目次

コンファレンスプログラム ········································ 2
発表演題及び講演時間 ············································ 3
特別講演要旨 ··················································· 16
シンポジウム講演要旨 ··········································· 19
一般講演要旨 ··················································· 38
ポスター発表講演要旨 ··········································· 47
人名索引 ······················································· 97
糸状菌分子生物学研究会会則 ···································· 101
糸状菌分子生物学研究会運営委員名簿 ···························· 102

1

第 7 回糸状菌分子生物学コ ンフ ァレンスプログラム
日時：平成 19 年 11 月 15 日(木)-16 日(金)会場：東京大学弥生講堂（東京都文京区弥生 1-1-1）
主催：糸状菌分子生物学研究会
後援：糸状菌遺伝子研究会
11 月 15 日（木）10:00-11:40
シンポジウム１（S-1-1~S-1-4）「糸状菌における隔壁と形態形成の分子メカニズム」
11:40-12:40
昼食
12:40-13:52
口頭発表（O-1~O-6）
13:52-14:00
休憩
14:00-16:00
ポスター発表（P-1~P-50）
16:00-16:45
特別講演① Dr. Nancy P. Keller(University of Wisconsin)
16:45-17:30
特別講演② Dr. Gregory Jedd
(Temasek Life Sciences Laboratory)
17:30-17:45
総会
18:00懇親会
11 月 16 日（金）9:30-11:35
シンポジウム２（S-2-1~S-2-5）「二次代謝研究の分子基盤」
11:35-12:30
昼食
12:30-13:30
口頭発表（O-7~11）
13:30-15:30
ポスター発表（P-51~P-99）
15:30-16:42
口頭発表（O-12~17）
16:42-17:00
閉会の辞

2発表演題および講演時間
特別講演

11 月 15 日（木）16:00-17:30

16:00-16:45

特別講演①
The LaeA complex regulates development, secondary metabolism andvirulence in Aspergillus spp.
Dr. Nancy P. Keller (Departments of Plant Pathology and Medical
Microbiology and Immunology,University of Wisconsin)

16:45-17:30

特別講演②
The Mechanism of Woronin body biogenesis.
Dr. Gregory Jedd (Temasek Life Sciences Laboratory & Departmentof Biological Sciences, The National University of Singapore)

シンポジウム１ 11 月 1５日（木）10:00-11:40「糸状菌における隔壁と形態形成の分子メカニズム」
10:00

S-1-1

10:25

S-1-2 「O-グリコシレーションによって制御される糸状菌の正常な形態形成」
後藤正利（九州大学大学院農学研究院）

10:50

S-1-3

「Aspergillus nidulans の隔壁形成と形態形成における各種キチン合成
酵素の機能」
堀内裕之（東京大学大学院農学生命科学研究科）

11:15

S-1-4

「担子菌ウシグソヒトヨタケ子実体の柄伸長に関わる遺伝子 eln1 とeln6 のクローニング」
村口 元１、鎌田 堯２（１秋田県立大学生物資源科学部、２岡山大学大学院自然科学研究科）「麹菌における隔壁孔を介した細胞間コミュニケーション」
丸山潤一（東京大学大学院農学生命科学研究科）

3

シンポジウム２ 11 月 1６日（金）9:30-11:35「二次代謝研究の分子基盤」
9:30

S-2-1

「麹菌が生産する有用な二次代謝産物について」
堤 浩子（月桂冠 総合研究所）

9:55

S-2-2

「トリコテセン系毒素の構造多様性を生み出すメカニズムの解明と生産制御にむけて」
木村 真 （理化学研究所・中央研究所）

10:20

S-2-3

「発ガン・毒性物質アフラトキシンの生合成機構とその防御」
矢部希見子１、中島廣光２（１農業・食品産業技術総合研究機構、２鳥取大農学部）

10:45

S-2-4

「糸状菌ポリケタイド生合成遺伝子の機能解析」
藤井 勲（岩手医科大学薬学部）

11:10

S-2-5

「ML-236B (compactin)生合成遺伝子群の解析と高生産株育種への応用」
馬場悟史、阿部有生（第一三共株式会社）4一般講演（口頭発表）（O-1〜O-17）
11 月 15 日（木）12:40-12:52

O-1

担子菌シイタケの Myb 型転写因子 Le.CDC5 と相互作用する新規 DNA 結合性タンパク質 CIPB
中沢威人, 金子真也，宮崎安将 1，山崎丘 2，勝川志穂 3，宍戸和夫（東工大・生命
理工

12:52-13:04

O-2

1 現・森林総研 2 現・JAXA

3 現・日本製紙）

担子菌シイタケの Myb 型転写因子 Le.CDC5 およびそのパートナーCIPB の標的遺伝子 ctg1
中沢威人，金子真也，宮崎安将 1，城島透 2，山崎丘 3 ，勝川志穂 4，宍戸和夫（東工大・生命理工 1 現・森林総研 2 現・RITE 3 現・JAXA 4 現・日本製紙）

13:04-13:16

O-3

木材腐朽担子菌においてセルロース分解酵 素系の 違いを与える分子生物学
的因子
加治佐 平，五十嵐圭日子，鮫島正浩（東大院・農生科・生材料）

13:16-13:28

O-4

Gibberella fujikuroi のフェロモンレセプター遺伝子 の単離と破壊株の作出
關波直子・寺岡

13:28-13:40

O-5

徹・有江

力

（東京農工大・院農生物制御）

イネいもち病菌の非相同末端再結合に関与 する遺 伝子 Khm70, Khm80 の欠損
変異株の解析
曾根

13:40-13:52

O-6

輝雄 1，阿部歩 1，芦澤武人 2（1 北大院農・応用菌学，2 中央農研）

Agrobacterium tumefaciens による形質転換法を利用 したアラキドン酸生産性糸状菌 Mortierella alpina 1S-4 株の脂肪酸組成改変安藤晃規，角田洋輔，櫻谷英治，小川順，清水 昌（京大院農・応用生命）

11 月 16 日（金）12:30-12:42

O-7

抽出液面固定化システムを用いたカビによ る抗カ ビ物質 6-pentyl-α-pyrone(6PP) の高濃度生産小田

12:42-12:54

O-8

忍・一色邦夫（メルシャン・生物資源研）

網羅的菌代謝物の比較解析システム
岡崎孝映 1、中島大輔 1、細内敦 1、櫻井望 1、飯島陽子 1、青木考 1 、鈴木秀幸 1、中島琢自 2 、小牧久幸 2、原山重明 2、柴田大輔 1（1 かずさ DNA 研究所、2NITE）

12:54-13:06

O-9

糸状菌 Aspergillus nidulans ヒスチジンキナーゼの機 能解析
金丸京子，松井哲児、鈴木麻子、山崎ゆかり、加藤雅士、小林哲夫 （名大・生命
農）5

13:06-13:18

O-10

糸状菌 Aspergillus nidulans の細胞壁構築シグナル伝達経路の解析
藤岡智則 1，水谷治 2 ，古川健太郎 2，佐藤奈津子 2，吉見啓 3，山形洋平 2，中島佑 2，
阿部敬悦 2,3（1 クミアイ化学・生科研，2 東北大院・農，3 東北大・未来研）

13:18-13:30

O-11

Aspergillus fumigatus の産生するトリプロスタチン類 の生合成遺伝子クラスタ
ーの同定
加藤直樹，鈴木宏和，高木海，高橋俊二，長田裕之

15:30-15:42

O-12（理研・中央研・抗生物質）

Aspergillus nidulans の低酸素応答に関するプロテオ− ム解析
志水元亨，藤井達也，桝尾俊介，藤田健作，北爪達也，伊藤尚志，高谷直樹 （筑波大院・生命環境）

15:42-15:54

O-13

米麹造りのポストゲノム解析
岩下和裕１,2、大北由佳１、河野美乃里１、西浦未華 2、冨村健太 1、坂本和俊１、山田
修１、三上重明(１酒総研・基盤, 2 広島大院・先端・生命機能)

15:54-16:06

O-14

麹菌 Aspergillus oryzae の Non-Syntenic 領域の転写制 御解析玉野孝一 1，佐野元昭 2，山根倫子 1 ，寺林靖宣 1，戸田智美 1，砂川美佐緒 1，小池英明 1，畑本修 3，海附玄龍 3 ，高橋理 3，小山泰二 3、旭井亮一 4、阿部敬悦 5、町田雅之 1,2 （1 産総研・セルエンジニアリング，2 金沢工業大・ゲノム研，3 野田産研，
4

16:06-16:18

O-15

産総研・生命情報工学研究センター，5 東北大院農・応生科）

Woronin body 形成に関与する麹菌 Aohex1 遺伝子の選択的スプライシングの生理的意義
岩崎健太郎 1，山下修一 2, 丸山潤一 1, 北本勝ひこ 1（東大院・農生科・1 応生工･2
生環生）

16:18-16:30

O-16

Localization and functional analyses of the AoSO protein in Aspergillus oryzae
Cristopher Salazar ESCAÑO, Jun-ichi MARUYAMA, Katsuhiko KITAMOTO (Dept. of
Biotechnol., Univ. of Tokyo)

16:30-16:42

O-17

麹菌 A. oryzae におけるエンドサイトーシスの 生理 学的機能解析
樋口裕次郎、正路淳也、有岡学、北本勝ひこ

6(東大院・農生科・応生工)

ポスター発表 P-1~P-50:
P-51~P-99:

P-1

11 月 15 日（木） 14:00-15:00（奇数番号）
15:00-16:00（偶数番号）
11 月 16 日（金） 13:30-14:30（奇数番号）
14:30-15:30（偶数番号）

リンゴ斑点落葉病菌の AM 毒素生合成遺伝子は複数コピー存在する．
播本佳明 1，児玉基一朗 2，山本幹博 3，尾谷浩 2，柘植尚志 1 (1 名大院生農・2 鳥取大農・3 岡山大

農)

P-2

トマトアルターナリア茎枯病菌において宿 主特異 的 AAL 毒素生合成遺伝子（ALT）クラス
ターが座乗する conditionally dispensable (CD)染色体
赤木靖典，赤松創，尾谷浩，柘植尚志 1，児玉基一朗

P-3（鳥取大農，1 名大院生農）

Fusarium oxysporum におけるピルビン酸脱炭酸酵素 遺伝子の破壊
本山愛，中原光一*, 川端砂矢香*, 金山典生*, 寺岡

徹, 有江

力

（農工大院農・*サントリー）
P-4

交配不全性糸状菌 Fusarium oxysporum における交配型遺伝子領域（MAT1）イディオモルフ
入換え体の作出
今井峻介・寺岡

P-5

徹・有江

力

（農工大院農・植物病理）Fusarium oxysporum の病原性遺伝子変異株の生物防 除活性緒方

綾 1，飯田祐一郎 1，黒田克利 2，柘植尚志 1（1 名大院生農，2 三重県科学技術振興センタ

ー）

P-6

アブラナ科野菜類炭疽病菌の効率的な遺伝 子ター ゲティング実験系の確立
寺田

P-7

寛，坪井基枝，牛丸拓磨，辻元人，久保康之（京府大院・農）ウリ類炭疽病菌の分裂酵母 tea1 ホモログ変異株を 利用した付着器形成に関与する Ca2+シグナル関連遺伝子の探索
坂口 歩・辻 元人・久保康之（京府大院農）P-8

ウリ類炭疽病菌の NADPHoxidase をコードする ClaNOX1、ClaNOX2 遺伝子の機能解析
大澤貴紀，辻P-9

元人，久保康之(京府大院･農)Mglig4 は Magnaporthe grisea の非相同末端結合修復 に関与する
鬼頭英樹，藤川貴志、西村麻里江（生物研）

P-10

イネいもち病菌 Magnaporthe oryzae のキチン合成酵 素の生長、分化、病原 性における役割の解析
本山高幸 1，落合奈緒子 1，工藤俊章 2（1 理研・中央研、2 長崎大・水産）

7

P-11

Aspergillus niger の分生子を用いたシアン非感 受性 呼吸系酵素遺伝子(aox1)の視覚的な発現
解析
服部貴澄，本田裕樹，木野邦器，桐村光太郎

P-12（早大・理工・応化）

クエン酸生産糸状菌 Aspergillus niger における NADP+依存性 isocitrate dehydrogenase 遺伝子(icdA)の高発現による代謝改変
林理恵，服部貴澄, 木野邦器, 桐村光太郎

P-13（早大・理工・応化）

麹菌 A. oryzae における後期エンドソーム構造 の同 定
正路淳也, 辰巳晶紀, 菊間隆志, 有岡学, 北本勝ひこ (東大院・農生科・応生工)

P-14

麹菌 A. oryzae における Rab family GTPase の網羅的解析
平田恭子，正路淳也，有岡学,北本勝ひこ

P-15（東大院・農生科・応生工）

A. oryzae 小胞体の糖タンパク質品質管理機構に関 連する遺伝子群の機能解析
渡邉泰祐 1,2，松尾一郎 1,2，戸谷希一郎 1,2，丸山潤一 3，北本勝ひこ 3，伊藤幸成 1,2（理研 1，CREST2，
東大院農生科・応生工 3）P-16

麹菌 A. oryzae における分泌タンパク 質 AmyB の動態解析
石川絵理，正路淳也，有岡学，北本勝ひこ

P-17（東大院・農生科・応生工）

麹菌 A. oryzae におけるペルオキシソーム生合 成因 子 AoPex11 の機能解析
Praveen Rao JUVVADI1、Cristopher Salazar ESCAÑO1 、金鋒傑 2 、高橋理 2 、小山泰二 2 、丸山潤一 1、
北本勝ひこ 1（1 東大院・農生科・応生工、2 野田産研）

P-18

麹菌 A. oryzae におけるキネシン様タンパク 質 AoKin3 を用いたエンドソームの動態解析
滝口鉄也、樋口裕次郎、正路淳也、有岡学、北本勝ひこ(東大院・農生科・応生工)

P-19

麹菌 A. oryzae におけるペルオキシソーム局在 配列 レセプターAoPex5, 7 の機能解析
田鍋康子, 岩崎健太郎,丸山潤一, 北本勝ひこ（東大院・農生科・応生工）

P-20

麹菌の産生する生分解性プラスチック分解 促進蛋 白質 RolA の疎水面への吸着 部位の特定
上原健二１ , 高橋徹 1 , 前田浩 2 , 山形洋平 2 , 長谷川史彦 1, 五味勝也 1 , 阿部敬悦 1(東北大・未来研 1 , 東北大・農・応生科 2)

P-21

麹菌の Ski 遺伝子群の探索と nonstop mRNA 分解 への関与
田中瑞己 1，徳岡昌文 2, 五味勝也 1

P-22

Aspergillus nidulans における protein O-mannosyltransferase 遺伝子群の機能解析
原田祐佳，松本翔，後藤正利

P-23（1 東北大院農・生物産業創成, 2 野田産研）（九大院・生資環）

麹菌 Aspergillus oryzae の潜在的なα‐マンノシダー ゼ活性について
芳賀

楓 1、赤尾健 2、山田修 2 、大町鉄雄 1、吉田

8

孝 1（1 弘前大・農学生命、2 酒総研）

P-24

糸状菌 Aspergillus nidulans のクラス III キチン合成酵素 ChsB の分生子形成、菌糸生長における役割
山田和成 1 、福田一治 1、山下修一 2 、堀内裕之 1 、太田明徳 1（東大院・農生科・1 応生工・2 生環生）

P-25

Rhizopus oryzae のキチン合成酵素新規クラス VIII について阿部歩，浅野行蔵，曾根輝雄（北大院農・応用菌学）

Aspergillus nidulans における pkcA 遺伝子の機能解析

P-26

内田博教，一宮維幸, 堀内裕之, 太田明徳
P-27

（東大院・農生科・応生工）

糸状菌 Aspergillus nidulans のミオシン様ドメイン を持つキチン合成酵素 CsmA、CsmB のドメイン互換性の解析
對崎真楠、竹下典男、堀内裕之、太田明徳（東大院・農生科・応生工）

P-28

Aspergillus nidulans における cell wall integrity 経路の解析と MAP kinase 遺伝子 mpkB の機能
解析
吉見啓 1 ，藤岡智則 2,3，丸井焞一郎 1，萩原大祐 1 ，佐藤奈津子 2，水谷治 2,4，古川健太郎 2,5，阿部敬悦 1,2（1 東北大・未来研，2 東北大院農・応生科，3 現・クミアイ化学工業㈱，4 現・酒類研，5 現・ヨー
テボリ大）

P-29

糸状菌 A. nidulans の速い先端成長を支える分子機 構の研究
1

堀尾哲也，2 紅朋浩，3Naimeh Taheri-Talesh， 3Berl R. Oakley（1 徳島大院・ヘルスバイオ，2 名古屋大院医系・分子標的，3 オハイオ州立大・分子遺伝）P-30

エノキタケがセルロース培養系において生 産する グリコシダーゼに関する研究
石黒真希，五十嵐圭日子，鮫島正浩

P-31（東大・農生科）

担子菌 Phanerochaete chrysosporium 由来 Cel6A の反応特性
五十嵐圭日子、石田卓也、和田昌久、鮫島正浩（東大院・農生科）

P-32

シイタケの子実体形成に特異的な新規ファ スシン クリン遺伝子 Le.flp1
宮崎安将 1，金子真也 2，砂川政英 1，山崎丘 2,3，宍戸和夫 2，中村雅哉 1，馬場崎勝彦 1（1 森林総研,
2P-33

東工大院生命, 3 現・JAXA）

担子菌 Coprinus cinereus 由来糖質加水分解酵素ファ ミリー６遺伝子の発現挙動
吉田

P-34

誠，福田清春（農工大・農）

シイタケにおけるリグニン分解酵素の解析
坂本裕一・中出啓子・佐藤利次

P-35（岩手生工研）竹バイオマス分解過程において担子菌が生 産する 菌体外タンパク質の解析
堀千明、五十嵐圭日子、鮫島正浩（東大院・農生科）

9

P-36

担子菌 Phanerochaete chrysosporium 由来ピラノース 酸化酵素のクローニングと大腸菌による
生産
福田

P-37

明，五十嵐圭日子，鮫島正浩（東大院・農生科）

バイオエタノール固体発酵に供する麹菌固 体培養 でのバイオマス分解酵素の大量生産
坂東弘樹，久田博元，石田博樹，秦洋二

P-38（月桂冠・総研）

バイオマスのグルコース変換を目指した麹 菌液体 培養でのセルロース分解酵素の大量生産
久田博元 1，長谷山陽平 1，石田博樹 1，秦洋二 1，近藤昭彦 2（1 月桂冠・総研，2 神戸大工・応化）

P-39

Trichoderma reesei の転写活性化因子 Xyr1 の機能解析
北上巨樹，Taki Koffi Alphonse，古川隆紀，志田洋介，小笠原渉，岡田宏文，森川 康 （長岡技科大・生物）
P-40

Trichoderma reesei 由来 Xylanase regulator 1 (Xyr1) の結合配列の解析
古川隆紀 1、志田洋介 1、小笠原 渉 1、岡田宏文 1 、加藤雅士 2 、小林哲夫 2、森川
（1 長岡技科大・生物、2 名大院・生命農）

P-41

Trichoderma reesei の固体培養条件下での糖質加水分 解酵素遺伝子の発現解析
齋藤勇司、関口裕久、小笠原

P-42

康1

渉、岡田宏文、森川康（長岡技科大・生物）

セルラーゼ高生産麹菌を用いた結晶性セル ロース の分解
中井喬彦 1，有岡学 1，川口剛司 2，荒井基夫 3，北本勝ひこ 1（1 東大院・農生科・応生工，2 阪府

大院・生環科，3 中部大・応生）

P-43

Trichoderma reesei 由来 3 種エンドグルカナーゼの酵 素学的性質
中澤光，岡田和士, 小林遼太, 小野寺朋子, 窪田哲也, 小笠原渉,

岡田宏文, 森川康

（長岡技科大・生物系）

P-44

Aspergillus oryzae における AoXlnR 類似転写因子の機能同定
金田貴詳，海附玄龍*，野口祐二，金丸京子，加藤雅士，小山泰二*，小林哲夫（名大院生命農・生物機構，*野田産研）

P-45

Aspergillus japonicus が産生する細胞外 β-キシロシダーゼをコードする遺伝子の構造解析
吉原浩司 1、脇山元気 1、林幸男 1 、太田一良 2（1 宮崎大・工・物質環境、2 宮崎大・農・応生

科）
P-46

Aspergillus japonicus には２種類の糖質加水分解酵 素ファミリー11 キシラナーゼ遺伝子が存在する
脇山元気 1、吉原浩司 1、林幸男 1 、太田一良 2科）

10（1 宮崎大・工・物質環境、2 宮崎大・農・応生糸状菌を用いたヤマイモ由来キチナー ゼ E の発現

P-47

太田康司，西北広信，池 正和，小笠原
P-48

渉，岡田宏文，森川 康（長岡技科大・生物）

麹菌ポストゲノム解析を支援する Aspergillus nidulans 発現用プラスミドの構築
石田博樹 1 、 秦洋二 1、 楠本憲一 2、 山形洋平 3 、 小出芳直 4 、 竹内道雄 5（1 月桂冠・総研、
2

P-49

食総研、

3

東北大院農・応生科、

4

5

天野エンザイム・研究部、

東京農工大院・応生科）

Aspergillus aculeatus における sC 選択マーカーを用 いた形質転換系の開発
足立浩美, 谷修治, 炭谷順一, 金政真 1, 荒井基夫 1, 川口剛司（阪府大院・生命・応生科, 1 中部大・
応生）

P-50

Aspergillus aculeatus ku80 遺伝子破壊による高頻度相 同組換え宿主の開発
辻篤史, 谷修治, 炭谷順一, 川口剛司（阪府大院生命・応生科）

P-51

Aspergillus aculeatus における pyrG，sC，niaD 三重欠損株の作出
國武絵美，足立浩美，谷修治，炭谷順一，荒井基夫 1，川口剛司（阪府大院生命・応生科，1 中部大応生・環境生化）
P-52

麴菌(Aspergillus oryzae)NS4 株に おける niaD 及び sC 遺伝子変異部位の同定
山田 修，林 梨咲，池田凉子，坂本和俊，岩下和裕，三上重明 （酒総研）

P-53

麹菌のプロリルアミノペプチダーゼ様遺伝 子産物 の組換え麹菌による生産と蛋白質の性質
松下真由美 1、楠本憲一 1、古川育代 1、鈴木
5

聡 1、小出芳直 2、石田博樹 3、山形洋平 4、竹内道雄、柏木豊 1 （1 食総研、2 天野エンザイム、3 月桂冠、4 東北大・院・応生科、5 東京農工大・院・応

生科）
P-54

麹菌 A. oryzae による異種タンパク質生産に及 ぼす α-amylase 発現抑制の効果
根本崇，丸山潤一，有岡学，北本勝ひこ

P-55（東大院・農生科・応生工）

麹菌 Aspergillus oryzae による cellobiose phosphorylase の分泌生産の検討
多田功生, 熊谷明夫 1, 鈴木聡, 楠本憲一, 天野良彦 1, 佐々木 堯, 柏木豊（食総研, 1 信州大院・工）P-56

アラキドン酸生産性糸状菌 Mortierella alpina 1S-4 における新規選択薬剤の探索及びマーカー遺伝子の評価安藤晃規、櫻谷英治、小川

P-57

順、清水

昌（京大院農・応用生命）

DNA リガーゼ遺伝子破壊による Cryptococcus neoformans 相同組換え効率への影響
清水公徳，李皓曼，渡辺哲，亀井克彦，山口正視，川本進（千葉大・真菌センター）

P-58

Production of Aspergillus fumigatus swollenin in A. oryzae
Xinai CHEN, Jun-ichi MARUYAMA, Manabu ARIOKA, Katsuhiko KITAMOTO (Dept. of Biotechnol.,
Univ. of Tokyo)

11

P-59

FTA 簡易ゲノム抽出法を用い た PCR-TTGE による味噌中の真菌叢の解析
鈴木聡，福岡真里,竹谷博子,

松下真由美,

多田功生,

楠本憲一,

柏木豊

（食総研）

P-60

液面固定化（LSI）システムによる麹菌酵素の生 産 性について
高木義弘、小田 忍＊、尾関健二、大箸信一（金沢工大・ゲノム研、＊メルシャン・生資研）

P-61

麹菌 A. oryzae のプロテアーゼ遺伝子発現解析 と nptB 破壊株によるヒトリゾチーム生産
木村信弥１，丸山潤一 1，竹内道雄２，北本勝ひこ１（東大院・農生科・応生工１，東農工大・農・応
生科２）

P-62

麹菌 A. oryzae における異種タンパク質生産時 のマ イクロアレイ解析
大野絢子，丸山潤一，有岡学，北本勝ひこ

P-63（東大院・農生科・応生工）

麹菌菌体内タンパク質解析条件の再検討
北川治恵，佐野元昭，大箸信一（金沢工大・ゲノム研）

P-64

P-65

米ヌカ培地で高発現するβ‐グルコシダー ゼの生 産条件の比較
尾関健二，中川浩志，近藤花菜，加治木佑紀子，篠島里江，佐野元昭，小田沢工大・ゲノム研 *メルシャン・生資研）

忍*，大箸信一 （金麹菌 A. oryzae の細胞質型ホスホリパー ゼ A2 の性質と機能
高谷康平、北本勝ひこ、有岡学（東大院・農生科・応生工）

P-66

ゲノム情報に基づく麹菌 Aspergillus oryzae 由来プロテアーゼ群の発現
片瀬徹 1, 星由紀子 1, 結城健介 1, 小出芳直 1, 竹内道雄 2, 山形洋平 3, 楠本憲一 4, 石田博樹 5(1 天野エンザイム, 2 東京農工大院・応生科, 3 東北大学・院・応生科, 4 食総研, 5 月桂冠・総研)

P-67

液体培養とフィルター培養における麹 菌 Aspergillus oryzae の熱応答比較解析
寺林靖宣 1、山根倫子 1、佐野元昭 2 、小池英明 1、大箸信一 2、町田雅之 1,2 (1 産総研、2 金沢工大)

P-68

黄麹菌菌蓋のプロテオーム解析
神太郎，竹内道雄（農工大院・応生化）

P-69

麹菌 Aspergillus oryzae の胞子形成制御系の解析
小川真弘, 徳岡昌文, 金鋒杰, 松島健一朗, 高橋理, 町田雅之ａ，小山泰二（野田産研，a 産総研）

P-70

麹菌の培養条件に応答したアミノ酸代謝制 御の解 析
小池英明1、寺林靖宣1 、山根倫子1、佐野元昭2、大箸信一2、町田雅之1,2（1産総研セルエンジニア、
2金沢工大）

P-71

麹菌の薬剤に対する転写応答解析と創薬標 的遺伝 子機能解析システムの構築
丸井淳一朗 1, 吉見

啓 1, 玉野孝一 2, 小池英明 2, 織田（1 東北大・未来研, 2 産総研, 3 金沢工大・ゲノム研）

12

健 3, 佐野元昭 3, 町田雅之 2, 阿部敬悦 1

P-72

麴菌の酸化ストレス条件下における遺伝子 発現と 転写制御因子 kapA についての解析
小竹学 1,2，坂本和俊 2 ，岩下和裕 1,2，山田

修 2 ，下飯仁 1,2，三上重明 2 （1 広島大・先端研，2 酒

総研）
P-73

Neurospora crassa の OS-2 MAP キナーゼは体内時計 により制御される遺伝子の調節に関与する
渡邊節子、高橋正和、山下和宏、坂野真平、福森文康、藤村真

P-74（東洋大・生命）

糸状菌 Aspergillus nidulans の His-Asp リン酸リレー系における農薬応答機構の解析
萩原大祐 1、水野猛 2、阿部敬悦 1 （1 東北大・未来研、2 名大院・生命農学）

P-75

Aspergillus nidulans ヒスチジンキナーゼ NikA の機 能解析
鈴木麻子, 金丸京子, 松林良博, 高見絵里香, 萩原大祐, 水野猛, 加藤雅士, 小林哲夫

（名大院生

命農・生物機構）
P-76

浸透圧アダプテーションにおける麴菌の遺 伝子発 現解析
西浦未華 1,2、坂本和俊 2、山田

P-77

修 2、岩下和裕 1,2、三上重明 2(1 広島大、2 酒総研)

アカパンカビの転写調節因子 ATF-1 は CRE 配列を認識してカタラーゼ cat-1 を制御する
山下和宏、渡邊節子、塩澤あずさ、福森文康、藤村真P-78

麹菌 A. oryzae における AoflbA 遺伝子破壊株の表現 型解析
山口悠，丸山潤一、北本勝ひこ

P-79(東洋大・生命)(東大院・農生科・応生工)

NsdD type GATA factor in Aspergillus fumigatus
Yoon-Hee Cheon, 1Hye-Ryun Kim, Jong Hwa Kim, 1Dong-Min Han and Kap-Hoon Han (Dept of Pharm.
Engineering, Woosuk Univ.)

P-80

糸状菌 CCAAT-box 結合因子によるリボソームタン パク質遺伝子の発現抑制機構
高橋明珠，佐野元昭＊，小林哲夫，加藤雅士（名大院生命農・生物機構、＊金沢工業大・ゲノム研）

P-81

糸状菌 CCAAT 結合因子サブユ ニットの発現・局 在性プロファイル
伊奈慎太郎，小林哲夫,

P-82

麹菌 A. oryzae の MAL クラスターの初期アミラーゼ 系酵素生産への関与
長谷川祥子，五味勝也

P-83

加藤雅士（名大院・生命農）（東北大院農・生物産業創成）

麹菌(Aspergillus oryzae)DNA トランスポゾン Crawler の転移活性とｍRNA 分子種変動に及ぼすストレス処理の影響
小笠原博信１、小畑 浩２、秦洋二２、高橋砂織１、五味勝也３（１秋田県農技セ・総食研、２月桂冠・総研、３東北大院農・生物産業創成）

13

P-84

麹菌 Aspergillus oryzae の転写制御関連遺伝子の破 壊と機能解析
戸田智美１，砂川美佐緒１，大澤靖子１，小川真弘２，徳岡昌文２，高橋 理２，小山泰二２，町田雅之１（１
産総研,２野田産研）

P-85

麹菌の低分子金属プロテアーゼ群の解析
山形洋平 1)，前田浩 1)，阿部敬悦 1)，内田隆史 1)，竹内道雄 2)，楠本憲一 3)，小出芳直 4)，片瀬徹 1,4)，
石田博樹 5)（1 東北大学・院・応生科，2 農工大・院・生物工学，3 食総研、4 天野エンザイム，5 月
桂冠）

P-86

麹菌機能未知 APase の解析
岡本綾子 1、森田寛人 1、山形洋平 2 、楠本憲一 3、小出芳直 4、石田博樹 5、竹内道雄 1（1 東京農工大学院・応生科、2 東北大院農・応生科、3 食総研、4 天野エンザイム・研究部、5 月桂冠・総研）

P-87

麹菌の新規アミノペプチダーゼ様遺伝子が コード する蛋白質の精製と性質
楠本憲一 1、松下真由美 1、古川育代 1、鈴木
5

聡 1、小出芳直 2、石田博樹 3、山形洋平 4、竹内道雄、柏木豊 1 （1 食総研、2 天野エンザイム、3 月桂冠、4 東北大・院・応生科、5 東京農工大・院・応

生科）

P-88

麹菌セリンタイプカルボキシペプチダーゼ の解析
1 1
森田寛人 1, 岡本綾子 1, 山形洋平 2, 楠本憲一 3, 小出芳直 4, 石田博樹 5, 竹内道雄（
東京農工大院・

応生科, 2 東北大院農・応生科, 3 食総研, 4 天野エンザイム・研究部, 5 月桂冠・総研）
P-89

シクロピアゾン酸生合成に関わる PKS/NRPS ハイブリッド型酵素の機能解析
勢〆康代 1、北本勝ひこ 2、海老塚豊 3、藤井勲 1（1 岩手医大・薬、2 東大院・農生科・応生工、3 東
大院・薬）

P-90

糸状菌由来メロテ ルペノイド化 合物生合成 に関与 するポリケタイド 合成酵素及び プレニル基転移酵素の機能解析
伊藤崇敬 1，勢〆康代 2,

P-91

久城哲夫 1, 海老塚豊 1（1 東大院・薬,2

岩手医大・薬）繰返し型タイプⅠポリケタイド合成酵素の 発現と 機能解析
森口

P-92

藤井勲 2,

智美、海老塚豊（東大院・薬）、藤井勲（岩手医大・薬）麹菌 A. oryzae の繰返し型タイプⅠポリケタイ ド合 成酵素遺伝子の発現と機能解析
守屋智博 1，勢〆康代 2, 北本勝ひこ 3, 藤井勲 2, 海老塚豊 1（東大院・薬 1,岩手医大・薬 2, 東大院・農生科・応生工 3）

P-93

麹菌のシクロピアゾン酸生産性に関する研 究
徳岡昌文 1 ，高橋理 1, 勢〆康代 2, 藤井勲 2, 北本勝ひこ 3, 小山泰二 1（1 野田産研、2 岩手医大・薬、
3

東大院・農生科）

14

P-94

タイ王国薬用植物からの生理活性物質生産 糸状菌 のスクリーニング
木下浩 1，Kanoktip Pansukusan1，木谷茂 1，五十嵐康弘 2 ，仁平卓也 1（1 阪大・生物工学国際交流

セ，２富山県大・工・生工)
P-95

酵母をホストとした Aspergillus fumigatus DHN-メラニン生合成系の再構成
南部夏希 1、藤井 勲 2、海老塚 豊 1 （東大院・薬 1、岩手医大・薬 2）

P-96

ヘルボール酸生合成に関与する糸状菌由来 オキシ ドスクアレン閉環酵素の機能解析
三ツ口尚志 1, 勢〆康代 2, 藤井勲 2, 渋谷雅明 1, 久城哲夫 1, 海老塚豊 1 (1 東大院・薬、2 岩手医大・
薬)

P-97

麴菌 LaeA は、コウジ酸生産に影響を及ぼす
織田健、佐野元昭、小林亜紀子、*久田博元、*石田博樹、*秦洋二、大箸信一（金沢工大・ゲノム研、*月桂冠・総研）
P-98

Aspergillus nidulans の亜硝酸耐性に関わる遺伝子の 単離と解析
鳴神寿昭，行木弥鈴，桝尾俊介，星野貴行，高谷直樹

P-99（筑波大・生命環境）

Fusarium oxysporum の硫黄還元機構
佐藤育男，安部剛史, 星野貴行, 高谷直樹

（筑波大院・生命環境）

15

Special Lecture I
The LaeA complex regulates development, secondary metabolism and virulence inAspergillus spp.
Nancy Keller, Departments of Plant Pathology and Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin,
Madison, USA

Abstract.

LaeA is a nuclear methyltransferase that transcriptionally regulates secondary metabolite gene clusters in thefilamentous fungal genus Aspergillus.

Deletion of this gene reduces virulence in both the human pathogen A.

fumigatus and the plant pathogen A. flavus.
production in ΔlaeA mutants.

Loss of virulence is attributed in part by diminishment of toxin

A whole genome comparison of the transcriptional profile of wild-type and laeAmutants (both ΔlaeA and overexpression laeA) of three different Aspergillus spp. indicates a global role of LaeA in
activating secondary metabolite gene clusters.

LaeA also is involved in the production of overwintering tissues

including cleistothecial production in A. nidulans and sclerotial production in A. flavus. Detailed studies of LaeA in
the genetic model A. nidulans indicates a novel mode of gene regulation by LaeA through chromatin remodeling whereloss of laeA results in increased heterochromatin formation and toxin gene cluster silencing.
formation of a nuclear complex with VeA-like proteins.

LaeA function requires

A model of LaeA involvement in epigenetic regulation of

secondary metabolite gene clusters will be presented.

16

Special Lecture II
The Mechanism of Woronin body biogenesis
Gregory Jedd, Temasek Life Sciences Laboratory & Department of Biological Sciences, 1 Research Link, The
National University of Singapore, Singapore 117604
Hyphae are the predominant mode of cellular organization in the fungi and in most species these filamentous
cells are compartmentalized by perforate septa, which allow intercellular cooperation and communication.

Woroninbodies are peroxisome-related organelles unique to Euascomycetous filamentous fungi, where they function to seal the
septal pore in response to cellular wounding [1, 2].

This organelle is centered on a Euascomcyete-specific protein,

HEX, which utilizes a peroxisome targeting signal-1 (PTS1) for localization to the peroxisome matrix [3] where it
self-assembles to produce a solid micrometer-scale protein assembly [3, 4]. In hex deletion mutants [3, 5-7] or hex
mutants that disrupt self-assembly [4], hyphae bleed protoplasm following cellular wounding and display a variety of
secondary defects including impaired invasive growth of the plant pathogen Magnaporthe grisea [6]. Thus, Woroninbodies provide an important adaptive function that supports the unique cellular architecture of Euascomycetes.
Woronin body biogenesis is believed to involve a multi-step process where HEX assemblies bud from theperoxisome matrix in apical compartments and subsequently associate with the cell cortex in a manner that roughly
coincides with septation [8, 9].

Cortical association retains Woronin bodies in sub-apical compartments, and thisprocess constitutes a form of organelle inheritance, which ensures that all hyphal compartments contain a complementof Woronin bodies. Structures where Woronin body cores appear to be budding from the peroxisome matrix have also
been observed by thin-section electron microscopy [10], suggesting that protein sorting underlies the biogenesis ofthese organelles.
We employed a forward genetic screen to isolate mutants defective in Woronin body formation and function.
This screen identified a large number of Neurospora peroxins. In addition, we identified wsc (Woronin sorting
complex), a membrane protein specifically associated with Woronin body biogenesis. In wsc mutant hyphae, HEX
assemblies accumulate to high levels in the apical compartment and fail to segregate into sub-apical compartments.
Video microscopy further shows that these assemblies fail to bud from the peroxisome and instead move randomly inthe peroxisomal matrix.

wsc was identified by positional cloning and encodes a novel membrane protein. WSC is

localized to the membrane of unusually large peroxisomes where it forms detergent-resistant oligomers that envelop
HEX assemblies to produce asymmetric nascent Woronin bodies. These structures are delivered to the cell cortex in areaction that also requires WSC and this permits partitioning and inheritance of the newly formed Woronin bodyorganelle. Together, our findings suggest that WSC and HEX collaborate and control distinct aspects of Woronin bodybiogenesis; cortical association depends critically on the assembly of WSC, which in turn depends on HEX.

This

dependency helps order events across the organellar membrane and permits the peroxisome to produce a second
organelle with a distinct composition and intracellular distribution.

1.
2.
3.
4.
5.

Trinci, A.P.J. and A.J. Collinge, Occlusion of Septal Pores of Damaged Hyphae of Neurospora crassa by
Hexagonal Crystals. Protoplasma, 1973. 80(1-3): p. 57-67.
Markham, P. and A.J. Collinge, Woronin Bodies of Filamentous Fungi. Fems Microbiology Reviews, 1987.
46(1): p. 1-11.
Jedd, G. and N.H. Chua, A new self-assembled peroxisomal vesicle required for efficient resealing of the plasma
membrane. Nat Cell Biol, 2000. 2(4): p. 226-231.
Yuan, P., et al., A HEX-1 crystal lattice required for Woronin body function in Neurospora crassa. Nat Struct
Biol, 2003. 10(4): p. 264-270.
Tenney, K., et al., hex-1, a gene unique to filamentous fungi, encodes the major protein of the Woronin body and17

functions as a plug for septal pores. Fungal Genet & Biol, 2000. 31(3): p. 205-217.
Soundararajan, S., et al., Woronin Body Function in Magnaporthe grisea Is Essential for Efficient Pathogenesis
and for Survival during Nitrogen Starvation Stress. Plant Cell, 2004. 16(6): p. 1564-74.
7.
Maruyama, J., et al., Three-dimensional image analysis of plugging at the septal pore by Woronin body duringhypotonic shock inducing hyphal tip bursting in the filamentous fungus Aspergillus oryzae. Biochem Biophys
Res Commun., 2005. 331(4): p. 1081-8.
8.
Momany, M., et al., Mapping Woronin body position in Aspergillus nidulans. Mycologia, 2002. 94(2): p.
260-266.
9.
Tey, W.K., et al., Polarized gene expression determines Woronin body formation at the leading edge of thefungal colony. Mol. Biol. Cell, 2005. 16: p. 2651-2659.
10. Wergin, W.P., Development of Woronin bodies from microbodies in Fusarium oxysporum f.sp lycopersici.
Protoplasma, 1973. 76: p. 249-260.
6.

