β-ラクタム薬耐性菌とその検出法
Resistant Bacteria Against β-lactam Antibiotics.

―話題の基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ産生菌およびメタロ-β-ラクタマーゼ産生菌について―
関東化学株式会社 技術・開発本部 伊勢原研究所 臨床化学研究室

中野 倫太

TOMOTA NAKANO
Clinical Chemistory Department Isehara Research Laboratory,Technology & Development Division, Kanto Chemical Co., Inc.

関東化学株式会社 試薬事業本部 ライフサイエンス部 マイクロバイオ部

久保 亮一
RYOICHI KUBO

Life Science Department Reagent, Division, Kanto Chemical Co., Inc.

1. はじめに

これまでにペニシリン系薬に加えて、セフェム系薬、カルバペネム系薬、モノバクタム系薬などが開発されてきた。

細菌感染症の治療には種々の抗菌薬が用いられてい特に、1980年代に登場した第3世代セフェム薬とカルバるが、近年になり、各種抗菌薬に対して耐性を獲得したペネム薬は従来型のβ-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ、セ病原菌が出現し、21世紀の医療において大きな問題とファロスポリナーゼ、オキサシリナーゼ）に対して安定でなっている。このような薬剤耐性をもつ菌の出現を監視あるといった特性を有していることから、細菌感染症を起していくことは、細菌感染症患者に適切な治療を施す上こした入院患者などの治療に幅広く使用されている。

で必要不可欠であるばかりでなく、薬剤耐性菌の蔓延や

表1 β-ラクタマーゼの分類新たな薬剤耐性菌の出現を防止する上で極めて重要である。
最近、基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ（ExtendedSpectrum β-Lactamase、ESBL）産生菌やメタロ-β-ラクタマーゼ（Metallo-β-Lactamase、MBL）産生菌といったβ-ラクタム薬に高度耐性を示す菌の蔓延が懸念されている。本稿ではこれらβ-ラクタム薬耐性菌の性状、並びに、ごく最近開発されたESBL、MBL同定検出試薬ついて概説する。

2. β-ラクタム薬とβ-ラクタマ ーゼ産生菌

3. ESBLおよびMBLとその産生菌

現在、細菌感染症治療に使用されている抗菌薬としてESBLは、従来型のβ-ラクタマーゼには安定であった第は、β-ラクタム薬、マクロライド薬、テトラサイクリン薬、アミ3世代セフェム薬やモノバクタムを含む広い範囲のβ-ラクタノグリコシド薬、キノロン薬などがある。これら抗菌薬の中ム薬を分解する酵素である。その遺伝子はペニシリナー

でβ-ラクタム薬は副作用が少なく細菌に対して選択毒性がゼやオキサシリナーゼ遺伝子が突然変異したものといわ高いことから、感染症治療に汎用されている。その一方、れている。ESBL産生菌は1980年頃、ヨーロッパ、米国

細菌の中にはβ-ラクタム薬の基本骨格であるβ-ラクタム環で相次いで発見され、日本国内で最初に存在が確認さを加水分解し、抗菌力を失わせる酵素（β-ラクタマーゼ）れたのは1995年である4）。ESBLは肺炎桿菌（Klebsiellaを産生するものが存在している（表1）1-3）。このβ-ラクタマpneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）から検出さーゼに対抗すべく、β-ラクタム薬は様々な改良がなされ、れる場合が多く、報告事例は年々増加している。

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MBLは活性中心に亜鉛を有していることからこの名がHMRZ-86を開発し、この化合物を用いたESBLおよび付されている。この酵素は第3世代セフェム薬に加え、MBL産生菌の検出方法を構築した 13）。この方法ではβ-ラクタム薬の中で切り札的な存在であるカルバペネム

MBL活性を阻害するキレート剤を併用することで、ESBL系抗菌薬をも分解するといった憂慮すべき性質を示す酵産生菌とMBL産生菌の鑑別を可能にしている。そこで当素である。本酵素の産生菌としてはBacillus cereusや社は、花木先生らと共同で、HMRZ-86を用いたESBL産

Stenotrophomonas maltophiliaなどが報告されてい生菌とMBL産生菌検出試薬の実用化に取り組み、図1

たが5,6）、1990年代に至り、新たにMBL産生能を獲得しに示すような試験紙タイプの検査試薬を開発した。

た緑膿菌（ Pseudomonas aeru-ginosa ）やセラチア（Serratia marcescens）が日本各地の施設から報告されている 7,8）。
これらのESBLおよびMBL産生菌は弱毒菌であるが、高度医療が発達した現代では免疫機能が低下した患者の増加により、それらの感染症は増加している。また、

テストストリップA、BにHMRZ-86溶液を滴下する。

被検菌のコロニーを採取する

一旦それらの感染症が発症すれば容易に難治性に陥り、時には致死性の感染症を起こすことがある。一般的に感染症の治療にはβ-ラクタム薬が使用されるため、ESBLまたはMBL産生菌であるか否かの確認は、治療2〜15分放置
黄色：陰性 赤色：陽性する抗菌薬を選択する上で極めて重要になっている。さHMRZ-86 溶液を滴下した部位に被検菌を塗りつける

