上原記念生命科学財団研究報告集, 33 (2019)

上原記念生命科学財団研究報告集、33（2019）219. 新規がん特異的遺伝子改変 T 細胞療法の開発研究
越智 俊元
愛媛大学 大学院医学系研究科 血液・免疫・感染症内科学講座
Key words：T 細胞免疫療法，一本鎖抗体，キメラ抗原受容体，可変領域ライブラリー，NY-ESO-1

緒 言
近年、がんに対する T 細胞免疫療法が目覚ましい発展を遂げている。がん細胞に表出される HLA／ペプチド複合体を特異的に認識する T 細胞受容体（TCR：T-cell receptor）遺伝子導入療法が国内外で進められてきた［1］。これらの臨床試験によって、TCR の標的 HLA／ペプチド複合体に対する結合力（標的親和性）を十分に高めることが、高い治療効果に繋がることが示されている。しかしながら、TCR の標的親和性を人為的に向上させた際、がん特異性が低下し、正常細胞も認識する危険性が示唆されている。
このような TCR に関わる課題を解決する手段の一つとして、抗体の重鎖と軽鎖可変領域配列をもとに一本鎖抗体（scFv：single chain fragment variable）を作製し、キメラ抗原受容体（CAR：chimeric antigen receptor）に応用する技術開発が進められた。これらの治療法の一部はすでに承認を受け、一般臨床の場でも用いられる段階に至っている。
scFv は TCR と標的分子を認識する様式が異なり、かつ数千倍標的親和性が高いとされている。従って、CAR を利用することによって、安全性を担保しつつ T 細胞をがん特異的に活性化し、がん細胞を効率的に排除できる可能性がある。
（A2/NY-ESOそこで本研究では、各種がん細胞表面に発現されている HLA-A*02:01/NY-ESO-1157-165 ペプチド複合体1157）を標的モデルとして、A2/NY-ESO-1157 を特異的に認識する既知の抗体（3M4E5）の可変領域配列と、ヒト免疫グロブリン可変領域ライブラリーとを組み合わせ、scFv ライブラリーを作製する。作製した scFv ライブラリーを CARの基本構造に組み込んで、CAR ライブラリーを作製して、T 細胞の応答性をリードアウトとした独自の完全ヒト型 scFvスクリーニング法を確立する。さらに、新たに同定した scFv レパトアを応用して、新規抗原特異的 CAR を作製し、A2/NY-ESO-1157 を標的とした造血器腫瘍や固形癌に対する CAR-T 細胞療法に応用する。

方 法
1． 細胞
K562 細胞株、Plat-A 細胞株（東大医科学研究所、北村俊雄先生より供与）、Jurkat 76 細胞株（Leiden 大学、Dr.
Heemskerk より供与）、PG13 細胞株、T2 細胞株を使用した。ヒト末梢血単核球は健常人より単離して、使用時まで液体窒素内で保管した。
2．遺伝子導入
レトロウイルスベクターに組み込んだ目的遺伝子を Plat-A 細胞に導入してレトロウイルスを得た。これらレトロウイルスを用いて、K562 細胞株に CD80、CD83、および HLA-A*02:01 遺伝子を導入した細胞株（K562／A2／CD80／CD83）を樹立した。また、同様にして、Jurkat 76 細胞株に新規 scFv を保持する CAR 遺伝子を導入した。

3．キメラ抗原受容体
A2/NY-ESO-1157 を特異的に認識する抗体（clone 3M4E5）の可変領域を利用して、3M4E5-scFv を作製した。これを、CD28 膜貫通領域、CD3 鎖を持つ第二世代 CAR に組み込んで、3M4E5-CAR を作製した。CAR 遺伝子導入 T 細胞を検出するために、NGFR（nerve growth factor receptor）遺伝子をタグ遺伝子として利用した。

