
ISSN: 2332-0796 JEES an open access journal

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OpenAccess
Access
Open

Electromagnetic Fields from Dental Devices and their Effects on Human
Health1

Citation: Kameda T, Ohkuma K (2014) Electromagnetic Fields from Dental Devices and their Effects on Human Health. J Electr Electron Syst 3: 118.
doi:10.4172/2332-0796.1000118

times and numbers of clinic visits for each patient. In a questionnairebased survey of the tooth brushing habits of 1200 Japanese people (600males and 600 females, with an age range from teens to sixties), 52.5% of
the respondents cleaned their teeth twice a day, and 48% had brushingtimes of 1–3 min [13]. Based on these figures, the average Japaneseperson’s brushing time was estimated to be 120 min/month (2 min × 2
times/day × 30 days), and 1440 min/year. For these reasons, we focusedon personal dental devices, and on electric toothbrushes in particular,
as the main MF sources. The effects of MF exposure from electric
toothbrushes on user health are likely to slowly but surely increase.

electromagnetic fields, which could cause health problems, e.g.
interference with pacemakers [10,14]. In dental clinics, light-cured
resins that are polymerized by curing light sources, which have also
been reported to produce low-frequency electromagnetic fields, arealso widely used for both convenience and speed [11].
The MFs produced by dental devices, e.g. by electric toothbrushes
and curing light sources for light-cured resin, and their frequencies were
evaluated. We estimated MFs within the 1–2000 Hz frequency range,
in keeping with our preliminary study and with the previous literature,
which indicated that this was the appropriate range to monitor [10,15].
Five commercially available electric toothbrushes and three commerciallyavailable curing lights that were investigated generated MFs [16].
The MFs produced by each representative dental device are shown in
Figure 1. The MFs produced by each of the electric toothbrushes were
found to be at quite different levels [16]. These MF levels could reflect
the cleaning ability of each electric toothbrush. Further investigation of
the relationship between MF level and cleaning ability is necessary, andshould be useful as part of a design and construction strategy for thedevelopment of electric toothbrushes with low MFs and high cleaning
ability. Interestingly, the MF levels from curing lights were found to be at
low levels in Light-Emitting Diode (LED)-type lights and at high levels
in halogen-type lights [17]. Compared with LED-type curing lights,
halogen-type curing lights generated much more heat. To prevent thesecuring lights from overheating, cooling fans with electric motors werebuilt into the halogen-type curing lights. The MF levels of these lights
were believed to be dependent on the strengths of the fan electric motors.
Similarly, the MFs from electric toothbrushes were found to be at different
levels at the front, back, right and left sides of the brushes, which is likely
to be related to the location of the motor or other electrical components
inside the toothbrushes.

MFs from Dental Devices Induce Electric Currents in
Intraoral Metallic Appliances and Teeth
Many questions have been raised with regard to the effects of MFsfrom dental devices on human health. There are questions over whether
or not these effects are harmful or harmless, and over the mechanismsof MF effects on human health. Many home electrical appliances andprofessional dental devices generate low-frequency MFs that can
induce electric currents in the human body and within any metallic
objects or devices worn in or on the body [10,15]. In low-frequency
MFs, the strength of the induced electric current is thought to be more
important than the strength of the MF itself in terms of the effects on
the health of living bodies [18]. To create a framework to discuss thesequestions, we set up our hypothesis as follows. (1) Dental electricaldevices generate MFs (as already described in the previous section)[16,17]. (2) These MFs can induce electric currents in teeth and metallic
appliances that are set in the oral cavity [17]. (3) The induced currents
produce certain effects that may have an influence on human health.
Initially, we investigated part 2 of the hypothesis, e.g. that currents are
induced in metallic appliances and teeth by MFs from dental devices(Figure 2). MF exposure was found to induce electric currents inevery dental metallic appliance, which were made of various metals,
including stainless steel (SUS), CoCr, 70%Ag alloy, 12%Au-40%Ag20%Pd alloy, nickel titanium, β-titanium (Ti-11.5MO-6Zr-4.5Sn) andpure titanium [16]. Interestingly, the measured electric voltages andcurrents that were induced in the dental appliances were not dependent
on the electrical resistivity values of the materials, but on their shapes
and specific metal contents [16].
Electric currents were also induced in human hard tissues such as
tooth and bone by MFs, and the roles that they play in the living bodymust be considered, because they may simply cause pain, or may perform
roles in bone formation and repair similar to the methods based onelectrical or electromagnetic field stimulation (which use MF-induced
currents) [19,20]. To clarify these roles, currents induced in teeth by MFs
from electric toothbrushes and curing lights were investigated. Induced
currents were observed in teeth under MF exposure. We found that thevoltages induced in teeth by electric toothbrushes were higher (102–103μV) than those previously measured in dental appliances (101–102 μV)[16,17]. In contrast, the currents induced by electrictoothbrushes inIn this review, we describe the effects of MFs from electric
toothbrushes and other dental devices on dental appliances and teeth
that could affect human health. In addition, interesting unpublisheddata and speculation with regard to MF effects are given in this paper.

MFs from Dental Devices
Electric toothbrushes are widely used because of their convenience.
However, they have also been reported to produce low-frequency*Corresponding author: Takashi Kameda, Department of Orthodontics, Nippon
Dental University, School of Life Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku,
Niigata 951-8580, Japan, Tel: +81-25-267-1500 ext. 3303; Fax: +81-25-267-1622;
E-mail: tkameda@ngt.ndu.ac.jp
Received December 19, 2013; Accepted January 06, 2014; Published January08, 2014
Citation: Kameda T, Ohkuma K (2014) Electromagnetic Fields from Dental
Devices and their Effects on Human Health. J Electr Electron Syst 3: 118.
doi:10.4172/2332-0796.1000118
Copyright: © 2014 Kameda T, et al. This is an open-access article distributed
under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits
unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided theoriginal author and source are credited.

Electromagnetic Wave Theory

Volume 3 • Issue 1 • 1000118

Figure 1:/RZIUHTXHQF\PDJQHWLF¿HOGVSURGXFHGE\GHQWDOGHYLFHV$HOHFWULFWRRWKEUXVK 3KLOLSV6RQLFDUH+;3KLOLSV2UDO+HDOWKFDUH,QF%RWKHOO:$ %FXULQJOLJKW 237,/8;.HUU,QF&DPDQR,VODQG:$ 7KH0)VSURGXFHGE\WKHHOHFWULFWRRWKEUXVKHVDQGWKHFXULQJOLJKWVDQGWKHLUIUHTXHQFLHVZHUHGHWHFWHGDQGHYDOXDWHGXVLQJDVSHFWUXPDQDO\]HU 63(&75$11)
$DURQLD$%,QF(XVFKHLG*HUPDQ\ 7KH0)VZHUHHVWLPDWHGDWFPGLVWDQFHVIURPWKHIURQWDQGEDFNVLGHVRIDFWLYDWHGRULQDFWLYHHOHFWULFWRRWKEUXVKHVDQG
cm distances from the light guide tips of activated or inactive curing lights.

J Electr Electron Syst
ISSN: 2332-0796 JEES an open access journal

Electromagnetic Wave Theory

Volume 3 • Issue 1 • 1000118

Citation: Kameda T, Ohkuma K (2014) Electromagnetic Fields from Dental Devices and their Effects on Human Health. J Electr Electron Syst 3: 118.
doi:10.4172/2332-0796.1000118

Citation: Kameda T, Ohkuma K (2014) Electromagnetic Fields from Dental Devices and their Effects on Human Health. J Electr Electron Syst 3: 118.
doi:10.4172/2332-0796.1000118

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brackets than in teeth that were bonded to identically shaped acrylic
brackets (unpublished data). Despite considerable efforts, we have been
unable to correlate these results with any specific material property. It
is likely that this unexpected induced current ranking order is becauseof a combination of tooth properties and the material properties of theappliance components rather than the materials and their resistivities
alone.
In any case, MFs from personal and professional dental devices
induced currents, not only in the metallic dental appliances, but also
in teeth. The effects of these induced currents on human health must
now be considered.

MFs from Dental Devices Promote Corrosion of
Intraoral Metallic Appliances via Induced Currents
Figure 2: Electric voltages and currents induced in SUS multibracket systemand tooth by dental devices at a distance of 1 cm between device andappliances.
Appliance: multibracket system consisting of brackets (SUS304 × 10,
6XSHU0HVK %UDFNHW 7RP\ ,QWHUQDWLRQDO ,QF 7RN\R -DSDQ  PRODU WXEHV
686 î  6LQJOH 7XEH 7RP\ ,QWHUQDWLRQDO ,QF  PRODU EDQGV 686î  ,GHDO 0RODU %DQG 7RP\ ,QWHUQDWLRQDO ,QF  DQG ZLUH 686 î 
6X]XNLVWDLQOHVVVWHHOZLUH0LWVXED2UWKR6XSSO\,QF7RN\R-DSDQ 7RRWKhuman maxillary premolar tooth of patient undergoing orthodontic treatment.
(OHFWULF WRRWKEUXVK 3KLOLSV 6RQLFDUH +; &XULQJ OLJKW 237,/8;
The electric currents induced in dental devices were estimated using a digital
multimeter (7351 A/E, ADC Corporation, Tokyo, Japan) in AC+DC mode (i.e.
voltage=(ACV2+DCV2)1/2DQGFXUUHQW $&,2'&, 1/2).

%UDFNHWZLUH%UDFNHWRQO\0) í

MF (+)

0) í

Cr

–

+

í

MF (+)
íFe

0.20±0.012

1.39±0.067*

0.11±0.018

0.71±0.082*

Ni

–

+

í

+

Sn

na

na

í

í

Ti

na

na

í

í

Q IRUHDFKH[SHULPHQWDOFRQGLWLRQ686VWDLQOHVVVWHHOZLUH0)PDJQHWLF¿HOG
 GHWHFWHG YDOXHV įVORSH   YDOXHV  GHWHUPLQDWLRQ OLPLW î1/2įVORSH ±YDOXHVGHWHFWLRQOLPLWDQGQDQRWDYDLODEOH7KHGDWDZHUHDQDO\]HGYLDWKH
0DQQ:KLWQH\8WHVWWRGH¿QHWKHVWDWLVWLFDOO\VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHV6XSHUVFULSWDVWHULVNV GHQRWH WKH VWDWLVWLFDOO\ VLJQL¿FDQW GLIIHUHQFHV S  ZLWKLQ HDFKDSSOLDQFHFRPSDUHGZLWK 0) í 
Table 1: (OXWLRQ DPRXQW RI HDFK HOHPHQW ȝJ  IURP 686 DSSOLDQFHV WR DUWL¿FLDO
saliva.

teeth were lower (≈101 μA) than those previously measured in dental
appliances (101–103 μA) [16]. This difference could relate to disparities
between the electrical resistivities of tooth tissue (≈103 Ω m) and metals(e.g. stainless steel ≈ 10-8 Ω m) [21,22]. We predicted that the ranking
order in which currents could be induced in different bracket materials
with completely same bracket shape and size (KBT metal bracket;
SUS304, KBT zirconia bracket; ZrO2, Rocky Mountain Morita Inc.,Tokyo, Japan) would be tooth+stainless steel bracket > tooth+zirconia
bracket ≈ tooth, based on their electrical resistivities (tooth, 103 Ω m;stainless steel, 10−8 Ω m; ZrO2, 1010–1012 Ω cm; resin (acrylic), 1013–1014
Ω m) [23,24]. However, we found that the actual ranking order was
tooth+zirconia bracket > tooth+stainless steel bracket > tooth [17]. The
reason for this unexpected result is unclear. The presence of the adhesive
does not appear to be a factor, because the induced currents with andwithout adhesive (no bracket) were comparable. The resistivity of thebracket material also appears to be insignificant, because the induced
current was greater in teeth that were attached to ZrO2 or stainless steel
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ISSN: 2332-0796 JEES an open access journal

