PRESS RELEASE（2023/02/22）

薬剤性アナフィラキシー制圧の鍵となる新しいシグナル経路を発⾒〜 MRGPRX2 受容体が関わる様々なアレルギー疾患の制御に期待 〜ポイント①

MRGPRX2 受容体を介したマスト細胞の脱顆粒は薬剤性アナフィラキシーと密接に関与するが、この受容体の下流のシグナル経路はほとんど分かっていなかった。

②

本研究ではマスト細胞の機能解析を⾏い、DOCK2 を介した Rac 活性化および PAK1 分⼦のリン酸化が薬剤による脱顆粒を制御していることを突き⽌めた。

③

本経路は薬剤性アナフィラキシーを含め、MRGPRX2 受容体が関わるとされる様々なアレルギー疾患を制御するための新規ターゲットとなる可能性がある。

概要
薬剤に起因するアナフィラキシー（※1）は、医療安全の観点から頻繁に問題となっています。近年、マスト細胞（※2）に発現する Mas 関連 G タンパク質共役型受容体（MRGPRX2、※3）を介して薬剤が直接マスト細胞を刺激することでヒスタミン等の脱顆粒を誘導し、薬剤性アナフィラキシーを招くことが分かってきました。しかし、MRGPRX2 受容体と脱顆粒を繋ぐ分⼦シグナル経路については不明な点が多く、本病態の発症を効果的に抑える予防法や治療法は確⽴されていません。
今回、九州⼤学⽣体防御医学研究所の福井宣規 主幹教授、國村和史 助教、秋好紗弥⾹ 助教らの研究グループは、細胞⾻格制御因⼦である DOCK2（※4）に着⽬することで、薬剤性アナフィラキシーに関わるマスト細胞の脱顆粒メカニズムの⼀端を解明しました。
研究グループはこれまで、DOCK2 が免疫細胞において Rac（※5）を活性化し種々の免疫応答に関与することを報告してきましたが、マスト細胞における役割はよく分かっていませんでした。そこで私達は、DOCK2 を⽋損したマスト細胞やマウス個体を解析したところ、薬剤誘導性の脱顆粒反応やアナフィラキシー症状が著しく減弱することを⾒出しました。DOCK2 を⽋損してもマスト細胞の Ca2+流⼊や幾つかのシグナル伝達分⼦のリン酸化に影響は⾒られませんでしたが、Rac 活性化および PAK1 のリン酸化が障害されていました。さらに、野⽣型マウスや健常⼈由来のマスト細胞を DOCK2 阻害剤や PAK1 阻害剤で処理すると、薬剤による脱顆粒が濃度依存的に抑制されました。
以上のことから、DOCK2-Rac-PAK1 経路は薬剤誘導性の脱顆粒反応に重要な経路であり、薬剤性アナフィラキシー制圧の鍵となる可能性が⽰唆されました。また、マスト細胞の MRGPRX2 受容体を介した反応は慢性蕁⿇疹や接触性⽪膚炎などとの関連も指摘されていることから、各種アレルギー疾患制御への応⽤も期待されます。本研究成果は、2023 年 2 ⽉ 16 ⽇（⽊）に⽶国の雑誌「TheJournal of Allergy and Clinical Immunology」のオンラインサイトに掲載されました。

