厚生労働科学研究費補助金	
 	
 地球規模保健課題解決推進のための研究事業	
 （H25-地球規模-指定-008）	
 	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築	
 に関する研究	 平成 26 年度	  総括・分担研究報告書	
 研究代表者	
  新見伸吾	 	 平成 27(2015)年 3 月

平成 26 年度	
  厚生労働科学研究費補助金	
 地球規模保健課題解決推進のための研究事業（H25-地球規模-指定-008）	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究目	
  次Ⅰ．総括研究報告書	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（新見伸吾）	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 #	
 
	
 
	
 
Ⅱ．分担研究報告書	 (1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究（中岡竜介）	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に	 	  	 関する研究（大熊一夫）	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究（蓜島由二）	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
	
 
	
 
Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料	
 (1)一覧表	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(2)バイオマテリアル−生体材料,33(1):56-63	
 (2015)	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 ##	
 
(3)Dental	
 Materials	
 Journal,33:422-429	
 (2014)	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 ##	
 
(4)J.	 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:721-728	
 (2014)	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  ##	
 
(5)J.	 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:1809-1816	
 (2014)	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(6)生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バイオマテリアル	 	  	 の設計・開発戦略	
  	
  	
 	
 	
 	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
(7)J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.,	
 in	
 press	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 ##	
 
	
 
	
 
	
 

研究班名簿	
 
	
 
	
 
	
 
研究代表者：新見伸吾	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 	
 研究分担者：蓜島由二	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  中岡竜介	  国立医薬品食品衛生研究所	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  大熊一夫	
  日本歯科大学	
 	
 研究協力者：野村祐介	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  福井千恵	  国立医薬品食品衛生研究所	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  中村義一	  株式会社リボミック	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  宮川	
  伸	
  株式会社リボミック	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  金	
  	
  玲	
  株式会社リボミック	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  柚場俊康	  川澄化学工業株式会社	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  坂口圭介	  テルモ株式会社	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  谷川隆洋	  テルモ株式会社	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  杉山知子	  テルモ株式会社	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  竹ノ内美香	  テルモ株式会社	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  新藤智子	  食品薬品安全センター	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  蛯原善則	  	 株式会社ジーシー	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  Somchai	
 Urapepon	  マヒドン大学	
 Ⅰ．総括研究報告書

	 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究	
 
	
 
新見伸吾	
 
国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 総括研究報告書
平成 26 年度厚生科学研究費補助金/地球規模保健課題解決推進のための研究事業	
 	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25-地球規模-指定-008）	
 	
 研究代表者	
  	
  新見	
 伸吾	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 研究分担者	
  	
  蓜島	
 由二	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  中岡	
 竜介	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  大熊	
 一夫	
  	
  日本歯科大学新潟生命歯学部歯科理工学講座	
 研究協力者	
 野村祐介	  	  国立医薬品食品衛生研究所	
 

谷川隆洋	
  	
  テルモ株式会社	
 

福井千恵	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

犬飼香織	
  	
  テルモ株式会社	
 

中村義一	
  	
  株式会社リボミック	 竹ノ内美香	
  テルモ株式会社	
 

宮川	
  伸	
  	
  株式会社リボミック	
 

新藤智子	
  	
  食品薬品安全センター	
 

金	
  	
  玲	
  	
  株式会社リボミック	
 

蛯原善則	
  	
 	
 株式会社ジーシー	
 

柚場俊康	
  	
  川澄化学工業株式会社	 Somchai	
 Urapepon	  マヒドン大学（タイ）	
 

坂口圭介	
  	
  テルモ株式会社	
 

	
 
研究要旨	
 
	
 
	
  本研究では、「国際標準化機構（ISO）及び国際電気標準会議（IEC）における医療機器の各種国際規格の策定に関する研究（H23-地球規模-指定-003）」において策定した「医療機器規格・基準の国際標
準化戦略に係る政策的提言」を具体的に実行する体制の構築に資する施策として、幾つかの ISO/TCの活動をサポートする窓口を試験的に開設し、その実用可能性を検証すると共に、国際標準に関する
世界情勢を周知する啓蒙活動を行った。また、新規規格の提案や国際規格の改定作業を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集することを目的として、材料開発分野、試験法分野及び歯科分野においてケーススタディを実施した。	
 	
  国際標準化戦略窓口の試験的設立については、昨年度に引き続き「再生医療等製品」及び「医療機器ソフトウェア」の国際標準化活動を行っている ISO/IEC の TC 国内委員会等に参加して情報収集を行い、それらの活動状況を取りまとめた。収集した情報は、医療機器部サーバー内にホームページを開設して可能な限り一般に発信した。また、啓蒙活動の一環として、医療機器の国際標準化に関する講演を 4 回行った。	
 	
  試験法分野のケーススタディでは、ISO/TC194/WG9 において実施されている溶血性試験国際ラウン
ドロビンテストを支援するため、2 種類の弱陽性対照材料 Genapol	
 X-080 含有 PVC シート（Y-2,	
 Y-3）
を本試験用標準品として提供した。Y-2 及び Y-3 は本試験においても良好な溶血特性を示し、その性能が世界的に確認されたことから、今後、ISO/TC194/WG12 に国際標準品として新規提案する。	
 	
  材料開発分野におけるケーススタディでは、機能性蛋白質を選択的に捕捉する RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の開発研究を行った。その結果、bFGF 捕捉型 RNA アプタマー（1p01）固定化表面は細胞増殖促進機能を有することが確認されたことから、RNA アプタマーを利用することにより、医用材料に意図した機能を付与できることが明らかとなった。また、BMP2 捕捉型 RNA アプタマー候補の選定を行った結果、B10 と B24 が有力な候補となることが判明した。	
 	
  歯科分野におけるケーススタディでは、歯科用 CAD/CAM に関する規格を ISO/TC106/SC9 に日本から新規提案し、CD 化に至るまでの情報を収集した。平成 26 年 9 月に開催された ISO/TC106/SC9/WG5	
 ベ
ルリン会議では、Convener として、5 ヵ国によるインターラボラトリーテストの結果報告及び各国から提出されたコメントに対応した。また、本 CD に新たな CMM 及びソフトウェアを追加することが提案され、2nd	 CD へステージアップした。	
 Ａ．研究目的	 	  近年、国際市場の拡大に伴い、医療機器に関する各国の法規制を整合化する動きが活発化している。IMDRF ではグローバ
ルな整合作業が進められており、その他、ISO や IEC では医療機器の性能や試験法等、有効性と安全性に関する各種規格・基準の国際整合化が行われている。医療機器については、品質維持の観点から国内法
規への適合が求められると共に、主に通商上の観点から国際規格への適合も要求される。すなわち、我が国の優れた製品を世界的に流通させるためには、日本の国内法規における要求事項を反映した国
際規格を作成し、運用することが最適と言える。また、日本は医療機器開発において先進的な技術力を持つことから、国際的な優位性を確立することが可能な状況にある。例えば、製品や材料の性能評
価等に関する技術については、差別化による高付加価値化を狙い、新たな市場を開拓していくことが重要である。このため、研究開発段階から標準化を視野に入れたプロジェクトを推進すると共に、国際標準策定に必要なデータ取得、ラウン
ドロビンテスト等を産業界と一体となり推進することが必要である。	
 	
  医療機器産業は急成長しており、世界的競争が激化しているが、国内で使用されている医療機器は輸入が年々拡大している。2010 年では 0.6 兆円の貿易赤字となっているのが現状であり、日本のモノづくりの力が生かされていない。米国・
FDA/ANSI、ドイツ・DIN、フランス・AFNOR、
英国・BSI 等、主要国には国内・国際規格に関与する国家機関が存在し、基礎デー
タの収集や保持も行っている。日本にはJISC/JSA があるが、諸外国の関連機関と比較して実質的に対等の機能を果たしていないと思われる。また、デファクト標
準に頼っていた我が国の医療機器関連企
業はデジュール標準の時代が到来していることを認識する必要がある等、我が国における国際標準化に係る環境や意識は他国と比較して立ち後れているのが現状である（図 1）。	
 	
  このような背景の中、現在までに国内の医療機器の評価手法、必要な基準の策定、国際的な整合等に関する研究や活動は行われて来ているが、日本発の良質な医療機器を障壁なく国際的に進出させる環境を整備する戦略的な研究は実施されていなかったため、平成 23,24 年度厚生
労働科学研究費補助金（地球規模保健課
題推進）研究事業「国際標準化機構（ISO）
及び国際電気標準会議（IEC）における医療機器の各種国際規格の策定に関する研究（H23-地球規模-指定-003）」において、国際的に提案できる基準の選別や原案策定過程への提案を含めて、国際標準化活動を国家的にサポートする体制の構築や戦略的な考え方等を取りまとめた「医療機器規格・基準の国際標準化戦略に係る政策的提言」を策定した。	
 本研究では、この政策的提言を具体的に実行する体制の構築に資する施策として、幾つかの ISO/TC の活動をサポートする窓
口を試験的に開設し、その実用可能性を検証すると共に、国際標準に関する世界情勢を周知する啓蒙活動を行った。また、新規規格の提案や国際規格の改定作業を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集することを目的として、材料開発
分野、試験法分野及び歯科分野においてケーススタディを立ち上げ、検証データ等を収集した（図 1）。	
 

	  本研究においては、以下に示した 3 件の分担研究課題を実施した。各課題の方法、結果及び考察の詳細については、該当する分担研究報告書を参照していただ
きたい。	
 
	
 
<サポート窓口の開設と啓蒙活動>	
 ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究（中岡、蓜島）	 <歯科分野ケーススタディ>	
 歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法
等の国際標準化に関する研究（大熊）	
 	
 <試験法･材料開発分野ケーススタディ>	
 医用材料規格の新規提案に向けた検証実
験に関する研究（蓜島）	
 	
 Ｂ．研究方法	 (1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究
1-1.ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 	
  再生医療等製品及び医療機器ソフトウ
ェアを取り扱う TC の国内委員会に委員又はオブザーバー等の立場で参加し、情報収集を行った。	
 	
 1-2.国際標準化に対する啓蒙活動	
 	
  啓蒙活動の一環として、本事業の紹介と医療機器分野における国際標準化の重要性に関する講演や医療機器関連の学会
誌へ総説・解説等の寄稿を行った。	
 	 (2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	
 2-1.インターラボラトリーテスト	 	  新規規格に記載した寸法の 1 級インレー用、2 級インレー用、クラウン用及びブリッジ用金型から三次元データを取得し、切削用三次元データに変換し、半焼結ジ
ルコニアセラミックブロックから CAD/	 CAM マシンを用いて修復物を作製した。作
製した修復物を金型に装着し、金型と修復物の変位量を測定し、修復物の精度の評価を行った。	
 	
 2-2.測定のための印記	 	
  最初の測定点を 0°とし、修復物と金型との変位量を測定した。同様に、45°、
90°、135°、180°、225°、270°、315°毎に試料を回転させ、計 8 点における修復物と金型との変位量を測定した。	
 	
 2-3.CAD/CAM 材料の被切削面	
 	
  ジルコニア未焼結の加工は Dry 条件下、
加工ピッチ 0.1mm、仕上げ代 0.1mm、ジル
コニア用ダイヤコート、送り速度500mm/min、工具回転数 2500min-1 で行い、ジルコニア本焼結、コンポジットレジン
及びチタンにおいても同一の加工条件で切削した。加工状態は被切削面を観察す
ることにより評価した。	
 	
 2-4.ISO/TC106/SC9/WG5 ベルリン会議	
  	
  	
 
	
  WG5（Machined	
 devices）に Convenerとして出席し、日本からの新規提案規格である「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-	 aided	
 milling	
 machine	 – Test	 methods」
について討議した。	
 	 (3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 3-1.ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンド
ロビンテスト支援	
 3-1-1.溶血性試験用弱陽性対照材料の調製	
 	  100 パーツの PVC に対して、DEHP	
 55 パーツ、ESBO	
 8 パーツ、ステアリン酸カル
シウム及びステアリン酸亜鉛 0.05 パーツのほか、1.0 及び 1.5 パーツの Genapol	 X-080 を含有する 2 種類の可塑化 PVC パウ
ダーを調製した。Genapol	
 X-080 含有 PVC
シート（Y-2 及び Y-3：厚さ 0.4	 mm）は同
パウダーを利用してヒートプレス法（180℃）により作製し、本試験用標準品
として WG9 に提供した。	
 	
 3-1-2.溶血性試験ラウンドロビンテスト	 ISO/TC194/WG9 から配布された 6 種類
（Polyethylene:	
 PE,	
 Nitrile	 glove:	 NG,	
 Latex	 glove:	 LG,	
 Buna	
 rubber:	
 BR,	
 Y-2,	
 Y-3）の材料を使用した。各試験法のインキュベーション時間は、ラウンドロビン
テスト用プロトコルに従い、ASTM 法（直接接触及び抽出液法）：3 時間、NIH 法（直接接触法）：1 時間、MHLW 法（抽出液法）：
4 時間とした。血液試料としては、ウサギ
血液及びヒト血液を使用した。	
 	
 3-1-3.倫理面への配慮	 	
  動物及びヒト血液を使用する研究は、実施機関が所管する動物実験倫理委員会
及び研究倫理審査委員会の承認を得て実
施した。	
 
	
 
3-2.RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 3-2-1.bFGF を捕捉する RNA アプタマー材
料開発	 	
  昨年度開発した方法に従い、bFGF 捕捉型 RNA アプタマー（1p01）及び陰性対照である poly	 dT（pdT）を金コートガラス
版上に固定化した。培地としては DMEM 及
び MSCGM を使用し、血清は 5%ヒト血清（HS）

及びウシ胎児血清（FBS）を用いた。各培地で 30 分間プレインキュベーションした
後、マウス線維芽細胞又はヒト間葉系幹細胞を播種し、5%	
 CO2 雰囲気下 37℃で培養した。hMSC は培養開始から 2 日後、NIH3T3 は培養開始 3 日後に固定化し、Hoechst	
 33258 染色後、核数を計測することにより、細胞増殖能を評価した。	
 	
 3-2-2.BMP2 を捕捉する RNA アプタマー材
料開発	
 	
  BMP2 結合能を有する RNA アプタマー候
補の選定は、BMP2 をアミノカップリング
させた NHS 樹脂を用いる SELEX 法により行なった。一連のサイクルを合計 10 ラウ
ンド繰り返し、最終ラウンドの PCR 産物
を TOPO ベクターにクローニングし、シー
クエンス解析を行なった。解析結果をClustalW によってグルーピングすることで、RNA アプタマー候補を取得するための評価を行った。得られた候補配列について、プログラム Mfold 及び RNAfold を用
いて二次構造解析を行ない、BMP2 結合に重要な構造モチーフを検索した。	
 SELEX 法によって得られた RNA アプタマ
ー候補と BMP2 の結合能は電気泳動移動度
シフトアッセイ法（EMSA）及び表面プラ
ズモン共鳴法（SPR）を用いて評価した。	
 	
 Ｃ．研究結果	 (1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究
1-1.再生医療等製品	
 	
  ISO における「再生医療等製品」の標準化における全体的な状況に大きな変化は見られなかったものの、International	 Alliance	  for	
  Biological	
  Standardi-	 zation	 (IABS)	
 が細胞治療に関する標準

化の議論を行っていることが判明した。
2-1.インターラボラトリーテスト	 また、個別の ISO/TC においては、昨年度
	  タイのクラウンと金型の変位量の測定よりも活発な動向が認められた。	
 
結果は、ジルコニアセラミックスで平均	
 ＋0.08mm、コンポジットレジンで+0.50mm、1-2.医療機器ソフトウェア	 ワックスで+0.08mm であった。日本のジル	  医療機器ソフトウェアのセキュリティ
コニアセラミックスで作製した精度はに関する参照規格は、IEC	
 SC	
 62A と ISO/TC	  +0.005mm であった。この差は変位量の測215 との JWG	 7 に集約された。医療機器の定機器の限界によるものである。加工精品質管理（QMS）に関する国際規格（ISO	  度は、被切削材料に影響をされるが、日13485）の改訂作業が ISO/TC	
 210 で進ん本から提案した方法により評価できるこでいる。この規格には参照文書としてソとが確認された。	
 フトウェアの製品及びプロセス規格が明	 記されると共に、非常に多くのソフトウ
2-2.測定のための印記	 ェア関連規格が QMS に取り込まれること	  	  	
  1 級インレーと金型との変位量の平均になっている。現在、二度目の DIS 投票
は+0.962mm であり、クラウンの場合はを目指して再改訂中であり、2015 年半ば+0.422mm となった。1 級インレーとクラには再度 DIS 投票が行われる予定である。 ウンの標準偏差は、それぞれ 0.074 及びまた、Software	
 for	
 Medical	
 Device にお0.024 であり、変位量平均値の 1/10 程度
ける設計・開発（ライフサイクル）プロの小さい値であった。また、測定回数がセスのための規格であった IEC	
 62304 を多くなるほど、修復物と金型の変位量がHealth	 software	
 全般を対象にした改訂減少する傾向が認められた。これらの成版（第 2 版）の作成が開始されたことも績から、測定のための印記は必要性ない
明らかとなった。なお、今回取りまとめことが確認された。	
 た調査結果は、昨年度同様、医療機器部
	 サーバーに開設した本研究紹介用ホーム
2-3.CAD/CAM 材料の被切削面	
 ページにより適宜更新の上、公開してい	  ジルコニア本焼結の被切削面の中心部
る (http://dmd.nihs.go.jp/chikyukibo/	  に十字用の大きな工具による痕が残るとindex.html)。	
 共に、切削加工中に工具が破損する等、
	
 適正な加工条件でないことが判明した。
1-3.国際標準化に対する啓蒙活動	 一方、ジルコニア未焼結は切削工具の痕
	  法人や学会等で医療機器業界関係者やが認められず、適正な被切削面であるこ
国際標準化に取り組んでいる関係者を対とが確認された。同様に、コンポジット
象にした発表・講演を行い、医療機器にレジンは適正な被切削面、純チタンは不おける国際標準化の現状報告とその重要適正な被切削面であることが確認され、性の啓蒙を行った。	
 
被切削面から適切な切削加工条件を評価
	 できることが判明した。	
 (2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工	 法等の国際標準化に関する研究	
 2-4.ISO/TC106/SC9/WG5 ベルリン会議	 	  平成 26 年 6-8 月にかけて実施された投票の結果、賛成 9 カ国、反対 3 カ国（オーストラリア、ブラジル及びスウェーデ
ン）、棄権 2 カ国をもって、日本が提案した CD は採択された。概ね日本の提案については合意が得られたが、日本提案の
金 型 を 用 い た 測 定 方 法 で な く 、 CMM	 (Coordinate	
 Measuring	
 Machine:三次元測定機)及び三次元の元データと CAD/CAM
で作製したセラミック修復物の三次元データの変位量の差を求めるソフトウェア法が米国から提案された。この結果、これらの項目を追加した 2nd	 CD にステージアップすることになった。	
 	 (3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 3-1.ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンド
ロビンテスト支援	
 	  陰性対照材料である PE は、ヒト血液及びウサギ血液を利用した評価系ともに、全ての試験法において溶血能を示さなかった。	
 	
  強陽性対照材料である NG は、ヒト血液及びウサギ血液を利用した評価系において、ASTM/直接接触法及び ASTM/抽出液法
ともに、ほぼ 100%の溶血率を示した。一方、NG の溶血特性を MHLW/抽出液法により評価した時の溶血率は、それぞれ 6.6%
及び 2.0%であった。	
 	
  主に直接接触法において弱陽性反応を示す LG 及び BR の溶血特性は、抽出液法
による試験では検出できなかった。一方、
我々が提供した弱陽性対象材料である
Y-2 及び Y-3 は直接接触法のほか、抽出液法においても理論的な溶血特性を示すことが確認された。	
 	
 3-2.RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 3-2-1.bFGF 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	 	  bFGF 捕捉型 RNA アプタマー1p01 及び陰性対照である pdT をコートした材料上で細胞培養を行なった結果、5%	
 HS 条件下では培地の種類を問わず、NIH3T3 及び hMSC
ともに、1p01 コート材料上で培養した方が高い増殖能を示すことが確認された。
また、5%	
 FBS/DMEM 培地条件下で hMSC を培養した場合にも、1p01 コート材料は増殖促進作用を示したが、5%	
 FBS/	 MSCGM 培
地条件下の場合、1p01 及び pdT コート材
料は同等の増殖能を示した。	
 	
 3-2-2.	
 BMP2 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	 	  BMP2 と結合する RNA アプタマー候補は5 種類（B10,	
 B20,	
 B24,	
 B32,	 B37）の配列に収束されていることが明らかとなった。B10,	
 B20,	
 B24,	
 B32 及び B37 の出現
頻度は、それぞれ 6.9%,	
 16.9%,	
 8.5%,	
 45.1%及び 12.7%であり、B32 が最も多く観測されていた。	
 	
  5 種類の RNA アプタマー候補と BMP2 の結合能を EMSA により評価した結果、二価イオン非存在下では、BMP2 を添加することにより、スメアな複合体バンドが観測された。一方、Mg2+イオン存在下で EMSAを行なった結果、B10 及び B24 については、
明瞭な複合体バンドが観測された。
BIAcore を用いた SPR 法による解析の結果、
RNA アプタマー候補に BMP2 を添加することにより、例外なく RU 値の上昇が確認されたことから、5 種類の RNA アプタマー候
補は、いずれも BMP2 に結合することが判
明した。	
 

	
 
Ｄ．考	
  察	
 
(1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究	
 1-1.ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 	
  再生医療等製品の開発から上市に至る
過去の経緯から判断すると、実用化を加速するための環境整備が必要であると共に、再生医療等製品の特性を理解し、その種類（細胞/Scaffold/増殖因子複合製
品、細胞シート製品、細胞治療等）を明確にしておく必要があると思われる。	
 	
  我が国の再生医療等製品で製造販売承認を得たものは 2 品目のみであり、そのめの連携体制構築に、非公式ながら取り組み始めている。この活動が、今後の再生医療等製品関連の国際標準作成を戦略的な All	
 JAPAN 体制で行うための土台となることを、我々は期待している。	
 	
  医療機器ソフトウェアの標準化については、米国が主導権を握ってその作成を行っていることが示唆される調査結果を得た。しかしながら、医療機器としての標準化にも拘わらず、ISO 側では主に情報系専門家で形成される TC	
 215 が関わっており、医療機器の特性を考慮しない規格が作成されるのではないかとの点が危惧された。	
 他は未だに治験や臨床研究の段階である
ことから、再生医療等製品の国際標準化にまで目が行き届かない面がある。しかしながら、実用化までの時間はまだ必要なものの、我が国発の万能細胞である iPS細胞を利用した製品開発が進んでいることから、知的財産権との効率的な併用を考慮しつつ将来展開を見越した「デジュール」規格の作成を戦略的に進めていか
なければならないと考える。作成された国際規格が実際に規制当局に利用されるか否かは別に議論しなければならないが、少なくとも我が国がこの分野で主導権を握っていくためには stakeholder 間で情報及び認識を共有しつつ、戦略的且つ統一的に再生医療等製品の国際標準化に取り組んでいかなければならないことが明確となった。	
 	  現在、我々は、再生医療等製品と関連した標準化作業を行っている TC	 150/SC	
 7、TC	
 194/SC	
 1、TC	
 198、TC	
 276 国内委員会
関係者及び関係省庁関係者との間で、再生医療等製品に関する国際標準化に関して統一した方向性と連動性を共有するた	  国内では、医薬品医療機器法が施行されたことに伴い、QMS 省令も修正され現行の ISO	
 13485 との整合性が高められたばかりである。上記改正が成立した場合、近い将来、QMS の国際整合の再考慮が課題となる可能性があるため、医療機器ソフ
トウェアのみならず、医療機器分野全体の課題として ISO	
 13485 の改訂内容を注視していかなければならないと考える。
また、現在改訂中の IEC	
 62304 を中心とした医療機器ソフトウェア関連国際規格
が規制においても重要になることは明らかであり、我が国も産官学共同でこれらの規格作成に積極的に関与しなければな
らない状況になっていることが示唆され
ている。	
 
	
 
1-2.	
 国際標準化に対する啓蒙活動	
 	
  平成 26 年度に行った講演は、それぞれ研究センター、学会、標準化関連団体、
ISO 活動支援団体が主催したものである。
国際標準化に関する興味の度合いは異なるが、講演後に多数の質疑を受けたことから、その重要性を相応に啓蒙することができたと思われる。本年度は企業を対象とした講演を実施できなかったことから、今後、企業上層部に直接国際標準化の必要性を周知する活動を実施する予定
である。	
 
	
 
(2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	 	  インターラボラトリーテストにおいて使用した 2 級インレーの治具では、咬合面と側方の両方から 50N の荷重を同時に加えることができるようになり、測定精度が格段に向上した。今回行った実験において、試料を 45°毎に回転させて計 8点の各金型との変位量を測定する場合、一定の小さい定点に定荷重を加えることが可能であり、精度の高い測定結果を得ることができた。また、測定精度の向上
及び測定時間の短縮を図ることを目的として作製したレーザ計測を応用した測定機は修復物と金型の変位量を随時測定することが可能であり、精度の高い測定結果を得ることができた。	
 	  ベルリン会議を通じて、国際標準化作業を円滑に進めるためには、国際会議における丁寧な説明、会議資料の提供や各
国エキスパートに対するロビー活動が非常に重要であることを再確認した。	
 	 (3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 3-1.ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンド
ロビンテスト支援	 	  NG は強陽性対照材料であるが、MHLW/抽出液法の検出感度は、その他の試験法と比較して大きく劣ることが確認された。LG及び BR は主に直接接触法における弱陽性
対照材料として配布された試料であり、本試験においても、その溶血特性が明瞭に示された。これらの現象は、事前に行ったパ
イロット試験においても確認されている。	
 	
  一方、我々が提供した Y-2 及び Y-3 は、直接接触法及び抽出液法のいずれにおいても弱陽性対照材料として利用することが可能であり、試験法に応じて、両者を使い分けることにより、試験系の評価を行う
ことができることが判明した。	
 	  ウサギ血液とヒト血液は多くの試験法において、ほぼ同等の感度を示した。しかし、NIH/直接接触法では、ウサギ血液を利用した試験系の方が感度的に優れていることが確認された。	
 	
 3-2.RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 bFGF 捕捉型 RNA アプタマー1p01 及び陰性対照である pdT を材料表面上に固定化し、両材料上で細胞培養を行なった結果、5%	
 FBS/MSCGM 培養条件下の場合、hMSC の増殖能は pdT 及び 1p01 間に顕著な相違は観察されなかった。この現象は、hMSC 増
殖用に最適化された MSCGM 培地に含まれる増殖因子が同細胞に優先的に作用し、RNA アプタマーによる効果が減弱したことに由来すると思われる。一方、その他の培養条件下においては、陰性対照である pdT と比較して、1p01 コート材料表面
上で細胞数が多く観測されていることから、同材料は細胞増殖促進効果を有していることが示唆された。今後、同材料表
面上の吸着蛋白質解析等を行うと共に、
本 RNA アプタマーとコラーゲンとの複合材料を作成し、ラット埋植試験等を実施することにより、医用材料としての有用性を検証する。	
 BMP2 に対する RNA アプタマーを用いた

