宮城教育大学 環境教育研究紀要

第 15 巻 (2013)

ため池水中の溶存態有機物の分画と同定に関する実験法の開発
三好直哉*・三品佳子**・村松隆*
Development of Experimental Techniques on Fractionation and Identification of Dissolved Organic
Compounds in Natural Ponds
Naoya MIYOSHI, Yoshiko MISHINA and Takashi MURAMATSU
要旨 : ため池等の閉鎖的な水環境における有機汚濁の実態を把握する目的で，ため池水中の溶存態有機物を分離し同定するための実験法（酸・アルカリによる分画と分子量分画，3 次元蛍光分析）を開発した．
キーワード：分画実験，有機汚濁，溶存態有機物

1． はじめに

2． ため池の有機汚濁

ため池は，環境学習の観点で言えば，生物と水質の人的影響の少ない自然のため池では，有機物は内在関係，食物連鎖と物質の関係などを，観察や実験を通する生物によって生産され消費される．有機物の生産して学ぶことができる自然フィールドである．ため池

は，食物連鎖の一次生産者である植物プランクトンのは，湖沼に比べて水の体積と表面積が各段に小さく，発生・増殖に始まる．そして，連鎖過程での生物代謝，その水質は，池内とその周辺の生物から強く影響を受あるいは生物の死による腐植分解，腐乱分解によって，ける．水の富栄養化によるアオコの発生はよく知られ多種多様な有機物が水中へ放出される．有機汚濁は，た現象である．ため池で繁殖した藻類の腐植化が，難生物分解性有機物の蓄積をもたらし，生物化学的酸素要求量（BOD）が低値にも関わらず COD が高値であるという性格の有機汚濁を進行させることも知られている（国立環境研報告，2004）．ため池の自然を理解する目的で行われる有機汚濁調査で，難生物分解性有機物を含む溶存態有機物の性質を実験的に確かめることは，ため池の実態と将来を予測する上で有意義である．
ここでは，ため池として岩沼市朝日山公園内の荒井堤（主に雨水浸透蓄積型の閉鎖的な富栄養性ため池（大きさ：東西 140m，南北 270m，周囲 800m，面積 2.1ha
で平均水深は約 1m））水中の難生物分解性有機物に着目し，その分画と同定に関する実験法を検討したの

図1. 朝日山公園荒井堤（岩沼市）の有機汚濁（2011年11月から2012年12月）
COD（未ろ過）：荒井堤の水をそのままCOD測定
COD（GF/F）：ガラスフィルター（GF/F）でろ過した水のCOD測定
BOD（GF/F）：ガラスフィルター（GF/F）でろ過した水のBOD測定で報告する．

* 宮城教育大学附属環境教育実践研究センター，** 宮城教育大学教育学部理科教育講座－ 49 －

ため池水中の溶存態有機物の分画と同定に関する実験法の開発

図2. ため池の有機物有機物の吸収と放出の差として，放出量が多く水中での蓄積量が増す現象である．しかも，この蓄積過程で（1）アクリル樹脂カラムのつくり方

水中有機物は微生物分解および自然分解を受けてゆっ

図 3 にカラムのつくり方を示す．内径 12 mm，長くりと変質していく．このようなため池の実態を実験さ 150 mm のガラス管の上下先端部に市販のアクリル的に捉えるために，ため池の有機物を図 2 のように分製のフィルターホルダーを取り付ける．ホルダーは取類整理しておくと分かりやすい．

り外しができるように，漏水防止テープ等でガラス管

図 1 はため池（荒井堤）の 1 年間における有機汚濁（カラム管）にしっかり固定する．吸着剤である樹脂の状況を示したものである．このため池は，環境基準

は，DAX-8 非イオン性のアクリル樹脂で，市販の樹C 類型（8mg/L）を超えた腐水性のため池と位置付け

脂をソックスレー抽出器で，メタノール，アセトニトられる（COD（未ろ過））．ガラスフィルター（GF/F：リル，ジエチルエーテル，メタノールの順にそれぞれGlass

