平成24年度

鹿児島県水産技術開発センター事業報告書

かごしまの水産物付加価値創出研究事業－Ⅱ（ボンタン抽出液による水産加工品のヒスタミン生成抑制試験）
保聖子，加治屋大，稲盛重弘【目的】

ヒスタミン（以下Ｈｍという）は，魚肉中の遊離アミノ酸であるヒスチジン（以下Ｈｉｓという）が，ヒスタミン生成菌のヒスチジン脱炭酸酵素（以下ＨＤＣという）の作用を受けてＨｍに変換されたものである。昨年度までに，Ｈｉｓ含有量が高くＨｍの生成が懸念されるイワシ丸干品については，内臓を含んだ原料形態での現状の加工工程では，Ｈｍ生成リスクを完全に回避することは困難との知見を得た。一方，数種の植物抽出物にＨＤＣ活性抑制効果があることが既に知られている。そこで，本県農産加工品の加工残滓であるボンタン外皮抽出物（以下ボンタン抽出液という）に着目し，Ｈｍ生成リスクを回避する新たな加工技術を開発することを目的とする。

試験１．ボンタン抽出液 のＨＤＣ活性阻害試験【材料及び方法】
ボンタン抽出液
阿久根市内のボンタン漬け加工業者が製造販売する市販品を用いた。
菌粗酵素液の調整
Ｈｍ生成菌は，（独）水産総合研究センター中央水産研究所より菌株分与されたMorganella morga-nii及びPhotobacterium damselae を用いた。それぞれ，0.5%のL-Hisを加えたトリプチケースソイブ
ロス(以下TSBという)培地で37℃・24時間の培養を行った（ただし，P.damselae は，前述培地に2.5%のNaClを添加）。培養した菌液を遠心分離し(8,000rpm,20分，4℃），得られた沈殿物を滅菌リン酸緩衝液(以下PBSという)で3回洗浄したものを洗浄菌体とした。次に，洗浄菌体をPBSに懸濁し，超音波粉砕機（UD-21P トミー精工製）で冷却しながら，10分間の間欠粉砕を行った。その後，遠心分離(14,000rpm,30分，4℃）して得られた上清を粗酵素液とした。
ＨＤＣ活性阻害の測定法
予め200mM 酢酸緩衝液にL-Hisを25mM になるよう添加し基質とした。また，ＨＤＣ活性阻害剤として基質にボンタン抽出液及びボンタン抽出液に代えて滅菌水を加えたものを添加した。基質にそれぞれの粗酵素液を加え，37℃で19時間の酵素反応を行った。16％トリクロロ酢酸を加えて反応を停止させ，基質中に生成したＨｍ濃度をEIA Histamarine kit（Beckman Coulter製）を用いて測定した。なお，測定は，マイクロプレートリーダー（MPR 東ソー製）で400nmにおける吸光度を求めた後，Ｈｍ標準品の吸光度と濃度の検量線からＨｍ濃度を求めた。

表１

ＨＤＣ活性阻害試験の条件

粗酵素液の種類
M.morganii 粗酵素
M.morganii 粗酵素
P.damselae 粗酵素
P.damselae 粗酵素

基質
阻害剤等
阻害剤等の添加割合(%) 反応条件
25mM L-His,200mM酢酸ﾊﾞｯﾌｧｰ ボンタン抽出液
425mM L-His,200mM酢酸ﾊﾞｯﾌｧｰ
水437℃・１９時間
25mM L-His,200mM酢酸ﾊﾞｯﾌｧｰ ボンタン抽出液
425mM L-His,200mM酢酸ﾊﾞｯﾌｧｰ
水4- 178 -平成24年度

鹿児島県水産技術開発センター事業報告書【結果及び考察】

4080

M.morganii HDC

35のＨＤＣ活性については，滅菌水添30602550

対し，ボンタン抽出液添加区では，201540305.5ppmと低い値であった。このこと

1020から，ボンタン抽出液がM.morganii

51000のＨＤＣ活性を阻害する効果がある

P.damselae HDC

70Hm (ppm)

加区のＨｍが34.1ppmであったのにHm (ppm)

結果を図１に示す。M.morganii

滅菌水

ボンタン抽出液

滅菌水

ボンタン抽出液ことが確認された。
同様に P.damselae のＨＤＣにつ

図１ボンタン抽出液のＨＤＣ活性抑制結果

いても，滅菌水添加区のＨｍが69.1ppmであったのに対し，ボンタン抽出液添加区では，4.5ppmと低い値であった。以上のことから，ボンタン抽出液は，M.morganiiのＨＤＣとP.damselae のＨＤＣの両方の活性を阻害する効果があることが確認された。
以上の結果から，イワシ丸干加工において，Ｈｍの生成を抑制するためにボンタン抽出が有効であることが示唆された。

