N−1 乳酸菌のヒトにおける効能試験

日本獣医畜産大学 応用生命科学部

寺

Ⅰ．目田厚

的

人の健康と深く関わる腸管は第二の脳といわれ、そこに棲息する腸内菌は生活習慣病・便秘予防に重要な役割りを演じている。その有用菌は乳酸菌で、そのうちビフィズス菌は加齢と共に減少し、有害菌のクロストリジウムや大腸菌は増加する。そこで、この状況を改善するために健康を維持・増進する機能性食品（プロバイオテックス、プレバイオテックス、バイオジェニクス）の摂取が重要である。7）
その一つであるヨ−グルトはプロバイオテックスといわれ、免疫力の増強、感染症・便秘の予防、ビタミンの生成などの効果が報告され、最近は、コレステロールの低減、血圧の抑制、アレルギーの予防などの効力が報告されている。これらの効果はそこに含まれる乳酸菌とその代謝産物の活性化が重要である。
そこで、ヨーグルトを人に摂取させ、腸内菌と腐敗産物について検討した。

Ⅱ．材料および方法

１．供試者および食事
ボランティアの健康成人（男性４名、女性６名：22〜23歳）に、食事は普通食で、試験期間には他のヨーグルト、乳酸菌やオリゴ糖などを含有した食品の摂取を禁止した。ヨーグルトは10%脱脂粉乳となるように25℃温水で溶かし、この1,000ml脱脂粉乳に Lactobacillus casei N−1
培養ヨールグト200mlを添加して、30℃48時間培養した。これを300ml／日を朝食後に14日間摂取し、それぞれ摂取前０日、摂取７日と14日目、摂取中止後７目に検体を採取し、腸内フローラ、腐敗産物、短鎖脂肪酸、大便pHおよび水分量を測定した。

− 19 −

Table 1

実験計画

摂取前週
ヨーグルト（g/日）
サンプル採取（日）検査項目
糞便の水分（％）
pH
糞便フローラ短鎖脂肪酸（μmol/g）
アンモニア（μg/g）
硫化物（μg/g）
フェノール類（μg/g）
インドール類（μg/g）

摂取中

摂取後

０日

７日

14日

７日

←２→00

←１→3007←１→30014←１→07＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊；実験項目

２．pHおよび水分量の測定
pHおよび水分量の測定：pHは糞便に直接ガラス電極pHメーター（堀場製作所）を差し込んで常法に準拠して測定した。水分は糞便１gを秤量し、赤外線水分計（Kett）によって測定した。

３．腸内フローラの検索
腸内フローラは光岡の方法 8）に準じ、３種類の非選択培地「嫌気性菌、好気性菌、特に嫌気性グラム陰性菌の分離に最適なEggerth−Gagnon（EG）寒天培地、嫌気性菌、好気性菌、特に乳酸菌などの嫌気性グラム陽性菌に最適なglucose blood liver（BL）寒天培地、好気性菌、特に大腸菌群、レンサ球菌、バチラスなどの分離に適したトリプチケース・ソイ（TS）血液寒天培地」と11種類の選択培地「ビフィズス菌分離用bifidobacteria selective（BS）寒天培地、バクテロイダッセイ分離用neomycin−brilliant green−taurocholate−blood（NBGT）寒天培地、ユーバクテリウム分離用eubacteria selective（ES）寒天培地、レシチナーゼ陽性クロストリ
ジュ−ム分離用ネオマイシン−ナグラー（NN）寒天培地、ベーヨネラやペプトストレプトコックスなどの分離用変法 veillonella selective（VS）寒天培地、乳酸桿菌用変法 lactobacilli
selective（LBS）寒天培地、大腸菌群分離用 deoxycholate hydrogen sulfide lactose（DHL）
寒天培地、レンサ球菌分離用 triphenyltetrazolium chloride−acrigine orange−thallous sulfate
aesculin crystal violet（TATAC）寒天培地、ブドウ球菌用フェニールエチルアルコールと卵− 20 −

