評価報告書
評価報告書
2018 年改定 OECD TG 438
2018 年改定 OECD TG 438
ニワトリ眼球を用いた眼刺激性試験
ニワトリ眼球を用いた眼刺激性試験（ICE 法 : Isolated Chicken Eye Test）（ICE 法 : Isolated Chicken Eye Test）

眼刺激性試験資料編纂委員会
眼刺激性試験資料編纂委員会

令和元年（2019 年）9 月 26 日
令和元年（2019 年）9 月 26 日

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眼刺激性試験資料編纂委員会
山 本 直 樹 （藤田医科大学）
小 島

肇 （国立医薬品食品衛生研究所）

佐々木正治 （アッヴィ合同会社）
竹 内 小 苗 （P&G イノベーション合同会社）
波多野浩太 （ホーユー株式会社）森 村 智 美 （一般財団法人食品薬品安全センター）

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要旨
ニワトリ眼球を用いた眼刺激性試験（ICE 法 : Isolated Chicken Eye Test）は、ニワトリから摘出した眼球に被験物質を曝露して生じる角膜の変化をもとに、 in vivo の眼刺激性を予測する試験であり、OECD TG 438 として試験法が標準化されている。2013 年に採択された改定 TG 438（2013）には、トップダウン方式により UN GHS 区分 1 物質を、ボトムアップ方式により UN GHS 区分に該当しない物質を判定する場合の基準が定められており、既に JaCVAM 評価会議において妥当性が確認されている。本報告では、2018 年 6月に採択された改定 TG 438（2018）について改正点の概要を説明し、バリデーション研究報告書、第三者評価報告書および関連論文などをもとに、JaCVAM 眼刺激性試験資料編纂委員会としての意見をまとめた。
改定 TG 438（2018）では、ボトムアップ方式による区分に該当しない物質の判定基準が変更され、偽陽性率が改善された。また、トップダウン方式による UN GHS 区分 1 の判定において、これまで偽陰性率の高かった界面活性剤の評価を向上させるため、病理組織学的検査の併用が検証された。この併用により、2<pH<11.5 の洗浄剤および界面活性剤（29 物質）の感度は 33%から 71%に向上し、偽陰性率は 67%から 29%に抑制された。
また、12 の界面活性剤を用いた 3 施設間の再現性は 83%であった。
以上より、本委員会は、ボトムアップ方式による判定基準の変更は妥当であり、また、
2<pH<11.5 の洗浄剤および界面活性剤については、トップダウン方式により UN GHS 区分 1 を検出する際、病理組織学的検査を補助的に用いることができると結論した。
略語
BCOP: Bovine Corneal Opacity and Permeability
BRD: Background Review Document
CM: Cytosensor Microphysiometer
CV: Coefficient of Variation
EURL ECVAM: European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing
GHS: Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals
ICCVAM: Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods
ICE: Isolated Chicken Eye
JaCVAM: Japanese Center for the Validation of Alternative Methods
NICEATM: NTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods
OECD: Organization for Economic Co-operation and Development
SSD: Streamlined Summary Document
TG: Test Guideline
UN: United Nations

