５．共同利用・共同研究－ 393 －

プロ

組換
変の

神経
える

ドー
動発

大規
た系

アル
解析

バイ
変性

Gut
す影

異常
の解

セロ

遺伝
ター

大脳
択的
研究

限局
明

オリ
解明

統合
及び

CRI
トマ

PNP
との

グリ
構の

タン
イノ

生体

大脳
伝達

Htr

哺乳
学的

ヒト
パク

opt

脳小
保護

－ 394 －

平成２７年度

共同利用・共同研究採択者一覧

プロジェクト型
研究課題名

申請者
所属

所内対応教員

職名

氏名

分野名

氏名

組換えウイルスを用いた筋萎縮性側索硬化症病
変の発症進展機序の解明

東京都医学総合研 副参事
究所
研究員

渡部

和彦

デジタル医学柿田分野

明美

神経変性疾患：特異的異常蛋白はシナプスを越えるのか

信州大学医学部

教授

小栁

清光

デジタル医学柿田分野

明美

ドーパミン受容体変異マウスを用いた不安様行動発症機序の解明

北里大学医学部

講師

山森

早織

動物資源開発笹岡
研究分野

俊邦

大規模アルツハイマー病ゲノムリソースを用いた系統的網羅的エピゲノム解析

東京大学医学部附 さきがけ
属病院
研究員

岩田

淳

遺伝子機能解池内析学分野健

アルツハイマー病に関連するゲノム配列変異の解析システムの構築

大阪大学大学院医
特任教授
学系研究科

中谷

明弘

遺伝子機能解池内析学分野健

バイオメタル・トランスポーターの動態と神経変性疾患に関する研究

岐阜薬科大学教授

保住

功

デジタル医学柿田分野

明美

Gut microbiotaの制御が脳虚血病巣進展に及ぼす影響日本医科大学大学
助教
院医学研究科西山康裕

生体磁気共鳴五十嵐 博中学分野

異常凝集体の形成と伝播による神経細胞死機構の解明

京都大学大学院医特定准教授 星学研究科

セロトニン5a受容体の生理的役割の解明

名古屋大学環境医教授
学研究所

遺伝子ターゲティングによるChR2/ArchTレポー
ターマウスの作成

東北大学大学院情教授
報科学研究科美奈子

デジタル医学
柿田
分野

明美

山中

章弘

細胞神経生物
﨑村
学分野

建司

井樋

慶一

細胞神経生物
﨑村
学分野

建司

教授

渡辺

雅彦

細胞神経生物﨑村
学分野

建司

限局性皮質異形成の分子遺伝学的発生機序の解明

山形大学医学部附
講師
属病院

加藤

光広

デジタル医学柿田分野

明美

オリーブ橋小脳萎縮症における細胞障害機構の解明

鳥取大学医学部

助教

瀧川

みき

デジタル医学柿田分野

明美

統合失調症脳内タンパク質多項目同時測定解析
及び関連遺伝子発現解析

福島県立医科大学

講師

國井

泰人

デジタル医学
柿田
分野

明美

CRISPR/Cas9システムを使った迅速なノックアウ
関西医科大学
トマウス作成

准教授

赤間

智也

細胞神経生物﨑村
学分野

建司

PNPLA6遺伝子の脳における機能―有機リン被爆との関連から東海大学医学部教授

木村穣

動物資源開発笹岡
研究分野

俊邦

グリオーマの分子標的治療・放射線治療耐性機構の解明と治療薬の開発

北海道大学大学院
講師
医学研究科

津田

真寿美

デジタル医学
柿田分野

明美

タンパク質分解システムを標的とするシヌクレ
イノパチーの分子病態解明と治療法の確立

弘前大学大学院医
准教授
学研究科

森

文秋

デジタル医学柿田分野

明美

生体リズムの遺伝子改変マウスによる解析

京都大学大学院薬
教授
学研究科

岡村

均

細胞神経生物
﨑村
学分野

建司

大脳基底核内情報伝達におけるドーパミン神経伝達の機能の解析

自然科学研究機構
教授
生理学研究所南部

篤

動物資源開発笹岡
研究分野

俊邦

HtrA1欠損マウスにおける脳小血管の機能解析

国立循環器病研究
医長
センター

猪原

匡史

分子神経疾患資
源解析学分野

哺乳類中枢神経系における神経回路形成の遺伝学的解析

国立遺伝学研究所

教授

岩里

琢治

動物資源開発笹岡研究分野

俊邦

ヒトてんかん原性脳組織における酸化損傷タン
パク質の網羅的探索

愛知県心身障害者部長
コロニー中央病院

島田厚良

デジタル医学柿田分野

明美

optineurinタンパク質の研究

広島大学原爆放射
教授
線医科学研究所川上秀史

デジタル医学柿田分野

明美

脳小血管病変モデルにおけるスタチンの脳組織保護効果

日本医科大学大学講師
院医学研究科

仁藤 智香子大脳におけるグルタミン酸受容体GluD1の入力選
北海道大学大学院
択的回路形成と高次神経機能発現に関する共同
医学研究科
研究

－ 395 －

小野寺理

生体磁気共鳴五十嵐 博中学分野

神経変性疾患におけるアクアポリン(AQP)および
福島県立医科大学
AQP関連タンパクの解析

講師

星

明彦

デジタル医学
柿田分野

明美

多系統萎縮症剖検脳におけるTPPP（p25α）蛋白 東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究 講師の発現解析およびその制御下流遺伝子の探索
科

石川

欽也

デジタル医学
柿田分野

明美

悪性脳腫瘍の非コードRNAの機能解析を基盤とし 京都府立医科大学
医学部
た分子標的創薬の展開

教授

山中

龍也

脳神経外科学藤井分野

幸彦

UBQLN2コンディショナルノックアウトマウスの解析に基づく神経変性機序の解明

横浜市立大学大学教授
院医学研究科田中章景

動物資源開発笹岡
研究分野

俊邦

免疫不全を伴わない患者に発生するEpsteinBarr virus関連の中枢神経原発悪性リンパ腫の臨床病理学的検討

久留米大学医学部

杉田保雄

デジタル医学
柿田
分野

明美

教授

連携資源利用型
研究課題名

申請者
所属

所内対応教員

職名

氏名

分野名

氏名

脳アミロイドアンギオパチー関連炎症の発症機構の解明

金沢大学附属病院

助教

坂井

健二

デジタル医学柿田分野

明美

筋線維メインテナンスに果たすWWP1ユビキチン
リガーゼの機能の解析

国立精神・神経医療研究センター神経研
究所

室長

今村

道博

動物資源開発笹岡
研究分野

俊邦

ゲノム編集技術と生殖工学技術を用いた効率的な遺伝子改変マウス作製

熊本大学生命資源研
究・支援センター

教授

中潟

直己

動物資源開発笹岡研究分野

俊邦

ALS/FTLDにおけるTDP-43関連軸索内mRNA輸送障
害の解析

国立精神・神経医療研究センター神経研
究所

室長

長野

清一

分子神経疾患資
源解析学分野

明美

が

小野寺

理

筋萎縮性側索硬化症脊髄におけるVGFの局在に関岐阜薬科大学
する研究

准教授

嶋澤

雅光

デジタル医学
柿田
分野

神経回路の興奮性に対するCB2受容体の役割の解 東京大学大学院医
学系研究科
明

助教

菅谷

佑樹

細胞神経生物﨑村
学分野

建司

タウオパチーにおける運動ニューロン障害の病
理学的研究

愛知医科大学加齢教授
医科学研究所吉田眞理

デジタル医学
柿田分野

明美

内在性TDP-43遺伝子改変と筋萎縮性側索硬化症
モデルへの応用北里大学医学部

教授

佐藤

俊哉

分子神経疾患資
源解析学分野アメリカ平原ハタネズミ（Prairie vole）から
東北大学大学院農のES細胞樹立条件の検討，及びCrispr/Cas9法に学研究科
よる遺伝子KOハタネズミ作出の試み

教授

西森

克彦

細胞神経生物﨑村
学分野

建司

パーキンソン病治療における標的タンパク質と 東北大学大学院生
しての Inhibitory PAS Domain Protein の検証 命科学研究科

教授

十川

和博

デジタル医学
柿田
分野

明美

講師

中山

耕造

動物資源開発笹岡
研究分野

俊邦

意思伝達不能状態（Stage V,TLS）の筋委縮性側 東京都立北療育医療センター
索硬化症の臨床病理学的検討

神経内科
医長

望月

葉子

デジタル医学
柿田分野

明美

酸化ストレスによる神経細胞機能の障害と細胞死に関する研究東京女子医科大学

主任教授

柴田

亮行

デジタル医学柿田分野

明美

ドパミン-D1Rシグナルが心不全に果たす役割の解明

東京大学医学部

教授

小室

一成

動物資源開発笹岡研究分野

俊邦

胎仔期および発達期の脳におけるドーパミン受容体D1Rの機能解析

北里大学医学部

准教授

大久保

直

動物資源開発笹岡研究分野

俊邦

Astroblastomaの網羅的遺伝子解析

群馬大学大学院医
助教
学系研究科

純人

デジタル医学柿田分野

明美

デジタル医学
柿田
分野

明美

惇

デジタル医学
柿田
分野

明美

育子

細胞神経生物﨑村
学分野

建司

APP細胞内ドメインの神経毒性の解析

信州大学医学部

信澤

筋萎縮性側索硬化症脊髄におけるGPNMB凝集体に
岐阜薬科大学
関する研究

教授

原

ヒト神経疾患脳におけるDAP12発現の病理学的検
埼玉医科大学討教授

佐々木

時間的空間的特異的Scrapperノックアウトマウ
スの作製と解析准教授

矢尾浜松医科大学※所属・職名は、申請時のものです。

－ 396 －

英彰

運

各

る

形

す

小野寺

理

A.

ュ
あ
VC
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経
お
に
非
ど
ン
ー
ト
せ
と
ン

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ウ
ウ
ン
た
ル

美

美

彦

邦

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

組換えウイルスを用いた筋萎縮性側索硬化症病変の発症進展機序の解明

美

美

邦

邦

理

美

研究代表者

渡部

研究分担者

柿田

和彦 1）
明美 2）

1）公益財団法人東京都医学総合研究所・神経変性病理
2）新潟大学脳研究所・デジタル病理学分野
研究要旨
ヒト筋萎縮性側索硬化症(ALS)における運動ニューロン変性のメカニズムは依然として不明である
が，ALS 関連遺伝子として TDP-43, FUS など様々なものが知られ，さらに蛋白分解系の異常によって運動ニューロンにおける細胞内凝集体形成や細胞死が促進されることがわかってきた．本研究では，各種の組換えウイルスベクターを用いて TDP-43, FUS などの ALS 関連遺伝子および蛋白分解系に対する shRNA を培養系および成体マウス・ラット運動ニューロンに発現させ，ALS に特徴的な凝集体の形成過程や細胞死，周囲の細胞への播種・進展様式を解析するとともに，ヒト ALS 剖検例と比較解析することにより，ALS 病変の発症進展機序の解明を目指している．

司

美

理

司

美

邦

美

美

邦

邦

美

美

美

司

A.研究目的
ヒト筋萎縮性側索硬化症(ALS)における運動ニ
ューロン変性のメカニズムは依然として不明であるが，近年，ALS 関連遺伝子として TDP-43, FUS,
VCP, UBQLN2, C9orf72 など様々なものが知られている．さらにプロテアソームやオートファジー
経路の凝集体形成・細胞死への関与が指摘されており，これら蛋白分解系の異常が ALS の発症進行にも影響を与えていると想定される．本研究では，
非増殖性組換えウイルスを用いて TDP-43, FUS な
どの ALS 関連遺伝子，およびプロテアソーム・エ
ンドソーム・オートファジーに対する抑制性ショートヘアピン(sh)RNA を培養系および成体ラット・マウス運動ニューロンに単独または共発現させ，凝集体の形成過程や細胞死をヒト ALS 剖検例と比較解析することにより，ALS の運動ニューロン変性機序の解明を目指している．
我々はこれまで，TDP-43, FUS cDNA や蛋白分解系を阻害する shRNA を発現する組換えアデノウイルスをラット，マウス末梢神経に混合接種し，ウイルスの軸索内逆行輸送により運動ニューロ
ンに細胞質内凝集体を形成しうることを報告した（Watabe et al., 2014）．しかし組換えアデノウイ
ルスによる外来遺伝子発現は一過性であるため，昨年度は，より長期間安定した遺伝子導入発現が可能な組換えアデノ随伴ウイルス 9 型(AAV9)を用いて成体マウスに TDP-43 と蛋白分解系阻害
shRNA を逆行性に共発現させ，運動ニューロン細胞体に凝集体の形成を認めた．そこで，今年度は凝集体の周囲の細胞への播種・進展様式を解析するための予備実験として，TDP-43 組換え AAV9を新生仔マウス側脳室に接種し，脳脊髄における外来性 TDP-43 の長期発現を検討した．
一方，正常 TDP-43 とその C 末断片を発現する
組換えアデノウイルスをプロテアソーム阻害条
件下で培養ニューロン，グリアに感染させると，細胞質に粗大な凝集体が形成される（Watabe et al.,2014）．しかし，凝集体形成と細胞死の関連性は明確ではない．そこで，昨年度に引き続き，培養
ニューロンおよびグリア細胞における細胞質凝
集体の形成過程と細胞死をタイムラプス・イメー
ジングにより経時的に観察した．
B.研究方法１．TDP-43 組換え AAV9 の新生仔マウス側脳室接種実験；ヒト正常 TDP-43 を EGFP とともに発現する組換え AAV9 を１日齢 ICR マウスの側脳室に注入接種した．接種 2,4 週〜6 ヶ月後－ 397 －

に灌流固定し脳脊髄の凍結切片を作成，観察した．
２．組換えアデノウイルスによる培養ニューロ
ン・グリア細胞質内 TDP-43 凝集体形成の経時的観察；ニューロン，アストロサイト，またはオリゴデンドロサイトに分化すると各々tubulin beta-3 (TUBB3), GFAP, cyclic nucleotide
phosphodiesterase (CNP) プロモータ制御下にEGFP を発現するプラスミドをラット神経前駆細胞株 1464R に導入し各安定発現株を得た．
これら細胞株をレチノイン酸負荷によって
EGFP 陽性ニューロン，グリアに分化させたのち，ヒト正常または C 末断片 (208-414) TDP-43
を DsRed とともに発現する組換えアデノウイ
ルスを共感染させた．感染 24 時間後，プロテアソーム阻害剤 MG-132 を添加し，タイムラプ
ス蛍光撮影を 72 時間行い，細胞質凝集体の形
成と細胞死を経時的に観察した．
C.研究結果１．TDP-43/EGFP 組換え AAV9 の側脳室注入接種により，接種 2,4 週〜6 ヶ月後にわたって大脳，
脳幹，脊髄に瀰漫性に EGFP 陽性ニューロンを認め，ヒト特異的 TDP-43 免疫組織化学では核が陽性に染色された．
２．培養タイムラプスの解析では，組換えアデノウイルスを EGFP 陽性分化ニューロン，グリアに感染発現させ MG-132 を負荷すると，DsRed 陽性
TDP-43 凝集体が細胞質に徐々に充満し，やがて細胞膜の破綻とともに細胞死に至り，残存した不溶性の凝集体が長時間浮遊する像が観察された．
この凝集体は sarkosyl 不溶性の顆粒状構造物からなり，リン酸化 TDP-43 を含んでいた．また細胞外に放出された凝集体が隣接する細胞に取り込まれる像も観察された．
D.考察
TDP-43 組換え AAV9 の新生仔マウス側脳室接種により，成体マウス脳脊髄ニューロンにおけるヒト TDP-43 の長期安定発現が可能となった．今後，このマウスにヒト TDP-43 および蛋白分解系
阻害 shRNA 組換えアデノウイルスを追感染させて局所の運動ニューロンにヒト TDP-43 凝集体を形成させ，凝集体が周囲の細胞にヒト TDP-43 を介して伝播していくか否かを経時的に観察する予定である．
一方，培養ニューロンにおける TDP-43 凝集体の形成過程を経時的に観察しえた．現在，凝集体の細胞間伝播の可視化に関しても検討を行っている．
これらの実験系を用いて，細胞変性や凝集体形
成のメカニズムを解析するとともに変性を抑止する方法を見出し，ALS の治療法開発に繋げてい
きたい．

E.結論
TDP-43 組換え AAV9 の新生仔マウス側脳室接種により，成体脳脊髄ニューロンにおけるヒト
TDP-43 の長期発現が可能となった．また，培養ニ
ューロン，グリアにおける TDP-43 凝集体の形成過程と細胞死を経時的に観察した．

2)

3)

4)

F.研究発表1.論文発表1) Tsukamoto M, Sango K, Niimi N, Yanagisawa H,
Watabe K, Utsunomiya K. Upregulation of
galectin-3 in immortalized Schwann cells IFRS1
under diabetic conditions. Neurosci Res
2015;92:80-85.
2) Murakami T, Sango K, Watabe K, Niimi N, Takaku
S, Li Z, Yamamura K, Sunada Y. Schwann cells
contribute to neurodegeneration of transthyretin
amyloidosis. J Neurochem 2015;134:66-74.
3) Nakayama Y, Shimizu T, Hayashi K, Mochizuki Y,
Nagao M, Watabe K, Kawata A, Nakano I,
Oyanagi K. Predictors of impaired communicationin amyotrophic lateral sclerosis patients withtracheostomy invasive ventilation. Amyotroph
Lateral Scler Frontotemporal Degener
2016;17:38-46.
4) Bokuda K, Shimizu T, Imamura K, Kawata A,
Watabe K, Hayashi M, Nakayama Y, Isozaki E,
Nakano I. Predictive factors for prognosis
following unsedated percutaneous endoscopic
gastrostomy in ALS patients. Muscle Nerve. 2016
Jan 21. doi: 10.1002/mus.25051. [Epub ahead ofprint]
5) 渡部和彦．筋萎縮性側索硬化症とニューロパチ
ーの病態解明をめざして；運動ニューロン・シ
ュワン細胞病変モデルの構築と解析．九州薬学会会報 2015;69:1-5.
2.学会発表1) 渡部和彦，石井智裕，河上江美子，柳澤比呂子，
秋山けい子，遠藤堅太郎，三澤日出巳．

－ 398 －

5)

6)

7)

8)

9)

10

細

形
止
い

接
ト
ニ
過

ku

Y,

on

6

チ
シ
学

子，

Adenovirus-induced neuronal TDP-43 aggregates
demonstrated by time-lapse imaging. 第 56 回日本神経学会学術大会，新潟，2015 年 5 月 20 日．
2) 木田耕太，清水俊夫，木村英紀，山崎寿洋，関口輝彦，上山勉，川田明広，渡部和彦，林雅晴，磯崎英治．筋萎縮性側索硬化症(ALS)における線維束電位(FP)のプロファイルについて．第 56 回日本神経学会学術大会，新潟，2015 年 5 月 21 日．
3) 村上龍文，三五一憲，渡部和彦，新見直子，高久静香，李生花，山村研一，砂田芳秀．Schwann cells
affect neuropathy in transthyretin amyloidosis. 第 56
回日本神経学会学術大会，新潟，2015 年 5 月 22日．
4) 林健太郎，望月葉子，竹内亮子，小森隆司，高橋均，柿田明美，渡部和彦，関絵里香，新井信隆，
小柳清光，清水俊夫，長尾雅裕，磯崎英治．意思伝達不能状態（意思伝達能力 stage V）となった
筋萎縮性側索硬化症（ALS）における大脳病変の免疫組織学的検討．第 56 回日本神経病理学会総会学術研究会，福岡，2015 年 6 月 5 日.
5) 石井智裕，河上江美子，柳澤比呂子，秋山けい子，
遠藤堅太郎，三澤日出巳，渡部和彦．組換えアデノウイルスによる培養ニューロン細胞質内TDP-43 凝集体形成の経時的観察．第 56 回日本神経病理学会総会学術研究会，福岡，2015 年 6 月 5日.
6) 石井智裕，河上江美子，柳澤比呂子，秋山けい子，
遠藤堅太郎，三澤日出巳，渡部和彦．組換えアデノウイルスによる培養ニューロン細胞質内TDP-43 凝集体形成の経時的観察．第 38 回日本神経科学大会，神戸，2015 年 7 月 28 日.
7) 渡部和彦，石井智裕，柳澤比呂子，三五一憲，秋山けい子，河上江美子，遠藤堅太郎，阿久津英憲，
三澤日出巳．幹細胞由来ニューロンと株化シュワ
ン細胞の共培養によるミエリン形成．第 38 回日本神経科学大会，神戸，2015 年 7 月 28 日.
8) 村上龍文，三五一憲，渡部和彦，大澤裕，李正花，
山村研一，砂田芳秀．シュワン細胞は TTR 型ア
ミロイドーシスの神経変性に関与する．第 26 回
日本末梢神経学会学術集会，松本，2015 年 9 月
18 日.
9) Murakami T, Sango K, Watabe K, Niimi N, Takaku S,
Ohasawa Y, Li Z, Yamamura K, Sunada Y. Schwann
cells contribution to neuropathy in transthyretin
amyloidosis. 2015 Peripheral Nerve Society Biennial
Meeting, Quebec, Canada, June28-Jul2, 2015.
10) 渡部和彦．筋萎縮性側索硬化症とニューロパチ

ーの病態解明をめざして；運動ニューロン・シュ
ワン細胞病変モデルの構築と解析．第 7 回信州大
学神経病理学セミナー，松本，2015 年 9 月 29 日.
（招待講演）
11) Moriwaki Y, Ohno Y, Ishii T, Takamura Y, Sango K,
Watabe K, Misawa H. SIMPLE, a causative gene for
Charcot-Marie-Tooth disease type 1C, participates inprotein trafficking in trans-Golgi network andrecycling endosome. 45th Annual Meeting of Society
for Neuroscience, Chicago, IL, USA, October 17-21,
2015.
12) 石井智裕，秋山けい子，河上江美子，柳澤比呂子，岡戸晴生，三輪昭子，遠藤堅太郎，三宅弘一，
三澤日出巳，渡部和彦．筋萎縮性側索硬化症における TDP-43 凝集体形成モデルの確立．第 37 回
神経組織培養研究会，霧島，2015 年 11 月 8 日.
13) 渡部和彦．株化シュワン細胞の樹立とミエリン形成．第 37 回神経組織培養研究会，霧島，2015
年 11 月 8 日.
14) 柳澤比呂子，石井智裕，河上江美子，遠藤堅太郎，平岡由佳，上野隆，山元大輔，小松雅明，渡部和彦．L-leucine 添加によるオートファジー不全を改善するメカニズムと Spin1 との関連．第 38
回日本分子生物学会年会，神戸，2015 年 12 月 2日.

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
該当なし－ 399 －

後
平成 27 年度新潟大学脳研究所

pT｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

D.

共同利用・共同研究報告書

神経変性疾患：特異的異常蛋白はシナプスを越えるのか

細

細

こ
研究代表者
研究分担者

清光 1）

小栁

絵美 2）、柿田

鈴木

し
明美 3）

を

他
信州大学医学部

1)神経難病学講座

2)分子神経生理学教室

3)新潟大学脳研究所脳疾患標本資源解析学分野

け

躍
研究要旨

pT

古典型孤発性（s）筋萎縮性側索硬化症（ALS）の疾患特異的なリン酸化（p）TDP-43 が神経細胞かこら神経細胞に連続的に伝播拡散するのかを明らかにする目的で、sALS 神経細胞の軸索内と胞体内とれにおける pTDP-43 封入体の存在部位と形態を免疫組織学的に検索した。軸索内の pTDP-43 は、顔面神支経核、舌下神経核の神経細胞、および前角細胞の軸索で見られ、顆粒網状と塊状の 2 形態を示した。

内

軸索内 pTDP-43 封入体は臨床経過が比較的短かい症例でのみ見られた。赤核では神経細胞を取り巻くい

軸索末端に pTDP-43 がみられ、pTDP-43 に取り巻かれた神経細胞では核内の TDP-43 が消失していた。

ししかし後シナプスであるこれら神経細胞胞体内に pTDP-43 の沈着は見られなかった。

て巻
依存性 TDP-43 抗体、抗リン酸化 neurofilament 抗プ

筋萎縮性側索硬化症（ALS）、パーキンソン病、体、抗シナプトフィジン抗体等を用いて免疫染色ス

アルツハイマー病などの神経変性疾患におけるし（ABC 法および蛍光抗体法）、前角細胞を明視た

特異的蛋白が脳内で神経細胞から神経細胞へ連野顕微鏡と共焦点顕微鏡（ツアイス LSM5）で観

た

察した。

TD

A.研究目的

続的に伝播拡散するのかを解析する目的で、本研究では、古典型孤発性（s）筋萎縮性側索硬化症（sALS）で、リン酸化（p）TDP-43 が神経細pT
C.研究結果ンし胞から神経細胞に連続的に伝播拡散するのかを、

軸索内 pTDP-43 陽性構造物は、sALS 症例の顔面神経核、舌下神経核の神経細胞、および前角細のsALS 神経細胞の軸索内と胞体内とにおける胞の軸索で比較的多数見られた。

いpTDP-43 封入体の存在部位と形態について免疫
組織学的に検索した。

その形態は、軸索外縁に存在する、大きさ 1µm

っ程度の顆粒-網状のものと、軸索内部に存在する、て大きさ 10µmx5µm 程度の塊状のものの 2 種類からなっていた。

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
日本人古典型孤発性 ALS19 剖検例（男 11 例、
女 8 例、経過は 6 カ月から 72 カ月）および日本
人対照 3 例（男 3 例）を用いた。ホルマリン固定、
パラフィン包埋された脳と脊髄各箇所の切片を、HE、KB 染色し、抗 pTDP-43 抗体、抗リン酸化非pT

軸索内 pTDP-43 陽性構造物は、顆粒-網状のも可のが概ね 30 カ月以内、塊状のものが概ね 10 ヶ月

pT

以内と、比較的経過が短い例でのみ認められた。

白

赤核では、神経細胞を取り巻く軸索末端にれ

pTDP-43 がみられ、pTDP-43 に取り巻かれた神経細胞では核内の TDP-43 が消失していた。しかし－ 400 －

後シナプスであるこれら神経細胞胞体内に

E.結論

pTDP-43 の沈着は見られなかった。

古典型孤発性筋萎縮性側索硬化症（sALS）下位
運動ニューロン軸索に見られる pTDP-43 凝集体
は軸索の機能障害を惹起している可能性が考え

D.考察
多くの sALS で胞体内の pTDP-43 封入体と神経られる。赤核周囲軸索末端の pTDP-43 は核内細胞脱落を呈する顔面神経核や舌下神経核、前角TDP-43 を減量させ、細胞内蛋白合成系の機能不細胞の軸索で pTDP-43 陽性構造物が認められた

全を惹起している事が考えられる。

ことは、胞体内と軸索内で、何らかの関連性を有して pTDP-43 陽性構造物が形成されていることを示している。しかし、どちらかが先に形成され、他方に流動している、という解析は出来なかった。

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表1. Onozato T, Nakahara A, Suzuki-Kouyama E,

軸索外縁の pTDP-43 は軸索表面の機能、とりわHineno A, Yasude T, Nakamura T, Yahikozawa H,

け膜電位の変化を障害する可能性が考えられ、跳Watanabe M, Kayanuma K, Makishita H, Ohara S,

躍 伝 導 に 影響 す る 可 能性 が あ る 。ま た 塊 状 のHashimoto T, Higuchi K, Sakai T, Asano K,

pTDP-43 は軸索流を阻害する可能性が考えられ、Hashimoto T, Kanno H, Nakayama J, Oyanagi K:

これはシナプス伝達を障害する可能性がある。こAxonal TDP-43 aggregates in sporadic amyotrophic

れらの機能障害は、顔面や舌、四肢、呼吸筋など

lateral sclerosis. Neuropathol Appl Neurobioly

支配筋の麻痺を惹起する可能性が考えられ、軸索内に pTDP-43 陽性構造を有する症例の経過が短いことや、筋の線維束攣縮と関連しているのかも2016 [Epub ahead of print]
2. Nakayama Y, Shimizu T, Mochizuki Y, Hayashi K,
Matsuda C, Nagao M, Watabe K, Kawata A,しれない。
経シナプス性 pTDP-43 の拡散の可能性についOyanagi K, Isozaki E, Nakano I: Predictors ofては、赤核の神経細胞が pTDP-43 陽性軸索に取り

impaired communication in amyotrophic lateral

巻かれていたが、それらの神経細胞胞体内後シナ

sclerosis patients with tracheostomy-invasive抗

プスに pTDP-43 陽性構造物は見られず、経シナプ

色ス的な pTDP-43 の拡散の所見は認められなかっ視た。しかし、pTDP-43 陽性軸索に取り巻かれてい観た神経細胞では核内のリン酸化非依存性のventilation. Amyotroph Lateral Scler
Frontotemporal Degener 17: 388-346, 2016
3. 日根野晃代、小栁清光、中村昭則、下島吉雄、

TDP-43 は消失していた。これは、前シナプスの吉田邦広、池田修一. SOD1 遺伝子 L106V 変異

pTDP-43 によって後シナプス神経細胞の核内のリ

家族性筋萎縮性側索硬化症における下部尿路

ン酸化非依存性 TDP-43 が影響されることをしめ機能障害の発現時期と排尿神経機構の病理所顔している。核内リン酸化非依存性 TDP-43 は RNA

見. 臨床神経学 56: 69-76, 2016

細のスプライシングはじめ種々の機能に関連していると言われており、前シナプスの pTDP-43 によµmって後シナプス神経細胞の蛋白合成が障害される、ている可能性がある。

ら4. Oyanagi K, Mochizuki Y, Nakayama Y, Hayashi K,
Shimizu T, Nagao M, Hashimoto T, Yamazaki M,
Matsubara S, Komori T: Marked preservation of thevisual and olfactory pathways in ALS patients in asALS 下 位 運 動 ニ ュ ー ロ ン 軸 索 に 見 ら れ た
pTDP-43 凝集体は軸索の機能障害を惹起している

totally locked-in state. Clin Neuropathol 34:

も可能性が考えられる。赤核周囲軸索末端の267-274, 2015月

pTDP-43 は、核内 TDP-43 を減量させ、細胞内蛋た。

白合成系の機能不全を惹起している事が考えら

Wakabayashi K, Takahashi H: Hippocampalにれる。

sclerosis in the parkinsonism-dementia complex of

5. Oyanagi K, Yamazaki M, Hashimoto T, Asakawa M,

経

Guam: quantitative examination of neurons,

しneurofibrillary tangles, and TDP-43－ 401 －

immunoreactivity in CA1. Neuropathology 35:
224-235, 2015
6. Kaneko M, Noguchi T, Ikegami S, Sakurai T, Kakita
A, Toyoshima Y, Kamve T, Yamada M, Inden M,
Hara H, Oyanagi K, Inuzuka T, Takahashi H,
Hozumi I: Zinc transporter (ZnT3 and 6) are
downregulated in the spinal cords of patients withsporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neurosci
Res 93: 370-379, 2015
2.学会発表ありません。
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得ありません。

ど2.実用新案登録

D2ありません。

択

3.その他

と

ありません。

に

ン

ス

ル

A.

が

も

害

か

い

い

ウ

発

因

す

B.

ー

や

－ 402 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

ドーパミン受容体変異マウスを用いた不安様行動発症機序の解明

研究分担者

山森 早織 1）
笹岡 俊邦 2）

研究分担者

板倉 誠

研究分担者

飯田 諭宜 1）

研究代表者

1）

1）北里大学医学部 2）新潟大学脳研究所
研究要旨
マウスの不安様行動の測定には、オープンフィールドテスト、明暗選択テスト、高架式十字迷路など、様々な試験が用いられる。C57/B6 マウスにキンピロール（ドーパミン D2/D3 受容体アゴニスト：
D2 高選択性）を投与してこれらの行動試験を行うと、オープンフィールドテストでは壁走性、明暗選
択テストでは明所忌避の不安様行動が出現することが明らかとなった。D2 受容体ノックアウトマウスと D3 受容体ノックアウトマウスを用いて、各受容体と不安様行動の関係性を調べると、キンピロール
によって生じる不安様行動のうち、明暗選択テストでの明所忌避は D2 受容体を介して発現し、オープンフィールドテストの壁走性は D3 受容体を介して発現する可能性が示唆された。さらに、野生型マウスに PD-128907（ドーパミン D2/D3 受容体アゴニスト：D3 高選択性）を投与しても、オープンフィー
ルドテストでの壁走性が出現した。

ト：D3 高選択性）をそれぞれ腹腔内投与し、オーA.研究目的現代社会では、うつなどを代表とする不安障害が問題となっているが、薬剤に対し難治性となる

プンフィールドテスト、明暗選択テスト、高架式
十字迷路を行った。

ものもあり早急な対応が求められている。不安障

さらに、笹岡らから供与を受けた D2 受容体ノ害の克服には不安感の発症機序を分子的に明らックアウトマウスおよび D3 受容体ノックアウト

かにすることが必要だが、未だ明らかにはなってマウスを用いて同様の実験を行った。

いない。本研究はドーパミン受容体の作用薬を用いた薬理学的解析と、ドーパミン受容体ノックア

C.研究結果ウトを用いた解析を行い、ある種の不安様行動のC57/B6 マウスにキンピロールを投与すると、オ発症がドーパミン受容体のどのサブタイプに起ープンフィールドテストでは壁走性、明暗選択テ因する可能性があるかを検証することを目的とストでは明所忌避の不安様行動が出現した。D2 受する。

容体ノックアウトマウスにキンピロールを投与すると明暗選択テストでの明所忌避は見られなくなるのに対し、オープンフィールドテストの壁

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
8 週齢の C67/BL6 マウスに、キンピロール（ド走性は観察された。これらのことから、明暗選択

ーパミン D2/D3 受容体アゴニスト：D2 高選択性）

テストでの明所忌避は D2 受容体を介して生じるや PD-128907（ドーパミン D2/D3 受容体アゴニス

不安様行動であるがオープンフィールドテスト－ 403 －

の壁走性は D3 受容体を介する可能性があると考

倉誠、笹岡俊邦、宮岡等、高橋正身

“ドーパ

えられた。

ミン D2 レセプターはマウスの不安様行動に関与している.” 日本神経科学会、2014 年 10 月、

また C57/B6 マウスに PD-128907 を投与すると、

奈良

オープンフィールドテストでの壁走性と明暗選
択テストでの明所忌避の不安様行動が出現する

・ Yuuki Iida, Takahito Kojima, Hiromichi

が、オープンフィールドテストの方がより低濃度

Nagayama, Saori Yamamori, Makoto Itakura,から不安様行動が出現した。D3 受容体ノックアウ

Toshikuni Sasaoka, Hitoshi Miyaoka, Masami

トマウスでは、PD-128907 の投与をしてもオープ

Takahashi “The dopmaine D2 receptor is

ンフィールドテストでの壁走性行動の有意な出involved in some types of anxiety-like

現は見られなかった。これらの結果から、少なく

behavior in mice.” 北米神経科学会、2014

ともオープンフィールドテストでの壁走性には

年 11 月、 Washington D.C.

D3 受容体が関与する可能性があることが推察でG.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

きた。

なし
D.考察
以上の結果は、ドーパミン D2 および D3 受容体的が、マウスの不安様行動と密接な関連があること

得を明確に示している。非常に興味深いことに、不もの安様行動実験の種類によって D2 受容体および D3必受容体シグナルの関与は大変異なっていた。この考結果はマウスの不安感を引き起こす脳内メカニをズムが多種多様であることを示唆している。この可

不安感を誘発する脳内の分子メカニズムの多様性を明らかにするには、今後さらなる研究が必要
である。

A.

E.結論

メ

D2 受容体ノックアウトマウスと D3 受容体ノッ

認

クアウトマウスを用いることで、キンピロール

伝（ドーパミン D2/D3 受容体アゴニスト：D2 高選の択性）によって生じる不安様行動のうち、明暗選

化

択テストでの明所忌避は D2 受容体を介して発現

皮し、オープンフィールドテストの壁走性は D3 受の容体を介して発現する可能性が示唆された。

がさらに、D3 受容体を介してオープンフィールド

検

テストでの壁走性が出現することは、低濃度のPD-128907（ドーパミン D2/D3 受容体アゴニス

B.

ト：D3 高選択性）の投与によっても確認された。

セ解F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表・投稿準備中もpy

能2.学会発表ハ・飯田諭宜、小嶋孝仁、永山博通、山森早織、板－ 404 －

パ

関

平成 27 年度新潟大学脳研究所

月、｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

hi

a,

mi

大規模アルツハイマー病ゲノムリソースを用いた系統的網羅的エピゲノム解析

is

ke

研究代表者

岩田

14

研究分担者

池内

淳 1）
健 2）

1）東京大学医学部附属病院 神経内科 2）新潟大学脳研究所遺伝子機能解析学分野
研究要旨
アルツハイマー病発症の原因を探索するために，死後脳の神経細胞核特異的 DNA メチル化解析を網羅的に施行したところ，複数の遺伝子の発現調整領域において DNA メチル化の異常を同定した．これによって得られた遺伝子群の発現変化を死後脳で検討したところ，アルツハイマー病特異的に発現変化を生じているものを同定した．この遺伝子の発現変化に至る DNA メチル化異常が中枢神経特異的かどうかの検討が次に必要と考えたが，使用した死後脳の脳以外の組織由来の DNA はなく，他のサンプルセットでの検討が必要と考え田．このため，新潟大学脳研究所で蓄積されている大規模ゲノムリソースを用いて網羅的に解析する事を提案した．それにより得られた結果が脳特異的なものなのか，また，原集団以外のサンプルでも異常と検出可能なのかを検討することとし，末梢血での DNA メチル化解析を施行する事とした．

ル化の程度を測定し，診断，性別，年齢などで比A.研究目的東京大学において行われた神経細胞特異的 DNA

較検討した．

メチル化解析では連続領域に DNA メチル化の際を認めた遺伝子を 3 つ同定した．これらのうち 2 遺C.研究結果伝子は遺伝子発現の差について mRNA，タンパク質

下図に示すように，測定した全ての CpG においの双方で確認する事が出来た．DNA メチル化の変て正常■，アルツハイマー病□の間で有意な差は化は 神経細胞以外のグリア細胞由来の DNA，大脳

見いだせなかった．

皮質ではない小脳由来の神経細胞の DNA でも同様の傾向が見られた．すなわち，DNA メチル化変化が中枢神経以外の細胞においても見られるかを検討する必要があると考えられた．
B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
新潟大学脳研究所付属生命科学リソース研究センターバイオリソース研究部門の遺伝子機能解析学分野において匿名化された臨床情報とともに取得された末梢血ゲノムでの DNA メチル化を
pyrosequencing 法で解析した．対象 DNA は認知機能正常高齢者 40 名，臨床的に診断されたアルツ
ハイマー病 36 名であり，22 の CpG においてメチ

D.考察
今回使用した末梢血サンプルはアルツハイマ
ー病の診断は臨床診断である点，認知機能正常高齢者の中には Preclinical アルツハイマー病としてアルツハイマー病病理の存在している者が統計学的には 20-30$程度存在していることを想定すると，今回の解析で末梢血に DNA メチル化異－ 405 －

常がないと 100%結論づけるのは早計である可能
性は残る．
E.結論
今回の解析では，少なくとも臨床的に診断されるアルツハイマー病の末梢血では神経細胞で認められるような DNA メチル化異常は観察されなかった．今後は脳サンプル取得対象者の脳以外のDNA での解析が考慮される．
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし 現在投稿準備中
2.学会発表Tatsuo Mano, Kenichi Nagata, Shigeo Murayama, Takaomi C.
Saido, Shoji Tsuji, Atsushi Iwata Epigenome wide analysis ofneuron specific DNA methylation in Alzheimer disease. The
13th International Congress of Human Genetics

2016,

Kyoto, Japan, 口演, 2016/4/5
Tatsuo Mano, Shigeo Murayama, Tadafumi Hashimoto,Takeshi Iwatsubo, Shoji Tsuji, Atsushi Iwata. Epigenetic
regulation of BRCA1 in Alzheimer’s disease. Evaluation of
post-mortem brain and model mice reveals importance of
aggregated tau. AAIC (Alzheimer’s association International
Conference)

2016.

Toronto,ON,

Canada,2016/7/25 (予定)

さ

異

Af

し

ー

現

領

は

変

文

ー

の

Atsushi Iwata, Tatsuo Mano, Ryo Ohtomo, Kenichi Nagata,
Takaomi Saido, Satoshi Yamashita, Toshikazu Ushijima,
Tadafumi Hashimoto, Akira Tamaoka, Takeshi Iwatsubo, Shoji
Tsuji. Neuron-specific methylome analysis reveals new
pathomehanism in Alzheimer’s disease brains. AAIC
(Alzheimer’s association International Conference)

2016,

Toronto, ON, Canada. 2016/7/25 (予定)

A.

発

分

社

ー

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得

的

ソ

塩

なし

で

2.実用新案登録

明

なし

す

3.その他

情

なし

と

に

－ 406 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

アルツハイマー病に関連するゲノム配列変異の解析システムの構築
研究代表者
研究分担者

中谷明弘 1)

池内健 2), 春日健作 2), 菊地正隆 1)

1)

大阪大学大学院医学系研究科 ゲノム情報学2)

新潟大学脳研究所 遺伝子機能解析学

研究要旨
アルツハイマー病の２つの疾患群（家族性早期発症型/孤発性晩期発症型）および健常検体群に分類される脳研究所が保有する約 2,000 名を想定して、ゲノム配列の変異情報（一塩基変異やコピー数変異など）を俯瞰的に解析および可視化するソフトウェアを開発する。脳研究所にて既に蓄積している
Affymetrix 社製アレイ系によるデータから配列変異情報の抽出を実現する処理パイプラインを構築し、そこで抽出した変異情報のデータベースの構築を可能とするシステムの開発を行う。構築したデータベースを用いて疾患との関連解析を行った結果の可視化を行い、抽出した知見の当該疾患の研究
現場への還元を目指す。本研究では、コピー数変異（CNV）領域や一塩基変異（SNV）の連鎖不平衡（LD）
領域を例とした染色体上での範囲情報を伴う変異に注目する。それによって、個々の塩基位置のみではなく、染色体領域と疾患との関連に注目することにより、検体群や疾患家系内でのゲノムワイドな変異情報の特性を明らかにする。さらに、遺伝子の発現量や、脳研究所にて公開している変異情報の文献データベースである JFADdb (Japanese Familial Alzheimer’s Disease Database)等とのデータベースとの連携、および、次世代シーケンサによる全エクソーム解析/全ゲノム解析（WEA/WGA）情報との連携も検討する。

ータベースの統合化を行う。

A.研究目的アルツハイマー病の２つの疾患群（家族性早期発症型/孤発性晩期発症型）および健常検体群にB.研究方法（倫理面への配慮を含む）

分類される約 2,000 名のゲノム配列の Affymetrix

アルツハイマー病の２つの疾患群（家族性早期

社製アレイ系による変異情報（一塩基変異やコピ発症型/孤発性晩期発症型）および健常検体群にー数変異）をはじめとする網羅的なデータを俯瞰

含まれる約 2,000 名のゲノム配列の変異情報（1

的に解析および可視化するデータベースおよび

塩基変異およびコピー数変異）を俯瞰的に解析おソフトウェアを開発する。コピー数変異領域や一よび可視化するソフトウェアを開発する。本研究

塩基変異の連鎖不平衡領域を例とした染色体上では、疾患群単位での変異情報の集計や疾患とのでの範囲情報を伴う変異の標的疾患との関連を関連が期待される変異領域の抽出、および、そこ明らかにすることを目指す。また、本研究で整備で抽出した変異情報のデータベースの構築するするリソースと脳研究所にて公開している変異ための手法の開発を行う。構築したデータベース

情報の文献データベースである JFADdb をはじめを用いて疾患との関連解析を行った結果の可視とする既存のデータベースとを連携させること化を行い、抽出した知見の当該疾患の研究現場へによって日本人・アルツハイマー病に関連するデの還元を目指す。

－ 407 －

本研究では、コピー数変異（CNV）領域や一塩

また、次世代シーケンサを用いた Tethered

Na

基変異（SNV）の連鎖不平衡（LD）領域を例としConformation Capture 法（TCC 法）による染色体Kaた染色体上での範囲情報を伴う変異に注目する。

近接構造の同定を神経芽細胞腫および星状細胞

Ik

各検体でのこれら変異領域の境界（始点と終点）

腫由来細胞株を用いて行ったデータの解析を併の算出や断続する複数の変異領域の扱い方の検せて実施して、より高次なゲノム構造の解明を進討を行い、ゲノム配列上に「点」として散在するめると共に、染色体セグメント間の複雑な相互関

マーカー情報から「領域」としてのゲノム配列の係を把握するための手法の開発を進めた。

Ja

an

子

構造情報を再構築する。それらを検体群内で集計することにより「領域と頻度」によって表現され

of

D.考察

る疾患に関連する変異情報の解析を進める。また、変異を「点」ではなく「領域」としてゲノムワ

Naアルツハイマー病で重要となることが想定されイドに評価することは変異情報の高密度化にはKaる稀少変異（例えば集団内変異頻度が 1%以下）に欠かせないものであると言える。また、同一染色

Ik

関しても検討を行う。

体上の連続した領域間の関係（≒連鎖不平衡）の獲得した変異情報は関係データベースに格納
して検索用のインタフェースを開発する。遺伝子

みではなく、染色体を跨がるような位置関係にある領域間の相互関係の考慮も必要である。

の発現量や、脳研究所にて公開している変異情報の 文 献 デ ー タ ベ ー ス で あ る JFADdb (Japanese

E.結論

Ge

Da

（

会

20

Familial Alzheimer’s Disease Database)等との検体における変異情報と疾患に関連した複雑データベース統合化を行う。また、次世代シーケな形質の間の関係性を明らかにするためには、多ンサによる全エクソーム解析/全ゲノム解析

因子的な評価も必要になってくる。しかしながら、

菊（WEA/WGA）情報との連携も検討する。

単因子的な評価の総和では捉えきれない要因の桑存在も想定されて、走査的処理や組合論的処理な
どの「表計算ソフト」では扱い難い要素を含んでC.研究結果ー

第アルツハイマー病疾患群および健常検体群のいるため、対象データに特化しての適切な処理手

ゲノム情報（コピー数変異や一塩基変異）を変異法の開発とその実装系が必要となる。また、そのの位置や頻度に基づいて可視化できるデータベ

処理結果は必ずしも単純ではないため、適切な可ースの構築手法を開発した (下図)。また本手法視化を行いながらデータの解釈や選別などを効Kiに基づくデータベースでは、染色体領域の位置や、率良く実現する解析支援システムの構築も必要

Ku

遺伝子名、マーカー名等をクエリとしたデータベとなると考えられる。本研究で開発した解析シス

Idース参照のための API（検索のための URL）を備

テムは、これらの概念実証系として期待できるもin

えており、その API を経由して他のデータベースのである。
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表該当なし。
2.学会発表

ル

Al

Ge

Ba

菊

菊地 正隆, 原 範和, 長谷川 舞衣, 宮下 哲典,

桑桑野 良三, 池内 健, 中谷 明弘「アルツハイマーー

病感受性領域が近接する染色体領域の同定」, 第第38 回日本分子生物学会年会, 神戸ポートピアホ

シテル, 2015 年 12 月 1 日(火)～4 日(金)～Kiとの連携を実現できる仕組みになっている。

－ 408 －

ed

Nakaya A, Kikuchi M, Miyashita A, Hara N,

Kuwano R, Ikeuchi T, and Nakaya A, Identifying

体Kasuga K, Nishida N, Tokunaga K, Kuwano R, andchromosomal

胞

Ikeuchi T, Genomic structure and distribution

Alzheimer’s disease GWAS SNPs, QBiC Symposiumof copy number variations in relation to2015, 理化学研究所生命システム研究センター,

Japanese Alzheimer's disease, Biochemistry

大阪, 2015 年 8 月 24 日〜26 日

併

進

関

regions

interacting

withand Molecular Biology, BMB2015 (第38回日本分
Kasuga K, Kikuchi M, Tokutake T, Nakaya A,

子生物学会年会), Kobe, December 1-4, 2015

Tezuka T, Tsukie T, Hara N, Miyashita A, Kuwano

ワ

Nakaya A, Kikuchi M, Miyashita A, Hara N,

R, and Ikeuchi T, Systematic review of JapaneseはKasuga K, Nishida N, Tokunaga K, Kuwano R, andfamilial Alzheimer’s disease and FTDP-17,

色

Ikeuchi T, AD/GD CNVdb (Alzheimer’s Disease

Alzheimer’s

Genomic Databases, Copy Number Variation

Conference

Database), 生命医薬情報学連合大会2015年大会

Washington Convention Center, Washington, DC,（日本バイオインフォマティクス学会2015年年

July 18-23, 2015

の

あ

雑

Association
2015(AAIC2015),

International
WalterE.

