18-07

SuperPrep® II
Cell Lysis & RT Kit for qPCR
(Code No. SCQ-401)

SuperPrep® II
Cell Lysis Kit for qPCR
(Code No. SCQ-501)

使用说明书

TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目录
[1] 前言 ........................................... 1[2] 产品内容 .................................... 3[3] 产品以外需要准备的物品 ............. 5[4] 使用方法 ...................................... 5[5] 荧光定量 PCR(例) ....................... 8[6] 实验例 ....................................... 15[7] Trouble Shooting ........................ 19[8] 相关产品 .................................... 19【注意】
本产品为研究用试剂。请勿作为诊断，临床试剂使用。 此外，对于产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。

【保存】所有组分请均保存于-20℃条件下

东洋纺（上海）生物科技有限公司[1] 前言SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-401)是为了能够用荧光定量 PCR 法进行基
因表达分析、由细胞裂解试剂(Lysis Reagents)和逆转录反应试剂(RT Reagents)组成的试剂盒。通过
使用本产品，可以从 96 孔板等培养的细胞开始简便地制备含有可作为逆转录反应模板用 RNA 的细胞
裂解液。而且，本试剂盒中含有的 RT Reagents 试剂，针对该细胞裂解液的 RT 反应进行了优化。
在以前的 SCQ-101 中，Lysis Solution 之后，需要添加 Stop Solution。SuperPrep® II 中在 Lysis
Solution 处理之后，可以直接进行 cDNA 合成步骤。此外，该试剂盒还可以对更多种类的哺乳类细胞进行高灵敏度的检测。使用本试剂盒，可以简便、迅速地从培养细胞开始合成荧光定量 PCR 用的模板 cDNA。
SuperPrep® II Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-501)是细胞裂解试剂的独立销售品。可用于 1step 荧光定量 RT-PCR 简易分析时细胞裂解液的制备。

图. 使用本产品进行荧光定量 PCR 分析的流程◆本产品的特征◆1
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1. 无需纯化 RNA从培养细胞开始，可简便地制备含有可用于逆转录反应模板用 RNA 的细胞裂解液。以 Lysis
Solution 处理过的裂解液为模板，直接就可以进行逆转录反应，可大幅度地缩短分析时间。
2. 从裂解液开始合成高品质的 cDNA通过 buffer 组份的最优化，有效地抑制了因 RNase 等的细胞成分引起的 RNA 降解（制备好的 RNA
在冰上可稳定放置 6 小时）。另外，由于用 gDNA Remover（DNase I）处理后再进行 cDNA 的合成，所以可以合成基因组 DNA 污染少的高品质 cDNA。逆转录试剂是用本公司的高效率逆转录酶「ReverTra Ace®」为基础进一步优化后的 Master Mix，可简便、高效率地合成 cDNA。合成的
cDNA 可长期保存。
3. 可适用于更多种的哺乳类细胞SuperPrep® II 相比以前的 SCQ-101,可适用于更多种类的哺乳类细胞的分析。
下表中这些代表性的细胞已确认可以使用。
表. 已确认本产品适用的细胞
细胞名称

贴壁／悬浮

种类

细胞

来源

1

HPA

贴壁

H.sapiens

preadipocytes (primary cell)

前体脂肪细胞

2HEK贴壁H.sapiensepidermal keratinocytes (primary

表皮角质细胞

cell)
3

HA

贴壁

H.sapiens

astrocytes (primary cell)星形胶质细胞4HDF

贴壁H.sapiensdermal fibroblasts (primary cell)

皮肤纤维芽细胞

5

HFLS

贴壁

H.sapiensfibroblast-like synoviocytes (primary成纤维样滑膜细胞

cell)
6

HBEpC

贴壁

H.sapiens

bronchial epithelial cells (primary支气管上皮细胞

cell)
7

HUVEC

贴壁

H.sapiens

umbilical vein endothelial cells

脐静脉内皮细胞

(primary cell)
8

HPAEC

贴壁

H.sapiens

pulmonary artery endothelial cells

脐动脉内皮细胞

(primary cell)
9

HC

贴壁

H.sapienschondrocytes (primary cell)

软骨细胞

10

HOb

贴壁

H.sapiens

osteoblasts (primary cell)

成骨细胞

11

HSkMC

贴壁

H.sapiensskeletal muscle cells (primary cell)

骨骼肌细胞

12

HAOSMC贴壁

H.sapiens

aortic smooth muscle cells (primary

主动脉平滑肌细胞

cell)
13

HFDPC

贴壁

H.sapiens

hair follicle dermal papilla Cells

人毛乳头细胞(primary cell)
14

HMSC

贴壁

H.sapiens

marrow stromal cell (primary cell)骨髓间质细胞

15

A431

贴壁

H.sapiensepidermoid carcinoma cell line

表皮癌细胞系

16

HeLa S3

贴壁

H.sapiens

cervix carcinoma cell line宫颈癌细胞系2
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17

