研究助成業績報告集

第 26 回（2018 年度）バイエル循環器病研究助成『血栓症とがん』

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次 ＊

究

課

題

研 究 者

頁

1

Trousseau 症候群における脳灌流状態の把握と有効な治療
体系の探求

井上

学

１

2

がん誘発性血栓症における腫瘍由来ポドプラニンの寄与

竹本

愛

４

3

プロテオーム解析を用いた免疫チェックポイント阻害剤
による心筋炎発症メカニズムの解明

田尻和子

８

4

血栓の形成および退縮過程における CCR5 システムの病態生理学的役割の解明

樽谷

１２

玲

Trousseau 症候群における脳灌流状態の把握と有効な治療体系の探求ﾞ

国立循環器病研究センター・脳血管内科 医長

井上 学
Ⅰ．緒 言

何より救急の現場では使用し難い現状がある．それにTrousseau 症候群 1)は，潜在性の悪性腫瘍の遠隔効

比べ MRI の灌流画像は通常撮像の MRI に 1 シークエン

果から神経症状を生じる傍腫瘍性神経症候群の一つ

スを追加するだけで撮像が可能であり，患者移動の負であり，悪性腫瘍に伴う血液凝固亢進により脳梗塞を担や被曝の影響もない．

生じる病態である．脳組織は凝固外因系の引き金とな

欧米では標準化されつつある灌流画像解析ソフト

るトロンボプラスチンが豊富に存在しており，トロン

ウエア RAPID は，各種大規模な急性期脳梗塞の臨床

ビンの拮抗因子であるトロンボモジュリンが乏しい試験に使用されており，信頼性が高い．5−7 分間で自ため DIC (Disseminated intravascular coagulation：

動解析された CBF (cerebral blood flow; 脳血流量)・

播種性血管内凝固異常症）の標的臓器となりやすいと

CBV (cerebral blood volume; 脳 血 液 量 ) ・ MTTいわれているためである．この Trousseau 症候群の(Mean Transit Time;平均通過時間)・Tmax (time to

治療方針は原疾患の治療が最優先とされ，早期に腫瘍

maximum;造影剤の最大到達濃度)のマップから，を見つけ加療にあたることとされているが，脳梗塞のTmax が 6 秒より遅延している領域をペナンブラ領治療としては抗凝固療法のヘパリンが第一選択とさ

域 と 判 定 し た マ ッ プ を 拡 散 強 調 画 像 (diffusion

れているだけで，ワーファリンや最近では直接作用型

weighted image; DWI)の自動計測マップとともに並

経口抗凝固薬（DOAC）による予防なども検討されてべて表示することができる．DWI と Tmax のミスマ

いるが有効的なものはいまだ確立されていない 2)．まッチ比が 1.8 より大きければ target mismatch と呼た画像上の特徴として MRI (Magnetic resonance

び，急性期血栓溶解療法への反応が良いとされている．

imaging：磁気共鳴画像)で血管支配域に一致しない多

逆に DWI が 70ml より大きい場合は malignant

数の散在性高信号を呈することが多く，明らかな脳主profile6)として急性期血栓溶解療法が不良であり，症

幹動脈の閉塞などは見られないことから，通常の脳梗

候性脳出血のリスクが非常に高いとされている．

塞治療のターゲットとなる閉塞血管の再開通療法な本研究ではこの RAPID により Trousseau 症候群

どは選択肢に挙がらない．この散在性の微小梗塞を引の急性期脳灌流を評価し，これらの病態把握から有効

き起こしている全身性の凝固能異常が脳灌流に与えな治療ストラテジーを検討する．

ている状況は今までに探索されたことがなく，抗凝固Ⅱ．対象・方法
当センターを受診した 2018 年 7 月から 2019 年
5 月までの連続症例を対象とした．担癌状態であり，当院に急性期脳梗塞で緊急搬送され，かつ 24 時間以内に頭部造影灌流画像が撮像できた症例を対象とした．担癌状態の血栓症リスクとして Khorana
scale を評価し，D ダイマーなどの血液凝固マーカ
ーも合わせて評価した．灌流画像に関しては腎機能障害と造影剤アレルギーがない症例を対象とし，急性期灌流画像解析ソフト RAPID による解析を行療法と合わせて有効な治療を確立するためには，急性期脳灌流画像パターンを解析し，治療効果を検討する必要がある．
さて欧米では脳梗塞発症から早期に脳灌流状態が評価し，患者の治療効果を予測した先行研究があるが3)4)，日本では同様の研究が少なく，灌流画像の解析するソフトウエア 5)の開発も十分に検討されていない状況である．脳灌流の評価には PET(Positron emission
tomography：陽電子放出断層撮影)がゴールデンスタ
ンダードとされているが，高額で放射線被曝もあり，1

い，拡散強調画像(diffusion weighted image;
DWI)と灌流画像(perfusion weighted image; PWI)の異常分布を検討した．治療内容(内科的保存療法
もしくは血栓溶解療法)や退院時の日常生活自立度(modified Rankin Scale; mRS)も評価した．

図1

RAPID による DWI と PWI の出力マップ.

本症例は膵癌 Stage4 の 81 歳男性であり，他院治療中に左半身麻痺が出現し当院に搬送された．来院時発症時刻は不明で脳卒中重症

収縮期血圧 (mmHg)

165±28.8

拡張期血圧 (mmHg)

83.6±17.8

Body mass index

21.7±2.3

ヘモグロビン濃度 (g/dL)

12.8±1.6

3

白血球数 (10 /μＬ)

6.5±1.4

血小板数 (万/μL)

20.3±2.7

来院時血糖 (mg/dL)

137.1±37.1

LDL-コレステロール(mg/dL)

77.3±18.1

BNP(pg/ml)

80.8±70.9

D ダイマー(μg/mL)

5.5±4.6

Khorana scale (中央値，IQR)

1.5 (0.25-2)

発症時 NIHSS(中央値，IQR)

5.5 (2-14)

静注血栓溶解(rt-PA)療法(%)2(25)

発症前ｍRS3（0-4）

退院時ｍRS4（2-4）

画像背景度評価スケールである NIHSS(National Institutes of Health Stroke

灌流異常(%)

Scale)は 22 点で頭部 MRI/MRA では右半球に広範梗塞と右内頚動脈閉塞を認めた．続いて灌流画像検査も行い，虚血性コア(DWI)は
86mL, PWI で示されるペナンブラ領域(Tmax >6s)は 257ｍL と，

6(75)Tmax 6 秒の延長領域(mL)

97.5(69.8-178.3)

虚血性コア(DWI)領域(mL)

12(0-58.2)

target mismatch 症例であったが腫瘍の頭蓋内転移の可能性があり，Ⅳ．考 察

全身状態などの観点から積極的な血栓回収療法は見送った．

悪性腫瘍の患者が脳梗塞を起こす発症率は報告があるが，脳梗塞全体での Trousseau 症候群の発症率

Ⅲ．結 果

は報告が少ない．本研究では期間中 603 例の急性期期間中，担癌状態で急性期脳梗塞を発症した 12 例

脳梗塞症例のうち，12 例が担癌状態で脳梗塞を発症のうち，腎機能不全のため造影剤の使用ができなかっ

したが，約 2%の発症率は，他の Trousseau 症候群のた 4 例を除く 8 例（男性 7 名，女性１名）が解析対象

国内報告 7)とや国際レビュー8）ともほぼ合致する数字となった．平均は 83 歳であった．胃癌が 3 例，肺癌であった．

が 2 例，膵癌が 1 例，肝癌が 1 例，喉頭癌が 1 例でまたリスク因子として Trousseau 症候群の D ダあった．Khorana scale は中央値 1.5（IQR 0.25-2）

