生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

シリアルフェムト秒結晶学における異常分散を用いた位相決定
山下恵太郎1，岩田想1,2，吾郷日出夫1，山本雅貴1，中津

1理化学研究所放射光科学総合研究センター

亨1,3〒6795148 兵庫県佐用郡佐用町光都 111

2京都大学大学院医学研究科〒6068501 京都府左京区吉田近衛町

3京都大学大学院薬学研究科〒6068501 京都府左京区吉田下阿達町4629

X 線自由電子レーザー（XFEL; Xray free electron laser）は，その超短パルス超高輝度特性によって，試料損

壊前に X 線回折を得ることを可能にした。シリアルフェムト秒結晶学（SFX; serial femtosecond crystallography）
は，大量の微小結晶試料から次々に XFEL による回折パターンを得て構造解析を行う手法であり，無損傷かつ高分解能のタンパク質構造を常温でも得ることを可能にし，時分割測定への応用も拡がりつつある。しかしながら，■
要旨

SFX による構造解析の大部分は既知の類似構造が必要な分子置換法によるものであり，新規構造の決定に応用された事例は存在しない。私たちは SACLA において12.6 keV の XFEL を用いて，ネイティブおよび水銀誘導体のタンパク質結晶から，異常分散を用いた同型置換法（SIRAS; single isomorphous replacement with anomalous
scattering）によって効率的に位相決定が可能であることを示した。さらに，データ処理方法が改良されたことで，誘導体結晶だけを用いた単波長異常分散（SAD; singlewavelength anomalous dispersion）法による位相決定も可能になった。

Barends ら6) が，ガドリニウム（ Gd ）原子を結合させた

1. はじめにlysozyme の構造を， SAD 法によって決定できたという報

生体中における化学反応など様々な生命現象を司るタン

告をおこなった。 Lysozyme 1 分子あたり 2 原子の Gd が

パク質の機能を理解するためには，その正確な立体構造情

結合しており，非常に大きな異常分散寄与があったが，そ報が欠かせない。現在主流の構造解析手法である X 線結

れでも 6 万枚もの回折パターンを必要とした。

晶回折では，質の良い結晶さえ得られれば高分解能構造解

本研究では，水溶性タンパク質であるルシフェリン再生析が可能であり，結晶作製技術の向上やシンクロトロン放酵素（ LRE; Luciferinregenerating enzyme ）の水銀誘導

射光による X 線の高輝度化などにより，構造解析の対象

体結晶を用いて SFX 実験を行い，位相決定を試みた。本は次第に拡大してきている。しかしながら，質の良い結晶ケースは，先の lysozyme ケースと比べて空間群の対称性が得られにくい試料も多く，数ミクロン程度の微小結晶

は半分，異常分散シグナルの寄与率は 3 分の 1 程度であや，回折能の低い結晶しか得られないことは多い。近年利

り，より現実的な系と言えるだろう。当初，収集した約用 可能 に な っ た X 線 自 由 電子 レ ー ザ ー（ XFEL; X ray

86,000枚のイメージを用いても SAD による位相決定は成free electron laser）は，試料位置で 1 ミクロン角あたり功しなかったが，ネイティブデータを併用して異常分散を

101013 光子という大強度の超短パルス（幅数十フェムト

用 い た 単 一 同 型 置 換 法 （ SIRAS;

singleisomorphous秒）光をもたらし，試料損傷前の回折 X 線 測定を可能に

replacement with anomalous scattering） を適用したとこし た。 た だ し 試料 は XFEL 照 射 後に 即 座 に 損 壊す る たろ，合計 20,000 枚のイメージで位相決定に成功し， SFX

め，連続的に試料を供給する必要がある。そこで，液体スにおいて同型置換法が新規構造決定の効果的な方法である

トリーム等により微小結晶試料を連続的に供給するシリアことを示した7)。その後，データ処理プログラムの性能向

ルフェムト秒結晶学（SFX; serial femtosecond crystal-

上により，データの質が劇的に向上し，13,000枚のイメー

lography）が考案された1)。これにより，微小結晶を用い

ジから SAD 法による位相決定が可能となった8)。

た無損傷高分解能構造解析の可能性が拡がり，時間分割
測定への応用など，世界で多くの取り組みがなされている。
既に SFX による様々な構造決定事例が報告されている25) が，大部分の構造解析は分子置換法によるもの，す2. SFX による新規構造決定
A. ターゲット試料