1

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4．可変領域ライブラリーの作製
ヒト末梢血単核球より CD19 マイクロビーズを用いて末梢血 B 細胞を単離した。RNA を単離した後、5’RACE 法に準じて cDNA を作製した。軽鎖もしくは重鎖定常領域を認識するプライマーを用いて 5’RACE PCR を行なった。このPCR 産物を鋳型として、J 領域特異的なプライマーセットを利用して semi-nested PCR を行い、ドナー毎に可変領域ライブラリーソースを作製した。
5．A2/NY-ESO-1157 CAR ライブラリーの作製
3M4E5-scFv の片方の鎖を固定して、もう片方を可変領域ライブラリーソースに置換することで、A2/NY-ESO-1157
scFv ライブラリーを作製した。これを第二世代 CAR の scFv 領域に組み込んで、A2/NY-ESO-1157 CAR ライブラリーを作製した。
6．A2/NY-ESO-1157 CAR ライブラリーT 細胞の作製
Plat-A 細胞株を用いて A2/NY-ESO-1157 CAR ライブラリーを含有するレトロウイルスを得た。これを PG13 細胞株に導入して、GaLV レトロウイルスを作製した。末梢血 T 細胞を 50 ng/mL 抗 CD3 抗体（clone OKT3）、100 U/mL
IL-2 存在下で刺激した後、CAR ライブラリー遺伝子を末梢血 T 細胞に導入して、A2/NY-ESO-1157 CAR ライブラリー
T 細胞を樹立した。MACS ビーズを用いて NGFR 発現細胞を単離し、NY-ESO-1157 ペプチドをパルスした K562／A2／CD80／CD83 細胞株で繰り返し刺激して、A2/NY-ESO-1157 特異的 CAR-T 細胞を濃縮した。
7．フローサイトメトリー
A2/NY-ESO-1157 CAR ライブラリー遺伝子を導入した T 細胞を、A2/NY-ESO-1157 テトラマーおよび A2/HIV Gag77
テトラマーで染色し、CD8、CD4、NGFR 抗体で共染色した。さらに、FACSAria を用いて NGFR＋CD8＋A2/NY-ESO1157 テトラマー陽性細胞および NGFR＋CD4＋A2/NY-ESO-1157 テトラマー陽性細胞を単離した。CAR-T 細胞の標的特異的サイトカイン産生を解析するために、TNF-α抗体、IL-2 抗体、IFN-γ抗体を用いて CAR-T 細胞内染色を行なった。

結 果
1．3M4E5-CAR 導入 T 細胞の A2/NY-ESO-1157 特異性
A2/NY-ESO-1157 CAR（3M4E5-CAR）を遺伝子導入した T 細胞は、A2/NY-ESO-1157 テトラマーによって特異的に染色された。さらに、HLA-A*02:01 陽性である T2 細胞株に NY-ESO-1157 ペプチドをパルスした標的細胞を特異的に認識して、各サイトカインを産生した（図 1）。
2．CAR ライブラリー導入 T 細胞の A2/NY-ESO-1157 特異性
末梢血 T 細胞に A2/NY-ESO-1157 CAR ライブラリーを遺伝子導入した。NGFR 陽性細胞を単離し、NY-ESO-1157 ペプチドをパルスした K562/A2/CD80/CD83 細胞株で刺激した。3 回刺激後、CAR ライブラリーT 細胞における A2/NYESO-1157 テトラマー陽性率を解析した。その結果、軽鎖 （Lambda：L 鎖）ライブラリーと 3M4E5 重鎖からなる scFvを保持する CAR ライブラリーT 細胞において、CD8 陽性 T 細胞においても、CD4 陽性 T 細胞においても、有意に。重鎖（H 鎖）ライブラリーと 3M4E5 軽鎖からなる scFv を
A2/NY-ESO-1157 テトラマー陽性細胞が増加した（図 2）
保持する CAR ライブラリーT 細胞においても、一部のドナーにおいて A2/NY-ESO-1157 テトラマー陽性細胞を検出した（図 2）。

2

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Control T cells

C
CD8+ T cells
IFN-γ production (%)

