研究助成業績報告集

2021 年度 公募自由課題研究助成

山内進循環器病研究助成

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次

究

課

題

＊

研 究 者

頁

1

深層学習を用いた心筋血流シンチグラフィー自動診断システムの
開発

楠本 大

1

2

脳 血 管 内 皮 を 標 的 と し た 脳 卒 中 、認 知 症 の 革 新 的 治 療 法 の
開発

服部 頼都

6

3

エクソソームを介した造血幹細胞と心血管系疾患のクロストーク
を理解する

山本 玲

11

深層学習を用いた心筋血流シンチグラフィーの自動診断システム開発慶應義塾大学医学部・助教

楠

本

大

Ⅰ．緒 言

分類が可能とされており、医学分野においても様々な

現在日本における死因としては癌が最大であるが、単研究開発がなされてきた(1-3)。従来の機械学習ではデ一の臓器としては心臓が最も多い。心臓による死因とータやその特徴を人間が設計してコンピューターにして最も多いものは、動脈硬化に起因し心臓に栄養を与えていたが、深層学習ではデータの特徴自体を機械供給する冠動脈に狭窄ないしは閉塞きたした狭心症、に自動的に最適化させる。そのため短期間での学習精

心筋梗塞などの虚血性心疾患が最も多い。虚血性心疾

度の飛躍的な向上を実現した。深層学習の重要性はそ患の診断においては、解剖学的に冠動脈血管がどの程の精度にある。特に画像認識のタスクにおいては、人度狭くなっているか、ということは大切であるが、実間の認識能力を超えるほどの精度に達している(4-6)。

際に治療法の選択を行う上では狭窄により機能的に

先述の通り心筋シンチの読影医の数は不足しており、心筋血流が不足しているかどうか、ということを確定

休むことなく読影を行うことができる分類器の存在することが必須である。特に機能的な心筋血流低下をは虚血性心疾患の診断において放射線科医の負担を診断するために、現在最も標準的に行われている検査

減らし、人為的なエラーを減らしてより正確な解釈を方法は心筋血流シンチグラフィーである。心筋血流シ得るために非常に有用であると言える。医療分野へもンチグラフィー検査では、心筋血流に分布する Tl-201

積極的に応用がされており皮膚腫瘍の分類を皮膚科

や Tc-99m などの放射性同位体を用いて、運動負荷時医と同等の予測精度を実現している(3)。
本研究では慶と安静時の心筋血流の画像化を行う。日本全体におい應義塾大学病院で過去 9 年間に実施された心筋血流て年間 20 万件ほどの検査が行われている循環器領域

シンチグラフィー画像全例を抽出し、最新の畳み込みにおける最も多い検査の一つである。しかし、心筋血

ニューラルネットワークの手法を用いて解析するこ流シンチグラフィでは独特のノイズやアーチファクとで、高性能で画像解析可能な自動読影システム構築

トが多く、得られた画像から正しく虚血性心疾患の診を行う。さらに同システムを併用することで、非専門断を行うための画像読影は非常に解釈が難しい。特別医レベルの循環器内科でもシステムの補助により専な訓練を受けた循環器内科医や放射線科医などが現門医レベルでの読影を可能とすることを目標とした、在読影を行なっているが、全国的に見ると専門的な読新規の診断システム開発を行いたいと考えた。

影医の数が非常に少ないことが問題となっている。現在の日本では放射線診断専門医は約 5,600 名余りしⅡ．対象・方法

かおらず、その中でも心筋シンチグラフィー読影に特(1) 症例の選択化した核医学専門医はさらに人数が少なく、深刻な人
手不足の状態である。そこで、得られた画像の自動読

本研究では、2012 年 5 月から 2021 年 3 月の９年

影を行うことで、訓練を受けていない循環器内科医で間に、当院において 201TlCl を用いた負荷心筋シンチ

も正しい読影を行うことができるような診断補助シグラフィー検査を受けた症例全例（7128 症例）を対ステム開発が期待されている。近年、人工知能の著し象とした解析を行った。全症例の中からラベル付けがい技術発展が認められているが、その中核となる技術困難であった 1631 症例を除外し、5443 症例を対象

は多層のニューラルネットワークにより構成されたとした。放射線診断科の診断レポートを参照して、画深層学習である。特に畳み込みニューラルネットワー

像を正常画像群 3801 症例（確定診断 3385 症例、アクを用いた画像分類技術は人間を凌駕する精度でのーチファクト画像 416 症例）、及び虚血性心疾患群

1

1642 症例（確定診断 1284 症例、アーチファクト画て精度の評価を行った。またさらに、テストデータの像 358 症例）に割り付けを行った（図 1）。

うち診断が確定的である症例、あるいはアーチファク
トやノイズが存在するために核医学専門医であっても診断困難であるような症例を抽出し、それぞれにおける性能の評価を行なった。

(2) 解析環境の構築
深層学習のうち、画像解析に特化した畳み込みニュー
ラルネットワークによる解析を行うため、解析環境の構 築 を 行 っ た 。 研 究 室 内 に 、 GPU (Graphics
Processing Unit)を搭載した解析専用のGPGPUサー
バーの設置を行った。設置したサーバー内での解析を行うために、docker システムをベースとした環境構(5) 医師との精度比較検証

築を行った。科学技術計算を行うパッケージである

構築したモデルの有用性がどの程度であるか検証を

Anaconda を基本環境とし、さらに Tensorflow、ある行うため、核医学を非専門とする循環器内科医による

いは Pytorch などの深層学習用のフレームワークを読影結果との比較を行った。まずは AI による診断を用いて、python 言語による解析が可能な環境の構築

