研究助成業績報告集

第 24 回（2016 年度）バイエル循環器病研究助成『生活習慣病と血液凝固』

熊本地震 震災特別枠『震災と血液凝固』

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次 ＊

究

課

題

研 究 者

頁

1

S100A9 をターゲットにした脳梗塞における抗血栓ペプチドワクチンの開発

島村 宗尚

１

2

血液凝固因子による全身の代謝異常発症機構の解明

清水 逸平

7

3

循環器疾患における後天性フォンビレブランド症候群の診断と治療法の開発

早川 正樹

10

4

新規接着因子、JCAD を介した生活習慣病と血栓性疾患の関連性の解明

原 哲也

15

末田 大輔

18

【熊本地震 震災特別枠】
１

熊本地震血栓塞栓症予防プロジェクト

S100A9 をターゲットにした脳梗塞における抗血栓ペプチドワクチンの開発

大阪大学大学院医学系研究科神経内科/健康発達
医学講座・寄附講座准教授

島 村 宗 尚Ⅰ．緒 言

おり、S100A9 の抑制が脳梗塞の悪化を抑制するこ脳梗塞発症後の二次予防にとって、抗血小板薬および抗凝固薬の長期的な継続服用が重要であるが、本邦においては脳梗塞再発時に 40.3％（心原性 43.8％、
非心原性 39.2％）の患者が抗血栓薬を内服しておらず
1、また、米国においては 34.1％の患者が 1 年後に内服を自己中止しており 2、不良な服薬コンプライアン
スが、脳梗塞の再発率増加を引き起こしている。
このような背景から我々は、ワクチンによる持続的な抗血栓作用の獲得が、服薬コンプラインス不良に伴う脳梗塞の再発抑制に貢献できる可能性を考えた。しかし、ワクチンによる長期間の抗血栓作用に伴う出血リスクの抑制が、抗血栓ワクチン開発の上では大きな課題であった。
そこで我々は、出血リスクのない抗血栓作用を期待できる分子ターゲットとして、血小板の CD36 を介した血栓形成を促進する新規因子として近年報告された S100A9 に注目した 3。この報告によると、S100Ａ
9-/-マウスでは、内皮細胞障害による血栓形成が抑制されるが、出血時間、APTT、血漿凝固能、血小板接着および遊走については、S100A9 欠損による影響を受けることがなく、リコンビナント S100A9 を投与する
ことにより内皮細胞障害に伴う血栓形成が回復する
ことが報告されていた。また、S100A9 は S100A8 とヘテロダイマーを形成するが、S100A9 が血栓形成には重要であることも示されている。
別の報告では S100A9-/-マウスでは、白血球の遊走低下に伴う易感染性の報告はあるものの 4,5、それに反する報告もあり 6、フェノタイプに大きな異常は生じないことも報告されている。さらに、S100A9-/-マウス
では、癌の抑制効果 7、血管傷害後の炎症抑制効果 8 も報告されていることから、ワクチンによる S100A9 シ
グナルの長期的な抑制は、副作用や出血リスクを増加させることなく、長期的に安全に血管内皮障害に伴う血小板凝集を抑制できる可能性を想定した。また、とも報告されていることから 9,10、S100A9 ワクチンが、脳梗塞発症時の脳梗塞の悪化抑制にも寄与できる可能性を考慮した。
このような観点から我々は、S100A9 において
CD36 との結合部位であり、B 細胞エピトープが想定されるアミノ酸部位をKLH に結合したS100A9 ワク
チンを作成し、同ワクチンを投与したマウスにおいて、中大脳動脈において血栓形成を惹起し、脳梗塞を生じる、塩化鉄（III）塗布モデルを用い、ワクチンの効果を検討するとともに、ワクチンの安全性を止血系への影響、T 細胞活性化の観点から検討行った。また、ワクチンの効果が抗体産生に伴う非特異的な反応によるものではないことを確認するため、S100A8 の B 細胞エピトープが想定されるアミノ酸部位をもとにワクチンを作成した。

S100A9 は、脳梗塞後の活性化ミクログリアやマク
ロファージに発現し、脳梗塞後の炎症を制御してにおけるワクチンの投与時期、抗体の測定時期の詳細

Ⅱ．対象・方法
1．ペプチドワクチンの合成
S100A9 において CD36 との結合部位であり、B 細胞エピトープが想定されるアミノ酸部位の N 末端を
KLH に結合した S100A9 ペプチドワクチンおよび、
S100A8 の B 細胞エピトープが想定されるアミノ酸
部位の N 末端を KLH に結合した S100A8 ペプチドワクチンを、株式会社ペプチド研究所に依頼し、作成した。なお、ペプチドは化学合成により作成した。
2. マウスにおけるワクチン投与
7 週齢の C57BL6／J 雄マウスに、ペプチド溶液と完全フロイントアジュバントを等用量混ぜた物を皮下投与し、2 週間後に不完全フロイントアジュバントと混合したものを皮下投与した。S100A9 ワクチンについては、さらに 2 週間後に再度、不完全フロイント
アジュバントと混合したものを皮下投与した。各実験は結果に標記する。なお、コントロールとして、KLH

1

のみを投与したマウスを用いた。

トロールとして、市販の抗 S100A8 あるいは抗3．中大脳動脈傷害モデル

S100A9 抗体を用いた。
8．ELISPOT アッセイ

イソフルレン吸入麻酔下において、側頭骨を電動ドリルにて開窓し、中大脳動脈を露出した。レーザード

96 ウエルのエリスポットプレートを anti-mouse

プラを中大脳動脈の遠位部の頭頂骨上に設置し、中大IFN-γ capture antibody あるいは anti-mouse IL-4

脳動脈に濾紙に浸した 20％塩化鉄（III）を 3 分間塗

capture antibody にてコーティングし、S100A9 にて布し、濾紙を外した。脳血流を 30 分間観測し、5 分免役した脾臓の懸濁液をプレートに加え（106 細胞/ウ

間以上、40％以上の血流低下が持続した場合、血管閉エル）、S100A9 ペプチド、KLH、リコンビナント

塞と判断し、低下開始時間を閉塞時間とした。

S100A9、ionomycin/PMA と反応させ、その後、抗また、3 日後に尻尾の遠位部をメスにて切断し、37

IFN-γ 抗体あるいは IL-4 抗体と反応させた後に、5-度にあたためた生食で満たしたファルコンチューブ

bromo-4-chloro-3 indolyl phosphate P-toluidine salt

内に入れ、止血するまでの時間を計測した。

and nitro blue tetrazolium solution にて可視化し、その後、脳を取り出し、クレシルバイオレット染色

スポット数を計測した。
9．統計処理を行い、染色されない部位を梗塞部位として、脳梗塞

数値は平均値±SEM で表した。2 群間の統計解析は、サイズを計測した。

unpaired two-tailed Student’s t-test にて行った。多4．クロピドグレルの投与方法
クロピドグレル 3 または 6 mg/kg を経口投与にて群間の解析には、ANOVA followed by Dunnett’s

2日間投与後、中大脳動脈傷害モデルを作成、その後、Multiple Comparison Test にて行った。JMP11.2.1

3 日間クロピドグレルを継続投与し、出血時間を計測を用いた統計解析を行った。

した。
5．T-TAS を用いた解析

Ⅲ．結 果

マウスの全血を用いて、Microchip flow-chamber

まず、S100A8 あるいは S100A9 ワクチンにて接種システムである T-TAS（藤森工業）により、血小板血を行い、それぞれ最終ワクチン 2 週間後の血清を用い栓の凝集能を解析した。

て、ELISA にて、S100A8 に対する抗体価、および6．ELISAS100A9 に対する抗体価を測定した（図 1）。

血清中に産生された抗体を ELISA で計測するために、方法 1 で述べた S100A8 または S100A9 アミノ酸配列を有するペプチドを BSA に結合したものをペ
プチド研究所にて作成し、プレートをこのペプチドでコーティングした。免役したマウス血清を 5％スキム
ミルクで希釈し、4℃でオーバーナイトにてインキュ
ベ ー シ ョ ン し 、 anti-mouse IgG horseradish

図 1 S100A8 ワクチン（左）、S100A9 ワクチンによる抗体価（右）peroxidase conjugate にて反応させ、可視化し、OD450 を計測した。

S100A9 ワクチンについては、20 µg の投与では抗体

また、IgG サブクラスの解析においては、antimouse

IgG

subclass-specific

価が S100A8 に比較し十分ではなかったため、50 µg

HRP-conjugatedで投与したところ、十分な抗体価を得ることができた。

antibodies (IgG1, IgG2b, and IgG2c)を使用した。

なお、それぞれの投与回数については、予備試験にて、

7. Western blotting

S100A8 ワクチンは2回の投与で十分な抗体価が得らワクチンによって産生された抗体が、S100A8 およ

れたが、S100A9 ワクチンでは 3 回の投与が必要であび S100A9 に特異的なものか確認を行うために、リコったため、S100A8 は 2 回、S100A9 は 3 回投与としンビナント S100A8 あるいは S100A9 を SDS/PAGE

