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50巻２号 2004〔免疫〕

第 39 回小島三郎記念文化賞

細胞培養弱毒痘瘡 LC16m8 株ワクチンの開発
Development of the attenuated smallpox vaccine, LC16m8, produced by cell culture
はしづめ

橋 爪

そう壮

So HASHIZUME

クチニア・ウイルス（vaccinia virus）であることがはじめに明らかになっているので，以後このウイルスをワクチニアと呼ぶことにする。

今回図らずも表記の業績に対して小島三郎記念文

Ⅱ．世界で用いられていた痘瘡ワクチン株とその製造法化賞を受賞することとなった。なにしろこの仕事は4 半世紀ほど前に行った仕事で，このワクチンの製造承認が下りた翌年 1976 年には WHO の痘瘡（天然痘）撲滅計画が進み，日本では種痘（痘瘡ワクチ

ところで，現代のように冷凍保存技術もない時代ンの接種）が中止になったので，当時種痘研究班ににはウイルスは動物から動物，あるいはヒトに継代属された先生方以外はご存じない方も多かろうと思して維持された。したがって，痘瘡ワクチン株は国われるので，開発された背景などを含めて述べてみによりさまざまな継代法で維持されてきており，多たい。

種 類 の ワ ク チ ン 株 が 存 在 し た。 例 え ば 米 国 で はNew York City Board of Health（NYBH） 株， 英 国

Ⅰ．痘瘡ワクチン，種痘とはを中心とした国々では Lister 株，ソ連では EM63 株，日本では池田株，大連 1 株などが使用されていた。

痘瘡の予防に痘瘡ワクチンが有効であることは

製法は仔牛（犢）の腹側の皮膚を剃髪消毒後に接1798 年の Jenner の報告以来次第に世界中に広まり

種刀で傷をつけ，そこにウイルス液を塗布し，発痘用いられるようになった。WHO の痘瘡撲滅計画が後これを掻き取り，乳剤として希釈液と混合し製造見事に成功した要因の 1 つは安価でよく効くワクチしていた。

ンがあったればこそであった。

Ⅲ．弱毒痘瘡ワクチン LC16m8 が開発された背景

日本に痘苗（痘瘡ワクチン）が伝えられたのは1813 年に中川五郎治がロシアから持ち帰ったとの説もあるが，はっきりしているのはモーニケ（Mohnike, O.G.J.）の斡旋により 1849 年に長崎に牛痘痂

日本でポリオの恐慌が収まった 1960 年代後半かが到着し，その後このウイルスをウシで継代するこら，DPT 接種後の死亡事故などを契機に予防接種とに成功し，日本全国に急速に牛痘種痘法が広まっの副作用問題が急速に社会問題となってきた。種痘た。その後もたびたび外国から痘苗株の分与を受けについても，Marennikova のマウスなどを用いた各1）ている。詳しくは添川正夫著『日本痘苗史序説』

種ワクチニア株の比較試験の情報などから，日本でを参照されたい。ここで牛痘と書いているが，現代使用されてきた池田株，
大連 1 株は Lister 株，EM63のウイルス学では種痘に使われていたウイルスは牛株よりも病原性が強いのではないかという疑惑が生痘（cowpox）ウイルスとは異なるウイルスで，ワじ，種痘研究班で 1968 〜 1971 年にかけ，池田株，財団法人 日本ポリオ研究所 技術参与
〠 189-0003 東京都東村山市久米川町５− 34 −４

Technical Consultant, Japan Poliomyelitis Research Institute(5-34-4, Kumegawa-cho, Higashimurayama-shi, Tokyo)

（4）

29

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Lister 株，EM63 株の比較臨床試験が行われた。また米国の Kemp のところで検討されていた弱毒のCV1−78 株 に つ い て は 1971〜1973 年 に，国産のLC16mO と LC16m8 株ワクチンについては 1973 〜1974 年に試験が行われた。この結果 LC16m8 株ワ
クチンは副作用が少なく，善感率も従来のワクチン株と変わりなく，抗体価の上昇も Lister 株と同程度
かやや良いことが証明され 2），1975 年にワクチン

