研究助成業績報告集

第 23 回（2015 年度）バイエル循環器病研究助成『動脈疾患と抗凝固療法』

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次 ＊

究

課

題

研 究 者

頁

1

動脈硬化リスクを有する慢性心不全患者に抗凝固療法が炎症性
バイオマーカーに及ぼす影響についての前向き探索的臨床研究

髙濱 博幸

1

2

動脈硬化発症における FXa-PARs シグナルのマクロファージ
活性化調節機構の解明

福田 大受

6

3

トロンビン活性化を促進する新しい凝固・血栓形成機構の解明

藤田 佳子

13

4

アテローム血栓症の直接的抗凝固療法に繋がるプラークの血栓形成能の解明山下 篤

15

動脈硬化リスクを有する慢性心不全患者に抗凝固療法が炎症性バイオマーカーに及ぼす影響についての前向き
探索的臨床研究
国立循環器病研究センター・心臓血管内科部門心不全科

髙濱 博幸NOAC）は作用機序より活性型血液凝固第Ⅹ因子（FXa）阻害薬とトロンビン阻害薬に大別される。ここで FXa は活性化血小板膜の陰性荷電リン脂質のホスファチジルセリンに結合して Va 因子と複合体を形成しプロトロンビンをトロンビンへ変換する。FXa
は白血球や血管組織の細胞膜上のプロテアーゼ活性化受容体（PAR）-1，2 を活性化して炎症促進や血管収縮などを惹起させる。さらにトロンビンは血小板や血管内皮細胞の PAR-1 を活性化して血小板凝集や血管内皮の炎症を惹起させるが、一方プロテイン C/活性化プロテイン C 受容体（ERCP）を介した抗炎症作用も有すると考えられている。このように凝固系と炎症には密接な関連があり、特に FXa 阻害剤について
は上記機序より抗炎症作用を期待し得る。実際、動物実験レベルでは、リバーロキサバンの投与により炎症性メディエーターの発現が低下することが報告されている 5。これらの NOAC の抗炎症作用が明らかとなっているのは、既出報告ではリバーロキサバンに限定されており本試験でリバーロキサバンを選択した
根拠となっている。
一方、ワルファリンについては近年、動物実験レベ
ルでビタミン K 依存性凝固タンパクの抑制から
matrix gla protein の抑制を介した血管の石灰化やオステオカルシンを介した骨粗鬆症などの副作用も知られるようになってきた 6-8。ワルファリンから
NOAC への治療変更がこれらの石灰化促進抑制に及ぼす効果についても不明な点が残されている。
また心不全患者における炎症は過凝固状態を惹起することが知られている 9。心不全によって惹起された過凝固状態に対する NOAC とワルファリンの効果の差異については不明な点が多く 10 本試験では凝固活性化マーカーの測定もあわせて行う。
前述のリバーロキサバンの抗炎症作用は心不全患

Ⅰ．緒 言
近年、心不全患者の病態進展において様々な炎症反応の誘導・維持が重要な役割を果たしていることが示唆されている。全身的な pro-inflammatory state（前炎症状態）は冠血管内皮細胞から reactive oxygen
species（ROS）産生に関与し、血管内皮細胞で産生された ROS は血管内皮細胞の一酸化窒素（NO）のavailability の低下や心筋細胞での PKG の低下をもたらし心筋肥大や passive stiffness の増大をもたらすことにより心不全病態の悪循環を惹起させることが考えられる 1。また心房細動は心不全患者に高率に合併するが、近年の研究では心房細動患者において炎症性マーカ－の上昇は心血管予後に関連することが明らかとなりつつある 2。つまり心不全悪化と心房細動の発症は相互に関連性を有し、その共通する背景因子に炎症が存在する可能性が示唆される。ここで前炎症状態を検出する技術は特にバイオマーカーの開発
分野で進歩が著しい。例えば、Pentraxin3（PTX3）は炎症性マーカーの一つであるが、リポ多糖体(LPS)
やインターロイキン-1(IL-1)、TNF-α などの炎症シグナルに反応して血管内皮細胞や血管平滑筋細胞などから産生される。そのため、主に IL-6 の刺激により肝臓で産生される CRP と比べ、より鋭敏に血管局所の炎症を反映すると考えられている。さらに近年の研究では拡張期心不全患者において冠循環で PTX3 の上昇が示唆されており高感度 CRP と比しても有意に左室の拡張不全の程度と相関する 3。また growthdifferential factor-15 (GDF-15)は TGF-β ファミリーに属し組織障害時の炎症や酸化ストレスに関与し心血管予後との関連性も深いことが知られている 4。さらに心房細動患者において GDF-15 は出血・塞栓イ
ベントの強力な予後予測因子であることも明らかとなった（ARISTOTLE 試験）2。これらのバイオマー
カー測定に代表されるように測定技術の進歩により前炎症状態の検出が可能となりつつあり本研究ではこれらのバイオマーカー測定により心不全患者の前炎症状態を検出する。
ここで新規経口抗凝固薬（Novel anti-coagulants:

者の前炎症状態の改善に有効であることが期待される。心不全患者では高率に心房細動を併発しており
11, 12 抗凝固薬導入を必要とする症例は多いが、最近の NOAC の登場で薬剤選択上、新しい選択肢が加1

わった。一方で、心房細動を併発する非弁膜症性心12) あらゆる理由による死亡の発生率（試験終了時）

不全患者に対する抗凝固療法の薬剤選択は未だ定ま

13) あらゆる理由による入院の発生率（試験終了時）っていない現状にある。本研究では心房細動を伴う

血栓塞栓症のイベントの評価として心不全患者において抗凝固薬の投与が炎症性マーカ

14) 脳卒中の発生率の評価 （試験終了時）

ーや血管石灰化に関するバイオマーカーに及ぼす影

15) 心尖部血栓塞栓症の発生率の評価 （任意・試験

響について探索的な検討を行い、将来の心不全患者の抗凝固薬選択に参考となり得る基礎的な情報を取終了時）
安全性評価項目

得することを研究の目的としている。

1)

血液学的検査（ヘモグロビン、ヘマトクリット値）

Ⅱ．対象・方法
1．目的
本試験では、心房細動合併心不全患者においてリバー

2)

肝機能（AST, ALT, 総ビリルビン）

3)

腎機能（BUN、クレアチニン）

4)

凝固系 （プロトロンビン時間、活性化部分ト
ロンボプラスチン、D ダイマー）

ロキサバンによる炎症性マーカー(高感度 CRP)に対する効果をワルファリンと比較して、単施設、無作為

5)化、非盲検、実薬対照並行群間比較試験にて評価する。

4．試験薬情報2．試験デザイン

4.1 試験薬名称・含量等

単施設、無作為化、非盲検、実薬対照並行群間比較試

一般名：リバーロキサバン

験

販売名：イグザレルト錠 10mg/イグザレルト錠 15mg

3．評価項目

4.2 試験薬の名称・含量等

3.1 主要評価項目

一般名：ワルファリン

高感度 CRP の変化量 （ベースラインと 12 週後/48

販売名：ワーファリン錠 1mg/ワーファリン 0.5mg

有害事象

週後）
3.2 副次評価項目

5．対象患者の選択：本試験は、心房細動合併心不全

有効性評価項目患者を対象とする。対象被験者として、登録時に下記

炎症性バイオマーカーの評価としてのすべての選択基準に合致し、いずれの除外基準にも

1) ペントラキシン 3 のベースラインと比較した変化

抵触しない患者を適格症例として登録する。

量 (3 ヶ月後)

5.1 選択基準

2) GDF-15 のベースラインと比較した変化量 （3 ヶ本臨床試験の登録には、以下の全ての選択基準を満月後）たさなければならない。

血管石灰化マーカ－として

1)3) matrix gla protein のベースラインと比較した変化

患者

量（3 ヶ月後）2)

凝固系活性化マーカ－として

以下のいずれかを満たす患者を心不全を呈する患者

4) トロンビン-アンチトロンビン複合体と定義する。

同意取得時の年齢が 20 歳以上 85 歳未満の心不全を呈する患者

5) プロトロンビンフラグメント 1＋2① 当院入院中の心不全患者

心不全重症度の評価として② 心不全入院既往のある外来通院患者

6) 血漿 BNP の変化量 （3 ヶ月後）

③ NYHA2 度以上の患者かつ過去 6 ヶ月以内

心血管イベントの評価としてに血漿BNP 値が100pg/ml 以上を呈した患

7) 複合エンドポイント（心血管死または心血管疾患者による入院）の発生率（試験終了時）

3)8) 複合エンドポイント（心血管死または心不全によ

永続性心房細動を伴う患者る入院）の発生率（試験終了時）

4)