研究成果の概要図
薬剤がマスト細胞上のMRGPRX2/MRGPRB2 受 容体に結合すると、その下流でDOCK2 による Rac 活性化、PAK1 リン酸化を経てヒスタミン等の脱顆粒が起き、薬剤性アナフィラキシーを引き起こす。
この脱顆粒とアナフィラキ
シーは DOCK2 阻害剤によって抑制できる。
【研究の背景と経緯】
アナフィラキシー（※1）は様々な原因物質 (アレルゲン) の侵⼊に対して全⾝的に引き起こされる即時型の過敏反応であり、重篤になると⾎圧低下・意識障害を招きます (アナフィラキシーショック)。ア
ナフィラキシーによる国内の死亡者数は薬剤に起因するものが最多であり、その原因薬剤も抗⽣剤・造影剤・筋弛緩剤・⿇酔薬など医療現場で頻⽤されるものが含まれることから、医療安全を確保する上で問題となっています。しかし、その発症機序については分かっていないことが多いため積極的な予防法や治療法は確⽴されておらず、発症後の早期発⾒・アドレナリン投与に頼っているのが現状です。
薬剤性アナフィラキシーは、薬剤の刺激によってマスト細胞（※2）からヒスタミンなどの⾎管に作⽤する物質が”脱顆粒”によって細胞外に放出されることが主な原因とされています。従来、アレルゲンの感作により誘導された免疫グロブリン E（IgE）抗体と FcRI 受容体を介した刺激が脱顆粒反応の⼊り⼝と考えられ、世界的に研究がなされてきました。その⼀⽅で近年、マスト細胞に発現する Mas 関連 Gタンパク質共役型受容体（※3、ヒトでは MRGPRX2、マウスでは MRGPRB2）に薬剤が直接結合して脱顆粒を誘導する経路が発⾒され、注⽬を集めています。しかしながら、MRGPRX2 受容体の下流で脱顆粒に⾄るまでの分⼦シグナル経路はほとんど不明なままです。
福井宣規 主幹教授らはこれまで、DOCK2（※4）が Rac（※5）の活性化を介して様々な免疫細胞の細胞⾻格を制御することを⾒出してきました。マスト細胞が秒〜分単位で迅速に脱顆粒を引き起こすまでには細胞⾻格系の再編成を伴う精緻なメカニズムが必要と考えられますが、その脱顆粒現象にDOCK2 が関与するのかどうか、関わるとしたらどのような役割を担っているかは解明されていませんでした。そこで私達は、DOCK2 を遺伝的に⽋損したマウスやマスト細胞を解析することで、薬剤性アナフィラキシーに関わるマスト細胞の脱顆粒誘導機構を検証しました。

【研究の内容と成果】
本研究ではまず、野⽣型マウスと DOCK2 ⽋損マウス、そして DOCK2 と同じサブファミリーに属する DOCK5 の⽋損マウスに対して、マスト細胞の MRGPRX2/MRGPRB2 受容体に結合することが知られるコンパウンド 48/80 という化合物を静脈内に投与し、その後の体温変化をモニタリングしました。
その結果、野⽣型マウスと DOCK5 ⽋損マウスでは速やかにアナフィラキシーショック状態に⾄りまし
たが、DOCK2 ⽋損マウスでは体温はあまり低下しませんでした（図 1：A）。これは、抗⽣剤の⼀種であるシプロフロキサシンの投与によってアナフィラキシーを誘導しても同様の結果でした。また、薬剤投与後 30 分時点の⾎中ヒスタミン濃度を解析したところ、野⽣型マウスと DOCK5 ⽋損マウスに⽐べて DOCK2 ⽋損マウスではあまり上昇しませんでした（図 1：B）。さらに、⽪膚のアナフィラキシー症状を解析した場合においても、DOCK2 ⽋損マウスは薬剤投与に対して抵抗性を⽰しました。これらのことから、DOCK2 は薬剤性アナフィラキシーの発症を規定する分⼦であることが⽰唆されました。
そこで、アナフィラキシーに⼤きく関わるとされるマスト細胞に着⽬し、DOCK2 との関連性を調べました。従来研究で頻⽤されてきた⾻髄由来マスト細胞は MRGPRB2 受容体を発現しないことから、この受容体を発現する結合組織型マスト細胞を培養し、野⽣型と DOCK2 ⽋損マスト細胞間における薬剤誘導性の脱顆粒を⽐較しました。その結果、野⽣型マスト細胞に⽐べて DOCK2 ⽋損マスト細胞ではコンパウンド 48/80、シプロフロキサシン、アトラクリウム（筋弛緩剤の⼀種）といった薬剤に対する脱顆粒が顕著に障害されていました（図 1：C）。

図1

DOCK2 を⽋損したマウスやマスト細胞は、MRGPRB2 受容体を介した薬剤性アナフィラキシーおよび脱顆粒反応に抵抗性を⽰す(A) 薬剤投与後の体温低下の幅は、野⽣型・DOCK5 ⽋損マウスに⽐べて DOCK2 ⽋損マウスは少ない。
(B) ⾎管拡張作⽤を持つヒスタミンの⾎中濃度は、薬剤投与後 30 分時点において野⽣型・DOCK5 ⽋損マウスに⽐べて DOCK2 ⽋損マウスで低い。
(C) マスト細胞に薬剤を添加して 30 分後の脱顆粒反応（培養液中のβ-ヘキソサミニダーゼと呼ばれる酵素を指標に判定）は、野⽣型に対して DOCK2 ⽋損マスト細胞で顕著に障害される。

