［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第［医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス，PMDRS,
4 報）］
53（1），37〜52（2022）］▲

財団 Information
onn

報告書

令和２年度「日本薬局方の試験法等に関する研究」研究報告＊2
薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）

辻 厳一郎＊1，内山 奈穂子＊1，合田 幸広＊1，出水 庸介＊1

Study on the Elimination of Harmful Reagents on the Testing Methods in Japanese Pharmacopoeia IV
Genichiro TSUJI ＊1, Nahoko UCHIYAMA ＊1, Yukihiro GODA ＊1 and Yosuke DEMIZU ＊1

1の可能性を検討し，国内外の関係者に利用されるよ

諸言

うに JP の普及を図ることは，医薬品各条の国際調日本薬局方（JP）は，医薬品の性状及び品質の適和という観点で重要である．第十九改正日本薬局方正を図るために定められた，日本の医薬品の公的な作成基本方針（案）においても，引き続き「最新の規範書であり，JP で規定される医薬品の試験法に学問・技術の積極的導入による質的向上」が 5 本のは普遍性が要求される．JP は 5 年ごとに改正が行わ

柱として掲げられている．また，「日本薬局方改正れており，科学技術の進展並びに国際調和に対応す

過程における透明性の確保及び日本薬局方の国内外るため，部分改正等を適宜行っている．

への普及」も挙げられている．

筆者らは，第十八改正日本薬局方作成基本方針に

令和 2 年度は，ロラゼパム 8）を対象として，合成掲げられた「保健医療上重要な医薬品の全面的収した類縁物質の定量 NMR（qNMR）による純度決載」，「最新の学問・技術の積極的導入による質的向定，定量法の設定に向けた HPLC クロマトグラム上

上」,「医薬品のグローバル化に対応した国際化の一における各化合物の完全分離の条件を検討した 9）．

層の推進」，「必要に応じた速やかな部分改正及び行

更に，トリヘキシフェニジル塩酸塩 10）及びクロモグ

政によるその円滑な運用」，「日本薬局方改正過程に

リク酸ナトリウム11）についても同様に，試験法の設おける透明性の確保及び日本薬局方の普及」の 5 本定を目的として類縁物質の合成，qNMR による純

1）

柱 の中で，「最新の学問・技術の積極的導入による度決定，HPLC における各化合物の完全分離条件の質的向上」として，薬局方試験法における有害試薬検討を行った．

の可及的排除を目的とした代替試験法，定量法改定等の検討を行ってきた．令和元年度は，各条（クロニジン塩酸塩 2））を対象として，低毒性溶媒への検討 3, 4）を行うとともに，定量法として設定されている電位差滴定法

5）をより簡便な HPLC 法への変更
6）7）2 実験方法2.1 実験用試薬類，器具及び方法
qNMR 測 定 用 の 試 薬 に は， ロ ラ ゼ パ ム（for（米国薬局方（USP） や欧州薬局方（EP） では既Biochemistry，富士フイルム和光純薬，Code No.

に HPLC 法が設定されている）についての検討を

122‑04591，Lot. KCL2967，純度 98.0+%（Titration））

行った．このように，USP や EP など他局で規定さを使用した．

れているより優れた試験方法について JP での採用

qNMR 用 基 準 物 質 に は， 認 証 標 準 物 質（NMIJ＊1

国立医薬品食品衛生研究所 神奈川県川崎市川崎区殿町 3‑25‑26（〒 210‑9501）
National Institute of Health Sciences, 3‑25‑26 Tonomachi, Kawasaki‑ku, Kawasaki‑shi, Kanagawa 210‑9501, Japan＊ 2 本研究は一般財団法人医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス財団の令和 2 年度 ｢日本薬局方の試験法等に関する研究｣ 事業により行ったものである．

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 1（2022）

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37［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］CRM）である DSS‑ 6（Sodium 3‑（trimethylsilyl）‑

No.D1716，Lot.JCFFG‑MM， 純 度 >97.0%），クロ

1‑propane‑1,1,2,2,3,3‑ 6‑sulfonate，Mw=224.36，

モグリク酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬 CodeLot. KPE1040，純度 92.3%）
もしくは 1,4‑BTMSB‑ 4

No.193‑15231，Lot.APM2019，純度 98.0+%）（1,4‑bis（trimethylsilyl）benzene‑ 4，Mw= 226.50，
Lot. TWN2900，純度 99.9％）（富士フイルム和光純

2.2 qNMR の試料溶液の調製及び測定条件薬）を使用した．qNMR 測定用重溶媒には，重ジメ

各試薬約 5 mg，qNMR 用基準物質約 1 mg をそれ

チルスルホキシド（DMSO‑ 6）（Acros（Geel），Lot.

ぞれ精密に量り採り，風袋ごと同一の容器に入れ

A0401114）を用いた．

NMR 測定溶媒 1 mL に溶解した．この溶液 0.6 mL

HPLC 分析用の製剤試料には，ロラゼパム錠 1mg

を NMR 試料管に封入したものを試料溶液とした．

「サワイ」（沢井製薬（大阪），製造番号 720201）を観測スペクトル幅は 20 ppm，デジタルフィルタ

使用した．

を使用し，スペクトル中心は 5 ppm の位置に設定，天秤は，最小表示値が 0.0001 mg のウルトラミク

パルス幅は 90 度パルスとなる時間に設定し，取りロ天秤（Mettler Toledo XPR2UV（Columbus））を

込 み 時 間 4 秒， デ ジ タ ル 分 解 能（Resolution）

使用した．NMR は，JNM‑ECA600（600 MHz）
（日

0.25 Hz，遅延時間 60 秒，オート FG シムによるシム

本電子（株））を使用し，化学シフト値は，qNMR 用調整，測定温度は室温（20〜30℃）とし，MPF8 に基準物質を基準シグナル（0 ppm）とし，σ値を ppm

