生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

シリアルフェムト秒結晶構造解析における結晶導入法
菅原道泰
国立研究開発法人理化学研究所放射光科学総合研究センター SACLA 利用技術開拓グループ〒6795148

兵庫県佐用郡佐用町光都 111

登野健介（公財）高輝度光科学研究センター XFEL 利用研究推進室先端光源利用研究グループ実験技術開発チーム〒6795198

兵庫県佐用郡佐用町光都 111

南後恵理子
国立研究開発法人理化学研究所放射光科学総合研究センター SACLA 利用技術開拓グループ〒6795148

岩田

兵庫県佐用郡佐用町光都 111

想国立研究開発法人理化学研究所放射光科学総合研究センター SACLA 利用技術開拓グループ〒6795148

兵庫県佐用郡佐用町光都 111

国立大学法人京都大学大学院医学研究科〒6068501

京都府京都市左京区吉田近衛町

X 線自由電子レーザー（XFEL）を用いたシリアルフェムト秒結晶構造解析（SFX）は，ランダムな配向の微結晶

を X 線レーザー照射ポイントに連続的に供給し，多数の結晶からの回折イメージを収集して構造解析を行う。
XFEL の非常に強力な X 線パルスにより，照射後試料は崩壊するが，放射線損傷によって化学結合が切断されるよ■
要
旨り短い時間（＜ 10 fs）でデータを測定するため，放射線損傷が無視できる構造を得ることが可能である。 XFEL
施設 SACLA ではタンパク質結晶の連続供給から回折イメージ収集まで行うことができる SFX 実験システム
DAPHNIS を開発し，結晶を含む液状試料をそのまま液体ストリームとして吐出する液体ジェットインジェクターに加え，最近では高粘度媒体で結晶を懸濁させることで低速で安定に吐出できる手法を見出し，その高粘度試料専用インジェクターを導入した。結果として，従来の液体ジェット法と比べて試料消費量が 1/10～1/100の 1 mg
以下でのタンパク質結晶構造の決定が可能になった。

Crystallography)1)が注目されている（ Fig. 1a）。 SFX では

1. はじめにランダムな配向のタンパク質結晶を X 線レーザー照射ポ

X 線自由電子レーザー（ XFEL  X ray Free Electron

イントに連続的に供給しながら，多数の結晶からの各回折

Laser）は超高輝度，極短パルス，高空間コヒーレンスと
イメージを収集して構造解析を行う。その特徴として，◯いう特徴を有している。生物試料を対象とした研究では，

連続して試料を供給するために微小結晶（一般には30 mm

XFEL によるタンパク質結晶の X 線構造解析，非結晶試

 試料の放射線損傷低減のために100 K以下）を用いる。◯

料からのコヒーレント X 線回折イメージング等の研究が程度の条件下で行う従来の回折実験とは異なり常温で行展開されている。現在，稼働中の XFEL 施設は，理研のう。そのため，生理条件（生体内）に近い条件でタンパク「SACLA（SPring8 Angstrom Compact Free Electron

質立体構造を得ることができる。また，極短パルスの X

Laser ）」 と 米 国 SLAC 国 立 加 速 器 研 究 所 の 「 LCLS

 放射線損傷を無視できる状態
線レーザーを使用するため◯（Linac Coherent Light Source）」があり，また欧州やアジ フェムト～ピコ秒単位でのでの構造解析が可能であり，◯

ア の 国 々 で XFEL 施 設 の 建 設 計 画 が 進 行 中 で あ る 。

時分割実験が行える。しかしながら， SFX は新しいタン

SACLA の光は SPring 8 と比較して 10 億倍もピーク輝度

パク質構造解析法であるため，その手法技術はまだ開発が高いため，1 パルスの照射により測定試料は崩壊してし段階にあり，特に X 線レーザー照射ポイントに微結晶をまうが， 10 フェムト秒以下という超短パルスゆえに，試一定の流速で安定に無駄なく導入することは難しく，結晶料が壊れる前の回折イメージを検出できる（ diŠraction 

導入法の確立が急務であった。そこで本稿では現在

before destruction と呼ばれている）。この XFEL の特性

SACLA での SFX 実験で導入されている連続結晶供給法を利用した主なタンパク質の構造決定法として，シリアルについて紹介する。

フ ェ ム ト 秒 結 晶 構 造 解 析 （ SFX  Serial Femtosecond

198 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4
(C) 2016 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

Fig. 1(Color online) Serial femtosecond crystallography. (a) Fresh nano/microcrystals are supplied for subsequentXray pulses to continue data acquisition. (b) Sample extrusion of the grease matrix through an inner diameter
110 mm nozzle. Grease matrix was extruded as a continuous column to intersect with the XFEL beam. Scale bar
represents 240 mm.

