第「qPCR」

第1章

目录

1-1

è 按用途分类的产品流程图

1-2è 关于荧光定量 PCR

1-4

è 二代测序相关问题

1-7

1章
荧
光
定
量
P
C
R

è qPCR
THUNDERBIRD® Probe One-step qRT-PCR Kit

RNA-direct ™ Realtime PCR Master Mix 系列
KOD SYBR® qPCR Mix
THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR 系列
THUNDERBIRD® qPCR 系列
Realtime PCR Master Mix 系列
è NGS 相关

1-8
1-12
1-13
1-17
1-19
1-21

GenNext® NGS Library Quantiﬁcation Kit

1-22

GenNext® NGS Library Prep Kit

1-24

GenNext RamDA-seq™ Single Cell Kit

1-26

®

INDEX

1-1

第

1章

「qPCR」{ 按用途分类的产品流程图 }

荧
光
定
量
P
C
R

提纯 RNA

培养细胞

cDNA 合成试剂盒荧光定量 PCR 用 cDNA 合成试剂盒è (3-8 页)

1-step Realtime PCR 试剂盒

THUNDERBIRD® Probe One-step qRT-PCR Kit
è (1-8 页)

RNA-direct TM Realtime PCR Master Mix 系列
è (1-12 页)【TaqMan® 探针用】

・RNA-direct TM Realtime PCR Master Mix【SYBR® Green 染料用】

・RNA-direct TM SYBR® Green Realtime PCR
Master Mix从培养细胞开始高效合成 cDNA

• SuperPrep ® Ⅱ Cell Lysis & RT Kit for qPCR
（RT Reagent）è (3-5 页)・ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover・ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
・ReverTra Ace® qPCR RT Kit

针对困难靶标（高 GC、长链）以及临床样品等困难模板。
高效率 Realtime PCR
试剂盒 （高 GC 含量・长链・粗样本）・KOD SYBR® qPCR Mix
è (1-13 页)

在通用条件下进行高性能、
准确的定量。

高效率 Realtime PCR 试剂盒（性能＋性价比）

THUNDERBIRD® Next qPCR Mix 系列 è (1-17 页)

THUNDERBIRD® qPCR Mix 系列 è (1-19 页)【TaqMan® 探针用】
新产品

THUNDERBIRD® Next Probe qPCR Mix・THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix

新产品

THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix・THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix【SYBR® Green 染料用】

高效率 Realtime PCR 试剂盒（性能稳定可靠）

Realtime PCR Master Mix 系列 è (1-21 页)【TaqMan® 探针用】

・Realtime PCR Master Mix【SYBR® Green 染料用】

・SYBR® Green Realtime PCR Master Mix・SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus-

1-2

「NGS」{ 按用途分类的产品流程图 }微量 RNA单细胞

微量 RNA/ 单细胞 cDNA 合成试剂盒
GenNext RamDA-seq™ Single Cell Kit®

è (1-26 页)【NGS 用】

・GenNext® RamDA-seq™ Single Cell Kit

常规 DNA/RNA高效多重 PCR/cDNA 合成

荧
光
定
量
P
C
R

・KOD -Multi & Epi-® è (2-26 页)・ReverTra Ace -α-® è (3-12 页)【qPCR 用】

・RT-RamDA™ cDNA Synthesis Kit【单细胞裂解液】

・RamDA Cell Lysis Kit

Illumina 平台二代测序用文库构建试剂盒・GenNext® NGS Library Prep Kit
è (1-24 页)高效率 Realtime PCR 预混液

THUNDERBIRD® Next qPCR Mix 系列

THUNDERBIRD® qPCR Mix 系列
Realtime PCR Master Mix 系列
KOD SYBR® qPCR Mix

Illumina 平台二代测序用文库定量剂盒

GenNext® NGS Library Quantification Kit è (1-20 页)

1-3

1

关于荧光定量 PCR
1. 关于荧光定量 PCR 的检测方法

荧
光
定
量
P
C
R

2. 引物设计方法

1-4

荧
光
定
量
P
C
R

3. 相对定量的方法

1-5

4. 用普通的荧光定量 PCR 难以检测的目的片段及样品的解决方法
荧
光
定
量
P
C
R

1-6

1-13

二代测序相关问题

2
NGS 简介基因测序技术通过在分子水平解读生物遗传信息，为解答基础研究、农业、环境、医学健康等领域最具挑战性的问题提供帮助。第二代测序（Next Generation Sequencing）因其高通量、低成本的特点，应用前景广泛，大致包括基因组测序、转录组测序、外显子测序、靶向测序等。虽然种类繁多，上机前的主要流程大致可分为以下几个步骤：
LPK-101
前处理Library制备

NLQ-101
Library
定量

Sequencing

数据分析1）样本前处理

与下一代单分子测序技术不同，NGS 测序仪可接受的文库形态比较固定，一般为较短的 DNA 片段，并且两端有固定

荧
光
定
量
P
C
R

的接头序列。相比之下，起始样本的种类要丰富得多，可以是实际样本中分离纯化的 DNA/RNA，也可以是探针捕获序列

或 PCR 产物等。对于平均长度较短的样本，可直接用于文库构建，而序列较长的模板则需要提前打断成合适大小的片段。
多重 PCR 是样品前处理的重要方式，常见于 SNP 检测、靶向测序等的序列扩增环节。专用的 KOD -Multi & Epi-® 高

保真 PCR 聚合酶能保证各靶序列均一扩增，从源头保证测序的准确性。

对于 RNA 样本，第一步需要通过逆转录酶转化为 cDNA，传统的转录组测序方法难以保证全长覆盖的均一性，在以单细胞或微量 RNA 为样本时尤为突出。GenNext® RamDA-seq™ Single Cell Kit 借助 RT-RamDA 全转录组扩增技术，可以实现从 RNA 直接扩增出足量的 cDNA，再结合优化后的 NSR 引物有效抑制 rRNA 的扩增，得到的 cDNA 可进行高质量的文库构建。相比传统使用 Oligo dT 为逆转录引物的技术，RT-RamDA 无需 PCR 即可实现 10 倍以上的 cDNA 得率，同时将偏差降到最低，对于较长的 RNA 片段保持与常规转录本一致的测序成功率。
2) DNA 文库制备以 Illumina 平台为例，前处理后的样品大致需要经过补齐末端、加 'A'、连接测序接头 (Adapter) 等步骤以构建文库。由于涉及的反应较多，以往试剂盒包含的试剂种类繁多，操作步骤冗长，建库效率较低，GenNext ®

NGS Library Prep Kit 整合了末端修复和加 'A' 过程，精简组分的同时缩短了操作时间，文库得率也大大提高。

针对低起始量的文库，有必要通过 PCR 增加文库产量，由此可能造成的扩增偏差会直接影响最终的测序结果。此外，在连接测序接头以及 PCR 扩增之后通常需

要使用磁珠进行产物纯化，一方面降低体系对下游实验的影响，另一方面也对片段大小进行筛选。

RNA 建库技术的比较3) 文库上机前定量

文库上机量过高或过低都有可能导致测序失败，因此上机前进行准确定量很重要，实时荧光定量 PCR 是应用较为广泛的方法之一。主要原理是，以测序接头上特异的 P5、P7 序列为引物，通过已知浓度的系列标准品对待测文库进行

绝对定量，从而精确计算出有效片段的浓度，也即排除了两端测序接头不完整的 DNA 片段。该方法结果精确，重复性好，很适合高通量操作。

定量前需要对文库按恰当的比例进行稀释，得到标准曲线和

待测样品的 Ct 值，然后根据公式计算出初始文库的 mole 浓度。

我司产品 GenNext® NGS Library Quantification Kit 包含了定量引物及 6 个浓度的标准品，无需额外试剂即可完成定量操作。同时
采用了高效率的 KOD SYBR® qPCR Mix，能够应对高 GC、长片
段这种难扩增的序列，保证了定量结果的准确性和可重复性。

1-7

qPCR

NGS

最适用于 RNA 病毒等迅速 • 高灵敏度的定量！
高效率 One Step qRT-PCR Kit

THUNDERBIRD® Probe One-Step qRT-PCR Kit
20次份 *
100次份 *

Code: QRZ-101S
Code: QRZ-101

荧
光
定
量
P
C
R

￥500
￥2,400产品内容：<QRZ-101>

本试剂盒是使用了高效逆转录酶
ReverTra Ace 和 PCR 酶 Tth
DNA Polymerase 的 2 酶体系一
步法荧光定量 PCR 试剂盒。主要用于使用 TaqMan ® 分析法的荧光定量 PCR。