HepG2

贴壁

H.sapiens

hepatocellular carcinoma cell line

肝癌细胞系

18

C2C12

贴壁

M. musculus

myoblast cell line

成肌细胞

19

NIH-3T3

贴壁

M. musculus

embryo fibroblast cell line

胚胎纤维母细胞

20

MDCK

贴壁

C. familiaris

kidney cell line

肾脏细胞

21

CHO-K1

贴壁

C. griseus

ovary cell line

卵巢细胞系

22

Jurkat悬浮

H.sapiens

T lymphocyte cell line

T 淋巴细胞系

23

K562

悬浮

H.sapiens

myelogenous leukemia cell line

粒细胞白血病细胞系

24

THP-1

悬浮

H.sapiens

acute monocytic leukemia cell line

急性单核细胞白血病细
胞系

25
26

U937

悬浮

HMNC

悬浮

H.sapiens
H.sapiens

leukemic monocyte lymphoma cell单核细胞白血病淋巴瘤

line

细胞系

mononuclar cells (primary cell)

单核细胞

4. 降低了高通量分析的误差操作步骤上因为减少了移液分管及稀释操作步骤，降低了高通量分析时的误差。另外，细胞裂解时无需
用移液枪头上下吹打混匀，而且进行了 gDNA Remover 处理，提高了操作性。无需添加终止反应液及进行引起 RNA 不稳定的加热操作。
5. 可使用各种荧光定量 PCR 试剂
可与各种荧光定量 PCR 试剂组合使用。可用于 SYBR® Green I 和 TaqMan® 两种分析方法。
与本公司的 THUNDERBIRD® qPCR Mix (Code: QPS-101)、KOD SYBR® qPCR Mix (Code: QKD201)等组合使用，可以从培养细胞开始进行简便且高度准确的基因表达分析。此外，与本公司的 RNAdirect™ Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101, QRT-201)、THUNDERBIRD® Probe One-step
qRT-PCR Kit[2](Code: QRZ-101)等的 1-step 荧光定量 PCR 试剂组合使用，也可进行简易的分析产品内容本产品中含有以下试剂，可供 100 次反应使用（使用 96 孔板时）。试剂请于-20℃保存。
SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-401)<Lysis Reagents>
试剂名称

保存

容量

Lysis Solution-20℃或 2～8℃可保存 5 个月以内(注 1)

6.5ml

gDNA Remover

-20℃

33μl

RNase Inhibitor

-20℃

110μl

保存(注 2)

容量<RT Reagents>
试剂名称3
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5x RT Master Mix

-20℃

860μl

5x RT Master Mix no-RT Control

-20℃

86μl

Nuclease-free Water-20℃

1.7ml x2

试剂名称

保存

容量

Lysis Solution-20℃或 2～8℃可保存 5 个月以内(注 1)

6.5ml

gDNA Remover

-20℃

33μl

RNase Inhibitor

-20℃

110μl

SuperPrep® II Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-501)[SCQ-401 的 Lysis Reagents 的单独销售品]

注1)

Lysis solution 在 2-8℃ 条件下可存放 5 个月。但是，添加过 gDNA Remover 的 Lysis solution 不建议保存在 2-8℃。

注2)如果试剂需要长时间存贮，请放置在-30℃保存。

Lysis Solution
是经过优化过的并适用于 RT-qPCR 的细胞裂解试剂。该溶液中含有降低 RNase 活性的成分。添加试剂盒中附
带的 RNase Inhibitor 和 gDNA Remover 后即可使用。在细胞裂解的同时进行基因组 DNA 的降解。

gDNA Remover
是本试剂盒中优化过的 DNase I 溶液。按 58.7μl Lysis Solution 中加入 0.3μl gDNA Remover 的比例进行添加后，可将测定时会产生背景信号的基因组 DNA 降解掉。

RNase Inhibitor
是本试剂盒中经过优化过的 RNase Inhibitor 溶液。按照 58.7μl Lysis Solution 添加 1μl 的比例进行添加使用，可以降低样品中 RNase 活性。

5x RT Master Mix
是含有高效逆转录酶 ReverTra Ace®、RNase inhibitor、Oligo dT Primer、Random Primer、反应 buffer、MgCl2、dNTPs、glycerol(甘油)等的 5x 浓度的 Master Mix。使用该溶液之前，请先瞬时离心，使液体离心至管底。另外，因为该溶液具有粘性，请用移液器缓慢吸取。

5x RT Master Mix no-RT Control
是 5x RT Master Mix 中只去掉 ReverTra Ace®的 Master Mix。它可作为逆转录反应的对照组使用。与 5x RT
Master Mix 相同，打开盖子之前，请先瞬时离心，使液体离心至管底。另外，因为该溶液具有粘性，请用移液器
缓慢吸取。
4
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Nuclease-free Water
Nuclease-free 级的灭菌蒸馏水。该蒸馏水未经对聚合酶活性可能有影响的焦碳酸二乙酯 (DEPC)处理。

