この使用説明書をよく読んでから使用してください。

パラフィン包埋切片用

研究用試薬

ヒストファイン

貯法：2－8℃保存
有効期間：製造後 1 年 6 ヶ月**

ハイステイン PO(MULTI)(ヒストステイナー用)○切片および標本の準備[パラフィン包埋切片]
切片を 3－6μｍに薄切し、スライドに付着させる。もし、熱による抗原賦活化処理やタンパク分解酵素処理を行う場合は、0.02％ poly-L-lysine
あるいはシランなどの組織切片用接着剤を使用する。

【全般的な注意】

1. 本品は、自動染色装置ヒストステイナー専用試薬である。
2. 研究用としてのみ使用すること。
3. 検体は感染の危険があるものとして取り扱いに注意すること。
4. ヒストステイナーおよびその他使用する機器の添付文書および取り扱
い説明書をよく読んでから使用すること。

[検体標本スライドの準備]*
検体標本スライドとして１検体あたり、2 枚準備する。
１枚は、試薬対照スライドとして、第一抗体のかわりにネガティブコントロール（マウス正常血清またはウサギ正常血清）を使用して染色操作を行う。
注）本試薬は高感度検出を目的としているため、バックグラウンド染色が認められる場合がある。陽性/陰性判定に影響を与える場合があるので、試薬対照スライドを必ず用意すること。*【内容】*

ハイステイン PO(MULTI)は2種類の試薬から構成される。
包装単位
構成試薬714481
ハイステイン

60テスト

A液

液状。
抗マウスIg(動物種：ヤギ)および抗ウサギIg(動物種：ヤギ)。
安定化タンパク質と抗菌剤を含むMOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)緩衝液(pH6.5)にて即時使用可能な濃度に調製済み。

ハイステイン[検体対照スライドの準備]
・陽性コントロールスライド
検体標本スライドと同様の方法で作製され、あらかじめ目的抗原が存在することを確認している組織切片スライド
・陰性コントロールスライド
検体標本スライドと同様の方法で作製され、あらかじめ目的抗原が存在しないことを確認している組織切片スライド

12mL×1本B液

液状。
アミノ酸ポリマーに、ペルオキシダーゼとFab’にした抗ヤギIg(動物種：ウサギ)を結合させた標識ポリマー。
安定化タンパク質と抗菌剤を含むMOPS(3-Morpholinopropanesulfonic acid)緩衝液(pH6.5)にて即時使用可能な濃度に調製済み。

12mL×1本以上の検体対照スライドを用意し、検体標本スライド及び試薬対照スライドと並行して、検体の準備から染色処理、検鏡までの全工程を行う。

【用途及び原理】
ヒト組織用免疫組織化学染色試薬。マウスまたはウサギ第一抗体に用いる。
酵素抗体法により、組織中の抗原を検出する。ヒト組織切片上の抗原にマウスまたはウサギ第一抗体を反応させ、次にハイステインA液を反応させ、さらにハイステインB液を反応させる。その結果、抗原・抗体・ポリマー・酵素の複合体が形成され、この複合体の酵素活性を利用して基質を発色させる。これにより抗原部位を視覚化し、光学顕微鏡により抗原の有無を確認する。

原理図【用法・用量(操作方法) 】○検体の準備組織形態や抗原活性を維持した最適固定を得るため、できるだけ新鮮で小さな組織切片(約 1cm×1cm×0.5cm)の使用と、下表の固定液の使用を勧める。
固定液10％(緩衝)ホルマリン
20％ホルマリン**2016 年 11 月改訂(第 4 版)
*2015 年 3 月改訂(第 3 版)
2012 年 12 月作成

