19-07

GenNext®
NGS Library Prep Kit（Code No. LPK-101, LPK-101T, LPK-101L）

中文说明书

科研用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目 录[1] 简介 ..............................................................................................................................................................................1[2] 产品内容.......................................................................................................................................................................2[3] 产品之外需要准备的物品............................................................................................................................................2[4] 使用方法.......................................................................................................................................................................3[5] 文库的验证...................................................................................................................................................................7[6] 实验例 ..........................................................................................................................................................................8[7] Trouble Shooting.........................................................................................................................................................9[8] 相关产品.......................................................................................................................................................................9―注意―本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。
请勿作为诊断、临床试剂使用。
在使用本试剂盒时，请严格遵守实验室的一般注意事项，注意安全。

―保存―各组分请均保存于-20℃条件下。

[1] 简介
Library Preparation Kit (Code: LPK-101) 是使用片段化的双链 DNA 或 PCR 产物为模板，制备 illumina®二代
测序用文库的试剂盒。使用本品可快速简便地制备文库样品。
基本流程包括，对 1 ng - 1μg 的双链 DNA 片段的进行末端修复及 3’末端的加 A 反应，随后与 adapter 进行连
接并使用特定引物进行 PCR 扩增。针对低起始量的 DNA 模板，借助改良型 KOD DNA polymerase 高保真
PCR 酶，也可低偏差地扩增末端带有 adapter 序列的文库。
本品中，不含有 adapter 接头与纯化用磁珠
片段化 DNA
末端修复及 3’ 端加 A
(30℃ 10min, 65℃ 5min)
连接 Adapter(20℃ 15min)磁珠纯化Agencourt® AMPure® XP beads (Beckman Coulter)
文库扩增 (DNA 量少时)
(根据 DNA 量确定循环数)扩增后的纯化
Agencourt® AMPure® XP beads (Beckman Coulter)文库图 . 使用本品进行文库制备的流程- 特征 ● 快速简便的操作流程从末端修复及 3’末端加 A 到 adaptor 连接的操作都在同一个反应管中进行。末端修复及 3’末端加 A 一共进行
15 分钟，adaptor 的连接仅需 15 分钟即可完成。文库扩增时使用退火 10 秒、延伸 15 秒的快速循环条件。
● 范围较广的 input 量对应较广范围的 input 量（1 ng - 1μg）进行的设计。
● 低偏差的文库扩增
文库扩增时使用的Library Amplification Master Mix是使用基因改良型KOD DNA polymerase进行开发的高保真 PCR 酶。因将 GC 不均导致的影响降到了最低、可均一地扩增各种片段。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[2] 产品内容
本品含有以下试剂，使用 50μl 片段化 DNA 时，LPK-101 可使用 24 次、LPK-101T 可使用 8 次、LPK-101L
可使用 96 次。试剂请于-20℃保存。
试剂名称End Repair and A-tailing Buffer
End Repair and A-tailing Enzyme
Ligation Solution
Library Amplification Master Mix
Library Amplification Primer Mix

保存*1-20℃*2-20℃*2-20℃-20℃-20℃

LPK-101240μl ×160μl ×11.2ml ×1690μl ×1138μl ×1

LPK-101T
80μl ×120μl ×1
400μl ×1230μl ×146μl ×1

LPK-101L
960μl ×1
240μl ×1
1.6ml ×3
1.38ml ×2552μl ×1*1 如果需要长期保存，请存放于-30℃。
*2 请不要将 End Repair and A-tailing Buffer 与 End Repair and A-tailing Enzyme 混合后保存。
请务必在使用前，按需取适量的 End Repair and A-tailing Buffer，然后添加对应量的 End Repair and A-tailing Enzyme。

