上原記念生命科学財団研究報告集, 34 (2020)

上原記念生命科学財団研究報告集, 34（2020）

127. 肥満炎症抑制を目指したマクロファージの脂質代謝制御川﨑 拓実
奈良先端科学技術大学院大学 先端科学技術研究科 バイオサイエンス領域 分子免疫制御
Key words：慢性炎症，PIKfyve，イノシトールリン脂質，肥満，Ｍ1 マクロファージ

緒 言
生体が障害を受けたり、病原体に侵入されたりすることにより、自然免疫系の応答が誘導され、サイトカインの産生に伴って生体防御のための炎症が誘導される。このような炎症が、原因が除去されても何らかの理由により収束せず持続的に慢性化することを慢性炎症と呼んでいる。慢性炎症を伴う病気として、ぜんそくやアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患、関節リウマチなどの自己免疫性疾患などが挙げられる。これら慢性炎症に対する治療には、ステロイド系抗炎症剤を用いることが多い。しかし、ステロイドによる炎症抑制は対処療法的に炎症を抑えるだけで原因の解消に至っていないため、より根本的に効果的な治療方法の開発が望まれている。これまでの我々の研究で慢性炎症とマクロファージの脂質代謝の重要性を明らかにしてきた。そこで本研究では、これまで得られた知見をもとに、慢性炎症の抑制のためのマクロファージの脂質代謝制御を目指して研究を行った。
マクロファージは個々の組織に常在し、個別の機能をもつことで病原体の除去や組織の恒常性維持に貢献している［1，2］。組織常在性マクロファージはその機能から大きく 2 つに大別され、炎症抑制性マクロファージ（M2 マクロファージ）は、組織の恒常性維持に寄与している一方、炎症性マクロファージ（M1 マクロファージ）はTNFαや IL-6 などの炎症性サイトカインを分泌することで炎症の増大を引き起こす［3］。この組織常在性マクロファージは、慢性炎症の発症及び収束に重要な役割を果たすことが明らかとなってきている。組織常在性マクロファージの M1／M2 分化のバランスは健康な状態であれば適切に制御されているが、慢性炎症状態の組織においては、M1 マクロファージが優位になり、より炎症の増悪化が引き起おこされると考えられている。
このマクロファージの状態を制御することにより、慢性炎症の収束を促すことができれば、新しい視点での慢性炎症の治療法方法を提案することができると考えられた。
イノシトールリン脂質は細胞内の微量な脂質でありながら、イノシトール環のリン酸化状態により様々な役割をもつ生理活性物質である。これまで、イノシトールリン脂質代謝酵素である PIKfyve のマクロファージ特異的欠損マウスを用いた研究により、肺組織でのマクロファージの分化とアレルギー炎症の関係を明らかにしてきた［4］。また、最近の研究では、これまで慢性炎症との関連についてはほとんど顧みられなかったがん、肥満などの病気でも、慢性炎症が関わっていることが明らかとなってきている。実際に我々の PIKfyve 欠損マウスを用いた研究では、野生型及び PIKfyve 欠損マウスは、通常食では変化がなかったが、高脂肪食を付加することにより肥満を誘導した
ところ、野生型マウスでは肥満になったものの PIKfyve 欠損マウスでは肥満状態が抑制されていることが明らかとなった。これらの結果は、イノシトールリン脂質の代謝制御によりマクロファージの分化状態を制御することで慢性炎症を制御できる可能性を示唆していたことから、肥満炎症を制御することによるマクロファージの脂質代謝制御を目指して研究を行った。

方法および結果
健康な通常状態の脂肪組織内には、炎症抑制性マクロファージ（M2 マクロファージ）が常在し、脂肪組織の恒常性維持に寄与している一方で、肥満状態になると脂肪組織は肥大化し、肥満状態では脂肪組織内に集積した Th1 細胞が分泌したⅡ型のインターフェロン（IFN-γ）によって活性化された炎症性マクロファージ（M1 マクロファージ）が1

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集積している。M1 マクロファージは、TNFαや IL-6 などの炎症性サイトカインを分泌し、インスリンシグナルに影響を与え、インスリン抵抗性を亢進する。好中球に続いて単球も誘引され、脂肪組織内に流入し、炎症性サイトカインをさらに産生することで、脂肪組織内を慢性的な炎症状態にすることが知られている。これまで予備実験として、野生型及び PIKfyve 欠損マウスに高脂肪食（High Fat Diet（HFD））を付加することにより肥満を誘導した
ところ、通常食（Normal Control Diet（NCD））では変化がなかったものの野生型マウスでは肥満を誘導できたものの、PIKfyve 欠損マウスでは肥満状態が抑制されていることが明らかとなった（図 1）。

図 1．HCD、HFD 投与時の経時的な体重変化
6 週令の野生型（Control）及び PIKfyve 欠損（KO）マウスに通常食（Normal Control Diet（NCD））（左）及び高脂肪食（High Fat Diet（HFD））（右）を与え、継時的な体重の変化を計測した。
un-paired t-test、*P＜0.05。

