2022年12月22日
サイエンスカフェ
In 静岡細胞の増殖ルール〜ゲノムを複数持つバクテリアからその普遍性を考える〜

大林龍胆（静岡大学）

今日の話

1. バクテリアの増殖ルール
2. ゲノム倍数体から増殖ルールの普遍性を考える（自身の研究）
3. 将来展望を少しだけバクテリア＝細菌

原核生物（核を持たない生物）
地球上の様々な場所に生息している

バクテリア＝細菌

What is true for E. coli is also true for elephants.
Jacques Monod（1965年ノーベル生理学・医学賞）
Trust the power of microbiology
Arthur Kornberg（1959年ノーベル生理学・医学賞）

バクテリアの増殖研究
ゲノムDNA

DNA
複製

分配

細胞
分裂

細胞成長
細かいメカニズムは非常によく研究されている

21.8

バクテリアの増殖研究
ゲノムDNA複製

1.6
1.4
1.2
複製は一箇所から始まる
10.8
0.6
0.4

Genomic position

Genomic position

oriCKatayama et al., 2010 Nat. Rev. Microbiol

バクテリアの増殖研究
細胞分裂
細胞は必ず真ん中で分裂する

Prokaryotic Cytoskeltons. Springer (2017)

バクテリアの増殖
ゲノムDNA

DNA
複製

分配

細胞
分裂

細胞成長
ゲノムを増やし、細胞がふたつに分裂する

バクテリアの増殖

栄養がある時は増え続ける
栄養がなくなると増殖を止める
栄養状態によって、速く増えたり、遅く増えたりする多くのバクテリアは1細胞に一つのゲノム
増殖速度：20分〜
ゲノム複製速度：30分
遅い
速い
どうすれば、このように規則正しく増殖するのか？

多くのバクテリアは1細胞に一つのゲノム

DNA
複製

分配

細胞
分裂

細胞成長

それぞれのプロセスを順番に起動する必要がある多くのバクテリアは1細胞に一つのゲノム

DNA
複製

分配

細胞
分裂

複製する前に分裂すると細胞成長DNAを持たない細胞ができてしまう

どのようなルールであれば、この順番通りに起動できるのか？

実験的検証Charles E Helmstetter
もとは原子物理学、放射線物理学
1958年〜
研究の方法を思いつくのに4年、それを応用する最適な方法を見つけ出すのに4年、分裂周期のデータをとり、解釈するまでに2年

BACTERIAL BABY MACHINE

大腸菌K-12を選ばなかったのが一つの幸運
Joe Coulterがバクテリアをカウントできる装置を持ってくる

とにかく、細胞を同調培養することにこだわった！

Helmstetter CE., et al., 2015 Front. Microbiol

どのように同調したのか？

細胞同調とは：ある状態の細胞だけにすること
方法
網に細胞をトラップして、落ちてくる細胞＝分裂直後の細胞だけを回収する

BACTERIAL BABY MACHINE

複製と分裂の時間的ルールの提唱（仮説）1968年

複製開始時のoriあたりの体積は一定
Cooper-Helmstetter model

複製開始から細胞分裂までの時間は一定
成長速度に関わらない

Cooper and Helmstetter. (1968) J. Mol. Bio

それから長年仮説はあったものの、検証はされて（できて）いなかった

1細胞イメージング技術の発展によるブレイクスルー

バクテリアの増殖を1細胞レベルで解析可能に！

1細胞イメージング技術の発展によるブレイクスルー
DNAポリメラーゼを可視化
DNA複製している細胞

大腸菌細胞

Walled et al., Cell (2016)

バクテリアの細胞成長とDNA複製開始制御
約4000細胞を重ね合わせた結果

DNA複製開始する細胞の大きさ

Walled et al., Cell (2016)

ある体積に達すると複製が開始する
生育速度に関わらず、この法則は成り立つ

増殖ルールをまとめると

複製開始

体積一定

時間は一定

細胞分裂

このルールだと細胞サイズはどうなるのか？
複製開始

体積一定

時間は一定

細胞分裂

細胞サイズは種によって決まっている

どうすれば細胞の大きさが同じになるのか？
これまでの仮説

バクテリアの細胞成長率に伴う細胞分裂制御

A. Adder model
成長する体積が一定
3 μm成長すると分裂する

Campos et al., Cell（2014）

細胞成長率に伴う細胞分裂制御とその普遍性
多くのバクテリアに保存されたルール

Willis et al., 2017, Nat. Rev. Microbiol.