Fig.1 Establishment of LC16m8 strain









Lister (Elstree) virus (LO)�
36 passages in RK cells at 30 C�Plaque cloning�LC16
�
6 passages in RK cells at 30 C�Plaque cloning �LC16mO
�
3 passages in RK cells at 30 C�Plaque cloning �LC16m8

Marker used for selection�

TsTs, Pock size on CAM

Pock size on CAM株として製造承認された。
図 1 Establishment of LC16m8 strain

Ⅳ．仔牛製造から細胞培養製造へ
は 106 〜 7 を接種しても臨床症状は認められず，脳内1962 年に厚生科学研究費による無菌の凍結乾燥から回収されるウイルス量は LO（親株）より低く，痘苗の開発研究にワクチンメーカー 7 社が参加してその差は 105 〜 7 摂取したウサギ群で著しかった。ま始められた。千葉血清研究所（以下千葉血清）も分た LO 株は 41C でも増殖するが，LC16 はまったく担することとなり，このとき仔牛により，無菌痘苗増殖できず ts 変異株であることを確認した。

を製造することがいかに難しいかを身をもって体験

幸いなことに LC16 が樹立できた直後に当時国立した。私は最初にサル腎細胞を用いた不活化ポリオ予防衛生研究所（以下予研）の部長をされていた故ワクチンの製造からワクチン製造に携わったため，多ケ谷勇先生からサルによる各種ワクチニア株の神痘瘡ワクチンも細胞培養にすべきと考えた。また同

経病原性の比較試験を計画しているが，サル舎の都時に当時使用されていた痘苗のような副作用の強い合で予研ではできないので千葉血清で引き受けてほワクチンはワクチンとはいえないのではないかと考しいという依頼があり，この試験に LC16 株を含めえ，細胞培養系でワクチニア株の弱毒化を目指すこることの了解を得てこの試験をお引き受けすることとにした。になった。

ウシで発痘が悪くなったときは，ウサギで継代しこの実験は当時，日，米，英，ソ連で痘瘡ワクチた後ウシに戻すのが良いということを痘苗製造担当ン株として使用されていた 4 株と弱毒株 3 株，計 7

者から聞いていたので，使用する細胞としてウシ腎株について各株 106 から 108 まで 3 希釈，各希釈 1細胞とウサギ腎細胞を選択し，Lister 株の増殖を調

群 3 匹のサルを用いた実験で，現在でも考えられなべてみたところ，ウサギ腎細胞のほうがウシ腎細胞いような贅沢な試験であった。

より増殖が良かったので，以後ウサギ初代腎細胞を接種ウイルス液として，LC16 はウサギ腎細胞で用いることにした。

30C に培養したウイルス液を，他の６株は漿尿膜で弱毒化の方法として，ポリオで実績のある高温非増殖させたウイルスをフロロカーボン処理後，蔗糖増殖性の温度感受性変異株（ts）を選択することと密度勾配遠心で精製したウイルス液を，片側の視床し，ウイルス培養は 30C で継代した。継代暦を図 1に 0.5ml 接種した。に示す。

この結果，弱毒株とされていた CV1-78 株は最も病 原 性 が 強 く， 次 い で 池 田 株 で あ っ た。NYBH,Ⅴ．サルによる神経病原性試験

EM63, Lister 株は CV1-78 株，池田株よりやや弱く，
DIs（多ケ谷らが大連 1 株より樹立した超弱毒株）

ウサギ腎細胞で 36 代継代した時点で，ts 変異のと LC16 は最も弱い性質を示した（表 1，図 2）3）。

LC16 株を樹立した。この株の神経病原性をウサギ

また接種サルの脳内からの蛍光抗体法による抗原の脳内接種後 6 日目に脳内ウイルス量を測定したと検出には東大医科学研究所の故青山友三先生のご支ころ，LO（親株）では 10症状を示し，106〜75〜7接種したものでも臨床援を頂いた。その結果，接種後 4 〜 7 日に死亡する

では死亡例もみられたが，LC16サルの髄膜脳炎例では病変局所に抗原が検出され（5）30 モダンメディア

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た。LC16 接種サルで 5，7，14 日に屠殺剖検したサ