End Repair and A-tailing Buffer
特别为末端修复及 3’末端加 A 优化的 buffer. 请配合附带的 End Repair and A-tailing Enzyme 进行使用。
End Repair and A-tailing Enzyme
末端修复及 3’末端加 A 用酶。按每 8μl 的 End Repair and A-tailing Buffer 添加 2μl 酶的比例进行添加。因为溶液具有粘性，请缓慢地用移液器进行吸取。
Ligation Solution
经过优化适用于本试剂盒的预混型连接试剂。因为具有粘性，请缓慢地用移液器进行吸取。

Library Amplification Master Mix
含有基因改良型 KOD DNA polymerase、dNTPs 及 Mg2+等的 2x 浓度的 PCR Master Mix。因将 GC 不均导
致的影响降到了最低、可均一地扩增各种片段，非常适合于二代测序中扩增产物的制备。
Library Amplification Primer Mix
10x 浓度的引物 Mix。可高效扩增带有 P5、P7 接头序列的 illumina®二代测序用文库。

[3] 产品之外需要准备的物品
除本产品之外，请准备以下仪器・试剂。
・ Thermal cycler 或 incubator请准备能够满足本产品反应温度（4℃、20℃、30℃、60℃、65℃、68℃、94℃及 98℃）的仪器。使用时，请根据各仪器的操作说明书进行。
・ Adapter能够使用带有 Index 的 Illumina® TruSeqTM 等文库制备方法中使用的 Adapter。例如：TruSeq DNA Single Indexes Set A（12 Indexes, 24 Samples）[目录号：20015960]
TruSeq DNA Single Indexes Set B（12 Indexes, 24 Samples）[目录号：20015961]（除上述外，本试剂盒还可用于有同样设计的 Adapter）

咨询电话：021-58794900

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・ SPRI（solid phase paramagnetic bead）磁珠推荐 Agencourt® AMPure® XP 的试剂（Beckman Coulter、目录号：A63880、A63881 等）。使用时，请根据试剂的说明书进行。
・ 10mM Tris-HCl（pH8.0‐8.5）
用于 Adapter Stock 的稀释及 DNA 的溶解。不可用水代替。
・ 磁力架使用磁珠进行纯化时使用。
・ 80%乙醇使用磁珠进行纯化时的洗涤液。

[4] 使用方法
文库制备操作（末端修复及 3’末端加 A 以及文库扩增），根据样品数量，大致在 3 个小时以内完成。在连接反应结束并纯化后，或在文库扩增后可以暂停操作。
1. 末端修复及 3’末端加 A （End Repair and A-tailing）
1) 制备 End Repair and A-tailing 必需的试剂。参考以下表格，在离心管或 PCR 板的孔中进行制备。
片段化的 DNAEnd Repair and A-Tailing Buffer*
End Repair and A-Tailing Enzyme Mix** 请在混合后 24 小时内使用。

1 个反应（60 μl）50 μl
8 μl
2 μl

2) 轻轻地涡旋振荡（Vortex），spin down 之后，再放回冰上。
3) 按以下温度进行温育：
30 ℃、 10 min
65 ℃、 5 min
4 ℃、 保温
4) 迅速进行下面的操作步骤（Adapter 的连接）。
2. Adapter 的连接（Adapter Ligation）
1) 请参考以下推荐的 Adapter（本产品中不含有）浓度，用 10mM Tris-HCl（pH8.0‐8.5）稀释，制备Adapter Stock 溶液。

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Input 量Adapter Stock 浓度

1μg
500ng
250ng
100ng
50ng
25ng
10ng
5ng
2.5ng
1ng

15μM
15μM
15μM
15μM
15μM
7.5μM
3μM
1.5μM
750nM
300nM

Adapter：Insert 的摩尔比
10:1
20:1
40:1
100:1
200:1
200:1
200:1
200:1
200:1
200:1

2) 参考下表，向 End Repair and A-tailing 反应管或 PCR 板中添加 Ligation Solution。
1 个反应（110 μl）
60 μl
5 μl
45 μl