よる 13C デカップル実施，ダミースキャン 2 回とし，単 位 で 表 し た． NMR 試 料 管 は Wilmad‑LabGlass

積算回数は S/N>200 になる回数として 8 回行った．

（Vineland）製 528‑pp を使用した．

内 部 標 準 法（AQARI:Accurate quantitative NMR

HPLCのシ ステムとし ては，PDA 検 出 器（MD‑with internal reference substance）により，原則と4015），ポンプ（PU‑4100），カラムオーブン（CO‑して各試料について 3 回秤量，調製した後，非連続

4060）， オ ー ト サ ン プ ラ ー（AS‑4050） を 備 え たに 3 回測定を行った．

EXTREMA（日本分光（東京））を使用し，分析用カ

NMR データの処理には，日本電子（株）製 Purity

ラムとしては，① ODSカラムCAPCELL PAK（C18，

Pro を使用，qNMR 用基準物質のトリメチルシリル

4.6 x 250 mm，5μm，大阪ソーダ（大阪）），② PBrカピ ー ク を 0 ppm と し， マ ニ ュ ア ル 法 で 位 相 補 正，

ラムCOSMOSIL PBr（C18，4.6 x 250 mm，5μm，

オートベースライン補正を行い，マニュアル法で各ナカライテスク（京都）），③ ODS カラム Mightysil

ピークの積分範囲を決定した．また，本報告では積RP‑18 GP II（C18，4.6 x 150 mm，5μm，関東化学

分値は，全て純度換算（%）により表示した．試薬），もしくは④ ODSカラムJASCO Vario ASB（東京）の純度は以下の Eq.（1）を用いて算出した．

C18（C18，4.6 x 250 mm，5μm, 日本分光（東京））を使用した．HPLC 分析に使用した移動相溶媒として

＝

×

×

×

×

（1）

は，蒸留水（関東化学，Code No. 11307‑2B）及びア
セトニトリル（Sigma‑Aldrich，Code No.34888‑2.5L）= シグナル強度（積分値）， = プロトン数（官能基の水素の数）， = 質量（秤量値）， = 分子量， = 純度を使用した．

（%），，= qNMR 用基準物質及びサンプル

トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質及びクロモ
グリク酸ナトリウム類縁物質の合成には富士フイルム

DSS‑ 6 の特定基のプロトン数（DSS‑ 6 = CH3 ×

和光純薬社製の溶媒を使用した．試薬類は以下に示す

3），1,4‑BTMSB‑ 4 の 特 定 基 の プ ロ ト ン 数

ものを試薬会社から購入することで入手した．トリヘ（1,4‑BTMSB‑ 4 = CH3 × 6）， 分 子 量（MW）；

キシフェニジル塩酸塩（東京化成 Code No.T3303，

DSS‑ 6：MW 224.36，1,4‑BTMSB‑ 4：MW 226.50，

Lot.PW4KD‑JI，純度 98.0+%），3‑ クロロプロピオ

ロラゼパム： MW 321.16，ロラゼパム類縁物質 A：

フ ェ ノ ン（ 東 京 化 成 ）， ピ ペ リ ジ ン（Sigma‑

MW 266.12，ロラゼパム類縁物質 B： MW 363.19，

Aldrich），4M 塩酸 ‑1，4‑ ジオキサン溶液（富士フ

ロラゼパム類縁物質 C： MW 321.16，ロラゼパム類

イルム和光純薬），酢酸（富士フイルム和光純薬），

縁 物 質 D： MW 321.16， ロ ラ ゼ パ ム 類 縁 物 質 E：

2 ,6 ‑ ジヒドロキシアセトフェノン（東京化成 CodeMW 303.14，トリヘキシフェニジル塩酸塩：MW

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医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

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337.93，トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質 A：

2.4

トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質及MW 217.31， ク ロ モ グ リ ク 酸 ナ ト リ ウ ム：MWびクロモグリク酸ナトリウム類縁物質の512.33，クロモグリク酸ナトリウム類縁物質 A：

合成

MW 152.15，クロモグリク酸ナトリウム類縁物質

反応の追跡は薄層クロマトグラフィー（TLC）（60
F254，Merck 社）を使用し，スポットの可視化はハ

B：MW 524.48

ンディUV ランプ（254/365 nm）（UVP 社）による紫2.3 HPLC 測定における試料の調製及び分析条件

外線照射，及びヨウ素蒸気によって行った．カラム

2.3.1 ロラゼパム類縁物質

クロマトグラフィー用の NH シリカゲルには，中圧各試料を蒸留水 / アセトニトリル混液（1：1，v/

カラムクロマトグラフィー装置（Smart Flash）（山v）にて溶解させることで 2.5 mM の濃度とし，0.45

善），及び中圧カラムクロマトグラフィー用充塡カ

μm のシリンジフィルターでろ過した溶液を分析用

ラム（Inject column Amino / Hi‑Flash columnの試料溶液とした．測定条件は以下のとおりであAmino，40μm）（山善）を使用した．融点（Mp）のる．流速： 1.0 mL/min，カラム温度：40℃，検出波