会）, 京都大学宇治キャンパスおうばくプラザ,
春日健作, 菊地正隆, 徳武孝允, 手塚敏之, 月

2015年10月29日〜31日

江珠緒, 原範和, 宮下哲典, 中谷明弘, 桑野良

多ら、

菊地 正隆, 原 範和, 長谷川 舞衣, 宮下 哲典,

三, 西澤正豊, 池内健, 本邦における家族性アの桑野 良三, 池内 健, 中谷 明弘「アルツハイマ

ルツハイマー病データベース(Japanese Familial

ー病感受性領域が近接する染色体領域の同定」,

Alzheimer's Disease database, JFADdb)の構築,

第 60 回日本人類遺伝学会年会, 京王プラザホテ

第 56 回日本神経学会新潟学術大会, 朱鷺メッル(新宿), 2015 年 10 月 14 日(水)～17 日(土)セ：新潟コンベンションセンター, 新潟, 2015 年

な

で

手

の

5 月 23 日

可効

Kikuchi M, Hara N, Hasegawa M, Miyashita A,

要

Kuwanoス

Identification

regions

1.特許取得もinteracting with susceptibility loci for

該当なし。

R,

Ikeuchi
of

T,

and

Nakayachromosomal

A,

Alzheimer’s disease, American Society of Human
Genetics 2015 Annual Meeting (ASHG2015),
Baltimore, Maryland, USA, October 6-10, 2015.

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

2.実用新案登録
該当なし。
3.その他
該当なし。

菊地 正隆, 原 範和, 長谷川 舞衣, 宮下 哲典,

典,

桑野 良三, 池内 健, 中谷 明弘「アルツハイマ

ーー病感受性領域が近接する染色体領域の同定」,

第第 34 回日本認知症学会学術集会, リンクステー

ホション青森・ホテル青森, 2015 年 10 月 2 日(金)～4 日(日)Kikuchi M, Hara N, Hasegawa M, Miyashita A,－ 409 －

て
平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

D.

共同利用・共同研究報告書量

バイオメタル・トランスポーターの動態と神経変性疾患に関する研究

存

の
研究分担者

研究代表者 保住 功 1）
位田 雅俊 1)、栗田 尚佳 1)、柿田 明美 2）、豊島 靖子 2)

しレ1）岐阜薬科大学 薬物治療学研究室 2）新潟大学 脳研究所

E.

研究要旨
これまでに筋萎縮性側索硬化症 (ALS)患者の脳髄液で亜鉛濃度の上昇、ALS 患者脊髄中において亜鉛輸送体である SLC30A3 発現量の有意な低下を報告している。以上より、神経における亜鉛代謝異常が ALS 発症に関わっている可能性がある。さらに近年、ALS の病因として小胞体ストレスの関与が報告されていることから、本研究では、小胞体ストレスに対する SLC30A3 の変動と防御効果について検討した。ヒト神経芽腫 (SH-SY5Y)、ヒト胎児腎細胞 (HEK293) においてツニカマイシン処置により、SLC30A3 mRNA が有意に上昇した。また、siRNA を用いて SLC30A3 をノックダウンした
HEK293 に対してツニカマイシンを 24 時間処置したところ、細胞生存率が有意に低下した。これらのことから、SLC30A3 の小胞体ストレスに対する防御効果が示唆された。

御

SL

AL

る

F.
1.
な

2.
A.研究目的測定した。そして、SLC30A3 の細胞内局在につい

筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は原因不明の神経て蛍光免疫染色法を用いて検討した。さらに、変性疾患であり、明確な発症機構は明らかにされsiRNA を用いて SLC30A3 をノックダウンした細ていない。これまでに ALS 患者の脳髄液中で亜鉛胞に対しても同様にツニカマイシンを処置し、細濃 度 の 上 昇 を 確 認 し て お り (Hozumi et al., J

胞生存率について調べた。

Neurol Sci, 2011)、また、我々は ALS 患者の脊髄中において亜鉛トランスポーターである SLC30A3

C.研究結果発現量の有意な低下を報告している (Kaneko et

SH-SY5Y 細胞にツニカマイシンを 24 時間処置

al., J Neurosci Res, 2015)。以上より、神経におけるしたところ、10 μg/ml の濃度で細胞生存率は約

亜鉛代謝異常が ALS 発症に関わっている可能性

60%であり、一方、HEK293 細胞では 1 μg/ml の濃がある。そこで、本研究では、小胞体ストレスを度で細胞生存率は約 70%であった。次に、細胞が与えたときの SLC30A3 の変動と防御効果につい

約 80%生き残るツニカマイシン濃度 (SH-SY5Y: 3て検討した。

μg/ml) 、 (HEK293: 0.5 μg/ml) の 処 置 に よ り

SLC30A3 mRNA が有意に上昇した。さらに蛍光免疫染色法の結果から、SLC30A3 は SH-SY5Y 細B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
ヒト神経芽腫細胞 (SH-SY5Y)、ヒト胎児腎細胞

胞、HEK293 細胞ともに小胞体において局在して(HEK293) にツニカマイシンを 0、1、3、5、10 µg/mL

いた。また、siRNA を用いて SLC30A3 をノック

(SH-SY5Y)、または 0、0.5、1 µg/mL (HEK293)のダウンした HEK293 細胞に対してツニカマイシン

終濃度で 24 時間処置し、細胞生存率について調を 24 時間処置したところ、1 μg/ml の濃度で細胞べた。また、ツニカマイシンを 4 時間処置したと生存率は約 70%であり、SLC30A3 のノックダウン

きの SLC30A3 mRNA を Real time RT-PCR によってにより、ツニカマイシンによる細胞死が増強され－ 410 －

1)

G.

な

い

、

細

細

置

ていることが示唆された。
D.考察
小胞体ストレスによって SLC30A3 mRNA 発現量が上昇した。また小胞体において SLC30A3 が存在し、小胞体ストレスによる細胞死が SLC30A3のノックダウンによって増強されることを確認した。これらのことから、SLC30A3 の小胞体スト
レスに対する防御効果が示唆された。
E.結論
SLC30A3 は小胞体ストレスに対して応答し、防御 効 果 を 示す 可 能 性 が示 唆 さ れ た。 今 後 は 、SLC30A3 の防御効果のメカニズムの解明および、
ALS モデル細胞を用いた検討も必要と考えられる。
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし
2.学会発表1).奥田莉加、栗田尚佳、井上綾子、市川かおり、
位田雅俊、保住功「小胞体ストレス曝露による
ZnT3 発現量および細胞内亜鉛の検討」メタルバイオサイエンス研究会 2015・2015 年 8 月 28
日・名古屋
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
なし

約

濃

が

:3

り

光

細

て

ク

ン

胞

ン

れ

－ 411 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

Gut microbiota の制御が脳虚血病巣進展に及ぼす影響
研究代表者 西山 康裕 1）
研究分担者 五十嵐 博中 2）C.

1）日本医科大学武蔵小杉病院 2）新潟大学脳研究所

２

研究要旨

３

１

脳梗塞における組織炎症に免疫系が大きく関与していることが解明されつつある。この免疫系の制御に重要な役割を果たしている機構の一つに腸管免疫を修飾する Gut microbiota（腸内細菌叢）があるが、現時点において microbiota の制御により脳梗塞病巣の進展が変化する可能性についての研究はなされていない。本研究では、抗生物質を２週間経口投与した後に脳虚血モデルを作成し、２４時間後の脳梗塞サイズおよび神経スコアを検証した。結果は、vehicle 群と抗生物質投与群の間にいずれも有意な差を認めなかったが、梗塞サイズの検討では vehicle 群が健常側比 48.5%であるのに対して、抗生物質投与群では 57.8%と 19.0%の梗塞サイズ拡大を認めている。本実験系では虚血後急性期に観察した梗塞サイズにおいては、両群での差が有意とならなかったものの、脳内に侵入した免疫担当細胞がさらに活性化する７２時間以降での現象を検討することが必要であると考えており、現在進行中でD.

ある。
B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

体

臨床において、脳虚血による死亡・後遺症はそ

１．急性脳虚血を惹起させるために、８週から１がの頻度の高さ、社会的な損失の大きさから重要な

０週齢の C57BL/6J マウスを用いて、総頸動脈け問題となっているが、予後改善が認められた治療からシリコンコートした塞栓糸を挿入して中には早期の血管再開通のみであるという現状であ

大脳動脈内を閉塞し、 ６０分後に塞栓糸を抜監る。一方で動物実験レベルでは、免疫寛容により去し、急性脳梗塞モデルとした(中大脳動脈閉に梗塞巣の縮小・予後の改善が認められるなど、脳塞術(MCAO モデル))。

８

A.研究目的梗塞における組織炎症に免疫系が大きく関与し

２．腸管の microbiota を修飾するため、抗生物やていることが解明されつつある。この免疫系の制質含有水による下痢・食思不振・体重低下等のin御に重要な役割を果たしている機構の一つに腸報告を認めない(Li M. et al. Immunity, Vol.43,

る

管免疫を修飾する Gut microbiota（腸内細菌叢）

527-, 2015) Ampicillin, Neomycin,

をがあるが、現時点において microbiota の制御に

Vancomycin, Metronidazole 剤の混合投与を行より脳梗塞病巣の進展が変化する可能性についった。具体的にはくての研究はなされていない。

Ampicillin(1g/L),Neomycin(1g/L),Vancomyci

れn(0.5g/L), Metronidazole(0.25g/L)を飲料水

菌に溶解し、１４日間投与を続けた。

に

我々は腸管免疫修飾が脳梗塞巣進展に及ぼす影響を検討するために、種々の microbiota 修飾
モデルマウスに脳梗塞巣を作成し、腸管免疫と急３．６０分脳虚血作成２４時間後に断頭した後、免性期脳虚血における炎症の関連性について解明

TTC 染色を行い、TTC 染色で染色されない梗塞てする。

巣を両群間で比較した。このとき、皮質領域、腸を－ 412 －

基底核領域については各々測定した。また、同抗生物質を経口投与することにより正常化され時に脳浮腫率も測定した。さらに、脳虚血前おることがわかった。すなわち、腸内細菌叢の変化

よび２４時間後に神経学的スコアを計測し、両が恒常性に変化を与えることが明らかとなった。

群間で比較した。なお、脳浮腫率は脳浮腫率

こうした現象に加え、近年脳梗塞は組織炎症の（％）＝〔虚血半球－対側半球〕×１００／対一つであり、免疫系が大きく関与している可能性

側半球で計算した。

があるとの報告が相次いでおり、腸内細菌叢の変化が脳虚血のシステムに関連するかに注目した。

C.研究結果我々が preliminary に行った抗生物質を２週間経１．平均の飲水量は両群ともに一日 6mL で有意差口投与した後に脳虚血モデルを作成し、２４時間を認めなかった。

後の脳梗塞サイズおよび神経スコアを検証した

２．抗生物質投与１４日間でマウスの体調に変化は認めず、死亡例はなかった。

結果は、vehicle 群と抗生物質投与群の間にいずれも有意な差を認めなかった。しかしながら、梗

３．虚血後２４時間の梗塞サイズにおいて、健常

塞サイズの平均値では vehicle 群が対側比 48.5%

側比にて皮質、基底核および全脳いずれにおいであるのに対して、抗生物質投与群では 57.8%とても vehicle 群と抗生物質投与群に統計学的有19.0%の梗塞サイズ拡大を認めている。本実験系

意差を認めなかった（皮質；32.01±4.73 vsは薬剤投与や遺伝子操作を加えた実験などによ37.1±7.01 % of control, respectively, n=10）

る特定の分子を標的とした実験系ではないため、（ 基 底 核 ； 16.53 ± 3.79 vs 20.6 ± 6.14% of

虚血後急性期に観察した梗塞サイズにおいては、

control）(全脳；48.54±5.70 vs 57.80±12.49 %両群での差が有意とならなかったものの、脳内にof control)。脳浮腫率においても、両群間で侵入した免疫担当細胞がさらに活性化する７２

有意差を認めなかった。

時間以降での現象を検討することが必要であると考えている。経時的に両群間で差が認められる

D.考察

ようになれば、この差を見いだす免疫担当細胞を食物等を介して多数の異物が侵入する腸管は検証し、分子生物学的アプローチにより、さらに体内で最も大きなリンパ器官の一つであり、我々病態を解明していくことが可能であると考えて１が摂取する様々な飲食物を通して、病原微生物だいる。

脈

けでなく、アレルゲンや毒性を持つ物質と恒常的中に接触する。こうした点から、腸管は侵入異物の

E.結論

抜

監視役を演じているものと推察される。腸管粘膜

１．抗生物質を２週間経口投与した後に６０分間

閉には全末梢リンパ球の６割、抗体産生性 B 細胞の中大脳動脈閉塞術を作成し、２４時間後の脳梗８割が集結すると言われ、実際には腸管上皮細胞

塞サイズおよび神経スコアを検証したが、物や 腸 管 上 皮 細 胞 間 T リ ン パ 球 （ intestinalvehicle 群と抗生物質投与群の間にいずれも有のintraepithelial lymphocytes: IEL）が恒常的あ意な差を認めなかったが、梗塞サイズでは43,

るいは感染などの刺激に反応してサイトカイン

vehicle 群が健常側比 48.5%であるのに対して、を発現している。

抗生物質投与群では 57.8%と 19.0%の梗塞サイ

行

ズ拡大を認めた。

最近、これらの粘膜免疫は消化管内だけではな
く、全身の免疫システム制御に影響すると注目さ

２．本実験系は薬剤投与や遺伝子操作を加えた実iれている。腸管粘膜機構の恒常性が乱れ、腸内細験などによる特定の分子を標的とした実験系

水菌叢の構成が変化し、一旦バランスが乱れた状態

ではないため、虚血後急性期においては、統計になると、全身の免疫系を過剰に活性化して自己学的に梗塞サイズの差が有意とならなかった

後、免疫疾患などの炎症を悪化させることがわかっが、免疫担当細胞がさらに活性化する７２時間塞ている。実際に我々は B 細胞を欠損するマウスに

以降での現象を検討することが必要と考え、今域、腸管上皮細胞の再生速度が著しく亢進すること

後の検討課題とする。

を発見したが、この現象は広域スペクトルを持つ－ 413 －

F.研究発表
1.論文発表なし
2.学会発表なし
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
なし

者
（
展
経
り
で
ま
使
構

A.

の

関

こ

薬

用

従

ト

診

に

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て

の

膜

し

で

を
－ 414 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

異常凝集体の形成と伝播による神経細胞死機構の解明
研究代表者 星 美奈子 1）
研究分担者 柿田 明美 2）
1）京都大学大学院医学研究科 2）新潟大学脳研究所

研究要旨
我々は、新潟大学脳研究所より剖検脳の供与を受けることで、世界で初めてアルツハイマー病患
者脳より極めて強い神経毒性を持つ球状の Aβ集合体＝Αmylospheroids（以下、ASPD）を単離した（Noguchi et al, JBC2009）。本研究では、これまでの新潟大学脳研究所との共同研究成果をさらに発展させるため、ASPD が成熟神経細胞に選択的に結合することで細胞死を起こすことに着目し、神経細胞膜上の ASPD 標的タンパク質を同定して下流の細胞死シグナル伝達経路を解明し、それにより新たな治療法開発への基盤を提供することを目的に進めてきた。それに加えて、過去の共同研究で培ったノウハウ及び成果を生かし、残された課題である、そもそも｢なぜ異常凝集体が形成され広まるのか｣というアルツハイマー病の発症機構に迫るため、病理組織化学、生化学、構造生物学を駆使した研究を進めたいと考えている。これについては、特に Aβ線維について、将来的に患者ごとの構造プロファイリングを取ることを目指して、初年度は方法論の確立を目指した研究を進めた。

A.研究目的

これにより、初めて神経細胞死の原因と機序につアルツハイマー病の原因は、アミロイドβ（Aβ）

いて明快な説明が可能となった。更に、ASPD にの異常凝集体とされているが、臨床症状と最も相結合するペプチド（ASPD 結合ペプチド）を同定

関する神経細胞死が、どの凝集体でどのように起し、これが ASPD の神経細胞死活性を中和するこ

こるかは不明であった。この状況で、様々な治療とも明らかにした（Ohnishi et al. PNAS2015）。

薬が、神経細胞死を伴わない齧歯類疾患モデルを

本共同研究では、過去の共同研究で培ったノウ用いて行われたが、多くは失敗に終わっている。

ハウ及び成果を生かし、残された課題である、そ従って、安全で有効な治療法開発のためには、ヒもそもなぜ異常凝集体が形成され、広まるのかと

トでの病態を解明し、それに基づく治療法と早期いう、アルツハイマー病の発症機構の解明を試み

診断システムを開発することである。

る。ASPD については、我々は既にラット神経に研究代表者である星は、柿田博士との共同研究

おいて、特定のタイプの神経細胞内で形成されるにより、患者脳から神経細胞死活性を持つ Aβ集

ことを見出しており（投稿準備中）、患者脳での合体「アミロスフェロイド（ASPD）」を世界初め解析を行いたいと考えている。さらに、線維につて単離するに至った（Noguchi et al, JBC2009）。そいても、特定の Aβ種だけで形成される、過去にの後の共同研究により、ASPD は、あるシナプス

報告のない新たな構造体を試験管において見出膜タンパク質（ターゲット分子）に特異的に結合しており（Xio et al. Nat. Str. Mol. Bio.2015）、これし、神経細胞死を誘導することを見出し、患者脳が患者脳に存在するのかどうかを検証したい。こでは実際に ASPD 量と相関してターゲット分子

れらの研究を足がかりに、ヒト脳で異常凝集体がを持つ神経細胞が脱落することを明らかにした。

どの部位でどのような機構で形成され、それがど－ 415 －

のように伝播していくのかについて、病理組織化

C.研究結果E.

初年度の研究により、ASPD については、ASPD

学、生化学、構造生物学を駆使した研究で迫りたが結合し毒性を発揮するターゲット分子が成熟が神経細胞にのみ発現するシナプス膜タンパク質

しNa, K-ATPase ポンプの活性ユニットである α3 でトあることを見出し、ASPD の結合によって Na,こ

究を実施する。

K-ATPase ポンプ活性が消失し、膜電位が上昇し神の（１） ASPD は特定の神経細胞内で形成され細胞

経細胞死が起きるという分子メカニズムを解明

残外に放出されることがラット神経細胞をした。これにより、なぜアルツハイマー病においし用いた研究から明らかになった（Komura,て成熟した成人神経が脱落するかについて実際

ら

Hoshi et al.投稿準備中）。そこで、既に確立の病態と合う明解な説明を与えた。さらに、ASPDとした抗 APSD 抗体を用いた組織染色及び電結合ペプチドは ASPD がターゲット分子 Na,

で

子顕微鏡観察により、ヒト患者脳において、K-ATPase α3 に結合することを阻止することでる

細胞内で ASPD 形成が起こるのかどうかを

ASPD の神経毒性を抑制することも明らかにした。

ツ

検証する。

以上により、治療法開発への道を拓くことに成功に（２） Aβは可溶性構造体以外に不溶性構造体でした（Ohnishi et al. PNAS2015）。線維についても、継ある線維を形成するが、実はその構造には患者由来の線維をシーズとして、オリジナルな構

もバリエーションがあることが明らかにな造をミミックした線維を試験管内で再構築出来

ありつつある（Lu et a. Cell2013 ）。共同研

る手法を確立し、それにより特定の Aβ種だけでを究者である Prof. Ishii のラボでは、線維に形成される、過去に報告のない新たな構造体を試

レ

なる凝集核をシードとすることで、ある特験管において見出した（Xio et al. Nat. Str. Mol.

そ定の線維構造を増幅し、NMR によって構

Bio.2015）。この手法を生かして、次年度以降に複造解析する手法を確立しており、これを用数の患者脳由来の線維について解析を試みたいF.

いて、新たに見出された特定の Aβ種だけと考えている。

1.

い。
B.研究方法
上記目的を達成するために、引き続き以下の研で形成される構造体（Xio et al. Nat. Str. Mol.
Bio.2015）が患者脳内に存在するのかどう

Xi
D.考察

Lo

上記の結果から、ASPD は病態と相関して患者(2

脳に蓄積し、その量と相関してターゲット分子をse

ヒト由来試料から ASPD を調製して用いる場

発現する神経細胞の脱落が起きていることが強Al

合は、剖検脳を新潟大学脳研究所より供与を受けく示唆された。次の課題として、ASPD の蓄積は49る。これについては、既に科学技術・学術審議会

いつから起きているのかという問題が残されてPa

生命倫理・安全部会「機関内倫理審査委員会の在いる。アルツハイマー病の初期像を再現しているNaり方に関する報告書」（平成 15 年 3 月 20 日）に

齧歯類モデルでは、神経細胞脱落が認められない（

従い、各機関内倫理・安全委員会の審査を受け、が、そこでは ASPD も蓄積していないことなどをBr

承認を受けている。実験に際しては、ご遺族の承考えると、発症の前、軽度認知症の段階で蓄積がSo

諾を得てその範囲を守り、連結可能匿名化により始まっているのではないかと考えられるが、軽度

64

個人情報を保護した上で、所定の設備の整った実

認知障害の場合、その後必ずしもアルツハイマー

Oh

験室にて安全に配慮して行った。

病を発症するとは限らないため、これについては

か解析を行い、重症度との相関などについても検証を行う。

今後の課題と考えている。

－ 416 －

E.結論

Nishiyama, T., Kakita, A., Takeda, H., Takeuchi, A., Arai,PD

上記のとおり、極めて順調に研究を進めること熟が出来た。上記の結果から、ASPD は病態と相関

Satomura, K., Inoue, M., Muramatsu, S., Matsui,K., Tada,

質して患者脳に蓄積し、その量と相関してターゲッ

M., Sato, M., Saijyo, E., Shigemitsu,Y., Sakai,S., Umetsu,

でト分子を発現する神経細胞の脱落が起きている

Y., Goda,N., Takino,N., Takahashi, H., Hagiwara, M.,

Na,

ことが強く示唆された。次の課題として、ASPD

Sawasaki, T., Iwasaki, G., Nakamura, Y., Nabeshima, Y.,神の蓄積はいつから起きているのかという問題がTeplow, D.B., and *Hoshi, M. (2015) Na,K-ATPase α3 is a明

残されている。アルツハイマー病の初期像を再現

death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly

いしている齧歯類モデルでは、神経細胞脱落が認め

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, E4465-E4474

際られないが、そこでは ASPD も蓄積していないこPDとなどを考えると、発症の前、軽度認知症の段階

2.学会発表Na,で蓄積が始まっているのではないかと考えられアルツハイマー病で起こる神経細胞死の新たなでるが、軽度認知障害の場合、その後必ずしもアルターゲット分子の発見、星美奈子（2015 年 10 月

た。

ツハイマー病を発症するとは限らないため、これ

20 日）

功

については今後の課題と考えている。これを是非、之倉優教授主催 第 4 回食品薬品生物構造学研究、

継続課題として検証したい。また、線維について会 （静岡）（招待講演）

構

も方法論が確立出来、興味深い結果が得られつつ

Na+,K+-ATPase α 3 Is a New Death Target of来あるため、是非、患者脳由来の試料を用いた解析

Alzheimer Amyloid-β Assembly, Hoshi, M., 4thでを行いたいと考えている。いずれも、非常に高い

International European Neurodegenerative Diseases &試

レベルを持つ新潟大学脳研の試料であるからこ

Optogenetics Europe-2015 Meeting, University ofol.

そ実施出来る課題である。

Cambridge, UK, Nov 2-3, 2015

Y., Ito, A., Komura, H., Hirao, H.,

東京大学大学院農学生命科学研究科 田Na+,K+-ATPase α 3 Is a New Death Target of

複F.研究発表Alzheimer Amyloid-β Assembly, Hoshi, M., KU

1.論文発表LEUVEN, Bergium, Nov 5, 2015

Xiao, Y., Ma. B., McElheny, D., Parthasarathy, S.,

アルツハイマー病患者脳由来のアミロイドβ凝Long, F., Hoshi, M., Nussinov, R., and * Ishii, Y.

集体アミロスフェロイドの発見から成熟神経細者(2015) Aβ （ 1-42 ） fibril structure illuminates

胞の分子機構の解明までの道のり、星美奈子

を

self-recognition and replication of amyloid in（2015 年 12 月 17 日）明治大学大学院 構造細胞

強Alzheimers’s disease Nature Str. Mol. Biol. 22,

生物学持論／細胞生物学持論（招待講演）

は499-U97 advanced on line publication

アルツハイマー病で起こる神経細胞死の新たなてParthasarathy, S., Inoue, M., Xiao, Y., Matsumura, Y.,

分子メカニズムの発見と革新的治療法の開発、星る

Nabeshima, Y., Long, F., Hoshi, M., and *Ishii, Y.

美奈子（2016 年 1 月 9 日）第 4 回 AAA（Academy ofい（2015）Structural Insight into an Alzheimer’s

Aging and Cardiovascular-Diabetes Research）

をBrain-Derived Spherical Assembly of Amyloidβ by（東京）（招待講演）

がSolid-state NMR J. Amer. Chem. Soc. 137,

アルツハイマー病患者脳由来のアミロイドβ凝度

6480-6483

集体アミロスフェロイドの発見から成熟神経細ー

Ohnishi, T., Yanazawa, M., Sasahara, T., Kitamura, Y.,

胞死の分子機構の解明までの道のり、星美奈子

いはHiroaki,H., Fukazawa, Y., Kii, I.,（2016 年 2 月 1 日）新潟大学脳神経研究会（新潟）（招待講演）－ 417 －

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし
2.実用新案登録
なし
3.その他
なし

能

体

系

に

か

セ

A.

リ

機

多

受

セ

そ

セ

異

発

こ

伝

ニ

B.

作

Cr

を

リ

セ

－ 418 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

セロトニン 5A 受容体の生理的役割の解明
研究代表者
研究分担者

崎村

章弘 1）
建司 2）、犬束 歩 1）山中1）名古屋大学環境医学研究所

2）新潟大学脳研究所

研究要旨
セロトニン神経は脳内に幅広く投射しており、リズム、気分、情動や痛みの知覚など広範な生理機能を担っている。一つの伝達物質がこのように多くの生理機能に関わっている理由の一つして、受容体が 11 種類もあり多様なことが挙げられる。それら受容体のうち、セロトニン 5A 受容体は中枢神経系に発現するが、その機能はほとんど分かっていない。本研究では、セロトニン 5A 受容体の生理機能について部位特異的遺伝子欠損マウスと、セロトニン 5A 受容体発現神経機能操作マウスを用いて明らかにすることを目的としている。これらの研究に必要な遺伝子改変マウスを本研究において作出し、セロトニン神経の生理機能について明らかにする。
ビナーゼを発現させる。Cre リコンビナーゼ依存A.研究目的セロトニン神経は脳内に幅広く投射しており、的に光遺伝学ツールであるチャネルロドプシン

リズム、気分、情動や痛みの知覚など広範な生理2(ChR2)やアーキロドプシン(Arch)を発現するア機能を担っている。一つの伝達物質がこのようにデノ随伴ウイルスベクターと組み合わせること

多くの生理機能に関わっている理由の一つして、によって、セロトニン 5A 受容体発現神経細胞機受容体が 11 種類もあり多様なことが挙げられる。

能を操作する。その時に表出する個体レベルでのセロトニン 5A 受容体は中枢神経系に発現するが、行動発現を解析することに依って、セロトニン 5A

その機能はほとんど分かっていない。本研究では、受容体発現神経細胞の機能を明らかにする。また、セロトニン 5A 受容体の生理機能について部位特このマウスは全身性のノックアウトマウスとし異的遺伝子欠損マウスと、セロトニン 5A 受容体ても使用することが可能であり、セロトニン 5A

発現神経機能操作マウスを用いて明らかにする

受容体機能が消失したときの表現型についてもことを目的としている。これらの研究に必要な遺解析する。

伝子改変マウスを本研究において作出し、セロト
ニン神経の生理機能について明らかにする。

次に、セロトニン 5A 受容体を部位特異的にノックアウトするために、flox マウスを作成する。
特定神経だけに Cre リコンビナーゼ発現細胞と交B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

配させることによって、Cre リコンビナーゼ発現

セロトニン 5A 受容体発現神経細胞の機能を操細胞においてセロトニン 5A 受容体遺伝子を欠損作するために、セロトニン 5A 受容体発現細胞にさせることができる。特に、視交叉上核においてCre リコンビナーゼを発現する遺伝子改変マウス

セロトニン 5A 受容体遺伝子を脱落させた時に個を作成する。セロトニン 5A 受容体遺伝子に Cre

体レベルでの日内リズム発現がどのように変化

リコンビナーゼ遺伝子をノックインすることで、するのかについて解析する。

セロトニン 5A 受容体発現細胞だけに Cre リコン－ 419 －

C.研究結果

らのマウスを用いて 5HT5A 受容体の機能が明らか

ES 細胞を用いた相同組み替えによって、セロトになることが予想される。

ニン 5A 受容体遺伝子座に Cre リコンビナーゼを
ノックインしたキメラマウス(5ht5a-iCre)マウ

E.結論

スを作成した。交配によりノックインマウスを得

生理的役割が十分分かっていないセロトニン

た。また、部位特異的にセロトニン 5A 受容体を受容体の一つである、5HT5A 受容体を解析するたノックアウトするために、相同組み替えを用いてめに、5HT5A 発現細胞特異的に遺伝子発現が可能

セロトニン 5A 受容体の開始コドン含むエクソン

な 5HT5A-iCre マウスおよび、部位特異的に 5HT5A

を loxP 配列で挟んだキメラマウス(flox-5ht5a)遺伝子を脱落させることが可能な 5HT5A-flox マを作成した。交配によりノックインマウスを得た。

ウスを作成しラインの確立に成功した。

こ れ ら の 系統 を 確 立 した マ ウ ス を名 古 屋 大 学
動物実験支援センターに搬入するために、クリー
ニングを行った。♂2 匹から精子を採取し、体外受精を行い、受精卵を仮親の子宮に戻して産仔を得た。仮親の微生物モニタリングを行ったところ
陰性であったため、飼育室への搬入を行った。野生型マウスとの交配を行い、産仔をジェノタイピ
ングして SPF 施設においてラインの確立をおこなった。
D.考察
セロトニン受容体の一つである 5HT5A 受容体の生理機能を明らかにするための遺伝子改変動物を作成することができた。セロトニン受容体は非常に数多く存在するが、受容体の構造が似ているなどから、特異的抗体を用いた発現部位の確認や、特異的拮抗薬等を用いた機能阻害が行えないために、その機能を明らかにすることが出来なかった。遺伝子工学の発展によって、特定遺伝子の遺伝子座にノックインを行うことで、細胞種特異的に外来遺伝子を発現させること、また組織特異的に脱落させることが可能となってきた。特に多くは Cre/loxP を用いた組換えを応用することで達成されており、目的遺伝子のプロモーターで Cre
リコンビナーゼを発現する遺伝子改変動物の作成が機能同定に大きな役割を果たすことが十分証明されてきている。そこで、本研究では、5HT5A
発現細胞特異的に遺伝子を発現させて、その神経機能を操作することで、生理機能を明らかにする
ための 5HT5A-iCre マウスを作成した。また、細胞種特異的に Cre を発現する動物と交配させることで、その部位における 5HT5A 受容体遺伝子を脱落させて機能欠損を引き起こすことが出来るマ
ウス floxed-5HT5A マウスを作成した。今後これ

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表1. Black SW, Yamanaka A, Kilduff TS:
Challenges
inthedevelopmentoftherapeutics for narcolepsy. Prog Neurobiol(2015) PMID: 26721620.
2. Hososhima S, Yuasa H, Ishizuka T, Hoque
MR, Yamashita T, Yamanaka A, Sugano E,
Tomita H, Yawo H: Near-infrared (NIR)
up-conversion optogenetics. Sci Rep (2015)
5:16533.
3. Ishii K, Kubo K, Endo T, Yoshida K, Benner S,
Ito Y, Aizawa H, Aramaki M, Yamanaka A,
Tanaka K, Takata N, Tanaka KF, Mimura M,
Tohyama C, Kakeyama M, Nakajima K:
Neuronal heterotopias affect the activities of
distant brain areas and lead to behavioral
deficits. J Neurosci(2015) 35(36):12432-12445.
4. Shibasaki K, Sugio S, Takao K, Yamanaka A,
Miyakawa T, Tominaga M, Ishizaki Y: TRPV4
activation at the physiological temperature isacriticaldeterminantofneuronal
excitability and behavior. Pflugers Arch(2015) 467(12): 2495-507.
5. Mizoguchi H, Katahira K, Inutsuka A,
Fukumoto K, Nakamura A, Wang T, Nagai T,
Sato J, Sawada M, Ohira H, Yamanaka A,
Yamada K: Insular neural system controls
decision-making
inhealthyandmethamphetamine-treated rats. Proc Natl
Acad Sci USA (2015) 112(29): E3930-9.
6. Kato HE, Kamiya M, Sugo S, Ito J, Taniguchi
R, Orito A, Hirata K, Inutsuka A, Yamanaka
A, Maturana AD, Ishitani R, Sudo Y, Hayashi
S, Nureki O: Atomistic design of microbial
opsin-based blue-shifted optogenetics tools.
Nat Commun (2015) 6:7177.
7. Manita S, Suzuki T, Homma C, Matsumoto T,
Odagawa M, Yamada K, Ota K, Matsubara C,
Inutsuka A, Sato M, Ohkura M, Yamanaka A,
Yanagawa Y, Nakai J, Hayashi Y, Larkum
ME, *Murayama M: A top-down cortical－ 420 －

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

9.

10

11

12

13

14

15

16

17

18

circuit for accurate sensory
Neuron (2015) 86(5):1304-16.

か

ン

1.

山中章弘、2015 年度第 2 回バイオ単分子研究会（平成 28 年 3 月 30 日～31 日）

21. 山中章弘、2015 年光化学討論会（平成 27 年 9 月
9 日～11 日）

2.

山中章弘、日本薬学会第 136 年（平成 28 年 3 月
26 日～29 日）

22. 山中章弘、Meeting of Sleep and Diabetes（平成 27
年 8 月 5 日）

3.

山中章弘、第 93 回日本生理学会大会（平成 28 年
3 月 22 日～24 日）

23. 山中章弘、第 38 回日本神経科学大会（平成 27 年
7 月 28 日～31 日）

4.

山中章弘、犬束 歩、山下 哲、第 89 回日本薬理学会年会（平成 28 年 3 月 9 日～11 日）

24. 山中章弘、田中謙二、喫煙科学財団第 30 回平成
25 年度助成研究発表会（平成 27 年 7 月 23 日）

5.

山中章弘、千里ライフサイエンスセミナー（平成 28
年 2 月 26 日）

25. 山中章弘、RIKEN BSI Summer Program Lecture
Course （平成 27 年 7 月 20 日～24 日）

6.

山中章弘、第 67 回 埼玉大学脳科学セミナー （平成 28 年 2 月 24 日）

26. 山中章弘、犬束 歩、山下 哲、日本睡眠学会第40 回定期学術集会（平成 27 年 7 月 2 日～3 日）

7.

山中章弘、大阪精神科診療所協会学術研究会（平成 28 年 2 月 27 日）

27. 山中章弘、第 11 回帝京大学バイオカフェ 特別セ
ミナー（平成 27 年 7 月 2 日）

8.

山中章弘、大脳新皮質構築終了国際シンポジウム「Neocortical Organization III」（平成 28 年 2 月 11
日～12 日）28. 山中章弘、山陰周術期管理研究会（平成 27 年 6月 27 日）9.

山中章弘、第 29 回上田記念講演会（平成 28 年 1
月 9 日）

5A

マ

S:
of
iol

ue
E,
R)
5)

S,
A,
M,
K:
of
al
6):

A,
V4
is
al
ch

19. 山中章弘、不眠症とオレキシン研究会（平成 27 年
9 月 26 日）
20. 山中章弘、第 42 回日本神経内分泌学会（平成 27
年 9 月 18 日～19 日）

2.学会発表た能

perception.

10. 山中章弘、日米科学技術協力事業「脳研究」分野
研究成果報告会（平成 27 年 12 月 19 日）

29. 山中章弘、第 56 回日本神経学会学術大会（平成27 年 5 月 20 日～23 日）
30. 山中章弘、尾北医師会学術講演会（平成 27 年 5月 16 日）11. 山中章弘、International Symposium Optogenetics
2015（平成 27 年 12 月 4 日～5 日）

31. 山中章弘、Seoul International Congress of
Endocrinology and Metabolism（平成 27 年 4 月 30
日～5 月 3 日）

A,
T,
A,
ols
nd
atl

12. 山中章弘、医用光学・分光学系合同研究会（平成27 年 12 月 3 日）

32. 山中章弘、岡崎内科医会学術講演会（平成 27 年 4月 24 日）13. 山中章弘、平成 27 年度生理学研究所研究会 大脳皮質の機能原理を探る（平成 27 年 12 月 3 日～4日）

33. 山中章弘、犬束 歩、他 第 88 回日本内分泌学会
学術総会（平成 27 年 4 月 23 日～25 日）

hi
ka
hi
al
ls.

15. 山中章弘、宮崎大学医学部精神科医講演会（平成 27 年 11 月 11 日）

T,
C,
A,
m
al

14. 山中章弘、第 42 回日本脳科学会（平成 27 年 11
月 12 日）34. 山中章弘、Tokyo Mental Disorder Conference（平成 27 年 4 月 4 日）

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

16. 山中章弘、第 68 回日本自立神経学会総会（平成27 年 10 月 29 日～30 日）
17. 山中章弘、比較記憶研究会（平成 27 年 10 月 8 日～9 日）
18. 山中章弘、岡山睡眠薬理研究会（平成 27 年 10 月
2 日）

1.特許取得なし
2.実用新案登録
なし
3.その他
なし

－ 421 －

li

し平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

ー

共同利用・共同研究報告書

交築

遺伝子ターゲティングによる ChR2/ArchT レポーターマウスの作成

ー

実研究代表者 井樋 慶一

1)

研究分担者 崎村 建司

2)

て

を
1）東北大学大学院情報科学研究科

2）

新潟大学脳研究所

C.
研究要旨
チャネルロドプシンは今や脳科学の実験手法として不可欠であり，チャネルロドプシン-floxed 遺伝

イ

子を特定のニューロンに発現させた実験系の必要性が日増しに高まっている．微量注入法を用いてウイ

特

ルスベクターをドライバーマウス脳内に注入するという従来の方法にはいくつか問題点が指摘されて

成

おり，

Cre-loxP 系の作動原理によりチャネルロドプシンを発現させるレポーターマウスの作成が望ト

まれる．そこで，本研究課題では従来の問題を克服し，Cre ドライバーマウスと交配することにより組が織（細胞）特異的に ChR2 が発現するレポーターマウスを作成した．また，ストレス研究に不可欠なコ
ルチコトロピン放出因子（CRF）遺伝子座に ChR2 遺伝子がノックインされたマウスも新たに作成した．

D.

これらのマウスは今後，脳科学領域に広く用いられ未解決の問題を解くためのブレイクスルーとなるで

ら

あろう．

と

細
A.研究目的

交配することにより組織（細胞）特異的に ChR2

る

チャネルロドプシンは今や脳科学の実験手法が発現するレポーターマウスを作成することをとして不可欠であり，チャネルロドプシン

目的とする．また，ストレス研究に不可欠なコル-floxed 遺伝子を特定のニューロンに発現させた

チコトロピン放出因子（CRF）遺伝子座に ChR2 遺実験系の必要性が日増しに高まっている．しかし伝子がノックインされたマウスも新たに作成すマながら，微量注入法を用いてウイルスベクターを

る．

遺

ス

ドライバーマウス脳内に注入するという従来の方法にはいくつか問題点が指摘されている．たとE.

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

えば，この技術にはウイルスベクター導入方法

まず相同組換えのためのターゲティングベク

（微量注入法）に起因したいくつかの欠点がある．

ターとして，CAG プロモーター下に floxstop-

すなわち、注入量や拡散範囲が個体ごとに異なる

ChR2（H134R），または、floxstop-ArchT 遺伝子，ため同一条件を再現することができない．また，

さらに標識マーカーとして mCherry，または，変拡散範囲が不十分で目的とするニューロンにチ

異型 YFP (Venus) 遺伝子を結合した DNA コンストャネルロドプシンが発現しない場合がある．加えラクトを作成する．これらのベクターを RENKA 株て，実験終了後全個体で注入領域を組織学的に確

ES 細胞内にエレクトロポレーションし，相同組換

認する労力が要る．そこで，Cre-loxP 系の作動

え に よ っ て β-actin 遺 伝 子 下 流 に 位 置 す る

原理によりチャネルロドプシンを発現させるレ

non-coding 領域に挿入する．Southern blot によポーターマウスの作成が望まれる．本研究課題でり同定された陽性クローンを胚盤胞に注入し，得は従来の問題を克服し，Cre ドライバーマウスとられたキメラマウスから germ line transmitted－ 422 －

F.
1.

line を選別しヘテロ接合体を得る．これらを交配

2. Itoi K. Exploring the regulatory mechanismof stress responses in the paraventricular

しホモ接合体を得てライン化する．

nucleus of the hypothalamus: background

本研究で作成されたチャネルロドプシンレポ
ーターマウスと様々な Cre ドライバーマウスとのand future perspectives of

交配によりニューロン選択的光操作実験系を構

corticotropin-releasing factor-modified

築することができる．これは従来ウイルスベクタ

yellow fluorescent protein-knock-in mouse.

ーを用いて行われていたほとんど全ての光操作

Interdisciplinary Information Sciences 21,

実験に応用可能であり，高い汎用性を具えた極め

213-224, 2015
3. Iwasaki Y, Itoi K. Transcriptional regulationて有用な実験ツールである．

of vasopressin gene: update in 2015.

同様の手法を用い，CRF 遺伝子座に ChR2 遺伝子

Interdisciplinary Information Sciences 21,

をノックインする．

267-271, 2015
4. Junko Kono, Kohtarou Konno, Ashraf

C.研究結果Hossain Talukder, Toshimitsu Fuse,

本研究課題では従来の問題を克服し，Cre ドラ伝

イバーマウスと交配することにより組織（細胞）Manabu Abe, Katsuya Uchida, Shuhei Horio,イ

特異的に ChR2 が発現するレポーターマウスを作

Kenji Sakimura, Masahiko Watanabe, andて成した．また，ストレス研究に不可欠なコルチコ

Keiichi Itoi. Distribution of望

トロピン放出因子（CRF）遺伝子座に ChR2 遺伝子

corticotropin-releasing factor neurons in the組

がノックインされたマウスも新たに作成した．

mouse brain: a study using
corticotropin-releasing factor-modified

コ

た．

で

R2

yellow fluorescent protein knock-in mouse.

D.考察

Brain Structure and Function (in press).

これらのマウスは今後，脳科学領域に広く用いられ未解決の問題を解くためのブレイクスルーとなるであろう．現在，これらのマウスを用い，

2. 学会発表

細胞特異的に ChR2 が発現することを検証中であ

招待講演

る．

1. 井樋慶一．Visualization ofcorticotropin-releasing factor neurons by

を

ル

E.結論

遺

Cre-loxP 系で作動する ChR2 が発現レポーター

すマウス，および，コルチコトロピン放出因子（CRF）

ク

p-

子，

変

ト

株

換

る

よ

得

ed

fluorescent proteins: development of mouselines for structural and functional analyses.
日本神経科学学会，神戸国際会議場，神戸，

遺伝子座に ChR2 遺伝子がノックインされたマウスを作成した．

2015 年 7 月 30 日
2. 井樋慶一．ストレス防御にはたらく神経内分泌系のメカニズム．宮城県保険医協会第 273 回

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1. 論文発表
1. Itoi K, Talukder AF, Fuse T, Kaneko T,

研究会・特別講演，宮城県保険医協会会議室，
仙台，2015 年 11 月 30 日

Ozawa R, Sato T, Sugaya T, Uchida K,
Yamazaki M, Abe M, Natsume R, Sakimura

3. Keiichi Itoi, Ashraf Hossain Talukder,

K (2014) Visualization of

Toshimitsu Fuse, Katsuya Uchida, Junko
Kono, Kotaro Konno, Maya Yamazaki,

corticotropin-releasing factor neurons byfluorescent proteins in the mouse brain andManabu Abe, Masahiko Watanabe and Kenjicharacterization of labeled neurons in the

Sakimura. Visualization of CRF Neurons inparaventricular nucleus of thethe Brain by Fluorescent Proteins: A

hypothalamus. Endocrinology, 155,

Comparison Between CRF-Venus,

4054-4060.
－ 423 －

CRF-Venus Delta Neo, and EGFP/CRF-Cre司，井樋慶一．視床下部コルチコトロピン放出

Mouse. Annual Meeting of the Endocrine

因子ニューロンへの抑制性入力セロトニンにSociety, San Diego Convention Center, San

よる制御機序に関する研究．第 42 回日本神経Diego, CA, USA, March 6, 2015

内分泌学会学術集会，仙台，2015 年 9 月 18-19
日

国際会議

4. 菅谷琢磨，佐藤隆幸，福田敦夫，杉本直哉，布1. Keiichi Itoi. Characterization and future
perspectives of the corticotropin-releasing

施俊光，内田克哉，阿部学，山崎真弥，崎村建

factor-modified yellow fluorescent司，井樋慶一．視床下部コルチコトロピン放出

protein-knock-in mouse. Parvo- and

因子ニューロンへのグルタミン酸作動性入力

Magnocellular Symposium in Sendai,―セロトニンによる調節メカニズムの検討．第Gonryo-kaikan, Sendai, Japan, September

42 回日本神経内分泌学会学術集会，
仙台，2015

17, 2015

年 9 月 18-19 日
5. 佐藤隆幸，菅谷琢磨，福田敦夫，杉本直哉，布2. Takayuki Sato, Takuma Sugaya, Izumi
Akiba, Toshimitsu Fuse, Katsuya Uchida,

施俊光，内田克哉，阿部学，山崎真弥，崎村建

Junko Kono, Atsuo Fukuda, Kenji Sakimura,司，井樋慶一．視床下部コルチコトルピン放出

Keiichi Itoi. Dual effects of serotoninergic

因子（CRF）ニューロンへの抑制性入力とセでinputs to the local circuits regulating the

ロトニン（5-HT）による制御機序に関する研造

corticotropin-releasing factor neurons in the究．包括脳冬のシンポジウム，一ツ橋大学，東paraventricular nucleus of the

京，2015 年 12 月 18 日

hypothalamus: an electrophysiological study

6. 菅谷琢磨，佐藤隆幸，福田敦夫，杉本直哉，布

こ

分

っ

こ

using the CRF-Venus deltaNeo mouse.

施俊光，内田克哉，阿部学，山崎真弥，崎村建状

Annual Meeting of the Society for司，井樋慶一．視床下部コルチコトロピン放出

ナ

Neuroscience, Chicago Convention Center,

因子（CRF）ニューロンへのグルタミン酸作

Chicago, IL, USA, October 19, 2015

動性入力

－セロトニン（5-HT）による調節

国内学会

メカニズムの検討．第 42 回日本神経内分泌学

1. 河野順子，内田克哉，今野幸太郎，布施俊光，

会学術集会，仙台，2015 年 12 月 18 日

阿部学，山形聡，伊藤貞嘉，崎村建司，渡辺雅彦，井樋慶一．CRF- VeusΔNeo マウスを用い

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

た CRF 発現細胞のマウス脳内分布の検討．第1.特許取得

42 回日本神経内分泌学会学術集会，
仙台，2015
年 9 月 19 日
2. 大塚寛子，内田克哉，布施俊光，崎村建司，井樋慶一．CRF-Venus ΔNeo ノックインマウスを用いた CRF 含有ニューロンの個体発生とそなし．
2.実用新案登録
なし．
3.その他
なし．

の脳内分布の神経解剖学的解析．第 42 回日本
神経内分泌学会学術集会，仙台，2015 年 9 月
18-19 日3. 佐藤隆幸，菅谷琢磨，福田敦夫，杉本直哉，布施俊光，内田克哉，阿部学，山崎真弥，崎村建－ 424 －

A.

