研究フロンティア（平成２４年度学術奨励賞受賞論文）

ヒト子宮内膜再構成システムを用いた in vivo 幹細胞アッセイの開発と内膜幹細胞の同定
宮﨑薫１），丸山 哲夫１），升田 博隆１），小田 英之２），内田 明花１），内田浩１），吉村 𣳾典１）

）慶應義塾大学医学部産婦人科学教室）永寿総合病院産婦人科

はじめに

ESP および EMP の表面マーカー発現

ヒト子宮内膜はホルモン制御下に各月経周期で再生・良性疾患による腹式単純子宮全摘術を施行する患者

分化・剥離を遂げる非常に再生能力の高い組織であり（年齢３８〜４９歳）から文書による同意を得たうえで，摘［出子宮から子宮内膜（n＝］，この周期的な再生には子宮内膜幹/前駆細胞が寄；移植用に例，系譜マー与すると考えられる．近年，子宮内膜幹/前駆細胞の存

カー発現解析用に在とその役割を示唆する所見がわれわれを含めたいくつ，Hoechst ３３３４２
処理にて子宮内膜細胞を単離し［４，１４］

かのグループにより報告されてきた［―］．子宮内膜

幹/前駆体細胞の候補となる細胞集団として，クローン例）を採取した．機械的処理・酵素にて染色して，フローサイトメトリーにて ESP およびEMP を同定・分離した［４，１５，１６］（図A）．ESP と］，子宮内膜 side population（SP）

EMP における系譜マーカーの発現をフローサイトメト，CD１４０b＋CD１４６＋間質細胞［１０］，CD細胞［４，６―９］リーで解析した．その結果，上皮細胞マーカー CD３２６

２９＋CD７３＋CD９０＋間質細胞［１１］，W５C５＋間質細胞［１２］および間質細胞マーカー CD１０の発現は両者で有意差をが挙げられる．しかしながら，in vivo での幹細胞活性

６±４．
１％ vs. ３８．
４±８．
３％；
認めなかった（CD３２６，２６．

を解析する有力なアッセイ系が今までに存在しなかったCD１０，１３．
９±４．
５％ vs. ２３．
３±１０．
３％）（図

ため，どの細胞集団が真の子宮内膜幹/前駆細胞分画で方，血管内皮細胞および間葉系幹細胞マーカー（CD３１，あるのか，一致した見解が得られていない．SP 細胞は，は ESP で有意に高値を示した（CDCD３４，および CD１４６）

ATP-binding cassette transporter G２（ABCG２）によっ

３１，５１．
４±６．
６％ vs. １４．
３±３．
９％，P＜０．
０１；CD３４，原性子宮内膜細胞［B）．一て DNA 結合色素である Hoechst ３３３４２を排出するとい４５．
７±７．
１％ vs. １２．
４±３．
５％ ， P ＜０．
００５； CD１４６，．多くの組織に SP 細胞が存在し，う特性をもつ［１３］２４．
５％ ±３．
５vs. ２．
３±０．
５％，P＜０．
００５）（図

組織特異的幹細胞候補として報告されている［１３］．わまた，子宮内膜の間葉系幹細胞様細胞と報告されている

れわれは以前，ヒト子宮内膜 side population 細胞（ESP）

CD１４０b＋CD１４６＋細胞［１０］の割合は，EMP よりも ESPの免疫不全マウスへの異種移植により，in vivo での子宮内膜様組織の再構成に成功した［］．子宮内膜 mainB）．

１±０．
９％ vs. １．
５±０．
５％，P＜で有意に高かった（４．
０．
０５）
（図C）
．

population 細胞（EMP）にはこの組織再構築能がないことから，ESP は幹細胞様性質を示すといえる．しかし再構築率は％と低く［ESP および EMP を用いた in vivo 幹細胞アッセイ］，その原因として ESP 単独

では幹細胞活性を支持するのに十分な微小環境（ニッチ）

赤 色 蛍 光 タ ン パ ク の 一 種 で あ る tandem Tomatoを確保することができないことが考えられた．本研究は，（TdTom）および発光タンパクの一種である red-emitting

細胞追跡と組織再構成システムを応用した斬新な子宮内firefly luciferase の同時発現が可能な自己不活化 HIV―１

膜幹細胞 in vivo アッセイを確立すること，そしてこの由来レンチウィルスベクターを ESP あるいは EMP（そアッセイの使用を通して ESP の幹細胞特性を調べるこ

れぞれとを目的とした．

９×１０５細胞）と各々混合標識していない全内膜細胞（４．

連絡先：宮﨑 薫，慶應義塾大学医学部産婦人科学教室〒１６０―８５８２ 東京都新宿区信濃町３５
TEL ：０３―３３５３―１２１１
FAX：０３―３３５２―１５９８
E-mail：inquirer８３＠yahoo.co.jp

×１０４細胞）に感染させて標識した．これらをし（ESP-graft，EMP-graft），NOD/Shi-scid，IL―２Rγnull（NOG）マウス［１７］の右腎被膜下に移植した（図）．

