墨に含まれる膠コラーゲンの質量分析による原料動物種の同定
宮路淳子]）・河原一樹!）・松尾良樹l)・
舘野和己!)・鈴木孝仁!)・高田将志2)・山崎雄三3）》《●キーワード：う ロテオミクス(proteomics)，膠(animalg1ue)，質量分析(massspectrometry),
墨(Chineseinkstick)

アミノ酸配列が異なっており，同じＩ型コラーゲンの１．はじめに

cM-１鎖であっても，動物種毎にアミノ酸配列が微妙に

コラーゲンはあらゆる動物種の主要なタンパク質成分異なるので，適当な方法でコラーゲンのアミノ酸配列のであり，骨や皮製品だけでなく，原材料の形態を全く残違いが読み取れれば，膠の原料となった動物種を特定すさない抽出物の膠またはその加工品として広く歴史資料ることが可能である。

に分布する。最近の研究から，八千万年前の恐竜の骨か

本研究では，古代から筆記用具として用いられてきたら抽出されたコラーゲンのアミノ酸配列解析により恐竜墨に注目し，その主要成分である煤の固着剤として約の進化上の位置まで特定できることが実証され４０％含まれる膠のコラーゲンのアミノ酸配列を，マト(Schweitzeretal.:2009),考古学における有用な分析

リックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量

対象として注目されるようになった(Dobbersteinet

分析法により解析し，原料動物種の同定を行った。日本

al.:2009,Krauseetal.:2010)｡
現在までに，ヒトやウシなどの哺乳類に関して，約３0種類以上の機能の異なるコラーゲンが知られており，

｡H9H

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OH,〜，α２、ﾝb"｡R

ヒドロキシラーゼーーーーレＯＨ

構造的には骨や表皮に多量に存在するＩ型をはじめとすCt

る繊維状のコラーゲンと，血管内皮細胞が生産する非繊維性のVII型コラーゲンなどに分類されている

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三重らせん構造▲(Shouldersetal.:2009)｡コラーゲンは，基本構造としコラーゲン繊維↓て３分千がらせん状に絡み合った三重らせん構造を形成しており，繊維に必要な強度と弾性をもたらしている。
例えば，繊維状のＩ型コラーケンの場合，２分子のα-l鎖とｌ分子のα­２鎖からなる三重らせん構造を形成す

m１１型コラーケンの翻訳後修飾と構造転移の模式図
Fig．1Schematicrepresentationofposttranslationalmodifi-

る（図l)。それぞれの鎖は別々の遺伝子にコードされ，cationandstructuraltransitionoftypelcollagenmoleｃｕｌｅ．

|)奈良女子大学古代学学術研究センター〒630-8506奈良市北魚屋東町
2)奈良女子大学共生科学研究センター〒630-8506奈良市北魚屋東町
3)島津製作所応用技術部〒604-8511京都市中京区西ノ京桑原町１４７

において，墨は古代から現代に至るまで使用されている「日本書紀』によれば，日本に墨を伝えたのは，推古数少ない筆記用具の一つであることから，墨に含まれる

天皇十八(610)年，高句麗からの渡来僧曇徴とされて膠の原料となった動物種を明らかにすれば，日本の文化いる。墨の製法が記されている日本の文献史料には１0

史，そして技術史を解明するための新たな情報を提示で枇紀に編纂された「延喜式』図書寮年料墨条・造墨条がきると考えられる。

ある。室町時代末の１５７７年に奈良の地で製墨業を創業し，現在する日本最古の造墨の老舗である古梅園では，

２．墨と膠代々和墨の研究，改良が重ねられており，「古梅園墨譜」の処々に記されている記述から日本における墨の製造史

2 . 1 墨墨は，煤と温水に溶かした膠を練り合わせ，成型，乾の 多 くを 知 る こ と が で き る 。 中 で も ， 六 代 松 井 元 泰

燥させるという方法で製造され，古代から現代にいたる(1689-1743)",元文４年(1739)に官許を得て長崎にまで基本的に変わっていない。漢字が誕生した中国では赴き，長崎寄留の清国人９人と，中国における製墨法に文字媒体としての墨を早くから作り出していたが，現在ついて質疑応答した記録は，「唐人墨製問答之記録」自のような膠を含む成形墨は，「中国文房四寶全集１塁」