次に、マスト細胞による薬剤誘導性の脱顆粒を DOCK2 がどのように制御しているのか調べました。
まず、薬剤刺激後のカルシウムイオンの流⼊や Akt・ERK1/2 などのシグナル分⼦のリン酸化に差はありませんでした。しかし、DOCK2 ⽋損マスト細胞では薬剤刺激後の Rac 活性化が障害される⼀⽅、DOCK2 阻害剤として機能するコレステロール硫酸（※6）を野⽣型マスト細胞に添加すると Rac 活性化（図 2：A）および脱顆粒反応（図 2：B）が低下することを⾒出しました。さらに、コレステロール硫酸をマウスに投与すると、薬剤性アナフィラキシー反応は顕著に減弱しました（図 2：C）。

図2

DOCK2 阻害剤により薬剤刺激後の Rac 活性化、脱顆粒、アナフィラキシーが抑制される(A) 野⽣型マスト細胞へコンパウンド 48/80 添加後 10 秒で Rac が活性化するが、コレステロール硫酸（DOCK2 阻害剤）で事前に処理すると濃度依存的に Rac 活性化が障害される。
(B) コレステロール硫酸（50 M）の添加により薬剤誘導性の脱顆粒反応は DOCK2 ⽋損マスト細胞と同程度にまで抑制される。
(C) コレステロール硫酸をマウスに投与することで、薬剤性アナフィラキシー反応は減弱する。

Rac と脱顆粒を繋ぐ経路を同定する上で、私達は Rac のエフェクター分⼦であり、かつ、アクチン線維による細胞⾻格を制御する分⼦ “PAK1” に注⽬しました。野⽣型マスト細胞をコンパウンド 48/80で刺激すると PAK1 の活性化に関わるアミノ酸残基がリン酸化される⼀⽅、DOCK2 ⽋損マスト細胞ではそのリン酸化が障害されていました（図 3：A）。また、野⽣型マスト細胞を PAK1 選択的な阻害剤で処理すると上記リン酸化が障害され、薬剤誘導性の脱顆粒反応も抑制されました（図 3：B）。

図3

PAK1 阻害剤の処理によって、薬剤誘導性の脱顆粒が抑制される(A) 野⽣型マスト細胞ではコンパウンド 48/80 添加後２分で PAK1 の 144 番⽬と 423 番⽬のアミノ酸残基がリン酸化されるが、DOCK2 ⽋損マスト細胞では両⽅のリン酸化が顕著に障害される。
(B) 野⽣型マスト細胞を PAK1 阻害剤（NVS-PAK1-1）で処理すると薬剤誘導性の脱顆粒が抑制される。

最後に、今までの知⾒がヒトにおいても当てはまるかどうか検証しました。まず、健常⼈由来の末梢⾎より造⾎幹細胞のみを採取し、様々な成⻑因⼦を添加して培養することで MRGPRX2 を発現するマスト細胞に分化させました（図 4：A）。その上で、DOCK2 阻害剤（コレステロール硫酸）や PAK1 阻害剤（NVS-PAK1-1）でヒトマスト細胞を処理した際の脱顆粒反応を解析すると、性別を問わずシプロフロキサシン誘導性の脱顆粒が抑制されることが確認できました（図 4：B、C）。以上より、マウス同様にヒトにおいても DOCK2-Rac-PAK1 経路が重要であることが明らかになりました。

図4

ヒトのマスト細胞でも DOCK2 阻害剤・PAK1 阻害剤は薬剤誘導性の脱顆粒反応を抑制する(A) 健常⼈の末梢⾎より採取した CD34+造⾎幹細胞を SCF、IL-3、IL-6 といった成⻑因⼦で 10週間培養すると、c-Kit+ MRGPRX2+ FcRI+の結合組織型マスト細胞に分化する。
(B) コレステロール硫酸を事前に添加しておくと、シプロフロキサシン誘導性の脱顆粒反応が濃度依存的に抑制される（男性・⼥性由来マスト細胞を問わず）。
(C) PAK1 阻害剤（NVS-PAK1-1）を事前に添加しておくと、薬剤誘導性の脱顆粒反応が抑制される。

【今後の展開】
本研究では、DOCK2-Rac-PAK1 経路が薬剤誘導性の脱顆粒反応に重要な経路であり、薬剤性アナフィラキシー制圧の鍵になることを明らかにしました。また、DOCK2 阻害剤として今回⽤いたコレステロール硫酸は私達の⾝体で合成されている天然物質であり、異物に対する過剰なアレルギー反応が起きないよう⽣理的な意義を持っている可能性があります。さらに、最近の臨床研究によるとマスト細胞のMRGPRX2 受容体を介した反応は慢性蕁⿇疹や⽪膚肥満細胞症、接触性⽪膚炎などと関連していることが指摘されているため、本知⾒の各種アレルギー疾患制御への応⽤も期待されます。