18

S-1-1

麹菌における隔壁孔を介した細胞間コミュニケーション
丸山潤一（東京大学大学院農学生命科学研究科 応用生命工学専攻）【はじめに】
麹菌 Aspergillus oryzae は古くから日本酒、醤油、味噌の醸造に用いられ、その歴史は約千年にわたる。現在では、アミラーゼなどの酵素生産や異種タンパク質生産の宿主としても用いられている。
A. oryzae の菌糸では多数の細長い細胞が連なっており、隣接する細胞は隔壁で仕切られる。隔壁の中心には隔壁孔と呼ばれる小さな穴が空いている。演者らは以前、A. oryzae を寒天培地に生育させ、コロニーに水をかけて低浸透圧ショックを与えると、菌糸先端から細胞内容物が噴き出して溶菌する現象を見出した 1)。溶菌した先端細胞に隣接する細胞を観察すると、溶菌が伝播しておらず、細胞内容物が維持されていた。さらに培養を続けると、この細胞から溶菌した先端細胞内に菌糸内菌糸が形成された 2)。以上のことから、通常の生育時は隣接する細胞どうしが隔壁孔を通じて連絡しあい、溶菌時にはなんらかの細胞内構造が隔壁孔をふさいで生存を維持するシステ
ムが存在することが推測された。
日本酒醸造の麹造りでは固体培養で麹菌を生育させるが、もろみを仕込む際に麹菌は水の中に投入される。このことは、低浸透圧ショックによる溶菌が、醸造の現場でも起きることを意味している。本講演では、A. oryzae の隔壁孔を介した細胞間コミュニケーションに関する、我々のこれまでの知見を紹介する。
【Woronin body の可視化】
Woronin body は子嚢菌類糸状菌および類縁の不完全菌類糸状菌に特異的に存在するオルガネラである。このオルガネラは隔壁近傍に観察され、菌糸損傷時には隔壁孔をふさぐことで溶菌の伝播を防ぐ役割をもつ。ロシアの生物学者 Woronin による発見(1864 年)から 140 年あまり経過しているが、その分子レベルでの解析は最近までまったく進んでいなかった。
2000 年に Jedd 博士により、アカパンカビ Neurospora crassa から Woronin body を構成するタンパク質 Hex1 が初めて同定された 3)。A. oryzae のゲノム配列にも hex1 相同遺伝子(Aohex1)が存在したことから、これをクローニン
グして Woronin body の動態の可視化を試みた 1)。Woronin body は赤色蛍光タンパク質 DsRed2 を
AoHex1 に融合することで、また隔壁は分泌酵素 RNase T1 に緑色蛍光タンパク質 EGFP を融合したタンパク質を発現させることで可視化した。寒天培地上に生育させたコロニーに低浸透圧ショックを与え、溶菌した細胞に隣接する隔壁を共焦点レーザー顕微鏡により観察した。その結果、Woronin body が隔壁孔をふさぐ様子を、生きている細胞で可視化することに成功した。したがって、低浸透圧ショックによる溶菌において Woronin body が溶菌の伝播を防ぐ機能を有していることが示唆された。
【AoHex1 タンパク質の機能解析】
透過型電子顕微鏡観察下では、N. crassa の Woronin body は六角形をしているが、A. oryzae は球状の形態として観察される。Aohex1 遺伝子の破壊株を取得し、透過型電子顕微鏡で観察すると、Woronin body が消失した 1,4)。低浸透圧ショックによって先端細胞の溶菌を誘導した結果、Aohex1
遺伝子破壊株では隣接する細胞にも溶菌の伝播が認められた。以上の結果より、AoHex1 タンパク質が Woronin body の形成および機能に必要であることを明らかにした。また、Aohex1 遺伝子破壊
株は細胞壁に作用する薬剤 Congo red および micafungin に対して感受性を示した 5)。
Aohex1 遺伝子は、選択的スプライシングにより２つの異なる遺伝子産物を発現する 1)。一方で、
N. crassa hex1 遺伝子において選択的スプライシングは起こらない。非スプライシング型 AoHex1タンパク質は、スプライシング型 AoHex1 に 50 アミノ酸が挿入されたかたちで発現する。選択的
スプライシングの意義を調べるため、スプライシング型または非スプライシング型 AoHex1 を

19

Aohex1 遺伝子破壊株で発現する株を作製した。そして、低浸透圧ショックで隣接する細胞に溶菌が伝播するかどうかを指標に相補解析を行った。この結果、スプライシング型発現株では破壊株の表現型が相補されたが、非スプライシング型発現株では相補が認められなった 6)。
Hex1 タンパク質はペルオキシソーム局在配列 PTS1 (Peroxisome Targeting Signal 1)を有することから、これまでに Woronin body 形成へのペルオキシソームの関与が指摘されている。現在、ペルオキシソームの形成に関与する Aopex 遺伝子の破壊をすることで、Woronin body の形成過程への影響を調べている 7,8)。また演者らは、in vitro で AoHex1 が protein kinase C (PKC)によりリン酸化されること、PKC 阻害剤存在下では AoHex1 の局在が異常になることを明らかにした 9)。
【AoSO タンパク質の局在解析】
最近、海外の２つのグループが隔壁孔に局在するタンパク質を報告している。N. crassa SO は菌
糸融合に必要なタンパク質であり、細胞質に局在し、溶菌時に隔壁孔に蓄積する 10) 。Sordaria
macrospora の有性生殖に関与する Pro40 は SO に相同なタンパク質であるが、Woronin body と共局
在し、溶菌時に隔壁孔に観察される 11)。我々は、A. oryzae のゲノム配列より SO/Pro40 をコードする遺伝子と相同性を示す遺伝子を見出し、Aoso と命名した。EGFP との融合によって局在解析を行った結果、AoSO は細胞質に観察されたが、様々なストレス条件（高温、低温、高 pH、低 pH、炭素源枯渇、窒素源枯渇）で隔壁孔に局在することがわかった 12)。このことから、生育環境によって AoSO が細胞間連絡を制御している可能性が示唆された。現在、Aoso 遺伝子の破壊株を取得して表現型を解析している。
【おわりに】
これまでに演者らは、多細胞真核生物としての麹菌の姿に焦点を当てて研究を行ってきた。麹菌の隔壁を介した細胞間連絡は、動物のギャップ結合や植物の原形質連絡のような、多細胞生物の恒常性を維持するための共通の機構と考えられる。今後、細胞間連絡に関するさらなる解析により、醸造や酵素生産における麹菌の生育特性の理解が深まることを期待したい。

1) J. Maruyama et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1081-1088 (2005)
2) J. Maruyama et al. Fungal Genet. Biol. 43, 642-654 (2006)
3) G. Jedd and N. H. Chua Nat. Cell Biol. 2, 226-231 (2000)
4) 内田博教ら、日本農芸化学会 2006 年度大会要旨集 p. 98
5) 丸山潤一ら、日本農芸化学会 2007 年度大会要旨集 p. 31
6) 岩崎健太郎ら、日本農芸化学会 2007 年度大会要旨集 p. 31
7) P. R. JUVVADI ら、日本生物工学会 2007 年度大会要旨集 p. 127
8) 田鍋康子ら、2007 年糸状菌分子生物学コンファレンス要旨集
9) P. R. Juvvadi et al. Biochem. J. 405, 533-540 (2007)
10) A. Fleissner and N. L. Glass Eukaryot. Cell 6, 84-94 (2007)11) I. Engh et al., Eukaryot. Cell 6, 831-843 (2007)
12) C. Escaño ら、日本農芸化学会 2007 年度大会要旨集 p. 31

Intercellular communication through the septal pore in Aspergillus oryzae
Jun-ichi MARUYAMA, Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo

20

S-1-2O-グリコシレーションによって制御される糸状菌の正常な形態形成後藤正利（九州大学大学院農学研究院

生物機能科学部門）

はじめに
麹菌はその安全性と優れた酵素生産性を示すことから、我が国で盛んに使用されている重要な微生物であり、外来遺伝子の発現分泌宿主菌としても注目を浴びている。真核生物の菌体外へのタンパク質分泌には小胞体、ゴルジ体を経由する過程が必須であり、この過程でタンパク質は糖鎖修飾される。糖鎖修飾には N-結合型と O-結合型が存在する。前者では酵母菌からヒトに至るまで基本的な部分で多くの共通点が認められるが、タンパク質の Ser/Thr 残基中の水酸基に糖が結合した O-グリコシレーションでは、N-グリコシレーションのような明確な糖鎖結合アミノ酸モチー
フは認められない。また、由来生物種によって構成糖やその結合様式が極めて多様である。本講では、Aspergillus nidulans の O-グリコシレーションの役割としての形態維持に関する話題を紹介したい。
1.糸状菌の O-グリコシレーション
真菌類の O-結合型糖鎖は、出芽酵母では直鎖状で 1~5 残基からなるマンノース鎖、Aspergillus
属糸状菌では 1~3 残基からなる直鎖状及び分岐したマンノース鎖や、量比は低いがガラクトー
スやグルコースも構成糖として含む。A. nidulans の O-結合型糖鎖合成酵素群には、その初発反応
で あ る タ ン パ ク 質 Ser/Thr 残 基 へ の マ ン ノ ー ス の 転 移 反 応 を 触 媒 す る protein:
O-D-mannosyltransferase (Pmt)、さらに続く糖転移反応を触媒する a-mannosyltransferase (Mnt) 及びgalactosyltransferase (Gct) が含まれる。A. nidulans には少なくとも 3 種の pmt 遺伝子 (pmtA、pmtB、
pmtC)、３種の mnt (mntA、mntB、mntC)、２種の gct と推定される遺伝子が存在する。
２．pmt 破壊株の表現型
pmt 遺伝子はいずれも菌の生育にともなって一定量発現していることから、糸状菌の生育に重要であることが示唆される。A. nidulans の各 pmt 破壊株を構築し、O-グリコシレーションの部分的欠損による形態への影響について調べた。pmtA 破壊株では、親株に比べ、特に低浸透圧培地において菌糸伸長能及び分生子形成能が著しく低下する。菌糸は所々にその中程が膨らむ異常構造を形成する。高浸透圧培地では菌糸伸長能や菌糸の異常構造が正常化する。また、pmtA 破壊株は細胞壁合成阻害剤に対し高感受性となる。従って、PmtA による糖鎖付加は細胞壁構造を正常に保つ役割がある。pmtB 破壊株では、菌糸伸長には影響しないが、菌糸の分岐度が増す。pmtC 破壊株
は、親株に比べコロニー形成が著しく遅くなり、分生子形成が不能となる。pmtA 破壊株と同様、
高浸透圧培地でコロニー形成速度は部分的に回復するが、通常の生育条件では分生子形成は回復しない。菌糸は、全ての部位で膨らんだ構造となる。すなわち、pmtA、pmtB、pmtC 破壊株の表現
型は互いに異なっており、Pmt は各々分泌タンパク質に対する固有の基質特異性を持っている。pmt
破壊株では、糖鎖付加されるべき分泌タンパク質が O-結合型糖鎖付加されないことで、本来の機能を発揮できなくなり、生育に負の影響を及ぼすと考えられる。このことは、わずか３残基程度の単純な糖鎖が糸状菌細胞の生育を制御維持していることを意味している。
mnt 破壊株の表現型
mnt のうち mntA 及び mntC は構成的に発現しているが、mntB は培養後期及びストレス条件下
で発現が強く誘導されることから、これら mnt の機能の相違が示唆される。mntA と mntC のそれぞれの破壊株は、互いに同一の表現型を示す。これらの破壊株のコロニーは極めて小さく、細胞は糸状ではなく丸く膨潤した異常構造となる。また、これらの破壊株は pmt 破壊株よりも生育抑制の程度が大きいことから、MntA、MntC が N-グリコシレーションにも関与している可能性が示唆される。一方、mntB 破壊株では、高温や抗真菌薬剤に対する感受性が増しており、MntB の機能がストレス応答に関係していることが示唆される。
3.

21

おわりに
出芽酵母においては、PMT の基質タンパク質として、細胞壁のストレスセンサータンパク質
Wscp や Mid2p、細胞融合に関与する Fus1p、出芽位置決定に関与する Axl2p が同定されている。
pmt 破壊株では、これらのタンパク質は糖鎖の欠損によってプロテアーゼによる分解や不適切な局在へと導かれ、機能が失われる。一方、糸状菌では、Pmt や Mnt の基質タンパク質は同定されていない。出芽酵母 WSC1 と相同性を示す A. nidulans wscA 遺伝子の破壊株は、pmtA 破壊株に類似した表現型を示すことから、WscA が PmtA の基質タンパク質の一つであると推定している。
A. nidulans pmt 破壊株では、特に細胞壁や膜画分のタンパク質において、野生株に比べ特異的に消失、あるいは低分子化したタンパク質が見いだされる。これらの糖タンパク質は、菌糸の伸長や分岐を行ないながら発達し分化を行なう糸状菌の正常な形態形成に重要な機能をもっているものと考えられる。

Protein O-glycosylation modulates fungal morphogenesis
Masatoshi Goto
Department of Bioscience & Biotechnology, Faculty of Agriculture, Kyushu University22S-1-3Aspergillus nidulans の隔壁形成と形態形成 における各種キチン合成酵素の機能
堀内裕之（東京大学大学院農学生命科学研究科）
糸状菌の隔壁は菌糸の強度を保つ一方で一部の菌糸に起きた菌糸損傷の影響を狭い範囲にとどめる等、糸状菌が生育してゆく上で重要な役割を果たしていると考えられる。子嚢菌類に属する糸状菌の隔壁は、キチン、グルカンなどの多糖を主要構成成分とし、その中央に小さな穴が存在するが知られているが、隔壁合成の分子レベルでのメカニズムについてはいまだ未解明の部分が多い。一方、糸状菌は胞子形成器官を分化させることから酵母などに比べて非常に複雑な形態形成を行う。形態形成のメカニズムを解明することは、糸状菌の産業上有用な面の分子レベルでの育種、動植物病原菌に対する抗真菌剤、農薬の開発とうに重要な情報をもたらすと考えられる。
糸状菌の形態形成において細胞壁が重要な役割を持つことが明らかにされてきているが、その細胞壁の主要構成成分は子嚢菌類の糸状菌においてはやはりキチンとグルカンである。これらのことから演者らのグループではキチン代謝関連酵素に注目してこれら酵素の隔壁形成、形態形成における機能解析を行っている。本講演ではこのうちキチン合成酵素について述べる。
菌類のキチン合成酵素は現在その構造から７種のクラス（クラス I〜VII）に分類されており、近年の酵母、糸状菌の全ゲノム配列の解析より酵母 Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans など
ではクラス I、
II、IV の 3 種のクラスのキチン合成酵素をコードする遺伝子しか持たないのに対し、糸状菌では数種以上のキチン合成酵素遺伝子を持ち、特に子嚢菌類の糸状菌では一般にすべてのクラスのキチン合成酵素をコードする遺伝子を少なくとも一つは持つことが明らかになりつつある。このように糸状菌には多種のキチン合成酵素遺伝子が存在する。Aspergillus nidulans にはその全ゲノム配列から８種のキチン合成酵素をコードする遺伝子が存在するが、演者らのグループではこのうちクラス I〜VI の６種キチン合成酵素遺伝子産物、それぞれ ChsC、ChsA、ChsB、ChsD、
CsmA、CsmB についてその役割の解析を行ってきた（図１）。このうちクラス V と VI のキチン合
成酵素 CsmA と CsmB はそれぞれのキチン合成酵素ドメインの N 末端側にアクチンの上を走るモータータンパク質であるミオシンと相同性を示すドメインを有する非常にユニークな構造を持つ。
このような構造を持つタンパク質は S. cerevisiae、C. albicans などには存在しないが、これまで全ゲノム配列が決定された細胞壁のキチン含量が比較的高い二形性酵母、糸状菌には普遍的に存在する。
1．隔壁形成におけるキチン合成酵素の役割
上記６種の遺伝子の破壊株についてその隔壁の構造について検討したところ、chsA、chsC、
chsD の一遺伝子破壊株については異常が認められなかったが chsA chsC の二重破壊株においては隔壁が肥厚化し、隔壁孔が大きく、隔壁の形成位置にも異常が見られた(1)。csmA、csmB の一遺伝子破壊株においては隔壁の構造自体には異常が見られなかったが、隔壁を起点として菌糸の中に新たな菌糸を生じる菌糸
内菌糸が観察された(2,3)。chsB の一遺伝子破壊株においては隔壁構造の異常も一部観察されたが、菌糸内菌糸の形成も観察された。一方、これまでクラス IV の ChsD を除く 5 種の

23

クラ ス

総 アミ ノ酸 数

ChsC

I

983

ChsA

II

1013

ChsB

III

916

III

(905)

ChsD

IV

1184

CsmA

V

1852

CsmB

VI

1739

VII

(739)

AN4367.3

AN1046.3

図１

A. nidulansのキ チン 合 成酵 素

推定上のアミノ酸数をカッコで示した。

キチン合成酵素についてタグをつけたタンパク質の細胞内における局在性について検討したとこ
ろそのすべてが形成中の隔壁に存在し、隔壁形成の終了とともに消失することが明らかになった(1-3)。
しかしこの局在には 2 つのパターンがあり、隔壁形成中その隔壁全体に分布するもの（ChsC、
CsmA、CsmB）と隔壁の形成に伴ってその先端部分、つまり細胞壁側から菌糸中央部へと移動してゆくもの（ChsA、ChsB）の 2 種類に分類された。以上のことから少なくともこれら５種のキチン合成酵素が隔壁の形成に関与することが推定された。
２．菌糸先端生長、形態形成におけるキチン合成酵素の役割
キチン合成酵素遺伝子破壊株における菌糸生長・形態形成への影響について検討したところ、
chsB 破壊株では菌糸生長が大きく阻害され非常に小さなコロニーを形成するのみであり分生子形
成も全く起こらなかった。さらに ChsB とタグとの融合タンパク質が菌糸先端、分生子形成器官に分布することも示されており、ChsB の先端生長、分生子形成器官の分化への関与が強く示唆された。また csmA、csmB それぞれの一遺伝子破壊株は類似の性質を示し、菌糸の途中がふくらむバルーンの形成、低浸透圧下での頻繁な溶菌などがみられた。また csmA csmB の二重破壊は合成致死を示すことから A. nidulans の生育には少なくともこれら遺伝子のどちらかは必須であることが示された(3)。一方、chsA、chsC は一遺伝子破壊では大きな表現型の変化を引き起こさないが、二重破壊では様々な変化がみられた。この二重変異株では細胞壁のキチン含量が増加しており、何らかの細胞壁修復機構が活性化していることが示唆されたが、chsA chsC csmA の３重破壊株は chsA
chsC 二重破壊株、csmA の一遺伝子破壊株と比較して生育が非常に悪いことからこの修復機構に
CsmA が関与していることが考えられた(4)。また chsA chsC 二重破壊株では分生子形成効率が極度に低く、その分生子形成器官が MedA、AbaA などの分生子形成に関わる転写因子、またはその関連遺伝子の変異株と類似した異常な構造を示すが、chsA chsC 二重変異株において分生子形成の際の abaA の発現が遅れることが明らかになった(5)。以上のことから chsA chsC 二重変異株では何らかのシグナル伝達系が活性化し、CsmA による細胞壁の修復を誘導するとともに分生子形成を抑えている可能性が示唆された。
以上述べてきたように糸状菌の隔壁形成・形態形成におけるキチン合成酵素の関与は非常に複雑であり、もう一つの細胞壁主要構成成分であるβ-1,3-グルカンの合成酵素をコードする遺伝子が糸状菌には一般に 1〜2 個しか存在しないのとは対照的である。またキチン分解酵素遺伝子も一般に十数種存在することが全ゲノム配列情報より明らかになっており、この中には主に自己溶菌に作用するものも存在するが(6)、何故このように多くの種類のキチン関連酵素が必要であるのかは
非常に興味深い問題であり、今後の更なる解析によってこれらの理由が明らかになることが期待
される。
参考文献
1. Ichinomiya, M., E. Yamada, S. Yamashita, A. Ohta, and H. Horiuchi (2005) Eukaryot. Cell 4:1125-1136.
2. Takeshita, N., A. Ohta, and H. Horiuchi (2005) Mol. Biol. Cell 16:1961-1970.
3. Takeshita, N., S. Yamashita, A. Ohta, and H. Horiuchi (2006) Mol. Microbiol. 59:1380-1394.
4. Yamada, E., M. Ichinomiya, A. Ohta, and H. Horiuchi (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:87-97.
5. Ichinomiya, M., A. Ohta, and H. Horiuchi (2005) Curr. Genet. 48:171-183.
6. Yamazaki, H., D. Yamazaki, N. Takaya, M. Takagi, A. Ohta, and H. Horiuchi (2007) Curr. Genet. 51:89-98.
Functions of Chitin Synthases in Septum Formation and Morphogenesis in Aspergillus nidulans.
Hiroyuki Horiuchi
Department of Biotechnology, The University of Tokyo.

24

S-1-4担子菌ウシグソヒトヨタケ子実体の 柄伸長に関わる遺伝子
eln1 と eln6 のクローニング
村口 元１、鎌田 堯２（１秋田県立大学生物資源科学部応用生物科学科、２岡山大学大学院自然科学研究科）
eln1 遺 伝 子の クロ ー ニン グ
担子菌ウシグソヒトヨタケでは、通常、二核菌糸が子実体を形成する。それゆえ子実体形成過程に欠損を示す突然変異体を得るために、二核菌糸株（5026+5132）に対して突然変異誘発処理が行われ、様々な欠損を示す優性突然変異体が単離された１）。ニトロソグアニジン処理により誘発された NG0398 株は、子実体の柄の伸長が起こらなくなる優性突然変異体（elongationless）であった。
その原因遺伝子 eln1-1 は栄養要求性マーカーとの連鎖解析により第 I 染色体上の his5 遺伝子近傍にマッピングされた２）。1980 年代の初めに、野外から新たに採取されたウシグソヒトヨタケから単胞子分離によって得られた一核菌糸株の中に、一核菌糸であるにも関わらず子実体形成を行う株（CopD5-12）が見い出され、この株に対して紫外線照射して、子実体形成過程の劣性突然変異体が単離された３）。この中に、eln1 遺伝子座の対立遺伝子と思われる eln1-2 劣性突然変異が見い出された。eln1-1 および eln1-2 変異体では、柄細胞が伸長せずに膨らむというだけでなく、傘上部にあるヴェール細胞も伸長せずに膨らむという表現型を示す。
アメリカのマサチューセッツ工科大学のブロード研究所で、本菌の Okayama-7 株を使ってゲノ
ムプロジェクトが行われ、2003 年にドラフトシークエンスが公開された４）。私たちは、Okayama-7株のゲノム DNA を使って、BAC（Bacterial artificial chromosome）ライブラリーを構築し、FPC（FingerPrintContig）解析を行い、BACFinder プログラムを用いて、公開ゲノム情報上に BAC クローンを位置付けて行った。BAC ベクターには本菌の trp1 遺伝子を組み込んでいるので、trp1 栄養要求性株の形質転換実験に BAC DNA を直接使うことができる５）。
eln1 野生型遺伝子を特定するために、形質転換受容菌株である B87（eln1-2 trp1-1, 1-6）株を構
築し、
eln1 遺伝子座を含むと期待される his5 遺伝子座近傍の BAC DNA を導入して行ったところ、
s2F7 クローンに eln1+活性があることを突き止めた。オーバーラップクローンの s14B9 クローンにも eln1+活性があったので、s14B9 よりサブクローンを作って eln1+活性を調べ、活性領域を 15 kb
ほどに狭めることができた。この領域にゲノムブラウザ上で出芽酵母の Cdc3 様セプチンをコードしている遺伝子が予測されていたので、セプチン遺伝子の前後 1 kb ほどを含む約 3 kb のゲノム
DNA を PCR によって増幅し、trp1+遺伝子とともに DNA 導入実験を行ったところ、eln1+活性を確認することができた。優性突然変異 eln1-1 では、第５イントロンの 5’-junction の GT が TT に変異していた。劣性突然変異 eln1-2 では、プロモーター領域の変異であろうと思われる。これらの変異と表現型がどのように結びついているのかについて、さらに実験を進めているところである。
eln6 遺 伝 子の クロ ー ニン グ
1980 年代の初めに、交配型因子 A および B の両方に突然変異を持つ AmutBmut 株が構築され、一核性子実体形成を示すことが示された６）。この AmutBmut 株を片親にした F1 子孫をマッピング集団として、RAPD および RFLP マーカーによる連鎖地図を作成し、本菌の各染色体に対応する 13の連鎖群を明らかにした７）。この AmutBmut 株に紫外線照射して、柄の伸長しない eln6-1 劣性突然変異体（#57’）を得た。この変異体の柄細胞は、まっすぐに伸長せず、蛇行していた。この株を野生型株と交配し、得られた F1 子孫における遺伝子型の分離を調べ、連鎖する RAPD マーカーを検索したところ、第 XIII 染色体に eln6 遺伝子が座乗することが判明した。形質転換受容菌株（eln6-1
trp1-1, 1-6）を構築し、第 XIII 染色体に位置付けた BAC クローンを導入して行ったところ、s3G11
クローンに eln6+ 活性のあることを突き止めた。サブクローンおよび候補遺伝子の PCR 断片の形
質転換活性を調べ eln6 遺伝子を特定したところ、eln6 遺伝子は、すでに本菌で eln3 遺伝子産物として同定されていた糖転移酵素８）と非常によく似たタイプの糖転移酵素をコードしていることが分かった。
今後は、柄の伸長欠損突然変異体から同定できた遺伝子産物が細胞内で互いにどのように機能して子実体成熟期の急激な柄細胞の伸長を可能にしているのかを明らかにしたい。

25

参考文献
1) Takemaru, T. & Kamada, T. (1972) Bot. Mag. Tokyo 85, 51-57.
2) Takemaru, T. (1982) in Experimental Methods in Microbial Genetics, ed. Ishikawa, T. (Kyoritsu
Publishing Company, Ltd., Tokyo), pp. 355-356.
3) Muraguchi, H., Takemaru, T. & Kamada, T. (1999) Mycoscience 40, 227-235.
4) http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/coprinus_cinereus/Home.html
5) Muraguchi, H., Kamada, T. & Yanagi, S. O. (2005) Mycoscience 46, 49-53.
6) Swamy, S., Uno, I. & Ishikawa, T. (1984) J. Gen. Microbiol. 130, 3219-3224.
7) Muraguchi, H., Ito, Y., Kamada, T. & Yanagi, S. O. (2003) Fungal Genet. Biol. 40, 93-102.
8) Arima, T., Yamamoto, M., Hirata, A., Kawano, S. & Kamada, T. (2004) Fungal Genet. Biol. 41,
805-812.

Cloning of the eln1 and eln6 genes involved in stipe elongation of Coprinus cinereus.
Hajime Muraguchi1, Takashi Kamada2
1
Department of Biotechnology, Faculty of Bioresource Sciences, Akita Prefectural University
2
Department of Biology, Faculty of Science, Okayama University26

S-2-1
麹菌が生産する有用な二次代謝産物につ いて
堤 浩子（月桂冠 総合研究所）
１．はじめに
麹菌 Aspergillus oryaze は伝統的な醸造産業になくてはならない微生物であり，各種酵素タンパク
質だけでなく，様々な代謝物を生産することから「代謝物の宝庫」といわれている．2005 年に A.
oryaze ゲノム解析が行われて以来，DNA マイクロアレイ解析やプロテオーム解析などのポストゲ
ノム解析が行われている．ゲノム情報からも二次代謝産物の生産に関わる遺伝子を，他の麹菌に比べ多く保有することからも，二次代謝産物を豊富に生産する機能があると考えられている 1)．分
析技術も進歩し代謝物を網羅的に解析することが可能となり，今まで知られていない有用な二次代謝産物が見つかる可能性も大きい．麹菌が生産する二次代謝産物について網羅的に解析することで，有用な代謝物を見出すことができる．今回，麹菌が生産する二次代謝産物の生合成経路とあわせて網羅的な代謝物解析について紹介する．
２．フェリクリシン
フェリクリシンを代表とするフェリクローム類は，清酒中の着色原因物質として 1967 年蓼沼らによって同定されている．フェリクリシンは，3 分子のアセチル化されたヒドロキシオルニチン，
2 分子のセリン，1 分子のグリシンが環状に結合したオリゴペプチドである．3 価の鉄イオンに対して，非常に特異的かつ強力に結合する．そのペプチド鎖（デフェリフェリクリシン）を麹菌が細胞外に分泌し鉄と結合することで鉄を可溶化し，麹菌にとって鉄供与体として機能をしている．
この環状ペプチドは通常のタンパクのようにリボソームで合成されるのではなく，ペプチドシンテターゼと呼ばれる巨大酵素蛋白によって合成される 2)3)．また鉄イオンをキレートする「腕」の部分
は、オルニチンに対してヒドロキシル化・アセチル化などの修飾が必要である．我々はこのフェリクリシンのペプチド合成酵素，修飾酵素，膜輸送タンパク，転写制御因子などフェリクリシン生合成に必要な遺伝子群が，麹菌染色体上で約 63 kb の大規模な遺伝子クラスターを形成していることを明らかにした．このように 2 次代謝産物の生合成遺伝子群が，麹菌ゲノム上で巨大なクラスターを形成していることは非常に興
味深い．
３．エポキシコハク酸誘導体
1998 年我々は清酒中からシステインプロテアーゼを阻害する物質を発見した．システインプロテアーゼには，カテプシンＢ，Ｈ，Ｌなどのカテプシンファミリーが属しており，生体内でアレルギーの発症や骨粗鬆症などの疾病に関与していると考えられている．このシステインプロテアーゼの阻害物質の構造決定を行ったところ、エポキシコハク酸の誘導体であることを見出した．これらはエポキシコハク酸，アミノ酸，
直鎖ジアミンの 3 つのユニットがペプチド結合によって連結した構造である．アミノ酸やジアミンの種類により，5 種類の誘導体が存在する．これらのエポキシコハク酸誘導体は，システインプ
ロテアーゼを特異的に阻害し，特に人体でアレルギーの発症に関与すると推定されているカテプ
シン L に対して強い阻害活性を示した．
このエポキシコハク酸誘導体の生合成条件を検討したところ，麹菌の固体培養により生産されることを見出した４）．特に米麹の培養末期にその生合成が大きく上昇する．これらの化合物は，327

種の構成ユニットがペプチド結合で連結されていることから，その合成にはリボソームを介さないペプチド合成酵素の関与が推定される．
４．麹菌のメタボロミクス
LC/MS，GC/MS，CE/MS など高度分析技術を用いたメタボロミクスは，様々な生物種における代謝物を網羅的に解析する技術として注目されている．麹菌にもメタボロミクス手法を用いることで，従来の分析技術では検出できない代謝物が検出されるように，代謝物プロファイルが見出されることが期待される．特に２次代謝産物に関しては，従来はなんらかの生理活性を有する物質に着目して単離精製されることが多く，二次代謝産物に着目した網羅的解析例は無い．
そこで，高分解能を持つ FT-ICR MS（フーリエ変換イオンサイクロトロン型質量分離装置）を用いて，培養別の固体培養や液体培養の菌体抽出物の分析を行った．麹菌は，培養方法によって遺伝子発現が異なるため，その代謝物にも違いが出ると考えられる．各菌体抽出物を FT-ICR MSで分析した結果，約 500 種の分子種が検出され，その精密分子量から代謝物予測を行った．さらに，主成分分析やクラスター解析により，培養条件によって細胞内代謝物が大きく変化することを見出したので紹介する５）．
５．おわりに麹菌は，固体培養や液体培養で，代謝物の生産性が異なっており，各代謝物の生体内での機能を探ることや生合成経路を明らかにすることは非常に重要である．さらに，メタボロミクスによって麹菌は「代謝物の宝庫」であることが裏付けられてきた．麹菌の代謝物を有効利用するためには，Omics といわれる網羅的解析や機能性研究など様々な方面からのアプローチが必要であると考えている．
1) 秦洋二： 化学と生物，39，１１３ （2001）
２） 石田博樹ら 2002 年度農芸化学会要旨集 p.199
３） O.Yamada et al J.Biosci Bioeng,95 ,82(2003)
４） T. Yamada et al. Biosci. Biotechnol. Biochem, 62, 907 (1998)
５） 堤 浩子ら 2007 年度農芸化学会要旨集 p.189

Valuable secondary metabolites from Asperugillus oryzae
Hiroko Tsutsumi
Gekkeikan Sake Co.Ltd, Research Institute28

S-2-2
トリ コテ セ ン系 毒素 の構 造 多様 性を 生 み出 す メカ ニズ ム の解 明と 生産 制 御に むけ て木村真（理化学研究所・中央研究所／微生物代謝制御研究ユニット）

コムギなどの重要穀類に感染し、収穫に大きな打撃を与えるムギ類赤かび病菌（Fusarium graminearum）は、セスキテ
ルペンであるトリコテセン系毒素（図１）を穀粒に蓄積させ、食の安全を脅かす。F. graminearum は C-8 位にケト基を持ち、側鎖に様々な置換基が特定の組み合わせで入るＢ型トリコテセンを生産する。二次代謝産物を生産する微生物において、同じ種の菌株がこのように多様な類縁体を生産するケースは稀であるが、この多様性がどのような遺伝因子によって決まるのかは全く分かっていない。トリコテセン生合成研究史上、モデル系として用いられてきたT2-toxin のようなＡ型トリコテセンでは、全生合成遺伝子（Tri 遺伝子）が同定され、それらの機能が示された 1) 。しかし、これらの知
見でＢ型トリコテセンの生合成まで説明できるのであろうか？本研究では、Tri 遺伝子の機能を分子遺伝学的手法や生化学的手法によって徹底的に検証し、Ｂ型トリコテセンの構造
多様性を生み出す機構を解明し、さらに TRI6
転写因子の上流に位置する情報伝達系の因子を同定して毒素生産制御のメカニズム解明のための切り口とすることを目指している 2) 。

図 １： トリ コテ セン 系毒 素 の構 造

B 型 トリ コテ セ ンの 生合 成経 路
トリコテセン基本骨格ができるまでの初期生合成経路はＡ型およびＢ型トリコテセンで共通で、ファルネシルピロリ
ン酸（FPP）の環化反応を担う Tri5 3)と直後の４連続水酸化ステップを担う Tri4 4)によって行われる。一方、穀粒での汚染が問題となるＢ型トリコテセンでは、基本骨格ができてからの後期生合成経路は全く分かっていない。そこで 4-ANIV/ 4,15-diANIV（図１）を同時生産する菌株を用いて全経路遺伝子の破壊体を作製し、蓄積する中間体の構造を決定した。
さらに、ΔTri5ΔTri101 二重破壊体、ΔTri5ΔTri3 二重破壊体、ΔTri5ΔTri8 二重破壊体を作製し、それらの菌株に対して各種中間体のフィーディングを行った。これらの実験結果から、（１）C-15 位の水酸化には C-3 位にアセチル基が必要なこと、（２）Ａ環の修飾には C-3 位と C-15 位の両方にアセチル基が必要なこと、（３）C-4 位が先に修飾されているＡ型トリコテセン中間体はＢ型トリコテセン生合成経路に入れず、Ａ環の修飾が起こらない（つまりＡ型トリコテセン
生合成とは異なってＣ環の C-4 位よりＡ環が先に修飾されなければならない）こと、（４）C-4 位の水酸化、アセチル
化には C-3 位のアセチル基が必要だが C-15 位のアセチル基は必要ないこと、（５）C-3 アセチラーゼは C-4 位にアセチル基があることによって反応性が低くなり、逆に C-3 デアセチラーゼは C-4 位にアセチル基があることによって反応性が高くなることが示され、図２に示す経路に沿って生合成が進むことが明らかとなった 2)。4-ANIV / 4,15-diANIV は最も反応ステップ数の多いＢ型トリコテセンであり、後期生合成経路の遺伝子（Tri13、Tri7、Tri8）の欠損や機能の進化（コードする酵素の基質特異性の変化）を経て、側鎖構造の多様性が生じたと考えられる。

29

図２ ：Ａ 型お よ びＢ 型ト リコ テ セン の生 合成 経 路
青矢印はＡ型トリコテセン T-2 toxin を生産する Fusarium sporotrichioides の経路で各反応ステップを担う経路遺伝子
を FsTri で、赤矢印は B 型トリコテセン 4-ANIV / 4,15-diANIV を生産する F. graminearum の経路で各反応ステップを担う経路遺伝子を FgTri で表記した。TDN, trichodiene; 7-HIT, 7-hydroxyITD; 8-HIT, 8-hydroxyITD; 7-HCA, 7-hydroxyCAL;
8-HCA, 8-hydroxyCAL; DHC, 7,8-dihydroxyCAL
浸透 圧情 報伝 達 系因 子の 糸状 菌 二次 代謝 への 関 与
F. graminearum は YG 培地（酵母エキス 0.5%、グルコース 2%）中でトリコテセン系毒素を生産しない。しかし、
YG 成分で作製した寒天培地上から立ち上がる気中菌糸では本毒素を生産し、YG 寒天培地中に 1% NaCl を加えること
によって生育にほとんど影響することなく毒素生産量が著しく低下する 5) 。そこで、浸透圧情報伝達系に関わる因子が、糸状菌の二次代謝の制御に関与するかどうかを解析した（後にこのトリコテセン系毒素産生に対する抑制効果は、浸透圧ストレスではなく Cl− や NO 3− など、特定の陰イオンによるものであることが判明した）。ハイブリッド型ヒスチジ
ンキナーゼをコードする浸透圧センサー遺伝子 FgOs1 の破壊体では赤色ポリケチド色素 aurofusarin の生産量が下がることが見出されたが、トリコテセンの生産量には変化がなかった。一方、センサー下流の浸透圧伝達系
mitogen-activated protein kinase (MAPK) カスケードを構成する遺伝子 FgOs4、FgOs5、FgOs2 各々の破壊体ではaurofusarin の生産量が顕著に増え、トリコテセンの生産量が減少した。以上の結果は、浸透圧ストレス応答に関与する
MAPK が糸状菌の二次代謝にも関与することを示した最初の例である 6) 。
B 型トリコテセンは F. graminearum とその近縁の Fusarium 属菌によって生産されるが、共通の祖先がトリコテセン
生産能を獲得してから、（後期生合成経路の遺伝子の進化的変遷を経て）植物病原菌として種々の宿主上で生存するのにより有利なケモタイプ 7)を生産できる菌株が選択されてきたと考えられる。それぞれのケモタイプを生み出すメカニズ
ムを生合成酵素のレベルで明らかにすることができれば、ゲノムサンプルからトリコテセンのケモタイプを判別する簡易遺伝子診断にもつながるかも知れない。一方、農薬散布によって菌の生育や病徴の伸展を抑えても逆にトリコテセン
系毒素の量が増える場合があるが、F. graminearum による本毒素の生産制御機構の分子レベルでの理解を深めることによって、毒素混入のない安心できる防除プロセスの開発へと結びつけることが期待される。

30

本研究は生研センター基礎研究推進事業「天然環境毒素による重要穀類の汚染低減化にむけた技術創成」の一環として推進しているものである。
1)
2)
3)
4)

Desjardins, A. E. (2004) Fusarium mycotoxins: chemistry, genetics, and biology, APS press, St. Paul MN
Kimura, M., Tokai, T., Takahashi-Ando, N., Ohsato, S., and Fujimura, M., Biosci. Biotechnol. Biochem., in press (2007).
Hohn, T. M., and Beremand, P. D., Gene, 79, 131-138 (1989).
Tokai, T., Koshino, H., Takahashi-Ando, N., Sato, M., Fujimura, M., and Kimura, M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 353,
412-417 (2007).
5) Ochiai, N., Tokai, T., Takahashi-Ando, N., Fujimura, M., and Kimura, M., FEMS Microbiol. Lett., 275, 53-61 (2007).
6) Ochiai, N., Tokai, T., Nishiuchi, T., Takahashi-Ando, N., Fujimura, M., and Kimura, M., Biochem. Biophys. Res. Commun., inpress (2007).
7) Nishiuchi, T., Masuda, D., Nakashita, H., Ichimura, K., Shinozaki, K., Yoshida, S., Kimura, M., Yamaguchi, I., and Yamaguchi,K., Mol. Plant-Microbe Interact., 19, 512-520 (2006).

