坐骨神経切除による筋萎縮に対する大豆たん白質とホエイたん白質の相加効果
二川健＊1・橋本理恵1・中尾玲子1, 2・内田貴之1・二宮みゆき1・木森有希1・真板綾子1・鉄野文香1・井田くるみ1・岸本ひかる1・高木麻里奈1・楊河宏章3・西良浩一41

徳島大学・大学院医歯薬学研究部・生体栄養学分野
2
産業総合研究所
3
徳島大学臨床試験管理センター
4徳島大学・大学院医歯薬学研究部・運動機能外科学分野

Eﬀects of Dietary Soy Protein and Whey Protein on Denervation-induced
Skeletal Muscle Atrophy
Takeshi NIKAWA＊1, Rie HASHIMOTO1, Reiko NAKAO1, 2, Takayuki UCHIDA1,Miyuki NINOMIYA1, Yuki KIMORI1, Ayako MAITA1, Ayaka TETSUNO1, Kurimi IDA1,Hikaru KISHIMOTO1, Marina TAKAGI1, Hiroaki YANAGAWA3 and Koichi SAIRYO4
1

Department of Nutritional Physiology, Institute of Medical Nutrition, Tokushima UniversityGraduate School, Tokushima 770-8503
2
National Institute of Advanced Industrial Science and Techonology (AIST), Tsukuba 305-8561
3
Tokushima University Hospital, Clinical Trial Center for Developmental Therapeutics,
Tokushima 770-8503
4Department of Orthopedics, Institute of Medical Sciences, Tokushima University Graduate
School, Tokushima 770-8503

ABSTRACTSoy protein and whey protein are beneficial dietary proteins against unloadingmediated muscle atrophy, although they have distinct effects on the muscle
atrophy. Soy protein has inhibitory effect on muscle protein degradation, while
whey protein stimulates muscle protein synthesis. We reported here whether they
have an additional effect on muscle atrophy, when the mixed diet with soy andwhey proteins were subjected to denervated mice. We found that the ratio of themixed protein diet was most eﬀective to prevent the denervation-induced muscle
atrophy. Thus, we are planning to perform the dietary intervention examination
with the ratio of the mixed soy and whey protein diet for bed-redden people nextyear. Soy Protein Research, Japan 20, 8-12, 2017.
Key words : denervation, muscle atrophy, whey protein, soy protein＊〒770-8503

8徳島市蔵本町3-18-15
大豆たん白質研究

Vol. 20（2017）

我 々 は， こ れ ま で 大 豆 た ん 白 質（Soy proteinisolate, SPI）は，実験動物や入院中の患者において筋試験食各試験食の組成を以下に示す．単位はグラムである．

たん白質分解を抑制することを明らかにした．大豆たProductsん白質にはCblin（DGpYMP）様配列が含まれており，骨格筋においてCbl-bとその基質であるIRS-1との結合を阻害することで，筋たん白質分解を抑制する1）．一方，ホエイたん白質は，筋たん白質合成を刺激することが知られている2）．ホエイたん白質にはロイシンが特に多く含まれており，それが筋たん白質合成経路を活性化すると考えられている．これらのことは，ホエイたん白質が大豆たん白質とは異なるメカニズムで骨格筋萎縮を抑制しうることを示唆している．以上の知見より，筋たん白質の分解を抑制する大豆たん白質単独の摂取よりも，筋たん白質の合成を促進するホエイたん白質を同時に摂取した方がよいのではないかと考えた．そこで，本研究では，大豆たん白質とホエイたん白質の坐骨神経切除による筋萎縮抑制効果を検討した．
大豆たん白質およびホエイたん白質の廃用性筋萎縮への効果を検討することで，廃用性筋萎縮の予防・治療の発展，寝たきりの患者のQOLの向上や，宇宙飛行士の充実した長期宇宙飛行に貢献できると考えている．

CaseinSoy

Whey

Soy+Whey
1:1 1:2 2:1

Casein20000
Soy protein
019.809.9 6.6 13.2
Whey protein
0022.4 11.2 14.9 7.5
L-Cystine
0.3
0.3
0.30.3β-Starch39.939.9
39.9
39.9
α-Starch13.2
13.2
13.2
13.2
Lactose hydrate
2.5
2.501.25
Sucrose
7.7
7.7
7.7
7.7
Soybean oil
775.8
6.4
Cellulose
5555
Mineral mix
3.5
3.5
3.5
3.5
Vitamin mix
1111
KH2PO400
0.2
0.1
t-Butylhydroquinone 0.0014 0.0014 0.00140.0014
ウエスタンブロット法
たん白質をSDS化後，8% ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った．ゲル中のたん白質はセミドライブロッティング（ATTO）を用いてpolyvinylidene
diﬂuoride（PVDF） 膜（BIO-RAD） に 転 写 し た． 転写 後，PVDF膜 を4%精 製 ミ ル ク カ ゼ イ ン で1時 間 ブ