新規骨充填剤の開発を目指し、SELEX 法により BMP2 に結合する RNA アプタマー候補の選定を行なった結果、得られた RNA ア
プタマー候補は 5 種類の配列に収束していたが、共通の構造モチーフが認められなかったことから、各候補はそれぞれ特有の構造を有していることが示唆された。
	 	  RNA アプタマー候補と BMP2 の相互作用
を EMSA によって解析した結果、Mg2+イオ
ンの有無により、その挙動が異なっていた。B10 及び B24 は Mg2+イオン存在下において、明瞭な複合体バンドとして検出された。これは、Mg2+イオンが両 RNA アプタ
マー候補と BMP2 の結合に密接に関与することを示唆している。一方、SPR 法による相互作用解析において、SELEX 法と同様に二価又は一価の金属イオンを添加した条件下で評価した結果、5 種類の RNA アプタ
マー候補は BMP2 に対して、40N ランダム
配列よりも強い結合能を有することが確認された。本研究において使用した SELEXの条件下では、Mg2+,	
 Ca2+,	
 K+及び Na+イオンが共存しているため、B10、B24 以外のRNA アプタマー候補については、Mg2+イオンとは別のイオンに依存した構造形成能を有する可能性も示唆された。	
 	
  今回得られた 5 種類の RNA アプタマー
候補は、二次構造予測の結果から保存された構造モチーフが確認されないと共に、相互作用解析における挙動が異なることから、それぞれが異なる機構で BMP2 と結合していることが示唆された。RNA アプタ
マーを利用した医用材料の開発に応用するためには、BMP2 の生理活性を阻害しない配列が必要であるため、今後、5 種類全
ての RNA アプタマー候補を用いて、BMP2
シグナル伝達阻害等の評価を行う。また、二次構造予測の結果に基づいて短鎖化した RNA アプタマーについても同様の解析を行うと共に、金属イオン依存性についても検討する。	
 
	
 
Ｅ．結	
  論	
 
(1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究
1-1.ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 	
  昨年度同様、「再生医療等製品」と「医療機器ソフトウェア」にテーマを絞り込
み、現在行われている国際標準化活動状
況を取りまとめた。その結果、前者では製品開発に先行して「デジュール」規格の作成が始まっており、複数の ISO/TC で関連技術の国際標準化作成作業が活発化していること、後者においてはその標準化が QMS をも巻き込み複雑化しているが、その鍵となる ISO	
 13485 の改訂が滞っていることが明らかとなった。前者においては、我が国が主導権を握れる分野であり、製品の実用化に先立った「デジュール」規格作成が活発化していることから、製品カテゴリーの明確化や All	 JAPAN 体制を構築して戦略的な活動を実施しなけ
ればならないことが明らかになった。後者においては、ソフトウェアを内包する
医療機器も含め、その規制が厳しくなる
可能性があることも示唆されたが、鍵となる ISO	 13485 の改訂が遅れていること、それに伴いその内容に変更が生じる可能性が示唆された。ISO	
 13485 の改訂は、我が国における QMS 省令へも影響を及ぼす可能性があること、ソフトウェア関連国
際標準をどのように規制に取り入れていくかを検討している段階であることから、
今後、我が国も積極的にその作成に関与していかなければならないことが示唆さ
れた。	
 

	
 
1-2.国際標準化に対する医療機器関連企
業の意識調査	 	  医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙する目的で、計４回、医療機器関連団体等を対象に研究発表、講演を行った。その結果、ある程度医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙することができた。	
 	 (2)歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	 	  インターラボラトリーテストの結果、
CAD/CAM により作成されたセラミック修
復物の加工精度は、日本が提案した CD「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-aided	
 milling	 machine	 – Test	 methods」により正しく評価できることが確認された。
また、ベルリン会議（平成 26 年 9 月）における討議の結果、本提案規格に CMM とソフトウェアを追加して 2nd	 CD ステージに進めることとした。	
 	
  国際会議では、会議前の丁寧な説明及び会議資料の提供により、各国からの信頼を得ることが重要である。また、日本から提案した医療技術を国際標準化する
一つの道は、WG の Convener を獲得することである。	 	 (3)医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 3-1.ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンド
ロビンテスト支援	 	  我々が開発した弱陽性対照材料（Y-2 及び Y-3）は、直接接触法及び抽出液法のいずれにおいても弱陽性対照材料として利用することが可能であり、試験法に応じて、両者を使い分けることにより、試験系の評価を行うことができることが判明した。Y-2 及び Y-3 の対照材料としての性能が世界的に確認されたことから、今後、
強陽性対照材料である Y-4 と合わせて、
ISO/TC194/WG12 に国際標準品として新規提案する。	 	
 3-2.RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 	
  bFGF 捕捉型 RNA アプタマー1p01 は、細胞増殖促進機能を有することが確認されたことから、新規医用材料の開発において有益なツールになることが示唆された。
また、BMP2 に結合する RNA アプタマー候
補として、5 種類の有力な配列を選定することができた。	
 	 Ｆ．健康危険情報	 	  特になし。	
 	
 Ｇ．研究発表等	 <誌上発表>	 	 1)中岡竜介、蓜島由二、新見伸吾．医療機器・材料の国際標準化動向．バイオ
マテリアル-生体材料，33(1):56-63	 (2015)．	
 	 2)Koide	
 M,	
 Ohkuma	
 K,	
 Ogura	 H,	
 Miyagawa	
 
Y.	
 A	
 new	
 method	
 for	
 fabricating	 zirconia	
 copings	
 using	 a	
 Nd:YVO4.	
 Dental	 Materials	
 Journal,33:422-	
 
429	
 (2014).	
 	 3)Haishima	  Y,	  Kawakami	  T,	  Fukui	  C,	 Tanoue	 A,	
 Yuba	 T,	 Ozono	 S,	
 Kumada	 H,	
 Inoue	 K,	 Morikawa	
 T,	
 Takahashi	
 M,	
 Fujisawa	
 A,	
 Yamasaki	
 K,	
 Nomura	 Y,	 Isama	 K,	 Chung	 U,	
 Ogawa	
 K,	
 Niimi	
 S,	
 Yoshida	  M.	
  Characterization	  of	
 alternative	  plasticizers	  in	  poly-	 vinyl	  chloride	
  sheets	  for	
  blood	 containers.	
 	
 J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.,	 in	
 press	 (2015).	
 	 4)Haishima	
 Y,	
 Hasegawa	
 C,	
 Nomura	 Y,	
 Kawakami	  T,	  Yuba	  T,	  Shindo	  T,	 Sakaguchi	
 K,	
 Tanigawa	 T,	
 Inukai	
 K,	
 Takenouchi	
 M,	
 Isama	 K,	
 Matsuoka	
 A,	
 Niimi	 S.	
 	
 Development	
 and	
 perfor-	 mance	
  evaluation	
  of	
  a	
  positive	 reference	  material	  for	
  hemolysis	 testing.	
  	
  J.	
  Biomed.	
  Mater.	
  Res.	
 
Part	
 B,	
 102B:1809-1816	
 (2014).	
 	 5)Haishima	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Hasegawa	
 C,	
 Tanoue	 A,	
 Yuba	 T,	 Isama	 K,	
 Matsuoka	 A,	  Niimi	  S.	
  	  Screening	  study	  on	
 hemolysis	
 suppression	 effect	
 of	
 an	
 
alternative	  plasticizer	
  for	
  the	
 development	
 of	
 a	
 novel	 blood	 con-	
 tainer	 made	 of	
 polyvinyl	
 chloride.	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:	
 721-728	
 (2014).	
 	 6)蓜島由二．第 1 部：医療機器市場の拡大と新規製品の開発：開発，上市化，市場確保において留意すべきポイン
ト．生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バイオマテリアルの設計・開発戦略（監修：田中	 賢）．
サイエンス＆テクノロジー，pp.3-21	
 (2014)．	
 	
 <学会発表>	 	 1)中岡竜介、蓜島由二、新見伸吾．橋渡し研究及び国際標準化の行政的支援．
第 53 回日本生体医工学会大会（2014年 6 月・仙台）	
 	
 2)中岡竜介．医療機器に関連した国際標準化状況について：ISO/TC	
 150（外科用インプラント）を中心に．「ISO/TC	
 150（外科用インプラント）とバイオ
セラミックスの国際標準化の状況」講
演会（2015 年 1 月・東京）	
 	
 3)中岡竜介．国際幹事経験談及び医療機器分野国際標準化の現状について．平成 26 年度第 2 回 ISO 国際標準化研修	 ―	
 上級編（実践コース）（2015 年 1月・東京）	 	 4)小出未来,	
 大熊一夫,	
 小倉英夫,	
 宮川
行男 Nd:YVO4 レーザを用いたジルコニ
アコーピングの新しい加工法	  被照
射面の熱処理後のラマン分光分析.	
 	 日本歯科理工学会第 63 回春季学術講
演会（2014 年 4 月・千葉）.	
 	 5)赫多	 清,	 大熊一夫,	
 宮川行男．陶材の咬合摩耗に及ぼす試験片支持材料の影響.	
 日本歯科理工学会第 64 回周期学術講演会（2014 年 10 月・広島）.	
 	 6)野村祐介，福井千恵，戸井田	
 瞳，新見伸吾，宮川	 伸，金	  玲，中村義一，
蓜島由二．RNA アプタマーを用いた新
規医用材料の開発．第 36 回日本バイ
オマテリアル学会大会（2014 年 11 月・
船堀）．	
 
	
 7)野村祐介，福井千恵，柚場俊康，新藤智子，坂口圭介，谷川隆洋，杉山知子，
竹ノ内美香，新見伸吾，蓜島由二．簡
易溶血性試験法の性能評価と公定法との比較検証．第 36 回日本バイオマ
テリアル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 	 8)蓜島由二，福井千恵，山﨑佳世，野村祐介，小園	
 知，熊田秀文，藤澤彩乃，
井上	
 薫，森川朋美，市村亮平，前田	
 潤，
高橋美和，河上強志，伊佐間和郎，柚場俊康，鄭	
 雄一，小川久美子，新見伸吾，吉田	
 緑．新規血液バッグ用代
替可塑剤 DOTH のラット亜慢性毒性試験．第 36 回日本バイオマテリアル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 	 	 9)蓜島由二，河上強志，福井千恵，田上昭人，柚場俊康，向井智和，野村祐介，伊佐間和郎 1，新見伸吾．新規血液バッグ素材 DOTH/DINCH 配合 PVC シートの性能評価．第 36 回日本バイオマテリアル学会大会（2014 年 11 月・
船堀）．	
 
	
 	
 

	
 
	
 

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¼ā"~1ĒÇ<āñ4ÆĂÁõùď:ĒføďôĀĂEøďç	 図 1. 本研究の概要
	 Ⅱ．分担研究報告書①	 ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究	
 
	
 
中岡竜介	
 
国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 分担研究報告書
平成 26 年度厚生科学研究費補助金（地球規模保健課題推進）研究事業	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25-地球規模-指定-008）	
 
	
 
	
 

分担研究課題名	 ISO/TC 共通窓口の試験的開設及び啓蒙活動に関する研究	 研究分担者	
  	
  	
 中岡	
 竜介	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 研究協力者	
  	
  	
 蓜島	
 由二	
  	
 	
 国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	
 
	
 
研究要旨	
 
	
 
	
  平成 23,24 年度に行った厚生労働科学研究費補助金／地球規模保健課題推進事業において作成
した「医療機器規格・基準の国際標準化戦略に係る政策的提言」を具体的に実行する体制の構築に資する施策として、ISO/TC の活動をサポートする窓口を試験的に開設した。今年度も、昨年度に引き続き「再生医療等製品」及び「医療機器ソフトウェア」の国際標準化活動を行っている
ISO/IEC の TC 国内委員会等に参加して情報収集を行い、それらの活動現状を取りまとめた。取りまとめた情報は、医療機器部サーバー内にホームページを開設して可能な限り情報を一般に発信した。また、啓蒙活動の一環として、医療機器の国際標準化に関する講演を４回行った。	
 

	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 

	
  	
  	
 

A.	
 研究目的	 	  医療機器に関しては、多くの JIS（Japan	 	
  近年の国際市場拡大により、法的規制

industrial	
 standards）規格が存在し、を国際的に整合化する動きが活発になっそれらは許認可における技術基準・規格ている。同時に、医療機器の性能や試験として数多く利用されている。近年、JIS法等、有効性と安全性に関する各種規規格は国際標準化機構（ISO）/国際電気格・基準の国際整合化が ISO や IEC で行標準会議（IEC）等の関連国際規格を医療われている。これらの規格・基準は各国

機器業界が翻訳して作成していることがにおける法的規制にも使用されている。

非常に多いため、元の国際規格を日本がこれらの状況を鑑みると、今後、医療機先導して作成することが、国際市場にお器の許認可においては、その国内法規へいて日本の医療機器業界が優位に立つ上の適合のみならず各種国際規格への適合で重要になってきていることになる。こも要求されることになる。	
 れまでも、医療機器の認証基準や各種ガ

	  平成 26 年に閣議決定された「健康・医イドライン等に引用規格として適宜 ISO療戦略」では健康・医療に関する国際展

や IEC は用いられてきたところであるが、開の促進が施策として挙げられ、医療分

今後は単なる引用に留まらず、我が国の野、特に医薬品、医療機器等の審査にお技術を医療機器関連の国際規格とし、日いて利用可能な国際標準化の策定、提案

本発医療機器を国際的に展開するための等の推進が明記された。	
 戦略とそのための環境構築が推進される

ことになる。	
 

るに留まっており、標準化の実務は各 TC

	  さらに、昨年 11 月 25 日より、薬事法を担当する国内審議団体に委ねられていが改正され医薬品医療機器等法が施行さる。医療機器分野に関連する複数の TC にれたことに伴い、国内において医療機器

おける実務は各々の国内審議団体によりの特性を踏まえた規制が構築されること取り仕切られており、その対象分野に特になった。この改正により、第三者認証

化した業界団体が活動を独立して実施・制度が一部の高度医療管理機器にも拡大支援している。そのため、それらの活動される等、医療機器規制が変化するため、状況や審議内容を包括的且つ具体的に把許認可における医療機器関連規格やその握している組織・団体等は存在しないの

国際標準化の重要性はますます高まる一が現状である。	
 方である。	 	  そこで、本研究においては、医療機器

	  このような状況にも関わらず、国内の関連の国際標準化状況の包括的な把握を医療機器の評価手法、必要な基準の策定、試行するために、特定の分野を選択して国際的な整合等に関する研究や活動は行

その国際標準化状況に関する情報収集とわれて来ているものの、日本発の良質な発信を行うと同時に、我が国における国医療機器を障壁なく国際的に進出させる

際標準化活動の課題やその有効活用を行

環境を整備する戦略的な研究は実施されうための対策を考察した。本研究では、ていなかった。	
 現在のニーズや社会的背景等を考慮して	  そこで、産官学連携のもとに平成 23,24「再生医療等製品分野」と「医療機器ソ年度厚生労働科学研究費補助金／地球規

フトウェア分野」を最初の対象分野とし、

模保健課題推進事業「国際標準化機構

昨年度からそれらに関連する ISO/IEC の（ISO）及び国際電気標準会議（IEC）に関連 TC	
 国内委員会に参加して各々の TC

おける医療機器の各種国際規格の策定ににおける活動状況及び国際標準化対象を関する研究（H23-地球規模-指定-003）」

調査してきた。今年度は、昨年度からのにおいて「医療機器規格・基準の国際標

両分野における進捗状況を取りまとめ、

準化戦略に係る政策的提言」が作成され上述した課題や対策、さらには今後、日た。その具体的な提言内容の一つが、自本発の国際標準を作成するための戦略を

国政府及び関連省庁と連携して基礎デー考察した。	
 タの収集や保持管理も行いつつ国際標準	  一方、国際標準化を戦略的に進めて行化活動を分野毎に取りまとめ、一元的且くためには、医療機器業界の積極的関与

つ戦略的に実施・サポートする機関を国も必須であることが前述した提言にも挙内に設立することであった。我が国におげられていた。そのためには、企業とし

いては、ISO への正式な参加機関として日て国際標準化活動に参画し、エキスパー

本工業標準調査会(Japanese	
 Industrial	
 トの貢献が正当に評価される環境を整え

Standards	
 Committee:	
 JISC)	
 が登録されるため、会社経営者層を対象として国際ているが、あくまでも ISO や各技術委員

標準に関する世界情勢とその重要性を周会（Technical	
 Committee:	 TC）における

知する啓蒙活動を行う必要がある。昨年

重要事項の決定・投票機関として機能す

度のアンケート調査結果から、医療機器

分野の国際標準化活性化のためには、国連する一般事項」（オブザーバー）	
 を挙げてのサポートだけではなく、企業

・IEC/TC	
 62「医用電気機器」（オブザー

上層部の意識改革を目的とした啓蒙活動を行う必要が示唆されたことから、本事バー）	
 ・IEC/TC	
 62/SC	 62A「医用電気機器の共業の紹介を兼ねた医療機器国際標準化の重要性に関する啓蒙のための講演や寄稿

通事項」（オブザーバー）	
 ・IEC/TC	
 62/SC	 62D「医用電子機器」（オを行った。	
 ブザーバー）	
 

	
 

	
 

B.	
 研究方法	 	  なお、ISO 全体の活動を実質的に管理す

1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 る Technical	
 management	
 board（TMB）に	  昨年度に引き続き、試験的窓口業務の日本がメンバーとして参加していること対象として、医薬品医療機器等法の施行から、TMB における審議を補助する目的でにより医薬品、医療機器と並んで個別分

ISO 上層対応委員会が設立されている。今野となる「再生医療等製品」と、Stand	 年度は、その委員会にもメンバーとして

alone 製品であっても医療機器として扱参加することで、ISO における最新の医療

われることになる「医療機器ソフトウェ

分野の標準化動向調査も行った。	
 ア」を選択した。	
 	
  収集した情報を元に、両分野における	  まず、それぞれの分野における国際標

国際標準化の動向を取りまとめ、今後の準化活動を行っている ISO/IEC の TC を調展開に関する考察を行った。また、取りべ出し、当該 TC の国内審議団体を介してまとめた動向等に関する情報発信用ホー

それぞれの国内委員会に委員、オブザー

ムページの立ち上げを開始した。	
 バー等で参加し、情報収集を行った。以	
 下に参加した TC を記す。	
 2)国際標準化に対する啓蒙活動	
 

	
 

	
  「政策的提言」では、我が国が国際標＜再生医療等製品＞	
 準化において戦略的に活動しその主導権

・ISO/TC	
 150/SC	
 7「再生医療機器」（国を握るために、まず、企業において国際際幹事）	
 ・ISO/TC	
 194「医療機器の生物学的及び臨床評価」（国内委員）	
 ・ISO/TC	
 194/SC	
 1「組織由来製品の安全性」（国内委員）	
 ・ISO/TC	
 198/WG	
 9「無菌処理」（オブザーバー）	
 ・ISO/TC	
 276「バイオテクノロジー」（ミーティング）	
 標準化に関する現在の状況とその重要性を認識してもらうことが重要であることが示されている。そこで、今年度は啓蒙活動の一環として、本事業の紹介と医療機器分野における国際標準化の重要性に関する講演や医療機器関連の学会誌へ総説・解説等の寄稿を行った。	
 
	
 
C.	
 研究結果	 	 1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 ＜医療機器ソフトウェア＞	
 	
  昨年度に引き続き、今年度も、「再生医・ISO/TC	
 210「医療機器の品質管理と関療等製品」及び「医療機器ソフトウェア」

を対象に国際標準化活動状況に関する調されたが、投票国全てが賛成票を投じて査を行った。以下に、両分野におけるこいたおり、その標準化文書発行のためのの１年での進捗状況を示す。	
 条件は満たされていたことから、2015 年

	
 中に当該文書が発行される可能性がある［再生医療等製品］	
 ことが判明した。	
 	  ISO における「再生医療等製品」の標準

	  TC	
 276 では「医療産業は業務範囲から化における全体的な状況に大きな変化は除外する」ことになっているものの、WG	
 見られなかったものの、International	
 4“Bioprocessing”で、日本の再生医療

Alliance	  for	
  Biological	
  Standardi-	 イノベーションフォーラム（FIRM）を中

zation	 (IABS)	
 が細胞治療に関する標準

心に再生医療等製品の製造プロセスに関化の議論を行っていることが判明した

連した標準化を目指して作業を進めてい（図１）。また、個別の ISO/TC においてることが明らかとなった。また、WG	
 1 で

は、昨年度よりも活発な動向が認められは、各国で定義されているバイオテクノ

た。	
 ロジー関連用語を収集・整理した「辞書」

	  今年度、TC	
 150/SC	
 7 においては、再生の作成に取りかかっているが、その用語

軟骨におけるグリコスアミノグリカン

対象の中に、再生医療等製品に関連する（sGAG）の染色による定量評価方法の標ものが含まれていることが判明した。	
 準化提案が正式に採択され、標準化に向	  TC	
 194 及び TC	 194/SC	
 1 では、現在、けた作業が始まった。一方、かねてから再生医療等製品に関連した標準化作業は提案されていた骨組織再生評価方法は、行われていないものの、4 月に三島市で開評価に用いる細胞ソースがラットの初代催された総会での WG	
 15 会議では再生医

間葉系幹細胞であったことから、動物愛療等製品の標準化状況に関する情報共有

護の観点からの反対票が多くなり、結果、が為された。また、SC	
 1 で発行された、

不採択となり、その内容修正を余儀なく

ISO における唯一の再生医療等製品関連されている。一方、「用語」や「一般的要標準である ISO	
 13022	
 “Medical	
 products	
 求事項」に関する標準化の取り組みに関containing	  viable	  human	  cells	  — 	
 しては、予備的作業が Web 会議ベースでApplication	  of	  risk	  management	  and	
 進んでいる。なお、日本提案で作成が始

requirements	  for	
  processing	  prac-	 まった「MRI を用いた軟骨再生評価方法」

tices”の定期見直しが 2015 年に行われに関する文書が、2014 年 2 月に Technical	
 る予定であったが、ISO のルール改訂が行

Report として発行されている。	
 われたため、その実施は不透明な状況で	  TC	 198/WG	
 9 では細胞を含む製品を対象あることも判明した。なお、SC	
 1 は、現とした「無菌操作」に関する国際標準化

在、活動再開を検討しており、2015 年中

文書の作成が進んでおり、既に DIS（Draft	 に TC	
 150/SC	
 7 との共同会議開催を行う

International	
 Standard）投票を２回終べく調整を行っていることが明らかとなえている.２度目の DIS 投票において、オっている。	
 ーストラリアとドイツから、非常に多く	 のコメントが寄せられていることが確認［医療機器ソフトウェア］	
 	
  医療機器ソフトウェアを取り巻く国際

医療機器関連の規格となるにも関わらず標準化の全体的な状況にも若干の変化がISO 側からは医療情報を中心に取り扱っ見られた。具体的には、医療機器ソフトており、情報系の専門家が多数参加してウェアのセキュリティに関する参照規格

いる TC	
 215 が関わっているケースが多い

が、IEC	
 	 SC	 62A と ISO/TC	
 215 との JWG	 7

ことが昨年の調査で明らかになったが、とで作成している規格類のみとなったこ

今年度の調査により、TC	 215 が参加するとである（図２）。このことは、ISO におJWG	  7 に お い て 、 本 来 、 Software	  for	 いて「セキュリティ」全般を扱う TC が新

Medical	
 Device における設計・開発（ラたに設立されることと関係している可能

イフサイクル）プロセスのための規格で性があるが、詳細は調査中である。なお、

あった IEC	
 62304 を Health	
 software	
 全

図２は、引き続き IEC/TC	
 62	
 Software	
 and	
 般を対象にした改訂版（第 2 版）作成がNetworks	
 Advisory	 Group	 (SNAG)国内支開始されたことも明らかとなった。	
 援委員会資料を改変したものである。	
 	  ISO における医療関係の標準化状況で	  「医療機器ソフトウェア」に関しては、あるが、先述した TC	
 276 以外に近年設立

医療機器とソフトウェアとの異なる視点

された TC は、６年前に設立された漢方薬を統合して標準化を行わなければならなを取り扱う TC	
 249 のみであり、現時点でいため、非常に複雑な状況となっている

新たな TC が設立される動きはないことがことが、昨年の段階で明らかとなってい明らかとなった。既存の TC においては、る。その中で、最も重要且つ影響度の大医療情報を扱い、IEC と共同でソフトウェ

きい「医療機器の品質管理（QMS）」に関

ア関連標準を作成している TC	
 215「医療する国際規格（ISO	 13485）の改訂作業が情報」の活動手順に関して問題点がある

ISO/TC	 210 で進んでいるが、昨年前半にこと、TC	
 121「麻酔装置及び人工呼吸器実施された DIS 投票において次のステー

関連装置」で欧州規格との調整が上手くジである Final	
 DIS（FDIS）文書とするこ

いかず標準化が遅れていること等が TMBとが否決された。この規格では参照文書で問題視されていることも判明したが、としてソフトウェアの製品及びプロセス

標準化の内容自体は問題になっていなか

規格が明記されることになり、医療機器った。	
 ソフトウェアが QMS の対象となりうるこ	  なお、今回取りまとめた調査結果は、と、それ以外に、図１に示したように、昨年度同様、医療機器部サーバーに開設

非常に多くのソフトウェア関連規格がした本研究紹介用ホームページにより適QMS に取り込まれることになっている。現宜更新の上、公開している(http://dmd.	
 在、二度目の DIS 投票を目指して再改訂

nihs.go.jp/chikyukibo/index.html)。	
 中であり、2015 年半ばには再度 DIS 投票

今年度は、特に医療機器ソフトウェア分が行われる予定である。	
 野の情報を中心に情報公開を進めた一方、	  また、QMS に引用される各種規格は IEC

再生医療等製品に関する情報も最新情報

単独ではなく、ソフトウェア関連のへの更新を適宜行った。	
 IEC/TC と ISO/TC との合同ワーキンググル	 ープ（joint	 WG）で作成されていること、

2)国際標準化に対する啓蒙活動	 	
  昨年度、医療機器企業における国際標（2015.1.28）	
 準化に関する理解や活動状況・姿勢を確	 認するために、医療機器業界団体に傘下

D.	
 考察	
 

企業への配布を依頼して実施したアンケ

1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設	
 ート結果から、企業のみならず、業界全	  現在、再生医療と呼ばれるものが実用

般に対する啓蒙活動の必要性が明らかに化にまで至ったケースは数少なく、米国なった。このことを受けて、法人や学会

で自家培養表皮、自家培養軟骨が 1997 年

等で医療機器業界関係者や国際標準化にに製造販売承認を得てから、新規の製品取り組んでいる関係者を対象にした発として実用化に至った例は数える程であ

表・講演を行い、医療機器における国際る。我が国においても、J-TEC が 2007 年

標準化の現状報告とその重要性の啓蒙をに自家培養表皮、2012 年に自家培養軟骨行った。以下に、今年度実施した講演をの製造販売承認を取得したが、それ以外記す。	
 の製品は未だ上市されていない。培養表	
 皮に関する研究が 1970 年代に開始された