見ずに循環器内科医が負荷心筋シンチグラフィー検を行った（図２）。

査の読影を行った。次に AI の診断結果を提示して循
環器内科医が診断を行った。診断精度、あるいは診断(3) モデルの学習に要する時間など、改善が見られるかどうか検証を行

各症例から画像を抽出し、３次元畳み込みニューラルった。

ネットワークを用いて特徴抽出を行った後に、年齢・Ⅲ．結 果

性別の情報を加えて、「正常画像」と「冠動脈疾患画像」を分類するように学習を行った。判定の汎化性能を向上させるために、データ拡張、L2 正則化、バッ(1) モデルの性能評価

チ正規化などの手法を組み合わせた学習を実行した。

モデルの学習を行い、テストデータにおいて精度の検証を行った。分類の精度検証のために縦軸に感度、横(4) モデルの性能評価

軸に偽陽性率 (False Positive Rate) をプロットした

全症例のうち、あらかじめ 10%のデータセットをテ

ROC 曲線(Receiver Operatorating Characteristic

スト用のデータセットとして抽出し、学習に用いるデcurve)を作成し、AUC (Area Under Curve:曲線の下ータセットとは独立して準備を行った。学習済みモデの面積)を算出した。さらに横軸に再現率，縦軸に適合

ルの性能評価のために、テスト用データセットを用い率をとったグラフである PR curve (Precision-recall

2

curve)を作成し、AUPRC (Are Under PR curve)を算

これは過去の研究と比較しても類を見ない高い精度出した。結果として、AUC 0.91、AUPRC 0.87 といであり、大規模な心筋シンチグラフィー検査の診断シう非常に高い精度で、「正常症例」、「冠動脈症例」をステムの中では最も精度が高い。

診断することが可能であった (図 3)。
(2) アーチファクト症例における精度
次に、負荷心筋シンチグラフィー検査の診断レポー
トをもとに、画像診断が確定的である「確定診断群」と、アーチファクトやノイズが存在するために診断がやや不確かである「アーチファクト群」に分類し、それぞれの群における診断精度の検証を行った。
確定診断群は、全データセットのうち 86%を占めていた。確定診断群においては、AUC = 0.93, AUPRC= 0.90 という非常に高い精度での分類が可能であった。またヒストグラムの結果からもほとんどの症例がきれいに分類可能であることが示されている（図６）。

図3: モデルのAUCとAUPRCの値は⾮常に⾼かった。
また正常症例と、冠動脈疾患をどの程度きれいに分離可能であるか検証するために、診断確度を横軸にとったヒストグラムの作成を行った。正常症例は、冠動脈疾患である確率が非常に低い地点に大多数の症例が位置しており、対して冠動脈疾患症例は、冠動脈疾患である確率が非常に高い地点に大多数の症例が位置していることが判明し、我々の構築したモデルは非常に高い精度で冠動脈疾患の画像を分類可能であることが判明した（図 4）。

予測結果のヒストグラム

図5：確定診断群における診断精度

一方、全体のデータセットのうち 14%をしめるアー

図4: 正常症例と冠動脈疾患症例の分類

チファクト画像においては、AUC = 0.74, AUPRC =0.78 と診断精度はやや低下した。
今後さらにアーチフ

3

ァクト画像をどのように見抜いていくかさらなる検トワークが登場する以前のシステムである(7, 8)。畳討が必要だと思われる。

み込みニューラルネットワークの登場により画像解析精度が劇的に改善していることが報告されている(3) 医師との診断精度比較

ことから、最新のネットワークを用いたシステム開発

核医学非専門である循環器内科医による負荷心筋シが必要とされている。負荷心筋シンチグラフィーの画

ンチグラフィーと、AI による診断精度の比較を行っ

像解析は、テクニカルに難しいこともあってか今までた。また実際の診療現場において AI を活用する際に、人工知能を用いた解析の報告は多くはなかった。類似

AI をガイドとした臨床医の診断を行うことが想定さ研究としては、2021年 Liu HらがEuropean Journalれるため、AI ガイドによる臨床医の診断も同時に行

of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 誌に報った。診断精度は、AI 診断が最も高く、AI ガイド、

告報告した論文がある(9)。同論文では 37243 症例も循環器内科と続いた。また診断に要した時間は、通常の症例に対して診断レポートを指標として正常画像の診断では 30 分程度かかっていたのに対して、AI ガ

か、冠動脈疾患画像か判定を行っており、我々の研究

イドでは 10 程度で実施が可能であり、実際の診療現に類似しているが、テストデータでの AUC 0.872 と、場に非常に有用である可能性が示された。

我々の AUC 0.91 よりも精度が劣る。理由としては、
彼らは心筋シンチ画像を 2D profile 画像という特殊な画像に変換して2D の画像として処理を行なってい診断精度
p = 0.036

ることから画像の特徴を失った状態での解析を行なっていることが考えられる。対して、我々は画像の 3次元情報を保ったまま解析を行なっている事から、画像の情報を損なう事なく解析できたために精度が非常に高かったのではないかと考えられる。また同様に
2021 年に Otaki H らも JACC Cardiovascularimaging 誌に自動診断システムの投稿を行なっている(10)。同論文では、各冠動脈の枝の異常を予測している事からより難しい予測を行なっていることもあ(分)

るが、AUC 0.8 であった。先行研究の精度も実用レベ診断に要した時間 (50枚)

