オートファジー；形態学と分子生物学の融合

初期胚発生におけるオートファジーの新しい役割
The Role of Autophagy during Early Embryogenesis in Mice
智史ａ，岸塚本千絵子ｂ，水島昇ｂ

Satoshi Tsukamoto, Chieko Kishi and Noboru Mizushimaａ（独）放射線医学総合研究所ｂ

要旨

実験動物開発管理課・先端動物実験推進室

東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科

細胞生理学分野

卵子は 100％母親由来の細胞であり，卵細胞質には母性の mRNA やタンパク質が蓄えられている．精子と融合して受精卵となった直後の細胞質にもこれらの母性因子は持ち込まれる．その後急速に分解され，受精卵由来の mRNA やタンパク質が発現する．受精してから着床するまでが 4 日間であることを考えると，母性因子の除去には大規模な分解系が関与すると思われる．オートファジー
はリソソームを分解の場とする細胞質成分の大規模な分解系である．これまで出生以前の胚発生におけるオートファジーの役割は不明であったが，筆者らはマウスの受精卵で活発にオートファジーが起こることを発見した．実際に，受精直後のオートファジーを欠損した受精卵は着床前致死になることも明らかとなった．母性タンパク質が受精直後のオートファジーによって大規模に分解され，その分解産物であるアミノ酸は着床するまでの胚発生に必要であることを示唆している．

キーワード：卵子，受精卵，オートファジー，Atg5，着床

1.

はじめに卵子や精子は究極に分化した細胞と考えられるが，受精に2.

母性因子の分解機構と胚発生における役割

2.1

受精直後にはオートファジーが活性化する

よって再び全能性をもつ 1 つの細胞すなわち受精卵となる．

最近，筆者らは全身のオートファゴソームが緑色蛍光タン

受精卵として発生するためにはあらかじめ卵子に蓄えられてパク質（green fluorescent protein）で蛍光標識されたマウス

いた mRNA やタンパク質などの母性因子を分解し，受精卵（GFP-LC3 マウス）を用いることによって，受精卵でオートゲノムにコードされる mRNA やタンパク質に入れ替えるこファジーが活発に起こることを見いだした（図 1）8）．受精直とが必要である．しかし，マウスでは卵子形成過程で発現し後に誘導されるオートファジーによって卵子由来のタンパクて成熟卵子に蓄えられる遺伝子の総数は全遺伝子の 20 ～質が大規模に分解されていることが予想された．そこで，45％にも達すると言われており

1,2），それらを短時間でかつGFP-LC3 マウスの受精卵で観察されたオートファジーをよ

効率的に分解するには大規模な分解系の関与が想定される．

り詳細に調べるために電子顕微鏡を用いて観察を行った．電一方，受精後の 1 細胞後期からはすでに受精卵ゲノムに由来

子顕微鏡を使った受精卵の観察自体は古くから行われてきたする転写が起こり始め，2 細胞期では劇的に転写が活性化すが，筆者らの調べた範囲では，オートファジーに焦点を当てることが明らかとなっている

3,4）．タンパク質レベルではた解析は見つからなかった．そこで，野生型の雌マウスを雄4 ～ 8 細胞期にかけて発現パターンが著しく変化することをマウスと交配させた 2 日後に 2 細胞期の胚を回収し電子顕微5）1975 年に Blerkom らが報告している ．したがって，受精鏡を用いて丹念に観察することにした．その結果，二重膜か卵では大規模な分解と同時に合成も起こっていると考えられらなるオートファゴソームやオートリソソーム様の構造体をる．最近の研究から，母性 mRNA は受精後に発現する二十観察することに成功した（図 2）．それらの直径は，他の哺数塩基からなる小さな RNA（マイクロ RNA）によって選択乳類細胞と大きな差はなく約 0.5 ～ 1 μm であった．また，

6）的に分解されることが示された ．しかし，卵子由来のタンマウス繊維芽細胞などの哺乳類細胞と同様に，二重膜が細胞パク質分解の機構については，一部のタンパク質の分解にユ質の一部分を囲っている像が観察された（図 2）．細胞質には，ビキチン・プロテアソーム系が関与すること

7）を除けばほとんど未解明であった．

オートファゴソームによく似た他の膜構造体も多数観察されるため，一見してオートファゴソームとそれらの膜構造体を識別することは困難であった．そのため，これまで通常電子ａ〒 263–8555 千葉県千葉市稲毛区穴川 4–9–1ｂ〒 113–0034 東京都文京区湯島 1–5–45
2010 年 2 月 22 日受付

