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KOD SYBR®
qPCR Mix(Code No.QKD-201,QKD-201T)

使用说明书

科研用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目 录【1】 简介 ...........................................................................................................................................1【2】 本产品的组成 ............................................................................................................................2【3】 其他必需品................................................................................................................................3【4】 使用方法....................................................................................................................................7【5】 使用例（Ⅰ） 长链 / GC Rich 目的片段的定量 PCR ....................................................... 14【6】 使用例（Ⅱ） 通过融解曲线对各种扩增长度进行分析 ...................................................... 16【7】 使用例（Ⅲ） 通过 ASP-PCR 进行 SNP 分析 .................................................................... 19【8】 相关 Protocol：从 RNA 样品合成 cDNA ............................................................................ 21【9】 常见问题................................................................................................................................. 22【10】相关产品 ................................................................................................................................ 27【 注意 】

该系列产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。

【 保存 】

所有组分请均保存于-20℃条件下。

※SYBR®为 Molecular Probes Inc.的注册商标。

【1】 简介
KOD SYBR® qPCR Mix是基于SYBR® Green I检测体系的Realtime PCR用2×浓度的MasterMix 试剂。本产品已将除 ROX（另外添附）和引物以外的成分预混，因此，使得反应液的配制非常
简便，同时，可将样品间的荧光强度散乱控制在最小范围内，可获得很高的重复性。
本产品通过将去除 3’→5’核酸外切酶活性（校正活性）的 KOD exo(-) DNA polymerase 和组分最适化的 buffer 相结合，使得 KOD 出色的合成能力和不易受粗样品抑制的能力在掺入法检测（SYBR® Green I）中得到最大限度的发挥。

◆ 本产品特征 ◆1. 可用于长片段（～2kb）
可对用以往 Realtime PCR 试剂难以扩增的 500bp~2kb 的目的片段进行定量的扩增。因此，对于为 KOD FX 系列、KOD -Plus-系列等常用的 PCR 设计的引物可直接使用。此外，由于可扩增至 2kb
的目的片段，引物的选择范围变得更大。而且，由于可选择各种长度的目的片段，因此对于 Tm 值
不同的扩增产物的设计变得更容易，可对更广范围的融解曲线进行分析。本产品的这些特性，可在使用 end point assay 的多重分析中得到充分发挥。
2. 可用于使用粗样品的 end point 分析

粗样品例

可使用粗样品（右表）进行扩增。因此，最适用于
直接使用裂解液的基因分型。

3.对高 GC 含量的目的片段非常有效
通过使用 KOD DNA polymerase，即便是用以往产品难以扩血液终浓度 1.0％左右指甲1mm 左右头发从发根开始 1～2cm

口腔粘膜

取样后、水悬浊液

培养细胞～103 细胞

动物组织

碱裂解液
裂解液
（终浓度 1％以下）

植物组织增的 GC 含量超过 70%的目的片段也可进行定量的扩增。

4. 高特异性
通过组分最适化，提高了 PCR 的特异性。通过抑制引物二聚体等非特异性反应，即便是低拷贝条1
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件下也能得到更广的可定量区域。

5. 可适应各种仪器
除适用于普通及高速的模块型（Block Type）仪器，也可用于玻璃毛细管型（Glass Capillary Type）
高速 Realtime PCR 仪。此外，由于另外添附了 50×ROX reference dye，对于使用 Passive
Reference 的仪器（如 Applied Biosystems 公司制造的仪器），可根据各种仪器的特征把 ROX 浓度调到最适值。

【2】 本产品的组成本产品包含以下试剂
品名及内容®

KOD SYBR qPCR
Mix
50×
ROX reference dye

保存
-20°C
（或在 2～8°C 条件下
3 个月以内）避光保存-20°C（或 2～8°C）
避光保存

容量（QKD-201）

容量（QKD-201T）

5ml（1.67ml×3）

1ml（1ml×1）

250μl

50μl

KOD SYBR® qPCR Mix
・该组分是包含反应缓冲液、SYBR® Green I、dNTPs、Mg2+、KOD exo(-) DNA polymerase 及抗DNA 聚合酶抗体的 2×预混液。请添加模板 DNA （cDNA、genomic DNA、plasmid DNA 等）和引物溶液，并用灭菌蒸馏水配制成 1×浓度后再使用。
・该溶液中不包含 ROX （passive reference dye）。
・收到产品后，请立即置于-20°C 冷冻保存。
・初次使用时，请先将其融解，然后轻轻地颠倒混合，使溶液完全均一后再使用。如果在短时间内
要持续使用时，可在 2～8°C 条件下冷藏保存，并在 3 个月内使用完毕。
・融解后的产品短期内不用时，请装入原包装袋，再次于-20°C 冷冻保存。经确认该组分反复冻融约 10 次对品质没有影响。