Recent progress in molecular genetic studies of Fusarium trichothecene biosynthesis: structural
diversity and regulatory network
Makoto Kimura (Plant & Microbial Metabolic Engineering Research Unit, DRI, RIKEN)

31

S-2-3
発ガン・毒性物質アフラトキシンの生合成機構とその防御
矢部希見子１、中島廣光２（１農業・食品産業技術総合研究機構、２鳥取大農学部）
カビが生産する二次代謝産物の中には、動物や人に健康被害を及ぼす物質、つまりカビ毒（マイコトキシン）があり、これまで 300 種以上のカビ毒が報告されてきている。種々のカビ毒の中で、アフラトキシンは極めて強力な発ガン性及び毒性を有する物質として恐れられている。アフラトキシンは主として Aspergillus parasiticus や Aspergillus flavus に属する一部のカビが生産する二次代謝産物であり、カビが生産するアフラトキシンは主として 4 種（アフラトキシン B1 (AFB1)、AFB2、AFG1、 AFG2）であるが(図１)、中でも AFB1
が最も発ガン性及び毒性が高く、またカビが多量に作る。アフラトキシン生産カビは熱帯・亜熱帯地方の土壌に常在するが、温帯地域においても干ばつ等の気候変動によりアフラトキシンによる穀物汚染が発生することがあり、また世界における穀物の貿易によって、アフラトキシン汚染は世界的に深刻な問題となっている。
カビ生体内において、アフラトキシンはアセチル CoA から 18 種以上の酵素反応を経て作られ、関与する 25 種以上の遺伝子群は染色体上 70ｋｂ以上の領域に遺伝子クラスターを形成する。その内部には制御遺伝子 aflR が存在し、他の酵素遺伝子群の発現をポジティブに制御している。一方、アフラトキシンの前駆体の一つ、ステリグマトシスチンを生産するカビは Aspergillus nidulans をはじめとして 20 種以上が報告されており、ステリグマト
シスチン生合成経路はアフラトキシン生合成経路と同一で、関与する遺伝子群は配置は異なるもののやはり遺伝子クラスターを形成している。従って、アフラトキシン生産菌はス
テリグマトシスチン生産菌が有する遺伝子群に加えてアフラトキシン生産に特異的に関与する遺伝子群を有するカビと考えることができる。
アフラトキシン生合成経路中ステリグマトシスチンからアフラトキシンまでの経路について、我々は既に、ステリグマトシスチン(sterigmatocystin)は O-methylsterigmatocystin(OMST) を 経 て AFB1 と AFG1 に 変 換 し 、 dihydrosterigmatocystin はdihydro-O-methylsterigmatocystin (DHOMST)を経て AFB2 と AFG2 に変換することをフィー
ディング実験によって明らかにした。酵素反応においても B-グループアフラトキシン（AFB1、AFB2）はそれぞれ OMST と DHOMST から OrdA monooxygenase 酵素によって形成することを確認した。一方、G-グループアフラトキシン（AFG1、AFG2）の生産については、OrdA 酵素以外に可溶性酵素が必要であることを確認していたが、その詳細は不明であった。我々は最近、アフラトキシン遺伝子クラスターの末端に位置する nadA 遺伝子を破壊して新たに蓄積した中間体の検索や破壊株の酵素反応の解析を行うことによって、nadA 遺伝子が G-グループアフラトキシンの形成に必要な可溶性酵素であることを明らかにした。そこで、本シンポジウムでは遺伝子破壊実験及び酵素反応実験を組み合わせることによって明らかになったＧ−アフラトキシンの生合成経路に関する知見について報告する。
さらに、世界の穀物の 4 分の 1 がカビが原因で廃棄されていると言われているが、その中でアフラトキシン汚染が大きな割合を占めていると予想される。しかし、アフラトキシンは安定な物質であり、未だ効果的な汚染防御法は得られていない。そのため多くの国が穀物のアフラトキシン汚染について規制値を設け厳密な検査態勢を敷いているが、それによる経済的負担は極めて大きいものがある。我々は、アフラトキシン汚染防御法を開発することを目的としてアフラトキシン生産を阻害する微生物のスクリーニング及び阻害物質の解析を行ってきている。それについても紹介する予定である。
32

図１．カビが生産する主要なアフラトキシン

Mechanism and inhibition of aflatoxin biosynthesis
Kimiko Yabe1 and Hiromitsu Nakajima2
1
National Agriculture and Food Research Organization (NARO)
2
Fuculty of Agriculture, Tottori University33

S-2-4
糸状菌ポリケタイド生合成遺伝子の機能解析
岩手 医科 大 学薬 学部 天然 物 化学 講座
藤井 勲
はじめ に
糸状菌のポリケタイド合成酵素 polyketide synthase（PKS）は、タイプＩ繰返し型と呼ばれる多機能型酵素であり、１本の大きなポリペプチド上にポリケタイド生成反応に関わる機能ドメインである縮合酵素 KS、アシル基転移酵素 AT、アシルキャリヤープロテイン ACP の基本ドメインの他、ケト還元 KR、脱水 DH、メチル
化 MeT、閉環 CYC などの修飾ドメインが存在し、これらが機能的に協調し、見掛け上、繰返して反応に関与し、最終的に各 PKS に特異的な炭素骨格が構築される。この基本的に同一の architecture をもつ糸状菌 PKS により生み出される化合物は、多環性芳香族化合物から高度に官能基化を受けた還元型化合物に至るまで、炭素鎖長、閉環様式など非常に多様性に富み、これが糸状菌タイプＩ繰返し型 PKS の特徴となっている。しかし、その反応制御機構、例えば生成物の炭素鎖長の制御や還元段階の制御などの機構については、現在のところ、ほとんど不明である。この制御機構を明らかにすることができれば、逆に所望の炭素骨格をもつ化合物を生成する PKS タンパクをもデザインすることが可能になることが期待される。
我々は、糸状菌 PKS を異種糸状菌、特に麹菌 Aspergillus oryzae を宿主として発現させることにより、芳香族 PKS の発現、機能解析を進めてきた。糸状菌のゲノム遺伝子中には、数十 bp 程度ながらもいくつかのイントロンを含む場合があり、また、発現させた PKS が活性型となるためには、その ACP ドメインの Ser残基がホスホパンテテイニル化されなければならない。しかし、異種糸状菌をホストとして用いることにより、
PKS のゲノム遺伝子を直接用いた場合でも、正常な splicing とホストのホスホパンテテイン転移酵素の働きにより ACP がホロ化された活性型 PKS の発現が可能となる。実際、我々は、Aspergillus terreus よりクローニングした atX 遺伝子をα-アミラーゼプロモーターを利用して Aspergillus oryzae で発現させ、6-メチルサ
リチル酸が生産されることから、ATX が A. terreus の MSAS（6-メチルサリチル酸合成酵素）であること示した。また、ペンタケタイド合成酵素である Colletotrichum lagenarium の PKS1、同ヘプタケタイド合成酵素である Aspergillus nidulans の WA、Aspergillus fumigatus の Alb1p、Phoma sp.のノナケタイド合成酵素 PNK2などの発現、機能同定にも成功している。WA PKS では、C-末のチオエステラーゼ TE とされていた領域が、単に PKS から生成物を加水分解的に遊離させる TE ではなく、芳香環生成のクライゼン型閉環に関わるクライゼンサイクラーゼドメイン CYC であることを明らかにした。この CYC ドメインは、他の糸状菌芳香族型
PKS、例えば、上記 PNK2 や、ステリグマトシスチンやアフラトキシン生合成の PKS にも存在する基本的なドメインと考えられる。
また、還元型 PKS についても、ソラナピロン生産菌であるバレイショ夏疫病菌 Alternaria solani より遺伝
子クローニングを試み、pksN、pksF などの PKS 遺伝子を取得した。pksN の A. oryzae での発現では、新規化合物アルタナピロンの生産が確認された。アルタナピロンは、デカケタイド鎖にメチオニン由来の８個の側メチルが導入され生成する化合物であり、PKSN 酵素タンパクの中央に存在するメチルトランスフェラー
ゼ MeT ドメインの働きにより、９回の縮合反応のうち、８回の各縮合反応後にアシルキャリヤープロテイン
ACP 上のβ-ケトアシル中間体のα位にメチル基を導入するものと考えられる。また、pksF の発現では、
PKSF が新規ポリエン化合物アスラニピロン、アスラニオールを主生成物として、11 以上のポリエン化合物を与える興味深い PKS であることを明らかにした。これらの化合物、あるいはその誘導体は、A. solani の代謝産物としては得られておらず、生合成遺伝子を強制的に誘導発現させることにより、これまで隠されていた化合物生産能を明らかにすることができたものと考えられる。A. solani より PKS 遺伝子のクローニングを更に進めたところ、新たに４つの還元型 PKS 遺伝子断片の取得に成功した。ゲノムウォーキングにより全
長 PKS 遺伝子、並びにその近傍領域の塩基配列決定を進めたところ、そのうちの１つがソラナピロン生合成に必要な各遺伝子をコードする生合成遺伝子クラスターを構成しているものと推定された。実際、本遺伝子クラスターの PKS 遺伝子 sol1 の発現は、A. solani のソラナピロン生産開始時期と一致していた。そこで、sol1 遺伝子を A. oryzae で誘導発現させたところ、ソラナピロン生合成前駆体であるデスメチルプロソラ
ナピロン I の生産を確認し、この遺伝子クラスターがソラナピロン生合成の遺伝子クラスターであると同定した。ところで、ソラナピロンのデカリン骨格は、プロソラナピロン II の酸化と続く Diels-Alder 反応により構築されることが知られていたが、この反応を触媒する Diels-Alderase とも呼ぶべき酵素の詳細は不明であった。

34

sol 遺伝子クラスターには、sol5 と名付けた酸化酵素をコードする遺伝子が存在しており、この酸化酵素がDiels-Alder 反応を触媒するものと考え、その発現を試みた。大腸菌での発現などを種々検討したものの、活 性は 見 ら れ ず 、 A. oryzae で の 発 現に よ り初 め て その 酵 素 活 性の 確 認に 成 功 した 。 非 酵素 的 な
Diels-Alder 反応では、エンド選択的に生成物を与えるが、Sol5 の触媒する反応では、エキソ選択的な生成物を与えることが確認された。
このように糸状菌発現系は PKS の機能解析系としても、また、化合物生産のための生物合成系としても優れた系であるが、糸状菌の形質転換効率の低さなどが問題点となる。そこで、現在、酵母を宿主とする
糸状菌 PKS の発現についても検討を進めている。
おわり に
ポリケタイド合成酵素 PKS は非常に巨大なタンパクであったり、あるいは酵素複合体であったりするため、直接 in vitro での反応に用いて化合物を得ることは、少なくとも現在のところ実用的ではない。しかし、基本的に同一のアーキテクチャーでありながら、多様な炭素骨格の化合物を生み出すことができる糸状菌タイプ I 型 PKS の合成ポテンシャルは非常に高い。今後、発現系の改良やドメイン交換などの遺伝子工学的手法を用いて、繰返し型タイプ I PKS を基盤とした生物合成系の構築などへと展開させていきたい。
なお、本研究は、演者の前所属である東京大学大学院薬学系研究科天然物化学教室において進めてきたものであり、海老塚豊教授、並びにともに研究を進めてきた学生諸氏に深く感謝いたします。

Functional analysis of fungal polyketide biosynthesis genes
Isao Fujii
Laboratory of Natural Products Chemistry, School of Pharmacy, Iwate Medical University35

S-2-5ML-236B (compactin)生合成遺伝子群の解析と高生産株育種への応用○馬場悟史、阿部有生（第一三共株式会社）
高脂血症治療剤 Mevalotin®(一般名:pravastatin）は、世界初の HMG-CoA 還元酵素阻害剤として 1989
年に日本で上市されて以来、その強力な生体内コレステロール合成抑制効果によって高コレステ
ロール血症治療に貢献してきた。これまでに約 100 カ国で販売され、スタチン系高脂血症治療薬の代表的存在として、世界中で広く使用されている。
Pravastatin は、二種類の微生物を利用した二段階発酵により生産される、天然物由来の医薬品である。すなわち、まず糸状菌 Penicillium citrinum により前駆体 ML-236B（compactin）が発酵生産され、さらに放線菌 Streptomyces carbophilus による微生物変換により ML-236B の 6β位に水酸基が導入されて pravastatin となる。ML-236B は HMG-CoA 還元酵素阻害作用を有する世界初の化合物であったが、より効果的な化合物探索の結果、S. carbophilus 変換物である pravastatin が見出された。
Pravastatin 発酵生産の工業化研究は、前駆体 ML-236B の生産量向上による生産コスト低減を目標に進められた。その中心は化学変異剤や UV を用いた ML-236B 高生産変異株の分離、生産に最適な培地の作製、さらにはコンピュータによる培養制御法の確立で、長期にわたる研究の結果、大幅な生産コストの低減に成功し現在の生産プロセスに結びついている。
広く使用される conventional な変異の誘発と高生産株の分離という育種法は、膨大な手間、労力、時間を要する。そこで近年、遺伝子工学的手法による不要遺伝子の破壊、有用遺伝子の増幅、ゲ
ノムシャッフリングなど、より短期間で菌株を分子育種する手法が試みられており、これまでにもいくつかの成功例が報告されている。
我々はこれまでに、ML-236B 生合成遺伝子群の単離と、個々の遺伝子産物の機能解析や発現制御機構の解析を実施し、得られた知見を利用して、高生産変異株の ML-236B 生産能をさらに向上
させることに成功した。
1. ML-236B(compactin） 生合 成遺 伝 子群 の単 離 と機 能解 析
ML-236B の生合成遺伝子群は、その類縁化合物ロバスタチン同様、約 40 kb の範囲でクラスターを形成し、ゲノム上に single copy で存在していた 1)。そのクラスターは、6 つの生合成関連遺伝子、2 つの耐性遺伝子、1 つのレギュレーターから構成される。mlcA と mlcB は、ポリケタイド合成酵
素（Polyketide synthase, PKS）をコードし、ML-236B の主鎖と側鎖の形成に関与する。mlcC、F、G、H はそれぞれ、P450、oxidoreductase、dehydrogenase、transesterase と相同性を持つ post-PKS 修
飾酵素をコードし、ML236B の骨格形成に関与している。これら 6 つの遺伝子は mlcR がコードする制御因子によって発現調節される。mlcD および F はそれぞれ、HMG-CoA reductase、efflux pumpに相同性をもつタンパク質をコードし、P. ctrinum の ML-236B に対する自己耐性を付与している。
決定した ML-236B 生合成遺伝子クラスター塩基配列には、野生株と高生産変異株間に変異点はな
く、またサザン解析から、ML-236B 生合成遺伝子クラスター自身のコピー数にも変化はないことが明らかになっている 2)。
2. ML-236B(compactin） 生合 成遺 伝 子群 の発 現 調節 機構

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ML-236B 生合成に関与する 6 遺伝子の転写は ML-236B の生産開始と密接にリンクしている 3), 4)。
この転写活性化は、Zn(II)2 Cys6 DNA 結合モチーフを有する GAL4 型転写因子様タンパク質 MlcRが、ML-236B 生合成遺伝子プロモーター領域近傍の特定の結合配列に結合することにより引き起こされる。高生産変異株における ML-236B 生合成遺伝子の転写量は野性株と比べて大きく増加しており、育種過程で誘発された変異により mlcR の転写量が増加したことが要因であると考えられ
る 2)。
3. 生合 成 遺伝 子を 用い た ML-236B 高 生産 株の 育種
高生産変異株の mlcR コピー数を人為的に増加させたところ、ML-236B 生産量が導入された mlcR
コピー数に応じて最大で約 1.5 倍増加し、高生産変異株においてもまだ mlcR 転写量増加による
ML-236B 生産量向上の余地があることがわかる。また、mlcR を含むクラスター全体のコピー数を増加させた場合でも、約 1.5 倍の生産量増加が見られた。これら形質転換株は 30L 発酵槽を用いた検討でも良好な生育および ML-236B 生産能を示し、ML-236B 高生産変異株のさらなる生産量向上に成功した 5)。
4. 今後 の 展望
変異処理により得られた高生産株は、育種の過程でどのような変異が入って高生産化に至ったのであろうか。その一因である mlcR の転写量増加につながった変異は、ML-236B 生合成遺伝子クラスター取得のために塩基配列を決定した約 70 kb の塩基配列には存在しない。また、mlcR プロモーター周辺には MlcR 結合配列は存在せず、自身の転写を活性化する能力はない。mlcR 転写を活性化するネットワークの解明が、遺伝子工学的手法を用いた簡便かつ迅速な高生産株育種法の確立につながると考えている。

1) Mol. Genet. Genomics, 267, 636 (2002)
2) J. Gen. Appl. Microbiol., 50(3), 169 (2004)
3) Mol. Genet. Genomics, 268, 352 (2002)
4) Biochim. Biophys. Acta, 1759, 410 (2006)
5) Mol. Genet. Genomics, 268, 130 (2002)

Analysis of ML-236B (compactin) biosynthetic gene cluster and its application to construction ofhigh-producing strain.
Satoshi Baba, Yuki Abe (DAIICHI SANKYO CO., LTD.)37

一般講演（口頭発表）
O-1
担子菌シイタケの Myb 型転写因子 Le.CDC5 と相互作用する新規 DNA 結合性タンパ
ク質 CIPB
中沢威人, 金子真也，宮崎安将 1 ，山崎丘 2 ，勝川志穂 3，宍戸和夫（東工大・生命理工2 現・JAXA

1 現・森林総研

3 現・日本製紙）

担子菌シイタケの子実体形成に関わると考えられる遺伝子 Le.cdc5 は、Schizosaccharomyces pombe cdc5+のホモログ遺伝子であり、真核生物で高度に保存されている Myb 型 DNA 結合性転写因子をコードしている。
以前に Le.CDC5 のロイシンジッパーを含む C 末端領域 と相互作用する 2 つの新規タンパク質 CIPA,
CIPB(CDC5 Interaction Partner A or B)を同定していたが、今回いくつかの DNA プローブを用いてゲルシフト解析を行った結果、CIPB が DNA 結合性タンパク質であることが明らかになった。そこで、CIPB がどのよ
うな DNA 塩基配列を認識し結合するのかを SELEX により解析した結果、結合コンセンサス配列は
5’AACAB(C/G/T)3’であることが分かった。以上から、CIPB は Le.CDC5（または他の DNA 結合性タンパク質）とともに DNA 結合性の転写因子として遺伝子の転写調節を行っている可能性が考えられる。
Lentinula edodes CIPB,Le.CDC5 Interaction Partner B, is a DNA-binding protein
Takehito Nakazawa, Shinya Kaneko, Yasumasa Miyazaki, Takashi Yamazaki, Shiho Katsukawa and Kazuo Shishido(Dept. of Life Science, Tokyo Tech)

O-2
担子菌シイタケの Myb 型転写因 子 Le.CDC5 およびそのパートナーCIPB の標 的遺伝
子 ctg1
中沢威人，金子真也，宮崎安将 1，城島透 2 ，山崎丘 3 ，勝川志穂 4，宍戸和夫（東工大・生命理工
森林総研

2 現・RITE

3 現・JAXA

1 現・

4 現・日本製紙）

担子菌シイタケの子実体形成過程において、Myb 型転写因子 Le.CDC5 は子実体原基時以降に存在しており、その間に子実体形成に関わる遺伝子の転写を調節していると考えられる。以前に Le.CDC5 の標的遺伝子を検索する目的で Genomic Binding Site (GBS) Cloning が行われ、Le.CDC5 が特異的に結合する可能性のある 3.7kbp の HindⅢ切断断片が得られていた。今回、本断片とその 5’隣接領域には 159 アミノ酸をコードする遺伝子（ctg1 と命名）が存在しており、その翻訳開始点下流領域内に Le.CDC5 結合コンセンサス配列（5’GCAATGT3’）に似た配列が複数存在することが確認できた。次にゲルシフト法およびクロマチン免疫沈降法により Le.CDC5 がそのうちの１つに対して子実体形成時期・子実体部位特異的に結合していることが明らかとなった。さらに、CIPB が ctg1 の上流域および転写領域内に複数結合することが明らかとなった。
以上の結果は、Le.CDC5 と CIPB が協調して ctg１の転写を調節している可能性を示唆する。

Binding of Lentinula edodes CDC5 and CIPB to a newly isolated taget gene ctg1
Takehito Nakazawa, Shinya Kaneko, Yasumasa Miyazaki, Toru Jojima, Takashi Yamazaki, Shiho Katsukawa andKazuo Shishido (Dept. of Life Science, Tokyo Tech)

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O-3
木材腐朽担子菌においてセルロース分解酵素系の違いを与える分子生物学的因子
加治佐平，五十嵐圭日子，鮫島正浩（東大院・農生科・生材料）

木材腐朽担子菌は、腐朽後における材の色から白色腐朽菌と褐色腐朽菌に分類される。両者における大きな差異はリグニン分解酵素の生産にあると考えられているが、植物細胞壁多糖の主成分であるセルロースを分解する酵素パターンも 2 種類の腐朽菌で大きく異なることが報告されている。すなわち白色腐朽菌が結晶性、非晶性セルロースを共に分解する酵素を生産するのに対して、褐色腐朽菌は非晶性セルロースを分解する酵素のみを生産することが知られている。そこで本研究ではセルロース分解系の酵素について、分子生物学的なアプローチを試みるとともに、木材腐朽担子菌の進化について考察した。
糸状菌による結晶性セルロースの分解に重要な役割を担っている糖質加水分解酵素ファミリー6、7 に属するセロビオヒドロラーゼ（Cel6、Cel7）、そして白色腐朽菌のセロビオース代謝に関与するセロビオース脱水素酵素（CDH）をコードする遺伝子に関して、様々な木材腐朽担子菌の全 DNA を鋳型に CODEHOP-PCR を行った。その結果、白色腐朽菌では全ての菌より Cel6、Cel7、CDH 遺伝子のバンドが確認できたが、褐色腐朽菌は Cel6、Cel7、CDH 遺伝子のバンドが確認できたグループと、いずれの遺伝子においても全くバンドが出なかったグループとに分かれた。さらに糖代謝酵素であるグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GPD）遺伝子と rDNA の ITS 配列によって作成した分子系統樹からも褐色腐朽菌は 2 つの異なった枝に分けられることが明らかとなり、それらはセルロース分解酵素系の遺伝子解析におけるグループと一致した。
以上の結果から、褐色腐朽菌はセルロース分解酵素系の遺伝子を有するものと、完全に欠失した 2 つのグループに分けられる可能性が示唆された。
Molecular biological factor for the difference in enzymatic system of cellulose degradation by wood-rotting
basidiomycetes
Taira Kajisa, Kiyohiko Igarashi, Masahiro Samejima (Dept. Biomat. Sci., Univ. of Tokyo)

O-4
Gibberella fujikuroi のフェロモンレセプター遺伝子の単離と破壊株の作出
關波直子・寺岡徹・有江力（東京農工大・院農生物制御）

生物は一般的に有性生殖（sexual reproduction）によって遺伝的多様性を維持してきたと考えられており、植物病原菌の病原性や薬剤抵抗性などの獲得、進化にも有性生殖が関与してきたと考えられる。しかし、重要
植物病原糸状菌の中には Fusarium oxysporum のように交配不全性（交配しないあるいは交配が未だに観察されていない）のものが数多く存在する。そこで本研究では，F. oxysporum の交配不全性の解明の一環として、近縁種で交配能を持つサトウキビしょう頭腐敗病菌 Gibberella fujikuroi mating population B（不完全世代名：
F. sacchari）の交配応答シグナル伝達経路を解析している．今回は本菌においても機能していると想定される Neurospora crassa フェロモンレセプター（PRE1, PRE2）ホモログ遺伝子（pre1，pre2）を G. fujikuroi と
F. oxysporum から単離した．両種の PRE1，PRE2 はアミノ酸レベルで高い相同性を示した．また，それらの機能解析のために G. fujikuroi において二回相同組換えによってそれぞれの破壊株を作出した．

Cloning and functional analysis of Gfpre2 and Gfpre1 genes in Gibberella fujikuroi
Naoko Sekinami, Tohru Teraoka, Tsutomu Arie
(Tokyo Univ. of Agric.&Tech.)

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O-5
イネいもち病菌の非相同末端再結合に関与する遺伝子 Khm70, Khm80 の欠損変異株の解析
曾根輝雄 1，阿部歩 1，芦澤武人 2 （1 北大院農・応用菌学，2 中央農研）

イネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）の圃場分離株は，染色体長多型を示すことが報告されており，DNAのダイナミックな組換えを行っていることが予想されている．細胞内の DNA 組換えには，相同組換え（Homologous recombination）と非相同末端再結合（Non homologous end joining, NHEJ）が有り，それぞれに関与する遺伝子群がすでに出芽酵母その他の生物で明らかにされている．我々は，イネいもち病菌におけるNHEJ の DNA 組換えへの関与を明らかにする目的で，ヒト KU70 及び KU80 のイネいもち病菌ホモログ，
Khm70, Khm80(=MgKU80 1)) をクローニングし,それらが N. crassa のホモログと高い相同性を示すことをすでに報告している．pDESTR 2)を用いてこれらの欠損変異株 Ina86-137ΔKhm70, Ina86-137ΔKhm80, Ina168Δ
Khm70，Ina168ΔKhm80 を作成した．Ina86-137ΔKhm70, Ina86-137ΔKhm80 は共に MMS（メチルメタンスルホン酸）への感受性が増大し，アデニン要求性を指標とした AdeA 遺伝子の相同組み換えによる破壊実験
でも，95%以上の高い相同組換え率を示した．一方，Ina168ΔKhm70 Ina168ΔKhm80 では，MMS 感受性，
遺伝子破壊に於ける相同組換え率は共に野生株 Ina168 と同等であった．また，各変異株共にイネに対する病
原性は野生株と同等であった．これらの結果は，イネいもち病菌において，Khm70, Khm80 は病原性発現に必須ではないこと，また，N. crassa 等の糸状菌同様，NHEJ に必須であるが，一部の菌株では Khm70, Khm80に依存しない NHEJ の主な経路が存在する可能性を示している．
1) Villalba et al., Fungal Genetics and Biology (in press).
2) Abe et al. Current Microbiology, 52, 210-215 (2006).
Deletion mutants of Khm70 and Khm80, genes involved in NHEJ in Magnaporthe oryzae
Teruo Sone1, Ayumi Abe1 and Taketo

Ashizawa2(1Hokkaido Univ., 2NARC)

O-6
Agrobacterium tumefaciens による形質転換法を利用したアラキドン酸生産性糸状 菌
Mortierella alpina 1S-4 株の脂肪酸組成改変安藤晃規，角田洋輔，櫻谷英治，小川順，清水 昌（京大院農・応用生命）【目的】我々はこれまでに Mortierella alpina 1S-4 及びその誘導変異体によるアラキドン酸をはじめとした種々の高度不飽和脂肪酸の工業的生産を実現している。本菌の分子生物学的アプローチにおいて、従来は遺伝子銃を用いた形質転換を行ってきたが、実用性の点において物理的損傷による生産性の低下、不安定な形
質、遺伝子挿入数のばらつきなどの問題を有していた。今回、実生産への応用を視野に入れ、従来の方法に変わるより穏やかな条件下での形質転換が可能な Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT)法により、本菌を題材とした過剰発現の構築ならびに脂肪酸組成改変を試みたので、報告する。
【方法・結果】T-DNA 領域にマーカー遺伝子である ura5 遺伝子発現用カセットと本菌由来の w3 desaurase
遺伝子発現カセットを複数個タンデムに挿入したバイナリーベクターを構築した。本ベクターをエレクトロ
ポレーションにより A.tumefaciens C58C1 株に導入し、M.alpina1S-4 を形質転換した。得られた 70 %の形質転換体は、形質を安定して保持し、一様に旺盛な生育を示した。また、w3 desaurase 遺伝子発現至適条件下にて培養後、菌体より脂肪酸を抽出し、脂肪酸組成を分析したところ、w3 desaurase 遺伝子過剰発現株では、全脂肪酸当たり 30 %以上のエイコサペンタエン酸の蓄積が認められた。以上のことより、M.alpina 1S-4 における ATMT 法の応用面での有効性を示すことができた。
Improvement of fatty acid in M.alpina 1S-4 by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
Akinori Ando，Yosuke Sumida，Eiji Sakuradani，Jun Ogawa，Sakayu Shimizu(Division of Applied Life Sciences Graduate School of Agriculture, Univ. of Kyoto)

40

O-7
抽出液面固定化システムを用いたカビによる抗カビ物質 6-pentyl-α-pyrone (6PP) の
高濃度生産
小田

忍・一色邦夫（メルシャン・生物資源研）【目的】カビ-マイクロスフェアー(MS) 複合マットの上部に低毒性な疎水性有機溶媒を重層し、生産される脂溶性二次代謝産物を in situ に抽出する新規な発酵法(抽出液面固定化システム)を開発した。本システム
を抗カビ性香料であり、biocontrol agent としての用途が期待される 6-pentyl-α-pyrone(6PP) の発酵生産に適用し、その有用性を確認することを目的とした。
【方法・結果】土壌より分離した 6PP 生産性 Trichoderma sp. の NTG 変異により、6PP 分解能を欠損した AG2755-5NM398 株を得た。本株を用いた標題システムについて、MS 種、抽出溶媒種、炭素源、窒素源、
初発 pH、培養温度、植菌量、前培養時間等の最適化を行い、また、6PP の前駆体である linoleic acid の添加効果を調べた。MS 種としては無機材コートなしの MFL-80SDE（平均粒径 20〜40 ìm、真比重 0.06）、抽出
溶媒としては低粘性シリコンオイル KF-96L-1CS （粘度 1 cP）、炭素源と窒素源はそれぞれ fructose もしくは glucose と malt extract が最適であった。6PP 前駆体である linoleic acid は有機層中 1%レベルの添加で有効であった。最適条件下での発酵試験により、有機層中濃度 7 g/L 以上の 6PP が生産され、液体培養法における世界記録の 10 倍以上の蓄積濃度に達した。
Production of high concentration of 6-pentyl-α-pyrone (6PP), a fungicidal secondary metabolite, in an
extractive liquid-surface immobilization (Ext-LSI) system
Shinobu Oda, Kunio Isshiki(Bioresource Lab., Mercian Corp.)

O-8
網羅的菌代謝物の比較解析システム
岡崎孝映 1 、中島大輔 1、細内敦 1、櫻井望 1、飯島陽子 1、青木考 1 、鈴木秀幸 1、中島琢自 2 、小牧久幸 2 、原山重明 2 、柴田大輔 1（1 かずさ DNA 研究所、2NITE）
生物学はゲノム情報の利用によって変革を遂げた。そしていま DNA の情報のみならず、RNA、蛋白質、代謝化合物などにおいても、構成要素の全て情報を余すところなく取り出してデータベース化し、利用しようという時代になった。しかし代謝化合物情報に関してはまだ完全に把握できる段階とは云い難く、メタボロームという言葉が使われていても、実際はゲノム情報からの推定と、一部の既知化合物の把握を指しているのが現状である。フューリエ変換質量分析器を使うと分子量を高精度で測定できることから、化合物の組成式が割り出すことが可能になる。私たちは、精密分子量（予想組成式）、高速液体クロマトグラフィーの溶出時間、化合物イオンのフラグメンテーションパターンに基づいて、抽出サンプルに含まれる化合物を、サンプル間で自動比較するシステムを構築し、微生物代謝物を未知物質も含めてデータベース化することを進めている。いくつかの菌類について解析事例を報告する。

Automated Comparison System for Fungal Matabolome
Koei Okazaki,1 Daisuke Nakajima,1 Tsutomu Hosouchi,1 Nozomu Sakurai,1 Yoko Iijima,1 Koh Aoki,1 Hideyuki
Suzuki,1 Takuji Nakashima,2 Hisayuki Komaki,2 Shigeaki Harayama,2 Daisuke Shibata1(1Kazusa DNA Res. Inst., 2NITE)

41

O-9
糸状菌 Aspergillus nidulans ヒスチジンキナーゼの機能解析
金丸京子，松井哲児、鈴木麻子、山崎ゆかり、加藤雅士、小林哲夫（名大・生命農）

糸状菌 Aspergillus nidulans には、His-Asp リン酸リレー情報伝達機構に関与する因子として、ヒスチジンキ
ナーゼ 15 種類、レスポンスレギュレーター4 種類、リン酸基転移中間因子１種類が存在し、浸透圧や農薬、酸化ストレスなどの応答や無性生殖、有性生殖の制御に重要な役割を担うと考えられている。本研究は 15
種類のヒスチジンキナーゼのうち、Aspergillus 属に特異的に存在し有性生殖期に多く発現するヒスチジンキ
ナーゼ HK8-2 に焦点をおいてその機能解析を行った。まず、HK8-2 欠失変異株（△8-2 株）を作製し、生育への影響を観察した。有性生殖を誘導するためにプレートの周りにテープを巻いて酸素を制限すると △8-2
株は野生株と同程度の生育を示したが、クライストセシアの形成率が低下していた。His-Asp リン酸リレー
経路の下流に HOG 経路が存在すること、及び HogA が有性生殖にネガティブに影響することがすでに分かっていたため、次に△8-2 株における HogA 制御遺伝子の発現レベルを Real Time PCR により解析した。その結果、有性生殖期において catA, gldB の発現レベルが野生株に比べ上昇していた。さらに、hk8-2 遺伝子を alcA プロモーターの下流においた株を用いた解析結果もふまえて、HK8-2 の機能について考察する。
Analysis of Histidine kinase for His-Asp phosphorelay in Aspergillus nidulans
Kyoko Kanamaru, Tetsuji Matsui, Asako Suzuki, Yukari Yamazaki, Masashi Kato, Tetsuo Kobayashi(Dept of Biological Mechanisms and Functions, Nagoya Univ.)

O-10
糸状菌 Aspergillus nidulans の細胞壁構築シグナル伝達経路の解析
藤岡智則 1，水谷治 2，古川健太郎 2，佐藤奈津子 2，吉見啓 3，山形洋平 2，中島佑 2，阿部敬悦 2,3（1 クミアイ
化学・生科研，2 東北大院・農，3 東北大・未来研）
真菌の細胞壁構築は cell wall integrity 経路と呼ばれる MAP kinase シグナル伝達経路によって制御されており、出芽酵母において研究が進んでいる。Aspergillus 属糸状菌においてもこの経路の存在が明らかとなっており、本経路が糸状菌の形態形成において非常に重要な働きを担っていると考えられているものの、知見はほとんど得られていない。我々は、糸状菌–酵母間での細胞壁の構造や形態における差異が、経路下流の MAP kinase–転写因子–標的細胞壁関連遺伝子の関係に起因すると推定し、この三者の関係に注目した糸状菌の細胞壁構築の制御機構の解析を行った。
出芽酵母の MAP kinase Mpk1p、転写因子 Rlm1p, Swi4/6p (SBF) の A. nidulans におけるホモログである
MpkA, RlmA, AnSwi4/6 の遺伝子破壊株を造成した。β-1,3-グルカン合成酵素阻害剤 micafungin 処理による経路活性化時の mpkA 遺伝子の転写解析から、A. nidulans では出芽酵母と異なり、mpkA 遺伝子の転写制御
は RlmA, SBF 以外の、MpkA 下流の未知の転写因子が行っていることが明らかになった。また、mpkA, rlmA
遺伝子破壊株における細胞壁関連遺伝子の転写解析により、A. nidulans では α-1,3-グルカン合成酵素遺伝
子の転写制御は cell wall integrity 経路を介して RlmA が行っていること、さらに cell wall integrity 経路以
外に細胞壁関連遺伝子の転写制御を行う未知のシグナル伝達経路が存在し、その経路は主に、β-1,3-グルカ
ンとキチンの合成関連遺伝子の転写制御を行っていることが明らかとなった。

Analysis of the cell wall integrity signaling pathway in Aspergillus nidulans
Tomonori Fujioka1, Osamu Mizutani2, Kentaro Furukawa2, Natsuko Sato2, Akira Yoshimi3, Youhei Yamagata2, Tasuku
Nakajima2, Keietsu Abe2,3 (1Kumiai Chem. Indust. Co., Ltd., 2 Tohoku Univ., Grad. Sch. Agri. Sci., 3 Tohoku Univ., NICHe)

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O-11
Aspergillus fumigatus の産生するトリプロスタチン類の生合成遺伝子クラスター の同定加藤直樹，鈴木宏和，高木海，高橋俊二，長田裕之（理研・中央研・抗生物質）

Aspergillus fumigatus の生産するトリプロスタチン（TPS）類は細胞周期を制御するジケトピペラジン化合物である。類縁体の構造によって微小管重合に対して阻害、あるいは促進する作用を示し、構造活性相関が非常に興味深く、そのファーマコアは抗ガン剤のリード化合物として期待される。そこで特定の TPS 類縁体の選択的生産、さらには新規類縁体の創製を目的に、生合成遺伝子クラスターの同定を行った。
A. fumigatus ゲノム情報中の推定 TPS 生合成遺伝子クラスターに含まれる９つの遺伝子のノックアウト株を作製した。初発の反応を担うと予測された非リボソーム型ペプチド合成酵素（NRPS）遺伝子の欠失により、TPS 生産が消失し、本遺伝子を含むクラスターが A. fumigatus において TPS 生産を担っていることが明らかとなった。NRPS による brevianamide F（cyclo-L- Trp-L-Pro）生成に次いで、プレニル基の付加による TPS-B、
インドール環へのメトキシ基の付加による TPS-A への変換が順に起きる。さらに環化反応、水酸化反応、プ
レニル基付加反応を経て、fumitremorgin C（FTM-C）、dihydroxy-FTM-C、FTM-B が生産される。野生株（BM939
株）ではこれら複数の TPS 類が培地中に検出されるのに対し、ノックアウト株では、それが担う反応よりも下流の代謝産物生産が欠損し、特定の化合物の蓄積が認められた。また、異宿主発現させた酵素を用いた invitro 反応により生成物を確認し、この一連の生合成経路の各段階を担う酵素遺伝子を同定した。今後は遺伝
子欠失と過剰発現を組み合わせた生合成経路改変により、有用な生物活性を示す TPS 類、例えば、微小管重合促進活性を示す cycloTPS-D の効率的生産を目指していきたい。
Identification of tryprostatin biosynthetic gene cluster of Aspergillus fumigatus
Naoki Kato, Hirokazu Suzuki, Hiroshi Takagi, Shunji Takahashi, Hiroyuki Osada(Antibiotics Lab., Discovery Res. Institute, RIKEN)

O-12Aspergillus nidulans の低酸素応答に関するプロテオ−ム解析
志水元亨，藤井達也，桝尾俊介，藤田健作，北爪達也，伊藤尚志，高谷直樹（筑波大院・生命環境）

嫌気的な環境下において、糸状菌 Aspergillus nidulans は、細胞質における酸化的リン酸化に伴い硝酸をアンモニアへと変換することによりエネルギーを獲得すること（アンモニア発酵）が見出されている。このことから、カビは低酸素条件に応答してエネルギー代謝を変化させるユニークな機構を有していると考えられた。一方、A. nidulans の全ゲノム塩基配列中には少なくとも約 10,000 の遺伝子が存在すると予測されており、細胞内の様々な代謝において、これらが複雑な機能ネットワーク構造を形成することが予想される。そこで、本研究では、低酸素条件下におけるカビの嫌気代謝機構を明らかにするために、プロテオミクスの手法を用いて低酸素（アンモニア発酵）条件下におけるタンパク質の発現挙動の変化を経時的に追跡した。
硝酸を窒素源として、低酸素条件下にて 6,12,24 時間培養後、菌体からタンパク質を抽出し、二次元電気泳動に供した。好気条件下と泳動パターンを比較したところ、低酸素条件下において発現挙動が変化するタ
ンパク質が多数確認された。MALDI-TOF-MS によるペプチドマスフィンガープリントから発現量が変化したタンパク質の同定を行った。その結果、嫌気条件下において、ペントースリン酸回路、グルタミン酸、脂肪酸、チアミン、ヌクレオチドおよび含硫アミノ酸の代謝経路の構成酵素をはじめとした種々のタンパク質の発現量が増加することが明らかとなった。特に、チアミンおよびヌクレオチド代謝とペントースリン酸回路の間のクロストークが、アンモニア発酵条件下において重要な役割を果たしていると考えられた。
Proteomic Analysis of Aspergillus nidulans under Anaerobic Conditions.
Motoyuki Shimizu, Tatsuya Fujii, Shunsuke Masuo, Kensaku Fujita, Tatsuya Kitazume, Takashi Ito, Naoki Takaya(Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba)

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O-13
米麹造りのポストゲノム解析
岩下和裕１,2、大北由佳１、河野美乃里１、西浦未華 2、冨村健太 1、坂本和俊１、山田

修１、三上重明(１酒総研・基盤, 2 広島大院・先端・生命機能)
麹菌の全ゲノム配列が報告され、醸造分野へのゲノム情報の利用が期待されている。しかし、これまでに米麹での経時的な全遺伝子発現及びタンパク質生産について検討した例はない。そこで、今後の清酒製造での研究開発の基盤情報とするため、米麹での全遺伝子の発現と生産タンパク質のプロファイル解析を行った。
使用菌株としては、清酒用麹菌の代表である RIB128 株を使用し、精米歩合 70%日本晴を用い箱製麹を行った。盛、仲仕事、仕舞仕事、最高温度、出麹時に複数箇所からサンプリングを行い、直ちに液体窒素で凍結後 RNA 抽出を行った。続いて麹菌 DNAchip により全遺伝子のトランスクリプトーム解析を行うと共に、出麹時の麹タンパク質のプロテオーム解析を行った。トランスクリプトーム解析の結果、盛から出麹にかけて麹菌の遺伝子発現は大きく変動することが明らかとなった。遺伝子の変動は、仲仕事から仕舞仕事の間で大きく、以前の NRIB3000 アレイの研究で報告された変曲点が観察された。また、出麹時の米麹抽出タンパ
ク質のプロファイルを解析したところ、これまでに米麹の研究で知られているタンパク質に加えて多数のタンパク質が同定された。
Postgenomic analysis of rice koji making
Kazuhiro IWASHITA1, 2, Yuka OHKITA1, Minori KOUNO1, Mika NISHIURA2, Kenta TOMIMURA1, Kazutoshi
SAKAMOTO1, Osamu YAMADA1, Shigeaki MIKAMI1(1National Research Institute of Brewing, 2, Hiroshima Univ.)

