人工血液第 17 巻 第 4 号 2010 年 2 月

目

次
会告

…………………………………………………………………… 146

総説

Acellular Hemoglobin-Based Oxygen Carrier Induced Vasoactivity:
a Brief Review of Potential Pharmacologic Remedies………………………………………………Hae Won Kim 他 147
水中で二原子分子（O2，CO，NO）を捕捉する完全合成化合物……………………………………………………北岸 宏亮 他 160
ヘモグロビン小胞体（HbV）の体内動態特性……………………………………………………田口 和明

他 169

トピックス
リポソームヘモグロビン投与下の心筋灌流 ………松本 健志 179
事務局たより ……………………………………………………………… 186

ARTIFICIAL BLOOD
Vol. 17 No. 4 Feb, 2010

Contents
Announcement ……………………………………………………………… 146
Review：Acellular Hemoglobin-Based Oxygen Carrier Induced Vasoactivity:
a Brief Review of Potential Pharmacologic Remedies………………………………………………Hae Won Kim, et al. 147
Completely Synthetic Compounds That Bind Diatomic Molecules（O2，CO，NO）in Aqueous Solution……………………………………………Hiroaki Kitagishi, et al. 160
The Pharmacokinetic Properties of Hemoglobin-vesicles…………………………………………Kazuaki Taguchi, et al. 169
Topics：Application of Liposome-encapsulated Hemoglobin to
Myocardial Perfusion ……………………Takeshi Matsumoto 179

会

告第17回日本血液代替物学会年次大会
期

日：2010年10月18日
（月）
〜19日
（火）

会

場：熊本市国際交流会館（熊本市花畑町）

大会長：小田切優樹（崇城大学薬学部教授・熊本大学客員教授）「血液代替物科学の最前線」
テーマ：
プログラム：◆シンポジウム1（人工酸素運搬体の臨床応用）◆シンポジウム2（人工血小板の現状と将来）◆シンポジウム3（細胞型ナノ医薬品の新展開）◆特別講演◆大会長講演

詳細はホームページなどでお知らせする予定です。
http://www.blood-sub.jp/info/announce.html

146

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

総説Acellular Hemoglobin-Based Oxygen Carrier Induced
Vasoactivity: a Brief Review of Potential Pharmacologic
Remedies
Hae Won Kim (1), Chi-Ming Hai (1), A. Gerson Greenburg (2)Abstract
Hemoglobin-based oxygen carriers（HBOCs）are currently in late phase clinical development as potential red blood cell
substitutes. However, in recent clinical trials, most HBOC products have elicited vasoconstriction and blood pressure elevation.
Mechanisms of the HBOC-mediated vasoactivity have not been fully elucidated. However, regardless of mechanisms involved,
observations from preclinical and clinical studies indicate that the HBOC-mediated vasoconstriction/blood pressure elevation canbe attenuated by conventional and newer anti-hypertensive agents and vasodilators. These include calcium channel blockers,
nitrovasodilators, ACE inhibitors, selective PDE inhibitors and inhalation of gaseous NO or nebulized nitrites. There is little
information available regarding the safety and effectiveness of these agents when used for treatment of HBOC-mediatedvasoconstriction and BP elevation. In this review we identify some potentially useful pharmacologic agents and discuss potential
issues involved in their use with HBOCs.
Keywords
acellular hemoglobin, hemoglobin-based oxygen carriers, vasoactivity, pressor effect, vasodilators, anti-hypertensive agents.

1. Introduction
Artificial oxygen carriers based on chemically modified orrecombinant human or animal hemoglobins（ Hb）arepromising as red blood cell substitutes because they havesome specific advantages over allogeneic donor red cells 1）.
For example, they are virtually pathogen-free, can be stored
at room temperature for extended periods and can beadministered to recipients regardless of blood type. A coupleof acellular hemoglobin-based oxygen carriers（HBOCs）are in
the final stages of clinical development 1，2）. However,regulatory approval has been hampered because someserious adverse effects including severe hypertension, cardiac
and other cardiovascular events have been observed inrecent clinical studies 3-9）. Results of these clinical trials arecontroversial since HBOC treatments did not significantly
improve mortality rate or other clinical outcome indicators
over donor red cell transfusion or standard fluid resuscitation
despite some clinical benefits including improved hemodynamic
status and reduction in allogeneic red cell use 10-14）. Debates are
ongoing as to whether the lackluster results are due to poor
study design, high protocol violation rates, or an inherent

toxicity of HBOC itself. Because of HBOC's propensity tocause vasoconstriction and a higher incidence of adverse
events（AEs）in HBOC treated patients than control fluid
treated patients, there have been concerns thatvasoconstrictive property of these products may be involvedin the genesis of those AEs 15，16）. Hypotheses and theories areabundant but a direct link showing HBOCs were thecausative agents for the observed AEs has not been
definitively established. It is clear, however, that mostcurrent acellular HBOC products do cause systemic andpulmonary BP elevations（ hypertensive responses）inanimals and human subjects. Both human and animal Hbs
have a high reactivity with endothelium derived NO, a potent
vasodilator constitutively produced by the vascularendothelium to regulate vascular tone 17，18）. Therefore, it isplausible that Hb scavenging of endothelial NO may
contribute to the observed hypertensive/vasoactivity effects.
Yet, the exact mechanism of HBOC-mediated BP elevation（hypertension）has not been fully elucidated. Other plausible
mechanisms have also been proposed and it is possible thatmultiple mechanisms may be involved depending on clinical（1）Department of Molecular Pharmacology, Physiology and Biotechnology, Brown University, Providence, RI 02912

Department of

Molecular Pharmacology, Physiology and Biotechnology Box G-B3 Brown University, 171 Meeting Street, Providence, RI 02912（2）Department of Surgery, Brown University, Providence, RI 02912
論文受付 2009 年７月１日 論文受理 2009 年９月 26 日

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circumstances. A recent NIH workshop recommended more
fundamental studies to delineate mechanisms of HBOCmediated vasoactivity/BP elevation and other adverse
effects 19）. One encouraging finding from recent preclinical andclinical studies is that the HBOC-mediated vasoactivity/BPelevation can be modulated with the use of conventional
vasodilators or anti-hypertensive agents regardless of themechanism involved. However, little information is available
regarding detailed descriptions of how these agents wereused（e.g., patients' conditions, doses used, outcome orcomplications）nor mention of mechanisms of therapeutic
action. To our knowledge, there are few published reportsthat have systematically reviewed and discussed use of theseagents for treatment of the HBOC-mediated BP elevation.
Here, we review preclinical and clinical studies that usedconventional or newer anti-hypertensive agents to attenuate
HBOC-mediated vasoconstriction/BP elevation and discuss
potential issues.

2. Nature of acellular HBOC-mediated vasoconstriction
and BP elevation
A recent FDA report 15） states that "all current HBOC
products or previously in development are vasoactive at thedoses proposed for resuscitation or for blood replacement".
Intravenous administration of most current acellular HBOC
products to animals and humans have shown to increasesystemic blood pressure without concomitant increase in the
cardiac output, an indication that HBOC induced BP elevationis mediated by systemic vasoconstriction. However, thehypertensive responses do seem to vary with HBOC productcharacteristics（［Hb］, MW, P50, viscosity, etc）
, dose/rate, andstudy protocol/models used 19） . Generally, after HBOC
infusion, BP starts to increase almost immediately, peaks
within few minutes, and lasts 1-3 hours after completion of
infusion depending on the dose given. The HBOC-mediatedBP elevations were described as generally mild to moderate
and transient in recent clinical trials 8，20）.
In animal studies, HBOC-mediated transient hypertensive
effects also varied with physico-chemical characteristics ofdifferent HBOCs, HBOC dose, species and protocols 19）.
Topload（hypervolemic）infusion or exchange（normovolemic）
transfusion protocols produced generally more pronounced
BP elevations than hemorrhagic shock-resuscitation protocols.
In-vitro isometric contraction studies with isolated vascularsegments revealed that vascular responses to a HBOC also
varied among animal species and vessel types. For example,
pig vessels were more sensitive than those of rats, rabbits
and dogs 21-23）. In addition, different blood vessel types even148

within the same animal species elicit substantially different
contractile responses to the same HBOC treatment 21）.
Further, for HBOC to elicit contraction, isolated thoracic
aortas from rats and rabbits require precontraction with anagonist while porcine pulmonary vessels do not 21，22）. At
comparable HBOC doses, pulmonary vessels are generally
more sensitive than other vessels. Removal of the endothelium
or pretreatment with N g-nitro-L-arginine methyl ester（LNAME, a nitric oxide synthase inhibitor）and certain adrenergic
antagonists prevented HBOC-induced contractions 22，24，25）.
In clinical studies, HBOC-mediated hypertensive effects werealso observed in patients as well as healthy subjects 4，8，9，14）. Ina multicenter clinical trial of 688 patients with surgicalanemia during orthopedic surgery 8，20）, there was significantly
higher incidences of adverse events associated with BP
increase in patients treated with HBOC-201（Hemopure ®,Biopure Corp., Cambridge, MA）compared with those treatedwith packed red cells: 17%（ 60/350）vs. 7%（ 22/338）,
respectively. In this study, the first 500 mL（65g Hb）infusionof HBOC-201 resulted in the largest increases in the systolicand diastolic blood pressures. After the first infusion, themean peak SBP of HBOC-201 treated patients were 143
mmHg compared with 126 mmHg for the packed red cell
（PRBC）treated group. The mean peak systolic bloodpressures（SBP）in subsequent infusions were 160 mmHg and
151 mmHg for HBOC-201 and PRBC groups, respectively.
While 26% of HBOC-201 treated patients experienced peak
SBP of >161 mmHg, only one patient experienced a severe
BP elevation considered a severe adverse event（ SAE）.
However, neither the criteria for hypertensive SAE nor
actual BP value of the patient was reported. In comparison,
only 6% of packed red cell treated patients experienced peak
SBP of >161 mmHg. All increases in BP resolved
spontaneously or with treatment 20）.
A phase II safety study with 250 ml or 500 ml MP4（Hemospan ® , Sangart Corp. San Diego, CA）in elderly
patients undergoing orthopedic surgery produced similar
results 9）; 10.2%（6/59）of patients who received human PEGHb developed hypertensive adverse events while only 3.2%
（1/31）of control solution（Ringer's acetate）patients did. In
stroke patients, 25-100mg/Kg DCLHb（HemeAssist®, Baxter
Corp., Deerfield, IL）produced a rapid rise in mean arterialpressure（MAP）, which reached a maximum within 2 hours
after the first infusion 4）. The authors stated that, the BP
increased from 113 mmHg at baseline to 134 mmHg versus
109 mm Hg in controls. The statement is somewhat unclear
but interpreted as DCLHb treatment caused significant BP

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elevations while no significant BP changes in saline treatedcontrol patients during the period. The magnitude of the BP
increases was similar for all HBOC doses but the duration of
the pressor effect was dose dependent. The hypertensive
reaction did not accompany clinical and radiological signs of
cerebral pathologic changes. Three of the 40（7.5%）patientstreated with DCLHb developed severe hypertension
requiring pharmacologic intervention while 3/45（6.7%）
control patients 4）. Unfortunately, the report provided neither
criteria of the severe hypertension nor description ofpharmacologic intervention used 4）. In a Phase I study of 42
healthy adult male volunteers 14）, 33 received 0.025- 0.6g
Hb/Kg o-raffinose Hb（Hemolink ®, Hemosol, Inc., Toronto,
Canada）; dose-dependent MAP increases were observed witha plateau occurring 14% above the baseline at 0.1 g Hb/Kg.
In patients undergoing coronary artery bypass graft（CABG）
surgery, hypertension（defined as SBP>140 mmHg）occurredin 16/28（57.2%）o-raffinose Hb（25-75 g Hb）treated patients
versus in 9/32（28.1%）control patients 10）.
It appears that HBOC elicits a more pronounced
hypertensive effects in normovolemic patients than in
hypovolemic patients. In a Phase II study with patients
undergoing an elective percutaneous coronary intervention
procedure, 31%（9/29）of HBOC（15 or 30 g Hb）treatedpatients developed a severe hypertension（SBP>180 mmHg）
while none of the artificial colloid treated patients（0/16）had
hypertension reported as adverse events（AEs）6）. The severe
BP elevations were treated with intravenous nitroglycerine
or other unspecified anti-hypertensive drugs as necessary.

3. Is there an acceptable level of vasoactivity?
In most patients with no significant underlying cardiovascularpathology, HBOC-mediated BP elevations are reported to bemoderate and transient and did not require therapeuticintervention while some patients who developed severe BP
elevations did require pharmacologic interventions 4，8，11-13，20）.
For patients with severe hemorrhagic shock or ischemic
stroke, the potential beneficial effect of HBOC-mediatedmoderate BP elevation is being debated 3，26）. But individual
patient's clinical condition and underlying pathologies should
be carefully considered as patients with significant
cardiovascular pathologies are at higher risk for hypertension
induced serious adverse events（e.g., cardiac events, stroke,hemorrhage, organ damage, etc）
. Therefore, if a patient is
hypertensive, diabetic or elderly with significant underlying
cardiovascular pathology, post-HBOC infusion BP should be
carefully monitored and a proper anti-hypertensive therapy
be instituted promptly if deemed necessary. Whether or

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when to treat HBOC-mediated BP elevation would depend
largely on the degree of BP elevation, patient's condition, theunderlying pathophysiology, and the indication for HBOC. Of
note, when administering antihypertensive agents toanesthetized patients, caution should be exercised as
halothane and certain local anesthetics have been reported tomask HBOC mediated BP responses 27）.

4. Key mechanisms proposed for the HBOC-mediatedvasoconstriction/BP elevation
There are several proposed mechanisms for the HBOCmediated vasoconstriction/BP elevation; the leading
hypotheses are briefly discussed below.
Vasoconstriction via Hb scavenging of endothelial NO
Under normal conditions, NO is constitutively produced in
the vascular endothelium by the action of endothelial nitricoxide synthase（eNOS or NOS-3）. Once diffused to thesmooth muscles, NO activates soluble guanylyl cyclase（sGC）
to produce elevated level of cGMP which results in smoothmuscle relaxation. One popular hypothesis for the HBOCmediated vasoconstriction and BP elevation is HBOC
inactivation of endothelium derived NO, a potent vasodilator
that mediates GC-cGMP dependent vascular smooth muscle
relaxation. Because Hb has an intrinsically high reactivity
with NO, the presence of large amounts of acellular
Hb/HBOC in the vascular lumen could interrupt
endothelium-derived NO flux into the smooth muscle
resulting in vascular contraction. In addition, because ofsmaller particular size（<5-10 nm）, some HBOC particles
could extravasate through the endothelial fenestrations into
the subendothelial space allowing closer contact withendothelial NO. Some HBOCs are too large in particle size topass through the fenestrations. However, acellular HBOC
dissolved in the plasma is several hundred times morereactive with NO than native Hb compartmentalized in theprotective red blood cells 28）. In addition, only Hbs and HBOCs
with ferrous hemes elicit contractions in the vessels with
intact functional endothelium supporting the hypothesis 24，29，30）.
Oxygen dependent autoregulatory vasoconstriction
It has been reported that two Hb preparations（native cellfree Hb and PEG-Hb）that have similar NO binding rates
elicit notably different hemodynamic effects 31）. In this study,
Hb solutions that exhibited transient or no significant
increase in BP had higher NO binding affinities than Hbsolutions that sustained BP increases. Based on theseobservations, they claimed that NO scavenging at the heme
site cannot be the cause of BP increases but rather must be149due to other physiologic mechanisms. They hypothesized thatacellular low O 2 affinity（P 50 〜 50）HBOCs may lead toexcessive oxygen offloading in the arterioles upstream fromthe capillary beds causing reactive arteriolar vasoconstriction
and decreased functional capillary density（O2 dependent
autoregulatory vasoconstriction）.31-33）.
Hb stimulation of endothelin-1 release
In preclinical and clinical studies, intravenous administrationof DCLHb caused dose-dependent increases in plasma levelsof endothelin-1（ET-1）, a potent vasoconstrictor 34-37）. The
pressor response and other cardiovascular effects of DCLHb
could be attenuated by pretreatment with BQ-123 and FR139317, ETA-receptor antagonists 35）suggesting that the
HBOC-induced vasoconstriction/BP elevation may involve
stimulation of ET-1 release. Interestingly, infusion of an ultralarge molecular weight based HBOC（20 MDa）caused nosystemic hypertension in animals with focal cerebral
ischemia. But the cerebro-arteriolar vasoconstriction observedthat was reported to be mediated primarily by ET-1 38）.
Further, ET receptor antagonists attenuated pressor effectsof DCLHb in rats 39）. These results suggest that ET-1 may
play a more significant role in certain vascular beds andanimal models 36，39）.
In addition, other mechanisms have also been proposed for
the HBOC-mediated vasoconstriction and BP elevation
including Hb stimulation of adrenergic vasoconstrictive
mechanisms 40）, and pseudo-ACE activity of Hb 41）. Although
one key mechanism may function as a dominant player, othermechanisms may also contribute depending on clinicalconditions and underlying pathologies of the patients
involved.

5. Potential pharmacologic remedies for HBOC-mediatedvasoconstriction and BP elevation
In recent clinical trials, hypertensive responses following
HBOC administration were described as mild and transientand did not require any therapeutic intervention 8，20） .
However, some patients did develop clinically serious postHBOC administration hypertension serious enough to bereported as AEs/SAEs but no information is available how
many of these patients actually needed treatment and, if
treated, specifics of therapy given. These patients and thosewith serious underlying cardiovascular pathology and limited
reserve capacity should be treated promptly with properanti-hypertensive therapies. The conventional anti-hypertensive
therapies for hypertensive emergencies/urgencies as definedby the Joint National Committee 42）should generally be

150

applicable to the treatment of HBOC-mediated acute BPelevations as well. In fact, HBOC-mediated critical BP
elevations do seem to occur more frequently in patients with
underlying conditions that tend to elicit BP elevation（e.g.,
essential hypertension, diabetes, renal disease）6，8）.
Conventional anti-hypertensive guidelines and therapies
including diuretics, rennin-angiotensin system antagonists, αand/or β-blockers and Ca ++ channel blockers are viable
treatment options 42）. As described previously, in clinical trials
HBOCs typically caused an almost immediate BP rise after
start of intravenous infusion. The BP rise did not generally
exceed 25 mmHg above the pretreatment values even at
relatively high topload（for non-hypovolemic indications）
6）
doses（e.g., 30g Hb）. However, in relatively small number ofpatients, the post-HBOC BP elevations were more severe（some may qualify as hypertensive urgencies or emergencies ）and were reported as hypertensive SAEs 6，8，15，20）. Managementof HBOC-induced severe BP elevation（ hypertensive
emergencies or urgencies）may require faster acting
intravenous agents to quickly lower the blood pressure to asafer level 43）. Some established anti-hypertensive therapies aswell as new approaches that seem relevant to the
management of HBOC-mediated BP elevation are discussed
below.
Today, there are many highly effective drugs available fortreatment of a chronic hypertension 42）. Only a couple of theseagents have actually been used in HBOC clinical trials.
Furthermore, virtually no study have been done
systematically to study safety and effectiveness of thesedrugs when used for prevention or treatment of HBOCmediated acute BP elevations even in preclinical studies. In
theory, any agent that increases NO availability to thevascular smooth muscle or causes vascular relaxation
through other mechanisms would be effective in modulating
HBOC-mediated vasoconstriction/ BP elevation. However,selection of an appropriate therapeutic agent must be basedon careful consideration of the individual patient's clinicalcondition, underlying pathophysiology, and potential
interaction with HBOC directly or indirectly. Of note, inpatients with severe hypertension, the recommended
treatment objective for patients with hypertensive
emergencies is not immediate normalization of BP but rather
to reduce BP to a more safely manageable level to prevent or
minimize end-organ damage followed by gradual return to anormal level 43）. In patients with hypertensive urgencies , it isrecommended that BP be lowered gradually over a period of
24-48 hours, usually with oral medications.
Rapid
uncontrolled BP reduction may result in cerebral, myocardial

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and renal ischemia/infarct 44，45）. Here we discuss advantages
and disadvantages of some selected anti-hypertensive agents,
potentially useful in the management of acute severe
elevations in BP that may occur following HBOC
administration.

