神経細胞の活動とネットワーク構築のメカニズムの解析
The analysis of neuronal activity and the mechanism of neuronal
network construction.
研究代表者

大阪市立大学

大学院医学研究科講師

豊岡和人

Osaka City University
Graduate School of Medicine
Assistant Professor, Kazuhito Toyo-oka
和文アブストラクト「認知」及び「記憶」という高度な脳機能は神経細胞が発生プログラムに従って大脳皮質及び海馬において緻密なネットワークを構築することにより達成される。この過程には様々な分子群が関与しているが Lis1、Ndell、14-3-3ε及び細胞質ダイニンが重要な役割を担っていることは間違いない。そこで私はこれら分子の機能解析を進めてきたが、本研究では特に分子モーターである細胞質ダイニンの制御機構について解析を進める。
この分子は自動車のように小胞という荷物を載せて動き出し、停止と発進を繰り返しながら目的地まで小胞を運搬する。そこで、私はどのような分子がどのようなメカニズムにより細胞質ダイニンの発進・停止を制御しているのかを明らかにすることを目指す。
この解析によって神経細胞のネットワーク形成機構の一端を解明し、「認知」及び「記憶」という高度な脳機能のメカニズムにせまる。

Abstract
The construction of neuronal network is an important event to exercise the sophisticatedfunctions of brain, such as recognition and memory. This comes from an appropriate
development of cerebellar cortex and hippocampus along with a developmental program.
There are many molecules involved in development of cerebellar cortex andhippocampus. Ndel1, 14-3-3 epsilon and cytoplasmic dynein have crucial roles in theseprocess. The purpose of this study is to clarify the structure, function and regulatorymechanism of cytoplasmic dynein activity, which details have not been analyzed wellbecause of its huge molecular size. Cytoplasmic dynein is a molecular motor, whichbinds to cargos and transport them from minus end of microtubules into plus end.
However, how cytoplasmic dynein motor activity is regulated has not been clear. That’swhy I try to make clear what molecules are important for the regulation of cytoplasmic
dynein motor activity. These results contribute to the profound understanding ofmolecular mechanism of the regulation of cytoplasmic dynein function.
1. 研究目的
脳が高度な機能を発揮するためには綿密ナント分子の作製が困難であり、細胞質ダな神経細胞間の回路網の構築が重要である。

イニンの詳細な機能解析は非常に困難であそのためには神経細胞が綿密に制御されたった。よって Lis1, Ndel1, 14-3-3 εによる細メカニズムに従って正しく移動することが胞質ダイニンの活性制御機構についてよ必要不可欠である。綿密な神経細胞間の回り詳細な解析を行うためには、リコンビナ路網の構築は神経細胞の移動と正しい位置ントの細胞質ダイニンを大量に精製し、細での停止、正しい細胞間でのシナプス形成

胞質ダイニンの活性を in vitro で再現できるにより達成される。私は Lis1, Ndel1, 14-3-3ε系を確立することが重要である。そこで、及び細胞質ダイニンが神経細胞の移動に私は細胞質ダイニンのどの部位が活性に重重要であることを明らかにしてきた。しか要であるのかを調べるために、細胞質ダイし、これら分子間のシグナル伝達に関してニンのさまざまな領域からなる変異分子をは詳細は明らかではない。特に、エフェク昆虫細胞にて作成・精製した。その結果、ターである細胞質ダイニンのモーター活

GFP タグをつけた全長の細胞質ダイニン重性の制御機構は不明のままである。そこ

鎖の作成に成功し、活性を持つことも確認

で私は Lis1, Ndel1, 14-3-3 εによる細胞質ダした。この細胞質ダイニンを用いればこれイニンの活性制御機構の解明を目指した。 まで困難であった細胞質ダイニンの制御機構を解析できる。すなわち、この系を応用

2.

研究経過

して LIS1, 14-3-3εさらには NDEL1 が細胞質(1) 細胞質ダイニン、LIS1、14-3-3εおよびダイニンの滑走にどのように作用している

NDEL1 の相互作用解析のための新しい実のかを明らかにすることができる。

験系の開発
私は Lis1, Ndel1, 14-3-3 εによる細胞質ダイニンの活性制御機構の解明を目指して(2) 細胞質ダイニンおよび微小管の活性制御における脱リン酸化の役割

新しい実験系の開発を試みてきた。すなわ

細胞質ダイニンの活性発現にはさまざま

ち、活性を有するタグ分子付きのリコンビな分子との結合とリン酸化・脱リン酸化がナント細胞質ダイニンの作成と精製である。

重要である。リン酸化に関しては多くの分細胞質ダイニンと同様なモーター活性を有子が同定され、メカニズムの一端が明らかする分子であるキネシンとは異なり、細胞にされているが、脱リン酸化に関してはあ質ダイニンは 1000-200kDa の巨大分子であまり解析は進んでいない。私はNDEL1の脱る。その活性中心である細胞質ダイニン重リン酸化を介して細胞質ダイニン・微小管鎖は 500kD 以上もあるため精製やリコンビの活性化をコントロールしている脱リン酸化酵素、Protein Phosphatase 4 (PP4) を同定した。
PP4は三つのサブユニットから構成され、そのうち二つの分子が活性を制御していることが明らかにされている。しかし、これまでのところ機能はほとんど明らかにされておらず、特に高等動物での機能は不明のままである。そこでPP4の機能を解析するために活性中心であるPP4cサブユニットのノ