試験２．魚肉でのＨｍ生成抑制試験【材料及び方法】
ボンタン抽出液
上記同様，市販品を用いた。
供試魚
2012年5月に鹿児島県北薩海域で漁獲された新鮮なカタクチイワシ（体重15.7±2.3g，尾叉長 12.7±0.7cm)を用いた。供試魚は，三枚に卸し，フィーレとした。冷水で洗浄し内臓等の付着物を取り除いた後，水気を拭き取り保存袋に入れ，試験に供するまで-35℃で保管した。
Ｈｍ生成菌の調整及び菌の接種方法
試験１同様，（独）水産総合研究センター中央水産研究所より菌株分与されたM.morganii及びP.da-mselae を用いた。それぞれの菌体は，0.5%L-Hisを加えたTSB培地で培養した。培養条件は，それぞれ37℃ならびに30℃で，107cfu/ml になるまで培養を行った（ただし，P.damselae は，前述培地に2.5%のNaClを添加）。それぞれの菌は，滅菌PBSで104cfu/ml に希釈し，試験用菌液とした。菌の接種方法は，供試フィレーを3分間菌液に浸漬して行う浸漬法とした。
試験の方法
イワシ丸干加工を想定し，塩漬工程中にボンタン抽出液を添加することで，Ｈｍの生成を抑制する手法を検討した。ボンタン抽出液を10％食塩水に対し，0％，0.3％，0.5％及び1.0％の割合で添加した浸漬液を準備し，これらに予め菌液で浸漬により汚染したカタクチフィーレそれぞれに6枚ずつ，30間分漬け込んだ。漬け込み後，浸漬液から取り出し，保存袋に入れ，25℃で16時間保存した後，すべてのフィレーについてＨｍ濃度を測定し，6枚の平均値を求めた。
Ｈｍ測定
サンプル約2gを正確に量り取り，8倍量のイオン交換水を加え，ポリトロンホモジナイザーでホモジネート（18,000rpm×1min）し，遠心分離（10,000rpm，5分，4℃）後，上清を得た。得られた上清- 179 -平成24年度

鹿児島県水産技術開発センター事業報告書を試験１同様の方法で分析し，Ｈｍ濃度を求めた。

【結果及び考察】
結果を図２に示す。10％食塩水が魚肉中に浸透している状態にも関わらず，25℃の高温下で保存したため，ボンタン抽出液0％の場合は，魚肉に付着した細菌によってＨｍの生成は209.7±36.3ppmと高濃度に蓄積した。一方，ボンタン抽出液の添加量が0.3％の場合のＨｍの生成は，117.3±21.9ppmとボンタン抽出液0％の場合に比べて，有意に低い値であった。添加量が0.5%の場合には，55.8±32.
6ppm，1.0%の場合には，73.3±32.8ppmと高温度保存条件下であってもＨｍの生成が低く抑えられていた。このことから，イワシ丸干し等の塩漬工程中にボンタン抽出液を添加することで，Ｈｍの生成を抑制することが明らかとなった。また，ボンタン抽出液の添加濃度が高くなる程Ｈｍの生成が抑制される傾向が確認されたが，添加濃度の0.5%と1.0%の間には有意差

300aは認められなかった。
細菌への浸漬ならびに保存条件下において，Ｈｍ生成抑制効果をもたらすボンタン抽出液の最適添加量は，0.5%であると推察された。
しかしながら，得られたデータをHm生成濃度 (ppm)以上のことから，今回実施した

(n=6)

250
200b150c

100c50

詳細に検討すると，ボンタン抽出0液を0.5%添加したサンプルフィー0%レにおいても，Ｈｍ生成濃度が100ppm程度まで蓄積しているサンプルもあるなどバラツキが認めら

0.3%

0.5%

1.0%

ボンタン抽出液添加量

図２

ボンタン抽出液添加量とＨｍ生成濃度の関係※異符号間で有意差あり（p<0.01）

れた。このことは，ボンタン抽出液が難水溶性であることが原因ではないかと推察している。そのため，実用化にあたっては，浸漬液中にボンタン抽出液が均等に添加されるよう加工工程中の作業に配慮が必要である。

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