サ イ エ ン ス へ の 招 待

遺伝子改変マウスを用いた創薬研究
東京理科大学 研究推進機構 生命医科学研究所 客員教授

■ はじめにいわくら

岩倉よういちろう

洋一郎て樹立された，多分化能をもつ培養未分化細胞（ES細胞）が大きな役割を果たしました．ES 細胞を胚盤

遺伝子改変マウスをご存知でしょうか．遺伝子改変

胞期胚に移植することによって，ES 細胞由来の細胞マウスとは，受精卵に遺伝子操作を加えて，外から新が種々の組織に分布した個体（キメラマウス）を作るたな遺伝子を導入したり，あるいは特定の遺伝子を破ことができます【図 1-1】．精子や卵子が ES 細胞由壊したりしたマウスのことです．ご存知のように，生来の細胞で作られている場合は，生まれてくる子孫は体の全ての機能は遺伝子の働きによるものですので，ES 細胞由来のものになります．そこで，予め ES 細このような操作を行ったマウスの各組織の異常や病気胞に突然変異を導入し，この変異 ES 細胞からマウスに対する感受性などを調べることにより，操作した遺個体を発生させることによって，特定の遺伝子に突然伝子が生体の中でどのような役割を果たしているかを変異を持つマウスを作ることが可能になりました．

知ることができます．外から新たな遺伝子を導入した

現在では，ES 細胞を使わないで，直接 CRISPR-マウスのことをトランスジェニック（Tg）マウスと呼Cas9 法によって受精卵に突然変異を導入することで，び，1980 年に Gordon らによって初めて作製されより簡便に遺伝子改変マウスを作ることができる様に

ま し た．細 い ガ ラ ス の 針 で マ ウ ス 受 精 卵 の 前 核 になっています【図 1-2】．特定の遺伝子の機能が失わDNA を注入すると，導入された外来 DNA はそのまれたマウスは，遺伝子の機能を知るために有用で，多ま 染 色 体 に 組 み 込 ま れ，子 孫 に 伝 達 さ れ ま す【図くの創薬研究で利用されています．本稿では私の行った Tg マウスが Palmiter らによって作られ，体重が研究への応用について紹介したいと思います．

1-1】．1982 年には，豚の成長因子遺伝子を導入し通常の 2 倍以上にもなることが示されました（ジャイアントマウス）．この結果は，成長因子に体重を増加させる機能があることを明確に示すものでした．
その後 1987 年には，外部から導入した突然変異を持つ遺伝子断片と内在性遺伝子の間で，相同遺伝子てきた遺伝子改変マウスを用いた研究を中心に，創薬■ インターフェロン（IFN）遺伝子導入

Tg マウスの作製

私は大学院時代，京都大学ウイルス研究所の由良隆，組み換えを起こさせることによって，特定の遺伝子に石浜明先生の下で大腸菌 RNA ポリメラーゼの分子遺突然変異を導入する方法が Capecchi らによって開伝学的研究を行いました．分子遺伝学においては，特発されました．この方法の開発には，1981 年に初め定の遺伝子の突然変異体を分離し，その変異が表現型

1）従来法【図 1】遺伝子改変マウスの作製

36

サイエンスへの招待

2）CRISPR-Cas9 法

にどのような影響を与えるかを調べることが，遺伝子の機能解析の基本となります．ところが当時，哺乳動物では突然変異体を作製する方法が無く，遺伝子の機能解析にこの方法は使えませんでした．Palmiter らの，胚に特定の遺伝子を導入して発生させ，個体レベルでその遺伝子の機能を調べる，というアプローチはとても斬新で，大きく発展することを予感させました．
そこで自分も Tg マウスを作製することを決意しました．しかし，当時私は，ウイルス研の川出由己教授の下で IFN の研究を行っており，Tg マウスを作るための知識も装置もありませんでした．それでも，手探りで Tg マウスの作製を始め，3 年後には何とかβ型IFN 遺伝子を導入した Tg マウスを世界で最初に作製することに成功しました．その結果，これらの Tg マウスがマウス脳心筋炎ウイルス感染に対して高い抵抗【図２】HTLV-I Tg マウスは関節リウマチ様関節炎を発症する1）．足首の肥大（上）と炎症性細胞の浸潤および骨破壊（下左）．下右は正常関節．

