10-07

One-step qPCR Kit®

RNA-direct SYBR GreenRealtime PCR Master Mix(Code No.QRT-201,QRT-201T)

使用说明书

科研用TOYOBO CO., LTD. Life Science Department
OSAKA JAPAN目

录[1] 前言 ...................................................................................................................................................1[2] 本产品的组成 ................................................................................................................................2[3] 其他必需品 .....................................................................................................................................3[4] 使用方法 ..........................................................................................................................................4[5] 常见问题 ..........................................................................................................................................8[6] 相关产品 ....................................................................................................................................... 10【 注意 】
本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。
NOTICE TO PURCHASER: LIMITED LICENSE
A license to perform the patented 5’ Nuclease Process for research is obtained by thepurchase of (i) both Authorized 5' Nuclease Core Kit and Licensed Probe, (ii) a Licensed 5’Nuclease Kit, or (iii) license rights from Applied Biosystems.
This product is an Authorized 5’ Nuclease Core Kit. Use of this product is covered by one ormore of the following US patents and corresponding patent claims outside the US:
5,079,352, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155, 5,677,152, 5,773,258, 5,407,800, 5,322,770,
5,310,652, 5,210,015, 5,487,972, and claims outside the US corresponding to US PatentNo. 4,889,818. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunityfrom suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product for thepurchaser’s own internal research. Separate purchase of a Licensed Probe would convey
rights under the applicable claims of US Patents Nos. 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930,6,030,787, 6,258,569, 5,804,375 (claims 1-12 only), and 6,214,979, and corresponding
claims outside the United States. No right under any other patent claim and no right toperform commercial services of any kind, including without limitation reporting the results ofpurchaser's activities for a fee or other commercial consideration, is conveyed expressly, byimplication, or by estoppel. This product is for research use only. Diagnostic uses under
Roche patents require a separate license from Roche. Further information on purchasing
licenses may be obtained from the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln
Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.
※LightCyclerTM是Idaho Technology Inc.和Roche Molecular Systems Inc.的商标。
※TaqMan®是Roche Molecular Systems Inc.的注册商标。
※SYBR®是Molecular Probes Inc.的注册商标。
※ABI PRISM®是The Perkin-Elmer Corporation的注册商标。

[1] 前言
本品采用Thermus thermophilus HB8 株来源的rTth DNA 聚合酶，该酶在二价
锰离子（Mn2+）存在下具有很强的逆转录活性，利用该特性，开发出单酶一步法定量PCR 试剂盒。逆转录反应和PCR 反应在同一反应体系连续进行，仅需一次加样即可完成，减少了样品间交叉污染的危险，而且操作便捷，尤其适用于高通量实验。
本品适用于SYBR® Green Ⅰ掺入法检测。

◆本产品特征◆1．逆转录反应和PCR 反应在同一反应体系中进行
本品以 RNA 为模板，逆转录反应和 PCR 反应在同一反应体系连续进行，快速方便，非常适合于高通量实验。同时也减少了样品间交叉污染的风险。
2．可应用于高级结构复杂的 RNA 和高 GC 含量的模板
本品采用单种耐热性rTth DNA多聚酶。和通常的逆转录酶相比较，可以在高温下进行逆转录，非常有利于对具有复杂高级结构的RNA模板进行逆转录反应，
同时该酶对高GC含量的模板也有出色的扩增表现。
3．快速热启动本品采用抗体法热启动，对控制非特异性扩增非常有效。同时，抗体在高温
下会迅速失活，释放多聚酶活性，最大限度地避免了高温对RNA 模板和聚合酶活性的损伤。
4．高适用性可应用于LineGene（BIoFlux 公司），LightCycler（Roche 公司），ABI PRISM（ABI公司）等仪器。
<关于 SYBR® GreenⅠ检测体系>
SYBR® GreenⅠ检测体系通过 SYBR® GreenⅠ染料与 DNA 的扩增产物结合，
并且结合后染料的荧光强度的增强作为指标，进行检测。
虽然该方法和普通的 PCR 反应一样简便，但由于会出现引物二聚体、目的条
带以外的扩增产物等，因此有必要在扩增后对融解曲线进行分析确认。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[2] 本产品的组成本产品分为两个包装，50μl 反应体系可用 40 次份（QRT-201T）和 100 次
份（QRT-201）。
<QRT-201T>

RNA-direct SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
50 mM Mn(OAc)20.5 ml x 2
0.2 ml x 1<QRT-201>

RNA-direct SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
50 mM Mn(OAc)20.5 ml x 5
0.5 ml x 1