固定時間
24-48 時間
12-24 時間-1-

[スライドバーコードラベルの印字と貼付](1) ヒストステイナーの操作法に従って各スライドのスライドバーコードラベルを作成する。
(2) スライドバーコードラベルをスライドのフロスト部分に貼り付ける。
この時、バーコードが切片側にくるように注意する。
○操作方法[必要な試薬、器具･機器]
・スライドガラス・乾燥器
・タイマー・染色ドーゼ・キシレン
・95%エタノール
・100%エタノール
・洗浄用容器・洗浄ビン
・PBS(｢PBS Code:415223｣を使用することを推奨する。)
・試験管・自動染色装置ヒストステイナーシステム
・スライドバーコードラベル(ヒストステイナー用)( Code: LV-6011JP)
・試薬ボトル(ヒストステイナー用)( Code:LV－6041JP)
・スライドスタンド・精製水・バッファー(｢PBS(ヒストステイナー用) Code:715224(10 倍濃縮)｣を使用することを推奨する。)
・ブロッキング試薬（3％過酸化水素水）(｢過酸化水素水(ヒストステイナー用) Code:715242｣を使用することを推奨する。あるいは、30％過酸化水素水を精製水で 10 倍に希釈する。)
・マウス第一抗体・ネガティブコントロール（マウス正常血清）・ウサギ第一抗体・ネガティブコントロール（ウサギ正常血清）
・基質溶液(｢DAB 基質キット(ヒストステイナー用)Code:725191｣を使用することを推奨する。）
・対比染色試薬・カバーガラス・封入剤(非水溶性永久封入剤)
・ティッシュペーパー ・光学顕微鏡
・組織切片用接着剤（0.02％poly-L-lysine、シランなど）
・抗原賦活化液(必要な場合)

[試薬バーコードラベルの印字と貼付](1) ヒストステイナー専用試薬以外の試薬を調製する場合、ヒストステイナーの操作方法に従って、試薬バーコードラベルを作成する。
(2) 試薬バーコードラベルを、ヒストステイナー専用試薬以外の各試薬を入れた試薬ボトルの上部平面部分に貼り付ける。この時、印字した文字が試薬ボトルの開口部側にくるように注意する。

[免疫染色の準備・開始](1) ブロッキング試薬、抗原賦活化液(必要な場合)、第一抗体、ネガティ
ブコントロール、ハイステイン A液、ハイステインB液、基質溶液は試薬ラック(ヒストステイナー用)にセットし、バッファー、精製水は各給液ボトルにセットする。
(2) 検体標本スライド、試薬対照スライド、検体対照(陽性コントロール、陰性コントロール)スライドをスライドラック (ヒストステイナー用)にセットする。洗浄ビンにバッファーを入れておき、セット後、すぐに組織が覆われるようにバッファーをかけておく。
注) 染色開始までの間に切片が乾燥しないように注意する。バッファーをかけた後、30分以上放置する場合は、30分おきに組織が覆われるようにバッファーをかけること。
(3) ヒストステイナーの操作法に従って染色を開始する。

[染色方法の設定]○フローチャート
脱パラフィン↓
熱処理(抗原賦活化液)による処理※第一抗体に応じて処理を設定[免疫染色の終了、対比染色](1) 全てのスライドをスライドラック (ヒストステイナー用)から取り出し、流水洗する。
(2) 対比染色試薬にスライドを浸す。
(3) 流水洗する。
(4) セットした試薬を試薬ラック(ヒストステイナー用)から取り出し、基質溶液以外の試薬は 2－8℃で保存する。
(5) 基質溶液用専用試薬ボトルに残った基質溶液は廃棄し、ボトル内を精製水で洗浄した後、完全に乾かして再利用する。

↓ブロッキング試薬(3％過酸化水素水)による処理↓
タンパク分解酵素(抗原賦活化液)による処理※第一抗体に応じて処理を設定↓
第一抗体またはネガティブコントロールの添加･反応↓
ハイステイン A 液の添加･反応↓
ハイステイン B 液の添加･反応↓
基質溶液の添加･反応↓
対比染色、封入注）基質溶液の使用については、｢DAB 基質キット(ヒストステイナー用)Code：725191｣の使用説明書内記載の 2.基質溶液の調製 を参照すること。

[封入]
DAB 発色の場合は、水洗、脱水、キシレンによる透徹後、非水溶性封入剤で封入する。

【測定結果の判定法】○判定方法光学顕微鏡によって陽性反応を観察する。
染色結果の判定は、3 種類の対照スライドとの比較により行う。
・陽性コントロールスライド陽性所見が得られる。
・陰性コントロールスライド
陽性を呈する細胞が認められない。
・試薬対照スライド陽性を呈する細胞が認められない。このスライドが染色されれば、非特異的なタンパク結合などによる非特異的反応が考えられる。