性を示すことがわかり，IFN がウイルス感染防御に重てくれませんでした．しかし，偶然にもある日これら要な役割を果たしていることを初めて個体レベルで示のマウスの足首関節が腫れていることに気がつき，調すことができました．

べてみると，これらのマウスは自己免疫になっており，■ HTLV-I Tg マウスによる関節リウマチモデル

関節炎の病理像は人の関節リウマチに非常に良く似ていることが分かりました【図 2】．この結果は，このの作製

ウイルスが人でも関節リウマチを引き起こしている可ウイルス研の日沼頼夫教授がヒト T 細胞白血病ウ

年に Science 誌に報告しました1）．その後，このウイルス（HTLV-I）を発見されたのは 1982 年のことでイルスが関節リウマチの発症に関与していることは疫した．日沼先生は気さくなお人柄で時々私の部屋に来学的にも示唆されており，発生工学的手法で作製したられて，その新しいウイルスについて話をして下さい

疾患モデルによって病因の一つが突き止められた最初ました．私はこのウイルスに興味を持ち，同研究所のの例になるのではないか，と考えています．

畑中正一教授からウイルス遺伝子を頂き，Tg マウスを作ることによって白血病のモデルができないかを試すことにしました．当時，ウイルス学分野でまだそのような試みはありませんでした．ところがこれらのTg マウスはいつまで待っても一向に白血病を発症し能性を示唆するものでした．私達はこの結果を 1991

■ 遺伝子欠損マウスを用いたサイトカイン機能の解析

私達は HTLV-I Tg マウスの関節炎の発症機構を解析する中で，関節炎局所で炎症性サイトカインの発現コラム１

関節リウマチが亢進していることを見出しました．サイトカインとは，T 細胞や樹状細胞などの免疫担当細胞が分泌する一群の蛋白質のことで，受容体を介して他の細胞に作関節リウマチは代表的な自己免疫病です．II 型コ用して，これらの細胞を活性化したり，細胞死を誘導

ラーゲンなどの関節構成成分や血中の免疫グロブリしたり，あるいは遊走を引き起こしたりします．しかン，シトルリン化蛋白質などに対する免疫応答が起きることが知られており，自己抗体が産生されます．
このために関節に炎症が起き，骨破壊が引き起こされる病気で，関節の痛み，腫れ，変形などの他，発熱や倦怠感，食欲不振などの全身症状も引き起こします．我が国では 70 万人，世界では 500 万人もの患者がいると推計されています．

し，1990 年初頭の頃はまだ生体の中での役割はよく解っていませんでした．私達は，炎症性サイトカインと呼ばれる一群のサイトカインは炎症を誘起する活性を持つため，これらのサイトカインが関節炎の病態形成で重要な役割を果たしているのではないか，と考えました．そこで，これらのサイトカイン遺伝子欠損マウスを作製し，その役割を検討することにしました．
理大

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らの IL-1 阻害剤は我国では関節リウマチ治療薬としては未承認です．また，IL-1Ra 欠損マウスで TNFを 欠 損 さ せ た 場 合，あ る い は HTLV-I Tg マ ウ ス でIL-6 を欠損させた場合も，強く関節炎の発症が抑制されることが分かりました．既に TNF については，イギリスの Maini と Feldmann らによって，IL-6 については，阪大の岸本と平野らによって関節リウマチの病態形成に重要な役割を果たしていることが示唆されておりましたが，私達の結果はこれらのデータを強くサポートするものでした．その後，TNF や IL-6 の阻害抗体が開発され，関節リウマチの治療に著効を発【図３】IL-1Ra 欠損マウスも関節リウマチ様関節炎を発症する2）