2. SFX における結晶導入法

をインジェクターから 0.3 ml / min 以下の低速で吐出すると，低粘度の溶液では液滴になってしまい連続に出すこと

SFX では，主に液体ジェットインジェクターと呼ばれは困難であるが，析出した結晶を含む LCP は高粘度ゆえる装置から噴出される多数の微結晶を含む液体ストリームにカラム状で連続的に押し出すことが可能である。結果とに X 線レーザーを照射する（液体ジェット法）。液体ジェして，この方法で試料導入を行うと，非常に少量の試料

ットインジェクターは，世界で最初に行われた SFX 実験（1 mg 以下）で構造決定に必要なデータが収集できる。一に導入され，LCLS では現在でも主流のインジェクターと方で，全てのタンパク質結晶を LCP 法により得るのは困して用いられている。本インジェクターでは，吐出された難であり，他の結晶化法から得た結晶でも少ない試料消費

液体ストリームの径をヘリウムガスにより絞り込むこと

量で SFX 実験ができる結晶導入法が必要である。

で，溶液からの散乱バックグランドノイズ，および試料消そこで我々は，蒸気拡散法などで結晶化した水溶性，お費量を低減でき，さらに試料が途切れることなく直線状のよび膜タンパク質結晶試料を高粘度化するための技術開発

安定した液体ストリームを形成できる。我々は SACLAを行った。具体的には，結晶輸送媒体としての高粘度物質で開発した液体ジェットインジェクターを用いて，これまとタンパク質微結晶を混ぜ合わせることで，結晶を X 線

でサイズ 1 mm のリゾチーム結晶から 2.4 Å 分解能での構レーザーの照射ポイントに低流速で供給する手法を検討し造解析に成功している。ただし，液体ジェット法ではサンた。その際，高粘度物質に必要とされる以下の条件を考慮

プルストリームを安定に保つために速い流速（10～300 ml

した。タンパク質結晶と混合しても結晶に損傷を与えない/min 程度）で試料を吐出する必要がある。この方法では，こと。高濃度の塩や多種多様の試薬を含む結晶溶液と混合

一般に結晶構造を決定するには 10～100 mg のタンパク質

しても，インジェクターから安定に試料を流せること。結を必要とする。しかしながら，回折イメージを収集する際，晶輸送媒体由来の散乱バックグランドノイズが低いこと。

X 線レーザーにヒットする結晶の数は全結晶の0.01程度

また，インジェクターノズルでの目詰まりを起こさないたのため，ほとんどの結晶が無駄になる。さらに，ガスフ

めに，結晶輸送媒体内で微結晶が凝集せず均一に分散する

ォーカスで用いるヘリウムガスが常時試料溶液に吹き付けこと。最初に我々は結晶輸送媒体としてハイドロゲルの導られるため，高濃度塩を含む試料ではインジェクターノズ

入を試みたが，水溶性媒体の使用は浸透圧により結晶に損

ル付近で塩結晶が析出し，その結果，サンプルストリーム

傷を与えることが問題となった。そこで，水溶性物質とはを乱すことも問題である。

異なる高粘度媒体を調査した結果，タンパク質結晶の輸送

最近になって，高粘度試料をそのままインジェクターか媒体として鉱物オイルベースのグリース（＃761，AZ Co.）ら吐出することで，大幅に試料消費量を低減した結晶導入が利用できることを見出し，これを高粘度試料専用インジ法が報告された2)。 Lipidic Cubic Phase （LCP）法は膜タ

ェクターに充填して測定する方法「グリースマトリックス

ンパク質をターゲットとした結晶化法の 1 つであり，サ法｣3)を開発した（ Fig. 1b）。従来の X 線結晶構造解析におイズが小さいが高分解能の回折能を有する結晶を多数析出

いては，タンパク質の放射線損傷を低減させるために結晶する傾向があるため， SFX に適した結晶を得ることがでの凍結処理を行う。その際，オイルはタンパク質結晶の汎きる。この方法では，モノオレインなどの脂質と膜タンパ

