上原記念生命科学財団研究報告集, 34 (2020)

上原記念生命科学財団研究報告集, 34（2020）

155. 細胞内膜リン脂質による YAP の活性化機構の解明
向井 康治朗東北大学 大学院生命科学研究科 細胞小器官疾患学分野
Key words：ホスファチジルセリン，リサイクリングエンドソーム，Hippo－YAP 経路，がん緒 言
悪性新生物（癌）は日本人の死亡原因の 30％以上を占めることから分かる通り、癌の治療法を開発することは非常に重要な課題である。Hippo－YAP 経路は器官の大きさを規定するシグナルとして同定された経路であるが、癌においては転写共役因子 YAP の恒常的な活性化が過剰な細胞増殖、細胞死の抑制、浸潤能の亢進を誘導し、癌の悪性化の一因となる［1］。
我々はこれまでに、YAP の活性化がリサイクリングエンドソームに局在する酸性リン脂質ホスファチジルセリンによって制御されることを明らかにしてきた［2］。この解析の中で、YAP 依存的に増殖する癌細胞の一つである
MDA-MB-231 細胞において、リサイクリングエンドソーム膜の細胞質側のホスファチジルセリンを制御する
タンパク質 ATP8A1 を発現抑制すると、YAP のリン酸化体（不活性化体）が増加し、細胞増殖が著しく減弱することを見出していたが、その分子機構に関しては未解明のままであった。そこで本研究では、リサイクリングエンドソーム膜の細胞質側のホスファチジルセリンが Hippo－YAP 経路を制御する分子機構を明らかにし、癌細胞に対する新規創薬ターゲットを提案することを目指した。

方 法
1．ホスファチジルセリン近傍タンパク質として同定されたセリンスレオニンホスファターゼにおける乳がん患者生存解析
上述の通り ATP8A1 を発現抑制すると YAP のリン酸化体が増加したことから、本研究ではホスファチジルセリン近傍タンパク質として同定された 11 個のセリンホスファターゼファミリー分子に着目し、The Cancer Genome Atlasにて乳がん患者における発現量と予後の相関解析を行った。
2．PPP1R12A 発現抑制時の細胞増殖
YAP 依存的に細胞増殖することが知られているトリプルネガティブ悪性乳がん細胞 MDA-MB-231 細胞を用いてPPP1R12A を発現抑制したのちに、細胞数を定量することで細胞増殖を評価した。PPP1R12A の発現抑制効率はリアルタイム PCR にて PPP1R12A mRNA を定量することで評価した。
3．PPP1R12A 発現抑制時の YAP のリン酸化MDA-MB-231 細胞に PPP1R12A に対する siRNA をトランスフェクションしたのちに、リン酸化 YAP、YAP、リン酸化 Lats1、Lats1 をウェスタンブロットにて検出した。
4．PPP1R12A の細胞内局在
エンドソームの空間分布が見やすい COS-1 細胞に Myc タグを付加した PPP1R12A を発現させるプラスミドをトランスフェクションしたのちに、細胞を固定して抗 Myc 抗体で染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察した。また、酸性リン脂質と相互作用することが知られている C 末端領域を欠損させた PPP1R12A（1～667）の細胞内局在も同様の方法で観察した。

