研究フロンティア（平成２２年度学術奨励賞受賞論文）

不妊症の新しいメカニズム―初期妊娠の子宮環境における DEDD 分子の重要性―
森真弓，新井 郷子，宮崎徹

東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター分子病態医科学部門

はじめに異常のある不妊の病態を明らかにし，女性不妊症において脱落膜の機能分化異常が原因かつ治療のターゲットの現在，生殖年齢で不妊症を経験する女性は，１０〜１５％１つになり得る可能性を示した［７］．

もいるとされている．明らかな原因として卵管や卵巣の形態・機能的異常，そして子宮内膜症が背景に認められDedd -/-マウスはメス不妊である

る場合があるが，原因がまったく不明な例も少なくない．
われわれは，女性不妊症の原因になりうる要素として脱最初にノックアウトマウスを作製したとき，繁殖の過落膜に注目した．脱落膜は，胎盤が形成されるまでの間程で遺伝子型―/―のメスがまったく仔を産まないことにに着床胚に対して栄養源や成長因子を供給し，また胎児気づいた．ヘテロ同士の交配ではメンデル則に従った割と母体の間で免疫的拒絶が起きるのを防ぐバリアの働き

合で各遺伝子型の仔が産まれること，および オ ス のをする，非常に重要な子宮組織である．

Dedd -/-マウスは正常な生殖能力を有したことから，原因マウスでは，交尾後４．
５日で着床が起きた直後に胚のはメス生殖機能に限定された．

周囲組織が脱落膜に分化し，８．
５日目に胎盤が形成され

しかし Dedd -/-メスの卵巣機能は正常で，交尾後の性始めるまで初期の妊娠維持に重要な役割を果たす．このホルモン血中濃度の変化や受精にいたるまでは間違いな脱落膜を構成する脱落膜細胞の特徴は，グリコーゲンやくうまくいっていた．一方で，野生型（Dedd ＋/＋）の子脂質などの栄養に富み，プロラクチンやそのファミリー宮組織において Dedd の発現量を調べると，着床直後にタンパクをはじめとする多種多様なマーカーを発現する発現が上昇し，脱落膜組織が最も拡張する５．
５日目でピーこと，さらに，４n，８n を中心として最大６４n ほどの多クを示した（図１a）．この遺伝子発現の増加は，in vitro核細胞になることである［１］．このような脱落膜細胞でマウスおよびヒトの細胞を脱落膜に分化誘導した時も分化は，ヒト子宮内膜あるいはマウス子宮間質細胞を単同様に観察された（図１b，c）．したがって，脱落膜の離培養し，エストロゲン・プロゲステロンを加えること分化において DEDD が何らかの関与をすることが強くにより，in vitro で誘導できる［２］．マウスでは７日間示唆されたのである．の誘導中に，細胞の増殖・分化マーカーの発現・多核化を伴う成熟という段階を経る．

Dedd ＋/＋と Dedd -/-のメスマウスの妊娠子宮を組織学的に比較解析すると，着床時までは着床率も含めて差がな

Death effector domain-containing protein（DEDD）

かったものの，６．
５日目以降で Dedd -/-子宮内の胚生存率

は元々 apoptosis 関連因子として同定された細胞内タンは大きく減少し，９．
５日目までに，すなわち胎盤形成がパク質であるが，われわれの解析によれば，cyclinB１―終わる前に，ほとんどの胚が死んで吸収されてしまってcdk１複合体と相互作用して細胞周期の調節に関与し，いた（図１d）．このことから，Dedd -/-マウスのメス不妊

また，インスリンシグナル下流に存在する Akt 分子のタの原因は脱落膜にあると考えた．

．今回われわれは，Dedd
ンパク質安定性に寄与する［３―６］遺伝子欠損マウス（Dedd -/-）を用いて，脱落膜の分化に子宮脱落膜化と脱落膜細胞の多核化不全
実際，子宮脱落膜組織を，脱落膜マーカーの１つであ