筆本として保管されており貴重な資料である（松尾：(北京出版社:2007）によれば，後漢(1〜３世紀年頃）

1993)｡今回分析の対象とした江戸時代の墨は，古梅園に始まる。中国においては６世紀に成立した「齊民要術」

が長崎への来舶清人に依頼して作らせた墨型を用いて作に，墨の具体的な製法が記されており，その後も『墨譜られた（図２）。西暦1741年（清・乾隆６年）に清国徽法式」「墨経」など墨の専門耆が数多く残されている。

州の印工が作った墨型であることが「古梅園墨譜」に記されている。

ｂ

ａ

2.2膠

■

墨の重要な材料の一つである膠は，動物や魚類を煮炊きした残置から発見され使われ始めたと言われるが，特定の目的のために作られた膠の起源は未だ明らかではない。先に挙げた「齊民要術」には，膠の製法について原料動物を含めた詳細な記述があり，当時の製造法を窺い知ることが出来る。一般的に，膠は，動物の皮・骨・爪・

璽
遡り■Ｉ

ｌ
ｉ

ウシ

ウサギ

図２分析対象とした墨と膠試料．ａ:江戸時代(1741年）に古梅園で製造された墨b:２００８年に古梅園で製造された墨，
ｃ:標準膠試料として用いた４種類（シカ，ウシ，ニベ，ウ腱などに含まれるコラーゲンを温水中で加熱・抽出して，乾燥して製造される。原料としては，皮が最も多く使われるが，その場合石灰のような強アルカリ処理やバクテリアによる腐敗を利用して，表面の角質や脂肪分を分解・除去する。コラーゲンの抽出効率を高めるために煮沸を何度も繰り返すこともあるが，高温処理によって膠の接着力が弱くなることが知られている（安孫子:1987)。
膠の原料となった動物種に関して，古代の文献史料に様々な記述がある。「膠」「阿膠」の原料として，古代中サギ）の膠試料．
Fig．２Chineseinksticksandanimalgluesusedinthisstudy.

国では「周礼』考工記に鹿，馬，牛，鼠魚，犀「齊ChineseinksticksmanufacturedbyKobaieninl７４1

民要術」（北魏）には沙牛，水牛，猪（ブタ)，鱸（ロバ)，(a)andin２00８(b).Animalglues(deer,cow,fish,andrabitt)usedasstandardmaterialsforMALDI-MS馬，駝（ラクダ)，螺（ラバ）の記述があり，日本におanalvsis(c).

いては，「延喜式」（平安中期）に牛皮の記述がある。ま4８

た，墨の製造に使われた膠としては，『墨譜法式」「墨経」

に関しては浮き袋から抽出したコラーゲンを原料として(宋）に牛，鹿角の記述があり，「墨法集要」（清）には製造された膠試料をそれぞれ（財）元興寺文化財研究所

魚鯉膠，牛膨と記されている。一方で，膠は墨ばかりでから提供を受けた。ウサギ由来の膠に関しては，皮からなく，美術分野において，顔料と混合して絵の具の製造抽出したコラーゲンを原料とした製品をホルベインエ業に利用されており，怯統的手工業や工芸などの広い分野

株式会社より購入した。

においては有用な接着・固着剤として使用されてきた。
アジア諸国とは異なり，ヨーロッパでは，絵画などに用いられる顔料の固着剤として兎を原料とした膠が普及している。

3.2試料謂製
各墨試料は，まず約１mgの墨片を刃物で削り，乳鉢
中で１００mM炭酸水素アンモニウム(NH4HCO3)緩衝膠の原料となるコラーゲンは，特定の温度範囲で，ゾ液1mlとともに粉砕し，墨汁液状にした。この液を溶

ル（液体）とゲル（固体）の間の可逆的な変化が起こる。

液Ａとし,２ml容量のエッペンドルフチューブに移し

例えば，ウシのＩ型コラーゲンは，約３７℃を境にゾル

た後，乳鉢に残った内容物を１mlの100mMとゲルの相転移が起こることが報告されており，相転移

NH４HCO論緩衝液で洗浄し，得た液Ｂと溶液Ａを合わの温度はコラーゲンの三重らせん構造の安定性と密接にせて保存液Ｃとした。

関わると考えられてい墓(Latinovicetal.:2010)。コ

保存液C(500"1)を100mMNH4HCO3緩衝液で洗っラーゲンと同様の特性を有する膠は，ゲル化に伴って水たシリンジフィルター(Whatmann/GDX-PTEE,０.２

