CronoSTARTM 96 Real-Time PCR Systemシリーズ
新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）検査のための操作マニュアル－SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit（RC300A, RC30JW）専用－
このマニュアルでは、SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit（製品コードRC300A, RC30JW）を用いてリアルタイムPCRを実施する際の操作方法を説明します。実験操作に関しては、本キットの取扱説明書に従ってください。
また、本装置は研究用機器であり、医薬品医療機器等法に定められる医療機器ではありません。

CronoSTAR 96 リアルタイムPCR装置とソフトウェアの起動
1. リアルタイムPCR装置本体の電源をONにする。
2. コンピューターの電源をONにする。
3. CronoSTAR 96ソフトウェアを起動する。

ランファイルの作成とランの開始
1. New Experimentをクリックし名前を入力してランファイルを作成する。
任意で変更可能変更不可

2. Run Settingタブの[+]を押し[Reverse Transcription],[2 Step Amplification],[Cooling]を追加する。

1v2105

タカラバイオ（株）

2.1. [Reverse Transcription]の設定
2.1.1. Step1は、52℃、5分、Ramp 6.1℃/sの設定にする。
2.1.2. Step2は、95℃、10秒、Ramp 6.1℃/sの設定にする。
2.2. [2 Step Amplification]の設定
2.2.1. Step1は、95℃、5秒、Ramp 6.1℃/sの設定にする。
2.2.2. Step2は、60℃、30秒、Ramp 6.1℃/sの設定にする。
2.2.3. サイクル数を×40から×45に変更する。
2.3. [Cooling]の設定
2.3.1 Step1は、35℃、30秒、Ramp 6.1℃/sの設定にする。

3. ExperimentのTube Type [Clear]、Reaction Volume [50µL]、Lid Heating[105℃]に設定する。

※ 他のランファイルからの設定を読み込む場合任意で変更可能

変更不可

以前と同じPCR条件でランを行う場合には、New Experiment From Existing Experimentをクリックし参照したいファイルを選択、名前を入力してランファイルを作成する。

2v2105

タカラバイオ（株）

4. Sample Setting タブでサンプルの情報を入力する（後で入力可）。
該当するウェルを選択し、サンプル名、タイプを選択する。DyeはCy5にチェック✔をいれる。
Negative：陰性コントロール
Positive：陽性コントロール
Unknown：検査対象サンプル

5. 装置にサンプルをセットする。
6. Run MonitoringタブのRunをクリックしてランを開始する。

結果の解析
1. Analysisタブで測定結果を確認する。

4 画面で別々の項目を表示

3v2105

タカラバイオ（株）

2.Analysis settingボタンを押すとウインドウが表示される。

.
3. Analysis settingウインドウのNormalization Methodを選択する。OKをクリックして一旦閉じる。

4. Analysis settingウインドウを再度開き、Baseline Gain Calibrationのチェックを外す。

5. Amplification Curve画面で増幅曲線を確認する。Cy5にチェック✔が入っていることを確認。

自動判定では曲線が見られなくとも陽性と判断される場合があるので Raw Curve で必ず増幅曲線、曲線の立ち上がりについてコントロールと比較して確認する。

4v2105

タカラバイオ（株）

6. Result Table 画面の Ct 値を確認する。

結果の判定方法（詳細はキット（RC300A）の説明書を参照）
コントロール反応の判定
・陰性コントロールは、不検出であることを確認する。
・陽性コントロールは、Ct 値が30 以下であることを確認する。
※陰性コントロールでCt値が算出された場合には、「補足②」に従いCt値算出の原因を確認する。また、Ct値算出の原因としてコンタミネーションの疑いがある場合は、反応液の調製場所や器具類を除染したうえで再反応を行う。

検体の測定結果の判定
・Ct 値が40 以下の場合は、陽性と判定する。
・Ct 値が40 より大きい場合、または不検出の場合*は検出限界以下と判定する。
※検出限界以下と判定された場合でも、40 サイクルより後で増幅曲線の立ち上りが認められた
場合は、低コピーの新型コロナウイルス遺伝子が存在する可能性があります。

5v2105

タカラバイオ（株）

解析結果の出力
1. Result Table 画面の Export Excel をクリックして名前を付けて保存する。

6v2105

タカラバイオ（株）

ソフトウェアと装置の終了
1. ソフトウェアを終了させる。
2. コンピューターを終了させて電源を切る。
3. 本体画面上でシャットダウンを押す。
4. 本体の電源を切る。

【補足①】前処理（核酸の簡易抽出）をリアルタイム PCR 装置で実施する場合
1. New Experimentをクリックし名前を入力してランファイルを作成する。
2. Run Settingタブの[+]を押し[Initial Denaturation],[Cooling]を追加する。
3. Initial Denaturation Step1は、95℃、5分、Ramp 6.1℃/sの設定にする。
4. Cooling Step1は、4℃、30秒、Ramp 6.1℃/sの設定にする。

5. 装置にサンプルをセットする。
6. Start ボタンを押しランを開始する。

7v2105

タカラバイオ（株）

【補足②】判定の際の注意
本機器はRunが終了すると、自動解析によりベースライン補正を行います。サイクル初期は蛍光値が揺らぎやすく、自動解析によりこの区間がベースライン範囲に指定されてしまうと、不適切な補正により増幅していない反応があたかも増幅したような曲線に補正されCt値が算出される場合があります。
そのため、判定の際には、以下の手順にしたがって、上述の自動補正による影響の有無を必ずご確認ください。
Amplification Curve の結果

サイクル初期で Ct 値が算出されている事例。Raw Curve でも増幅が見られるか確認する。
Raw Curve の結果

サイクル初期 10 サイクル目くらいまでは蛍光値が揺らぎやすいため、どの区間をベースライン範囲として認識しているか確認する。

8v2105

タカラバイオ（株）

ベースラインの確認と変更方法①②③①Analysis Setting アイコンをクリックする。
②Analysis Setting の変更したい Well と Manual Baseline を選択する。
③Start Cycle と End Cycle の数値を変更して OK をクリックする。
ベースラインの変更後

End Cycle を 4 から 10 に変更すると Ct 値が算出されなくなる。

9v2105

タカラバイオ（株）