外部環境因子により発症する慢性閉塞性肺疾患の分子解析
The molecular analysis for environmental
factors-induced chronic obstructive pulmonary disease.
千葉大学

研究代表者
大学院医学研究院 助教授

粕谷善俊

Chiba University, Graduate School of Medicine
Associate Professor Yoshitoshi Kasuya
研究協力者

要旨：

筑波大学 動物資源センター
理化学研究所
千葉大学 大学院医学研究院
千葉大学 大学院医学研究院助教授
研究員
教授
助手

杉山文博
須藤龍彦
桑木共之
古屋充子

肺気腫および慢性気管支炎の総称である慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、喫煙・大気汚染・職業的な塵埃や化学物質が発症原因として考えられ、気管支・細気管支と肺胞に炎症性の病変が生じ、慢性的な呼吸困難を起こす病気である。最近の WHO の統計では世界の死亡原因の第 4位にランクされ、日本においても約 530 万人の患者がいると推定されている。その発症機構は不明な点が多く、現時点では有効な治療法も存在せず、COPD の発症機構の分子レベルでの解明および治療法の開発は、社会的な急務と位置づけられている。
本研究は、遺伝子改変により COPD の症状を呈するモデルマウスを樹立し、その発症機構を分子レベルで解明するとともに有効な治療法を開発することを目的とする。

Abstract:

COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) is lung disease associated with airflow

obstruction, including emphysema, chronic bronchitis and chronic asthma either alone or in combinations.
The main cause of COPD is cigarette smoke, but air pollution by diesel particle matter is also one ofreason for causing COPD.

Worldwide, WHO reports that COPD is the fourth leading cause of death.

It is estimated that there are currently over 5 million people in Japan diagnosed with COPD.

The precise

mechanism of COPD is still poorly understood. However, tissue inflammation is noted throughout thebronchial tree and in the parenchyma of lungs from patients with COPD, suggesting that inflammation isat least critical in progression of COPD.

This notion was supported by the fact that the overexpressionof proinflammatory cytokine in lung causes a mouse phenotype with emphysema.
We and other investigators have demonstrated that p38 mitogen-activated protein kinase(p38) plays a central role in process of tissue inflammation by regulating proinflammatory cytokines

1production.

We hypothesized that p38 constitutively activated in lung leads COPD secondary toinflammation.

To address this hypothesis, we used a site-specific overexpression transgenic modelingsystem to target p38 to the murine lung. Our preliminary data clearly demonstrated that activated p38
causes alveolar enlargement, one of characteristic features of COPD.

By using this mice model, weelucidate the molecular mechanism of COPD and develop the effective treatment for COPD.

１.研究目的異により常時不活性型としたもの）の N 末に第一の達成目標：肺胞特異的に p38 の常時M2-tag を配したコンストラクトを作製した。

活性上昇を促したトランスジェニックマウス

これら２つの遺伝子をそれぞれヒト・サーフ(TG)を作出し、COPD の所見を呈するか否か？

ァクタント蛋白(SP)-C プロモーターの下流にまた、肺胞特異的に p38 の常時活性低下を促配したトランスジーンを作製し Black6J マウした TG も同時に作出し、両者をかけ合わせるス由来の受精卵に導入した。SP-C プロモータ

ことで COPD が抑えられるかを検討し、これまーは、それぞれの遺伝子の肺胞（肺胞 II 型上で全く示されていない COPD 発症への p38 の関皮細胞）特異的発現を可能にする。

与を直接証明することである。

誕生したマウスの遺伝子解析から、第二の達成目標：この COPD モデルマウスをMKK6-c.a./TG は１２ライン、p38-d.n./TG は用いて、分子基盤に根ざしたアプローチで２ラインの Founder マウスを得た。Mating にCOPD の有効な治療法に切り込んでいく。具体より F1 マウスを得て、解析に用いた。Mating

的には、COPD を発症するに至る過程で、免疫・を経て、MKK6-c.a./TG は５ラインに減じ、炎症作用を司る蛋白分子群の遺伝子発現変化

p38-d.n./TG は２ラインを維持した。

および蛋白発現変化を網羅的に解析し、COPD抗 Tag 抗体および肺胞 II 型上皮細胞のマー発症関与因子を絞り込んでいく。その情報をカー蛋白：サーファクタント蛋白(SP-B)に対もとに、COPD の治療法・予防法の確立を目指する抗体を用いて、トランスジーンの肺胞特す。

異的な発現を確認した（図１）。

２.研究経過（１）２系統の TG の作出①MKK6-c.a.（p38 の活性亢進を促す変異体
遺伝子：p38 を特異的に活性化するリン酸化酵素である MKK6 を点変異により常時活性型としたもの）の N 末に HA-tag を配したコンストラクトを作製した。②p38-d.n.（p38 の活図１：p38-d.n./TG の結果を例として示す性阻害を促す変異体遺伝子：p38 自身を点変（MKK6-c.a./TG においても同様の結果を得た）

2

（２）MKK6-c.a./TG での解析に陥った。

得られた 5 ラインの MKK6-c.a./TG のうち、この現象の正確な理由はつかめていないが、サザンブロットにより、導入トランスジーン

これと、並行して受精卵への MKK6-c.a.トラの頻度により、低コピー数：１ライン、中等ンスジーン導入を、１クール 150 個前後の受度コピー数：３ラインおよび高コピー数：１精卵を用い３クール行なったが、新たに、ラインと群分けし、高コピー数（line -4）をMKK6-c.a./TG を得ることは出来なかった。

