Literature Seminar#1 Q&A
2024-02-09
B4 Mayo Yamazaki
2024/01/25 Literature Seminar#1
B4 Mayo Yamazaki
Question & Answeru

PIP 全般について

Q1. βアラニンの挿⼊位置を事前に計算などでデザインできるか？

A1. 事前に計算等でβアラニンの位置を決めた例は⾒つけられませんでした。さらにβアラニンに置き換えると必ず親和性が向上するわけではなく、疎⽔性相互作⽤の低下により親和性が下がってしまう例*もありました。いろいろな PIP が設計される中で、GC 配列の繰り返しの時にはβアラニンへの置き換えが有効なことや、Im/Py が 5 つ以上続かないよ
うにした⽅が良いことなどの知⾒は増えてきているので、予測はしやすくなってきているのではないかと思います。
*Wilson, W. D. et al. Biochimie 2013, 95(2), 271-279
Q2. Py、Im の数で細胞取り込みのしやすさが変わるのか？

A2. ⼀般的に Im の数が少ない⽅が細胞の取り込みが良好であるとされています。PIP の分⼦量が⼤きいと核膜透過性には負の影響がありますが、細胞膜透過性にはそこまで影響がなく、細胞膜透過性に対しては分⼦量よりも Im の数の増加の⽅が負の影響があることが調べられていました。
Sugiyama, H. et al. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18(2), 978-983
Q3. メチル化修飾された DNA も PIP は認識するのか？

A3. シトシンがメチル化されたものも認識できます。メチル化されていない DNA 配列と⽐べて親和性が⾼い例*がありました。

*Sugiyama, H. et al. Nucleic Acids Res. 2008, 36(9), 2889-2894
In vitro でメチル化 DNA に結合するタンパク質の結合を、PIP を利⽤して阻害できることを⽰した例**もありました。PIP のメチル化された DNA とされていない DNA に対する結合の明確な選択性はないとされているようです。

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B4 Mayo Yamazaki**Sugiyama, H. et al. Bioorg. Med. Chem. 2019, 27(11), 2167-2171
Q4. 遺伝⼦配列を標的とする PIP と核酸医薬品の違いは？

A4. 核酸医薬品との違いとして、PIP はヌクレアーゼの影響を受けず細胞内で安定であるということが挙げられると思います。また、核酸は DNA の標的配列に対して４つの塩基から選んで⽐較的簡単に⽬的の分⼦を作ることができる⼀⽅で、PIP は A/T の安定した区別が難しいことに加えてそれぞれの配列に対するデザイン最適化が必要であると考えられます。
さらに、核酸医薬品は RNA を標的としたものもありますが、PIP は DNA と RNA を区別しており、RNA に対する結合⼒を持たない*とされています。
* Dervan, P. B. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 415-418
Q5. 抗体医薬では⼀つの抗体に幾つの薬剤をつけられるのか(DAR)が重要なファクターとなるが、PIP の場合は⼀つの PIP にいくつ化合物をつけられるのか？また化合物を導⼊可能な位置は末端とヘアピンの折り返しのみか？

A5. PIP に化合物をつけた例は、折り返しと末端につけたもののみ⾒つけられました。現在発表されている事例においては、つけられる化合物の数は最⼤２つと考えられます。
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PIP + DNA alkylating agent (KR12)

Hiraoka, K., Sugiyama, H., Nagase, H. et al. Nat. Commun. 2015, 6, 6706
Q6. CBI を選んだ理由はあるか？

A6. 合成が容易で活性が⾼く、PIP に結合させた DNA アルキル化剤として広く研究されているという記述がありました。
Q7. In vivo で LS180 細胞 (G12D ヘテロ変異) を接種したマウスの⽅で効き⽬が⼩さいようだがなぜか？

A7. 該当論⽂中に考察はありませんでしたが、LS180 細胞はヘテロ接合型変異だが、SW480細胞はホモ変異であるという違いなどの影響が考えられます。
Sugiyama, H., Nagase, H. et al. Chem. Eur. J. 2015, 21, 14996-15003
uBi-PIP

Taniguchi, J., Sugiyama, H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 7108‒7115
Q8. Bi-PIP が⽬的の DNA 配列にくっついてその後 P300 が Ac 認識しているのか？

ヌクレオソームの弛緩状態によって Kac の認識に差が出てしまうことはあるか？ヌクレオソームの種類の違いで Kac 認識に差が出るみたいなデータはあるか？

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A8. Bi-PIP が DNA 配列と P300 のどちらと先に結合するかについて明記はありませんが、Bi と P300 の Kd が約 30 nM 程度なので、DNA 配列に先にくっつく割合は多いのではないかと思います。ヌクレオソームの弛緩状態について調べてはいませんが、in vitro でヌクレオソームのコアに近い位置に標的の配列があるヌクレオソームを⽤いた場合に⽐較的⾼いアセチル化レベルを⽰したというデータはありました。この論⽂中で⾔及はありませんが、転写活性化された遺伝⼦のヌクレオソームにおける位置を詳細に調べれば、ヌクレオソームの状態による影響の傾向が何かわかるかもしれません。
Q9. Bi-PIP は同時に転写抑制もしてしまうのではないか？