発作性心房細動もしくは持続性心房細動、文書による同意が得られる患者

9) 心血管死の発生率（試験終了時）
10) 心血管疾患による入院の発生率（試験終了時）

5.2 除外基準

11) 心不全による入院の発生率（試験終了時）

1) 既に第 Xa 因子阻害剤もしくは直接トロンビン阻

2

り付けには国立循環器病研究センター内の SAS 動的

害剤を内服中の患者
2) 心尖部血栓症の既往のある患者

割り付けシステムを用いる。

3) 中等度以上の弁膜症を有する患者（ただし中等度
6. 試験薬の投与の機能性僧帽弁逆流の有無は問わない）
4) 機械的補助循環装置を装着中の患者

本試験のスケジュールは以下のとおりである。

5) 心血管疾患の手術を予定している患者

発作性・持続性・永続性心房細動を伴う心不全患者

6) 明らかな感染性疾患や自己免疫性疾患を有して（ワーファリン内服の有無は問わない。NOAC を既に内服中の患者は除外する）

いる患者やステロイド製剤を内服している患者
7) 心サルコイドーシスの患者研究説明、同意取得

8) 同意取得 3 ヶ月前よりスタチン、アセチルサリチ

適格性判定・登録

ル酸の内服を開始した患者

ランダム割付

9) 同意取得 3 ヶ月前より以降に急性心筋梗塞・脳卒
中・全身性塞栓症を発症した患者
10) クレアチニンクリアランス 15ml/分未満の患者
11) 血液凝固能の異常を伴う肝疾患、もしくは中等度以上の肝障害(Child-Pugh 分類の B または C)
12) 同意取得 6 ヶ月前より以降に頭蓋内出血や消化リバーロキサバン群（試験介入群）

ワルファリン群(対照治療群)

リバーロキサバンを 1 日 1 回、PT-INR モニタリング下にワルフ

10mg/15mg を 48 週間投与する。

ァリンを投与する。

管出血の既往のある患者
13) 妊婦、または妊娠している可能性のある女性
観察ポイント14) コビシスタットを含有する薬剤、HIV プロテア

投与開始 12 週、48 週後に血液検査を行う。
投与開始後 48 週後に心血管イベントの評価を行う。

ーゼを内服している患者
15) アゾール系抗心筋剤の系抗真菌剤を経口または6.1 リバーロキサバン群（介入群）

内服加療を受けている患者

リバーロキサバンとして15mgを１日1回経口投与す

16) ワルファリンカリウムもしくはリバーロキサバる。なお中等度の腎機能障害（クレアチニンクリアラ

ンに過敏性を有する患者

ンス 30-49ml/分）の患者ではリバーロキサン 10mg17) 骨粗鬆症治療薬ビタミン K2（メナテトレノン）

１日１回投与への減量を行う。リバーロキサバン群にを内服中の患者

割り付けられた症例は、試験開始日以降、試験終了ま18) イグラチモドを内服中の患者
19) 重篤な悪性腫瘍の患者

たは試験中止まで、他の NOAC ならびにワーファリ

20) 他の臨床試験に既に参加もしくは本試験期間中

ンの服薬を禁止する。

に参加する予定がある患者（ただし観察研究は除ワルファリン服用患者のリバーロキサバンへの切りく）

替えは以下のように行う。ワルファリン最終投与後、

21）その他の理由により、試験責任医師または分担

PT-INR が 2.0 以下（70 歳未満）
、1.6 以下（70 歳以

医師が本試験への参加を不適当と判断した患者。

上）であることを確認しリバーロキサバンの投与を開始する。
6.2 ワルファリン群（対照群）

5.3 割付ワルファリンコントロールは日本循環器学会抗凝被験者は、最小化法によりランダムにリバーロキサバ

固・抗血小板療法に関するガイドラインに準じて

ン群またはワルファリン群に割り付けられる。リバー
ロキサバン群とワルファリン群の割付比は１：１であPT-INR によるモニタリングを行う。循環器疾患に関る。最小化法で考慮する割付因子は、登録時点におけする抗凝固・抗血小板療法に関するガイドラインに準る CRP 値（0.50 以上または未満）、左房径（45mm

じる。ワルファリン群に割り付けられた症例は、試験以上または未満）、年齢（75 歳以上または未満）、腎開始日以降、試験終了または試験中止まで NOAC へ

機能 （eGFR30ml/min/1.73m2 以上または未満）、の変更は禁止する。

EF（50%以上または未満）、心房細動（発作性心房細動または永続性心房細動）の 6 項目である。なお、割3

7. 目標症例数

9. 倫理的事項

目標症例数：70 例（[リバーロキサバン群] 35 例 [ワ遵守すべき諸規則

ルファリン群] 35 例）

本試験は、ヘルシンキ宣言に基づく倫理的原則、

8. 統計的事項「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」

8.1 目標症例数の設定根拠

及び試験実施計画書を遵守して実施する。

孤立性心房細動に対するリバーロキサバン、ダビガト

Ⅲ．結 果

ランが炎症性マーカーに与える影響について検討した先行研究（Circulation 2014; 130: A11890）に基づ

本臨床試験は 2017 年 6 月 30 日までに 70 症例のき、投与から 12 週後のリバーロキサバン投与群とダエントリーを予定する前向き介入臨床試験である。

ビガトラン投与群における，対数変換後の高感度

途中解析は予定しておらず全症例をエントリー後、CRP の投与前からの変化について，群間差を 1.5、標結果の公表を行う予定である。ただし試験開始前に

準偏差 2 と仮定した。リバーロキサバン投与群の変化

先立ち予備的な調査としてレトロスペクティブな解がダビガトラン投与群よりも大きいとの片側仮説の析を実施したので報告する。病名登録システムならもとで、検出力を 80%、有意水準を 2.5%とすれば、びにカルテ解析から288名の心不全入院患者を抽出

t 検定に基づく必要最小例数は 29 例と計算された。

した。さらにこのうちリバーロキサバンを内服した

さらに脱落例を考慮し、組み入れ目標被験者数を 35

10 名の心不全患者（NYHA3-4）を抽出した。この

例/群と設定した。

患者群の患者(DCM３例、ICM1 例、収縮性の保持された心不全患者（HFpEF）4 例)との結果であっ8.2 主要評価項目の解析

た。3 日間の観察期間(リバーロキサバン投与前日、

高感度 CRP のベースラインから 12 週ならびに 48 週

投与開始翌日)のなかで平均血清 CRP 値は 0.99±の変化量についてワルファリン群、リバ－ロキサバン

2.13mg/dlから0.89±1.37mg/dlへの低下を認めた。

群の比較について t 検定を用いて解析する。解析を実

ただし、以前に当院で実施した急性心不全患者のデ施する前に、高感度 CRP は対数変換を施す。対数変ータベースを用いると心不全患者全体でも入院時換に基づき得られた結果を指数変換し、投与後値の投CRP1.71±2.94mg/dl に対し退院時の CRP は 0.55

与前値に対する比として結果を両側 95%信頼区間と±1.07mg/dl への低下が認められた（n=432）。

一緒に表示する。必要に応じて、ベースライン、12
週，48 週の高感度 CRP の推移をモデルに基づく方法

Ⅳ．考 察(例えば、混合効果モデルなど)を用いて検討する。

上記予備調査の結果からリバーロキサバン内服後の炎症反応の低下傾向を確認し得たが、自験例を上

8.3 副次評価項目の解析記に示したとおり、急性心不全入院患者には CRP

有効性評価項目値の上昇が認められ心不全の安定期（退院時）には

GDF-15、ペントラキシン 3、matrix gla protein のベ

CRP 値の低下傾向が認められた。従ってこの炎症反ースライン・3ヶ月の変化量についてワルファリン群、応の改善が心不全自体の改善によるものであるか？

リバ－ロキサバン群の群間の比較を，主要評価項目と薬剤による影響であるか？を弁別するためには前向同様の解析を実施する。

きの介入試験が必要であると考えた。本臨床試験は安全性評価項目2016 年 4 月時点で試験継続中の段階である。中間出血性合併症について、ワルファリン群、リバ－ロキ

解析については予定しておらず、全症例解析後、結サバン群のそれぞれについて、発生頻度、発生割合を果を公表予定である。従って現時点での結果公表は計算する。必要に応じて、Fisher の直接確率計算を控えたい。緒言に記載したように本試験はリバーロ用いてこれらの発生割合を群間で比較する。

キサバンの多面的作用に着目する一方で炎症の複数のカスケードに着目しており今後の研究の進展に期
待したい。

Ⅴ．結 論
リバーロキサバンの抗炎症作用に着目した前向き

45.

臨床試験を開始した。

Hara T, Fukuda D, Tanaka K, et al.
Rivaroxaban, a novel oral anticoagulant,

Ⅵ．研究協力者

attenuates atherosclerotic plaque安斉俊久・国立循環器病研究センター・部長

progression and destabilization in

北風政史・国立循環器病研究センター・部長

apoe-deficient mice. Atherosclerosis.
2015;242:639-646

神崎秀明・国立循環器病研究センター・医長
6.

朝倉正紀・国立循環器病研究センター・医長

Fusaro M, Dalle Carbonare L, Dusso A,

菅野康夫・国立循環器病研究センター・医長

et al. Differential effects of dabigatran

長谷川拓也・国立循環器病研究センター・医師

and warfarin on bone volume and大原貴裕・国立循環器病研究センター・医師

structure in rats with normal renal

天木誠・国立循環器病研究センター・医師

function. PLoS One. 2015;10:e0133847
7.

