第1 9 回日本再生医療 学 会 総 会
筆頭発表者のCO I 開 示

ラット心筋梗塞モデルを用いた細胞シート積層化の有効性検討

筆頭発表者指名：榊原 基 嗣

演 題 発 表 に 関 連し，
開示 す べ き C O I 関係にある○ 榊 原 基 嗣 1) , 水町 凉治 1) , 森田 枝美 1) , 吉原 佐江子 1) , 田代 貴士 1) , 片山 誠一 1) , 廣中 直行 1) , 西 勝英 1),2)

企 業 等 は あ り ません．

1) 株式会社ＬＳＩメディエンス 薬理研究部，2) 熊本大学医学部 名誉教授

● 線維化画像（代表例）目

心機能評価（エコー）

的左室駆出率（LVEF）(%)

心不全の治療として，これまでは心臓移植や外科的心筋切除手術等が行われてきた．
心臓への直接的な外科的手術は侵襲やリスクが大きい．再生医療分野においては，心筋梗塞に対する「細胞治療」の研究が多く行われている．中でも，近年，心筋梗塞に対する細胞シートによる治療法が発表され，注目を集めている．また，積層化させた細胞シートの方が単層（1 層）のシートよりも心機能改善効果が高いと報告されている．我々はこれまでに，心筋梗塞モデルラットにおいて梗塞部位への細胞の直接注入移植や単層細胞シート移植で心機能が改善することを報告している．
今回，心筋梗塞モデルラットを用いて細胞シートの積層化による有効性の検討を行った．

7570†††

†††††

6055

†††
**

**

ラット，Crl:CD(SD)，♂，9 週齢（入荷時；8 週齢）
虚血－再灌流モデル
SD ラット胎児（妊娠 18 日目）由来初代心筋含有細胞（以下，初代細胞）
初代細胞を予備培養後，足場素材（ゼラチン：Genocel, 株式会社ニッケ・メディ
カル，コラーゲン：セルキャンパス，多木化学株式会社）上で 2×106 cells/sheetの条件で 24 時間培養（37℃，5% CO2）．
3 層積層化：
足場素材上に播種後 24 時間で 3 枚のシートを重ね合わせて作製．
重ね合わせ翌日に移植．
移植：
初代細胞を培養している足場素材ごと，左心室梗塞部位に貼付け移植．
移植タイミング： 虚血－再灌流モデル作製後1 週間
評価方法：
エコーによる評価．移植（投与）後より2 週間おきに 10 週間計測．
移植後10 週のエコー計測後に心臓を採取，線維化評価を実施．
群構成：
群
例数 足場素材 シートの枚数
細胞数
Control
4コラーゲン
1枚
2×106 cells
ゼラチン 1 層
4
ゼラチン
1枚
2×106 cells
コラーゲン 1 層
4
コラーゲン
1枚
2×106 cells
コラーゲン 3 層
4
コラーゲン
3枚
6×106 cells
動物：
モデル：
細胞：
細胞シート：

動物実験スケジュール
モデル作製
入荷
移植

***

**

5025

†††††

**

**

**

**

*

204540153530

Before2WTransplant

4W

6W

8W

10W

ゼラチン 1 層

10Before2W
Transplant

4W

コラーゲン 1 層

6W

8W

コラーゲン 3 層

10W

n=4Mean±SEM

エコー0W

エコー

2W4W

エコー

6W

エコー エコー・採材

8W

左室駆出率（LVEF），左室収縮率（LVFS）
・ ゼラチン 1 層群は Control 群と比べて移植後 10 週まで有意に高値で推移した．
・ コラーゲン 1 層群およびコラーゲン 3 層群は Control 群と比べて移植後 10 週まで有意に高値で推移した．
コラーゲン 3 層群はコラーゲン 1 層群と比べて有意差はないものの移植後 10 週まで高値で推移した．
これらのことから，細胞シートは，心機能を改善した．
また，コラーゲン 3 層の方が 1 層よりも心機能を改善させることが示唆された．
(µL)
1600

拡張末期左室容積（LVEDV）

800600†

Before2W
Transplant

培地交換

Day2Day4Day7Day02移植

0細胞シート移植

足場素材の上に播種

24 時間培養

3 層に積層化し24 時間培養

10W

ゼラチン 1 層

拡張末期左室前壁厚（IVSTd）††††Before
2W
Transplant

コラーゲン 1 層

4W

6W

†††8W

*10W
n=4
Mean±SEM

コラーゲン 3 層††††

*Before2W
Transplant

4W(mm)
2

拡張末期左室後壁厚（LVPWTd）

††6W

*8W

Control*

10W

ゼラチン 1 層

10Before
2W
Transplant

コラーゲン 1 層

4W

6W

コラーゲン 3 層

8W

10W

n=4
Mean±SEM*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001, Stidentʼs t-test (vs Control)†: p<0.05, ††: p<0.01, †††: p<0.001, Dunnett test (vs Control)