5.1. Adrenergic agonists/antagonists
In studies with isolated arterial vessel segments and wholeanimals in-vivo, Hb/HBOC in nM 〜μM concentration range
were shown to elicit vascular contraction 21-24，29）. In theseexperiments, pretreatment with phentolamine or prazosine（α-adrenergic antagonists）prevented Hb/DCLHb-mediatedcontractions or pressor effect 25，40）. However, phentolamine
pretreatment did not prevent Hb-mediated contraction invessel rings precontracted with KCl suggesting adrenergic
activation does not appear to be a pre-requisite. In cervicalsectioned and bilateral adrenectomized rats, intravenous
DCLHb still caused significant systemic BP elevations 40）. In
these animals, however, pretreatment with phenoxybenzamineand prazosin（α-1 adrenergic antagonists）blocked DCLHb
mediated pressor effect. In addition, the DCLHb-mediated BP
increases were also blocked by yohimbine（alpha-2 adrenergic
antagonist）pretreatment 46）suggesting that DCLHb-mediatedpressor effect may be partially mediated through alpha-2adrenergic mechanism. Alternatively, a centrally acting αadrenergic agonist（e.g., clonidine）may also be useful as it
stimulates presynaptic alpha-2 receptors that results ininhibition of norepinephrine release and lower vascular tone.
Clonidine is currently used for treatment of hypertensive
urgencies 43）. Because oral clonidine lowers BP more gradually,
it may be suitable for those patients that a rapid BP
reduction is not necessary. Therefore, α-adrenergic
antagonists/agonists may be potentially useful in attenuating
HBOC-mediated vasoconstriction and BP elevation. However,their use may be complicated in certain patients because
adrenergic vasopressors are often used in severely
hypotensive hemorrhagic patients 47）.

5.2. Nitrovasodilators
Organic nitrates
One strategy to alleviate HBOC-mediated vasoconstriction, isto supplement NO towards the normal level with anexogenous NO source. Nitroglycerine or glyceryl tri-nitrate（GTN）, the most commonly used of all organic nitrates, is apotent vasodilator widely used clinically for coronary
vasospasm and other conditions. Its vasodilatory mechanism
has not been fully elucidated but, recently, it was reported toelicit vasodilation via NO produced by action of mitochondrial
aldehyde dehydrogenase 48，49）which catalyzes reduction of

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GTN to generate nitrite and 1,2-glycerate dinitrate. The
nitrite so generated is proposed to be further metabolized togenerate NO which then elicit GC-cGMP mediatedvasodilation. However, this theory has recently beenchallenged as GTN mediated relaxation was not observedwith concomitant NO fluorescence nor inhibition of O 2
consumption by vascular mitochondria 50）. Nevertheless, GTN
may be an effective therapeutic agent for modulation of the
HBOC-mediated vasoconstriction and BP elevation. In rat
aortic ring preparations, GTN significantly reduced acellular
Hb-mediated contraction 29）. In a recent clinical study inpatients undergoing an elective percutaneous coronary
intervention procedure, critical elevations of BP（defined as
SBP>180 mmHg）occurred in 31% of patients following
treatment with HBOC-201 6）. In these patients, BP elevations
were generally managed with intravenous GTN. As GTN
tolerance often occurs, one patient was not responsive to
GTN treatment and required nifedipine（calcium channel
blocker）to control the BP.
Of note, nitrates are known to oxidize Hb creating ferric Hbor metHb and instances of intraerythrocytic
methemoglobinemia following administration of GTN andother organic nitrates have been documented 51）. Because of
the presence of large amounts of metHb-reductase（NADHcytochrome b complex）and other reducing agents in the red
blood cells of normal people, toxic levels of metHb
accumulation is relatively rare. However, intravenously
administered HBOCs circulate in the plasma phase where
metHb reducing capacity is relatively low. Therefore, plasma
metHb levels could rise more easily in patients with plasma
HBOC following administration of GTN or other nitro-drugs
with a high oxidation potential. In a clinical trial of surgicalpatients administered up to 2.0-2.5g Hb/Kg of HBOC-201（total of approximately 180g Hb）, metHb level was <2% at
post-operative day 1 but reached a peak of approximately
7% 13）. In a more recent clinical study of orthopedic surgery
patients, cumulative HBOC-201 doses of up to 330 g（11 units）
were given over a 6-day period（average of 136 g Hb）. The
mean metHb levels ranged 0.6%-5.8% after each infusion
including two patients whose peak metHb levels reached 11%
and 14% but none of the patients exhibited symptoms or
required treatment 8）. In addition, when significant amount of
metHb or ferric HBOC is formed, the total oxygenbinding/carrying capacity of HBOCs is also reduced as
metHb is unable to bind and carry O2 . Of note, until metHb
level reaches >30%, clinical symptoms may not appear. When
metHb level reaches over 50%（fatal if >70%）, cardiovascular
dysfunction and neurologic deficits may occur as the blood is151unable to transport sufficient O2 to meet metabolic demand.
In such case, metHb level can generally be reduced byadministering intravenous methylene blue 52）.
In addition, although GTN and other organic nitrates areuseful in controlling severe hypertension in patients withcardiac ischemia, they may not be the best choice in other
patients 53）. GTN causes arterial as well as venodilation thus
reducing preload and cardiac output. Besides, many patientsdevelop tolerance to GTN making it less effective withrepeated doses. For these drugs, optimal dosing inhemodynamically unstable patients poses significant
challenges.
Sodium nitroprusside
Sodium nitroprusside（SNP）is a potent vasodilator often used
for treatment of severe acute hypertension. However, in rats
treated with clinically relevant doses（>1g/Kg）of DCLHb,
potency of SNP potency was significantly reduced 54）implying
higher doses of SNP would be required to control severe
hypertension in the presence of high levels of plasma HBOC.
SNP is a potent arterial and venous vasodilator andintravenous administration is the clinical treatment of acute
hypertension or for hypertensive crisis（defined as SBP>160
mmHg or DBP>110 mmHg）43）. Its pharmacologic action isthought to be due to spontaneous degradation to release NO
in the blood. But recent reports suggest that it, too, may go
through biotransformation in the vascular smooth muscle andendothelial cells to produce NO 55，56）.
Of note, when treating HBOC-mediated BP elevation with
SNP, caution should be exercised since SNP releases highly
toxic cyanide ions（CN -）causing potentially lethal cyanide
poisoning. Thus, the maximal dose should generally notexceed normal hepatic cyanide clearance rate of 2μg/kg/min 57）.
Small amount of cyanide in the blood is rapidly metabolized
by the liver to less harmful thiocyanate by the action of the
enzyme rhodanase（requires sulfur donor such as thiosulfate）.
Thiocyanate is then excreted in the urine by the kidney.
However, in the absence of sufficient sulfur donor, cyanide
ions could quickly reach toxic levels（>1 mg/ml）. Thus, theduration of treatment should generally not exceed 72 hours
and plasma thiocyanate concentrations should be carefully
monitored. SNP also degrades upon exposure to light toproduce cyanide. In patients with renal failure or patientswith a deficiency in rhodanase enzyme or low sulfur donor
levels, SNP should not be used as it could cause fatal cyanide
poisoning.

152+

5.3. Ca2 -channel blockers
Calcium channel blockers are commonly used antihypertensive drugs which generally reduce cardiac andvascular smooth muscle cytosolic Ca2+ leading to decreased
cardiac output and vasodilation. The Ca2+-channel blockers
are further classified into dihydropyridines（e.g., nicardipine,
nifedipine）, phenylalkylamines（ e.g., verapamil）andbenzothiazepines（e.g., diltiazem）. With exception of few, mostof Ca 2+ -channel blockers are typically formulated to beadministered orally due to low water solubility. For
management of acute severe HBOC-mediated BP elevation,
fast acting intravenous or sublinguial formulations would be
more desirable. In fact, a recent Phase II study of HBOC-201
reported that intravenous administration of nifedipine
successfully controlled critical hypertension（>180 mmHg）
which did not respond to an intravenous nitroglycerine 6）.
In a study with awake spontaneous hypertensive rats, 10%
topload infusion of o-raffinose Hb resulted in significant
increase in MAP（36 mmHg）at 10 minutes after the start ofinfusion. In these animals, pretreatment with 10 mg/kg
nifedipine by gavage reduced subsequent MAP rise by
50% 58）. Similarly, in anesthetized rats, DCLHb inducedpressor effect was significantly inhibited by nimodipine andverapamil 59）. However, the bradycardiac effect of DCLHb was
not affected by nimodipine. These results suggest thattreatment with Ca2+-channel blockers may prevent/modulate
HBOC-mediated hemodynamic effects.

5.4. Angiotension converting enzyme inhibitors andangiotension-II receptor blockers
The renin-angiotension system is a powerful endocrine bloodpressure regulating mechanism. When BP is low, kidneys
produce renin that activates angiotension-I production frominactive angiotensinogen. By action of an angiotension
converting enzyme（ACE）, angiotension-I is then converted toangiotension-II, a potent vasoconstrictor. ACE inhibitors（ ACEIs）block production of angiotension-II thereby
effectively reduce BP. Currently, ACEIs are one of the major
categories of drugs used for treatment of hypertension 60）.
Interestingly, a recent study reports that cell-free Hb exerts
an ACE-like activity when activated by plasma hydrogen
peroxide 41）. The assertion was based on the observation thatangiotension-I was converted to angiotension-II in thepresence of cell-free Hb. If confirmed, this mechanism may
also contribute to the Hb-mediated vasoconstrictive effect.
Therefore, drugs that prevent or antagonize the action ofrennin-angiotensin system including ACEIs and angiotensin-II
receptor blockers（ARBs）may potentially be useful in

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modulating the HBOC-mediated BP elevation. Use of ACEIs
is generally recommended in patients with compromised
renal function but some new data seems to indicate thatACEI may elicit end-stage renal failure 61-63）.

5.5. Phosphodiesterase inhibitors
Phosphodiesterases（PDEs）breakdown second messenger
cyclic nucleotides, cGMP and cAMP which are ubiquitous in
virtually all cells and are involved in many different functions
including vascular smooth muscle relaxation. Therefore, nonspecific PDE inhibitors（PDEIs）have not generally been usedin the treatment of hypertension per se. Nevertheless, some
PDEIs including a recently discovered highly selective PDEI（e.g., sildenafil）have shown to reduce HBOC-mediatedvasoconstriction/hypertensive effects.
Sildenafil
Sildenafil is a PDE-5 selective inhibitor（PDE5I）that preventsdegradation of cGMP in the corpus cavernosum and iscurrently used primarily as remedies for erectile dysfunction.
But they also lower systemic and pulmonary hypertension
making them potentially useful in modulating HBOCmediated hypertensive responses. In fact, results of a recent
animal study seem to indicate that HBOC-mediated negative
vascular responses can largely be overcome by concomitant
PDE5I treatment 64）.
Papaverine
Papaverine is an opium alkaloid used for treatment ofgastrointestinal, cerebral and coronary vasospasms. The
vascular relaxation mechanism of papaverine action has notbeen fully elucidated but is generally considered to act via
nonspecific inhibition of cAMP-phodiesterase. In an in-vitro
experiment, papaverine significantly attenuated or reversed
Hb-induced contractions of isolated rat thoracic aortic ringpreparations 24）. These results suggest that some selective
PDE inhibitors may have potential in attenuating orreversing HBOC-mediated vasoconstriction/BP elevation but
further studies are needed to evaluate their safety andefficacy.

5.6. Sodium nitrite
Substantial plasma nitrite levels have been reported in theplasma of healthy individuals（values for brachial artery and65，66）.
antecubital vein: 322-540 nM and 305-466 nM, respectively）
Therefore, nitrites are considered as a possible endogenous
NO reservoir for blood flow regulation and other functions 67）.
Mechanisms for the in-vivo conversion of nitrite to NO havebeen proposed. Recently, deoxyhemoglobin is proposed to

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009serve as a nitrite reductase under hypoxic conditions 68）. To
test the hypothesis, 18 normal subjects were infused with up
to 1 mmoles of sodium nitrite over about a 30 minute period
into the forearm brachial arteries which resulted in asystemic concentration of 16 μM. Infusion of nitrite caused
an immediate increase in forearm blood flow by 175% andconcomitant reduction in the systemic BP of 〜 7 mmHg 68）.
This reduction in BP occurred with rapid formation of ironnitrosyl Hb and, to a lesser extent, S-nitroso Hb in the blood.
MetHb levels increased significantly from the baseline but
still remained relatively low（from 〜 0.2% to 〜 0.5%）. In a69）
more recent study , 20 normal human volunteers were given
intravenous sodium nitrite to determine endocrine effect,
pharmacokinetics, and tolerance. In this study, the highest
dose given was 110 μg/kg/min which resulted in whole blood
nitrite concentration of 〜 850-900 μM. Forearm blood flow
increased in a dose dependent manner from 2.8 to 12.3
ml/min/100ml tissue and plateaued at around 300 μM nitrite.
Plasma nitrite concentration increased from 0.13 to 26.1 μM
with mean clearance of 0.95 L/min（T1/2=42 min）
. Plasma
nitrate concentration increased from 18 to 64 μM with T1/2
of 6 hours. Systemic nitrosyl Hb levels increased from 0.14 to
7.9 μM with apparent T1/2 of 53 minutes. These changes werecoincided with decrease in MAP from 97 to 86 mmHg with aslight but nonsignificant increase in the heart rate（68-76
beats per minute）. Of note, the MAP remained significantly
lower than baseline for 2 hours after the nitrite infusion wascompleted. Whole blood metHb levels increased from 0.7 to
3.2 % of total Hb. The highest metHb level was reached 20
minutes after completion of nitrite infusion with T1/2 of 78
minutes.
In a recent Phase I/II clinical trials, patients with sickle celldisease 70） were given 3.2-320 μmoles of sodium nitrite
administered through the brachial arterial line（1 ml/minuteof 0.4-40 μM sodium nitrite over about 8 minutes）which
resulted in 7.9-77% increase in forearm blood flow but without
significant drop in systemic BP. Dose dependent metHb
increases were observed following nitrite infusion reaching
peak regional venous concentration of 4% at the highest dosetested（40 μM）. Aside from nausea in one patient, none of thepatients exhibited ill-effects including clinical signs of hypoxia
such as cyanosis or shortness of breath. However, all of themetHb levels reported were concentrations within theerythrocyte compartment not in the plasma. In normal
erythrocytes, metHb is constantly reduced by action of
intracellular reductases. Intravenously administered acellular
HBOCs circulate in the plasma phase where metHb reduction
activity is relatively low. Therefore, presence of high level of153

nitrite would facilitate conversion of ferrous HBOC to nonoxygen carrying ferric HBOC（metHBOC）. In fact, for thisreason, sodium nitrite is a FDA approved treatment for acyanide poisoning as it produces metHb that neutralizes toxic
cyanide ion by forming a non-toxic cyanometHb 71）. If
substantial amount of HBOC is converted to metHBOC bynitrite, however, oxygen carrying capacity of HBOC will be
reduced accordingly raising the possibility of insufficient
oxygen supply despite vasodilation and improved blood flow.
In addition, optimal dosing of nitrite would be extremely
challenging especially in patients with significant underlying
pathologies. In a more recent animal study 72）, a single bolus
30-100 nmol sodium nitrite（resultant blood nitrite level= 1.2μM）at the onset of HBOC-201 resuscitation following
trauma-hemorrhage prevented HBOC-201-mediatedhypertension while resuscitation with nitrite plus Ringer's
lactate did not alter mean arterial pressure suggesting a
possible role of HBOC-201 as a nitrite reductase. It wasreported that nitrite doses of <100 nmol did not significantly
increase plasma metHb level beyond that observed with
HBOC-201 alone（2-3% at 2 hr post-resuscitation）. Based onthese findings, nitrite has been proposed as a potential
adjunctive therapy to prevent HBOC-mediated hypertension 72）.
Of note, however, 10 μmol nitrite did increase metHb level
beyond that observed with HBOC-201 alone while 100 μmol
caused death during resuscitation. The cause of death was
not described but possibly due to severe systemic
hypotension. Further, in a study with healthy humanvolunteers, infusion of 180 μmol of sodium nitrite alone（measured systemic blood nitrite concentration, 16μM）
caused a decrease in systemic MBP of only 〜 7 mmHg 68）. At
this nitrite concentration without HBOC, measured serum
metHb level was approximately 1.5%. Therefore, in thepresence of a HBOC, a substantially higher dose of nitrite
must be used to prevent/attenuate severe HBOC-induced BP
elevations（ΔBP> 60 mmHg）observed in some recent clinical
trials 6，8，20）. Under such conditions, a much higher HBOC
oxidation（metHb formation）may occur. Therefore, clinicalefficacy and safety of nitrite therapy will have to be
determined in human studies. In addition, the intravascularoxidation rate of acellular Hb/HBOC in humans may behigher than that observed in mice since humans areincapable of producing endogenous ascorbic acid, an
important anti-oxidant that contributes to maintaining Hb in
the functional ferrous state 73）. Unlike rats and mice, humans
are unable to produce endogenous ascorbic acid due toevolutionary loss of hepatic L-gulonolactone oxidase.
Alternatively, sodium nitrite can also be administered via

154

inhalation. In a recent study of newborn lambs with hypoxic
pulmonary hypertension, aerosolized sodium nitrite wasadministered through a ventilator（30 mg nitrite in 5 ml
buffered saline over 20 min）74）. Nebulized nitrite inhalation
elicited a rapid and sustained reduction in pulmonarypressure without measurable changes in the systemic bloodpressure. Interestingly, it was reported that this means of
nitrite delivery did not cause clinically significant increase inblood metHb levels. Immediate detection of NO in theexhaled gas and nitrosyl Hb formation in the blood supports
the hypothesis that the pulmonary vasodilation was effectedby NO produced possibly through nitrite reduction. If
validated, this mode of nitrite delivery may be particularly
useful in attenuating HBOC-mediated pulmonary
hypertension.

5.7. Inhaled NO
Inhalation of gaseous NO has been reported to be effective inthe treatment of persistent pulmonary hypertension as thismode of administration preferentially delivers NO to thepulmonary circuit eliciting selective pulmonary vasodilation 74-77）.
To test whether inhalation of NO modulates the hypertensive
effects of HBOC, animals were subjected to breathe low
doses of NO（iNO, 5-80 ppm）before or during the HBOC
administration. In anesthetized pigs, pulmonary hypertension
elicited by 200 mg/kg 10% α-α crosslinked Hb wascounteracted by repeated low doses of inhaled NO（5 ppm x
10min + 10 min rest + 10 ppm x 10min）78）. However, more
recent studies indicate that longer exposure and/or higher
dose of iNO may also have extra-pulmonary effect as NO is
known to form S-nitroso compounds with variety of proteins
under normal and pathologic conditions 79）. In anesthetized
dogs, continuous inhalation of 80 ppm NO prevented systemic
vasoconstriction elicited by cell-free plasma hemoglobin（as aresult of intravascular hemolysis）released by intravenous
water administration 80）. However, Hb administration while
continuous breathing of NO caused high rate of plasma Hb
oxidation to methemoglobin which has much lower reactivity
with NO. Therefore, significant metHb formation in this study
might also have contributed to the absence of
vasoconstriction. Of note, metHb does not bind O2 as well as
NO making it an ineffective oxygen carrier. Interestingly, in a
recent study with awake mice and lambs, pretreatment with80 ppm iNO for 15 minutes or 200 ppm for 7 minutes
prevented acellular Hb or HBOC-201 mediated systemic
hypertension without significant increase in metHb levels 81）. If
validated, this mode of NO administration may be useful inmodulating HBOC-mediated pulmonary and systemic BP
elevation in patients undergoing scheduled surgical

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

operations and elective ischemic rescue procedures. However,in patients undergoing emergency surgeries or in severe
hypovolemic shock out of hospital, pretreatment with iNO
before HBOC administration may not be practical.
Nonetheless, inhalation of NO should be investigated further
for their safety and effectiveness in modulating HBOCmediated pulmonary and systemic BP elevation.

