Ver.310315

やってみよう！
遺伝子実験
PCR 法を用いる実験の解説書～PCR 法を用いたイネの品種判別を題材として～©いらすとや※A４用紙に小冊子印刷するとポケットサイズになります。

目

次

実験実施の前に◇イネの品種判別実験とは……………………………………………１◇PCR 法を用いる実験に関して ………………………………………２◇実験の流れ……………………………………………………………３

知っておきたい実験器具※必要な部分だけお読みください◇実験器具の滅菌………………………………………………………４①オートクレーブ…………………………………………………………………………………………………４②その他の滅菌方法（圧力鍋を使った実験器具の滅菌）………………………………………………………６◇マイクロピペット……………………………………………………７◇サーマルサイクラー…………………………………………………８◇電気泳動装置…………………………………………………………10◇遠心分離機……………………………………………………………11◇PCR 反応に必要な試薬…………………………………………………12①PCR 反応とは……………………………………………………………………………………………………12②PCR 反応液について……………………………………………………………………………………………13③DNA を保護する緩衝液…………………………………………………………………………………………14
ア 0.5M EDTA (pH8.0)･…………………………………………………………………………………………14
イ１M Tris-HCL(pH8.0)…………………………………………………………………………………………14
ウ 50×TAE (Tris-acetate-EDTA)溶液…………………………………………………………………………15
エ TE 溶液（Tris-EDTA buffer）………………………………………………………………………………16④プライマーの調整………………………………………………………………………………………………17⑤ローディングバッファー………………………………………………………………………………………19⑥DNA の染色試薬…………………………………………………………………………………………………21
ア 和光純薬製 SAFELOOK™プレグリーン(ポストグリーン，ロードグリーン)…………………………21
イ 関東化学製核酸染色用試薬ビューアブルーステイン(ViewaBlue® Stain)……………………………22
ウ エチジウムブロマイド溶液の調整(参考)…………………………………………………………………22⑦DNA サイズマーカーの調整……………………………………………………………………………………23

やってみよう！遺伝子実験（実験手順）◇マイクロピペットの使い方…………………………………………24①
DNA 抽出…………………………………………………………23(1)DNA
抽出………………………………………………27①DNA 抽出の準備…………………………………………………………………………………………………27②DNA 抽出の流れ…………………………………………………………………………………………………29②
PCR………………………………………………………………27(2)PCR………………………………………………………31①PCR の準備………………………………………………………………………………………………………31②サーマルサイクラーでの実施…………………………………………………………………………………33③人力サーマルサイクラーでの実施……………………………………………………………………………34(3)電気泳動………………………………………………38③
電 気 泳 動 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 31
①ゲルの作製方法…………………………………………………………………………………………………38②電気泳動について………………………………………………………………………………………………39③UV トランスイルミネーターの使い方…………………………………………………………………………42

実験を授業に取り入れる（授業展開案）①マイクロピペットの使い方と電気泳動による DNA の分離の原理を学ぶ…………………………………43②人力サーマルサイクラーを用いた PCR………………………………………………………………………44③岩手県産品種のイネを使った遺伝子判定実験………………………………………………………………45

自作できる実験器具の作成①電気泳動装置の作成と使い方…………………………………………………………………………………46②人力遠心分離機の作り方………………………………………………………………………………………52③PCR の原理を学べるペーパークラフト………………………………………………………………………55④断熱紙コップを用いたチューブ・チップ立ての作成…………………………………………………………57

試薬や器材の入手方法①試薬・実験器材関連………………………………………………………………………………………………59②実験材料の入手について………………………………………………………………………………………60

困った時は？
◇実験器具の貸出しについて…………………………………………61◇廃棄物の処理について………………………………………………63①試薬の廃棄方法…………………………………………………………………………………………………63②DNA を含む使い捨て実験器具の廃棄について………………………………………………………………63◇参考文献など…………………………………………………………65

本編

実験実施の前に
本書は，第一学習社「高校生物」に掲載されている「PCR 法を用いたイネの品種判別実験」を題材として，知識や設備がなければ行えないとされていた遺伝子実験を，50 分授業の中に取り入れるために開発した教材・教具をまとめたものです。

◇イネの品種判別実験とは
イネは日本人の主食として全国で栽培や品種改良が積極的に行われています。しかし，イネや米粒は外見で区別できないため，PCR 法を用いた品種判別が行われています。第一学習社「高校生物」では，「コシヒカリ」，「あきたこまち」，「ひとめぼれ」について，いもち病耐性遺伝子 Pii とコシヒカリ由来の塩基配列の有無から品種判別を行う
実験方法が紹介されています【図１】。この実験は，PCR や電気泳動が体験できるとともに親子鑑定や品種改良などの，遺伝子を扱う技術であるバイオテクノロジーについてより理解を深められる教材です。
●イネの類縁関係
奥羽 292 号

コシヒカリ

初星

あきたこまち●各品種が持ってい
る塩基配列

Pii

ひとめぼれ 由来DNA

プライマーⅠ

５’

Piiている，いもち病

DNA
５’

５’

①

遺伝子

①

遺伝子

Ⅰ

②

②

由来の塩基配列(830bp)を増幅す

ｺｼﾋｶﾘ

ｺｼﾋｶﾘ

由来の

由来の

塩基

Ⅱ

塩基

①

配列

①

配列

830bp

830bp

Ⅱ

②
３’

５’

Ⅱ

Ⅱ

る。

第9

1610bpⅠいる，コシヒカリ

×

〇

染色体
５’

Pii

1610bp

シヒカリが持って

DNA

染色体

Ⅰ

ひとめぼれ，コPii

コシヒカリ 由来

第9Pii

(1610bp*)を増幅

プライマーⅡ

×

Ⅰ

耐性遺伝子Pii 領域する。

〇

あきたこまち 由来

第9５’

きたこまちが持っ塩基対の数である。

〇

〇

染色体

ひとめぼれ，あ*bp(base pair)は，

ひとめぼれ

②
３’

３’

３’

３’

３’

【図１】教科書で紹介されているイネの類縁関係とプライマーが増幅する遺伝領域
本書では，この実験に県産食材を用いることで，生徒の興味・関心をさらに引き出したいと考え，県産品種のコメである「金色の風」，「銀河のしずく」も実験で使用します。
１

◇PCR 法を用いる実験に関して●遺伝子組換え実験の実施には規定があります。
しかし PCR 法の実施には特別な規定はありません【図２】。

【図２】文部科学省が定めた遺伝子組換え実験を行う際のガイドライン

この規定は，カルタヘナ法に基づいた遺伝子組換え実験を行う際に適用されるルールです。本書で扱っている PCR 法を用いた遺伝子実験は，DNA を抽出しますが，他の生物に組換える操作は行いません。また，ヒトの遺伝子など個人情報にあたる実験材料も使用しませんので，実験実施の報告や事前の保護者承諾なども必要ありません。
試薬の廃棄についてもほとんど気にする必要はありません。

２

◇実験の流れ●この実験は，次の３つのステップで構成されています【図３】。

(１)【主に使用する実験器材】
・遠心分離機，劇物を含む抽出液【本書で解説している内容】
・劇物を使用しないコメからの DNA 抽出

p.27

(２)

【主に使用する実験器材】
・サーマルサイクラー【本書で解説している内容】
・人力サーマルサイクラー

p.31

(３)

【主に使用する実験器材】
・電気泳動装置【本書で解説している内容】
・安価で簡易的な電気泳動装置

p.38

DNA 抽出

PCR

電気泳動【図３】PCR を用いる遺伝子実験の流れ

本書では，PCR を用いる遺伝子実験を(1)，(2)，(3)の段階に分けて授業に導入できるようにしています。実験の一部，もしくは全てを体験させることで，生徒の興味・関心を高めることを目的としています。また，実験に使用する高額な器材に関しては，実験器材の原理に着目し，費用を抑えて再現しています。さらに，PCR や電気泳動装
置の原理を再現しているため，原理自体を学べる教材となっています。

３

知っておきたい実験器具※必要な部分だけお読みください◇実験器具の滅菌①オートクレーブ
オートクレーブ(高圧蒸気滅菌) 【図４】は，高温と圧力をかけた飽和水蒸気中で微生物や酵素などを滅菌もしくは失活させる方法です。遺伝子実験では，他の遺伝子の混入を防ぐためや，
DNA 分解酵素を失活するために使用します。気体，ゴム製，紙や繊維製の物品，水，培地，試薬・試液または液状の医薬品等にも行うことができますが，器具ごとに適切な条件があります
ので特にプラスチック等を滅菌する際は，必ず条件を確認してください。

●オートクレーブの一般的な設定
・115℃ 30 分間
・121℃ 20 分間※基本的な設定
・126℃ 15 分間
・134℃ 10 分間●本書遺伝子実験において滅菌が必要と思われる器具
・マイクロチューブ(滅菌済みで販売されているものもある)・ピペットチップ(少なくとも教員試薬調整するものには行う)・緩衝液など長期保存する試薬・保存瓶に行う②耐圧容器のふたを開けてス
テンレスかごに入れた実験
器具を水が浸された容器内に設置する。
③ふたは高圧になるため固定具でしっ
かり止める必要がある。

ステンレスかご

飽和水蒸気①実験器具はフラスコなどに入れ，アルミホイルでおおってか
らかごに入れる。
【図４】オートクレーブの設定や使用方法について
４

［操作］(一般的な方法です。詳しくはそれぞれの実験機材に付属する説明書をご覧ください。)(1)オートクレーブ内には，内蓋が入っており，この内蓋が浸るくらいまで水を入れる【図５】。
(2)アルミホイルで滅菌する器具のフタや表面を覆う。
※特にプラスチック器具は滅菌可能か確認すること。

内蓋には穴が開いており水量を確認できる

器具同士が接触しても良い【図５】オートクレーブの準備(3)蓋を閉じる際は，蓋のパッキンの状態を確認し，設定圧力や温度を確認してからスタートする。
(4)完了後，圧力計を見ながら温度や圧力がしっかりと下がるのを待つ。
※滅菌後すぐに開ける方法を示しているものもあるが，120℃前後の蒸気が出るので火傷に注意すること。
温度・圧力設定ダイアル
圧力計
排水弁
タイマー
圧力弁
【図６】オートクレーブの各部の名称(5)軍手やミトンを用いて，火傷に注意しながら取り出す【図７】。(必要に応じて乾燥機にかける)

圧力低下後でも高温の蒸気に注意する【図７】オートクレーブ後の処理
５

必要に応じて乾燥機にかける②その他の滅菌方法(圧力鍋を使った実験器具の滅菌)
オートクレーブは高額な実験機材のため，持っていない学校も多いと思われます。そこで，調理用の圧力鍋(121℃，
2 気圧対応)を用いて滅菌する方法を紹介します。

［操作］(一般的な方法です。詳しくは機器に付属する説明書をご覧ください。)(1)内蓋が浸るくらいまで水を入れ，アルミホイル表面を覆った実験器具を置く。
(2)蓋を閉じる際は，弁や錘が取り付けられているか，パッキングが正常に装着されているか確認する。
おもり(3)鍋を火にかけて，しばらくすると 錘 や表示窓が浮き上がり，調整弁から湯気が出はじめるので，そこから 20 分
E A

間弱火で加熱を続ける。(121℃，2 気圧，20 分が基本となる滅菌条件)(4)20 分したら加熱を終了し，調整弁を見ながら圧力がしっかりと下がるのを待つ。
※滅菌後すぐに鍋を開けられるものもあるが，120℃前後の蒸気が出るので火傷に注意すること。
(5)軍手やミトンを用いて，火傷に注意しながら取り出す。
※圧力鍋の中には，121℃，2 気圧まで加圧できないものもあるので購入時に注意して下さい。
調整弁

左：蓋 中：内蓋 右：鍋

内蓋が無い時は，金属のざる等で底上げする

蓋のロック機構

圧力確認をするための表示窓

ゴムパッキンに破損がないか確認する【図８】圧力鍋をオートクレーブとして用いる際の注意事項
６◇マイクロピペット
マイクロピペットは，1.0 mL(= 1000 µL)以下の液体を測りとる実験器具であり，使用する際には使い捨てのピペッ
トチップを装着します【図９】。遺伝子実験では頻繁に利用されますが，高等学校の実験ではなかなか使われません。
そのため，生徒に実験操作をさせる場合は，使い方を指導する必要があります。

装着するピペットチップ

マイクロピペットの本体【図９】マイクロピペットに装着するピペットチップ
本書では，P1000(200～1000µL)，P200(20～200µL)，P20(２～20µL)，P2(0.1～２µL)の容量のピペットを使用しています。使用方法については，p.24 に示しました。
容量固定型

容量変更可能型

5µL

100µL
10µL

名称

容量(µL)

P2

0.1

～

P10

2

P20

2

～

P200

20

P1000

チップの色
2

白色

10

白色

20

黄色

～ 200

黄色

200 ～ 1000

青色※業者によっては色が異なる場合がある【図 10】マイクロピペットの各部の名称やピペットチップの容量
７

ピペットチップラック◇サーマルサイクラー
サーマルサイクラーは，プログラムされた温度変化を自動的に制御して PCR に必要な条件を作り，DNA を増幅するための機械です。
この機械には，「サーマルブロック」と呼ばれる PCR 反応液の入ったマイクロチューブをセットする金属ブロッ
クがあります。この金属ブロックにはヒーターがついており，あらかじめ設定したプログラムの通りに反応液の温度を上下させることができます。
サーマルサイクラーは，現在様々な形状や価格のものが販売されており，年々その価格も下がってきています。しかし，自分で装置を組み立てるキットであっても 10 万円前後なので，この実験のためだけに装置を購入することは難しいと思います。そこで本書では，サーマルサイクラーの原点である，恒温槽を使って温度制御を人力で行う「人力サーマルサイクラー」の実験方法を紹介しています。詳細については p.34 に示しました。
上部ヒーター
加熱や冷却を行う金属のサーマルブロック
温度制御をプログラムする部分「RUN」ボタン
背部電源ボタン※様々な形状や価格のものが販売されている【図 11】サーマルサイクラーの各部の名称や設定温度について[アニーリングについて]
アニーリングとは， DNA 伸長の足場となるプライマーだけを DNA に結合させることです(p.12)。このときの設
定温度をアニーリング温度といい，一般的には 55～65℃に設定します(プライマーによって設定が変わります)。この温度を正確に設定するために，
各プライマーのTm値(melting temperature・融解温度)を計算する必要があります。