た。

electrophoresis にて分離し、メンブレンにブロッティ

これらの産生された抗体が、特異的に S100A8 ある

ングしたものをマウス血清と反応させ、HRP-

いは S100A9 を認識できるか、Western blotting にてconjugated antibodies specific for mouse IgG と反応解析した（図 2）。陽性対象である市販 S100A8 抗体

させ、化学発光を行い、LAS にて観察した。陽性コン2

（図 2、S100A8Ab のレーン）、あるいは市販 S100A9することに対し、S100A9 ワクチンでは、コントロー

抗体（図 2、S100A9Ab のレーン）では、それぞれ、

ル群と比較し、出血時間の延長を認めなかった。

recimbinant S100A8, A9 が認識されるが、S100A8で免疫したマウスの血清では、S100A8 を認識するバンドが検出され（S100A8v のレーン）、S100A9 で免疫したマウスの血清では（S100A8v のレーン）、
S100A9 のみを認識するバンドが検出され、それぞれの血清において、S100A8,S100A9 に特異的な抗体が産生されているこことが明らかとなった。
図 4 尾動脈からの出血時間の計測結果

また、血小板数、PT,APTT についても S100A9 ワ
クチンによる影響は認められなかった（図 5）。

図 2 免疫したマウス血清を用いた産生抗体の解析。S100A8v
は S100A8、S100A9v は S100A9 でワクチンしたマウス血清。
S100A8Ab, S100A9Ab は市販 S100A8,S100A9 抗体。

次に、最終ワクチンの 3 週間後に塩化鉄（III）塗布による中大脳動脈血栓閉塞モデルを用いて、中大脳動
脈の閉塞時間を計測した（図 3）。
図 5 S100A9 ワクチンによる血小板数、PT、APTT への作用

これらのことから、S100A9 ワクチンはクロピドグ
レルと同程度の抗血栓作用を有している一方で止血機構には影響を及ぼすことが無いことが明らかとなった。
また、T-TAS を用いた検討でも、S100A9 ワクチンを投与したマウスの全血では、flow chamber 内での図 3 中大脳動脈塩化鉄（III）血栓閉塞モデルでの血栓閉塞までの血栓形成が有意に抑制されることも示され（図 6）、

時間

S100A9 ワクチンによる抗血栓作用が示された。

その結果、S100A8 ワクチンでは、血栓閉塞までの時間がコントロール（KLH）と同じであったが、S100A9 ワクチンでは血栓閉塞までの時間が有意に延長しており、その効果は 20 µg よりも 50 µg で強く認められた。S100A8 ワクチンでは十分な抗体産生が認められたにもかかわらず、抗血血栓作用が無いことから、産生された抗体による非特異的な作用により抗図 6 T-TAS による血栓形成に対する S100A9 ワクチンの効果の解析

血栓作用が生じるわけではなく、S100A9 ワクチンに

次に、S100A9 ワクチンの長期的な効果を検討した。

よる S100A9 に対する特異的な抗体が、投与量依存性

まず、抗体価の長期発現を検討したところ、ワクチンに抗血栓作用を有することが示された。また、抗血栓開始後 126 日目でも抗体が維持されていることが明

作用は、クロピドグレルによる作用と同程度のものでらかとなった（図 7）。

あった。
次に、尾動脈からの出血時間を計測したところ（図4）、クロピドグレル投与群では出血時間が顕著に延長

3

最後に、S100A9 ワクチンの安全性について検討を行った。過去のレニンワクチンでは腎臓における炎症細胞の浸潤 11、また、アミロイド Aβ ワクチンでは、髄膜脳炎が報告されているため 12、免疫後 147 日目の

図 7 S100A9 ワクチン投与後の抗体価の時間的推移

また、112 日目の時点で、塩化鉄（III）血栓閉塞モ

脳と腎臓の HE 染色、PAS 染色にて検討を行った（図デルを作成したところ、抗血栓作用は維持されながら11）。その結果、いずれにも炎症細胞の浸潤などの組も出血時間の延長も認められないことが明らかとな織学的な異常は認められなかった。

り（図 8）、S100A9 ワクチンの長期的な作用も明らかとなった。

図 8 S100A9 ワクチンにて免疫後 112 日目での血栓形成抑制効果と出血時間への影響についての解析

次に、S100A9 ワクチンに脳梗塞サイズの縮小効果

図 11 免疫後 147 日目の腎臓（HE 染色、PAS 染色）と脳（HE 染色）があるか、最終ワクチン後 3 週間目のマウスにて塩化の組織像。明らかな形態異常、炎症細胞の浸潤は認めなかった。

鉄（III）血栓閉塞モデル作成後の脳梗塞サイズを解析

さらに、免疫系に対するワクチンの影響を検討した。

したところ、予想に反して、明らかな縮小効果は認め

血清中の IgG サブクラスの解析では、S100A9 ワクチ

られなかった（図 9）。

ンでは IgG1 優位であり、Th2 優位となっていることが示唆された（図 12）。

図 9 脳梗塞サイズの解析。塩化鉄（III）にて血栓閉塞後 3 日後に脳梗塞サイズを計測。

図12 最終免疫後14日目の血清でのIgGサブクラスアッセイ。
S100A9

次に、血清中の S100A9 濃度について検討を行っ

ワクチン群では IgG1 優位であった。

た。S100A9 は、血管傷害にて血中濃度が高くなるが、

また、ELISPOT assay では、免役したマウスの脾S100A9 で免疫したマウスでは、S100A9 の発現が抑臓から採取した細胞において、リコンビナント

制される傾向にあることが明らかとなった（図 10）。

S100A9 あるいは S100A9 ペプチドに対する IL-4 あ
るいは IFN-γ の産生が認められず、有害な自己免疫反応は本ワクチンでは発現しないことが明らかとなった（図 13）。
これらの結果から、免疫学的な点においても、本ワ

図 10 血清中の S100A9 濃度の解析

4クチンは安全性にすぐれていることが示唆された。

可能性と、S100A9 の受容体としては、CD36 以外にも RAGE16 や TLR10 が存在し、そのいずれもが脳梗塞の悪化に関与しており、本ワクチンでは、
S100A9/RAGE あるいは S100A9/TLR シグナルを抑制できないため、脳梗塞の悪化抑制には効果が無かった可能性もある。また、本モデルは血栓閉塞後は永久閉塞モデルとなるため、虚血再灌流モデルでの再検討

図 13 最終免疫後 14 日目の脾臓細胞を用いた ELISPOT アッセイ。

は必要と考えられる。これらの観点からは、脳梗塞のS100A9 ペプチド、リコンビナント S100A9 の添加に対する反応は認め

悪化抑制もターゲットとするのであれば、さらに高抗られなかった。

体価の抗体を得ることができるよう、ワクチンの方法を改良するか、RAGE や TLR との結合も抑制できる

Ⅳ．考 察

ようエピトープを変更する、あるいは動物モデルを変本研究結果より、S100A9 と CD36 の結合部位をタ更しての解析、などが必要と考えられた。

ーゲットに作成した S100A9 ワクチンは、長期間にわ

今後の課題としては、
ワクチン開始 126 日目まで抗たって S100A9 に対する抗体価を維持することがで体価は維持されているが、抗体価は低下傾向となるこき、止血機構に影響を及ぼすこと無く、血管傷害に伴とから、ブースターにより、再度、抗体価が上昇する

う血栓形成をクロピドグレルと同程度に抑制できる

か、また、その際に効果があるかの確認は必要であり、ことが明らかとなった。また、ワクチンによる有害な

血小板での S100A9/CD36 シグナルの抑制を確認す

自己免疫反応を惹起することがないことも明らかとるために、JNK や VAV のリン酸化が抑制されているなった。

か 3 の実験が必要であると考えられた。また、本実験

今回の検討では、ワクチンによる S100A9/CD36 シは探索的研究のため、ヒトでは使用することができな

グナル抑制が血栓形成を抑制することが明らかとない、complete フロイントアジュバントを使用しておったことから、CD36 に対するワクチンでも同様の効り、ヒトへの応用を目指して、アラムなどによるワク果を期待できるかもしれない。しかし、過去の報告にチンが可能であるか、検討が必要であると考えられた。

よると、CD36 は血小板だけで無く、様々な細胞、組以上のような課題を今後、克服する必要があるが、織に発現しており、CD36 ノックアウトマウスでは、

本研究は、血管内皮傷害に伴う血小板血栓形成をワク

脂質異常症やインスリン抵抗性を示すこと 13、また、チンにより安全に抑制できることを初めて示したもヒトにおいても CD36 欠損患者では、脂質異常症やイのであり、抗血栓ワクチンがコンプライアンス不良に