Currents induced in intraoral metallic appliances by MFs fromdental devices must have some effects. We must therefore determine
these effects.
Previous results showed that the MFs from electric toothbrushes
could induce alternating electric currents in both dental metallic
appliances and teeth [16,17]. Electric currents in oral appliances,e.g. galvanic currents, could cause both discomfort for the user andcorrosion of the metallic dental appliances [25,26]. Currents induced
by electric toothbrushes were also thought to cause some problems in
the oral condition of patients. However, the currents induced by theMFs from dental devices are unlike galvanic currents [16,17]. Galvanic
currents, which are direct currents, produced high voltages (several
tens to hundreds of mV) with low currents (several tens to hundreds
of nA), whereas the electric currents that were induced by electric
toothbrushes were of the order of μA to mA with a voltage range of μV
to mV [16]. These findings seemed to indicate that galvanic currents
were one of the causes of metal corrosion, whereas the electric currents
that were induced in dental appliances should not directly cause metal
corrosion. However, there were some reports in the literature about
metallic corrosion caused by induced Alternating Currents (AC). Rapid
geomagnetic variations have been known to induce electric currents in
power lines and pipelines, which could then lead to the destruction of
power transmission systems and pipeline corrosion [27]. In the straycurrent corrosion caused by alternating currents, the induced currents
occurred in embedded metal objects lying parallel to the high voltage
AC power lines or to the transportation routes of AC electric railways,
which then caused the corrosion of the embedded metal objects [28].
Based on these reports, we must therefore consider that the induced
currents in metallic appliances produced by MFs from dental devices
could be a trigger for corrosion in metallic appliances.
Metallic elution and the surface roughness of metallic appliances
immersed in artificial saliva during MF exposure were investigatedusing a ICP-OES (iCAP 6300 Duo, Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA) and a 3D laser confocal microscope (LEXT OLS4000,
Olympus Inc., Tokyo, Japan) [29]. MF exposure (120 min; 24 min/day
× 5 days) dramatically increased Fe elution, with low levels of Cr andNi elution from SUS appliances (Table 1). The surface roughness of
SUS appliances after MF exposure supported these results (Figures 3
and 4). In contrast to SUS appliances, Ti elution and increased surface
roughness were not observed in titanium appliances [29]. In addition,
while the induced voltages were almost identical in SUS and titanium
appliances, the induced currents in titanium appliances were double
those in SUS appliances [29]. These values were not in proportion to
the material electrical resistivities, which were 70–80 Ωm for SUS304
and 80–100 Ωm for NiTi. In contrast to the surface roughness evidenceElectromagnetic Wave Theory

Volume 3 • Issue 1 • 1000118

Figure 3:'ODVHUFRQIRFDOPLFURJUDSKVRI686ZLUHDQGEUDFNHWVXUIDFHVLPPHUVHGLQDUWL¿FLDOVDOLYDZLWKRUZLWKRXWH[SRVXUHWR0)VIURPHOHFWULFWRRWKEUXVKHVî 7KHZKLWHOLQHVLQWKHPLFURJUDSKVUHSUHVHQWȝP

Figure 4:6XUIDFHURXJKQHVVHVRI686EUDFNHWVDQG686ZLUHVLPPHUVHGLQDUWL¿FLDOVDOLYDZLWKRUZLWKRXWH[SRVXUHWR0)VIURPHOHFWULFWRRWKEUXVKHVQ IRUHDFKH[SHULPHQWDOFRQGLWLRQ5DUHSUHVHQWVWKHDULWKPHWLFDYHUDJHRIWKHDEVROXWHYDOXH 5D Q-1Ȉ_<L_ L Q 5]UHSUHVHQWVWKHKLJKHVWSHDNVDQGORZHVWYDOOH\VRYHUWKHHQWLUHVDPSOLQJOHQJWKDQG6DUHSUHVHQWVWKHDULWKPHWLFDYHUDJHRIWKH'URXJKQHVV DUHDOURXJKQHVV 7KHGDWDZHUHDQDO\]HGYLDWKH0DQQ
:KLWQH\8WHVWWRGH¿QHWKHVWDWLVWLFDOO\VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHV$VWHULVNVGHQRWHWKHVWDWLVWLFDOO\VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHV S ZLWKLQHDFKPHDVXUHPHQWLWHPRIHDFKappliance group when compared with *non-treated and **MF(-).

for the occurrence of metallic elution, no pH differences were observed
between the non-MF-exposed and MF-exposed groups measured witha pH meter (F-12, Horiba Inc., Kyoto, Japan) [29]. The pH values werelowered by the immersion of the appliance in each case; however, thesepH values, which did not reach the depassivation pH, could not have
led to the erosion of these alloys [30,31]. However, these pH values
in the immersed solutions may not always reflect the local pH values
around the appliances.
In any case, these results suggested the following novel MF
phenomena for human health. (1) The currents induced in metallic
appliances by MFs from dental devices could be one of the causes of
SUS corrosion. (2) The corrosion resistivity of titanium alloys is highcompared with that of SUS alloys. (3) The pH values of the solutions

J Electr Electron Syst
ISSN: 2332-0796 JEES an open access journal

used for immersion, with or without MF exposure, showed nostatistical significance. The low-frequency MFs around the oral cavity
that originate from electronic equipment such as electric toothbrushes
induce electrical currents in intraorally installed metals (especially in
SUS), prostheses and appliances, and promote metallic elution, which
is likely to be one of the causes of metallic allergies.

What are the Possible Effects of MFs from Dental
Devices on Human Health?
The corrosion of metallic appliances under MF exposure could
have detrimental results for human health, such as metal allergies.
The induced current itself could also produce similar results, e.g.
pain and discomfort for the patients. Because the role of low-Electromagnetic Wave Theory

Volume 3 • Issue 1 • 1000118

Citation: Kameda T, Ohkuma K (2014) Electromagnetic Fields from Dental Devices and their Effects on Human Health. J Electr Electron Syst 3: 118.
doi:10.4172/2332-0796.1000118

Citation: Kameda T, Ohkuma K (2014) Electromagnetic Fields from Dental Devices and their Effects on Human Health. J Electr Electron Syst 3: 118.
doi:10.4172/2332-0796.1000118

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frequency electromagnetic fields in carcinogenesis, and especiallyin the development of leukemia and central nervous system tumors,
has been well-documented [1,2,6-9], the effects of MFs were believed
to be basically harmful to human health. It is very difficult to protect
ourselves from low-frequency MFs because they can pass throughhuman tissue and most other materials, including glass, plastics, metals
and concrete [32]. The only viable way to limit our exposure to lowfrequency electromagnetic fields is thought to be to eliminate theirgeneration by electrical home appliances and dental devices.
However, there may also be some effective positive use of MFs
generated by dental devices for human health. First, we consideredthat the induced current in appliances could be used for biocidal
applications or for suppression of dental caries- or periodontal diseasecausing microorganisms. However, the number of oral bacteria were
not reduced, but were actually increased by the electric currents inappliances under MF exposure from dental devices (unpublisheddata). The oral bacteria suppression effects might not be caused by MF
exposure.
The intraoral aging of dental materials includes the plasticization ofpolymeric adhesives and increased porosity and roughness in metallic
alloys, which disturbs the smooth progress in courses of treatment
and causes losses in terms of time and money, along with emotional
distress for both patients and clinicians [33,34]. The oral environmentsof living organisms, including those of humans, are most hospitablefor biofilm creation and biocorrosion (microbially influenced
corrosion or MIC). If MIC existed in oral areas, the currents induced
in metallic appliances by MF exposure can be considered a means ofprotection against corrosion, like electrical protection in other fields.
We first investigated the existence of MIC based on oral bacteria.
Three representative indigenous oral bacteria, Streptococcus mutans,
Streptococcus sanguinis and Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
were selected for this experiment. S. mutans and S. sanguinis wereoral bacteria that easily created biofilms on the surfaces of the teeth
and appliances. A. actinomycetemcomitans is a pathogenic bacteriumthat occurs in localized aggressive periodontitis. We found that S.
mutans (ATCC49296) and S. sanguinis (ATCC25175) corroded SUS
dental appliances when the appliances were cultured with them in
BHI medium (Brain Heart Infusion medium, Beckton, Dikinson
and Company Inc., Detroit, MI, USA) at 37°C in 5 % CO2 in air in
the incubators without shaking from the results of metallic elution
and surface roughness of appliances by a ICP-OES and a 3D laser
confocal microscope respectively [35], but A. actinomycetemcomitans
did not corrode SUS or titanium appliances (unpublished data). We
then investigated the protection effects of MF-exposure against thebiocorrosion of these appliances at a distance of 2 cm between device
and appliances. In the groups that were co-cultured with S. sanguinis,
remarkable protection effects of 120 min (24 min/day × 5 days) - MF
exposure against MIC were observed (Figure 5). This MF effect on oral
bacterial corrosion of metallic appliances is novel effective use of MFsfrom dental devices. However, the reasons for this result are unclear,and further detailed investigation is required.
In the orthopedic field, MFs have been used for bone repair inmethods based on electrical or electromagnetic field stimulation[19,20]. The MFs from dental devices were found to induce currents inhuman hard tissue, e.g. teeth [17]. These results indicate the possibility
that MFs from dental devices could induce electric currents not onlyin teeth but also in bone tissue, which would then promote boneformation and repair.
J Electr Electron Syst
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Acknowledgement
The authors would like to thank Assistant Prof. Hirotake Oda (Departmentof Periodontology, Nippon Dental University, Niigata) for his technical assistancewith bacterial cultures, and Prof. Soh Sato (Department of Periodontology, Nippon'HQWDO8QLYHUVLW\1LLJDWD DQG3URI.D]XWR7HUDGD 'HSDUWPHQWRI2UWKRGRQWLFV
Nippon Dental University, Niigata) for providing valuable advice.

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Figure 5: Surface roughnesses of SUS brackets immersed and co-cultured withoral bacteria and with or without exposure to MFs from electric toothbrushes.
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compared with *intact products (medium (-) and bacteria (-) group) and withineach measurement item of each groupwhen compared with **MF(-).