測定は MP‑500V（ヤナコ株式会社）を使用し，補正

長：230 もしくは 235 nm，試料導入量： 25μL，USP

せずに測定を行った．高分解能質量分析（HRMS）

記載の条件を参考にした移動相： アセトニトリ

は Shimadzu IT‑TOF MS（島津）にて，エレクトロル : 酢酸 : 水 = 50 : 1.2 : 50（v/v/v），EP 記載の条件

スプレーイオン化法にて測定した．

を 参 考 に し た 移 動 相： A = 20 mM リ ン 酸 緩 衝 液（pH6.0），B =アセトニトリル，グラジエント：

B = 0% to 5% （0‑10 min），5% to 60% （10‑20 min），60%（20‑60 min）
． 製 剤 に つ い て は，10錠を粉体化したものから成分 1 mg に相当する重量3 結果及び考察
3.1 ロラゼパム類縁物質の qNMR による純度決定

分を量りとり，蒸留水 / アセトニトリル混液（1：1，

HPLC 分析に使用した試薬及び合成した化合物

v/v）（1 mL）を加えてボルテックスミキサーで振と（Fig. 1） は 1H‑qNMR に よ っ て 純 度 を 決 定 し たう（20 分間，室温）させた．得られた懸濁液を遠心（Table 1）．代表例として，類縁物質 C（4）の NMR

分離し，上澄みを 0.45μm のシリンジフィルターでチャートを Fig. 2 に示している．各試料の定量シグろ過した溶液を分析用の試料溶液とした．

ナルは，不純物由来のシグナルなど妨害ピークが観

2.3.2 トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質

測されないシグナルを選択した．ロラゼパムについ各試料を Table 7 中記載の移動相 A にて溶解（終ては 9 位（7.28 ppm, d）及び 6 位（6.96 ppm, d）を定

濃度；トリヘキシフェニジル塩酸塩：6 mM，類縁物

量シグナルとして絶対純度を求めた結果，99.24 ±質 A：2 mM）させ，0.45μm のシリンジフィルター

0.09% であった．同様にして類縁物質 A（1）についでろ過した溶液を分析用の試料溶液とした．試料導ては，3 位（6.94 ppm, d）及び 6 位（6.87 ppm, d）を

入量は 10μL とし，カラム③を使用して分析を行っ

定 量 シ グ ナ ル と し た 結 果， 絶 対 純 度 は 99.30 ±た．測定条件は Table 7 に記載のとおりである．

0.30% であった．類縁物質 C（4）については，6 位

2.3.3 クロモグリク酸ナトリウム類縁物質（6.81 ppm, d）を定量シグナルとした結果，絶対純度

各 試 料 を Table 9 中 記 載 の 移 動 相 A と B の 混 液

は 97.92 ± 0.21% であった．これら 3 化合物は，いず（1:1，v/v）にて溶解（終濃度；クロモグリク酸ナト

れの試料においても標準偏差（S.D.）が 0.1~0.3% 程

リウム：1 mM，類縁物質 A：5 mM，類縁物質 B：

度とばらつきが小さく良好な結果であった．類縁物

0.3 mM）させ，0.45μm のシリンジフィルターでろ質 B（5）については，6 位（7.00 ppm, d）及び 3 位

過した溶液を分析用の試料溶液とした．試料導入量（5.85 ppm, s）を定量シグナルとした結果，絶対純度

は 10μL とし，カラム④を使用して分析を行った．

は 87.82 ± 0.26% であり，類縁物質 E（8）について

測定条件は Table 9 に記載のとおりである．

は，8 位（8.43 ppm, d）を定量シグナルとした結果，絶対純度は 90.82 ± 0.09% であった．この両試料は，絶対純度の S.D. は，0.26，0.9% とばらつきが小さく

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8

H

9

O

1N

7

Cl

N

5

6

OH

1

4’

7

6

Cl

1’

Cl

6

Cl

O

3’

N
1’

3
4

Cl

O
Cl

O

Cl

4 O

4’

9

H

O

1N

3

6

4’

5

Cl

Fig. 1 ロラゼパム及び類縁物質 A‑E の化学構造)LJ

థ໿੟ସ E(8)

H‑qNMR により値付けしたロラゼパム及び類縁物質 A‑E の純度
Average ± S.D.（%）
of target signals

Internal standard

Target signals（ppm）

Lorazepam

DMSO‑ 6

DSS‑ 6

H‑9（7.28, d）
H‑6（6.96, d）

99.24 ± 0.09

類縁物質 A（1）DMSO‑ 6

DSS‑ 6H‑3（6.94, d）
H‑6（6.87, d）

99.30 ± 0.30

類縁物質 B（5）DMSO‑ 6

DSS‑ 6

H‑6（7.00, d）
H‑3（5.85, s）

87.82 ± 0.26

類縁物質 C（4）DMSO‑ 6

DSS‑ 6H‑6（6.81, d）

97.92 ± 0.21

類縁物質 D（7）DMSO‑ 6

DSS‑ 6

H‑9（7.26, d）

95.57 ± 0.20

類縁物質 E（8）DMSO‑ 6

DSS‑ 6

H‑8（8.43, d）

90.82 ± 0.09

DSSͲd6
2

10
11

7

6

Water

3

6

4
1’

6’

2’

5’

3’
3.23

4’

7.00

6.95

6.90

6.85

6.80

6.75

6.70

6.65

Solvent
9NH

3’/4’/5’/6’
3

8

PPM
12.50

10.00

7.50

5.00

2.50

Fig. 2 ロラゼパム類縁物質 C（4）の 1H‑qNMR スペクトル（DMSO‑ 6）

40

3’
4’

