皮膚刺激性試験代替法 EpiDerm および SkinEthics

目次
評価会議報告書 --------------------------------------------------------------------------------

1

第三者評価報告書 -----------------------------------------------------------------------------

7

評価委員会の意見------------------------------------------------------------------------

8

皮膚刺激性試験のための in vitro 試験の科学的評価についての声明---9

皮膚刺激性試験のための 3 種の in vitro アッセイの UN GHS 下における性能および ECVAM による皮膚刺激性の性能標準における参照物質と正確性の値の適用に関する声明 ------------------------------------------------------------

23

再構築ヒト表皮を用いた in vitro 皮膚刺激性試験の性能標準に関する
ESAC 声明------------------------------------------------------------------------------------

37

皮膚刺激性試験代替法 EpiDerm および SkinEthics の評価会議報告書

JaCVAM 評価会議

平成 24 年（2012 年）7 月 4 日

1

JaCVAM 評価会議
吉田武美（日本毒性学会）：座長
浅野哲秀（日本環境変異原学会）
五十嵐良明（国立医薬品食品衛生研究所 生活衛生化学部）
大島健幸（日本化学工業協会）
小笠原弘道（独立行政法人

医薬品医療機器総合機構）

小野寺博志（独立行政法人

医薬品医療機器総合機構）

黒澤 努（日本動物実験代替法学会）
杉山真理子（日本化粧品工業連合会）
西川秋佳（国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター）
長谷川隆一（独立行政法人
牧

製品評価技術基盤機構）

栄二（日本免疫毒性学会）

増田光輝（座長推薦）
横関博雄（日本皮膚アレルギー・接触皮膚炎学会）
吉田 緑 （国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター 病理部）
吉村 功（座長推薦）
渡部一人（日本製薬工業協会）
任期：平成 24 年 4 月 1 日～平成 26 年 3 月 31 日

以上

2

皮膚刺激性試験代替法 EpiDerm および SkinEthics について、第三者評価委員会からの報告を受け
１）、以下の 9 項目について審議した。本 2～8 項目は OECD ガイダンス文書 No．34 に示された検討項目である２）。なお、本動物実験代替法の利用にあたっては、適用範囲を十分に配慮した上で使用されるべきである。
＜審議内容＞
１．検討対象の試験法は、日本のどの法規制やガイドラインに関係しているか。
本試験法は、医薬品、医療機器、医薬部外品若しくは化粧品の原料、又はその他の物質若しく
は製品に関する法規制又はガイドラインが求めている皮膚刺激性に関係する。
２．検討対象の試験法とその妥当性を示すデータは、透明で独立な評価を受けているか。

本試験法は、ECVAM 科学諮問委員会（ESAC)によって評価を受け公表されており、その内容は OECD GD No.34 に準拠している。したがって、透明で独立な評価を受けている。
３．当該試験法で得られるデータは、対象毒性を十分に評価あるいは予測できるものであるか。デー
タは、当該試験法と従来の試験法の、代替法としての繋がりを示しているか。あるいは（同時に）そのデータは、当該試験法と、対象としているあるいはモデルとしている動物種についての影響との繋がりを示しているか。
本試験法は、正常ヒト由来表皮細胞からなる 3 次元培養表皮モデルによる試験法であって、試験試料を直接曝露し、接触した表皮細胞の生存率を評価しており、従来の試験法であるヒトおよび動物を用いる皮膚刺激性試験法と類似性がある。そのデータは従来の 4 時間貼布試験法と良好な一致性を示している。
４．当該試験法は、ハザードあるいはリスク、あるいはその両方を評価するのに有用であるか。
本試験法は、化学物質の皮膚刺激性について、 GHS をベースとした EU の「化学品及び混合物の分類、表示、包装に関する規則（CLP 規則）｣に基づき、刺激性(カテゴリー2；スコア 2.3 以上)と非刺激性（カテゴリー表示なし：スコア 2.3 未満）を識別できる。
したがって、本試験法は曝露された化学物質のハザードを評価するのに有用であるが、リスク評価への有用性は確認されていない。
５．当該試験法とその妥当性を示すデータは、その試験法で安全性を保証しようとする、行政上のプログラムあるいは関係官庁が対象としている化学物質や製品を、十分広く対象としたものとなっているか。当該試験法が適用できる条件及び適用できない条件が明確であるか。
・ 試験物質のセットは、OECD により適切に選択された 20 種である。また、これらは GHS をベースとした EU の CLP 規則により定義されたウサギ皮膚刺激性分類システムに従えば、刺激性(カテゴリー2；スコア 2.3 以上)の 10 種、カテゴリーなし（スコア 2.3 未満）の 10 種合計 20 種から成る。したがって、化学物質の GHS 分類の識別に関しては十分であると判断される。た3

だし、製剤は扱っていない。
・ 試験法の適用限界として、細胞の生存率を指標としており、皮膚損傷からの回復効果をみる
ことはできない。ＭＴＴ還元法であることから着色による影響や還元物質による影響を受ける。
６．当該試験法は、プロトコルの微細な変更に対して十分頑健で、適切な訓練経験を持つ担当者と適切な設備のある施設において、技術習得が容易なものであるか。
各試験法のプロトコルが定められており、試験成立条件を満たす限り頑健である。微細なプロト
コル変更による影響は調べられていない。本試験法は基本的な培養技術を習得した担当者と適切な培養設備のある施設において，技術習得が容易である。
７．当該試験法は、時間的経費的に有用性があり、行政上で用いられやすいものであるか。
本試験法の試験にかかる時間は、前培養を含めて 3 日間と短時間である点と、動物実験と比較して受け入れ可能な価格であることから行政上受入れやすい。
＊： 本試験の市販表皮モデル EpiDerm11.3 万円（24well）

Skin Ethics 納入価不明
EPISKIN

9.8 万円（12well）

８．当該試験法は、従来の試験法と比べて、科学的・倫理的・経済的に、新しい試験法あるいは改訂
試験法であることが正当化されているか。
・ 本試験法は、従来の試験法であるヒトおよび動物を用いる皮膚刺激性試験法と類似性があることから科学的に妥当である。
・ 動物を使用せず、動物福祉の面から代替法として妥当であり、正当化されうる。
・ 表皮モデルは日本では入手に時間がかかり、購入後に長期保存ができないこともあるが、経済的にも正当化される。
９. 安全性評価のための行政的資料として、 受け入れ可能な試験法であるか。
・ 本試験法は、4 時間適用による皮膚刺激性を評価する方法であり、GHS の区分 2 で定められた
皮膚刺激性を評価する試験法であるが、我が国の医薬部外品、化粧品の皮膚刺激性の評価に使用されてきた従来の動物モデルを用いた 24 時間適用による皮膚刺激性試験との同等性を判断するための科学的根拠が十分ではない。

・ 一般的な化学物質におけるハザードの評価に利用可能である。
以上の審議の結果、JaCVAM 評価会議は、皮膚刺激性試験代替法 EpiDerm および SkinEthics について以下のように結論した。
本試験法は、倫理的に優れた試験法であり、適切な利用条件下で適用するならば、化学物質の皮膚に対する 4 時間適用の一次刺激性を評価することが可能である。

参考文献
１．皮膚刺激性試験代替法 EpiDerm および SkinEthics の第三者評価報告書
２．OECD (2005) OECD Series on testing and assessment Number 34, Guidance document on the4validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard
assessment, ENJ/JM/MONO(2005) 14
３．Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM),

National Toxicology Program (NTP), et al. Background Review Document:“in vitro
Cytotoxicity Test Methods for Estimating Acute Oral systemic Toxicity”, NIH
Publication No: 07-45185皮膚刺激性試験第三者委員会報告書
皮膚刺激性試験代替法（培養表皮モデル）