2垂询电话：021-5879 4900

・为防止 SYBR® Green I 的荧光淬灭，请避光保存。

50×ROX reference dye
・以 Applied Biosystems 公司、Agilent Technologies 公司制造的仪器为代表，为校正各孔间的荧光
强度及分注误差，在使用 Passive Reference 的仪器进行反应时，请添加 ROX。最适添加量根据仪器种类的不同而不同。几种主要仪器的添加量请参考[4] 使用方法（1）反应液的配制。
・不用 Passive Reference 进行校正的仪器无需添加 ROX。
・请在-20°C 或 2～8°C 条件下避光保存。
・长时间不使用时，请于-20°C 冷冻避光保存。
※ROX reference dye 固定使用同一浓度时，也可将 50×ROX reference dye 预先与 KOD SYBR®
qPCR Mix 混合后保存。混合后请轻轻颠倒混匀，然后按上述 KOD SYBR® qPCR Mix 的保存条件
保存。混合比例如下。ROX 的浓度请参考[4] 使用方法（１）反应液的配制。
1×ROX 浓度qPCR Mix : 50×ROX = 1.67ml : 66.8μl （QKD-201） / 1ml : 40μl （QKD-201T）
0.1×ROX 浓度qPCR Mix : 50×ROX = 1.67ml : 6.7μl （QKD-201） / 1ml : 4μl （QKD-201T）【3】 其他必需品
除本产品外，还需准备以下试剂和仪器。
（1）Realtime PCR 仪
本产品适用于普通及高速的模块型（Block Type）、玻璃毛细管型（Glass Capillary Type）等各
种 Realtime PCR 仪。请使用者根据各仪器说明书，结合实际情况进行适当调整。
（2）引物
请准备与目的基因序列相对应的引物。在使用 SYBR® Green I 的掺入法检测中引物的特异性非常重要。而为 KOD -Plus-系列、KOD FX 系列、KOD Dash 等普通 PCR 设计的扩增片段长达 2kb

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的高特异性引物，基本上也可直接使用。
以下列举了设计引物时需注意的一般事项。
・引物请设计在扩增长度 2kb 以下。
・引物的融解温度（melting temperature: Tm*1）请设定在 60～70°C 的范围内。融解温度根据计算
方法不同而有所差异，但请以 60～70°C 为基准进行考虑。
・GC 含量为 45～60%。
・请注意不要使其形成引物二聚体。其中，以下三种情况很容易产生引物二聚体，请尽量避免。
① Forward、Reverse 引物的 3’末端相互补
② 引物的 3’末端附近 GC 含量很高
③ 引物内含有相互补的序列・3’末端设计为 G 或 C 可提高引物与模板结合效率。但如前所述，如果 GC 过于偏向 3’端，则容易出现非特异性反应。
・以 cDNA 为目的片段时，引物设计应尽量横跨内含子，以防止基因组 DNA 的扩增而引起假阳性。

此外，引物的纯化程度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物荧光强度
散乱，容易产生非特异性产物。请尽可能使用 HPLC 级别纯化，至少要用经 Cartridge（OPC）级
别以上纯化的引物。
*1:引物Tm值的计算请使用最邻近法（Nearest Neighbor method）。本说明书中所记载的引物Tm值是

在50mM Na+浓度和0.5μM寡聚核苷酸浓度条件下计算而得。

（3）模板 DNA
用本产品，cDNA、genomic DNA、plasmid DNA、virus DNA 等各种 DNA 及一部分粗样品都
可作为模板使用。但含尿嘧啶的模板不能使用。

（a）cDNA・将普通逆转录反应试剂合成的 cDNA，无需纯化，用灭菌水等适当稀释后可直接添加到

4垂询电话：021-5879 4900

RealtimePCR 反应液中。
・添加量不应超过总反应体系的 10%*1。过量添加会大大改变 PCR 反应缓冲液的组成，导致定量性低下。
・本公司的 Realtime PCR 用逆转录试剂盒 ReverTra Ace® qPCR RT Kit （Code: FSQ-101）、
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix（Code : FSQ-201）、
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with
gDNA Remover（Code : FSQ-301），通过改良组分，使带入到 Realtime PCR 反应体系的逆转录反应液的影响降到最小，即便在 PCR 反应体系中添加最多至 20%的液量，也能表现出良好的反应曲线。
*1: 市售的某些逆转录反应用试剂不是专门针对荧光定量PCR设计的，此时添加量应小于总反应体系

的10%。

（b）genomic DNA、virus DNA
・genomic DNA、virus DNA 也可以作为模板使用。
・添加量以每 50μl 反应体系 200ng*2 为上限。
*2

: 由于SYBR® Green I具有和双链DNA分子结合发光的特性，在以大量的双链DNA为模板的情况下，

SYBR® Green I与模板DNA自身相结合，会造成基线上飘。因此，在以genomic DNA为模板时，在高浓度区域会出现直线性低下的情况。

（c） plasmid DNA・plasmid DNA 也可作为模板使用。
・如果直接使用环状 plasmid DNA，容易导致扩增效率低下，从而不真实地反应拷贝数*3。因此，请
使用限制酶将其切断，线性化后再使用。
・当稀释纯化过的 plasmid DNA 溶液时，溶液中的 DNA 浓度会变得非常低，DNA 容易被容器吸附。
因此，进行 Realtime PCR 时，会造成低浓度区域的线性和重现性低下。如果在稀释时，将与反应无关的核酸（yeast RNA 等）作为掺入物与稀释液混合，可改善低浓度区域的线性。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司*3: plasmid DNA的拷贝数，可用以下简易公式计算。
每1μg plasmid DNA的拷贝数 = 9.1 x 1011 / plasmid DNA的大小（kb）（d）粗样品将活体组织等粗样品添加到 PCR 反应液中时，请参照以下的添加量。过量添加会导致反应性低下，
请务必注意。
●end point检测时可确认到扩增的添加量（20μl反应体系时）
全血
指甲
头发
口腔粘膜
培养细胞
动物组织
植物组织