まず，一番産生量の多かった IL-1（α, β の 2 種類存在
す る の で そ の 両 方）を 欠 損 さ せ た マ ウ ス を 作 製 し，揮することが示されています．このように，遺伝子改変マウスは，ヒト疾患の治療標的を探索する為に有用であることが分かります．

HTLV-1 Tg マ ウ ス と 掛 け 合 わ せ て IL-1α/β 欠 損■ IL-17 欠損マウスを用いた IL-17 の機能解析抑制されることを見出しました．この結果から IL-1

次に，私達は IL-17A，IL-17F，IL-17A/F 欠損マ

HTLV-1 Tg を作製したところ，関節炎の発症が強くが関節炎の発症に重要な役割を果たしており，IL-1ウスを初めて作製することに成功しました3，4）．当時，を阻害することによって発症を抑制できることが示唆

IL-17A は炎症性サイトカインの一つで，好中球を遊されました．

走させることによって細菌感染防御に関与することがそこで，実際 IL-1 の過剰シグナルによって自己免疫が発症するかどうかを調べるために，IL-1 受容体への IL-1α/β の結合を阻害する因子である，IL-1 レセプターアンタゴニスト（IL-1Ra）の欠損マウスを作製しました．このマウスでは IL-1α/β の結合阻害因子が存在しないために，過剰な IL-1 シグナルが入力知られておりましたが，アレルギー，自己免疫などへの関与は知られておりませんでした．私達は IL-17A欠損マウスを作製することにより，接触性過敏症，遅延型過敏症，気道過敏症などのアレルギー応答や，関節リウマチモデルや多発性硬化症のモデルである実験

すると考えられます．その結果，予想通りこのマウス
2）．
が関節炎を自然発症することを見出しました【図 3】

このマウスでは II 型コラーゲンや IgG 抗体に対する自己抗体が検出されることや，このマウスの T 細胞をヌードマウスに移植すると関節炎を誘導することができることなどから，自己免疫を発症していることが分かりました．この結果は過剰な IL-1 シグナルが自己免疫を誘導することを示唆します．私達は，IL-1
は T 細胞上に CD40L や OX40 などの副シグナル分【図４】IL-17A 欠損よる関節リウマチモデルの発症抑制4）子の発現を促進することにより，自己に対する免疫寛容を破綻させることを示しました．自己免疫発症の詳
細なメカニズムは現在解析中です．

それではヒト関節リウマチ患者でも IL-1 は重要な役割を果たしているのでしょうか．マウスの結果がそのままヒトで再現されるかどうかは，非常に気掛かりなことでしたが，実際，関節リウマチ患者でも IL-1Ra，あるいは抗 IL-1β 抗体を投与することによって，治療できることが分かっています．ただし，これ38

サイエンスへの招待【図５】自己免疫の発症には IL-17A が関与している7）

コラム 2

IL-17A の産生細胞は最初 CD4 陽性のヘルパー T

IL-17細胞の一種として同定され，Th17 細胞と命名されました．2000 年頃，T 細胞には主に IFN-γ を産生する

IL-17A は分子量 21k の糖蛋白質であり，相同性をTh1 サブセットと，IL-4，IL-5 などを産生する Th2持つ 6 個のファミリー分子（IL-17A〜IL-17F）が存在サブセットしか知られておりませんでした．そこに，し，ホモあるいはヘテロダイマーとして機能します

IL-17 を産生する新しい T 細胞サブセットが発見され【図 1】 ．IL-17 ファミリー受容体も IL-17RA からたことで，Th17 細胞は非常に大きな注目を集めましIL-17RE まで 5 つのサブユニットが知られており，た．しかし，実際の IL-17A 産生細胞は多様であり，

