第「Appendix」

第7章

目录

7-1

è 主要大肠杆菌的基因型

7-2

è 遗传 Marker

7-4

è DNA 片段的泳动

7-6

凝胶电泳

7章

聚丙烯酰胺凝胶电泳è 遗传密码 • 氨基酸省略符号表7-8è 计算式 • 换算式

7-8

寡聚核苷酸 Tm 值的计算公式
寡聚核苷酸摩尔数的计算公式
各种换算式

è 基因工程中常用的培养基和试剂组成

7-9èTOYOBO 常见问题 Q&A

7-11

Appendix

INDEX
7-1

主要大肠杆菌的基因型

Appendix
7-2

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε7-3遗传 Marker

Appendix
7-4

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε7-5

DNA 片段的泳动è 凝胶电泳（使用 1 × TBE Buﬀer）
参照以下图片Lane 11；Loading Quick
Lane 12；Loading Quick
Lane 13；Loading Quick① 0.5％λ／ Hind Ⅲ

λ／ Hind Ⅲ - φ X174 ／ Hae Ⅲ

φ X174 ／ Hae Ⅲ② 1.0％

1 2 3

1 2 3

4.4kb

4.4kb

1.1kb

1.1kb

③ 1.5％④ 2.0％

1 2 3

1 2 3

4.4kb

1.1kb

0.5kb
1.1kb

Appendix
不同的凝胶浓度所对应的适合分析的 DNA 片段长度。

7-6凝胶浓度

DNA 片段长度范围

0.3％

60~5 kb

0.6

20~1

0.7

10~0.80.9

17~0.51.2

16~0.41.5

14~0.22.0

13~0.1

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在凝胶电泳中与色素 marker 具有同样迁移率的DNA 片段长度（碱基对） 凝胶浓度：0.5~1.4％
Orange G约 50bp

BPB

XC~300bp~4,000bp

参考文献

1.R. T. Maniatis, E. F. Fritsh and J. Sambrook. Molecular
Cloning⸺A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, New York. （1982）

URL: http://www.bio-toyobo.cn㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌεè 丙烯酰胺凝胶电泳

不同的聚丙烯酰胺凝胶浓度所对应的适合分析的DNA 片段长度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳在聚丙烯酰胺电泳中与色素 marker 具有同样迁移率的片段长度（碱基对）DNA 片段长度范围聚丙烯酰胺凝胶

BPB

XC

13.5％

100~1000bp

13.5％

100 bp15.0

180~500

15.0

165

200

18.0

160~400

18.0

145

160

12.0

140~200

12.0120170

20.0

110~100

20.0

112145在变性聚丙烯酰胺电泳中与色素 marker 具有同样迁移率的 DNA 片段长度（碱基对）聚丙烯酰胺凝胶

BPBXC

15.0％

35 bp

130 bp16.0

20100 bp18.0

1970~80 bp

10.01255 bp20.0

1828 bp`400 bp

参考文献

1.R. T. Maniatis, E. F. Fritsh and J. Sambrook. Molecular
Cloning⸺A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, New York. （1982）

以下电泳图片各泳道的样品同前页（7-6 页）。
① 4.0％② 6.0％

1 2 3

1 2 3

1.1kb

1.1kb

0.2kb
0.4kb

1 2

④ 10.0％3123Appendix③ 8.5％

0.6kb
0.6kb

0.2kb

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URL: http://www.bio-toyobo.cn㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε7-7遗传密码 • 氨基酸省略符号表è 遗传密码
UUCA

GG3 个字母1 个字母

UUU PheUCU Ser

UAU TyrUGU Cys

GlycineUUC PheUCC Ser

UAC Tyr

UGC Cys

AlanineAla

A

UUA Leu

UCA SerUAA Ochre

UGA OpalUUG Leu

UCG Ser

UAG Amber

UGG Trp

ValineValVLeucine

Leu

L

CUU Leu

CCU ProCAU HisCGU Arg

Isoleucine

Ile

I

CUC Leu

CCC ProCAC HisCGC Arg

CUA Leu

CCA Pro

CAA Gln

CGA Arg

SerineSerS

CUG Leu

CCG ProCAG Gln

CGG Arg

Threonine

Thr

T

AUU IleACU Thr

AAU Asn

AGU Ser

Aspartic Acid

Asp

DAUC Ile

ACC Thr

AAC Asn

AGC SerGlutamic AcidGluE

AUA IleACA Thr

AAA Lys

AGA Arg

Asparagine

Asn

N

AUG MetACG Thr

AAG Lys

AGG Arg

GlutamineGlnQ

GUU ValGCU AlaGAU AspGGU Gly

GUC ValGCC AlaGAC Asp

GGC Gly

GUA ValGCA AlaGAA Glu

GGA Gly

GUG ValGCG AlaGAG Glu

GGG Glyè 寡聚核苷酸 Tm 值的计算公式Appendix

寡聚核苷酸 Tm 值的计算：①寡聚核苷酸长度小于 18bp 时
Tm ＝（A ＋ T）× 2℃＋（G ＋ C）× 4℃：寡核苷酸中 A 的数目：寡核苷酸中 C 的数目：寡核苷酸中 G 的数目：寡核苷酸中 T 的数目：寡核苷酸中 G ＋ C 的％：寡核苷酸的长度（mer）