稀释至1/10、添加2μl
按米粒的1/3大小、直接添加从发根处开始1~2cm、直接添加
用棉棒取样后，在200μl水中悬浊、向反应液中添加5μl~103 cells
1

碱裂解液*
2
一步法得到的植物裂解液**1: 碱裂解液按以下方法配制。
活体样品（添加量参照右图）↓←添加50mM NaOH 180μl↓Vortex充分振荡↓95°C、10分钟温育
↓←用1M Tris-HCl(pH8.0) 20μl中和↓Vortex充分振荡↓离心 12,000rpm、5分钟（optional）
在20μl反应体系中添加上清0.5μl～2μl（活体样品不会也无需完全溶解）

活体样品例
鼠尾
猪肉
牛肉
指甲

约 3mm
约 20mg约 20mg
约 5mg*2: 植物裂解液按以下方法（一步法）配制。
植物（稻叶、烟草叶、米粒等）（约3mm的小块）↓←添加Buffer A 100μl↓Vortex充分振荡↓95°C、10分钟温育
↓Vortex充分振荡
用灭菌水将上清稀释至1/10↓
在20μl反应体系中添加上清0.5μl～2μl

Buffer A
100mM Tris-HCl (pH9.5)
1M KCl10mM EDTA

在Buffer A中，通过使用Pestle对植物组织进行匀浆，可提高效率。此时，不需要加热。

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【4】 使用方法（1）反应液的配制
以下为 50 μl 及 20 μl 反应体系时的配制例。请根据使用的 Realtime PCR 仪的特性，适当增减
反应液量。
试剂

50μl反应体系

20μl反应体系

终浓度

灭菌水

X μl

X μl

KOD SYBR®
qPCR Mix

25 μl

10 μl

1×

Forward Primer
Reverse Primer

10 pmol
10 pmol

4 pmol4 pmol

0.2 μM*1
0.2 μM*1

50×ROX
reference dye

1 / 0.1 μl

0.4 / 0.04μl

1× / 0.1×*2

DNA溶液

Y μl

Y μl

合计液量

50 μl

20 μl

*1

: 扩增效率不充分的情况下，可提高引物浓度，发生非特异性反应时，可降低引物浓度，从而改善反应结果。引物浓度，请以终浓度0.05～1.0 μM为标准进行探讨。

*2: Applied Biosystems公司的仪器，Agilent Technologies公司的仪器等，为校正各孔间的荧光强度及分注误差而使用了Passive Reference。因此使用这些仪器时请添加ROX reference dye。最适
添加量根据仪器种类的不同而有所差异，几种主要仪器的添加量如下。不用Passive Reference进行校正的仪器无需添加。
表1：几种主要仪器的最适ROX reference dye浓度仪器终浓度（添加量）

Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、StepOne™、
StepOnePlus™ 等
Applied Biosystems 7500、7500Fast、
Agilent Technologies公司生产的仪器（Option）等
Roche公司生产的仪器、Bio-Rad公司生产的仪器、BioFlux LineGene等

1× (1/50量)0.1× (1/500量)
不添加

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此外，长期稳定地使用 ROX reference dye 同一浓度的情况下，可预先按以下比例将 50×
ROX reference dye 与 KOD SYBR® qPCR Mix 混合后保存。
ROX 按 1×浓度使用时
或 1ml : 40μl (QKD-201T)

qPCR Mix : 50×ROX = 1.67ml : 66.8μl (QKD-201)
ROX 按 0.1×浓度使用时qPCR Mix : 50×ROX = 1.67ml : 6.7μl (QKD-201)

或 1ml : 4μl (QKD-201T)（2）PCR循环条件的设定（a）推荐的PCR循环条件
首先，建议以以下的条件进行PCR。反应特异性较低，或扩增效率较低时，再按「（b）PCR
循环条件探讨方法」中记载的方法摸索条件。
Step温度时间升降速度

预变性 98°C

2分钟*1

最大

变性 98°C
PCR退火 60°C*2（40 cycles*4）延伸 68°C

10秒
最大
10秒
最大
3
30秒/500bp*
最大（500bp以下30秒）（Data Collection设定在延伸步骤）

融解曲线分析（Melting / Dissociation Curve Analysis）*5*1: 本产品由于采用了使用抗体的热启动系统，需进行98°C、2分钟的预变性，使抗体热变性。

*2: 无法得到充分的扩增效率的情况下，可将退火温度设定得低一些（～50°C），发生非特异性反应时，可将退火温度设定得高一些（～68°C），从而改善反应结果。

*3: 一般情况下，标准序列目的片段在500bp以下时，延伸时间30秒即可进行充分的反应。但一部分仪器为测定稳定的荧光，延伸时间需大于30秒。扩增曲线散乱，或各孔间的差异较大时，请设定较长的延伸时间（45-60秒）。另外，部分仪器由于硬件或控制用的软件原因，无法设定为30秒，此时请根据仪器的使用说明书，设定最适的可设定时间。标准序列目的片段在500bp以上时，延伸时间按目的片段链长30秒/500bp设定。

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*4: 检测粗样品时，有时会出现起峰值（Ct值）很低的情况。此时，在特异性不影响的范围内增加循环数（～50 cycles），可改善检测灵敏度。

