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Food and Environmental

The Power of Precision

CE-SDS方法对婴儿配方奶粉中乳清蛋白的定量分析
Quantiﬁcation of Whey Protein Content in Infant Formula by CE-SDS
高铁1，陈泓序1，吴建华1，冯慿2
Gao Tie1, Chen Hongxu1, Wu Joshua1, Feng Ping2
1

SCIEX，中国；2 惠氏营养，中国
1SCIEX, China; 2 Wyeth, China

Key words: capillary electrophoresis, infant formula, content ofwhey protein, SDS

2.2 样品前处理
乳品蛋白标准品混合物
根据配方奶粉中的含量比例，取相应质量的蛋白标准品，溶1. 前言乳清蛋白作为一组从乳清中分离出来的球状结构的蛋白，是于水中，配置成乳品蛋白标准品混合物。
表1. SDS-MW分子量分析试剂盒。

人体生长、发育、增强机体抵抗力首选的蛋白来源，也是婴儿配货号项目338451

50 μm 内径毛细管

A30341

SDS凝胶缓冲液

面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）和β-巯基乙醇，在加热的条件

A26487

10 kDa 标准品下，蛋白质间的分子间力和二硫键断开，SDS结合到蛋白质分子

A22196

不同分子量标准品方奶粉中重要配方成份。
本技术说明采用CE-SDS的方法定量分析乳清蛋白在婴儿配方奶粉的蛋白中百分含量。通过在配方奶粉样品中加入阴离子表上，形成带负电的蛋白质与SDS的复合物。该复合物进入填装了分SDS样品缓冲液离凝胶的电场后，在电压的驱动下迁移至检测窗口而被检测。奶

0.1N 碱洗液

粉中的乳清蛋白和乳酪蛋白被分离成两组不互相干扰的蛋白质峰

0.1N 酸洗液

组，根据这两组蛋白质组的峰面积，以及乳清蛋白对乳酪蛋白的质量对面积校正系数1.4，利用峰面积归一化法，计算出乳清蛋白
在奶粉总蛋白质中的百分含量。

婴儿配方奶粉2. 材料和方法
2.1 试剂
SDS-MW分子量分析试剂盒（SCIEX，PN 390953），所含试剂称取100 ± 4 mg婴儿配方奶粉，置于1.5 mL离心管中，加入水
到1 mL刻度，涡旋振荡，至充分溶解并混合均匀。

变性过程

见表1；β-巯基乙醇（Sigma，PN M7154或M6250）；乳品蛋白标

以SDS样品缓冲液与10 kDa Marker为84:1 μ L体积比例配置分

准品（Sigma：α-乳白蛋白，L6010；β-乳球蛋白，L3908; 免疫析预备液，用移液器将10 μL的婴儿配方奶粉和蛋白标准品混合溶球蛋白，I5506; 牛血清白蛋白，A1933；β-酪蛋白，C6905；αS-液，分别移入至1.5 mL离心管中，然后相继加入85 μL分析预备液、酪蛋白，C6780；κ-酪蛋白, C0406；ALAR Ingredient：酪蛋白糖巨

5 μL β-巯基乙醇，混合并涡旋振荡，盖紧瓶盖。在水浴或金属浴肽）和婴儿配方奶粉由国内某厂家提供；去离子水（Millipore）。

中加热样品100 ± 5 ℃ 10 min，冷却样品至室温，列入样品盘。

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Pic‐2图1. 毛细管预平衡程序。

图 2. 分离程序。

2.3 运行条件及方法
SCIEX PA 800 Plus 药物分析系统；检测器：PDA，220 nm，采集
频率：2 Hz；样品室温度：25 ℃；毛细管温度：25 ℃；窗口狭缝：2号（100×200 μm）；毛细管：熔融石英毛细管，50 μ m内径，20/30 cm有效/总长。毛细管预平衡和分离时间程序如图1和图2。

3. 数据处理

3.2 含量测定
按照公式（1）和（2）计算乳清蛋白在婴幼儿配方奶粉中的含量：
Aw.c. = 1.4×Aw

式中：Aw.c. – 乳清蛋白校正峰面积；Aw – 总乳清蛋白实测峰面积；
1.4 – 校正因子

3.1 积分方法
完成采集后，需要使用32 Karat™软件进行积分处理。首先要进行凯撒积分的关闭，从32 Karat™软件工具栏中以仪器管理员(1)

乳清蛋白含量（%）= Aw.c./(Aw.c.+Acn)×100(2)式中：Acn – 总乳酪蛋白实测峰面积身份登录，然后选择使用的仪器模块，在仪器配置中关闭凯撒积分。

4. 结果分析积分乳品蛋白混合物标准品电泳图：对照试剂空白，确定乳

清蛋白和乳酪蛋白标准品的位置，进行数据的积分处理。
积分婴儿配方奶粉电泳图：对奶蛋白的第一个乳清蛋白峰
组和乳酪蛋白峰组进行自动积分，积分起始时间是10 kDa内标前
小峰开始（大约内标前0.4 min），结束时间是酪蛋白结束的位置；根据乳品蛋白混合物标准品所得的酪蛋白组起始和终止的
出峰迁移时间，确定酪蛋白峰组。用手动积分从酪蛋白后到第乳品蛋白标准品混合物
乳清蛋白（α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白糖巨肽、免疫球蛋白和血清白蛋白）和乳酪蛋白（β-酪蛋白，αS-酪蛋白，κ酪蛋白）标准品的CE-SDS分离结果如图3所示。乳酪蛋白刚好移动到免疫球蛋白的轻链和重链之间, 而没有主要乳清蛋白在此间出峰,
乳清蛋白组和乳酪蛋白组完全分离, 互不干扰。

二个乳清蛋白峰组后的基线，得到乳酪蛋白后的相对分子质量
高的乳清蛋白。

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5. 结论利用毛细管凝胶电泳（CGE）对乳清蛋白在婴儿配方奶粉的总蛋白中含量的测定，可将乳清蛋白和乳酪蛋白按照峰组进行区分，达到定量乳清蛋白的测定。经过多方验证，方法稳定重现。
通过每个厂家的样品测定，结果反馈符合厂家预期，方法可提供
准确的婴儿配方奶粉的总蛋白中乳清蛋白含量信息1。

参考文献
图3. 乳品蛋白标准品混合物CE-SDS分离的电泳图。

1. Ping.Feng, Christophe Fuerer, Adrienne McMahon.
Quantification of Whey Protein Content in Infant Formulas bySodium Dodecyl Sulfate-Capillary Gel Electrophoresis (SDS-CGE):婴儿配方奶粉Single-Laboratory Validation, First Action 2016.15; Journal of按照中国国标GB 10765 的定义：婴儿奶粉是“指以乳类及乳AOAC International Vol. 100, No.2, 2017.

蛋白制品为主要原料，加入适量的维生素、矿物质和/或其他成分，仅用物理方法生产加工制成的液态或粉状产品。”婴儿配方奶粉中蛋白的CE-SDS分析电泳图见图4。经计算，此婴儿配方奶粉Pic‐4
中乳清蛋白含量为61.97%。

图4. 婴儿配方奶CE-SDS分离的电泳图（图中2号峰为10 kDa内标）。

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