NMR solvent

1

Cl
2’

5’

3’

Sample

9

N3
1’

1

Table 18

46’థ໿੟ସ D(7)

థ໿੟ସ C(4)N 2 CHO

6

2’

5’

3’

Cl

4

1’

6’

Cl

O

NH

5

1

8
7

2

7

2’

5’

థ໿੟ସ B(5)థ໿੟ସ A
(1)

N
1’

6’

8

2
3

5

6

3’

4’

O

1N

7

2’

5’

H

9

8

2

5

6’

4’

Lorazepam

H

1N

7

2’

5’

3’

9

8

O

6’

2’

5’

2 NH2

5

Cl

4

1’

6’

3

3

4

2

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0.00

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定量自体は良好な結果であったが，純度が低いの

り，各ピークの分離が不十分であった（Fig. 3）．一は，合成時の不純物が多く含まれているためと考え方で，EP 記載の条件では，各化合物のピークが検られる．類縁物質 D（7）については，40℃において出できたものの，ロラゼパムと類縁物質 D とが分

9 位（7.26 ppm, d）を定量シグナルとした結果，絶離せず，類縁物質 B と類縁物質 E がクロマトグラム

対純度は 95.57 ± 0.20% であった．

上で近接した位置に溶出した（分離度 1.1）（Fig. 4，
Table 4）
．複数他社の ODS カラムの使用，移動相の組成やグラジエントについても検討したが，JP

3.2 ロラゼパム類縁物質の HPLC 分析
各分析対象の HPLC 分析では，まず USP（USP42‑th

12, 13）で完全分離を示す分離度 1.5 を達成することができ（Table

なかった．そこで，カラムの分離特性を変更するた

2，3）を参考に検討を行った．USP では約 1% の酢

めに，固定相にペンタブロモベンジル基（PBr）で酸を含む水 / アセトニトリル溶液系を移動相として修飾されたカラム（分子の疎水性及び分散力の違い

おり，EP ではリン酸緩衝液を移動相としているが，を分離モードとしているカラム）を使用して分析をいずれも分析カラムにおける固定相はオクタデシル

行った．PBr カラムを用いた検討の結果，ベースラ

シリル（ODS，C18）である．初めに，ODS カラム

インが若干上昇するものの，類縁物質 B と類縁物質を使用した HPLC 分析によって各化合物の保持時間

E との分離度を改善することができた（分離度 1.8）を確認した．その後，それぞれの化合物の混合溶液（Fig. 5，Table 4）．次に，この分析条件が製剤（錠について一斉分析を行った．その結果，USP の移剤）からの抽出液に対して適用可能であるかを検討

動相条件では，類縁物質 E のピーク形状が不良であした．ロラゼパム製剤（Lorazepam Tablets）の定NF37）や EP（9ed）に記載の分析条件

Table 2

USP（USP42‑NF37）と本研究で使用した HPLC 条件の比較
USP condition

USP modified condition（This study）

1）Column

ODS, 4.6 × 250 mm, 5μm

ODS, 4.6 × 250 mm, 5μm2）Column temperature

5℃

40℃

3）Mobile phaseacetonitrile, glacial acetic acid, and water（50:1.2:50, v/v/v）

acetonitrile, glacial acetic acid, and water（50:1.2:50, v/v/v）

4）Flow rate

1.0 mL/min

1.0 mL/min

5）Detection

230 nm

230 nmTable 3EP（9th ed）と本研究で使用した HPLC 条件の比較
EP condition

EP modified condition（This study）

1）Column

ODS（end‑capped, resistant to bases up to pH11.5），4.6 × 250 mm, 5μm

ODS（end‑capped, resistant to bases up to pH
10），4.6 × 250 mm, 5μm2）Column temperature

Not listed

40℃

3）Mobile phaseA : 20 mm aqueous K2HPO4/acetonitrile（95:5,v/v）（adjust to pH 10.5 with NaOH）
B : acetonitrile

A : 20 mm aqueous NaH2PO4（adjust to pH 8.0
with NaOH）
B : acetonitrile4）Gradient table（Solution B conc.）

20% to 70%（5‑35 min）to 70%（35‑50 min）to20%（50‑60 min）

30% to 55%（0‑20 min）
，55% hold（20‑40 min），
55% to 80%（40‑50 min）

5）Flow rate

1.0 mL/min

1.0 mL/min

6）Detection

235 nm235 nmPharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 1（2022）

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Fig. 3 ロラゼパム及び類縁物質 A‑E の HPLC による一斉分析（USP 改変法）
)LJ

Fig. 4)LJ

ロラゼパム及び類縁物質 A‑E の HPLC による一斉分析（EP 改変法，ODS カラム）

Table 4 HPLC クロマトグラム上の各ピークの保持時間及び分離度
ColumnODS

PBrRetention time（min）

Resolution ＊

13.1

6.8

32.9

18.3

3.7

20.0

5.5

Lorazepam

20.3

1.0

22.1

3.8

類縁物質 D

20.8

10.9

23.6

19.0

類縁物質 B

25.9

1.1

31.2

1.8

類縁物質 E

27.6

6.0

35.5

5.0

類縁物質 A

37.8

N /A

47.7

N/A

Specific peaks

Retention time（min）

Resolution

類縁物質 E（hydrate）

9.0

類縁物質 C＊

N/A : Not available

量において，USP では 90.0‑110.0% の範囲が設定さ出液に適用したところ，Fig. 6 に示すクロマトグラ

れており，分析法として移動相や製剤の抽出溶媒にムが得られた．また，qNMR によって純度を定量12）が設定されているが，したロラゼパム（99.24%）から標準試料を調製し，同条件で実施できることがより望ましいと考えられ