ルとしては十分高いと考えられるが、我々の研究での

p = 0.010

精度はそれをさらに上回る結果であった事から、実用面での活用が非常に期待される。
また実際の臨床医の診断精度の比較により、AI を用いたほうが、診断精度も、診断に要した時間も格段に上がることが証明されており、今後本システムを導入することで診断補助システムとして非常に有用であることは間違いがないと考えられる。
一方本システムの最も大きいリミテーションは、単施設での研究であることである。実際に他施設におい

図6: 循環器内科医との精度⽐較て有用なシステムであるかどうかはまだ検証されておらず、今後検証が待たれるところである。複数施設

Ⅳ．考 察

での大規模データセットを加えることで、今後真に汎本研究において、最新の人工知能技術を用いること用性のあるシステムを構築し、実臨床でも有用性の高で、負荷心筋シンチグラフィー検査に対する高精度でい負荷心筋シンチグラフィー検査の自動診断システの自動診断システムが構築できたことが判明した。今ムを構築していきたい。

までに負荷心筋シンチグラフィー検査に対する自動Ⅴ．結 論

診断として、人工ニューラルネットワークを用いたシステムが開発されているが、畳み込みニューラルネッ

我々は、人工知能を用いた画像解析技術である畳み

4

込みニューラルネットワークを用いて、高い精度で冠5H.

動脈疾患を自動診断するシステムの構築に成功した。

6.

同システムを用いることで循環器内科医の診断精度

S, Anguelov D, et al. Going Deeper withが向上することが示されており、今後臨床現場におけ

Convolutions. ArXiv e-prints [Internet]. 2014

る補助システムとして非常に有望であると考えられSeptemberる。実臨床応用に向けてさらなる改良を進めていきた

http://adsabs.harvard.edu/abs/2014arXiv1409.4842

い。

S.
7.

Szegedy C, Liu W, Jia Y, Sermanet P, Reed

1,

2014;

1409.

Availablefrom:

Nakajima K, Matsuo S, Wakabayashi H,

Ⅵ．研究協力者

Yokoyama K, Bunko H, Okuda K, et al. Diagnostic

秋山 工・慶應義塾大学・学生

Performance of Artificial Neural Network for

岩渕 雄・慶應義塾大学・助教

Detecting Ischemia in Myocardial Perfusion

橋本正弘・慶應義塾大学・助教

Imaging. Circ J. 2015;79(7):1549-56.

陣崎雅弘・慶應義塾大学・教授

8.

福田恵一・慶應義塾大学・教授

Kinuya S, Garcia EV. Comparison of phase

Nakajima K, Okuda K, Matsuo S, Kiso K,

dyssynchrony analysis using gated myocardial
perfusion imaging with four software programs:

Ⅶ．参考文献Based on the Japanese Society of Nuclear Medicine
working group normal database. J Nucl Cardiol.
1.

Ting DSW, Cheung CY, Lim G, Tan GSW,

2017;24(2):611-21.

Quang ND, Gan A, et al. Development and9.

Validation of a Deep Learning System for Diabetic

Liu, et al. Diagnostic accuracy of stress-only

Retinopathy and Related Eye Diseases Using

myocardial perfusion SPECT improved by deep

Retinal Images From Multiethnic Populations Withlearning.

Diabetes. Jama. 2017;318(22):2211-23.

2021;48(9):2793-800.

2.

10.

Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Johannes

Liu H, Wu J, Miller EJ, Liu C, Yaqiang,

Eur J

Nucl

Med MolImaging.

Otaki Y, Singh A, Kavanagh P, Miller

van Diest P, van Ginneken B, Karssemeijer N,

RJH, Parekh T, Tamarappoo BK, et al. ClinicalLitjens G, et al. Diagnostic Assessment of Deep

Deployment of Explainable Artificial Intelligence ofLearning Algorithms for Detection of Lymph Node

SPECT for Diagnosis of Coronary Artery Disease.

Metastases in Women With Breast Cancer. Jama.

JACC Cardiovasc Imaging. 2021.

2017;318(22):2199-210.
3.

Esteva A, Kuprel B, Novoa RA, Ko J,

Swetter SM, Blau HM, et al. Dermatologist-levelclassification of skin cancer with deep neuralnetworks. Nature. 2017;542(7639):115-8.
4.

Krizhevsky A, Sutskever I, Hinton GE.

ImageNet classification with deep convolutional
neural networks.

Proceedings of the 25th

International Conference on Neural Information
Processing Systems; Lake Tahoe, Nevada. 2999257:
Curran Associates Inc.; 2012. p. 1097-105.
5.

He K, Zhang X, Ren S, Sun J. Deep

Residual Learning for Image Recognition. ArXiv eprints [Internet]. 2015 December 1, 2015; 1512.
Availablefrom:

