大気汚染による樹木光合成抑制の分子的実体の解明
The study on molecular architectures of photosynthesis
hindrance in woody plants by air-pollution
高橋美佐
広島大学大学院理学研究科 助教

Misa Takahashi
Assistant Professor, Graduate School of Sciences, Hiroshima University
研究の大要
樹木は二酸化炭素の大きな吸収体である。特に都市部においては街路樹が主要な吸収体である。しかし、大気汚染物質によってその炭酸ガス固定および酸素発生など光合成作用は、大きく抑制されている。街路樹の大気汚染物質耐性を高めることは都市部における二酸化炭素削減の促進につながるものである。そのためには、街路樹の大気汚染物質による阻害機構の解明が必須である。しかし、その詳細の理解は立ち遅れている。申請者はモデル植物シロイヌナズナを用い、二酸化窒素(都市大気の主大気汚染物質)による光合成抑制の分子的実体を把握しつつある。本研究では、これらの実績を基礎として、二酸化窒素による樹木光合成抑制の分子的実体の解明を直接の目的とし、以て、樹木の大気汚染耐性能力を高め、樹木の光合成促進すなわち二酸化炭素削減効率の飛躍的向上をめざすものである。
Abstract
Woody plants are a powerful sink for carbon dioxide (CO2). However, thephotosynthesis activities of plants such as CO2 fixation and oxygen evolution arehindered by atmospheric nitrogen dioxide (NO2), a major pollutant in the urban air. Thisis also the case for roadside trees in the urban area. The investigation on the molecularmechanism of hindrance of photosynthesis by NO2 is vital to improve the capability ofroadside trees as a CO2 sink. Recently, we have discovered proteomic evidence forhindrance of photosynthesis by NO2 in Arabidopsis thaliana, a model plant. The present
study focuses on the proteomic analysis of woody plants to investigate moleculararchitectures of photosynthesis hindrance by NO2 in these plants.

-1-１．研究目的

シンのニトロ化を比較解析して、大大気汚染物質である二酸化窒素気汚染物質による光合成抑制の分子（NO2）は強力なニトロ化剤で、タン的実体を解明し、樹木の大気汚染耐パク質をニトロ化して活性を阻害す性能力を高めることにより、樹木のることが知られている。申請者はモ光合成促進を目指した。

デル植物であるシロイヌナズナを用いて、高濃度の NO2（4~40 ppm）で２．研究経過

曝露すると、タンパク質チロシンが単離チラコイドにおけるニトロ化とニトロ化されるが、タンパク質チロ酸素発生

シンのニトロ化は PsbO/PsbP に特異ヌナズナ（Arabidopsis thaliana）葉か的に生じることをプロテオミクス解ら単離チラコイドを調整して、NO2析(antibody-based proteomics)により明を溶解したバッファーに懸濁 60 分後らかにした。PsbO/PsbP は、光化学系に PsbO/PsbP タンパク質ニトロ化とII の酸素発生複合体（OEC）を構成酸素発生量を測定した。バッファーするタンパク質である。そこで、本の NO2-と NO3-濃度をキャピラリー電研究ではシロイヌナズナ葉の単離チ気泳動装置で測定し、数値計算によラコイドを調整して、PsbO/PsbP のニりバッファー中の NO2 濃度を求めた。

トロ化と酸素発生の関係を調査した。

PsbO タンパク質のニトロ化レベルは、他方、申請者はこれまでに、200 種ウェスタンブロットおよびデンシメ以上の植物種について、NO2 の吸収・トリーによる定量によって調べた。

同化能について調査し、植物種間の酸素発生量はクラーク型酸素電極をNO2 同化能には最大 600 倍以上の差用いて定量した。

異があることを見いだした。さらに、樹木におけるタンパク質ニトロ化解樹木について、4 ppm NO2 と 0.1 ppm

析

NO2 で曝露した場合、どちらの条件

あ る ク ス ノ キ （ Cinnamomum

下 でも高い NO2 同化 能を 示す樹木camphora）、ユズリハ（Daphniphyllum（NO2 に強い樹木）と低濃度 NO2 でmacropodum ）、 オ オ イ タ ビ （ Ficus

は高い NO2 同化能を示すが、高濃度pumila）と NO2 に強い樹木であるクNO2 では低い NO2 同化能を示す樹木

チナシ（Gardenia jasminoides）、ギン（NO2 に弱い樹木）に分かれることを報告した。樹木の炭酸ガス固定、ヨウアカシア（Acacia baileyana）、フサアカシア（Acacia dealbata）を用い酸素発生など光合成作用は、大気汚た。樹木は園芸店で購入した後、温染物質により大きく抑制されるが、室で１週間以上順化して実験に用いその詳細の理解は立ち遅れている。

