研究フロンティア

δGABAA 受容体特異的作動薬 DS による
ゴナドトロピンサブユニット発現
折出 亜希，金崎 春彦，ミジドルジ ツェルメグ，スクバッタル ウヌルジャルガル，京哲

島根大学医学部産婦人科

ある GABAA，GABAB，GABAc 受容体を介して作用を発揮はじめにしている．GABAA，GABAc 受容体は Cl―チャネル結合型
下垂体ゴナドトロピンである黄体化ホルモン（luteiniz-

であり，リガンド依存性イオンチャネルのファミリーにing hormone : LH）と卵胞刺激ホルモン（follicle-stimu-

属する．一方 GABAB 受容体は GTP 結合タンパク質とlating hormone : FSH）は，卵巣において卵胞発育や，共役する

回膜貫通型受容体ファミリーに属する［ ］．

卵の成熟，性ステロイドホルモンの合成など女性の生殖これらの種類の GABA 受容体は中枢神経系だけでは］．LH と FSH はなく下垂体にも発現していることが明らかになっている

視床下部からパルス状に分泌されるゴナドトロピン放出［ ， ］．in vitro で GABA 阻害剤はプロラクチン分泌ホルモン（gonadotropin-releasing hormone : GnRH）にを抑制したとする報告がある一方［ ， ］，下垂体細

よって主に制御されている［機能に重要な役割を果たしている［］．さらにゴナドトロピ

胞では副腎皮質刺激ホルモンや甲状腺刺激ホルモン，LH

ンは卵巣から産生されるインヒビン，アクチビン，フォの分泌に促進的に作用するという報告もある［ ， ］．

］や，pituitary adenylate cyclase activat-

ほ乳類の GABAA 受容体にはクローニングされ，構造ing polypeptide : PACAP）によっても調節を受けているが同定されている少なくともα ― ，β ― ，γ ― ，δ，ε，ことが知られている［ ， ］．

π，θの 個のサブユニットの存在が知られている［ ］．

リスタチン［GnRH は視床下部―下垂体―性腺軸（hypothalamic-pi-

それらの脳内では GABAA 受容体はヘテロ量体で機能

tuitary gonadal axis : HPG axis）の最も重要な活性化

しており，muscimol は GABAA 受容体の特異的な作動薬因子であることは周知であるが，最近の報告では視床下である．脳内の GABAA 受容体はα β γ 受容体が大多数部に存在するキスペプチンニューロンが HPG axis の最を占めるが，δサブユニットを含む GABAA 受容体も少上位の調節因子であり，GnRH 分泌はキスペプチンによないながらも存在していることが明らかとなっている．

り制御されていることが明らかとなってきている［ ，］．

興味深いことに，δサブユニットを含む GABAA 受容体

一方，γ―アミノ酪酸（GABA）ニューロンもまたその受（δ―GABAA 受容体）は，マウス海馬のニューロンでの発容体を介して GnRH ニューロンに直接作用しているこ現が発情周期で変化し［ ］，その発現は性ステロイドとを示唆する報告がある［ ， ］．視床下部に存在するホルモンによって影響を受けることが報告されている

GnRH ニューロンは GABA ニューロンから多くのシナプ［ ］．δ―GABAA 受容体はシナプス外あるいはシナプス

ス入力を受けている［ ］．齧歯類，ヒツジにおいては周囲に存在し，GABA によって活性化される［ ］．ま

GABA antagonist がゴナドトロピン分泌を増加させるこたδ―GABAA 受容体はベンゾジアゼピン系薬物に反応しとが報告されており［ ， ］，GABA は GnRH ニュー

ないので，新規薬剤開発のターゲットとして注目されてロンに対して抑制的制御を行っていることが推測されている［ ］．またδ―GABAA 受容体は下垂体に発現していいる．一方，GABA は GnRH ニューロンに対し即時的ることも明らかにされている［ ］．

に興奮性作用をし，LH 分泌を促進するという報告もあ．
る［ ― ］GABA は中枢神経系において重要な神経伝達物質であり，つの構造的および薬理作用的に異なった受容体で連絡先：折出亜希，島根大学医学部産婦人科〒 ―島根県出雲市塩治町 ―
TEL ：
― ―
FAX：
― ―
E-mail : oride@med.shimane-u.ac.jp―Chloro―N―［ ， ―dibromo― ―（ ―thienyl）imidazo（DS ）はδサ ブ ユ ニ ッ ト を 含 む［ ，―alpyridine― ―yl］
GABAA 受容体であるα β δ受容体の特異的かつ強力な作動薬である．今回私たちは，下垂体ゴナドトロピン細胞株における DS のゴナドトロピンサブユニット発現に対する作用を明らかにするために研究を行った．

