神経活動の光学的計測法による脳機能発生・機能破綻に関する研究
Optical Analysis of Functional Development / Failure of the Brain
代表研究者： 東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科 細胞生理学分野 講師 佐藤
Katsushige Sato, MD, PhD
Senior Assistant Professor, Department of Physiology
Tokyo Medical and Dental University Graduate School and Faculty of Medicine
共同研究者： 東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科 細胞生理学分野 講師 佐藤
Yoko Momose-Sato, MD, PhD
Senior Assistant Professor, Department of Physiology
Tokyo Medical and Dental University Graduate School and Faculty of Medicine
オスロ大学 医学部 生理学講座 ポストドクトラルフェロー
持田Hiraku Mochida, MD, PhD
Postdoctral Fellow, Department of Physiology
University of Oslo School of Medicine

勝重容子

啓

アブストラクト神経細胞の病変・細胞死の過程は、個体発生の途中に引き起こされる自然発生的細胞死の過程と酷似していることが指摘されている。したがって、個体発生にともなう神経系の機能的形成過程を明らかにすることは、脳の機能発生の解明という側面のみでなく、脳の老化、神経細胞の変性のメカニズムを知る上でも極めて重要である。しかしながら、発生初期のニューロンは小さく脆弱なため、従来の電気生理学的測定法を適用することができず、このような発生学的アプローチは大きく立ち遅れてきた。
本研究では、まず研究の焦点を神経機能発生に定め、膜電位感受性色素によるニューロン電位活動の光学的計測法を発生初期の脳幹に適用し、第 VIII 脳神経関連核の個体発生過程について解析した。
Abstract
It has been suggested that a process of the neuronal cell death in the neuronal diseases resembles
that of the naturally-occurring cell death during embryogenesis.

Therefore, to explore complex

mechanisms of the neuronal cell death, it is a powerful strategy to ontogenetically analyze how neuralfunctions are formed during embryogenesis.

One approach to such analyses is to examine

developmental processes of neural circuit formation using morphological, histochemical and molecularbiological techniques. Another approach is to trace how spatiotemporal patterns of electrical activity aregenerated within the morphologically organized neural circuits. In contrast with the large number ofmorphological investigations, electrophysiological studies in early embryonic nervous systems have beenhampered because of the small size and fragility of the immature embryonic neurons. Optical recording
techniques using fast voltage-sensitive dyes have made it possible to monitor electrical activities in small
cells that are difficult or impossible to access by traditional electrophysiological means, and also facilitate
the simultaneous recording of electrical activity from multiple sites in a living system. In this study, weapplied this optical technique to the embryonic chick brainstem, and analyzed the functional developmentof the N. VIII-related nuclei.

-1-

皮質領域が侵されることが多く、植物状態に１．研究目的
老人性痴呆や、神経細胞の変性をともなうはなり得ても、脳幹領域が障害をうけて個体多くの疾患において、神経細胞の病変・細胞死に至ることはない。これは、脳幹と皮質と死の過程は、個体発生の途中に引き起こされの間で、神経栄養因子への依存性などをはじる自然発生的細胞死 (Naturally occurring

めとする機能的・器質的な特性に何らかの違cell death) の過程と酷似していることが指いがあるためと考えられる。本研究プロジェ

摘されている。細胞死は、標的細胞由来の神クトの最終的な目的は、この仮説を検証する

経栄養因子の欠乏により引き起こされるが、ために、脳幹領域と皮質領域との機能発生過老化にともなう神経細胞の変性脱落や学習能程を比較検討し、両者の間にどのような相違力の低下にも、この神経栄養因子が関与してが見られるのかを明らかにすることであるが、いるとの報告がある。
また、
老人性痴呆の 15％

まず、その一段階として、第 VIII 脳神経関連は神経細胞内因型であり、老化にともなう細核とその回路網の個体発生過程に焦点を定め、胞数減少の一部は、個体発生過程に見られる膜電位感受性色素によるニューロン電位活動アポトーシスと同様の経過を経ることが知らの光学的計測法を、発生初期の脳幹に適用しれている。したがって、個体発生にともなう解析を試みた。