イマーの平均値が 5.5±4.6μg/ml と，他の脳梗塞ので中等度リスク症例が多かった．また全例において D

タイプと比較して著明に高値を示しており，その他のダイマーの上昇が見られた．急性期灌流画像にて灌流

血管リスクとして知られている脂質異常，血糖異常や異常を示した症例は 6 例であり，そのうち 2 例が遺伝

高血圧はさほど目立たなかった．Trousseau 症候群

子組み替え組織プラスミノーゲン・アクチベータ

では悪性腫瘍による凝固能亢進状態から血栓症を生(recombinant tissue plasminogen activator; rt-PA)

じる病態であるゆえ，悪性腫瘍合併脳梗塞は悪性腫瘍

による経静脈的血栓溶解療法を受けた．この 6 例の画

非合併脳梗塞と比較して高血圧，脂質異常症は有意に像背景として虚血性コアは中央値(IQR)で 12ｍL(0-低いとされており 9)，本研究からも脳梗塞発症機序と58.2)であり，ペナンブラ領域とされる Tmax 6 秒の延して通常の血管リスク因子よりも過凝固状態が大き長領域の中央値(IQR)は 97.5(69.8-178.3)であった．

く関わっていることが示唆された．

表１ 患者/画像背景

近年，急性期脳梗塞において DWI と PWI の比率

平均±標準偏差(SD)，中央値(IQR)もしくは率(%)

を見て安全に再灌流療法を行うことで治療時間枠がn=8
年齢 (歳)

83±4

男性(%)

7(88)

24 時間まで拡大した．本研究のように担癌状態で出血性リスクの高い症例は，安全性が評価できていれば積極的な再灌流療法も十分に可能であることがわか2

った．本研究で経静脈的血栓溶解療法を受けた症例は4)

Lansberg MG, Straka M, Kemp S, et al. MRI

2 例とも DWI と PWI の比率が 1.8 を上回っており

profile and response to endovascular reperfusion

安全性が画像上確認できており，また内科的治療およafter stroke (DEFUSE 2): a prospective cohort

び経静脈的血栓溶解療法後の出血性合併症は 0 例でstudy. Lancet Neurol. 2012;11:860-867.

あった．このように急性期脳灌流状態の評価は

5)

Straka M, Albers GW, Bammer R. Real-time

Trousseau 症候群に対して再灌流療法を行う際の安diffusion-perfusion mismatch analysis in acute

全性の指標となる可能性がある．残念ながら担癌状態

stroke. J Magn Reson Imaging. 2010;32:1024-1037.

であることで元々の日常生活自立度は中央値で 3 で

6)Inoue M, Mlynash M, Straka M, et al. Patients

あったが，治療後の日常生活自立度は大幅に悪化してwith the malignant profile within 3 hours of

いておらず，むしろ 5 例は元の ADL と変化なく退院

symptom onset have very poor outcomes after

できていることから，今後画像で安全性が確認できた

intravenous tissue-type plasminogen activator

場合は「Trousseau 症候群は積極的に脳梗塞治療をす

therapy. Stroke. 2012;43:2494-2496.

る」という治療体系に切り替えるべきかもしれない．

7)

赤塚和寛, 服部直樹, 伊藤瑞規ほか．当院でのTrousseau 症候群 40 例の臨床的特徴．脳卒中 2018；

Ⅴ．結 論

40: 421-426.

担癌患者における脳梗塞は多様であり，症例も少な

8)Cestari DM1, Weine DM, Panageas KS, et al.

いことから特徴的な患者画像背景を捉えることは困

Stroke in patients with cancer: incidence and

難であった．Trousseau 症候群における急性期脳灌流

etiology. Neurology. 2004;62:2025-30.

画像評価は，その後の安全な再灌流療法を実施する指9)標となる可能性がある．

Schwarzbach CJ, Schaefer A, Ebert A, et al.
Stroke and cancer: the importance of cancerassociated hypercoagulation as a possible stroke

Ⅵ．研究協力者

etiology. Stroke 2012;43: 3029–3034

豊田一則・国立循環器病研究センター・副院長
古賀政利・国立循環器病研究センター・脳血管内科部長

猪原匡史・国立循環器病研究センター・脳神経内科部長

森田佳明・国立循環器病研究センター・放射線部医長

Ⅶ．参考文献1) Trousseau A. Plegmasia alba
dolens. Lectures on clinical medicine,delivered at the Hotel-Dieu,
Paris. 1865;5:281–332.
2)

Varki A. Trousseau's syndrome: multiple
definitions and multiple mechanisms. Blood.
2007;110:1723-1729.

3)

Albers GW, Thijs VN, Wechsler, L et al. Magnetic
resonance imaging profiles predict clinicalresponse to early reperfusion: the diffusion andperfusion imaging evaluation for understanding
stroke evolution (DEFUSE) study. Ann Neurol.
2006;60:508-517.

3がん誘発性血栓症における腫瘍由来ポドプラニンの寄与
公益財団法人がん研究会 がん化学療法センター
基礎研究部・研究員

竹 本

愛

Ⅰ．緒 言

して、肺腺がん細胞株 A549 (ATCC)と PC-10 のポド

ポドプラニンは扁平上皮がん、骨肉腫、悪性膠芽腫

プラニンノックアウト細胞 (5) を使用した。それぞなど多様ながんで発現している膜貫通型糖タンパク

れの細胞は、PC-10 と A549 が 10% ウシ胎児血清質で、がん細胞が血行性に転移する過程において、血(FBS) を含む DMEM、SJSA-1 が 10% FBS を含む

小板上のレセプターCLEC-2 と結合することで血小RPMI1640、Sa-Xeno-147-P0 が 15% FBS を含む板の活性化・凝集を誘導する。このポドプラニンの作

RPMI1640 /Ham’s F-12 (1:1) を培養用培地として用用により、がん細胞は腫瘍塞栓として毛細血管に留まいた。

り、転移成立に繋がる ( 1)。また、血小板を纏ったがん細胞は、血流によるシアストレスや NK 細胞による抗体排除機構に対して抵抗性を示し、転移が助長される可エクソソームマーカーの検出用に、抗 Alix 抗体能性もある。我々は、これまでにポドプラニンが血小(Santa Cruz)、抗 Tgs101 抗体 (Santa Cruz)を用い、板凝集を介して転移を促進する経路、腫瘍増大を促進

ローディングコントロールの検出用に、抗 β-actin 抗する経路を明らかにしてきた (2)。また、ポドプラニ

体 (MBL) を用いた。ヒトポドプラニン中和抗体は所

ン―CLEC-2 結合を阻害できるポドプラニン中和抗属研究室にて樹立したマウスモノクローナル抗体

体を独自に創製し、マウスを用いた血行性転移のモデ

PG4D2 を用いた (3)。

ルにおいて、この中和抗体のがん転移抑制効果を示し
た (3)。そこで、このポドプラニン中和抗体を抗腫瘍

細胞外小胞の分画
70-80%コンフレントまでディッシュ上で培養した薬・転移阻害薬として臨床応用することを目指し開発
研究が進められている。

細胞の培地を通常の培養用培地から FBS 非添加の培

がん患者の静脈血栓塞栓症のリスクは、転移性のが地に置換し 2 日間培養した。その培養上清を回収し、んにおいてさらに増大することが知られる (4)。そこ

300 g, 10 min, 4℃で遠心続いて 2,000 g, 10 min で遠で本研究では、血小板凝集誘導活性示す転移促進因子

心することで細胞や死細胞片を除いた。さらに、そのであるポドプラニンの寄与に着目し、がん誘発性の血上清を 10,000 g, 30 min の遠心分離し、さらにその上栓症に繋がる経路とポドプラニン中和抗体による抑清を 100,000 g, 2 h 遠心後、沈殿を PBS(-)に懸濁し、制効果を検討する目的で、①がん由来遊離ポドプラニ