ンスリン抵抗性、高血圧を呈することも報告されてい伴う脳梗塞の再発を抑制できる新たな治療法となりる 14。緒言にて述べたように、S100A9 の欠損マウス

うることが示された。

では、フェノタイプに大きな異常はないことから、
CD36 をターゲットとするよりも、S100A9 をターゲ

Ⅴ．結 論ットとした方が、安全性により優れいていると考えら

S100A9/CD36 シグナル抑制をターゲットとしたれた。

S100A9 ワクチンは、頭蓋内血管の内皮傷害に伴う血過去の報告では、S100A9 が脳梗塞後の活性化ミク栓形成を、出血リスクを増加させること無く、長期間

ログリア、マクロファージに発現しており、S100A9にわたり抑制できることが示された。

のシグナル抑制が脳梗塞の悪化を防ぐことが報告されている 10。また、CD36 も同様に活性化ミクログリ

Ⅵ．研究協力者

ア、マクロファージに発現し、その抑制が脳梗塞の悪中神啓徳・大阪大学医学系研究科健康発達医学講座・化を抑制できることから 15、本ワクチンによる脳梗塞

寄附講座教授悪化の抑制作用が期待された。しかし、結果的には、

望月秀樹・大阪大学大学大学院医学系研究科神経内科

このワクチンでは、脳梗塞発症後の脳梗塞の悪化を抑学・教授制する作用は認められなかった。原因として、産生さ森下竜一・大阪大学大学院医学系研究科臨床遺伝子治れた S100A9 抗体が、脳実質には十分に浸透すること療学・教授ができずに、S100A9 シグナルを十分に抑制できない

河野友裕・大阪大学医学系研究科・大学院生

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6

血液凝固因子による全身の代謝異常発症機構の解明

新潟大学大学院医歯学総合研究科 先進老化制御学講座 特任准教授

清 水 逸 平Ⅰ．緒2)遺伝子改変マウスの表現型解析：言

私はこれまで、肥満や糖尿病、心不全時に白色内臓

これまでの予備実験において、FXa は褐色脂肪細胞に脂肪が老化することで全身のインスリン抵抗性が生じ、存在する PAR1 受容体を介したシグナルにより恒常性

これらの加齢疾患の病態が負に制御されることを明ら破綻をきたす可能性が示唆されていた。そこで、全身かにしてきた(1-4)。また最近、褐色脂肪不全を介してPAR1 ノックアウト(KO)マウスを作製した(崎村ら、笹肥満や糖尿病の病態が促進することを明らかにした(5)。

岡ら)。また、さらに詳細な検討を行うために floxed

褐色脂肪組織は主に乳幼児に存在する熱産生器官としPAR1 マウスを作製（崎村ら）した。

て認識されてきたが、成人にも存在し、全身の代謝を

3)細胞実験：

制御する可能性を秘めた臓器であることがわかってき褐色脂肪細胞株を用いて、FXa が褐色脂肪細胞不全をた(6-8)。褐色脂肪組織の恒常性を維持することで、次きたす詳細な分子機序を検討した。

世代の糖尿病治療薬や治療コンセプトを創出し、肥満Ⅲ．結 果に合併する病態を抑制できる可能性が高い。これまで
我々が肥満モデルマウスを用いて行った予備実験の結肥満モデルマウスを用いて行った検討の結果、血液果、血液凝固第 X 因子(FX)が褐色脂肪に発現し、代謝

凝固第 X 因子(FX)が褐色脂肪組織に発現し、代謝スト

ストレスにより組織因子(TF)と FXa レベルが褐色脂肪

レスにより組織因子(TF)と血液凝固第 VII 因子(FVII)、

組織で上昇することを見出した。また、FXa の受容体

FXa の発現レベルが褐色脂肪組織で上昇することを見である Proteinase-activated receptor(PAR)-1 が褐色脂出 し た 。 ま た 、 FXa

肪組織で多く存在し、肥満により発現レベルが上昇すProteinase-activated receptor(PAR)-1 が褐色脂肪組織

ることがわかった。FXa-PAR1 シグナルを抑制するこで多く存在し、肥満により発現レベルが上昇することとで褐色脂肪不全と全身の代謝異常を抑制できることがわかった。FXa-PAR1 シグナルを FXa 阻害薬で抑制から、肥満時には FXa-PAR1-ミトコンドリア活性酸素

すると、褐色脂肪不全と全身の代謝異常を抑制するこ上昇-褐色脂肪不全という経路により糖尿病が発症、進とができた。肥満ストレスに伴う褐色脂肪の白色化は展する可能性が高いと考えられた。そこで本研究におFXa 阻害薬により抑制され、電子顕微鏡を用いた検討

いて、血液凝固因子を介して生じる褐色脂肪不全によの結果、褐色脂肪細胞におけるミトコンドリアの減少

り、全身の代謝的リモデリングが生じる詳細なメカニが改善することがわかった。肥満モデルマウスの血液

ズムの解明に挑むこととした。

中では FXa の発現レベルが上昇しないことから、褐色の 受 容 体 で あ る

脂肪における FXa シグナルが病的意義をもつ可能性がⅡ．対象・方法高いと考えられた。分化した褐色脂肪細胞を用いた検1)FXa 阻害による抗肥満効果の検討：

討の結果、FXa のリコンビナントタンパクを添加する

４週齢の野生型マウスに高脂肪食(HFD)負荷を 8-12 週

ことでミトコンドリアの活性酸素レベルが上昇し、ミ間行い肥満モデルを作製した。HFD 食に FXa 阻害薬

トコンドリアの膜電位が低下することがわかった。まを混餌投与したマウス(HFD +FXai マウス)を作製し、た、これらの変化は PAR-1 阻害薬によりいずれも抑制

全身の糖代謝不全や熱産生能の低下が改善するか検討された。PAR1 アゴニストを用いても同様の変化が生じした。代謝ケージや、その他あらゆる分子細胞生物学

た。FXa、PAR-1 アゴニストによるこれらの変化は、的手法を用いて表現型を解析した。

いずれも ERK 阻害薬により抑制されるため、ERK を

7

介したシグナルによりミトコンドリアの活性酸素レベ

害薬が持つ抗肥満効果が明らかになると確信する。

ルが上昇すると考えられる。さらに我々は、代謝スト
レス下で FVII、FXa、TF が上昇するメカニズムを検Ⅵ．研究協力者討することとした。分化褐色脂肪細胞に低酸素刺激を南野徹

新潟大学循環器内科学 教授

加えると FVII や PAR-1 の発現レベルの上昇を認めた。

吉田陽子

新潟大学先進老化制御学講座/循環器内科

Hypoxia inducible factor-1a(Hif-1a)を発現するアデノ

学 特任助教ウイルスを感染させると FVII や PAR-1 の発現レベル

林由香

新潟大学循環器内科学 大学院生が上昇することから、低酸素刺激→Hif-1a→FVII or

奥田修二郎

新潟大学バイオインフォマティクス分野

PAR-1 というシグナル経路によりこれらの分子の発現

准教授が制御される可能性が高いと考えられた。分化褐色脂早野俊哉

立命館大学生命科学部 教授

肪細胞にパルミチン酸を添加すると TF の発現レベル

崎村建司

新潟大学細胞神経生物学分野 教授が上昇することもわかった。現在 Crispr/Cas9 の系を阿部学

新潟大学細胞神経生物学分野 准教授

用いて全身 PAR-1 ノックアウトモデルマウスを作製し、笹岡俊邦

新潟大学脳研究所 教授

動 物実 験室 で繁 殖中 である 。さ らに 我々は Floxed
PAR-1 マウスを作製し、動物実験室で繁殖中である。

Ⅶ．参考文献UCP-1 Cre マウスと交配し、褐色脂肪特異的 PAR-1 ノ1.

ックアウトを作製し解析する予定である。

UemuraShimizu I, Yoshida Y, Moriya J, Nojima A,
A,

Kobayashi

Y,

et

al.

Semaphorin3E-induced inflammation contributes toⅣ．考insulin resistance in dietary obesity. Cell metabolism.

察

2013;18(4):491-504.

本研究により、褐色脂肪組織に血液凝固因子が発現すること、代謝ストレスに伴い過剰な FXa-PAR-1 を介

2.

したシグナルにより、ミトコンドリア機能異常が生じ、Okada S, Moriya J, et al. p53-induced adipose tissue

褐色脂肪不全から全身の代謝異常が生じることがわか

inflammationった。肥満褐色脂肪において、低酸素刺激、代謝スト

development of insulin resistance in heart failure.

レスが重要なシグナルであるが、前者により FVII や

Cell metabolism. 2012;15(1):51-64.

PAR-1 のレベルが上昇、後者により TF の発現レベル3.

が上昇することが明らかとなった。褐色脂肪組織におT, Yokoyama M, Ito T, et al. A crucial role for adipose

いて血液凝固因子が発現する意義については未だ明ら

tissue p53 in the regulation of insulin resistance. Nat

かではない。太古の時代では、飢えと寒冷に対する防Med. 2009;15(9):1082-7.

御システムの構築が、生存する上で重要であったと考4.

えられる。褐色脂肪は微小な血管ネットワークに富む

DNA damage response and metabolic disease. Cell

臓器であり、出血を抑制して褐色脂肪の機能を維持す

metabolism. 2014;20(6):967-77.

ることが重要であったのであろうか。遺伝子改変モデ5.

ルマウスを用いた検討により、更なる検討を行う予定

Shimizu A, Papanicolaou KN, MacLauchlan S, et al.