分の乾燥を待つまでもなく直ちに接着力を発揮し，必要ｍｍ径）で濾過し，濾液を1時間,６0℃で静置しコラーがあれば温和な加熱によって接着力のないゾル状態に変ゲンの三重らせん構造を変性させた。この液を室温に冷換できる。すなわち，古代から伝わる膠製造技術は，現却後,1０"1のトリプシン溶液(10mg/mllOOmM

代の最先端科学をもってようやく解明されようとしてい

NH4HCO3)を加えて,３７℃で１６〜２４時間，酵素消化るコラーゲン分子の構造と機能を巧みに利用している。

した。酵素消化によって生じるペプチド断片の混合物のコラーゲンの分析によ患膠原料の同定は，膠に関連す署

溶液10"１に４0"lの0.5%トリフルオロ酢酸水溶液を古代の科学および技術史の新たな一側面を明らかにする

加えて酸性(pH4.0)にし,ZipTip-C18で濃縮・脱塩

考古学的意義があ墨。

して試料溶液Ｄとした。標準のＩ型コラーゲンおよび以上の事実と文献上の知識を背景に，次項では墨に含

各動物種の膠試料に関しては，各々約１mgを１００mM

まれている膠の分析を例に我々の方法論とその結果につ炭酸水素アンモニウム(NH4HCO3)緩衝液lmlに溶解いて紹介する｡

させ溶液Ａを調製し，その後の実験操作は墨試料の場

３．試料と手法
3.1分析賦料合と同様に実施した。

3.3質量分析

試料の江戸時代の墨は，前述の通り古梅園が西暦

MALDIサンプルプレート上で１狸１の溶液Ｄと１鰹］

1741年（清・乾隆６年）に清国徽州の印工が作った墨のマトリックス溶液（α-シアノ-p-ヒドロキシ桂皮酸の型を用いて成形してあり，古梅園の土蔵に保存されていアセトニトリル溶液）を混ぜた後，乾燥させ,MALDIたものである（図２a)。本研究では，比較試料として，タンデム飛行時間型(MALDI-TOF/TOF)質量分析測

2008年に古梅園でウシの皮を原料とした膠を用いて製定を行った。質量分析計は,AXIMA-Performance

造された市販の墨（製品名：百楽）についての分析を並(Shimadzu/Kratos)を使用し,MALDI-TOFスペク

行して行った（図２b)。これらの試料に加えて，標準

トル及びへリウムガスによる衝突誘起解離(CID)に基の膠試料としてウシ，シカ，ニベ，ウサギの膠を用意しづ く M A L D I -T O F / T O F スペ ク トル を 測 定 し た 。

た（図２c)。ウシとシカに関しては皮を原料とし，ニベ

MALDI-TOFスペクトル中に検出された各ペプチドの
４９アミノ酸配列は,MALDI-TOF/TOFスペクトルの測時代）に製造された墨から抽出された膠成分のトリプシ定によって得られた開裂パターンを手動で解釈す愚こと

ン消化物，および標準試料として分析したウシＩ型コラーによって推定した。また，最終的な動物種の同定は，質ゲンのトリプシン消化物のMALDI-TOFスペクトルは，

量分析データの解析結果か ら得られたアミ ノ酸配列をデーほぼ一致したパターンを示した（図３)。

タベースに登録されてある各種動物のコラーゲンのアミ

特に，プロテオミクス実験においてしばしば検出されノ酸配列と照合することに加えて独自に用意した各動物

るケラチンやトリプシンの自己消化物竃どの不純物に由種の膠試料の質量分析結果と直接比較することによって来する数本の信号を除いて，検出された信号の数は完全行った。

に一致した。また，これらのスペクトル中で検出された同一の質量／電荷比(m/z)を示した主要な１５本の信

４．結果および考察

号 に つ いて は , M A L D I -T O F / T O F 分 析 で 得 ら れ る 開

本研究では， 製造年代が異なる二種類の墨を分析の対裂パターンを解釈することにより，検出されたペプチド

象とした（図(図２)｡MALDI質量分析の結果から，図３

断片のアミノ酸配列を推定することができた（図４およに示すように，に,２００８年に製造された墨と1741年（江戸

ぴ表１）。

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図32008年に製造された墨(a)と1741年に製造された墨(b)から抽出されたペプチドのトリプシン消化物のMALDI-TOF質量スペク
トル．MALDI-TOF/TOF分析を行った信号を#1〜#１５で示してある．
Fig.３MALDI-TOFmassspectraoftrypticdigestofpeptidesextractedfrominksticksmanufacturedin2008(a)andinl７４１(b)ThepeakssubjectedtoMALDI-TOF/TOFanalysisarelabeledfrom#lto#15.
5０

