調整する試薬

SDS page

10 % SDS

必要な試薬

SDS

50 g

Dw

up to 500 ml

アクリルアミドN, Nʼ メチレンビス（アクリルアミド）

pH 8.8 Tris-HCl 1.5 M

SDS

Tris

90.9 gDw

400 mlくらい

1 mol/L HClでpH 8.8に調整

TrisNaCl
KCl

Dw

up to 500 ml

Tris

12.1 gDw

100 mlくらいpH 6.8 Tris-HCl 0.5 M

グリシン
メタノール

1 mol/L HClでpH 6.8に調整

APS (ペルオキソ２硫酸アンモニウム)

Dw

up to 200 ml

TEMED (N, N, Nʼ, Nʼ-テトラメチルエチレンジアミン)
PBS

40 % アクリルアミド

βメルカプトエタノール、もしくはbond breaker

神経毒なので取り扱い注意！

アクリルアミド

190 g (38 %)N, Nʼ メチレン ビス（アクリルアミド）10 g (2 %)Wako クイックCBB
Dw

スキムミルクup to 500 ml

westernのみ

1濃縮ゲル

サンプルバッファー

分離ゲル
10 %

12 %

pH 6.8 Tris-HCl 0.5 M

1 ml

pH 6.8 Tris-HCl 0.5 M

5 ml

pH 8.8 Tris-HCl 1.5 M

10 ml

10 ml

10 % SDS

400 ul

10 % SDS

200 ul

10 % SDS

400 ul400 ulグリセロール800 ul

40 % アクリルアミド

2 ml

40 % アクリルアミド

10 ml

12 ml

ブロモフェノールブルー（BPB）

0.04 g

Dw

13 ml

Dw

20 ml

18 ml

40 ml

40 ml

20 ml

Dw

5.8 ml
8 ml

10xSDS PAGE buffer
TBS buffer

Transfer buffer

Westernのみ

Westernのみ

final
Tris

6.057 g50 mM

Tris

5.8 g

NaCl

8.06 g

138 mM

グリシン

2.9 g

KCl0.2 g

2.7 mM

MeOH

200 mlDw

800 mlくらいDw

up to 1L

1 mol/L HClでpH 7.8~7.9に調整
Dw

Tris15 g

グリシン

72 g

SDS5g

Dw

up to 500 ml

pH 9.0~9.4になる

up to 1L
固定液
メタノール

500 ml酢酸

100 mlDw

up to 1 L

2

必要なものゲル板

コームとシリコンパッキン

クリップ（大）ゲル板を水でふいて次いでEtOHでふくシリコンパッキンの凸がスペーサーのないゲル板にあたるように組み立てる

組み立て

コームをさして、コームの先端から1 cmくらい下にマジックで印をつける

底辺のシリコンを舟底型にすると泳動槽へのセットが楽チン。

3

分離ゲル 10 mlをビーカーにとる
分離ゲルのアクリルアミド濃度は分析したいタンパク質の分子量に合わせる。
APS
75 ul加えて混ぜる

マイクロスパチュラ軽く一杯を100 ul Dwに溶解
25 ul加えて混ぜる

TEMED
25 ul加えてよく混ぜる

ゲル板を立てて目印の位置まですばやく注ぐ
注いだら、EtOHが分離ゲルの液面を覆うくらいかける

濃縮ゲル
ビーカーに残ったゲルが固まるまで待って、Dwでゲル表面のEtOHを洗い流す。
紙で水気を吸い取る。

5 mlをビーカーにとる

TEMED
15 ul加えてよく混ぜる

ゲル板を立てて上部まですばやく注ぐ
注いだら、コームをさす。

ビーカーに残ったゲルが固まったら出来上がり！コームを抜く前にゲル板の斜めの部分に溜まった余分なゲルをとる。コームをそっと抜く。このときコーム間の細長いゲルがクネクネしても後で直せるのでOK。
コームの平たい部分とゲル板の間のゲルは紙にくっつけてとる。

4泳動槽にセット
ゲル板からシリコンパッキンをはずし上部泳動槽にクリップで止める。泳動槽ごとに形が違うのでそれに合わせてつける。

泳動槽下部にSDS pageバッファーを先にいれておいてゲル板の底辺を斜めに浸けていく。ゲル板の底辺に泡が入ると泡の部分だけ電気の流れが悪いので泡を入れないように。

サンプル, 1.5 ml tube使用。
タンパク質はPBSにけん濁しておく。不溶の場合サンプ
ルバッファーにダイレクトにけん濁する。
サンプルバッファーに1/20のβメルカプトエタノール、もしくはbond breakerを加える。どちらもS-S結合を切る還元剤。βメルカプ
トエタノールは臭くて有害なのでbond breakerを推奨。

PBSにサンプルをけん濁した場合、等量加える

2~3 min茹でてS-S結合を切る

on ice上部泳動槽にバッファーを入れ、シリンジを用いてウェルを洗って細かなゲルかすをとばす。コーム間の細長いゲルがクネクネしていたらシリンジの先の針で直す。

サンプルをアプライ。イエローチップで。ウェルのサイズによるが、だいたい10~40 ulアプライできる。

マーカーがブロードバンドが一般的。westernの場合は泳動中に見えるマーカー、カレイドスコープも泳動する。また、westernの場合はトランスファーしたサンプ
ルを抗体処理するレーンとクマシーで染色するレーンに分けて、泳動象と抗体の結果を合わせてもいい。

