69●全自動甲状腺レセプター自己抗体測定試薬の開発
バイオサイエンス事業部 開発部 試薬開発G

河合新谷永田井上

バイオサイエンス事業部 企画開発室

信之
晃司
喜彦
益男

ブフィードバックによるコントロールを受けないた

1．はじめにめ、バセドウ病のような甲状腺機能亢進状態をもたら甲状腺疾患は、内分泌疾患の中では最も頻度が高く、す。このことからTRAbの測定は、甲状腺疾患の鑑別

日常診療の機会も多い疾患であり、大きく分けて甲状に有用であり、特にバセドウ病と無痛性甲状腺炎及び腺機能亢進症（甲状腺ホルモン過剰）と甲状腺機能低亜急性甲状腺炎の鑑別診断、バセドウ病の治療経過観下症（甲状腺ホルモン不足）の二つがある。甲状腺疾察に利用される（１−６）。

患が疑われたら、まず行う検査は甲状腺ホルモン（遊TRAbの測定には図１に示すようなラジオ・レセプ

離型サイロキシン：FT4）と甲状腺刺激ホルモン

ター・アッセイ法（RRA法）が主に用いられてきたが、（TSH）の測定である。この結果によって、甲状腺機最近では非放射線系（non−RIA）の試薬（エンザイム

能亢進、低下、正常の三つに区分される。甲状腺機能イムノアッセイ：ELISA法、化学発光酵素イムノアッ

亢進症の場合には、その原因がバセドウ病かそれ以外

セイ：CLEIA法）に変わりつつあり、さらにはTSHの（無痛性甲状腺炎、亜急性甲状腺炎）かの鑑別診断を代わりにスミスらによって開発されたヒト由来の抗行う。バセドウ病は、甲状腺の細胞の表面にあるTSH（７−10）
TSHレセプターモノクローナル抗体（M22）を用のレセプターに対する自己抗体（抗TSHレセプター抗いた高感度且つ迅速測定可能な試薬も販売されている。

体：TRAb）による甲状腺の刺激活性化に起因してい今回、我々は全自動免疫測定装置（AIA−2000、る。

AIA−1800、AIA−900及びAIA−600Ⅱ）を用いて簡便か

TSHレセプターは分子量約100kDaの糖蛋白質で甲つ迅速にTRAbを測定可能な試薬の開発を行ったので状腺細胞膜上に存在し、これにTSHが結合すると細胞報告する。

内のcAMPが増加し、甲状腺ホルモンの合成を促進する。このレセプターに対する自己抗体が抗TSHレセプ

2．測定原理と材料ター抗体（TRAb）である。TRAbはTSHと同様に甲状腺ホルモンの合成を促進するものがあるが、ネガティ

RRA法

ブタTSHレセプター（リコンビナント）とヒト由来非放射線による試薬

M22抗体を用いた試薬

酵素Radio labeled

Labeled TSH

TSH

酵素
アビジン

アビジン
Labeled M22
三次反応

ビオチン

ビオチン

TSH
二次反応

TRAb

一次反応
TSH receptor

図１

二次反応

三次反応

M22抗体
TRAb

二次反応一次反応
TSH receptor

市販されているTRAb測定試薬の測定原理

TRAb

一次反応
TSH receptor

70

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.54（2010）の抗TSHレセプターモノクローナル抗体（M22）を用として以下のようなTRAb全自動測定試薬の開発を試いた競合EIA法である。磁性ビーズに固定化したブタみた。

TSHレセプターが安定性を高めるため凍結乾燥体とし製品化されるまでにTSHレセプターの保存条件の最て試薬カップに封入されている。この試薬カップに検適化には時間を要した。本試薬の測定原理は、先に述体（血清）と分注水を注入すると、凍結乾燥試薬が溶べたようにブタTSHレセプターとヒト由来の抗TSHレ解し第一免疫反応が開始する。37℃、10分間の反応後、セプターモノクローナル抗体（M22）を用いた競合未反応の検体成分をB／F分離により洗浄除去する。B／EIA法である。磁性ビーズに固定化したブタTSHレセ

