耐塩性ラン藻の分子シャペロニン遺伝子導入によるポプラの生長促進作用

Growth enhancement of poplar plant transformed withmolecule chaperone gene from a halotolerant cyanobacterium.

日比野隆

名城大学理工学部准教授

Takashi HIBINO, Faculty of Science & Technology, Meijo University, Associate Professor

研究の大要
分子シャペロニンは細胞内の様々な蛋白質の生合成反応に関与する蛋白質であると同時に様々な環境ストレスに曝された時に、細胞内の蛋白質が変性・失活するのを保護する作用があると考えられている。これまでに、地中海の死海で生育している耐塩性ラン藻（Aphanothece. halophytica）から分子シャペロニン dnaK 遺伝子をタバコに導入し、その性質を調べた結果、コントロール株と比較して①CO2 取り込み速度が高く、②光合成活性が高いことが明らかとなった。さらに、高温ストレスに対して遺伝子導入植物は①発芽率が高く、②光合成活性が向上し、③初期成長が早いことが明らかとなった。そこで本研究課題である dnaK 遺伝子を導入したポプラを作出した。
遺伝子導入ポプラは、通常の生育条件下において遺伝子導入ポプラは明らかに成長促進効果が見られている。
Abstract
The DnaK/HSP family is a molecular chaperone that binds non-native states ofother proteins and assists them to reach a functional conformation. Molecularchaperones function in many biochemical processes such as protein synthesis,
transport of proteins across membrane, and protection of proteins against
inactivation under several abiotic stresses.
We isolated a chaperone gene dnaK from a halotoleranct cyanobacteriumAphanothece halophytica. We constructed transgenic tobacco plants overexpressing
dnaK gene (DnaK-tobacco plants). Transgenic plants exhibited higher CO2 uptake
rate and higher photochemical activity than the wild-type plants. Under hightemperature stress condition, DnaK tobacco plants showed higher rate ofgermination, higher photosynthetic activity and higher growth rate of young
seedlings than the wild-type plants. Transgenic poplar trees overexpressing dnaK
gene were also constructed. The overexprssion of DnaK enhanced the growth oftransgenic poplar even under normal environmental condition.

１．研究目的DnaK/Hsp70 ファミリーは、分シャペロンとも呼ばれタンパク質の生合成に関与するだけでなく、様々な環境ストレスでタンパク質が失活するのを防ぐ原ら気がある。これ ま で に 耐 塩 性 ラ ン 藻 （ Aphanothecehalophytica）から DnaK 遺伝子 (ApDnaK) を単離し、大腸菌発現システムにより ApDnaKのユニークな性質を明らかにしてきた。さらに、 ApDnaK をタバコに導入した結果、発芽時期・栄養成長期・生殖成長期において耐塩性・高温耐性が向上することを明らかにしてきた。そこで今回、このポプラ(Populus alba) に ApDnaK 遺伝子導入し、その解析を行った。また、同時にイネにApDnaK 遺伝子導入し、その解析を行った
ところ興味深い結果が得られたのであわせて報告する。

構築した。これをアグロバクテリア（LBA4404）に導入した。ポプラの葉および茎からカルスを誘導し、遺伝子導入したアグロバクテリアを感染させた。抗生物質を含んだ培地で遺伝子導入カルスを選抜し、シュート誘導を行った。茎が５ｃｍくらいで切断し発根誘導を行い、以下のストレス条件での生育を試みた。通常のポプラの生育は人工気象器（25 °C、 16-時間明所 (70µmol m-2 s-1)、8-時間暗所）で生育させた。
遺伝子導入ポプラは PCR 法により ApDnaK遺伝子の導入を確認し、ウエスタンブロッテイング法により発現効率が高い TTP1、TTP2 の２種類の株を選抜して以下の研究を行った。
これまでに作出した dnaK 遺伝子導入タバコ、イネの解析の経験を参考にして、
１）dnaK 遺伝子導入ポプラが、栄養成長期・生殖成長期の生育促進効果があるかどうか調べる。

２．研究経過２）dnaK 遺伝子導入ポプラが、塩・乾燥・遺伝子導入ポプラ

高温・低温ストレスなどに対して、耐性がApDnaK 遺 伝 子 を バ イ ナ リ ー ベ ク タ ー

付与されているかどうか調べる。

(pEL2Ω-MCS)に組み込んだ pEL2Ω-DnaK を３）dnaK 遺伝子を導入することにより、成長促進あるいは環境ストレスに対して防が認められた。乾燥葉重量および乾燥茎重御機構にどのように関与しているか総合的量は野生株と比較して約１．５倍であり、に評価する。

