評価報告書
皮膚感作性試験代替法
Interleukin-8 Reporter Gene Assay (IL-8 Luc assay)

皮膚感作性試験資料編纂委員会

令和元年（2019 年）11 月 1 日

17

皮膚感作性試験資料編纂委員会
小 島 幸 一 （委員長：一般財団法人

食品薬品安全センター）

足利太可雄 （国立医薬品食品衛生研究所）
安 達 玲 子 （国立医薬品食品衛生研究所）
佐 藤 一 博 （国立大学法人

福井大学）

瀬 崎 拓 人 （三井化学株式会社）
武 吉 正 博 （一般財団法人

化学物質評価研究機構）

福 山 朋 季 （麻布大学､（前）一般財団法人

残留農薬研究所）

2
8

略語
AOP:

Adverse Outcome Pathway

AP-1:

Activator Protein 1

ARE:

Antioxidant/electrophile Response Element

ARE-Nrf2:

ARE-Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2

BrdU:

5-Bromo-2-deoxyuridine

CRO:

Contract Research Organization

DC:

Dendritic Cell

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DPRA:

Direct Peptide Reactivity Assay

EU:

European Union

FBS:

Fetal Bovine SerumGAPDH:

GlycerAldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase

IATA:

Integrated Approaches to Testing and Assessment

h-CLAT:

Human Cell Line Activation test

ICATM:

International Cooperation on Alternative Test Methods

IL-8:Interleukin-8

IL-8 Luc Assay:

Interleukin-8 Reporter Gene Assay

JaCVAM:

Japanese Centre for the Validation of Alternatives Methods

KE:

Key Event

KeratinoSens

TM:

The ARE-Nrf2 luciferase KeratinoSensTM test method

LA:

Lactic acid

LLNA:

Local Lymph Node Assay

LuSens:The ARE-Nrf2 luciferase LuSens test method

MTA:

Material Transfer Agreement

4-NBB:

4-NitroBenzyl Bromide

NFkB:

Nuclear Factor kB

OECD:

Organisation for Economic Co-operation and Development

QSAR:

Quantitative Structure-Activity Relationship

REACH:

Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals

SLO:

Stable Luciferase Orange

SLR:

Stable Luciferase Red

TG:
U-SENS

Test Guideline
TM:

U937 cell line activation Test

UN GHS:

United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labellingof Chemicals

VMT:

Validation Management Team

3
9

要旨
皮膚感作性は化学物質の安全性評価において重要な評価項目であり、従来、モルモッ
トやマウスを用いた動物実験によって評価されてきた。近年 EU における欧州化学品規制（REACH）では、コンピューターを用いた定量的構造活性相関（QSAR）モデルや invitro 試験法による安全性評価が推奨されており、動物実験によって安全性が評価された成分を含む化粧品の販売が禁止されたことから、動物を用いない in vitro 試験法の開発が強く望まれている。
IL-8 Luc assay は、感作性発現機序における第三段階のイベントである樹状細胞が活性化する際の IL-8 の発現亢進を利用した in vitro 試験法であり、東北大学の相場らにより開発された。単球系培養細胞株である THP-1 細胞に 2 種のレポーター遺伝子を導入した THP-G8 細胞を用い、活性化に伴う細胞での IL-8 遺伝子の発現量の変化をルシフェ
ラーゼレポーターアッセイで測定することによって皮膚感作性の有無を判定する試験法である。IL-8 Luc assay は、経済協力開発機構（OECD）試験法ガイドライン（TG） 442E
ANNEX I の h-CLAT と類似の方法であり、同様に類似の方法である U-SENSTM（ANNEXII）と共に、TG 442E の ANNEX III として改定版にこれら 3 種の試験法が記載された。
本報告書は、JaCVAM の主導によって行われたバリデーション研究についてまとめられたバリデーション報告書、ICATM の支援等のもと行われた第三者評価報告書および試験開発者の投稿論文などをもとに試験手順をまとめ、有用性と限界を評価したものである。
本試験法は、バリデーション研究実施中に、使用する媒体や予測方法の改善が複数回行われた。これらをもとに作成された TG 442E ANNEX III によれば、14 物質を用いて3 施設で実施され、施設内再現性の平均は 87.7%であった。また、32 物質を用いて 3 施設で行われた施設間再現性は 87.5%であった。34 物質を用いた 3 施設によるバリデー
ション研究においては、感度は 75 から 87%、特異度は 90 から 100%、正確度は 79 から 91%であった。
本試験法では、液相での反応系を必要とし、媒体の X-VIVOTM 15 に 20 mg/mL の濃度で溶解せずに陰性と判定された物質では、判定不可となり、溶解しても偽陽性を起こす
可能性が高い。
さらに、IL-8 Luc assay は、無水物では偽陰性率が高く、界面活性剤は偽陽性となる可能性がある。細胞毒性を示す界面活性剤系の物質は適用範囲外である。ルシフェラー
ゼ活性を阻害する物質は測定を妨害する可能性がある。プレハプテンやプロハプテン
は、バリデーション研究では多くが正しく判定されたが、IL-8 Luc assay で用いる細胞の代謝能は限定的であるため偽陰性を生じる可能性がある。
以上の結果から、本試験法は、強度感作性物質（UN GHS 1A 分類）に比べて、軽度から中等度感作性物質（UN GHS 1B 分類）で偽陰性を生じやすい傾向にあるため、本法単独での感作性強度分類や UN GHS のサブカテゴリー分類への利用には適さない。なお、本法では 20mg/mL で X-VIVOTM 15 に溶解せず、陰性相当の結果となった場合は判定不可となるが、現行結果からは特に陰性物質で判定不可となる割合が高いことから、陰性
結果の判定に重点を置く場合には、注意が必要である。
410

本委員会は、上記の本試験法の様々な限界を勘案すると、本試験法単独では皮膚感作性の判定は不十分で有り、証拠の重み付けや他の試験法との組み合わせで用いることを推奨する。

511

1. 緒言皮膚感作性を評価することは化学物質の安全性評価において重要である。化学物質の皮膚での接触感作性のリスクを動物で予測する試験法として、モルモットを用いる
皮膚感作性試験（OECD TG 406）や、マウスを用いる局所リンパ節試験（LLNA, OECD TG
429）がある。LLNA には、[3H-Methyl]-thymidine 取込量を測定する方法以外に、ATP 量を測定する LLNA:DA*（OECD TG 442A）や BrdU 取込量を測定する LLNA: BrdU-ELISA†
および BrdU-FCM‡（OECD TG 442B）がある 1)。
EU において、REACH では、安全性評価においては QSAR モデルや in vitro 試験法の活用が推奨されており 2)、EU 化粧品規則（EC No 1223/2009）では、動物実験によって安全性が評価された成分を使用した化粧品の販売が禁止された 3)（2013 年 3 月全面施行）。
そのため、化学物質の皮膚感作性を判定する代替法の開発が強く求められている。
In chemico 試験法としてペプチド結合反応を利用した DPRA（OECD TG 442C）、in vitro
試験法として、ケラチノサイト細胞系の標的遺伝子を用いた KeratinoSensTM（OECD TG
442D Appendix IA）および LuSens（OECD TG 442D Appendix IB）、単球系培養細胞の活性化を利用した h-CLAT（OECD TG 442E ANNEX I）および U-SENS™（OECD TG 442E
ANNEX II）が OECD から TG として公表されている 1)。これら以外に、同じく単球系培
養細胞の活性化を利用した皮膚感作性試験の in vitro 法である IL-8 Luc assay が提案されて、JaCVAM 等によってバリデーション研究が行われた。
IL-8 Luc assay は、多くの皮膚感作性物質が樹状細胞を活性化することを利用し、ヒト単球系培養細胞である THP-1 細胞に 2 種のレポーター遺伝子を導入した THP-G8 細胞を用いて、活性化に伴う IL-8 の発現量の変化をルシフェラーゼレポーターアッセイにより測定する試験法で、東北大学の相場らにより開発された 4)。IL-8 Luc assay のバ
リデーション研究の結果 5) については、ICATM 等の支援による第三者評価 6) が完了し、2017 年 10 月に OECD の TG に追記された（OECD TG 442E ANNEX III）1)。
JaCVAM 皮膚感作性試験資料編纂委員会（以下、委員会）は、IL-8 Luc assay の皮膚感作性試験代替法としての科学的妥当性について、現在までに公開されている情報をもとに評価したので、その結果を報告する。
2. 試験法の原理
皮膚感作性は、ヒトでは接触皮膚炎、動物（齧歯類）では接触過敏症として知られる
化学物質の毒性の一つである。OECD がまとめた有害性発現経路（AOP）では、化学物
質による皮膚感作は次の 4 つの重要な事象（KE）から成るとされている 7)。
KE1:

化学物質とタンパク質のシステイン残基あるいはリジン残基との共有結合*LLNA:DA とは、リンパ球の増殖反応を adenosine triphosphate（ATP）を指標として定量する LLNA
†LLNA:BrdU-ELISAとは、リンパ球の増殖反応を非放射性標識の 5-bromo-2-deoxyuridine（BrdU）取り込み量を ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）で定量する LLNA
‡ LLNA:BrdU-FCM とは、リンパ球の増殖反応を非放射性標識の BrdU 取り込み量を FCM（flowcytometry method）で定量する LLNA

6
12

KE2:

ケラチノサイトにおける炎症性応答および ARE-dependent pathway による遺伝
子発現

KE3:

樹状細胞（DC）の活性化（特異的細胞表面マーカーの発現、ケモカインやサイト
カインの産生）KE4:リンパ節における T 細胞の増殖

IL-8 Luc assay は IL-8 遺伝子のプロモーターを用いたレポーター遺伝子アッセイであり、親細胞として DC 様細胞への分化能を有する THP-1 細胞を使用している。IL-8 遺伝子のプロモーター領域には NFkB、AP-1 等の応答配列があり、本試験系は DC 様細胞の IL-8 遺伝子プロモーターを介する転写活性化を指標とし、IL-8 の産生を間接的に捉える試験系と解釈できる。
本試験系で使用される THP-G8 細胞の親株である THP-1 細胞において、感作性物質の刺激により IL-8 産生が誘導されることが報告されている 8)。IL-8 は代表的な好中球
走化性因子であり、感作成立には局所における好中球の動員が必須であることが報告されていることから 9)、IL-8 は局所への好中球動員によって感作成立に関与しているものと考えられる。また、IL-8 遺伝子のプロモーター配列に存在する NFkB は種々の免疫系細胞の分化・活性化や炎症応答を制御するメディエーターとして知られ、IL-8 等のサイトカイン分泌制御の他、DC の活性化に関与することも知られている 10)。
以上のことから、IL-8 Luc assay は感作性 AOP における KE3:樹状細胞の活性化を検出する試験系と位置づけることができる。
本法で使用される THP-G8 細胞は、h-CLAT で使用される THP-1 細胞に IL-8 プロモー
ターで制御される SLO 遺伝子と GAPDH プロモーターで制御される SLR 遺伝子を安定的に導入した細胞であり、SLO（λmax = 580 nm）および SLR（λmax = 630 nm）の発光をそれぞれに対応したフィルターを装備したルミノメーターで分別測定して感作性の有無を判定する 11)。二種のルシフェラーゼレポーター遺伝子のうち、GAPDH プロモーター
で制御される SLR 遺伝子の発現量は細胞生存率の評価に加え、IL-8 プロモーター依存性 SLO 発現量の補正に利用される。
3. 試験手順／判定
IL-8 Luc assay の試験手順および判定は、被験物質を曝露した IL-8 プロモーターで制御される SLO 遺伝子と GAPDH プロモーターで制御される SLR 遺伝子を安定的に導入した THP-G8 細胞における SLO および SLR 遺伝子の発現量解析によって実施される。
3-1. THP-G8 細胞の準備、試薬および反応性確認試験
本法では、株式会社ジーピーシー研究所（鳥取）より供給されている THP-G8 細胞を使用する。細胞は、起眠後、継代数として 12 回もしくは 6 週間以内の使用が可能であり、細胞の増殖速度によるが、理論的にはかなりの被験物質の試験が可能と算出される。細胞培養培地としては、RPMI-1640 の基礎培地に牛胎仔血清（FBS：終濃度 10%）、Penicillin G（終濃度 100 units/mL）、Streptomycin（終濃度 100 μg/mL）、Amphotericin B（終713濃度 0.25 μg/mL）、Puromycin（終濃度 0.15 μg/mL）および G418（CAS:108321-42-2、終濃
度 300 μg/mL）を加えたものを使用する。試験開始前には本法における細胞の反応性確認を実施するべきである。反応性の確認は、細胞を起眠後 1 ～ 2 週間もしくは 2 ～ 4 回の継代後に陽性対照物質である 4-NBB（CAS:100-11-8、純度 99%以上）および陰性対照物質である LA（CAS:50-21-5、純度 85%以上）を用いて行う。4-NBB で陽性反応（IndIL8LA が 1.4 以上）、LA で陰性反応（Ind-IL8LA が 1.4 より低い）を示した細胞のみを本実験に使用する。
試験実施前に、THP-G8 を 2 ～ 5×105 cells/mL の細胞濃度で培養フラスコに播種し、48 時間もしくは 96 時間培養する。試験日に、1×106 cells/mL の濃度で 10%FBS 含有
RPMI-1640（抗生物質は入っていない）に再懸濁した THP-G8 細胞を 96 穴平底黒色プレートに 50 μL ずつ加える（各 well あたりの最終細胞数は 5×104 cells/well）。
3-2. 被験物質および対照物質の調製（図 1）
被験物質および対照物質は、試験当日に調製する。IL-8 Luc assay では、被験物質および陽性対照物質の調製媒体として X-VIVOTM 15（Lonza）の使用が推奨されている。ただし X-VIVOTM 15 を用いた場合の再現性を証明するデータが乏しい。また、DMSO と比較した場合、X-VIVOTM 15 の正確度は高いが感度が低い 10) ため、X-VIVOTM 15 の有用性判断には疑問の余地がある。ガイドラインでは、X-VIVOTM 15 以外の媒体（DMSO、水等）や培養液を使用する科学的に妥当な理由が存在する場合は、使用してもよいと記載されている。まず、20 mg の被験物質を 1 mL の X-VIVOTM 15 に溶解または懸濁し（20 mg/mL）、ボルテックスミキサーにて激しく撹拌した後、攪拌機を用いて最大 8 rpm、
室温（約 20℃）、30 分間撹拌する。上記工程でも溶解しない場合、被験物質が完全に溶解するか安定した分散状態が得られるまで超音波破砕を行う。被験物質が X-VIVOTM
15 に溶解する場合は、さらに X-VIVOTM 15 で 5 倍希釈したものを Stock solution（4mg/mL）として以降の試験に使用する。被験物質が X-VIVOTM 15 に溶解しない場合は、撹拌機でさらに 30 分以上攪拌した後、15,000 回転（約 20,000G）で 5 分間遠心分離し、得られた上清を Stock solution として以降の試験に使用する。
初回試験は、細胞毒性および感作性のある濃度を検出するために実施する。Stocksolution を X-VIVOTM 15 を用いて公比 2 で段階希釈して得られた 11 濃度を調製する。
得られた被験物質調製液を 50 μL/well ずつ、96 穴平底黒色プレートにまかれている細胞に添加する。被験物質が X-VIVOTM 15 に溶解する場合、被験物質の終濃度は 0.002 から 2 mg/mL となる。一方、被験物質が X-VIVOTM 15 に完全に溶解しない場合、被験物
質の終濃度は X-VIVOTM 15 に飽和した被験物質量に依存する。2 回目以降の試験では、1 回目の試験結果を踏まえて、Stock solution を CV05§ の 4 倍高い濃度とする。初回試験の最高濃度で Inh-GAPLA が 0.05 より低くならなかった場合は、2 回目以降の Stocksolution も初回試験と同じ濃度を使用する。
2 回目以降の試験では、Stock solution を X-VIVOTM 15 で 1.5 倍段階希釈する事で調§CV05 とは、Inh-GAPLA が 0.05 より低くなる最低濃度814製する。各試験、各濃度とも 4 well ずつ設定する。
4-NBB を推奨陽性対照物質とし、20 mg を 1.5 mL チューブ内で 1 mL の X-VIVOTM
15 と混合し、8 rpm 以下の撹拌機で 30 分以上攪拌した後、15,000 回転（約 20,000G）で
5 分間遠心分離する。得られた上清を以降の試験に使用する。X-VIVOTM 15 を用いて 8
倍希釈および 16 倍希釈し、50 μL の希釈液を同量の THP-G8 細胞とともに 96 穴平底黒色プレートに播種し（4 well/濃度）、攪拌した後 CO2 インキュベーター内で 16 時間反応
させ、ルシフェラーゼ活性を測定する。
LA を推奨陰性対照物質とし、20 mg を 1.5 mL チューブ内で 1 mL の X-VIVOTM 15 に溶解させる（20 mg/mL）。さらに X-VIVOTM 15 を用いて 10 倍希釈（2 mg/mL）および 20
倍希釈（1 mg/mL）し、50 μL の希釈液を同量の THP-G8 細胞とともに 96 穴平底黒色プレートに播種し（4 well/濃度）、攪拌した後 CO2 インキュベーター内で 16 時間反応させ、ルシフェラーゼ活性を測定する。
上記対照物質と同等の陽性・陰性反応を証明する背景データがある場合、それらの物
質を対照物質として使用しても構わない。ウェル間の被験物質交差汚染を防ぐため、プ
レートをシールするなどの処置を施す。