方法

C57BL/6マウスにおける摂食実験
6週齡のC57BL/6雄マウス（n = 6）を，1週間予備飼育後，4試験食（カゼイン食，大豆たん白食，ホエイたん白質，大豆たん白質＋ホエイたん白質食：各試験食ともに総カロリー中20%たん白質含有）の摂食を開始し2週間後，左足に坐骨神経切除を施した．坐骨神経切除4日後に屠殺し，下肢の筋肉を摘出した．試験食は，自由摂食とした．

ロッキングし，0.05% Tween-20を含むPBS（PBS-T）
で 洗 浄 し た． 次 に， 希 釈 し た 一 次 抗 体［ 抗IRS-1抗体（MILLIPORE）， 抗p-Akt抗 体， 抗t-Akt抗 体， 抗GAPDH抗 体（Santa Cruz Biotechnology）］と膜を
37 ℃ で1時 間 ま た は4 ℃ で1晩 反 応 さ せ た．PBS-Tで洗浄後，希釈した二次抗体［抗マウスIgG抗体（GEHealthcare），抗ウサギIgG抗体（GE Healthcare）］と37℃でさらに1時間反応させた．洗浄後，Enhanced
Chemiluminescence検 出 シ ス テ ム（GE Healthcare）を用いて抗体と反応したたん白質を検出した．
Real Time RT-PCR法
SYBRTM Green dyeを用い，ABI 7300リアルタイム
PCRシステム（Applied Biosystems, Foster City, CA）
を使用した．使用したプライマーの配列を以下に示す．
Cbl-b

S
AS
Atrogin-1 SAS
MuRF-1 S
AS

大豆たん白質研究

Vol. 20（2017）

5'-GAGCCTCGCAGGACTATGAC-3'5'-CTGGCCACTTCCACGTTATT-3'5'-GGCGGACGGCTGGAA-3'
5'-CAGATTCTCCTTACTGTATACCTCCTTGT-3'5'-ACGAGAAGAAGAGCGAGCTG-3'5'-CTTGGCACTTGAGAGAGGAAGG-3'9GAPDH

S5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'AS 5'-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3'（S: sense primer, AS: antisense primer.）

WB:IRS-1
WB:GAPDH

統計処理
データは平均±標準偏差で表した．また，統計学的有意差は解析ソフトSPSS（release 6. 1, SPSS Japan）
を 用 い てDuncan's multiple range testで 検 定 し，p <0.05を有意とした．

結果

筋湿重量低下に対する試験食の効果
腓腹筋の筋湿重量を計測した結果，カゼイン食群に

Non DenNon Den Non Den Non Den

Casein dietgroup

SPI dietgroup

WPC dietgroup

SPI and WPCdiet group

Fig. 2. Effect of various protein diets on IRS-1
degradation caused by denervation. We
administered casein control, soy protein t (SPI)
diet, whey protein concentrate (WPC) diet,and SPI＋WPC diet to mice for 10 days. Mice
were denervated, and gastrocenius muscles
were isolated and weighed after 4 days. The
homogenates of gastrocnemius muscle weresubjected to Western blotting for IRS-1.

おいて，4日間の坐骨神経切除は湿重量を14.5%減少させた．これに対し，大豆たん白質，ホエイたん白質，WB : p-Akt

大豆たん白質＋ホエイたん白質（比率1:1, 1:2, 2:1）食WB : t-Akt群の筋湿重量低下はそれぞれ6.2%，10.3%，4.0%，6.3%，Non Den Non Den Non Den Non Den

6.4%にとどまり，1:1の比率で混合した大豆たん白質+

Casein dietgroup

ホエイたん白質食群において最小値を示した（Fig. 1）．
IRS-1量減少に対する試験食の効果
腓腹筋内のIRS-1量をウエスタンブロット法で確認した．

Gastrocnemius muscle□ Non-operation limbs■ Denervation

0.007
GA/B.W. (g)

0.006
0.005
0.004
0.003
0.002

SPI dietgroup

WPC diet SPI and WPC
diet groupgroup

Fig. 3. E f f e c t s o f v a r i o u s p r o t e i n d i e t s o ndephosphorylation of Akt-1 caused bydenervation. We administered casein control,
soy protein t (SPI) diet, whey protein
concentrate (WPC) diet, and SPI＋WPC dietto mice for 10 days. Mice were denervated,and gastrocnemius muscles were isolated
and weighed after 4 days. The homogenatesof gastrocnemius muscle were subjected toWestern blotting for phosphorylated Akt-1 andtotal Akt-1.