6. Issues in the use of nitrovasodilators, nitrites, and iNO/
nebulized nitrites with HBOC
Rodriguez, et al 72）recently proposed that the HBOC-mediatedhypertension/vasoconstriction can be modulated by coadministration of HBOC with sodium nitrite based on thetheory that Hb also possesses nitrite reductase activity
thereby reducing nitrite into vasodilating NO as discussed
above. However, there are also problems with this approach.
First, because of very high affinity of NO to ferrous hemeiron（ 10 7 /M/sec）, the liberated NO will be captured
immediately by the deoxyHb limiting its availability tosmooth muscle cells where NO mediates vascular relaxation
via the GC-cGMP mediated mechanism. Second, nitrite is aknown Hb oxidant that could convert both erythrocytic andacellular Hbs to non-oxygen carrying ferric metHb 51，80）.
Acellular HBOCs in the plasma phase are particularly
susceptible to oxidation lacking anti-oxidant enzymes
normally present in red blood cells. If the extent of HBOC
oxidation is significant, the oxygen carrying capacity of theinfused HBOC will be proportionately reduced thus
potentially compromising its intended efficacy.
Of note, because organic nitrovasodilators, nitrites and iNO
are known oxidizers of Hb, metHb levels must carefully bemonitored. In patients who are highly hemodiluted with a
HBOC, a clinically significant level of plasma metHb/
metHBOC may lead to insufficient oxygen delivery to tissues.
If clinical signs of hypoxia are present, intravenous
administration of Hb reducing agent such as methylene blue
should be considered 52）.
In addition to the pharmacologic agents discussed above,
there are numerous other highly effective antihypertensive
agents that are potentially useful in preventing/attenuating
the HBOC-mediated BP elevations（e.g., K+-channel openers,
hydralazine, pentoxyfylline and others）. However, they havenever been tested in the modulation of HBOC-mediated BP
elevation and need to be investigated. Some desired
characteristics of an ideal anti-hypertensive agent for use in
prevention or treatment of HBOC-induced BP elevation
include a rapid therapeutic action, low tendency to develop

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

tolerance and a low HBOC oxidation potential, and a wide
margin of safety.

7. Conclusions
Most acellular Hb based HBOCs appear to cause
vasoconstriction and BP elevation. Although relatively rare,
HBOC-induced severe BP elevation（SBP>180 mmHg）
requires prompt intervention to minimize consequences
especially in patients who are diabetic, hypertensive or withother serious underlying cardiovascular pathologies. The
mechanism（s）for HBOC-mediated vasoconstriction and BP
elevation has not been fully elucidated. Regardless of
mechanisms, however, HBOC-mediated vasoconstriction andBP elevation appears to be manageable by various
conventional and new pharmacologic agents including
nitrovasodilators, adrenergic receptor blockers, calcium
channel blockers, ACE inhibitors, PDE inhibitors and inhaled
NO gas. Whether and when to treat HBOC-mediated BP
elevation and the selection of appropriate anti-hypertensive
therapy may be debated but must be based on individual
patient's clinical condition, medical history, and underlying
pathology. In addition, because titration of HBOC-mediatedBP elevation could be very challenging in hemodynamicallyunstable patients, pharmacologic anti-hypertensive treatment
should only be performed in settings where sophisticatedvital sign monitoring/resuscitation resources are available.
In conclusion, HBOC-mediated vasoactivity and hypertensive
response may be manageable by use of selected conventionalanti-hypertensive pharmacologic agents along with some new
emerging vasodilatory therapeutics. However, very little
information is available regarding safety and effectiveness ofthese approaches. For the current leading HBOC products tomove forward through the regulatory approval, it would be
worthwhile to explore these approaches to prevent or
attenuate HBOC-induced adverse vasoactivities.

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159

総

説

水中で二原子分子（O2，CO，NO）を捕捉する完全合成化合物
Completely Synthetic Compounds That Bind Diatomic
Molecules（O2, CO, NO）in Aqueous Solution
北岸 宏亮，加納 航治
Hiroaki Kitagishi, Koji Kano

和文抄録
ミオグロビンの酸素結合機能を人工的に再現する試みは古くから行われてきたが，これまでに合成された酸素捕捉剤は厳密に脱水された有機溶媒中で機能するものがほとんどであり，水が存在する系で酸素を結合させることは非常に困難であった．我々は近年，環状オリゴ糖である heptakis（2,3,6-tri-O-methyl）-β-cyclodextrin（TMe-β-CD）が水中でテトラアリールポルフィリンの周辺に強い疎水場を提供するという性質に着目し，水中で機能するミオグロビンモデルの合成を試みた．TMe-β-CD の包接によって FeII ポルフィリンを周辺の水から隔離しつつ，中心金属の FeII を酸素結合が可能な５配位状態とするために，ピリジンもしくはイミダゾール配位子を含むリンカーによって２つの TMe-β-CD を連結したシクロデ
キストリン二量体（Py3CD，Py2CD，ImCD）を合成した．これらの二量体はいずれも水中において［5,10,15,20-tetrakis（4-sulfonatophenyl）porphinato］iron（II）（FeIITPPS）を非常に強く包接し，かつその中心の FeII へはリンカーの塩基が第５配位子として配位するため，水中で可逆的な酸素結合が可能であった．それぞれの包接錯体における酸素親和性および自動酸化（メト化）によるオキシ体の分解に対する半減期は pH 7.0 のリン酸緩衝液中 25 ℃において，Py3CD-FeIITPPS 錯体（hemoCD1）: P1/2O2 = 17 Torr, t1/2 = 30 h, Py2CD-FeIITPPS 錯体（hemoCD2）: P1/2O2 = 176 Torr, t1/2 > 100 h, ImCDFeIITPPS 錯体（hemoCD3）: P1/2O2 = 1.7 Torr, t1/2 = 3 h となった．また，hemoCD1 は一酸化炭素（CO）と非常に強く結合する性質を示したが，一酸化窒素（NO）に対しては不安定で hemoCD1 の分解が起こった．一方，hemoCD2 は CO お
よび NO と水中で安定な付加体を形成した．MM2 計算から推定される hemoCD1-3 の分子構造から，水中で安定な酸素付加体を生成するためには，ポルフィリンの FeII 中心への水の接触を厳密に遮断することが重要であるという結論が得られた．シクロデキストリンをグロビンタンパク質の代替とした我々のミオグロビンモデルは，分子デザインの改良によってさらに機能向上を図ることができ，完全合成物による血液代替物質として非常に有望であると考えられる．
Abstract
Although chemists succeeded in preparing synthetic hemoglobin（myoglobin）models that bind oxygen（O2）in absolute organic
solvents more than 30 years ago, no successful example has been reported with binding O2 in aqueous solution except for the
picket fence porphyrin embedded in liposomal membrane. In this paper, we describe novel synthetic hemoglobin（myoglobin）
models that work in aqueous solutions at ambient temperatures. We synthesized three types of per-O-methylated β-cyclodextrin
dimers having pyridine（Py3CD and Py2CD）and imidazole linkers（ImCD）as the models of the globin protein. These dimers
formed very stable 1:1 inclusion complexes with a heme model,［5,10,15,20-tetrakis（4-sulfonatophenyl）porphinato］iron（II）（FeIITPPS）, in aqueous solutions. The resulting Py3CD-FeIITPPS（hemoCD1）, Py2CD-FeIITPPS（hemoCD2）, and ImCD-FeIITPPS
O2（hemoCD3）complexes reversibly bind O2 as well as carbon monoxide（CO）. The O2-affinities（P1/2 ）and half-lifetimes（t1/2）of theO2-adducts of hemoCD1-3 in phosphate buffer at pH 7.0 and 25℃ were determined: hemoCD1, P1/2O2 = 17 Torr, t1/2 = 30 h;
hemoCD2, P1/2O2 = 176 Torr, t1/2 > 100 h; hemoCD3, P1/2O2 = 1.7 Torr, t1/2 = 3 h. HemoCD2 also binds nitric oxide（NO）in aqueous
solution, while hemoCD1 decomposes upon addition of NO. The molecular mechanics（MM）calculations of hemoCD1-3 suggestthat the encapsulation of the iron center of FeIITPPS by the hydrophobic cages formed by two per-O-methylated β-cyclodextrin
units is quite effective for protecting the FeII-O2 center from the attack of the water molecule, leading to the formation of the同志社大学 理工学部 機能分子・生命化学科〒 610-0321

京都府京田辺市多々羅都谷 1-3

Department of Molecular Chemistry andBiochemistry, Faculty of Science and Engineering, Doshisha University, 1-3 Tatara Miyakodani, Kyotanabe, Kyoto 610-0321, Japan
論文受付 2009 年８月 20 日 論文受理 2009 年 10 月６日

160

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

stable O 2-adduct in aqueous solution. Our hemoglobin（myoglobin）model system composed of porphinatoiron（ II）andcyclodextrin dimer is expected to be a powerful candidate of the completely synthetic blood substitute.
Keywords
Artificial oxygen carriers, Biomimetic chemistry, Cyclodextrin dimers, Hemoglobin（myoglobin）models, Porphinatoiron（II）

１．はじめに
生体内で起こる優れた化学反応をフラスコの中で人工的に再現することは，我々化学者にとって夢のある挑戦である．生体分子の複雑な機能のエッセンスのみを抽出し，人工的に合成した化合物によってその機能を再現できれば，生体反応の機構を
分子レベルで解明できるとともに，生体のシステムを模倣した
新しい機能性材料の開発につながるであろう．このような研究
分野はバイオミメティックケミストリー（生体模倣化学）と呼ばれ，過去 50 年の長きにわたり様々な生体分子を対象としたモデル化合物が合成されてきた 1）．その中でも酸素を可逆的に吸脱着するヘモグロビンならびにミオグロビンのバイオミメテ
ィックケミストリーは，この分野の主流をなす研究対象のひとつであり，研究の歴史は長い 2-4）．しかし，有機溶媒中で酸素を可逆的に結合するモデル化合物は数多く報告されているものの，生体と同じ媒体である水中で酸素を捕捉することは非常に困難であり，その報告例は極めて少ない．水は酸素錯体を著し
く不安定化するのである．
近年，著者らは環状オリゴ糖であるシクロデキストリンの包接現象に着目し，酸素結合サイトである FeII ポルフィリンをミ
クロな疎水環境にカプセル化して水の侵入を防ぐことのできる
ミオグロビンモデルを設計した 5）．このモデル化合物は水中，室温で酸素を安定かつ可逆的に結合することが可能である．水中で機能するヘモグロビン（ミオグロビン）モデルの開発に成功したことにより，酸素錯体の安定性におよぼす水の影響について詳細に検討ができるとともに，完全合成化合物を用いた人工血液の実現へと一歩踏み出すことができたものと考えている．
本稿では，著者らの合成したミオグロビンモデル化合物を中心に，水中で酸素を結合するための分子設計，モデル化合物の O2，
CO および NO に対する反応性や，人工血液の実現を視野に入れたさらなるアプローチについて化学的な観点から解説する．

Fig. 1. Crystal structure of sperm whale oxy-myoglobin（Protein Data
Bank; 1A6M）and chemical structure of the oxygen-binding site inmyoglobin.

アミノ酸から構成されている．ミオグロビンのタンパク質部分であるグロビン（globin）は，全体的に球状（globular）のタンパク質であることからその名が付けられた．ミオグロビンはA 鎖から H 鎖までの８本のα-へリックス鎖から構成されており，補欠分子としてヘム（プロトポルフィリン IX 鉄（II）錯体）を保有している．ヘムはグロビンの表面近くの疎水ポケットに存在し，His 93（近位 His）からの配位結合，プロピオン酸側鎖と周辺のアミノ酸残基との静電相互作用，および周辺の疎水性アミノ酸残基との疎水相互作用によってグロビン内に固定されている 6）．ヘムは中心に二価の鉄原子（FeII）を有しており，
その FeII 上に１分子の酸素が配位する．ヘムはグロビンの疎水
ポケットに覆われることによって外部の水から遮断されており，水中で安定な酸素錯体を形成することが可能となっている．
さらに ヘムの６配位目に結合した酸素分子は His 64（遠位 His）と水素結合を形成し，酸素錯体の配位構造は相当安定化されている 6，7）．ミオグロビンに対する酸素の結合は可逆的であり，まわりの酸素分圧に応じて酸素の吸着と脱離を繰り返すことができる．

２．ミオグロビンの分子構造
動物は呼吸によって外界から酸素を取り入れ，細胞内において炭水化物を代謝する際の酸化剤として利用し，生きるためのエネルギーを得ている．脊椎動物の場合，取り入れられた酸素は肺胞で赤血球へと渡され，血液によって各組織へと運搬される．赤血球内で酸素と結合するのは可逆的な酸素結合能力を有するヘモグロビンである．酸素の運搬先の各組織には，酸素貯蔵タンパク質として，ヘモグロビンの４分の１の構造ユニットから成るミオグロビンが含まれる．Fig. 1 に X 線結晶構造解析
によって明らかにされたマッコウクジラ（sperm whale）由来のミオグロビン酸素付加体の構造およびヘム周辺の構造を示す．ミオグロビンは約 17,000 Da のタンパク質であり，153 個のARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

３．ミオグロビンのモデル化合物
ミオグロビンのような酸素結合機能をフラスコ内で人工的に再現することは，酸素の結合メカニズムについて様々な知見をもたらすとともに，血液代替物質，酸素富化膜，酸素センサー，
酸素供給あるいは酸素除去剤などの実用化の面においても非常に興味深い研究対象である．ミオグロビン機能を人工的に模倣する試みは 1950 年代からすでに行われていたが 8），均一溶液中
において酸素分子を可逆的に結合した最初の成功例は，1973 年に Collman らが開発したピケットフェンスポルフィリンである 9）．
ミオグロビンの場合，酸素結合部位であるヘムはタンパク質によって立体的に保護されている．溶液中において，特に立体的161

に保護されていない単純な FeII ポルフィリンに酸素を作用させると，不可逆的に二分子間の会合による酸素架橋型（μ-オキソ）二量体が生成し，それにともなう FeII から FeIII への酸化反応が起こって酸素結合能を失ってしまう（Fig. 2a）2，3）．Collman ら
は FeII ポルフィリンに対して立体的にかさ高い置換基（ピバル
アミド基）を導入することで，二分子間の会合によるμ-オキソ錯体の生成を抑え，無水ベンゼン中，25 ℃において安定かつ可逆的に酸素を吸脱着することに成功した（Fig. 2b）．その後，彼らの分子設計指針に基づいたミオグロビンモデルが数多く合成され，それらの酸素結合挙動について詳細に検討されてきた 2-4）．

Aida らは，FeII ポルフィリンの周辺に疎水的なデンドリマー側鎖を導入して FeII-O2 結合部分への水の接近を防ぎ，水を混ぜた
トルエン中でも安定な酸素錯体を形成することに成功した 11）．
しかし，この分子は水に不溶であるため，100 ％水中での知見は得られていない．一方，Collman および Diederich らが合成した水溶性の FeII ポルフィリンデンドリマーは，Aida らの系と同様に水を混ぜたトルエン中では酸素錯体を生成するものの，100 ％水中では瞬時に自動酸化反応が起こると報告されている 12）．Tsuchida らはカチオン性ポルフィリン-シクロデキスト
リン-フェニルイミダゾールを組み合わせた水溶性の超分子錯体を報告しており，DMF / 水 = ３/２の溶媒中で酸素錯体が生成すると報告している 13）．Groves らはトリエチレングリコール
およびピリジンで修飾したシクロデキストリン誘導体と FeII ポ
ルフィリンとの包接錯体を用いて水中で酸素錯体の生成を確認したと報告しているが 14），酸素錯体生成の証拠が不十分であり，その後も詳細な報告がなされていない．100 ％の水中で酸素錯体を形成したという確かな成功例は，Tsuchida らの脂質膜を利用した系である 15-18）．彼らは水中において，疎水的な脂質分子膜中に FeII ポルフィリンを埋め込むことによって，安定な酸素錯体が形成可能となることを報告している．
これらの水を含んだ系での検討から，水が FeII ポルフィリン
酸素錯体の自動酸化反応を誘発することは明らかである．水中でミオグロビンと同じように FeII-O2 結合部位周辺を隔離し，安定な酸素錯体を構築することは極めて困難である．これまでに脂質膜の系を除いて完全な水中で酸素錯体を形成した合成化合物の報告例はない．このため，水中における酸素錯体の詳細な研究は遅れており，合成化合物による血液代替物の開発も遅れている．水中で機能するミオグロビンモデルを実現するためには，水中で FeII ポルフィリンを疎水環境に隔離することが必要不可欠である．

Fig. 2. Irreversible oxidation of an iron（II）
porphyrin to the μ-oxo iron（III）porphyrin dimer induced by oxygen（a）and a picketfence
porphyrin reported by Collman et al（b）.

４．シクロデキストリンを用いた生体モデル系の構築

ピケットフェンスポルフィリン成功後の次なる課題は，生体系と同じ環境で機能する水溶性のモデルを合成することであった 4）．しかし水が存在する系で酸素の結合に成功した報告例は極めて少ない．合成化合物の酸素錯体は水に対して非常に不安定で，ピケットフェンスポルフィリンをはじめとするほとんどの人工の酸素錯体は，溶媒にほんの少しでも水を混入させるとFeIII への自動酸化反応が起こり，酸素結合能を失ってしまう．
そのため，モデル化の研究は厳密な脱水条件下でのみ行われてきた．ミオグロビンのように水中で安定な酸素錯体を形成する
ためには，立体障害によって二量化によるμ-オキソ錯体の形成を抑えるだけでは不十分であり，タンパク質内のポケットのよ
うに周囲の水から隔離されたミクロな疎水環境をつくる必要がある 10）．
水系におけるいくつかのモデル化のアプローチを挙げる．

162

シクロデキストリン（CD）はグルコピラノース環がα-1,4 グ
ルコシド結合によって連なった環状オリゴ糖であり，構成単位であるグルコピラノースが６，７および８個のものをそれぞれα-，β-およびγ-CD と呼ぶ（Fig. 3）．CD は円錐台形のへりに多数の水酸基を有するために水溶性であり，その空洞内は C-H結合に覆われているために疎水性を示す．この疎水空洞の大き

Fig. 3. Cyclodextrins and their per-O-methylated derivatives.

