10-08®

SYBR Green
Realtime PCR Master Mix(Code No.QPK-201,QPK-201T)

使用说明书

科研用

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目

录[1] 前言 .................................................................................................................................................. 1[2] 本产品的组成 ............................................................................................................................... 2[3] 其他必需品.................................................................................................................................... 3[4] 使用方法......................................................................................................................................... 4[5] 常见问题......................................................................................................................................... 8[6] 相关产品....................................................................................................................................... 10【 注意 】
本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。

本产品是在与F. Hoffmann-La Roche Ltd.、Roche Molecular Systems Inc.及The Perkin-Elmer
Corporation的特许合同约定下销售的。
“Purchase of this product is accompanied by a limited license to use it in the Polymerase Chain
Reaction (PCR) process for The Research Field in conjunction with a thermal cycler whose use in
the automated performance of the PCR process is covered by the up-front license fee, either bypayment to Perkin-Elmer or as purchased, i.e., an authorized thermal cycler.”※LightCyclerTM是Idaho Technology Inc.和Roche Molecular Systems Inc.的商标。
※TaqMan®是Roche Molecular Systems Inc.的注册商标。
※SYBR®是Molecular Probes Inc.的注册商标。
※ABI PRISM®是The Perkin-Elmer Corporation的注册商标。

[1] 前言本产品是在 Taq DNA polymerase 基础上开发的通用性很高的 Realtime PCR
用 2×浓度的预混液，已包含除引物和样品 DNA 以外的所有组分。适用于以cDNA、DNA 为样品的 SYBR® Green Ⅰ掺入法检测，可获得重复性良好的结果。

◆本产品特征◆1．高通用性本产品适用于各种常见实时定量 PCR 仪：1）产品中添加了 BSA，能够应用于 Roche 公司的 LightCyclerTM 以及其它使
用 Glass Capillary 的分析体系；2）产品中还添加了 Passive Reference（内含 1×浓度 ROX reference dye），
可应用于 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM®实时定量 PCR 仪。经确认，使用
其它仪器的时候，即使不使用 Passive Reference，也不会对实验本身造成影响。
本说明书仅以 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM®和 Roche 公司的LightCyclerTM 为例进行说明，供使用者参考。对于其他厂家的实时定量 PCR 仪，
请使用者根据仪器说明书，并结合实际情况进行适当调整。
2．快速热启动为了抑制非特异性反应，本产品中添加了抗 Taq DNA 多聚酶的单克隆抗体进行热启动。此方法的优点是酶活力的释放极快，在 1 分钟内即可完成预变性。各循环的变性步骤只需考虑核酸变性所需的时间进行设定即可。
如果使用 LightCyclerTM 等高速 PCR 仪，则更能显示出其缩短时间的优越性。
3．操作简便由于采用了 2×Master Mix 体系，已经把除引物、模板之外的酶、Buffer、dNTP
等预混在一起，因而减少了操作步骤，既缩短了加样时间，又降低了污染的几率。

<关于 SYBR® GreenⅠ检测体系>
SYBR® GreenⅠ检测体系通过 SYBR® GreenⅠ染料与 DNA 的扩增产物结合，
并且结合后染料的荧光强度的增强作为指标，进行检测。

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虽然该方法和普通的 PCR 反应一样简便，但由于会出现引物二聚体、目的条
带以外的扩增产物等，因此有必要在扩增后对融解曲线进行分析确认。

[2] 本产品的组成本产品分为两个包装，50μl 反应体系可用 40 次份（QPK-201T）和 200 次
份（QPK-201）。
<QPK-201T>
SYBR® Green Realtime PCR Master Mix1 ml<QPK-201>
SYBR® Green Realtime PCR Master Mix

1 ml x 5

该组分是包含反应缓冲液、SYBR® GreenⅠ、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶
及抗Taq单克隆抗体的2×预混液。请添加模板DNA和引物，并用灭菌蒸馏水配制成1×浓度后再使用。该溶液中已包含1×浓度ROX（Passive reference dye）。