高潮征爾・国立循環器病研究センター・医師

Luo G, Ducy P, McKee MD, et al. P
Spontaneous calcification of arteries and岡田厚・国立循環器病研究センター・医師

cartilage in mice lacking matrix gla
protein. Nature. 1997;386:78-81

Ⅶ．参考文献8.

参考文献
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failure: Relation to disease severity andprognosis in the valsartan heart failure
trial. Circulation. 2010;122:1387-13955動脈硬化発症における FXa-PARs シグナルのマクロファージ活性化調節機構の解明―FXa-PARs シグナルと動脈硬化―

徳島大学大学院医歯薬学研究部循環器内科学分野・特任講師

福田 大受
ある rivaroxaban を用いた薬理学的阻害実験と、

Ⅰ．緒言
近年、新規の経口血液凝固阻害薬が臨床応用され、ApoE KO マウスにおいて PAR-2 を遺伝学的に欠損

抗凝固療法において良好な成績を収めている(1)。一させた PAR-2/ApoE 2 重欠損(dKO)マウスを用いた方、最近の大規模臨床試験(ATLAS 試験)によって、遺伝学的阻害実験を行う。動脈硬化病変の形成の程

直接型活性化血液凝固第 X 因子(FXa) 阻害薬の一つ

度を、大動脈における en face Sudan IV 染色で検討

rivaroxaban を通常の抗凝固療法に用いられる用量する。また、大動脈起始部における動脈硬化病変によりも少量投与することで、急性冠症候群患者におおけるOil red O 染色(脂質沈着の解析)やpicrosirius

ける新たな心血管イベントが減少することが示されred 染色(膠原線維の解析)、マクロファージマーカー

た (2-4)。この結果は FXa 阻害が動脈血栓の形成をである Mac3 や monocyte chemoattractant protein抑制したのみならず、抗凝固以外の何らかの抗動脈(MCP-1)、matrix mettaloproteinase-9 (MMP-9)硬化作用を有する可能性を示唆している。

に対する免疫染色などの組織学的検討を行い、動脈動脈硬化は、マクロファージを中心とした血管の硬化病変の不安定化の程度を評価する。また、大動

慢性炎症を基盤として発症する (5)。様々な経路が、脈の遺伝子発現を定量的 RT-PCR (qPCR)を用いてマクロファージの活性化を引き起こす (6)。以前か検討する。

ら、血液凝固因子が血液凝固に関与するだけでなく、さらに、マクロファージにおける FXa-PAR2 シグ

種々の臓器の炎症反応を引き起こす可能性が示唆さナルが、動脈硬化病変形成に与える影響を検討するれている (7)。特に、FXa は、プロテアーゼ受容体

ため、ApoE KO マウスの骨髄を PAR-2/ApoE dKO(protease-activated receptor, PAR)のサブタイプのマウスの骨髄で置換し、骨髄特異的 PAR-2 欠損

うち、主に PAR-2 を活性化することが報告されていApoE KO マウスを作製し、コントロールの骨髄キメる (8, 9)。しかしながら、FXa-PARs シグナルのマラマウス(ApoE KO マウスの骨髄を ApoE KO マウ

クロファージ活性化における役割は知られていない。

スの骨髄で置換)との間で、動脈硬化病変の形成や不そこで、我々は、「FXa-PARs シグナルがマクロファ

安定化を比較検討する。
これらのマウスにおける、血糖値や血中脂質値、ージを活性化し、血管の炎症を惹起することで、動脈硬化病変の進展に関与する」との仮説に着想し、

血圧、体重などを比較検討する。

検証を行うこととした。

また、マクロファージの活性化における
FXa-PAR2 シグナルの役割を検討するため、PAR-2
KO マウスと野生型マウスから、骨髄細胞を採取し、Ⅱ．対象・方法
最初に FXa-PARs シグナルの動脈硬化への関与の

M-CSF の存在下で骨髄由来マクロファージを分化可能性を検討するため、性別と週齢を一致させた

させ、FXa や PAR-2 アゴニスト(AP-2)を用いて刺激

動脈硬化モデルマウスである apolipoprotein E 欠損を行い、炎症性物質の発現の程度や脂質の取り込み(ApoE KO)マウスと野生型マウスの間で、大動脈との程度などを比較検討する。

動脈硬化の進展に重要な役割を果たすマクロファー

さらに、ヒト冠動脈病変の形成におけるジにおける PARs の発現を比較検討する。次に

FXa-PAR2 シグナルの関与を検討するため、当科でFXa-PAR2 シグナルを阻害することで動脈硬化病変

スタチンの投与から最低 6 か月後に、左前下行枝にの形成を抑制できるか検討するため、FXa 阻害薬で対してステント留置を行い、ステントの近位端から

6

5 mm 以上離れた部位のプラーク量を血管内超音波

（表 1）
。

法(intravascular ultrasound, IVUS)で測定しえた

表 1. Rivaroxaban の代謝パラメーターに対する影響

32 症例において、血中の FXa 濃度を測定し、プラーク量との相関を検討した。
データは全て平均値±標準誤差で表記。2 群間の比較は unpaired-T test で行い、多群間の比較はone-way ANOVA で行い、各群間の比較にはScheffe's post hoc analysis を行った。臨床検体を用いた検討では、2 変量の相関は univariate analysis
を用い解析を行った。
しかし、大動脈弓部における大動脈病変の形成は

Ⅲ．結果

（図 2）
、
rivaroxaban の投与によって有意に抑制され

1. 大動脈とマクロファージにおける PARs の発動脈硬化プラークにおける脂質沈着や膠原線維の減現検討

少、さらにマクロファージの浸潤や MMP-9 の発現

性別と週齢が一致した野生型マウスと ApoE KO

は、rivaroxaban 群で有意に低下し、動脈硬化プラ

マウスの大動脈において、PARs の発現を qPCR でークは安定化していることが分かった（図 3）。

比較したところ、PAR1 と PAR2 に関しては、ApoE
KO マウスにおいて有意な発現増加が認められた。
また、動脈硬化の発症と進展に重要な役割を果たす
マクロファージにおいても、PARs の発現が認められることが分かった（図 1）。

図 2．薬理学的 FXa-PAR-2 シグナル阻害による動脈硬化抑制作用
ApoE KO マウスにおいて、FXa 阻害薬である rivaroxaban の投与により FXa-PAR-2 シグナルを薬理学的に阻害すると、無治療のApoE KO マウスと比べて、Sudan IV 染色で評価される大動脈弓部の動脈硬化病変の形成が有意に抑制された。*P<0.05。

また、大動脈から抽出した RNA を用いた qPCR

図 1．PARs の発現では、rivaroxaban の投与によって、大動脈におけ（上段）大動脈における PAR-2 の発現は、野生型マウスに比べてるマクロファージの浸潤や MCP-1 や TNF-α などのApoE KO マウスで有意に多い。
（下段）マクロファージには PAR-1

炎症性物質の発現が有意に低下していることが分かと PAR-2 が多く発現する。*P<0.05、**P<0.01。

った（図 4）。また、今回用いた rivaroxaban の投与量は、臨床容量の下限程度であった（表 1）。これら

2. rivaroxaban による抗動脈硬化作用の検討の結果は、rivaroxaban 投与によって FXa を阻害す

生後 8 週齢の雄性 ApoE KO マウスに対してることで FXa-PAR2 シグナルが遮断され、血管壁に

rivaroxaban (5 mg/kg/day)を西洋食に混ぜ、20 週間

おける炎症を抑制することで動脈硬化の形成が抑制投与した。その間の体重増加量は、投与群と無投与されたことを示唆していると考えられた。

群との間で差は認めず、さらに投与 20 週間後の血圧や血糖値、血中脂質レベルは有意差を認めなかった7

ウスの間に、体重や血糖値、血中脂質値、血圧に差は認められなかった（表 2）。
表 2. PAR-2 の遺伝的欠損が代謝パラメーターに与える影響

しかし、大動脈弓部における動脈硬化病変の形成は PAR-2 の遺伝的欠損によって有意に抑制されていた（図 5）。

図 3．薬理学的 FXa-PAR-2 シグナル阻害による動脈硬化病変の安定化作用
ApoE KO マウスにおいて、FXa 阻害薬である rivaroxaban の投与により FXa-PAR-2 シグナルを薬理学的に阻害すると、無治療のApoE KO マウスと比べて、動脈硬化病変における脂質沈着(A)、
膠原線維の減少(B)、マクロファージの浸潤(C)、MMP-9 の発現(D)が有意に減少し、動脈硬化病変が安定化していることが明らかになった。*P<0.05、**P<0.01。

図 5. 遺伝的 FXa-PAR-2 シグナル阻害による動脈硬化抑制作用
PAR-2 を遺伝的に欠損させた ApoE KO マウス（PAR-2-/-/ApoE-/-）は、通常の ApoE KO マウスと比べて、Sudan IV 染色で評価される大動脈弓部の動脈硬化病変の形成が有意に抑制された。*P<0.05。

図 4．薬理学的 FXa-PAR-2 シグナル阻害による大動脈における炎症性物質の発現抑制効果
ApoE KO マウスにおいて、FXa 阻害薬である rivaroxaban の投

