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60 巻 5 号 2014［新しい検査法］169

新しい検査法迅速ヒトメタニューモウイルス診断キット－保険適用されたイムノクロマト法による hMPV 抗原定性－
A rapid human metapneumovirus（hMPV）antigen detection kit−Immunochromatography assay for the detection of hMPV covered by health insurance−
きく菊た田ひで英あき明

Hideaki KIKUTA

どの免疫不全状態のヒトでは、重症の下気道感染症はじめにが多くなる。臨床症状の発現頻度は重症度により異なっているが、臨床で問題となる喘鳴を伴う気管支ヒトメタニューモウイルス（human metapneumo-炎、細気管支炎、肺炎では発熱、咳嗽、鼻汁はいず

virus : hMPV）
は、2001 年に RS ウイルス（respiratory

れも 90％以上の患児でみられ、その他、呼吸困難、

syncytial virus : RSV）と同様の臨床症状を持つ小児嘔吐、下痢、頭痛がみられる。稀ではあるが脳炎・の鼻咽頭から猿の継代 3 代目腎臓細胞を使用し発脳症の報告がある。hMPV の流行時期はわが国では見されたウイルスである。200 年位前から世界中に3 ～ 6 月である。生後 6 カ月頃から感染が始まり、2存在してきたウイルスであったが、ウイルスの分歳までに 50％、5 歳までに 75％、遅くとも 10 歳ま離、培養が難しかったために、2001 年まで発見されでに 1 度は感染する。ただし、乳幼児期においても1）なかったウイルスである 。そのため、hMPV の証明再感染を繰り返している 。hMPV の感染力は非常には Reverse transcription-polymerase chain reaction

強く、高齢者施設での高齢者の二次発病率は 20 ～（RT-PCR）法でウイルス遺伝子を検出することが最30％と推定され、施設内の集団感染（保育園、幼稚も鋭敏な最良の方法であった。2014 年からイムノ園、高齢者施設）、院内感染、両親を含めた家族内クロマト法による hMPV 抗原定性が保険適用となっ感染を引き起こす。鑑別すべき感染症は RSV、ラた。今回、hMPV と迅速 hMPV 診断キットについイノウイルス、ヒト・ボカウイルス、インフルエンて概説する。

ザウイルス、パラインフルエンザウイルスなど喘鳴2）を伴いやすい呼吸器症状を引き起こすウイルス感染

Ⅰ. hMPV について症である。

Ⅱ. 従来の hMPV 感染の証明

感染様式は飛沫感染のほか、喀痰や鼻汁中にも存在し手指や器物を介して接触感染によっても伝播する。呼吸器感染症におけるウイルスの検出率は 65

1. ウイルス分離・検出～ 85％であり、低年齢ほど検出率が高い。呼吸器感染症で検出されるウイルスの検出率は年齢、サン

一般的にウイルス分離がウイルス証明のゴールド

プリング時期、呼吸器感染症の種類により異なるが、スタンダードである。一般的に hMPV の分離は LLC-

小児の呼吸器感染症の 5 ～ 10％、成人の 2 ～ 4％はMK2 細胞を使用しトリプシン存在下で数週間かけhMPV が原因とされる。hMPV は上気道炎（鼻炎、て行うが、RT-PCR 法で陽性であった検体の約 1/3咽頭炎、副鼻腔炎）、下気道炎（喘鳴を伴う気管支炎、しか継代可能なウイルス分離には成功できず非常に細気管支炎、肺炎）を引き起こす。大部分は上気道

難しい 。
2）炎、いわゆる「かぜ」と推測されるが、乳幼児、高齢者などの免疫力の弱いヒト、白血病や移植患者な特別医療法人 とこはる 東栄病院 副院長、小児科 医長
北海道大学 客員教授
〠007 - 0841 北海道札幌市東区北41条東16丁目3 - 14

Touei Hospital, Pediatric Clinic
Hokkaido University Visiting Professor(N-41, E-16, 3-14, Higashi-ku, Sapporo 007- 0841, Japan)

（1）

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い蛋白であることが望ましい。インフルエンザでは

2. RT-PCR 法

N 蛋白（Nucleoprotein : 核蛋白）に対する 2 種類のhMPV を分離することは難しいため、hMPV は単クローン抗体、RSV では F 蛋白（Fusion protein :RT-PCR 法でウイルス遺伝子を検出することが最も融合蛋白）に対する 2 種類の単クローン抗体を使用鋭敏な最良の方法である。PCR 産物の塩基配列をしていることが多い。hMPV では、N 蛋白または F決定し系統樹解析を行い、グループ、サブグループ蛋白に対する 2 種類の単クローン抗体を使用するこを決定する。Real-time RT-PCR 法で測定したウイとになる。hMPV 抗原定性はウイルス RNA を検出