24 時間ずつ洗浄し，その後 25％エタノール水溶液中

Filter/Fine の略，孔径約 1 µm）でろ過した試

料水の COD 値（COD（GF/F））は COD（未ろ過）値に保管したものを使用する．のおよそ 6 割を占め，溶存態有機物による汚濁が大きカラム管への樹脂の充填は，アスピレーターでカラく寄与していることが分かる．また，ろ過水の BODム下部より静かに吸引しながら洗浄済の樹脂を流し込（GF/F）は COD（GF/F）に比べると極端に低く，溶む方法で行う．カラム管内の気泡を脱気し，保存液で存態有機物の多くが難生物分解性有機物であることをあるエタノールを完全に除去するために，カラム下部示している．に取り付けた三方栓から約 1 mL/min の流速で蒸留水

難生物分解性有機物は図 2 から分かるように，主要（8 時間約 500 mL）を流す．

なものは腐植質に由来している．植物の枯死により腐植が生産されると，その腐植のうち，難生物分解性のものは，ため池底土へ沈降しヘドロ化するなど，有機汚濁の長期的原因のひとつとなる．有機汚濁の現状とその性格を知る上で，溶存態有機物の中で特に難生物分解性有機物の分析が重要である．

3. 溶存態有機物の分画と同定
3.1 吸着クロマトグラフィーを利用した酸 ・ アルカリ分画
これは，試料水（ガラスフィルター（GF/F）でろ過した水）に含まれる有機物を吸着能の低い高分子樹脂に吸着させ，酸とアルカリによる有機物の溶離性の違いを利用して有機物を分画する方法である．

図3.

－ 50 －

アクリル樹脂カラムのつくり方

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化学的作用で分解して生じた物質を指す）が含まれ得（2）アクリル樹脂カラムを用いた溶存有機物の分画
分画とは，水中に含まれる複数の成分を性格の類似る．タンパク質様物質は易生物分解性有機物で，これしたグループに分けることを言う．分画方法を図 4 にを検出しその消失を追跡すれば，ため池における動物示す．ため池の水 200 mL をガラスフィルター（GF/のアクティビティ（生物による汚濁と浄化の能力など）F）でろ過し，濃塩酸でろ液を pH ＝ 2.0 に調整するを推測できる．また，分画 2 は，腐植成分（フミン酸，（pH メーター使用）．これを分画実験用の試料水とす

フルボ酸，ヒューミン，いずれも難生物分解性有機物）

る．試料水の全てを図 4 の左図に示すカラム下部Ｂ側で，フミン酸やフルボ酸が検出できれば，ヘドロ化（沈からゆっくりと流し込む（流速 1mL/min）．試料水中降蓄積）などの進行予測，有機汚濁の性格などを検討の溶存態有機物の中に含まれる疎水性塩基成分（フルできる．このように，分画 1 と分画 2 は，ため池の有ボ酸）や糖類，核酸，タンパク様物質などは樹脂に吸機汚濁の現状把握と将来予測を行う上で有益なもので着されず，カラム上部（Ａ側）から流出してくる．こある．の段階の流出液を「分画 1」とする．カラム下部のＢ

分画 1 と分画 2 に含まれる成分の同定法としては蛍に近い樹脂層には，試料中の疎水性酸性成分（アルカ光法が知られている（福島，2001）．これは，アミノ酸，リに溶けやすいフルボ酸やフミン酸）などが吸着されタンパク質の成分であるチロシンやトリプトファンがるため，試料水 200 mL を全て流し終えた後，少量（5λ =275 nm 付近の励起光でλ max=345 nm 付近に発mL 程度）の蒸留水（pH ＝ 2）でカラムを洗浄し，次光（蛍光）が見られ（これを 275/345 の蛍光特性と記

いで，図 3 の右側に示すように，カラム管を上下反転述する），一方，腐植由来のフミン酸とフルボ酸はそさせ（A を下側として），Ａ側から，0.1M NaOH 水溶

れぞれ 320/420，300/420 の蛍光特性をもつことに由液を流速 0.2 mL/min で流し，吸着成分を溶出させる来している．これらの蛍光特性は，3 次元蛍光スペク（溶出量はおよそ 10 mL 程度）．この溶出液を「分画 2」トル測定によって容易に確認できる．図 5 に，一例ととする．