http://adsabs.harvard.edu/abs/2015arXiv15120338

5脳血管内皮を標的とした
脳卒中、認知症の革新的治療法の開発

国立循環器病研究センター脳神経内科・医長

服
Ⅰ．緒 言

部

頼 都

すると共に、血管内皮傷害の修復にも関与し、更に頸動脈狭窄/閉塞症は，脳梗塞の主要な原因疾患で

eNOS 自身を活性化する。我々は、頸動脈狭窄症モあり、かつ、脳梗塞を発症せずとも認知機能障害をデルマウスにおいて，「長寿遺伝子」SIRT1 が eNOS

惹起し、血管性認知障害(VCI)の原因疾患の 1 つでを脱アセチル化（活性型）し、脳血流増加を介してある。世界における本疾患の患者数は、515 報のメ

認知機能が改善し(6)、頸動脈閉塞症モデルマウスにタ解析等の結果から、30~79 歳において、1.5%程度

おいて、脳血流量の低下を抑制して海馬の虚血性遅と推定されており、約 5,779 万人と推計される(1)。

発性神経細胞死を抑制した(7)ことを報告しており、当該推定に基づくと、日本における患者数は、
約 130

頸動脈狭窄/閉塞症における SIRT1 の有効性の非臨～250 万人と推計される。

床 POC が得られている。

脳梗塞の発症のリスクについて、無症候性の頸動以上より、血管内皮を標的として脳血流量を増加

脈狭窄患者を対象に米国及びカナダで実施された大させる新たな治療法として、NAD+/SIRT1 経路を活

規模な臨床試験である ACAS において、中等度以上性化させる作用を有するレスベラトロールに着目し（径狭窄率 60%以上）の頸動脈狭窄患者では、内科た。トランスレスベラトロールの薬理作用は、ホス治療（アスピリン及びリスクファクターの管理）に

ホジエステラーゼ 4 に結合し、活性を阻害するとおける 5 年間の脳梗塞のリスクが11.0%であること

cAMP が上昇する。cAMP の上昇にて CamKKβが報告されている。また、認知機能障害の発現リス-AMPK 経路を活性化し、その結果，細胞内 NAD+

クについて、無症候性高度頸動脈狭窄症患者（210を増加させ、SIRT1 活性を上昇させる(8)。その後，例）を対象に認知機能の変化を前向きに 36 ヶ月間

SIRT1 は eNOS の脱アセチル化を介して活性型へ評価した結果、健康成人と比較して認知機能が低下

変換し、eNOS-NO 軸によって脳血管を拡張させるした患者（Mini mental state examination 3 点以上(6,9)ことが期待される。

低下）が多く(2)、無症候性の中等度以上（径狭窄率50%以上）の頸動脈狭窄症患者（82 例）において、コントロール群と比較して認知機能の低下が認められ(3)、さらに、中等度以上頸動脈狭窄症患者（25例）において、コントロール群と比較してストルー
プ検査の結果が有意に悪化し 5、無症候性頸動脈狭窄/閉塞症は VCI の代表的原因疾患の１つである。
現在、頸動脈狭窄/閉塞症に対して、認知機能を改善する有効な治療法は確立されておらず、新たな治図 1 SIRT1 は，血管内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS）を
脱アセチル化し，活性型 eNOS へ変換し，一酸化窒素(NO)を増加し脳血管拡張へ導く．

療法の開発が期待されている。
頸動脈狭窄/閉塞症の原因として、血管内皮傷害が重要な役割を果たしており(4)、血管内皮型一酸化窒
素合成酵素（eNOS）の発現が低下し血管内皮機能低下が発症を惹起することが報告されている(5)。
eNOS は、NO による血管拡張を介して血流を改善

6

Ⅱ．対象・方法

動物性脂肪を大量摂取するフランス人の心血管疾
患、脳卒中の発症率・死亡率が低いのは、適度な赤本研究では、SIRT1 活性化薬レスベラトロールを

ワイン摂取によるとされる「フレンチパラドックス」

使用して、人の生体内でレスベラトロールが SIRT1(10)において、ブドウの果皮や赤ワインに含まれる活性化を介して脳血流を増加させ、そして最終的にポリフェノールの一種のレスベラトロールが動脈硬認知機能障害の軽減に寄与するかどうかの追求を行化を来すメカニズムを抑制していると考えられるよう。

うになり、細胞内 NAD+の増加を介して長寿遺伝子

脳血流低下、知機能低下を惹起しうる、径狭窄率と称される SIRT1 を活性化させる(8,11)。

>50%の内頸動脈狭窄症の患者を選択基準とし、イ

心血管障害のみならず脳血管障害関連疾患においンフォームドコンセントで事前同意が得られた患者て、これまで、Virchow の血栓形成の 3 要因（血液、をレスベラトロール群（150 mg/日）、対照薬群（プ血管、血流）の中でも血液成分のみに注目し、種々ラセボ）に無作為に割り付けるランダム化比較試験の抗血小板療法、抗凝固療法が現在実臨床で行われを施行する。レスベラトロール群の 150 mg/日の設ている。しかしながら、この血液成分のみを標的と定根拠として、以下の 2 報告がある。50～75 歳のした従来の治療戦略では、治療中、常に出血という健常な男女（23 例）を対象として、レスベラトロー

重篤な合併症の危険性が懸念される。さらに、VCI

ル 200 mg/日を 26 週間投与した無作為化プラセボの予防において、抗血栓薬使用のエビデンスは乏し

対照並行群間試験において、記憶の保持は、プラセ

い(12)。このような状況の中で、2014 年に初めてレボと比較してレスベラトロール群は有意に改善しスベラトロールによる VCI または血管内皮機能改(15)、45～85 歳の健常女性 80 名（プラセボ群 41

善の報告を認めた。レスベラトロールは、高齢マウ

例、レスベラトロール摂取群 39 例）を対象として、

ス（24 か月齢）の酸化ストレスを軽減して血管内皮

レスベラトロール 150 mg/日を 14 週間投与した無機能を改善させることで Neurovascular function

作為化プラセボ対照並行群間試験を行ったところ、を救済した(13)。さらに、レスベラトロールは、抗即時記憶、遅延再生、カテゴリの記憶の流暢さ、名アポトーシス効果によって VCI モデルラットの認