平成 23 年 11 月 19 日

皮膚刺激性試験評価委員会

赤松浩彦（藤田保健衛生大学医学部）
寒水孝司（京都大学大学院医学研究科）

皮膚刺激性試験代替法（培養表皮モデル）を用いる方法に対する評価委員会の意見

この度、JaCVAM（日本動物実験代替法評価センター）からの依頼を受け、OECD テス
トガイドライン No.439 In Vitro Skin Irritation Reconstructed Human Epidermis
Test Method 成立のもとになった ECVAM（European Center for the Validation of
Alternative Methods）がこれまでに提出した培養表皮モデルを用いる皮膚刺激性試験
代替法に関する提案書（以前に行われたものは除く）を和訳するとともに、それらの内容および関連資料を検討致しました。
その結果、EpiSkin、EpiDerm SIT 法および SkinEthics RHE 法（MTT 指標）を用いた
皮膚刺激性試験代替法を OECD テストガイドラインに記載された条件下で適切に用いれば、化学物質の皮膚刺激性の有無を区別できると判断しましたのでここに報告致します。
以上

欧州代替法バリデーションセンター（ECVAM）
保健・消費者保護研究所
共同研究センター
欧州委員会
JRC 理事会

皮膚刺激性試験のための in vitro 試験の科学的評価についての声明2008 年 11 月 4・5 日にブリュッセルで開催された第 29 回欧州委員会会議にて、ESAC（ECVAM 科学諮問委員会）非理事会メンバーは以下の声明を全会一致で了承した。
２種類の in vitro 皮膚刺激性試験が、ECVAM 文書“in vitro 皮膚刺激性試験のためのヒト皮膚モデ
ル適用における性能標準”に概説された原理に基づき評価された(1)。これらの性能標準は 2 種類の試験
方法の信頼性と正確性を評価するために用いられた。これら両試験方法はヒト再構築表皮に基づいており、フルバリデートおよび承認された標準的な参照方法（EPISKIN 法）と同様の生物学的または毒性的効果の測定または予測が可能である（2007 年 ESAC 声明およびバリデーション試験報告書）(2、3)。
ESAC 第三者評価パネルによって、以下の試験をもとに提出されたデータの評価が実施された。
１．EpiDerm SIT 法：最新バリデーション（バリデートされた EpiDerm 試験の変法（MTT 指標））
２．SkinEthics RHE 法：追走的バリデーション（MTT 指標）
これらの試験における MTT 分析の性能は、バリデートされ、承認された方法と比較して、R38 皮膚
刺激性および非ラベル（非皮膚刺激性）物質予測のために十分な正確性および信頼性を持つと判断されたことを示す基準に合致した。過去にバリデートおよび承認された皮膚刺激性のための in vitro 法に関する限界を、ここで評価された２種類の方法においても適用する(4)。
この承認は、第三者評価のために作成された文書である、定義されたバリデーション基準をもとに文書を評価した独立した専門家の意見、ECVAM による第三者評価パネルが利用する補助文書および、プロセスを監視する第三者評価パネルの考察に基づいてなされている。
ECVAM
In vitro 毒性試験チーム
チーム長
Joachim Kreysa

2008 年 11 月 5 日1出典
1. ECVAM (2007) Performance Standards for Applying Human Skin Models to In Vitro Skin

Irritation Testing. Online: http://ecvam.jrc.it/
2. ECVAM (2007) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the

Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation. Online: http://ecvam.jrc.it/
3. ECVAM (2007) Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the primary endpoint MTT

and the secondary endpoint IL-1α. Online: http://ecvam.jrc.it/
4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R.,
Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A.,
Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The

ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the
Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA, 52 35,
559-601.

2

参考資料
性能標準を基に実施された皮膚刺激性試験としての２種類の in vitro 試験のバリデーションにおけるECVAM の背景情報
Claudius Griesinger
イスプラ、イタリア
2008 年 11 月 11 日
目次
１．性能標準に基づいたバリデーション試験の背景
２．ECVAM in vitro 皮膚刺激性の性能標準を参考とした２種類の in vitro 皮膚刺激性試験のバリデーション
３．２種類の試験法により評価された指標
４．２種類の試験法の予測値
５．出典
１．性能標準に基づいたバリデーション試験の背景
in vitro 皮膚刺激性試験にヒト皮膚モデルを適用するための ECVAM 性能標準(1)は、ECVAM 皮膚刺激性バリデーション試験（SIVS）においてバリデートされた２種類の市販皮膚モデル、EPISKIN および EpiDerm の特性に基づいている(2-4)。
性能標準には、試験法の科学的有効性を証明するための指針および、新規の類似する試験法または変法が満たすべき最低限の基準が記載されている。性能基準には、(a)テストシステムとして使用される個々の組織の質に関する受入れ基準を含む一般的かつ機能的なモデルの条件が記載されており、(b)受け入れ基準（例：陽性および陰性対照のためのガイダンス値）、(c)試験方法およびデータ解釈によるガイ
ダンス（予測モデル）、(d)フルの前向きバリデーション試験(3)で使われた一連の代表的な化学物質からなる 20 の参照物質および、(e)試験法の信頼性および予測性の性能標準が含まれる。
性能標準とは、フルの前向きバリデーション試験の場合と比較して大幅に数を減らした一連の実験用化学物質（PS 参照物質）に基づいた、新規の方法に対する評価およびバリデーションに役立つツー
ルとなることを目的としている。有害性評価(5)を目的とした新規または改訂版の試験法のバリデーショ
ンおよび国際的な受入れについて示した OECD ガイダンス文書 No.34 に従うことによって、以下に示す２種類の試験法について性能標準に基づいた評価を行うことができる。
a)バリデートされた方法と比較して、構造および機能的パラメーターが十分に類似している試験法（similar：類似方法または me-too：同様の方法）。対応するバリデーション過程は、追走的バリ
デーションとする。

b)

性能標準で概説されている限定的な実験評価の保証が可能な程度のバリデートされた方法のマ
イナーな変更（modified：改訂方法）。対応するバリデーション過程は、最新バリデーションと呼ぶ。

3

２．ECVAM in vitro 皮膚刺激性の性能標準を参考とした２種類の in vitro 皮膚刺激性試験のバリデー
ション
2-1 支持された試験法
第 29 回 ESAC により支持された２種類の試験法a) SkinEthics RHE モデルによる試験法：類似／同様試験法、ECVAM が関与していない追加試験として ECVAM に提出された。本試験は性能標準を参考に、構造的および機能的特徴が十分に類似していることが ECVAM により確認された。よって、本試験法は非 ECVAM 関与の追走的バリ
デーション試験として認められた。
b) EpiDerm SIT モデルによる試験法：以前にバリデートされた EpiDerm 法の変法(2)、ECVAM が関与していない追加試験として ECVAM に提出された。主な変更は、物質の曝露時間が 15 分か
ら 60 分に延長されたことである。他の基本的なパラメーターの変更はない。よって、本試験法は
非 ECVAM 関与の追走的バリデーション試験として認められた。
生体異物の皮膚刺激性評価のためにバリデートされたすべてのヒト再構築組織モデルは、ポスト
インキュベートを 42 時間とすることに注意する。しかしながら、試験は表皮表面が実際に生体異物で処理された時間、つまり曝露時間によって異なる。ECVAM SIVS のいわゆる共通プロトコル(3)に記載されている 15 分の比較的短い曝露時間に対して、本試験では曝露時間が延長されている。
SkinEthics RHE では 42 分の曝露時間だが、上記の EpiDerm SIT 試験では 60 分の曝露時間である。
曝露時間はテストシステムが持つ様々なバリア特性を反映しており、力学的反応を保証するためそれぞれのシステムに応じて調整されている。測定可能な効果を得るために、暴露時間は十分に長くする必要があるが、システムが飽和しない程度の時間にする必要がある。
2.2

提出、評価および第三者評価過程

SkinEthics RHE 法は、スキンエシックラボラトリーズ（フランス・ニース）により 2008 年 4 月 7日に提出された。EpiDerm SIT 法は、ドイツ連邦リスク評価研究所（ベルリン）により 2008 年 4 月
23 日に提出された。
両試験の提出物とも、ECVAM 性能標準文書に詳述されている基準をもとに ECVAM によって評価が行われた(1)。
両試験法の提出物に示された技術移転の外部評価に加え、SkinEthics RHE 法と標準作業手順書の技
術移転は、2008 年 3 月から 5 月にかけて ECVAM で個別に評価された。ECVAM による個別評価は
EpiDerm