なわち既知構造を利用した方法で位相決定がなされてお本実験のターゲット試料として，水銀を結合させたルシ

り，新規構造解析に応用された事例は無い。 2014 年にフェリン再生酵素（ LRE ）の微小結晶を使用した。 LRE

204 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4
(C) 2016 The Japanese Society for Synchrotron Radiation Research

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

は 308アミノ酸から成る水溶性タンパク質であり，システ（ 2014 年 5 月）で利用可能であった CrystFEL 0.5.3a12) にイン残基を 1 つだけ持つため，水銀結合部位は 1 つであ

よってデータ処理を行った。次小節で改良された方法による。

る結果を紹介するが，ここでは文献7)で発表した解析を紹LRE は大腸菌発現系によって大量発現精製され，バッチ法によって 2 5 mm × 10 30 mm の棒状の結晶が得られた。水銀誘導体結晶は，ネイティブ結晶が安定に存在で介する。SFX におけるデータ処理の概要および CrystFEL
に関しては，Appendix を参照されたい。
ネイティブ結晶からは 133,958 枚のイメージが収集さきるストック溶液に 1 mM HgO を加えた溶液に 6 日間浸れ，このうち 20 にあたる 26,238 枚が検出器の中心領域

漬し，結合せずに結晶溶媒中に残った水銀を除くためにス

強度に基いて選択された（ Low level ‰lter）。さらにそのトック溶液へ 1 時間バックソークすることで得られた。

41 の 10,792 枚が CrystFEL による指数付けに成功し，この結晶は空間群 P212121 であり，非対称単位中に 1 分子

Monte Carlo 積分によって平均多重度 222 の 1.5 Å 分解能の LRE が含まれていた。本実験の条件（12.6 keV）ではのデータが得られた。水銀誘導体結晶からは 583,291枚が水 銀 の 持 つ 異 常 分 散 寄 与 は f ″＝ 9.71e で あ り ， Bijvoet

収集され， 51 の 298,061 枚が選択され，さらに 29 のratio〈|DF|〉/〈|F|〉は4.2である。

85,747枚が指数付けに成功した。Monte Carlo 積分によって平均多重度908の1.6 Å 分解能のデータが得られた。

B. SFX 実験

異常分散シグナルの評価には，ランダムに 2 つに分け

SACLA BL3 において SFX 実験を行った。LRE のネイ

たデータセット間で I ( hkl )I ( hkl )の相関係数を評価した

ティブ結晶および水銀誘導体結晶の両方からデータ収集を

CCano がしばしば使われるが，本ケースではわずか 0.0453

行った。サンプル消費量を抑えるため，サンプル媒体にはしか無く，絶望的な数値に思えた。 Gd 結合 lysozyme のgrease matrix 法9) を用いた。 XFEL の繰り返し周波数はケースでは，位相決定に成功した 60,000 枚の回折パター

30 Hz で，パルス幅は 10 fs 以下である。 LRE 微小結晶をンで CCano＝ 0.48であり，対称性によって決まる等価反射

混合したグリースは，湿潤ヘリウム雰囲気の DAPHNISの多重度や Bijvoet ratio の違いを考えても，非常に小さチ ャ ンバ ー10) 中に 取 り 付 け ら れた シ リ ン ジ から 供 給 さい数値であった。 SHELXC / D / E13) を用いて SAD 法によれ，回折パターンは MPCCD 検出器11) を用いて記録される位相決定を試みたが，成功しなかった。しかしながら，た 。 検 出 器 は セ ン サ ー 8 枚 か ら な る short working dis-

異常分散差 Patterson 図を確認してみると，マージする枚tance （ SWD ）の配置で用いた（ Fig. 1 ）。試料とカメラ間数を増やすごとに明瞭になるピークが存在しており，実際の距離は約81 mm で，12.6 keV（波長0.984 Å）ではエッ

これは水銀のサイトであった（Fig. 2）。2 万枚以上マージ

ジで約1.7 Å 解能まで回折斑点が記録可能である。

した場合には， SHELXD でも正しくこの位置が決められていたが， SHELXE で解釈可能な電子密度が得られるほC. CrystFEL 0.5.3a によるデータ処理および位相決定
まずはじめに，X 線回折強度データを収集した時点

