アセチル化酵素複合体によるクロマチン構造抑制機構
Regulation of Silenced Chromatin by the Acetyltransferase Complex
研究代表者

大阪大学 大学院薬学研究科 助手
長田 茂宏
Graduate School of Pharmaceutical Sciences,
Osaka University, Research Associate, Shigehiro OSADA

真核生物の遺伝子は細胞の核の DNA に存在する。DNA 分子は非常に長く、核内ではヒストンタンパク質に巻き付いて、クロマチンと呼ばれる凝縮した構造をしている。生物が正常に生きていくためには、クロマチンが弛緩し、遺伝情報の担い手である遺伝子が正常に発現する必要がある。遺伝子は必要な時期に、必要な場所でのみ発現する以外は、ほとんどの遺伝子はクロマチン内で抑制されている。近年、ヒストン修飾が遺伝子発現制御に重要であることが明らかにされている。そこで、ヒストン修飾酵素によるクロマチン構造変換を解析した。その結果、クロマチン形成因子がサイレンシングに関与するヒストンアセチル化酵素複合体の局在を基底し、遺伝子発現が抑制されることが明らかとなった。

Abstract
Eukaryotic DNA is packaged into a nucleoprotein structure known as chromatin,
consisting of DNA and histones. This structure is able to regulate access ofthe cellular factors, which are important for transcription, replication, repair,and recombination, to DNA. Many multiprotein complexes can modify chromatin.
One of the most studied of these complexes is the histone modifying complexes,
which posttranslationally modify histones. In this study, we showed that thehitone acetyltransferase activity of the SAS complex is required for the genesilencing. Furthermore, we revealed that recruitment of the SAS complex to thesilent loci was important to form the repressive chromatin.

１.

研究目的ことが必要である。このようなクロマチン上で生命活動は正常な遺伝子発現により制御され起きる反応の制御にはヒストンの修飾が重要でており、その異常は癌などの疾患、細胞・個体あり、なかでもヒストンのアミノ末端領域をアの異常・死を引き起こす。遺伝子発現の多くはセチル化するヒストンアセチル化酵素（histone

転写の段階で制御されており、多くの転写調節

acetyltransferase, HAT ）の転写制御における因子が解析されてきた。真核生物の DNA は核に役割が注目されている。HAT の多くは酵母からおいてヌクレオソーム（ヒストンに DNA が巻付

ヒトに至るまで保存されている因子が多い。

いた構造）を基本としたクロマチン構造をとり、MYST (MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2, and TIP60)

その内部の遺伝子は通常抑制状態にある。転写acetyltransferase ファミリーに属する因子は反応が起こるためには、この高次構造体が（部様々な生命現象に関与するとして注目されてい分的に）破壊され、DNA がほどけた状態になるる。多くの HAT は複合体として機能し、活性制1

御にサブユニットが必要不可欠であることも明

活性を欠いた M1 変異型の Sas2 を sas2sir1 二重らかにされつつある。MYST ファミリーのひとつ破壊株に発現させたが、α２発現は抑制されなである酵母 Something about silencing 2 (SAS2)かった。このことは Sas2 の HAT 活性がサイレンはクロマチン構造を介したサイレンシングに重シングに必要であることを示唆している。 また、要な因子として、遺伝学的手法により単離されこの結果も接合活性と完全に一致することが明た。サイレンシングとは遺伝子の種類に関係ならかとなった。

く、ゲノム上の位置に依存したゲノム DNA の広範囲に及ぶ転写の抑制状態である。これまでのAの解析により、Sas2 は Sas4, Sas5 とともに SAS複合体を形成し、Sas2 のアセチル化酵素活性がMATαMATa

WTsas2∆
WT sir4∆ sir1∆ sas2∆ sir1∆

123strain

接合に必要なことを明らかにしている。本研究
α2においては、Sas2 の標的遺伝子を明らかにし、SCR1

Sas2 の酵素活性がクロマチン構造に与える影響

matingactivityを解析した。また、SAS 複合体が局在するためにはクロマチン形成因子が必要であることを明らかにした。

BMATαstrain

２.
２.１

研究経過

HML 座に存在する遺伝子α２の発現456MATa

SAS2+++---

SIR1++----

plasmid

vec

vec

vec

vec SAS2 M11234sas2 単独破壊株もしくは sir1 単独破壊株はα2接合活性を示すが、sas2sir1 遺伝子二重破壊株

SCR1matingactivityは接合活性を示さない。野生株においてサイレンシングにより発現が抑えられている HML 座に56存在するα２遺伝子の産物は接合に重要な遺伝

Fig. 1. Derepression of α2 expression子の発現を制御している。そして、HML サイレand non-mating phenotype in sas2

ンシング活性と接合活性の相関性は高い。そこ

deletion strain in combination with

で、α２発現をノザンブロット解析により調べ

null allele of SIR1. (A) RNA wasた（Fig. 1A）。sas2sir1 遺伝子二重破壊株におhybridized by Northern blotting to

いて、接合活性を示さない sir4 破壊株と同様

probes specific for either the α2 orのα２発現が観察された。sas2, sir1 遺伝子そSCR1 genes. Qualitative mating assay

れぞれの単独破壊株は二重破壊株ほどではない

was performed by patches, which wereが、若干の発現が測定された。このことから、

replica plated to a lawn of α cells.

α２発現は接合活性と完全に一致することが明(B) A sas2sir1 double deletion strain

らかとなった。

was transformed with a plasmid

次に、このサイレンシングに Sas2 の HAT 活性

carrying the wild-type or the mutantが必要であるかについて検討した（Fig. 1B）。

form of the SAS2 gene under the controlsas2sir1 二重破壊株に野生型 Sas2 を発現させ

of its own promoter.