<注意>
本 产 品 原 则 上 在 -20 ℃以 下 避 光 冷 冻 保 存 。 但 是 ， 如 果 在 短 期 内 需
持 续 使 用 时 ， 可 于 融 解 后 在 4 ℃避 光 保 存 ， 此 时 最 长 可 保 存 2个 月 。 保存时请使用避光箱或产品内配有的铝箔袋。
5支 装 的 QPK-201包 装 内 另 外 还 添 附 有 一 个 铝 箔 袋 ，建 议 逐 支 融 解使 用 。 融 解 后 ， 于 4 ℃状 态 保 存 ， 并 尽 量 在 3周 内 使 用 完 毕 。 融 解 后 的产 品 短 期 内 不 用 时 ，请 装 入 原 包 装 袋 ，再 次 于 -20 ℃状 态 下 进 行 避 光 冷冻 保 存 。 （ 本 公 司 经 实 验 确 认 ， 反 复 冻 融 20次 对 产 品 质 量 没 有 明 显 影响。）
为保证实验效果，请在收到产品的一年之内使用完毕。

垂询电话：021-58794900

2[3] 其他必需品
除本产品外，还需准备以下试剂和仪器。
（1）Realtime PCR 仪
本产品适用于普通及高速的模块型（Block Type）、玻璃毛细管型（GlassCapillary Type）等各种 Realtime PCR 仪。请使用者根据各仪器说明书，结合实际情况进行适当调整。本书仅以 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM®和 Roche 公
司的 LightCyclerTM 为例进行说明，供使用者参考。

（2）引物
请根据目的基因的序列设计引物对，引物设计对实时定量PCR实验的精确度
和重现性非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。
-引物长度请设定为 20～30mer、GC 含量为 40～60%。
-扩增片段应小于 200bp，如可能请尽量设定在 50～150bp。过长的片段容易导致扩增效率低下，而且容易导致非特异性反应，影响定量准确性。
-引物设计应尽量横跨内含子，以防止基因组 DNA 的扩增而引起假阳性。

（3）模板 DNAcDNA
1st Strand cDNA合成产物请使用苯酚氯仿处理•乙醇沉淀等方法提纯。1st
strand cDNA合成时的引物，可采用随机引物或者Oligo(dT)n引物，请注意引物用量对于后续PCR反应的影响。
如果使用本公司的1st Strand cDNA合成试剂盒「ReverTra Ace -α-」( Code:FSK-100 )，请稀释10倍以上使用。原液也可以进行扩增，但cDNA合成时的引物或逆转录酶会对PCR产生影响，因此，建议稀释后使用。添加量不应超过总反应体系的10%。过量的添加会大大改变PCR反应缓冲液的组成，导致定量性低下。
※本公司的 Realtime PCR 用逆转录试剂盒 ReverTra Ace qPCR RT Kit（Code No.FSQ-101），通过改良组分，使带入到 Realtime PCR 反应体系的逆转录反应液的影响降到最小，即便在PCR 反应体系中添加最多至 20%的液量，也能表现出良好的反应曲线。

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基因组 DNA请使用普通PCR用的DNA纯化样品。如果是人类基因组DNA，1～10ng比较适当。如果加入大量基因组DNA，会检测出基因组本身的信号，导致基线上飘。

（4）蒸馏水请使用普通PCR用灭菌蒸馏水。

[4] 使用方法
4.1 ABI PRISM®7700 的 SYBR® Green 掺入法使用说明
(1)反应液的配制试剂蒸馏水SYBR® Green Realtime PCR Master Mix上游引物 (10 μM )下游引物 (10 μM )样品溶液
Total volume

z

添加量
16 μl
25 μl
2 μl
2 μl
5 μl
50 μl

终浓度
1x0.4 μM
0.4 μM将SYBR® Green Realtime PCR Master Mix设定为反应体系的1/2，其他的组成成份请参照最适条件进行调整。如需改变反应体系的总体积，其他组成成份也应按相同比例改变。

z引物的添加量请在终浓度0.2～0.6 μM的范围内进行调整。若扩增效果不理
想，增加引物的添加量会有所改善，但添加量过多，则可能会由于非特异性扩增的原因，出现信号检出率低的情况。

z实际配制时，可先将除样品溶液之外的其他组份预混成n+α倍（n为样品数，α为分注损耗）的混合液，然后分注到各管（即n管），最后在每管中分别加
入相应的样品溶液。

(2)PCR的循环条件

垂询电话：021-58794900

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[PCR循环(例1)](三步法，退火温度 60℃ ／ 延伸温度 72℃)
95℃ 60s↓PCR循环 (×40循环)：
95℃
15s
60℃
15s
72℃
45s（data collection）↓融解曲线分析(Melting Curve Analysis)[PCR循环(例2)](两步法，退火／延伸温度 60℃)
95℃ 60s↓PCR循环 (×40循环)：
95℃
15s
60℃
60s（data collection）↓融解曲线分析(Melting Curve Analysis)z