どデータの質は良くはなかった。
残 念 な が ら ， 85,747 枚 の 回 折 パ タ ー ン を 用 い て も ，SAD 法の適用ができるほどの質のデータには到達できなかったと結論されたが，幸いネイティブ結晶の回折データも得ていたため，重原子同型置換法の適用を試みることができた。 SIRAS 法を適用したところ，ネイティブ結晶
10,792枚と水銀誘導体結晶10,000枚の回折パターンから高品 質 の 位 相 決 定 が 可 能 な こ と が 判 明 し た （ Table 1 ）。
SHELXE で平均 FOM （ ˆgure of merit; 位相誤差の余弦の期待値） 0.615 の位相が得られ，主鎖トレースでは 197
残基が構築され，構築したモデルとネイティブデータの相関を表す CC 値（規格化構造因子から計算）は27であった。この時点で得られた電子密度図は，容易に解釈可能なものであった（Fig. 3）。この位相を用いて ARP/wARP17)
で自動モデル構築を行ったところ304残基がほぼ正確に構築された。
Fig. 1

A diŠraction image of Hgbound LRE microcrystal with
MPCCD detector in SWD octal conˆguration. The rings are
drawn at 25, 10, 4, 3, 2, and 1.7 Å resolutions. The lowangle Xray absorber was used for Hgderivative crystals to
mitigate detector saturation by low resolution strong spots.
The ˆgure was prepared using hdfsee in CrystFEL package.

マージする枚数を様々に変えて位相決定を試みたところ，位相決定の成功には常に合計 2 万枚程度は必要であった（Fig. 4）。重原子同型置換法の適用には，ネイティブ
重原子誘導体結晶間での同型性が非常に重要となるが，今回のケースでは格子定数の差異は 0.2未満であり，高放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 205

い同型性を有していた。また，両データ間での不一致を表す Riso ＝∑hkl|| Fderiv |－| Fnative ||/∑hkl| Fnative |（ Scaleit21) による計算）は23.0であった。

D. CrystFEL 0.6.1を用いた再解析
2015 年 8 月に CrystFEL 0.6.1 が発表され，多くの新機能が利用可能になった23) 。先の解析で用いていた 0.5.3a（2014年 4 月に発表）と比べると，以下のような機能が追加されている。） prediction reˆnement（回折パターン
ごと に結 晶方 位行列 と検 出器の 水平面 内シ フトを 精密化），）geoptimiser24)（各センサーの幾何学配置回転および位置を精密化），）proˆle_radius（逆格子点半径）Fig. 2Anomalous diŠerence Patterson maps. The v＝1/2 Harker
section is calculated using diŠerent numbers of indexed Hg
derivative patterns. When 10,000 patterns are used, a peak of
3.2s is observed at the Hg position; however, there are otherhigher false peaks. The correct Hg peaks (indicated by arrows) with heights of 5.0s and 6.9s using 20,000 and 30,000
patterns, respectively, are observed as the highest peaks. The
Patterson maps were calculated using the CCTBX
functionality14) and the ˆgure was prepared using R15) with
ggplot2 package16).

Table 1

Fig. 3

Data collection statistics.
Hgderivative

Native10,792 patterns(CrystFEL 0.5.3a)
Wavelength (Å)
Beam energy
Space group
Unit cell (a, b, c; Å)Resolution range† (Å)
Completeness† ()SFX multiplicity†
Rsplit††〈I/s(I )〉CC1/2†
CCano

10,000 patterns(CrystFEL 0.5.3a)

13,000 patterns(CrystFEL 0.6.1)

0.981
30.0 mJ/pulse
P 212121
48.2, 77.6, 84.8
101.50 (1.561.50)
100 (100)
222.2 (196)0.2727 (1.671)
2.6 (0.63)

0.984
86.4 mJ/pulse
P 212121
48.1, 77.5, 84.8
251.60 (1.661.60)
100 (100)
106.2 (44)0.3727 (5.772)
1.8 (0.19)

P 212121
48.1, 77.5, 84.8
251.60 (1.661.60)
100.0 (99.98)
62.3 (13)0.2238 (1.457)
3.3 (0.83)

0.893 (0.1988)
n/a

0.835 (0.0279)－0.066

0.935 (0.2356)
0.020† Values in parenthesis are for the highest resolution shell.

206 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

The SIRAS electron density map and a reˆned model of
LRE. For the calculation, 10,000 Hgderivative and 10,792
native diŠraction patterns were used. The SIRAS electron
density map produced by SHELXE is contoured at 1.0s.
The model was manually and automatically reˆned using
Coot18) and phenix.reˆne19) after automated model building
by ARP / wARP17). The ˆgure was prepared using
PyMOL20).

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

Fig. 4Phase quality (map CC) for the diŠerent numbers of the native and the derivative indexed patterns. The success andfailure of phasing are represented as circular and triangularsymbols, respectively. The map CC is deˆned as the correlation coe‹cient between the SIRAS electron density map
produced by SHELXE and the Fc map calculated using theˆnal reˆned structure. The result was judged as a success if
the map CC was greater than 0.65. The map CC was calculated using phenix.get_cc_mtz_pdb22) and the ˆgure was prepared using R15) with ggplot2 package16).