A2/NY-ESO-1157 A2/HIV Gag77

A2 tetramer

A

3M4E5LH-CAR
T cells30

CD4+ T cells
30

T2 + HIV Gag77

T2 + HIV Gag77
T2 + NY-ESO-1157

T2 + NY-ESO-1157

202010100control

0

3M4E5LH-CAR

control

3M4E5LH-CAR

A2 tetramer

IL-2 production (%)

CD8aControl T cells

CD410010050n=5 (CD4+)

T2 + HIV Gag77
T2 + NY-ESO-1 157

44220control

0

3M4E5LH-CAR

10T2 + HIV Gag77

8T2 + NY-ESO-1157

control

15

3M4E5LH-CAR

T2 + HIV Gag77
T2 + NY-ESO-1157

1064

520control

0

3M4E5LH-CAR

control

3M4E5LH-CAR

co-C

ntr
ol

AR

l-Cntro

3M

4E
5L
H

co

AR

004E
5L
H

50n=5 (CD8+)

3M

A2/NY-ESO-1157
tetramer positivity (%)

B

6T2 + HIV Gag77
T2 + NY-ESO-1 157TNF-α production (%)

3M4E5LH-CAR
T cells6

図 1．A2/NY-ESO-1157 特異的 CAR-T 細胞
A) A2/NY-ESO-1157 特異的 scFv（3M4E5-scFv）を組み込んだ第二世代 CAR を末梢血 T 細胞に遺伝子導入して、A2 テトラマーで染色を行った。NGFR 陽性細胞をゲーティングして解析した。
B) 3M4E5-CAR-T 細胞は再現性をもって A2/NY-ESO-1157 テトラマーに染色された （n = 5）。
C) 3M4E5-CAR-T 細胞は NY-ESO-1157 ペプチドをパルスした T2 細胞を認識して、各サイトカインを産生した。
hL_3M4E5H-CAR

hH_3M4E5L-CAR

A2/HIV Gag77

A2/NY-ESO-1157

Donor 1

Donor 1

Donor 2

Donor 2

A2/HIV Gag77

CD8aCD8aCD8+ T cells

CD4+ T cells
10075506

Transduced with CAR-library

AR

AR
4E

5L-C

AR-C-C
M

5H

5H
4E

M

M

/3AR

tr oC

on

5/3

C

4E
3M

4E

5L

-C

AR

AR-C-C
/3
hH

/3
M

4E

5H

5H
hL

M

M

AR

tr oC

on

54E

3M

hK/3

C

CD4

l0

4E

30AR

3*

hK

*l

Donor 4100
755064E

A2/NY-ESO-1157
tetramer positivity (%)

Donor 3/3

B

hH

A2/NY-ESO-1157

hL

A

Transduced with CAR-library

図 2．A2/NY-ESO-1157 特異的 CAR ライブラリーT 細胞A） L 鎖 CAR ライブラリー、および H 鎖 CAR ライブラリーを末梢血 T 細胞に導入後、A2 テトラマーで染色した。
B） L 鎖 CAR ライブラリーT 細胞は、CD8 陽性 T 細胞も、CD4 陽性 T 細胞も有意に A2/NY-ESO-1157 テトラマーに染色された（Mann Whitney test、* p < 0.05）。

3．新規 A2/NY-ESO-1157 scFv 遺伝子の同定
上記 A2/NY-ESO-1157 テトラマー陽性細胞を単離して、新規 scFv 遺伝子の同定を行なった。その結果、全く新しいH 鎖である H1 と、複数の L 鎖とを同定した。さらに、軽鎖（Kappa：K 鎖）ライブラリーと H1 からなる scFv を保持する CAR ライブラリーT 細胞の中から、CD8 陽性 T 細胞において A2/NY-ESO-1157 テトラマー陽性細胞を検出した
ため（図 3）、同様にこの集団を単離して、新規 scFv 遺伝子の同定を行なった。その結果、全く新しい複数の K 鎖を同定した（表 1）。
3上原記念生命科学財団研究報告集、33（2019）

hK_H1-CAR
A2/NY-ESO-1157

A2/NY-ESO-1157

A2/HIV Gag77

ControlDonor 1

H1 CARDonor 2

A2/HIV Gag77

CD8a

CD8a

図 3．A2/NY-ESO-1157 特異的 K_H1-CAR ライブラリーT 細胞
H1 を固定した K 鎖 CAR ライブラリーT 細胞を、A2 テトラマーで染色した。