SIT 法の場合には不要とみなされた。その理由は、EpiDerm モデルはフル皮膚刺激性バリ

デーション試験(2-4)にて広範な評価が行われており、かつ試験方法はわずかに改定されたのみと考えられたからである。
ECVAM 評価後、試験法についての提出物および ECVAM によって作成された追加の補助資料がESAC 第三者評価パネルにより精査されると共に、ECVAM 性能標準(1)に従って個別に評価された。この第三者評価過程は 2008 年 9 月 8 日に終了した。

4

３．２種類の試験法により評価された指標
両試験において、主要評価項目として MTT 法が使用された。比色分析による細胞の生存率の評価は、MTT 色素が紫色のフォルマザンに変化するミトコンドリア還元を基本にしている。細胞生存率はヒト
再構築表皮モデルにおける、化学物質による刺激性の推定に適したパラメーターであることが実証されている(3、4)。
さらに、SkinEthicsRHE および EpiDerm 法の両提出物において、副次的評価項目として IL（インターロイキン）-1αの情報を提供している。提出書類に記載の IL-1αのデータは、試験法の予測能力の改善については言及していない。したがって、両試験とも MTT 指標のデータのみを用いて、その予測能力を検討している。
IL-1α指標の背景
ECVAM SIVS の結果から、IL-1αは指標として有用であることが示されていた(2)。IL-1αは非古典的経路によって分泌された炎症性メディエーターである(6、7)。ECVAM SIVS では、IL-1αが特定の条件下で有用であり、MTT 指標の偽陰性を特定するための段階的試験体系で用いられた場合などにおいて、ヒト再構築表皮法の感度を増加させる可能性があると判断されている(2-4)。
４．２種類の試験法の予測値
MTT 指標を考慮したバリデートされた２種類の試験法の予測値を表１に示す。20 の参照物質それぞれの試験予測値の中央値（もしくは最頻値）をもとに算出された。比較のために、参照法である EPISKINの換算値を示している。提出された両試験法とも、性能標準で示された予測値に適合している（特異度＝80％、感度＝70％）。
表１．ECVAM バリデーション試験でフルバリデートされた参照法（EPISKIN 法）と比較した場合の、皮膚刺激性試験のための２種類の新規バリデートされた in vitro 試験（SkinEthics RHE およびEpiDerm SIT 変法)の MTT 指標における予測値（％）
EPISKIN (参考法)

Modified EpiDerm SIT

SkinEthic RHE

特異度

80

80

80

感度

70

80

90

偽陽性率

20

20

20

偽陰性率

30

20

10

正確性

75

80

85

５．出典
1. ECVAM (2007) Performance Standards for Applying Human Skin Models to In Vitro Skin Irritation Testing.
Online: http://ecvam.jrc.it/
2. ECVAM (2007) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the Validity of In Vitro

Tests for Skin Irritation. Online: http://ecvam.jrc.it/
3. ECVAM (2007) Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the5secondary endpoint IL-1α. Online: http://ecvam.jrc.it/
4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R.,Cotovió, J., Cole,
T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R.,
Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on

In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on theValidity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on
the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601.
5. OECD (2005) OECD guidance document on the validation and international acceptance of new or updated

test methods for hazard assessment. OECD series on testing and assessment Nr. 34.
6. Prudovsky I, Tarantini F, Landriscina M, Neivandt D, Soldi R, Kirov A, Small D, Kathir KM, Rajalingam D,
Kumar TK. (2008) Secretion without Golgi. J Cell Biochem. 103(5):1327-43.
7. Prudovsky I, Mandinova A, Soldi R, Bagala C, Graziani I, Landriscina M, Tarantini F, Duarte M, Bellum S,
Doherty H, Maciag T. (2003) The non-classical export routes: FGF1 and IL-1alpha point the way. J Cell
Sci. 116(Pt 24):4871-81.

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STATEMENT ON THE SCIENTIFIC VALIDITY OF IN-VITRO TESTS FOR SKIN
IRRITATION TESTING
At its 29th meeting, held on 4-5th November, 2008 at the European Commission in Brussels, the nonCommission members of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) unanimously endorsed
the following statement:
Two in-vitro skin irritation tests have been evaluated according to the principles outlined in the ECVAM
document ‘Performance Standards for Applying Human Skin Models to in-vitro skin irritation testing’(1). These performance standards were used to evaluate the reliability and accuracy of two test
methods which are both based on reconstructed human epidermis and which measure or predict thesame biological or toxic effect as the fully validated and accepted reference method (see ESAC
statement, 2007 and validation study report) (2, 3).
A review of the data submitted on the following studies was conducted by an ESAC peer review panel:
1.

EpiDerm SIT – update validation study: modification of the validated EpiDerm Test (MTT
endpoint)

2.

SkinEthic RHE assay –external catch up validation study (MTT endpoint)

It is concluded that the performance of these assays in these studies met the criteria outlined to beconsidered to have sufficient accuracy and reliability for prediction of R38 skin irritating and no-label(non-skin irritating) test substances compared to the validated and accepted method. Limitations
associated with the previously validated and accepted in-vitro method for skin irritation (e.g.
applicability domain) also apply to the two tests reviewed here (Ref. 4).
This endorsement takes account of the dossiers prepared for peer review; the views of independent
experts who evaluated the dossiers against defined validation criteria; supplementary material madeavailable to the Peer Review Panel by ECVAM; and the considered view of the Peer Review Panelappointed to oversee the process.

Joachim Kreysa
Head of Unit
In-Vitro Toxicology Unit
European Centre for the Validation of Alternative Methods
5th November 2008

Draft ESAC statement on two novel skin irritation test methods

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References
1. ECVAM (2007) Performance Standards for Applying Human Skin Models to In Vitro Skin
Irritation Testing. Online: http://ecvam.jrc.it/
2. ECVAM (2007) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the
Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation. Online: http://ecvam.jrc.it/
3. ECVAM (2007) Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the primary endpoint MTT
and the secondary endpoint IL-1α. Online: http://ecvam.jrc.it/
4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R.,
Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A.,
Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The
ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the
Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA35, 559-601.

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The ESAC was established by the European Commission, and is composed of nominees from the EU
Member States, industry, academia and animal welfare organisations, together with representatives of
the relevant Commission services.
This statement was endorsed by the following members of the ESAC:
Ms Sonja Beken (Belgium)
Mr Albert Breier (Slovakia)
Ms Maija Dambrova (Latvia)
Ms Katalin Horvath (Hungary)
Ms Dagmar Jírová (Czech Republic)
Mr Roman Kolar (Eurogroup for Animals)
Ms Elisabeth Knudsen (Denmark)Mr Manfred Liebsch (Germany)
Mr Lionel Larue (France)
Mr Gianni Dal Negro (EFPIA)
Mr Efstathios Nikolaidis (Greece)
Mr Constantin Mircioiu (Romania)
Mr. Walter Pfaller (Austria; moderator)
Mr Jon Richmond (UK)Ms Vera Rogiers (ECOPA)
Mr Hasso Seibert (ESF)
Mr Dariusz Sladowski (Poland)
Mr Jan van der Valk (The Netherlands)
Mr Carl Westmoreland (COLIPA)
Mr Timo Ylikomi (Finland)
The following Commission Services and Observer Organisations were involved in the consultation
process, but not in the endorsement process itself:
Ms Elke Anklam (IHCP; chairman)
Mr Joachim Kreysa (ECVAM)
Mr Jürgen Büsing (DG RTD)
Ms Silvia Casati (ECVAM, DG JRC)
Mr Thomas Cole (ECVAM, DG JRC, ESAC secretary)
Ms Laura Gribaldo (ECVAM, DG JRC)Mr Claudius Griesinger (ECVAM, DG JRC)
Ms Eimear Kelleher (IHCP)
Ms Karin Kilian (DG SANCO)
Ms Barbara Mentré (DG ENTR)
Ms Pilar Prieto (ECVAM, DG JRC)Mr Juan Riego Sintes (CPSQ, DG JRC)
Ms Sigrid Weiland
Ms Valérie Zuang (ECVAM, DG JRC)Mr Patric Amcoff (OECD)
Mr Hajime Kojima (JaCVAM)
Mr William Stokes (NICEATM)
Mr Raymond Tice (NICEATM)
Ms Marilyn Wind (ICCVAM)

Draft ESAC statement on two novel skin irritation test methods

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Informative Annex

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110

ECVAM Background Information on the Validation of two in vitro Test Methods
for Skin Irritation Testing performed on the Basis of Performance Standards

111

Contents

Claudius Griesinger, Ispra, Italy, 11 November 2008

112

1.