表 1 Mortality of the monkeys inoculated into the thalamus with different vaccinia strains
Virus strain
Ikeda
NYBH
CV1-78
Lister
EM63
LC16DIsInoculum

Rate of Death2x10 82x10 72x10 62x10 82x10 72x10 62x10 82x10 72x10 62x10 82x10 72x10 62x10 82x10 72x10 62x10 82x10 72x10 62x10 82x10 72x10 6

3/3
3/3
3/33/33/31/33/33/33/36/65/61/62/32/3
1/30/30/30/30/30/30/3

ルでは特異的蛍光は弱いか，全く認められない。比LD50

較のために NYBH と EM63 株の成績を表 2 に示す。

< 6.3 x10 5−

低濃度のウイルスを接種され，死亡しなかったサルの接種後 14 日の剖検例では一般的にウイルス抗2.9x10 6

原は検出できないが，間接蛍光抗体法により髄膜と実質の小血管周囲および，血管周囲に細胞浸潤のあ< 6.3 x10 5−る部位に IgG の存在が認められた 3）。このことは後

6.3x10 6に倉田らにより種痘後の髄膜脳炎症例で，局所の血1.4x10 7

管周囲の抗体除去の処理をすると抗原が検出される> 6.3x10 8−成されていることが明らかになった。この成績は，例があることから，血管周囲に抗原抗体結合体が形種痘後脳炎の発生機序を示唆するのではないかと考> 6.3x10 8−

えられ，この研究の大きな成果の１つと考えている。
幸運にもこの実験に超弱毒株の DIs，LC16 と弱+++ ++++++ +++++ +++ ++++++++++M

C

CV1
NYBH
Ikeda
Lister
EM63
DIs
LC16
6

M:Meningen

C:Choroid Plexus

図2

表2Virusstrain

78
Virus Inoculum（log10）The severity of inflammation in the meninge ｓ and choroid
plexus in the monkeys inoculated with vaccinia strains

Specific Immunofluorescence in the CNS of the monkeys inoculated
NYBH, EM63, LC16 strains

Inoculum per monkey2x10^8 PFU

NYBH

2x10^7 PFU
2x10^6 PFU

2x10^8 PFU
EM63

2x10^7 PFU
2x10^6 PFU
2x10^8 TCID50

LC162x10^7 TCID50
2x10^6 TCID50

CerebrumCh.pl.
Days p.i.
MeEp＋＋＋3＋＋＋＋＋＋＋6＋＋＋＋＋5＋＋＋＋4−＋＋
NT
6NT＋＋−−−
14＋＋＋＋＋5＋＋＋＋
NT
5＋−
NT
14＋NTNT
5＋＋＋−
NT
5−
NTNT
14−−
NT
13−−−14−−−
14NT＋−
5−−
NT
7＋−
−
14−−
−
14−−−
14（6）

Spinal cord
CL
Me R.n. Me R.n.
＋＋ NT ＋＋ ＋＋＋＋ NT ＋＋ ＋＋＋ − ＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋
NT＋＋−−−− ＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋ ＋＋ NT−−−−＋＋＋−NT NT＋−−−−−＋−−NT−−−−−−NT NT＋−＋−＋−−−＋＋＋−−−−−−−
NT NT

31

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毒株とされていた CV1-78 株が組み込まれていたこ

中ウイルス量も急速に低下し，脳内からウイルスはとである。この 3 株の比較から，私はワクチニアの検出されなかったが，コルチゾン処置群では 103 程

病原性は①抹梢（皮膚）での増殖性，②抹梢から中度のウイルス血症が 6 日まで続いたためか，5 日に枢神経への侵襲性，③中枢神経での増殖性の 3 つの102 と 6 日に 101 のウイルスが検出された。
LC16mO因子が関係するのではないかと考えるようになり，と LC16m8 株では無処置群はもちろんのこと，コ以下の実験を行った。

ルチゾン処置群マウスでも脳内からウイルスは検出できなかった（図 3 〜5）4，5）。

Ⅵ．皮膚増殖の比較試験
Ⅷ．免疫原性についてサルの神経病原性の成績を得たので，早速小規模の接種試験を臨床研（駒込病院）の南谷幹夫先生に

LC16m8 株 は LO あ る い は LC16mO 株 に 比 し てお願いした。この試験で，痘疱の痂皮形成が 34 例中 2 例に著しく遅れる症例があったとの報告を頂