８

[Tm 値(融解温度)とは]Tm 値とは，プライマーが 50％の割合で相補的な DNA と結合する温度のことです。Tm 値の計算には様々な方法がありますが，『最近接塩基対法』，『GC%法』，『Wallace 法』が主に使われています【表１】。『最近接塩基対法』が最も正確にアニーリング温度を求められると言われていますが，計算が複雑なため計算用ソフトの使用をおす
すめします。また，プライマーを販売している会社のインターネットサイトでは，計算用ソフトが無償で公開されています。自分で計算する場合は，以下に示した『GC%法』，『Wallace 法』で計算してください。（①が，最も高い精度で Tm 値を求められると言われています。）【表１】Tm 値を求める計算方法① GC%法(Tm値)=60.8+0.41×(G,Cの割合(%))-(500/総塩基数)② GC%法(近似計算)(Tm値)=4×(G,Cの数)+2×(A,Tの数)+35-2×(総塩基数)③ Wallace法(Tm値)=4×(G,Cの数)+2×(A,Tの数)[アニーリング温度について]
アニーリング温度とは，PCR におけるアニーリング(p.12)の際の設定温度で，Tm 値を基にして設定します。1 つの塩基配列を PCR で増幅するためには２種類のプライマーが必要となるため，その中間の温度を基準として，一般
的にその２～３℃低い温度にアニーリング温度を設定します。プライマーが目標の領域以外の塩基配列と結合し，目的以外の(非特異的な)DNA が増幅される場合は，設定温度を上げます。(本書では，確定した実験条件を記載していますので，その通りに行ってください。)[マイクロチューブについて]PCR には，様々な種類のマイクロチューブ(微量遠心管)が使われています。容量には 2ml，1.5ml，0.2ml（PCR用）などがあり，ロック式のふたが本体につながっている構造になっています。ドーム型キャップのものは，サーマ
ルサイクラーの熱を迅速に伝える構造で，PCR に一般的に用いられています。エッペンドルフ（Eppendorf）社の製品が代表的なため，マイクロチューブ全般の通称としてエッペンドルフチューブということもありますが，その他にも多数の実験機器メーカーでほぼ同規格の製品を出しています。本書では【図 12】に示したマイクロチューブを使用しました。

1.5mL マイクロチューブ
PCR 用ドーム型キャップ付きマイクロチューブ【図 12】本書で用いたマイクロチューブ
９◇電気泳動装置
泳 動 方 向電気泳動とは，水溶液中で＋又は－の荷電を持つペプチド，タン

分子量 大

パク質，核酸などの物質が，電流を流すことで移動する現象です。
アガロースゲルを用いる電気泳動では，アガロース分子の網目状の立体構造が「ふるい」の役割を行い，小さな核酸分子は速く，大き分子量 小な核酸分子は遅く移動します。

【図 13】バンドパターンの例

これによって，PCR で増幅された DNA を長さに応じて分離させることができます。このようにして大きさ順に分離した DNA は縞模様となって現れます。これをバンドパターン【図 13】と言います。
電気泳動装置は，交流の家庭用電源(100V)を直流に変えて通電を行っています。安全装置はついていますが，高い電圧がかかっている旨を生徒に説明してください。本書では，この電気泳動装置を安価に作成する方法を p.46 に掲載しています。
●電気泳動装置とゲル作製器の各部の名称

電源装置

泳動カバー

コーム
→ゲルにウェル(穴)を作る

泳動槽
ゲルトレイ(大)安全装置(この部分が電源装置にはまると通電する)

ゲルトレイ(小)ゲル作製器●電気泳動装置の断面図

緩衝液

DNA断片(－の電荷を帯びている)－

アガロースゲル短い断片ほど早く進む

＋

電

電

極

極

ウェル

DNA断片の移動方向【図 14】電気泳動装置の各部の名称と電気泳動装置の断面図
１０◇遠心分離機
遠心分離機は，高速回転によって強力な遠心力を発生させることで，各成分を分離する装置です。微量な薬品を混ぜ合わせる際にも用いられています。その用途に応じて，冷却しながら遠心分離が可能なものや，一定の速度しか出せない安価な装置もあります。強力な遠心力が発生しますので，使用する際には，以下の注意事項を守って使用する必要があります。
・高速冷却遠心分離機（\200,000～）
冷却しながら遠心できるので，タンパク質や DNA の破壊を防ぐ。
・速度調整可能な遠心分離機(\25,000～)
冷却できないが，速度の調整ができる。DNA 抽出にも使用できる。
・速度固定型遠心分離機
主にマイクロチューブの壁面にくっついた溶液を下に落として(フラッシュという)混ぜ合わせるために使用する。
【図 15】遠心分離機の種類と価格・用途［注意事項］(1)本体を安定した水平な場所に設置すること。
(2)使用時には，必ず対角の試料同士の重量バランスを合わせること。不釣合いなバランスで使用するとローターが破損し，事故や怪我の原因となる。
(3)ローターが回転している間は本体の蓋を開けないこと。また，回転中のローターには触れないこと。
(4)ローターに傷や腐食，変形などがある場合は直ちに使用を中止すること。
ローターは，マイクロチューブのサイズによって変更する必要がある。事故防止のため，必ず対角線上及びサンプル同士を離れさせない位置に同量のサンプルを入れて重量バランスをとる。
← 1.5～2.0mL のマイクロチューブ用ローター →１ ３●●〇〇〇〇〇〇
４ ２〇〇〇〇〇〇●●

数字の順番にマイクロチューブを設置する。
← PCR 用マイクロチューブローター →【図 16】遠心分離機のローターを使用する際の注意事項

１１◇PCR 反応に必要な試薬①PCR 反応とは
PCR は，Polymerase Chain Reaction （ポリメラーゼ連鎖反応）のことで，微量の DNA を鋳型として，DNA の特定の領域を数時間で数百万倍に増幅する方法です。

ステップ 1：Denaturation(熱変性)
５’

３’

３’

５’

94～98℃に温度を上昇させると，塩基間の水素結合が切断され，二本鎖 DNA が一本鎖に解離する。

５’

３’

５’

３’

ステップ 2：Annealing(アニーリング)
５’

３’

５’

３’

DNA 増幅の足場となる
プライマーをつける。

３’

５’

３’

５’

ステップ 3：Extension reaction(伸長反応)●68～75℃になると，Taq ポリメラーゼ(DNA 合成酵素)が元の DNA の塩基配列を鋳型にして相補的なDNA を合成する。
５’

３’

５’

３’

※ DNA 合成酵素は，５’→３’方向のみに DNA 合成を行う。
５’

３’

３’

５’

以上の３ステップを 1 サイクルとして，通常は 35～40 サイクル繰り返して DNA 領域を増幅します。

１２

②PCR 反応液について
PCR 反応液は【表２】で示した成分から構成されています。PCR は，通常の酵素では変性・失活してしまう 45℃以上の条件下で行われます。そこで，高温に耐えられる好熱菌一種である Thermus aquaticus 由来のDNA 合成酵素である Taq ポリメラーゼが使われています。
【表２】PCR 反応液の成分

試薬もしくは溶液

用途

DNA抽出液増幅されるDNA

PCR用バッファー

DNAを保護する緩衝液

プライマー

DNA合成の足場となるプライマー

dNTP

Taq ポリメラーゼ

DNAの部品となるA,T,G,Cそれぞれのデオキシリボヌクレオチド三リン酸
DNA合成酵素

本書では，タカラバイオ株式会社の Sapphire Amp® Fast PCR Master Mix(以降 Sapphire
Amp Taq)を使用して実験を行っています。この製品は，反応時間が通常の Taq ポリメラーゼよりも短くて済み，バッファー，DNA 合成酵素，dNTP が予め混合されているため，
プライマーと DNA 抽出液を加えるだけで簡単に PCR を行うことができます。また電気泳動の際に必要なローディングバッファー(p.19)も添加済みのため，PCR 産物を直接電気泳動槽に注入でき，実験時間を大幅に短縮できます。本書ではこの試薬を用いて，110 分
かかっていた実験を，約 30 分で行う方法について紹介しています(p.34)。
また，コストや試薬の管理を考えた場合にも下表のような優れた点があります。実験可能回数は少なくなりますが，価格が安価で，１本あたり約 80 回分(10 班分)ごとの個別包装になっています。また，解凍後は冷蔵庫(4℃)で３ヶ月保存可能なため，事前に PCR 反応液を生徒用のチューブに分注し，準備しておくことができます。
【表３】Taq ポリメラーゼの比較

コスト
同社のTaq ポリメラーゼ

価格

実験可能回数管理

他に必要な試薬

Taq ポリメラーゼ用緩衝液¥27,500

400回

-20℃

dNTP Mixture
Loading Buffer

320回
Sapphire Amp Taq

１３¥17,000

約80回分×4本-20℃
解凍後は，4℃で3ヶ月使用可能全て添加済み③DNA を保護する緩衝液
緩衝液(Buffer)とは，少量の酸や塩基を加えても，希釈して濃度を変えても，その影響を緩和して pH（水素イオン指数）をほぼ一定に保つ働き（緩衝作用）をもつ水溶液のことです。遺伝子実験では，電気泳動や冷却による水溶液の変化から DNA を保護する目的で使用されます。

ア 0.5M EDTA (pH8.0)
EDTA(エチレンジアミン四酢酸)は，Ca2+，Mg2+等を除去するキレート剤で，金属イオン要求性の DNA 分解
酵素を不活性化し，DNA の分解を抑制します。
【表４】0.5M EDTA(pH8.0)の調整に必要な試薬

試薬もしくは溶液
EDTA

1L

500mL

200mL

(EDTA 2Na 2H20)

186.1 g93.1 g37.2 g

固形化NaOH (pH調整用)

±20 g

±10 g

±4 g

5N NaOH (pH調整用)

適量

適量

適量

蒸留水

適量

適量

適量

最終濃度
0.5 M
5M

[調整方法](１L 作成時)
(1)800 mL の蒸留水に EDTA の粉末をゆっくり加えマグネチックスターラーで撹拌する。
(2)固形化 NaOH を少しずつ加え，EDTA を溶かす(pH の上昇に伴って溶ける)。
(3)EDTA が溶けたら，水酸化ナトリウム溶液で pH を 8.0 にし，１L までメスアップする。
(4)オートクレーブして常温保存する。（121℃，20 分）

イ １M Tris-HCL(pH8.0)
Tris(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)は，安価で pH の適応範囲が７〜９程度と生命科学系の実験に適しているため頻繁に使われる緩衝液の成分です。
【表５】１M Tris-HCL(pH8.0)の調整に必要な試薬

試薬もしくは溶液
Tris aminomethane

1L

500mL

200mL

121.1 g60.6g

24.2 g

6N HCl溶液(塩酸)約100 mL

約50mL

約20 mL

1N HCl溶液(塩酸)

適量

適量

適量

蒸留水

適量

適量

適量

(分子量121.2)

最終濃度
1M

１４

[調整方法](１L 作成時)
(1)Tris の粉末を蒸留水 800mL に溶かす。
(2)塩酸を加えて pH が 8.0 になるように調整する。
(3)pH が 8.0 になった後，溶液が冷めるのを待つ。
(Tris の pH は温度依存的に変化するため)(4)塩酸を加えて pH が 8.0 になるよう最終調整を行う。
(5)液量が１L になるまでメスアップする。
(6)オートクレーブ後，常温で保存する。
※実験系によっては他の pH でも作製する場合がある。
※塩酸を加えると発熱するが，上記の濃度では問題ない。

ウ 50×TAE(Tris-acetate-EDTA)溶液
Tris，酢酸，EDTA を含む緩衝液であり，電気泳動の際に DNA を保護する目的で使用されます。PCR における実験操作の様々な場面で使用するため，
通常 50 倍濃度に調整したものを作っておき，希釈して使用します。

【表６】50×TAE(50 倍 TAE)溶液の調整に必要な試薬

試薬もしくは溶液
Tris

1L

500mL

200mL

242 g

121 g

48.4 g2M

0.5 M EDTA(pH=8.0)

100 mL

50mL

20mL

50 mM

氷酢酸

57.1 mL

28.6 mL

11.4mL

1M

蒸留水

適量

適量

適量

[調整方法](50 倍 TAE 溶液を１L 作成する場合)(1)試薬を 500 mL ほどの蒸留水に溶かす。(結構溶けにくい)(2)１L になるように蒸留水でメスアップする。
(3)常温で保存する。

１５

最終濃度

エ TE 溶液（Tris-EDTA buffer）
TE 溶液は，Tris と EDTA を含み，基本的にプライマーの調整や DNA の保存の際に使用される緩衝液で，pH はおよそ 7.2～8.0 になるように調整します。

【表７】TE 溶液の調整に必要な試薬

試薬もしくは溶液

500mL

250mL

100mL

最終濃度

1.0 M Tris-HCL

5 mL

2.5 mL

1 mL

10 mM

0.5 M EDTA(pH8.0)1 mL

0.5 mL0.2 mL

1 mM

蒸留水

適量

適量

適量

[調整方法](500mL 作成時)
(1)試薬を蒸留水に溶かし，500 mL までメスアップする。
(2)オートクレーブをする。
(3)常温で保存する。

いくつもの試薬を自分で調整するのは大変です。そこで，全て調整済みのものが販売されています。状況に応じて使用してください。

【表８】調整済み緩衝液について

試薬名

役割

容量

価格

取扱業者

備考

50×TAE DNA保護

500mL ¥9,000 ニッポン・ジーン

25L分(10班分で２L程度使用する)

１×TE

100mL ¥8,000 ニッポン・ジーン

DNA抽出サンプル１本につき50µL使用

DNA保護

１６

④プライマーの調整
プライマーは PCR において，DNA の伸長反応を行う際の足場となる 20～30 塩基の DNA 断片です(p.12)。通常プライマーは，最終濃度が 0.2～0.5µM(0.5pmoL/µL)に調整する必要があります。以下，粉末のプライマーを購入した場合の調整方法についてまとめました【図 17】。

[粉末で購入した場合の調整方法]
プライマーは，それぞれ塩基配列が違うため分子量が異なります。そのため，粉末で購入した場合は，プライマーごとに異なる量の TE 溶液か蒸留水で溶解する必要があります。購入したプライマーに付属する分析書を基にして，調整してください。以下の調整方法は，プライマーの物質量（nmoles）が 10.9 の場合を例にして説明しています。

〇プライマーを注文した時に届く分析書の例
Custom Primers

Order Number: ******A

Certificate of Analysis (分析書)

Order Date: 2018/**/**(項目名)(項目の説明)(備考)
自分で名前を付けられる

Primer name:

プライマーの名前

Primer Number:

メーカーでつける番号

Primer Length:

塩基数Researcher:

研究者名

Sequence(5' to 3'):配列

20～30塩基が多い

Molecular Weight µg/μmole

分子量

塩基配列によって異なる

Millimolar Extinction Coefficient:

吸光度

DNAの純度を示す

Purity:

精製度

不良のプライマーが入っていないか

Tm(1M Na ):Tm値

アニーリング生成用温度

Tm(50mM Na+):

Tm値

通常のPCR用温度

%GC

GC含有量

60％を越えるとうまくPCR反応が進まないµg per OD

質量当たりの吸光度

nmoles per OD

溶液中の吸光度nmoles10.9+

純度の高さを示す
プライマーの物質量(溶解する量の目安となる)