表 1．新たに同定した A2/NY-ESO-1157 特異的可変領域配列
Clone

V region

J region

Heavy chains
H1

4-59*01

6*02

3M4E5H

3-20*01

6*02

Light chains (paired with H1)
K131

1-NL1*01

K145

1-NL1*01

5*01
1*01

K151

1-39*01

5*01K156

3-15*01

3*01

K160

3-15*01

1*01

3M4E5L

11*01

1*01

3M4E5Lを固定して、H鎖ライブラリーより新たにA2/NY-ESO-1157特異的なH1鎖を同定した。
同様にH1を固定して、K鎖ライブラリーよりA2/NY-ESO-1157特異的な各K鎖を同定した。

4．新規 A2/NY-ESO-1157-CAR の標的特異性
新しく同定した scFv を保持する CAR 遺伝子を、それぞれ Jurkat 76（J76）細胞株に遺伝子導入して、その標的特異性を確認した。図 4 に示す通り、J76/H1_3M4E5L CAR は、J76/3M4E5 CAR 細胞株と同様に A2/NY-ESO-1157 テトラマーで染色された。さらに、J76/K_H1 細胞株は、K 鎖を変化させることによって、A2/NY-ESO-1157 に対して様々な標的親和性と交差反応性とを示すことが明らかとなった。
Jurkat 76 cells transduced with
3M4E5-CAR

3M4E5L_H1-CAR

K145_H1-CAR

K156_H1-CAR

K160_H1-CAR

K131_H1-CAR

K151_H1-CAR

Control

A2/NY-ESO-1157

A2/HIV-Gag77

図 4．A2/NY-ESO-1157 特異的新規 CAR 遺伝子の標的特異性と交差反応性
H1 と、様々な K 鎖を保持する CAR 遺伝子をそれぞれ個別に Jurkat 76 細胞株に遺伝子導入し、A2 テトラマーで染色した。positive control として 3M4E5-CAR を遺伝子導入した Jurkat 76 細胞株を、negative control として NGFR のみ遺伝子導入した Jurkat 76 細胞株を用意した。