IL-17RA/RC，RA/RB，RA/RE，RA/RD，RC/RCγδ T 細胞やグループ 3 自然リンパ球（ILC3）細胞ななどのダイマーとして機能することが知られています．

ども産生します5）．IL-17F の場合は，上記以外に腸IL-17A と IL-17F は 50％ のアミノ酸同一配列を持管上皮細胞などでも産生されることがわかっています．

ち，ヘテロダイマーを形成できるだけでなく，それぞIL-17A の発現には転写因子として Rorγt が重要です

れのホモダイマーも同じ受容体（IL-17RA/RC およが，他の IL-17 ファミリー遺伝子の転写因子についび IL-17RC/RC）に結合することができます．最近，てはよく解っていません．Th17 細胞の分化には T 細IL-17A のホモダイマーは IL-17RA/RD にも結合す

胞受容体（TCR）刺激とさらに（TGF-β＋IL-6）刺激4，5）5）ることが報告されました ．

が必要です．一方，γδ T 細胞や ILC3 細胞の場合は，

IL-17RA/RC は繊維芽細胞や上皮細胞，血管内皮TCR 刺激無しに IL-23 と IL-1β によって IL-17A の細胞，マクロファージなど種々の細胞に発現しており， 発 現 が 誘 導 さ れ ま す【図 2】6）．こ の 時，IL-23 はリ ガ ン ド が 受 容 体 に 結 合 す る と，Act1―TRAF6―

IL-23 受容体を刺激するだけでなく，IL-1 受容体のNF-κB 軸，及 び Act1-TRAF6―MAPK―AP1 軸 が発現を亢進させることによって，IL-23 と IL-1 シグそれぞれ活性化されます．その結果，G-CSF や TNF，ナルのシナジーを引き出すことにも一役買っていると

IL-6，CCL1，CXCL2，などの種々のサイトカイン，考えられますが，そのメカニズムはよく解っておらず，ケモカイン，細胞接着因子などの発現が誘導され，自今後明らかにすべき課題です．

己免疫や炎症を引き起こすと共に，好中球の産生や局所への遊走を引き起こし，細菌や真菌の感染防御にも重要な役割を果たします．IL-17RA/RC 以外の受容体のシグナル伝達についてはまだ詳しく解析されておりません．

【図１】IL-17 ファミリー分子とその受容体5）【図２】IL-17 産生細胞の分化と関与因子6）的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の発症などが強く抑制

この結果，IL-17 を阻害することにより，自己免疫疾されることを初めて見出しました【図 4，5】 ．

患を治療できることが初めて示唆されました．そこで，アレルギーや自己免疫疾患において重要な役割を果た

関節リウマチや多発性硬化症だけでなく，2010 年頃，

3，4）

これらの結果は，IL-17A が感染防御だけでなく，していることを示唆するものです．これは IL-17A がG-CSF や TNF，IL-1 などの炎症性サイトカインや製薬企業により IL-17A に対する阻害抗体が作製され，自己免疫が疑われていた乾癬や炎症性腸疾患などに対する治療効果が検証されました．その結果，後に述べCXCL2 などのケモカインの発現を誘導すると共に，るように乾癬や乾癬性関節炎，強直性脊椎炎などの治T 細胞の活性化にも関与しているためと考えられます．

療に著効を発揮することが認められ，現在これらの治理大

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コラム 3

乾癬・乾癬性関節炎・強直性脊椎炎
乾癬とは皮膚が炎症を起こし，表皮を構成するケラチン細胞が過剰増殖する結果，盛り上がった紅班を生じる病気で，発症率は日本では人口の 0.1％程度ですが，欧米では 2〜13％ に及びます．発症には IL-17A/F，IL-23 が重要な役割を果たしています．発症メカニズムは，以下のように考えられます．まず，皮膚に存在するランゲルハンス細胞／樹状細胞上の TLR7 や TLR9，Dectin-1 などの自然免 疫 受 容 体 が 皮 膚 常 在 菌 や 死 細 胞 由 来 の DNA【図６】大腸における C. rodentium（緑蛍光）の増殖7）