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

さに適合した疎水性化合物あるいは疎水性置換基があると，それらの疎水部分は水溶液中で CD に包接される 19）．1960 年代，
Bender らは CD が水中でエステルの加水分解反応を位置異性体
選択的に触媒することを見出した 20）．これはあたかも CD が酵
素のように分子を識別しているものと考えられ，CD を用いた
バイオミメティックケミストリー研究のさきがけとなった．これをきっかけに水中でのバイオミメティックケミストリーは飛躍的に発展し，CD はタンパク質モデルとして広く利用されるようになった 21，22）．
我々は過去にβ-CD の全ての水酸基を O-メチル化した TMeβ-CD（Fig. 3）が，水中でアニオン性のテトラアリールポルフ
ィリン類を異常なほど強く包接することを見いだしている（Fig. 4）23-25）．これらの錯体に対する結合定数は測定できない程に大きく，水中で極めて安定な１：２包接錯体が生成する．さらに２分子の TMe-β-CD がポルフィリン金属錯体を包接すると，その金属イオン周辺には水分子の接近が妨げられたミクロな疎水環境が形成されることを明らかにした 26，27）．このような機能は，まさにミオグロビンのグロビンタンパク質が果たす機能の１つと同じである．我々は，TMe-β-CD-水溶性ポルフィリ
ン包接錯体が水中で機能するミオグロビンモデルの素材として非常に有望であると考えた．

（１）
２つの L がジアキシャル配位してしまうと，肝心の酸素結合サイトを失ってしまう．そこで我々は２つの TMe-β-CD によってFeII ポルフィリンを疎水場にカプセル化しつつ，FeII 中心が５配位状態となるように，ピリジン配位子を分子内に組み込んだ
TMe-β-CD の二量体（Py3CD）を設計した（Fig. 5）．

Fig. 5. Structures of an O-methylated β-cyclodextrin dimer having apyridine linker（Py3CD）,［5,10,15,20-tetrakis（4-sulfonatophenyl）
porphinato］iron（FeTPPS）, and Py3CD-Fe II TPPS complex（hemoCD1）as a myoglobin model that works in aqueous solution.
Fig. 4. Formation of a stable 1:2 complex of a 5,10,15,20-tetrakis（ 4sulfonatophenyl）porphyrin and TMe-β-CDs in aqueous solution.

５．水中で酸素を結合させるための分子設計
ミオグロビンやそのモデル系で実証されているように，酸素結合部位となる Fe2+ イオンには，ポルフィリン平面の４つの窒素原子からの配位結合に加えて，５番目の配位子としてひとつの芳香族へテロ環化合物が結合した状態となって，はじめて第６配位座に酸素を結合することができる．すなわち，安定な酸素付加体の形成には，酸素結合サイトの反対側（トランス位）の配位子からの電子供与による FeII-O2 結合の安定化が不可欠である 3，6，28）．TMe-β-CD をミオグロビンのタンパク質モデルとして用いるためには，１つの配位子をポルフィリンの FeII 中心に配位させて５配位状態を作らなければならない．ここで難しいのが，単にイミダゾールやピリジンなどの配位子を FeII ポルフ
ィリンに共存させるだけでは，５配位状態よりもはるかに熱力
学的に安定な６配位状態を容易に形成してしまうことである
3，
28）（K2 > K1）（式１）．

６．水中・室温で酸素を結合するミオグロビンモデル hemoCD
我々が設計した Py3CD は，市販のβ-CD を出発物質に計４段
階のステップを経て合成可能であった（Fig. 6）5）．得られた
Py3CD の包接能を調べるために，FeIIITPPS（Fig. 5）との相互作用を UV-vis，NMR スペクトルおよび質量分析により確認した．その結果，Py3CD は FeIIITPPS と Fig. 5 下段に示したよう

Fig. 6. Synthesis of Py3CD.

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009163

な非常に安定な１：１の包接錯体を形成することが分かった．5，29）
もともと TMe-β-CD は FeIIITPPS への包接力が大きい上に，第５配位子としてピリジンリンカーが中心の鉄へ結合するために，結果として Py3CD と FeIIITPPS との相互作用は結合定数が測定不可能なくらいに強くなっている．
FeIIITPPS-Py3CD 包接錯体（met-hemoCD1）の水溶液に還元剤としてハイドロサルファイトナトリウム（Na2S2O4）を加えると，met-hemoCD1 の１電子還元体である FeIITPPS-Py3CD
包接錯体（hemoCD1）が得られる（Fig. 7）．このとき，過剰に加えた Na2S2O4 は溶液中の酸素とも反応し，溶液に含まれる酸素が失われて無酸素状態となる．そこで Na2S2O4 添加後の溶液をゲルろ過カラム（Sephadex G-25）によって精製することにより，過剰の Na2S2O4 を除く操作を行った．カラム処理中にhemoCD1 の溶液は鈍い赤色から徐々に鮮血色へと変化するため，hemoCD1 が空気中の酸素と結合して oxy-hemoCD1 と変化していく様子が視覚的に分かる．カラム精製後の溶液の UVvis スペクトルを測定すると，極大吸収波長が 422 nm に観測された（Fig. 8）．その溶液中の酸素分圧を下げる目的で窒素ガスを 10 分間程度通気すると，スペクトルの極大吸収波長は脱酸素（デオキシ）状態を示す 434 nm へと変化した．そこへ空気を吹き込むと再びスペクトルは元の 422 nm へと戻る．この変化は可逆的で何度も繰り返すことが可能であった（Fig. 8）．したがって hemoCD1 は水中の酸素分圧に応じた可逆的な酸素の吸脱着能を保有することが明らかとなった．酸素錯体の証拠をFig. 7. Reduction of met-hemoCD1 by Na2S2O4 , oxygenation of hemoCD1,
and autoxidation of oxy-hemoCD1.

得るために，oxy-hemoCD1 の共鳴ラマンスペクトルを測定した結果，FeII-O2 結合を証明するバンドが 569 cm-1 に観測され，天然のミオグロビンの値（571 cm-1）30）と非常に近い値となり，構造的にもミオグロビンと類似していることが分かった．
oxy-hemoCD1 は天然のオキシミオグロビンと同じ様に，水溶液中で放置すると徐々に met-hemoCD1 へと変化する自動酸化（メト化）反応が観測された（Fig. 9a）．その反応速度は
k = 0.023 h-1 であり，半減期（t1/2）にすると約 30 時間となった．
ほぼ同条件の測定で報告されているミオグロビンの自動酸化31）と比べるとかなり速いが，（sperm whale，半減期約 140 時間）
用途によっては十分に実用可能なレベルの安定性である．このoxy-hemoCD1 の自動酸化反応速度は周囲の環境に大きく影響される 32）．Fig. 9b に oxy-hemoCD1 の自動酸化反応速度の pH
依存性を示す．ミオグロビンやヘモグロビンと同様 31）に oxyhemoCD1 の自動酸化は中性の pH 領域で最も遅く，pH 4 以下
および pH 10 以上において，著しい酸素錯体の不安定化が観測された．酸性条件下では Py3CD のピリジンの窒素原子にプロトン化が起こって配位結合が外れ，酸素錯体を維持できなくな
る．一方アルカリ性条件下では，水酸化物イオンによる FeII への求核攻撃が起こり，スーパーオキシドアニオンが脱離しやす
くなると考えられる（式２）．

Fig. 9.（a）Progressive spectral change during autoxidation reaction of
oxy-hemoCD1（5 x 10-6 M）under air in 0.05 M phosphate buffer
at pH 7.0 and 25 ℃. Scans were carried out at 2.5 hour intervals.
Inset: first-order plot based on the absorption change at 423 nm.
（b）Plot of log（kobs）versus pH for autoxidation of oxy-hemoCD1
at 25 ℃.

（２）

Fig. 8. Reversible oxygen binding of hemoCD1 by successive O 2 / N2
bubbling cycles in 0.05 M phosphate buffer at pH 7.0 and 25 ℃.

164

この求核置換（SN2）反応に類似した自動酸化反応メカニズムを支持する結果として，中性の水溶液中で求核性の高い N 3-イ
オンや OCN-イオンを添加したときにも，アルカリ性の溶液中と同じく自動酸化の著しい加速が見られた 32）．天然のミオグロ
ビンの自動酸化反応はタンパク質の構造変化など複雑な要因があるためにその機構を一義的に解釈できず，数々のメカニズム

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

が提案されている 6，31）．一方，oxy-hemoCD1 の自動酸化の場合は非常にシンプルであり，SN2 反応に類似した機構で説明することができる．これは，Shikama らが一貫して主張してきたミオグロビンの自動酸化反応メカニズム 31）とよく一致している．
hemoCD1 水溶液の UV-vis スペクトルを酸素分圧を変化させて測定すると，分圧の変化に伴ってスペクトルはデオキシ体か
らオキシ体へと段階的な変化を示した（Fig. 10a, b）．このスペ
クトル変化から得られた酸素飽和曲線は，ミオグロビンと同様に単純な飽和型となり，酸素親和性を示す P1/2O2 の値は 17 Torrとなった．この値から，hemoCD1 の酸素親和性はミオグロビン
よりも低く，ほぼ同条件で報告されているヘモグロビンの T 状態の親和性（26 Torr）に比較的近いことが分かった（Table 1）．
すなわち hemoCD1 は，ヘモグロビンのような酸素運搬体としての性能を秘めていることが示唆された．

Fig. 10. UV-vis spectral change of hemoCD1（5 x 10-6 M）as a function of
O2
the O2 partial pressure（P ）in N2（a）, the titration curve for O2
binding to hemoCD1（b）, UV-vis spectral change of oxy-hemoCD1（5 x 10-6 M）as a function of the CO partial pressure（PCO）in N2O2（c）, and the titration curve for CO binding to oxy-hemoCD1（d）. All spectra were measured in 0.05 M phosphate buffer at pH
7.0 and 25 ℃. The solid lines in（b）and（d）are the theoreticalcurves for determining P1/2L（L = O2 and CO）.

７．CO および NO に対する反応性
hemoCD1 はヘモグロビンやミオグロビンと同様に一酸化炭素（CO）と非常に強く結合する 32）．Fig. 10c および d に，CO分圧を徐々に上げていったときの oxy-hemoCD1 の水溶液のUV-vis スペクトル変化およびその飽和曲線を示す．この UVvis スペクトル変化から，hemoCD1 の CO に対する親和性を算出すると P1/2CO = 1.5 x 10 -5 Torr となり，ミオグロビン（0.029
Torr）と比べると圧倒的に CO 親和性が高いことが分かった（Table 1）．ヘモグロビンやミオグロビンでは遠位 His による立体的および電子的な効果によって，有毒な CO のヘムへの結合をある程度抑制することができる 4，33，34）．しかし hemoCD1 には
そのような抑制部位がないために，結果として CO に対する親和性が高くなったものと考えられる．ミオグロビンの遠位 Hisのように，hemoCD1 の CO 親和性を抑制するような部位を導入することができればより天然に近いモデルとなり，人工酸素運搬体としての性能の向上につながるであろう．現在，
hemoCD1 への遠位 His の導入をめざした分子設計を進めている段階である．
ミオグロビンに対して O2 や CO よりもさらに強く結合する二原子分子は，一酸化窒素（NO）である 6）．体内に存在する NOには血管拡張作用があるため，hemoCD1 が体内で NO を結合してその働きを奪ってしまうと，高血圧症を誘発する恐れがある．しかしながら，hemoCD1 の水溶液に NO ガスを加えると，
hemoCD1 は NO と結合せずに徐々に分解するのみであった．
hemoCD1 は分子内にスルフィド結合を有しているため，NOによる硫黄原子の S-ニトロシル化反応が起こり，それにともなって分解反応が起こるものと考えられる．そこで hemoCD1 の類縁体として，硫黄原子を持たない Py2CD（Fig. 11）とFeIITPPS との包接錯体（hemoCD2）を用いて，NO との反応性を検討した 35）．FeIII の状態である met-hemoCD2 の水溶液にNO ガスを吹き込むと，UV-vis スペクトルは瞬時に変化し，
420 nm に極大吸収波長を持つ化合物へと変化した．この吸収極大は FeII ポルフィリンに NO とピリジン環の窒素原子がそれ

Table 1. O2 and CO affinities and half-lifetimes in biological and model
systems in aqueous solutions at pH 7 and 25 ℃
system

P1/2O2（Torr）

P1/2CO（Torr）

t1/2（h） refmyoglobin（sperm whale）

0.54

0.029

140

6, 31

hemoglobin（human R）

0.22

1.3 x 10-3

>60

4

hemoglobin（human T）

26

hemoCD117

1.5 x 10-5

30

5, 32

hemoCD2176

1.6 x 10-2

>100

35

hemoCD3

1.7

1.6 x 10-3

3

39

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 20093

Fig. 11. Structures of Py2CD and ImCD

165

ぞれアキシャル配位した６配位錯体の文献値 36）とよく一致す
る．したがって，FeIII の還元的ニトロソ化 37）によってミオグロ
ビンと同じ FeII-NO 錯体（NO-hemoCD2）が生成したものと考えられる．NO-hemoCD2 の配位構造は，77 K における EPR ス
ペクトル測定によっても６配位構造であることが確かめられた．
NO-hemoCD2 は水中，室温および空気下において徐々に
met-hemoCD2 と NO3-へと変化した（半減期 6.3 h）．この反応
速度は溶液中の酸素分圧に依存して変化することから，NO 錯体の酸化反応には酸素分子が関与した式 3 のようなメカニズム
で進行しているものと考えられる．

（３）
すなわち，FeII-NO 錯体が溶液中の酸素と交換反応を起こしていったん FeII-O2 錯体が生成した後，解離した NO は FeII に配位した酸素によって酸化され，FeIII と NO3-となって溶液中に拡散すると考えられる．NO から NO3-への酸化反応はオキシミオグ
ロビンやオキシヘモグロビンによっても同様に起こることが知られている 38）．この研究によって，モデル化合物を用いて初めてそのメカニズムを水中で検証することに成功した．

８．分子設計による機能改変
酸素運搬体として合成化合物を用いるひとつのメリットは，分子構造を可能な範囲で自由にデザインし，より高機能化をはかることができる点である．我々は上述の hemoCD1 およびhemoCD2 に加えて，より天然のミオグロビンの構造に近づける目的で，第５配位子をミオグロビンと同じイミダゾールにした ImCD を合成した（Fig. 11）39）．ImCD も Py2CD および
Py3CD と同様に水中において FeIITPPS と非常に安定な包接錯体（hemoCD3）を形成し，hemoCD3 の FeII 中心には酸素が結合可能であった．hemoCD1，hemoCD2 および hemoCD3 それぞれの酸素親和性および酸素錯体の半減期を Table 1 に示す．
第５配位子をイミダゾールに変えると，酸素親和性は著しく向上し，ミオグロビンと比較的近い値を示した．これは，
hemoCD1 および hemoCD2 の第５配位子であるピリジンよりも，ミオグロビンや hemoCD3 の持つイミダゾールの方が FeII
への電子供与能が強く，より強い FeII-O2 結合を形成することによる結果である．酸素錯体の半減期をそれぞれ比較すると，
hemoCD1 は 30 時間，hemoCD2 は測定範囲内（〜 100 h）では
ほとんど自動酸化を起こさなかったのに対し，hemoCD3 の場
合では３時間とかなり速くメト化した．これについては，分子計算により求めた最適化構造を比較すると，その原因を推察することができる．MM2 計算により求めた hemoCD1，
hemoCD2 および hemoCD3 の分子の最適化構造を Fig. 12 に示
す．hemoCD1 および hemoCD2 では，スペースフィリングモデ
ルで表示すると，中心の FeII は CD によって完全に覆い隠され

166

Fig. 12. Energy-minimized structures of hemoCD1, hemoCD2, andhemoCD3 obtained from the MM2 calculations using a
BioMedCAChe 6.0 software.

ているのに対し，hemoCD3 では FeII 中心が CD によって覆われきれずに露呈していることが分かる．すなわちこの計算結果は，
hemoCD3 では FeII 中心へのバルク水の侵入を防ぎきれていないことを示しており，これが酸素錯体の不安定性につながっていると考えられる．このような違いは，２つの CD を繋ぐリンカーの構造に起因している．hemoCD1 や hemoCD2 では，リンカーがフレキシブルな構造で CD が FeIITPPS を十分にカプセル化できるように構造変化が起こるのに対し，hemoCD3 ではリ
ンカー部分の構造に剛直なアミド結合を含むため，それが原因となり２つの CD ユニットが FeIITPPS を深くカプセル化することができない．このような微妙な分子構造の違いが酸素錯体の安定性に大きく影響する．これら３つの分子の比較から，水中で酸素を安定に結合するためには，できる限り FeII 中心をバル
ク水から保護してやることが大切であることが分かった．

９．今後の展望 −人工血液へのアプローチ−
以上の検討から，タンパク質を用いずとも完全合成系で水
中・室温で酸素を可逆的に結合できることが明らかとなった．
合成化合物を血液代替物として用いることにより,（１）自由に分子設計することにより酸素結合機能を目的に合うように調整でき,（２）生物由来のものを用いないため感染症の心配がなく,（３）大量に生産することができるなどのメリットがある．我々のモデル化合物を人工血液へと近づけるにあたって解決しなければならない問題点は，その分子サイズである．ヘモ
グロビンは血液中で数百μm の大きさの赤血球に包まれており，血管外へと漏れだすことはない．一方，hemoCD の分子サ
イズは約２ nm と非常に小さく，血管外へと漏れでてしまう可能性が高い．実際に動物を用いた実験では，oxy-hemoCD1 の人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

PBS 溶液をラットの静脈内へ注入すると，毒性などは全く示さなかったが，注入した hemoCD1 はすみやかに糸球体ろ過されて 30 分以内に尿中に排泄されてしまうことが分かった．尿を分析した結果，尿中の hemoCD1 はその包接錯体の構造を保っ
たままであった．さらに興味深いことに，尿中の hemoCD1 は内因性の CO と結合した CO 錯体の形となっていた．すなわち
hemoCD1 はその非常に高い CO 親和性と小さな分子サイズの効果により，体内で CO を捕まえて体外へと排出させる CO 除
去試薬としての効果があることが明らかとなった 40）．このように，生体分子をモデル化するにあたって，当初予想しなかった
新たな事実を発見することができるのは，バイオミメティック
ケミストリーの醍醐味の１つであろう．
現在，我々は hemoCD を人工血液として利用するために，
hemoCD の高分子化やナノ粒子化を試みている．分子サイズの増大により hemoCD の血中滞在時間が長くなれば，生体内で酸素運搬体として働く可能性は非常に高い．これまでにバイオミ
メティックケミストリーにおける研究成果が実用化された例はほとんどない．我々の研究がこの状況を打破できることを願っ
ている．

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人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

総説

ヘモグロビン小胞体（HbV）の体内動態特性
The Pharmacokinetic Properties of Hemoglobin-vesicles
田口和明（1），丸山徹（1，2），小田切優樹（1，3）
Kazuaki Taguchi (1), Toru Maruyama (1, 2), Masaki Otagiri (1, 3)