の自動決定，）安定して動作するようになった
partialator25)（分解能に伴う強度減衰を表す B 値を含めたスケーリング，あるいは partiality 補正込みのスケーリン
グおよび post reˆnement ）。 LRE の水銀誘導体データをCrystFEL 0.6.1を用いて再解析を行ったところ，大きな改善が見られた。指数付け枚数は同程度だが，）および）は， prediction （回折斑点の出現予測位置）の精度を向上させ，劇的なデータの質的向上をもたらした。更に）は，partiality 補正の性能は（少なくとも本ケースに関しては）

まだ実用的とは言えなかったが， partiality 補正無しのスケーリングでは，これまでの方法と比べて改善があった。
これまでは単純な Monte Carlo 積分と，フレームスケー
リングを行ってから Monte Carlo 積分を行う 2 通りがあったが，前者だと低角，後者だと高角のデータが悪化する
ことが多かった。 Partialator による B 値を含めたスケー
リングを，回折パターンごとの分解能カットオフとともに
用 い る こ と で ， 高 低 分 解 能 ま で の 範 囲 で デ ー タ の 質（ CC1/2; Appendix 参 照 ） を 保 た せ る こ と が で き た （ Fig.
5a）。同時に，異常分散差データの質も大きく改善した。

Fig. 5Comparison of data quality with two CrystFEL versions. In
CrystFEL 0.5.3a, process_hkl (the simple Monte Carlo integration) was used for merging. In CrystFEL0.6.1, partialator with unity option (Monte Carlo integration after scaling patterns with linear scale and relative Bfactors and withbypattern resolution cutoŠs) was used. (a) Comparison of
CC1/2 by resolution. In CrystFEL 0.5.3a 34,393 patterns
were merged while 35,231 patterns were merged in CrystFEL
0.6.1. (b) Comparison of anomalous diŠerence Fourier
peak heights (calculated with ANODE26)) at the mercury site
by the number of indexed patterns. These ˆgures were prepared using the ggplot2 16) in R15).

例えば，決定した構造の位相を用いて計算した異常分散差
Fourier ピーク高さは，同じ枚数の回折パターン数でも再解析によって大きく向上している（ Fig. 5b ）。再解析後の

ただし，本再解析の結果でも CCano は低く，13,000枚でデータを用いて SAD 法による位相決定を試みたところ，0.02であった。CCano はランダムに 2 分したデータ間の相13,000 枚の回折パターンから位相決定に成功した（ Table

関を見ており，再解析でもデータ精度（ precision ）は低1 ）。位相決定には，前小節同様に SHELX C / D / E を用い

いままであることを示している。一方，異常分散差 Fouri-

た。SHELXE は前小節で用いたバージョン（2014/2）の

er のピーク高さが大きく改善していることから異常分散

期限が切れたため，最新版（ 2014 / 4 ）を用いている。ま

データの確度（accuracy）が改善している，すなわち真値

た，本再解析によって，SIRAS に必要な枚数も合計7,000に接近していることは明らかである。本結果はデータ処理枚にまで減少することが確認された。

方法の改善によってデータ確度が向上したことを示してい放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 207

る。元々 CCano がゼロ付近であったときから異常分散差

4. まとめPatterson のピークは観察され，異常分散差 Fourier ピー

クも有意にあったことから， CCano は少なくとも SFX に

12.6 keV と い う SACLA の 得 意 と す る 高 エ ネ ル ギ ー

おける異常分散シグナルの指標としては適切でない可能性

XFEL を利用して，微小結晶を用いたタンパク質の新規があると言えるだろう。

立体構造決定が可能であることが示された。データ処理方法の改善によって SAD 法も成功に至ったが， SIRAS はより効率的に構造決定できる可能性があるので，現実の3. 国内外における SFX による新規構造決定の取り組み

ケースでは可能であればネイティブデータも収集しておくことが望ましいだろう。本稿では紹介できなかったが，前述のとおり， Barends らは Gd 結合 lysozyme を用い

SACLA では他にも SeMet 置換体を利用した SAD 法によた SAD 法による位相決定を成功させ，SFX においても新る位相決定や，その他の原子種を用いた新規構造決定の取規構造決定が可能であることを示した。彼らは米り組みがなされている。今回のケースでは1.7 Å 程度の高Stanford にある LCLS の CXI ステーションで実験を行い，分解能データが用いられており，今後はより低分解能の8.5 keV の X 線を用いた。当初60,000枚の回折パターンがケースでも検証していく必要がある。今後もデータ処理プ