内因性卵巣ホルモンの影響を除去するため，移植時に両側 卵 巣 摘 出 を 行 い，１７β-estradiol お よ び progesterone

日本生殖内分泌学会雑誌（2013）18 : 21-25

21

宮﨑薫

他

図ESP と EMP の分離および細胞表面マーカー発現（A）ヒト子宮内膜からの子宮内膜細胞の単離および Hoechst ３３３４２で染色した子宮内膜細胞からの ESP・EMP の分離．５０μM reserpine 存在下にて ESP 分画の消失が確認できる．
（B）ESP・EMP の細胞表面マーカー発現．＊P＜０．
００５．＊＊P＜０．
０１．
（C）ESP・EMP における CD１４０b＋CD１４６＋細胞の割合．＊P＜０．
０５．
〈Miyazaki K, et al, PLoS One ２０１２より引用〉

E2+P4E2+P4

図ESP・EMP を用いた in vivo ヒト子宮内膜幹細胞アッセイ E２＋P４：１７β-estradiol および progesterone の投与〈Miyazaki K, et al, PLoS One ２０１２より引用〉を投与した．

化マーカー（間質：ビメンチン［Vm］，腺上皮：サイトケラチン［Ck］，平滑筋：平滑筋アクチン［Sm］，血管内皮：CD３１）のいずれかと TdTom の再構築組織の組織学的解析

重免疫染色を行った．分化マーカー・TdTom 共陽性細胞/分化マー週間後に右腎を摘出して組織切片を作製したとこ

カー陽性細胞（%DPC/MPC ）が各構成成分への TdTomA）．

陽性細胞の寄与を反映すると考え，これを ESP-graft とH＆E 染色にて，同部位は腺腔構造をもった子宮内膜様EMP-graft 各々３６視野について TissueQuestTM を用いて構造物であることが示された（図B）．すべての移植定量的に解析・比較したところ，間質，腺上皮，血管内細胞から内膜様組織が再構築された．内膜構成成分の分皮にて，ESP-graft の%DPC/MPC は EMP-graft よりも有ろ，移植部位に一致して囊胞状構造物を認めた（図22

日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013

in vivo ヒト子宮内膜幹細胞アッセイ

図In vivo 幹細胞アッセイにて再構築された組織の所見（A）肉眼所見にて，移植部位に一致して囊胞状構造物が認められる．
（B）H&E 染色にて，同部位は腺腔構造をもった子宮内膜様構造物であることが分かる．
〈Miyazaki K, et al, PLoS One ２０１２より引用〉

意に高値であった（Vm：２６．
２±３．
４％ vs１１．
０±２．
６％，での ESP の分化を観察できるのも利点である．本研究

０００５； Ck ：５８．
７±５．
６％ vs３６．
９±５．
３％ ， P ＜P ＜０．

で新たに開発された in vivo 子宮内膜幹細胞アッセイ

０．
０１；CD３１：３１．
９±６．
０％ vs６．
８±４．
３％，P＜０．
０００５）

は，今までに報告された，あるいはこれから発見される（図であろうヒト子宮内膜幹/前駆細胞の同定及び評価に有）
．

用である．
おわりに謝
このアッセイでは，細胞追跡と組織再構成システムを応用することで，再生組織内における ESP の分化を観察することができた．ESP は EMP と比較して，上皮，辞

本稿は２０１２年度に日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞した研究内容をまとめたものである．本稿の執筆の機会を与えてくださいました日本生殖内分泌学会理事長 苛原 稔教授，第１７回学術集会会長 吉村𣳾典教授に感謝いたします．

間質，内皮細胞への分化の寄与が有意に高かった．この結果は，ESP 分画が子宮内膜構成要素に分化できる幹/前駆細胞を EMP 分画よりも高い割合で含むことを示唆

引用文献している．実際，子宮内膜の間葉系幹細胞様細胞と報告されている CD１４０b＋CD１４６＋細胞［１０］の割合は，EMPよりも ESP で有意に高かった．以前の報告および今回の結果により，ESP は子宮内膜幹/前駆体細胞候補である可能性が高いと考えられるが，ESP 分画の構成にはつの可能性がある．第に，すべての子宮内膜構成要素を作り出すことのできる多能性幹細胞が含まれるかもしれない．第に，各子宮内膜構成要素の前駆細胞が全て含まれているという可能性もある． ESP 分画が上皮，間質，内皮マーカー陽性細胞を含むという今回の結果にもとづくと，後者の可能性のほうが高いと考えられる．
本研究にて，各子宮内膜構成成分への ESP 分画の分化を追跡できる，斬新な in vivo 子宮内膜幹細胞アッセイを確立した．このアッセイにおける子宮内膜組織再構
成 の 効 率 は１００％で あ り，ESP 単 独 移 植 で は％と 低かったことを考慮すると再現性の面で大きなメリットがある．また，ニッチ存在下，すなわちより生理的な環境．Maruyama T, Yoshimura Y（２００８）Molecular and cellularmechanisms for differentiation and regeneration of theuterine endometrium. Endocr J ５５, ７９５-８１０.
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23

薫他

ESP-graft

宮﨑

ESP-graft
ESP-graft

EMP-graft

EMP-graft

ESP-graft

EMP-graft

ESP-graft

EMP-graft

ESP-graft

EMP-graft

EMP-graft

図24

ESP-graft 移植腎および EMP-graft 移植腎における各子宮内膜系譜マーカーと TdTom の共発現〈Miyazaki K, et al, PLoS One ２０１２より引用〉
日本生殖内分泌学会雑誌

Vol.18 2013

in vivo ヒト子宮内膜幹細胞アッセイ

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研究フロンティア

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