析

ス

に

と

の

脳

表

B.

sit

Gl

組

体

Gl

出

に

平成 27 年度新潟大学脳研究所

経｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

19

共同利用・共同研究報告書

布大脳におけるグルタミン酸受容体 GluD1 の入力選択的回路形成と建

高次神経機能発現に関する共同研究

出

力
研究代表者

．第

研究分担者

15

渡辺雅彦 1）
崎村建司 2）1）北海道大学大学院医学研究科

2）新潟大学脳研究所

布

建

研究要旨

出

GluD1 はグルタミン酸との結合能を失いシナプス伝達機能を失ってしまった GluD ファミリーの１つセである。これまで小脳プルキンエ細胞に豊富な GluD2 についての研究から、この分子がシナプスの構研

造的および機能的結合性を制御する重要な分子であり、その遺伝子異常により小脳性の運動障害が起東布こることを遺伝子変異を有するヒト家系やマウスの研究から明らかになっている。しかし、その類縁分子である GluD1 については、シナプス発現から分子機能に至るまで、これまで全く不明な分子であった。GluD1 欠損マウスの作成と供給による本共同研究を通して、特異的な発現プローブを開発することができ、この分子が成体マウスの大脳を含む脳の広範な領域に発現し、特に大脳皮質、海馬、歯建状回、視床 VPM 核、扁桃体、分界条床核、小脳皮質に強く発現し、小脳では特定の入力を受けるシ出

ナプスに発現し、その神経回路形成に関与していることが明らかとなった。

作

節

学

GluD1 欠損マウスにおける回路表現型を電子顕A.研究目的GluD1 の大脳における細胞発現と回路発現を解微鏡を用いて解析した。

析し、その解析結果から想定される GluD1 のシナプ
ス回路形成制御と高次脳機能発現に対する機能

C.研究結果について GluD1 欠損マウスを用いて解析するこ

１．GluD1 の細胞発現とを共同研究の目的とした。具体的には、GluD1

GluD1 の全長をコードするリボプローブを用いの細胞発現と神経回路発現を大脳を含むマウスることにより、特異的で高感度の in situ ハイブ

脳において明らかにし、GluD1 欠損マウスの回路

リダイゼーション法が可能となった。その結果、表現型を追求した。

GluD1 は大脳を含む広範な領域に発現し、特に大脳皮質、海馬、歯状回、視床 VPM 核、扁桃体、分界条床核、小脳皮質に強く発現していた。

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
GluD1 の細胞発現をジゴキシゲニン標識の in
situ ハイブリダイゼーション法により検討し、

２．GluD1 の神経回路発現

GluD1 の神経回路発現を特異抗体を用いた免疫平成２７年度の共同研究では、神経回路が最もよ

組織化学法により解析した。用いたプローブと抗くわかっている小脳皮質を回路発現の解析対象

体の特異性を共同研究により作成・供給されたとして行った。その結果、GluD1 は分子層の介在

GluD1 欠損マウスを用いて証明した。さらに、

ニューロンに選択的に発現し、平行線維シナプス－ 425 －

の後部に局在していた。同様の入力選択的な回路F.研究発表（上記課題名に関するもの）

発現は視床 VPM 核や分界条床核においても確認で

1.論文発表きた。

Konno K, Matsuda K, Nakamoto C, Uchigashima
M, Miyazaki T, Yamasaki M, Sakimura K, Yuzaki

３．GluD1 欠損マウスの回路表現型

M, Watanabe M: Enriched expression of GluD1

GluD1 欠損マウスの小脳皮質を電子顕微鏡で解

in higher brain regions and its involvement in析したところ、この分子が局在する平行線維・介parallel fiber-interneuron synapse formation in

在ニューロンシナプスが半減していた。同様の表

the cerebellum. J. Neurosci, 34:7412-7424, 2014.

現型は視床 VPM 核においても得られつつある。
以上の観察結果より、GluD1 は特定の入力を受け

2.学会発表るシナプスに発現し、その接着を強化しているこ

今野幸太郎、渡辺雅彦：マウス脳におけるグルタとが判明した。

ミン酸受容体 GluD family の発現特性。日本解剖学会、2016 年 3 月 30 日、郡山市。

D.考察
これまで小脳プルキンエ細胞の平行線維シナG.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

プスに豊富な GluD2 についての研究から、この

1.特許取得分子がこのシナプスの構造的および機能的結合なし性を制御する重要な分子であり、その遺伝子異常

2.実用新案登録

により小脳性の運動障害が起こることを遺伝子なし

変異を有するヒト家系やマウスの研究から明ら

3.その他

かになっている。一方、GluD1 の遺伝子変異もなし

1）

様々な精神・神経疾患と関連することが報告され本ているが、その細胞発現、回路発現、生理機能はい全く不明であった。

セ本共同研究の推進により、GluD1 も特定のニュ

れーロンに発現し、特定の神経入力を受けるシナプ

いス後部に選択的に発現し、その結合を制御する分に子であることが判明した。しかも、この GluD1

見の発現特性と分子機能は視床 VPM や分界条床核の解析から、小脳以外の脳領域でも保たれており、脳に普遍的なものであることもクローズアップ

A.

されてきた。今後、本共同研究が最終目的とする大脳皮質や海馬などの大脳領域における研究成ら

果へと発展・結実することにより、この分子の発ep

現と機能の全貌が明らかとなることが期待され

科

る。

る

理
E.結論

乱

GluD1 および GluD2 からなる GluD ファミリー

をは、特定の神経入力を受けるシナプス後部に発現こし、そのシナプス接着を強化する。

発

発

能

－ 426 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所

ma｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣ki

共同利用・共同研究報告書

D1

in

限局性皮質異形成の分子遺伝学的発生機序の解明

in

4.

研究代表者

加藤

研究分担者

柿田

光広 1）
明美 2）
延之 2）
直通 3）

武井

タ

松本

剖

才津

浩智 3）
光子 3）

中島

茂樹 4）
潤 4）

亀山
遠山
1）昭和大学医学部小児科学講座

2）新潟大学脳研究所 3）横浜市立大学遺伝学講座 4）国立病院
機構西新潟中央病院
研究要旨

限局性皮質異形成(FCD)の原因を明らかにするために、FCD と病理診断されたてんかん患者の脳手術標
本 24 検体および同患者の血液から gDNA を抽出し、次世代シーケンサーによる deep sequence を行な
い、体細胞モザイク変異の有無を検討した。FCD IIb 型 13 例中 6 例で MTOR に体細胞モザイクのミス
センス変異を検出した。MTOR 変異体を導入した細胞では mTOR の標的である 4EBP のリン酸化が促進されていた。変異症例の脳組織では mTOR のもう一つの標的である S6 キナーゼのリン酸化が促進されていた。FCD IIb 型における MTOR 変異は機能が亢進する活性型変異であった。mTOR 信号伝達経路の上流には、結節性硬化症や巨脳症関連疾患の原因分子 TSC1/TSC2, PIK3, AKT3 が存在する。三者は病理所見の類似性から共通病態が示唆されていたが、分子レベルで共通性が証明された。

A.研究目的られる。発作は薬剤抵抗性を示し、多くは病変切限局性皮質異形成(FCD)は、1971 年に Taylor

除を必要とする。病理的には皮質層構造の異常にらが focal dysplasia of the cerebral cortex in

よる神経細胞の配列の乱れと、異型細胞やepilepsy として報告され、難治性てんかんの外balloon cell などの異常細胞の出現を特徴とす

科切除病変で認められる特異的な病理像を呈する。皮質の局所的な発生異常が病態として推測さる疾患単位である。てんかん発作の発症時期は病れているが、その原因は全く不明である。本研究

理変化の程度に反比例し、皮質神経細胞の配列のでは FCD の分子遺伝学的発生機序を明らかにす

乱れのみの I 型では中高生以降が多く、異常細胞ることを目的とする。初年度の研究で脳病理組織を伴う II 型では乳幼児期から学童期に発症するに存在し、血液には認められない体細胞モザイクことが多い。発作型は年齢によって変化し、部分

変異の有無を検討し、１名に細胞外カルシウム濃発作だけでなく、発症時には強直発作、強直間代度の減少による神経細胞興奮に関与する遺伝子発作も多く認められ、症状の進行に伴い、認知機

X を同定したが、他の８名の患者に共通する変異能の障害や片麻痺など局所運動症状の出現がみは認められなかった。昨年度も脳組織で発現する－ 427 －

遺伝子の体細胞モザイク変異が原因と推定し、病FCD は従来から病理学的に結節性硬化症の脳病

理学的に形成異常の強い FCD II 型と診断された

理標本所見と類似しており、結節性硬化症との病

脳組織標本と血液のペア検体を増やして、FCD の態の共通性が示唆されていた。結節性硬化症の原原因遺伝子の特定をめざし、遺伝子 Y を同定した。

因遺伝子である TSC1/TSC2 は PI3K-AKT3-mTOR 経

遺伝子 Y は MTOR であり、同定された mTOR 変異体

路の AKT3 と mTOR の間に位置しており、FCD と結の機能を解析し、FCD の発生機序を解明する。

節性硬化症の分子機構が共通することを直接的2)に示唆する。また、同じく病理学的に類似所見を示す片側巨脳症も PI3K-AKT3-mTOR 経路の遺伝子

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
FCD と病理診断されたてんかん患者の脳手術

変異が原因である。さらに、画像的に両側性の巨標本 24 例の凍結組織もしくはパラフィン標本か

脳症と脳形成異常をきたす皮膚毛細管異常を伴らゲノム DNA を抽出した。FCD IIb 型の 9 例に対う巨脳症(MCAP)や多小脳回と多指症を伴う巨脳してライブラリー調整後、次世代シーケンサーに症 (MPPH) もよるエクソーム解析を行ない、体細胞変異が検出

PI3K-AKT3-mTOR 経路の遺伝子変異が原因であるされた遺伝子を FCD の原因候補として、他の 15ことを我々と他のグループが明らかにしている。

例について変異解析を行った。また、新たに病理所見から推測されていた病態の共通性が、原FCDIIb 型 4 例から同意を得て、体細胞モザイク因遺伝子の同定によって分子レベルで共通する変異の有無を比較検討した。また、ヒト培養細胞病態が示されたことは「脳神経病理標本資源活2.

株に MTOR 変異体を発現するプラスミドをトラン用」の本プロジェクトの趣旨からも意義深いと考1)

スフェクションし、同定された各変異が mTOR 経

えられる。

路に及ぼす影響を調べた。

AKT3

な ど

3)

MTOR の変異は FCD IIb 型のみに同定され、他（倫理面への配慮）のタイプ(I 型、IIa 型)では MTOR の変異は同定さ山形大学医学部倫理委員会（平成 24 年 8 月 6日

PIK3R2,PIK3CA,

れなかった。上述した結節性硬化症や片側巨脳症、第 71 号）および昭和大学医学部ヒトゲノ

MCAP, MPPH のいずれもが PI3K-AKT3-mTOR 経路のム・遺伝子解析倫理審査委員会（平成 27 年 7 月

複 数 の 遺 伝 子 が 原 因 に 関 与 す る 。 FCD は

1日

PI3K-AKT3-mTOR 経路の局所的な体細胞変異が原

第 220 号）の承認を受け、患者もしくは保護者から研究に対する同意を得た。

因と考えられ、MTOR 以外の PI3K-AKT3-mTOR 経路2)3)の遺伝子や他の関連する遺伝子変異が原因で生C.研究結果じている可能性がある。今後さらに他の症例で解FCD IIb 型 13 例中 6 例で MTOR の体細胞モザイ

析を行うとともに、限局性皮質異形成の病態と分ク変異を同定した。脳組織のモザイク率が 1-9%

子基盤を細胞や臓器・個体レベルで精査する必要に対し、血液における頻度は 0.1%未満であり、がある。

明らかに差を認めた。脳組織の他のタイプの FCD
では変異が認められなかった。MTOR 変異体を発E.結論

現するプラスミドをトランスフェクションした

FCD 24 例の脳と血液を用いて体細胞モザイク

細胞株は MTOR 正常体を発現するプラスミドをト

変異解析を行い、FCD IIb 型 13 例中 6 例でランスフェクションした細胞株に比べて、4EBP

PI3K-AKT3-mTOR 経路に関与する MTOR に体細胞突の発現が亢進し、mTOR 経路の活性が著明に上昇

然変異を検出した。FCD が結節性硬化症等と共通していた。

の病態を有することが分子レベルで示された。

4)

G.

1.
F.研究発表（上記課題名に関するもの）

な

1.論文発表2.

変異を同定し、FCD IIb 型の主要な原因と考えら

1) Nakashima M, Saitsu H, Takei N, Tohyama J,

なれた。MTOR は PI3K-AKT3-mTOR の信号伝達経路を

Kato M, Kitaura H, Shiina M, Shirozu H,

3.

構成するタンパク質をコードする遺伝子である。

Masuda H, Watanabe K, Ohba C, Tsurusaki Y,

なD.考察
FCD IIb 型の約半数で MTOR の体細胞モザイク－ 428 －

病

Miyake N, Zheng Y, Sato T, Takebayashi H,病

Ogata K, Kameyama S, Kakita A, Matsumoto N:

原

Somatic Mutations in the MTOR gene cause経focal cortical dysplasia type IIb. Ann

結

Neurol 2015;78(3):375-386

的2) Fukasawa T, Kubota T, Negoro T, Maruyama S,をHonda R, Saito Y, Itoh M, Kakita A, Sugai子K, Otsuki T, Kato M, Natsume J, Watanabe K:

巨Two siblings with cortical dysplasia:

伴Clinico-electroencephalographic features.

脳Pediatr Int 2015;57(3):472-475

ど3) Kato M. Genotype-phenotype correlation inるneuronal migration disorders and corticalる。

dysplasias. Front Neurosci 9 (181):e1-8,、原2015 doi: 10.3389/fnins.2015.00181

る活

2.学会発表考1) Mitsuhiro Kato: Molecular pathomechanisms
for epilepsies in early childhood. 11th

他

Asian Society for Pediatric Research April

さ17th-19th, 2015, Osaka (invited lecture)症、2) 加藤光広：脳形成障害の分子診断．シンポジのウム 7：脳形成障害の臨床、画像、病理、遺は伝子の最新の知見．第 57 回日本小児神経学会

原

学術集会：大阪

2015 年 5 月 28-30 日路3) 中島光子、才津浩智、武井延之、遠山潤、加生

藤光広、北浦弘樹、椎名政昭、白水洋史、増解田浩、渡辺啓介、佐藤龍洋、竹林浩秀、緒方分

一博、亀山茂樹、柿田明美、松本直通：限局

要性皮質異形成(FCD)IIb 型における MTOR 体細胞変異の同定．日本人類遺伝学会第 60 回大会：東京

2015 年 10 月 14-17 日4) 加藤光広：mTOR 経路の分子異常による小児神ク

経疾患．第 17 回小児神経わかて会（東京大学で小児科神経グループ）：東京

突日2015 年 8 月 29

通。

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし
2.実用新案登録

J,

なし

H,

3.その他

Y,

なし

－ 429 －

変
平成 27 年度新潟大学脳研究所

ap｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

を共同利用・共同研究報告書

ずca

オリーブ橋小脳萎縮症における細胞障害機構の解明

プ

細
研究代表者

瀧川

みき

研究分担者

柿田

明美

加藤

信介

1）
2）

較

1）

ap

速
1）鳥取大学医学部病理学講座脳病態医科学分野
2）新潟大学脳研究所脳科学リソース研究部門脳疾患標本資源解析学分野

E.

研究要旨

は

オリーブ橋小脳萎縮症(MSA-C)21 例、年齢層を一致させた正常対照 10 例を用い、免疫組織学的解析にれとして、p53 抗体、caspase3 を用いた。
MSA-C の残存プルキンエ細胞は、p53 抗体で陰性を呈した。一方、caspase3 は発症後 6～9 年頃に発現が認められる傾向があった。
これまでの我々の研究により、MSA-C の残存プルキンエ細胞の一部では、酸化ストレスによる酸化型 SOD1 の形成が認められ、Ca++代謝を含めた神経細胞の機能が低下し、やがて、酸化ストレスを一要因として、変性・細胞死に至ることが推測された。今回の研究からは、酸化ストレスと関連して p53
は MSA-C のプルキンエ細胞死に関与しないことが判明した。一方、caspase3 を介して、酸化ストレスは病態の進行に関与する可能性が示唆された。

F.
1.
な

2.

第

福

G.
を用いた。

A.研究目的MSA-C は日本に多い多系統萎縮症（MSA)の一亜型であり、プルキンエ細胞の脱落が主たる病理学

C.研究結果的所見の一つである。しかし、MSA の基本病態とMSA-C の残存プルキンエ細胞は、p53 抗体にはされるα-シヌクレインの蓄積はプルキンエ細胞

陰性を呈した。一方 caspsase3 抗体に対しては、そのものには認められず、細胞死の原因は未だ不発症後 6～9 年の症例は、一部の残存プルキンエ

明である。これまでの我々の研究で、MSA-C にお細胞で陽性を呈した。

けるプルキンエ細胞死には、酸化ストレスが関与

残存プルキンエ細胞における酸化型 SOD1 の発している事が判明した。今回は、酸化ストレスが現は、発症後より徐々に増加し、発症後 6 年頃をどのような機序で細胞死に関与しているかを、ピークとして横ばいとなり、発症後 9 年以降は減

apoptosis の観点から検討した。

少する傾向が見られた。

B.研究方法D.考察

MSA-C21 例、年齢層を一致させた正常対照 10 例

これまでの我々の研究で、MSA-C の残存プルキを用い、通常染色に加え、免疫組織学的解析としンエ細胞の一部では、酸化ストレスによる酸化型て、我々が開発した酸化型 SOD1 抗体、カルビン

SOD1 の形成が認められ、Ca++代謝を含めた神経細ジン抗体、SOD1 抗体、p 53 抗体、caspase3 抗体胞の機能が低下し、やがて、酸化ストレスにより、－ 430 －

1.

な

2.

な

3.

な

は

は、

エ

変性・細胞死に至る機序が推測されていた。今回
apoptosis の観点から、p53 および caspase3 抗体を用いて検討したが、p53 は明らかな発現を認めず、細胞死への関与は低い事が推測された。一方、
casepase3 は、発症後 6～9 年の症例における残存プルキンエ細胞に発現が多く見られ、この時期の細胞死に深く関与していると考えられた。
酸化型 SOD1 発現様式と caspase3 発現様式が比較的似通っている点から、酸化ストレスがapoptosis を介して、残存プルキンエ細胞死を加速している可能性が示唆される。
E.結論
MSA-C における原因不明のプルキンエ細胞死には、酸化ストレスが関与しており、酸化ストレスによる apoptosis を介した細胞死の機序が示唆された。
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし
2.学会発表第 56 回神経病理学会

2015 年 6 月 3 日～5 日、福岡
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし
2.実用新案登録
なし
3.その他
なし

発

を

減

キ

型

細

り、

－ 431 －

て
平成 27 年度新潟大学脳研究所

名｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

C.

統合失調症脳内タンパク質多項目同時測定解析及び関連遺伝子発現解析

症

研究分担者

研究代表者 國井 泰人 1）
柿田明美2）矢部博興1）、丹羽真一3）、和田明1）、松本純弥1）、日野瑞城1）、
那波宏之2）、高橋均2）

サ

い

(V

Ak
1）福島県立医科大学

2）新潟大学脳研究所

3）会津医療センター

sig

ER

研究要旨
本研究では、統合失調症発症のメカニズムの解明を目的として患者死後脳内タンパク質の発現解析を行う。ドパミン関連分子、グルタミン酸関連分子、GABA 関連分子を標的タンパク質として、統合失調症群と健常対照群の死後脳凍結組織における発現量の差異を大槻法で用いてスクリーニングし、タ

β(

res

現

ンパク質 10 種について脳内の複数の部位についてルミネックス法によるタンパク定量を行う。更に、（免疫組織化学的手法を用いて、より詳細な標的タンパク質の組織内分布を観察し発現している細胞をさ同定する。統合失調症群に関しては、当バンク特有の詳細な臨床情報（罹病期間、抗精神病服薬量、み

生活歴・既往歴・手術歴・鎮痛薬を含む全服薬歴等）を駆使して関連を検討する。また、タンパク質床

発現解析から得られた情報を元に遺伝子発現解析を行う。

多とによる死後脳タンパク質群の多項目同時測定をA.研究目的
本研究の目的は、統合失調症病態におけるドパ行う。測定対象のタンパク質は大槻法によって統

ミン系・グルタミン酸・GABA 系の異常を、動物実合失調症患者死後脳で健常対照群に対して発現

験や画像研究などの間接的アプローチではなく、死後脳組織を用いて病態の現場を直接的に検討することである。これまで代表者らが統合失調症
死後脳組織を用いて分析を進めてきたドパミン

量に変化が認められたタンパク質 10 種程度とする。さらに免疫組織化学的手法を用いて、より詳
細な標的タンパク質の組織内分布を観察し発現

系・グルタミン酸・GABA 系の分子を中心に、ごくしている細胞を同定する。統合失調症群に関して

少量のサンプルでタンパク質の多項目同時測定

は、当バンク特有の詳細な臨床情報を駆使して関を可能にするルミネックス法という革新的新手連を検討する。解析した分子の中で異常が捉えら法から新たな脳内表現型の創出し、更に免疫組織れたものについては、レーザーマイクロダイセク

化学、遺伝発現解析などを通して精神疾患病態のション等により、免疫組織化学解析と同じ解析部

鍵となる分子や治療標的分子を同定する。

位の組織を抽出し、局所的遺伝子発現解析も実施する。

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

年齢、性別、死後時間等をマッチさせた非精神神
経疾患対照例を測定対象として、ルミネックス法

意

皮

の

の

遺

(rs

の

た

rs1

D.

E.

なおこの研究は各施設の倫理委員会の承認をグ得ており、ヘルシンキ宣言に基づいた倫理的原則

失に則って実施され、発表にあたっては死後脳提供

統

遺族から十分なインフォームド・コンセントを得と

当講座の精神疾患死後脳バンクにおいて凍結保存された死後脳及び新潟大学脳研究所保管のVE－ 432 －

、

を

統

現

す

詳

現

て

関

ら

ク

部

施

て、プライバシーに関する守秘義務を遵守し、匿名性の保持に十分な配慮をした。

F.研究発表(上記課題名に関するもの)
1.論文発表Sakai M, Watanabe Y, Someya T, Araki K,
Shibuya M, Niizato K, Oshima K, Kunii Y, Yabe

C.研究結果
年齢、性別、死後時間をマッチさせた統合失調

H, Matsumoto J, Wada A, Hino M, Hashimoto T,

症死後脳 19 例、健常対照死後脳 21 例の凍結脳

Hishimoto A, Kitamura N, Iritani S, Shirakawa

サンプルの前頭前皮質(BA10)および側坐核につO, Maeda K, Miyashita A, Niwa S, Takahashi

いて vascular endothelial growth factor receptor 2

H, Kakita A, Kuwano R, Nawa H.Assessment(VEGFR2), epidermal growth factor receptor (EGFR)、
Akt1 、 リ ン 酸 化 Akt1 (Ser473) 、 extracellularsignal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) 、 リ ン 酸 化
ERK1/2 (Thr185/Tyr187)、glycogen synthase kinase 3β (GSK3β)、リン酸化 GSK3β(Ser9)、および cAMP
response element binding protein (CREB)の蛋白質発
現 量 を

Bead-BasedMultiplex

Immunoassay（Luminex システム）により多項目同時測定した。
さらに統合失調症群と対照群間で発現量の差がみられた VEGFR2 については、発現量と生前の臨

of copy number variations in the brain genomeof schizophrenia patients.

Mol Cytogenet.

2015;1;8:46. doi: 10.1186/s13039-015-0144-5.
eCollection 2015.
2.学会発表(国内学会）
國井泰人；若手研究者育成プログラム・プログレ
スレポート, 精神疾患死後脳を用いたジェネティ
ックニューロパソロジーの展開. 第 37 回 日本生
物学的精神医学会,東京,2015/9/25

床症状スコアとの関連について、またその遺伝子多型と各蛋白質の発現量、統合失調症発症の有無との相関を解析した。同時多項目測定の結果、
VEGFR2 が統合失調症群の前頭前皮質において有意に減少していた。統合失調症群において前頭前皮質の VEGFR2 発現量と生前の陽性症状スコアの間に負の相関がみられた。また、統合失調症群

日野瑞城、國井泰人ら；統合失調症患者死後脳前頭前皮質における Akt シグナル伝達系蛋白質群の多項目同時測定．第 11 回日本統合失調症学会,群馬,2016/3/26(国際学会)なし。

の前頭前皮質ではリン酸化 Akt1 が増加していた。
遺伝子多型解析の結果、VEGFR2 遺伝子の多型

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）(rs7692791)は Akt1 の発現量と ERK1/2 および Akt1

1.特許取得のリン酸化レベルを予測することが示された。まなし。

た VEGFR2 遺伝子の 2 多型(rs17709898 および
rs1870377)が統合失調症と相関していた。

2.実用新案登録
なし。
3.その他
なし。

D.考察
E.結論
VEGFR2 は細胞外からの血管増殖刺激を Akt シをグナル伝達系に伝える因子であることから、統合則失調症群の前頭前皮質の VEGFR2 発現量低下は

供

統合失調症の病因が微小血液循環の異常にある得とする仮説を説明するものと考えられる。

－ 433 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

CRISPR/Cas9 システムを使った迅速なノックアウトマウス作成
研究代表者
研究分担者
1）関西医科大学薬理学

2)

赤間智也 1）
崎村建司 2）2）新潟大学脳研究所細胞神経生物学分野
研究要旨

我々は角膜や脳に存在する直鎖状糖鎖であるケラタン硫酸グリコサミノグリカンの生合成経路とその生物学的機能解明に向けた研究を行なっている。ケラタン硫酸糖鎖合成の律速段階となる酵素は
β3GnT2 およびβ3GnT7 と考えられており、この遺伝子をノックアウトした変異マウスは角膜の細胞外
マトリックスの異常や新生仔致死の表現型を示すことが明らかとなった。現在我々はタモキシフェン
誘導型のコンディショナルノックアウトマウスを作成して成体でのケラタン硫酸合成酵素の必要性を調べており、成体でβ3GnT2 の発現を抑制した場合、急性の変化は見られなかったことから少なくとも
β3GnT2 の発現の消失は成体マウスの生存に必須ではないということが明らかとなった。

とでタモキシフェン誘導型の変異マウスを作成

A.研究目的ポリ N アセチルラクトサミンやケラタン硫酸はし、15 週齢の段階で腹腔内にタモキシフェンを投細胞表面や細胞外マトリックスタンパク質に見与することでβ3GnT2 の発現を抑制してその後のられる直鎖状の糖鎖構造であり、細胞間あるいはマウスの変化を調べた。一方で別のケラタン硫酸

タンパク質間相互作用に影響を与えていると考合成酵素である Chst1 や Chst5 遺伝子を迅速に破えられている。我々はこれら直鎖状糖鎖の生物学

壊する CRISPR/Cas9 システムの構築も行った。

的 機 能 を 解析 す る 目 的で そ の 合 成酵 素 で あ る
β3GnT2 およびβ3GnT7 の遺伝子ノックアウトマウ

C.研究結果スを作成しその表現型を解析した。また化合物誘1)B3gnt2 ノックアウトマウス

導型のコンディショナルノックアウトマウスを

B3gnt2 の全身性ノックアウトマウスは生後 2作成することで成体における酵素遺伝子および日以内にそのほとんどが死んでしまう新生仔

直鎖状糖鎖の必要性についても解析を試みた。

致死であることからβ3GnT2 の合成するポリ N
アセチルラクトサミンおよびケラタン硫酸は
新生仔の発生に重要であることが明らかとなB.研究方法（倫理面への配慮を含む）
我々は既に新潟大学脳研究所との共同研究にったが、成体でも必須であるのかどうかは不明てβ3GnT2 をコードする遺伝子である B3gnt2 のであった。そこで

3)

floxed マウスおよびβ3GnT7 をコードする遺伝子

構である B3gnt7 の floxed マウスを作成済みである。

B3gnt2(flox/-)/ROSA26(+/CreERT2)マウス（B3gnt2 CKO マウス）を作成し、成体（15 週

これらのマウスに Cre 発現マウスを掛け合わせる

齢）の段階で腹腔内にタモキシフェンを投与ことで全身性のノックアウトマウスを作成して（150 mg/kg/日で 5 日連続投与）し、その後のその表現型を解析した。また B3gnt2 の floxed マ

影響を調べた。B3gnt2 CKO マウスは投与後 1

ウスを ROSA26-CreERT2 マウスと掛け合わせるこ

週間以上経過しても特に変化を見せず生存し－ 434 －

ていたことからβ3GnT2 の発現抑制は成体マウで破壊することを目的として CRISPR/Cas9 シスの生存にとって急性の影響を与えるものでステムの構築を行った。それぞれの遺伝子に対はないことが分かった。このマウス（投与後 1応する gRNA 発現ベクターを 3 種類作成してヶ月経過）はさらに飼育を続け、β3GnT2 発現

Cas9 発現ベクターと共に細胞内で発現させ、抑制の影響の観察を続けている。

発現細胞をピューロマイシン選択培地で選択

2) B3gnt7 ノックアウトマウス

すると同時にクローニングし、この培養細胞に

B3gnt7 全身性ノックアウトマウスは正常に成おける遺伝子破壊の効率をシークエンスにて育し交配も行うが、詳細な解析の結果、ケラタ

調べた。その結果、CRISPR/Cas9 による遺伝子

ン硫酸が豊富に存在する角膜実質においてその破壊効率は充分高く（CHST1 20 アレル中 15の厚さが減少し、細胞外マトリックスの構造がアレル、CHST6 20 アレル中 10 アレル）、ケラ

より乱雑になるという表現型が確認された。こタン硫酸の産生を行わない細胞を入手するこれはヒトの斑状角膜ジストロフィーに類似すとに成功した。一方でクローニングしたはずのる表現型であり、この疾病を有する患者ではケ細胞の遺伝子変異を調べたところ 3 アレル以

ラタン硫酸の生合成が不全となりケラタン硫

上の変異を検出し、クローニングしたはずの細酸鎖の伸長が抑制されていることが明らかと胞株は 2 種類以上の細胞が混在することが明なっている。B3gnt7 ノックアウトマウスでもらかとなった。

角膜実質のケラタン硫酸合成が阻害されており、マウスにおいてもケラタン硫酸の合成阻害

D.考察

が角膜実質細胞外マトリックスの構築不全を

β3GnT2 とβ3GnT7 は in vitro では共にポリ N ア

引き起こして角膜厚の減少を示していること

セチルラクトサミンおよびケラタン硫酸の合成が分かった。そこで成体の角膜においてもケラに関わることが知られているが、その全身性ノッ

タン硫酸糖鎖のターンオーバーがあるとすれクアウトマウスの表現型を調べるとβ3GnT2 は新成ば成体角膜でβ3GnT7 の発現を抑制することで生仔の発生に重要であるがβ3GnT7 は必須ではな

投

角膜厚が減少するのではないかと予想し、いことが明らかとなった。これはβ3GnT2 は主に NのB3gnt7(flox/-)/ROSA26(pA-lacZ/CreERT2) マ型糖鎖のポリ N アセチルラクトサミン合成に関与

酸

ウスを作成して眼球に直接タモキシフェンをし、β3GnT7 は主に角膜におけるケラタン硫酸合成

破投与することを計画している。予備的実験としに関わっているからで、β3GnT7 が合成を行なう糖て ROSA26(pA-lacZ/CreERT2)マウスを作成し、鎖は機能が限局していて発生に致命的な影響をこのマウスの眼球に活性型タモキシフェンで与えないからではないかと考えられる。β3GnT2 はある 4-hydroxytamoxifen (OHT)をワセリンに新生仔発生に必須であることが分かったが、成体懸濁して塗布（麻酔下で 5-10 µg/眼/日で 5 日

で発現を抑制しても急性の影響が出ないことが2連続投与）したところ CreERT2 の活性化とそれ今回の研究で明らかとなった。成体での糖タンパ

仔に伴う lacZ の発現が角膜上皮細胞および実質

ク質のターンオーバーは長いものから短いもの

N細胞で確認されたことからこの条件での OHTまで幅があり、β3GnT2 の酵素活性が寄与する糖タは投与で角膜実質細胞にβ3GnT7 の発現抑制を誘ンパク質のターンオーバーは比較的長いため急な導することが出来るものと考えられた。現在実性の影響が表れないのかも知れない。あるいは通明験に必要な数のマウスの繁殖を進めている。

常のマウスの生存には必須でないが、炎症など病

3) CRISPR/Cas9 による迅速な遺伝子発現抑制系の的な状態で必要とされることも考えられるので構築

更なる研究が必要であると考える。

週

Chst1 および Chst5 遺伝子はマウスにおいてケCRISPR/Cas9 システムによる遺伝子破壊はシス

与

ラタン硫酸の硫酸化を行う酵素をコードする

テムの構築が簡単で変異導入細胞を調製するだの遺伝子である。これらの遺伝子の発現していなけであれば非常に迅速に行なえることが分かっ

1

い細胞を入手するべく、ヒトの遺伝子のオーソた。しかしながら均一なゲノムを有するクローン

しログである CHST1 と CHST6 をヒト HEK293T 細胞

化細胞の作成はクローニングが容易ではなく比－ 435 －

較的煩雑であるのでこの点を改良することが必要であると考えられた。この手法を遺伝子破壊マ
ウスの作成に使用することはそれほど難しくな
く、少なくとも変異 ES 細胞の作成は簡単であると考えられる。但し得られた変異細胞はクローンではなく、その細胞群の中からフレームシフトを生じている細胞のみをマウス作成に使う必要があるので注意が必要である。
E.結論
糖鎖合成酵素のノックアウトマウスの作成により、これまでに知られていない糖鎖の生体内における機能が明らかとなり、この手法が機能解析に有用であることが分かった。またコンディショ
ナルノックアウトマウスを作成することで成体になってからの機能を解析することができ、発生過 程 で の 機能 と 区 別 する こ と が 可能 で あ る 。
CRISPR/Cas9 システムは細胞内の遺伝子を破壊す

Ne

後

有

ることは容易であり、この方法を用いた全身性遺し，伝子ノックアウトの作成は難しくないものと考エえられるが、コンディショナルノックアウト型のはES 細胞を作成するには loxP の挿入などいくつか作の課題があると考えられる。今後の研究でこれらの問題点を克服することが出来ることを期待する。

A.

F.研究発表(上記課題名に関するもの)

して

1.論文発表

も有

該当なし

ウス

2.学会発表

とす

該当なし

そ

複

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

し

該当なし

re

ス

伝

体

神

使

与

響

点

－ 436 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

PNPLA6 遺伝子の脳における機能—有機リン被爆との関連から
研究代表者
研究分担者

木村穣 1

笹岡俊邦 2、畑中朋美 11）東海大学医学部基礎医学系分子生命科学 2）新潟大学脳研究所
研究要旨
我々は有機リンやホルムアルデヒド等の被爆が主原因とされるシックハウス症候群の患者単球においてNeuropathy Target Esterase(以下 NTE)の活性が健常者に比べて高いことを報告した(2013)。有機リンの曝露
後に神経症状が生じることが知られているが、そのメカニズムについては良くわかっていない。本研究では、
有機リン関連疾患の発症機構解明を目指し、まず NTE をコードする遺伝子 PNPLA6 を導入したマウスを作製し，有機リンやホルムアルデヒド投与実験を開始した。シックハウス症候群の原因物質の一つとされるフタル酸
エステルの経皮吸収とエステラーゼの関わりについては良いモデルができた。有機リンと NTE の複合体検出は進行中である。最近、いくつかの小脳疾患で PNPLA6 に点突然変異が見いだされており、マウスモデルを作製すべく、CRISPR/Cas9 システムを整えた。

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

A.研究目的
本研究ではシックハウス症候群やその原因物質とヒト PNPLA6 遺伝子導入マウスを用いた実験計

して指針値が定められている１３種の化学物質—中で画は東海大学遺伝子組換え実験安全委員会およも有機リンに対しての発症メカニズムを遺伝子操作マび東海大学動物実験委員会を通じて大学より承認

ウスを駆使して探求することを目的とした。また、対象されている。

とする酵素は有機リンと共有結合を形成することから、その複合体が種々の症状を生み出す可能性を考え、

ROSA26 部 位 に CAG プ ロ モ ー タ ー 下 に ヒ ト
PNPLA6 遺伝子 cDNA および同時に EGFP 遺伝子

複合体検出への取り組みを行っている。すでに確立を導入したマウスである。F0 マウスと Cre マウスとのし た NTE 高 発 現 マ ウ ス と 、 CRISPR(Clustered

交配により発現を誘導し、F１以降の系統化はregulatory Interspaced short parindromic repeats)シC57BL/6 との交配によった。ヒト皮膚を用いた経皮

ステムによる遺伝子変異導入技術をマウス pnpla6 遺吸収実験計画は医学部医の倫理委員会の審議後、伝子に応用することにより最終的には pnpla6 変異個

承認を受けている。

マウスは我々独自の方法で、体を得て、pnpla6 遺伝子の個体レベルでの機能を、

マウスのホルムアルデヒド曝露実験および経皮

神経系を中心に明らかにしたい。また、農薬等に良く吸収実験は独自の装置を用いて行い、酵素活性使用されるジクロルボス(DDVP)をこれらのマウスに投測定は常法に従った。

与し、中枢および末梢神経系における有機リンの影複合体検出では島津製作所の質量分析器

響を、NTE に対する急性および遅延性反応という観（Shimazu LC-MS）を使用した。眼球運動は高速度点から解析することが本研究の最終目的である。

デジタルカメラを用いた瞳孔追跡システム、空気中のホルムアルデヒド濃度は新規に開発した－ 437 －

レーザーを用いたガスセンシング法及び高速液

た”NTE”の精製を試みている。当初のタグでは２種体クロマトグラフィを用いて測定した。

の分子が生じるため、ゲル上で単一バンドとするべ

C.研究結果
ヒト PNPLA6 遺伝子導入マウスでは PNPLA6 遺にく再度トライしている。大量精製ののち in vitro で経

DDVP との複合体を形成させ、質量分析を行う予定

技

である。

組

伝子がコードする NTE の発現がモザイク状態となる

CRISPR（Clustered regulatory Interspaced short

ようであり、全身発現性の CAG プロモーターを用い

parindromic repeat）技術は、遺伝子の特定の配列ているせいか、成長遅延の個体も見られる。しかしを利用して、任意の動植物種や細胞に変異を導入

ながら各臓器で遺伝子導入個体では通常のマウスすることができるとされる方法だが、我々も今年度にに比べ少なくとも数倍の活性上昇があった。

は複数のマウス遺伝子系で条件を検討しているが、NT

点突然変異の導入に関しては難しい例もある。

臓

pnpla6 遺伝子の改変を進行中である。

あ有機リンの一種で殺虫剤等にも使用されている
ジクロルボス（DDVP）を投与したが、成体では今のE.

ところ特に変化はないが、妊娠マウスに投与した場

脳研柿田教授のご協力により、ヒト農薬被爆者の例

合には、遺伝子導入マウスの死亡胎仔の割合が高標本が１例ある事が判明した。NTE 抗体で Western群

い（以上既報告）。

blot に用いることが可能な抗体が準備出来てきていに

東海大学准教授加藤明先生の協力を得てるので、今後、他の例も含めて年齢ごとの脳内 NTE

こと

60-80 ppm の蒸散ホルムアルデヒドガス曝露後発現量を検討し、基礎データを得ていきたい。なお、

細(18 時間 / 日、７日間、n = 1)、HE 染色した

貴学ヒト脳標本の利用については、本学では 2016 年

グ

脳切片を用いて遺伝子導入マウス脳の形態異常

3 月に承認が得られた段階である。

を解析したところ、小脳プルキンエ細胞の委縮及び海馬歯状回-CA3 周辺の層構造異常を示唆

相D.考察

する結果が得られた。

CR

我々が開発した独自の方法で、全身で NTE の高配経皮吸収に関しては表皮と真皮の境界領域で発現を示すトランスジェニックマスの系統化に成功しるデNTE の発現を免疫組織学的に認めた。ついでフたが、DDVP 投与やホルムアルデヒド曝露では神経タル酸ベンジルブチルの結合切断の種特異性を症状や行動上の顕著な外見上の変化はない。もともF.

利用してその皮膚の透過実験からこのマウス皮とマウスはヒトでは致死量のホルムアルデヒド濃度で1.

膚では NTE 活性が 100 倍上昇し、かつヒト型のも耐性であることや、そのくせ DDVP の腹腔内投与等

畑

主代謝物の特性を備えていることを解明した。

では微妙な投与量の違いですぐに死亡する個体が内

NTE 活 性 は 吉 草 酸 エ ス テ ル を 基 質 と し て出現することから、マウスはこの課題において、あまりシ

paraoxon 耐性で mipafox 感受性のエステラーゼ

適切な実験動物とは言えないのではないかと考えてす

活性として定義されるが、より簡便な検出法開いる。今後は感受性の高い鳥類の利用等も視野に88発に取組んだ。ヒト単核球中での総エステラー

入れて検討したい。

ゼ活性が paraoxon 耐性のエステラーゼ活性としかしながら、ヒト PNPLA6 遺伝子導入マウス

2.

比例することを確認し、マウス皮膚と脳で NTE

ではフタル酸エステルの代謝について、見事にマ畑

活性と paraoxon 耐性のエステラーゼ活性は比ウス型とヒト型を区別することができ、個体レベ内例した。しかし、フタル酸エステル代謝活性とルでヒト型皮膚の経皮吸収実験が行える道が開シは必ずしも比例しなかった。

けた。また、手術時のヒト皮膚を用いた活性測定

す

一過性の NTE 高発現 293 細胞を利用し、ゲルよ

では NTE 活性は低いものの、paraoxon 耐性の活性学り抽出したバンドが NTE であることを質量分析系でで代用出来る見通しがある程度出来ることとな

畑

確認していたが、このクルードな系ではった。

部

NTE-DDVP 複合体の検出には至らなかった。そこ

DDVP-NTE 複合体の質量分析器での検出は現在

ス

で、現在は大腸菌で活性を有するペプチド部分の大量精製している大腸菌に産生させた NTE によっフ

N 末および C 末にタグを配置して大量産生して実現可能になると思われる。その先では複合体

38－ 438 －

種に特異的な抗体作成に挑戦したい。

べNTE をコードする PNPLA6 遺伝子の変異が運動神

杉野雅浩、畑中朋美、荻野瑛里奈、青山謙一、内で経系関連疾患で続々報告されているので、CRISPR

堀雅博、太田嘉英、今川孝太郎、宮坂宗男、竹内定

技術でマウスの相同遺伝子に変異導入する取り

絵理、坂部貢、從二和彦、木村穣: シックハウス

組みを開始した。

症候群における NTE 活性の役割に関する研究—フt

列

タル酸エステルの経皮吸収に及ぼす影響 II. 第38 回日本分子生物学会年会 2015.12.1-4 神戸

E.結論

入

有機リン関連疾患の発症機構解明を目指すため

度に、有機リンと活性中心で共有結合を形成するヒト、。

NTE を発現するマウスを系統化した。発現の程度は臓器や週齢によって異なるがいずれも高発現である。DDVP 投与やホルムアルデヒド曝露では少数

赤塚尚子、大塚正人、木村穣、井ノ上逸朗、佐藤健人: コーデン症候群患者由来iPS細胞の樹立と解析. 第38回日本分子生物学会年会

2015.12.

1-4 神戸の例ではあるが影響は見られている。シックハウス症候

rn群の原因物質とされるフタル酸エステルの経皮吸収いについては良いヒト型モデルができ、論文にまとめる

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

TE

ことができた。有機リンと NTE の複合体検出は動物

なし。

お、

細胞使用例ではうまく行かず、現在は大腸菌でのタ

年

グ付き NTE 産生に切り替えた。
現在、ヒトで報告される PNPLA6 遺伝子変異に相当するマウスを CRISPR 法で作製するべく、
CRISPR/Cas9 システムを整えているが、DNA の塩基高配列によって効率がかなり変化する可能性を示唆すしるデータを得ている。

経

とも

F.研究発表（上記課題名に関するもの）

で

1.論文発表等

畑中朋美、荻野瑛里奈、山村勇貴、本杉奈美、竹が内絵理、坂部貢、杉野雅浩、從二和彦、木村穣まり

シックハウス症候群原因物質の経皮吸収に及ぼてす NTE 活性の影響. 臨床環境医学に

88-93 (2015)

ス

2.学会発表マ

畑中朋美、荻野瑛里奈、山村勇貴、本杉奈美、竹ベ

内絵理、坂部貢、杉野雅浩、從二和彦、木村穣:開

シックハウス症候群原因物質の経皮吸収に及ぼ定す NTE 活性の影響. 第 24 回日本臨床環境医学会

性学術集会 2015.6.6-7 東京

な畑中朋美、荻野瑛里奈、本杉奈美、竹内絵理、坂

24 巻

2 号

北里大学薬学部

部貢、杉野雅浩、從二和彦、木村穣: シックハウ

在ス症候群における NTE 活性の役割に関する研究—っ

フタル酸エステルの経皮吸収に及ぼす影響 I. 第体

38 回日本分子生物学会年会 2015.12.1-4 神戸－ 439 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

グリオーマの分子標的治療・放射線治療耐性機構の解明と治療薬の開発
津田 真寿美 1)
田中 伸哉 1,2)、谷野 美智枝 1)、王 磊 2)、長嶋 和郎 3)、柿田

ポ
種
こ
す
法
分
し

研究代表者

研究分担者

明美 4)

1)北海道大学大学院医学研究科腫瘍病理学分野 2)北海道大学大学院医学研究科探索病理学講座
3)札幌東徳洲会病院、北海道大学名誉教授 4)新潟大学脳研究所病理学分野
研究要旨
膠芽腫は極めて予後不良の悪性腫瘍であり、この一因は腫瘍細胞が治療経過中に放射線や化学療法に対して治療抵抗性を獲得するためである。当該研究の目的は、放射線や今後高い治療効果が期待される分子標的治療薬に対する抵抗性獲得機構を解明し、より有効な新規治療法を臨床現場に届けるための基盤を構築することである。具体的には、治療抵抗性細胞株を樹立し、遺伝子プロファイリング、蛋白プロファイリングを行い、治療抵抗性獲得シグナル経路および責任分子を同定、これらの結果の普遍性を病
理組織検体にて検証する。これまでの研究により、分子標的治療薬耐性株は上皮間葉移行から幹細胞様へと形質変化を遂げることを明らかとし、耐性獲得の責任分子として IGFBP2 を同定した。平成 27 年度の研究では、分子標的治療薬耐性に直接関与する分子として MSX1 を新たに同定し、ヒストンのメチル化を含むエピジェネティクスとの関連性について解明した。

A.研究目的膠芽腫は WHO grade IV の極めて予後不良の原
発性脳腫瘍である。近年、化学療法および放射線治療の進歩に伴い一時的な腫瘍退縮が認められるようになってきたが、診療経過中に治療抵抗性を獲得し悪性転化するため、依然として長期予後は不良である。昨年、アルキル化剤による治療後の再発に際して、特定の遺伝子変異が高頻度に生じることが報告されたが（Science 343, 189-193, 2014）、その他の悪性転化の機構は未だ不明な点が多く、再発時の治療法選択が困難となっている。
近年、膠芽腫において受容体型チロシンキナー
ゼ（RTK）の EGFR、c-Met、PDGFR の遺伝子増幅や変異が報告されており、これらを標的とした
分子標的治療の臨床治験が試みられている。阻害剤投与により一時的な治療効果は認められるものの、EGFR 阻害後の c-Met 発現亢進に伴う腫瘍
幹細胞性の獲得、PDGFR 阻害による副側経路の持続的な活性化や RTK 間のクロストーク等が生じて薬剤耐性や腫瘍幹細胞性を獲得することが報告されており、分子標的治療を標準治療とするには未だ多くの課題が残されている。
本研究では、膠芽腫の分子標的治療において異なる種類の RTK 阻害剤に対する共通の治療耐性獲得メカニズムを解明し、耐性解除に有用な新規治療標的分子を同定することを目的とした。
B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
ヒト膠芽腫細胞株 KMG4 において、RTK 阻害剤（EGFR、c-Met、PDGFR 阻害剤）に対する 3 種類の耐性株を樹立した（平成 25 年度の研究で樹立済み）。定量的 RT-PCR 法にて耐性細胞における幹細胞性を規定する遺伝子の発現を検討後、幹細胞
関連 PCR アレイ（QIAGEN）を実施し、その結果を定量的 RT-PCR 法にて検証した。耐性細胞特異的に発現亢進を認めた分子に対し、siRNA を用いて発現を抑制後、高濃度の阻害剤を添加し、Cell
Death Detection ELISA キット（Roche）を用いてア－ 440 －

C.