Notes：
希釈の際には，nmolesを値を見て希釈する。例えば10.9 と書いてある場合は，10.9µLのTE溶液を添加すると,1000µM(１nmol/µL)の濃度になる。通常は，プライマーの冷凍と解凍による劣化を避けるため，109µLのTE
バッファーを添加して100µM(100pmol/µL)の溶液を作成し，10µLずつマイクロチューブに分注して－20℃で保管しておく。

【図 17】プライマー分析書の見方の例

１７

プライマーは何度も凍結・融解を繰返すと品質が劣化する可能性があります。そこで，保存用として高濃度(100µM)に調整したプライマーを複数のマイクロチューブに分注して保管してください。

(a) 100µM に調整(プライマーが到着した際に氷冷しながら行う操作)(1)109µL の TE 溶液に溶解する（濃度が 100µM になる）。
(2)(1)で作成したプライマーを 10µL ずつ 1.5mL マイクロチューブに分注し，全て-20℃で保管する。
※プライマーが残った場合は，別のチューブに入れておおよその液量を記入し，-20℃で保存する。
※分注したプライマーをセットにして袋に入れておくと使いやすい【図 18】。

(b)10µM に調整(実験前に 10 班分を用意する場合)(1) (a)で分注したプライマー(10µL)を１セット取り出し，それぞれ蒸留水を 90µL 加えて，10 倍に希釈する(濃度は 10µM になる)。
(2)10µL ずつ分注し，-4℃以下で保管する。(長期保存する場合は-20℃)(3) 実験の際に，(2)で分注したプライマー溶液を生徒に配布して，プライマーの最終濃度である 0.2µM になる
ように，PCR 反応液に加えさせる。
※PCR 反応液の合計が 100µL の場合は 2.0µL，50µL の場合は 1.0µL，25µL の場合は 0.5µL のように，50 倍希
釈なるように(2)のプライマー溶液を PCR 反応液に加える。

本書の実験では，２つの DNA の領域について調べるため，４種類のプライマーを使用しています【図 19】。微量なプライマーをそれぞれ生徒に加えさせるのは大変です。
あらかじめ実験で使用する分のプライマーを教員が混ぜておくと効率的です。
126

5199

-

001

18.07.04

5199

-

002

18.07.04

Pii1b(いもち病耐性遺伝子Pii用)

5'-CCGCAGTTAGATGCACCATTAGAA

5'-CCGCAGTTAGATCAAGTGGCAAGG

TTGCTTCATTGCCTGTGGA-3'

TTCCATGTTTGGACTCAA-3'

4.5OD

Tm=67.3

4.6OD

Tm=67.5

144.0㎍

32.4㎍/OD

147.1㎍

31.7㎍/OD

10.9nmol

MW=13208.7

11.4nmol

MW=12953.5

126

5199

-

001

18.07.04

RC1a(コシヒカリ系統共通塩基配列)
5'-TGGCCGGCATGACTCAC-3'【図 18】本研究で作成したプライマーセット

126

Pii1a(いもち病耐性遺伝子Pii用)

126

5199

-

002

18.07.04

RC1b(コシヒカリ系統共通塩基配列)
5'-ACTGGCCGGCATCAAGAC-3'

8.4OD

Tm=63.0

8.6OD

Tm=62.3

279.4㎍

33.3㎍/OD

272.0㎍

31.7㎍/OD

54.0nmol

MW=5171.4

49.5nmol

MW=5493.6【図 19】本研究で使用したプライマー
１８

⑤ローディングバッファー
ローディングバッファー※は，無色透明の DNA が，電気泳動中にどこまで泳動されたかを確認するための色素です。DNA がゲルに入り込む前に浮いてしまうのを防ぐため，ショ糖(もしくはグリセロール)が入っています。
よく使われる色素はオレンジ G(OG)とブロモフェノールブルー(BPB)，キシレンシアノール(XC)で，どんな長さ(bp：塩基対)の DNA 断片を電気泳動するかで使用する色素を変えたり，混合したりします。本書では最も一般的な調整方法を紹介しましたが，DNA サイズマーカー(p.23)等を購入すれば，ローディングバッファーは付属しています。また，最初から添加してある試薬もありますので，そちらの使用をお勧めします。
※ゲルローディングバッファー, ブルージュース, ローディングダイ，Dye などとも呼ばれる。

各色素によって電気

DNA が染色されているわけ

泳動による移動速度

ではありませんが異なっているため
ウェル

時間の経過とともに分かれる。
泳 動 方 向①

対応塩基対数ウェル

キシレンシアノール(XC)②

対応塩基対数ウェル

約5000bp③

対応塩基対数ウェル

約1500bp

約500bp①アガロースゲル１％
泳②アガロースゲル２％動③アガロースゲル３％

方向ブロモフェノールブルー(BPB)

約900bp

約300bp約100bp

オレンジG(OG)約100bp

約30bp

約10bp

●アガロースゲルの濃度の違いにおける各ローディングバッファーの対応塩基対数【図 20】ゲルに注入されたローディングバッファーと一般的なローディングバッファーの構成

１９

【表９】10×ローディングバッファー調整に必要な試薬

試薬もしくは溶液

10mL*

最終濃度

オレンジG(OG)25mg

0.25 % (w/v)

ブロモフェノールブルー (BPB)

25mg

0.25 % (w/v)

キシレンシアノール (XC)

25mg

0.25 % (w/v)

0.5M EDTA

0.1mL

5 mM

3mL

30 % (w/v)a(4g)(40 % (w/v))

ショ糖(もしくはグリセロール)

**

蒸留水

適量

* ６倍に調整する場合は，16.7mLにメスアップする。
**フィコールを加える場合もある。

[調整方法](10×ローディングバッファーを 10mL 作成する場合)(1)色素及び EDTA をよく混合する。
(2)(1)が溶けきった後でショ糖もしくはグリセロールを混合する。
(3)10 mL になるよう蒸留水でメスアップする(6 倍濃度を作成する場合は 16.7mL にメスアップ)。
※保存にあたっては基本的に常温で問題ないが，使用頻度が少ない場合は 4℃にて保存する(長期保存になる場合
は-20℃で保存する)。
※調整においては，手が染色されないようにゴム手袋等を着用し，実験器具が染色されないように，直接コニカル
チューブ等に入れて作成する。

２０

⑥DNA の染色試薬
DNA の染色試薬は，PCR 産物の電気泳動後にバンドパターンを観察するために用いられます。染色試薬には，特定の波長の光で発光させる蛍光色素と，可視光下で観察が可能なものがあります。ゲルにあらかじめ染色試薬を入れておく「先染め」と電気泳動後にゲルを染色試薬に浸す「後染め」があります。一般的に使用されているエチ
ジウムブロマイド(EtBr)は，発がん性があると言われており高等学校で扱う薬品としては使用・廃棄に安全対策や配慮が必要となりますので，本書では他の試薬をお勧めしています。

SAFELOOK™プレグリーン

ViewaBlue® Stain

エチジウムブロマイド(参考)

染色像

価

格

発がん性
結果確認
観

察

扱い易さ

高額

安価

安価

無

無

有

可視光(特別な装置不要)

強力なUVライト必要

泳動後すぐ観察可能

染色・脱色が必要

泳動後すぐ観察可能

生徒が扱える

後日でも観察可能

使用には配慮が必要

強力なUVライトか
490nmLED※背景色の違いは，染色液及び光源の違いによる影響【図 21】各 DNA 染色液の特徴

ア 和光純薬製 SAFELOOK™プレグリーン(ポストグリーン，ロードグリーン)
SAFELOOK™シリーズ【表 10】は，発がん性が低い核酸染色試薬で，エチジウムブロマ
イドの代わりとして開発されました。本書では，先染め用のプレグリーンを使用しています。

[使用方法]【表 10】各 SAFELOOK™シリーズの特徴と使用方法

種類

励起波長 蛍光波長

光源 検出感度

使用方法
先染め用で，ゲル100mLにつ

プレグリーン

490nm

520nm

LED

0.1～

き5µL添加する。また，泳動

(DNA)

かUV

0.4ng

バッファーにも200mLあたり5～10µL添加する。

ポストグリーン

490nm

525nm

LED

0.05～

かUV

0.2ng

後染め用で，泳動バッファー
100mLにつき、10～20µL(1:5000～1:10000)添加する。
ローディングバッファーが添加

ロードグリーン

490nm

525nm

LED

0.2～

済みである。本試薬とPCR産物

かUV

0.7ng

やDNAマーカーが１対５の比率になるように添加する。

２１

イ 関東化学製核酸染色用試薬ビューアブルーステイン(ViewaBlue® Stain)
ビューアブルーステインは，核酸を青色に染色し可視光下で観察でき，エチジウムブロマイドのような発がん性がないため取扱いが容易な試薬です。後染めの方が DNA の検出感度が高く，泳動後に染色・脱色を行い，翌日パンドパターンを確認するのに適しています。

[使用方法]●先染め(1)試薬を 100 倍希釈になるようにアガロースゲルを作成する際に加える。
(2)可視光下で観察する。状況によって蒸留水中で脱色する。
※ DNA の検出感度はおよそ 20 ng までである。
●後染め(1)原液を別容器に分注しておく。
(2)電気泳動後のゲルを原液に完全に浸し，室温で５分間静置する。
しんとう(3)ゲルを蒸留水に移し，５分間 振盪 する。
AE

しんとう

(4)新しい蒸留水に移し，更に５分間 振盪 する。(10 分間原液に浸し，一晩脱色してもよい)
AEAE(5)DNA が青く呈色しているか可視光下で観察する。
※ DNA の検出感度は５ng までである。

ウ エチジウムブロマイド溶液の調整(参考)エチジウムブロマイドは，最も一般的に PCR 産物の蛍光染色に使用されている試薬です。しかし，発がん性があるため使用には直接手で触れないなど注意が必要となります。高等学校で使用する場合のガイドラインなど
は特に定められていませんが，本書では使用しないことをお勧めします。
【表 11】エチジウムブロマイドを調整するための試薬試薬もしくは溶液

10 mL

200 mL

最終濃度

エチジウムブロマイド

100 mg

2g

蒸留水

10 mL

200 mL

10 mg/mL２２

[調整方法](200 mL 作製の場合)(1)直接触れないように遮光可能な容器にエチジウムブロマイドを 2g 入れ，蒸留水を 200 mL 入れる。
(2)エチジウウムブロマイドは溶けにくいので，スターラーバー※を入れて１時間から一晩溶かす。
(3)遮光した上で常温もしくは冷蔵庫で保存。
(4)アガロースゲルに直接溶かして使用する場合は，ゲルトレイ(大)１つ分の容量である 30mL あたり，上記の調整を行ったエチジウムブロマイドを 1.5µL 加える。
※強い発がん性，有害性があるため，使用後はエチジウムブロマイド調整専用にする方が良い。
※GENESEE SCIENTIFIC 社の製品には，小分けにされた袋ごと溶かして調整が可能なものや，50mL のアガロース
ゲルに1 滴添加するだけで10 ㎎/mL になる製品が発売されており，体への付着や吸引を極力防ぐことができます。

⑦DNA サイズマーカーの調整
DNA サイズマーカー※は，DNA の長さ(塩基対数)を推定する「ものさし」となる試薬です。中には様々な長さの DNA 断片が混ぜられており，PCR 産物のバンドパターンと比較して塩基対数を推定することができます。
※DNA 分子量マーカーやラダーマーカーなどとも呼ばれる。

[調整方法]※DNA サイズマーカーは，【表 12】に示したように，購入時のロットによって初期濃度が異なるため，最終濃度が200～800ng/µL になるようにそれぞれを調整する必要がある。また，何度も凍結・解凍を繰返すと品質が劣化する可能性があるため，いくつかに分注しておく。
(1)注文したマーカーが届いたら初期濃度と容量(主に 20・100µL)を確認し，分注するマイクロチューブを準備する。
(2)【表 12】のように，DNA サイズマーカー，蒸留水，6×ローディングバッファーをよく混ぜ合わせて分注する。
【表 12】DNA サイズマーカーの調整方法(最終濃度 200ng/µL に調整する場合)

名称

原液の濃度

λ-Hin d III

0.5µg/µL

12µL作成原液

蒸留水 6×LB*

5µL

5µL

2µL

2.3µL

7.7µL

2µL

0.8µg/µLの場合
pHY Marker ※製品ごとに濃度が異なる＊6×LB…Loading Buffer(ローディングバッファー)

２３

備考
1ウェルに6～12µLを注入し，残りは-20℃で保管やってみよう！遺伝子実験（実験手順）◇マイクロピペットの使い方
試薬の調整や PCR などの遺伝子実験にマイクロピペットは必ず必要になります。自分で試薬調整を行うだけでなく，生徒に行わせる実験もありますので，使い方を覚えておくことをお勧めします。

［操作］(1)目盛り調節ダイアルを回してセットする【図 22】。

P20

1
2
5

12.5µL

P200

1
2
5

125µL

P1000

0
7
5

※注意
故障の原因となるため，目盛り調節
ダイアルを回す際には，容量の範囲を超えて回さないようにすること。

750µL【図 22】マイクロピペットの目盛りの読み方(2)親指でプッシュボタンとチップイジェクターボタン(p.７，【図 10】参照)を押せるように，片手でハンドグリップを握る【図 23】。

(3)ピペットチップラック【図 24】は，あらかじめ滅菌したも 【図 23】マイクロピペットの握り方のを用意する。そのふたを開け，ピペットチップにチップホルダーの先端を差し込んで装着する。P1000 は青色，
P200 と P20 は黄色，P2 は白色のピペットチップを使用する。ピペットチップとチップホルダーの間から空気が漏れないように，装着したピペットチップでチップラックを軽くトントンと叩くように押し込んで装着する。装着後チップラックのふたを閉める。

ピペットチップラックに直接ピペット本体を差し込んでチップをしっかりと固定する。
【図 24】ピペットチップの取り出し方

２４

(4)プッシュボタンをトップから第１ストップまで押し込み，その状態のままピペットチップの先端を液につけ，ゆっくりかつ滑らかにプッシュボタンをトップまで戻して液を吸い上げる【図 25(a)】。
(5)ピペットチップの先端を容器内に入れ，プッシュボタンをゆっくりと第１ストップまで押し下げて液を排出する。第１ストップで一度止めたプッシュボタンを続けて第２ストップまで 強く押し下げ，ピペットチップ内に残った液を完全に排出する【図 25(b)】。
(6)プッシュボタンをトップまでゆっくりと戻す【図 25(c)】。
(a)

(b)

(c)

トップ
第１ストップ第２ストップ【図 25】マイクロピペットのプッシュボタンの使い方(7)イジェクターボタンを親指で押してピペットチップを取り外す。ピペットチップは測りとる液体が変わるたびに交換する。