和文抄録
ヘモグロビン（Hb）小胞体（hemoglobin vesicle ； HbV）は直径約 250 nm の均一な粒径のリン脂質二分子膜より構成される小胞体中に，ヒト赤血球由来 Hb を高濃度で内包させたポリエチレングリコール（PEG）修飾細胞型人工酸素運搬体である．これまでに，製剤化試験・薬理試験など数多くの前臨床試験において HbV の有用性が証明されているが，HbV の体内動態に関する情報は不足している．そこで我々は，HbV の体内動態特性について検討を行った．Hb 及び HbVの内部 Hb をヨウ素（125I）標識した 125I-Hb 及び 125I-HbV を用いた体内動態実験より，Hb を小胞体化することで腎臓及び肝臓への分布が抑制され，血中半減期は 30 倍に延長した．また，投与量依存的に 125I-HbV の肝臓及び脾臓における取り込み
クリアランス（CLuptake）は減少し，消失半減期は 1400 mg Hb/kg の投与量において約 19 時間まで増大した．125I-HbV 及びHbV の膜構成コレステロールをトリチウム（ 3H）で標識した HbV（ 3H-HbV）を用い，HbV 構成成分の体内動態について検討したところ，125 I-HbV 及び 3 H-HbV の血漿中濃度推移はほぼ一致したことから HbV は小胞体構造を保持したまま血中を滞留することを確認した．また両標識体ともに主要分布臓器は肝臓及び脾臓であることが示された．加えて，初代肝実
質及び肝内皮細胞，さらにはクッパー細胞の代替として RAW 264.7 細胞を用い，HbV の取り込みに関与する細胞種の探索を行ったところ，RAW 264.7 細胞においてのみ，125I-HbV の特異的な取り込み及び分解が認められ，HbV の取り込み・分解には細網内皮系細胞（MPS）が関与することが明らかとなった．さらに興味深いことに，肝臓及び脾臓で分解された
後，HbV の内部 Hb と脂質成分は異なる動態特性を示すことが判明した．すなわち，Hb は速やかに臓器中から消失後，７日以内に尿中へ排泄されるものの，脂質成分は 14 日以内に胆汁中より糞中へ排泄された．また，マウスにリポソーム製剤を投与することで惹起される Accelerated Blood Clearance（ABC）現象の有無を HbV について検討するために，非標識
HbV 投与（0.1 or 1400 mg Hb/kg）７日後に 125I-HbV を投与（0.1 or 1400 mg Hb/kg）した．その結果，HbV 低投与量（0.1 mg Hb/kg）においては，ABC 現象誘発の原因となる抗 HbV IgM の産生が確認され，初回投与時と比較して，２回目投与時には著しい血中滞留性の低下とともに，肝臓及び脾臓による CLuptake の有意な増大が観察された．一方，HbV 高投与量（1400 mg Hb/kg）では，抗 HbV IgM の産生は確認されたものの，MPS による取り込みの飽和により，低投与量時において観察された血中滞留性の低下は有意に抑制された．また，抗 HbV IgM の認識部位は HbV 脂質膜構成成分のDSPE-PEG であった．最後に，出血性ショックのモデルラットを用いて，HbV の単回及び連続投与時における体内動態を検討したところ，出血性ショック時の消失半減期は健常時に比べ短縮したが，２回目投与時の消失半減期は単回投与時に比べ延長し，健常時と同レベルまで回復した．さらにこれらの結果に基づき，ヒトにおける HbV の半減期をアロメトリ
ック式を用い算出したところ約３-４日と予想された．以上の結果から，薬理試験で示されていた HbV の安全性及び有効性を，我々は体内動態特性の観点より明らかにした．
Abstract
Hemoglobin vesicles（HbV）have been developed as a cellular type of oxygen carrier, in which highly concentrated hemoglobin（Hb）is encapsulated in a phospholipid bilayer membrane with polyethylene glycol（PEG）, and the diameter of HbV can be
tailored to approximately 250 nm. Despite evidence for many types of effectiveness of HbV evaluation, including formulation test
（1）熊本大学大学院医学薬学教育部 〒 862-0973 熊本市大江本町 5-1

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kumamoto University, 5-1

Oe-honmachi, Kumamoto 862-0973, Japan.
（2）熊本大学育薬フロンティアセンター Center for Clinical Pharmaceutical Sciences, Kumamoto University（3）崇城大学薬学部 Faculty of Pharmaceutical Sciences, Sojo University
論文受付 2009 年 11 月４日 論文受理 2009 年 12 月３日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009169

and pharmacological test, the pharmacokinetics of HbV have not been well characterized. Therefore, we examined the preclinical pharmacokinetic studies of HbV. Using HbV in which the internal Hb was labeled with iodine-125（125I-HbV）and cell-free
125
I-Hb, it was found that encapsulation of Hb increased the half-life by 30 times, accompanied by a decreased distribution in boththe liver and kidney. The uptake clearances for the liver and spleen were decreased with increasing dose of HbV, and the halflife of HbV was increased up to approximately 19 hours at a dose of 1400 mg Hb/kg. The pharmacokinetics of HbV components（internal Hb and liposomal lipid）were also investigated using 125I-HbV and 3H-HbV（liposomal cholesterol was radiolabeled withtritium-3（ 3H））
. Similar plasma concentration curves of 125I-HbV were observed for 3H-HbV, and time course for the plasma ironconcentration curve derived from HbV was consistent with the plasma concentration curves for both labeled-HbV. 125I-HbV and3
H-HbV were mainly distributed to the liver and spleen. In an in vitro study, the specific uptake and degradation of HbV in
RAW 264.7 cells was observed, but this was not the case for parenchymal and endothelial cells. After degrading HbV in liverand spleen, internal Hb disappeared from both the liver and spleen 5 days after injection, and the liposomal cholesterol
disappeared at about 14 days. Internal Hb was excreted into the urine and cholesterol into feces via biliary excretion. To
examine whether HbV induces the Accelerated Blood Clearance（ABC）phenomenon in mice, at 7 days after the first injection of
non-labeled HbV（0.1 or 1400 mg Hb/kg）, the mice received 125I-HbV（0.1 or 1400 mg Hb/kg）. At a dose of 0.1 mg Hb/kg, 125I-HbV
was rapidly cleared from the circulation and uptake clearances in liver and spleen were significantly increased, and at this time,
IgM against HbV was produced. In contrast, at a dose of 1400 mg Hb/kg, the pharmacokinetics of HbV were negligibly affectedby repeated injection despite the production of IgM against HbV. This is due to the saturation of phagocytic processing by themononuclear phagocyte system. In addition, the recognition site was determined to be DSPE-PEG in HbV. Next, we investigatedthe pharmacokinetics of single versus repeated administration of HbV during hemorrhagic shock. The half-life was shorter inhemorrhagic shock rats as comparison with normal rats, but it returned to levels similar to those of normal rats after the second
HbV injection in hemorrhagic shock rat. Finally, the half-life of HbV in humans was estimated to be approximately 3-4 days
using an allometric equation. We could determine the detailed pharmacokinetics properties of HbV, and our results suggest thatHbV could be used as an oxygen carrier from the view point of pharmacokinetic studies.
Keywords
hemoglobin based oxygen carrier, pharmacokinetic, accelerated blood clearance（ABC）phenomenon, anti-HbV IgM, hemorrhagic
shock, extrapolation

はじめに通常，生体内においてヘモグロビン（Hb）は赤血球内に存在し，主に酸素運搬の役割を担っている．現代の医療において，不慮の事故や手術中の大量出血時には赤血球濃厚液の投与が行われているが，既知の AIDS や肝炎ウィルス及び未知のウェス
トナイルウィルスなどの感染症に加え，血液型不一致等の医療過誤を引き起こす可能性が否定できない．さらには，日本における赤血球濃厚液の保存期間は採血後，冷蔵で３週間という短い期間であるなどといった様々な問題点が残されている．このような問題を克服するために，これまでにパーフルオロカーボン（Perfluorocarbon; PFC）や非細胞型及び細胞型 Hb-based
oxygen carrier（HBOCs）などの人工酸素運搬体の開発が進められてきた 1，2）．
Hb 小胞体（hemoglobin vesicle ； HbV）は直径約 250nm の均一な粒径リン脂質二分子膜より構成される小胞体中に，ヒト
赤血球由来の精製 Hb を高濃度で内包させた細胞型 HBOCs である．これまでにアルブミンを添加することにより膠質浸透圧の調節が可能であること，さらには，アロステリック因子として Pyridoxal 5'-phosphate を共封入することによる酸素分圧の調節が可能であることなど，赤血球と同等の物理化学的特性を付加することができることが報告されている 3，4）．また，ポリエ

170

チレングリコール（PEG）を粒子表面へ導入することにより，
小胞体粒子間の凝集抑制と分散安定性が向上し，溶液状態で２年以上の室温保存を可能にしただけでなく，細網内皮系細胞（MPS）からの捕捉を抑制できることが報告されている 5，6）．同時に，ヒト赤血球から HbV の原料となる Hb の精製段階におけるウィルスの除去及び不活化工程に関しても数多くの検討がなされ，高い安全性が確保されつつあると言える 7，8）．この物理化学的検討に加え，薬理効果についても，ラットを用いた 50 ％出血ショックモデルの蘇生などの動物試験において，赤血球と同等の効果を有することが証明されており，今後の臨床応用が期待されている 9-11）．
一般に，医薬品の開発過程の中で，前臨床試験として製剤化試験，薬理試験，薬物動態試験，さらには安全性試験など多くの段階を経て，その有効性と安全性を確立していく．2008 年，
Journal of American Medical Association（JAMA）誌において，欧米で開発された HemAssist, Hemopure, Hemolink,
PolyHeme, Hemospan の５種類の非細胞型 HBOCs の臨床試験結果を基に，メタアナリシスを行ったところ，非細胞型
HBOCs 投与群の死亡率および心筋梗塞発症率が対照群に比べ高いというエビデンスが報告された．これを受け Natanson らは人工酸素運搬体の開発過程で動物試験における十分な検討が人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

必要であると指摘しており，以前にもまして，さらなる前臨床試験とその解釈の重要性が求められるようになった 12）．
前述したように，HbV の有用性は数多くの前臨床試験において確認されているが，前臨床試験で必要不可欠な検討項目の１つである体内動態に関する情報は不足している．1997 年，
Kennedy は，新薬開発断念の理由に不十分な薬物動態試験が大きく関与していることを報告している 13）．これは薬物動態試験
がただ単なる，薬物の吸収（Absorption）
・分布（Distribution）・代謝（Metabolism）・排泄（Excretion）といった，いわゆるADME を把握するだけでなく，これらのデータを踏まえた上で薬理効果や毒性発現を予測すること，つまり有効性や副作用を考える上で有用であるからである．実際に，過去に開発された人工酸素運搬体の一つである PFC は，その有用性が in vivo
及び in vitro 試験において証明されたが，クリアランス（排泄）の悪さから，１年以上にわたる臓器蓄積（特に肺）が原因となる副作用が確認された 14）．この問題は体内動態試験の結果から十分に予想できたと思われる．また，リポソーム製剤は上市されるようになって日が浅いため，従来の製剤に比べて体内動態についても不明な点が残されている．加えて HbV の場合，赤血球代替物であるため投与量が通常のリポソーム製剤の 100 倍
以上と多く，これまでの構築されてきた動態解析の成果を当てはめることができない．そのため，予期せぬ副作用や生体蓄積性が懸念されると同時に，新たに HbV の臨床使用状況でデータを構築する必要がある．
現在，上市されている Amphotericin B 内封リポソーム製剤（AmBisome®）は健常人と病態患者によって体内動態が一部異なることが報告されている 15，16）．また，PEG 修飾リポソームにおいて，ある投与間隔で２回投与を行うと２回目投与された
PEG 修飾リポソームの血中クリアランスが亢進するといった，
いわゆる Accelerated Blood Clearance Phenomenon（ABC 現象）が誘導されることが報告されている 17）．そのため，PEG 修
飾リポソーム製剤である HbV においても健常時と病態時（大量出血時），また頻回投与時において体内動態が異なる可能性が懸念され，そのような条件をふまえて HbV の体内動態特性を把握することは HbV を安全かつ有効に臨床使用するために重要であると考えられる．
本稿では，我々がこれまで明らかにしてきた HbV の体内動態特性について紹介する．

Fig. 1. A, Time course for the plasma level of 125I-Hb（open circle）and
125
I-HbV（closed circle）after administration to mice. DdY micereceived a single injection of 125I-Hb or 125I-HbV from the tail vain
at a dose of 1 mg Hb/kg. Blood was collected from the inferior
vena cava under ether anesthesia, and a plasma sample wasobtained. Each point represents the mean ± SD（n=3-6）. B, Tissue
distributions of 125I-Hb（open bar）and 125I-HbV（filled bar）at 3 minafter administration to mice. DdY mice received a single injectionof 125I-Hb or 125I-HbV from the tail vain at a dose of 1 mg/kg. At 3
min after injection, each organ was collected. Each bar represents
the mean ± SD（n=3-6）. ＊p<0.05, ＊＊p<0.01 and ＊＊＊p<0.001 vs 125I-Hb.

125

１

Hb 及び HbV の体内動態解析

18）

通常，溶血により血漿中へ放出された Hb は血漿タンパク質の一つであるハプトグロビンと結合することで，肝臓へ取り込
まれる 19）．ハプトグロビンと結合していない遊離型の Hb は，速やかに二量体へ解離し，糸球体のサイズバリアーを潜り抜けることで糸球体濾過をうけ，尿中へ排泄される．そこで，ddY
系雄性マウスに Hb 及び HbV の内部 Hb をヨウ素（125 I）標識した 125 I-Hb あるいは 125 I-HbV を１ mg Hb/kg で尾静脈内投与し，Hb を小胞体化することによる，体内動態の変化について検討した．

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

I-Hb 及び 125I-HbV を１ mg Hb/kg で ddY マウスに尾静脈内投与後の血漿中濃度推移を Fig. 1A に示す．125 I-Hb は投与後速やかに血漿中より消失するのに対して，125 I-HbV は長時間滞留
し，半減期（t 1/2）は，約 30 倍に延長していた（t 1/2 ; 3.1 ± 1.0,
0.1 ± 0.1 hr, p<0.01, for 125I-HbV and 125I-Hb, respectively）．それに伴い， 125 I-HbV の血漿中濃度-時間曲線下面積（AUC）は125
I-Hb に比べ約３倍増大し，一方で全身クリアランス（CL）
は 有 意 に 減 少 し た （ AUC; 29.4 ± 9.2, 7.9 ± 3.9 hr ＊ ％ of
dose/mL, p<0.001 and CL; 3.4 ± 0.1 mL/hr, 12.7 ± 2.1 mL/hr,
p<0.001, for 125I-HbV and 125I-Hb, respectively）．この際の投与
３分後の主要臓器への分布を Fig. 1B に示す．125I-HbV は 125I-Hb

171

と比較して，腎臓及び肝臓への移行が著しく抑制されるとともに，125I-Hb においてほとんど分布していなかった脾臓や肺への移行が有意に増大した．
この現象は，血漿中において極めて不安定であった Hb を小胞体化するこで，①ハプトグロビンとの結合の抑制，②血漿中での Hb の解離及び排泄の抑制，つまり，肝臓及び腎臓における HbV の取り込みが有意に抑制されたため，血中滞留性が大幅に改善されたと解釈される．また，リポソーム製剤は MPS
により取り込み・分解を受けるため，HbV は脾臓・肺マクロファージに取り込みを受けた結果，脾臓・肺への分布量が増大したのではないかと推察される．

２

HbV 体内動態に及ぼす投与量依存性 18）

マウスにおける 125 I-HbV の体内動態の投与量依存性について，投与量を１，10，200 mg Hb/kg 及び臨床使用量の目安とされる 1400 mg Hb/kg に設定して検討した．Fig. 2 にマウスに静脈内投与後の血漿中濃度推移を示す．投与量の増大とともに血中滞留性は向上し，t1/2 は 1400 mg Hb/kg の投与量において，
約 19 時間まで延長した（t1/2 : 3.1 ± 3.1, 3.6 ± 1.3, 7.2 ± 3.1 and18.8 ± 1.3 hr at doses of 1, 10, 200 and 1400 mg Hb/kg,
respectively）．ラットにおいても同様の検討を行ったところ，投与量増大に伴い血中滞留性は向上した（t1/2 : 8.8 ± 0.7, 11.5 ±0.3 and 30.6 ± 4.0 hr at doses of 10, 200 and 1400 mg Hb/kg,
respectively）．

Fig. 2. Dose-dependent plasma concentration curve of 125 I-HbV afteradministration of 125 I-HbV in mice. All mice received a single
injection of 125 I-HbV at a dose of 1（closed square）, 10（open
square）, 200（closed circle）and 1400mg Hb/kg（open circle）
containing 5 ％ rHSA. At each time（0.05, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 and 24hr）after the 125I-HbV injection, blood samples were collected fromthe inferior vena cava, and a plasma sample was obtained. Eachparameter was calculated by MULTI using a two-compartment
model. Each point represents the mean ± SD（n=3-6）

172

次に 1400 mg Hb/kg の投与量で 125I-HbV をマウスに静脈内投与し，８時間後における各臓器の組織対血漿中濃度比（Kp）を算出したところ，肝臓及び脾臓においてのみ Kp 値は，１より大きくなり（1.8，2.8 mL/g of tissue for liver and spleen,respectively），肝臓及び脾臓に高い濃度で蓄積することが示唆された．そこで，肝臓，脾臓について，125 I-HbV の分布の投与
量依存性を検討したところ，肝臓において，１，10 mg Hb/kgの投与量では，投与 30 分後までに 30 ％以上の高い分布が認められたが，投与量の増大とともに分布の程度は減少し，1400
mg Hb/kg において肝臓へ分布した割合は数％にまで阻害された（Fig. 3A）．分布量の程度は異なるものの，同様の傾向が脾
臓においても認められた（Fig. 3B）．また，各臓器の 125 I-HbV
取り込みクリアランス（CLuptake）を算出したところ，肝臓，脾臓において，CLuptake は投与量依存的に減少し，腎臓，肺及び心臓においてはこのような傾向は認められなかった（Table 1）．
以上のことより，HbV の消失には肝臓，脾臓が主要な役割を果たしていること，また，これら臓器への分布に投与量に依存
した飽和現象が観察されたことから，HbV の臓器取り込み過程には輸送担体が関与している可能性が示された．

Fig. 3. Time dependent distribution of 125I-HbV to liver（A）and spleen（B）
after administration of 125I-HbV in mice. All mice received a single
injection of 125I-HbV at a dose of 1（closed square）, 10（open square）,
200（closed circle）and 1400mg Hb/kg（open circle）containing 5 ％rHSA. At each time after injection, the liver and spleen wascollected. Each point represents the mean ± SD（n=3-6）

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

Table 1. Dose-dependent uptake clearance of HbV in liver, spleen, kidney, lungand heart after 125I-HbV administration in mice
All mice received a single injection of 125I-HbV（1, 10, 200 and
1400 mg Hb /kg）containing 5 ％ rHSA. The uptake clearance
for each organ was calculated by integration plot analysis at
designated times from 1 min to 30 min after injection.

そこで，初代肝実質及び肝内皮細胞，さらにはクッパー細胞の代替としてマウス単球由来マクロファージである RAW 264.7細胞を用い，HbV の取り込みに関与する細胞腫の探索を行ったところ，初代肝実質及び肝内皮細胞において，125 I-HbV の特異的な取り込みは認められなかったが，RAW 264.7 細胞においてのみ，125 I-HbV の特異的な取り込みと分解が認められた．また，RAW 264.7 細胞における 125I-HbV の取り込みに飽和現象がみられたことから，肝臓及び脾臓への取り込みにはクッパー細胞及び脾臓マクロファージの関与が明らかとなった．先述した
ように，リポソーム製剤は肝臓や脾臓などの MPS によって取り込まれ易く 20），この過程には，補体系活性化によるリポソー
ムのオプソニン化が関与すると考えられている．また，リポソーム製剤の取り込み経路としては CD14, CD36, CD51/61 などのスカベンジレセプターを介した経路も報告されている 21）．さらに我々は最近，補体系を不活化させた培養液中において，RAW 264.7 細胞による HbV の特異的な取り込まれることを見出しており，HbV の肝臓及び脾臓への取り込み過程には補体系活性化による経路に加えて，スカベンジレセプターなどが一部関与している可能性が示唆された．

３に原子発光分析法を用いて，Hb 構成元素であるヘム鉄の血漿中濃度を併せて測定したところ，125 I-HbV 及び 3 H-HbV の推移とよく一致した．これらの結果は，HbV が血中で分解を受けることなく，小胞体構造を保持した形で血中を循環していることを強く示唆している．
また，125 I-HbV 及び 3 H-HbV ともに，HbV の主要分布臓器である肝臓及び脾臓に分布していた．そこで，肝臓及び脾臓における経時的な分布推移の検討を行い，CLuptake を算出したところ，
125
I-HbV 及び 3 H-HbV でよく一致し（Liver; 256 ± 37, 301 ± 41:
Spleen; 51 ± 6, 43 ± 12 μL/hr, for 125 I-HbV and 3 H -HbV,
respectively），HbV は小胞体構造を保持した形で臓器へ取り込まれることが示唆された．しかしながら体内分布を経時的に確認したところ，投与数時間後からの 125 I-HbV 及び 3 H-HbV の挙動は明らかに異なった．すなわち，125 I-HbV 投与では７日以内に放射活性が臓器中から消失したが，3 H-HbV 投与においては 14 日後まで活性が認められた．このことより，HbV は肝臓及び脾臓において，脂質成分と Hb に分解され，それぞれの代謝，排泄経路は異なることが示唆された．
そこで 125I-HbV 及び 3 H-HbV の排泄経路について調べた結果，
125
I-HbV 投与時ではその放射活性の 84 ％ が７日以内に尿中へ排泄されたのに対して，糞中への排泄は数％であった．一方，
3
H-HbV は 70 ％ 以上が糞中に排泄されていた．また，胆汁中にも 3 H 活性が認められたため，脂質成分は分解された後，胆汁中から糞中へ排泄されることが示唆された．加えて，SD ラ
ットに 125I-HbV 及び 3H-HbV を 1400 mg Hb/kg で投与し，同様の検討を行ったところ，マウスと同様の挙動を示した．

HbV 構成成分の体内動態解析 18）

人工酸素運搬体は赤血球代替物であるため通常の薬剤とは異なり，一度に大量投与される．そのため，一般的な薬物に比べて予期せぬ副作用や生体内蓄積性を示すことが懸念される．特に HbV の構成成分である Hb は腎傷害，高血圧の原因となり 22），
脂質膜成分（特にコレステロールの蓄積）は腎臓や心血管疾患のリスクファクターに成り得る 23）．そこで，HbV の内部 Hb 及び膜構成成分の一つであるコレステロールをそれぞれ 125 I 及びトリチウム（ 3 H）で標識した HbV（125 I-HbV 及び 3 H-HbV）を用い，臨床推奨量とされる 1400 mg Hb/kg で ddY マウス及びSD ラットに投与し，HbV 構成成分の詳細な体内動態的特性の検討を行った．
ddY マウスに 125I-HbV あるいは 3 H-HbV を静脈内投与後の 125IHbV 及び 3 H-HbV はほぼ同様の血漿中濃度推移を示し，濃度推移曲線より得られた体内動態パラメータもほぼ一致した．さらARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

Fig. 4. Representation of a sequence of HbV disposition, metabolism andexcretion from pharmacokinetic examinations using 125I-HbV and3
H-HbV.