再度同じ条件で遠心しエクソソーム画分として回収

ンの検出と②がん由来血栓症モデルの構築を試みる

した (6)。その沈殿を PBS(-)に懸濁し、BCA Protein

こととした。

Assay (Thermo Fisher Scientific) によりタンパク定
量後、実験に用いた。エクソソーム生合成阻害剤であⅡ．対象・方法

る GW4869 (Sigma) は、FBS 非添加の培地に置換す細胞株と培養条件る際に 20 M で添加し、2 日間培養後、細胞外小胞

ポドプラニン陽性ヒトがん細胞株として、肺扁平上皮 が ん 細 胞 株の遠心分離に用いた。

PC-10 (Immuno-Biological

Laboratories, Gunma) 、 骨 肉 腫 細 胞 株 SJSA-1

マウス血小板凝集アッセイ(American Type Culture Collection, ATCC)、同意をマウスから 0.32% クエン酸を用いて心採血し、150得られた骨肉腫患者由来の検体から樹立した細胞株

g, 8 min, 室温で遠心し、血小板を含む血漿画分を回

Sa-Xeno-147-P0 を用い、ポドプラニン陰性細胞株と収した。さらに、500 g, 10 min, 室温で遠心し、血小4

板を沈殿させた。血小板を Tyrode’s buffer (0.4 mM

体による抑制効果が示された。ポドプラニン依存的なNa2HPO4, 11.9 mM NaHCO3, 137 mM NaCl, 2.7

血小板凝集が認められた細胞株について、がん細胞か

mM KCl, 1.1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose) に懸濁後、ら遊離したポドプラニンの存在を検討した。細胞を再度 500 g, 10 min, 室温で遠心し、洗浄血小板を回FBS を含まない培地で 2 日間培養し、培養上清から収した。Tyrode’s buffer に再懸濁し、血小板の濃度をトリクロロ酢酸沈殿させたタンパク質をウェスタン

測定し、2.5 x108/ml 血小板懸濁液（200 l/反応系）

ブロットで解析したところ、ポドプラニン陽性細胞としてアッセイに用いた。アッセイ開始時に細胞や細PC-10 の培養上清においてポドプラニンを検出した。

胞外小胞を刺激因子として添加し、血小板の凝集を一方で、ポドプラニン陰性細胞 A549, ポドプラニン

MCMヘマトレーサー313血小板凝集測定計でモニタをノックアウトした PC-10 細胞の上清からは当然ポーした。ポドプラニン中和抗体による抑制を検出する

ドプラニンは検出されなかった。それまでの検討にお際には、反応系の血小板懸濁液にポドプラニン中和抗いて、ポドプラニンを発現する細胞と異なり、細胞か体もしくはコントロールとしてマウス IgG2a を 5-50

ら精製した可溶性のポドプラニンは、多量に血小板懸g/ml になるようにあらかじめ添加し、2 分後に刺激

濁液に添加しても、血小板凝集を誘導することがなか

因子を添加しその後の凝集率を測定した。

ったことから、ポドプラニンの存在状態は血小板活性化誘導能に重要といえる。そこで次に、培養上清中に

In vivo での血小板活性化・血栓誘発の評価認められたポドプラニンが、がん細胞から遊離した可ポドプラニン陽性がんに起因した血栓症誘導モデ

溶性分子として存在しているのか、細胞外小胞に含まルとして、ポドプラニン陽性がん細胞やポドプラニン

れるのかを検討した。超遠心による細胞外小胞分画法

陽性がん細胞の培養上清から分画したエクソソームで培養上清を分画し、ポドプラニンの所在をウェスタの尾静脈移植、ポドプラニン陽性のがん細胞を皮下移

ンブロットで解析したところ、Alix、Tsg101 といっ植した担がんマウスモデルを用い検討を行った。血小たエクソソームマーカーが多く検出される画分にポ板活性化の検出のため、これらのモデルマウスからドプラニンの存在を認めた。さらに、中性スフィンゴ

0.32% クエン酸で心採血し、血漿を調製した。血漿のミエリナーゼ阻害剤である GW4869 処理によりエク

分離は、500 g, 10 min, 室温で遠心後上清を回収し、ソソーム生合成を抑制したところ、同画分からポドプ

さらに 10,000 g, 5 min 室温で再度上清を回収するこラニンが顕著に減少したことから、ポドプラニンが特とで行った。血漿は、-80℃にて保管した。血小板活性にエクソソームに存在していることが示された。また化の検出は、活性化によって放出された血小板由来増興味深いことに、ポドプラニンをノックアウトした

殖因子の ELISA (R&D)、マウス D-dimer の ELISA

PC-10 細胞から回収したエクソソーム画分中のエク(LifeSpan Biosciences)で行った。マウスは、SCID-

ソソームマーカー分子は、GW4869 処理同様、減少傾

beige またはBALB/c-nu (日本チャールスリバー)を用向にあった。この結果から、ポドプラニンがエクソソいた。

ーム中の構成因子に影響を与える可能性とエクソソーム産生量自体に影響を与える可能性が考えられた。

Ⅲ．結 果

一方、ポドプラニンを高発現している骨肉腫細胞株

市販のポドプラニン高発現ヒトがん細胞株、非発現

SJSA-1 については、培養上清にポドプラニンを検出細胞に加え、同意を得た患者由来の検体から我々が樹できなかったが、エクソソームマーカーも検出できな

立した細胞株を用いて以下の解析を行った。

かったことからエクソソーム産生自体が培養条件下①がん細胞由来遊離ポドプラニンの検出で低い細胞であると考えられた。続いて、ポドプラニ

まず、使用したポドプラニン発現細胞株が示す血小ン陽性エクソソームを含む画分に血小板活性化能が板凝集誘導活性におけるポドプラニンの寄与を検討

あるか検討を行った。ポドプラニン陽性がん細胞 PC-した。特にポドプラニンの高発現を示す肺扁平上皮が10, Sa-Xeno-147-P0 から超遠心で分画したエクソソん細胞株 PC-10 や骨肉腫細胞株 SJSA-1、Sa-Xeno-

ームを定量し、血小板凝集誘導アッセイに添加したと147-P0 を用いたところ、誘導された血小板凝集は、ころ、血小板凝集能を示した。また、誘導された血小ポドプラニン中和抗体の添加により、濃度依存的に抑板凝集はポドプラニン中和抗体添加によって濃度依制された。したがって、これらの細胞の血小板凝集能

存的に抑制された。一方、ポドプラニンを発現しないにおけるポドプラニンの寄与とポドプラニン中和抗A549 細胞の培養上清から取得したエクソソーム画分

5

は血小板凝集誘導活性が弱かった。ポドプラニンをノ

制効果の検証によりポドプラニンの寄与を明らかに

ックダウンした PC-10 細胞から回収したエクソソー

していきたい。

ムも血小板凝集活性を示したが、ポドプラニン中和抗Ⅳ．考 察体を添加しても抑制されなかった。以上の結果から、ポドプラニン陽性のがん細胞から放出されるエクソ本研究では、がん患者で問題となる血栓症におけるソームは、ポドプラニン依存的に血小板に作用し凝集

ポドプラニンの関与とその経路の解析とポドプラニを誘導することが示された。

ン中和抗体による抑制効果を検証できるモデルの構②がん由来血栓症モデルの構築

築を目指して検討を進めた。その結果、ポドプラニン①の結果を踏まえると、ポドプラニン陽性のがん患

陽性がん細胞からポドプラニンが遊離すること、細胞者においては、腫瘍から遊離したエクソソームに含まから遊離したポドプラニンがエクソソームに存在すれるポドプラニンが血小板を活性化・凝集させ血栓症