2×Reaction Buffer
1.25ml×2 支
DNA Polymerase
125μl×1 支
125μl×1 支
RT Enzyme Mix
50×ROX Reference dye**
100μl×1 支
RNase free Water
1.25ml×2 支* 表示的是 50μl 反应体系时的使用次数。

è特 征迅速 • 高灵敏度通过使用 TaqMan® 探针一步法 qRT-PCR, 能够对微量 RNA 进行迅速、高灵敏度的检测。

降低了序列偏差性

不受目的基因序列影响，可高灵敏度地检测各种 RNA，把多重荧光检测中各目的
片段扩增的偏差性抑制到最低。

对 PCR 抑制物的抗性

能够降低血红素等 RNA 中混入杂质而引起的抑制作用。

使用 dUTP**ROX 溶液另外添附，可以适用于所有市
售的荧光定量 PCR 仪。
保存：
-20℃

备注：

LightCycler® 是 Idaho Technology Inc. 的商标。
TaqMan ® 是 Roche Molecular Systems
Inc. 的注册商标。

可通过添加 UNG，防止因 carryover 污染导致的假阳性。
* 本试剂盒中不含 UNG。

è 用 途 : 荧光定量 PCRè说 明本试剂盒是使用了高效率逆转录酶 ReverTra Ace® 和 PCR 酶 Tth DNA Polymerase
的两酶一步法荧光定量 PCR 试剂盒。主要用于 TaqMan 分析法的荧光定量 PCR。

1-8

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

URL: http://www.bio-toyobo.cn

㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌεNGS由于逆转录反应与 PCR 在同一反应体系中连续进行，反应液的分装操作只需一次
即可完成，适用于高通量分析。
此外，还降低了样品间交叉污染的危险性。
本产品通过将两种酶与最优化的 buffer 相组合，可以对微量 RNA 进行迅速定量。
适用于对 RNA 病毒及低表达量 mRNA 的定量。同时，不易受目的基因序列的影响，
可高灵敏度地检出各种 RNA。

qPCR

基本反应条件：反应液组成试剂
RNase free Water
2×Reaction Buffer
DNA Polymerase
RT Enzyme Mix
Forward Primer
Reverse Primer
TaqMan® probe
50×ROX Reference dye(Uracil-N-Glycosylase
RNA 溶液
总体积

*1

Xμl
25μl
1.25μl
1.25μl25pmol25pmol10pmol1/0.1μl
1Unit*1)Yμl
50μl

进行 Uracil-N-Glycosylase(UNG) 处理时，请使用热敏性 UNG(heat-labile)。
可根据各公司推荐的条件，调整酶的用
量。

Cycle
(20~25℃ ,10min.*2)
50℃ ,
95℃ ,
95℃ ,
60℃ ,

è 结果示例肠道病毒 RNA 的高灵敏度检测将肠道病毒 RNA 作 4 倍稀释，使用 TaqMan 探针法，与其他公司的产品进行检测灵敏度 •定量性的比较。引物、TaqMan® 探针直接使用了论文记载的序列（未进行优化处理）。
用 ABI 的 StepOne PlusTM 进行分析。
结果可见，只有在使用本试剂的情况下，才能检测出 10 个拷贝数以下的 RNA, 因此可得
到更广的可定量扩增区域。
因此，本试剂盒对 RNA 病毒及低表达量的 mRNA 检测 • 定量非常有效。

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901®

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

URL: http://www.bio-toyobo.cn*2

10min.
1min.
15sec.
45sec.

荧
光
定
量
P
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R

40~45 cycles

进行 UNG 处理时，请在逆转录反应前设定 UNG 反应的步骤。上述表示的是
通常的温度条件及反应时间，请根据各公司推荐的条件进行适当调整。

㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

1-9

qPCR

NGS

各种病毒检测灵敏度的比较

配制 11 种病毒 RNA 的 4 倍稀释系列溶液，使用 TaqMan ® 探针法，进行最高检测灵敏度的比较。

引物、TaqMan® 探针直接使用论文记载。
使用 ABI 的 StepOne PlusTM 进行检测。

右图是将各试剂能检测到的最低拷贝数连线作成的。

结果显示，只有在用本试剂盒的情况下，
才能对所有的目的基因 30 个拷贝以下

荧
光
定
量
P
C
R

1-10

的灵敏度进行检测及定量。本实验表明，
本产品不受目的片段序列的影响，能高灵敏度地检测到各种 RNA。

多重荧光检测（Multiplex）体系中的表达定量

使用 3 种荧光染料标记的 TaqMan ® 探针，分别进行单独检测及通过多重荧光检测体系一次性使用 3 种 TaqMan® 探针进行检测，分析 IL-1β、TNF-α、GAPDH 基因的表达量。
实 验 中 以 HeLa S3 RNA (1pg~100ng 的 10 倍 稀 释 [6 个 梯 度 ]) 为 样 品， 用 Roche
Diagnositics 公司的 LightCycler® 96 进行分析。
结果显示，各基因单独检测（Singleplex） ( 图 1) 与使用 3 通道的多重荧光检测（Multiplex）（图 2）得到了相同的灵敏度，PCR 效率及相关系数并没有太大的差异（表 1）。

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

NGS

qPCR

使用临床检测样本的 RS 病毒 A 型、B 型的同时定量

使 用 从 20 个 检 测 样 本 中 的 咽 喉 粘 液 中 抽 提 的 RNA 样 品， 用 RT-PCR 法 及 使 用
THUNDERBIRD® One-step qRT-PCR Kit 的 qRT-PCR 法进行 RS 病毒的检测。
另外，同时与用抗体检测方法进行分析的结果进行比较。
为了判别 RS 病毒的 A 型和 B 型，使用特异性引物及各种不同荧光标记的 TaqMan® 探针，
用 qRT-PCR 进行定量分析。
分析使用了 Roche Diagnositics 公司的 LightCycler® 96。结果显示，在抗体检测法中判
定为假阴性的检测体，用 PCR 法可以高相关性地判定有无感染，且类型判定结果完全
一致。

荧
光
定
量
P
C
R

è 相关产品简便的掺入法 One-step Realtime PCR 用试剂

RNA-direct SYBR® Realtime PCR Master Mix

RNA 配制相关器具

QRT-201

Magical Trapper

MGS-101

MagExtractor™ -Viral RNA-

NPK-401F

MagExtractor™ -RNA-

NPK-201F

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FAX: 021-5879-4901

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0.5ml×5 支
1个

100 次

100 次

URL: http://www.bio-toyobo.cn¥2,000¥1,000¥1,600¥2,600→ 1-12 页→ 5-11 页→ 5-8 页→ 5-6 页㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

1-11

qPCR

NGS

单酶 • 一步法 迅速、高性能的 Realtime PCR 试剂盒。

RNA-direct Realtime PCR Master Mix 系列

One Step qRT-PCR Kit

RNA-direct Realtime PCR Master Mix
Code: QRT-101

荧
光
定
量
P
C
R

0.5ml× 5支￥2,000RNA-direct SYBR® Realtime PCR Master Mix
Code: QRT-201￥2,000产品内容：<QRT-101,QRT-201>
Master Mix
0.5ml×5 支
50mM Mn(OAc)2
0.5ml×1 支(50μl 反应体系可用 100 次，20μl 反应体
系可用 250 次 )本酶是以 rTth DNA polymerase为基础开发的单酶一步法 2 ×
Master Mix。直接以 RNA 为模
板，可在单管中进行高效率的
Realtime PCR 分析。

保存：-20℃ ( 避光保存 )备注：LightCycler® 是 Idaho Technology Inc. 的
注册商标。
SYBR® 是Molecular Probes Inc.的注册商标。
TaqMan ® 是 Roche Molecular Systems
Inc. 的注册商标。
ABI PRISM® 是 Applied Biosystems Inc.
的注册商标。

è特 征一步法 • 高通量

以 RNA 为模板，可在单管中进行高效率的 Realtime PCR 分析，快速方便，非常适用于高通量反应。

网络版追加信息：• 简要备注• 实验例为了控制非特异性反应，采用了中和抗体的热启动法。

基本反应条件：高特异性<SYBR® Green I Assay>广泛的应用性可用于 Probe Assay 和 SYBR® Green Assay 等方法。

高通用性（可用于各种仪器）因产品中已添加了 Passive Reference，因此可用于需要校正荧光信号的仪器（如Applied Biosystem 公司的 ABI PRISM® 7700 等）。
可应用于使用 Glass Capillary 分析体系的仪器（如 Roche 公司的 LightCycler® 等）。