用的クライオプロテクタントとしてよく用いられており，

ク質を LCP へと再構成し，沈殿剤を加えて結晶化を行う

多くの場合タンパク質結晶に損傷を与えないことが知られことから，一般的に結晶は高粘度環境下で析出する。試料ている。したがって，オイルベースのグリースは， SFX

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 199

における汎用的高粘度結晶輸送媒体となることが期待でき

ノズル先端部での試料の巻き付きを防止し，直線状のストた。

リームを形成することができる。さらに，サンプルカート
リッジにより試料の充填を行うため，効率良く測定試料を3. DAPHNIS を用いた SFX

交換することができる。また，恒温水循環システムにより，試料充填部は 4～20°
Cの任意の温度で保持できる。

SACLA での SFX は，汎用的実験システム DAPHNIS（diverse application platform for hard Xray diŠraction in
SACLA）を用いて行っている4)。DAPHNIS システムは，

サンプルチャンバー，各種サンプルインジェクター，およ4. グリースマトリックス法を用いた回折実験，および室温結晶構造

び multiport chargecoupled device（MPCCD）検出器5)

我々は SACLA で独自に開発したグリースマトリック

により構成されている（Fig. 2）。これら一連の装置を一つス法の実用性を確かめるため，リゾチーム，グルコースイのシステムとして構築したことで，SACLA 実験ハッチ内

ソメラーゼ，ソーマチン，および脂肪酸結合タンパク質への迅速な搬入設置を可能にし，限られたビームタイム（FABP3）の 4 種類の水溶性タンパク質の結晶（サイズ約を効率よく利用することができる。また，米国 XFEL 施

7 ～ 30 mm ，その一例

Fig. 3a ）を用いた SFX 実験を試み

設の LCLS では空気散乱を防ぐために真空サンプルチャ

た。測定は SACLA ビームライン BL3 にて DAPHNIS を

ンバーを導入しているのに対し， DAPHNIS のサンプル

用 い ， 測 定 波 長 1.24 Å ， 繰 り 返 し 周 波 数 30 Hz で 行 っチャンバー内は大気圧ヘリウム雰囲気環境下のため，迅た。集光したビームのスポットサイズはサンプル位置で約速，かつ容易に測定試料を交換することができる。そのチ

1.5 mm 径（半値全幅），パルスあたりの光子数は 7 × 1010

ャンバー内は温度 26 °C ，湿度 80 ～ 99 に保たれている

photons / pulse であった。各試料 30 ml 程度を内径 110 mm

が，実験目的，または測定試料に応じて調整が可能であのノズルから吐出させ，約 1 時間の測定で約 10 万枚の回る。また， MPCCD 検出器は，測定試料の飛散，および折イメージを収集した（試料流速0.46～0.48 ml/min）。グ

不要な光の入射を防止するために，サンプルチャンバーとリースマトリックス法を用いることで，良質な回折イメー

ベリリウムウィンドウで仕切られている。
現在，我々は液体ジェットインジェクターに加えて，
LCP ，およびグリースマトリックス法で使用する高粘度

試 料 用 イ ン ジ ェ ク タ ー を 開 発 し ， DAPHNIS を 用 い た
SFX で使用している。初期型の高粘度試料用インジェク

ターにおいては，ハミルトンシリンジに試料を充填し，プ
ランジャーをモーターで駆動することでニードルから試料を吐出するというシンプルな機構を導入した。また，最近開発した第二世代の高粘度試料専用インジェクターでは，HPLC ポンプにより水圧でシリンダーを押すことで試料を吐出する機構になっている。このインジェクターはヘリ
ウムガスによるストリームガイド機能を有しているため，Fig. 3Fig. 2(Color online) The DAPHNIS system. The experimental
system DAPHNIS consists of a sample chamber, injectors
and an MPCCD detector with eight sensor modules.

200 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

(Color online) (a) Lysozyme microcrystals used for SFX
measurements. Scale bar represents 100 mm. (b) A typical
XFEL single diŠraction pattern from grease matrix. Resolution at the edges corresponds to ～1.6 Å (lined circle).

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

ジを得ることができた（ Fig. 3b ）。 SFX で回折イメージを結晶から回折データを収集する従来の結晶構造解析法と比処理するためのプログラム CrystFEL6) を使用し，最終的較し，室温環境下での数万個の結晶からの回折データを平に各試料で 1 万～3 万枚の指数付け可能な回折イメージを均化する SFX では，結晶のクライオ処理による影響がな得た。

く，また各結晶固有の誤差がキャンセルされる。さらに結各タンパク質において，結晶構造の評価に十分な回折分晶が放射線損傷を受けないため，ジスルフィド結合の解離

解能 2 Å 以上の回折データセットの収集に成功し，構造などのない“より天然状態を反映した”電子密度マップがを決定した。使用した各試料タンパク質は 1 mg 以下であ得られる傾向がある。 SFX により得られる結晶構造の特り，従来の液体ジェット法に比べ 1 / 10 ～ 1 / 100 の試料消徴の詳細は今後徐々に明らかになるであろう。また，グ費量の少量化に成功した。また内径110 mm のノズルを使

