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Drug Discovery and Development

The Power of Precision

CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS技术对促红细胞生成素糖肽的分析Analysis of Glycopeptides in Erythropoietin by CESI-MS/MS andNanoLC-MS/MS Techniques
王文涛1，赵颖华1，陈泓序1，肖志良1，罗继1，刘冰2，李响3Wang Wentao1, Zhao Yinghua1, Chen Hongxu1, Xiao Zhiliang1, Luo Ji1, Liu Bing2，Li Xiang3
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SCIEX中国，2 重庆市食品药品检验检测研究院；3 中国食品药品检定研究院
1
SCIEX China; 2 Chongqing Institute for Food and Drug Control; 3 National Institutes for Food and Drug Control

Keywords：Erythropoietin; Glycopeptide; CESI-MS/MS; NanoLC-MS/MS;

1. 前言
促红细胞生成素（EPO）是一种糖蛋白激素，可刺激红细胞生成，是多种贫血病临床治疗的主要药物。EPO同时含有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点，糖链约占总分子量的40%，对其体内的生物活性有较大影响。EPO以其高度的异质性闻名，因此它的糖基化分析十分具有挑战性。EPO糖基化的分析方法主要为毛细管电泳（CE）、液相色谱（LC）及其与质谱（MS）的联用方法，通图1. CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS技术对EPO糖肽的分析流程。
Picture 1

过这些方法可对其进行三个水平的分析：完整糖蛋白、糖肽和糖基水平的分析。完整 EPO 的分析虽然具有样品消耗量少、前处理简单（不需化学或酶解处理）等优点，有效避免了人为因素的干扰，可以获得比较准确的糖型信息，但是对质谱仪器和数据解析
软件提出了很高的要求。糖基分析为EPO糖基化提供了详细的信息，除了可以识别EPO分子上存在的特定糖基，也可获得其准确的结构信息，但无法获得糖基化位点的信息。相比而言，对酶切后的样品进行糖肽水平的分析，能够获得糖基和糖基化位点间的对应关系的信息，对于EPO糖基化分析具有非常重要的意义。

2. 仪器与试剂2.1. 仪器与试剂
CESI 8000 Plus (SCIEX)，NanoSpray® III离子源（SCIEX），
NanoLC™ 425 HPLC系统（SCIEX），YMC C18色谱柱（150×2.1 mm,Phenomenex），TripleTOF® 5600+ LC-MS/MS系统（SCIEX，数据采集软件Analyst®软件1.7；数据处理软件PeakView®软件2.2
和BioPharmaView ™软件3.0），OptiMS熔融石英毛细管卡盒

本文以高糖基化蛋白药物EPO为分析对象，使用胰蛋白酶进行（91 cm×30 μm ID, SCIEX），10 K超滤管（Millipore）。冰醋酸

酶解，使用无鞘液毛细管电泳质谱联用（CESI-MS/MS）和纳升液（HAc，质谱纯，Sigma-Aldrich公司），二次去离子水（Millipore相色谱质谱联用（NanoLC-MS/MS）的检测方法，从糖肽水平上对公司），甲醇（质谱纯，Merck公司），甲酸（质谱纯，Sigma-EPO的N-糖基化进行分析（如图1），并对糖肽的鉴定结果进行了Aldrich公司），乙腈（质谱纯，Sigma-Aldrich公司）。二硫苏糖对比。

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醇（DTT）、盐酸胍、碘乙酰胺（IAM），碳酸氢铵均为分析纯试2) 加入40 μL 7 M盐酸胍进行变性处理，再加入1 μL 1 M DTT

剂，均购自Sigma-Aldrich。背景电解质（BGE）：10% HAc溶液；（溶于7 M盐酸胍）进行还原处理，涡旋震荡后低速离心，导电液（CL）：10% HAc溶液。胰蛋白酶（Promega公司），欧洲之后55 ℃ 孵育1 小时。

药典EPO标准品（EDQM公司）均在-20 ℃下保存。

3) 加入4 μ L 1 M IAM（溶于7 M盐酸胍），涡旋震荡后低速离心，室温避光放置30分钟进行烷基化。之后加入40 μ LOptiMS熔融石英毛细管卡盒初次使用时：用甲醇在100 psi下冲洗毛细管10分钟，然后分别依次用水、0.1 M NaOH、0.1 M HCl和50 mM 碳酸氢铵，14000 g离心至见底，重复两次。