173

これらの検討により，HbV は小胞体構造を保持した状態で血中を循環し，小胞体構造を保持したまま，主に肝臓・脾臓に存在する MPS に取り込まれ分解をうけると結論付けた．また，
HbV 分解後では内部 Hb と脂質成分の挙動は異なり，前者は臓器においてアミノ酸レベルまで分解を受けた後に，速やかに臓器から消失し，主に尿中に排泄されるのに対して，脂質膜成分
は臓器に一時的な蓄積性を示し，その大部分は胆汁中から糞中へ排泄される一連の体内動態特性が明らかとなった（Fig. 4）．
これらの結果は，HbV が臨床使用量とされる 1400 mg Hb/kgという大量投与された場合においても，生体蓄積性が少なく，また，内因性の Hb や脂質成分と同様の経路で代謝排泄される
ことを示唆しており，HbV が代謝・排泄性に優れていることが強く示唆された．しかしながら，今回の標識体は内部 Hb のグロビン蛋白または脂質膜構成成分のコレステロールを標識したものであるため，今後，内部 Hb 中のヘムや他の脂質膜構成成分（リン脂質など）の動態特性に関しても詳細な検討を行う
必要があると考えられる．

４

HbV による ABC 現象の誘導 24）

HbV を現行の輸血代替として使用されることを想定した場
合，同一患者へ繰り返し投与される状況は十分に想定される．
近年，リポソーム製剤，特に PEG 修飾リポソームにおいて，２回目に投与した PEG 修飾リポソームの CL が１回目投与時と比べて著しく増大する，いわゆるABC 現象が幅広く認識され 17），
リポソーム製剤を上市する際には頻回投与時における体内動態
特性の変化について理解することが重要であると考えられる．
そこで，PEG 修飾新規リポソーム製剤である HbV においても，
ABC 現象が誘導されるか否かについて検討した．
マウスに非標識 HbV を用いて，一般に PEG 修飾リポソーム製剤で ABC 現象が誘導されると知られている低投与量（0.1mg Hb/kg）及び HbV の臨床推奨量である高投与量（1400 mg
Hb/kg）を静脈内投与し，初回投与７日後に再び同じ投与量の125
I-HbV を投与したところ，低投与量（0.1 mg Hb/kg）時では，２回目に投与した 125 I-HbV が速やかに血漿中から消失した．この時，CL は著しく増大し，ABC 現象の誘導が確認された（Fig. 5A）
（CL; 3.69 ± 0.4 and 22.3 ± 8.1 mL/hr, p<0.001, forthe first and second injections, respectively）．一方，高投与量（1400 mg Hb/kg）時は，２回目に投与した 125I-HbV の血中 CLの増大は確認されず，ABC 現象は誘導されなかった（Fig. 5B）（CL; 0.12 ± 0.04 and 0.14 ± 0.05 mL/hr, not significantly, forthe first and second injections, respectively）
ABC 現象の誘導には，クッパー細胞による取り込み量の増大が観察されることが報告されていることから 25），肝臓への分布を投与後 72 時間まで追跡した．その結果，低投与量（0.1mg Hb/kg）群の場合，初回投与時は，投与後３分で投与量の10 ％ 程度が分布したのに対し，２回目投与時では投与量の50 ％ 以上が分布していた．この変化は，CLuptake にも有意な差として反映された（CLuptake ; 3.5 ± 0.4 and 29.6 ± 18 mL/hr,
p<0.01, for the first and the second injection, respectively）．

174

対称的に，高投与量（1400 mg Hb/kg）時では，CLuptake のわ
ずかな増大が確認されたものの，低投与量（0.1 mg Hb/kg）
時のような有意な変化は確認されなかった（CL uptake ; 0.26 ±0.04 and 0.37 ± 0.03 mL/hr, p<0.05, for the first and thesecond injection, respectively）．
これまでの報告によると，ABC 現象の誘導には初回投与に呼応して脾臓から分泌された IgM 抗体が２回目投与された
PEG 修飾リポソームに結合する結果，クッパー細胞に認識され易くなり，取り込み量の増加と，それに伴う血中滞留性の減少
といった一連のメカニズムが提唱されている 26）．そこで，HbV

Fig. 5. Plasma concentration curve of 125 I-HbV after the first injection（open circle）or the second injection（closed circle）of 125I-HbV tomice at a dose of 0.1 mg Hb/kg（A）or 1400 mg Hb/kg（B）. MaleddY mice received a single injection of a non-labeled HbVsuspension or 125I-HbV to the tail vein at a dose of 0.1 or 1400 mg
Hb/kg. Seven days after the first injection of the non-labeled HbVsuspension, the same ddY mice received the 125I-HbV suspension
to the tail vein. Blood was collected from the inferior vena cava
under ether anesthesia, and plasma was obtained. Each point
represents the mean ± SD（n=3-6）. C, Determination of IgMagainst HbV after a single intravenous injection of saline（graybars）, HbV at a dose of 0.1 mg Hb/kg（open bars）or 1400 mg
Hb/kg（closed bars）in mice. D, Determination of the specificrecognition site of IgM against HbV after a single intravenous
injection of HbV at a dose of 0.1 mg Hb/kg（open bars）or 1400
mg Hb/kg（closed bars）in mice. DdY mice were injected withsaline or HbV（0.1 or 1400 mg Hb/kg）to the tail vein. At 7 day
after injection of saline or HbV, blood was collected from theinferior vena cava, and plasma was obtained. IgM against HbVand each lipid component were detected with ELISA. Each bar
represents the mean ± SD（n=4）.

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

低投与量（0.1 mg Hb/kg）及び高投与量（1400 mg Hb/kg）
時において抗 HbV IgM 産生に関する検討を行ったところ，興味深いことに ABC 現象の誘導されなかった高投与量（1400mg Hb/kg）時においても，抗 HbV IgM の産生が確認された（Fig. 5C）．さらに，抗 HbV IgM の認識部位を特定するために
HbV の脂質膜構成成分別に検討を行ったところ，1,2-distearoylsn-glycero-3-phosphatidylethanolamine-N-PEG（DSPE-PEG）にのみ特異的に結合することが判明した（Fig. 5D），この結果
は Ishida らの PEG 修飾空リポソームにおける報告とよく一致した 27）．つまり，高投与量（1400 mg Hb/kg）時において，抗HbV IgM の産生が確認されたにも関わらず，ABC 現象が誘導されなかった現象は，クッパー細胞による HbV の取り込み過程に飽和が生じたためと推察される．事実，上述したように，
HbV の高投与量時には肝臓における取り込み過程に飽和が確認されている 18）．
以上の結果から，臨床想定される高投与量（1400 mg Hb/kg）
条件下では，頻回投与による ABC 現象は見掛け上誘導されず，薬理効果への影響は少ないものと考えられるが，安全な投与設計を確立するためには，今後，様々な病態で同様の検討を行い，データを構築していく必要がある．

5 出血性ショックモデルラットにおける HbV の体内動態解析 28）
現在上市されているリポソーム医薬の Amphotericin B 内封
リポソーム製剤は健常人と病態患者によって体内動態が異なることが報告されている 15，16）．このことは，同じリポソーム製剤
である HbV 投与時においても健常時と病態時（大量出血時）
で体内動態特性が異なる可能性が推察される．そこで，大量出血時（40 ％ 脱血）に誘発される出血性ショックモデルラット
において HbV の体内動態実験を行った．
まず初めに，出血性ショックモデルラットに 125I-HbV を 1400
mg Hb/kg で投与後の血漿中濃度の変化を検討した．その結果，健常時に比べ出血性ショック時において投与初期から急激な血漿中濃度の低下が確認された（Fig. 6）．血漿中濃度推移曲線より各速度論パラメータを算出したところ，健常群と比較すると出血性ショック群では t1/2 が約 2/3 倍に減少し（30.6 ± 4.0 and
18.1 ± 3.7 hr, p<0.01, for normal and hemorrhagic shock,respectively），それに伴って，CL の有意な増加（0.47 ± 0.04
and 0.80 ± 0.08 mL/hr, p<0.01, for normal and hemorrhagic
shock, respectively）が確認された．興味深いことに，初期血漿中濃度及び中枢コンパートメントの分布容積は両群間で同じ値を示したが，末梢コンパートメントの分布容積（V2）は出血性ショック群で約２倍に増加した．また，中枢と末梢のコンパートメント間の移行性を示す k12 /k21 の値は健常群では約 0.6 であるのに対して，出血性ショック時では約 1.2 であり１より大きくなっていた．これら V2 や k12 /k21 値の増大より，出血性ショ
ック時には組織への移行性が亢進していることが強く示唆された．そこで，次に HbV の各臓器（腎臓，肝臓，脾臓，肺，心臓）への経時的な分布推移について検討したところ，健常群にARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

比べ，出血性ショック群の方が，投与初期から臓器分布が亢進していた．これらの結果より，出血性ショック時において，HbV は臓器により多く移行することが確認された．また，出血性ショック群における 125 I-HbV 投与時の糞中及び尿中排泄量の経時的な推移は，健常群と同様に主に尿中へ排泄され，糞中への排泄はほとんど確認されず，排泄量においても両群間で有意な違いが認められなかった．
これらの結果から，出血性ショック時には HbV の血中滞留
性が短縮し，臨床有用性の低下が懸念されたが，この HbV の血中滞留性の短縮は，血中から臓器への移行性増大に伴う血漿中濃度の低下によるものと推察された．つまり，出血性ショッ
ク時においては，臓器中への HbV の移行性が増大することにより，臓器中の低酸素状態を改善している可能性が示唆された．
ところで，大量出血の患者に対しては，目標 Hb 値まで上昇させるために濃厚赤血球製剤の頻回投与（約１時間間隔）を行っているため，HbV が現行の輸血代替として機能することを想定した場合，同一患者への頻回投与が十分に想定される．上述したようにリポソーム製剤の頻回投与には ABC 現象の誘導が懸念される．そこで次に，出血性ショックモデルラットを用いて HbV を連続投与した場合の体内動態を検討した．
出血性ショックモデルラットに非標識 HbV を 1400 mg Hb/kg
で投与し，１時間後に再び同量の 125 I-HbV（1400 mg Hb/kg）を投与した．その結果，出血性ショックモデルラットへ単回投与した時に比べ２回目投与した時の方が明らかな血中滞留性の向上が確認された（Fig. 6）．また，各速度論パラメータを算出したところ，出血性ショックモデルラットへ単回投与した時には２回目投与した時より，t1/2 は約２倍に増加した（18.1 ± 3.7
and 32.4 ± 1.1 hr, p<0.01, for one-injection group and twoinjection group, respectively）．興味深いことに，この出血性ショックモデルラットへ２回目投与した際の血漿中濃度推移とFig. 6. Relative plasma concentration of 125I-HbV after administration of
1400 mg Hb/kg via injection of normal, one-injection group or
two-injection rats. Each point represents the mean ± SD（n=5）.
＊< 0.05 or ＊＊<0.01 vs. normal rats.

175速度論パラメータは，健常ラット群の結果とよく類似していた．
そこでこのことを確かめるために，出血性ショックモデルラッ
トに単回及び２回目投与時における各臓器（腎臓，肝臓，脾臓，肺，心臓）への経時的な分布推移を検討した．その結果，単回投与時に比べ，２回目投与時では投与後 12 時間まで臓器分布の減少が確認されたが，12 時間を過ぎると，２回目投与した時の臓器分布が亢進していた．また，尿中及び糞中への排泄挙動を検討したところ，単回及び２回目投与した時では，125 I-HbVの排泄経路に変化は確認されなかったが，半減期の延長に伴い，２回目投与した時において排泄の遅延が観察された．加えて，出血性ショックモデルラットに非標識 HbV を 1400 mg Hb/kg
で投与し，１時間後における抗 HbV IgM の産生を調べたとこ
ろ，その存在は観察されなかった．
従って，出血性ショック時に現行の濃厚赤血球と同様にHbV を１時間間隔で連続投与しても，抗 HbV IgM は産生されず，ABC 現象は誘導されないことが確認された．興味深いことに，出血性ショック時の初回投与時に観察された血中滞留性の低下は２回目投与時には回復しており，また，初回投与時に比べて，２回目投与時では臓器へ持続的に分布し，排泄は遅延していた．このことから，出血性ショック時に HbV を２回目投与すると，初回投与による MPS による取り込みの飽和により，HbV は血中に長時間滞留することで，臓器への酸素供給を持続的に行う可能性が示唆された．

6

アニマルスケールアップ 28）

HbV の臨床試験を想定した際，ヒトにおける HbV の半減期の予測，いわゆるアニマルスケールアップは，投与設計を行う上で非常に有用である．そこで，上述したマウス・ラットの結果と Sou らによる 99mTc-HMPAO 内封 HbV を用いたウサギにおける HbV の体内動態結果 29）を用いて，アロメトリック式（P =α・ Wβ P; pharmacokinetic parameters, W; body weight,α;coefficient, β; exponent）を作成し，ヒトに HbV を 1400
mgHb/kg で投与した場合の HbV の半減期の予測を試みた（Fig. 7）．
その結果，ヒトにおける半減期は約 96 時間であると予測された．他のリポソーム製剤であるドキソルビシン封入リポソー
ムの場合，ラットにおける半減期は 35 時間であるのに対して，
ヒトにおいては 56-90 時間であった．また，経験的にリポソー
ムのヒトにおける半減期はラットの約２-３倍であると言われており，今回の我々の結果ともよく対応していた 30）．従って，今回の検討と過去の報告を総合的に解釈すると，ヒトにおける
HbV の半減期は約３-４日ではないかと予測される．

おわりに冒頭で述べたように，古くから前臨床試験段階における薬物動態試験の重要性が言われている．これは，薬物動態試験が，ただ単なる薬物の ADME を把握するだけでなく，薬効や副作用を予測するのに役立つからである．2008 年，JAMA 誌に報告された，非細胞型 HBOCs 投与群の死亡率および心筋梗塞発

176Fig. 7. Allometric relationships between body weight and body weightand clearance（CL）. The linear regression of the logarithmicvalues was calculated using the least-squares method（y=1.466x0.764,
r2=0.984）. The extrapolated human values based on a body weightof 70 kg（open circle）are also shown. a Data from reference for
Rabbit, and we calculated the human CL using ke, which is fromSou et al.11）, and our estimated V1 .

症率が対照群に比べ高いことや 12），PFC が，１年以上にわたる臓器蓄積（特に肺）により副作用が確認されたことは 14），体内動態試験を初め，その他の試験から総合的に判断することで十分に予想できたのではないかと感じる．これらの教訓を生かし，
薬物動態試験を含め，様々な前臨床試験結果を基に，HbV の安全性及び有効性を総合的に判断し，日本だけで開発が進められている細胞型 HBOCs の一つである HbV の臨床使用に向けた最終試験を進めていく必要性があるだろう．

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トピックス

リポソームヘモグロビン投与下の心筋灌流
Application of Liposome-encapsulated Hemoglobin to
Myocardial Perfusion
松本 健志
Takeshi Matsumoto

和文抄録
心筋血流は各心筋領域の酸素需要に見合った空間的な不均一性を示し，そのパターン変化は微小心筋障害の発生に深く関与する．本邦で開発の進むリポソーム・ヘモグロビン（LEH）の投与が心筋局所灌流に及ぼす影響について，インビボおよび交叉灌流実験によって評価した．約半分の血液を LEH 溶液（LEH 体積率，17 〜 18 ％）と交換すると，左室心筋内の灌流分布不均一性の低下，循環血液の見かけの粘性低下により，冠動脈および頸動脈において 70 ％の血流増加が認められた．一方，血圧，左室発生圧，心拍動数，および血管トーヌスは概ね維持された．さらに，解剖学データに基づく冠動
脈分岐モデルを作成し，これに Fa°hraeus-Lindqvist 効果，Fa°hraeus 効果，および phase separation 効果を考慮して，LEH
灌流下の心筋酸素分配の数値解析を行った．交換輸血に伴う低ヘマトクリット化は赤血球分配の偏向性を強め，赤血球依存性の酸素分配の偏りは増大するが，プラズマ中の LEH がこれを代償し，心筋酸素分配は交換前とほぼ同様であることが示された．
Abstract
Regional myocardial blood flows match the oxygen demands in the corresponding regions, which are not spatially uniform.
Thus, myocardial blood flow distribution is heterogeneous and its alteration will be involved in the occurrence of myocardial
microinfarction. The effect of liposome-encapsulated hemoglobin（LEH）transfusion on regional myocardial perfusion was
evaluated by in vivo and cross-circulated rat heart experiments. Myocardial flow distribution in the left ventricular free wallmeasured by tracer digital radiography was lowered when half the amount of blood was replaced with LEH solution（17 〜 18 ％v/v）
. Coronary and carotid flows increased by 70 ％, which is likely to be explained by the reduction of apparent flow viscosity.
Arterial pressure, left ventricular developed pressure, and heart rate remained unchanged and coronary tone was fairly
preserved. In addition, a mathematical model based on the coronary arterial anatomy, including the Fa°hraeus-Lindqvist,
Fa°hraeus, and phase separation effects, showed that the LEH transfusion may compensate for an enhanced bias in erythrocyteassociated O2 flux under hemodilution and is expected to be beneficial for maintaining local O2 deliveries.
Keywords
liposome-encapsulated hemoglobin, regional myocardial perfusion, spatial heterogeneity, tracer digital radiography,
blood rheology, local oxygen delivery, mathematical model

１．はじめにリポソームにヘモグロビンを封入した人工赤血球（LEH）は，血液製剤の持つウィルス感染や免疫反応のリスク減少，さらに献血人口低下に伴う輸血用血液不足の克服を目的に，本邦で開発が進められている．血液型を問わず輸血が可能であるため，救急輸血にも適し，保存期間も血液より長い．本来の赤血球と類似した酸素結合・解離特性を持つことから，パーフルオロケ
ミカルなどと比較して理想的であるといえる 1-3）．その第一義的大阪大学 基礎工学研究科 生体工学領域 〒 560-8531 大阪府豊中市待兼山町 1-3 Bioengineering Division, Osaka University Graduate Schoolof Engineering Science, Machikaneyama-machi 1-3, Toyonaka 560-8531, Japan
論文受付 2009 年９月 24 日 論文受理 2009 年 11 月 10 日