である。

Vascular rarefaction mediates whitening of brown

Shimizu I, Yoshida Y, Katsuno T, Tateno K,
iscriticallyinvolved

intheMinamino T, Orimo M, Shimizu I, Kunieda

Shimizu I, Yoshida Y, Suda M, Minamino T.

Shimizu I, Aprahamian T, Kikuchi R,

fat in obesity. The Journal of clinical investigation.

Ⅴ．結2014;124(5):2099-112.

論6.

本研究により、血液凝固因子がもつ負の代謝制御機

Nedergaard J, Bengtsson T, Cannon B. New

構の一端が明らかとなった。FXa-PAR1-ミトコンドリ

powers of brown fat: fighting the metabolic syndrome.

ア間に存在する負の連関が存在することが強く示唆さCell metabolism. 2011;13(3):238-40.

れた。FXa 阻害薬は心房細動症例に対してワーファリ

7.

ンに代わる抗凝固薬として広く使われるようになった。

An D, Nygaard EB, Hitchcox KM, et al. Brown

抗肥満は心房細動治療や再発予防にとって、非常に重adipose tissue regulates glucose homeostasis and

要な治療戦略である。本研究をさらに発展させること

insulin

で FXa が持つ負の代謝的側面が明らかになり、FXa 阻

investigation. 2013;123(1):215-23.

8

Stanford KI, Middelbeek RJ, Townsend KL,

sensitivity.

The

Journalofclinical8.

Jespersen

NZ,

Larsen

TJ,

Peijs

L,

Daugaard S, Homoe P, Loft A, et al. A classical brown
adipose tissue mRNA signature partly overlaps withbrite in the supraclavicular region of adult humans.
Cell metabolism. 2013;17(5):798-805.

9循環器疾患における後天性フォンビレブランド症候群の診断と治療法の開発-肺血栓塞栓症は血栓性疾患か出血性疾患か？-

奈良県立医科大学

輸血部 助教早 川 正 樹I.はじめに止血機能は一次止血と二次止血に大別され、一次な分子量の VWF からなる集団（マルチマー）を構

止血ではフォンビレブランド因子(VWF)と血小板成する。VWF の高ずり応力下での血小板形成能は、を中心とした血小板血栓、二次止血では凝固因子

分子量に依存し、UL-VWFM が存在することは血栓が活性化されフィブリノゲンを中心とするフィ症のリスクなり、高分子マルチマーが欠損すればブリン血栓が形成される。血小板血栓は、流速の出血傾向となる。

速い動脈での重要な止血機構であると同時に、心筋梗塞や脳梗塞などの致死的動脈血栓症に重要

Heyde 症候群な役割を果たしている。また、フィブリン血栓は大動脈弁狭窄症(AS)では、狭窄した弁口で非常流速の遅い静脈での重要な止血機構であると同に高いずり応力が発生するため、ADAMTS13時に、深部静脈血栓や播種性血管内凝固症候群

により VWF が過剰に切断され、高分子量（DIC)などの静脈性血栓症にかかわっている。よVWF が欠損する後天性フォンビレブランド症って VWF の機能を制御することが動脈性の出血候群（aVWS）を呈する。特に AS に下血など症、血栓症いずれにとっても非常に重要であるが、の消化管出血を合併する病態を Heyde 症候群

現在は動脈系では「血小板」静脈系では「トロンと呼んでいる 1) 。しかし診断確定に必要なビンを中心とする凝固因子」による病態説明、治VWF の解析が実施困難であることもあり、日療が主体となっており、VWF 関連の疾患や治療は本国内の臨床医にはほとんどその存在は知ら

ほとんど行われていない。

れていない。我々の検討では、重症 AS のほと

VWF は、早い血流に生じる高ずり応力下で活性化んどが aVWS であり、その患者数は数万人にされる一方、高ずり応力下では VWF 切断酵素であ及ぶ可能性があると発表している 2)。そのようる ADAMTS13 によって切断され、絶妙に機能が制な AVWS の患者に Heyde 症候群がどれくらい御されている。VWF は主として血管内皮細胞で産含まれているかもまだ分かっていない 3)。今回、生され、分泌直後は非常に大きな分子量（2,000

循環器疾患に伴う AVWS 代表的疾患である

万ダルトン以上）の超高分子量 VWF 重合体(UL-AS のように流速の非常に速い左心系ではなく、

VWFM)である。UL-VWFM は血液中では ADAMTS13 に右心系にも AVWS が存在するかについて検討より切断されて、50 万〜1500 万ダルトンの様々

を試みた。

10

年
齢

性別

1

65

女性

自宅で失神、救急搬送

変形性
股関節症

2

78

女性

1週間前からの進行性呼吸苦

肺癌
肺高血圧症

3

70

女性

4

75

5

発症時期

出血
症状

基礎疾患

DVT

治療

有

tPA
Heparin有Heparin

1週間前からの進行性呼吸苦有Heparin女性

リハビリ中の突然の呼吸苦有Heparin78

女性

13日前からの進行性呼吸苦有tPAHeparin

651

男性

1ヶ月前からの進行性呼吸苦と
失神

ADL低下

有

tPA
Heparin

7

77

女性

突然の呼吸苦II型糖尿病血痰有Heparin

8

77

女性

造影CT時偶発的に発見、入院
加療

骨髄性白血
病

性器不正 有出血

tPA
Heparin

980

男性

造影CT時偶発的に発見、入院
加療

COPD
胆石

有

Heparin

慢性 PE では治療前に欠損は認められなかった。

10

63

女性

造影CT時偶発的に発見、入院
加療

肺癌

有

Heparin

また、抗凝固療法中に▽に示すように 10 例中 3

喀血

NP 前 Day1 2NP
前 1 朝2 昼 2 3 3 4 4 5 5 6

NP
1 12
NP 前
前
5hr 朝

3 3 5 66

NP
NP 前前
Day1122 3
3 3 44 77 14
14

夕

朝

夕

（図 2)慢性(無症候性)肺血栓塞栓症のマルチマー解析

Ⅱ.方法・対象

例で高分子 VWF マルチマーの欠損を認めた。抗凝2014 年 9 月から 2016 年 7 月までに当院で加療し固療法前に高分子欠損を認めた 4 症例中 2 例で喀た急性、慢性肺血栓塞栓症(PE)10 例について、血や血痰など出血症状を認めた。また抗凝固療法

診断時、抗凝固療法中の経時的採血の残血より前に高分子 VWF マルチマー欠損を認めた 4 症例すADAMTS13 活性、VWF マルチマー解析を行い、AVWS

べてにおいて、抗凝固開始後速やかに欠損は改善を呈しているかを確認した。対象は 51 歳から 80していた。

歳、男性 2 名、女性 8 名であった。10 例のうち急性の PE（症候性）は 7 例、無症候性(

Ⅳ.考察慢性)PE が 3 例であった。詳細は以下に示す。

現在高分子マルチマーが欠損する病態としては以下のものがあげられる。

(表 1)対象患者背景

1)過剰に VWF が血小板と血栓を形成して、消耗性

Ⅲ.結果に高分子 VWF マルチマーが減少する。

抗凝固療法前後の経時的採血 VWF マルチマー解ex) 血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)

析を以下に示す。

2)ADAMTS13 により高分子 VWF マルチマーが過剰に切断される。
ex)Heyde 症候群
TTP に代表されるような 1)の場合、消耗性の血小板数の低下が出現するため、高分子 VWF の欠損と

NP 前

1 2

3 NP 前 1 2 3 4 6 8 NP 前 1 1 3 3 3 5 NP

NP 前

1 4 7

血小板数について解析を行った。

9

Heyde 症候群に代表される 2)では ADAMTS13 活性の差や、AS と同じく血栓塞栓による肺動脈血流速度の上昇に基づくずり応力の上昇が VWF の過
NP 前

1

2

3

治療前に高分子VWF欠損

NP 前

1 2 4

NP 前

剰な切断に寄与すると考えられたため、高分子

1 4 6 9 13

治療中に高分子VWF欠損

VWF の欠損と ADAMTS13 活性、三尖弁圧格差につ（図１)急性(症候性)肺血栓塞栓症のマルチマー解析

いて解析を行った。
i)高分子 VWF 欠損と血小板数

急性 PE 例では▼に示すように、7 例中 4 例で診

高分子 VWF 非欠損群、欠損群について診断時の血断時に高分子 VWF 欠損を認めた。

小板数を比較検討した。最低値で 5 万/ul まで低下した症例を認めたが、両群間で有意差は求めな

11

かった。
（表 2）

（表 4)三尖弁圧格差と高分子 VWF 欠損の関係
症例
No

診断時の
三尖弁圧格差(TR-PG mmHg)

高分子VWF
欠損の有無

診断時の
血小板数
(×104)