また、PAR-2 の欠損により動脈硬化プラークにお与により FXa-PAR-2 シグナルを薬理学的に阻害すると、無治療のける脂質沈着や膠原線維の減少、さらにマクロファ

ApoE KO マウスと比べて、大動脈における炎症性物質の発現が低ージの浸潤や MMP-9 の発現は低下し、動脈硬化プ下することが明らかになった。*P<0.05、**P<0.01。

ラークは安定化していることが分かった（図 6）。また、
大動脈から抽出した RNA を用いた qPCR では、

3. PAR-2 の遺伝的欠損による抗動脈硬化作用の検PAR-2 の遺伝的欠損によって、大動脈におけるマク

討

ロファージの浸潤や MCP-1 や TNF-α などの炎症性

ApoE KO マウスと PAR-2 KO マウスを交配し、物質の発現が有意に低下していることが分かった

PAR-2/ApoE 2 重欠損 (dKO)マウスを作製した。生（図 7）。これらの結果は、PAR-2 の遺伝的欠損によ

後 8 週齢の雄性 PAR-2/ApoE dKO マウスに西洋食って FXa-PAR2 シグナルが遮断され、血管壁におけを 20 週間投与した。ApoE KO マウスを対象群としる炎症を抑制することで動脈硬化の形成が抑制されて用いた。PAR-2/ApoE dKO マウスと ApoE KO マ

たことを示唆していると考えられた。

8

の PAR ファミリーには見られない発現パターンを示すことが明らかになっている。これまでに血管内皮細胞における PAR-2 の役割については検討されているが、PAR-2 がマクロファージ機能に与える影響については検討されていない。そこで、ApoE KO
マウスの骨髄を PAR-2/ApoE dKO マウスの骨髄で置換した骨髄移植マウスを作製した。ApoE KO マウスの骨髄を ApoE dKO マウスの骨髄で置換した骨髄移植マウスをコントロール群として、西洋食負荷
により、動脈硬化病変を誘導した。尚、骨髄特異的
PAR-2 欠損マウスとコントロールマウスの間で、体重や血圧、血中脂質レベルや血糖値に差は認めなかった（表 3）。
表 3. 骨髄特異的 PAR-2 欠損が代謝パラメーターに与える影響

図 6．遺伝的 FXa-PAR-2 シグナル阻害による動脈硬化病変の安定化作用
PAR-2 を遺伝的に欠損させた ApoE KO マウス（PAR-2-/-/ApoE-/-）

骨髄特異的 PAR-2 欠損マウスは、有意に動脈硬化は、通常の ApoE KO マウスと比べて、動脈硬化病変における脂質病変の形成が抑制され（図 8）、

沈着(A)、膠原線維の減少(B)、マクロファージの浸潤(C)、MCP-1の発現(E)、MMP-9 の発現(E)が有意に減少し、動脈硬化病変が安定化していることが明らかになった。*P<0.05、**P<0.01。

図 7．遺伝的 FXa-PAR-2 シグナル阻害による大動脈における炎症性物質の発現抑制効果
PAR-2 を遺伝的に欠損させた ApoE KO マウス（PAR-2-/-/ApoE-/-）は、通常の ApoE KO マウスと比べて、大動脈における炎症性物質
図 8. 骨髄特異的 PAR-2 欠損による動脈硬化抑制作用の発現が低下することが明らかになった。*P<0.05、**P<0.01。

骨髄移植により ApoE KO マウスの骨髄を PAR-2-/-/ApoE-/-マウスの骨髄によって置換した骨髄特異的 PAR-2 欠損マウスは、コント

4. 骨髄特異的 PAR-2 欠損による抗動脈硬化作用のロール骨髄移植マウス(ApoE KO マウスの骨髄を ApoE KO マウ

検討
これまでの論文で PAR-2 は、血管内皮細胞や平滑スの骨髄によって置換した)と比べて、Sudan IV 染色で評価される筋細胞などの血管構成細胞と、白血球系の細胞に発大動脈弓部の動脈硬化病変の形成が有意に抑制された。*P<0.05。

現しており、逆に血小板には発現しないという、他9プラークにおける脂質沈着や膠原線維量、マクロフ

骨髄移植により ApoE KO マウスの骨髄を PAR-2-/-/ApoE-/-マウス

ァージ浸潤などで評価された不安定性も減弱していの骨髄によって置換した骨髄特異的 PAR-2 欠損マウスは、コントた（図 9）。

ロール骨髄移植マウス(ApoE KO マウスの骨髄を ApoE KO マウスの骨髄によって置換した)と比べて、大動脈における炎症性物質の発現が低下することが明らかになった。*P<0.05、**P<0.01。

5. マクロファージの活性化における FXa-PAR2 シグナルの役割の検討
FXa-PAR2 シグナルがマクロファージの活性化に与える影響を検討するため、野生型マウスと PAR-2
KO マウスから骨髄由来マクロファージを作製し、FXa と PAR-2 の特異的アゴニストペプチドを用いて刺激を行った。 その結果、野生型マウス由来の骨髄由来マクロファージでは、FXa と PAR-2 アゴニ
ストによる刺激によって、MCP-1 や TNF-α の発現が増加したが、PAR-2 KO マウス由来のマクロファージでは、同様の反応は認められなかった。さらに、
マクロファージは脂質を取り込み、泡沫化することで活性化し、動脈硬化の発症を促進する。野生型マ
ウスの骨髄由来マクロファージに FXa や AP-2 を作用させることで泡沫化が促進されたが、PAR-2 KO
マクロファージでは、泡沫化の促進が認められなかった。これらの結果は、FXa-PAR2 シグナルの活性

図 9．骨髄特異的 PAR-2 欠損による動脈硬化病変の安定化作用

化が、マクロファージの活性化を促進することを示

骨髄移植により ApoE KO マウスの骨髄を PAR-2-/-/ApoE-/-マウス唆していると考えられた（図 11）。

の骨髄によって置換した骨髄特異的 PAR-2 欠損マウスは、コント
ロール骨髄移植マウス(ApoE KO マウスの骨髄を ApoE KO マウスの骨髄によって置換した)と比べて、動脈硬化病変における脂質沈着(A)、膠原線維の減少(B)、マクロファージの浸潤(C)、MCP-1の発現(E)、MMP-9 の発現(E)が有意に減少し、動脈硬化病変が安定化していることが明らかになった。*P<0.05、**P<0.01。

さらに、大動脈における MCP-1 や TNF-α などの炎症性物質の遺伝子発現も骨髄特異的 PAR-2 欠損
マウスで減少していた（図 10）。

図 11．FXa-PAR-2 シグナルによるマクロファージ活性化効果(A) FXa や PAR-2 の特異的アゴニスト(AP-2)は、野生型マウスの

図 10．骨髄特異的 PAR-2 欠損による大動脈における炎症性物質の骨髄由来マクロファージを活性化し、炎症性物質の発現を増加させ発現抑制効果10

たが、PAR-2-/-マウスの骨髄由来マクロファージでは、炎症性物質

った。今回、我々が行った薬理学的ならびに遺伝的の発現増加は認められなかった。(B) 野生型マウスの骨髄由来マクな FXa-PAR-2 シグナルの遮断実験は、ApoE KO マ

ロファージは、FXa や AP-2 により、酸化 LDL の取り込みが促進

ウスにおける動脈硬化病変の形成と不安定化を抑制

したが、PAR-2-/-マウスの骨髄由来マクロファージでは、酸化 LDL

し、FXa-PAR-2 シグナル動脈硬化病変形成に関与すの取り込み促進効果は認められなかった。*P<0.05、**P<0.01。

ることを示した。さらに骨髄移植により作製した骨髄特異的 PAR-2 欠損マウスを用いた検討では、動脈6. ヒト動脈硬化における FXa-PAR2 シグナルの関

硬化発症の中心的役割を果たすマクロファージの活与の検討性化に FXa-PAR-2 シグナルが関与することを明ら

スタチンの内服歴が 6 カ月以上ある安定狭心症患かになった。また、骨髄由来マクロファージを用い者で、当科で左前下行枝にステント留置を受けた安た in vitro 実験においても、PAR-2 シグナルがマク

定狭心症患者のうち、ステント近位端から 5 mm 以

ロファージの炎症反応を惹起することが証明された。

上離れた血管を、5 mm 以上にわたって、IVUS を

また、ヒトの冠動脈疾患の重症度と、血中の FXa が用いて観測し、プラーク容積を計測できた 32 症例

相関したことから、ヒトの動脈硬化病変の形成にも（69.6±1.1 歳、男性 63%）において、血液中の FXa

FXa-PAR-2 シグナルが関与することが推測された。

濃度を測定し、冠動脈プラークの容積との相関を検以上から、FXa-PAR-2 シグナルは、マクロファージ

討したところ、有意な正の相関を認めた（r=0.42,の活性化を介して血管の炎症を惹起し、動脈硬化病

p<0.05）（図 12）。

変の形成を促進することが示唆された。今回の結果
は、新しい動脈硬化発症の機序を明らかにするだけ
でなく、FXa-PAR-2 シグナルが、動脈硬化の新しい治療標的になる可能性を示すものであると考えられた。