ルス量は発熱後 1 ～ 4 日に高く、多くはピーク時にしているのではなく、検体中に存在する遊離してい10 copies/ml レベルの高値を示す 。hMPV は RT-るウイルスの蛋白と hMPV 感染細胞の細胞質内にPCR 法で発症後 1 ～ 2 週間検出される 。他のウイ多く作られる蛋白を合わせて検出しているものであ

ルスとの重感染もあるため、ウイルス量が多い時はるが、一般的にウイルス RNA 量の多い検体ほどhMPV 感染症と考えてよいが、少ない時は他のウイhMPV 抗原定性は陽性になる。hMPV 抗原定性のルスとの重感染も考える必要がある。

イムノクロマト法では、コンジュゲートパッドに金83）1）

属コロイドで標識された 1 個の単クローン抗体（金3. 感染細胞の蛍光抗体法での抗原検査

コロイド標識 - 抗 hMPV 抗体）が含まれている。も単クローン抗体を使用し、蛍光抗体法で鼻咽頭ス

う 1 個の単クローン抗体はテストライン（判定ライ

ワブの hMPV 感染細胞の hMPV 抗原を検出する方ン）にキャプチャー抗体として塗布されている。コ法であるが、技術が必要であり感度は RT-PCR 法よ

ントロールラインには、金コロイド標識 - 抗 hMPVり劣る 。

抗体を捕捉する抗体（コントロール用抗体：使用す4）る単クローン抗体に対する抗体）が塗布されている。

4. 血清学的検査（抗体検査）

サンプルパッドに抗原を含む陽性検体を滴下する

hMPV の血清学的診断は感染細胞を使用した蛍光と、hMPV 抗原はコンジュゲートパッド内の金コロ抗体法（FA 法）、リコンビナント蛋白を使用した

イド標識 - 抗 hMPV 抗体と免疫複合体を形成しながFA 法と酵素抗体法、ウイルスの中和能を測定する

らセルロース膜状を移動しテストラインに塗布され

中 和 抗 体 法 な ど が 報 告 さ れ て い る。 初 感 染 後、ている抗 hMPV 抗体がエピトープの異なる hMPVhMPV 抗体は持続する。血清中の hMPV に対する抗原と結合捕捉し集積することで可視化される。次主要な抗体は抗 F 蛋白抗体であるが、F 蛋白に対すいで、コントロールラインで、残った金コロイド標る抗体はグループ特異性がない。G 蛋白に対する抗識 - 抗 hMPV 抗体を捕捉し、可視化される。抗原を体はサブグループに特異的な抗体であるが、中和活含まない陰性検体では、コントロールラインのみで性はほとんどなく感染数週後から一過性に上昇する

可視化される （図）。

のみである7）。初感染、再感染の鑑別には血清学

イムノクロマト法による抗原定性で重要視される

5, 6）的診断が必要である。のは、キットの感度と特異度である。感度とは陽性と判定されるべき検体を正しく陽性と判定する確率Ⅲ. イムノクロマト法の原理

で、特異度とは陰性と判定されるべき検体を正しく陰性と判定する確率である（表）。インフルエンザ

測定の原理は、セルロース膜上を検体が試薬を溶の迅速診断キットにおいては RT-PCR と比べ感度は解しながら毛細管現象により流れる間に抗原抗体が少なくとも 70％～ 80％以上、特異度は少なくとも起こる免疫測定法である。一般的に、ウイルス抗原90％以上が必要とされる 。感度、特異度が両方高をイムノクロマト法で検出するためには、あるウイいのが良いキットであるのは当然であるが、PCRルス蛋白（抗原）に対するエピトープの異なる 2 種と比較した場合には感度には限界があり、パーセン類の単クローン抗体を使用する。その蛋白の条件はトから見ると感度より特異度が重要であることが分ウイルス構成蛋白であり、感染細胞の細胞質内に大かる。インフルエンザウイルス、マイコプラズマ、量に作られる蛋白であり、ウイルス間で変異が少な