して荒井堤の分画水について測定した 3 次元蛍光スペクトルを示す．ため池水中の有機物の動態を蛍光スペ（3）分画 1 と分画 2 の蛍光特性

クトル測定で追跡調査することで，易生物分解性有機

分画 1 はタンパク質様物質（タンパク質が微生物的・物と難生物分解性有機物の種類と存在量の推移を把握

図 4. アクリル樹脂カラムを用いた溶存有機物の分画法－ 51 －ため池水中の溶存態有機物の分画と同定に関する実験法の開発

図5. 分画1と分画2の3次元蛍光スペクトル
試料：朝日山公園荒井堤水（ガラスフィルター（GF/F）ろ過）（採水：2012年9月22日）
測定条件：無蛍光石英セル（1 cm×1 cm）蛍光分光光度計（Horiba Fluoromax-4）
サンプリング波長間隔：励起、蛍光波長とも5 nm、スリット幅：5 nmを装着する．ゲルは Sephadex G-15（分画範囲分子量でき，ため池の有機汚濁の実態を詳しく評価できる．

1500 以下）で，予め市販の乾燥樹脂を蒸留水で膨潤
3.2 ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量分画し（約 1 日間放置），これをゲル長が 300 mm になる

ため池には，種類の異なる複数の有機物が含まれる．

ようにカラム管に詰める（ガラス管内に水を張り，そこれらを分子量の違いで分画するのがゲルろ過クロマの中に湿性ゲルを少量づつ落とし込む）．樹脂上端部

トグラフィーである（石渡，2008）．にはガラスフィルター（GF/F）を敷く．さらに，カ

ゲルろ過クロマトグラフィーでは，多孔質の高分子ラム管上端にシリコン栓をし，3 方栓を通して溶離液樹脂（ゲル）をカラムに詰めて試料水をカラムの上端（蒸留水）を滴下（流速 1.0 mL/min）できるようにする．

から展開する．試料中に含まれる分子量の小さい（分（2）ゲルろ過カラムを用いた溶存態有機物の分画子サイズの小さな）有機物はゲルの孔中（有機物の分子サイズより大きな穴）に侵入しながら流下するため，腐植由来の難生物分解性有機物（フルボ酸やフミン

カラム内部での流路長が長くなり，分子量の大きな（分酸など）の分子量は 1500 以下であることが知られて子サイズの大きな）有機物に比べると保持時間が長い．

いる（仲川，2011）．そこで，樹脂（ゲル）の選定に当たっ

一方，分子量の大きな有機物はゲル中の穴に入ることなては Sephadex G-15（分画範囲分子量が 1500 以下）

くカラムを流下するため，カラム内部の流路長が短くなを用いることとした．展開溶媒（溶離液）は蒸留水で，り，成分の保持時間が短くなる．このような方式で分子高速液体クロマトグラフ（日立 HPLC L-6000）の定サイズの異なる物質群を分画する．

流ポンプを用い 1.0 mL/min の流速で展開する（図 7）．
カラムからの溶出液はフローセルに入り，紫外・可視分光光度計（VARIAN Cary300）で検出波長 260 nm（1）ゲルろ過カラムのつくり方
図 6 にゲルろ過カラムのつくり方を示す．内径 25固定（スリット幅 2.0 nm）で，吸光度の時間変化（タmm，長さ 350 mm のガラス管の下端にフィルターホイムドライブ：5 秒間隔）を測定した．カラム分離にルダーをとりつけ，これにガラスフィルター（GF/F）

用いる試料水は，原水そのものでは有機物濃度が低い－ 52 －

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図6. ゲルカラムのつくり方

図7. ゲルろ過クロマトグラフィー 分子量分画－ 53 －

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図8. 標準物質のゲルろ過クロマトグラフィー
BD: ブルーデキストラン（分子量 約200万）
CC: シアノコバラミン（ビタミンB12) （分子量1355）

ことから，予めロータリーエバポレーターで 20 倍に

出開始時間は展開開始後 48 分，シアノコバラミン濃縮し，濃縮液をメンブレンフィルター（ワットマン（Mw 1355）の溶出開始時間は 79 分であった．この溶GD/X，孔径 0.2 µm）でろ過したものを 0.5 mL 使用す

出開始時間と標準物質の分子量との関係を表す検量線ることとした．

（Mw ＝ -4.677t +1725，ｔは溶出開始時間）より，有カラムへの試料の導入は次の手順で行う．①あらか機物の分子量を算出できる．しかし，ゲルろ過クロマ

じめ蒸留水をカラムに 1 時間以上通じ（流速 1.0 mL/

トグラフィーでは，有機物の構造や極性，展開溶媒のmin），カラムを安定化（樹脂の均一化などのコンディイオン強度などによって，保持時間が異なるため，算ショニング）させる．②次に，カラム上部のシリコ出される分子量は，その時に設定したカラム分離条件