称記憶、図形、文字の記憶テスト、視覚探索と注意

知機能を改善された(14)。さらに、我々は、前述の機能評価、総合的認知機能について、プラセボと比ごとく，頸動脈狭窄症モデルマウスを使用して、較してレスベラトロール群は有意に改善した(16)。

SIRT1 が eNOS を脱アセチル化（活性型）し、脳本特定臨床研究を行うに際して、至適サンプルサ

血流増加を介して認知機能が改善し(6)、頸動脈閉塞

イズを決定するために、国立循環器病研究センター症モデルマウスにおいて、脳血流量の低下を抑制し単施設後ろ向き観察研究を行った。2020 年 7 月よて海馬の虚血性遅発性神経細胞死を抑制した(7)こり 2021 年 8 月までに国立循環器病研究センターとを明らかにした。つまり、レスベラトロールは、を受診した、トランスレスベラトロール 30mg/日をVirchow の血栓形成の 3 要因の血液以外の「血管」

摂取、または、非摂取の無症候性の中等度以上頸動と「血流」に焦点を当てた血栓防止機構によって、脈狭窄症または閉塞症患者を対象とした。選択基準
は、(1) 90 歳未満、(2)頸動脈エコーにおいて、狭窄
部の peak systolic velocity が 130 cm/s 以上（径狭窄率>50%に相当(17)）の無症候性頚動脈中等度以上
狭 窄 症 ま た は 閉 塞 症 、 (3) 認 知 機 能 検 査（

Alzheimer's

DiseaseAssessment

Scale-Cognitive subscale 13: ADAS-Cog 13 とMontreal Cognitive Assessment: MoCA）を 6 か月
から１年のインターバルをおいて測定している、(4)15O ガス positron emission tomography (PET) も

認知機能の改善/悪化予防に貢献できることが期待同様に、6 か月から１年のインターバルをおいて測される。

定している患者である。主要アウトカムは、観察期間における ADAS-Cog 13 の変化量（差分解析）の比較である。副次アウトカムは、(1) 観察期間にお図2 Virchow の血栓形成の 3 要因

7

ける MoCA の変化量（差分解析）の比較、(2) 15O ガ

当識、再認、教示再起）、合計点で、RES 摂取と認ス PET での脳血流量の変化量（差分解析）の比較

知機能改善に有意な関連を認めた（表 2）。MoCAである。国立循環器病研究センター研究倫理審査委については、遅延再生、合計点を含め、いずれの項

員会での承認を受けて本研究を開始した（研究課題目においても 2 群で有意差を認めなかった（表 3）。

番号：R20113）。
表 2 ADAS-Cog 13 で測定した認知機能の変化量

Ⅲ．結 果
1. 患者背景
34 人のレスベラトロール摂取患者 (RES 群)と26
人のレスベラトロール非摂取患者 (Non-RES 群)が、選択基準を満たした。平均年齢は、Non-RES 群で

表 3 MoCA で測定した認知機能の変化量

75.8 歳、RES 群で 77.8 歳であり、男性の割合は、
Non-RES 群で 76.9%、RES 群で 73.5%であった。
ベースラインの ADAS-Cog 13 は、Non-RES 群で15.7±6.4 点、RES 群で 17.0±8.5 点であった。
MoCA は、Non-RES 群で 23.4±3.7 点、RES 群で3. 脳血流量の変化

23.6±3.7 点であった。ADAS-Cog 13、MoCA とも

15O ガス PET で脳血流量を測定した。
当センターに両群で有意差は認めず、MoCA の点数を MMSEの診療で用いられている ROI（図 3）を元に、変化に換算すると、MMSE<28 点となり(18)、軽度認知量を解析した。
表 4 のように、
脳血流量の前後差は、

障害 (MCI) の範疇であった。表 1 の患者背景で 2

右視床、右前大脳動脈領域、右中大脳動脈領域、右群で有意差は認めなかった。

後大脳動脈領域で RES 摂取と脳血流量増加との有意な関連を示した。

表１ 患者背景

このことから、RES は、脳血流量を増加させ、認知機能を改善することを示唆する結果を得た。

図3

15O ガス PET の脳血流量の ROI

Str: 基底核、Thl：視床、ACA：前大脳動脈、
MCA: 中大脳動脈、PCA: 後大脳動脈、a: 前方領域、
p: 後方領域

表4

15O ガス PET で測定した脳血流量の変化量（前後差）

4. 特定臨床研究を行うためのサンプルサイズ測定
2. 認知機能の変化と準備状況

ADAS-Cog 13 で測定した認知機能の変化につい

本研究は、RES 投与群とプラセボ群を比較する二て、遅延再生、再認、記憶ドメイン（遅延再生、見重盲検ランダム化比較試験の予備実験として行い、8

本研究の主要アウトカムの ADAS-Cog 13 の合計点

トロール（5,000 mg/日）を投与した非盲検非対照試の変化量を元に、次相の臨床試験のサンプルサイズ

験において、腎障害が発現し、試験が中止された(20)算出を行った。

のみであり、150 mg/日の長期投与で有害事象は認

主要評価項目の解析の際にはベースライン時のめられていない。このことから、レスベラトロール

ADAS-Cog 13 の合計点を共変量とした共分散分析

は、VCI の一次予防、二次予防に安全に貢献する可により群間の比較を行う。ただし、限定的なデータ能性がある。

から推定された相関係数の点推定値は参考にしにくⅤ．結 論

いことから、
保守的に無相関を仮定する。
この下で、両側有意水準を 5%、見込みの対立仮説上での検出

レスベラトロールは、頸動脈狭窄症または閉塞症

力を 80%とした場合に必要な症例数は片群 64 例とを原因とする VCI の認知機能悪化予防に有意に関なる。以上の根拠と 10%程度の脱落等を想定し、次連しており、前向きの特定臨床研究においてもレス

相の介入試験における目標登録症例数を142 例とす

ベラトロールの VCI における予防効果が十分に期

る。

待される。

この目標症例数を元に、国立循環器病研究センタ
ーデータサイエンス部の支援の下、介入試験のプロ

Ⅵ．研究協力者

トコール作成を行うことができ、臨床研究倫理審査

吉本武史・国立循環器病研究センター 脳神経内科

委員会へ提出する。

医師

Ⅳ．考 察

Ⅶ．参考文献1.