A9. 論⽂中で特に議論はありませんが、その可能性は否定できないと思います。今回標的とした配列が転写因⼦の標的とする遺伝⼦配列だった場合、転写抑制につながると考えられます。
PIP1 や PIP2 のみでダウンレギュレーションされた遺伝⼦について詳しく調べれば、そのようなことが起きているかわかるかもしれません。⼀⽅で、⽣体内の転写因⼦の多くはマイナーグルーブよりも、主に DNA のメジャーグルーブと相互作⽤しているとされているので、完全に転写を阻害している可能性は⼩さいと考えられます。
参考: Molecular Biology of the Cell 6th edition (2017)
uPIP-HoGu

Yu, Z., Sugiyama, H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 2426−2429
Q10. ホストゲストの部分の相互作⽤は強すぎて困ることはあるか？

A10. PIP 部分が⻑いもの、すなわち認識する配列を⻑くするとより強い Host-guest 作⽤が必要なことが、ePIP-HoGu の論⽂中で確かめられており、また強くしたことで、8bp の gapにも対応できるようになっていることから、強い作⽤があっても困ることはないように思います。論⽂中の PIP-HoGu を使⽤した細胞実験では、エンドポーターを利⽤していたのでわかりませんが、Host-guest 相互作⽤による細胞透過性への影響については検討する必要があるのではないかと思います。
Q11. ヘアピン型 PIP を 2 つ使っているのはなぜか？

A11. 理由について特に論⽂中に記述はありませんが、ヘアピン型 PIP は現在の PIP の設計において最も標準的な形であり、⼀つにつながっていないホモダイマーの PIP と⽐べておよそ 100 倍⾼い親和性を⽰すとされているからだと思います。γターンのおかげで、ポリアミドの構造が固定され、部分的に 1:1 で結合するといった曖昧さを防げることが確認されています。
Dervan, P. B. & Edelson, B. S. Curr. Opin. Struct. Biol. 2003, 13, 284-299

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B4 Mayo Yamazaki
Q12. 2 bp の gap の時に DNA との最も安定な結合が⾒られたのはアダマンタンとシクロデキストリンの距離に依存しているのか？

A12. 特に論⽂中で考察はありませんが、リンカーの⻑さを⻑くした実験でも 2 bp の距離で最も安定な相互作⽤を⽰したことから、Host-guest の向きに関わる、根元の位置関係が重要なのではないか思います。モデルでは以下の図のようになっていると考えられています。

Q13. 10 bp を PIP-HoGu で標的とするのと単⼀の PIP で標的とするのとの違いはどこか？

A13. 過去に 10bp 以上を標的とする単⼀の PIP の設計も⾏われていますが、柔軟性と特異性が貧弱であるとされています。その点、PIP-HoGu であれば、⽣体内の転写因⼦を模倣して gap 距離も含めて設計できるので、天然の転写因⼦を阻害したい場合には１つの PIP よりも PIP-HoGu が優れているのではないかと思います。

4Literature Seminar#1 Q&A2024-02-09
B4 Mayo Yamazaki↓10 bp 以上を標的とした例

1 bp mismatch と⽐較した特異性
約４倍

Dervan, P. B. & Edelson, B. S. Curr. Opin. Struct. Biol. 2003, 13, 284-299
Dervan, P. B. et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 6872-6878
Q14. 6 bp+gap+6 bp の塩基を狙えることでどれくらいのオフターゲットが抑制できるのか？

A14. ある 6 bp の塩基配列の存在確率は、単純計算で 4096 塩基に１つとなります。PIPHoGu では 6 bp+6 bp と gap 距離という⻑い配列を標的とできるため、ヒトゲノム3 × 10!
塩基対において、標的とする配列の発⽣頻度は⼩さくなると考えられます。6 bp+6 bp と gap
距離の配列は、単純計算で 16777216 塩基に１つ現れることとなります。
参考: Molecular Biology of the Cell 6th edition (2017)
Q15. PIP-HoGu の PIP の部分を３つ分に拡⼤したようなものは可能か？

A15. 協同的なシステムを使って PIP を 3 つ繋いだ例は⾒つけられませんでした。ただ脂肪酸リンカーを利⽤してヘアピン型 PIP を３つ繋ぎ、テロメアの配列を標的とした例はあります。

Kawamoto, Y., Sugiyama, H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 14100‒14107
Q16. エンドポーターの仕組みについて詳しく

A16. エンドポーターそのものについては、親油性⾯(ロイシンなど)と弱塩基性⾯(ヒスチジ5Literature Seminar#1 Q&A
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B4 Mayo Yamazakiン)とで作られた、ペプチドです。エンドサイトーシスの仕組みを利⽤して、化合物を細胞の損傷なしで細胞内へ運ぶことができます。陥⼊により化合物が膜ごと細胞の中に取り込まれ、膜の塊の中が酸性になるとヒスチジンがカチオン性を帯びます。するとアニオンが膜の中に増えて膜内の浸透圧が上がり、容積に耐えられなくなって膜が破れて中の化合物が細胞の中に出るという仕組みになっています(プロトンスポンジ効果)。
Summerton, J. E. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006, 1058, 62‒75

Q17. ERα⽚⽅の阻害(Ada3 のみを⼊れた場合)で活性が下がっているのはなぜか？

A17. PIP 単体と、PIP とシクロデキストリンまたはアダマンタンをつなげたものでは、何かつなげたものの⽅が DNA への結合⼒が落ちているというデータがあったので、論⽂中で議論はありませんでしたが、より⼤きいものがつながっている Cyd2 の⽅が不安定で Ada3よりも阻害効果が⼩さいということではないかと思います。

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