学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）

氏 名

伊藤 甲雄

学 位 論 文 題 名
9 インテグリンのリガンド認識機構とリンパ節外移出調節に関する研究[背景] インテグリンは細胞外マトリックスの受容体として働き、細胞の接着や遊走、生存などを誘導することが報告されている。9 インテグリン(以下9)は4 インテグリン(以下4)と種々のリガンドを共有していることや、一次構造の相同性から独立したサブファミリーに分類されている。α9 と α4 の共通のリガンドの一つであるオステオポンチン(OPN)は分子中央部に 159RGD161 配列を有し、α51、αv3 インテグリンなどの RGD 受容体と結合する。
またその下流の R168 と S169 の間にトロンビン切断部位が存在し、露出した 162SVVYGLR168 配列を介して α4、α9 と結合する。特に α9 はトロンビン切断型 OPN とのみ接着する。OPN はマクロファージの IL-12 産生を介した T 細胞の Th1 への分化、腫瘍の浸潤、転移など多彩な機能を有していることが報告されており、当研究室では OPN に対する中和抗体や遺伝子欠損マウスを用いた検討から、関節炎や肝炎において OPN が病態形成に重要な役割を持つことを報告してきた。OPN の機能はトロンビン等プロテアーゼ切断による構造変化と、それにより結合する受容体の変化、更には、リン酸化等の翻訳後修飾などによって変化しうる。プロテアーゼは炎症において局所で活性化することが報告されていることから、炎症状態では OPN とインテグリンの結合様式が変化することが予測される。更に α4 と α9 は共に OPN 上の SVVYGLR 配列を結合領域としているが、その結合機構の違いについては不明であった。また、OPN は G166 と L167 の間で MMP-3/-7 により切断を受けるが、これに対する α4、α9 の接着についての研究も断片的である。そこで、初めに α4 と α9 の細胞接着と遊走における OPN 機能部位の同定を行った。
次に、炎症における α9 の機能を解析するために、リンパ管内皮細胞(LEC)上の α9 に着目した。α9 遺伝子欠損マウスはリンパ管の弁の形成不全による乳び胸症を示し、出生後早期に死亡することから、LEC 上で発現する α9 の重要性が示唆された。更に、リンパ管新生因子である VEGF-A、-C、-D は α9 に接着することが報告されているが、成体における LEC上の α9 の機能は不明であった。そこで、マウスに完全フロイントアジュバント(CFA)を投与することにより炎症を誘導し、当研究室で樹立した抗 α9 インテグリン抗体(55A2C)を用いて LEC における α9 の機能を解析した。
[方法と結果] OPN 機能部位の解析のために OPN N 末断片(RAA N half)の SVVYGLR 配列を一つずつ A に置換したリコンビナントタンパク質を作製した。
同様にして MMP 切断型 Nhalf (MMP RAA N half)を作製した。また CHO-K1 細胞に、α4 と α9 をそれぞれ遺伝子導入し安定発現細胞株(α4/CHO-K1、α9/CHO-K1 細胞)を樹立した。これらを用いて細胞接着試験と細胞遊走試験を行い、各変異体と RAA N half に対する接着性、遊走性との比較を行った。
細胞接着試験の結果、SVVYGLR 上で α4 との接着に重要なアミノ酸は V164、Y165、L167 であり、α9 では V164、Y165、L167、R168 であること、MMP RAA N half は α4/CHO-K1 細胞に対して有意な接着性を示したが、α9/CHO-K1 細胞に対しては接着性を示さないことが分かった。
この結果と一致して、V164A、Y165A、L167A 変異体は α4 と α9/CHO-K1 細胞いずれに対しても遊走性が低下した。α4/CHO-K1 細胞はさらに V163A に対しても細胞遊走の低下を示した。
LEC 上の α9 の機能を解析するために、CFA を投与する前日に 55A2C あるいは対照抗体を投与し、CFA 投与 6 日後にリンパ節(LN)を採取し、LEC マーカーである LYVE-1 で免疫染色することによりリンパ管新生を評価したが、両群に差は認められなかった。しかしながら、55A2C 投与群において髄洞の空洞化と CD4+ T 細胞数の増加が認められた。そこで、
CFSE ラベルした MOG35-55 特異的 TCR トランスジェニックマウス(2D2)CD4+ T 細胞を予め55A2C あるいは対照抗体を投与しておいたマウスに移入し、MOG35-55/CFA を免疫し、3 日目の鼠径リンパ節(iLN)における CFSE+細胞を共焦点顕微鏡により計数した。その結果、55A2C 投与群において iLN における CFSE+ 細胞数の顕著な増加が認められた。一方、
MOG35-55 を免疫しなかった場合両群に差は認められなかった。更に、抗 α4、αL 抗体の投与により LN へのリンパ球の移入を遮断する実験を行い、LN からのリンパ球の移出について検討した。その結果、対照群では抗 α4、αL 抗体の投与により iLN における細胞数の減少が見られたが、55A2C 投与群ではその細胞数の減少が抑制された。一方、腸間膜 LN や、MOG35-55
非免疫群の iLN では 55A2C 投与による影響は認められなかった。この結果は、α9 が炎症の所属 LN に限局して細胞移出に関与していることを示唆している。これをさらに検証するた
め、LEC を単離し、α9 リガンドである OPN や Tenascin-C で刺激し、細胞移出に重要と考えられる S1P の産生を薄層クロマトグラフィーによって解析した。その結果、α9 リガンドで刺激することにより、培養上清中の S1P が増加した。さらに、LEC における S1P の特異的輸送体である Spns2 の遺伝子発現が α9 リガンド刺激で亢進することが分かった。最後に、55A2C あるいは対照抗体を投与した SJL/J マウスに PLP139-151/CFA を免疫し、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘導し、臨床スコアを比較した。その結果、55A2C 投与群において臨床スコアの抑制、発症の遅延、脊髄の炎症細胞浸潤及び脱髄斑の形成の抑制が認められた。
一方、iLN 細胞を用いた抗原再刺激による細胞増殖及びサイトカイン産生には両群間で差は認められなかった。
[考察] OPN 変異体を用いた細胞接着試験の結果から、α4、α9 の OPN に対する細胞接着はR168 に違いがあることが分かった。R168 はトロンビン切断部位であることから、この部位に対する接着性の差によって、α4 は OPN との接着においてトロンビン切断を必要とせず、α9はトロンビン切断が必須であるという相違が現れることが示唆された。さらに α9 は MMP N
half に対しては接着性がみられなかった。炎症においては MMP,やトロンビンなど種々のプロテアーゼが活性化することから、様々な型に切断された OPN が存在すると考えられ、α9はより限局した状況で機能が発揮されると考えられる。また、この仮説と一致して、55A2C投与による細胞移出の抑制は、CFA 投与により炎症を誘導した所属 LN においてのみ観察された。さらに、55A2C 投与によって EAE 臨床スコアの抑制が認められた。リンパ節における T 細胞の抗原認識は炎症性疾患に共通した現象であることから、抗 α9 抗体の投与は EAEのみならず他の炎症性疾患においてもその治療効果が期待される。