アルツハイマー病原因遺伝子による神経細胞死誘導と拮抗遺伝子の解明
The novel factor, Humanin that abolish the neuronal cell death caused by
FAD (familial研究代表者

Alzheimer'sdisease) genes

慶應義塾大学医学部薬理学教室

and助手

Aβ.
橋本祐一

Department of Pharmacology, KEIO Univesity School of medicine,
Instructor, Yuichi Hashimoto

和文アブストラクト
Humanin(HN)は 24 アミノ酸からなるアルツハイマー病関連侵害刺激に特異的に拮抗する因子である。HN には 2 つの Ser 残基があるがそれらの役割については明らかでない。本研究では、
これら 2 つの Ser 残基の働きについて検討した。その結果、HN の第 14Ser を D 体化すると、その神経保護作用は約 1,000 倍増強された。これは、S14G‑HN 誘導体と同等の活性であり、Ser14の D 体化により生体内で活性型 HN へと変換される可能性を示している。一方、S7A‑HN は神経保護作用を有していなかったが、二量体化ペプチドを付加すると活性が回復した。このことから、第 7Ser 残基は HN の二量体化に必須であると考えられた。これらの実験事実から、10 pM の濃度で 25 μM A β(1‑43)に対し完全に拮抗する HN 誘導体を創出した。本研究の成果は、アルツハイ
マー病根治療薬の開発に大きく貢献するものと考えられる。

Abstract
Humanin (HN), a novel rescue factor against Alzheimer's disease‑related neurotoxicity,
consists of 24 amino acids and contains two Ser residues. In this study, we attempted toclarify the function of these Ser residues in HN. We found that D‑isomerization at Ser14of HN shows the neuroprotection more than 1,000 times potent, while the substitution ofSer7 to Ala nullfies the neuroprotective function of HN. The fusion of dimerization peptide
to S7A‑HN causes the recovery of neuroprotective activity. Therefore, Ser7 plays anessential role in self‑dimerization of HN. Based upon these findings, we succeeded increating a very potent HN derivative that fully protects neurons at 10 pM against 25 μ
M Aβ(1‑43). The results of this study could greatly contribute to the development ofanti‑Alzheimer's drugs and therapeutics.

１、研究目的(PS)1 および PS2 が同定されている。アルツアルツハイマー病は、全世界に 1000 万人以ハイマー病患者大脳に観察されるアミロイド上の有病率を誇り、進行性の記憶・認知障害斑等の異常な構造物がアルツハイマー病の原と神経脱落を主徴とするる原因不明の神経変因であるのか、単なる結果なのか、あるいは性疾患である。現在までに、その変異がアル重要な原因病態を反映する指標なのかについツハイマ 病の原因となる３つの遺伝子、アては明らかでないが、APP や PS の変異遺伝子

ミロイド前駆体蛋白質(APP) 、プレセニリンが家族性アルツハイマー病の中心的原因であ1ることは確実である。事実、家族性アルツハ

２‑１

実験方法

イマー病と連鎖する APP 変異体、PS1 変異体、本研究に使用した試薬、遺伝子、細胞、遺および PS2 の変異体は全て、その遺伝子を神伝子導入の方法等はすべて過去に記載した。

経細胞に導入することで細胞死が誘導出来る

２‑２ことをこれまでに我々は明らかにしてきた。

神経保護活性に与える影響

第 7 および 14Ser 残基リン酸化の HN

我々が一昨年報告した広範なアルツハイマ

まず、初代神経培養細胞を用い、25 μM Aー病関連侵害刺激[APP 変異体、PS1 変異体、β(1‑43)が誘導する細胞死に対する第７およPS2 変異体、およびアミロイドβペプチド(Aび第 14Ser 残基リン酸化 HN 誘導体の神経保護β )] に 特 異 的 に 拮 抗 す る ペ プ チ ド 性 因 子活性を検討した。その結果、第７のみ、第 14

Humanin (HN) は、MAPRGFSCLLLLTSEIDLPVKRRAのみ、および第７と第 14Ser 残基のリン酸化の 24 アミノ酸からなる短鎖ペプチドである。

により HN の活性は変化しなかった。同様の検既に詳細な構造活性相関の検討から、HN の討を、神経細胞株 F11 を用いて、家族性アル中央部の第 3Pro‑第 19Pro の 17 アミノ酸残基ツハイマー病原因遺伝子の１つであるが活性中心であり、その中でも第 3Pro、 第V642I‑APP の遺伝子導入で誘導される細胞死8Cys、第 9Leu、第 13Thr、第 14Ser、第 19Proに対しても検討した。結果は同様であった。

