こうえいフォーラム第 31 号 / 2023.6

ダムにおける外来種モニタリングのための環境 DNA チップの開発について
DEVELOPMENT OF ENVIRONMENTAL DNA CHIP FOR MONITORING THE INVASIVEALIEN FISHES IN DAM RESERVOIRS

加藤 靖広*・今村 史子**・郡司 未佳**・中尾 遼平***・赤松 良久***・岡村 浩****Yasuhiro KATO, Fumiko IMAMURA, Mika GUNJI, Ryouhei NAKAO, Yoshihisa AKAMATSU and Hiroshi OKAMURA

Control and prevention of invasive alien species (IAS) are important issues for theenvironmental management of dam reservoirs. Recently, environmental DNA (eDNA) analysis
has been used for monitoring IAS in aquatic ecosystems. In this study, as a simple and userfriendly eDNA method for monitoring IAS, we developed an eDNA chip analysis for monitoring
three IAS, largemouth bass, smallmouth bass and bluegill sunfish, in dam reservoirs. The
developed eDNA chip detected three IAS from water samples collected in five dam reservoirs,indicating that eDNA chip analysis can be used as a monitoring tool for IAS. For theestablishment of an eDNA chip for biomonitoring, some challenges faced by other techniques
like qPCR and metabarcoding remain, such as sensitivity at low target concentrations and“real-time” detections in the field and further improvement of performance in eDNA chip will
be required.

Keywords ： eDNA, eDNA chip, Invasive alien species (IAS), reservoir, real-time qPCR

1. はじめにがあげられる。これらの種は釣り等の用途のために人為的に持ち込まれ、現在では全国各地で定着している。また、魚食性が環境 DNA 技術は、生物モニタリングの新たなツールとして強く、在来魚を捕食することで在来の生態系を大きく改変する注目され、利用され始めている。

ため、外来生物法によって特定外来 生物に指定されており、

本稿 では、中でも医療分野 や衛生 分野で多用されている積極的な防除の対象となっている。

DNA チップの環境分野への転用の可能性のひとつとして、主このことから、ダム湖 における外 来魚 の駆除 と侵入 の抑制にダム湖等で問題となっている外来種のモニタリング等への活は、ダム管理上の重要な課題のひとつとなっている。外来魚の用を想定した DNA チップの開発結果について示す。

駆除方法として、投網、刺し網、定置網等での捕獲が実施されている。また、繁殖および定着の抑制として、人工産卵床の設2. ダム湖等における外来種問題置および産卵床の破壊等が取り組まれている。しかし、これら外来種とは、国内に自然分布せず主に人為的な影響によっの駆除対策はすべて人力で行われており、継続的な対策の実て国外から持ち込まれた生物種の総称である。外来種は移入施には多大な労力とコストを必要とする。そのため、対策を効先の在来の生態系を脅かし、その地域の生態系および生物多率的かつ継続的に進めていくためには、効果の効率的な把握

様 性 を著 しく喪 失 させる要 因 となって おり、世 界 中 で問 題 とと対策技術の向上に資する優れたモニタリング手法の開発がなっている。そのため在来の生態系の健全性を維持していくに必要である。

は、外来種への対策は必要不可欠な課題である。
外来種の侵入しやすい環境として、人の立ち入りが容易な

3. 環境 DNA 分析による外来種モニタリングの課題

人工水域であるダム湖があげられ、我が国においても外来種の侵入が確認されている。ダム湖に定着している外来種のうち近年、環境中に存在する生物由来の DNA 断片を検出する

有名な種としては、オオクチバス Micropterus salmoides や

環境 DNA 分析手法が、生物モニタリングの新たなツールとしコクチバス M. dolomieu、ブルーギル Lepomis macrochirusて注目され、利用され始めている。環境 DNA 分析手法は、現地調査では水等の環境サンプルを採集するだけでよいこと、種**********