O-14
麹菌 Aspergillus oryzae の Non-Syntenic 領域の転写制御解析
玉野孝一 1，佐野元昭 2，山根倫子 1 ，寺林靖宣 1，戸田智美 1，砂川美佐緒 1，小池英明 1，畑本修 3 ，海附玄龍 3，高橋理 3，小山泰二 3、旭井亮一 4、阿部敬悦 5、町田雅之 1,2（1 産総研・セルエンジニアリング，2 金

沢工業大・ゲノム研，3 野田産研，4 産総研・生命情報工学研究センター，5 東北大院農・応生科）
麹菌全ゲノム配列解析の結果、麹菌の遺伝子総数は約 12,000 個で近縁菌の A. fumigatus や A. nidulans に比べて 3,000 個ほど遺伝子が多いことが明らかとなった。更にこれらの麹菌固有の遺伝子群は麹菌ゲノムに特異的な領域（Non-syntenic 領域, NSB）に存在することが認められた。NSB は加水分解酵素などの代謝系遺伝子が数多く存在していることから発酵に重要であるものと推測されるが、本研究では NSB の発酵の固体培養やその他培養条件での発現を解析することで、NSB の役割を解析することを目標とした。
麹菌 DNA マイクロアレイを用いた解析により、NSB の遺伝子群は固体培養で最も誘導され、逆に 42℃の培養で最も抑制されることが認められた。更に固体培養で誘導される NSB の遺伝子について調べた結果、代謝に関係する遺伝子で発酵に働く菌体外分泌酵素をコードする遺伝子群が主に誘導されることが明らかとなった。一方で NSB に存在する二次代謝物質合成に係る遺伝子は固体培養で全く誘導されていなかった。
本研究から、NSB は麹菌による発酵生産に重要な役割を担っている可能性が示唆された。
Transcriptional regulation of genes on the non-syntenic blocks of Aspergillus oryzae
Koichi Tamano1, Motoaki Sano2, Noriko Yamane1, Yasunobu Terabayashi1, Tomomi Toda1, Misao Sunagawa1,
Hideaki Koike1, Osamu Hatamoto3, Genryou Umitsuki3, Tadashi Takahashi3, Yasuji Koyama3, Ryoichi Asai4, Keietsu
Abe5, Masayuki Machida1,2 (1AIST RICE, 2KIT, 3NISR, 4AIST CBRC, 5 Tohoku Univ.)

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O-15
Woronin body 形成に関与する麹菌 Aohex1 遺伝子の選択的スプライシングの生理的意義
岩崎健太郎 1，山下修一 2, 丸山潤一 1, 北本勝ひこ 1（東大院・農生科・1 応生工･2 生環生）
【目的】Woronin body は、菌糸損傷時に溶菌の伝播を防ぐため隔壁孔を塞ぐ糸状菌特有のオルガネラである。
A. oryzae の Woronin body を形成する Aohex1 遺伝子の転写産物は選択的スプライシングを受け、スプライシ
ング型と５０アミノ酸長い非スプライシング型の 2 つのタンパク質を発現する 1)。本研究では、Aohex1 遺伝
子の選択的スプライシングが与える Woronin body の機能や形態への影響について解析した。
【方法・結果】Aohex1 遺伝子破壊株では、低浸透圧ショックによって菌糸の先端細胞が溶菌した際、隣接する細胞に溶菌が伝播する割合が高くなることが既に分かっている。また、破壊株では Congo red と micafungin
に対する感受性を示す。この破壊株にスプライシング型の AoHex1 のみを発現させた場合、これらの表現型は相補されるが、非スプライシング型の AoHex1 のみでは完全には相補できなかった。現在、各種 AoHex1
発現株での Woronin body の違いを解析するために、透過型電子顕微鏡による形態観察や、ショ糖密度勾配による Woronin body の分画を行っている。
1) Maruyama et al., (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 33, 1081-8.
Analysis of the effects caused by alternative splicing of Aohex1 transcripts on Woronin body in A. oryzae.
Kentaro Iwasaki1, Shuichi Yamashita2, Jun-ichi Maruyama1, Katsuhiko Kitamoto1(1Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo, Dept. 2Agric. and Envir. Biol., Univ. of Tokyo)

O-16
Localization and functional analyses of the AoSO protein in Aspergillus oryzae
Cristopher Salazar ESCAÑO, Jun-ichi MARUYAMA, Katsuhiko KITAMOTO (Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)
A network of interconnected hyphae is usually formed in mycelial colonies of filamentous ascomycete fungi.
Cytoplasmic continuity via septal pores and hyphal fusion facilitate translocation of nutrients within colonies. In
Aspergillus species, molecular mechanism regulating such mycelial network has not been intensively studied. Recently,
it has been reported that 2 homologous proteins, SO (Neurospora crassa) and Pro40 (Sordaria macrospora) localize at
the septal pore, similarly to Woronin bodies which plug during hyphal injury. These proteins are known to benecessary for hyphal fusion and sexual development in the ascomycete fungi. Here we report the characterization of
the SO/Pro40 homolog (AoSO) from Aspergillus oryzae. Microscopic investigations of AoSO-EGFP fusion protein
showed localization of AoSO in the septal pore as a punctuate dot under various stress conditions (high/low
temperature, extreme acidic/alkaline pH, nitrogen/carbon starvation). This suggests that AoSO may regulateintercellular communication during environmental changes. In the Aohex1 deletion strain lacking Woronin bodies,accumulation of the protein on the central portion of the septum was still evident under these stress conditions,although its migration to the septal pore was delayed. Furthermore, Aoso disruptants were obtained and will bephenotypically analyzed.

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O-17
麹菌 A. oryzae におけるエンドサイトーシスの生理学的機能解析
樋口裕次郎、正路淳也、有岡学、北本勝ひこ(東大院・農生科・応生工)【目的】我々はこれまでに細胞膜タンパク質 AoUapC と EGFP を融合した AoUapC-EGFP を用いて糸状菌におけるエンドサイトーシスの存在を初めて示した。しかし、糸状菌においてはエンドサイトーシスの詳細な機構や役割に関してはほとんどわかっていない。本研究では、S. cerevisiae におけるエンドサイトーシス関連
遺伝子である SLA2/END4 の A. oryzae におけるホモログ Aoend4 の条件発現株を作製し、糸状菌におけるエンドサイトーシスの生理学的機能の解析を行った。
【方法と結果】AoEnd4 の発現抑制条件下においては、菌糸の生育が著しく阻害され、先端生長に異常をきたしていることが示唆された。また、さまざまなストレス条件下においても生育は阻害され、ストレス感受性であることが示された。さらに、AoUapC-EGFP およびエンドサイトーシス経路を染色する試薬である
FM4-64 を用いてエンドサイトーシスが起こらないことを確認した。AoEnd4 の発現抑制条件下では、細胞膜上にエンドサイトーシスによる取り込み不全が原因と考えられる陥入様構造が観察された。この陥入様構造
は細胞壁の染色試薬である Calcofluor White と、FM4-64 により染色されたことから、エンドサイトーシスが欠損したことにより、取り込み部位に細胞壁成分が蓄積したものと示唆された。また、電子顕微鏡観察によっても陥入様構造に細胞壁が蓄積していることが確認された。次に、エンドサイトーシスによる取り込み部位に関する解析を行うため、エンドサイトーシス小胞形成の際のアクチン重合に関与し、エンドサイトーシスにおける取り込み部位に局在すると考えられている S. cerevisiae Abp1p の A. oryzae におけるホモログ
AoAbp1 と mDsRed の融合タンパク質を発現する株を作製した。
AoAbp1-mDsRed は菌糸の細胞表面に存在し、先端で多く観察され、さらに菌糸の中程および基部でも観察されたことから、糸状菌においてエンドサイト
ーシスはそれらの部位で行われていることが示唆された。
Analysis of physiological function of endocytosis in Aspergillus oryzae
Yujiro HIGUCHI, Jun-ya SHOJI, Manabu ARIOKA, Katsuhiko KITAMOTO (Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

46

P-1
リンゴ斑点落葉病菌の AM 毒素生合成遺伝子は複数コピー存在する．
播本佳明 1，児玉基一朗 2，山本幹博 3，尾谷浩 2 ，柘植尚志 1 (1 名大院生農・2 鳥取大農・3 岡山大農)

リンゴ斑点落葉病菌は，宿主特異的 AM 毒素を生産し，毒素感受性のリンゴ品種にのみ斑点性病害を引き起こす．
先に，本菌から 2 個の AM 毒素生合成遺伝子（AMT1 および AMT2）を単離し，これら遺伝子が小型の CD 染
色体にコードされていることを明らかにした．さらに，AMT 遺伝子を含む BAC クローンの塩基配列を決定し，118 kb の領域から新たに 23 個の推定読み枠(ORF)を同定した．毒素生産時と非生産時におけるこれら
ORF の発現レベルの比較によって，AMT1，AMT2 および 11 個の ORF が毒素生産時に高発現することを見出し，これら遺伝子を含む 69 kb 領域が毒素生合成遺伝子クラスターであると推定した．今回，これら遺伝子のうち AMT2, ORF6(チロクローム P450)および ORF11(チオエステラーゼ)の機能を遺伝子破壊によって解析した．遺伝子破壊株の解析によって，3 遺伝子はどれも本菌のゲノム中に 3 コピー存在することが明らかとなった．各遺伝子の 1 コピー破壊株は野生株に比べ毒素生産量が有意に減少し，ORF6 と ORF11 も毒素生合成に関与することが明らかとなった．そこで、これら ORF を AMT3，AMT4 とそれぞれ命名した．さらに，
AMT2 と AMT3 の 2 コピー破壊株を作出したところ，毒素生産量がさらに減少した．これら破壊株の病原性を検定したところ，各遺伝子の 1 コピー破壊株と AMT3 の 2 コピー破壊株は野生株とほぼ同様な病原性を示した．一方，AMT2 の 2 コピー破壊株は，正常な AMT2 遺伝子を 1 コピー有しているにもかかわらず，病原性をほとんど失った．以上の結果は，本菌の病原性発現には，少なくとも 2 コピーの AMT2 が必要であることを示唆した．
Presence of multiple copies of AM-toxin biosynthetic genes in the apple pathotype of Alternaria alternata
Yoshiaki Harimoto1, Motoichiro Kodama2, Mikihiro Yamamoto3, Hiroshi Otani2, Takashi Tsuge1(1Grad. Sch. Bioagric. Sci., Nagoya Univ., 2Fac. Agric., Tottori Univ., 3Fac. Agric., Okayama Univ.)

P-2
トマトアルターナリア茎枯病菌において宿主特異的 AAL 毒素生合成遺伝子（ALT）
クラスターが座乗する conditionally dispensable (CD)染色体
赤木靖典，赤松創，尾谷浩，柘植尚志 1，児玉基一朗（鳥取大農，1 名大院生農）

トマトアルターナリア茎枯病菌（Alternaria alternata tomato pathotype）は，病原性因子である宿主特異的
AAL 毒素を生産する．AAL 毒素生合成を支配する ALT クラスターは，ポリケチド合成酵素（PKS）遺伝子（ALT1）などを含む少なくとも 13 遺伝子群から構成されており，茎枯病菌のみが保有する 1.0 Mb CD 染色体に座乗している．世界各地から分離された茎枯病菌株における PFGE 核型分析の結果，本菌の CD 染色体
は，菌株の由来には関わらず全て共通サイズ (1.0 Mb) を示した．そこで本研究では，茎枯病菌におけるこれら CD 染色体の起源・由来について検討した．CD 染色体および他の主要（essential）染色体 (E 染色体) 上の遺伝子に関して，分子系統学的解析を行った．その結果，各菌株の CD 染色体に座乗する ALT1 および他の PKS 遺伝子の塩基配列はすべて同一であったのに対し，E 染色体上の遺伝子では菌株間で差異がみられた．
またテロメア配列，反復配列などを用いた fingerprinting 解析の結果，各菌株間において多型が認められた．
さらに rare cutting enzyme を用いた RFLP 解析においても，E 染色体座乗 PKS 遺伝子をプローブとした場合，菌株間で多型がみられるのに対し，CD 染色体上の ALT1 をプローブとした場合では，バンドパターンは全ての茎枯病菌株で一致した．これらの結果から，茎枯病菌 CD 染色体の遺伝的バックグラウンドは他の染色体群とは異なっていると考えられた．さらに，茎枯病菌と他の A. alternata 菌株間における細胞融合により得られたハイブリッド株の解析結果から，茎枯病菌由来の CD 染色体が菌株間で選択的に移行および保持されることが明らかとなった．以上の結果より，茎枯病菌 CD 染色体は本菌における病原性染色体であり，本 CD 染色
体が水平移動により茎枯病菌株の集団中に拡散した可能性が示唆された．
A gene cluster on a conditionally dispensable (CD) chromosome controlling AAL-toxin biosynthesis in thetomato pathotype of Alternaria alternata
Yasunori Akagi, Hajime Akamatsu, Hiroshi Otani, Takashi Tsuge, Motoichiro Kodama(Fac. Agric., Tottori Univ., 1Grad. Sch. Bioagric. Sci., Nagoya Univ.)

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P-3
Fusarium oxysporum におけるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の破壊
本山愛，中原光一*, 川端砂矢香*, 金山典生*, 寺岡

徹, 有江

力

（農工大院農・*サントリー）

Fusarium oxysporum はアルコール発酵能を有する (Shigh et al., 1991). アルコール発酵の初期反応であるピルビン酸からアセトアルデヒドへの変換はピルビン酸脱炭酸酵素が司っている. F. graminearum のゲノム情報を参考に, 縮重 PCR 法によって, トマト萎凋病菌 (F. oxysporum

f. sp. lycopersici: FOL) からピルビン酸

脱炭酸酵素をコードすると考えられる遺伝子（pdc1）をクローニングした (平成 18 年本学会で発表). FOLNBRC 6531 株を用いて pdc1 破壊株を作出した. pdc1 破壊株は好気条件下での菌糸生育、胞子形成能に変化はみられなかったが, 嫌気条件 (アネロパックケンキ使用, 酸素濃度約 0％) 下での生育は遅延した. また,液体振盪培養時のアセトアルデヒド, エタノール等の生産量の著しい低下がみられた. FOL は酸素分圧が低いと想定される植物の道管内で生育するため, 嫌気条件での生育と病原性の関連性に興味が持たれた. そこで, pdc1 破壊株のトマトに対する病原性検定を行ったところ, 病原性の低下やレースの変化, 植物組織内進
展速度に変化は認められなかった. 逆に, FOL の PDC1 過剰発現による表現型の変化をみるためにベクターを構築している.
Disruption of pyruvate decarboxylase gene in Fusarium oxysporum
Ai Motoyama, *Koichi Nakahara, *Sayaka Kawabata, *Norio Kaneyama, Tohru Teraka,Tsutomu Arie
(Tokyo Univ. of Agric.& Tech., *Suntory)

P-4
交配不全性糸状菌 Fusarium oxysporum にお ける交配型遺伝子領域（MAT1）イディオ
モルフ入換え体の作出
今井峻介・寺岡徹・有江力（農工大院農・植物病理）

植物病原性糸状菌 Fusarium oxysporum は交配不全性（asexual）である。ゲノム上に交配型遺伝子領域（MAT1）を持つこと、MAT1 には 2 つのイディオモルフ（MAT1-1、MAT1-2）が存在すること（Arie et al. 2000）、
MAT1 領域に存在する遺伝子が近縁で交配能を持つ Gibberella fujikuroi のものと極めて高い相同性を示すこと、各々の遺伝子が発現していること（Yun et al. 2000）等から、本菌は本質的に self incompatible な交配能を保持していると想定される。一方、F. oxysporum の 1 分化型であるトマト萎凋病菌（FOL）では同一 VCG（vegetative compatibility group）に属する菌株間でのみ菌糸融合及びヘテロカリオンを形成できるが、同一
VCG 内には単一の交配型の菌株しか存在しない（Kawabe et al. 2005）。さらに、FOL の染色体パターンをパ
ルスフィールドゲル電気泳動で調査したところ、同一 VCG に属する菌株間でも多様性が認められたことから、FOL の交配不全性の原因として「交配可能な集団内における異交配型菌株の不在」を想定した。この仮説を検証するために、同一 VCG に属し、染色体パターンも同一で、異なる交配型の菌株を人工的に作出することを試みた。FOL Tomino1-c 株 (MAT1-2) の MAT1 領域約 3.5 kb を 880621a-1 株 (MAT1-1) の MAT1 領
域約 4.5 kb に入換えた形質転換体 Tomino1-c（ΔMAT1-2:MAT1-1）株を二回相同組換えによって作出した。
同時に、異交配型の MAT1 領域が異所に挿入され、ゲノム上 MAT1-2 と MAT1-1 を併せ持つ Tomino1-c（MAT1-2:MAT1-1）株も作出した。現在、これらの形質転換体の交配能を検定している。
Replacement of MAT1 idiomorph in an asexual ascomycetes Fusarium oxysporum
Shunsuke Imai, Tohru Teraoka, Tsutomu Arie
(Lab. of Plant Pathology, Tokyo Univ. of Agri. and Tech. (TUAT)

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P-5
Fusarium oxysporum の病原性遺伝子変異株の生物防除活性緒方

綾 1，飯田祐一郎 1，黒田克利 2，柘植尚志 1（1 名大院生農，2 三重県科学技術振興センター）

Fusarium oxysporum 病害では，非病原性の F. oxysporum 菌株を各種作物に前接種することによって病害発生を抑制できること，すなわちこれら菌株が生物防除活性を有することが見出されている．しかしながら，全ての非病原性菌株が生物防除活性を示すわけではなく，有効な菌株の生理学的，遺伝学的特徴については
ほとんど明らかにされていない．そこで本研究では，生物防除に有効な非病原性株を作出するための遺伝学的情報の提供を最終目的として，先に同定したメロンつる割病菌（F. oxysporum f. sp. melonis）の病原性遺伝
子のうち，FOW2 と FoPCK1 の変異株についてメロンつる割病に対する生物防除活性を検定した．FOW2 は
Zn(II)2Cys6 タイプの転写制御因子をコードし，その変異株は根表皮細胞への侵入能力を失い，メロンに対して全く病原性を示さない．FoPCK1 は糖新生の鍵酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードし，その変異株は低頻度ではあるが，根表皮細胞へ侵入し，根組織中である程度増殖するが，病原性をほとんど失っている．各種濃度（106, 107 および 10 8 細胞/ml）の変異株の bud cell 懸濁液を本葉が 1 枚展開したメロン苗に浸根接種した後，汚染土壌（野生株の bud cell を 105 細胞/g の濃度で添加）で 3 週間栽培
し，継時的に発病程度を観察した．変異株無接種区では，20 日後には全ての苗が枯死した．ΔFOW2 変異株を前接種した場合には，前接種 bud cell 濃度に依存して顕著な発病抑制が認められ，ΔFOW2 変異株が高い
生物防除活性をもつことが明らかとなった．一方，ΔFoPCK1 変異株を前接種した場合には，むしろ発病が助長され，本変異株は生物防除活性をもたないことが明らかとなった．以上の結果は，同じ菌株由来の非病
原性変異株でも，変異遺伝子によって生物防除活性が異なることを示した．
Biological control activity of pathogenicity mutants of Fusarium oxysporum
Aya Ogata1, Yuichiro Iida1, Katsutoshi Kuroda2, Takashi Tsuge1(1Grad. Sch. Bioagric. Sci., Nagoya Univ., 2 Mie Pref. Sci. Technol. Prom. Cent.)

P-6
アブラナ科野菜類炭疽病菌の効率的な遺伝子ターゲティング実験系の確立
寺田寛，坪井基枝，牛丸拓磨，辻元人，久保康之（京府大院・農）

アブラナ科野菜類炭疽病菌はモデル植物シロイヌナズナに感染することから、病原菌‐植物間相互作用を解析する上で有用な病原糸状菌である。本菌における遺伝子機能解析を進めるにあたり、相同組み換えを利用した標的遺伝子破壊実験系の確立は重要である。しかしながら、本菌より単離した 2 種の遺伝子、ポリケ
チド合成酵素遺伝子 ChPKS1 および酵母 SSD1 オルソログ ChSSD1 について、アグロバクテリウム形質転換(AtMT)法による標的遺伝子破壊実験を行ったところ、その破壊効率はそれぞれ 2.4%、0.6%と極めて低く、破壊株作出が困難であることが明らかとなった。近年、非相同組換えに関与する遺伝子 mus-51 を欠損させたアカパンカビにおいて、相同組換え効率が上昇するとの報告がされている。そこで、degenerate PCR 法によりアブラナ科野菜類炭疽病菌から mus-51 オルソログ（ChMUS51）を単離し、chmus51 破壊株を作出した。
その性状解析を行ったところ、菌糸生育、胞子形成、感染器官分化および病原性のいずれにおいても野生株との差は認められなかった。そこで、本系統を親株とした ChPKS1 および ChSSD1 破壊実験を行った結果、破壊効率はそれぞれ 97.5％、98.3％と野生株と比較して大きく上昇した。以上の結果から、AtMT 法を用いた本菌の効率的な遺伝子破壊株の作出に chmus51 破壊株が有用であると考えられた。
Establishment of efficient gene targeting system in Colletotrichum higginsianum.
Hiroshi Terada, Kie Tsuboi, Takuma Ushimaru, Gento Tsuji, Yasuyuki Kubo
(Grad. Sch. Agri., Kyoto Pref. Univ.)

49

P-7
ウリ類炭疽病菌の分裂酵母 tea1 ホモログ変異株を利用した付着器形成に関与する
Ca2+シグナル関連遺伝子の探索
坂口歩・辻

元人・久保康之（京府大院農）ウリ類炭疽病菌における分裂酵母 tea1 ホモログ ClaKEL2 の遺伝子破壊株は、人工基質上で異常形態の付着器を形成するが、宿主上では正常付着器を形成する。このことから、本菌の付着器分化には少なくとも 2
つ以上の情報伝達経路が存在することが考えられ、また、この clakel2 破壊株の正常付着器分化には、植物因子により誘導される Ca2+シグナル伝達経路が関与していることを示す結果がすでに得られている。本研究では，AtMT 法を用いて clakel2 破壊株を親株とした T-DNA 挿入変異株を作出し、付着器分化に関与する Ca2+
シグナル関連遺伝子の探索を行った。最初に、得られた 8485 株の T-DNA 挿入株について、400 mM CaCl2
添加 PDA 上で培養し CaCl2 に対して耐性または感受性を示す株、およびコロニー形態が親株と異なる株 945
株を Ca2+シグナル伝達関連遺伝子変異候補株として選抜した。次に、得られた候補株の宿主上での付着器形態を観察し，付着器形態異常を示した 30 株を選抜した。現在、これら異常付着器形成株の ClaKEL2 相補試験を行い、宿主上で正常付着器形成を示す株を、宿主上での clakel2 破壊株の正常付着器形成に関与する遺伝子破壊候補株として同定を行っている。
A search for Ca2+ signaling related genes involve in appressorium development by using Schizosaccharomyces
pombe tea1 homologue mutant of Colletotrichum lagenarium.
Ayumu Sakaguchi, Gento Tsuji, Yasuyuki Kubo.
(Grad. Sch. Agri., Kyoto Pref. Univ.)

P-8
ウリ類炭疽病菌の NADPHoxidase をコードする ClaNOX1、ClaNOX2 遺伝子の機能 解析大澤貴紀，辻元人，久保康之(京府大院･農）ウリ類炭疽病菌から NADPHoxidase をコードする遺伝子 ClaNOX1、ClaNOX2、ClaNOX3 を単離した。そのうち ClaNOX1、ClaNOX2 の破壊株の作出に成功し、遺伝子の機能解析を行った。clanox1 破壊株は野生株と比べて胞子形成量の減少が見られたが胞子発芽や付着器の分化、病原性に違いは見られなかった。一方、clanox2 破壊株はキュウリ子葉を用いた病原性試験で野生株と比較して顕著な病斑形成率の低下が認められた。また、有傷接種では clanox2 破壊株は野生株様の病斑を示し、ClaNOX2 は宿主内進展に関与していない
ことが示唆された。一方、セルロース膜上では、clanox2 破壊株は胞子発芽から付着器形成過程における形
態形成は野生株と同様であったが、侵入菌糸の形成は全く見られず貫穿糸の形成も見られなかった。このことから、clanox2 破壊株の病原性の低下は貫穿糸が形成できないことによると考えられた。しかしながら、
clanox2 破壊株をキュウリ子葉の裏表皮に接種し、侵入菌糸を観察したところ、一部で侵入菌糸の進展が観察された。このことから、ClaNOX2 は付着器からの侵入菌糸形成過程に関与するが、植物体上では ClaNOX2を介さない経路が働く可能性が考えられた。
Characterization of ClaNOX1 and ClaNOX2 genes coding for NADPHoxidase in Colletotrichum lagenarium.
Takanori Osawa, Gento Tsuji, Yasuyuki Kubo
(Grad. Sch. of Agric., Kyoto Prefectural Univ)

50

P-9
Mglig4 は Magnaporthe grisea の非相同末端結合修復に関与する
鬼頭英樹，藤川貴志、西村麻里江（生物研）
糸状菌を含めた多くの真核生物における二本鎖 DNA 切断の修復機構の一つに非相同末端結合修復がある。真核生物の非相同末端結合修復に重要な機能を持ついくつかの遺伝子のうち、ヒトの Ku70 ホモログ
（Mgku70）および Lig4 ホモログ（Mglig4）の植物病原性糸状菌 Magnaporthe grisea における機能を調べた。
MgKU70 と MgLIG4 の構造遺伝子領域を Hygromycin phosphotransferase 遺伝子で置換し遺伝子破壊を行った。mgku70、 mglig4 破壊株では栄要成長、交配能、病原性については野生型株との間に違いが見られなかった。野生株、mgku70 破壊株、 mglig4 破壊株に対して形質転換をした場合の遺伝子ターゲッティング効率は mgku70 破壊株で野生株の約 2 倍、mglig4 破壊株で約 5 倍に上昇した。mgku70 破壊株は各種二本鎖切断因子に対して野生株と同等の耐性を示した。mglig4 破壊株では UV、4-Nitroquinoline 1-oxide, camptothectin に対し感受性が増したが、ethylmethansulfonate、 Hydroxyurea、Etoposide、Bleomycine では変化がなかった。
mglig4 破壊株に MgLIG4 を再度導入した相補株では、遺伝子ターゲッティング効率、薬剤耐性が野生型を回復した。
以上のことから、M. grisea の非相同末端結合修復において、Mgku70 と異なり Mglig4 は重要な機能を持つことが明らかになった。
（本研究は生研センター異分野融合研究事業により支援を受けた。）
Mglig4, a human Lig4 homolog, is involved in non-homologous end-joining events in Magnaporthe grisea.
Hideki Kito, Takashi Fujikawa, Marie Nishimura(NIAS)P-10
イネいもち病菌 Magnaporthe oryzae のキチン合成酵素の生長、分化、病原性に おける役割の解析
本山高幸 1，落合奈緒子 1，工藤俊章 2（1 理研・中央研、2 長崎大・水産）【目的】キチンは糸状菌細胞壁の主要成分であり、糸状菌の生長分化において重要な役割を持つ。一方、植物と植物病原糸状菌との相互作用においてはキチンは重要なシグナル物質として働くことが知られている。
特にイネといもち病菌の系ではイネにおけるキチンレセプターがクローニングされるなど解析が進んでいる。本研究では、イネいもち病菌 Magnaporthe oryzae のキチン合成酵素がイネとの相互作用においてどのような役割を持つかについて明らかにすることを目的とする。
【方法・結果】イネいもち病菌のゲノム中にはクラス I からクラス VII まで合計 7 種のキチン合成酵素遺伝
子が存在する。まず、発現量の多いクラス I キチン合成酵素遺伝子の破壊株を作製したが、野生株との顕著な違いは認められなかった。次に、クラス I キチン合成酵素と重複した機能を持つことが知られているクラス II キチン合成酵素との二重遺伝子破壊株を作製したところ、顕著な生育の遅延、キチン合成酵素阻害剤感
受性の上昇、分生子形成能の低下、感染特異的器官（付着器）の形成能と機能の低下が認められた。
Analysis on roles of chitin syntases of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae in growth, differentiation, andpathogenicity
Takayuki Motoyama1, Naoko Ochiai1, Toshiaki Kudo2(1Discovery Res. Institute, RIKEN, 2Fac. Fish., Univ. Nagasaki)

51

P-11
Aspergillus niger の分生子を用いたシアン非 感受性呼吸系酵素遺伝子(aox1)の視覚的な発現解析
服部貴澄，本田裕樹，木野邦器，桐村光太郎（早大・理工・応化）【目的】クエン酸生産糸状菌 Aspergillus niger WU-2223L には、alternative oxidase(AOX)が触媒するシアン非感受性
呼吸系が存在する。演者らは、AOX 遺伝子(aox1)と EGFP 遺伝子(egfp)の融合遺伝子を用いた視覚的な発現解析系を構築し、菌糸における aox1 の構成的発現を確認した 1)。本研究では、単核かつ単細胞の A. niger の分生子を発現解析に供し AOX-EGFP の蛍光測光により、代表的なストレスである熱および浸透圧に対する aox1 の発現応答について解析した。
【方法および結果】上流領域を含む aox1 の下流に egfp を連結した融合遺伝子を、A. niger WU-2223L 由来の aox1
破壊株に導入した AOXEGFP-1 株を供試菌として使用した。AOXEGFP-1 株の菌糸においては AOX-EGFP の蛍光強度と AOX 活性が正に相関し蛍光強度による発現解析が可能である 1)。さらに、AOXEGFP-1 株の分生子を用いた
AOX-EGFP の蛍光測光により、aox1 の視覚的かつ定量的な発現解析を可能とした 2)。一方、aox1 の上流領域には
HSE や STRE が存在する。そこで、AOXEGFP-1 株の分生子を利用した AOX の生理学的機能の解析例として熱等に対する aox1 のストレス応答の解析を行った。40℃で 1 時間処理し熱ストレスを与えた分生子において予想通り
AOX-EGFP の蛍光強度の増大を検出した。以上より、AOXEGFP-1 株の分生子を用いて、aox1 のストレス応答の視覚的な発現解析に成功し、AOX が熱等のストレスに関連した生理学的機能と関連する可能性が示唆された。
1)
K. Kirimura, et al., J. Biosci. Bioeng., 102, 210-214 (2006)
2)
T. Hattori, et al., J. Biosci. Bioeng., submitted.
Visual Expression Analysis of the Alternative Oxidase Gene (aox1) in the Conidia of Aspergiilus niger
Takasumi Hattori, Yuki Honda, Kuniki Kino, Kohtaro Kirimura(Dept. Appl. Chem., Sch. Sci. Eng., Waseda Univ.)

P-12
クエン酸生産糸状菌 Aspergillus niger における NADP+依存性 isocitrate dehydrogenase
遺伝子(icdA)の高発現による代謝改変
林理恵，服部貴澄, 木野邦器, 桐村光太郎（早大・理工・応化）【目的】クエン酸は TCA 回路内の主要な中間体の一つであり、クエン酸生産糸状菌 A. niger におけるクエン酸の大量蓄積には、NADP+依存性 isocitrate dehydrogenase (NADP+-ICDH) が関連するとされている。本研究では、クエン酸生産糸状菌 A. niger WU-2223L において NADP+-ICDH 遺伝子(icdA)の高発現を行い、クエン酸生産量をはじめとする代謝改変を検討した。
【方法および結果】糸状菌用高発現プロモーターP-No8142 の下流に A. niger WU-2223L 由来の icdA cDNA1)を連結したプラスミドを WU-2223L に導入し、WU-2223L と比較してクエン酸生産条件において約４倍のNADP+-ICDH 比活性を示す OPI-1 株を取得した。また、同条件で 12 日間培養した場合、OPI-1 は WU-2223Lと比較してクエン酸生産量が約 25%、消費グルコース量が約 15%減少した。これは NADP+-ICDH 比活性の上昇によりイソクエン酸の分解が促進されるとともに、TCA 回路の進行により解糖系の進行が抑制されたものと考えられる。以上より、icdA の発現量を変化させることにより人為的にクエン酸生産性を改変しうる可能性が示唆された。
1) K. Kirimura, et al., J. Biosci. Bioeng., 93, 136-144 (2002)
Metabolic Changes by Overexpression of NADP+-specific Isocitrate Dehydrogenase Gene (icdA) in Citric
Acid-Producing Aspergillus niger
Rie Hayashi, Takasumi Hattori, Kuniki Kino, Kohtaro Kirimura (Dept. Appl. Chem., Sch. Sci. Eng., Waseda Univ.)

52

P-13
麹菌 A. oryzae における後期エンドソーム構造の同定
正路淳也, 辰巳晶紀, 菊間隆志, 有岡学, 北本勝ひこ (東大院・農生科・応生工)【目的】真核微生物の液胞は、細胞質の恒常性を維持するとともに、産業上重要な多くの加水分解酵素を含む。これまで我々は、糸状菌 Aspergillus oryzae において液胞への小胞輸送および液胞機能の解析を行ってきた。しかし、液胞への輸送において重要な中間構造体である後期エンドソームに関する知見の不足が更なる解析を妨げていた。そこで本研究では、出芽酵母の後期エンドソームに局在する複数のタンパク質の相同タ
ンパク質を用いることで、A. oryzae における後期エンドソーム構造の同定を行った。
【方法と結果】出芽酵母において後期エンドソームに局在する Vps23p、Snf7p、Syn8p の A. oryzae における
相同タンパク質 AoVps23p、AoSnf7p、AoSyn8p と EGFP の融合タンパク質を発現し、その局在を蛍光顕微鏡
により観察した。その結果、いずれの融合タンパク質も液胞近傍の粒状構造体に局在することが分かった。
さらに AoVps23p-EGFP 融合タンパク質と AoSnf7p-mDsRed または mDsRed-AoSyn8p 融合タンパク質がこの粒状構造体において共局在することを明らかにした。このことから、これら融合タンパク質が局在する液胞
近傍の粒状構造体は、出芽酵母の後期エンドソームと同等な機能を持つ構造体、すなわち A. oryzae における後期エンドソームであることが示唆された。さらに今回用いた融合タンパク質を後期エンドソームのマーカーとして用いることで、液胞膜上の t-SNARE タンパク質 AoVam3p が後期エンドソームにも局在すること、後期エンドソームの機能に関わると考えられる Aovps24 の破壊によって、液胞と後期エンドソーム両者の性質を持つ複合オルガネラが生じることを明らかにした。
Identification of the late endosome in the filamentous fungus Aspergillus oryzae
Jun-ya Shoji, Akinori Tatsumi, Takashi Kikuma, Manabu Arioka, Katsuhiko Kitamoto(Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

P-14
麹菌 A. oryzae における Rab family GTPase の網羅的解析
平田恭子，正路淳也，有岡学,北本勝ひこ（東大院・農生科・応生工）【目的】真核生物の細胞内において小胞輸送に関わる Rab GTPase は、輸送小胞が出芽する際に輸送小胞表面に集められ、小胞がその目的のオルガネラへ間違いなく輸送されるためのタグのような働きをしている。
これまでに我々は、小胞輸送において中心的に働く全 21 個の SANRE タンパク質の局在を明らかにすること
で、A. oryzae における小胞輸送の大まかな全体像を把握することに成功している。本研究においては、糸状菌細胞を小胞輸送という側面から細胞生物学的に理解し細胞内構造のより詳細な全体像を捉えるために、A.
oryzae ゲノム情報から予想された 10 個の Rab GTPase の局在を、EGFP との融合タンパク質を用い網羅的に解析することを目的とする。
【方法と結果】A. oryzae において Rab GTPase をコードすると予想される遺伝子に対し、MultiSite Gateway
Cloning System を用いることにより egfp との融合遺伝子(各遺伝子の 5ʼ末端側に egfp を融合)を amyB promoter
下において発現するベクターを順次構築し、これらを用いて A. oryzae niaD300 株の形質転換を行っている。
さらに、蛍光顕微鏡を用いて各形質転換体の EGFP 蛍光を確認し、その局在を細胞染色等の結果と比較する
ことにより各 Rab GTPase の細胞内局在部位を観察する予定である。これまでに Rab11、Sec4 のホモログである AoRab11、AoSec4 について形質転換体を取得し、EGFP 蛍光を観察した。その結果、いずれの融合タン
パク質も、細胞質と同時に何らかのオルガネラ上に蓄積していることが分かった。今後、FM4-64 を用いた細胞染色によって局在部位の同定を行う予定である。また、その他の Rab GTPase についても同様に解析を進めていく。
Comprehensive analysis of Rab family GTPases in Aspergillus oryzae.
Kyoko HIRATA, Jun-ya SHOJI, Manabu ARIOKA, Katsuhiko KITAMOTO(Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

53

P-15
A. oryzae 小胞体の糖タンパク質品質管理機 構に関連する遺伝子群の機能解析
渡邉泰祐 1,2，松尾一郎 1,2，戸谷希一郎 1,2，丸山潤一 3，北本勝ひこ 3，伊藤幸成 1,2（理研 1，CREST2，東大院
農生科・応生工 3）【目的】真核生物の小胞体において、アスパラギン結合型糖鎖を介した糖タンパク質の品質管理機構の存在が示唆されている。麹菌 A. oryzae のゲノム配列情報から、A. oryzae では糖タンパク質品質管理機構に関連する遺伝子群（カルネキシン（CNX）、グルコシダーゼ II（GII）、UDP-グルコース-糖タンパク質グルコース
転移酵素（UGGT）、マンノシダーゼ等）の存在が明らかとなっている。しかしながら、これに関与するタンパク質としての機能を解析した研究は限られている。そこで我々は、A. oryzae の糖タンパク質品質管理機
構を包括的に理解することを目的として、これらの遺伝子を系統的に破壊し、表現型解析を行った。
【方法と結果】MultiSite GatewayTM System を用いることにより、CNX, GII α サブユニット, GII βサブユニ
ット、UGGT をコードする遺伝子に adeA マーカーを挿入した遺伝子破壊用 DNA 断片を作製した。これらを
A. oryzae ligD 欠損株 NAR-AlD3 (niaD- sC- adeA- ΔligD)に導入することにより、遺伝子破壊株を取得した。
各遺伝子の破壊は、サザン解析により確認した。現在、各遺伝子破壊株の小胞体を含む膜画分を用いて、グルコシダーゼ II 活性、UGGT 活性に対する遺伝子破壊の影響を検討している。グルコシダーゼ II 活性は、蛍光タグが結合した Glc2Man9GlcNAc2 糖鎖に対するグルコース切断反応、UGGT 活性に関しては、蛍光タグが結合した Man9GlcNAc2 糖鎖に対するグルコース転移反応について、HPLC を用いた定量解析を行っている。
Functional analysis of the genes related with ER glycoprotein quality control in Aspergillus oryzae
Taisuke Watanabe1,2, Ichiro Matsuo1,2, Kiichiro Totani1,2, Jun-ichi Maruyama3, Katsuhiko Kitamoto3, Yukishige Ito1,2(RIKEN1, CREST2, Dept. of Biotech., Univ. of Tokyo3)

P-16
麹菌 A. oryzae における分泌タンパク質 AmyB の動態解析
石川絵理，正路淳也，有岡学，北本勝ひこ（東大院・農生科・応生工）[目的] 麹菌 Aspergillus oryzae は優れたタンパク質分泌能力を有しており、有用タンパク質生産の宿主として利用されていることから、その分泌機構の解明は重要である。糸状菌において分泌は主に菌糸先端から起こると考えられているが、隔壁など菌糸先端以外からの分泌が存在することも示唆されている。本研究では、A. oryzae において大量に分泌されるアミラーゼである AmyB を利用することにより、菌糸先端や隔壁への分泌を含む A. oryzae の分泌機構の全容を明らかにすることを目的とした。
[結果]AmyB の観察のため、AmyB に EGFP を付加した融合タンパク質を発現する株を使用した。この株
を液体培地で培養すると、菌糸の先端と隔壁に EGFP 蛍光の局在が見られた。このことから、タンパク質分泌は菌糸先端及び隔壁の両方へ起こっていることが示唆された。一方、0.8％アガロースを含んだ培地で培養すると、EGFP 蛍光は菌糸の先端には見られたものの隔壁には見られず、かわりに細胞全体に小胞体様の蛍光が見られた。これに対し、アガロースを含む培地で生育させた菌糸に液体培地を添加したところ、隔壁においても EGFP 蛍光が見られるようになった。以上の結果から、菌糸先端へのタンパク質分泌はある程度恒常的に起こるものの、隔壁への分泌は環境条件によって制御されていることが示唆された。現在、隔壁への分泌が隔壁形成時にのみ起こるのか、構成的に起こっているのかの検討を行っている。
Dynamics analysis of EGFP fused AmyB in Aspergillus oryzae
Eri Ishikawa, Jun-ya Shoji, Manabu Arioka, Katsuhiko Kitamoto (Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