高分子VWF
欠損の有無

142mmHgあり

278mmHg

あり

1

34.7

有

3

45mmHg

なし

2

15.6

有

4

22mmHg

なし

3

16.4

なし

5

56mmHg

あり

4

16.8

なし

6

38mmHg

なし

5

23.8

有

7

ND

あり

6

19.6

なし

8

32mmHg

なし

7

18.5

有

9

23mmHg

なし

8

5.7

なし

10

ND

なし

9

20.5

なし

10

29.7

なし

血小板数（×104）

症例
No

欠損なし

P<0.05

三尖弁圧格差（mmHg）

表 2 高分子 VWF 欠損と血小板数

欠損なし

欠損あり

欠損あり

iv)高分子 VWF 欠損と出血症状との関連性ii) ADAMTS13 活性と高分子 VWF 欠損の関係

抗凝固療法前に出血症状を認めたのは 3 例、高分高分子 VWF 欠損群、非欠損群について診断時の血

子 VWF 欠損を認めたものは 4 例であった。出血症

小板数を比較検討した。非欠損・欠損群の状を認めた 3 例のうち、高分子 VWF 欠損を伴ってADAMTS13 活性の平均値は 65.53%、55.65%で両群いたものは 2 例(約 66.7%)であり、PE における間に有意差は認められなかった。欠損を認める群

AVWS が出血性素因に関与している可能性が大きでは ADAMTS13 の平均活性が低かった。(表 3)く示唆された。しかし、高分子 VWF 欠損を認める
が出血症状を呈していない症例の 2 例も存在し（表 3)ADAMTS13 活性と高分子 VWF 欠損の関係ていたことから、必ずしも高分子 VWF が欠損する

診断時のADAMTS13活性
(％)

欠損の有無

1

61.1

あり

2

56.2

あり

3

70.7

なし

4

90.6

なし

5

70.3

あり

6

76.6

なし

7

35

あり

8

60.9

なし

9

50

なし

10

44.4

なし

のみでは出血しないと考えられた。本来臨床的にはフォンビレブランド病とは関節などの損傷す

ADAMTS13活性（％）

症例
Noることの多い動脈からの出血、Heyde 症候群はぜい弱な消化管動脈からの出血症状を呈する疾患である。高分子 VWF 欠損とともに、何らかの破綻
欠損なし

欠損あり

しやすい動脈の存在が必要である。今回の PE 患者において悪性腫瘍などの破綻しやすい動脈の有無などのより出血するかしないかが左右されiii)三尖弁圧格差と高分子 VWF 欠損の関係る可能性が考えられる。症例 2 は三尖弁圧格差の高分子 VWF 欠損群、非欠損群について診断時の三上昇と高分子 VWF 欠損、出血部位に悪性腫瘍を認

尖弁圧格差を比較検討した。ただし、症例 7,10

めることから、AVWS による出血が強く疑われた。

については診断時の三尖弁圧格差は測定されて（表 4) 高分子 VWF 欠損と出血症状の関係いなかったため、8 例で検討した。非欠損・欠損
群 の 三 尖 弁 圧 格 差 の 平 均 値 は 32.00mmHg 、

症例
No

58.67mmHg で両群間に有意差が認められ、8 例と

癌の合併

有

1

少ないサンプル数にも関わらず三尖弁圧格差の2

高分子VWF 治療前の欠損の有無 出血症状

肺癌

有

有（喀血）

増大と高分子 VWF 欠損には相関性が示唆された。

5

有

(表 3)

7

有

有（血痰）

無

有（性器
出血）

8

12

白血病

症例２について更に詳細な臨床データ、経過とマ

尖弁圧格差を認めることから、AVWS を合併した

ルチマー解析の結果を示す。

急性 PE を強く疑った。よって高ずり応力の原因【現病歴】78 歳女性。肺小細胞癌（未治療）、肺となる血栓に対して抗凝固療法を開始した。抗凝高血圧、慢性腎機能障害で通院中。1 週間ほど前

固療法中の臨床経過、マルチマー解析、血液検査

より労作時呼吸困難感と喀痰に少量の血痰を認

データを示す(図 3)めたため、肺高血圧の悪化や肺血栓塞栓症疑い緊

day2
軽度
呼吸苦

急入院を指示された。胸部 CT 上腫瘍増悪やリンパ節腫張認めず、下肢エコーにて深部静脈血栓を

BiPAP
FiO2 0.5 0.4 0.3

認めた。心臓エコー検査から三尖弁圧が上昇に伴

day2
軽度
呼吸苦

Day6～9
SpO2
軽度低下

BiPAP
FiO2 0.5 0.4 0.3

経鼻2L

Day6～9
SpO2
軽度低下

経鼻2L

喀血

喀血
Heparin開始

120

う右心不全を示唆する所見であったため右心不100

全対策として酸素投与を開始したが入院日深夜、
突然の低酸素血症、呼吸苦とともに、喀血を認めため NIPPV 管理を開始した。臨床経過から PE を疑うが、腎機能障害のため造影 CT は困難であっNP 前 1 2 3 4 6
Heparin投与後日数

8300

Heparin
開始

D-D

FDP

ADAMTS13

VWF

250

80

200

60

150

40

100

20

50

0

0

前 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Heparin投与後日数た。単純 CT・MRI を試みるが血栓の確定を得られなかった。臨床症状からヘパリン投与を考慮する

図 3 臨床経過とマルチマー解析

が、喀血が続くために投与に苦慮していた。

ヘパリン開始後翌日には高分子 VWF 欠損は改善していた。また、血液検査では FDP、D-dimer な(表 5)検査結果

ども改善していた。臨床症状では抗凝固療法開始
血液検査
【末梢血】
RBC
HBG
HCT
Plt
WBC
【生化学】
AST
ALT
LDH
γ GTP
BUN
Cre
T-bil
Na
K

411
13.2
38.7
14.7
7600

万/μ l
g/dl
%
万/μl
/μl

32
9
374
27
20 0
1.33
0.6
137
4.6

IU/l
IU/l
IU/l
IU/l
mg/dl
mg/dl
mg/dl
mEq/l
mEq/l

後喀血、呼吸苦も同時に改善していった。入院病【止血・凝固系】
PT-INR
aPTT
FDP
D-dimer日 3 日目には経鼻酸素投与のみで体内の酸素化

1.05 秒
28.1
87.8 μ g/ml
27.1 μ g/mlを維持できるようになった。

この症例において入院病日 2 日目に突然高分子
VWF の欠損を呈していた。症例 2 のみならず、症例 7、8 でも同じく抗凝固療法中に突然の高分子
VWF の欠損を呈していた。加療途中に高分子 VWF
欠損を呈していた３例をカルテにて後方視的解血液検査から D-dimer 上昇を認めるが、血小板数析を行うと 3 例中 2 症例において、高分子 VWFは維持されていた(表 5)。旧厚生省 DIC スコアで欠損した日に突然の経皮的酸素濃度(SpO2)の低は 6 点であり、DIC による出血も疑われたが、プ下や、一時的に酸素投与量増加を施されていた。

ロトロンビン時間、活性部分プロトロンビン時間

しかし、どの症例も抗凝固療法中であるため、「肺には異常は認められなかった。

血栓塞栓の再発」を疑うことなく、翌日には症状

当院輸血部にて VWF マルチマー解析を行った。そ改善していた。

の結果、高分子 VWF マルチマーが欠損していること、以前から止血困難などのイベントを認めず、このような、状況から PE は抗凝固療法中に再発

フォンビレブランド病と診断されたことがなかしている可能性が示唆され、三尖弁圧格差がったこと、呼吸苦が急性進行であったこと、心臓40mmHg 以上であれば、VWF マルチマー解析でも、エコー検査で以前から認められていた以上の三

PE の補助的診断が可能かもしれない。

13

Ⅴ.結論（まとめ）

い弱な血管のリスクを有していなくても、これら

PE 抗凝固療法開始前に 10 例中４例で、高分子量のカテーテル検査、血液ガスの測定、動脈ライン

VWF マルチマーの欠損を認めた。高分子 VWF の欠の留置など動脈への侵襲を伴う医療行為によっ損群と、非欠損では、血小板数、ADAMTS13 活性て出血傾向を呈する可能性が予想されるので注では有意差を認められなかったことから、VWF の意する必要があると思われる。

欠損には血小板による消耗や ADAMTS13 活性の差による過剰な切断ではないと思われる。三尖弁圧

Ⅵ. 研究協力者

格差との関係性では、圧格差が上昇すると有意に

松本雅則

奈良県立医科大学

輸血部

教授

高分子 VWF が欠損することが示された。同時に、

酒井和哉

奈良県立医科大学

輸血部

病院助

高分子 VWF 欠損を呈すると思われる圧格差は

教

40-50mmHg 前後ではないかと今回の解析から示唆された。肺動脈の血圧は、正常値は収縮期圧

Ⅶ. 文献30～15mmHg、拡張期圧 8～2mmHg、平均圧 18～1) Loscalzo J. From clinical observation to mechanism –9mmHg とされており 4)、大動脈に比べその圧

Heyde's syndrome. N Engl J Med 2013;368:579-80

格差は 1/5～1/3 と小さい。そのため VWF を切断

2) Yamashita K, Yagi H, Hayakawa M,

するために必要なずり応力はかからず、右心系でTaniguchi et al, S: Rapid restoration of thrombus

は AVWS はあまり起きないということが定説とな

formation and high-molecular-weight von Willebrandっていた。しかし今回 10 例ではあるが小規模な

factor multimers in patients with severe aortic stenosis

解析においても 4 例の AVWS を発見することがでafter valve replacement. J Atheroscler Thromb, 2016; 23:

きた。また、VWF 切断が亢進すると思われる肺動1150-1158.

