オートファジー；形態学と分子生物学の融合

Atg5 非依存性オートファジーの形態学と分子生物学
Molecular Biology and Morphology of Alternative Macroautophagy
清水重臣，荒川聡子，西田友哉

Shigeomi Shimizu, Satoko Arakawa and Yuya Nishida
東京医科歯科大学・難治疾患研究所・病態細胞生物
要旨

オートファジーは細胞内小器官などの自己構成成分を分解するシステムで，細胞の健全性の維持に貢献している．また，その機能異常は神経疾患や発癌など様々な疾患に関与することが報告されている．従来オートファジーの実行メカニズムは，酵母菌から哺乳動物まで保存されている複数の分子群 Atg5, Atg7, LC3 等によって完全に支配されていると考えられてきた．しかしながら，私たちは，Atg5, Atg7, LC3 などの分子に依存しない新たなオートファジー機構が存在することを発見した．この新規オートファジーは，ゴルジ装置やエンドソームを起源としており，Rab9 等の分子によって調節されている．また，細胞に DNA 傷害などのストレスが加わった時に強く誘導される他，赤血球が成熟する際に起るミトコンドリア除去にも関与している．

キーワード：オルタナティブオートファジー，ゴルジ装置，LC3，Rab9

1.

質やオルガネラを囲い込み，最終的には 2 重膜のオートファ
マクロオートファジーの形態学

マクロオートファジー（自食現象）とは，細胞内成分が二重の膜によって周囲から隔離され，リソソームと融合するこゴソームを形成する．オートファゴソームはリソソームと直接融合し，リソソームの消化酵素によってその内容物が消化される．とによって消化される細胞内浄化機構である．オートファジーとは，リソソームによって細胞構成成分が消化される現2.

マクロオートファジーの分子機構象のことであり，マクロオートファジー以外にも，①リソ上述した形態学的特徴が解析された一方で，この機構に関ソーム膜の陥入を介して細胞質成分が消化されるミクロ連する複数の分子が出芽酵母の解析により同定されていっオートファジーや，②個別の分子が直接リソソームに運搬さた 3,4）．即ち，出芽酵母では栄養源の枯渇によってオートファれて消化されるシャペロン依存性オートファジー，などが含ジーが誘導されることを利用して遺伝学解析が行なわれ，こまれる．ただし，単にオートファジーと称する場合は，通常れまでに 30 個以上のオートファジーに必要な遺伝子が同定二重膜形成を介して実行されるマクロオートファジーを意された．まず，オートファゴソーム形成の初期段階において味する．

は Atg1（セリンースレオニンキナーゼ）や Atg6（PI3 キナー

マクロオートファジーの研究は，電子顕微鏡観察による解ゼ構成分子）などが重要な役割を果たしている．続いて起こ析が端緒となった．即ち，ミトコンドリアなどが含まれたユる隔離膜の伸長には，Atg5, Atg12, Atg8 等が重要な役割をニークな二重膜構造物（オートファゴソームと呼ばれる）や，担っている．Atg5-Atg12 複合体は隔離膜の外膜に偏って分布これがリソソームと融合し内部が消化されたオートリソソーし隔離膜の伸長に寄与する．一方，Atg8 は，Atg5-Atg12 複ムが，肝臓の超微形態観察により発見されたことが出発点で合体依存的に脂質化され隔離膜やオートファゴソーム膜に結ある

1,2）．その後，オートファゴソーム／オートリソソーム合し，オートファゴソームを形成する 5）．の動態と役割が解析され，マクロオートファジーは栄養飢餓

現在，酵母の遺伝情報を基盤として，哺乳動物におけるマや分泌顆粒等のクリアランスに関与していることが明らかにクロオートファジー機構が解き明かされつつあるが，重要ななった．現在，マクロオートファジーの形態学的進行は下記

分子はその構造，機能共に酵母から哺乳動物細胞まで保存さのように考えられている．即ち，まず隔離膜と呼ばれる 2 重れている．例えば，Atg5 の遺伝子欠損マウスにおいては，膜が形成される．この隔離膜は伸長すると共に湾曲し，細胞①オートファジーが誘導されない細胞が存在すること，②こ〒 113–8510 東京都文京区湯島 1–5–45
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2010 年 3 月 1 日受付
94のマウスは生後 24 時間以内に死亡すること，が報告されており 6），Atg5 は哺乳動物のオートファジーにおいても重要な役割を果たしている．また，酵母 ATG8 の哺乳類ホモログの一つである LC3 は，オートファジーの実行過程でフォスファ
顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 Atg5 非存在下で誘導されるオートファジー
A：野生型および Atg5 欠損細胞をエトポシドで刺激したところ，同程度のオートファジーが誘導された．
B：エトポシド投与後に，オートファジーによるタンパク質分解活性を測定したところ，野生型細胞と Atg5 欠損細胞では同程度であった．
C：新規オートファジーには，LC3 の脂質化や GFP-LC3 のドット形成は伴わなかった．（Nishida et al., 2009, Nature, 461, 654–658 より改変引用）

チジルエタノールアミン（PE）と共有結合し，細胞質から化は見られなかった（図 1C）8）．即ち，新規オートファジー隔離膜に移動しオートファゴソームの形成に関わる．には LC3 の変化は伴わないものと考えられた．

3.