End Repair and A-Tailing 反应液Adapter Stock
Ligation Solution3) 轻轻地涡旋振荡（Vortex），spin down。
4) 按以下温度进行温育。
20 ℃、15 min
4 ℃、保温5) 迅速进行下面的操作步骤（连接后的纯化）。
3. 连接后的纯化 （Purification after ligation）
1) 参考下表，向 Adapter Ligation 反应管或平板中添加 0.8x SPRI 磁珠（Agencourt® AMPure® XP 试剂）。
1 个反应（198 μl）
110 μl88 ulAdapter Ligation 反应液Agencourt® AMPure® XP 试剂*2) 使用涡旋振荡器（Vortex）或移液器上下吹打，将混合液充分混匀。
3) 室温孵育 5－15 分钟。
4) 将反应管或板置于磁力架上，静置直至溶液变透明。
5) 去除上清液。
6) 向静置于磁力架上的反应管或板中添加 80%的乙醇 200μl。
7) 温育 30 秒。
8) 去除乙醇。
9) 将反应管或板静置于磁力架上，然后添加 80%的乙醇 200μl。
10) 温育 30 秒。

咨询电话：021-58794900

411) 使用移液器，将乙醇完全除去。
12) 将反应管或平板静置于磁力架上，室温温育 3－5 分钟，进行风干。
13) 从磁力架上取下反应管或平板。
14) 扩增文库时，添加 10mM 的 Tris-HCl（pH8.0‐8.5）25μl，室温孵育 2 分钟溶解 DNA。或者，进行
文库 size selection 时，添加 10mM 的 Tris-HCl（pH8.0‐8.5）55μl 进行温育，请参考 p.10 [4] 6. Sizeselection（option）。
15) 将反应管或平板置于磁力架上，静置直至溶液变透明。
16) 将透明的上清液移入新的反应管或平板中。
17) 完成上述操作，纯化后的文库可放于-20℃保存。

4. 文库的扩增（Library Amplification）
1) 参考下表进行反应液的制备。

Library Amplification Master Mix (2x)
Library Amplification Primer Mix (2x)
添加 Adapter 后的文库

1 个反应（50 μl）
25 μl
5 μl
20 μl

2) 轻轻地涡旋振荡（Vortex），spin down。
3) 参考以下循环条件进行文库扩增。扩增后，完成操作时，可保存于-20℃。
步骤预变性变性退火延伸Hold温度
94℃
98℃
60℃
68℃
4℃

表 1. 推荐循环数Input 量
1μg
500ng
250ng
100ng
50ng
25ng
10ng
5ng
2.5ng
1ng

时间2 min
10 s
10 s
15 s∞

循环数
1
尽可能减少
（参考下表设置）
1

循环数*0
0
0
0-2
3-5
5-6
7-9
9-11
11-13
13-15

* 根据样品种类、片段大小分布，最适循环数有时会差 1～3 循环数。

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5. 文库扩增后的纯化（Purification after amplification）
1) 参考下表，向 Adapter Ligation 反应管或平板中添加 1x SPRI 磁珠（Agencourt® AMPure® XP 试剂）。
1 个反应（100 μl）
50 μl
50 ul

扩增后的文库
Agencourt® AMPure® XP 试剂** 请确保磁珠完全呈悬浊状态2) 使用涡旋振荡器（Vortex）或移液器上下吹打，将混合液充分混匀。
3) 室温孵育 5－15 分钟。
4) 将反应管或板置于磁力架上，静置直至溶液变透明。
5) 去除上清液。
6) 向静置于磁力架上的反应管或板中添加 80%的乙醇 200μl。
7) 温育 30 秒。
8) 去除乙醇。
9) 将反应管或板静置于磁力架上，然后添加 80%的乙醇 200μl。
10) 温育 30 秒。
11) 使用移液器，将乙醇完全除去。
12) 将反应管或平板静置于磁力架上，室温温育 3－5 分钟，进行风干。
13) 从磁力架上取下反应管或平板。
14) 添加必要量（如: 20μl）10mM 的 Tris-HCl（pH8.0‐8.5）25μl，室温孵育 2 分钟溶解 DNA。或者，进行文库 size selection 时，添加 10mM 的 Tris-HCl（pH8.0‐8.5）55μl 进行温育，请参考 p.10 [4]6. Size selection（option）。
15) 将反应管或平板置于磁力架上，静置直至溶液变透明。
16) 将透明的上清液移入新的反应管或平板中。
17) 完成上述操作，纯化后的文库可放于-20℃保存。

