12-03

PCR 选东洋纺
就

ReverTra Ace qPCR RT Kit(Code No.FSQ-101)

中文说明书科研用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPANTSB-029

目录
[1] 前言 ...............................................1[2] 产品内容 ...........................................2[3] 其他必需品 .........................................3[4] 使用方法 ..........................................4[5] 相关操作步骤 ......................................5[6] 常见问题 ..........................................8[7] 相关产品 ..........................................9【注意】
本试剂盒中所含的试剂均为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。

【保存】所有组分请均保存于 -20℃条件下。

[1] 前言
ReverTra Ace qPCR RT Kit 是基于制作 Realtime PCR 用模板 cDNA 的目的而开发的高效率且使用简单方便的逆转录反应试剂盒。本产品采用了本公司高性能逆转录酶 ReverTra Ace 和作为 Realtime PCR 目的片段短链 cDNA
合成的最优化反应成分，能够高效率地合成适用于 Realtime PCR 的 cDNA 模板。此外，本产品简化了试剂盒的构成并且拥有快速的反应操作的特点，能够在短时间内简单方便地进行 cDNA 合成。
※ 本产品的试剂盒内没有添附 Realtime PCR 试剂。关于 Realtime PCR 产品，推荐使
用本公司的 Realtime PCR 用试剂 Realtime PCR Master Mix 系列。（详情请参考 [7]相关产品的内容）。

◆本产品特征◆1．对应各种不同长度目标片段的高效率逆转录
ReverTra Ace qPCR RT Kit 采用了最适合于 Realtime PCR 用 cDNA 合成的反应缓冲液，和以最恰当比例混合的 Primer 混合液，对于各种不同长度的目标片段，不用摸索条件就能够进行高效率的逆转录反应。

2．
反应时间短、操作简单方便
ReverTra Ace qPCR RT Kit 只需要 15 分钟的逆转录反应，就能够对各种长度的目标片段进行高效率的逆转录反应。此外，在 Realtime PCR 的过程中，会自动清除抑制反应的残留 RNA，无须另外进行 RNase H 处理。

3．提高了与 Realtime PCR 试剂的兼容性
ReverTra Ace qPCR RT Kit 采用了对于 Realtime PCR 反应体系的影响
程度最小的成分，即使在 PCR 反应中添加了最多 20% 液量的逆转录反应液，
也能表现出良好的反应曲线（已通过使用本公司的 Realtime PCR Master Mix确认）。最适合用于表达量较少的 mRNA 的高灵敏度检测。

1[2] 产品内容◆本产品包含以下几种试剂，每 10μl 反应体系可使用 200 次。
所有试剂请均保存在 -20℃条件下。

试剂名保存条件

容量5×RT Buffer（Reaction Buffer+MgCl2+dNTPs）-20℃

400μlEnzyme Mix（ReverTra Ace reverse transcriptase+RNase Inhibitor）

-20℃

100μl

Primer Mix（Random Primer+Oligo(dT) Primer）

-20℃

100μl

Nuclease-free Water-20℃

1000μl×2

5×RT Buffer
含有反应缓冲液、MgCl2、dNTPs 等 5 倍浓度的逆转录反应液 Buffer。溶解时，可能会出现白色沉淀，但不影响其品质。请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解之后再使用。
Enzyme Mix
含有本公司高性能逆转录酶 ReverTra Ace 和 RNase Inhibitor 的混合酶液。
-20℃条件下不会冻结。
Primer Mix
含有 Random Primer 和 Oligo(dT) Primer 的混合引物，以最恰当的比例混合，对于各种不同长度的目标片段都能进行高效率的逆转录反应。
Nuclease-free Water
Nuclease-free 级别的灭菌蒸馏水。为避免影响聚合酶的活性，未经过DEPC 处理。