本研究で、(1) レスベラトロールと脳血流増加、Song P, Fang Z, Wang H, et al. Global and(2) レスベラトロールと認知機能（特に記憶）の改

regional prevalence, burden, and risk

善、に関連を認めることができた。レスベラトロー

factors for carotid atherosclerosis: aル は、ホスホジエステラーゼを阻害して cAMP を

systematic review, meta-analysis, and

分解抑制し、NAD+/SIRT1 経路を活性化させて、modelling study. Lancet Glob Heal.

eNOS を活性型に変換し脳血管拡張を介して脳血流2020;8:e721–9.
2.

を改善し、最終的に認知機能改善に寄与したことがBalestrini S, Perozzi C, Altamura C, et al.
Severe carotid stenosis and impaired

考えられた。
この予備研究の結果を元に、レスベラトロール

cerebral hemodynamics can influence

150mg/日の投与が VCI の予防に寄与するかどうか

cognitive deterioration. Neurology.

を特定臨床研究で検討していく。

2013;80:2145–50.

NAD+/SIRT1 経路を活性化可能な要素として、レ3.

Lal BK, Dux MC, Sikdar S, et al.

ス ベ ラ ト ロ ー ル の ほ か に 、 nicotinamide 、

Asymptomatic carotid stenosis is associatednicotinamide mononucleotide の投与が挙げられる。

with cognitive impairment. J Vasc Surg;VCI のモデルである慢性脳低灌流モデルマウスに

2017;66:1083–92.

nicotinamide を投与すると、oligodendrocyte 分化

4.

のマーカーの CnPase や軸索障害でも減少しうる

Ross R. Inflammation or Atherogenesis. N
Engl J Med. 1999;340:115–26.

synaptophysin が増加し、虚血性白質傷害を軽減す

5.

Rundek T, Hundle R, Ratchford E, et al.

る(19)。しかしながら、nicotinamide は、人での至Endothelial dysfunction is associated with

適用量、至適投与期間が検討されていない。

carotid plaque: A cross-sectional study from

nicotinamide mononucleotide に関しては、VCI モ

the population based Northern Manhattan

デルへの投与研究は行われていない。一方、レスベ

Study. BMC Cardiovasc Disord. 2006;6:35.
6.

ラトロールはすでに健常者での至適用量、至適投与

Hattori Y, Okamoto Y, Maki T, et al. Silent

期間が検討されている。さらに、レスベラトロール

information regulator 2 homolog 1 countersの安全性も特筆すべきである。重篤な有害事象は、

cerebral hypoperfusion injury by

再発難治性の多発性骨髄腫患者に高用量のレスベラ

deacetylating endothelial nitric oxide

9synthase. Stroke. 2014;45:3403–11.
7.

14.

Hattori Y, Okamoto Y, Nagatsuka K, et al.

resveratrol on learning and memory in rats

SIRT1 attenuates severe ischemic damage

with vascular dementia. Mol Med Rep.

by preserving cerebral blood flow.

2019;20:4587–93.

Neuroreport. 2015;26:113–7.
8.

9.

10.

15.

resveratrol on memory performance,

Resveratrol ameliorates aging-related

hippocampal functional connectivity, andmetabolic phenotypes by inhibiting cAMP

glucose metabolism in healthy older adults.

phosphodiesterases. Cell. 2012;148:421–33.

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Mattagajasingh I, Kim CS, Naqvi A, et al.

16.

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Renaud S, de Lorgeril M. Wine, alcohol,

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Small molecule activators of sirtuins extend

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SIRT1 promotes endothelium-dependent

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Toth P, Tarantini S, Tucsek Z, et al.

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Resveratrol treatment rescues

20.

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2 study of SRT501 (resveratrol) withof improved cerebromicrovascularbortezomib for patients with relapsed andendothelial function and downregulation ofor refractory multiple myeloma. Br J

NADPH oxidase. Am J Physiol Heart Circ

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Physiol. 2014;306:H299-308.

10エクソソームを介した造血幹細胞と心血管系疾患のクロストークを理解する
京都大学高等研究院・特定拠点准教授

山
Ⅰ．緒 言

本

玲

を用いることで造血幹細胞の増幅培養が初めて可能

造血幹細胞は、自己複製能と多分化能という特徴をとなり(5)、造血幹細胞を 1 ヶ月で 900 倍に増幅する有した細胞であり、一生涯にわたって、あらゆる造血ことができるようになった。さらに、現在、別のポリ系を維持している(1)。
加齢に伴い造血幹細胞に特異的マーを用いることにより 2000 倍の増幅培養も可能とな遺伝子変異が蓄積し、血液疾患の発症のみならず動なっており、この新規技術を用いることにより非常に脈硬化・心血管障害などに関与することが近年明らか