神経系の機能的形成過程を明らかにすること

２．研究経過は、脳の機能発生の解明という側面のみでな孵卵６ ８日の鶏胚を麻酔下に取り出し、く、脳の老化、神経細胞の変性のメカニズム

実体顕微鏡下で第 VIII 脳神経（前庭神経およを知る上でも極めて重要である。しかしながび蝸牛神経）を付けたままの脳幹インタクト

ら、発生初期のニューロンは小さく脆弱なた標本を作製した。標本を膜電位感受性色素め、従来の電気生理学的測定法を適用するこNK2761 0.2mg/ml を含むリンゲル液に約 20 分とができず、このような発生学的アプローチ間浸し染色した。

は大きく立ち遅れてきた。
我々は、これまでに中枢神経系の機能的形成/構築過程を明らかにする目的で、膜電位感受性色素とニューロン電位活動の光学的多チ
ャネル計測法を発生初期胚に適用し、個体発生に伴う神経回路網の機能的システム構築と、それに関わる受容体の機能的発現過程について解析を行ってきた。この光学的計測法は、未分化で脆弱なニューロンの電気的活動を、［図１］膜電位感受性色素 NK2761 で染色した孵卵７日の脳幹インタクト標本。

非侵襲的に多数領域から同時記録し、その機能マッピングを行えるという他の測定法にはない利点を有している。我々は、脳幹、脊髄、光学的測定には、我々の研究室で独自に作および末梢神経標本を用いて、ニューロン電成した、光学的 144 および 1020 チャネル同時位活動を 128 1020 ヶ所の領域から同時記録測定システムを用いた。前庭神経あるいは蝸することに成功し、ニューロン・シナプスの牛神経刺激により脳幹内に誘発される光学シ分化・形成期と、それに引き続く神経細胞死グナルを、144 1020 ヶ所の領域から同時記の期間におけるニューロン応答の機能発生過録した。

程を明らかにしてきた。
老化をはじめとする神経系の変性では、脳-2-QuickTimeý Ç²Ç»Çµ êLí£ÉvÉçÉOÉâÉÄÇ™Ç±ÇÃÉsÉNÉ`ÉÉÇ¾å©ÇÈÇ Ç½Ç…ÇÕïKóvÇ-Ç•ÅB［図３］孵卵８日の鶏胚脳幹において前庭神経刺激によって得られる光学シグナルの時空間パターン。

経核では、孵卵７日の標本で EPSP が観察された。外転神経核における電気的応答は、他の神経核にやや遅れて孵卵８日の発生段階で発［図２］光学的 1020 チャネル同時測定システムの模式図。

現した。
３）前庭神経核におけるシナプス伝達は、グ３．研究成果ルタミン酸受容体の阻害剤である APV と CNQX

前庭神経を介する末梢（内耳前庭系）からの 投 与 に よ っ て 完 全 に 消 失 し 、NMDA 型、の感覚性入力は、まず前庭神経核（第 VIII 脳

non‑NMDA 型の両グルタミン酸受容体が関与し神経核）に終止し、シナプスを乗り換えたあていることが明らかとなった。外液をと、動眼神経核（第 III 脳神経核）、滑車神経

Mg 2+‑free 液に置換すると、NMDA 型受容体の活核（第 IV 脳神経核）、外転神経核（第 VI 脳神性が高まり、通常の Ringer 液中では EPSP が経核）に投射し、前庭 動眼反射を司る神経回観察されない発生段階でも、EPSP が発現する路網を形成する。本研究における解析の結果、ようになった。すなわち、前庭神経核では孵この神経回路網の機能形成過程について、以

卵５ ６日、動眼神経核、滑車神経核では孵卵下のことが明らかとなった。

６ ７日、外転神経核では孵卵７日から EPSP

１ ） 孵 卵 ８ 日 （ Hamburger‑Hamilton stageが観察された。

33‑34）の鶏胚脳幹 前庭神経標本において、

４）これらの結果は、前庭 動眼反射経路が、前庭神経を吸引電極で電気刺激すると、まず個体発生の非常に早い段階で機能的に形成さpre‑synapticれていることを示している。鶏胚脳幹の他のaction

potentialとexcitatory post‑synaptic potential (EPSP)