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009179

役割は，大量出血による血圧減少と酸素供給不足を回避するための輸血用代替血液としての役割であり，その効果や安全性も確認されている 4-7）．一方，LEH の球径は 200 〜 300nm 程度であり，赤血球では変形しないと通過できないような毛細血管も容易に通過できることから，微小循環改善を目的とした利用価値にも注目が置かれている．実際に脳，心臓などの梗塞部位に対する LEH の保護的，治療的効果が確認されている 8-10）．
しかし，扁平で変形し易い赤血球とは大きさもレオロジーも異なる LEH が，臓器内の局所灌流にどの様な影響をもたらすのか不明な点も多い．微小血管分岐において，赤血球は必ずしも血流に比例して分配されるわけではなく，血流の高いほうにより多く分配される傾向がある 11，12）．血液と LEH が混和した時のヘマトクリットの低下や血流粘性変化，また，血管トーヌスの変動によって血管分岐部の血流分配は変化し，異なる血液/
酸素供給分布のパターンが形成される可能性がある．元来，心筋の酸素需要は空間的に一様ではなく，通常，心筋灌流も酸素需要に見合った空間的不均一性を示しているが 13，14），LEH 投与
による局所的な酸素需給バランスの変化は微小心筋障害の一因にもなり得る．心筋内血流分布が LEH 投与によってどう変化
し，その結果，局所酸素供給がどの様な影響を受けるのか，興味深いところである．
本稿では，著しい血流不均一性を示し，心機能不全発症において微小循環障害が重要視される心筋に注目し，我々が開発した計測手法により明らかにした LEH 投与の局所心筋灌流への影響，さらに，その酸素分配促進効果に対するモデル論的アプ
ローチを紹介する．

２．心筋灌流ラジオグラフィーによる心筋内血流分布計測
血流が赤血球を含む混相流としてその特徴を表すのは，赤血球軸集中に起因する Fa°hraeus 効果，Fa°hraeus-Lindqvist 効果，および血管分岐部における phase separation 効果が顕著に認められる微小循環レベルである（付録参照）．また，心筋血流調節の主座も小動脈血管より小さな直径数百ミクロンに満たない末梢の細動脈血管にあることから 15），LEH の局所心筋灌流への影響を評価するには，マイクロスフェア法を凌ぐ非常に高い空間分解能での血流分布計測が必要になる．解剖学的には１本の終端細動脈によって灌流される毛細血管床，機能的には，例えば，NADH 蛍光計測で示されるまだら領域（酸素需要＞酸素供給の領域）が心筋循環単位 16）と考えられ（図１），その大きさ数百ミクロンレベルでの局所血流評価が望まれる．我々はトレーサ・デジタルラジオグラフィ 17，18）を用いて，血液 50 ％を同量の人工血液と置換（交換輸血）したラット心筋スライス内の血流分布イメージをコントロールのそれと比較した（図２）19）．
ここで，イメージは相対的な分布を 256 階調で示しており，平
均血流はグレー値 128 に標準化されている．明らかに交換輸血
によって不均一性は減少し，局所血流の変動係数（標準偏差／平均）はコントロールの 50 ％に対し，38 ％であった．使用した人工血液は，テルモ製の LEH（Neo Red Cell）を含む生理食塩水にアルブミン（5g/dl）を加え，NaOH 添加で pH を 7.4 に180

調整したもので，LEH の体積率は 17 〜 18 ％，LEH のヘモグロ
ビン含有率は同体積のラット赤血球の 2/3 程度である．混和後の LEH 体積率は８％，ヘマトクリットは 23 ％であった．また，
頸動脈血流は 70 ％増加した．混和血液の粘性は血液より 40 ％低下していることから，頸動脈血流の増加はこの粘性低下によるところが大きく，末梢血管抵抗（血管トーヌス）にはほとん
ど変化の無かったことが示唆される．なお，血圧，心拍数は交換輸血前後で変化はなく，LEH の血管外への漏出は認められなかった．

Fig. 1. Anatomical and functional units of myocardial perfusion. Top,
arteriolar and venular microvasular beds; bottom, NADH
fluorescence pattern appeared on the left ventricular surface
under hypoxic perfusion.

Fig. 2. Top: myocardial flow images of control and NRC-transfused invivo hearts resolved into 64 × 64 pixels of 100 × 100μm2, shaded
proportionately with flows normalized by respective means.
Bottom: the coefficient of variations of flows（CV（mean ± SD））
within outer and inner layers in control and LEH-transfusedhearts. ＊ p<0.05 vs. control.

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交換輸血による血流不均一性の低下のメカニズムは明らかではないが，一因としてヘマトクリット低下と流速増加の相効果による赤血球凝集頻度，凝集塊の大きさの低下が考えられる20，21）．
赤血球は低流速，高ヘマトクリットで凝集し易く，赤血球凝集
はさらに血流抵抗の増加や一過性の血管閉塞による機能的血管数の減少をもたらして血流低下にはたらき，局所血流の不均一性を増加させる要因となる．交換輸血によって低流量域で赤血球凝集が抑制され，高血流域と低血流域の血管閉塞頻度の差が減少すれば血流不均一性は低下する．さらに，血管内皮上のグ
ライコカリクスも関与している可能性がある 22-24）．グライコカ
リクス層の厚さは特に低流速域でずり速度依存性が高いために，流速増加に伴うグライコカリクス層の薄化，すなわち血流抵抗の低下は低流量域においてより顕著となり，やはり血流不均一性の低下に働く．
インビボ実験による検討に加え，交叉灌流モデルの摘出心における冠灌流量および動静脈血の酸素飽和度を計測した結果，50 ％の交換輸血前後の心筋酸素摂取率はともに 20 ％で変化はなく，交換輸血後の血中ヘモグロビン濃度の減少にもかかわらず，灌流量増加によって心筋への酸素供給量は交換輸血前より若干増加し，心収縮期圧も数％の増加を示した 25）．図３には，交換輸血前後の冠血流量と 30 秒間の冠血流遮断後の再灌流時に見られる一過性の冠血流増加（反応性充血）を示す．冠血流量はインビボ実験の頸動脈血流と同程度に増加し，交換輸血後の反応性充血では交換前と同程度の冠血流増加率が見られた．
このことは，冠血管トーヌスが交換輸血後もほぼ維持されていることを示唆しており，人工血液存在下の高い血液循環量は低粘性によるもので，メカニカルストレスや代謝依存性の末梢血管の径変化によるものではないことを意味している．

Fig. 3. Coronary perfusion rates（mean ± SD）at baseline and at the peakduring reactive hyperemia following 30-sec flow interruption
before（control）and after LEH coperfusion in cross-circulatedhearts. ＊ p<0.05 vs. control.

３．冠動脈ネットワークモデルによる酸素供給分布解析
図２に示した血流分布の不均一性は赤血球分配，あるいは酸
素供給の不均一性とは一致しない．微小血管分岐におけるphase separation（赤血球の偏向分配）やプラズマスキミング（図４）によって，赤血球の運搬による酸素供給の不均一性は
血流不均一性を上回ると考えられるが，LEH はこれを緩和す

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

Fig. 4. Facilitated tissue oxygenation by liposome-encapsulated
hemoglobin flowing through a small vessel branching off a large
parent vessel.

Fig. 5. Coronary arterial tree models originating from the vessel of order
8 down to vessels of order 1, constructed on the basis of
anatomical statistics. Regional flows and O2 fluxes were resampledby aggregating original nearby regions. Branching angles were
not addressed in this study.

ることが容易に予想できる．より詳細な検討を行うために，冠血管解剖データに基づく動脈ネットワークモデルを構築し，酸素供給シミュレーションを行った 26）．
使用した冠動脈統計データは，ブタ左前下行枝の抵抗血管に相当する 27）．この統計データに従って，直径 400 〜 500μm ほどの小動脈（order 8）の入口から分岐部までの長さ，分岐後の２本の daughter vessel の直径，長さを確率的に決定し，これを毛細血管直前の最小細動脈（order 1）まで繰り返してモデルを作成した（図５）．血流はポアズイユ流れとし，各分岐部
で血流の連続性を仮定して全血管内の流れを求めた．但し，各血管 i における粘性ηi は非ニュートン性（Fa°hraeus-Lindqvist
effect）を考慮し，ヘマトクリットと血管径に依存するとした 28）．
2ci
Di
（1−Hd i ） −1
ci
（1−0.45） −1 Di −1.1

ηi ＝ηplasma 1＋（η'0.45 −1 ）

Ci ＝

1
−11

1＋10

Di

−0.085Di

η'0.45 ＝6e

12

＋ −1＋

1
−11

1＋10

D

−0.06Di12 （i−0.075Di

0.8 ＋ eDi2

Di −1.1

）

（１）

0.645

＋3.2−2.44e

ここで，ηplasma はプラズマ粘性，Hdi は流出ヘマトクリット，Diは血管径（μm）である．

181

血管分岐部において，parent vessel i の直径を Di，daughter
vessel j，k の直径を各々 Dj，Dk としたとき，赤血球分配比をPries らが提案している以下の実験式で決定した 28）．
logit

Eij
Ei

＝A＋B・logit
2

A＝13.29

Dj

2

Dj

2

（Qj Qi ）−X 0

l−2X 0Dk −1

l−Hd i

2

Di

Dk ＋1

（２）

B＝1＋6.98（1−Hd i ）Di
X 0 ＝ 0.694（1−Hd i ）Di

ここで，Qi は parent vessel i 内の流量，Qj は daughter vessel j
内の流量，E（=Hdii･Qi）は parent vessel i からの赤血球流出量，
E ij は daughter vessel j への赤血球流入量，また，logit（ x）=
ln［x/（1-x）］である．流出ヘマトクリットとチューブヘマトク
リット（Hti）は以下の実験式（Fa°hraeus effect）で関係づけた 28）．
Hti
Hdi

＝Hd i ＋
（1−Hd i（
）1＋1.7e−0.415Di−0.6e−0.011Di ）（３）

LEH は血漿中に均一に分布すると仮定して，血管 l による酸素供給量を以下の式で決定した．
Oxyl ＝C Hb Q［（1−Hd l ）］l λRBC Hd l ＋λLEH VfLEH（４）

ここで，CHb（1.34mL-O 2/g-Hb）はヘモグロビンの最大酸素運
搬量，λRBC，λLEH は各々，動脈血中の酸素化され赤血球ヘモグ
ロビンおよび LEH のヘモグロビン濃度で，動脈血酸素分圧
100torr では各々，0.174，0.279g-Hb/mL に設定した．また，
VfLEH は血漿中の LEH 体積率である．血漿への酸素溶存は無視
している．
入口動脈圧（order 8）を 100mmHg，出口動脈圧（order 1）
を 30mmHg として，入口動脈内のチューブヘマトクリット
Htinlet=0.4，VfLEH=0，ηplasma=1.2cP の場合，Htinlet=0.2，VfLEH=0.25，
ηp l a s m a = 1 . 4 c P の 場 合 （ L E H と の 5 0 ％ 置 換 ）， H t i n l e t = 0 . 2 ，
VfLEH=0.0，ηplasma=1.2cP の場合（血漿増補液（PVE）との 50 ％置換）について計算を行った．なお，平均的な灌流パターンへの影響が小さいと報告されている血圧，心筋の拍動性は考慮していない 29）．
統計確率的に作成した５つの動脈ネットワークモデルにおける平均をみると，LEH 置換では 37 ％の全灌流量の上昇に応じて酸素供給量は 11 ％上昇したが，PVE 置換では全灌流量は60 ％上昇するものの，酸素供給量は 20 ％低下した．一つのモデルに対する局所血流および局所酸素供給量のヒストグラムを図６に示す．各局所量は平均値で標準化されている（本モデルで求めた局所血流分布について，LEH，PVE 置換の違いは式（１）のηplasma のみであり，標準化された局所血流分布について両者は等しくなる）．ここで局所心筋サイズは図５に示すように，全てのモデルで 2 11 個のサンプル数になるようにリサンプ

182

Fig. 6. Effects of 50 ％ exchange transfusion on the frequency
distributions of relative flow（top）, and relative O2 flux with LEH
or PVE（middle and bottom, respectively）.

リングした（５つのモデルの order 1 血管の総数 N は 4011 ±187（3817-4294）であり，ほぼ２本の order 1 血管が一つのサンプルを灌流している（N/2 〜 211））．局所血流については絶対量は異なるものの，ラットの実験で認められたような交換輸血による血流不均一性の減少は再現できず，置換による影響はほとんど現れなかった．ここでは血球の凝集や血管塞栓，血管内皮グライコカリクスなどの効果は考慮されておらず，これらは血流配分において重要な要素であることが示唆される．
一方，酸素供給分布については，其々の置換は特に低灌流領域において異なる結果を示した．局所酸素供給が 0.4 以下の領域（グレーで示した部分）に注目すると，LEH 置換ではほとんど変化が見られなかったものの，PVE 置換ではこれら低灌流領域数は増加した．すなわち，PVE 置換では全酸素供給量の低下に加えて，他の領域より相対的に大きく酸素供給が減少する領域が現れ，local hypoxia の発生が予想される．これに対し，LEH 置換は相対的な分布を維持しながらも，絶対的な酸素供給量をも増加させた．さらに詳細にこの違いを検討した結人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

果を図７に示す．置換前の標準化された局所酸素供給量を５クラスに分け，置換後の各クラスに属する領域数の増加率を５つのモデルの平均で示している．<0.4 の低酸素供給の領域数は，PVE 置換では LEH 置換に比べて３倍近くの増加率を示し，
LEH の酸素運搬体としての効用がこの領域で特に高いことがわかる．平均酸素供給量付近では，LEH 置換による領域数の減少は，PVE 置換の場合の約半数に抑えられている．

Fig. 7. Percentage（mean ± SD）changes in the proportions of regions
due to 50 ％ exchange transfusion with LEH or PVE. Regions areclassified into five divisions according to their relative O2 fluxes（<0.4, 0.4-0.8, 0.8-1.2, 1.2-1.6, and >1.6）.

ヘマトクリットの減少は血流粘性低下による灌流量上昇に働く一方で，式（２）に従って血管分岐部における赤血球の偏向
分配の傾向を増加させる．赤血球によって運搬される酸素は高血流方向に偏り，PVE 置換では酸素供給分布のばらつきの増加に働く．これに対し，LEH 置換ではプラズマ中の LEH によって運ばれる酸素が，赤血球の偏向流れによる酸素供給の不均一増大効果を代償する．その代償効果はヘマトクリットが低い
循環領域ほど，すなわち，低灌流領域ほど大きい．

４．おわりに
ここでは，LEH の心筋灌流への影響について局所的な血流/酸素分配に着目し，インビボおよび交叉灌流実験による検討，
さらに数学モデルによるアプローチを紹介した．これらの結果
は Neo Red Cell（テルモ）のデータに基づくものであるが，他のサブ・マイクロカプセル型や非カプセル型の人工赤血球でも同様の結論が得られると思われる．人工赤血球による交換輸血
は，血圧・心機能の維持に加え，心筋灌流を一様化し，また，
冠血管トーヌス（冠予備能）の維持にも有効であった．ヘマト
クリットの低下によって赤血球依存性の酸素供給の偏りは増大
するが，プラズマ中の人工赤血球はこれを代償し，正常ヘマト
クリット時と同等の局所酸素需給のバランスが保たれ，心機能の維持に寄与している可能性が窺われた．
数学モデルでは考慮しなかった心拍動は，微小血管床の平均的な血流分布に関する限り，その影響は小さいと報告されている．しかし，心筋メカニカルストレスに起因する冠スロッシュ

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

現象 30）は，他臓器には見られない冠循環の特徴であり，血液粘性の減少はこれをより強調することが予想される（図８）．今回の実験では確認されなかったものの，この血流の揺り戻し効
果により，心内膜側から心外膜側への血流シフトが増大すれば，
易虚血性の心内膜側には悪影響を与えかねない 31）．流れ依存性の赤血球の凝集や離散も含め，これらが血流不均一性や局所酸素供給に与える影響について，血液との交換率，人工赤血球の循環時間を考慮した詳細な検討も今後の課題である．

Fig. 8. Coronary slosh phenomenon, produced through cardiac
mechanical stress exerted on intramyocardial vessels.

付録：微小循環における赤血球
血管半径方向のずり速度の違いによって，赤血球は流れの速い中心軸方向に移動し，流れの遅い血管壁近傍には赤血球が排除された数ミクロンの血漿層が形成される．その結果，赤血球は血漿に比べて血管内を速く通過し，血管から流出する血液のヘマトクリット（流出ヘマトクリット，Hd）に比べて血管内のヘマトクリット（チューブヘマトクリット，Ht）は小さくなる．この現象は Fa°hraeus 効果と呼ばれ，直径数百ミクロン以下の小動脈で現れ始め，赤血球と血漿との流速差が最大となる
微小細動脈で最も顕著になる．さらに血管径が小さくなると，
赤血球の流れは多層流から単層流へと変化するため，赤血球と血漿との流速差は減少し，その効果は弱まる（実験式（３））．
また，チューブヘマトクリットの低下によって血液の見かけの粘性は減少するが，これは Fa°hraeus-Lindqvist 効果として知られている．一方，血管分岐部では，赤血球の軸集中によって分岐血管に流れ込む血漿層の体積率が低血流側で高くなる phaseseparation が発生し，その結果，高血流側の分岐血管に比べて低血流側の分岐血管のヘマトクリットが低くなる（赤血球の偏向分配）．この現象は血管分岐部を経るごとに末梢に至るまで繰り返され，血流分配の不均一性を上回る赤血球配分，すなわ
ち酸素供給の不均一分布が形成されることになる．Pries ら 28）
によって与えられた Fa°hraeus-Lindqvist 効果の実験式（１）から求まる血液粘性のプラズマ粘性に対する相対値（η/ηplasma）と血管径の関係，および phase separation 効果の実験式（２）から求まる赤血球分配比と血流分配比の関係を図 A に示す．

183

Fig. A. Left: Fa°hraeus-Lindqvist effect（equation（1））. Apparent blood
viscosity divided by plasma viscosity（relative apparent viscosity）
versus tube diameter is shown. Right: phase separation at a
microvascular bifurcation（equation（2））. The relation between
fractional erythrocyte flow and fractional blood flow into the two
daughter vessels is shown for D i =D j =50μm, D k =20μm, and
Hdi=0.1, indicating that the hematocrit in the daughter vessels
differs from that in the feeding vessel.

