● TSKgel FcR − IIIA − NPR を用いた血中 IgG 分離
パターン測定による疾患検査法の開発
研究企画部 オープンイノベーション推進グループ
バイオサイエンス事業部 第一開発部 技術グループ

秋山森本泰之篤史

本手法により、血中抗体の糖鎖構造に基づく ADCC

1．はじめに活性の違いを迅速、簡便に明らかにすることが可能と液性免疫の重要な要素の一つである抗体（図１）は、なる。本稿では、本カラムを用いた血中抗体測定にお中和活性、補体依存性細胞傷害活性（CDC 活性）、抗ける基本的性能と、臨床検体を用いた応用例について体依存性細胞傷害活性（ADCC 活性）などの免疫活性述べる。

1）に深く関与している 。特に、抗体の Fc 領域に付与

なお、本技術はヒト体内で産生される抗体活性の臨する糖鎖構造によって、抗体の活性が大きく影響を受床的有用性およびメカニズム解明に資するものであけることがわかっており 2）、広く利用されている抗体り、SDGs が定める国際目標の内、「すべての人に健医薬品の薬効にも影響を与えることから、品質管理に康と福祉を」への貢献が期待できる。

おけるリスク因子として注目されている。ヒト体内で産生される抗体に結合している糖鎖構造においても、
性別 3）、年齢 3，4）、妊娠 5）、自己免疫疾患 6）、癌 6） な

2．基本原理ど疾患を含めた身体的変化との関連性が報告されてい抗体による免疫活性の一つである ADCC 活性は、る。これまでの報告では、主に抗体に結合した糖鎖構抗体分子がターゲット細胞上の抗原に結合するだけで造を質量分析計により測定しており、測定に係る作業なく、細胞傷害活性を有するエフェクター細胞との結の煩雑さ、前処理から解析結果を得るまでの時間の長合に依存して、活性が変わると考えられている。そのさから、糖鎖構造に着目した臨床研究は多くなく、ま結合は、エフェクター細胞上の FcR と抗体の Fc 領域

た体内における糖鎖構造変化のメカニズムは未だ明らとの結合であり、特にナチュラルキラー細胞（NK 細胞）かにされていない。

上の FcγRIIIa との結合が重要とされている 7）。Fcγ

そこで当社では、抗体の活性に関わる Fc レセプター

RIIIa と抗体の Fc 領域との結合が強いほど、ADCC 活（FcR）の中でも、ADCC 活性に深く関与している Fc性が強くなることが知られており、その結合能に Fc

γRIIIa を担体表面に固定化した、アフィニティ分析領域に結合した糖鎖構造が影響を与えていることが報

カラム TSKgel FcR − IIIA − NPR を用いたヒト血中抗体

告されている 8，9）。例えば、糖鎖構造としてフコースの測定法を構築した。本カラムは抗体医薬品の品質管が結合していると ADCC 活性が低下し、ガラクトー理や品質向上に向けて商品化した製品であるが、ヒトスが結合すると ADCC 活性が向上することが明らか

血中抗体においても適用可能であることを実証した。となっている 2）。
本稿で用いている TSKgel FcR − IIIA − NPR は、Fcγ
RIIIa との親和性の違いに基づいて抗体を分離するこFab領域とができるカラムであり、抗体の ADCC 活性に基づいた分析を可能とする 10）。本カラムは、非多孔質性の親水性ポリマー基材に、遺伝子組換えヒト FcγRIIIaの細胞外領域をリガンドとして導入した担体を充填し糖鎖

糖鎖
Fc領域

：N－アセチルグルコサミン：フコース：マンノース：ガラクトース：シアル酸

図１

た HPLC 用カラムである。中性条件で多くの抗体がFcγRIIIa リガンドに吸着し、酸性条件にすることで溶出するため、2 液グラジェントが可能な HPLC システ
ムを用いることで、迅速、簡便に測定することが可能である 11）。

抗体の構造75

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）［2］溶出時間の補正と測定再現性

3．基本的性能

HPLC における測定値は、溶離液組成の変動、カラムのロット、カラムへの夾雑物の付着等、様々な要因［1］標準的分離条件
本 稿 で 用 い た カ ラ ム は、4.6mmI.D. × 7.5cm ので変動する可能性がある。日内差、日間差を抑えるた