ること、そしてそのエクソソームがポドプラニンを介を誘導する可能性がある。我々が、がん治療薬としてした血小板凝集能を示すことを明らかにした。このこ開発を目指しているポドプラニン中和体が、このようとは、エクソソーム膜表面にポドプラニンが発現してなポドプラニン陽性がんに起因した血栓症を抑制す

おり、血小板凝集誘導に最重要なドメイン PLAG4 をる効果を付随することも期待される。そこで、これらエクソソーム膜外に提示していることを示唆していを評価する in vivo モデルの構築を行った。まず、ポる。ポドプラニンを高発現している細胞からは、低発ドプラニン依存的に誘導された血小板活性化・凝集を

現細胞より高レベルのポドプラニン発現エクソソー

検出する系の検討を行った。in vitro で血小板凝集誘ムが認められると予想された。しかし、ポドプラニン

導活性を示したポドプラニン陽性のがん細胞と活性を高発現する骨肉腫細胞株 SJSA-1 では上清中の遊を示さなかったポドプラニン陰性のがん細胞をマウ

離ポドプラニンおよびエクソソームマーカー分子のス尾静脈に移植し、in vivo での血小板の活性化を活レベルは低かったことから、がん細胞ごとにエクソソ性化によって放出される増殖因子の血中濃度を測定

ーム放出量は異なり、ポドプラニン陽性腫瘍であってすることで検出した。細胞を移植し 1 時間後の血漿にも遊離ポドプラニンによる血小板活性化のリスクがついて、ELISA で解析した結果、ポドプラニン陽性

高いとは限らないと思われた。また、がんの進行に従のがん細胞を移植した場合に、血小板由来増殖因子のってエクソソーム産生量が高まることが知られてい血中濃度が高かった。一方、ポドプラニン陰性のがんる (7)。よって、腫瘍のポドプラニン発現以上に、血細胞 A549 を移植した場合は、コントロールとして行

液中の遊離ポドプラニンの検出が血小板活性化およった PBS(-) 移植と同レベルの血中濃度であった。移び血栓症のリスクを予測するマーカーとして有用で植後 24 時間、48 時間の血液から調整した血漿を用いあるかもしれない。現在、がん研究会有明病院にて診て D-dimer の検出も ELISA で行ったところ、ポドプ療を受け同意を得られた患者で、特にポドプラニン発

ラニン陽性細胞移植により、血栓が生じたことを示す

現頻度が高い骨軟部腫瘍に罹患した患者から血液検

D-dimer のレベルが 24 時間で増加していた。この結体の収集を行っており、我々の構築した高感度サンド

果から、in vitro で血小板凝集能を示す細胞は、実際イッチELISAによるポドプラニン検出とD-dimerのに in vivo でも血小板の活性化を誘導し、その活性化検出を併せて行うことで、両者の関係を検討する計画

は血小板由来増殖因子や D-dimer の血中濃度のモニである。さらに今後は、がんに関連した血栓症が臨床ターで検出可能であることがわかった。尾静脈移植し上問題となるがん種における検討が特に重要である。

たポドプラニン細胞と同レベルの凝集能を示す量の少なくとも、血栓症のリスクが高い脳腫瘍においては、

エクソソームを移植すればポドプラニンを介したエ

ポドプラニンの発現頻度が特に高く、ポドプラニンのクソソーム誘導血栓症モデルの構築も可能でポドプ発現と予後との相関に加え(8)、ポドプラニン発現と静ラニン中和抗体による抑制効果を評価できると考え

脈血栓塞栓症のリスクとの相関も近年示唆された (9)。

られた。多量の培養上清中からエクソソームを調製す

また、ポドプラニン陽性頻度が 50%程度の卵巣明細ると共に、より臨床を反映したモデルとしてポドプラ

胞がんでは (10)、患者の 40%ほどで静脈血栓塞栓症

ニン陽性の担がんマウスを用い、血小板活性化およびが起こると報告されており (11)、
これらの腫瘍でポド血栓症マーカーの検出検討を進めている。最適なモデ

プラニンの関与がどの程度あるのか、ポドプラニンをルが得られたら、ポドプラニン中和抗体投与による抑高発現しているモデル細胞株とポドプラニン中和抗6role in pulmonary metastasis. Int J Cancer

体を用いて検討していく必要がある。

2014; 134: 2605-2614.
4)

Ⅴ．結 論

Blom JW, Doggen CJ, Osanto S, et al.

多様ながん細胞の細胞膜に発現し、血小板を活性化

Malignancies, prothrombotic mutations, andすることで転移を促進する因子であるポドプラニン

the risk of venous thrombosis. JAMA 2005;
293: 715-722.

が、がん細胞から遊離したエクソソーム上にも発現し5)ており、血小板活性化に寄与することが示唆された。

Miyata K, Takemoto A, Okumura S, et al.

したがって、ポドプラニンを発現するがんに関連した

Podoplanin enhances lung cancer cell growth

血栓症の誘導にこの経路が関与する可能性がある。まin vivo by inducing platelet aggregation. Sci

た、ポドプラニン陽性のエクソソームが誘導する血小Rep 2017; 7: 4059.
6)

板活性化・凝集はポドプラニンと血小板の結合を阻害

Hood JH, Pan H, Lanza GM, et al. Paracrine

できるポドプラニン中和抗体によって抑制すること

induction of endothelium by tumor exosomes.

が可能であった。がん転移抑制および抗腫瘍効果が期

Lab Invest 2009; 89: 1317-1328.

待され応用に向けた開発を進めているポドプラニン

7)

中和抗体の副次的効果として、そのがんに起因した血Greening DW, Gopal SK, Xu R, et al. Exosomes
and their roles in immune regulation and栓症の抑制も期待できる。腫瘍におけるポドプラニン

cancer. Semin Cell Dev Biol 2015; 40: 72-81.

の発現レベルだけでなく、エクソソーム放出の程度に8)も依存する経路であるため、エクソソーム上のポドプ

Eisemann T, Costa B, Harter PN, et al.

ラニンと考えられる血中のポドプラニンレベルは、ポPodoplanin

expression

isaprognostic

ドプラニン陽性腫瘍患者における血栓症の予測マー

biomarker but may be dispensable for the

カーとして可能性がある。

malignancy of glioglastoma. Neuro Oncol 2019;21: 326-336.

Ⅵ．研究協力者9)片山量平・がん研がん化学療法センター

Podoplanin expression in primary brain

基礎研究部・部長
tumors induces platelet aggregation and高木聡・がん研がん化学療法センター

increases risk of venous thromboembolism,

基礎研究部・研究員
Riedl J, Preusser M, Nazari PM, et al.

Blood 2017; 129: 1831-1839.

佐藤重男・がん研がん化学療法センター

10) Oe S, Hasegawa K, Nagase S, et al. Expression

基礎研究部・主任研究助手
高見美穂・がん研がん化学療法センター

of podoplanin in epithelial ovarian carcinomas

基礎研究部・研究助手

and its potential as a marker for clear cell

阿江啓介・がん研有明病院 整形外科・部長

adenocarcinoma. Int J Gynecol Pathol. 2010;



船内雄生・がん研有明病院 整形外科・医長

29: 405-10.

11) Duska LR, Garrett L, Henretta M, et al.