[3] 产品以外需要准备的物品
除本产品之外，请准备以下的试剂及仪器。
・ Thermal cycler 或者是 Incubator请准备能保持本产品的 RT 反应推荐温度(37℃、50℃、以及 98℃)的仪器。
・ 荧光定量 PCR 仪器及荧光定量 PCR 用的试剂
使用时请按各仪器，试剂使用说明书的指导进行。

[4] 使用方法
1. 细胞裂解液的制备(1)96 孔板培养的贴壁细胞① 向 96 孔板内放入适当数量的细胞（例如: 1～2x104 cells）。
如果细胞数量过多，有可能会使得裂解不充分或对 RT-PCR 产生抑制，及基因组 DNA 不能充分
被降解。本试剂一般可以处理 1x101～7x104 cells 的细胞样品，因细胞种类不同会有些差异。以104 个细胞为标准，建议在预实验中确认细胞数的上限。
②③④⑤

根据实验条件，孵育细胞。
将培养基从孔中弃掉。
向各孔中加入 PBS(-)（100μl 左右）。
将 PBS 从孔中弃掉。根据反应次数向所需量的 Lysis Solution 中添加 RNase Inhibitor 及 gDNA
Remover。为了防止在加样过程中溶液损失，请参考下表，制备比所需量多一些的反应液。使用
多通道移液器时，请按比所需量多出 10%的量制备反应液。
1 个反应
10 个反应
96 个反应
Lysis Solution

58.7μl587μl5635.2μl

RNase Inhibitor

1μl

10μl

96μl

gDNA Remover

0.3μl

3μl

28.8μl请在实验前制备⑥的混合液，并避免保存已添加 RNase Inhibitor 及 gDNA Remover 的 Lysis
Solution。
⑥ 向各孔中加入 60μl Lysis Solution (含有 RNase Inhibitor 与 gDNA Remover)。

5
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东洋纺（上海）生物科技有限公司⑦ 请用 Plate Mixer，在室温下振动 30 秒（强度要适当，不要使培养基飞溅出来）。如果没有 platemixer,请用手背敲打 plate 的侧面，使其轻轻地振动。直接于室温下孵育 4 分钟 30 秒。孵育时间
可延长至 10 分钟。
⑧ 将细胞培养板置于冰上。
因为有些种类的细胞 RNase 的活性很强，处理后仍有 RNase 活性的残留，所以建议立即进行逆转录(RT)反应，得到 cDNA。实验临时中断时，请在 6 小时以内进行逆转录。
cDNA 可以长期保存。以细胞裂解液的形式保存时，虽然-80℃可以冻存，但是请在 2 个月以内进行逆转录反应。
(2) 96 孔板培养的悬浮细胞
为了避免裂解不完全，当 1 个孔中的细胞数超过 7.5×104 时，请将细胞培养液的一部分移到新的 96 孔板后再进行以下处理。
① 在培养板离心机上 2,000 rpm、离心 5 分钟。
② 除去培养基。
请用吸引器或移液器除去培养板中的培养基及 PBS。倾滤法或在滤纸上敲打会造成细胞的损失。
③ 添加 PBS(-) 100μl，洗涤细胞（无需用移液器上下吹打）。
④ 2,000 rpm、离心 5 分钟。
⑤ 弃去 PBS，进行(1) ⑥以后的操作。
(3) 用 96 孔板以外的容器培养的细胞请参考下表调整试剂用量，贴壁细胞请按(1)，悬浮细胞请按(2)进行操作。

每孔中细胞数的标准每孔使用的洗涤液每孔使用的 Lysis

PBS(-)量Solution *1 量384 孔板

4x103 cells

100μl

16μl

48 孔板

2x104 cells

250μl

120μl

24 孔板

4x104 cells

500μl

240μl

12 孔板

8x104 cells

1000μl

480μl

6 孔板

1x105 cells

2000μl960μl*1: 表示的是 Lysis Solution 与 RNase Inhibitor 及 gDNA Remover 混合液的量。请参照(1)的⑥进行
混合。
细胞回收、细胞计数后处理时请按以下操作进行。
6
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东洋纺（上海）生物科技有限公司① 计算细胞数，离心去除培养基。
② 用 PBS(-)洗涤细胞。
③ 最好将细胞的浓度控制在 1x107 cells/ml 以下，用 PBS(-)悬浮细胞。
④ 向各多孔板或微量管中分别注入 5μl，按(1) ⑥以下的步骤操作。
2. 逆转录(RT)反应（使用 SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-401)时）① 反应液的制备（40μl 反应体系时）
参考下表，根据反应次数配制，在冰上制备需要量多一些的反应液。在充分混合和瞬时离心后向各
PCR 管或板中分别注入 32μｌ该混合液。使用多通道移液器时，请按比所需量多出 10%的量制备
反应液。
1 个反应

