19-9GenNext® RamDA-seqTM Single Cell Kit(Code No. RMD-101, RMD-101T)

NSR Primer Set for human(Code No. NSR-101)

NSR Primer Set for mouse(Code No. NSR-102)

使用说明书
TOYOBO CO., LTD. Biotech support Department
OSAKA JAPAN- 目录 [1] 前言 ....................................................................................................................................- 1 [2] 产品组成 .............................................................................................................................- 2 [3] 其他必需品 .........................................................................................................................- 2 [4] 使用方法 .............................................................................................................................- 3 1.

细胞裂解或 RNA 稀释（Cell lysis or RNA dilution） ......................................................- 3 -2.

热变性反应（Denature） ..............................................................................................- 4 -3.

基因组去除反应（Digestion of genomic DNA） ............................................................- 5 -4.

cDNA 合成及扩增反应（RT-RamDATM 反应） ..............................................................- 5 -5.

第二链合成反应（2nd strand synthesis） .....................................................................- 6 -6.

文库制备 ........................................................................................................................- 6 -7.

文库的验证 ....................................................................................................................- 8 -8.

测序数据的确认 .............................................................................................................- 9 -[5] 实验例 ..............................................................................................................................- 10 1.

检测到的转录产物数量及各区域 alignment 比例的比较 ...............................................- 10 -2.

长链 RNA 全长性的比较 ..............................................................................................- 10 -[6] 常见问题 ........................................................................................................................... - 11 [7] 相关产品 ........................................................................................................................... - 11 [8] 参考文献 ........................................................................................................................... - 11 -- 注意事项 –本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全操作。

※illumina®、NexteraTM 是 illumina Inc. 的注册商标或商标。
※MultiNA® 是株式会社岛津制作所的注册商标。
※RamDA-seqTM 是国立研究开发法人理化研究所的商标。

东洋纺（上海）生物科技有限公司[1] 前言RamDA-seqTM Single Cell Kit 是从单细胞或微量 RNA 开始制备 NGS 分析用 cDNA 的试剂盒。使用
本产品可制备 Full-length total RNA-seq 用 cDNA。
参考文献

(1)
本试剂盒在 Reverse Transcription with Random Displacement Amplification (RT-RamDATM)法的基础上开发。该方法是利用逆转录酶的链转换活性实现 cDNA 扩增的新技术，除了常规 poly(A) RNA，也可以高灵敏度地逆转录出 non-poly(A)来源的 cDNA。因此，RT-RamDATM 技术相比原来的 cDNA 合成
方法能检测到更多基因。

注：本试剂盒不含文库制备试剂和磁珠。

图 1. 本试剂盒的工作流程◆本试剂盒的特征◆1.

可从单细胞或微量 RNA 制备 cDNA
可以使用 1~100 个细胞或者 10pg~1ng total RNA 作为起始模板。

2.

可分析全长 cDNA使用本产品可以制备出测序 reads 覆盖全长 RNA（10kb 以上）的 cDNA。

3.

可检测各种 RNA，且能检测到的基因数相比原来技术大大提高 可进行转录本 isoform 或可变剪切的鉴定 poly(A) RNA 或 non-poly(A) RNA (组蛋白 RNA 或 lncRNA)的检测 核内 RNA(pre-mRNA 或 lncRNA)的检测-1-[2] 产品组成本试剂盒中含有以下试剂。试剂请放-20℃保存。
RamDA-seqTM Single Cell Kit (Code: RMD-101, RMD-101T)
试剂名称保存(RMD-101)(RMD-101T)①Lysis Buffer

-20℃

480μL

120μL

②Lysis Enhancer

-20℃

108μL

27μL

③RNase Inhibitor

-20℃

22μL

6μL

④Nuclease free water

-20℃

960μL

240μL

⑤RT-RamDATM Buffer

-20℃

240μL

60μL

TM

Enzyme Mix

-20℃

54μL

14μL

TM

Primer Mix

-20℃

54μL

14μL

⑧gDNA Remover

-20℃

54μL

14μL

⑨2nd strand synthesis Buffer

-20℃

330μL

83μL

⑩2nd strand synthesis Enzyme

-20℃

55μL

145μL

⑪2nd strand synthesis Primer Mix

-20℃

275μL

69μL

NSR Primer Set for human (Code: NSR-101)
1st NSR Primer Mix for human

-20℃

54μL

2nd NSR Primer Mix for human

-20℃

275μL

NSR Primer Set for mouse (Code:NSR-102)
1st NSR Primer Mix for mouse-20℃

54μL

2nd NSR Primer Mix for mouse-20℃

275μL⑥RT-RamDA⑦RT-RamDA[3] 其他必需品
除本产品外，请准备以下仪器・试剂。
・PCR 仪或恒温仪。使用时，请根据各仪器说明书进行操作。

・磁珠。推荐 Agencourt AMPure XP 试剂（Beckman Coulter、目录编号：A63880、A63881 等）。使用时，请根据试剂说明书进行操作。

