（300 μm）より薄すぎるとキャリア内に空気が混入して凍結不良をきたし，逆に厚すぎると試料が圧迫されて形態が崩れる為，筆者らはプラスティックフィルムを二枚のカミソリ刃

高圧凍結技法による胃粘膜の超微形態研究の間に挟んで刃の間隔を 300 μm に調整した二枚刃を使用しUltrastructural Study of Gastric Mucosa by
Using High-pressure Freezing Technique

難があり，高圧負荷により試料キャリアが変形して胃粘膜がている 3）．また，標準品として市販されている厚さ 200 μmのアルミニウム製試料キャリアは熱伝導性に優れるが強度につぶれることが少なくなかった．そこで，筆者らは強度に優れる僅か 10 μm 厚のステンレス箔と試料保持リングを組み合わせて考案した方法により，試料の圧損もなく（図 1D），

澤

口朗，豊嶋

典 世

Akira Sawaguchi and Fumiyo Toyoshima
宮崎大学医学部解剖学講座超微形態科学分野

硝子様凍結が凍結面からの深度で 50 ～ 100 μm に達する良好な凍結を安定して得られている 4）．
高圧凍結後は直ちに試料を液体窒素に移し，形態観察用試料は 2％四酸化オスミウム／アセトン溶液，組織化学用試料

要旨

高圧凍結技法は金属圧着法に代表される従来の凍結技法をはるかに凌ぐ深い硝子様凍結が得られ，形態保持と物質保存性に優れる魅力的な凍結技法として注目されている．筆者らの研究室では 1994 年に高圧凍結装置を導入して以来，胃粘膜の超微形態研究を軸に医学生物学研究への応用に取り組んできた．読者がそれぞれの研究課題へ応用を検討する材料となるよう，これまでの研究成果を紹介する．

は 0.5％グルタルアルデヒド／アセトン溶液を用いて凍結置換を施し，それぞれ Epoxy 系樹脂，Lowicryl 系樹脂に包埋して薄切する．
3.

胃漿液・粘液流動動態に関する電顕組織化学的研究

胃に食物が入ると胃粘膜を構成する胃底腺から消化酵素を含む漿液や胃酸が分泌されて消化が促進される一方，これらの攻撃因子から胃粘膜を保護する粘液が分泌されるが，細キーワード：高圧凍結技法，胃粘膜，超微形態，組織化学胞から分泌された漿液や粘液が胃粘膜表層に達する流動動態については未解明のままであった．それは従来の化学固定法による試料作製では組織の収縮や脱水操作によって胃底

1.

はじめに腺腔内の漿液や粘液が失われて解析できないことが主因で形態保持と物質保存性に優れる凍結技法は，形態観察ならあったが，ラット胃底腺の高圧凍結試料では胃底腺腔内に分びに組織化学的解析の最初のステップとしてさらに重要性を泌された漿液や粘液の形態が保持されていることが組織化増している．その中でも，2,100 bars（= 210 MPa）の高圧下学的観察によって明らかとなった 5）．さらに Lowicryl K4M

では氷晶形成と成長が抑制されるという原理に基づく高圧凍に包埋して薄切した切片を 0.1％過マンガン酸カリウムで結技法は，金属圧着法に代表される従来の凍結技法をはるか1 分間，酸化処理してからウラン鉛染色を施すことで，漿液に凌ぐ深い硝子様凍結が得られる魅力的な凍結技法として注を高電子密度に染め出して“可視化”することに成功した 6）

目されている1,2）．筆者らの研究室では 1994 年に BAL-TEC（図 2A）．

社製高圧凍結装置 HPM010 を導入して以来，試料キャリア腺腔内に分泌された漿液と粘液の流動動態を解明するた等の改良や培養細胞の高圧凍結技法の開発を進めながら医学め，副細胞型粘液と特異的に結合する Griffonia Simplicifolia

生物学研究への応用に取り組んできた．本稿では，読者が各Agglutinin (GSA)-II レクチンを用いた金コロイド標識と前述研究領域への応用を検討される材料として，筆者らが主題との染色法を併用して観察を進めた結果，胃底腺底部で分泌さして推し進めてきた「高圧凍結技法による胃粘膜の超微形態れた漿液が頚部から分泌された副細胞型粘液との間に界面を研究」に関する成果を紹介する．

保持した状態で腺腔内を上昇し（図 2B），胃小窩部に到達す
ると界面が解消して漿液と副細胞型粘液が一筋の流路を形成

2.