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結果および考察1．ホスファチジルセリン近傍タンパク質として同定されたセリンスレオニンホスファターゼにおける乳がん患者生存解析
近接するタンパク質を非特異的にビオチン化する酵素 BirA*と、ホスファチジルセリンに選択的に結合するタンパク質 evectin-2 の PH ドメインをタンデムに繋いだもの（2×PH）を連結したコンストラクト BirA*-2×PH をCOS-1 細胞に発現させ、ホスファチジルセリン近傍タンパク質を網羅的に探索した。その結果、セリンスレオニンホスファターゼファミリー分子として、触媒サブユニット（PP1A/PP1B/PP1C、PPM1G）と 8 種類の調節サブユニット（PPP1R8、PPP1R9A、PPP1R10、PPP1R12A、PPP1R13B、PPP1R37、PPP2R1A、PPP2R5D）が同定された。これらのホスファターゼのうち、TCGA で遺伝子発現情報のない PPP1R37 を除いた 11 種類のホスファターゼについて、TCGA データベースをもとに乳がん患者のカプランマイヤー曲線を作成したところ、
PPP1R12A と PP1B においてのみ、高発現の乳がん患者群で予後が悪いという結果が得られた（図 1）。このことから
PPP1R12A と PP1B は乳がんの悪化を促進する因子である可能性が考えられた。
2．PPP1R12A 発現抑制時の細胞増殖
そこで次に、MDA-MB-231 細胞で siRNA を用いて PPP1R12A を発現抑制したときの細胞増殖を検討した。2 種類の siRNA オリゴを用いて PPP1R12A を発現抑制したが、いずれにおいても PPP1R12A の発現抑制により細胞増殖が顕著に抑制された（図 2A）。さらに、Hippo pathway において YAP のリン酸化を担うキナーゼである Lats1/2 を
PPP1R12A と同時に発現抑制したところ、PPP1R12A の発現抑制による細胞増殖の抑制が回復した（図 2B）。
これより、PPP1R12A が Hippo pathway に関与して MDA-MB-231 細胞の増殖を正に制御していることが示唆された。
次に、別の種類の乳がん細胞として MCF-7 細胞を用いて、細胞増殖を検討した。MCF-7 細胞はホルモン受容体陽性のルミナル A タイプに分類され、YAP/TAZ の発現が低く、YAP/TAZ を発現抑制しても、細胞増殖が抑制されないことが知られている［3，4］。MCF-7 細胞においても、RNAi により PPP1R12A の mRNA の十分な発現抑制が確認できた（図 2C）。しかしながら、PPP1R12A を発現抑制しても、MCF-7 細胞の増殖は抑制されなかった（図 2D）。
この結果から、YAP 非依存的に増殖する乳がん細胞においては、PPP1R12A が細胞増殖には寄与していない可能性が示唆された
3．PPP1R12A 発現抑制時の YAP のリン酸化
次に、MDA-MB-231 細胞において PPP1R12A が YAP の脱リン酸化に寄与しているか、PPP1R12A の発現抑制により検討した。その結果、PPP1R12A の発現抑制により、Lats1 の全タンパク量に占めるリン酸化 Lats1 の比率は変化しなかった一方で、リン酸化 YAP については YAP の全体量と比較して増加した（図 3）。このことから、
MDA-MB-231 細胞において PPP1R12A が YAP の脱リン酸化に関与することで、細胞の増殖を正に制御していることが示された。
4．PPP1R12A の細胞内局在
次に、核近傍のオルガネラ分布が観察しやすい COS-1 細胞にタグ付き PPP1R12A を発現させ、PPP1R12A の細胞内局在を、免疫染色により検証した。先行知見から、PP1R12A の C 末端側 （アミノ酸 668～1,030）が酸性リン脂質と相互作用する可能性が示唆されていたので［5］、PPP1R12 の全長コンストラクトに加え、PPP1R12A（1～667）とPPP1R12A（668～1030）の局在も検証した。その結果、全長 PPP1R12 と PPP1R12A（668～1,030）は、核や細胞質に加えて核近縁部の RE にも局在が観察された。一方、PPP1R12A（1～667）は核にのみ局在した（図 4A）。
さらに、PP1B の局在も検証したところ、既知の核局在に加えて、RE 局在も観察され、全長 PPP1R12A と共局在した。一方、興味深いことに、PPP1R12A（1～667）を発現させた細胞では、PPP1R12A（1～667）だけでなく、PP1Bも核に局在した（図 4B）。これらの結果から、PPP1R12A の C 末端領域が PP1B をリサイクリングエンドソーム局在にさせるのに必要である可能性が示唆された。

