分子シャペロンを利用したＡＴＰ応答性ナノデバイスの創製
Fabrication of ATP-Responsive Nanodevice Utilizing Molecular Chaperons
研究代表者

東京大学大学院工学系研究科

講師

金原数

Lecturer, School of Engineering, The University of Tokyo
和文アブストラクト
分子シャペロンと呼ばれる ATP 応答性タンパク質が、発光性を有する CdS ナノクラスターを空孔に取り込み、安定化なシャペロニン／ナノクラスター複合体を形成することを見出した。この複合体中では、ナノクラスターはタンパク質の包接によって外部環境から保護されており、熱的な刺激、消光剤に対する耐性が非常に強いことが分かった。さらに内包されたナノクラスターが ATP の添加により速やかに放出されることが分かった。このように、分子シャペロンを利用することにより、安定でありながら ATP という外部刺激に速やかに応答する、刺激応答性のナノクラスター複合体の創製に成功した。

Abstract
Molecular chaperons, such as GroEL and T.th cpn were found to form stable complexes
with cadmium sulfide nanoparticles.

In the resulting chaperonin/nanoparticle complexes,

nanoparticles were protected from the external environment by encapsulation with thickprotein walls.

On the other hand, by the action of ATP, the included nanoparticles were

thoroughly thrown out and coagulate to lose their unique fluorescence.

When thechaperonin from thermophilic bacterium (T.th cpn) was used as a host protein assembly, thestability of the chaperonin/nanoparticle complex was considerably enhanced from that of thecorresponding GroEL complex.
１．研究目的すことから、生体物質との複合化により標識

生体物質と無機材料とのナノスケールの材料としての応用がすでに始まっている。

複合体は、医療をはじめとする幅広い分野

本研究では、内部に筒状の空孔を有するにおいて大いに注目を集めている。この中巨大タンパク質であるシャペロニンを用いた、で半導体ナノ粒子は特異な発光挙動を示

これまでに報告例のない刺激応答性ハイブ

リッド材料の構築を目標として検討を行った。 ル・CD スペクトルによりハイブリッド化を確
シャペロニンは、天然ではタンパク質のリフ認した。ハイブリッド化された CdS ナノクラス

ォールディングを補助している。即ち、自己

ターは、Tris-HCl 溶液中でナノクラスターのの空孔内に変性タンパク質を取り込み、そ存在を示唆する短波長側へシフトした

こでリフォールディングを促進させ、ATP にUV-Visスペクトルを示した。同様に、蛍光ス応答して自己の構造を変化させ、内包タンペクトルではナノクラスター特有の発光バンパク質を吐き出すことが知られている。本研

ドを示すことが分かった（図２）。一方で、ハ究ではタンパク質の空孔内に半導体ナノク

イブリッド化されていないCdSナノクラスターラスター（CdS）を導入した複合体を調製し、ではこのような特徴的スペクトルは観測されシャペロニンの ATP 応答性を利用して、ナず、セル中でナノクラスターが即座に凝集し、ノクラスターに刺激応答性を付与した新し沈殿が生じた。まい複合体を創製することを目的としている（図１）。

図１ ATP 応答性シャペロニン／ナノクラス
ター複合体
２．研究経過２．１シャペロニン／ナノクラスター複合体の調製
文献法 1 に従い、DMF 溶液中で調製した
CdS ナノクラスター（直径 2.2 nm）及び、

図２ シャペロニン／CdS ナノクラスター複Tris-HCl 水溶液中で精製した大腸菌由来合体の(a)蛍光、(b)励起スペクトル並びに高度好熱菌由来シャペロニン（GroEL, T.th cpn）を適当な条件下にて混合、精製した後に蛍光スペクトル（λ Ex =370 nm, λEm = 400-720nm）・UVスペクトいても評価した。即ち、複合体を 4℃から90℃まで加熱冷却を繰り返し、それぞれの温度での蛍光強度を測定し、複合体の熱安定性を検討した。その結果、大腸菌由来の GroEL との複合体では 40℃以上になると複合体が損壊し始めるのに対し、高度好熱菌由来 T.th cpnとの複合体では 80℃まで安定に存在し、蛍光性を維持することが分かった（図４）。両者の耐熱温度の違いは、
図３ シャペロニン／ナノクラスター複合体

シャぺロニンの TEM 像
た、シャペロニン／CdS ナノクラスター複合体を TEM により観察したところ、シャペロニン中心部に、ナノクラスターと思われる暗点が観測され、複合体中ではナノクラスターがシャペロニンの空孔に取り込まれていることが強く示唆された（図３）。
２．２複合体の安定性および ATP 応答性調製したシャペロニン/CdS ナノクラスター複合体について、その安定性ならびに ATP応答性について以下のような物性評価を行った。まず、タンパク質空孔内への CdS ナノクラスターの内包による電子移動阻害の効

図４ T.th cpn／CdS ナノクラスター複合体

果を評価するため、メチルビオロゲンによるの蛍光強度の温度変化。上のグラフは温度、蛍光消光実験を行った。この結果、複合体下のグラフは蛍光強度を示している。の CdS ナノクラスター由来の蛍光は、CdSの由来する菌の生存可能温度に相当してナノクラスター単体の蛍光に比べて、20 倍いる。

消光されにくいことが分かった。
続いて、加熱による蛍光強度の変化につ以上のように、今回調製したシャペロニン／半導体ナノクラスター複合体は様々な環境において安定であることが確認された。

ラスターを取り込ませることに成功し、安定一方で、ATP、Mg2+イオン、K+イオンを複合なシャペロニン／CdS ナノクラスター複合体体の溶液に添加すると、蛍光性の消失が確を得ることに成功した。さらに、この複合体認された。即ち、ATP に応答してシャペロニが ATP に応答し、内包したナノクラスターをンが構造変化することにより内包ナノクラス放出することを見出した。この複合体はターを放出し、ナノクラスターが Tris-HCl 水ATP の加水分解によって起こるタンパク質溶液中で凝集したことが示唆された (図５)。 の運動（構造変化）を利用した機能性材料
このような応答は、ATP 単独、あるいは、の最初の例である。

ADP+Mg2+ などを加えた場合には全く起こらなかった。このことから、生体系と同様の機構により、内包されたナノクラ４．今後の課題と発展
シャペロニンを初めとする ATP 加水分解性タンパク質の多くは、機械的な運動を通して生体機能を実現していることが知られている。このようなタンパク質の生物学的機能を利用することにより、これまでにない概念の機能性材料の開発が可能になると考えられる。
５．発表論文リスト
1. Chaperonins mediated stabilization andATP-triggered release of semiconductor
nanoparticles, D. Ishii, K. Kinbara, Y. Ishida,
N. Ishii, M. Okochi, M. Yohda, and T. Aida,
Nature in press.

図５ シャペロニン／ナノクラスター複合体の ATP 応答性スターが放出されたものと考えられる。
３．研究成果以上のように、分子シャペロンと呼ばれるシャペロニンタンパク質の空孔に CdS ナノク[1] K. Murakoshi et. al., J. Chem. Soc. Faraday
Trans. 94, 579 (1998).