学術奨励賞受賞論文

性腺系特異的に発現する新規 HMG-box 蛋白質の解析
梶谷宇，水谷哲也，宮本薫

福井医科大学生化学第二講座，科学技術振興事業団・CREST

要旨

体機能不全などの病因解明および治療法の確立など，生殖医療の現場における臨床応用へ向けても非常に重要でわれわれは，種々の細胞生物学的および分子生物学的あると考えられる．われわれはこれまで，卵巣内で発現手法を用いて卵胞発育を司る因子の探索および機能解析しているさまざまな遺伝子を単離し，その遺伝子産物のを行っている．その中で，ラット卵巣 cDNA ライブラ

機能解析を行うことで卵胞発育のメカニズムに迫ること

リーより，転写因子のモチーフである HMG-box モチーを目標として研究を行ってきている．その中で今回は，

フ を 有 す る 新 規 蛋 白 質（Granulosa cell HMG-box

視床下部―下垂体―性腺系に特異的に発現する新規転写protein-1; GCX-1と命名）をコードする遺伝子を単離し，因子 GCX-1を単離し，詳細な解析を行ったのでその結この新規因子の発現様式および機能について解析を行っ果を中心に報告する．

た．この遺伝子の mRNA は視床下部―下垂体―性腺系に特異的な発現が認められ，特に卵巣において強く発現卵巣からの機能的遺伝子の単離していた．卵巣内においては未成熟卵胞の顆粒膜細胞において強い発現が認められた．細胞内では核に存在するある組織で発現している遺伝子を単離する方法としてこ と が 明 ら か と な り，Mammalian GAL4 one-hybrid

これまでに数多くの手法が考案され，さらに改良が重ねsystem により強力な転写活性化能を有していることがられ，効率的な遺伝子のクローニング法が確立されてき示された．以上より，GCX-1は性腺系特異的な新規転ている．その中でもわれわれが主に用いている方法が写活性化因子であることが明らかとなり，卵胞の発育分PCR を利用したサブトラクションクローニング法［１］化に重要な関りをもつことが示唆された．と酵母 one-hybird 法および two-hybrid 法［2, 3］である．
サブトラクションクローニング法はある特定の組織に特はじめに異的に発現している遺伝子群をクローニングする方法であり，ある組織で発現している遺伝子から，別の組織で卵胞発育は，胎生期における原始卵胞の形成に始まり，発現している遺伝子を差し引くことで，その特定の組織ゴナドトロピン非依存性および依存性の発育を経て主席にだけ発現している遺伝子を同定しようとするものであ卵胞が選択され，排卵，黄体形成に至る過程であり，そる．この方法は，同じ組織であっても，発育段階あるいのメカニズムに関しては古くから数多くの研究が行われはホルモン等の刺激の有無による遺伝子発現の違いを見ている．特に，近年の分子生物学，細胞生物学の飛躍的い出すことも可能であるため，われわれはラットをモデな進歩に伴って，これらの手法を用いて，これまで不明ル動物として，ゴナドトロピン刺激によって卵巣内で発であったさまざまな生理現象のメカニズムを細胞レベ現が誘導あるいは抑制される遺伝子群を網羅的に探索

ル，遺伝子レベルで明らかにしようという試みが活発にし，卵胞発育メカニズムの解明への足がかりにすべく研行われている．このような研究は，単に卵胞発育のメカ究を継続している．これまでに，サブトラクションクロニズムを理解するということだけでなく，体外受精―胚ーニング法によって StAR や SR-BI といったステロイ移植（IVF-ET）における効率的な排卵誘発法や，多嚢ド合成に関与する因子群や Epiregulin, Amphiregulin 等