0.001
0Casein diet SPI dietgroup
group

WPC diet
group

1:2
2: 1
1:1
20％ SPI + WPC diet group

denervation-limbs/
non-operation limbs (%)

Gastrocnemius muscle atrophy rate

020％ SPI + WPC diet group
Casein SPI Diet WPC Diet SPI+ WPC
1:21 : group
12: 1diet group group
group
diet

-5-10-15-20-25-30

Fig. 1. Eﬀect of various protein diets on denervationinduced gastrocnemius muscle wet weight loss.
We administered casein control, soy protein(SPI) diet, whey protein concentrate (WPC)
diet, and SPI＋WPC diet to mice for 10 days.
Mice were denervated, and gastrocnemius
muscles were isolated and weighed after 4days.
10カ ゼ イ ン 食 群 に お い て， 坐 骨 神 経 切 除 に よ り，IRS-1の減少が確認された．これに対し，大豆たん白質食，ホエイたん白質食，大豆たん白質+ホエイたん白質食群はIRS-1の分解が抑制され，中でも大豆たん白質＋ホエイたん白質食摂取群において，最もIRS-1分解抑制効果が示された（Fig. 2）．
リン酸化Akt量減少に対する試験食の効果
カゼイン食群において，坐骨神経切除により，リン酸化Akt量の減少がみられたが，大豆たん白質食，ホエイたん白質食，大豆たん白質+ホエイたん白質食群においてはこの減少が抑制された．なかでも大豆たん白質食の摂取が最もこの抑制効果が高かった（Fig. 3）．

大豆たん白質研究

Vol. 20（2017）

86420casein diet SPI dietgroup
group

WPC diet SPI + WPC
group
diet group

8Day 4: Cbl-b / GAPDH

10Day 4 : MuRF-1 / GAPDH

Day 4 : Atrogin-1 / GAPDH□ Non-operation limbs■ Denervation

6420casein dietgroup

SPI dietgroup

WPC diet SPI + WPCgroupdiet group2.521.5
10.50casein dietgroup

SPI dietgroup

WPC diet SPI + WPCgroupdiet group

Fig. 4. Effects of various protein diets on denervation-induced atrogene expression in gastrocneium muscle.
We administered casein control, soy protein t (SPI) diet, whey protein concentrate (WPC) diet, and SPI＋WPC diet to mice for 10 days. Mice were denervated, and gastrocnemius muscles were isolated andweighed after 4 days. Total RNA was extracted from gastrocnemius muscle and subjected to real time
RT-PCR for atrogine.
筋萎縮関連遺伝子に対する試験食の効果20%）および脂質を会合しているたん白質（約40%）

4日間の坐骨神経切除により，Atrogin-1，MuRF-1の3種類であることが明らかになっている．大豆たんの発現量は有意に増加した．大豆たん白質およびホエ白質の主要な構成たん白質であるグリシニンにおいイたん白質摂取による筋萎縮関連遺伝子の発現抑制て，筋萎縮抑制効果を持つCblinと類似するアミノ酸は，4日間の坐骨神経切除においてはみられなかった．

配列が発見されている．グリシニンたん白質のサブユ

しかしながら，Cbl-b発現量は，4日間の坐骨神経切除ニットをマルチプルアライメントした結果，全5種類により有意に上昇したが，ホエイたん白質食，大豆たのサブユニットのうち，4つがCblinと類似した配列をん白質+ホエイたん白質食の2群間で発現量の抑制傾有していることが明らかになった．カゼイン食群とグ向が見られた（Fig. 4）．

リシニン食摂取群におけるIRS-1発現量を検討した実験において，グリシニン食摂取群で坐骨神経切除を施した足の筋肉におけるIRS-1の分解が抑制され，その考察

ユビキチン化も抑制されていることが分かっている3）．
一方，筋たん白質合成を促進しうる食品成分とし

本研究では，筋萎縮に対する様々な食餌性たん白質て，ロイシンを多く含むホエイたん白質が注目されての効果を検討した．本試験では，試験食として，カゼいる．分岐鎖アミノ酸であるロイシンは，筋たん白イン食，大豆たん白質食，ホエイたん白質食，大豆た質合成経路を活性化すると考えられている．たん白質

ん白質・ホエイたん白質（1:1, 1:2, 2:1）の混合食を用の栄養価を示す指標である生物価やたん白質効率においた．その結果，6つの試験食の中で，1 : 1の比で混いて，ホエイたん白質は全卵に匹敵しており，カゼイ合した大豆たん白質・ホエイたん白質混合食が最も効

