細胞移入療法を目指した腫瘍抗原
特異的遺伝子改変リンパ球の開発
塚 原 智 英［札幌医科大学／助教］
水 江 由 佳［札幌イムノ・ダイアグノスティック・ラボラトリー（札幌 IDL）／主任研究員］

中 村 健 治［株式会社ホクドー／テクニカルマネージャー］

背景・目的
癌抗原を標的としたペプチドワクチンは、抗原ペプチ
ド特異的細胞傷害性 T 細胞（CTL）を増殖活性化させることで癌拒絶を目指す治療法である。ワクチンにより増殖活性化したペプチド特異的 CTL は T 細胞受容体（TCR）を介して、HLA／ペプチド複合体を認識して癌細胞を殺傷する。しかし症例によってはペプチドワクチンでは十分な CTL の増殖活性化が得られないことがある。これを克服するひとつの方法として、CTL クローンから遺伝子クローニングした TCR を発現させた患者末梢血リンパ球を患者に移入する養子免疫療法が近年行われ、臨床効果を示している。しかし抗原特異的 CTL クローンの樹立は一般に大変難しく多大な時間と労力を要し、特にメラノーマ以外の患者末梢血からの樹立は困難を極める。今回我々は、理論上あらゆる抗原に対して特異性および親和性の高いヒト型人工抗体を in vitro で選別可能なファージディスプレイ抗体ライブラリを用いて、ヒト癌細胞表面の様々な HLA／ペプチド複合体を直接認識する人工抗体を分離同定し、人工抗体を発現する遺伝子改変 T 細胞の樹立を目指す。また、人工抗体発現 T 細胞移入療法においては腫瘍細胞表面上における標的 HLA／ペプチドの発現が必須となるため、本抗体により HLA／ペプチド複合体を臨床検体で検出する診断キットを開発する。

内容・方法
1 ．申請者がナイーブドナー 31 人の末梢血単核球と摘出扁桃 2 つの RNA より作製した約 1 億のレパトアを有する single chain variable fragment（scFv）
ファージディスプレイライブラリを用いる。ナイーブドナーを用いることで、あらゆる抗原に対する抗体をライブラリより分離することが可能となる。
2 . scFv を発現するライブラリファージと抗原のパニングを行う。抗原にはビオチン化 HLA／ペプチドモノマー（HLA−A 24/PBFA 24.2 ペプチド、HLA−A2/PBFA2.2 ペプチド、HLA−A 24/SYT−SSX 改変ペプチド K 9I、HLA−A 24／サバイビン 2 B ペプチド HLA−A24／リビンペプチド）を用いる。3〜4 回のパニングを行い、ビオチン化 HLA／モノマーに特異的に結合する scFvを発現するクローンを同定する。

3 ．同定されたクローンの scFv 遺伝子をヒトまたはマウス IgG 1 型を発現する改変ベクターに挿入し、293T 細胞に発現させる。培養上清を精製してビオチン化
HLA／ペプチドモノマー特異的 IgG1型抗体を得る。これらの抗体を用いて、ペプチドパルスを行った T 2細胞および HLA−A24/A2陽性癌細胞株に対する FACS解析と表面プラスモン共鳴解析を行い、抗体の親和性を評価する。そして scFv 遺伝子を二次シグナル伝達分子 CD 28 および CD 3 をコードするレトロウイルスベクターに導入する。これをヒト末梢血 T 細胞に感染させることで、人工抗体発現ヒト T 細胞を樹立する。
人工抗体発現 T 細胞の抗原特異性を様々ながん細胞株で検討し、担癌マウスへの細胞移入療法を行って治療効果を確認する。また同時に人工抗体をテトラマー化して、臨床検体における HLA／ペプチド複合体の発現を人工抗体テトラマーで検出可能かどうか検討する。