左室前壁厚（IVSTd）
・ コラーゲン 1 層および 3 層群は Control 群と比べて高値を推移した．
・ ゼラチン 1 層群は Control 群と比べて移植後 10 週まで高値で推移し，移植後 2, 8 および 10 週では有意に高値であった．
・ コラーゲン 1 層群は Control 群と比べて移植後 10 週まで高値を推移し，移植後 2, 4, 6 および 8 週で有意に高値であった．コラーゲン 3 層群は Control 群と比べて移植後 10 週まで高値を推移し，移植後 2, 4, 6および 8 週で有意に高値であった．
左室後壁厚（LVPWTd）
・ 全ての群が同程度を推移した．
これらのことから，細胞シートは，梗塞の起こった前壁の菲薄化を抑制する可能性が考えられた．

足場素材

初代細胞培養1Day9
1層シート移植
3層シートへ積層化

心筋梗塞モデルControl8W**

拡張末期左室容積（LVEDV）
・ 移植後 8 週および 10 週で全ての群が同程度であった．
収縮末期左室容積（LVESV）
・ ゼラチン 1 層群は Control 群と比べて移植後 8 週まで有意に低値で推移した．
・ コラーゲン 1 層およびコラーゲン 3 層群は Control 群と比べて移植後 8 週まで有意に低値で推移した．
これらのことから，細胞シートは拡張機能ではなく，収縮機能に改善効果があることが示唆された．
(mm)

モデル作製～移植のイメージ図
手術前

6W

††

*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001, Stidentʼs t-test (vs Control)†: p<0.05, ††: p<0.01, †††: p<0.001, Dunnett test (vs Control)

3層シート
Day84W0*††††

200600††††400800

†

培地交換

†††

*100010W

シート化
播種/継代

1000

1200400

収縮末期左室容積（LVESV）

(µL)

1400

細胞シート作製スケジュール

結†††††††

†††

*

††

初代細胞採取††††††††

30†††*: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001, Stidentʼs t-test (vs Control)†: p<0.05, ††: p<0.01, †††: p<0.001, Dunnett test (vs Control)

法－2Ｗ －1Ｗ††††††

Control

方35

†††

†††65

†††

†††

左室収縮率（LVFS）

(%)

線維化評価

果細胞シートＨＥ染色画像

細胞シート
足場素材

ま と め
・ 3 層に積層化させた細胞シートを作製することができた．

・ ゼラチン足場素材を用いた細胞シート1 層は，前回発表と同様に Control 群と比べて心機能を改善しており，再現性を確認できた．同時に，コラーゲン
1 層群とコラーゲン 3 層群においても，Control 群と比べて心機能が改善したことから，細胞シートは心筋梗塞モデルによる心機能の悪化を抑制することが示唆された．
また，細胞シート移植による心機能の改善効果は，収縮末期左室容積（LVESV）の結果を考慮すると，収縮機能を改善することで現れていることが考えられた．

・コラーゲン 3 層群はコラーゲン 1 層群と比べて心機能の代表的なパラメータである LVEF および LVFS が高値を推移したことから，積層化させた細胞シートの方が心筋梗塞による心機能の悪化を抑制する可能性が示唆された．
・ 線維化評価では，コラーゲン素材が心臓断面積に占める線維化領域の割合を抑制する可能性が考えられたが，足場素材の違いによる線維化への影響や再現性についてさらなる検討が必要であると考えられた．
ラット心筋梗塞モデルへの細胞シート移植は心筋梗塞による心機能低下を改善する．さらに，細胞シートは 3 層の方が 1 層よりも心機能低下を改善することが示唆された．

線維化領域をシリウスレッド陽性（赤色）で示す．
なお，HE 染色標本において，線維化のほか，梗塞部位を主体とする炎症性細胞浸潤を伴う例も認められたが，その程度に群間差は認められなかった．また，梗塞部位外の心筋に顕著な変化はなかった．

● 線維化領域定量評価
1.4

線維化領域（mm2）20

心臓断面積 (mm2)1.28151.060.8100.640.4520.2010

線維化領域／心臓断面積×100 (%)

Control ゼラチン コラーゲン コラーゲン
1層
1層3層0

Control ゼラチン コラーゲン コラーゲン
1層1層3層0

Control

ゼラチン コラーゲン コラーゲン
1層
1層
3層

線維化領域では，・ 有意差はないものの，コラーゲン 1 層および 3 層は Control 群と比べて低値を示した．
心臓断面積では，・ 全ての群が同程度であった．
心臓断面積に占める線維化領域の割合では，・ 有意差はないものの，ゼラチン 1 層群は Control 群と比べて高値を示し，コラーゲン 1 層および3 層は Control 群と比べて低値を示した．さらに，コラーゲン 3 層群は 1 層群よりも低値を示した．
これらのことから，コラーゲン素材は心筋梗塞による線維化を抑制する可能性が考えられた．