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Conclusions and Outlook
This review has discussed the electromagnetic fields of dental
devices and their effects on human health. The electromagnetic
fields produced by dental devices were basically low-frequency MFs.
MFs have been considered to be generally harmful to human health,especially in the development of leukemia and central nervous system
tumors [1,2,6-9]. However, it is very difficult to protect ourselves fromthese low-frequency MFs, because they easily pass through humantissue and most other materials [32].
Under these conditions, there are two possible conclusions as towhat can be done about MFs from dental devices:
1. Find ways to use MFs from dental devices effectively for humanhealth promotion;
2. Abolish the devices that generate these MFs, or reduce the MF
levels generated bythe dental devices.
The first conclusion was investigated and discussed in the sections
above, eg. suppression of oral bacterial corrosion of intraoral dental
appliances, and promotion of bone formation and repair. Further andmore detailed study is needed to establish effective methods for MF
utilization. With regard to the second conclusion, viable way to limit
exposure to low-frequency electromagnetic fields is thought to beelimination of their generation by dental devices, eg. development ofdental devices with low MF generation and keeping the devices awayfrom tooth and metallic appliances as possible, and/or elimination of
metallic appliances from oral cavity. New regulatory standards specificto human health, and particularly for the craniocervical region, arealso needed in conjunction with the current conventional EMC(electromagnetic compatibility) standards, such as ISO standards.
In conclusion, further study is required to clarify the mechanisms
by which the electric currents that are induced by MFs affect humanoral health and to explore whether countermeasures can be developed
to provide methods of protection from or methods for effective use of
these effects.

Electromagnetic Wave Theory

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17. Kameda T, Ohkuma K, Sano N, Ogura H, Terada K (2013) Electric current
LQGXFHGLQWHHWKE\HOHFWURPDJQHWLF¿HOGVIURPHOHFWULFWRRWKEUXVKHVDQGFXULQJOLJKWV2UWKRG:DYHV
18. 0L\DNRVKL - <DPDJLVKL 1 2KWVX 6 0RKUL . 7DQDEH +   ,QFUHDVH LQ

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Citation: Kameda T, Ohkuma K (2014) Electromagnetic Fields from Dental
Devices and their Effects on Human Health. J Electr Electron Syst 3: 118.
doi:10.4172/2332-0796.1000118

This article was originally published in a special issue, Electromagnetic Wave
Theory handled by Editor(s). Dr. Cheng-Wei Qiu, National University of Singapore, Singapore.

J Electr Electron Syst
ISSN: 2332-0796 JEES an open access journal

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Electromagnetic Wave Theory

Volume 3 • Issue 1 • 1000118

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑧

	 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:721-728	
 (2014)Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑨

	 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:1809-1816	
 (2014)	
 Development and performance evaluation of a positive referencematerial for hemolysis testing

TABLE I. List of a Candidate of Hemolytic Compound and the Hemolytic Activity Estimated by Simple Hemolysis Test Method

Yuji Haishima,1* Chie Hasegawa,1 Yusuke Nomura,1 Tsuyoshi Kawakami,2 Toshiyasu Yuba,3Tomoko Shindo,4 Keisuke Sakaguchi,5 Takahiro Tanigawa,5 Kaori Inukai,5 Mika Takenouchi,5Kazuo Isama,2 Atsuko Matsuoka,6 Shingo Niimi1
1

Division of Medical Devices, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo 158–8501, Japan
Division of Environmental Chemistry, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo 158–8501,
Japan
3
Kawasumi Laboratories, Inc., Corporate Research and Development Division, Shinagawa Intercity Tower B, Konan,
Minato-ku, Tokyo 108–6109, Japan
4
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center, 729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa 257–8523, Japan
5
R&D Headquarters, Evaluation Center, TERUMO Corporation, 1500 Inokuchi, Nakai-machi, Ashigarakami-gun, Kanagawa
259-0151, Japan
6
Office of Standards and Guidelines Development, Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, 3-3-2 Kasumigaseki,
Chiyoda-ku, Tokyo 100-0013, Japan
2

Received 3 September 2013; revised 24 February 2014; accepted 19 March 2014
Published online 8 April 2014 in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002/jbm.b.33169
Abstract: This study deals with the development and performance evaluation of a positive reference material for
hemolysis testing, which is used for evaluating the biologicalsafety of medical devices. Genapol X-080, a nonionic detergent, was selected as a candidate hemolytic substance in asurvey of 23 chemical compounds; it showed significant
hemolytic activity against rabbit defibrinated blood at concentrations more than 20 mg/mL. A polyvinyl chloride (PVC)
sheet spiked with 0.6% (w/w) of the compound exhibited
weak hemolytic activity in direct contact and/or extract-based
assays after 4 h incubation at 37! C. A PVC sheet containing
5.8% (w/w) Genapol X-080 induced complete hemolysis inboth assays. The amount of Genapol X-080 eluted from each
PVC sheet during hemolysis testing using the direct contact
method increased time-dependently and reached 25.6 (former
sheet) or 1154 (later sheet) mg/mL after 4 h incubation, which

was similar to or much higher than the critical micelle concentration, respectively. Similar elution behavior wasobserved using the extract-based method, and the Genapol
X-080 content in test solutions prepared by autoclave extraction of both sheets was 22.5 and 358 mg/mL, respectively,
indicating a clear relationship between the degree of hemolytic activity and the eluted amount of Genapol X-080. Thus,
a PVC sheet spiked with a compound exhibiting different
hemolytic activity depending on its concentration may be
useful as a positive reference material to validate the hemolyC 2014 Wiley Periodicals, Inc. J Biomed Mater Res Part B:
sis tests. V

Final concentration
for test (lM)

Hemolytic
ratio (%) d

DMSOb
PBS
PBS
PBS
PBS
DMSO
DMSO
DMSO

500
5
50
50
50
500
500
500

0.5
1.3
0.9
1.0
0.7
93.0
0.3
0.6

DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO

500
500
500
500
500
500

0.4
0.7
6.3
0.4
0.3
0.3

DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO

500
500
500
50c
500
500
500
500
500

1.4
0.5
1.2
100.9
0.3
8.6
0.6
0.4
0.3

Compound (manufacturer No.)a

Dissolved solvent

Triphenyl phosphate (1)Lactic acid (1)Orcinol anhydrous (1)Lead acetate (1)Sodium chlorate (1)Diphenyl disulfide (2)Dimethylglyoxime (1)3-Phenylazo-2,6-diaminopyridine
monohydrochloride (2)5-Aminosalicylic acid (1)4-Nitroaniline (3)o-Aminophenol (1)Aniline (1)p-Aminodipheylamine (1)2-Nitrophenylhydrazinehydrochloride (2)Sulfasalazine (2)Nitrobenzene (1)Resorcinol(1)Genapol X-080 (3)2,4,6-Trinitrophenyl (1)Zineb standard (4)D-Penicillamine hydrochloride (5)1-Naphthylamine (3)p -Aminosalicylic acid sodium
salt dihydrate (5)a(1) Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Tokyo, Japan), (2) Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokyo, Japan), (3) Sigma-Aldrich Co. (Tokyo,
Japan), (4) Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan), and (5) MP Bio Japan K.K. (Tokyo, Japan).
bCompound dissolved in DMSO was diluted to 100 folds with PBS at the final concentration for hemolysis test.
clg/mL.
dHemolytic ratio after 4 h incubation.

Correspondence to: Y. Haishima (e-mail: haishima@nihs.go.jp)
Contract grant sponsor: Health and Labor Sciences Research Grants (Japanese Ministry of Health, Labor, and Welfare); contract grant number:
H23-CHIKYUKIBO-SHITEI-003 and H25-CHIKYUKIBO-SHITEI-008

oxygenators or hemodialyzers that may physically damage
blood cells, the test should be designed considering
mechanical factors, for example, using a blood circulation
system. For devices that have little mechanical impact onblood cells, established static or semi-static in vitro testing
can be used. This testing may be also useful for devices
with mechanical impact on blood to evaluate the impact ofmaterials on hemolysis.
Biological testing methods have to be validated to confirm that test results meet the requirements for evaluating
safety in clinical use.2,3 Negative and positive referencematerials or positive control substances have been used inbiological safety evaluation tests such as cytotoxicity, sensitization, genotoxicity, and implantation tests to detect toxicity
in test samples and to certify the validity of the test system.
However, no reference materials have been used for hemolysis testing to date.
Hemolysis is a phenomenon accompanied by the ruptureof erythrocytes and the release of their cytoplasm into thesurrounding fluid; thus, the cell membrane is damaged byphysical, chemical, and biological factors. Certain types ofsnake and vespid venoms8,9 with phospholipase A2 activity
and bacterial exotoxins10–12 produced by pathogenic
microbes (e.g., Clostridium perfringens, Streptococcus pneumoniae, and Staphylococcus aureus) are known as typicalhemolysins, but considering the safety, stability, and cost

C 2014 WILEY PERIODICALS, INC.
V

1810

Appl Biomater, 102B: 1809–1816, 2014.

Key Words: hemolysis test, positive control, biological safety
evaluation, guidance

How to cite this article: Haishima Y, Hasegawa C, Nomura Y, Kawakami T, Yuba T, Shindo T, Sakaguchi K, Tanigawa T, Inukai
K, Takenouchi M, Isama K, Matsuoka A, Niimi S. 2014. Development and performance evaluation of a positive reference material for hemolysis testing. J Biomed Mater Res Part B 2014:102B:1809–1816.

INTRODUCTION

Biological safety evaluation of raw materials or medical devices must be conducted using risk analysis techniques specified
in ISO 14971.1 The intended use or purpose and the safety
properties of a medical device must be clarified or known
foreseeable hazards must be identified, and the risk of eachhazard must be anticipated. Items to be evaluated to determine the biological safety of each medical device are selectedaccording to the requirements specified in ISO 10993-1.2

As a general rule, the items must be evaluated depending on their categorization in accordance with the nature ofbody contact and the duration of contact. Hemocompatibility
testing is required to evaluate the safety of a medical device
or material that has contact with blood.4–7 Hemolysis testingis a part of hemocompatibility testing, which involves tests
for thrombosis, coagulation, platelets, hematology, and thecomplement system. Mechanical and biochemical factors
affect hemolysis. For medical devices such as membrane

1809

HAISHIMA ET AL.

performance of potential positive reference materials, a candidate hemolytic substance should be selected from commercially available chemical compounds.
In this study, we developed a positive reference material
made of a plasticized polyvinyl chloride (PVC) sheet thatshows strong or weak hemolytic activity dependent on thecontent of Genapol X-080, selected as a candidate hemolytically toxic substance, based on results obtained using 23
types of chemical compounds, and we evaluated the performance of this material as a positive reference material inthree types of official test methods used in Japan and theUSA.
MATERIALS AND METHODS

Materials, chemicals, and utensils
Twenty-three types of chemicals selected as candidate
hemolytic compounds and their suppliers are listed in Table
I. Dimethyl sulfoxide (DMSO) of molecular biology grade,sodium citrate, sodium carbonate, ammonium thiocyanate,cobalt (II) nitrate hexahydrate, nitric acid for analysis of poisonous metals, metal standard solution (Co and Ag), andDulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without Ca11and Mg11 were purchased from Wako Pure Chemical Industries (Tokyo, Japan). Toluene of pesticide residue and PCB
analysis grade and Drabkin reagent were purchased from
Sigma-Aldrich (Tokyo, Japan), and 4-(2-pyridylazo)-

POSITIVE REFERENCE MATERIAL FOR HEMOLYSIS TESTINGORIGINAL RESEARCH REPORT

resorcinol (PAR) was purchased from Dojindo MolecularTechnologies (Kumamoto, Japan). The hemoglobin standard
was purchased from Alfresa Pharma Corporation (Osaka,
Japan). All utensils made of glass, metal, or TeflonV used toprepare samples for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) analysis were heated at 250! C for morethan 16 h prior to use.
R

