研究フロンティア（平成 年度学術奨励賞受賞論文）

出生後の精巣における胎仔型ライディッヒ細胞の細胞運命と生理機能の解明
嶋雄一，宮林香奈子，松崎佐和子，井上 実紀，諸橋憲一郎

九州大学大学院医学研究院分子生命科学系部門性差生物学講座［ ， ， ， ］
．しかしながら，これまでの解析は両者のはじめに違いを断片的に記述するにとどまっていたことから，胎男性ホルモン（アンドロゲン）は，精巣内での精子形成に必須であるばかりでなく，脳や外生殖器を含む全身仔型ライディッヒ細胞と成獣型ライディッヒ細胞の細胞系譜や機能的差異の詳細な解明が待たれていた．の雄性化を促進する重要な機能を担っている．有胎盤類

筆者らは最近，トランスジェニックマウスを用いた解においては胎仔期にアンドロゲンの産生が始まり，出生析により，核内受容体型の転写因子をコードする Ad以前に脳や外生殖器の性差が生じることが知られていBP/SF ― （Nr a ）遺伝子の上流領域に，胎仔型ライる．また，アンドロゲンの産生量は出生後に一時的に低ディッヒ細胞特異的エンハンサーを同定した［］．Ad

下し，思春期以降に再び増加することがよく知られていBP/SF― は副腎皮質におけるステロイド代謝酵素群の．アンドロゲンの産生を担うのは精巣間質に存る［ ― ］

転写活性化因子として諸橋らによって同定され［在するライディッヒ細胞であり，胎仔期の精巣にも成獣その後の解析により，副腎の他にも，視床下部腹内側核の精巣にもライディッヒ細胞が存在する．しかしながらや脳下垂体前葉，精巣のライディッヒ細胞や卵巣の莢膜興味深いことに，アンドロゲン産生量の増減に一致して，細胞に発現することが明らかにされている［

ライディッヒ細胞の数は胎仔期にいったん増加した後出

われわれは，これらの組織における Ad BP/SF― の発現生後に減少し，思春期以降に再び著しく増加すると報告が，それぞれの組織特異的なエンハンサーによって制御されている．また，胎仔期と成獣期のライディッヒ細胞．胎仔型ラされていることを明らかにしてきた［ ― ］

は形態的・機能的に多くの相違点を示すことが報告されイディッヒ細胞特異的エンハンサーの同定により，細胞ている．たとえば，ラットの胎仔期のライディッヒ細胞を特異的に EGFP で標識し，セルソーティングによりは細胞質に多数の脂肪滴をもつが，成獣のライディッヒ純粋な胎仔型ライディッヒ細胞を回収することが可能と細胞には脂肪滴は少数しか認められない［］．さらに，なった．そこで，胎仔型ライディッヒ細胞および胎仔期

成獣のライディッヒ細胞では Ptgds 遺伝子（プロスタグのセルトリ細胞をそれぞれ回収し，その遺伝子発現を検

ランジン D 合成酵素）や Sult e 遺伝子（エストロゲ討した結果，過去に報告された通り［ ］，胎仔型ライン硫酸基転移酵素）の発現が高い一方で，胎仔期のライディッヒ細胞にはテストステロン合成の最終反応を担うディッヒ細胞ではこれらの遺伝子の発現は認められない

β―HSDtype （ β―hydroxysteroid］，］．また，dehydrogenaseなど，両者の間で異なる発現パターンを示す遺伝子群がtype ）が発現しておらず，その代わりに胎仔期セルト同定されている［］．これらの観察結果をもとに，胎リ細胞に発現していることが明らかになった．この結果

仔期に存在するライディッヒ細胞（胎仔型ライディッヒを踏まえ，分取した細胞のステロイド合成能を測定した細胞）と出生後に出現するライディッヒ細胞（成獣型ラところ，胎仔期の精巣においては，胎仔型ライディッヒイディッヒ細胞）は異なる起源をもつ別個の細胞集団で細胞がアンドロステンジオンを合成し，これが胎仔セルあり，出生後に胎仔型ライディッヒ細胞が消失し，成獣トリ細胞へ受け渡され，最終反応を経てテストステロン型ライディッヒ細胞に置き換わると考えられてきたへ変換されることが明らかになった．一方で，成獣型ライディッヒ細胞は単独でテストステロンを合成可能で連絡先：嶋雄一，九州大学大学院医学研究院分子生命科
学系部門性差生物学講座〒 ―福岡市東区馬出 ― ―TEL ： ― ―FAX： ― ―E-mail：yshima@cell.med.kyushu-u.ac.jpあった［ ］．以上の結果は，胎仔型ライディッヒ細胞と成獣型ライディッヒ細胞の機能的差異の一端を明らかにするものであった．
本研究では，上記の研究結果をさらに発展させ，胎仔日本生殖内分泌学会雑誌（2014）19 : 45-50