可应用于易形成高级结构的 RNA 和高 GC 含量的目的片段

由于本试剂盒可以在高温下进行逆转录反应，因此可以应用于易形成高级结构的模板 RNA。而且因为 Tth DNA Polymerase 对高 GC 含量的序列扩增有效，因此也适用于对高 GC 含量目的片段的检测。

è 用 途 : 荧光定量 PCR

由于 Tth DNA Polymerase 在 Mn2+ 存在的情况，显示出独特的逆转录活性，因此使用该酶可在同一离心管连续进行 cDNA 合成反应和 PCR。本试剂是利用该特性开 发 而 成 的「 单 酶 • 一 步 法」Realtime PCR 试 剂， 与 在 同 一 反 应 体 系 内 使 用
RTase 和 Taq DNA Polymerase 的「双酶 • 一步法」系列试剂相比，由于用单酶反应更容易设定最佳条件，因此能进行高效率的分析。

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

使用 PRISM®7900HT(Applied Biosystems)
灭菌水Xμl
Master Mix
25μl
50mM Mn(OAc)2
2.5μl
各引物
10pmoles eachRNA 样品<1μg
Total Volume
50μl
Cycle
90℃ ,
61℃
95℃
95℃
55~65℃
74℃

è说 明

1-12

0.5ml× 5支

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

URL: http://www.bio-toyobo.cn↓↓

30sec.
20min.
60sec.
15sec.
15sec.
45sec.

45cycles※ 退 火 温 度 请 根 据 引 物 的 Tm 值 在
55~65℃之间调整。
※ 扩增片段最大如在 200bp 左右，则延伸反应的时间为 45sec. 也没有问题。

㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

NGS

qPCR

最适用于融解曲线分析的多重 PCR。
高效率荧光定量 PCR Master Mix

KOD SYBR® qPCR Mix

KOD SYBR® qPCR Mix
Code: QKD-201T
Code: QKD-201

KOD SYBR® qPCR Mix 是使用 KOD DNA polymerase(KOD) 的 SYBR®
Green I 检测体系的荧光定量 PCR 用 Master Mix。通过将去除了 3’→ 5’
核酸外切酶活性（校正活性）的 KOD exo(-) DNA polymerase 与优化过的 buffer 相组合，最大程度地发挥了 KOD 出色的合成性能和不易受粗样
品成分抑制的特性，可稳定地用于各种用途的荧光定量 PCR 检测分析。

è特 征适用于高 GC 含量的目的片段用以往的产品难以扩增的 GC 含量超过 70% 的目的片段，也能确认到定量的扩增。
IGF2R（GC 含量：83％、模板：cDNA）

1ml× 1支
1.67ml× 3支
产品内容：

￥500
￥2,450<QKD-201T>
qPCR Mix
1ml×1 支50×ROX reference dye
50μl(50μl 反应体系可使用 40 次，20μl 反应
体系可使用 100 次）<QKD-201>qPCR Mix
1.67ml×3 支
50×ROX reference dye
250μl(50μl 反应体系可使用 200 次，20μl 反应
体系可使用 500 次）

荧
光
定
量
P
C
R

保存：

-20℃ ( 避光保存 )※ 在短时间 (3 个月以内 ) 使用完毕的情况下，可在 2~8℃避光保存。
参考文献：

1） R.M.de Breuil et al.,PCR
Methods Appl.,3:57-59 (1993)
2） P.M.Holland et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 88:7276-7280.(1991)

图 1. 针对于 GC-rich 目的片段的荧光定量 PCR（使用 ABI StepOne Plus™）

针对于 GC 含量超过 70% 的目的片段，用各种荧光定量 PCR 试剂进行反应性能的比较。模板用了本公司高性能逆转录反应试剂 [ReverTra Ace® qPCR RT Kit(Code No.FSQ-101)] 合成的 HeLa 细胞 total RNA 来源的 cDNA，对 cDNA 作 5
倍稀释（5 个梯度）进行反应。结果显示，用本公司以往产品难以扩增的高 GC 含量的目的片段也可以得到定量的扩增。
另外，由于其高特异性及不易产生引物二聚体的特性，拷贝数较低时也能够进行定量，因此可用于更广的可定量扩增区域。

备注：LightCycler® 是 Idaho Technology Inc. 的
注册商标。

SYBR® 是Molecular Probes Inc.的注册商标。

Homo sapiens telomerase RNA(TR) gene 的启动子区域（GC 含量：64%、扩增长度：219bp）

CCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGGCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCT
TTATAAGCCGACTCGCCCGGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCATTTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTT

图 2. 针对于 GC 含量有偏差的启动子区域的荧光定量 PCR（使用 ABI StepOne Plus™）
已确认本试剂也适用于易形成二级结构的目的片段。

适用于长链目的片段（～ 2kb）

针对于 KOD FX 及 KOD -Plus- 系列等一般 PCR 设计的引物可以直接使用。由于
长链目的片段也可以扩增，因此可极大地扩大引物的选择范围。

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

URL: http://www.bio-toyobo.cn

㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

1-13

qPCR

NGS

基本反应条件：< 掺入法 >

灭菌水qPCR Mix
Forward Primer
Reverse Primer
50×ROX reference dye
DNA 样品
Total Volume

荧
光
定
量
P
C
R

图 3. 针对长链目的片段的荧光定量 PCR（使用 ABI StepOne Plus™）

使用能够用 KOD FX 系列及 KOD -Plus- 系列扩增的引物，对约 2kb 目的片段进行扩增。结果显示，用以往使用 Taq
DNA polymerase 的试剂难以扩增的约 2kb 的目的片段，用本产品也可以进行定量的扩增。

由于能够选择长至 2kb 的各种长度的目的片段，因此可以在很广的范围内进行融解曲线分析。因为可以避开产生引物二聚体的区域（短链区域）进行扩增，所以在用
endpoint assay 法进行多态性分析及多重 PCR 分析方面非常有利。

Xμl
10μl
4pmoles
4pmoles0.4/0.04μl*
Yμl
20μl

*50×ROX reference dye， 是 对 于 使 用
Passive Reference 的仪器 ( 如 Applied
Biosystems 公司制造的仪器等 )，为校正
各孔间的荧光强度及分注误差而使用。最适 添 加 量 根 据 仪 器 不 同 而 不 同。 不 用
Passive Reference 进行校正的仪器无需
添加。
Cycle
98℃,
98℃ ,
60℃ *1,68℃ ,↓120sec.
10sec.
10sec.
30sec./500bp

40cycles*1 : 退火温度请设定在 50 ～ 68℃范围之间。

图 4. 使用扩增长度不同的目的片段进行分析（使用 ABI 7500）

以人基因组 DNA 为模板对 β-actin 基因上不同长度的目的片段进行扩增，并进行融解曲线分析。结果表明，可得到从
60bp~ 约 1kb 范围内的扩增产物，且在 74 ～ 87℃的范围内可识别出本次扩增的 PCR 产物。因此，就可通过设计引物来改变扩增片段长度使融解温度产生差异，从而使在单管中进行多目的片段检测成为可能。这种融解曲线的差异虽然会受
GC 含量的影响，但是可以通过计算扩增产物的 Tm 值来进行预测。

可使用粗样品进行分析※ 目的序列在 500bp 以下时延伸时间 30
秒就可以充分进行反应，但是有一部分仪器在检测稳定的荧光时，需要的时间
要大于 30 秒。扩增曲线散乱或各孔的差异较大时，请设定较长的延伸时间
（45 ～ 60 秒）。

可直接对植物裂解液、鼠尾碱裂解液、血液等粗样品进行检测。应用 SYBR ®
Green I 分析体系，能够使复杂的多态性分析及 SNP 分析简单化。
①使用扩增长度多态性进行基因分型
只需通过设计引物来改变 2 个扩增产物的长度，从而使得 Tm 值产生差异，就可在同一离心管里进行小鼠的基因分型（参照前述特征）。

图 5. 应用融解曲线分析在单管中进行小鼠基因分型（使用 ABI 7500）

使用鼠尾的碱裂解液在同一离心管中进行了基因分型。通过改变 WT 特异性扩增产物和 knock-in 特异性扩增产物的片段
长度，在计算上，将引物设计为使扩增产物的 Tm 值产生差异。WT 特异性引物相对于 CreER knock-in，因其扩增长度更长，30 秒的延伸时间太短，所以无法扩增。另外，为了在杂合子检测中使各个基因型的峰值比例比较均衡，可将 WT特异性引物：knock-in 特异性引物 =1:3， 检测结果显示，所有种类均成功地进行了基因分型。