ン栓を外し，ガラスフィルター表面上に試料水（原における「見かけの分子量」である．

水の 20 倍濃縮水）0.5 mL をマイクロピペットで滴下し，ガラスフィルター直下の狭い樹脂層に有機物の吸（4）ゲルクロマトグラムの解析と同定

着帯をつくる．③次に，カラム上端にシリコン栓を

ため池水のゲルろ過クロマトグラムは，複数の吸収し HPLC ポンプを稼働し，蒸留水を展開し分画を開ピークの重ね合わせとして観測されることが多い．図始する．

9 にその一例を示す．このクロマトグラムには 4 種類の成分ピークが観測され，流出開始時間は，a, b, c, d（3）ゲルろ過クロマトグラフィーにおける保持時間とそれぞれ，48 分，52 分，68 分，113 分である．各成

分子量との関係

分ピークについて，ガウス関数等の適当な曲線をあて

本研究で使用する樹脂 Sephadex G-15 は，分画範囲はめ，波形分離による線形解析を行い，より正確な流が分子量（Mw）1500 以下である．Mw 1500 以上の出開始時間を求めるようにしている．この解析の結有機物は Mw 1500 と同じ時間に溶出する．保持時間

果，a についてはブルーデキストランの溶出時間に一が短ければ分子量が大きく，逆に保持時間が長ければ致しており，分子量が 1500 以上（分子量が定まらな分子量が小さいことになる．そこで，自作したカラムい）であることが確かめられた．さらにａ成分をフラを使って保持時間と分子量との関係を，標準物質（ブクションコレクターで分取し，その 3 次元蛍光スペク

ルーデキストラン：Mw 200 万と，シアノコバラミン：

トルを測定すると，280/330 の蛍光特性が認められ，aMw 1355）を用いて調べた．その結果を図 8 に示す．

成分がタンパク質様物質であることが確かめられた．

ブルーデキストラン（すなわち Mw 1500 以上）の溶同様に，b, c, d の各成分についても，それぞれ見かけ－ 54 －

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図9. ゲルろ過クロマトグラムとそのピーク成分の蛍光特性
朝日山公園荒井堤（2012年9月22日採水）
流速 1.0 mL /min λmax=260 nm における吸光度の時間変化を追跡
a: タンパク質様物質

蛍光特性：280/330 （分子量＞1500）

b：フルボ酸 蛍光特性:320/440（分子量1480）
c：フルボ酸 蛍光特性:320/440（分子量1450） ｄ： 非蛍光性有機物 無蛍光性（分子量1100）の 分 子 量 は，1480，1450，1100 で あ り， 特 に b と c

COD 測定や BOD 測定などに加えて，有機汚濁の起源

はその 3 次元蛍光スペクトルに見られる蛍光特性かと汚濁化・浄化の動的プロセスを明らかにする応用的ら，いずれもフルボ酸であることが推測された．d にな取り組みとして期待されている．

ついては明瞭な蛍光特性は認められず，無蛍光性の有機物の存在が考えられた．

引用文献
湖沼における有機炭素の物質収支および機能・影響の4. さいごに評価に関する研究 2004. 国立環境研究所特別研究報

本論文は，学校の教員が，大学で研修する際の実験

告，SR-62-2004.

マニュアルとして利用できるように（実験上のノウハ

福島武彦・中島俊之・今井章雄・松重一夫・尾崎則篤

ウが理解できるように）内容を構成した．溶存態有機

2001. EEMS による水中溶存有機物の特性解析．水物の酸・アルカリによる分画実験とゲルろ過クロマト

環境学会誌，Vol 24, No 10, 686-692.

グラフィーによる分子量分画実験は，いずれも，平成
24 年度に実施した宮城教育大学公開講座，教員研修，

石渡良志・米林甲陽・宮島徹著 2008. 環境中の腐植物
質その特徴と研究法，82-87, 三共出版．

高等学校 SSH 事業などで行われたものである．学校

仲川直子・金澤良昭・上村育代・宮原一隆・梅本諭の教員と生徒が大学の分析装置等を活用し体験的かつ2011．珪藻類を対象とした植物プランクトン由来の探求的な学びを深化させようとする取組は今後さかん

難分解性溶存有機物に関する特性評価，兵庫県環境に行われると思われる．身近な水域や水塊を対象に，センター紀要，Vol 2, 1-7.

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