同定のための専門的な知識が不要であることから、時間的・コ

基盤技術事業本部 地球環境事業部 環境部
中央研究所 先端研究センター
山口大学
東洋鋼鈑株式会社

スト効率的な生物モニタリング手法であるとされている。

1

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環境 DNA 分析手法としては、一般的にリアルタイム定量「HySHOT」を用いて蛍光シグナルとして検出する。本手法をPCR 分析が活用されており、その中でも特定の種を検出する利用するメリットとしては、一回の計測で複数種の DNA を一度種特異的な検出手法と、対象とする分類群の種を網羅的に検に検出できるため、リアルタイム定量 PCR より簡便にモニタリン出するメタバーコーディングがある。

グ検査が可能になる点や、メタバーコーディングでは判定が難

このうち、種特異的な検出は、特定の種について DNA の検しい種の在･不在が明確に判別できる点があげられる。

出を行い、DNA 濃度から種のバイオマス量の定量評価が可能であるとされている。しかし、一度に検出できる種の数は多く

5. ダム湖における野外実証試験の場合 1 種であり、複数種の DNA を同時にかつ高精度に検（1） サンプル採取出するためには、プライマー同士の相補関係やプローブ同士

本研究では、開発した環境 DNA チップの野外適用を目的の干渉等の検出系の慎重な条件設定を求められる。

として、ダム湖を調査地とした環境 DNA 調査を実施し、リアルもうひとつの分析手法であるメタバーコーディングでは、生物タイム定量 PCR 法を用いた従来の環境 DNA 分析と比較する群集のモニタリングにおいて高いパフォーマンスを有していることで、その検出性能や有効性について検討した。

一方、外来魚モニタリングにおいては、外来魚以外の種の情野外適用の調査地として、七ヶ宿、三春、宮 ヶ瀬、天ヶ瀬、報 も同 時 に検 出 するためコストが余 分 にかかること、超 並 列布目の 5 ダムを選定した。これらのダム湖では、過去の調査でシーケンサーから出力されるデータの解析や解釈には高度な外来魚 3 種のうち一部またはすべてが採捕されていることが確専門性を要すること等の課題もある。

認されている。

そのため、外来魚モニタリングを継続的かつ簡易的に行うた予備調査として、2019 年 12 月から 2020 年 1 月にかけてめの新たなツール開発が求められている。

七ヶ宿 3 地点、三春 5 地点、宮ヶ瀬 4 地点で採水調査を実施した。各地点で環境水 1L を採水し、DNA の分解を抑制する

4. 環境 DNA チップの特徴ために 10%塩化ベンザルコニウム水溶液を 1mL/L 添加した。

一般的に環境 DNA 分析にはリアルタイム定量 PCR 分析

その後 、冷蔵 状態 で日本 工営 株式 会社中 央研究 所 へ輸送が活用されており、その有効性が確認されているが、上記のよし、ステリベクスフィルターでそれぞれのサンプルをろ過した。ろうな課題があげられる。そのため、この課題を解決可能なダム

過 後 の カ ー ト リ ッ ジ フ ィ ル タ ー は -20 ℃ で 保 存 し 、 そ の 後 の湖における外来魚モニタリングの新規手法として、医療分野やDNA 抽出に用いた。カートリッジフィルターからの DNA 抽出

衛生分野で多用されている DNA チップ技術を環境 DNA 分には、QIAGEN 社製の DNA 抽出キット（DNeasy Blood &析手法に活用した、環境 DNA チップを用いることが有効であTissue Kit）を用いた。DNA 抽出のプロトコルは、（一社）環境ると考え、チップの開発を行った。

DNA 学 会発行の調査・分析マニュアル（Minamoto et al.