病理解析に用いた。

また、低コピー数 MKK6-c.a./TG（line-3）

生後 3 ヶ月後の肺所見を示す（図２）。

においては、１２ヶ月を経過しても、肺に COPD様の所見は認められなかった。ただし、LPS（リポポリサッカライド）およびブレオマイシンの負荷をかけた際に、Wt に比べて、血管周囲での急峻かつ激しい白血球の浸潤が認め

図２：MKK6-c.a./TG において、血管周囲への白血球の浸られた。このことは、肺胞特異的な p38 の活潤という炎症所見が見られた

性化は、炎症誘導に対する感受性の増加を促生後８ヶ月後の肺所見を示す（図３）。

すことを示唆した。
MKK6-c.a.を常時高頻度に発現させた TG では、系統維持の問題点を有することが明らかになったので、現在、新たに Tet-ON システムを用いた誘導型 TG マウスの作出をすべく、す

図３：MKK6-c.a./TG において、肺胞の破壊消失と気腔のでに必要となる２つのコンストラクトの作製拡大が認められたを終え、細胞発現実験でその機能連関を確認

以上の結果により、MKK6-c.a./TG（line -4）中である。の肺において、炎症反応に続く COPD の典型的（３）p38-d.n./TG での解析な病態的指標である肺胞の破壊消失と気腔のp38-d.n./TG に関しては、当初得られた２拡大が認められた。したがって、肺胞特異的ラインに加え、引き続き行なった受精卵へのな p38 の活性化は COPD 発症に密接に関わるこ

p38-d.n.トランスジーン導入で、新たな３ラとが示唆された。

インを得、５ラインの系統維持をしている。

そこで、COPD の発症頻度、重症度、発症ま各々のラインのコピー数は２~４であった。

での時間とトランスジーンコピー数の相関関p38-d.n./TG は MKK6-c.a./TG の COPD 発症係を検討すべく、系統維持を行なっていたが、へのカウンターエフェクトを１つの目的とし低コピー数（line-3）を除き、中等度コピーて作出したが、それ自身、炎症性肺疾患の解数（line-1, -2 & -5）および line-4 は F4 に析に有用であると考え、p38-d.n./TG を用い至るまでに淘汰され、Wt のみが誕生する現象て、抗癌剤であるブレオマイシンの主要な副3作用である間質性肺炎／肺線維症への p38 のが抑えられていた。したがって、間質性肺炎関与を検討した。また、我々が系統維持して／肺線維症の発症に p38 は深く関与するとといる p38αKO マウスも解析に供した。

もに、p38 をターゲットとした治療ストラテ

経 気 管 的 に ブ レ オ マ イ シ ン を Wt 、ジー開発の有用性を示唆した。

p38-d.n.TG、p38αKO マウスに投与し、対照群には生理食塩水を投与した。２週間後、静３.研究成果

止時肺コンプライアンスを測定したところ、本研究から、肺胞内における p38 の活性化図４の結果となった。
図中の dn は p38-d.n.TGが COPD や間質性肺炎などの深刻な肺疾患とを、KO は p38αKO を、また、-s および-b は密接に関わることを、個体レベルで証明する

それぞれ、生理食塩水投与群とブレオマイシことができた。

ン投与群を示している。Wt のブレオマイシン投与群のみに、コンプライアンスの有意な低４.今後の課題と発展下が見られ、p38αKO、 p38-d.n.TG では、ブ当初、想定した申請者の仮説は正しいこと

レオマイシン投与群においてもコンプライアが明らかとなり、第一の達成目標の一部はクンスの低下は見られなかった。

リア出来た。しかし、研究の社会還元という見地に立つと、第二の達成目標がより重要であると考えられる。現在、作出に向けて準備している誘導型の MKK6-c.a./TG の開発により、その目標に迫れると期待している。

５.発表論文リスト

図４：マウス肺の静的コンプライアンス

以上の結果から、ブレオマイシン誘発性のThe involvement of p38α mitogen-activated

間質性肺炎の発症に、p38 が関与することがprotein kinase in lung metastasis of tumor cells.

示唆された。特に、TG マウスを用いた結果か

Yuji Matsuo, Shinya Amano, Mitsuko Furuya,

ら、肺胞 II 型上皮細胞の p38 活性が間質性肺Kanako炎の発症に関与することが明らかとなった。

Namiki, Tatsuhiko Sudo, Koichiro Tatsumi,

また、現在解析中の組織所見において、Wt のTakayuki

ブレオマイシン投与群で見られた肺線維化が、

Yoshitoshi Kasuya. Submitted

p38αKO、 p38-d.n.TG では抑えられているこ（本研究とは直接関係しないが、謝辞に助成とを確認している。また、コラーゲン蓄積のを記載）指標となるヒドロキシプロリンの肺含有量も、Wt のブレオマイシン投与群では上昇していた
ものの、p38αKO、 p38-d.n.TG ではその上昇

4Sakurai,

MarikoKuriyama,

Nishiyama,

Sadao

Kimura,Kanaand