療に広く用いられるようになっています．ただ，IL17A に対する阻害抗体を用いた関節リウマチの臨床試験では，治療効果は認められるものの，既存薬に対する優位性が無いため治療薬としては承認されておりません．また，炎症性腸疾患については，抗 IL-17A抗体によって却って悪化する場合があることが判り，治験は中断されました．多発性硬化症に対する効果は現在検証中です．
■ IL-17A は自己免疫の発症に重要な役割を果たすのに対し，IL-17F の関与は少ない（alarmin）などによって活性化されると，IL-1β やIL-23，IL-36α などのサイトカインの発現が誘導されます．IL-36α は IL-23 や IL-1β の他，CCL20などの発現を誘導して CCR6 陽性の ILC3 や γδ T細胞などの自然免疫細胞を局所にリクルートします8）．そこで，IL-1β と IL-23 がこれらの細胞に作用して IL-17A/F の産生を誘導し，IL-17A/F は皮膚 の ケ ラ チ ン 細 胞 に 作 用 し て TNF や G-CSF，CXCR2 などの発現を誘導し，好中球を引き寄せると共に，STAT3 を活性化してケラチン細胞の増殖を 促 し，乾 癬 を 発 症 さ せ る も の と 考 え ら れ ま す【図】．乾癬性関節炎や強直性脊椎炎においても同様に IL-17A/F，IL-23 が重要な役割を果たしていることが知られています．

IL-17 ファミリ ー 分 子 の 中 で，IL-17A と IL-17Fはアミノ酸配列がよく似ており，ヘテロダイマーを形成し，同じ受容体に結合できることから，当初両者はよく似た生物活性を持つと考えられました．ところが，IL-17A の欠損は IL-1Ra 欠損マウスの関節炎や EAEの発症をほぼ完全に抑制するのに対し，IL-17F 欠損はほとんど影響を与えません【図 5】．従って，IL17A が自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たすのに対し，IL-17F の関与は低いと考えられます．

■ IL-17A/F は共に細菌，真菌に対する感染防御に重要

興味深いことに，IL-17A/F 二重変異マウスは日和【図】乾癬の発症機構5）

見感染を受け易く，口周辺部の粘膜部位に黄色ブドウ球菌の感染が頻繁に起ることを見つけました7）．また，病原性大腸菌の一種である Citrobacter rodentiumを感染させた場合も IL-17A/F 二重変異マウスで感受性が非常に高く，IL-17A あるいは IL-17F 単独欠損40

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マウスでもある程度感受性が亢進することが分かりま7）．これらの欠損マウスでは β -ディフェした【図 6】ンシンなどの抗菌蛋白質の発現が著しく低下しており，これが細菌の増殖を許した原因と考えられます．従って，IL-17F の機能としては免疫応答より，むしろ粘マウスとヒトという種間の相違も大きく影響します．

膜，表皮での感染防御で重要な役割を果たしている事

こうした反省から，最近は患者材料を使った研究がこが示唆されます．IL-17A/F は共に細菌感染防御だけではなく，真菌の感染防御でも重要な役割を果たしています．これらの知見から，IL-17A/F を共に抑制すれまで以上に重視されるようになってきました．しかし，遺伝子を欠損させるような実験手法はヒトでは許されません．従って，実験動物を用いた創薬研究が今る治療を行う場合は，感染症に注意する必要があるこ

後も非常に重要な役割を果たすことは間違いありませとが分かります．

ん．今後はヒトで治験を行う前に，より詳細に患者と■ IL-17A/F は共に乾癬の発症に重要な役割を果たしている

マウスモデルの形態や遺伝子，蛋白質レベルでの病態比較を行い，疾患モデルとしての妥当性を検証することが求められるものと考えられます．
基礎研究には，ある現象の裏でその現象を引き起こ