915

X-VIVO TM 15 に 20mg/mL で溶解する場合

1016

X-VIVO TM 15 に 20mg/mL で溶解しない場合

1117

図 1 被験物質および対照物質の調製
3-3. 被験物質および対照物質の曝露
3-2 で調製した被験物質および対照物質を細胞懸濁液と 96 穴平底黒色プレート内にて 1 : 1 で混合し、37±1°C、5% CO2 条件下にて 16±0.5 時間培養する。揮発性の高い被験物質は揮発により他の被験物質曝露区と交差汚染が生じる可能性があるので、その他の被験物質とは別の単独のプレートにて実験を行う。
被験物質ごとに感作性を予測するために 2 ～ 4 回の試験を行う。各試験は新たな被験物質調製液および細胞を用いて別日に行う。
3-4. ルシフェラーゼ活性測定
ルシフェラーゼ活性は光学フィルターを備えた 96 穴平底黒色プレート用ルミノメー
ターを用いて測定する。測定前にルミノメーターの校正および色の識別能を橙色および赤色発光ルシフェラーゼを用いて実施する必要がある。
事前に温められた 100 μL の Tripluc® ルシフェラーゼ測定溶液を被験物質、媒体ない
し対照物質を曝露した細胞に添加する。プレートは通常の実験室内環境下（約 20°C）で
10 分間振とうした後、ルミノメーターで測定する。生物発光は各 well 3 秒ずつフィル
ター存在下（F1）と、非存在下（F0）で測定する。測定結果をもとに下記の項目を算出する。
IL8LA：橙色ルシフェラーゼ活性値で、IL-8 プロモーター活性を示す。



GAPLA：赤色ルシフェラーゼ活性値で、GAPDH プロモーター活性（細胞生存率および細胞数）を示す。



nIL8LA：IL8LA を GAPLA で除した値で、細胞生存率もしくは細胞数をノーマライズした後の各曝露区における IL-8 プロモーター活性を示す。



Ind-IL8LA：被験物質を曝露した細胞における nIL8LA を無処理細胞の nIL8LA で1218

除した値で、被験物質曝露により増加した IL-8 プロモーター活性の程度を示す。


Inh-GAPLA：GAPLA の阻害値。被験物質を曝露した細胞における GAPLA を無処理細胞の GAPLA で除した値で、被験物質曝露による細胞毒性の程度を示す。

3-5. データの解析
測定毎に以下の基準で陽性ないし陰性を判断する。
Ind-IL8LA が 1.4 以上で 95%信頼限界の下限が 1.0 以上を示す被験物質を陽性と判断する。一方で、Ind-IL8LA が 1.4 より低い場合か、95%信頼限界の下限が 1.0 より低い場合、もしくはその両方の場合を陰性と判断する。
3-6. 予測方法
4 回の独立した試験において 2 度の陽性反応が認められた場合は感作性陽性と判断する。一方で、4 回の独立した試験において 3 度の陰性反応が認められた場合は感作性陰性と判断する。
表 1 陽性および陰性反応判断の基準

表 1 で陰性と判断された被験物質で、20 mg/mL 濃度にて X-VIVOTM 15 に溶解した被
験物質は図 2 のごとく陰性と判断するが、溶解しない被験物質については判定不可と
する。

13
19

図 2 感作性予測モデル
3-7. 試験成立の条件
IL-8 Luc assay においては、以下の条件が成立する必要がある。


試験毎に設定する陽性対照物質（4-NBB）の少なくとも 1 濃度で Ind-IL8LA が 5.0 より高い。



試験毎に設定する陰性対照物質（LA）の全ての濃度で Ind-IL8LA が 1.4 より低い。



対照区（細胞と Tripluc® はあり，被験物質は無処置）における GAPLA の値が媒体
対照区（50 μL/well の 10%FBS 含有 RPMI-1640 に 50 μL/well の X-VIVOTM 15）の 1/5より低いプレートは採用不可とする。



媒体対照区および被験物質曝露区の全ての濃度における Inh-GAPLA の値が 0.05 より低いプレートは採用不可とする。

3-8. 試験手順および判定方法に関する樹状細胞を指標とした他試験との比較
本試験法は樹状細胞の活性化を指標にした検査法であることから、同様に樹状細胞の活性化に着目した h-CLAT や U-SENS™ との比較が想定される。しかし、h-CLAT お
よび U-SENS™ が細胞表面抗原の発現に着目している一方、本法では IL-8 遺伝子の活性化を指標としているため、両者を単純に比較する事は困難である。
IL-8 Luc assay の最大の利点は、培養時間の短縮化と操作の簡便化にあると言える。
h-CLAT と U-SENS™ がそれぞれ 24 時間および 45 時間の培養を必要とするのに対し、
IL-8 Luc assay は 16 時間で終了し、操作も比較的単純である。細胞の維持にも一般的な培地を用いており、継代頻度や手間も h-CLAT および U-SENS™ と同等と考えられる。
一方、難点としては、本法の調製媒体として推奨されている X-VIVOTM 15 に溶解しない被験物質において、判定不可と判断される点が挙げられる。
4. 精度
Phase 0（技術移転性の評価）および Phase I、IIa、IIb、IIc、III、IV（6 つのバリデーション研究）が、JaCVAM 主導で行われ 5)、続いてバリデーション結果に関して ICATM 等の支援による第三者評価 6) を受けた。
4-1. 技術移転性
Phase 0 として、参加する A、B、C の 3 施設が主導施設から IL-8 Luc assay の説明を受け、感作性物質の 4-NBB、Tetramethylthiuram disulfide と非感作性物質の LA の 3 物
1420質をそれぞれ評価した（Lab A は 2 回、Lab B は 1 回、Lab C は 3 回）。合計 18 回の実験のうち、Lab A が UN GHS 1A である 4-NBB を非感作性物質と 1 回誤判定した以外は正
しく判定された。バリデーション実行委員会（VMT）は IL-8 Luc assay の技術移転性の結果を妥当なものとした 5)。
4-2. 再現性
施設間再現性を検討するために行われた Phase I において、感作性陰性の物質に関しては良好な結果であったが、陽性の物質に関しては偽陰性の結果が多く、陽性とする基準、濃度範囲、細胞と被験物質のインキュベーション時間、陽性対照物質の変更などを
VMT から求められた。Phase IIa から Phase III においてこれらに対する改善が図られた。
さらに、Phase IV において被験物質の培地中のタンパク質（FBS 等）への結合による被験物質ロスを減らし偽陰性を減らす目的で媒体を DMSO から X-VIVOTM 15 に変更した
結果、予測精度も向上することが明らかとなった。技術移転性の結果を除き、Appendix
1 の数値はこれらの改善後の結果である 5)。
次に、Phase 毎の改良のポイントと結果について述べる。Phase I は、原法の IL-8 Luc
assay プロトコルで行われた。3 施設の施設間再現性は 70%であった。Phase IIa では、希釈濃度・希釈率等が修正された。施設間再現性は 70％であった。Phase IIb は、培養時間等が修正された。施設間再現性は 86%、施設内再現性は 78%だった。Phase IIc は、
ルシフェラーゼ活性値のクライテリアが修正された。施設間再現性は 86%、施設内再現性は 71%だった。Phase III でもルシフェラーゼ活性値のクライテリアに修正が加えられ、施設間再現性は 95%だった。Phase IV では、予測性の向上を目的に溶媒が XVIVOTM-15 に変更された。施設間再現性は 91%、施設内再現性は 93%だった。ただしこれは 5 品のみの結果であり不十分と考えられたため、本評価書では、本試験法の再現性は DMSO と X-VIVOTM 15 の両方の結果より評価し、妥当と判断した。
バリデーション研究が多くの phase を経たことから、事前に先行バリデーション研究などでプロトコルの最適化を行っておくことの重要性が示唆された。
施設内と施設間の再現性はいずれも、適用 16 時間の Phase IIb、IIc、III（以上 DMSO
溶媒）および Phase IV（X-VIVOTM 15 溶媒）の結果をクライテリア 3 により評価して算出された。したがって、溶媒として異なる 2 種類（DMSO と X-VIVOTM 15）の結果を統合して再現性が評価された。なお、Phase IIb の結果はバリデーション研究終了後に改めてクライテリア 3 に基づいて評価された。
4-2-1. 施設内再現性
施設内再現性は Phase IIb, IIc およびⅣの結果（Appendix 1 参照）から算出された。施設内再現性は Lab A が 85.7%（12/14）、Lab B が 91.7%（11/12）、Lab C が 85.7%（12/14）、
平均 87.7%であり 5)、 VMT の受け入れ基準（85%）を満たしており、本委員会は妥当と
判断した。