Ⅴ．結論（まとめ）FXa-PAR-2 シグナルは、マクロファージを活性化することで血管の炎症を惹起し、動脈硬化病変の形成を促進する。特に最近、経口直接型抗凝固薬が臨床で使用できるようになり話題となっているが、今図 12．冠動脈プラーク容積と FXa 濃度の関係

回の研究結果から、これらの薬剤が、抗凝固薬とし冠動脈疾患患者において冠動脈プラーク容積と FXa 濃度は、有意てだけではなく、抗動脈硬化薬としても効果が期待な正の相関を認めた。

できるのではないかと考えられた。

Ⅳ．考察
凝固系は、血液凝固以外にも、多くの機能を持っⅥ．研究協力者ている (10)。PARs の中でも、特に、今回注目した

原知也 徳島大学大学院医歯薬学研究部循環器内科

PAR-2 は、血小板には発現せず、血管内皮細胞や血学分野・医員管平滑筋細胞と、白血球系の細胞に発現しており、山口浩二 徳島大学大学院医歯薬学研究部循環器内

血管の生理活性調整に関与することが報告されてい科学分野・助教

る (8)。さらに、PAR-2 シグナルが、脂肪組織の炎村田知慧 徳島大学大学院医歯薬学研究部人類遺伝症に関与し、引き続くインスリン抵抗性の発症に関学分野・助教与すること (11)、血管障害後の新生内膜増殖に関与

八木秀介 徳島大学大学院医歯薬学研究部循環器内する (12)ことから、生体内の慢性炎症への関与も推科学分野・助教測された。また、近年、FX が動脈硬化内のマクロフ

添木武 徳島大学大学院医歯薬学研究部循環器内科

ァージに発現していることも報告された (13)。しか学分野・講師し、FXa-PAR-2 シグナルのマクロファージ活性化に

若槻哲三 徳島大学大学院医歯薬学研究部循環器内おける役割と動脈硬化への関与は検討されていなか

科学分野・講師11

7.

井本逸勢 徳島大学大学院医歯薬学研究部人類遺伝

Spronk HM, de Jong AM, Crijns HJ, et al.

学分野・教授

Pleiotropic effects of factor Xa and thrombin:

島袋充生 徳島大学大学院医歯薬学研究部心臓血管

what to expect from novel anticoagulants.

病態医学分野・特任教授

Cardiovasc Res 2014;101:344-351.
8.

佐田政隆 徳島大学大学院医歯薬学研究部循環器内

Leger AJ, Covic L, Kuliopulos A.
Protease-activated receptors in

科学分野・教授

cardiovascular diseases. Circulation
2006;114:1070-1077.

Ⅶ．参考文献1.

9.

Ageno W, Spyropoulos AC, Turpie AG. Role of
new anticoagulants for the prevention ofExtracellular mediators in atherosclerosis

venous thromboembolism after major

and thrombosis: lessons from thrombin

orthopaedic surgery and in hospitalised

receptor knockout mice. Arterioscler Thromb

acutely ill medical patients. Thromb

Vasc Biol 2003;23:931-939.

Haemost 2012; 107:1027-1034.
2.

10. Levi M, van der Poll T, Buller HR.

Mega JL, Braunwald E, Mohanavelu S, et al.

Bidirectional relation between inflammation

Rivaroxaban versus placebo in patients withand coagulation. Circulation

acute coronary syndromes (ATLAS

2004;109:2698-2704.

ACS-TIMI 46): a randomised, double-blind,3.

11. Badeanlou L, Furlan-Freguia C, Yang G, etphase II trial. Lancet 2009;374:29-38.

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Mega JL, Braunwald E, Wiviott SD, et al.

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Rivaroxaban in patients with a recent acuteadipose inflammation. Nat Med

coronary syndrome. N Engl J Med

2011;17:1490-1497.

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4.

12. Tennant GM, Wadsworth RM, Kennedy S.

Mega JL, Braunwald E, Wiviott SD, et al.

PAR-2 mediates increased inflammatory cellComparison of the efficacy and safety of two

adhesion and neointima formation following

rivaroxaban doses in acute coronary

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syndrome (from ATLAS ACS 2-TIMI 51). Am

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12トロンビン活性化を促進する新しい凝固・血栓形成機構の解明―凝固因子新規受容体の発見―

信州大学医学部・生理学教室・助教

藤
Ⅰ．緒 言

田 佳 子

固関連蛋白質を応用した阻害物質であったり、血中血栓形成は、血管機能の病理的変化と結びついてからそのものを精製蛋白として用いたり、組み換え

いると古くから考えられてきた。Virchow’s triad と蛋白質として作製して用いられている。そのため、して知られるように、向血栓性は血液・血流・血管病気においても治療においても、その凝固作用と抗壁の病理的変化から生じている。血液の粘稠度の増凝固作用のバランスが閾値を超えると、その途端に加、繊維素溶解活性低下、血液凝固因子の増加、血凝固機構が破綻してしまう。

流の緩慢、血管内皮障害が血栓形成の要因となる。
近年、凝固因子に着目して開発された抗凝固薬が２．研究の目的

登場してきた。トロンビン阻害薬、第 Xa 因子阻害

本研究課題では、血栓形成を引き起こす血液凝固薬はワルファリンに代わるべく、この数年続々と登系の新しいトロンビン活性化機構を解明することを場している。しかし、新しく抗凝固薬が開発されれ目的とする。血液凝固因子によって引き起こされる

ば、その薬による正常な凝固阻害がおこるため、さカスケードによりトロンビンが生成される。凝固因

らにそれを抑制する薬が開発されている（1-3）
。

子に結合する蛋白に着目し、それらの相互作用によ

凝固関連蛋白質は血中に多く存在するが、それらって引き起こされる凝固促進作用を検討した。

が、凝固カスケード反応の開始と共に各々活性化さ

Ⅱ．対象・方法

れていき、最終的にトロンビンが大量に生成される仕組みが成り立っている。そしてトロンビンによる(1) 血漿を用いたトロンビン活性化の検出

フィブリノーゲン切断により、フィブリンができ、血漿希釈溶液に、トロンビン基質（Chromogenix

血栓ができる。そして血栓は、脳梗塞、心筋梗塞、

S-2238）を加え、トロンビン活性を検出した。凝固

肺塞栓症などを引き起こす。

因子（Haematologic Technologies Inc.（HTI）社よ

血中の凝固関連蛋白質は非常に多いが、各々の血り購入）、リン脂質、CaCl2 溶液、蛋白質 A を加え中濃度や半減期、働きが異なることや、血友病をはて反応を開始させた。蛋白質 A、およびそのネガテじめとした凝固因子欠損疾患などが多く存在するたィブコントロールとしての蛋白質 B は Expi293 細め、古くから幅広く研究が続けられている。また、

胞 シ ス テ ム を 用 い 、 pcDNA6.2/V5/GW/D-TOP

血中の凝固関連蛋白質は凝固を促進するものと、凝（Lifetechnologies inc.）にてクローニングした固を抑制するものとが存在する。凝固を亢進するもplasmid を用いて作製した。

のは、凝固カスケードの主な因子だけにとどまらず、反応溶液は 384-well プレートに混合し、CaCl2 溶

血小板活性化に伴う因子も含まれる。また、凝固を液を加えて反応を開始させた。405 nm での吸光度抑制する因子についても、アンチトロンビンⅢをはを Spectra Max 340PC384 (Molecular Devices,

じめヘパリン類似物質、プロテイン C などがある。

Sunnyvale, CA)で経時的に測定した。SoftMax Pro

体内には、凝固因子、抗凝固因子を制御する機構がソフトウエア (Molecular Devices)にて解析し、備わっている。出血に対し、止血機構、抗凝固作用

kinetic reduction の Vmax mode (milli-units perが働き、血栓に対しては線溶系が働くようになって

min, Max ΔOD/min)にて算出した。
血漿は市販のコントロール血漿（SIEMENS,いる。現在行われている薬物治療は、体内にある凝13

54819924）、各凝固因子欠損血漿（GEORGE KING

反応が加速されることはトロンビンが多く生成され、）を用い、試薬の調製には 20 mM HEPES, 150 mM

トロンビン作用が爆発的に上昇することを意味する。

NaCl, pH7.4 緩衝液を用いた。リン脂質溶液は、L-

過度な血栓生成を防ぐために、トロンビンの働きを

α-phosphatidylcholine (PC) (Avanti, Alabaster,

制御する直接トロンビン阻害剤や、トロンビン生成

AL, 187535) と L- α -phosphatidylserine (PS)を阻害する Xa 阻害剤が誕生しているが、出血リス(Avanti, 189557)を用いた。それらをソニケーター

クがつきまとう。Xa 阻害剤がワルファリンのよう(BIORUPTOR UCD-300, COSMO BIO, Tokyo,

な定期的な血液検査を必要としないといっても、過Japan) を用いてリン脂質溶液を調製した。

度な出血が起こる可能性がある。
本研究で用いた、蛋白質 A は血管の細胞に存在す(2) プロトロンビンから生成されるトロンビンのる蛋白であり、今回調べた凝固関連蛋白質とは異な検出
血漿中の凝固因子（HTI 社より購入）を組み合わるリガンドをもつ。また、近年、蛋白質 A が血栓塞

