REVIEW

始原生殖細胞の試験管内再構成系とその応用：
エピゲノムリプログラミング機構の解明に向けて
栗本 一基，斎藤 通紀
京都大学大学院医学系研究科機能微細形態学

胞系列から運命を分かつ．

はじめに

古典的研究により，PGCs は発生 ．日ごろに，原条
生殖細胞は世代を越えた生命の継承を担う細胞種であの後部，胚体外中胚葉の尿膜基底部において，アルカリり，次世代への遺伝情報の正確な伝達，減数分裂によるフォスファターゼ陽性細胞として同定された［ゲノムの多様性，胚発生のすべてを滞りなく行うための胞の色素標識による系譜追跡や，移植などの発生生物学］．細全発生能の（再）獲得などの特性を持つ．始原生殖細胞的実験によって，
PGCsがepiblastの近位（マウスのepiblast（primordial germ cells ; PGCs）は胚発生時にのみ出現

は特徴的なコップ状構造をしており，前後・背腹・左右する生殖細胞の起源であり，全発生能の再獲得や次世代に加え，遠位・近位軸が存在する）に由来することが示

へのゲノム情報の伝達を実現するため，ゲノムに付加さされた［ ， ］．また遺伝学的な解析により，epiblast

れた後成的情報を初期化・刷新すると考えられているに発現する液性因子 WNT と胚体外外胚葉に発現する（エピゲノムリプログラミング）．PGCs は胚発生の初期

液性因子 BMP が必須であることが知られている［ ，］．

において一時的に現れる少数の細胞であり，形態的にも単一細胞遺伝子発現解析により，初期の PGCs を特異的体細胞との判別が容易ではないために，分子生物学的，に発現する遺伝子 stella（Pgc /Dppa ）と fragilis が同

生化学的，細胞生物学的なアプローチは，長年にわたり定され，PGCs が特異的にマークされるようになった

困難であった．近年，単一細胞発現プロファイルの解析，［

主要因子の遺伝学的解析，機能的な PGCs の試験管内再形成が始まると考えられていたよりも明らかに早い発生

構成系の開発により，PGCs 形成機構の理解が飛躍的に． 日ごろに，epiblast 最後部のわずか数個の細胞にお進展した．本稿では，これらの研究進展の経緯を，最近

いて Bmp 依存的に発現を開始す る こ と が 示 さ れ たの知見を含め概説したい．

［］．さらに，転写制御因子 Blimp が，それまで PGCs］
．Blimp をノックアウトすると正常な PGCs は全く形成されなくなり，PGCs の運命決定に必須な特異的

始原生殖細胞の形成過程とその細胞生物学的特性

内在因子として同定された．また，Blimp と stella の制御下で蛍光タンパク質を発現するレポーターマウスが生殖細胞の起源である始原生殖細胞（primordial germ
cells ;

PGCs）は，胚発生の初期に出現する．哺乳類における PGCs の研究は，主としてマウスをモデル動物として行われてきた．マウスの胚は，発生開発され，PGCs を容易に可視化することが可能となって研究が促進された［］．

PGCs が形成される時期の epiblast 後部は，まさに原日ごろに，胚腸陥入を進行しつつあって，T （Brachyury），Hox 遺伝

組織のすべてを構築するべく運命づけられた一層の多能子群をはじめとする転写制御因子が体軸に沿った体細胞

性の上皮葉組織 epiblast を形成し，発生

日ごろに原腸のパターン形成を行うべく順序よく発現していく．ゲノ）．Epiblast は上皮間葉転換を起ムワイドな単一細胞発現プロファイルの解析等により，こして中胚葉・内胚葉へと分化し，胚体および胚体外組

最初期の PGCs が中胚葉誘導の強い影響下にあって，こ織を形成する三胚葉を形成する．PGCs は三胚葉のいず

れら中胚葉関連因子群を一過的に発現することが明らか

れにも属さない細胞系譜として，原腸陥入において体細になった［ ， ］
．転写制御因子 Blimp を強く発現す

陥入を開始する（図る細胞だけが，中胚葉化を抑制し，PGCs 特有の発現プ
連絡先：栗本一基，京都大学大学院医学系研究科機能微細形
態学〒 ―京都市左京区吉田牛ノ宮町
TEL ： ― ―FAX： ― ―E-mail：kurimoto@anat .med.kyoto-u.ac.jp

