36 (2022)
上原記念生命科学財団研究報告集,上原記念生命科学財団研究報告集, 36（2022）

19. 致死性海藻中毒原因物質ポリカバノシド類の作用機序山下 まり＊東北大学 大学院農学研究科 生物産業創成科学専攻
天然物生物機能科学講座 天然物生命化学分野

Key words：ポリカバノシド類，食中毒，電位依存性カルシウムチャネル，作用機序，構造活性相関

緒 言
ポリカバノシド A および B（PA（11）、PB（22））（図 1）は、1991 年にグアムで発生した紅藻カタオゴノリ Gracilaria。この事例では 13 名がedulis による致死性食中毒の原因物質として安元らと単離、構造決定した化合物である［1］発症し 3 名が死亡した。その後、2002～2003 年にもフィリピンで同様の食中毒が発生し、36 名が発症し 8 名が死亡した事例も発生し、同様に PA、PB を同定した［2］。PA と PB はマウスに対して致死毒性を示し、マウス腹腔内投与、および Paquette ら［4］が全合成した PA の毒性は LD５０ 200～400μg/kg であった。その後、藤原、村井ら［3］
類縁体についてマウス毒性を指標に構造活性相関研究を行い、側鎖の構造や糖部の有無が活性に大きく影響することを示した［5］。また、アグリコンの構造が PA、PB と異なる、ポリカバノシド C 類（PC、PC2）（図 1）を単離し、アグリコンのモデル化合物を合成して構造を決定した［6］。ポリカバノシド C 類の毒性は A、B に比べて低く、アグリコンの 5 員環アセタールが毒性発現に重要であることが示された。

図 1．ポリカバノシド類の化学構造
ポリカバノシド類の作用機序について、これまで非天然型の合成 PA 類縁体をヒト神経芽細胞腫 BE(2)M-17 細胞に作用させ、Ca２＋を蛍光色素で検出する系で、細胞外 Ca２＋が細胞内へ流入し、脱分極が誘発されることが Botana らにより報告された［7］。しかし、作用機序の詳細は解明されていなかった。東北大学大学院生命科学研究科の佐々木誠教
授らが 2017 年に PA、PB の全合成に成功し［8］、PB を合成中間体とともに供与いただいた。本研究では、その全合成された天然型 PB を用いて実験を行い、ポリカバノシド類の作用機序に関する新たなデータを得て、電位依存性カルシウムチャネル（Cav）の活性化作用がある可能性が強まった。また、構造活性相関に関するデータを得た。詳細について、以下に報告する。

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現在の所属：東北大学
大学院農学研究科
農芸化学専攻食品天然物化学講座
天然物生命化学分野*現在の所属：東北大学
大学院農学研究科
農芸化学専攻食品天然物化学講座
天然物生命化学分野

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方法および結果
1. Nav に対する作用
ポリカバノシド類の作用機序として、食中毒患者の症状から神経毒であることが疑われた。そのため、電位依存性 Naチャネル（Nav）および Cav にターゲットを絞って調査した。まず、マウス神経芽細胞腫 Neuro2A にウアバインとベラトリジンを添加し、細胞毒性を指標に Nav に対する作用を調べる Neuro2A アッセイを行った。Neuro2A 細胞に一定濃度の Na＋/K＋ATPase 阻害剤のウアバインと Nav 活性化剤のベラトリジンを加えると細胞死に至るが、テトロドト。この試験（Neuro2A アッセイ）を PBキシンなどの Nav 阻害剤を加えると濃度依存的に細胞生存率が上昇する［9］に対して実施したところ、ウアバイン、ベラトリジン存在下で PB を作用させると 5μM、10μM の濃度で、濃度依存的に細胞生存率が上昇することが示された（図 2）。このことから、PB の Nav 阻害作用が疑われたため、共同研究者の此木が Neuro2A 細胞を用いた Nav のホールセルパッチクランプ法（電気生理実験）を行った。しかし、予想に反してPB 25μM で阻害作用は全く観測されなかった。この結果は、Neuro2A アッセイでは Nav 阻害剤以外でも陽性の結果がでる場合があることを示していた。これはまだ報告がなく、さらにその理由を詳細に検討する必要があるが、後に述べるように PB は Cav 活性化作用をもつことが示されたため、Cav 活性化剤でも Neuro2A アッセイで陽性を示すことが示唆された。