せ、プロトロンビンから生成されるトロンビンを検栓症にも強い働きがある可能性が見出された。蛋白出した。反応溶液は、CaCl2、リン脂質、血中濃度

質 A は、これまでの血液凝固系研究ではターゲットに合わせた各凝固因子、蛋白質 A、B を含む混合液になることはなかった。蛋白質 A を制御することにを用意した。反応溶液を 37℃ウォーターバスでイン

よって、蛋白質 A に関与する凝固亢進を制御できる

キュベートし、sample buffer と混合し、反応を停可能性が考えられた。

止させた。反応溶液を SDS-PAGE（Wako, 5-20%#194-15021）で泳動し、CBB（Wako, Quick CBB

Ⅴ．結 論

PLUS）染色を行った。

今回の結果から、凝固系活性化を促進する新しい蛋白があることがわかった。本研究で得られた止Ⅲ．結 果

血・血栓・凝固の生理的・病態生理的メカニズムをトロンビン基質の発色にて、トロンビン活性を評もとに、副作用の少ない治療の開発、凝固・血栓の価したところ、正常血漿でみられるトロンビン活性未解明の病態を解く可能性がある。本研究から、血は蛋白質 A によって増加傾向を示した。一方、コン栓形成機構の研究を発展させる機会を得るこができ

トロール蛋白として用いた蛋白質Bではその増加傾た。

はみられなかった。複数の凝固因子欠損血漿を用いて、トロンビン基質試験を行った。欠損因子や蛋白Ⅵ．研究協力者質Aなどの添加でトロンビン活性の増加を示すもの

沢村達也・信州大学医学部・教授があった。

垣野明美・信州大学バイオメディカル研究所・助教

次に、プロトロンビンからのトロンビン生成をみる再構成系を組み、SDS-PAGE によって評価した。

Ⅶ．参考文献

トロンビンの基質として、合成基質ではなくプロト

1)

Lu G, DeGuzman FR, Hollenbach SJ, et

ロンビンを用意し、その切断をみた。この実験によ

al. A specific antidote for reversal of antic

り、
合成基質によるトロンビン活性検出だけでなく、

oagulation by direct and indirect inhibitor

プロトロンビン切断によるトロンビン生成を確認しs of coagulation factor Xa. Nat Med. 2013;19:

た。

446-451

2)

プロトロンビンは、プロトロンビンを切断する凝Xu Y, Cai C, Chandarajoti K, et al. Hom

固因子 Xa を含むいくつかの凝固因子を混合した溶

ogeneous low-molecular-weight heparins w

液中で、経時的に切断された。
蛋白質A存在下では、

ith reversible anticoagulant activity. Nat

コントロール蛋白質 B と比較し、早くトロンビンがChem Biol. 2014;10:248-2503)検出された。

Larsson M, Rayzman V, Nolte MW, et al.
A factor XIIa inhibitory antibody provides thromboprotection in extracorporeal circⅣ．考 察

ulation without increasing bleeding risk.

血液が凝固する際、凝固カスケードによってでき

Sci Transl Med. 2014;6:222ra17.

るトロンビンが重要な働きをもつ。凝固カスケード

14アテローム血栓症の直接的抗凝固療法に繋がるプラークの血栓形成能の解明

宮崎大学医学部病理学講座構造機能病態学分野・助教

山下 篤
Ⅰ．緒 言

素状態に影響されること 6)や、プラークの糖代謝が動脈の血栓形成能を反映することを報告した 7)。こ

心筋梗塞や脳梗塞などの心血管イベントの多くは、動脈硬化巣（プラーク）の破綻に伴う血栓形成によれらの結果から、
ヒトプラーク内の低酸素状態がTFって発症することからアテローム血栓症と総称され発現やプラークの血栓形成能に関与することが推察ている。アテローム血栓が血小板とフィブリンからされた。

なることから抗血小板薬に抗凝固薬の併用が試みら

本研究では、人体病理標本、動脈硬化性血栓モデれたが出血性合併症のリスクが問題となっている。

ル、培養細胞を用いて、冠動脈の血栓サイズと関連

イベント発症にはプラーク破綻が重要であることする因子やプラークの低酸素状態と血栓形成能の関は認識されているが、これまでの人体病理学的研究

連を明らかにすることを目的とする。

や臨床画像診断により、プラーク破綻の多くは無症候性（血栓が小さく非閉塞性）であることが明らか

Ⅱ．対象・方法にされてきており、プラーク破綻が必ずしも血栓性1. 剖検症例の病理学的解析

イベントに発展するとは限らない 1)。よって、プラ

宮崎大学で行われた剖検症例のうち、急性心筋梗ークの血栓形成能（プラーク破綻時に血栓形成を促

塞で亡くなった19 症例の責任冠動脈（症候性血栓、す程度）が破綻後の血栓の大きさとイベント発症に20 血管標本）と非心臓死で血栓を有する 15 症例の極めて重要であると考えられる。このため、プラー

冠動脈（無症候性血栓、20 血管標本）を用いた。

クの血栓形成能を制御する機序の解明は、アテロー

ホルマリン固定後、パラフィンブロックにし連続組

ム血栓症の病態解明のみならず、あらたな抗血栓薬

織標本を作成した。

の開発に繋がることが予想される。

HE 染色標本を用いて、血栓サイズ（μm2）
、血栓/

これまでに、ヒトの大動脈プラークに血液凝固の内腔比（血栓性内腔占拠率、%）、内膜/中膜面積比、開始因子である組織因子（TF）が過剰に発現してい内腔/内膜比（狭窄率、%）、脂質コア面積/血管面積ること 2)、イベント発症急性期に採取された冠動脈比（脂質コア領域比）、プラーク破綻の長さ（μm）

血栓は TF とフィブリンが豊富であること 3)、さらを顕微鏡用画像解析ソフトで測定した。プラーク破に動脈硬化性血栓モデルを用いてプラークの TF 発

綻の長さは線維性被膜の破綻部の長さと定義し図 1

現が動脈血栓サイズに大きく影響すること 4)などをのように測定した。

報告してきた。一方、TF の発現がプラーク破綻部

平滑筋細胞、マクロファージ、TF、グルコース輸での血栓形成において重要な役割を果たしていると

送体 1（Glut-1）、ヘキソキナーゼ II（HK-II）の発考えられているが、冠動脈の血栓サイズを規定する

現を免疫組織化学で半定量評価、もしくは染色陽性

因子は明確になっていない。

細胞数を計測した。

ヒトのプラークにおいて低酸素領域が存在することが報告され、動脈硬化の病態との関連性が示唆さ

2. ヒト冠動脈アテレクトミー標本の病理学的解析

れている 5)。実際、動物モデルのプラークにおいて不安定狭心症 (n=16)、安定狭心症 (n=16)の臨床

低酸素領域の存在を確認し、プラークの代謝が低酸

診断で治療的に摘出されたアテレクトミー標本を用15いた。採取直後に 4%パラフォルムアルデヒドで固(PMA)でマクロファージに誘導、非接着細胞を除去

定しパラフィン標本とした。平滑筋細胞、マクロフ

洗浄し、低酸素下(1%O2)もしくは通常酸素下で培養

ァージ、T リンパ球、hypoxia inducible factor

した。TFmRNA をリアルタイム PCR 法、TF 蛋白(HIF)-1、nuclear factor (NF)-B、フィブリン、と HIF-1、NF-Bp65 核内局在を elisa 法で測定しTF、plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 を免た。また凝固活性の指標として培養細胞による家兎

疫組織化学で評価した。

血漿凝固時間を測定した。

3. 家兎動脈硬化性モデル

7. 統計処理

日本白色家兎 (2.5-3.0kg)を使用した。動脈硬化巣

2 群間比較は Mann-Whiteney U 検定、対応のなの作成のため 0.5%コレステロール食負荷 1 週間後

い t 検定を行った。多群間比較は two way ANOVAに右頸動脈から 2.5mm 径のバルーンカテーテルをののち Bonferroni post-hoc 検定を行った。相関解

挿入し片側の大腿動脈内膜を傷害した。バルーンカ

析では Spearman 順位相関、多重比較解析を行った。

テーテル傷害 3 週後に摘出し組織評価やプラーク培

p<0.05 を統計学的有意差ありとした。

養を施行した。組織内低酸素の検出のためピモニダ
ゾール (Hypoxiaprobe-1, 60mg/kg)もしくはコント

Ⅲ．結 果

ロールの生理食塩水を血管採取 2 時間前に静脈投与

1-1 症候性、無症候性血栓を有する冠動脈の特徴した。平滑筋細胞、マクロファージ、ピモニダゾー

症候性血栓は無症候性血栓と比較して血栓サイズ、ル、HIF-1、NF-B、TF を免疫組織化学で評価、血栓による内腔占拠率、プラーク破綻の長さが高値

染色陽性面積等を画像処理ソフトで半定量評価した。

であった（図１）。

局在を蛍光免疫染色で評価した。

無症候性プラーク破綻

4. 家兎動脈硬化性血栓モデル
上記同様に動脈硬化巣を作成し、バルーンカテー
テル傷害 3 週後、大腿動脈に再度 2F のバルーンカ*

テーテルを挿入し内膜を傷害した。傷害 15 分後、ヘパリン(500U/kg)による抗凝固処理後に摘出、4%パラフォルムアルデヒドで固定しパラフィン標本を作成した。大腿動脈に形成された血栓面積を顕微鏡下で測定し血栓量とした。血栓中に占める血小板とフィブリンを免疫組織化学で半定量評価した。