た。曝露チャンバー内で 40 ppm NO2

そこで、本研究では NO2 に強い樹木で 8 時間曝露した後、葉を採取してと NO2 に弱い樹木のタンパク質チロ粗タンパク質溶液を調整した。粗タ-2-

播種後４週間目のシロイ

樹木として、NO2 に弱い樹木でンパク質を SDS PAGE で分離、PVDF

ハ、オオイタビ、クチナシ、ギンヨ膜（Millipore）にタンパク質を転写しウアカシア、フサアカシアで 23 kDた後、抗ニトロチロシン抗体（Sigma）バンド観察された。特にユズリハとを用いた免疫学的手法によりタンパギンヨウアカシアで強いシグナルがク質チロシンのニトロ化の解析を行検出された。LC MS/MS 解析により 23なった。ニトロ化タンパク質の同定

kD および 33 kD バンドは、それぞれは、LC M/MS 解析により行った。

PsbP および PsbO に由来することが３．研究成果
単離チラコイドにおけるニトロ化と酸素発生
NO2 による PsbO タンパク質チロシンのニトロ化と酸素発生量との間には負の相関関係が認められた(図 1)。
従って、光化学系 II を取り囲む表在タンパク質のニトロ化が NO2 による光合成阻害の分子的実体の一つであると考えられる(後述参照)が示された。 図１ シロイヌナズナ PsbO タンパク質
さらに、PsbO タンパク質ニトロ化にのニトロ化と酸素発生量の関係及ぼす因子に関する解析から、光および活性酸素は、この反応を促進する因子であることが分かった。
樹木におけるタンパク質ニトロ化解析
調べた全ての樹木で抗ニトロチロシン抗体と反応するバンドが観察された（図２）。ギンヨウアカシアで最も多くのバンドが観察された。次い

図２ NO2 曝露した樹木タンパク質のウェスタンブロット解析.
40 ppm NO2 で 8 時間曝露した樹木な
どか ら抽 出した 粗タ ンパク 質に ついて、抗ニトロチロシン抗体を用いて解析した。レーン 1：クスノキ、2：ユズリハ、3：オオイタビ、4：クチナシ、5：ギンヨウアカシア、6：フサアカシ
ア、7：シロイヌナズナ、8：ニトロ化
BSA．

でフサアカシアであった。クスノキ、ユズリハ、オオイタビ、クチナシでは 1~2 本のバンドが観察された。33kD と 23 kD のバンドに着目すると、クスノキ、ユズリハ、オオイタビ、クチナシ、ギンヨウアカシア、フサアカシアで 33 kD バンドが、ユズリ-3-ニトロ化

図３

NO2 による PsbO/ PsbP のニトロ化による酸素発生阻害．

分かった。すなわち、これら樹木に究中である。このような耐大気汚染

おいても NO2 曝露により、PsbO/PsbP酸素発生複合体タンパク質遺伝子をタンパク質がニトロ化されることを樹木に遺伝子導入して、大気汚染耐示すものである。樹木におけるニト性樹木が作出できると考えている。

ロ化と酸素発生の関係の調査するため、樹木葉からのチラコイドの単離５．発表論文リスト（印刷中も含む）を数種の樹木について試みたが、再Takahashi Misa, Shigeto Jun, Asada Kozi,現性の良い結果が得られなかった。

SakamotoAtsushiandMorikawa

図 3 に我々の考えている NO2 によHiromichi.

Nitrationof

peripheral

る酸素発生阻害モデルを示す．高濃proteins度 NO2 に植物を曝すと、葉緑体光化

atmospheric nitrogen dioxide suppresses

学系 II の酸素発生中心(OEC)を取りoxygen evolution in plants. NISSAN

囲む表在性膜タンパク質である

SCIENCE FOUNDATION Woody Plants

PsbO/PsbP がニトロ化され、タンパクBiotechnology Symposium, Tokyo, 26th質複合体のパッキングに何らかの不February, 2009ofphotosystem

IIby具合が生じ、その結果酸素発生の阻
Takahashi Misa, Shigeto Jun, Asada Kozi,害が生じると考えている。
４．今後の課題と発展

SakamotoAtsushi

andHiromichi.

PreferentialMorikawa
nitrationof

NO2 によるニトロ化に敏感なチロ

chloroplast oxygen evolving complex

シン残基を欠失させることにより、

proteins in Arabidopsis thaliana shoots

NO2 に よ る ニ ト ロ 化 攻 撃 に 耐 性 な

by atmospheric nitrogen dioxide (投稿準PsbO タンパク質(遺伝子)をデザイン備中).

できるのではないかと考え、目下研-4-