PEEK 製カラムである TSKgel FcR − IIIA − NPR に充填

め、補正のための標品を血液サンプル測定毎に測定すした担体を、4.6mmI.D. × 5cm のステンレス製カラムることで、血中抗体の分離パターンを補正した。に再充填することで得たカラムを用いている。分離能補正で用いる標品としては、市販の抗体医薬品 X をは低下するものの、分析時間を従来の 3 分の 2 である用い、標品測定で得られる 3 つのピーク時間と基準と約 20 分で測定が可能である迅速性を優先して、本カなる各ピーク時間との差異（図４）から得られる単回ラムを用いた。

帰式を基に、標品測定直後に測定した血液サンプル溶離液は、サンプル導入時の吸着用溶離液（溶離液の溶出時間を補正することで、測定間差を補正したA）として 100mM NaCl を含む 10mM クエン酸緩衝液（図５）。基準となる各ピーク時間は、特定時点の標品（pH6.5）、溶出用溶離液（溶離液 B）として 500mMの測定結果の値を用いればよく、本評価では、カラムNaCl を含む 10mM クエン酸緩衝液（pH4.5）を用いた。

使用開始日に測定した標品の結果を基に求めた。クオ測定に用いた血液サンプルは、血液を遠心することリティーコントロールとして、同一検体の血液サンプで得た血清を溶離液 A で 20 倍に希釈した後、0.45μm

ルを各測定日の開始直後、終了直前、中間時点の 3 点のフィルターで処理したサンプルを用いている。血液サンプルの導入量は 10μl としている。

30

血液サンプル導入後、不純物が素通りするまで溶25UV 280 nm

離液 A で平衡化し、その後溶離液 B をグラジェントで流すことによって血中抗体の分離パターンを得た（図２）。溶離液 B でのグラジェントを開始してから得られるピークを溶出時間の早い順に第 1、第 2、第第 3 ピーク領域

20

第 2 ピーク領域

15

第 1 ピーク領域

10503 ピークと定義し、全ピーク面積で各ピーク面積の値－50を割った値をピーク面積％とした。また異なる検体の果から、ヒト血中抗体の分離パターンを取得することが可能であり、さらに血中抗体の本カラムとの結合能

図２の個人差を評価可能であることが確認できた。

UV 280 nm（a.u.）15

グラジエント：B0％（0－7 min）
，B0→100％（7－18 min）
流速：1.2 mL ／ min
検出：UV 280 nm
温度：25℃
試料：血液サンプルンの形状が異なることが確認された（図３）。この結検体 A

110Retention time［min］

血液サンプルを測定すると、検体毎に抗体分離パター

1.25

血中抗体分離パターン

検体 B

検体 C

0.80.60.40.20－0.2
71217Retention time［min］

71217Retention time［min］

71217Retention time［min］

グラジエント：B0％（0－7 min）
，B0→100％（7－18 min）
流速：1.2 mL ／ min
検出：UV 280 nm
温度：25℃
試料：血液サンプル
分離パターン処理：グラジエント開始時間（7 min）、終了時間（18 min）に対してベースラインを取り、その間の最大ピーク値を 1 として正規化

図３76

各検体における血中抗体分離パターン

東ソー研究・技術報告［3］血中抗体の安定性基準となる分離パターン補正のための分離パターン

1.2

血中抗体の保存における分離パターン変化を評価した。採血から血清に分離するまでの時間、および血清

第 2 ピーク

1

分離後の保存期間においても変動は見られないことか

第 1 ピーク

0.80.6ら、血中抗体の安定性の高さを確認した（図７）。

第 3 ピーク

0.4［4］抗体糖鎖構造と抗体分離パターンとの相関

0.20

血中抗体分離パターンから得られるピーク面積％

Retention timeと、抗体結合糖鎖比率との相関を評価した（図８）。

グラジエント：B0％（0－7 min）
，B0→100％（7－18 min）
流速：1.2 mL ／ min
検出：UV 280 nm
温度：25℃
試料：抗体医薬品 X
分離パターン処理：グラジエント開始時間（7 min）、終了時間（18 min）に対してベースラインを取り、その間の最大ピーク値を 1 として正規化

図４

抗体結合糖鎖は質量分析計を用いて抗体から切り出した糖鎖を測定した。その結果、ガラクトースが結合した糖鎖の割合と、第 3 ピーク面積％とが有意に正の相関を示すことがわかり、糖鎖の違いを抗体分離パター