Animal blood
The rabbit defibrinated blood used in simple hemolysis testing for a candidate hemolytic compound as described below
was purchased from Kohjin Bio (Saitama, Japan). For hemolysis tests provided by the Japanese Ministry of Health,
Labor, and Welfare (MHLW), rabbit defibrinated blood was
prepared in our laboratory according to Japanese guidelines.7 For hemolysis tests provided by the American Societyof Testing and Materials (ASTM) and the National Institutesof Health (NIH),5,6 fresh-drawn rabbit blood was anticoagulated by adding sodium citrate at a final concentrationof 0.38 w/v% and stocked at 4! C until use. New Zealandwhite rabbits and Japanese white rabbits were used in thisstudy, and the drawn blood was directly used for hemolysis
testing without washing the blood cells. The procedure was
performed in accordance with the ethical guidelines on animal experiments of the Hatano Research Institute of theFood and Drug Safety Center (approval number 1120331A)
and Terumo Corporation (approval number 120163).
Preparation of PVC sheet
PVC powder (100 g) was added gradually to a mixture of
DEHP (55 g) and ESBO (8 g) containing different amountsof Genapol X-080 or diphenyl disulfide (0, 0.01, 0.1, 1.0, and10 g, respectively; final concentration 5 0, 0.006, 0.06, 0.6,
and 5.8% [w/w]) under stirring with a spatula. The mixed
powder was gently heated from room temperature to 100! C
in an oven and then stirred well. The powder was stirred asecond time after heating at 100! C for 5 min to completely
plasticize the PVC. The plasticized powder was heat-pressedat 180! C to prepare the PVC sheets (thickness 5 0.4 mm).
Each sheet was cut into small pieces (1 3 3 cm2).
Simple hemolysis testing to survey a candidate
hemolytic compound
Purchased rabbit defibrinated blood (1 mL) was placed intoa screw-capped test tube and centrifuged at 700g for 5 min
at 4! C. The supernatant was removed, and PBS (10 mL)
was added to the sedimented red blood cells (RBC) andthen gently mixed. After centrifugation at 700g for 5 min at
4! C, the supernatant was removed, and this step was
repeated two times to wash RBCs. The RBC sediment was
finally suspended in PBS of equal volume to original sample
and stored at 4! C until use.
Hydrophilic compounds were dissolved in PBS (1 mL) at
the final concentration shown in Table I, and the washed
RBC suspension (20 mL) was added to the solution and thengently mixed. After incubation at 37! C for 1, 2, and 4 h,each sample was centrifuged at 700g for 5 min at 4! C, andthen the absorbance of the supernatant (100 mL) was

measured at 415 nm using a SH-9000 Lab microplate
reader (Corona Electric, Ibaraki, Japan). The RBC suspension
in PBS alone was also tested under the same conditions asa negative control, whereas a positive control was preparedusing distilled water instead of PBS. The calculated amountof the hydrophobic compound was dissolved in DMSO, andthe solution was diluted 100-fold with PBS at the final concentration listed in Table I. The washed RBC suspension (20mL) was immediately added to the diluted sample (1 mL),and then hemolytic behavior was estimated using the same
method.
The hemolytic behavior of Genapol X-080 and diphenyl
disulfide exhibiting high hemolytic activity against RBC was
additionally estimated in detail at concentrations from 0.1
to 50 mg/mL for Genapol X-080 and from 50 to 100 mM fordiphenyl disulfide.
These tests were performed in duplicate. The hemolytic
ratio was calculated in accordance with the following
formula.
ðAT 2AN Þ%Hemolysis 53100:
ðAP 2AN Þ
where AT is the test sample absorbance, AN is the average
negative control mean absorbance, and AP is the average
positive control mean absorbance.
Hemolysis testing of PVC sheet spiked with hemolytic
compoundThis test was performed using four methods: a simple
method used to survey a candidate hemolytic compound,and official methods provided by ASTM, NIH, and Japanese
MHLW guidelines.5–7 PVC sheets (5 g for the NIH method or
1 3 3 cm2 for the other methods) containing different
amounts of Genapol X-080 or diphenyl disulfide were cut
into small pieces and placed into a screw-capped glass bottle. A PVC sheet containing no Genapol X-080 or diphenyl
disulfide was used as a negative material control.
In the simple method, 1 mL of PBS and 20 mL ofwashed, suspended RBCs prepared according to the procedure described above were added to the bottle containing
the test pieces for the direct contact hemolysis test. In theextraction method, 1 mL of PBS was added to the bottle
and autoclaved at 121! C for 1 h to make the test solution,and then the washed RBC suspension (10 mL) was added to
0.5 mL of each test solution replaced into another glass
tube. After incubation at 37! C for 1, 2, and 4 h, the hemolytic ratio of each sample was measured according to thesame method described above.
For ASTM direct contact hemolysis testing, PBS (7 mL)
and 1 mL of rabbit blood anticoagulated with sodium citrate
were used to adjust the hemoglobin concentration to 9.456
mg/mL, and they were added to the bottle containing sample pieces. For the ASTM extract method, PBS (8 mL) was
added to the bottle and autoclaved (121! C, 1 h) to prepare
the test solution. Citrated rabbit blood (1 mL) was added to
7 mL of the test solution replaced into another glass bottle.
Each sample was incubated at 37! C for 3 h under gentle

JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS | NOV 2014 VOL 102B, ISSUE 8

1811

mixing followed by centrifugation at 800g for 15 min. The
supernatant (1 mL) was mixed with Drabkin reagent (1 mL)
and the absorbance was measured at 540 nm after incubation at room temperature for 15 min. The hemoglobin concentration in each sample was calculated according to a
standard curve.
For the NIH direct contact method, rabbit blood (8 mL)
anticoagulated with sodium citrate was diluted with saline(10 mL). The diluted blood (0.2 mL) was hemolyzed by adding 0.1 w/v% sodium carbonate solution (10 mL), and theabsorbance at 545 nm was adjusted to the range of 0.9–1.0
by adding saline or blood. Saline (10 mL) was added to thebottle containing the sample pieces and pre-incubated at
37! C for 30 min. The blood adjusted according to the absorbance (0.2 mL) was added to the glass tube and incubated at
37! C for 1 h. After centrifugation at 500g for 5 min, theabsorbance of the supernatant was measured at 545 nm.
For the Japanese MHLW extract hemolysis test, the test solution was prepared by autoclave extraction (121! C, 1 h) withsaline, and 0.2 mL of rabbit defibrinated blood freshly preparedin our laboratory was added to 10 mL of the test solution, followed by incubation at 37! C for 4 h. After centrifugation at 750g
for 5 min, the supernatant (0.5 mL) was mixed with Drabkin reagent (4.5 mL) and incubated at room temperature for 20 min followed by measurement of the absorbance at 540 nm.
Negative and positive controls and the hemolysis ratio
were prepared or calculated in accordance with the method
provided by the guidelines. These tests were performed intriplicate, and significant differences were calculated by
two-way analysis of variance.
Elution testing of Genapol X-080 from the PVC sheet
The amount of Genapol X-080 eluted from the PVC sheet wasquantified by ICP-MS analysis as the amount of cobalt (II)formed complex produced according to a previously reported
method.13,14 Briefly, 1 mL of PBS and 20 mL of washed RBC
suspension were added to the bottle containing the test
pieces of the PVC sheet (1 3 3 cm2) spiked with different
amounts of Genapol X-080. After incubation for 1, 2, and 4 h,
500 mL of each sample solution was replaced into anotherscrew-capped glass tube, and 500 mL of test solution prepared by autoclave extraction of the test pieces with PBS (1mL) was also sampled into another tube. PBS (0.5 mL), toluene (6 mL), and a mixture (3 mL) of ammonium thiocyanate(456 g/L) and cobalt (II) nitrate hexahydrate (46.6 g/L) solutions (1:1, v/v) were added to each sample and shaken for
15 min at room temperature followed by centrifugation at
2500 rpm for 3 min. PAR solution (1 mL, 0.01 g/L, pH 9.5)
was added to 5 mL of the supernatant (toluene layer), andgently shaken for 3 min followed by centrifugation. The
water layer was sampled for ICP-MS analysis. PBS containing
Genapol X-080 in a concentration range from 1.0 to 200 mg/
mL was also treated using the same method to generate astandard curve. This test was repeated in triplicate.
ICP-MS analysis
The sample solution was diluted appropriately 100–400fold with 5 v/v% nitric acid and filtered through a

1812

HAISHIMA ET AL.

membrane filter (pore size 0.45 mm, Sartorius Stedim, Goettingen, Germany). The concentration of Co (m/z 5 59) in thesample solution was determined by ICP-MS (Agilent 7500ce,
Agilent Technologies, Santa Clara, CA) using an octopole
reaction system.15,16 Helium gas was used as the collisiongas. The operation conditions of ICP-MS were as follows: RF
power 1500 W; argon plasma gas 15 L/min; nebulizer gas
0.7 L/min; make-up gas 0.33 L/min; helium collision gas 5
mL/min; spray chamber temperature 2! C; integration time
0.1 s; three replicates. Ag (m/z 5 107) was used as an internal standard (5 mg/L in 5% nitric acid solution) for quantification of the Co concentration. The method limit ofdetection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for Co in
the final sample solution were calculated as follows17:
LOD 5 3 3 q
LOQ 5 14:1 3 q
where q is the standard deviation obtained from the resultsof a control blank sample (only PBS, n 5 10). The LOD and
LOQ of Co thus obtained were 6.67 and 31.7 ng/L, respectively. The background equivalent concentration (BEC) of Co
in this study was 1.25 ng/L. Linearity (r 5 0.997) of thestandard curve used to quantify Genapol X-080 was
observed in the concentration range from 1.0 to 200 mg/mL,
and hence, the LOQ for Genapol X-080 was set at 1.0 mg/
mL.
RESULTS

Hemolytic activity of a candidate compound
The 23 chemicals listed in Table I were selected as candidate hemolytic compounds according to previous reports,18–
20
and the hemolytic behavior against rabbit RBCs was estimated using a simple survey method. As shown in Table I,
although most of the compounds did not exhibit hemolytic
activity under the conditions used in this study, Genapol X080 and diphenyl disulfide significantly induced hemolysis.
As shown in Figure 1(a), the activity of Genapol X-080
remarkably increased at concentration higher than approximately 20–25 mg/mL. Diphenyl disulfide exhibited hemolytic
activity in a concentration-dependent manner in the concentration range from 50 to 100 mM [Figure 1(b)].
Preliminary study on the hemolytic activity of the PVC
sheet spiked with Genapol X-080 or diphenyl disulfide
To confirm its availability as a positive reference material,
the hemolytic behavior of PVC sheets spiked with different
amounts of Genapol X-080 or diphenyl disulfide was preliminarily estimated using a simple method.
As shown in Figure 2(a), although PVC sheets containing
0.006% or 0.06% (w/w) Genapol X-080 did not exhibit significant hemolytic activity when compared with PBS (control) and the negative material control, the PVC sheet spiked
with 0.6% (w/w) Genapol X-080 induced weak hemolysis of
RBCs in the direct contact method, and the hemolytic ratio
reached 37.4% after 4 h of incubation. In addition, complete
hemolysis was induced by the PVC sheet containing 5.8%

POSITIVE REFERENCE MATERIAL FOR HEMOLYSIS TESTINGORIGINAL RESEARCH REPORT

compound. Similar hemolytic behavior was also yielded by
the ASTM or Japanese MHLW extract-based method and the
NIH direct contact method, in which PVC sheets spiked withthe highest amount of Genapol X-080 induced complete
hemolysis (Figure 4). However, a PVC sheet spiked with
0.6% (w/w) Genapol X-080 did not exhibit significant
hemolytic activity, which was different from the results in
the ASTM direct contact method and the simple method
used to survey the candidate hemolytic compound.