ログラムを獲得する．さらに，Blimp 強陽性細胞においては新規 DNA メチル化酵素群 （Dnmt a，Dnmt b）やメチル化の維持に関わる因子（Uhrf /Np）の発現が著しく低下し，後述するゲノムワイドな DNA の脱メ

日本生殖内分泌学会雑誌（2015）20 : 7-13

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栗本

一基

他

図

マウス胚発生と PGCLCs 誘導系（A）マウス胚発生模式図．inner cell mass（ICM）, epiblast, primordial germ cells（PGCs）を示す．
（B）試験管内 PGCs 再構成系．ICM に対応する ESCs，epiblast に対応する EpiLCs，PGCs に対応する
PGCLCs と，それぞれの細胞の誘導に用いられるサイトカインや化合物を示す．
（C）PGCLCs を用いたエピゲノム解析の概要．

チル化に寄与すると考えられる．Blimp 遺伝子を破壊た，PGCs を適当な条件下で培養すると ESCs や iPSCs

すると，本来 PGCs になるように運命づけられた細胞にと同様の多能性幹細胞（embryonic germ cells; EG cells）

おいても中胚葉化が抑制されず，周囲の体細胞と区別でへと「脱分化」させることができる［ ］．さらに多能きない発現プロファイルを示すようになってしまう．

性幹細胞は，精巣由来の雄性生殖細胞系列の 幹 細 胞

PGCs は， Blimp によって体細胞化を抑制しながら，

Germ line stem cells（GS cells）からも樹立すること

尿膜基底部に数十個の細胞からなるクラスターを形成ができる［ ］
．これらの事実は，PGCs を含む生殖細し，特異的な遺伝子群の発現を獲得する．その後，将来胞系列が，潜在的に多能性を保持し続け雌雄配偶子の接の生殖巣に向かって移動するべくつひとつ遊離し，後合とともに全発生能を発揮するための基盤となっている

腸上皮の中にもぐりこんでいく．興味深いことに，このことを示唆する．これは「潜在的多能性」と呼ばれてお時 期 の PGCs は，Oct / や Nanog な ど，胚 性 幹 細 胞

り，PGCs はその形成過程の初期においてこの特性を獲（Embryonic stem cells ; ESCs）
や多能性幹細胞（induced得する．

pluripotent stem cells ; iPSCs）等の多能性幹細胞で重この時期の PGCs は，インプリント領域やトランスポ］．一方，

ゾンを含む，全ゲノムにわたる DNA のメチル化を低下

ESCs や iPSCs を胚盤胞に注入すると，三胚葉のすべて．また，転写抑制に関わるヒストン修飾させる［ ― ］に由来する細胞種に分化することができるが，PGCs は

H K me （ポリコームによる転写抑制を反映する）とどの細胞組織にも寄与することができない．ところが，

H K me （G A/GLP による転写抑制を反映する）のレ

胚発生時に生殖巣以外の部位に到達した PGCs は各胚葉ベルが短期間の内に激しく変動する．すなわち，それぞ由来の細胞が無秩序に混在する奇形腫の原因となり，されのヒストン修飾に対する抗体を用いて免疫染色する

らに奇形腫からは，多能性幹細胞 Embryonic Carcinomaと，周囲の体細胞に比べて H K me が著しく減少する

cells（EC cells）を単離することができる［ ， ］．まのに対し，H K me のレベルは増加する［ ］．これ要な働きをする転写因子群を高発現する［ ，8日本生殖内分泌学会雑誌 Vol.20 2015

始原生殖細胞の試験管内再構成系とその応用：エピゲノムリプログラミング機構の解明に向けてらの後成的修飾の変動はエピゲノムリプログラミングと連因子群が一時的に高発現し，ついでそれらが抑制され，呼ばれる．