3 / 1291．改定の背景
ICE 法は、ウサギを用いた Draize 眼刺激性試験法（Draize 法）の代替法であり、トップダウン方式により眼に重篤な損傷を引き起こす化学物質（UN GHS 1) 区分 1 物質）を検出する方法として、2009 年に OECD で TG 438（2009）として採択された。その後、眼刺激性に関する UN GHS 分類 について、in vivo と in vitro、双方のデータベースが再評価され、トップダウン方式における区分 1 物質の検出のみならず、ボトムアップ方式で UNGHS 区分 1 物質及び眼刺激性を引き起こす化学物質（UN GHS 1) 区分 2 物質）のいずれの区分にも該当しない物質も検出することが可能であると判断され、2013 年に改定
TG 438（2013）として採択された。
今回、ICE 法の再評価が行われ、 改定 TG 438（2018）2)が採択された。主な改正点は、
ボトムアップ方式による区分に該当しない物質検出のための判定基準の変更と、トップダウン方式による UN GHS 区分 1 を識別するエンドポイントとして 2<pH<11.5 の洗浄剤および界面活性剤についての病理組織学的検査の併用である。本資料編纂委員会は、この TG 438（2018）の改定点について検討した。以下にその 結果を報告する。
2．標準的な ICE 法の概要
ICE 法では、ニワトリから摘出した眼球に被験物質を曝露し、その結果、眼球の角膜に生じる変性を角膜の腫脹、混濁度およびフルオレセイン染色性の変化としてとらえ、個別のスコアに変換して得られる総合評価をもとに in vivo での眼刺激性を予測する。
試験では、被験物質群および陽性対照群は 3 眼球以上、媒体対照群および陰性対照群は 1 眼球以上を使用する。角膜の腫脹は、光学的厚度計を装着した細隙灯顕微鏡を用いて角膜の厚さを被験物質曝露後 240 分間測定し、経時的な変化率として定量的に求める。
角膜の混濁度は、細隙灯顕微鏡にて角膜混濁度の経時的な変化を曝露後 240 分間観察し、結果を評点化する。フルオレセイン染色性は、細隙灯顕微鏡にて曝露 30 分後の角膜表面のフルオレセイン染色性を観察し、評点化する。得られた結果を項目毎に眼刺激性の最も弱いクラス I から最も強いクラス IV の 4 段階に分類し、それらの分類結果を総合して、被験物質の眼刺激性を判定する。
3．改定点
3−1．ボトムアップ方式による UN GHS 区分に該当しない物質判定基準の変更
TG 438（2013）に制定された UN GHS 区分に該当しない物質のボトムアップ方式における判定基準に「1 項目がクラスⅠに分類され、2 項目がクラスⅡに分類される」場合が加わった（表 1）。
表 1.

被験物質を UN GHS 区分に該当しないと評価するための判定基準 2)

UN GHS 区分
区分外

3 評価項目の組み合わせ
3 項目ともクラスⅠに分類される
2 項目がクラスⅠに分類され、1 項目がクラスⅡに分類される
1 項目がクラスⅠに分類され、2 項目がクラスⅡに分類される

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区分外：UN GHS による眼に対する重篤な損傷性および眼刺激性のいずれの区分にも該当しない。「用語」参照。
上記の基準の下に、新たな物質を加えて再構築したデータにおいて正確性が再評価された。その結果、表 2 に示すように、Draize 法との比較では、ICE 法の正確度は 88%（161/184）、感度 97%（98/101）、特異度は 76%（63/83）、偽陰性率は 3 %（3/101）および偽陽性率は 24%（20/83）を示した。TG 438（2013）の判定基準と比較して、偽陰性率は低く抑えられたまま、偽陽性率は改善された。なお、ボトムアップ方式で陽性結果が得られた場合、他の適切な試験法による確認が必要とされている。また、固体で陰性結果が得られた場合、3 眼球を用いて 2 回目の実験を行い、陰性結果を承認または棄却することが推奨されている。

表 2.

ボトムアップ方式における ICE 法の正確性－UN GHS 区分法での区分に該当しない物質の同定 2)

ボトムアップ方式

No.

判定基準（2018）
判定基準（2013）

正確度%

No.

感度

偽陰性率特異度

偽陽性率%

No.

%

No.

%

No.

%

No.

184

88 161/184 97

98/10133/1017663/832420/83152

82 125/152 9972/73

11/73

6753/79

3326/79

なお、トップダウン方式においても、新たな物質が加わったデータにおいて区分 1 物質を検出する場合の正確性が再評価され、これらの予測性は、更新前と同程度であった。

3−2．トップダウン方式による UN GHS 区分１物質の判定
3−2−1．病理組織学的検査の追加
病理組織学的検査を行う場合、ICE 法に用いた眼球（被験物質を曝露した 3 眼球全て）の病理組織標本を作製して評価する。10%中性緩衝ホルマリン、4 %グルタールアルデヒ
ドまたは 2.5%グルタールアルデヒドと 2 %ホルムアルデヒド混合液で固定した眼球（角膜）を常法に従い脱水、パラフィン包埋、薄切し、HE 染色あるいは PAS 染色等を施した病理組織標本を作製する。角膜上皮のびらん、空胞化および壊死、角膜実質（固有層）の核濃縮の程度および線維の乱れ、ならびに角膜内皮の壊死の有無を基準に刺激性を評点化する（表 3）。

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表 3.