*5: 在 SYBR® Green I 检测体系中，通过将 SYBR® Green I 和 DNA 扩增产物结合，以该荧光强度的增大为指标，进行检测。虽然与普通的 PCR 进行同样的反应非常简便，但由于会检测出引物二聚体及非特异性的扩增产物，需要在扩增后通过融解曲线分析进行确认。融解曲线分析的设定请
按各仪器的标准进行设定。详细请参照各仪器的使用说明书。
目的片段的GC含量超过80%时，根据仪器的不同，有时会发生融解曲线中途无法检测到的情况，此时，请进行电泳以确认特异性。将融解温度的上限设定为99°C可解决该问题。

（b）PCR循环条件探讨方法
反应特异性较低或扩增效率较低（无法确认扩增）时，请按以下方法摸索PCR循环的最适条件。
●反应特异性较低时可通过提高退火温度及2 step PCR来改善反应特异性。此时，请在确认与扩增效率平衡性的同时，来决定最适的退火条件。
推荐条件
98°C、10秒 → 60°C、10秒 → 68°C、30秒/500bp （40 cycles）
提高退火温度*1
98°C、10秒 → ～68°C、10秒 → 68°C、30秒/500bp （40 cycles）
进行 2 step PCR
98°C、10秒 → 68°C、30秒/500bp （40 cycles）●扩增效率较低（无法确认扩增）时
可通过延长延伸时间、降低退火温度来改善扩增效率。此外，有时也可通过增加引物量来改善扩增效率。

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推荐条件
98°C、10秒 → 60°C、10秒 → 68°C、30秒/500bp （40 cycles）
延长延伸时间
98°C、10秒 → 60°C、10秒 → 68°C、～1分钟/500bp （40 cycles）
降低退火温度*1
98°C、10秒 → 50°C～、10秒 → 68°C、30秒/500bp （40 cycles）*1: 摸索退火温度时，可通过使用ABI StepOnePlus™的VeriFlexTM功能、Bio-Rad公司仪器的温度梯
度功能，一次运转可探讨几个退火温度，从而使得摸索条件更加简便。

（3）-1 Applied Biosystems StepOnePlusTM循环条件设定例
（普通的Block type、软件版本2.2.2）
以下为在Applied Biosystems StepOnePlusTM上使用本试剂的循环条件设定例。
① 启动软件，选择Design Wizard、Advanced Setup、QuickStart中的其中之一。
② 选择下表的标签，reagents选择SYBR® Green Reagents。
Design Wizard
Advance Setup
QuickStart

Methods & Materials
Setup → Experiment Properties
Experiment Properties③ 选择Run Methods，如下所示设定温度条件。
*1
*2

*4

*3

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*1

: Sample Volume (μL)栏中，请务必输入正确的反应液量。

*2: 由于初期设定为2 step，请选择Add Step，变更为3 step。

*3: 延伸反应时请设定为数据回收point。

*4: 请添加制作融解曲线用的循环。GC含量较高时，融解温度的上限请设定为99°C。

④ 在正确的位置放置PCR板和离心管，就可以开始PCR反应了。

（3）-2 Applied Biosystems 7500 Fast Real Time System循环条件设定例
（普通的Block type、软件版本1.4）
以下为在Applied Biosystems 7500 Fast Real Time System上使用本试剂的循环条件设定例。
① 启动软件，选择Instrument标签。
② 如下所示设定温度条件。

*3

*1
*2

*1

: Sample Volume (μL) 栏中，请务必输入正确的反应液量。

*2: 延伸反应时请设定为数据回收point。

*3: 请添加制作融解曲线用的循环。GC含量较高时，融解温度的上限请设定为99°C。目的片段的
GC含量超过80%时，会出现融解曲线中途无法检测到的情况。

② 在正确的位置放置PCR板和离心管，就可以开始PCR反应了。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司（3）-3 Roche LightCycler® Nano循环条件设定例
（软件版本1.0）
以下为在Roche LightCycler® Nano上使用本试剂的循环条件设定例。
① 启动软件，选择New键。
② 打开Experiment标签，在Name中记载实验名。
③ 打开Run Settings标签，选择Intercalating Dyes。
④ 打开Profile标签，如下设定温度条件。
A）按Program的add按钮，选择Hold。
B）温度条件变更为98℃、120秒、5°C /秒。
C）按Program的add按钮，选择3-step Amplification。
D）如下所示设定温度条件。
E）请确认延伸反应时Acquire有check。

F） 按Program的add按钮，选择Melting。
G）请确认是否已按如下所示设定程序。

⑤ 在正确的位置放置PCR板和离心管，就可以开始PCR反应了。

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（3）-4 Bio-Rad MiniOpticon循环条件设定例
（软件版本2.0）
以下为在Bio-Rad MiniOpticon上使用本试剂的循环条件设定例。
① 启动软件，选择Create a new run。
② 选择Create New…，按如下所示设定温度条件。
*1