食事誘導性の肥満が起こることで、脂肪細胞の肥大化に伴う内臓脂肪の肥大化が知られている。そこで、Control
及び PIKfyve 欠損マウスの卵巣周囲脂肪組織を採取し、重量を計測した。その結果、ND を摂餌させた場合では脂肪組織の大きさ、重量に差は見られなかった（図 2 左）。一方、HFD を摂餌させた場合では、野生型マウスで脂肪組織が肥大化していたのに対し、PIKfyve 欠損マウスにおいては、肥大化が抑制されていた（図 2 右）。次に、HFD摂餌後の PIKfyve 欠損マウスにおいて、脂肪細胞の肥大化が起きているかを確認するために、パラフィンにより作製した脂肪組織切片の H&E 染色を行った。ND を摂餌させた場合は、野生型及び PIKfyve 欠損マウスの脂肪細胞の大きさに差は見られなかった。HFD を摂餌させた場合では、野生型マウスにおいて脂肪細胞が肥大化しているのに対し、PIKfyve 欠損マウスでは肥大化が抑えられていることが観察された。

図 2．NCD、HFD 投与後の腹腔内の脂肪組織6 週令の野生型（Control）及び PIKfyve 欠損（KO）マウスに通常食（Normal Diet（ND））（左）及び高脂肪食（High Fat Diet（HFD））（右）を与え、腹腔内の脂肪組織の大きさと重量を測定した。
un-paired t-test、＊P＜0.05。

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PIKfyve 欠損マウスにおける肥満誘導の抑制と免疫細胞の関与を明らかにするため、脂肪組織内の炎症反応に関与
す る こ と が 知 ら れ て い る 好 酸 球 （ Eosinophils ： CD45 ＋ CD11b ＋ SiglecF ＋ ）、 好 中 球 （ Neutrophils ：CD45＋CD11b＋Ly6G＋）、樹状細胞（Dendritic cells：CD45＋CD11b＋CD11c＋）、T cells（CD45＋CD11b－TCRβ＋）、NK cells（Natural killer cells：CD45＋CD11b－NK1.1＋）、マクロファージ（Macrophages：CD45＋CD11b＋F4/80＋）の分布をフローサイトメトリーを用いて解析した（図 3）。その結果、NCD 及び HFD を摂餌させたマウスでは、野生型マウスと PIKfyve 欠損マウスの間でこれら免疫細胞の割合に有意な差は認められなかった（図 3）。

図 3．脂肪組織に浸潤した免疫細胞の解析
6 週令の野生型（Control）及び PIKfyve 欠損（KO）マウスに通常食（Normal Diet（ND））（上）及び高脂肪食（High Fat Diet（HFD））（下）を与え、Control および PIKfyve KO マウスの脂肪組織を採取し、浸潤している
好酸球（Eosinophils：CD45＋CD11b＋SiglecF＋）、好中球（Neutrophils：CD45＋CD11b＋Ly6G＋）、樹状細胞（Dendritic cells：CD45＋CD11b＋CD11c＋）、T cells（CD45＋CD11b－TCRβ＋）、NK cells（Natural killer cells：CD45＋CD11b－NK1.1＋）、マクロファージ（Macrophages：CD45＋CD11b＋F4/80＋）の割合をフローサイト
メトリーで解析した。

ＡＢ

図 4．脂肪組織に浸潤したマクロファージの解析
A） ND および HFD を摂餌させた Control、PIKfyve KO のオスマウスの脂肪組織内マクロファージをM1／M2 マクロファージの分画に分けた図を示す。CD45＋CD11b＋F4/80＋のマクロファージ分画とした
後、CD11c＋CD206－を示す細胞分画を M1 マクロファージ、CD11c－CD206＋を示す細胞分画は M2マクロファージを表している。
B） ND および HFD を摂餌させた Control、PIKfyve KO のマウスの脂肪組織からマクロファージを単離し、遺伝子発現をマイクロアレイにより調べた。

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次に、マクロファージをさらに詳しく調べるため、脂肪組織内マクロファージを CD45＋CD11b＋F4/80＋でゲートした後、さらに CD11c と CD206 を用いて M1（CD45＋CD11b＋F4/80＋CD11c－CD206＋）および M2（CD45＋CD11b＋F4/80＋CD11c＋CD206－）マクロファージとして分離しその割合を解析した（図 4）。M1 マクロファージは HFD による脂肪組織内に誘導されることがこれまでの研究で示されているが、本研究でも、野生型マウスにおいてM1 マクロファージ割合が増加していることが分かった一方、PIKfyve 欠損マウスでは HFD を摂餌させた場合特に、M1 マクロファージの増加が抑制されていた（図 4A）。表面抗原を用いた M1／M2 マクロファージの分離では HFD により野生型では M1 マクロファージが増加するのに対して、PIKfyve 欠損マウスでは M1 マクロファージの増加が抑制されていた。そこで、次に脂肪組織内のマクロファージの遺伝子発現を網羅的に調べることにより、マクロファージによる慢性炎症について検証した（図 4B）。その結果、野生型マウスでは HFD の投与によりマクロファージの遺伝子発現が NCD に比べ顕著に増減する遺伝子が 100 程度あるが、それら遺伝子の発現の増減はPIKfyve 欠損マウス由来マクロファージでは見られなかった。また、炎症性マーカーやマクロファージの分化マーカーの詳細な解析により、PIKfyve 欠損 マウス由来マクロファージは M1 マクロファージへの分化が抑制されていることが示唆された。