・	 （公財）先端医療振興財団臨床研究情ことを鑑みると、我が国におけるその実

報センターにて「再生医療分野の標準用化には 30 年を要したことになる。また、

化状況、一般的な ISO 作成手順と取得

軟骨に関しても、実用化に繋がった研究

対象及び方法」のタイトルで講演が開始してから 20 年以上の時間を要して（2014.5.9）	
 おり、それらの事実からも、再生医療等

・	
 第 53 回日本生体医工学会大会、オー製品の実用化を加速するための環境整備

ガナイズドセッション「医療機器におが必要であることが示唆される。そのたける橋渡し研究と国際標準化の推進」

めには、「再生医療等製品」の特性を理解

にて「橋渡し研究及び国際標準化の行し、その種類を明確にしておく必要があ

政的支援」のタイトルで講演ると思われる。	
 （2014.6.24）。	
 	
  単純に「再生医療」と言っても、その・	 ファインセラミックス国際標準化推種類は様々であるため、そのことを理解

進協議会主催「ISO/TC	
 150（外科用イ

せずに一括りに考えようとすると、それ

ンプラント）とバイオセラミックスのらの安全性、性能評価が難しくなる。「再国際標準化の状況」講演会にて「医療生医療」が時代の脚光を浴びたのは、1993

機器に関連した国際標準化状況につ

年に Nature で「人の耳を背中にもつマウ

いて：ISO/TC	
 150（外科用インプランス」が発表されたことに溯る。これ以降、ト）を中心に」のタイトルで講演

終末分化した細胞と人工物（Scaffold）、（2015.1.27）	
 増殖因子等を組み合わせて、組織再生を・	
 （一財）日本規格協会における平成 26

試みる研究が活発化した。その成果の一

年度第 2 回 ISO 国際標準化研修	
 ―	
 上

つが J-TEC の自家培養軟骨である。	
 級編（実践コース）で「国際幹事経験	  一方、培養皿を化学的に加工して細胞談及び医療機器分野国際標準化の現をシート状に回収する技術も進み、その状について」のタイトルで講演

シートを疾患治癒に用いるための研究も進んでいる。前述の研究と違うのは、最のが現状である。	
 終製品に人工物が存在しないことである	  このように、国内外において上市されが、この研究も元々は工学研究者によるている再生医療等製品は数えるほどであ細胞と人工物との複合体を利用した組織

り、且つ海外展開を行っている企業は存

再生研究が出発点であるため、上記同様、在しない。それにも関わらず、ISO の複数細胞と人工物との相互作用が安全性の面の TC、SC で再生医療の stakeholder らがからも重要視された。現在、この研究を集まり国際規格の作成を行っていること基にした虚血性心疾患治療用ヒト骨格筋

は、将来の海外展開を見据えた戦略を準芽細胞シートは治験段階に、角膜障害治備している国や企業があることを示唆し療のための角膜上皮（幹）細胞シートはている。とりわけ、各 TC での活動に米国

治験前相談が終了しているとの情報があ

FDA 関係者が積極的に関与していること

るが、それらが上市されるにはまだまだから、産業化を先行させ自国規格を実質時間を必要とする状況である。	
 上の国際標準とする「デファクト」手法	  上記 2 種類とは異なるアプローチとしを重視してきた米国が、再生医療等製品て、細胞のみを用いて組織再生を行う「細においては「デジュール」標準重視へと胞治療」研究が存在する。従来から、幹シフトしつつその国際標準化における主細胞や ES 細胞、終末分化細胞を用いて同導権を握ろうとしていることを示してい様の研究は行われており、癌治療のためる。なお、他の医療機器関連 TC でも同じに患者から取り出した樹上細胞を体外でような動きが見られていることから、こ培養して人為的に癌抗原を提示させた後の米国の国際標準化に対する方針変更がに患者に戻す Provenge、重度のしわを修

全ての分野に広がっている可能性も否定

復する LaViv 等が米国でバイオロジクス

できないが、少なくとも「再生医療等製として実用化されているが、未だに我が品」分野を含む医療分野全般に及んでい国では同等の製品は実用化されていない。 ることが考えられる。	
 （注：バイオロジクスとしては、造血系

	  上述したように、我が国の再生医療等

再構築を目的とした細胞治療製品が複数製品で製造販売承認を得たものは 2 品目品実用化されているが、これらは骨髄移のみであり、その他は未だに治験や臨床植等に代わるものであり、再生医療とは

研究の段階であることから、再生医療等

趣を異にするものであるため、ここでは製品の国際標準化にまで目が行き届かな言及しない。）しかしながら、2014 年に、い面がある。しかしながら、実用化まで我が国において細胞治療製品の第一例との時間はまだ必要なものの、我が国発のなり得る、移植片対宿主病（GVHD）抑制

万能細胞である iPS 細胞を利用した製品を目的としたヒト間葉系幹細胞製剤の製開発が進んでいることから、知的財産権

造販売承認申請が為された。さらに、iPSとの効率的な併用を考慮しつつ将来展開細胞の樹立成功により、細胞治療によるを見越した「デジュール」規格の作成を

再生医療研究が活発化し、多くの公的研

戦略的に進めていかなければならないと究資金も投下されているが、iPS 細胞を用考える。作成された国際規格が実際に規いた製品の実用化にはまだ時間を要する

制当局に利用されるか否かは別に議論しなければならないが、少なくとも我が国のように、細胞治療と組織工学製品、いがこの分野で主導権を握っていくためにずれにおいても工学技術が関与する度合

は stakeholder 間で情報及び認識を共有いが高い。両者の品質、安全性及び有効しつつ、戦略的且つ統一的に再生医療等性を考慮するためには、両者を明確に区

製品の国際標準化に取り組んでいかなけ

別した上で、各々の製造工程・特性を鑑ればならないことが明確となった。そのみた各種評価方法の構築が必要となるが、ために直面する問題として、以下の２点

その際、工学的視点からの評価方法構築

が挙げられる。	
 も重要となる。よって、現在、再生医療

	 研究に携わっている全ての研究者が、携1.先述したように、「再生医療等製品」にわっている研究の種類、特性を明確に理相当するものは大きく分けて２つ（細解した上で、他分野の研究者と密に情報胞単独による細胞治療、あるいは細胞交換や共同研究を行わなければこの問題と人工物、薬剤とを複合化した組織工は解決せず、再生医療等製品の迅速な実学製品）存在するが、その点に関する

用化や関連技術の国際標準化は進展しな理解・区別が stakeholder の間で共有

いと考えられる。今後、関連学会同士のされていない。	
 密な連携の構築等、何らかの対策を講じ

	
 て問題を解決する方法を模索していく必

2.複数の ISO/TC で再生医療等製品に相当要がある。	
 する分野の標準化が試みられており、

	  2 に示したように、現在、複数の ISO/TC

その作業が各々独立して進んでいる。	
 で再生医療等製品関連の標準化が試みら

	 れているが、これまでに ISO で発行され	  1 は、現在、再生医療に携わる研究者が、た再生医療等製品関係の標準は ISO	
 13022

先述した再生医療等製品の種類を明確にのみである。この原因の一つとして、こ理解しないまま、各々の背景を中心に研の分野における human	 resource が不足し究を進めるために生じている問題である。	
  ていることが挙げられる。事実、TC	
 150/SC	 	  再生医療等製品の実用化においては、

7 において、標準化提案は複数行われてい細胞治療研究者の多くが、細胞のみを研るものの、作業開始にまで至った案件は究対象とした「製品」の開発が可能と考活動年数に比べて少ない。その原因は、えている様子が見受けられる。しかしな

ISO の規程で定められている作業開始にがら、細胞治療においても、製品化に伴必要な expert が集まらないためである。

う工学技術（培養関連装置、保存装置等）

現在、標準化に積極的関与している国とが重要であることは明らかである。また、しては、我が国以外には米国、ドイツ、

現在、実用化されている多くの再生医療

中国、韓国、ブラジルが挙げられ、いず等製品は、細胞と人工物との複合品かられの国においても研究自体は活発であるなる「組織工学製品」であり、この場合が、標準化のための Expert 選任には苦労には細胞のみならず、人工物、さらにはしているのが現状である。よって、ISO に

それらの相互作用解析を基にした品質、おける当該分野の標準化活動を集約し、安全性及び有効性評価が必要となる。こhuman	
 resource を有効に使う必要性があると考えられる。	
 めの連携体制構築に、非公式ながら取り	  ISO	
 13022 は、様々な議論を経た結果、組み始めている。この活動が、今後の再対象となる細胞は終末分化細胞のみとな

生医療等製品関連の国際標準作成を戦略

り、再生医療等製品において重要なツー的な All	
 JAPAN 体制で行うための土台とルである各種幹細胞は対象となっていななることを、我々は期待している。	
 い。そのため、幹細胞の取扱いが改定時

	  医療機器ソフトウェアの標準化も、現の論点となることが予想される。現在、在、米国が主導権を握ってその作成を行

幹細胞を含む細胞の品質及び安全性に関っていることが示唆される調査結果を得

しては、IABS でも議論が行われているもた。しかしながら、医療機器としての標のの、IABS によるそれらの標準化を目指

準化にも拘わらず、ISO 側では主に情報系している様子は認められない。しかしな

専門家で形成される TC	
 215 が関わっておがら、WHO をその議論に巻き込んでいるこ

り、医療機器の特性を考慮しない規格がとから、IABS での議論を反映させた WHO作成されるのではないかとの点が危惧さガイダンスの発行を最終目標にしているれた。医療機器業界側でも同様の点を危と思われる。そのため、ISO	
 13022 の改定惧しているようであり、その解決のため、時に幹細胞を対象とする方向で議論を行TC	
 215、あるいは joint	
 WG にメンバーをうことは、IABS の活動と重複する可能性

送り込んでいることが明らかとなった。

を孕んでいる。現在、国策として推進さ

また、ISO	 13485 の改訂に伴い医療機器ソれている健康・医療戦略において、医療フトウェアが QMS の対象となりうること、分野における規制に利用可能な国際標準

その際の引用規格が非常に多くなること化の作成推進が掲げられていることを鑑から医療機器ソフトウェアの製造工程管

みると、適切な戦略の元、国内関係者間理が非常に複雑化する可能性が示唆されで事前に意見調整を行い両者の業務切りた。このことは、ソフトウェアを必要と分けや共同作業を提案する等の活動を行する医療機器にとっても非常に大きな変えば、それを足がかりに ISO/TC の集約や更になることから、ISO	
 13485 の改訂状況

human	
 resource の有効な再配置に繋がり、を注視していく必要があると思われる。	
 この分野における国際標準化を我が国が	  ISO	
 13485 の改訂に関しては、先述した主導できる可能性がある。他国に先立っ

変更点についての議論も紛糾しているが、て活動できるこの機会を逃してはならな

日本を含めた数の国が反対票を投じた大いが、関係者間でそのような戦略を立てきな原因は ISO	
 13485 の親規格である ISO	 るための組織がまだ構築されていないの

9001 が現在改訂されていることが挙げらが現状である。	
 れる。この改訂版は、2015 年中に発行さ	  現在、我々は、再生医療等製品と関連れる可能性があることから、以下のようした標準化作業を行っている TC	 150/SC	
 7、 な懸念が存在している。	
 TC	
 194/SC	
 1、TC	
 198、TC	
 276 国内委員会

	
 関係者及び関係省庁関係者との間で、再・	
 用語の定義、項立てが改訂されている

生医療等製品に関する国際標準化に関しため、現在改訂中の ISO	
 13485 と齟齬て統一した方向性と連動性を共有するたが生じてしまう	 ・	 結果として、ISO	
 13485 の改訂版を発なることは明らかであり、我が国も産官行しても、すぐに ISO	
 9001 に合わせ学共同でこれらの規格作成に積極的に関た改訂が必要になる	 与しなければならない状況になっている

	 ことが示唆されている。	
 	
  そのため、二度手間を恐れた多くの国	 が反対票を投じたことが考えられる。改2)国際標準化に対する啓蒙活動	
 訂作業がさらに遅れることになったこと

	  昨年度、実施したアンケート結果で、から、上記の懸念は増大しており、2 回目

医療機器企業関係者への啓蒙活動が必要の DIS 投票においてその改訂が受け入れであることが明らかとなったことから、られるかどうかは未だに不透明である。	
 医療機器分野における国際標準化の重要	  国内では、医薬品医療機器法が施行さ性を啓蒙する目的で、4 回、発表・講演をれたことに伴い、QMS 省令も修正され現行行った。今回行った講演は、それぞれ研の ISO	
 13485 との整合性が高められたば究センター、学会、標準化関連団体、ISOかりである。よって、上記改正が成立し活動支援団体が主催したものであり、そた場合、近い将来、QMS の国際整合の再考

れぞれ国際標準化に関する興味の度合い慮が課題となる可能性がある。よって、は異なるものの、講演後の質疑で多数の医療機器ソフトウェアのみならず、医療質問が出たことから、その重要性をある

機器分野全体の課題として ISO	
 13485 の程度啓蒙することができたと思われる。	
 改訂内容を注視していかなければならな	  アンケート結果で、企業内にも潜在的いと考える。	
 には国際標準化の重要性を感じている	  医薬品医療機器等法の施行に先立って、 方々が多いことが示唆されていたことか
医療機器の基本要件基準も改正され、第 2ら、企業を対象とした講演を実施できな章第 12 条第 2 項に「プログラムを用いた

かった面で啓蒙活動は十分ではなかった

医療機器については、最新の技術に基づと思われる。よって、医療機器産業界をく開発のライフサイクル、リスクマネジ

対象に同様の取り組みを行い、関係者、

メント並びに当該医療機器を適切に動作

特に、企業上層部に直接国際標準化の必させるため確認及び検証の方法を考慮し、 要性を訴えていく等の活動を実施するこ
その品質及び性能についての検証が実施とが、今後の課題となった。	
 されていなければならない」と明記され	 た。このことは、医療機器ソフトウェア

E.	
 結論	
 

に関する国際標準を何らかの形で規制に

1)ISO/TC 共通窓口の試験的開設	 取り込むことを示唆している。事実、こ	  昨年度同様、「再生医療等製品」と「医の規定は 3 年間適用されないが、取扱い

療機器ソフトウェア」にテーマを絞り込については国際規格の取扱いも含め今後

み、現在行われている国際標準化活動状検討が必要と報告されている。よって、況を取りまとめた。その結果、前者ではISO	
 13485 のみならず、現在改訂中の IEC	
 製品開発に先行して「デジュール」規格62304 を中心とした医療機器ソフトウェの作成が始まっており、複数の ISO/TC で

ア関連国際規格が規制においても重要に関連技術の国際標準化作成作業が活発化していること、後者においてはその標準

2)中岡竜介、蓜島由二、新見伸吾．橋渡化が QMS をも巻き込み複雑化しているが、し研究及び国際標準化の行政的支援．

その鍵となる ISO	
 13485 の改訂が滞って第 53 回日本生体医工学会大会（2014 年

いることが明らかとなった。前者におい

6 月・仙台）	
 ては、我が国が主導権を握れる分野であ3)中岡竜介．医療機器に関連した国際標

り、製品の実用化に先立った「デジュー準化状況について：ISO/TC	
 150（外科ル」規格作成が活発化していることから、用インプラント）を中心に．「ISO/TC	
 製品カテゴリーの明確化や All	 JAPAN 体

150（外科用インプラント）とバイオセ制を構築して戦略的な活動を実施しなけラミックスの国際標準化の状況」講演

ればならないことが明らかになった。後会（2015 年 1 月・東京）	
 者においては、ソフトウェアを内包する

4)中岡竜介．国際幹事経験談及び医療機

医療機器も含め、その規制が厳しくなる

器分野国際標準化の現状について．平可能性があることも示唆されたが、鍵と成 26 年度第 2 回 ISO 国際標準化研修	
 ―	
 なる ISO	 13485 の改訂が遅れていること、上級編（実践コース）（2015 年 1 月・東

それに伴いその内容に変更が生じる可能京）	
 性が示唆された。ISO	
 13485 の改訂は、我	
 が国における QMS 省令へも影響を及ぼす

G．知的財産権の出願・登録状況	
 可能性があること、ソフトウェア関連国

	
  	
  なし

際標準をどのように規制に取り入れていくかを検討している段階であることから、
今後、我が国も積極的にその作成に関与していかなければならないことが示唆さ
れた。	
 
	
 
2)国際標準化に対する医療機器関連企業の意識調査	 	  医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙する目的で、計４回、医療機器関連団体等を対象に研究発表、講演を行った。その結果、ある程度医療機器分野における国際標準化の重要性を啓蒙することができた。	
 	
 F.	
 研究発表	
 1)中岡竜介、蓜島由二、新見伸吾．医療機器・材料の国際標準化動向．バイオ
マ テ リ ア ル - 生 体 材 料 ， 33(1):56-63	 (2015)．	
 図１．再生医療等製品関連規格の現状（2015 年版）

図２．医療機器ソフトウェア関連規格の現状（2015 年版）

Ⅱ．分担研究報告書②

	 歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	
 
	
 

大熊一夫	
 
日本歯科大学新潟生命歯学部	
 歯科理工学講座	
 分担研究報告書
平成 26 年度厚生科学研究費補助金（地球規模保健課題推進）研究事業	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25-地球規模-指定-008）	
 
	
 
	
 

分担研究課題名	 歯科用 CAD/CAM によるセラミック加工法等の国際標準化に関する研究	 	
 研究分担者	
  	
  	
 大熊	
 一夫	
 	
 	
 	
 日本歯科大学新潟生命歯学部	
 歯科理工学講座	
 	
 研究協力者	
  	
  	
 蓜島	
 由二	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 蛯原	
 善則	
  	
 	
 株式会社ジーシー	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 Somchai	
 Urapepon	  	  マヒドン大学（タイ）	
 
	
 
	
 
研究要旨	
 
	
 
	
  本研究では、「国際標準化機構(ISO)及び国際電気標準会議(IEC)における医療器機の各種国際規格の策定に関する研究(H23-地球規模-指定-003)	
 」において策定した「医療機器規格•基準の国際標準化戦
略に係る政策的提言」を具体的に実行する一環として、新規規格の提案を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集するため、歯科分野におけるケーススタディを実施した。	
 	
  歯科界で注目されている医療器機である歯科用 CAD/CAM に関する規格を ISO/TC106/SC9 に日本から新規提案し、CD 化に至るまでの情報を収集した。本規格は、平成 25 年度 ISO/TC106 総会（インチョン会議）における新規提案を経て、平成 26 年 6 月に CD 案「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-aided	
 milling	 machines	
 –Test	 methods」の投票が行われ、賛成 9 カ国及び反対 3 カ国の結果をもって採択された。同年 9 月に開催された ISO/TC106/SC9/WG5	
 ベルリン会議では、Convener として、5 ヵ国によるインターラボラトリーテストの結果報告及び各国から提出されたコメントに対応した。また、本 CDに新たな CMM 及びソフトウェアを追加することが提案され、2nd	
 CD へステージを進めた。	
 
	
 
	
 

Ａ．研究目的	 	  金属アレルギーの問題や金属の高騰か
ら、厚生労働省は脱金属を提唱し、新しい修復用材料の開発を熱望している。一つの答えがセラミック材料である。しかし、セラミックスは修復材料としては、脆弱過ぎる。そこで、高強度セラミックスとして、
ジルコニアセラミックスが開発された。ジ
ルコニアセラミックスは本焼結すると、
1200	
 vH(エナメル質：350vH)に達し、通常の切削は困難である。また、焼結による収縮が 30%にも達するため、精度の高いジル
コニアセラミッククラウンは修復物の三次元データを 30%拡大し、半焼結状態のジ
ルコニアセラミックブロックから切削加工し、加工後本焼結することにより作製される（図 1）。ジルコニアセラミッククラウンを作製するために不可欠な機械が
CAD/CAM である。歯科用 CAD/CAM は、1985
年にスイス・チューリッヒ大学のグループが、世に送り出した。日本国内では数年後に通産省／NEDO（新エネルギー・産業技術
総合開発機構）傘下のプロジェクトとして、「次世代オーラルデバイスエンジニアリ
ングシステム」（1993〜1996 年）が実施された。国内に視点を向けても、平成 26

年 4 月に、CAD/CAM 冠として CAD/CAM が歯科診療報酬に初めて組み込まれた。このよ
うに、歯科分野において世界的に最も注目されている医療器機が CAD/CAM である。	
 	
  本研究では、新規規格の提案を通じて国際標準化に必要な戦略を収集することを目的として、歯科分野においてケーススタ
ディを実施した。近未来に歯科界のリーダーシップを獲得するため、平成 22 年から準備を開始し、新しい SC（SC9：CAD/CAM	 systems）の設立（平成 23 年フェニックス
会議/Plenary）、事前説明（平成 24 年パリ
会 議 ） を 経 て 、 平 成 25 年 に 新 規 規 格「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-aided	 用、2 級インレー用、クラウン用及びブリッジ用金型から三次元データを取得し、切削用三次元データに変換し、半焼結ジ
ルコニアセラミックブロックから CAD/	 CAM マシンを用いて修復物を作製した。作
製した修復物を金型に装着し、金型と修復物の変位量を測定し、修復物の精度の評価を行った。	
 	
 1-1-2.測定のための印記	 	  インチョン会議において、1 級インレー
及びクラウンのような上面像が正対称の修復物の場合、測定を行う上で試料に印記する必要性が話題となった。そこで、

milling	 machine	
 –Test	 methods」を日本から正式に提案した（インチョン会議/Ad-hoc	 5/暫定 Convener）。平成 26 年度のベルリン会議では、SC9/WG5 を Convenerとして開催し、CD に対する各国からのコメントに対応し、本規格の国際標準化を目指して活動した。	
 	  	 Ｂ．研究方法	 (1)ケーススタディ	 1-1.歯科用 CAD/CAM によって作製したセラミック修復物の加工精度の評価方
法を国際標準化に関する研究	
 1-1-1.インターラボラトリーテスト	 	  平成 25 年度 ISO/TC106/WG5 会議（インチョン会議）において、タイと日本で実施した新規規格に準じて行った実験結果を報告し、実現可能な規格であることを報告した。そこで、CAD/CAM で作製したセラミック修復物の精度の評価方法の理解や改善のため、米国、タイ、ドイツ、スウェーデン及び日本の 5 カ国でインターラボラトリーテストを行うことになった。
新規規格に記載した寸法の 1 級インレー

最初の測定点を 0°とし、修復物と金型との変位量を測定した。同様に、45°、90°、135°、180°、225°、270°、315°毎に試料を回転させ、計 8 点における修復物と金型との変位量を測定した（図 2）。	
 	
 1-1-3.CAD/CAM 材料の被切削面	
 	  歯科用修復物の外面及び内面の表面粗さは、修復物の臨床的寿命に大きく影響する。切削加工後の表面粗さは、被切削
材料や切削加工条件（Dry/Wet，加工ピッ
チ速度，仕上げ代量，切削工具の種類，
送り速度及び工具回転数）が主な要因となる。そこで、一定加工条件下における 4
種類の修復物材料（ジルコニア未焼結、ジルコニア本焼結、コンポジットレジン
及び純チタン）の被切削表面の画像を取得し、加工痕を評価した。通常、表面粗さの評価には表面粗さ計を用いるが、国際標準としての利用価値を高めるため、容易にデータを取得できる画像による解析法を採用した。ジルコニア未焼結の加工は Dry 条件下、加工ピッチ 0.1mm、仕上
げ代 0.1mm、ジルコニア用ダイヤコート、

送り速度 500mm/min、工具回転数 2500min-1
できることが確認された。	
 で行い、ジルコニア本焼結、コンポジッ	 トレジン及びチタンにおいても同一の加1-1-2.測定のための印記	
 工条件で切削した。加工状態は被切削面 	
  	  	
  1 級インレーと金型との変位量の平均を観察することにより評価した（加工痕は+0.962mm であり、クラウンの場合はが明確な場合：加工条件が不適切，加工+0.422mm となった。1 級インレーとクラ痕が明瞭でない場合：加工条件が適切）。	
  ウンの標準偏差は、それぞれ 0.074 及び	
 0.024 であり、変位量平均値の 1/10 程度
1-1-4.ISO/TC106/SC9/WG5 ベルリン会議	  	  	
 の小さい値であった。また、測定回数（こ	  WG5（Machined	
 devices）に Convenerの場合角度が大きくなる）が多くなるほとして出席し、インターラボラトリーテ
ど、修復物と金型の変位量が減少する傾ストの結果報告及び各国からのコメント
向が認められた（図 3）。これらの成績かに回答した。また、CMM 及ソフトウェアによら、測定のための印記は必要性ないこと
る精度の測定方法が米国から提案された。	
 が確認された。	
 	 	
 1-1-5.倫理面への配慮	 	  ヒト又は動物を用いた試験を実施しな
いため、非該当である。	
 	
 Ｃ．研究結果	 (1)歯科用 CAD/CAM によって作製したセラ
ミック修復物の加工精度の評価方法
を国際標準化に関する研究	
 1-1-1.インターラボラトリーテスト	 	  インターラボラトリーテストには米国、
タイ、ドイツ、スウェーデン及び日本の 5ヵ国が参加したが、ベルリン会議までに作業が完了し、結果の報告に至った国は
タイと日本のみであった。タイのクラウ
ンと金型の変位量の測定結果は、ジルコ
ニアセラミックスで平均＋0.08mm、コン
ポジットレジンで+0.50mm、ワックスで+0.08mm であった。日本のジルコニアセラ
ミックスで作製した精度は+0.005mm であった。この差は変位量の測定機器の限界によるものである。	
 	
  加工精度は、被切削材料に影響をされるが、日本から提案した方法により評価

1-1-3.CAD/CAM 材料の被切削面	
 	
  同一加工条件下におけるジルコニア未
焼結、ジルコニア本焼結、コンポジット
レジン及び純チタンの被切削表面の画像を図 4 に示した。	
 	
  ジルコニア未焼結（a）とジルコニア本
焼結（b）の被切削面を比較すると、ジル
コニア本焼結の被切削面の中心部に十字用の大きな工具による痕が残ると共に、切削加工中に工具が破損する等、適正な加工条件でないことがわかる。一方、ジ
ルコニア未焼結（a）は切削工具の痕が認められず、適正な被切削面であることが確認された。同様に、コンポジットレジン（c）は適正な被切削面、純チタン（d）
は不適正な被切削面であることが確認され、被切削面から適切な切削加工条件を評価できることが判明した。	
 	
 1-1-4.ISO/TC106/SC9/WG5 ベルリン会議	  	 	
  6 月に CD の投票が始まり、8 月に CD 投
票が締め切られた。その結果、賛成 9 カ国、反対 3 カ国（オーストラリア、ブラジル及びスウェーデン）、棄権 2 カ国をもって、本 CD は採択された。	
 	
  反対票を投じたオーストラリアとスウ
ェーデンは本 CD が「加工機の精度に特定した評価法」であることを理解しておらず、「システム全体」の評価法として誤認している可能性が考えられたため、事前の国内委員会において、「序文及び適用範囲」を修正した。国際会議にあたり、本修正版を事前に各国エキスパートへ回
付した。	
 
	
  ベルリン会議は各国から寄せられたコ
メントに対する回答で始まった。会議中、
概ね日本の提案については合意が得られ	  従来、CAD/CAM で作製したクラウン及びブリッジと金型の変位量を測定する場合、試料を手指で把持してノギスを用いて計測していた。そこで、測定精度の向上及び測定時間の短縮を図るため、レーザ計
測を応用した測定機を考案し、作製した（図 6,7）。この装置では、修復物と金型の変位量を随時測定することが可能であり、精度の高い測定結果を得ることができた。	
 	  ベルリン会議において、スウェーデンのエキスパートは経験が浅く、日本からの提案を理解できなかった。また、スウ
ェーデンはインターラボラリトーテスト

たが、日本提案の金型を用いた測定方法
で な く 、 CMM	  (Coordinate	  Measuring	 Machine:三次元測定機)及び三次元の元
データと CAD/CAM で作製したセラミック
修復物の三次元データの変位量の差を求めるソフトウェア法が米国から提案された。この結果、これらの項目を追加した
2nd	
 CD にステージアップすることになっ
た。	
 
	
 
Ｄ．考	
  察	
 
	
  平成 26 年度は、CAD/CAM で作製したセラミック修復物の測定精度を向上させるための治具（図 5）を作製し、インターラ
ボラトリーテストに利用した。特に、2 級インレーの治具では、咬合面と側方の両方から 50N の荷重を同時に加えることができるようになり、測定精度が格段に向上した。今回行った実験（1-1-2 項）において、試料を 45°毎に回転させて計 8 点の各金型との変位量を測定する場合、一定の小さい定点に定荷重を加えることが可能であり、精度の高い測定結果を得る
ことができた。	
 に参加表明し、測定用金型を提供したにも拘わらず、試験成績を報告しなかったのは非常に残念な結果である。	
 	
  一方、反対を投票したオーストラリア
は、事前回付した修正版の内容を理解し、日本提案を受け入れた。国際標準化を円滑に進めるためには、国際会議における丁寧な説明、会議資料の提供や各国エキスパートに対するロビー活動が非常に重要であることを再確認した。また、米国代表団長の Mrs.	
 Sharon が本会議の議事録の作成にも援助してくれる関係を築いていたので、会議がスムーズに進行した。	
 	  ベルリン会議中、概ね日本の提案については合意が得られたが、日本提案の金型を用いた測定方法でなく、CMM 及びソフ
トウェアを利用する方法が米国から提案されたため、現在、これらの項目を追加
した 2nd	 CD を作成している。2015 年 3 月
末までに SC9 事務局に送付した後、2nd	
 CD
投票が行われる予定である。	
 
	
 
Ｅ．結	
  論	
 
	
  インターラボラトリーテストの結果、

CAD/CAM により作成されたセラミック修
復物の加工精度は、日本が提案した CD「Machining	 accuracy	
 of	
 computer-aided	
 milling	 machine	
 –Test	 methods」により正しく評価できることが確認された。また、ベルリン会議（平成 26 年 9 月）における討議の結果、本提案規格に CMM とソフトウェアを追加して 2nd	 CD ステージに進めることとした。	
 	
  国際会議では、会議前の丁寧な説明及び会議資料の提供により、各国からの信頼を得ることが重要である。また、日本から提案した医療技術を国際標準化する
一つの道は、WG の Convener を獲得することである。	 	 Ｆ．健康危険情報	 	  特になし。	
 	
 Ｇ．研究発表等	 1)Koide	 M,	
 Ohkuma	
 K,	
 Ogura	 H,	
 Miyagawa	
 
Y.	
  A	
  new	
  method	  for	
  fabricating	 zirconia	  copings	
  using	  a	  Nd:YVO4.	
 Dental	 Materials	
 Journal,33:422-	
 429	
 (2014).	
 2)小出未来,	 大熊一夫,	
 小倉英夫,	
 宮川
行男 Nd:YVO4 レーザを用いたジルコニ
アコーピングの新しい加工法	
  被照射面の熱処理後のラマン分光分析.	
 	
