福岡水海技七研報 第10号 2000年3月
Bull.Fukuoka Fisheries Mar.Technol.Res.Cent.,No.10March2000

AFLPフィンガープリント法で求めたBSIによる、アワビ集団の遺伝変異保有量の推定
岩渕 光伸・太刀山 透・筑紫 康博・深川 敦平(研究部)

Estimation of Genetic Variabilityln Population of Abalone by BSIfTOm AFLP FingeTPrinting

Mitsunobu

IwABUCHI,Toru TACHIYAMA,Yasuhiro CHIKUSHI and Atsutoshi FUKAGAWA(Research DepaTtment)

西日本におけるアワビの栽培漁業は,クロアワビ

材料及び方法(Halitos disccus discus)の種苗放流による生産性の増大が図られ成果を上げてきた。しかし疾病の発生による供試アワビ

クロアワビのサンプルとして1996年に福クロアワビ種苗生産の不調のため,エゾアワビ(H.d.

岡県大島地先で採集された個体と1999年に静岡県で採集hanai)の種苗生産,放流が西日本各地で行われるようされた個体を用いた。またエゾアワビのサンプルとしてになった。クロアワビとエゾアワビでは生態的な違いが1996年宮城県で採集された個体を用いた。福岡県ではエあると言われているが,形態的には似通っており,判別

ゾアワビの種苗放流は1990年に開始されており,今回のは難しく,エゾアワビの放流が生態系に与えた影響や,クロアワビのサンプルは採集年,採集場所及び年齢査定

今後の種苗放流が遺伝的多様性に与える影響を把握するの結果6年以上経過したものと判断され,エゾアワビのことは重要な課題であると考えられる。

種苗放流の影響を受けていない集団である。一方静岡県
においてはエゾアワビの種苗放流は行われておらず,サ遺伝的多様性を推定する方法としてDNA多型の検出による方法があり,最近では水産生物においてもアンプルはクロアワビであると判断された。
供試個体数は各サンプル10個体で,採集後,

ユ,1)2)マダイ3)4)をはじめとして多くの魚種で解析が行なわれている。また,DNA多型の検出法にはいくつかDNA抽出処理まで‑20℃で冷凍保存した。の方法があるが,5)植物の多型解析用に開発されたAFLP

DNA抽出 DNAは各個体の筋肉部からSDS‑フェノーフィンガープリント法(以下AFLP法と略記)6)が有望視

ル法を用いて抽出した。抽出後AFLP処理を行なうまで‑されている。その理由として,従来の方法に比べて解析20℃で保存した。に使用するDNAが微量で良いこと,1回の解析で多くのAFLP解析

AFLP処理はパーキンエルマーバイオシDNA断片を解析できること,データの再現性と信頼性

ステムズ社のAFLPTM Plant Mapping Kit Regularが非常に高いことがあげられる。しかし水産生物に対すPlant Genomes用を用いた。処理手順は添付マニュア

るAFLP法の応用例はまだ少なく,アワビに用いた報告

ルに従い,以下のように行なった。

は見当たらない。本研究では,植物用に開発されたAF(1)サンプルDNAO.05μgを制限酵素EcoRIとMseIで切LP法がアワビのDNA多型検出に利用できるか否かにつ断し,同時にアダプターをライゲーション処理した。こいて検討し,同法によるアワビ集団の遺伝変異保有量推の処理は25℃の温度条件で一晩行なった。

定の有効性を調べた。その結果,AFLP法によって検出(2)アダプターに相補的で末端に1塩基を付加したプラされた増幅断片のBSI(断片の共有度)が,クロアワビイマーを用いてPre Selective PCRを行ない,両端がEcとェゾアワビ集団の地理的隔離距離と遺伝的分化程度をoRIとMseIの組み合わせの断片のみを増幅した。

示唆するという知見が得られたので報告する。

(3)EcoRI側にAGG,MseI側にCTTの塩基配列を加えたプライマーペアを用いてSelective PCRを行なった。

ー35‑岩 渕・太刀山・筑 紫・深 川

塩 基 数(bp)306090120150180210240

図1270300330360390420450480510540570アワビDNAのAFLP解析パターン

塩 基 数(bp)200

図2

同一の固体から採集したDNAのAFLPパターン(4)PCR後の増幅断片はパーキンエルマーバイオシス

BSI=2Nab/(Na+Nb)