25~30 mA, BPBの色素が流れきるくらいまで泳動。
だいたい1.5~2 hくらい

5泳動が終わったら泳動槽からゲル板をはずす。マイクロスパチュラの反対側（平たい部分）をゲル板下すみに差し込み、ひねる。カパっと二枚のゲル板がはずれる。

イメージ図

濃縮ゲルと分離ゲルの境をマイクロスパチュラの平たい部分で切る。スペーサーと分離ゲルのくっついているところも同様に切る。

適当なサイズの容器の上でゲルのついている面を下にして、分離ゲルのはじをマイクロスパチュラの平たい部分で持ち上げると、ペロンと落ちる。意外と丈夫なので崩れない。

SDS pageのみ

イメージ図

westernをやる

6

SDS pageで終わる場合。
適当なサイズの容器中のゲルがゆったり浸る程度、固定液を入れる。
MeOHが入っているのでラップを！
10 min
固定液を別の容器へ

WakoクイックCBBのA液とB液を25 mlずつ50 mltubeに入れて混ぜ、ゲルの入った容器に入れる。
静置でもよいが、ゆっくり揺らすと染まりがいい。10~30 min
ゲルが青っぽくなるまでWakoクイックCBB mixを50 ml tubeに回収。何回かは使用可能。染まりが悪くなったら新しい物を。

先ほどの固定液を加える。

バックの色が抜けたら終了。バンドが薄くてもDwに浸けておくと濃くなるので気にしない。バックの色が抜けなかったら、固定液を捨て再度固定液を加える。

Dwで洗浄後、Dwに浸けておく。一晩経つと見やすくなる。ゲル乾燥機で乾燥させるか、スキャナーで泳動象を取り込む。

できあがり！

7

westernまでやる場合。
適当なサイズの容器中のゲルにtransfer bufferをゲルが浸る程度入れる。

9x9 cmのろ紙を６枚、Hibond-P(アマシャムファルマシア)を１枚切っておく。

Hibond-Pは浸る程度のMeOHに浸け、次いでDwに浸ける。

ろ紙をtransfer bufferに浸け、western blot transferマシーンに、ろ紙、ろ紙、ろ紙、Hibond-P、ゲル、ろ紙、ろ紙、ろ紙、の順にのせていく。空気が入らないように！

ろ紙
ろ紙
ろ紙
ゲル
Hibond-P：方向があとでわかるように印をつけておく
ろ紙
ろ紙
ろ紙

最後にtransfer bufferを少量かけて、電気の流れをよくする！

フタをして、25 Vで1.5~2 h8

サンプル２

サンプル１

見えるマーカー

見えないマーカー

サンプル２

サンプル１

transferが終わったら、フタをとってろ紙をとってゲルをとる。
トランスファーされてれば、見えるマーカーがHibond-Pフィルターにくっついているのが見える。トランスファー後のゲルをCBBで染色することも可ではある
けど、マーカーの一番長いところくらいしか見えないのであまり意味がない。

見えるマーカーの真ん中でHibond-Pフィルターを切る

見えないマーカーを含んだ半分

残りの半分

CBBのA, B混合液に浸す

パラフィルムを舟形にしたパラフィルム舟に移しTBSに浸す

10 minTBS捨てる
CBBのA, B混合液を回収

固定液で脱色1.5 gのスキムミルクを50 mlのTBSに溶かし、そのうち20 mlでフィルターを浸しblocking
ゆっくり揺らしながら1 hour

Dwで洗う

スキムミルク溶液を捨てる

乾燥

スキムミルク溶液15 mlにFlag抗体を適量加えた溶液をフィルターにかける。

切る
こっち半分はCBB染色

こっち半分はwestern

ゆっくり揺らしながら1 hour
スキムミルク溶液を捨て、TBSをゆったり浸る程度加える
ゆっくり揺らしながら5 min
3回
次のページ
内側がパラフィルム舟9スキムミルク溶液15 mlにFlag抗体を2 ul加えた溶液をフィルターにかける。
ゆっくり揺らしながら1 hour
スキムミルク溶液を捨て、TBSをゆったり浸る程度加える
ゆっくり揺らしながら5 min
3回
遺伝子実験施設に行く

reagent1液とreagent2液を混ぜ、ラップにのせたフィルターにかける。フィルターをひっくり返してまんべんなくつける。
化学発光開始！

アマシャムファルマシア、ECL Western Blotting Detection Reagentsのreagent1液とreagent2液を800 ulずつ2 ml tubeにとり、遺伝子実験施設に持って行く。

余分な液体を紙で軽く吸い取る。

ラップで包んで暗室でX線フィルムに感光させる。

現像

現像したフィルムとフィルターを合わせる。

さらにCBB染色した半分と合わせる。

できあがり！

10