Journal of Advanced Science, Vol. 35, 35301 (2023)
LetterImage-based parallel measurement of alcohol metabolism-related
ethanol and acetaldehyde in exhaled air
アルコール代謝に基づく呼気中エタノールおよびアセトアルデヒドの並列画像計測
Riki SHINOHARA * and Yuuki HAYAKAWA *Tokyo Medical and Dental University (TMDU), Graduate School of Medical and Dental Sciences,
1-5-45 Yushima, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8580, Japan
Kenta IITANI ** and Kohji MITSUBAYASHI **Tokyo Medical and Dental University (TMDU), Institute of Biomaterials and Bioengineering,
2-3-10 Kanda-Surugadai, Chiyoda-ku, Tokyo 101-0062, Japan
TEL: +81-3-5280-8091 FAX: +81-3-5280-8094 e-mail: m.bdi@tmd.ac.jp(Received30 January, 2023

Accepted16 May, 2023)

Measurement of volatile organic compounds (VOCs) contained in exhaled air and skin gas would be
effective for the noninvasive assessment of metabolism and disease screening. Furthermore, simultaneous
measurement of multiple VOCs that were generated at the same metabolic pathway is important forunderstanding metabolic functions, e.g., evaluation of alcohol metabolism possible by measuring ethanol(EtOH) and acetaldehyde (AcH). Here we report a parallel gas-imaging system of breath EtOH and AcH
using the oxidation and reduction reactions of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-dependentalcohol dehydrogenase (ADH). This system allowed gas-imaging of two VOCs by using a high-sensitivity
camera to capture a fluorescence of NADH (excitation:340 nm, fluorescence: 490 nm), which increased by
the oxidation of EtOH and decreased by the reduction of AcH catalyzed by the ADH in the enzyme
immobilized meshes placed parallel in front of the camera. In addition, the system was possible to quantify
the EtOH and AcH in exhaled air after alcohol consumption based on the image analysis technique.
Keywords: Enzyme-based biosensor, Gas-imaging, Fluorescence, Alcohol metabolism, Exhaled air

I. INTRODUCTION

信頼性に資する情報を提供できるものと考えられる。本呼気や皮膚ガスには疾患や代謝に関連して生成される研究ではアルコール代謝を対象とし、その代謝経路血中由来の揮発性有機化合物(VOCs)が含まれている。こ（EtOH→AcH→酢酸）にて段階的に生成される EtOH とれらの濃度を計測することで、非侵襲的な代謝評価や疫AcH を、同時に並列イメージング可能な装置を開発し、病スクリーニングへの応用が可能で、1

飲酒後のアルコール代謝評価に応用し、その有効性を調また新たな計測応用も期待されている。例えば、VOCs の生化学的な評べた。

価応用において、代謝経路や疾患メカニズムに基づく複数の VOCs を同時に計測し評価することで、生理学的な***II. METHODS AND MATERIALS
II-A. Construction of gas-imaging system
ADH の可逆反応を利用した EtOH と AcH のバイオ蛍

東京医科歯科大学大学院 医歯学総合研究科

光検出原理を Fig. 1 (a)に、またガスイメージング装置の東京医科歯科大学 生体材料工学研究所

SAS Award was given to this paper presented as Poster

概略図を Fig. 1 (b)に示す。可逆酵素である ADH は、そPresentation at the 2022 SAS Symposium.の酸化・還元反応を溶液の pH により制御可能であり、©2023 Society of Advanced Science

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pH9.0 にて EtOH の酸化、pH6.5 では AcH の還元が支配け摂取させ、呼気を 0, 15, 30, 45, 60, 90 分後にサンプル的な反応となる。2

その際に、補酵素である還元型ニコバッグにて回収した。
その後、採取した呼気を保湿カバー

チンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)が生成またにて 36℃保持後、小型 DC ダイアフラムポンプを用いて、は消費される。この NADH は自家蛍光(励起:340 nm, 蛍

各 メ ッ シ ュ に 負 荷 し た (EtOH 用 酵 素 メ ッ シ ュ : 100

光:490 nm)を有し、この蛍光の増減を高感度カメラで捉

mL/min, AcH 用酵素メッシュ: 40 mL/min)。ガス計測ではえることにより 2 成分をイメージングすることができる。

「清浄ガス(20 s)→呼気ガス(20 s)→清浄ガス(140 s)」の順

本システムは暗箱内に設置された励起光源(UV-LED)、励でガスを負荷し、得られた動画を画像解析することで、起光用バンドパスフィルタ(BPF, λ= 340 ± 42.5 nm)、並列