2[3] 其他必需品◆除本产品之外，请再准备以下几种试剂和仪器。
• Thermal cycler 和 Incubator
本产品的建议使用温度为 37℃、98℃、以及 65℃，请准备好符合条件的相关仪器。
• Nuclease-free Water
本产品已添附可使用 200 次的 Nuclease-free Water，此外请再准备一些
Nuclease-free Water，以便在稀释模板 RNA 时使用。推荐使用未经过 DEPC
处 理 的 Nuclease-free Water。也可以使 用经 DEPC 处 理 过 的 水，但 残 留的
DEPC 会抑制反应的进行，因此请使用高压灭菌器彻底清除 DEPC 之后再使用。此外，为防止核酸的混入，用于逆转录反应和 PCR 反应的 Nuclease-freeWater，建议和用于其它实验的 Nuclease-free Water 分开保存，避免共用。
• Total RNA
使用本产品，可以把 Total RNA 直接作为模板使用。从组织、培养细胞等得到 Total RNA 中，作为表达分析对象的 mRNA 的含量通常为 1-2%。除了进行检测表达量极低的目的基因之外，通常情况下都可以明显地检测到作为模板的Total RNA。
通过 AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform) 法等提纯的 Total RNA中，混有基因组 DNA。对于在检测的目的基因中存在很多假基因的情况，以及跨内含子位置不能设计引物的情况，可能是因为由混入的基因组 DNA 产生的
假阳性信号引起的。请采取必要的措施（如：DNase I 等）清除基因组 DNA< 或使用本公司去除基因组 DNA 专用试剂盒 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover>。
• poly(A)+ RNA(mRNA)
利用 poly(A)+ RNA 和 Oligo(dT) 杂 交 后，选 择 性 地分离出仅有 poly(A)+末 端的 mRNA。在提 纯 过程中浓 缩 mRNA，是 为了在高灵敏 度下能 够 检 测mRNA。但是，与 Total RNA 相比 mRNA 更容易受到 RNase 的分解，也不能以ribosomal RNA 为内参来进行相对定量。

3[4] 使用方法（1）RNA 的变性
把 RNA 在 65℃条件下进行 5 分钟后，立即放于冰上冷却。
• 在经过以上步骤的处理后，对于容易形成高级结构的 RNA 可以提高逆转录的效率。
• 在进行以上步骤处理的时候，请不要添加 5×RT Buffer 和酶。

（2）反应液的配制
反应液组成
Nuclease-free Water
5×RT Buffer
RT Enzyme Mix
Primer Mix
RNATotal volumeup to 10μl
2μl
0.5μl
0.5μl
0.5pg-1μg10μl• 除了在本试剂盒内添附的 Primer Mix 之 外，也可以使 用基因特异性引物（GeneSpeciﬁc Primer）。此时，在反应体系中添加的最终浓度为 0.5pmol/μl（每 10μl 反应体系添加 5pmol）。

（3）逆转录反应
在 37℃条件下，进行 15 分钟的逆转录反应。
↓在 98℃条件下，进行 5 分钟的酶失活反应。
↓反应结束之后，请保存于 4℃或者 -20℃条件下。在进行 Realtime PCR 反应时，请在作为模板的反应液内直接添加或者稀释之后添加。
• 此温度条件是最适合本试剂盒组成成分的条件，一旦改变此温度条件，除了影
响酶的活性之外，对引物的退火效率、RNA 的清除效率、以及逆转录反应后的酶失活效率等也会产生很大的影响。摸索条件的时候，请一定要基于此温度条
件来进行实验。
• 把逆转录反应液添加到 Realtime PCR 反应液内时，请不要超过 20% 的量。添加过量的逆转录反应液，会降低 PCR 的反应效率，不能进行准确的定量。
• 在使用基因特异性引物的情况下，特别是使用相同序列的逆转录引物和 PCR 引
物的时候，在逆转录反应时的非特异性退火是导致 PCR 非特异性扩增产物产生的原因。此时，提高逆转录反应的温度（至 42-50℃）可得到改善。

4[5] 相关操作步骤1．Total RNA 的 DNase I 处理
在通过 AGPC 法等提纯的 Total RNA 内混有基因组 DNA，可能会发生由
基因组 DNA 产生假阳性信号的情况（请参考 p3），请根据以下的方法清除基因组 DNA< 或使用本公司去除基因组 DNA 专用试剂盒 ReverTra Ace qPCR
RT Master Mix with gDNA Remover>。
（1）反应液的配制和反应反应液组成（例）
Nuclease-free Water
Total RNA（<10μg）
10×DNase I Buffer（10mM Tris-Cl, pH7.6, 2.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2）