胞性卵巣症候群（PCOS）をはじめとする排卵障害や黄の成長因子の遺伝子が，ラット卵巣においてゴナドトロピン刺激によって早期に発現誘導される遺伝子群として連絡先：梶谷 宇，福井医科大学生化学第２講座，〒910-1193 福井県吉田郡松岡町下合月23-3
TEL: 0776-61-3111
FAX: 0776-61-8102
E-mail: kajitani@fmsrsa.fukui-med.ac.jp

ク ロ ー ニ ン グ さ れ て い る［4-6］． 一 方， 酵 母 onehybrid 法および two-hybrid 法は，ある特定の DNA 配列もしくは蛋白質と，cDNA ライブラリー内のある特定の遺伝子産物との相互作用を酵母内でのレポーターシ

日本生殖内分泌学会雑誌（2003）８：35-39

35

梶谷 宇

他

図１

GCX-1のドメイン構造の模式図

ステムを用いて検出し，ある特定の DNA 配列もしくは蛋白質に結合する蛋白質の遺伝子を同定する方法であり，これまでに Egr-1, USF-2といった転写調節に関わる因子をラット卵巣顆粒膜細胞の cDNA ライブラリーより単離し，機能解析を行ってきた［7, 8］．
以上に紹介した方法では，当然のことながら既知遺伝子のみならず未知遺伝子も数多く単離されてくる．われわれは，サブトラクションクローニング法を用いてゴナドトロピン誘導性新規転写抑制因子 GIOT-1をクローニ

図２

精巣決定因子 SRY の HMG-box モチーフの立体構造ングし，その機能解析を行っているが，標的遺伝子等，その生理機能に関しては不明な点が多い［9 10］．そこで，卵巣内で GIOT-1と相互作用している蛋白質を同定もったポリペプチド鎖が L 字型に配置されており，こすることで GIOT-1の機能解明への手がかりにしようとの L 字型の先端が DNA 鎖の二重らせんにはまりこむこ考え，GIOT-1をおとり蛋白に用いた酵母 two-hybridとで DNA 鎖と結合し，さらに DNA 鎖を折り曲げるこ法によるラット卵巣顆粒膜細胞 cDNA ライブラリーのとで転写調節に関っていることが知られている［11］．

探索を行った．その結果，いくつかの既知の転写制御蛋これまで，数多くの HMG-box 蛋白質が同定され，その白質とともに，新規転写因子様蛋白質の cDNA が単離中には，精巣の発生に深く関与している SRY や Sox9なされた．この新規遺伝子産物は，アミノ酸配列より，転ど，生殖生理現象に深く関っている蛋白質もある［12］．

写 因 子 の DNA 結 合 モ チ ー フ の １ つ で あ る Highさらに最近では，ある HMG-box 蛋白質がステロイドホMobility Group (HMG)-box モチーフを有していること

ルモン受容体と相互作用し，その転写調節能に関っていが示唆され，あとで述べるように視床下部―下垂体―性るとの報告［13］もあることから，卵巣内で発現してい腺系に特異的に発現していることから，卵胞発育をはじる GCX-1も同様に，卵胞発育をはじめなんらかの生殖め生殖生理現象に深く関与している新規転写因子である生理現象に関っているのではないかと考えられた．
また，と 考 え ら れ る．そこでわれわれは， 新たにこ の因 子

GCX-1は HMG-box モチーフの他にも，核局在シグナ（Granulosa cell HMG-box protein-1; GCX-1と命名）にル（NLS）やセリン，リジン，プロリンといった特定のついて詳細に解析を行うこととした．

アミノ酸に富む領域も有しており，典型的な転写制御因子様の蛋白質であると推定された．

GCX-1の発現解析

発現解析においては，まず，GCX-1遺伝子発現の組織分布を調べたところ，図３のように視床下部，下垂体，図１には GCX-1のドメイン構造を模式的に示した．

精巣，子宮および卵巣にのみその発現が確認された．こ

全長473アミノ酸よりなり，N 末端と C 末端のちょうどのような組織分布を示す転写因子としては，先述の中 ほ ど に HMG-box モ チ ー フ を ひ と つ 有 し て い る．

