KEKサマーチャレンジ2017実習テキストからオリジナル箇所のみ抽出・改変

分光学の基本とUVスペクトル
参考図書

光とは？・・・電磁波
電磁場の伝播形態
電場成分𝐸と磁場成分𝐵からなる
zλ：波長yc

P𝐸x𝐵
x軸上の任意の点Pにおいて𝐸と𝐵は直交している（𝐸から𝐵へ右ねじを回したとき，ねじの進む向きに電磁波は進行する）

電磁波の種類
vibration

electronic
10-8

γ線

10-6
可赤外線

光(IR)

X線 紫外線 視(UV)

10-4

リモコンrotation
10-2

NMR
100102 λ (m)

マイクロ波

ラジオ波

電子レンジ

ラジオ・テレビの電波

紫藍青緑黄橙赤 ：狭義の光原子や分子のエネルギーは不連続（離散化：とびとびの値をとる）
エネルギー!
hc
= ΔE2
λ2
hc
= ΔE1
λ1

E2（第二励起状態）

ΔE2=E2− E0

E1（第一励起状態）

ΔE1=E1− E0
E0（基底状態）(h：Planck定数，c：光速）

基底状態にある原子（分子）は，準位間のエネルギーにちょうど等しいエネルギーの電磁波を吸収して，励起状態に遷移する（上図の場合，波長がλ1，λ2の電磁波を吸収する）

紫外線（UV）の波長は，電子のエネルギーと同程度電子状態の遷移⇔UVの吸収
化学結合（共有結合）の原因：電子対の形成
電子軌道の重なり
原子Aー原子B
σ結合：結合軸と電子軌道が平行

B

A

単結合に存在π結合：結合軸と電子軌道が垂直二重結合の2本目の結合
三重結合の2本目と3本目の結合

A B

この他に，非結合性の電子対（lone pair）がある→ n軌道という生体分子のUVスペクトルタンパク質
芳香族アミノ酸の側鎖・・・280 nm付近のUVを吸収する
H 2N

CH COOHCH2

H 2N

CH COOHCH2

H 2N

CH COOHCH2HNOH

トリプトファン

フェニルアラニン

チロシン

ペプチド結合・・・220 nm付近のUVを吸収する（弱い）核酸（DNA，RNA）
塩基・・・260 nm付近のUVを吸収する
正確には，260 nm付近を極大として，その近傍の波長の光も吸収するため，280 nm付近のUVも吸収される

吸光度（Absorbance）とは？・・・光吸収の程度を表す量

Io
入射光

I
試料

光路長

透過光

I0
吸光度= log10I
280 nmにおける吸光度を，A280またはOD280と書く（他の波長でも同様）

問題① ある波長の光を試料にあてたところ，90%が吸収された。
このときの吸光度はいくらか。
② 同様に，入射光の99%が吸収されたときの吸光度はいくらか。
吸光度の値が大きくなると，精度が悪くなるランベルト・ベールの法則・・・吸光度測定の基本式
ランベルト（Lambert）の法則とベール（Beer）の法則からなる

I0= ε cl
吸光度= log10Il：光路長（cm），c：試料のモル濃度（mol/L）
ε：モル吸光係数（物質固有の定数）使い方
吸光度は，光路長と試料濃度に比例する（εは比例定数）
光路長（セルで決まる）が一定の場合，吸光度は試料濃度に比例
試料溶液を入れる容器をセル（cuvette）というUV測定の場合は，石英製のセルが用いられる

発色団のモル吸光係数（280 nm）
トリプトファン(Trp)
H 2N

CH COOH
CH2チロシン(Tyr)
H 2N

CH COOH
CH2フェニルアラニン(Phe)
H 2N

CH COOHCH2HNOHε = 5550

ε = 1340

わずか

他に，ジスルフィド結合1本あたり200
問題
あるタンパク質は分子量が1万で，分子中にTrp2個，Tyr5個，ジスルフィド結合を1本含む。このタンパク質1mg/mLの吸光度はいくらか。
タンパク質の単位濃度あたりの吸光度は，アミノ酸配列から概算できる（ただし，溶媒効果の影響を無視した場合）

プログラミング言語Rubyで作成したWebアプリケーション

https://www.ls.toyaku.ac.jp/~bioinfo/cgi-bin/amino_acid_seq_analysis.cgi

紫外吸収法を用いたタンパク質濃度の測定

問題1
あるタンパク質溶液を10倍に希釈して吸光度を測定したところ，0.72であった。このタンパク質1mg/mLあたりの吸光度が1.80のとき，原液のタンパク質濃度はいくらか。

問題2
高濃度タンパク質溶液を，吸光度1以下で測定するには，どのようにしたらよいか。

CDスペクトルとタンパク質の二次構造

再び光について電場成分のみ考える（磁場成分でも同様）
電場ベクトルの振動する面を偏光面という進行方向から見ると自然光では直線偏光

あらゆる角度の偏光面をもつ

直線偏光・・・電場ベクトルの向きが一定で大きさが変化
円偏光 ・・・電場ベクトルの大きさが一定で向きが変化

右円偏光・・・進行方向から見て電場ベクトルの先端が右回り
左円偏光・・・進行方向から見て電場ベクトルの先端が左回り
円偏光はらせんを描く
EL ER

ELERELERELER

直線偏光は，右円偏光ERと左円偏光ELの重ね合わせとみなせる

円偏光と光学活性掌性（キラリティー）のある分子は，電子軌道も掌性がある

BEEAADCDB
C

掌性（キラリティー）のある物質は，右円偏光に対する吸光係数εRと左円偏光に対する吸光係数εLが異なる←軌道の空間配置により電子状態の遷移の様相が異なるため
εL−εRを円偏光二色性（CD）と呼び，光学活性の程度を表す