Background to Validation Studies based on Performance Standards ................................................ 4

113
114

2.

Validation of two in vitro skin irritation methods in reference to the ECVAM in vitro Skin Irritation
Performance Standards ............................................................................................................................. 5

115

3.

Endpoints assessed by the two test methods ........................................................................................ 5

116

4.

Predictive values of the two test methods.............................................................................................. 6

117

5.

References................................................................................................................................................... 6

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1.

Background to Validation Studies based on Performance Standards

The ECVAM Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing(1) are based on the specifications of the two skin models that were validated during the ECVAM skinirritation validation study (SIVS), the commercially available EPISKIN and the EpiDerm test methods(2-4).
The Performance Standards describe guidance and minimum performance criteria that novel ‘me-too’or modified test methods should fulfil so that they may be considered scientifically valid. The
performance criteria include inter alia (a) a description of general and functional model conditions
including acceptance criteria regarding the quality of individual tissues used as test system, (b) test
acceptance criteria (e.g. guidance values for positive and negative control), (c) guidance regarding thetest procedure and data interpretation (prediction model), (d) 20 reference chemicals that constitute a
representative set of chemicals used during the full prospective validation study (3) as well as (e)performance criteria for test method reliability and predictivity.
The Performance Standards are intended as a tool to aid the evaluation, assessment and validation ofnovel methods on the basis of an experimental testing set of chemicals (the PS reference chemicals)that is markedly reduced in comparison with that of a full prospective validation study. According toOECD guidance document Nr. 34 on the validation and international acceptance of new or updated
test methods for hazard assessment (5), two types of test methods can be evaluated on the basis ofperformance standards. These area) Test methods that are sufficiently similar with regard to structural and functional parameters incomparison with the validated methodology (“similar methods” or “me-too methods”). The
corresponding validation process is referred to as “catch-up validation”.
b) Modifications of validated methods (“modified methods”) which are minor enough to warrant
the limited experimental assessment as outlined in the Performance Standards. The
corresponding validation process is referred to as “update validation”.

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2.

Validation of two in vitro skin irritation methods in reference to the ECVAM in vitro Skin
Irritation Performance Standards

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2.1

Test methods endorsed

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2.2

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191

3.

The two test methods endorsed by the 29th ESAC area) The SkinEthic RHE model, a similar/me-too method, submitted to ECVAM as a non-ECVAM
coordinated catch-up study. The test was confirmed by ECVAM as sufficiently similar withregard to its structural and functional characteristics in reference to the PerformanceStandards and the test method was therefore admitted as a non-ECVAM coordinated catch-up
validation study.
b) The EpiDerm SIT model, a modification of the previously validated EpiDerm method (2),submitted to ECVAM as a non-ECAVM coordinated update validation study. The main
modification performed is the prolongation of the exposure time to the test substances from 15(‘common protocol’, ECAVM SIVS) to 60 minutes, while all other essential model parameters
remained unchanged. The test method was therefore admitted by ECVAM as a Non-ECVAM
coordinated update validation study.
It is important to note that all human reconstructed tissue models that have been validated so far forthe assessment of skin irritancy potential of xenobiotics, use a postincubation time of 42 hours.
However, the assays differ with regard to the exposure time employed, i.e. the period that the
epidermal surface is acutely treated with the xenobiotic. In contrast to the relatively short exposure
time of 15 minutes outlined in the so-called “common protocol” of the ECVAM SIVS (3), the assays
validated in the current context use extended exposure times: the modified EpiDerm SIT assay
features, as stated above, an exposure time of 60 minutes while the SkinEthic RHE uses an exposure
time of 42 minutes. The exposure times are understood to reflect the different barrier properties of thetest systems and are adjusted for each test system in order to guarantee a dynamic response: theexposure time needs to be long enough to allow the development of measurable effects while being
short enough to ensure that the system is not driven into saturation.
Submission, evaluation and peer review process

The SkinEthic RHE test method had been submitted by SkinEthic Laboratories, Nice, France on 7
April 2008. The EpiDerm SIT test method had been submitted on 23 April 2008 by the Federal Institutefor Risk Assessment (BfR), Berlin, Germany.
Both test method submissions were evaluated by ECVAM on the basis of the criteria laid out in the
ECVAM performance standards document (1). In addition to the external assessment of transferability
provided in both test method submissions, the transferability of the SkinEthic RHE method as well as
its standard operating procedure (SOP) were independently assessed and confirmed in-house at
ECVAM from March to May 2008. Such independent assessment by ECVAM was deemed notnecessary in the case of the EpiDerm SIT method since the EpiDerm model had undergone extensive
assessment during the full skin irritation validation study (2-4) and since the modification of the test
method was considered minor.
After ECVAM evaluation, the test method submissions and additional auxiliary material made available
by ECAVM were reviewed by an ESAC Peer Review Panel and independently evaluated by this panel
with regard to the ECAVM Performance Standards (1). The Peer Review Process was finalised on
September 8, 2008.
Endpoints assessed by the two test methods

Both tests use the MTT test as primary endpoint. This colorimetric assay for cell viability is based on
the mitochondrial reduction of the vital dye MTT [3-(4,5-Dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide] to a purple-coloured formazan. Cell viability has been demonstrated to be a suitableparameter to extrapolate on the irritancy potential of chemicals in human reconstructed epidermis
models (3,4).
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In addition, both the SkinEthic RHE and EpiDerm submission provided information on the secondary
endpoint IL-1α (Interleukin 1 alpha). The data on IL-1α submitted in both dossiers did not demonstrate
an improvement of the predictive capacity of the test methods. Therefore, for both methods, only thedata for the MTT endpoint were considered with regard to the predictive capacity.

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Background to the IL1 α endpoint:

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210

4.

As a result of the ECVAM SIVS, the IL-1α endpoint had been suggested as a potentially useful adjunct(2). IL-1α is an inflammatory mediator secreted by the non-classical pathway (6,7). The ECVAM SIVS
had concluded that IL 1α may be capable, under certain conditions, to increase the sensitivity ofhuman reconstructed epidermis assays (2-4), e.g. when used in a tiered testing approach to identify
false negatives of the MTT endpoint.
Predictive values of the two test methods

Considering the MTT endpoint, the two validated method have predictive values as shown in Table 1,
calculated on the basis of the median (or mode) of the individual laboratory predictions for each of the
20 reference chemicals. For comparison, the corresponding values for the reference method EPISKIN
are provided. Both submitted test methods meet the values of predictivity indicated in the performancestandards (specificity = 80% and sensitivity = 70%).
Table 1: Predictive values (in %) for the MTT endpoint of the two novel validated in vitro tests for skinirritation testing (SkinEthic RHE and modified EpiDerm SIT) in comparison to the fully validated
reference method (EPISKIN) of the ECVAM skin irritation validation study.
EPISKIN (reference method)

Modified EpiDerm SIT

SkinEthic RHE

Specificity

80

80

80

Sensitivity

70

80

90

False positive rate

20

20

20

False negative rate

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Accuracy

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227
228

5.