DNA チップ分析は、DNA マイクロアレイ技術を用いた分析2020）に従って実施した。得られた各サンプルの抽出液は、そ手法である。今回開発した環境 DNA チップでは、シリコン基の後の分析まで-20℃で保存した。

板の DNA チップ上の、複数の種それぞれの遺伝子に特異的

次に本調査として、すべてのダム湖で 2020 年 8 月に 1 回な DNA プローブが固相化されたスポットに PCR 産物をロー採水調査を実施し、七ヶ宿 2 地点、三春 5 地点、宮ヶ瀬 4 地ディングし、ハイブリダイゼーション法（相補性の高い DNA 配点、天ヶ瀬 2 地点、布目 3 地点の採水地点を設けた。また、各列と二本鎖を形成する性質を利用して特定の DNA を検出する手法）によって、対象とする DNA の有無を専用測定装置

図－1 環境 DNA チップを用いた分析概要

図－2 調査対象ダムと過去の調査で採捕された種2

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採水地点はすべてダム本湖内とし、ダム湖の水面全域に偏りの影響が考えられたため、阻害に耐性のある酵素（qPCR と同なく配置した。各地点で環境水を 2L（1L×2 回）採水し、DNA様のマスターミックス）を用いた環境 DNA チップによる検討をの分解を抑制するために 10%塩化ベンザルコニウム水溶液を実 施 した。 その際 の PCR 試 薬 条 件 は、以 下 の通 りとした ;1mL/L 添加した。ろ過および DNA 抽出については、予備調

TaqMan Environmental Master Mix (2 × ) 10 μ L 、査と同様の手法で行った。

Primer Mix 5.7μL（Msa primer mix (F and R) 0.7μL、Mdo primer mix (F and R) 2μL、Lma primer mix (F and（2） 環境 DNA 分析R) 3μL）、ミリ Q 水 1.3μL、テンプレート DNA 3μL を PCR

野外適用における種特異的な検出方法の有効性を確認す用ミックスとした。PCR の温度条件、およびハイブリダイゼーることを目的として、予備調査で得られたサンプルについて、リション反応条件は、種特異的な検出方法の検証と同様とした。

アルタイム定量 PCR（qPCR）および環境 DNA チップによる環

また、qPCR は環境 DNA の量的評価が可能であるため、

境 DNA 分析を実施した。qPCR では、外来魚 3 種の種特異

環境 DNA 濃度と環境 DNA チップの在判定の関係を解析し、的な検出および環境 DNA の相対定量を行った。種特異的な環境 DNA 濃度がどの程度あれば環境 DNA チップで検出で検出に用いるプライマーおよび TaqMan プローブ（遺伝子のきるのかについても検討した。比較の方法として、qPCR で検定量を行うために蛍光標識を用いた一本鎖 DNA 断片）につ出された 3 種の環境 DNA 濃度について、環境 DNA チップ

いては、環境 DNA チップで用いた検出系と同様のものを使用で検出された地点とされなかった地点で分類し、ウィルコクソンした（Takahara et al. 2012, Jo et al. 2019）。qPCR におけの順位和検定を用いて両地点間の差異を検討した。

る試薬条件は、以下の通りとした; TaqMan Environmental
Master Mix (2×) 10 μL、種特異プライマーおよびプローブ（3） 結果をそれぞれ 900nM と 125nM 含む Primer Probe Mix (201) 分析プロトコルの検討結果

×) 1μL、AmpErase Uracil N-Glycosylase (UNG) 0.1μ

環境 DNA チップによる現地サンプルの分析に先立ち、対L、ミリ Q 水 6.9μL、テンプレート DNA2μL を PCR 用ミック

象種（外来魚 3 種）の組織 DNA を用いて種特異的な検出方スとした。qPCR の温度条件は、50℃ 2 分、95℃10 分の熱変法の検討を行った。組織 DNA を用いた種特異性の検討で性の後、95℃ 15 秒、60℃ 1 分の増幅・伸長サイクルを 55 サは、種特異的な検出系および MiFish プライマーの両方の環イクルに設定した。また、それぞれのサンプルについて、3 回繰

境 DNA チップにおいて、3 種すべての種特異性を確認するこり返しの PCR 反復を設けた。各 PCR には、実験中のサンプとができ、組織 DNA では対象種のみを増幅・検出していることル間のクロスコンタミネーションを検証するために、DNA の代が示された（図－3）。