Table 2 腸内フローラの検索に使用された培地と培養法
培

地非選択培地BL寒天
EG寒天
トリプチケースソイ血液寒天選択培地
BS寒天ES寒天NBGT寒天ネオマイシンNagler寒天
VS寒天変法LBS寒天
DHL寒天
TATAC 寒天
PEES寒天NAC 寒天ポテトデキストローゼ寒天
熱処理サンプルに使用する培地
BLおよび CW寒天

対象菌群
嫌気性菌
嫌気性菌
好気性菌

培養法と希釈培養日数（37℃）

スチールウール法
10−6, 10−7, 10−8
空気中10−5, 10−6, 10−7
10−1, 10−3, 10−5, 10−7

ビフィズス菌ユーバクテリアバクテロイデスクロストリジューム
ベ−ヨネラ
乳酸かん菌
大腸菌群
連鎖球菌
ブドウ球菌
シュードモナス
酵母、カビ
クロストリジューム

31−2

スチールウール法

3

空気中

1
2

10−1, 10−3, 10−5
スチールウール法

2

黄添加 staphylococcus 110（PEES）寒天培地、緑膿菌用 nalixidic acid cetrimide（NAC）寒天培地、酵母とかび用 poteto dextrose（PD）寒天培地」を用いて検索した。その方法は、糞便検体１gを10倍希釈液で希釈し、10−6 から10−8 希釈液および10−1、10−3、10−5、10−7 希釈液を作り、それぞれの0.05mlを非選択培地の1/3、および選択培地の1/4分画に塗抹して、それぞれの培養時間（２日から４日）により培養した。さらに、レシチナーゼ陽性クロストリジウム
は加熱処理は寺田らの方法 11）、即ち、検体を80℃で10分間加熱し、BL 寒天培地とCW 寒天培地（栄研化学）の1/3分画に、10−1、10−3、10−5 希釈液をそれぞれ0.05mlを塗抹して検査した。

４．短鎖脂肪酸の測定
短鎖脂肪酸は原ら4）の高速液体クロマトグラフィーの方法、即ち、前処理として、①検体0.5gを取り、蒸留水4.5mlを加えて良く撹拌した後、冷蔵庫で一夜抽出する。②４℃で、3,000〜5,000rpm、10分間遠心分離する。③上澄みを2.5mlのシリンジで吸引し、0.45μmのメンブランフィルターで濾過する。④オートサンプラー用のバイアル瓶にクロトン酸0.1mlを加えて撹拌後、分析用サンプルとする。移動層と緩衝液の調整；移動層は５ｍMのp−トルエンスルホン酸液（951mg/l）、緩衝液は５mMの p−トルエンスルホン酸液（951mg/l）、エチレンジアミン四酢酸液（29mg/l）、Bis−Tris（2,2Bis（hydroxymethyl）−2,2,,2,,−nitrilo−triethanol、98%；4,185mg/l）の混合液である。

− 21 −

５．腐敗産物の測定
腐敗産物について、アンモニアおよび硫化物は寺田らの方法 12）で、アンモニアは検体１gを取り、蒸留水48.5mlおよび１M水酸化ナトリウム0.5mlを加えてスターラーで良く撹拌しながら、アンモニア隔膜電極で測定した。硫化物は検体１gを取り、蒸留水44mlおよび S−DIMB溶液５mlを加えてスターラーで良く撹拌しながら、硫化物イオン電極にて測定した。インドールやフェノール類は高速液体クロマトグラフィーの方法で、前処理は①検体１gを採り、3.9ml蒸留水と0.1gスルホサルチル酸を加えて良く撹拌し、冷蔵庫で一夜抽出する。②４℃で、3,000〜5,000rpm、10分間遠心分離する。③上澄みを2.5mlのシリンジで吸引し、0.45μmのメンブランフィルターで濾過する。④オートサンプラー用のバイアル瓶に入れた後、分析用サンプルとする。移動層はメタノール６：蒸留水４の割合である。
インドールやフェノール類は高速液体クロマトグラフィーの方法で、前処理は①検体0.5gを採り、4.4ml蒸留水と0.1gスルホサルチル酸を加えて良く撹拌し、冷蔵庫で一夜抽出する。②４℃で、3,000〜5,000rpm、10分間遠心分離する。③上澄みを2.5mlのシリンジで吸引し、0.45μmのメンブランフィルターで濾過する。④オートサンプラー用のバイアル瓶に入れた後、分析用サンプルとする。移動層はメタノール６：蒸留水４の割合である。