References
1. ECVAM (2007) Performance Standards for Applying Human Skin Models to In Vitro Skin
Irritation Testing. Online: http://ecvam.jrc.it/
2. ECVAM (2007) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the
Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation. Online: http://ecvam.jrc.it/
3. ECVAM (2007) Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the primary endpoint MTT
and the secondary endpoint IL-1α. Online: http://ecvam.jrc.it/
4. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R.,
Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A.,
Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The
ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the
Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA35, 559-601.
5. OECD (2005) OECD guidance document on the validation and international acceptance of
new or updated test methods for hazard assessment. OECD series on testing andassessment Nr. 34.

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6. Prudovsky I, Tarantini F, Landriscina M, Neivandt D, Soldi R, Kirov A, Small D, Kathir KM,
Rajalingam D, Kumar TK. (2008) Secretion without Golgi. J Cell Biochem. 103(5):1327-43.
7. Prudovsky I, Mandinova A, Soldi R, Bagala C, Graziani I, Landriscina M, Tarantini F, Duarte
M, Bellum S, Doherty H, Maciag T. (2003) The non-classical export routes: FGF1 and IL1alpha point the way. J Cell Sci. 116(Pt 24):4871-81.

Draft ESAC statement on two novel skin irritation test methods

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皮膚刺激性試験のための 3 種の in vitro アッセイの UN GHS 下における性能およびECVAM による皮膚刺激性の性能標準における参照物質と正確性の値の適用に関する声明
2009 年 3 月 9-10 日に開催された欧州代替法評価センター科学諮問委員会（ESAC）の第 30 回会議にて、非常任メンバーは以下の声明を全会一致で了承した。その後、明記された手続きにより ESAC 事務局での校了とESAC での最終合意を経て 2009 年 4 月に声明が発効された。
1. UN GHS 下における ECVAM でバリデートされた皮膚刺激性 in vitro 試験の性能
3 種の再構築ヒト表皮モデルを用いた皮膚刺激性 in vitro 試験法（Episkin 法、EpiDerm SIT 変法、SkinEthics
RHE 法）が、従来の EU 分類システムに従って、ECVAM により既にバリデートされている。この分類システムは、数年後、国連（以下、UN とする）の「化学品の分類および表示に関する国際調和システム（GHS [1]）」に基づく
CLP 規制下（以下、参照）の新しい分類システムに置き換えられる。新たな CLP の規則に従った分類では、以下の期限が適用される。
・2010 年 12 月 1 日 物質の分類
・2015 年 6 月 1 日 混合物の分類（すなわち、調製品）
重要なこととして、2003 年から 2007 年に実施された ECVAM による皮膚刺激性バリデーション研究（以下、SIVSとする[2]）では、すでに新しい UN GHS 分類システムを考慮して試験物質が選択されていた。ECVAM による
SIVS が終了すると、Episkin 法は皮膚刺激性を区別する方法として信頼できる唯一の試験法であるとされた（2007 年 4 月 ESAC 声明 [3]）。そのため，EpiSkin 法の予測性に関する性能が、2007 年 5 月に発行された
ECVAM による皮膚刺激性の性能標準の正確性と信頼性に対する要求水準を決定するために使用された。その後、EpiDerm SIT 変法と SkinEthics RHE 法が、20 の指定された参照物質（2008 年 11 月 ESAC 声明[4]）を用いて、性能標準のもとバリデートされた。
2008 年 12 月、EU は「分類」と「表示」のために UN GHS を採用し、「化学品および混合物の分類、表示、梱包に関する規制（CLP 規制 EC1272/2008 [5]」によりこれを実行する予定である。この規制は 2009 年 1 月 20 日から実施され、移行期間を経て、これまでの EU における化学品および混合物（すなわち、調製品）の分類の規制にとって代わることなる。UN GHS システムの規定に従うと、新たな CLP 規制下の皮膚刺激性分類システムは、単一の皮膚刺激性のカテゴリー（カテゴリー2）を使用するので、刺激性（カテゴリー2）と非刺激性（カテゴリーなし）を区別する 2 つのカテゴリーを使用する。しかし、皮膚刺激性の分類と表示に関する UN GHS の規則により、カテゴリ
ーなしとカテゴリー2 の物質を分けるカットオフ値は、in vivo スコアが（以前の EU 分類で使用されていた）2.0 から
2.3 以上に変更された。結果として、in vivo スコアが 2.0 から 2.3 の物質は、以前の EU 分類では刺激性とみなされたが、今後の CLP の分類システムでは非刺激性とみなされることになる。ただし、2 つ以上の皮膚刺激性のカテ
ゴリーが必要という行政機関（例えば、農薬の評価）で利用される，任意に追加される UN GHS カテゴリー3（弱刺激性: 1.5 以上 2.3 未満のスコア）の使用は意図しない。
3 種の試験法の性能は、CLP 下（すなわち、1 つの刺激性のカテゴリーを使用する UN GHS）で、カットオフ値の変更を考慮して再評価され、十分な結果が確認された（表１および[6]の正確性の値の再計算に関する詳細な結果）。Episkin 法の特異度は 81.8%（従来の EU システム）から 71.1%（CLP）に低下し、感度は 72%（従来の1

EU システム）から 84.6%（CLP）に向上した。他の 2 つの方法については、特異度は同様の値（どちらも 69.2%*）
であり、感度は CLP 下で参照試験法（Episkin 法）より高かった。
これら試験法の科学的な妥当性に関する旧 ESAC 声明は、皮膚刺激性を区分するための方法として、引き続き妥当であり、CLP システムへの適用が可能である。CLP 下で再計算した正確性の値はこの文書中に示されている。
さらに、3 種の方法の十分な性能を確認できる書類をもとに、ESAC は次の意見を述べている。
・現段階で追加の作業は不要である。
・バリデーション研究に関する既存情報とその追加の背景情報が、EU での GHS システムの適用によるカットオフ
値の変更によって生じた試験法の性能や性能標準の重要な側面（すなわち、参照物質と指定された正確性の値）の変化を説明・正当化するために十分である。
当然のことながら、必要に応じて、適切に技術的進歩への対応が必要である。現段階では、適用範囲に関する
いかなる結論は、主として、ECVAM による SIVS で使用された試験物質に基づくということに注意しなければならない。

*) All values are based on the final predictive decisions of the study calculated on the basis of the median of theindividual laboratory predictions. Since the predictions are essentially categories (i.e. positive or negative) and takevalues of either 1 or 0, the final decision can be derived by using either the median or the mode.
表1 CLP (UN GHS)下におけるECVAMでバリデートされた皮膚刺激性 in vitro 試験の正確性の値

1) The test substances from the ECVAM Skin Irritation Validation Study (SIVS) conducted from 2003 to 2007.
2) Based on the median (or mode) of the individual laboratory predictions. The values in parentheses provide thecorrect predictions per total number of substances either per categorical group (for sensitivity and specificity
values) or per total number of substances tested (for accuracy value).
3) Original 20 RC from the ECVAM Performance Standards May 2007
2. ECVAM による性能標準における参照物質と指定された正確性の値の適応
2.1 参照物質の更新リスト
EU での UN GHS システムの採用によるカットオフ値の変更により、ECVAM による性能標準の原本に記載され2

た参照物質は、刺激性と非刺激性の物質の数が同じではなくなった。
この問題と他の問題（すなわち、国際的に市販されていること、ヒトに対する非刺激性の事実、操作特性）に対処するため、参照物質のセットが更新された。更新された参照物質のセットには、改良的または模倣的試験法に対する適切な将来のバリデーションを考慮して、ECVAM による SIVS での 58 の試験物質をもとに、UN GHS 下での Episkin 法で得られた偽陰性と偽陽性が反映されている。
削除: 次の 6 つの物質を削除 (括弧内の数値は in vivo スコアを表す)
1) d-propylene glycol (0)2) allyl heptanoate (1.7)
3) terpinyl acetate (2.0)4) tri-isobutyl phosphate (2.0)5) alpha-terpineol (2.7)
6) butyl methacrylate (3.0)
追加: 次の 6 つの物質を追加 (括弧内の数値は in vivo スコアを表す)。
1) cinnamaldehyde (2.0)2) 2-chloromethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridine HCl (2.7)
3) 5% potassium hydroxide (3.0)
4) benzenethiol, 5-(1,1-dimethyl)-2 methyl (3.3)5) 1-methyl-3-phenyl-1-piperazine (3.3)6) 1,1,1-trichloroethane (4.0)
さらに、更新された参照物質（表 2）は次の基準を満たす。
1. 市販されている
2. 広範な Draize 皮膚刺激性スコア（非刺激性から強刺激性）について代表的である
3. 構造が明確である
4. バリデーションの過程で使用される化学的な機能について代表的である
5. 重篤な毒性プロファイル（例、発癌性や生殖毒性）、環境的な懸念、高額な廃棄価格について問題がない
表 2 更新された参照物質