GIOT-1や，ステロイド合成に深く関っている Ad4BP/

HMG-box モチーフは，酵母から植物，昆虫，哺乳類にSF-1や Dax-1等があげられるが，いずれも，副腎にもいたるまで真核生物に広く分布している DNA 結合モチその発現が認められており，厳密に生殖系でのみ働いてーフである．図２のように３本のα - へリックス構造をい る転 写 因 子で あ る と は い え な い．し か し ながら，

36日本生殖内分泌学会雑誌

Vol. 82003

性腺系特異的に発現する新規 HMG-box 蛋白質の解析

図３

図４GCX-1 mRNA の組織分布
視床下部，下垂体，精巣，子宮，卵巣においてのみ発現しており，特に卵巣において強い発現が認められる．

図５

Mammalian GAL4 one-hybrid システム
GAL4 DNA 結合ドメイン（DBD）と融合させた目的の蛋白質をレポーター上に強制配置させることで転写制御能を調べる．

図６

GCX-1の転写活性化能
GAL4 DBD-GCX-1融合蛋白発現ベクターの用量依存的に転写活性化能の顕著な増大を確認した．E1b/Luc は GAL4結合配列を持たないレポーターである．

ハイブリダイゼーションによる卵巣内の各発育段階における GCX-1 mRNA の発現解析
左から，8日齢，21日齢，8週齢ラット卵巣．未成熟な卵胞では非常に強い発現が認められるが卵胞の発育とともに発現量は低下し，黄体（CL）ではごくわずかに発現しているのみである．
Scale bar=0.2 mm

GCX-1は副腎での発現が認められず，生殖機能に特化して機能している転写因子である可能性が強く示唆された．続いて，ハイブリダイゼーションによる卵巣内における発現パターンの解析を行ったところ，図４のように，未成熟卵胞の顆粒膜細胞中に強く発現していることが分かった．この発現は，卵胞発育に伴って顕著に減少していき，黄体化細胞においてはごくわずかに発現しているのみであることが明らかになった．以上のことから，GCX-1は卵胞発育，特に，初期のゴナドトロピン非依存性発育に重要な役割を果たしている可能性が考えられた．しかしながら，初代培養のラット卵巣顆粒膜細胞を用いたゴナドトロピン刺激試験においては，
GCX-1 mRNA は FSH, hCG 刺激によって発現量が変化せず，ゴナドトロピン刺激による直接の発現調節は受けていないことが示唆された．単離した顆粒膜細胞中ではゴナドトロピン刺激による発現調節を受けていないのに，生体内では卵胞発育のステージが進むにつれて発現量が低下するという事実より，GCX-1の発現調節には，ゴナドトロピン刺激が直接関っているというよりもむしろ，卵母細胞や莢膜細胞との相互作用，あるいは，オー蛋白（GFP）との融合蛋白質を用いた実験で明らかとな