乾癬については良い動物モデルがなく，発症機構のしている原理やメカニズムを明らかにするという重要解析が遅れました．長い間自己免疫の一種ではないかな使命があります．現象を引き起こす原理やメカニズと考えられてきましたが，2009 年に尖圭コンジロー

ムが解ると，次にはそのことを利用して現象を再現しマの治療薬であるイミキモドがマウスに乾癬様皮膚炎たり，制御したりすることが可能になります．従って，を引き起こすことが発見されてから，研究が大きく進本当にある現象を理解するということは，その現象を展しました．イミキモドはトル様受容体 7（TLR7）制御し，自由に操れる様になる事だとも言えます．最のリガンドで，イミキモドを皮膚に塗布すると IL-23が誘導され，その下流で IL-17A/F の発現が誘導され
ま す．そ し て，IL-17A あ る い は IL-17F，IL-23 などを欠損させたマウスでは皮膚炎が強く抑制されることが示され，これらのサイトカインを阻害すると乾癬を治療できることが示唆されました．そこで，IL17A や IL-17A/F，IL-23，あ る い は IL-17RA に 対する阻害抗体が作製され，現在これらの抗体は広く乾近応用研究の重要性が強調されることが多くありますが，しっかりとした基礎研究に基づく発症機構の解明がなければ，創薬などの応用研究はあり得ない事を心に留めておく必要があります．
今からわずか 20 年位前までは，関節リウマチや乾癬に対する治療は，痛みを抑えるなどの対処療法しかなく，病態の進行を食い止められませんでした．しかし，この間の発症機構の解析研究によって TNF や癬治療薬として用いられ，著効を発揮することがわか

IL-6，IL-17，IL-23 などの種々のサイトカインの関っています．これらの抗体は同様の発症メカニズムが与が解ってくると，これらのサイトカインを標的とす示唆されている乾癬性関節炎に対して有効である他，る生物学的製剤が次々と開発され，早期に治療を始めIL-17 の阻害は強直性脊椎炎に対しても有効です．

れば，寛解に持ち込むことも可能になってきました．

重要なことは，自己免疫を引き起こす Th17 細胞大きな進歩であり，基礎研究の成果であると思います．

は乾癬発症に殆ど関与しておらず，ILC3 や γδ T な遺伝子改変マウスを用いた研究がこの流れの中で果たどの自然免疫細胞が IL-23 および IL-1β 刺激を受けて IL-17 を産生していることです．従って，乾癬は従来考えられていたような自己免疫ではなく，自然免疫受容体を介した IL-23-IL-17 軸の過剰活性化によした重要な役割を考えると，当初からこうした研究に参加できたことを誇らしく，かつ，幸せに思います．
若い人達の中から遺伝子改変マウスを使った新たな創薬を目指す人が出てくることを期待しています．って引き起こされた病態であると考えられます．
■ 遺伝子改変動物を使った創薬研究
この様に，遺伝子改変マウスを利用した遺伝子機能の解析は，その結果を直接創薬に結びつけることができる可能性が高いと言えます．ただ，マウスモデルの結果がヒトでは再現されないこともあります．これは見かけ上同じ様な病態に見えても，病因や発症メカニ

参考文献

1) Iwakura Y. et al., Science, 253, 1026-28（1991）.
2) Horai R. et al., J. Exp. Med., 191, 313-320（2000）.
3) Nakae S. et al., Immunity, 17, 375-387（2002）.
4) Iwakura Y. et al., Immunity, 34, 149-162（2011）.
5) Chung, S.-H. et al., Int. Immunol., 33, 723-729（2021）.
6) Akitsu A. et al., Nat. Commun., 6, 7464（2015）.
7) Ishigame, H. et al., Immunity, 30, 108-119（2009）.
8) Hashiguchi, Y. et al., J. Immunol., 201, 167-182（2018）.

ズムが異なっていることがあるためです．もちろん，
理大

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