連絡先：森 真弓，東京大学大学院医学系研究科疾患生命工学センター分子病態医科学部門〒１１３―００３
３ 東京都文京区本郷７―３―１
TEL：０３―５８４
１―１４３７FAX：０
３―５８４
１―１４３８E-mail : msmori@m.u-tokyo.ac.jpる tissue inhibitor of metalloproteinase ３（TIMP３）の免疫染色により比較したところ，Dedd -/-では Dedd ＋/＋より有意に染色領域が縮小していた（図２a）．他のさまざまな脱落膜マーカーの発現量も同様に，Dedd -/-子宮で

日本生殖内分泌学会雑誌（2011）16 : 15-1915

森真弓

他

図１

初期妊娠における Dedd の発現上昇と Dedd -/-マウス子宮内着床後の胚致死（a）着床後の子宮における Dedd mRNA 発現量の増加（b）In vitro 脱落膜分化誘導時のマウス子宮間質細胞における Dedd mRNA 発現量の増加（c）In vitro 脱落膜分化誘導時のヒト子宮内膜細胞における Dedd mRNA 発現量の増加（d）Kaplan-Meier 法によるマウス子宮内の胚生存率

３．
２Log-rank, x２＝１

有意な減少あるいは減少傾向がみられた（図２b）．
子宮間質細胞を脱落膜へ分化誘導した際も，多核化を指標として観察すると，Dedd -/-由来の細胞では成熟脱落膜細胞の割合が半減していた（図３）．これは，同一条件下である in vitro の系で，受精卵の存在や他のあらゆる因子と無関係に，脱落膜細胞への分化成熟能が低下していることをあらわす．
以上の解析から推定されることは，Dedd -/-マウス子宮において脱落膜の分化・多核化が不完全であることが，妊娠初期の胚を育成すべきはずであった子宮環境を悪化させ，その結果着床後早期の胚の成長がサポートされず死に至るため，仔が産まれない，すなわち不妊になるということである．

Akt，cyclinD３を介した分子メカニズムの解明
ここで生まれる疑問は，なぜ DEDD がないと脱落膜が成熟分化しにくいのかである．分子レベルでの DEDDの脱落膜分化への関与とそのメカニズムを，以下のように明らかにした．
まず，インスリンシグナル下流の Akt に着目した．
図２16

Dedd -/-子宮の脱落膜化不全（a）妊娠５．
５日目の子宮着床部位の免疫組織染色による TIMP３発
現の定量
５日目の子宮着床部位の脱落膜マーカー遺伝子発（b）妊娠４．
５―５．
現の比較

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.16 2011

DEDD は Akt 分子に結合してタンパク質レベルで安定化することにより，インスリン感受性に寄与する．このAkt はすでに，ヒト脱落膜細胞に発現して脱落膜分化に関与することが報告されていた［８］．そこで子宮組織

不妊症の新しいメカニズム―初期妊娠の子宮環境における DEDD 分子の重要性―

図３

図４

Dedd -/-マウス脱落膜化細胞の多核化不全（a）In vitro 脱落膜分化誘導中の検鏡による細胞多核化の算出（b）同細胞のフローサイトメトリーによる DNA 定量

Akt タンパク質発現レベルの多核化への関与（a）妊娠５．
５日目の子宮着床部位における Akt およびリン酸化 Akt の immunoblot とその定量（b）In vitro 脱落膜分化誘導時に Akt１を過剰発現させた時の Dedd -/-細胞多核化の改善

でも DEDD によって Akt が安定化されていることを調０分と短く
Dedd -/-由来細胞では cyclinD３の半減期が約６べるため，妊娠５．
５日目の子宮着床部位における Akt タなっていた．ここにプロテアソームインヒビターを加えンパク量を比較した．その結果，Dedd では Dedd