細胞成長と協調したゲノム複製、細胞分裂

複製開始

体積一定

時間は一定

分裂終了

成長する体積一定

Campos et al., Cell（2014）
Walled et al., Cell (2016)
Si et al., Curr. Biol. (2017)

今後の課題

細胞分裂
複製開始

分裂までの成長率＝一定
体積＝一定

どのように細胞サイズを感知しているのか？
どのように成長率を感知しているのか？
複製と分裂はカップリングしているのか？

このシステムは普遍的なのだろうか？

大林の研究：なぜ多倍数化するのか？
1倍体

倍数体

モデルバクテリア
大腸菌、枯草菌など

シアノバクテリアなど
共生、寄生細菌

多くの共生細菌に共通にみられるゲノム倍数化に着目

大腸菌、枯草菌など多くのモデル生物は1細胞あたり一つのゲノムを持つ1倍体
観察されているほぼすべての共生、寄生細菌は多倍数体（10コピーから100コピー以上）
葉緑体、ミトコンドリアも複数コピーのゲノム

1.そもそもなぜ倍数化するのか？
2.ゲノム倍数化の生物学的意義は？

2525

91511AB2B1POlac

λclExpression

dnaA gene is essential
dnaA gene is not essential
dnaA gene is not encoded
Asymmetric GC skew

10063
73
99

99

62
709399

1100
71
100

10091
10099

98

77

10096

88
66

100

4

Chloroplasts

C-GR

295

396

66

99

100
74

100

tet

Polyploid
Monoploid

Time

λP R

71
60

AAAA
A
100

TetR

Evolutionary rate
Phenotype diversity
100lacI
PtetO

AAAA’’A’’
dnaA essentility
GC skew
Ploidy level

AAAA’
A’
Cyanidioschyzon merolae
Phaeodactylum tricornutum
Cyanophora paradoxa
Chlamydomonas reinhardtii
Arabidopsis thaliana
Oscillatoria nigro viridis PCC 7112
Trichodesmium erythraeum IMS101
Arthrospira platensis NIES 39
Oscillatoria acuminata PCC 6304
Geminocystis sp. NIES 3709
Geminocystis sp. NIES 3708
Cyanobacterium aponinum PCC 10605
Cyanobacterium stanieri PCC 7202
Stanieriacyanosphaera PCC 7437
Dactylococcopsis salina PCC 8305
Halothece sp. PCC 7418
Pseudanabaena sp. PCC 7367
Leptolyngbya sp. PCC 7376
Synechococcus sp. PCC 7002
Cyanothece sp. ATCC 51142
Candidatus Atelocyanobacterium
Cyanobacterium endosymbiont
Cyanothece sp. PCC 8801
Cyanothece sp. PCC 7424
Cyanothece sp. PCC 7822
Pleurocapsa sp. PCC 7327
Synechocystis sp. PCC 6803
Microcystis panniformis FACHB 1757
Anabaena variabilis ATCC 29413
Nostoc sp. PCC 7120
Nostoc sp. PCC 7524
Nostoc sp. PCC 7107
Nostoc azollae 0708
Anabaena cylindrica PCC 7122
Calothrix sp. PCC 7507
Cylindrospermum stagnale PCC 7417
Nostoc punctiforme PCC 73102
Rivularia sp. PCC 7116
Fischerella sp. NIES 3754
Calothrix sp. 3363
Geitlerinema sp. PCC 7407
Synechococcus sp. CC 9902
Synechococcus sp. WH 8109
Cyanobium gracile PCC 6307
Paulinella chromatophoraSynechococcus elongatus PCC 7942
Leptolyngbya sp. NIES 3755
Acaryochloris marina MBIC 11017
Thermosynechococcus elongatus BP-1
Synechococcus sp. PCC 6312
Cyanothece sp. PCC 7425
Synechococcus sp PCC 7502
Synechococcus sp. JA 2 3Ba (2-13)
Synechococcus sp. JA 3 3Ab
Gloeobacter violaceus PCC 7421

人工遺伝子回路による増殖機構の再構成
構成的理解と応用を目指して協調的な細胞増殖制御機構とその普遍性

λcl

Chromosome Copy Number

ゲノム多倍数体の遺伝様式と進化可能性
理論と実験室進化実験

ゲノム複製機構の進化
シアノバクテリアから葉緑体へ

DnaA FtsZ

LacI

Cell Volume

大林の研究複数コピーゲノムをどうやって維持しているのか？

Cell Volume

倍数性のバクテリアは細胞の大きさとゲノムの数には正の相関がある

Chromosome Copy Number<Cyanobacteria>
Jain IH, et al., PNAS. (2012)
Chen AH, et al., PLoS One. (2012)
Zheng X and O’Shea EK, Cell Rep. (2017)<Epulopiscium spp>
Mendell JE, et al., PNAS. (2008)<Archaea>
Breuert S, et al., PLos One. (2006)