特集

初期胚発生におけるオートファジーの新しい役割

顕微鏡解析によってオートファゴソームが受精卵に観察されたという報告はなかったのかもしれない．しかし，LC3 抗体を用いた免疫電子顕微鏡解析によって，それらの構造体は受91【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

精卵におけるオートファゴソームやオートリソソーム構造体8）であることが明らかとなった ．

ある．実際に，卵子にカルシウムオシレーションを誘導する薬剤を処理するとオートファジーが活性化することからも，興味深いことに，受精直後に誘導されたオートファジーは，カルシウムオシレーションが関与していると考えられる．こ受精卵が 1 細胞から 2 細胞へと分裂する際には一時的に抑制のように，受精直後のオートファジー誘導は時空間的に巧妙されることが分かった（図 1）．この時期の細胞質には核膜に制御されている．

崩壊によってリプログラミング因子などの核内因子が放出さ2.2

れるようであり 9），この因子の分解を最小限にとどめるためでは，筆者らが発見した受精卵のオートファジーは胚発生か，あるいは放出された核内因子によってオートファジーがにとって本当に必要なのだろうか．現在までにオートファ一時的に抑制されている可能性がある．受精卵の発生段階にジーに関連する遺伝子（Atg）群が 33 個同定されており，そよってオートファゴソームの局在が異なるのも興味深い点でのうち全身の組織で Atg5 や Atg7 をノックアウトしたマウスある．1 細胞期の胚では細胞質全体に，2 細胞期や 4 細胞期

でも出生までは正常であることから 11,12），それまでの胚発生の胚では細胞膜の周辺部にオートファゴソームが多く観察さにオートファジーは必要ないようにも思える．しかし，単純れた．なぜ，発生段階によってオートファゴソームの局在がノックアウトマウスを用いた実験では，受精卵でオートファ異なるのか今のところはっきりしないが，上述した核内因子ジーが機能する可能性があったのである．Atg5 の全身ノッの放出などが原因で，オートファゴソームの局在が変化する

クアウトマウスは，遺伝子型がヘテロ（Atg5+/+/−）の雌雄をのかもしれない．

オートファジーは着床前胚の発生に必要である交配させて一定の割合で得ることができる．この際ヘテロ雌

また，受精直後のオートファジーは，一般的によく知られ由来の排卵卵子には卵子形成の過程で細胞質に Atg5 タンパている飢餓応答とは異なる分子メカニズムで誘導されるようク質が蓄積され，受精直後には Atg5 タンパク質が持ち込まである．受精した胚は輸卵管内で発育する．輸卵管液中にはれて機能することになる．つまり，遺伝子型が見かけ上ホモ10），飢餓（Atg5−/−/−）の受精卵でも，卵細胞質には Atg5 タンパク質がによってオートファジーが誘導されたとは考えにくい．さらありオートファジーが機能することが可能であった．実際にに，受精して 3 時間まではオートファジーは抑制されている

ヘテロマウス同士の交配から得られたホモの受精卵ではオーことから，排卵による刺激でオートファジーが誘導されたとトファジーが誘導することが明らかとなっている．そこで，も考えにくい．何が引き金になってオートファジーが誘導さ筆者らは受精直後のオートファジーを完全に抑制するためれるのかは未解明だが，受精直後から卵細胞質ではカルシウに，卵子特異的に Atg5 を欠損したコンディショナルノック

ム濃度の定期的な変動（カルシウムオシレーションという）アウトマウス（卵特異的 Atg5 ノックアウトマウス）を作製が起こり，結果としてオートファジーが誘導される可能性がして，この時期のオートファジーの必要性について調べるこ

アミノ酸などの栄養は豊富に含まれていることからとにした．このノックアウトマウスでは卵子形成の初期からオートファジーが抑制されるため，卵子形成や成熟に異常が生じることも考えられたが，これらの過程は正常であった．
そこで，卵特異的 Atg5 ノックアウト雌マウスと Atg5 ヘテロ雄マウスを同居させて，それらの交配から得られた産仔の遺伝子型を調べることにした．その結果，産仔のすべてがAtg5+ の精子に由来するものであり，Atg5− の精子由来の産仔は一匹も産まれないことが分かった．この結果は，受精直図 1 受精卵で起こるオートファジーの様子
GFP-LC3 マウスの卵子と野生型マウスの精子を用いて体外受精を行った後に，GFP-LC3 のドット（オートファゴソーム）を経時的に観察した．受精前の未受精卵（0 h）ではオートファジーは観察されないが，受精 12 時間後には多数のオートファゴソームを示すドットが観察される．分裂直後の受精 22 時間後には一時的にオートファジーは抑制されている様子が分かる．受精 38 時間後には再びオートファジーが活性化している．括弧内は体外受精後の時間を示す．
スケールバーは 20 μm．
92

