2あいち産業科学技術総合センター

研究報告2023

研究論文

酵 母 の育 種 を目 指 したシ ンク ロ トロ ン光 の最 適 照 射 条 件 の 検 討
杉 山 信 之 *1 、 三 井 俊 * 2 、 家 田 明 音 *3 、 野 本 豊 和 *4 、 柴 田 佳 孝 *5

Op ti miza tion Stu d y of Ir r adi ation Con diti on s for Yeas t Br ee din g b ySynchrotron R ad ia tion
Nobuyuki SUGIYAMA *1 , Shun MITSUI *2 , Akane IEDA *3 , Toyokazu NOMOTO *4 andYoshitaka SHIBATA *5
Research Support Department * 1 * 4 * 5 Food Research Center *2 *3
 あ い ち シ ン ク ロ ト ロ ン 光 セ ン タ ー BL8S2 に て 酵 母 に 様 々 な 条 件 で シ ン ク ロ ト ロ ン 光 照 射 実 験 を 行 い 、突然変異株を取得することにより、シンクロトロン光照射による 菌体育種の最適な照射条件を検討した。
酵母の生菌率は吸収線量の増加に伴ってほぼ指数関数的に減少するが、低エネルギーの割合が 大きくなるフィルターを用いるとその減少が顕著になった。一方、シクロヘキシミド耐性変異が入る確率は吸収線量の 3 乗に比例して増加した。これらの結果から、変異率の極大値は線量率に相関して増加すると判明した。

1. はじめに得られた酵母は遠心分離で上清を取り除いた後、滅菌水

 普通酒比率の高い愛知県の清酒業界において、特徴ので洗浄した。洗浄後の酵母を再び滅菌水で懸濁させた後、ある酵母の育種は、県産の清酒の知名度を向上し、中小0.5mL マイクロチューブに分注して再び遠心分離を行

清酒企業の活性化のために重要である。当センターではい、上清を除いたものを照射用の試料とした。なお、一

これまで、知の拠点あいち重点研究プロジェクトⅡ期等部の実験では分注後のマイクロチューブをそのまま照射の研究課題において、シンクロトロン光を用いた酵母の図 1 に示す。に用いた。照射の様子の概観を図

育種が行われてきており、尿素非生産性の酵母を取得することに成功するなど一定の成果が得られている 1)。しかしながら、シンクロトロン光照射による育種における系統的なデータの取得、最適な照射条件の検討は行われていなかった。本研究では、酵母を例に様々な条件でシンクロトロン光照射実験を行い、突然変異株を取得することにより、シンクロトロン光照射の特徴を抽出し、酵母へのシンクロトロン光照射による育種の最適な照射条件を検討することを目的とした。

2 . 実験方 法 

図 1 照射の様子概観
 照射はあいちシンクロトロン光センターBL8S2 の白

2 . 1 供 試 菌 株 と使 用 培 地色光を用いた。単位時間あたり照射される線量である線 実験には、愛知県吟醸酒用酵母(FIA2)を親株とし、2量率を制御するため、照射試料前に適切な金属箔フィル度のシンクロトロン光照射にて尿素非生産性、高香気性ター(以下フィルター)を設置した。また、試料への照射を付与した菌株を用いた。酵母の照射前培養には麹エキはポリプロピレン製のマイクロチューブ越しに行い、1ス培地を使用した。酵母数の測定は YPD 寒天培地を用条件につき 3 本照射することで、誤差の評価を行った。

いて行った。一方、シクロヘキシミド耐性菌数の測定は、総線量の影響を確認するため、照射時間は 0 秒(未照シクロヘキシミド 1μg/mL 含有 YM 培地を用いた。

射)~300 秒とした。

2. 2 照射方法

2. 3 生菌率の計 数方 法

 酵母を 48 時間 37℃で振とう培養することで増殖させ、

 未照射試料・照射後試料に対し、それぞれ滅菌水*1

共同研究支援部 シンクロトロン光活用推進室 *2 食品工業技術センター 発酵・バイオ技術室（現産業振興課）
発酵・バイオ技術室 *4 共同研究支援部 シンクロトロン光活用推進室（現あいちシンクロトロン光センター） *5 共同研究支援部 シンクロトロン光活用推進室（現共同研究支援部 計測分析室）*3 食品工業技術センター3行った。各フィルターを用いた場合における酵母吸収エ