図１ NDEL1 の欠損した神経細胞ではアックアウトマウスを作成してその機能解析ポトーシスが引き起こされる。

を行った。興味深いことにPP4cサブユニッ

Ndel1 ヘテロノックアウトマウス及びトは細胞骨格の維持に重要であることがわ

Lis1/Ndel1 ダブルヘテロノックアウトマウ

かった。

スの大脳皮質において TUNEL アッセイを行いアポトーシスを起こしている細胞を検(3) Ndel1 ノックアウトマウスの表現型解析出した。

私は LIS1 の結合分子として NDEL1 を同定し、Ndel1 の生体内での機能を明らかにす(4) NDEL1 の新たな結合分子の同定るためにノックアウトマウスを作成した。

我々は Lis1, Ndel1, 14-3-3 εによる細胞質そして大脳皮質形成における機能、特に神ダイニンの活性制御機構について長年解経細胞の移動における Ndel1 の役割につい析を行ってきた。そして両分子が結合してて解析を行った。その結果、Ndel1 ノックア

同じシグナル伝達経路において機能し、細ウトマウスの大脳皮質では階層構造に形成胞質ダイニンの活性制御に関与しているこ異常が認められた。これらは Ndel1 欠損神とは疑う余地がない。しかしながら、両分経細胞の移動における異常だけでなく、細子のノックアウトマウスの解析をとおして、胞死も関わっていることを明らかにした表現型の多くは共通しているが一部に差が（図１）。また、Ndel1 欠損細胞では微小管あることを明らかにした。このことはの形成に異常が見られ、細胞内小器官の細NDEL1 が LIS1 を介さないシグナル伝達に胞内分布にも異常が見られた。この細胞内も関与していることを示唆している。そこ

小器官の細胞内での輸送に細胞質ダイニンで私は NDEL1 の新たな結合分子の同定をが重要であることが明らかにされているこ

試みた結果、微小管の剪断活性を有するとから Ndel1 欠損によって細胞質ダイニン

Katanin p60 を同定した。リン酸化 NDEL1の機能にも異常をきたすことを示した。

が Katanin p60 と結合し、Katanin p60 の細胞内における局在を制御する事によってKatanin p60 の機能発現を制御していること、Katanin p60 が神経細胞の移動に重要であることを明らかにした（図２）。

導入効率が低く、今後は更に導入効率の改良が必要である。そうすれば今後細胞質ダイニンの更に詳細な in vivo での機能解明に貢献するものと考えられる。さらに細胞質ダイニンの活性を制御している LIS1、NDEL1 および 14-3-3ε等の分子の機能を invitro で解析するためにも有用である。これ
らの解析を通して長年不明であった細胞質
図２

Katanin p60 は神経細胞の移動に重要である。

ダイニンの機能解析は新たな局面へと前進できるものと考えられる。

小脳顆粒神経細胞を用いて in vitro での神経細胞の Migration Assay を行った。Katanin

5.

p60 に対する RNAi を導入した細胞では有1. Recruitment

意に細胞の移動が抑制された。

発表論文リストPhosphorylatedofKatanin
NDEL1,p60
anbyLIS1

interacting protein, is essential for mitotic

3. 研究成果

cell division and neuronal Migration.

細胞質ダイニン重鎖は 500kDa を越える

Toyo-oka K., Sasaki S., Yano Y., Mori D.,

巨大分子であるため精製やリコンビナント

Kobayashi T., Toyoshima Y. Y., Tokuoka M.

分子の作製が困難であり、活性を保持した

S., Ishii S., Shimizu T., Muramatsu M.,

GFP タグ付きのリコンビナント細胞質ダイHiraiwa N., Yoshiki A., Wynshaw-Boris A.

ニン重鎖の作成は報告されていなかった。

and Hirotsune S., Hum. Mol. Genet.

そこで私は活性を持つリコンビナント細胞

14:3113-3128, 2005.

質ダイニン重鎖の精製を行った。その結果、活性を持つ GFP タグ付きの細胞質ダイニン

2. Complete Loss of Ndel1 Results in重鎖の作成に成功した。このようにこれら

Neuronal Migration Defects and Earlyの系は、これまで細胞内での詳細な機能がEmbryonic Lethality. Sasaki S., Mori D.,

明らかになっていない細胞質ダイニンの機

Toyo-oka K., Chen A., Garrett-Beal L.,

能及び Lis1, Ndel1, 14-3-3 εによる細胞質ダ

Muramatsu M., Miyagawa S., Hiraiwa N.,

イニンの活性制御機構を in vitro 及び in vivoYoshikiの系で解析可能にする。よってこれらの系

Hirotsune S., Mol. Cell Biol. 25:7812-7827,

は当該研究分野に新たな可能性をもたらす2005.

ものである。

4. 今後の課題と発展
私が新たに作成した活性を保持したリコ
ンビナント細胞質ダイニン重鎖は細胞へのA.,

Wynshaw-Boris

A.

and