Ⅶ．参考文献1)

plateletaggregation-inducing

clinical guidelines: the case of venous

factorpulmonarythromboembolism in clear cell cancer of themetastasis. Am J Pathol 2007; 170: 1337-1347.

ovary compared with other epithelial histologic

Takemoto A, Miyata K, Fujita N. Platelet-

subtypes. Gynecol Oncol. 2010; 116: 374-377.

aggrus/podoplaninpromotes
2)

When 'never-events' occur despite adherence toKunita A, Kashima TG, Morishita Y, et al. The

activating factor podoplanin: from discovery to
drug development. Cancer Metastasis Reviews
2017; 36: 225-234.
3)

Takagi S, Oh-hara T, Sato S, et al. Expressionof Aggrus/podoplanin in bladder cancer and its

7プロテオーム解析を用いた免疫チェックポイント阻害剤
による心筋炎発症メカニズムの解明
筑波大学医学医療系循環器内科・助教

田 尻 和 子Ⅰ．緒 言している可能性が示唆されるが、未だ明らかになって

免疫チェックポイント阻害剤を用いたがん免疫療いない。

法は、様々な悪性腫瘍で有効性が示されており、今後

さらに最近の研究結果では、免疫関連有害事象の発さらに使用が拡大することが予想される。免疫チェッ

生には細胞性免疫だけでなく B 細胞を主体とした液

クポイント分子（cytotoxic T-lymphocyte associated

性免疫も大きな役割を果たしていることが示唆されantigen-4 [CTLA-4] や programmed cell death-1ているが 4、心筋炎において検討はなされていない。

[PD-1]、programmed death-ligand 1 [PD-L1]など）

そこで、本研究では免疫チェックポイント阻害剤には抑制性共シグナルを伝達することによって免疫細よって発症した心筋炎の病態に自己抗体が関与して胞の活性化を抑制し、免疫応答の恒常性を維持していいるかどうかをプロテオーム解析の手法を用いて網る分子群である。免疫チェックポイント阻害剤より抗羅的に検討した。

腫瘍免疫が活性化される一方、自己免疫の賦活化によ

Ⅱ．対象・方法

ると考えられる免疫関連有害事象の発生が問題となっている。免疫関連有害事象は全身の様々な部位で認

対象は免疫チェックポイント阻害剤により心筋炎を発症した 2 症例である（表１）。

められ、従来の抗がん剤による副作用とは異なる特徴を有する。心臓への有害事象の発生頻度は 1%程度と希な合併症と考えられている 1、診断に至っていない

表１ 患者背景

ケースも多く、実際にはもっと多いものと予想される。

免疫チェックポイ

臨床像は多彩で、心筋炎、たこつぼ型心筋症、伝導ブ

ント阻害剤

ロック、致死性不整脈、心膜炎、心タンポナーデ等の報告がある 2。心筋炎症例では、心筋生検でマクロファージと CD8 陽性 T 細胞を主体とした炎症細胞浸潤

年齢

原疾患
腎細胞癌

症例①

Nivolumab

70 代

症例②

Nivolumab

50 代

非小細胞
性肺癌

を認める例が多い 3。今後、がん免疫療法はますます発展していくことが予想され、それに伴い未知の心臓症例①は 70 代男性。肺転移を伴う進行腎細胞がん

合併症の発症が危惧される。腫瘍医との綿密な連携の患者で、nivolumab 投与後に心筋炎、筋炎、重症筋無もと、がん診療チームの一員として腫瘍循環器医が果力症を発症した（初回 nivolumab 投与 30 日後に発症たすべき役割も増していくことが予想される。

した）。心筋生検では CD3 陽性 T リンパ球と CD68

免疫チェックポイン阻害剤使用後に心筋炎と筋炎

陽性マクロファージの浸潤を多数認め、T リンパ球はを発症した症例の T 細胞受容体レパトア解析結果にCD8 陽性リンパ球が主体であった。また、少数のよると、がん組織と心臓、骨格筋に同じ T 細胞受容体

CD20 陽性 B リンパ球の浸潤も認めた。心筋炎診断を持つ T 細胞クローンが浸潤していることが明らか

後にステロイドパルス治療を行い心筋炎は改善したとなった 3。さらに、がん組織のトランスクリプトー

が、その後がんが増悪し、8 ヶ月後に死亡した。

ム解析によって、がん組織にも骨格筋や心筋特異的な

症例②は 50 代女性。遠隔転移を伴う非小細胞性肺遺伝子発現を認めたことから、がん組織が体細胞遺伝

がんの診断で nivolumab が開始となった。しかし、子変異によりネオアンチゲンを合成し、その蛋白には

初回 nivolumab 投与後 23 日目に心不全のために入骨格筋や心筋と共通の T 細胞ネオエピトープが存在院となった。心筋生検では明らかな炎症細胞浸潤は指8摘できなかったが、心エコー図検査では心尖部や前壁

次に、その他の自己抗体に関して網羅的に検討したの新規の壁運動低下を認め、冠動脈病変は認めなかっ（図１）。図１の volcano plot の赤枠内に示した自己たために nivolumab による心筋炎と診断し、ステロ

蛋白に対する自己抗体（IgM）が免疫チェックポイン

イドパルス治療を行った。しかし、病態の改善なく

ト阻害剤投与後に有意に増加していた。

nivolumab 投与 2 ヶ月後に心不全のために死亡した。
免疫チェックポイント阻害剤投与前後に血清を採6取し、プロテオーム解析を行うまで−80℃に保存した。

6

C20orf24-Log10 (Pvalue)

自己抗体の網羅的解析に使用したプロテインアレイ
は、
20,000以上のタンパク質コレクションを搭載し、
ヒ ト プ ロ テ オ ー ム の 81 ％ を 網 羅 し た CDI

5

4

TMEM1233ITK

ZSCAN18

TAX1BP1CLDN7CNKSR1

2-Log10 (Pvalue)

5

STR AP
TMEM106A

4
3

AD D1

TMEM92
CCT5

2
AMTN

Laboratories 社 の HuProtTM Human Proteome1

Microarray v3.1 を用いた。

0

0
-6

-4

-2

0

2

4

6

8

Log2 (FC)Log2 (foldchange)

また、心筋炎患者の血清中のサイトカイン量をAbcam 社の Cytokine Array – Human Cytokine

GABPB2

1

図1

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

Log2 (FC)Log2 (foldchange)

プロテオーム解析による自己抗体の検出（左：心筋炎①、

Antibody Array (Membrane, 80 Targets)を用いて検

右：心筋炎②。赤枠内は心筋炎発症時に免疫チェックポイント阻害剤

討した。

投与前に比べて 4 倍以上に有意に[p < 0.01]増加していた自己抗体を
示した）

Ⅲ．結 果
免疫チェックポイント阻害剤投与により心筋炎をさらに、免疫チェックポイント阻害剤の投与やステ生じた 2 症例の免疫チェックポイント阻害剤投与前

ロイド治療により生じたサイトカインプロファイルと心筋炎発症時の血清中の自己抗体をプロテオームの変化をサイトカインアレイを用いて検討した（図２、アレイを用いて検出した。まず、これまでに心筋炎を

図３）。心筋炎発症時には免疫チェックポイント阻害

含む種々の心疾患に関与することが報告されている剤投与前と比べ、fibroblast growth factor-4（FGF-4）、

自己抗体について検討を行った 。その中で、neurotrophin-4（NT-4）が上昇し、interleukin (IL)-

toropomyosin1-4、Na-K ATPase 、熱ショック蛋白7、macrophag-derived chemokine（MDC/CCL22）、

60 に対する自己抗体を検出した（表２）。しかし、そinsulin-like growth factor 1 （ IGF-1 ）、 TIMP

れらの自己抗体は免疫チェックポイント投与前と比metallopeptidase inhibitor 1（TIMP-1）が減少して較して最大で 1.23 倍の上昇にとどまり、有意な上昇いた。ステロイドパルス治療により心筋炎発症時よりとは言えなかった。他のこれまでに心疾患との関与がIL-4、interferon-γ（IFN-γ）、thymus and activation