図 2 電子顕微鏡で観察した 2 細胞期胚のオートファジー
野性型マウスから得られた受精後 1.5 日目の 2 細胞期胚では，多数のオートファゴソーム（矢印）やオートリソソーム（矢じり）が観察される．M と L はそれぞれミトコンドリアとリソソームを示す．
スケールバーは 0.5 μm．文献 8 より改変．
顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

後のオートファジーを完全に欠損すると胚性致死になる可能栄養のセンサーとしての役割も担っている．したがって，受性を示唆していた．一方で，卵特異的にオートファジーを欠精直後のオートファジーは胚の栄養要求性とも密接に関連し損しても，受精後に胚（Atg5+ 精子）由来の Atg5 が発現すた自給自足のシステムとも言えるだろう．

れば胚発生は正常に起こると考えられ，この時期のオートファジーの必要性を示す結果でもあった．次に，オートファ3.

おわりにジー欠損卵が受精後のどの時期まで発生するかを検討するこ

受精卵の発生は短期間のうちに起こり，マウスでは受精しとにした．Atg5 ヘテロ雄と交配させて 3 日後に卵特異的て 4 日後には子宮に着床する．着床時の受精卵（ブラストシ

Atg5 ノックアウト雌の子宮から胚盤胞（ブラストシスト）スト）を構成する細胞数はおよそ 100 個である．受精直後にを採取した．得られたブラストシストを形態的に分類したとはわずか 1 細胞だったことを考えると受精卵は劇的な変貌をころ，正常なブラストシストと 4 ～ 8 細胞期の胚が混在して成し遂げる．その中でも卵子にあらかじめ蓄えられていた膨いることが分かった．これらの受精卵を体外で 1 日培養した大な情報を消去することは，受精卵として成長するために必ところ，正常なブラストシスは発生するものの 4 ～ 8 細胞期要不可欠と言える．受精卵にしてみればオートファジーのよの胚はそのままの形態であった．遺伝子型判定の結果，正常うな大規模な分解システムを正常に作動させることが全能性なブラストシストはすべてが Atg5+ の精子由来であることもを獲得するために必須なのかもしれない．

明らかとなった．また，上記と同様の交配によって得た 2 細最近の研究からオートファジーの多彩な役割が次々と明ら胞期の胚をブラストシストまで体外発生させたところ，4 ～かになっているが，初期胚における役割については未だ不明

8 細胞期の胚までは正常に発生するもののブラストシストまな点が多い．今後さらなる研究によって胚発生におけるオーで達するものは全体の 30％前後であった．これらの結果かトファジーの新しい役割が解明されることを期待したい．

ら，Atg5− の精子と受精したオートファジー完全欠損卵は着床前の 4 ～ 8 細胞期で致死となると結論付けられた．
2.3

受精卵におけるオートファジーの役割

オートファジー欠損卵が着床前致死になる理由は定かではないが，4 ～ 8 細胞期のオートファジー欠損卵では新規のタンパク質合成率が低下することが明らかとなった．可能性の一つとして，受精直後に誘導されるオートファジーによって卵子由来のタンパク質が分解され，その分解産物であるアミノ酸が新規のタンパク質合成に利用されていると考えられる．他の可能性としては，オートファジーによって胚発生に影響を与える細胞質因子が積極的に除去されるとも考えられるが，証明するまでには至っていない．
マウスの受精卵を用いた体外培養は古くから行われており，数種類の培養液がこれまでに開発されている 13）．最近では，培地中にアミノ酸を添加した培養液が主流になりつつあるが，アミノ酸を添加しない培地でも受精卵は発生することができる 14）．したがって，オートファジーによる分解産物であるアミノ酸は着床までの栄養源になっているとも考えられる．Schultz らは，各時期の受精卵内のアミノ酸濃度を測定して 8 細胞期にアミノ酸含量が増加することを報告している 15）．オートファジー欠損卵が致死になるのも 4 ～ 8 細胞期にかけてであることからも，細胞内のアミノ酸不足によって胚発生が停止した可能性も否定できない．さらに受精卵のオートファジー活性の変動は，mTOR（Mammalian Target ofRapamycine）の活性と逆相関の関係にあることも分かった．
mTOR はオートファジー経路に関わる中心的な分子であり特集

初期胚発生におけるオートファジーの新しい役割

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