首先请尝试三步法（例1）。退火温度请根据引物的Tm值在55℃-65℃之间进行调整。根据引物的不同，有时最佳温度可能超出此范围，此时请根据实际情况调整。

z本产品因可以在极短时间内完成多聚酶的再活性化，所以最初变性时间60秒，各循环变性时间15秒即可达到良好的扩增效果。请注意，绝大多数情况下，最初变性时间1分钟就足够了，过分加热会影响酶的活性，特别要注意避免变性时间超过5分钟。

z请将Detector设为SYBR，Quencher设为None。详细设置请参照仪器说明书。

z实时定量PCR中目标片段通常都很小，一般不需调整延伸时间，如需变更，请务必确保data collection步骤在30秒以上。

z上述实例的循环设置采用的是三步法。此外也可采用两步法作为PCR的循环条件，此时请将data collection设置在退火／延伸步骤（即将退火／延伸步骤合并在一起）。

z

融解曲线分析请根据各仪器的标准设定。详细请见各仪器的使用说明书。

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4.2 Roche Light CyclerTM 的 SYBR® Green 掺入法使用说明
(1)反应液的配制试剂蒸馏水
SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
上游引物 (10 μM )下游引物 (10 μM )样品溶液
Total volumez

添加量
6.4 μl10 μl
0.8 μl
0.8 μl2 μl
20 μl

终浓度1x0.4 μM
0.4 μM将SYBR® Green Realtime PCR Master Mix设定为反应体系的1/2，其他的组成成份请参照最适条件进行调整。如需改变反应体系的总体积，其他组成成份也应按相同比例改变。

z

引物的添加量请在终浓度0.2～0.6 μM的范围内进行调整。若扩增效果不理想，增加引物的添加量会有所改善，但添加量过多，则可能会由于非特异性扩增的原因，出现信号检出率低的情况。

z实际配制时，可先将除样品溶液之外的其他组份预混成n+α倍（n为样品数，α为分注损耗）的混合液，然后分注到各管（即n管），最后在每管中分别加
入相应的样品溶液。

(2) PCR的循环条件[PCR循环(例)](三步法 退火温度 55℃ ／ 延伸温度 72℃)
95℃ 30s↓PCR循环 (×40循环)：
95℃
5s
55℃
10s
72℃
15s（data collection）↓融解曲线分析(Melting Curve Analysis)

垂询电话：021-58794900

6z

退火温度请根据引物的Tm值在55℃-65℃之间进行调整。根据引物的不同，有时最佳温度可能超出此范围，此时请根据实际情况调整。首先，请尝试退
火温度55℃、退火时间10秒。若扩增效果不理想，可将退火时间延长至20秒；
若出现引物二聚体等非特异性反应，可将退火时间缩短至5秒。

z本产品因可以在极短时间内完成多聚酶的再活性化，所以最初变性时间30秒，各循环变性时间5秒即可达到良好的扩增效果。请注意，绝大多数情况下，最初变性时间1分钟就足够了，过分加热会影响酶的活性，特别要注意避免变性时间超过5分钟。

z对于200bp以内的目标片段，延伸15秒通常已经足够。如需调整，请确保datacollection步骤在10秒以上（仪器数据采集方式限定）。

z

Detector 设 为 F1 。 另 外 ， 通 常 可 将 Temperature Transition Rate 全 部 设 为
20℃/sec(最大)。详细设置请参照仪器使用说明书。

z上述实例的循环设置采用的是三步法。如果发生了非特异性反应也可尝试采用两步法，此时请将data collection设置在退火／延伸步骤（即将退火／延伸步骤合并在一起）。

z融解曲线分析请根据各仪器的标准设定。详细请见各仪器的使用说明书。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[5] 常见问题
¾ 扩增曲线混乱或没有仪器设置方面的问题（请参照相关仪器的说明书）原因
Detector的设置与荧光染料不匹配数据采集的设置不恰当样品位置设置错误
仪器方面的其他故障或不匹配对策根据荧光染料的种类不同，对检测仪器的设置进行相应的更改，然后再进行实验。
请调整设置再进行实验。
设置适当的样品位置后再进行分析或再进行实验。
请根据各仪器的说明书进行检查。