a三脚沌回弧弛廊帆亜蝿垂弛G恥y23y22y2]yl"18yl"1"15yl4ymyl"lly.ySy７y６y5y４yl

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図42008年に製造された墨のMALDI-TOF質量スペクトル中に観測された"Z/Z２１３２(#13)の信号のMALDI-TOF/TOF分析結果．一連のｙ系列のフラグメントイオンのみ示してある．
Fig.４MALDI-TOF/TOFmassspectrumanddenovosequencingofpeakatm/Z２１３２(#13)ofChineseinkstickmanufacturedim
2008.They-typei･nsareindicated.

表ｌ墨から抽出したペプチドのMALDI-TOF/TOF分析によるアミノ酸配列解析結果
TablelSummaryofthepeptidesequencesdeterminedbytheMALDI-TOF/TOFanalysis

wz/Z(#)

1105.5(1)1267.8(2)1427.9(3)1435.8(4)1460.1(5)1585.8(6)1649.6(7)1818.0(8)1834.0(9)1977.2(10)2021.2(11)2057.4(12）2132.4(13）2217.4(14)2855.1(15）アミノ酸配列ａG(685)VQGPPGP*AGPR(696)
G(326)IP*GPVGAAGATGAR(340)G(572)IP*GEFGLP*GPAGAR(586)G(472)EP*GPAGLP*GPPGER(486)G(865)SAGPP*GATGFP*GAAGR(881)
G(397)ANGAP*GIAGAP*GFP*GAR(414)G(380)STGEIGPAGPPGPPGLR(397)
G(994)P*PGPMGPPGLAGPP*GESGR(1013)
G(994)PP"GP*MGP*PGLAGPPGESGR(1013)
S(1062)GDRGETGPAGPAGPIGPVGAR(1083)
G(448)EP*GPTGIQGPP*GPAGEEGKR(468)E(463)GPVGLPGIDGRPGPIGPAGAR(484)G(881)LP*GVAGSVGEP*GPLGIAGP*PGAR(904)G(910)ETGPAGRP*GEVGP*P*GPPGPAGEK(933)
G(763)LTGPIGPPGP*AGAP*GDKGEAGPSGPAGPTGAR(795)

鎖（型）

ql(1)
cU２(1)"２(1)fM１(1)"1(1)cw１(1)q２(1)cI１(1)q１(1)"１(1)
fM1(1)
"２(1)
"２(1)
αｌ①
"１(1)

α各ペプチドの先頭と末尾のアミノ酸配列番号は、データベースUniProtに登録されているウシＩ型コラーケンのＮ末端からの順番に従って付した。

５１

#１l"?/g=２０２１.２#４畑だ=１４３5.８
墨 - - G E P G F T G I Q G E P G PA G E E G K R - - - G E P G P E C I J P G P P G E R
ロバ(ID:89VR88)AKGEPGPTGIQGPPGFAGEEGKRGARGEPGPGLPGPPGER
ウシ(ID:PO2453)AKGEPGPTGIQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPAGLPGPPGER
イヌ(ID:Q9XSJ7)AKGEPGPTGIQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPGLPGPPGER
ゾウ(ID:G3UE48)HKGEPGPGIQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPGLPGPPGER
ゴリラ(ID:G358D4)AKGEPGPGQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPGLPGPPGER
マウス(ID:P11087)AKGEPGATGQGFPGPAGEEGKRGARGEPGPsGLPGPPGER
ラット(ID:PO2454)AKGEPGPGQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPsGLPGPPGER
ニワトリ(ID;PO2457)AKGEPGPGQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPAGLPGPGER
カエル(ID:Q80285)AKGEPGPGQGPPGPsGEEGKRGsRGEPGPAGPPGPGER
ニジマス(ID:Q910CO)AKGEsGPGQGPGPAGEEGKRGGRGEPGGAGAGPGER
図５アミノ酸配列データベースに登録されている主な動物種のＩ型コラーゲンのアミノ酸配列とMALDI-TOF/TOF分析結果から推定された墨試料に含まれるベプチドのアミノ酸配列の比較．各動物種の右側の括弧内には，データベースUniProtの配列IDを示してある．
各配列の中でウシのアミノ酸配列と異なるアミノ酸を水色で示してある．またトリプシンの切断部位のアミノ酸を赤で示す．
Fig.５Sequencealignmentbetweenthepeptides(#４and#ll)derivedfromtheglueintheChineseinkstickandtypelcollagenin
severaltaxa.ThetypelcollagensequenceswereextractedfromthedatabaseUniProtandthieraccessionnumberswerepro.
videdinparentheses

得られた結果を,NCBInr(http://www・ncbi.nlm.