２５

［注意点］
・必ずピペットチップを装着して液を吸い上げること。
・液を吸い上げた状態でマイクロピペットを逆さまにしないこと。
・液を吸い上げる際に，マイクロピペット本体まで液を吸い込まないよう注意してゆっくり操作すること。特に吸い上げ途中でプッシュボタンから指を離すことは絶対にしないこと。また，できるだけ滑らかに動かすよう注意する。
吸い上げ開始から完了まで １〜２ 秒かけるのが適正な速度である。また，マイクロピペット作業中に本体まで液を吸い込んでしまった場合は，速やかに分解し，洗浄や乾燥を行う必要がある。
・マイクロピペットの保管については，下に示した安価に製作できるピペット立てを使うと，生徒への配布や回収，管理などが簡単に行える。

・ワイヤー棚を縦に設置する・フックを 1 本のピペットに 2個とりつける【図 26】安価で製作できるピペット立て

フックの間にピペットを差し込む(フック同士を輪ゴムで固定しておくとさらに安定する)。

傾けてもある程度バランスをとってピペットは落下しない。

【図 27】ピペット立ての使い方

２６◇(1)DNA 抽出D

N

A

抽

出

①DNA 抽出の準備
DNA 抽出に用いられるエタノール沈殿は，DNA を塩とアルコールを使って析出させる方法です。DNA を構成している核酸は，塩基とアルコールに溶けにくい糖・リン酸から成るヌクレオチドがつながったものです。DNA
中のリン酸基は負電荷を帯びているため，DNA 同士の静電的な反発が起きてしまい，そのままアルコールを加えても析出しません。そこで，核酸の水溶液に塩を加えることで発生する陽イオンによって反発を打ち消して析出しやすくするのがエタノール沈殿の原理【図 28】です。

―

＋

M

M＋
―

―

―
―

―
―

反発

―

―

反発
―

各 DNA 断片

―

塩の添加

M＋
M＋

―
―

M＋
―

―

―
M＋

―

M＋

―

―

凝集

反発力の低下リン酸部位の負電荷

M＋
―
M＋

―

M＋

M＋
M＋

―

―
＋

M M
―
― ＋ ―
＋
―
＋
M
M
＋M
M
―
―
― ― ＋
M
M＋
― M＋
＋
M
―
―
―
＋
M
―
エタノールを加える＋

M＋【図 28】エタノール沈殿の原理
また，粗抽出された DNA には，タンパク質や糖質などの夾雑物が多く含まれており【図 29】，通常はそのまま
PCR に用いることはできません。そこで加熱や試薬を加えることでタンパク質や糖質を除去し，DNA の純度を高める必要があります。
糠(玄米)含まれる夾雑物 ビタミン・鉄・リン・脂質・糖質・繊維・タンパク質等
胚乳(白米)
含まれる夾雑物 糖質・タンパク質等
米粒の模式図胚芽含まれる夾雑物 タンパク質・脂質【図 29】米粒に含まれる DNA 以外の夾雑物
本書では兵庫県立農業研究センターの手法を参考に開発した抽出方法で DNA を抽出する方法を紹介しています。この方法では，夾雑物の除去に一般的に使われている劇物のフェノール・クロロホルム処理を行わず，加熱処理によって夾雑物を分離しやすくし，エタノール沈殿を２度行うことで DNA の純度を高めています。

２７

[実験に必要なもの]
実験器具
1.5ｍL マイクロチューブ(１種類のコメから抽出するために３本使用する)，マイクロピペット，乳鉢，ボル
テックスミキサー※，恒温槽などサンプルを加熱する器具，遠心分離機，真空エバポレーター(減圧乾燥機)※※所持していなくても実験できます。

使用する材料・試薬
各品種のコメ５粒(約 0.1g) ※，DNA 抽出液，99%エタノールもしくはイソプロピルアルコール(2-プロパノー
ル)，70%エタノール，TE 溶液，蒸留水※教科書ではひとめぼれ・あきたこまち・コシヒカリを用いて実験を行っていますが，本書では同様の結果が得られ，なおかつ教科書に結果が掲載されていない金色の風・銀河のしずく・コシヒカリを用います。

[DNA 抽出液の調整]
DNA 抽出液は，DNA を保護する Tris‐HCL 緩衝液と EDTA，塩によって DNA の凝集を助けるための NaClと細胞膜等を破壊して DNA を取り出しやすくする界面活性剤である SDS で構成されています【表 13】。

【表 13】DNA 抽出液の調整に必要な試薬

試薬もしくは溶液
1M Tris-HCL

10mL

50mL 100mL 最終濃度

2mL

10mL

20mL

200mM

5M NaCl

0.5mL 2.5mL

5mL

250mM

0.5 M EDTA(pH8.0)

0.5mL 2.5mL

5mL

25mM

10%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)

0.5mL 2.5mL

5mL

0.5%

蒸留水

適量

適量

適量

●100mL 作成する場合(1)50ｍL の蒸留水に各試薬を入れ，よく混ぜ合わせる。
(2)100ｍL になるように蒸留水でメスアップする。
(3)実験の状況に応じてコニカルチューブ等に分注する。
(4)常温保存する。(SDS が含まれているのでオートクレーブは行わないこと)※SDS は細かい粒子のため，扱う際には手袋やマスクを装着する。

２８

②DNA 抽出の流れ（１）米粒を５粒(約0.1g)に1000µLのDNA抽出液を添加する↓（２）米粒に抽出液が浸透するとつぶしにくくなるため速やかに砕く↓・すりつぶしが足りないと分離するので注意する。

※乳液状になるまですりつぶす※他品種の米粒と混じらないように注意する（３）1.5mLマイクロチューブに採取してボルテックスミキサーで攪拌する↓※ミキサーがない場合，マイクロピペットで抽出液を何度か吸い上げ・放出を繰返し(ピペッティング)懸濁する（４）65℃で10分間保温(インキュベート)する↓※ヒーターや恒温槽を使用する

・タイマー付きのドライヒー
ターなどで加熱する。

（５）×12,000rpmで10分間遠心分離する↓（６）400µLの上清を採取し，別の1.5mLマイクロチューブに入れる↓※沈殿物の混入を防ぐため，少なく採取してもよい（７）99％エタノール800µLをよく混合して10分間室温に静置する↓※上清の２倍量のエタノールを入れる[抽出作業のポイント]
・米粒が多いほど抽出量は多くなりますが，夾雑物も増えるため 1.5ｍL マイクロチューブを使用する場合は，５粒で行ってください。
・99％エタノールを混合後は，24 時間程度であれば実験を中断することができます。冷蔵庫等で保管してください。

（８）×12,000rpmで10分間遠心分離する↓（９）上清を捨て，キッチンペーパー上で逆さまにして10分間乾燥する↓※ドライヤーで乾燥してもよい（10）200µLのTE溶液を加えピペットで懸濁し，×12,000rpmで５分間遠心分離する↓

２９・マイクロチューブを逆さまにして乾燥する際はチューブラックで固定すると転倒しにくい。

（11）170µLの上清を採取して，別のマイクロチューブに入れ，５MのNaClを10µLと99％エタノール350µLを加え攪拌する↓※沈殿物を採取しないように注意する※エタノールを除きNaClが0.25mMになるように加える[エタノール沈殿のポイント]
・NaCl は，0.25mM 以上の濃度になっていれば多少濃くても問題ありません。

（12）×12,000rpmで２分間遠心分離する↓（13）上清を捨て，70％エタノールを１ｍL加える↓

・真空ポンプと真空エバポレーターによる乾燥※抽出中に加えられた塩などの試薬を除去する（14）×12,000rpmで1分間遠心分離する↓（15）上清を捨て，真空エバポレーターで10分間乾燥する※真空エバポレーターは，真空ポンプによって減圧された状態で遠心することで減圧乾燥させる装置です。総合教育センターにあ↓るものを利用することができます。(p.61)※キッチンペーパー上で逆さまにして乾燥してもよい※ドライヤーで乾燥してもよい（16）50µLのTE溶液に溶解し，－20℃以下で保管する※本書ではＤＮＡ抽出液の冷凍保存にＴＥ溶液を用いています。
↓

が，ＴＥ溶液がＰＣＲを阻害するとの理由から，蒸留水での保管を紹介しているものもあります（17）PCRに使用する場合は，0.5～1µLを用いる[人力遠心分離機を使った DNA 抽出に関して]
p.52 に示した人力遠心分離機を用いて DNA 抽出を行う場合は，(6)で採取する上清を 400µＬから 200µＬに減らして沈殿物ができるだけ入らないように注意してください。ただし，この操作によって全体的な DNA 抽出
液の濃度が薄くなってしまいますので，PCR に用いる際には DNA 抽出液を倍量にして使用してください。

３０

◇PCR
(2)PCR①PCR の準備
コメから抽出した DNA を用いて，いもち病耐性遺伝子 Pii とコシヒカリ由来の塩基配列を PCR で増幅します。

[実験に必要なもの]
実験器具①サーマルサイクラーで行う場合(p.33)
PCR 用マイクロチューブ（１品種につき１本），マイクロピペット，遠心分離機※，サーマルサイクラー②人力サーマルサイクラーで行う場合(p.34)
PCR 用マイクロチューブ（１品種につき１本），マイクロピペット，遠心分離機※，恒温槽３台(もしくはp.31 に示した代替する器材)，マイクロチューブの固定具(p.35)※所持していなくても実験できます。

使用する材料・試薬
各品種の DNA 抽出液，４種類のプライマー(Piia，Piib，RCa，RCb)，Taq ポリメラーゼ(Sapphire Amp
Taq)，蒸留水[PCR 反応液の調整]
PCR 反応液は，DNA 合成酵素(Taq ポリメラーゼ)，dNTP，緩衝液，プライマー【表 14】，DNA 抽出液，蒸留水で構成されています【表 15】。ここでは，dNTP と緩衝液が添加済みの Sapphire Amp Taq を用いて効率的に準備ができるようにしています。また，PCR 反応液は，事前に用意できるものを教員が準備しておくこと
で，実験時間を短縮できます。

【表 14】各プライマーの役割
名称
Piia

役割

塩基配列
5'-CCGCAGTTAGATGCACCATTAGAATTGCTTCATTGCCTGTGGA-3'

フォワード いもち病耐性遺伝子Piiの遺伝領域を増幅する

Piib 5'-CCGCAGTTAGATCAAGTGGCAAGGTTCCATGTTTGGACTCAA-3'

リバース

Rca

フォワード コシヒカリ由来の5'-TGGCCGGCATGACTCAC-3'

RCb 5'-ACTGGCCGGCATCAAGAC-3'※教科書に示されているプライマーの塩基配列を掲載した。
※プライマーの名称については，本研究で独自に設定したものである。

３１

リバース

塩基配列を増幅する【表 15】PCR 反応液の調整

試薬もしくは溶液
Sapphire Amp Taqポリメラーゼ (dNTPと緩衝液を含む)

チューブ １班分
最終濃度
1本あたり
(３品種)
(１品種)
12.5µL 37.5µL
1倍

蒸留水(DNA抽出液量によって変化)

9.5µL

28.5µL

プライマーミックス液(0.5µLずつ4種類を混ぜたもの)

2.0µL

各6µL

DNA抽出液(0.5～2.0µL)

1.0µL

3µL

計

25µL

75µL

0.2µM

(a)事前準備(生徒に行わせてもよい)(1)【表 15】に従って，Sapphire Amp Taq と蒸留水を PCR 用のマイクロチューブに入れる。
(2) 各マイクロチューブに油性ペン(もしくは耐水シール)で品種を書き，判別できるようにしておく。
※Sapphire Amp Taq は１本に１mL 入っており，25µL で PCR 反応液を作成する場合，約 80 本分の実験が可能である。1 班につき 12.5µL×３品種分＝37.5µL 消費するので，約 26 班分に相当する。
前日に小分けにして冷蔵庫で保管できる。
※Sapphire Amp Taq は解凍後 4℃以下で 3 ヶ月間の保管が可能なため，(b)直前に準備するもの(1)全てのプライマー【表14】を混ぜたプライマーミックス溶液を作成する(各プライマーを0.5µLずつ混ぜて2.0µLにしたものを１品種分として，PCR を行うマイクロチューブの本数分の量を用意する)。
(2)事前準備した PCR 反応液の入ったマイクロチューブを１班につき 3 本用意する。
(3)班ごとに手分けをしてプライマーミックス液と DNA 抽出液を PCR 反応液に加える。
※チューブに書いた品種と DNA 抽出液の品種が合っているか確認させる。
(5)液体がマイクロチューブの壁面に飛び散らないように注意しながら，マイクロチューブを指先で優しくはじくようにして(タッピングという)溶液を混ぜる。
(6)陰性コントロールとして，1 本のチューブに蒸留水を 1.0µL 添加する(実験によっては省略可)。
(7)マイクロチューブのふたがきちんとしまっているか，生徒同士で確認させる。
※壁面に液体がついている場合は，チューブをしっかりとつかんで下に強く振り下ろすか，小型遠心分離機を使って液体を下に落とす(フラッシュという)。
壁面の液

短時間遠心する

下に振って液を落とす

液を下に落とすフラッシュの目安として，遠心分離機では 5~10 秒，振り下ろしは 5 回程度行うと良い。
【図 30】フラッシュの説明
３２

②サーマルサイクラーでの実施
様々なサーマルサイクラーが販売されていますが，例として総合教育センターで貸し出しを行っているサーマ
ルサイクラーについて，使用方法を示します(貸出しについては p.61)。

[実験手順](1)電源ケーブルをコンセントに接続し，背部電源ボタンを【ON】にする。ディスプレイが点灯したら，上部の蓋を開け，保護用のマイクロチューブを取り外す(必ず使用後は元の状態に戻すこと)。
(2)【図 31】に示した操作パネルを使って，温度条件，サイクル数などを入力する【図 32】。
プログラムを表示する LCD
液晶

多くの機種であらかじ温度制御プログラムを記憶しておける。

【RUN】ボタン【PAUSE】ボタン

操作パネル【図 31】サーマルサイクラーの操作パネル
28回繰返し
熱変性
98℃

60秒

→ 98℃

アニーリング

5秒

→

64℃

5秒

冷却

伸長反応
→

68℃ 45秒 → 68℃

加熱

60秒

→ 終了後４℃で保管

合計で※Sapphire Amp Taqによって教科書の条件よりも高速反応が可能である。

約60分【図 32】サーマルサイクラーに入力する PCR の条件(3)セットするチューブの容量や本数をサーマルサイクラーに入力し，【START】もしくは【RUN】ボタンを押す。
(4)LCD 画面を見ながら装置が正常に稼働していることを確認する。【PAUSE】が表示されている場合は，装置が稼働していないので注意すること(反応が開始されると終了までの時間が表示される)。
(5)反応終了のブザーが鳴ったら，【STOP】ボタンを押しマイクロチューブを取り出す。
※反応終了後，通常の場合４℃で保管するように設定してあるため，慌てて取り出す必要はない。
※装置全体が手で触れる程度に冷えていることを確認してから片付ける。
※近年使われているサーマルサイクラーの多くが，下からの加熱による PCR 反応液の蒸発を防ぐため，上部ヒーター(lid ヒーター)を装着している。上部ヒーターがない古い機種を使用する場合は，PCR 反応液の上部にミネ
ラルオイルを積層して蒸発を防ぐ必要がある(総合教育センターで貸出しているサーマルサイクラーには lid ヒーターが付属している)。