 日
本歯科理工学会第 63 回春季学術講演会（2014 年 4 月・千葉）.	
 
3)赫多	
 清,	
 大熊一夫,	
 宮川行男．陶材の咬合摩耗に及ぼす試験片支持材料の影
響.	
 日本歯科理工学会第64回秋期学術講演会（2014年10月・広島）.	
 
	
 
	
 

	
 

参照資料	
 
	
 1)第 50 回 ISO/TC106 会議報告書。2014 年（通巻35 号）．日本歯科材料器械研究協議会	
  2015 年
1 月 13 日．	
 	 図3. Influence on discrepancy by themeasurement position	a) Class 1 Inlay	

図1. ジルコニアセラミッククラウンの作製行程	

b) Crown	

図2. 各修復物の測定点	

図6. クラウンの変位量測定器（全景）	
a)ジルコニア未焼結 	b)ジルコニア焼結 	c)コンポジットレジン	

d)純チタン2種	

図4. 被切削材料の加工後の表面	

a) 全景（上方と側方から50N）	

b) 金型に装着された2級インレー試料に二方向から荷重	

図5. 定荷重試験機	
図7. クラウンの変位量測定	別添1	

© ISO 2014 – All rights reserved

ISO/TC 106/SC 9WG 5 N 12

Reference number of working document: ISO/TC 106/SC 9

N 12(replace
N10 )Date: 2014-09-02

Reference number of document: ISO/CD 18845.2
Committee identification: ISO/TC 106/SC 9
Secretariat: JISC

Revised CD 18845

Revised CD 18845.2

Copyright noticeThis ISO document is a working draft or committee draft and is copyright-protected by ISO. While thereproduction of working drafts or committee drafts in any form for use by participants in the ISO
standards development process is permitted without prior permission from ISO, neither this document
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ISO copyright officeCase postale 56 CH-1211 Geneva 20
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org

Page

Foreword.............................................................................................................................. iv
Introduction .......................................................................................................................... v
1 Scope ............................................................................................................................... 1
2 Normative references ..................................................................................................... 1
3 Terms and definitions ..................................................................................................... 1
4 Requirements .................................................................................................................. 1[as appropriate, of the Copyright Manager of the ISO member body responsible for the secretariat of
the TC or SC within the framework of which the draft has been prepared]

Dentistry — CAD/CAM systems – Machining accuracy ofcomputer-aided milling machines – Test methods

Contents

5 Test methods ................................................................................................................... 1
5.1 Target restorations ........................................................................................................ 1

Reproduction for sales purposes may be subject to royalty payments or a licensing agreement.

5.2 Apparatus ....................................................................................................................... 1

Violators may be prosecuted.

5.3 Preparation of three-dimensional data ........................................................................ 2

Médecine bucco-dentaire —5.4 Machining of restorations ............................................................................................. 4
5.5 Evaluation of accuracy .................................................................................................. 5

Warning
This document is not an ISO International Standard. It is distributed for review and comment. It is subject tochange without notice and may not be referred to as an International Standard.

5.5.1 General......................................................................................................................... 5
5.5.2 Class I inlay .........................................

Recipients of this draft are invited to submit, with their comments, notification of any relevant patent rights ofwhich they are aware and to provide supporting documentation.

!    

5.5.23 Class II inlay .............................................................................................................. 5
5.5.34 Crown ......................................................................................................................... 7
5.5.45 Four-unit bridge ........................................................................................................ 9
6 Test report ...................................................................................................................... 10

Document type: International standard
Document subtype: if applicable
Document stage: (30.20) Committee Draft
Document language: E© ISO 2014 – All rights reserved© ISO 2014 – All rights reserved

Ⅱ．分担研究報告書③

	
 医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	
 
	
 
蓜島由二	
 
国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 分担研究報告書
平成 26 年度厚生科学研究費補助金/地球規模保健課題解決推進のための研究事業	
 医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25-地球規模-指定-008）	
 
	
 
	
 

分担研究課題名	 医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究	 研究分担者	
  	
  	
 蓜島	
 由二	
  	
  	
 国立医薬品食品衛生研究所	
 医療機器部	 	
 研究協力者	
 野村祐介	  	  国立医薬品食品衛生研究所	
 

坂口圭介	
  	
  テルモ株式会社	
 

福井千恵	
  	
  国立医薬品食品衛生研究所	
 

谷川隆洋	
  	
  テルモ株式会社	
 

中村義一	
  	
  株式会社リボミック	
 

杉山知子	
  	
  テルモ株式会社	
 

宮川	
  伸	
  	
  株式会社リボミック	 竹ノ内美香	
  テルモ株式会社	
 

金	
  	
  玲	
  	
  株式会社リボミック	
 

新藤智子	
  	
  食品薬品安全センター	
 

柚場俊康	
  	
  川澄化学工業株式会社	
 

	
 
研究要旨	
 
	
 
	
  本研究では、新規規格の提案や国際規格の改定作業を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情報を収集することを目的として、試験法及び材料開発分野において 2 件のケーススタディを実施した。	
 	
  試験法分野のケーススタディでは、ISO/TC194/WG9 において実施されている溶血性試験国際ラウン
ドロビンテストを支援するため、2 種類の弱陽性対照材料 Genapol	
 X-080 含有 PVC シート（Y-2,	
 Y-3）
を本試験用標準品として提供した。Y-2 及び Y-3 は本試験においても良好な溶血特性を示し、その性能が世界的に確認されたことから、今後、ISO/TC194/WG12 に国際標準品として新規提案する。	
 	
  材料開発分野におけるケーススタディでは、機能性蛋白質を選択的に捕捉する RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の開発研究を行った。その結果、bFGF 捕捉型 RNA アプタマー（1p01）固定化表面は細胞増殖促進機能を有することが確認されたことから、RNA アプタマーを利用することにより、医用材料に意図した機能を付与できることが明らかとなった。また、BMP2 捕捉型 RNA アプタマー候補の選定を行った結果、B10 と B24 が有力な候補となることが判明した。	
 	
 Ａ．研究目的	
 に関する多施設国際共同検証試験（ラウン本研究では、新規規格の提案や国際規格 ドロビンテスト）を支援している。血液にの改定作業を通じて、国際標準化に必要な 接触する医療機器には安全性上の不具合
戦略等に関する情報を収集することを目 を生じないよう、ISO	
 10993-4 において規的として、医療機器関連業界と連携のもと、 定される血液適合性評価が求められてい試験法分野及び材料開発分野におけるケ るが、具体的且つ標準化された試験法が明ーススタディを実施している。	
 記されていない点が大きな課題となって	  試 験 法 分 野 の ケ ー ス ス タ デ ィ で は 、 いる。ISO	
 10993-4 文書としては、2002 年
ISO/TC194/WG9 が実施している溶血性試験 及び 2006 年に本体と Amendment がそれぞ

れ発行されたが、現在、ISO/TC194「医療 標的蛋白質を特異的に捕捉する RNA アプ
機器の生物学的評価」技術委員会では、WG9 タマーが多数ヒットする。RNA の生体内寿が主体となって同文書の改訂作業を行っ 命は非常に短いが、相応の化学修飾を施ており、日本も積極的に参画している。溶 すことにより、その寿命を延長すること
血性試験の国際ラウンドロビンテストは、 が可能となる。すなわち、適切な RNA ア
その一環として行われており、平成 26 年 プタマーを医用材料上に固定化すること度に本試験が実施された。	
 により、特定の蛋白質を特異的且つ能動	  過去に行ったパイロット試験において、 的に材料表面に補足し、その機能を一定
WG9 が配布した弱陽性対照材料は標準品と 期間に渡り制御できる可能性が非常に高して十分な性能を発揮しないことが確認 い。また、抗体や増殖因子等と異なり、された。そこで、我々が開発した 2 種類の RNA アプタマーは単独では生理活性を示
弱陽性対照材料（Genapol	
 X-080 含有 PVC さない合成可能な化学物質である利点もシート 1））を提供し、ミニテストを実施し ある。そこで材料開発分野におけるケー
た結果、良好な成績が得られたため、国際 ススタディでは、RNA アプタマーを用いた
ラウンドロビンテストの本試験用標準品 革新的医用材料の創製を目指し、生理活として、全参加国に配布した。	
 性を保持した状態で bFGF 並びに BMP2 を	  材料開発分野におけるケーススタディ 特異的に補足する RNA アプタマーを選定
では、機能性蛋白質を選択的に補足する すると共に、RNA アプタマー固定化材料をRNA アプタマーを用いた革新的医用材料の 作製し、その機能を解析した。	
 開発研究を行っている。医用材料を生体内 	 に埋植すると、材料表面に水やイオンが速 Ｂ．研究方法	
 やかに吸着し、次いで生体蛋白質の吸着が (1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶起こる。すなわち、医用材料と細胞は吸着
血性試験ラウンドロビンテスト支援	
 蛋白質層を介して相互作用するため、同蛋 1-1.溶血性試験用弱陽性対照材料の調製	
 白質は材料の機能発現や生体適合性に大 	  100 パーツの PVC に対して、DEHP	
 55 パ
きく関与すると考えられている。通常、材 ーツ、ESBO	
 8 パーツ、ステアリン酸カル
料表面への蛋白質吸着は受動的であり、そ シウム及びステアリン酸亜鉛 0.05 パーツの吸着挙動は材料表面の物理化学的特性 のほか、1.0 及び 1.5 パーツの Genapol	
 に大きく影響される。成長因子等の生理活 X-080 を含有する 2 種類の可塑化 PVC パウ
性物質や抗体を固定化し、特定の機能を付 ダーを調製した。Genapol	
 X-080 含有 PVC
与した表面も開発されているが、現在のと シート（Y-2 及び Y-3：厚さ 0.4	 mm）は同ころ、新しい医用材料として実用化には至 パ ウ ダ ー を 利 用 し て ヒ ー ト プ レ ス 法っていない。一方、核酸医薬分野では特定 （180℃）により作製し、本試験用標準品の蛋白質を特異的に捕捉し、その活性を阻 として WG9 に提供した。	
 害する RNA アプタマーが医薬品として上 	 市化されている。	
 1-2.溶血性試験ラウンドロビンテスト	 SELEX 法により RNA アプタマー医薬品候1-2-1.試験材料及び方法	
 補を検索する際、活性を保持した状態でISO/TC194/WG9 から配布された 6 種類

（Polyethylene:	
 PE,	
 Nitrile	 glove:	 NG,	  （pdT）は、ジーンデザインに合成を委託
Latex	 glove:	 LG,	
 Buna	
 rubber:	
 BR,	
 Y-2,	
  し、末端に 3ʹ′-アミノ CA リンカーを付加
Y-3）の材料を使用した。各試験法のインした。両末端にそれぞれ SH 基とカルボキ
キュベーション時間は、ラウンドロビン
シル基を有するポリエチレングリコール
2)
テスト用プロトコルに従い、ASTM 法 （直5000（PEG5k）を常法に従って、金コート
3)
接接触及び抽出液法）：3 時間、NIH 法
したガラス板上に固定化した後、カルボ
4,5)（直接接触法）：1 時間、MHLW 法 （抽出ジイミド法により、1p01 及び pdT を結合液法）：4 時間とした。血液試料としては、させた。作製した両ガラス版を 70%	 EtOH
ウサギ血液及びヒト血液を使用した。	
 に浸漬後、風乾させて殺菌し、細胞培養
国内からは、テルモ株式会社と食品薬
用 24 ウェルプレートに設置した。培地と品安全センターの 2 施設が参画し、それしては DMEM 及び MSCGM を使用し、血清はぞれ独立して試験を実施した。なお、海5%ヒト血清（HS）及びウシ胎児血清（FBS）
外からは 11 施設が参画した。	
 を用いた。各培地で 30 分間プレインキュ	 ベーションした後、マウス線維芽細胞
1-2-2.倫理面への配慮	
 （NIH3T3：5.4×103	
 cell/well）又はヒト
	  動物血液の採取については、所属機関
間葉系幹細胞（hMSC：9.0×103	
 cell/well）
が規定する動物実験指針に従い、動物にを播種し、5%	
 CO2 雰囲気下 37℃で培養し対する苦痛が最小となるよう務めた（財た。hMSC は培養開始から 2 日後、NIH3T3
団法人ヒューマンサイエンス振興財団/
は培養開始 3 日後に固定化し、Hoechst	
 動物実験実施施設認証認定番号：食品薬33258（Ex=360	
 nm,	
 Em=460	 nm）により染品安全センター/12-005、テルモ/12-030）。 色後、BZ-9000 を用いて核数を計測するこ
動物実験にあたっては、動物実験倫理委とにより、細胞増殖能を評価した。	
 員会の承認を得て実施した（食品薬品安	
 全センター/承認番号 114002A、テルモ/
3-2.BMP2 を捕捉する RNA アプタマー材料
承認番号 140070）。食品薬品安全センター
開発	
 において実施したヒト血液を使用した試
3-2-1.RNA アプタマー候補の選定	
 験は同センター倫理審査委員会の承認をBMP2 結合能を有する RNA アプタマー候得て行った（承認番号：H2014-01A）。テ
補の選定は、BMP2 をアミノカップリング
ルモはヒト血液を使用した製品評価（血させた NHS 樹脂を用いる SELEX 法により液適合性評価）を実施するにあたり、社行なった。テンプレート DNA、フォワード
内倫理委員会による審査を必要としない。
	  プライマー及びリバースプライマーはジ	 ーンデザインに合成委託し、これらを用(2)ケーススタディ 2：RNA アプタマーをいて RNA プールの転写合成を行なった。
用いた革新的医用材料の創製	
 RNA にヌクレアーゼ耐性を付与するため、
3-1.bFGF を捕捉する RNA アプタマー材料
ピリミジン残基のリボースに 2ʹ′F 修飾を開発	
 
施した dNTP を取り込める DuraScribe	
 T7	 	  昨年度選定した bFGF 捕捉型 RNA アプタ
Transcription	
 Kit（エアブラウン）を用
マー（1p01）及び陰性対照である poly	 dTい、転写反応を行なった。転写産物を簡易精製し、SELEX	
 buffer（20	 mM	
 Tris-HCl	
 pH	
 7.6,	 145	 mM	 NaCl,	
 5.4	
 mM	
 KCl,	 0.8	 mM	
 MgCl2,	
 1.8	
 mM	
 CaCl2）条件下で tRNA 等の競合物質と共に BMP2 固定化樹脂と混合し、結合した RNA を回収・精製した。回収した RNA を逆転写反応により DNA に戻し、
PCR によって増幅させ、DNA を精製した。
この DNA を用いて再度転写を行なうこと
により、次のラウンドの RNA プールを合成した。このサイクルを合計 10 ラウンド
繰り返し、最終ラウンドの PCR 産物を TOPO
ベクターにクローニングし、シークエン
ス解析を行なった。解析結果を ClustalWによってグルーピングすることで、RNA ア
プタマー候補を取得するための評価を行った。得られた候補配列について、プロ
グラム Mfold 及び RNAfold を用いて二次構造解析を行ない、BMP2 結合に重要な構
造モチーフを検索した。	
 	
 3-2-2.RNA アプタマー候補の BMP2 結合能評価	
 
SELEX 法によって得られた RNA アプタマ
ー候補と BMP2 の結合能を電気泳動移動度
シフトアッセイ法（EMSA）及び表面プラ
ズモン共鳴法（SPR）を用いて評価した。	
 EMSA では Mg イオンの有無の違いによる影響を評価するために、TB（89	 mM	
 Tris,	
 89	
 mM	
 Borate）及び TBM（89	 mM	
 Tris,	
 89	
 mM	
 Borate,	
 1	
 mM	
 MgCl2）を泳動用緩衝液として使用した。RNA と BMP2 の混合比は1:0 及び 1:5 とし、12%	
 非変性 PAGE によって RNA アプタマー候補と BMP2 の結合能を評価した。	
 SPR 解析は BIAcore3000 を用いて行ない、
ランニング緩衝液及びセンサーチップとして、それぞれ SELEX	
 buffer 及びストレ
プトアビジン固定化チップ（SA チップ）を使用した。同チップに 5ʹ′末端ビオチン
標識 pdT（16	 nt）を 100	 Resonance	
 Unit	
 (RU)程度結合させた後、リガンドとなる
3ʹ′末端に Poly	
 A を付加した候補 RNA をpoly	
 A/pdT 間の相互作用を利用して SA チ
ップに固定化した。候補アプタマーとBMP2 との結合能は同チップを利用して評
価した。	
 
	
 
Ｃ．研究結果	 (1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	 	  総計 13 施設において試験を実施したが、集計が完了していないため、国内施設が行った試験結果を示す。	
 	
 1-1.陰性対照及び強陽性対照の試験結果	
 	
  図 1a に示したとおり、陰性対照材料である PE は、ヒト血液及びウサギ血液を利用した評価系ともに、全ての試験法において溶血能を示さなかった。	
 	
  強陽性対照材料である NG は、ヒト血液及びウサギ血液を利用した評価系において、ASTM/直接接触法及び ASTM/抽出液法
ともに、ほぼ 100%の溶血率を示した（図1b）。NIH/直接接触法の場合、ウサギ血液を利用した評価では完全溶血が観察されたが、ヒト血液を使用した試験系の溶血率は若干低く、51.4%であった（図 1b）。
一方、NG の溶血特性をウサギ血液及びヒト血液を利用した MHLW/抽出液法により評価した時の溶血率は、それぞれ 6.6%及び 2.0%であった。	
 	
 1-2.弱陽性対照材料の試験結果	
 	
  図 2a に示したとおり、LG の溶血特性を最も感度良く検出できる試験法は NIH/直接接触法であり、ウサギ血液及びヒト血液を利用した試験系における溶血率は、(2)ケーススタディ 2：RNA アプタマーをそれぞれ 30.5%及び 13.5%に達した。LG の用いた革新的医用材料の創製	
 
溶血特性は ASTM/直接接触法においても3-1.bFGF 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 探知可能であった（ウサギ血液：7.6%，
昨年度、bFGF の生理活性を阻害せずに
ヒト血液：7.7%）。一方、抽出液法は LG
bFGF を捕捉する RNA アプタマー候補であの溶血特性を十分探知できず、ASTM/抽出
る 1p01、1p02 及び 2p03 を選定した。ま液法及び MHLW/抽出液法において観察さた、金コートしたガラス板表面に PEG5k
れた溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、 を介して pdT を固定化させることにも成それぞれ 2.6%/0.5%及び 0.6%/0.3%であっ功している。そこで、金コートしたガラ
た。	
 ス板に PEG5k 及び 1p01 又は pdT を固定化
	  図 2b	
 に示したとおり、BR の溶血特性した材料が及ぼす細胞増殖能への影響をは ASTM/直接接触法において最も感度良評価した。	
 く検出された（ウサギ血液：6.9%，ヒト
bFGF 捕捉型 RNA アプタマー1p01 及び陰血液：4.9%）。ASTM/抽出液法、NIH/直接性対照である pdT をコートした材料上で接触法及び MHLW/抽出液法における溶血細胞培養を行なった結果、5%	
 HS 条件下で率（ウサギ血液/ヒト血液）は、それぞれ
は培地の種類を問わず、NIH3T3 及び hMSC
2.3%/0.9%、3.4%/1.1%及び 0.5%/0.5%）でともに、1p01 コート材料上で培養した方あった。	
 が高い増殖能を示すことが確認された
	
  図 3a に示したとおり、ASTM 法は Y-2 の （図 4）。また、5%	
 FBS/DMEM 培地条件下で溶血特性を感度良く検出することが可能
hMSC を培養した場合にも、1p01 コート材
であり、直接接触法及び抽出液法におけ料は増殖促進作用を示したが、5%	
 FBS/	
 る溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、そMSCGM 培地条件下の場合、1p01 及び pdT
れぞれ 9.3%/8.8%及び 13.1%/12.7%であっ
コート材料は同等の増殖能を示した（図た。NIH/直接接触法と MHLW/抽出液法の感5）。	
 度は、ほぼ同等であり、両試験法におい	 て観察された溶血率（ウサギ血液/ヒト血3-2.BMP2 捕捉型 RNA アプタマー材料開発	
 液）は、それぞれ 3.0%/3.0%及び 1.0%/2.5%
3-2-1.RNA アプタマー候補の選定	 であった。	
 BMP2 に結合する RNA 候補を SELEX 法に	  Y-3 は ASTM/抽出液法及び MHLW/抽出液
よって選定し、72 クローンの配列解析を法において強溶血を示し、両試験法にお行った後、ClustalW を用いたグルーピン
ける溶血率（ウサギ血液/ヒト血液）は、 グ解析を行なった結果、BMP2 と結合する
それぞれ 94.5%/95.1%及び 86.3%/86.6%にRNA アプタマー候補は 5 種類（B10,	
 B20,	
 達した（図 3b）。直接接触法による検出感
B24,	
 B32,	 B37）の配列に収束されている
度は抽出液法と比較して低く、ASTM/直接ことが明らかとなった。B10,	
 B20,	
 B24,	
 接触法及び NIH/直接接触法における溶血B32 及び B37 の出現頻度は、それぞれ 6.9%,	
 率（ウサギ血液/ヒト血液）は、それぞれ
16.9%,	
 8.5%,	
 45.1%及び 12.7%であり、B32
49.7%/39.9%及び 15.6%/11.9%であった。	
  が最も多く観測されていた。この 5 種類	
 の候補についてプログラム Mfold 及びRNAfold による二次構造解析を行なったても弱陽性対照材料として利用すること
結果、それぞれ図 6 に示した構造を形成が可能であり、試験法に応じて、両者を使していることが予測された。	
 い分けることにより、試験系の評価を行う
	 ことができることが判明した。	
 3-2-2.RNA アプタマー候補の BMP2 結合能	  ウサギ血液とヒト血液は多くの試験法
評価	
 において、ほぼ同等の感度を示した。しかSELEX 法によって得られた 5 種類の RNA
し、NIH/直接接触法では、ウサギ血液を利アプタマー候補と BMP2 の結合能を EMSA
用した試験系の方が感度的に優れているにより評価した結果、二価イオン非存在
ことが確認された。	
 下では、BMP2 を添加することにより、ス	 メアな複合体バンドが観測された。一方、 (2)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを
Mg2+イオン存在下で EMSA を行なった結果、用いた革新的医用材料の創製	
 B10 及び B24 については、明瞭な複合体バ
本研究では、RNA アプタマーを用いた革ンドが観測された（図 7）。	
 新的医用材料の創製を目指し、生理活性
BIAcore を用いた SPR 法による解析の結を保持した状態で増殖因子である bFGF 及果、RNA アプタマー候補に BMP2 を添加す
び BMP2 を捕捉する RNA アプタマーを選定ることにより、例外なく RU 値の上昇が確し、新規医用材料としての有用性を評価認されたことから、5 種類の RNA アプタマした。	
 ー候補は、いずれも BMP2 に結合すること
bFGF 捕捉型 RNA アプタマー1p01 及び陰が判明した（図 8）。	
 性対照である pdT を材料表面上に固定化
	 し、両材料上で細胞培養を行なった。そ
Ｄ．考	
  察	
 