い
に
発
胞
剤
1（

て
て
癌
ト
成
M
す
遺
シ
害
現
（
化
的
の
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上
（
た

D.

ー
ノ
素
遺
関

芽
Ca

が
る

異
性
規

剤
類
立
幹
胞
果
異
い
ell
ア

ポトーシス誘導能を検討した。発現抑制により 3
種類の耐性細胞の薬剤耐性を共通して解除することができる分子を同定後、耐性獲得機序を解析するために、定量的 RT-PCR 及びイムノブロット
法により、アポトーシス関連分子や薬剤耐性関連
分子、幹細胞性を規定する分子との関連性を検討した。
C.研究結果EGFR、c-Met、PDGFR 阻害剤耐性 KMG4 を用いた定量的 RT-PCR により、全ての薬剤耐性細胞
において幹細胞性遺伝子 Sox2、Oct3/4、Nanog の発現が亢進していることが明らかとなった。幹細胞関連 PCR アレイ解析より、EGFR、PDGFR 阻害剤耐性細胞において転写抑制因子 Msh homeobox
1（MSX1）の発現亢進を認めた。
MSX1 はアポトーシス誘導遺伝子 p53 と相関して発現し、本来は腫瘍抑制遺伝子として報告されている（Park et al., 2005, Cancer Res）
。ヒト子宮頸癌細胞株 HeLa に MSX1 を過剰発現させるとアポトーシス誘導遺伝子 p53 の発現を誘導し、腫瘍形成を抑制する（Shien et al., 2013, Cancer Res）。
MSX1 特異的 siRNA を用いて MSX1 の発現を抑制
すると、全ての薬剤耐性細胞株において幹細胞性遺伝子 Sox2 の発現が低下した。一方、アポトー
シス誘導能は有意に亢進し、チロシンキナーゼ阻
害剤に対する感受性が回復した。また MSX1 の発現抑制により、ヒストン H3K27 トリメチル化（H3K27me3）が抑制された。H3K27 トリメチル
化酵素 Enhancer of zeste homolog（EZH2）を特異的阻害剤 GSK343 により抑制すると、H3K27me3の低下に伴いアポトーシス関連遺伝子 Bcl-2、p53、
薬剤耐性に関与する ALDH1A1 の発現が亢進した。
上記研究成果は、第 74 回日本癌学会学術総会（2015.10.8-10.10、名古屋市）において報告された。
D.考察
H27 年度の研究により、MSX1 は幹細胞マーカ
ー遺伝子の発現上昇に寄与し、また腫瘍のエピゲ
ノム異常に関わる因子の一つである H3K27me3 酵
素の EZH2 を競合的に阻害することで、薬剤耐性遺伝子やアポトーシス抑制遺伝子の発現上昇に関与する可能性を見出した。
ヒストン H3 のメチル化酵素である EZH2 は膠芽腫幹細胞の維持に重要であり（Suva et al., 2009,
Cancer Res）
、既に他の癌腫においても EZH2 に対する阻害剤を用いて基礎実験が実施されている。
EZH2 を阻害し H3K27me3 を抑制すると、大腸癌
では EGFR 阻害剤の効果が向上し細胞死が誘導され（Katona et al., 2014, Cancer Biol Ther）、BRG1や EGFR の遺伝子変異が検出された肺癌においては多剤併用による抗腫瘍作用の向上が報告されている（Fillmore et al., 2015, Nature）。一方で、
H3K27me3 活性の減少が及ぼす抗腫瘍作用機序の解析は不明であった。当該研究により、分子標的治療薬に対する耐性細胞では MSX1 の発現が亢進しており、EZH2 を介して H3K27me3 を制御する
ことにより薬剤耐性に関する遺伝子の発現を変化させていることが明らかとなった。
将来的に MSX1 を分子標的治療の新規ターゲッ
トとして臨床応用を目指すためには、網羅的な分子解析によって詳細な機序解析を行うと共に、生体内でも in vitro と同様の薬剤耐性解除効果が認められるかを検討する必要がある。また、エピジェネティックな変化が薬剤耐性に及ぼす機序を解析することは、膠芽腫のみならず、他の癌腫の新規治療法開発においてもブレイクスルーとなり得る可能性を持ち合わせていると期待される。
E.結論
膠芽腫において、MSX1 はチロシンキナーゼ阻
害剤に対する治療抵抗性獲得に重要な分子であることが明らかとなった。MSX1 および MSX1と協調して作用する EZH2 は、膠芽腫の分子標的治療の展開に大きく貢献するものと期待される。
F.研究発表1. 論文発表
1. Matsumoto R, Tsuda M, Wang L, Maishi N, Abe T,
Kimura T, Tanino M, Nishihara H, Hida K, Ohba Y,
Shinohara N, Nonomura K, Tanaka S. CRK
adaptor protein induces epithelial- mesenchymaltransition and metastasis of bladder cancer cells via
HGF/c-Met feedback loop. Cancer Sci, 106,709-217. 2015.
2. †Furukawa J, †Tsuda M, Okada K, Kimura T,
Piao J, Tanaka S, Shinohara Y. Comprehensive
glycomics of a multistep human brain tumor model
reveals specific glycosylation patterns related tomalignancy. PLoS One, 10, e0128300. 2015. [†,These authors contributed equally to this work]
3. Makino Y, Tsuda M, Ohba Y, Nishihara H, Sawa
H, Nagashima K, Tanaka S. Tyr724
phosphorylation of ELMO1 by Src is involved in－ 441 －

Tsuda M, Tanaka S. Novel signaling collaboration
between TGF-β and adaptor protein Crk facilitates
EMT in human lung cancer. Oncotarget, in press,
2016

cell spreading and migration via Rac1 activation.
Cell Commun Signal, 13:35, 2015.
4. Moriya J, Tanino AM, Takenami T, Endoh T,
Urushido M, Kato Y, Wang L, Kimura T, Tsuda
M, Nishihara H, Tanaka S, R-IHC study Group.
Rapid immunocytochemistry based on alternating
current electric field using squash smear
preparation of central nervous system tumors.
Brain Tumor Pathol, 33, 13-18, 2016
5. Kimura T, Wang L, Tabu K, Tsuda M, Tanino M,
Maekawa A, Nishihara H, Hiraga H, Taga T, Oda Y,
Tanaka S. Identification and analysis of
CXCR4-positive synovial sarcoma initiating cells.
Oncogene, in press, 2016
6. Goto K, Kimura T, Kitamura N, Semba S, Ohmiya
Y, Aburatani S, Matsukura S, Tsuda M,
Kurokawa T, Gong JP, Tanaka S, Yasuda K.
Synthetic PAMPS gel activates BMP/Smadsignaling pathway in ATDC5 cells, which plays asignificant role in the gel-induced chondrogenic
differentiation. J Biomed Mater Res A. in press,
2016
7. Inuzuka T, Fujioka Y, Tsuda M, Fujioka M, Satoh
AO, Horiuchi K, Nishide S, Nanbo A, Tanaka S,
Ohba Y. Attenuation of ligand-induced activationof angiotensin II type 1 receptor signaling by thetype 2 receptor via protein kinase C. Sci Rep,
6:21613, 2016
8. Yuzawa S, Nishihara H, Wang L, Tsuda M,
Kimura T, Tanino M, TanakaS. Analysis of
NAB2-STAT6 gene fusion in 17 cases ofmeningeal solitary fibrous tumor/
hemangiopericytoma: review of the literature. Am
J Surg Pathol, in press, 2016
9. Hiroshima Y, Nanjo H, Sasajima T, Shimizu H,
Minamiya Y, Yoshioka T, Oda M, Kudo-Asabe Y,
Tsuda M, Tanino M, Tanaka S, Akagami Y, Goto
A. Rapid immunohistochemistry of IDH-1 for the
intraoperative diagnosis of gliomas. Akita J Med
42, 147-156, 2016
10. Yamada T, Tsuda M, Wagatsuma T, Fujioka Y,
Fujioka M, Satoh AO, Horiuchi K, Nishide S,
Nanbo A, Totsuka Y, Haga H, Tanaka S, Shindoh
M, Ohba Y. Receptor activator of NF-κB ligand
induces cell adhesion and integrin α2 expression
via NF-κB in head and neck cancers. Sci Rep, 6:23545, 2016
11. Elmansuri A, Tanino M, Mahabir R, Wang L,
Kimura T, Nishihara H, Kinoshita I, Akita H,

5)

12. Yuzawa S, Nishihara H, Yamaguchi S, Mohri H,
Wang L, Kimura T, Tsuda M, Tanino M,
Kobayashi H, Terasaka S, Houkin K, Sato N,
Tanaka S. Clinical impact of targeted ampliconsequence for meningioma as a practical clinicalsequence system. Mod Pathol, 2016, in press

6)

13. 伊東民雄、佐藤憲市、及川光照、杉尾啓徳、浅野
目卓、尾崎義丸、中村博彦、田中伸哉、津田真寿
美、長嶋和郎 Pilomyxoid-spectrum astrocytoma2例の臨床病理学的検討—BRAF 遺伝子異常の検討も加えて— 脳神経外科、43 巻 9 号、825-833、
2015

7)

（総説など）

1. Tanaka S, Kanno H, Ito T, Pineal Region Tumors.
Advances in surgical pathology. Brain Cancer,
2015
2. 学会発表
1) 湯澤明夏、西原広史、加藤容崇、王磊、木村太一、津田真寿美、谷野美智枝、田中伸哉：血管周皮腫・孤在性線維性腫瘍の FFPE 検体を用いた NAB2-STAT6 融合遺伝子の検出 第104 回日本病理学会総会 2015.4.30-5.2 名古屋国際会議場（名古屋市）
2) 津田真寿美、王磊、谷野美智枝、木村太一、
西原広史、田中伸哉：膠芽腫における分子標的阻害薬耐性獲得責任分子としての IGFBP2の同定 第 33 回日本脳腫瘍病理学会
2015.5.29-30 JR ホテルクレメント高松（高松市）
3) 鈴鹿淳、津田真寿美、王磊、谷野美智枝、木
村太一、西原広史、田中伸哉：悪性脳腫瘍におけるチロシンキナーゼ阻害剤への耐性獲得に関与する MSX1 の解析 平成 27 年度 新学
術領域研究「がん研究分野の特性等を踏まえた支援活動」がん若手研究者ワークショップ
2015.9.2-5 蓼科グランドホテル滝の湯（長野県茅野市）
4) Shinohara Y, Furukawa J, Tsuda M, Okada K,
Kimura T, Piao J, Tanaka S: A comprehensive
glycomic approach to overview the causal
relationships between various phases of multistep
tumorigenesis and glycosylation status by using ahuman brain tumor/glioma progression model.

－ 442 －

8)

9)

10

11

on
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3、

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村
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体
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古

、
標
2

松

木
に
得
学
え
プ
野

p
a

sequencing using MiSeq. 20th Annual Society for
Neuro-Oncology Annual Scientific Meeting,
November 19-22, 2015, Marriott Rivercenter, San
Antonio, Texas, USA

23rd International Symposium on
Glycoconjugates, September 15-20, 2015, Split,
Croatia
5) 津田真寿美、高阪真路、王磊、木村太一、谷野美智枝、西原広史、Marc Ladanyi、田中伸哉：
NGS-based MSK-IMPACT analysis reveals
specific genetic alterations in recurrent
glioblastoma. 第 74 回日本癌学会総会
2015.10.8-10 名古屋国際会議場（名古屋市）
6) Shinohara Y, Furukawa J, Tsuda M, Okada K,
Kimura T, Piao J, Tanaka S：Comprehensive
glycomics of multistep human brain model
reveals specific glycosylation patterns related tomalignancy. 第 74 回日本癌学会総会
2015.10.8-10 名古屋国際会議場（名古屋市）
7) 鈴鹿淳、津田真寿美、王磊、谷野美智枝、木
村太一、西原広史、田中伸哉：膠芽腫におけるチロシンキナーゼ阻害薬に対する耐性獲得への MSX1 の役割 第 74 回日本癌学会学術総会 2015.10.8-10.10 名古屋国際会議場（名古屋市）
8) Tsuda M, Kohsaka S, Wang L, Kimura T, Tanino
M, Nishihara H, Ladanyi M, Tanaka S:
NGS-based MSK-IMPACT analysis reveals
specific genetic alterations in recurrent
glioblastoma. 20th Annual Society for
Neuro-Oncology Annual Scientific Meeting,
November 19-22, 2015, Marriott Rivercenter, San
Antonio, Texas, USA
9) Tanaka S, Tsuda M, Wang L, Tanino M, Kimura
T, Nishihara H: Molecular machinery foraquisition of TKI resistance in glioblastoma by
IGFBP2 through profile transition from GMT tostemness feature. 20th Annual Society for
Neuro-Oncology Annual Scientific Meeting,
November 19-22, 2015, Marriott Rivercenter, San
Antonio, Texas, USA
10) Yuzawa S, Nishihara H, Wang L, Kimura T,
Tsuda M, Tanino M, Yamaguchi S, Kobayashi H,
Terasaka S, Tanaka S: Analysis of NAB2-STAT6
gene fusion in 17 cases of meningeal solitary
fibrous tumor/hemangioepricytoma. 20th AnnualSocietyfor Neuro-Oncology Annual Scientific
Meeting, November 19-22, 2015, MarriottRivercenter, San Antonio, Texas, USA（シンポジウム、特別講演など）
1) 田中伸哉：教育講演「脳腫瘍の分子診断と治療を目指した基礎研究」第 26 回日本臨床口腔病理学会 2015.7.30 北大学術交流会館（札幌市）
2) 田中伸哉：Neuro-Oncology Challenges in a
Diverse Asia「Pathological Features of Tumors of
the Pineal Region」2015.9.17 St.Luke’s Medical
Center（Manila, Philippines）
3) 田中伸哉：第 74 回日本癌学会学術総会「Molecular machinery for agaisition of TKI
resistance in glioblastoma」2015.10.8 名古屋国際会議場（名古屋市）
4) 田中伸哉：第 8 回香川県脳腫瘍学術研究会「悪性グリオーマの分子病理学的研究：治療耐性メカニズムに挑む」2015.10.30 高松国際ホテル（高松市）
G.知的財産権の出願・登録状況
1.特許取得1) 篠原康郎、田中伸哉、古川潤一、津田真寿美：グリオーマの診断マーカー、診断方法、糖鎖マーカーを検出する方法及び糖鎖マーカー、PCT/ JP2015 /072583（国際特許出願日：平成 27 年
8 月 7 日）2) 田中伸哉、津田真寿美、谷野美智枝：ホルマリ
ン固定生体組織内での活性型低分子量 GTP 結合蛋白質検出方法、PCT / JP2016 /056890（国際
特許出願日：平成 28 年 3 月 15 日）
2.実用新案登録
なし
3.その他
なし

11) Yuzawa S, Nishihara H, Mouri H, Wang L,
Kimura T, Tsuda M, Tanino M, Yamaguchi S,
Kobayashi H, Terasaka S, Sato N, Tanaka S:
Genotyping of meningioma by targeted amplicon－ 443 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

タンパク質分解システムを標的とするシヌクレイノパチーの分子病態解明と治療法の確立

C.
1)

研究分担者
1)

丹治

研究代表者 森 文秋
邦和 1)、三木 康生 1)、柿田 明美 2)、高橋

弘前大学大学院医学研究科

脳神経病理学講座 2)新潟大学脳研究所3)
新潟大学脳研究所 病理学分野

１均 3)、若林孝一 1)

脳疾患リソース解析部門

研究要旨
シヌクレイノパチー（パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症）を含む神経変性疾患
では、疾患特異的な分子の蓄積が認められる。特に異常な翻訳後修飾を受けたαシヌクレインは蓄積しやすく、病態と深く関連している。今回、多系統萎縮症の延髄および脊髄腹側の軟膜下にリン酸化α
シヌクレインの蓄積を認め、さらなる解析の結果、これらはアストロサイトの突起に局在することを見出した。一方、シヌクレイノパチーの治療法開発を目的に「脳内オートファジーの活性化」を進めた。これまでトレハロースにより脳内のどこでオートファジーが活性化しているのかは不明であった。そこで今回オートファジー可視化マウスを利用して解析を進めた結果、海馬および大脳皮質の錐体細胞において、特に強いオートファジー活性化シグナルを検出した。今後もヒト剖検例およびモデル動物の双方の利点を生かした研究を進めることにより、シヌクレイノパチーの病態を改善する新たな治療法に結び付く可能性がある。

A.研究目的ートファジーを活性化した際の病態への影

レビー小体病（パーキンソン病、レビー小体型

響。

認知症）と多系統萎縮症（MSA）は、神経細胞およびグリア細胞内におけるαシヌクレインの異B.研究方法常凝集（封入体形成）を特徴とする神経難病であ

１. ヒト剖検脳を用いたタンパク質分解システ

り、その進行を遅延・阻止する治療法は確立して

ム関連分子群の病理学的解析

いない。我々はこれまでにヒト凍結脳組織を用い

MSA および正常対照のホルマリン固定パラフ

た検討などから、シヌクレイノパチーの病態には

ィン包埋組織の miRNA 解析によって得られたタンパク質分解システムの障害が深く関与して病態関連タンパク質のうち細胞内のタンパクいることを報告してきた。実際に、MSA および正質分解系、特にオートファジー関連分子に対す

常対照のホルマリン固定パラフィン包埋組織をる抗体を用い、神経変性疾患の剖検脳組織を免用いて網羅的にマイクロ RNA（miRNA）の変動を検

疫組織化学的に解析した。

討したところ、複数のタンパク質分解システム関２.マウスを用いた『オートファジー活性化』の連分子群が変動している可能性を得た。以上より生化学的および病理学的解析

本年度は以下二点を目的として研究を遂行した。

オートファジーはカロリー制限、飢餓状態、さ１．miRNA 解析によって同定された分子群と病態

らには種々の薬物により活性化される。既に二糖のトレハロースによる脳内オートファジーとの関連性。
２．シヌクレイノパチーの治療を視野に入れ、オ－ 444 －

活性化を確認しており、より効果的な投与法や

２

影

テ

フ

た

ク

す

免

の

さ

投与物質を検討した。活性化のスクリーニングにはオートファゴソーム膜可視化マウス（GFP-LC3 マウス）を用い、病態への効果はαシヌクレイン過剰発現 TG マウス（SNCA-TG）および対照マウスを用いて、病理学的、生化学的および行動学的に解析した。
C.研究結果図１

１. タンパク質分解システム関連分子群の病理

パラフィン（A,B）及び凍結切片（C）に学的解析おけるオートファジーシグナル（GFP-LC3）のオートファゴソーム膜形成の調節分子として比較

働く AMBRAI は、異常シヌクレインと病理学的と LC3 抗体（B）による免疫染色の結果から、に密接に関連していることを見出した。さらに、

LC3 抗体の方がより感度良く検出できた。一方、

AMBRAI はリン酸化αシヌクレインと病理学的、凍結切片では GFP シグナル（C）を直接可視化

生化学的に一致した挙動を示した。また、我々できるため最も感度良く検出できることを確

パラフィン切片における GFP 抗体（A）

認した。Bars = 10 μm.

は今回、MSA の軟膜下アストロサイトにリン酸化αシヌクレインの蓄積を認めた。これらはp62、ユビキチンまたは Gallyas-Braak 染色にD.考察

陰性であり、線維性凝集を形成していないとい

細胞内のタンパク質分解システム（オートファ

う点で、MSA における既知の封入体（グリア細ジー・リソソーム系、ユビキチン・プロテアソー

胞および神経細胞）とは組織学的に異なっていム系）はシヌクレイノパチーの病態と密接に関連ることを見出した。

していることをこれまでに報告してきた。
そこで細胞内の分解システムの活性化を生か

２. マウスを用いた『オートファジー活性化』の生化学的、病理学的解析

して病態を改善できる可能性を探ってきた。特にマウスに天然二糖のトレハロースを経口投与

天然二糖のトレハロースは脳内オートファジー

すると、効率よく脳内のオートファジーを誘導を活性化し、アルツハイマー病やポリグルタミン

する（前年度に報告）。しかし、脳内のどこで病のモデルマウスに対して効果がある証拠を複オートファジーが誘導されているのかは不明

数のグループが示している。これらの報告と一致であった。そこでオートファジー可視化マウス

して、我々もトレハロースがレビー小体病モデルを用いて検討を行った。パラフィン切片およびマウスの脳内オートファジーを活性化すること

凍結切片でオートファジーのシグナル（GFP おを報告した。しかし、トレハロースが脳内のどこよび LC3 染色）を比較したところ、凍結切片にで活性化しているのかについての報告はこれま

おけるシグナルの方がより明瞭であった（図でになかった。今回、オートファジー可視化マウ１）。特に、海馬および大脳皮質の錐体細胞にスを利用することで海馬および大脳皮質の神経

おいて、オートファジーのシグナルが顕著であ細胞において、LC3 は特に高発現していることをった。トレハロース給水投与の効果を検討した見出した。また、トレハロース給水投与により、

ところ、前述した領域において、特に神経細胞

これらのシグナルが増強することに加え、樹状突の樹状突起におけるシグナルの増強が確認で起部のシグナル増強が観察された。トレハロース

きた。

によるオートファジー活性化をより増強する手法を探索することで、シヌクレインの異常蓄積を抑制するばかりでなく、記憶の改善も期待できる。

二

ー

E.結論

や

昨年度に引きつづきシヌクレイノパチーを含－ 445 －

む神経変性疾患の病態解明および治療法の開発

Alteration of upstream autophagy-relatedを視野に入れ研究を遂行した。天然二糖のトレハ

proteins (ULK1, ULK2, Beclin1, VPS34 andロースは、これらのオートファジー形成分子を修AMBRA1) in lewy body disease. Brain Pathol

飾することにより、脳内のオートファジー、特に海馬や大脳皮質の神経細胞に影響を与えている知見を得ることができた。トレハロースはすでに(in press).
6)

Mori F, Miki Y, Tanji K, Kakita A, Takahashi
H, Utsumi J, Sasaki H, Wakabayashi K.

食品添加物として認可されており、安定して供給されている。今後、トレハロースと相乗効果を示

Sortilin-related receptor CNS expressed 2

す活性化剤を探索することができれば、治療法と(SorCS2) is localized to Bunina bodies in

して有用であり、他の神経変性疾患への応用も可

amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett

能である。

608: 6-11, 2015.
7)F.研究発表Tanji K, Miki Y, Maruyama A, Mimura J,
Matsumiya T, Mori F, Imaizumi T, Itoh K,
Wakabayashi K. Trehalose intake induces
chaperone molecules along with autophagy ina mouse model of Lewy body disease.
Biochem Biophys Res Commun 465: 746-752,
2015.

1.論文発表1) Nakamura K, Mori F, Tanji K, Miki Y,
Toyoshima Y, Kakita A, Takahashi H, Yamada
M, Wakabayashi K. Alpha-synuclein pathology
in the cranial and spinal nerves in Lewy bodydisease. Neuropathology (in press).
2)

Nakamura K, Mori F, Kon T, Tanji K, Miki Y,
Tomiyama M, Kurotaki H, Toyoshima Y,
Kakita A, Takahashi H, Yamada M,

響

第 57 回 日本神経病理学会（2016 年 6 月 1－3 日、

を

弘前）

リ

木秀直、柿田明美、高橋 均、若林孝一．多系統萎縮症におけるオートファジー上流分子のperiventricular astrocytes in multiple system異常2) 丹治邦和、三木康生、丸山敦史、森 文秋、三press).
Tanji K, Miki Y, Maruyama A, Mori F, Mimura
J, Itoh K, Kamitani T, Wakabayashi K. The

A.

部

村純正、伊東 健、神谷 哲、若林孝一．レビーの小体病における synphilin-1 結合タンパク質nu（NUB1）の役割の3) 森 文秋、三木康生、丹治邦和、豊島靖子、吉role of NUB1 in alpha-synuclein degradation

な田眞理、佐々木秀直、柿田明美、高橋 均、若胞

林孝一．ポリグルタミン病および核内封入体病

らBiophys Res Commun 470: 635-642, 2016.

におけるパラスペックル関連蛋白の免疫組織

ン

Mori F, Tanji K, Miki Y, Toyoshima Y, Yoshida

化学的検討

(c

in Lewy body disease model mice. BiochemルM, Kakita A, Takahashi H, Utsumi J, Sasaki H,
Wakabayashi K. G protein-coupled receptor 26
immunoreactivity in intranuclear inclusions
associated with polyglutamine and intranuclear
inclusion body diseases. Neuropathology 36:
50-55, 2016.
5)を

2.学会発表phosphorylated alpha-synuclein in subpial andatrophy of long duration. Neuropathology (in4)nu1) 三木康生、丹治邦和、森 文秋、内海 潤、佐々Wakabayashi K. Accumulation of3)

機Miki Y, Tanji K, Mori F, Utsumi J, Sasaki H,

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

が

1.特許取得子なし

概2.実用新案登録

特

なし

に

3.その他

る

なし

Kakita A, Takahashi H, Wakabayashi K.

－ 446 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所

ol

n

2,

、

｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

生体リズムの遺伝子改変マウスによる解析
研究代表者

岡村

研究分担者

崎村

均 1）
建司 2）

1）京都大学大学院薬学研究科・医薬創成情報科学・システムバイオロジー
2）新潟大学脳研究所・基礎神経科学部門・細胞神経生物学
研究要旨
24 時間周期の生体リズムは生命にとって最も根源的な「時間」の仕組みであり、細胞の代謝や基本機能と密接にリンクしている。哺乳類生体リズムの中枢は、脳の視交叉上核（Suprachiasmatic
nucleus: SCN）である。SCN は強力なリズム信号を発し、他の脳部位や全身の細胞で発生するリズム
を調律・統合している。我々は SCN に発現する遺伝子を組織化学で同定し、それがリズムに及ぼす影響をノックアウトマウスの表現型を解析することで検定する網羅的プロジェクト(SCN-Gene Project)を推進しているが、本研究では、我々が近年見出した、SCN でリズミックに発現振動するアセチルコ
リン受容体の生体リズムへの影響を、SCN 特異的ノックアウトマウスを作製することで特定する。

々

系
A.研究目的B.研究方法
具体的な SCN-Gene Project の実施過程は以下

網膜で受容された光シグナルは、網膜-視床下

三部路を介し、体内で独自のリズムを刻む概日時計の通りである。

ーの 中 枢 で あ る 視 交 叉 上 核 （ Suprachiasmatic

１）一次スクリーニング：直径 0.5 mm の球形のnucleus: SCN）に到達し、体内時計の位相を外界

視交叉上核を顕微鏡下でパンチアウトし、の明暗周期に同調させている。この伝達の主力に

Affimetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0 array吉なっているのは、メラノプシン含有網膜神経節細により、SCN での発現量を測定したところ、これ

若胞―グルタミン酸受容体系であることは、よく知までに、12,379 個の遺伝子が SCN で発現している病

られている。一方、1970 年代より、アセチルコリ

ことを同定した。このうち、ターゲット分子、制ン受容体作動薬である カルバコ－ル

御因子といった分子機能が未知の受容体を２次(carbachol)を用いた薬理学的研究が行われ、カスクリーニングへと進めた。

ルバコールの脳室内投与では行動リズムの位相

２）二次スクリーニング：SCN は、0.5 mm 程度のが変動するとの報告がなされた。しかし、その分小核であり、上記のパンチアウト法では SCN 以外

子メカニズムは未だ不明である。そこで、我々はの部分も試料に含有されるため、false positive

概日リズムを制御するアセチルコリン受容体をが含まれる。そこで、in situ hybridization あ

特定し、カルバコールの生体リズムへの生理作用

るいは免疫組織化学の手法を用い、SCN での発現におけるアセチルコリン受容体の役割を解明す

を定量形態学的に確認した。これにより、昼（CT4）る。

と夜（CT16）で遺伝子発現の差も検出できる。この二次スクリーニングにより、ターゲット遺伝子－ 447 －

を約 2000 個へと絞った。

後 2 週―4 週で全匹死亡した。そこで、SCN で Cre

３）三次・四次スクリーニングとして、ターゲッ

を 発 現 す る マ ウ ス と か け あ わ せ 、 SCN 特 異 的ト遺伝子のノックアウトマウスを作成する。特に、AChS01-KO マ ウ ス を 作 成 し た 。 SCN 特 異 的SCN 特異的 Cre マウスを用いて、SCN 特異的ノッ

AChS01-KO マウスは、外見上の成長障害は確認さクアウトマウスを作成する。続いて、専用の明暗れず、成体となり、繁殖能力も正常であった。

2)

コントロールボックスにて、個体ごとのマウスの
24 時間行動リズムを一ヶ月以上にわたって測定

D.考察

し、リズム異常をきたすマウスを同定する。既に、

生体リズムの中枢である SCN において、大量に、この手法にて、バソプレッシン V1 受容体、RGS16

かつリズミックに発現変動するアセチルコリンのリズムへの機能を明らかにしている。

受容体 AChS01 の SCN 特異的コンディショナルノ

本研究で行う動物実験は全て、京都大学動物実ックアウトマウスを作成できた。今後、この変異

験委員会の承認を得ている（2015-21）。また、本マウスを用いて、AChS01 のリズム機能を特定する。

研究で行う組換え DNA 実験についても、京都大学

まず、明暗環境下、恒暗条件下、時差環境下での組換え DNA 実験委員会の承認を得ている（140157）。

概日行動リズムや短時間光パルス照射に対するまた、研究機関等における動物実験等の実施に関反応などの時間行動学的検索を行う。また、カルする基本指針（平成 18 年文部科学省告示第 71 号）

バコールによる概日行動リズム位相変動の応答を遵守して遂行する。

性を測定する。また、SCN で AChS01 のリズムを生C.研究結果4)

み出す転写調節領域をプロモーターアッセイにG.

より同定する。

1.

本研究課題にて、SCN 特異的マイクロアレイを用いて、SCN に発現する 24 時間の発現変動がある

3）

な
E.結論

2.

アセチルコリン受容体の候補分子、AChS01 を得た。

我々は、SCN-Gene Project により同定した遺伝な

続いて、定量的 RI in situ hybridization 法に子の解析を行い、SCN でリズミックに発現振動す

3.

より、SCN においてこの分子が明期にピークを迎るアセチルコリン受容体 AChS01 を、新たに同定なえる明瞭な 24 時間リズムを示すことを見出した。

した。続いて、AChS01 の概日リズムにおける生理

そこで、AChS01 が生体リズム形成に関与をするか機能を同定するために、AChS01 の全身ノックアウ

どうかを検定するため、SCN 特異的な AChS01 コン

トマウスを作成したが、顕著な成長障害のために、

ディショナルノックアウトマウスの作成を開始

成体を得ることができなかった。そこで、我々は、した。AChS01 の機能の重要と考えられる Exon を

SCN 特異的 Cre マウスを利用して、SCN 特異的

loxP 配列で挟んだ targeting vector を作成し、AChS01 ノックアウトマウスを作成した。このコン

ES 細胞へとエレクトロポレーションにより導入

ディショナルノックアウトマウスは、成長障害がした。計画通り、AChS01 の遺伝子座にて相同組み観察されず、成体となり繁殖も可能であった。よ

換えを起こした ES 細胞をサザンブロッティングって、この変異マウスを用いることにより、SCN

により選別し、この変異 ES 細胞を胚盤胞へ注入における AChS01 の生理的意義が解明されるものした。これにより得た、高寄与率のキメラマウスと期待できる。さらに、カルバコールを用いて概と野生型マウスを交配させ、ヘテロ変異体 F1 マ

日行動リズムを検証することで、SCN のリズム発ウスを得た。F1 マウスのゲノムが、計画通り遺伝振の分子機構の解明や概日リズム障害に対する

子変異されたかを、サザンブロッティングにより創薬が多いに期待される。

確認した。続いて、全身で flippase を発現するマウスと交配させることで AChS01-flox マウスを得た。さらに、AChS01-flox マウスを、全身で Creを発現するマウスとかけあわせ、全身 AChS01-KO

F.研究発表1.論文発表なし

マウスを作成した。しかし、AChS01 の全身ホモノックアウトマウスは成長障害がみられ、およそ生

2.学会発表1) 岡村 均：サーカディアンリズムの分子機構と－ 448 －

re

そ の 異 常 と し て の 生 活 習 慣 病 、 Circadian

的Rhythm Forum、東京（明治記念館）、2015 年 5

的

月 20 日。

さに、

2) 岡村 均：生体リズム異常と高血圧、サーカディアンメディシンの基礎臨床連携研究拠点、文部科学省私立大学戦略的研究基盤形成支援事
業シンポジウム、下野（自治医科大学）、2015
年 6 月 8 日。

ン3）山田咲子、山口賀章、土居雅夫、Fustin JM、ノ阿部学、崎村健司、岡村均：生体リズム研究の

異為の視交叉上核発現物質のノックアウトマウ

る。

スの作成、東京（学術総合センター）2015 年の12 月 18 日

る4) 岡村 均：時差とバソプレッシン、バソプレッ

ル

シン研究会、東京（慶応義塾大学病院）、2016

答

年 1 月 9 日。

生にG.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし
2.実用新案登録

伝

なし

す

3.その他

定

なし

理

ウ

に、

は、

的

ン

が

よ

CN

の

概

発

る

と
－ 449 －

ン
平成 27 年度新潟大学脳研究所

刺｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

ー

共同利用・共同研究報告書

よD1

大脳基底核内情報伝達におけるドーパミン神経伝達の機能の解析(Dた研究代表者 南部 篤

1)

研究分担者 知見 聡美 1)、笹岡 俊邦 2)の研
1) 自然科学研究機構 生理学研究所 生体システム研究部門
2）新潟大学 脳研究所 生命科学リソース研究センター 動物資源開発研究分野

お

た

の
研究要旨

組

パーキンソン病では、中脳のドーパミン作動性ニューロンが変性、脱落し、重篤な運動障害、非運関動症状が生じるが、その病態生理については不明な部分が多い。ドーパミン受容体は D1 様受容体ファ所ミリーと D2 様受容体ファミリーとに大きく分類されるが、ドーパミン受容体を無くしたノックアウト

関

マウスの大脳基底核内情報伝達と運動症状を解析することは、パーキンソン病の病態解明につながる認と考えられる。本研究においては、昨年度に引き続き、ドキシサイクリンの投与によりドーパミン D1

意受容体の発現を制御することができるコンディショナルノックダウン（KD）マウスを用い、覚醒下神動

経活動の記録と行動解析を行った。その結果、D1 受容体を介したドーパミン神経伝達が、大脳基底核

場の直接路を介した情報伝達と正常な運動の発現に必須であることが示された。これらのことから、D1受容体を介した神経伝達の消失がパーキンソン病における無動の少なくとも一部を説明できると考え

C.

られる。

自

ウ
A.研究目的
パーキンソン病では、中脳のドーパミン作動性

発 現 を ド キ シ サ イ ク リ ン (Dox) 投 与 に よ っ てべon/off することが可能である（Tet-Off）。

抑ニューロンが変性、脱落し、無動、筋強剛、振戦

マウスに十分なハンドリングを行い馴化させた後、示などの重篤な運動障害を生じる疾患である。有病

ケタミン (100 mg/kg, 腹腔内投与)・キシラジン (2-5ダ

率は１０万人あたり１００〜１５０人程度と高mg/kg)麻酔下において、頭部固定器具をマウスの頭

生

いが、その病態生理については、まだ不明な部分

蓋骨に装着する手術を行った。また、大脳皮質運が多い。本研究では、遺伝子改変マウスを用いる

動野に刺激電極を埋め込み留置した。手術から回態ことにより、D1 受容体（D1R）を介したドーパミ

復後、神経活動の記録を開始した。

動

ン神経伝達が、大脳基底核内情報伝達と運動制御

マウス頭部を固定器具により無痛的にステレはにおいて果たす機能を解析することにより、パーオ装置に固定し、大脳基底核ニューロンの活動をもキンソン病の病態解明とより効果的な治療法の覚醒下で記録した。ドーパミン作動性ニューロン型開発を目指す。

の主な投射先は、大脳基底核の入力部である線条に体であり、線条体の直接路ニューロンは D1R を発起現し淡蒼球内節 (GPi)に投射しているのに対し、

こ

昨年度に引き続き、笹岡らが作製した D1R コンデ

間接路ニューロンは D2R を発現し淡蒼球外節ュィショナルノックダウン（KD）マウスを用いた。

(GPe) に投射している。金属記録電極を、GPi おー

本マウスは、D2R の発現は正常であるが、D1R のよび GPe に刺入することにより、これらニューロ方

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

GP－ 450 －

てンの自発発火の頻度とパターン、大脳皮質の電気意な変化は示さなかった。

刺激に対する応答パターンを記録した。また、ケDox 投与を止めると、自発運動量も正常化した。

ージ内における自発運動量、ロタロッドテストに

また、大脳皮質刺激によって GPi に誘発される反よる運動機能の測定も行った。これらの計測を、

応も３相性になり、正常化した。

D1R が発現している状態と、ドキシサイクリン(Dox) を投与することによって D1R の発現を抑え

D.考察
GPi および GPe で記録される大脳皮質由来の３た状態で行った。
本研究計画は所属研究機関の動物実験委員会

相性の応答のうち、早い興奮は大脳皮質－視床下の審査、承認を受けており、関連する法令、所属

核－GPi/GPe 路を、抑制は大脳皮質－線条体－

研究機関の指針などを遵守して行った。動物実験

GPi/GPe 路を、遅い興奮は大脳皮質－線条体－GPe

および飼養保管は、動物実験委員会の承認を受け－視床下核－GPi/GPe 路を介して伝達されることた実験室で行った。また、本研究計画は P1A レベルが明らかにされている。D1R が発現していない状の遺伝子組換え実験を含むため、所属研究機関の態では、GPi における抑制がほとんど消失したこ

組換え DNA 実験安全委員会の審査、承認を受け、とと、マウスの運動量が低下したことから、D1R

関連する法令、ならびに、これに基づいて作成されたを介したドーパミン神経伝達が、直接路（大脳皮所属研究機関の規定を遵守して行った。実験場所に

質－線条体－GPi 路）を介した情報伝達と正常な関しては、組換え DNA 実験安全委員会の審査、承運動の発現に必須であることが示された（図参認を受けた実験室で行った。実験動物飼育中は注照）。これらのことから、D1R を介したドーパミン

意深く様子を観察し、健康状態を維持するように努め、神経伝達の消失が、パーキンソン病における無動動物が苦痛を感じる状態が長期に亘り回復が困難なや寡動の症状発現の少なくとも一部は説明して場合には、安楽死の処置をとるようにした。

いると考えられる。一方、自発発射頻度、パターンとも変化しなかったことから、これらの変化はC.研究結果

症状発現への寄与は少ないと思われる。

まず、D1R が発現している状態において調べた。
自発運動量、ロタロッドの滞在時間とも野生型マ
ウスと変わらなかった。GPi、GPe の神経活動を調べたところ、大脳皮質刺激に対して、早い興奮－
抑制－遅い興奮という３相性の応答パターンを、示した。また、GPi、GPe ともに、約 50 Hz でラン-5ダムな自発発火を示した。これら神経活動は、野頭

生型マウスと同様であった。

運

次に、Dox を投与し D1R の発現が抑制された状回態で調べた。Dox 投与により、ケージ内の自発運動量が減少した。また、ロタロッド上の滞在時間

レは野生側マウスより短く、訓練によって増加するをも、野生型マウスの成績には至らなかった。野生ン型マウスに Dox を投与しても、また D1RKD マウス

条に Dox 非投与の場合でも、このような行動変化は

発起こらなかった。GPi、GPe の神経活動を調べたとし、ころ、大脳皮質刺激に対して、GPi では多くのニD1R を介したドーパミン神経伝達が、直接路を節ューロンが興奮－興奮という２相性の応答パタ

介した情報伝達と正常な運動の発現に必須であおーンを示すようになり、抑制が消失していた。一る。また、D1R を介したドーパミン神経伝達が、

ロ

方、GPe では有意な変化は見られなかった。GPi、パーキンソン病における無動や寡動の症状発現

GPe ともに、自発発火頻度とパターンにおいて有に寄与すると考えられる。

E.結論－ 451 －

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表Chiken S, Sato A, Ohta C, Kurokawa M, Arai S,
Maeshima J, Sunayama-Morita T, Sasaoka T, Nambu A(2015) Dopamine D1 receptor-mediated transmission
maintains

information

cortico-striato-entopeduncularflowthroughdirectthepathwaytorelease movements. Cereb Cortex 25: 4885-4897.
DOI: 10.1093/cercor/bhv209
2.学会発表知見聡美、南部篤（2015.6.27）パーキンソン病モ
デルサルにおける大脳皮質－大脳基底核路の情報伝達異常. 第９回 Motor Control 研究会（京都）Sasaoka T, Sato A, Chiken S, Maeshima J, Arai S,
Sunayama-Morita T, Oda K, Maeda Y, Sakai S, Jinbo Y,
Umakawa E, Sato T, Okubo T, Fujisawa N, Yokoyama
M, Nambu A (2015.7.30) D1 dopamine receptor-

Le

mediated signal is required to maintain normal motor

究activity. 第３８回日本神経科学大会（神戸）用Chiken S, Sato A, Sasaoka T, Nambu A (2015.10.31)

マ

Dopamine D1 receptor activation maintains information
flow through the cortico-basal ganglia direct pathway torelease movements. International Symposium on
Prediction and Decision Making (東京)A.

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

で

1.特許取得状なし

ツ2.実用新案登録

へ

なし

研

3.その他

が

なし

こ

認

本

B.

1.

子

使

究

認

－ 452 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

HtrA1 欠損マウスにおける脳小血管の機能解析

研究分担者

研究代表者 猪原 匡史 1）
齊藤 聡 2） 山本 由美 2） 上村 麻衣子 3）小野寺 理 4）1）国立循環器病研究センター 脳神経内科
2）国立循環器病研究センター 再生医療部
3）京都大学大学院医学研究科 臨床神経学
4）新潟大学脳研究所 神経内科分野
研究要旨

CARASIL (Cerebral Autosomal Recessive Arteriopathy with Subcortical Infarcts andLeukoencephalopathy) の原因として HtrA1 遺伝子変異が同定されている. 今回我々は, 新潟大学脳研究所で作りだされた HtrA1 遺伝子欠損（HtrA1 KO）マウスについて, CARASIL モデルマウスとしての有用性を検証した. その結果, 組織学的解析や行動解析では有意な異常は認められなかったが, HtrA1 KO
マウスは野生型マウスに比して, 脳血流量の減少と, 脳循環予備能の異常が示された.

HtrA1 KO マウスは CARASIL や認知症の病態解析に有用なモデルであると考えられた.

2. 脳血流量の測定

A.研究目的16 ヶ月齢の HtrA1 KO マウスおよび野生型マウ

脳血管障害はわが国における三大死因の一つであると同時に，認知症による要介護・寝たきりスを解析した. 脳血流はレーザースペックル血状態の最大の原因である．近年，血管病変のアル流計 (Omegazone-2; Omegawave 社, 日本) にて測

ツハイマー病への関与も示唆され，血管性認知症

定した. 麻酔は 2%イソフルレンで導入し, 1.5%

への関心も高まっている．しかし，血管性認知症

イソフルレンで維持した. bregma から 2mm 外側,

研究の障壁となるのが，その多くが孤発性である

1mm 後方を中心とした直径 1mm の円を関心領域とが故の危険因子あるいは病型の多様性である．そして設定し, 左右の測定値の平均値を記録した.

こで，単一遺伝子疾患 CARASIL を突破口に血管性認知症の病態を明らかにすることを目的として,

3. 脳循環予備能の評価
16 ヶ月齢の HtrA1 KO マウスおよび野生型マウ本研究を開始した.

スを解析した. マウスの麻酔は α-chloralose
B.研究方法（倫理面への配慮を含む）(50 mg/kg)および urethane (750 mg/kg)の腹腔内

1. 実験動物投与で行った. 気管内挿管の上, 5%二酸化炭素を新潟大学脳研究所で作りだされた HtrA1 遺伝
子欠損（HtrA1 KO）マウスと C57BL/6J マウスを

10 分間吸入させ，レーザースペックル血流計にて脳血流を継時的に測定した.

使用した. すべての動物実験は国立循環器病研究センター動物実験管理委員会で審査され, 承4. 行動解析24 ヶ月齢の HtrA1 KO マウスおよび野生型マウ

認された内容である.

－ 453 －

スについて, Y 迷路試験を行い, 総進入回数と自機序に深く関連していている可能性が考えられ

発的交替行動数を評価した.

ている. 本研究においても, HtrA1 KO マウスでは脳血流量の減少に加え, 血管反応性の障害が認

5. 組織学的解析

められた.

HtrA1 KO マウスおよび野生型マウスについて,

本研究では HtrA1 KO マウスが CARASIL の病態

H&E 染色, KB 染色および抗 BMP-4 抗体を用いた免を再現していることが確認され, CARASIL の治療

疫染色を施し, 解剖学的評価を行った.

法開発に有用なモデル動物となりうる可能性が示された. また本モデルは CARASIL にとどまらず,

C.研究結果認知症の病態解明にも有用であり, さらなる研究が必要と考えられた.

１. 脳血流量の測定

HtrA1 KO マウスは野生型マウスに比して有意にE.結論

HtrA1 KO マウスは CARASIL や認知症の病態解析

脳血流量が減少していた (p < 0.05).

に有用なモデルであると考えられた.
2. 脳循環予備能の評価
α-chloralose および urethane 麻酔下では, 炭酸ガス投与前のベースラインの脳血流量について, HtrA1 KO マウスと野生型マウスの間で有意なF.研究発表(上記課題名に関するもの)
1.論文発表なし.

差異を認めなかった. 一方, 炭酸ガスの投与後,

HtrA1 KO マウスは, 野生型マウスに比して,脳血2.学会発表流量の増加が鈍化しており, 脳血管反応性の異なし.

常が示唆された (p < 0.05).
G.知的財産権の出願・登録状況
1.特許取得3. 行動解析

HtrA1 KO マウスは野生型マウスに比べ, Y 迷路

ヒ

ミ

て

そ

ン

ベ

なし.

試験での総進入回数が少なかったが, 作業記憶

2.実用新案登録の指標である自発的交替行動数には有意差がな

なし.

かった.

3.その他
なし.

4. 組織学的解析

A.

α

欠

脈

H&E 染色等の一般染色や抗 BMP-4 抗体等の免疫体

染色では HtrA1 KO マウスと野生型マウスの間で記有意な差異を認めなかった.

α

を
D.考察

そ

2009 年, 新潟大学で CARASIL の原因遺伝子をHtrA1 遺伝子が同定された. その後, 欧州や中国など世界各国で CARASIL の報告が相次ぎ, 本疾患

B.

は孤発性の血管性認知症全体を含む難治性血管障害疾患の病態解明や治療法開発に与することよが期待され, 近年ますます注目を集めている.