結果・成果（i） HLA−A 2/PBF A 2.2 ペプチド（ALPSFQIPV）複合体を認識する scFv 抗体を 1 クローン分離した。scFv
より2価のヒト型 IgG1を作成した。また scFv の HLA_A 2/PBF A 2.2 ペプチドに対する結合親和性を表面プ
ラスモン共鳴解析で測定した結果、Kd 値は 1.5 x 10−9 であった。scFv が抗原に対して高い親和性を持つことがわかった。scFv−hIgG1は PBF A2.2ペプチドをパルスした T 2 細胞を認識した。一方、HIV ペプチドをパルスした T2細胞に対する反応は弱いものであった。
scFv による PBF A 2.2 ペプチドをパルスした T2細胞に対する反応性は、scFv のテトラマー化によって 10倍程度に増強された。しかし scFv テトラマーによって、肉腫細胞株細胞表面における HLA ペプチド複合体の特異的な発現は検出されなかった。また、ホルマリン固定腫瘍標本においても HLA ペプチド複合体の検出は困難であった。細胞表面に提示される抗原分子の存在頻度はかなり低いこと、ホルマリンによる HLAペプチド複合体の変性が原因として考えられる。また
scFv 遺伝子を共刺激分子 CD 28 の膜貫通領域と細胞内領域および T 細胞共受容体 CD3の細胞内領域を連結したキメラ抗原受容体の cDNA を作成し、これをレトロウイルスベクター pMXpuro に導入したクローンを作成した。現在この受容体を Jurkat/MA 細胞に導入することを試みている。導入効率を上げるために、ウイルスタイターの増強、レトロネクチンの使用などで最適な条件を検討している。
（ii）HLA−A24/PBF A24.2ペプチド複合体を認識するscFv抗体を1クローン分離した。cFv より2価のヒト型 IgG1 を作成した。また scFv の HLA−A24/PBF A24.2ペプチド（AYRPVSRNI）に対する結合親和性を表面プラス― 9 ―モン共鳴解析で測定した結果、Kd 値は 10−9オーダーであり、scFv が抗原に対して高い親和性を持つことがわかった。しかし scFv−hIgG 1は PBF A24.2ペプチ
ドをパルスした T 2−A 24 細胞を認識しなかった。また
scFv による PBF A 24.2 ペプチドをパルスした T 2−A
24細胞に対する反応性は、scFv のテトラマー化によっても検出は出来なかった。
（iii）滑 膜 肉 腫 抗 原 SYT−SSX 由 来 改 変 ペ プ チ ド（GYDQIMPKI）と HLA−A 24 複 合 体（HLA−A 24/K 9 Iペプチド）に対する scFv 抗体の分離を試みた。しかしバイオパニングを繰り返しても候補 scFv クローンを得ることは出来なかった。
（iv）HLA−A24/survivin2B ペプチド
（AYACNTSTL）
複合体を認識する scFv 抗体の分離を試み、この複合体に反応する scFv クローンを 20 個得た。しかしこれらのクローンは全て HLA−A 24/HIV ペプチドにも交差反応を示した。

今後の展望（i） HLA−A2/PBF A2.2ペプチド複合体を認識する scFv
抗体：より親和性の高いクローンの選別と結合性の高い抗体の作成（マルチマー化）を行うことと、新鮮凍結腫瘍標本を用いることでこれらの問題は解決できると考えている。またキメラ受容体を安定発現するJurkat 細胞を用いて受容体の感受性、特異性を解析していく。
（ii）HLA−A24/PBF A24.2ペプチド複合体を認識するscFv
抗体：キメラ抗原受容体発現細胞を樹立し、抗原に対する反応性をルシフェラーゼ活性を測定することで、抗原のより高感度な検出を目指す。
（iii）HLA−A 24/K 9 I ペプチド複合体を認識する scFv
抗体：scFv ライブラリのスケールを増強して特異的scFv を同定する。
（iv）HLA−A 24/survivin 2 B ペプチド複合体を認識する
scFv 抗体：あらかじめ HLA−A 24/HIV ペプチド複合体を用いたパニングで、HLA−A24/HIV に反応するクローンを除去してから HLA−A 24/survivin 2 B ペプチド複合体を用いたパニングを行うことで HLA−A 24/survivin 2 B 複合体特異的な scFv を分離していく。

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