たところ、α２発現が再び抑制された。次に HAT2

２.２

標的遺伝子のクロマチン構造の変化

A

α２遺伝子発現を調べた細胞株から核を単離

SAS2 + myc +し、MNase 処理後に調製した DNA を鋳型として、strain

特異的なプライマーを用いたプライマー伸長法+ myc +

SAS5 ++レオソームのヒストンが不安定になり、クロマ

relative intensity(ChIP / input)

チンの弛緩が観察された。sas2sir1 遺伝子二重ChIP, anti-myc

破壊株において、sir4 破壊株と同様のクロマチ

ChIP, (-) antibodyた。これまでに報告されているように、sir4 破壊により、α２遺伝子の転写開始点を含むヌク0.3
0.20.10input

ン構造の部分的な弛緩が同程度に観察された。

Sas4-myc
Sas2-myc
Sas5-myc

Western blot
(anti-myc)

この結果は、α２発現および接合活性と完全に一致していた。これらの結果から、sas2sir1 遺1伝子の破壊による接合活性の消失は、α２遺伝

strain0sir1∆0sas2∆00

SAS4 +SAS5 +4+-+-++--2340.4

relative intensity(ChIP / input)

sir4∆

WT

3SAS2 + myc myc myc myc

α２遺伝子の発現によると考えられた。

G A T C 02

B

子領域のクロマチン構造弛緩により誘導された

sas2∆
sir1∆

+ myc

0.4

により、α２遺伝子のクロマチン構造を解析しA+

SAS4 +

n0.3
0.20.10

α1 TATA

ChIP, anti-myc
ChIP, (-) antibody

UASinput
Western blot(anti-myc)

α2 TATA

15Fig. 3. The SAS complex occupancy at

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Fig. 2. High resolution MNase

the promoter of the α2 gene. (A)mapping of the α2 gene.

Recruitment of subunits of the SAScomplex to the promoter of the α2 gene

２.３

SAS 複合体の標的遺伝子座への局在

is detected by the ChIP assay. (B) SAS4

Sas2 のα２遺伝子の発現抑制機構のひとつとand/or SAS5 are required for the

して、SAS 複合体の標的遺伝子領域の局在が考

recruitment Sas2 to the promoter ofえられる。そこで、クロマチン免疫沈降法によthe α2 gene.

り、in vivo における SAS 複合体の HML 座の局在について検討した。野生株と Myc エピトープ切断後、抗 Myc 抗体による免疫沈降を行った。

タグが付加した Sas2 を発現する細胞株から、沈降物から精製した DNA を鋳型として、α２遺クロマチン分画を調製し、DNA を超音波により伝子のプロモーター領域を PCR により増幅した。

3

その結果、野生株に比べて、Sas2-Myc を発現す子の破壊は、SAS 複合体の局在に影響を与えなる細胞株の方が、約３倍 DNA が増幅され、Sas2かった（結果省略）。これまでに我々はクロマ（Fig.
が HML 座に局在することが明らかとなった

チン形成因子である Asf1 が SAS 複合体と相互3A）。同様の方法により、Sas4、Sas5 Myc エピ作用し、ASF1 は SAS 遺伝子と同様の経路でサイトープタグを発現する細胞を用いて、局在を検レンシングに関与することを明らかにしている。

討した。これらの因子の発現量は異なったが、そこで、SAS 複合体の局在に対する asf1 破壊のすべての Sas タンパク質が HML 座に局在するこ影響を検討した（Fig. 4）。その結果、asf1 破とが示された。これらの結果から、SAS 複合体壊により、SAS 複合体の HML 座への局在は失わが HML 座に局在する可能性が示唆された。そこれた。この現象は SIR1 に依存していなかった。

で、sas4, sas5 単独もしくは二重破壊株における Sas2 の局在を検討した（Fig. 3B）。その結３.

研究成果

果、これらの遺伝子の破壊により、Sas2 の発現

Sas2 の HAT 活性は HML 座の抑制クロマチン構量に変化はなかったが、Sas2 の局在が失われた。

造に重要であることを明らかにした。また、ここのことは Sas2 が SAS 複合体として HML 座にの抑制構造には、クロマチン形成因子 Asf1 を局在することを意味している。

介した SAS 複合体の HML 座への局在が必要であBることも明らかとなった。
SAS2+ myc myc myc myc

SIR1+++--ASF1 ++-+-strain４.

本研究は下等真核生物である酵母をモデル生0.4

relative intensity(ChIP / input)

今後の課題と発展物として用いている。クロマチン構造は、下等0.3から高等真核生物において保存されており、遺0.2伝子発現制御において重要である。酵母 Sas20.1の HAT 活性および SAS 複合体局在の抑制クロマチン形成における重要性は高等真核生物の遺伝

0ChIP, anti-myc

子発現抑制機構解明に役立つと考えられる。現

ChIP, (-) antibody

在、Sas2 の哺乳類に対応する因子の解析を進めている。

input
Western blot
(anti-myc)
1234

５.

5

発表論文リスト

Chromatin assembly factor dependentFigure 4. Sas2 occupancy at therecruitment

promoter of the α2 gene is dependentacetyltransferase complex is required

on chromatin assembly factor ASF1.

for silencing at mating type locusofHMLα.（投稿準備中）
次に、SAS 複合体の HML 座における局在に影響を与える因子について検討した。サイレンシ
ングに重要である因子 SIR1 もしくは SIR2 遺伝4theSAShitone