阻害剤の反応速度論

福岡大学理学部化学科

寺田 成之

０. はじめに阻害剤(inhibitors)は酵素と相互に作用し，その反応効率を低下させる合成物または天然に存在する化合物
である1)。それらは代謝反応速度をコントロールするための医薬品として用いられたり，酵素反応機構を理解するための道具としても用いられる。多くの有毒な化合物は酵素阻害剤で，生体に大きな影響を与えるため，抗生物質，農薬，除草剤などに使われている。一方，天然の生理的な阻害剤は生体調節や生体防御等のために働いている。阻害剤は異なる機構で酵素と相互作用するが，酵素反応速度論はこれらの機構を区別することのできる重要な手段となる。ここでは阻害機構の特徴や酵素反応速度式を導出し，さらに，阻害定数（解離定数）Kiを決定する方法を述べる。
以下の解説では次の略号を使用する。
E
酵素S
基質
ES 酵素・基質複合体
I
阻害剤
EI 酵素・阻害剤複合体
P
生成物[E]0 全酵素濃度(または[E]) [E]f 遊離の酵素濃度[ES] 酵素・基質複合体濃度[S]0 基質初濃度(または[S])[S]f 遊離の基質濃度k反応速度定数Km ミカエリス定数
Vmax 最大反応速度
Ki
阻害定数（EIの解離定数）１. 酵素反応速度式――ミカエリス・メンテンの式
酵素(E)と基質(S)は速やかに反応して酵素・基質複合体(ES)を形成する。その速度定数はk1である。ついで，
ESは速度定数k2で分解するか，速度定数kcatで反応産物Pになる。全過程は(1.1)のように表わされる。
k1kcat
E ＋ S
ES
E ＋ P
(1.1)
k2
以下，定常状態近似を用いて反応速度（v）を求めると，次のミカエリス・メンテン（Michaelis- Menten）の式
Vmax[S]0Km＋[S]0が得られる。
v＝(1.2)定常状態近似では，複合体の生成速度と消失速度は等しいとおく。
複合体の生成速度＝k1[E]f[S]f(1.3)
複合体の消失速度＝(k2＋kcat)[ES](1.4)
これより，k1[E]f[S]f－(k2＋kcat)[ES]＝0(1.5)
ところで，[E]0＝[E]f＋[ES][S]0＝[S]f＋[ES]＋[P]
なので，これらを(1.4)に代入すると，k1([E]0－[ES])([S]0－[ES]－[P])－(k2＋kcat)[ES]＝0(1.6)となる。
通常の実験条件では[S]0≫[E]0 であり，反応の初期（初速度）*をとれば[P]は無視できるから，[S]0－[ES]－[P]≒[S]0 としてよい。
k1([E]0－[ES])[S]0－(k2＋kcat)[ES]＝0(1.7)*通常，加水分解率が10％以下にする。

変形すると，
k1[E]0[S]0[ES]＝ k ＋k ＋k [S]2cat10(1.8)

生成物を生じる反応速度は次のように表される。
v＝kcat[ES](1.9)を代入して，
k1kcat[E]0[S]0v＝ k ＋k ＋k [S]2cat10(1.9)(1.10)

酵素に対して大過剰の基質を用いた場合，酵素の活性部位の全てが基質で飽和されると考えることができる。つまり、[E]f≒0なので[ES]≒[E]0となり，このときの反応速度を最大反応速度Vmaxと表す。
Vmax＝kcat[E]0(1.11)
これを，(1.10)に代入するとともに，分母分子をk1で割ると，
Vmax[S]0v＝(1.12)
k2＋kcat＋[S]0k1
ここで，k2＋kcat
Km＝(1.13)
k1
とおく。Km はミカエリス定数と呼ばれる。これより，(1.2)が得られる。

Michaelis-Menten の式(1.2)を図で表すと右のようになる。以下，
簡単のために[S]0 を[S]，[E]0 を[E]と記す。
【ミカエリス・メンテンの式の特徴（右図）】
・[S]≫Kmの場合：
v＝Vmaxとなり，反応速度は[S]に依存せず，０次反応になる。
一般にVmaxは酵素濃度に比例するが，酵素濃度一定の条件で測定すれば，Vmaxは定数と見なせる。
・Km≪[S]の場合：
v＝（Vmax／Km）[S]となり，基質濃度に関して一次反応になる。

Vmaxv
Vmax
20Km

[S]