報告されている β2-、β3-、α1-アドレナリン受容体、

regulated chemokine （ TARC/CCL17 ） 、 B

ムスカリン受容体（M2）、心筋トロポニン T /I、ラミ

lymphocyte chemoattractant（BLC/CXCL13）、
FGF-

ニン、熱ショック蛋白 70 に対する自己抗体は検出さ4、FGF-6、fractalkine（CX3CL1）、insulin-like

れなかった。

growth factor-binding protein 3 （ IGFBP-3 ）、、TNF superfamily
leukemia inhibitory factor（LIF）
member 14 （ LIGHT ）、 monocyte chemotactic

表２ 心筋炎関連自己抗体の関与（数字は免疫チェックポイント

protein-4（MCP-4/CCL13）、NT-4、pulmonary and阻害剤投与後の信号強度を投与前の信号強度で除した値）

自己抗原

症例①

症例②

activation-regulated chemokine（PARC/CCL18）、

Tropomyosin 1

0.76

0.84

placental growth factor （ PlGF ）、 transforming

Tropomyosin 2

1.02

検出されず

growth factor, beta 3（TGF-β3）が有意に減少し、IGF-

Tropomyosin 3

1.23

0.88

Tropomyosin 4

0.75

検出されず

Na-K ATPase, alpha 3

1.13

0.94

0.93

検出されず

1 が有意に増加していた。

polypeptide
Heat shock protein 60

9図 3 免疫チェックポイント阻害剤（ICI）投与前後ならびにステロ
イド治療によるサイトカインの変化（*P<0.05 vs before ICI, #P <0.05 vs after ICI。ICI 投与前の信号強度を 1 として計算した）Ⅳ．考 察
本研究で、toropomyosin1-4、Na-K ATPase 、熱ショック蛋白 60 に対する自己抗体が免疫チェックポ
イント阻害剤による心筋炎の 2 症例で検出された。
Latif ら 5 は、抗 tropomyosin 抗体は拡張型心筋症（DCM）患者の 55%に、虚血性心疾患患者の 21%で検出されると報告しているが、その機能は明らかになっていない。Baba ら 6 は DCM 患者 100 症例と年齢を一致させた健常人 100 例の抗 Na-K ATPase 抗体の有無を検討したところ、DCM 患者では 26％に検出されたのにたいして、健常人では 2%の陽性率にとどまったと報告している。また本抗体の存在は心室頻拍の独立した予測因子であるとともに、心臓突然死や低心機能の予測因子であることも報告した。心室頻拍のを高頻度に認めることも明らかにした。さらに、抗Na-K ATPase 抗体陽性患者血清中の IgG は in vitro
で Na-K ATPase 活性を抑制したことから、本抗体は病態形成に一定の役割を果たしていることが示唆されている。熱ショック蛋白 60 に対する自己抗体はDCM 患者の 85%に、虚血性心疾患患者の 42%で検出されると報告されているが 5、その病態生理学的な影響は不明である。我々が経験した 2 症例は免疫チェックポイント阻害剤投与前からこのような自己抗体が検出されたことから、免疫チェックポイント阻害剤
による心筋炎発症の予測因子として用いることができる可能性が考えられる。しかし、免疫チェックポイ
ント阻害剤投与後の心筋炎発症時に有意な上昇を示さなかったことから、病態への関与は少ないことが示唆される。
免疫チェックポイント阻害剤による心筋炎発症時に有意な上昇を認めた自己抗体は、両症例で共通するものは認めなかった。症例①では制御性 T 細胞の分化に有用な IL2-inducible T cell kinase（ITK）7 や、
NF-κB を介した炎症の活性化を負に制御する蛋白で
図 2 免疫チェックポイント阻害剤（ICI）投与前後ならびにステロ

ある TAX1 binding protein 1（TAX1BP1）8 に対するイド治療によるサイトカインの変化（#1：症例①、#2：症例②）

自己抗体の著明な増加を認め、心筋炎の発症と進展に10重要な役割を果たしていることが示唆された。一方、

Immune Checkpoint Inhibition Therapy.

症例②においてはがんの進展に関連する蛋白（serine-

Front Cardiovasc Med 2019;6:3.

threoninekinasereceptor-associated（ STRAP ） 9 、 transmembraneprotein3.

protein 106A

Johnson DB, Balko JM, Compton ML, et al.
Fulminant Myocarditis with Combination（TMEM106A）10、chaperonin containing TCP1（T-Immune Checkpoint Blockade. N Engl J Med

Complex Protein 1）subunit 5（CCT5）11）に対する

2016;375:1749–1755.

自己抗体の著明な上昇を認め。免疫チェックポイント 4.

Das R, Bar N, Ferreira M, et al. Early B cell

阻害剤による抗腫瘍作用に影響を与えている可能性

changes predict autoimmunity followingが示唆された。

combination immune checkpoint blockade. J
Clin Invest 2018;128:715–720.

免疫チェックポイント阻害剤投与前、心筋炎発症
5.

時、ステロイド投与後の血清中のサイトカインプロフ

Latif N, Baker CS, Dunn MJ, et al. Frequency

ァイル変化を網羅的に検討したところ、サイトカイン

and specificity of antiheart antibodies in

プロファイルが大きく変化していることが明らかと

patients with dilated cardiomyopathy

なった。これらの液性因子も心筋炎の発症と進展、な

detected using SDS-PAGE and western

らびにステロイド治療効果に影響していた可能性が

blotting. J Am Coll Cardiol 1993;22:1378–

考えられる。

1384.
6.

本研究全体を通しての大きなリミテーションは症

Baba A, Yoshikawa T, Ogawa S.

例が少ないこと、心筋炎を生じなかった免疫チェック

Autoantibodies produced against sarcolemmal

ポイント阻害剤使用患者との比較ができていないこ

Na-K-ATPase: possible upstream targets ofとが挙げられる。病態解明には今後の研究でこれらのarrhythmias and sudden death in patients

課題を克服することが必要である。

with dilated cardiomyopathy. J Am Coll
Cardiol 2002;40:1153–1159.
7.

Ⅴ．結 論

Huang W, Solouki S, Koylass N, et al. ITK
signalling via the Ras/IRF4 pathway

本研究では免疫チェックポイント阻害剤使用後に心筋炎を生じた稀な 2 症例から既知の心筋炎関連自regulates the development and function of Tr1

己抗体や未知の自己抗体を検出した。本研究のように、

cells. Nat Commun 2017;8:15871.
8.

腫瘍循環器の見地から免疫チェックポイント阻害剤

Shembade N, Pujari R, Harhaj NS, et al. Theの作用機序や心筋障害を臨床的・基礎的に詳細に解析

kinase IKKα inhibits activation of theすることで、これまでにない心筋炎の機序あるいは治transcription factor NF-κB by

療に向けた研究のシーズが見つかり、新たなトランス

phosphorylating the regulatory molecule

レーショナルリサーチへと展開できる可能性を多い

TAX1BP1. Nat Immunol 2011;12:834–843.
9.

に含んでいると考える。

Yuan G, Zhang B, Yang S, et al. Novel role of
STRAP in progression and metastasis ofⅥ．研究協力者

colorectal cancer through Wnt/β-catenin

家田真樹・筑波大学医学医療系循環器内科・教授

signaling. Oncotarget 2016;7:16023–16037.
10. Liu J, Zhu H. TMEM106A inhibits cell

関根郁夫・筑波大学医学医療系臨床腫瘍学・教授

proliferation, migration, and induces

Ⅶ．参考文献apoptosis of lung cancer cells. J Cell Biochem

1.

2019;120:7825–7833.