多能性関連因子群の再獲得，エピゲノムリプログラミン

潜在的多能性の（再）獲得とエピゲノムリプログラミ

グ（DNA メチル化の低下，H K me の亢進，H K me

ングは，全発生能を保持しつつ，次世代に継承するゲノの低下）と続く発生過程をたどった．PGCLCs の遺伝

ムを正しく初期化するために重要な特性であると考えら

子発現をゲノムワイドに解析すると，発生日目におけれている．遺伝学的解析や単一細胞発現解析によって，る胚体内の PGCs によく類似したプロファイルを示すこ

エピゲノムリプログラミングや潜在的多能性の再獲得にとが明らかになった．さらに，誘導した PGCLCs を単が同定された

離して不妊マウス新生仔の精巣に移植すると，未分化なは PGCs 形 成 に 必 須 で あ り，Blimp と多能性細胞に由来するテラトーマを形成することなく，

主 要 な 役 割 を 果 た す 転 写 因 子 Prdm
［ ］
．Prdm

ほぼ同時期に PGCs 特異的に発現する．また，Prdm

機能的な精子形成に寄与した．このことは，PGCLCs がは胚盤胞内部細胞塊（inner cell mass ; ICM）や，そこ

遺伝子発現，エピゲノム，機能のいずれの側面から見てから樹立される ESCs にも発現しており，ポリコームともまさしく試験管内で再構成された PGCs に対応する細協働して Fgf シグナルと DNA メチル化酵素を抑制する胞であり，その誘導過程もまた，PGCs のそれによく対ことによって，多能性細胞のナイーブな状態（naïve plu-

応づけられることを示している．また，この研究によりripotency）を保つ［ ］．

EpiLCs が epiblast に相当する培養細胞であることも示

後腸に移動した PGCs は細胞周期をほぼ停止し［ ］，
背側腸間膜を通って発生 ．日ごろに，形成されつつあされたといえる．PGCLCs を誘導する EpiLCs の能力は，
ESCs から誘導してから日目に最も高くなり，その後る生殖巣に移動する．そこで細胞周期の停止が解除され，は失われていく．この事実も，epiblast が胚体内に一過細胞数を増加しつつ DNA のメチル化レベルをさらに低的に現れる細胞であることとよく一致している．さらに下させ，雌雄それぞれの生殖細胞として分化していく．

年には，メスマウス由来の PGCLCs を，メス生殖
隆起の体細胞と混合して細胞塊を形成し，卵巣被膜化に

PGCs の試験管内再構成系の確立

移植することにより，機能的な卵母細胞へと分化させられることが示された［ ］．この一連の研究により，多PGCs は胚発生にのみ，一過的に出現する少数の細胞であるため，可能な生化学的・分子生物学的解析は限定

能 性 幹 細 胞 か ら の PGCs 再 構 成 系 が 確 立 さ れ，初 期
PGCs 形成機構の詳細な解明への道が拓かれた．

されていた．このため，PGCs 形成機構の詳細な解析に用いることができる，機能的な PGCs を誘導する培養系

転写因子による PGCs の再構成の開発が待たれていた．大日向らは，マウス胚から単離した epiblast を浮遊培養して BMP をはじめとするサイ

PGCs 試験管内再構成系を用いた，生殖系列決定機構

トカインで刺激することにより，高い効率で PGCs 様のの解明において，まず重要と考えられたのは PGCs 形成細胞を誘導し，その細胞を不妊マウス新生仔の精巣に移に十分な内在性因子の同定であった．マウスの遺伝学的植すると機能的な精子形成に寄与することを示した研究から，PGCs 形成に必須であることが示された［の転写因子［Blimp ，Prdm］．
その後，林らは年に，PGCs の分化過程が胚盤胞

つ，Tfap c（Ap γ）］を，

EpiLCs に 強 制 発 現 さ せ る と，ほ ぼ す べ て の 細 胞 が内部細胞塊（inner cell mass ; ICM）から epiblast を介

PGCLCs に 分 化 し た（transcription

して行われることに注目し，まず ESCs や iPSCs を Ac-

PGCLCs :factor-induced

tivin A と bFGF の存在下で平面培養することによって，すると正常な精子形成に寄与し，健常な個体が得られた．

epiblast に著しく類似した遺伝子発現プロファイルを示

ところが遺伝子発現を詳細に解析すると，胚 体 内 のす細胞 epiblast like cells（EpiLCs）を誘導することに成PGCs で観察される中胚葉プログラムの一時的な活性化

功した［ ］．PGCs の蛍光レポーター（Blimp およびが，TF―PGCLCs では認められないことが明らかになっstella）をもつ EpiLCs を，BMP をはじめとするサイト