３３

③人力サーマルサイクラーでの実施
県内の高等学校では，高額なサーマルサイクラーはほとんど配備されていません。そこでサーマルサイクラーが行っている温度制御を複数の恒温槽を用いて生徒自身が行う「人力サーマルサイクラー」の手法を導入し，器材不足の解消を図りました。また，この人力サーマルサイクラーでは直接恒温槽間を移動するため，加熱や冷却によるタイム
ロスがなく，前述(p.13)の Sapphire Amp Taq と併用することで，約 30 分で PCR 反応が行えます【図 33】。
28回繰返し
熱変性
98℃

60秒

→ 98℃

5秒

アニーリング
→

63℃

5秒

伸長反応
→

68℃ 45秒 → 68℃

60秒→ 終了後４℃で保管

合計で※人力サーマルサイクラーの場合，アニーリングの温度は63℃にすると明瞭な結果が得られる。

約30分【図 33】人力サーマルサイクラーで行う PCR の条件[実験手順](1)恒温槽３つを１セットとして用意する【図 34】。(コンセントの最大電流に注意する。あらかじめお湯を沸かしておくと消費電力が少なくなり，ブレーカーが落ちる危険性を回避できる。)(2)それぞれの恒温槽を 98℃，63℃，68℃に設定する。98℃はお湯の量が減りやすいので注意する。特にアニーリ
ングは厳密に温度をコントロールすることが望ましいので，デジタル温度計があるとよい。

●恒温槽を用いる場合
熱変性

アニーリング

98℃

63℃

伸長反応
68℃

最大電流は 36 アンペア
●他の器材で代替する場合(p.36)

電熱線調理器

サーモスタット

ガスコンロ

最大電流は 12 アンペア

【図 34】人力サーマルサイクラー実施のための工夫
３４

(3)PCR 反応液入りのマイクロチューブのふたがしまっているか確認し，割りばしや固定具に装着する【図 35】。
●従来の方法
割箸の間にチューブを挟み輪ゴムで固定する。

締め付け過ぎるとチューブが変形する可能性がある。

熱湯に手を入れないように注意させる●本書でお勧めする固定具
１本ずつ加熱するタイプ
ダブルクリップ

防水糸を使うため，自由に熱源から距離をとれる。手を放しても保護ケースによりチューブは守られる。

防水糸
クリップに紐を通し釣針カバーで覆うようにする

釣針カバーを利用し，圧力を蓋にかけない。

３本同時に加熱できるタイプ
安価な玩具を利用(ハンドスピナー)

ダブルクリップ

隙間にマイクロチューブを入れる。

チューブを入れた後でクリップを中心方向に押し込む。

中心に防水糸を通す【図 35】マイクロチューブの固定方法(4)教員の合図で，98℃に１分間マイクロチューブをつけ，その後 98℃5 秒→63℃5 秒→68℃45 秒の温度変化を 28
サイクル繰り返す。最後に 68℃に 1 分間つけて実験操作を終了する(１時間以上放置する場合は氷冷する)。

［注意点］
・マイクロチューブの漏れや破損を想定して予備や事前に作成した演示用の PCR 産物を用意しておくとよい。
・人力サーマルサイクラーは，恒温槽に浸かっている時間を多少変えても，基準の時間より長ければ成功する。特に，伸長反応は浸している時間を増やした方が明瞭なバンドパターンが得られる。
３５

[他の器材で代替する方法について]
他の器材で代替する方法では，98℃をガスコンロにすることで消費電力を抑えている。また，高額な恒温槽に代わって，より安価な電熱線調理器等とサーモスタットを組み合わせ，
厳密な温度管理を可能にしている【表 16】。
【表 16】人力サーマルサイクラーに使用する実験器材の費用の比較●恒温槽を用いる場合
実験器具

費用

恒温槽

30,000●他の器材で代替する場合

個数
3

合計

実験器具

費用

個数

90,000 電熱線調理器

5,500

2

11,000

1,700

2

3,400

サーモスタット
合計

合計¥90,000

合計¥14,400

電熱線調理器とサーモスタットの組み合わせで実験を行うときは，設定温度に到達後，電熱線調理器の発熱量の設定を弱めておくと，温度がコントロールしやすい。サーモスタットは，設定温度に対して±0.5℃で電化製品のスイッチが ON/OFF になるように設定する。

[サーモスタットについて]
安価なサーモスタットの中には，日本規格のコンセントケーブルが付属していないものがあります。その場合
は，100 円均一ショップで販売している延長用のコンセントケーブルを加工して取りつける必要があります。電子工作に不安を感じる場合は，3,000 円以下で日本規格のコンセントケーブルを取りつけて販売している商品がありますのでそちらの使用をお勧めします【図 36】。
サーモスタットの裏蓋をドライバーでこじ開ける

コンセントケーブルが無い商品

延長用コンセントケーブルを切断する

コンセントケーブルを接続し，ホットボンドなどで固定する

オス端子を長くすると取り回ししやすい

初めから取りつけ済みの商品もある
出典：Amazon.co.jp【図 36】サーモスタットへのコンセントケーブルの取りつけ

３６

[サーモスタットを用いて人力サーマルサイクラーを行う利点]
サーモスタットを用いて人力サーマルサイクラーを行う場合，電気ポットやフライヤーなど，水を沸騰させる機能を持った家電製品を全て利用して実験ができるようになります。各学校に初めからある家電製品を利用して実験が行えるようになりますのでお勧めします。
また，サーモスタットはデジタル制御なので，水温の管理が簡単に行えます。教員の負担を減らす意味でもサー
モスタットは優れています【図 37】。
サーモスタット

近くのコンセントから集中してつながないこと
温度センサー
家電製品の電源
フライヤーや電気ポット等も使用できる温度の上限(電源が切れる)
温度の下限(電源が入る)【図 37】サーモスタットを用いて人力サーマルサイクラーを行う際の設定
３７◇(3)電気泳動

電

気

泳

動

①ゲルの作製方法
PCR 産物の電気泳動に使用するゲルは，１％の濃度で作製します【表 17】。作製するゲルの量は，ゲルトレイ(大)を使う場合は 30mL，ゲルトレイ(小)は 15mL として計算します(大×２，小×４の場合，30×2＋15×4＝120mL)。教科書では２％で実験を行っていま
すが，１％でも問題なくバンドパターンが検出できます。

[調整方法]【表 17】アガロースゲル作製のための試薬

15mL

試薬もしくは溶液

③

10班分

最終濃度

0.15 g

0.3 g

2g

1％

0.3mL

0.6mL

4mL

1倍

0.75µL

1.5µL

10µL

0.5µg/µL

14.7mL29.4mL

196mL

0.15mL

0.3mL

蒸留水

14.6mL29.1mL

194mL

DNA染色液(EtBr)

0.75µL

1.5µL

10µL

蒸留水

14.7mL29.4mL

196mL

50×TAE溶液②

200mL

ゲルトレイ(小) ゲルトレイ(大)アガロースゲル粉末

①

30mL

*

DNA染色液(SAFELOOK™プレグリーン)
蒸留水**

DNA染色液(ViewaBlue® Stain)

2mL 100倍希釈
0.5µg/µL* ゲル100mLに５µL添加する。また泳動の際に+極側の泳動バッファーに５～10µL加える。
** ゲル100mLに１mL添加する。十分な発色 が得られない時は，原液を用いて後染めする。
※①・③で染色したゲルは，②で後染めすることもできる。
※先染めの場合は，染色液の分解を防ぐため，ゲルを冷却して60℃以下にしてから試薬を加える。

(a)電子レンジを使用して 200mL(10 班分)を作製する場合【図 38】(1)容器にアガロース２g，50×TAE 溶液４mL，蒸留水 196mL を加える。

ラップ※容器の壁面につかないように溶液にアガロースを入れて軽く混ぜること。

三角フラスコ(3)突沸を防ぐため，三角フラスコを使う場合はラップを煙突状にまく。また，耐熱容器を使う
場合は付属の蓋をつけて，それぞれ 500～600Ｗで 30 秒間電子レンジにかける。
(4)加熱と確認を繰り返し，２～３回沸騰させる。(確認の際は，軍手着用の上，優しく振り混ぜること。)(5)人肌より少し熱い程度に冷却してから染色液を加えて攪拌し，ゲル作製器に流し込む。
※ゲルを高温のまま作製器に入れると変形の可能性がある。また，作製後のゲルはもろいので取り扱いに注意する。
※ゲルは，ゲルトレイごとサランラップ等で包んで乾燥を防ぎ，冷蔵庫で保管すれば，数日間使用できる。

３８

耐熱容器に直接試薬を入れる

電子レンジは家庭用のものを使用できる冷却の目安は，熱く感じるが手で触れる温度

冷却後に DNA 染色液を入れて攪拌する

ゲルを作製器に入れた後でコームを差し込む

ゲルが十分に固まってから左右にコームを少し揺らしながら慎重に引き抜く【図 38】耐熱容器を使ったゲルの作成(b)オートクレーブや圧力鍋を使用する場合(1)200mL フラスコにアガロース２g，50×TAE 溶液４mL，蒸留水 196mL を加える。
(2)オートクレーブにかけ，火傷に注意しながらアガロースを溶かす。
(4)50～60℃に冷却してから，ゲル作製器に流し込む。(DNA 染色液は冷却後に入れる)②電気泳動について［泳動用試料の調整］(a)ローディングバッファーを用いる場合【図 39】
通常の Taq ポリメラーゼを用いる場合は，PCR 産物にローディングバッファーを加える必要があります。
(1)スライドガラスに，PCR 産物の数だけ，6×ローディングバッファーを１µL ずつ滴下する。
(2)PCR 産物を５µL とり，スライドガラス上の 6×ローディングバッファーに加え，ピペットを使って混合する(ピペッティング)。
※PCR 産物同士が混じらないようにチップを変えて操作を行う。
３９

6×ローディングバッファー
1µL＋PCR 産物 5µL をよくピペットで混ぜ合わせる。

あらかじめ 6×ローディ
ングバッファー 1µLを滴下しておく。

【図 39】ローディングバッファーの混合の仕方(b) Sapphire Amp Taq を用いる場合
ローディングバッファーがあらかじめ混合されているため，PCR 産物をそのまま泳動できます(p.13)。

[電気泳動]【図 40，41】(1)泳動槽にゲルをセットしてから，ゲルの上部まで浸るように泳動用バッファー(１×TAE 溶液)を入れる。
※必要に応じて蛍光染色液を加える。
(2)ゲルの１番左端のウェルに DNA サイズマーカーを６µL 注入し，２番目のウェルんだところで，泳動を終了する。

サンプル
DNA

(3)ローディングバッファーの先頭がゲルの全長の６～８割程度(約 25 分間)まで進

サイズマーカーから順に泳動する PCR 産物を６µL ずつ注入し，電気泳動を開始する。

(4)泳動後，ゲルを取り出し UV トランスイルミネーターで結果を確認する。
(5)泳動槽は，バッファーを捨てて蒸留水などで洗う。
※染色液による後染めをする場合は，ゲルトレイからゲルを外して別容器に移してから染色・脱色する。
※泳動バッファーは，２～３回使いまわすことができるが，浮遊物等が現れた場合は交換する

ピペットの先端を入れす
ぎてウェルを壊さないよ
うに注意する。

ウェルからあふれても特に問題はない。

このように片方の指を添えると安定して注入できる。
【図 40】PCR 産物注入の仕方

４０

サーマルサイクラーから取り出す際に何を入れたチ
ューブか判別できるようにしておく。

通常は左端に DNA 分子量マーカーを入れ，その隣のウェルに PCR 産物を入れていく。

電極を逆転させられるものや電圧を変更できるものもあるのでよく確認して電気泳動する。

ローディングバッファーがゲルトレイの 8 割以上流れてしまうと，ゲルから DNA が流れ出てしまっている可能性があるので注意する。

【図 41】電気泳動の流れ

４１

③UV トランスイルミネーターの使い方
蛍光染色した PCR 産物のバンドパターンの確認するために使用する。強力な紫外線が照射されるため，透明(もしくはオレンジ色)の紫外線防止カバーが付属している。

[操作](1)ＵＶ照射面にゲルを置き，紫外線防止カバー(オレンジカバー)を適当な位置に調整します。
(2)本体と電源コードをつなぎ，電源コードをコンセントに差し込む。
(3)電源を入れて観察や作業を行う。

●紫外線防止カバー観察を行う場合は，必ずカバーをかけて目を保護する●本体保護カバー
背景を黒くすることで観察しやすくする●紫外線照射部
サランラップ等を装着して直接ゲルが接触しないようにする

電源スイッチ【図 42】UV トランスイルミネーターの各部の名称と役割
紫外線保護カバーをすると，外部に漏れてくる
紫外線は少なくなる

紫外線保護カバーをしないと多くの紫外線が漏れてしまうので注意すること増幅された DNA が長さに応じて縞模様(バンドパターン)を形成する【図 43】UV トランスイルミネーターの使い方
４２

実験を授業に取り入れる（授業展開案）①マイクロピペットの使い方と電気泳動による DNA の分離の原理を学ぶ※簡易的な電気泳動装置の作成については p.46～p.51 を参照してください。

・評価の観点

関心・意欲・態度

思考・判断・表現――

観察・実験の技能

知識・理解

マイクロピペットの容量を変電気泳動により DNA が分離す
更し，正しく扱うことができる。 る原理を理解している。
正確に溶液を吸い取ってゲルのウェルに注入できる。

・授業展開
学 習 活 動

指導上の留意点

評 価 規 準(方法)導・バイオテクノロジーと現在の生活との関連性を認識する。

・遺伝子診断の CM を見せながら，生活との関連性を説明する。

入・遺伝子を切断，結合，増幅する技術について学ぶ。

・生徒向け実験テキストを用いて，遺伝子を操作する技術を説明する。

10

・本時の実験内容を理解する。

・マイクロピペットが遺伝子実験になくてはならないことを説明する。

分

学習課題：遺伝子実験に必要なマイクロピペットを使えるようになって，DNA サイズマーカー(λ-HindⅢ)
を電気泳動し，DNA の分離がどのように行われるか理解する。
・２人一組にマイクロピペット(P2，P20)とピペッ
トチップ，DNA サイズマーカーの入ったマイク
ロチューブとローディングバッファーの入ったマイクロチューブ，空のマイクロチューブを配
付する。