Salem J-E, Manouchehri A, Moey M, et al.
Cardiovascular toxicities associated with11.

immune checkpoint inhibitors: an

containing TCP1 subunit 5 is a tumor

observational, retrospective,

associated antigen of non-small cell lungpharmacovigilance study. Lancet Oncolcancer. Oncotarget 2017;8:64170–64179.

2018;19:1579–1589.
2.

Gao H, Zheng M, Sun S, et al.Chaperonin

Tajiri K, Ieda M. Cardiac Complications in

11

血栓の形成および退縮過程における CCR5 システムの病態生理学的役割の解明
和歌山県立医科大学 循環器内科 博士研究員

樽谷 玲
Ⅰ．緒 言

１）

マウス深部静脈血栓塞栓症モデル

担癌患者において静脈血栓塞栓症の発症リスクは深麻酔下でのマウスの下大静脈結紮術によって深健常群に比べ４〜７倍高い（1）。さらに血栓症を有部静脈血栓を形成させ、血栓サイズ・血栓重量・下する担癌患者は、血栓症を認めない担癌患者に比べ大静脈血流の推移を検討した。

予後が悪い（2）。また、担癌患者の静脈血栓塞栓症

２）

病理組織学的および免疫組織化学的検索

は、非担癌患者に比べ再発リスクが高いとも報告さ

採取した血栓について、HE 染色による病理組織

れている（3）。担癌患者における血栓形成は、①癌学的検索を行い、さらにマクロファージ、uPA、tPA、細胞由来サイトカインによる血管内皮傷害、②癌細VEGF、CCR5、CCR5 以外のサイトカイン・ケモ

胞からトロンボプラスチンが過剰による凝固系の亢

カインに対する免疫染色を行った。

進が原因と言われている（4）。しかしながら、静脈

３）

遺伝子発現およびタンパク定量

血栓塞栓症の発症・退縮の機序は現在においても未血栓試料から total RNA を抽出し real time

だ十分に解明されているとは言いがたい。
そのため、

RT-PCR 法にて、凝固・線溶系の因子（tPA、uPA）、

臨床的には抗凝固療法などの対症療法しかないのがCCR5、CCR5 以外のサイトカイン・ケモカイン、

現状である。

について検討した。

そこで予防を含めた静脈血栓塞栓症に対する根本

４）

的治療法開発のため、申請者らの研究グループはサ

サイトカイン・ケモカインの治療効果の検討

イトカイン・ケモカインに注目し、炎症性サイトカ

WT マウスに血栓を発症させた後に、CCR5 のリインである IFN-gamma が血栓退縮に抑制的に作ガンドに対する中和抗体を投与し、その影響を検討

用することを明らかにしている（5）。さらなる血栓した。

形成・融解の分子メカニズムを詳細に解明するため、

１）〜４）の結果を総合し、静脈血栓塞栓症に本研究では大腸癌・膵癌・乳癌・前立腺癌など様々

おける CCR5 の病態生理学的役割について検討しな癌腫の転移への関連が報告され（6）
、血栓の形

た。

成・退縮過程における Key player の一つと考えら

データは全て平均値±標準偏差で表記し、2 群間の比較は T 検定を行った。

れるケモカインレセプターCCR5 に注目し、血栓の形成・退縮における CCR5 システムの病態生理学的Ⅲ．結 果

役割を検討した。

1．深部静脈血栓の経時的変化についての検討
生後 8 週齢オスの WT マウス及び CCR5KO マウ

Ⅱ．対象・方法
本研究では、実験動物として主に CCR5 遺伝子

スに対し下大静脈結紮 10 日後に血管内から採取し欠損（CCR5KO）マウス(Balb/c)、及びコントロー

た血栓を比較したところ、図 1・図２のように時間

ルとして野生型（WT）マウスを使用した。静脈血が経過するにつれて、CCR5KO マウスの方が、血栓塞栓症モデルを用い、血栓の形成・退縮において

栓サイズ・重量ともに WT マウスに比べ大きいこと差異を認めるか比較検討した。

が分かった。

12

生後 8 週齢オスの WT マウスに対し、下大静脈結紮後、得られた血栓を免疫組織化学的染色を行った。
その結果、WT マウスの血栓内には CCR5 陽性細胞
が、主に血栓辺縁部に観察され、その数は結紮からの時間経過に伴い増加した（図４）。
また血栓中には、
Ccr5 遺伝子の発現も認められた（図５）。また、血栓に対し、CCR5 と F4/80 を用いた蛍光二重染色を行ったところ、CCR5 陽性細胞と F4/80 陽性細胞が

図１ 下大静脈結紮 10 日後の血栓一致した（図６）。これより、血栓内において CCR5

血栓サイズは、CCR5KO マウスの方が WT マウスに比較し、大きかを産生する細胞は、主として F4/80 陽性マクロファった。

ージであると考えられた。

図４ 深部静脈血栓における CCR5 陽性細胞の発現
CCR5 陽性細胞が、血栓辺縁部を中心に観察され、経時的に増加した。

図２ 下大静脈結紮後の血栓重量の推移
深部静脈血栓の重量は、WT マウスに比べ CCR5KO マウスで有意に重かった。*P<0.05、**P<0.01。

また、時間経過に伴い WT マウスの下大静脈の血流量は、CCR5KO マウスに比べ、高値を示すことが分かった（図３）。これらの結果より、WT マウス
では CCR5KO マウスに比較して、より短期間で血栓が退縮するため、下大静脈血流も速やかに回復す

図５ 深部静脈血栓の CCR5 遺伝子発現
深部静脈血栓において下大静脈結紮5 日後をピークにCCR5 遺伝

ると考えられた。

子発現を認める。

図３ 下大静脈結紮後の下大静脈流速の推移
図６ F4/80 陽性マクロファージによる CCR5 産生

結紮前の血流速を 100%とし、それに対する結紮後の流速の比率

下大静脈結紮 14 日後の深部静脈血栓において、CCR5 陽性細胞とを縦軸、時間経過を横軸とした。WT マウス・CCR5KO マウスともに

F4/80 陽性細胞が一致した。

下大静脈の血流は改善していくが、WT マウスの方が有意に流速の改善が見られた。**P<0.01。

3．深部静脈血栓の器質的変化についての検討
2．CCR 発現細胞の経時的変化とその発現細胞に

血栓溶解に伴う器質的変化の有無を明らかにするために血栓内の新生血管について検討を行った。下ついての検討13

大静脈結紮 3 日後までの血栓では、WT マウス・
CCR5KO マウス共に全く新生血管を認めなかった。

4．深部静脈血栓における血栓溶解因子の発現に一方、下大静脈結紮 5 日後以降の血栓に血管新生をついての検討認め（図 7）、その数は時間経過とともに増加した（図深部静脈血栓の退縮と血栓溶解因子との関連を明

8）。新生血管数では、WT マウスの方が CCR5KO

らかにするため、血栓溶解因子であるウロキナーゼ

マウスと比較して、有意に多いことが分かった。さ型プラスミノゲンアクチベータ（uPA）及び組織プ

らに血栓内における血管内皮増殖因子（VEGF）のラスミノゲンアクチベータ（tPA）の遺伝子発現に遺伝子発現量も WT マウスの方が CCR5KO マウス

ついて検討した。CCR5KO マウスの深部静脈血栓と比較して、有意に多いことが分かった（図９）。

は WT マウスに比べ、uPA・tPA ともに遺伝子発現

CCR5 が深部静脈血栓内の血管新生に影響しているが有意に低下していることが分かった。この結果よことが考えられた。

り、CCR5 が深部静脈血栓内において血管溶解因子に影響していることが考えられた。

図７ 深部静脈血栓内の新生血管
結紮後 21 日目の血栓を示す。下大静脈結紮後 5 日以降の血栓に新生血管を認めた。
図１０ 深部静脈血栓における血栓溶解因子(uPA・tPA)発現
血栓内の uPA 及び tPA の遺伝子発現量において、CCR5KO マウスの方が WT マウスと比較して、uPA・tPA ともに有意に少なかった。
＊*P<0.01、*P<0.05。