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subendocardial flow? Am J Physiol Heart Circ Physiol
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185

●事務局たより

日本血液代替物学会
１． 日 時 ：平成21年10月17日（土）13：40〜14：00

総会

３． 議 題 ：報告事項

２． 場 所 ：慶應義塾大学信濃町キャンパス 北里講堂
〒108-8582 東京都新宿区信濃町35

以下審議内容を略記します。
報告事項①年次大会の開催状況として下記事項が報告された。
1）第16回日本血液代替物学会年次大会
2）平成21年10月16日（金）・17日（土）3）東京都新宿区信濃町35慶應義塾大学信濃町キャンパス
北里講堂
4）日本血液代替物学会会員、臨床医学・理工学研究者、国内の大学および医療機関臨床医、
血液センター関係者の参加があった。
②会員状況は以下のとおり。
1）維持会員：４社2）賛助会員：２社
3）正会員：142名
4）購読会員：19箇所③各種委員会からの報告は以下のとおり。
＊編集委員会
会誌「人工血液」の発行。
・平成20年度：第15巻3-4号、第16巻1号、2号、3号、4号発行。
・平成21年度：第17巻1号、2号、3号発行。第17巻4号発行予定。
＊ホームページ委員会
学会ホームページURL： http://www.blood-sub.jp/④平成20年度事業報告（平成20年 4 月 1 日〜平成21年 3 月31日）
が行われ各々承認された。
1）定期総会の開催
平成20年10月23日（木）ス北里講堂にて開催。

186① 第16回年次大会の報告② 会員動向
③ 委員会報告④ 平成20年度事業報告⑤ 平成20年度収支決算⑥ 平成21年度事業（実績報告）⑦ その他

2）第15回年次大会 （大会長 堀之内 宏久）
平成20年10月23日（木）慶應義塾大学信濃町キャンパス北里講堂にて行われた。
3）「人工血液をつくる（9）」後援⑤平成20年度収支決算報告が行われ承認された。
平成20年度 会計（自 平成20年４月１日

収摘
要
前 期 繰 越 金
正 会 員 会 費
入会
金
賛助会員会費
維持会員会費
購読会員会費
雑
収
入
利
息

入
金
額
12,648,432
510,000
15,0008,000,000
200,000
54,000263,490
47,212

計

21,738,134

収支決算表

至 平成21年３月31日）

支
出
金
額
摘
要
4,495,892
会 誌 出 版 費629,490
集会・委員会費
2,000,000
年 会 補 助 金
ホームページ維持費
485,520
事 務 人 件 費3,000,525
事
務
費
335,451
人工血液をつくる（9）開催費助成
307,866
基金に繰り入れ2,500,000
次 期 繰 越 金
7,983,390
計
21,738,134⑥平成21年度事業（実績報告）
1）定期総会の開催
平成21年10月17日（土） 於 慶應義塾大学信濃町キャン
パス北里講堂2）第16回年次大会の開催（大会長 高折 益彦）
平成21年10月16日（金）・17日（土）於 慶應義塾大学信濃町キャンパス 北里講堂
3）「人工血液」の発行
現行役員は下記の通り。

慶應義塾大学信濃町キャンパ

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

●事務局たより
日本血液代替物学会 役員名簿
顧

問

尾形利郎
高久史麿
堀 原一
遠山 博

東海大学医学部 名誉教授
自治医科大学 学長
筑波大学 名誉教授
埼玉医科大学総合医療センター 名誉所長

会

長

小林紘一

慶應義塾大学 名誉教授

副会長

池田康夫

早稲田大学理工学術院 教授理東寛
北海道赤十字血液センター 研究部長
小田切優樹 崇城大学薬学部 教授
酒井宏水
早稲田大学理工学術院 准教授
末松 誠
慶應義塾大学医学部 医学部長
高折益彦
東宝塚さとう病院 名誉院長
武岡真司
早稲田大学理工学術院 教授

事土田英俊
早稲田大学理工学術院 名誉教授
西 勝英
肥後医育振興会 理事
半田 誠
慶應義塾大学医学部 教授
平澤博之
千葉大学 名誉教授
堀之内宏久 慶應義塾大学医学部 准教授
米川元樹
特定医療法人北楡会 理事長
監

事

清水 勝
阿岸鉄三

西城病院 理事
ふれあい町田ホスピタル
血液浄化センター センター長（事務局） 堀之内宏久 慶應義塾大学医学部 准教授（会誌担当）酒井宏水
早稲田大学理工学術院 客員准教授（HP担当） 藤島清太郎 慶應義塾大学医学部 講師

日本血液代替物学会 評議員名簿
青木
阿岸

克憲
鉄三

浅野 茂隆
東
寛
阿部喜代司
池田 久實
池田 康夫
池淵 研二
石原 弘規
伊藤 俊之
稲田 英一
大塚 節子
大柳 治正
尾形 利郎
小田切優樹
片岡 一則
川村 明夫
木下
学
黒澤 良和
小林 紘一
小室 勝利
斎藤 英彦
酒井 清孝
酒井 宏水
佐久間一郎
佐藤
誠
鮫島 達也
清水
勝
清水 慶彦
十字 猛夫
末松
平

誠
明

浜松医科大学 教授
ふれあい町田ホスピタル
血液浄化センター センター長
早稲田大学理工学術院 教授
北海道赤十字血液センター 研究部長
筑波大学 名誉教授
北海道赤十字血液センター 所長
早稲田大学理工学術院 教授
埼玉医科大学 教授
弘前大学医学部 准教授
京都赤十字血液センター
順天堂大学医学部 教授
岐阜大学医学部 講師
近畿大学医学部 教授
東海大学医学部 名誉教授
崇城大学薬学部 教授
東京大学大学院工学系研究科 教授
特定医療法人北楡会 会長
防衛医科大学校 准教授
藤田保健衛生大学総合医科学研究所 教授
慶應義塾大学 名誉教授
名古屋セントラル病院 院長
早稲田大学理工学術院 教授
早稲田大学理工学術院 客員准教授
カレスサッポロ北光記念クリニック 所長
ニプロファーマ（株）社長
青山学院大学理工学部 名誉教授
西城病院 理事
日本赤十字血液事業本部
中央血液研究所 前所長
慶應義塾大学医学部 医学部長
鹿児島大学医学部 名誉教授

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

高折 益彦
高久 史麿
高橋
晃
高橋 英嗣
高橋 恒夫
武岡 真司
田所 憲治
土田 英俊
遠山
博
友田
夫
豊田 忠之
仲井 邦彦
中井 一士
長澤 俊郎
中島 常隆
西
勝英
西出 宏之
西谷 孝子
半田
誠
平澤 博之
福島 昭二
藤井 寿一
藤島清太郎
船津 昭信
外 須美夫
堀
進悟
堀
原一
堀之内宏久
宮尾 秀樹
村田
満
湯浅 晋治
四津 良平
米川 元樹

東宝塚さとう病院 名誉院長
自治医科大学 学長
テルモ（株）代表取締役社長
山形大学医学部 准教授
東京大学医科学研究所 客員教授
早稲田大学理工学術院 教授
日本赤十字社血液事業本部
早稲田大学理工学術院 名誉教授
埼玉医科大学総合医療センター 名誉所長
東京医科大学 教授
東部地域病院 元院長
東北大学大学院医学研究科 准教授
血液製剤調査機構 元理事
筑波大学臨床医学系 教授（株）ベネシス 経営戦略部 担当部長
肥後医育振興会 理事
早稲田大学理工学術院 教授
ナノキャリア株式会社
慶應義塾大学医学部 教授
千葉大学 名誉教授
神戸学院大学薬学部製剤学 准教授
東京女子医科大学 教授
慶應義塾大学医学部 講師（財）化学及血清療法研究所 理事長
九州大学大学院医学研究院 教授
慶應義塾大学医学部 准教授
筑波大学 名誉教授
慶應義塾大学医学部 准教授
埼玉医科大学総合医療センター 教授
慶應義塾大学医学部 教授
順天堂大学 名誉教授
慶應義塾大学医学部 教授
特定医療法人北楡会 理事長（ア順敬称略）187

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190

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009Call for Papers
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in the text using superscript letters as follows: 2）, 3-5）, 1, 4-6）, etc.
References should be listed using the Vancouver style as follows:
Names of all authors. Title of paper. Title of journal. Year of
publication; volume number: inclusive page numbers.
Abbreviations of journal names should be in accordance with
Index Medicus. References to books should be given as follows:
Names of all authors. Title of paper. Name of editor（s）. Booktitle. Place of publication: Publisher, year; inclusive page
numbers.
References to electronic sources should be given as follows:

ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

Name of website.
Address on new line（month and year of last access）.
Examples:
１. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: a novel
oxygen carrier with platelet-like properties in a hemodiluted
setting. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 2007; 35:
481-489.
２. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM. Cell-freehemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial
infarction and death: a meta-analysis. J Am Med Assoc 2008;
299: 2304-2312.
３. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly. Characteristicsof Preparation Process and Performances or Artificial
Oxygen Carriers. In: Winslow RM, ed. Blood Substitutes.
London: Academic Press（Elsevier）, 2006; 514-522.
４. Oxygen Infusion Project, Waseda University, Japan.
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（ lastaccessed Sept 2008）13）In the case of citation or reproduction of previously
published figures or tables and other content, the permission of
the copyright holder（s）must first be obtained. Copyright in the
published papers shall belong to the Society.
14）Regarding secondary use and copyright in works publishedin the Journal, secondary use may be made of the Journal, in
whole or in part, via media such as CD-ROM or the Internet.
Reproduction rights, translation rights, film rights, dominion, andpublic transmission rights（including the right to make theworks transmittable）are transferred to the Society by theauthor's submission of the aforementioned Copyright Transfer
Agreement. This clause shall not restrict reuse by the author
himself/herself, but the Editor-in-Chief must be informed in theevent of reuse.
15）No publication fee is charged for publication in the Journal,
and the author（s）shall receive as a gift 30 offprints of theircontributions. Authors will be charged for copies in excess of
this number（approximately 100 yen per copy）. Authors wanting
prints of color photos or on art paper, etc. must pay the actual
cost of such prints.
16）Address for manuscripts to be sent:
Attn: Artificial Blood Editorial Office
The Society of Blood Substitutes, Japan
Division of General Thoracic Surgery, Department of Surgery,
Keio University, School of Medicine
35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo 160-8582, Japan
Tel: +81-3-5363-3493 Fax: +81-3-5363-3499
E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp193投稿規定（平成20年9月30日改訂）
本誌は，血液を構成するあらゆる成分について，その代替物を開発する研究に貢献する論文，関連する情報，学会会員のための会報，学会諸規定等を掲載するが，形式にはこだわらず創
意ある投稿を広く集める．本誌への投稿者は本学会会員であることが望ましいが，投稿を希望する者は誰でも投稿することが出来る．原稿掲載の採否は，査読結果に従って編集委員会が決定する．原著論文について，他誌に既発表あるいは投稿中の論文は掲載しない．
共著者がいる場合には，共著者全員の承諾を得てから投稿する．論文の版権は本学会に譲渡しなければならない．このため，
著者の代表者は，本誌に添付の著作権譲渡同意書（CopyrightTransfer Agreement）或は，本会のホームページサイト（http://www.blood-sub.jp/home/index.html）からダウンロードしたものに署名捺印の上，郵送，Fax，またはpdfファイル
としてE-mailにて編集委員会宛に提出する．
ワープロを用いて作製した原稿の投稿を原則とする．ただし，手書き原稿による投稿でも受け付ける．欧文による投稿を歓迎する．
１）原稿の種類は，「原著論文」，「総説」，「学会報告」，「トピックス」，「オピニオン」，「海外文献紹介」から選び，これを第１頁の右肩上に明記すること．これらに該当しない原稿も受け付ける．査読意見によっては種類が変更される場合がある．次のいずれかの方法により，送付状（任意のフォーマット）を添
えて編集委員長宛に投稿する．

者名，全著者所属，英文著者名，英文著者所属，続いて連絡の取れる著者（corresponding author）の住所，英文住所を記入する．手書き原稿の場合はＢ5版，1行20字，20行とする．
５）「原著論文」，「総説」，「トピックス」，「オピニオン」については，第2頁以降に和文抄録，Keywords（英文で6個程度）
を付け，最終頁または別紙に英文抄録を付けること．
６）投稿論文に記載の研究が公的助成を受けて実施された場合に は ， 謝 辞 に そ の 旨 を 記 載 す る こ と ． ま た ， Conflict ofInterests（例えば，論文に記載された薬品を販売する企業と著者との利害関係: 雇用，コンサルタント，研究助成，株式，特許など）があれば，これを第１頁の脚注，謝辞などに記載する
こと．
７）ヒトを対象とした研究結果，および動物実験の結果を掲載する場合には，各研究機関のガイドラインに従って実施したことを方法等に明記すること．
８）論文中の略語は初出の際に省略しないこと．薬品，医薬品，測定装置等は，外国語名の場合は言語のまま用い，日本語化しているものはカタカナとする．型式，販売（製造）元とその所在地も記入すること．
（例） Rhodamine B（Sigma-Aldrich, St. Louis, USA）
, ポリグラフシステム（LEG-1000; 日本光電工業, 東京）
９）句読点はコンマ（，）ピリオド（．）とする．

i）文章と図表の電子ファイルをE-メールで送付する（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．

10）文中の英語に使用するフォントは，Times, Helvetica,
Courier, Symbolを原則とし，英文半角小文字とする．ただし，文頭および固有名詞は大文字で書きはじめること．

ii）ハードコピー4部を郵送する．

11）数字はアラビア数字を使い，度量衡の単位はm, cm, mm, μm,
L, mL, μL, mol, g, mg, μg, ng, pg, fg, N／10などを用いる．

２）投稿論文の査読は，編集委員長が選んだ人工血液分野の研究者に依頼する．査読意見によっては，原稿の修正を求める場合がある．修正論文（Revised Manuscript）の投稿に際しては，送付状に「査読意見に対する回答」を添え，意見に対して一つ一つ回答をするとともに，修正箇所がある場合にはこれを明記する．
３）掲載決定通知の後，著者は採択論文の文章・図表のファイ
ルを電子媒体として，指定する宛先に送付すること（使用したソフトを明記すること）．文章・表のファイル形式は，doc, txtが好ましい．図は，ppt, jpg, tiffが好ましい．
４）原稿はA4版の大きさとし，第1頁には表題，英文表題，著

19412）FigureとTable：引用順にそれぞれ番号を付けること．表
題，説明，図表中文字は，全て英文とすることが好ましい．本
文中に挿入箇所を明記すること．Figureは直接オフセット印刷とする．Tableは編集部にて入力し原図とする．
13）文献：本文に引用した順序に番号を付け，文中では2），3-5），1，4-6）などとする．文献の記載法はthe Vancouver styleに従う．全
著者名．論文題名．誌名 西暦発行年；巻数：頁〜頁．とし，誌名の省略は医学中央雑誌またはIndex Medicus に準拠する．
単行本の場合は全著者名．題名．編集者名．書名．発行地：発行書店，年号；頁〜頁．の順とする．電子文献の場合は，ホームページ名．改行してアドレス（引用した西暦年月）とする．

人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

（例）１. 高折益彦. 人工酸素運搬体:その将来への期待. 人工血液2007;15:90-98.
２. 橋本正晴. 単回投与毒性試験. 野村 護, 堀井郁夫, 吉田武美編. 非臨床試験マニュアル. 東京: エルアイシー, 2001;3748.
３. Wong NS, Chang TM. Polyhemoglobin-fibrinogen: anovel oxygen carrier with platelet-like properties in ahemodiluted setting. Artif Cells Blood Substit Immobil
Biotechnol 2007; 35: 481-489.
４. Natanson C, Kern SJ, Lurie P, Banks SM, Wolfe SM.
Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of
myocardial infarction and death: a meta-analysis. J Am
Med Assoc 2008; 299: 2304-2312.
４. Sakai H, Sou K, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E.
Hemoglobin vesicles as a Molecular Assembly.
Characteristics of Preparation Process andPerformances or Artificial Oxygen Carriers. In: Winslow
RM, ed. Blood Substitutes. London: Academic Press（Elsevier）, 2006; 514-522.
５. 早稲田大学酸素輸液プロジェクト．
http://www.waseda.jp/prj-artifblood/index-ja.html（2008年9月現在）
14）既発表の図表，その他を引用，転載する場合には，あらか
じめ版権所有者の許可を得ること．また，掲載論文の著作権は本学会に帰属する．
15）二次掲載について．本誌は，他の言語ですでに掲載された論文を和文で二次掲載することは二重投稿ではなく正当な掲載と認めるが，著者は以下の事項を遵守する．
ａ）すでに掲載された論文であること．
ｂ）著者は両方の雑誌の編集者より許可を得ていること．二ARTIFICIAL BLOOD Vol. 17 , No.4, 2009

次掲載する編集者に最初に掲載されたもののコピー，別刷，もしくは原稿のいずれかを添付すること．
ｃ）論旨を変えないこと．執筆者は同一（順不同）であること．
ｄ）二次掲載版のタイトル・ページに掲載される脚注には，その論文の全体もしくは一部分がすでに掲載されている旨を明記し，更に初出文献も示すこと．適切な脚注の例を以下に示す．
「This article is based on a study
first reported in the［...雑誌タイトル（完全な典拠情報を添えたもの）...］（訳：この論文記事は，［...］に最初に報告された研究に基づくものである）」．
これらの要件を満たしている場合は，その旨を明記して，総説
または論文記事（二次掲載）として投稿する．
16）本誌掲載著作物の二次利用および著作権について．本誌の一部，もしくは全部をCD-ROM，インターネットなどのメディ
アに二次利用する場合がある．本誌に掲載する著作物の複製権・翻訳権・上映権・譲渡権・公衆送信権（送信可能化権を含む）は，著者が上述の著作権譲渡同意書を提出することにより，本学会に譲渡される．本項は，著作者自身の再利用を拘束する
ものでは無いが，再利用する場合は，編集委員長に通知をする
こと．
17）掲載料．掲載料は無料とし，論説，総説，原著，報告等については別刷り30部を贈呈する．それを越える分についての費用は著者の負担とする（およそ1部100円）．カラー写真掲載・
アート紙希望などの場合は，著者の実費負担とする.
18）原稿の送付先〒160-8582 東京都新宿区信濃町35
慶應義塾大学医学部呼吸器外科内日本血液代替物学会 会誌「人工血液」編集部 宛
電話：03−5363−3493，FAX：03−5363−3499
E-mail：amorjsbs@sc.itc.keio.ac.jp

195●編集後記●2008年秋に慶大で開催された国際会議Current Issues on
Blood Substitutes Researchに招聘したBrown UniversityのDr.
Kimが総説を寄稿してくださった．非細胞型のHBOCsは血管収縮-血圧亢進を起こす事が問題であるが，これを血圧降下剤
や血管拡張剤などの薬剤の併用で改善させようとするものである．非細胞型のHBOCsについてはFDAが否定的な見解を示していることは本誌でも2008年16（1）号に紹介しているが，果して薬剤の併用で問題が解決されるのか，今後の展開が注目される．同志社大の北岸先生・加納先生からは，完全合成系の人工酸素運搬体について，ご報告頂いた．早稲田大学の土田先生のグループが行ったポルフィリン誘導体とはまた異なる，シクロ
デキストリンで中心鉄を保護する形式である．今後の動物実験
でどのような結果が出るか，特に代謝性や半減期の結果についてはとても楽しみである．熊本大の田口先生からは，ヘモグロ

196

ビン小胞体の体内動態についておまとめ頂いた．周知の如くリ
ポソーム製剤として既に抗癌剤や抗菌剤を含有した製剤が認可されているが，いずれも投与量は少ない．対して人工血液としてのヘモグロビン小胞体は大量投与を前提としている．大量投与をした際の体内動態を詳細に検討し，安全性に関する詳細な知見を得ている．最後に，阪大の松本先生は，同じく細胞型人
工酸素運搬体（LEH）の微小循環系における流動特性と，その心筋虚血に対する効果についてトピックスとして御寄稿頂いた．なぜ虚血性疾患に対し粒径の小さい人工血液が有効である
か，シミュレーションを駆使して見事に明らかにしている．
編集委員会からの突然の寄稿依頼に対し，ご快諾を頂き，著者の先生方に心より御礼申し上げます．
（酒井 宏水）人工血液 Vol. 17 , No.4, 2009

編集委員会●酒井 宏水（委員長），東 寛，大谷 渡，武岡 真司，堀之内 宏久，村田 満，渡辺 真純●日本血液代替物学会 会誌■発行

日本血液代替物学会■編集・制作「人工血液」編集委員会

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vol.17（4） 2010年 2 月28日発行〒160−8582 東京都新宿区信濃町35
慶應義塾大学医学部呼吸器外科内TEL（03）5363−3493 FAX（03）5363−3499〒169-8555 東京都新宿区大久保3−4−1 55号館S棟703号室
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