RNA-direct SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
该组分是包含反应缓冲液、SYBR® Green Ⅰ、dNTPs、rTth DNA聚合酶及抗DNA聚合酶抗体的2×预混液。请添加模板RNA、Mn(OAc)2和引物，并用灭菌蒸馏
水配制成1×浓度后再使用。该溶液中已包含1×浓度ROX（Passive referencedye）。
50 mM Mn(OAc)2
逆转录反应必需溶液。通常按反应体系的1/20 体积（终浓度2.5mM）添加，
根据RNA 模板的不同，也可适当增减Mn(OAc)2 的终浓度，以获得更高的扩增效率该 系 列 产 品 原 则 上 在 -20 ℃以 下 避 光 冷 冻 保 存 。 但 是 ， 如 果 在 短 期
内 需 持 续 使 用 时 ，可 于 融 解 后 在 4 ℃避 光 保 存 ，此 时 最 长 可 保 存 2个 月 。
保存时请使用避光箱或产品内配有的铝箔袋。
建 议 每 支 产 品 融 解 后 ，于 4 ℃状 态 保 存 ，并 于 3周 内 使 用 完 毕 。融 解后 的 产 品 短 期 内 不 用 时 ，请 装 入 原 包 装 袋 ，再 次 于 -20 ℃状 态 下 进 行 避光冷冻保存。

垂询电话：021-58794900

2[3] 其他必需品
除本产品外，还需准备以下试剂和仪器。
（1）Realtime PCR 仪
本产品适用于普通及高速的模块型（Block Type）、玻璃毛细管型（GlassCapillary Type）等各种 Realtime PCR 仪。请使用者根据各仪器说明书，结合实际情况进行适当调整。本书仅以 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM®和 Roche 公
司的 LightCyclerTM 为例进行说明，供使用者参考。
（2）引物
请根据目的基因的序列设计引物，引物设计对实时定量PCR实验的精确度和重现性非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。
-引物长度请设定为 20～30mer、GC 含量为 40～60%。
-扩增片段应小于 200bp，如可能请尽量设定在 50～150bp。过长的片段容易导致扩增效率低下，而且容易导致非特异性反应，影响定量准确性。
-引物设计应尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性。

（3）模板 RNA
Total RNA可直接以Total RNA作为模板进行定量。通过常规AGPC（AcidGuanidium-Phenol-Chloroform）法制备的Total RNA中可能会混入基因组DNA，从而造成假阳性，必要时可用DNase I等试剂去除。在组织、细胞等样本中，作为目标检测对象的mRNA含量通常仅占Total RNA的1-2％。
poly(A)+ RNA (mRNA)具有poly(A)+结构的mRNA可通过Oligo(dT)n制备。通过纯化过程，mRNA得到
高度浓缩，通常用于对mRNA的高灵敏度检测。需要注意的是，mRNA比Total RNA
更容易被RNase所降解，操作时须特别小心。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[4] 使用方法
4.1 ABI PRISM®7900 的 SYBR® Green 掺入法使用说明
(1)反应液的配制试剂蒸馏水RNA-direct SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
50 mM Mn(OAc)2
上游引物 (10 μM )下游引物 (10 μM )样品RNATotal RNApoly(A)+ RNA
Total volume添加量X μl
25 μl
2.5 μl
1.0 μl
1.0 μlY μl

终浓度1x2.5mM
0.2 μM
0.2 μM<2.5μg/50μl<500ng/50μl

50 μl

蒸馏水必须用RNase-free级别，建议用过滤法制备的RNase-free水。如用DEPC处理过的水，残留的DEPC会阻碍PCR反应，因此请通过高压灭菌彻底去除DEPC。此外，用于Realtime PCR的RNase-free水请与其它实验用水分开保存，避免混用。

每种引物的添加量请在10-30pmol（终浓度0.2-0.6μM）之间调整，若扩增效果不理想，增加引物的添加量会有所改善，但添加量过多，则可能会由于非特异性扩增的原因，出现信号检出率低的情况。

Mn(OAc) 2终浓度通常为2.5mM，根据RNA样品浓度和目标序列的不同，有时在1.5-3.5mM浓度范围内适当增减Mn(OAc) 2浓度会得到更好的结果。

作为的模板的RNA，通常Total RNA不要超过2.5μg，poly(A)+ RNA（mRNA）
不要超过500ng。模板过多会降低反应效率，从而造成扩增曲线的线性不好。

垂询电话：021-58794900

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(2)PCR的循环条件[RT-PCR温度设定(例)]变性190℃
30s
↓
RT61℃
20min
↓
变性295℃
60s↓
PCR循环 (×45循环)：
95℃
15s
55℃
15s
74℃
45s（data collection）↓融解曲线分析(Melting Curve Analysis)