②使用 ASP(Allele specific primer)-PCR 进行 SNP(Single nucleotide polymorphism)分析
将一条引物的 5' 末端加上 GC tail，就可以通过融解曲线分析法识别相同的目的基因，可应用于各种原理的 ASP-PCR。如下所示，从引物 3' 端开始，将第二个碱基设计为 SNP 位点，第三个碱基设计为错配位点，进行分析。

1-14

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

NGS

qPCR

荧
光
定
量
P
C
R

图 6. 血液及口腔粘膜的检测（使用 ABI 7500 Fast）（A）所示的是用于 ALDH2 SNP 检测的引物。为了能在同一离心管中识别出基因型，引物设计时，在一边等位基因特异
性引物上加上了 GC tail( 下划线部分 )，使扩增产物的融解温度（Tm 值）产生差异。为了通过添加 GC tail 使得融解
温度大幅上升，可将扩增片段长度设计为 100bp 以下。另外，在本实验中，将等位基因特异性引物从 3’末端开始
的第二个碱基设计为 SNP 位点（红色），第三个碱基设计为错配位点（绿色）。
（B）分别取 5μl 血液的水稀释液及口腔粘膜的悬浊液添加到 20μl 反应体系中进行检测。其结果可判断基因型。

③粗样品中目的片段的扩增
用以往使用 Taq DNA polymerase 的荧光定量 PCR 试剂难以扩增的粗样品也可以
用本试剂进行分析。

图 7. 粗样品的荧光定量 PCR 检测（使用 ABI 7500）（A）使用一步法配制的水稻叶裂解液及纯化 DNA，对本公司以往产品和本产品进行了比较实验。结果显示，使用本产品的情况下，用裂解液确认到了特异性扩增，而用使用 Taq DNA polymerase 的以往产品则无法确认到特异性扩增。
（B）对长度为 1.3kb 的目的片段进行了扩增。结果显示，使用本产品的情况下，裂解液样品也可以确认到特异性扩增。

高特异性

由于抑制了引物二聚体等非特异性反应，因此在低拷贝区域也能够进行定量，可得到更广的可定量扩增区域。另外，将本产品与本公司荧光定量 PCR 专用 cDNA 合成试剂盒 [ReverTraAce® qPCR RT 系列 ] 组合使用，可更稳定地进行检测。

图 8. 与其他公司荧光定量 PCR 试剂的反应特异性比较。（使用 ABI StepOnePlus™）对容易产生引物二聚体的目的片段进行荧光定量 PCR。结果显示，使用本产品的情况下，即便是低拷贝数样品及no-template control(NTC) 引物二聚体也都得到了很好的抑制。

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

1-15

qPCR

NGS

适用于各种仪器

本产品除适用于普通及高速的模块型（Block type）仪器外，还适用于使用玻璃毛细
管（Glass Capillary Type）的高速循环仪。由于 50× ROX reference dye 单独添附 ,对于需要 passive reference 的仪器，可根据各仪器的特征把 ROX 调整到最适浓度。

荧
光
定
量
P
C
R

è 用 途 : 荧光定量 PCRè说 明

KOD SYBR® qPCR Mix 是使用 SYBR® Green I 检测体系的荧光定量 PCR 用 2×
浓度的 Master Mix 试剂。本试剂将除了 ROX( 另外添附 ) 与引物以外的成分预先
混合，因此，反应液的配制非常简单，并且将各样品间荧光强度的偏差抑制在最小范围内，可得到重复性很高的结果。
本 产 品 将 去 除 了 3' → 5' 核 酸 外 切 酶 活 性（ 校 正 活 性） 的 KOD exo(-) DNA
polymerase 与最适化的 buffer 相组合，在使用 SYBR® Green I 的分析检测中，可以最大限度地发挥 KOD 出色的合成能力及不易受粗样品成分抑制的特性。

è 注意事项
保存条件

经确认本产品反复冻融 10 次对品质没有影响。

引物设计

参照 1-4 页引物设计方法。

逆转录反应液的加入量

将普通逆转录试剂合成的 cDNA，无需纯化，用灭菌水等稀释后可直接添加到
Realtime PCR 反应液中。添加量不应超过总反应体系的 10%。而使用本公司
ReverTra Ace® qPCR RT Kit (Code:FSQ-101)、ReverTra Ace® qPCR RT MasterMix (Code:FSQ-201)、ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code:FSQ-301) ( → 3-8 页 ) 时，则最多可带入总反应体系 20% 的量。

è 相关产品Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂盒

ReverTra Ace® qPCR RT Kit
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover

1-16

TEL: 021-5879-4900

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FSQ-101
FSQ-201
FSQ-301

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200 次份
200 次份
200 次份

URL: http://www.bio-toyobo.cn￥1,500￥2,000￥2,800→ 3-10 页→ 3-8 页→ 3-8 页㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

NGS

qPCR

新一代 THUNDERBIRD 荧光定量 Mix，更快、更准、更方便！
高效率荧光定量 PCR Master Mix

THUNDERBIRD® Next qPCR Mix 系列
g soonTHUNDERBIRD® Next Probe qPCR Mix Comin
Code: QPX-101T
Code: QPX-101

1ml× 1支
1.67ml× 3支￥325￥1,500

THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix
Code: QPX-201T
Code: QPX-201

1ml× 1支
1.67ml× 3支产品内容：<QPX-101T, QPX-201T>
qPCR Mix*(50μl 反应体系使用 40 次 )本品是基于 THUNDERBIRD qPCR
Mix (Code No. QPS-101、QPS-201)
进 行 组 分 改 良 后 的 高 效 率 Realtime
PCR 用 Master Mix（2 x 浓度），相比原产品进一步提高了反应特异性和
PCR 效 率， 且 内 含 通 用 规 格 的
passive reference dye 以及提高可视
性的蓝色染料，使用更加便捷。
®

￥325￥1,500
1ml×1 支<QPX-101, QPX-201>
qPCR Mix*
1.67ml×3 支(50μl 反应体系使用 200 次 )* 含有 passive reference dye 可兼容不同
qPCR 仪器。蓝色染料只作为加样辅助，不影响定量效果。

è特 征

荧
光
定
量
P
C
R

保存：

更高的特异性通过优化组分从而降低非特异性反应，进一步提高了低拷贝样本检测时的准确度。

更广的可定量扩增区域

通过高效且特异的扩增，可在更广的测定范围进行分析。

可进行高速 PCR 循环-20℃ ( 避光保存 )※ 在短时间 (3 个月以内 ) 使用完毕的情况下，可在 2~8℃避光保存。
已确认反复冻融 10 次不会影响定量效果。
备注：由于扩增效率高、快速循环条件下也可高效扩增。

高速热启动

采用抗体法热启动的方式，通过加热使抗体迅速失活并释放 DNA 聚合酶活性，所以可设置较短的预变性时间。

SYBR® 是 Molecular Probes Inc. 的注册商标。
TaqMan ® 是 Roche Molecular Systems
Inc. 的注册商标。

可均一地检测各种目的片段

使用了新的反应增强剂。将因目的片段不同而导致的 PCR 效率的误差抑制到了最低、可定量长至 500bp 的片段。

可使用 UNG（防污染）本 产 品 组 分 中 含 有 dUTP。 通 过 添 加 Uracil-N-Glycosylase(UNG)*， 可 防 止carryover 污染导致的假阳性。
* 本产品中不含有 UNG。请使用另外销售的 Uracil-DNA Glycosylase(UNG),
Heat-labile(Code No. UNG-101)。

含有蓝色染料（视觉辅助）

本产品组分中含有蓝色染料。
分装之后的孔呈蓝色，可以减少分装差错。
* 蓝色染料对 qPCR 反应及荧光信号无影响。

适用于各种仪器

除了一般的模块型仪器外，还可用于玻璃毛细管型高速循环仪。另外，本产品的组
分中含有 passive reference dye，所以需要 passive reference 的仪器 ( 如：Applied
Biosystems 公司的仪器、Agilent Technologies 公司的仪器等 ) 无需再添加 ROX。
[ 适用仪器例 ]:Applied Biosystems

Roche Diagnostics
Bio-Rad/MJ
TaKaRaQIAGEN
BioFlux

7300 / 7500 / 7500 Fast / StepOne™ / StepOnePlus™
ViiA™ 7 / QuantStudio®
LightCycler® 1. x / 2.0 / Nano / 96 / 480
MiniOpticon™ / CFX96 Touch
Dice / DiceII / Dice Lite / Dice III
Rotor-Gene Q
Line Gene