トクライン的，パラクライン的に発現調節に関わる因子

り，さらに，この局在には，アミノ酸配列より推定されの 存 在 が 重 要 なのではないかと思 われた．続 い て，

た NLS 領域が必須であることが分かった．また，ウエ

GCX-1は細胞内において核に局在することが緑色蛍光

スタンブロット法によりラット卵巣顆粒膜細胞抽出液の学術奨励賞受賞論文37

梶谷 宇他

核画分から GCX-1蛋白質が検出されたことと合わせ，GCX-1遺伝子をクローニングし，その詳細な解析を行

GCX-1は実際にラット卵巣顆粒膜細胞中で転写調節にってきた．GCX-1 mRNA は視床下部―下垂体―性腺系関っている可能性が示唆された．

において特異的に発現しており，特に卵巣内において未成熟卵胞の顆粒膜細胞において強く発現していた．副腎GCX-1の転写調節能解析や胎盤での発現は認められなかったことと合わせて考えると，GCX-1蛋白質は，卵巣内ではゴナドトロピン依続いて，培養細胞を用いて GCX-1の転写制御能の解存性の卵胞発育やステロイド産生よりも，むしろ初期の析を行った．GCX-1は新規の遺伝子産物であり，HMG-ゴナドトロピン非依存性発育に関与していると思われbox モチーフを有していることから DNA 結合性ではある．ゴナドトロピン非依存性の卵胞発育には，卵巣局所ると考えられるが，実際の標的配列などはまだ明らかでで産生される局所因子の関わりが重要視されており［15，は な い． そ こ で， そ の 転 写 調 節 能 を 調 べ る た め，16］，GCX-1はこれらの因子の発現調節に関っているか

Mammalian GAL4 one-hybrid システム［14］を用いたもしれない．今後さらなる解析を行って，GCX-1の生解析を行った．Mammalian GAL4 one-hybrid システム

理作用についても明らかにし，これまでの成果と合わせ，とは，図５に示すように，酵母の転写因子 GAL4の結合複雑な卵胞発育のメカニズム解明へとつなげていきたい配列を上流に配置したレポーター遺伝子と，DNA 結合と考えている．

能の分からない蛋白質を GAL4の DNA 結合ドメイン(DBD) と融合させた蛋白質の発現ベクターとを同時に哺乳類細胞に導入し，転写制御能を調べたい蛋白質を強制的にレポーター上に配置させることでその転写制御能を解析する方法である．GCX-1と GAL4 DBD との融合蛋白質発現ベクターを構築してヒト肝癌由来 HepG2細胞にレポーターとともに導入し，転写制御能の検討を行った．その結果，発現ベクターの用量依存的な転写活性化能の増大を確認した．発現ベクターの用量がごく少量でも十分な転写活性化能がみられたことから，GCX-1は非常に強力な転写活性化因子であることが示唆された．続いて，GCX-1蛋白質中における転写活性化能に必須のドメイン検索を，さまざまな長さに欠損させた
GCX-1蛋白質と GAL4 DBD との融合蛋白質を用いて同様の系で行った．その結果，N 末端側25〜63アミノ酸領域が転写活性化に必須の最小領域であることが分かった．さらに，変異導入により，転写活性化に関る重要なアミノ酸残基の同定を試みたが，さまざまな変異体を作製した結果，どれも一様に転写活性化能が低下していたことから，この領域全体の構造が転写活性化には重要であると考えられた．この25〜63アミノ酸領域は，明確な二次構造をもたないと予測され，既知の転写活性化モチーフとも相同性を示さないことから，新たな転写活性化ドメインとしても興味深い．

おわりに以上，本研究では，卵胞発育に関与する遺伝子群の検索の過程において，ラット卵巣顆粒膜細胞 cDNA ライ
ブ ラ リ ー よ り， 新 規 の HMG-box 転 写 活 性 化 因 子38

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謝辞
本稿は2002年度日本生殖内分泌学会学術奨励賞の受賞対象になった研究をまとめたものですが，本奨励賞にご推薦くださいました日本生殖内分泌学会理事長 青野敏博先生に心より感謝いたします．また，本稿の執筆の機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会広報担当理事 西原真杉先生に深く感謝いたします．また，研究遂行に際しご助言，ご協力をいただきました福井医科大学第二生化学講座諸氏に感謝の意を表します．