F分離後、アルカリ性ホスファターゼ標識されたM22

プターは安定性を保つために凍結乾燥体として試薬カ抗体を加えることにより第二免疫反応が開始される。

ップに封入されている。その磁性ビーズへのTSHレセ

37℃、10分間の反応後、未反応の酵素標識抗体をB／Fプターの固定化は、抗体を固定化するときのような緩分離により洗浄除去し、酵素基質である4−メチルウン

衝液のみを用いる条件ではTSHレセプターが急速に失ベリフェリルりん酸（4MUP）を分注後、経時的に蛍活し十分な反応性が得られないため、緩衝液に安定化光強度を測定し単位時間あたりの4−メチルウンベリフ剤を添加させ、温度、時間を最適化することでTSHレェロン（4MU）の生成量を測定する（図２）。基質のセプターの失活を防ぐ固定化条件を確立した。また

蛍光強度は固定化された酵素量に依存するため、予めTSHレセプターを固定化した磁性ビーズも従来の保存既知濃度のTRAbを含む標準品を用いてその蛍光強度液では製造中に反応性の低下が認められたため、保存とTRAb濃度による標準曲線を作成し、TRAb濃度未知液についても最適化を実施した。の患者検体の蛍光強度に相当するTRAb濃度を標準曲臨床的に十分耐えうる性能を出すためには、本項目線より算出することによりTRAbの定量が可能となる。

特有の試薬仕様を選定した。特に第一反応液は、測定の際、検体のカップへの分注、一定時間下での反TRAb陰性検体の測定値を収束させるための複数の添応、B／F分離、基質分注、蛍光強度の測定は東ソー株

加剤を組み合わせるとともに、TRAb陽性検体の反応式会社製の全自動免疫測定装置（AIA−2000、AIA−性を増大させるための増感剤も加えた。さらに酵素標

1800、AIA−900及びAIA−600Ⅱ）により自動で行われ、識M22抗体の調製には新規の架橋試薬を採用すること測定開始から約35分後に結果が得られる。

でTSHレセプターとの反応性を高め、酵素標識M22抗体希釈液を最適化することにより溶液での安定性も確保した。

3．AIA試薬の開発の経緯

なお、標準品のTRAb濃度は、国際標準品（NIBSC
Code：90／672）を基準として決定した。

本試薬の開発においてTSHレセプターの安定性を保ちながら臨床的に十分耐えうる性能を出すことを目標

Free：TSHレセプター固定化磁性ビーズ
Bound：酵素標識抗TSHレセプター抗体（M22）：検体中のTRAb

B／F分離

検体分注

：反応に関与しない成分（第一免疫反応）（洗浄）：酵素基質（4MUP）：酵素反応生成物（4MU）

Free
Bound

酵素標識抗TSHレセプター抗体（M22）

B／F分離（第二免疫反応）

基質分注
（洗浄）

図２

TRAb測定原理図（蛍光測定）

東ソー研究・技術報告 第54巻（2010）

表１71

測定内および測定間再現性試験

測定内再現性試験（n＝10）
Low
MiddleHigh16.0
Mean［IU／L］ 8.923.3
SD0.4
0.5
0.6
CV［％］
4.6
3.1
2.4

測定間再現性試験（n＝20、94日間）
Low
Middle
High
9.1
16.3
23.4
0.5
0.7
0.9
5.0
4.0
3.8

倍希釈し測定した結果、概ね良好な希釈直線性を示し

4．基本性能評価

た（図４）
。

（1）感度
8種の低濃度TRAb陽性血清を10重測定し、変動係数（4）共存物質の影響試験（CV）が10％の理論値を実効感度として算出したとき検体中に含まれる可能性のある各物質を高濃度で血の濃度は1.8 IU／L、2SD法による最小検出限界は0.5