テムズ社のGenetic Analyzer310によって検出した。

Nab:個体aおよびbに共有する断片数

サンプル中には分子量マーカーを加え,Gene Scanソフ

Na:個体aに認められた断片数

トウェアで増幅断片のサイズを決定した。

Nb:個体bに認められた断片数

各サンプルの遺伝的類似度を示す指標として2個体問結で検出された総断片数に占める共有断片数の割合

果(Band SharingIndices:BSI)を次式によって算出し,増幅断片は図1に示したように塩基数50bpから500bp

集団内と集団間の平均を求めて集団の遺伝的な類似度をの問に検出された。また,図2に示したように同一の個求めた。

体から単離したDNAではAFLPパターンは完全に一致

ー36‑

アワビ集団の遺伝変異保有の推定

塩基数(bp)200

福岡1‑1‑ご1‑一l一一一一一一Il一一一一一一一一一11‑‑‑一一一一一‥1一一一l一一一ll‑h

福岡
2↓

静
岡且ふ

宮
城且もふ

宮城 2

̲̲̲l一Ⅶ‑‑tlu‑111‑‑‑1■‑ll

図3

一‑‑1‑‑一Ll1‑1‑1‑

1‑1‑ll‑各サンプルのAFLPフィンガープリントパターン

矢印は多型を示した主な増幅断片ピークを表す

し,SDS‑フェノール法で単離したDNAがAFLP解析に200を超える条件を満たした断片は,福岡県のサンプル使用できること,植物用のAFLPキットでもアワビDNが42本〜55本(総断片数103本),静岡県のサンプルが39Aを処理できることが判明した。さらに図3に示したよ

本〜51本(総断片数89本),宮城県のサンプルが38本〜5うに,個体ごとに多型を示す増幅断片が多く確認され,5本(総断片数85本)認められ,総断片数は142本であっDNA多型の検出と遺伝変異保有量の推定が可能である

た。各集団の遺伝的多様度の指標となる各県ごとのすべことが分かった。しかし300bp以上の増幅断片では検出てのサンプルで認められた断片数,すなわち単型を示しされるピークの幅が広くなり,データの信頼性が低下する傾向が認められたため,今回の解析からは除外した。

た断片数は福岡県が16・5%に卒たる17本,静岡県が24・7%にあたる22本,宮城県が18.8%にあたる16本であった。

また,図中の縦軸に相当する検出した増幅断片のピーク

すべての30サンプルで認められた共通の断片は,塩基数が200未満のものについても除外し,強い蛍光ピークが61bp,64bp,98bp,100bp,122bp,136bp,200bp,21得られた増幅断片のみを解析することとした。

2bp及び279bpの9本であった。
各個体問のBSIから求めた各集団内と集団間のBSIのしたがって増幅断片サイズ50〜300bpで,ピークがー37‑岩 渕・太刀山・筑 紫・深 川

較することが可能である。このため,集団の遺伝的多様表1 各県アワビの集団内と集団問のBSIの平均度の推定など多数のサンプルを解析しなければならない
福岡

県

静岡

県

宮城

場合には,非常に有効な手法であると考えられる。しか県しながら今回,同じ条件で処理しているにもかかわらず,

福岡県 0.7134±0.的0 0.0709±0.0450.6571±0.的1
静岡県

0.7494±0.0400.6720±0.049

宮城県

0.7223±0月55

同じ塩基数の増幅断片でもサンプルによってはピークの高さに大きな違いが認められるものがあった。本研究では,増幅断片のピークとノイズとを明確に区別する目的で,解析に使用する増幅断片のピークを200以上に限定平均を表1に示した。集団内は静岡県0.749,宮城県0.72した。このため,ピークの高さが200に近く,増幅断片2,福岡県0.713となり,静岡県がもっとも遺伝的類似度であることが疑われる断片も排除している。より信頼性が高く,福岡県がもっとも低い結果となった。一方,集の高い解析結果を得るためには,多くのデータを蓄積し,団問のBSI平均は,福岡県と静岡県問が最も高く0.709と解析に使用するピークの下限について検討を加えていくなり,福岡県と宮城県問が0.657と最も低くなった。

ことが必要であると考えられた。
今回使用したプライマーペアはEcoRI‑AGG,MseI‑C考TTであるが,AFLPキットには,プライマーペアの組察み合わせが他に63通りある。したがって同じサンプルで単型を示した断片の割合と集団内のBSIの平均から,もプライマーペアの組み合わせを変えることによって,静岡県のサンプルが最も遺伝的類似度の高いことが判明