わりにミリ Q 水をテンプレートに加えた PCR ブランクを作成した。
各 qPCR では、濃度既知のスタンダード DNA（3.0×101–104 コピー/テンプレート DNA）の希釈系列を用いて検量線を作成し、環境 DNA 濃度の相対定量を行った。qPCR における各サンプルの反復数は 3 繰り返しに設定し、それらの定量値の平均値を算出することで、環境 DNA 濃度（copy /template）を推定した。また、検出/非検出（在不在）の閾値について、本図－3 環境 DNA チップを用いた種特異性の確認結果研究では 1 copy/template と設定した。
環境 DNA チップでは、種特異の検出系と MiFish プライマーの検出系（魚類の環境 DNA メタバーコーディングのため種特異的検出および MiFish プライマーの環境 DNA チッのプライマーセット）の両方を検討した。環境 DNA チップの試プを用いて、予備調査で得られた DNA サンプルから外来魚薬および実験条件は、種特異的な検出方法 の検証と同様でDNA の検出を試みた。その結果、種特異的検出の環境 DNAある。環境 DNA チップについては定量的な評価ができないたチップではほとんど対象種が検出されなかった一方で、め、蛍光の検出の有無による在不在の判定にとどめた。また、

MiFish プライマーの環境 DNA チップでは多数の地点で検環境 DNA チップでは各サンプルの反復回数を 2 回とし、どち出された（表－1）。

らか片方でも蛍光シグナルが閾値（S/N 比 2）以上であれば在なお、表中では検出地点を＋とし、非検出地点を–として示判定とした。本調査で得られたサンプルについても、予備調査している。さらに、qPCR でも同様のサンプルを用いて種特異と同様の手法や条件で qPCR および環境 DNA チップ分析を的な検出を実施したところ、多くの地点で検出されたものの、そ行った。また、本調査ではサンプルに含まれる PCR 阻害物質の DNA 濃度は非常に低くなっていた。qPCR とそれぞれの環3

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境 DNA チップの結果を比較したところ、MiFish プライマーでしか検出されず、濃度も非常に低くなっていた。また、qPCR には地点数との大幅な乖離が見られたため、本調査に使用するおいて、すべてのサンプルで PCR 阻害は確認されなかった。

環境 DNA チップは種特異的検出系が妥当であると考えた。

環境 DNA チップにおいても、各ダム湖で外来魚 3 種の環2) 現地サンプルによる環境 DNA チップの検出精度

境 DNA を検出することができた（表－2）。また、この検出結果

本調査で得られた DNA サンプルを用いた環境 DNA 分析

は qPCR と同様の傾向を示したが、qPCR に比べて検出地点の結果を表－2 に示す。qPCR の結果では、七ヶ宿ダムを除く数は低くなっていた（オオクチバス 36.3 %、コクチバス 50.0 %、すべてのダム湖からオオクチバスの環境 DNA が検出されておブルーギル 41.6%）。コクチバスの検出は 1 地点のみの確認でり、すべてのダムからブルーギルの環境 DNA が検出されていあったが、qPCR の地点とは一致していた。

た。また、どちらの種も布目ダムで高い環境 DNA 濃度が検出

一方で、PCR 酵素を阻害耐性の強いものに変更した環境されていた。オオクチバスおよびブルーギルの環境 DNA 濃度

DNA チップ分析（環境 DNA チップ＋）では、オオクチバスとは天ヶ瀬ダムおよび七ヶ宿では非常に低く、qPCR でも定量限ブルーギルにおいて大幅な検出感度の改善がみられた（オオ界を下回っていた。また、三春ダムおよび宮ヶ瀬ダムでは検出

クチバス 63%、ブルーギル 83%）（表－2 の赤矢印）。コクチバ

された地点間で環境 DNA 濃度の違いが大きく開いていること

スでは同一ダム湖内において qPCR で検出されていない地点が確認された。一方で、コクチバスは宮ヶ瀬ダムと七ヶ宿ダムでからコクチバスの DNA が検出されたが、検出地点の一致数は0 地点となった。