位相決定には必要という結果だったが，データ処理の改善

ログラムの性能向上によって，より少ないデータ量から位により，現在では 7,000枚でも位相決定が可能になってい相決定可能な高品質なデータが得られるようになるだろう。

る27)。

LRE の回折パターンは， XFEL の実験データデータバン

ク CXIDB ID 31（http://cxidb.org/id31.html）から誰でSACLA に お け る SFX で は ， 本 稿 で 解 説 し た LRE の他，非標識 lysozyme の硫黄および塩化物イオンを用いたも自由にアクセスができるようになっている。 CXIDB で

SAD 法による位相決定の成功が中根らによって報告されは他の SFX 実験の生データも多く利用可能になっている

た28)。さらに福田らによって，天然状態で Cu が結合したので，興味のある方はデータ処理に挑戦してみていただき

A. faecalis 由来亜硝酸還元酵素 Af NiR（nitrite reductase）

たい。

も SAD 法 に よ る 位 相 決 定 に 成 功 し た と の 報 告 も あ った29) 。 ま た LCLS で は ， Nass ら か ら thaumatin の S 
SAD に成功したとの報告があった27)。
Table 2 に，現在までに報告されたケースをまとめた。

5. APPENDICES
A. タンパク質結晶における位相決定

Bijvoet ratio と空間群の対称性によって必要になる枚数は

X 線回折では，電子密度分布の Fourier 変換である構造変化するが，Bijvoet ratio の低いケースでも許容範囲と思因子の位相情報を直接観測することができない。この問題

われる程度の枚数で SAD 法による位相決定に成功していは位相問題と呼ばれ，結晶学の中心的な問題の 1 つである。この表にある全てのケースでは，CrystFEL によってる。タンパク質結晶学では，構成原子数が非常に多く，まデータ処理が行われ，Monte Carlo 積分によってマージさた分解能も典型的には 2 3 Å 程度であるため，直接法のれたデータが使用されている。

適用は通常困難である。現在主流の位相決定法は，第一に分子置換法であり，既知の類似構造を用いる方法である。
類似構造が存在せず分子置換法の適用が困難な場合，つまり新規構造決定の場合は，重原子を用いる方法が一般的でTable 2Published experimental phasing cases with SFX.

SampleMethodFacility

Energy(keV)Element

Space
group

Lysozyme

SAD

LCLS

8.5

Gd

P 43212

LRE

SIRAS

SACLA

12.6

Hg

P 212121

Lysozyme
AfNiR
Thaumatin
LRE

SAD
SAD
SAD
SAD

SACLA
SACLA
LCLS
SACLA

7
10.8
6
12.6

S, Cl
Cu
S
Hg

P 43212
P 212121
P 41212
P 212121

Requiredpatterns

Bijvoetratio

60,0007,000†
20,000

11.9

7,000,†150,000
156,000§
125,000
13,000

4.2
1.6
1.7
2.1
4.2

Year
20146)
201627)
20157)
2016
201528)
201629)201627)
20168)† Updated number by reprocessing the same data since the ˆrst publication. The total number (native and derivative) of indexed patterns.
§ Not necessarily the minimum required number, which was not studied in the reference.

208 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新ある。重原子を用いる方法には，ネイティブタンパク質結アの性能改善によって，単一の重原子誘導体結晶から単一晶および特定位置に重原子を導入した誘導体結晶を用いる

波長のデータのみで位相決定が可能な SAD 法も十分に実単一同型置換法（SIR; single isomorphous replacement），

用性が高まり，現在では分子置換法に次いで最も一般的なネイティブ結晶および 2 種以上の誘導体結晶を用いる多方法となっている。ただし，それでも SAD 法で求められ重同型置換法（MIR; multiple isomorphous replacement），

るデータの質のハードルは高い。 SAD 法では，異常分散

これらに異常散乱シグナルの利用を加えた SIRAS および

差 Dano(hkl)＝|F(hkl)|－|F(hkl)| を正確に測定する必要

MIRAS （ SIR / MIR with anomalous scattering ）， 1 種 のがあるが，この値は| F (hkl)| に対して一般的に小さい。

誘導体結晶のみを用いた単波長異常分散法（ SAD ）法，Bijvoet ratio〈|Dano|〉/〈|F|〉は近似的に以下のように計算

複数の波長のデータを用いる多波長異常分散法（ MAD;できる30)。

multiple wavelength

anomalous

dispersion ）法がある（Table 3）。
異常分散とは，原子核に強く束縛された内殻電子が入射〈|Dano|〉＝ 2〈|F|〉NA f ″A
NP ZeŠ