脳神経核におけるシナプス伝達機能の発現は、からなる光学的シグナルが前庭神経核に誘発

通常の Ringer 液中では孵卵７日、Mg 2+‑freeされ、ついで潜時を伴った二次・三次応答が、液中では孵卵６日頃であるとされているので、動眼神経核、滑車神経核、外転神経核に誘発

前庭神経系の機能的発達はそれよりも若干早された。同じ標本で蝸牛神経（前庭神経と同いものと考えられる。

じ第 VIII 脳神経の一つ）を刺激した場合には、

５）同側の動眼神経核、滑車神経核、外転神

Nucleus magnocellularis、Nucleus angularis、

経核の応答は、GABA‑A 受容体の阻害剤である

Nucleus laminalis などの聴覚系神経核におbicuculline によって消失することから、抑いて、同様の action potential と excitatory

制性のシナプスを介していることが示された。

post‑synaptic potential (EPSP)が観察され一方、対側の動眼神経核、滑車神経核、外転たが、動眼神経核、滑車神経核、外転神経核

神経核の応答は、グルタミン酸受容体の阻害

では光学的シグナルは観察されなかった。

剤である APV と CNQX の投与によって消失し、

２）通常の Ringer 液中において、前庭神経核興奮性シナプスを介していることが示唆されにおける EPSP は、孵卵６日 ７日の発生段階た。これらの結果から、興奮性、抑制性のシで観察された。また動眼神経核、滑車神ナプスを介する agonistic、antagonistic な反射経路が、この発生段階ですでに形作られ-3-

detection of developmental origin of synapticfunctionintheembryonicchickvestibulo-cochlear nuclei.
Journal of Neurophysiology 89, 3215-3224.
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(10) Sato, K., Momose-Sato, Y. and Kamino, K.
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In: Recent Research Developments inMembrane Biology II. Eds. Fagan, J., Davidson,J., N. & Shimizu, N. Research Signpost, Kerara,in press.ていることが明らかとなった。
個体発生の過程で、前庭神経系の電気的活動能がどの時点から発現するのかは、これまで全く不明であった。これは、発生初期の神経細胞が非常に小さく脆弱で、微小電極を用いた従来の電気生理学的測定法を適用することが困難であったことが一つの原因と考えられる。本研究において、我々はその機能的発現過程を明らかにすると同時に、ニューロン活動パターンの時空間的広がりを可視化、イメージング化することに、世界で初めて成功した。解析の結果から、前庭 動眼反射系の神経回路網が、個体発生の非常に早い段階で機能的に発現していることが明らかにされた。
形態学的な解析では、前庭神経核をはじめとする各神経核のニューロンは、この時期にはまだ分化・成熟の途上にあることが示されており、形態形成と比較しても、「機能形成」の過程は従来考えられていたよりも格段に早いことがうかがわれる。
４．今後の課題と発展
本助成期間内では、解析した対象は鶏胚脳幹の第VIII脳神経関連核とその回路網に限られた。今後は、本研究プ ロジェクトの最終的な目標、すなわち「 中枢神経系の機能発生に焦点をあて、その成果を機能破綻過程と比較検討することにより、老化にともなう細胞の死滅のメカニズムの一端を明らかにする」ことにむけ、さらに研究を継続していく予定である。
５．発表論文(1) Momose-Sato, Y., Honda, Y., Sasaki, H. andSato, K. (2004) Optical mapping of the functionalorganization of the rat trigeminal nucleus: Spatialand temporal dynamics of sensory informationtransfer during embryogenesis.
Journal of Neuroscience 24, 1366-1376.
(2) Sato, K., Miyakawa, N. and Momose-Sato, Y.
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European Journal of Neuroscience 19,1217-1225.
(3) Sato, K. and Momose-Sato, Y. (2003) Optical-4-