ついて YPD 寒天培地を用いて酵母数を測定した。得ら

ネルギーの X 線エネルギーとの関係(計算値)を図
図 3 に示れた酵母数について、未照射試料の酵母数に対する酵母す。各フィルターでの線量率は図 3 を積分することで得数を生菌率とした。

られ、それぞれ 16.6Gy/sec、4.2Gy/sec である。
×1012
Al0.5mm2.5
Al2.0mm2.02. 4 変異率の算 出方 法
 未照射試料・照射後試料に対し、それぞれ滅菌水0.5mL を加えて懸濁させたものを用意し、それぞれをシクロヘキシミド含有培地に接種した。37℃4 日間培養後、大きさが φ1mm を超えたコロニーをシクロヘキシミド耐性菌由来とし、その数を変異数として計数した。
未照射試料の酵母数に対する変異数を変異率とした。

酵母吸収エネルギー(eV/sec)

0.5mL を加えて懸濁させたものを用意し、それぞれに

3 . 実験結 果 及び考 察 

1.51.00.50.036912 15 18 21 24 27 30
照射エネルギー(keV)
図 3 酵母吸収エネルギーの分布（計算値）

3 .1 照 射 時 の 水 の 有 無 の 評 価 照射試験の結果、得られた生菌率・変異率と照射時間

 照射時に水が共存する場合としない場合について、生図 4 に示す。大線量率の場合、単位時間当たとの関係を図

菌率と変異率にどのような影響を与えるか検討した。フりの生菌率の減少が著しく高かった。一方、変異率につィルターに 0.5mm の Al 板を用い、上清を取り除いたもいては、ピークとなる照射時間は違うものの、線量率にのと取り除かなかったものに同条件で照射試験を行った。

よる大きな違いは観察されなかった。なお、横軸を吸収
図 5 のようになっ線量としてグラフを作成したところ、図す。生菌率については水の共存の有無にかかわらず、ほた。生菌率は線量率にかかわらず、吸収線量に従って減ぼ同等に減少した。一方、変異率は水が共存する場合に少したが、変異率に単純な相関関係は見られなかった。
1.E+1
Al0.5mm
1.E+0
Al2.0mm

おいて、著しく低いという結果が得られた。少なくともシクロヘキシミド耐性の変異に関しては、水の共存は悪影響を与えることが示唆されたため、今後の実験はすべて上清を取り除いた状態で照射を行った。
1.E+1
水なし
懸濁

生菌率

1.E+0
1.E-1

生菌率

図 2 に示得られた生菌率と変異率の照射時間との関係を図

1.E-1
1.E-21.E-3

1.E-4

1.E-2

1.E-40500

x 10-61210001500
吸収線量(Gy)

2500

水なし
懸濁10
変異率

200086

変異率

1.E-3353025201510500100
x 10-6Al0.5mm200300照射時間(sec)

400

200
300
照射時間(sec)

400

Al2.0mm0100

図 4 各フィルターでの生菌率と変異率の比較

423 . 3 照 射 エネ ル ギー によ る 違 い0

 照射 X 線エネルギーによる影響を検討するため、フィ0500

1000
1500
吸収線量(Gy)

20002500

図 2 懸濁有無による生菌率と変異率の比較

ルターとして Cu を用いた場合と Al を用いた場合で比較を行った。線量率が Al とほぼ同じになるように、Cuについては 0.02mm と 0.07mm のフィルターを用いた。

3. 2 線量率の影 響の評 価

各フィルターを用いた場合における酵母吸収エネルギー 線量率を変化させるため、フィルターとして Al 板の X 線エネルギーとの関係(計算値)を図
図 6 に示す。Cu(0.5mm 及び 2.0mm)を用いた場合における照射試験を