10 个反应

96 个反应

5x RT Master Mix

8μl

80μl

768μl

Nuclease-free Water

24μl

240μl

2304μlRT 反应中，虽然推荐向 20～40μl 的反应体系中添加 20%体积的裂解液（例如 40μl 的体系中含
有 8μl 裂解液），但是细胞种类不同，更改为添加 15%体积（例如 40μl 时，裂解液 6μl）可提高
定量性能。
制备 RT(-)样品时，请用 5xRT Master Mix no-RT Control 代替 5xRT Master Mix。试剂盒中附有可用 10 次（40μl 反应体系）的 no-RT Control 的试剂。
② 向分装后的 RT Master Mix 中加入 8μl 细胞裂解液，轻轻地混合之后，瞬时离心使混合液置于离
心管的底部。
③ 按以下温度进行温育。
37℃、15 分钟*1
50℃、 5 分钟*2
98℃、 5 分钟
4℃、 保温
*1: 必要时可延长至 60 分钟。
*2: 本产品的逆转录酶，高温反应性能卓越。进行本步骤有时可提高逆转录效率。根据需要本步骤也可省略。
④ 反应结束后，产物可保存在 4℃或-20℃。4℃可保存一周左右、-20℃可长期保存。

7
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东洋纺（上海）生物科技有限公司[5] 荧光定量 PCR(例)在进行 Realtime PCR 时，请参考所使用试剂及仪器的使用说明书。通常，按 10～15%体积的标准添
加 cDNA，就可以得到再现性很高的 Realtime PCR。由于使用的 Realtime PCR 试剂不同，有时模板的最适量也会不同，推荐先进行预实验。以下以本公司的试剂为例进行介绍。
1. 使用 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code: QPS-101)
详细信息请参考 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix 的使用说明书。
(1) 反应液的制备
下面是使用 TaqMan® Probe 法进行荧光定量 PCR， 50μl 及 20μl 反应体系的实验例。请根据所使
用的 Realtime PCR 仪器的特性，适当增减反应液的量。
20μl 反应50μl 反应

Xμl

Xμl

10μl

25μl

1x

Forward Primer

6pmol

15pmol

0.3μM

Reverse Primer

6pmol

15pmol

0.3μM

TaqMan® Probe

4pmol

10pmol

0.2μM

50x ROX reference dye

0.4 or 0.04μl

1 or 0.1μl

1x / 0.1x*1

cDNA 溶液 （[4].2.④）*2～3μl～7.5μl灭菌水
THUNDERBIRD®

Probe

终浓度

qPCR Mix*1:*2:

Applied Biosystems 公司的仪器、Agilent Technologies 公司的仪器等，为了校正孔间荧光强度
及分装误差，使用 passive reference。使用这些仪器进行反应时，请添加试剂盒中附带的 ROX
reference dye。最适添加量因仪器型号不同而异。主要仪器的添加量如下所示。另外，不需要
校正的仪器则无需添加。
Realtime PCR 反应液中添加的 cDNA 溶液体积请保持在总体积的 15%以内。

表 1.

主要仪器的最适 ROX reference dye 浓度仪器Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、
StepOne™、 StepOnePlus™ 等
Applied Biosystems 7500、7500Fast、
Agilent Technologies 公司的仪器(option)等
Roche、Bio-Rad、QIAGEN、
TaKaRa 公司的仪器等终浓度(添加量)
1× (1/50 倍)
0.1× (1/500 倍)
不需要(2) PCR 循环条件设定（例）8
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步骤预变性PCR 变性(40 cycles)
延伸

温度
95°C
95°C

时间
60 秒*1
15 秒*2

升降速度
最大
最大

60°C

60 秒
最大
(Data Collection 设在延伸步骤)*1: 本产品采用了高速热启动体系，通过极短的预变性时间，即可将酶重新活化。但是，为了使模板
DNA 充分变性，请根据各仪器的特性设定足够的预变性时间。当最适的预变性时间不确定时，请设定为 60 秒 (预变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)。
*2: PCR 循环中的变性时间，请根据仪器的特性，按以下时间设定。请注意，变性不充分将会导致
PCR 效率低下。当最适的变性时间不确定时，请设定为 15 秒 (变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)。
表 2.
主要仪器最适预变性时间的标准仪器
Applied Biosystems 公司的高速循环仪(Applied Biosystems 7500Fast 等)
毛细管型高速循环仪

预变性时间
20 秒
30 秒

(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的模块型循环仪(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(普通模块)、
StepOne™、StepOnePlus™、Bio-Rad CFX、
QIAGEN Rotor-Gene、Agilent Technologies、TaKaRa 公司的仪器等)
表 3.