脈の圧力として三尖弁圧格差で 40-50mmHg とそ3) Lenting PJ, Casari C, Christophe OD, Denis CV. vonの閾値を算定した。今後さらにデータを拡充してWillebrand factor: the old, the閾値の特定を進めていくことが必要である。

new

しかし、高分子 VWF 欠損症例すべてに出血症状

and

the

unknown.

J

Matsumoto M,

Thromb

Haemost.

2012;10(12):2428-2437.

が認められたわけではなかった。本来高分子 VWF

4) 難病情報センター.肺動脈性肺高血圧症（指定難病８６）を欠損することで出血傾向を呈する代用的疾患[internet].東京:厚生労働省;2012 Apr 24. Available from:であるフォンビレブランド病や Heyde 症候群でhttp://www.nanbyou.or.jp /entry/253. Japaneseは、破綻しやすい動脈が存在しその部位から出血しやすい特性がある。よって、今回の PE で AVWS
であり、なおかつ出血する症例を解析すると、癌などのぜい弱な動脈を有する基礎疾患を有する症例で出血しやすくるのではないかと推測された。
このようなことから、三尖弁圧格差が 40-50mmHg
以上の急性 PE においては、出血を来す基礎疾患を持つ症例では出血のリスクに注意が必要である。また、最近ではカテーテル治療の発展、ICUなどの生体機能測定技術が発達して、動脈ラインから治療や測定を行うことが増えてきている。ぜ14

新規接着因子、JCAD を介した生活習慣病と血栓性疾患の関連性の解明

神戸大学大学院医学研究科 内科学講座
循環器内科学分野・特命助教

原 哲 也
Ⅰ．緒 言

することを目標とする。

生活習慣病と呼ばれる高血圧、脂質異常症、糖尿病は動脈硬化性疾患の危険因子であることは広く知ら

１．生活習慣病によって JCAD 分子がどのような変化、れているが、血液凝固異常の代表的疾患である「深部静修飾をうけるかを明らかにする。

脈血栓症」と生活習慣病の関連性はほとんど知られおら

２．JCAD が血液凝固疾患である深部静脈血栓症の発ず、生活習慣病と血液凝固疾患をつなぐ分子機序は不症にどのような分子機序で影響を及ぼしているのかを、明な点が多い。

生体分子イメージング手技を駆使して、明らかにする。

そのような現況の中、近年のヒトゲノムワイド関連研究

Ⅱ．対象・方法（GWAS）によって、心筋梗塞に関連する新規の分子として JCAD（Junctional protein associated with coronary

１. 培養細胞を用いたトロンビン刺激後の催血栓性変化における JCAD の役割の解明

artery disease）が同定されたが(1,2) 、JCAD が心筋梗塞に影響する分子機構は不明である。
(i)心筋梗塞は動脈血栓症であること、(ii)JCAD は血JCAD はトロンビン刺激によりリン酸化修飾をうけること

管内皮の接着因子であること、(iii)トロンビン刺激でリンが、近年の網羅的解析により明らかとなった (3)。培養ヒ酸化修飾を受けること (3)から、JCAD は血管内皮におト内皮細胞において siRNA 等を用いて JCAD のノックダ

いて血液凝固反応を制御しているのではないかと申請

ウンないし過剰発現を誘導し、トロンビン刺激後の組織者は着想し、JCAD と DVT との関連性を前実験的に解因子やトロンボモジュリンなどの血栓関連因子の発現の析したところ、JCAD-/-マウスでは野生型マウスに比変化を分子細胞学的手法を用いて（ウェスタンブロット、べ、大型の DVT が形成されることが分かった（図１）。

リアルタイム PCR 法など）検証する。これにより、トロンビ

すなわち、心筋梗塞と臨床的に関連することが証明さ

ン刺激による JCAD のリン酸化修飾が、血栓形成シグナ
ルに関わるか否かが明らかとなる。

２． 脂質異常症モデル等における生体内での JCAD 発
現の変化の解明
ApoE-/-マウスによる脂質異常症モデルマウスにおいて、大動脈やその他組織での JCAD 発現レベルの経時的変化を明らかにし、野生型マウスと比較する。これによって、生活習慣病による生体内での JCAD への影
響を明らかにする。

れている JCAD 分子が血液凝固疾患である DVT の形成も制御していることが強く示唆された。それゆえ、生活

Ⅲ．結 果
１. 培養細胞を用いたトロンビン刺激後の催血栓性変化における JCAD の役割の解明

習慣病による血管内皮障害が血管内皮細胞に発現する
JCAD 分子の異常を引き起こし、それによって、血液凝固反応が亢進する、という仮説をたて、以下を明らかに

15ヒト臍帯血静脈内皮細胞（HUVEC）にトロンビン
刺激を行い、それによるシグナル伝達経路におけるJCAD の役割を解明するために、JCAD を siRNA を用いた特異的ノックダウンを行い、WB による各種シグナル分子の分子動態を検討した。

図２ WT マウスとApoE-/-マウスにおける各種臓器でのJCAD 発現結果、図２にのように大動脈や脂肪組織においてRT—PCR 法で JCAD 分子の発現レベルを解析すると、
ApoE ノックアウトマウスにおいて血管での JCAD 発現が抑制される傾向にあることがわかった。一方、腎臓や肝臓では発現に差は認めなかった。これはおそらく腎臓や肝臓内の mRNA 内においては血管成分の影響は非常に低いためだと考えられる。
それゆえ、動脈硬化がおこるような炎症性刺激によって JCAD の発現が抑制されているのか、もしくは単純に血中の脂質濃度が影響しているのかを明らかにするために培養血管内皮細胞（HUVEC）に TNF 刺激を

図２ JCAD 特異的ノックダウンによるトロンビン刺激後のシグナ行い、JCAD の発現レベルの経時的変化を RT-PCR 法を

ル伝達の変化用いて検討した。
図２のようにJCAD のsiRNA による特異的ノック結果、下の図３の様に、TNF 刺激によって JCAD 発現

ダウンノックダウンが確認された。Akt シグナルはやが減少する傾向があった。

や亢進しているようにも見えるが、そもそもトロンビンによる Akt のリン酸化レベルが低く、差は明らかではなかった。一方、ERK のリン酸化は JCAD のノックダウンにより明らかに抑制された。すなわち、
JCAD はトロンビン刺激によるシグナル伝達経路のうち、特に ERK のリン酸化に関わることが明らかとなった。
また、JCAD をノックダウンした状態でトロンビン
刺激による組織因子の発現の変化を検討したところ、JCAD 特異的ノックダウンにより、トロンビン刺激で誘導される組織因子の発現レベルが亢進した。

図３ HUVEC における TNF 刺激後の JCAD 発現の経時的変化

２． 脂質異常症モデル等における生体内での JCAD 発
現の変化の解明

Ⅳ．考 察
今回、我々はトロンビン刺激後のシグナル伝達におApoE-/-マウスによる脂質異常症モデルマウスにける JCAD の役割において、特に ERK のリン酸化経

おいて、大動脈やその他組織での JCAD 発現レベルを路に影響していることを明らかにし、動脈硬化モデル

野生型マウスと比較した。

である ApoE ノックアウトマウスにおける JCAD 発

16

現レベルの変化、すなわち脂質異常症による動脈硬化

Europeans and South Asians identifies five

性変化において血管壁における JCAD 発現が減少す

new loci for coronary artery disease. Nat

ることがわかった。さらにその機序を明らかにするた

Genet 2011;43:339-44.
2.

めに培養血管内皮細胞に炎症刺激（TNF）を加えて、Erdmann J, Willenborg C, Nahrstaedt J et

それによる JCAD 発現の変化も検討したが、炎症性al.

刺激によって血管内皮細胞における JCAD 発現が減identifies a new locus for coronary artery

少することがわかった。

disease on chromosome 10p11.23. Eur

すなわち、JCAD は脂質異常症を始めとする、生活Genome-wide

association

study

Heart J 2011;32:158-68.
3.

習慣病のような血管内皮に炎症性刺激が加わるよう

van den Biggelaar M, Hernandez-Fernaudな状況では血管内皮における発現が減少する。そしてJR, van den Eshof BL et al. Quantitative

JCAD 発現の減少は、ノックダウンによる in vitro のphosphoproteomics

実験結果によればトロンビン刺激による ERK のリン

dynamics of thrombin signaling in human

酸化を抑制し、組織因子の発現が亢進された。

endothelial cells. Blood 2014;123:e22-36.