3*) Substances which are irritant in the rabbit but for which there is reliable evidence that they are non-irritant in
humans.
2.2 ECVAM による皮膚刺激性の性能標準で指定かつ更新された正確性の値（ECVAM による皮膚刺激性の性能標準に含まれる）指定された正確性の値は、GHS-EU 下で、更新された参照物質を用いて、興味のある種類について適切な考察をもとに、バリデートされた参照試験法である Episkin 法の性能から設定されている。値は表 3 に与えられている。
表 3 指定された正確性の値

Joachim Kreysa
Head of Unit
In-Vitro Methods Unit
European Centre for the Validation of Alternative Methods

4Ispra, 8th July 2009

REFERENCES
1. United Nations Economic Commission for Europe (UNECE) (2008). UN Globally Harmonised System ofClassification and Labelling of Chemicals, 2nd revised edition; Online:
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html; (as of 156 April 2009).

2. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T.,
Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H.,
Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for
Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity
Function Test. ATLA 35, 559-601.

3. ECVAM (2007) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the Validity of In Vitro
Tests for Skin Irritation. Online: http://ecvam.jrc.it/

4. ECVAM (2008) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity ofin vitro tests for skin irritation testing. Online: http://ecvam.jrc.it/

5. REGULATION (EC) No 1272/2008 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 16
December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing
Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006)

6. Griesinger, C., Barroso, J., Zuang, V., Cole, T., Genschow, E. and Liebsch M. (2009). Explanatory backgrounddocument to the OECD draft test guideline on in vitro skin irritation testing. Available under “Validation Study
Documents, section Skin Irritation” at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu
最後のページは翻訳対象外（原著参照）。

5

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1

STATEMENT1 ON

2
3

THE PERFORMANCE UNDER UN GHS OF THREE IN-VITRO ASSAYS FOR SKIN
IRRITATION TESTING

4

AND

5
6
7
8

THE ADAPTATION OF THE REFERENCE CHEMICALS AND DEFINEDACCURACY VALUES OF THE ECVAM SKIN IRRITATIONPERFORMANCE STANDARDS

9
10
11
12

At its 30th meeting, held on 9 and 10 March 2009, the non-Commission members of the
ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) unanimously endorsed the following
statement, subject to editorial finalisation by the ESAC secretariat and final ESAC consensus
established by written procedure as of 9th April 2009:13

1. Performance of the ECVAM-validated skin irritation in vitro tests under UN GHS

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Previously, three reconstructed human epidermis models (the EpiSkin, the modified EpiDerm
SIT and the SkinEthic RHE test methods) have been validated by ECVAM primarily
according to the previous EU classification system. This system is being replaced over the
next few years by the new classification system laid out in the CLP regulation (see below)
which is based on the United Nations' Globally Harmonised System of Classification andLabelling of Chemicals (GHS; Ref. 1). For classification according to the new CLP rules thefollowing deadlines apply: 1 December 2010 for the classification of substances and 1 June2015 for the classification of mixtures (i.e. preparations). Importantly, the selection of test
substances used for the ECVAM skin irritation validation study (SIVS; Ref. 2), performed
from 2003 to 2007, already took account of the upcoming UN GHS classification system.
Upon completion of the ECVAM SIVS, the EpiSkin test method was found to be a reliable
stand-alone method for distinguishing between skin irritants and non-irritants (ESAC
statement from April 2007, Ref. 3) and, hence, its performance as reference method withregard to the agreed predictive values was used to determine required standards of accuracy
and reliability of the ECVAM skin irritation Performance Standards in May 2007. The
modified EpiDerm SIT and the SkinEthic RHE test methods were subsequently validated on
the basis of these Performance Standards using the 20 defined Reference Chemicals (ESAC
statement from November 2008, Ref. 4).

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In December 2008, the EU adopted the UN Globally Harmonised System (UN GHS) for
Classification and Labelling and will implement this by means of the Regulation on theClassification, Labelling and Packaging of Substances and Mixtures (CLP Regulation EC
1272/2008; Ref. 5) which came into force on 20 January 2009 and will, after a transitional
period, replace the previous EU legislations for the classification of substances and mixtures(i.e. preparations). In agreement with the provisions of the UN GHS system, the new CLP
1This statement has been updated during the 31st ESAC meeting, 7-8 July 2009 with respect to minor additions(e.g. providing the test results in table one behind the percentage figures) and, more importantly, one of thereference chemicals: As a result of an OECD Expert Consultation Meeting 15-17 June 2009, Washington D.C.,
1,1,1,-trichloroethane, a substance listed in the Montreal Protocol, has been replaced by Tetrachloroethylene.
Agreement on the update was established by written procedure as of 22.9.2009.
ESAC statement on the performance under UN GHS of three in-vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of
the reference chemicals and defined accuracy values of the ECVAM skin irritation Performance Standards. 9 April 2009.

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skin irritation classification system will use a single irritant category (category 2) and hence
continues to use a total of two classification categories to distinguish irritant (category 2) from
non-irritant (no-category) substances. However, according to the GHS rules for skin irritation
classification and labelling, the cut-off score to distinguish between no-category and category
2 substances was shifted to an in vivo score of greater or equal 2.3 from a value of 2.0 (asused for the previous EU classification system). Consequently substances with an in vivo
score between 2.0 and 2.3 that are considered irritant under the previous EU classification
system will be considered non-irritants under the future CLP classification system, which
does not implement the optional additional UN GHS category 3 ("mild irritants": substanceswith scores greater or equal to 1.5 and smaller than 2.3), which is available for thoseauthorities (e.g. pesticides) that want to have more than one skin irritant category (Ref. 1).

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The performance of all three tests under CLP (i.e. UN GHS using one single irritantcategory) has now been re-evaluated to take account of this shift of cut-off value into
consideration and has been found satisfactory (Table 1; Ref. 6 for extensive backgroundregarding the re-calculation of these values). While the specificity of the EpiSkin method
is decreased from 81.8%* (previous EU system) to 71.1 %* (CLP), the test sensitivity
has increased from 72%* (previous EU system) to 84.6%* (CLP). The two othermethods show similar values for the specificity (both tests 69.2%*), and higher
sensitivity values than the reference method under CLP.

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The original ESAC statements relating to the scientific validity of these test methods
therefore remains valid and, with regard to their use in the context of classification
decisions, can now be extended to the CLP system. Updated accuracy values under CLP
are provided in this statement.

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Moreover, on the basis of the documentation available confirming the overallsatisfactory performance of the three methods, the ESAC is of the opinion that nofurther work is required at this stage and that the existing information on the validation
studies and additionally available background information is sufficient to explain andjustify the changes in performance of the tests and key aspects of the performancestandards (i.e. reference chemicals and defined accuracy values) necessitated by thethreshold shift upon adaptation of the GHS system in the EU. As is common practice,adaptations to technical progress should be performed as appropriate and necessary. Itshould be noted, that any conclusions on the applicability domain are based, at thisstage, mainly on the testing set used during the ECVAM SIVS.
*) All values are based on the final predictive decisions of the study calculated on the basis of the median of theindividual laboratory predictions. Since the predictions are essentially categories (i.e. positive or negative) andtake values of either 1 or 0, the final decision can be derived by using either the median or the mode.

