NGSハンズオンセミナー

ChIP-seqの基礎実習 (初級)
理化学研究所 情報基盤センター
森岡勝樹
msmorioka-tky@umin.ac.jp

はじめに
本実習の達成目標は、NGS解析の初心者がNGSデータの一つであるChIP-seqデータに触れ、ChIP-seq解析の流れを概要として掴み、自ら解析するときの足がかりとなることを目指します。
本実習で利用する方法は、一般的に利用される方法ではありますが、Biolinux8という限られた環境で行うという性質上、あくまでも“練習”であり、自分で実際に臨むときは最新のバージョンやさらに良いソフトウェアを利用することをオススメします。

ppt講義中にデータをDLしてもらいます
指示するまでDLしないでください
DLサイト1: http://tinyurl.com/npewxs7
DLサイト2: http://tinyurl.com/pomlke3(このパワーポイントも入っています)

実習資料 (コピペ用に開いておく)
https://github.com/suimye/NGS_handson2015

ChIP-Seqとは
ChIP: chromatin Immuno precipitaton
抗原抗体反応を利用して、抗原タンパク質が結合しているクロマチン構造を免疫沈降させ、クロマチン内に含まれるDNAを濃縮する手法

架橋結合による固定DNA切断

免疫沈降

目的のゲノム領域に特異的なプライマーを設計してgenomic PCR

脱架橋DNAを精製

ChIP-PCR

濃縮enrichment
http://g86.dbcls.jp/~togoriv/
Togo picture gallery by DBCLS is licensed under a Creative
Commons Attribution 2.1 Japan license (c)並列シーケン
シングなど

ChIP-Seq

ChIP-Seqとは注意: あくまでも模式図

シークエンシング前のDNA断片

シークエンシングされたDNA領域
genomeへmapping

参照元となる
Genomic DNA
抗原タンパク質の結合部位

Genomic DNA

ChIP-seqで得られるデータの例
TP53の遺伝子領域400bpぐらいのシャープな山から1000bpを越えるブロードな山まで、抗体の特性によって様々な「山」が得られる良い例(figure)の一つとしてMediator and cohesin connect gene expression and chromatinarchitecture. Michael H. Kagey et al. (nature 2010)

ChIP-seqの目的
TP53の遺伝子領域• DNA結合性タンパク質のゲノム上の局在をみる• 転写因子• ヒストン

Enhancers
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ChIP-Seqデータ解析の流れ
Peak Call
QC

アライメント(mapping)• FastQC• FastX-toolkit Bowtie• HTseq
BWA• prinseq• Cutadapt• Picard tools• MACS• FindPeak(Homer)• F-Seq• SWA(ERANGE)• 遺伝子注釈(Nearest
Neighbor geneannotation)• TFBS search• Motif discovery
Analysis• SICER• BroadPeak

Genome,Transcriptome,
Proteome, etc.

MajorPeakCallCallers
Peak
Enrichされた領域を山の頂点としてみたい
Broad peak (eg. H3K27Ac, K3K9… )SICER, BroadPeak
Narrow and sharp peak with low noise (TFs)

MACS, F-Seq, SWAs
S/N is non-good or low peak (FAIRE-Seq, DNase-Seq)

F-Seq, ZIMBAMajor1.Peak
Callers
SICER
SICER

ヒストン修飾をはじめとするBroad peak用のpeak caller

Broad peak (eg. H3K27Ac, K3K9… )Shiliyang Xu et al. Methods Mol Biol. 2014 ; 1150: 97–111. doi:10.1007/978-1-4939-0512-6_5.

MajorCallers
2.PeakMACS
MACS Sequencingによって得られるタグの分布形状を加味したモデルに基づいて、Tag-shiftを行いPeak Callする。

二重螺旋がランダムに読まれる

GenomicDNA

MajorPeakshift
Callers
2. TagMACS

FRF, Rのそれぞれの頂点からcenterになる位置
をPeakとする

d: distance between
the summits of red
and blue curves

Major3.Peak
Callers
F-Seq
Binのstartを0.5で分けた場合
UnimodalStartを1.75にした場合Broad peak (eg. H3K27Ac, K3K9… )SICER, BroadPeak

Narrow and sharp peak with low noise (TFs)
MACS, F-Seq, SWAs 足し合わせる

Peakを比較してみる

S/N is non-good or low peak (FAIRE-Seq,Readが得られた位置にDNaseガウス分布を仮定
Seq)
F-Seq, ZIMBAPeak Call法の種類は沢山ありますが、2009年から現在までそれほど進化していません。

Shirley Pepke et al. Nature REVIEW 2009

MajorCall後の解析
Peak Callers
Peak
HOMERがオススメ
ChIP-seq: Pipelineが一通り揃ったもの• 遺伝子注釈(Nearest
Neighbor geneannotation)• TFBS search• Motif discovery
Analysis
Genome,Transcriptome,
Proteome, etc.

http://homer.salk.edu/homer/chipseq/

HOMER
プログラミングなしで解析できるおおよそ全てのChIP-seq解析内容がパイプライン化されている。カスタマイズもRとperlの知識で簡単。

Peak Call
QC

Visualize

Data integration
Motif analysis
Heatmap

NGS plot
Rを用いて、データの可視化が行える。
特に、gene bodyでの分布や、データ間の分布の違いを表示するのに便利統合解析環境galaxyhttps://usegalaxy.org
http://galaxy.dbcls.jp

ChIP-seqデータをとにかく可視化
http://www.devbio.med.kyushu-u.ac.jp/sra_tailor/

Sratailer

http://togotv.dbcls.jp/20150106.html

本日のデータ• ヒトリンパ芽球様細胞の細胞株• CTCF抗体

Ram O, et al. Combinatorial patterning of chromatin
regulators uncovered by genome-wide location analysis in
human cells. Cell. 2011 Dec 23;147(7):1628-39.

本日のデータ
ENCODEプロジェクトのNGSデータは、実験プロトコルが公開されているので、ChIP-seqをはじめNGS用の実験をはじめる
場合の参考にもなる
https://genome.ucsc.edu/ENCODE/protocols/

今回のデータhttps://genome.ucsc.edu/ENC
ODE/protocols/cell/human/GM
12878_protocol.pdf