・磁力架。使用磁珠进行纯化时使用。

・80%的乙醇。作为使用磁珠纯化时的洗涤液使用。

・文库制备试剂。请使用 illumina 公司的 NexteraTM XT DNA Sample Kit。
产品名NexteraTM XT DNA Sample Kit (24 Samples)
NexteraTM XT DNA Sample Kit (96 Samples)・目录编号
FC-131-1024
FC-131-1096

TE Buffer（10mM Tris 1mM EDTA）pH8.0。文库制备时用于溶解 DNA。不能用水代替。

-2-东洋纺（上海）生物科技有限公司[4] 使用方法
本试剂盒可使用细胞或提纯的 total RNA。使用 FACS 获得细胞时请从 section 1. A 开始；使用 FACS以外的方法得到细胞时请从 section 1. B 开始；使用提纯的 total RNA 时请从 section 1. C 开始。然后进
入 section 2．热变性反应步骤。

细胞裂解 / RNA 稀释

样品
细胞

FACS
FACS 以外
Total RNA热变性反应section 2.

section 1. A
section 1. B
section 1. C

1. 细胞裂解或 RNA 稀释（Cell lysis or RNA dilution）
A. 使用 FACS 获得细胞时：(1) 将细胞裂解需要的试剂制备于离心管中。请参考下表，制备比必需量稍有余量的裂解液。
细胞裂解液的制备1 个反应(μL) 20 个反应(μL)※ 100 个反应(μL)※①Lysis Buffer

244220②Lysis Enhancer

0.45

9.949.5③RNase Inhibitor

0.05

1.1

5.5

④Nuclease free water

0.5

1155

366

330Total※余量为 10%时(2) 向 96 孔板或 8 连管中每孔分装 3μL 细胞裂解液。注意冰上操作，分装后请立刻封膜或盖上管盖。
(3) 细胞分选前，请将离心管一直置于冰上或 4℃保存，请根据所用 FACS 的操作说明书或厂家推荐的参数进行细胞分选。
(4) 细胞分选后，请进行密封，离心。
(5) 随后，迅速进行下一步或将样品置于-80℃保存。
B. FACS 以外的方法获取细胞时：使用人工拣选等细胞获取方法时，为了保证充分裂解，请控制细胞样品的液量小于 0.5μL。
(1) 将细胞裂解需要的试剂预混在离心管中。请参考下表，提前制备如下试剂，等待添加细胞样品。
细胞样品的液量不足 0.5μL 时，请根据情况调整水的添加量。
例) 细胞样品液量 0.5μL 时，细胞裂解液的制备
1 个反应(μL)①Lysis Buffer②Lysis Enhancer③RNase Inhibitor
细胞样品（不足 0.5μL）④Nuclease free water
Total※余量为 10%时

※※

20 个反应(μL)
100 个反应(μL)
244
220
0.45
9.9
49.5
0.05
1.1
5.5x(0.5-x)×22(0.5-x)×110
0.5-x
60
300
3-3-(2) 向 96 孔板或 8 连管中每孔分装细胞裂解液 2.5μL（或(3-x) μL）。分装在冰上进行，分装后请立刻
密封、离心。
(3) 添加细胞样品前，请将离心管一直置于冰上或 4℃保存，请根据所用细胞获取仪器的操作说明书，添加细胞样品。
(4) 添加细胞样品后，请进行密封，离心。
(5) 随后，迅速进行下一步或将样品置于-80℃保存。
C. 使用提纯后的 total RNA 时：(1) 请将 RNA 溶液的 90%稀释为 RNA 稀释液。请参考下表，在必要量的离心管中制备 RNA 稀释液。
RNA 稀释液的制备
100 个反应(μL)①Lysis Buffer