各

CARASIL における脳梗塞の発症機序は未だ不明
であるが, 病理学的に血管壁細胞の変性が報告

パっされており, 血管反応性の異常が本疾患の病態－ 454 －

は

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

態

哺乳類中枢神経系における神経回路形成の遺伝学的解析

療

ず,

研究分担者

琢治 1）,2)
笹岡 俊邦 3）

研究分担者

香取

研究代表者

岩里

将太 1）

1）国立遺伝学研究所形質遺伝研究部門
2）総合研究大学院大学生命科学研究科遺伝学専攻

析3）新潟大学脳研究所
研究要旨
マウス遺伝学を用いた研究によって哺乳類の中枢神経系回路形成のメカニズムを解明することは、
ヒトの脳高次機能の基盤を理解するために重要である。本課題では、細胞骨格制御に重要な Rho ファ
ミリーの一つである Rac に特異的な GTPase activating protein (GAP)であるαキメリンに焦点を当てて研究を行っている。昨年度までの研究において、様々なタイプのαキメリン変異マウスを作製し、それらのマウスの包括的な行動解析を行うことにより、αキメリンのα２イソフォーム（α２キメリン）がある種の海馬依存的学習において重要な働きをすることを明らかにした。今年度はその回路レベルの基盤について解析を行った。

組換えDNA実験は、法律と所属機関の規程に従A.研究目的
昨年度までの研究により、RacGAPαキメリンのい、機関長に承認された計画に沿って行った。動

α２型イソフォーム（α２キメリン）を発達期に物を使用する実験は、文科省の定める指針と所属欠損したマウスではある種の海馬依存的記憶（文脈型恐怖条件付けなど）に亢進が見られるが、成体になってから欠損したマウスは正常レベルの記憶を示すことを報告した。すなわち、発達期の研究機関の規程に従い、機関長に承認された計画に沿って行った。特定化学物質等の取り扱いについては、所属研究機関の規程に従い使用した。研

α２キメリンが成体での海馬依存的記憶の能力究に用いる実験動物・試薬などの提供に関するを調節していることが明らかになった。本年度は、

MTAは提携済みである。

その神経回路レベルの基盤を明らかにすること
C.研究結果と考察を目的に解析を行った。

これまでの我々の研究によって、α２キメリンが皮質脊髄路の回路形成において軸索誘導を制B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
各種のαキメリン変異マウス（α１キメリンお御していることが明らかになっている（Iwasato

よびα2 キメリンの全身性ノックアウトマウスとet al., Cell 2007）。同様のことが海馬でも起き各種の条件的ノックアウトマウス）を用いて、スている可能性がある。それを検証する目的で、終パインに特に注目して詳細な形態学的解析を行脳（海馬、大脳皮質）特異的にα２キメリンを欠った。

損するマウス（DT-α２ChnKO マウス）の海馬にお－ 455 －

Ce

顕著な異常が見られなかった。また、樹状突起のD.研究発表1.論文発表形態にも顕著な異常はみられなかった。

Iwata, R., Matsukawa, H., Yasuda, K., Mizuno,ch

いて、軸索投射パターンを解析したが、それらに一方、αキメリンがスパイン形成に関与してい

H., Itohara, S., Iwasato, T. Developmental

るという報告はこれまでになかったが、アクチン

RacGAPa 2-chimaerin signaling is a determinant

細胞骨格を制御するという性質から考えて、αキof the morphological features of dendritic spines

メリンがスパイン形態に影響する可能性がある。
それを検証する目的で、スパイン形成を解析した
ところ、3 週齢において、α２キメリン変異マウ

in adulthood. J. Nerurosci. 35, 13728-44. (2015).
Suzuki, A., Lee, L.J., Hayashi, Y., Muglia, L.,スの海馬 CA1 の錐体細胞のスパインは、コントロ

Itohara, S., Erzurumlu, R.S., & *Iwasato, T.

ールマウスのものと比較して、大きいことがわか

Thalamic adenylyl cyclase 1 is required for barrelった。ただし、密度には違いがみられなかった。

formation in the somatosensory cortex. Neurosci.

成体で解析したところ、大きさも密度もどちらも

290, 518-529. (2015)

コントロールマウスのものよりも有意に増加しMita,ていることが明らかになった。一方、α１キメリ

Fünfschilling, U., Kawasaki, T., Mizuno, H.,

ンノックアウトマウスではこうした異常は見られなかった。これらの結果によって、α２キメリ
ンがスパイン形態を制御していることが初めて明らかになった。
興味深いことに、成体になってからα２キメリ

S.,

de

Monasterio-Schrader,P.,

Iwasato, T., Nave, K.A., Werner, H.B., & Hirata,
T. Transcallosal Projections Require Glycoprotein
M6-Dependent Neurite Growth and Guidance.
Cereb. Cortex, 25，4111-25 (2015).

ンを欠損した場合ではスパインは正常であった。

Takahashi, A. Lee, R.X, Iwasato, T. Itohara, S,

すなわち、発達期のα２キメリンが成体におけるArima, H., Bettler, B, Miczek, K.A. & Koide, T.

スパイン形態を制御していることがわかった。さGlutamate input in the dorsal raphe nucleus as a

らにα２キメリンの作用する時期を特定する目

determinant of escalated aggression in male mice.

的で、生後 10 日目のα２キメリン floxed マウスに Cre 組換え酵素を発現する AAV ウイルスベクタ
ーをインジェクションすることによって、海馬特
異的にα２キメリンをノックアウトしたところ、

J.Neurosci. 35, 6452-63 (2015).

Ra

10

W

Iw

Su

lab

So

月
S.

Lo

co

co

17
T.

In
ne
Co
6日
岩

哺

学

ナ
S.

2.学会発表
T. Iwasato. （招待講演）

Lo

In vivo Imaging of Circuit Refinement in CorticalcoLayer 4 of Neonatal Mouse. 第 38 回日本神経科学

co

大会（シンポジウム） 2015 年 7 月 28 日-7 月 31

日

日

（横浜市）

S.

10 日目以降の海馬特異的にα2 キメリンをノック

岩里琢治（招待講演）

Lアウトしたマウスでは、記憶の亢進も見られた。

新生仔バレル皮質における回路発達の二光子イ

co

一方、成体になってからα２キメリンをノックア

メージング

co

ウトしても記憶は正常である。

for Neuroscience 2015」

3 週齢においてスパインのサイズの増大が見られた。なお、2 週目以降はスパイン成熟が活発に起きる時期であり、α２キメリンがスパイン形態形
成に重要な働きをすることがさらに確認された。
なお、海馬への AAV ベクター導入によって生後すなわち、発達期のα２キメリンが海馬のスパイン形態を制御することによって成体での記憶

日研究戦略ワークショップ「Strategy
2015 年 9 月 4 日-9 月 5日H.

玉川大学（町田市）

岩里琢治（招待講演）

In

新生仔マウス大脳皮質における神経回路形成の inne

脳高次機能研究に造詣の深い研究分担者の笹岡

vivo イ メ ー ジ ン グ

ト

教授との議論の機会を得られたことは本研究の2015 年 9 月 20 日-9 月 22 日

推進に有効であった。

S. Katori, S. Itohara, T. Iwasato.

能力を制御している可能性が強く示唆された。
遺伝子変異マウスを用いた神経回路レベルの－ 456 －

認 識 と 形 成 研 究 会 2015
OIST（沖縄）

日香

Cell autonomous and non-autonomous functions of

哺乳類中枢神経系における神経回路形成の遺伝

RacGAP α-chimaerin in axon guidance at the midline

学的解析〜神経回路形成における RacGAP α キメ

choice point. Society for Neuroscience 2015, 2015 年

リンの新たな役割〜

10 月 17 日-10 月 21 日, （Chicago）

究合同セミナーW. Luo, H. Mizuno, R. Iwata, S. Nakazawa, T.

潟市）

Iwasato.

S. Katori, S. Itohara, T. Iwasato

Supernova systems enable high intensity single-cell

Spinal RacGAP α-chimaerin is required to establish

labeling and labeled cell-specific gene-manipulation.

midline barrier for proper corticospinal projection. 第Society for Neuroscience 2015, 2015 年 10 月 17 日-10

9 回神経発生討論会・難治疾患共同研究拠点共同

月 21 日, （Chicago）
S. Nakazawa, H. Mizuno, T. Iwasato.
Long-term 2-photon imaging of thalamocorticalconnectivity refinement in the neonatal mouse barrel

学術集会

特になし

17 日-10 月 21 日, （Chicago）
T. Iwasato.

In vivo imaging of neural circuit formation in the
neonatal mouse cortex. 遺 伝 研 研 究 会 Circuit
Construction in the Mammalian Brain 2015 年 12 月
6 日-12 月 7 日 国立遺伝学研究所（三島市）
岩里琢治（招待講演）
哺乳類中枢神経系における神経回路形成の遺伝
ナー

新潟大学脳研究所共同研究合同セミ2015 年 12 月 22 日（新潟市）

S. Nakazawa, H. Mizuno, T. Iwasato.
Long-term 2-photon imaging of thalamocorticalcalconnectivity refinement in the neonatal mouse barrel

学

cortex. 遺伝研国際シンポジウム

31

日-1 月 11 日 （東京）2016 年 1 月 9

S. Nakazawa, H. Mizuno, T. Iwasato.
Long-term 2-photon imaging of thalamocorticalイ

connectivity refinement in the neonatal mouse barrel

gycortex. 遺伝研国際シンポジウム

月5日-1 月 13 日

2016 年 1 月 12

国立遺伝学研究所（三島市）

H. Mizuno, T. Iwasato.
In vivo 2-photon imaging of population activity in theinneonatal barrel cortex. 新学術領域「適応回路シフ

15ト」国際シンポジウム日2016 年 3 月 11 日-3 月 12 日 （新2016 年 3 月 18 日-19 日（東京）

E.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

cortex. Society for Neuroscience 2015, 2015 年 10 月

学的解析

新潟大学脳研究所共同研

2016 年 3 月 3 日-3 月 4

同志社大学（京都市）

香取将太、岩里琢治（招待講演）－ 457 －

細平成 27 年度新潟大学脳研究所

ん｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

B.

ヒトてんかん原性脳組織における酸化損傷タンパク質の網羅的探索

ヘ

す
研究分担者

研究代表者 島 田 厚 良 1）
古川 絢子 2）、千葉 陽一 3）、柿田 明美 4）

県びを1）愛知県心身障害者コロニー

中央病院 中央検査部
2）鈴鹿医療科学大学 薬学部
3）香川大学 医学部
4）新潟大学脳研究所

が

認

ぞ

例
研究要旨

位

内側側頭葉てんかんに代表されるてんかん原性脳組織では、繰り返すけいれん発作に伴う興奮毒性

タによって神経細胞死が生じる。興奮毒性による神経細胞死のメカニズムには酸化ストレスが関与する

標と報告されているが、てんかん焦点においてどのようなタンパク質が酸化損傷を受けるかは不明であ成る。本研究は、内側側頭葉てんかんで外科的切除手術適応となった症例のうち、海馬硬化が認められくる症例と、海馬硬化が認められない症例を比較し、神経細胞死が顕著で海馬硬化をきたした海馬組織

でにおいて酸化損傷を受けたタンパク質の同定を行った。組織から抽出したタンパク質サンプルを二次質

元電気泳動にて展開し、タンパク質酸化損傷の指標のひとつであるカルボニル化を検出する抗体を用(1

いて、酸化損傷タンパク質をウェスタンブロットにて検出した。定量解析の結果、海馬硬化組織において共通して酸化損傷を受けるタンパク質スポットが３個検出された。従って、てんかん原性脳組織

ル

においては、酸化ストレスによって特定のたんぱく質が損傷され、機能低下をきたすことが病態形成ラに関与するものと考えられる。現在、３個のスポットについて、飛行時間型質量分析装置を用いたタジ

ンパク質同定を試みている。

たの写て、組織は慢性的な興奮毒性に曝されていると考用

興奮毒性による神経細胞死は、新生児では低酸

えられ、タンパク質などの生体高分子が酸化損傷

タ

素性虚血性脳症や新生児仮死において認められを受けている可能性がある。しかし、どのタンパ(2る。この急性期の障害を脱した後は、重篤な神経ク質が特異的に酸化されるかなどは明らかでは学的後遺症を引き起こす事が知られている。興奮なく、酸化ストレスが興奮毒性に起因する神経細元

毒性による細胞死の原因のひとつとして、酸化ス

胞死に果たす役割は不明な点が多い。本研究では、

メ

トレスの関与が示唆されている。我々は興奮毒で薬剤抵抗性の内側側頭葉てんかん患者から治療

Imあるカイニン酸を投与した３週齢ラットの海馬

目的で外科的に切除された脳組織を用い、酸化損

クにおいて、投与３時間後に特定のタンパク質に酸

傷タンパク質の網羅的解析を行って、てんかん焦(3

化 損 傷 が 生 じ る 事 を 報 告 し た (Neurobiol Dis.

点において特異的に酸化傷害を受けるタンパク

43(3):706-714, 2011)。内側側頭葉てんかんに代質を同定することが目的である。てんかん原性病

ス

表されるてんかんの焦点となる脳組織において態形成において中心的となり得る分子をタンパ

後は、繰り返すけいれん発作に伴う興奮毒性によっ

ク質損傷の観点から同定し、酸化ストレスが神経析

A.研究目的デ－ 458 －

細胞死に果たす役割を解明することによって、てプリント(PMF)法および、MS/MS 解析によるアミノんかんの病態解明に繋がる基礎的知見を得たい。

酸配列決定によりタンパク質を同定した。

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

C.研究結果本研究はヒト外科切除脳組織を使用するため、昨年度までの結果に新たな症例を加え、グレーヘルシンキ宣言を忠実に遵守し、「臨床研究に関

ド０/Ⅰを 13 症例、グレードⅣを 15 症例としてする倫理指針」に従って進めている。また、愛知

解析を進めた。カルボニル化タンパク質を比較し

県心身障害者コロニー発達障害研究所「ヒトおよた結果、海馬硬化が認められる海馬では、３つのびヒト材料を対象とする研究」倫理委員会の承認

タンパク質スポットが強くカルボニル化されてを得て行っている。

いた。現在、これらのタンパク質の同定を試みて研究には、内側側頭葉てんかん患者で海馬硬化

いるが、まだ同定には至っていない。

が認められた症例（グレードⅣ）と、海馬硬化がタンパク質発現変動解析については、グレード認められなかった症例（グレード０/Ⅰ）のそれ

０/Ⅰ、グレードⅣをそれぞれ 10 症例ずつ用いた。

ぞれから得られた外科切除脳組織を用いた。各症

定量解析の結果、海馬硬化が認められる海馬にお例から病変対象部位として海馬 CA1 領域、基準部

いて発現が有意に増加したタンパク質が 8 個、減位として側頭葉新皮質を切り出した。各組織から少したタンパク質が 24 個検出された。それぞれタンパク質を抽出した。タンパク質酸化損傷の指についてタンパク質同定を進めている。これまで

標のひとつであるカルボニル化タンパク質の生に、発現が増加したタンパク質として GFAP を、成を比較定量し、海馬硬化を呈する海馬組織で強減少したタンパク質として熱ショックタンパク

く酸化損傷を受けるタンパク質を探索した。次い質のいくつかを同定した。他のスポットについて

で、飛行時間型質量分析装置を用いて、タンパクも同定を進めている。

質同定を試みた。
D.考察(1)カルボニル化タンパク質の検出
まず、タンパク質の酸化損傷により生成したカ

本研究から、内側側頭葉てんかんにおいて、海ルボニル基に対して、2,4-ジニトロフェニルヒド

馬硬化が認められる海馬組織で特異的に酸化損

ラジン(DNPH)を反応させ、タンパク質結合 2, 4-

傷を受けるタンパク質の存在が明らかになった。

ジニトロフェニルヒドラゾン(DNP)に誘導体化しこのような酸化損傷の蓄積はタンパク質の機能た。２次元電気泳動法により等電点および分子量変化をもたらす可能性があり、酸化ストレスがての差に基づいてタンパク質を分離し、PVDF 膜に転んかん焦点形成過程において何らかの役割を果写した後、DNP を特異的に認識する抗 DNP 抗体をたしていると考えられる。海馬硬化の海馬におい考用いたウェスタンブロット法を行って酸化損傷て GFAP の発現が増加したことは、海馬硬化に伴傷タンパク質を検出した。

うグリオーシスを反映していると考えられる。一パ(2)タンパク質発現変動の解析

方、熱ショックタンパク質は、ストレスに応答しは抽出したタンパク質を蛍光色素で標識し、２次て発現誘導されるが、その発現が減少していたこ細元電気泳動法にて分離した（2D-DIGE 法）。蛍光イとから、海馬硬化組織ではストレスに対する応答

は、メージャーにて電気泳動像を取得し、性が低下している可能性がある。

療ImageMaster 2D Platinum 7.0 を用いて各タンパ

損

ク質の発現量を定量解析した。

焦(3)タンパク質の同定

E.結論
本研究から、海馬硬化が認められる海馬組織にク(1)、(2)の結果に基づいて絞り込んタンパク質

おいて特異的に酸化されるタンパク質の存在が病

スポットをゲルから切り出し、トリプシン消化の明らかになった。タンパク質酸化損傷はリジンをパ

後、脱塩・濃縮を行ってサンプルとした。質量分

含む塩基性アミノ酸残基が標的となることから

経

析(MS)により得られたペプチドピークリストを

翻訳後修飾と競合することも考えられる。従って、データベース検索するペプチドマスフィンガー

酸化ストレスがこれらのタンパク質に何らかの－ 459 －

機能異常を引き起こす可能性が考えられる。今後、酸化損傷タンパク質を同定することにより、海馬硬化へと至る病変形成の過程における酸化スト
レスの役割が解明できると予想する。
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし
2.学会発表第 57 回日本新規得病理学会（平成 28 年 6 月 2 日、弘前市）において発表の予定。
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし
2.実用新案登録
なし

の
FT
と

A.

化

じ

学

序

B.

フ

を

る

C.

FL

20

を

に

よ

－ 460 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

optineurin タンパク質の研究
研究分担者

大澤

研究代表者 川上 秀史 1)
亮介 1) 柿田 明美 2) 鈴木 秀規 3) 高橋

均 4)

1)広島大学原爆放射線医科学研究所

分子疫学研究分野
生命科学リソース研究センター 脳疾患標本資源解析学
3)広島文教女子大学 人間科学部 人間栄養学科
4)新潟大学脳研究所 病態神経科学部門 病理学分野

2)新潟大学脳研究所

研究要旨
筋萎縮性側索硬化症 ALS の原因遺伝子の一つである Optineurin(OPTN)が、神経変性の発症にどのように機能しているかを明らかにする為に実験を行った。TBK1 と OPTN の遺伝子変異がFTD-ALS の患者で見つかっていることから、TBK1 と OPTN の機能について、神経変性の原因のひとつとして考えられる傷害ミトコンドリアの除去（マイトファジー）との関わりについて調べた。

いものの、TBK1 存在下で OPTN タンパクの分解

A.研究目的ALS 患者と健常者の脳組織で起こっている変が促進されることが明らかとなった。(図１)

化を生化学的に明らかにし、ALS 患者特異的に生じる ALS 原因遺伝子 Optineurin タンパクの生化
学的な変化を明らかにすることで ALS の発症機序を明らかにする。
B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
HeLa 細胞に Optineurin および TBK1 をトランス
フェクションして、CCCP でミトコンドリアに傷害を与えてから Optineurin タンパクに変化が生じ(図 1)

るかどうかを調べた。
TBK1 と OPTN を共に発現させると 177 番目のC.研究結果

セリン残基(S177)をリン酸化すること（図２）、

HeLa 細胞に FLAG-OPTN および

さらに S177 のリン酸化がオートファジーの際にFLAG-TBK1 をトランスフェクションして、20µMCCCP 刺激、3 時間および 6 時間後に細胞を回収して、サンプルを調製した。前年度の報告

LC3 との結合を促進することがこれまでに知られていることから、S177 のリン酸化がマイトフ
ァジーの亢進に関わっていると考えられる。

にあるようなヒトの脳のサンプルで認められる
ような分子量の小さい OPTN 断片は認められな－ 461 －

1
（図２）
D.考察
ALS の発症機序として傷害ミトコンドリアの除去の異常が可能性の１つとして考えられるが、その過程において TBK1 と OPTN が関わっている可能性が示唆された。TBK1 の欠損もしくは変異体、OPTN の欠損または変異体を発現した細胞でマイトファジーの進行に異常があるかどうかを確認

行
あ
果
あ
知
脳
価

する必要がある。

A.

E.結論
細胞内における OPTN、TBK1 の働き、またこ
れらの分子のヒト脳組織での状態について更なる解析、検討が必要である。
F.研究発表1.論文発表なし
2.学会発表

効
具
続
マ
られ

B.

（S
り体
に
管

なし

G.知的財産権の出願・登録状況
1.特許取得なし

次

2.実用新案登録
なし

1.

3.その他

2.

3.

－ 462 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

脳小血管病変モデルにおけるスタチンの脳組織保護効果
仁藤 智香子 1）
研究分担者 五十嵐 博中 2）
研究代表者

1）日本医科大学大学院医学研究科 神経内科学分野 2）新潟大学脳研究所統合脳機能研究センター
研究要旨
脳小血管病変は脳梗塞ないしは脳出血の大きなリスクファクターとなるのみならず、認知機能や遂行機能に多大な障害を惹起する。しかし、現時点では、その進展防止法としてはリスクファクターである血圧の是正があげられるのみで、これとて一度出現した病理変化、徴候の進展にたいする抑制効
果は小さいのが現状である。一方、臨床に於いて既に汎用されている dyslipidemia を是正する薬剤であるスタチンが脳血管保護作用を有しており、急性期脳血管障害に対して脳組織保護的に働くという知見が得られている。本実験では脳微小血管障害モデルである SHR ラットにスタチンを投与し、その脳組織保護作用を、血液脳関門障害、脳循環障害の観点から磁気共鳴イメージング（MRI）を用いて評価する。

A.研究目的脳小血管病変に対して、スタチンが病変進展抑制効果を有するか否かを動物実験において評価する。
具体的には、脳微小血管モデルラットにスタチンを連続投与し、微小血管病変出現、および小血管病変のマーカーである血液脳関門障害の抑制作用が認められるかを MRI にて評価する。
B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
矢守らにより開発された高血圧自然発症ラット（Spontaneously Hypertensive Rat: SHR）は若年時より体血圧の上昇が認められ、自然経過に於いては脳に微小出血、微小梗塞、白質病変などの脳微小血管病変を呈する。
実験にはこのラットを用いる。生後 8 週齢の SHR を
次の 4 群に分けて 3 か月間治療介入を行う。

る。
4. カルシウム拮抗剤、アトルバスタチン併用群
上記に関して、治療介入後、日本医科大学設置の動物用 MRI 装置を用い、脳循環、血液脳関門障害、
炎症性蛋白、活性酸素、脳血管障害の評価を経時的に生体にて評価する。
1. 脳循環障害：CASL 法による脳血流量絶対値の算出により各動物の数値比較を行う。
2. 血液脳関門障害：DCE 法により、Gｄ－DTPA の脳組織への漏出を 2 compartment model を用いて modeling することにより「漏出し易さ」を数値化し、これをもって血液脳関門障害の指標とする。

1. Vehicle 投与群（対照群）

3. 微小出血・梗塞の出現頻度：T2* image およびT2 image により脳梗塞、脳出血病巣の有無の評価を行う。

2. カルシウム拮抗剤投与群：従来、唯一微小血管病変の進展抑制作用があると考えられる降圧剤としてカルシウム拮抗剤投与を行う。

4. 活性酸素の産生：ラット脳切片を作成し、ハイドロ
エチジン法を用いて活性酸素の産生を評価する。

3. アトルバスタチン投与群：微小血管保護効果があると考えられるストロングスタチンの投与群であ得られたデータの画像化および、評価条件の最適－ 463 －

化、数値化は新潟大学脳研究所、統合脳機能研究センターに設置された画像処理装置にて行う。
得られた数値化データより４群間において微小血管障害の状態の差異を検討し、アトルバスタチン投与
は脳微小血管障害抑制効果を有するか、および降圧効果を示さない用量のカルシウム拮抗剤との併用
で相乗効果が認められるかを検証する。

G.知的財産権の出願・登録状況
特記すべきことなし

C.研究結果カルシウム拮抗剤群、アトルバスタチン群および両者併用群では、血管内皮における LOX-1 およびMCP1 の発現は対照群に比べて有意に抑制されていた。また、併用群では、カルシウム拮抗剤群およびアトルバスタチン単独群に比して、LOX-1、MCP1 ともに有意な陽性率の低下を認め、活性酸素の産生も有意に抑制されていた。また、アトルバスタチン投与は対照群と比較し、有意に脳血管障害（脳梗塞、脳出血）の発生を抑制し、生存日数を有意に延長させ
た。

の

D.考察
脳小血管病変モデルを用いた研究において、自に然経過に於いては、病理組織像にて血管内に投与びした Evans-blue の脳実質内への漏出、小血管の破謝綻による微小出血の出現など血液脳関門の障害・破群綻を示唆する病変が月齢を経ると共に増加し、更にては脳梗塞病変が出現することが確認されている。
今回、SHR においては、低用量スタチンに加えて降圧効果を示さない用量のカルシウム拮抗薬を長期併用投与することにより、抗酸化および抗炎症作用が増強され、血管内皮細胞保護に働く可能性が示唆
された。

唆

A.

ー

で

を

E.結論
ラット脳小血管病変モデルにおいて、スタチンは抗酸化および抗炎症作用により血管障害の発生を有意に抑制した。さらに、カルシウム拮抗薬との併用に
より血管内皮保護効果が増強され、生存期間を有意に延長させたものと考えられた。

こ

al

al

sy

見

る

F.研究発表1.論文発表
なし

き

関

Gl

性

2.学会発表なし

関－ 464 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

神経変性疾患におけるアクアポリン（AQP)および AQP 関連タンパクの解析
明彦 1）研究代表者 星研究分担者 角田綾子 1）、宇川義一 1）、他田研究協力者 柿田
1）福島県立医科大学神経内科

真理 3）、西澤

正豊 2）

明美 3）

2）新潟大学脳研究所神経内科

3）新潟大学脳研究所病理研究要旨
本年度は多系統萎縮症（MSA）剖検脳における AQP および AQP 関連タンパクを含めたアストロサイトの病理学的解析を進めた。MSA 群の線条体では GFAP あるいは S100β陽性アストロサイトーシス像と共に AQP4 および AQP1 の発現は対照群よりも高度であった。一方、AQP 関連タンパクである Kir4.1 および GLT-1 は、MSA 群において対照群よりもそれぞれの発現が増強と減弱を示していた。グルタミン代
謝酵素である GS や GDH 発現は MSA 群においていずれも対照群より低下していた。
MSA-P 群の方が MSA-C
群より上述の病理学的変化は顕著な傾向であった。今回の結果は、MSA 脳の神経変性プロセスにおいてアストロサイトを介した水・カリウム代謝異常およびグルタミン酸神経毒性が関与する可能性を示
唆するものと考えられる。
A.研究目的

発現する分子群の病理学的解析をさらに進めた。

我々は、これまでアルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、多系統萎縮症（MSA）剖検脳

B.研究方法

で有意な AQP および AQP 関連タンパクの発現変化

MSA 群（n=8）は MSA-C（n=4）と MSA-P（n=4）

を免疫組織学的に確認し、神経変性疾患におけるの 2 群に分類し、線条体（尾状核、被殻）をター

これらの役割について考察してきた（Hoshi et

ゲットとした。免疫組織学的に線条体での GFAP、al., J Neuropathol Exp Neurol 2012；Hoshi etal., Brain Pathol 2016）。
一方、近年脳内リンパ流を制御する Glymphatic
system 仮説（Nedergaard, Science, 2013）の知S100β、AQP4、AQP1、内向き整流性カリウムチャ
ネル Kir4.1、グルタミン酸トランスポーター
GLT-1、グルタミン合成酵素（GS）およびグルタ

見が集積されつつあり、アストロサイトに発現す

ミン酸脱水素酵素（GDH）発現について対照群

る AQP4 がその中心的役割を担うことが判明して（n=5）と比較し、さらに glial cytoplasmic

きた。我々がこれまで示してきた AQP および AQP

inclusion （GCI）の多寡との関連性にも着目し関連タンパクの解析結果は神経変性疾患の解析を行った。

Glymphatic system 破綻を示唆し、疾患発症や変性過程に関与する可能性が考えられる。

C.研究結果

本年度は、MSA 剖検脳における AQP および AQP
関連タンパクを含め、アストロサイトに特異的に－ 465 －MSA 群では対照群よりも GFAP あるいは S100β

陽性アストロサイトーシス像と共に AQP4 と AQP1

特異的に発現する分子群の解析を進めることに発現の増強が認められた。

よって、新しい観点で MSA の神経変性メカニズム

一方、AQP 関連タンパクである Kir4.1 と GLT-1を解明することができるかもしれない。

免疫染色性については、MSA 群において対照群よ
りもそれぞれの発現が増強と減弱を示した。グル
タミン代謝酵素である GS や GDH 発現は MSA 群に
お い て い ずれ も 対 照 群よ り 低 下 傾向 で あ っ た

F.研究発表1.論文発表１．Expression of aquaporin 1 and aquaporin 4（Figure）。

in the temporal neocortex of patients with

サブグループの解析結果としては、MSA-P 群のParkinson’s disease. Akihiko Hoshi, Ayako

方が MSA-C 群より上記の変化は顕著であり、またTsunoda, Mari Tada, Masatoyo Nishizawa,

尾状核よりも被殻でその傾向が強かった。

Yoshikazu Ugawa, Akiyoshi Kakita. Brain

なお、α-synuclein に標識される GCI は MSA-C

Pathol, in press.

群よりも MSA-P 群の方が、またそれぞれの群において尾状核よりも被殻において高度に蓄積して２．Increased neuronal and astroglial

1）

aquaporin-1 immnuoreactivity in rat

いた。

striatum by chemical preconditioning with
Figure： 被殻での GS/GDH 蛍光二重免疫染色像（対照例）

3-nitropropionic acid. Akihiko Hoshi, Ayako（MSA 例）

Tsunoda, Teiji Yamamoto, Mari Tada, Akiyoshi
Kakita, Yoshikazu Ugawa. Neurosci Letters,
minor revision.

pr

他

の

根

2.学会発表１．第 56 回日本神経病理学会総会．多系統萎縮症剖検脳におけるアストロサイトの病理学的Cy3: GS, Alexa488: GDH

解析．星明彦、角田綾子、宇川義一、西澤正豊、

A.

OD

他田真理、柿田明美．平成 27 年 6 月、福岡．

でMSA 脳における詳細なアストロサイト特異的蛋２．第 27 回日本脳循環代謝学会総会．多系統萎の白の解析は検索し得た範囲では渉猟できず、AQP

縮症におけるアストロサイト特異的タンパクての動態やグルタミン酸代謝、さらにはこれらと質の解析．星明彦、角田綾子、宇川義一、西澤態

GCI 沈着との関連性について注目した研究もない。

正豊、他田真理、柿田明美．平成 27 年 10 月、

生

富山．

行

D.考察

今回の結果は、MSA 脳で AQP やその関連タンパ

るクあるいはグルタミン酸代謝酵素が有意に発現変化することを示している。我々はこれらの変化と GCI の蓄積程度の軽重に何らかの相関性があることを想定しており、現在定量的なデータ解析を進めている。これらのアストロサイト特異的蛋白の病理学的変化は、MSA における GCI 病理を修飾する可能性があるものと考えられる。

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし
2.実用新案登録
なし
3.その他
なし

E.結論
MSA の神経変性プロセスには水・カリウム代謝異常およびグルタミン酸神経毒性が関与する可能性がある。これらを制御するアストロサイトに－ 466 －

B.

検
析
ン
ト
て
の
分
ン
討
つ

に
平成 27 年度新潟大学脳研究所

ム｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

多系統萎縮症剖検脳における TPPP(p25α)蛋白の発現解析
およびその制御下流遺伝子の探索

4

th

ko
研究分担者

研究代表者 石川 欽也 1）
柿田明美 2）、他田真理 2）、高橋均 2）、水澤英洋 1）、
横田隆徳 1）、太田浄文 1）、尾崎心 1）

1）東京医科歯科大学大学院脳神経病態学分野

2）新潟大学脳研究所脳疾患標本資源解析学分野

h

研究要旨

ko

多系統萎縮症については、オリゴデンドログリア特異的タンパクである Tubulin polymerizationhis,promoting Protein(TPPP)の多系統萎縮症における病態への関与、細胞内局在変化を解析し、それらを他のオリゴデンドログリア変性を来たす疾患との相違について検討する。また、非中枢神経疾患患者の標本および凍結脳組織を用いて、対照状態との違いを探索する。加えて、病理学的変化をもたらす
根本原因を解明するためにコントロール例と多系統委縮症例の凍結脳での網羅的遺伝子解析も行った。

縮的

染色を行なった。

A.研究目的．

である。ODG 特異的蛋白である TPPP が示す TPPP

萎の細胞内局在異常に着目し病理学的解析を用い定量的評価を行うために多系統萎縮症およびコントロール凍結脳を用いて脳部位ごとの TPPP
局在の量的変化をイムノブロッティング法とマイクロアレイ法を用いて評価する。
上記の病理学的変化をもたらす根本原因を明クて多系統萎縮症においての細胞内局在変化と病らかにするために凍結脳を用いた網羅的遺伝子

澤態への関与を明らかにすること、多系統萎縮症で発現解析(マイクロアレイ)を行い、TPPP 制御下流

月、生じている脳白質での網羅的遺伝子発現解析を遺伝子の探索を行う。

行い根本的な多系統萎縮症発症の原因を解明す（倫理面への配慮）、

多系統萎縮症はオリゴデンドログリア（以下ODG）の変性が原因となる孤発性脊髄小脳変性症

ることを目的とする。

公表された患者剖検脳を用いた染色結果には本人を特定できる情報はない。

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
非中枢神経疾患患者（コントロール疾患）の剖
検脳を抗 TPPP 抗体を用いた免疫組織化学にて解析し脳部位ごとに TPPP 細胞内局在の正常パターンを分析する。さらに多系統萎縮症患者ではコントロールと比較してどのような局在変化を来しているかを解析する。TPPP の局在について、GCIの主たる構成タンパクであるαシヌクレインの分布との関係についても、リン酸化αシヌクレイ
ン抗体と TPPP 抗体との蛍光 2 重染色を行い、検討する。また MSA におけるミトコンドリア異常について検討するために TOMM20 抗体を用いて蛍光C.研究結果これまで TPPP はオリゴデンドログリアの細胞質にのみ存在するとされていた。東京医科歯科大学脳神経病態学研究室にて独自に感度、特異度ともに優れた抗 TPPP 抗体を作製した。その抗体を用いた解析では TPPP はオリゴデンドログリアの細胞質だけではなく核質および核膜周囲にも免疫反応が強く認められた。MSA 患者脳を用いた蛍光 2 重染色ではαシヌクレイン陽性の GCI を形－ 467 －

成する ODG と、GCI が明確でない ODG を計測しE.結論比較したところ、GCI 陽性 ODG では、統計的に有TPPP は ODG 特異的な細胞質内蛋白として知ら

意に核内 TPPP が消失していた(19.6 ± 10.9 vs

れていたが、今回の研究で ODG 核にも豊富に存在

48.63 ± 10.37 %, p<0.05)。MSA でα-synuclein

することと、MSA 脳では変性早期から核内から陽性の GCI を持たない ODG とコントロール患者

TPPP が減少し、細胞体へ移行しミトコンドリア

脳の ODG の核内 TPPP 陽性率を比較すると MSA 患

蛋白とともに集積することが判明した。

者で有意に核内 TPPP の減少を認めた(48.63 ±

減少していることが推測された。ミトコンドリア

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表Acta Neuropathol Commun. 2014 Sep 11;2:136.

関連蛋白 TOMM20、TPPP 抗体、リン酸化αシヌク

doi: 10.1186/s40478-014-0136-4.

10.37 % vs 62.4 ± 13.5 %, p<0.05)。MSA では
αシヌクレインの沈着よりも早期に核内 TPPP がレインを用いた蛍光 3 重免疫染色では、TPPP は

Relocation of p25α/tubulin polymerization

ミトコンドリ蛋白 TOMM20 の充満で膨化した ODG

promoting protein from the nucleus to the

細胞体に集積し、ほぼ一致してαシヌクレインがperinuclear cytoplasm in the oligodendroglia

集積する像が見られた。このような、TPPP とof sporadic and COQ2 mutant multiple system

TOMM20 の細胞質内集積は、αシヌクレイン沈着

atrophy.
Ota K, Obayashi M, Ozaki K, Ichinose S,

前の細胞にも見られた。
また、マイクロアレイ解析では、大脳白質での検索で変性が生じる早期の状態の遺伝子発現プ

Kakita A, Tada M, Takahashi H, Ando N, Eishi
Y, Mizusawa H, Ishikawa K.

ロファイリングを行った。結果として興味深い遺伝子を同定した。現在、検体数を増やして意義を2.学会発表太田浄文、石川欽也、大林正人、尾崎心、柿田

確認中である。そのうえで、培養細胞などを用い

明美、高橋均、水澤英洋： Glial cytoplasmicて病態への関与を探索する。

解
計
に
た
め
を

inclusion を 形 成 す る 多 系 統 萎 縮 症 のA.

oligodendroglia では、チュブリン重合促進蛋白

D.考察
MSA の ODG において TPPP は細胞質に異常集積することが報告されているが、その詳細は、まだ

TPPP が核から消失する．第 54 回日本神経学会学術大会，2013 年 5 月 30 日，東京

織

ケ

ー

解明されていなかった。今回の研究で我々は、
TPPP が核に多く存在することと、MSA の ODG で

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

上は核から辺縁、細胞質の中のミトコンドリアに関

1.特許取得子

連して集積することを見出した。さらに、この変なし

標化は、GCI 形成より先行することが示唆されたが、2.実用新案登録

これはこれまでの報告の内容とも一致する。別途なし

我々が行った研究では、TPPP は本来ミトコンド

3.その他

リアにも存在する蛋白であることが示されていなし

る。今後この MSA でのミトコンドリア内集積が二次的な、例えば何らかの防御的機序によって起きているのか、あるいは、ミトコンドリアへの集積が病態の悪化因子であるのか、検討する必要があ

B.

情

Ka

髄

い

織

ると考えた。
マイクロアレイ解析については興味深い遺伝

ア

子発現変動を同定しており、現在解析を続行中で

す

ある。

た

開

－ 468 －

ら

平成 27 年度新潟大学脳研究所

在｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

ら

共同利用・共同研究報告書

ア

悪性脳腫瘍の非コード RNA の機能解析を基盤とした分子標的創薬の展開
龍也 1,2）
研究分担者 藤井 幸彦 3）

研究代表者 山中6.

1）京都府立医科大学・医学部・保健看護学研究科医学講座

on2) 京都府立医科大学・医学研究科・腫瘍分子標的治療学分野
3）新潟大学･脳研究所・脳神経外科

he

ia

em

S,

hi

研究要旨
中枢神経原発悪性リンパ腫（PCNSL）腫瘍組織から DNA/RNA を抽出し、mRNA, SNP アレイ、miRNA
解析を行ってきた。特に PCNSL34 症例の遺伝子発現解析から患者の予後と相関する遺伝子 21 種類を統計学的方法を用いて選択し、それらの遺伝子の発現レベルから、患者の予後予測式を考案した。さらに、これらの中から 3 種類の遺伝子産物に対する抗体を用いた免疫組織学的解析と年齢、KPS を用いた簡便法で予後が良く予測できることが判明した。現在、高速シーケンス解析から DNA/RNA 解析を進めているが、今後は腫瘍特異的な遺伝子異常を明らかにし、バイオマーカー開発、創薬に向けた研究を進める予定である。

田

ic

の

白

学

2000 年～2010 年に外科的切除ないし生検術をA.研究目的
中枢神経原発悪性リンパ腫(PCNSL)の腫瘍組受けた患者 34 人から、PCNSL 標本を得た。患者の織を、次世代型シーケンサーを用いて RNA シー

平均年齢は 65.5 歳（44-76 歳）であり、男性 19

ケンス解析を行い遺伝子変異・再構成の異常、コ人、女性 15 人であった。手術前の KPS は、80 以ードおよび非コード RNA の発現を検討する。以上が 10 人、60-70 が 16 人、50 以下が 8 人であっ上から疾患特異的な診断治療標的となりうる分子を選択し、バイオマーカーの開発、および分子標的創薬に向けた研究を展開する。

た。病理組織学的には全て瀰漫性大細胞性 B リンパ腫であった。腫瘍の診断後に、患者は高用量メ
ソトレキセート単独ないし高用量メソトレキセ
ートを含む多剤併用化学療法による第一選択化
学療法を受け、外照射療法（標準線量 20-40 Gy）

B.研究方法PCNSL 対象症例について臨床サンプルと臨床および再発時に多剤併用化学治療を受けた。初期治療および維持治療中の腫瘍の再発について、情報の収集を行った。症例の年齢、性別、MRI または CT により観察した。全症例の 5 年生存

Karnofsky Performance Status (KPS)、画像所見、率は 46.37%であった。摘出腫瘍から mRNA を抽出

髄液所見、治療法、治療効果、副作用、転帰につし 、 GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0

いて詳細な検討を行った。PCNSL の凍結腫瘍組
織から DNA/RNA を抽出し、エクソーム, mRNA, SNP
アレイ,miRNA 解析を行い、特に患者の予後と相関

Expression array (Affymetrix, Inc.)（約 47,000
遺伝子を含む）を用いて各 mRNA の発現量を測定した。これらの発現プロファイルと、追跡調査によ り 得 た 各患 者 の 術 後の 生 存 期 間と の 相 関 をする遺伝子を選択し、それらの遺伝子を標的としRandom survival forest model を用いて統計学的た創薬への取り組み、さらには新しい診断方法のに処理し、発現プロファイルと生存期間との間に開発に向けた研究を進めている。

強い相関を示す遺伝子を同定した。さらに、これ－ 469 －

らの遺伝子の発現値を用いた予後予測法を考案

症

した。

例

現在、これらの腫瘍 RNA を用いた高速シーケン

相ス解析を終了し、スーパーコンピューター解析をイ行っている。これらの研究は倫理委員会で承認さ

考

れている。

す

な

C.研究結果GeneChip 解析（遺伝子発現解析）から患者のイ予後と相関する遺伝子 21 種類を統計学的方法を

成

用いて選択し、それらの遺伝子の発現レベルか
ら患者の予後予測式を考案した。高用量メソト
レキセートにより治療された症例および高用量
メソトレキセートを含む多剤併用化学療法により治療された症例に拘わらず 21 遺伝子のセット
によって予後が良く予測可能であった。21 遺伝子を用いた予測式により分類された群について、
Kaplan-Meier 曲線を描くと Logrank 検定のための p 値（p）は、p＜0.0001 であった。この結果

析D.考察
がんの基礎研究の進歩から、同じ病理組織型であってもその分子病態は個々の腫瘍ごとにかな
り相違があることが明らかになってきた。そうした背景から、がんの薬物療法はバイオマーカーを免疫組織化学染色の結果を考慮に入れた、より簡略化した予後予測式を考案した。

遺な期待できる症例を選別することによる個別化医め療が主流となると考えられている。
中枢神経系原発悪性リンパ腫（PCNSL）は中枢で、多くは B 細胞リンパ腫である。PCNSL はあら

F.
1.
1.

ゆる年齢層に発生するが、50-60 歳代の高齢者に•Z2 = 0.04 × AGE + 1 × DEEP.CONTACT + 0.82 ×

好発し、その頻度は最近増加している。本邦ではPPP3R1 + 0.75 × BRCA1

現在、High dose Methotrexate（HD—MTX）3.5 g/m2

(ここで AGE は年齢値、DEEP.CONTACT とは深部病

化学療法 3 コース後、全脳放射線治療（30-40 Gy）

変があれば 1,なければ 0、PPP3R1, BRCA1 とは免が広く行われている。その 5 年生存率は約 30％、

疫組織化学染色で 1 ポイント以上なら 1,0 ポイン

生存期間中央値は 33-39.5 か月とされている。

2.

本治療法の問題点として整理してみると、

トなら 0)•ルール
Z2 ＞ 3.48 ⇒Z2 ≦ 3.48 ⇒E.

いる。がん治療はバイオマーカーによって効果の神経系に原発する節外性非ホジキン型リンパ腫

さらに、Z 式を算出した方法で、臨床データとさ用いて治療方法の選択がなされるようになっては、21 遺伝子予測式により予後を良く予測可能であるという事を示す。

診（１）生存率の向上が見られたが、全身性非ホジ
キン病と比べ治療成績は不良である。

Poor 群
Good 群（２）治療効果を予測するバイオマーカーがない

このルールに従って生存曲線を描いたものをため、画一的な治療が行われている。

図に示す。Z2 式でより簡易に予後良好群と不良群（３）副作用として晩発性の神経毒性がある。

が分けられることがわかる。Z2 式の有用性は他の（４）多くは再発し治療抵抗性となり、新たな治症例群（validation set）を用いた解析によって療スケジュールの開発が待たれている。

2.

1.Y

も確かめられた。
RNA シーケンス解析は PCNSL30 症例について終実臨床では、PCNSL という臨床診断がなされる

了し、現在、コンピューター解析を行っている。

と、前記にもあるような画一的な治療がなされるが、その予後は１年以内に再発し転帰不良となる－ 470 －

2.

症例から、10 年以上にわたって寛解が得られる症

Yamanaka R (ed.), Primary Central Nervous

例まで、治療に対する感受性は症例毎でかなりのSystem相違がある。本研究により治療困難な PCNSL のバ

Management and Outcomes, Nova Science

イオマーカーが明らかにされると、予後が不良とPublishers, NY, in press.

考えられる症例には造血幹細胞移植などを併用

で

な

し

を

3.Yamanaka

LymphomaR:(PCNSL):SALVAGE

Incidence,

THERAPY FORすることにより強力な薬物療法を選択すること

PRIMARY CENTRAL NERVOUS SYSTEMなどから予後の改善が期待できる。このようにバ

LYMPHOMA. In Yamanaka R (ed.), Primary

イオマーカー用いた個別化治療が確立され、治療

Central Nervous System Lymphoma (PCNSL):

成績の向上が期待できる。さらに、シーケンス解

Incidence, Management and Outcomes, Nova

析から腫瘍特異的な遺伝子異常が明らかにされ、

Science Publishers, NY, in press.

診断マーカーとしての発展、分子標的創薬が展開

4.Yamanaka R, Yoshioka S, Fujimoto S, Iwawaki Y:
LONG-TERM

されることが期待される。

OUTCOMEANDSUPPORTIVE CARE IN PATIENTS WITH
PRIMARY CENTRAL NVERVOUS SYSTEM

E.結論
今後、高速シーケンサーを用いた RNA 解析から、てLYMPHOMA. In Yamanaka R (ed.), Primary

遺伝子変異、遺伝子発現情報解析も行い、体系的のな解析から標的分子を同定し、分子標的創薬を進Central Nervous System Lymphoma (PCNSL):

医

める。

枢

F.研究発表1.原著論文発表
1. Koyama-Nasu R, Hayashi T, Nasu-Nishimura Y,

腫

ら

に

は
m2

y）

％、

る

る

3.学会発表1. Yoshida K, Yamanaka R and Ogawa S (他 31 名).

Akiyama T and Yamanaka R : Thr160 of Axin1

Genetic Basis of Primary Central Nervous

is critical for the formation and function of the

System Lymphoma. 57th ASH Annual Meeting

β-catenin destruction complex. Biochemical

and Exposition. Orland, FL, December 5-8,

biophysical Res Comm. 2015 ;459(3):411-415.

2015.

Yamanaka R: Prognostic significance of S-phaseG.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

fractions in peritumoral invading zone analyzed

特になしby laser scanning cytometry in patients withhigh-grade

glioma(preliminary

study).

ONCOLOGY LETTERS 11:2106-2110,2016.
2. 書籍発表
1.Yamanaka

R,

Hayano

A:Radiation-induced

glioma., pp129-141, In Terry Lichtor (ed.),治

る

Science Publishers, NY, in press.

2. Nakajima S, Morii K, Takahashi H, Fujii Y,ジいIncidence, Management and Outcomes, Nova

Molecular Considerations and Evolving SurgicalManagement Issues in the Treatment of Patientswith a Brain Tumor, INTECH, 2015.
2.

Kanayama
MICRORNAST,

HayanoA,REGULATION

Yamanaka
AND

R:

PRIMARY

CENTRAL NERVOUS SYSTEM LYMPHOMA. In－ 471 －ス

る。

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

物

共同利用・共同研究報告書をUBQLN2 コンディショナルノックアウトマウスの解析に基づく
神経変性機序の解明

生

討

を
研究代表者
研究分担者
研究分担者

田中

章景 1）

行

土井

宏 1）

に

笹岡

俊邦 2）

患

C.