本品是采用高温热启动的产品，第一次变性过程90℃，30秒后，即可充分释
放酶活性，过分加热会影响酶活性及损伤模板RNA的稳定性。

退火温度请根据引物的Tm值在55℃-65℃之间进行调整。根据引物的不同，
有时最佳温度可能超出此范围，此时请根据实际情况调整。

Detector通常设为Reporter：SYBR，Quencher：None Flurorescent。Passive
Reference设为ROX。详细设置请参照仪器使用说明书。

实时定量PCR中目标片段通常都很小，一般不需调整延伸时间，如需变更，请务必确保data collection步骤在30秒以上。

上述实例的循环设置采用的是三步法。此外也可采用两步法作为PCR的循环条件，此时请将data collection设置在退火／延伸步骤（即将退火／延伸步骤合并在一起）。

上例采用ABI PRISM® 7900HT的标准模式。使用SYBR® Green分析法时，ABI公司不推荐使用快速模式（Fast Mode）。

融解曲线分析请根据各仪器的标准设定。详细请见各仪器的使用说明书。

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4.2 Roche Light CyclerTM 的 SYBR® Green 掺入法使用说明
(1)反应液的配制试剂蒸馏水RNA-direct SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
50 mM Mn(OAc)2
上游引物 (10 μM )下游引物 (10 μM )样品RNATotal RNApoly(A)+ RNA
Total volume

添加量X μl
10 μl
1 μl
0.4μl
0.4μl
Y μl

终浓度
1x2.5mM
0.2μM
0.2μM<1μg/20μl<200ng/20μl

20 μl

蒸馏水必须用RNase-free级别，建议用过滤法制备的RNase-free水。如用DEPC
处理过的水，残留的DEPC会阻碍PCR反应，因此请通过高压灭菌彻底去除DEPC。此外，用于Realtime PCR的RNase-free水请与其它实验用水分开保存，避免混用。

每种引物的添加量请在4-12pmol（终浓度0.2-0.6μM）之间调整。若扩增效果
不理想，增加引物的添加量会有所改善，但添加量过多，则可能会由于非特异性扩增的原因，出现信号检出率低的情况。

Mn(OAc) 2终浓度通常为2.5mM，根据RNA样品浓度和目标序列的不同，有时
在1.5-3.5mM浓度范围内适当增减Mn(OAc) 2浓度会得到更好的结果。

作为的模板的RNA，通常Total RNA不要超过1μg，poly(A)+ RNA（mRNA）不要超过200ng。模板过多会降低反应效率，从而造成扩增曲线的线性不好。

垂询电话：021-58794900

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(2)PCR的循环条件[RT-PCR温度设定(例)]变性190℃
30s
↓
RT61℃
20min
↓
变性295℃
30s↓PCR循环 (×45循环)：95℃
5s
55℃
10s
74℃
15s（data collection）↓融解曲线分析(Melting Curve Analysis)


本品是采用高温热启动的产品，第一次变性过程90℃，30秒后，即可充分释
放酶活性，过分加热会影响酶活性及损伤模板RNA的稳定性。

退火温度请根据引物的Tm值在55℃-65℃之间进行调整。根据引物的不同，
有时最佳温度可能超出此范围，此时请根据实际情况调整。另外，当发现有
引物二聚体等非特异性反应时，将退火步骤缩短至5秒，有可能得到改善。

对于200bp以内的目标片段，延伸15秒通常已经足够。如需调整，请确保datacollection步骤在10秒以上（仪器数据采集方式限定）。

Detector设为F1。

上述实例的循环设置采用的是三步法。此外也可采用两步法作为PCR的循环条件，此时请将data collection设置在退火／延伸步骤（即将退火／延伸步骤合并在一起）。



本品支持 20℃/sec 的最快升温模式。但当扩增效果不理想时，可尝试将退火
和延伸步骤之间的升温速度降至 2℃/sec。

融解曲线分析请根据各仪器的标准设定。详细请见各仪器的使用说明书。

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东洋纺（上海）生物科技有限公司[5] 常见问题 扩增曲线混乱或没有仪器设置方面的问题（请参照相关仪器的说明书）原因
Detector的设置与荧光染料不匹配数据采集的设置不恰当样品位置设置错误仪器方面的其他故障或不匹配对策根据荧光染料的种类不同，对检测仪器的设置进行相应的更改，然后再进行实验。
请调整设置再进行实验。
设置适当的样品位置后再进行分析或再进行实验。
请根据各仪器的说明书进行检查。