4. 新規オートファゴソームの形成は隔離膜とトランス・新しい分子機構を介したオートファジーの発見

ゴルジ／エンドソームの融合によりおこる

このように，酵母と哺乳動物のオートファジー関連分子は，機能的，構造的に良く保存されていることより，哺乳動物にそれでは，このような新規オートファジーはどのようなメおいても Atg5 の存在や LC3 と PE との結合は，オートファカニズムによって実行されるのであろうか？まず，既知のジーに必要不可欠であると考えられてきた．しかしながらオートファジー関連分子の中から新規オートファジーに関わ我々は，Atg5 マウスの胎仔には殆ど異常がみられない

7）

ことより，Atg5 に依存しない代替機構の存在を疑った．

る分子を検討したところ，Ulk1, Fip200, Beclin1 などオートファジー機構の比較的上流で機能する分子群は，新規オートこの代替メカニズムの存在を検討するために，野生型マウファジーにおいても重要な役割を果たしていることが判明しスと Atg5 欠損マウスより細胞を調整し，エトポシド（DNAた．一方，Atg7, Atg9, Atg12, Atg16 の関与はみられなかった．

傷害誘導剤）を用いて細胞にストレスを加えた．すると，野これらの分子は，隔離膜からのオートファゴソーム形成に必

生型細胞において大規模なオートファジーが観察されたばか須と考えられていることから，この反応の代替機構の存在がりか，Atg5 欠損細胞においても同程度の大規模なオートファ想定される．この機構を解析するため，微細構造観察等によジーが観察された（図 1A）7）．また，この際に，隔離膜，オーる検討を行った．その結果，①隔離膜はゴルジ体のトランストファゴソーム，オートリソソーム等，オートファジーの各側（トランス・ゴルジ）より伸張してくること，②オートファステップが観察できた．即ち，Atg5 欠損細胞においても，ゴソームの形成は，隔離膜とゴルジ体輸送小胞／エンドソー正常細胞と同様のメカニズムによるオートファジーが実行さムとの融合によって行われていること，を見出した．実際に，れているものと思われた．また，オートファジーに伴うタントランス・ゴルジやエンドソームの融合を担っている低分子パク質の分解も確認された（図 1B）．以上の結果より，Atg5

量 G タンパク質 Rab9 9）は，オートファゴソーム／オートリを必要としないオートファジーの存在が明らかとなり，このソソーム上に存在していた．また，Rab9 の発現を抑制する

オートファジーを我々は“alternative macroautophagy”（以下，と新規オートファジーの誘導は妨げられた 7）．これらの結果

7）「新規オートファジー」と記す）と命名した ．

より，新規オートファジーにおけるオートファゴソーム形成

上述の如く，LC3 と PE との共有結合は，Atg5 依存性のオーは，Rab9 を介した隔離膜とトランス・ゴルジ／エンドソートファジーに必須の現象である．その為に，この現象はオームとの融合によって実行されるものと考えられた（図 2）．

8）トファジーの多寡を示す良い指標として認識されてきた ．
そこで，新規オートファジーにおける LC3 の変化を検討し

5.

生体内での新規オートファジーの役割た．野生型の細胞にオートファジーを誘導すると，GFP 融最後に，新規オートファジーの生体内での存在を，Atg5合 LC3（以下 GFP-LC3）は細胞質から隔離膜に移動し，こ欠損胎仔を用いて検討した．その結果解析した全ての臓器（間の為 GFP-LC3 の局在はドット状に観察された．一方，Atg5脳，心臓，肝臓）において，新規オートファジーの存在が確欠損細胞では，オートファジーを誘導しても GFP-LC3 の変認された．また赤血球を観察したところ，この新規オートファ特集

Atg5 非依存性オートファジーの形態学と分子生物学

95【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 2 Atg5 非依存性オートファジーの実行機構の模式図
新規オートファジーにおけるオートファゴソーム形成は，隔離膜とトランス・ゴルジ／エンドソームとの融合によって実行される．電子顕微鏡像にて，融合途中の隔離膜（左）と融合が終了したオートファゴソーム（右）を示す．Scale bar = 0/1 μm．

哺乳動物には Atg5 に依存したオートファジーと依存しないオートファジーが存在しており，両者は刺激依存的に使い分けられているものと考えられる．

謝辞

本研究成果は，主に医薬基盤研究所の委託事業「オートファジー細胞死の制御を基盤とした癌分子標的治療薬の開発」にジーは赤血球の最終分化時におけるミトコンドリアの排除にて為されたものである．

7）

も貢献していた ．新規オートファジーの制御分子である
Ulk1 を欠損したマウスにおいて，赤血球のミトコンドリア除去が遅延することも報告されており 10），新規オートファジーが赤血球におけるミトコンドリア排除に関わっていることは間違いないものと思われる．このように，哺乳類のオートファジーには Atg5 依存性の従来から知られているオートファジーと Atg5 に依存しない新規オートファジーの少なくとも 2 種類が存在しており，両者は細胞の種類や刺激の種類によって使い分けられているものと思われる（図 3）．
6.

おわりに

本稿では，Atg5 や Atg7 に依存しない新規オートファジー機構に関して概説したが，現状において，新規オートファジーの全体像が明らかになっている訳ではない．具体的には，①新規オートファジーのメカニズムの詳細，② 2 種類のオートファジーの機能分担や相補性，③過去に報告されてきたオートファジーの形態学的な観察結果は，どちらのオートファジーに由来しているか，④種々の疾患との関連性，など，今後解決していくべき問題は多い．

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