5．深部静脈血栓に発現した CCR5 のリガンドについての検討
深部静脈血栓内 CCR5 のリガンドを検討するため、real time RT-PCR 及び蛍光二重染色を行ったと

図８ 深部静脈血栓内の新生血管数の経時的変化
深部静脈血栓内の新生血管数は時間経過とともに増加した。さころ、CCR5 のリガンドとして、主に CCL3、CCL4、らに、WT マウスの方が CCR5KO マウスと比較して、その数が有意にCCL5 が存在していることが分かった（図 11・図多かった。*P<0.05。

12）。

図１１ 深部静脈血栓内の CCL3,CCL4,CCL5 の遺伝子発現
深部静脈血栓内に CCL3・CCL4・CCL5 遺伝子の発現が増加した。

図９ 深部静脈血栓の血管内皮増殖因子（VEGF）発現
血栓内の VEGF 遺伝子発現量において、WT マウスの方が CCR5KO
マウスと比較して、有意に多かった。*P<0.05。

14

リコンビナント蛋白を投与したところ、rmCCL3 ではｔPA、rmCCL4
では Vegf、rmCCL5 では uPA の遺伝子発現が、有意に多い結果となった。*P<0.05。

さらに CCR5 システムの血栓溶解への関与を明らかにするために、CCR1KO マウスの腹腔内マク
ロファージをリコンビナントCCL3で刺激したとこ
ろ、uPA 遺伝子の発現増加を認めた(図 14)。また、
WT マウスの腹腔内マクロファージに抗CCL4 抗体を加えると、Vegf 遺伝子の発現低下を認めた(図 15)。
これらより、CCL3/CCR5 システムが uPA 産生に、CCL4/CCR5 システムが VEGF 産生に関与してい図１２ CCR5 のリガンドると考えられた。

CCR5 発現F4/80 陽性マクロファージがそれぞれCCL3・CCL4・CCL5が発現していた。CCR5 のリガンドとして、CCL3、CCL4、CCL5 が存在していると考えられた。

さらにそれらのリガンドがそれぞれ血管新生や血栓融解へのどのように影響を及ぼしているか検討す
るため、WT マウス・CCR5KO マウスそれぞれから採取した腹腔内マクロファージを、リコンビナントマウス CCL3 を加えて 24 時間刺激した後、血栓溶解因子（uPA・tPA）および血管内皮増殖因子（VEGF）の遺伝子発現量を検索した。WT マウス

図 14 CCL3/CCR5 システムによる uPA 産生の腹腔内マクロファージは CCR5KO マウスと比較

CCR1KO マウスの腹腔内マクロファージをリコンビナント CCL3

して、uPA の遺伝子発現が有意に増加することが分で刺激したところ、uPA の増加を認めた。*P<0.05。

かった。同様の方法にて腹腔内マクロファージをリ
コンビナントマウス CCL4 で刺激すると、WT マウ
スで Vegf 遺伝子の発現が増加し、リコンビナントマ
ウス CCL5 で刺激すると、WT マウスで tPA 遺伝子の発現がそれぞれ増加した（図 13）。

図 15 CCL4/CCR5 システムによる VEGF 産生
WT マウス由来の腹腔内マクロファージに抗 CCL4 抗体を加えると、Vegf 遺伝子の低下を認めた。*P<0.05。

Ⅳ．考 察
肺動脈血栓塞栓症の 90％以上は，下肢および骨盤
図 13 腹腔内マクロファージにおけるリコンビナントマウス

内の深部静脈血栓に由来するものである(7)。病理学（rm）CCL3・CCL4・CCL5 投与後の血栓溶解因子および血管内皮増的に血栓形成の主要因として、血流うっ滞，血管内殖因子の遺伝子発現

皮傷害、凝固能亢進が Virchow の三徴としてよく知られている(8)。その一方で、血栓の形成・退縮には、

CCR5KO マウスに対し WT マウス由来のマクロファージにおいて、

15

4)

各種サイトカイン・ケモカインが複合的に関与していることが示唆されてきた(5, 9, 10)。

Wang R, Chadalavada K, Wilshire J, et al.
Glioblastoma stem-like cells give rise to

本研究により CCR5 がマクロファージを通して、

tumour

血栓溶解因子および血管内皮増殖因子の発現に関与

829-833.
5)

し、血栓の退縮に関与していることが新たに示されendothelium. Nature

2010; 468:

Nosaka M, Ishida Y, Kimura A, et al.

た。この成果は CCR5 を分子標的とする新薬開発に

Absence of IFN-γ accelerates thrombus

つながると考えられ、新薬が開発されれば、担癌患

resolution through enhanced MMP-9 and者において、癌自体による死亡の次に、静脈血栓塞

VEGF expression in mice. J Clin Invest栓症による死亡が多いという現状を打破する可能性

2011; 121: 2911-2920.
6)を秘めている。

Mañes S, Mira E, Colomer R, et al. CCR5
expression influences the progression ofhuman breast cancer in a p53-dependent

Ⅴ．結 論
CCR5 遺伝子が欠損すると、深部静脈血栓内の血manner. Journal of Experimental Medicine
2003;198: 1381-1389.

栓溶解因子（tPA・uPA）および血管内皮増殖因子
7)（VEGF）産生は低減する。その結果、CCR5 遺伝

伊東正明，池田正孝，石橋宏之ほか編．肺血栓

子欠損マウスでは深部静脈血栓の溶解が阻害され、塞栓症および深部静脈血栓症の診断,治療,予CCR5 が血栓の退縮に関与していることが示唆され防に関するガイドライン(2017 年改訂版)

た。

2017. p 1-93.
8)

今回の研究成果は、CCR5 システムを分子標的とMeissnerMH,

Strandness

JR.

The

epidemiology and natural history of acuteする新薬開発につながるのではないかと考えられた。

deep vein thrombosis. In: Gloviczki P, et al.

Ⅵ．研究協力者

editors. Hand-book of venous disorders.

近藤稔和・和歌山県立医科大学法医学・教授

Arnold, 2001.p.38-48.
9)石田裕子・和歌山県立医科大学法医学・講師

Humphries J, McGuinness CL, Smith A, et

野坂みずほ・和歌山県立医科大学法医学・助教

al. Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)

木村章彦・和歌山県立医科大学法医学・博士研究員

accelerates the organization and resolution

川口真理子・和歌山県立医科大学法医学・研究員

of ve- nous thrombi. J Vasc Surg 1999; 30:
894-899.
10) Varma MR, Varga AJ, Knipp BS, et al.

Ⅶ．参考文献1)

Blom JW, Doggen CJ, Osanto S, et al.

Neutropenia impairs venous thrombosis

Malignancies, Prothrombotic Mutations, andresolution in the rat. J Vasc Surg 2003; 38:

the Risk of Venous Thrombosis. JAMA 2005;

1090-1098.

293: 715-722.
2)

Lee AY, Levine MN, Baker RI, et al.
Randomized Comparison of Low Molecular
Weight Heparin and Coumarin Derivatives
on the Survival of Patients With Cancer andVenousThromboembolism.

JournalofClinical Oncology 2005; 23: 2123-2129
3)

Prandoni P, Lensing AW, Piccioli A, et al.
Recurrent venous thromboembolism andbleeding complications during anticoagulant
treatment in patients with cancer andvenousthrombosis.

Blood

2002;

100:

3484-3488.

16