*2

*3
*4

*1

: Sample Volume (μl) 栏中，请务必输入正确的反应液量。

*2: 由于初期设定为2 step，请选择、Insert Step，变更为3 step。

*3: 选择Insert Melt Curve，追加制作融解曲线用的循环。GC含量较高时，融解温度的上限请设定
为99℃。

*4

: 延伸反应循环请选择Add Plate Read to Step，设定数据回收point。

③ 在正确位置放置PCR板和离心管，就可以开始PCR反应了。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司【5】使用例（Ⅰ） 长链 / GC Rich 目的片段的定量 PCR
实验例1：长链目的片段【方法】
直接使用为KOD FX系列、KOD -Plus-系列等普通PCR用设计的引物，用以往产品和本产品对TGF
β的长链目的片段（1.9kb）进行反应性的比较。模板使用Human genomic DNA （gDNA），gDNA
的10倍稀释（5个梯度）和no-template control（NTC），进行反应。
PCR循环条件： 98℃，2分钟 → 98℃，10秒 / 60℃，10秒 / 68℃，120秒（40 cycles)※延伸时间设定为30秒 / 500bp
仪器： ABI StepOnePlusTM【结果】
即便是使用Taq DNA polymerase的本公司产品（THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix）难以扩
增・定量的1.9kb的长链目的片段，用本产品也能确认到扩增。
电泳分析
M

1

2.0 kb

2

3

1:
2:
3:

M : 1kb DNA Ladder
KOD FX Neo
KOD FX
KOD -Plus- Ver.2

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实验例2：GC Rich目的片段【方法】
用各Realtime PCR试剂对GC含量超过70%的目的片段进行反应性的比较。模板使用本公司高效率逆转录试剂盒「ReverTra Ace® qPCR RT Kit （Code: FSQ-101）」合成的源于HeLa细胞total RNA
的cDNA，cDNA 5倍稀释（5个梯度），进行反应。PCR循环条件使用各试剂推荐的条件。
本产品的PCR循环条件： 98℃，2分钟 → 98℃，10秒 / 60℃，10秒 / 68℃，30秒 (40 cycles)
仪器： ABI StepOnePlusTM【结果】
即便是用本公司以往产品（THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix）难以扩增的GC含量超过70％
的目的片段，用本产品也能确认到定量的扩增。另外，用其他公司产品会确认到引物二聚体，而用本产品不容易产生，因此在低拷贝区域也能得到范围很广的定量。
目的片段：IGF2R基因 （GC含量83% / cDNA）®

KOD SYBR qPCR Mix

A公司Realtime PCR试剂（适用于GC含量70%以上的片段）本公司以往产品
THUNDERBIRD® SYBR®
qPCR Mix15
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东洋纺（上海）生物科技有限公司【6】 使用例（Ⅱ） 通过融解曲线对各种扩增长度进行分析由于KOD SYBR® qPCR Mix可选择长至2kb的各种目的片段，如下图，可通过扩增长度不同使
得扩增产物的Tm值产生差异。因此，在计算上，可通过在Tm值*1产生差异的区域设计数个引物，从而可在单管中进行Multiplex PCR、扩增长度不同的目的片段等。该Multiplex PCR中的峰值识别，Tm值的间隔在3°C以上（根据仪器种类的不同，有时可能是5°C以上）时可进行分析。

（C）扩增长度和预测以及实测Tm值
扩增长度
(bp)
60
94
141
199
357
552
1,061

1

预测Tm值*
(°C)
72
76
79
82
84
86
88

2

实测Tm值*
(°C)
74
77.5
79
82
85
86
87

使用KOD SYBR® qPCR Mix，用各种引物对人β-actin
基因进行扩增。
（A）扩增后，进行电泳。
（B）扩增后，进行融解曲线分析，求Tm值的实测值。
（C）比较扩增产物的实测Tm值和预测Tm值。

*1：扩增产物的Tm值按以下公式估算。
Tm = 64.9 + 41×(yG+zC-16.4) / (wA+xT+yG+zG)※w、x、y、z为扩增产物中A、T、G、C的各碱基数

Wallace RB et al. (1979) Nucleic Acids Res 6:3543-3557
Sambrook,J., and Russell,D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
※本公司已将基于上述方法的Tm值计算表格公布在网站上，请登录本公司中文网站www.bio-toyobo.cn下载。
*2：有时会出现预测Tm值和实测Tm值不一致的情况。

以下为利用各种扩增长度对Knock-in小鼠进行基因分型检测的引物设计应用例。在该方法中，
通过调整目的片段长度使得两个扩增产物的Tm值产生差异，可进行Multiplex PCR。

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【基因分型用引物的设计方法 （一端共用引物的设计方法）】① 短链目的片段的设定为了和引物二聚体相区别，请将引物设计为扩增产物70bp~150bp。下图为Wild type（WT）
作为短链侧的例子，但Knock-in（KI）为短链侧也没有关系。

② 短链扩增产物 Tm 值的计算计算扩增长度为70bp~150bp的短链扩增产物的Tm值（参考P16）。
③ 长链目的片段的设定长链目的片段扩增产物的Tm值设计为比①设计的短链扩增产物高3°C以上（如有可能，最好是5°C以上）。考虑到扩增效率的平衡，应将扩增长度设计为500bp以下（最好是300bp左右）。
此时，如不能将Tm值的差设计为3°C以上，请将短链目的片段的扩增长度设计得更短些。

④ 使用实际设计的引物的预实验这里主要的问题是异质体的检测。在SYBR® Green I Assay中，信号强度不是与扩增产物
的摩尔数，而是与扩增产物的量（链长）成比例。因此，请按以下计算公式决定PCR时的引物量。
＜引物浓度设定＞
长链用引物
共用引物、短链用引物