( 2)

X 線の エ ネ ル ギ ー 依 存 的 に 起 こ す共 鳴 散 乱 の こ と で ある。原子散乱因子 fatom のうち，構成電子を自由電子とみこの数値は一般には 5程度以下であり，このようなわずなした場合の散乱因子 f 0 に対する補正項として現れ，実かな差を正確に決定できるような高精度な測定が必要とな，虚部を f ″と呼ぶ。これらは内殻電子に起因する部を f ′る（ここで NA は異常散乱原子の数， NP はタンパク質原ため一般に回折角（分解能）には非依存である。

子の数， ZeŠ はタンパク 質の平均原子番号である）。一方，同型置換法ではネイティブ結晶と重原子誘導体結晶間(l)＋if ″(l)fatom＝f 0 (sin u/l)＋f ′(1 )の 差 を 用 い ， こ の 差 Diso ( hkl ) ＝ | Fderiv ( hkl ) | － | Fnative(hkl)| は近似的に以下のように計算できる31)。

タンパク質結晶学において通常使用する波長範囲（～1.0
2.0 Å ）の場合，タンパク質を構成する軽元素では硫黄を除いて異常分散効果は無視できるほど小さく，位相決定に用いることはできない。一方，たとえばセレンは K 吸収
端を波長 0.9793 Å 付近に持ち，有意な異常分散効果（ f ″

 1
NA ZA
（acentrics）

2
NP ZeŠ〈|Diso|〉＝〈|F|〉 NA ZA （centrics）
 NP ZeŠ( 3)

 3.85e ）を有するため，セレノメチオニン置換体タンパ
ク質を大腸菌発現系などで大量発現させ結晶化する方法がこの差は 10 程度以上あることが多く，検出は比較的容

近年広く用いられている。タンパク質結晶学において長い易である。ただし，両結晶間で同型性が維持されているこ

歴史を持つ水銀は，波長1.0 Å においても高い異常分散効とが大前提である。すなわち，格子定数の差が無く，構造

果（ f ″ 10.0e）を有し，しばしばシステイン残基に結合の差異も重原子の有無のみであることが理想的な条件であすることが知られている。シンクロトロン放射光におけるる。 SIRAS / MIRAS 法では，この Diso に加えて Dano も同タンパク質結晶学では波長1.0 Å 程度が最も一般的に使わ時に利用する。したがって，同型性さえ維持されていれば，れているため，異常分散効果を用いた位相決定では，このSIRAS 法は SAD 法に対して大きなシグナルが使えると波長付近で高い異常分散効果を持つ元素の利用が一般的でいう優位性を持つ。
同型置換法および SAD/MAD 法では，以下のような共ある。
歴史的には同型置換法（SIR, MIR, SIRAS, MIRAS）

通の手続きを取る。）まず重原子のみの部分構造の構造が多く使われてきたが，シンクロトロン放射光の利用によ

振幅を推定し，）Patterson 法や直接法などにより重原

り波長の変更が可能になったため MAD 法の利用が拡が

子座標を決定，）部分構造の構造因子から全体構造の位った。さらに，データの質の向上や，位相決定ソフトウェ

相を計算，）密度改良法により位相を改良して解釈可能な電子密度図を得る。代表的な位相決定プログラムである

Table 3

Experimental phasing methods using heavy atom derivative(s).

MethodCrystals

Wavelength

SIR
MIR
SIRAS

native & derivative
native & multiple derivatives
native & derivative

MIRAS
SAD
MAD

native & multiple derivatives
a derivativea derivativeany
anythat gives large f ″that gives large f ″that gives large f ″＞1 varying f ′and f ″SHELXC/D/Eは， SHELXC が）を， SHELXD が）を， SHELXE が）および）を行う。位相決定の成功には 2 つのハードルがあり，まず）において重原子が正確に見つかること，そして）でモデル構築が可能な質の電子密度図を得ることである。これらの点においては現在でもプログラムの性能向上が続けられており，
SHELXE は従来の密度改良に加えてタンパク質の主鎖構造のトレースを行うサイクルを繰り返すことで位相改良の性能を高めている13)。

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 209

B.