考 察
NCD の摂餌時の PIKfyve 欠損マウスは、野生型マウスと同様の体重だった一方、HFD の摂餌時では野生型は顕著な体重増加が見られたものの、PIKfyve 欠損マウスの体重増加が抑制されていた（図 1）。また、腹腔内に蓄積した脂肪組織の大きさ及び重さも野生型に比べ PIKfyve 欠損マウスでは抑制されおり、組織検査によって脂肪組織の肥大化の抑制が起きていることが明らかとなった（図 2）。このことから、マクロファージ特異的 PIKfyve の欠損により HFD 摂餌による食事誘導性肥満が抑制されることが明らかとなった。次に PIKfyve 欠損マウスにおける肥満抑制と、免疫細胞との関与を明らかにするため、脂肪組織内へと浸潤する免疫細胞の変化を調べたところ、マクロファージや NK 細胞といった脂肪組織の炎症に関与する免疫細胞の割合には大きな変化が見られなかった（図 3）。しかし、脂肪組織内マクロファージの詳細な解析では、野生型マウスでは ND に比べ HFD 摂餌によりM1 マクロファージの割合が増加し、 PIKfyve 欠損マウス では増加しないことが分かった。一方で、
M2 マクロファージは、Control マウスで減少が見られたのに対し、PIKfyve 欠損マウスでは減少は見られなかった（図 4）。また、網羅的な発現解析でも、野生型マウス由来のマクロファージでは多くの炎症関連遺伝子が HFD により発現誘導していたが、PIKfyve 欠損マウス由来マクロファージはそれら遺伝子発現が抑制されており、脂肪組織内のPIKfyve 欠損マウスの M1 マクロファージへの分化が抑制されていることが示唆された（図 4）。
本研究で、PIKfyve は脂肪組織内におけるマクロファージの制御因子、特に M1／M2 マクロファージの分化過程への関与が示唆された。脂質代謝酵素である PIKfyve は産生脂質であるホスファチジルイノシトール 5 リン酸もしくはホスファチジルイノシトール 3，5 リン酸の産生制御を通じて、慢性炎症の際のマクロファージの分化を制御していることが示唆された。しかし、マクロファージ特異的な PIKfyve の欠損がどのようにマクロファージの分化に影響を与えているのか、その分子機構は不明である。これまでの先行研究で、PIKfyve はウイルス感染時においてイノシトールリン脂質のリン酸化を介して、IRF ファミリー転写因子の一つである IRF3 を活性化することが報告していることから［4］、PIKfyve は転写因子の機能を直接的もしくは間接的に制御することで、マクロファージの分化制御を行っていると考えられる。転写因子 IRF3 の同じファミリーに属する IRF5 は、M1 マクロファージへの分化誘導に重要であることが報告されていることから、今後、IRF5 がどのように PIKfyve により制御を受けるのかに着目し研究を行う。また、慢性炎症制御に PIKfvye が関与することが示されたことから、肥満をはじめとする慢性炎症の関わる疾患において PIKfvye の阻害剤が治療効果を示すのか検証を行う。

共同研究者・謝辞
本研究は、奈良先端科学技術大学大学院先端科学研究科分子免疫制御学研究室の河合太郎教授のもと行った。
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文 献1） Xu, H., Barnes, G. T., Yang, Q., Tan, G., Yang, D., Chou, C. J., Sole, J., Nichols, A., Ross, J. S., Tartaglia, L. A.,
Chen, H.. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulinresistance. The Journal of clinical investigation, 112, 1821-1830. (2003)

PMID: 14679177 DOI:

10.1172/JCI19451
2） Weisberg, S. P., McCann, D., Desai, M., Rosenbaum, M., Leibel, R. L., Ferrante, A. W.. Obesity is associatedwith macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of clinical investigation, 112(12), 1796-1808.
(2003) PMID: 14679176 DOI: 10.1172/JCI200319246
3） Fernando O. Martinez and Siamon Gordon The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time forreassessment F1000Prime Rep. 6 13 (2014) PMID: 24669294 DOI: 10.12703/P6-13
4） Kawasaki T, Ito K, Miyata H, Akira S, Kawai T. Deletion of PIKfyve alters alveolar macrophage populations
and exacerbates allergic inflammation in mice. EMBO J. 2017 Jun 14;36(12):1707-1718. PMID: 28533230 DOI:
10.15252/embj.201695528.

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