1） 横浜市立大学大学院医学研究科 神経内科学・脳卒中医学
2）新潟大学脳研究所 動物資源開発研究分野

ウ
研究要旨

築

われわれがポリグルタミン病核内凝集体の構成成分として同定した UBQLN2 は家族性 ALS の責任遺伝子

成であることが明らかにされたことからも、両疾患の病態に深く関与する機能分子と考えられる。そこで UBQLN2

薬が神経変性の病態形成に係わる機序を明らかにするために、運動ニューロン特異的な Ubqln2 ノックアウトマウ♀

を掛け合わせ、♂

全細胞でのノックアウトマウスを作成している。これにより、神経変性の病変選択性を明らかにする。また、野生（型、変異型の UBQLN2 に結合するタンパクを網羅的に同定することにより、UBQLN2 が神経変性に係わる病に態機序の解明を行った。

♂

スの作成をめざしている。UBQLN2 Flox マウスを維持し、♂Actb-Cre マウスと♀Ubqln2

flox/flox

せにする。まず、運動ニューロンに Cre 発現をおこす

A.研究目的る

われわれがポリグルタミン病核内凝集体の構成成

VAchT-Cre マウス(Misawa et al, Genesis 2003)との交分として同定した UBQLN2 は家族性 ALS の責任遺配により、運動ニューロン特異的な Ubqln2 ノックアウ

伝子であることが明らかにされたことからも、両疾患のトマウスを作成する。Ubqln2 はポリユビキチン化され病態に深く関与する機能分子と考えられる。

たタンパク質とプロテアソーム間のアダプターとしててUBQLN2 は、核内凝集体への sequestration により、機能しているので、ノックアウトによってユビキチン-プ

研

また遺伝子変異により、loss of function によって両疾

ロテアソーム系による基質の分解障害、蓄積が生じる

タン

患の病態を形成することが予想される。そこで、可能性が予想される。そこで、マウス樹立後は、運動UBQLN2 のコンディショナルノックアウトマウスを作機能の観察に加え、ユビキチン陽性封入体、

成・解析することで、両疾患に共通する神経変性機

TDP-43、FUS/TLS の細胞質内蓄積をはじめとする序を明らかにする。

ALS 患者運動ニューロンで観察される各種の病理学

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

D.

異

質

に

的所見がこのマウスモデルでも見られるかを検討すドメる。これまでの我々の dynactin1, TDP-43 のコンディ

してUbqln1 のショウジョウバエ、オルソログ Dsk2 についシ ョ ナル ノック アウ ト マウス 作成 の 経験 (PLos Oneては過剰発現、ノックアウトともに致死的であることが2013, Brain 2013 )では、Cre 発現の効率から考えるとこす

知られている。そこで、コンディショナルなノックアウト

Ubqln2 の発現は正常の 50%程度と予想され、完全に行を行うべく、loxP 配列で UBQLN2 遺伝子を挟み込む

ノックアウトされるわけではない。この点から、本モデUBQLN2 Flox マウスと、細胞群特異的な Cre 発現をルが ALS 病態を反映していることが明らかになれば、

パ

おこすマウスを交配し、その表現型と病理像を明らか

治療戦略として UBQLN2 活性化をめざし、in vitro で変－ 472 －

スクリーニングを行った薬剤のマウスへの投与を試み

E.結論
UBQLN2 Flox マウスの作成が終了し、今後コンる。
これらの各種実験において、新潟大学脳研究所動物資源開発分野の笹岡教授の助言を得ながら研究

ディショナルノックアウトマウスの解析を行い病態解析を進めていく。

を推進する。また、笹岡教授と共同して、マウスの発をはじめとした Cre 発現マウスとの交配も同時平行でF.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし

行い、特にどのニューロンにおいて神経変性が高度

2.学会発表に生じやすいかを明らかにすることで、神経変性疾なし

生工学・生殖工学に関する助言をうけ、実験経過の討論を行い、全ニューロンに Cre 発現をおこすマウス

患の病変選択性の形成機序についても検討する。
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
なし

C.研究結果われわれは、平成 26 年度より Ubqln2 flox マ
ウスの作成を開始し、相同組み替えベクターの構
築、組み替え ES 細胞の樹立、キメラマウスの作成を経てヘテロマウス（Ubqln2flox/+）を取得し、薬剤耐性遺伝子の除去を行った。平成 27 年度は♀のホモ接合性マウス（Ubqln2flox/flox）マウスと♂ の ヘ ミ 接 合 性 マ ウ ス （ Ubqln2flox ） を 作 成 し（Ubqln2 は X 染色体上の遺伝子である。）、恒常的に flox マウスを維持可能な状態とした。現在は♂Actb-Cre マウスと♀Ubqln2flox/flox を掛け合わせ、全細胞でのノックアウトマウスを作成してい

す

る。

交

アウ

D.考察

れ

コンディショナルノックアウトマウスについててはまだ作成中であるため、これに直接関与する

プ

研究成果はないが、質量解析により UBQLN2 結合

じる

タンパクの網羅的同定を行い、野生型 UBQLN2 と変

動
、
る

学

異型 UBQLN2 で異なる結合性を示す結合タンパク質の同定に成功した。この結合タンパクは UBQLN2に特異的なドメインであり、変異が集中している PXX

す

ドメインを欠失させると結合性が低下することを確認

ディ

している。

ne

平成 28 年度には、全ニューロンに Cre 発現をおるとこすマウスをはじめとした Cre 発現マウスとの交配をに行うことで、神経変性の病変選択性を明らかにする。

デ

また、野生型、変異型の UBQLN2 に結合するタンば、パクを網羅的に同定することにより、UBQLN2 が神経で変性に係わる病態機序を解明する。

－ 473 －

C.
平成 27 年度新潟大学脳研究所①｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

免疫不全を伴わない患者に発生する Epstein-Barr virus 関連の中枢神経原発悪性リンパ腫の臨床病理学的検討
研究代表者

杉田

研究分担者

柿田

1）久留米大学医学部病理学講座

保雄 1）
明美 2）
2）新潟大学脳研究所

研究要旨

②

EBV 関連陽性の PCNS リンパ腫の臨床事項および EBV 関連の PCNS リンパ腫の進展と宿主の免疫機能との相関関係を検討した。今回の研究では EBV 関連の PCNS リンパ腫症例群が EBV 陰性の PCNS リンパ腫群に比較して統計学的には予後に有意差は得られなかった。しかし、EBV 関連の PCNS リンパ腫症例群と比較して EBV 陰性群では長期生存例がみられ、両者に差がある可能性は否定できない。 本腫瘍と進展と宿主の免疫機能について PD-1/PD-L1 発現で検討した。EBV 陰性の PCNS リンパ腫群では高頻度に PD-1 発
現が腫瘍浸潤リンパ球にみられ、一方、PD-L1 発現が腫瘍、組織球にみられた。この結果から宿主と腫瘍との間に免疫寛容の状態が成立していることが考えられる。一方、EBV 関連の PCNS リンパ腫症例
群では PD-L1 の発現は陰性例と大差がないが、PD-1 については 83％の症例で PD-1 陽性リンパ球はほ
とんどみられなかった。この現象は腫瘍と宿主間における免疫寛容が不成立いうよりも、むしろ宿主

死
亡
率側の免疫応答の減弱を示唆してる所見と考えられた。

PCNS リンパ腫の臨床上の特徴を明らかにする。

A.研究目的
中枢神経原発悪性リンパ腫（PCNSリンパ腫）の脳③ 前年度と同様に PCNS リンパ腫症例を対象と内浸潤機構、腫瘍発生についてのEpstein-Barr

して腫瘍の免疫回避機構に関わっている免疫

Virus (EBV)の役割を明らかにする。本腫瘍の臨

チ ェ ッ ク ポ イ ン ト 分 子 で あ る Programmed

床事項の解析を行い、さらにEBV関連のPCNSリンパdeath 1(PD-1) お よ び そ の リ ガ ン ド で あ る腫の進展と宿主の免疫機能との相関関係を明らかに

PD-L1 検討する。

してPCNSリンパ腫の臨床病理像を解明する。

④ EBV 陽性 PCNS リンパ腫症例で PD-1/ PD-L1 の発現を検討して EBV 陽性 PCNS リンパ腫と宿主B.研究方法（倫理面への配慮を含む）の間の免疫応答の状態を検討する。

① 前年度 in situ hybridization (ISH)で検出⑤ 臨床病理学的な検討を行い、①～④で得られした EBV 陽性例の臨床事項を検討する。

たデータとリンパ腫症例の予後、生物学的態② 前年度 in situ hybridization (ISH)で検出度との相関関係を明らかにする。

した EBV 陽性例とほぼ年齢、性別が一致する⑥ 本研究の実施にあたっては久留米大学倫理EBV 陰性例と臨床事項を照合させて EBV 関連の委員会での承認の上で行われた。

－ 474 －③

C.研究結果①

FOX 標識数よりも有意に高かった (p＜0.001)

今回の研究で予後調査可能であった EBV 関連

一 方 、 EBV 陽 性 の PCNS リ ン パ 腫 で のの PCNS リンパ腫症例は ISH で検出された 23 例

PD-1/PD-L1 の検討可能例は 12 例であり、腫瘍中 20 例であった。性別では男性:11 例、女性:9細胞が PD-L1 陽性を示した例は 12 例中 4 例で例であった。年齢は 56 歳から 96 歳(平均 67+18あり、陰性 8 例中 4 例で介在組織球が陽性であ歳)であった。治療内容としては生検(BP)およった。PD-1 については EBV 陰性例の PD-1 陽性

び外科手術(SR)のみの症例は 7 例であり、BP お

リンパ球の平均値を示した症例は 2 例のみであよび SR に放射腺・化学療法(RA,CH)を受けた症

り、残り 10 例(83％)では PD-1 陽性リンパ球は

例は 13 例であった。BP,SR のみの症例の生存期ほとんどみられなかった。また腫瘍細胞からの間あるいは追跡期間は平均 5.4+7.0 ヵ月であり、

PD-L1 陽性 4 例では全例でリンパ球は PD-1 陰性

BP,SR, RA,CH の 治 療 を 受 け た 症 例 で は 平 均を示した。

27.7+28.2 ヵ月であった。EBV 関連の PCNS リンパ腫症例においても BP,SR, RA,CH の治療群の方D.考察が BP,SR のみの治療群に比べて生存期間あるい①

陽性の B 細胞型リンパ腫の予後は陰性のもの

は追跡期間は長い傾向がみられた(P=0.02)。
今回の研究で予後調査可能であった EBV 関連に比較して高齢者に好発し、生物学的に悪性陽性の PCNS リンパ腫 19 症例と今回の研究で予度が高く予後不良であったことを報告して後調査可能であった EBV 陰性の PCNS リンパ腫

いる(1)。Utsuki らは EBV が ISH で強く発現

20 症例との比較検討を Kaplan Meier 生存曲線にした症例ほど予後不良であったことを報告より行った(下図)。

している(2)。一方、Jamal らは予後は症例に②

よって様々であり、一定の傾向はみられなか

Kaplan-Meier 生存曲線
100
90
80
70
死 60
亡 50
率 40
30
20
10
0

ったと報告している(3)。
今回の私共の研究では EBV 関連陽性の PCNS
リンパ腫症例群の方が EBV 陰性の PCNS リンパ腫群に比較して予後が悪い傾向が伺われたが、
0

20

40

60

80

100

120

Log-rank test による検定では有意差は得ら140れなかった (P=0.48)。その理由として 1)比

生存期間
Ａ群

Ｂ群

較対象とした EBV 陰性の PCNS リンパ腫群も

。

と

疫

ed

る

の

主

れ

態

Oyama らは中枢神経以外で発生した EBV 関連

高齢者例が多くて放射線、化学療法などが完A 群は EBV 関連陽性の PCNS リンパ腫であり、B遂できなかった例が多かったこと。2)両群共群は EBV 陰性の PCNS リンパ腫である。長軸方向に症例数が少なかったことの 2 点が考えられは生存月数を示している。EBV 陰性の PCNS リンパる。しかし、腫の方が予後が良い傾向が伺をれたが、EBV 関連陽性の PCNS リンパ腫症例群では長期

Log-rank test による検定では有意差は得られ生存例は皆無であり、今後、症例数を増やしなかった (P=0.48)。

て再検討する必要がある。

③ EBV 陰性の PCNS リンパ腫での PD-1/PD-L1 の検討可能例は 21 例であり、腫瘍細胞が PD-L1
陽性を示した例は 21 例中 11 例であり、 陰性②

10 例中 5 例で介在組織球が陽性であった。PD-L1
陽性 16 例では全例で TIL が PD-1 陽性を示した。
PD-1, TIA-1, FOXP3 陽性の TIL 数の平均値はそ
れぞれ 39±53, 81±82, 5.90±6.80 であり、標識数において PD-1 は TIA-1 は統計学的に相関を示したが(r=0.71)、 FOXP3 とは相関しなかった(r=0.23)。 TIL における TIA-1 標識数は
－ 475 －

Programmed death 1(PD-1)は免疫チェックポ
イント分子であり, そのリガンドである
PD-L1 と共に腫瘍細胞の免疫回避機構に重要な役割を担っている。今回の研究では EBV 陰性の PCNS リンパ腫群では高頻度に PD-1 の発現が腫瘍浸潤リンパ球、PD-L1 の発現が腫瘍、介在する組織球にみられて宿主と腫瘍との間に免疫寛容の状態が成立していることが明らかになった。

瘍細胞に PD-L1 が発現し、他の 4 例においても一方、EBV 関連陽性の PCNS リンパ腫症例群で介在組織球に PD-L1 発現がみられた。しかし、は 12 例中 4 例で腫瘍細胞に PD-L1 が発現し、PD-1 については EBV 陰性例の PD-1 陽性リンパ他の 4 例においても介在組織球に PD-L1 発現

球の平均値を示した症例は 2 例のみであり、残がみられた。しかし、PD-1 については EBV 陰

り 10 例では PD-1 陽性リンパ球はほとんどみら

性例の PD-1 陽性リンパ球の平均値を示した

れなかった。また腫瘍細胞からの PD-L1 陽性 4

症例は 2 例のみであり、残り 10 例では PD-1

例では全例でリンパ球は PD-1 陰性を示した。

陽性リンパ球はほとんどみられなかった。まこれは宿主と腫瘍との間に免疫寛容の状態がた腫瘍細胞からの PD-L1 陽性 4 例では全例で成立していないということではなくて、むしろリンパ球は PD-1 陰性を示した。これは宿主

宿主側の免疫応答の減弱を示唆してる所見とと腫瘍との間に免疫寛容の状態が成立して考えられる。

いないというよりも、むしろ宿主側の免疫応
答の減弱を示唆してる所見と考えられる。したがって EBV 関連陽性の PCNS リンパ腫症例と陰性症例では腫瘍発生の機序に差がある
ことが示唆される。

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表Primary central nervous system lymphomas and relateddiseases: Pathological characteristics and discussionof the differential diagnosis Neuropathology Nov 26,[Epub ahead of print].

参考文献
1. Oyama T et al.(2007) Senile Age-related
EBV-associatedB-celllymphoproliferative

disorders

2.学会発表第 33 回日本脳腫瘍病理学会・2015 年 5 月 29 日・
高松

constitute a distinct clinicopathologic
group:a study of 96 patients. Clin Cancer

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

Res 13:5124-5132

1.特許取得2. Utsukietal(2011)

virus-associated

Epstein-Barr

primary

central無し
無し

ofEBV expression associated with median

3.その他

survival?

無し

Tumor

Pathology

28:145-149
3. Jamal SE et al (2014) Primary central
nervoussystemEpstein-Barrvirus-positive large B-cell lymphoma of
the elderly: clinicopathologic study offivecases.

Brain

Tumor

Pathology

31:265-273

的

い

て

疫

し

つ

例

A.

膜

疾

る

は

炎

が

細

免

EBV 関連陽性の PCNS リンパ腫症例群の方がEBV 陰性の PCNS リンパ腫群に比較して予後が悪い傾向が伺われたが、Log-rank test による検定では有意差は得られなかった (P=0.48)。

②

の

に

E.結論
①

こ

2.実用新案登録

nervous system lymphoma:is incidence
Brain

あ

EBV 関連陽性の PCNS リンパ腫症例群では、腫－ 476 －

つ

連

る

開

も

し、

平成 27 年度新潟大学脳研究所

パ｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

残共同利用・共同研究報告書

ら

脳アミロイドアンギオパチー関連炎症の発症機構の解明

性4

。

が

研究代表者

坂井

ろ

研究分担者

柿田

健二 1）
明美 2）

と

ed
on
6,

日・

1）金沢大学附属病院

神経内科2）新潟大学脳研究所

デジタル医学分野

研究要旨
脳アミロイドアンギオパチー（CAA）は脳や髄膜内の血管へのアミロイドの沈着により生じる疾患である。CAA では沈着した Aβに対する免疫反応によって生じる炎症・血管炎（CAA 関連炎症）を引き起こすことが知られているが、高度な炎症を生じる機序の詳細は不明である。本研究では CAA 関連炎症の発症機構を明らかにするため、炎症や免疫系の活動に関連するサイトカインや蛋白についての定量的な解析や遺伝子多型に関する検討を行い、CAA 関連炎症の発症との関連を明らかにする。方法について、新潟大学脳研究所で病理診断され、Boston criteria の possible CAA 以上を満たす症例についてパラフィンブロックおよび凍結組織を収集する。TREM2 および TGF-β1 の定量的な解析について、免疫組織化学染色やリアルタイム PCR 法を用いた mRNA の定量を行う予定である。また、凍結組織を利用して DNA を抽出し、TREM2、TGF-β1 や apolipoprotein E の遺伝子多型の解析も行う。これらの結果について CAA 群と CAA 関連炎症群を比較検討する。本年度は研究を行うための倫理申請と解析を行う症
例の選択、条件検討のための予備実験を行った。

A.研究目的B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

脳アミロイドアンギオパチー（CAA）は脳や髄CAA のみおよび CAA 関連炎症を生じた症例につ膜内の血管へのアミロイドの沈着により生じる

いて、孤発性 Aβ型アミロイドアンギオパチー

疾患であり、アミロイドβ蛋白（Aβ）の沈着によ（CAA）の遺伝的危険因子で、炎症に関連するサる CAA は 60 歳以上の約半数に認められる。CAA で

イ ト カ イ ン で あ る transforming growthは沈着した Aβに対する免疫反応によって生じる

factor-β1 (TGF-β1)および脳内の免疫系を担当す

炎症・血管炎（CAA 関連炎症）を引き起こすことる細胞であるミクログリアの活動に関連する蛋が知られているが、高度な炎症を生じる機序の詳白であり、アルツハイマー病との関連が報告され細は不明である。本研究では CAA 関連炎症の発症

た triggering receptor expressed on myeloidに関連する危険因子を明らかにするため、炎症や

cells（TREM2）の脳内における発現量を解析し、免疫系の活動に関連するサイトカインや蛋白に

CAA 関連炎症との関連を明らかにする。また、凍ついて定量的な解析を行い、CAA 関連炎症との関結組織より DNA を抽出し、TGF-β1 や TREM2、連を明らかにする。CAA 関連炎症の発症に関連すapolipoprotein E の遺伝子多型についての解析もる危険因子を明らかにし、発症予防や新規治療法行う。
対象とする症例について、新潟大学脳研究所で開発の端緒とすることが目的である。

病理診断され、Boston criteria の possible CAA
以上を満たす症例とし、それらのパラフィンブロ－ 477 －

Biophys Acta 2016;1862:1047-1053.

ックおよび凍結組織を収集する。
脳組織における TREM2 および TGF-β1 の定量的な解析について、TREM2 については、パラフィン

2.学会発表ブ ロ ッ ク を用 い て 免 疫組 織 化 学 染色 を 行 う 。

1. Sakai K, Boche D, Carare R, Johnston D,

TGF-β1 の解析については凍結脳を用いてリアル

Holmes C, Love S, Nicoll J. Aβ immunothreapy

タイム PCR 法を用いた mRNA の定量にて行う。こfor

れらの結果について CAA 群と CAA 関連炎症群を比Alzheimer’s

disease:effectsonapolipoprotein E and cerebral vasculature.

較検討する。

7th World Congress of the International

研究に利用する検体については匿名化が行われている。また、研究計画について、金沢大学医Societyfor

Vascular

Behaviouraland学倫理委員会と新潟大学医学部倫理委員会におCognitive Disorders (Vas-Cog2015 Tokyo),

いて承認済みである。

Tokyo, 2015.9.16-19

1）

2. Sakai K, Boche D, Carare R, Johnston D,
C.研究結果

Holmes C, Love S, Nicoll J: Aβ immunotherapy

平成 27 年度では、新潟大学脳研究所における

for Alzheimer’s disease: effects on apoE

保存検体利用のための倫理委員会への申請およ

and vasculopathy. 第 34 回日本認知症学会学

び承認、必要な検体の準備と金沢大学における予術集会. 青森. 2015.10.2-4

備実験を行った。
対象とする症例について、脳出血を伴う CAA の剖検例では 12 症例、生検例では 31 症例、CAA 関

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

連炎症は剖検例で 2 例、生検例では 7 例の検体が1.特許取得

利用可能であることを確認した。

なし

金沢大学神経内科では遺伝子多型解析のため

2.実用新案登録なしのプライマーの設定と条件の検討を行った。

3.その他
なし

D.考察

た
モ
ユ
は
と局
るト
置

研究の遂行に必要な倫理申請は終了し、すでに承認が得られている。今後は提供を受けた検体を利用し、金沢大学において予定している解析を行
っていく。

A.

着

と

子

定

原

E.結論
研究の遂行に必要な倫理委員会の承認と症例の抽出はほぼ終了しており、今後は金沢大学神経内科において、新潟大学脳研究所より提供された検体を使用した解析を行っていく。

て

験

原

ロ

割

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表
1. Zekonyte J, Sakai K, Nicoll JAR, Weller RO,
Carare RO. Quantification of molecularinteractions between apoE, amyloid-beta(Aβ) and laminin: relevance to accumulationof Aβ in Alzheimer’s disease. Biochim－ 478 －

ト

ス

類

は

解

未

の

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

D,py

筋線維メインテナンスに果たす WWP1 ユビキチンリガーゼの機能の解析

on

e.

研究代表者

al

研究分担者

nd

武田

今村
伸一

道博
1）

笹岡

1）

俊邦

2）

),
1）

2）

国立精神・神経医療研究センター神経研究所

新潟大学脳研究所生命科学リソース研究センター

D,

py

oE

学

研究要旨
ヒト筋ジストロフィーの病因解明及び治療法の開発においては筋ジストロフィーモデル動物を用いた研究から極めて重要な知見を得ることができるため、我々は NH-413 と呼ばれる筋ジストロフィー
モデルニワトリに注目し、分子病態の解析を進めている。この筋ジストロフィーの原因は WWP1 E3
ユビキチンリガーゼ遺伝子のミスセンス変異に因るとされているが、その分子機構は不明である。我々は WWP1 に対する特異抗体を作製し、NH-413 ニワトリの骨格筋に発現する変異型 WWP1 タンパク質の発現と局在が正常型分子とは異なることを明らかにすると同時に、これと同じ変異を導入した WWP1 分子を発現す
るトランスジェニックマウス（Tg マウス）を作製し、表現型を解析した。その結果、ミスセンス変異による１アミノ酸置換が WWP1 を不安定化し、E3 ユビキチンリガーゼ活性を消失させることを明らかにした。

A. 研究目的

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

本研究は NH-413 筋ジストロフィーニワトリに

NH-413 ニワトリはヘテロでも軽度の筋ジスト

着目し、その分子機構を明らかにすることを目的

ロフィー症状を呈するため、N-413 で同定されたとしている。

ものと同じ変異(R436Q)を持つ WWP1 を CAG プロモ

デュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因遺伝

ーターにより発現する Tg マウスを作製して、解子(ジストロフィン遺伝子)とその遺伝子産物が同析に用いた。マウスの骨格筋における WWP1 の局

定されて以来、様々な種類の筋ジストロフィーの在とタンパク質分子の安定性は蛍光組織染色法

原因遺伝子が明らかにされている。これと並行しとイムノブロット法によって解析した。WWP1 分解て自然発生により系統維持されていた筋疾患実

断 片 の 構 造と 酵 素 活 性に 関 す る 解析 の た め 、

験動物の原因遺伝子も明らかにされ、ヒトと同じ

R436Q 変異を特異的に認識する抗体と、E2 分子の原因遺伝子を有する動物モデルはヒト筋ジスト

共有結合に必須な 890 番目のシステイン残基

ロフィーの病態の解明や治療法開発に大きな役(890C)のアミノ基端側を認識する抗体を作製し割を果たしてきた。一方、筋ジストロフィーニワ

た 。 ま た 通 常 の WWP1 検 出 に お い て は マ ウ ス

トリについては、その原因が WWP1 遺伝子のミWWP1(全 918 アミノ酸)の 199 番目から 346 番目まスセンス変異に因るものと報告されたが、これにでのアミノ酸配列を抗原として得られたアフィ

類似するヒト筋疾患は見出されていない。本研究ニティー精製抗体を用いた。R436Q Tg マウスの骨はこの変異型 WWP1 による筋変性の分子機構を格筋におけるα-DG の糖鎖修飾と機能について解明することで、これに関わる分子群を同定し、はイムノブロット法とラミニンオーバーレイ法

未だ原因が明らかにされていないヒト筋疾患とを用いて行った。尚、マウスを用いた本研究は国の関連を検証することも目標としている。

立精神・神経医療研究センター神経研究所の小型－ 479 －

実験動物倫理問題検討委員会による審査と承認ることから、正常型 WWP1 の非存在下での変異型を得て行われた。

WWP1 を発現させ解析する必要がある。α-DG につ
いては R436Q Tg マウスにおいて、糖鎖修飾とラミニ

C.研究結果正常マウス組織における WWP1 の発現は、骨格筋、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、腸、脳で 130 kDa のタ
ンパク質として発現していたが、R436Q WWP1 Tg マ
ウスにおいてはこの 130-kDa 分子に加え、骨格筋と心筋のみに約９０ kDa の分解断片が検出された。この分解物は WWP1 の R436Q 変異を特異的に認識すン結合能について特筆すべき変化は認められず、また、免疫沈降でも DG と WWP1 との結合は示されなかったが、これについても正常型 WWP1 の非存在下での再度解析を行う必要があると考えられた。
E.結論
本研究により我々は NH-436 筋ジストロフィー

る 抗 体 と 反 応 す る の に 対 し 、 130-kDa （ 未 分 解 ）ニワトリに見出された WWP1 遺伝子のミスセンス

WWP1 とは反応しなかったことから、R436 変異型

変異が横紋筋特異的な WWP1 分解を生じ、E3 ユビ

WWP1 のほとんどが分解され 90-kDa 断片となったこ

キチンリガーゼの酵素活性を消失させることをとを示していた。これとは逆に 890C の直前を認識す

明らかにした。また、変異型 WWP1 の発現はα-DG

る抗体は 130-kDa 分子と反応し、90-kDa 断片とは反の糖鎖修飾異常に直接関与しないことが示唆さ時れた。しかしながら、正常型 WWP1 が残存してい短ることの影響を検証する必要があり、今後は WWP1

で遺伝子のノックアウトマウス、或いは変異型 WWP1

率のノックインマウスを用いた解析の必要性が確

技

応せず、分解断片がユビキチンリガーゼ活性を有さないことが示された。一方、Tg マウス骨格筋の免疫組織染色では、NH-413 ニワトリでの結果とは異なり、筋形質膜への局在は消失せず、むしろより強くなると認された。

いう現象が認められた。Tg マウスの骨格筋におけるα-DG の糖鎖修飾については、イムノブロットでもオーバーレイ法によるラミニン分子との結合能評価においても野生型マウスとの間に差は認められなかった。
また、免疫沈降法による解析では変異型或いは正常型 WWP1 と DG 分子との結合を検出することはできな

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表Imamura M, Nakamura A, Mannen H, Takeda S.
Characterization of WWP1 protein expressionin skeletal muscle of muscular dystrophic
chickens. J Biochem, 159, 171-179, 2016

かった。
D.考察
我々の研究から、ニワトリではミスセンス変異による１アミノ酸置換が WWP1 の分解と筋形質膜からの消失を誘起することが示唆されていたが、本研究により、特定のアミノ酸の変化が WWP1 の分解を横紋筋特異的に生 じさ せるこ とを明 らか にする こ とができた 。
NH-413 とは異なり、９０-kDa 消化断片は安定であったが、E3 ユビキチンリガーゼとしての酵素機能を失っ

2.学会発表Imamura M, Nakamura A, Mannen H, Takeda S:
Changes in stability and subcellular
localization of WWP1 protein in skeletal
muscle of muscular dystrophy chickens.
55th
American Society for Cell Biology Annual
Meeting, Dan Diego, USA, December 15, 2015
G.知的財産権の出願・登録状況
なしていることが明らかとなった。また、この消化断片が筋

A.

nu

pa

pr

は

（C

ジ

改

開

ベ

に

新
卵
効
開

B.

形質膜への局在をより強固にしていることが示唆されたが、このニワトリとの違いについては不明である。マをウスでは正常型 WWP1 が野生型マウスと同じレベルので発現しており、これが NH-413 ニワトリとの違いであ20－ 480 －

型

つ平成 27 年度新潟大学脳研究所

ニ｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

ま

共同利用・共同研究報告書

かで

ゲノム編集技術と生殖工学技術を用いた効率的な遺伝子改変マウス作製
中潟 直己 1）
中川佳子1）笹岡俊邦2）

研究代表者
研究分担者

ー
1）熊本大学生命資源研究・支援センター 2）新潟大学脳化学研究所

ス

ビ

を

研究要旨

DG

これまでのノックアウトマウス作製では、ES 細胞を介したキメラマウスの樹立が主流であり、作製までにかなりのさ

時間とコストを要してきた。しかし、近年、ゲノム編集技術を用いた遺伝子改変マウス作製の報告が数多くなされ、い

短時間、低コストな遺伝子改変マウスの作製が可能となった。ゲノム編集技術の開発、改良はかなりのスピード

P1で進んでおり、この技術の発展に同調して遺伝子改変マウスの作製を進めるには、生殖工学技術を活かした効P1

率的な遺伝子改変マウス作製法を確立していくことが不可欠である。本研究では、ゲノム編集技術と生殖工学

確技術を用いて、効率的な脳疾患関連遺伝子改変マウス作製法を確立する。

.
n
c

S:
ar
al
th
al

受精により作製した凍結融解受精卵が CRISPR-Cas

A.研究目的近年、TALEN（transcription activator-like effector

システムによる遺伝子破壊マウスの作製に利用可能

nuclease) や ｃ lustered regulatory interspaced short

か否か明らかとなっていなかった。

palindromic(CRISPR)-CRISPR-associated

CRISPR-Cas システムを用いたゲノム編集では、標的

protein 9 (Cas9) を利用したゲノム編集技術の発展

遺伝子への特異性の低さから、しばしばオフターゲッ

は目覚ましく、これらのプラスミドベクターやｍRNA

ト問題が言及される。そのため、野生型 Cas9 ベクタ（CRISPR-Cas9 では gRNA と mRNA）を受精卵へイン

ーの他、標的配列への特異性を上げるよう開発されジェクションすることにより、短時間、低コストな遺伝子たニッカーゼ型 Cas9 ベクター、FokI 融合型 dCas9

改変マウスの作製が可能となった。ゲノム編集技術のベクターを用いて、同一遺伝子座での遺伝子破壊マ開発、改良はかなりのスピードで進んでおり、新規のウス作製を試みた。

repeatまた、

ベクター開発や効率的な遺伝子改変マウス作製法

CRISPR-Cas 9 ベクターは、1）ガイド RNA と Cas9についての研究が盛んに行われている。本研究では、

ヌクレアーゼ、2）2 つのガイド RNA と Cas9 ニッカーゼ、

新規のゲノム編集ベクターや体外受精および受精卵の凍結保存などの生殖工学技術を用いた、より効率的な 脳疾患関連 遺伝子改変マウス作製法の開発、改良を目的とする。

3）2 つのガイド RNA および FokI ヌクレアーゼと不活性化 Cas9 の融合タンパク質（FokI-dCas9）を発現す
るベクターを構築した。これらの環状 DNA を体外受精により作製した凍結融解受精卵の前核内へインジェクションした。生存卵を偽妊娠雌マウスへ移植し、B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

産子への発生率および変異導入効率の確認を行っ

私達は、体外受精により作製した凍結融解受精卵た。

を用いて、TALEN による効率的な遺伝子破壊マウスの作製が可能であることを報告した（Nakagawa et al.,C.研究結果2014）。しかしながら、C57BL/6 マウスを用いた体外－ 481 －

全ての実験区から標的遺伝子破壊マウスが得られたことにより、体外受精により作製した凍結受精卵はfertilized oocytes. Nakagawa Y, Sakuma T, Sakamoto

CRISPR-Cas システムによる遺伝子破壊マウスの作

T, Ohmuraya M, Nakagata N, Yamamoto T. BMC

製にも利用可能であることが明らかとなった。Cas9 ヌ

Biotechnol., 15: 33, 2015 査読有

クレアーゼの利用では、変異導入効率が最も高く、産子への発生率は最も低かった。一方、Cas9 ニッカ

2.学会発表ーゼの利用では、その逆に、産子への発生率が高い• ワークショップ W3 研究者と技術者が支える実

ものの、変異導入効率は最も低かった。FokI-dCas9

験動物科学の柱を再考する-生殖工学技術の立の利用では、変異導入効率、産子への発生率ともに場から-

バ ラ ンスの とれ た 成績であった （ Nakagawa et al.,

• 凍結受精卵を用いた CRISPR/Cas9 システムによ2015）。本研究では CRISPR-Cas システムを用いて遺る遺伝子破壊マウスの作製

伝子破壊マウスを作製するための有用な知見を提供

第 62 回日本実験動物学会総会 2015 年

京都

することができた。
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
D.考察

該当なし

体外受精により作製した凍結融解受精卵が、様々なゲノム編集技術を用いた遺伝子破壊マウスの作製に利用可能であることが明らかとなった。そのため、今後も C57BL/6 マウスを用いて体外受精を行い、凍こ結保存した受精卵を使用することにより、交配後に採で卵する新鮮受精卵の使用よりも、効率的に遺伝子改リ変マウス作製作業を進める。

皮ゲノム編集技術を利用した受精卵へのインジェク

障ション法では、遺伝子破壊マウスは効率良く作製可維

能であるが、条件的ノックアウトマウスやノックインマウ

らスの作製については、産子への発生率や目的とする変異マウス作製効率がいまだ低く、改善されるべき課題である。そのため、今後は条件的ノックアウトマウス

A.

やノックインマウスの効率的な作製法についても検討を行い、効率的に脳疾患関連遺伝子改変マウスを作陽

製するための研究を進める。

は

（

E.結論

沈

当センターでは、これまで、様々な生殖工学技術

遺の開発、改良のための研究を行ってきた。今回、研御究課題としたゲノム編集技術は、遺伝子改変マウス

が作製のスタンダード技術となりつつあり、生殖工学技

よ術を有効利用できれば、更なるゲノム編集技術の発さ

展および効率的な脳疾患関連遺伝子改変マウスの性作製に貢献できると考える。

TD

白

F.研究発表（上記課題名に関するもの）の

1.論文発表のProduction of knockout mice by DNA microinjection

潟of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed－ 482 －

to
平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

ALS/FTLD における TDP-43 関連軸索内 mRNA 輸送障害の解析

実

立

よ

研究分担者

研究代表者 長野 清一 1）
小野寺 理 2）、西澤 正豊 3）、﨑村 建司 4)、荒木 敏之 1）

1）国立精神・神経医療研究センター神経研究所疾病研究第五部
2）新潟大学脳研究所脳科学リソース研究部門分子神経疾患資源解析学分野
3）同臨床神経科学部門神経内科学分野
4）同基礎神経科学部門分子細胞神経生物学分野
研究要旨
ALS/FTLD-U で神経細胞内に異常沈着する TDP-43 は RNA 結合蛋白質であり、mRNA の輸送に関与することが推測されている。我々はこの TDP-43 による軸索内での特定の mRNA の輸送機能が ALS/FTLD-U
では障害され神経変性を生じると考え、培養神経細胞での検討により同蛋白質の標的 mRNA 候補としてリボソーム蛋白質 mRNA を同定した。本研究では神経特異的 TDP-43 遺伝子欠損マウス由来の培養大脳皮質神経細胞を用いて解析を行い、軸索の伸長障害および軸索でのリボソームによる蛋白質合成能の障害を認めた。これらより TDP-43 はリボソーム蛋白質 mRNA の輸送を介した軸索での蛋白質合成能の維持により神経細胞機能を保っており、その障害が ALS/FTLD-U の発症要因となっている可能性が考えられた。

A.研究目的

遺伝子欠損マウスを用いた解析を行った。

筋萎縮性側索硬化症（ALS）およびユビキチン
陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症（FTLD-U）でB.研究方法（倫理面への配慮を含む）

は RNA 結合蛋白質である TAR-DNA binding protein

神経特異的TDP-43遺伝子欠損マウスはTDP-43（TDP）-43 が病変部位の神経細胞内に異常凝集、

floxマウスとEnolase 2-Creマウスとの交配によ沈着することが知られている。TDP-43 は核内でのり得られたものを用いた。胎生15日齢の胎仔より遺伝子の転写や pre-mRNA のスプライシングの制大脳を摘出して皮質神経細胞の培養を行い、培養御に加え、核外での mRNA の輸送に関与すること

開始2日後に抗βⅢ-チューブリン抗体を用いたが推測されている。我々は TDP-43 の異常沈着に免疫組織染色を行って最も長い神経突起長の計よりその軸索への特定の mRNA の輸送機能が障害

測により軸索長を評価した。さらに培養開始5日

され ALS/FTLD-U における神経変性が生じる可能

後に培地中にピューロマイシン（最終濃度10μ性 を 考 え 、培 養 神 経 細胞 を 用 い た検 討 に よ りg/mL）を1時間添加して新規合成蛋白質の標識を

TDP-43 の輸送標的 mRNA 候補としてリボソーム蛋行い、抗ピューロマイシン抗体を用いた免疫組織

白質 mRNA を同定した。そこで本研究では TDP-43

染色を行って軸索中における蛋白質合成能を評の発現低下が軸索の形成やそこでのリボソーム

価した。本動物実験は国立精神・神経医療研究セの機能に影響を与えるかを明らかにするため、新ンター神経研究所小型動物実験倫理問題検討委

潟大学脳研究所で作成された神経特異的 TDP-43

員会で承認を受けた計画に基づいて実施した－ 483 －

C.研究結果

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

神 経 特 異 的 TDP-43 遺 伝 子 欠 損 （ TDP-43

1.特許取得flox/flox, Eno2-Cre(+)）マウス由来の大脳皮質

長野清一、荒木敏之、上山盛夫、永井義隆．

神 経 細 胞 は コ ン ト ロ ー ル （ TDP-43 flox/flox,

TDP-43 プロテイノパチー治療用組成物．特願

Eno2-Cre(-)および TDP-43 flox/+, Eno2-Cre(+)）

2016-087320．

マウス由来の神経細胞と比較して軸索の伸長が2.実用新案登録不良であった。また神経特異的 TDP-43 遺伝子欠なし

損マウス由来の大脳皮質神経細胞ではコントロ

3.その他

ールマウスに比し軸索でのピューロマイシンのなし

取り込みが低下しており、同部位でのリボソームによる蛋白質合成能の低下が認められた。
D.考察
我々が同定した TDP-43 によるリボソーム蛋白
質 mRNA の軸索への輸送機能が神経特異的 TDP-43
遺伝子欠損マウスの神経細胞では障害され、それにより軸索での局所蛋白質合成能が低下して軸索の伸長不全が生じることが示唆された。今後さらに TDP-43 によるリボソーム蛋白質 mRNA の詳細な輸送機構や軸索局所でのリボソーム機能障害

期
が
し
AQ
て
え

と神経変性との関連につき、明らかにする必要が
ある。

A.

E.結論
ALS/FTLD-U において TDP-43 の細胞内異常沈着

scに伴う神経変性の機序として、同蛋白質によるリがボソーム蛋白質 mRNA 輸送の障害を介した軸索で患の局所蛋白質合成能の低下が関与する可能性が約考えられた。

族

dis
F.研究発表(上記課題名に関するもの)

が

1.論文発表過なし

究2.学会発表ン

S. Nagano, S. Hirokawa, M. Nishizawa, K.

いSakimura,

TDP-43りtransports mRNA of ribosomal proteins. 第 56

過回日本神経学会学術大会．平成 27 年 5 月．新潟．

AL

O.

Onodera,T.

Araki.

S. Nagano, S. Hirokawa, M. Nishizawa, K.
Sakimura,O.

Onodera,T.

Araki.

TDP-43transports mRNA of ribosomal proteins. 第 38回日本分子生物学会年会、第 88 回日本生化学会

髄

ne

少

少

大会合同大会．平成 27 年 12 月．神戸．

－ 484 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

願

共同利用・共同研究報告書

筋萎縮性側索硬化症脊髄における VGF の局在に関する研究
研究代表者
研究分担者
1)

嶋澤 雅光

1）

野田 泰裕 1)、原 英彰 1)、柿田 明美 2)

岐阜薬科大学 薬効解析学研究室2)

新潟大学脳研究所 脳疾患標本資源解析学分野

研究要旨
我々は、VGF の発現を増加させる薬剤が ALS（筋萎縮性側索硬化症）モデルマウスにおいて発症時期および生存期間を延長することを明らかにした。また、ALS 患者の脊髄における VGF 陽性細胞数が減少していることを明らかにした。VGF は prohormone convertase などの酵素により切断され、生成したペプチドが生理活性を持つ。我々の過去の検討より、ALS 病態に対して VGF 由来ペプチド
AQEE-30 が保護作用をもつ可能性が示唆されている。しかし、VGF の産生細胞や産生組織は特定されておらず、これらを明らかにすることで、VGF の病態に対する関与を明らかにすることができると考える。そこで今回、ヒト ALS 患者のサンプルにおいて in situ hybridization 法を用いて解析を行う。

A.研究目的して起こることが示唆されている (1)。

筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 （ Amyotrophic lateral

VGF は、中枢あるいは抹消の神経細胞や膵臓、

sclerosis: ALS）は上位および下位運動ニューロン

下垂体前葉、副腎髄質、消化管等の内分泌細胞にが選択的かつ進行性に変性、脱落する神経変性疾

発現している分泌ポリペプチドであり、プロセッ患である。多くの症例は孤発例 (約 90%) であり、シングによって生じる様々なペプチドが生理活

約 10%は家族性に発症すると考えられている。家性を有する。VGF は摂食行動やエネルギー恒常性

族 性 の 遺 伝 子 変 異 と し て 、 Cu/Zn superoxideの維持に関与することや、うつ病の改善や海馬シ

dismutase1 (SOD1) 遺伝子のミスセンス変異など

ナプスの可塑性増進、海馬歯状回の神経新生に関が報告されており、ヒト変異 SOD1 (SOD1

G93A

) を

与することが報告されている。過去の研究により、過剰発現させたトランスジェニックマウスが研

パーキンソン病、N-methyl-D-aspartat 誘発高眼圧網究に用いられている。治療薬としては、グルタミ膜障害などの神経変性を来す病態モデルマウス

ン酸放出抑制薬であるリルゾールが用いられてに対し、VGF の発現誘導剤は神経保護作用を示す

いるが、病態の進行抑制効果は約 3 ヶ月程度であことが明らかになり、神経保護作用を有する VGF

り、より有効な新規治療薬の開発が望まれている。

由来ペプチドの存在が示唆された。また、ハンチ

過去の報告において、孤発性 ALS の患者およびントン病モデル細胞において、VGF 前駆タンパク

ALS モデルマウスである SOD1

G93A

マウスの脳脊質の C 末端 30 アミノ酸からなる AQEE-30 が神経髄液において、分泌ポリペプチドである VGF

保護作用を示すことを明らかにしている (2)。さnerve growth factor inducible (VGF) の発現量が減

らに、VGF の発現誘導剤は ALS モデルマウスに

G93A

マウスにおいて VGF の減対して神経保護作用を示すことが報告されてい少は ALS の主要評価項目である筋力低下に先行る (3)。これらより、VGF 由来ペプチドは ALS に少しており、SOD1－ 485 －

対して保護作用を持つ可能性が示唆される。しか得た上で行う。

In

し、ALS 病態における内在性の VGF 発現は脳脊髄液中でしか検討されておらず、その産生細胞などは明らかにされていない。本検討では in situ
hybridization 法等を用いて ALS 患者組織切片において、VGF の発現部位や発現量の変化などを詳細に検討する。

C.研究結果2015 年 10 月 23 日(金)に共同研究の方針につい

2:て、新潟大学脳研究所脳疾患標本資源解析学分野

an

教授

明美先生と打ち合わせを行なった。

Ph

その会議で、本研究課題についての今後の方針に10

柿田

ついて議論した。その打ち合わせにより、古典的
ALS では脊髄と並行して大脳皮質運動野も障害

B.研究方法(A3:ce

RNA プローブの作製を岐阜薬科大学においてされるため、サンプルが限られている脊髄で検討行う。標的配列および設計したプライマーを示す。

を行う前に、運動野パラフィン切片で検討を行っ

ofてはどうかとご提案していただき合意した。現在、9;5

岐阜薬科大学生命倫理委員会の許可を得ており、新潟大学の倫理申請審査中である。岐阜薬科大学
において in situ hybridization のプローブ作製を進めている。両倫理委員会の許可を受けた上で、新Blend taq plus (Toyobo) を用いて、PCR 反応を行い、目的配列を増幅する。Template DNA には VGF 過剰発現プラスミドベクターを用いた。PCR 産物を潟大学よりサンプルを受領次第染色を開始する。
D.考察

1 %アガロースゲルを用いて電気泳動し、トラン

ヒト VGF に対する RNA プローブに関しては過スイルミネーターで観察しながら切り取ったゲ

去に使用実績が無いため、独自に設計を行った。

ル 小 片 を NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up(TAKARA Bio) を用いて精製する。

E.結論
サンプルが届き次第実験を開始し、2016 年 6 月

pGEM-T (Easy) vector systems を用いて、PCR 産物
を vector へ導入し、コンピテントセル (Nippon

頃を目途に結果を報告する予定である。

gene) へトランスフォーメーションを行い、Amp(+) 寒天 LB 培地で培養する。翌日に数コロニーを選択し、液体 LB 培地 5mL 中で培養を行った後、
PureYield™ Plasmid Miniprep System (Promega)を用
いてプラスミド DNA を回収する。M13 プライマ

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし
2.学会発表なし

ーおよび target sequence 3’プライマーを用いてPCR を行い、導入遺伝子の挿入方向を確認した後、制限酵素 SalⅠを用いてプラスミド DNA を 1 本鎖化する。得られた 1 本鎖 DNA を template とし、
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) (Sigma) を用いてDIG 標識 RNA プローブを得る。 サンプルが届き次第染色操作を行う。
本研究は新潟大学脳研究所で「病理解剖ならびに病理検体保存とその使用に関する承諾」が得られている症例を用い、新潟大学医学部倫理委員会の承認 (申請中) および岐阜薬科大学生命倫理委
員会の承認 (承認番号: 岐阜市薬会第 334 号) を

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし
2.実用新案登録
なし
3.その他
なし
[参考文献]
1: Zhao Z. et al., Vgf is a novel biomarker associatedwith muscle weakness in amyotrophic lateral sclerosis－ 486 －pr

(ALS), with a potential role in disease pathogenesis.
Int J Med Sci. 2008 Apr 15;5(2):92-9.

い2: Noda Y., VGF and striatal cell damage in in vitro

野and in vivo models of Huntington's disease.

た。

Pharmacol Res Perspect. 2015 Jun;3(3):e00140. doi:に10.1002/prp2.140.

的

害

討

3: Shimazawa M. et al., An inducer of VGF protects
cells against ER stress-induced cell death andprolongs survival in the mutant SOD1 animal models

っ

of

在、

9;5(12):e15307.

familial

ALS.