引物浓度（μM）
0.2μM×（短链扩增产物长[bp] ÷ 长链扩增产物长[bp]）
0.2μM

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东洋纺（上海）生物科技有限公司⑤ 峰值平衡的修正进行融解曲线分析，比较峰值的高度。峰值的平衡有显著差异时，尝试降低峰值高的目的片段扩增的引物浓度。下图为固定共用引物与短链用引物的浓度，改变长链用引物浓度的例子。降低长链用引物的浓度，则短链目的片段的峰值会变高；提高长链用引物的浓度，则短链目的片段
的峰值会降低。

实验例3： 鼠尾裂解液的基因分型【方法】
如上，将引物设计为两种扩增产物的Tm值有差异，可在单管内直接进行鼠尾裂解液（碱裂解液）
的基因分型。在本实验中，将引物设计为产生100bp（预测Tm值: 79°C）、341bp（预测Tm值: 84°C）
的扩增产物。
鼠尾（3mm左右）↓←添加50mM NaOH 180μl↓Vortex充分振荡↓95℃、10分钟温育
↓←在1M Tris-HCl(pH8.0) 20μl中中和↓Vortex充分振荡↓离心 12,000rpm、5分钟（optional）
在20μl反应体系中添加0.5μl～2μl上清*1PCR 反应循环
98°C、2 分钟
↓98°C、10 秒 / 60°C、10 秒 / 68°C、30 秒(40 cycles*1)

仪器
ABI 7500 Fast Real Time System：为了抑制引物二聚体的产生，建议添加不会阻碍扩增的最大浓度的样品，将循环数设定为使扩增达到平台（Plat）的最低数。

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【结果】
按照以上流程，摸索引物设计、引物比，结果可知，Reverse侧的引物比在长链：短链＝1：3
的情况下，可获得良好的分析。

【7】 使用例（Ⅲ） 通过 ASP-PCR 进行 SNP 分析
即便扩增片段长度相同，通过在特定的引物5’端添加高GC含量的tail序列（GC tail），可将特定扩增产物的Tm值提高3~5°C。用该方法，可在单管内使用ASP(Allele specific primer)-PCR法进行
SNP(Single-nucleotide polymorphism)分析。ASP-PCR方法在添加GC tail以外，和普通的ASP-PCR
一样。通过将引物设计为3’末端（附近）为SNP部位，可分析扩增的有无。
【GC tail 引物的设计方法】
・为了通过GC tail使Tm值上升的效果显著，应将扩增长度设计为100bp以下。
・可应用于各种原理的ASP-PCR。在实验例4（下例）中，SNP部位可设计在3’末端第二碱基，mismatch部位设计在第三碱基。第三碱基的mismatch，可以选择任何与A相互补的T以外的任何碱基。下例中，分别为G和A。
・设计好之后，请确认两种扩增产物的Tm值差异是否在3°C以上*1。不满3°C的情况下，请缩短扩增长度。
・GC tail请参考下图添加。在Tm值产生差异的范围内，可改变GC tail的长度。可参考各种关于GC
tail的论文。
・扩增后，峰值的平衡不好的情况下，请参考【基因分型用引物的设计方法】(P.17)探讨引物比。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司【为SNP检测的引物设计例】
5’*1： 根据仪器种类的不同，有的smoothing功能可将相邻的两个峰值表示为一个范围比较广的峰
值。此时，请将引物设计为Tm值的差在5°C以上。为了将Tm值的差设计在5°C以上，建议将扩增长度设计得短一些（50bp～60bp左右）。

实验例4：血液、口腔粘膜的检测 ～ALDH2 SNP的检测～【方法】
血液、口腔粘膜的DNA不进行纯化，在单管中进行ALDH2（aldehyde dehydrogenase2） SNP
的检测。
SNP检测时，由于扩增片段长度相同，通过在一侧的Allele特异性引物中添加GC tail，将扩增产
物的Tm值设计为产生差异。

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按如下条件配制模板，直接添加到反应液中。
PCR循环条件： 98℃,2分钟 → 98℃,10秒 / 60℃,10秒 / 68℃,30秒 (50 cycles)【结果】
无需纯化基因组DNA，可识别基因型。

【8】 相关 Protocol：RNA 样品合成 cDNA
本试剂可以用各种逆转录反应用试剂合成的cDNA作为模板。如使用Realtime PCR专用的逆转
录反应用试剂，则可进行灵敏度更高的反应。
本公司ReverTra Ace® qPCR RT Kit (Code: FSQ-101)、ReverTra Ace® qPCR RT Master
Mix(Code : FSQ-201)、ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code :FSQ-301)是专为Realtime PCR设计的高效率cDNA合成试剂盒，与本产品组合使用，可获得可信度
更高的结果。以下为使用ReverTra Ace® qPCR RT Kit，Realtime PCR用cDNA合成法的介绍（详细请参考该试剂盒添附的产品使用说明书）。
●ReverTra Ace® qPCR RT Kit (Code: FSQ-101)（1）RNA的变性（Option）
按使用量分取作为模板使用的RNA溶液，在65°C条件下进行5分钟温育后，在冰上急速冷却。
・该步骤可省略，但通过该处理，可提高容易形成高级结构的RNA的逆转录效率。
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・进行该处理时，请不要添加5×RT Buffer、RT Enzyme Mix，否则会造成RNA的分解和酶活性的低下等。
（2）反应液的配制
在冰上配制如下反应液。
Nuclease-free Water X μl
5×RT Buffer
2 μl
RT Enzyme Mix
0.5 μlPrimer Mix
0.5 μlRNA
0.5pg～1μg相当
Total volume
10 μl（3）逆转录反应
将反应液轻轻搅拌均匀后，在以下温度条件下进行温育。
37°C,
98°C,
4°C,