ンや大豆たん白質と比較して，より優れていること

果的に筋萎縮を抑制していた．

がわかっている．また，ホエイたん白質は構成アミ

これまでの研究より，大豆たん白質は，筋たん白質ノ酸の約20%が分岐鎖アミノ酸と含量が多く，さらに分解を抑制することが明らかになっている．本研究にバリン:ロイシン:イソロイシン=1：2：1の比率で含まおいても大豆たん白質の摂取はIRS-1の分解を抑制し，れ，ロイシン含量が多いという特徴がある．分岐鎖ア筋萎縮関連遺伝子の発現を抑制していた．大豆たん白ミノ酸が翻訳開始段階の活性化をもたらし，たん白質質は，骨格筋においてCbl-bとその基質であるIRS-1と合成を亢進させることが報告されている．特に，ホの結合を阻害することで，筋たん白質分解を抑制する

エイたん白質に豊富に含まれているロイシンは，Rasことも見出した．大豆たん白質の原料となる大豆は，

homolog enriched in brain（Rheb）とmammalian target

全体の35%をたん白質が占めており，たん白質を豊富of rapamycin（mTOR）の結合を促進し，mTORを介に含む食品である．大豆たん白質を構成する主要たんしたS6KおよびeIL-4E binding protein（4E-BP）のリ

白質は，グリシニン（約40%），β−コングリシニン（約ン酸化が起こり，たん白質合成が促進される4）．たん大豆たん白質研究

Vol. 20（2017）11白質の生体利用性を考慮すると，大豆，カゼインに比合成を促進するホエイたん白質を同時に摂取すること

べホエイたん白質は摂取後，速やかに吸収され，血中で，それらの単独摂取よりも効果的に筋萎縮を抑制でアミノ酸濃度の上昇が早いことも報告されており，たきたのではないかと考えている．しかし，これらの同5）ん白質合成の促進作用が注目されている ．興味深い

時摂取がどのようなメカニズムで筋萎縮を抑制していことに，今回ホエイたん白質を含む食事がユビキチるのかはまだ明らかになっていない．また，本研究でン化酵素であるCbl-bの発現を抑制する傾向を示した．

は，大豆たん白質とホエイたん白質を1:1の割合で配合

ホエイたん白質は筋たん白質の合成系だけでなく，分したものが，最も効果的かつ相加的な筋萎縮抑制効果解系にも影響を与えるのかもしれない．

を示した．おそらく，それぞれの作用を示すためには，前述したように，大豆たん白質が筋たん白質の分解有効成分の必要最小限の量があるのだろう．以上の所抑制に作用するのに対し，ホエイたん白質は筋たん白見を基に，今年度は寝たきりの患者での大豆たん白質質の合成促進に作用する．つまり，大豆たん白質とホとホエイたん白質混合食の有効性を実証するため，徳エイたん白質は，異なるメカニズムで骨格筋萎縮を抑島大学附属病院の関連施設を利用して，大豆たん白質制しうることを示唆している．以上の知見より，筋たとホエイたん白質を1:1の割合で配合したものの食事

ん白質の分解を抑制する大豆たん白質と筋たん白質の介入試験を実施する予定である．

要約

大豆たん白質とホエイたん白質はともに筋萎縮に有効であることが報告されている．しかし，前者は筋たん白質分解系を阻害し，後者は筋たん白質合成系を刺激すると考えられており，その筋萎縮抑制効果のメカニズムは異なるとされている．そこで，我々は，大豆たん白質とホエイたん白質を混合すれば，より強い筋萎縮抑制効果を得られるのではないかと考えた．平成27年度は，大豆たん白質とホエイたん白質を1：1に今後した20%混合たん白質食が，大豆たん白質やホエイたん白質単独で与えるより，坐骨神経切除による筋萎縮に対して強い相加的な抑制効果を示すことを示した．
平成28年度は大豆たん白質とホエイたん白質を1：1だけでなく，2：1または1：2とした混合食をマウスに与え，その効果を比較した．その結果，大豆たん白質とホエイたん白質を1：1の混合食が最も強い筋萎縮効果を示した．

文献1）Nikawa T, Ishidoh K, Hirasaka K, Ishihara I,3）A b e T , K o h n o S , Y a m a T , O c h i A , S u t o

Ikemoto M, Kano M, Kominami E, Nonaka I,T, Hirasaka K, Ohno A, Teshima-Kondo S,Ogawa T, Adams GR, Baldwin KM, Yasui N,

Okumura Y, Oarada M, Choi I, Mukai R, Terao

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12

大豆たん白質研究

Vol. 20（2017）