SFX におけるデータ処理や格子定数の精密化（ post reˆnement ）を通じて観測強

現在，シンクロトロン放射光または実験室系 X 線発生度の部分度を計算し完全反射強度へのスケーリング装置におけるタンパク質結晶学では，単色光を用いた振動（––model＝scsphere）も可能である。いずれのプログラム

写真法によるデータ収集が最も一般的である。すなわちゴでも，偏光因子に対する補正は行われる。

ニオメータを用いて結晶を任意の軸まわりに回転させながデ ー タ の 質 の 判 断 に は CC1/2 や Rsplit が よ く 用 い ら れら X 線を露光し， 2 次元 X 線検出器を用いて連続的に回る。これらは，得られた回折パターンのセットをランダム

折パターンを収集する。結晶を回転させながらイメージをまたは交互に 2 つのセットに分け，それぞれの中でマー収集することで，逆格子点体積を積分した強度を実験的にジし，2 セット間でマージされた強度を比較するものであ得ることができる。放射線損傷の問題が存在するが，数十る。CC1/2 は両者の相関係数であり，Rsplit は以下の式で計mm 程度以上の大きさがあれば，構造解析可能な完全な算される12) 。 Rsplit はマージ後のデータ精度を表す R 値でデータを 1 つの結晶から得ることが可能である。

あり，Rpim と類似した統計的性質を持つ。

一方， XFEL におけるデータ収集はこれと大きく異なる。数～数十 fs の超短パルス光は，その照射直後に試料

Rsplit＝とその周囲に物理的損壊を引き起こし，また，フェムト秒

1 ∑hkl|〈I 〉set1－〈I 〉set2|
2 ∑hkl(〈I 〉set1＋〈I 〉set2)/2( 4)

オーダーの時間で結晶を回転させることも不可能であるから，振動写真法の適用はできない。結晶は XFEL 露光中

振動写真法では CC1/2 の他にも〈〈I 〉/s(〈I 〉）〉がよく用いらにほぼ静止状態であるので，得られる回折パターンは静止れるが， CrystFEL の算出する s (〈 I 〉）は測定多重度が低（ still ）写真と呼ばれるものになる。自己増幅自発放射い場合に過小又は過大評価されることがあり12) ，振動写（SASE; selfampliˆed spontaneous emission）による真法の場合と単純に比較はできない。

XFEL は DE / E  0.5  の エ ネ ル ギ ー 幅 を 持 つ た め ，Ewald 球に厚みを生じ，静止写真上に得られる強度は逆

謝辞

格子点のうち一定の有限体積が積分されたもの（つまり部本研究は理研 RSC ， JASRI ，京都大学，大阪大学，キ

分強度のみの観測）となる。 SFX ではすべての回折写真

ッコーマン株式会社のグループによる共同研究で行われまは別々の結晶に由来しており，露光体積や結晶方位，さらした。特に結晶試料調製については潘東青博士村井智洋には XFEL の強度やエネルギー分布などが回折写真ごとさんをはじめとする方々にご尽力頂きました。また，本研に変化していることになる。これらの独立な測定結果か

究は JST /X 線自由電子レーザー施設重点戦略課題推進事ら，構造解析に用いる構造振幅を得るためにはどうすれば業「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発」およ良いか。理想的には個々の部分反射強度から完全反射強度

び JSPS 科 研 費 15K14941 の 支 援 を 受 け 実 施 し た も の でを補完し，適切な結晶間スケーリング強度補正を経て，す。本実験にご協力頂いた JASRI， RSC エンジニアリン

マージするべきであろう。しかしこのような方法開発はまグチームの皆様を始めとする関係各位に深く感謝申し上げ

だ発展途上であり，現在最もロバストな方法は， Monteます。本稿に関する実験は SACLA 利用実験課題（課題

Carlo 積分によるもの，つまり各 hkl に関して，全ての部

番号 2014A8032 および 2013B8045 ）でデータ収集を行

分反射強度を平均化したものを構造振幅の二乗として扱うった成果です。本稿における計算解析は SACLA に併設ことである32,33)。

された HPC システムおよびミニ京スーパーコンピュータ

CrystFEL12,23)は SFX のデータ処理のために新規開発さシステムを利用して実行しました。また本稿執筆にあた

れたソフトウェアパッケージであり，現在 ver. 0.6.2 がり，原稿を丁寧にチェックして頂いた東京大学の中根研究最新である。大量の入力画像に対して，ピークサーチを行