试剂方面的问题原因对策PCR反应条件、引物的浓度、序列 可通过调整引物浓度、PCR反应条件等加等不恰当以改善。扩增不理想时，一般可尝试降低
退火温度、延长退火时间或提高引物浓度。
在少数情况下，提高退火温度或延长延伸时间也会有改善。另外，对于GC含量高的目的片段，延长变性时间也会有改善。
仍不能改善时，建议重新设计引物。
样品纯度不好DNA样品可通过苯酚抽提、乙醇沉淀等方法提纯后再进行实验；如样品为cDNA，逆转录酶的残留会有一定的影响。

¾ 定量值重现性差仪器设置方面的问题（请参照相关仪器的说明书）原因
仪器方面的故障或不匹配

垂询电话：021-58794900

对策
因为仪器的不适用，在温度管理或检测时会产生扩增曲线散乱的情况。此时请根据相应仪器的说明书进行检查。

8试剂方面的问题原因对策样品纯度不好不纯的样品会导致扩增曲线散乱，请使用充分混匀的样品。如样品为cDNA，逆转录酶的残留会有一定的影响。通过苯酚抽提或乙醇沉淀等方法提纯后再进行实验。
PCR反应条件、引物的浓度、序列 扩增效率差的PCR容易产生扩增曲线散乱等的不恰当的情况。此时，可通过调整引物的浓度、PCR其他反应条件等来改善扩增效果。一般可尝试降低退火温度、延长退火时间或提高引物浓度。有时延长延伸时间也会有改善。对于GC含量高的目的片段，延长变性时间也会有改善。扩增曲线散乱较严重时，建议重新设计引物。
计量误差反应体积太小会导致检测精度下降。请根
据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。
¾ 空白样品中有信号
请在融解曲线分析(Melting Curve Analysis)的基础上进行判断。
融解曲线的顶点所对应的温度与阳性样品的温度相同原因
阳性样品或PCR产物等的污染对策
首先请更换用作空白样本的水。如果还发生同样情况，请分别更换蒸馏水、引物或另启用一管新的Master Mix后再进行实验。

融解曲线的顶点所对应的温度比阳性样品低原因
对策发生了引物二聚体等的非特异性反 调整引物的浓度或PCR其他反应条件。出应现非特异性反应时，一般可尝试提高退火
温度、缩短退火·延伸时间，或降低引物浓
度。进行三步法PCR的操作也可能改善。
仍得不到改善时，建议重新设计引物。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[6] 相关产品SYBR® GreenⅠ检测体系用 Realtime PCR 试剂
品名
容量1ml x 1 (40次份)THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix
1.67ml x 3 (200次份)®
SYBR Green Realtime PCR
1ml x 5 (200次份)Master Mix -Plus-Code No.
QPS-201T
QPS-201
QPK-212※THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix 中，50X ROX reference dye 另外单独添付。
※SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus-中，Plus solution 另外单独添付。
※容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数。

TaqMan®探针法检测体系用 Realtime PCR 试剂
品名
容量1ml x 1 (40次份)THUNDERBIRD Probe qPCR Mix
1.67ml x 3 (200次份)Realtime PCR Master Mix
1ml x 5 (200次份)Code No.
QPS-101T
QPS-101
QPK-101※THUNDERBIRD Probe qPCR Mix 中，50X ROX reference dye 另外单独添付。
※容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数。

Realtime PCR用cDNA合成试剂盒
品名
ReverTra Ace qPCR RT Kit

1 步法•Realtime PCR 相关试剂
品名各种荧光Probe、荧光引物检测体系用
1步法•Realtime PCR试剂RNA-direct Realtime PCR Master Mix
SYBR® Green I检测体系用
1步法•Realtime PCR试剂RNA-direct SYBR® GreenRealtime PCR Master Mix※RNA-direct 系列中，50mM Mn(OAc)2 另外单独添付。
※容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数。

垂询电话：021-58794900

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容量Code No.

200次份

FSQ-101

容量

Code No.

0.5ml x 5(100次份)QRT-101

0.5ml x 5(100次份)QRT-201[销售商]

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地址：上海市浦东新区张杨路 500 号华润时代广场 28 楼 AL
邮编：200122
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Tel:021-5879-4900

Fax:021-5879-4901

E-Mail:tech@bio-toyobo.cn
http://www.bio-toyobo.cn[生产商]东洋纺株式会社敦贺生物工厂地址：日本国福井县敦贺市东洋町 10 番 24 号

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