の結果、5%	
 FBS/MSCGM 培養条件下の場合、(1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶
hMSC の増殖能は pdT 及び 1p01 間に顕著な血性試験ラウンドロビンテスト支援	
 相違は観察されなかった。この現象は、
	  ラウンドロビンテストのプロトコルは、 hMSC 増殖用に最適化された MSCGM 培地に
医療機器の溶血性試験のために国際的に 含まれる増殖因子が同細胞に優先的に作広く用いられている ASTM 法、NIH 法及び 用し、RNA アプタマーによる効果が減弱し
MHLW 法の 3 法から構成されている。NG は たことに由来すると思われる。一方、そ強陽性対照材料であるが、MHLW/抽出液法 の他の培養条件下においては、陰性対照の検出感度は、その他の試験法と比較して である pdT と比較して、1p01 コート材料
大きく劣ることが確認された。LG 及び BR 表面上で細胞数が多く観測されているこは主に直接接触法における弱陽性対照材 とから、同材料は細胞増殖促進効果を有料として配布された試料であり、本試験に していることが示唆された。今後、同材
おいても、その溶血特性が明瞭に示された。 料表面上の吸着蛋白質解析等を行うと共これらの現象は、事前に行ったパイロット に、本 RNA アプタマーとコラーゲンとの試験においても確認されている。	
 複合材料を作成し、ラット埋植試験等を	
  一方、我々が提供した Y-2 及び Y-3 は、 実施することにより、医用材料としての直接接触法及び抽出液法のいずれにおい 有用性を検証する。	
 BMP2 に対する RNA アプタマーを用いた新規骨充填剤の開発を目指し、SELEX 法により BMP2 に結合する RNA アプタマー候補の選定を行なった。得られた RNA アプタ
マー候補の解析を行なった結果、5 種類の配列に収束していたが、共通の構造モチーフが認められなかったことから、各候
補はそれぞれ特有の構造を有していることが示唆された。RNA アプタマー候補とBMP2 の相互作用を EMSA によって解析した
結果、Mg2+イオンの有無により、その挙動が異なっていた。B10 及び B24 は Mg2+イオン存在下において、明瞭な複合体バンドとして検出された。これは、Mg2+イオンが両 RNA アプタマー候補と BMP2 の結合に密接に関与することを示唆している。一般
的な機能性 RNA の構造形成には二価の金属イオンが関与する場合が多く、ヒト IgGに対する RNA アプタマーにおいても複合体形成に Mg2+もしくは Ca2+イオンが必要となっている。一方、SPR 法による相互作用
解析において、SELEX 法と同様に二価又は一価の金属イオンを添加した条件下で評価した結果、5 種類の RNA アプタマー候補
は BMP2 に対して、40N ランダム配列よりも強い結合能を有することが確認された。
本研究において使用した SELEX の条件下
では、Mg2+,	
 Ca2+,	
 K+及び Na+イオンが共存しているため、B10、B24 以外の RNA アプ
タマー候補については、Mg2+イオンとは別のイオンに依存した構造形成能を有する可能性も示唆された。また、EMSA 及び SPR
解析において、40N ランダム配列の RNA は非常に弱い BMP2 結合能を有することが確認されたが、この現象は BMP2 に存在する
塩基性アミノ酸に富んだ正電荷領域と、負電荷を帯びている RNA との非特異的な静電相互作用に由来すると思われる。今回得られた 5 種類の RNA アプタマー候補
は、二次構造予測の結果から保存された構造モチーフが確認されないと共に、相互作用解析における挙動が異なることから、それぞれが異なる機構で BMP2 と結合していることが示唆された。RNA アプタマ
ーを利用した医用材料の開発に応用する
ためには、BMP2 の生理活性を阻害しない配列が必要であるため、今後、5 種類全ての RNA アプタマー候補を用いて、BMP2 シ
グナル伝達阻害等の評価を行う。また、二次構造予測の結果に基づいて短鎖化した RNA アプタマーについても同様の解析を行うと共に、金属イオン依存性についても検討する。	
 
	
 
Ｅ．結	
  論	
 
(1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶血性試験ラウンドロビンテスト支援	 	
  我々が開発した弱陽性対照材料（Y-2 及び Y-3）は、直接接触法及び抽出液法のいずれにおいても弱陽性対照材料として利用することが可能であり、試験法に応じて、両者を使い分けることにより、試験系の評価を行うことができることが判明した。Y-2 及び Y-3 の対照材料としての性能が世界的に確認されたことから、今後、
強陽性対照材料である Y-4 と合わせて、
ISO/TC194/WG12 に国際標準品として新規提案する。	 	 (2)ケーススタディ 2：RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の創製	
 bFGF 捕捉型 RNA アプタマー1p01 は、細胞増殖促進機能を有することが確認されたことから、新規医用材料の開発において有益なツールになることが示唆された。
また、BMP2 に結合する RNA アプタマー候補として、5 種類の有力な配列を選定することができた。	
 	 Ｆ．健康危険情報	 	  特になし。	
 	
 Ｇ．研究発表等	 	 1)Haishima	  Y,	  Kawakami	  T,	  Fukui	  C,	 Tanoue	 A,	
 Yuba	 T,	 Ozono	 S,	
 Kumada	 H,	
 Inoue	 K,	 Morikawa	
 T,	
 Takahashi	
 M,	
 Fujisawa	
 A,	
 Yamasaki	
 K,	
 Nomura	 Y,	 Isama	 K,	 Chung	 U,	
 Ogawa	
 K,	
 Niimi	
 S,	
 Yoshida	  M.	
  Characterization	  of	
 alternative	  plasticizers	  in	  poly-	 vinyl	
  chloride	
  sheets	  for	
  blood	 containers.	
 	
 J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.,	 in	
 press	 (2015).	
 	 2)Haishima	
 Y,	
 Hasegawa	
 C,	
 Nomura	 Y,	
 Kawakami	  T,	  Yuba	  T,	  Shindo	  T,	 Sakaguchi	
 K,	
 Tanigawa	 T,	
 Inukai	
 K,	
 Takenouchi	
 M,	
 Isama	 K,	
 Matsuoka	
 A,	
 Niimi	 S.	
 	
 Development	
 and	
 perfor-	 mance	
  evaluation	
  of	
  a	
  positive	 reference	  material	  for	
  hemolysis	 testing.	
  	
  J.	
  Biomed.	
  Mater.	
  Res.	
 
Part	
 B,	
 102B:1809-1816	
 (2014).	
 	 3)Haishima	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Hasegawa	
 C,	
 Tanoue	 A,	
 Yuba	 T,	 Isama	 K,	
 Matsuoka	 A,	  Niimi	  S.	
  	  Screening	  study	  on	
 hemolysis	
 suppression	 effect	
 of	
 an	
 
alternative	  plasticizer	
  for	
  the	
 development	
 of	
 a	
 novel	 blood	 con-	
 tainer	 made	 of	
 polyvinyl	
 chloride.	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:	
 721-728	
 (2014).	
 	 4)蓜島由二．第 1 部：医療機器市場の拡大と新規製品の開発：開発，上市化，市場確保において留意すべきポイン

ト．生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バイオマテリアルの設計・開発戦略（監修：田中	 賢）．
サイエンス＆テクノロジー，pp.3-21	
 (2014)．	
 	 5)中岡竜介，蓜島由二，新見伸吾．医療機器・材料の国際標準化動向．バイオ
マテリアル-生体材料，33(1):56-63	 (2015)．	
 	 6)中岡竜介，蓜島由二，新見伸吾．橋渡し研究及び国際標準化の行政的支援．
第 53 回日本生体医工学会大会（2014年 6 月・仙台）．	
 	 7)野村祐介，福井千恵，戸井田	
 瞳，新見伸吾，宮川	 伸，金	  玲，中村義一，
蓜島由二．RNA アプタマーを用いた新
規医用材料の開発．第 36 回日本バイ
オマテリアル学会大会（2014 年 11 月・
船堀）．	
 
	
 8)野村祐介，福井千恵，柚場俊康，新藤智子，坂口圭介，谷川隆洋，杉山知子，
竹ノ内美香，新見伸吾，蓜島由二．簡
易溶血性試験法の性能評価と公定法との比較検証．第 36 回日本バイオマ
テリアル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 	 9)蓜島由二，福井千恵，山﨑佳世，野村祐介，小園	
 知，熊田秀文，藤澤彩乃，
井上	
 薫，森川朋美，市村亮平，前田	
 潤，
高橋美和，河上強志，伊佐間和郎，柚場俊康，鄭	
 雄一，小川久美子，新見伸吾，吉田	
 緑．新規血液バッグ用代
替可塑剤 DOTH のラット亜慢性毒性試験．第 36 回日本バイオマテリアル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 10)蓜島由二，河上強志，福井千恵，田上昭人，柚場俊康，向井智和，野村祐介，
伊佐間和郎 1，新見伸吾．新規血液バ

ッグ素材 DOTH/DINCH 配合 PVC シートの性能評価．第 36 回日本バイオマテ
リアル学会大会（2014 年 11 月・船堀）．	
 
	
 
参照資料	
 
	
 1.Haishima	
 Y,	
 Hasegawa	
 C,	
 Nonura	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Yuba	 T,	 Shindo	
 T,	
 Sakaguchi	
 K,	
 Tanigawa	 T,	
 Inukai	
 K,	
 Takenouchi	
 M,	
 Isama	 K,	
 Matsuoka	
 
A,	
 and	
 Niimi	
 S.	
 Development	
 and	
 performance	 evaluation	
 of	 a	
 positive	 reference	
 material	
 for	
 hemolysis	 testing.	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	 B,	 102B:1809-1816	
 (2014).	
 	
 2.ASTM	
  Standard	  F756-08:2008.	
  Practice	  for	
 assessment	  of	  hemolytic	
  properties	  of	
 materials.	
 

ASTM	
 

International,	
 

West	
 

Conshohocken,	
 PA.	
 
	
 3.National	  Institute	  of	  Health:	
  1977.	
 Evaluation	  of	  hemodialyzers	  and	
  dialysis	 membranes.	
  <Hemolysis-Rabbit	  Blood>	
  DHEW	 Publication	
 77– 1294.	
 Bethesda,	
 MD.	
 
	
 4.平成 24 年 3 月 1 日付け薬食機発 0301 第 20 号：
厚生労働省医薬食品局審査管理課医療機器審査管理室長通知「医療機器の製造販売承認申請等に必要な生物学的安全性評価の基本的考え方について」.	
 	
 5.	
 Japanese	 domestic	 committee	
 of	
 ISO/TC	
 194.	
 Haemocompatibility	  test.	
  In:	
  Matsuoka	  M,	 Editor-in-chief.	
  Basic	  principles	  of	
 biological	
 safety	 evaluation	
 required	
 for	
 application	
 for	
 approval	
 to	
 market	 medical	 devices	 (bilingual	 in	
 Japanese	
 and	
 English).	
 Tokyo:	
 Yakuji	 Nippo,	 Ltd.;	 2013.	
 p189-203.	
 
	
 	
 
	
 
	
 

a)	

b)	

（%）	

溶
血
率

（%）	

溶
血
率

図1. 陰性対照材料及び陽性対照材料の溶血特性． a) PE，b) NG．	

a)	

b)	

（%）	

溶
血
率

（%）	

溶
血
率

図2. 弱陽性対照材料の溶血特性． a) LG，b) BR．	

a)	

b)	
溶
血
率

（%）	

（%）	

溶
血
率

図3. 弱陽性対照材料の溶血特性． a) Y-2，b) Y-3．	

16000	  	
  14000	
  	
  

8000	
  	
  

細胞数	

細胞数	

10000	
  	
  

6000	
  	
  

12000	  	
  10000	
  	
  

4000	
  	
  

8000	
  	
  
6000	
  	
  
4000	
  	
  

2000	
  	
  

2000	
  	
  

0	
  	
  

0	
  	
  
NIH3T3	
DMEM	

hMSC	
DMEM	

hMSC	
MSCGM	

図4. アプタマー材料の細胞増殖能への影響評価	
（5% HS）．黒：1p01，白：ｐｄＴ．	

B10	
  (6.9%)	

B20	
  (16.9%)	
	

hMSC	
DMEM	

hMSC	
MSCGM	

図5. アプタマー材料の細胞増殖能への影響	
評価（5% FBS）．黒：1p01、白：ｐｄＴ．	

B24	
  (8.5%)	
	
B10	
 B20	
 B24	
 B32	
 B37	
 40N	
BMP2	

RNAfold	
  &	
  Mfold	

RNAfold	
  &	
  Mfold	

B32	
  (45.1%)	
	

RNAfold	
  &	
  Mfold	

-­‐	
 +	
 -­‐	
 +	
 -­‐	
 +	
 -­‐	
 +	
 -­‐	
 +	
 -­‐	
 +	

With	
  Mg2+	B37	
  (12.7%)	
	Without	  Mg2+	

RNAfold	Mfold	

RNAfold	
  &	
  Mfold	

図6. SELEX法によって得られたRNAアプタマー候補	
の出現頻度と二次構造予測結果	

図7. EMSAによるRNAアプタマー候補とBMP2の	相互作用解析	Time (s)	

図8. SPR法によるRNAアプタマー候補とBMP2の	相互作用解析	

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料①

	
 
一覧表	
 

（別添５）

研究成果の刊行に関する一覧表	
 

	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
	
 
	
 
	
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 誌	
 
	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
発表者氏名	
  論文タイトル名	
 
発表誌名	
 
巻	
 号	
  ページ	
  出版年	
 中岡竜介,	
 医療機器・材料の バイオマテリアル
蓜島由二,	
 33(1)	
 国際標準化動向	
 
-生体材料	
 新見伸吾	
 56-63	 2015	
 Koide	
 M,	
  A	
 new	
 method	 for	
 Ohkuma	 K,	
 fabricating	 Dental	 Materials	
 Ogura	 H,	  zirconia	
 copings	
 Journal	 Miyagawa	
 Y	
  using	 a	
 Nd:YVO4	
 33	
 422-429	
 

2014	
 

Screening	 study	 on	
 hemolysis	 Haishima	
 Y,	
 suppression	 Kawakami	 T,	 effect	 of	 an	
 Hasegawa	
 C,	
 alternative	 Tanoue	 A,	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 plasticizer	
 for	
 
102B	
 
Yuba	
 T,	
 
Res.	
 Part	 B	
 the	
 development	 Isama	
 K,	
 
of	
 a	
 novel	 blood	 Matsuoka	 A,	 container	 made	 of	
 Niimi	 S	
 polyvinyl	
 chloride	 721-728	
 

2014	
 

Haishima	
 Y,	
 Hasegawa	
 C,	
 Nomura	 Y,	
 Development	
 and	
 Kawakami	
 T,	
 performance	
 
Yuba	
 T,	
 
evaluation	
 of	
 a	
 
Shindo	 T,	 positive	
 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Sakaguchi	
 K,	
 
102B	
  1809-1816	
 reference	
 Res.	
 Part	 B	
 Tanigawa	
 T,	
 material	
 for	
 Inukai	 K,	
 hemolysis	 Takenouchi	 testing.	
 M,	
 Isama	 K,	
 Matsuoka	 A,	 Niimi	
 S	
 

2014	
 

第 1 部：医療機器市場の拡大と新規製品の開発：開発，上市化，市場確保において留意すべきポイント	 生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バ
イオマテリアルの設計・開発戦略（
監修：田中	 賢）．
サイエンス＆テク
ノロジー	
 

	
 

3-21	
 

2014	
 

Haishima	
 Y,	
 Kawakami	
 T,	
 Fukui	 C,	 Tanoue	
 A,	
 
Yuba	
 T,	
 Ozono	 S,	 Kumada	 H,	  Characterization	 Inoue	 K,	 of	
 alternative	 Morikawa	
 T,	
  plasticizers	
 in	
 Takahashi	
 M,	
 polyvinyl	 Fujisawa	
 A,	
  chloride	
 sheets	 Yamasaki	
 K,	
 
for	
 blood	 Nomura	 Y,	
 containers.	
 Isama	 K,	 Chung	 U,	 Ogawa	 K,	 Niimi	 S,	 Yoshida	 M	
 J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.	
 in	
 press	
 

	
 

2015	
 

蓜島由二	
 

	
 
	
 
	
 

	
 

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料②

	 バイオマテリアル−生体材料,33(1):56-63	
 (2015)Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料③

	 Dental	 Materials	
 Journal,33:422-429	
 (2014)

! Dental Materials Journal 2014; 33(3): 422–429
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!

A new method for fabricating zirconia copings using a Nd:YVO4 nanosecond
laser
Miku KAZAMA-KOIDE1, Kazuo OHKUMA2, Hideo OGURA3 and Yukio MIYAGAWA1,2
Developmental Science of Oral Biomaterials, The Nippon Dental University Graduate School of Life Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuoku, Niigata 951-8580, Japan2
Department of Dental Materials Science, The Nippon Dental University School of Life Dentistry at Niigata, 1-8 Hamaura-cho, Chuo-ku, Niigata
951-8580, Japan
3
The Nippon Dental University, 1-9-20 Fujimi, Chiyoda-ku, Tokyo 102-8159, Japan
Corresponding author, Miku KAZAMA-KOIDE; E-mail: miku@ngt.ndu.ac.jp
1

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!
!

The purpose of this work was to fabricate zirconia copings from fully sintered Y-TZP blocks using a Nd:YVO4 nanosecond laser inorder to avoid complicated procedures using conventional CAD/CAM systems. To determine the most appropriate power level of a
Nd:YVO4 laser, cuboid fully sintered Y-TZP specimens were irradiated at six different average power levels. One-way ANOVAs for the
average surface roughness and laser machining depth revealed that an average power level of 7.5 W generated a smooth machined
surface with high machining efficiency. Y-TZP copings were then machined using the proposed method with the most appropriate
power level. As the number of machining iterations increased, the convergence angles decreased significantly (p<0.01). The accuracyof the machined copings was judged to be good based on 3D measurements and traditional metal die methods. The proposed method
using the nanosecond laser was demonstrated to be useful for fabricating copings from fully sintered Y-TZP.
Keywords: Y-TZP, CAD/CAM, Zirconia, Laser, Nd:YVO4

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!
!

!

INTRODUCTION
Recently, dentists and patients have become interested
in all-ceramic restorations, which do not contain metals,
which block light transmission, and better resemble thenatural tooth appearance than any other restorative
option1). In addition, all-ceramic restorations do notcause metal allergy problems. The clinical shortcomingsof ceramic materials, such as brittleness, low tensile
strength, and marginal inaccuracy, continue tolimit their use compared to porcelain-fused-to-metalcrowns2,3). Nevertheless, patients’ demand for improved
esthetics has driven the development of ceramic
restorations. The use of all-ceramic restorations has
spread as a result of the application of high-strength
ceramics, such as zirconia, to the coping materials.
Zirconia ceramics for dental restorations havehigh strength and high toughness, which allows thesematerials to be used as all-ceramic coping materials forlong-span bridges. However, machining fully sinteredzirconia by milling is very difficult because of its highhardness. The coping is fabricated with an establishedmethod using a CAD/CAM system in which a partiallysintered zirconia block is milled and subsequently
sintered in a furnace. A linear shrinkage of 15 to 30%
occurs due to sintering4). The increased milling efficiencyof the softer partially sintered block has the tradeoff of a potentially poorer fit caused by the sintering
shrinkage, the scanning process, compensatory software
design, and milling5). In order to avoid these complicatedprocedures, we have devised a new simple method bywhich to machine high-hardness zirconia using a laser.
A range of lasers is now available in dentistry. The
Received Dec 13, 2013: Accepted Mar 12, 2014
doi:10.4012/dmj.2013-348 JOI JST.JSTAGE/dmj/2013-348

Nd:YAG laser can be used in the dental laboratory for
laser welding. Metal parts such as frameworks can bejoined by self-welding of the parts with combustible
acrylic denture base resins and artificial composite teeth,
which would be burned by conventional soldering6).
Noda et al. conducted an experiment involving theirradiation of zirconia using this Nd:YAG laser andexamined the possibility of welding zirconia7). They
reported that laser irradiation induced cracking on thesurfaces of zirconia so Nd:YAG dental laser welding
should not be performed on zirconia7). Nd:YAG dental
laser irradiation, which produced a millisecond-orderpulse width, generated thermal effects on zirconia8).
Therefore, we devised a new method by which tomachine zirconia copings using an industrial Nd:YVO4
Q-switched nanosecond laser, which had a smaller pulse
width and a power density that was several hundred
times higher than that of the conventional Nd:YAG
dental laser. The purpose of the present study was todemonstrate the possibility of Nd:YVO4 Q-switchednanosecond laser machining of zirconia copings.
!

!
!

MATERIALS AND METHODS

Nd:YVO4 laser machine
In the present study, fully sintered yttria-stabilized
tetragonal zirconia polycrystal (Y-TZP) specimens weremachined using a Q-switched Nd:YVO4 (Neodymium
Doped Yttrium Vanadate) laser machine (Lasertec 40,
DMG, Berlin, Germany, Fig. 1) for fabricating the Y-TZP
copings of all-ceramic restorations. This nanosecond
laser machine generated a power density of 2.26×104(kW/mm3), which is several hundred times higher than!

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429!

!

Table 1!

2

Specifications of the laser machine
Specification

Description

Laser type

Nd:YVO4 crystal

Wave length

1,064 nm

Pulse width

18 nsOperation mode

Q switched pulse

Scan speed

500 mm/s

Peak power

16 kW

Pulse frequency

50 kHz

Focus diameter

30 µm

Track distance

10 µm

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!

!

Fig. 1

Nd:YVO4 laser machine.

a dental Nd:YAG laser with a millisecond pulse. The
fundamental parameters of the Nd:YVO4 laser machine
are listed in Table 1.
Fully sintered yttria-stabilized tetragonal zirconia
polycrystals (Y-TZP)
Two types of fully sintered Y-TZP specimens wereprepared as follows. The discs of partially sintered
Y-TZP (height: 25 mm, diameter: 98.5 mm, Aadva Zr
disk, GC, Tokyo, Japan) were milled and subsequently
sintered at 1,550°C for 18.5 h in a furnace using adental CAD/CAM system (GM-1000, GC, Tokyo, Japan).
Partially sintered Y-TZP consisted of >91 wt% ZrO2, 5
wt% Y2O3, <3 wt% HfO2, and <1 wt% Al2O3.
One cuboid (13 mm×13 mm×17 mm) fully
sintered Y-TZP specimen was used to determine themost appropriate power level of the Nd:YVO4 laser
irradiation condition for fully sintered Y-TZP andanother specimen (height: 7 mm, baseline: 10.6 mm), as
shown in Fig. 2, was machined to form a Y-TZP coping
on an abutment tooth of an imitation lower first molar.
Determination of the most appropriate power level of the
Nd:YVO4 laser
In order to determine the most appropriate power levelof the Nd:YVO4 laser, a cuboid fully sintered Y-TZP
specimen was irradiated at six different average power
levels (3, 6, 7.5, 9, 12, and 14 W). The irradiated surface
area was square (2 mm×2 mm). The specimen was
cleaned in distilled water using an ultrasonic cleaner.
The machining depth and the calculated averageroughness (Ra in µm) at each of the six power levels
were evaluated. The machining depth was measured
using a measuring microscope (STM6, OLYMPUS,!

Fig. 2!
!
!

Dimensions of the fully sintered Y-TZP specimen
simulating a lower first molar, and 3D-CAD for
laser machining to fabricate zirconia coping.

Tokyo, Japan). The calculated average roughness was
also measured using a laser microscope (VK-8500,
KEYENCE, Osaka, Japan) with a cut off value of 0.8
mm. One-way ANOVA and Tukey’s multiple comparison
test were used to analyze the data.

!

Machining Y-TZP copings using the Nd:YVO4 laser
machineMachining 3D-CAD data of a Y-TZP coping wereconstructed using CAD software (Rhinoceros4.0, Robert
McNeel & Associates, WA, USA). Y-TZP copings weremachined in order to create the final form with aconvergence angle of 11°, a cervical width of 10.6 mm,
and a shoulder part width of 0.5 mm using 3D-CAD data
(Fig. 2). The part that touched the abutment tooth, asshown in Fig. 2, was machined. Y-TZP copings were
fabricated from fully sintered blocks using the Nd:YVO4
laser machine with an optimal machining condition

! 424

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429

!

!

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!

(n=6). Machining each coping required eight hours.
Y-TZP copings were machined in 100-µm increments,
as measured using calipers integrated into the laser
machine for depth control. At first machining, themachining residue in the width direction of Y-TZP coping
occurred on the inner surface so that the convergenceangle of coping was greater than 11°, as designed basedon machining 3D-CAD data. Therefore, the coping wasmachined two, three, or four times until the machining
residue disappeared (Fig. 3).
Machining accuracy
1. Evaluation of machining accuracy by 3D measurement
Machined Y-TZP copings were measured using a nondestructive industrial 3D scanner (ATOS I 2M, GOM
mbH, Brunswick, Germany) at every machining, and
3D-CAD data of copings were constructed. Dimensional!

differences in the height direction and width direction
between the 3D-CAD data for machined Y-TZP copings
and the target 3D-CAD data of Y-TZP copings were
inspected using inspection software (GOM inspect, GOM
mbH, Brunswick, Germany). Twelve measurement
points were set in the width direction: 0, 0.5, 1, 1.5, 2,
2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, and 5.5 mm away from the inner
cervical line of the Y-TZP coping (Fig. 4). In the height
direction, six measurement points were set: −3, −2,−1, 0, 1, 2, and 3 mm away from the occlusal center of
Y-TZP coping (Fig. 4). The results for the dimensional
differences in the width direction and the machining
frequency were analyzed by two-way repeated-measures
ANOVA and Sidak’s multiple comparison test. Oneway repeated-measures ANOVA and Sidak’s multiple
comparison test were used to analyze the results forthe dimensional differences in the height direction. The
convergence angle of the inner coping was measured ateach machining. One-way repeated measures ANOVA
and Sidak’s multiple comparison test were used foranalyzing the results of the convergence angle of innermachined copings.

!

!

Fig. 3

Method of fabricating a zirconia coping having an
inner taper of 11° and a cervical width of 9.6 mm.

Fig. 4

Schematic diagrams of 3D measurement formachining accuracy.
The dimensional differences between (a) and(b) were inspected using inspection software. (c)Measurement points in the height and width
directions.

2. Evaluation of machining accuracy using metal dies
Machined copings at the fourth machining were
measured using dies having different cervical widthsof 9.60 mm (Abutment 1), 9.58 mm (Abutment 2), and9.56 mm (Abutment 3). The convergence angle of eachdie was 11°. Y-TZP copings were placed on the metaldie (Fig. 5) without cementation, and the marginal
discrepancy (L-L1) was measured using a measuring
microscope (STM6, OLYMPUS, Tokyo, Japan). Negativevalues for L-L1 indicate that copings were machinedsmaller than the machining CAD, whereas positive
numbers indicate that the copings were machinedlarger than the machining CAD (Fig. 5). One-way
ANOVA and Sidak’s multiple comparison test were used
to analyze the results for the goodness of fit.

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Fig. 5

Schematic diagrams of a metal die having a taperof 11° used to evaluate machining accuracy.

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429

!

425

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RESULTS
Determination of the most appropriate power level of the
Nd:YVO4 laser
The means and standard deviations (SD) of thecalculated average roughnesses (Ra) and the machining
depths of the irradiated Y-TZP surfaces are shown in
Table 2 and Fig. 6.
The values of Ra for average powers of 6 W, 7.5 W,
and 9 W were smaller than those for average powers of
3 W and 12 W, and the values of Ra for average powersof 6 W and 7.5 W were smaller than that for an average
power of 14 W (p<0.05). Therefore, the Y-TZP surface wasmachined to be the smoothest at 6 W and 7.5 W using
the Nd:YVO4 laser. As the average power increased, theTable 2Average roughness and machining depth perpulse after nanosecond laser irradiation of fully
sintered Y-TZP
Average roughness(Ra, µm)

Machining depth(µm)

Mean (SD)

Mean (SD)3

0.63 (0.11)

1.9 (1.4)

6

0.37 (0.06)

3.7 (0.4)

7.5

0.40 (0.05)

4.8 (0.5)

90.43 (0.02)

5.5 (0.6)

12

0.67 (0.07)

5.9 (0.6)

14

0.62 (0.07)

4.7 (0.2)

Average power
(W)
!
!
!
!

!