CDと楕円偏光
αCDが観測されると，直線偏光が楕円偏光になる

ELER

右円偏光の振幅ERと左円偏光の振幅ELが異なるため，合成ベクトルは楕円軌道内で振動する
楕円の長軸は，元の直線偏光の偏光面から角度αだけ回転する→旋光性

楕円の形状は，短軸と長軸の比（の逆正接）で表される

ER − ELtan θ =ER + ELθ を楕円率というCDを楕円率で表す
ランベルト・ベールの法則より，

I01IRlog10=−ln = ε R cl
IR2.303 I 0（ILについても同様）

すなわち

I R = I 0 exp(−2.303ε R cl)（ILについても同様）

強度I は振幅Eの2乗に比例するのですなわちE − ELtan θ = R=
ER + ELIR − IL
IR + ILIR − ILexp(−2.303ε R cl / 2) − exp(−2.303ε L cl / 2)
θ = arctan= arctanexp(−2.303ε R cl / 2) + exp(−2.303ε L cl / 2)
IR + IL=!"

2.303(ε L − ε R )cl4

∵ exp 𝑥 ≃1 + 𝑥, arctan 𝑥 ≃ 𝑥

CDをモル楕円率で表す
θ!

2.303
(ε L − ε R )cl4

θ!

2.303 × 180(ε L − ε R )cl4π

θ の単位はラジアンθ の単位は度（deg）

c (mol/L) = c’ (mol/dL)，l (cm) = l’ (dm)とすると，c = 10 c’，l = 10l’θ100θ
[θ ] = =をモル楕円率というc'l 'cl100θ 100 × 2.303 × 180∴ [θ ] ==(ε L − ε R ) = 3298(ε L − ε R )cl
4π

モル楕円率（単位はdeg・cm2/dmol）は， 𝜀/ − 𝜀0 に比例する

吸光度の差とCDとの関係
左円偏光の吸光度を𝐴/ ，右円偏光の吸光度を𝐴0 とすると，ランベルト・ベールの法則：𝐴/ = 𝜀/ 𝑐𝑙 および 𝐴0 = 𝜀0 𝑐𝑙 より，∆𝐴 = 𝐴/ − 𝐴0 = 𝜀/ − 𝜀0 𝑐𝑙
また，θ の単位が度（deg）のとき，2.303×180𝜃≃𝜀/ − 𝜀0 𝑐𝑙 = 32.98∆𝐴
4𝜋
したがって，・吸光度の差∆𝐴 および楕円率𝜃 ：試料濃度𝑐や光路長𝑙に依存する・ Δ𝜀 = 𝜀/ − 𝜀0 およびモル楕円率[𝜃] ：𝑐や𝑙に依存しない→通常は，∆𝐴 の方をCDと呼び，∆𝜀をモルCDと呼んで区別する（掌性の分子には∆𝜀が存在するため，現象として∆𝐴 が観測される）

タンパク質の二次構造
主鎖原子間の水素結合により形成

αヘリックス
右巻きらせん，1周3.8残基

βシート（ストランド間に水素結合）平行型と逆平行型がある

CDが観測されるための条件
1. 吸光度がある
2. 対象分子に掌性がある
タンパク質の主鎖は遠紫外部（190〜250 nm）でCDが観測される
1. ペプチド結合は220 nm付近に極大吸収をもつ
2. 二次構造によって発色団の空間配置に掌性が現れる

・二次構造によって特徴的なCDスペクトルが得られる・ペプチド結合の数はアミノ酸残基数に比例するため，平均残基モル楕円率で表す

CDスペクトルとタンパク質の二次構造
αヘリックス
nπ*遷移（222 nm），ππ*遷移（平行成分208 nm，垂直成分190 nm）

80
αヘリックス[θ]x10-3 (deg・cm2/dmol)

60

βシート
40

βシートnπ*遷移（218 nm），ππ*遷移（195 nm）

ランダムコイル

200190200210220-20230240

ランダムコイル
196 nm付近に大きな負の極大をもつ-40-60波長（nm）

実際のタンパク質のCDは，これらのスペクトルの重ね合わせとして観測される

問 αヘリックスを50%，βシートを20% ，ランダムコイルを30%含むタンパク質のCDスペクトルはどのような形状になるか？
→ 実測したCDスペクトルから各二次構造の含量が計算できる

CD測定時の注意点
CDは右円偏光と左円偏光の吸光度の差を見ているので，吸光度自体が大きくなると精度が下がる
1. 酸素分子はUV照射によりラジカルを発生し，遠紫外部に吸収をもつ → 測定中は試料室に窒素ガスを流して酸素を追い出す
2. 遠紫外部に吸収をもつ溶媒（DMSOなど）は，CD測定の障害となる
3. 測定中はフォトマル電圧で吸光度をモニターし，基準値を超えないようにする→ 試料濃度をあまり濃くしてはいけないが，薄いとS/Nが悪くなる（積算を繰り返す）