は 9keV 付近に吸収端が存在するため、低エネルギーX

4

あいち産業科学技術総合センター

少なくとも Cu の 0.07mm のフィルターは微生物育種に線の量が相対的に大きくなる。
1.E+1

Al0.5mm
Al2.0mm

不向きであることが示唆された。

1.E-1
1.E-2

生菌率

生菌率

1.E+0

1.E-3

3530252015
10500x 10-65001000
吸収線量(Gy)

1500

Al0.5mm
Al2.0mm

500
1000
1500
吸収線量(Gy)
図 5 各フィルターでの生菌率と変異率の比較(横軸が吸収線量の場合)

吸収エネルギー (eV/sec)

1.E+1
1.E+0
1.E-1
1.E-2
1.E-3
1.E-4
1.E-5
1.E-6

変異率

変異率

1.E-404.0
3.5
3.02.52.01.51.00.50.0

研究報告2023×1012

Al0.5mm
Al2.0mm
Cu0.02mm
Cu0.07mm

35302520
15
1050Al0.5mm
Al2.0mm
Cu0.02mm
Cu0.07mm0500
1000
吸収線量(Gy)x 10-61500

Al0.5mm
Al2.0mm
Cu0.02mm
Cu0.07mm

0500
1000
1500
吸収線量(Gy)
図 8 各フィルターでの生菌率と変異率の比較
3. 4 線量率と 生菌 率の関 係
 変異率を最大化する条件を検討するため、まずは生菌率の減少を数値化することを検討した。微生物の単位時間当たりの変化量は、照射による減少と遺伝子修復による増殖能の再獲得の合計であると思われる。つまり、

36912 15 18 21 24 27 30
照射エネルギー(keV)
図 6 各フィルターの酵母吸収エネルギー分布(計算値)𝑑𝑑𝑑𝑑= −𝛽𝛽𝛽𝛽 + 𝛼𝛼(𝐶𝐶0 − 𝐶𝐶)𝑑𝑑𝑑𝑑

ここで、α は修復の確率、β は増殖能喪失の確率である。
初期濃度 C 0 としてこの微分方程式を解くと、生菌率
C(t)/C0 は

 図 7 は各フィルターの線量率をグラフ化したものであ

𝛼𝛼𝛽𝛽+𝑒𝑒 −(𝛼𝛼+𝛽𝛽)𝑡𝑡
𝛼𝛼 + 𝛽𝛽 𝛼𝛼 + 𝛽𝛽

るが、Cu は 9keV 以下のエネルギーの X 線が比較的多となる。各フィルターについて、α と β を変数として最図 8 に示す。Cu フィルターは、Al フィル試験の結果を図小二乗法を適用すると、表表 1 のようになった。なお、

ターと比較して生菌率の減少が著しく、低エネルギーXCu0.07mm の照射時間 180 秒のデータは外れ値として線は生菌率の減少に大きく寄与することが判明した。変除外している。β の値は Al と Cu のいずれのフィルター異率についてはばらつきが大きく評価は難しいものの、においても、おおよそ線量率に比例する形となった。ま

酵母吸収エネルギー(Gy/sec)

くなっていることがわかる。各フィルターを用いた照射520316.613.3

509keV未満

415109keV以上

22.80Al(0.5mm) Cu(0.02mm) ーX 線の生菌率への影響は大きいことが示された。一方、
α の値は、本来なら線量率に関係せず一定になると思われるが、今回の実験では明確な関係性は見られなかった。

4.23.1

10.0

た、Al と Cu の β の値は 2.4 倍程度となり、低エネルギ

0.00.3Al(2mm) Cu(0.07mm)