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P-17
麹菌 A. oryzae におけるペルオキシソーム生合成因子 AoPex11 の機能解析
Praveen Rao JUVVADI1、Cristopher Salazar ESCAÑO1、金鋒傑 2、高橋理 2、小山泰二 2、丸山潤一 1、北本勝ひこ 1（1 東大院・農生科・応生工、2 野田産研）【目的】ペルオキシソームは真核生物に普遍的に存在するオルガネラであり、多数の peroxin と呼ばれるペルオキシソーム生合成因子がその形成に関与している。Woronin body タンパク質 Hex1 は C 末にペルオキ
シソーム局在配列(PTS1)を有することから、これまでに Woronin body 形成へのペルオキシソームの関与が指摘されている。しかし、ペルオキシソームから Woronin body が分化・独立する機構についてはあまりわかっていない。peroxin のひとつである Pex11 はペルオキシソームの分裂・増殖に必要なことから、本研究ではA. oryzae の pex11 相同遺伝子に着目し機能解析を行った。
【方法と結果】PEX11 遺伝子と相同性を有する遺伝子を A. oryzae ゲノムデータベースで検索した結果、２つ見出し、それぞれ Aopex11-1、Aopex11-2 と命名した。これらの遺伝子について、A. oryzae Ku70 欠損株
NSRKu70-1-1 (niaD- sC- ΔargB adeA- Δku70::argB)を宿主とし、adeA マーカーを用いて破壊株を取得した。グ
ルコースを炭素源とした培地では生育に影響は見られなかったが、オレイン酸を炭素源にすると Aopex11-1
遺伝子破壊株で生育阻害が認められた。また、ペルオキシソームおよび Woronin body を蛍光タンパク質で可視化したところ、Aopex11-1 遺伝子破壊により両オルガネラが肥大化しているのが観察された。現在、各遺伝子破壊株における Woronin body の機能への影響を解析している。
Functional characterization of AoPex11 involved in peroxisome biogenesis in Aspergillus oryzae
1
Praveen Rao JUVVADI, 1Cristopher Salazar ESCAÑO, 2Feng Jie JIN, 2 Tadashi TAKAHASHI, 2 Yasuji KOYAMA,
1
Jun-ichi MARUYAMA, 1Katsuhiko KITAMOTO (1Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo, 2Noda Inst. Sci. Res.)P-18
麹菌 A. oryzae におけるキネシン様タンパク質 AoKin3 を用いたエンドソームの動態解析
滝口鉄也、樋口裕次郎、正路淳也、有岡学、北本勝ひこ(東大院・農生科・応生工)【目的】エンドソームは、エンドサイトーシスにより取り込まれた輸送小胞およびトランスゴルジ網からの輸送小胞と融合し、運び込まれたタンパク質の分類と選別を行うオルガネラである。我々は麹菌 A. oryzaeを用いて、糸状菌におけるエンドソームの動態解析を試みている。これまで、細胞膜タンパク質である
AoUapC と EGFP の融合タンパク質 AoUapC-EGFP を用いて、エンドソームが菌糸中を平均 5 μm/s で微小管依存的に動くことを示した 1)。本研究ではエンドソームの動態とモータータンパク質との関係を明らかにするため、まずキネシン様タンパク質の可視化を行った。
【方法と結果】Ustilago maydis において微小管プラス端方向へのエンドソーム輸送に関与するとされる
UmKin3 のホモログ AoKin3 と EGFP との融合タンパク質を発現する株を作製し、その動態を解析した。その結果、AoKin3-EGFP は AoUapC で観察されたエンドソームと同様の挙動を示し、菌糸中を先端および基部の両方向へ移動した。また薬剤を用いた実験から、この動態が AoUapC-EGFP で可視化されたエンドソー
ムの動態と同様に、アクチン非依存的であり、微小管依存的であることが分かった。次にエンドサイトーシ
ス経路の染色試薬である FM4-64 との共染色を行った。その結果、AoKin3-EGFP が FM4-64 と共局在しながら菌糸内部を移動している様子が観察された。以上のことから AoKin3 はエンドソームに局在し、エンドソームの動態を制御するキネシンであることが示唆された。現在、AoKin3 のより詳細な動態解析を行うため、異なる蛍光タンパク質と融合したα-チューブリンおよび AoKin3 を同時に発現する株の作製を行っている。
1) Higuchi Y. et al.(2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 340, 784-791.
Analysis of the movement of endosome using AoKin3 in Aspergillus oryzae
Tetsuya TAKIGUCHI, Yujiro HIGUCHI, Jun-ya SHOJI, Manabu ARIOKA, Katsuhiko KITAMOTO (Dept. of
Biotechnol., Univ. of Tokyo)

55

P-19
麹菌 A. oryzae におけるペルオキシソーム局在配列レセプターAoPex5, 7 の機能解析
田鍋康子, 岩崎健太郎,丸山潤一, 北本勝ひこ（東大院・農生科・応生工）【目的】ペルオキシソームは真核細胞に存在するオルガネラであり、過酸化水素の無毒化や脂肪酸β酸化な
ど様々な機能を持つことが知られている。ペルオキシソームへのタンパク質の輸送には、ペルオキシソーム
局在配列である PTS1、PTS2 によって運ばれる２つのタイプがある。このとき PTS1、PTS2 配列を認識する
レセプターがそれぞれ Pex5,7 である。また、Woronin body は菌糸損傷時に溶菌の伝播を防ぐため隔壁孔を塞ぐ糸状菌特有のオルガネラであるが、これを形成するタンパク質 AoHex1 も PTS1 配列を有している。本研究では、A. oryzae におけるペルオキシソーム局在シグナルレセプターPex5,7、および AoHex1 の PTS1 配列の機能解析を行った。
【方法・結果】PEX5 遺伝子の配列をもとに A. oryzae のゲノムデータベースで検索した結果、相同な遺伝子を見出し、Aopex5 と命名した。AoPex5 は、Saccharomyces cerevsiae、Homo sapiens の Pex5 とそれぞれ 25.5%、
20.1%の相同性を有する。Aopex5 遺伝子について、A. oryzae Ku70 欠損株 NSRKu70-1-1 を宿主として用い、
adeA マーカーで置換することで破壊した。
一方で、Woronin body 機能不全を示す Aohex1 遺伝子破壊株を用いた相補実験により、AoHex1 の PTS1
配列の機能を調べた。その結果、PTS1 欠損 AoHex１発現によって Aohex1 破壊株は相補されなかった。このことから、AoHex1 のペルオキシソーム局在配列が Woronin body の機能発現に必要であることがわかった。
今後は Aopex7 破壊株の取得とともに、各遺伝子破壊株におけるペルオキシソームおよび Woronin body の機能を調べる予定である。
Functional analysis of the peroxisome targeting signal receptors AoPex5,7 in A. oryzae.
Yasuko TANABE, Kentaro IWASAKI , Jun-ichi MARUYAMA, Katsuhiko KITAMOTO(Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

P-20
麹菌の産生する生分解性プラスチック分解促進蛋白質 RolA の疎水面への吸 着部
位の特定
上原健二１ , 高橋徹 1 , 前田浩 2 , 山形洋平 2 , 長谷川史彦 1, 五味勝也 1 , 阿部敬悦 1(東北大・未来研 1 , 東北大・農・応生科 2)[目的] 我々は麹菌を用いた生分解性プラスチックの大規模分解リサイクル系の構築を目指している。麹菌は
cutinase CutL1 を分泌して生分解性プラスチックの一種である PBSA を分解する(1)。 我々は麹菌が PBSA 分
解時、CutL1 以外に界面活性蛋白質 hydrophobin RolA を産生し、RolA が CutL1 を PBSA 表面にリクルート
して分解を促進する事を明らかにした(2)。また RolA が疎水表面に吸着後、表面上を水平方向に可動するという特殊な物理化学的な現象を見出した(2)。疎水表面に吸着した蛋白質がこのような現象を示すことは知られていない。本研究では、RolA の疎水表面における水平方向可動機構を解明すべく、RolA の疎水面への吸着部位の特定を試みた。
[方法・結果] 1 )RolA 合成ペプチドを用いた競合阻害実験：RolA の全アミノ酸配列をカバーする 6 種のペプチドを合成した。疎水性物質への吸着に関わる領域が含まれるペプチドは RolA と競合的に疎水性物質に吸着すると考えられた。RolA の疎水性物質への吸着を阻害する合成ペプチドを探索し、阻害するペプチドを見出した。2 )変異体 RolA の疎水性物質への吸着実験：RolA のアミノ酸配列から、吸着に関与していると考えられる疎水性アミノ酸の集中する部位を置換した変異体を作製した。変異体の吸着能を調べたところ、吸着能が減少している変異体が見出された。
(1)Maeda et al. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 67: 778–788(2)Takahashi et al. Mol Microbiol (2005) 57(6), 1780–1796
Assignment of the binding region of A.oryzae hydrophobin RolA to hydrophobic surface
Kenji Uehara１ , Toru Takahashi1 , Hirosi Maeda2 , Youhei Yamagata2 , Fumihiko Hasegawa1, Katsuya Gomi1 , Keietsu
Abe1 (NICHe.,Tohoku Univ.1 , Grad.Sch.,Tohoku Univ.2)

56

P-21
麹菌の Ski 遺伝子群の探索と nonstop mRNA 分解 への関与
田中瑞己 1，徳岡昌文 2, 五味勝也 1（1 東北大院農・生物産業創成, 2 野田産研）

麹菌において異種遺伝子を発現させた場合、異種遺伝子 ORF 内への異常 poly(A) 付加が起こり、ストップ
コドンを有さない nonstop mRNA が生成され、nonstop mRNA decay (NSD) によって分解されることが示唆された。NSD の機構についてはこれまでに出芽酵母において、 Ski7p による nonstop mRNA 認識に伴うエキソソームによる 3’→5’ 分解モデル、および Ski7p 非依存的な 5’→3’ エキソヌクレアーゼ Ski1p による
5’→3’ 分解モデルが示されている。出芽酵母の Ski タンパク質と相同性を持つタンパク質を Aspergillus 属
カビのゲノムデータベースから探索したところ、興味深いことに出芽酵母において NSD に重要な役割を担う Ski7p と相同性を示すタンパク質は存在しなかった。一方で、5’→3’ エキソヌクレアーゼ Ski1p, エキソ
ソームによる 3’→5’ mRNA 分解に必須な因子である Ski 複合体の構成タンパク質の１つである Ski2p, エ
キソソームの構成サブユニットの１つである Ski4p と高い相同性を持つタンパク質が見いだされた。麹菌においてこれらの遺伝子破壊株を作製したところ、ski1 破壊株では出芽酵母と同様に著しい生育低下を示した。
しかし、ski4 破壊株については、出芽酵母では致死性を示すことが報告されているのにも関わらず、麹菌においては生育にほとんど影響が現れなかった。一方、親株および ski4 破壊株において nonstop mRNA を発現させた結果、親株では nonstop mRNA 量が正常 mRNA 量と比較して著しく減少したのに対し、ski4 破壊株においては nonstop mRNA の減少が抑制された。このことから、麹菌においては nonstop mRNA はエキ
ソソームによる 3’→5’ 分解によって分解されることが示唆された。
Identification of Ski genes and their involvement in nonstop mRNA decay in A.oryzae
Mizuki Tanaka1, Masafumi Tokuoka2, Katsuya Gomi1(1Div. Biosci. Biotechnol. Future Bioind., Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ., 2Noda.Inst.Sci.Res.)

P-22
Aspergillus nidulans における protein O-mannosyltransferase 遺伝子群の機能解析
原田祐佳，松本翔，後藤正利（九大院・生資環）

Protein O-mannosyltransferase(PMT)は、O-マンノース型糖鎖の初発合成酵素であり Aspergillus nidulans には、少なくとも pmtA、pmtB、pmtC の 3 種が存在する。先の研究で A. nidulans の pmtA 遺伝子破壊株が菌糸伸長能や分生子形成能の低下、バルーンの形成、高温、抗真菌薬剤への高感受性化を引き起こすことを明らかにした。本研究では、A. nidulans の pmtB、pmtC、pmtApmtB 二重遺伝子破壊株を構築し、3 つの pmt 遺伝子の機能と相互関係に注目することで、O-マンノース型糖鎖の糸状菌細胞における機能の解明を目指した。
A. nidulans A89-AKU(akuB::aurA)を宿主として、相同組換えにより pmtB、pmtC 遺伝子破壊株(ΔpmtB、Δ
pmtC)を取得した。また、ΔpmtB 株を宿主として pmtApmtB 二重遺伝子破壊株(ΔpmtApmtB)を構築した。ΔpmtB 株では、分生子形成能が宿主の約 50%に低下し、菌糸の分岐構造が増加していた。ΔpmtApmtB 株は菌糸伸長能や分生子形成能が著しく低下しており、菌糸では高頻度にバルーンが見られた。 ΔpmtC 株では、菌糸が隔壁間で膨張した異常構造をしており、分生子形成能が欠損していたが、高温、高浸透圧条件下で培養することで分生子形成能が回復した。抗真菌薬剤については、
ΔpmtA 株はキチン結合薬剤 Calcofluor white、
β-グルカン合成阻害剤 Congo red に対し感受性を示すが、ΔpmtB 株及びΔpmtC 株は Congo red に対してのみ感受性を示すことが明らかとなった。以上、各 pmt 遺伝子破壊株においてそれぞれ固有の異なる表現型が見られたことから、各 Pmt は A. nidulans 細胞内で異なる基質特異性を持ち機能していることが示唆された。
Functional analysis of the genes encoding protein O-mannosyltransferase of Aspergillus nidulans
Yuka HARADA, Sho MATSUMOTO, Masatoshi GOTO
(Grad.Sch.Biores.Bioenviron.Sci.,Kyushu Univ.,)

57

P-23
麹菌 Aspergillus oryzae の潜在的なα‐マンノシダーゼ活性について
芳賀

楓 1、赤尾健 2、山田修 2 、大町鉄雄 1、吉田孝 1（1 弘前大・農学生命、2 酒総研）

麹菌の分泌糖タンパク質の糖鎖成形メカニズムを探る目的で、A. oryzae のゴルジ体型 1,2-α-マンノシダーゼ
欠損株（⊿ManIB 株、2002 年糸状菌分子生物学コンファレンスで報告）及びその親株（niaD 株）からタカアミラーゼ（TAA）を精製し、その Asn 結合型糖鎖構造を比較した。酵素的に切り出された糖鎖をピリジル
アミノ化後、HPLC により分析した結果、niaD 株と⊿ManIB 株由来の TAA はいずれも M5 及び M6 と思われる糖鎖を有していた。一方、⊿ManIB 株の培養上清について調べた所、ゴルジ体型 1,2-α-マンノシダーゼ
活性は消失している事が確認された。これらの結果から今までに知られていないマンノシダーゼの関与が推定された。次に、菌体を破砕後、遠心分離した上清液より粗酵素液を調製し、高マンノース糖鎖、マンノビ
オース（1,2-α結合、1,3-α結合、1,6-α結合）及び pNP-α-Man 等の基質に対する分解活性を調べた。その結果、マンノビオース基質については⊿ManIB 株由来の粗酵素による加水分解は見られなかった。一方、niaD
株と⊿ManIB 株由来のいずれの酵素ともに M8A、M5、pNP-α-Man に対する加水分解活性を示した。⊿ManIB
株のα-マンノシダーゼ活性に関し、さらに詳細な検討を進めている。
A cryptic α-mannosidase activity in Aspergillus oryzae
Kaede Haga1, Takeshi Akao2, Osamu Yamada2, Tetsuo Ohmachi1, Takashi Yoshida1 (1Hirosaki Univ., 2NRIB)

P-24
糸状菌 Aspergillus nidulans のクラス III キチン合成酵素 ChsB の分生子形成、菌糸生長における役割
山田和成 1、福田一治 1、山下修一 2 、堀内裕之 1、太田明徳 1（東大院・農生科・1 応生工・2 生環生）
糸状菌の形態を決める上で細胞壁の主要構成成分の一つであるキチンが重要な役割を担っていることが明らかにされている。A. nidulans にはそのゲノム配列よりクラス I~VII のキチン合成酵素をコードする遺伝子の存在が明らかになっているが、このうちクラス III のキチン合成酵素 ChsB をコードする遺伝子の破壊株は菌糸生長が大きく阻害され、菌糸は多分岐で分生子を全く形成しないことが明らかにされている。本研究ではまず ChsB の分生子形成への関与を検討するため、EGFP を ChsB の N 末端に連結した融合タンパク質
EGFP-ChsB を発現する株においてその分生子形成器官における局在観察を行った。その結果、EGFP-ChsB
は分生子形成時には頂囊の表面、メトレの先端、メトレとフィアライドの境面、分生子の表面などへの局在がこれら器官の形成の進行に伴い順次観察されたが、頂囊およびメトレにおいて液胞と予想されるオルガネ
ラでの蛍光も観察され、急速に分解されることが示唆された。一方、菌糸生長における役割を検討するため
chsB 破壊株の菌糸について透過型電子顕微鏡を用いて観察を行ったところ菌糸の中に細胞壁が二重、三重に存在すると思われるものが多数確認され、ChsB が菌糸細胞壁の合成の極性を含めた制御において重要な働きを担うことが示唆された。
Function of class III chitin synthase, ChsB, in the morphogenesis and hyphal growth of Aspergillus nidulans.
Kazunari Yamada1, Kazuharu Fukuda1, Shuichi Yamashita2, Hiroyuki Horiuchi1, and Akinori Ohta1 (1Dept.
Biotechnol., Univ. of Tokyo, 2Dept. Agric. and Envir. Biol., Univ. of Tokyo)

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P-25
Rhizopus oryzae のキチン 合成酵素新規クラス VIII について
阿部

歩，浅野

行蔵，曾根

輝雄

（北大院農・応用菌学）

Rhizopus oryzae のゲノムには，担子菌類や子嚢菌類に属する他の菌と比較して２倍以上の， 26 個ものキチン合成酵素遺伝子が存在している．この中には，これまでに報告のあるキチン合成酵素とは異なる新規なクラス（Class VIII）に属する遺伝子が 2 つ存在することを報告した．また，接合菌類の中でゲノム解析が行われている Phycomyces blakesleeanus についても解析したところ，クラス VIII に属する遺伝子があり，この新規なクラスは接合菌類特有のクラスであると推測された．一方これら接合菌類のゲノムにはクラス III や VIに属する遺伝子は見つからなかった．クラス VIII のキチン合成酵素の推定アミノ酸配列を他のクラスのものと比較したところ，ミオシンモータードメインやシトクローム b5 ドメインを持たず，系統樹からは近い位置にあるクラス V やクラス IV とは異なっていた．また，クラス VI とは CHS ドメインの位置が異なっていた．
このようにクラス VIII に属するキチン合成酵素はこれまでに報告のあるものと異なった構造をもつと推測される．実際にキチン合成酵素として機能するか確認するために， R. oryzae (=R. delemar) CBS120.12 より，クラス VIII に属する遺伝子 RO3G_08731 及び 11625 について遺伝子の全長を取得した．RT-PCR によりこれらの遺伝子の転写が行われていることを確認した．さらに，3’-RACE により全長 cDNA を取得し，大腸菌にてタンパク質発現を行っている．
New class VIII of chitin synthase gene in Rhizopus oryzae
Ayumi Abe, Kozo Asano, Teruo Sone
(Lab. of Appl. Microbiol, Univ. of Hokkaido)

P-26
Aspergillus nidulans における pkcA 遺伝子の機能解析
内田博教，一宮維幸, 堀内裕之, 太田明徳

（東大院・農生科・応生工）

糸状菌には、発酵産業や酵素生産、異種タンパク質生産への利用など産業上有用なものが存在する一方、動植物に対する病原菌も存在する。糸状菌は、菌糸体を枝分かれさせた複雑な形態形成を行うが、この構造上の特徴は上記両面の働きと密接に関与していると考えられている。細胞壁は、糸状菌が形態を維持する上で必須の構造であり、細胞壁合成・分解は糸状菌の生長・分化の各段階において厳密に制御されていると考えられる。出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae では、細胞壁ストレスに対し細胞壁の完全性を維持する機構が存在し、プロテインキナーゼ C (PKC)が中心的な役割を担っていることが明らかにされているが、糸状菌においては、PKC の機能解析は遅れている。これまで当研究室では、糸状菌 Aspergillus nidulans における PKC
ホモログをコードする pkcA 遺伝子の機能解析を目的として pkcA 欠失株が作製され、その致死性が示唆されていた。今回、ku 遺伝子破壊株を用いて pkcA 欠失株を作製したところ、菌糸生長が野生株に比べ著しく遅く多数の枝分かれや溶菌が見られコロニーを形成できなかったことから、pkcA は A. nidulans の生育に必須であることが強く示唆された。さらに、alcA プロモーター下で pkcA を発現する株を作製し、高発現条件下における表現型を観察したところ、alcA の発現を誘導する完全培地上で野生株に比べ生育の低下が見られ、細胞壁合成を阻害する各種薬剤に感受性を示した。この結果は、pkcA の高発現により細胞壁合成制御に何らかの異常をきたしていることを示唆している。現在 pkcA 高発現条件下において、細胞壁合成酵素をコードする遺伝子の転写量を定量 PCR 法により解析中である。
Functional analysis of a protein kinase C gene from Aspergillus nidulans
Hirotaka Uchida, Masayuki Ichinomiya, Hiroyuki Horiuchi, and Akinori Ohta
(Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

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P-27
糸状菌 Aspergillus nidulans のミオシン様ドメインを持つキチン合成酵素
CsmA、CsmB のドメイン 互換性の解析
對崎真楠、竹下典男、堀内裕之、太田明徳（東大院・農生科・応生工）
キチンは糸状菌細胞壁の主要構成成分の一つであり、その生合成は形態形成、分化に重要な役割を持つ。
A. nidulans には、N 末端側にミオシンと相同性を示すドメイン (MMD) 、C 末端側にキチン合成酵素ドメイン (CSD) を持つタンパク質をコードする遺伝子が csmA、csmB の二種存在する。これまでに、各々の単独
破壊株の生育遅延、形態異常等の表現型の類似性、二重破壊の合成致死性が示されている。また CsmA、CsmBは菌糸先端、隔壁形成部位に局在することが示されている一方 1)、両者の機能的差異も示唆されている 2)。
今回、両者の機能的差異に関わるドメインを検討するため、csmA 破壊株 (ΔA 株) 及び csmB 破壊株 (ΔB 株)
において、CsmA の MMD と CsmB の CSD の融合タンパク質 MACB あるいは CsmB の MMD と CsmA の CSDの融合タンパク質 MBCA を発現させたところ、MACBΔA 株はΔA 株における生育遅延や形態異常が回復せず、MBCAΔA 株は生育遅延が回復したが、形態異常は完全には回復しなかった。一方、MACBΔB 株はΔB
株における生育遅延、形態異常が回復したが、MBCAΔB 株は回復しなかった。以上の結果から、CsmA の
MMD は CsmB の MMD により機能の一部を代替できること、CsmB の MMD は CsmA の MMD により機能を代替できること、両者の CSD は相互に機能を代替できないこと等が示唆された。
1) Takeshita, N. et al (2006) Mol. Microbiol. 59:1380-1394
2) 對崎ら、第 6 回糸状菌分子生物学コンファレンス講演要旨集、p. 79
Functional analysis of the domains of two chitin synthases, CsmA and CsmB, in Aspergillus nidulans
Makusu Tsuizaki, Norio Takeshita, Hiroyuki Horiuchi, and Akinori Ohta
(Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

P-28
Aspergillus nidulans における cell wall integrity 経路の解析と MAP kinase 遺伝子 mpkBの機能解析
吉見啓 1 ，藤岡智則 2,3，丸井淳一郎 1，萩原大祐 1 ，佐藤奈津子 2，水谷治 2,4，古川健太郎 2,5，阿部敬悦 1,2（1 東北大・未来研，2 東北大院農・応生科，3 現・クミアイ化学工業㈱，4 現・酒類研，5 現・ヨーテボリ大）
我々はこれまでに A. nidulans の cell wall integrity 経路について，MpkA MAPK をはじめとした経路構成遺伝子の機能解析，細胞壁合成関連遺伝子の転写解析，酵母相同遺伝子との比較解析を行ってきた。その結果，
A. nidulans の cell wall integrity 経路は，酵母のものとは全く異なる様相を呈する事が判明した。特筆すべき点として，A. nidulans の MpkA は，α-1, 3-glucan 合成遺伝子群の転写を制御しており，β-1, 3-glucan 合成遺伝子群の転写は別経路によって制御されていたことが挙げられる。A. nidulans には，MpkA と相同なリン酸化モチーフを有する MpkB MAPK が存在する。そこで，MpkB の cell wall integrity 経路への関与を明らかにするため，mpkB 遺伝子の破壊株を造成し，mpkB 破壊株における細胞壁合成関連遺伝子の転写解析，ミカフ
ァンギンをはじめとする細胞壁合成阻害剤への感受性試験およびウエスタン分析によるリン酸化解析を行ったので報告する。また，mpkA 遺伝子破壊株におけるマイクロアレイ解析ならびに MpkA と MpkB の相互関係についても議論したい。
（本研究は生研センター異分野融合研究事業により支援を受けた。）
Analysis of cell wall integrity pathway and functional analysis of MAP kinase gene mpkB in Aspergillus nidulans
Akira Yoshimi1, Tomonori Fujioka2,3, Junichiro Marui1, Daisuke Hagiwara1, Natsuko Sato2, Osamu Mizutani2,4，
Kentaro Furukawa2,5, Keietsu Abe1,2(1 Tohoku Univ., NICHe, 2 Tohoku Univ., Grad. Sch. Agri. Sci., 3Kumiai

4Chemical Industry Co., Ltd, National Research Institute of Brewing, 5Göteborg Univ.)

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P-29
糸状菌 A. nidulans の速い先端成長を支える分子機構の研究
1

堀尾哲也，2 紅朋浩，3Naimeh Taheri-Talesh， 3Berl R. Oakley（1 徳島大院・ヘルスバイオ，2 名古屋大院医系・分子標的，3 オハイオ州立大・分子遺伝）
先端成長は、糸状菌の細く伸びた形態を形成する特徴的な成長様式で、多数の分子がネットワークを形成
し協調的に機能する事により達成されると考えられている。我々は GFP 標識チューブリン等を用いた解析
により、A. nidulans の速い先端成長において微小管が必須である事を明らかにした。先端成長における微小管の必須な機能としては、①先端成長分子ネットワークの構造を維持するための骨組み、②成長端マーカー
分子の運搬と成長点への埋め込み、③成長に必要な分子の成長端への運搬、等が考えられる。①については、
微小管の破壊により成長端近傍に局在するパッチ状アクチンが散逸する事が分っている。アクチンパッチの散逸により、先端における膜融合を司る SNARE タンパク質の回収が阻害される。微小管はこれらの分子ネットワークが空間的に正しく配置されるための構造的な基盤となっていると考えられる。③について検討するために、A. nidulans ゲノム中に存在する 11 種のキネシンについて、蛍光標識タンパク質による局在の検討と遺伝子破壊を行った。キネシンの局在は大まかに、核／スピンドルに局在するもの、細胞質中にドット状に局在し細胞先端に集積するもの、特に特徴的な局在を示さないものに分類された。また全 11 種のキネ
シンの内、既に必須である事が報告されている BIMC を除いた 10 種については、すべて生育に必須でない
事が明らかになった。これらの結果は、それぞれのキネシンの機能が互いにオーバーラップしている事を示唆する。
Analysis of molecular mechanism that supports rapid and steady tip growth of a filamentous fungus A.
nidulans.
1
Tetsuya Horio, 2 Tomohiro Akashi, 3Naimeh Taheri-Talesh, 3Berl R. Oakley (1 Health Bio., Tokushima Univ. Grad.
Sch., 2 Mol. Mycol. Med., Nagoya Univ. Grad. Sch., 3 Mol. Genet., Ohio State Univ.)

P-30
エノキタケがセルロース培養系において生産するグリコシダーゼに関する研究
石黒真希，五十嵐圭日子，鮫島正浩（東大・農生科）

エノキタケ(Flammulina velutipes)は、食用キノコを生産する担子菌として広く栽培されており、培地基材としては広葉樹材だけでなく針葉樹材も利用できることが知られている。このため、セルロース系バイマスの変換利用という位置づけにおいても、本菌は有用な担子菌であると言える。しかしながら、本菌がセルロース系バイオマス分解時に菌体外に生産する酵素に関する研究は限られており、菌体外酵素の主成分であり細胞壁構造多糖のセルロースおよびヘミセルロースの分解に関与する糖質加水分解酵素の情報はほとんど得られていない。そこで本研究では、本菌がセルロース培養系において生産する菌体外糖質加水分解酵素群のキャラクタライズを試みた。
コットン由来の結晶性セルロースを 2%含む YP 培地（pH 5.0）において、本菌を 26.5℃で 4 日間培養し、得られた菌体外酵素をカラムクロマトグラフィーにより分画した後、モデル基質に対する分解活性を測定した。その結果、糖質加水分解酵素ファミリー7 に属するセロビオヒドロラーゼのほか、β-キシロシダーゼ、
α-アラビノフラノシダーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびβ-マンノシダーゼ活性を持つタンパク質がそれぞれ分画された。針葉樹におけるヘミセルロースは、主に、広葉樹キシランにはない L-アラビノフラノースの側鎖を有するアラビノグルクロノキシランやグルコマンナンおよびガラクタンから構成されていることか
ら、本菌が針葉樹細胞壁構造多糖の分解に関与する酵素を生産していることが示唆された。
Study of glycosidases produced in cellulose-degrading culture of Flammulina
Maki Ishiguro, Kiyohiko Igarashi, Masahiro Samejima(Dept. Biomat. Sci., Univ. of Tokyo)

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velutipes

P-31
担子菌 Phanerochaete chrysosporium 由来 Cel6A の反応特性
五十嵐圭日子、石田卓也、和田昌久、鮫島正浩（東大院・農生科）
担子菌 Phanerochaete chrysosporium は、セルロースを含む培地中において糖質加水分解酵素（GH）ファミリー6 に属するセロビオヒドロラーゼ（PcCel6A）を生産する。しかしながら、本酵素の諸性質に関する知見が少ないことから、本研究では、P. chrysosporium の全ゲノム配列情報を利用して Cel6A をコードする cDNAを取得し、メタノール資化性酵母を用いて PcCel6A を異宿主発現した。さらに、得られた酵素を、二段のカ
ラムクロマトグラフィーによって精製し、シオグサ由来の高結晶性セルロースを基質として、吸着および分解挙動を調べ、表面密度に基づく解析を行った。その結果、PcCel6A は、糸状菌由来のセルラーゼの中で最も研究が盛んな Trichoderma 属由来 Cel7A と同程度の吸着が観察され、また分解産物であるセロビオースの生成量もほぼ同程度であった。しかしながら、Trichoderma 属由来 Cel7A とは異なり、表面密度の増加に対して反応生成物の生成速度が低下しないことが明らかとなった。このことから、PcCel6A は非生産的結合をしにくい酵素であると考えられた。

Characterization of Cel6A from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium
Kiyohiko Igarashi, Takuya Ishida, Masahisa Wada, Masahiro Samejima(Dept. Biomat. Sci.,Univ. Tokyo)

P-32
シイタケの子実体形成に特異的な新規ファスシンクリン遺伝子 Le.flp1
宮崎安将 1，金子真也 2，砂川政英 1 ，山崎丘 2,3，宍戸和夫 2，中村雅哉 1，馬場崎勝彦 1（1 森林総研, 2 東工大院生命, 3 現・JAXA）
シイタケの子実体形成に特異的に働く遺伝子を網羅するため、遺伝子サブトラクションcDNA-RDA(cDNA-Representational Difference Analysis)を行った結果、105クローン(子実体原基期51種、成熟子実体期54種)の遺伝子群が単離された1)。これら遺伝子は必須な代謝、細胞構築、シグナル伝達など多岐に係わることが推定されたほか、40クローンについては機能未知であり、子実体形成に関与する「きのこに特有な未知遺伝子」であると考えられた。これらのクローンの1つ、子実体形成過程を通じて発現する新規遺伝子Le.flp1
は、細胞接着活性を有し動・植物などの形態形成にきわめて重要な働きをする「ファスシクリン」様のタン
パク質をコードしていた2)。In situハイブリダイゼーションの結果、Le.flp1転写産物はシイタケ子実体において、(1)かさ、柄(茎)及び子実体原基の外側(表面)部分、(2)「ひだ」に局所的に分布していた。きのこを含む
菌類界において、ファスシクリンが見出されたのは初めてのことであり、Le.flp1産物は細胞接着を介してきのこの子実体形成に重要な役割を担っていると考えられる。
1) Miyazaki et al.(2005) Fungal.Genet.Biol. 42(6)493-505.
2) Miyazaki et al.(2007) Curr.Genet. 51(6)367-375.
The fruiting-specific Le.flp1 gene, encoding a novel fungal fasciclin-like protein, of the basidiomycetous
mushroom Lentinula edodes. Yasumasa Miyazaki1, Shinya Kaneko2, Masahide Sunagawa1, Kazuo Shishido2, Takashi
Yamazaki2,3, Masaya Nakamura1, Katsuhiko Babasaki1. (1Dept. Appl. Microbiol., FFPRI, 2 Dept. Life. Sci., Tokyo
Tech., 3 Present address: JAXA)

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P-33
担子菌 Coprinus cinereus 由来糖質加水分解酵素ファミリー６遺伝子の発現挙動吉田誠，福田清春（農工大・農）【目的】担子菌は地球上で唯一、木材を完全分解可能な生物である。担子菌の生産するセルラーゼとして、
セロビオヒドロラーゼ(CBH)およびエンドグルカナーゼが知られており、前者はさらに CBHI と CBHII に分けられる。また、これら CBH は、アミノ酸配列の相同性に基づく分類においては、前者は糖質加水分解酵
素ファミリー7(GH7)に、後者はファミリー6(GH6)にそれぞれ属する。現在までに、様々な担子菌から両酵素をコードする遺伝子がクローニングされてきており、GH7 遺伝子をゲノム上に多コピー保持する担子菌が多数見出されているのに対して、GH6 遺伝子は多くの担子菌において単一コピーとして存在している。しかしながら、演者らが担子菌 Coprinus cinereus のゲノムデータベースを検索したところ、GH6 遺伝子に相同性を示す領域が 5 箇所見出された。そこで本研究では、これらの遺伝子をクローニングし、さらに、様々な培養条件における遺伝子の発現挙動を解析した。
【結果】ゲノム検索により見出された C. cinereus 由来 GH6 遺伝子の cDNA をクローニングし、塩基配列から予想されるアミノ酸配列をそれぞれ比較したところ、互いに高い相同性を示した。また、全ての GH6 遺伝子が分泌シグナルを有しており、そのうちの 1 種のみが N 末端にファミリー1 に属する糖質結合モジュールを有していることが明らかとなった。また、C. cinereus をグルコース、セルロースおよびキシランそれぞれを単一の炭素源とする培地で培養し、各酵素の遺伝子発現を調べたところ、それぞれの遺伝子が異なる発現挙動を示した。各遺伝子の発現挙動をさらに詳細に調べるために、C. cinereus を様々な単糖類および二糖類を炭素源とした培地で培養し、各遺伝子の発現挙動を比較した。
Transcript analysis of the genes encoding GH6 enzyme from the basidiomycete Coprinus cinereus
Makoto Yoshida, Kiyoharu Fukuda(Faculty of Agriculture, Tokyo Univ. of Agriculture and Technology)

P-34
シイタケにおけるリグニン分解酵素の解析
坂本裕一・中出啓子・佐藤利次（岩手生工研）

担子菌類におけるリグニン分解酵素は栄養成長期の養分獲得だけでなく、子実体形成や子実体の着色等にも寄与していると考えられる。また、近年ラッカーゼ等のリグニン分解酵素を用いたバイオレメディエーショ
ン等の応用研究が進められており、注目されている。そこで、日本において栽培量の多い担子菌類であるシ
イタケのリグニン分解酵素の解析を行った。これまで既に、シイタケにおいてラッカーゼ（Lcc）、マンガン
ペルオキシダーゼ(MnP)活性が確認されていたことから、Lcc, MnP 遺伝子のクローニングを行った。その結果、シイタケから Lcc を 4 遺伝子（lcc1-4）、MnP を 2 遺伝子(mnp1,2)クローニングすることが出来た。lcc1
は、培養菌糸中で高い発現が認められ、培養時に分泌されるラッカーゼ Lcc1 をコードすることが明らかになった。lcc4 は、収穫後に褐変したひだで発現し、褐変化に関わるラッカーゼをコードすることが明らかになった。lcc2, 3 は子実体の傘で発現し、lcc2 はさらに収穫後に褐変したひだにおいても発現することが明らかになった。mnp1,2 はともに液体培養ではほとんど発現せず、木粉培地で培養した菌糸で発現が認められた。
しかしながら、mnp2 のみが MnP 活性の上昇と相関して発現量が上昇することが明らかになった。また、木粉培地中に分泌される MnP を精製したところ、mnp2 のペプチド抗体でのみ検出されることから、木粉培地
中で分泌される MnP は MnP2 であることが明らかになった。
Lignin degrading enzymes in Lentinula edodes
Yuichi Sakamoto, Keiko Nakade, Toshitsugu Sato

(Iwate Biotech. Res. Center)

63

P-35
竹バイオマス分解過程において担子菌が生産する菌体外タンパク質の解析
堀千明、五十嵐圭日子、鮫島正浩（東大院・農生科）

竹材は日本において古くから利用されていたが、放置された竹林による生態系への影響が問題となっていることから、新たな利用法の開発が望まれている。そこで本研究では、竹材をきのこ培地として利用することを視野に入れて竹材の生物変換の可能性を考察した。まず竹粉固体培地で食用担子菌 Flammulina velutipes（エノキタケ）を培養したところ、培地重量減少は木紛固体培地と同様な傾向がみられ、菌体の増加に伴い竹粉培地成分中のα-グルカンが減少した。さらに竹粉を炭素源とする液体培地で F. velutipes を培養したところ、セルロースを炭素源とする場合より初期菌体生長が良好であった。この培養系で回収した菌体外タンパク質について糖質加水分解活性を調べたところ、セルロース培地との顕著な差としてα-グルカン分解活性を示した。以上から、竹材中のα-グルカンが担子菌の生長にとって重要であり、竹材が生物変換によって利用できること、特にきのこ培地基材および初期生長を促進する栄養剤として利用できる可能性が示唆された。
Analysis of extracellular protein produced by basidiomycetes in bamboo degrading process
Chiaki Hori, Kiyohiko Igarashi, Masahiro Samejima(Dept.Biomat.Sci.,Univ.Tokyo)

P-36
担子菌 Phanerochaete chrysosporium 由来ピラノース酸化酵素のクローニングと大腸菌による生産福田明，五十嵐圭日子，鮫島正浩（東大院・農生科）

ピラノース酸化酵素（POX）は、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を補欠分子族として含む酸化還元酵素であり、様々な単糖の C2 位または C3 位を酸化する反応を触媒することが知られている。本研究では POX の機能解析を目的として、担子菌 Phanerochaete chrysosporium 由来 POX をコードする cDNA（pox）
をクローニングし、大腸菌を宿主として組換えタンパク質を生産した。塩基配列から推定されたアミノ酸配列を解析した結果、POX が菌体内に存在するタンパク質であると考えられ、グルコース-メタノール-コリン（GMC）酸化還元酵素ファミリーに属する他の酸化酵素と同様、フラビンタンパク質のモチーフ、GMC 酸
化還元酵素モチーフを有し、FAD 結合ドメインと基質結合ドメインの 2 つのドメインからなるタンパク質であることが示唆された。種々の単糖に対する反応性を測定した結果、得られた組換えタンパク質はグルコースに対して最も高い活性を示し、次いでキシロースに対して高い活性を示すことが明らかになった。両基質に対する反応速度パラメーターを算出したところ、それぞれの kcat 値に大きな違いは見られなかったがグルコースに対する Km 値はキシロースに対する Km 値の 1/40 程度であった。グルコースとキシロースの化学構造の比較から C6 位の構造の違いが酵素と基質の親和性に影響を与えている可能性が示唆された。
Cloning and expression of pyranose oxidase cDNA from Phanerochaete chrysosporium in Escherichia coli.
Akira Fukuda, Kiyohiko Igarashi, Masahiro Samejima(Univ. of Tokyo)

64

P-37
バイオエタノール固体発酵に供する麹菌固体培養でのバイオマス分解酵素の大量生産
坂東弘樹，久田博元，石田博樹，秦洋二（月桂冠・総研）【目的】 植物系バイオマスからのバイオエタノール生産において、その糖化発酵過程は液体反応であり、最終的にエタノールの蒸留操作が必要となる。この蒸留操作の無駄を回避すべく、バイオマスの糖化と発酵が固体反応で同時進行する、バイオエタノール高効率回収システムの構築に着手した。具体的には、固体状態のバイオマスを、麹菌のエンド型酵素で液化し、エキソ型酵素を表層提示したアーミング酵母で糖化発酵
する、バイオエタノール生産システムである。その第一段階であるバイオマスの液化を目的として、麹菌（Aspergillus oryzae）を宿主とした固体培養でのエンド型バイオマス分解酵素の大量生産を試みた。
【方法及び結果】 麹菌ゲノム配列からエンド型酵素遺伝子の候補を 11 個選抜し、これらを麹菌 OSI1013
において amyB プロモーター制御下で発現させた。それぞれの形質転換株の固体培養におけるバイオマス分解酵素発現を SDS-PAGE により解析した結果、2 種類のエンドグルカナーゼおよび 4 種類のキシラナーゼについて、菌体外での発現が認められ、これらの酵素が固体培養において大量生産していることが判明した。
なお、本研究は NEDO バイオマスエネルギー高効率転換技術開発／バイオマスエネルギー先導技術研究開発／微生物固体発酵による高効率なリグノセルロース完全利用システムの研究開発の一環として実施した。
Over expression of biomass degradation enzymes in solid-state culture of Aspergillus oryzae for solid-statebioethanol fermentation.
Hiroki Bando, Hiromoto Hisada, Hiroki Ishida, Yoji Hata
(Res. Inst., Gekkeikan Sake Co.)