小さい細胞はゲノム数が少なくて、大きい細胞は多くのゲノムを持つ
これは制御されているように見える複数コピーゲノムを可視化する

0.1 mM

顕微鏡写真
どうやって増やしているのか？
Ohbayashi et al., in prep

ゲノムはひとつずつ複製される

NSI::lacO seq (120 repeats)
NSII::LacI-mNG

Ohbayashi et al., in prep

ゲノムはひとつずつ複製される
複製しているゲノムを観察
Synechococcus elongatus PCC 7942

ゲノム
Chromosome

複製中のゲノム
Replication
SSB-GFP

Watanabe, et al., Mol. Microbiol (2012)
Jain IH et al., PNAS. (2012)
Chen AH et al., PLos One. (2012)
Ohbayashi et al., ISME J (2016)

Q. 複製されるゲノムの数は制御されているのか？
Ohbayashi et al., mBio. (2019)複製するゲノム数は厳密に制御されている
DnaA：複製開始因子
Replication fork
(SSB-GFP)DnaAWT

Number of cellswith SSB foci (%)
020

4060

DnaAWT

80 100(Ave.)
0.91
DnaAR328H

2.16

DnaAR328H
0 12 >3

Ohbayashi et al., mBio. (2019)

複数コピーゲノムをどうやって維持しているのか？
細胞サイズとゲノム数の正の相関

Cell Volume

考えられる可能性

Chromosome Copy Number① ゲノムが増えるから、細胞が大きくなるのか？
② 細胞が大きくなるからゲノムが増えるのか？

ゲノムの数が増えれば、細胞は大きくなるのか？

30Pecent of cells

DnaAWT

DnaAR328H

生育速度

1細胞あたりのゲノム数
DnaAWT

細胞サイズ

1020
OD750

複製するゲノム数

成長速度や細胞サイズは変わらない

1030

DnaAWT

DnaAR328H

20

DnaAR328H
0.18Dn46Days

108H

2R3aA

WT

Chromosome copy number

2432aA

1 2 3 4 5 6 7065Dn

1001

Cell volume (μm3)

人為的にゲノムの数を増やす

Ohbayashi et al., mBio. (2019)

複数コピーゲノムをどうやって維持しているのか？
細胞サイズとゲノム数の正の相関

Cell Volume

考えられる可能性

Chromosome Copy Number① ゲノムが増えるから、細胞が大きくなるのか？
② 細胞が大きくなるからゲノムが増えるのか？

細胞が大きくなるから、ゲノムが増えるのか？
細胞が早く大きくなる
成長速度

複製しているゲノム数は増える

Growth rate

Numberof replicating chromosome
複製しているゲノム数-2 -1Lightintensity(μEms )
-2 -1

250

OD750

OD750

0.8
0.60.400.60.4
0.20.205

100.05

70
50.03
0.01

0
15
15 0 20 5 25 1030 (h)Growth rate (h-1)

Light intensity
0.8 (μE m s )250(High light)

2025705(Low light)(h)Growth rate (h-1)

1.20.0525012>360800.03700.015
02040100

Number of cells with SSB foci (%)
Number of replicating chromosome (%)

Ohbayashi et al., mBio. (2019)

どのようにゲノムコピー数/細胞体積を維持しているのか？

成長した分だけゲノムを補充するようなイメージ

Ohbayashi et al., mBio. (2019)

増殖ルールの普遍性と、なぜ多倍数化するのかを考える

Cell
Volume

複製開始

体積＝一定

Gene No.
/ Cell

細胞分裂分裂までの成長率＝一定

1 倍体（大腸菌）

1Campos et al., Cell（2014）
Walled et al., Cell (2016)
Si et al., Curr. Biol. (2017)

22倍数体（シアノバクテリア）
分裂閾値 2複製閾値

1143216543時間（t）
時間（t）
Replication initiation

人為的に細胞を制御する
細胞分裂の閾値を下げる（分裂タイミングを速くする）
DICDNAWT

分裂閾値 2

複製回数

複製閾値

3回

野生株

15 μm

2分裂閾値

NSI::
分裂因子
Ptrc-ftsZ

1誘導

Cell size
1 0.591または2回

DNA

1 0.75Chlorophyll
1 0.66

Ohbayashi et al., in prep

増殖ルールを理解した、その先には・・・

生命をデザインする

例えば、人為的に細胞の増殖を制御できれば→バクテリアを必要な時だけ増やし、必要な時にだけ有用物質を作らせることができる