15分钟 ・・・・・・・・・・・・
5分钟 ・・・・・・・・・・・・
hold（逆转录反应）（酶失活反应）反应结束后，在4°C或-20°C条件下保存。进行Realtime PCR时，可作为模板直接或稀释后添
加到反应液中。

【9】常见问题
现象

原因对策

用高浓度样品反应时线性由于SYBR® Green I与样品SYBR® Green I与全部双链DNA相结合，由于具有发荧

混乱DNA的结合导致基线上飘

光的特性，当样品中含高浓度的双链DNA时，会造成
基线上飘，从而无法计算出正确的Ct值。请适当降低样品浓度再进行反应。

样品溶液中的杂质抑制了反 当样品纯度较低时，其所含的杂质会抑制PCR反应。
应此外，使用非Realtime PCR专用逆转录试剂盒合成的
cDNA时，逆转录反应液中所含的物质也会抑制PCR反应。请降低样品浓度，或将样品纯化后再进行反应。建议使用Realtime PCR专用cDNA合成逆转录试剂盒。

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现象
用低浓度样品反应时线性原因对策目标DNA的拷贝数过少反应液中的目标DNA的拷贝数只有几倍到几十倍时，拷混乱

贝数散乱的概率变大，容易形成线性混乱。此时请适当
提高样品浓度再进行反应。
使用样品的DNA量较少或样品稀释后被长时间存放的情

DNA被反应离心管所吸附况下，会使得DNA被反应离心管吸附，从而造成实质性
的模板量减少。请提高样品浓度再进行反应。另外，如果要对样品进行稀释，请稀释后立即进行反应。
同时产生引物二聚体

对目标DNA进行扩增时，同时发生引物二聚体的扩增，从而无法检测出目的片段的扩增曲线。进行融解曲线分析，出现几个峰值时，请再次摸索反应条件，防止引物
二聚体的再次发生。在end point assay中，在不会抑制
反应的前提下，将模板量增加到最大，减少循环数，可避免出现该问题。

稀释系列样品的扩增曲线

与非特异性反应的竞争

引物的特异性不够充分的情况下，会同时发生目标以外的间隔不均一的扩增，从而无法检测出目的片段的扩增曲线。进行融
解曲线分析，出现几个峰值时，请再次摸索反应条件，防止引物二聚体的再次发生。仍无法得到改善时，请尝试重新摸索引物序列。
以质粒为模板以环状质粒为模板使用时，容易产生荧光散乱。此时请
用限制酶酶切，使用直链的质粒。

PCR效率低于80%

反应条件不合适根据目的片段的不同，有可能出现在标准的反应条件下无法得到充分的PCR效率的情况。请根据[4]使用方法(slope < -3.95)(2) PCR循环条件的设定，重新摸索PCR反应条件。
引物的Tm值低于一般情况

使用Tm值较低的引物时，会出现在标准的循环条件下无

(60°C以下)

法充分退火的情况。请根据[4]使用方法 (2) PCR循环条
件的设定，重新摸索退火温度。

引物质量不好当引物质量不好时，会导致PCR效率大幅下降。可从引物原液重新稀释，或重新合成引物。

计算PCR效率时，包含了偏离 如果计算PCR效率时，包含了偏离直线的Ct值，会增大直线的Ct值

计算值的误差。应将偏离直线的Ct值排除后再计算。

引物量少增加引物量，可改善扩增效率。

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现象

原因

对策

PCR效率高于110%

计算PCR效率时，包含了偏 如果计算PCR效率时，包含了偏离直线的Ct值，会增(slope > -3.1)

离直线的Ct值大计算值的误差。应将偏离直线的Ct值排除后再计算。

发生非特异性反应由于发生了非特异性反应，有时会出现PCR效率高于
110%的情况。可进行融解曲线分析确认特异性。

重现性差样品纯度不好不纯的样品会抑制PCR反应，从而导致实验的重现性差。可降低样品的浓度或对样品进行纯化后再反应。

使用了稀释后长时间放置的

浓度较低的DNA溶液长时间存放时，由于被反应容器样品吸附，实际浓度会更低。请从原液重新稀释后再进行反应。另外，通过梯度稀释的标准样品应避免稀释后再保存，最好每次使用时直接从原液稀释。

使用了纯化质粒DNA或使用纯化质粒DNA溶液或PCR扩增产物作为模板时，

PCR扩增产物作为模板有时会使用稀释后的溶液。此时，溶液中DNA浓度非
常低，DNA很容易被容器吸附而减少，这会造成低浓
度区域的直线性及重现性差。在稀释时，可以在稀释液
中混合一些与反应无关的核酸(Yeast RNA等)，可改善
低浓度区域的直线性。