まれな細胞集団である造血幹細胞のエクソソーム解になってきている(2)。しかし、その詳細なメカニズム

析が初めて可能となる。

は未だ不明であり、このような生活習慣病を、造血幹

造血幹細胞という非常にまれな細胞を対象とした細胞を中心とした造血系から捉え、解明し、治療しよエクソソーム研究はこれまで行われておらず、さらに、うという試みは非常に新規性が高い。本研究では、加心疾患など生活習慣病を造血幹細胞の加齢の観点か

齢に伴い造血幹細胞に蓄積する遺伝子変異と動脈硬ら捉える点は非常に独創性が高い。エクソソーム研究

化の関連を明らかにし、そのメカニズムの解明を行う。

の先駆者である Raffai 教授と、画期的な造血幹細胞

新たな治療戦略構築の基盤ともなり得ると期待でき増幅培養の技術を組み合わせることにより、かつて困る。

難とされていた造血幹細胞におけるエクソソーム解

造血幹細胞は、健常者においても加齢に伴って析を世界に先駆けて実行させることができる。

DNMT3A や TET2 や RNA スプライシング分子

以上のように、(1) 造血幹細胞から産生されるエク(SF3B1、SFRS2、U2AF1)などの遺伝子変異が蓄積すソソームに着目 (2) そのエクソソームの加齢や加齢ることが近年明らかとなり、これはクローナル造血と特異的遺伝子変異による変化に着目 (3) 造血幹細胞呼ばれる(3)。
このクローナル造血は将来の血液疾患のを増幅培養できる新規培養技術 (4) 造血幹細胞からリスクにもなり、さらに興味深いことに、心血管障害

産生されるエクソソームをマウスに注入し心血管系のリスクにもなることが近年明らかとなっている。申疾患に対する影響を検討 という特色があり、これら請者らの知見により、若齢造血幹細胞を骨髄移植するを統合することにより心血管系疾患と造血幹細胞のことにより心不全や動脈硬化モデルが軽快すること

新しいクロストークを提唱できると期待できる。

が分かっている(論文投稿中)。一方、iPS 細胞などを用いた幹細胞治療による心機能や心臓修復に関するⅡ．対象・方法

研究はなされているが、そのメカニズムは注入されたマウス骨髄採取

幹細胞からのエクソソームなどの分泌因子によるもマウスの下肢・骨盤・背骨より骨髄を採取し、cKit-のであると考えられている。そこで申請者は、これらAPC（2B8）抗体で 107 細胞あたり 0.2 uL の量で 30の知見を統合し、造血幹細胞から産生されるエクソソ

分 4℃で染色する。PBS wash 後、Anti-APC beads

ームを若齢・加齢・加齢特異的遺伝子変異を有した個で 107 細胞あたり 0.2 uL の量で 15 分 4℃で染色す

体で比較することにより、心機能や心血管障害に影響る。PBS wash 後、LS カラムで cKit 陽性細胞を濃縮するエクソソームを同定できると仮説を立て、本研究する。その後、CD34-FITC (RAM34) 2.5 uL、CD150-

課題を立案した。エクソソーム解析には大量の細胞がPE-Cy7 1.0 uL、
CD41-BV421 1.0 uL、
cKit-APC 0.5必要とされるが、造血幹細胞は骨髄有核細胞の

uL、Sca1-PE 0.5 uL、Lineage マーカー 2.5 uL で0.004%しか存在しない(4)。しかし、申請者らにより染色する（抗体量は 107 細胞あたり）。30 分染色後、2019 年に液体糊の成分であるポリビニルアルコール

ソーティングを行った。

11

Raffai 先生は、高品質のエクソソーム単離法を開発し造血幹細胞の培養・培地回収
マ ウ ス 造 血 幹 細 胞(CD150+CD34-

sKit+Sca1+Lineage-)を、F12 基本培地に 0.1%ている（図 3）。

ポリマ

マウス造血幹細胞由来エクソソームの輸注

ー、マウス TPO 100 ng/mL、マウス SCF 10 ng/mL

エクソソームを単離しエクソソームが実際、単離で存在下で培養する。1 日おきに培地を交換する。1 週

きたか確認を行った（図 4）。実際、エクソソームが単間後より、培地交換の際に培地を回収し、4℃で保存離されたことを確認し、その in vivo における意義をする。培養開始後 4 週間培地を集め、800g x 30 min

確認するために、野生型マウス及び動脈硬化モデルマ

で遠心し、0.45 um フィルターで細胞残渣物などを除ウスにエクソソームの輸注を行った。動脈硬化モデル去する。

マウスとして Western diet 下の ApoE ノックアウ
トマウスを用いた。エクソソームの役割をみるために、

Ⅲ．結 果

骨髄や末梢血中の血液細胞の内訳うあ動脈硬化の進マウス造血幹細胞の培養系の確立

展を評価する必要があり、輸注後、3 ヶ月後に解析予

エクソソームを単離・解析及びマウスに輸注するた定である。具体的には、各血液細胞の割合や特に造血めには大量のエクソソームが必要であり、必要細胞数

幹・前駆細胞の割合や血液中のコレステロール量、動は 107 のオーダーである。しかし、マウス造血幹細胞

脈の組織切片によるプラーク形成・ネクローシス領域

は骨髄中の CD150+CD34-CD41-cKit+Sca1+Lineage-の測定を行う。これにより、どの加齢特異的遺伝子変に濃縮（図 1）されるが、骨髄有核細胞の 0.004%以

異が動脈硬化の増悪に関与するか同定することがで下と非常にまれな細胞であり、マウス 1 匹より 103 のきる。さらに、輸注後定期的に末梢血の血液細胞の細オーダーでしか採取できず、1000 匹のマウスを使う