るＩ型コラーゲンの種類は極めて限られており，シカ，

nih.gov/)JPUniProt(http://www.uniprot.org/)な

サカナ（ニベ)，サイ，スイギュウ，ラクダ，ラバは存

どのアミノ酸配列データベースに登録されている様々な在せず，ウマ，ブタ，ウサギに関して部分的な配列が登動物に由来するコラーゲンのアミノ酸配列と比較したと録されているのみである。したがって，最終的な動物種

ころ，１５本の信号の全てがウシ(Bovine)のＩ型コラーの同定は，当該動物種から製造した膠の質量分析結果とゲンのアミノ酸配列と一致し，その内の１０本はα-１鎖

直接比較対照することが必要である。本研究では，ウシに該当し，残りの５本はα­２鎖に一致することが明ら由来の膠に加えて，上記の中から比較的入手の容易であかになった（表l)｡この結果は,I型コラーゲンの特る，シカ，サカナ（ニベ)，ウサギの膠を収集し分析を徴的な３本鎖構造が２本のα-１鎖と１本のα-２鎖から実施した。

形成されている事実とよく一致している。図５には，一コラーゲンは，分子量1３１４万でアミノ酸が約１４００

例として，現在データベースに登録されている主な動物

残基連なる長いポリペプチド鎖中に３残基毎にグリシン

種のＩ型コラーゲン(cM-１鎖）と墨から抽出したペプチ( G ) が 繰 り 返 し 現 れ ， そ の 間 に 多 くの プ ロ リ ン ( P ) がドのアミノ酸配列の比較結果を部分的に抜粋して表示し挟まれる特徴的な配列を数多く含む。さらに，三重らせた。ここでは，図３の３種類の試料に共通して検出されん構造を安定化するためにプロリルヒドロキシラーゼにた#４(wZ/21435.8)と#1１(m/Z2021.2)を参考としてより，プロリン残基が高い割合で酵素的に酸化され上ド示したが，これらの部分的な配列情報だけでも墨試料とロキシプロリン（ここではP*と表示する）に変換され完全に合致する動物種はウシしか存在しないことがわかている（図l)。この翻訳後修飾の割合は，同じＩ型コる。各動物の#４JP#11のペプチド断片に相当する部分

ラーゲンであっても動物種ごとに異なっておりのアミノ酸配列は，３残基ごとにGlyが存在するなど極(Burjanadze:1982),DNAの配列情報を基本とした既めて良く似ているが，各々数か所異なっており，そのこ

存のデータベースには，その様なDNAの翻訳後に修飾とが動物種の判別を可能にしていることは興味深い。とが起こるヒドロキシプロリンの情報が含まれていない場

はいえ，墨の原料となった膠に用いられた動物種を同定合が多い。そのため，今後データベースに蓄積される配するためには，本来ならば，２．２の節にあげた膠原料とﾀﾘ情報が一層充実したとしても，膠試料を直接分析する

して可能性のある動物種と比較することが望ましいが，意義はあると思われる。

現在(2012年１０月）でもデータベースに登録されてい５２

図６の膠試料の質量分析結果が示すように，二種類の墨試料，ウシ，そしてシカに関しては蝿/Z１４６０に特徴

ところで，膠の製造時の加熱処理によりコラーゲン分的な信号が検出された。MALDI-TOF/TOF分析から，子が非特異的に加水分解を受けて低分子化すると考えら

そのアミノ酸配列はGSAGPP*GATGFP*GAAGRと推れている。ゼラチンに関する他の研究例において，加水定され，翻訳後修飾の位置も一致した。一方，ウサギと分解後のペプチド断片が３重らせん構造を再形成するこサカナ（ニベ）では,m/Z1４５４と蝿/Z1４8７に相当すとが報告されていることから(Fujitsuetal.:1997),