FIGURE 1. Hemolytic behavior of Genapol X-080 (a) and diphenyl
disulfide (b) estimated by the simple method. Concentration of Genapol X-080: , 1; w, 10; ~, 20; !, 25; ~, 30; ", 40 mg/mL. Concentration of diphenyl disulfide: , 50; w, 60; ~, 70; !, 80; ~, 90; ", 100
mM. The hemolytic ratio of negative control (PBS) after incubation for
1, 2, and 4 h was 4.2%, 4.8%, and 7.2%, respectively.

••

Amount of Genapol X-080 eluted from the PVC sheet
The amount of Genapol X-080 eluted from the PVC sheet
was measured by ICP-MS analysis to elucidate the correlation with the hemolytic behavior of the sheet. In the directcontact method, the amount eluted from PVC sheets spiked
with 0.6% or 5.8% (w/w) Genapol X-080 increased overtime and reached 25.6 or 1154 mg/mL, respectively, after 4
h of incubation as shown in Table II. The test solution prepared by autoclave treatment for the extract-based method
contained 22.5 (former sheet) or 358 (later sheet) mg/mL
Genapol X-080, respectively. In contrast, the amount eluted
from the PVC sheet containing the lowest amount of Genapol X-080 was less than the LOQ in the direct contact and/or extract-based methods. No significant elution wasobserved from the PVC sheet spiked with 0.06% (w/w)
Genapol X-080, except for 3.75 mg/mL Genapol X-080
detected after incubation for 4 h using the direct contact
method.

(w/w) Genapol X-080 independently of incubation time.
Similar hemolytic behavior was observed for the extractbased method as shown in Figure 2(b), in which the test
solution prepared by autoclave extraction of PVC sheets
spiked with 0.6% or 5.8% (w/w) Genapol X-080 exhibited
weak or strong hemolysis, respectively, but no activity wasobserved for extracts from PVC sheets containing 0.006% or
0.06% (w/w) Genapol X-080.
In contrast, the PVC sheet containing diphenyl disulfide
did not exhibit hemolytic activity in the direct contact and/or extraction methods, despite the presence of the spiked
diphenyl disulfide as shown in Figure 3.

Performance evaluation of PVC sheet spiked with
Genapol X-080 as a positive reference material
The hemolytic activity of PVC sheets spiked with Genapol X080 was also estimated using three official methods to certify the sheet as a positive reference material for hemolysis
testing. As shown in Figure 4, the hemolytic behavior of the
sheet detected by the ASTM direct contact method was
almost identical to that in the simple method used in the
preliminary survey, in which the PVC sheet containing 0.6%
or 5.8% (w/w) Genapol X-080 induced weak (hemolytic
ratio 5 21.1%) or strong (hemolytic ratio 5 92.4%) hemolysis, respectively, but no hemolysis for observed for the othertwo sheets spiked with relatively low amounts of the

FIGURE 3. Hemolytic behavior of PVC sheets spiked with different
amounts of diphenyl disulfide estimated by direct contact (a) andextract-based (b) assays using a simple method. In addition to PBS
alone (negative control), a *PVC sheet containing no diphenyl
disulfide was used as a negative material control.

DISCUSSIONFIGURE 2. Hemolytic behavior of PVC sheets spiked with different
amounts of Genapol X-080 estimated by direct contact (a) andextract-based (b) assays using the simple method. In addition to PBS
alone (negative control), a *PVC sheet containing no Genapol X-080
was used as a negative material control. **Significant differences(p < 0.01) were detected between these data points and other data
points.

JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS | NOV 2014 VOL 102B, ISSUE 8

1813This investigation attempted to develop a positive referencematerial for certifying the validity of hemolysis tests, which
are used for evaluating the hemocompatibility of medical
devices. From the survey of 23 chemical compounds, Genapol X-080 and diphenyl disulfide were selected as
candidates.
Genapol X-080 is a polyethyleneglycol (PEG) monoalkyl
ether that is used as a general-purpose non-ionic detergent,and it has been widely used in various fields including cosmetics. Alkyl PEG ethers were not genotoxic at a concentration of 1000 mg/L,21 and no evidence of systemic toxicity
or sensitization was found for intact skin.22 Recently, theCosmetic Ingredient Review (CIR) Expert Panel assessed thesafety of alkyl PEG ethers used in cosmetics and concluded
that they are safe as used in cosmetic products.23 Taking
these findings into consideration, it seems that this compound is safe for handling and useful as an ingredient for
preparing a positive reference material for hemolysis testing. Genapol X-080 induces hemolysis of RBCs by destroying
the cell membrane through the detergent effect at concentrations higher than the critical micelle concentration(CMC), which may be approximately 25 mg/mL according to
the hemolytic behavior of the compound [Figure 1(a)]. PVC
sheets spiked with 0.6% or 5.8% (w/w) Genapol X-080

1814

HAISHIMA ET AL.

exhibited weak or strong hemolysis, respectively, in the
direct contact and/or extract-based assays using the simple
method. In the direct contact method, the amount of Genapol X-080 eluted from the PVC sheets increased over timeand reached 25.6 (0.6% [w/w] sheet) and 1154 (5.8% [w/w] sheet) mg/mL after 4 h incubation, corresponding
approximately to the CMC or much higher than the CMC,
respectively. The Genapol X-080 content in the test solution
prepared by autoclave extraction was also similar to or
higher than the CMC. Thus, a clear relationship wasobserved between the degree of hemolytic activity and elution amount of Genapol X-080. In addition, identical or similar hemolytic behavior was also yielded by the ASTM, NIH,
and Japanese MHLW methods according to the protocol forinter-laboratory hemolysis round robin testing produced by
ISO/TC 194/WG 9, which was implemented in April 2013.
Although weak hemolytic activity induced by the PVC sheet
spiked with 0.6% (w/w) Genapol X-080 was not detectedby official methods other than the ASTM direct contact
method, the detection may be improved by slightly increasing the spiked amount of the compound. The Genapol X-080
content in the test solution prepared by autoclave extractionof the PVC sheet spiked with the highest amount of thecompound was considerably lower than the amount eluted
from the sheet during the hemolysis test using the directcontact method. The difference in elution amount may originate from the physicochemical properties of Genapol X-080
because the solubility of the compound markedly decreases
at temperatures higher than the cloud point (74! C–76! C).
These data clearly indicate that a PVC sheet spiked with
Genapol X-080 exhibiting different hemolytic activity
dependent on the Genapol X-080 content may be useful as apositive reference material to certify the validity of hemolysis tests.
It has been reported that aromatic disulfides induce
hemolysis of erythrocytes,19,20 and in fact, diphenyl disulfide itself also exhibited significant hemolytic activity inthis study. This compound induces hemolysis as the resultof biological effects in erythrocytes such as hydrogen

FIGURE 4. Hemolytic behavior of PVC sheets spiked with different
amounts of Genapol X-080 estimated by official methods for hemolysis testing provided by ASTM, NIH, and the Japanese MHLW. ",ASTM extract-based method; !, ASTM direct contact method; w, NIH, Japanese MHLW extract-based method.
direct contact method;*PVC sheet containing no Genapol X-080 was used as a negative
material control. **Significant differences (p < 0.01) were detected
between these data points and other data points.

•

POSITIVE REFERENCE MATERIAL FOR HEMOLYSIS TESTINGORIGINAL RESEARCH REPORTTABLE II. Amount of Genapol X-080 Eluted from PVC Sheet During Hemolysis Test with Direct Contact Method or into Test
Solution for the Extract Method
Amount of Genapol X-080 (lg/mL) eluted from PVC sheet in
Genapol X-080 content
in PVC sheet (% [w/w])
0.006
0.06
0.6
5.8
a

Direct contact method after incubation for
1h

2h

4h

Extract method-a6.2060.2136265.0

21.260.43523614.8

3.7560.12
25.660.701154631.6

22.560.32
35866.4

19. Munday R. Toxicity of aromatic disulphides. II. Intra-erythrocytichydrogen peroxide formation and oxidative damage by aromatic
disulphides. J Appl Toxicol 1985;5:409–413.
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disulphides. J Appl Toxicol 1985;5:409–413.

less than LOQ.

peroxide production, hemoglobin oxidation, and destruction of nonprotein thiols and protein-bound thiols.24
Although diphenyl disulfide itself seemed to be superior to
Genapol X-080 as a candidate hemolytic compound withregard to the wide range of concentrations that induced
hemolysis, PVC sheets spiked with diphenyl disulfide
exhibited no hemolytic activity in the direct contact and/or
extract-based methods. The reason is unknown, but it isspeculated that although diphenyl disulfide itself may beheat-stable, because its hemolytic activity was maintainedeven after heating at 200! C for 10 min (data not shown),
it may interact with DEHP, ESBO, or PVC molecules during
the heat-press process used to make the PVC sheet. In fact,
PVC sheets prepared by casting a tetrahydrofuran solution
containing the calculated amounts of plasticized PVC anddiphenyl disulfide induced hemolysis of RBCs (data notshown). However, it was finally decided that the PVC cast
sheet was not useful as a positive reference material for
hemolysis testing because the degree of hemolytic activity
was independent of the spiked amount and the reproducibility of the data was low (data not shown), probably
because the amount of diphenyl disulfide eluted from the
PVC sheet may have varied according to the hydrophobicityof the compound.
It is known that most plastic products do not exhibit
significant hemolytic activity against RBCs. In fact, we havealso confirmed that no hemolytic activity is present in commercially available plastic sheets made from polycarbonate,acrylate, and terephthalate (data not shown), which indicates that these sheets can be used as a negative referencematerial for hemolysis testing. Although there is a possibility that the method used to form the sheets will be changed
suddenly without any publicity, plastic products that can beused as a negative reference material may be easily foundand purchased at any time. Thus, the use of efficient positive and negative reference materials to certify the validityof hemolysis tests is now possible, and our next step is toestablish a reliable supply of a positive reference material
containing Genapol X-080.
CONCLUSIONSPVC sheets spiked with Genapol X-080 exhibiting different
hemolytic activity dependent on the Genapol X-080 content
may be useful as a positive reference material to certify thevalidity of hemolysis tests.

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JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS | NOV 2014 VOL 102B, ISSUE 8

1815

1816

HAISHIMA ET AL.