製剤抽出液（1 mg/mL）の一点検量線における定量

る．今回検討した分析条件を製剤（錠剤）からの抽値を求めたところ，1.08 mg/mL となり USP で設定

ついて原薬とは異なる条件

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医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

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Fig. 5 ロラゼパム及び類縁物質 A‑E の HPLC による一斉分析（EP 改変法，PBr カラム）
)LJ


された数値の範囲内であった．この結果は USP 記
載の方法で得られた製剤抽出液を使用した場合（1.05 mg/mL）と同等であったことからも，本研究で検討した分析条件は製剤に対しても適用可能であることが明らかになった．

3.3 トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質の合成
Scheme 1 に示す合成経路にてトリヘキシフェニジ
ル塩酸塩類縁物質 A・HCl（10）（Fig. 7）を合成した．

3.4 クロモグリク酸ナトリウム類縁物質の合成
Scheme 2 に示す合成経路でクロモグリク酸ナト)LJ
Fig. 6 ロラゼパム製剤抽出液の HPLC クロマトグラム

O

O

O

a

Cl

HCl

b

N

N

10

9


a) Piperidine, CH2Cl2; b) 4M HCl in 1,4-dioxane
Scheme 1 トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質 A（9）及び A・HCl（10）
6FKHPH
の合成

2’
3’
4’

1’

O

HCl

HO

2’

4

1

2

3

N

5

3’

6

4’

Trihexyphenidyl hydrochloride

1’

2’

4
1

2

3

N

5

3’

6

4’

HCl

O
1’

1

4
2

3

N

5
6

థ໿੟ସA

థ໿੟ସA嵣HCl

(9)

(10)



Fig.)LJ
7 トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質の化学構造

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 1（2022）

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43

［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］

O

O

O

O

NaO2C

O

O

O

a

OH
CO2Na

O

O

O

OH
EtO2C

O

O

CO2Et

12

a) 4M HCl in 1,4-dioxane, EtOH, 80oC
Scheme 2 クロモグリク酸ナトリウム類縁物質 B（12）の合成

6FKHPHFig. 8 クロモグリク酸ナトリウム及び類縁物質の化学構造)LJ

リウム類縁物質 B（12）（Fig. 8）を合成した．

乾燥，濾過して減圧留去した．得られた油状物質をトリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質 A の合成：

NH シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサ3‑ クロロプロピオフェノン（1）をジクロロメタン中，

ン / 酢酸エチル = 100 : 0 to 15 : 85）に付すことで遊離

ピペリジンと反応させることでトリヘキシフェニジのアミン体 9 を淡黄色油状物質として得た（979 mg，

ル塩酸塩類縁物質 A（9）を得た．また，トリヘキシ

76%）．

フェニジル塩酸塩類縁物質 A・HCl（10）を合成した．
クロモグリク酸ナトリウム類縁物質 B の合成：ク

1

H‑NMR（MeOH‑ 4）δ : 8.00（2H, dd,

1.2 Hz），7.60（1H, t,= 8.4,= 8.4 Hz），7.50（2H, dd,

ロモグリク酸ナトリウムをエタノール中，4M 塩= 8.4, 8.4 Hz），3.25‑3.19（3H, m），2.78（2H, t,

酸 ‑ ジオキサン溶液を加えて加熱還流することでク= 7.5 Hz），2.49（4H, br），1.62（4H, ddd,

ロモグリク酸ナトリウム類縁物質 B（12）を得た．
これらの化合物の構造決定は核磁気共鳴法
11310.8, 5.4 Hz），1.48（2H,br）;= 16.8,13

C‑NMR（MeOH‑ 4）

δ : 200.7, 138.2, 134.4, 129.8, 129.1, 55.5, 54.8, 36.5,/ 218.1540（Calcd for（ H‑NMR 及 び C‑NMR）， 質 量 分 析 に て 行 っ た．

26.6, 25.1; ESI‑HRMS

合成した各化合物の合成プロトコル，機器データ及C14H20NO : 218.1539［M+H］+）

びスペクトルデータ（Fig. 9〜14）を以下に記載する．

遊離のアミン体 9（2.12 mmol）を 4M 塩酸 ‑1,4‑ ジ

1‑Phenyl‑3‑（piperidin‑1‑yl）propan‑1‑one

オキサン溶液に溶解させ，溶媒を減圧留去して生じ（9）及び 1‑Phenyl‑3‑（piperidin‑1‑yl）propan‑

た固体をジエチルエーテルに懸濁させ，濾取，洗浄

1‑one hydrochloride（10）して真空乾燥することで塩酸塩 10 を無色固体とし3‑ クロロプロピオフェノン（1.0 g，5.93 mmol）のジクロロメタン溶液（12 mL）にピペリジン（294μL ，て得た（536 mg，96%）．
1

H‑NMR（DMSO‑ 6）δ : 10.0（1H, brs），8.02

2.97 mmol）を加えて，室温にて 20 時間撹拌した後，（2H, dd,

反応液を減圧留去した．残渣をジエチルエーテルに7.58 （2H, dd,

懸濁させ，濾取，洗浄して真空乾燥することで無色= 4.8 Hz），3.49（2H, d,= 12.0 Hz），3.38（2H, d,．得られた固体に 2M 水酸
固体として得た（710 mg）= 5.4 Hz），2.93（1H, dd,= 10.8, 10.8 Hz），1.82‑