員に感謝いたします。

い，DirAx34)や MOSFLM35)などの既存のプログラムある

参考文献

いは DirAx アルゴリズムの再実装である asdf を使用して指数付けを行い，Bragg反射強度の積分およびバックグラ
ウンド減算を行う。これを担うのが indexamajig と呼ばれるプログラムであり，その結果は stream ファイルと呼ばれる形式で保存される。 Monte Carlo 積分によるマージ
は process_hkl で行われる。このとき，一度マージした強度に対して各フレームの線形スケール因子を決め，それを適用して再度マージするオプション（––scale）も存在す
る 。 Ver. 0.6.1 か ら 実 用 可 能 と な っ た partialator は ，process_hkl の上位互換で，線形スケールに加えて B 値によるスケーリング（––model＝unity）や，さらに結晶方位210 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4

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小特集 ■ 生体高分子の微結晶構造解析における技術革新

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著者紹介
山下恵太郎

吾郷日出夫

国立研究開発法人理化学研究所 放射光科
学総合研究センター 利用システム開発研究部門 ビームライン基盤研究部 生命系放射光利用システム開発ユニット 基礎科学
特別研究員
Email: k.yamashita＠spring8.or.jp
専門X 線構造生物学［略歴］
2013 年北海道大学大学院生命科学院博士後期課程修了，博士（生命科学）。同年，理化学研究所に入所，上記所属にて特別研究員。2015年より現職。

国立研究開発法人理化学研究所 放射光科
学総合研究センター 利用システム開発研究部門 ビームライン基盤研究部 生命系放射光利用システム開発ユニット 専任研究員
Email: ago＠spring8.or.jp
専門放射光構造生物学［略歴］
1991 年大阪大学大学院理学研究科博士課
程前期修了。日本たばこ産業株式会社，理化学研究所研究員，先任研究員を経て2013 年より現職。この間 1995 年博士（理学）（東京工業大学）
。

岩田

想

国立研究開発法人理化学研究所 放射光科
学総合研究センター SACLA利用技術開拓
グループ グループディレクター
E mail: s.iwata ＠ mfour.med.kyoto u.ac.
jp
専門膜タンパク質の構造生物学，X 線結晶学［略歴］
1991 年東京大学大学院農学系研究科博士課程修了，博士（農学）。 2000 年より英国
インペリアルカレッジ生命科学科教授（～ 2015 年）。理化学研究所ゲノム科学総合研究センター客員主管研究員を経て2012 年より現職。 2007 年より京都大学大学院医学研究科教授（兼任）。

山本雅貴
国立研究開発法人理化学研究所 放射光科
学総合研究センター 利用システム開発研究部門長（兼）ビームライン基盤研究部長
Email: yamamoto＠riken.jp
専門放射光構造生物学［略歴］
1991 年大阪大学大学院理学研究科博士後期課程修了，博士（理学）。同年，理化学研究所に入所， 2011 年より利用システム開発研究部門長。兵庫県立大学大学院客員教授および神戸大学連携創造本部客員教授
を兼任。

中津

亨

京都大学大学院薬学研究科 薬科学専攻 准教授
Email: nakatsu＠pharm.kyotou.ac.jp
専門タンパク質結晶学，構造生物学［略歴］
1997 年京都大学農学研究科博士後期課程修了，博士（農学）。京都大学化学研究所
教務職員，理化学研究所播磨研究所連携研究員，京都大学大学院薬学研究科助教授を経て2007年より現職。

放射光 July 2016 Vol.29 No.4 ● 211

Experimental phasing with serial femtosecond
crystallography using anomalous dispersion
Keitaro YAMASHITA1, So IWATA1,2, Hideo AGO1,
Masaki YAMAMOTO1, Toru NAKATSU1,3
1RIKEN SPring
8 Center, 111 Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo 6795148, Japan,
2Graduate School of Medicine, Kyoto University, Yoshidakonoe-cho, Sakyo-ku, Kyoto 606
8501, Japan,
3Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University, 46
29 Yoshida-Shimoadachi-cho, Sakyo-ku

Kyoto 6068501, Japan

Abstract

XFEL, Xray free electron laser, has enabled the Xray diŠraction data collection before the sample destruction due to its super-short pulse and ultra-high brilliance. Serial femtosecond crystallography (SFX), which successively collects XFEL diŠraction data from many micro-crystals, has
opened a new door for damage-free, room-temperature, and high-resolution protein crystallography using micro-crystals. However, most of structures determined by SFX were phased using molecular replacement, which requires a previously solved similar structure, and SFX has
never been applied to the proteins whose structures were previously unknown. Using native andmercury derivative crystals and 12.6 keV XFELs at SACLA, we showed single isomorphous
replacement with anomalous scattering (SIRAS) eŠectively worked for de novo phasing with
SFX. Moreover, the improved data processing enabled single-wavelength anomalous dispersion(SAD) phasing using mercury derivative crystals only.

212 ● 放射光 July 2016 Vol.29 No.4