RNase-free DNase I（10U /μl）
Total volumeup to 10μl
Xμl
1μl
0.5μl
10μl

配制好以上的反应混合液后，置于冰上反应 10~30 分钟。
（2）提纯（可使用一般的提纯试剂盒）
在反应液内添加 100μl 的 Nuclease-free Water、100μl 的 TE 饱和苯酚，用 vortex 使其充分混合后，置于冰上 5 分钟。
↓12,000rpm、5 分钟的离心后，回收上清液。
↓添加 100μl 的氯仿后使其混合。
↓12,000rpm、5 分钟的离心后，回收上清液。
↓添加 100μl 的 5M 醋酸铵、200μl 的异丙醇，使其混合后置于 -20℃条件下30 分钟。
↓12,000rpm、5 分钟的离心后，弃上清液。
↓在沉淀中加入 70% 乙醇。
↓12,000rpm、5 分钟的离心后，弃上清液。
↓在沉淀中加入适量的 Nuclease-free Water，使其溶解。
5

2．Poly(A)+ RNA 提纯法
在进行检测表达量较少的遗传基因时，从 Total RNA 中提取 poly(A)+ RNA
作为模板使用，可以提高灵敏度。在此介绍一个 poly(A)+ RNA 提纯法的例子：通过使用 Oligo(dT) 结合磁珠的专用提纯试剂盒 MagExtractor -mRNA-（CodeNo. NPK-801）的方法。
（1）DNase I 反应液的配制和提纯前的处理反应液组成（例）MagExtractor -mRNA- 溶出液
Total RNA（<100μg）
10×DNase I Buffer
RNase-free DNase I（10U /μl）
Total volumeup to 100μl
Xμl
10μl
1μl
100μl

配制好以上的反应混合液后，置于冰上反应 15 分钟。
↓在反应液内添加 400μl 的溶解液（含 2- 巯基乙醇）和 800μl 的吸附液。
（2）反应和提纯
在新的 1.5ml 离心管内加入 250μl 磁珠。
↓使用磁力架 Magical Trapper（Code No.MGS-101）或离心机等进行固液
分离（B/F 分离）后，弃上清液。
↓添加上述经过事先处理的 Total RNA 液。
↓用 vortex 充分搅拌（至均匀程度）后，在室温下放置 10 分钟。
↓
进行固液分离（B/F 分离）后，弃上清液。
↓
添加 1ml 的洗净液。
↓
用 vortex 充分搅拌（至均匀程度）。
↓进行固液分离（B/F 分离）后，弃上清液。
↓

添加 1ml 的洗净液。
↓（转下页）
6

（接上页）↓
用 vortex 充分搅拌（至均匀程度）。
↓进行固液分离（B/F 分离）后，弃上清液。
↓
添加 1ml 的洗净液。
↓
用 vortex 充分搅拌（至均匀程度）。
↓进行固液分离（B/F 分离）后，弃上清液。
↓
进行离心后，再弃上清液。
↓
添加适量的溶出液。
↓
用 vortex 充分搅拌（至均匀程度）。
↓65℃、2 分钟。
↓
用 vortex 充分搅拌（至均匀程度）。
↓离心。
↓
进行固液分离（B/F 分离）后，回收含有 poly(A)+ RNA 的上清液。
• MagExtractor -mRNA- 的标准操作，需要反复进行 2 次上述的提纯。经过 2 次反复提纯，能够清除 1 次提纯未能完全清除的 rRNA 和基因组 DNA。通常情况下，只需提纯 1 次，但如需要获取高纯度的 poly(A)+ RNA 时，请进行 2 次提纯。
• 关于此提纯法的详细介绍参考 MagExtractor -mRNA- 附带的使用说明书。

7

［6］常见问题
1．在 Realtime PCR 时检测无信号，或者信号出现延迟。
原因对策RNA 的纯度较低可能是由于配制 RNA 时残留的杂质抑制了逆转录反应。请重新提纯模板 RNA。