POSITIVE REFERENCE MATERIAL FOR HEMOLYSIS TESTING

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑩

	
 生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バイオマテリアルの設計・開発戦略	 Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑪

	
 バイオマテリアル−生体材料,	
 33(1):56-63	
 (2015)	
 Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑫

	 J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.,	
 in	
 press	 (2015)	
 J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

Stage:

Page: 1

Characterization of Alternative Plasticizers in Poly(vinyl
chloride) Sheets for Blood Containers

AQ8

AQ1

Yuji Haishima,1 Tsuyoshi Kawakami,2 Chie Fukui,1 Akito Tanoue,3 Toshiyasu Yuba,4 Satoru Ozono,1Hidehumi Kumada,5 Kaoru Inoue,6 Tomomi Morikawa,6 Miwa Takahashi,6 Ayano Fujisawa,7Kayo Yamasaki,8 Yusuke Nomura,1 Kazuo Isama,2 Ung-il Chung,7 Kumiko Ogawa,6 Shingo Niimi,1Midori Yoshida6
1Division of Medical Devices, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo
158–8501, Japan
2

Division of Environmental Chemistry, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku,
Tokyo, 158-8501, Japan3

Department of Pharmacology, National Center for Child Health and Development, 2-10-1 Okura,
Setagaya-ku, Tokyo 157-8535, Japan
4
Corporate Research and Development Division, Kawasumi Laboratories, Inc., Shinagawa Intercity Tower B,
9th Floor 2-15-2, Konan, Minato-ku, Tokyo 108-6109, Japan
5
Department of Dental Education, Kanagawa Dental University, 82 Inaoka-cho, Yokosuka, Kanagawa
238-8580, Japan
6
Division of Pathology, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo
158-8501, Japan
7
Department of Bioengineering, The University of Tokyo Graduate Schools of Engineering and Medicine, 7-31 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033, Japan
8
Research Department, Public Welfare Institute of Scientific Research Foundation, 3–8-14 Nukuikitamachi,
Koganei, Tokyo 184-0015, Japan

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

disruptors in male rats, wherein alterations in the development of the male reproductive system, especially in spermatogenesis, are observed [3–5]. Although the in vivo
reproductive and developmental toxicity of DEHP in thehuman body are not yet well understood, recent in vitro
toxicological studies using human cells have reported thatmono(2-ethylhexyl) phthalate, an active metabolite of
DEHP [6–9], causes adverse effects, such as the reductionof germ cells by increasing apoptosis without altering
their proliferation [10–12]. Therefore, precautions should
be taken to limit human exposure to DEHP and mono(2ethylhexyl) phthalate, particularly for high-risk patients,
such as male neonates, male fetuses, and peripubertal
male individuals.
Several agencies and official organizations worldwide
have individually evaluated the safety of DEHP released
from PVC products. Recently, regulation of the use of
DEHP has been tightened worldwide, particularly inEurope, not only for toys, childcare products, food apparatus, containers, and packages but also for medical devices. In many countries, including the USA, Canada, andJapan, the use of alternative plasticizers to develop safer
PVC products and a switch to other plastic products has
been recommended for the medical treatment of high-riskpatients. However, the use of PVC blood bags containing
DEHP has been permitted in Japan without any regulation
other than storage at low temperatures because DEHP has
been found to be effective in preserving stored red blood
cells (RBCs) [13].
We recently reported [14] that the presence of two
carboxy-ester groups at the ortho position on a sixmembered ring of carbon atoms may be needed for theplasticizer to exhibit a hemolysis suppression effect on(mannitol-adenine-phosphate)/(redcellconcentrates)(MAP/RCC), and the degree of prevention closely relates
to the amount of plasticizer eluted from heat-pressed
PVC sheet. Based on these results, we concluded that
dioctyl 4-cyclohexene-1,2-dicarboxylate (DOTH) and diisononyl-cyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCHV, BASF
SE, Germany) are possible candidates to replace DEHP in
RBC storage bags because of their ability to inhibit
hemolysis. The amount of DOTH eluted from the PVC
sheet is relatively higher than that of DEHP [14], but the
total exposure of plasticizer to the patient during medical
treatments should be reduced as much as possible. Thereis a possibility that the amount of plasticizers eluted fromheat-pressed PVC sheets may be different from that of Tdie molded PVC sheets used to manufacture commercial
PVC products, because PVC molecules take on a different
orientation and density in the sheet types. In the present
study, to develop a novel and safer blood container, we
optimized the minimum mixing ratio of DOTH to T-die
molded PVC sheet and the precise dose of DINCHV thatmaintains low leachability [14–16] compared with DEHP.
The plasticizer for the blood container must be safe forhumans. Recently, Hirata-Koizumi et al. reviewed the
toxicity of alternative plasticizers and showed that
DINCHV had minimal toxicity [17]. On the other hand,
R

This study aimed to optimize the ratio of dioctyl 4cyclohexene-1,2-dicarboxylate (DOTH) and di-isononylcyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCHV) for use asplasticizers in poly(vinyl chloride) (PVC) sheets. We
also evaluated the biological safety of DOTH for its
potential to be part of a safe PVC-based blood container. The suppression of hemolysis in (mannitol-adenine-phosphate)/(red cell concentrates) with DOTH/(DINCHV-PVC) sheets and the elution of plasticizers
from the sheets increased with higher DOTH compositions. The properties of the PVC sheet containing
DOTH and DINCHV in the ratio of 25:33 parts against
PVC 100 parts as a weight were almost identical to the
PVC sheet made of di(2-ethylhexyl) phthalate. From aRsubchronic toxicity test, DOTH did not show any adverse
effects on all organs, including the testes, epididymis, liver,and kidneys. The no-observed-adverse-effect level was
300 mg/(kg body weight)/day in a rat. These results suggestthat DOTH/DINCHV (25:33) is a promising candidate for the
replacement of di(2-ethylhexyl) phthalate in blood containers.
C 2015 Society
J. VINYL ADDIT. TECHNOL., 00:000–000, 2015. V
of Plastics Engineers
R

R

R

Correspondence to: Yuji Haishima; e-mail: haishima@nihs.go.jp
This study was supported by the Health and Labor Sciences Research
Grants (H25-CHIKYUKIBO-SHITEI-008 and H26-SOUYAKU-IPPAN008) from the Japanese Ministry of Health, Labor, and Welfare.
DOI 10.1002/vnl.21472
Published online in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com).
C 2015 Society of Plastics Engineers
V

INTRODUCTION
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), a typical plasticizer for increasing the flexibility of poly(vinyl chloride)(PVC), is easily eluted from PVC products into food,
pharmaceuticals, and any body fluids that come into contact with the plastic, thereby resulting in the transfer of
DEHP directly and/or indirectly into the human body [1,2]. Some phthalates, including DEHP, are considered
toxic because they exhibit effects in young rodents thatare similar to the antiandrogenic effects of endocrine

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

R

R

2

Stage:

Page: 2

DOTH’s overall toxicity is not well known. Hence, we
also evaluated the biological safety of DOTH using a subchronic toxicity test in a rat to confirm the Japanese
reports [18–20] on several toxicity tests conducted by
BOZO Research Center Co., Ltd. (Shizuoka, Japan) commissioned by the Japanese Ministry of Health, Labor, andWelfare.
MATERIALS AND METHODS
Materials
DOTH, trioctyl trimellitate (TOTM), and epoxidized
soybean oil were purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japan). DINCHV was provided by
BASF (Ludwigshafen, Germany). DEHP, DEHP-d4,
diethyl ether of pesticide residue, PCB analysis grade,and phthalate-analytical-grade hexane were purchasedfrom Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan). Sodium chloride from pesticide residue, PCB analysis grade,
phthalate-analytical-grade anhydrous sodium sulfate(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan),and ultrapure water obtained by using Milli-Q Synthesis
A10 (Millipore, Tokyo, Japan) were used to prepare thesample for (gas chromatography)/(tandem mass spectroscopy) ([GC-MS]/MS) analysis. Other chemicals were purchased from Wako Pure Chemical Industries. All thetools, which were made of glass, metal, or TeflonV, were
heated at 250! C for more than 16 h prior to use.
R

AQ2

R

Preparation of RCCs
Human blood (200 mL) was obtained from a volunteer
at our own laboratory. The procedure was performed inaccordance with the ethical guidelines of the National
Institute of Health Sciences (approval number 188). The
blood was immediately mixed at 4! C with citratephosphate-dextrose solution (28 mL) consisting of sodium
citrate hydrate (26.3 g/L), citric acid hydrate (3.27 g/L),
glucose (23.2 g/L), and sodium dihydrogen phosphate(2.51 g/L). The blood was divided into two equal volumes followed by centrifugation at 3,000g for 10 min at
4! C and the removal of the upper layer. MAP solution(23 mL), consisting of D-mannitol (14.57 g/L), adenine(0.14 g/L), sodium dihydrogen phosphate (0.94 g/L),
sodium citrate hydrate (1.5 g/L), citric acid hydrate(0.2 g/L), glucose (7.21 g/L), and sodium chloride(4.97 g/L), or saline-adenine-glucose-mannitol (SAGM)
solution (23 mL), consisting of sodium chloride (8.77 g/L), adenine (0.17 g/L), glucose (9.0 g/L), and D-mannitol(5.25 g/L), was added to the remaining RCC layer to prepare MAP or SAGM/RCC (Htc. 59%). The solution wasstored at 4! C until use.
Preparation of PVC Sheets
T-die molded PVC sheets (thickness 5 0.4 mm) containing DEHP 55 parts and epoxidized soybean oil 8 parts

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

DOI 10.1002/vnl

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DOI 10.1002/vnl

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

3

tr50.563.54
ndndtr
11460.98
38.563.54
nd
nd
nd
tr
10161.03
37.067.07
nd

The elution test of the plasticizers from the T-die
molded PVC sheets was performed to determine the mixing ratio of DOTH and DINCHV from the point of the
exposure amount to patient. All plasticizers, except for
TOTM, with low leachability and no effect on hemolysis
suppression [14], were quantified by (GC-MS)/MS analysis by using DEHP-d4 as the internal standard.
As shown in Table 1, the amounts of DEHP, DINCHV,
and DOTH released from the T-die molded PVC sheets
increased in a time-dependent manner and reached50.5 6 3.54, 25.6 6 1.32, and 114 6 0.98 mg/mL, respectively, after a 49-day incubation in MAP/RCC. These elution patterns were similar to those of the heat-pressed
PVC sheets previously reported [14]. Similarly, the total
amount of DOTH and DINCHV eluted from DOTH/(DINCHV-PVC) sheets also increased with higher DOTH
content. The total elution amounts of the plasticizers from
DOTH/DINCHV (10:49.5) and DOTH/DINCHV (40:16.5)
PVC sheets were lower and higher, respectively, than theamount of DEHP released from DEHP-PVC sheet at all
sampling points. On the other hand, the total amount ofplasticizers released from the DOTH/DINCHV (25:33)
PVC sheet was similar to that of DEHP-PVC sheet.
As shown in Table 2, the DOTH/DINCHV elution ratio
decreased in a time-dependent manner during the test
period, and the trend was similar to the elution test performed with the heat-pressed PVC sheet [14]. Hence, thedata indicate that the plasticizers were leaching out at different rates. Specifically, the elution of DOTH into MAP/
RCC slowed over time, whereas DINCHV steadily
released during the incubation period.
Taken together, the data suggest that the DOTH/DINCHV (40:16.5) PVC sheet is not a useful material fora blood container because patients will be exposed to alarger amount of plasticizer compared with the traditional
RBC storage bag consisting of a DEHP-PVC sheet.
Rtr
95.065.69
36.562.12
nd

nd
nd

R

T1

nd
nd

R

tr
82.062.89
32.067.07
nd

R

R

R

nd
nd

R

tr
66.167.34
27.061.41
nd

R

T2

R

nd
nd
tr
49.963.58
16.061.41
nd
nd
nd
26.768.18
nd

tr

tr

14.060.37
37.161.92

68.562.51 6.61 60.20

tr

tr
tr

64.563.34 5.8060.08

tr

tr

58.364.87 4.7160.38

tr

tr47.260.01 2.9060.06

57.961.64 4.5360.14

tr
28.060.94 6.6560.48

tr
tr
21.063.18 1.0360.14

33.961.45 1.7660.05

tr8.7960.42 1.5360.09

18.860.93 3.5960.14

tr

30.360.56 8.6060.24

35.063.47 10.360.76

32.462.87 11.360.67

tr
tr
25.661.32
20.761.44
nd
12.860.70
tr
trnd20.460.82
10.962.76 15.462.81
tr
tr
nd
19.061.53
10.861.76 14.061.50
tr
tr
nd
16.860.64
12.161.08 13.660.01
tr
tr
nd
12.460.42
8.3860.32 8.0760.10
tr
tr
nd
6.5860.21
6.9960.35 5.4860.24
tr
tr
nd
3.7761.06
4.5160.21 3.2860.01

nd

trb

nd

nd

tr

nd

nd

tr

nd

nd

tr

nd

nd

tr

nd

nd

tr

tr
nd
nd

DEHP
DINCH
DOTH

49days42days34daysDOTH DINCH DEHP

29 days

DOTH DINCH DEHP

DOTH DINCH

DEHP
4

AQ5

RESULTS AND DISCUSSION

nd, not detected, btr, trace amount less than LOQ

A repeated-dose 90-day oral toxicity study similar tothe principles of OECD 408 [3] was performed on male