!
!

machining depth tended to increase, but became smallerfrom 12 W to 14 W. The machining depths per pulse foraverage powers of 7.5 W, 9 W, 12 W, and 14 W weregreater than that for an average power of 3 W (p<0.05),
and machining depth per pulse for an average powerof 12 W was greater than that for an average power of
6 W (p<0.05). When the above analysis results for the
calculated average roughness and the machining depth
were put together, the average power level of 7.5 W, atwhich the smoothest Y-TZP surface could be obtainedwith high machining efficiency, was decided to be themost appropriate power level.

!

Machining Y-TZP copings using the Nd:YVO4 laser
machineAn optimal machining condition with an average powerof 7.5 W was used to machine Y-TZP copings from fully
sintered specimens. At first machining, machining
residue was deposited in the width direction on the
inner surface of the Y-TZP copings, so that theconvergence angle was greater than 11°, which were
designed as the machining 3D-CAD data (Fig. 3). The
machining residue of Y-TZP copings was measured using
an industrial 3D scanner, and the machining data werereacquired. The Y-TZP copings were then machined
again using the new data. This process was repeated forthe same Y-TZP coping until the fourth machining.

!

Machining accuracy
1) Machining accuracy using 3D measurement
Figure 7 and Table 3 show the dimensional differencein the height direction for a certain section between
the CAD data of the machined Y-TZP copings and thetarget CAD data for the coping obtained through 3D
measurement. The average dimensional difference inthe height direction was 73.6 µm. Figure 8 and Table 4
show the dimensional difference in the width direction
obtained using 3D measurement. Two-way repeated-

!
!

!

!

Fig. 6Means and standard deviations of calculated
average roughnesses (Ra) and machining depthsof irradiated Y-TZP surfaces for different average
power levels.
The six average power levels were statisticallydivided into three subgroups (a, b, and c) withrespect to average roughness and three subgroups(A, B, and C) with respect to machining depth.
Means with different letters are significantly
different (p<0.05).

!

Fig. 7

Means and standard deviations of dimensional
differences in the height direction.
The asterisk (*) indicates a significant difference at
p<0.05.

! 426

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429!
Table 3

Dimensional difference in the height direction ateach measurement point

Distance from
occlusal center (mm)!
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Dimensional difference (µm)
Mean

(SD)

−3.0

55.0

(37.3)−2.0

51.7(26.4)−1.0

61.7(17.2)

0.0−1.7(14.7)

1.0

131.7(58.8)

2.0

95.0(130.9)

3.0

121.7

(63.7)!

measures ANOVA revealed that both main effects weresignificant (p<0.01). As shown in Fig. 8, the dimensional
difference in the width direction decreased as thenumber of machining iterations increased and as the
distance from the cervical line decreased, although theinteraction between the two primary effects was alsosignificant (p<0.05). The simple primary effect of the
distance from the cervical line was not significant at thethird or fourth machining (p<0.05). The dimensional
difference in the width direction at the fourth machining
was at most approximately 20 µm.
Figure 9 shows the inner convergence angle ofmachined copings of particular cross sections. The
means and standard deviations, which are shown inparentheses, of the inner surface convergence angle were

!

!

!

!

Fig. 9Fig. 8Means and standard deviations of dimensional
differences in the width direction.

!

Means and standard deviations of convergenceangles of inner machined copings.
Means labeled with different letters (a, b, c, and d)
are statistically different from each other (p<0.01).

!

!

Table 4

Dimensional difference in the width direction at each measurement point!

Distance from cervical line(mm)

Dimensional difference (µm)!

First machining

Second machining

Third machining

Fourth machining

!

0.0

−30.1

(14.8)

−6.5

(3.0)

15.1

(12.0)

17.2

(5.0)

0.5

−107.5

(2.9)

−31.0

(4.7)

−1.9

(3.0)

7.6

(0.6)

1.0

−132.6

(4.6)

−36.3

(6.1)

−3.1

(4.4)

14.0

(2.8)

1.5

−161.9

(9.0)

−44.7

(8.3)

−6.0

(5.5)

18.2

(2.7)

2.0

−192.2(10.9)

−55.3

(9.3)

−10.8

(8.0)

20.0

(2.4)

2.5

−229.2(16.3)−68.0(10.4)

−16.7

(8.7)

19.1

(3.9)

3.0

−265.0(21.4)−81.1(12.7)−23.5(12.0)

16.5

(4.2)

3.5

−305.6(21.8)−102.6(10.3)−30.0(12.2)

17.8

(4.5)

4.0

−369.4(40.1)−110.6(15.7)−39.0(14.1)

14.3

(5.8)

4.5

−481.8(127.6)−125.0(16.4)−48.2(15.8)

11.5

(5.7)

5.0

−649.0(274.6)−143.9(16.8)−58.2(19.4)

6.8

(6.9)

5.5

−926.4(536.0)−162.8(17.9)−70.6(20.5)

1.8

(5.1)

!

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429

!

!

427

average power level of 7.5 W belonged to both subgroupa (smallest average roughness) and subgroup A(greatest machining depth). Therefore, the average
power level of 7.5 W, at which the smoothest Y-TZP
surface could be obtained with high machining efficiency,
was considered to be the most appropriate power level
for the Nd:YVO4 laser. High machining efficiency
reduces the machining time.

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!

!

!
!
!

!

!

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!

Fig. 10

Machining accuracy using three metal dies having
convergence angles of 11° and different cervicalwidths; Abutment 1: 9.60 mm, Abutment 2:
9.58 mm, and Abutment 3: 9.56 mm. Significant
differences are indicated by asterisks ‘**’(p<0.01).

determined to be as follows: 18.5° (0.86°) for the firstmachining, 13.9° (0.47°) for the second machining, 12.1°(0.34°) for the third machining, and 10.9° (0.18°) for the
fourth machining. One-way repeated-measures ANOVA
revealed that the number of machinings significantly
affected the inner convergence angle of Y-TZP coping.
As the number of machining iterations increased, theconvergence angle decreased significantly (p<0.01).
At the fourth machining, the convergence angle wascomparable to the target 3D-CAD data.
2) Machining accuracy using the metal dies
The marginal fits of the Y-TZP copings that weremachined four times were measured using metal dies.
The means and standard deviations, which are shownin parentheses, of L-L1 were −80.2 (40.0) µm, 4.8 (32.6)µm, and 77.0 (42.0) µm using Abutments 1, 2, and 3,
respectively. The larger the cervical width, the smaller
the value of L-L1 (Fig. 10). The copings fit accurately on
Abutment 2.

DISCUSSION
Determination of the most appropriate power level of the
Nd:YVO4 laser
The average roughness and machining depth were
measured in order to determine the most appropriate
average power level (W) of the Nd:YVO4 laser on fully
sintered Y-TZP. Excellent lasing performance on Y-TZP,
which has high machining efficiency and provides asmooth surface, is most important. As shown in Fig.
6, the six average power levels considered herein were
statistically divided into three subgroups (a, b, and c)with respect to average roughness and three subgroups(A, B, and C) with respect to machining depth. The

Machining accuracy of Y-TZP copings
The copings, which were extracoronal restorations, wereable to be machined from fully sintered Y-TZP using thenanosecond laser. Figure 7 shows that the dimensional
difference in the height direction was not uniform. Air
was blown from three directions on the Y-TZP coping inorder to avoid reattachment of fine particles. However,locational differences were thought to occur as a resultof the air being blown non-uniformly against the copings.
Controlling the depth direction in machining (Z-axis)
using a focused laser beam is generally difficult.
Therefore, the copings were machined using an improved
method for the depth control. In this experiment, thedimensional difference in the height direction was
at most 132 µm for the planned 6.5 mm in the height
direction based on machining CAD data, which gives
an error of only 2.0%. In the width direction, thedimensional difference was at most 20 µm. The meanand standard deviation of the convergence angles of theinner copings were 10.9° and 0.18°, respectively.
In addition, the inside of the coping might be slightly
oval-shaped. Therefore, in order to clinically evaluate
the precision, a traditional experiment was conductedin which the dimensional accuracy was evaluated using
a die method. We prepared three metal dies having
different cervical widths. Since the machining 3D-CAD
data (Fig. 2) did not take into account the cement layeror the coefficient of friction, the marginal discrepancy at
the cervical line could not be obtained using Abutment
1, the cervical width of which was the same as in themachining 3D-CAD data. Therefore, dies having smaller
cervical widths had to be used to measure the marginal
discrepancy. The results revealed that the copings fit
accurately on the die. The aforementioned discrepancies
could be further improved by a slight modificationof the design program of the CAD system. Marginal
discrepancies of less than 120 µm have been reported
to be clinically acceptable9). Thus, accurate machiningof zirconia coping for clinical use using the Nd:YVO4
laser is possible.

!

Laser machining of Y-TZPAt present, Y-TZP copings are fabricated using a dental
CAD/CAM system in which a partially sintered Y-TZP
block (12 HV) is milled and subsequently sintered ina furnace. Machining design can compensate for theapproximately 20% volume shrinkage that occurs later
during sintering of the zirconia blocks. Therefore, we
devised a new method by which to machine a Y-TZP
coping directly from a fully sintered Y-TZP blockusing an industrial Nd:YVO4 Q-switched nanosecond! 428Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429!
laser. The use of lasers to machine ceramics presents
a number of advantages over the other methods. Laser
machining is a noncontact technique that allows highprecision machining of numerous types of ceramics andeliminates tooling costs, which are expensive.
Generally, the material properties of Y-TZP,
specifically its high thermal expansion coefficient(11×10−6/°C) and low thermal conductivity (2 W/mK)10),
make laser machining of this material difficult. Due tothe strong thermal nature of the laser beam-materialinteraction, especially in the case of long pulse widths,
microcracks are generated by dental lasers, which
generate millisecond-order pulse widths, as a resultof thermal damage. In the present study, we used ananosecond pulsed laser, which could significantly
reduce thermal damage. The formation of cracks in theirradiated surface was seldom observed when using
the nanosecond laser, and cracks that observed were
extremely small, having depths of approximately 3 µm.
Thus, the use of an ultrashort pulse laser that producesa picosecond pulsed laser or a femtosecond pulsed
laser can significantly reduce the above-mentioned
thermal effects, such as thermal damage or microcracks.
However, such lasers require too much machining time
to be adapted for practical application. Therefore, thepotential of nanosecond laser machining on Y-TZP
was demonstrated herein. Approximately 90% of thematerial removed through the proposed laser machining
is a result of the interaction between the laser beam andthe surface of the Y-TZP workpiece being machined. The
nanosecond laser used is thus suitable for use in themachining of dental restorations.
The laser machine used herein provided three-axis
machining, in which a Y-TZP specimen was irradiatedfrom one direction (Z-axis). In addition, machining a holewith a convergence angle by condensing a laser beam
has certain limitations because a focused laser produces
a tapered hole. Accurately machined copings for clinicaluse were obtained after the fourth machining. On theother hand, a five-axis laser machine can instantly
machine a taper-less hole because the laser beam canirradiate vertically with respect to the work piece11).
In other words, a five-axis machine would provide the
Y-TZP copings with improved retention and accuracy forclinical use and reduce costs by reducing the machining
and finishing times.
Figure 11 shows a crown coping that was machined
at an average power of 7.5 W. A dental restoration more
complicated than the simple abutment coping shown in
Fig. 2 was successfully machined from a fully sintered
Y-TZP block, as shown in Fig. 11.
In comparison with a Nd:YAG laser, the Nd:YVO4
laser has advantages such as the ability to produce
more compact systems, because the Nd:YVO4 crystal
has 5 times higher absorption coefficient than Nd:YAG
crystal. In addition to this, the laser has a higher
efficiency thanks to a high stimulated emission crosssection. A Nd:YVO4 single crystal can be used forcompact, high-efficiency machining, as compared with a
Nd:YAG single crystal12,13).

!

Fig. 11!
!

A crown coping machined at an average power of
7.5 W.
The crown coping was successfully fabricated in aclinical form.

!

Darkening of the machined Y-TZP surface andcorresponding countermeasures
After ultrasonic cleaning, the machined Y-TZP surface
was dark gray. Darkening of Y-TZP irradiated by ananosecond laser should be a result of oxygen vacancies
that were generated at high temperatures due to therelease of oxygen atoms after substoichiometric dioxide
formation, in which ZrO2 became ZrO2-X14,15) . Noda et al.
reported that a surface irradiated by a Nd:YAG laser
became darkened and that the oxygen concentration
clearly decreased, whereas the zirconium concentration
increased7). Irradiated Y-TZP disks heated at 1,000°C
for 5 min in air retuned to their original white color.
Applying the above reduction reaction to the present
study, Y-TZP was heated in the atmosphere to reabsorb
oxygen. After heating, the Y-TZP became white again.
The high temperature allows oxygen to diffuse backto vacancies in the irradiated surface, rebuilding the
crystalline structure and recovering the white color of
Y-TZP. This heating is thought not to have an adverse
clinical effect because the porcelain is sintered on Y-TZP
at higher than 1,000°C. Matysiak et al. reported a similar
result in which blackening occurred within holes on
zirconia irradiated using a HeNe laser16). After heating
at 1,350°C, the sample became white again, and there
was no significant variation after the heat treatment.
The recovery of the white color of the surface enables
the fabrication of esthetic dental prostheses without
opaquing using Y-TZP machined with a Nd:YVO4 laser.
The effect of the nanosecond laser on the machined
Y-TZP surface was small, and we assume that themechanical properties will not be adversely affected toa significant degree.

!

Future development
The primary problems associated with the laser
machining of Y-TZP reported herein are a longmachining time and high cost. Fabrication of the innersurface of the Y-TZP coping required approximately
eight hours. However, sintering a partially sinteredzirconia coping fabricated by a CAD/CAM system
requires up to 18 h. Moreover, the long machining timerequired when using the laser can be shortened byusing a prefabricated coping of fully sintered Y-TZP.

Dent Mater J 2014; 33(3): 422–429

!

429

!

!

!
!

A nanosecond laser machine that can machine a highthermal-expansion, low-thermal-conductivity material,
such as Y-TZP, will also be able to machine other dental
materials, such as resins and metals. If the machine isminiaturized and becomes widely used, the cost may be
reduced considerably.
The toughness and high strength of Y-TZP are
similar to the characteristics of metallic materials.
For this reason, Y-TZP has been used in numerous
applications in which previously only metals were
believed to be suitable, such as moving parts of engines,
valve components, milling and cutting tools, wiredrawing dies, and scissors8). Y-TZP is also a popularmaterial for use in bio-medical applications due to its
outstanding mechanical properties, reliability, andexcellent biocompatibility. The ability to carry out
accurate laser machining of Y-TZP would allow its
properties to be more widely exploited, in particular
for applications in which uniquely shaped, intricately
structured components are required, not only in industry
but also in dentistry.

CONCLUSIONSA Y-TZP coping was fabricated using a CAD/CAM
system in which a partially sintered Y-TZP block
was milled and subsequently sintered in a furnace,because fully sintered Y-TZP is too difficult to machineusing milling techniques. Furthermore, the designcompensates for the volume shrinkage that occurs
during sintering of Y-TZP blocks. Thus, we devised a
new method by which to machine Y-TZP copings using
an industrial Nd:YVO4 Q-switched nanosecond laser.
The following conclusions were obtained based on the
results of the present study.
1. An average power of 7.5 W was determined tobe the optimal lasing condition because thiscondition provided the smoothest surface withhigh machining efficiency.
2. The convergence angle of the inner coping obtainedat the first machining did not adequately agreewith the provided machining 3D-CAD data. At
the fourth machining, however, the convergenceangle of the inner coping was 10.9° (SD=0.18°),
which is approximately the same as the provided
machining 3D-CAD data.
3. The dimensional difference in the height
direction was at most 132 µm (SD=59 µm), andthe dimensional difference in the width direction
at the fourth machining was at most 20 µm(SD=2.4 µm).
4. The machined copings fit accurately on the metal

!

!
!

die.
5. The proposed method using a nanosecond
Nd:YVO4 laser machine was demonstrated to be
useful for fabricating a coping directly from fully
sintered Y-TZP.

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Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料④

	 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:721-728	
 (2014)Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑤

	 J.	
 Biomed.	
 Mater.	
 Res.	
 Part	
 B,	 102B:	
 1809-1816	
 (2014)

Development and performance evaluation of a positive referencematerial for hemolysis testing
Yuji Haishima,1* Chie Hasegawa,1 Yusuke Nomura,1 Tsuyoshi Kawakami,2 Toshiyasu Yuba,3Tomoko Shindo,4 Keisuke Sakaguchi,5 Takahiro Tanigawa,5 Kaori Inukai,5 Mika Takenouchi,5Kazuo Isama,2 Atsuko Matsuoka,6 Shingo Niimi1
1

Division of Medical Devices, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo 158–8501, Japan
Division of Environmental Chemistry, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo 158–8501,
Japan
3
Kawasumi Laboratories, Inc., Corporate Research and Development Division, Shinagawa Intercity Tower B, Konan,
Minato-ku, Tokyo 108–6109, Japan
4
Hatano Research Institute, Food and Drug Safety Center, 729-5 Ochiai, Hadano, Kanagawa 257–8523, Japan
5
R&D Headquarters, Evaluation Center, TERUMO Corporation, 1500 Inokuchi, Nakai-machi, Ashigarakami-gun, Kanagawa
259-0151, Japan
6
Office of Standards and Guidelines Development, Pharmaceuticals and Medical Devices Agency, 3-3-2 Kasumigaseki,
Chiyoda-ku, Tokyo 100-0013, Japan
2

Received 3 September 2013; revised 24 February 2014; accepted 19 March 2014
Published online 8 April 2014 in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002/jbm.b.33169
Abstract: This study deals with the development and performance evaluation of a positive reference material for
hemolysis testing, which is used for evaluating the biologicalsafety of medical devices. Genapol X-080, a nonionic detergent, was selected as a candidate hemolytic substance in asurvey of 23 chemical compounds; it showed significant
hemolytic activity against rabbit defibrinated blood at concentrations more than 20 mg/mL. A polyvinyl chloride (PVC)
sheet spiked with 0.6% (w/w) of the compound exhibited
weak hemolytic activity in direct contact and/or extract-based
assays after 4 h incubation at 37 C. A PVC sheet containing
5.8% (w/w) Genapol X-080 induced complete hemolysis inboth assays. The amount of Genapol X-080 eluted from each
PVC sheet during hemolysis testing using the direct contact
method increased time-dependently and reached 25.6 (former
sheet) or 1154 (later sheet) mg/mL after 4 h incubation, which

was similar to or much higher than the critical micelle concentration, respectively. Similar elution behavior wasobserved using the extract-based method, and the Genapol
X-080 content in test solutions prepared by autoclave extraction of both sheets was 22.5 and 358 mg/mL, respectively,
indicating a clear relationship between the degree of hemolytic activity and the eluted amount of Genapol X-080. Thus,
a PVC sheet spiked with a compound exhibiting different
hemolytic activity depending on its concentration may be
useful as a positive reference material to validate the hemolyC 2014 Wiley Periodicals, Inc. J Biomed Mater Res Part B:
sis tests. V
Appl Biomater, 102B: 1809–1816, 2014.

Key Words: hemolysis test, positive control, biological safety
evaluation, guidance

How to cite this article: Haishima Y, Hasegawa C, Nomura Y, Kawakami T, Yuba T, Shindo T, Sakaguchi K, Tanigawa T, Inukai
K, Takenouchi M, Isama K, Matsuoka A, Niimi S. 2014. Development and performance evaluation of a positive reference material for hemolysis testing. J Biomed Mater Res Part B 2014:102B:1809–1816.

INTRODUCTION

Biological safety evaluation of raw materials or medical devices must be conducted using risk analysis techniques speciﬁedin ISO 14971.1 The intended use or purpose and the safety
properties of a medical device must be clariﬁed or known
foreseeable hazards must be identiﬁed, and the risk of eachhazard must be anticipated. Items to be evaluated to determine the biological safety of each medical device are selectedaccording to the requirements speciﬁed in ISO 10993-1.2

As a general rule, the items must be evaluated depending on their categorization in accordance with the nature ofbody contact and the duration of contact. Hemocompatibility
testing is required to evaluate the safety of a medical device
or material that has contact with blood.4–7 Hemolysis testingis a part of hemocompatibility testing, which involves tests
for thrombosis, coagulation, platelets, hematology, and thecomplement system. Mechanical and biochemical factors
affect hemolysis. For medical devices such as membrane

Correspondence to: Y. Haishima (e-mail: haishima@nihs.go.jp)
Contract grant sponsor: Health and Labor Sciences Research Grants (Japanese Ministry of Health, Labor, and Welfare); contract grant number:
H23-CHIKYUKIBO-SHITEI-003 and H25-CHIKYUKIBO-SHITEI-008

C 2014 WILEY PERIODICALS, INC.
V

1809

TABLE I. List of a Candidate of Hemolytic Compound and the Hemolytic Activity Estimated by Simple Hemolysis Test Method
Final concentration
for test (lM)

Hemolytic
ratio (%) d

DMSOb
PBS
PBS
PBS
PBS
DMSO
DMSO
DMSO

500
5
50
50
50
500
500
500

0.5
1.3
0.9
1.0
0.7
93.0
0.3
0.6

DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO

500
500
500
500
500
500

0.4
0.7
6.3
0.4
0.3
0.3

DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO

500
500
500
50c
500
500
500
500
500

1.4
0.5
1.2
100.9
0.3
8.6
0.6
0.4
0.3

Compound (manufacturer No.)a

Dissolved solvent

Triphenyl phosphate (1)Lactic acid (1)Orcinol anhydrous (1)Lead acetate (1)Sodium chlorate (1)Diphenyl disulfide (2)Dimethylglyoxime (1)3-Phenylazo-2,6-diaminopyridine
monohydrochloride (2)5-Aminosalicylic acid (1)4-Nitroaniline (3)o-Aminophenol (1)Aniline (1)p-Aminodipheylamine (1)2-Nitrophenylhydrazinehydrochloride (2)Sulfasalazine (2)Nitrobenzene (1)Resorcinol(1)Genapol X-080 (3)2,4,6-Trinitrophenyl (1)Zineb standard (4)D-Penicillamine hydrochloride (5)1-Naphthylamine (3)p -Aminosalicylic acid sodium
salt dihydrate (5)a(1) Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Tokyo, Japan), (2) Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokyo, Japan), (3) Sigma-Aldrich Co. (Tokyo,
Japan), (4) Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan), and (5) MP Bio Japan K.K. (Tokyo, Japan).
bCompound dissolved in DMSO was diluted to 100 folds with PBS at the final concentration for hemolysis test.
clg/mL.
dHemolytic ratio after 4 h incubation.

oxygenators or hemodialyzers that may physically damage
blood cells, the test should be designed considering
mechanical factors, for example, using a blood circulation
system. For devices that have little mechanical impact onblood cells, established static or semi-static in vitro testing
can be used. This testing may be also useful for devices
with mechanical impact on blood to evaluate the impact ofmaterials on hemolysis.
Biological testing methods have to be validated to conﬁrm that test results meet the requirements for evaluating
safety in clinical use.2,3 Negative and positive referencematerials or positive control substances have been used inbiological safety evaluation tests such as cytotoxicity, sensitization, genotoxicity, and implantation tests to detect toxicity
in test samples and to certify the validity of the test system.
However, no reference materials have been used for hemolysis testing to date.
Hemolysis is a phenomenon accompanied by the ruptureof erythrocytes and the release of their cytoplasm into thesurrounding ﬂuid; thus, the cell membrane is damaged byphysical, chemical, and biological factors. Certain types ofsnake and vespid venoms8,9 with phospholipase A2 activity
and bacterial exotoxins10–12 produced by pathogenic
microbes (e.g., Clostridium perfringens, Streptococcus pneumoniae, and Staphylococcus aureus) are known as typicalhemolysins, but considering the safety, stability, and cost

1810

HAISHIMA ET AL.

performance of potential positive reference materials, a candidate hemolytic substance should be selected from commercially available chemical compounds.
In this study, we developed a positive reference material
made of a plasticized polyvinyl chloride (PVC) sheet thatshows strong or weak hemolytic activity dependent on thecontent of Genapol X-080, selected as a candidate hemolytically toxic substance, based on results obtained using 23
types of chemical compounds, and we evaluated the performance of this material as a positive reference material inthree types of ofﬁcial test methods used in Japan and theUSA.
MATERIALS AND METHODS

Materials, chemicals, and utensils
Twenty-three types of chemicals selected as candidate
hemolytic compounds and their suppliers are listed in Table
I. Dimethyl sulfoxide (DMSO) of molecular biology grade,sodium citrate, sodium carbonate, ammonium thiocyanate,cobalt (II) nitrate hexahydrate, nitric acid for analysis of poisonous metals, metal standard solution (Co and Ag), andDulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) without Ca11and Mg11 were purchased from Wako Pure Chemical Industries (Tokyo, Japan). Toluene of pesticide residue and PCB
analysis grade and Drabkin reagent were purchased from
Sigma-Aldrich (Tokyo, Japan), and 4-(2-pyridylazo)-

POSITIVE REFERENCE MATERIAL FOR HEMOLYSIS TESTINGORIGINAL RESEARCH REPORT

resorcinol (PAR) was purchased from Dojindo MolecularTechnologies (Kumamoto, Japan). The hemoglobin standard
was purchased from Alfresa Pharma Corporation (Osaka,
Japan). All utensils made of glass, metal, or TeﬂonV used toprepare samples for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) analysis were heated at 250 C for morethan 16 h prior to use.
R

Animal blood
The rabbit deﬁbrinated blood used in simple hemolysis testing for a candidate hemolytic compound as described below
was purchased from Kohjin Bio (Saitama, Japan). For hemolysis tests provided by the Japanese Ministry of Health,
Labor, and Welfare (MHLW), rabbit deﬁbrinated blood was
prepared in our laboratory according to Japanese guidelines.7 For hemolysis tests provided by the American Societyof Testing and Materials (ASTM) and the National Institutesof Health (NIH),5,6 fresh-drawn rabbit blood was anticoagulated by adding sodium citrate at a ﬁnal concentrationof 0.38 w/v% and stocked at 4 C until use. New Zealandwhite rabbits and Japanese white rabbits were used in thisstudy, and the drawn blood was directly used for hemolysis
testing without washing the blood cells. The procedure was
performed in accordance with the ethical guidelines on animal experiments of the Hatano Research Institute of theFood and Drug Safety Center (approval number 1120331A)
and Terumo Corporation (approval number 120163).
Preparation of PVC sheet
PVC powder (100 g) was added gradually to a mixture of
DEHP (55 g) and ESBO (8 g) containing different amountsof Genapol X-080 or diphenyl disulﬁde (0, 0.01, 0.1, 1.0, and10 g, respectively; ﬁnal concentration 5 0, 0.006, 0.06, 0.6,
and 5.8% [w/w]) under stirring with a spatula. The mixed
powder was gently heated from room temperature to 100 C
in an oven and then stirred well. The powder was stirred asecond time after heating at 100 C for 5 min to completely
plasticize the PVC. The plasticized powder was heat-pressedat 180 C to prepare the PVC sheets (thickness 5 0.4 mm).
Each sheet was cut into small pieces (1 3 3 cm2).
Simple hemolysis testing to survey a candidate
hemolytic compound
Purchased rabbit deﬁbrinated blood (1 mL) was placed intoa screw-capped test tube and centrifuged at 700g for 5 min
at 4 C. The supernatant was removed, and PBS (10 mL)
was added to the sedimented red blood cells (RBC) andthen gently mixed. After centrifugation at 700g for 5 min at
4 C, the supernatant was removed, and this step was
repeated two times to wash RBCs. The RBC sediment was
ﬁnally suspended in PBS of equal volume to original sample
and stored at 4 C until use.
Hydrophilic compounds were dissolved in PBS (1 mL) at
the ﬁnal concentration shown in Table I, and the washed
RBC suspension (20 mL) was added to the solution and thengently mixed. After incubation at 37 C for 1, 2, and 4 h,each sample was centrifuged at 700g for 5 min at 4 C, andthen the absorbance of the supernatant (100 mL) was

measured at 415 nm using a SH-9000 Lab microplate
reader (Corona Electric, Ibaraki, Japan). The RBC suspension
in PBS alone was also tested under the same conditions asa negative control, whereas a positive control was preparedusing distilled water instead of PBS. The calculated amountof the hydrophobic compound was dissolved in DMSO, andthe solution was diluted 100-fold with PBS at the ﬁnal concentration listed in Table I. The washed RBC suspension (20mL) was immediately added to the diluted sample (1 mL),and then hemolytic behavior was estimated using the same
method.
The hemolytic behavior of Genapol X-080 and diphenyl
disulﬁde exhibiting high hemolytic activity against RBC was
additionally estimated in detail at concentrations from 0.1
to 50 mg/mL for Genapol X-080 and from 50 to 100 mM fordiphenyl disulﬁde.
These tests were performed in duplicate. The hemolytic
ratio was calculated in accordance with the following
formula.
%Hemolysis 5