る信号が検出されているが，各々に関して推定されるア

製造時の加熱処理により，断片化が生じたとしてもある

ミ ノ 酸 配 列 が G S P G P P G AT G F P G A A G R と程度の量のペプチド断片は３重らせん構造を再形成する

GPSGPP*GATGFP*GAAGRとなり，幾つかのアミノことが充分考えられ石。また，古い墨の劣化がコラーゲ

酸残基や翻訳後修飾の割合に差がみられた（図６a)。

ンの分解によ患ものであるとも考えられており，今回試

さらに，図６bに示すように，ウサギにおいて蝿/Z２１２９料とした江戸時代の墨に含まれている膠は製造以来270に検出されるペプチド断片は，そのアミノ酸配列が年余りを経ていることから，こうした分解が著しく進ん

G L P * G VA G A L G E P * G P L G I A G P * P G A R と推定され，でいると予想された。即ち，製造時または経年劣化によ二種類の墨試料，ウシ，そしてシカに関して得られたスりコラーゲンを構成しているペプチド結合がある特定のペクトル中の〃I/Z２１３１に観測されるペプチドと２残基

アミノ酸残基の位置で分解を受けていれば，先に述べた異なっていることも明らかにざった。サカナ（ニベ）に加水分解と同様に，トリプシン消化が正常に進行してリ関しては，今回の実験では，相当するペプチドは検出さ

ジ ン ( K ) あ る い は アル ギ ニ ン ( R ) の Ｃ 末 端 側 で 切 断れなかった。

されて生じたペプチド以外についてもピークが観測されここまでの結果から，今回対象とした墨試料の製造にるはずである。ところが，今回の実験で明らかになった用いられた膠がウサギおよびサカナ（ニベ）を原料としように，図３の各スペクトルは非常に似ており，経年劣ていないことは明白であ患が，同じウシ亜目，真反鍔下化は観測されなかった。この事実は，今回の実験で墨に目に属するウシとシカのコラーゲンのアミノ酸配列は非含まれる膠は，製造後270年の時を経ているにもかかわ常に類似している可能性があり,MALDI-TOFスペク

らず現代のものとほぼ同じ化学構造を保ち，動物種の特トルも極めて似ていたた強，判別が困難であった。しか定が十分に可能であることを示唆している。おそらく，しながら．我々は図３のａとｂに共通して観測された膠は固形の墨の内部で湿気や酸素，さらに微生物との接１５本のピークの中で,"M/Z２８５５のピークのみがシカで触を絶たれたた勘に分析を困難にする大きな分解を免れ

は蝿/Z２８８５となり，その原因がA(アラニン）からＴたのであろう。しかしながら，今回解析によって明らか（トレオニン）への変異によるものであることを見出しになったアミノ酸配列の総延長は230残基余りで,a-1た（図６c)(Kawaharaetal.:2011)。質量分析を基

鎖とα-2鎖の三重鎖部分（各１１００残基）を合わせた全盤とした今回提案する方法では，あるピークについての長の約1/１０に過ぎない。図３のスペクトルの類似性か

アミノ酸配列解析結果が一つのアミノ酸でも違えば，他り，のピークすべてについて配列が一致したとしても特定のとは考え難いが，抽出条件の再検討や本研究では考慮し動物に同定することは不可能である。

ていなかったコラーゲン特有の架橋構造の情報などを取したがって，膠原料がシカである可能性は蝿/鷺２８５５のピークの検出によって排除できる。以上の結果から，

回

残りの９０％の部分に経年劣化箇所が多数存在する

り入れることで，アミノ酸配列の解析可能な領域がさらに拡大する必要はあるだろう。

今回の試料中のコラーゲンがウシ以外のシカ，ニベ，ウ

コラーゲンはタンパク質の一種であることから，これサギなどの膠原料として想定される主要な動物由来の可を成分として含む膠が「腐りやすい」あるいは「不安定」

能性は否定できた。膠原料がウシであるとする今回の分と考えられている。しかし江戸時代の墨に含まれている析結果は，「牛皮を貢て之を作る」と記載した「和名類コラーケンの分析結果が示す通り，少なくともこの墨と聚抄」が伝える膠の製法から考えても妥当といえる。