6. 片段大小选择（Size Selection）
通过进行 size selection, 可得到目的片段长度在指定区间的文库。但另一方面会使得率及文库多样性减
少，所以仅在必要时进行该步骤。以下以 250bp～450bp 的文库 selection 为例进行实验。
1) 参考下表，向 Adapter Ligation 反应管或平板中添加 1x SPRI 磁珠（Agencourt® AMPure® XP 试剂）。
1 个反应（80 μl）
50 μl
30 ul

将要进行 size selection 的文库
Agencourt® AMPure® XP 试剂** 请确保磁珠完全呈悬浊状态。

2) 使用涡旋振荡器（Vortex）或移液器上下吹打，将混合液充分混匀。
3) 室温孵育 5－15 分钟。

咨询电话：021-58794900

64) 将反应管或板置于磁力架上，静置直至溶液变透明。
5) 将透明的上清液 75μl 移入新的反应管或板中。将含磁珠的反应管或板丢弃。
6) 参考下表，向分取得到的上清中，添加 0.13x SPRI 磁珠（Agencourt® AMPure® XP 试剂）。
将要进行 size selection 的文库
Agencourt® AMPure® XP 试剂*

1 个反应（85 μl）
75 μl
10 ul

7) 使用涡旋振荡器（Vortex）或移液器上下吹打，将混合液充分混匀。
8) 室温温育 5－15 分钟。
9) 将反应管或板置于磁力架上，静置直至溶液变透明。
10) 向静置于磁力架上的反应管或板中添加 80%的乙醇 200μl11) 温育 30 秒。
12) 使用移液器，将乙醇完全除去。
13) 向静置于磁力架上的反应管或板中添加 80%的乙醇 200μl。
14) 使用移液器，将乙醇完全除去。
15) 将反应管或平板静置于磁力架上，室温温育 3－5 分钟，进行风干。
16) 从磁力架上取下反应管或平板。
17) 添加必要量（如: 20μl）10mM 的 Tris-HCl（pH8.0‐8.5）25μl，室温孵育 2 分钟溶解 DNA。
18) 将反应管或平板置于磁力架上，静置直至溶液变透明。
19) 将透明的上清液移入新的反应管或平板中。
20) 完成上述操作，纯化后的文库可放于-20℃保存。

[5] 文库的验证
1. 文库的定量
使用 GenNextTM NGS Library Quantification Kit(Code: NLQ-101)或同类市售商品，推荐采用 qPCR 方法
进行定量。GenNextTM NGS Library Quantification Kit(Code: NLQ-101) 是 illumina® NGS 用文库定量试剂盒，针对 illumina®采用的 P5、P7 的 Adapter 序列，可以特异且准确地定量出能与 Flow cell 有效结合的文库。
2. 文库片段大小分布的确认确认文库分布时，推荐使用 Bioanalyzer（Agilent）等电泳仪进行文库片段大小分布的确认。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[6] 实验例
1. 文库得率及分布的比较
＜方法＞
以片段化处理过的人基因组DNA 1、10、100ng 以及大肠杆菌基因组DNA 1ug为模板，
使用Library Preparation
Kit (Code: LPK-101T)或 K 公司文库制备试剂盒进行文库的制备。以 100bp DNA Ladder 1、10ng 做参照进行电泳。
Adapter 是使用 illumine 公司的 Index Adapter, 文库的 cleanup 是使用 Agencourt ® AMPure® XP 的试剂(Beckman Coulter)。
1ug 没有扩增、1ng 用 11 个循环、10ng 用 8 个循环、100ng 用 5 个循环进行扩增，文库 size 的分布用 MultiNA（岛津生产公司）的产品进行确认。
文库的得率用 GenNextTM NGS Library Quantification Kit(Code: NLQ-101)
进行确认。
＜结果＞