図1 基質濃度と酵素反応速度の関係

２. 動力学パラメーターKmとVmaxの意味
・KmとVmaxは酵素の特徴を表す重要なパラメーターで，反応速度や触媒効率等がわかり，酵素の触媒機構の理解にもつながる。
・最大反応速度Vmaxは，１秒間に酵素が変化させうる基質のモル数で表され，酵素の作用回転数(turn over)という。
・ミカエリス定数Kmの意味： ミカエリス・メンテンの式(1.2)から，v＝Vmax/2のとき，基質濃度[S]＝Kmになる（図参照）。一方，ESの解離定数をKS とすると，KSは次のように表される。
[E]f[S]fk2
KS＝＝(2.1)[ES]
k1
もし，ES→E＋Pの反応が律速段階ならばk2≫kcat となり，(1.2)と(2.1)から，Km≒KSとなる。
したがって，Kmは酵素と基質の親和性を表わすパラメーターと考えてよい。
Km値が小さい程ESの解離が起きにくく，EとSが結合し易いことになる。一般に，EとSは極めて速い平衡にあり，k1，k2≫kcatの条件は満たされていることが多い。
【KmとVmaxの求め方――Lineweaver-Burkプロット】
Michaelis-Mentenの式(1.2)を変形すると，1／vと1／[S]のプロットは次のように直線となる。これをLineweaver-Burkの式という。
1/v
11Km＝＋(2.2)
v
Vmax
Vmax[S]Km
1／[S]に対して1／vをプロットすると，直線のX切片からKm，＋Y切片からVmaxが求まる。Vmaxは直線の傾き(＝Km／Vmax)か
傾き=Km/Vmax[S]0ら求めてもよい。Lineweaver-Burkプロット以外に，Michaelis-Mentenの式を変形したいくつかのプロット法が知1/Vmaxられている。
・Hanes-Woolfプロット[S]
1
K＝[S]＋ m(2.3)
v
Vmax
Vmax
Km
３. 阻害剤と酵素活性への影響＋
３-１ 阻害の形式[S]0
拮抗阻害(Competitive Inhibition)
・阻害剤は活性部位に結合する阻害形式である。
・基質と阻害剤が活性部位を競って結合するため，
Km 値は大きくなるが，Vmax は変化しない。
非拮抗阻害(Non-competitive Inhibition)・阻害剤が活性部位とは異なる部位に結合して酵素の立体構造を変え，基質が生成物に変わるのを抑える阻害形式である。また、酵素基質複合体-1/Km

01/[S]

図2 Lineweaver-Burkプロット（ES）にも結合して阻害するため，基質濃度を高くしても阻害は解消されない。
・Vmax が低下するが，阻害剤は直接活性部位に結合しないため基質の親和性に変化がなく，Km 値は変化しない。
不拮抗阻害(Uncompetitive Inhibition)・阻害剤が遊離の酵素とは結合せず，酵素基質複合体（ES）とだけ結合するような阻害形式である。
・Km 値と Vmax は両方とも変化する。

これらの阻害をモデル的に表わすと，次のようになる。
拮抗阻害

非拮抗阻害

不拮抗阻害

基質活性部位拮抗阻害剤

不拮抗阻害剤

活性部位
非拮抗阻害剤

酵素酵素

図3 酵素の阻害の仕組み

基質生成物

基質

ＥＳ複合体生成物

これらを式で示すと，図４のようになる。反応速度はそれぞれ右の式ようになる。
S
拮抗阻害
kcat
Vmax[S]
v＝
E
ES
E＋P
[I]
Ks
[S]＋Km 1＋
I
Ki

Ki

EI S

非拮抗阻害

EES

KsI
Ki

kcat

Vmax[S]

v＝[I][S]＋Km 1＋
Ki

E＋PIαKi

v＝αKs

EIS

EI

不拮抗阻害

（3.1）

α=1 の場合(3.2)

Vmax[S]

(3.3)

[I]
[I]
[S] 1＋ αK ＋Km 1＋ Kii

α≠1の場合。これを混合非拮抗阻害(Mixed non-competitive inhibition)という。

SS

E

Ks

kcat

ES

v＝E＋PI
Ki

Vmax[S](3.4)[I]
Km＋[S] 1＋Ki

図4 酵素阻害のスキーム（左）と反応速度式（右）EIS

３-２ Lineweaver-Burkプロットによる阻害様式の決定――弱い阻害剤に適用阻害剤が存在するときの Lineweaver-Burk の式は次のようになる。阻害形式はこのプロットで区別できる。
Km1[I][I]1Km11拮抗阻害
不拮抗阻害
v ＝ Vmax[S] ＋ Vmax 1＋ Ki
v ＝ Vmax[S] 1＋ Ki ＋ Vmax
[I]
[I]
[I]
Km
非拮抗阻害 1 ＝混合型 1 ＝ Km1＋ K ＋ 11＋ αK＋ 11＋ Kv
v
Vmax
Vmax
Vmax[S]ii
Vmax[S]
i
拮抗阻害

非拮抗阻害

混合型非拮抗阻害

1v

1v

1v

[I]>0α<0α>01v[I]>0α=0

no inhibitor

－1/Km

不拮抗阻害

no inhibitor

no inhibitor

no inhibitor

1/Vmax－1/Kmobs 0

1
[S]