図 2．Neuro2A アッセイの結果（代表的一例）
ウアバイン、ベラトリジン存在下での Neuro2A 細胞の細胞生存率を示す。
PB（a）、比較に用いたテトロドトキシン（b）。

2．Cav に対する作用
上記の Neur2A アッセイで PB は陽性を示したが、Nav 阻害作用は示されなかった。この結果および既報の結果［7］から、PB の Cav に対する作用が推測された。そこで、ヒト Cav1.2（hCaV1.2/β2/α2δ1）を CHO 細胞に発現させた系で、ホールセルパッチクランプ法（電気生理実験）を薬物安全性試験センターに委託して実施したところ、図 3 のよ
うに PB 3μM で弱い活性化作用が観測された。この結果から、ポリカバノシド類の作用機序の一つとして、Cav1.2 の活性化作用が示唆された。

2図 3．PB（3μM）のヒト Cav1.2 に対する電気生理実験の結果（代表的一例）
9 min に比較のための 0.1％ DMSO を添加し、12 min に PB（3μM）を添加し、16 min に洗浄を開始した。

3．合成中間体 3 から還元体 4 の調製と活性の比較
佐々木らの合成中間体 PB-vinyl iodide (33)（図 4）から、還元体 PB-vinyl (44)（図 4）を調製し、33, 4 の活性を PB と比較し、ポリカバノシド類の構造活性相関研究の一助とすることとした。化合物 3 から 4 への還元反応は、佐々木らの3 から PB へ共役ジエン側鎖を形成する際の Still カップリングの条件を参考に図 4 に示した条件［8］で行い、3（0.40 mg）から 43％の収率で 4（0.14 mg）が得られ、HR-MS、1H NMR で構造を確認し、1H NMR で定量した。

3)から PB-vinyl (44)の合成
図 4．合成中間体 PB-vinyl iodide (32)、33、４４の活性を調べて比較した。その結果を図 5 に示す。側鎖がビニル基の上記の Neur2A アッセイで合成 PB (24)は 10μM で活性が示されなかったが、ヨウ化ビニル基の場合(33)は PB（EC５０ 約 3μM）の約 1/2 の活性が見場合(4られた。この結果から、二糖を有する場合、側鎖が短くても電子豊富で、かさ高い置換基（ヨウ素）があれば活性を示すことが初めて明らかになった。

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図 5．合成 PB (22)、合成中間体 PB-vinyl iodide (33)、PB-vinyl (44)の Neuro2A アッセイによる活性比較考 察
本研究では、全合成された天然型のポリカバノシド B（PB, 2）が、3μM でヒト Cav1.2 に対して弱い活性化作用を示した。この結果は、先に Botana らが報告している［7］、非天然型ポリカバノシド A 類縁体（12μM）がヒト神経芽細胞腫 BE(2)M-17 細胞に蛍光色素（Fura-2）で検出する系で、細胞外 Ca２＋が細胞内へ流入し、脱分極が誘発される結果と矛盾しない。一方、彼らはその細胞内 Ca２＋レベル上昇が、nifedipine で阻害されなかったため、L-type の。しかし、本研究では、天然型の PB を用いて、直接的に電気Ca２＋チャネルを介した作用ではないと考察している［7］生理実験でヒト Cav1.2 が弱く活性化されることが示されたので、L-type Cav であるヒト Cav1.2 は、ポリカバノシド類の作用機序に関わっていると考えられる。蛍光色素による Ca２＋濃度の検出系では細胞内プール（小胞体）からのCa２＋放出が関与して生じた可能性も考えられる。PB が、小胞体への Ca２＋取り込みを阻害し、小胞体 Ca２＋の枯渇により二次的にヒト Cav1.2 の活性化が起こっている可能性も考えられる。構造活性相関については、本研究で新しく、二糖を有し側鎖が vinyl iodide の PB 類縁体は、Neuro2A アッセイで PB の約半分の活性を保っていることが示された。一方、vinyl だけでは活性は示されなかった。これまで、二糖がない vinyl iodide ではマウス毒性がなくなることが示されたが［5］、本研究の結果から、二糖を有する場合、側鎖が短くても電子豊富でかさ高いヨウ素があれば活性を示すことが初めて明らかになった。今後、さらに十分な検討が必要であるが、ポリカバノシド類による食中毒に対して、これらの知見が有効な治療法探索の一助になれば幸いである。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、全合成ポリカバノシド B および合成中間体を譲渡下さった東北大学大学院生命科学研究科の佐々木誠教授、および Nav パッチクランプ実験を実施して下さった東北大学大学院農学研究科の此木敬一准教授である。共同研究者並びにポリカバノシド B の合成をされた東北大学大学院生命科学研究科の岩崎浩太郎博士、佐々木理氏、川島悠岐博士、および本研究に関わった東北大学大学院農学研究科の土肥裕花氏、島田紀子氏に深謝する。