○ヒストステイナーのプロトコール設定
ヒストステイナーの操作法に従って下記染色方法のプログラムを設定する。必要な場合には、第一抗体との反応の前に抗原賦活化液(Pretreatment)処理を追加すること。
注)( )内の名称はヒストステイナープログラム内の｢プロトコール要素｣設定の際の名称である。
(1) ブロッキング試薬(3％過酸化水素水)(End.Enz.Block) 5 分間
(2) バッファー(Rinse Buffer)
1回(3) 第一抗体(Primary Antibody)30 分間
検体標本スライド、検体対照(陽性コントロール、陰性コントロール)
スライドには第一抗体、試薬対照スライドにはネガティブコントロー
ルを反応させる。
(4) バッファー(Rinse Buffer)
2回(5) ハイステイン A 液(Secondary Reagent)
10 分間(6) バッファー(Rinse Buffer)
2回(7) ハイステイン B 液(Labelled Polymer)
10 分間(8) バッファー(Rinse Buffer)
2回(9) 基質溶液(Substrate)
5 分間(10)バッファー(Rinse Buffer)
1回(11)精製水(Rinse Water)
1回滴下する試薬の用量は、スライドあたり 200μL を推奨する。ただし、組織切片の大きさに応じて 100μL、150μL、400μL あるいは 600μL に設定することが可能である。

○判定上の留意事項*(1) 必ず各検体対照スライドおよび試薬対照スライドの染色結果と比較して、染色結果を判定すること。*(2) 明瞭な染色を得るには、包埋剤を完全に除去することが大切である。
パラフィンの残存物は、バックグラウンド染色を強める原因となる。
(3) 一般的にタンパク質や基質反応生成物の非免疫的結合により、偽陽性結果が観察される場合がある。偽陽性結果は赤血球による偽ペルオキシダーゼ反応やサイトクローム C による内因性ペルオキシダーゼ反応によっても起きることがある。
(4) 検体組織の壊死部分は、抗体が非特異的に結合しやすく、非特異染色の原因となりやすいので、試薬対照スライドと比較し、十分注意して判定すること。*(5) 間質系のコラーゲンは固定後疎水性となって抗体と結合しやすくなり、また、陰性に帯電しているため陽性に帯電している抗体と結合しやす
く、非特異染色の原因となりやすいので、各検体対照スライドおよび試薬対照スライドと比較し、十分注意して判定すること。*(6) 顆粒球の一部およびマクロファージなどは細胞膜表面に Fc レセプターを有するため、抗体の Fc 部分と結合する可能性がある。抗体本来の特異的反応部位以外に染色が現れることがあるため、必ず各検体対照スライドおよび試薬対照スライドと比較し、十分注意して判定すること。*[脱パラフィン]1.キシレン処理(1) スライドをキシレンに 3 分間浸す。
(2) 余分な液を振り払い、別のキシレンに 3 分間浸す。
(3) 余分な液を振り払い、さらに別のキシレンに 3 分間浸す。
2.エタノール処理(1) 100%エタノールに 3 分間浸す。
(2) 余分な液を振り払い、別の 100%エタノールに 3 分間浸す。
(3) 余分な液を振り払い、95%エタノールに 3 分間浸す。
(4) 余分な液を振り払い、別の 95%エタノールに 3 分間浸す。
3.洗浄
余分な液を振り払い、PBS またはバッファーでよくすすぐ (3 分間ずつ容器を 2 度かえるか、または洗浄ビンを使用する)。

-2-【使用上又は取り扱い上の注意】【貯蔵方法・有効期間】**

1.取り扱い上（危険防止）の注意(1) 検体は、取り扱い者に感染を引き起こす危険性がある。従って、適切な取り扱いを必要とする。
(2) 皮膚などへの接触は避けること。

貯蔵方法：2－8℃で保存
有効期間：製造後 1 年 6 ヶ月**

2.使用上の注意(1) 試薬は 2－8℃で保存すること。
(2) 全ての試薬は使用前に常温(15－25℃)に戻して使用すること。
(3) 使用期限の過ぎた試薬は使用しないこと。
(4) 染色開始前はいかなる過程でも切片を乾燥させないようにすること。
なお、バッファーを洗浄ビンに入れておき、スライドラック(ヒストステイナー用)にセットした後すぐに、組織が覆われるようにバッファーをかけておく。その後 30 分以上放置する場合は、30 分おきに組織が覆われるようにバッファーをかけること。
(5) 抗原は熱に弱いので、組織を包埋する際に、パラフィンの温度を 58℃以上に上げてはならない。
(6) 脱パラフィンに用いるキシレンおよびエタノールは、スライドを 40枚処理するごとに取り替える。
(7) 脱パラフィンおよび封入過程で、キシレンがスライドバーコードラベルに接しないように注意する。キシレンがラベルに接すると、印字が消えやすくなる。もしラベルがキシレンで濡れたり、キシレンを取り扱った手袋で触れた場合、完全に乾燥するまでラベルに触れないようにスライドを扱うこと。
(8) ステロイドやその他小さな分子は、有機溶媒に極めて溶けやすく、抗原の損失を防ぐには、固定剤の選択に注意する必要がある。