PLoS

One.

2010

Dec

り、

学

進

新

る。

過

た。

月

ed

sis
－ 487 －

同
平成 27 年度新潟大学脳研究所

C.

｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

しＣ

神経回路の興奮性に対する CB2 受容体の役割の解明

受

狩野

佑樹 1）
方伸 1）

崎村

建司 2）

／

研究代表者

菅谷

研究分担者
研究分担者

て

割

も
1）東京大学大学院医学系研究科

2）新潟大学脳研究所

ら

ス
研究要旨

酸

近年、カンナビノイドＣＢ２受容体が中枢神経系においても発現し、何らかの機能を持っている可能

死性が示唆されている。本研究では、遺伝子改変技術により作出したＣＢ２受容体コンディショナルノッ

2

クアウトマウスやＣＢ２受容体の薬理学的阻害を用いて、神経回路の興奮性におけるＣＢ２受容体の役割

ウを明らかにすることを目的とした。野生型マウスにおけるＣＢ２受容体単独の薬理学的阻害では、カイ受

ニン酸誘発発作に影響が認められなかったが、ＣＢ１ノックアウトマウスではＣＢ２受容体の薬理学的阻

高害によって発作が重篤化した。また、野生型マウスにおいてＣＢ１受容体との共阻害によりてんかん焦ド点の形成を促進する効果が認められた。この結果から、ＣＢ２受容体が神経回路の興奮性を抑制する可化能性が示唆された。現在、ＣＢ２受容体の中枢神経系における機能をより詳細に明らかにするためにＣがＢ２コンディショナルノックアウトマウスを作成中である。

んの究所の崎村教授と共同で神経細胞特異的ノック

A.研究目的D.

内因性カンナビノイドは生体において合成さアウトマウスを作出し、行動学的、生理学的、解れる脂質メディエーターであり主に神経系、免疫剖学的解析を行い、ＣＢ２受容体の中枢神経系に神系において重要な役割を担っていると考えられおける役割を明らかにすることを目的とする。

よたている。神経系に強く発現しているカンナビノイ
ドＣＢ１受容体はシナプス伝達を逆行性に抑制しB.研究方法（倫理面への配慮を含む）に学習や情動、食行動、神経細胞保護に重要な役割

興奮性細胞特異的にＣＢ２受容体を欠損したマ身を果たしていることが報告されている。もう一つウスを作出する目的で、ＣＢ２ｆｌｏｘｅｄマウ

発のカンナビノイド受容体であるＣＢ２受容体は免スをＣ５７ＢＬ／６系統で作出し、興奮性細胞でま

疫系細胞に発現し、免疫反応を抑制していること

Ｃｒｅを発現するＥｍｘ１－Ｃｒｅマウスと交Ｃが報告されている。しかし近年、ＣＢ２受容体が配する。これらのマウスを用いて電気生理学的、

抗中枢神経系に発現し、神経細胞の機能を調節して行動学的に解析する。特にＣＢ２受容体の活性化

関いる可能性を示す報告が多くされている。ただ、が回路の異常興奮やてんかん発作を抑制する可ク

ＣＢ２受容体の抗体染色は世界的にいまだ成功し能性があるとの結果が得られていることから、カじておらず、神経細胞特異的ノックアウトマウスをイニン酸や電気刺激によるてんかん誘発試験をと用いた研究もないことから、神経細胞における発行う。並行して、ＣＢ２受容体シグナルの急性阻用現と機能は明らかになっていない。本研究はカン

害と長期阻害では異なる影響があることが報告がナビノイドＣＢ２受容体について、新潟大学脳研されていることから、薬理学的な急性阻害を行い、－ 488 －

同様に解析する。

E.結論
ＣＢ２受容体の活性化は神経回路の異常興奮を抑える可能性が示唆された。今後はコンディショ

C.研究結果
現在、ＣＢ２ｆｌｏｘｅｄマウスを樹立に成功

ナルノックアウトマウスを用いた細胞特異的なし、薬剤耐性カセットの除去を行っている。今後、

ＣＢ２受容体の欠失による機能解析が必要である。

Ｃｒｅマウスと交配し、解析対象の動物を作出して解析に供する。
ノックアウトマウスの作成と並行して、ＣＢ２受容体の薬理学的な阻害によるＣＢ２受容体の役

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし

割の検討を行った。その結果、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスではＣＢ２受容体阻害薬を投与して2.学会発表もカイニン酸誘発性てんかん発作に影響は認め

Gordonられなかったが、ＣＢ１受容体ノックアウトマウ

Function in the CNS・2015 年 5 月 24-29 日・ル

スではＣＢ２受容体阻害薬の投与によりカイニン

ッカ、イタリア

Research

Conference:

Cannabinoid

酸誘発性てんかん発作開始までの潜時が短縮し、能死亡率が有意に上昇した。内因性カンナビノイド

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

ッ

2 アラキドノイルグリセロールを産生できないマなし

割ウス（ＤＧＬαノックアウトマウス）でもＣＢ１

イ受容体ノックアウトマウスより発作潜時が短く

阻

高い死亡率が認められた。したがって、2 アラキ

焦ドノイルグリセロールによるＣＢ２受容体の活性可化がてんかん発作の悪化を阻止している可能性

Ｃが示唆された。また、長期間の発作誘発によるて

クんかん回路の形成もＣＢ １受容体とＣＢ ２受容体の共阻害によって促進した。
D.考察

解

以上の結果から、ＣＢ２受容体シグナリングはに神経回路の興奮性を抑制し、てんかん発作重積による死亡率を低下させる働きがあると考えられた。さらにてんかんの進行に伴う回路変化の過程にも影響する可能性が示唆された。本実験では全マ身投与による薬理学的阻害を用いており、作用をウ

発現している細胞種の特定ができなかった。これ

でまでの報告によると中枢神経系の神経細胞での交ＣＢ２受容体ｍＲＮＡの発現が認められているが、的、抗体染色による受容体の発現パターンの解析に化

関しては信頼性の高い報告がない。今後は、ノッ

可クアウトマウスをもちいた抗体の作成などを通カじて、解剖学的な発現パターンを明らかにするとをともに、コンディショナルノックアウトマウスを阻用いてスライス電気生理による詳細な機能解析

告が必要である。

い、－ 489 －

C.
平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

ー

共同利用・共同研究報告書

大石

タウオパチーにおける運動ニューロン障害の病理学的研究

タ

AL
研究分担者

研究代表者 吉田 眞理 1）
三室マヤ 1）、岩崎靖 1）、柿田明美 2）、桑野良三 3）が3

ta1）愛知医科大学加齢医科学研究所 2）新潟大学脳研究所病理学分野
3）同附属生命科学リソース研究センター遺伝子機能解析学分野

ー

の

【
研究要旨

階

臨床的に運動ニューロン疾患との鑑別が問題となったタウオパチーを抽出し、病理学的特徴を解析した。

て剖検 5400 例中、ALS、FTLD-MND、PLS との鑑別が問題となった 3 症例が存在し、2 例は上位および下位運科

動ニューロン系などに 4 リピートタウ陽性封入体を形成する globular glial tauopathy（GGT）と診断された。GGT 症例は中心前回と錐体路に高度な変性を示し、小球状タウ陽性オリゴデンドログリア封入体が多数出現した。脊髄錐体路では小径線維の脱落が強く、大径線維は残存する傾向を認めた。脊髄前角などの下位運動ニューロンにはタウ陽性封入体が出現するものの、細胞脱落は比較的軽度に留まり、

仮

舌

関

脊髄前根の大径軸索の脱落は軽度であった。GGT では、TDP-43 proteinopathy type B の病理像に比しニて、上位と下位運動ニューロン系の軸索障害の選択性や程度に相違がある可能性が示唆された。

観下筋
A.研究目的B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

HD

筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 （ amyotrophic lateral

愛知医科大学加齢医科学研究所に蓄積された

sclerosis, ALS）、あるいは前頭側頭型認知症を

5400 例の剖検例中、運動ニューロン疾患との鑑別

伴う運動ニューロン疾患（frontotemporal lobarが問題となったタウオパチーの症例を抽出し、上degenerationdisease,

位および下位運動ニューロン障害の特徴を検討

FTLD-MND）では 95％以上の症例で通常 TDP-43

した。また新潟大学脳研究所内で、運動ニューロ

無proteinopathy による神経細胞封入体と細胞障害

ン障害を呈したタウオパチーの症例の病理像を従を認める。一方、臨床的に ALS、FTLD-MND、ある

参照した。

疎

with

motor

neuron縮以側

い は 原 発 性 側 索 硬 化 症 （ primary lateral

病理学的検索は、中心前回を含む前頭葉、側頭な

sclerosis、PLS）との鑑別が問題となる症例の中葉、頭頂葉、後頭葉、基底核、視床、中脳、橋、

死に、タウオパチーが存在し、中心前回や脊髄前角

延 髄 、 小 脳 、 脊 髄 の 各 髄 節 、 HE 、 KB 染 色 、などの運動ニューロン系に封入体を形成する。

Gallyas-Braak 染色、AT8,RD3,RD4 免疫染色、CD68,

TDP-43 proteinopathy とタウオパチーにおける運

リン酸化ニューロフィラメント、リン酸化 TDP-43

動ニューロン障害の類似点と相違点を比較し、タの免疫染色を施行し、上位および下位運動ニュー

ウオパチーにおける運動ニューロン系障害の特ロン系の変性を評価した。また剖検時にグルターの徴を病理学的に検討する。この相違点は、臨床像ル固定した頚髄、胸髄、腰髄の錐体路と前根を観はや検査所見に反映され、生前により正確な診断に

察した。

回

到達できる可能性が考えられる。

【

の

は

を

化

視

－ 490 －

、

た

別

上

討

黒質、青斑核の細胞脱落を認め、動眼神経核はよC.研究結果5400 例中アルツハイマー病を除くタウオパチ

く残存し NFT はみられなった。小脳歯状核、上小ーは、ピック病 5 例、進行性核上性麻痺 110 例、脳脚はよく保たれていた。脊髄は前側索の萎縮、大脳皮質基底核変性症 33 例、嗜銀顆粒病 86 例、石灰化を伴う神経原線維変化病 5 例、分類不能のタ ウ オ パ チ ー 14 例 で あ り 、 こ の 中 で
ALS/FTLD-MND/PLS との鑑別が問題となった症例
3 例 中 2 例 は 病 理 学 的 に globular glial

ニッスル小体は比較的保たれるものが散見され

tauopathy（GGT）の病理像を示し、1 例は 3 リピ

た。錐体路は中心前回から皮質下白質、内包後脚、ートと 4 リピートのタウオパチーを示した。GGT

大脳脚錐体路、橋縦束、延髄錐体、脊髄錐体路との 2 例中 1 例の臨床病理像を報告する。

連続した変性を認めた。

【症例】82 歳女性。74 歳から右手の書字障害と、階段の上りにくさを自覚した。76 歳右手で箸を持てず歩行障害が進行したため ALS を疑われ神経内科に紹介された。会話は緩徐で言葉が出にくく、
仮面様顔貌を認めた。眼球運動と挺舌はほぼ正常、舌の萎縮はなかった。頚部は固縮し、右上肢の肘関節は屈曲位で自動運動がほとんどなく、ジスト
ニアを認めた。利き手は右で書字は困難、左手は観念運動失行を認めた。両下肢は右優位の筋力低下と固縮があり起立は困難、四肢深部反射は亢進、筋萎縮や線維束収縮はなく、感覚障害はなかった。
HDS-R 26/30。頭部 MRI では左前頭から頭頂の萎以上から臨床的に大脳皮質基底核変性症、原発性側索硬化症を疑った。78 歳から四肢は屈曲拘縮で従命不可、強制泣きを認めた。79 歳時には、意思疎通困難となり、80 歳嚥下障害のため経管栄養と頭なった。声をかけると視線を向けた。82 歳肺炎で

橋、

死亡した。

ー

Gallyas-Braak, AT8、RD4 免疫染色では皮質、白質、基底核、脳幹部などに oligodendroglia

優位に globular inclusion（GOI）を多数認め、
太 い coiled body の 形 態 も 多 く み ら れ た 。
Astrocyte の封入体は少数で、 tufted-astrocyte
や astrocytic plaque はなかった。大脳皮質の神経細胞には少数の pretangle を認めた。脊髄前角に は GOI と と も に 大 型 運 動 ニ ュ ー ロ ン に もG-B,AT8,RD4 陽性封入体を認めた。GOI などのグリア封入体の出現は中心前回、運動前野に多数認め、それ以外の前頭側頭葉では出現量はかなり減少した。

縮、SPECT では左中心前回の血流低下を認めた。

を43るものが多いものの、細胞脱落の程度は比較的軽度に留まっていた。Bunina 小体の出現はみられず、

ロ

8,たが、大型の運動ニューロンの細胞は萎縮していが分類不能のタウオパチー14 例中 3 例にあった。

無動、言語はあいさつのみで、挺舌や眼球運動は、淡明化を認め前角は萎縮しグリオーシスを認め

リン酸化ニューロフィラメントの免疫染色では、脊髄錐体路の軸索脱落は大径小径ともに高度であったが、高度な脱落であるにもかかわらず大径線維の残存傾向を認めた。脊髄前根の大径軸索
は頚髄、胸髄、腰髄のいずれのレベルでも残存を認めた。グルタール固定した脊髄錐体路は有髄線
維の強い脱落を認めるが、大径線維の一部残存を認め、前根においても大径有髄線維の残存を認め【病理所見】肉眼的所見：脳重 1090ｇ。左優位の両側の中心前回、運動前野の高度萎縮、割面では前頭葉皮質、白質、脳幹の萎縮、黒質、青斑核

ーの褪色を認めた。小脳歯状核は保たれ、脊髄前根

観は肉眼的に保たれていた。組織学的所見：中心前
回、運動前野皮質は強い細胞脱落とグリオーシスを認め、皮質下白質は U-fiber を含めて萎縮淡明

た。リン酸化 TDP-43 の免疫染色では、海馬、海馬傍回、前頭葉の神経細胞やグリア細胞に dot 状の陽性像を認め、脊髄前角にも少数の dot 状の陽性像を認めた。
老人性変化は NFT/AT8 stage III, argyrophilic
grain は Saito stage III。以上の所見から本例は GGT と病理診断した。

化を示した。基底核では被殻、淡蒼球、視床下核、視床の軽度の細胞脱落とグリオーシスを認めた。

－ 491 －

【遺伝子検索】

軽く、上位と下位運動ニューロン系の軸索障害の凍結保存脳から解析したタウの遺伝子には選択性や程度に相違がある可能性が示唆された。

MAPT 遺伝子変異は確認されなかった。APOE タ

参考文献

イピングは 3/3 であった。

1.

Ahmed Z, et al. Acta Neuropathol 122:415-428, 2011

2.

Ahmed Z, et al. Acta Neuropathol 126: 537-544, 20133.

Fu YJ, et al. Acta Neuropathol 120: 21-32, 2010

4.

Takeuchi R, et al. Brain Pathol 2015 March 18

D.考察
GGT は、従来分類不能とされていた 4 リピート
（4R）タウオパチーの中から、グリアに小球状のタウ封入体が蓄積する一群として Kovac らにより提唱された疾患である 1、2)．GGT は多彩な症状を示し、前頭側頭型認知症（frontotemporal（progressive non-fluent aphasia: PNFA），進

F.研究発表1.論文発表佐々木良元他．認知症を伴う筋萎縮性側索硬化症

行性核上性麻痺（progressive supranuclearの臨床像を呈した globular glial tauopathy のpalsy: PSP）
，大脳皮質基底核変性症

１剖検例（現在投稿中）

dementia: FTD）、進行性非流暢性失語症（corticobasal degeneration: CBD）
， PLS などと臨床診断される．GGT は病理学的に，封入体が2.学会発表前頭側頭葉に分布するタイプ I，運動野と錐体路

吉田眞理他．第 56 回日本神経病理学会総会学術に分布するタイプ II，前頭側頭葉と錐体路の両方

研究会 2015 年 6 月福岡市に分布するタイプ III の 3 型に分類される。本例
は運動野と錐体路に高度の変性、前頭側頭葉と脊G.知的財産権の出願・登録状況

髄前角にも GOI などの広がりがあることからタイプ III に相当すると考えられた。GGT には PLS や
ALS との鑑別が問題となる症例が報告されている。

なし

こ

ア

末

検

変

確

TD

る

A.

3、4)

GGT における上位および下位運動ニューロン系の障害が、異なる蛋白である TDP-43

的

孤

（

proteinopathy による運動ニューロン系の障害と類似しているのかあるいは相違があるのか、相違があるとするとどの様な相違がありこれが臨
床像にどのように反映するのかが問題である。今回の少数例の検討では、GGT では、大径軸索の選択性障害はやや弱く、小径線維の障害がより優位である可能性が示唆された。通常の ALS では錐体路は大径優位に大径線維と小径線維が脱落する。
このため、TDP-43 proteinopathy による ALS より、筋萎縮や筋力低下、あるいは筋電図での神経原性変化などの臨床的な LMN の症候はより軽く、タウと TDP-43 では異なる細胞障害機序が推測された。

て

発

染

伝

お

か

が

領

工

Nu

欠
C

理

E.結論
タウオパチーの中で、新たな 4R タウオパチーの 一 群 と し て 確 立 さ れ た GGT で は 、 TDP-43
proteinopathy に比して、大径軸索の障害がより－ 492 －

め

の

た。

3

症

の

術

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

内在性 TDP-43 遺伝子改変と筋萎縮性側索硬化症モデルへの応用

研究分担者

研究代表者 佐藤 俊哉 1）
大久保 直 1）、東 貞宏 1）、小野寺

1）北里大学医学部実験動物学

理 2）2）新潟大学脳研究所

研究要旨
Zinc-Finger Nuclease（ZFN）を用い、内在性 TDP-43 C 末領域の部分欠損マウス 8 系統を樹立した。
この系統は特性により 3 種に大別され（A〜C 系統）、150 アミノ酸残基からなる C 末領域の中央部 6
アミノ酸までの欠損（A 系統）では、ホモマウスにおいても明らかな異常を指摘できなかったが、C末領域の約半分程度を欠損（B・C 系統）させると致死となり、TDP-43 機能が失われた。蛋白レベルで検討すると、前半部分欠損（B 系統）では 36 kDa の変異蛋白が確認されたが、核から細胞質に局在が変化し、核蛋白としての TDP-43 機能が失われた。一方、後半部分欠損（C 系統）では僅かなバンドが確認されるのみであり、変異蛋白が何らかの品質管理を受けていると考えられた。これらの結果から、TDP-43 C 末領域の前半部分は機能維持に重要であり、後半部分は蛋白の安定性維持に重要な領域であることが明らかとなった。
A.研究目的B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
第 1 世代のゲノム編集技術である ZFN を用い、筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、運動神経特異的な変性を特徴とする神経難病である。2006 年秋、TDP-43 C 末領域の中央部を標的とした部分欠損マ

孤発性 ALS に認められるユビキチン陽性封入体

ウ ス を 作 成し 、 そ の 変異 の 効 果 を検 討 し た 。

（skein-like inclusion）の主要な構成蛋白としTDP-43 の残存活性に関しては、既に TDP-43 ノッて TAR DNA-binding protein 43 kDa（TDP-43）がクアウトマウスが着床早期に死亡することが報発見された。さらに研究分担者の小野寺らは、常告されていることから、各系統のホモ接合体マウ

染色体性優性遺伝形式を示す家族性 ALS の原因遺スを作成し、その死亡時期により評価した。次に伝子として TDP-43 を再発見し、ALS の発症機序に

ヘテロ接合体マウスの大脳から mRNA を抽出し、おいて TDP-43 が一次的な役割を担うことを明ら

qPCR 法を用いて TDP-43 mRNA 発現量を測定するこかにした。しかし現在までに多くの TDP-43 変異とにより、オートレギュレーション機構の関与をが報告されているが、その変異が TDP-43 の C 末検討した。また変異 TDP-43 蛋白の細胞内局在変領域に集中している理由は不明である。そこで人化などを検討するため、細胞分画とウェスタンブ

工制限酵素技術の先駆けとなった Zinc-Finger

ロット、あるいは病理学的解析により解析した。

Nuclease（ZFN）を用い、内在性 TDP-43 C 末領域

なお、本研究における遺伝子組換え実験は、北欠損マウスの作成を計画した。この研究により、

里大学医学部遺伝子組換え実験安全管理委員会、C 末領域の生理的機能を理解するとともに、そのおよび北里大学遺伝子組換え実験安全委員会の理解に基づき、全く新しい ALS モデルの開発を進審査と学長の承認を受けて実施した。また動物実めることを目的とする。

験は、北里大学医学部動物実験委員会の審査と医学部長の承認を受けて実施した。

－ 493 －

C.研究結果

領域の残りと C 末の終端領域を含む後半部分が蛋

ZFN を用いて内在性 TDP-43 C 末領域の部分欠損

白の安定性維持に重要であることが明らかにさマウス 8 系統を樹立した。この 8 系統を塩基配列れた。特に強調すべきは、36 kDa の前半部分欠損から推定される蛋白構造により分類すると、150蛋白の挙動で、核移行シグナル（NLS）が残ってアミノ酸残基からなる TDP-43 C 末領域の（A）6

いるにも関わらず核内に移行しない現象で、このアミノ酸までの欠損、（B）前半部分欠損、（C）後原因を検索することが、TDP-43 の核内外シャトル

半部分欠損の 3 種に大別され、グループ毎に異な機構の解明、さらに細胞質内での凝集体形成機構

る特性が認められた。

の究明につながる可能性がある。

6 アミノ酸までの欠損（A 系統）では、ホモマ

本研究は。新潟大学脳研究所で樹立したマウス

ウスは正常に生まれ、明らかな表現型の異常も認を用いた結果であるが、既に報告された培養細胞

められなかった。ウェスタンブロットでは、アミによる結果とは大きな乖離がある（Ayala et al.

ノ酸欠損に応じたバンドシフトが認められたが、J Cell Sci 2008 121: 3778-85）。これが意味す

TDP-43 mRNA 量は野生型と変わらず、TDP-43 機能

ることは、TDP-43 の生理的機能を正確に理解するには著明な変化は無いものと推定された。

ためには個体レベルでの解析が必須であり、新潟

一方、TDP-43 C 末領域の約半分程度を欠損（B・C 系統）させると、ホモマウスが主に着床前後に

大学脳研究所のリソースを用いた共同研究を継続することが重要であると考えている。

致死となり、TDP-43 機能が失われた。両系統のヘテロマウスは、体格の小さい 1 系統を除き、正常

ア

デ

で
E.結論

学

に生まれた。全ての系統で TDP-43 mRNA 量は野生

TDP-43 C 末領域の前半部分は機能維持に重要で開型に比して増加し、TDP-43 機能の低下を補正するあり、後半部分は蛋白の安定性維持に重要な領域

ハ

オートレギュレーション機構の関与が示唆されであることが明らかとなった。

Trた。しかしヘテロマウスの脳を用いて蛋白レベルで検討すると、両系統に大きな相違があった。前
半部分欠損（B 系統）では、36 kDa の変異蛋白が確認されたが、核から細胞質に局在が変化し、核蛋白としての TDP-43 機能が失われることが明らかとなった。他方、後半部分欠損（C 系統）では僅かなバンドが確認されるのみであり、変異蛋白が何らかの品質管理を受けている可能性が高いと考えられた。
最後に、B 系統に認められた 36 kDa の変異蛋白の挙動を病理学的に解析したが、変異蛋白は細胞質内に比較的均一に分布し、明らかな凝集体形成は認められなかった。

細F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表該当なし
2.総説・著書発表
佐藤俊哉：TDP-43 の生理的機能と ALS 病態における意義. 北里医学 45(2): 79-85, 2015
3.学会発表該当なし
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
該当なし

D.考察

A.

し

い

（

し

基

自

社

究

な

(1

TDP-43 C 末領域は、グリシンリッチ領域（GRR）、

ES

Q/N 領域、C 末の終端領域に分類することができメるが、その 3 領域全てに ALS 変異が認められる。

ネ

しかし、この 3 領域の機能的差異は明らかではな

工く、領域内に生じた変異による機能的変化を推定をすることも難しい。本研究から明らかにされた点のは、GRR と Q/N 領域の約半分を含む TDP-43 C 末領

盤域の前半部分が機能維持に重要であること、Q/N－ 494 －

蛋

さ平成 27 年度新潟大学脳研究所

損｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣て共同利用・共同研究報告書

の

ル

構

アメリカ平原ハタネズミ(Prairie Vole)からの ES 細胞樹立条件の検討、及び CRISPR/Cas9 法による遺伝子 KO ハタネズミ作出の試み

ス

研究代表者

西森

胞

研究分担者

崎村

克彦 1）
建司 2）

l.

す

1）東北大学農学研究科･応用生命科学専攻 2）新潟大学脳研究所細胞神経生物学分野

る

潟

研究要旨

継

高度な社会性を持つ北米原産平原ハタネズミ(ハタネズミ)は、社会性低下を伴う神経疾患研究のモデル動物として注目されるが、遺伝子変換系が整備確立されていない大きな弱点を持つ。本共同研究
で我々は遺伝子 KO ハタネズミ作成を目指し、ハタネズミ ES 細胞，又は同 iPS 細胞の樹立と、生殖工学確立による胚盤胞への当該細胞導入によるキメラ作成より、遺伝子操作ハタネズミを作成する技術で開発を計画した。並行し、受精卵への CRISPR/Cas9 法適用によるオキシトシン受容体(OXTR)遺伝子 KO

域

ハタネズミ作成を計画した。ES/iPS 細胞樹立に関しては、正常初代繊維芽細胞へ６因子を PiggyBac

けTransposon により導入し、三胚葉分化能等を保持しマウス ES 細胞の性質と極めて近いハタネズミ iPS
細胞を樹立した。また、CRISPR/Cas9 法により、受精卵より OXTR 遺伝子 KO ハタネズミを取得した。

A.研究目的ミ作成の技術を開発する事、を本研究の研究目的

社会性の低下を伴う神経疾患のモデル動物ととした。その為、①ハタネズミ iPS 細胞の樹立をして高度な社会性を持ちながら齧歯類として扱試み、並行して②ハタネズミ受精卵へガイド RNA

いが容易であるアメリカ平原ハタネズミと Cas9mRNA を導入する事で、OXTR 遺伝子の破壊（Prairie vole）より、その遺伝子を破壊･操作を試みる事とした。

したモデル動物を作成し、社会性を支える遺伝子
基盤、神経回路基盤などの研究を進めることは、

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

自閉症を始め、統合失調症や鬱病、認知症など、

27 年度は、iPS 細胞樹立の為の最新技術をハタ

社会性の低下を伴う様々な神経疾患の基礎的研

ネ ズ ミ 胚 より 得 た 初 代繊 維 芽 細 胞に 適 用 し 、究や、こうした症状の回復を狙った精神医薬開発

Piggybac transposon 骨格に Oct3/4、Sox2、Klf4、などに大きな可能性を与える事となる。この為、

c-myc、Lin28、Nanog の 6 種のリプログラミング(1)ハタネズミ ES 細胞（又は iPS 細胞）を樹立し、遺伝子を搭載した PB-6F ベクターを作製、これをES 細胞での相同組み替えによる遺伝子変換と、キ用いてリプログラミング遺伝子をハタネズミ繊

メラハタネズミ作成を経由した、遺伝子変換ハタ

維芽細胞に導入した。

ネズミ作成の可能性、及び、(2)ハタネズミ生殖

一方、ハタネズミへの過排卵処置と、受精卵の工学を樹立し、これにより得たハタネズミ受精卵取得法の確立に努め、また過排卵処置後の未受精を利用、CRISPR/Cas9 技術のハタネズミ受精卵へ卵を得て、ハタネズミ精子を利用した in vitroの直接適用により、ES 細胞や iPS 細胞，そして胚

fertilization を行うなど，ハタネズミ受精卵の盤胞キメラ等を経由せずに、遺伝子 KO ハタネズ

取得方法を検討、確立することとした。さらに、－ 495 －

この受精卵へ、CRISPR/Cas9 法を適用し、ハタネ

ハタネズミ生殖工学樹立と CRISPR/Cas9 法によCRり、OXTR 遺伝子 KO ハタネズミを作製した。また、平

ズミオキシトシン受容体(OXTR)遺伝子を直接破壊する事を試みることとした。

re

E.結論

良好な性質を持つハタネズミ iPS 細胞を樹立した。

C.研究結果G.

ハタネズミ胚より得た初代繊維芽細胞にPiggybac transposon 骨格に Oct3/4、Sox2、Klf4、
c-myc、Lin28、Nanog の 6 種のリプログラミング
遺伝子を搭載した PB-6F ベクターを導入したとこ
ろ、三胚葉分化能を持ち、核型が正常で、諸性質がマウス ES 細胞に酷似したハタネズミ iPS 細胞を樹立した。
一方、ハタネズミに対する過排卵処理法、ハタ
ネズミ精子の凍結保存法、ハタネズミ卵子の invitro fertilization 法、ハタネズミ受精卵のハ
タネズミ卵管、又は子宮への移植による，後代ハ
タネズミの取得等に成功し、ハタネズミ生殖工学を確立した。また過排卵処置後のハタネズミ受精
卵へ CRISPR/Cas9 法を適用し、OXTR 遺伝子の破壊されたハタネズミ（OXTR 遺伝子 KO ハタネズミ）の作製に成功した。

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表Katayama M, Kiyono T, Horie K, Hirayama T,
Eitsuka T, Kuroda K, Donai K, Hidema S,
Nishimori K, Fukuda F, “Establishment of animmortalized cell line derived from the prairie volevia lentivirus-mediated transduction of mutant
cyclin-dependent

kinase4,cyclinD,andtelomerase reverse transcriptase” Exp Anim,
2016. 65 (1) pp. 87-96
Katayama M, Hirayama T, Horie K, Kiyono T,
Donai K, Takeda S, Nishimori K, Fukuda T,“Induced

pluripotent

stem

cells

with

six

reprogramming factors from Prairie Vole, which isan animal model for social behaviors” Cell
Transplant, 2016. 25 (5) pp. 783-96
Horie K, Hidema S, Hirayama T, Nishimori K,

D.考察
CRISPR/Cas9 法は、ハタネズミ受精卵に対して“In vitro culture and in vitro fertilization techniques

極めて有効であり、遺伝子組 KO ハタネズミ作成

for prairie voles (Microtus ochrogaster)” Biochemに成功した。しかし、現在得ているハタネズミ生Biophys Res Commun, 2015. 463 (4) pp. 907-11

殖工学は、決して十分なレベルの受精卵、又は未受精卵を得られるレベルとは言い難く、季節やそ2.学会発表の他未知の因子･条件によりその受精卵や、未受

第３８回日本神経科学会大会、2015 年 7 月 28

精卵の収量は著しく変動する。従って、その誘導

日、兵庫県神戸市・神戸国際会議場、神戸国際展

方法や取得条件についての検討を更に進めてい示場”社会行動モデルとしての遺伝子組み換え

く必要がある。

ハタネズミの作製”堀江謙吾、平山貴士、平岡優今回樹立したハタネズミ iPS 細胞は、マウス

一、日出間志寿、西森克彦

ES 細胞に類似した性質を示し、今後ハタネズミ胚
盤胞への導入によるキメラハタネズミ作成を経第 42 回日本神経内分泌学会・第 23 回日本行動由した、遺伝子操作ハタネズミ作製法が確立され神経内分泌研究会合同学術集会、2015 年 9 月 18

る可能性を示した。

日、宮城県仙台市・戦災復興記念館“CRISPR/Cas

また、CRISPR/Cas9 法により、単純な遺伝子 KOを用いた Oxtr 遺伝子欠損平原ハタネズミの作だけでなく、短い DNA 配列(FLAG や LoxP など)、

製” 堀江謙吾、平山貴士、平岡優一、日出間志

或いは長い DNA 配列(EGFP や Td-Tomato などの蛍

寿、西森克彦光マーカーなど)の特定遺伝子領域への正確な導第 38 回日本分子生物学会年会･弟 88 回日本生入についての試行も、充分高いその可能性を示している。

化学会大会合同大会、2015 年 12 月 1 日兵庫県神戸市ポートアイランド“Generation of oxytocin－ 496 －

1.

2.

3.

receptor knock-out prairie voles by usingよCRISPR/Cas.” 堀江謙吾、平山貴士、鈴木紳吾、、

平岡優一、日出間志寿、西森克彦

しG.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得
なし
T,

S,

an

ole

2.実用新案登録
なし
3.その他
なし

nt

nd

m,
T,
T,

six
is

ell

K,

es

m

1

28

展

え

優

動

18

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作

志

生

神

in

－ 497 －

し判
平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

節

中

パ

コ

パーキンソン病治療における標的タンパク質としての Inhibitory PAS Domain

解Protein の検証

E.

十川 和博 1）
葛西 秋宅 1）、柿田 明美 2）

研究代表者
研究分担者

1）東北大学大学院生命科学研究科 2）新潟大学脳研究所
研究要旨

て

て

F.
1.
1.

Inhibitory PAS Domain(IPAS)は低酸素遺伝子応答を抑制する転写因子であり、ミトコンドリアでのアポトーシスを促進する因子としても機能する。われわれは IPAS のアポトーシス活性がパーキンソン病(PD)での神経細胞死に関与することを解明した。さらに培養細胞系で DNA トランスフェクションによって一過性に発現した IPAS が紫外線照射によって活性化した p38 MAPK 経路の MKII によってリン酸化されること、このリン酸化は IPAS の C 末端領域で起きること、さらにこのリン酸化によってミトコンド
リアのクラスター化とアポトーシス活性が増加することを見出した。パーキンソン病でキーとなる酸化ストレスは、NF-κB を介して IPAS を転写活性化し、さらに翻訳後修飾によって制御していることが明2.

らかになった。

C.研究結果

A.研究目的
パーキンソン病は酸化ストレスの亢進によっ

紫外線照射により、HEK293T 細胞にトランスフて、引き起こされることが報告されている。酸化ェクションにより発現した IPAS の C 末端領域がストレスは MAPK の活性化を誘導することが知修飾されることが欠失変異体を用いて判明した。

られているので、IPAS が MAPK によってリン酸

特異的な阻害剤を用いてリン酸化酵素を特定し化される可能性を検討した。

たところ、JNK の阻害剤は阻害せず、p38 MAPK

2.
1.

の阻害剤と、それによるリン酸化で活性化する
MKII の特異的阻害剤が IPAS によるミトコンドリ

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
HEK293T 細胞などの培養細胞に JNK と p38 のアのクラスター化や、アポトーシスをほぼ完全に活性化を引き起こす紫外線を照射し、IPAS による阻害し、MKII が直接のリン酸化酵素であること

ミトコンドリアのクラスタリングとカスパーゼ 3が判明した。また、MKII の siRNA によるノックの活性化を、抗体染色によって解析した。また、ダウンも紫外線の効果を阻害した。

関与するプロテインキナーゼを特異的な阻害剤、
siRNA によるノックダウンによって同定した。

D.考察
本研究を通じて、パーキンソン病に関与する酸

IPAS の欠失変異体を用いて、リン酸化領域を推定した。

化ストレスは、IPAS の転写活性化を促進するほかに、同ストレスで活性化する p38 MAPK 経路を介

－ 498 －2.

n

して、IPAS のアポトーシス活性を促進することがG.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）判明した。酸化ストレスは 2 重に IPAS 活性を調1.特許取得節していることになる。現在リン酸化部位を特定なし中であり、特定後、リン酸化抗体を作成し、ヒト
パーキンソン病患者脳において、IPAS リン酸化がコントロール脳に比較して増強していることをて C 末端領域がリン酸化された。この修飾によって IPAS のアポトーシス活性は亢進した。
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表1. Involvement of inhibitory PAS domain protein in
S.,てKasai,

Yokozawa,K.,

さS.,

Suzuki,A.,

Todoroki,Y.,

Yasumoto,K-I.,

Sekine,N.,

Kiyonari,H., Mukumoto,Y., Kakita,A.,Sogawa,K.

ド

Cell

化

Death

Discovery(2015)

1,

15015;

doi:10.1038/cddiscovery.2015.15

明

2. Inhibitory PAS domain protein is a substrate of
PINK1 and Parkin and mediates cell death in a
Parkinson’s disease model. Kasai.S., Torii, S,
Kakita, A., Sogawa,K. Cell Death Disease (2015)

フ

6, e1886; doi:10.1038/cddis.2015.243がる

2.学会発表1.

PINK1/Parkin-mediated degradation of Inhibitory
PAS domain protein (IPAS) attenuates neuronalリcell death. S Kasai, S Torii, A Kakita, and KにSogawa 23rd Conference of the European CellとDeath Organization 2015 年 10 月、スイス･ジュ

ク

ネーブ

酸

なし

IPAS は酸化ストレスで活性化する MKII によっneuronal cell death in Parkinson’s disease. Torii,

PK

3.その他

E.結論

D)

し

なし

解明する。

ト

た。

2.実用新案登録

2. PINK1-Parkin induces IPAS degradation andattenuates neuronal cell death. S Kasai, S Torii,
K-i Yasumoto, A Kakita, K Sogawa 2015 年 12 月、
神戸

か

介

－ 499 －蛋
平成 27 年度新潟大学脳研究所

な｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

γ-セ共同利用・共同研究報告書

へ伝

APP 細胞内ドメインの神経毒性の解析
研究代表者
研究分担者

cD

中山 耕造 1）
長瀬 尚志 2）

細笹岡 俊邦 3）

現Ga

1）信州大学医学部医学科・人体構造学講座、2）信州大学医学部医学科・病理学講座、3）新潟大学（

脳研究所附属生命科学リソース研究センター・バイオリソース研究部門・動物資源開発研究分野

各

大
研究要旨
我々は Notch や Delta の解析から、γ-セクレターゼ本来の生理機能は１型膜蛋白質のシグナル伝達の調節にあるという仮説を提唱している。さらに、amyloid precursor protein （APP）も Notch に類似した γ-セクレターゼによって制御されるシグナル伝達機構を持ち、それがアルツハイマー病（AD）の発

[32

に

効
32

P

症に関係していると考えている。実際、γ-セクレターゼによって APP が切断されるときに Aβと同時体に生じる細胞内ドメイン（AICD）が核へ移行し、遺伝子発現を変化させ、神経細胞選択的にアポトー

AI

シスを誘導することを細胞レベルで明らかにしている。これらの結果は、AD の原因だと考えられている Aβ以外にも、APP を介した AD 発症に関与する機構が存在することを示唆している。
AICD によって引き起こされる神経細胞選択的アポトーシスの機序を解明することを目標に、本年度は AICD 核移行検出系の構築、及び核移行を制御していると考えられる AICD 脱リン酸化酵素の解析をおこなった。

発

い

リ

培

を

製

い

A.研究目的への移行の過程を解明することにある。

我々は、Notch や Delta の解析から、γ-セクレタ

AICD の核移行には、アダプター蛋白質 Fe65 とーゼ本来の生理機能は amyloid precursor proteinの結合が必須であることが知られている。また（APP）を含む１型膜蛋白質のシグナル伝達の制

我々は、AICD と Fe65 との結合には AICD の脱リ御にあり、それが APP のシグナル伝達を通してアン酸化が必要ではないかと考えている。本年度はルツハイマー病(AD)の発症に関係していると推将来的に必要となる AICD 核移行阻害物質のスク

測 し て い る ( 総 説 ： Nakayama et al., Cell Mol.

リーニング系の確立を目指して（１）AICD 核移

Neurobiol., 31,887,2011)。実際に我々は、γ-セクレ

行検出系の構築を行った。加えて、前年度から続

タ ー ゼ で 細胞 膜 か ら 細胞 質 へ と 切り 出 さ れ た

けている(２)AICD 脱リン酸化酵素の解析を行っ

APP の細胞内ドメイン（AICD）が核へ移行し、

た。

約
し
を
ラ
な
つ
カ
Cr
か
っ

遺伝子発現を大きく変化させ、神経細胞選択的にアポトーシスを引き起こす事を示している（総B.研究方法（倫理面への配慮を含む）。

説：Nakayama et al., Current Psychopharmacology,（１）AICD 核移行検出系の構築

1,155,2012）。

Fe65 に依存した AICD の核移行を検出する系を

これらの結果を基に、本研究の目的は、AD に構築するために、AICD の前に Gal4 を繋いだ発現

おける新規創薬ターゲット分子の検索を念頭に、ベクターを構築した。このベクターの場合、γ-セAICD の神経毒性の分子機序、特に細胞質から核クレターゼによる切断がなくてもフュージョン

－ 500 －

フ
え

等

と

た

リ

は

ク

移

続

っ

を

蛋白質（Gal4-AICD）が細胞質に存在することにC.研究結果なる。つまり通常シグナルが伝わるときに起こる、（１）AICD 核移行検出系の構築

γ-セクレターゼによる AICD の細胞膜から細胞質

サルの腎臓由来の Cos7 細胞と、マウスの神経への切り出しを必要とせず、構成的にシグナルが由来の N2a 細胞に Gal4-AICD を発現させ、Fe65伝わることになる。

の共発現の有無でルシフェラーゼ活性を比較しGal4 依存性のプロモーターとルシフェラーゼ

た。なお、インターナルコントロールとしては、

cDNA を持つレポータープラスミドを核内に持つ

CMV プロモーターとクラゲルシフェラーゼを持細 胞 に 、 この 発 現 ベ クタ ー を 導 入し た 場 合 、つベクターを用いた。
AICD を持たない Gal4 のみ発現させた場合、

Gal4-AICD が核に移行するとルシフェラーゼが発Fe65 の有無にかかわらず、どちらの細胞でもルシ現する事になる。

フェラーゼ活性は検出できなかった。
Gal4-AICD を発現させても、両方の細胞におい（２）AICD 脱リン酸化酵素の同定
各分画の脱リン酸化活性の測定に用いる基質は、て、Fe65 を共発現させなければ極めて低いルシフ

大 腸 菌 で 産 生 し た リ コ ン ビ ナ ン ト AICD をェラーゼ活性しか示さなかった。しかしながら、

32[ P]-γ-ATP を用いて in vitro で P ラベルすること

どちらの細胞においても、Fe65 を共発現させるとによって作製する予定であったが、この方法では10 倍以上に活性の増強が見られた。

32

効率よくラベルする事ができなかった。そこで、
32

P を用いてメタボリックラベルを行なった。具

（２）AICD 脱リン酸化酵素の同定

体的には、HEK293T 細胞に、FLAG タグを持つ

マウス脳のライセートを DEAE sepharose カラ

AICD の発現ベクターを導入して FLAG-AICD をムで分画し場合、225-300mM の NaCl で溶出した発現させた。遺伝子導入 1 日後、リン酸を含まな

フラクションに AICD 脱リン酸化酵素活性が認めい培養液に、
5µg/ml の Nocodazole と 1mCi/ml の

32

P

られた。

リン酸を添加した培養液に置換してさらに一日

これらのフラクションをさらに Hydroxyapatite

培養を行なった。培養の後、抗 FLAG 抗体カラム

カラムに吸着させ、リン酸濃度を上げる事によりを用いて細胞のライセートから FLAG-AICD を精

蛋白質を溶出した。その結果、幅広い範囲（150mM製し、脱リン酸化アッセイのための基質として用から 300mM）のフラクションが AICD 脱リン酸化

いた。
脱リン酸化酵素の精製は、1 回の実験について
約 50 匹のマウスの脳（約 25g）をホモジェネート
し、遠心して約 20ml のライセートを得て、これを 10ml の DEAE sepharose カラムに添加した。カ
ラムからの溶出は、NaCl の濃度勾配によっておこなった。さらに、AICD 脱リン酸化酵素活性を持
つ DEAE sepharose フラクションを 20mM リン酸
カ リ ウ ム バ ッ フ ァ ー に 対 し て 透 析 し 、 2ml のCreamic Hydroxyapatite カラムに添加した。カラムからの溶出は、リン酸の濃度勾配によっておこなった。
各フラクションの脱リン酸化酵素活性は、各フラクションに前述の 32P ラベルした AICD を加え測定した。
なお、動物を用いる実験は、信州大学動物実験等実施規程に基づいておこなった。

活性を示した。
溶出されたフラクションの幅が広いために、
Hydroxyapatite で分画できていない可能性が考えられた。しかしながら、各フラクションを SDS 電
気泳動して銀染色をおこなったところ、フラクシ
ョンでバンドのパターンは異なっており、分画自体はうまくいっていた。
電気泳動では、AICD 脱リン酸化酵素活性と相関するバンドは検出できず、さらなる精製が必要でありゲルろ過を行ったところ、活性を検出できなくなった。現在、その原因を調べている。
D.考察（１）AICD 核移行検出系の構築
Gal4-AICD を発現させても Fe65 を共発現させ現ないとルシフェラーゼ活性が検出できないといセ

う結果は、構築した系において AICD の核移行に

ン

Fe65 が必須である事を示している。つまり、ここ－ 501 －

で検出されたルシフェラーゼ活性は、細胞質に存て、我々が同定しようとしている酵素は、カルシ

在する Gal4-AICD に Fe65 が結合したためにニューリンではないと考えられた。

Gal4-AICD が核に移行して、レポーターが持つGal4 依存プロモーターを活性化させ、ルシフェラ

E.結論ーゼの発現を誘導したと考えられる。

（１）AICD 核移行検出系の構築

現在のところ我々は、AICD は構成的にリン酸

Fe65 に依存した AICD の核移行を、ルシフェラ

化されており、AICD と Fe65 の結合には AICD 自ーゼを測定することにより高感度で検出する細体の脱リン酸化が必要だと考えられる結果を得

胞系を構築した。この系は、AICD 核移行阻害物ている。Phos-tag による電気泳動を行ったところ、質のスクリーニング等に有用だと考えられた。

このアッセイ系では AICD を高発現させたために、大半の AICD はリン酸化されていなかった。その研（２）AICD 脱リン酸化酵素の同定

結果、脱リン酸化なしに AICD が Fe65 と結合でAICD 脱リン酸化酵素の同定を目標に、蛋白質

きたのではないかと考えている。従ってこの系は、の精製を進めている。この酵素を同定できた場合、

Fe65 に依存した AICD の核移行を反映しており、実際に AICD の核移行及び神経細胞特異的な細胞

AICD 核移行阻害物質のスクリーニング等に有用死に関わっていることを確認するために、精製しだと考えられる。

た蛋白質の情報を基に cDNA をクローニングし、それを培養細胞に発現させて検証する予定である。

（２）AICD 脱リン酸化酵素の同定
前述のように我々は、AICD は構成的にリン酸化されており、AICD と Fe65 の結合には AICD 自体の脱リン酸化が必要だと考えている。本研究において、マウスの脳のライセート中に AICD 脱リ
ン酸化活性を検出した。このライセートを DEAE
sepharose カラムで分画したところ、
225-300mM のNaCl で溶出したフラクションに高い AICD 脱リン
酸化活性が認められた。これらの結果は、AICD
脱リン酸化酵素が実際に存在することを示しており、この酵素が AICD の核移行を調節しているという仮説が正しいことを示唆していると考えている。
AICD 脱リン酸化活性が認められた DEAE フラ
クションを Hydroxyapatite カラムを用いて分画したところ、150mM から 300mM のリン酸で溶出し討
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし
2.学会発表なし
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし
2.実用新案登録
なし
3.その他
なし

を

回

数

NC

病

蒼

A.