Serum levels of 17b-estradiol (E2), testosterone (TS),follicle-stimulating hormone (FSH), and thyroidstimulating hormone (TSH) were measured with ELISA
kits provided by Enzo Life Sciences Inc. (Farmingdale,NY) for E2 and Endocrine Technologies (Newark, CA)
for others. The significant difference was calculated by
two-way ANOVA.

a

Animal Treatment

nda

The quantity of plasticizer in each PVC sheet soaked withthe blood samples was measured according to the methods
previously reported [14, 21–25]. Briefly, an aliquot (50 mL)of the MAP/RCC sample for the hemolysis test was collected into a screw-capped glass tube every week, andsodium chloride (1 mL, 1 w/v%), DEHP-d4 (0.1 mg), andhexane (1 mL) were added. After shaking vigorously for 15
min and centrifuging at 3,000 rpm for 10 min at room temperature, the organic phase was collected and dehydrated
with anhydrous sodium sulfate. Subsequently, the sample
was analyzed by (GC-MS)/MS, which included an analysis
of precision based on the same conditions described in a previous report [14]. This test was repeated in triplicate, eachwith a hemolysis test performed simultaneously. The significant difference was calculated by two-way ANOVA.

Page: 4

Stage:

Plasticizer Elution Test

Control(no sheet)
DINCH (60.5)
DOTH/DINCH(10:49.5)
DOTH/DINCH(25:33)
DOTH/DINCH(40:16.5)
DOTH (55)
DEHP(55)

Elution Test for the Plasticizer

21 dayswhere AT is the test sample absorbance; AN is the average
negative control mean absorbance; and AP is the average
positive control mean absorbance.

DOTH DINCH DEHP

% Hemolysis5ðAT 2AN Þ=ðAP 2AN Þ3100

13 days

AQ4

The hemolysis test was performed according to themethod previously reported [14]. Each PVC sheet (3.2 cm
3 1 cm, thickness 5 0.4 mm) containing different kinds ofplasticizers was placed into a screw-capped glass bottle, and5 mL of freshly prepared MAP or SAGM/RCC was added
to the bottle. During incubation at 4! C for 49 days, an aliquot (50 mL) of the blood sample was collected into Eppendorf tubes every week. Phosphate-buffered saline (PBS;
1 mL) was added to each sample and gently mixed, followed by centrifugation at 500g for 2 min at 4! C; then theabsorbance of the supernatant (100 mL) was measured at
415 nm with a SH-9000 Lab microplate reader (Corona
Electric Co. Ltd., Ibaraki, Japan). MAP or SAGM/RCC wasalso tested under the same conditions as the negative control, whereas the positive control was prepared by adding
distilled water instead of PBS. This test was repeated in triplicate, and the significant difference was calculated by twoway analysis of variance (ANOVA). The hemolytic ratio
was calculated in accordance with the following formula:

DOTH DINCH DEHP

Hemolysis Test

rats. The procedure was performed in accordance with theanimal experiment guidelines of the National Institute of
Health Sciences (approval number 434).
Sprague-Dawley rats were purchased at age of 4 weeks(body weight; 90–110 g) from CLEA Japan, Inc. (Tokyo,
Japan). The animals were maintained under controlled
light and temperature conditions. The rats also were given
free access to food and water. Their food was a customized vehicle for DOTH intake; DOTH was mixed withcorn oil to obtain final concentrations of 0 (control), 5,
50, 500, and 5,000 mg/g corresponding to the target doselevels of 0 and approximately 0.3, 3, 30, and 300 mg/(kgbody weight)/day, and the mixture was kneaded at a concentration of 4% and shaped into CE-2 chow (CLEA
Japan Inc.). The highest dietary concentration was
decided according to the protocol of the repeated-dose
toxicity and reproduction/development toxicity tests of
DOTH conducted by BOZO Research Center [18]. Aftera weeklong habituation period, 40 rats were divided into
five groups of eight animals with two animals housed ineach cage. For the next 13 weeks, the rats were fed thebasal diet containing various concentrations of DOTH.
Food consumption and body weight were determined
weekly.
At the termination of the study, the animals were anesthetized with an inhalation of isoflurane, exsanguinated,and euthanized by decapitation. A portion of the blood(10 mL each) was immediately collected into a BD VacutainerTM Blood Collection Tube (Japan Becton and Dickinson Co., Tokyo, Japan), and a serum sample wasprepared according the manufacturer’s protocol.
During necropsy, the epididymis was weighed, cut into
small pieces in PBS (4.5 mL), and fixed by adding 37%
neutral-buffered formalin (0.5 mL). The nuclei of the
sperm were stained with Hoechst 33258 under standard
conditions, and counting was performed by using a BIOREVO BZ-9000 fluorescence microscope (KEYENCE
Co., Osaka, Japan) and software. The significant difference was calculated by two-way ANOVA.
After complete necropsy, the testes and eyes were
fixed in Bouin or Davidson solution. The brain, thymus,
heart, spleen, liver, adrenal glands, kidneys, epididymis,
thyroid glands, trachea, gullet, thoracic aorta, mediastinal
lymph node, lungs, pancreas, stomach, small intestine,mesenteric lymph node, femoral muscle, sciatic nerve,
sternum, thoracic vertebrae, seminal vesicle, colon, rectum, skull with pituitary, trigeminal nerve, and tongue,
salivary gland with cervical lymph node, skin with mammary gland, prostate and congealing gland with urinary
bladder, and bulbourethral gland were fixed in 10%
neutral-buffered formalin. The testes, brain, thymus, heart,spleen, liver, adrenal glands, kidneys, epididymis, andprostate were weighed before the fixation. The significant
difference was calculated by using a Dunnett’s test orDunnett-type rank-sum test. The fixed tissues were processed routinely and embedded in paraffin. The paraffinblocks were sectioned and stained with hematoxylin andeosin for microscopic examination.

7 daysR

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

PVC sheet(parts)R

Page: 3

TABLE 1. Amount of plasticizer eluted from T-die molded PVC sheet incubated in MAP/RCC at 37! C for 49 days (mg/mL in blood).

against PVC 100 parts as a weight ratio and other additives
were mixed according to the standard recipe of Kawasumi
Laboratories, Inc. (Tokyo, Japan). T-die molded PVC
sheets were also prepared with TOTM 85 parts, DOTH 55
parts, DINCHV 60.5 parts, or DOTH/DINCHV mixtures(10:49.5, 25:33, and 40:16.5 parts) instead of DEHP. Each
sheet was cut into small pieces (3.2 cm 3 1 cm).

Stage:DOTH DINCH DEHP

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

R

Hemolysis Suppression Effect of Each PVC Sheet
The hemolysis suppression effect of the PVC sheetscontaining alternative plasticizers was estimated and compared with those of DEHP-PVC and TOTM-PVC sheets
used as the positive and negative control, respectively.
As shown in Fig. 1, the hemolytic ratio of MAP/RCC
in the absence of the PVC sheets increased in a timedependent manner, reaching 4.9% after 49 days of

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

DOI 10.1002/vnl

F1

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

Stage:

Page: 5

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

TABLE 2. Mean ratio of DOTH and DINCHV eluted from the PVC sheet into MAP/RCC (DOTH/DINCHV).
R

R

7 days

DOTH/DINCHV (10:49.5)
DOTH/DINCHV (25:33)
DOTH/DINCHV (40:16.5)
R

1.38
5.73
20.4

R
R

13 days

21 days

1.27
5.23
19.2

29 days

1.04
4.22
16.3

0.89
3.52
12.8

Page: 6TABLE 4. Relative organ weights of SD rats treated with DOTH for 13 weeks.

Incubation time
PVC sheet (parts)

Stage:

Group treated with DOTH (mg/[kg body weight]/day)
34 days

42 days

0.77
3.39
12.4

0.71
2.87
11.1

Control

0.3

3

30

300

8
0.36 6 0.03a
0.06 6 0.01
0.29 6 0.03
0.15 6 0.02
2.83 6 0.24
10.5 6 1.5
0.63 6 0.04
0.60 6 0.06
0.22 6 0.04
0.11 6 0.02

8
0.34 6 0.03
0.06 6 0.01
0.28 6 0.03
0.15 6 0.01
2.71 6 0.15
9.3 6 1.2
0.63 6 0.05
0.60 6 0.07
0.21 6 0.03
0.10 6 0.03

8
0.36 6 0.03
0.06 6 0.02
0.28 6 0.02
0.14 6 0.02
2.84 6 0.27
9.6 6 0.6
0.05
0.63 6 0.04
0.20 6 0.02b
0.10 6 0.02

8
0.35 6 0.03
0.06 6 0.01
0.29 6 0.02
0.14 6 0.02
2.81 6 0.19
9.0 6 1.7
0.65 6 0.04
0.63 6 0.08
0.21 6 0.02
0.10 6 0.03

8
0.37 6 0.03
0.06 6 0.01
0.30 6 0.03
6 0.12
3.04 6 0.30
11.7 6 1.3
0.67 6 0.06
0.65 6 0.05
0.22 6 0.02
0.10 6 0.02

49 daysNo. of animals examined
Brain (g/100 g BW)
Thymus (g/100 g BW)
Heart (g/100 g BW)
Spleen (g/100 g BW)
Liver (g/100 g BW)
Adrenals (mg/100 g BW)
Kidneys (g/100 g BW)
Testes (g/100 g BW)
Epididymides (g/100 g BW)
Prostate, ventral (g/100 g BW)

0.62
2.65
10.4

a

Mean 6 SD.
One animal was excluded due to lack of the head of unilateral epididymis at the sampling.

b

These results suggest that the DOTH/DINCHV (25:33)
PVC sheet is the most suitable material for a novel blood
container based on the reduction of hemolysis and an eluR

FIG. 1. Hemolytic behavior of MAP/RCC in the presence of T-die
molded PVC sheets containing different plasticizers. Based on the hemolytic ratio, three distinct groups were observed: Group 1: the control and
TOTM-PVC; Group 2: DINCHV- and DOTH/DINCHV (10/49.5) PVC
sheets; and Group 3: DEHP-, DOTH-, and DOTH/DINCHV (40/16.5 and25/33) PVC sheets. Significant difference (*p < 0.01) was detected
between Group 1 and Group 2. Significant difference (**p < 0.05) was
detected between Group 2 and Group 3, but not within the group. [Color
figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.]