これはおそらく、JCAD はトロンビン刺激による血管内皮細胞の向血栓性変化の negative feedback 機構に何らかの機序を介して関わっており、トロンビン刺激のブレーキ的な役割を果たしていることが予想される。このブレーキである JCAD が生活習慣病による炎症性刺激で発現が低下することが、動脈硬化による動脈血栓、すなわち心筋梗塞の発症に影響するという、GWAS（ヒトゲノムワイド研究）結果を説明しう
る機序であると推測された。今後はより詳細な分子機序の解明により、この JCAD 機能を制御することによる動脈硬化、血栓症の新規治療法の開発が望まれる。

Ⅴ．結 論
JCAD 分子はトロンビン刺激における血管内皮細胞でのシグナル伝達経路のうち、ERK のリン酸化を介することによって刺激伝達を制御している。また、
APOE ノックアウトマウスにおいて、血管壁における
JCAD 発現が減少しており、培養血管内皮細胞においても TNF による炎症刺激によって減少したことから、
生活習慣病による慢性炎症状態によって JCAD の発現が減少することが、心筋梗塞発症の機序の一つである可能性が示唆された。

Ⅵ．研究協力者
石田達郎 神戸大学大学院医学研究科 内科学講座
循環器内科学分野 特命教授
杜隆嗣 神戸大学大学院医学研究科 立証検査医学分野 特命准教授

Ⅶ．参考文献
1.

Coronary Artery Disease Genetics C. A
genome-wide

association

study

in

17

unveils

temporal熊本地震血栓塞栓症予防プロジェクト

熊本大学医学部附属病院循環器内科・特任助教

末 田 大 輔1)われわれは震災は発生した当日より県内 20 施設

Ⅰ．緒 言
近年、大規模地震を含む自然災害と静脈血栓塞栓(熊本大学医学部附属病院、熊本中央病院、済生会熊症（VTE）との関連が明らかになってきており、そ本病院、国立病院機構熊本医療センター、熊本赤十

れらはマスメディアに大きく取り上げられ、社会問

字病院、熊本市民病院、熊本機能病院、熊本地域医題ともなってきている。この関連が注目を浴びる理療センター、阿蘇医療センター、熊本労災病院、熊由としては、一度被災すると誰にでも発症する可能本総合病院、杉村病院、公立玉名中央病院、荒尾市

性があり、また重篤化するリスクが高いことが挙げ

民病院、
人吉医療センター、
天草地域医療センター、られる。

国保水俣市立総合医療センター、上天草総合病院、

災害後の避難生活では①車中泊，狭い避難所、床熊本再春荘病院、山鹿市民医療センター)に電話ある

生活(雑魚寝)などにより下肢静脈うっ滞、②ライフ

いは電子メール等を用い、熊本地震に関連し、VTE

ラインの途絶による水・食料不足およびトイレ不足により入院を要すると判断された患者がどの程度いによる摂水制限による脱水、③避難する際のけがなるか調査を連日行った。調査内容は人数、年齢、性どによる血管損傷など Virchow の 3 徴が重なるこ

別、車中泊の有無であった。その後各施設の倫理委とで、VTE が起きやすい。また大規模災害では様々

員会の承認を経て、必要に応じて臨床記録を閲覧し、な疾患発生が遷延し、VTE は最も長期にわたって発必要な情報を得た。調査は現在も継続されているが症する可能性がある。さらに VTE は震災直後の肺本稿では急性期・亜急性期にあたる発災から 2 か月

塞栓症による突然死のみでなく、その予防は長期的間の 6 月 13 日までを調査対象とする。

な 2 次的健康被害の予防にも重要である(1)深部静脈血栓症(DVT)は(1)造影 CT あるいは(2)2016 年 4 月熊本地震(3 回のマグニチュード 7 級

下肢静脈エコー、
肺塞栓血栓症(PTE)は(1)造影CT、の地震ととそに次ぐ余震)(2)が発生した。熊本は日(2)肺動脈造影、(3)肺血流シンチグラフィあるいは本の南西に位置し、図 1 に熊本の位置を示した。熊

(4)急性発症かつ心エコーなどで著明な右心系の拡

本県は発災直後より現在に至るまで本震災に関連す大などが確認され臨床的に診断された場合とした。

る VTE の発症数に関する調査を行っており、発災本調査で得られた 51 症例を車中泊を経験していから 2 か月間の 6 月 13 日までに VTE により入院をない群(9 症例)、
経験した群(42 症例)の 2 群に分け、要すると判断された患者が 51 名いるとの発表があ両群の臨床的特徴について考察した。

った。同時にこの 51 名のうち 42 名に車中泊の経験があったことが発表された。本稿では主に車中泊の2)統計解析

有無による臨床的特徴について述べ、①車中泊の危すべての統計値は平均±標準偏差で示した。群間の険性ならびに②行政・大学・基幹病院・マスメディ

比較に t 検定を用いた。P 値 0.05 未満を統計学的にアの連携の重要性について述べる。

有意であると判断した。すべての統計解析に the
SPSS software version 23 (IBM 社)を用いた。

Ⅱ．対象・方法
すべての工程はヘルシンキ宣言ならびにその改訂

Ⅲ．結 果

版に基づき実行された。また本研究は参加施設すべての倫理委員会の承認を得ている。

図2に本震災に関連して入院を必要とした患者数

18

の入院日別の推移を示した。われわれが後述する基幹病院への紹介を行い、弾性ストッキング着用指KEEP プロジェクトとして介入を開始した 4 月 19

導を含めた保健衛生活動も同時に行ってきた。
また、日以降 VTE の発生例が減少傾向にある。

熊本県庁のホームページを通じまして、全県下基幹

表 1 に本調査で得られた 51 症例を車中泊を経験

病院との共同でエコノミークラス症候群発症状況をしていない群(9 症例)、経験した群(42 症例)の 2 群

逐一報告することで、注意喚起を行った。

に分け、両群の臨床的特徴を示した。結果、車中泊

最終的に、を経験した群の方が、年齢は低く、発災から入院ま1） 大学、基幹病院、地元医院の地域医療機関、での日数が短く、肺塞栓を起こす率が高い。それに

2） 日本循環器学会、日本静脈学会、日本脳卒中協も関わらず、下大静脈フィルターを要した率は低か会、
日本臨床衛生検査技師会、
日本心エコー図学会、った。性別や既往などでは有意差を生じなかった。

日本心臓病学会等の主要学会、福島県立医科大学、
福井大学、新潟大学等の大学や県外医療機関からの

Ⅳ．考 察

団体・個人的支援

震災に限らず災害と VTE の関連性は数多く報告さ

3） 行政（厚生労働省、熊本県、熊本市）

れているが、発災早期から発生する急性肺血栓塞栓

4） マスメディアとの連携症（いわゆるエコノミークラス症候群）などの VTE

四位一体による活動となり、熊本地震血栓塞栓症予に対する予防活動体制は必ずしも確立されていない。

防 プ ロ ジ ェ ク ト ： Kumamoto Earthquakes

平成 28 年熊本地震では発災早期に車中泊の女性

thrombosis and Embolism Protection（KEEP）

がエコノミークラス症候群で死亡し、マスメディア

Project と命名することとした。

の報道が過熱するなか、平成 28 年 4 月 20 日、熊本

プロジェクトは、

県健康福祉部長名で日本循環器学会と日本静脈学会

1） エコノミークラス症候群の予防・啓発

に対しエコノミークラス症候群に関する正式依頼が2） 現状把握（サーベイランス）出された（具体的には、専門医師・技師・看護師派

3） 将来的な建設的提言

遣と弾性ストッキング依頼であったが、発災の非常3 つを軸とした。

に早期に行政から特定の主要学会に正式依頼がある活動にあたっては、日本循環器学会（プロジェクのは異例であり当時の熊本県の決断は高く評価されトリーダ−：啓二郎福岡大学教授）、日本静脈学会、るのではと思われる）。
その依頼の被災地受け皿とし

日本脳卒中協会、日本脳卒中学会、日本臨床衛生検て、熊本大学循環器内科はエコノミークラス症候群

査技師会（長沢光章副会長）、
日本心エコー図学会（中に対する予防・啓発活動を開始致した。また、正式

谷敏理事長）、日本心臓病学会、日本超音波医学会、

依頼とは個別に災害医療専門の新潟大学心臓血管外等の主要学会、また弾性ストッキング関連の企業、科呼吸器外科・榛沢和彦講師が 4 月 19 日に熊本入製薬企業、検査薬企業、検査機器企業、マスメディ

りされ、下肢静脈エコーを含めた DVT 一斉検診を

ア関連企業など、たくさんの方々のご支援があり、

熊本市民病院（橋本洋一郎先生、坂本憲治先生）、熊また KEEP プロジェクト発足当初から医療救護調

本赤十字病院（細川浩先生）、熊本大学スタッフと一整本部 JMAT 近藤祐史先生、厚生労働省現地対策本緒に開始していた。熊本県から学会への依頼に対し部高山啓先生、有賀玲子先生、国立循環器病研究セ

4 月 21 日に日本循環器学会からの要請で国立循環ンター小川久雄理事長、安田聡先生、新潟大学榛沢器病研究センターから専門スタッフが派遣され、ま和彦先生、熊本県健康づくり推進課の皆様、倒壊危た日本臨床衛生検査技師会の献身的なご協力と、そ機で入院機能停止となり積極的に活動に従事されまの後、熊本市エコノミークラス症候群対策責任者のした熊本市民病院の皆様（橋本洋一郎首席診療部長、長井洋平先生の合流、神経疾患がご専門の中島誠先