60 秒

主要仪器最适 PCR 循环中变性时间的标准仪器
Applied Biosystems 公司的高速循环仪(Applied Biosystems 7500Fast 等)
毛细管型高速循环仪(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的模块型循环仪(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(普通模块)、

PCR 循环中的变性时间

StepOne™、StepOnePlus™、Bio-Rad CFX、
QIAGEN Rotor-Gene、Agilent Technologies 公司的仪器、
TaKaRa 公司的仪器等)

15 秒

3秒
5秒

2. 使用 KOD SYBR® qPCR Mix (Code: QKD-201)时
本试剂使用 KOD DNA polymerase 可表现出卓越的合成性能，另外不易受粗样品成分的抑制，比一
般的 qPCR 试剂检测灵敏度更高。详细信息请参考 KOD SYBR® qPCR Mix 的使用说明书。
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东洋纺（上海）生物科技有限公司(1) 反应液的制备以下是 50μl 及 20μl 反应时的制备例。请根据所使用的荧光定量 PCR 仪器特性，适当增加或减少反应液的用量。

灭菌水
KOD SYBR®
qPCR Mix
Forward Primer
Reverse Primer
50x ROX reference dye
cDNA 溶液（[4].2.④）*2

20μl 反应Xμl
10μl

50μl 反应
Xμl
25μl

终浓度

4pmol
4pmol
0.4 or 0.04μl～3μl

10pmol10pmol1 or 0.1μl～7.5μl0.2μM
0.2μM
1x / 0.1x*1

1x*1: Applied Biosystems 公司的仪器、Agilent Technologies 公司的仪器等，为了校正孔间荧光强度
及分装误差，使用 passive reference。使用这些仪器进行反应时，请添加试剂盒中附带的 ROX
reference dye。最适添加量因仪器型号不同而异。主要仪器的添加量如下所示。另外，不需要校正的仪器则无需添加。
*2: Realtime PCR 反应液中添加的 cDNA 原液量请保持在总体积的 15%以内。
表 1.
主要仪器的最适 ROX reference dye 浓度仪器Applied Biosystems 7000、7300、7700、7900HT、
StepOne™、 StepOnePlus™ 等
Applied Biosystems 7500、7500Fast、
Agilent Technologies 公司的仪器(option)等
Roche、Bio-Rad、QIAGEN、
TaKaRa 公司的仪器等终浓度(添加量)
1× (1/50 倍)
0.1× (1/500 倍)
不需要(2) PCR 循环条件设定（例）KOD SYBR® qPCR Mix 的说明书中以 3 步法的 protocol 为标准，与本试剂组合使用时推荐用 2 步法
protocol 进行。
步骤
温度
时间
95°C
预变性
60 秒*195°C
PCR 变性
15 秒*2(40 cycles)
60°C
延伸
60 秒
(Data Collection 请设定在延伸这一步)
融解曲线分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)*3

升降速度
最大
最大
最大

*1: 本产品采用了高速热启动体系，通过极短的预变性时间，即可将酶重新活化。但是，为了使模板
DNA 充分变性，请根据各仪器的特性设定足够的预变性时间。当最适的预变性时间不确定时，请设定为 60 秒 (预变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)。
10
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东洋纺（上海）生物科技有限公司*2: PCR 循环中的变性时间，请根据仪器的特性，按以下时间设定。请注意，变性不充分将会导致
PCR 效率低下。当最适的变性时间不确定时，请设定为 15 秒 (变性时间的延长几乎对反应效率没有影响)。
*3: 融解曲线分析的设定，请根据各仪器的标准设定。详细信息请参考各仪器的使用说明书。
表 2.
主要仪器最适预变性时间的标准仪器
Applied Biosystems 公司的高速循环仪(Applied Biosystems 7500Fast 等)
毛细管型高速循环仪(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的模块型循环仪(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(普通模块)、
StepOne™、StepOnePlus™、Bio-Rad CFX、
QIAGEN Rotor-Gene、Agilent Technologies 公司的仪器、
TaKaRa 公司的仪器等)
表 3.
主要仪器最适 PCR 循环中变性时间的标准仪器
Applied Biosystems 公司的高速循环仪(Applied Biosystems 7500Fast 等)
毛细管型高速循环仪(Roche LightCyclerTM 1.x、2.0)
一般的模块型循环仪(Applied Biosystems 7700、7500、7900HT(普通模块)、
StepOne™、StepOnePlus™、Bio-Rad CFX、
QIAGEN Rotor-Gene、Agilent Technologies 公司的仪器、
TaKaRa 公司的仪器等))

预变性时间
20 秒
30 秒

60 秒

PCR 循环中的变性时间
3秒
5秒

15 秒

3. 使用 THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code: QPS-201)时
详细信息请参考 THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix 的使用说明书。
(1) 反应液的制备以下是 50μl 及 20μl 反应时的制备例。请根据所使用的荧光定量 PCR 仪器特性，适当增加或减少反应
液的用量。