001
[S]

1
[S]

01
[S]

図5 Lineweaver-Burkプロットによる阻害様式の判定

拮抗および非拮抗阻害では Lineweaver-Burk プロットの直線の傾きが大きくなるが，不拮抗阻害の場合は変化しない。阻害剤のあるなしでの直線の交点は次のような特徴がある（図５も参照）。
表１. Lineweaver-Burk プロットによる阻害様式の判定基準
拮抗阻害
非拮抗阻害
混合非拮抗阻害
不拮抗阻害
Ｙ軸上α=0α>0α<0

Ｘ軸上

Ｘ軸の上方

Ｘ軸の下方

平行

３-３ 見かけのKm（Kmobs）からのKiの計算
拮抗阻害の場合，阻害剤はKmにだけ影響を与えるので，見かけのKmからKiを求めることができる。
[I]

Kmobs＝Km 1＋ Ki(3.5)

図５のようにしてKmとKmobsを求めれば(3.5)からKiを計算できる。

３-４ Dixonプロットによる可逆的阻害剤のKi値の決定[I]≫[E]の条件が当てはまるような，結合が弱い阻害剤の場合，Ki 値の測定法として Dixon 法 2)がある。
【操作】２つ以上の基質濃度で，種々の濃度の阻害剤を酵素に作用させて反応速度を測定する。
Lineweaver-Burk プロットと同様に，次ページの図のようにして 1/v と[I]でプロットする。直線の交点がKi 値である。不拮抗阻害の場合は[S]/v と[I]でプロットして交点から Ki 値を求める。
●1/v と[I]でプロット
ここで，S1<S2
拮抗阻害

非拮抗阻害

S11v

不拮抗阻害
1v

1v

S1S1S2S2S21/Vmax－Ki0[I]

－Ki00

[I]

[I]

図6A DixonプロットによるKi値の決定： 1/vと[I]でプロット●[S]/v と[I]でプロット[S]v

S2[S]v

[S]v

S2

S2

S1
S1

S1Km/Vmax0[I]0－Ki＝Ki’

[I]

－Ki0

[I]

図6B DixonプロットによるKi値の決定： [S]/vと[I]でプロット

４. 強く結合する阻害剤(tight binding inhibitors)
４-1 強く結合する阻害剤のKi値の決定
酵素濃度に近い濃度([I]≈[E])を用いる必要があるような阻害剤ではDixonの方法は使えない。Morrison(1969)3) によって提案さ れた阻害の一般式 (4.15)は，酵素と強く結合する阻害剤の場合に適用できる 。
Morrisonの式は，阻害剤濃度[I]と酵素活性比 fractional enzymatic activity (vi/v0)の関係を示す。
vi([E]＋[I]＋Kiapp)－√([E]＋[I]＋Kiapp)2－4[E][I]
＝
v0
2[E]

(4.15) Morrisonの式【操作】一定濃度の酵素および基質に対して，種々の濃度の阻害剤を作用させ，酵素活性比を計算する。後述の非線形curve-fitting法によって，見かけのKi（Kiapp）が求まる。
見かけの解離定数Kiappから真の解離定数Ki を求めるには，次の式を用いる。
[S]
拮抗阻害： Kiapp＝Ki 1＋(4.16)
Km
Ki（Km＋[S]）非拮抗阻害： Kiapp＝(4.17) ここで，α=1ならば，Kiapp =Kiとなる。
Km[S]Ki ＋ αKi
K
不拮抗阻害： Kiapp＝Ki 1＋ m
(4.18)[S]

（Morrisonの式の導き方）
E ＋ I

kon

EI

(4.1)

koff
酵素と阻害剤の全濃度を[E]，[I]，遊離の酵素と阻害剤の濃度を[E]f，[I]fとす
ると，[E]＝[E]f＋[EI][I]＝[I]f＋[EI]

(4.2)
(4.3)

平衡では，解離定数は次のようになる。

[E]f[I]f[EI]

Ki＝

ところで，[EI]を求めるには，酵素の反応速度を測定する方法が用いられる。
Michaelis-Mentenの式から，阻害剤がない場合の反応速度は，
kcat[E][S]v0＝(4.10)[S] + Km阻害剤が存在すると，反応速度vi は[E]f に比例する。
kcat[E]f[S]vi＝(4.11)[S] + Km
よって，fractional enzymatic activity (vi/v0)は

(4.4)

vi
[E]f
v0 ＝ [E]

