20-04

RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit(Code No. RMD-201, RMD-201T)

使用说明书
TOYOBO CO., LTD. Biotech support Department
OSAKA JAPAN- 目录 [1] 前言 ....................................................................................................................................- 1 [2] 产品组成 .............................................................................................................................- 2 [3] 其他必需品 .........................................................................................................................- 2 [4] 使用方法 .............................................................................................................................- 3 1.

细胞裂解或 RNA 稀释（Cell lysis or RNA dilution） ......................................................- 3 -2.

热变性反应（Denature） ..............................................................................................- 5 -3.

基因组去除反应（Digestion of genomic DNA） ............................................................- 5 -4.

cDNA 合成及扩增反应（RT-RamDATM 反应） ..............................................................- 6 -[5] 实验例 ................................................................................................................................- 7 1.

与原来的逆转录反应的 cDNA 量的比较 .........................................................................- 7 -[6] 常见问题 .............................................................................................................................- 8 [7] 相关产品 .............................................................................................................................- 8 [8] 参考文献 .............................................................................................................................- 9 -- 注意事项 –本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，安全操作。

※ RT-RamDATM 是国立研究开发法人理化研究所的商标。

东洋纺（上海）生物科技有限公司[1] 前言RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit 可从单细胞或微量 RNA 制备 cDNA。使用本产品制备的 cDNA 可作为 Realtime PCR 实验的模板，用于高灵敏度的基因表达分析。
本试剂盒在 Reverse Transcription with Random Displacement Amplification (RT-RamDATM)法参考文献(1)的基础上开发。该方法是利用逆转录酶的链转换活性实现 cDNA 扩增的新技术，除了常规 poly(A) RNA，也可以高灵敏度地逆转录出 non-poly(A)来源的 cDNA。因此，RT-RamDATM 技术相比原来的 cDNA 合成方法能检测到更多基因。

图 1. 本试剂盒的工作流程◆本试剂盒的特征◆1.

可从单细胞或微量 RNA 制备 cDNA
可以使用 1~100 个细胞或者 10pg~1ng total RNA 作为起始模板。

2.

可分析全长 cDNA
使用本产品可以制备出测序 reads 覆盖全长 RNA（10kb 以上）的 cDNA。

3.

兼容各种 Realtime PCR 试剂可与各种 Realtime PCR 试剂组合使用。SYBR® Green I 及 TaqMan® 分析两种方法都可使用。
例如，可使用本公司的 THUNDERBIRD® qPCR Mix (Code: QPS-101, QPS-201)、KOD SYBR® qPCR
Mix(Code: QKD-201)等试剂。

-1-[2] 产品组成本试剂盒中含有以下试剂。各组分请放-20℃保存。
RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit (Code: RMD-201, RMD-201T)

试剂名称保存RMD-201

RMD-201T①Lysis Buffer

-20℃

480μL

120μL

②Lysis Enhancer

-20℃

108μL

27μL

③RNase Inhibitor

-20℃

22μL

6μL

④Nuclease free water

-20℃

960μL

240μL

⑤RT-RamDATM Buffer

-20℃

240μL

60μL

⑥RT-RamDATM Enzyme Mix

-20℃

54μL

14μL

⑦RT-RamDATM Primer Mix

-20℃

54μL

14μL

⑧gDNA Remover

-20℃

54μL

14μL

[3] 其他必需品
除本产品外，请准备以下仪器・试剂。
・PCR 仪或恒温仪
使用时，请根据各仪器说明书进行操作。

・Realtime PCR 仪器及 Realtime PCR 试剂
使用时，请根据各仪器、试剂的使用说明书进行操作。

-2-东洋纺（上海）生物科技有限公司[4] 使用方法
本试剂盒可使用细胞或提纯的 total RNA。使用 FACS 获得细胞时请从 section 1. A 开始；使用 FACS 以外
的方法得到细胞时请从 section 1. B 开始；
使用提纯的 total RNA 时请从 section 1. C 开始。
然后进入 section
2．热变性反应步骤。

细胞样品

细胞裂解 / RNA 稀释

FACS

section 1. A

FACS 以外

section 1. B

纯化的 RNA热变性反应～
section 2.

section 1. C

1. 细胞裂解或 RNA 稀释（Cell lysis or RNA dilution）
A. 使用 FACS 获得细胞时：(1) 将细胞裂解需要的试剂预混在离心管中。请参考下表，制备比必需量稍有余量的裂解液。
细胞裂解液的制备
20 个反应(μL)※