坂本憲治循環器医長のリーダーシップで看護師さん、生、安東由喜雄教授にもご指導頂き、これまでの災技師さんも含めまして）、
熊本赤十字病院細川浩先生、

害ではみられなかった一元化されたエコノミークラ

熊本大学消化器外科長井洋平先生等には特に大変おス症候群への対応が可能となり、活動を継続してき世話になりました。この場をお借りしましてお礼申た。具体的には、下肢静脈エコーを避難所、車中泊し上げたい。

の方々に施行し、DVT のスクリーニング、血栓の存急性期を過ぎた後も、避難所、仮設住宅での深部在では、血中 D-ダイマーを測定し、高値であれば、静脈血栓症一斉検診を含めたエコノミークラス症候

19

群予防・啓発活動を継続し、脳卒中、けいれん、た管系専門医が常駐しており、熊本県東西南北地域をこつぼ型心筋症、心不全、不整脈等の急性脳・心血十分にカバーしている。仮に、患者が対応困難な施管疾患の予防・啓発まで拡充し、また日本循環器学設を受診したとしても、必ず県内 20 施設のいずれ会、日本脳卒中学会、日本脳卒中協会との共同で、かに搬送されている。特に熊本市内においては各施

パンフレット、チラシを作成、配布し、二次的健康

設独自にモービル CCU を含むドクターカーを保有

被害を最小化する努力を行う必要がある。

しており、連絡があればすぐに出動できる体制がで本調査の結果に関して、車中泊を経験した群の方きている。また、離島や陸路が寸断された地域など

が、年齢が若かったことに関しては車中泊を経験す

車による搬送が困難な場合にはヘリコプターを使っる母集団が若年であったことに起因すると考えられ、た搬送も行われている。よって基本的に熊本大学医

病的な問題ではないと考えられる。特筆すべきこと

学部附属病院と県内の熊本大学医学部附属病院関連

は車中泊を経験した群の方が、発災から発症までの20 施設における患者数を算出することで県内の発日数が短く、肺塞栓を起こしやすいという点である。

症数がほぼ正確に把握できるものと考えられる。県

このことからも車中泊は単に VTE を起こしやすい

内の熊本大学医学部附属病院関連 19 施設は以前かという点のみならず重症化しやすいという点が今回ら臨床のみならず研究においても、熊本大学大学院の少ない症例数からでも顕著に示された。このこと

生命科学研究部循環器内科学、神経内科学を中心とは今回の震災から得た教訓として今後の災害医療にした相互の協力体制ができあがっていることから、活かす責任があると考える。

脳・心血管系の疾患の発症数などを含めた本研究は災害に関連して病気が発症、増悪することは認識十分に実施可能なものと考えている。本研究ではエされていたが、医療従事者、行政を含め広く知られコノミークラス症候群(肺塞栓症)、脳卒中、心筋梗るようになったのは1995年に発生した阪神•淡路大塞などすべての凝固異常を調査し、それが県内すべ

震災後である。これを期に 2004 年の新潟県中越地てを網羅されていることが重要であり、価値がある

震(3,4)、2011 年東日本大震災において震災に関連しと考える。本研究に際しては、第一人者である新潟て発症する疾患が調査され、長期にわたる避難生活

大学・榛沢和彦先生にもご参画いただき地震発生直により様々な疾患が問題になることが分かってきた。

後より的確な助言をいただいている。厚生労働省、

特に脳・心血管系臓器はストレスの影響を受けやす熊本県としても熊本地震被災者だけではなく日本国

く、しかも疾患の性質上緊急対応が必要になること

民へ震災後に発症しうる疾患の知識と予防啓発を進が多い。しかし、被災状況や二次災害など災害毎にめていく必要があると考えていることから、本研究状況は異なるため、日本のみならず世界においてもが今後の災害時の脳・心血管系疾患の対応に大きく

地震急性期に震災後に発生する疾患の予防が十分に貢献していくものと期待される。本研究の結果が、できず、対応が後手に回りがちである。今回の熊本各病院にとって地域に根ざす一端となり、医師にお地震ではマグニチュード 6.5 以上の地震が連続していても患者に情報を還元することで、患者に対して起こったことや収束する気配のない余震への恐怖か

病気に関する重要な意識付けになると思われる。

ら車中への避難を選択する被災者が多く、車中泊が今回の災害により、深刻な被害体験や、頻繁な余長期化し、心身とも長期的なストレスにさらされて震の継続によって引き起こされる恐怖や精神的ストいる特徴がある。このため熊本地震ではこれまでのレスが血栓症をいかに容易に促進するかが認識され震災とは状況が異なり DVT をはじめとする脳・心た。脱水や車中泊による血液の停滞により発症が加血管系疾患がより長期にわたって発症し、病状も重速したと考えられる。病気の概念を啓蒙することに症化することが予想される。したがって、熊本地震

よって VTE を完全に予防し治療することが急務で後に急性発症した脳・心血管系の疾患の発症数、発あると考えられる。

症状況、予後を正確に把握し、地震前と地震後でのⅤ．結 論

発症率の違いやこれまでの震災との違いを比較検討することで、将来の災害医療に対して重要かつ貴重

車中泊を経験した群の方が、発災から発症までのな情報となると考えられる。被災地広域の疾病発生

日数が短く、肺塞栓を起こしやすく、車中泊は単に数を正確に把握するためには多施設によるデータのVTE を起こしやすいという点のみならず重症化し統合が重要である。熊本県では 20 施設に脳・心血やすいことが分かった。今後の災害医療に活かす必20

要がある。

Ⅵ．研究協力者
掃本誠治・熊本大学循環器内科・准教授
橋本洋一郎・熊本市民病院・首席診療部長
中島 誠・熊本大学脳血管障害先端医療寄附講座・特任教授
榛沢 和彦・新潟大学心臓血管外科呼吸器外科・講師
小島 淳・熊本大学心不全先進医療共同研究講座・特任准教授
坂本 憲治・熊本市民病院循環器内科・医長
藤末 昂一郎・熊本大学循環器内科・医員

Ⅶ．参考文献1) 榛沢和彦. 災害と静脈血栓塞栓症. 最新医学別冊
新しい診断と治療の ABC. 最新医学社. 東京
2) Sueta D, Akahoshi R, Okamura Y, Kojima S,
IkemotoT,

Yamamoto

E,

et

al.

VenousThromboembolism Due to Oral Contraceptive
Intake and Spending Nights in a Vehicle-A Casefrom the 2016 Kumamoto Earthquakes. Internal
Medicine 2017;56:409-412.
3) Sakuma M, Nakamura M, Hanzawa K,
Kobayashi T, Kuroiwa M, Nakanishi N, et al.
Acute pulmonary embolism after an earthquake
in Japan. In: Seminars in thrombosis andhemostasis; 2006: Copyright© 2006 by Thieme
Medical Publishers, Inc., 333 Seventh Avenue,
New York, NY 10001, USA.; 2006. p. 856-860.
2008;129:152-154.
4)

Watanabe H, Kodama M, Tanabe N,

Nakamura Y, Nagai T, Sato M, et al. Impact ofearthquakes on risk for pulmonary embolism.
International

journalofcardiology

2008;129:152-154.

21

図１．熊本の位置。赤丸は震源地を指す。時刻は現地時間。M,マグニチュード。

12

10

8

6

4

2

0

図２. 入院を要した静脈血栓塞栓症の患者数

22表 1. 車中泊の有無による静脈血栓塞栓症入院患者の臨床的特徴

総計

車中泊なし

車中泊あり

(51 例)(9 例)(42 例)

67.3±14.2

79.8±12.1

64.6±13.3

0.001

男性 (%)

13(25)

2(22)

11(26)

0.81

発災から入院ま9.5±12.0

20.1±25.6

7.3±5.3

0.003

38(75)

3(33)35(83)

0.001

3(5.9)

2(11)

1(2)

0.24

肺疾患既往

1(2)

0(0)

1(2)

0.64

悪性腫瘍既往7(13.7)

2(22)

5(12)

0.44

脈拍数>100

2(3.9)

0(0)

2(5)

0.51

7(13.7)

1(11)

6(14)

0.81

呼吸数>304/49(8.2)0(0)4/40(10)0.36

体温<36.0 (℃)

7/49(14.3)

1(11)6/40(15)

0.77

D ダイマー値

14.1±13.1

21.8±23.7

12.5±9.30.07

抗凝固療法 (%)

35(68.7)

8(89)27(64)

0.16

血栓溶解療法

0(0)

0(0)

0(0)

N/A

0(0)

0(0)

0(0)

N/A

手術療法 (%)

0(0)

0(0)

0(0)

N/A

下大静脈フィル

8(15.7)

4(44)

4(10)

0.02

1(1.9)

0(0)

1(2)

0.65

年齢

P値

での日数 (日)
肺塞栓 (%)
心不全既往

(bpm)
収縮期血圧<100(mmHg)(µg/mL)(%)
経カテーテル療法 (%)

ター (%)
大動脈内バルーンパンピング療法 (%)

23