P-38
バイオマスのグルコース変換を目指した麹菌液体培養でのセルロース分解酵素の大量生産
久田博元 1，長谷山陽平 1，石田博樹 1，秦洋二 1，近藤昭彦 2（1 月桂冠・総研，2 神戸大工・応化）
化石燃料の枯渇・地球温暖化防止の観点から、再生可能な植物性バイオマスから生分解性のプラスチックを生産することが望まれる。生分解性のプラスチックは発酵有機酸を用いて合成されるが、その有機酸は植物性バイオマスから変換したグルコースを発酵原料とすることが環境面で望ましい。植物性バイオマスからグルコースへの糖化処理法としては、濃硫酸法や希硫酸法が主流であるが、廃液の環境への負荷や大幅なコストの低減ができないなどの問題がある。そこで硫酸処理法に代わる方法としては、糖化酵素を用いる方法が最も有望と考えられるが、最大のネックはその糖化酵素（セルラーゼ等）のコストである。そこで我々は、酵素の分泌生産性の高い麹菌を用いてセルラーゼ系分解酵素を液体培養で高生産させることを検討した。
麹菌 Aspergillus oryzae、Aspergillus niger と Aspergillus nidulans 由来のエンドグルカナーゼ遺伝子、セロビ
オハイドラーゼ遺伝子とβ-グルコシダーゼ遺伝子を各種遺伝子データベースから抽出し、sodM プロモータ
ーの下流に各遺伝子を接続し、発現プラスミドを作成した。各発現プラスミドを麹菌 OSI1013Leu-株に形質転換し、得られたそれぞれの形質転換体の液体培養でのタンパク質生産量を比較した。SDS-PAGE 解析とタンパク質の定量から、DPY 培地で最大約 1g/L-broth の生産能を示すものも存在した。また、AZCL-セルロー
ス分解試験においては、いずれの形質転換体も寒天プレート上で青色のハロを形成することから、生産された酵素はセルロース分解活性を持つことが判明した。
なお、本研究は NEDO 微生物機能を活用した高度製造技術開発プロジェクト（環境調和型ソフトバイオ
マス糖化技術の開発）の一環として行われたものである。
Overproduction of fungal cellulases in submerged culture of Aspergillus oryzae.
Hiromoto Hisada1, Youhei Haseyama1, Hiroki Ishida1, Yoji Hata1, Akihiko Kondo2(1Res. Inst., Gekkeikan Sake Co., 2Dept. Chem. Sci. Eng., Kobe Univ.)

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P-39
Trichoderma reesei の転写活性化因子 Xyr1 の機能解析
北上巨樹，Taki Koffi Alphonse，古川隆紀，志田洋介，小笠原渉，岡田宏文，森川康（長岡技科大・生物）
T. reesei におけるセルロース・キシラン分解酵素遺伝子群の誘導発現は唯一の C 源としてセルロース系、あるいはキシラン系の誘導物質が存在する場合でのみ起こる。近年、Aspergillus niger のキシラナーゼ遺伝子群の発現に関わる転写活性化因子 XlnR のオルソログである Xyr1 が T. reesei から単離された。Xyr1 は主要なセルラーゼ・キシラナーゼ遺伝子の転写を活性化していることが報告されている。しかしながら、他の遺伝子群の誘導発現への関与は明らかとなっていない。本研究では xyr1 高発現株および破壊株を構築し、野生株の遺伝子発現パターンと比較することで、Xyr1 の支配下にある遺伝子を網羅的に解析することを目的としている。
キシラナーゼ Ⅲ 遺伝子(xyn3)のプロモータ支配下で xyr1 を発現させ、その転写量が向上した変異株を構築した。破壊株においては、同様に xyr1 の ORF 内にアセトアミダーゼ遺伝子(amdS)を挟むことで機能を欠損させた。T. reesei PC-3-7 株の形質転換はプロトプラスト PEG 法を用いた。その際の形質転換体のスクリー
ニングは選択マーカーとして amdS を用い、唯一の N 源としてアセトアミドを含む培地で行った。現在、得られた xyr1 高発現株および破壊株における遺伝子の発現パターンをリアルタイム定量 PCR により解析中である。
Comprehensive analysis of genes regulated by Xyr1 in Trichoderma reesei
Naoki Kitagami, Taki Koffi Alphonse, Takanori Furukawa, Yosuke Shida, Wataru Ogasawara, Hirohumi Okada,
Yasushi Morikawa(Dept. Of Bioeng., Nagaoka Univ. of Tech)

P-40
Trichoderma reesei 由来 Xylanase regulator 1 (Xyr1) の結合配列の解析
古川隆紀 1、志田洋介 1、小笠原渉 1、岡田宏文 1 、加藤雅士 2 、小林哲夫 2、森川康1

（1 長岡技科大・生物、2 名大院・生命農）【目的】 Trichoderma reesei の Xylanase regulator 1 (Xyr1) は、最近単離された転写活性化因子であり、セル
ラーゼ・キシラナーゼ遺伝子群の誘導発現において中心的な役割を果たしていることが明らかにされている。
これまでにキシラナーゼ I 遺伝子プロモーター領域の解析から、Xyr1 は 5’GGCTAA-N10-TTAGCC3’ 配列に結合することが報告されている。しかし、機能的な Xyr1 結合配列に関する報告はこれ以外になく、結合様式などを含めてその詳細は不明である。我々は Xyr1 支配下にあると推定される遺伝子プロモーター領域の解析において、複数の Xyr1 結合配列様配列が転写活性化に関与していることを明らかにしており、Xyr1の結合配列にはいくつかの揺らぎが存在すると推察している。本研究では、Xyr1 の結合配列を決定することを目的とし、様々な Xyr1 結合配列様配列に対する Xyr1 の結合特異性を解析した。
【方法と結果】Xyr1 の DNA 結合ドメインおよび coiled-coil ドメインをコードする領域を PCR によりクローニングし、GST 融合タンパク質として発現させた。融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって精製したのち、GST 部分を除去し、得られた組換え Xyr1 をゲルシフト解析に供した。各セルラーゼ・キシラナーゼ遺伝子のプロモーター領域から抽出した様々な Xyr1 結合配列様配列をプローブとして解析を行った結果、5’GGCTAT3’ および 5’GGCAAA3’ 配列に対して特異的な Xyr1 の結合が観察された。
さらに cbh2 activating element (CAE) として報告されている 5’GGGTAA3’ 配列に対しても特異的な結合が観察された。以上の結果より、Xyr1 の結合配列認識には比較的広い揺らぎが存在していることが明らかとなった。現在、これら以外の Xyr1 結合配列様配列に対する Xyr1 の結合特異性を解析している。
In vitro recognition of specific DNA targets by the transcriptional activator Xyr1
Takanori Furukawa1, Yosuke Shida1, Wataru Ogasawara1, Hirofumi Okada1, Masashi Kato2, Tetsuo Kobayashi2,
Yasushi Morikawa1(1Dept.of Bioeng, Nagaoka Univ. of Tech.,2Grad.Sch.Bioagricultural Sci. Nagoya Univ.)

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P-41
Trichoderma reesei の固体培養条件 下での糖質加水分解酵素遺伝子の発現解析
齋藤勇司、関口裕久、小笠原渉、岡田宏文、森川康（長岡技科大・生物）

Trichoderma reesei は菌体外セルラーゼを多量に分泌することが知られ、その性質解明や遺伝子発現解析がなされてきた。しかし、これら研究のほとんどが液体培養でされており、自然環境下において固体基質で生育する T. reesei の潜在能力のすべてを解析しているとは言えない。そこで小麦フスマを用いて固体培養を行い、糖質加水分解酵素を中心とした遺伝子発現パターンを解析することを目的とした。さらに、固体培養
特異的な酵素・タンパク質の同定を試みた。
固体培養の培地として吸水させた小麦フスマを用い、湿度飽和条件下で培養を行った。液体培養は小麦フスマあるいはアビセルを炭素源として行った。それぞれ培養中の菌糸から total RNA を抽出し、リアルタイ
ム定量 PCR によって糖質加水分解酵素遺伝子の転写量を解析した。解析した結果、固体培養では液体培養に比べて、エンドグルカナーゼやキシラナーゼ遺伝子の発現比率が増加すること、およびそれぞれの中でも発現比率大きく異なっていることが明らかとなった。現在、固体培養で特異的に発現する遺伝子の探索を行っている。また、固体培養時のみに検出されるタンパク質を二次元電気泳動と MALDI-TOF MS を用いて解析を進めている。
Expression analysis of glycosyl hydrolase gene from Trichoderma reesei in solid state fermentation
Yuji Saito, Hirohisa Sekiguchi, Wataru Ogasawara, Hirofumi Okada, Yasushi Morikawa(Dept. of Bioeng., Nagaoka Univ. of Tech.)P-42
セルラーゼ高生産麹菌を用いた結晶性セルロースの分解
中井喬彦 1，有岡学 1，川口剛司 2，荒井基夫 3，北本勝ひこ 1（1 東大院・農生科・応生工，2 阪府大院・生

環科，3 中部大・応生）【目的】我々は、これまでに木質バイオマスの糖化を目的として、A. aculeatus 由来セルラーゼ (FI-CMCase,
β-glucosidase 1, cellobiohydrolase I) を tef1 プロモーター下で同時に生産する麹菌株(MBH 株 1))を育種した 1)。
今回、異なる 3 つのプロモーターを用いることで、セルラーゼ 3 重発現株の酵素生産量の改善を試みた。更
にこの株において、セルラーゼ遺伝子の発現を制御する転写因子 AoXlnR を高発現させることで内在性セルラーゼの発現を誘導し、セルロース分解能の向上が認められるかどうかを検討した。
【方法及び結果】A.oryzae プロテアーゼ遺伝子 2 重破壊株 NS-tApE 株を親株として、3 つの A. aculeatus 由
来セルラーゼ遺伝子をそれぞれ tef1, pgkA, glaA142 プロモーター下で同時に発現する麹菌株(TPG 株)を育種した。酵素生産性を比較したところ、今回作製した TPG 株は MBH 株よりも高い酵素生産量を示すことがわかった。特に、β-glucosidase の生産量は MBH 株の約 10 倍の約 1.0 g/l であった。更に、TPG 株に対して UV
変異処理を行うことによって、pyrG マーカーが付与された株を取得し、このマーカーを用いて転写因子
AoXlnR の高発現を行った。現在、作製したこれらの株について結晶性セルロースの分解能等を調べている。
1)中井ら、日本農芸化学会大会要旨集 p61 (2007)
Degradation of crystalline cellulose by A.oryzae highly producing cellulases
Takahiko Nakai1, Manabu Arioka1, Takashi Kawaguchi2, Motoo Arai3, Katsuhiko Kitamoto1(1Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo, 2Dept.Appl.Life Sci., Osaka Pref.Univ., 3Dept.Environ.Biol., Chubu Univ.)

67

P-43
Trichoderma reesei 由来 3 種エンドグルカナーゼの酵素学的性質
中澤光，岡田和士, 小林遼太, 小野寺朋子, 窪田哲也, 小笠原渉,

岡田宏文, 森川康

（長岡技科大・生物系）
セルラーゼ高生産菌として知られる Trichoderma reesei は 2 種の Cellobiohydrolase（CBH）I,II および 少な
くとも 6 種の Endoglucanase(EG) I-VI を分泌する。このうち CBH については、結晶セルロースの還元末端側から CBH I が、非還元末端から CBH II がそれぞれ作用するということが知られているが、EG についてはな
ぜ多種が生産されるのか、それぞれがセルロース分解においてどのような役割を担うのかほとんどわかっていない。そこで T.reesei EG の酵素学的性質を明らかにするために、EG I および EG II の CBD とリンカーを除いた触媒ドメインのみを大腸菌を宿主として発現させた。そして同様に大腸菌で発現させた EG III と比較した。触媒ドメインのみをコードする egl1-cd および egl2-cd を発現ベクターpET22b および pET15b にそれぞれ導入し、E.coli Rosetta-gami B(DE3)pLacI を宿主として発現させたところ、いずれも 37℃では封入体を形成したが、培養温度を下げることで可溶性画分に活性を有する形で培地 1ml 当たりそれぞれ 12mg の EG I-CD
（培養温度 15℃）および 72mg の EG II-CD（培養温度 20℃）が得られた。精製酵素の pH 特性、耐熱性および種々の基質に対する特異性を調べた。その結果、3 種の EG で基質特異性が異なり、EG II-CD はセルロー
ス、リケナンおよび β−グルカンに特異性を示し、EG III はそれに加えてキシログルカンにも活性を示した。
EG I-CD は更にマンナンおよびキシランに活性を示す広い基質特異性を持っていた。
Enzymatic properties of three endoglucanases from Trichoderma reesei
Hikaru Nakazawa, Katsunori Okada, Ryouta Kobayashi, Tomoko Onodera, Tetsuya Kubota, Wataru Ogasawara,
Hirofumi Okada, Yasushi Morikawa. (Bioeng., Nagaoka Univ.Tech.)

P-44
Aspergillus oryzae における AoXlnR 類似転写因子の機能同定
金田貴詳，海附玄龍*，野口祐二，金丸京子，加藤雅士，小山泰二*，小林哲夫（名大院生命農・生物機構，*野田産研）
麹菌 Aspergillus oryzae の転写因子 AoXlnR は、キシラン・セルロース代謝を正に制御する転写因子である。
A. oryzae はこの AoXlnR のホモログを１種有しており、我々はこれを AoXlnR2（仮名）と名付けた。AoXlnR2は、AoXlnR と全長に渡って相同性を示すが、DNA 結合ドメインの相同性は比較的低い。従って、転写活性化メカニズムは AoXlnR に類似しているが、制御する遺伝子群は異なると考えられた。
A. oryzae AoXlnR2 破壊株の糖の資化能を検討したところ、L-アラビノースの資化能に欠損が見られたため、
L-アラビノース資化に関与する L-アラビノースレダクターゼ、L-アラビニトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を RT-PCR により解析した。いずれの遺伝子についても、L-アラビノースによる誘導発現が大幅に低下していた。また、培養上清を SDS-PAGE に供し、破壊株において生産量の著しい低下が見られる蛋白質の N
末端アミノ酸配列を決定したところ、エキソアラビナナーゼであった。RT-PCR により本酵素遺伝子の発現量が低下していることも確認された。以上から、AoXlnR2 はアラビナン代謝の正の制御因子であると考えられる。一方、欠損株ではアラビノースによるエンドキシラナーゼ XynG2 の発現誘導が観察された。これは、キシラン代謝に対して AoXlnR2 が負に関与することを示唆している。
Physiological roles of a novel XlnR-type transcription factor in Aspergillus oryzae.
Takayoshi Kanada, Gennryo Umitsuki*, Yuji Noguchi, Kyoko Kanamaru, Masashi Kato, Yasuji Koyama*, Tetsuo
Kobayashi (Dept. of Biological Mechanisms and Function, Grad. Sch. of Nagoya Univ., *Noda Institute for Scientific
Research)

68

P-45
Aspergillus japonicus が産生する細胞 外 β-キシロシダーゼをコードする遺伝子の 構造
解析吉原浩司 1、脇山元気 1 、林幸男 1 、太田一良 2（1 宮崎大・工・物質環境、2 宮崎大・農・応生科）〔目的〕糸状菌 Aspergillus japonicus MU-2 株は、分子量 113.2 kDa のβ-キシロシダーゼ XylA を菌体外に生産する。本報では、XylA をコードする遺伝子 xylA の構造解析を目的とする。
〔方法および結果〕精製 XylA を V8 プロテアーゼ処理して得られたペプチド断片のアミノ酸配列を基に縮重プライマーを作製し、染色体 DNA を鋳型として PCR を行った。DIG 標識した約 1.0 kbp の増幅断片をプローブとして、サザン・ハイブリダイゼーションを行った結果、xylA 遺伝子は A. japonicus の染色体上に 1
コピー存在する事が示唆された。クローニングした 4.9 kbp の EcoRⅠ断片を用いて、xylA 遺伝子の完全長ORF と周辺領域の塩基配列を決定した。xylA 遺伝子の ORF は、イントロンを含まない 2412 bp から成り、
17 アミノ酸残基の分泌シグナルと 787 アミノ酸残基の成熟酵素 (推定分子量 84,638 Da)をコードした。XylAには 18 箇所の N 型糖鎖付加のためのコンセンサス配列、708 bp の 5’ 非コード領域には 5 箇所のカタボライ
ト抑制因子 CreA 結合可能部位や 3 箇所の転写誘導因子 XlnR 結合可能部位が存在した。
Sequence analysis of beta-xylosidase gene from Aspergillus japonicus
Koji Yoshihara1, Motoki Wakiyama1, Sachio Hayashi1, Kazuyoshi Ohta2(1Dept. Appl. Chem., Univ. of Miyazaki, 2Dept. Biochem. Appl. Biosci., Univ. of Miyazaki)

P-46
Aspergillus japonicus には２種類の糖質加 水分解酵素ファミリー11 キシラナーゼ遺伝子が存在する脇山元気 1、吉原浩司 1 、林幸男 1 、太田一良 2（1 宮崎大・工・物質環境、2 宮崎大・農・応生科）〔目的〕糸状菌 Aspergillus japonicus MU-2 株は、エンド型グリコシダーゼの一種であるキシラナーゼを菌体外に産生する。本報では、この細胞外キシラナーゼを精製し、コードする遺伝子をクローニングした。
〔方法および結果〕カラス麦製キシランを炭素源として培養した A. japonicus の培養上清より、塩析、各種
クロマトグラフィーも用いてキシラナーゼを電気泳動的に単一に精製した。精製酵素の N 末端および内部ア
ミノ酸配列をそれぞれ 1 箇所ずつ決定した結果、本酵素は糸状菌由来の糖質加水分解酵素ファミリー11(GH-11)のキシラナーゼと高い相同性を示した。内部アミノ酸配列および GH-11 にコンセンサスな配列を基にして縮重プライマーを設計し、染色体 DNA を鋳型として PCR を行った。その結果、約 200 bp の増幅断片を得た。その配列は 2 種類存在し、それぞれは、他の糸状菌由来の GH-11 のキシラナーゼと高い相同性を示した。それらの配列をプローブとしてサザン・ハイブリダイゼーションを行った所、異なった検出バンドのパターンを示した事から、2 種類のキシラナーゼ遺伝子は染色体上の異なった位置に存在する事が示唆された。
Existence of two copies of glycoside hydrolase family 11 xylanase gene from Aspergillus japonicus
Motoki Wakiyama1, Koji Yoshihara1, Sachio Hayashi1, Kazuyoshi Ohta2(1Dept. Appl. Chem., Univ. of Miyazaki, 2Dept. Biochem. Appl. Biosci., Univ. of Miyazaki)

69

P-47
糸状菌を用いたヤマイモ由来キチナーゼ E の発現太田康司，西北広信，池 正和，小笠原渉，岡田宏文，森川 康（長岡技科大・生物）【目的】ヤマイモ由来のキチナーゼは 5 種類 (YamE，F，G，H1 および H2)生産することが明らかにされている。その中で，糖質加水分解酵素ファミリー 19 のクラス IV に属する YamE は，病原性真菌に対して高い溶菌活性を持つことが報告されている。さらに，YamE は耐熱性や pH 安定性にも優れていることから，酵素農薬としての応用が期待されている。しかしながら YamE はヤマイモにおいて少量しか生産されず，工業的に生産し農薬として用いるためには，微生物等を用いた大量発現系の構築が必要である。そこで本研究では，YamE の大量発現を目的とし，糸状菌 Aspergillus oryzae および Trichoderma reesei を宿主とした YamE の分泌発現を試みた。
【方法と結果】A.oryzae での発現では，分裂酵母での分泌発現用に改良した T.reesei 由来 cellobiohydrorase II(cbh 2) 遺伝子の分泌シグナルを付加し，2 種類の発現ベクター（pNAN8142 および pNEN142）を用いての分泌発現を試みた。その結果，培養上清中に最大で 822 mU/ml の活性が検出され，49 mg-protein /L の発現量と算出された。一方，T.reesei での発現では，cbh 2 遺伝子の分泌シグナルを付加した YamE の cDNA を，
CBH II プロモーター支配下に導入し，分泌発現を試みた。その結果，培養上清中に最大で 151 mU/mL の活性が検出され，16 mg-protein/L の発現量となった。T.reesei を宿主とした植物由来タンパク質の発現は過去に報告がなく，本研究で初めて成功したこととなるが，工業的に利用するためには更なる発現量が必要である。
現在，発現量増大を目指し T.reesei 由来 CBH I プロモーターを用いた発現系の構築を試みている。
Expression of chitinase E from yam tuber in filamentous fungi
Koji Ota, Hironobu Nishikita，Masakazu Ike，Wataru Ogasawara，Hirohumi Okada，Yasushi Morikawa(Dept. of Bioeng., Nagaoka Univ. of Tech.)P-48
麹菌ポストゲノム解析を支援する Aspergillus nidulans 発現用プラスミドの構築
石田博樹 1、 秦洋二 1 、 楠本憲一 2 、 山形洋平 3、 小出芳直 4、 竹内道雄 5（1 月桂冠・総研、研、 3 東北大院農・応生科、 4 天野エンザイム・研究部、 5 東京農工大院・応生科）

2

食総［目的］ 麹菌のゲノム解析が完了し、そのゲノム配列が公開されたが、麹菌ゲノム中に 135 種類存在する
プロテアーゼも、そのほとんどが機能未知である。これらの機能を特定するために、麹菌よりも遺伝子操作が容易な Aspergillus nidulans を宿主として、前記遺伝子を高発現させるための基本プラスミドを構築した。
［方法と結果］ まず、麹菌遺伝子を発現させるための A. nidulans の宿主ベクター系として、A. nidulans A89(argB)とオーレオバシジン耐性遺伝子 A. nidulans aurAr を選択した。
菌体外プロテアーゼ分泌発現用プラスミドについては、A. nidulans aurAr を含むプラスミドに、麹菌 amyA
プロモーター、マルチクローニング部位、Factor Xa 認識配列、His タグ、終止コドン、麹菌 amyA ターミネーターの順でサブクローニングした。なお、種々の遺伝子のフレームに対応するため、マルチクローニング
部位直後に 0-2 塩基挿入したタイプの 3 種類のプラスミドを構築した。マルチクローニング部位としては、
SacI, SacII, NotI, Eco52I, SpeI, BamHI, EcoRV, EcoO109I, ApaI の 9 種類が使用可能である。
一方、菌体内プロテアーゼ分泌発現用プラスミドについては、菌体外プロテアーゼ分泌発現用プラスミドの、麹菌 amyA プロモーターとマルチクローニング部位の間に、麹菌酸性プロテアーゼのプレ、プロ配列をサブクローニングした。マルチクローニング部位としては、前記 9 種類が使用可能である。なお、いくつかのプロテアーゼについては、当該プラスミドを使用して発現が確認されている。
［謝辞］ 本研究は、生研センター基礎研究推進事業の一環として行われたものである。
Construction of expression plasmids in Aspergillus nidulans for post-genomics of A. oryzae.
Hiroki Ishida1, Yoji Hata1, Ken-Ichi Kusumoto2, Youhei Yamagata3, Yoshinao Koide4, Michio Takeuchi5(Gekkeikan1, NFRI2, Univ. of Tohoku3, Amano Enzyme4, Tokyo Univ. of Agric. And Technol. 5)

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P-49
Aspergillus aculeatus における sC 選択マーカーを用いた形質転換系の開発
足立浩美, 谷修治, 炭谷順一, 金政真 1, 荒井基夫 1, 川口剛司（阪府大院・生命・応生科, 1 中部大・応生）【目的】Aspergillus aculeatus が生産する多種類のセルラーゼはセルロースの糖化力に優れ、各種セルラーゼ
遺伝子の発現調節機構を分子レベルで明らかにすることは極めて興味深い。これには、外来遺伝子を相同組換えで同一遺伝子座に 1 コピー導入でき、形質転換体の選択を簡便に行え、且つ A. aculeatus 自身を宿主とした形質転換系の開発が必須である。そこで本研究では、硫酸代謝に関わる ATP スルフリラーゼ遺伝子(sC) を選択マーカーとした A. aculeatus の形質転換系を確立することを目的とした。
【方法及び結果】sC 欠損変異株 (sC-) は、硫酸のアナログであるセレン酸含有培地で生育できることを利用して取得した。自然変異により生育したセレン酸耐性株のうち、硫酸塩を単一硫黄源として同化できず、且つクロム酸感受性を示した 6 株を sC- 候補株として単離した。A. aculeatus からクローニングした sC 遺伝子を用いて sC- 候補株 4 株を形質転換した結果、全てにおいて硫酸塩を単一硫黄源として生育できる形
質転換体が得られた。A. aculeatus sC- 及び sC 遺伝子の有用性が示されたため、sC 選択マーカーによる形質転換系が構築された。4 株の sC-の表現型は sC 座位での大規模な欠損に起因しない事がサザンブロット分析
より示されたことから、変異点をシークエンス解析により同定した。 結果、3 株では点変異が、1 株では38bp の欠失が起こっていたため、相同組換えの宿主として利用可能であることが示された。現在、この系を用いた形質転換を行い、相同組換え効率およびコピー数等について検討中である。
Development of a transformation system for Aspergillus aculeatus using the sC gene as selectable marker
Hiromi Adachi, Shuji Tani, Junichi Sumitani, Shin Kanamasa1, Motoo Arai1, Takashi Kawaguchi (Life & Env. Science,
Osaka Pref. Univ., 1 Biochem., Chubu Univ.)

P-50
Aspergillus aculeatus ku80 遺伝子破壊による高頻度相同組換え宿主の開発
辻篤史, 谷修治, 炭谷順一, 川口剛司（阪府大院生命・応生科）【目的】近年糸状菌において、非相同組換えに関与する ku70 または ku80 遺伝子破壊株を宿主として用いた
ターゲティング効率の極めて高い形質転換系が開発されている。Aspergillus aculeatus No. F-50 株(A. aculeatus)
は環境に応答して誘導的に多種のセルラーゼ・ヘミセルラーゼを生産することから、これら遺伝子群の発現調節機構解明のために、A. aculeatus ku 破壊株を宿主としたターゲティング効率の高い形質転換系の構築を目指している。
【方法・結果】まず A. aculeatus 染色体 DNA を鋳型とし、近縁種の ku 遺伝子間の相同性を基に設計した縮重プライマーを用いて PCR を行い、A. aculeatus ku80 ortholog (Aaku80)の一部 DNA 断片を得た。
この DNA 断片をプローブとして行ったサザンブロッティング分析より、約 6.4 kb の Sph I 消化断片が Aaku80
全長とその周辺領域を含むことが示された。作製したゲノムライブラリーからその DNA 断片をクローニン
グし、シークエンス解析を行った結果、Aaku80 は、9 個のイントロンを含む 2,178 bp の ORF から成り、アミノ酸レベルで他の Aspergillus 属 Ku80 と約 75%の相同性を示した。Aaku80 を破壊するために、まず fusion
PCR 法により、両端に約 1.5 kb の Aaku80 相同配列、その内側に選択マーカーである A. nidulans pyrG と遺伝
子導入後 Aaku80 隣接配列と direct repeat を形成するための約 1 kb の配列を含む遺伝子破壊カセットを構築した。形質転換体約 40 株についてサザンブロッティング分析を行った結果、1 株の Aaku80 破壊株を取得した。
この株の分生糸を 5-FOA 含有培地に塗布し、生育した菌株のサザンブロッティング分析を行ったところ、そのうちの約 9 割の株において direct repeat 間の相同組換えによる pyrG 遺伝子の脱落が確認された。
Development of highly efficient gene targeting in Aspergillus aculeatus ku80 mutant
Atsushi Tsuji, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani, Takashi Kawaguchi(Grad. schl. of Life & Env. Sci., Osaka Pref. Univ.)

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P-51
Aspergillus aculeatus における pyrG，sC，niaD 三重欠損株の作出
國武絵美，足立浩美，谷修治，炭谷順一，荒井基夫 1，川口剛司（阪府大院生命・応生科，1 中部大応生・

環境生化）【目的】Aspergillus aculeatus F-50 株は多種の糖化力に優れたセルラーゼをセルロース性基質存在下で誘導的に生産する。この遺伝子発現制御機構に関する知見を得るためには形質転換系が必須である。我々はオロチ
ジン脱炭酸酵素遺伝子 (pyrG)，ATP スルフリラーゼ遺伝子 (sC) を選択マーカーとして用いた形質転換系を構築している。本課題では，セルラーゼ遺伝子発現誘導因子の探索を目的として，硝酸還元酵素遺伝子(niaD) を選択マーカーに用いた形質転換系の開発を行い，さらに pyrG，sC，niaD 三重欠損株を作出したことを報告する。
【方法・結果】まず niaD をマーカーとした形質転換系の構築を行った。niaD 欠損 (niaD-) 候補株は，自然突然変異により塩素酸に耐性を示した株の中から，硝酸資化能がなく，亜硝酸，アデニン資化能のある株として選択された。その後クローニングした A. aculeatus niaD 遺伝子を用いて niaD- 候補株を形質転換した結果，全ての株の表現型が相補された。またサザンブロット分析により niaD- 株において niaD 座位で大規模な欠失が起こっていないことを確認し，niaD を選択マーカーとした形質転換系を確立した。次に，セレン酸耐性株から取得した sC 欠損株から 5-フルオロオロチン酸耐性を示す，pyrG，sC 二重欠損株を単離した。
この二重欠損株に上記と同様の方法で niaD - を付与し，pyrG，sC，niaD 三重欠損株を作出した。現在，この三重欠損株を用いてセルロースにより発現が誘導される cbhI 遺伝子発現制御因子のスクリーニング系を構築している。
Construction of Aspergillus aculeatus pyrG sC niaD triple mutant
Emi Kunitake, Hiromi Adachi, Shuji Tani, Jun-ichi Sumitani, Motoo Arai, Takashi Kawaguchi(Grad. schl. of Life & Env. Sci., Osaka Pref. Univ.,Biochem.,Chubu Univ.)

P-52
麴菌(Aspergillus oryzae)NS4 株における niaD 及び sC 遺伝子変異部位の同定
山田 修，林 梨咲，池田凉子，坂本和俊，岩下和裕，三上重明 （酒総研）麴菌(Aspergillus oryzae)は、清酒をはじめとした醸造産業に広く利用されている有用糸状菌＝「国菌」であり、その高い安全性から米国 FDA より GRAS (Generally Recognized As Safe) グレードとして記載されている。また、麴菌ゲノ
ムシーケンスが報告されるとともに、伝統的な利用のとどまらず有用タンパク質の生産ホストとしても注目を集めている。
麴菌 NS4 株 1)は、ゲノム解析株 RIB40 より UV 変異による取得された株であり、nitrate reductase 遺伝子(niaD)及びATP sulfurylase 遺伝子(sC)に変異を有し、形質転換用ホストとして比較的広く利用されている。しかし、どのような変異が原因となり、niaD- 及び sC- となっているのかについては不明であった。そこで、NS4 株及びその親株である
niaD300 株について変異部位の同定を行うこととした。
麴菌 niaD300 及び NS4 株ゲノム DNA より niaD 及び sC 遺伝子についてプロモーター及びターミネーター領域をそれぞれ 1-kb 含む断片を PCR により増幅し、ダイレクトシークエンスを行った。niaD 遺伝子の PCR 増幅産物は、
niaD300 及び NS4 両株において RIB40 と比較して移動度の増加が観察され、何らかの欠失が予想された。シークエ
ンスの結果、両株では、niaD 遺伝子の第 6 exon からターミネータ部分へかけて 769-bp が欠失しており、結果として C末に位置する oxidoreductase NAD-binding domain が大きく欠落し、これが硝酸イオン資化性欠如の原因と推定された。一方、sC 遺伝子について niaD300 及び NS4 株について比較したところ、ORF 内にのみ 2 塩基の変異とアミノ酸置換（CTT→CCC, L44P）が確認された。しかし、この変異は Pfam による推定機能ドメイン外に位置していることから、
現在、NS4 株の硫酸イオン非資化性への寄与について、さらに解析を行っている。
1) Yamada et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61, 1367 (1997)
Identification of the mutated reagion in niaD and sC genes from Aspergillus oryzae NS4.
Osamu Yamada, Risa Hayashi, Ryoko Ikeda, Kazutoshi Sakamoto, Kazuhiro Iwashita, and Sigeaki Mikami (NRIB)

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P-53
麹菌のプロリルアミノペプチダーゼ様遺伝子産物の組換え麹菌による生産と蛋白質の性質
松下真由美 1、楠本憲一 1、古川育代 1、鈴木聡 1 、小出芳直 2 、石田博樹 3、山形洋平 4、竹内道雄 5、柏木

豊 1（1 食総研、2 天野エンザイム、3 月桂冠、4 東北大・院・応生科、5 東京農工大・院・応生科）[目的] Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドは一般的にプロテアーゼでは分解されないが、prolyl
aminopeptidase（PAP）はＮ末端からプロリンを遊離する活性を有する。PAP はこれまで細菌でのみ知られていたが 、Aspergillus niger から PAP が 見出 された 。その 推定ア ミノ 酸配列 に対 し、 麹菌ゲ ノム 情報(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top) か ら 79 ％ の 同 一 性 を 示 す 蛋 白 質 を コ ー ド す る 遺 伝 子 AopapA（AO090003000302）を見出した。そこで、本遺伝子の翻訳産物の生産と性質の解明を目的とした。
[方法と結果] AopapA の推定コーディング領域 1.8 kb を麹菌 RIB40 株のゲノムから PCR により取得した。目的蛋白質のＣ末端に His-tag を付加し、これを AmyB プロモーター下流に組み込んだベクターを作成し、麹菌 RIB40 株に形質転換した。形質転換株は AmyB 誘導条件下で培養後、菌体を凍結破砕し、細胞抽出液を得た。RIB40 株に比べて約 10 倍の Pro-p-nitroanilide（P-pNA）分解活性を示す高活性株が得られ、His-Tag 抗体を用いたウエスタンブロットによって、蛋白質の発現生産を確認した。現在、P-pNA 分解活性画分の精製を進めている。
本研究は、生研センター基礎研究推進事業の一環としておこなわれたものである。
Isolation and characterization of a prolyl aminopeptidase gene from Aspergillus oryzae
Mayumi Matsushita1, Ken-Ichi Kusumoto1, Ikuyo Furukawa1, Satoshi Suzuki1, Yoshinao Koide2, Hiroki Ishida3,
Youhei Yamagata4, Michio Takeuchi5, Yutaka Kashiwagi1 （1Natl. Food Res. Inst., 2Amano Enzyme, 3Gekkeikan, 4Grad. Sch. Agric. Sci.,Tohoku Univ., 5 Tokyo Univ. of Agric. Tech.）P-54
麹菌 A. oryzae による異種タンパク質生産に及ぼすα-amylase 発現抑制の効果
根本崇，丸山潤一，有岡学，北本勝ひこ（東大院・農生科・応生工）【目的】優れたタンパク質分泌能を有する麹菌 A. oryzae は、異種タンパク質生産の宿主として使用されている。これまでに我々は、tppA pepE プロテアーゼ遺伝子 2 重破壊株 NS-tApE1)、また NS-tApE 株から得られた
高分泌変異株 AUT12) が野生株に比べて高いキモシン生産能を示すことを報告している。A. oryzae はα-amylase を多量に分泌するが、異種タンパク質の生産を目的としたときには精製の障害となると考えられる。
また、様々な細胞内プロセスで競合している可能性もある。しかし、A. oryzae には 3 つの α-amylase 遺伝子が存在し破壊株を作製することは難しい。最近、RNAi による α-amylase の生産抑制が報告された 3）ことから、今回は、キモシン生産株において RNAi 法による α-amylase の発現抑制を試みた。
【方法と結果】まず、キャリアタンパク質としてグルコアミラーゼ(GlaA)を用いたプロキモシン発現プラスミドを作製し、sC マーカーを用いて NS-tApE 株に形質転換した。取得した株は 5×DPY 液体培地で培養後、その培地上清について凝乳活性測定およびウエスタン解析を行い、キモシンの生産を確認した。さらに、
α-amylase 遺伝子の第 9 番目のエキソン領域を dsRNA として発現しスペーサー配列にイントロン領域を用
いたプラスミドを作製し、niaD マーカーを用いてキモシン生産株に形質転換した。取得した株を 5×DPY 液体培地で培養後、培地上清について α-amylase 活性測定および凝乳活性測定を行ったところ、親株よりもα-amylase が減少し、キモシンの生産量が増加していた。
1) 根本ら、2006 年度生物工学会大会講演要旨集、p.131、2) 根本ら、2007 年度農芸化学会大会講演要旨集、
p.179、3) Yamada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 71 (1), 138-144, (2007)
Effect of suppression of α-amylase on heterologous protein production in A.oryzae
Takashi Nemoto, Jun-ichi Maruyama, Manabu Arioka, Katsuhiko Kitamoto(Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

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P-55
麹菌 Aspergillus oryzae による cellobiose phosphorylase の分泌生産の検討
多田功生, 熊谷明夫 1, 鈴木聡, 楠本憲一, 天野良彦 1, 佐々木 堯, 柏木豊

1（食総研, 信州大院・工）（目的）細菌Cellvibrio gilvus由来のcellobiose phosphorylase（CBPase）はセロビオースを加リン酸分解し、グ
ルコース-1-リン酸とグルコースを生成する反応を触媒する酵素で、分子量は約90kDa、細胞内において二量体あるいは四量体を形成することが報告されている。この酵素は同時に逆反応も触媒するので、ヘテロオリ
ゴ糖を生成することが可能であり、有用な酵素である。しかし、C. gilvus培養では生産性が低いため、タンパク質分泌能に優れた麹菌Aspergillus oryzaeを用いたCBPaseの分泌生産について検討した。
（方法と結果）CBPase遺伝子の上流に分泌のためのキャリアーとしてグルコアミラーゼ（glaA）遺伝子とKexB認識配列を連結した融合遺伝子をA. oryzaeに導入し、形質転換株を取得した。得られた形質転換株の培
養上清には、抗CBPase抗体を用いたウエスタン解析によりCBPaseが確認されたが、その量は非常にわずかであった。また、同様に細胞壁中にもCBPaseとその分解産物が確認された。現在、Trichoderma reeseiなどで、O型結合糖鎖が付加されたタンパク質の分泌量の向上に効果があるとの報告がある酵母Saccharomyces
cerevisiaeのdolichol phosphate mannose synthase（DPM1）等を用いて、分泌量の改善を試みている。
本研究は、生研センター異分野融合研究支援事業の一環として行われたものである。
Production and secretion of cellobiose phosphorylase in Aspergillus oryzae
Sawaki Tada, Akio Kumagai1, Satoshi Suzuki, Ken-Ichi Kusumoto, Yoshihiko Amano1, Takashi Sasaki, Yutaka
Kashiwagi(NFRI, 1Grad.Sch.Engneering, Shinshu Univ.)