灭菌水
THUNDERBIRD®

SYBR®

20μl 反应50μl 反应

Xμl

Xμl

10μl

25μl

终浓度

1x

qPCR Mix11
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Forward Primer

6pmol

15pmol

0.3μM

Reverse Primer

6pmol

15pmol

0.3μM

50x ROX reference dye

0.4 or 0.04μl

1 or 0.1μl

1x / 0.1x*1

Cdna 溶液（[4].2.④）*2

～2μl

～5μl

*1: 请参考 2（1）表 1。
*2: Realtime PCR 反应液中添加的 cDNA 原液量请保持在总体积的 10%以内。
(2) PCR 循环条件的设定请参考 2.（2）。
4. 使用其他公司的 qPCR 试剂时
使用 SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-401)制备的 cDNA，请以 qPCR 反应
体系的 10～15%体积标准使用。使用本试剂盒的逆转录反应试剂以外的试剂合成时，请根据所使用的试剂的说明书添加 cDNA 的量及 qPCR 反应体系。
使用化学修饰的热启动 qPCR 试剂时，本产品的 RT 反应液的最大添加量，请以 10%为标准。根据所用 qPCR 试剂的性质不同，该值有可能会下降。请减少逆转录反应液的添加量。
5. 使用 1-step RT-qPCR 试剂时
可以用本试剂制备的细胞裂解液作为 1-step RT-qPCR 的模板进行简易的测定。作为 1-step RT-qPCR
的 试 剂 ， 请 使 用 本 公 司 的 RNA-directTM Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101) 、THUNDERBIRD® Probe One-step qRT-PCR Kit(Code: QRZ-101)、RNA-directTM SYBR® Green

Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-201)。详细信息请参考各产品附带的说明书。
A. 使用 RNA-directTM Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101)(1) 反应液的制备以下是 50μl 及 20μl 反应时的制备例。请根据所使用的荧光定量 PCR 仪器特性，适当增加或减少反应
液的用量。
20μl 反应50μl 反应灭菌水 (RNase-free grade)

Xμl

Xμl

RNA-directTM Realtime PCR

10μl

25μl

1x

50mM Mn(OAc)2

1μl

2.5μl

2.5 mM

Forward Primer

6pmol

15pmol

0.3μM

终浓度Master Mix

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Reverse Primer

6pmol

15pmol

0.3μM

TaqMan® Probe

4pmol

10pmol0.2μM

细胞裂解液（[4].1.(1)⑨）

1～2μl

2.5～5μl(2) PCR 循环条件的设定
步骤
预变性
逆转录反应
变性

温度
90°C
55°C
95°C

时间
30 秒
20 秒
60 秒

升降速度
最大
最大
最大

PCR
变性
(40 cycles)
延伸

95°C

15 秒

最大

60°C
60 秒
(Data Collection 请设定在延伸这一步)B. 使用 THUNDERBIRD® Probe One-step qRT-PCR Kit

最大(Code: QRZ-101)时

(1) 反应液的制备以下是 50μl 及 20μl 反应时的制备例。请根据所使用的荧光定量 PCR 仪器特性，适当增加或减少反应
液的用量。
试剂

*1:

终浓度

20μl 反应50μl 反应

RNase free water

Xμl

Xμl

2×Reaction Buffer

10μl

25μl

DNA Polymerase

0.5μl

1.25μl

RT Enzyme Mix

0.5μl

1.25μlForward Primer

10pmol25pmol

0.5μM

Reverse Primer

10pmol25pmol

0.5μM

TaqMan® probe

4pmol

10pmol

0.2μM

50×ROX Reference dye

0.4 /0.04μl*1

1/0.1μl*1

1×/0.1×*1(Uracil-N-Glycosylase)

0.4unit*2

1unit*2

细胞裂解液（[4].1.(1)⑨）

1～2μl

2.5～5μl

1×Applied Biosystems 公司的仪器、Agilent Technologies 公司的仪器等，为了校正孔间荧光强度
及分装误差，使用 passive reference。使用这些仪器进行反应时，请添加试剂盒中附带的 ROX
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reference dye。最适添加量因仪器型号不同而异。主要仪器的添加量如表 1 所示。另外，不需要
校正的仪器则无需添加。。
*2: 使用 Uracil-N-Glycosylase(UNG)处理时，请使用热敏感性(heat-labile)UNG。可根据各公司的推荐条件，调整酶的用量。
表 1：主要仪器的最适 ROX Reference dye 浓度仪器终浓度（添加量）

Applied Biosystems®7000、7300、7700、7900HT、

1×(1/50 倍)

StepOneTM、StepOnePlusTM 等
Applied Biosystems®7500 、 7500Fast 、 Agilent

0.1×(1/500 倍)