1 个反应(μL)①Lysis Buffer

100 个反应(μL)※

244220②Lysis Enhancer

0.45

9.949.5③RNase Inhibitor

0.05

1.15.5④Nuclease free water

0.5

1155

366

330Total※余量设定为 10%(2) 向 96 孔板或 8 连管中每孔分装 3μL 细胞裂解液。分装在冰上进行，分装后请立刻封膜或盖上管盖。
(3) 细胞分选前，请将离心管一直置于冰上或 4℃保存，请根据所用 FACS 的操作说明书或厂家推荐的参数进行细胞分选。
(4) 细胞分选后，请进行密封，离心。
(5) 随后，迅速进行下一步或将样品置于-80℃保存。

B. FACS 以外的方法获取细胞时：使用人工拣选等细胞获取方法时，请控制细胞样品的液量小于 0.5μL。
(1) 将细胞裂解需要的试剂预混在离心管中。请参考下表，提前制备如下试剂，等待添加细胞样品。
细胞样品的液量不足 0.5μL 时，请根据情况调整水的添加量。

-3-细胞裂解液的制备
1 个反应(μL)①Lysis Buffer

2②Lysis Enhancer

0.45③RNase Inhibitor

0.05

细胞样品~0.5④Nuclease free waterXTotal3例) 细胞样品液量为 0.5μL 时20 个反应(μL)※

100 个反应(μL)※①Lysis Buffer

44220②Lysis Enhancer

9.949.5③RNase Inhibitor

1.15.5Total※余量为 10%时

55275(2) 向 96 孔板或 8 连管中每孔分装细胞裂解液 2.5μL。分装在冰上进行，分装后请立刻密封、离心。
(3) 添加细胞样品前，请将离心管一直置于冰上或 4℃保存，请根据所用细胞获取仪器的操作说明书，添加细胞样品。
(4) 添加细胞样品后，请进行密封，离心。
(5) 随后，迅速进行下一步或将样品置于-80℃保存。

C. 使用提纯后的 total RNA 时：(1) 请将 RNA 溶液的 90%稀释为 RNA 稀释液。请参考下表，在必要量的离心管中制备 RNA 稀释液。
RNA 稀释液的制备
100 个反应(μL)①Lysis Buffer

220②Lysis Enhancer

49.5③RNase Inhibitor

5.5④Nuclease free water

55Total330RNA 稀释例)输入量为 1ng 时(μL)
10ng/μL total RNA

1RNA 稀释液

29Total30请从稀释的 333pg/μL total RNA 溶液中取 3μL 使用。
-4-

东洋纺（上海）生物科技有限公司

输入量为 10pg 时(μL)
333pg/μL total RNA

1RNA 稀释液

99Total100
请从稀释的 3.3pg/μL total RNA 溶液中取 3μL 使用。
(2) 向 96 孔板或 8 连管中每孔分装稀释后的 RNA 溶液 3μL。
(3) 分装后，请进行密封，离心。
(4) 随后，迅速进行下一步或将样品置于-80℃保存。

2. 热变性反应（Denature）(1) 请将样品板或离心管置于 4℃离心、在以下温度进行温育。
使用冻结样品时，热变性反应前，请置于 4℃融解、离心后再进行热变性反应。
热变性反应步骤

温度

时间Denature

70℃

1.5min.

4℃

hold

3. 基因组去除反应（Digestion of genomic DNA）
(1) 将基因组去除反应必需的试剂预混于离心管中。请参考以下体系进行制备。
*

使用 ERCC RNA 等对照 RNA 时请调整④Nuclease free water 的添加量。

基因组去除反应液的制备
1 个反应(μL) 20 个反应(μL)※

100 个反应(μL)※⑤RT-RamDATM Buffer

0.36.633⑧gDNA Remover

0.45

9.949.5④Nuclease free water*

2.2549.5247.5

366330Total※余量为 10%时

(2) 向进行热变性反应之后的 96 孔板或 8 连管中每孔分装 3μL 基因组反应液，离心后，请在以下温度条件
下进行温育。
基因组去除反应步骤温度时间

Genomic DNA digestion

30℃

5min.

4℃

hold

(3) 基因组去除反应后，迅速进行下一步反应。
-5-

4. cDNA 合成及扩增反应（RT-RamDATM 反应）(1) 在离心管中配制 RT-RamDATM 反应必需的试剂。请参考下表进行配制。
*

使用 NSR Primer 时，请使用 1st NSR Primer Mix for human 或 1st NSR Primer Mix for mouse 代
替⑦RT-RamDATM Primer Mix 进行反应。

RT-RamDATM 反应液1 个反应(μL)

20 个反应(μL)※

100 个反应(μL)※

1.533165⑤RT-RamDATM Buffer⑥RT-RamDA

Enzyme Mix

0.459.949.5⑦RT-RamDA

*0.45

9.9

49.5

0.6

13.2

66

366

330

TMTM

Primer Mix④Nuclease free waterTotal※余量为 10%时

(2) 向进行过基因组去除反应的 96 孔板或 8 连管中每管添加 RT-RamDATM 反应液 3μL，离心后，请在以
下温度条件下进行温育。
RT-RamDATM 反应步骤温度时间Priming 1

25℃

10min.