症候性プラーク破綻
5. プラーク培養
上記同様に動脈硬化巣を作成し、バルーンカテー
テル傷害 3 週後に大腿動脈を摘出し、実体顕微鏡下で動脈硬化巣を剥離、無血清の Dulbecco’s modified*

Eagle’s medium に浸し、低酸素下(1%O2)もしくは
通常酸素下で培養した。培養血管の HIF-1、
NF-Bp65核内局在を免疫組織化学もしくは蛍光免疫染色法で、
TF とPAI-1 発現をelisa 法で測定した。
HIF-1 阻害薬 dimethyl-bisphonol (100μmol/L)や
NF-B 阻害薬 Bay11-7085 (20μmol/L)を使用した。

図１ 冠動脈の無症候性および症候性プラーク破綻に伴う血栓のHE 染色写真。

6. 細胞培養

プラーク破綻の長さを線維性被膜の破綻部の長さ（両矢印）とし単球系細胞 THP—１を RPMI1640 培地で培養した。無症候性血栓は小さな壁在血栓（上段、＊）であるが、症候た。100 nmol/L の phorbol 12-myristate 13-acetate性血栓の破綻部は長く閉塞性血栓（下段、＊）の形成を認める。

16

スケールバー1mm、文献 8 より。

また、内膜/中膜比、狭窄率、脂質コア領域も症候性血栓を有する冠動脈で高値であった。図 2 に無症候†性、症候性血栓を有する冠動脈の HE 染色とマクロファージを認識する抗体CD68 と平滑筋を認識する

HE

*
HE

抗体 SMA を用いた免疫組織化学を示す。いずれもプラーク破綻と血栓形成を認めるが、無症候性血栓は非閉塞性血栓であるのに対し、症候性血栓は内腔*†をぼぼ閉塞していた。破綻部のプラークにはマクロファージの浸潤を認め、平滑筋細胞に乏しかった。

CD68

CD68

マクロファージの浸潤は症候性血栓を有するプラークで多い傾向を示したが有意差を認めなかった。平

†滑筋細胞は症候性血栓を有するプラークで少ない傾*向を示したが有意差を認めなかった。このように、プラーク破綻にはプラークの脆弱性が重要であるが、TF

大きな血栓形成にはプラーク破綻の程度やプラーク

図 3. 症候性血栓を有する血管の標本の HE 染色写真と、CD68、の大きさが重要であると考えられる。

TF の免疫組織染色。

無症候性プラーク破綻

TF の発現を脂質コア辺縁、内部（左列）、プラーク表層（右列）TFで認め、CD68 陽性マクロファージの分布と関連している。*印は血栓を示す。†印は、脂質コアを示す。スケールバー500m （左段）、100m（右段）、文献 8 より。

***
これまでの基礎研究から動脈の糖代謝と血栓形成能やプラークの低酸素と糖代謝産物の変化の関連性が示唆されたため 6,7)、糖代謝関連の低酸素応答性因子の発現を検討した。図 4 に症候性血栓の標本にお症候性プラーク破綻

けるHE 染色とCD68、グルコース輸送体のGlut-1、
解糖系の酵素である HK-II の免疫組織化学を示す。

**

Glut-1 と HK-II は CD68 陽性のマクロファージの*一部に局在していたが、HK-II の陽性細胞は Glut-1
よりも広範囲に分布した。Glut-1 や HK-II の陽性
細胞数は症候性血栓を有するプラークで有意に多か

HE

CD68

SMA

った。

図2 無症候性、症候性血栓を有する血管のHE染色写真とCD68、
SMA の免疫組織化学。無症候性血栓は壁在血栓（星印）であるが、症候性血栓（*印）は狭窄した内腔を閉塞している。いずれも線維性被膜破綻部周囲に平滑筋細胞は乏しくマクロファージの浸潤を認める。スケールバー1mm、文献 8 より改変。

図 3 に症候性血栓の標本における HE 染色、CD68と TF の免疫組織化学を示す。
TF は脂質コアの周辺や内部、プラーク表層に分布しており、一部はマクロファージの分布と一致していた。TF 染色陽性面積は症候性血栓を有するプラークで有意に大きかった。

17

固活性の重要性を支持する結果であった。さらに冠動脈においても低酸素応答と糖代謝活性や血栓形成能の関連が示唆された。

HE

2 虚血性心疾患の冠動脈プラークにおける HIF-1

CD68

や NF-B と血栓性因子の関連
HIF-1や NF-B は低酸素応答性の転写因子であり、後者は TF 発現を誘導することが知られている。
冠動脈の血栓性病態と HIF-1や NF-B の関連を検討するために、安定狭心症と不安定狭心症のアテGlut-1

HK-II

レクトミー標本を用いた。不安定狭心症のプラーク

図 4. 症候性血栓を有する血管の HE 染色写真と、Glut-1、HK-IIは安定狭心症のプラークと比して、フィブリン、TFの免疫組織染色。

及び低酸素応答性線溶抑制因子であるPAI-1 の陽性

プラーク辺縁に分布するマクロファージ領域の一部に Glut-1 と面積、マクロファージ陽性面積が広く、T リンパ球

HK-II の発現を認める。
Glut-1 の発現は HK-II と比較して少ない。

数、HIF-1と NF-Bp65 蛋白の陽性核数が増加しスケールバー100m、文献 8 より。

ていた。血栓性プラークの免疫組織化学で、TF、
PAI-1、フィブリン、HIF-1、NF-Bp65 が近傍に

1-2. 冠動脈の血栓サイズや血栓性内腔占拠率と血局在していた（図 5）。

管因子の相関HE

冠動脈血栓の大きさや血栓による内腔閉塞と関連

Tissue Factor

FibrinPAI-1thrombus

する血管因子を明らかにするために相関解析を行っ100μmた。冠動脈の血栓サイズは、破綻の長さ、TF 陽性

HIF-1αNF-κB p65

面積、
HK-II 陽性有核細胞数と正の相関を示した（表
1）。また、血栓性内腔占拠率は、破綻の長さ（r=0.77）、
100 μm内膜/中膜比（r=0.49）、狭窄率（r=0.43）
、脂質コア

50mm

100μm

50mm

領域比（r=0.31）、TF 陽性面積（r=0.46）、HK-II

図 5. 不安定狭心症プラークにおける HIF-1や NF-B と血栓性陽性有核細胞数（r=0.43）と正の相関を示した。

因子の局在。
血栓性プラークにフィブリンの付着、
tissue factor や PAI-1 の局在、HIF-1と NF-Bp65 の陽性核を認める。HIF-1と NF-Bp65

表１ 血栓サイズと血管因子の相関（文献 8 より改変）

画像内の黒枠の強拡大をそれぞれ下段右側に示す。文献 9 より。

p値

r
破綻の長さ

0.80

<0.0001

内膜・中膜比0.24

0.13

冠動脈プラークの HIF-1陽性核数はマクロファ

狭窄率

0.15

0.37

ージ面積(r=0.56, p<0.01)、NF-Bp65 陽性核数

脂質コア領域比

0.23

0.16

(r=0.48, p<0.01), TF 陽性面積 (r=0.50, p<0.01)、

SMA 陽性面積

-0.17

0.29

PAI-1 陽性面積 (r=0.19, p<0.01)、フィブリン面積CD68 陽性面積

0.23

0.16

TF 陽性面積

0.38

<0.05

Glut-1 陽性面積

0.16

0.33

HK-II 陽性面積

0.40

<0.05

(r=0.38, p<0.05)との相関を認めた。さらに、冠動脈プラークの HIF-1陽性核数は血栓性プラークで増加していた。
上述の冠動脈の病理学的解析より低酸素応答と冠動脈の血栓形成能やその病態における HIF-1やNF-B の関与が示唆されたため、以下の動物実験や破綻の長さと血栓サイズや閉塞率との強い関連性