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図 1．ホスファチジルセリン近傍セリンスレオニンホスファターゼにおける乳がん患者の生存解析
赤が高発現群、青が低発現群を表す。ホスファチジルセリン近傍セリンスレオニンホスファターゼのうち、PPP1R12A と PP1B は、発現量が高いほど生存率が悪かった。カプランマイヤー曲線を作成したのちにLog-rank test にて有意差検定を行った。

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図 2．PPP1R12A 発現抑制時の乳がん細胞の細胞増殖
A） MDA-M231 細胞で各遺伝子の発現抑制効率を定量 PCR で評価した。
B） MDA-M231 細胞において各遺伝子を発現抑制し、1 週間後の時点での細胞数で評価した。
C） MCF-7 細胞で各遺伝子の発現抑制効率を定量 PCR で評価した。
D） MCF-7 細胞において各遺伝子を発現抑制した際の細胞増殖を発現抑制後 1 週間の時点での細胞数で評価した。
n＝3、Mean±SD、One-way ANOVA、Tukey-Kramer post hoc test、**p＜0.01、***p＜0.001、NS：not significant。

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図 3．PPP1R12A 発現抑制時の YAP のリン酸化
MDA-MB231 細胞において PPP1R12A を発現抑制し、YAP 及び Lats1 のリン酸化をウェスタンブロットで評価した。下の数字はバンドを定量。

Fig.3-3 PPP1R12A発発現抑制時のリン酸化YAP
MDA-MB-231細胞でPPP1R12Aの発現抑制により、リン酸化YAPが増加した。�

図 4．PPP1R12A と PP1B の細胞内局在A） COS-1 細胞に Myc-PPP1R12A を強制発現させ、免疫染色を行った。Scale Bar は 10μm。
B） COS-1 細胞に Myc-PPP1R12A と HA-PP1B を強制発現させ、免疫染色を行った。
Scale Bar は 10μm。

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共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、東京大学大学院薬学研究科衛生化学学研究室の河野望准教授、東京大学大学院医学系研究科の新井洋由客員研究員、早稲田大学理工学術院の仙波憲太郎教授、中山淳助教、東京医科歯科大学の仁科博史教授、コロンビア大学の宮村憲央博士である。

文 献1） Harvey, K. F., Zhang, X., and Thomas, D. M. The Hippo pathway and human cancer. Nat Rev Cancer. 2013. 13,246-257. PMID: 23467301 DOI: 10.1038/nrc3458
2） Matsudaira, T., Mukai, K., Noguchi, T., Hasegawa, J., Hatta, T., Iemura, S., Natsume, T., Miyamura, N.,
Nishina, H., Nakayama, J., Semba, K., Tomita, T., Murata, S., Arai, H., and Taguchi, T. Endosomal
phosphatidylserine is critical for the YAP signalling pathway in proliferating cells. Nat Commun. 2017. 8, 651.
PMID: 29093443 DOI: 10.1038/s41467-017-01255-33） Oku, Y., Nishiya, N., Shito, T., Yamamoto, R., Yamamoto, Y., Oyama, C., and Uehara, Y. Small molecules
inhibiting the nuclear localization of YAP/TAZ for chemotherapeutics and chemosensitizers against breastcancers. FEBS Open Bio. 2015. 5, 542-549. PMID: 26199863 DOI: 10.1016/j.fob.2015.06.007
4） Mi, W., Lin, Q., Childress, C., Sudol, M., Robishaw, J., Berlot, C. H., Shabahang, M., and Yang, W.
Geranylgeranylation signals to the Hippo pathway for breast cancer cell proliferation and migration. Oncogene.
2015. 34, 3095-3106. PMID: 25109332 DOI: 10.1038/onc.2014.251
5） Ito, M., Feng, J., Tsujino, S., Inagaki, N., Inagaki, M., Tanaka, J., Ichikawa, K., Hartshorne, D. J., and Nakano,
T. Interaction of smooth muscle myosin phosphatase with phospholipids. Biochemistry. 1997. 36, 7607-7614.
PMID: 9200713 DOI: 10.1021/bi9702647

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