ðAT 2AN Þ3100:
ðAP 2AN Þ

where AT is the test sample absorbance, AN is the average
negative control mean absorbance, and AP is the average
positive control mean absorbance.
Hemolysis testing of PVC sheet spiked with hemolytic
compoundThis test was performed using four methods: a simple
method used to survey a candidate hemolytic compound,and ofﬁcial methods provided by ASTM, NIH, and Japanese
MHLW guidelines.5–7 PVC sheets (5 g for the NIH method or
1 3 3 cm2 for the other methods) containing different
amounts of Genapol X-080 or diphenyl disulﬁde were cut
into small pieces and placed into a screw-capped glass bottle. A PVC sheet containing no Genapol X-080 or diphenyl
disulﬁde was used as a negative material control.
In the simple method, 1 mL of PBS and 20 mL ofwashed, suspended RBCs prepared according to the procedure described above were added to the bottle containing
the test pieces for the direct contact hemolysis test. In theextraction method, 1 mL of PBS was added to the bottle
and autoclaved at 121 C for 1 h to make the test solution,and then the washed RBC suspension (10 mL) was added to
0.5 mL of each test solution replaced into another glass
tube. After incubation at 37 C for 1, 2, and 4 h, the hemolytic ratio of each sample was measured according to thesame method described above.
For ASTM direct contact hemolysis testing, PBS (7 mL)
and 1 mL of rabbit blood anticoagulated with sodium citrate
were used to adjust the hemoglobin concentration to 9.456
mg/mL, and they were added to the bottle containing sample pieces. For the ASTM extract method, PBS (8 mL) was
added to the bottle and autoclaved (121 C, 1 h) to prepare
the test solution. Citrated rabbit blood (1 mL) was added to
7 mL of the test solution replaced into another glass bottle.
Each sample was incubated at 37 C for 3 h under gentle

JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS | NOV 2014 VOL 102B, ISSUE 8

1811

mixing followed by centrifugation at 800g for 15 min. The
supernatant (1 mL) was mixed with Drabkin reagent (1 mL)
and the absorbance was measured at 540 nm after incubation at room temperature for 15 min. The hemoglobin concentration in each sample was calculated according to a
standard curve.
For the NIH direct contact method, rabbit blood (8 mL)
anticoagulated with sodium citrate was diluted with saline(10 mL). The diluted blood (0.2 mL) was hemolyzed by adding 0.1 w/v% sodium carbonate solution (10 mL), and theabsorbance at 545 nm was adjusted to the range of 0.9–1.0
by adding saline or blood. Saline (10 mL) was added to thebottle containing the sample pieces and pre-incubated at
37 C for 30 min. The blood adjusted according to the absorbance (0.2 mL) was added to the glass tube and incubated at
37 C for 1 h. After centrifugation at 500g for 5 min, theabsorbance of the supernatant was measured at 545 nm.
For the Japanese MHLW extract hemolysis test, the test solution was prepared by autoclave extraction (121 C, 1 h) withsaline, and 0.2 mL of rabbit deﬁbrinated blood freshly preparedin our laboratory was added to 10 mL of the test solution, followed by incubation at 37 C for 4 h. After centrifugation at 750g
for 5 min, the supernatant (0.5 mL) was mixed with Drabkin reagent (4.5 mL) and incubated at room temperature for 20 min followed by measurement of the absorbance at 540 nm.
Negative and positive controls and the hemolysis ratio
were prepared or calculated in accordance with the method
provided by the guidelines. These tests were performed intriplicate, and signiﬁcant differences were calculated by
two-way analysis of variance.
Elution testing of Genapol X-080 from the PVC sheet
The amount of Genapol X-080 eluted from the PVC sheet wasquantiﬁed by ICP-MS analysis as the amount of cobalt (II)formed complex produced according to a previously reported
method.13,14 Brieﬂy, 1 mL of PBS and 20 mL of washed RBC
suspension were added to the bottle containing the test
pieces of the PVC sheet (1 3 3 cm2) spiked with different
amounts of Genapol X-080. After incubation for 1, 2, and 4 h,
500 mL of each sample solution was replaced into anotherscrew-capped glass tube, and 500 mL of test solution prepared by autoclave extraction of the test pieces with PBS (1mL) was also sampled into another tube. PBS (0.5 mL), toluene (6 mL), and a mixture (3 mL) of ammonium thiocyanate(456 g/L) and cobalt (II) nitrate hexahydrate (46.6 g/L) solutions (1:1, v/v) were added to each sample and shaken for
15 min at room temperature followed by centrifugation at
2500 rpm for 3 min. PAR solution (1 mL, 0.01 g/L, pH 9.5)
was added to 5 mL of the supernatant (toluene layer), andgently shaken for 3 min followed by centrifugation. The
water layer was sampled for ICP-MS analysis. PBS containing
Genapol X-080 in a concentration range from 1.0 to 200 mg/
mL was also treated using the same method to generate astandard curve. This test was repeated in triplicate.
ICP-MS analysis
The sample solution was diluted appropriately 100–400fold with 5 v/v% nitric acid and ﬁltered through a

1812

HAISHIMA ET AL.

membrane ﬁlter (pore size 0.45 mm, Sartorius Stedim, Goettingen, Germany). The concentration of Co (m/z 5 59) in thesample solution was determined by ICP-MS (Agilent 7500ce,
Agilent Technologies, Santa Clara, CA) using an octopole
reaction system.15,16 Helium gas was used as the collisiongas. The operation conditions of ICP-MS were as follows: RF
power 1500 W; argon plasma gas 15 L/min; nebulizer gas
0.7 L/min; make-up gas 0.33 L/min; helium collision gas 5
mL/min; spray chamber temperature 2 C; integration time
0.1 s; three replicates. Ag (m/z 5 107) was used as an internal standard (5 mg/L in 5% nitric acid solution) for quantiﬁcation of the Co concentration. The method limit ofdetection (LOD) and limit of quantiﬁcation (LOQ) for Co in
the ﬁnal sample solution were calculated as follows17:
LOD 5 3 3 q
LOQ 5 14:1 3 q
where q is the standard deviation obtained from the resultsof a control blank sample (only PBS, n 5 10). The LOD and
LOQ of Co thus obtained were 6.67 and 31.7 ng/L, respectively. The background equivalent concentration (BEC) of Co
in this study was 1.25 ng/L. Linearity (r 5 0.997) of thestandard curve used to quantify Genapol X-080 was
observed in the concentration range from 1.0 to 200 mg/mL,
and hence, the LOQ for Genapol X-080 was set at 1.0 mg/
mL.
RESULTS

Hemolytic activity of a candidate compound
The 23 chemicals listed in Table I were selected as candidate hemolytic compounds according to previous reports,18–
20
and the hemolytic behavior against rabbit RBCs was estimated using a simple survey method. As shown in Table I,
although most of the compounds did not exhibit hemolytic
activity under the conditions used in this study, Genapol X080 and diphenyl disulﬁde signiﬁcantly induced hemolysis.
As shown in Figure 1(a), the activity of Genapol X-080
remarkably increased at concentration higher than approximately 20–25 mg/mL. Diphenyl disulﬁde exhibited hemolytic
activity in a concentration-dependent manner in the concentration range from 50 to 100 mM [Figure 1(b)].
Preliminary study on the hemolytic activity of the PVC
sheet spiked with Genapol X-080 or diphenyl disulﬁdeTo conﬁrm its availability as a positive reference material,
the hemolytic behavior of PVC sheets spiked with different
amounts of Genapol X-080 or diphenyl disulﬁde was preliminarily estimated using a simple method.
As shown in Figure 2(a), although PVC sheets containing
0.006% or 0.06% (w/w) Genapol X-080 did not exhibit signiﬁcant hemolytic activity when compared with PBS (control) and the negative material control, the PVC sheet spiked
with 0.6% (w/w) Genapol X-080 induced weak hemolysis of
RBCs in the direct contact method, and the hemolytic ratio
reached 37.4% after 4 h of incubation. In addition, complete
hemolysis was induced by the PVC sheet containing 5.8%

POSITIVE REFERENCE MATERIAL FOR HEMOLYSIS TESTINGORIGINAL RESEARCH REPORT

compound. Similar hemolytic behavior was also yielded by
the ASTM or Japanese MHLW extract-based method and the
NIH direct contact method, in which PVC sheets spiked withthe highest amount of Genapol X-080 induced complete
hemolysis (Figure 4). However, a PVC sheet spiked with
0.6% (w/w) Genapol X-080 did not exhibit signiﬁcanthemolytic activity, which was different from the results in
the ASTM direct contact method and the simple method
used to survey the candidate hemolytic compound.

FIGURE 1. Hemolytic behavior of Genapol X-080 (a) and diphenyl
disulfide (b) estimated by the simple method. Concentration of Genapol X-080: , 1; w, 10; ~, 20; 䊊, 25; ~, 30; 䊏, 40 mg/mL. Concentration of diphenyl disulfide: , 50; w, 60; ~, 70; 䊊, 80; ~, 90; 䊏, 100
mM. The hemolytic ratio of negative control (PBS) after incubation for
1, 2, and 4 h was 4.2%, 4.8%, and 7.2%, respectively.

••

Amount of Genapol X-080 eluted from the PVC sheet
The amount of Genapol X-080 eluted from the PVC sheet
was measured by ICP-MS analysis to elucidate the correlation with the hemolytic behavior of the sheet. In the directcontact method, the amount eluted from PVC sheets spiked
with 0.6% or 5.8% (w/w) Genapol X-080 increased overtime and reached 25.6 or 1154 mg/mL, respectively, after 4
h of incubation as shown in Table II. The test solution prepared by autoclave treatment for the extract-based method
contained 22.5 (former sheet) or 358 (later sheet) mg/mL
Genapol X-080, respectively. In contrast, the amount eluted
from the PVC sheet containing the lowest amount of Genapol X-080 was less than the LOQ in the direct contact and/or extract-based methods. No signiﬁcant elution wasobserved from the PVC sheet spiked with 0.06% (w/w)
Genapol X-080, except for 3.75 mg/mL Genapol X-080
detected after incubation for 4 h using the direct contact
method.

(w/w) Genapol X-080 independently of incubation time.
Similar hemolytic behavior was observed for the extractbased method as shown in Figure 2(b), in which the test
solution prepared by autoclave extraction of PVC sheets
spiked with 0.6% or 5.8% (w/w) Genapol X-080 exhibited
weak or strong hemolysis, respectively, but no activity wasobserved for extracts from PVC sheets containing 0.006% or
0.06% (w/w) Genapol X-080.
In contrast, the PVC sheet containing diphenyl disulﬁdedid not exhibit hemolytic activity in the direct contact and/or extraction methods, despite the presence of the spiked
diphenyl disulﬁde as shown in Figure 3.

Performance evaluation of PVC sheet spiked with
Genapol X-080 as a positive reference material
The hemolytic activity of PVC sheets spiked with Genapol X080 was also estimated using three ofﬁcial methods to certify the sheet as a positive reference material for hemolysis
testing. As shown in Figure 4, the hemolytic behavior of the
sheet detected by the ASTM direct contact method was
almost identical to that in the simple method used in the
preliminary survey, in which the PVC sheet containing 0.6%
or 5.8% (w/w) Genapol X-080 induced weak (hemolytic
ratio 5 21.1%) or strong (hemolytic ratio 5 92.4%) hemolysis, respectively, but no hemolysis for observed for the othertwo sheets spiked with relatively low amounts of the

FIGURE 2. Hemolytic behavior of PVC sheets spiked with different
amounts of Genapol X-080 estimated by direct contact (a) andextract-based (b) assays using the simple method. In addition to PBS
alone (negative control), a *PVC sheet containing no Genapol X-080
was used as a negative material control. **Significant differences(p < 0.01) were detected between these data points and other data
points.

JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH B: APPLIED BIOMATERIALS | NOV 2014 VOL 102B, ISSUE 8

1813

FIGURE 3. Hemolytic behavior of PVC sheets spiked with different
amounts of diphenyl disulfide estimated by direct contact (a) andextract-based (b) assays using a simple method. In addition to PBS
alone (negative control), a *PVC sheet containing no diphenyl
disulfide was used as a negative material control.

DISCUSSION

This investigation attempted to develop a positive referencematerial for certifying the validity of hemolysis tests, which
are used for evaluating the hemocompatibility of medical
devices. From the survey of 23 chemical compounds, Genapol X-080 and diphenyl disulﬁde were selected as
candidates.
Genapol X-080 is a polyethyleneglycol (PEG) monoalkyl
ether that is used as a general-purpose non-ionic detergent,and it has been widely used in various ﬁelds including cosmetics. Alkyl PEG ethers were not genotoxic at a concentration of 1000 mg/L,21 and no evidence of systemic toxicity
or sensitization was found for intact skin.22 Recently, theCosmetic Ingredient Review (CIR) Expert Panel assessed thesafety of alkyl PEG ethers used in cosmetics and concluded
that they are safe as used in cosmetic products.23 Taking
these ﬁndings into consideration, it seems that this compound is safe for handling and useful as an ingredient for
preparing a positive reference material for hemolysis testing. Genapol X-080 induces hemolysis of RBCs by destroying
the cell membrane through the detergent effect at concentrations higher than the critical micelle concentration(CMC), which may be approximately 25 mg/mL according to
the hemolytic behavior of the compound [Figure 1(a)]. PVC
sheets spiked with 0.6% or 5.8% (w/w) Genapol X-080

1814

HAISHIMA ET AL.

exhibited weak or strong hemolysis, respectively, in the
direct contact and/or extract-based assays using the simple
method. In the direct contact method, the amount of Genapol X-080 eluted from the PVC sheets increased over timeand reached 25.6 (0.6% [w/w] sheet) and 1154 (5.8% [w/w] sheet) mg/mL after 4 h incubation, corresponding
approximately to the CMC or much higher than the CMC,
respectively. The Genapol X-080 content in the test solution
prepared by autoclave extraction was also similar to or
higher than the CMC. Thus, a clear relationship wasobserved between the degree of hemolytic activity and elution amount of Genapol X-080. In addition, identical or similar hemolytic behavior was also yielded by the ASTM, NIH,
and Japanese MHLW methods according to the protocol forinter-laboratory hemolysis round robin testing produced by
ISO/TC 194/WG 9, which was implemented in April 2013.
Although weak hemolytic activity induced by the PVC sheet
spiked with 0.6% (w/w) Genapol X-080 was not detectedby ofﬁcial methods other than the ASTM direct contact
method, the detection may be improved by slightly increasing the spiked amount of the compound. The Genapol X-080
content in the test solution prepared by autoclave extractionof the PVC sheet spiked with the highest amount of thecompound was considerably lower than the amount eluted
from the sheet during the hemolysis test using the directcontact method. The difference in elution amount may originate from the physicochemical properties of Genapol X-080
because the solubility of the compound markedly decreases
at temperatures higher than the cloud point (74 C–76 C).
These data clearly indicate that a PVC sheet spiked with
Genapol X-080 exhibiting different hemolytic activity
dependent on the Genapol X-080 content may be useful as apositive reference material to certify the validity of hemolysis tests.
It has been reported that aromatic disulﬁdes induce
hemolysis of erythrocytes,19,20 and in fact, diphenyl disulﬁde itself also exhibited signiﬁcant hemolytic activity inthis study. This compound induces hemolysis as the resultof biological effects in erythrocytes such as hydrogen

FIGURE 4. Hemolytic behavior of PVC sheets spiked with different
amounts of Genapol X-080 estimated by official methods for hemolysis testing provided by ASTM, NIH, and the Japanese MHLW. 䊏,
ASTM extract-based method; 䊊, ASTM direct contact method; w, NIH, Japanese MHLW extract-based method.
direct contact method;*PVC sheet containing no Genapol X-080 was used as a negative
material control. **Significant differences (p < 0.01) were detected
between these data points and other data points.

•

POSITIVE REFERENCE MATERIAL FOR HEMOLYSIS TESTINGORIGINAL RESEARCH REPORTTABLE II. Amount of Genapol X-080 Eluted from PVC Sheet During Hemolysis Test with Direct Contact Method or into Test
Solution for the Extract Method
Amount of Genapol X-080 (lg/mL) eluted from PVC sheet in
Genapol X-080 content
in PVC sheet (% [w/w])
0.006
0.06
0.6
5.8
a

Direct contact method after incubation for
1h

2h

4h

Extract methoda21.260.43523614.8

3.7560.12
25.660.701154631.6

22.560.32
35866.4

6.2060.2136265.0

less than LOQ.

peroxide production, hemoglobin oxidation, and destruction of nonprotein thiols and protein-bound thiols.24
Although diphenyl disulﬁde itself seemed to be superior to
Genapol X-080 as a candidate hemolytic compound withregard to the wide range of concentrations that induced
hemolysis, PVC sheets spiked with diphenyl disulﬁdeexhibited no hemolytic activity in the direct contact and/or
extract-based methods. The reason is unknown, but it isspeculated that although diphenyl disulﬁde itself may beheat-stable, because its hemolytic activity was maintainedeven after heating at 200 C for 10 min (data not shown),
it may interact with DEHP, ESBO, or PVC molecules during
the heat-press process used to make the PVC sheet. In fact,
PVC sheets prepared by casting a tetrahydrofuran solution
containing the calculated amounts of plasticized PVC anddiphenyl disulﬁde induced hemolysis of RBCs (data notshown). However, it was ﬁnally decided that the PVC cast
sheet was not useful as a positive reference material for
hemolysis testing because the degree of hemolytic activity
was independent of the spiked amount and the reproducibility of the data was low (data not shown), probably
because the amount of diphenyl disulﬁde eluted from the
PVC sheet may have varied according to the hydrophobicityof the compound.
It is known that most plastic products do not exhibit
signiﬁcant hemolytic activity against RBCs. In fact, we havealso conﬁrmed that no hemolytic activity is present in commercially available plastic sheets made from polycarbonate,acrylate, and terephthalate (data not shown), which indicates that these sheets can be used as a negative referencematerial for hemolysis testing. Although there is a possibility that the method used to form the sheets will be changed
suddenly without any publicity, plastic products that can beused as a negative reference material may be easily foundand purchased at any time. Thus, the use of efﬁcient positive and negative reference materials to certify the validityof hemolysis tests is now possible, and our next step is toestablish a reliable supply of a positive reference material
containing Genapol X-080.
CONCLUSIONSPVC sheets spiked with Genapol X-080 exhibiting different
hemolytic activity dependent on the Genapol X-080 content
may be useful as a positive reference material to certify thevalidity of hemolysis tests.

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disulphides. J Appl Toxicol 1985;5:409–413.

POSITIVE REFERENCE MATERIAL FOR HEMOLYSIS TESTING

Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑥

	 生体適合性制御と要求特性掌握から実践する高分子バイオマテリアル	
 の設計・開発戦略Ⅲ．研究成果の刊行に関する資料⑦

	 J.	
 Vinyl	 Add.	 Technol.,	
 in	
 pressJ_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

Stage:

Page: 1

Characterization of Alternative Plasticizers in Poly(vinyl
chloride) Sheets for Blood Containers

AQ8

AQ1

Yuji Haishima,1 Tsuyoshi Kawakami,2 Chie Fukui,1 Akito Tanoue,3 Toshiyasu Yuba,4 Satoru Ozono,1Hidehumi Kumada,5 Kaoru Inoue,6 Tomomi Morikawa,6 Miwa Takahashi,6 Ayano Fujisawa,7Kayo Yamasaki,8 Yusuke Nomura,1 Kazuo Isama,2 Ung-il Chung,7 Kumiko Ogawa,6 Shingo Niimi,1Midori Yoshida6
1Division of Medical Devices, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo
158–8501, Japan
2

Division of Environmental Chemistry, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku,
Tokyo, 158-8501, Japan3

Department of Pharmacology, National Center for Child Health and Development, 2-10-1 Okura,
Setagaya-ku, Tokyo 157-8535, Japan
4

Corporate Research and Development Division, Kawasumi Laboratories, Inc., Shinagawa Intercity Tower B,
9th Floor 2-15-2, Konan, Minato-ku, Tokyo 108-6109, Japan
5

Department of Dental Education, Kanagawa Dental University, 82 Inaoka-cho, Yokosuka, Kanagawa
238-8580, Japan
6

Division of Pathology, National Institute of Health Sciences, 1-18-1 Kamiyoga, Setagaya-ku, Tokyo
158-8501, Japan
7

Department of Bioengineering, The University of Tokyo Graduate Schools of Engineering and Medicine, 7-31 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033, Japan
8

Research Department, Public Welfare Institute of Scientific Research Foundation, 3–8-14 Nukuikitamachi,
Koganei, Tokyo 184-0015, Japan

This study aimed to optimize the ratio of dioctyl 4cyclohexene-1,2-dicarboxylate (DOTH) and di-isononylcyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCHV) for use asplasticizers in poly(vinyl chloride) (PVC) sheets. We
also evaluated the biological safety of DOTH for its
potential to be part of a safe PVC-based blood container. The suppression of hemolysis in (mannitol-adenine-phosphate)/(red cell concentrates) with DOTH/(DINCHV-PVC) sheets and the elution of plasticizers
from the sheets increased with higher DOTH compositions. The properties of the PVC sheet containing
DOTH and DINCHV in the ratio of 25:33 parts against
PVC 100 parts as a weight were almost identical to the
PVC sheet made of di(2-ethylhexyl) phthalate. From aRsubchronic toxicity test, DOTH did not show any adverse
effects on all organs, including the testes, epididymis, liver,and kidneys. The no-observed-adverse-effect level was
300 mg/(kg body weight)/day in a rat. These results suggestthat DOTH/DINCHV (25:33) is a promising candidate for the
replacement of di(2-ethylhexyl) phthalate in blood containers.
C 2015 Society
J. VINYL ADDIT. TECHNOL., 00:000–000, 2015. V
of Plastics Engineers
R

R

R

Correspondence to: Yuji Haishima; e-mail: haishima@nihs.go.jp
This study was supported by the Health and Labor Sciences Research
Grants (H25-CHIKYUKIBO-SHITEI-008 and H26-SOUYAKU-IPPAN008) from the Japanese Ministry of Health, Labor, and Welfare.
DOI 10.1002/vnl.21472
Published online in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com).
C 2015 Society of Plastics Engineers
V

INTRODUCTION
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), a typical plasticizer for increasing the flexibility of poly(vinyl chloride)(PVC), is easily eluted from PVC products into food,
pharmaceuticals, and any body fluids that come into contact with the plastic, thereby resulting in the transfer of
DEHP directly and/or indirectly into the human body [1,2]. Some phthalates, including DEHP, are considered
toxic because they exhibit effects in young rodents thatare similar to the antiandrogenic effects of endocrine

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

disruptors in male rats, wherein alterations in the development of the male reproductive system, especially in spermatogenesis, are observed [3–5]. Although the in vivo
reproductive and developmental toxicity of DEHP in thehuman body are not yet well understood, recent in vitro
toxicological studies using human cells have reported thatmono(2-ethylhexyl) phthalate, an active metabolite of
DEHP [6–9], causes adverse effects, such as the reductionof germ cells by increasing apoptosis without altering
their proliferation [10–12]. Therefore, precautions should
be taken to limit human exposure to DEHP and mono(2ethylhexyl) phthalate, particularly for high-risk patients,
such as male neonates, male fetuses, and peripubertal
male individuals.
Several agencies and official organizations worldwide
have individually evaluated the safety of DEHP released
from PVC products. Recently, regulation of the use of
DEHP has been tightened worldwide, particularly inEurope, not only for toys, childcare products, food apparatus, containers, and packages but also for medical devices. In many countries, including the USA, Canada, andJapan, the use of alternative plasticizers to develop safer
PVC products and a switch to other plastic products has
been recommended for the medical treatment of high-riskpatients. However, the use of PVC blood bags containing
DEHP has been permitted in Japan without any regulation
other than storage at low temperatures because DEHP has
been found to be effective in preserving stored red blood
cells (RBCs) [13].
We recently reported [14] that the presence of two
carboxy-ester groups at the ortho position on a sixmembered ring of carbon atoms may be needed for theplasticizer to exhibit a hemolysis suppression effect on(mannitol-adenine-phosphate)/(redcellconcentrates)(MAP/RCC), and the degree of prevention closely relates
to the amount of plasticizer eluted from heat-pressed
PVC sheet. Based on these results, we concluded that
dioctyl 4-cyclohexene-1,2-dicarboxylate (DOTH) and diisononyl-cyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCHV, BASF
SE, Germany) are possible candidates to replace DEHP in
RBC storage bags because of their ability to inhibit
hemolysis. The amount of DOTH eluted from the PVC
sheet is relatively higher than that of DEHP [14], but the
total exposure of plasticizer to the patient during medical
treatments should be reduced as much as possible. Thereis a possibility that the amount of plasticizers eluted fromheat-pressed PVC sheets may be different from that of Tdie molded PVC sheets used to manufacture commercial
PVC products, because PVC molecules take on a different
orientation and density in the sheet types. In the present
study, to develop a novel and safer blood container, we
optimized the minimum mixing ratio of DOTH to T-die
molded PVC sheet and the precise dose of DINCHV thatmaintains low leachability [14–16] compared with DEHP.
The plasticizer for the blood container must be safe forhumans. Recently, Hirata-Koizumi et al. reviewed the
toxicity of alternative plasticizers and showed that
DINCHV had minimal toxicity [17]. On the other hand,
R

R

R

2

Stage:

