特定課題利用 利用報告書（概要）

実施課題名

19F 核を利用した低親和性リガンドの結合モード決定法の開発【背景】
NMR 測定において、19F核は、1H核に次いで感度が良く、また、生体分子には存在しないので、バックグラウンドが見えない。近年、この利点を活かし、19F NMRを用いたリガンドータンパク質間の相互作用研究が盛んになりつつある。これまでに私たちは、19F 含有フラグメン
トのNMR スクリーニング系の構築を行ってきた。スクリーニングヒットの誘導体化を展開する場合には、化合物とタンパク質の複合体構造が必要となる。ところが、親和性の低い化合物の場合、結晶構造解析が困難な場合が多い。そこで、本課題では、溶液NMR を用い、19F核を利用して、低親和性化合物の結合モードが決定できる方法を確立することを目的とする。
【実施内容】
リガンドの19F信号の飽和または非飽和下で、1H‐13C HMQCを測定し、差スペクトルからリガンドータンパク質間の相互作用情報を取得することを目指し、今回は主にそのための条件検討を実施した。実験にはFKBP12タンパク質と、19FスクリーニングによりFKBP12に結合することを同定した２化合物を用いた。まず、TrNOE の検討を行ったところ、２化合物のうちのひとつ（以下、化合物A という。）においてTrNOEの信号が確認できた（Fig.1）。次に、化合物A 単独、あるいは化合物A とFKBP12 を混合したサンプルを用い、19F飽和による１H１D スペクトルの強度変化の検出を試みた。FKBP12由来の信号に関しては、飽和移動差（STD）は検出できなかったが、化合物由来の信号に関しては、単独及びFKBP12存在下ともに、STDが検出された。化合物のSTDスペクトルのパターンは、FKBP12 の有無で異なっており、FKBP12 との相互作用様式を反映している可能性が考えられた（Fig.2）。また、同様のサンプルを用い、1H‐19F HOESY実験を行った。化合物A分子内の信号のみが観測され、化合物AとFKBP12の間のNOEは観測されなかったが、化合物内のHOESYピーク強度がFKBP12の有無で変化することから、 FKBP12 との相互作用を反映していると考えられた。

•Fig.1

Fig.1説明 TrNOE スペクトル。負のNOE を赤で囲んで示す。

•Fig.2

Fig.2説明 19F 飽和1H 観測 STD測定。リファレンス（上）及びSTD（下）。青は化合物のみ、赤は化合物＋タンパク質。

NMR 共用プラットフォーム 特定課題利用
利用報告書
申請番号PF018

課題受付番号

実施機関名

帝人ファーマ株式会社

実施部署名

生物医学総合研究所 創薬科学研究所

実施責任者管理職名・氏名

職名

実施部署所在地〒191-8512

分子構造設計担当課長

PF15-400-003

氏名

上村みどり

東京都日野市旭が丘４丁目３番２号
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利用課題名

F 核を利用した低親和性リガンドの結合モード決定法の開発
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F 核は、1H に次いで感度のよい核であり、また、生体分子には存在しない核で本課題の概要・目的あるので、バックグラウンドが見えない。近年、この利点を活かした 19F を用いたリガンドータンパク質間の相互作用研究が盛んになりつつある。
これまで我々は、19F 核を利用した NMR スクリーニング法を確立すべく、大阪大学蛋白質研究所の NMR 装置群で、平成 25 年 2 月に、「フッ素含有化合物ライブラリーの溶解度試験」の課題名で、また平成 26 年 8 月には、「フッ素含有化合物ライブラリーを用いたスクリーニング」の課題名でトライアルユースに応募し、実験を行った。2 課題の利用によって、ライブラリー化合物の溶解度を調べて、使用可能な化合物を絞り込み、ライブラリーを作成することができた。また、R2 フィルターでスクリーニングを行い、FKBP12 や複数のキナーゼに相互作用する化合物を見出し、本法の有効性を確認した。
ヒットフラグメントから化合物の誘導体化を展開する場合には、化合物とタンパク質の複合体構造が必要となる。ところが、親和性の低い化合物の場合、結晶構造解析では、化合物結合モードを明確にできない場合が多い。そこで、本課題では、
19F 核含有化合物という特徴を活かし、19F 核を利用して、化合物の結合モードが決定できる方法を確立することを目指す。
利用実施時期、及び期間

平成 27 年 1 月

9 日～平成 28 年 5 月 12 日

総利用日数： 27 日
当初計画どおり・当初計画変更(変更理由)
条件検討で問題があり、理研で実施予定であった実験を取りやめた。
利用施設

ＮＭＲ装置

利用装置①

大阪大学

（該当部分に・(○）)固体 500MHz、() DNP 固体 600MHz、()DNP 固体 700MHz（高度化後）、(()溶液 400MHz、()固体 700MHz､) 溶液 500MHz、( ○ ) 溶液 600MHz、( ○ )溶液 800MHz、( ○ ) 溶液 950MHz