が活性に必須であることが明らかになっていこのことから、HN の第 7 および 14Ser 残基る。特に注目すべきは第 14Ser 残基である。のリン酸化は、その神経保護活性に影響しな

HN の第 14Ser 残基を Gly に置換すると、HNいと考えられた。の神経保護活性はおよそ 1,000 倍増強された。

２‑３

私達は、HN が遺伝子から産生され、翻訳後修換による HN 活性の保持飾を受け、「活性型 HN」となるのではないか

第 14Ser 残基の他のアミノ酸への置

次に、第 14Ser 残基を他のアミノ酸に置換と考えた。

し、どのアミノ酸で HN の活性が保持されるか

本研究の目的は、何故第 14Ser 残基を Glyについて検討した。その結果、第 14Ser 残基に置換すると HN の活性が 1,000 倍増強されるは Pro に置き換えることが出来ることが分かのかを明らかにするために HN に存在する２った。

つの Ser 残基の有する機能を明らかにするこ

２‑４とであり、また、将来的な見地から、すなわ基の D 体化の影響

HN 活性に対する第 7 および 14Ser 残

ちアルツハイマー病根治療薬開発のシード分

Gly は D 体のない唯一のアミノ酸であり、子としての可能性を探究するために、より低また Pro の側鎖は非常に小さいことから、第濃度で神経保護作用を有する HN 変異体を得14Ser 残基が D 体化されることにより、HN のることも目的とした。

活性が増強されているのではないかと考えた。
そこで、第 7 および 14Ser 残基を D 体化し２、研究経過た HN 誘導体を合成し、その活性を検討した。

2

そ の 結 果 、 Ser14 を D 体 化 し た

たことから、私達は、これらの誘導体が予想HN(D‑Ser14‑HN)は、初代神経培養細胞においされる HN 受容体に結合する前に何らかの過て、25 μM Aβ(1‑43)に対し 10 nM の濃度で程が必要であり、これら 2 つの HN 誘導体では、完全な細胞死抑制活性を示した。この活性は、この過程が欠けているために活性を発揮出来

S14G‑HN のそれと同等であった。また、Ser7ないのではないかと考えた。

を D 体化した HN(D‑Ser7‑HN)の活性は増強さ

２‑７

HN は二量体として機能する

れ ず 、 Ser7 お よ び 14 を D 体 化 し た

HN は細胞表面に存在すると考えられる HN

HN(D‑Ser7/14‑HN)の活性は、D‑Ser14‑HN と同受容体に結合し、tyroine kinese 依存性のシ等であった。このことから、HN 遺伝子から産グナルを介して神経細胞保護機能を発揮して生された HN ペプチドは、生体内で何らかの修いることがこれまでの研究で明らかとなって飾を受け Ser14 が D 体化されることでその神いる。tyroine kinese 依存性受容体のリガン経保護作用が発揮される可能性があると考えドの多くは二量体として機能していることがられた。

良く知られているので、私達は、HN も二量体２‑５化しているのではないかと推察した。

S7A‑HN の失活と S7A‑HNG17 の活性保持

そこで、二量体するペプチド配列以上の実験から、HN の活性に第 7Ser 残基(EFLIVIKS)を

S7A‑HN(EF‑(S7A)HN)とは重要な役割を果たしていないのではないか

HNG‑KKK(EF‑HNG‑KKK)に付加し、その活性を初と考えられた。この考察は、私達が以前に行代神経細胞を用いて調べた。EFLIVIKS ペプチった前述の HN の中央部の第 3Pro‑第 19Pro のドに神経保護活性は認められず、EF‑(S7A)HN

17 アミノ酸残基(HN17)中の Ser7 を Ala に置と EF‑HNG‑KKK はともにその活性を回復した。

換しても活性が保持されたこ ととも一致してこのことから、
S7A‑HN と HNG‑KKK は、共に、いる。この考察を検証するために、S7A‑HN を二量体化することが出来ない誘導体であり、合成し、その活性を調べた。その結果、予想