変形して，[E]f[I]f[EI]＝Ki
これに(4.2)(4.3)を代入して，([E]－[EI])([I]－[EI])[EI]＝Ki([E]－[EI])([I]－[EI])－Ki[E]＝0(4.2)を代入して，
vi[E]－[EI]
[EI]
＝1－
v0 ＝
[E]
[E]
(4.9)に(4.13)を代入して，
vi([E]＋[I]＋Ki－√([E]＋[I]＋Ki)2－4[E][I]
＝1－
v0
2[E]

(4.5)

(4.6)
(4.7)

展開して，

[EI]2－([E]＋[I]＋Ki)[EI]＋[E][I]＝0([E]＋[I]＋Ki－√([E]＋[I]＋Ki)2－4[E][I]2app

v0vi ＋[E][I]0/(1－vi/v0)30Morrisonの式は非線形なので，コンピュータの使用が一般化する前は使いにくい式だった。そこで，Henderson(1972)4)はMorrisonの式を直線の 式 に 直 し ， グ ラ フ の 直 線 の 傾 き か ら Ki を 導 け る こ と を 示 し た 。
Hendersonの一般式は次のようになる。
v ＝Ki
1－ v i0(4.14)(4.9)

４-2 Hendersonプロット[I](4.13)

基質濃度がKi にどう影響するかは阻害形式で異なる。そこで，Ki の代わりに見かけの解離定数Kiappを用いると，(2.14)からMorrisonの(2.15)が得られる。

(4.8)

根の公式より，[EI]＝(4.12)

20
Slope = Kiapp
10[E]0(2.20)

1234v0/vi
図7 Hendersonプロット【操作】一定濃度の酵素および基質に対して，種々の濃度の阻害剤を作用させ，酵素活性比を計算する。

式(2.20)より，v0/viに対して[I]/(1—vi/v0)をプロットすると，直線の傾きがKiapp，Y切片が酵素濃度[E]となる（図7）。また，次に示すように，阻害の形式も判別できる。
Hendersonプロットによる阻害様式の判定は，基質濃度を増加した時の直線の傾きの変化で調べる（図８）。
拮抗阻害では[S]の増加に伴い傾きも増加するが，不拮抗阻害では逆に減尐する。一方，非拮抗阻害では直線の傾き（=Ki）は基質濃度に影響されない。
拮抗阻害

不拮抗阻害

[S]増加

[I]0/(1－vi/v0)[I]0/(1－vi/v0)[S]増加

図8 Hendersonプロットによる阻害様式の判定[E][E]00v0/viv0/vi

1.0

Hendersonの方法はコンピュータを使用しなくて済むが，式の両辺にv0が入っているためv0 の正しい測定値が必要になる。v0 が不正確な場合はvi値が正しくても計算値が大きくずれ，直線にならなくなる可能性が示
唆されている(Henderson, 1973)。コンピュータの使用が一般化した現代ではMorrisonの式を用いてcurve-fittingすることが可能で，Kiappの算出にはむしろその方が望ましいとされている（図8）。
４-４ 解離平衡定数を用いるKi測定の簡便法

vi/v0

４-3 Morrisonの式を用いるcurve-fitting
0.5010203040[I], nM
図9 Morrisonの式を用いるcurve-fitting.

今，同じモル濃度の酵素と阻害剤（例えば，最終濃度 4×10－7 Mとする）を混ぜて残存活性を測定した時，vi/v0が0.06だったとする。酵素の残存活性が 6%なので，94%は酵素-阻害剤複合体で存在する。
[E]f＝[I]f＝4×10－7×0.06＝0.24×10－7 M[EI]＝4×10－7×0.94＝3.76×10－7 Mとなる筈。式(4.4)より，解離平衡定数は次のようになる。
Ki＝[E]f[I]f(0.24×10－7)2＝＝0.0153×10－7 M≒1.5×10－9 M[EI]
3.76×10－7

この方法は残存活性の誤差により，計算結果がかなり変動するという欠点があるが，おおよその値を見積もるのには使える。（上の例で残存活性を7%にするとKiは2.1×10－9 Mになる。）

５ 引用文献1)

Copeland, R. A., “Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists.” Wiley-Interscience,
2005
2)
Dixon, M., The Determination of Enzyme Inhibitor Constants. Biochem. J., 55, 170-171 (1953); Dixon, M., The graphical determination of Km andKi. Biochem. J., 129, 197-202 (1972); Cornish-Bowden, A Simple Graphical Method for Determining the Inhibition Constants of Mixed,
Uncompetitive and Non-Competitive Inhibitors. Biochem. J., 137, 143-144 (1974).
3)
Morrison, J.F., Kinetics of the reversible inhibition of enzyme-catalysed reactions by tight-binding inhibitors. Biochim Biophys Acta, 185,269-286 (1969).
4)
Henderson, P. J. F., A linear equation that describes the steady-state kinetics of enzymes and subcellular particles interacting with tightly boundinhibitors. Biochem. J., 127, 321-333 (1972).