葉の数も野生株では２１枚であったが、遺伝子導入株では約３１−３５枚であった。
また、葉の面積もわずかに野生株より大き３．研究成果通常生育条件における遺伝子導入ポプラ
野生型ポプラの生育と比較して、４０日後から遺伝子導入ポプラの方が生育が早く、６０日後には明らかな生育促進が認められた。乾燥葉重量および乾燥茎重量は野生株と比較して約１．５倍であり、葉の数も野生株では２１枚であったが、遺伝子導入株では約３１−３５枚であった。また、葉の面積もわずかに野生株より大きいという結果が得られた。さらに、光合成活性を比較したところ、遺伝子導入株で明らかな活性の増加が見られ、野性株の約１．３倍であった。また、糖含量を上葉、中葉、下葉、茎に区別して測定したところ、いずれの画分においてもわずかに野生株より高い値をいという結果が得られた。さらに、光合成活性を比較したところ、遺伝子導入株で明らかな活性の増加が見られ、野性株の約１．
３倍であった。また、糖含量を上葉、中葉、下葉、茎に区別して測定したところ、いずれの画分においてもわずかに野生株より高い値を示していた。このことから、ApDnaK遺伝子を過剰発現させたポプラは光合成活性を高め、結果として糖含量の蓄積を高め、成長促進の効果が得られたと思われる。また、各種ストレス処理後通常の生育条件に戻し、その回復を光化学系Ⅱの電子伝達活性反応を測定した。その結果、いずれのストレス条件からの回復においても野生株と比較して明らかに遺伝子導入株の電子伝達活性が高いことが明らかとなった。

示していた。このことから、ApDnaK 遺伝子を過剰発現させたポプラは光合成活性を高め、結果として糖含量の蓄積を高め、成長促進の効果が得られたと思われる。

通常生育条件における遺伝子導入イネ

これまでに作出した dnaK 遺伝子導入
イネの解析をすすめていたところ、通常ストレス条件における遺伝子導入ポプラの生育条件化においても明らかな成長促３週間通常条件で生育させ野生株と遺伝進効果が認められ（下図）、発芽時期・栄子導入株を塩、乾燥、低温ストレスで生育養成長期のみで無く種子形成能が極めて高させ比較した。

くなっていることを明らかにした。具体的

４０日後から遺伝子導入ポプラの方が生には、野生株より分ゲツ数が多くなり、乾育が早く、６０日後には明らかな生育促進

燥重量も約 1.3 倍になった。また種子含量も約 1.3 倍となった。ショ糖やフルクトースなどの糖類が増加しており、細胞内浸透５．発表論文リスト（印刷中を含む）圧が高くなっていることを明らかにした。
Rungaroon WADITEE, Md. Nazmul H.
BHUIYAN, Emi HIRATA, Takashi HIBINO,
Yoshito TANAKA, Masamitsu SHIKATA,Teruhiro TAKABE:Metabolicengineering

forbetaine

accumulation in microbes and plants.
〔J. Biol. Chem., 282, 34185-34193 (2007)〕
Md.
野生株

遺伝子導入株

NazmulH.

BHUIYAN,Akira

HAMADA, Nana YAMADA, Vandna RAI,Takashi HIBINO, Teruhiro TAKABE:

４．今後の課題と発展
耐塩性ラン藻 （Aphanothece halophytica）

Regulation of betaine synthesis by precursor
supply and choline monooxygenase expressionin Amaranthus tricolor.

由来のｄnaK 遺伝子 (ApDnaK) は他の生物〔J. Exp. Bot., 58, 4203-4212 (2007)〕

種のｄnaK と比較しても過酷な条件化でもAkio UCHID, Takashi HIBINO, Takiko

高いシャペロニン活性を有しており、そのSHIMADA, Masahiko SAIGUSAS, Tetsuko

ApDnaK 遺伝子を導入した植物は各種環境

TAKABE, Etsuko ARAKI, Hiroshi KAJITA,ストレスに対しても耐性が向上したことをTeruhiro TAKABE

明らかにしている。しかしながら、一方で、ApDnaK は細胞内のさまざまなタンパク質保護に関わると予想されるが具体的な機構

Overexpression of DnaK chaperone from a
halotolerantcyanobacterium

Aphanothece

halophytica increases seed yield in rice andtobaccoが明らかにされていない。今後、その作用〔Plant Biotechnol.，25, 141-150 (2008)〕

機構を明らかにしていきたいと考えている。

Takashi HIBINO, Akio UCHIDA, Masashi

ApDnaK 遺伝子導入ポプラは、通常の生FUJITA, Koji YAMANE, Takiko SHIMADA,育条件化でも生育が早く成長促進効果が認Shiro MITSUYA, Tetsuko TAKABE, Teruhiro

められた。これは、大気中の CO2 取り込み活性の高く（CO2 削減に貢献）、光合成活性が高く（光エネルギーを有効利用）、環境ス
トレスに強く（地球温暖化・砂漠化の防止に貢献）、早い成長（都市緑化、植林に貢献）が期待される。

TAKABE:
Co-expressionofchloroplastic-fibrillin

cytosolic-DnaK
from

and

halotolerantorganisms increased salt tolerance of tobacco
plants〔 J. Res. Inst. Meijo. Univ., 6, 105-114(2007)〕