化ナトリウム水溶液を加えてジクロロメタンで 3 回1.80（2H, m），1.74‑1.69（3H, m），1.41‑1.37（1H,

抽出し，合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上でm）; 13C‑NMR（DMSO‑ 6）δ : 196.7, 135.9, 133.7,

44

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス= 7.8, 0.9 Hz），7.69（1H, t,= 4.8 Hz），

= 7.8, 7.8 Hz），3.64 （2H, d,Vol. 53 No. 1（2022）

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［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］)LJ
Fig. 9 化合物 9 の 1H‑NMR スペクトル)LJ
Fig. 10 化合物 9 の 13C‑NMR スペクトル

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45

［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］)LJ
Fig. 11 化合物 10 の 1H‑NMR スペクトル)LJ
Fig. 12 化合物 10 の 13C‑NMR スペクトル46

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

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［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］)LJ
Fig. 13 化合物 12 の 1H‑NMR スペクトル)LJ
Fig. 14 化合物 12 の 13C‑NMR スペクトル

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［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］= 7.2 Hz）; 13C‑NMR

128.8, 128.0, 52.3, 51.1, 32.8, 22.5, 21.3; Mp : 199‑

4.29（3H, m），1.33（6H, t,

201oC.

（DMSO‑ 6）δ : 176.55, 160.1, 158.5, 157.2, 150.2,

Diethyl 5,5ʼ‑（（2‑hydroxypropane‑1,3‑diyl）

135.4, 115.4, 114.6, 110.3, 109.1, 70.2, 67.1, 62.7, 13.9;

bis（oxy））bis（4‑oxo‑4H‑chromene‑2‑

ESI‑HRMS

carboxylate）（12）［M+H］ : 525.1391）; Mp（EtOH）: 182‑185 oC.

/ 525.1394 （Calcd for C 27H 25O 11+

クロモグリク酸ナトリウム（5.12 g，10.0 mmol）のエタノール懸濁液（160 mL）に 4M 塩酸 ‑1,4‑ ジオキ

3.5 トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質のサン溶液（40 mL）を加えて，80℃にて 36 時間加熱

qNMR による純度決定撹拌した．反応液を室温に冷却後，乾固するまで溶HPLC 分析に使用した試薬及び合成した化合物

媒を減圧留去した．残渣を熱エタノール（250 mL/（Fig. 7） は 1H‑qNMR に よ っ て 純 度 を 決 定 し たg）から再結晶し，無色綿状結晶固体として得た（Table 5）．代表例として，類縁物質 A（9）の NMR（4.77 g，91%）．この化合物の一部に対して更に再チャートを Fig. 15 に示している．各試料の定量シ結晶を行い，得られた固体をサンプルとした．

グナルは，不純物由来のシグナルなど妨害ピークが1= 8.4,

観測されないシグナルを選択した．トリヘキシフェ= 8.4, 0.6 Hz），7.10（2H, d,

ニジル塩酸塩については，2ʼ，6ʼ 位（7.40, d），3ʼ，5ʼ

H‑NMR（DMSO‑ 6）δ : 7.70（2H, dd,

7.8 Hz），7.17（2H, dd,= 7.8 Hz）
，6.71（2H, s），5.37（1H, d,
4.38‑4.34（2H, m），4.36（4H, d,

Table 5

= 3.6 Hz），

位（7.34, t）及び 4 位（7.24, t）を選択して絶対純度= 7.2 Hz），4.31‑を算出した結果，99.46% ± 0.26% であった．今回，

1

H‑qNMR により値付けしたトリヘキシフェニジル塩酸塩及び類縁物質 A の純度

SampleNMR solvent

Internal standard

Target signals（ppm）

Average ± S.D.（%）of target signals

Trihexyphenidylhydrochloride

DMSO‑ 6

DSS‑ 699.46 ± 0.26

類縁物質 A（9）MeOH‑ 41,4‑BTMSB‑ 4

H‑2ʼ,6ʼ（7.40, d）
H‑3ʼ,5ʼ（7.34, t）
H‑4（7.24, t）
H‑2ʼ,6ʼ（8.05, d）
H‑4ʼ（7.72, t）
H‑3ʼ,5ʼ（7.60, t）

99.39 ± 0.26 ＊＊分解物が確認されている条件下であるため，参考値として記載している．

Fig. 15 トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質 A（9）の 1H‑qNMR スペクトル（MeOH‑ 4）)LJ
48

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンスVol. 53 No. 1（2022）

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［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］

Fig. 16 溶液中における 10 の経時的な分解)LJ1H‑NMR チャート（MeOH‑ 4，室温，2 時間）

O

O

H
N

H
N

HCl

H

3.6 クロモグリク酸ナトリウム類縁物質の
qNMR による純度決定

Cl

HPLC 分析に使用した試薬及び合成した化合物

Fig. 17 10 から生じた分解産物の推定生成機構)LJ

（Fig. 8） は 1H‑qNMR に よ っ て 純 度 を 決 定 し た（Table 6）． 代 表 例 と し て， 類 縁 物 質 B（12） のNMR チャートを Fig. 18 に示している．各試料の定類縁物質 A は塩酸塩 10 とすることで固体化できた量シグナルは，不純物由来のシグナルなど妨害ピーため，保存や秤量における取り扱いが容易となっ