展
開
35
分

ま
と
め
10
分

４３

・実験道具の使い方をワークシートや説明を聞きながら確認する。

・テキストやプレゼン資料を使い，マイクロチュ
ーブや，マイクロピペットの正しい使い方を説明する。生徒同士が協力して実験を行えるようサポートする。

・マイクロチューブに入っているローディ
ングバッファーを 10µL 取り，空のマイク
ロチューブに移す(一人２回行う)。

・机間指導をしながらピペットの使い方や全員が溶液の移動を行ったか確認する。

・電気泳動装置を使う際の注意事項や実験方法を確認する。

・電気泳動装置を扱う際の注意事項を全員に確認させる。

・電気泳動装置にアガロースゲルをセットし，先ほど取り分けたローディングバッフ
ァーを 10µL ずつアガロースゲルのウェルに注入する。最後に、DNA サイズマーカーが入ったマイクロチューブから６µL をゲルに注入する。

・机間指導をしながらピペットの使い方や全員がウェルに注入する操作を行っているか確認する。

・15～20 分ほど電気泳動する。電気泳動中の様子を観察する。

・電気泳動中にその原理を説明する。また，電気泳
動中のアガロースゲルを観察させる。

・使用した道具を片付ける。

・片付けの指示をする。

・電気泳動の結果についてテキストで，原理を確認する。

・電気泳動の結果から，DNA 断片は短いものから早く泳動されることを理解させる。

・事前に用意した記録媒体でバンドパター
ンを撮影する。

・事前に用意させた記録媒体(デジタルカメラやス
マートフォン等)にバンドパターンを撮影させる。

【観察・実験の技能】
・マイクロピペットの容量を変更し，正しく扱うことができる。

【観察・実験の技能】
・正確に溶液を吸い取ってアガ
ロースゲルのウェルに注入できる。

【知識・理解】・電気泳動の結果を観察し，DNAが分離する原理を理解している。

②人力サーマルサイクラーを用いた PCR

・評価の観点

関心・意欲・態度

人力サーマルサイクラーを他の班員と協力して行うことができる。

思考・判断・表現

観察・実験の技能

―

―

知識・理解

異なる温度条件の反復により，
DNA が増幅されることを理解し
ている。

・授業展開
学 習 活 動

指導上の留意点

評 価 規 準(方法)・３品種のコメの DNA 抽出液と PCR 反応液を準備しておく。
・恒温槽の水を下図のように加熱しておく。

導
熱変性
98℃

入

ｱﾆｰﾘﾝｸﾞ
63℃

伸長反応
68℃

５
分

・PCR の原理及びサーマルサイクラーが行っている温度制御を理解する。
・本時の実験内容を理解する。

・実験テキストを用いて，本時の実験内容等を説明する。

学習課題：人力サーマルサイクラーでコメの遺伝子を増幅し，PCR の原理を理解する。
・マイクロチューブ３本にそれぞれ DNA 抽出液(３種類)，プライマー，Sapphire Amp
Taq，蒸留水を規定量入れる。

・試薬をマイクロチューブに確実に入れさせる。プライマーやDNA 抽出液は誤って多く入れても問題なく反応するので生徒を慌てさせないようにする。
・役割分担させて，できるだけ素早く準備を行えるようにする。

・３本のマイクロチューブを固定具に装着する。

・マイクロチューブのふたがきちんとしまっているか確認させる。
マイクロチューブ固定具【関心・意欲・態度】
・人力サーマルサイクラーを他の班員と協力して行うことができる。

展
加熱時の様子開45
分下部に固定される→・マイクロチューブを 98℃で 1 分間加熱し ・2 人一組で行い，７サイクルごとに生徒を交代さた後で，98℃で 5 秒，63℃で 5 秒，68℃でせることで全員に人力サーマルサイクラーを経
45 秒の順で恒温槽につける作業を 28 サイ
験させる。
クル行い，その後 68℃に 1 分間つける。 ・やけどをしないように，特に 98℃の恒温槽周辺では注意させる。
・人力サーマルサイクラーを行っていない ・ペーパークラフトを行う生徒に手順を説明する。
生徒は，空いた時間を利用して PCR の原 ・事前にはさみとのりを用意しておく。
理を学ぶためのペーパークラフト(p.55)を完成させる。

PCR の原理を学ぶ
ペーパークラフト

・終了後，マイクロチューブを長時間放置する場合は 4℃で保存する。
(長期保存の場合は-20℃)

ま
と
め
５
分

・使用した道具を片付ける。

・片付けの指示をする。

・人力サーマルサイクラーで行ったそれぞ
れの温度設定でどんな現象が起きていたか再度考える。

・人力サーマルサイクラーで行った 3 つの温度設定の意味を解説し，DNA が増幅される過程を理解させる。

【知識・理解】・異なる温度条件の反復により，
DNA が増幅されることを理解
している。

４４

③岩手県産品種のイネを使った遺伝子判定実験

・評価の観点

関心・意欲・態度

思考・判断・表現

PCR の結果を基に，岩手県産品
種のコメがどのような遺伝的性質を持っているか判断できる。

―

観察・実験の技能

知識・理解

―

―

・授業展開
学 習 活 動導入５分

指導上の留意点

評 価 規 準(方法)・3 種類のコメの PCR 産物を用意する。
・電気泳動の仕方について実験テキストで確認する。

・実験テキストを用いて，電気泳動について説明する。

学習課題：PCR で増幅したイネの DNA を電気泳動し，県産品種の遺伝的性質を判定する。
・ゲルを電気泳動槽に設置し，１×TEA 溶液
をゲルが浸るくらいまで入れる。

・2 人一組で実験を行う
・電気泳動装置は，２組に１台用意する。(簡易的な電気泳動装置を使用する場合は、１組に１台)・pHY マーカーを６µL 取り，第一レーンに ・マイクロピペットの設定や正しいピペットチッ
入れる。第二レーン以降は，金色の風，銀プの選択及び装着を行っているか確認する。
河のしずく，コシヒカリの順に PCR 産物 ・ゲルの向きを確認させる。
を入れる。
・ゲルを破損してしまった際は，空いているレーン
ゲルへの注入に入れさせる(漏れてしまった PCR 産物は気にする必要はない)。

展
開・電気泳動を開始する。
(泳動の時間は概ね 25 分)

35分

・電気泳動を行っている間に，今回行った実験や技術が，社会においてどのように使われているかを学ぶ。
・電気泳動後のゲルに UV ライトを照射してバンドパターンを確認する。
現れたバンドパターンの説明をする・使用した道具を片付ける。

ま
と
め
10
分

４５

・ローディングバッファーがゲルの６～８割の位置になるまで泳動することを確認させる。
・電圧が 50V なっていないか確認する。また，安全カバーがうまくはまっていないと通電しないので確認させること。
・テキストの資料を使って説明する。
（教科書に掲載されていないが，ゲノム編集についても触れる）
・生徒にデジタルカメラやスマートフォンを用いて撮影させる。(第１時限に持ってきてもよいことを指示)
・pHY マーカーを基に，バンドパターンがどの
PCR 産物であるか確認する。

・片付けの指示をする。

・自分の班の結果と，教員がサーマルサイク ・参考としてサーマルサイクラーで行った PCR 産
ラーで行った PCR 法の結果を比較して，物を電気泳動し，生徒に結果を比較させる。
人力サーマルサイクラーと同じことが機械によって行われていることを理解する。
・テキストを基に、岩手県産品種の遺伝的特 ・あきたこまちやひとめぼれの PCR 産物の泳動結性を分析し，発表する。
果も提示する。ひとめぼれと金色の風，あきたこ
まちと銀河のしずくがそれぞれ同様の遺伝的特性を持っていることを説明する。
※まったく同じ遺伝子であると誤解させないように，資料を提示して解説する。

【思考・判断・表現】
・電気泳動の結果と教科書の内容を比較して，岩手県産品種のコメがどのような遺伝的性質を持っているか判断できる。

自作できる実験器具の作成①電気泳動装置の作成と使い方
電気泳動装置は，交流電源を直流電源に変換する電源装置と，電流を水溶液中に流す電気泳動槽で構成されています。本書では，100 円均一ショップなどで安価に購入できる部品を用いて電気泳動装置を作成する方法を紹介します。

[電源装置の作成]
電源装置の作成に必要不可欠なのが 100 円均一ショップで購入できるスイッチ付き節電タップです【図 44】。この節電タップは，裏のネジを外すと簡単に分解ができます。また，発光するスイッチが組み込まれているため，電源の ON/OFF が分かりやすく，高電圧を使用する電気泳動では安全性の確保にもつながると考えられます。なおこの装置は，半田づけなしで作成が可能です。
節電タップ

回路の全てを組
み込める

発光するスイッチ

裏側にネジがあり簡単に分解可能※ねじ止めされていないものは分解が難しい【図 44】電源装置作成で使用する節電タップ
この装置は，節電タップ内にコンセントから供給される交流 100V を直流 100V に変換する 1.5A のブリッジダイ
オードと安全装置である 1.5A ヒューズを組み込んだものです【図 45】。
●ブリッジダイオードの外形上から見た形

横から見た形～～＋－

上部の記号の例(プラスの記号のみの製品もある)●ガラス管ヒューズの外形
ガラスの部分
内部を確認できる

金属棒●記号の意味＋：直流のプラスの電気を出す－：直流のマイナスの電気を出す～：交流の電気をつなぐ※交流には＋や－はありません。
どちらでも接続できます。
※本書では，1.5A のものを使用しています。
※記号の裏から端子(足)が伸びている。
●ヒューズとはある一定以上の電流が流れるとガラス管
内の金属棒が焼き切れてそれ以上電気が流れないようにする安全装置です。
本書では，1.5A250V(125V)のものを使っています。

【図 45】電源装置に組み込む電子部品

４６

[電源装置作成の手順]組立に必要な工具・材料●工具 プラスドライバー，ワイヤーカッター，熱収縮チューブ※，ワイヤーストリッパー※，半田ごて※●材料 節電タップ，ワニ口クリップ(できれば色違い)×２本，ブリッジダイオード(1.5A) ，ガラス管ヒューズ(1.5A・250V(125V)・20 ㎜)※所持していなくても組立可能です。
下の組立て手順の②で金属板の配線を切断しますが，金属板にはある程度の厚さがあり，ニッパーでは刃が欠ける可能性がありますので，ワイヤーカッターを使うことをお勧めします。また，多数の配線の被覆を剥ぎ操作には，200円程度で販売されているワイヤーストリッパーを用いると効率的に作成できます。ブリッジダイオードとヒューズについては，インターネットで販売されています。個別店舗で購入する場合は，エレパーツ(住所：岩手県盛岡市三ツ割１丁目９－７，電話番号：019-681-3575) で購入できます。
組立手順①ワニ口クリップの末端の

図①

配線の被覆を剥ぎ取る

被覆を５㎝剥ぎ，ねじっ解②

裏のネジを取り外す④

ﾌﾞﾘｯｼﾞﾀﾞｲｵｰﾄﾞの端子の位置関係てまとめておく。
1②節電タップの裏ネジを外して，中の配線を露出さ
せる。
③

B

⑥交流側の足を端子にきっちりと接触するように巻
き付ける。

４７

＋

交流（～）

～

3

＋極

A

④ﾌﾞﾘｯｼﾞﾀﾞｲｵｰﾄﾞの金属製の足を，表の印刷を見ながら確認して交流側，直流側に折り曲げる。
⑤右図のように，ﾌﾞﾘｯｼﾞﾀﾞ
ｲｵｰﾄﾞをひっくり返して端子の間に押し込み，交流の足を上に，プラスを右に，マイナスの足を左側に折り曲げる。

A,Bラインで切断～

2③２本の金属板の配線を
ＡとＢのラインで切断して，交流電流がコンセン
ト穴の方に流れないように遮断する。

－

ー極

模式図

コンセント穴⑤交流を直流の±に変換⑥

交流の足をここに接触させない

交流(～)の足

ー極の足

＋極の足

交流端子に配線を巻き付ける

今回作成する電源装置は，必要以上の電流が流れないように 1.5Ａを最大電流としており，1.5Ａのヒューズを組み込むことで安全性を増しています。ブリッジダイオードは長時間使用すると発熱する特徴を持っていますが，電気泳動に必要な 30 分前後の使用においては異常に加熱するなどの問題は発生しませんでした。
組立手順⑦＋極側の足を長めに切り取り，残った側を＋極側の端子に接触するように折り曲げる。
4

図⑦⑨右図のようにカッターで切り取りヒューズを押し込む場所を作る。

切り取った配線をフック状に曲げる＋端子を長めに切り取る⑨

ヒューズが入る形に加工⑩

ヒューズが半分以上入った状態にする⑩切り取った部分にヒューズが入るか確認し，入らない場合はさらに深く切り取る。
カッター等で２カ所を切り取る

6

⑧

切断

※白丸は半田づけする場合⑧切り取った足の部分を図のようにフック状に折り曲げる。(ヒューズ用の5〇の部分を接触解⑪右図のように右側のコンセント穴から赤の配線を通し，切り離しておいた
コンセント端子に配線をねじって巻きつける。

⑪

矢印方向に配線を回してねじる⑨の部分にヒューズを押し込む⑫

引張ってほどけないか確認する⑭〇コンセント穴との接触点⑫右図のように巻き付けた
後で配線を引張り，配線がほどけないことを確認する。
⑬図のように配線をコンセ
ント端子部分にドライ
バーなどで隙間を作って押し込めて固定する。
7

8

⑬

⑧でフック
状にした端
子の足

⑭マイナス極側の足を赤の配線側に折り曲げ，⑧で作ったフックを黒の配線側の隙間に押し込み，右
図のように配置する。
⑮二つの足がヒューズの金属部と接触していることを確認しながらヒューズを押し込む。(全ての配線をテスターでチェッ
クするとよい)※白丸は半田づけする場合⑯ケースに「＋」，「－」を書き込み，通電をテス
ターなどで確認する。

黒側

赤側

配線を端子の間に通して固定する●ヒューズとの接触点になる⑮

蓋を押しながらねじ止めする⑯〇の接触を確認する＋と－を書き，通電を確かめる
４８

[泳動槽の作成]
本書で作成する泳動槽は，100 円均一ショップで販売している耐熱のプラスチック容器を泳動槽として使用しています。通常はゲルをゲル作製器で作成してから泳動槽に設置する必要がありますが，この泳動槽は，直接泳動槽内にゲルを作製することができます【図 46】。

組立に必要な工具・材料●工具 はさみ，ホチキス，絶縁テープ(赤・黒)※●材料 耐熱容器(120℃対応，ポリプロピレン製，105mL，蓋つきだとゲル作製後保管しやすい)，目玉クリップ×２，ステンレス線(Φ0.9 ㎜以上)，ろ紙(短冊状のものが使いやすい)※所持していなくても組立可能です。