ESAC statement on the performance under UN GHS of three in-vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of
the reference chemicals and defined accuracy values of the ECVAM skin irritation Performance Standards. 9 April 2009.

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Institute for Health and Consumer Protection
In vitro methods Unit
European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM)

74
75
76

Table 1. Accuracy values for the three ECVAM-validated skin irritation in vitro test
methods under CLP (UN GHS)
EpiSkintest method

EpiSkintest method

Modified
EpiDerm
test method

SkinEthic
test method(58 chemicals1)(20 reference
chemicals3)(20 reference
chemicals3)(20 reference
chemicals3)

Specificity (%) 2

71.1 (32/45)

76.9 (10/13)

69.2 (9/13)

69.2 (9/13)

2

84.6 (11/13)

85.7 (6/7)

85.7 (6/7)

100 (7/7)

Overall
Accuracy (%) 2

74.1 (43/58)

80 (16/20)

75 (15/20)

80 (16/20)

Sensitivity (%)

77
78
79
80
81
82

1

83
84

2. Adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM
Performance Standards

85

2.1 Updated list of Reference Chemicals

86
87
88
89

Due to the threshold shift resulting from the adoption of the UN GHS system in the EU, thereference chemicals set listed in the original ECVAM Performance Standards were no longer
properly balanced with regard to an equal representation of Irritant versus Non-irritant
substances.

90
91
92
93
94
95

To address this and other issues (i.e. global commercial availability, evidence that some
substances are non-irritant in human, handling qualities) the reference chemical set was
updated. The updated reference chemical set retains the false negative and false positive rates
obtained with the EpiSkin method under UN GHS on the basis of the full set of 58 test
substances from the ECVAM skin irritation validation study allowing for the appropriate
future validation of modified or similar (“me-too”) test methods.

96

Deletions97

The following six substances were deleted (in vivo scores in parentheses):) The test substances from the ECVAM Skin Irritation Validation Study (SIVS) conducted from 2003 to 2007.
) Based on the median (or mode) of the individual laboratory predictions. The values in parentheses provide the correct
predictions per total number of substances either per categorical group (for sensitivity and specificity values) or per total
number of substances tested (for accuracy value).
3) Original 20 RC from the ECVAM Performance Standards May 20072

98

1) d-propylene glycol (0)992) allyl heptanoate (1.7)1003) terpinyl acetate (2.0)1014) tri-isobutyl phosphate (2.0)1025) alpha-terpineol (2.7)

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1036) butyl methacrylate (3.0)

104Additions105

The following six substances were added (in vivo scores in parentheses):1061) cinnamaldehyde (2.0)

1072) 2-chloromethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridine HCl (2.7)1083) 5% potassium hydroxide (3.0)

1094) benzenethiol, 5-(1,1-dimethyl)-2 methyl (3.3)

1105) 1-methyl-3-phenyl-1-piperazine (3.3)

1116) Tetrachloroethylene (4.0)

112

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113
114

Moreover, the updated reference chemicals (table 2) meet the following criteria:

115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125

1. the chemicals are commercially available
2. they are representative of the full range of Draize skin irritancy scores (from nonirritant to strong irritant)
3. they have a well-defined chemical structure
4. they are representative of the chemical functionalities used in the validation
process
5. they are not associated with an extremely toxic profile (e.g. carcinogenic or toxic
to the reproductive system) and they are not associated with environmental
concerns or prohibitive disposal costs.
Table 2: Updated reference chemicals

Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

Reference Chemical
1-bromo-4-chlorobutane
diethyl phthalate
naphthalene acetic acidallyl phenoxy-acetate
isopropanol
4-methyl-thio-benzaldehyde
methyl stearate
heptyl butyrate
hexyl salicylate
cinnamaldehyde
1-decanol *cyclamen aldehyde
1-bromohexane
2-chloromethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridine HCl
5% potassium hydroxide
di-n-propyl disulphide *benzenethiol, 5-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl
1-methyl-3-phenyl-1-piperazine
heptanal
Tetrachloroethylene

In vivo
Score
0
0
0
0.3
0.3
1
1
1.7
2
2
2.3
2.3
2.7
2.7
3
3
3.3
3.3
3.4
4

EU
in vivocategory
no
no
no
no
no
no
no
no
R38
R38
R38
R38
R38
R38
R38
R38
R38
R38
R38
R38

GHS-EUin vivocategoryno categoryno categoryno categoryno categoryno categoryno categoryno category
optional cat. 3
optional cat. 3
optional cat. 3
category 2
category 2
category 2
category 2
category 2
category 2
category 2
category 2
category 2
category 2

EPISKIN
classification
I
NI
NI
NI
NI
I
NI
NI
NI
I
I
I
I
I
I
NI
I
I
I
I

126
127
128

*) Substances which are irritant in the rabbit but for which there is reliable evidence that they
are non-irritant in humans.

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129
130
131

2.2 Updated defined accuracy values as specified in the ECVAM skin irritation
Performance Standards

132
133
134
135

The defined accuracy values (to be included in the ECVAM skin irritation PerformanceStandards) are derived from the performance of the validated reference method EpiSkin withthe updated reference chemicals and under GHS-EU and on the basis of additional
considerations relating to relevance in the species of interest. The values are given in table 3.

136
137

Table 3: Defined Accuracy Values
Defined Accuracy Values
Specificity (%)

70

Sensitivity (%)

80

Overall Accuracy (%)

75

138
139
140
141
142
143
144
145
146

Joachim Kreysa

147

Head of Unit

148

In-Vitro Methods Unit

149

European Centre for the Validation of Alternative Methods

150
151
152
153

Ispra, 8th July 2009

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REFERENCES

155
156
157
158

1.

United Nations Economic Commission for Europe (UNECE) (2008). UN Globally
Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals, 2nd revised edition;
Online: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html; (as ofApril 2009).

159
160
161
162
163
164

2.

Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C.,
Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C.,
Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A.,
Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In
Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and
EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559-601.

165
166

3.

ECVAM (2007) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on
the Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation. Online: http://ecvam.jrc.it/

167
168
169

4.

ECVAM (2008) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on
the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing. Online:
http://ecvam.jrc.it/

170
171
172
173

5.

REGULATION (EC) No 1272/2008 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF
THE COUNCIL of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of
substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006)

174
175
176
177

6.

Griesinger, C., Barroso, J., Zuang, V., Cole, T., Genschow, E. and Liebsch M. (2009).
Explanatory background document to the OECD draft test guideline on in vitro skinirritation testing. Available under “Validation Study Documents, section Skin
Irritation” at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

178
179

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the reference chemicals and defined accuracy values of the ECVAM skin irritation Performance Standards. 9 April 2009.

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180
181
182
183

The ESAC was established by the European Commission, and is composed of nominees fromthe EU Member States, industry, academia and animal welfare organisations, together withrepresentatives of the relevant Commission services.

184
185

This statement was endorsed by the following members of the ESAC:

186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205

Ms Argelia Castaño(Spain)
Ms Maija Dambrova (Latvia)
Ms Alison Gray (ESTIV)
Ms Katalin Horvath (Hungary)
Ms Maggy Jennings (Eurogroup for Animals)
Ms Dagmar Jírová (Czech Republic)
Mr Roman Kolar (Eurogroup for Animals)
Ms Elisabeth Knudsen (Denmark)Mr Manfred Liebsch (Germany)
Mr Gianni Dal Negro (EFPIA)
Mr. Walter Pfaller (Austria)
Mr Tõnu Püssa (Estonia)
Mr Jon Richmond (UK)Ms Vera Rogiers (ECOPA)
Mr Hasso Seibert (ESF, acting as co-moderator at the meeting)
Ms Annalaura Stammati (Italy)
Mr Jan van der Valk (The Netherlands)
Mr Carl Westmoreland (COLIPA, acting as moderator at the meeting)

206
207

The following Commission Services and Observer Organisations were involved in the
consultation process, but not in the endorsement process itself:

208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219

Commission services
Mr Joachim Kreysa (DG JRC, Head of In vitro methods Unit/ECVAM, chairman)
Mr Claudius Griesinger (DG JRC, ESAC secretariat)
Ms Eimear Kelleher (DG JRC)
Ms Karin Kilian (DG SANCO)Mr Juan Riego Sintes (DG JRC)
The following observers were present
Mr Patric Amcoff (OECD)
Mr Hajime Kojima (JaCVAM)
Mr William Stokes (NICEATM)
Ms Marilyn Wind (ICCVAM)ESAC statement on the performance under UN GHS of three in-vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of
the reference chemicals and defined accuracy values of the ECVAM skin irritation Performance Standards. 9 April 2009.