引物质量不好即便是同一序列的引物，在合成时也会发生质量上的差异。可在新合成时，与原来使用的引物做一下比较实验，以确认质量差异。

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现象

原因

对策

no-template control (NTC) 产生了引物二聚体

融解曲线分析时，no-template control在目的片段的可见扩增

低温侧出现峰值，疑似有引物二聚体产生。引物二聚
体根据引物序列或引物质量的不同而发生的程度有所差异。首先根据[4] 使用方法 (2) PCR循环条件的设定 再次探讨PCR的反应条件，如果仍无法改善，则可进行引物的再设计或再合成。合成时，纯化级别请选择HPLC以上。
发生交叉污染进行融解曲线分析时，no-template control的峰值和
目的片段大致在同一位置时，可能是扩增产物的带入
所引起的。如果再次尝试仍然如此，则可能是由试剂类或灭菌水的交叉污染所引起的，此时请换新的试剂或灭菌水。

扩增曲线的荧光信号很弱， 50×ROX reference dye添加 使用Passive Reference的仪器，50X ROX reference
或扩增曲线呈锯齿状dye添加量过剩的情况下，荧光值修正后，SYBR®

量过剩Green I的荧光值会较低。根据[4] 使用方法 (1) 反应
液的配制 确认50X ROX reference dye的添加量。
荧光测定时间太短

一部分仪器，PCR的延伸时间过短时，荧光测定不能
充分完成。扩增曲线的锯齿状较明显时，将延伸时间设定得稍长些(45～60秒)可得到改善。

反应液量太少以少于仪器的标准条件的液量进行反应时，荧光测定值的误差会增大，此时应增加液量。

融解曲线分析时可看到几发生了非特异性反应

引物的特异性不好的情况下，会同时发生非特异性扩个峰值增，无法检测出纯粹的目的片段的扩增曲线。此时应
重新探讨反应条件，以避免非特异性反应的产生。仍
无法得到改善时，请重新设计引物序列。
产生了引物二聚体目标DNA的扩增与引物二聚体的扩增同时发生。此时
应重新探讨反应条件以避免引物二聚体的的发生。仍
无法得到改善时，可重新设计引物或提高纯化级别。

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现象

原因

对策

在引物上添加了GC tail，但 扩增长度过长扩增长度过长时，GC tail对Tm值的影响会减小。请

无法确认到Tm值的差

将引物设计为扩增长度在100bp以下。另外，通过求扩增产物的Tm值，可推测Tm值的差。
扩增产物的GC含量过高扩增产物的GC含量过高时，即便不添加GC tail，Tm值也会显著变高。因此，GC tail对Tm值的影响会减
小。此时，请在其他区域设计引物。

Multiplex检测时，不知道扩增长度过长

扩增产物的Tm值在扩增长度较短的范围内，与扩增长度成比例，Tm值会上升，但到了某一长度之后，

Tm值

Tm值会变得恒定。在计算时，求扩增产物的Tm值，请在产生差异的扩增长度的范围内重新设计引物。
扩增产物的GC含量过高扩增产物的GC含量过高时，由于在短链目的片段中Tm值也会变高，Tm值的差不容易产生。在短链范围
内计算，请将引物设计为Tm值产生差异。Tm值不变时，请尝试在其他区域设计引物。

Multiplex检测时，峰值的平 两种目的片段的扩增长度差SYBR® Green I Assay中，与扩增长度成比例，荧光

衡不好强度会增强。因此，扩增长度显著不同时，即便扩增异过于显著

量相同，峰值的高度也不同。请将引物重新设计为目
的片段长度差异较小。此外，减少峰值较高的目的片段的扩增引物量，也可改善结果。
退火效率不同由于两种引物的Tm值显著不同时，退火效率也会有显著差异，因此扩增量的平衡会变差。此时，请先尝试减少峰值高的引物量。仍无法得到改善时，请重新
将引物设计为两种引物的Tm值相同。

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【10】 相关产品● 高效率 SYBR® Green I 检测体系用 Realtime PCR 试剂
品名®

SYBR Green I检测体系用Realtime PCR试剂THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

容量
1ml×1
(40次份)

Code No.
QPS-201T

1.67ml×3(200次份)®
®
※THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 中，50×ROX reference dye 另外单独添附。

QPS-201※容量为 50μl 反应体系时的反应次数。
● 各种荧光 Probe・荧光引物检测体系用 Realtime PCR 试剂
品名各种荧光Probe・荧光引物检测体系用
Realtime PCR试剂THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix

容量
1ml×1
(40次份)

Code No.
QPS-101T

1.67ml×3(200次份)®
®
※THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 中，50×ROX reference dye 另外单独添附。

QPS-101※容量为 50μl 反应体系时的反应次数。
● cDNA 合成试剂
品名Realtime PCR用cDNA合成试剂盒
ReverTra Ace® qPCR RT Kit
Realtime PCR用cDNA合成试剂盒
完全预混型
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
Realtime PCR用cDNA合成试剂盒完全预混型（添附去除基因组DNA试剂）
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover

容量

Code No.

200次份

FSQ-101

200次份

FSQ-201

200次份

FSQ-30127
www.bio-toyobo.cn

[销售商]

东洋纺（上海）生物科技有限公司
地址：上海市浦东新区张杨路 500 号华润时代广场 28 楼 AL
邮编：200122
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http://www.bio-toyobo.cn[生产商]东洋纺株式会社敦贺生物工厂地址：日本国福井县敦贺市东洋町 10 番 24 号

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