遺伝変異保有量の推定などのデータの信頼性は高まるこした。この理由は明らかではないが,静岡県のサンプルとが期待される。また,EcoRLAGG,MseI‑CTTのプラ採集年が1999年と,福岡県,宮城県のサンプル採集年よ

イマーペアではクロアワビとェゾアワビを個体レベルでり3年遅かったことから,遺伝的多様度の低い人工種苗

明確に識別するマーカーは見っからなかったが,他のプの放流が天然アワビ集団の遺伝変異保有量を低下させてライマーペアの組み合わせの中に,クロアワビとェゾアいる可能性も考えられた。この点を明らかにするためにワビの識別が可能なマーカーが見っかることも期待されは,種苗放流の影響を全く受けていないと判断される海る。

域の天然アワビ集団の解析,福岡県と宮城県の最新のサ謝

ンプルの解析,さらには人工種苗集団の解析が必要である。

辞本研究を行なうにあたり,サンプルを提供いただいた

各集団問のBSIの平均は,福岡県と宮城県のアワビ集

東京大学海洋研究所小島茂明助教授および静岡県水産試団問で最も低い値を示し,次いで静岡県と宮城県問,そ験場伊豆分場川嶋尚正氏にお礼申し上げる。

して福岡県と静岡県間で最も高い値を示した。これは,要集団問の地理的な隔離距離を表しているものと推定され約た。また,クロアワビとェゾアワビの遺伝的分化程度を

1)福岡県,静岡県,宮城県の天然アワビ10個体ずつか示唆していることも推察され,さらに多くのサンプルのらDNAを抽出し,EcoRI‑AGG,MseI‑CTTのプラ解析が必要である。またクロアワビ,エゾアワビの他にイマーペアを用いてAFLP解析を行なった。

も,メガイアワビ,マダカアワビなど種の異なる集団に2)塩基数50bpから300bpの間に認められた増幅断片数

ついても同様に解析して比較することも重要であると考は,福岡県のサンプルが42〜55本,静岡県のサンプえられる。

ルが39〜51本,宮城県のサンプルが38〜55本であっ

今回,植物用のキットを用い,DNAシーケンサーでた。

増幅バンドを検出するAFLP法によって,アワビ集団の3)をれぞれの集団内のBSIが最も高かったのは静岡県

遺伝変異保有量の推定が可能なことが明らかとなった。の集団で,最も低かったのは福岡県の集団であった。

AFLP法は,サイズマーカーとの比較により増幅断片サ4)集団問では福岡県と宮城県のBSIが最も低く,地理イズを1塩基単位で特定することが可能である。また,的隔離距離が長いことを反映している結果が得られ再現性が高いため,RFLP法やRAPD法のように比較した。

たいサンプルを同一ゲル上に泳動しなくてもデータを比ー38‑アワビ集団の遺伝変異保有の推定

文4)M.Takagi,N.Taniguchi,D.Cook andR.W.Doyle:

献

Isolation and characterization of micro satellite1)高木基裕,谷口順彦:DNAフィンガープリントに

locifrom red sea bream Pagrus mtuor and de‑おけるリュウキュウアユの遺伝保有量と地理的分化

tectionin closely related species.Fish.Sci.,

水産育種,20,29‑37(1984).

63,199‑204(1997)。

2)高木基裕,曽我部五郎,谷口順彦:AFLPフィンガー

5)谷口順彦・高木基裕:DNA多型と魚類集団の多様プリント法によるアユの遺伝変異保有量と分化。水性解析,「魚類のDNA」(青木苗・陸島史夫・平野産育種,26,5541(1998).

哲也編),恒星社厚生閣,東京,1997,pp.117‑137.

3)K.Tabata,H.Kishioka,A.Mizuta and N.Taniguch

6)P.Vos,R.Hoger,M.Bleeker,et al.:AFLP:a neW

i:Genetic Diverslty Of Five Strains of Red Sea

technique for DNA fingerprinting.Nuceic Acids
Res.,23,4407‑4414(1995).

Bream Pagrus major by RFLP AnalysIS Of
mtDNA D‑Loop ReglOn.Fish。Sci.,

63,344‑348(1997).

ー39‑