Priming 2
Reverse transcription andamplification
Reverse transcription 230℃

10min.

37℃

30min.

50℃

5min.

Inactivation

98℃

5min.

4℃

hold

(3) RT-RamDATM 反应后，迅速进行下一步反应或将样品置于-20℃～-30℃保存。
(4) 进行 Realtime PCR 时，可直接作为模板添加到反应液中或稀释后添加。
请按 RT-RamDATM 反应液(9μL)体积的 1/10~1/25 (0.9～0.36μL) 作为模板添加量。过量添加有时会导致 PCR 反应效率低下，影响定量准确性。
例）以 1/25 体积的量添加模板时
(μL)
反应液

9Nuclease free water

41

TMRT-RamDATotal50
请取稀释过的反应液 2μL 作为 Realtime PCR 的模板使用。

-6-

东洋纺（上海）生物科技有限公司[5] 实验例
1. 与原来的逆转录反应的 cDNA 量的比较＜方法＞
使用 NIH3T3 细胞来源的 Total RNA 10pg，分别用 RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit (Code:RMD-201)和原来的逆转录反应试剂 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code:FSQ-301)进行 cDNA 的合成。
然后，
分别以各自的 cDNA 为模板，使用 THUNDERBIRD® SYBR® qPCR
Mix (Code: QPS-201)对 7 种 House Keeping Gene 进行了 Realtime PCR 扩增分析的比较。通过 Ct
值计算出来的 RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit 的 cDNA 量除以原来的逆转录试剂得到的 cDNA 量，
最终数值作为扩增效率指标。

＜结果＞

相比使用原来的逆转录反应试剂时的 cDNA 量，使用 RT-RamDATM cDNA Synthesis Kit 时可得到大约
10 倍的 cDNA 量。

-7-

[6] 常见问题现象

原因Realtime PCR 中 RNA 降解了
无信号出现或较迟才能检测到。

对策・请确保 RNA 没有降解。
・请确保枪头及离心管没有 RNase 的污染。
・请在冰上进行细胞裂解与 RNA 稀释的操作步骤。

RNA 的量过少或
过多使用本产品，虽然已确认可以对 10pg 到 1ng 的 RNA 进行逆转录反应，但 RNA 的种类或质量不同，能够反应的 RNA 量也
可能有变化。请适当增减模板 RNA 的添加量。

反应温度不合适反应条件的改变，会对引物的退火效率、酶活性、逆转录反应后酶的失活等较多方面产生影响。反应温度请务必按照说明书里的条件进行。

逆转录反应液添加过多添加量过多时，PCR 反应有可能被抑制。逆转录反应液向Realtime PCR 反应液中的添加量，请控制在 PCR 反应液量的10%以下。

[7] 相关产品
产品名称NGS 测序用 cDNA 制备试剂盒
GenNext® RamDA-seqTM Single Cell Kit

容量96 次份*
24 次份*

Code No.
RMD-101
RMD-101T

RamDA Cell Lysis Kit

1,152 次份*RMD-301

NSR Primer Set for human

96 次份*

NSR-101

NSR Primer Set for mouse

96 次份*NSR-102

Illumina 公司 NGS 测序用文库定量试剂盒
GenNext® NGS Library Quantification Kit*96 孔板的１个孔的使用次数。

500 次份/20μL 反应

NLQ-101

Realtime PCR 试剂产品名称容量
1.67ml×3 支(500 次份/20μL 反应)
1.67ml×3 支(500 次份/20μL 反应)
1.67ml×3 支(500 次份/20μL 反应)

Probe・SYBR® Green I 检测用 Realtime PCR 试剂
THUNDERBIRD® Probe qPCR Mix
高效率 SYBR® Green I 检测用 Realtime PCR 试剂
KOD SYBR® qPCR Mix
高性能 SYBR® Green I 检测用 Realtime PCR 试剂
THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix-8-Code No.
QPS-101
QKD-201
QPS-201东洋纺（上海）生物科技有限公司[8] 参考文献
1. Hayashi .T et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive
splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9：619(2018)-9-

<销售商>
东洋纺（上海）生物科技有限公司
邮编：200122
邮箱：tech@bio-toyobo.cn
网址：http://www.bio-toyobo.cn
联系电话：021-58794900
公司地址： 上海市浦东新区张杨路 500 号华润时代广场 28 楼 AL 单元<生产商>东洋纺株式会社敦贺生物工厂地址：日本国福井县敦贺市东洋町 10 番 24 号