溶血性連鎖球菌のように治療薬がある疾患は見落と

8）

（2）

171①
コンジュゲートパッド②③④
コントロールライン

テストライン

金コロイド標識 - 抗hMPV抗体
コントロールライン用抗体
抗hMPV抗体抗原（hMPV）

図 イムノクロマト法の原理
表 hMPV 抗原定性反応の感度と特異度なる。また、感度は検体の選び方で大きく変わる。

RT-PCR陽性

RT-PCR陰性

同一のキットを使用しても、ウイルス量の多い検体

hMPV抗原定性陽性

A（真陽性）

C（偽陽性）が多いとキットの感度は上がり、ウイルス量の多い

hMPV抗原定性陰性

B（偽陰性）

D（真陰性）

検体が少ないと感度は下がる。また、血液の混入に

感度＝ A/A＋ B

特異度＝ D/C＋D

より反応が阻害され感度が低下する可能性があるので、血液が混入した検体は使用すべきではない。粘し（偽陰性）がないように感度がより優先されると度が高い検体は、イムノクロマトの展開に障害とな思われる。また、hMPV、RSV、ノロウイルス、ロタり感度が低下する。

ウイルスのように特別な治療法がなく軽症の患者が検体のウイルス量に影響を与える因子として、ま周囲に存在する疾患は、見落とし（偽陰性）より過ず鼻咽頭拭い液を採取する手技の巧拙がある。鼻腔剰な心配、過剰な対応を防ぐために過剰診断（偽陽の鼻水だけでなく、鼻咽頭粘膜を擦過して拭い液を性）がないように特異度がより優先されると思われ採取することが重要である。また、検体を採取するる。hMPV のウイルス分離は難しいため、イムノク際に使用するブラシは、フロックスワブ（植毛綿棒）

ロマト法による抗原定性はウイルス分離より陽性率を使用したほうが採取量の多いことが報告されていが高くなり、ウイルス分離を指標に感度を出すことる。ウイルス量の多い検体を採取するためには、はできない。迅速 hMPV 診断キットの感度、特異hMPV 感染症では発症から 1 ～ 4 日のウイルス量の度は、感度の高い RT-PCR 法を指標に出すことにな多い時期に迅速 hMPV 診断キットを使用すべきでる。そのため、迅速 hMPV 診断キットの感度、特異ある。検体の採取方法は、鼻腔吸引液＞鼻咽頭拭い度は、その指標となる RT-PCR 法自体の感度に大き液＞咽頭拭い液の順に感度が高いため、複数のウイく影響されることになる。RT-PCR 法の感度が低け

ルスを検査する場合は患者の負担を少なくするたればキットの感度が上昇することになり、RT-PCR

め、検体は感度が高い鼻腔吸引液を使用するのが良法の感度が高ければキットの感度が低下することにいと思われる。

（3）

172

難がある場合は、酸素投与、ロイコトリエン拮抗薬、Ⅳ. 保険収載された hMPV 抗原定性

気管支拡張剤、ステロイド（経口、静脈内投与、吸入）などの治療が行われることが多い。RSV による細イムノクロマト法による hMPV 抗原定性が 2014

気管支炎に対するステロイドの効果はほぼ否定され

年 1 月 1 日から、
「画像診断により肺炎が強く疑わているが、hMPV 感染症においてステロイドの効果れる hMPV 感染症の 6 歳未満の患者」に体外診断はまだ不明である。早期からブデソニド吸入を試み用医薬品として保険適用となり、日常診療においてて入院を少なくできたという印象を著者はもってい迅速、簡単に診断が可能となった。ただし、RSV、る。さらに重症患者にリバビリンや免疫グロブリン

インフルエンザウイルス、hMPV の 3 個の迅速抗原を使用し有効との報告もある。今後、hMPV 感染症定性を行った場合は、保険点数は 2 個だけ算定するに対する治療法の確立の検討にも迅速 hMPV 診断ことになっている。現在、2012 年 4 月より販売されキットは有用である。ていた「チェック hMPV」（製造元：SA Scientific,hMPV 感染症の大部分は不顕性感染、上気道炎とInc.； 製 造 販 売 元：大 蔵 製 薬 株 式 会 社； 販 売 元：推測される。保育園、幼稚園で重症の hMPV 感染

Meiji Seika ファルマ株式会社）に加え、2014 年 2 月症の子どもが発症した時には、すでに周囲に hMPVから新たに「プロラスト hMPV」（製造販売元：アド

感染している子どもが存在し、その感染した子ども

テック株式会社；販売元：株式会社 LSI メディエンの大部分は軽症の風邪の状態でウイルスを排泄してス；旧三菱化学メディエンス株式会社）が販売されいる。集団生活をしている保育園、幼稚園のようにた。さらに他社からも販売予定である。