【⽤語解説】（※1） アナフィラキシー
蕁⿇疹や呼吸困難、嘔吐などを伴う急性のアレルギー症状をアナフィラキシーと呼び、さらに重篤なものでは⾎圧低下を伴うアナフィラキシーショックに進み、対応が遅れると死に⾄る。アナフィラキシーの原因物質としてハチ刺傷による昆⾍毒、甲殻類などの⾷物、そして薬剤が挙げられる。
（※2）マスト細胞
細胞内にヒスタミンなどの顆粒を多く蓄えており、その細胞形態から肥満細胞とも呼ばれる。抗原に感作されると蓄えた顆粒を迅速に放出し、寄⽣⾍の排除に働く。しかし、顆粒中に含まれる様々な物質が⾎管にも作⽤することでアナフィラキシーを引き起こすため、先進国では負の側⾯が⼤きい。
（※3）Mas 関連 G タンパク質共役型受容体
ヒトでは MRGPRX2 受容体として知られ、主に⽪膚に存在するマスト細胞で発現している。マウスではMRGPRB2 受容体に相当する。コンパウンド 48/80 やシプロフロキサシン（抗⽣剤）、アトラクリウム（筋弛緩剤）といった物質がリガンドとなり、マスト細胞を直接刺激する。IgE 抗体を介する経路とは異なり初回の感作で脱顆粒を誘導すること、反応が速いことが特徴である。
（※4）DOCK2（Dedicator of cytokinesis 2）
免疫細胞のみで発現し、細胞の動きや活性化を制御しているタンパク質。低分⼦量 G タンパク質の 1 種である Rac の活性化を介して、アクチン線維の重合・再構築を制御する。
（※5）Rac
Rho ファミリーに属する低分⼦量 G タンパク質。GDP 結合型から GTP 結合型へ転換することで活性型となり、標的分⼦に結合して細胞内シグナルを伝達する分⼦スイッチとして機能する。
（※6）コレステロール硫酸
コレステロールから合成され、涙や⽪膚に含まれる天然物質。DOCK2 タンパク質内の Rac 活性化ドメインに結合し、DOCK2-Rac 機能を抑制することで “DOCK2 阻害剤” としての⽣理活性作⽤を持つ。
【謝辞】
本研究は、国⽴研究開発法⼈⽇本医療研究開発機構（AMED）免疫アレルギー疾患実⽤化研究事業「⾷物・薬品アナフィラキシーにおける DOCK ファミリー分⼦の機能と制御機構の解明」（研究代表者：福井宣規）、⾰新的先端研究開発⽀援事業ユニットタイプ（AMED-CREST）「胎児・⺟体免疫クロストークによる⽣体恒常性維持と疾患感受性決定の分⼦基盤」（研究代表者：福井宣規）、JSPS 科研費 若⼿研究
「薬剤性アナフィラキシー克服を⽬指したマスト細胞の脱顆粒制御機構の解明」（JP21K15472、研究代表者：國村和史）、九州⼤学 QR Program 若⼿研究「薬剤性アナフィラキシーの攻略を⽬指した分⼦基盤の解明」（No.02243、研究代表者：國村和史）の助成を受けた研究成果です。また、九州⼤学⾼深度オミクス医学拠点形成事業よりご⽀援を頂きました。この場をお借りして御礼申し上げます。
【論⽂情報】
掲載誌：The Journal of Allergy and Clinical Immunology
タイトル：DOCK2 regulates MRGPRX2/B2-mediated mast cell degranulation and drug-inducedanaphylaxis
著者名：Kazufumi Kunimura, Sayaka Akiyoshi, Takehito Uruno, Keisuke Matsubara, Daiji Sakata,Kenji Morino, Kenichiro Hirotani, Yoshinori Fukui
DOI：10.1016/j.jaci.2023.01.029

【お問合せ先】＜研究に関すること＞
九州⼤学 ⽣体防御医学研究所 主幹教授 福井 宣規 (フクイ ヨシノリ)
助教 國村 和史 (クニムラ カズフミ)
TEL：092-642-6828 FAX：092-642-6829
Mail：fukui@bioreg.kyushu-u.ac.jp / kunimura@bioreg.kyushu-u.ac.jp＜報道に関すること＞
九州⼤学 広報室
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