呼

全

っ

態

神

たフラクションに AICD 脱リン酸化活性が認めらのれた。電気泳動では、AICD 脱リン酸化酵素活性らと相関するバンドは検出できず、さらなる精製がは必要であり、ゲルろ過により精製を進めたところ、

家活性が検出できなくなった。現在、活性が検出で体きなくなった原因を調べている。

ロ

なお、カルシニューリンは脳で極めて多い脱リ性ン酸化酵素である。この酵素が AICD 脱リン酸化性酵素である可能性を検討するためにリコンビナをン ト カ ル シニ ュ ー リ ンを 用 い て 検討 し た が 、をAICD 脱リン酸化活性は検出できなかった。従っ－ 502 －

シラ

細平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

意思伝達不能状態（Stage V、TLS）の筋萎縮性側索硬化症の臨床病理学的検討

物

研究分担者

研究代表者 望月葉子 1）2）
林健太郎 3）、竹内亮子 4）5）、高橋 均 5）、柿田明美 5）、渡部和彦 6）、小柳清光 7）、
小森隆司 1）、磯崎英治 3）

質合、1）都立北療育医療センター内科・神経内科

2）都立神病院検査科 3）都立神病院脳神経内科

4）新潟大学脳研究所神経内科

胞5）新潟大学脳研究所病理学分野

6）都医学研運動・感覚システム研究分野

し7）信州大学医学部神経難病学

し、

あ

研究要旨
意思伝達不能（Stage V）になった ALS 例の臨床病理学的な特徴について大脳皮質病変を中心に検討した。対象は TDP-43 陽性封入体を有する 6 例、SOD1 陽性封入体を有する 3 例と FUS 陽性封入体を有する 2 例。大脳萎縮の有無は蓄積蛋白の違いでは説明できなかった。TDP-43 陽性例では海馬歯状回に NCI のない例では軽度な変性が前頭葉に限局していたが、NCI のある例では大脳皮質に変性と多数の NCI が出現していた。FUS 陽性例では、逆に大脳皮質の変性が高度な例で海馬歯状回顆粒細胞に
NCI はなかった。SOD1 陽性例の 3 例の大脳皮質は比較的保たれていた。したがって、Stage V に至る
病理学的背景は、大脳病変よりも、全例に共通していた高度な運動ニューロン変性に加えた黒質、淡蒼球、視床下核、脳幹網様体、小脳出力系の変性と考えられた。
A.研究目的ることを目的とした。

筋萎縮性側索硬化症（ALS）例のなかで、人工呼吸器を装着して外眼筋も含めた全随意筋が完B.研究方法

全麻痺し、現在の補助手段では意思伝達不能にな

昨年度抽出した意思伝達能力 Stage V の 11 例にった（意思伝達能力 Stage V、完全閉じ込め症状状

ついて、神経細胞・神経線維の脱落、グリオーシ

態：totally locked-in state; TLS）症例の臨床経過、スの程度と免疫染色標本により、TDP-43、SOD1、

神経病理所見を多数例で検討し、このような症例

または FUS による神経細胞質内封入体（NCI）のの臨床病理学的な特徴とその多様性の有無を明出現について検索した。

らかにする。平成 26 年度には、Stage V の症例には、発症 2 年以内に呼吸器を装着した例が多く、C.研究結果家族性/遺伝子変異 ALS のほか、TDP-43 陽性封入

対象は 11 例で、発症から呼吸器装着までの期体を有する孤発例があること、高度な運動ニュー

間は平均 17.1 ヶ月であった。早期から行動障害、

ロン変性と運動ニューロン系を超えた広汎な変感情障害、言語障害を生じた前頭側頭型認知症例

性を全例で呈し、その病変分布には共通性と多様はなかった。

性があり、蓄積蛋白の違いでは分類できないこと

神経病理学的には、全例で上位及び下位運動ニを明らかにした。今年度は、蓄積蛋白ごとの違い

ューロンの非常に高度な変性に加えて黒質、淡蒼をさらに検討し、神経病理学的特徴を明らかにす球、視床下核、脳幹網様体に中等度以上変性があ－ 503 －

った。小脳歯状核、上小脳脚の変性も全例に見らえて広汎な変性を来し、Stage V となりうる事を明れたが、軽度な症例は Stage V に至ってから死亡らかにした。一方、FUS 陽性例では、大脳病変がまでの期間が短かった。変性が高度な部位では神高度な症例で海馬歯状回に NCI がなく、大脳病変

経細胞脱落が高度なために、NCI の評価をできなが軽度な例で歯状回に NCI があった。これは、かった。

TDP-43 例と逆の傾向であり、FUS 陽性例では、大脳萎縮が高度であったのは TDP-43 陽性の 3

海馬歯状回顆粒細胞の NCI が大脳の広範囲な病例と FUS 陽性の 1 例で、その他の例では大脳は比変の指標にはならないことが明らかになった。

較的保たれていた。

SOD1 例の大脳皮質は保たれる傾向がみられた。

大脳皮質病変については、TDP-43 陽性例ではSOD1 変異例に前頭側頭型認知症例の報告は少数

海馬歯状回に NCI がない例で変性は前頭葉に限であり、SOD1 陽性例では大脳皮質病変が軽度な局して脳重は保たれていた。これに対し、NCI が例が多い可能性がある。

ある例では側頭葉、海馬支脚と大脳皮質に変性があり、NCI は大脳皮質にも広汎に確認され、この

E.結論

うちの 3 例は高度な大脳萎縮を呈していた。FUS

Stage V に至った症例は、大脳皮質病変には多様

陽性例では、p.P525L 変異例は前頭葉に強い高度性があったが、高度な運動ニューロン変性に加えな大脳萎縮があり、compact NCI が大脳皮質に多て、黒質、淡蒼球、視床下核、脳幹網様体、小脳

数出現していたが、海馬歯状回顆粒細胞に NCI は

出力系の変性が共通しており、Stage V に至る病理ンなかった。大脳萎縮が目立たなかった p.K510M 変

学的背景と考えられた。このことから、発症から酸

異例は、小脳入力系の変性も伴っていた点が特徴

呼吸器装着までが早い症例では特に、運動ニューコ

で、non-compact NCI が海馬歯状回顆粒細胞にもロン以外の症状の出現、画像による拡大病変の出化

出現していた。SOD1 陽性例の 3 例の大脳皮質の現に注意することが意思伝達能力の低下を予測

AC

神経細胞脱落はなく、1 例で少数の NCI が側頭葉

するうえで重要と考えられた。

がF.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表準備中。

A.

に見られた。
D.考察
病理学的には、全例で上位及び下位運動ニュー
ロンの非常に高度な変性に加えて黒質、淡蒼球、
視床下核、脳幹網様体に中等度以上変性があった。

2.学会発表小脳歯状核、上小脳脚といった小脳出力系にも全林

健太郎、望月葉子、竹内亮子、小森隆司、高例で変性があり、これらの変性が軽度な例は Stage橋均、柿田明美、渡部和彦、関絵里香、新井信

V から死亡までの期間が短かったことから、病変隆、小柳清光、清水俊夫、長尾雅裕、磯崎英治：

により出現する時期が異なる可能性があると考意思伝達不能状態（stage V）となった筋萎縮性側えられた。以上の病変は、大脳病変の強弱や蓄積

索硬化症（ALS）における大脳萎縮の免疫組織学

蛋白の違いにかかわらず、共通していたので、これらの共通病変が、Stage V に至る病理学的背景と考えられた。
Nishihira ら(2008) は TDP-43 陽性 NCI を持つ例の ALS の病変を運動ニューロン系以外に変性の乏しい type 1 と、運動ニューロン以外の変性も目立つ type 2 に分類し、海馬歯状回の NCI は type 2の指標となる事を報告している。TDP-43 陽性例の大脳皮質病変も、海馬歯状回の NCI の有無で分類可能であることが明らかになった。そして、海的検討．第 56 回日本神経病理学会学術研究会、
2015 年 6 月 5 日、福岡。
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得なし。
2.実用新案登録
なし。
3.その他
なし。

馬歯状回に NCI のない例も運動ニューロンを超－ 504 －

と

に

B.

各

た

た

ン

C-

さ

視

側

定

対

マ

局

明

が

平成 27 年度新潟大学脳研究所

変｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣、

共同利用・共同研究報告書、

病

酸化ストレスによる神経細胞機能の障害と細胞死に関する研究

。

。

研究代表者

柴田 亮行 1)

数研究分担者

野口 範子 2)

な研究分担者

柿田 明美 3)1)

東京女子医科大学病理学第一講座

2)

同志社大学生命医科学部医薬分子機能学3)

新潟大学脳研究所脳疾患標本資源解析学分野

様

え

研究要旨

脳

アルツハイマー病 (AD) 脳海馬におけるコレステロール-24-水酸化酵素 (C24OHase)、カルモジュリ

理ンキナーゼ II (CaMKII)、リン酸化 CaMKII (p-CaMKII)、切断型カスパーゼ 8 (C-Casp8) およびリンら

酸化 RIPK (p-RIPK) の局在と筋萎縮性側索硬化症 (ALS) におけるセルロプラスミン (Cp) およびアーコニターゼ 1 (ACO1) の局在を免疫組織化学的に解析した。AD 脳海馬では、CaMKII と RIPK のリン酸出化活性化が観察された。ALS 脊髄では、アストロサイトにおける Cp 発現亢進とミクログリアにおける測

ACO1 の発現維持が観察された。AD、ALS のいずれの病変の主座においても、酸化ストレス亢進の関与

高

信

：

側

学

、

が示唆された。

疫組織化学染色標本との比較により同定した。

A.研究目的
本研究の目的は、神経変性疾患の細胞死の様式と細胞死における酸化ストレスの関与を明らか

C.研究結果AD 脳海馬では、C24OHase と C-Casp8 に対するにすることにある。

有意な免疫活性は検出されなかったが、CaMKII 免
疫活性は全ての錐体細胞の細胞質に均一に分布

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
本研究は、新潟脳研究所と東京女子医科大学のしており、p-CaMKII 免疫活性は約 3 分の 2 程度の各倫理委員会で、あらかじめヒト剖検材料を用い錐体細胞の細胞質に粗大顆粒状の分布を示し、た研究計画書を提出して承認を得た後、開始され

p-RIPK 免疫活性は少数の錐体細胞の細胞質に粗た。AD 脳海馬 (5 例) のホルマリン固定パラフィ

大顆粒状の分布を示した。

ン包埋切片に対し、C24OHase、CaMKII、p-CaMKII、ALS 脊髄では、Cp と ACO1 の発現様式に違いが

C-Casp8、p-RIPK の各々に対する特異抗体を反応みられた。Cp 免疫活性は脊髄前角の反応性アストさせ、免疫反応産物をポリマー免疫複合体法で可ロサイトに局在し、染色性が増強していた。これ視化した。ブニナ小体の出現する孤発性筋萎縮性に対し、ACO1 免疫活性は脊髄前角の活性化ミクロ

側索硬化症 (ALS) 脊髄 (5 例) のホルマリン固

グリアに局在していたが、染色性は増強していな

定パラフィン包埋切片に対し、Cp、ACO1 の各々にかった。

対する特異抗体を反応させ、免疫反応産物をポリマー免疫複合体法で可視化した。免疫反応産物のD.考察

局在は、連続切片における各種細胞マーカーの免－ 505 －

AD 脳海馬標本の観察から、一部の錐体細胞内部

ALS 脊髄における Cp 発現亢進と ACO1 活性上昇

でカルシウム流入の亢進を反映する CaMKII のリ
ン酸化とネクロトーシスの実行部隊である RIPKの関与が示唆された。

のリン酸化が起こっているものの、ネクロトーシ

今回、パーキンソン病剖検脳を用いた解析が不十スの秘儀金と目されている酸化コレステロール分であったため、次年度の課題としたい。

の産生酵素 C24OHase の発現ならびにデスシグナ
ル起因性アポトーシス仲介因子 Casp8 の切断が起こっていないことが判明した。p-CaMKII と p-RIPKのいずれに対する免疫活性も錐体細胞の細胞質に粗大顆粒状構造物を形成していた意義づけは現時点において困難である。
ALS 脊髄標本の観察結果から、中枢神経系の主な Cp 発現の場であるアストロサイトが Cp を過剰発現する一方、ミクログリアにおける ACO1 の発現量に増減がないことが判明した。近年、Cp は炎症促進性サイトカイン IL-1β の刺激を受けた網膜
ミュラー細胞で発現レベルの増加が報告されてF.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし
2.学会発表なし
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
1.特許取得：なし
2.実用新案登録：なし
3.その他：なし

いる。これまでに報告された多くの ALS 研究では、脊髄における IL-1β 産生を含む炎症活動亢進が指な摘されている。ミュラー細胞とアストロサイトのゴ

類似性を考慮すると、脊髄内炎症反応がアストロ的サイトの Cp 発現レベルを高めた可能性は十分あ心りうる。一方、我々は最近、培養ミクログリアに分

可溶性 Cp を添加すると培養上清中のグルタミン

D1酸が増加することを発見した。これは、細胞外か損

らの Cp 刺激を契機にミクログリア内部でグルタミン酸が産生され、細胞外へ放出されたことを意味している。細胞内でグルタミン酸を産生する酵A.

素として近年、ACO1 が注目されている。ACO1 は細胞質内の鉄イオン濃度が低いと不活性型であ心る iron-regulatory protein (IRP) として存在すとるが、鉄イオン濃度が上昇すると活性型となるこ序とが知られている。一方、Cp は細胞外鉄イオンを化

細胞内へ導く性質を有する。従って、細胞外 Cp

今の増加はミクログリア内部への鉄イオン流入をお介して ACO1 の酵素活性をもたらすことが予想さD1れる。その際、ACO1 の発現レベルに変動が起こら

全ないという実験結果が報告されている。従って、的本研究で ACO1 の染色性に変動がみられなかった
ことは頷ける結果である。

B.

E.結論
AD 脳海馬における細胞内カルシウムイオン流
入とネクロトーシスの証拠となる結果が観察さ

て

や

し

れた。

－ 506 －

昇

平成 27 年度新潟大学脳研究所

十｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

ドパミン-D1R シグナルが心不全に果たす役割の解明
研究代表者

小室

一成

研究分担者

笹岡

俊邦

研究分担者

山口

敏弘

1）東京大学医学部循環器内科

1）
2)
1）

2）新潟大学脳研究所 生命科学リソース研究センター
研究要旨

神経伝達物質ドパミンは運動調節や情動に関わり、パーキンソン病等神経疾患の発症と治療に重要な役割を持っている。一方、ヒトの心不全において、ドパミンアナログ、D１ドパミン受容体(D1R)ア
ゴニストの長期投与はその予後を悪化させることが報告されているが、心臓におけるドパミンの生理的作用や心不全における役割はほとんど明らかにされていない。本研究は、ドパミン−D1R シグナルが心不全の発症・進展に関与するという仮説を検証することで、心不全発症および進展における新たな分子機構の解明に取り組むものである。我々は、心不全の進展とともに顕著に変化する遺伝子として
D1R を見いだし、その発現が主に心筋細胞に多く認められることから、現在、心筋細胞特異的 D1R 欠
損マウスやテトラサイクリン制御による D1R 発現マウスに心不全を誘導し、表現型を解析中である。

る。これらの予備的データをもとに以下の点に注

A.研究目的
本研究では、マウス心不全モデルを用い、不全心においてドパミンが果たす役割を解析することで、心不全発症・進展において働く分子細胞機目して研究を進めた。
① 不全心の D1R 発現心筋細胞の局在の同定序の解明に取り組む。心臓における自律神経活性

心不全の進行とともに mRNA レベルで心臓 D1R の化の重要性は以前から知られているが、本研究は発現が増加するというデータを得てきたが、心臓今まで解析されることが少なかった、自律神経ににおける D1R 高発現細胞の局在は同定しきれていおいて産生されるドパミンとその受容体であるなかった。これまでイムノブロッティングや免疫D1R の役割について注目して解析することで心不全における新たな病態生理を見いだすことを目的とする。

染色法を用いて D1R の局在の証明を図ってきたが、心臓における D1R 発現量が多くないことから完全にその局在を同定できるには至っていなかった。
そこで、申請者らは分担者より提供された LacZ

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
申請者らは、心不全モデルマウスの心臓において D1R の発現が病態の進行とともに増加すること
や、心臓におけるドパミンの spill over が増加していることを示唆する予備的データを得ていラベルされた D1R 強制発現マウス心臓組織を Xgal
染色することで D1R の発現細胞の局在同定を図った。
② 心筋一細胞レベルでの D1R の発現量解析－ 507 －

申請者らはランゲンドルフ法を用いて単離した

れており、心臓においては心不全のみならず不整不全心筋細胞においても D1R が mRNA レベルで上脈発症に影響を与える可能性も考えられる。In

昇していることを確認している。申請者らの研究

vivo で心筋細胞におけるドパミン-D1R シグナル

室ではランゲンドルフ法で単離した心筋一細胞毎の mRNA の発現量の違いを同定するシステムも既に構築済みである。同システムを用いて心不全の阻害効果を明らかにするために心筋特異的 D1R
ノックアウトマウスに現在心不全を誘導し、その効果を解析中である。
今後は、ドパミン-D1R シグナルを活性化させた

時に D1R を高発現する細胞を解析することでその心筋細胞がどの様な表現型を示すのかを in vitro

特徴や意義に迫った。

で解析していく必要もある。現在アデノウイルス③ In vivo における D1R シグナルの重要性を用いて D1R を強制発現した心筋細胞を作成中で心筋特異的 D１R コンディショナルノックアウト

ある。同時に、分担者が進めているテトラサイク
リン誘導型 D1R レスキューマウスの D1R 発現様式

（CKO）マウスを作成し、同マウスにおいて心不と運動機能の解析の研究成果とあわせて検討す

全を誘導することで D1R が心不全の進行にどのよることで、ドパミン-D1R シグナルの更なる役割のうな影響を及ぼすのかを検証する。更には、分担理解を深めることにつなげていく

研究者の協力により得た、テトラサイクリン制御による D1R 発現マウスに圧負荷心不全モデルを作成し、(1)生理的機能解析、(2)分子生物学的解析、(3)生存解析を行うことでドパミン-D1R シグナルが心不全の病態形成において果たす役割を検討する。

C.研究結果分担者の協力により、D1R 強制発現マウスを作成し、同マウスに心不全を誘導の上、心臓 Xgal
染色を行ったところ、D1R を発現している細胞がび漫性・散在性に増加していることを見出した。

E.結論
心不全の進展とともに D1R の発現が限局的な心筋細胞において増加し、心筋細胞におけるドパミ
ン-D1R シグナルは CREB シグナルの活性化を誘導することを見いだした。今後の課題として、心筋のみであることが明らかとなり、両者の結果は矛
盾しないものであった。現在、心筋細胞特異的 D1R

らと

全誘導時の表現型解析を行うとともに、D1R の高し発現心筋細胞の in vitro における機能解析も必し要となってくると考える。

ッD1
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし

A.

2.学会発表平成 27 年度
究

新潟大学脳研究所共同利用共同研

す合同セミナー・平成 27 年 12 月 22 日・新潟

ョ起

ノックアウトマウスに心不全を誘導し解析を行G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）っている。

1.特許取得
該当なし

D.考察

の

細胞特異的 D1R ノックアウトマウスに対する心不また、心筋一細胞レベルの RNA 解析でも、心不全時に D1R を高発現している細胞は一部の心筋細胞

デ2.実用新案登録

ウ行る

心不全の進展に伴い発現が増加する遺伝子と

該当なし

て

して D1R を見いだし、その発現増加は限局的な心

3.その他

い

筋細胞にのみ認められることを明らかにした。ま特記事項なし達

た、心筋細胞における D1R 刺激は CREB シグナルしの活性化を誘導していることも明らかにしていをる。神経細胞や近位尿細管細胞においては D1R シ
グナルは Na-K ATPase を制御していることが知ら－ 508 －

整Inル

平成 27 年度新潟大学脳研究所

1R｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣の共同利用・共同研究報告書

た

胎仔期および発達期の脳におけるドーパミン受容体 D1R の機能解析

ro

ス

研究代表者

大久保

直 1)

で

研究分担者

佐藤

俊哉 1)

ク

研究分担者

笹岡

俊邦 2)

式

す

1)北里大学医学部実験動物学の2)新潟大学脳研究所動物資源開発研究分野

心

ミ

導

筋

研究要旨
ドーパミン D1 受容体（D1R） は、運動を促進する役割があると考えられている。これまでに、コンディショナル D1R 発現マウスを用いることにより、成熟マウスにおいて D1R の働きを抑制すると運動量の減少が起こることが判明した。しかし、通常の D1R ノックアウトマウス(KO)では、運動の亢進が認められる。このような行動発現の差は、胎仔期からの D1R の欠損が脳機能の正常な構築に影響を及ぼすこ不とを示唆している。そこで本研究では、まず D1R を生後発達期において時期特異的にノックダウン(KD)高し、その脳に及ぼす影響を形態学的・生化学的・行動学的に解析することを目的とした。生後母乳を介必してドキシサイクリンを飲水させた D1R KD マウスを用いて各種行動解析を行った。その結果、D1R がノックダウンされる時期により行動の表現型に違いが見られたことから、発生発達期と成体期における
D1R の機能が異なる可能性が示唆された。

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）

A.研究目的
ドーパミン D1 受容体（D1R） は、運動を促進

Tet-Off システムを導入したコンディショナ

研する役割があり、成熟マウスにおいてコンディシ

ル D1R 発現マウスの受精卵を仮親マウス（ICR 系

潟ョナルに D1R の働きを抑制すると運動量の減少が統）に移植後、ドキシサイクリンを飲水投与する起こる。しかし、通常の D1R ノックアウト(KO)マ

ことにより、発達期および成体期の D1R の発現をウスでは、運動の亢進が認められる。このようなノックダウンした。コントロールとして、野生型

行動発現の違いは、胎仔期から D1R が欠損していマウス、D1R KO マウス、同時期に水のみを与えた

るか、あるいは成熟期になって欠損するかによっコンディショナル D1R 発現マウスを用い、各種行て、脳機能や脳組織の構造に異なる影響を与えて動解析を行った。KD マウスは自力での摂餌が困難いると示唆される。そこで本研究では、D1R を発になり衰弱する可能性があるので、その場合は実達期、および成体期に特異的にノックダウン(KD)験をやめ安楽死とした。

して運動機能を行動レベルで解析し、D1R の機能を明らかにすることを目的とした。

C.研究結果平成 26 年度に検討した、発達期における D1R KO－ 509 －

の条件に沿って、生後０日からドキシサイクリン

該当無し

を母乳を介してあるいは直接飲水によって投与3.その他した。D1R の発現が検出不可能なレベルに達した

該当無し

時期に、D1R KD マウスと他のコントロールマウスの行動の表現型を比較した。行動解析として、オープンフィールドテストによる新奇環境での活動性、さらにバランスビームテストによる協調運動、平衡感覚を評価した結果、発達期の D1R KD
マウスでは、成体期の KD マウスと比べ行動異常の現れ方が異なることが判明した。
D.考察
発達期と成体期では、正常な行動発現に D1R が必要であるが、その機能は異なる可能性があると考えられた。D1R KO マウスのように、受精卵の段
階から D1R がないと、他のドーパミン受容体による何らかの機能的補償作用が働く可能性もあると考えられた。

as

リ

断

網

ch

E.結論
生後発達期および成体期に D1R の発現をノッ
クダウンしたところ、各行動テストにおいて異なる表現型が現れたことから、発達期と成体期では

と

発

れ

D1R が異なる機能を持つことが示唆された。

A.

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし

つ他

呈2.学会発表笹岡俊邦、佐藤朝子、知見聡美、大久保直、前島純、新井慧、砂山智子、小田佳奈子、酒井清子、
前田宜俊、神保幸弘、馬川恵梨子、佐藤俊哉、藤

は

す

で

as

D1 dopamine

数

receptor-mediated signal is required to maintain常normal motor activity 第 38 回日本分子生物学会

分

澤信義、横山峯介、南部篤

総会2015 年 12 月 3 日子

神戸G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

B.

1.特許取得

・
し

該当無し

・

2.実用新案登録－ 510 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

Astroblastoma の網羅的遺伝子解析
信澤 純人 1）
横尾 英明 1）柿田 明美 2）

研究代表者
研究分担者

1）群馬大学大学院医学系研究科病態病理学分野

2）新潟大学脳研究所病理学分野

研究要旨
Astroblastoma は小児～若年成人に発生する非常に稀な原発性脳腫瘍である。病理組織学的に、
astroblastic rosettes と呼ばれる血管周囲性偽ロゼット構造を特徴とするが、この構造は浸潤性グ
リオーマ等にも見られることがあり、また、特異性の高い免疫組織化学的マーカーを欠くことから診断に難渋することがある。本研究では、astroblastoma に特異性の高い分子マーカーを検索するため、網羅的遺伝子解析を行った。高解像度の arrayCGH 法を用いた解析では、ある染色体全体に渡ってchromothripsis を思わせるような大小の欠失が無数に認められた。また、鑑別を要する腫瘍に特異的として最近報告された遺伝子異常は見られなかった。今回の検索で認められた異常がどのように腫瘍発生に関わっているかは不明であるが、本腫瘍は分子遺伝学的に独立性の高い疾患群であると考えられる。

A.研究目的Astroblastoma は非常に稀な原発性脳腫瘍の一つであり、その組織診断基準は明確とは言えない。
他のグリオーマや髄膜腫と類似した組織所見を呈するが、特異性の高い免疫組織化学的マーカー
はいまだ知られていない。また、遺伝子異常に関する報告はほとんど存在していない。今回の研究
で は 、 高 解 像 度 の arrayCGH 法 を 用 い て 、astroblastoma におけるゲノム全体に亘るコピー数の異常を網羅的かつ高精度に検出し、遺伝子異常の全体像の解明と、診断に有用な特異性の高い
分子マーカー、治療の標的となる可能性のある分子の探索を行う。

genomic DNA を抽出し、arrayCGH 法によりコピー数異常を検索する。
本研究は群馬大学医学部ヒトゲノム・遺伝子解
析研究に関する倫理委員会での審査を受け、承認を得ている。
C.研究結果全国の複数の施設から astroblastoma と診断された症例、およびそれが疑われた症例を 20 例程
集め、1. 境界明瞭であること、2. 偽乳頭状構造を示すこと、3. 血管周囲に比較的均質な硝子化（線維化）を認めること、4. 血管指向性を示していること、5. 上皮様の細胞形態を有している
ことに重点を置き、脳腫瘍を専門とした複数の病理医にて検討した結果、典型的な astroblastoma

B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
・脳腫瘍を専門とした複数の病理医の診断が一致した astroblastoma 症例の収集を行う。
・収集した症例のパラフィン包埋切片からとして意見が一致した症例を 8 例収集することができた。そのうち 6 例のパラフィン包埋切片から質の高い genomic DNA を抽出することができ、－ 511 －

arrayCGH 法を行った。結果、解析した全例において、ある染色体全体に渡って chromothripsis を思わせるような大小の欠失が無数に認められた。
その他、2 例で recurrent に見られる異常が 3 個認められた。また、astroblastoma と同様に、星細 胞 や 上 衣 細 胞 へ の 分 化 を 示 す angiocentric
glioma や ependymoma などの腫瘍に特異的として最近報告された遺伝子異常の存在を示唆する結果は得られなかった。
D.考察
網羅的な遺伝子解析において全例に認められた異常は、他の疾患群において recurrent に見られるものとして現在までに報告されていないため、astroblastoma に特異的と考えられる。また、
astroblastoma に類似した腫瘍に特異的な遺伝子B)異常も認められていないため、本腫瘍は分子遺伝

い学的に独立性が高いと考えられる。

凝

さ
E.結論

pr

Astroblastoma は、病理組織学的に類似した腫[T

瘍が複数あるが、分子遺伝学的には独立性の高いAL疾患群であると考えられる。
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表
無し。

A.

性

患

2.学会発表Hirose T, Nobusawa S. Astroblastoma and its
mimics. The 9th Asia Pacific Congress of theInternational Academy of Pathology. June 6,
2015, Brisbane, Australia.

約

な

る

で

て

me

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

細

無し。

で

骨

ル

(g

て

い

や

－ 512 －

平成 27 年度新潟大学脳研究所｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書

筋萎縮性側索硬化症脊髄における GPNMB 凝集体に関する研究
研究代表者
研究分担者
1)

原 英彰 1)

長原 悠樹 1)、嶋澤 雅光 1)、柿田 明美 2)

岐阜薬科大学 薬効解析学研究室2)

新潟大学脳研究所 脳疾患標本資源解析学分野

研究要旨
我々は筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 患者腰髄で GPNMB (Glycoprotein nonmetastatic melanoma proteinB) 凝集体が認められることを報告した。しかしながら GPNMB 凝集体の正体は明らかになっていない。そこで ALS 患者および対照疾患患者の脊髄パラフィン切片を作製し、ALS 患者における GPNMB
凝集体の局在を検討した。GPNMB 凝集体は ALS 患者の頸髄・胸髄・腰髄の灰白質および白質で観察された。GPNMB は GFAP (Glial fibrillary acidic protein) と共局在せず、MAP2 (Microtubule-associatedprotein 2) や SMI32 (Neurofilament H non-phosphorylated) と共局在していた。また、GPNMB は TDP-43[Transactive response (TAR)-DNA-binding protein 43] と共局在していた。以上より、GPNMB 凝集体はALS 患者脊髄の神経細胞に局在し、TDP-43 とも何らかの関連があることが示唆された。

の過剰発現によって SOD1G93A マウスの生存期間

A.研究目的
筋萎縮性側索硬化症 (ALS) は筋肉の萎縮や変が延長することを報告した。さらに、GPNMB が性、運動機能障害等が生じる進行性の神経変性疾ALS の in vitro モデルである SOD1G93A 誘発運動神患であり、有病率は 2-7 人/10 万人である。患者の経細胞死を抑制することも報告した。さらに ALS

約半数が発症後 3-5 年以内に死亡する非常に重篤患者の脊髄 (腰髄灰白質) で、GPNMB の異常なな疾患であるにもかかわらず、唯一の治療薬であ凝集体が見られることを明らかにした (参考文献

るリルゾールも生存期間を約 3 ヶ月延長するのみ

1)。しかしながら GPNMB 凝集体がどこに局在すであり、病態解明や新規治療薬の開発が切望されるか、どのような物質と結合しているか等は明らて い る 。 GPNMB (Glycoprotein nonmetastatic

かにされていない。

melanoma B; Osteoactivin, DC-HIL) は悪性黒色腫

TDP-43 [Transactive response (TAR)-DNA-binding細胞から発見された一回膜貫通型糖タンパク質

protein 43] は、ALS や FTLD (前頭側頭葉変性症)

であり、種々の癌の転移に関与する他、骨吸収・等の疾患との関連が指摘されているタンパク質

骨形成、緑内障等にも関与する。

である。TDP-43 は正常な神経細胞では主に核に

我々は DNA マイクロアレイにより、ALS モデ
G93A

存在しているが、ALS 等の疾患では細胞質中に凝[superoxide dismutase 1

集・蓄積し、核から消失することが知られている。

(glycine 93 changed to alanine)] マウス脊髄におい平成 26 年度、ALS 患者 (2 例) および対照疾患て、野生型マウスと比較して GPNMB が上昇して患者 (2 例) の検討を行ったところ、ALS 患者脊いることを明らかにした。また、ALS 患者の脊髄髄 で 観 察 さ れ た GPNMB 凝 集 体 が MAP2や血清、脳脊髄液で発現上昇すること、GPNMB(Microtubule-associated protein 2) と共局在する可ルマウスである SOD1

－ 513 －

能性が示唆された。そこで本年度、ALS 患者 (10に病理検体保存とその使用に関する承諾」が得ら

例) および対照疾患患者 (10 例) において、同様れている症例を用い、新潟大学医学部倫理委員会に 検 討 を 行 う と と も に 、 GFAP (Glial fibrillaryの承認 (承認番号: 2428) および岐阜薬科大学生

acidic

命倫理委員会の承認 (承認番号: 岐阜市薬会第protein)や

SMI32(NeurofilamentH

non-phosphorylated) と共局在するか検討した。さ

353-1 号) を得た上で行った。

らに、ALS 患者脊髄における GPNMB 凝集体がC.研究結果TDP-43 と共局在するか検討した。

GPNMB 凝集体は ALS 患者の頸髄・胸髄・腰髄
B.研究方法（倫理面への配慮を含む）の灰白質および白質において、対照疾患と比較し新潟大学脳研究所において孤発性 ALS 患者 10て有意に増加していた。

例および対照疾患 (非神経変性疾患) 患者 10 例の

GPNMB 凝集体は、神経細胞 (細胞体・樹状突

頸髄・胸髄・腰髄のパラフィン切片 (厚さ 4μm) を起) のマーカーである MAP2 や、軸索のマーカー作製した。

である SMI32 と共局在していた。その一方で、ア

岐阜薬科大学において、脱パラフィン操作 (キシレン 15 分×3 回、無水エタノール 10 秒×2 回、ストロサイトのマーカーである GFAP とは共局在していなかった (Fig.1)。

99%エタノール 10 秒×2 回、90%エタノール 10

TDP-43 は正常な神経細胞では主に核に存在し秒×1 回、70%エタノール 10 秒×1 回、蒸留水 10ているが、ALS 等の疾患では細胞質中に凝集・蓄

秒×1 回) を行った。クエン酸緩衝液 (pH 6.2) を積し、核から消失することが知られている。ALS

用いて 120°C で 15 分間オートクレーブすること

患者脊髄の神経細胞の細胞質において TDP-43 凝により賦活化した。PBS で Wash 後、10%Horse

集体が生じていた。また、二重免疫染色を行った

serum によりブロッキング (室温、1 時間) を行っところ、GPNMB 凝集体は TDP-43 と共局在してた。PBS で Wash 後、Goat anti-human GPNMB

いることが明らかになった (Fig.2)。

polyclonal antibody (1/20; #AF2550, R&D) を 4°C
donkeyanti-goat

IgG

anti-SMI32#ab11267,(1/1,000;がるで 1 時間反応させた。PBS で Wash 後、Alexa Fluor
anti-mouse

IgG

E.

(1/1,000;#A21204, Invitrogen) 、 ま た は Alexa Fluor

が488-conjugated chicken anti-rabbit IgG antibody

凝(1/1,000; #A21441, Invitrogen) を室温で 1 時間反応経させた。PBS で Wash 後、Hoechst33342 (1/5,000) 又

さ

は DAPI (1/1,000) を室温で 30 分反応させること

GP

で核染色を行った。PBS で Wash 後、フルオロマ
ウントを用いて封入した。Olympus IX50 inverted
epifluorescence microscope (Olympus) を用いて、頸とてMillipore

antibody (1/100; #10782-2-AP, Proteintech) を室温
rabbi

患

抑

Corporation)、または Rabbit anti-TDP-43 polyclonal

488-conjugate

してabcam) 、 Mouse#NE1023,ス

示

PBS で Wash 後、Mouse anti-MAP2 monoclonal(1/500;でお(1/1,000;#A11056, Invitrogen) を室温で 1 時間反応させた。
antibody起

いで 一 晩 反 応 さ せ た 。 PBS で Wash 後 、 Alexa
546-conjugate

D.

Fig.1 ALS 患者腰髄灰白質における二重免疫染色

髄、胸髄、腰髄それぞれについて、灰白質と白質を撮影し、評価を行った。
本研究は新潟大学脳研究所で「病理解剖ならび－ 514 －

TD

で

あ

こ

る

F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表
準備中

ら

会

生

第

2.学会発表なし
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

髄

し

突

ー

ア

在

し

蓄

LS

凝

た

て

色

1.特許取得なし

2.実用新案登録

なし

3.その他

なし

Fig.2 GPNMB と TDP-43 の二重免疫染色[参考文献]

D.考察
GPNMB 凝集体は、神経細胞 (細胞体・樹状突

1: Tanaka H. et al. The potential of GPNMB as novel
neuroprotective factor in amyotrophic lateral起) のマーカーである MAP2 や、軸索のマーカーである SMI32 と共局在していた。その一方で、ア
ストロサイトのマーカーである GFAP とは共局在

sclerosis. Scientific reports 2, 573 (2012).
2: Nagahara Y. et al. Glycoprotein nonmetastaticmelanoma protein B ameliorates skeletal muscle

していなかった。よって、GPNMB 凝集体は ALS

lesions in a SOD1 (G93A) mouse model of

患者脊髄の神経細胞において形成されているこ

amyotrophicとが明らかになった。
また、GPNMB 凝集体は TDP-43 と共局在していた。我々のこれまでの研究で、GPNMB が in vivo

lateralsclerosis.

Journalofneuroscience research 93, 1552-1566 (2015).
3: Nagahara Y. et al. The effect of GPNMB on

および in vitro の ALS モデルに対して保護作用を示すことが示唆されている (参考文献 1-3)。従って GPNMB は TDP-43 凝集に起因した細胞障害を抑制するために、ALS 患者脊髄の神経細胞において発現増加するのかもしれない。GPNMB 凝集体がどうして生じるのか、どのような作用をしているか等は今後の検討課題である。
E.結論
ALS 患者の頸髄・胸髄・腰髄で GPNMB 凝集体が生じることが明らかになった。また、GPNMB
凝集体はアストロサイトには局在しておらず、神経細胞の細胞体や軸索に局在する可能性が示唆された。よって、本研究により ALS 患者脊髄のGPNMB 凝集体の局在が明らかになった。
また、GPNMB 凝集体は ALS 患者脊髄においてTDP-43 と共局在していた。さらなる検討が必要ではあるが、GPNMB 凝集体が TDP-43 と関連がある可能性が示唆された。本研究をさらに進めることで、ALS の病態解明や治療薬の開発につながると考えられる。
－ 515 －

muscular atrophy caused by ALS. Musculoskeletal
Regeneration 1 (2015).

学
平成 27 年度新潟大学脳研究所

脳｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

En

共同利用・共同研究報告書

gl(C

ヒト神経疾患脳における DAP12 発現の病理学的検討

(1

い

C.
研究代表者：佐々木 惇 1）
研究分担者：柿田 明美 2）
1)埼玉医科大学病理学，2)新潟大学脳研究所

mi

DA

で

mi

ma
研究要旨

ら

Nasu-Hakola病（以下、NHDと略す）では近年，DAP12 (DNAX-activation protein 1), also known as

で

TYROBP (TYRO protein tyrosine kinase-binding protein)遺伝子およびDAP12のアダプター分子である
TREM2（triggering receptor expressed on myeloid cell 2）の変異ないし欠損が見出され，脳内の蛋白発TA

現消失が脳病変の病態に関与する可能性が示唆された．DAP12（DNAX activating protein of 12 kDa）

ac

はI型膜貫通糖タンパクであり，染色体19q13に位置する遺伝子でコードされている．本研究では、NHD

peなどの神経疾患でのNHD12の役割を明らかにするために，剖検および生検脳組織を用いて，DAP12蛋白/
遺伝子発現を検討した．
平成26年度までの結果について、佐々木が筆頭著者となり、共同研究者の柿田をはじめとする共著者

腫

血

D.

と英文論文を作成した。その論文はNeurogenetics誌に受理され、2015年度に掲載された。
NHD以外の疾患として、悪性脳腫瘍である膠芽腫を検討したところ、一部の症例で多数のtumor

でassociated macrophage (TAM)がDAP12強陽性となり，腫瘍周囲では，activated microglia, resting可microglia, perivascular cellも陽性となった．さらにTAMは膠芽腫組織内の微小血管増殖部に増加し分ていることが示された。

がるグ
A.研究目的NHD2 例、埼玉医科大学国際医療センターで摘出さ

本研究の目的は NHD などのヒト神経疾患でのれた膠芽腫 30 例と非神経疾患剖検例 6 例を対象

DAP12 の役割の解明であり，研究期間内に以下のとした。いずれの症例とも遺族への説明は臨床担点を明らかにする：

当医師からなされており，文書により研究に使用

1) DAP12 遺伝時異常することに関する同意が得られていた．また．す2) DAP12 蛋白発現でに診断された後の保存資料であり，資料提供者

3)脳内 DAP12 蛋白発現のミクログリア特異性・

本人や遺族への不利益や危険性は全く生じてい活性化との関係ない．
DAP12 遺伝子検索は、NHD 凍結脳を用いて、シB.研究方法（倫理面への配慮を含む）

ークエンス、RT-PCR、real time PCR により行っ

新潟大学脳研究所に保存された NHD2 例と他院た。

－ 516 －

係

ce

る

の

今

析

に

bl

白

ma

as

DAP12 蛋白解析は、Western blot と免疫組織化

発現との比較解析も望まれる．

学（IH）により行った。IH では、ホルマリン固定
脳 パ ラ フ ィ ン 切 片 を 作 製 し ， LSAB 法 な い し

E.結論

EnVision FLEX 法を行った．一次抗体として，Iba1，

今回、我々は、NHD 症例の中には通常の症例とglucose transporter 5 (Glut5), MHC class II同様の臨床・病理像を示し、DAP12 遺伝子変異を(CR3.43), CD68 (PG.M1), CD204 (SRA-E5), CD163持つにも拘わらず、DAP12 の mRNA や蛋白が高発現(10D6），抗 DAP12 抗体(FL-113 と ab11017)，を用される症例があることを初めて論文発表した。今いた．

後は，DAP12 ないし TREM2 の DNA, mRNA,蛋白の詳
細な解析、疾患特異性，および他の受容体分子発現との比較検討が必要であることが示唆された．

C.研究結果
今年度は、従来の結果にもとづき、activated

では，非神経疾患脳において，DAP12 は resting

F.研究発表1.論文発表A Sasaki, A Kakita, K Yoshida, T Konno, T

microglia,

meningeal

Ikeuchi, S Hayashi, H Matsuo, K Shioda:

macrophages, choroid plexus macrophage に認め

Variable expression of microglial DAP12 andられた，一方，抗 DAP12 抗体（goat, ab11017）

TREM2

では，明らかな陽性像は得られなかった．

Neurogenetics

microglia や TAM での DAP12 発現を解析した。抗DAP12 抗体（ラビット，FL-113）を用いた免疫染色

perivascular

cells,

genesinNasu-Hakola

16:265-276,

disease.

2015.

DOI

10.1007/s10048-015-0451-3

る一方，脳腫瘍手術摘出組織においては，多数の

発

TAM が DAP12 強陽性となり，腫瘍周囲では，

2.学会発表）activated

microglia,

佐々木惇：「Nasu-Hakola 病におけるミクログリ

Dperivascular cell も陽性となった．さらに膠芽ア：病態への関与」教育講演 E-04「神経疾患にお腫の MVP 部に M2 型を含む多数の TAM がみられ、いてミクログリアはもはや脇役ではない」第 56

血管増生での役割が示唆された。

回日本神経学会学術大会 （新潟、2015.5.21.）

D.考察

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

/

者

し

さ

象

担

用

す

者

い

シ

っ

microglia,

resting

NHD 脳における DAP12 蛋白異常は、蛋白レベル

1.特許取得

での発現低下だけでなく、蛋白の機能異常がある

なし可能性が示された。NHD は、DAP12 ないし TREM2

2.実用新案登録

分子の異常による、”microgliopathy”の可能性

なし

が高いが、その発症メカニズムは未だ未解決であ

3.その他る。今後は、microglia と axon との関係、ミクロなし

グリアとオリゴデンドログリア・ミエリンとの関係についての詳細な解析が必要と考える。
従来の検討で，我々は，DAP12 が perivascularcell を含む脳内の macrophage 系細胞にも発現することを示した．さらに，悪性グリオーマ組織内の TAM にも DAP12 が発現することを初めて示した．
今後は DAP12 分子の発現細胞数や発現レベルの解析が必要と考えられた。具体的には悪性 glioma
においても，免疫組織化学だけでなく，western
blot 法，real-time PCR 法による mRNA および蛋白発現量の検討が必要であり、DAP12 とともに
macrophage 受容体分子である TREM2 や CSF1-R の－ 517 －

マ個
平成 27 年度新潟大学脳研究所の｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣

を共同利用・共同研究報告書

ド部

時間的空間的特異的 Scrapper ノックアウトマウスの作製と解析

階矢尾 育子 1）2）
研究分担者 伊藤 誠二 1）

D.

研究分担者 片野 泰代 1）
研究分担者 崎村 建司 3）

位

研究代表者

に

ノ
1）関西医科大学 2）浜松医科大学 3）新潟大学

ま

び
研究要旨

る

SCRAPPER は神経シナプスに局在し、神経伝達物質放出の制御にかかわるユビキチン E3 リガーゼであがる。Scrapper 遺伝子ノックアウト（SCR-KO）マウスが生後致死であるため、成体での SCRAPPER 分子のれ機能を十分に解析できなかった。そこで部位特異的なコンディショナル KO（cKO）マウスを作製し、そ統の詳細な機能解析を行うことを計画した。前年度までに、コンディショナルノックアウトマウス作製のるための floxed 型のベクターを構築し、組換え ES 細胞株よりキメラマウスを作出している。生殖系列にES 細胞が分化した個体より標的 floxed 型マウスを樹立し、F1 世代のマウスが得られており、ドライバ

E.

ーマウスとの交配により時間的空間的特異的 SCR-cKO マウスを作製しようとしている。今後ドライバー
マウスとの交配により部位手特異的 SCR-cKO マウスを作製するとともに、以前に解析した null ノック

樹

アウトマウスと同じ表現型が得られるかも合わせて検討するため、共同研究を継続していく予定である。

繁異新潟大学崎村研究室で開発された RENKA 株 ES 細A.研究目的F.
1.
なScrapper 欠損マウス（SCR-KO マウス）は体が胞に導入し、相同組み換え体を選別する。これら

小さい上に寿命が短く、恐怖記憶形成の異常、脳の組換え ES 細胞株よりキメラマウスを作出し、の海綿状変性や神経細胞の萎縮といった老化現

生 殖 系 列 に ES 細 胞 が 分 化 し た 個 体 よ り 標 的象が見られる。SCR-KO マウス脳において変動してfloxed 型マウスを樹立する。さらに、脳部位特異2.

いる分子の同定が神経変性疾患病態解明の 1 つの的な Cre 発現マウスを利用して、部位特異的なノ

1)

鍵になると考えられる。

ックアウトマウスを作製して解析に供する。

「

SCR-KO マウスは、多くの個体が生後半年程度で動物実験計画は大学の内規に準じて行う。実験

第死亡する。また、産仔数もメンデルの法則に従わ時には適切に麻酔処理を行い、動物への苦痛を可

20

ず少ないことから、SCRAPPER が発生段階において能な限り除く。

2)も機能していることが予想される。本研究では、致死の表現型を回避し脳に限定した機能を解析

C.研究結果現在までに、コンディショナルノックアウトマ

第ウス作製のための floxed 型のベクターを構築し、20することができる、部位特異的なコンディショナ
ル KO マウスを作製し解析をおこなう。

「

このベクターを新潟大学崎村研究室で開発されB.研究方法floxed 型のベクターを構築し、このベクターをた RENKA 株 ES 細胞に導入し、相同組み換え体を3)選別した。これらの組換え ES 細胞株よりキメラ「

可－ 518 －

マウスを作出し、生殖系列に ES 細胞が分化した

第 93 回日本生理学会大会

個体より標的 floxed 型マウスを樹立し、F1 世代

2016/3/22 札幌コンベンションセンター（北海道のマウスを得ている。今年度、浜松医大への導入札幌市）を完了し、FLP マウスとの交配を進めた。現在、ドライバーマウスとの交配により、時期あるいは

4) 矢尾育子

部位特異的なノックアウトマウスを作製する段「質量顕微鏡法による神経疾患モデル動物解析

階である。

に向けて」
第 121 回日本解剖学会総会・全国学術集会
2016/3/28 ビッグパレットふくしま（福島県郡山

D.考察
脳部位特異的な Cre 発現マウスを利用して、部

市）

位特異的なノックアウトマウスを作製して解析に供する計画であることから、今後、交配を行い

G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）

ノックアウトマウスラインの樹立が必要である。

1.特許取得また、解析に適するドライバーマウスの選択およなし

び交配、その後の解析を行う必要がある。現存す

2.実用新案登録

るノックアウトマウスはバックグラウンド系統

なし

あが複数の雑種となっていることから、新たに得ら

3.その他

の

れるマウスを用いた解析はバックグラウンド系

なし

そ統の影響を消去できる点でも有用であると考え

の

る。

に

バ

E.結論

ー

SCR-cKO マウス作製のための floxed 型マウスをク樹立し、F1 世代のマウスが得られた。今後さらにる。

繁殖、ドライバーマウスとの交配により部位手特

細

ら

、

異的 SCR-cKO マウスを作製する。
F.研究発表（上記課題名に関するもの）
1.論文発表なし

的異2.学会発表ノ1) 矢尾育子「質量分析イメージングで何が見えるか」験

第 42 回 BMS コンファレンス

可2015/7/6 岐阜グランドホテル（岐阜県岐阜市）
2) 矢尾育子「質量分析イメージングの実際」

マ

第 56 回日本組織細胞化学会総会

し、2015/10/3 関西医科大学（大阪府枚方市）

れを3) 矢尾育子

ラ「ユビキチンリガーゼ SCRAPPER によるシナプス
可塑性の調節」－ 519 －