完全に隔離できない環境では感染を防御することは

hMPV 抗原定性は RT-PCR 法より感度が低いた

RSV と同様に困難であると思われる。そのため、め、迅速 hMPV 診断キットで陰性に出ても hMPV

hMPV 感染症の子どもが発症したからといって、周感染を完全に否定するものではない。逆に、hMPV

囲の軽症の風邪の子どもに hMPV の検査を行うべきと他のウイルスとの重感染率は 5 ～ 20％あり、低ではなく、保険適用のある「画像診断により肺炎が年齢ほど重感染が多いため、迅速 hMPV 診断キッ強く疑われる患者」にのみ使用すべきである。ただトでバンドが濃い時は hMPV 感染症と考えてよい

し、ハイリスクの子どもが多い病院では隔離が可能が、バンドが非常に薄い時は他のウイルスとの重感であるので院内感染を防ぐために hMPV の検査は染も考える必要がある。

重要である。迅速 hMPV 診断キットにより hMPV感染症の診断が迅速にできることは、患児の重症化

Ⅴ. イムノクロマト法による
hMPV 抗原定性の臨床的意義の予測や治療方針の決定、適切な抗菌薬の使用、患児家族の安心、また医師の安心にもつながると期待される。以上のように、RSV やインフルエンザウウイルスが原因で起きる風邪の大部分は 3 日以内

イルスと同様に、日常臨床の現場で簡便かつ短時間に解熱することが多いが、hMPV の重症例は細菌ので診断を行うことが可能となった意義は大きいと思2 次感染がなくとも平均 5 日程度の発熱がみられ、われる。

発熱が長いだけで抗菌薬は必要ない。聴診で呼気時おわりにの笛様音や吸気時の断続性ラ音があり、呼吸困難を示し、RSV 抗原が陰性で血液検査で細菌感染を示す所見がないとしても、原因が明らかでなければ患

今回、hMPV 抗原定性が「画像診断により肺炎が児家族は不安になり、医師も心配になり、抗菌薬の強く疑われる hMPV 感染症の 6 歳未満の患者」に保処方へとつながる。このような時に、迅速 hMPV 診険適用されたことにより、日常臨床の現場で hMPV 感断キットにより hMPV 感染症の診断ができることは、染症の診断が可能となった。高齢者施設での集団感細菌による 2 次感染がないかぎり、不適切な抗菌薬染による死亡例も報告されており、早期に hMPV 抗の使用を避けることができる。治療は重症度に応じ原定性が高齢者へも保険適用されることを強く望む。

た対症療法が基本となるが、hMPV 感染症で呼吸困

（4）

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文

cence assay for detection of human metapneumovirusspecific antibodies by means of baculovirus-expressed fusion protein. Clin Diagn Lab Immunol. 2004 ; 12 : 202-205.
6 ）Endo R, Ebihara T, Ishiguro N, et al. Detection of four genetic subgroup-specific antibodies to human metapneumovirus attachment（G）protein in human serum. J Gen
Virol. 2008 ; 89 : 1970-1977.
7 ）Kikuta H, Ebihara T, Endo R, et al. Development of a rapid chromatographic immunoassay for detection of humanmetapneumovirus（hMPV）
using monoclonal antibodies
against nucleoprotein of hMPV. Hybridoma. 2007 ; 26 :17-21.
8 ）Executive summary. Proposed reclassification of the rapid influenza detection tests. CDRH Microbiology Devices
Advisor y Committee Meeting. June 13, 2013. Gaithersburg, Maryland.
http://www.fda.gov/downloads/Advisor yCommittees/
CommitteesMeetingMaterials/MedicalDevices/MedicalDevicesAdvisoryCommittee/MicrobiologyDevicesPanel/
UCM356185.pdf

献1 ）van den Hoogen BG, de Jong JC, Groen J, et al. A newly
discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease. Nat Med. 2001 ; 7 :719 -724.
2 ）Ebihara T, Endo R, Kikuta H, et al. Human metapneumovirus infection in Japanese children. J Clin Microbiol. 2004
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3 ）Kikuta H, Sakata C, Gamo R, et al. Comparison of a lateralflow immunochromatography assay with real-time RTPCR for detection of human metapneumovirus. J Clin
Microbiol. 2008 ; 46 : 928 -932.
4 ）Ebihara T, Endo R, Ma X, et al. Detection of human metapneumovirus antigens in nasopharyngeal secretions by animmunofluorescent antibody test. J Clin Micro. 2005 ; 43: 1138 -1141.
5 ）Ishiguro N, Ebihara T, Endo R, et al. Immunofluores-（5）