クが観測されないシグナルを選択した．クロモグリた．しかしながら，NMR 測定の結果から塩酸塩 10

ク酸ナトリウムにおいては芳香環のプロトン（7 位は溶液中での経時的な分解が観測された（Fig. 16）．

（7.65, t），8 位（7.16, d），6 位（7.04, d）及び 3 位（6.50,

1

H‑NMR 測定の結果から，Fig. 17 に示すような反s））を定量シグナルとして選択し純度を求めた結果，

応が起こっていることが推測された．この経時的な絶対純度は 83.93% ± 0.46% と算出された．今回使用

分解反応は重ジメチルスルホキシドの他，複数の測したクロモグリク酸ナトリウムは試薬会社から購入

定溶媒中においても確認された．一方で遊離のアミした試薬（純度 98%）であり，1H‑NMR から，水以ン体である 9 では観測されなかったことから，この外の不純物は検出されなかったことから測定に供し顕著な分解反応はアミン塩の溶液中における特有のた サ ン プ ル は 吸 湿 し て い た こ と が 考 え ら れ た．

現象であることが分かった．そのため類縁物質 A

JP17 記載の方法（乾燥減量；減圧，105℃，4 時間）

をアミン塩として使用する場合には，溶液中での安でサンプルを乾燥させた後，乾燥重量を測定して計定性について検討する必要があることが分かった．

算したところ，qNMR 測定で得られた純度と良く一致した．このことからクロモグリク酸ナトリウムの qNMR での純度の値付けが適切に実施できていると考えられた．また類縁物質 A（11）についてはTable 6

1

H‑qNMR により値付けしたクロモグリク酸ナトリウム及び類縁物質 A‑B の純度

SampleNMR solvent

Internal standard

Target signals（ppm） Average ± S.D.（%）of target signals

Sodium cromoglycate

DMSO‑ 6

DSS‑ 6

H‑7（7.65, t）
H‑8（7.16, d）
H‑6（7.04, d）
H‑3（6.50, s）

83.93 ± 0.46

類縁物質 A（11）DMSO‑ 6

DSS‑ 6

H‑4（7.27, t）
H‑3,5（6.39, d）

99.29 ± 0.34

類縁物質 B（12）DMSO‑ 6

DSS‑ 6

H‑7（7.75, t）
H‑15（1.34, t）

94.90 ± 0.18

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49［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］

Fig. 18 クロモグリク酸ナトリウム類縁物質 B（12）の 1H‑qNMR スペクトル（DMSO‑ 6）)LJ


Table 7

USP（USP42‑NF37）と本研究で使用した HPLC 条件の比較
USP condition

USP modified condition（This study）

1）Column

ODS, 3.9 × 150 mm, 5μm

ODS, 4.6 × 150 mm, 5μm2）Column temperature

30℃

40℃

3）Mobile phase

A : 0.1% triethylamine in water（adjust
to pH 4.0 with phosphoric acid）
B : acetonitrile

A : 0.1% triethylamine in water（adjust to
pH 3.8 with phosphoric acid）
B : acetonitrile4）Gradient table（Solution B conc.） A/B = 25 : 75（isocratic）

20% to 55%（0‑20 min）

5）Flow rate

1.0 mL/min

1.0 mL/min

6）Detection

210 nm

210 nm4 位（7.27, t）及び 3,5 位（6.39, d）を定量シグナルと

USP 記載の移動相グラジエントでは化合物の保した結果，絶対純度は 99.29 ± 0.34% であった．類

持が不良であり分析が困難であったため，移動相の縁物質 B（12）については 7 位（7.75, t）及び 15 位メ

グラジエントを変更した条件にて分析を検討した．

チルプロトンを定量シグナルとした結果，絶対純度

結果として，Table 7 右に示すグラジエント条件

は 94.90 ± 0.18% であった．

（USP modified condition）にて，トリヘキシフェニ
ジル塩酸塩と類縁物質 A との一斉分析が実施可能

3.7 トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質のであった（Fig. 19，Table 8）．

HPLC 分析
トリヘキシフェニジル塩酸塩類縁物質の HPLC 分

3.8 クロモグリク酸ナトリウム類縁物質の析においては，まず USP（USP42‑NF37）に記載の14）

分析条件 （Table 7 左，USP condition）を参考にして実施した．

50

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

HPLC 分析
クロモグリク酸ナトリウム類縁物質の HPLC 分析
では，当初，ODS カラムを使用し，蒸留水とアセVol. 53 No. 1（2022）

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［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］

Table 8థ໿੟ସ A

Trihexyphenidylhydrochloride

HPLC クロマトグラム上の各ピークの保持時間
及び分離度

Specific peaks

Retention time（min）

Resolution

類縁物質 A（9）

3.6

13.2

Trihexyphenidylhydrochloride

11.8

N/A

N/A : Not available

Fig. 19 トリヘキシフェニジル塩酸塩及び類縁物質 A の)LJ HPLC による一斉分析（USP 改変法）

トニトリルを移動相とした条件にて分析を実施し子系が混在しているためと考えられた．そこで，カた．しかしながら，この条件ではクロモグリク酸ナ

ルボキシル基のプロトン（H +）の解離を抑制するたトリウムのピークが保持されず保持時間が安定しなめに酸性（pH2.0）の移動相（Table 9）を使用し，い結果となった．これはクロモグリク酸ナトリウム低 pH 条件に耐性のある ODS カラムを用いて分析しがカルボン酸構造を有することから，緩衝能のないたところ，ピークの保持を改善することができた．

