NGS解析基礎

講 義 内 容•••••

ファイル形式
データの可視化
データのクオリティチェック
マッピング
アセンブル

資料の見方
$ pwd
※実際に入力するコマンドを黄色い四角の中に示します

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2

フ ァ イ ル 形 式• NGS解析でよく使われるファイル形式
ファイル形式
fastq
bam/samvcf

bed
fasta

サンプルデータの場所/home/ユーザ名/Desktop/amelieff/1K_ERR038793_1.fastq/home/ユーザ名/Desktop/amelieff/1K_ERR038793.bam/home/ユーザ名/Desktop/amelieff/1K_ERR038793_sort.vcf/home/ユーザ名/Desktop/amelieff/1K_ERR038793.bed（講義中に作成）/home/ユーザ名/Desktop/amelieff/Scerevisiae/WholeGenomeFasta/genome.fa

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3

フ ァ イ ル 形 式 | f a s t q• シーケンサから出力されるリード情報$ less 1K_ERR038793_1.fastq

4行で1リード@ERR038793.1 HS19_6178:5:1208:12689:35298#1 length=100
GGACAAGGTTACTTCCTAGATGCTATATGTCCCTACGGCCTTGTCTAACACCATCC+ERR038793.1 HS19_6178:5:1208:12689:35298#1 length=100
D/DDBD@B>DFFEEEEEEEEF@FDEEEBEDBBDDD:AEEE<>CB?FCFF@F?FBFF
:
1行め
2行め
3行め
4行め

必須の情報
@から始まる配列ID
リードの塩基配列+
リードのクオリティ

オプション
付加情報
配列ID、または1行めと同じ情報

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4

フ ァ イ ル 形 式 | f a s t q• fastqのクオリティは、「記号のASCIIコード－33」と対応する。
（例）クオリティ値：%→37－33＝4

ASCIIコード表

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フ ァ イ ル 形 式 | b a m / s a m• リードをゲノムにマッピングしたアライメント情報– sam: テキストデータ– bam: 圧縮したsam。コンピュータが扱いやすいバイナリデータ• 相互変換には主にsamtoolsというソフトを用いる
 samからbam

入力がsam、出力がbamsamtools view –Sb sam > bam bamからsam

ヘッダ付で出力

samtools view –h bam > sam$ samtools view –h 1K_ERR038793.bam > 1K_ERR038793.sam$ ls
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フ ァ イ ル 形 式 | b a m / s a m• samファイルの中身– @から始まるヘッダ行と、1行に1リードの情報がタブ区切りで記載されているデータ行からなる

ヘッダ行$ less 1K_ERR038793.sam
@SQ
@SQ
@SQ

SN:I
SN:II
SN:III

LN:230218
LN:813184
LN:316620：

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フ ァ イ ル 形 式 | b a m / s a m• samファイルの中身– @から始まるヘッダ行と、1行に1リードの情報がタブ区切りで記載されているデータ行からなる
1行で1リード$ less 1K_ERR038793.sam：
ERR038793.1 113 XII 1065143 412M4I84M
I150 0AGGGTGTGGTGTGTGGGTATATCTATGTCACCTTATTGCATGCTGGATGGTGTTAGACAAGGCCGTAGGGACATATAGCATCTAGGAAGTAACCTTGTCC
CD;?C@FEFEFFFFFDC8=DA=?>>.EEE=BEEEBEE:EEE:?@FFBF?F@FFCF?
BC><EEEA:DDDBBDEBEEEDF@FEEEEEEEEFFD>B@DBDD/D NM:i:6
MD:Z:0T93A1 AS:i:83 XS:i:80 RG:Z:ERR038793 XA:Z:V,570330,18S82M,1;：Copyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved.

8フ ァ イ ル 形 式 | b a m / s a m• samファイルの中身– 最初の11列は必須である列項目意味例1 QNAME リード名

ERR038793.1

2113

FLAG

フラグ

3 RNAME 染色体名

XII

4POS

リードのスタートポジション 1065143

5MAPQ

マッピングクオリティ

6CIGAR CIGAR：：

412M4I84M：Copyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved.