è 用 途 : 荧光定量 PCR

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FAX: 021-5879-4901

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

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1-17

qPCR

NGS

è 结果示例检出率︵ ︶%SYBR® Green Ⅰ检测体系 1 个拷贝的扩增确认扩增 1 个拷贝的目的片段时，可认为 1 个拷贝的检测数与泊松分布的设定检测数相同。
根据泊松分布计算出的理论值
泊松分布的理论值中，0 拷贝
数 的 概 率 为 37%、1 个 以 上
THUNDERBIRD® Next
检测1个拷贝的扩增
拷贝数的概率为 63%。
因此，使用 THUNDERBIRD®
未检出
检出
（0拷贝）
（1个以上拷贝）Next SYBR® qPCR Mix，以稀释的 1 个拷贝的沙门氏菌基因组为模板，N=96 进行检测。结果显示，未检测出的为 38.5%，检测出的为 61.5%，与根据泊松分布推测的检出率相同，这表明检测到了 1 个拷贝相当的模板。

荧
光
定
量
P
C
R

扩增效率

100 ～ 500bp 长度范围目的片段的扩增
以人工合成的基因为模板，Forward 引物为共用引物，设计扩增长物为 100bp、200bp、300bp、400bp 及 500bp 的 Reverse 引 物。 使 用 这 些 引 物， 分 别 用
THUNDERBIRD® NextSYBR ® qPCR Mix 及各公司
THUNDERBIRD® Next
Realtime PCR 试 剂 进 行
A公司Realtime PCR试剂
107~101 拷贝的扩增，比较各
B公司Realtime PCR试剂扩增长度的 PCR 效率。结果
C公司Realtime PCR试剂
显示，用其他公司的产品时扩
D公司Realtime PCR试剂增效率低下或不能检测的*Realtime PCR按各公司推荐条件
400bp 以上的目的片段，使用
进行反应。
扩增长度
本产品检测时也未见扩增效率低下。
体系配制过程中 PCR 反应液的稳定性
PCR 反应液中加入引物、模板（HeLa 细胞 total RNA 来源的 cDNA），室温避光温
育 48 小时后，进行目的片段的扩增。结果显示，使用本公司原产品及其他公司的产品，
室温放置后得到的 Ct 值出现了延迟，但是使用 THUNDERBIRD ® Next SYBR ®
qPCR Mix 扩增时，即使室温放置 48 小时处理后也显示出稳定的性能。黄色标记表示△ Ct 在 0.5 以上。
THUNDERBIRD Next SYBR qPCR Mix®

Ct值（新制备的） Ct值（48hr后）

目的片段

目的片段

®

D公司Realtime PCR试剂

Ct值（新制备的） Ct值（48hr后）

△Ct

目的片段

△Ct

目的片段

本公司原来的产品Ct值（新制备的） Ct值（48hr后）

F公司Realtime PCR试剂
Ct值（新制备的） Ct值（48hr后）

基本反应条件：<SYBR® Green I Assay>灭菌水qPCR Mix
Forward Primer
Reverse Primer
UNG [Code No. UNG-101]
DNA 样品
Total Volume(UNG* 反应：20 ～ 25℃ 10min.)

Xμl
10μl
6pmoles
6pmoles
0.4U*
Yμl
20μl

* 请先确认仪器是否允许设置为 10 秒。

条件以另外销售的 Uracil-DNA
Glycosylase(UNG),Heat-labile [Code No.
UNG-101] 为例。
Cycle<2 步法 PCR · 快速循环 >95℃,
30sec.
↓
95℃ ,
3sec.
60℃ ,
10sec.*
40cycles* 请先确认仪器是否允许设置为 10 秒。
<2 步法 PCR · 常规循环 >95℃,
30sec.
↓
95℃ ,
5sec.
60℃ ,
30sec.*
40cycles<3 步法 PCR>
95℃,
20~60sec.
↓
95℃ ,1~5sec.
55~65℃ , 5~30sec.
72℃ ,10~60sec.
40 cycles※Tm 值低于 60℃ 或扩增效率较低时
请尝试 3 步法。

△Ct

△Ct

*各目的片段按N=2进行得到的平均值è 相关产品Carryover 污染应对 • 防止假阳性试剂

Uracil-DNA Glycosylase (UNG), Heat-labile

UNG-101200μl×1 支¥1,000→ 2-38 页

ReverTra Ace® qPCR RT Kit

FSQ-101

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix

FSQ-201

200 次份

￥1,500→ 1-23 页

200 次份

￥2,800→ 1-21 页

Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂盒

ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover

1-18

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

FSQ-301

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

200 次份

URL: http://www.bio-toyobo.cn￥2,000→ 1-21 页㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

NGS

qPCR

荧光定量 PCR 界的「幸运鸟」诞生。解决可测定区域、特异性等烦恼。
高效率荧光定量 PCR Master Mix< 以抑制引物二聚体为着眼点开发 >THUNDERBIRD® qPCR Mix 系列
THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix
Code: QPS-101

1.67ml× 3支￥1,500

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix
Code: QPS-201

1.67ml× 3支￥1,500产品内容：

THUNDERBIRD qPCR Mix 是在 Taq DNA®

<QPS-101, QPS-201>
qPCR Mix
1.67ml×3 支
50×ROX reference dye
250μl(50μl 反应体系使用 200 次 )polymerase 基础上开发的高效率 Realtime
PCR 用 Master Mix（2 ×浓度） 。

适用于以 cDNA、病毒 DNA 等为模板的保存：

Realtime PCR 检测。针对 TaqMan® 探针

-20℃ ( 避光保存 )法及 SYBR® Green Ⅰ染料法，本公司有

荧
光
定
量
P
C
R

※ 在短时间 (3 个月以内 ) 使用完毕的情况下，可在 2~8℃避光保存。

两种试剂盒可供选择。

è特 征

参考文献：

高特异性（降低引物二聚体）

1） R.M.de Breuil et al.,PCR
Methods Appl.,3:57-59 (1993)
2） P.M.Holland et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 88:7276-7280.(1991)

通过对组分的最优化，使得 PCR 的特异性更高。通过降低非特异性反应，使得SYBR® Green Ⅰ及 TaqMan® Assay 等对低拷贝目的片段的检测灵敏度更高。
( 参照结果示例 1)

备注：对各种目的片段均可均一地检测

LightCycler® 是 Idaho Technology Inc. 的
注册商标。

采用了新的增强剂，对各种目的片段 PCR 效率的波动可控制在最小范围内。

SYBR® 是Molecular Probes Inc.的注册商标。
TaqMan ® 是 Roche Molecular Systems
Inc. 的注册商标。

通过 SYBR ® Green Ⅰ检测体系对 Norovirus GI
cDNA 的检测（使用缩合引物）( 使用 Roche Diagnostics LightCycler® 1.1)

ABI PRISM® 是 Applied Biosystems Inc.
的注册商标。

通过 TaqMan® 检测体系对 GAPDH cDNA 的定量( 使用 Roche Diagnostics LightCycler® 1.1)

更广的可定量扩增区域

由于产品的高效率、高特异性，可对更广的测定范围进行分析。

通过 SYBR® Green Ⅰ检测体系对质粒模板的检测 ( 使用 Applied Biosystems 7900HT)高适用性 ( 可用于各种仪器 )除适用于普通及高速的模块型 (Block Type) 仪器外，还适用于使用玻璃毛细管(Glass Capillary Type) 的高速循环仪。由于另外添附了 50 × ROX referencedye，对于使用 Passive Reference 的仪器 ( 如 Applied Biosystems 公司制造的仪器、Stratagene 公司制造的仪器 )，可根据各种仪器的特征把 ROX 调整到最适浓度。

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

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URL: http://www.bio-toyobo.cn

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1-19

qPCR

NGS

基本反应条件：<SYBR® Green I Assay>灭菌水qPCR Mix
Forward Primer
Reverse Primer
50×ROX reference dye
DNA 样品
Total Volume

高速热启动

荧
光
定
量
P
C
R

本产品采用了抗 Taq 聚合酶抗体的热启动系统。由于通过升温能使抗体迅速失活，
因此预变性时间可以设定为很短。

è 用 途 : 荧光定量 PCRè说 明

本产品采用了新的增强剂等方法对组分进行了根本性的改良，反应特异性和 PCR
效率得到了飞跃性的提高。通过这些改良，可得到更广的可定量扩增区域（dynamic
range），除适用于普通及高速的模块型（Block Type）仪器外，还适用于玻璃毛细管（Glass Capillary Type）高速循环仪等各种仪器。

è 注意事项

*50×ROX reference dye， 是 对 于 使 用
Passive Reference 的仪器 ( 如 Applied
Biosystems 公司制造的仪器等 )，为校正
各孔间的荧光强度及分注误差而使用。最适 添 加 量 根 据 仪 器 不 同 而 不 同。 不 用
Passive Reference 进行校正的仪器无需
添加。
Cycle
<2 步法 PCR>
95℃,
20~60sec.
↓
95℃ ,1~15sec.
60℃ ,30~60sec.
<3 步法 PCR>95℃ ,20~60sec.
↓
95℃ ,1~15sec.
55~65℃ ,5~30sec.
72℃ ,30~60sec.