文 献1） Yotsu-Yamashita M, Haddock LH, Yasumoto T. Polycavernoside A: A Novel Glycosidic Macrolide from the Red
Alga Polycaremosa tsudai (Gracilaria edulis). J Am Chem Soc. 1993;115:1147-1148. doi:10.1021/ja00056a048

42） Yotsu-Yamashita M, Yasumoto T, Yamada S, Bajarias FA, Formeloza MA, Romer ML, Fukuyo Y.
Identification of polycavernoside A as the causative agent of the fatal food poisoning resulting from ingestionof the red alga Gracilaria edulis in the Philippines. Chem Res Toxicol. 2004;17(9):1265-1271.
doi:10.1021/tx0498556
3） Fujiwara K, Murai A, Yotsu-Yamashita M, Yasumoto T. Total Synthesis and Absolute Configuration ofPolycavernoside A. J Am Chem Soc. 1998;120:10770-10771. doi:10.1021/ja982431b4） Paquette LA, Barriault L, Pissarnitski D. A Convergent Total Synthesis of the Macrolactone Disaccharide
Toxin (-)-Polycavernoside A. J Am Chem Soc. 1999;121:4542-4543. doi:10.1021/ja990384x
5） Barriault L, Boulet SL, Fujiwara K, Murai A, Paquette LA, Yotsu-Yamashita M. Synthesis and biologicalevaluation of analogs of the marine toxin polycavernoside A. Bioorganic Med Chem Lett. 1999;9:2069-2072.
doi:10.1016/S0960-894X(99)00341-8
6） Yotsu-Yamashita M, Abe K, Seki T, Fujiwara K, Yasumoto T. Polycavernoside C and C2, the new analogs ofthe human lethal toxin polycavernoside A, from the red alga, Gracilaria edulis. Tetrahedron Lett.
2007;48(13):2255-2259. doi:10.1016/j.tetlet.2007.02.003
7） Cagide E, Louzao MC, Ares IR, Vieytes MR, Yotsu-Yamashita M, Paquette LA, Yasumoto T, Botana LM.
Effects of a synthetic analog of polycavernoside A on human neuroblastoma cells. Cell Physiol Biochem.
2007;19:185-194. doi:10.1159/000099206
8） Iwasaki K, Sasaki S, Kasai Y, Kawashima Y, Sasaki S, Ito, T, Yotsu-Yamashita, M, Sasaki, M. Total Synthesisof Polycavernosides A and B, Two Lethal Toxins from Red Alga. J Org Chem. 2017;82(24):13204-13219.
doi:10.1021/acs.joc.7b02293
9） Saruhashi S, Konoki K, Yotsu-Yamashita M. The voltage-gated sodium ion channel inhibitory activities of a
new tetrodotoxin analogue, 4,4a-anhydrotetrodotoxin, and three other analogues evaluated by colorimetric cellbased assay. Toxicon. 2016;119:72-76. doi:10.1016/j.toxicon.2016.05.012

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