ニワトリ眼球の病理組織標本のための半定量的評点化システム 2)

指標上皮：びらん上皮：空胞化上皮を上、中、下の各層に分けてスコア化上皮：壊死

実質：核濃縮上部または下部領域
実質の線維異常
内皮：壊死

判定
ごく軽度
軽度
中等度
重度
ごく軽度
軽度

スコア
1/2
1231/21

中等度
重度
正常範囲
ごく軽度
軽度
中等度

231/2
12重度

3正常範囲
軽度
中等度

－12説明
数個の細胞から最表層 1 層までの欠損
3 層以下の欠損50%までの上皮層の欠損
基底膜に達する上皮層の欠損
空胞化細胞が 1 個～数個散在性にみられる
空胞化細胞の集簇または小空胞を有する細胞が単一層にみられる上皮の 50%まで空胞化細胞が占める上皮の 50～100%を空胞化細胞が占める
細胞質が膨化した細胞 10 個未満
細胞質が膨化した細胞 10～20 個
細胞質が膨化した細胞 20～40 個
細胞質が膨化した細胞が多数認められるが上皮層の 50%未満を占める場合
細胞質が膨化した細胞が上皮層の 50～100%を占める場合
5 個未満の細胞の核濃縮5～10 個の細胞の核濃縮10 個を超える細胞の核濃縮ありあり

PP

不規則な線維内皮は単層のため、グレード分けはしない

表 3 の刺激性のスコアを区分 1 物質の評価基準（表 4）に照らし、合致した場合にUN GHS 区分１と判定し、合致しない場合には予測不可とする。
表 4.

UN GHS 区分 1 物質の同定のため、ICE 法に加えて実施することが推奨される病理
組織学的検査の評価基準 2)

組織層眼に重篤な損傷を引き起こす可能性（UN GHS区分1）の評価基準
・少なくとも 3 眼中 2 眼で中等度（スコア 2）以上のびらんを示す
・3 眼中 2 眼で角膜上皮の中層ないし下層におけるごく軽度の空胞化（スコア 1/2）を伴う

角膜上皮

・3 眼中 1 眼で中程度（スコア 2）以上のびらんを示した場合、少なくともその他の 2 眼中 1 眼で角膜上皮の中層ないし下層におけるごく軽度の空胞化（スコア 1/2）を伴う・少なくとも 3 眼中 2 眼で中等度（スコア 2）以上の壊死を示す

さらに、表 3 のうち、角膜の空胞化については、洗浄剤および界面活性剤による空胞化の好発部位を考慮し、形態的な背景値に対して表 5 の鑑別基準が示されている。

6 / 1212表 5.

背景値として認められる小さな空胞と真の空胞化を鑑別するための基準 3)空胞の大きさ

発生部位

真の空胞化であるか?
（Yes/No）

上皮細胞の核の大きさの1/3 またはそれ以上

上皮細胞内 (不特定)Yes

基底膜に接する部位

No

上皮細胞内の基底膜側から数えて 1 列目の核の層よりも上Yes

基底膜と 1 列目の核の層との間追加情報を基に判断*上皮細胞の核の 1/3よりも小さい*段階的評価：1) 他 2 つの眼球標本を観察し、2 つとも作用が認められない場合は真の空胞化ではな
いと判断し、2 つのうち 1 つの眼球ではっきりした作用が認められた場合は真の空胞化と判断する。
2) 他 2 つの眼球標本を観察してもはっきりしない場合、例えば固形物による局所的な作用の可能性を考慮するといった標準的な ICE 法での観察結果も参考にする。
これら上皮細胞の空胞化の他、界面活性剤による組織変化の特徴として、曝露および培養によって角膜上皮細胞と基底膜との接着性が低下したことにより生じた空隙や、刺激物質によって脆弱となった細胞-細胞間に病理標本作製過程で間隙が生じることが知られている。
なお、組織標本の評価は検査担当者の見解の基に成り立っていることから、病理組織学的検査は、ICE 法の組織標本観察に習熟した病理専門家が行った上で、OECD GLP
No.16 4) に準じて、別の病理学専門家によるピアレビューを実施することを定めている。
3−2−2．病理組織学的検査の追加結果
TG 438（2013）の検証 5)において偽陰性率が高かった洗浄剤および界面活性剤について、検出感度を向上させるため、病理組織学的検査の併用が検証された。検証では、まず洗浄剤（1 種類以上の界面活性剤を 3 %超含む洗浄用混合物、界面活性剤単体の希釈液は含まない）のうち、2<pH<11.5 の 30 物質 6)、pH≤2 の 9 物質および 11.5≤pH の 9 物
質 7) について病理組織学的検査を併用し、重篤な眼の損傷を引き起こす可能性（UNGHS 区分 1）を評価した。その結果、2<pH<11.5 の洗浄剤では、病理組織学的検査の併用により感度が向上した（0%から 75%、n=8）6)。一方、pH≤2 または 11.5≤pH の洗浄剤
では、病理組織学的検査の併用により、偽陽性率が高くなり（17％から 67％、n=12）、その結果、特異性が 83%から 33%に低下した 7)。
これらの結果を受け、2<pH<11.5 の洗浄剤および界面活性剤に限り病理組織学的検査を併用することが検討され、最終的に 30 物質について検証された 8)。このうちの 1 物質がアルカリ洗剤（pH=12.0）であったことから、本委員会では、それを除く 29 物質につい7 / 1213

て解析した（表 6）。
表 6.