保存条件经确认本产品反复冻融 10 次对品质没有影响。

引物设计

参照 1-4 页引物设计方法。

逆转录反应液的加入量

将普通逆转录反应试剂合成的 cDNA ，无需纯化，用灭菌水等稀释后可直接添加到
Realtime PCR 反应液中。
添加量不应超过总反应体系的 10%。使用本公司产品 ReverTra Ace qPCR RT Kit
系列（→ 3-8 页），可添加最多至 20% 的液量。

è 结果示例SYBR® Green Ⅰ检测体系反应特异性的比较

Xμl
10μl
6pmoles
6pmoles0.4/0.04μl*
Yμl
20μl

40 cycles

40 cycles※ 退火温度请设定在引物 Tm~Tm-5℃的
范围内。

※ 一般情况下，目的片段在 300bp 以下时，延伸时间 30 秒即可进行充分的反应。
但一部分仪器为测定稳定的荧光，延伸
时间需大于 30 秒。扩增曲线散乱，或各孔间的差异较大时，请设定较长的延伸时间 （45~60 秒） 。

使用可能产生引物二聚体的引物对，对各种 Realtime
PCR 试剂的反应特异性进行比较。
引物对用针对人 β -Actin cDNA 的，模板使用本公司
高性能逆转录反应用试剂「ReverTra Ace qPCR RT
Kit ( Code No.FSQ-101)」 合 成 的 HeLa 细 胞 Total

RNA 来源的 cDNA，对 cDNA 的 10 倍梯度稀释液（4个梯度）和 no-template control ( NTC) 分别进行两次反应。（使用 Roche Diagnostics LightCycler® 1.1）

è 相关产品Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂盒

ReverTra Ace® qPCR RT Kit
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover

1-20

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

FSQ-101
FSQ-201
FSQ-301

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

200 次份
200 次份
200 次份

URL: http://www.bio-toyobo.cn￥1,500￥2,000￥2,800→ 3-10 页→ 3-8 页→ 3-8 页㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

NGS

qPCR

高性能、性价比极佳的 Realtime PCR 试剂。
高性能 Realtime PCR Master Mix

Realtime PCR Master Mix 系列
Realtime PCR Master Mix
Code: QPK-101

SYBR® Green Realtime PCR Master Mix

1ml× 5支￥1,500 Code: QPK-201

1ml× 5支SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus-￥1,500 Code: QPK-212

1ml× 5支￥1,600产品内容：<QPK-101, QPK-201>
Master Mix
1ml×5 支(50μl 反应体系可用 200 次，20μl 反应体
系可用 500 次 )本 试 剂 是 以 Taq DNA
polymerase 为基础开发的通用性很高的 Realtime PCR 用
2×Master Mix。可获得重复性很好的结果。

<QPK-212>
Master Mix
1ml×5 支Plus solution
1ml×1 支(50μl 反应体系可用 200 次，20μl 反应体
系可用 500 次 )保存：-20℃ ( 避光保存 )

è特 征

备注：

高特异性

为抑制非特异性反应，采用了含抗 Taq 单克隆抗体的热启动法。请见（→ 2-5 页）广泛的应用性可用于 Probe Assay 和 SYBR® Green Assay 等方法。

高通用性 ( 可用于各种仪器 )• 因产品中已添加了 Passive Reference，因此可用于需要校正荧光信号的仪器（如Applied Biosystem 公司的 ABI PRISM® 7700 等）。
• 可应用于使用 Glass Capillary 分析体系的仪器（如 Roche 公司的 LightCycler® 等）。

高可靠性 [SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -plus-]对 Buffer 进行了最优化处理，可抑制 SYBR® Green 分析时出现的引物二聚体等非特异性反应的产生，提高了特异性和重现性。

è 用 途 : 荧光定量 PCRLightCycler® 是 Idaho Technology Inc. 的
注册商标。
SYBR® 是Molecular Probes Inc.的注册商标。
TaqMan ® 是 Roche Molecular Systems
Inc. 的注册商标。
ABI PRISM® 是 Applied Biosystems Inc.
的注册商标。
商品使用文献：1） Y. Azuma et al., Biological &Pharmaceutical Bulletin, 30(4):655-660(2007)
2） Hua Wang et al., J.Bone Miner.
Res.23:939-948(2008)

网络版追加信息：• 简要备注• 实验例

基本反应条件：è说 明<SYBR® Green I Assay>

各产品的性能、用途等请参照下表。
对应Passive 对应Glass
Capillary
Reference

品 名

用 途

Realtime PCR
Master Mix

Probe
Assay**SYBR Green
Realtime PCR
Master Mix

SYBR
Green
Assay

○

SYBR® Green
Realtime PCR
Master Mix -Plus-

SYBR®
Green
Assay

○

®

荧
光
定
量
P
C
R

○

1 step
RT-PCR*

可靠性

○

☆☆☆

○

®

○

○

○

-

☆☆☆

☆☆☆☆

*逆转录酶 ReverTra Ace (→3-14页) 与 RNase Inhibitor (→3-16页) 组合使用，可进行一步法PCR。
**可用于TaqMan® Probe Assay和Hybridization Probe Assay等。

灭菌水
Master Mix
各引物
DNA 样品
Total Volume
Cycle
95℃ ,

↓

95℃ ,
55~65℃ ,
72℃ ,

Xμl
25μl
10 pmoles each~
Yμl
50μl

60sec.
15sec.
15sec.
45sec.

40 cycles※ 退 火 温 度 请 根 据 引 物 的 Tm 值 在
55~65℃之间调整。
※ 扩增片段最大如在 200bp 左右，则延伸反应的时间为 45sec. 也没有问题。

è 相关产品Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂盒

ReverTra Ace® qPCR RT Kit
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

FSQ-101
FSQ-201
FSQ-301

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

200 次份
200 次份
200 次份

URL: http://www.bio-toyobo.cn￥1,500￥2,000￥2,800→ 3-10 页→ 3-8 页→ 3-8 页㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

1-21

qPCR

NGS

对 Illumina 平台二代测序文库进行准确且低偏差的定量。

Illumina 公司二代测序仪用文库定量试剂盒

GenNext® NGS Library Quantification Kit
Code: NLQ-101
Code: NLQ-101S

500次 ¥ 5,450
50次 ¥ 1,100※ 表示的是 20μl 反应体系时的使用次数。

荧
光
定
量
P
C
R

产品内容：

〈KOD SYBR® qPCR Mix〉*
・KOD SYBR® qPCR Mix
・50×ROX reference dye

GenNext® NGS Library Quantification
Kit 是 Illumina 二代测序用的文库定
量试剂盒。针对于 Illumina 采用的P5、P7 接头序列，特异且准确地只定量能够结合在 flow cell 上的文库
序列。

〈Standard & Primer Set〉
・Standard DNA 1 ～ 6**・5×Primer mix
・50×Dilution Buffer* 包含一套完整的 KOD SYBR® qPCR Mix(Code No.QKD-201)** 包含浓度为 20pM、2pM、0.2pM、0.02pM、0.002pM、0.0002pM 的 Standard DNA。

è特 征

保存：

低偏差地准确定量

使用了 KOD SYBR qPCR Mix，不易受文库 GC 含量及长度影响，无论何种文库都可以正确地定量。使用本试剂盒定量得到的值，可以得到稳定的簇密度。
®

更广的可定量区域

-20℃

备注：

SYBR® 是 Thermo Fisher Scientific K.K. 的
注册商标。

备有从 20 pM 到 0.0002 pM 的 6 个浓度的 Standard DNA，可以在较广的范围内进行准确的定量。

简便本产品含有文库定量必需的全部试剂（qPCR 试剂、Primer Mix、Standard DNA、
以及文库稀释 buffer），可以很方便地进行文库的定量。