ラット胃粘膜の高圧凍結試料作製法

して胃粘膜を覆う粘液ゲル層へ向かうことが明らかとなった

生体ラットから胃粘膜を採取して高圧凍結を施す場合，麻（図 2C）．粘液ゲル層の層状構造については光顕レベルの組酔下で胃粘膜の一部を採取し，試料ホルダー（図 1A）内部

織化学染色で既に報告されていたが 7），それを裏付けるように装塡するリング状の試料キャリア（図 1B，C）の内径（2 mm）に漿液成分の存在によって高電子密度を呈する副細胞型粘液に合わせて素早く細切する．試料が試料キャリアの厚さと電子密度の低い表層粘液細胞型粘液が交互に複数の層を形〒 889–1692 宮崎県宮崎市清武町木原 5200
TEL: 0985–85–1784; FAX: 0985–85–8406* E-mail: sawa@fc.miyazaki-u.ac.jp
2010 年 3 月 5 日受付
130

成することが確認された（図 2D）．
以上の研究成果は，生体の形態保持や物質保存性に加え，細胞や組織を瞬時に固定する高圧凍結技法が形態観察の時間分解能にも優れることを示すもので，従来の化学固定法では顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 1 高圧凍結装置（BAL-TEC HPM010）の試料ホルダー（A）内部に胃粘膜と試料キャリア（外径 3 mm）を装塡する概略図（B）とその断面図（C）．a；試料キャリア（厚さ 300 μm），b；試料保護ステンレス箔製円板（厚さ 10 μm），c；スペーサーリングⅠ（厚さ 300 μm），d；スペーサーリングⅡ（厚さ 500 μm）．（D）ラット胃粘膜の準超薄切片トルイジンブルー染色像．矢頭は試料保護ステンレス箔製円板（b）に面した冷却面を示す．Bar = 50 μm．

解明し得なかった胃漿液・粘液流動動態の詳細な検討が可能となった具体例として参考にされたい．
4. 胃酸分泌刺激に伴う壁細胞の超微形態変化に関する研究

筆者らは新たなアプローチとして，ウサギの胃底腺から採取した初代培養壁細胞に高圧凍結を施した 300 nm 厚の切片をもとに，Tecnai TF30（FEI 社）を用いて約 3 nm 間隔のトモグラムを作成し，IMOD software で三次元立体再構築した

胃酸分泌に与る胃底腺壁細胞は，空腹時の酸分泌休止期に（図 3B，C）．その結果，ヒスタミン刺激によって頂上膜のは酸分泌を担うプロトンポンプを有する細管小胞が細胞内に直下に細管小胞が集まり，一部が頂上膜に向かって伸長する貯留する形態を示す一方，摂食刺激を受けて酸分泌活動期に再構築像が得られた（図 3C）．胃酸分泌機構解明の鍵を握る

入ると細管小胞膜が頂上膜と融合してプロトンポンプの局在膜融合の決定的な形態学的所見を捉えるべく，更なる解析を

8,9）が頂上膜へ移行すると考えられている （図 3A）．しかし，2 つの膜が融合する瞬間を捉えた決定的な観察報告はなく，前述の「膜融合仮説」は未だ“仮説”の域を越えていない．

加えていきたい．
5. 胃酸分泌後回復期の壁細胞膜動態に関する超微形態研究
前述の胃底腺壁細胞は摂食後の酸分泌活動期と食間の休止期を繰り返すが，このうち休止期から酸分泌活動期へ移行する際の膜動態については，初代培養壁細胞や単離胃底腺などの実験モデルが確立され，数多くの知見が集められてきた．
しかし，酸分泌活動期から休止期への回復過程にある壁細胞の膜動態については再現性の高い実験モデルがなく，未だ不明な点が多い．近年，筆者らは生体の胃粘膜に近い組織形態を保ち，ヒスタミン等の試薬に速やかな反応性を示す「ラット単離胃粘膜モデル」を開発し 3），その応用研究によって再現性の高い“酸分泌後回復期”壁細胞実験モデル確立に成功した 10）．
この実験モデルを用いて，抗プロトンポンプ抗体を用いた免疫組織化学的解析を行った結果，酸分泌後回復期におけるプロトンポンプの局在が頂上膜から細胞内へ経時的に移行す

図 2 高圧凍結技法によるラット胃粘膜の漿液・粘液流動動態観察像．（A）胃底腺底部．過マンガン酸カリウム酸化反応を応用した漿液成分可視化染色法による主細胞酵素原顆粒の開口分泌像（矢印）．（B–D）副細胞型粘液と特異的に結合するGSA-II レクチンを用いた金コロイド標識と漿液成分可視化染色法を併用．（B）胃底腺頚部．副細胞型粘液が占める腺腔（L）を漿液成分が界面を保持した状態で表層へ上昇．
（C）胃小窩部．
漿液成分と副細胞型粘液の界面が解消し，両者が一筋の流路（矢頭）を形成して表層へ向かう．
（D）胃粘膜表面を覆う粘液ゲル層．漿液成分と副細胞型粘液が電子密度の高い層（＊）を形成．Bars = 0.5 μm．