P-56
アラキドン酸生産性糸状菌 Mortierella alpina 1S-4 における新規選択薬剤の探索及びマーカー遺伝子の評価
安藤晃規、櫻谷英治、小川順、清水昌（京大院農・応用生命）【目的】本研究室で見出された Mortierella alpina 1S-4 はアラキドン酸をはじめとする各種高度不飽和脂肪酸（PUFA）を菌体内に著量蓄積することから、PUFA 生合成系機構解明におけるモデル生物として注目されている。我々はこれまでに本菌の PUFA 生合成機構の解明及び生産制御を目的として栄養要求性を指標とした基礎的な形質転換系の開発に成功している。今回新たに宿主に依存しない汎用的な形質転換系の開発を目的として本菌に有効な新規薬剤の探索及び、マーカー遺伝子の評価を行ったので報告する。
【方法・結果】様々な抗生物質、抗真菌剤を通常のＧＹ培地（グルコース 1%、酵母エキス 0.5%）に添加し生育実験を行った結果、担子菌に特異性の高い薬剤カルボキシンが本菌にも有効であることがわかった。本
薬剤のターゲットであるコハク酸脱水素酵素複合体 Ip サブユニット(SdhB)遺伝子を本菌より単離し、耐性機構に関与する１塩基変異を挿入しヒスチジンからロイシンへの１アミノ酸置換を導入した。本変異導入遺伝
子と ura5 遺伝子の発現カセットをタンデムに挿入した pSDura5 を構築し、耐性遺伝子を過剰発現した形質転換株を選抜、その後カルボキシン含有ＧＹ倍地上に移し、評価を行ったところ形質転換株は有意な耐性能を獲得した。結果、組み換え体選抜のためのマーカー遺伝子としての利用の可能性を示すことができた。
Screening of fungicide and investigation of novel selective marker for the arachidonic acid producing
filamentous fungus Mortierella alpina 1S-4
Akinori Ando, Eiji Sakuradani, Jun Ogawa, Sakayu Shimizu (Division of Applied Life Sciences Graduate School of
Agriculture, Univ. of Kyoto)

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P-57
DNA リガーゼ遺伝子破壊による Cryptococcus neoformans 相同組換え効率への影響
清水公徳，李皓曼，渡辺哲，亀井克彦，山口正視，川本進（千葉大・真菌センター）
酵 母 か ら ヒ ト に 至 る 真 核 生 物 で は ， DNA 二 重 鎖 切 断 は 主 と し て 非 相 同 末 端 結 合 (non-homologous
end-joining; NHEJ)と相同組換え(homologous recombination; HR)によって修復される。ところが，ヒト病原性
酵母 Cryptococcus neoformans では，NHEJ による遺伝子修復機構により，標的とする遺伝子の相同組換え（遺伝子ターゲッティング）による遺伝子破壊操作が困難であることが問題となっていた。近年，Neurospora
crassa において DNA 結合反応を触媒するタンパク質（DNA リガーゼ）をコードする遺伝子 LIG4 を破壊す
ることにより，HR 効率が著しく上昇することが報告された。そこで本研究では，C. neoformans のもつ LIG
４遺伝子ホモログ（LIG4）の遺伝子破壊株の作製と HR 効率の向上を目的として実験を行った。まず，C.
neoformans ゲノムデータベースより LIG4 遺伝子ホモログの塩基配列を抽出した。RACE 解析により決定した LIG4 遺伝子の cDNA 部分配列をもとに PCR プライマーを構築し，cDNA を増幅し，塩基配列を決定した。
cDNA 配列と染色体 DNA 配列の比較により，本菌の LIG4 遺伝子は 29 個のイントロンを含み 1079 アミノ酸をコードすることが推定された。続いて，本菌の野生型株 B4500（血清型 D）および B4500 株由来のウラシル要求性株 TAD1 を用いて LIG4 破壊株の作製を行った。LIG4 遺伝子の上流および下流それぞれ約 1kb の領
域と nourseothricin 耐性遺伝子 NATR を PCR により結合し，遺伝子銃を用いて形質転換を行った。得られた
NAT 耐性株の遺伝子型を検定したところ，HR 効率はいずれも 3％程度であったが，目的の遺伝子型（ΔLIG4）をもつものが得られた。この LIG4 破壊株について HR 効率，HR に必要な相同領域サイズなどについて報告する。
Efficient homologous recombination in Cryptococcus neoformans by DNA ligase disruption
Kiminori Shimizu, HaoMan Li, Akira Watanabe, Katsuhiko Kamei, Masashi Yamaguchi, Susumu Kawamoto.
(MMRC, Chiba Univ.)

P-58
Production of Aspergillus fumigatus swollenin in A. oryzae
Xinai CHEN, Jun-ichi MARUYAMA, Manabu ARIOKA, Katsuhiko KITAMOTO (Dept. of Biotechnol., Univ. ofTokyo)
Swollenin (SWOI), an expansin-like protein, was firstly isolated from Trichoderma reesei with the ability to swell
cotton fibers and disrupt the structure of plant cell walls. We found that there is a predicted swollenin gene present in A.
fumigatus genome database. To explore the biochemical function of swollenin from A. fumigatus, the gene (Afswo1,
and its protein AfSWOI) was cloned from a clinical isolated strain, A. fumigatus TIMM0063. Afswo1 gene contains 7
exons and encodes a protein of 476 amino acids composing of a signal peptide, an N-terminal fungal type
carbohydrate-binding module (CBM), an expansin-like domain in the middle and a C-terminal expansin-like cellulose
binding domain. An expression plasmid of Afswo1 was constructed under the control of tef1 promoter and introduced
into a double-protease gene disruptant, A. oryzae NS-tApE (niaD- sC- ΔargB adeA- ΔtppA::argB ΔpepE::adeA).
SDS-PAGE analysis indicated that AfSWOI was efficiently secreted into the culture broth and got over-glycosylatedwith a molecular weight of approximately 75 kDa, 1.5 times higher of its deduced molecular mass. AfSWOI was
purified with cellulose affinity chromatography, and its biochemical properties are currently being investigated.

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P-59
FTA 簡易ゲノム抽出法を用いた PCR-TTGE による味噌中の真菌叢の解析
鈴木聡，福岡真里,竹谷博子,

松下真由美,

多田功生,

楠本憲一,

柏木豊（食総研）

味噌の醸造には麹菌を始めとする様々な微生物が働いている。近年 PCR 法を利用して、微生物の同定を行う手法が開発され、その簡便、迅速さから広く行われるようになっている。しかし、味噌等の醗酵食品は混合物であり、種々の PCR 阻害物質を含むうえ、麹菌、酵母等の真菌類は強固な細胞壁を持つため、菌体からの DNA の抽出が難しく、多数のサンプルを一度に扱うことは困難であった。そのため、多検体解析の効率化が求められている。我々は、既に、寒天培地上のコロニーや味噌等から簡便な前処理によって鋳型
DNA を抽出するコロニーPCR 法について発表した。本手法は、FTA カード（Whatman）を用いて麹菌ゲノ
ム DNA を固定化、安定化させるものであり、有機溶媒やカオトロピック塩などの有害物質、細胞破砕機等の機器を必要とせず、PCR テンプレートとして十分量の DNA を抽出することができる。本手法によって味噌サンプルから真菌ゲノム DNA を抽出し、リボソーム DNA を PCR 増幅することにより、各種味噌中の真菌叢を PCR-TTGE にて解析したので報告する。
Analysis of fungal community in miso by PCR-TTGE using genomic DNA extracted by FTA card
Satoshi Suzuki, Mari Fukuoka, Hiroko Taketani, Mayumi Matsushita, Sawaki Tada, Ken-Ichi Kusumoto, Yutaka
Kashiwagi(NFRI)

P-60
液面固定化（LSI）システムによる麹菌酵素の生産性について
高木義弘、小田忍＊、尾関健二、大箸信一（金沢工大・ゲノム研、＊メルシャン・生資研）＜目的＞液面固定化（LSI）システムは、ポリアクリロニトリルを主成分とする微粒子の中空マイクロスフ
ェアーの液面浮上性を利用して、液体培地中に分散させて糸状菌の胞子ならびに菌糸を液面に浮上させて培養することにより、培地液面に強固な糸状菌‐マイクロスフェアー複合マットを形成する全く新規な培養方法である。今回、この LSI 培養と液体培養とで麹菌とキシラナーゼ高生産組換え麹菌での目的酵素の生産性について比較検討することを目的とした。
＜方法および結果＞麹菌としては RIB40 とキシラナーゼ（XynF1）高生産株を用い、YPD 培地での液体振とう培養と LSI 培養法とで経日的に培地中に生産するタンパク質含量、SDS-PAGE、酵素活性、麹菌菌体量について測定した。RIB40 では、LSI 培養のほうが培地中に生産するタンパク質含量が多く、SDS-PAGE で生産するタンパク質のパターンが異なっていた。キシラナーゼ高生産麹菌では、液体培養では培養後期でキシラナーゼのタンパク質が減少するのに対して、LSI 培養では培養期間中キシラナーゼの生産は継続しており、酵素の生 産性 が良い 結果と なっ た。ま た麹菌 菌体 量あたり のキ シラナ ーゼの 生産 性、他 の麹菌 でのSDS-PAGE の結果についても報告する。
Productivity of Aspergillus oryzae enzymes by the liquid-surface immobilization (LSI) system.
Yoshihiro Takagi， Shinobu Oda*， Kenji Ozeki，Shinichi Ohashi

76(K.I.T. ，*Mercian Co.)

P-61
麹菌 A. oryzae のプロテアーゼ遺伝子発現解析と nptB 破壊株によるヒトリゾチーム
生産
木村信弥１，丸山潤一 1 ，竹内道雄２，北本勝ひこ１（東大院・農生科・応生工１，東農工大・農・応生科２）【目的】麹菌 A. oryzae には多数のプロテアーゼ遺伝子が存在し、生産された異種タンパク質の分解に関与している。これまでにプロテアーゼ遺伝子破壊株が複数取得され、異種タンパク質生産に効果的であることが示されている１）。しかし、その破壊のターゲットを的確に選択することは難しい。そこで本研究では、DNA
マイクロアレイを用いて 132 のプロテアーゼ遺伝子の発現を解析し、破壊のターゲットを絞り込むこととした。
【結果】5X DPY(pH 8.0)培地におけるプロテアーゼ遺伝子の発現パターンに基づき、クラスタ解析を行った。
解析の結果、培養前期（2 日）から中期（4 日）、後期（6 日）と経過するにつれて発現量が上昇するプロテアーゼ遺伝子群の存在が認められた。その中には、これまでにヒトリゾチーム生産に効果のあったプロテアーゼ遺伝子 pepA、 tppA、 alpA 等が含まれており、中性プロテアーゼ II をコードする nptB 遺伝子が同様の発現パターンを示していた。そこで、nptB 遺伝子の破壊株を取得し、5X DPY（pH 8.0）培地でヒトリゾチー
ム生産を行った。その結果、培養中期において生産量の増加が確認された。
1) Jin et al., (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol., in press
Monitoring global gene expression of proteases and improvement of human lysozyme production in nptB genedisruptant of Aspergillus oryzae
Shinya Kimura1, Jun-ichi Maruyama1, Michio Takeuchi2, Katsuhiko Kitamoto1(Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo1, Tokyo Univ. of Agriculture and Technology2)P-62
麹菌 A. oryzae における異種タンパク質生産時のマイクロアレイ解析
大野絢子，丸山潤一，有岡学，北本勝ひこ（東大院・農生科・応生工）【目的】麹菌 A. oryzae は高いタンパク質生産能力を持つが、動物や植物由来のタンパク質を生産させた場合には一般に生産量が高くない。その解決策のひとつとして、宿主が大量に分泌しているタンパク質（キャリアータンパク質）と異種タンパク質を融合して発現させるという方法がある。しかし、何故キャリアータン
パク質を融合すると生産性が向上するかという問題に対して、その詳細は明らかにされていない。本研究ではこの生産量増加の原因を解明することを目的として、キャリアータンパク質の有無による A. oryzae の遺伝
子発現への影響についてマイクロアレイを用いて網羅的に解析した。
【方法及び結果】A. oryzae を用いたウシ・キモシンの生産では、キャリアータンパク質を融合して発現することにより生産量が増加することが知られている 1)。そこで、キャリアータンパク質としてα-アミラーゼ(AmyB)とウシ・キモシンとの融合タンパク質、またはα-アミラーゼシグナル配列とウシ･キモシンとの融合
タンパク質をそれぞれ発現するためのプラスミドを作製し、A. oyrzae niaD300 株に形質転換した。これらの株を液体培地で生育させたところ、α-アミラーゼを融合することによるキモシン生産量の増加が確認された。さらに、これらの株を用いてマイクロアレイ解析を行い、キャリアータンパク質の有無による遺伝子発現応答の違いを調べた。その結果、α-アミラーゼとウシ・キモシンの融合タンパク質発現株において小胞体関連遺伝子の発現上昇が認められた。
1) Tsuchiya et al. (1994) Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 895-899
Microarray analysis of the strains producing a heterologous protein in Aspergillus oryzae
Ayako Ohno, Jun-ichi Maruyama, Manabu Arioka, Katsuhiko Kitamoto(Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

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P-63
麹菌菌体内タンパク質解析条件の再検討
北川治恵，佐野元昭，大箸信一（金沢工大・ゲノム研）
さまざまな培養条件下において麹菌 Aspergillus oryzae が生産するタンパク質を網羅的に解析するため、二次元電気泳動、MALDI-TOF 質量分析を用いた麹菌菌体内タンパク質のプロテオーム解析を行っている。これまでに、YPD 液体培地、貧栄養液体培地、フィルター培地などの条件下で発現するタンパク質の解析を行い、それぞれの条件下で特異的に発現するタンパク質を明らかにしてきた。これらの過程において、より厳密な比較を進めるためには、菌体破砕法、タンパク質抽出法、電気泳動条件などの基礎的な条件の再検討が必要であることが明らかになった。
上記諸条件の検討を行い、それぞれの最適条件を確立し、従来よりも著しく再現性を高めることが出来た。
中でも、抽出溶媒に少量の SDS を加える効果が顕著で、タンパク質の抽出効率が向上し、従来行っていたタンパク質の濃縮過程が不要になり、所用時間の短縮と共に、再現性が向上した。確立した方法を用い、培地の種類、培養時間による発現タンパク質の変化を明らかにした。
Analysis of intracellular proteins from Aspergillus oryzae grown under various culture conditions.
Harue Kitagawa, Motoaki Sano, Shinichi Ohashi (KIT)P-64
米ヌカ培地で高発現するβ‐グルコシダーゼの生産条件の比較
尾関健二，中川浩志，近藤花菜，加治木佑紀子，篠島里江，佐野元昭，小田大・ゲノム研 *メルシャン・生資研）

忍*，大箸信一（金沢工＜目的＞米ヌカは豊富な栄養や機能性成分を含んでいるが、米油などとしての利用に限られている。米ヌカの各種有用成分を可溶化できる食品用酵素剤の種類は少なく、バイオコンバージョン素材としての更なる有効活用が望まれている。麹菌は酵素の宝庫であり、米ヌカの有用成分を可溶化できる新規加水分解酵素遺伝
子群の取得、市販酵素剤と遺伝子群の組合せ、機能性バイオコンバージョン素材開発への展開を目指している。麹菌 DNA アレイの結果、米ヌカの外側の成分で高発現する麹菌遺伝子としてβ‐グルコシダーゼを取得し、麹菌の発現ベクターで高生産株を育種し、β‐グルコシダーゼの生産性を比較検討した。
＜方法および結果＞日本酒醸造時に排出する赤ヌカ(飯米の米ヌカ)と中ヌカ(内側の米ヌカ)を麹菌の液体培
養時の炭素源、窒素源として添加し、培養菌体より RNA 抽出、DNA マイクロアレイ用プローブの調製、遺伝子の発現プロファイルを解析した。その結果、β‐グルコシダーゼ遺伝子が高発現する遺伝子の一つであり、麹菌のセルフクローニング株を育種し、各種培養で生産性を検討した。β‐グルコシダーゼは、液体培
養では培地中には分泌されず、菌体内の酵素活性は親株に比べ 100 倍程度高生産した。小麦フスマ培養では、抽出液は親株に比べ 50 倍程度の生産性を示した。LSI 培養では、培地中に分泌され、親株の 300 倍程度の生産性が確認できた。LSI 培養が菌体内酵素の分泌生産できる培養法である可能性があることが分かった。
Producution of β-glucosidase in Aspergillus oryzae under a rice bran cultivation.
Kenji Ozeki, Hiroshi Nakagawa, Kana Kondo, Yukiko Kajiki, Rie Shinojima, Motoaki Sano, Shinobu Oda*, Shinichi
Ohashi(K.I.T., *Mercian Co.)

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P-65
麹菌 A. oryzae の細胞質型ホスホリパーゼ A2 の性質と機能
高谷康平、北本勝ひこ、有岡学（東大院・農生科・応生工）【目的】ホスホリパーゼ A2(PLA2)はグリセロリン脂質の２位のエステル結合を加水分解し、脂肪酸とリゾリ
ン脂質を遊離する酵素であり、哺乳類ではアラキドン酸代謝系を通じた脂質メディエーターの産生に関与す
ることが知られている。一方で、微生物由来の PLA2 に関する知見は乏しく、その生理的役割は殆ど明らかにされていない。我々はこれまで、麹菌 A. oryzae がゲノム中に持つ２つの分泌型 PLA2 の生理機能の解析を行い、それが分生子および菌糸における酸化ストレス抵抗性などに働く可能性を示した。一方、本研究では麹菌の持つ細胞質型 PLA2(cPLA2)の機能解析を目的とした。
【方法と結果】麹菌ゲノムから唯一の cPLA2 遺伝子である AoplaA をクローニングした。その C 末端に HAおよび His6 タグを付加した AoPlaA-HA-His6 融合タンパク質を高発現する麹菌株の作製を行い、その菌体抽出液から Ni2+カラムを用いて AoPlaA タンパクを精製した。現在、精製したタンパク質を用いて Ca2+濃度依
存性および至適 pH 等の酵素学的性質を検討している。続いて、AoPlaA-EGFP 融合タンパク質を麹菌に発現させその局在を観察した。その結果、AoPlaA-EGFP が細胞内の動的な線状構造体に局在することが分かった。
ミトコンドリア染色試薬 MitoTracker との共染色およびミトコンドリアマーカータンパク質を共発現する株の観察により、AoPlaA-EGFP が予想外にもミトコンドリアに局在することが示唆された。この局在については予備的な細胞分画実験による確認を行っている。一方、AoplaA 破壊株の取得が可能であったことから、
AoplaA は必須遺伝子ではないと考えられた。現在、高発現株とともに破壊株の表現型を探索しており、それらを通じて AoPlaA タンパクの生理的な機能が同定できるものと期待している。
Molecular characterization of cytosolic phospholipase A2 in Aspergillus oryzae.
Kohei Takaya, Katsuhiko Kitamoto, Manabu Arioka (Dept. of Biotechnol., Univ. of Tokyo)

P-66
ゲノム情報に基づく麹菌 Aspergillus oryzae 由来プロテアーゼ群の発現
片瀬徹 1, 星由紀子 1, 結城健介 1, 小出芳直 1, 竹内道雄 2, 山形洋平 3, 楠本憲一 4, 石田博樹 5(1 天野エンザイム, 2 東京農工大院・応生科, 3 東北大学・院・応生科, 4 食総研, 5 月桂冠・総研)【目的】麹菌ゲノム解析の結果、麹菌には他の Aspergillus sp. よりも 3 割ほど多い 135 種のプロテアーゼ
遺伝子の存在が見出された。本研究は、麹菌全プロテアーゼ遺伝子の糸状菌を宿主とした強制発現、網羅的なプロテアーゼの酵素化学的性質の解明、および麹菌全プロテアーゼのカタログ化を目的としている。
【方法・結果】我々はセリンおよびシステインプロテアーゼを中心とした 26 種のプロテアーゼに関して、
塩基配列、推定アミノ酸配列を基に In silico 解析を行い、各々の解析結果から判断してその局在を決定した。
続いて、月桂冠総研により開発された高発現共通プラットフォームを用い、A. nidulans を宿主とする形質転換を実施した。得られた形質転換体を培養した結果、いくつかのプロテアーゼの発現が確認された。以上の事から、本発現系によりプロテアーゼ生産が正常に行われる事が実証された。
なお本研究は、生研センター基礎研究推進事業の一環として行われたものである。
Expression of Putative Proteases from Aspergillus oryzae Genome Analysis.
Toru Katase1, Yukiko Hoshi1, Kensuke Yuuki1, Yoshinao Koide1, Michio Takeuchi2, Youhei Yamagata3,
Ken-Ichi Kusumoto4, Hiroki Ishida5(1Amano Enzyme Inc., 2 Tokyo Univ. of Agriculture and Technology, 3 Tohoku Univ., Grad. Sch. Agri. Sci, 4Natl. Food.
Res. Inst, 5Gekkeikan Sake Co. Ltd)

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P-67
液体培養とフィルター培養における麹菌 Aspergillus oryzae の熱応答比較解析
寺林靖宣 1、山根倫子 1、佐野元昭 2 、小池英明 1、大箸信一 2、町田雅之 1,2 (1 産総研、2 金沢工大)<目的> 麹菌をはじめとする糸状菌は産業的にも重要な微生物であり、伝統的醗酵産業や蛋白質分泌生産に広く用いられている。醸造醗酵産業に用いられる培養法は、液体培養と固体培養の 2 種類に大別される。醗
酵生産においては pH、水分、通気性、温度などの最適な制御がなされていると考えられる。一般に、固体培養は重要な酵素の生産に有利とされるが、培地の熱伝導や流動性の低さにより、温度制御は液体培養に比較して難しい。そこで本研究では、固体培養に広く用いられている麹菌の熱ストレス応答性の解析を行った。
固体培養のモデルとして、菌体と培地の分離が容易であるフィルター培養 1)を用い、マイクロアレイによる遺伝子発現量、CE-MS による代謝物質量の経時的変化を測定することにより、フィルター培養と液体培養における熱ストレスへ対する応答の比較を行った。
<方法> Aspergillus oryzae RIB40 株の液体培養およびフィルター培養を行い、それぞれに heat shock を与えてサンプルとした。抽出した mRNA より麹菌オリゴ DNA マイクロアレイを用いて発現量を解析し、熱応答による遺伝子発現の経時的変化を測定した。また、抽出物の CE-MS 測定 2)を行い、熱応答による菌体内の代謝物の変化を測定した。現在、モデル生物との熱ストレス応答性の比較、培養条件特異的な熱ストレス応答の解析を行っている。
1)H.Ishida et al. J. Ferment. Bioeng.(86) 301-307(1998)
2)寺林ら、日本生物工学会大会講演要旨集 27(2006)
Compartive heat shock analysis of Aspergillus oryzae between liquid and filter cultivations
Yasunobu Terabayashi1, Noriko Yamane1, Motoaki Sano2, Hideaki Koike1, Shinichi Oohashi2, Masayuki Machida1,2(1AIST, 2KIST)

P-68
黄麹菌菌蓋のプロテオーム解析
神太郎，竹内道雄（農工大院・応生化）

黄麹菌は多種多様な遺伝子を発現するが、その発現産物であるタンパク質の種類・量は培養条件によって大きく異なることが知られている。この違いを明らかにするため、これまでに数種類の培養条件下で、菌体
内タンパク質について研究を行ってきた。振とう培養した麹菌はペレット状となり分生子の形成は認められないが、静地培養した場合には菌蓋を形成し菌蓋上面に分生子の形成が起こる。
今回、Aspergillus oryzae RIB40 を液体培地で 3 日間振とう培養した菌体と、静地培養して得た菌蓋の菌体
内タンパク質について比較した。タンパク質は二次元電気泳動・MALDI-TOF/MS を用いた同定と、画像解析ソフトによる発現量の定量化で解析した。その結果、全体で約 400 個のスポットを確認したが、発現量の多いメインのスポットに関しては大きな差は認められなかった。しかし、液体培養菌体に比べ、菌蓋で 5 倍
以上強く検出されるスポットが約 30 個存在していた。一方、振とう培養菌体では約 50 個のタンパク質が多くなっていた。静地培養で多いタンパク質は、低分子側に、振とう培養で多いものは高分子側に集中していた。菌蓋で強く検出されたスポットには分解産物の他、低分子の機能未知なタンパク質も含まれていた。それらの不活化や活性化が菌蓋としての生育に重要である可能性が考えられた。
Proteome analysis of intracellular proteins from surface pad of Aspergillus oryzae RIB40.
Taro Ko, Michio Takeuchi(Tokyo Univ. of Agriculture and Technology)

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P-69
麹菌 Aspergillus oryzae の胞子形成制御系の解析
小川真弘, 徳岡昌文, 金鋒杰, 松島健一朗, 高橋理, 町田雅之ａ，小山泰二（野田産研，a 産総研）
【目的】麹菌 Aspergillus oryzae の胞子は、「種麹」とよばれ産業利用の上で非常に重要な地位を占めるものであるが、その形成を制御する機構に関する研究は少ないのが現状である。また近年、同じ Aspergillus 属であっても A. nidulans と A. fumigatus では胞子形成制御系に違いがあることが報告されており 1)、A. oryzae の制御系がどのようになっているか興味深い。そこで我々は、A oryzae の胞子形成制御系について遺伝子破壊株を用いた解析を行ったので、その結果について報告する。
【方法および結果】A. nidulans において胞子形成に関与すると言われている、シグナル伝達系（flbA など）
および転写制御因子(ｂrlA, abaA など) の A. oryzae でのオーソログ遺伝子の破壊株を作製し、その表現型を調べた。ターゲッティングベクターは Fusion PCR を用いて作製しマーカーには pyrG を用いた。宿主には A.
oryzae RIB40 の Δku70 ΔpyrG 株およびその誘導体を使用した。その結果、A. oryzae の flbA オーソログ破壊
株では A. nidulans の flbA 破壊株での報告 1)と同様に胞子形成が見られなくなった。いっぽう A. fumigatus の
flbA 破壊株では胞子形成に大きな変化が現れないことが報告されている 1)。以上のことから、
A. oryzae の flbAを介した胞子形成制御系は A. nidulans と類似していることが示唆された。
また我々は現在、転写制御因子を網羅的に破壊したライブラリーを作製しているが 2)、そのライブラリーの中から新規の胞子形成制御因子を見出したので、その解析結果についても報告する。
1) J.-H., Mah. and J.-H., Yu.: Eukaryot. Cell, 5, 1585-1595 (2006)
2) 小川真弘, 平成 19 年度糸状菌遺伝子研究会, 第 28 回例会, 講演要旨集
Analysis of conidiation control in the Koji-mold Aspergillus oryzae
Masahiro Ogawa, Masafumi Tokuoka, Feng Jie Jin, Ken-ichiro Matsushima, Tadashi Takahashi,
Masayuki Machidaa and Yasuji Koyama (Noda Institute for Scientific Research, aAIST)

P-70
麹菌の培養条件に応答したアミノ酸代謝制御の解析
小池英明1、寺林靖宣1、山根倫子1、佐野元昭2、大箸信一2、町田雅之1,2（1産総研セルエンジニア、2金沢工大）
麹菌は、伝統的な食品産業に利用される。それら醸造過程では、培地の栄養価などの環境に合わせて、麹菌は、分解酵素や様々な低分子性の物質を生産して分泌する。この高い物質生産能力は、
従来の食品産業でも経験的に利用されているが、その分子機構を解明し、さらに生産・分泌能力を高めて、今後有用物質の生産として応用すべきである。
培地中の栄養価の相違や、液体中と固体上という培養方法の相違による遺伝子発現の比較から、500個以上の遺伝子が転写レベルで制御されることを明らかにした。特にアミノ酸代謝に関わる遺伝子群に注目して、培養条件の違いによる遺伝子発現量の変化、代謝物の変化から、代謝系遺伝子群の制御機構を解析した。DNAマイクロアレイ、CE-MSを用いた解析を行った結果、アミノ酸の生合成系遺伝子は、貧栄養および固体培養の両方で共通して抑制された。その一方で、栄養価の違いでは栄養素に特異的に応答する制御を同定することができた。これらの結果を基に、その変化を司る
転写因子や変化を伝達するシグナルの推定を行っている。
Regulation of amino acid metabolism of Asperigllus oryzae
Hideaki Koike1, Yasunobu Terabayashi1, Noriko Yamane1, Motoaki Sano2, Shinichi Ohashi2, Masayuki
Machida1,2(1 RICE, AIST, 2 Kanazawa Institute of Technology)

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P-71
麹菌の薬剤に対する転写応答解析と創薬標的遺伝子機能解析システムの構築
丸井淳一朗 1, 吉見

啓 1, 玉野孝一 2, 小池英明 2, 織田

健 3, 佐野元昭 3, 町田雅之 2, 阿部敬悦 1 （1 東北大・

未来研, 2 産総研, 3 金沢工大・ゲノム研）【目的】糸状菌には動植物に対し病原性を示すものが数多く存在し、優れた選択毒性と効き目を示す新しい抗真菌剤の開発が常に求められている。我々は麹菌をはじめとする微生物ゲノム情報を活用し、抗真菌剤開発に有用な標的遺伝子のデータベースの作成を目的とした研究開発を行っている。本発表では抗真菌剤
に対する麹菌遺伝子の転写応答について解析した結果と、創薬標的候補遺伝子の機能解析に有効なアッセイ系の構築について報告する。
【方法および結果】作用点既知の抗真菌剤を添加した最少培地で培養した麹菌より RNA を抽出し、DNA マ
イクロアレイ解析を行った。作用点の異なる複数の薬剤を使用することにより、麹菌の薬剤応答に関する転写プロファイルの体系的理解を図った。その結果、薬剤に曝された麹菌においては、P450、輸送体などの一般的な解毒排出機構に加え、薬剤に特異的な遺伝子発現応答が見られた。現在、これらの知見を活用し、麹菌の生理機能の状態を観察するアッセイ系の構築を行っている。また、創薬標的遺伝子の機能解析への有効性についても検討する予定である。
A genomic approach to develop a reporter system exploring novel antifungal targets
Junichiro Marui1, Akira Yoshimi1, Koichi Tamano2, Hideaki Koike2, Ken Oda3, Motoaki Sano3, Masayuki Machida2,
Keietsu Abe1 (1 Tohoku Univ. NICHe, 2AIST, 3KIT)

P-72
麴菌の酸化ストレス条件下における遺伝子発現と転写制御因子 kapA についての解析
小竹学 1,2，坂本和俊 2 ，岩下和裕 1,2，山田

修 2 ，下飯仁 1,2，三上重明 2 （1 広島大・先端研，2 酒総研）

麴菌(Aspergillus oryzae)は発酵産業から医薬品産業まで広く利用されている微生物であり、培養形態の違い
により生産するタンパク質や代謝産物に違いがあることが知られている。産業的利用の中で麴菌は様々な条件下で生育しており、多種の環境ストレスを受けていると考えられている。このことから、培養形態の違い
による各種ストレスへの応答機構について研究することは重要であると考えられるが、現在のところその多くは明らかになっていない。そこで本研究では麴菌の酸化ストレスへの応答機構について解析を行った。
まず、麴菌(RIB40 株)について、液体培養と固体培養を模倣した条件であるメンブレン培養でのストレス応答について、全遺伝子を搭載した麴菌 DNAChip を使って網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、酸化ストレスによって遺伝子発現が減少する遺伝子群は、液体培養とメンブレン培養間で大きく異なることが分かった。一方で遺伝子発現が上昇する遺伝子群については、共通して発現上昇する遺伝子が多く見られた。
また、他の生物種において酸化ストレス応答遺伝子の発現制御をしていると報告されている転写制御因子
AP-1 について、麴菌のオルソログ遺伝子である kapA の破壊株を作成し、液体培養での酸化ストレス応答時の遺伝子発現解析を行った。その結果、RIB40 株において酸化ストレスに応答して発現が上昇していた遺伝子の多くが、kapA 破壊株においては発現上昇が起こらないことが明らかになった。また、興味深いことに麴
菌の kapA 遺伝子の破壊は H2O2 感受性を引きおこすが、その cDNA は、Saccharomyces cerevisiae の AP-1 オルソログである yap1 遺伝子破壊株の H2O2 感受性を全く相補しなかった。
Analysis of gene expression under oxidative stress condition and kapA, a transcription-factor gene in Aspergillus
oryzae.
Manabu Kotake1,2, Kazutoshi Sakamoto2, Kazuhiro Iwashita1,2, Osamu Yamada2, Hitoshi Shimoi1,2, Shigeaki Mikami2(1Hiroshima Univ., 2NRIB)

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P-73
Neurospora crassa の OS-2 MAP キナーゼは体内時計により制御される遺伝子の調節に関与する
渡邊節子、高橋正和、山下和宏、坂野真平、福森文康、藤村真（東洋大・生命）アカパンカビの OS-2（MAP キナーゼ）は、浸透圧などのストレスに応答して、グリセロール合成酵素や糖新生合成酵素の遺伝子群を制御している。昨年度、体内時計により制御されている ccg-1/grg-1 （clockcontrolled gene: CCG）が OS-2 により発現調節されていることを報告した。今回は、CCG 群および時計遺伝子に着目し、Universal Probe を用いたリアルタイム RT-PCR 解析を行った。その結果、CCG 群のうち、新たに ccg-13, bli-3（blue light inducible）, con-10 （conidiation）が、浸透圧およびフルジオキソニル処理により、OS-2 依存的に誘導されることが明らかになった。一方、ccg-2 や bli-4 は誘導されなかったことから、CCG
群の一部が OS-2 制御を受けると考えられた。また、体内時計を構成する frq, wc-1, wc-2 の発現に浸透圧処理の影響は認められなかった。さらに、アカパンカビの概日リズムは、ras-1 の点変異である bd 変異により bandとして可視化できるが、os-1:bd および os-5:bd の二重変異は、バンド形成に影響は認められなかった。このことから、OS-2 と概日時計は、下流で制御される遺伝子に共通性がみられるが、基本的には独立していると考えられた。
OS-2 mitogen activated protein kinase regulates some clock-controlled genes in Neurospora crassa
Setsuko Watanabe, Masakazu Takahashi, Kazuhiro Yamashita, Shinpei Banno, Fumiyasu Fukumori, and Makoto
Fujimura (Fac.of Life Sci.,Toyo Univ.)

P-74
糸状菌 Aspergillus nidulans の His-Asp リン酸リレー系における農薬応答機構の 解析
萩原大祐 1、水野猛 2、阿部敬悦 1 （1 東北大・未来研、2 名大院・生命農学）
His-Asp リン酸リレー情報伝達系はバクテリアから高等植物にまで保存された普遍的な環境応答機構である。この機構は糸状菌にも広く保存されており、我々は Aspergillus nidulans を対象に体系的な機能解析を進めている。これまでの解析から、A. nidulans におけるジカルボキシイミド系およびフェニルピロール系の抗菌剤に対する分子応答および生育感受性は、His-Asp リン酸リレー系の構成因子である NikA(HK)、SrrA(RR)、
SskA(RR)に依存していることが示された。A. nidulans に限らず、他の糸状菌においてもこれらの因子を中心とした抗菌剤応答モデルが予想されており、新規薬剤開発に向けた基盤知識という点からも詳細な分子機構の解明が期待されている。そこで、この抗菌剤に対する糸状菌の細胞応答の理解を目的として DNA マイク
ロアレイ実験を行ない、抗菌剤に応答した遺伝子発現挙動を網羅的に解析した。これらのデータをもとにして抗菌剤の作用機序の解明を目指すとともに、糸状菌における His-Asp リン酸リレー情報伝達系の生理機能についても考察したい。
Analysis of His-Asp phosphorelay signaling pathway in response to fungicide in Aspergillus nidulans
Daisuke Hagiwara,1 , Takeshi Mizuno2, Keietsu Abe1
(NICHe, Tohoku Univ.1 , Grad. Sch. Bioagricultural Sci. Nagoya Univ.2)

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P-75
Aspergillus nidulans ヒスチジンキナーゼ NikA の機能解析
鈴木麻子, 金丸京子, 松林良博, 高見絵里香, 萩原大祐, 水野猛, 加藤雅士, 小林哲夫 （名大院生命農・生物機構）
糸状菌 Aspergillus nidulans は、ジカルボキシイミド系およびフェニルピロール系の糸状菌特異的農薬により、著しく生育が阻害される。当研究室におけるこれまでの研究により、他の多くの糸状菌同様、Nik-1 型
histidine kinase である NikA を破壊することで、これらの農薬に対して耐性となることが明らかにされている。また A. nidulans が持つ２つの response regulator, SskA と SrrA の二重破壊株は農薬耐性となることから、
NikA により認識された農薬シグナルは SskA–HogA 依存的経路と SrrA 依存的経路の両方に伝達されることが、共同研究者の萩原らにより報告されている。
本研究では、A. nidulans NikA の機能をより詳細に解析するため、NikA 過剰発現株を作製して様々なス
トレスに対する応答を検討した。その結果、農薬に対しては NikA 過剰発現株と野生株の生育に顕著な差は見られなかった。一方浸透圧(1M NaCl)に対しては、NikA 過剰発現株は野生株よりも強い感受性を示し、NikA が浸透圧ストレス応答に何らかの関与をしていることが示唆された。また、NikA はシグナル感知に関与する HAMP domain を 6 つ持っているが、現在その農薬・浸透圧応答における機能についても検討している。
Physiological roles of the NikA histidine kinase in Aspergillus nidulans.
Asako Suzuki, Kyoko Kanamaru, Yoshihiro Matsubayashi, Erika Takami, Daisuke Hagiwara, Takeshi Mizuno,
Masashi Kato, Tetsuo Kobayashi (Dept. of Biological Mechanisms and Functions, Grad. Sch. Bioagricultural Sci. Nagoya
Univ.)

P-76
浸透圧アダプテーションにおける麴菌の遺伝子発現解析
西浦未華 1,2、坂本和俊 2、山田修 2、岩下和裕 1,2、三上重明 2(1 広島大、2 酒総研)

醸造において麴菌は、「麴」という「固体培養」により使用され、液体培養に比べて固体培養では多種多量の酵素を生産するなど、周囲の環境条件に合わせて遺伝子の発現パターンが異なることが明らかになってきている。これまでの醸造工学上の知見、glaB 遺伝子の発現解析から、浸透圧の変化が麴菌の遺伝子発現に影響を与えることが知られている。また酒総研では、2005 年に発表された麴菌「RIB40 株」のゲノム情報に基づき、麴菌 DNAchip(Affymetrix 社製)を作成している。
そこで本研究においては、この麴菌 DNAchip を用いて、浸透圧に対する麴菌遺伝子の発現応答、特に高浸透圧条件にアダプテーションが起こったと考えられる時点での遺伝子発現について検討を行った。炭素源
を Glucose または Dextrin とした最少培地で、液体培養及びメンブレンを用いたプレート培養にて前培養を行い、0.8M NaCl 条件に移行後 6hr 経過した時の遺伝子発現について検討を行った。その結果、液体培養と固体培養間では、浸透圧アダプテーションにより発現が上昇する遺伝子群、または発現が減少する遺伝子群
が大きく異なることが明らかとなった。このことは、液体培養と固体培養では浸透圧アダプテーションの機構が異なることを示唆している。また、培地の炭素源によって浸透圧アダプテーション時の遺伝子発現が大きく異なることが明らかとなった。
Analysis of Aspergillus oryzae gene expression in adaptation to osmotic pressure
Mika Nishiura1,2, Kazutoshi Sakamoto2, Osamu Yamada2, Kazuhiro Iwashita1,2, Shigeaki Mikami2(1 Hiroshima Univ., 2 NRIB)

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P-77
アカパンカビの転写調節因 子 ATF-1 は CRE 配列を認識してカタラーゼ cat-1 を制御する
山下和宏、渡邊節子、塩澤あずさ、福森文康、藤村真(東洋大・生命)アカパンカビの OS-2 MAP キナーゼは、浸透圧ストレスおよびフルジオキソニル処理により活性化され、カタラーゼ遺伝子（cat-1）、clock-controlled 遺伝子（ccg-1）などの遺伝子発現を誘導する。
CREB（cAMP response
element-binding protein）型の転写調節因子 atf-1 遺伝子の破壊株では、これらの遺伝子の発現誘導が、os-2 破壊株と同様に顕著に低下する。そこで、ゲルシフト法を用いて ATF-1 タンパク質の結合配列の決定を行った。
大腸菌でタグ融合タンパク質として発現した ATF-1 を精製し、各遺伝子の上流 500bp について相互作用検出をおこなったところ、cat-1 および ccg-1 遺伝子で DNA-タンパク質複合体形成によるシフトバンドが検出された。cat-1 のプロモーター領域について更なる解析を行った結果、ATF-1 は CRE 配列（TGACGTCA）を認識して結合することが示唆された。CAT-1 は、分生子特異的に存在するカタラーゼであるが、フルジオキソ
ニル処理した菌糸で、その酵素活性が検出される。atf-1 破壊株では、フルジオキソニル処理による菌糸でのCAT-1 の誘導が消失すると同時に、分生子の CAT-1 活性を完全に消失していた。このことから、CAT-1 の発現は、完全に ATF-1 に依存していると考えられる。一方、os-2 変異株では、フルジオキソニルによる菌糸の CAT-1 誘導は消失したが、分生子には、野生株よりは低いものの十分な CAT-1 活性が検出された。従って、ATF-1 が OS 経路以外の制御を受けることが示唆された。
ATF-1 transcription factor regulates catalase cat-1 expression through CRE-element in Neurospora crassa.
Kazuhiro Yamashita, Setuko Watanabe, Azusa Shiozawa, Fumiyasu Fukumori, Makoto Fujimura (Life Sci., Toyo
Univ.)P-78
麹菌 A. oryzae における AoflbA 遺伝子破壊株の表現型解析
山口悠，丸山潤一、北本勝ひこ(東大院・農生科・応生工)【目的】A. oryzae はこれまで有性世代が見つかっていないことから、不完全菌として分類されている。しかしゲノム配列が解読され、接合型遺伝子 MAT1-1 を初めとする有性生殖関連遺伝子が A. oryzae にも存在する
ことが分かった。S. cerevisiae の Sst2 は RGS (Regulator of G-protein Signaling)タンパク質をコードしており、３量体 G タンパク質のαサブユニット Gpa1 を不活性化する GTPase 活性促進因子 GAP である。この欠損株
は接合フェロモンに対し高い感受性を示す。本研究では、SST2 相同遺伝子破壊により、A. oryzae の有性生殖に関する機能解析を行った。
【方法と結果】A. oryzae ゲノムデータベー スよ り SST2 に相同性を有する遺伝子を 検索した結果 、AO090026000532 を見出した。この遺伝子は 719 アミノ酸からなるタンパク質をコードすると推定され、Aspergillus nidulans FlbA と 77.6％の相同性を有するため AoflbA と命名した。A. oryzae NSRKu70-1-1 株(MAT1-1 niaD- sC- adeA- Dku70)を宿主に、adeA をマーカーを用いて AoflbA 遺伝子破壊株を作製した。破壊株を様々な寒天培地で培養したところ、生育が若干悪くなり、分生子形成能が著しく低下した。PD 培地ではコントロール株と比較して気中菌糸が短いため、コロニーが平らになった。また DPY 培地でコントロール
株は菌核を形成するが、破壊株では観察されなくなった。次に破壊株を Mating Type が異なる株である AO6
株 (MAT1-2 型)と対峙培養を行い、菌核の形成を調べたところ、破壊株と AO6 との境界に黒い菌核が形成された。さらに、菌核を割って断片を観察したところ、球状の構造体が観察された。
Phenotypic analysis of the AoflbA disruptant in Aspergillus oryzae
Haruka Yamaguchi, Jun-ichi Maruyama, Katsuhiko Kitamoto(Dept. Biotechnol., Univ. Tokyo)

85

P-79
NsdD type GATA factor in Aspergillus fumigatus
Yoon-Hee Cheon, 1Hye-Ryun Kim, Jong Hwa Kim, 1Dong-Min Han and Kap-Hoon Han (Dept of Pharm. Engineering,Woosuk Univ. 565-701, S. Korea, 1Faculty of Life Sciences, Wonkwang Univ. 570-749, S. Korea)
Aspergillus fumigatus is known as a primary causative agent of aspergillosis, which is an opportunistic infectious
fungal disease mainly localized in the respiratory system of human and animals. Currently, A. fumigatus has no known
sexual development process, while a homothallic fungus Aspergillus nidulans, which is a close relative of A. fumigatus,
undergoes complete sexual development process. To dissect hidden sexual development-related process in A.
fumigatus, we first identified a putative ortholog of the nsdD gene, which encodes a GATA type transcription factor
required for sexual development in A. nidulans. Gene expression study showed that the A. nidulans nsdD gene ishighly expressed in the hypoxic condition. Similarly, the A. fumigatus ortholog of nsdD, named AfnsdD, behaves very
similar to A. nidulans nsdD. AfnsdD gene encodes a putative GATA type factor consist of 493 aa and has 62% identitywith A. nidulans NsdD. Knock-out mutant of AfnsdD showed highly melanized phenotype which is very similar to A.
nidulans nsdD mutant. These results indicate that the NsdD-mediated molecular mechanism is conserved in Aspergilli
although many of them have no sexual development. This work was supported by grant from KOSEF(R1-2006-000-11204-0).