15
21

4-2-2. 施設間再現性
施設間再現性は Phase IIb, IIc、III およびⅣの結果（Appendix 1 参照）から算出された。
施設間再現性は、87.5%（28/32）であり 5) 、VMT の受け入れ基準（80%）を満たしており、本委員会は妥当と判断した。
5. 正確度（感度および特異度）
バリデーション報告書 5) によると、34 物質（Phase IIb から Phase IV、Appendix 1）を用いて 3 施設で行われた結果では、感度は 75 から 87%、特異度は 90 から 100%、正確度は 79 から 91%であった。
主導施設は、DPRA、KeratinoSensTM および h-CLAT で検討された物質を網羅する 143
物質について、最終化されたプロトコル（ガイドライン収載）（媒体は X-VIVOTM 15）に従い、IL-8 Luc assay を行った。その結果を LLNA およびヒトのデータと比較した 5)。
143 物質中判定不可の 25 物質を除く 118 物質を LLNA のデータ 11) と比較すると、感度96%（92/96）、特異度 41%（9/22）、正確度 86%（101/118）であった。143 物質から適用範囲外の 7 物質を除いた 136 物質から、さらに判定不可の 23 物質を除いた 113 物質を
LLNA と比較すると、感度 96%（92/96）、特異度 53%（9/17）、正確度 89%（101/113）であった。
ヒトのデータ 5) がある 90 物質のうち、判定不可の 14 物質を除く 76 物質では、感度93%（54/58）、特異度 39%（7/18）、正確度 80%（61/76）であった。適用範囲外の 6 物質と判定不可の 13 物質を除く 71 物質では、感度 93%（54/58）、特異度 54%（7/13）、正確度
86%（61/71）であった。
6. 評価可能な物質の範囲
IL-8 Luc assay のバリデーション報告書 5) には主導施設において検討された 143 物質を用いた評価結果が示されている。これは、本法開発当初の媒体である DMSO と、評
価物質の溶解性の改善のために用いることとした媒体 X-VIVOTM 15 を用いた結果である。これらに加えて、VMT との議論の中で予測方法の改善（Option 1 から Option 2）などが行われ、バリデーション報告書中には X-VIVOTM 15 を用いた Option 2 の結果が合わせて表に載せられている。
予測モデルは以下のように定義された。Option 1 では、第 1 回から第 4 回までの実験で、2 回の陽性結果を示した場合は陽性と判定する。3 回の陰性結果を示した場合「Supposed negative」とする。この中で、第 1 回の実験で Inh-GAPLA＜0.8 の化学物質と、Inh-GAPLA≧0.8 で X-VIVOTM 15 に 20 mg /mL 可溶の物質は陰性と評価する。InhGAPLA≧0.8 で X-VIVOTM 15 に不溶であれば判定不可と評価する。
Option 2 では、第 1 回から第 4 回までの実験で、2 回の陽性結果を示した場合は陽性と判定する。3 回の陰性結果を示した場合 「Supposed negative」 とする。この中で、XVIVOTM 15 に 20 mg/mL の濃度で可溶であれば陰性と評価し、不溶であれば判定不可と評価する。
最終的に Option 2 が採用されたが、この予測モデルでは、被験物質が 20 mg/mL で溶1622

解するか否かを判定基準とし、どの実験室でも明快で容易に判断できることを挙げている。しかも、この予測モデルの採用結果をみると、原法の施設内および施設間再現性の判定と大きく乖離していないし、むしろ正確度と感度は有意に向上し、評価の性能は原法と有意な差はないとバリデーション報告書には記載されている。
この表の一部に誤植（ガイドラインの記載内容には影響しない）が認められたため、開発者に確認して修正したものが Appendix 2 である。143 物質のうち 25 物質（LLNA で陽性が 11 物質、陰性が 14 物質）が判定不可である。さらに、5 物質（LLNA ですべて陰性）は、いずれも細胞毒性を示す界面活性剤系の物質で適用範囲外である。なお、判定不可の中にある 2 物質（LLNA ですべて陽性）は酸無水物で、適用範囲外にも含まれている。
IL-8 Luc assay で評価している 143 物質の判定方法および媒体の変更に伴って判定の結果がどのように変化したのかを、バリデーション報告書 217 頁（Appendix 16. Table S2
Option 1）および 269 頁（Appendix 16. Table S2 Option 2）のデータをもとにまとめたのが
表 2 である。さらに、本評価書 Appendix 2 に載せた表の 143 物質の判定の推移を表 2の物質から適用範囲外の物質を除いて同様にまとめたのが表 3 である。
いずれの表を見ても、媒体を DMSO から X-VIVOTM 15 に変更したことによって感度、正確度、および特異度は大きく変わらなかった。
判定方法を Option 1（Op-1）から Option 2（Op-2）へと変えたことによって、感度がさらに高くなり、特異度は低くなっている。これは判定不可（ガイドライン上では陰性でも陽性でもなく“Should not be considered”とされ、バリデーション報告書の表中では“inconclusive”とされている）とされた物質数が分母から除外（適用外も同様）されたためである。このことにより、特に LLNA やヒトのデータで非感作性と評価されている物質が除外候補となる確率が高く、結果的に陰性物質の評価数が減少してしまっている。したがって、被験物質が感作性陰性であることを示すための試験においては、XVIVOTM 15 の使用が適切であるとする十分なデータがないと考えられる。

17
23

表2

IL-8 Luc assay で評価している 143 物質の判定の推移*
右記条件
での判定

DMSO

X-VIVOTM 15

Op-1

Op-2

Sen

82

92

92

92

Non-sen

25

15

9

4

Inconclusive

---

---

6

11

Sen

11

13

13

13

Non-sen

25

23

16

9

Inconclusive

---

---

7

14

正確度
(%)

75
(107/143)80(115/143)83(108/130)86(101/118)

感度
(%)

77
(82/107)86(92/107)91(92/101)96(92/96)

特異度
(%)