Technologies（option）等公司生产的仪器
Roche、Bio-Rad、

不需要

Qiagen 及 TaKaRa 等公司生产的仪器(2) PCR 循环条件的设定步骤(UNG 反应)
逆转录反应
预变性

温度
(25～25°C *1)
50°C
95°C

时间
(10 分*1)
10 分
60 秒

升降速度
最大

PCR
变性
(40～45 cycles) *2
延伸

95°C

15 秒

最大

最大

60°C
45 秒
(Data Collection 请设定在延伸这一步)最大*1: 使用 UNG 处理时，在逆转录反应前，请设置 UNG 反应步骤。虽然上表中给出了通常的温度条件
及反应时间，请根据各公司的推荐条件进行调整。
*2: 用 40 个循环进行反应时，如果扩增不充分，请增加至 45 个循环。
C. 使用 RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(Code: QRT-201)时
(1) 反应液的制备以下是 50μl 及 20μl 反应时的制备例。请根据所使用的荧光定量 PCR 仪器特性，适当增加或减少反应
液的用量。

灭菌水 (RNase-free grade)

20μl 反应50μl 反应

Xμl

Xμl

终浓度

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RNA-directTM SYBR® Green

10μl

25μl

1x

50mM Mn(OAc)2

1μl

2.5μl

2.5 mM

Forward Primer

4pmol

10pmol

0.2μM

Reverse Primer

4pmol

10pmol0.2μM

细胞裂解液（[4].1.(1)⑨）

1～2μl

2.5～5μl

Realtime PCR Master Mix(2) PCR 循环条件的设定
步骤
温度
95°C
预变性
55°C
逆转录反应
95°C
变性
95°C
PCR
变性
(40 cycles)
55°C
退火
延伸

时间
30 秒
20 分
60 秒
15 秒

升降速度
最大
最大
最大
最大

15 秒

最大

74°C
60 秒
最大
(Data Collection 请设定在延伸这一步)
融解曲线分析 (Melting / Dissociation Curve Analysis)*3[6] 实验例
1 与纯化后的 RNA 检测结果的比较＜方法＞
使用 SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-401)，对 2.5x104 个 HUVEC（人脐带静脉内皮细胞）细胞进行处理得到细胞裂解液后，进行 cDNA 的合成（40μl 反应体系）。另外，同时使用 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix (Code: FSQ-201)对从 HUVEC 细胞提取的 66.6 ng 的Total RNA 进行 cDNA 合成（40μl 反应体系）。分别以上述两个试剂得到的 cDNA 为模板，用
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code: QPS-201)试剂，对 15 种管家基因进行 Realtime PCR
分析比较。
＜结果＞

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结果表明：15 种目的基因中，试剂盒制备的 cDNA 与纯化的 RNA 制备的 cDNA 之间，存在很高的相关性。由此可见，使用本试剂盒，无需进行复杂的 RNA 纯化， 就可以简便地通过 Realtime PCR 进行
基因表达分析
2. 分析准确性的评价＜方法＞
将 HeLa S3 细胞铺板于 96 孔板中，每孔 2x104 个细胞，添加 100nM phorbol 12-myristate 13acetate (PMA)，培养 24 小时。然后，分别用 PBS(-)洗涤 PMA 处理过的 12 个孔及未处理过的 12 个
孔中的细胞，用 SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-401)处理后，进行 cDNA的合成。以得到的 cDNA 为模板，使用 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code: QPS-101)，对
IL-6、IL-1β、β-actin 基因的表达量进行 Realtime PCR 分析。同样使用 A 公司的细胞处理试剂进行
Realtime PCR 分析。IL-6、IL-1β基因的 Ct 值用β-actin 基因进行校正（ΔCt）、计算出有无 PMA 处
理的差值（ΔΔCt）。接着计算 Z’-factor，进行比较。
Note：Z’-factor : 是将数据的误差考虑在内的、 高通量分析体系中质量标准的数值。一般认为在
0.5 以上是良好的结果。这里使用以下公司计算得到。
Z’-factor = 1-3 x 【ΔCt(+) 标准偏差 + ΔCt(-) 标准偏差)】/ |ΔΔCt|＜结果＞

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A 公司试剂

SuperPrep® II

Ct(IL-IL-1β1β）

ΔCt(IL-1β-β-actin)

PMA

平均

平均

标准偏差

ΔΔCt

Z'

SuperPr

(+)

27.83

5.93

0.18

-6.81

0.66

ep® II

(-)

34.85

12.75

0.59

A 公司试

(+)

28.42

5.01

0.28

-7.38

0.59

剂

(-)

35.98

12.39

0.74

Ct(IL-6)

ΔCt(IL-6-β-actin)

PMA

平均

平均

标准偏差

ΔΔCt

Z'

SuperPre

(+)

25.35

3.45

0.20

-4.05

0.66

p® II

(-)

29.60

7.50

0.26

A 公司试

(+)

25.64

2.24

0.19

-3.94

0.64

剂

(-)