清検体へ添加し、測定値への影響を確認した。共存物

IU／Lであった（図３）。

質としてヘモグロビン、遊離型ビリルビン、抱合型ビリルビン、脂質、ヒト血清アルブミン、アスコルビン（2）再現性試験

酸を各々表２に記載の濃度まで添加し、測定した結果、測定内再現性、測定間再現性試験を濃度の異なる3

未添加に対して測定値はいずれも±10％以内の変動で種の血清検体を用いて行った。使用した3検体（Low、あり、これら物質による影響は認められないと判断しMiddle、High）は1回の測定分を小分け分注し使用また。

で凍結保存した。10重同時測定による測定内再現性試

更に溶血の影響を確認するために、偽似溶血検体を験の結果、各検体の測定値の変動係数（coefficient of調製して評価を行った。ヘパリン入り採血管にて採血variation；CV）は、2.4〜4.6％の範囲内であった。90

し遠心分離して得た赤血球画分を生理食塩水にて3回日間の測定を各2重測定にて行った測定間再現性試験

洗浄した後、純水を赤血球画分に対して1：1の割合での結果、各検体の測定値のCVは、3.8〜5.0％の範囲内であった（表１）。
40

TRAb濃度の異なる4種の血清検体を用い3重測定にて行った。各々の検体を専用の検体希釈液で5倍、10

40

30

検体−A
検体−B
検体−C
検体−D

20

10030CV（％）

TRAb［IU／L］（3）希釈直線性試験

1／10 1／51
希釈率

図４2010

表２001234

TRAb（IU／L）

図３

感度

56

希釈直線性試験

共存物質の影響試験

ヘモグロビン
遊離型ビリルビン
抱合方ビリルビン
脂質
ヒト血清アルブミン
アスコルビン酸［mg／dL］［mg／dL］［mg／dL］［mg／dL］［mg／mL］［mg／dL］

44019181600502072TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.54（2010）

加えて溶血させ、遠心分離して得られた上清を用いて溶血検体とした。評価の結果、ヘモグロビン濃度5005．臨床上の有用性確認（1）健常人における分布

mg／dLまで影響は認められなかった。

健常人100例のTRAb濃度は1.0 IU／L未満であった（5）他社キットとの相関性試験（図７）。

血清検体を用いてA社RRA法およびB社RRA法と測定値の比較を行った結果、AIA試薬による測定値（ｙ）（2）ROC分析法を用いた検証

は、A社RRA法と回帰式y＝0.993x＋0.0345、相関係数

ROC（Receiver Operating Characteristic）分析曲線

r＝0.959（n＝92）、B社RRA法と回帰式y＝1.009x−による未治療のバセドウ病患者（30例）と健常人0.150、相関係数r＝0.975（n＝118）と良好な相関性が（133例）、無痛性甲状腺炎（20例）の鑑別を行った。

認められた（図5、図６）。

ROC分析の結果から、健常人を陰性群とした場合は0.9 IU／Lで最も診断効率が高く、感度、特異度は、それぞれ100％、100％であった。無痛性甲状腺炎を陰性群とした場合は2.3 IU／Lで最も診断効率が高く、感度、Eテスト「TOSOH」Ⅱ（TRAb）［IU／L］

40

特異度は、それぞれ96.7％、100％となり、未治療のy＝0.993x＋0.0345
R＝0.959n＝9230

バセドウ病と良好な鑑別結果が得られた。
（3）各種甲状腺疾患におけるTRAb濃度
各種甲状腺疾患（未治療のバセドウ病、橋本病、腫20

瘍性疾患、無痛性甲状腺炎、亜急性甲状腺炎）及び健常人のTRAb濃度の分布を比較した。未治療バセドウ
10病（30例）は1.2〜147 IU／L、橋本病（26例）は0〜1.1 IU／L、腫瘍性疾患（33例）は0〜1.1 IU／L、無痛性甲状腺炎（20例）は0〜2.3 IU／L、亜急性甲状腺0010203040