Ⅲ．成績

１．腸内フローラの構成
腸内フローラの構成における普通食摂取後７日目、普通食にヨーグルト摂取７日目と14日目、および普通食摂取後７日目の結果を Table３に10名の平均値の菌数の対数±標準偏差で示した。ビフィズス菌の菌数はヨーグルト摂取中有意（７日目p＜0.05、14日目p＜0.01）に増加し、乳酸桿菌も摂取14日目に有意（p＜0.05）に増加した。これに対して、レシチナーゼ陽性クロストリジウムはヨーグルト摂取中有意（p＜0.05）に減少し、緑膿菌も摂取14日目に有意（p＜0.05）に減少した。また、レシチナーゼ陽性クロストリジウムおよび緑膿菌は検出率において、摂取７日目には低下傾向を示し、14日目には有意に低下した。

− 22 −

Table 3 Effect of yoghurt consumption on fecal flora of 10 human volunteers
Organism

Before intake
day 0Total anaerobic
bacteria

10.74±0.180（100）.

10.70±0.110（100）.

10.84±0.060（100）.

10.71±0.280（100）.

Bifidobacteria

9.95±0.19（100）.

10.22±0.14*0（100）.

10.31±0.17**（100）.

9.92±0.29（100）.

Bacteroidaceae

10.56±0.220（100）.

10.36±0.180（100）.

10.53±0.150（100）.

10.52±0.320（100）.

Eubacteria

9.56±0.46（100）.

9.52±0.49（100）.

9.86±0.18（100）.

9.69±0.35（100）.

Peptococcaceae

8.67±0.75（90）.

9.25±0.48（90）.

8.97±0.63（80）.

8.80±0.64（90）.

4.89±1.69（80）.

2.97±0.41*（50）.

2.89±0.30*（30）.

3.94±1.29（70）.

Lecithinase−negative

7.22±1.89（60）.

7.05±1.44（30）.

7.37±0.93（20）.

6.94±0.53（40）.

Lactobacilli

5.97±1.89（100）.

7.58±1.50（100）.

8.26±0.82*（100）.

4.69±1.43（100）.

Enterobacteriaceae

8.08±0.49（100）.

8.01±0.75（100）.

8.12±0.96（100）.

8.16±0.69（100）.

Pseudomonas

3.91±0.43（70）.

3.76±0.27（40）.

2.83±0.20**（30）.

4.09±0.63（70）.

Streptococci

7.30±1.16（100）.

7.07±1.99（100）.

7.98±1.14（100）.

7.18±1.49（100）.

Staphylococci

4.24±1.21（70）.

3.72±0.87（80）.

3.48±0.72（80）.

3.84±0.51（60）.

Bacilli3.27±1.36（70）.

2.73±0.60（70）.

3.18±0.40（70）.

3.10±0.20（60）.

Yeasts

3.65±0.82（70）.

3.07±0.34（70）.

3.08±0.56（70）.

4.12±0.73（60）.

Clostridia
Lecithinase−positive

During consumption
day 7day 14* Bacterial counts expressed as mean±SD of log 10 number per gram pf stool.
** Figures in parentheses are frequency of occurrence（%）.
*** Significant difference from the concentrations before intake : **P＜0.01, *P＜0.05.