表－1 予備調査における環境 DNA チップの分析結果

表－2 本調査における環境 DNA チップの分析結果

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また、qPCR で推定された環境 DNA 濃度の環境 DNA チッがより顕著になると考えられる。(2) では、種特異的に作成したプ分析における検出/非検出間の比較を図－4 に示す。オレンプローブの特異性を担保できていなかったということである。こジ色と青色は、それぞれ環境 DNA チップで検出された地点のれは、MiFish で増幅できる DNA 配列の中でプローブを作成

環境 DNA 濃度と、環境 DNA チップで非検出であった地点のしたが種特異性の担保ができておらず、対象種以外の DNA環境 DNA 濃度を示している。環境 DNA チップにおける検出や微生物等の DNA を環境 DNA チップで誤検出してしまったと非検出のデータ間には、統計的に有意な差が見られた（ウィ（偽陽性を示した）と考えられた。

ルコクソン順位和検定、p < 0.05）。コクチバスは検出された地

よって、MiFish プライマーを環境 DNA チップに用いるの点数が少なく、環境 DNA チップと qPCR 間の一致もなかったは、現状では不適当であると結論づけ、野外への適用には種ため、除外した。その結果、環境 DNA チップで対象種の検出特異的検出系の環境 DNA チップが妥当であることを確認しされた地点では、環境 DNA チップで検出されなかった地点よた。

りも qPCR の環境 DNA 濃度が有意に高くなっていることが示

この種特異的検出系の環境 DNA チップを国内のダム湖 5唆された（図－4; p < 0.05）。

箇所の計 16 地点で野外適用した結果、それぞれのダム湖において外来魚 3 種の DNA を検出することができた。これにより、環境 DNA チップを用いてオオクチバス等の外来魚の生息モニタリングが可能であることが示された。
モニタリングにおける検出感度は、従来の環境 DNA 分析手法で外来魚検出に用いられている qPCR と比較すると、対象魚 3 種において、qPCR と環境 DNA チップの両手法で環境DNA が検出できた地点を共有していた。
一方で、当初は従来の医療用の DNA チップに用いられる試薬を用いていたこともあり、環境 DNA チップの外来魚検出地点数は qPCR の地点数に比べて少なくなっており、qPCR よりも検出感度が若干落ちていることが示唆された。これは、湖水に含まれる腐植酸やアオコ等の懸濁物が PCR を阻害したこ

図－4 qPCR で推定された環境 DNA 濃度の環境とで、ターゲットの DNA の増幅効率が落ちてしまったためであDNA チップ分析における検出/非検出間の比較ると考えられ、再検査で qPCR と同様の阻害物による影響を受けにくい試薬により検出感度の大幅な改善がみられた（表－6. 考察2、環境 DNA チップ+）。

環境 DNA 分析を用いた新規のモニタリング手法として、環ダム湖等の野外サンプルでは環境 DNA チップ分析を適用

境 DNA チップの開発を行い、環境 DNA チップを用いて外来する際には、PCR 阻害の影響を考慮して分析手法を工夫する魚の環境 DNA を検出できることが示された。

ことにより検出精度が向上することが確認できた。

種特異的検出系とユニバーサルプライマーである MiFishの 2 種類の検出系の環境 DNA チップへの適用を試みた結7. 実用に向けて

果、MiFish プライマーの環境 DNA チップでは組織 DNA で開発した環境 DNA チップは、qPCR による種特異的な検は利用できたものの環境 DNA では野外適用は難しいことが分出よりも多くの種を同時に検出でき、メタバーコーディングよりもかった。一方、qPCR で利用されている種特異的検出系の環簡易的に環境 DNA 分析を行えるツールとなると考えられる。