日本生殖内分泌学会雑誌（2015）20 : 53-58

53

他

C

A
LHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

3

**

2.5

**
**

*

2
1.5
1
0.5
0

control

DS1
100 nM

DS1
1 μM

DS1
10 μM

α-Luciferase promoter(Fold induction)

亜希

6

**

5
4

**

*

3
2
1
0

DS1
DS1
50 μM 100 μM

control

DS1
100 nM

DS1
1 μM

DS1
10 μM

DS1
DS1
50 μM 100 μM

D

FSHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

B

図

3
**

2.5
2

**

*

1.5
1
0.5
0

control

DS1
100 nM

DS1
1 μM

DS1
10 μM

DS1
DS1
50 μM 100 μM

GnRHR-Luciferase promoter(Fold induction)

折出

3
2.5

**

2

*

**

**

1.5
1
0.5
0

control

DS1
100 nM

DS1
1 μM

DS1
10 μM

DS1
DS1
50 μM 100 μM

ゴナドトロピンサブユニットプロモーター活性に対する DS の作用
LβT 細胞に ．µg LHβ―Luc（A），FSHβ―Luci（B），α―Luci（C），GnRHR―Luci（D）ベクターを pRL―TK（ ．μg）プラ
スミドとともにトランスフェクトした．トランスフェクション 時間後に DS で時間刺激を行った．LHβ（A）
，FSHβ

（B）
，α
（C）サブユニットおよび GnRH 受容体（D）プロモーター活性を Luciferase assay で評価した．結果は独立した回の実験の平均値±SEM とし，コントロールに対する fold stimulation で表した．＊P＜ ． ，＊＊P＜ ． vs. control．

B，C）．また LβT 細胞における DS による GnRH

ゴナドトロピンサブユニットプロモーター活性に（図

対する DS の効果

受容体プロモーター活性に対する作用についても同様に検討を行ったところ，GnRH 受容体プロモーター活性も今回の研究では，下垂体ゴナドトロピン産生細胞のモ

DS の濃度依存的に増加することが分かった（図D）．

デル細胞としてトランスジェニックマウス由来の細胞株である LβT 細胞を使用した．まず研究をするのに先立

GnRH の作用に対する DS の影響

ち，LβT 細胞およびラット下垂体前葉初代培養細胞にδ
―GABAA 受容体の発現があることを PCR 法にて確認し

DS は単独でつすべてのゴナドトロピンサブユニッ

トプロモーター活性を増加させたが，その効果は GnRHている（データ未掲載）．
まず LβT 細胞におけるゴナドトロピンサブユニット

刺激によるゴナドトロピンサブユニット発現に比べると発現に対する DS の作用について検討した．LβT 細胞

限定的であった．GnRH は LHβプロモーター活性を ．

μM の DS でそれ± ． 倍増加させたが，DS の存在下では LHβプロモー

ぞれ刺激し，ゴナドトロピン LHβ，FSHβ，αサブユニッ

ター活性は ． ± ． 倍となり，GnRH 単独刺激に比トのプロモーター活性を dual luciferase assay で測定しし有意な増加を認めた（図た．DS はすべてのゴナドトロピンサブユニットのプロで ． ± ． 倍に増加した FSHβサブユニットプロモー

をnM， μM， μM， μM，A）．同様に，GnRH 刺激

モーター活性を増加させた．LHβサブユニットプロモー

ター活性は，DS の存在下で ．± ． 倍と GnRH 単独

ター活性は，DS 濃度 μM 以上で有意に増加し， μM

刺激に比べ有意に増加した．αサブユニット発現に関しではコントロールと比べ ． ± ． 倍となり最大の増加ても DS 存在下で GnRH 単独刺激に比べて有意な増加を認めた（図を認めた（図

A）．FSHβサブユニット，αサブユニッ

B，C）．このことから DS は単独でゴナト発現も同様に DS 刺激で増加し，FSHβサブユニット

ドトロ ピ ン を 発 現 さ せ，か つ GnRH と の 同 時 投 与 で，αサブユニッは DS 濃度 μM で最大（ ． ± ． 倍）

GnRH の作用を増強することが明らかとなった．

トは DS 濃度54μM で最大（ ． ± ． 倍）となった

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.20 2015

δGABAA 受容体特異的作動薬 DS によるゴナドトロピンサブユニット発現

A

B
P<0.05LHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

16

**

14
12
**

10
8
6
4

*

2
0

control

GnRH

C

DS1

FSHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

P<0.05
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0

GnRH
+
DS1

**

**

*
Control

GnRH

DS1

GnRH
+
DS1

P<0.01α-Luciferase promoter(Fold induction)