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嶋雄一

図他

胎仔型ライディッヒ細胞特異的エンハンサーを用いた細胞系譜追跡実験の概要
核内受容体型転写因子 Ad BP/SF― をコードする遺伝子は， つのエクソンから構成される．筆者らが同定した胎仔型ライディッヒ細胞特異的エンハンサー（Fetal Leydig Enhancer, FLE）は，遺伝子の上流領域に位置していた．エンハンサーとプロモーターを用いて，CreERT を胎仔型ライディッヒ細胞特異的に発現するマウスを作出した．なお，未分化生殖腺における活性を低下させるため，プロモーター上の Lhx の結合配列に変異を導入した．このマウスと CAG―CAT―EGFP マウスを交配し，胎齢 ．日の時点で妊娠母体にタモキシフェンを投与して胎仔型ライディッヒ細胞を EGFP 標識し，標識された細胞の運命を胎齢 ．日，生後 日，および生後週の各発生段階において解析した．

型ライディッヒ細胞の機能を生体レベルで解明すること運命を追跡した（図を目的とした．特にこれまで出生後に消失すると考えらにおいては，円形の胎仔型ライディッヒ細胞 の み がれていた胎仔型ライディッヒ細胞の，出生後の精巣におEGFP で標識されていたのに対して（図

ける細胞運命と機能を明らかにすることを目標として実験を行った．

）．その結果，胎齢 ．日の精巣A），出生後日目の精巣では，胎仔型ライディッヒ細胞の一部が扁平な細胞に変化し，精細管周囲に局在することが明らかとなった（図胎仔型ライディッヒ細胞の細胞系譜追跡実験

B）．さらに生後週齢の成熟雄個体の精巣を解析したところ，円形の細胞と扁平な細胞の両方に EGFP の発現が認められた（図まず，胎仔型ライディッヒ細胞の細胞運命を追跡するC）．また，円形の細胞のなかには β―HSD type 陰性の細胞集団に寄与すために，筆者らが同定したエン ハ ン サ ー を 用 い て，る細胞（図CreERT （Cre 組換え酵素と変異型エストロゲン受容体F）のD）と， β―HSD type を発現する細胞（図種類が認められた．現在のところ，出生後にの融合タンパク．タモキシフェンと結合することで核内胎仔型ライディッヒ細胞が変化して出現する扁平な細胞へ移行し loxP 配列の組換えを起こす）を胎仔型ライや，胎仔型ライディッヒ細胞由来の β―HSD type 陽性ディッヒ細胞特異的に発現するマウスを作出した．この細胞， β―HSD type 陰性細胞の機能の詳細は不明であマウスと CAG―CAT―EGFP マ ウ ス［ ］を 交 配 し，胎る．

齢 ．日の時点で母体の腹腔内に体重g あたり ．mgのタモキシフェンを投与することによってオス胎仔の胎仔型ライディッヒ細胞を EGFP 標識し，その後の細胞

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胎仔型ライディッヒ細胞の出生後の運命と機能図

胎仔型ライディッヒ細胞特異的 CreERT 発現マウスを用いた細胞系譜追跡実験の結果（A）胎齢 ．日の精巣においては，内在性の Ad BP/SF― と一致して，円形の細胞に EGFP の発現が認められた．
（B）生後 日の精巣においては，円形の細胞（矢印）に加えて，精細管周囲の扁平な細胞にも EGFP の発現が認められた（矢頭）．
（C）生後 週齢の成熟精巣においても，円形の細胞（矢印）と扁平な細胞（矢頭）に EGFP の発現が認められた．また，円形の EGFP陽性細胞のうち，一部は β―HSD type 陰性の細胞集団に寄与していた（D，矢印）が，一部は β―HSD type を発現していた（F，矢印）．
（Bar＝μm）

胎仔型ライディッヒ細胞特異的 Ad BP
P/SF ― （Nra ）遺伝子破壊マウスの解析―ΔFLC/―マウス）を作出した（図B）．

ノックアウトマウス胎仔を胎齢 ．日の時点で観察す
ると，精巣の大きさはコントロールとほぼ同等であった

次に，胎仔型ライディッヒ細胞の生体における機能をが，精巣下降は全く起こっておらず，腎臓の下極付近に明らかにすることを目的として，細胞特異的 Ad BP/SFとどまっていた（図― 遺伝子ノックアウトマウスを作出し解析した．上述