69
(25/36)64(23/36)55(16/29)41(9/22)LLNA
Sen(107 物質)

Non-sen(36 物質)*バリデーション報告書 217 頁および 269 頁の表データを使用、Sen：陽性、Non-sen：
陰性、Inconclusive：判定不可、小数第 1 位四捨五入

表3

Appendix 2 に載せた 143 物質の判定の推移*
右記条件
での判定

DMSO

X-VIVOTM 15(Op-1)**

Op-2

Sen

82

92

(92)

92

Non-sen

23

13

(6)

4

Out of AD

2

2

(2)

2

Inconclusive

---

---

(7)

9

Sen

7

8

(8)

8

Non-sen

24

23

(17)

9

Out of AD

5

5

(5)

5

Inconclusive

---

---

(6)

14

正確度
(%)

78
(106/136)85(115/136)(89)(109/123)

89(101/113)

感度
(%)

78
(82/105)87(92/105)(94)(92/98)96(92/96)

特異度
(%)

77
(24/31)74(23/31)(68)(17/25)53(9/17)LLNA

Sen(107 物質)

Non-sen(36 物質)*Appendix 2 のデータを使用、表 2 の物質から適用範囲外の物質数を除いて正確度等が求められている。Sen：陽性、Non-sen：陰性、Out of AD：適用範囲外、Inconclusive：判
定不可、小数第 1 位四捨五入、**開発者確認データ
1824

技術的限界として、液相での反応を必要とする試験系であるため、X-VIVOTM 15 に20 mg/mL の濃度で溶解しない陰性の物質は判定不能となる。現試験法では、完全に溶解しない場合、遠心で沈殿物を除き上清を適用するため、適用濃度が不明である。XVIVOTM 15 に 20 mg/mL の濃度で溶解しない物質を感作性陰性と判断するためには、完
全に溶解した溶液で評価をするか、上清中の被験物質濃度の測定をするなどの改良が望まれる。ただし、科学的根拠があれば他の溶媒も使用可能とされている。
バリデーション研究においては、酸無水物の偽陰性率が高かった。界面活性剤は、偽陽性となる可能性がある。さらに、ルシフェラーゼ活性に干渉する化合物は測定を妨害する可能性がある。以上より、酸無水物、界面活性剤およびルシフェラーゼ活性に干渉する化合物は適用範囲外である。プレハプテン（酸化により活性化される物質）やプロ
ハプテン（P450 等による代謝活性化を必要とする物質）に関しては、これまでの検討では多くが正しく判定された（プレハプテン 11/11、プロハプテン 6/6、およびプロ/プレハ
プテン 6/8）5)。しかし、本細胞の代謝能は限定的である 12) ため、未検討のプロハプテ
ンやプレハプテンについては偽陰性を生じる可能性がある。従って、プロハプテンやプレハプテンの可能性がある化合物の陰性結果の解釈は注意が必要である。
7. 有用性と限界
本法は細胞実験とルミノメーターを組み合わせた皮膚感作性試験法であり、ルミノ
メーターを保有し、その技術に習熟した施設であれば実施可能と思われる。ただし本試
験法は 2 色同時発光のため、分離するフィルターを装着することができる特殊なルミ
ノメーターが必要である。
本試験法は動物を用いない in vitro の手法であり、同じ目的のために実施される動物実験と比べ、より「動物の愛護及び管理に関する法律」および 3Rs の精神と合致している。
IL-8 Luc assay 実施の際に必要となる消耗品費については、1 アッセイ当たり約 2.7 万円と試算され、LLNA（同約 10 万円）より低額であり、h-CLAT（同約 2 万円）や U-SENSTM（同約 1.8 万円）とほぼ同程度であった。一方で、本試験法実施に必要な THP-G8 細胞は一般的な細胞バンクでは取り扱われておらず、現状では株式会社ジーピーシー研究所
のみから入手可能であることから、価格面で h-CLAT や U-SENSTM で使用される THP1 や U-937 と比較して割高になる可能性がある。さらに、入手には株式会社ジーピー
シー研究所と譲渡契約（MTA）を締結する必要があり、現行の MTA（2018/2/9 付）では本試験法を実施できるのは受託試験機関（CRO）以外で細胞培養機器を保有し、自ら本細胞を培養し試験用細胞ストックを作製可能な施設である。こうした点は試験実施の際に留意すべき点であると考えられる。試験期間については、IL-8 Luc assay は最短 4 日間で実施可能であり、LLNA（同 1 週間）、U-SENSTM（同 6 日間）や h-CLAT（同 6 日間）よ
り短期間であった。
本試験法は、試験の実施と評価のための戦略的統合方式（IATA）において他の試験法と組み合わせることにより、感作性物質と非感作性物質との区別に使用することが可能である 13)。しかし、強度感作性物質に比べて、軽度から中等度感作性物質で偽陰性の判
1925

定が生じやすい傾向にあるため、本法単独での感作性強度分類や UN GHS のサブカテゴ
リー分類への応用には適さない。
8. 結論
IL-8 Luc assay は、感作性発現機序における第三段階のイベントである樹状細胞が活性化する際の IL-8 の発現亢進を利用し、化学物質刺激に対する IL-8 誘導活性をレポー
ター遺伝子アッセイによって被験物質の皮膚感作性を評価する in vitro 試験法である。
本法で使用される THP-G8 細胞は、h-CLAT で使用される THP-1 細胞（単球系培養細胞）に IL-8 プロモーターで制御される SLO 遺伝子と GAPDH プロモーターで制御される SLR 遺伝子を安定的に導入した細胞であり、SLO（λmax = 580 nm）および SLR（λmax= 630 nm）の発光をそれぞれに対応したフィルターを装備したルミノメーターで分別測
定して感作性の有無を判定する。二種のルシフェラーゼレポーター遺伝子のうち、
GAPDH プロモーターで制御される SLR 遺伝子の発現量は、細胞生存率の評価に加え、IL-8 プロモーター依存性 SLO 発現量の補正に利用される。
本試験法は、バリデーション研究実施中に、使用する媒体や感作性予測モデルの改善などが頻繁に行われた。その結果をもとに作成された TG 442E ANNEX III によれば、
14 物質を用いて 3 施設で実施された施設内再現性の平均は 87.7%、32 物質を用いて 3
施設で実施された施設間再現性の平均は 87.5%であった。
TG 442E ANNEX III で示された媒体 X-VIVOTM 15 を用い、かつ TG 442E ANNEX III
収載の予測モデルによれば、LLNA のデータがある 143 物質について、判定不可の 25
物質を除いた 118 物質の評価では、感度 96%（92/96）、特異度 41%（9/22）、正確度 86％（101/118）であった。適用範囲外 7 物質および判定不可 23 物質を除いた 113 物質では、
感度 96%（92/96)、特異度 53%（9/17）、正確度 89%（101/113）であった。143 物質のうち、ヒトのデータがある 90 物質について、判定不可の 14 物質を除く 76 物質の評価では、
感度 93%（54/58）、特異度 39%（7/18）、正確度 80%（61/76）であった。適用範囲外 6 物質
および判定不可 13 物質を除いた 71 物質では、感度 93%（54/58）、特異度 54%（7/13）、
正確度 86%（61/71）であった。この 143 物質を見る限り、本法は様々な化学物質の皮膚
感作性の予測が可能であることが示されている。
IL-8 Luc assay の試験法は、液相での反応を必要とする試験系であるため、X-VIVOTM
15 に 20 mg/mL の濃度で溶解しない物質が陰性の場合は判定不可となる。X-VIVOTM 15を用いる場合、評価された陰性物質が少ないこと、DMSO と比較して感度、正確度および特異度に大きな違いは見られないことから、X-VIVOTM 15 は媒体として DMSO よ
りも常に優れているとは一概には言えないと本委員会は考えている。
界面活性剤等の細胞毒性を引き起こすような物質、酸無水物、ルシフェラーゼ活性に干渉する物質などは適用範囲外である。プレハプテンやプロハプテンに関しては、本法開発の段階では正しく判定されているが、本細胞の薬物代謝能は限定的であるため、活性化に代謝系を必要とする化学物質では、その感作性が正しく検出されない可能性があり、未検討のプロハプテンやプレハプテンについては偽陰性を生じる可能性もある。
本試験法は、強度感作性物質（UN GHS 1A 分類)に比べて、軽度から中等度感作性物
20
26