た．このことは，TF―PGCLCs が中胚葉を経ずに EpiLCs

カイン存在下で浮遊培養すると，epiblast からの誘導とから直接誘導されていることを示しており，それでは一

TF-PGCLCs）［ ］．この細胞を精巣に移植同様の高い効率で蛍光タンパク質を強く発現する PGCs

体なぜ，PGCs が一時的にでも中胚葉プログラムの活性様の細胞が観察された（PGC-like cells ; PGCLCs）．

化を経なければならないのか，という新たな疑問を惹起

PGCLCs は，胚体内の PGCs と同様に，まず中胚葉関した．また，これらの転写因子群を ESCs に直接強制発

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現しても TF-PGCLCs は誘導されず，PGCs の誘導にはクアウト細胞を WNT に曝露してから T を強制発現さ

EpiLCs や epiblast に特有のコンピテンスが重要である

せると，WNT への曝露時間が長ければ長いほど，Blimp

ことが示された．

と Prdm
のみを EpiLCs に強制発現

興味深いことに，Prdm

させた場合でも機能的な TF―PGCLCs が誘導され，の発現誘導が阻害された．すなわち，WNT

は T の発現を誘導するが，WNT によって誘導されるそつの他の体細胞プログラムは PGCs の誘導に対して抑制的の転写因子すべての同時発現とほぼ同等の遺伝子発現変に働くと考えられる．このため BMP は，WNT シグナ

が PGCsルの作用を制御し，PGCs プログラムが誘導されるため特異的な遺伝子群や多能性関連因子群の発現誘導，DNAの許容状態を作り出しているのではないかと考えられメチル化酵素の発現抑制を行っていることが示唆される．このことは胚体において，PGCs が BMP 産生部位

た．このことは PGCs 形成過程における Prdmの最も近傍で，すなわち最も強い BMP シグナルの存在化を示した．詳細な発現解析によって Prdmの中心的役割を強く示唆している．また，ESCs における Prdm

下で形成されることともよく一致する．

の機能との類似性は興味深い．この研究によって機能的に十分な転写因子群が同定されたので，PGCs 形成

PGCLCs におけるクロマチン動態の解明

における遺伝子始制御機構の更なる解明が期待される．
蛍光免疫染色や Western blot により，PGCs がその形

PGCs 形成過程における中胚葉誘導の意義

成過程の初期から大規模なエピゲノム変動を示すことが示されてきた．われわれは，ゲノムのどの部位がその制

PGCs が誘導されるためには，胚体外からの BMP シ

御の対象となっているのかを解明するために，転写活性グナルの前に，epiblast での WNT シグナルが必要であ化に関連するヒストン修飾（H K me と H K ac），転り，これが生殖細胞誘導のコンピテンス獲得に重要であ写抑制に関わる修飾（H K me と H K me ），およびると考えられた．Wnt ノックアウト胚に由来する試験

転写制御因子 BLIMP と T について ChIP-seq を行い，管内誘導系において，培養液に WNT を加えると失わESCs から EpiLCs を介して PGCLCs が誘導される過程れたコンピテンスが回復することが示された［ ］．さを定量的に解析した［ ］．その結果，この過程におけらに WNT を加えるタイミングを BMP と同時にしてるヒストン修飾パターンの大規模な再編成が明らかにな

も PGCLCs が誘導されることが示され，EpiLCs の形成

り，特に H K me は，全ゲノムにわたる基底レベル

自体には WNT が必要ではないことが明らかになった．

の変動に，特定の遺伝子周辺での修飾レベルが重ね合わ

さらなる解析によって，EpiLCs において，WNT によっさった複雑な動態を示した（図て誘導される多くの中胚葉関連転写因子群が同定され的な H K me レベルは，EpiLCs で最も低くなり，こた．その中でも，中胚葉誘導に重要な働きをする，古典の細胞の「プライムされた多能性状態（primed pluripo-

的によく知られた 転 写 因 子 T （Brachyury）が，PGCstent state）」を反映することが示唆された．中胚葉誘導）．遺伝子周辺の相対の分化に必要であることが明らかになった．Wnt ノッの開始とともに，形態形成等に関連する遺伝子群の周辺