220②Lysis Enhancer

49.5③RNase Inhibitor

5.5④Nuclease free water

55

Total

330

RNA 稀释例)输入量为 1ng 时（333pg/μL total RNA 溶液）(μL)
10ng/μL total RNA

1RNA 稀释液

29Total30输入量为 10pg 时（3.3pg/μL total RNA 溶液）(μL)
333pg/μL total RNA

1RNA 稀释液

99Total100(2) 向 96 孔板或 8 连管中每孔分装稀释后的 RNA 溶液 3μL。
(3) 分装后，请进行密封，离心。
(4) 随后，迅速进行下一步或将样品置于-80℃保存。

2. 热变性反应（Denature）(1) 请将样品板或离心管置于 4℃离心、在以下温度进行温育。
使用冻结样品时，热变性反应前，请置于 4℃融解、离心后再进行热变性反应。
热变性反应步骤

温度

时间Denature

70℃

1.5min.

4℃

hold-4-东洋纺（上海）生物科技有限公司

3. 基因组去除反应（Digestion of genomic DNA）
(1) 将基因组去除反应必需的试剂预混于离心管中。请参考以下体系进行制备。
*

使用 ERCC RNA 等对照 RNA 时请调整④Nuclease free water 的添加量。

基因组去除反应液的制备
※

1 个反应(μL) 20 个反应(μL)

100 个反应(μL)※⑤RT-RamDATM Buffer

0.36.633⑧gDNA Remover

0.459.949.5④Nuclease free water*

2.2549.5247.5366330Total※余量为 10%时
(2) 向进行热变性反应之后的 96 孔板或 8 连管中每孔分装 3μL 基因组反应液，离心后，请在以下温度条件下进行温育。
基因组去除反应步骤
Genomic DNA digestion

温度时间30℃

5min.

4℃

hold

(3) 基因组反应后，迅速进行下一步反应。

4. cDNA 合成及扩增反应（RT-RamDATM 反应）(1) 在离心管中配制 RT-RamDATM 反应必需的试剂。请参考下表进行配制。
* 使用 NSR Primer 时，请使用 1st NSR Primer Mix for human 或 1st NSR Primer Mix for mouse
代替⑦RT-RamDATM Primer Mix 进行反应。
RT-RamDATM 反应液※1 个反应(μL)※20 个反应(μL)

100 个反应(μL)⑤RT-RamDATM Buffer1.533165⑥RT-RamDATM Enzyme Mix

0.459.949.5⑦RT-RamDATM Primer Mix*

0.45

9.949.5④Nuclease free water

0.6

13.266366330Total※余量为 10%时
(2) 向进行过基因组去除反应的 96 孔板或 8 连管中每管添加 RT-RamDATM 反应液 3μL，离心后，请在以
下温度条件下进行温育。
RT-RamDATM 反应步骤温度时间Priming 125℃

10min.

Priming 230℃

10min.

Reverse transcription and amplification

37℃

30min.

Reverse transcription 250℃

5min.

Inactivation

98℃

5min.

4℃

hold

(3) RT-RamDATM 反应后，迅速进行下一步反应或将样品置于-20℃～-30℃保存。

-5-5. 第二链合成反应（2nd strand synthesis）(1) 在离心管里配制第二链合成反应必需的试剂。请参考下表进行配制。
*

使用 NSR Primer 时，请使用 2nd NSR Primer Mix for human 或 2nd NSR Primer Mix for mouse
代替 2nd strand synthesis Primer Mix 进行反应。

第二链合成反应液
1 个反应(μL) 20 个反应(μL)※ 100 个反应(μL)※
2nd strand synthesis Buffer

363315

2nd strand synthesis Enzyme

0.5

10.5

52.5

2nd strand synthesis Primer Mix＊

2.5

52.5

262.5

6126630

Total※余量为 5%时

(2) 向进行了 RT-RamDATM 反应的 96 孔板或 8 连管中每管分装第二链合成反应液 6μL，离心后，在以下
温度条件下进行温育。
第二链合成反应步骤温度时间Second-strand synthesis

16℃

60min.

Inactivation

70℃

10min.

4℃

hold(3) 第二链合成反应后，迅速进行下一步反应或将样品置于-20℃～-30℃保存。

6. 文库制备本试剂盒的文库制备步骤，是按 illumina 公司 NexteraTM XT DNA 文库制备试剂盒推荐体系的四分之一
进行操作的步骤。请注意：以下有所变更的步骤，仅适用于本试剂盒。
另外，关于文库制备的详细操作步骤，请参考 illumina NexteraTM XT DNA 文库制备指导进行确认。
A. 双链 cDNA 的纯化(1) 请制备用于纯化步骤的 1/4 稀释过的 AMPure XP beads。
稀释时，请先将 AMPure XP beads 进行离心，上清液作为稀释液使用。
例) 8 个样品份的 1/4 稀释的 AMPure XP beads 的配制方法：a.