:9フ ァ イ ル 形 式 | b a m / s a m• samファイルの中身
列項目意味例：：：：7

RNEXT ペアリードがある染色体名

I

8PNEXT ペアリードのスタート位置

150

9TLEN

ペア間の距離＋各リード長

0リード配列AGGGTGTGGTGTGTGGGTATATCTATGTCACCTTATTGCATGCTGGATGGTGTTAGACAAGGCCGTAGGGACATATAGCATCTAGGAAGTAACCTTGTCC

リードクオリティ

CD;?C@FEFEFFFFFDC8=DA=?>>.EEE=BEEEBEE:EEE:?@FFBF?F@FFCF?BC><EEEA:DDDBBDEBEEEDF@FEEEEEEEEFFD>B@DBDD/D

10SEQ

11

QUAL

：：：Copyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved.

:10

フ ァ イ ル 形 式 | v c f• 変異の情報– # で始まるヘッダ行と、1行に1つの変異の情報がタブ区切りで記載されているデータ行から成る
ヘッダ行$ less 1K_ERR038793_sort.vcf##fileformat=VCFv4.1##FORMAT=<ID=AD,Number=.,Type=Integer,Description="Allelicdepths for the ref and alt alleles in the order listed">:##INFO=<ID=AC,Number=A,Type=Integer,Description="Allele countin genotypes, for each ALT allele, in the same order as
listed">:##reference=file:///home/genome/genome.fa#CHROM POS ID REF ALT QUALFILTER INFOFORMAT ERR038793:Copyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved.

11

フ ァ イ ル 形 式 | v c f• 変異の情報– # で始まるヘッダ行と、1行に1つの変異の情報がタブ区切りで記載されているデータ行から成る$ less 1K_ERR038793_sort.vcf
1行で1変異
:
:
I

111 .
C
T
105.93 .
AC=1;AF=0.50;AN=2;BaseQRankSum=0.729;DP=9;Dels=0.00;FS=0.000;HRun=1;HaplotypeScore=0.0000;MQ=59.16;MQ0=0;MQRankSum=-1.159;QD=11.77;ReadPosRankSum=-0.361;SB=-0.01
GT:AD:DP:GQ:PL 0/1:5,4:9:99:136,0,173::
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フ ァ イ ル 形 式 | v c f• 変異の情報– # で始まるヘッダ行と、1行に1つの変異の情報がタブ区切りで記載されているデータ行から成る
列

項目

説明

例

1

#CHROM

変異がある染色体名

I

2

POS

変異のポジション

111

3

ID

rsID、COSMIC IDなど

.

4

REF

該当ポジションにおけるリファC
レンスゲノムのアリル

5ALT

変異のアリル::T:

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:
13

フ ァ イ ル 形 式 | v c f• 変異の情報列:6

項目:QUAL

7FILTER

説明:
変異のクオリティ
変異検出ソフトが変異につける変異のクオリティ

例:105.93

AC=1;AF=0.50;AN=2;BaseQRankSu
m=0.729;DP=9;Dels=0.00;FS=0.00
0;HRun=1;HaplotypeScore=0.0000;
MQ=59.16;MQ0=0;MQRankSum=1.159;QD=11.77;ReadPosRankSum=-0.361;SB=-0.01

GT:AD:DP:GQ:PL

.

8

INFO

検出ソフトやアノテーション
ソフトが変異につける変異の情報やアノテーション。記述は自由

9

FORMAT

以降の列に記載されるサンプ
ルごとの変異情報の書式説明

:

サンプル列

変異の情報。書式はFORMAT
0/1:5,4:9:99:136,0,173
に従うCopyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved.

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フ ァ イ ル 形 式 | b e d• ゲノム上の領域の情報– エクソームシーケンスなどのターゲットシーケンスで解析範囲を指定するために用いられるほか、ChIP-seqで検出されたピークを示すのに用いる– 例としてbamファイルをbedファイルに変換した場合$ bamToBed –i 1K_ERR038793.bam > 1K_ERR038793.bed$ less 1K_ERR038793.bed
XII 1065142 1065238 ERR038793.1/1 4I
149 248 ERR038793.1/2 60 XIII923961 924028 ERR038793.2/1:
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-40+15フ ァ イ ル 形 式 | b e d• ゲノム上の領域の情報– エクソームシーケンスなどのターゲットシーケンスで解析範囲を指定するために用いられるほか、ChIP-seqで検出されたピークを示すのに用いる
列項目1chrom2