LysK

Arginine

Arg

R

Cysteine

CysC

Methionine

MetM

Phenylalanine

PheF

Tyrosine

TyrY

Tryptophan

TrpW

Histidine

His

H

Proline

ProPè 各种换算式
1pg ＝ 10-12g

1kb double stranded DNA （Na ＋）＝ 6.6×105 daltons

1kb single stranded DNA （Na ＋）＝ 3.3×105 daltons

1kb single stranded RNA （Na ＋）＝ 3.4×105 daltons
average mass of amino acid ＝ 126.7 daltons
10,000dalton protein ＝ 270bp DNA

1μg/ml of nucleic acid ＝ 3.0μM phosphate

1μg/ml of a 1kb nucleic acid ＝ 3.08nM end concentration
1pmol of a 1kb DNA ＝ 0.66μg1mole of linear pBR322 DNA ＝ 2.8×106g
1pmole of linear pBR322 DNA ＝ 2.8μg

è 寡聚核苷酸摩尔数的计算公式

1 O. D. double stranded DNA ＝ A260 of 1.0 ＝ 50μg/ml

利用脱氧核苷酸的吸光系数来计算

1 O. D. single stranded DNA ＝ A260 of 1.0 ＝ 37μg/ml

E260×100

A×1.54 ＋ C×0.75 ＋ G×1.17 ＋ T×0.92※A：寡核苷酸中 A 的数目C：寡核苷酸中 C 的数目
G：寡核苷酸中 G 的数目
T：寡核苷酸中 T 的数目

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Lysine1kb DNA ＝ 333 - amino acid coding capacity：溶液中 Na ＋浓度（M）

mole［pmol ／μl］＝G1ng ＝ 10-9g- （600 ／N）［Na ＋］

Gly

1μg ＝ 1γ＝ 10-6g②寡聚核苷酸长度大于 18bp 时
Tm ＝ 81.5 ＋ 16.6 （log10［Na ＋］） ＋ 0.41 （％ G ＋ C）
ACGT％G＋CN

7-8氨基酸A计算式 • 换算式※è 氨基酸省略符号C

1 O. D. single stranded RNA ＝ A260 of 1.0 ＝ 40μg/ml
oligonucleotide

15mer 50ng ＝ 10pmoles
17mer 56ng ＝ 10pmoles
20mer 66ng ＝ 10pmoles
24mer 80ng ＝ 10pmoles

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌε基因工程中常用的培养基和试剂组成Appendix

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Appendix
7-10

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㩛ѐᰬ䰪φ9:00~17:30δളᇐ㢸‫ٽ‬ᰛ䲚ཌεTOYOBO 产品常见问题 Q&A
Q1 KOD FX Neo 与 KOD FX 的区别？

A1 KOD FX Neo 是在「KOD FX」的基础上，结合新开发的「KOD -Plus- Neo」的「延伸增强剂」等技术，抑制< 停滞现象＞，使长链目的片段 • 难配序目的片段、粗样品的扩增效率更高。以基因组 DNA 为模板最大可扩增40kb 的片段，实现了 30 sec/kb 的高速循环（粗样品推荐 1min/kb）。

Q2 KOD -Plus- Neo 与 KOD -Plus- 的区别？

A2 KOD -Plus- Neo 在高保真性 PCR 酶「KOD -Plus-」系列技术的基础上，应用了本公司新开发的「延伸增强剂」，保持了「KOD -Plus-」系列高保真性（约为 Taq 的 80 倍）的同时，通过抑制 < 停滞现象 >，明显提高了对微量
模板 DNA、长目的片段的扩增效率。延伸时间缩短到 30 sec/kb。是高保真、高效率、高速的 PCR 酶。

Q3 FSK-101 与 FSQ-101 的区别？

A3 FSK-101 是用于 RT-PCR 的高效率 cDNA 合成试剂盒，适用于长链 cDNA（10kb 以上）的合成。FSQ-101 是用于 RT-qPCR 的高效率 cDNA 合成试剂盒，通过改良，使得带入到 Realtime PCR 反应体系中的逆转录反应液的影响降到最小，即使在 PCR 反应体系中添加了多至 20％体积的逆转录反应液，也能表现出良好的反应曲线，因此，最适合用于表达量较少的 mRNA 的高灵敏度检测。由于精简了试剂盒的构成，可非常简便地进行操作，仅需约
15 分钟的逆转录反应，即可得到充分的 cDNA。