巣の間質からは脂肪滴をもつ細胞が消失し（図したように，Ad BP/SF― は核内受容体型の転写因子で免疫染色の結果， β―HSD のシグナルもほぼ完全に消失

C，D）．組織学的解析の結果，精E， F），あり，全身性ノックアウトマウスにおいて副腎や生殖腺していた（図が消失することから，本因子は副腎皮質や生殖腺を構成

ス精巣において，分化した胎仔型ライディッヒ細胞が消する細胞の発生・分化に必須であると考えられている失したことを示しており，Ad BP/SF― が胎仔型ライ［ ］．このことから，細胞特異的に Ad BP/SF ― 遺伝

ディッヒ細胞の機能分化に必須であることが証明され子を破壊することにより，胎仔型ライディッヒ細胞の機た．ノックアウトマウスにおいては，胎仔型ライディッ能分化を阻害できると予想した．エンハンサーを用いてヒ細胞の消失に伴ってテストステロン産生がほぼ消失し胎仔型ライディッヒ細胞特異的 Cre 発現マウスを作出ており（データ未掲載），アンドロゲン依存性の組織でし（図A），これを Ad BP/SF ― 遺伝子（全身性）ノッ

クアウトマウスおよび Ad BP/SF ― 遺伝子 flox マウス

G，H）．この結果は，ノックアウトマウある輸精管は低形成であった（図D，矢印）．

一方，成獣の精巣を解析したところ，興味深い表現型と交配することにより，胎仔型ライディッヒ細胞特異的が観察された．精巣は矮小化しており（図Ad BP/SF ― 遺伝子ノックアウトマウス（Ad BP/SF

織学的解析の結果，精巣の間質は高度に線維化しており，A，B），組研究フロンティア

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嶋雄一

図他

胎仔型ライディッヒ細胞特異的 Ad BP/SF ― 遺伝子ノックアウトマウスの作成と表現型解析（胎齢 ．日）（A）胎仔型ライディッヒ細胞特異的 Cre 発現コンストラクト．
（B）胎仔型ライディッヒ細胞特異的 Cre マウスと Ad BP/SF ― 遺伝子ノックアウトマウス，Ad BP/SF ― 遺伝子 flox マウスを交配し，胎仔型ライディッヒ細胞特異的 Ad BP/SF ― 遺伝子ノックアウトマウス（ Ad BP/SF ― ΔFLC/- マウス）を作出した．
（C，D）泌尿生殖器の外観

精巣は腎臓下極付近に位置しており，下降していなかった．輸精管は低形成であった（D，矢印）．
（Bar＝mm）（E，F）精巣のトルイジン・ブルー染色像

コントロールでは脂肪滴をもつ胎仔型ライディッヒ細胞が（E，矢印）が観察されたが，ノックアウトでは観察されなかった．
（G，H）抗 Ad BP/SF― 抗体，抗 β―HSD 抗体を用いた免疫組織染色像（C，D : Bar＝ mm，E，F，G，H : Bar＝ μm）

基底膜が肥厚していた（図C，D）．一方，免疫染色のの異常が認められた．

結果， β―HSD 陽性のライディッヒ細胞が精巣の間質にノックアウトマウスが停留精巣を呈していたことかE，F）．しかし，定量的 RT―PCR のら，上記の表現型が停留精巣によるものであるか否かを出現していた（図結果，StAR 遺伝子（Steroidogenic Acute Regulatory Pro-

確認するために，過去に報告された手法に基づき［ ］，type ）の発現はコノックアウトマウスの新生仔精巣をヌードマウスの皮下tein）や Hsd b 遺伝子（ β―HSDントロールと差がなかったのに対して，成獣 型 ラ イ
ディッヒ細胞の機能的成熟の指標である Hsdb 遺伝に移植し，週間後に精巣を摘出して組織学的解析を行った．その結果，ノックアウトマウスの精巣はコント子（ β―HSD type ）や Hsd b 遺伝子（ β―HSD typeロールより小さく（図）の発現が低下しており，この結果，精巣重量あたり

結果，間質の高度の線維化と基底膜の肥厚が認められたのテストステロン産生量がコントロールに比べて低下し（図ていた（データ未掲載）．また，精子形成にも異常が認イディッヒ細胞が観察されたものの，その数はコントめられ，円形精子細胞は認められるものの，成熟した伸ロールより少なかった（図長精子細胞は全く認められなかった（図C，D）．以上