クアウト EpiLCs に T を強制発現すると，BMP のシグ

で H K me レベルが顕著に増加し，PGCLCs ではそナルなしに Blimp や Prdmの傾向がさらに増強された．

の発現が効率よく誘導された．クロマチン免疫沈降と次世代シークエンスの組み

H K me は遺伝子のプロモーター付近に局在して HのK me と均衡をとるように分布し，両者の修飾レベル

近傍のゲノム領域に結合すること，さらにこれらの T

は対数逆相関を示す．多くの発生関連遺伝子群は，多能結合部位が転写を活性化する機能をもつことが示され性幹細胞や後期の PGCs において，H K me と H K

た．このことは，中胚葉因子である T こそが WNT シ

me の両方が一定レベル以上で共存する二価状態（biva-

グナルの下流にあって，PGCs を誘導する転写制御因子

lent

群の最上流に位置することを示唆している．

写活性化と抑制の平衡状態に保ち，適切な発生タイミン

合 わ せ（ChIP-Seq）に よ り，T が Blimp と Prdm

state）にある．このことは，これらの遺伝子を転EpiLC に T を強制発現すれば，WNT や BMP を加えグで発現を開始するために重要な機構なのではないか，ることなく PGCs プログラムを開始することができる．

すなわち，（潜在的）多能性の基盤なのではないかと考しかしながら WNT が T の発 現 を 誘 導 す る 一 方 で，えられている．EpiLCs では多数の遺伝子が二価状態にBMP なしには PGCLCs は誘導されない．BMP の役割あり，次いで中胚葉誘導とともに，一部の遺伝子から H

興味深いことに，Wnt ノッ

K me が失われる．その後，PGCLCs の誘導において，とは何なのであろうか？

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始原生殖細胞の試験管内再構成系とその応用：エピゲノムリプログラミング機構の解明に向けて

H K me とともに H K me レベルが再び増加し，多ヒト PGC（LCs）の誘導とその形成過程の解明にむくの遺伝子が新たに二価状態を取るようになる．すなわ

けてち，PGCLCs における発生関連遺伝子群は，高レベルのH K me に代表される強い抑制状態を取りつつ，一定

ヒト PGCs の形成機構は，現在までほとんど分かってレベルの H K me をも獲得し独特の均衡状態を形成しいない． 古典的な記述は， Fuss による形態学的解析で，ているといえる．

発生

週目の終わりに卵黄囊背側壁の内胚葉に PGCs がこれと同時に，H K me は，EpiLCs からの PGCLCs

同定された［ ］．その後の解析により，卵黄囊背側壁

誘導過程においてほぼ一定のペースで減少し続けた．H

から後腸，腸間膜を経て生殖巣に至る過程が示された

K me は，核ラミナとゲノムの相互作用ドメイン（Lam-［ ， ］．PGCs は周囲の体細胞より大きく，淡明な細ina associated domains ; LADs）において高いレベルを胞質と著明な核小体等の形態的特徴や，過ヨウ素酸―シッ示すことが知られている．PGCLCs では LADs からも H

フ（Periodic acid-Schiff ; PAS）染色，アルカリフォス

K me が失わ れ，同 時 に 核 周 辺 部 に お け る ’, ―dia-

ファターゼ活性により同定された［ ］．

midino― ―phenylindole（DAPI）強陽性のヘテロクロマ

マウスにおける PGCs の決定機構は，特徴的なコップ

チン領域の減少が観察された．このことは PGCLCs が状の epiblast の構造と BMP の供給源となる胚体外外胚

エピゲノムリプログラミングに伴い，核の構造をも変化

葉に依拠している（図させていくことを示唆している．

長類では epiblast は扁平な胚盤を形成し，胚体外外胚葉

転写因子 T と BLIMP の結合部位の解析から，T が，初期中胚葉関連因子群と PGCs 決定因子群（Blimp お
よび Prdm）の周辺に，H K ac をリクルートして）．ところが，ヒトと含めた霊に相当する構造をもたない（図）．このため，ヒトにおいては，マウスとは異なるシグナル伝達機構が PGCsを決定しているのではないかと考えられる．