29.76

6.18

0.29

IL-6

结果表明：虽然两种试剂得到的 Z’-factor 都超过了良好分析体系的标准 0.5，但是使用本公司的SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-401)と THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix(Code: QPS-101)试剂时，比其他公司的试剂得到了更高的 Z’-factor，可见是相对质量更高的分析体系。
3. 细胞裂解液在冰上稳定性的确认＜方法＞

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使用 SuperPrep® II Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-401)，分别从 4x104 个 HeLa S3 及U937 细胞制备细胞裂解液，将样品移至冰上以后，分别取放置 0~6 小时后的细胞裂解液样品进行 cDNA的合成。同样使用 A 公司试剂制备细胞裂解液，同样方法取样，进行 cDNA 的合成。以得到的 cDNA
为模板，使用 THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix (Code: QPS-101)，对 GAPDH 基因的表达量进行
Realtime PCR 分析。
＜结果＞<HeLa S3>

<U937> 冰上冰上

HeLa S3 细胞时及 RNase 活性较强的 U937 细胞，，在冰上放置 6 小时，未见到 Ct 值有显著的差异。
*细胞的种类及处理细胞的数量较多时，定量 PCR 的结果有可能受到较强的 RNase 活性的影响。细
胞裂解液制备后，建议迅速将样品置于冰上或 4℃进行 cDNA 的合成。另外，根据需要，推荐对使用
的细胞进行预实验。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[7] Trouble Shooting
现象

原因

对策

细胞数过多

・过多的细胞来源的组分，有时会抑制 RT 反应或
qPCR 反应。请减少铺板的细胞数，或将裂解液用Lysis Solution 稀释后，再添加到 RT 反应中。
・因细胞的种类不同，有时 RNase 的活性会较强，裂解液中的 RNase 不能完全失活。遇到这种细胞时，推荐细胞裂解后，将裂解液移至冰上，立刻进
行 RT 反应，转化为 cDNA。一般细胞株的裂解液
在冰上放置 6 小时左右是稳定的。

RNA 发生降解
Realtime PCR 中没检
测到信号，或检测延迟・保存裂解液时，请冻存于-80℃并尽量减少冻融次
数。
・请使用新制备的细胞。要冻结保存分析用的细胞时，培养后，请用 PBS(-)进行洗涤，将 PBS(-)从细
胞中弃去，于-80℃冻结。

逆转录反应液添加过多

・虽然用本产品得到的 RT 反应液，即使以最大15%的比例添加到 qPCR 反应液中，也可以确认对线性没有影响，但根据所用 qPCR 试剂的性质不同，这个允许量有可能下降。请减少逆转录反应液
的添加量。使用 THUNDERBIRD® SYBR® qPCR
Mix (Code: QPS-201)时，RT 反应液向 qPCR 反应
液中添加的最大量请按 10%添加。
・使用本产品以外的 RT 试剂时， 带入 qPCR 反应
的允许量有可能发生变化。请先进行预实验。

定量性能低细胞裂解时没有混合均匀

・添加 Lysis Solution、Stop Solution 后，请充分混
合，不要产生搅拌不均匀。

[8] 相关产品
产品名称

容量

Code No.

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Realtime PCR 用细胞裂解&Cdna 合成
试剂盒（培养细胞用）
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for
qPCR

100 次反应SCQ-101

Realtime PCR 用细胞裂解液（培养细胞用）®
SuperPrep Cell Lysis Kit for qPCR

100 次反应SCQ-201

1mlx1(40 次份)1.67mlx3(200 次份)
1.67mlx15(1000 次份)1mlx1
(40 次份)1.67mlx3(200 次份)
1.67mlx15(1000 次份)1mlx1
(40 次份)1.67mlx3(200 次份)
1.67mlx15(1000 次份)QPS-101T

各种荧光探针・荧光引物检测用Realtime PCR 试剂
THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix

高效率 SYBR® Green I 检测用 Realtime
PCR 试剂
KOD SYBR® qPCR Mix

高效率 SYBR® Green I 检测用 Realtime
PCR 试剂
THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix
高效率 One-step qRT-PCR Kit
THUNDERBIRD® Probe One-step
qRT-PCR Kit
One step qRT-PCR kit （TaqMan®分析

100 次份
0.5mlx5(100 次份)
0.5mlx25(500 次份)
0.5mlx5(100 次份)
0.5mlx25(500 次份)・探针分析用）RNA-directTM Realtime PCR MasterMix
One step qRT-PCR kit （SYBR®
Green I 分析用）
RNA-directTM SYBR® Green Realtime
PCR Master Mix

QPS-101
QPS-101X5
QKD-201T
QKD-201
QKD-201X5
QPS-201T
QPS-201
QPS-201X5
QRZ-101
QRT-101
QRT-101X5
QRT-201
QRT-201X5

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