A社 RRA法［IU／L］

図５炎（9例）は0〜0.7 IU／Lの範囲に分布していた（図８）。甲状腺機能亢進症の診断において重要であるバセドウ病の鑑別（バセドウ病とそれ以外の無痛性甲状

AIA試薬とA社 RRA法との相関性試験

腺炎、亜急性甲状腺炎の判別）ができており、本試薬の臨床的有用性が確認された。

y＝1.009x−0.150
R＝0.975
n＝1183060504020

頻度

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（TRAb）［IU／L］

403020101000010203040〜0.5〜0.6

B社 RRA法［IU／L］

図６AIA試薬とB社 RRA法との相関性試験〜0.7〜0.8TRAb［IU／L］

図７

健常人における分布〜0.9〜1.0東ソー研究・技術報告 第54巻（2010）4073＞40

TRAb［IU／L］

302010

カットオフ値
0未治療
バセドウ病

橋本病

図８

腫瘍性疾患

無痛性甲状腺炎

亜急性甲状腺炎

健常人

甲状腺疾患と健常人の分布の感度、特異度は、96.7％、100％、無痛性甲状腺炎

6．ま と めを陰性群とした時の感度、特異度は、96.7％、95.0％

Ｅテスト「TOSOH」Ⅱ（TRAb）の試薬構成及び仕となり、従来法と同様の性能が確認できた。更に1様は表３の通りである。従来のTRAb測定（RRA法）

次反応時間を10分から20分に延長させることでカは測定時間が長く用手法で煩雑である。また測定に放ットオフ値付近の測定精密度が向上することが確

射性同位元素を使用するため特別な施設が必要であ認されており、バセドウ病治療における投薬中止

り、放射性廃棄物の管理と処理に大きなコストを必要やバセドウ病の寛解時の判断に大きく貢献できるとしている。しかし本法はnon−RIAで測定前に試薬調と思われ、仕様変更された試薬の開発も検討中で製することなくサンプルをセットして全自動で測定がある。

可能であり、開始から約35分後に測定結果が得られる。

既に製品化されているEテスト「TOSOH」シリー

また凍結乾燥形態を用いていることで検量線の保証期ズの甲状腺関連項目（TSH，T4，FT4，T3，FT3，間は90日間である。従って従来法と比べ低コストで迅TPOAb，TgAb）との同時測定が可能なことから、日速な診察前検査としてTRAbの測定を行なうことがで常検査に加え、診療前検査にも有用であり、甲状腺疾きる。

患の診断において今後さらに幅広い用途が期待でき

本法は検体中の共存物質や溶血の影響がないことがる。

確認された。健常人におけるTRAb濃度は1.0 IU／L未満であり、本法の実効感度を考慮し、カットオフ値を2.0 IU／Lとして未治療バセドウ病と健常人、無痛性甲状腺炎の鑑別を行った結果、健常人を陰性群とした時

表３

7．謝

辞

本開発において臨床的有用性の確認に対してご協力

Eテスト「TOSOH」Ⅱ（TRAb）の試薬構成及び仕様

検体種 検体量 検量域上限 有効期間
試薬構成
免疫反応試薬セット 標準品セット 検体希釈液［μL］ ［IU／L］［月］
免疫反応試薬
凍結乾燥
液状
血清100
4012
酵素標識試薬
6濃度
基質セット
分注水
洗浄水
基質
液状
液状
基質溶解液

74

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.54（2010）

していただいた、すみれ病院 院長 浜田昇 先生に厚く御礼申し上げます。

文献１）日本臨床検査医学会、 臨床検査のガイドライン、第2章（2005／2006）２）B. R. Smith and R. Hall, Lancet, 24, 427−431（1974）
３）G. Shewring and B. R. Smith, Clinical

Endocrinology, 17, 409−417（1982）
４）B. R. Smith and R. Hall, Endocrine Review, 9, 106−121（1988）
５）K. Southgate et al, Clinical Endocrinology, 20,539−548（1984）６）A. Kakinuma et al, Thyroid, 9, 849−855（1999）
７）B. R. Smith et al, Thyroid, 14, 830−835（2004）
８）J. Sanders et al, Thyroid, 14, 560−570（2004）
９）J. Sanders et al, Lancet, 362, 126−128（2003）
10）K. Kamijo et al, l, Endocrine Journal, 52, 525−529（2005）