目玉クリップ

自作の電源装置
市販の耐熱プラスチ
ック容器で，ゲルを直接泳動槽に作製することができる。

電極はステンレス線にろ紙を 2 つ折りにしたものをホチキスで止め，ぶら下げて使う。

+極になる側には，容器の外側から赤テープを貼って目印とする。

ウェルに PCR 産物を注入する際に確認しやすいように，容器の裏側から黒テープを貼っている。

【図 46】自作の電気泳動槽装置の泳動槽の概要(1)ステンレス線を６㎝ずつ切り離す。(１つの装置に２本
使用する)

約2㎝

ステンレス線を左図のような形に成型する。

(2)【図 47】のように，ステンレスワイヤーを折り曲げる。
(3)加工したステンレス線にろ紙を 2 つ折りにしたものをホチキスで止め，ぶら下げる。
(4)完成した電極を容器にに引っ掛け，目玉クリップで固定する。

・電極の拡大図
濾紙が目玉クリップに触れると電気分解が起きて，目玉クリップが腐食するため，離して設置する。
【図 47】自作の泳動槽用電極の作成

４９

[泳動槽を使用する準備] 【図 48】(1)泳動槽は，電子レンジ対応でふたが付属しているものを選び，直接アガロースゲルの粉末と水を入れて電子レンジで加熱してゲルを作成する。
(2)下記に示した，この泳動槽に合わせたウェル作成用コームを厚紙で作成し，これを用いてウェルを作成する。
(3)泳動槽に直接作製したアガロースゲルの両端を，それぞれ５㎜切り取って除去する。
(4)ゲルの表面が浸るまで 1×TAE 溶液を注ぐ。

この泳動槽のためのウ
ェル作成用コーム

・直接泳動槽にゲルを入れ，
上記のコームを使用してウ
ェルを作る－

作成したウェル

+５㎜ずつゲルを切って除去する※１×TAE 溶液は，電極のステンレス線が浸らないように注ぐこと。

ウェル作成用コーム実
物大の型紙

上記の型紙を使ってウェルを４～５つ作成する

・黒塗りを
切り取る
と４ウェ
ル作成で
きる。
・白抜きを
切り取る
と５ウェ
ル作成で
きる。

使用前に両端の電極のゲルを除去する【図 48】泳動槽を使用するための準備［電気泳動］【図 49・50】(1)PCR を行う際の電極の設定は，泳動上流側に－極，下流側に＋極になるように接続する。
(2)調整しておいた DNA サイズマーカー６µL をウェルの 1 番左側に注入する。
(3)PCR 産物の入ったマイクロチューブから６µL 取り，ウェルの左側から 2 番以降に注入する。
※異なる PCR 産物同士が混じらないように，ピペットチップを変えて同様の操作を行う。
(4)感電や回路がショートする危険性のあるものがないか装置の周りを確認し，電源を入れる。
※通電中も回路がショートしないように装置に不用意に触れないように注意させること。
(5)ローディングバッファーの先端がゲルの全長の６～８割程度まで進んだところで，泳動を終了する。
(6)泳動後，UV トランスイルミネーターで結果を確認する。

５０

直接原液を流し込む※結果が確認しにくい場合は，黒テープをはがすとよい。
※ビューワブルーステイン(染色液)を使用する場合は，右図のように泳動槽に直接染色液を入れて染色・脱色する。

通電時スイッチが
発光する。

－

－

＋

+

「＋」，「－」の
つなぎ間違いに注意する。

ローディングバッファーの先端が６～8 割くらいまで泳動したら止める。
通電中＋極，－極に同時に接触(ショート)すると感電するので注意する。

【図 49】自作の電気泳動装置を使う際の注意事項

ステンレスとろ紙を使った電極をクリップで固定する。

電気泳動用バッファーを入れ，電気泳動槽に直接作製したゲルに PCR 産物を分注していく。

電極を間違わないように電源装置を接続し，電極同士をショートさせないようにしながら電源を入れる。

電気泳動槽からバッファーを取り除き，容器ごとUV トランスイルミネーターに乗せて観察を行う(見にくい時はゲルを外して観察する)。

【図 50】自作の電気泳動装置の使い方
５１

②人力遠心分離機の作り方
人力遠心分離機は，「松風ごま」や「ぶんぶんゴマ」と呼ばれる伝統的な玩具の原理を利用したものです。この原理を利用した「Paperfuge」と呼ばれる装置は，回転数は毎分 12 万回転，遠心加速度は 3 万×g になり，２分間で血液から血漿を分離する実験に使用できると報告されています（Bhamla, 2017) 。しかしこの器具は，細いガラスチューブなどに入れたサンプルの遠心分離にしか使用できず，マイクロチューブを用いた遠心分離を行うことはできませんでした。そこで，回転部を平面から円盤状にすることで，装置自体に厚みを持たせ，マイクロチューブを使用できるように改良しました【図 51】。
この装置を利用して，コメからの DNA 抽出を行ったところ，遠心分離機よりも不純物の沈殿効率は悪かったものの，PCR では目的の遺伝子の増幅が確認されました。DNA 抽出の際に，採取する上清の量を少なくすることで，十分な DNA の純度になります【図 52】。

従来の人力遠心分離機

人力遠心分離機の全容

強力な横回転が発生

上端を固定する

出典: Design to Improve Life®

タコ糸
遠心分離の結果ガラス管に入ったサンプルを遠心分離できるが，マイクロチューブは使用できない。

人力遠心分離機本体

上清沈殿

本研究で開発したもの
人力遠心分離機で抽出した DNA を PCR した
結果，明瞭なバンドパターンが検出された。
円盤状の外形のためマイクロチ
ューブを使用できる。

下端のタコ糸を引いた
り，緩めたりすることで回転を発生させる。

【図 51】人力遠心分離機の概要

５２

DNAの抽出処理
A 農業研究センターサンプル
B エタ沈*・フェノクロ**処理
C イソ沈***・フェノクロ処理
D エタ沈２回・65℃処理
E イソ沈２回・65℃処理
F エタ沈１回・65℃処理
G イソ沈１回・65℃処理
H Dと同条件・人力遠心分離機
I Eと同条件・人力遠心分離機
J エタ沈２回・炊飯米
K エタ沈２回・90℃処理* エタノール沈殿** フェノール・クロロホルム処理*** イソプロピルアルコール沈殿

収量(ng/µL) Abs280/Abs260 DNA純度※
393.1501.222
99%
572.300
3.333
97%
470.900
4.667
95%
234.900
9.222
91%
233.200
1.333
99%
679.550
16.16784%612.750
17.33383%417.800
17.27883%
34.5505.667
94%84.4508.000
92%126.100
2.444
98%※DNA純度は,DNAの吸光度(Abs280)÷タンパク質の吸光度(Abs260)の測定値から，その理想値(1.8)を100%とした場合の割合を示している。

ng/µL

夾雑物少

夾雑物多

800 収量が多い
F
G
600

B
C

H

A

400
D
200
0

E
J

DNA純度が高い
80%

85%

90%

K
I
95%

100%

【図 52】様々な方法で抽出した DNA の純度[人力遠心分離機の作成]【図 53】
人力遠心分離機の型紙(p.52)を厚紙やプラスチック素材に貼りつけて切り離してください。穴あけや切込みが必要な部分については組立前に行っておくと組み立てやすくなります。組み立てには，糊だけでなく両面テープやホチキスなどで補強すると壊れにくくなります。また，タコ糸はほどけないように固結んでください。タコ糸については，100 円
均一ショップで販売している太目のタコ糸を２重にすると耐久性が増します。

ホッチキス等で円錐形になるように組み立てる

上下のパーツの数字が一致するように貼り合わせる【図 53】人力遠心分離機の組み立て方[人力遠心分離機の使い方]
番号のついている部分の切れ込みにマイクロチューブがきちんと固定されるように差し込む。紐の上下を持って 10回程度回転させ，紐にねじれを作る。上下の紐を引き，回転が始まったら引く力を緩めると，回転力によってねじった
方向と逆方向にさらにねじれる。これを繰返すと回転力が増加していく【図 54】。

各番号の部分にある隙間にマイクロチューブをきっちりと差し込む【図 54】人力遠心分離機の使い方
５３

紐を長くすると回転数が増すが，耐久性や安定性は減少する

５４

③PCR の原理を学べるペーパークラフト
PCR の原理を学べるペーパークラフトは，無限に開けるカード（endless card）と呼ばれるペーパークラフトを応用したものです。４枚の絵が繰り返し現れる特徴に注目し，同じ温度変化を繰り返すサーマルサイクラーがその温度ごとに何を行っているかを視覚的に学べる教材として作成しました【図 55】。
何名かの班で人力サーマルサイクラーを行う際には，実験操作を行っていない生徒に，このペーパークラフトを作成させることで時間を有効に使うことができます。型紙(p.56)は，A４用紙１枚に，組み立て方法を含めた全ての情報が記載されており，20~30 分の製作時間で完成させることができます。

中心からカードを開く【図 55】PCR の原理を学べるペーパークラフト
５５

表紙→①→②→③→表紙を繰返す５６

④断熱紙コップを用いたチューブ・チップ立ての作成
班ごとにマイクロチューブやピペットチップを配布するのは大変です。そこで断熱性の紙コップを用いたマイク
ロチューブ立てとピペットチップ立てを作成しました。断熱性紙コップは，通常の紙コップよりも強度と耐水性に優れ，氷を入れてマイクロチューブの冷却もできます。また，再利用も可能で安価に購入できる素材です【図 56】。
本書では，断熱紙コップのふたのような形状のチューブ・チップ立てを設計し，３D プリンターで作成【図 56】
して実験に使用できることを確認しました。

表面が防水されている断熱紙コップ

３D プリンターで作成したもの

複数の種類のピペットチップを同時に立てられる

1.5mL・PCR 用のマイクロチューブを氷冷できる【図 56】断熱紙コップを使ったチューブ・チップ立ての概要
また，厚紙やプラスチック素材に貼りつけて，チューブ・チップ立てを作成するための型紙(p.58)を作成しました【図 57】。100 円均一ショップで購入できるポンチ等で穴をあけるだけで作成できます。用途に応じて穴の数の調整や，型紙のパーツを拡大・縮小することで様々な断熱紙コップの大きさに対応できます。
穴あけポンチやパンチを使って穴を空ける

厚紙で再現したもの【図 57】ペーパークラフトによるチューブ・チップ立ての再現

５７

５８

試薬や器材の入手方法①試薬・実験器材関連
現在，試薬や実験器材については，多くの業者が様々な商品を販売しているため，どれを購入すればよいか迷うと思います。そこで【表 18】には，本書の実験を行うにあたって便利な規格のものや最も安価なものを選んで一覧にしました。各校で実験器具や試薬をそろえる一つの目安としてお使いください。(サーマルサイクラーや遠心分離機は年々低価格化しています。業者に現在の価格を確認してください。)【表 18】試薬・実験器材の入手方法一覧[DNA抽出関係]
●試薬
TAE溶液

正式名称・容量・型番等

容量

価格

50×TAE

500mL
100mL

取扱業者

¥9,000 ニッポン・ジーン

備考
25L分

TE溶液

１×TE(pH8.0)¥8,000 ニッポン・ジーン

DNAを含む試薬調整

SDS(界面活性剤)

ドデシル硫酸ナトリウム25g¥2,450 富士フィルム・和光純薬

取扱注意

Tris

トリスヒドロキシメチルアミノメタン

25g¥1,350 ナカライテスク株式会社

EDTA

エチレンジアミン四酢酸

50g¥3,000 同仁化学

エタノール

99%

●器材

500mL
正式名称・容量・型番等

Mgイオンのキレート剤¥1,000 モノタロウ

容量

価格

DNAの析出取扱業者

マイクロピペット(容量調整可)

AccumaxPro(p.2，p.20)

0.2～10mL\8,000～

日本テクノサービス

マイクロピペット(定量タイプ)

AccumaxJr

5～200µL\1,600～

日本テクノサービス

卓上型遠心分離機

HSC-12000

1.5mL×6\23,500～ アズワン

備考
p.13参照決まった容量のみ測り取れる
速度調整可能(抽出に必要)[PCR関係]●試薬

正式名称・容量・型番等

容量

価格

取扱業者

備考

DNA合成酵素(Taqポリメラーゼ)

SapphireAmp® Fast PCR Master Mix

1mL×4本¥17,000 タカラバイオ

各種プライマー

p.14参照p.14参照\8,000～ Thermo Fisher

10クラス分DNAサイズマーカー

λ-Hind III digest

100µg¥10,500 タカラバイオ

1000ウェル分（どちらかを選択する）

pHY Marker¥14,000 タカラバイオ

200ウェル分●器材
サーマルサイクラー

正式名称・容量・型番等

20µg
規格

Qamp Mini Portable PCR Thermal Cycler

価格

1mLで１クラス分

取扱業者

8本 \200,000～ フナコシ

備考
p.６，25参照[DNA抽出関係]●試薬
電気泳動用ゲルDNA染色液正式名称・容量・型番等

容量

アガロースゲル価格
5g

SAFELOOK™プレグリーン

50µL

ViewaBlue® Stain KANTO

500mL

●器材

正式名称・容量・型番等

水平型電気泳動装置

CM-5001K(ウェル数最大17)

UVトランスイルミネーター

SRT-TUBE

規格
ゲル50×75

取扱業者¥2,000 ニッポン・ジーン

備考
0.5gずつ小分けになっている¥3,000 富士フィルム・和光純薬

蛍光染色液¥6,200 関東化学

可視光下で観察可能

価格

取扱業者

約\30,000 ケニス

備考
ゲル作製器付属¥21,000 アズワン

[実験キット]●試薬
DNA合成酵素(Taqポリメラーゼ)

正式名称・容量・型番等
MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.3

コシヒカリ鑑定団®

容量

価格

取扱業者

備考

250U

¥34,000 タカラバイオ

コメ粉から直接PCR可能
全てがキットに含まれる

24人用¥72,000 ビジョンバイオ

コメDNA抽出キット(精米20粒)

50回¥26,400 タカラバイオ

抽出のみのセット

コメ判別用PCR Kit I

100回¥57,000 タカラバイオ

KitⅡでは他品種の判別可能[自作できる実験器材関係]●人力遠心分離機
タコ糸

正式名称・容量・型番等

２本セット●簡易的な電気泳動装置

正式名称・容量・型番等
長方形

ステンレス線

太さは0.9㎜以上

目玉クリップ中(耐熱タッパーの短辺よりも短いもの)