図 7 各フィルターでの酵母吸収線量

表 1 生菌率パラメータの決定
種類AlAlCuCu

厚み0.5mm

2.0mm

0.02mm0.07mm

α7.7×10-5

1.3×10-4

3.9×10-5

3.7×10-4

β0.1630.0476

0.436

0.109

53. 5 線量率と 変異が 入る確率の 関係

プロットしたところ、図図 11 のように単調に増加するこ 微生物の生死にかかわらず、変異が入る確率を考える。とが判明した。線量率が上がるほど変異率が上昇すると対象となる遺伝子への変異は時間とともに増加し、変異いう結果であり、最適な照射条件はグラフ上では存在しが入っていない菌の濃度が下がるにつれて増加速度が鈍ないことになる。ただし、線量率が上がるほど最適な照る形になると考えられる。つまり、変異が入る確率は、射時間は短くなり、シャッターの開閉時間などを考える

1 − 𝑒𝑒 −𝜆𝜆𝜆𝜆と、物理的な限界は存在する。また、低エネルギーX 線のようになる。ただし、実際に変異率として観察されるの影響が無視できなくなるため、フィルターを薄くしすのは、変異が入ってさらに増殖する菌体であるため、変ぎることはできない。
x 10-653.4 で得られた生菌率の理論値をもとに、変異が入る確
図 9 である。Al フィルターの率をグラフとしたものが図場合、下に凸の単調増加する曲線に載るように推移した。
一方、Cu フィルターは法則性が見られなかった。Cu フ

4変異率

異が入る確率は変異率を生菌率で割ったものとなる。

32

ィルターは単純な遺伝子変異とは違う現象が起こってい1る可能性が高く、今回の考察ではこれ以上検討しないこ

0Al0.5mm
Al2.0mm
Cu0.02mm
Cu0.07mm

0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.00200500

1000

1500

照射線量(Gy)
図 9  照射線量に対する変異の入る確率
3. 6 変異率の変 化の検 討100150200照射時間(sec)
図 10 線量率 5Gy/sec の場合の変異率理論曲線050x 10-640
変異率極大値

変異の入る確率ととした。
0.014302010002040
線量率(Gy/sec)
図 11 変異率極大値と線量率との関係

60

 1 遺伝子の変異が入る確率は、吸収線量が小さい場合、4 . 結び吸収線量に比例する形になると思われる。ところが、

 シンクロトロン光を用いた酵母の育種を検討し、以下

Al フィルターを用いた場合における変異が入る確率は、の結果が得られた。

グラフの形状から吸収線量の 3 乗に比例する形をとって(1) 照射時に水が存在する場合、変異率が著しく低くないる。これは、シクロヘキシミド耐性の変異が 3 種類の遺伝子が改変されることで発現することを示唆している。
図 9 への 3 次関数のフィッティングを行ったところ、その係数はやはり線量率に比例する形となり、線量率をd(Gy/sec)とした場合の係数は 4.3×10-13d であった。
 これまでの結果から、一連の現象を見積もってみる。
増殖能に著しい影響を与える低エネルギーX 線がない場った。
(2) 酵母の生菌率は吸収線量の増加に伴ってほぼ指数関数的に減少した。
(3) 低エネルギーX 線を透過するフィルターを用いた場
合、上記現象が顕著になった。
(4) シクロヘキシミド耐性の変異が入る確率は吸収線量の 3 乗に比例して増加した。

合、微生物の増殖能喪失の確率 β はおおよそ線量率 d に(5) 変異率の変化は極大値を取る形になり、その極大値比例する形であった。一方修復の確率 α は、簡単のためは線量率に相関して増加することが判明した。

Al フィルターで得られる値の中間値を用いる。変異が入る確率は吸収線量の 3 乗に比例し、その比例係数は

文献

4.3×10-13d とする。これらの条件から線量率 5Gy/sec の

1) 三井俊, 山本晃司, 伊藤彰敏, 家田明音, 近藤徹弥,場合の変異率をグラフ化したものが図
図 10 となる。変異杉山信之, 赤尾健, 吉村明浩, 榊原康彰, 船井秀哉,

率は照射時間に従って上昇するものの、一度減少し、再原本直幸, 志水元亨, 加藤雅士: 日本醸造協会誌 ,度上昇する形をとる。この極大値の位置を線量率横軸で116(10), 703(2021)