− 23 −

After intake
day 7

Log 10 number of Lactobacillus per g feces

109876543210
Day 0
Before consumption

Day 7

Day 14

During consumption

Day 7
After consumption

Log 10 number of Bifidobacteria per g feces

Fig.1 Change in the levels of Lactobacillus during yorghurt consumption
by 10 human volunteers

111098Day 0
Before consumption

Day 7

Day 14

During consumption

Day 7
After consumption

Fig.2 Change in the levels of Bifidobacterium during yorghurt consumption
by 10 human volunteers− 24 −

61

糞便1g当たりの緑膿菌の菌数の対数

5243435261780907摂取前

14摂取中

710摂取後

Fig.3 10ボランティアにおける緑膿菌の糞便レベルのヨーグルトの摂取効果

２．腐敗産物
Table４に示すように、アンモニアはヨーグルト摂取中有意（７日目p＜0.05、14日目p＜0.01）に減少し、硫化物も摂取14日目に有意（p＜0.05）に減少した。
インドールはヨーグルト摂取中有意（p＜0.05）に減少した。フェノール、クレゾールとエチルフェノールはヨーグルト摂取14日目に有意（p＜0.05）に減少した。

Table 4 Effect of yoghurt consumption on fecal ammonia, putrefacitive products, sulfide,
fecal pH and water
Before intake
day 0

During consumption
day 7
day 14After intake
day 7

Ammonia（μg/g）
Sulfide（μg/g）

430±184
1.0±0.4258±77*0.5±0.2

193±33**0.4±0.2*289±100
0.8±0.5

Phenolp−Cresol
Ethylphenol
IndoleSkatolpH
Water content

4.22±2.85
15.72±12.48
3.48±2.61
21.98±11.85
10.21±8.800
6.5±0.476.9±6.90

1.37±0.89
14.21±6.950
2.94±2.82
11.19±4.69*
14.19±10.55
6.2±0.778.8±5.80

0.99±0.73*
09.09±5.880
0.14±0.09*
10.96±8.43*
11.89±10.88
6.2±0.679.2±6.50

3.84±2.42
17.38±10.05
2.84±1.86
25.11±23.34
11.12±10.32
6.6±0.676.4±4.80* Putrefactive products expressed as mean±SD of μg/g wet feces** Statistically significant at *P＜0.05 and **P＜0.01 levels when compared with the values before intake.

− 25 −

３．糞便pHおよび水分
Table４に示すように、糞便pHはヨーグルト摂取前に比べて摂取中0.3低下した。水分は摂取前に比べわずかに増加した。

1.2

400

0.9

300
0.6
200
0.3

100
0

Sulfide（μg/g）

Ammonia（μg/g）

5000day 0day 7

Before intake

day 14

During consumption

Ammonia（μg/g）

day 7
After intake
Sulfide（μg/g）

Concentration of metabolites
feces（μg/g）

Fig.4 Change of yoghurt consumption on fecal ammnonia
and sulfide of 8 human volunteers

80
Skatol60

Indole40
Ethylphenol
20

p-Cresol0Phenol
day 0
Before intake

day 7

day 14

During consumption

day 7
After intake

Fig.5 Changes in the concentrations of fecal metabolites during yoghurt intake− 26 −

４．糞便短鎖脂肪酸
糞便短鎖脂肪酸はTable５に示すように、酢酸はヨーグルト摂取中有意（７日目p＜0.05、14日目p＜0.01）に増加し、プロピオン酸および乳酸は摂取14日目に有意（p＜0.05）に増加した。

Table 5 Effect of yorghurt consumption on fecal volatile fatty acids
Before intake
day 0Formic acidAcetic acid
Propionic acid
Butyric acidiso−Butyric acid
Valeric acidiso−Valeric acid
Lactic acid
Succinic acid

0.56±0.43
5.84±2.86
2.23±0.98
0.94±0.52
0.28±0.21
0.21±0.07
0.15±0.08
1.57±1.35
0.37±0.17

During consumption
day 7
day 140.51±0.74
8.59±3.29*
2.35±1.05
1.35±0.76
0.34±0.21
0.36±0.18
0.22±0.11
1.71±1.17
0.41±0.31

0.57±0.88
9.66±2.88**
4.12±1.68*
1.22±0.53
1.87±1.67
0.37±0.13
0.41±0.275.39±2.70*
0.78±0.50

After intake
day 7
0.45±0.48
4.66±1.45
2.03±0.89
0.85±0.55
0.51±0.29
0.22±0.09
0.47±0.25
0.91±0.61
0.67±0.56* Metabolic products expressed as mean±SD of mg/g wet feces** Statistically significant at *P＜0.05 and **P＜0.01 levels when compared with the values before intake.