试剂方面的问题
原因
对策PCR反应条件、引物的浓度、序列 可通过调整引物浓度、PCR反应条件等加等不恰当以改善。扩增不理想时，一般可尝试降低
退火温度、延长退火时间或提高引物浓度。
在少数情况下，提高退火温度或延长延伸时间也会有改善。另外，对于GC含量高的目的片段，延长变性时间也会有改善。
仍不能改善时，建议重新设计引物。
样品纯度不好RNA模板可能会在RNase的作用下降解，此时，请使用RNA的专用仪器再次抽提制
备RNA样品；DNA样品可通过苯酚抽提、乙醇沉淀等方法提纯后再进行实验；如样
品为cDNA，逆转录酶的残留会有一定的影响。

 定量值重现性差仪器设置方面的问题（请参照相关仪器的说明书）原因
仪器方面的故障或不匹配垂询电话：021-58794900

对策
因为仪器的不适用，在温度管理或检测时产生重现性差的情况。此时请根据相应仪
器的说明书进行检查。

8试剂方面的问题
原因对策样品纯度不好不纯的样品会导致实验的重现性差。请使
用充分混匀的样品。如样品为cDNA，逆转录酶的残留会有一定的影响。通过苯酚抽提或乙醇沉淀等方法提纯后再进行实验。
另外，样品中残留的基因组DNA也可能导
致定量值偏差，请用DNaseⅠ处理以除去
基因组DNA。
PCR反应条件、引物或探针的浓度、 扩增效率差的PCR较容易产生重现性差的序列等的不恰当情况。此时，可通过调整引物或探针的浓度、PCR其他反应条件等来改善扩增效果。
若重现性很差，且无法通过提高扩增效率加以改善，则建议重新设计引物。
计量误差
反应体积太小会导致检测精度下降。请根
据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

 空白样品中有信号
请在融解曲线分析(Melting Curve Analysis)的基础上进行判断。

融解曲线的顶点所对应的温度与阳性样品的温度相同原因
阳性样品或PCR产物等的污染对策
首先请更换用作空白样本的水。如果还发生同样情况，请分别更换蒸馏水、引物或另启用一管新的Master Mix后再进行实验。

融解曲线的顶点所对应的温度比阳性样品低原因
对策发生了引物二聚体等的非特异性反 调整引物的浓度或温度。出现非特异性反应应时，一般可提高结合温度或降低引物浓
度。通过缩短退火·延伸的时间或进行三步
法PCR的操作也可改善。仍得不到改善时，建议重新设计引物。

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Http://www.bio-toyobo.cn东洋纺（上海）生物科技有限公司[6] 相关产品SYBR® GreenⅠ检测体系用 Realtime PCR 试剂
品名
容量1ml x 1 (40次份)®
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix
1.67ml x 3 (200次份)1ml x 1 (40次份)SYBR® Green Realtime PCR
Master Mix
1ml x 5 (200次份)1ml x 1 (40次份)SYBR® Green Realtime PCR
Master Mix-Plus1ml x 5 (200次份)Code No.
QPS-201T
QPS-201
QPK-201T
QPK-201
QPK-212T
QPK-212®

※THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 中，50X ROX reference dye 另外单独添付。
※SYBR® Green Realtime PCR Master Mix-Plus-中，Plus solution 另外单独添付。
※容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数。

TaqMan®探针法检测体系用 Realtime PCR 试剂
品名
容量1ml x 1 (40次份)THUNDERBIRD Probe qPCR Mix
1.67ml x 3 (200次份)1ml x 1 (40次份)Realtime PCR Master Mix
1ml x 5 (200次份)Code No.
QPS-101T
QPS-101
QPK-101T
QPK-101※THUNDERBIRD Probe qPCR Mix 中，50X ROX reference dye 另外单独添付。
※容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数。

Realtime PCR用cDNA合成试剂盒
品名
ReverTra Ace qPCR RT Kit
1 步法•Realtime PCR 相关试剂
品名

Code No.

200次份

FSQ-101

容量0.5ml x 2(40次份)

各种荧光Probe、荧光引物检测体系用1步法•Realtime PCR试剂RNA-direct Realtime PCR Master Mix

0.5ml x 5(100次份)※RNA-direct 系列中，50mM Mn(OAc)2 另外单独添付。
※容量是指反应体系为 50μl 时的反应次数。

垂询电话：021-58794900

容量10Code No.
QRT-101T

QRT-101[销售商]东洋纺（上海）生物科技有限公司
地址：上海市浦东新区张杨路 500 号华润时代广场 28 楼 AL
邮编：200122
订购 • 技术相关咨询
Tel:021-5879-4900

Fax:021-5879-4901

E-Mail:tech@bio-toyobo.cn
http://www.bio-toyobo.cn[生产商]东洋纺株式会社敦贺生物工厂地址：日本国福井县敦贺市东洋町 10 番 24 号

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