已确认：在 Input 100bp 的 DNA Ladder 时，因为在两端加了 Adapter，所以要再上大约 120bp 的条带（100bp的条带时大约 220bp 长）。
结果显示：进行文库 size 的分布时，用本公司试剂和其他公司试剂时，结果相同；低 input 量时，使用我们公司的试剂，与使用其他公司的试剂相比，可得到较高的得率。因为不管哪一种都是要提供给 MiSeq，所以都得到了必需的 4nM 以上的得率。
2. NGS 分析结果的评价＜方法＞
使用 MiSeq（illumina 公司）及 MiSeq Reagent Kit v2（300 Cycles）（illumina 公司）进行大肠杆菌基因组（1ugPCR Free 或 1ng 用 12 循环进行扩增）的 NGS 分析。
文库的制作使用 Library Preparation Kit (Code: LPK-101T)或 K 公司文库制备试剂盒进行。
文库数据为了与 read 数相等，进行 down sampling, 各样品收集 100 万 read 数，进行分析。分析是使用 CLC
Genomics Workbench（QIAGEN 公司/CLC bio）进行的。

咨询电话：021-58794900

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＜结果＞
1ug PCR Free 时
比对成功的比率

与参考基因组不一致的比率

93.14
93.01

5.65
5.89

比对成功的比率

与参考基因组不一致的比率

92.31
89.64

5.77
5.99

使用本公司 Library Preparation Kit
使用 K 公司文库制备试剂盒1ng 12 循环扩增时
使用本公司 Library Preparation Kit
使用 K 公司文库制备试剂盒结果显示，使用本公司的试剂比使用其他公司的试剂，得到了更好的 mapping 效率与错误率。

[7] Trouble Shooting现象Adapter 二聚体较多原因
Adapter 质量不好对策・因 Adapter 是部分双链 DNA，为了避免双链部分分开，请尽量减少 Adapter stock 的冻融次数。或者，请尽量在室温以下的温度条件下进行 Adapter 操作。
・Adapter stock 请用 10mM 的 Tris-HCl（pH8.0‐8.5）进行稀释。

Adapter 的浓度不合适・请参考 p.6 [4] 2.(1)的内容，在推荐的 Adapter stock浓度左右，进行浓度的预先优化。
・文库得率足够时，可再次进行纯化，请参考 p.10 [4] 6.
进行 size selection（option）。

文库得率较低添加的磁珠试剂与文库 ・纯化用的 SPRI 磁珠试剂文库溶液的量的比例对 size
溶液的比例不正确
分布、得率有很大影响。请确认液量的比例是否正确。
吸附 DNA 的磁珠干燥 ・DNA 吸附在磁珠上，乙醇洗涤后，磁珠过度干燥，DNA过度有可能洗脱不下来。室温干燥时间请保持在 5 分钟以内。

[8] 相关产品产品名称Illumina 公司 NGS 用文库定量试剂盒

GenNextTM NGS Library Quantification Kit

9包装Code No.

500 次用NLQ-101

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<销售商>
东洋纺（上海）生物科技有限公司
邮编：200122
邮箱：tech@bio-toyobo.cn
网址：http://www.bio-toyobo.cn
联系电话：021-58794900
公司地址： 上海市浦东新区张杨路 500 号华润时代广场 28 楼 AL 单元<生产商>东洋纺株式会社敦贺生物工厂地址：日本国福井县敦贺市东洋町 10 番 24 号