リースマトリックスを用いた SFX を進めていく中で，グ用した場合，測定に最適な試料の結晶密度は 107 個/ml でリースが結晶に損傷を与える試料も幾つか見つかっていあった。使用した各試料は高濃度塩，もしくは高濃度のポる。その対策として，我々は浸透圧による結晶損傷を与えリエチレングリコールを含んでいたが，本グリースマトリ

にくい水溶性高粘度結晶輸送媒体を既に見出している。こックス法においてはそれら溶液の組成に大きく影響される

れら油性，および水溶性媒体を使い分けることで膜タンパことなく安定に試料を流すことができた。

ク質を含む様々なタンパク質の SFX 実験が可能になりつ

次に，結晶サイズ 7 ～ 10 mm のリゾチーム結晶を用いつある。

て，内径50 mm のノズルからの試料吐出を行った。その結果，内径 50 mm のノズルでも安定にタンパク質結晶を X
線レーザー照射ポイントに供給することができ，回折分解

5. 終わりに

能2.0 Å のデータ収集，および構造決定に成功した。細い我々は，タンパク質結晶を高粘度物質のグリースに混ぜ径のノズルの使用は試料消費量の大幅な低減（内径 110て試料供給を行う「グリースマトリックス法」の開発に成mm ノズルの場合と比較して約 1 / 10 の 0.1 mg 程度）に加功し，高粘度試料専用インジェクターを導入した汎用的実

えて，グリース由来の散乱バックグランドノイズの低減に

験システム DAPHNIS を用いることで多種多様のタンパも寄与する。

ク質試料の SFX 実験を可能にした。その高粘度試料を用

現在，さらなる SN 比向上を目指して，よりバックグラ

いることで，必要なタンパク質試料が 1 mg 以下と従来のンドノイズの低い結晶輸送媒体を調査している。一例とし

液体ジェット法の 1 / 10 ～ 1 / 100 程度での結晶構造解析がて，鉱物オイルベースのグリースと比較して散乱バックグ可能になった。これまで，グリースマトリックス法によ

ランドの低い合成グリース（Super Lube, ＃21030, Synco

り，膜タンパク質を含む 20 種以上のタンパク質試料から

Chemical Co. ）を導入した SFX 実験を行っている。本合の良質回折データを収集し，幾つかの試料で結晶構造の決

成グリースを利用することで，我々は同サイズの結晶，お定に成功している79) 。また中津亨博士（京都大学）らのよび内径 110 mm ノズルを用いて，より高分解能の 1.6 Å

研究グループは，グリースマトリックス法を用いて，重原

回折分解能でのリゾチームの結晶構造を得ることに成功し子の水銀の異常分散効果を利用した単一重原子同型置換

た（Fig. 4）。一般に，クライオ条件下で 1 個のタンパク質（SIRAS）法による新規タンパク質結晶構造の決定に成功
している10) 。加えて我々は，重原子化が難しい試料のために，タンパク質が有する硫黄原子を利用した単波長異常分散（ S SAD ）法による構造決定にも成功した11) 。このように SACLA では各タンパク質に応じて様々な構造解析法が利用できることを実証している。
世界各国でも SFX で使用するインジェクターの高度化が行われており，今日では XFEL のフェムト秒という超短パルス幅を活かした時分割実験が展開されている。酵素
反応，また光励起などに伴うタンパク質，およびリガンドの状態変化が起きるフェムト秒～マイクロ秒間の動的過程を観察する実験が積極的に行われている。現在， SACLA
では光励起に伴う一連の構造変化を観察するポンププ
ローブ実験が進行中である。 DAPHNIS の高粘度試料専用インジェクターは，低速から高速までの広い領域で安定

Fig. 4(Color online) A close
up view of the lysozyme structurewith a 2FoFc electron density map (contoured at the 1.0s
level) at 1.6 Å resolution.