è 用 途 : Illumina 公司二代测序用文库的定量è说 明

GenNext® NGS Library Quantification Kit 是 Illumina 二代测序用的文库定量试剂盒。Illumina 公司 NGS 测序仪上加载的文库量对数据的数量及质量有很大影响。
文库量过少，簇密度就较低，得到的测序数据量就比较少。相反，文库量过多，簇清晰度就变差，数据质量就会下降。因此，文库的正确定量就变得非常重要。文库
定量的方法有分光光度检测法及荧光测定法，这些测定法中，因为测定的是全部的DNA，所 以 不 能 正 确 地 测 定 对 测 序 有 效 的 包 含 P5、P7 接 头 的 DNA 的 浓 度。
GenNext ® NGS Library Quantification Kit 中，设计了能与 Illumina 公司采用的P5、P7 序列配对的引物，来进行 qPCR 法分析，能准确定量能够结合在 Flow cell的文库。另外，因为使用了 KOD SYBR ® qPCR Mix（→ 1-13 页），针对长链及GC 富集的目的片段，也可以稳定进行文库定量。

1-22

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌεNGSè 注意事项

qPCR

基本反应条件：

5x Primer Mix、50x Rox reference dye 及灭菌蒸馏水10μl
KOD SYBR® PCR Mix
50x ROX reference dye
0.4/0.04μl
5x Primer Mix
4μl
Library Sample / Standard DNA
4μl
灭菌蒸馏水
1.6/1.96μl

预先混合到 KOD SYBR® qPCR Mix 里，添加 4μl 文库或 Standard DNA，可配制
成能够直接使用的混合液进行保存。

KOD SYBR® qPCR Mix

已确认反复冻融 10 次对品质没有影响。

Total Volume

Standard DNA

PCR 反应条件
98℃ , 2min.*1
98℃ , 10sec.
65℃ , 10sec.
68℃ , 30sec.*2

不能对 Illumina 以外的二代测序仪器制备的文库进行定量。

è 实验例各种长度的目的片段的 PCR 效率用各公司的文库定量试剂盒对附加有接头序列的 150~800bp 的模板 DNA 进行分析，比较了 PCR 效率。结果显示，其他公司的文库定量试剂盒随着目的片段长度的变长，
可以看到 PCR 效率降低，本试剂盒没有因目的片段长度变化而出现 PCR 效率下降。

20μl

35cycles*1 本产品因为使用了抗体，采用了热启动体系，

所以请进行 98° C、2min. 的预变性，使抗体失活。

*2 600bp 以上的文库时，请设定为 45 sec.。

荧
光
定
量
P
C
R

各种 GC 含量的目的片段的 PCR 效率比较

用各个公司的文库定量试剂盒对附加有接头序列的各种 GC 含量的模板 DNA 进行
分析 ，比较 PCR 效率。结果显示：其他公司的文库定量试剂盒在定量 GC 含量高
的目的片段时，如融解曲线分析图所示，不能确认目的片段的扩增，PCR 效率也
不能测定。另一方面，使用本试剂盒可特异地扩增全部的目的片段，而且各目的片段的 PCR 效率误差也最小。通常，含有 CpG 的启动子区域或嗜热菌等细菌中 GC
含量比较高。在对其进行文库定量时，使用不易受 GC 影响的本产品就可以正确地
进行定量。

【GC 含量 83.0％的目的基因的融解曲线】
GenNext® NGS Library Quantification Kit

A 公司文库定量试剂盒B 公司文库定量试剂盒è 相关产品高效率 SYBR® Green Ⅰ检测用实时荧光定量 PCR 试剂
KOD SYBR® qPCR Mix

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QKD-201T
QKD-201

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1ml×1 支（40 次）
1.67ml×3 支（200 次）

URL: http://www.bio-toyobo.cn￥500￥2,450→ 1-13 页→ 1-13 页㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

1-23

qPCR

NGS

简便·低成本地构建高质量 Illumina 二代测序平台兼容的 DNA 文库。

Illumina 公司二代测序仪用文库构建试剂盒

GenNext® NGS Library Prep Kit￥2,100￥4,100￥12,600※ 表示的是使用 50μl 片段化 DNA 时的使用次数。
Code: LPK-101T
Code: LPK-101
Code: LPK-101L

荧
光
定
量
P
C
R

8次份
24次份
96次份

产品内容：

GenNext® NGS Library Prep Kit 可从片段化的双链 DNA 或 PCR 产物开始，制备 Illumina ® 公司 NGS 测
序用文库。使用本产品，可简便且
迅速地制备文库。
Input 的 DNA 量少，需要扩增文库时，可使用基因改良型 KOD DNA
polymerase 开发的高保真性 PCR
酶， 低 偏 差 地 扩 增 末 端 带 有Adapter 序列的文库。

〈LPK-101〉
End Repair and A-tailing Buffer
End Repair and A-tailing Enzyme
Ligation Solution
Library Amplification Master Mix
Library Amplification Primer Mix

240 μl60 μl
1.2 ml690 μl138 μl* 本试剂盒不含有 Adapter 以及纯化用磁珠。

保存：

-20℃
※ 如果需要长期保存，请存放于 -30℃。

è特 征

备注：

简便且快速的操作流程从末端修复及 3' 末端加 A 到 Adapter 连接操作都在同一个反应容器中进行。末端修复及 3' 末端加 A 进行 15 分钟，Adapter 的连接需要 15 分钟即完成。文库扩增时使用退火 10 秒、延伸 15 秒的循环即可进行反应。

Illumina® 、TruSeq™ 是 Illumina Inc. 的
注册商标。
MultiNA® 是岛津制作所的注册商标。

范围较广的 input 量对应较广范围的 input 量（1ng ~ 1μg）进行的设计。

低偏差的文库扩增文库扩增

文库扩增时使用的 Library Amplification Master Mix 是使用基因改良型 KOD DNA
polymerase 进行开发的高保真 PCR 酶。因 GC 不均导致的影响降到了最低、可均一
地扩增各种片段。

è 用 途 : Illumina 公司二代测序用文库的制备
è 基本流程1-24

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FAX: 021-5879-4901

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

NGS

qPCR

è 实验例

NGS 评价文库制备试剂盒

使用 MiSeq（Illumina 公司）及 MiSeq Reagent Kit v2（300 Cycles） （Illumina公司）进行大肠杆菌基因组（1µg PCR Free 或 1ng 用 12 循环进行扩增）的 NGS
分析。文库的制备使用 GenNext® NGS Library Prep Kit 或 A 公司文库制备试剂盒进行。文库数据为了与 read 数相等，进行 down sampling, 各样品收集 100 万
read 数，进行分析。分析是使用 CLC Genomics Workbench（QIAGEN 公司 /CLC bio）进行的。
结果显示，使用 GenNext® NGS Library Prep Kit 比使用其他公司的试剂，得到了
更好的 mapping 效率与更低的错误率。
95

95

93

94.5

91

94

89

93.5

87

荧
光
定
量
P
C
R

GenNext® NGS Library
Prep Kit

A公司文库制备试剂盒

93
1μg

1ng

1μg

被mapping的reads数（%）

1ng

与参考基因组一致的碱基数（%）

文库得率及分布的比较

以片段化处理过的人基因组 DNA 1、10、100ng、大肠杆菌基因组 DNA 1µg、以及 100bp DNA Ladder 1、10ng 开始，使用 GenNext® NGS Library Prep Kit 或 A
公司文库制备试剂盒进行文库的制备。

Adapter 是使用 Illumina 公司的 Index Adapter, 文库的 cleanup 是使用 Agencourt
AMPure XP 的试剂 (Beckman Coulter)。

1µg 没有扩增、1ng 用 11 个循环、10ng 用 8 个循环、100ng 用 5 个循环进行扩增，文库 size 的分布用 MultiNA ®（岛津生产公司）的产品进行确认。文库的得率用

GenNext® NGS Library Quantification Kit(Code: NLQ-101) 进行确认。
人基因组1ng
11个循环
M

1

2

人基因组10ng
8个循环
M

1

2

人基因组100ng5个循环

人基因组1μg
PCR free

M

M

1

2

1

100bp DNA Ladder
1ng
11个循环

2

M

1

100bp DNA Ladder
10ng
8个循环
M

2

1

2

得率

得率

M: 100bp DNA Ladder

M: 100bp DNA Ladder

1: 使用GenNext ® NGS Library Prep Kit

1: 使用GenNext® NGS Library Prep Kit

2: 使用K公司的文库制备试剂盒

2: 使用A公司的文库制备试剂盒120bp adaptor dimer进行文库 size 分布的确认时，用本公司 GenNext® NGS Library Prep Kit 和 A 公司
试剂时，结果相同；低 input 量时，使用 GenNext® NGS Library Prep Kit，与使用
A 公司的试剂相比，可得到较高的得率。所有文库均得到了 4nM 以上的得率，都满足 MiSeq 平台上机条件。

è 相关产品Illumina 公司 NGS 用文库定量试剂盒

GenNext® NGS Library Quantification Kit

TEL: 021-5879-4900

FAX: 021-5879-4901

NLQ-101

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

500 次份

URL: http://www.bio-toyobo.cn￥5,450→ 1-22 页㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