標品による分離パターンの変動評価ンが反映していることを確認した。

で測定することで、血中抗体分離パターンの各ピーク4．応用例

面積％の変動度を評価した（図６）。各ピーク面積％の平均値± 10％以内にどの測定値も収まっており、［1］肺がん患者の血中抗体評価

日間変動度も CV 値 10％以下であることから、安定し和歌山県立医科大学で収集した非小細胞肺がん患者た測定が可能であることが確認できた。

（NSCLC）の血清 96 例、慢性閉塞性肺疾患（COPD）の血清 42 例、東北メディカル・メガバンク機構より測定時点 AUV 280 nm（a.u.）

1.2

測定時点 B

補正処理前

1

補正処理後

0.8
0.6
0.4
0.2
0－0.2

71217

71217

Retention time［min］

Retention time［min］

グラジエント：B0％（0－7 min）
，B0→100％（7－18 min）
流速：1.2 mL ／ min
検出：UV 280 nm
温度：25℃
試料：血液サンプル
分離パターン処理：グラジエント開始時間（7 min）、終了時間（18 min）に対してベースラインを取り、その間の最大ピーク値を 1 として正規化

29

日間 CV 値：2.6％ 平均値 ×110％

24平均値 ×90％

19カラム A
14246カラム B カラム C
8 10 12 14 16
測定日

図６

血中抗体分離パターンへの溶出時間補正

第 2 ピーク面積％

第 1 ピーク面積％

図５40

日間 CV 値：1.2％

3530252468 10 12 14 16測定日

第 3 ピーク面積％

UV 280 nm（a.u.）

第 66 巻（2022）

51

日間 CV 値：1.0％

4641362468 10 12 14 16
測定日

クオリティーコントロールによる各ピーク面積％の変動評価

77

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

血液での保存期間（4℃）

1.2
10.8
0.6
0.4
0.2
0－0.2

血清での保存期間（4℃）

UV 280 nm（a.u.）

0h24h515525

血清での保存期間（－20℃）
0d7d150d7d25

5Retention time［min］

Retention time［min］

1525

Retention time［min］

グラジエント：B0％（0－5 min）
，B0→100％（5－30 min）
流速：1.0 mL ／ min
検出：UV 280 nm
温度：25℃
試料：血液サンプル
分離パターン処理：グラジエント開始時間（5 min）、終了時間（30 min）に対してベースラインを取り、その間の最大ピーク値を 1 として正規化

図７

各保存条件における血中抗体分離パターンの変動評価

糖鎖構造略号

糖鎖構造略号

G0G2F：N－アセチルグルコサミン

G0F：マンノース
100
第 3 ピーク面積％

第 3 ピーク面積％

100806040200：フコース：ガラクトース

相関係数＝0.983
P＜0.0001
0.1

110806040200

相関係数＝－0.461
P＝0.2443
1G2F 比率／ G0F 比率

図８101001000

G0F 比率／ G0 比率

血中抗体分離パターンと抗体結合糖鎖との相関評価

分譲を受けた健常者の血清 50 例について（表１）、血第 3 ピーク面積％

中抗体分離パターンを測定した。
その結果、健常者検体および COPD 検体では、第3 ピーク面積％（ADCC 活性の高い IgG の割合）に違いは見られなかったが、NSCLC 患者では第 3 ピーク面積％が有意に低下した（図９）。喫煙歴等の臨床背景の似ている COPD、NSCLC 患者間においても有意

図９

P＝0.0004

806040200

差があることから、肺疾患の中でもがん疾患特異的に値が変動したと考えられる。

P＝0.0002

100

健常者

COPD

NSCLC

各検体における血中抗体分離パターンの測定値［2］肺がん患者の生存予後予測評価
免 疫 チ ェ ッ ク ポ イ ン ト 阻 害 剤（ICI） 投 与 後 のその結果、無増悪生存期間に有意差は見られなかっ

NSCLC 患者の無増悪生存期間および全生存期間を、たが、全生存期間において投与前の第 3 ピーク面積％

全患者の ICI 投与前の血中抗体分離パターンの第 3の値が低い群で有意に生存予後が悪いことが明らかとピーク面積％の中央値を閾値として高値、低値の 2 群なった（図 10 A，C）。ICI 投与前に化学療法を受けてに分けた患者集団で評価した（図 10）。