利用期間 1：平成 27 年 1 月 9 日～平成 27 年 1 月 12 日
利用期間 2：平成 27 年 1 月 27 日～平成 27 年 1 月 29 日
利用期間 3：平成 27 年 2 月 16 日～平成 27 年 2 月 16 日
利用期間 4：平成 27 年 2 月 25 日～平成 27 年 2 月 25 日
利用期間 5：平成 27 年 3 月 16 日～平成 27 年 3 月 16 日

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利用装置②・(()固体 500MHz、() DNP 固体 600MHz、)DNP 固体 700MHz（高度化後）、()固体 700MHz､( ○ )溶液 400MHz、() 溶液 500MHz、(() 溶液 950MHz)溶液 800MHz、() 溶液 600MHz、

利用期間 1：平成 28 年 4 月 9 日～平成 28 年 4 月 10 日
利用期間 2：平成 28 年 4 月 16 日～平成 28 年 4 月 17 日
利用期間 3：平成 28 年 4 月 20 日～平成 28 年 4 月 21 日
利用期間 4：平成 28 年 4 月 28 日～平成 28 年 5 月 1 日
利用期間 5：平成 28 年 5 月 6 日～平成 28 年 5 月 12 日
その他の利用施設
成果のリガンドの 19F 信号の飽和または非飽和下で、1H-13C HMQC を測定し、差スペクト実施内容概要

ルからリガンドータンパク質間の相互作用情報を取得することを目指し、今回は主にそのための条件検討を実施した。実験には FKBP12 タンパク質と、19F スクリーニングにより FKBP12 に結合することを同定した化合物を用いた。
まず、TrNOE の検討を行った。2 種のヒット化合物、ネガティブコントロールとして FKBP12 との結合が見られなかった 1 種の化合物、および FKBP12 を混合して、タンパク質濃度、測定温度を変化させて 2 次元 NOESY スペクトルを測定した。
次にヒット化合物のうちのひとつ（以下、化合物 A という。
）について、化合物のみ、および化合物と FKBP12 を混合したサンプルを用い、19F 飽和 1H 検出の 1D 飽和移動差（STD）実験を行った。19F 照射時間、サンプル濃度、測定温度を変化させ、
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F 飽和あるいは非飽和化で 1H1D スペクトルを測定した。
さらに、同様のサンプルを用い、1H-19F HOESY 実験を行った。サンプル濃度、測定温度、ミキシング時間を変化させて測定を行った。
本課題により得ら

TrNOE 測定では、化合物 A について、タンパク質濃度が化合物の約 3%以上、温度れた成果と当初目288 K 以下で TrNOE 信号が確認できた。19F 飽和の STD 実験では、FKBP12 由来の信標との比較号に関しては、STD は検出できなかった。化合物由来の信号に関しては、単独及びFKBP12 存在下ともに、STD が検出された。低温(283 K)では、化合物の STD のパターンが FKBP12 の有無で異なっていた。FKBP12 添加による STD への影響は、化合物の部位によって異なっており、FKBP12 との相互作用様式を反映している可能性が考えられた。1H-19F HOESY 実験では、化合物 A 分子内の信号のみが観測され、化合物 A と FKBP12 の間の NOE は観測されなかった。低温(283 K)では化合物内の HOESY
ピーク強度が FKBP12 の有無で変化することが分かった。
予定ではリガンドの 19F 信号の飽和または非飽和下で、タンパク質信号の STD を検討する予定であったが、今回の実験ではタンパク質側の STD は検出できなかった。タンパク質の STD 信号は弱いため、オーバーラップの激しい 1H1D 測定では検出が難しいと考えられた。

成果発表

無し

2今後の展開

今回の実験により、FKBP12 と化合物の間に NOE 生じさせるには低温が良いことが分かった。今回の測定結果をもとに、今後は 2 次元スペクトルを用い、19F 飽和によるタンパク質側の STD の検出を試みる。また、タンパク質の有無による化合物の STD や HOESY スペクトルの変化が見られたので、この変化から相互作用情報が取得できないかを検討する。
FKBP12 での実験が成功すれば、キナーゼにも応用し、ターゲットを選ばないことを示したい。

社会・経済への波及効果の見通し今回の結果はそのままでは波及効果は期待できない。今後の研究の進展により、簡便な方法で低親和性リガンドの結合モードが決定できることを示すことができれば、結晶構造解析の代替ツールとしての利用が期待でき、19F スクリーニング法とともに Drug discovery のプロセスの加速に貢献できると思われる。

利用における感想

高感度の 19F プローブの導入を希望します。

（改善要望等を含む）
利用周辺環境に関する希望
今後の NMR 共用プラットフォームに対する期待
成果公開延期の希望の有無

() あり

：

（〇）なし

「あり」の場合理由：
その他

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