節電タップ

発光するスイッチがついたもの●人力サーマルサイクラー

価格

取扱業者

備考

¥100 100円均一ショップ

穴あけパンチ・ポンチ
耐熱タッパー容量

太目

正式名称・容量・型番等

容量¥100 100円均一ショップ
価格

取扱業者

チューブ・チップ立てにも使用
備考

４個セット

¥100 100円均一ショップ

ゲル保管時，蓋つきが便利¥100 100円均一ショップ

アルミ線は溶解するので注意

6個セット¥100 100円均一ショップ¥100 100円均一ショップ

容量

価格

取扱業者

裏蓋がネジ止めされているもの
備考

サーモスタット(電源コード無)¥1,700 Amazon

電源コードの加工が必要

サーモスタット(電源コード有り¥2,700 Amazon

電源コード取付済み

５９

②実験材料の入手について
現在，毎年様々な水稲品種が開発され，地域を代表するブランド米として全国に流通しています。そのため，様々なブランド米を試したいという消費者のニーズに合わせ，１～３合単位の個別包装の商品が増えてきており，入手が容易になってきています【図 58】。例えば，岩手県産品種はＪＡ全農いわてが贈答品として，３合ほどのパッケージで販売しています。また，他県の米粒を使用したい時には，株式会社 PEBORA のペットボトルライスを利用すれば，他県産品種も手に入れることができます。
また今回開発した実験器具・実験器材の多くは，できるだけ手に入りやすい素材で作成できるように，100 円均
一ショップや大手の量販店で販売している商品を使用して実験器具を作成しています。

ＪＡ全農いわてが贈答用に販売している個別包装米は，量販店等で購入可能である。

株式会社 PEBORA のペットボトルライスは，インターネット等で購入可能である。

【図 58】様々なコメの品種の入手方法について

６０

困った時は？
◇実験器具の貸出しについて
岩手県立総合教育センターでは，下の表にある物品を貸出ししています【図 59】。また，随時研修として当センターで使用することができます。遺伝子実験の普及のため積極的にご活用ください。

[連絡先]
電話番号 0198-27-2742（生物直通）担

当 理科教育担当

器材名称

用途など

PCR装置(サーマルサイク

PCRに必要な温度制御を

ラー)

プログラム通りに行う装

外観

数量
２台

置で，複数のマイクロ①

チューブを同時にPCRすることができる。
電気泳動装置

液体に高電圧を流して，5台

電気泳動を行う装置，ふたが閉められていないと②

電流が流れないようになっている。
ゲル作製器

電気泳動に使用するアガ

4台

ロースゲルを作製する。
コームと呼ばれる器具を③

使って，ゲルにウェルと呼ばれる穴を作る。
卓上型遠心分離機

DNA抽出やチューブの壁

2台面にくっついた少量の液
体を下に落とす際に使用④する。
高速冷却遠心分離機

サンプルを冷却しながら１台

遠心分離することができる大型の遠心分離機で，⑤

持ち出しはできない。
チューブ攪拌機

液体を攪拌するときに使(ボルテックスミキサー)

用する。

⑥

【図 59】岩手県総合教育センターで貸出し・使用が可能な実験器材(次ページへ続く)

６１

1台

器材名称

用途など

マイクロピペット

設定した微量の液体を取(P2，P20)

れるピペットで，様々な⑨

数量各10本ずつ容量のものがある。

⑦

⑧

外観

教員用マイクロピペット

教員への貸出用に様々な(P2，P10，P20，P100，

容量のマイクロピペット

P200，P1000)がある。

UVトランスイルミネー

蛍光DNA染色液で染色さ

ター(紫外線防護マスクがれたDNAを発光させて観付属する)察できるようにする装置

各1本ずつ

1台

で，強い紫外線を照射する。
真空エバポレーター

真空状態を作り出して(真空ポンプとのセット)

DNA抽出液を乾燥させ

1台

る。

⑩

ドライヒーター

DNA抽出の際にマイクロ2台

チューブを一定の温度で加熱するために使用す⑪る。
恒温槽(ウォーターバス)

一定の温度のお湯を作6台る。人力サーマルサイク
ラーに使用する。

⑫

実験解説DVD

実験準備や操作について5枚撮影したもので，貸出し⑬

時に自由にコピーして使用してもよい。

【図 59】岩手県総合教育センターで貸出し・使用が可能な実験器材

６２◇廃棄物の処理について①試薬の廃棄方法
本書の実験方法では，廃液に有害な物質が出ないよう配慮しています。しかし一般的に，PCR 法ではフェノールやクロロホルム等の取扱い方に注意を要する物質を使用することがあります。そこで p.64 の【図 61】に
実験廃液の一般的な取扱い方法をまとめました。
また，発がん性があるとされる DNA 染色液であるエチジウムブロマイドの処分方法については，日本では特定の規則はありませんが，一般的な処分方法について【表 19】にまとめました。
【表 19】エチジウムブロマイドの処分方法について
処分方法

コスト

備考

下水への放流

処分方法

希釈

◎

∞

×

◎

環境への影響を考えると行ってはいけない

次亜塩素酸(ハイター)

脱色

△

×

業者引渡し

○

より有毒な物質になるとの報告がある

活性炭・樹脂

吸着

○

○

業者引渡し

△

処理後は不燃物として業者引渡し

おからへの吸着吸着○○

一般ゴミ(可燃)○

処理後は可燃物として廃棄できるゼロ・カラム【AXEL】

吸着

○

◎

一般ゴミ(可燃)△

処理後は可燃物として廃棄できる

EtBr Destroyer【チヨダサイエンス】 分解

◎

◎

ー

△

スプレーで吹きかけるだけで分解できる日光による分解

◎

◎

一般排水

◎

ペットボトル等に保管し日光で分解する◎非常に良い〇良い原理 操作性 処理能力

分解
△問題あり

×非常に問題あり②DNA を含む使い捨て実験器具の廃棄について
本書では扱っていませんが，大腸菌の遺伝子組換えキットなどでは，使い捨ての実験器具ごとビニール袋に入れ，【図 60】に示したようにオートクレーブで不活性化処理する必要があります。生徒には授業の中で，こうした廃棄方法が遺伝子実験を行う場合は必要であることを周知させてください。
滅菌用バッグも販売されている

袋はほとんど損傷しない

オートクレーブ

121℃・20 分で滅菌

ごみ袋やレジ袋で滅菌処理【図 60】DNA を含む使い捨て実験器具の処理方法

６３

圧力鍋

滅菌され圧縮された実験器具

●実験廃液とは？

水

原液

→
↓

実験によって発生した化学物
質を含むすべての廃液と廃液が

すすぎ水

水

→
↓

すすぎ水

↓

入っていた容器の２回のすすぎ
水のことであり，全てを廃液タンクで保管する。

↓
固形物を
含む

↓

NO

シアン

Yes

→
←

有機物
を含む

↓

溶存
を含む

↓

を含む

↓

固形物を除く

を含む

↓

以上

↓

を含む

↓

②使用済みシリカゲル，活性炭等
シアン廃液①強アルカリ性で保管(pH12.0以上)** 灯油および軽油は廃油であっても廃油ではなく自燃性廃液に区分する②酸性下では青酸ガス(有毒)が発生*** 水を５％以上含む液は「燃焼性廃液」に分類する(ｼﾞｴﾁﾙｴｰﾃﾙは特殊引火物)**** pHを5.0以上9.0未満に調整し(現像液は除く)，引火性の無い濃度に希釈する
Yes

溶存無機水銀廃液

Yes→①中性保管(pH5.0以上9.0未満に調整する)②金属水銀，有機水銀は絶対に混入させない
ヒ素廃液

Yes

→

①ヒ素を含まないアルカリ廃液を含む②アルカリ性で保管(pH9.0以上)

→
Yes

化合物

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ，ｸﾛﾛﾎﾙﾑ，四塩化炭を含む素，ﾄﾘｸﾛﾛｴﾁﾚﾝ，ﾃﾄﾗｸﾛﾛｴﾁﾚﾝ，

Yes

ｼﾞｸﾛﾛﾒﾀﾝ，ｼﾞｸﾛﾛｴﾁﾚﾝ，ﾄﾘｸﾛﾛｴﾀ→↓②直接皮膚に触れないように注意する

廃油
Yes

→
↓

→

廃油**
ｼﾘｺﾝ油，ﾛｰﾀﾘｰﾎﾟﾝﾌﾟ油，機械
油，粘性の廃油等↑※引火の危険性が高い廃液は消防法により研究室内での貯蔵が制限される

↓

有機溶剤
95％以上

ヒ素廃液に入れる

重金属廃液

Yes

Yes

ﾝ，ｼﾞｸﾛﾛﾌﾟﾛﾍﾟﾝ等

NO①フッ化水素酸などは３％以下に希釈する→→

ハロゲン含有廃液*

有機塩素

NO
フッ素廃液

Yes

NO

廃酸

固形廃棄物(有害重金属を除く)* 水溶性の場合はpH5.0以上9.0未満に調整し，引火性の無い濃度に希釈する

NO

重金属

よび病気感染の疑いの①ろ過，沈殿等にで生じた固形物やろ紙

NO

pH９

猛毒性物質，病原菌お※①と②は分別する

NO

フッ素性物質，爆発性物質，

ある廃液※ろ過，沈殿などによりNO

ヒ素

内容不明の廃棄試薬，
不要試薬，PCB，放射(廃液の種類によってタンクの材質を変更すること）

NO

無機水銀

する物質

⇔

原液とすすぎ水の全てを廃液用のタンクに保管する

液体部分 60メッシュろ過(<0.25mm)

を含む

↓

注意を要

Yes

NO

※専門業者に連絡

その他※重金属(Cr,Cd,Pb,Cu,Mn,Fe,Ni,Zn,Al等)①pH9.0未満にするため，硫酸や硝酸は危険性が無いように希釈する②過酸化水素水はチオ硫酸ナトリウム等で不活性
化する

↓

NO

自燃性廃液***
ｱｾﾄﾝ，ﾍｷｻﾝ，ﾒﾀﾉｰﾙ，酢酸ｴﾁﾙ，
ｷｼﾚﾝ，ｲｿﾌﾟﾛﾋﾟﾙｱﾙｺｰﾙ，ｱﾙｺｰﾙ，

Yesﾄﾙｴﾝ，ﾃﾄﾗﾋﾄﾞﾗﾌﾗﾝ，ｴﾀﾉｰﾙ，ﾍﾞﾝ→

種ｱﾙｺｰﾙ，有機溶媒↓

NOｾﾞﾝ，氷酢酸，灯油，軽油，各難燃性廃液****

水を含む各種ｱﾙｺｰﾙと有機溶媒，ﾎﾙﾏﾘﾝ，滅菌済み培養液，ｱﾐﾉ酸，ﾌｪﾉｰﾙ，現像液，ｺ
ﾋﾟｰ廃液，尿酸，ｼｭｳ酸等の有機酸，すすぎ
水などの有機物の水溶液↓※専門業者へ連絡：岩手県産業廃棄物処理業者名簿 http://www.pref.iwate.jp/kankyou/sanpai/009601.html※以下の①～⑦に該当する場合は「その他」区分として申請し，専門業者に回収してもらう。
①金属水銀は密閉容器に入れる。水銀温度計は破損防止措置をして袋に入れる。
②有機水銀化合物，溶存無機水銀(有機物が共存)は，有機物を含む水銀廃液として申請する。
③有機リン化合物は，有機リン化合物名を明記する。
④消防法の第３類危険物(金属ナトリウム等)は別に回収する。
⑤消防法の第４類の特殊引火物(ジエチルエーテル等)は「第４類 特殊引火物 火気厳禁 危険等級Ⅰ」と表記し，運搬時に転倒・漏洩防止対策を行う。
⑥消防法の第５類危険物(ピクリン酸等)は爆発の恐れの無い濃度まで希釈する。
⑦消防法上の危険物である有機塩素化合物(ジクロロエタン等)は「第４類 第１石油類 火気厳禁 危険等級Ⅱ」と表記する。

【図 61】実験廃液の一般的な廃棄方法の流れ

６４◇参考文献など【参考文献】

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内閣府（2017），『科学技術イノベーション総合戦略 2017』

文部科学省（2018），『高等学校学習指導要領解説理科編理数編』

文部科学省（2009），『高等学校学習指導要領解説理科編理数編』実教出版株式会社

岩手県農業研究センター（2016），「平成 28 年度岩手県農業研究センター試験研究成果書」『品種極良食味の主
食用晩生粳水稲「金色の風」』岩手県農業研究センターBull. Iwate Agric. Res. Ctr.

岩手県農業研究センター（2017），『水稲新品種「銀河のしずく」の育成』岩手県農業研究センター
Bull.IwateAgric.Res.Ctr.16

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貝沼喜兵・大藤道衛・中島春紫・斉藤淳一・飯田秀利・原田和雄・小林興（2005），「科学教育研究」『現職教員の中・高等学校生物教育に対する認識と展望－SPP 研修会参加者のアンケート調査より－』日本科学教育学会，
Vol.29，No3

笹川由紀・小野道之（2009），「科学教育研究」『高等学校におけるヒトゲノム・遺伝子解析実験に関する現状と教員意識の調査研究』日本科学教育学会，Vol.33

山内宗治（2012），「平成 24 年度研究報告」『高等学校生物における PCR 法を利用した遺伝子判定実験を取り入れた教材開発－遺伝子組換え「青いバラ」を可能にした遺伝子の起源の探求を通して－』広島県立教育センター

菅万希子・鈴木紀子・藤原靖也・吉澤剛・工藤充・加納圭（2017），「科学技術コミュニケーション」『国民参画型科学技術イノベーション政策形成に向けたセグメンテーションの開発：科学技術イノベーション政策に関する世論調査をもとに』北海道大学高等教育推進機構オープンエデュケーションセンター（科学技術コミュニケーション
教育研究部門），No22

薄井芳奈（2015），「授業実践報告 50 分授業で行う遺伝子分野の生徒実験」『人力サーマルサイクラー～PCR 法
で DNA を増やそう～』兵庫県立須磨東高等学校

大藤道衛（2016），『「教員のための遺伝子組換え実験教育研修会アドバンストコース」遺伝子リテラシー教育と
米国の教育教材』

奥村仁一（2018），「理科教育学研究」『高等学校生物における科学技術の発展を踏まえた実験の在り方についての実践的研究』日本理科教育学会，Vol.59，No1doi:10.11639/sist.17038

Bhamla et al.（2017），『Hand-powered ultralow-cost paper centrifuge』Nat.Biomed.Eng.1: 0009.doi:10.1038/

s41551-016-0009

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内閣府・科学技術政策・科学技術イノベーション総合戦略 2017

http://www8.cao.go.jp/cstp/sogosenryaku/2017.html（平成 30 年６月８日閲覧）

文部科学省・新しい時代における教養教育の在り方について（答申）

http://www.mext.go.jp/b_menu/shingi/chukyo/chukyo0/toushin/020203.htm（平成 31 年１月 15 日閲覧）

文部科学省 科学技術基本計画・第 4 期科学技術基本計画

http://www.mext.go.jp/a_menu/kagaku/kihon/main5_a4.htm（平成 30 年６月８日閲覧）

PAPERFUGE -INDEX: Design to Improve Life®

https://designtoimprovelife.dk/paperfuge/（平成 30 年 11 月 21 日閲覧）

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