将 1×AMPure XP beads 220μL 静止于磁力架上，待磁珠完全吸附后，取出上清作为稀
释液使用。

b.

请将 a 步制备的上清 180μL 与 1×AMPure XP beads 60μL 充分混合，作为 1/4 稀释的
AMPure XP beads 进行使用。

(2) 请向 15μL 双链 cDNA 溶液中添加 1/4 稀释的 AMPure XP beads 27μL。然后进行离心、25℃、2,000rpm 离心后，请搅拌 2 分钟，静置 5 分钟。
(3) 将离心管或板置于磁力架上，直至溶液澄清。随后移除上清。
(4) 将离心管或板置于磁力架上，添加 80%乙醇 150μL、室温温育 30 秒。
(5) 去除乙醇。

-6-东洋纺（上海）生物科技有限公司(6) 继续将离心管或板置于磁力架上，添加 80%乙醇 150μL、室温温育 30 秒。
(7) 使用移液器，将乙醇完全去除。有乙醇残留时，请更换枪头，彻底吸净乙醇。
(8) 继续将离心管或板置于磁力架上，25℃放置 5 分钟，进行干燥＊。
* 如果乙醇有残留，可能会导致实验失败。请在磁珠开始龟裂之前进行干燥。请根据室温及湿度，调整干燥时间。
(9) 干燥的同时，用离心管配制溶解用试剂。请参考下表进行制备。
溶出用溶液
1 个反应(μL)
100 个反应(μL) ※Tagment DNA Buffer
2.5270(NexteraTM XT DNA Sample prep kit)
④Nuclease free water
1.25135Total※余量为 8%时

3.75405(10) 向 96 孔板或 8 连管中每管添加 3.75μL 溶解用试剂，离心。
(11) 在磁珠完全分散之前进行 Vortex 振荡，然后 25℃温育 5 分钟、离心。
(12) 将离心管或板置于磁力架上，静置 5 分钟直至溶液澄清。
(13) 请将 3.75μL 澄清的上清转移到离心管或板中，再进行下面的步骤。
B. Tagmentation（NexteraTM XT DNA 文库制备）(1) 向提纯的双链 cDNA 中每管添加 1.25μL Amplicon Tagment Buffer，离心后，请在以下温度条件下
进行温育。
Tagmentation 反应步骤Tagmentation

温度

时间55℃

5min.

10℃

holdC. 中和反应（NexteraTM XT DNA 文库制备）(1) 向 tagmentation 之后的双链 cDNA 中每管添加 1.25μL Neutralization Buffer。随后进行离心，在25℃条件下，2000rpm 混匀 1 分钟，随后静置 5 分钟。
D. library enrichment（NexteraTM XT DNA 文库制备）(1) 向中和的双链 cDNA 中每管添加 3.75μL NPM PCR Master Mix，进行离心。之后，向各管中分别
添加 Index primer(S5XX)和 Index primer(S7XX)各 1.25μL、离心。

-7-

(2) 离心后，请按以下循环条件进行 PCR。
步骤温度72℃时间3min.

Denature

95℃

30sec.

PCR

95℃
55℃72℃
72℃

10sec.
30sec.
30sec.

4℃

hold14 cycles＊5min.

＊请参考下表内容调整 PCR 循环条件。
Estimated amount of total RNA percell / total RNA amount>10pg

Typical Number of PCR Cycles
145-10pg
14-15＊RNA 量低于 5pg 时，可增加 PCR 循环数。
＊得到的文库量较多时，可减少 PCR 循环数。
E. 文库的纯化(1) 每 12.5μL PCR 溶液中请添加 15μL 1×AMPure XP beads。随后离心，25℃、2,000rpm 混匀 2 分
钟，然后静置 5 分钟。
(2) 将离心管或板置于磁力架上，直至溶液澄清。之后，去除上清。
(3) 将离心管或板置于磁力架上，然后添加 80%乙醇 150μL、室温温育 30 秒。
(4) 去除乙醇。
(5) 继续将离心管或板置于磁力架上，添加 80%乙醇 150μL、室温温育 30 秒。
(6) 使用移液器，将乙醇完全去除。
(7) 继续将离心管或板置于磁力架上，25℃放置 5 分钟，进行干燥＊。
* 如果乙醇有残留，则可能会导致实验失败。请在磁珠开始龟裂之前进行干燥。请根据室温及湿度，
调整干燥时间。
(8) 向 96 孔板或 8 连管中每管添加 24μL TE Buffer、离心。
(9) 在磁珠完全分散之前进行 Vortex 振荡，然后 25℃温育 5 分钟、离心。
(10) 将离心管或板置于磁力架上，静置 5 分钟直至溶液澄清。
(11) 将 24μL 澄清的上清液转移到离心管或板中，请进行 QC 操作或放于－20℃保存。