RNA 被降解RNA 可能是被混入的 RNase 降解。请重新配制RNA。此外，低浓度的 RNA 保存时，除更容
易被 RNase 降解外，由于被反应容器吸附，实际的 RNA 的量会有所减少。建议避免把使用过的低浓度 RNA 冻结保存后再使用，最好每次使用时直接从高浓度的保存液稀释。

RNA 的量过多或者过少

经确认，使用本产品时，添加 1pg-2μg 范围的 RNA 的量都能够进行稳定有效的逆转录反应。但是由于 RNA 的种类和品质等的不同，
可以进行反应的 RNA 的量可能会有所改变。
请适当增减模板 RNA 的添加量。

反应温度不当改变反应条件会对引物的退火效率、酶的活性、逆转录后的酶失活、模板 RNA 的清除效率等
多方面产生影响。在进行实验时，请务必要按
照本使用说明书上记载的条件来设定反应温度。

逆转录反应液的添加量过多 经确认，使用本产品时，即使在 PCR 反应液内
添加最多 20% 的逆转录反应液也能表现出良
好的反应曲线。但是使用不同的 PCR 试剂，可能会使表达量降低。请减少逆转录反应液的添加量。

2．在 Realtime PCR 时检测到非特异性的信号。
原因

对策发生引物的非特异性退火的 使用基因特异性引物进行逆转录时，引物的非情况（使用基因特异性引物 特异性退火是在 PCR 时出现非特异性信号的时）
重要因素。提高逆转录反应的温度，可以有效地提高退 火的特异性。请把反应温 度设 定在42℃ -50℃的范围内。

8[7] 相关产品Realtime PCR 试剂规格

Code No.

1ml×5

QPK-101

1ml×5

QPK-201

1ml×5

QPK-2121.67ml×3

QPS-101

1.67ml×3

QPS-201

容量Code No.

5次

NPK-801F

100 次

NPK-201

1个MGS-101

规格Code No.

200 次

FSQ-201

200 次

FSQ-301

品名Realtime PCR 用 Master Mix（Probe Assay 用）

Realtime PCR Master Mix
Realtime PCR 用 Master Mix（SYBR Green Assay 用）SYBR Green Realtime PCR Master Mix
Realtime PCR 用 Master Mix（SYBR Green Assay 用）SYBR Green Realtime PCR Master Mix -PlusRealtime PCR 用 Master Mix（Probe Assay 用）

THUNDERBIRD Probe qPCR Mix
Realtime PCR 用 Master Mix（SYBR Green Assay 用）

THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix

配制 RNA 的相关试剂
品名利用磁珠简单方便地提纯 mRNA 的试剂盒

MagExtractor -mRNA利用磁珠简单方便地提纯 Total RNA 的试剂盒

MagExtractor -RNA通过磁珠简单地进行提纯的专用磁力架

Magical Trapper

Realtime PCR 用预混型 cDNA 合成试剂盒
品名Master Mix Version

ReverTra Ace qPCR RT Master Mix

去除基因组 DNA 试剂 +Master Mix Version

ReverTra Ace qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover9One-step PCR 试剂
品名One-step Realtime PCR 用 Master Mix（Probe Assay 用）

RNA-direct
Realtime PCR Master Mix
One-step Realtime PCR 用 Master Mix（SYBR Green Assay 用）

RNA-direct SYBR GreenRealtime PCR Master Mix◆详情请浏览本公司中文网页
http://www.bio-toyobo.cn

10规格

Code No.

500μl×5QRT-101

500μl×5QRT-201

[ 制造 • 销售商 ]东洋纺（上海）生物科技有限公司
上海市浦东新区张杨路 188 号汤臣商务中心 C 座 310 室
邮编：200122
交货期限 • 订货相关咨询
Tel:021-58794900 Fax:021-58794901
E-Mail:sales@bio-toyobo.cn
产品内容 • 技术相关咨询
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E-Mail:tech@bio-toyobo.cn
http://www.bio-toyobo.cn

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