図1 試験方法

らに、ESBLおよびMBL産生菌は院内感染の起因菌になりえることから、これらβ-ラクタマーゼ産生菌対策は急務となっている。

本試薬の測定手順は、HMRZ-86溶液をテストストリップに滴下し、分離培養した試験菌を塗沫し、色調の変化を確認するという簡便なものであり、判定までの時間

4. ESBLおよびMBL産生菌の検査法は2〜15分と非常に短時間である。MBL阻害剤添加の有無による2種類のテストストリップの反応性からESBLお従来のESBL産生菌とMBL産生菌の検査方法を表2に示す

よびMBLを鑑別する
（表3）。

9-12）

。ESBL産生菌およびMBL産生菌の検査は、微量液体希釈法やディスク拡散法などが用いられている

表3 本試薬によるβ-ラクタマーゼの型分類

が、菌を培養するため検査時間が長いといった問題がある。またPCR法や等電点電気泳動は専門の高度な技術が必要である上、検査コストが高いといった問題がある。いずれの方法も一般の検査室等で実施するには難しい面があり、より簡便且つ迅速な検査法の確立が求められている。
表2 ESBLおよびMBLの検査法

実際に試験したテストストリップを図2に示す。陽性は赤色、陰性は黄色とコントラストが明瞭で、容易に目視で判別することができた。本試薬を用い、産生するβ-ラクタマーゼの種類が明らかになっているATCC標準株や臨床分離株などの30株について試験した結果を表4に示す。ESBL産生菌とMBL産生菌、またはそれ以外のβラクタマーゼ産生菌を正しく同定できることが確認され、ごく最近、北里研究所の花木秀明先生らは、ESBLおよび M B Lと特 異 的に 反 応して 変 色する新 規 化 合 物

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本試薬を用いることにより、ESBLおよびMBL産生菌を同定、検出できることが示唆された。

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5）Sadath LD, Abdaham EP : Zinc as a cofactor for a
cephalosporinase from Bacillus cereus 569. BiochemJ, 98 : 11c-13c, 19666）Saino K, et al. : Purification and properties ofinducible penicillin β-lactamase isolated

Pseudomonas maltophilia. Antimicrob Agents
図2 CEPase、MBL、ESBLと2種類のテストストリップとの反応性
表4 各種β-ラクタマーゼ産生菌の試験成績

Chemother, 22 : 564-570, 1982
7）Osano E, et al. : Molecular characterization of anenterobacterial metallo-β-lactamase found in aclinical isolate of Serratia marcescens that shows
imipenem resistance. Antimicrob Agents Chemother,
39 : 824-829, 19958）Senda K, et al. : Multifocal outbreaks of metallo-βlactamase producing Pseudomonas aeruginosa
resistant to broad-spectrumβ-lactams, including
carbapenems. Antimicrob Agents Chemother, 40 :349-353, 1996

5. まとめ今日、ESBLおよびMBL産生菌は世界的に広がりを見せており、迅速、正確且つ簡便な検査法が必要になっている。上述のHMRZ-86を用いたESBLおよびMBLの検出試薬は、特別な器具を必要とせず、簡便且つ迅速な検出が可能である。本検査試薬は、殊にESBLおよび

9）National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance Standards for antimicrobial disk
susceptibility tests ; Approved Standard Eighthedition, M2-A8. National Committee for ClinicalLaboratory Standards, Villanova, Pa, 2003
10）National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for Dilution antimicrobial susceptibility

MBLのスクリーニング検査に非常に有用と思われる。なTests for Bacteria That grow Aerobically ; Approved

お、本試薬は近日中に発売の予定である。

Standard Sixth-edition, M7-A6. National Committee

最後に、試薬の開発にあたり、ご懇篤なるご指導を頂いた北里研究所の花木秀明博士、並びに全薬工業株式会社の山崎宏亮様に厚く御礼申し上げる。

for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa, 200311）Jarlier V, et al. : Extended broad-spectrum βLactamases conferring transferable resistance tonewerβ-lactam agents in enterobacteriaceae :hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev

参考文献1）Bush K, et al. : A functional classification scheme for

Infect Dis, 10 : 867-878, 199112）Arakawa Y, et al. : Convenient test for screening

β-lactamases and its correlation with molecularmethallo-β-lactamase producing gram-negativestructure. Antimicrob Agents Chemother, 39 : 1211-

bacteria by using thiol compounds. J Clin Microbiol,1233, 1995.

38 : 40-43, 2000.

2）Ambler RP : The structure of β-lactamases. Philos13）久保亮一ら : 新しい発色基質HMRZ-86を用いたESBLsとTrans R Society Lond (Biol) , 289 : 321-331, 1980

メタロβ−ラクタマーゼの簡易・迅速検査法. 第52回日本3）石井良和：基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ産生大腸菌、クレ感染症学会東日本地方会 プログラム・講演抄録集, P166,

ブシエラ、臨床と微生物, 26 : 121-125, 1999

20034）Ishii Y, et al. : Cloning and sequence of the geneencoding cefotaxime-hyrolyzing class A β-lactamaseisolated from Escherichia coli. Antimicrob Agents

Chemother, 39 : 2269-2275, 1995

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