培養実験を行った。

から、急性心筋梗塞の発症にプラーク破綻の程度が極めて重要であることが考えられる。また血小板と

3. 家兎動脈硬化血管における低酸素と TF 発現

フィブリンからなる血栓形成においてプラークの凝0.5%コレステロール負荷食とバルーンカテーテ

18ルによる内腔傷害により誘導した動脈硬化病変と非5. 大腿動脈プラーク内の低酸素応答と血栓性因子

傷害コントロール血管の組織写真を示す。ピモニダの発現

ゾールの免疫組織化学で検出される低酸素領域はププラーク内での低酸素細胞の応答と TF や PAI-1

ラーク深部のマクロファージに富む部分とプラークの発現を検討するために、家兎大腿動脈からプラー

表層の細胞の一部に局在していた（図 6）。

クを摘出し 1%O2 の低酸素下で培養した。蛍光２重

HE

SMC

Macrophage

Pimonidazole

染色で低酸素細胞の核内にHIF-1やNF-Bp65のHIF-1α局在を認めた。また同部位では TF の発現が亢進していた（図 7）。
1%O2 の低酸素下で HIF-1と NF-Bp65 の陽性
核数は 6 時間、3 時間をピークとして増加し、TF
や PAI-1 の発現は６時間で有意に増加した。その増図 6. 家兎大腿動脈の動脈硬化巣における低酸素領域の局在

加は HIF-1阻害薬もしくは NF-B 阻害薬の添加

動脈硬化巣（下段）は平滑筋細胞、マクロファージと細胞外器質で抑制された。

からなり、プラーク深部と一部の表層細胞にピモニダゾール陽性の低酸素領域と HIF-1陽性核を認める。上段はコントロール血管。

Apimonidazole

NF-κB p65

NI (動脈硬化巣の新生内膜) 、文献 9 より。

脂肪染色ではマクロファージに富む領域に、中性50 μm

脂肪の蓄積が見られた。蛍光２重染色でピモニダゾ
DAPI

Merge

HIF-1αNF-κB p65

ール陽性細胞の主体はマクロファージであった。低酸素領域、HIF-1や NF-Bp65 の陽性核数、TF
陽性面積はコントロール血管と比較して動脈硬化血管で増加していた。血管内に占める低酸素領域は、B

内膜中膜比 (r=0.70, p<0.01)、マクロファージ面積(r=0.63, p<0.01) 、 HIF-1 (r=0.62, p<0.01) や
NF-Bp65 (r=0.42, p<0.05)の陽性核数、および TF
陽性面積 (r=0.59, p<0.01)と相関していた。このよ

50 μm

うに低酸素領域に一致したHIF-1やNF-Bp65の

DAPI

Merge

核内局在や組織因子発現との関連性が確認された。
4. 血管壁の低酸素と動脈血栓形成
血管壁の低酸素と血栓形成の関連を検討するため
Cに、家兎大腿動脈血栓モデルを用いて評価した。大pimonidazole

Tissue Factor

Merge

腿動脈のバルーン傷害 15 分後に形成される血栓はコントロール血管と比して動脈硬化血管で大きく血50 μm

小板やフィブリンで形成されていた。血管壁の低酸

図 7. 低酸素下プラーク組織における HIF-1、NF-B、TF の発素領域は血栓総面積 (r=0.38, p<0.01)、血小板陽性

現

面積 (r=0.32, p<0.05)、血栓のフィブリン陽性面積

家兎大腿動脈の動脈硬化巣を剥離し 1％O2 下で 6 時間培養した。

(r=0.87, p<0.0001)と正の相関を認めた。多変量解析

ピモニダゾール、HIF-1、NF-B、TF、DAPI の蛍光３重染色。

の結果、低酸素領域とマクロファージ面積は TF 発

ピモニダゾール陽性細胞に NF-Bp65 の陽性核、同一核における現の独立した予測因子であった。この結果より、血HIF-1、NF-B の局在、ピモニダゾール陽性領域に TF の発現を

管壁の低酸素状態は血液凝固活性を反映しプラーク認める。文献 9 より改変。

破綻後のフィブリン形成に関与することが示唆された。
6. マクロファージにおける低酸素と TF 発現

19

マクロファージにおける低酸素刺激と TF 発現をづけることが示唆された。その応答に HIF-1や検討するために、PMA を用いて THP-1 細胞をマク

NF-B の関与が考えられる。興味深いことにそれら

ロファージに誘導した。TFmRNA や TF 蛋白は低２つの因子は相互作用性に TF の発現に寄与してい酸素刺激(1%O2)6 時間後をピークに増加し、核内タると考えられた 9,10)。 一方、プラークの病態には炎ンパクに占めるHIF-1やNF-Bp65も増加してい症性刺激が重要である。プラークの血栓形成能におた。細胞の血液凝固活性の指標である血漿凝固時間

いて炎症性刺激と低酸素環境の相加作用もしくは相は低酸素培養下で短縮（凝固活性の増加）していた。

乗作用が予想され、現在検討を進めている。

それらは HIF-1阻害薬もしくは NF-B 阻害薬の添加で抑制された（図 8）。

Ⅴ．結 論
プラークの血栓形成能を規定する機序は明確ではなく、それを標的とした治療法は確立されていない。
本研究の成果によりプラークの血栓形成能の指標として低酸素応答により誘導される TF 発現の重要性が動物モデルや培養細胞のみならずヒトの冠動脈においても確認された。本研究はアテローム血栓症の抗凝固治療法を目指した基礎的研究でありプラーク
内の TF 発現を標的とした抗凝固療法の発展に重要な情報をもたらすと考えられる。

Ⅵ．研究協力者
松浦祐之介・宮崎大学医学部・大学院生
図 8. 培養マクロファージにおける TF 発現と凝固活性

前川和也・宮崎大学医学部・大学院生

THP-1 マクロファージを 1%O2 の低酸素下もしくは通常酸素下で浅田祐士郎・宮崎大学医学部・教授

6 時間培養、TFmRNA (n=6 ずつ)、TF 蛋白 (n=4~6)、核蛋白質
における HIF-1 α (n=5 ずつ)や NF-κBp65 (n=8~10 ずつ)、家Ⅶ．参考文献兎血漿凝固時間 (n=6 ずつ)を測定した。dimethyl-bisphonol

1)Sato Y, Hatakeyama K, Yamashita A,(HIF-1 阻害薬, 100mol/L)や Bay11-7085 (NF-κB 阻害薬,

Marutsuka K, et al. Proportion of fibrin and20mol/L)、†p<0.01, ‡p<0.0001、文献 9 より改変。

platelets differs in thrombi on ruptured anderoded coronary atherosclerotic plaques inhumans. Heart. 2005;91:526-30.

Ⅳ．考 察
2)

冠動脈プラーク破綻後の血栓形成には血小板の凝Hatakeyama K, Asada Y, Marutsuka K, Sato

集とフィブリンの形成からなる。
病理学的検討より、

Y, et al. Localization and activity of tissue

プラーク破綻の程度が血栓サイズや急性心筋梗塞の

factor in human aortic atherosclerotic lesions.

発症と強い関連を示し、血小板や血液凝固反応の活

Atherosclerosis. 1997;133:213-219.
3)

性化の程度が、症状の発症に極めて重要であること

Yamashita A, Sumi T, Goto S, Hoshiba Y, et

考えられた。今回の検討では血小板の活性化因子を

al. Detection of von Willebrand factor and

検討していないためプラークの血栓形成能を総合的

tissue factor in platelets-fibrin rich coronaryに判断することはできないが、冠動脈の血栓形成に

thrombi in acute myocardial infarction. Am J

おけるプラークの凝固活性の重要性が確認された。

Cardiol. 2006;97:26-28.
4)血液凝固反応によって生じるトロンビンが血小板活Yamashita A, Matsuda S, Matsumoto T,

性化に働くことが一因と考えられる。また動物モデ

Moriguchi-Goto

S,

ルの検討同様に糖代謝と血栓形成能の関連が示唆さ

generation

intimalれた。今回の研究によりプラーク内の低酸素環境に

contributes to thrombus formation on

対する細胞応答が糖代謝の亢進と血栓形成能を関連

macrophage-rich neointima but not normal

20

by

et

al.

Thrombintissuefactorintimaofhyperlipidemic

rabbits.

Atherosclerosis. 2009;206:418-426.
5)

Sluimer JC, Gasc JM, van Wanroij JL,
Kisters N, et al. Hypoxia, hypoxia-inducible
transcription factor, and macrophages inhumanatherosclerotic

plaquesarecorrelated with intraplaque angiogenesis. J
Am Coll Cardiol. 2008;51:1258-1265.
6)

Yamashita A, Zhao Y, Matsuura Y, Yamasaki
K, et al. Increased metabolite levels of
glycolysis and pentose phosphate pathway inrabbit atherosclerotic arteries and hypoxic
macrophage. PLoS One. 2014;9:e86426.

7)

Yamashita A, Zhao Y, Zhao S, Matsuura Y, etal. Arterial (18)F-fluorodeoxyglucose uptake
reflects balloon catheter-induced thrombus
formation and tissue factor expression via
nuclear factor-κB in rabbit atherosclerotic
lesions. Circ J. 2013;77:2626-2635.

8)

Okuyama N, Matsuda S, Yamashita A,
Moriguchi-Goto S, et al. Human coronary
thrombus formation is associated with
degree of plaque disruption and expressionof tissue factor and hexokinase II. Circ J.
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9)

Matsuura Y, Yamashita A, Iwakiri T, Sugita
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arterial

thrombus

formationvia

augmentation of vascular thrombogenicity.
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editor.

Thrombosis,

atherothrombosis:

atherosclerosisNew

insights

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Intech; 2015. p.1-p.25.

21