Q4 Blend Taq 与 Blend Taq -Plus- 的区别？

A4 Blend Taq -Plus- 是在「Blend Taq」的酶溶液中预混了抗 Taq 单克隆抗体，采用热启动法，更提高了 PCR 反应的灵敏度和特异性。

Q5 THUNDERBIRD qPCR Mix 与 Realtime PCR Master Mix 的区别？

A5 THUNDERBIRD qPCR Mix 对 Realtime PCR Master Mix 的组分进一步优化，使得反应特异性和 PCR 效率有了提升。THUNDERBIRD Next 系列则在此基础上进一步提高了产品性能以及操作便捷性。

Q6 Ligation high Ver.2 产生冻结或白色沉淀是否影响连接效率？

融解后使用不影响活性。可用手指捏着离心管使其融解，但注意不要使其升温。

Q7 Ligation high 融解后有白色沉淀，是否影响使用？

Appendix

A6 在 -30℃以下长期保存，或在冷冻柜的冷气出风口处保存时，可能会产生冻结或白色沉淀，但经实验证明，将其A7 作为稳定剂使用的 BSA 可能会形成沉淀，但对反应没有影响，无需将沉淀融解直接使用，不会影响连接效率。
Q8 为什么 FSK-101/FSQ-101 中的 5×RT Buﬀer 融解后有白色沉淀？

A8 低温长期保存后可能在短时间融解后 buﬀer 中会有白色沉淀，请务必将其融解后使用，融解后不会对反应有影响。
Q9 QPK/QPX 系列产品中是否添附 ROX ？ ROX 的浓度是多少？

A9 Realtime PCR Master Mix 中 添 附 了 1× 浓 度 的 ROX。THUNDERBIRD Next qPCR Mix 中 含 有 passivereference dye，可代替 ROX 起到校正作用。

Q10 使用 ReverTra Ace -α- 合成 cDNA 时 RNA 热变性的作用？

A10 热变性可消除 RNA 大多数二级结构，从而使引物可以结合。因此，对于容易形成高级结构的 RNA 可以提高逆转录的效率。

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Q11 使用 Target Clone -Plus- 时，为什么纯化后的 PCR 产物在添加 10×A-attachment Mix 之前需要添加

PCR buﬀer、MgCl2 和 dNTPs?

A11 由于纯化后 PCR 反应液中的 PCR buﬀer、MgCl2 和 dNTP 都被去除了，因此要重新加入 PCR buﬀer、MgCl2 和dNTP，形成 1×PCR 反应体系，以便 3’端 dA 的附加。

Q12 使用 ReverTra Ace qPCR RT Kit 制备的 cDNA 做 Realtime PCR，制备的 cDNA 需不需要稀释 10倍以上使用？

A12 可以不稀释 10 倍以上使用，但将其添加到 RealtimePCR 反应液时请不要超过 20% 的量。因为添加过量会降低 PCR的反应效率。

Q13 SuperPrep Ⅱ Cell Lysis & RT Kit for qPCR 可以处理的细胞数量范围是多少？

A13 使用 96 孔板时，每个孔可处理的细胞数建议控制在 1x101~7x104 个之间。该上限因细胞种类而异，可在 104 数量级范围通过预实验来验证。

Q14 MagExtractor -RNA- 能否用于抽提植物组织 Total RNA?

A14 NPK-201F 能从培养细胞、动物组织、酵母中抽提出 Total RNA，不能用于抽提植物组织 Total RNA。
Q15 使用 KOD FX 时循环条件的设定三步法循环和两步法循环的区别 ?

A15 当引物 Tm 值未满 73℃时 , 请用三步法。使用粗样品时，相比两步法，用三步法能得到更为稳定的结果。
Q16 使用 KOD -Plus- / KOD -Plus- Ver.2 时对引物设计的要求？

A16 引物的 GC 含量不可太高，长度应保持在 22 ～ 34mer 的范围之内（Tm 值 >60℃）。

另外，设计引物时要注意不要使其形成分子内二级结构、引物二聚体等情况。对长链目的片段进行扩增时，请
使用 Tm 值 65℃以上的引物。

Appendix

Q17 KOD One 的 PCR 反应条件没有预变性步骤，是否支持热启动？

A17 支持。在以复杂样本为模板扩增时，增加预变性步骤可能提高 PCR 效果。
Q18 QRT-101 可否加入 Mn2+ 后长期保存？

A18 不可以，加入 Mn2+ 后在 4℃保存三周后经检测会相差 1 ～ 2 个 Ct 值。
Q19 是否可以使用 KOD -Plus- 的 10×PCR buﬀer 代替 SMK-101 中的 iPCR buﬀer?
A19 可以使用 10×PCR buﬀer 加 MgSO4 代替 iPCR buﬀer, 但突变效率会降低。

Q20 FSQ-201 中的 5×RT Master Mix 与 FSQ-301 中的 5×RT Master Mix Ⅱ是否可以混用？

A20 不可以。FSQ-201 中的 5×RT Master Mix 与 FSQ-301 中的 5×RT Master Mix Ⅱ组分不同，请勿混用。另外
FSQ-301 中的 5×RT Master Mix Ⅱ要同试剂盒中的 4×DN Master Mix 组合使用进行逆转录反应。

7-12

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