上原記念生命科学財団研究報告集, 34 (2020)

上原記念生命科学財団研究報告集, 34（2020）

28. CFTR modulator の薬効増強薬標的分子の同定
沖米田 司
関西学院大学 理工学部 生命医化学科
Key words：CFTR，嚢胞性線維症，CFTR modulator，ゲノムワイドスクリーニング

緒 言
嚢胞性線維症（Cystic Fibrosis：CF、平均寿命 40 歳）は日本での患者数 50 人未満の希少疾患（指定難病）で、全世界に約 8.5 万人の患者（米国に約 3 万人、欧州に約 4 万人）が存在する致死性の劣性遺伝病である。CF は塩素イオンチャネル CFTR 遺伝子変異により発症する単一遺伝病で、半数以上は CFTR ΔF508 ホモ変異を有する。現在、抗生物質や抗炎症薬による CF 対症療法が行われているが、患者の寿命中央値は約 40 歳で、未だ根本治療法は確立されていない。近年ΔF508 変異の CF 治療剤（CFTR modulator）が上市されたが、ΔF508-CFTR の形質膜発現量を十分に改善できず［1］、臨床での有効性は疑問視されている［2］。従って、CF 病態を著しく改善治療法を確立する
ためには、現在臨床で使用されている CF 治療剤の薬効を増強し、ΔF508-CFTR の形質膜発現量を十分に改善する必要がある。
これまでに我々は、ΔF508 変異が CFTR NBD1（ATP 結合ドメイン）不安定化とドメイン間相互作用阻害を誘導し、CFTR フォールディング異常を引き起こすことを証明した［3，4］。また、CF 治療剤は CFTR ドメイン間相互作用を改善するが、NBD1 不安定性を改善できないことを明らかにした［5］。CF 治療剤はΔF508-CFTR の形質膜移行を促進し、そのイオンチャネル活性を亢進するが、形質膜からのΔF508-CFTR 分解を促進する［6］。従って、CF 治療剤の薬効を増強するためには、① ΔF508-NBD1 不安定性と② ΔF508-CFTR 形質膜不安定性を改善する必要がある（図 1）。我々はこれまでに、形質膜 CFTR 簡便標識法を確立し［7］、ΔF508-CFTR 形質膜発現増加を指標とした siRNA 表現型スクリーニング（約 600 遺伝子）により、ΔF508-CFTR 形質膜不安定性に関わるユビキチン化酵素を同定してきた［8，9］。本研究では、我々が独自に開発した形質膜 CFTR 簡便標識法と、近年、比較的安価に入手可能となったプール型ゲノムワイド sgRNA ライブラリー（約 19,000 遺伝子）を利用することで、CF 治療剤の薬効抑制に関わる分子の全貌解明を行った（図 1）。

図 1．本研究の目的
CF 治療剤の有効性を増強するためには、NBD1 不安定化と形質膜での CFTR 不安定化を改善する必要がある。本研究では、ゲノムワイド sgRNA スクリーニングにより、CF 治療剤の有効性を増強するアドオン薬の標的分子を同定する。

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方法および結果
1． F508-CFTR-3HA/Cas9 安定発現細胞株の樹立
sgRNA 表現型スクリーニングを行うために、ΔF508-CFTR-3HA 及び Cas9 安定発現気道上皮細胞（CFBE）の樹立を行った。Doxycyline 誘導性 ΔF508-CFTR-3HA 安定発現 CFBE 細胞［8］に Cas9 発現レンチウイルスを感染（MOI 7.5）させ、10 日間の薬剤選抜（Blastcidin 10μg/ml）後、細胞のクローニングを行い、ΔF508-CFTR3HA/Cas9 安定共発現 CFBE 細胞を樹立した。ウエスタンブロットを行った結果、ΔF508-CFTR-3HA の発現と共に Cas9 タンパク質の発現を確認した（図 2A）。免疫蛍光染色法の結果、ΔF508-CFTR-3HA と Cas9 タンパク質の共発現を確認した（図 2B）。さらに、ΔF508-CFTR の表現型が保存されているか確認するために、ΔF508-CFTRの成熟型および形質膜発現を誘導する低温培養（Rescue 処理、26℃）を 2 日間行った。その結果、Rescue 処理により、本細胞においてもΔF508-CFTR の成熟化（図 2A）と形質膜発現が促進された（図 2B）。