最終評価に用いた 29 物質の内訳 8)
区分 1

区分 2

区分外界面活性剤1323

洗浄剤 (2 < pH < 11.5)

82

1

区分外：区分１および区分２のいずれにも該当しない。
その結果、表 7 に示すように、in vivo の判定との比較において、病理組織学的検査を併用することにより、感度が 33%から 71%に向上し、正確度も 52%から 76%に上昇した。
表 7.

トップダウン方式において病理組織学的検査を併用し 2<pH<11.5 の洗浄剤および界面活性剤を判定した場合の正確性の検証結果 2)

病理組織学的検査

No.

併用あり（2018)
併用なし（2013）

正確度

感度

偽陰性率

特異度

偽陽性率%

No.

%

No.

%

No.

%

No.

%

No.

297622/2971

15/21296/21877/8131/8295215/29337/216714/211008/800/8

さらに、UN GHS 区分 1 の 6 物質、区分 2A の 3 物質、区分に該当しない 3 物質の計 12
物質の界面活性剤について、3 施設で UN GHS 区分１物質であるか否かを判定した場合の再現性を確認した結果 8)、施設間再現性は 83%（10/12）となり、良好であった。
以上、2<pH<11.5 の洗浄剤および界面活性剤については、トップダウン方式において偽陰性率が高いことから、標準的な ICE 法で陰性結果が得られた際には、病理組織学的検査を併用して判定することを推奨する。
3−3．その他
3−3−1．習熟度確認物質の変更：
TG 438（2013）では、ICE 法の習熟度確認物質として 13 物質が推奨された。本改定版
では、このうち 4 物質が変更（濃度のみの変更を含む）され、表 8 に示す 13 物質になった。

8 / 1214表 8.

ICE 法の習熟度確認物質 2)
化学物質CAS 番号分類

物理的性状In Vivo
UN GHS 区分

ICE
UN GHS 区分

Benzalkonium chloride(10%)

8001-54-5

オニウム化合物類

液体

区分 1

区分 1

Chlorhexidine

55-56-1

アミン類
アミジン類

固体

区分 1

区分 1

Sodium hydroxide (10%)

1310-73-2

塩基液体

区分 1

区分 1

Imidazole288-32-4

ヘテロサイクリック化合物類

固体

区分 1

区分 1

Trichloroacetic acid (30%)

76-03-9カルボン酸類

液体

区分 1

区分 1

2,6- Dichlorobenzoylchloride

4659-45-4

アシルハライド類

液体

区分 2A

予測不可

Ammonium nitrate

6484-52-2

無機塩

固体

区分 2B

予測不可

Sodium hydroxide (1%)

1310-73-2

塩基液体区分 2B

予測不可

Dimethyl sulfoxide

67-68-5

有機硫黄化合物

液体

区分外

区分外

Ethyl trimethyl acetate

3938-95-2

エステル

液体

区分外

区分外

Methylcyclopentane

96-37-7炭化水素（環状）

液体

区分外

区分外

n-Hexane

110-54-3炭化水素（鎖状）

液体

区分外

区分外

Triacetin102-76-1

脂質液体

区分外

区分外

区分外：表１参照。
予測不可：エンドポイントのスコアの組み合わせが区分 1 および区分外のどちらにも該当しないため、ICE における区分が判定できない
3−3−2．病理組織学的検査における習熟度確認物質
今回、新たに ICE 法の病理組織学的検査における習熟度確認物質として、表 9 に示す 6物質（同一物質の濃度違いを含む）が推奨された。

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表 9．ICE 法の病理組織学的検査の習熟度確認物質 2)
UN GHS 区分

界面活性剤 物理的の種類
性状In Vivo

標準的ICEICE 病理組織学的検査*Benzalkonium chloride
8001-54-5(5%)