3.5

き，自己接種など皮膚合併症を少なくするため，皮Blood C（−）
Blood C（＋）
Brain C（−）
Brain C（＋）

log10 CCID50/m�

3

膚増殖のより弱い変異株を選択すべきと考えた。
発育鶏卵の漿尿膜の外側（卵殻に面した側）は上皮性（ectoderm）細胞でできているので，ワクチニアを漿尿膜上に接種したとき作られるポックの大2.521.510.5

きさが皮膚増殖の指標となる遺伝的マーカーになる

01234のではないかと考え，これを指標に変異株の選択を
イズの中等度の LC16mO を，これからさらに 3 代
継 代 後 に ポ ッ ク サ イ ズ の 小 さ い（1mm 前 後 ）8Blood C（−）
Blood C（＋）
B r a i n C（−）
B r a i n C（＋）

3.5
log10 CCID50/m�

これらの株を階段希釈（102 〜 106）し，ウサギの皮内に接種した後，現れる発赤径が 10mm 以上を陽性とし，その 50% 発赤量を求めた。幸いなことに予想が的中し，LCm8 は 103 〜 9 ともっとも弱く，
とい32.521.5
10.50

う結果を得た 。
5）12345

678Days

図 4 Virus recovery from the blood and brain of miceinoculated i.p. with LC16 strain

Ⅶ．抹梢から中枢神経への侵襲性の比較試験
LO, LC16, LC16mO, LC16m8, お よ び CV1-78 の 5
7〜3のウイルスを接種し，log10 CCID50/m�

株について，腹腔内に 1074LC16m8 をクローニングした 4）。

CV1-78 と LCmO は LC16 よりはやや弱い 106

図 3 Virus recovery from the blood and brain of miceinoculated i.p. with LO strain

行った。すなわち LC16 から 6 代継代後にポックサ

2〜55

D a y s p.i.

ウイルスを接種後，その半数のマウスには直ちにコルチゾン 2mg を皮下注射し，接種の翌日より経日的に，各群 5 匹ずつのマウスを用いて，その血中ウイルス量と脳内のウイルス量を測定し，ウイルスが抹消より中枢神経に侵入し増殖する性質を調べた。

21.81.61.41.2
10.80.60.40.20Blood C（−）
Blood C（＋）
Brain C（−）
Brain C（＋）

1LO および CV1-78 株では，コルチゾン処置群も2345678Days

無処置群でも 5 〜 7 日の間にウイルスは脳内から検図 5 Virus recovery from the blood and brain of miceinoculated i.p. with LC16m8 strain

出された。LC16 では無処置群は接種後 2 日より血（7）32 モダンメディア

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明らかに反応が弱く，安全性が高いと判断された表 3 HI and NT antibody titer after inoculation with LO,
LC16mO and LC16m8HI（表 4）。

NTWeeks p.i.

LOLC16mO

LC16m8

LO26.5

8.0

4.5

4.9

5.7

4.9

46.5

7.5

5.0

4.9

6.9

4.7

613

4.5
3.5

7.5
7.0

5.0
5.5

5.0
5.0

6.6
6.8

4.6
4.7

副作用として，種痘性湿疹１，自己接種９，種痘LC16mO LC16m8

疹８，一過性の良性熱性痙攣３が観察されたが，幸いなことに重篤な副作用の報告は全くなかった。
LC16m8 株ワクチンの免疫原性は HI 抗体価，NT（中和）抗体価とも従来株ワクチンと差がみられ

HI =2 n NT=4 nず，また初回接種後 6 カ月および 1 年後に従来株による追加接種をしたところ , 明らかな 2 次免疫反応

皮膚増殖が悪いので，抗体産生能について比較してを示し，細胞性免疫を含め十分強力な免疫を与えるみた。これらの株を 2 羽ずつのウサギに 10 PFU のことがわかり，CV1-78 株より優れた免疫原性を持ウイルスを接種し，13 週まで中和および HI 抗体価つと判断された。