した試料の吐出が可能であるため，試料供給速度の安定性が重視されるポンププローブ実験に適している。また最近では，放射光施設の X 線を利用して10～100ミリ秒オー

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 201

ダーの露光時間で行うシリアルミリ秒結晶構造解析（SMX）も行われており12,13)，高粘度結晶輸送媒体を用い3)て行われた構造解析例も報告されている。近い将来，実験目的に応じて手法実験施設を選べるようになるであろう。最後に，本研究で開発した高粘度媒体を用いた SFX
は，今後さらに重要度を増すことが期待され，また本手法

4)はタンパク質結晶のみを研究対象として限定するものではなく，有機，無機物質を問わず幅広い研究対象への応用が期待できる。

5)謝辞
本研究は文部科学省 X 線自由電子レーザー施設重点6)

戦略研究課題の「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発」（研究代表者岩田想)14) において，理化学研究所，高輝度光科学研究センター，東京大学，京都大学，大7)

阪大学，兵庫県立大学，高エネルギー加速研究機構の共同で実施された成果の一部である。特に，高粘度媒体を用いた研究については，溝端栄一博士（大阪大学），鈴木守博
士（大阪大学），桝田哲哉博士（京都大学），井上茂之博士

8)（東京大学）らに深謝する。

参考文献
9)
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202 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

10)

11)

12)

13)

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M. Sugahara, S. Inoue, T. Masuda, F. Yumoto, N. Matsugaki, E. Nango, K. Tono, Y. Joti, T. Kameshima, C. Song, T.
Hatsui, M. Yabashi, O. Nureki, M. E. P. Murphy, T. Inoue,
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T. Nakane, C. Song, M. Suzuki, E. Nango, J. Kobayashi, T.
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Tanaka, T. Shimamura, K. Tono, Y. Joti, T. Kameshima, T.
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その詳細は http://www1a.biglobe.ne.jp/sfxproject/

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

著者紹介
菅原道泰

南後恵理子

理化学研究所放射光科学総合研究センター
SACLA 利用技術開拓グループ 特別研究員
Email: msuga＠spring8.or.jp
専門構造生物学［略歴］
2000 年大阪大学大学院工学研究科物質
生命工学専攻博士後期課程修了，工学博士。米国リーハイ大学化学科博士研究員，理化学研究所研究員を経て， 2015 年 7 月より現職。

理化学研究所放射光科学総合研究センター
SACLA 利用技術開拓グループ 研究員
Email: nango＠spring8.or.jp
専門構造生物学，生物有機化学［略歴］
2004 年東京工業大学大学院理工学研究科
化学専攻博士課程単位取得満期退学，理学博士。 2004 年同大学助手， 2007 年同大学助教などを経て2013年 4 月より現職。

登野健介
高輝度光科学研究センター XFEL 利用研究
推進室先端光源利用研究グループ実験技術
開発チーム チームリーダーEmail: tono＠spring8.or.jp
専門物理化学［略歴］
2002 年東京大学大学院理学系研究科化学専攻博士課程修了，理学博士。東京大学博士研究員，東京理科大学助教，理化学研究所研究員を経て，2011年 4 月より現職。

岩田想

理化学研究所放射光科学総合研究センター
SACLA 利用技術開拓グループ グループ
ディレクターEmail: s.iwata＠spring8.or.jp
専門X 線結晶学，膜タンパク質構造生物学［略歴］
1991 年東京大学大学院農学系研究科博士課程修了，農学博士。インペリアルカレッ
ジロンドン生命科学科（イギリス）教授，
ダイヤモンド放射光実験施設（イギリス）
ダイヤモンドフェローなどを経て， 2012
年 6 月より現職。京都大学大学院医学研究科教授兼任。

Method of sample loading for serial femtosecond
crystallography
Michihiro SUGAHARASACLA Science Research Group, RIKEN SPring8 Center, 111, Kouto,
Sayocho, Sayogun, Hyogo 6795148, Japan

Kensuke TONOJapan Synchrotron Radiation Research Institute, 111, Kouto, Sayocho,
Sayogun, Hyogo 6795198, Japan

Eriko NANGOSACLA Science Research Group, RIKEN SPring8 Center, 111, Kouto,
Sayocho, Sayogun, Hyogo 6795148, JapanSo IWATASACLA Science Research Group, RIKEN SPring8 Center, 111, Kouto,
Sayocho, Sayogun, Hyogo 6795148, Japan
Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University,
Yoshidakonoecho, Sakyoku, Kyoto, 6068501, Japan

Abstract

Serial femtosecond crystallography (SFX) using ultrashort pulses from Xray freeelectron lasers(XFELs) allows structures to be determined with minimal radiation damage at room temperature.
We have developed a sample loading method for SFX using an experimental system DAPHNIS.
This method enables structure determination with a sample amount of less than 1 mg, which is
one to two orders of magnitude smaller than typical amounts in a conventional liquidjet method.
In this article, we introduce our sample loading method and its applications to SFX experiments at
SACLA.

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 203