移動相中においてはカルボキシル基のイオン形と分

この条件を類縁物質との一斉分析に適用すること

Table 9 クロモグリク酸ナトリウム及び類縁物質の HPLC 分析条件
Conditions
1）Column

ODS（resistant to acidic pH ~2），4.6 × 250 mm, 5μm2）Column temperature

40℃

3）Mobile phaseA : 20 mm sodium phosphate（adjust to pH 2.0 with phosphoric acid）
B : acetonitrile4）Gradient table （Solution B conc.）

0% to 20%（0‑5 min）
，20% to 100%（5‑10 min）
，100% hold（10‑30 min）

5）Flow rate

1.0 mL/min

6）Detection

230 nmTable 10 HPLC クロマトグラム上の各ピークの保持時間
及び分離度

Sodiumcromoglycateథ໿੟ସ Aథ໿੟ସ B

Specific peaks

Retention time（min）

Resolution

Sodium cromoglycate

13.6

11.0

類縁物質 A（11）

16.8

11.5

類縁物質 B（12）

20.3

N /A

N/A : Not available)LJ
Fig. 20 クロモグリク酸ナトリウム及び類縁物質 A，B のHPLC による一斉分析

Pharmaceutical and Medical Device Regulatory ScienceVol. 53 No. 1（2022）

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51［辻ら：薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究（第 4 報）］

で，各化合物の完全分離を達成できた（Fig. 20，

Iyakushokuhinkyoku/jp18kihonsousin.pdf,（accessed
2020‑11‑08）.

Table 10）．

2）Maniwa, A.; Tsuji, G.; Ito, T.; Uchiyama, N.; Hosoe, J.;
Ohtsuki, T.; Matsufuji, T.; Demizu, Y.; Goda, Y.

4

結語

Changes in Test Methods for Internationalization in
the Japanese Pharmacopoeia（Part 1）:Establishment of

筆者らは，「有害試薬の可及的排除」と並び重要な課題である「JP の国際化」を目指し，令和 2 年度は，

a Quantitative Test Method for Clonidine
Hydrochloride Using HPLC Analysis.
. 2021, 141, p.591‑598.

定量法として JP では電位差滴定法，USP，EP では
HPLC 法が設定されているロラゼパムをモデルとし，JP における HPLC 法設定に向けた検討を行った．合成した各類縁物質の純度決定は 1H‑qNMR に

3）出水庸介，辻厳一郎，合田幸広．日本薬局方各条における有害試薬の可及的排除に関する研究．医薬品医療機器
レギュラトリーサイエンス． 2019，50（5），p.280‑285.
4）辻厳一郎，出水庸介，合田幸広．薬局方各条における有より行い，それらの純度は 88〜99% であった．こ害試薬の可及的排除に関する研究（第 2 報）
．医薬品医療れらの化合物について HPLC 上での各類縁物質の分機器レギュラトリーサイエンス．2020，51（11）, p.618‑

離条件について検討した結果，PBr を固定相としたカラムを使用し，EP の分析条件を改変することで，各化合物の一斉分析による完全分離を達成できた．
また，この分析条件はロラゼパム製剤の分析においても適用可能であることが明らかとなった．更に，トリヘキシフェニジル塩酸塩及びクロモグリク酸ナトリウムについても同様の試験法の検討を行うため

627.
5）第十七改正日本薬局方．クロニジン塩酸塩 , p.727‑728,
厚生労働省告示第 64 号，平成 28 年 3 月 7 日．
6）United States Pharmacopeia, the National Formulary（USP42‑NF37），p.1081‑1082.
7）European Pharmacopoeia 9.0, p.2127‑2128.
8）第十七改正日本薬局方．
ロラゼパム , p.1726, 厚生労働省
告示第 64 号，平成 28 年 3 月 7 日．

に，各類縁物質の合成，qNMR 測定による純度決9）Maniwa, A.; Tsuji, G.; Ito, T.; Uchiyama, N.; Hosoe, J.;定及び HPLC による一斉分析を実施した．分析条件

Ohtsuki, T.; Matsufuji, T.; Demizu, Y.; Goda, Y.

を検討した結果，各化合物の HPLC 上での完全分離条件を見出すことができた．トリヘキシフェニジル
塩酸塩類縁物質 A についてはアミン塩酸塩とする
ことで溶液中での安定性が低下したものの，保管やChanges in Test Methods for Internationalization in
the Japanese Pharmacopoeia（Part 2）:Establishment ofa Quantitative Method for Lorazepam Using HPLC
Analysis.

. 2021, 141, p.961‑970.

10）第十七改正日本薬局方．トリヘキシフェニジル塩酸塩 ,秤量などにおいては固体として取り扱い可能である

p.1152, 厚生労働省告示第 64 号，平成 28 年 3 月 7 日．

ことが望ましい．今後は塩酸とは異なる酸により適11）第十七改正日本薬局方．クロモグリク酸ナトリウム ,切な塩を調整し，溶液中においても安定な標品の調製についても検討したい．

（USP42‑NF37），p.2629‑2635.
13）European Pharmacopoeia 9.0, p.2924‑2925.

文 献1）第 十 八 改 正 日 本 薬 局 方 作 成 基 本 方 針 . https://www.
mhlw.go.jp/file/0 6‑Seisakujouhou‑1 1 1 2 0 0 0 0‑52

医薬品医療機器レギュラトリーサイエンス

p.738, 厚生労働省告示第 64 号，平成 28 年 3 月 7 日．
12）United States Pharmacopeia, the National Formulary14）United States Pharmacopeia, the National Formulary（USP42‑NF37），p.4477‑4481.

Vol. 53 No. 1（2022）

本誌掲載記事の無断転載・翻訳を禁止します．また，無断複写・複製は著作権法上の例外を除き禁止されています．