ノックアウトマウスで観察された表現型は，停留精巣や胎仔型ライディッヒ細胞がホルモン環境（アンドロゲンの低下）によって生じたもの表現型をまとめると，①消失しても，成獣型ライディッヒ細胞は出現した．②
出現した成獣型ライディッヒ細胞は機能的に十分成熟できず，そのためテストステロンの産生量も少なかった．
③48

精巣間質の線維化や基底膜の肥厚に加え，精子形成

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G，H 点線），組織学的解析のI，J）．また，免疫染色の結果， β―HSD 陽性のラK， L）． これらの結果から，のではないことが確認された．

胎仔型ライディッヒ細胞の出生後の運命と機能図

胎仔型ライディッヒ細胞特異的 Ad BP/SF ― 遺伝子ノックアウトマウスの表現型（生後（A，B）精巣の外観 ノックアウトにおいて精巣は矮小化していた．

週齢）と精巣移植実験の結果（C，D）精巣のマッソン・トリクローム染色組織像 ノックアウトにおいて，精子形成の異常と精巣間質の著しい線維化が認められた．
（E，F）精巣の免疫組織染色像（Ad BP/SF― ， β―HSD） ノックアウトマウスにおいても，Ad BP/SF― 陽性・ β–HSD 陽性のライディッヒ細胞が観察された．
（G，H）ヌードマウス背部皮下へ移植された精巣精巣の外観（点線，移植後（I，J）移植精巣のマッソン・トリクローム染色組織像（K，L）移植精巣の免疫組織染色像（ β–HSD）（A, B : Bar＝ mm, G, H : Bar＝ mm, C―F, I―L : Bar＝おわりに週間）μm）

発現プロファイルの解明や同種移植実験などにより，その機能や運命がさらに詳細に明らかになると期待され細胞系譜追跡実験により，胎仔型ライディッヒ細胞はる．

出生後にも消失せずに存在し続けること，また出生後に一方，胎仔型ライディッヒ細胞特異的 Ad BP/SF ―一部の細胞が扁平な細胞へ変化し精細管周囲に局在する遺伝子破壊マウスの解析からは，胎仔型ライディッヒ細ことが明らかになった．これらの細胞は，Ad BP/SF―胞が出生後の成獣型ライディッヒ細胞の分化に関与するや β–HSD を発現しておらず，アンドロゲンを産生することが示唆された．また，胎仔型ライディッヒ細胞の分ライディッヒ細胞としての性質を失っていることから，化異常が間質の線維化や精子形成の異常を引き起こす病どのような機能をもつのかは興味深い点である．過去の態が観察された．つまり，これまで考えられてきたよう報告によると，精細管周囲に存在する PDGF（Platelet-de-に胎仔型ライディッヒ細胞は出生後に機能を失って消失

rived Growth Factor，血小板由来成長因子）受容体陽するのではなく，出生後にも成獣型ライディッヒ細胞の性/GATA 陽性/c-kit 受容体陽性の扁平な細胞が，成獣機能分化や精巣間質の正常な環境の維持に関与すると考型ライディッヒ細胞の幹細胞として機能するとされていえられる．ヒトの非閉塞性無精子症患者の精巣において，．このことから，胎仔型ライディッヒ細胞がる［ ― ］

高頻度に精巣間質の線維化が認められることから［ ］，変化した扁平な細胞が，成獣型ライディッヒ細胞の幹細われわれの作出したノックアウトマウスは，ヒトの精子胞として機能する可能性も考えられる．一方，別の研究形成異常の病態をライディッヒ細胞の分化異常という新グループからは，精細管周囲筋様細胞（Peritubular My-たな視点から解明する手がかりになるかもしれない．

oid cell, PTMC）が，精細管の伸長を制御する他，成獣今後，胎仔型ライディッヒ細胞に由来する細胞の各発型ライディッヒ細胞の分化や精子形成に関与することが生段階のトランスクリプトーム解析や，CreERT マウス報告され，生後の精巣における PTMC の機能的重要性を用いた時期特異的なノックアウトマウスの解析等によ．今後，扁平な細胞の遺伝子が注目されている［ ― ］

り，出生後の精巣における胎仔型ライディッヒ細胞の機研究フロンティア

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嶋雄一

他

能を分子レベルでより詳細に解明したいと考えている．
謝辞

本稿では，年度に日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容を紹介した．本稿執筆の機会を与えていただ
いた，日本生殖内分泌学会理事長 苛原 稔先生，第 回学術集会会長 緒方 勤先生，および本誌編集委員長 筒井和義先生に感謝申し上げます．

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