図 2．ΔF508-CFTR および Cas9 安定発現ヒト気道上皮細胞株（CFBE-tet iΔF508-CFTR-3HA/Cas9）の樹立
a) Cas9 およびΔF508-CFTR 安定発現をウエスタンブロットで確認した。
b) 免疫蛍光染色による共発現細胞の確認．ΔF508 -CFTR 発現は Doxycycline（1μg/ml）4 日間処理により誘導した。
また、ΔF508-CFTR 形質膜発現を低温培養（Rescue：26℃、2 日間）により誘導した。細胞固定後、膜透過（P）または膜非透過（NP）条件で細胞内または細胞表面のΔF508-CFTR を染色した（スケールバー：100μm）。

2． ΔF508-CFTR-3HA/Cas9 安定発現細胞株における CF 治療剤の効果樹立した CFBE-tetiΔF508-CFTR-3HA/Cas9 において、現在、臨床で使用されている CF 治療剤が有効であるか
ΔF508CFTR 成熟化および形質膜発現を指標に評価した。CF 治療剤として、VX-809（lumacaftor）、VX-661（tezacaftor）、VX-445（elexacaftor）、VX-770（ivacaftor）を使用した。VX-809 と VX-770 の配合薬は Orkambi（2015 年 FDA 認可）として、VX-661、VX-445、VX-770 の配合薬は Tricafta（2019 年 FDA 認可）として臨床応用されている。樹立した細胞にこれらの CF 治療剤を 2 日間処理し、ΔF508CFTR 成熟化をウエスタンブロット法で解析した結果、ΔF508CFTR の成熟化が確認された（図 3）。また、CF 治療剤を処理後、細胞表面に出現した
ΔF508-CFTR-3HA を HA 抗体および AlexaFluorPlus488 抗体で蛍光標識し、フローサイトメトリー解析を行った。
その結果、VX-661、VX-445、VX-770 処理でΔF508-CFTR の形質膜発現が増加し、約 11％の細胞で劇的な増加が観察された（図 4）。ΔF508-CFTR 形質膜発現を強制的に促進する低温培養（Rescue 処理、26℃、2 日間）も同様の効果が見られ、また、ΔF508-CFTR 形質膜発現を野生型レベル近くまで回復する低温培養と VX-809 併用処理では、約 50％の細胞で劇的な形質膜ΔF508-CFTR 発現増加が観察された（図 4）。以上の結果より、CFBE-tetiΔF508CFTR-3HA/Cas9 において、部分的な CF 治療剤（Tricafta）の薬効を定量する評価系の確立に成功した。

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図 3．CFBE-tetiΔF508-CFTR-3HA/Cas9 細胞における CF 治療剤の効果
CF 治療剤（VX-809、VX-661、VX-445、VX-770）を 37℃で 2 日間処理後、ΔF508-CFTR 発現量をウエスタンブロット法で解析した。ΔF508-CFTR 発現は Doxycycline（1μg/ml）4 日間処理により誘導した。また、ΔF508-CFTR 形質膜発現を低温培養（Rescue:26℃、2 日間）により強制的に促進した。

図 4．フローサイトメトリー解析による CF 治療剤効果の評価
CFBE-tetiΔF508-CFTR-3HA/Cas9 細胞に CF 治療剤（VX-661、VX-445、VX-770）を 37℃で 2 日間処理後、HA 抗体および AlexaFluorPlus488 抗体で細胞表面のΔF508-CFTR を蛍光標識後、フローサイトメトリーにより解析した。ΔF508-CFTR 発現は Doxycycline（1μg/ml）4 日間処理により誘導した。また、
ΔF508-CFTR 形質膜発現を低温培養（Rescue：26℃、2 日間）と CF 治療剤 VX809 併用処理により強制的に誘導した。図中の数字は、形質膜ΔF508-CFTR 陽性細胞の割合を示す。