このことで活性が発揮出来なかったものと考外にもこの HN 変異体の神経保護活性は消失えられた。この考察を検証するために、していた。

EFLIVIKS ペプチドの過剰添加の効果を調べた。

２‑６

その結果、EF‑(S7A)HN と EF‑HNG‑KKK の神経

HN の C 末端"RRA"の"KKK"への置換による失活

保護作用は共に EFLIVIKS ペプチドの過剰添

私達は、S14G‑HN の C 末端の"RRA"を"KKK"加により抑制され、同条件下で EFLIVIKS‑HNに置換した HN 誘導体(HNG‑KKK)を合成していや EFLIVIKS‑(S14G)HN の活性は影響されなかたので、この HNG‑KKK の神経保護作用を検討った。このことから、HN や S14G‑HN は自ら二した。その結果、S7A‑HN と同様にこの HNG‑KKK

量体化することで、その神経保護活性を発揮も神経保護作用を有しないことが判明した。

しているものと考えられる。

S7A‑HN と HNG‑KKK が共に神経保護作用を失っ

次 に 、(His)6 tag を N 末端に融合した

3

HN((His)6‑HN)と C 末端に FLAG tag を融合し対し 10 pM で完全な作用として発揮された。

た HN (HN‑FLAG) を用い、Ni ビ ー ズ に よ り

また、神経細胞株 F11 においても、家族性ア(His)6‑HN を沈降させ、抗 FLAG 抗体によるウ

ルツハイマー病原因遺伝子である V642I‑APPェスタンブロットによる HN‑FLAG の検出を試および M146L‑PS1 遺伝子導入によって誘導さみた。Ni ビーズが HN‑FLAG を沈降させない条れる細胞死も、同様に 10 pM で完全に抑制し件下で、(His)6‑HN は HN‑FLAG を共沈させた。

た。

一方で、(His)6‑(S7A)HN は(S7A)HN‑FLAG を全く共沈させず、(His)6‑EFLIVIKS‑(S7A)HN は４、今後の課題と発展

EFLIVIKS‑(S7A)HN‑FLAG を共沈させた。これ

本研究では、in vitro での検討を行い、HNらの結果から、HN の第 7Ser 残基は HN や HNGの２つの Ser 残基がそれぞれ異なる役割を果が自ら二量体化するために非常に 重要な役割たしていることを明らかにし、また、使用しを果たしていると考えられた。

た 25 μM Aβ(1‑43)の 1/2,500,000 の濃度でまた、EFLIVIKS を融合した HN (EF‑HN)は野完全な神経保護作用を示す HN 誘導体の創出

生型 HN より数十倍高い活性を示した。

が出来た。今後は、アルツハイマー病のマウスモデル（脳室内への A β投与による行動異３、研究成果

常など）に対する HN や HN 誘導体の効果を検以上の結果から、HN に存在する２つの Ser討し、アルツハイマー病根治療薬の開発の礎残基の異なる役割が明らかとなった。としたいと考えている。

すなわち、HN の第 14Ser 残基は D 体化されて「活性型 HN」に変換されることに重要な役

５、発表論文リスト割を果たし、第 7Ser は HN が二量体化（もしKenzo Terashita, Yuichi Hashimoto (firstくは多量体化）する過程に必須の役割を果た

author equivalent), Takako Niikura,していることが分かった。

Hirohisa Tajima, Yohichi Yamagishi, Miho

これらの結果から、私達は、より活性の高Ishizaka, Masaoki Kawasumi, Tomohiro Chiba,い HN 誘導体の創出を試みた。これまでに分か

Kohsuke Kanekura, Marina Yamada, Mikiroっている中で最も活性の高い HN 誘導体は

Nawa, Yoshiko Kita, Sadakazu Aiso, and Ikuo

R4A/F6A‑HNG (AGA‑HNG)であり、初代神経培養

Nishimoto Two Serine residues distinctly

細胞において、25 μM Aβ(1‑43)に対しそのregulate the rescue function of Humanin, an

神経保護作用は 100‑300 pM であった。
そこで、

inhibiting factor of Alzheimer's disease

AGA‑HNG に 前 述 の EFLIVIKS を 付 加 し‑related neurotoxicity: functional

EFLIVIKS‑AGA‑HNG

potentiation by isomerization andを合成した。

EFLIVIKS‑AGA‑HNG の神経細胞保護作用は初代

dimerization.

神経培養細胞において、25 μM Aβ(1‑43)にin Press (2003)

4

Journal of Neurochemistry