4

上原記念生命科学財団研究報告集、33（2019）

考 察
我々は、A2/NY-ESO-1157 特異的抗体をモデルとして、末梢血 B 細胞由来可変領域を用いた CAR ライブラリーを作製した。片方の鎖を可変領域ライブラリーソースに置換することで、CAR をベースに T 細胞応答性をリードアウトとした全く新しい新規 scFv 遺伝子の同定法を確立した。
がん抗原特異的 scFv を同定する方法は大きく 2 つに分けられる。1 つは Phage display 法、もう 1 つはマウスに標的抗原を免疫して抗体を作製するハイブリドーマ法である。どちらの方法も、作製した scFv が CAR として機能するかはスクリーニングの時点では不明である。しかし、本手法では、scFv 遺伝子内の軽鎖、もしくは重鎖可変領域遺伝子の片方を抗原特異的な鎖に固定することによって、理論上 10６程度のヒト免疫グロブリン可変領域ライブラリーを駆使して新たな scFv をスクリーニングすることが可能となる［2］。従って、T 細胞を用いて CAR として機能する scFvをスクリーニングできることから、効率の良いシステムであると言える。
多くのがん抗原特異的マウス由来 scFv においては、マウスとヒト遺伝子配列との相同性を利用して、超可変領域を除いてヒト型に置換したヒト型類似 scFv などが作製され臨床応用されてきた。しかし、輸注時に生じる異種アレルギー反応を回避するためには、完全ヒト型がん抗原特異的 scFv を作製し利用することが望ましい。本手法を用いれば、理論上、マウス由来 scFv をもとに完全ヒト型 scFv レパトアを作製することが可能となる。scFv の片鎖を固定したスクリーニング技術であるため、標的結合部位を保持したレパトア作製が可能である点も大きな特徴である。
図 4 に示すように、新規に同定した A2/NY-ESO-1157 特異的 H1 鎖を固定して、K 鎖を変化させることで、非常に幅広く scFv の A2/NY-ESO-1157 結合性を変化させることが可能であった。さらに、K156_H1-CAR のように、A2/NYESO-1157 にも、A2/HIV Gag77 にも、両方に結合する新規 scFv の同定にも成功した。MHC／ペプチド複合体を認識する scFv の結晶構造解析によると、scFv の標的認識方法には大きく 3 種類ある。（A）MHC とペプチド複合体とを両方認識する場合、（B）MHCα1 ドメインに寄りかかる形で認識する場合、（C）MHCα2 ドメインに寄りかかる形で認識する場合である。（B）と（C）の認識様式では、MHC への依存度が高まり、ペプチド依存性が低下するようである［3，4］。3M4E5-CAR や、多くの K_H1-CAR レパトアは A2/NY-ESO-1157 特異的に認識しているため、（1）の認識様式が想定されるが、K156_H1-CAR は（2）および（3）の認識様式が想定される。このことは、片方の差を変化させることによって、A2/NY-ESO-1157 に対する標的親和性、ならびに交差反応性が細かく変化していくことを示している。将来的には NY-ESO-1157 ペプチド依存性を高めた CAR（scFv）の同定も可能であるかもしれない。
CAR-T 細胞の標的に対する反応性は、scFv の標的親和性だけでなく、CAR 細胞内シグナル伝達ドメインにも大きく影響される。新規 A2/NY-ESO-1157 scFv は、第二世代 CAR を用いて同定したものである。CAR の細胞内ドメインを改良して、T 細胞活性化シグナルを強化する試みが盛んになされているが、細胞内ドメインや CAR の構造に応じて、scFv の適切な標的親和性/立体構造が異なる可能性がある。その意味で、様々な A2/NY-ESO-1157 scFv レパトアを作製して保持することは、次世代 CAR に適した scFv レパトアを保持することでもあり、極めて有用であると考えられる。
本研究課題では A2/NY-ESO-1157 をモデルとしたが、他の抗体可変領域を利用した scFv においても応用が可能である。初期段階ではあるが、我々は、CD19 特異的抗体（clone FMC63）を用いて、HLA／ペプチド複合体以外の表面抗原においても本技術が応用可能であることを確認している。将来的には、がん免疫 T 細胞療法、特に CAR-T 細胞療法において最適と考えられる様々ながん抗原特異的 scFv レパトアを作製して、臨床応用を目指したいと考えている。

共同研究者・謝辞
本研究において、愛媛大学プロテオサイエンスセンターの安川正貴先生にご指導を賜った。

5上原記念生命科学財団研究報告集、33（2019）文 献1） Rapoport AP, Stadtmauer EA, Binder-Scholl GK, et al. NY-ESO-1-specific TCR-engineered T cells mediate

sustained antigen-specific antitumor effects in myeloma. Nat Med. 2015;21（8）:914-21. PMID:26193344 DOI
10.1038/nm.3910
2） Jespers LS, Roberts A, Mahler SM, et al. Guiding the selection of human antibodies from phage display

repertoires to a single epitope of an antigen. Biotechnology （N Y）. 1994;12（9）:899-903. PMID:7521646
3） Mareeva T, Martinez-Hackert E, Sykulev Y. How a T cell receptor-like antibody recognizes major
histocompatibility complex-bound peptide. J Biol Chem. 2008;283 （ 43 ） :29053-9. PMID:18703505
DOI:10.1074/jbc.M804996200
4） Ataie N, Xiang J, Cheng N, et al. Structure of a TCR-Mimic Antibody with Target Predicts Pharmacogenetics.
J Mol Biol. 2016;428（1）:194-205. PMID:26688548 DOI:10.1016/j.jmb.2015.12.002

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