必須36:

染色体オプション

例XII

chromStart 開始ポジション。最初の塩基は0 1065142
chromEnd 終了ポジション45

説明1065238

name

遺伝子名や任意の文字列

ERR038793.1/1

score0-1000までの数値

4strand

順鎖なら＋、逆鎖なら－-:

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::

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フ ァ イ ル 形 式 | f a s t a• NGS解析以外でもよく使われる、塩基配列やアミノ酸配列の情報。
ここではリファレンスゲノム配列のfastaについて説明する– 拡張子が統一されておらず、.fa、.fasta、.fna、.fasなどが使われていることがあるが、中身は同じ• 1行めは「>」で始まるヘッダ、2行めから配列$ less /home/ユーザ名/Desktop/amelieff/Scerevisiae/WholeGenomeFasta/genome.fa>ICCACACCACACCCACACACCCACACACCACACCACACACCACACCACACCCACACACACACATCCTAACA
CTACCCTAACACAGCCCTAATCTAACCCTGGCCAACCTGTCTCTCAACTTACCCTCCATTACCCTGCCTCCACTCGTTACCCTGTCCCATTCAACCATACCACTCCGAACCACCATCCATCCCTCTACTTACTACCACTC

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デ ー タ の 可 視 化•Integrative Genomics Viewer（IGV）– 米 Broad Instituteが開発したゲノムブラウザ– GUIで直感的な操作が行える– bam、bed、vcfなどのファイル形式に対応（可視化できる形式一覧は
http://www.broadinstitute.org/software/igv/FileFormats）– Windows、MacOS、LinuxのいずれのOSでも動作する– クローズドな環境で使用でき、セキュリティ上安全

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デ ー タ の 可 視 化•

IGVの起動$ igv.shCopyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved.

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デ ー タ の 可 視 化 ｜ イ ン デ ッ ク ス の 作 成• サイズの大きなデータを高速に扱うため、サイズの大きなファイルにはインデックス（目次）ファイルが必要なことが多い– bamファイルインデックス作成前に$ ls
ソートが必要1K_ERR038793.bam$ samtools sort 1K_ERR038793.bam 1K_ERR038793_sort$ ls
1K_ERR038793.bam

1K_ERR038793_sort.bam$ samtools index 1K_ERR038793_sort.bam$ ls
1K_ERR038793.bam
1K_ERR038793_sort.bam1K_ERR038793_sort.bam.bai
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デ ー タ の 可 視 化 ｜ イ ン デ ッ ク ス の 作 成• サイズの大きなデータを高速に扱うため、サイズの大きなファイルにはインデックス（目次）ファイルが必要なことが多い– vcf・bedファイル• igvtoolsを起動する①②③

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① Commandを「index」② Input Fileを選択③ Run（実行完了のメッセージなどは出ません）
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デ ー タ の 可 視 化

1. リファレンスゲノムを選択する
2. 可視化したいファイルを選択する– 「File」 > 「Load from File」からファイルを選択する
3. 詳細に見たい領域を選択する①

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③22

デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク• FastQC : fastqまたはbamのクオリティを確認するソフトウェア– fastqファイル1つに対して実行する$ ls
1K_ERR038793_1.fastq$ fastqc –f fastq 1K_ERR038793_1.fastq
Started analysis of 1K_ERR038793_1.fastq
Approx 5% complete for 1K_ERR038793_1.fastq
Approx 10% complete for 1K_ERR038793_1.fastq::Approx 100% complete for 1K_ERR038793_1.fastq
Analysis complete for 1K_ERR038793_1.fastq
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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク• FastQC– クオリティチェックのレポートがあるディレクトリと、ディレクトリの圧縮ファイルが生成される$ ls
1K_ERR038793_1.fastq
1K_ERR038793_1_fastqc.zip

1K_ERR038793_1_fastqc– 解析レポート$ cd 1K_ERR038793_1_fastqc
$ ls
Icons
Imagesfastqc_data.txt
fastqc_report.html

summary.txt

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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク• FastQC$ firefox fastqc_report.html
fastqc_report.htmlを、ウェブブラウザで開く
問題なし

注意 (warning)
問題あり (failure)