質（UN GHS 1B 分類)で偽陰性の判定が生じやすい傾向にあるため、本法単独での感作性強度分類や UN GHS のサブカテゴリー分類への利用には適さない。
なお、本法では 20mg/mL で X-VIVOTM 15 に溶解せず、陰性相当の結果となった場合
は、判定不可となるが、現行結果からは特に陰性物質で判定不可となる割合が高いことから、陰性結果の判定に重点を置く場合には本法の適用には注意が必要である。本委員会は、上記の本試験法の様々な限界を勘案すると、本試験法単独では皮膚感作性の判定は不十分であり、上記の点に留意して、証拠の重み付けや他の試験法との組み合わせで用いることを推奨する。
9. 利益相反(COI)について
特になし。

21
27

10. 引用文献（最終アクセス日：2019 年 11 月 1 日）
1) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4 , Available at: http://www.oecdilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-4-healtheffects_20745788
2) Corrigendum to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of theCouncil of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation andRestriction of Chemicals (REACH), establishing3) REGULATION (EC) No 1223/2009 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE
COUNCIL of 30 November 2009 on cosmetic products (recast) (Text with EEA relevance) ,Availableat:https://ec.europa.eu/health/sites/health/files/endocrine_disruptors/docs/cosmetic_1223_200
9_regulation_en.pdf
4) Takahashi T, Kimura Y, Saito R, Nakajima Y, Ohmiya Y, Yamasaki K, Aiba S. (2011) An in
vitro test to screen skin sensitizers using a stable THP-1-derived IL-8 reporter cell line, THPG8. Toxicol Sci.; 124:359-69
5) OECD (2017). Validation report for the international validation study on the IL-8 Luc assay
as a test evaluating the skin sensitizing potential of chemicals conducted by the IL-8 Luc
Assay. Series on Testing and Assessment No. 267, ENV/JM/MONO (2017)19. Organizationfor
Economic
Cooperation
andDevelopment,
Paris.
Availableat:https://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm
6) Report of the peer review panel for the IL-8 Luciferase (IL-8 Luc) assay for in vitro skinsensitization. Series on testing and assessment. No.268 ENV/JM/MONO(2017)20.
Organization for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at:
http://www.oecd.org/env/ehs/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm
7) OECD (2014) The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent
Binding
toProteins,
OECD
Publishing,Paris,
Availableat:
http://dx.doi.org/10.1787/9789264221444-en
8) Nukada Y, Miyazawa M, Kosaka N, Ito Y, Sakaguchi H, Nishiyama N. (2008) Production of
IL-8 in THP-1 cells following contact allergen stimulation via mitogen-activated protein
kinase activation or tumor necrosis factor-alpha production. J Toxicol Sci., 33, 175–85.
9) Weber FC1, Németh T, Csepregi JZ, Dudeck A, Roers A, Ozsvári B, Oswald E, Puskás LG,
Jakob T, Mócsai A, Martin SF. (2015) Neutrophils are required for both the sensitization andelicitation phase of contact hypersensitivity, J. Exp. Med., 212 (1), 15-22.
10) Liu T, Zhang L, Joo D, Sun SC. (2017) NF-κB signaling in inflammation, Signal Transduct
Target Ther. 2, 17023.
11) Kimura Y, Watanabe M, Suzuki N, Iwaki T, Yamakage K, Saito K, Nakajima Y, Fujimura C,
Ohmiya Y, Omori T, Kojima H, Aiba S. (2018) The performance of an in vitro skinsensitisation test, IL-8 Luc assay (OECD442E), and the integrated approach with direct
peptide reactive assay (DPRA), J. Toxicol. Sci., 43 (12), 741-749.
12) Ashikaga T, Sakaguchi H, Sono S, Kosaka N, Ishikawa M, Nukada Y, Miyazawa M, Ito Y,
Nishiyama N, and Itagaki H. (2010) A comparative evaluation of in vitro skin sensitisation
tests: the human cell-line activation test （h-CLAT) versus the local lymph node assay（LLNA). Alternatives to laboratory animals : ATLA 38:275-84.
13) Guidance Document on the Reporting of Defined Approaches and Individual Information
Sources to be Used within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) for Skin
Sensitisation, Annex 1 and Annex 2. Available at: http://www.oecd.org/chemicalsafety/riskassessment/iata-integrated-approaches-to-testing-and-assessment.htm
2228

Appendix 1

バリデーション研究 Phase IIb、IIc、III、IV の結果

Phase Chemicals RepeatⅡb 5 codedⅡc 5 coded

3 sets3 setsNo,
No. Chemical name

CAS No.

LLNA
EC3

GHS
Category

1

p-Benzoquinone

106-51-4

0.099

1A

2

1-Thioglycerol

96-27-5

3.6

1B

3

Benzyl cinnamate

103-41-3

18.4

1B

4

Diethyl maleate

141-05-9

5.8

1B

5

2,4-Dichloronitrobenzene

611-06-3

1

1,4-Phenylenediamine

106-50-3

0.00991A

2

2-Mercaptobenzothiazole

149-30-4

1.7

1A

3

Glycerol

56-81-5NC

4Isopropanol

67-63-0NC

5Methyl salicylate

119-36-8

NC

NC

Lab A
Judge

Lab B
Judge

Lab C
Judge

G(1/2)
P(2/2)
G(1/2)
P(4/4)
P(2/3)
P(3/3)
P(4/4)
P(3/3)
P(4/4)
N(0/3)
N(0/3)
N(0/3)
N(0/3)
N(0/3)
N(0/4)
P(2/2)
P(2/4)
P(3/4)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
N(0/3)
N(1/4)
N(1/4)
N(1/4)
N(0/3)
N(0/3)
N(0/3)
P(2/4)
N(0/3)

G(1/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(4/4)
P(3/3)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(3/3)
N(0/4)
N(0/3)
N(0/3)
N(0/3)
G(0/2)
G(1/3)
P(2/4)
N(1/4)
P(2/2)
G(1/3)
P(2/2)
P(2/2)
N(0/4)
N(0/3)
N(1/4)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/4)
N(0/3)
N(0/4)
N(1/4)

P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(4/4)
P(3/3)
P(3/3)
P(4/4)
P(3/3)
P(3/3)
N(0/3)
N(0/4)
N(1/4)
G(1/3)
N(0/4)
N(1/4)
N(1/4)
N(1/4)
P(2/3)
P(2/3)
P(2/2)
P(2/2)
N(0/4)
N(0/3)
N(0/4)
N(1/4)
P(2/4)
P(2/4)
N(0/3)
N(0/4)
N(0/3)

23
29

Ⅲ

Ⅳ

20 coded

5 coded

1 set

3 sets1

2,4-Dichloronitrobenzene

611-06-3

NC

N(1/4) N(0/3) N(0/3)

2

DNCB(1-Chloro-2,4dinitrobenzene)

97-00-7

0.06

1A

P(2/2)

P(2/2) P(2/2)

3

Glyoxal solution

107-22-2

0.8

1A

P(2/2)

G(1/3) P(2/2)

4

1,2-Benzisothiazol-3(2H)one

2634-33-5

8

1B

P(2/2)

P(2/2) P(2/2)

5

Citral5392-40-55

1B

P(2/2)

P(2/2) P(2/2)

6

4-Hydroxybenzoic acid

99-96-7NC

N(0/4) N(0/3) N(0/4)

7Beryllium sulphate7787-56-6

0.001

1A

N(1/4) N(0/3) N(0/3)

8Formaldehyde

50-00-00.61

1A

P(2/3)

P(2/2) P(2/3)

9Chlorpromazine HCL

69-09-0

0.14

1A

P(2/2)

P(2/2) P(2/2)

10Chloramine T

127-65-1

0.4

1A

P(2/3)

P(2/2) P(2/2)

11

Benzyl salicylate

118-58-1

2.9

1B

P(2/2)