胞数を計測しているが末梢血においては有意な差はのは現実的ではない。 そこで我々が近年開発したポ現時点（輸注後 3 週）では認められていない。

リビニルアルコールを用いた造血幹細胞の維持増幅培養法(5)をさらに改善した。これは、ポリビニルアル

図１ 造血幹細胞の分取

コールと同様にポリマーの一種であり、これを用いることにより造血幹細胞を半年以上にわたり培養可能
で、さらに 2000 倍以上に増幅できる。実際、これにより造血幹細胞画分が非常に増幅され（図 2）、約 1 ヶ月間培養し、定期的に培養液を回収することにより、

マ ウ ス 造 血 幹 細 胞 は CD150+CD34-CD41-

解析に必要な量を確保できる。

sKit+Sca1+Lineage-の中に存在する細胞であり、フロ

マウス造血幹細胞からのエクソソーム単離

ーサイトメトリーにて図のようなゲーティングスト

以下のマウスよりまず造血幹細胞をフローサイト

ラテジーで分取した。

メトリーにて分取した。使用したマウスは、C57BL/6（10 週齢、加齢マウス C57BL/6（60 週齢）、共同研

図 2 マウス造血幹細胞の増幅培養究者の京都大学医学部教授 小川誠司先生よりいた
だいた Dnmt3a コンディショナルノックアウトマウ
ス, Tet2 コンディショナルノックアウトマウス（10−20 週齢）である。各々のマウス造血幹細胞を確立した新規増幅培養法を用いて培養した。培養 1 週間後より、隔日で培養液を回収した。培養液は遠心及び0.22um の濾過フィルターを用いて細胞を除去した。
定期的に培養開始後 4 週まで培養液を回収を継続しマウス造血幹細胞 CD150+CD34-sKit+Sca1+Lineage-

た。 エクソソームは 4℃保存で安定しており、回収しをフローサイトメトリーにて分取後、F12 基本培地にた培養液を共同研究者であるカリフォルニア大学サ

ポリマー、マウス TPO 100 ng/mL、マウス SCF 10 ng/mL

ンフランシスコ校 Professor of Surgery Division of

存在下で培養。1 週間培養したところの画像。

Vascular and Endovascular Surgery の Robert
Raffai 先生へエクソソーム単離をお願いした。
Robert

図 3 エクソソーム分離法

12Ⅴ．結 論本研究により、新規造血幹細胞培養法を用いること
により、非常にまれな細胞集団のエクソソームを解析できることが分かった。さらに、未発表データではあるが、糖尿病モデルから単離されたエクソソームが造血系に影響することも分かっており、エクソソームを介した疾患と造血幹細胞の関連は興味深いところである。
図4 マウス造血幹細胞より産生されたエクソソームの単離Ⅵ．研究協力者
Robaert Raffai, Ph.D., カリフォルニア大学サンフラ
ンシスコ校

Professor of Surgery Division of

Vascular and Endovascular Surgery, Professor
小川誠司先生、京都大学医学部、教授

Ⅶ．参考文献1.

Seita J, Weissman IL. Hematopoietic stem
cell: self‐renewal versus differentiation. Wi
ley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2010 Nov 1;2(6):640–53.

蛋白のポンソー染色および Flotillin/CD9 のウェス
タンブロッティングにてエクソソームが単離できた

2.

ことが分かる。

Warren LA, Rossi DJ. Stem cells and agin
g in the hematopoietic system. Mech Ageing Dev. 2009 Jan;130(1–2):46–53.

Ⅳ．考 察
エクソソーム研究には多数の細胞を必要とするが、3.

Steensma DP. Clinical Implications of Clon

本研究により、造血幹細胞の新規培養法を確立し、そal Hematopoiesis. Mayo Clin Proc. 2018 Au

れにより解析に必要十分量のエクソソームを確保す

g;93(8):1122–30.

ることができた。
4.

最近、我々は、エクソソームが造血幹・前駆細胞に

Ema H, Morita Y, Yamazaki S, Matsubara

作用しアテローム性動脈硬化症の炎症状態に影響す

A, Seita J, Tadokoro Y, et al. Adult mouse

ることを示した(6)。これは、様々な疾患状態における

hematopoietic stem cells: purification and si

エクソソームが造血幹・前駆細胞を介した全身への影

ngle-cell assays. Nat Protoc. 2006;1(6):2979–

響が重要であることを示唆している。本研究をさらに87.

展開し、慢性炎症（加齢）という観点より骨髄（造血5.

幹細胞）と心臓（心血管）の臓器連関を捕らえ、従来

Wilkinson AC, Ishida R, Kikuchi M, Sudo
K, Morita M, Crisostomo RV, et al. Long-teの視点とは異なり、動脈硬化や心血管などの生活習慣

rm ex vivo haematopoietic-stem-cell expansi

病を一見無関係である造血幹細胞の加齢に伴う遺伝on allows nonconditioned transplantation. N

子変異や慢性炎症による造血幹細胞の変化に注目しature. 2019 Jul;571(7763):117–21.

捉え直すことも可能となる。造血幹細胞から様々な「生活習慣病」を再定義し病態を解明することで、治6.

療戦略を構築する上での新しいアプローチ方法を創Bouchareychas L, Duong P, Covarrubias S,
Alsop E, Phu TA, Chung A, et al. Macroph

成できる。

13

age Exosomes Resolve Atherosclerosis by R
egulating Hematopoiesis and Inflammation
via MicroRNA Cargo. Cell Rep. 2020 Jul 1
4;32(2):107881.

14