140
**

120
100

**

80
60
40
20

*

0
control

図

GnRH

DS1

GnRH
+
DS1

GnRH によるゴナドトロピンサブユニットプロモーター活性反応に対する DS の効果
LβT 細胞に ．μg LHβ―Luc（A），FSHβ―Luci（B），α―Luci（C）ベクターを pRL―TK（ ．μg）プラスミドとともにトラ
ンスフェクトした．トランスフェクション 時間後に GnRHnM，DSμM でそれぞれ

時間刺激を行った．LHβ（A），

FSHβ（B），α（C）サブユニットプロモーター活性を Luciferase assay で評価した．結果は独立した 回の実験の平均値±
SEM とし，コントロールに対する fold stimulation で表した．＊P＜ ． ，＊＊P＜ ． vs. control．LHβ，FSHβ，αサブユ
ニットプロモーター活性において GnRH 単独刺激と GnRH，DS 併用刺激間に有意差を認めた．

ゴナドトロピンサブユニットプロモーター活性に行った．SRE は ERK により調節を受ける転写因子が結対する muscimol および一般的 GABA 化合物の効果

合する DNA プロモーター領域であり，CRE は cAMP/protein kinase A（PKA）経路のターゲットとなるプロ

DS はその量体にδサブユニットを含む GABAA 受容

モーター領域として知られている．GnRH は SRE と CRE

体特異的な作動薬である．DS によるゴナドトロピン発のプロモーター活性をそれぞれ ． ± ． 倍， ． ±現促進作用がδサブユニットに特異的なものかどうか検． 倍に増加させた．一方，DS によって SRE プロモー討するために，他の GABA 受容体作動薬でも同様の作ター活性は ． ± ． 倍，CRE プロモーター活性は ．

用がみられるのか検討を行った．一般的に GABAA 受容± ． 倍に増加した．SRE，CRE プロモーター活性に体（α β γ ）作動薬として使用される muscimol を用

対する DS の作用は有意なものであったが，GnRH の効

いて，ゴナドトロピン発現を検討したが，muscimol は果に比べると限定的であった．ゴナドトトピンプロモー

LHβ，FSHβプロモーター活性どちらも増加させず，まターと同様に，GnRH による SRE，CRE プロモーター

た GnRH によるゴナドトロピン発現に対しても何ら影

活性は DS の存在下でより増強された（図

A，B）
．こ

A，B）
．一方，一般的な GABAのことより，DS は SRE 活性，CRE 活性をともに単独

化合物は LHβ，FSHβサブユニットプロモーターの基礎で増加させ，GnRH による刺激効果を増加させることが響を与えなかった（図活性を増加させなかったが（図C），GnRH による FSHβ

プロモーター活性を有意に増強した（図

分かった．

D）
．

DS― によるゴナドトロピンプロモーター活性に
SRE，CRE プロモーター活性に対する DS の作用
続いて DS による細胞内情報伝達系について検討を対する ERK 阻害剤，PKA 阻害剤の効果
DS によるゴナドトロピンサブユニット発現に至る情研究フロンティア

55

亜希

他

LHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

A

n.s.

8
**

7
6
**

5
4
3
2
1
0

control

GnRH

muscimole

GnRH+
muscimole

C

**
**

Control

GnRH 10nM muscimole

GnRH+
muscimole

**

30
25
**

20
15
10
5
0

P<0.0125FSHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

35
LHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

8
7
6
5
4
3
2
1
0

D
n.s.

図

n.s.

B
FSHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

折出

**

20
15
**

10
5
0

control

GnRH

GABA

Control

GnRH
+
GABA

GnRH

GABA

GnRH
+
GABA

ゴナドトロピンサブユニットプロモーター活性に対する muscimol および一般的 GABA 化合物の効果
LβT 細胞に ．μg LHβ―Luc（A，C），FSHβ―Luci（B，D）ベクターを pRL―TK（ ．μg）プラスミドとともにトランスフェクトした．トランスフェクション 時間後に GnRH

nM，muscimol

μM，GABAμM でそれぞれ

時間刺激を行った．LHβ（A，C），FSHβ（B，D）サブユニットプロモーター活性を Luciferase assay で評価した．結果は独立した 回の実験の平均値±SEM とし，コントロールに対する fold stimulation で表した．＊＊P＜ ． vs. control．GnRH と GnRH
＋muscimol には LHβ，FSHβサブユニットプロモーター活性において有意差を認めなかった．GnRH と GnRH＋GABA には LHβサブユニットプロモーター活性において有意差を認めなかったが，FSHβサブユニットプロモーター活性において有意差を認めた（P＜ ． ）
．