最近の研究と技術

高圧凍結技法による胃粘膜の超微形態研究ることが明らかとなった（図 4A）．これを裏付けるように，高圧凍結技法を用いた超微形態観察の結果，酸分泌活動期に発達した頂上膜が酸分泌後回復期 60 分後あたりから細胞内に取り込まれ（図 4B），同 90 分後にはオートファゴソーム様の多重膜構造（図 4C）を形成しながら次の酸分泌刺激に備えた休止期に戻ることが示唆された．今後はさらに詳細な超微形態観察を加えると共に，その所見に基づいた分子生物学的解析を加えることよって，胃酸分泌機構の解明が進むものと期待される．
131【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 3 （A）酸分泌休止期と活動期における胃底腺壁細胞の形態変化を示す模式図．酸分泌刺激を受けると休止期に貯留していた細管小胞膜が頂上膜に融合し，プロトンポンプが細胞表面に露呈される．（B）ウサギ初代培養壁細胞にヒスタミンによる酸分泌刺激を加えて 10 分後に高圧凍結を施した観察試料のトモグラム像．300 nm 厚の切片から約 3 nm 間隔の断面を作成し，IMOD software を用いて頂上膜と細管小胞膜をトレースした連続シリーズより抜粋．（C）（B）の三次元立体再構築像．
右図に抽出した細管小胞（緑）の一部が頂上膜に向かって伸長．
Bar = 0.5 μm．

6. おわりに胃粘膜の超微形態研究をもとに高圧凍結技法がもたらす優れた超微形態ならびに生体物質の保存性を紹介した．近年，生体組織や培養細胞，酵母などの観察対象に応じた高圧凍結技法の改良が進み，観察方法に応じた凍結試料の加工法も種々，開発されている11）．本稿をきっかけに読者の各研究課題に高圧凍結技法が応用され，その利点から得られる新知見によってまた新たな研究が展開されることを期待してやまない．
本研究はカリフォルニア大学バークレー校の John G. Forte教授ならびに Kent L. McDonald 研究員，コロラド大学ボルダー校の Mary K. Morphew 研究員との共同研究であり，ここに謝意を表します．

132

図 4 ラット単離胃粘膜モデルを応用した酸分泌後回復期壁細胞の動態観察．（A）抗プロトンポンプ抗体による免疫組織化学像．回復期 5 分後（左）に分泌細管の頂上膜に集積していた強陽性反応が，同 60 分後（中）には分泌細管が狭小化して反応も減弱．さらに同 120 分後（右）には細胞内に瀰漫性の陽性反応を認める．
（B）回復期 60 分後に分泌細管（IC）の頂上膜付近で観察された膜取り込み像（矢印）．M；ミトコンドリア．
（C）回復期 90 分後に観察された多重膜構造（矢頭）と，次の分泌刺激に備えるように再び貯留しはじめた細管小胞（TV）．
Bars = 10 μm（A），0.5 μm（B, C）．
文献

1）Dahl, R. and Staehelin, L.A.: J. Electron Microsc. Tech., 13, 165–174(1989)
2）McDonald, K.: Methods. Mol. Biol., 117, 77–97 (1999)
3）Sawaguchi, A., Aoyama, F., Ide, S. and Suganuma, T.: Arch. Histol.
Cytol., 68, 151–160 (2005)4）Sawaguchi, A., Ide, S. and Suganuma, T.: J. Electron Microsc., 54,143–146 (2005)5）Sawaguchi, A., Ishihara, K., Kawano, J., Oinuma, T., Hotta, K. andSuganuma, T.: J. Histochem. Cytochem., 50, 223–234 (2002)
6）Sawaguchi, A., Ide, S., Kawano, J., Nagaike, R., Oinuma, T., Tojo, H.,
Okamoto, M. and Suganuma, T.: Arch. Histol. Cytol., 62, 447–458(1999)
7）Ohta, H. and Katsuyama, T.: Histochem. J., 24, 86–92 (1992)
8）Forte, T.M., Machen, T.E. and Forte, J.G.: Gastroenterology, 73,941–955 (1977)
9）Yao, X. and Forte, J.G.: Annu. Rev. Physiol., 65, 103–131 (2003)
10）Sawaguchi, A., Aoyama, F., Ohashi, M., Ide, S. and Suganuma, T.: J.
Electron Microsc., 55, 97–105 (2006)11）McDonald, K.L., Morphew, M., Verkade, P. and Müller-Reichert, T.:
Methods Mol. Biol., 369, 143–173 (2007)
顕微鏡 Vol. 45, No. 2（2010）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】