Page: 2

DOTH’s overall toxicity is not well known. Hence, we
also evaluated the biological safety of DOTH using a subchronic toxicity test in a rat to confirm the Japanese
reports [18–20] on several toxicity tests conducted by
BOZO Research Center Co., Ltd. (Shizuoka, Japan) commissioned by the Japanese Ministry of Health, Labor, andWelfare.
MATERIALS AND METHODS
Materials
DOTH, trioctyl trimellitate (TOTM), and epoxidized
soybean oil were purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tokyo, Japan). DINCHV was provided by
BASF (Ludwigshafen, Germany). DEHP, DEHP-d4,
diethyl ether of pesticide residue, PCB analysis grade,and phthalate-analytical-grade hexane were purchasedfrom Kanto Chemical Co. (Tokyo, Japan). Sodium chloride from pesticide residue, PCB analysis grade,
phthalate-analytical-grade anhydrous sodium sulfate(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan),and ultrapure water obtained by using Milli-Q Synthesis
A10 (Millipore, Tokyo, Japan) were used to prepare thesample for (gas chromatography)/(tandem mass spectroscopy) ([GC-MS]/MS) analysis. Other chemicals were purchased from Wako Pure Chemical Industries. All thetools, which were made of glass, metal, or TeflonV, were
heated at 250! C for more than 16 h prior to use.
R

AQ2

R

Preparation of RCCs
Human blood (200 mL) was obtained from a volunteer
at our own laboratory. The procedure was performed inaccordance with the ethical guidelines of the National
Institute of Health Sciences (approval number 188). The
blood was immediately mixed at 4! C with citratephosphate-dextrose solution (28 mL) consisting of sodium
citrate hydrate (26.3 g/L), citric acid hydrate (3.27 g/L),
glucose (23.2 g/L), and sodium dihydrogen phosphate(2.51 g/L). The blood was divided into two equal volumes followed by centrifugation at 3,000g for 10 min at
4! C and the removal of the upper layer. MAP solution(23 mL), consisting of D-mannitol (14.57 g/L), adenine(0.14 g/L), sodium dihydrogen phosphate (0.94 g/L),
sodium citrate hydrate (1.5 g/L), citric acid hydrate(0.2 g/L), glucose (7.21 g/L), and sodium chloride(4.97 g/L), or saline-adenine-glucose-mannitol (SAGM)
solution (23 mL), consisting of sodium chloride (8.77 g/L), adenine (0.17 g/L), glucose (9.0 g/L), and D-mannitol(5.25 g/L), was added to the remaining RCC layer to prepare MAP or SAGM/RCC (Htc. 59%). The solution wasstored at 4! C until use.
Preparation of PVC Sheets
T-die molded PVC sheets (thickness 5 0.4 mm) containing DEHP 55 parts and epoxidized soybean oil 8 parts

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

DOI 10.1002/vnl

AQ3

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

against PVC 100 parts as a weight ratio and other additives
were mixed according to the standard recipe of Kawasumi
Laboratories, Inc. (Tokyo, Japan). T-die molded PVC
sheets were also prepared with TOTM 85 parts, DOTH 55
parts, DINCHV 60.5 parts, or DOTH/DINCHV mixtures(10:49.5, 25:33, and 40:16.5 parts) instead of DEHP. Each
sheet was cut into small pieces (3.2 cm 3 1 cm).
R

R

Hemolysis Test

AQ4

The hemolysis test was performed according to themethod previously reported [14]. Each PVC sheet (3.2 cm
3 1 cm, thickness 5 0.4 mm) containing different kinds ofplasticizers was placed into a screw-capped glass bottle, and5 mL of freshly prepared MAP or SAGM/RCC was added
to the bottle. During incubation at 4! C for 49 days, an aliquot (50 mL) of the blood sample was collected into Eppendorf tubes every week. Phosphate-buffered saline (PBS;
1 mL) was added to each sample and gently mixed, followed by centrifugation at 500g for 2 min at 4! C; then theabsorbance of the supernatant (100 mL) was measured at
415 nm with a SH-9000 Lab microplate reader (Corona
Electric Co. Ltd., Ibaraki, Japan). MAP or SAGM/RCC wasalso tested under the same conditions as the negative control, whereas the positive control was prepared by adding
distilled water instead of PBS. This test was repeated in triplicate, and the significant difference was calculated by twoway analysis of variance (ANOVA). The hemolytic ratio
was calculated in accordance with the following formula:% Hemolysis5ðAT 2AN Þ=ðAP 2AN Þ3100
where AT is the test sample absorbance; AN is the average
negative control mean absorbance; and AP is the average
positive control mean absorbance.
Elution Test for the Plasticizer
The quantity of plasticizer in each PVC sheet soaked withthe blood samples was measured according to the methods
previously reported [14, 21–25]. Briefly, an aliquot (50 mL)of the MAP/RCC sample for the hemolysis test was collected into a screw-capped glass tube every week, andsodium chloride (1 mL, 1 w/v%), DEHP-d4 (0.1 mg), andhexane (1 mL) were added. After shaking vigorously for 15
min and centrifuging at 3,000 rpm for 10 min at room temperature, the organic phase was collected and dehydrated
with anhydrous sodium sulfate. Subsequently, the sample
was analyzed by (GC-MS)/MS, which included an analysis
of precision based on the same conditions described in a previous report [14]. This test was repeated in triplicate, eachwith a hemolysis test performed simultaneously. The significant difference was calculated by two-way ANOVA.
Animal Treatment
A repeated-dose 90-day oral toxicity study similar tothe principles of OECD 408 [3] was performed on male
DOI 10.1002/vnl

Stage:

Page: 3

rats. The procedure was performed in accordance with theanimal experiment guidelines of the National Institute of
Health Sciences (approval number 434).
Sprague-Dawley rats were purchased at age of 4 weeks(body weight; 90–110 g) from CLEA Japan, Inc. (Tokyo,
Japan). The animals were maintained under controlled
light and temperature conditions. The rats also were given
free access to food and water. Their food was a customized vehicle for DOTH intake; DOTH was mixed withcorn oil to obtain final concentrations of 0 (control), 5,
50, 500, and 5,000 mg/g corresponding to the target doselevels of 0 and approximately 0.3, 3, 30, and 300 mg/(kgbody weight)/day, and the mixture was kneaded at a concentration of 4% and shaped into CE-2 chow (CLEA
Japan Inc.). The highest dietary concentration was
decided according to the protocol of the repeated-dose
toxicity and reproduction/development toxicity tests of
DOTH conducted by BOZO Research Center [18]. Aftera weeklong habituation period, 40 rats were divided into
five groups of eight animals with two animals housed ineach cage. For the next 13 weeks, the rats were fed thebasal diet containing various concentrations of DOTH.
Food consumption and body weight were determined
weekly.
At the termination of the study, the animals were anesthetized with an inhalation of isoflurane, exsanguinated,and euthanized by decapitation. A portion of the blood(10 mL each) was immediately collected into a BD VacutainerTM Blood Collection Tube (Japan Becton and Dickinson Co., Tokyo, Japan), and a serum sample wasprepared according the manufacturer’s protocol.
During necropsy, the epididymis was weighed, cut into
small pieces in PBS (4.5 mL), and fixed by adding 37%
neutral-buffered formalin (0.5 mL). The nuclei of the
sperm were stained with Hoechst 33258 under standard
conditions, and counting was performed by using a BIOREVO BZ-9000 fluorescence microscope (KEYENCE
Co., Osaka, Japan) and software. The significant difference was calculated by two-way ANOVA.
After complete necropsy, the testes and eyes were
fixed in Bouin or Davidson solution. The brain, thymus,
heart, spleen, liver, adrenal glands, kidneys, epididymis,
thyroid glands, trachea, gullet, thoracic aorta, mediastinal
lymph node, lungs, pancreas, stomach, small intestine,mesenteric lymph node, femoral muscle, sciatic nerve,
sternum, thoracic vertebrae, seminal vesicle, colon, rectum, skull with pituitary, trigeminal nerve, and tongue,
salivary gland with cervical lymph node, skin with mammary gland, prostate and congealing gland with urinary
bladder, and bulbourethral gland were fixed in 10%
neutral-buffered formalin. The testes, brain, thymus, heart,spleen, liver, adrenal glands, kidneys, epididymis, andprostate were weighed before the fixation. The significant
difference was calculated by using a Dunnett’s test orDunnett-type rank-sum test. The fixed tissues were processed routinely and embedded in paraffin. The paraffinblocks were sectioned and stained with hematoxylin andeosin for microscopic examination.
JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

3

tr
11460.98
38.563.54
nd

nd
nd

tr
50.563.54

Serum levels of 17b-estradiol (E2), testosterone (TS),follicle-stimulating hormone (FSH), and thyroidstimulating hormone (TSH) were measured with ELISA
kits provided by Enzo Life Sciences Inc. (Farmingdale,NY) for E2 and Endocrine Technologies (Newark, CA)
for others. The significant difference was calculated by
two-way ANOVA.

AQ5

RESULTS AND DISCUSSION

nd
nd
tr
10161.03
37.067.07
nd

The elution test of the plasticizers from the T-die
molded PVC sheets was performed to determine the mixing ratio of DOTH and DINCHV from the point of the
exposure amount to patient. All plasticizers, except for
TOTM, with low leachability and no effect on hemolysis
suppression [14], were quantified by (GC-MS)/MS analysis by using DEHP-d4 as the internal standard.
As shown in Table 1, the amounts of DEHP, DINCHV,
and DOTH released from the T-die molded PVC sheets
increased in a time-dependent manner and reached50.5 6 3.54, 25.6 6 1.32, and 114 6 0.98 mg/mL, respectively, after a 49-day incubation in MAP/RCC. These elution patterns were similar to those of the heat-pressed
PVC sheets previously reported [14]. Similarly, the total
amount of DOTH and DINCHV eluted from DOTH/(DINCHV-PVC) sheets also increased with higher DOTH
content. The total elution amounts of the plasticizers from
DOTH/DINCHV (10:49.5) and DOTH/DINCHV (40:16.5)
PVC sheets were lower and higher, respectively, than theamount of DEHP released from DEHP-PVC sheet at all
sampling points. On the other hand, the total amount ofplasticizers released from the DOTH/DINCHV (25:33)
PVC sheet was similar to that of DEHP-PVC sheet.
As shown in Table 2, the DOTH/DINCHV elution ratio
decreased in a time-dependent manner during the test
period, and the trend was similar to the elution test performed with the heat-pressed PVC sheet [14]. Hence, thedata indicate that the plasticizers were leaching out at different rates. Specifically, the elution of DOTH into MAP/
RCC slowed over time, whereas DINCHV steadily
released during the incubation period.
Taken together, the data suggest that the DOTH/DINCHV (40:16.5) PVC sheet is not a useful material fora blood container because patients will be exposed to alarger amount of plasticizer compared with the traditional
RBC storage bag consisting of a DEHP-PVC sheet.
Rtr
95.065.69
36.562.12
nd

nd
nd

R

T1

nd
nd

R

tr
82.062.89
32.067.07
nd

R

R

R

nd
nd

R

tr
66.167.34
27.061.41
nd

R

T2

R

a

nd, not detected, btr, trace amount less than LOQ

nd
nd
tr
49.963.58
16.061.41
nd
nd
nd
26.768.18
ndtr
68.562.51 6.61 60.20
tr
tr
57.961.64 4.5360.14
47.260.01 2.9060.06
tr
21.063.18 1.0360.14

33.961.45 1.7660.05

tr

tr

58.364.87 4.7160.38

64.563.34 5.8060.08

tr

tr
14.060.37
37.161.92
tr
tr30.360.56 8.6060.24
28.060.94 6.6560.48
tr
8.7960.42 1.5360.09

18.860.93 3.5960.14

tr

tr

35.063.47 10.360.76

32.462.87 11.360.67

tr

25.661.32
20.761.44
nd
12.860.70
tr
trnd20.460.82
10.962.76 15.462.81
tr
tr
nd
19.061.53
10.861.76 14.061.50
tr
tr
nd
16.860.64
12.161.08 13.660.01
tr
tr
nd
12.460.42
8.3860.32 8.0760.10
tr
tr
nd
6.5860.21
6.9960.35 5.4860.24
tr
tr
nd
3.7761.06
4.5160.21 3.2860.01

trnd

Page: 4

Stage:

Plasticizer Elution Test

Control(no sheet)
DINCH (60.5)
DOTH/DINCH(10:49.5)
DOTH/DINCH(25:33)
DOTH/DINCH(40:16.5)
DOTH (55)
DEHP(55)

nd

tr
tr

tr
nd
nd
nd

nd

tr

nd

nd

tr

nd

nd

tr

nd

nd

tr

nd

nd

tr

DEHP
DINCH
DOTH
DEHP
DOTH DINCHDOTH DINCH DEHP
DOTH DINCH DEHP
DOTH DINCH DEHP
DOTH DINCH DEHP
DOTH DINCH DEHPb

42days34days29 days
21 days
13 days

PVC sheet(parts)7 daysTABLE 1. Amount of plasticizer eluted from T-die molded PVC sheet incubated in MAP/RCC at 37! C for 49 days (mg/mL in blood).
4a49days

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

R

Hemolysis Suppression Effect of Each PVC Sheet
The hemolysis suppression effect of the PVC sheetscontaining alternative plasticizers was estimated and compared with those of DEHP-PVC and TOTM-PVC sheets
used as the positive and negative control, respectively.
As shown in Fig. 1, the hemolytic ratio of MAP/RCC
in the absence of the PVC sheets increased in a timedependent manner, reaching 4.9% after 49 days of

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

DOI 10.1002/vnl

F1

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

Stage:

Page: 5TABLE 2. Mean ratio of DOTH and DINCHV eluted from the PVC sheet into MAP/RCC (DOTH/DINCHV).
R

R

Incubation time
PVC sheet (parts)

7 days13 days

21 days

29 days

34 days

42 days

49 days

DOTH/DINCHV (10:49.5)
DOTH/DINCHV (25:33)
DOTH/DINCHV (40:16.5)

1.38
5.73
20.4

1.27
5.23
19.2

1.04
4.22
16.3

0.89
3.52
12.8

0.77
3.39
12.4

0.71
2.87
11.1

0.62
2.65
10.4

R
R
R

FIG. 1. Hemolytic behavior of MAP/RCC in the presence of T-die
molded PVC sheets containing different plasticizers. Based on the hemolytic ratio, three distinct groups were observed: Group 1: the control and
TOTM-PVC; Group 2: DINCHV- and DOTH/DINCHV (10/49.5) PVC
sheets; and Group 3: DEHP-, DOTH-, and DOTH/DINCHV (40/16.5 and25/33) PVC sheets. Significant difference (*p < 0.01) was detected
between Group 1 and Group 2. Significant difference (**p < 0.05) was
detected between Group 2 and Group 3, but not within the group. [Color
figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.]

FIG. 2. Hemolytic behavior of SAGM/RCC in the presence of T-die
molded PVC sheets containing different plasticizers. Based on the hemolytic ratio, three distinct groups were observed: Group 1: the control and
TOTM-PVC; Group 2: DINCHV-PVC sheet; and Group 3: DEHP- andDOTH/DINCHV (25/33) PVC sheets. Significant difference (*p < 0.01)
was detected between Group 1 and Group 2. Significant difference(**p < 0.05) was detected between Group 2 and Group 3, but withineach group. [Color figure can be viewed in the online issue, which isavailable at wileyonlinelibrary.com.]incubation. The hemolytic behavior of MAP/RCC in thepresence of the TOTM-PVC sheet was almost identicalat 4.6% after the incubation. DOTH/DINCHV (25:33)
and DOTH/DINCHV (40:16.5) PVC sheets exhibited thehemolysis suppression effect, in which the hemolytic
ratios were 1.4% and 1.3%, respectively. These ratios
were almost identical to those of DOTH-PVC and
DEHP-PVC sheets. The suppression effect was also

detected in DINCHV-PVC and DOTH/DINCHV(10:49.5) PVC sheets in comparison with those of control (no sheet) and TOTM-PVC sheet (p < 0.01), but thedegree of suppression from both sheets was slightly
weaker than that of the DOTH/DINCHV (25:33), DOTH/DINCHV (40:16.5), DOTH-PVC, and DEHP-PVC sheets(p < 0.05).

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

R

TABLE 3. Final body and absolute organ weights of SD rats treated with DOTH for 13 weeks.
Group treated with DOTH (mg/[kg body weight]/day)

No. of animals examined
BW (g)
Brain (g)Thymus (g)Heart (g)Spleen (g)Liver (g)Adrenals (g)Kidneys (g)Testes (g)Epididymides (g)Prostate, ventral (g)Control

0.3

3

30

300

8
622.6 6 63.0a
2.22 6 0.11
0.38 6 0.06
1.79 6 0.23
0.92 6 0.16
17.58 6 2.29
0.065 6 0.009
3.93 6 0.43
3.71 6 0.40
1.37 6 0.20
0.69 6 0.12

8629.6 6 57.1
2.15 6 0.07
0.38 6 0.07
1.73 6 0.11
0.94 6 0.09
17.10 6 2.28
0.058 6 0.008
3.92 6 0.37
3.74 6 0.26
1.29 6 0.13
0.62 6 0.17

8617.3 6 42.9
2.18 6 0.08
0.39 6 0.08
1.74 6 0.18
0.89 6 0.10
17.53 6 2.08
0.059 6 0.004
4.13 6 0.40
3.88 6 0.24
1.26 6 0.10b
0.60 6 0.14

8630.4 6 48.9
2.17 6 0.05
0.34 6 0.09
1.80 6 0.14
0.88 6 0.13
17.72 6 2.08
0.056 6 0.008
4.09 6 0.25
3.92 6 0.34
1.30 6 0.08
0.62 6 0.16

8598.0 6 42.5
2.18 6 0.09
0.36 6 0.06
1.76 6 0.17
0.99 6 0.11
18.17 6 2.05
0.070 6 0.008
4.00 6 0.23
3.90 6 0.26
1.30 6 0.12
0.60 6 0.10aMean 6 SD.
One animal was excluded due to lack of the head of unilateral epididymis at the sampling.
Group treated with DOTH (mg/[kg body weight]/day)b

DOI 10.1002/vnl

JOURNAL OF VINYL & ADDITIVE TECHNOLOGY—2015

ID: nareshrao Time: 04:57 I Path: N:/3b2/VNL#/Vol00000/150017/APPFile/JW-VNL#150017

5

J_ID: VNL Customer A_ID: VNL21472 Cadmus Art: VNL21472 Ed. Ref. No.: 14-075.R1 Date: 14-March-15

Stage:

Page: 6TABLE 4. Relative organ weights of SD rats treated with DOTH for 13 weeks.
Group treated with DOTH (mg/[kg body weight]/day)

No. of animals examined
Brain (g/100 g BW)
Thymus (g/100 g BW)
Heart (g/100 g BW)
Spleen (g/100 g BW)
Liver (g/100 g BW)
Adrenals (mg/100 g BW)
Kidneys (g/100 g BW)
Testes (g/100 g BW)
Epididymides (g/100 g BW)
Prostate, ventral (g/100 g BW)aControl

0.3

3

30

300

8
0.36 6 0.03a
0.06 6 0.01
0.29 6 0.03
0.15 6 0.02
2.83 6 0.24
10.5 6 1.5
0.63 6 0.04
0.60 6 0.06
0.22 6 0.04
0.11 6 0.02

8
0.34 6 0.03
0.06 6 0.01
0.28 6 0.03
0.15 6 0.01
2.71 6 0.15
9.3 6 1.2
0.63 6 0.05
0.60 6 0.07
0.21 6 0.03
0.10 6 0.03

8
0.36 6 0.03
0.06 6 0.02
0.28 6 0.02
0.14 6 0.02
2.84 6 0.27
9.6 6 0.6
0.05
0.63 6 0.04
0.20 6 0.02b
0.10 6 0.02

8
0.35 6 0.03
0.06 6 0.01
0.29 6 0.02
0.14 6 0.02
2.81 6 0.19
9.0 6 1.7
0.65 6 0.04
0.63 6 0.08
0.21 6 0.02
0.10 6 0.03

8
0.37 6 0.03
0.06 6 0.01
0.30 6 0.03
6 0.12
3.04 6 0.30
11.7 6 1.3
0.67 6 0.06
0.65 6 0.05
0.22 6 0.02
0.10 6 0.02

Mean 6 SD.
One animal was excluded due to lack of the head of unilateral epididymis at the sampling.

b

These results suggest that the DOTH/DINCHV (25:33)
PVC sheet is the most suitable material for a novel blood
container based on the reduction of hemolysis and an eluRtion of plasticizer comparable to the DEHP-PVC sheet.
Although the DOTH-PVC and DOTH/DINCHV (40:16.5)
PVC sheets exhibited adequate prevention of hemolysis,
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FIG. 3. Histopathological observation of the testes in the subchronic toxicity test in rats administered with DOTH. (a) Control (base diet) and (b)DOTH (300 mg/[kg body weight]/day). I–XVI, the stages of sperm cell formation cycle; G, spermatogonia; ES, early spermatocytes; LS, late spermatocytes (pachytene stage); RT, round spermatids; ET, elongate spermatids; S, sertoli cells; L, Leydig cells; red circle, late spermatocyte apoptosis;
green circle, degenerated and atrophied testicular vessel in ordinary state. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available atwileyonlinelibrary.com.]

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FIG. 4. Histopathological observation of the liver in the subchronic toxicity test in rats administered DOTH. (a) Control (base diet) and (b) DOTH
(300 mg/[kg body weight]/day). C, central vein; P, Glisson’s capsule; *, slight infiltration of inflammatory cells located around Glisson’s capsule.
[Color figure can be viewed in the online issue, which is available at wileyonlinelibrary.com.]the total amount of the plasticizers released from the
sheets was higher than that of the DEHP-PVC sheet. Conversely, although DINCHV-PVC and DOTH/DINCHV(10:49.5) sheets had less plasticizer leached, the hemolytic ratios were higher than the DEHP-PVC sheet. The
data for the DINCHV-PVC sheet are in agreement with astudy by Dumont et al. [26] in which DINCHV-PVC bags
exhibited protective effects against RBC hemolysis thatwere similar to normal DEHP-PVC containers under periodic mixing conditions, but not adequate under static
conditions.
The type of anticoagulant and the viability of RBCs
may be closely correlated with hemolysis suppression of
the plasticizer [27]. The RCC product used in Japan contains the MAP solution as an anticoagulant, whereas the
SAGM solution is widely used in other countries. Hence,hemolysis suppression with SAGM/RCC was also performed, and the results are shown in Fig. 2. The hemolytic behavior using SAGM/RCC was almost identical to
the result yielded from MAP/RCC described above. The
DINCHV-PVC sheet exhibited significantly greater hemolysis suppression than that shown by the control (nosheet) and TOTM-PVC sheet (p < 0.01). The hemolysis
suppression effect of DOTH/DINCHV (25:33) PVC sheet
was higher than that of the DINCHV-PVC sheet(p < 0.05) and equal to that of DEHP-PVC sheet. Thus,
the potential of the DOTH/DINCHV (25:33) PVC sheet aspart of a suitable blood container was reaffirmed with
SAGM/RCC.
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F2

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logical examination, no abnormalities were observed in
the testes of rats in the control and treated groups, and allrats were normal (Fig. 3). Diffuse fatty change of hepatocytes and inflammatory cell infiltration were noted in several rats of both the control and the treated groups in theliver (Fig. 4). Although these changes are not common inrats of this age, they were not due to treatment-related
toxicity. The changes may be related to the rats’ diet. The
prepared food included oil in the basal diet, which
resulted in high calorie consumption of all groups including the control group. Other histopathological changes,
such as focal inflammation in the prostate and focal myocarditis, were scattered in all groups. All of these observations are known to be common changes in rats, andtheir incidences or intensities were comparable among thecontrol and the treated groups, indicating they were nottreatment-related. Other organs including the epididymis
and kidneys were not affected by the treatment withDOTH even at the highest dose. From the hormone
assays, no significant differences in the number of sperm
cells in the epididymis and the levels of TS, E2, FSH,
and TSH in serum were observed between each group
including control, as shown in Figs. 5 and 6. Based on
the results of the study, the no-observed-adverse-effectlevel (NOAEL) of DOTH was found to be 300 mg/(kgbody weight)/day.

R

Subchronic Toxicity of DOTH in Rats

T3
T4

The growth rate and feed consumption in the DOTH
groups were comparable to those in the control groupthroughout the study. The mean dietary intake of DOTH
administered to rats at the highest dose level was calculated to be 297 mg/(kg body weight)/day based on foodconsumption. The treatment-related macroscopic change
was not detected in any of the organs except for a fatty
liver observed in the control and DOTH groups. There
was no significant difference in the absolute and/or relative weights shown in Tables 3 and 4. In the histopathoDOI 10.1002/vnl

FIG. 5. Number of sperm cells in the epididymis of rats administereddifferent amounts of DOTH for 13 weeks.

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FIG. 6. The levels of hormones in the blood of rats administered different amounts of DOTH for 13 weeks. (a) TSH, (b) FSH, (c) testosterone, and(d) 17b-estradiol.

Poon et al. [28] reported that DEHP caused hepatomegaly to Sprague-Dawley rats by the administration of thediet containing the plasticizer at the concentration of
5,000 mg/g for 13 weeks. They reported there was mild tomoderate seminiferous tubule atrophy and Sertoli cellvacuolation in male rats at 375.2 6 98.5 mg/(bodyweight)/day, rats of both sexes showed hepatic peroxisome proliferation at the same dose. They also found that
DEHP caused mild histological changes in the thyroid,
consisting of reduced follicle size and colloid density, andthe liver, consisting of endothelial nuclear prominence,nuclear hyperchromicity, and anisokaryosis at 5,000 mg/g.
In addition to the results of other experiments, Poon et al.
judged the NOAEL of DEHP in the rats to be 3.7 mg/(kgbody weight)/day for testicular toxicity. In contrast, these
histological changes were not observed in our study ofrats treated with DOTH even at the highest dose
described above. Our findings indicate that DOTH has no
toxicity in the subchronic study in male rats, thereby suggesting that DOTH is a less toxic plasticizer than DEHP
with the NOAEL at 300 mg/(kg body weight)/day.
The weak toxicity of DOTH was also found in anotherJapanese report [18], in which the NOAEL in the malerats was determined to be 100 mg/(kg body weight)/day.
In this case, centrilobular hepatomegaly and a significant
increase of liver and kidney weights were observed after
treatment with DOTH at 300 mg/(kg body weight)/day inthe repeated oral administration for 56 days. It was also
confirmed that these changes were reversible in that therecovery was observed by 2 weeks after stopping theadministration [18], no effect of DOTH was detected in
testing for reproductive/developmental toxicity [18], bacterial reverse mutation [19], and chromosomal aberration[20].
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CONCLUSIONS
Our data suggest that the DOTH/DINCHV (25:33)
PVC sheet may be the most suitable material to replace
the DEHP-PVC sheets used in traditional RBC storage
bags because of its ability to suppress hemolysis and eluteless plasticizer. A prototype of a blood container made ofthis sheet is now in progress: a clinical trial with thecooperation of a suitable number of volunteers will be
performed in the near future. We will evaluate the chemical, physicochemical, biological, and dynamic properties
required for a medical device product.
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ACKNOWLEDGMENTS
We greatly appreciate the skillful assistance of Drs. Ryohei Ichimura and Jun Maeda, Division of Pathology,
National Institute of Health Sciences.
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Page: 10

AQ1: Please confirm that all author names are OK and are set with first name first, surname last as well as the affiliations and the correspondence footnote.
AQ2: Please spell out PCB.
AQ3: Please spell out Htc. here at only mention.
AQ4: Please verify PBS is spelled out correctly.
AQ5: Please verify cities as added for Enzo Life Sciences Inc. and Endocrine Technologies.
AQ6: Please supply publisher and location for ref. 3.
AQ7: Please supply year of reference and accessed on date for refs. 18–20.
AQ8: Please confirm that given names (red) and surnames/family names (green) have been identified correctly.

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