A

B

図

40

P<0.05
**

35
30
25

**

20
15
10
5
0

**
control

GnRH

DS1

GnRH
+
DS1

CRE-Luciferase promoter(Fold induction)

SRE-Luciferase promoter(Fold induction)

P<0.01
30

**

25
20

**

15
10
**

5
0

control

GnRH

DS1

GnRH
+
DS1

SRE，CRE プロモーター活性における DS の作用
LβT 細胞に ．μg SRE―Luc（A），CRE―Luci（B）ベクターを pRL―TK（ ．μg）プラスミドとともにトランスフェクト
した．トランスフェクション 時間後に GnRH nM，DS
μM でそれぞれ 時間刺激を行った．LHβ（A），FSHβ（B）
プロモーター活性は Luciferase assay で測定した．結果は独立した 回の実験の平均値±SEM とし，コントロールに対す
る fold stimulation で表した．＊P＜ ． ，＊＊P＜ ． vs. control．GnRH と GnRH＋DS には LHβ，FSHβサブユニットプ
ロモーター活性共に有意差を認めた（P＜ ． ，P＜ ． ）．

56

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.20 2015

δGABAA 受容体特異的作動薬 DS によるゴナドトロピンサブユニット発現

3P<0.01FSHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

LHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

B

P<0.01

A
**

2.5
2
1.5
1
0.5
Control

DS1

U0126

C

1.5
1
0.5

2
1.5
1
0.5
0
H89

DS1
+
H89

U0126

DS1
+
U0126

n.s.

FSHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

**

DS1

DS1

D

2.5

Control

Control

DS1
+
U0126

n.s.
3

LHβ-Luciferase promoter(Fold induction)

**

2

0

0

図

2.5

3
**

2.5
2

**

1.5
1
0.5
0
Control

DS1

H89

DS1
+
H89

DS― によるゴナドトロピンプロモーター活性に対する ERK 阻害剤，PKA 阻害剤の効果
ERK の特異的阻害剤として U，PKA 阻害剤として H を用いた．LβT 細胞に ．μg

SRE―Luc（A，C），CRE―Luci（B，D）ベクターを pRL―TK（ ．μg）プラスミドとともにトランスフェクトした．トランスフェクション 時間後に DSμM および U
μM（A，B），H
μM（C，D）でそれぞれ 時間刺激を行った．LHβ（A，C），FSHβ（B，D）
プロモーター活性は Luciferase assay で測定した．結果は独立した 回の実験の平均値±SEM とし，コントロールに対す
る fold stimulation で表した．＊P＜ ． ，＊＊P＜ ． vs. control．LHβ，FSHβサブユニットプロモーター活性において DSと DS ＋U間で共に有意差を認めた（P＜ ． ）．一方 DS と DS ＋H 間には有意差を認めなかった．

報伝達系路を明らかにするため，ERK および cAMP/

受容体δサブユニット特異的な効果であると考えられ

PKA 経路の特異的阻害剤を用いて検討を行った．

た．また DS によるゴナドトロピン発現には ERK 活性

ERK 特異的阻害剤である Uは DS によるゴナド化が関与していると考えられた．

A，B）．一方 PKADS のこれらの作用が果たして GABAA 受容体δサブ阻害剤である H は DS によるゴナドトトピン発現にユニットを介した特異的な効果なのかどうかさらに検討

C，D）．このことより DSを進め，GABA およびその受容体の生殖内分泌への関与

トロピン発現を完全に抑制した（図影響を与えなかった（図のゴナドトロピン発現作用は，PKA/cAMP よりもむしについて解明を行う必要があると考えられた．

ろ ERK 活性化が関与している可能性が考えられた．

引用文献
おわりに
今回の研究ではα β δGABAA 受容体アゴニストである DS によるゴナドトロピンサブユニット発現について検討を行った．DS は下垂体ゴナドトロピン産生細胞株である LβT 細胞において，単独でα，LHβ，FSHβの全てのゴナドトロピンサブユニット発現を増加させ，また GnRH によるゴナドトロピン発現を増強した．この
ゴナドトロピンサブユニット発現は muscimol や一般的
GABA 化合物では認められなかったことより，GABAA．Gharib SD, Wierman ME, Shupnik MA, Chin WW （）
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折出

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