いた検体のみで評価した結果、全生存期間の P 値はよ78

東ソー研究・技術報告

評価に用いた各検体情報

表１（B）

80
60
40HighLow

2010（20.0）

37（88.1）

75（78.1）

0（0）
0（0）

42（100）55.75（14.5－132）

76（79.2）
40.7（0－147）

化学療法治療歴集団

100

HR, 0.848
95％ Cl, 0.547 －1.32
Log－rank P＝0.4571

HR, 0.955
95％ Cl, 0.587 －1.55
Log－rank P＝0.1510

806040High
Low

20（C）

0180 360 540 720 900 1080 1260 1440

No. at risk
Low 48 14 8High 48 17 10

期間［days］
56252322

11

No. at risk
Low 37 9High 38 13

図 10806040High
Low

20180 360 540 720 900 1080 1260 1440

期間［days］

5725242322

1
1（D）

HR, 0.511
95％ Cl, 0.277 －0.918
Log－rank P＝0.0236

00

全集団

100

00NSCLC（N＝96）
70（49－91）

0HR, 0.392
95％ Cl, 0.203 －0.734
Log－rank P＝0.0010

806040HighLow

200180 360 540 720 900 1080 1260 1440

期間［days］

No. at risk
Low 48 30 17 10 5High 48 34 29 20 15

化学療法治療歴集団

100

全生存率［％］

全集団

100

無増悪生存率［％］無増悪生存率［％］（A）（N＝42）
健常者（N＝50） COPD
75（53－90）
69.5（60－74）

全生存率［％］

検体数
年齢［中央値（幅）］性別［n（％）］
男性
喫煙歴［n（％）］
現在もしくは元喫煙者
Pack year［中央値（幅）］第 66 巻（2022）

3724230180 360 540 720 900 1080 1260 1440

期間［days］

No. at risk
Low 37 22 11 6 5High 38 28 24 18 13372423

ICI 投与後の無増悪生存期間（A，B）、全生存期間（C，D）

り低い値となった（図 10 B，D）
。この結果は、血中ます。また、本臨床評価で用いた健常者検体の分譲を抗体分離パターンががん患者の予後バイオマーカーと行って頂きました東北大学 東北メディカル・メガバしての可能性を秘めていることを示している。

ンク機構および岩手医科大学 いわて東北メディカル・メガバンク機構に厚く御礼申し上げます。

5．おわりに
本稿では、アフィニティ分析カラム TSKgel FcR −7．引用文献IIIA − NPR を用いたヒト血中抗体測定における基本的

１）C. Peters., et al., Biosci. Rep ., 35, e00225（2015）

性能と、臨床検体を用いた応用例について報告した。

２）A. C. Chan, et al., Nat. Rev. Immunol ., 10（5）, 301 −

従来、抗体の糖鎖構造解析や活性解析には煩雑な作業

316（2010）

や、解析結果を得るまでの長い時間が必要であったが、３）X. Yu, et al., Medicine , 95（28）,e4112（2016）

本カラムを用いた新規分析法では簡易な前処理を行っ

４）M. Pucic' , et al., Mol. Cell. Proteomics , 10（ 10）,た後、HPLC で測定するのみであることから、簡便、迅速に安定した結果を得ることができる。また血中抗体分離パターンの相違や変動を基に、疾患の発生、進M111.010090（2011）５）F. E. van de Geijn, et al., Arthritis Res. Ther ., 11,R193（2009）

行評価にも応用できる可能性があることから、今後ヒ６）I. Gudelj, et al., Cell. Immunol ., 333, 65 − 79（2018）

ト体内で産生された抗体活性を測定することの臨床有７）R. A. Clynes, et al., Nat. Med ., 6, 443 − 446（2000）

用性および抗体糖鎖構造の変動メカニズム解明の一助

８）G. Cartron, et al., Blood , 99（3）,754 − 758（2002）になることを期待したい。

９）R. Gennari, et al., Clin. Can. Res ., 10, 5650 − 5655
（2004）

6．謝辞
本臨床評価における多大なるご協力、ならびに多く

10）M. Kiyoshi., et al., Sci. Rep ., 8:3955（2018）11）田中亨ら、東ソー研究・技術報告、63、77 − 82（2019）のご助言を頂きました和歌山県立医科大学内科学第三講座・洪 泰浩病院教授、同大学バイオメディカルサ
イエンスセンター・小柳 潤助教に厚く御礼申し上げ
79