転写を活性化すること，次いで BLIMP が，より広範な

最近になって複数のグループから，ヒトの多能性幹細発生関連遺伝子群を直接の標的にして，体細胞プログラ

胞から，BMP を含めたサイトカインの刺激によって，ムを抑制することが示唆された．BLIMP の結合を追うマウスの初期 PGCs 関連遺伝子群を発現し，生殖巣におようにして，周辺に H K me が広がり，BLIMP によけるヒト PGCs と一定の類似性を示す遺伝子発現パター

るポリコームを介した発現抑制や，全ゲノムにわたる H

ンを示す細胞の誘導が報告された［ ， ］．これらのK me 増加への関与が示唆される．

細胞は human PGC-like cells（hPGCLCs）と名付けられ，

ゲノムワイドな DNA メチル化レベルの低下は，主要その誘導に内胚葉因子 SOXなエピゲノムリプログラミングのつである．初期胚や，が必要十分な役割を果た

すこと，BLIMP が内胚葉を含む体細胞遺伝子を抑制す

発生 ．日以降の PGCs におけるゲノム DNA のメチル

ること，PRDM

化パターンの動態は，Bisulfite sequencing（DNA を亜硫報告されている．興味深いことに，hPGCLCs の誘導法

酸水素ナトリウムで処理することによって，メチル化さは多様であり，すでにが必ずしも必要ではないことなどが種の誘導法―多能性の「基底状れていないシトシンをウラシルに変換してからシークエ態（ground state）」にあるとされるヒト ES 細胞（hESCs）

ンス解析する手法）
を用いて，詳細に解析されてきた［ ，［ ］
から直接誘導する方法，その細胞からマウス EpiLCs― ］．これらの研究により，ゲノムワイドな DNA 脱メチル化機構として，DNA の複製に依存した受動的なメカニズムが有力視されている．また発生 ．日の PGCs
において，すでに相当な DNA の脱メチル化が起きており，その後さらに，受動的な機構による脱メチル化が進行することが強く示唆されている．しかしながら，発生．日以前の PGCs における DNA のメチル化動態は未解明であり，この時期の PGCs が増殖をほぼ停止していることからも，その脱メチル化機構は興味深い．試験管内培養系を用いた詳細な解析が待たれている．

図

マウスと霊長類の原腸胚の比較
マウス原腸胚（発生 ．日）［ ］とアカゲザル原腸胚（発生 日）［ ］を示す．マウス胚が特徴的なカップ状の epiblast をもつのに対し，ヒトを含む霊長類では epiblast は扁平な二層性の胚盤の上層を形成する．

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と同様の条件で前駆細胞を誘導する方法，原条または中胚葉様の細胞を含む前駆細胞を経由する方法―が存在している．また，標準的な培養法によって維持されたヒト
hESCs からの，直接の誘導効率は著しく低く，hPGCLCs
へのコンピテンスには基底状態での維持が重要であるようだ［ ］．はたしてこれら hPGCLCs が同じ細胞であるのか，ヒト PGCs に相当する細胞であるのか，またどの発生過程に相当するのか，ヒト多能性幹細胞からの誘導は胚体内のどの発生過程に対応づけられるのか等の興味は尽きず，今後の研究の発展が期待される．また，試験管内で誘導されたヒト生殖細胞の厳密な機能検証は事実上不可能であるため，試験管内での hPGCLCs の解析に加えて，ヒト以外の霊長類における生殖系列形成機構の基礎的研究が必要不可欠であると考えられる．最近，次世代シークエンサーを用いた単一細胞発現解析技術が改善され，高効率かつ信頼性の高い，ゲノムワイドな定量が可能となった［ ］．この手法をはじめとして，マウスを用いた研究で培われてきた知見や技術等が，霊長類の生殖細胞研究を切り開いていくと期待される．

おわりに
PGCs 形成機構の研究は，数々の遺伝学的解析，胚体内 PGCs への直接的アプローチを経て，試験管内での培養法が確立されるに至り，急速な進展を遂げつつある．
将来的には，臨床応用への展開も視野に入る可能性があるが，倫理的・技術的問題の慎重な議論が必要であろう．
ヒト PGCLCs の誘導と，霊長類胚における PGCs 形成機構，そのエピゲノムリプログラミング機構の解明は，今後の中心的課題になっていくであろう．

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REVIEW

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