水在100 psi下各冲洗10分钟，最后用BGE在100 psi下冲洗10分钟。

4) 将超滤管取出置于新的接收管中，加入40 μL 50 mM碳酸氢

在针与针之间依次用0.1 M NaOH、0.1 M HCl和水在100 psi下各冲洗铵，加入0.2 μg• μL-1的胰蛋白酶25 μL，旋涡震荡后短时离4分钟，最后用BGE在100 psi下冲洗5分钟。

心，密封后放置于37 ℃恒温箱中过夜。

2.2. 样品处理5) 过夜后离心收集溶液，往超滤管中再加入50 μL水，充分震荡，离心收集溶液，与之前的溶液混合，加入1 μL甲酸终

1) 取100 μg EPO蛋白溶液置于10 K超滤管中，用50 mM碳酸氢

止反应。每50 μL分装一管，抽干备用。

铵溶液补足体积至60 μL，14000 g离心至见底。

3. 方法设置
3.1. CESI-MS/MS方法
表1. CESI-MS/MS方法设置。

CESI条件设置MS条件设置CE 类型

CESI 8000 Plus

质谱型号

Triple TOF® 5600+ LC-MS/MS系统

CE 卡盒OptiMS 熔融石英毛细管卡盒极性正离子模式

BGE

10% HAc溶液

雾化气/辅助气0导电液

10% HAc溶液

气帘气5样品缓冲液

100 mM NH4Ac，pH 4.0溶液

喷雾电压+1650 V

毛细管温度

25℃

源温度

50 ℃

样品温度

10 ℃

一级扫描范围（m/z）

350-1250分离条件

30 kV，45 min with 1.0 psi

一级累计扫描时间

250 ms进样压力进样：5 psi 60 s

候选离子

20二级扫描范围（m/z）

100-1500二级累计扫描时间50 ms

去簇电压

100

碰撞能量（Rolling CE）

True

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3.2. NanoLC-MS/MS方法
表2. NanoLC-MS/MS方法设置。

LC条件设置

MS条件设置LC 型号

NanoLC™ 425 HPLC系统

质谱型号

TripleTOF® 5600+ LC-MS/MS系统

色谱柱

YMC C18 色谱柱极性正离子模式检测

A相

98% Water/0.1% Formic Acid

雾化气

15

B相

98% Acetonitrile/0.1% Formic Acid

辅助气

20

进样温度4℃气帘气30

柱温30 ℃喷雾电压5500 V

流速

Loading：10μl/min，gradient：5μl/min

源温度

300 ℃分离时间45 min一级扫描范围（m/z）

350-1250一级累计时间250 ms

时间

梯度（B相%）

05候选离子20212二级扫描范围（m/z）

100-1500

3035二级累计时间50 ms

3180

去簇电压1003880

碰撞能量（Rolling CE）

True

3954554. 结果与讨论
4.1. BiopharmaView™ 软件3.0数据检索为糖肽的分析提供新的方法。本文中，利用胰蛋白酶对EPO进行酶解，使用CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS方法对EPO的酶解产物进行
分析，采用BiopharmaView™ 软件3.0对其结果进行解析。如图2所

采用BiopharmaView™软件3.0进行糖肽的谱图解析，首先将示，CESI-MS/MS方法可以单独鉴定出32条糖肽，NanoLC-MS/MS方EPO的氨基酸序列导入软件，将N-糖基修饰作为预设蛋白翻译后修

法可以单独鉴定到42条糖肽；通过两种方法结合使用，共鉴定到饰来定义EPO蛋白的修饰信息，同时配对好EPO的二硫键信息。在86条糖肽，共涉及到58种糖基。该结果充分证明，CESI-MS/MS方软件中选择IAM进行半胱氨酸烷基化处理，胰蛋白酶酶解，在还原