ヒストファイン ハイステイン PO(MULTI) (ヒストステイナー用)【包装単位】*

ハイステイン A 液

12mL×1本

ハイステイン B 液

12mL×1 本

上記キットと組み合わせて使用することを推奨する。
製品名
コード

包装単位

DAB 基質キット(ヒストステイナー用)

600 テスト725191【試薬バーコードラベル】
試薬バーコードラベルを使用する場合は、自動染色装置ヒストステイナーのプログラムにバーコードラベル情報を入力する必要がある。本製品が未登録の場合は、下記データを入力(漢字のみ全角、他半角入力)し、登録すること。
専用ボトルに貼付されているバーコードラベル内の情報
Secondary Reagent
登録するカテゴリ
試薬名
ﾊｲｽﾃｲﾝ PO(Mu)A
試薬略称（10 文字） HIPO-MuA
バーコード
HIPO-MuA
時間(分)103.廃棄上の注意(1) 検体組織に接触した器具・試薬および試薬容器等は感染の危険性があるので、オートクレーブで 120℃、20 分間滅菌処理するか、または 1.0％次亜塩素酸などの消毒液に浸して一晩処理すること。

【トラブルシューティング】*
問題点

考えられる原因

対策○陽性コントロール
スライド及
び標本スラ
イドの染色が認められない、あるいは弱い。
○陽性コントロール
スライドは染色されるが、標本ス
ライドは染色 さ れ ない。
○全ての染色スライドのバックグラウンドが強く染色される。

①切片が乾燥している。
②包埋剤が不適当あるいはパラフィン包埋組織からのパラフィン除去が不完全である。
③基質溶液の反応が不十分。

①切片を湿潤させた後は、乾燥させない。
②適当な包埋剤を選択する。また、包埋組織から、パラフィンを完全に除去する。
②キシレン、エタノール溶液を取り替える。
③基質溶液の設定処理時間を延長する。

①抗原が固定あるいは包埋過程で変性したり、マスクされている。
②自己消化により抗原が破壊されている。
③組織に存在する抗原が少ない。

①抗原の中には、固定や包埋に敏感なものがあるので、穏やかな固定剤を使用し固定時間を短縮する。
②採取した組織はすみやかに適切な方法で固定を行うこと。
③基質溶液の設定処理時間を延長する。

①高感度検出用 ハイス
テイン PO (MULTI)の使用によるため。*②内因性ペルオキシダー
ゼを不活性化するための処理が不十分。

①各検体対照スライドおよび試薬対照ス
ライドの染色結果と比較して、染色結果を判定する。*②ブロッキング試薬（3％過酸化水素水）による指定された処理を設定する。または、設定処理時間を 5 分間から 10 分間に延長する。
③可能ならば、新鮮な組織を包埋する。

③自己消化の結果、組織液に遊離した抗原が過剰に存在する。
④不完全なパラフィン除去。
⑤不十分な抗体の洗浄。
⑥室内温度が高すぎて、酵素反応が早すぎる。
○ 反 応 中 ①スライドへの切片の貼に組織切片り付けが不十分。
がスライドからはがれてしまう。

包装単位
コード：714481
60テスト

登録するカテゴリ
試薬名
試薬略称（10 文字）バーコード時間(分)Labelled Polymer
ﾊｲｽﾃｲﾝ PO(Mu)B
HIPO-MuBHIPO-MuB
10

問合せ先、製造販売元、販売元は次頁に記載。

④キシレン、エタノール溶液を取り替える。
⑤抗体の洗浄の回数を増やす。
⑥常温（15－25℃）にコントロールする。
①0.02％poly-L-lysine、シランなどの組織切片用接着剤を使用する。

-3-

【問合せ先、製造販売元、販売元】〒104-8402 東京都中央区築地 6-19-20
TEL：03-3248-2208
FAX：03-3248-2243-4-