同様に温和な条件で保存されていれば数百年間はその分
5３

ａ

G S A G P P * G AT G F P ★ＧＡＡＧＲ、脚だ＝１４５９．６ ３

古梅園（2008）

ＧＳＡＧＰＰ★ＧＡＴＧＦＰ ★ＧＡＡＧＲ­­­­〃Jと＝１４６０．００

古梅園（1741）
一ﾊ墨八A八一̅̅．

Cow

ＧＳＡＧＰＰ★ＧＡＴＧＦ Ｐ★ＧＡＡＧＦ
ノ"た＝１４５９ ６

G S A G P P * G AT G F P * G A A G R ̅"J/t=１４６０.２

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…

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＝ＧＳＰＧＰＰＧＡＴＧＦＰＧＡＡＧＲ

Rabitt…公一寺今･".〜­．竺二令ﾑーーー

ＧＰＳＧＰＰ★ＧＡＴＧＦＰ★ＧＡＡＧＲ〃7/宮＝１４８６．５８

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14釦１４５５１４６０１４６５１４７０１４７５１４８０１４８５１４釦１４９５１５”"たｂ

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一

古梅園（2008）"7な＝２１３１．１９

ﾍ姪̅-ＧＩＪＰ★ＧＶＡＧＳＶＧＥＰ★ＧＰＬＧ工ＡＧＰ★ＰＧＡＲ"1/含＝２１３１．４２

古梅園（1741）

八A典̲ﾆｰﾆｰ〜W
八一/GLP*GVAG｡:;:v;GEP/GPLGIAGP*PGAR Cow

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G LT G P I G P P G P * A G A P * G D KG E A G P S G PA G P T G A R"7と, ＝２８５３．３

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古梅園（2008）
古梅園（1741）"7/も＝２８５３．７-尖…ご令一­­­­­ＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰ★ＡＧＡＰ★ＧＤＫＧＥＡＧＰＳＧＰＡＧＰＴＧＡＲ

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2M０２８４５２８m２８５５２８６０２%５２８７０２８７５２８８０２８８５２８W" た"６２００８年および１７４１年に製造された墨と各種動物山来膠試料から抽IIIされたベプチドのトリプシン消化物のMALDI-TOF質量スペク
トルの比較．陳料動物種の判別に利用した各信号を含む領域,m/Z1４５0-1500(a),m/Z2115-2165(b),"Z/22840-2890(c)をそれぞれ示した．
F i g . ６ S e l e c t e d r e g i o n s o f M A L D I -T O F m a s s s p e c t r a o f t r y p t i c d i g e s t o f p e p t i d e s d e r i v e d f r o m t h e g l u e i n t h e C h i n e s e i n k s t i c k
m a n u f a c t u r e d i n 2 0 0 8 a n d i n l 7 4 1 ・ T h e M A L D I -T O F m a s s s p e c t r a f r o m a n i m a l g l u e s ( c o w , d e e r, r a b i t t , a n d f i s h ) a r e a l s oｓｈｏｗｎ．
5４

･子構造が例え部分的であったとしても破壊されずに，質量分析可能な状態で残ると予想される。カビやバクテリ

5．終わりにアによるコラーゲン又は膠の分解については現在研究中

本研究の結果から，比較的少量の試料（墨の場合，約であ患が，一般的に腐敗には適度な湿度が必要であり，1mg程度）で墨の固着剤である膠の原料が特定できる

また，コラーゲンの特徴的な三重らせん構造はコラゲナー

ことが実証された。今後，より古い時代の試料を入手し，ゼの様芯特殊な酵素でなければ分解することはできない

また様々な地域にわたる墨試料を収集・分析することで，た砧，江戸時代の墨の分析結果が示す分解に対する安定

コラーゲンの経年劣化の過程の追跡と，墨の製法の変遷

性の一部は，特徴的な三重らせん構造が一般的芯タンパについての研究を進めていきたい。現時点でウシ，シカ，

ク質分解酵素による消化を受けるペプチド結合を立体的

サカナ（ニベ)，ウサギなどの膠についての分析を行い，に保護していることで説明できるであろう。

これらの動物種の区別と同定は可能となった。さらにデー

熱変性により三重らせん構造が部分的に崩れたゼラチ

タベースに登録されていない動物種の豚を独自に調製し，ン状態では，当然接着力も低く，タンパク質分解酵素の動物種別の質量分析およびアミノ酸配列データの作成を作用を受けやすい。したがって腐りやすいはずである。