呼気 EtOH と AcH 濃度の経時変化を調べた(東京医科歯に配置された酵素メッシュ、蛍光用 BPF(λ= 490 ± 10 nm)、科大学 承認番号: 2012-6)。なお比較のため、検知管高感度カメラを用いて構築した。酵素メッシュは、ADH(EtOH: 112 L, AcH: 92 L, GASTEC)による濃度計測も実施をコットンメッシュ(15 × 15 mm2)にグルタルアルデヒドした。

にて架橋結合にて固定化した後、NAD+溶液(EtOH用)･NADH 溶液(AcH 用)をそれぞれに浸漬し、並列に配置した。

III. RESULTS AND DISCUSSION
III -A. Measurement of standard gases
Fig. 2 (a)は、100 ppm EtOH 並びに 5 ppm AcH の両ガスを負荷して得られた蛍光強度分布の経時変化を 3D 表示した結果である。この図に示されるように、EtOH と AcH
ガス負荷により蛍光強度が増・減し、同一カメラで 2 成分を並列にて同時イメージングが可能であった。また、動画像より、蛍光変化速度を算出したところ、各ガス負荷による出力を明確なピークを有する曲線として取得できた[Fig. 2 (b)]。また異なる濃度の標準ガス濃度を負荷した結果、飲酒時の呼気中濃度を含む、濃度範囲(EtOH:0.1~1000 ppm, AcH: 0.2~10 ppm)で各ガス濃度を定量可能であった。3

Fig. 1. (a) Biofluorometric detection principle of EtOH
and AcH using reversible reactions of ADH, (b) Gaseous
EtOH and AcH parallel-imaging system based on
detection of NADH autofluorescence.

II-B. Imaging of EtOH and AcH in exhaled air
呼気中 EtOH および AcH の濃度は肺でのガス交換に基づくことから、血中濃度を反映している。また遺伝子多型により、アルコール代謝に関連する肝臓中の ADH お
よびアルデヒド脱水素酵素(ALDH)の活性が異なることから、各濃度は酵素活性にも影響を受ける。本研究では予め、被験者にアルコールパッチテストを実施し、Fig. 2. (a) 3D views of parallel imaging results with

ALDH2 不活性型(ALDH2[-])と活性型(ALDH2[+])に分類

application of standard gases (EtOH: 100 ppm, AcH: 5

した。各群の被験者には、4 h 以上の空腹状態で 0.4 g/体ppm), (b) Changing with time in differentiations of

重 1 kg の摂取量となるようにアルコール飲料を 15 分か

NADH fluorescence intensity by EtOH & AcH.

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III-B. Evaluation of alcohol metabolism

lV. CONCLUSIONS

Fig. 3 に、飲酒後 30 分の ALDH2[-]と ALDH2[+]群の呼本研究では、アルコール代謝に関わる EtOH と AcH を気中 EtOH と AcH のガス濃度の比較を示す。なお両群と対象ガス成分として、ADH の酸化並びに還元反応を利用もに飲酒後 30 分をピークとして、EtOH と AcH のガスした並列のガスイメージング装置を構築し、飲酒後の呼濃度の漸次低下が観察され、検知管においても同等の濃気中のガス成分を計測すると共に、アルコール代謝評価度値が得られた。この図に示すように、ALDH[-]群は[+]を行った。実験の結果、標準ガスを用いたセンサ特性評群に比べ呼気中 AcH 濃度が 4.8 倍高い値を示した。これ

価にて、本システムは両ガス成分を同時かつ並列イメー

は ALDH2 が AcH を酢酸に代謝分解することから、ALDH

ジング、および飲酒時の呼気レベルを含む濃度範囲にてが低活性の被験者では血中 AcH 濃度が高くなると共に、ガス計測が可能で、飲酒後の呼気に含まれる EtOH と肺でのガス交換を介して呼気濃度にも反映し、高い値をAcH のガス計測も行なうことができた。

示したものと考えられる。

ACKNOWLEDGEMENTS
本研究の一部は、JSPS 科研費 JP22K14267, JP21H04888
および生体医歯工学共同研究拠点の支援を受けて行われた。

Fig. 3. Comparisons of EtOH and AcH concentrations inexhaled air between ALDH2[-] and ALDH2[+] subject
groups 30 min after drinking.

REFERENCES
1M. Phillips, Sci. Am., 267, 1, pp. 74-79 (1992).
2 K. Iitani, P. Chien, T. Suzuki, K. Toma, T.
Arakawa, Y. Iwasaki, K. Mitsubayashi, ACS
Sens., 2, 7, pp. 940-946 (2017).
3 A. W. Jones, Alcohol, 30, 3, pp. 271-285 (1995).

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