境 DNA チップは、組織 DNA およびダム湖の予備調査の両また、qPCR やメタバーコーディングでは分析者の専門性や方で利用可能であった。

技量によって得られる結果（定量値のばらつきや検出種数）やこれには、(1) MiFish プライマーが対象種以外の魚類（たと解釈（検出の閾値判定や種分類の精度）が異なることから、最えばコイ科等）や他の分類群（哺乳類や微生物）を増幅してい終 的な手法 の統一 化は困 難な課題 である。一方 で、 環境ること、(2) 蛍光検出のためのプローブの種特異性が低かった

DNA チップはすべて同一の製造ラインで作製される一定のクこ と が 考 え ら れ た 。 (1) で は 、 MiFish プ ラ イ マ ー は 魚 類 のオリティをもった DNA チップであり、チップ上で指定した対象DNA に加えて微生物等の非対象分類群の DNA を増幅する

種のみを検出すること、種の在不在のみを判定する手法であることが知られており、非対象種である魚類や微生物の DNA がことから、同じ環境 DNA チップを用いる限り、分析結果や解釈増幅されることで、対象種となる外来魚の環境 DNA の増幅効がほぼ一定になるという利点がある。また、一定のクオリティの率が落ち、検出力の低下が起きたと考えられた。特に野外サン

環境 DNA チップで継続的な調査が可能であることから、ダム

プルでは環境中の様々な生物が含まれているため、この影響
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湖の管理における外来魚の定期モニタリングを実施するうえで

more than 230 subtropical marine species, Royal Society

非常に有用なツールとなりえる。

Open ScienceVolume 2, Issue 7, 2015

一方で、環境 DNA チップでは、種特異的検出で実施可能

3)

Takahara T., Minamoto T., & Doi H.：Using Environmental

な定量的な評価が実施できない。また、環境 DNA チップでDNA to Estimate the Distribution of an Invasive Fish Species

は、多様な種を一度に解析できるメタバーコーディングとは異in Ponds, PLoS ONE 8(2), 2013

なり、対象種以外の分布は把握できない。そのため、ダム湖におけるモニタリングを行う際には、対象種（例えば外来魚）のみの分布をスクリーニングしたいのか、定量的な情報が欲しいのか、魚類相全体の情報が欲しいのか、といったように必要とする情報を得るための手法の使い分けが重要になってくるであろう。
なお、環境 DNA チップは最大 32 種を分析対象とすることが可能であるため、今後は重要種や魚類以外の分類群も含めて、モニタリングの目的に応じた対象種を検討し、汎用性の高い技術としていくことが重要であると考える。
表－3 環境 DNA チップ活用の利点と課題

利点

課題
対応策

・qPCR による種特異的な分析と同程度の検出精度が得られる
・一回の計測で複数種の DNA を一度に検出できるため効率的にモニタリングが可能
・メタバーコーディングでは成果のばらつきが見られるが、同じ環境 DNA チップを用いる限り、分析結果や解釈がほぼ一定になる
・1 枚のチップで最大 32 種を分析対象とできる
ため多様な用途に対応可能
・定量的な評価ができない・環境 DNA チップに乗せた対象種以外の分布を把握できない・モニタリングにおいて必要とする情報を得るための手法の使い分けが重要

謝辞： 本 研 究 は、水 源 地 環 境 センター（ Water ResourcesEnvironment Center） 応用生態研究助成を受けて山口大学との共同研究により実施されたものである。研究に用いた環境 DNA チップの制作にあたっては東洋鋼鈑株式会社のご協力をいただき、現地調査の実施にあたっては仙台支店、大阪支店の協力を得た。記して感謝を示す。
参考文献
1)

Jo T., Fukuoka A., Uchida K., Ushimaru A., & Minamoto T.：
Multiplex real-time PCR enables the simultaneous detectionof environmental DNA from freshwater fishes: a case studyof three exotic and three threatened native fishes in Japan,
Biol Invasions 22, 455–471, 20202)

Miya, M., Sato, Y., Fukunaga, T., Sado, T., Poulsen, J. Y.,
Sato, K., Minamoto, T., Yamamoto, S., Yamanaka, H., Araki,
H.,& Iwasaki, W.：MiFish, a set of universal PCR primers formetabarcoding environmental DNA from fishes: detection of6