文

献１．Gurskaya NG, Diatchenko L, Chenchik A, Siebert PD,
Khaspekov GL, Lukyanov KA, Vagner LL, Ermolaeva OD,Lukyanov SA, Sverdlov ED (1996) Equalizing cDNA subtraction based on selective suppression of polymerase chain
reaction: Cloning of jurkat cell transcripts induced by phytohemaglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal Biochem 240, 90-97.
２．Chevray PM, Nathans D (1992) Protein interaction cloningin yeast: Identification of mammalian proteins that reactwith the leucine zipper of Jun. Proc Natl Acad Sci USA 89,5789-5793.
３．Wang MM, Reed RR (1993) Molecular cloning of the olfactory neuronal transcription factor Olf-1 by genetic selection inyeast. Nature 364, 121-126.
４．Mizutani T, Sonoda Y, Minegishi T, Wakabayashi K,
Miyamoto K (1997) Molecular cloning, characterization andcellular distribution of rat steroidogenic acute regulatory
protein (StAR) in the ovary. Life Sci 61, 1497-1506.
５．Mizutani T, Sonoda Y, Minegishi T, Wakabayashi K,Miyamoto K (1997) Cloning, characterization, and cellular
distribution of rat scavenger receptor class B type I (SRBI)
in the ovary. Biochem Biophys Res Commun 230, 518-523.

性腺系特異的に発現する新規 HMG-box 蛋白質の解析

６．Sekiguchi T, Mizutani T, Yamada K, Yazawa T, Kawata H,
Yoshino M, Kajitani T, Kameda T, Minegishi T, Miyamoto K(2002) Transcriptional regulation of epiregulin gene in therat ovary. Endocrinology 143, 4718-4729.
７．Yoshino M, Mizutani T, Yamada K, Tsuchiya M, MinegishiT, Yazawa T, Kawata H, Sekiguchi T, Kajitani T, MiyamotoK (2002) Early growth response gene-1 regulates the expression of the rat luteinizing hormone receptor gene. BiolReprod 66, 1813-1819.
８．Yamada K, Mizutani T, Shou Z, Yazawa T, Sekiguchi T,
Yoshino M, Inazu T, Miyamoto K (2001) Cloning and functional expression of an E box-binding protein from rat granulosa cells. Biol Reprod 64, 1315-1319.
９．Mizutani T, Yamada K, Yazawa T, Okada T, Minegishi T,Miyamoto K (2001) Cloning and characterization of gonadotropin-inducible ovarian transcription factors (GIOT1 and-2) that are novel members of the (Cys)2-(His)2-type zincfinger protein family. Mol Endocrinol 15, 1693-1705.
10．Yazawa T, Mizutani T, Yamada K, Kawata H, Sekiguchi T,Yoshino M, Kajitani T, Shou Z, Miyamoto K (2003) Involvement of cyclic adenosine 5 -monophospate response element-binding protein, steroidogenic factor 1, and Dax-1 inthe regulation of gonadotropin-inducible ovarian transcrip-tion factor 1 gene expression by follicle-stimulating hormone
in ovarian granulosa cells. Endocrinology 144, 1920-1930.
11．Thomas JO, Travers AA (2001) HMG1 and 2, and relatedarchitectural DNA-binding proteins. Trends Biochem Sci
26, 163-174.
12．Clarkson MJ, Harley VR (2002) Sex with two SOX on: SRYand SOX9 in testis development. Trends Endocrinol Metabol
13, 106-111.
13．Boonyaratanakornkit V, Melvin V, Prendergast, P, Altmann
M, Ronfani L, Bianchi ME, Taraseviciene L, Nordeen SK,
Allegretto EA, Edwards DP (1998) High-mobility groupchromatin proteins 1 and 2 functionally interact with steroid
hormone receptors to enhance their DNA binding in vitro
and transcriptional activity in mammalian cells. Mol Cell Biol18, 4471-4487.
14．Webster N, Jin JR, Green S, Hollis M, Chambon P (1988)
The yeast UASG is a transcriptional enhancer in human
HeLa cells in the presence of the GAL4 trans-activator. Cell52, 169-178.
15．Richards JS (2001) Perspective: The ovarian follicle-a perspective in 2001. Endocrinology 142, 2184-2193.
16．Epifano O, Dean J (2002) Genetic control of early folliculogenesis in mice. Trends Endocrinol Metab 13, 169-173.

学術奨励賞受賞論文39