8の変動を追跡してみた。

また村瀬らは，ワクチン接種後 14 日に脳波検査

皮膚増殖が良かった LC16mO は中和抗体，HI 抗を行い，LC16m8 株では 56 例中脳波異常を認める

体ともに最も上昇が良く，持続も良い。LC16m8 の例は 1 例もなかったが，CV1-78 株ワクチンで 30 例抗体産生能はほぼ LO 株と同程度であった（表 3）。

中 1 例（3.3％）に一過性の脳波異常が認められた。

この成績の傾向は , 後に行われたヒトの臨床試験で1972 年に行われた木村らの Lister 株（旧来のワク得られた成績とよく一致したチン）での成績では 19 例中 5 例（26.3%）に一過性。

2，4）の脳波異常が観察されており，これらの成績は動物

Ⅸ．臨床試験成績

2）

実験で確認された LC16m8 株の向神経性の弱い性質を裏付ける成績と考えられた（表 5）。

これまで述べてきたような基礎研究を踏まえ，前述のように種痘研究班でこの株の検討が取り上げら

表 5 各種痘瘡ワクチンによる種痘後の脳波検査成績（村瀬・小川，*木村・福山 種痘研究班研究報告書）

れ，1973 〜 1974 年にかけて種痘研究班に属する全国の諸施設で LC16m8 は約 50,000 例，また LC16mO

ワクチン・接種方法

は約 3,000 例の接種が行われた。LC16m8 について

検査数

一過性脳波異常例数（%）

は詳細に臨床症状を観察することができた 10,578

Lister*195（26.3）

例について成績が集計された。以下 LC16m8 につ

Lister + g-globulin181（ 5.6）

CV-1

301（ 3.3）

CV-1 + g-globulin

190

LC16m8560

いての成績の概略を述べる。
善感率は 95.1％で従来の痘瘡ワクチンと差がな
く，平均発赤径（10 日目判定）18.4mm，平均硬結
径 6.1mm，発熱率 7.7％で，従来のワクチンに比べ

表 4 種痘株別反応の比較（種痘研究班報告書より）
善感率

平均発赤径 平均硬結径

調査年度 調査人数

池田1968-70

1,506

99.1

22.9

18.2

25.0

エクアドル 1969-70

1,846

67.5

19.2

17.4

21.3

リスター

1968-71

3,662

93.7

17.6

15.3

26.6

4 2.4（5）CV-1

1971-73

22,97692.4

21.1

16.8

8.5

4 1.9（6）LC16mO

1973-74829

94.819.6

14.5

12.1

4 3.0（15）LC16m8

1973-74

10,578

95.1

18.4

6.1

7.7

4 2.5（97）

（8）

発熱率

中和抗体価
（検査数）

ワクチン

33

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おわりに
これまで述べたように，LC16m8 株ワクチンの開発は基礎研究 , 臨床研究ともに多くの先生方のご支援とご協力により成し遂げられたもので，私一人が受賞することに忸怩たるものがあり，改めてご協力頂いた諸先生に深く謝意を奉げたい。

文献１）添川正夫 : 日本痘苗序説，近代出版，1987.
２）山口正義，木村三生夫，平山宗宏：種痘研究班研究報
告書−厚生省特別研究，種痘後副反応および合併症の治験に関する研究−．臨床とウイルス，3:269−279, 1975.
３）M.Morita, Y. Aoyama, M. Arita, H. Amano, H. Yoshizawa,
S.Hashizume, T. Komatsu, I. Tagaya: Comparative studies
of several vaccinia vir us strains by intrathalamic
inoculation into cynomolgus monkeys. Arch. Virol. 53:197−208, 1977.
４）橋爪 壮：新しい弱毒痘苗株 LC16m8 株の基礎．臨床とウイルス，3 : 229−235, 1975.
５）S. Hashizume, H. Yoshizawa, M. Morita, K.Suzuki:
Proper ties of attenuated mutant of vaccinia vir us,
LC16m8, derived from Lister strain. Vaccinia Virus as
Vectors for Vaccine Antigens, Quinnan, Ed. Elsvier
Science Publishing Co., Inc.87−99, 1985.

（9）