FIG. 2. Hemolytic behavior of SAGM/RCC in the presence of T-die
molded PVC sheets containing different plasticizers. Based on the hemolytic ratio, three distinct groups were observed: Group 1: the control and
TOTM-PVC; Group 2: DINCHV-PVC sheet; and Group 3: DEHP- andDOTH/DINCHV (25/33) PVC sheets. Significant difference (*p < 0.01)
was detected between Group 1 and Group 2. Significant difference(**p < 0.05) was detected between Group 2 and Group 3, but withineach group. [Color figure can be viewed in the online issue, which isavailable at wileyonlinelibrary.com.]incubation. The hemolytic behavior of MAP/RCC in thepresence of the TOTM-PVC sheet was almost identicalat 4.6% after the incubation. DOTH/DINCHV (25:33)
and DOTH/DINCHV (40:16.5) PVC sheets exhibited thehemolysis suppression effect, in which the hemolytic
ratios were 1.4% and 1.3%, respectively. These ratios
were almost identical to those of DOTH-PVC and
DEHP-PVC sheets. The suppression effect was also

detected in DINCHV-PVC and DOTH/DINCHV(10:49.5) PVC sheets in comparison with those of control (no sheet) and TOTM-PVC sheet (p < 0.01), but thedegree of suppression from both sheets was slightly
weaker than that of the DOTH/DINCHV (25:33), DOTH/DINCHV (40:16.5), DOTH-PVC, and DEHP-PVC sheets(p < 0.05).

R

R

R

R

R

tion of plasticizer comparable to the DEHP-PVC sheet.
Although the DOTH-PVC and DOTH/DINCHV (40:16.5)
PVC sheets exhibited adequate prevention of hemolysis,
R

R

R

R

R

R

R

TABLE 3. Final body and absolute organ weights of SD rats treated with DOTH for 13 weeks.
Group treated with DOTH (mg/[kg body weight]/day)

No. of animals examined
BW (g)
Brain (g)Thymus (g)Heart (g)Spleen (g)Liver (g)Adrenals (g)Kidneys (g)Testes (g)Epididymides (g)Prostate, ventral (g)Control

0.3

3

30

300

8
622.6 6 63.0a
2.22 6 0.11
0.38 6 0.06
1.79 6 0.23
0.92 6 0.16
17.58 6 2.29
0.065 6 0.009
3.93 6 0.43
3.71 6 0.40
1.37 6 0.20
0.69 6 0.12

8629.6 6 57.1
2.15 6 0.07
0.38 6 0.07
1.73 6 0.11
0.94 6 0.09
17.10 6 2.28
0.058 6 0.008
3.92 6 0.37
3.74 6 0.26
1.29 6 0.13
0.62 6 0.17

8617.3 6 42.9
2.18 6 0.08
0.39 6 0.08
1.74 6 0.18
0.89 6 0.10
17.53 6 2.08
0.059 6 0.004
4.13 6 0.40
3.88 6 0.24
1.26 6 0.10b
0.60 6 0.14

8630.4 6 48.9
2.17 6 0.05
0.34 6 0.09
1.80 6 0.14
0.88 6 0.13
17.72 6 2.08
0.056 6 0.008
4.09 6 0.25
3.92 6 0.34
1.30 6 0.08
0.62 6 0.16

8598.0 6 42.5
2.18 6 0.09
0.36 6 0.06
1.76 6 0.17
0.99 6 0.11
18.17 6 2.05
0.070 6 0.008
4.00 6 0.23
3.90 6 0.26
1.30 6 0.12
0.60 6 0.10aMean 6 SD.
b
One animal was excluded due to lack of the head of unilateral epididymis at the sampling.
Group treated with DOTH (mg/[kg body weight]/day)

DOI 10.1002/vnl

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ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

5FIG. 3. Histopathological observation of the testes in the subchronic toxicity test in rats administered with DOTH. (a) Control (base diet) and (b)DOTH (300 mg/[kg body weight]/day). I–XVI, the stages of sperm cell formation cycle; G, spermatogonia; ES, early spermatocytes; LS, late spermatocytes (pachytene stage); RT, round spermatids; ET, elongate spermatids; S, sertoli cells; L, Leydig cells; red circle, late spermatocyte apoptosis;
green circle, degenerated and atrophied testicular vessel in ordinary state. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available atwileyonlinelibrary.com.]

6

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

DOI 10.1002/vnl

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

Stage:

Page: 7

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

Stage:

Page: 8

FIG. 4. Histopathological observation of the liver in the subchronic toxicity test in rats administered DOTH. (a) Control (base diet) and (b) DOTH
(300 mg/[kg body weight]/day). C, central vein; P, Glisson’s capsule; *, slight infiltration of inflammatory cells located around Glisson’s capsule.
[Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.]the total amount of the plasticizers released from the
sheets was higher than that of the DEHP-PVC sheet. Conversely, although DINCHV-PVC and DOTH/DINCHV(10:49.5) sheets had less plasticizer leached, the hemolytic ratios were higher than the DEHP-PVC sheet. The
data for the DINCHV-PVC sheet are in agreement with astudy by Dumont et al. [26] in which DINCHV-PVC bags
exhibited protective effects against RBC hemolysis thatwere similar to normal DEHP-PVC containers under periodic mixing conditions, but not adequate under static
conditions.
The type of anticoagulant and the viability of RBCs
may be closely correlated with hemolysis suppression of
the plasticizer [27]. The RCC product used in Japan contains the MAP solution as an anticoagulant, whereas the
SAGM solution is widely used in other countries. Hence,hemolysis suppression with SAGM/RCC was also performed, and the results are shown in Fig. 2. The hemolytic behavior using SAGM/RCC was almost identical to
the result yielded from MAP/RCC described above. The
DINCHV-PVC sheet exhibited significantly greater hemolysis suppression than that shown by the control (nosheet) and TOTM-PVC sheet (p < 0.01). The hemolysis
suppression effect of DOTH/DINCHV (25:33) PVC sheet
was higher than that of the DINCHV-PVC sheet(p < 0.05) and equal to that of DEHP-PVC sheet. Thus,
the potential of the DOTH/DINCHV (25:33) PVC sheet aspart of a suitable blood container was reaffirmed with
SAGM/RCC.
R

R

R

R

F2

R

R

R

logical examination, no abnormalities were observed in
the testes of rats in the control and treated groups, and allrats were normal (Fig. 3). Diffuse fatty change of hepatocytes and inflammatory cell infiltration were noted in several rats of both the control and the treated groups in theliver (Fig. 4). Although these changes are not common inrats of this age, they were not due to treatment-related
toxicity. The changes may be related to the rats’ diet. The
prepared food included oil in the basal diet, which
resulted in high calorie consumption of all groups including the control group. Other histopathological changes,
such as focal inflammation in the prostate and focal myocarditis, were scattered in all groups. All of these observations are known to be common changes in rats, andtheir incidences or intensities were comparable among thecontrol and the treated groups, indicating they were nottreatment-related. Other organs including the epididymis
and kidneys were not affected by the treatment withDOTH even at the highest dose. From the hormone
assays, no significant differences in the number of sperm
cells in the epididymis and the levels of TS, E2, FSH,
and TSH in serum were observed between each group
including control, as shown in Figs. 5 and 6. Based on
the results of the study, the no-observed-adverse-effectlevel (NOAEL) of DOTH was found to be 300 mg/(kgbody weight)/day.

R

Subchronic Toxicity of DOTH in Rats

T3
T4

The growth rate and feed consumption in the DOTH
groups were comparable to those in the control groupthroughout the study. The mean dietary intake of DOTH
administered to rats at the highest dose level was calculated to be 297 mg/(kg body weight)/day based on foodconsumption. The treatment-related macroscopic change
was not detected in any of the organs except for a fatty
liver observed in the control and DOTH groups. There
was no significant difference in the absolute and/or relative weights shown in Tables 3 and 4. In the histopathoDOI 10.1002/vnl

FIG. 5. Number of sperm cells in the epididymis of rats administereddifferent amounts of DOTH for 13 weeks.

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

7

F3

F4

F5 F6

FIG. 6. The levels of hormones in the blood of rats administered different amounts of DOTH for 13 weeks. (a) TSH, (b) FSH, (c) testosterone, and(d) 17b-estradiol.

Poon et al. [28] reported that DEHP caused hepatomegaly to Sprague-Dawley rats by the administration of thediet containing the plasticizer at the concentration of
5,000 mg/g for 13 weeks. They reported there was mild tomoderate seminiferous tubule atrophy and Sertoli cellvacuolation in male rats at 375.2 6 98.5 mg/(bodyweight)/day, rats of both sexes showed hepatic peroxisome proliferation at the same dose. They also found that
DEHP caused mild histological changes in the thyroid,
consisting of reduced follicle size and colloid density, andthe liver, consisting of endothelial nuclear prominence,nuclear hyperchromicity, and anisokaryosis at 5,000 mg/g.
In addition to the results of other experiments, Poon et al.
judged the NOAEL of DEHP in the rats to be 3.7 mg/(kgbody weight)/day for testicular toxicity. In contrast, these
histological changes were not observed in our study ofrats treated with DOTH even at the highest dose
described above. Our findings indicate that DOTH has no
toxicity in the subchronic study in male rats, thereby suggesting that DOTH is a less toxic plasticizer than DEHP
with the NOAEL at 300 mg/(kg body weight)/day.
The weak toxicity of DOTH was also found in anotherJapanese report [18], in which the NOAEL in the malerats was determined to be 100 mg/(kg body weight)/day.
In this case, centrilobular hepatomegaly and a significant
increase of liver and kidney weights were observed after
treatment with DOTH at 300 mg/(kg body weight)/day inthe repeated oral administration for 56 days. It was also
confirmed that these changes were reversible in that therecovery was observed by 2 weeks after stopping theadministration [18], no effect of DOTH was detected in
testing for reproductive/developmental toxicity [18], bacterial reverse mutation [19], and chromosomal aberration[20].
8

CONCLUSIONS
Our data suggest that the DOTH/DINCHV (25:33)
PVC sheet may be the most suitable material to replace
the DEHP-PVC sheets used in traditional RBC storage
bags because of its ability to suppress hemolysis and eluteless plasticizer. A prototype of a blood container made ofthis sheet is now in progress: a clinical trial with thecooperation of a suitable number of volunteers will be
performed in the near future. We will evaluate the chemical, physicochemical, biological, and dynamic properties
required for a medical device product.
R

ACKNOWLEDGMENTS
We greatly appreciate the skillful assistance of Drs. Ryohei Ichimura and Jun Maeda, Division of Pathology,
National Institute of Health Sciences.
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JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

DOI 10.1002/vnl

AQ6

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

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