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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク• FastQC
Basic Statistics
ファイルの基本的な情報。
ファイルタイプや、リード数、リード長などの情報が表示される。
ここではwarning, failureは出ない。

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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク•FastQCPer Base Sequence Quality
横軸はリード長、縦軸はquality valueを表す。
リードの位置における全体のクオリティの中央値や平均を確認できる。赤線は中央値、青線は平均値、黄色のボックスは25%〜75%の領域を表す。上下に伸びた黒いバーが10%〜90%の領域を意味する。

Per Sequence Quality Scores
縦軸がリード数、横軸がPhred quality scoreの平均値。

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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク•

FastQCPer Base Sequence Content
リードにおける位置での各塩基の割合を示す。
いずれかの位置で、AとTの割合の差、もしくはGとCの割合の差が10%以上だとwarning,20%以上でfailureとなる。
Per Base GC Content
リードにおける位置でのGC含量を表す。
いずれかの位置で、全体でのGC含量の平均値より5%以上の差が開くとwarning, 10%でfailureとなる。
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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク•FastQCPer Sequence GC Content
各リードにおけるGC含量の平均の分布(赤線)と、理論分布(青線)。
理論分布との偏差の合計が、総リードの15%以上でwarning, 30%以上でfailureとなる。

Per Base N Content“N”はシーケンサーの問題でATGCいずれの塩基にも決定出来なかった
場合に記述される。
リードのいずれかの位置で5%以上Nが存在するとwarning, 20%以上でfailureとなる。
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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク
Sequence Length Distribution
リード長の全体の分布。
全てのリードの長さが同じであることを前提としており、一定でなければwarning、ゼロのものが含まれているとfailureになる。

Sequence Duplication Levels
リードの重複レベルを見ている。
1〜10はそれぞれ重複のレベルで、全体の20%以上がユニークでないものだとwarning, 50%以上がユニークでないとfailureとなる。

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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク
Overrepresented Sequences
重複している配列とその割合を表す。
特定の配列が全リードの0.1%を超えるとwarning、1%を超えるとfailureとなる。

K-mer Content
5 bpの任意の配列(5mer)を考えた時、ライブラリに含まれるATGCの割合を元に「実際に観測された値/理論的に観測される期待値」を計算している。
それぞれの任意の配列について、実測が期待値を大きく上回っている時、それはライブラ
リに配列的な偏りがあると解釈される。
「実測値/期待値」は、リード長全体における計算と、リードのある位置での計算を行い、全体における値が3倍、リードのある位置における値が5倍になるとwarning、リードのある位置における値が10倍になるとfailureとなる。
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デ ー タ の ク オ リ テ ィ チ ェ ッ ク•

テキストデータによるレポートも出力される$ less fastqc_data.txt>>Per base sequence content fail#Base GAT117.435.8
217.935.9
3
14.4
35.1
4
16.03206
33.16633
5
17.8
33.3
6
17.7
35.5
7
16.9
33.3
8
15.1
32.6
9
15.8
32.5

C
28.9
32.8
34.5
35.97194
32
28.8
33.3
34.9
33

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17.9
13.4
1614.82966
16.9
18
16.5
17.4
18.7
32

マ ッ ピ ン グ• シーケンサから得られたリード（DNA配列）を、リファレンスゲノムや転写産物上の類似した配列に対して並べること– BLASTのような従来のマッピングソ
フトは正確だが時間がかかり、NGS解析に向かないため、NGS解析用の高速なマッピングソフトが使われる

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ショートリード

リファレンスゲノム33

マ ッ ピ ン グ• 各解析で使われるマッピングソフトの特徴と主なマッピングソフト– Reseq：データの大きなゲノムファイルに対して数カ所のミスマッチを許容して高速にマッピングする。BWAやBowtieなど– RNA-seq：スプライシングにより生じるギャップを考慮してマッピングする。TopHatなど– Methyl-seq：メチル化を考慮してマッピングする。BSMAPなど

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ア セ ン ブ リ ン グ•

ゲノムde novoアセンブリングで主に使われるソフト– Velvet– SOAPdenovo– AbySS•

トランスクリプトームde novoアセンブリングで主に使われるソフト– Oases– SOAPdenovo-Trans– Trans-ABySS– Trinity

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