7. 文库的验证
A. 文库的定量
推荐使用 GenNext® NGS Library Quantification Kit(Code: NLQ-101)或同类市售商品进行 qPCR 定量。GenNext® NGS Library Quantification Kit 是 illumina NGS 测序仪用的文库定量试剂盒、适用于
illumina 采用的 P5、P7 adaptor 序列，可特异且正确地定量只与 Flow cell 结合的文库。

-8-东洋纺（上海）生物科技有限公司

B. 文库 size 分布的确认确认文库分布时，推荐使用 Bioanalyzer（Agilent・technology 株式会社）、MultiNA®（株式会社岛津
制作所）等平台进行电泳确认。
文库分布例
使用本试剂盒与 NexteraTM XT DNA 文库制备试剂盒(14cycle)，进行小鼠 ES 细胞的单细胞 NGS 文库制备时，如下图所示，已确认最终文库大约分布在 100bp~600bp 之内，得率大约为 10~20nM(溶于 24μL TE buffer)。

Size(bp)

8. 测序数据的确认推荐在分析测序数据之前先确认覆盖范围的均一性。本试剂盒可得到均一的覆盖范围，如下图所示。

-9-[5] 实验例1. 检测到的转录产物数量及各区域 alignment 比例的比较
＜方法＞
使用从 Mouse ES 细胞提取的 Total RNA 10pg，分别用 GenNext® RamDA-seqTM Single Cell Kit (Code:RMD-101)和 A 公司的试剂盒，同时制备 cDNA、双链 DNA 并进行 NGS 分析。使用 GenNext® RamDAseqTM Single Cell Kit 时使用了 NSR Primer Set for mouse(NSR-102)引物。GenNext® RamDA-seqTM
Single Cell Kit 因为无需扩增 cDNA，而 A 公司的试剂盒，则进行了 18 个循环的扩增。之后，使用Nextera XT DNA Library Preparation Kit 进行文库的制备、使用 illumina Miseq 进行测序。
＜结果＞

与 A 公司的试剂盒相比，GenNext® RamDA-seqTM Single Cell Kit 的检测量更多，可以检测到大约5,000 个转录产物。

2. 长链 RNA 全长性的比较＜方法＞
对实验例 1 得到的测序数据进行分析。

＜结果＞GenNext® RamDA-seqTM Single Cell Kit 可以在全长范围内检测到用 A 公司的试剂盒难以检测的
Neat1 及 Malat1 这样的 lncRNA。

- 10 -东洋纺（上海）生物科技有限公司[6] 常见问题
现象
得到的 cDNA 比较少

原因RNA 降解了对策・请确认 RNA 没有降解。
・请确认枪头及离心管没有 RNase 的污染。
・请在冰上进行细胞裂解与 RNA 稀释的操作。

文库得量比较少

纯化时有乙醇残留・洗涤磁珠时残留的乙醇会抑制后面的反应。请确保磁珠充分干燥。
・操作房间的湿度过高时，有时磁珠的干燥会比较困难。推荐操作房间的湿度在 55%以下。

[7] 相关产品
容量96 次份
24 次份

Code No.
RMD-201
RMD-201T

RamDA Cell Lysis Kit

1,152 次份RMD-301

NSR Primer Set for human96 次份

NSR-101

NSR Primer Set for mouse

96 次份NSR-102

内容Code No.

500 次份

NLQ-101

产品名称Realtime PCR 分析用 cDNA 制备试剂盒
RT-RamDATM cDNA synthesis Kit

产品名称Illumina 公司 NGS 测序用文库定量试剂盒GenNext® NGS Library Quantification Kit[8] 参考文献
1. Hayashi .T et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive
splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9：619(2018)- 11 -<销售商>东洋纺（上海）生物科技有限公司
邮编：200122
邮箱：tech@bio-toyobo.cn
网址：http://www.bio-toyobo.cn
联系电话：021-58794900
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