マイクロサンプリングのご紹介

株式会社LSIM安全科学研究所
安全性研究部 高橋 一彰

P-144:マイクロサンプリング法のマウスの生体及び毒性評価への影響検討Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved私たちは高い倫理観を持ち、動物実験に臨んでいます。
• 環境エンリッチメントの強化• 動物の飼育環境の改善• AAALAC認証取得 （2012年～）
さらなる動物のウエルビーイングの向上→ マイクロサンプリングの導入Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved

検討内容のご紹介マイクロサンプリングとはマイクロサンプリングに用いる
採血部位
デバイス
マイクロサンプリングによる生体への影響
まとめⒸ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved

検討内容のご紹介マイクロサンプリングとはマイクロサンプリングに用いる
採血部位
デバイス
マイクロサンプリングによる生体への影響
まとめⒸ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reservedマイクロサンプリングとは・・・
薬物やその代謝物の濃度を測定しTKパラメータを算出するために、ごく微量の血液を採取する手法
採血量:50 μL以下
対象マトリックス:血液、血漿、血清
対象動物:毒性評価群のラット（マウスは検討中）
詳細は、2019年に発出されたICH S3A「トキシコキネティクス（毒性試験における全身的暴露の評価）に関するガイダンス」におけるマイクロサンプリング手法の利用に関する質疑応答集（Ｑ＆Ａ）により規定されております。
Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reservedマイクロサンプリングの利点
採血量最小化による動物福祉（3R）への貢献
動物の痛みや苦痛の軽減（refinement）
TKサテライト群の動物数を削減・無くす（reduction）→ 被験物質量の削減による試験コストの圧縮

Replacement
代替3RReduction
削減

Refinement
洗練【例】ラット反復2週予備試験
従来法

マイクロサンプリング適用
毒性評価群

TK群

毒性評価群

TK群

被験物質量*92g→51g

用量

雄雌

雄雌

0 mg/kg

550044.6%減

250 mg/kg

55004500 mg/kg

550041000 mg/kg

5500用量雄雌雄

雌0 mg/kg

5544250 mg/kg

5544500 mg/kg

5541000 mg/kg

554*: ロス分を含まない理論値Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved

検討内容のご紹介マイクロサンプリングとはマイクロサンプリングに用いる
採血部位
デバイス
マイクロサンプリングによる生体への影響
まとめⒸ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reservedマイクロサンプリングに用いる採血部位
無麻酔下で反復採血が可能な採血部位・・・• 頸静脈（鎖骨下静脈）メリット:
採血量を確保しやすい
デメリット: 高度な採血技術が必要
止血が不確実（目視で確認できない）
胸筋を介するため組織への影響が懸念• 外側尾静脈
メリット:

採血が容易
止血が容易
尾が多少損傷するが組織への影響は限定的デメリット: 採血量の確保が難しい（血流が弱い）
外側尾静脈投与時は不適（被験物質のコンタミ）Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved採血部位の違いによるTKパラメータへの影響【方法】Crl:CD(SD)ラット7週齢、雌雄各群3または5匹

初回投与時TK採血

被験物質

最終回投与時TK採血

投与経路

メトトレキサート アセトアミノフェン(MTX)(APAP)
経口投与

ドキソルビシン
(DOX)
腹腔内投与

投与用量

0.2 mg/kg/day

2.5 mg/kg/week

投与回数
採血部位

1000 mg/kg/day

1日1回、7回/週、4週間、計28回

1日1回、1回/週、4週間、計5回

尾静脈

鎖骨下静脈

採血量

約50 μL/時点（血漿量:約20 μL/時点）

採血時点

初回:0.5, 1, 2, 4, 8及び24時間（6時点）
最終回:pre, 0.5, 1, 2, 4, 8及び24時間（7時点、第28or5回）

採血デバイス

ガラス製キャピラリー+25G翼付採血針

27G FNシリンジ

抗凝固剤

ガラス製キャピラリーに処理済み（風乾）液体をフラッシュして処理Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved

採血部位の違いによるTKパラメータへの影響
MTX

APAPDOX

採血部位の違いにより血漿中薬物濃度推移に明確な差は認められなかった。

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検討内容のご紹介マイクロサンプリングとはマイクロサンプリングに用いる
採血部位
デバイス
マイクロサンプリングによる生体への影響
まとめⒸ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved

採血用デバイスの比較検討
デバイスの違いがTKパラメータに及ぼす影響は・・・
アセタゾラミド(60または200 mg/kg)を雄性ラット(6週齢、各群n=3)に単回経口投与後、各種デバイスを用いてマイクロサンプリング法により採血。
血漿中薬物濃度をLC-MS/MS法で測定し、TKパラメータを算出・比較。
アセタゾラミド:血球移行率が高いため、マイクロサンプリングによる反復採血の影響を受ける可能性がある。

①採血デバイス①BDロードーズTM
インスリン皮下投与用針付注射筒 (29G）

採血部位

鎖骨下静脈

採血量
採血時点

②樹脂製
キャピラリー②③ガラス製
キャピラリー③④④MSW2 TM
Type Udck TM＋動物実験用翼付採血針（25G）
外側尾静脈

約50 μL/時点

約23 μL/時点

投与後0.5, 1, 2, 4, 8及び24時間（6時点）Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved

デバイス別血漿中薬物濃度推移

50000
Subclavian

40000

MSW
Capillary-old

30000

Capillary-new

20000
10000

Plasma concentration (ng/mL)

Plasma concentration (ng/mL)

50000

0BDロードーズ（鎖骨下）

Subclavian
40000

樹脂製キャピラリー（尾静脈）MSW
Capillary-old
Capillary-new

30000

ガラス製キャピラリー（尾静脈）MSW2（尾静脈）20000
10000004812Time (h)16202404812162024Time (h)Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved薬物動態パラメータ60 mg/kg

200 mg/kg

採血部位

デバイス

Cmax
(ng/mL)

AUC0-24h(ng∙h/mL)

Cmax(ng/mL)

AUC0-24h(ng∙h/mL)

鎖骨下静脈①BDロードーズ

30,800±2,700149,000±9,00043,700±10,600

404,000±50,000②樹脂製キャピラリー

25,200±1,500129,000±1,00048,600±5,500360,000±72,000③ガラス製キャピラリー

29,900±1,900153,000±4,00046,400±6,800380,000±61,000④MSW227,700±1,100140,000±6,00040,300±7,200449,000±92,000① vs ②、③、④ (採血部位比較)

0.82～0.98倍

0.87～1.03倍

0.92～1.11倍

0.89～1.11倍② vs ③、④ (デバイス比較)

0.84～0.93倍

0.84～0.92倍

0.87～1.05倍

0.95～1.18倍

外側尾静脈

採血部位の違い（鎖骨下静脈 or 外側尾静脈）による薬物動態パラメータへの影響はみられなかった。
→ Cmax:0.82～1.11倍、AUC0-24h:0.87～1.11倍
また、外側尾静脈採血において、デバイスの違いによる薬物動態パラメータへの影響もみられなかった。
→ Cmax:0.84～1.05倍、AUC0-24h:0.84～1.18倍

以上より、採血量を確保しやすい鎖骨下静脈からの採血が推奨されます。鎖骨下静脈採血には高度な技術が要求されますが、当社の熟練した技術者はこの問題をクリアしています。
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検討内容のご紹介マイクロサンプリングとはマイクロサンプリングに用いる
採血部位
デバイス
マイクロサンプリングによる生体への影響
まとめⒸ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reservedマイクロサンプリングによる生体への影響【方法】注射用水を単回経口投与（Crl:CD(SD)ラット6週齢、雌雄各3匹）
Day 2

Day 1 投与Day 3

尾静脈から50 μL×6時点（投与後0.5, 1, 2, 4, 8及び24時間）採血投与の2日後
・血液学的検査・血液生化学的検査

【結果】
♂

♀

RBC
(106/μL)

HGB(g/dL)

HCT(%)

RBC(106/μL)

HGB(g/dL)

HCT(%)

1. 検査結果

6.43

13.9

42.0

6.41

13.7

40.4

2. 背景値(Mean±2S.D.)

6.68±0.30

14.21±0.68

43.37
±2.07

6.76
±0.32

14.25
±0.54

42.48
±1.76

血液学的検査、血液生化学的検査全ての項目が、背景値の範囲内であることを確認した。
（表は赤血球系の項目を抜粋）Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved

検討内容のご紹介マイクロサンプリングとはマイクロサンプリングに用いる
採血部位
デバイス
マイクロサンプリングによる生体への影響
まとめⒸ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reserved

まとめ・マイクロサンプリングは、3RのRefinementとReductionを推進すると共に、被験物質量の削減による試験コストの圧縮を可能にする技術である。
・分析技術の進歩により、少ない血漿量で問題なくTK測定は可能である。
・採血部位あるいはデバイスの違いは、TK測定結果に影響を与えない。
・マイクロサンプリングは、ラットの生体に大きな影響を与えない。
課題
マイクロサンプリングは手技そのものでは生体に影響を与えないものの、被験物質を投与した動物への影響は、十分には解明されていないため、慎重に吟味して考察する必要はある。
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当社の取り組み状況
AMED創薬基盤推進研究事業への参画（2017年～現在）

・Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative
28-day study (J. Toxicol. Sci., 2020)

第44回 日本毒性学会学術年会（2017年）

・ラットを用いた尾静脈からのマイクロサンプリング技術の確立と毒性試験への応用に関する検討

第45回 日本毒性学会学術年会（2018年）

・マイクロサンプリングの導入に関する国内CROの取り組み
・ラットを用いた反復投与毒性試験における毒性評価及び薬物動態に及ぼすマイクロサンプリング法の影響

第46回 日本毒性学会学術年会（2019年）

・ラットを用いたマイクロサンプリング法におけるデバイスの比較検討

第14回 非臨床血液コンファレンス（2019年）

・非臨床安全性試験におけるマイクロサンプリング導入に向けた取り組み

第48回 日本毒性学会学術年会（2021年）

・マイクロサンプリング法のマウスの生体及び毒性評価への影響検討Ⓒ 2021 LSIM Safety Institute Corporation All rights reservedお問い合わせ
株式会社ＬＳＩＭ安全科学研究所 鹿島研究所
茨城県神栖市砂山14番地1
担当:安全性研究部 高橋 一彰
TEL: 0479-46-7554
E-mail: takahashi.kazuaki@mg.medience.co.jp
HP: https://www.ankaken.co.jp/index.html
お気軽にお問合せ・ご相談ください。
まずは2週間反復投与予備試験で試してみませんか?!

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