P(2/2) P(2/3)

12Dihydroeugenol

2785-87-7

6.8

1B

P(2/3)

P(2/2) P(2/2)

13

Nickel chloride

7718-54-9

1B

P(2/2)

P(2/2) P(2/2)

14Imidazolidinyl urea

39236-46-9

24

1B

P(2/3)

P(2/3) P(2/2)

15

R(+)Limonene

5989-27-5

69

1B

P(2/2)

N(0/4) N(0/3)

16Methylmethacrylate

80-62-690

1B

N(0/3) N(0/4) N(0/4)

17

Benzyl alcohol

100-51-6NC

N(0/4) N(0/3) N(0/3)

18

Dimethyl isophthalate

1459-93-4

NC

N(0/3) N(0/4) N(1/4)

19

4-Aminobenzoic acid150-13-0NCN(0/3) N(0/3) N(0/4)

20

Xylene1330-20-7

95.8

NC

N(0/4) N(0/3) N(0/3)

1Ethyleneglycol
dimethacrylate

97-90-528

1B

2

4-Nitrobenzylbromide

100-11-8

0.05

1A

3

4-Allylanisole

140-67-0

18

1B

4

Ethylenediamine

107-15-3

2.2

1B

5

Salicylic acid

69-72-7

P: positive, N: negative, G: inconclusive

24
30

NC

P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/4)
P(2/3)
P(2/2)
N(0/3)
P(2/3)
N(1/4)

P(2/4)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
N(1/4)
N(1/4)
N(1/4)
N(1/4)
N(1/4)
N(0/3)

P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
P(2/2)
N(0/3)
N(1/4)
N(1/4)
N(1/4)
N(0/3)
N(0/3)

Appendix 2 ガイドラインに収載された IL-8 Luc assay により得られた 143 物質の評価
結果の比較
GHS

LLNA
Potency
category

IL-8 Luc
assay(DMSO)

IL-8 Luc
assay(X-VIVO)

IL-8 Luc assay(Test Guideline
protocol)(Op. 2)

1-Benzoylacetone (1-BA)

1A

Extremepositive

positive

positive

1-Chloromethylpyrene

1A

Extremepositive

positive

positive

1A

Extremepositive

positive

positive

1A

Extremepositive

positive

positive

Bandrowski's base

1A

Extremepositive

positive

positive

7787-56-6

Beryllium sulfate tetrahydrate

1A

Extremenegative

positive

positive

770-34-8

Dinitrofluorobenzene

1A

Extremepositive

positive

positive

8886-38-4

Diphenylcyclopropenone(DPCP)

1A

Extremepositive

positive

positive

915646-46-5

Oxazolone

1A

Extremenegative

positive

positive10

106-51-4

p-Benzoquinone

1A

Extremepositive

positive

positive11

7778-50-9

Potassium dichromate

1A

Extremepositive

positive

positive

121154-59-2

Tetrachlorosalicylanilide

1A

Extremepositive

positive

positive13

123-31-9

1,4-Dihydroquinone

1A

Strongpositive

positive

positive14

106-50-3

1,4-Phenylenediamine(PPD)

1A

Strongnegative

positive

positive15

95-55-6

2-Aminophenol

1A

Strongpositive

positive

positive16

5307-14-2

2-Nitro-1,4-phenylenediamine

1A

Strongpositive

negativeinconclusive

17

94-36-0

Benzoyl peroxide

1A

Strongpositive

negativeinconclusive

18

100-39-0

Benzyl bromide

1A

Strongpositive

positive

positive19

127-65-1

Chloramine-T

1A

Strongpositive

positive

positive20

69-09-0

Chlorpromazine hydrochloride

1A

Strongpositive

positive

positive

217646-79-9

Cobalt chloride hexahydrate

1A

Strongpositive

positive

positive22

50-00-0

Formaldehyde

1A

Strongpositive

positive

positive23

111-30-8

Glutaraldehyde

1A

Strongpositive

positive

positive

246259-76-3

Hexyl salicylate

1A

Strongpositive

negativeinconclusive

25

55406-53-6

Iodopropynyl butylcarbamate

1A

Strongpositive

positive

positive

26

1166-52-5

Lauryl gallate

1A

Strongpositive

positive

No.

CAS#

1

93-91-4

21086-00-6

3

97-00-7

4

100-11-8

520048-27-5

6

27
28

Chemical

2,4-Dinitrochlorobenzene(DNCB)
4-Nitrobenzyl bromide (4NBB)

108-31-6

Maleic anhydride

1A

Strong35691-65-7

Methyldibromoglutaronitrile(MDGN)

1A

Strongnegativeout of negativeout ofADAD

positiveinconclusive,
negativeout of AD

positive

positive

positive

negative

negativeinconclusive,
negativeout of AD

out

out

29

85-44-9Phthalic anhydride

1A

Strong30

121-79-9

Propyl gallate

1A

Strongpositive

positive

positive31

90-15-3

1-Naphthol

1A

Moderate

positive

positive

positive

32

579-07-7

1-Phenyl-1,2-propanedione

1A

Moderate

positive

positive

positive33

96-27-5

1-Thioglycerol(3-Mercapto1,2-propanediol)

1B

Moderate

positive

positive

positive

342634-33-5

1,2-Benzisothiazolin-3-one

1B

Moderate

positive

positive

positive

of AD

of AD

25
31

IL-8 Luc
assay
(X-VIVO)

IL-8 Luc assay(Test Guideline
protocol)(Op. 2)

ChemicalGHS

3344-77-2

12-Bromo-1-dodecanol

1B

Moderate

positive

positive

positive36

818-61-1

2-Hydroxyethyl acrylate

1A

Moderate

negative

negative

negative37

149-30-4

2-Mercaptobenzothiazole (2MBT)

1A

Moderate

positive

positive

positive38

93-51-6

2-Methoxy-4-methylphenol

1B

Moderate

positive

positive

positive39

93-53-8

2-Phenylpropionaldehyde

1B

Moderate

positive

positive

positive40

4313-03-5

2,4-Heptadienal

1B

Moderate

positive

positive

positive41591-27-5

3-Aminophenol

1B

Moderate

positive

positive

positive42

109-55-7

3-Dimethylaminopropylamine

1B

Moderate

positive

positive

positive

4317369-59-4

3-Propylidenephthalide

1B

Moderate

positive

positive

positive44

119-84-6

3,4-Dihydrocoumarin

1B

Moderate

negative

positive

positive45

106-47-8

4-Chloroaniline

1B

Moderate

negative

positive

positive

46

21834-92-4

5-Methyl-2-phenyl-2-hexenal

1B

Moderate

positive

positive

positive47

101-39-3

a-Methylcinnamic aldehyde

1B

Moderate

positive

positive

positive48

118-58-1

Benzyl salicylate

1B

Moderate

positive

positive

positive49

122-57-6

Benzylideneacetone

1B

Moderate

positive

positive

positive50

104-55-2

Cinnamic aldehyde(Cinnamal)

1B

Moderate

positive

positive

positive51

23593-75-1

Clotrimazole

1B

Moderate

positive

negativeinconclusive52

141-05-9

Diethyl maleate

1B

Moderate

negative

positive

positive53

64-67-5

Diethyl sulfate

1B

Moderate

negative

positive

positive54

111-40-0

Diethylenetriamine

1B

Moderate

positive

positive

positive55

2785-87-7

Dihydroeugenol (2-Methoxy4-propylphenol)

1B

Moderate

positive

positive

Positive56

107-15-3Ethylenediamine

1B

Moderate

negative

positive

Positive57

107-22-2

Glyoxal1A

Moderate

negative

positive

Positive58

97-54-1

Isoeugenol

1A

Moderate

positive

positive

Positive59

111-80-8

Methyl-2-nonynoate

1B

Moderate

negative

positive

Positive60

2682-20-4

Methylisothiazolinone, 2Methyl-2H-Isothiazol-3-one

1A

Moderate

positive

positive

Positive

61

10101-97-0

Nickel sulphate hexahydrate

1B

Moderate

positive

positive

Positive

627718-54-9

Nickel (II) chloride

Moderate

positive

positive

Positive

63

18031-40-8

Perillaldehyde

1B

Moderate

positive

positive

Positive64

122-78-1

Phenylacetaldehyde

1B

Moderate

positive

positive

Positive65

108-46-3

Resorcinol

1B

Moderate

positive

positive

Positive66

133-37-9

Tartaric acid

1B

Moderate

positive

positive

Positive67

137-26-8

Tetramethylthiuramdisulphide(TMTD)

1B

Moderate

positive

positive

Positive

686728-26-3trans-2-Hexenal

1B

Moderate

positive

positive

Positive69552-30-7

Trimellitic anhydride

1B

Moderate

negative

positive

Positive

No.