よる と cyclinD３レ ベ ル は 一 定 に 保 た れ た．し た が っ てり Akt レベルが低く，妊娠子宮で DEDD が Akt 安定化

DEDD が cyclinD３に対してもタンパク質安定化に働くに働くことを確認した（図４a）．さらに in vitro で分化ことが示された．Akt の場合と同様に，cyclinD３の過剰誘導中に Akt 発現ベクターを導入すると，Dedd 由来細発現によっても Dedd -/-細胞の多核化が改善された（図

胞の多核化が大きく改善された（図４b）．DEDD によ５c）．

-/-＋/＋-/-る Akt タンパクの安定化・発現量維持が脱落膜の多核化では，cyclinD３に対して DEDD は直接相互作用するに働くといえる．なお in vivo でも，Akt シグナル下流のことによって安定化させるのか．このことは，妊娠５．
５タンパク質発現が脱落膜分化に関与すると推測している．

日目の子宮タンパク質を用いた免疫共沈降実験によって

１］
次に，脱落膜多核化に必須とされる cyclinD３［９―１示された（図６a）．ま た，DEDD は cyclinD３だ け で なについて妊娠５．
５日目の子宮で発現レベルを調べると，

く，これと複合体を形成する cdk４，cdk６とも直接結合．しかし mRNA
これも Dedd -/-で減少していた（図５a）しうることを明らかにした．さらに in vitro の免疫共沈

レベルには差がなかったことから，cyclinD３に関しても降実験で各相互作用の再現を得た（図６b）．すなわちタンパク質レベルの安定化機構が予想された．この確証

DEDD は，cyclinD３―cdk４複 合 体 お よ び cyclinD３―cdk６を得るために in vitro の系でタンパク分解実験を行った複合体と結合することによって，脱落膜細胞の多核化に（図５b）．薬剤処理によりタンパク合成を停止させると，必須な細胞周期調節に関与していると推察できる．

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図５CyclinD３分子の発現安定性と脱落膜多核化への関与（a）妊娠５．
５日目における免疫組織染色による cyclinD３発現量の比較定量（b）In vitro 脱落膜分化誘導３日目におけるタンパク質分解実験．CHX : cycloheximide, MG１
３２: proteasome inhibitor（c）In vitro 脱落膜分化誘導時の cyclinD３過剰発現による Dedd -/-細胞の多核化改善

図７

初期妊娠における脱落膜分化・細胞多核化にDEDD が不可欠に働くメカニズム

おわりにDEDD は，Akt と cyclinD３にそれぞれ直接結合してタンパク質レベルの安定性を維持し，それぞれの経路で脱落膜細胞の分化・多核化に寄与することが明らかとなった（図７）．Dedd -/-マウスでは Akt と cyclinD３のタンパ
図６18

DEDD と cyclinD３分子の免疫共沈降による結合実験（a）妊娠５．
５日目の子宮着床部位における cyclinD３，cdk４，cdk６それぞれと DEDD 結合の検出（b）２９３T 細胞に DEDD, cyclinD３，cdk４，cdk６を組み合わせて発現させたときの結合の検出

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.16 2011

ク質発現レベルがともに低下することにより，脱落膜の成熟が十分たらず，胚の発生を支持するに機能が不十分となって不妊の表現型を呈すると考えられる．われわれが示したのは，DEDD が胎盤形成前，初期の妊娠維持不妊症の新しいメカニズム―初期妊娠の子宮環境における DEDD 分子の重要性―に非常に重要な因子であるということである．今後，女性不妊症患者を中心に子宮における妊娠時の DEDD
発現制御や遺伝子レベルの変異について解析すれば，診断・治療応用のターゲットとしても有用となるであろう．
謝辞

本稿を執筆する機会を与えてくださった，日本生殖内分泌学会理事長 峯岸 敬先生，第１５回日本生殖内分泌学会学術集会会長 並木幹夫先生，また本誌編集委員長 筒井和義先生に感謝申し上げます．

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