法与NanoLC-MS/MS方法之间具有很好的互补性，可以鉴定到更多状态下产生EPO胰蛋白酶酶解后的理论肽段信息。将采集得到的原的糖肽信息。

始数据（wiff 格式）导入到BiopharmaView™软件3.0中，进行自动搜库，通过肽段质量数可确定EPO的糖肽信息，并给出具体的糖型
和糖基化位点信息。

4.2. CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS方法对EPO糖肽的分析
NanoLC-MS/MS技术是蛋白药肽段分析的常用方法之一，目前以使用反向色谱柱（C18）居多，适合于非极性肽段的分析。
CESI-MS/MS方法是另外一种进行肽段分析的方法，主要根据电荷/体积比的差异进行分离，对极性肽段表现了较佳的分离效果，可RUO-MKT-02-11894-ZH-A

图2. CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS技术鉴定到的糖肽数目比较。
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The Power of Precision为了更好地分析CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS技术对蛋白药糖间相差较大，具有更好的分离效果（如图3B、3D）。此外，CESI-

肽分析的差别，本文选取了4条氨基酸序列相同但糖基修饰不同的MS/MS方法可以得到更好的峰型，从而更加有利于糖肽的准确定糖肽（详见表3）对两种分析方法的分离效果进行了比较。如图

量。这主要是由于糖基的修饰导致肽段极性增强，更有助于CE方3A、3C所示，这4条糖肽在反相色谱柱上的保留时间相近，分离法进行分析。

效果较差；而利用CESI-MS/MS方法进行分析时，4条糖肽的迁移时

表3. CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS方法对4种糖肽的鉴定信息。

序号

肽段序列

NO.1

糖基糖基结构糖肽理论分
子量 (Da)糖肽实测分子量(Da)时间 (min)

CESIMS/MS

NanoLCMS/MSCESIMS/MS

NanoLCMS/MS

FA3G3S1

4787.12944

4787.16032

4787.09296

24.02026

17.78306

FA3G3S35370.32755

5369.34108

5370.31135

26.14864

18.22461

NO.3

FA4G4Lac1S4

6392.69460

6392.74068

6392.68926

27.00404

17.55979

NO.4

FA4G4S2

5444.36430

5443.38648

5444.36940

24.64285

17.77313

NO.2
GQALLVNSSQPWEPLQLHVDK

此外，对CESI-MS/MS与NanoLC-MS/MS所鉴定到的糖肽分子量分布进行了比较，如图4所示，CESI-MS/MS方法鉴定到的糖肽质量
范围为4500~10000 Da，NanoLC-MS/MS方法鉴定到的糖肽质量范围为4500~7500 Da。通过两种方法的对比结果可以发现，CESI-MS/
MS方法鉴定出的糖肽分子量范围更宽。对于高分子量的糖肽，在NanoLC-MS/MS方法中未鉴定到，但可以在CESI-MS/MS方法中得以成功鉴定。这主要是由于长肽段在反向色谱柱上不易被洗脱下来，从而导致分析效果欠佳。相比而言，CE-MS/MS方法无需使用固定相，不存在样品残留，有效促进了糖肽的分离。

5. 结论
本文利用胰蛋白酶对EPO进行酶解，采用CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS方法对EPO的糖肽进行了深入分析。CESI-MS/MS方Picture 3图3. 4种糖肽在CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS方法中的结果比较。保留/迁移

法主要依据不同糖肽的电荷与体积比差异进行分离，NanoLC-MS/时间比较（图3A、3B）；MS中提取离子流图比较（图3C、3D）。

MS方法则主要依据不同糖肽的疏水性进行分析。通过两种技术的

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The Power of Precision有效结合，有助于提高糖肽鉴定的数目，加深对EPO糖基化的研究。对于选定的4条糖肽来说，其氨基酸序列完全相同的，仅在糖基修饰方面存在差别，CESI-MS/MS方法表现了更优异的分离效果，并获得了更好的峰型，从而更加有助于糖肽的准确定量。此外，CESI-MS/MS方法鉴定出的糖肽分子量范围更宽。结果充分证明，CESI-MS/MS技术结合了CE对极性
化合物高分离效率的优势，在蛋白药糖肽分析方面是NanoLCMS/MS极佳的互补工具，为糖蛋白在糖肽水平的全面表征和准确定量提供了互补的解决方案。

更多详细信息，可参考：
CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS技术对促红细胞生成素中糖
肽的分析，药物分析杂志。

图4. CESI-MS/MS和NanoLC-MS/MS方法所鉴定的糖肽分子量分布。

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