CAS#

35

26
32

IL-8 Luc
assay(DMSO)

LLNA
Potency
category

IL-8 Luc
assay
(DMSO)

IL-8 Luc
assay(X-VIVO)

IL-8 Luc assay(Test Guideline
protocol)(Op. 2)No.

CAS#

Chemical

GHS

LLNA
Potency
category

70

112-45-8

Undec-10-enal

1B

Moderate

positive

positive

Positive715989-27-5(R)-(+)-Limonene

1B

Weak

negative

positive

Positive72

111-25-1

1-Bromohexane

1B

Weak

negative

negativeinconclusive73

103-11-7

2-Ethylhexyl acrylate

1B

Weak

positive

positive

Positive

74

431-03-8

2,3-Butanedione

1B

Weak

positive

positive

Positive75

140-67-0

4-Allylanisole

1B

Weak

negative

positive

Positive

7613706-86-0

5-Methyl-2,3-hexanedione

1B

Weak

negative

positive

Positive77514-10-3

Abietic acid

1B

Weak

positive

positive

Positive78

122-40-7

Amyl cinnamic aldehyde

1B

Weak

positive

positive

Positive79

62-53-3

Aniline1B

Weak

negative

negative

Negative80

94-09-7

Benzocaine

1B

Weak

negative

negativeinconclusive

81

103-41-3

Benzyl cinnamate

1B

Weak

positive

positive

Positive82

1565-94-2

Bis-GMA

1B

Weak

positive

positive

Positive

832426-08-6

Butyl glycidyl ether

1B

Weak

positive

positive

Positive

84

104-54-1

Cinnamic alcohol

1B

Weak

positive

positive

Positive

855392-40-5

Citral

1B

Weak

positive

positive

Positive86

103-95-7

Cyclamen aldehyde

1B

Weak

positive

positive

Positive87

97-90-5Ethylene glycol dimethacrylate

1B

Weak

negative

positive

Positive88

97-53-0

Eugenol

1B

Weakpositive

positive

Positive89

19317-11-4

Farnesal

1B

Weakpositive

positive

Positive90

106-24-1

Geraniol

1B

Weakpositive

positive

Positive91

101-86-0

Hexyl cinnamic aldehyde

1B

Weak

positive

positive

Positive92

107-75-5

Hydroxycitronellal

1B

Weak

positive

positive

Positive

9339236-46-9

Imidazolidinyl urea

1B

Weak

positive

positive

Positive94

80-54-6

Lilial

1B

Weak

positive

positive

Positive95

78-70-6

Linalool

1B

Weakpositive

positive

Positive

96

31906-04-4

Lyral

1B

Weak

positive

positive

Positive

97

80-62-6

Methyl methacrylate

1B

Weak

negative

negativeinconclusive98613-29-6

N,N-Dibutylaniline

1B

Weak

positive

positive

Positive99

112-05-0

Nonanoic acid

1B

Weak

positive

positive

Positive100

144-62-7

Oxalic acid

1B

Weak

positive

positive

Positive101

61-33-6

Penicillin G

1B

Weak

negative

negative

Negative

102

87-86-5

Pentachlorophenol

1B

Weak

positive

positive

Positive

1032050-14-8

Phenol, 2,2-azobis-

1B

Weak

positive

positive

Positive104

93-99-2

Phenyl benzoate

1B

Weak

positive

negativeinconclusive105

110-86-1

Pyridine

1B

Weaknegative

negative

Negative27
33

IL-8 Luc
assay
(X-VIVO)

IL-8 Luc assay(Test Guideline
protocol)(Op. 2)No.

CAS#

ChemicalGHS

1061330-20-7

Xylene1B

Weaknegative

negativeinconclusive

107

127-51-5α-iso-Methylionone

1B

Weak

positive

positive

Positive

108

109-65-9

1-BromobutaneNonnegative

negative

negativeinconclusive

109

71-36-3

1-ButanolNonnegative

negative

negative

Negative110874-23-7

2-Acetylcyclohexanone

Nonnegative

positive

positive

Positive111923-26-2

2-Hydroxypropyl methacrylateNonnegative

negative

negative

Negative112

611-06-3

2,4-Dichloro-1-nitrobenzeneNonnegative

negative

negativeinconclusive

113

99-96-7

4-Hydroxybenzoic acidNonnegative

negative

negativeinconclusive

114

92-48-8

6-MethylcoumarinNonnegative

negative

negativeinconclusive

100-06-1

Acetoanisole (4Methoxyacetophenone)Nonnegativeinconclusive

115

negative

negative

positiveout

positiveoutof AD

positiveout of AD

116

8001-54-5

Benzalkonium chloride

Non

negative117

65-85-0

Benzoic acidNonnegative

negative

negativeinconclusive

118

100-51-6

Benzyl alcohol

Nonnegative

negative

positive

Positive119108-90-7

ChlorobenzeneNonnegative

negative

negativeinconclusive

120

9004-54-0

DextranNonnegative

negative

negative

Negative121

84-66-2

Diethyl phthalateNonnegative

positive

positive

Positive122

68-12-2

Dimethyl formamide

Nonnegative

negative

negative

Negative

1231459-93-4

Dimethyl isophthalateNonnegative

negative

negativeinconclusive

124

94-02-0Ethyl benzoylacetate

Nonnegative

positive

negativeinconclusive

125

121-32-4Ethyl vanilline

Nonnegative

positive

positive

positive

126492-94-4

Furil

Non

negative

positive

negativeinconclusive

127

56-81-5GlycerolNonnegative

negative

negative

negative

128

57-09-0

Hexadecyltrimethylammonium
bromideNonnegative

positive

positive

129

67-63-0IsopropanolNonnegative130

50-21-5Lactic acidNonnegative131

119-36-8

Methyl salicylateNonnegative

of AD

out

out

of AD

positiveout of AD

negative

negative

negative

negative

negative

negativeinconclusiveof AD

negative

negative

positiveout

positiveoutof AD

positiveout of AD

132

124-07-2

Octanoic acid (Caprylic acid)Nonnegative133

150-13-0

p-Aminobenzoic acidNonnegative

negative

negativeinconclusive134

94-13-3

Propyl parabenNon

negative

negative

positive

positive

135

57-55-6

Propylene glycol

Nonnegative

negative

negative

negative

136

81-07-2

Saccharin

Nonnegative

negative

positive

positive137

69-72-7

Salicylic acidNonnegativeinconclusiveof AD

negative

negative

positiveout

positiveoutof AD

positiveout of AD

138

151-21-3

Sodium lauryl sulfate

Nonnegative139

3810-74-0

Streptomycin sulfate

Nonnegative

negative

negative

negative

140

63-74-1

Sulfanilamide

Nonnegative

negative

negativeinconclusive28
34

IL-8 Luc
assay(DMSO)

LLNA
Potency
categoryof ADIL-8 Luc assay(Test Guideline
protocol)(Op. 2)

IL-8 Luc
assay(DMSO)

IL-8 Luc
assay(X-VIVO)

positiveout

positiveoutof AD

positiveout of AD

No.

CAS#

Chemical

GHS

LLNA
Potency
category141

9005-65-6

Tween-80

Nonnegative142

121-33-5

VanillinNonnegative

positive

positive

positive

1437733-02-0

Zinc sulfate

Nonnegative

positive

positive

positiveof AD

out of AD: out of applicability domain, inconclusive: Should not be considered2935