VFA（mg/g）

30

Succinic acid
Lactic acid20

iso-Valeric acid
Valeric acidiso-Butyric acid10

Butyric acid
Propionic acid0day 0
Before intake

day 7

day 14

During consumption

day 7

Acetic acid

After intake

Formic acidFig.6 Effect of yoghurt consumption on fecal volatile fatty acids− 27 −

Ⅳ．考察

機能性食品およびその成分は免疫、内分泌、神経、循環および消化システムを改善して健康を増進させる。それらは作用のメカニズムからプロバイオテックス、プレバイオテックス、バイオジェニクスの３つに分けられる。
他方、人の腸内には100種類100兆個の微生物が棲息し、人によって遺伝子的にそれぞれの菌数のバランスが保たれ、その菌叢が体を守っている。腸内フローラの宿主に及ぼす影響はビフィズス菌や乳酸桿菌などの有用菌の作用とクロストリジュームや大腸菌などの有害菌による作用が考えられる。従って、食品やその成分などの摂取によって菌叢は変動するが、摂取をやめ

15.8%

16.6%

Bifidobacterium

16.2%

19.3%

Bacteroides
Others

67.6%

64.5%

Day 7
Before consumption

21.2%

Day 7
After consumption

21.5%

29.1%

49.7%29.5%

49%
Day 7Day 14
During consumption

Fig.7 Changes in fecal flora by yorghurt consumption− 28 −

れば元の遺伝子的に維持されている菌叢に戻る。一般的に成人のビフィズス菌の割合は10%前後であるが、ヨーグルトなどの摂取で25%前後までに増加し、摂取を中止すれば10%位に戻る。
Lactobacillus casei 菌は15℃の低温と45℃の高温で発育するホモ発酵性乳酸菌で、人の腸管から低率（30%）に検出される。田中ら2）（1994）は５名の健康成人に L. casei 菌を毎日1010 cfu/gを飲用させ、この菌の回収は10 7−8 cfu/gで、飲用中止後１週以内に消失すると報告している。
9）
Saxelinら（1991）
は７名の健康成人に L. casei strain GGを1.5x10 11 cfu/日摂取させると、このGGは10 6−7 cfu/gの割合で回収されたと報告されている。本実験では L. casei N−1 10 10 cfu/g菌を300ｇ/日摂取させると、10 6−7cfu/g検出され、Saxelinらの報告に類似した。
乳酸菌使用ヨーグルトの摂取における腸内菌に対する影響はL. casei 2）、L. rhamnosus（L. casei5）、L. plantarum 1）、L. bulgricus・Streptococcus thermophilusの２種 3,13）、L. Bulgricus・
strain GG）

S. thermophilus に L. gasseri 15）または Bifidobacterium lactis 6）の添加の３種、さらに、L. acidophilus とB. longumの添加の４種 14）、L. helveticus・L. acidophilus・B. bifidum・S. thermophilus の４種におけるヨーグルトの報告がある。
L. casei N−1 使用ヨーグルト摂取において、ビフィズス菌が増加し、多くの報告と類似したが、レシチナーゼ陽性クロストリジウムの減少についてはTakumiら10）の乳果オリゴ糖添加冷凍ヨーグルトの報告と同様であった。本ヨーグルト摂取におけるPseudomonas の減少は抗菌グッズなどの使用拡大傾向と考えられる。
本ヨーグルト摂取によるアンモニアの低下は勝野ら13）や田中ら2）の報告と類似し、硫化物の減少は原ら3）の報告と同様であった。また、インドールは寺田ら16）の報告と同様に全ボランティアで減少した。フェノールおよびクレゾールの減少は原ら3）の報告に類似した。
本ヨーグルト摂取における短鎖脂肪酸の酢酸、プロピオン酸、乳酸の増加は Takumi ら10）の報告と類似し、これは有用菌のビフィズス菌や乳酸桿菌の増加によるものと思われる。
以上より、本ヨーグルト摂取は腸内フローラと腸内代謝の活性によって、腸内環境の改善と大便の脱臭効果が明らかにされた。

− 29 −

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