1-25

qPCR

NGS

使用 [RamDA-seq™ 技术 ] 从单细胞或微量 RNA 中获得高质量 cDNA ！

NGS 分析 / Realtime PCR 用 cDNA 合成试剂盒

GenNext® RamDA-seq™ Single Cell Kit

24次份 ￥15,000
96次份 ￥53,000

GenNext Ⓡ RamDA-seq™ Single Cell Kit Code: RMD-101T
Code: RMD-101

24次份 ￥7,500
96次份 ￥26,500

RT-RamDA™ cDNA Synthesis Kit Code: RMD-201T

荧
光
定
量
P
C
R

Code: RMD-201

NSR Primer
Code: NSR-101
Code: NSR-102

96次份 ￥3,000
96次份 ￥3,000

RamDA Cell Lysis Kit
Code: RMD-301

本产品是从单细胞或微量 RNA 中合成高质量 cDNA 的试剂盒。其中 RamDAseq™ Single Cell Kit 的 产 物 用 于 full-length total RNA-seq 文 库 制 备，
R T- R a m D A ™ c D N A
Synthesis Kit 的产物作为细胞裂解或RNA稀释
Realtime PCR 的模板进热变性反应
行高灵敏度的基因表达分
基因组去除反应析。 由 于 采 用 了
cDNA合成及扩增反应
RT-RamDA™ 技 术， 本
第二链合成反应qPCR检测
纯化产品不仅能覆盖 poly(A)Nextera反应RNA， 而 且 能 高 灵 敏 度
纯化 & QC
地合成 non-poly(A) 来源
上机测序
的 cDNA。相比原来的方
法能检测到更多基因。

è特 征可使用单细胞及微量 RNA

可以使用 1~100 个细胞或者 10pg~1ng total RNA 作为起始模板制备 cDNA。

可以制备全长 cDNA

现有的只使用 Oligo-dT 引物的方法难以分析 10kb 以上的 RNA，使用本产品可以制备出测序 reads 覆盖全长 RNA 的 cDNA。

除了 poly(A) RNA，还可检测出 non-poly(A) RNA

借助 NSR(Not so random) 引物，可检测到用现有方法难以检测的 non-poly(A) RNA。

相比原来技术，检测到的基因数大大提高了

可检测组蛋白 RNA、lncRNA、pre-mRNA、circRNA 等各种类型的 RNA。

è说 明

TEL: 021-5879-4900￥2,000产品内容：〈RMD-101〉
Lysis Buffer
Lysis Enhancer
RNase Inhibitor
Nuclease free water
RT-RamDA™ Buffer
RT-RamDA™ Enzyme Mix
RT-RamDA™ Primer Mix
gDNA Remover
2nd strand synthesis Buffer
2nd strand synthesis Enzyme
2nd strand synthesis Primer Mix

480μl
108μl
22μl
960μl
240μl
54μl
54μl
54μl
330μl
55μl
275μl

〈RMD-201〉
Lysis Buffer
Lysis Enhancer
RNase Inhibitor
Nuclease free water
RT-RamDA™ Buffer
RT-RamDA™ Enzyme Mix
RT-RamDA™ Primer Mix
gDNA Remover

480μl
108μl
22μl
960μl
240μl
54μl
54μl
54μl

※ 对 于 文 库 制 备， 除 本 产 品 外， 还 需
要 磁 珠（Beckman Coulter 公 司 的
Agencourt AMPure XP） 以及文库制备试剂（Illumina 公司的 Nextera XT DNA
Sample Preparation Kit）。
※ 本 试 剂 盒 不 包 含 NSR Primer。 建 议
NSR Primer Set for human(NSR-101)
用 于 人 源 样 本，NSR Primer Set formouse(NSR-102) 用于鼠源样本。
保存：
-20℃

RamDA-seq™ 是由日本理化学研究所·生命机能科学研究中心·生物信息学研究开
发小组研发的「Random Displacement Amplification Sequencing」技术。现有的
只使用 Oligo-dT 引物的技术无法覆盖 non-poly(A) RNA，并且由于逆转录可能出
现的延伸中止，要得到全长数据比较困难。random 或 NSR 引物可以从 RNA 全部
位置引导 cDNA 合成，从而消除了 poly(A) RNA 的限制，更容易得到 RNA 全长
reads。此外，RamDA-seq™ 法在 cDNA 合成的同时完成扩增，无需额外引入
adapter，也无需 PCR 反应，从而降低偏差。
*NSR 是 Not so random 的缩写，NSR 引物是指为抑制 rRNA 逆转录成 cDNA，利用计算机算法将 18S, 28S RNA 相关的序列剔除后的随机引物。建议 NSR Primer
Set for human (NSR-101) 用于人源样本，NSR Primer Set for mouse(NSR-102)
用于鼠源样本。

1-26

1,152次份

FAX: 021-5879-4901

E-mail: tech@bio-toyobo.cn

URL: http://www.bio-toyobo.cn

备注：

RamDA-seq™、RT-RamDA™ 是日本理化学研究所的注册商标。

㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε

NGS

è 实验例

荧
光
定
量
P
C
R

cDNA 扩增效率的验证由 NIH3T3 Total RNA 10pg 开始，分别用以前的试剂及 RT-RamDA™
cDNA Synthesis Kit 制备 cDNA, 通过 THUNDERBIRD® SYBR® qPCR
Mix[Code No. QPS-201] 进 行
Realtime PCR。 结 果 显 示，
RT-RamDA™ cDNA Synthesis Kit
得到的 cDNA 量是以前试剂得到的
cDNA 量的 9 倍以上。

qPCR

™

input RNA 使用量的验证

分别使用 10pg 和 1ng NIH3T3 Total
RNA ， 用 RT-RamDA™ cDNA
Synthesis Kit 制 备 cDNA, 通 过Realtime PCR 比较 8 个基因（N=3）
的 Ct 值。结果显示，10pg 的 input
量和 1ng 的 input 量具有高度相关性，
即使是微量模板也可高效制备
cDNA。

覆盖范围均一性的验证

以 10pg mES total RNA 开始 , 使用
GenNext ® RamDA-seq™ Single
Cell Kit 制备 cDNA，合成双链 DNA
后构建文库，使用 illumina MiSeq 仪
器进行 NGS 分析。结果显示，制备的文库基本覆盖了全部基因。

'

'( )

可检测基因数的比较及各类 RNA Reads 数的验证检测到的转录产物数

以 10pg mES total RNA 开始 , 使用我司 GenNext® RamDA-seq™ Single Cell Kit
搭配 NSR Primer Set for mouse 与 A 公司的同类试剂盒同时制备 cDNA、并进行
NGS 分析。我司产品无需进行 cDNA 扩增，而 A 公司试剂盒进行了 18 个循环的PCR 扩增。随后，使用 Nextera XT DNA Sample Preparation Kit 进行文库制备，测序使用 illumina MiSeq 仪器。结果显示，与 A 公司的试剂盒相比，GenNext ®
RamDA-seq™ Single Cell Kit 可以多检测出大约 5000 个以上的基因。

既有方法A

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FAX: 021-5879-4901

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε1-27荧光定量 PCR (qPCR) 试剂选择指导东洋纺使用 3 种耐热性聚合酶生产出了各种各样的 qPCR 试剂。

荧
光
定
量
P
C
R

1-28

根据用途不同进行使用分类可有效地推动实验进程。

高 GC
长片段
粗样品
目的片
扩增
扩增
段

Passive 玻璃毛特异性
reference 细管

效率

√

+++

+++

++

++

+

1-17

√

√

+++

+++

++

++

+

1-17

√

√

√

+++

++

+

+

+

1-21

SYBR®

√

√

√

+

++

+

+

+

1-21

THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix

Probe

√

√

√

+++

++

+

+

+

1-19

THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix

SYBR®

√

√

√

++

++

+

+

+

1-19

RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix

Probe

√

√

√

√

+++

++

+

++

++

1-12

RNA-direct™ SYBR® Green Realtime
PCR Master Mix

SYBR®

√

√

√

√

++

++

+

++

++

1-12

THUNDERBIRD® Probe One-step
qRT-PCR Mix

Probe

√

√

√

√

+++

++

+

++

++

1-8

KOD SYBR® qPCR Mix

SYBR®

√

√

√

++

++

+++
(＜2kb)

+++

+++

1-13

产品名称

类型

一步法 热启动

THUNDERBIRD® Next Probe qPCR Mix

Probe

√

√

THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix

SYBR®

√

Realtime PCR Master Mix

Probe

SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(-Plus-)页面