カチオン

液体

区分 1

区分 1

区分 1（びらん）

Benzensulphonylchloride

98-09-9

アニオン

液体

区分 1

区分 1

区分 1
(壊死および空胞化)

Cetylpiridinium
bromide (10%)

140-72-7

カチオン

液体

区分 1

予測不可

区分 1
（空胞化）

Cetylpiridinium
bromide (1%)

140-72-7

カチオン

液体

区分 2A

予測不可

予測不可

N-Lauroyl sarcosine Na137-16-6
salt (10%)

アニオン

液体

区分 2A

予測不可

予測不可

Cetylpiridinium
bromide (0.1%)

カチオン

液体

区分外

予測不可

予測不可

化学物質

CAS 番号

140-72-7*表 3 ～ 表 5 の基準に従って判定し、合致することを確認する。
区分外：区分に該当しない
4．結論
JaCVAM 眼刺激性試験資料編纂委員会は、TG 438（2018）に基づいた正確性と再現性の結果から、UN GHS の眼刺激性分類においてトップダウ ン方式における区分 1 物質の同定およびボトムアップ方式における区分に該当しない物質の同定に ICE 法を適用することは可能であると考えた。また、2<pH<11.5 の洗浄剤および界面活性剤については、トップダウン方式において陰性結果が得られた場合、病理組織学的検査を併用することを推奨する。

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用語（TG 438 ANNEX 1, DEFINITIONS）2)
トップダウン方式：
TG 438（2018）では、眼に重篤な損傷を引き起こす疑いのある化学物質に適用する段階的な評価方式を指し、眼に重篤な損傷を引き起こす化学物質（陽性結果）と、それ以外の化学物質（陰性結果）を 識別することから始める。
ボトムアップ方式：
TG 438（2018）では、眼刺激性あるいは重篤な眼の損傷性はないと予測される化学物質に適用される段階的な評価方式を指し、眼刺激性物質に区分されない化学物質と、それ以外の化学物質を識別することから始める。
区分 1 物質:UN GHS 分類体系 2)下、眼球表面へ適用することにより、眼球の組織損傷や重篤な視力低下を引き起こす化学物質。いわゆる「重篤な眼の損傷」や「眼に対する非可逆的な作用」を示し、その損傷は適用後 21 日を経ても十分には回復しない。
区分 2 物質:UN GHS 分類体系下、眼球表面へ適用することにより、眼球の変化をもたらす化学物質。
「眼刺激性」や「眼に対する可逆的な作用」を示し、その損傷は適用後 21 日以内に完全に回復する。
区分外または UN GHS 区分に該当しない物質:
UN GHS 分類体系下、GHS 区分 1 あるいは 2（2A または 2B）への分類を要求される
ような刺激性を有しておらず、眼刺激性物質として区分されない化学物質。

引用文献
1) United nations (UN) (2017). Globally Harmonized System of Classification and Labeling ofChemicals (GHS), Seventh revised edition, UN New York and Geneva, 2017. Available at:[https://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev07/English/03e_part3.pdf]
2) OECD Guidelines for The Testing of Chemicals, Isolated Chicken Eye Test Method for
Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring
Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage, TG 438 (Adopted 25 June 2018)
3) OECD (2017) Guidance Document on "The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP)
and the Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for HistologicalEvaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants. Series on Testing and Assessment
No. 160, ENV/JM/MONO(2011)45/REV1. Available at: [https://www.oecd.org/ chemicalsafety/testing/series-testing-assessment-publications-number.htm]
4) OECD Series on Principles of Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring, Number
16 Advisory Document of the Working Group on Good Laboratory Practice -Guidance on theGLP Requirements for Peer Review of Histopathology, JT03362564 26-Sep-2014
5) OECD Guidelines for The Testing of Chemicals, Isolated Chicken Eye Test Method for

11 / 1217Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring
Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage, TG 438 (Adopted: 26 July 2013)
6) Cazelle E., Eskes C., Hermann M., et al. (2014). Suitability of Histopathology as an Additional
Endpoint to the Isolated Chicken Eye Test for classification of non-extreme pH detergent.
Toxicology In Vitro 28, 657-666.
7) Cazelle E., Eskes C., Hermann M., et al. (2015). Suitability of the Isolated Chicken Eye Testfor Classification of Extreme pH Detergents and Cleaning Products. Toxicology In Vitro 29,609-616.
8) OECD (2019). Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on theIsolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment No 188.
ENV Publications, OECD, Paris.

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