予定してい墨。また，牛膠の「三千本」や「鹿膠」が日膠の製造工程で，熱変性に伴ってペプチド結合が切断さ

本画の，また兎膠が西洋画の画材として利用されているれる可能性は否定できないが，その過程で起こる物理化

ことから，今回示した墨に含まれる膠の分析法の研究対学的現象は未だ理解されておらず，膠の安定性を解明す

象は，墨書から絵画に腹げられる･さらに接着剤に膠をる上で今後詳細に研究す墨必要があ患。伝統産業や美術使った仏像や木工芸品など広範囲の文化財も今後研究対

工芸では，これらの膠の特性が経験的知識に基づいて巧象としたい｡

みに利用されている。例えば墨の製造工程では二重釜の謝 辞

湯煎で膠を温水に溶き，直火による過熱を避けている。
古代から継承されてきた経験に基づく技術を現代科学に（財）元興寺文化財研究所の植田直見氏，天野山文イヒ

よって理論的に裏付け患ことも，我々の研究の重要な目

遺産研究所の山内章氏，株式会社呉竹の野田盛弘氏には，的の一つである。まだ文献上に記述のあるシカやニベの膠試料の提供および膠生産・使用に関してさまざまなご膠を使った墨は見つかっていないが，膠の種類と墨の品

教示を賜りました。深く感謝を申し上げます。また，本質の関係は，コラーゲンの物性と密接に関連しているは

研究は，独立行政法人日本学術振興会『異分野融合によずである。魚のような変温動物のコラーゲンの変性温度

る方法的革新を目指した人文・社会科学研究推進事業」

は体温の高い恒温動物のものに比べて低く，従ってゾル｢公募型研究領域」受託研究「文化財に含まれる膠の自(液体）とケル（固体）の間の転移温度も低くなり，こ然科学的分析による古代文化史および技術史の解明」

れはヒドロキシプロリンの低い含有量と関係があること(平成21〜25年度，研究代表者：宮路淳子）ならびに奈が知られてい墨(Burianadze:1982)。

良女子大学古代史・環境史プロテオミクス研究創成事業(平成２１〜２３年度）の研究成果の一部である。

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５
６

IdentiﬁcationofAnimalSourcesofCollagen
UsedasGlueinChineselnkSticksbyMALDIMassSpectrometry
１

AtsukoMiyaji!),KazukiKawahara'),YoshikiMatsuo'),
KazumiTateno'),TakahitoSuzuki'),MasashiTakada2)andYuzoY乱mazaki3)')CenterforResearchofAncientCulture,NaraWomen'sUniversity,Kita-Uoya-HigashiMachi,Nara630-8506!
Japan2)KyCuseiScienceCenterforLifeandNature,NaraWomen'sUniversity,Kita-Uoya-HigashiMachi,Nara６３０.
8506,Japan3)ApplicationsDevelopment

Center,ShimadzuCorporation,Nishinokyo-Kuwabaracho,Nakagyo-ku! Kyoto604-

8511,Japan

CollagenisthemostabundantproteininanimalsandhasoftenbeenfＣundasanimalgluein
avarietyofarchaeologicalmaterials・InEastAsia,theChineseinkstick,consistingofsootand
animalglue,hasbeenusedalmostexclusivelyasameanstowriteletters.Accordingtoancient
records,theglueusedtｏbindsootcanbepreparedfromavarietyｏfanimalssuchascow,deer!
fish,andd｡nkey,butsuchpreparationisdifficulttoprovescientifically.Theref･re,therelationshipbetweenthephysicochemicalpropertiesofcollagenandthesourceanimaloftheglueremainstobeclariﬁed.Wesuggesthereamethodforunambiguouslyidentifyingtheanimalsource･fcollagenbyaminoacidsequencingwithmatrix.assistedlaserdesorption/ionizationtime-ofﬂight/time-of-ﬂight(MALDI-TOF/TOF)massspectrometry.Despitethelimitednumberof
aminoacidsubstitutionsinl5majorpeptidepeaksintheMALDIspectraoftrypticdigestofcollagen,wecoulddistinguishdiﬀerentanimalsincludingcow,deer,ﬁsh,andrabbitfromwhichcCllagenwasderived.Employingthesepeaksasmarkers,weidentiﬁedcollagenql(1)andCM2(1)ofcowastheglueofaninkstickmanufacturedabout270yearsagoinNaraPrefecture,withno
signsofchemicalorbiologicaldegradation･Theseresultsdemonstratethepossibilityofobtaininghistoricalinformationthroughtheanalysisｏfanimalglueremainsinarchaeologicalmaterials̲

５７