学位論文内容の要旨
博士の専攻分野の名称

博士（医 学）

氏 名

加藤 容崇

学 位 論 文 題 名
ヒト腫瘍における COX-2 発現の分子病理学的解析【背景と目的】腫瘍における COX—2 過剰発現は多くの組織で報告されている。腫瘍細胞は COX-2 過剰発現により造腫瘍能の獲得、細胞増殖能の上昇、抗アポトーシス、リンパ管や毛細血管など脈管新生を促進することが知られている。COX-2 阻害薬を用いた検討では、長期間のアスピリン投与は大腸癌発生リスクを減少させ、COX-2 阻害薬による大腸癌に対する予防的効果が認められている。しかしながら、大腸癌患者に対し COX-2 阻害薬を用いた臨床試
験では有効性に対し意見が分かれる結果であり、癌に対して COX-2 阻害薬による治療の有効性に関して一致した見解は得られていない。腫瘍細胞組織中での COX-2 発現の意義を明確にするために、本研究では、大腸癌および髄膜腫、転移性脳腫瘍に対し免疫組織化学的検討を行い、大腸癌に対して分子生物学的検討を行った。
第 1 章 ヒト腫瘍における COX-2 発現の免疫組織化学的解析【対象と方法】大腸癌、髄膜腫および転移性脳腫瘍に対し抗 COX-2 抗体(Polyclonalantibody, Cayman Chemical, Michigan, USA )を用いて免疫組織化学染色を施行し、腫瘍細胞の COX-2 発現の評価は染色強度と陽性率を判定した。
①大腸癌: 北海道大学病院消化器外科Ⅰにて 2002 年 1 月から 2004 年 12 月まで施行された大腸癌切除検体 91 例を用いた。腫瘍細胞とともに周囲間質細胞の COX-2 発現も評価した。COX-2 発現と病理学的進展因子および全生存期間、無増悪生存期間との相関を統計学的に検討した。また、腫瘍細胞に加えて浸潤部および非浸潤部の周囲間質細胞のCOX-2 発現の相関も同様に検討した。
②髄膜腫: 北海道大学医学研究科腫瘍病理学分野にて 2005 年から 2012 年の間に髄膜腫と病理診断された 76 例を用いた。COX-2 発現と WHO Grade および MIB-1 index との相関を統計学的に検討した。
③転移性脳腫瘍: 北海道大学医学研究科腫瘍病理学講座にて 2003 年から 2012 年の間に髄膜腫と病理診断された 166 例を用いた。また 166 例のうち再発した症例 13 例に対しても免疫組織化学染色を施行し COX-2 の発現を確認した。
【結果】①大腸癌：74.7 %の症例に COX-2 発現がみられた。大腸癌細胞および周囲間質細胞における COX-2 発現と病理学的進展因子との相関あるいは全生存、無増悪生存期間との間に統計学的有意相関は見られたかったが(p = 0.550, p = 0.124)、大腸癌細胞と周囲間質細胞との間には非浸潤部では統計学的有意相関は見られなかったが(p =0.15)、浸潤部では統計学的有意相関を認めた(p = 0.0015)。
②髄膜腫：75.0 %の症例に COX-2 発現が認められた。髄膜腫細胞の COX-2 発現と全生存期間および無増悪生存期間との間に統計学的有意相関は見られなかった(p = 0.822, p= 0.970)。
WHO Grade および MIB-1 index との間には統計学的有意相関が見られた(p =0.0153, p = 0.0075)。
③転移性脳腫瘍：15.0 %の症例に COX-2 発現が見られた。再発した 13 例中 1 例(7.7 %)に COX-2 発現の陽性化を認めた。
第 2 章 ヒト腫瘍における COX-2 発現の分子生物学的解析【対象と方法】大腸癌細胞株(WiDr、HCA7)およびヒト培養胎児腎細胞(293FT)に対し、
COX-2 発現レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを作成し、一過性導入およびウイルス感染を行った。また、COX-2 の 5’-UTR 側に 132、120、90、60、30
塩基対および Kozak 配列のみ付加した COX-2 発現レトロウイルスベクターも作成し同様の検討を行った。COX-2 発現確認はウェスタンブロット法にて確認し、COX-2 発現が見られた 293FT 細胞の培養液中の PGE2 濃度を ELISA 法にて測定し、得られた順化培地と大腸癌の培地を交換し BrdU アッセイを行い増殖能の変化を確認した。
【結果】いずれの発現ベクターにおいてもウイルス感染による COX-2 過剰発現は認められなかった。一過性導入においても COX-2 の 5’-UTR 側に付加のない発現ベクター
では発現は不安定であり、5’-UTR 側に 132 塩基対および Kozak 配列を付加した発現ベクターでは安定した COX-2 発現が見られ、PGE2 濃度の上昇が確認された。また、
ELISA により PGE2 濃度の上昇が確認された順化培地に培養液を置換した大腸癌細胞株では、元々培養液中の PGE2 濃度が低い WiDr のみで COX-2 発現誘導が見られ、BrdU取り込みが統計学的に有意に上昇していた。培養液中の PGE2 濃度の高い HCA7 では
COX-2 発現誘導は見られず、BrdU 取り込みの統計学的有意差は見られなかった。
【考察】
1) 第 1 章の免疫組織化学的検討では大腸癌の浸潤部において大腸癌細胞と周囲間質細胞の COX-2 発現は統計学的有意相関を示し、髄膜腫では COX-2 発現と WHO Grade およびMIB-1 index が統計学的に有意相関を示すことを明らかにした。いずれも COX-2 発現と予後については有意な相関は認められなかったが、髄膜腫において WHO Grade と MIB-1index に相関があることは髄膜腫細胞において COX-2 発現が悪性化に寄与することが示
唆され、大腸癌において浸潤部にて腫瘍細胞と周囲間質細胞の COX-2 発現には相関が見られた。腫瘍における COX-2 の主要なメディエーターは PGE2 であることから腫瘍細胞と周囲間質細胞の COX-2 発現との間には PGE2 が介在する可能性がある。PGE2 の介在する COX-2 相互発現の悪性化への寄与を明らかにするために分子生物学的検討を加える必要があると考えられた。
2) 第 2 章の分子生物学的検討では、COX-2 の 5’-UTR 側の付加領域が COX-2 安定発現のために重要であることを示し、大腸癌細胞では培養液中の PGE2 濃度上昇により COX-2が誘導され、増殖能が統計学的に有意に上昇することを示した。これは免疫組織化学的検討において大腸癌浸潤部における腫瘍細胞と周囲間質細胞の COX-2 発現が相関することと合わせ、大腸癌浸潤部では PGE2 を介する COX-2 発現の正のフィードバック回路が存在し、悪性化に寄与することが示された。
【結論】
ヒト腫瘍における COX-2 発現は腫瘍悪性化および増殖能上昇をもたらす。特に腫瘍浸潤部では PGE2 を介する COX-2 相互誘導による正のフィードバック回路が存在する。
COX-2 阻害薬により浸潤部での正のフィードバック回路を遮断することにより腫瘍の悪性化を低下させることで、COX-2 は腫瘍の治療標的として有用である可能性がある。
【結語】
本研究により腫瘍における PGE2 を介する COX-2 相互誘導の正のフィードバック回路が存在し悪性化に寄与しうることが示されたが、COX-2 発現と予後との相関あるいは非浸潤部での COX-2 の検討や、浸潤部においても腫瘍細胞や線維芽細胞、免疫細胞など多くの細胞が存在し、多細胞系での in vitro の検討および in vivo での検討が今後の課題である。