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再構築ヒト表皮を用いた in vitro 皮膚刺激性試験の性能標準に関する ESAC 声明
目次
I. ESAC 声明
II. 声明における参考文献
III. ESAC
IV. 声明に対する参考情報
1. 性能標準に対する一般的情報
2. in itro 皮膚刺激性試験に対する更新された ECVAM の性能標準に対する詳細な背景
V. 参考情報における参考文献
I. ESAC 声明2009 年 7 月 7-8 日に開催された欧州代替法評価センター科学諮問委員会（ESAC）の第 3１回会議にて、非常任メンバーは以下の声明を全会一致で了承した。その後、明記された手続きにより ESAC 事務局での校了とESAC での最終合意を経て 2009 年９月 22 日に発効された。
2007 年に ECVAM による皮膚刺激性バリデーション研究（以下、SIVS とする）が終了すると、ECVAM は
EpiDerm 原法[1-2]と同様、EpiSkin 法をもとに再構築ヒト表皮（RhE）を用いた in vitro 皮膚刺激性試験に対する性能標準を定義した。2008 年、ECVAM は性能標準をもとに 2 種の試験法をバリデートした。1 つは模倣的試験（SkinEthics RHE 法）、もう一つは改良的試験法（EpiDrem SIT 変法）である[3]。
SIVS は国連（以下、UN とする）の「化学品の分類および表示に関する国際調和システム（GHS）」の採用前に計画・実行された[4]。そのため、SIVS は有害物質規制（EU DSD システム）[5]に記載されている EU 分類システムのもとで試験法を評価した。ただし、バリデーションで使われた被験物質の選定に関しては、GHS 分類システムを考慮した。
2008 年 12 月、EU は UN GHS [4]を採用し、「化学品および混合物の分類、表示、梱包に関する規制（CLP 規制[6]）」によりこれを実行する予定である。この規制は、2009 年 1 月 20 日から実施され、段階を経て，EU DSD シス
テムにとって代わることなる。
UN GHS システムは、これまでと異なる刺激性と非刺激性を区分するカットオフ値を使用する。EU DSD のカッ
トオフ値は、in vivo スコアが 2.0 で、 UN GHS のそれは 2.3 である。
CLP 規制[6]の採用により、ECVAM は 3 種のバリデートされた in vitro 皮膚刺激性試験の性能を慎重に評価した。ESAC は、ECVAM による評価が UN GHS システムのもとでも 3 種のすべての試験法の性能が十分であることを確認したものと判断した[7]。
CLP 規制の採用により、ECVAM による皮膚刺激性の性能標準は次の 2 つ項目への適応が必要である。
1

1) 性能標準に記載された参照物質のセット
2) 指定された正確性と信頼性の値
2008 年に EU が UN GHS[4,6]を採用したことを考慮して、従来の ECVAM による皮膚刺激性の性能標準は現在改定されている。ESAC および ECVAM からの専門家、ICCVAM と OECD からの ESAC のオブザーバー、企業からの招聘専門家で構成された ECVAM/ESAC Task Force の枠組みで改定が実施された。性能標準の改定の技術的な詳細や ECVAM がバリデートした in vitro 皮膚刺激性試験の性能に関する文書は、BfR／ZEBET との共同で ECVAM が作成している。
ESAC は、改定された ECVAM による性能標準[9]は CLP 規制下[6]で分類および表示として、急性の皮膚刺
激性を予測するために提案された試験法の科学的妥当性の評価に使用できると結論している。

Joachim Kreysa
Head of Unit
In-Vitro Methods Unit
European Centre for the Validation of Alternative Methods

Ispra, 9 July 2009
II. 声明における参考文献
1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T.,
Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H.,
Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for
Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity
Function Test. ATLA 35, 559-601.

2. ECVAM (2007) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the Validity of In Vitro
Tests for Skin Irritation. Online: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/ "Publications / ESAC Statements"

3. ECVAM (2008) Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of invitro tests for skin irritation testing. Online: http://ecvam.jrc.it/

4. United Nations Economic Commission for Europe (UNECE) (2008). UN Globally Harmonised System ofClassification

andLabellingofChemicals,

2ndrevisededition;Online:http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html; (as of April 2009). ECVAM (2008)
Statement of the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of in vitro tests for skinirritation testing. Online: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/ "Publications / ESAC Statements"
5. EC (2001) Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical progress for the 28th time
Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to2

the classification, packaging and labelling of dangerous substances. Official Journal of the European Union L225,
1-333.

6. REGULATION (EC) No 1272/2008 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 16
December 2008 on classification, labelling and packaging of substances andmixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No
1907/2006)

7. ECVAM (2009) Statement on the performance under UN GHS of three in-vitro assays for skin irritation testing
and the adaptation of the Reference Chemicals and defined Accuracy Values of the ECVAM Skin Irritation
Performance Standards. Original statement March 2009, updated July 2009 to reflect further changes of theReference Chemical set following the OECD acceptance process. Online: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/ under"Publications / ESAC Statements"

8. Griesinger, C., Barroso, J., Zuang, V., Cole, T., Genschow, E. and Liebsch M. (2009). Explanatory backgrounddocument to the OECD draft test guideline on in vitro skin irritation testing. Available under “Validation Study
Documents, section Skin Irritation” at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

9. EC-ECVAM (2009). Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed
human Epidermis (RhE). Available under “Validation Study Documents, section Skin Irritation”, at:
http://ecvam.jrc.ec.europa.eu
ＩＩＩ. ESAC
ESAC は欧州委員会により設立され、EU加盟国、産業界、アカデミア、動物愛護団体から推薦された者、および関係委員会からの代表で構成される。
この声明はESACの以下の委員により承認された。
Ms Argelia Castaño(Spain)
Ms Maija Dambrova (Latvia)
Ms Alison Gray (ESTIV)
Ms Katalin Horvath (Hungary)
Ms Dagmar Jírová (Czech Republic)
Mr Roman Kolar (Eurogroup for Animals)
Ms Elisabeth Knudsen (Denmark - acting as moderator at the meeting)
Mr Manfred Liebsch (Germany)
Mr Gianni Dal Negro (EFPIA)
Mr Walter Pfaller (Austria)
Mr Tõnu Püssa (Estonia)
3

Mr Dariusz Sladowski (Poland)
Mr Jon Richmond (UK)Ms Vera Rogiers (ECOPA)
Mr Michael Ryan (Ireland)
Ms Annalaura Stammati (Italy)
Mr Jan van der Valk (The Netherlands)
Mr Carl Westmoreland (COLIPA)
Mr Timo Ylikomi (Finland)
次の委員会およびオブザーバーの組織は議論の過程に参加したが、承認の過程には含まれていない。
委員会
Mr Joachim Kreysa (DG JRC、 Head of In vitro methods Unit/ECVAM、 chairman)
Mr Claudius Griesinger (DG JRC、 ESAC secretariat)
Ms Susanne Hoke (DG ENTR)
Ms Susanna Louhimies (DG ENV)
Mr Juan Riego Sintes (DG JRC)
オブザーバー
Mr Hajime Kojima (JaCVAM)
Mr William Stokes (NICEATM)
Ms Marilyn Wind (ICCVAM)
IV. 声明に対する参考情報
翻訳対象外（原著参照）
V. 参考情報における参考文献
翻訳対象外（原著参照）

4