3． ΔF508-CFTR 膜発現増加を指標としたゲノムワイド sgRNA 表現型スクリーニング
CF 治療剤（Tricafta）の有効性を増強する治療標的分子を同定するために、sgRNA 表現型スクリーニングを行った。
まず、樹立した CFBE-tetiΔF508-CFTR-3HA/Cas9 細胞（1×10 ８個）にゲノムワイド sgRNA ライブラリー（19,114 遺伝子、76,612 種 sgRNA-mCherry、Guide-itCRISPRGenome-WidesgRNALibrarySystem、Takara）発現レンチウイルスを感染させた。多重感染を防ぐために、レンチウイルス感染は MOI 0.4 で行った。感染後、薬剤選抜（200μg/ml HygromycinB）を 10 日間行い、sgRNA-mCherry 安定発現細胞を樹立した。樹立した細胞を免疫蛍光染色法で確認した結果、ΔF508-CFTR-3HA と sgRNA-mCherry の共発現が確認できた（図 5）。

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図 5．sgRNA-mCherry-hyg 安定発現 CFBE 細胞の樹立
CFBE-tet iΔF508-CFTR-3HA/Cas9 細胞に sgRNA-mCherry 発現レンチウイルスを感染し、ハイグロマイシン選抜後、安定発現細胞を樹立した。ΔF508CFTR 発現を Doxycycline（1μg/ml）4 日間処理により誘導後、細胞を固定し、HA 抗体および AlexaFlur488 抗体でΔF508-CFTR を蛍光標識した。ΔF508-CFTR と sgRNA-mCherry 共発現を共焦点レーザー顕微鏡により解析した。#1、#2 は 2 つの視野を示す（スケールバー：100μm）。

4． CF 治療剤の薬効を増強する sgRNA の同定
上記で樹立した CFBE-tet iΔF508-CFTR-3HA/Cas9/sgRNA-mCherry 細胞に CF 治療剤（VX-661、VX-445、VX-770）
を 37℃で 2 日間処理後、HA 抗体および AlexaFluorPlus488 抗体で細胞表面のΔF508CFTR を蛍光標識し、フローサイトメトリーにより解析した。パイロットテストとして、全ゲノムの 10％をカバーする sgRNA ライブラリーを用いた。その結果、CF 治療剤処理でΔF508-CFTR の形質膜発現が増加し、約 6％の細胞で劇的な増加が観察された（図 4）。しかしながら、sgRNA 発現細胞において、CF 治療剤の有効性は低下し、今回テストした遺伝子集団においては、CF 治療剤の有効性を増強するものは得ることができなかった（図 6）。

図 6．CF 治療剤効果に影響する遺伝子の sgRNA スクリーニング
CFBE-tetiΔF508-CFTR-3HA/Cas9/sgRNA-mCherry 細胞に CF 治療剤（VX-661、VX-445、VX7-70）を 37℃で 2 日間処理後、HA 抗体および AlexaFluorPlus488 抗体で細胞表面のΔF508-CFTR を蛍光標
識後、フローサイトメトリーにより解析した。パイロットテストとして、本サンプルでは全ゲノムの10％をカバーする sgRNA ライブラリーを用いた。図中の数字は、形質膜ΔF508-CFTR 陽性細胞の割合を示す。

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考 察
本研究により、嚢胞性線維症の原因タンパク質ΔF508-CFTRの形質膜発現を指標としたゲノムワイドsgRNA表現型スクリーニングを実施可能な細胞モデルの確立に成功した。本評価系は、CF治療剤の有効性を増強するアドオン薬の治療標的分子の探索だけではなく、あまり解析が進んでいない形質膜タンパク質品質管理機構の解明にも大きく貢献すると考えられる。本研究では、時間的制限のため、全ゲノムの10％遺伝子のみをパイロット試験として実施し、残念ながらCF治療剤アドオン薬の標的分子を同定することはできなかった。今後、全ゲノムをカバーするsgRNAスクリーニングを実施することで、CF治療剤アドオン薬の有望な治療標的分子を同定したい。

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