P-80
糸状菌 CCAAT-box 結合因子によるリボソームタンパク質遺伝子の発現抑制機 構
高橋明珠，佐野元昭＊，小林哲夫，加藤雅士（名大院生命農・生物機構、＊金沢工業大・ゲノム研）
糸状菌 CCAAT-box 結合因子(Hap 複合体)は産業上重要な酵素遺伝子を始めとする様々な遺伝子の転写を制御することが明らかとなっている。これまでに我々は、麴菌 DNA マイクロアレイ解析により、Hap 複合体がリボソーマルタンパク質（RP）遺伝子の転写を一様に抑制することを明らかにした。
今回、麹菌に加え、遺伝学的解析に優れた Aspergillus nidulans の代表的な RP 遺伝子の発現についてもノーザン解析を行ったところ、A. nidulans においても Hap 複合体依存の転写抑制が起こることが分かった。従って、Hap 複合体による RP 遺伝子の転写抑制は麹菌特有の現象ではなく、より普遍的な現象であることが明らかとなった。これら RP 遺伝子のプロモータ配列には CCAAT 配列を有するものと有さないもの両方があり、Hap 複合体による抑制はプロモータ領域への直接の結合によるものでなく、間接的なものであることが示唆された。この可能性を検証するために、代表的ないくつかの RP 遺伝子プロモータに lacZ 遺伝子を融合して A. nidulans に導入し、in vivo における CCAAT 配列の機能を解析した。その結果、予想通りプロモータ中の CCAAT 配列は RP 遺伝子の転写抑制に直接関与していないことが示された。プロモータ中の保存配列を詳細に調べると、全ての RP 遺伝子プロモータに共通する９塩基の配列（ＣＴＡＡＧＣＧＡＧ）が存在していることが明らかとなった。現在、この配列が RP 遺伝子の発現に与える影響に関して詳細な解析を進めている。
Mechanisms for transcriptional repression of ribosomal protein genes by the CCAAT-box binding factor infilamentous fungi.
Akemi Takahashi, Motoaki Sano＊, Tetsuo Kobayashi, Masashi Kato
(Grad. Sch. of Bioagricultural Sci., Nagoya Univ., ＊KIT)

86

P-81
糸状菌 CCAAT 結合因子 サブユニットの発 現・局在性プロファイル
伊奈慎太郎，小林哲夫,

加藤雅士（名大院・生命農）【目的】糸状菌 CCAAT 結合因子である Hap 複合体は、様々な遺伝子の転写制御に関与する広域転写制御因子であり、HapB/C/E の 3 つのサブユニットからなる。我々はこれまでに Hap 複合体のアセンブリ機構
や核移行の仕組みなどを明らかにしてきた。本研究では、各サブユニット遺伝子の発現時期や発現部位、発現量についての知見を得ることを目的として、糸状菌 Aspergillus nidulans の 各 Hap 複合体サブユニット
を GFP で蛍光標識し、その発現の様子を観察した。
【方法と結果】A. nidulans の各サブユニットの構造遺伝子を PCR により単離し、その C 末端部分に GFP
遺伝子を翻訳の読み枠が合うように連結したプラスミドをそれぞれ作成し、A. nidulans 染色体上の各サブユ
ニットの遺伝子座において、相同組換えによりサブユニット遺伝子の下流に GFP 遺伝子を導入した。得られた株を様々な条件で培養し、各サブユニットと GFP との融合タンパク質の発現強度、局在性を蛍光顕微鏡により観察した。その結果、各 GFP 融合サブユニットは菌体のほとんどの部分に存在しており、それらは核に局在化していたが、存在量が低下している部分も見られた。また、経時的な観察から、細胞の分裂にともなう一時的な局在性の低下も観察された。
Expression and localization profiles of the subunits of the CCAAT-binding complex in filamentous fungi.
Shintaro Ina, Tetsuo Kobayashi, Masashi Kato
(Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya Univ.)

P-82
麹菌 A. oryzae の MAL クラスターの初期ア ミラーゼ系酵素生産への関与
長谷川祥子，五味勝也（東北大院農・生物産業創成）【目的】A. oryzae のアミラーゼ系酵素生産は古くから醸造産業に利用されてきた重要な特徴である。アミラーゼ系酵素遺伝子は、培地中のデンプン、マルトースなどのマルトオリゴ糖の存在下で転写因子 AmyR により正の制御を受けている。この AmyR 研究の過程で、A. oryzae のマルトース資化遺伝子群である MAL クラスターが見出された。私達は、MAL クラスターを構成するマルトースパーミアーゼ遺伝子 malP、菌体内マ
ルターゼ遺伝子 malT が、AmyR ではなくクラスター内に存在する転写因子 MalR により発現誘導されていることをすでに明らかにしている。本研究では、この MAL クラスター遺伝子をはじめとするマルトオリゴ糖の分解資化関連遺伝子の総合的な発現制御機構の解明を中心に、A. oryzae の最大の特徴であるアミラーゼ系
酵素生産機構を、炭素源の取り込みから酵素生産まで総合的に明らかにすることを目的としている。 【結果】malP 破壊株および malR 破壊株は、マルトース培地だけでなくデンプン培地での生育不良を示した。そこで、両株のα−アミラーゼ活性を調べたところ、マルトースによる誘導後 12 時間までは野生株に比べて著しく活性が低く、その後徐々に活性の上昇が認められ、遺伝子発現量や培地中のアミラーゼタンパク量も同様の傾向が見られた。malP は MalR により発現が制御されていることから、この結果は MAL クラスターの MalP により取り込まれたマルトースが AmyR に制御されているアミラーゼ系酵素の誘導初期における生産に直接的または間接的に関与していることを示唆している。A. nidulans では A. oryzae の MAL クラスターのオーソログは AmyR により制御されていると報告されており、マルトオリゴ糖、デンプンの分解資化には
A. oryzae 独自の機構が存在するものと考えられる。現在、malP、malR 各破壊株のフルゲノムアレイを用いた解析により、他の遺伝子発現への影響についても検討している。
The MAL cluster in A. oryzae is involved in production of amylolytic enzymes at early stage.
Sachiko Hasegawa, Katsuya Gomi
(Div. Biosci. Biotechnol. Future Bioind., Grad. Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.)

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P-83
麹菌(Aspergillus oryzae)DNA トランスポゾ ン Crawler の転移活性とｍRNA 分子種変動に及ぼすストレス処理の影響
小笠原博信１、小畑 浩２、秦洋二２、高橋 砂織１、五味 勝也３（１秋田県農技セ・総食研、２月桂冠・総研、３東北大院農・生物産業創成）【目的】A. oryzae OSI1013 株より見いだされた活性型 DNA トランスポゾン Crawler は、転移が認められない通常培養条件下では transposase ORF 内部での splicing や poly(A)付加が起きており、Crawler 遺伝子からは複数の mRNA 分子種が生成していることが明らかとなった１）。そこで、麹菌における transposon 転移活性に対する制御機構の解明を目的に種々のストレス条件下における転移活性と Crawler-ｍRNA 分子種比率の変化について解析を行った。
【方法と結果】転移促進を引き起こす Cu や高温ストレス処理後の分生子より total RNA を抽出し、定量
RT-PCR により Crawler-ｍRNA 分子種の組成を測定した。その結果、転移活性が認められる Cu 処理区や高温処理区の分生子では、ストレス強度の上昇に伴い splicing や poly(A)付加による不完全なｍRNA 分子種は減少し、インタクトな全長ｍRNA の分子種比率が高くなっていることが認められた。また、致死的に近い条件にもかかわらず転移活性化が僅かしか認められない酸、高浸透圧、H2O2、および UV によるストレスではインタクトな全長ｍRNA の分子種比率の増加は認められなかった。さらに、OSI1013 株と同じく活性型
Crawler を多コピーで有する RIB128 株および AOK139 株においても Cu および高温ストレス条件下では同様の現象が認められ、ストレス処理による mRNA 分子種の変動が Crawler の転移促進につながるものと推定された。
1) 小笠原・他，農化大会要旨，p190(2007)
Effects of stress conditions on transposability and proportional changes in mRNA of DNA transposon Crawler
in Aspergillus oryzae.
Hironobu Ogasawara1, Hiroshi Obata2, Yoji Hata2, Saori Takahashi1, Katsuya Gomi3(1Akita Res. Inst. Food and Brewing, ３Res.Inst.,Gekkeikan Sake Co., 3Div. Biosci. Biotech. Future Bioind., Grad.
Sch. Agric. Sci., Tohoku Univ.，)

P-84
麹菌 Aspergillus oryzae の転写制御関連遺伝 子の破壊と機能解析
戸田智美１，砂川美佐緒１，大澤靖子１，小川真弘２，徳岡昌文２，高橋 理２，小山泰二２，町田雅之１（１産総研,２野田産研）
麹菌ゲノムの解読により麹菌の遺伝子レベルでの解析が飛躍的に進む一方、麹菌には機能未知遺伝子が未だ多数存在しており、今後遺伝子の機能や発現制御に関する統括的な知見が益々重要になると予想される。
本研究では、遺伝子破壊による遺伝子の機能解析を目的とし、その強力なツールとして形質転換効率を向上させた麹菌 Ku 遺伝子破壊株 1)を宿主とした遺伝子破壊ライブラリーの作製を試みた。
まず、麹菌のゲノム情報をもとに、麹菌が有する約 12,000 の全遺伝子から転写制御に関連すると推測される遺伝子を抽出し、100 以上の遺伝子破壊候補を決定した。次に標的遺伝子の上流および下流領域を PCR 法
により増幅し、マーカー遺伝子である pyrG に連結させた遺伝子破壊用 DNA 断片を構築した。この DNA 断
片を
相同組み換え頻度を上昇させた麹菌⊿Ku70 ⊿pyrG 株に導入することにより 95％以上の高頻度で形質転換体を取得した。得られた形質転換体を PCR あるいは Southern hybridization で確認したところ 75％以上の確率で目的の遺伝子を破壊していた。現在、取得した破壊株を用いて様々な培養条件下での生育特性を調べるとともに、DNA マイクロアレイ解析により遺伝子発現プロファイルの解析に取り組んでいる。
1) T. Takahashi et al. Mol Gen Genomics (2006) 275:460-470
Gene disruption and functional analysis of transcriptional regulatory factor in Aspergillus oryzae
Tomomi Toda１, Misao Sunagawa1, Yasuko Oosawa1, Masahiro Ogawa２，Masafumi Tokuoka２， Tadashi Takahashi２,
Yasuji Koyama２ and Masayuki Machida１ (１AIST, ２NISR)

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P-85
麹菌の低分子金属プロテアーゼ群の解析
山形洋平 1)，前田浩 1)，阿部敬悦 1)，内田隆史 1)，竹内道雄 2)，楠本憲一 3)，小出芳直 4)，片瀬徹 1,4)，石田博
樹 5)（1 東北大学・院・応生科，2 農工大・院・生物工学，3 食総研、4 天野エンザイム，5 月桂冠）
麹菌のゲノム解析の結果、麹菌 Aspergillus oryzae ゲノムには、A. nidulans や A. fumigatus に比べ約 1.4
倍ものタンパク質分解酵素がコードされていることが示された。一般に糸状菌は同種の加水分解酵素を複数持つことがよく知られている。Aspergillus 属も同種のタンパク質分解酵素遺伝子を複数有している。しかし、麹菌は同種のタンパク質分解酵素遺伝子中に、他の Aspergillus 属と共通の酵素以外にさらにもうひとつ（以上）の酵素を持っていることが示された。これは、外来遺伝子の水平伝達によっていると推定されているが、その詳細は明らかでない。我々は、麹菌がなぜ同種の酵素を複数持つ必要があるのかをタンパク質側から検証しようとしている。麹菌低分子型金属プロテアーゼ群には、３つの酵素が属しているとゲノム解析で報告されている。これら deuA、deuB、deuC のコードする酵素の性質を比較することとした。dueA、deuB の 2 つの遺伝子は、イントロン-エキソンの構成等もよく似ており、コードされている酵素も、お互いによく似た
酵素化学的な性質を持つが、基質特異性が異なっていた。deuC の推定 ORF の構成やそれに由来するアミノ酸配列は、deuA、deuB とは異なっている。現在、この構成の再検討を行っており、DeuC の正しいアミノ酸
配列や酵素化学的性質について DeuA，DeuB との比較検討を行っている。
なお本研究は、生研センター基礎研究推進事業の一環として行われたものである。
Studies on low molecular mass metallopeptidases from Aspergillus oryzae
Youhei Yamagata, Hiroshi Maeda, Keietsu Abe, Takafumi Uchida, Michio Takeuchi, Ken-Ichi Kusumoto, Yoshinao
Koide, Toru Katase, Hiroki Ishida (Grad. Sch. Agric. Sci.,Tohoku Univ., Dept. Biochem. Biotech. Tokyo Univ. ofAgric. Tech., Natl. Food Res. Inst., Amano Enzyme Inc., Research Inst. Gekkeikan Sake Co. Ltd.)P-86
麹菌機能未知 APase の解析
岡本綾子 1、森田寛人 1、山形洋平 2、楠本憲一 3、小出芳直 4、石田博樹 5、竹内道雄 1（1 東京農工大学院・応生科、2 東北大院農・応生科、3 食総研、4 天野エンザイム・研究部、5 月桂冠・総研）
麹菌ゲノム解析の結果、麹菌ゲノムには APase と推定される遺伝が 11 種類、存在することが分かった。
本研究室ではさらにアノテーションの見直しを行った。見直しによって、APase11 種類中 3 種類で活性中心
モチーフ、開始メチオニン、終止コドンが従来のアノテーションとは異なることが推定された。
次にスターチで誘導できる強制発現用プロモーターである AmyA プロモーターの下流に麹菌 APase 遺伝子を組み込み、オーレオバシジンを選択マーカーとした強制発現用ベクターを作製した。作製したベクターを用いて A. nidulans の形質転換を行い、A. nidulans における APase の強制発現を試みた。
A. nidulans をホストとした形質転換の結果、機能未知である 070319-053 遺伝子の形質転換体を取得した。
得られた形質転換体をカゼインプレートに植菌、30℃ 3 日間培養した。その結果、野生株に比べて形質転換体では、菌体から分泌されたプロテアーゼがカゼインを分解することによって出現するクリアゾーンの増大が確認された。
この結果、アミノ酸配列を用いた系統樹解析から分泌型 APase と推測された機能未知である 070319-053
遺伝子がカゼイン分解能を持つアスパルティックプロテアーゼをコードしている可能性が示唆された。
なお、本研究は生研センター基盤研究推進事業の一環として行われたものである。
Analysis of hypothetical APase genes in Aspergillus oryzae
Ayako Okamoto1, Hiroto Morita1, Yohei Yamagata2, Ken-Ichi Kusumoto3, Yoshinao Koide4, Hiroki Ishida5, Michio
Takeuchi1(1 Tokyo Univ. of Agriculture and Technology, 2Univ. of Tohoku, 3NFRI, 4Amano Enzyme, 5Gekkeikan)

89

P-87
麹菌の新規アミノペプチダーゼ様遺伝子がコードする蛋白質の精製と性質
楠本憲一 1、松下真由美 1、古川育代 1、鈴木
1

1

2

3

聡 1 、小出芳直 2 、石田博樹 3、山形洋平 4、竹内道雄 5、柏木
4

豊 （ 食総研、 天野エンザイム、 月桂冠、 東北大・院・応生科、5 東京農工大・院・応生科）【目的】麹菌を用いた発酵食品に含まれる多種類のペプチドの生成には、麹菌由来ペプチダーゼが深く関与すると考えられる。本研究では、麹菌ゲノム情報（http://www.bio.nite.go.jp/dogan/Top）から、出芽酵母の Aspartyl
aminopeptidase と 推 定 ア ミ ノ 酸 配 列 で 52% の 同 一 性 を 示 す 蛋 白 質 を コ ー ド す る 遺 伝 子 Aodap1（AO090005001447）を見出した。そこで本蛋白質を組換え麹菌によって生産し、精製と性質の解明を行った。
【方法及び結果】Aodap1 の推定コーディング領域約 1.8kb を Aspergillus oryzae RIB40 株のゲノム DNA から PCR により取得した。蛋白質のＣ端にリンカー-His-tag を付加した合成遺伝子を作製し、これを AmyB プ
ロモーターの下流に組み込んだベクターを作製の後、麹菌に導入して高発現株を作出した。高発現株の細胞抽出液から、Ni-IMAC ビーズカラムを用いて Asp-p-nitroanilide（Asp-pNA）分解活性を指標として蛋白質を精製した。精製蛋白質は、SDS-PAGE で約 54kD の単一なバンドを示し、Asp-pNA 及び Glu-pNA の分解活性を有したが、Gly、Met、Leu、Lys、Arg、Ala、Val、Pro の pNA 誘導体に対しては、分解活性を示さなかった。Angiotensin II を基質とした場合は、N 末端から Asp が除去された Angiotensin III のみが反応生成物として得られた。以上のことから、Aodap1 は酸性アミノ酸特異的なアミノペプチダーゼをコードすることが明らかになった。本研究は、生研センター基礎研究推進事業の一環として行われたものである。
Enzymatic characterization of the product of an aminopeptidase-like gene from Aspergillus oryzae
Ken-Ichi Kusumoto1, Mayumi Matsushita1, Ikuyo Furukawa1, Satoshi Suzuki1, Yoshinao Koide2, Hiroki Ishida3,
Youhei Yamagata4, Michio Takeuchi5, Yutaka Kashiwagi1 （1Natl. Food Res. Inst., 2Amano Enzyme, 3Gekkeikan, 4Grad. Sch. Agric. Sci.,Tohoku Univ., 5 Tokyo Univ. of Agric. Tech.）P-88
麹菌セリンタイプカルボキシペプチダーゼの解析
森田寛人 1, 岡本綾子 1, 山形洋平 2, 楠本憲一 3, 小出芳直 4, 石田博樹 5, 竹内道雄 1（1 東京農工大院・応生科,
2

東北大院農・応生科, 3 食総研, 4 天野エンザイム・研究部, 5 月桂冠・総研）

麹菌 A. oryzae のゲノム解析が終了した結果、A. oryzae のゲノムには 12 種類の CPase と推定される遺伝子が存在した。しかし、本研究室においてアノテーションの見直しを行ったところ、12 種類のうち 4 種類は活性中心、開始コドン、終始コドンが従来のアノテーションとは異なると推定された。これら CPase 遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列をもとに系統樹解析を行ったところ、４つのグループに分類することができた。
また、これら 12 種類の CPase のうち、5 種類は A. oryzae の EST 解析において見い出されていない CPaseであった。そこで、amyA プロモーター下流にこれらの CPase 遺伝子を組み込んだプラスミドベクターを用いて A. nidulans の形質転換を行った。得られた形質転換体を amyA プロモーター誘導条件下で培養し、Z-グ
ルタミルチロシンを基質として培養上清の CPase 活性を測定した。その結果、これらの CPase には活性を有しているものが含まれていることが分かった。このことから、これらの EST 解析で見い出されなかった CPaseと推定された遺伝子が、A. oryzae において活性を有する CPase をコードし、その生産物は何らかの機能を有している可能性が示唆された。
なお、本研究は生研センター基盤研究推進事業の一環として行われたものである。
Analysis of serine-type carboxypeptidase in A. oryzae.
Hiroto Morita1, Ayako Okamoto1, Yohei Yamagata2, Ken-Ichi Kusumoto3, Yoshinao Koide4, Hiroki Ishida5, Michio
Takeuchi1(1 Tokyo Univ. of Agriculture and Technology, 2Univ. of Tohoku, 3NFRI, 4Amano Enzyme, 5Gekkeikan)

90

P-89
シクロピアゾン酸生合成に関わる PKS/NRPS ハイブリッド型酵素の機能解析
勢〆康代 1、北本勝ひこ 2、海老塚豊 3 、藤井勲 1（1 岩手医大・薬、2 東大院・農生科・応生工、3 東大院・薬）【目的】シクロピアゾン酸（CPA）は、Aspergillus 属や Penicillium 属の糸状菌が生産するテトラミン酸化合物の一種である。標識前駆体の投与実験から、酢酸、メバロン酸、トリプトファン由来の構造を併せ持つこと、酵素学的な研究から、oxidocyclase、dimethylallyl-cycloacetoacetyl-L-tryptophan synthase（DCAT-S）が関与することが示されているが、その全容は未だ明らかとなっていない。我々は、A. flavus のゲノムデータベースから、oxidocyclase、DCAT-S、PKS/NRPS ハイブリッド型酵素、転写因子をコードすると予想される 18
kb の遺伝子クラスターを見出した。この遺伝子クラスターが CPA 生合成に関わること、また、PKS/NRPS
ハイブリッド型酵素遺伝子の機能を確認するため、異種発現による生成物の同定を試みたので報告する。
【方法および結果】これまでに提唱されている生合成経路から、PKS/NRPS ハイブリッド型酵素は、トリプ
トファンと diketide から CPA の前駆体である cycloacetoacetyl- L-tryptophan を生成すると考えられる。A. flavus
NRRL 3357 から本酵素遺伝子をクローニングし、その配列を決定したところ、PKS に特徴的な KS、AT、ACP と NRPS に特徴的な Condensation、Adenylation、Thiolation、Reductive domains からなる全長 3906 aa の
PKS/NRPS をコードすると予想された。本酵素の機能を確認するため、A. oryzae M-2-3 株を宿主とした異種発現系を構築した。マルトース存在下で誘導培養後、生成物の分析を行ったところ、培養液および菌体中に、形質転換体に特異的な化合物の生産が認められた。現在、本化合物の単離・精製、各種スペクトルによる構造決定を行っている。
Functional analysis of PKS/NRPS hybrid involved in cyclopiazonic acid biosynthesis
Yasuyo Seshime1, Katsuhiko Kitamoto2, Yutaka Ebizuka3, Isao Fujii1(1School of Pharmacy, Iwate Med. Univ., 2Dept. of Biotechnology, Univ. of Tokyo, 3Grad. School of Pharm. Sciences,
Univ. of Tokyo)

P-90
糸 状 菌 由 来 メ ロテ ル ペノ イド化 合物 生 合 成に関 与 する ポリケ タ イ ド合成 酵素 及 び
プレニル基転移酵素の機能解析
伊藤崇敬 1，勢〆康代 2,

藤井勲 2,

久城哲夫 1, 海老塚豊 1（1 東大院・薬,2

岩手医大・薬）糸状菌 Aspergillus terreus の生産する terretonin はポリケタイドと farnesyl 基由来のテルペノイドの構造を併せ持つ特異なハイブリッド型化合物である。類縁の化合物には AchE 阻害活性を有する territrem が含まれ、これらメロテルペノイドの生合成遺伝子の解明は、今後の創薬を目指した物質生産において重要である。そこで、A. terreus のゲノム data base 上で、ポリケタイド合成酵素 (PKS) 遺伝子と prenyl transferase（PT）遺伝子を併せもつ遺伝子クラスターを検索したところ、13 遺伝子からなる約 36 kb のクラスターが見出され、
terretonin 生合成遺伝子クラスターと推定した。本クラスター内の PKS 遺伝子の機能を確認するため、糸状菌発現ベクターpTAex3R に A. terreus ATCC46038 株由来 PKS 遺伝子全長 (ATEG_10080) を導入した発現プ
ラスミド pTA-PksTI で A. oryzae を形質転換した。誘導培養後、PKS 特異的な生産物が確認され構造解析を行ったところ、terretonin 生合成中間体である 2,4-dihydroxy-3,5,6-trimethylbenzoic acid (DTBA) である事が判明した。続いて、同様に PT 遺伝子全長 (ATEG_10078) を導入したプラスミド pTA-trtPT で A. oryzae を形質転換し、形質転換体を DTBA を含む培地中で誘導培養した。その結果、DTBA に farnesyl 基の付加した化合物の生産が確認され、本クラスターが terretonin 生合成に関わることが強く示唆された。現在、terretonin
生産株における PKS の破壊体を作製中である。
Identification of gene clusters involved in the biosynthesis of meroterpenoids from fungi
Takayuki Itoh1, Yasuyo Seshime2, Isao Fujii2, Tetsuo Kushiro1, Yutaka Ebizuka1(1Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Univ. of Tokyo, 2 School of Pharmacy, Iwate Medical Univ.)

91

P-91
繰返し型タイプⅠポリケタイド合成酵素の発現と機能解析
森口智美、海老塚豊（東大院・薬）、藤井勲（岩手医大・薬）

6-メチルサリチル酸合成酵素（MSAS）は、触媒酵素ドメインとして、縮合酵素 KS、アシル基転移酵素
AT、脱水酵素 DH、ケト還元酵素 KR、アシルキャリヤープロテイン ACP を持つ、糸状菌の繰返し型タイプ
I ポリケタイド合成酵素（PKS）として最小のタンパク質である。我々は、Aspergillus terreus 由来の MSAS
である ATX について、繰返し型タイプⅠPKS の構造と反応機構の解明を目的に、酵母発現系を用いた検討を行ってきた。これまでに、単独では不活性な末端欠失体や、触媒ドメインの変異体を作製、酵母内で共発現させることで、４量体で機能する ATX が高次構造をとって活性中心を構成するために必要な領域（ID）
や、５つ全ての触媒ドメインが他のサブユニット上の同一ドメインにより相補されることを明らかにしてきた。これらの結果から、ATX の高次構造として、２つのポリペプチド鎖が head-to-head/tail-and-tail で近接し、全体として４量体を形成するモデルを新たに提案した。
触媒ドメイン変異体の発現実験において、KR 変異体はトリケタイド中間体の環化体である triacetic acidlactone（TAL）を合成したが、DH-KR 共変異体は TAL を合成しなかったことから、DH は中間体の脱水反応を触媒する以外の機能を持つ可能性が示唆されていた。今回、DH についてより詳細な検討を行うため、DH とその下流に位置する ID を併せ持つ、ATXDH を DH 変異体とともに酵母内で共発現させたところ、
ATXDH が活性体として DH 機能を相補できることを見出した。さらに、大腸菌を宿主とした発現系を構築
し、in vitro アッセイにおいても ATXDH の活性を確認することができた。現在、ATXDH の精製、機能解析とともに、全長 ATX の精製についても併せて検討中である。
Expression and functional analysis of iterative type I polyketide synthase
Tomomi Moriguchi1), Yutaka Ebizuka1), Isao Fujii2)(1.Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo)(2.School of Pharmacy, Iwate Medical University)P-92
麹菌 A. oryzae の繰返し型タイプⅠポリケタイド合成酵素遺伝子の発現と機能解析
守屋智博 1，勢〆康代 2, 北本勝ひこ 3, 藤井勲 2, 海老塚豊 1（東大院・薬 1,岩手医大・薬 2, 東大院・農生科・応生工 3）
麹菌 A.oryzae RIB40 のゲノム解析により本菌には多数のポリケタイド合成酵素（PKS）遺伝子が存在する
ことが明らかになった。完全長の繰返し型タイプⅠPKS 遺伝子は 28 個存在し、そのドメイン構成から、芳香族化合物を生成すると考えられる芳香族型 PKS をコードする遺伝子は 13 個（Ao1-1~13）、脂肪族化合物を生成する還元型 PKS の遺伝子は 12 個（Ao2-1~12）、また、非リボソームペプチド合成酵素とのハイブリッド
型 PKS の遺伝子は 3 個（Ao3-1~3）であった。しかし、これまでに A. oryzae よりこれら PKS の産物と考えられる化合物の単離は報告されておらず、その機能を明らかにすることを目的として、これら PKS を順次誘導発現させ、その生成産物を同定することとした。
PKS 遺伝子を糸状菌用発現ベクターpTAex3R に Gateway 法により導入し、発現プラスミドを構築、A.oryzae
M-2-3 株に形質転換・導入した。得られた形質転換体を誘導培養し、生産化合物を分析したところ、芳香族型 Ao1-1 よりノナケタイド topopyrone D 、Ao1-7 よりヘプタケタイド alternariol、Ao1-8 よりヘプタケタイド
YWA1 の生産を確認し、各 PKS の機能を同定した。現在、他の PKS 遺伝子についても同様に発現系の構築と解析を進めている。
Expression and functional analysis of typeⅠpolyketide synthase genes from A. oryzae
Tomohiro Moriya1, Yasuyo Seshime2, Katsuhiko Kitamoto3, Isao Fujii2, Yutaka Ebizuka1(1Grad. School of Pharm. Sciences, Univ. of Tokyo, 2School of Pharmacy, Iwate Medical Univ., 3Dept. of
Biotechnology, Univ. of Tokyo)

92

P-93
麹菌のシクロピアゾン酸生産性に関する研究
徳岡昌文 1 ，高橋理 1, 勢〆康代 2, 藤井勲 2, 北本勝ひこ 3, 小山泰二 1（1 野田産研、2 岩手医大・薬、3 東大院・
農生科）
シクロピアゾン酸(CPA)は Penicillium cyclopium で最初に発見されたマイコトキシンであり、LD50 ：36mg/kg(ラット経口投与)の毒性をもつ。これまでの研究から、Aspergillus flavus と A. oryzae の一部の株において CPA の生産が報告されており、食品の安全性の観点から、生産性を左右する遺伝的要因を明らかにすることが望まれている。そこで我々は A. oryzae の CPA 非生産株(RIB40)と生産株(NISL3010, NBRC4177)との比較を行うことで、その要因を明らかにすることを試みた。
A. oryzae のゲノム情報から第３染色体末端の遺伝子が、CPA 生合成遺伝子クラスターを形成していると推定された。しかし、A. flavus のゲノム情報と比較すると、PKS と予想されている約 4.2 kb の遺伝子は 3'側が欠失して、ORF 内でテロメアが付加していると考えられたことから、この欠失と CPA 生産性との関連に注目して研究を行った。まずサザンブロッティングと PCR による解析を行ったところ、CPA 生産株のテロメア配列は非生産株よりも 20 kb 程度下流に存在し、非生産株で欠失していると考えられた遺伝子は、生産菌では完全な ORF をもつことが分かった。また、推定アミノ酸配列から、この遺伝子が CPA 生合成の初発段階を触媒する酵素をコードしている遺伝子である可能性が示唆された。そこで、CPA 生産株においてこの遺伝子の破壊株を作製したところ、CPA 生産能が失われたことから、この遺伝子は CPA 合成に関与していることが明らかとなった。以上の結果より、A. oryzae RIB40 株では CPA 生合成に必須な遺伝子の 3'領域の大部分が欠失しているため、CPA 生産能を失っていると結論した。
Studies on productivity of cyclopiazonic acid in Aspergillus oryzae strains.
Masafumi Tokuoka1, Tadashi Takahashi1, Yasuyo Seshime2, Isao Fujii2, Katsuhiko Kitamoto3, Yasuji Koyama1(1Noda Ins. Sci. Res., 2School of Pharm., Iwate Med. Univ., 3 Univ. of Tokyo)

P-94
タイ王国薬用植物からの生理活性物質生産糸状菌のスクリーニング
木下浩 1 ，Kanoktip Pansukusan1，木谷茂 1，五十嵐康弘 2，仁平卓也 1（1 阪大・生物工学国際交流セ，

２

富山県大・工・生工）【目的】多剤耐性菌や新たな疾病の出現により、新規生理活性物質の発見が求められている。植物内生菌は宿主である植物の生育や諸性質に影響を及ぼすことから、多様な生理活性物質を生産していると考えられ、生理活性物質資源として有望視されている。本研究ではタイ王国に生育する薬用植物から生理活性物質生産能を有している内生糸状菌の単離を目指した。
【方法および結果】タイ王国マヒドン大学の植物園から３０種類の薬用植物の葉を単離し、滅菌処理後、培地成分を含まない寒天プレートに静置し、28℃で二週間培養した。生育が見られた菌糸を PDA プレートに植え次ぎ、８６菌株を単離した。得られた菌株を植物病原菌 Phytophthora sojae および Aphanomycescochlioides を被験菌として固体培地で共培養を行ったところ、内生菌の内、約４分の１が被験菌に対して抗菌活性を示した。続いて生理活性物質の生産・単離を効率的に行うために、液体静置培養法を検討し、生育速度が速く、生理活性物質の生産性の高い二種類の培地を決定した。決定した培地を用いて 28℃で三週間培養した菌体の培養液を n-ブタノールで抽出、抽出液を蒸発乾固し、得られたサンプルについて HPLC による解析を行った。その結果、サンプル中には多様な二次代謝物質を含んでいることが明らかとなり、本研究で単離された植物内生糸状菌は新規生理活性物質の有望な生物資源であると考えられた。
Screening endophytic fungi producing bioactive compounds from medicinal plants in Thailand
Hiroshi Kinoshita1 ，Kanoktip Pansukusan1，Shigeru Kitani1，Yasuhiro Igarashi2 ，Takuya Nihira1(1ICBiotech, Osaka Univ., ２Fac. Eng., Dept. Biotech., Toyama Pref. Univ.)

93

P-95
酵母をホストとした Aspergillus fumigatus DHN-メラニン生合成系の再構成
南部夏希 1、藤井勲 2、海老塚豊 1（東大院・薬 1、岩手医大・薬 2 ）ヒトアスペルギルス症の主たる病因菌である Aspergillus fumigatus の胞子色素生合成遺伝子クラスターには、芳香族繰返し型タイプⅠポリケタイド合成酵素（PKS）をコードする alb1 を含む 6 つの遺伝子が存在する。ヘプタケタイド合成酵素である Alb1p によりナフトピロン YWA1 が生成し、これがクラスターを構成する側鎖切断酵素、還元酵素、脱水酵素などにより、順次、1,8-dihyroxynaphthalene（DHN）へと変換され、最後に DHN がフェノール酸化酵素により重合して DHN-メラニンが生成すると考えられている。しかし、クラスター内にコードされる２つの酸化酵素 Abr1p、Abr2p のどちらが DHN の重合を触媒するかなど不明な点も多い。本研究においては、A. fumigatus の DHN-メラニン生合成に関わる各酵素の機能を同定するとともに、酵母をホストとした糸状菌二次代謝生合成系の再構成モデルとして DHN-メラニン生合成系の構築を目的とした。
まず、酵母内で発現した PKS を活性型とするため、Aspergillus nidulans のホスホパンテテイン転移酵素遺伝子 npgA を染色体に組み込んだ酵母を作製し、これに alb1、YWA1 の側鎖切断酵素遺伝子 ayg1 、
1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene（T4HN）還元酵素遺伝子 arp2 を順次共発現させることにより YWA1 から
scytalone までの生合成系を酵母内で再構成することに成功した。また、scytalone 脱水酵素をコードすると予想される arp1 遺伝子と alb1 との共発現により、YWA1 がアンギュラー型に環化し脱水したピロン化合物が生産されることを見出した。in vitro での解析により、Arp1p が YWA1 を基質として、この変換反応を触媒することを確認した。現在、酸化酵素遺伝子 abr1 、abr2 についても発現プラスミドを構築、酵母に導入して、
DHN-メラニン生合成系の再構成と反応解析を進めている。
Reconstitution of DHN-melanin biosynthetic pathway of Aspergillus fumigatus in yeast
Natsuki Nambu1, Isao Fujii2, Yutaka Ebizuka1(1Grad. School of Pharm. Sciences, The Univ. of Tokyo,2School of Pharmacy, Iwate Medical Univ.)

P-96
ヘルボール酸生合成に関与する糸状菌由来オキシドスクアレン閉環酵素の機能解析
三ツ口尚志 1, 勢〆康代 2, 藤井勲 2, 渋谷雅明 1, 久城哲夫 1, 海老塚豊 1 (1 東大院・薬、2 岩手医大・薬)
糸状菌 Aspergillus fumigatus が産生する抗生物質ヘルボール酸は、その構造からオキシドスクアレンがオキシ
ドスクアレン閉環酵素（OSC）により protosta-17(20)Z,24-dien-3b-ol に閉環した後、酸化やアセチル化等を経て生合成されると考えられる。我々はこの新規 OSC の同定を試み、近年公開された A. fumigatus のゲノム配列中に既知 OSC の相同性遺伝子の検索を行った。その結果、3 種の該当遺伝子が見出され、そのうちの 1 種
1Afu4g14770 は、シトクロム P450 や 3-ketosteroid Δ -dehydrogenase 遺伝子など、ヘルボール酸の生合成に関わると思われる 8 遺伝子と共に 16.3kb に渡る遺伝子クラスターを形成していた。そこで、本 OSC 遺伝子をAfuOSC3 と命名し、A. fumigatus IFO 8866 株よりクローニング後、酵母発現用ベクターpESC(Ura)に導入した。
pESC-AfuOSC3 でラノステロール合成酵素欠損酵母株 GIL77 を形質転換後、5L の培養液から生成物をヘキサンで抽出し、一部を GC-MS で分析したところ、2 種類の導入遺伝子特異的トリテルペンを検出した。そこで、それらをシリカゲルカラムと硝酸銀 TLC によって分離し、NMR で構造解析を行ったところ、主生成物がヘルボール酸の生合成前駆体である protosta-17(20)Z,24-dien-3b-ol であり、副生成物は二重結合の異性体である(20R)-protosta-13(17),24-dien-3b-ol であることが判明した。AfuOSC3 がヘルボール酸の生合成前駆体を生成したことから、本遺伝子クラスターがヘルボール酸生合成に関与することが強く示唆され、現在、P450を含めたクラスター内の遺伝子の機能解析を順次進めている。
Identification of fungal OSC responsible for biosynthesis of helvolic acid
Hisashi Mitsuguchi1, Yasuyo Seshime2, Isao Fujii2, Masaaki Shibuya1, Tetsuo Kushiro1, Yutaka Ebizuka1(1Grad. School of Pharm. Sci., Univ. of Tokyo, 2School of Pharm., Iwate Med. Univ.)

94

P-97
麴菌 LaeA は、コウジ酸生産に影響を及ぼす
織田健、佐野元昭、小林亜紀子、*久田博元、*石田博樹、*秦洋二、大箸信一（金沢工大・ゲノム研、*月桂冠・総研）
糸状菌は、多種多様な２次代謝物を生産し、有用な薬剤生産供与体として利用されている。近年、Aspergillus
nidulans において２次代謝制御遺伝子 laeA が見出され、糸状菌の２次代謝制御が明らかにされつつある。
laeA
は、種によって２次代謝生産に及ぼす影響が異なることが報告されている 1)。そこで、麴菌 A. oryzae の laeAの２次代謝生産への影響を考察するため、麴菌 laeA をクローニングし、その破壊株を取得して解析を行った。 A. nidulans の laeA を元に麴菌ゲノム database にて BLAST 検索を行い、麴菌 laeA を見出した。5’-RACEを行い、開始コドンを推定し ORF を決定したところ、アミノ酸配列の相同性は A. nidulans や A. fumigatusとそれぞれ 76、77%であった。遺伝子破壊株の取得を簡便にするために相同組換え効率を向上させた
ΔligDΔpyrG 株を宿主に用いて pyrG を選択マーカーとして推定 S-adenosylmethionine 結合領域を欠失させる形
で laeA 破壊株を作製した。破壊株は、他の種と同様に色素の低減などの表現型を示した。一方で分生子形
成は A. nidulans とは異なり、減少した。また、麴菌における代表的な２次代謝産物であるコウジ酸について
コウジ酸生産培地での生産の検討を行ったところ、破壊株では培地中にコウジ酸が検出されなかったことから、LaeA は、コウジ酸生産の制御にも寄与することが示唆された。
1) Jin Woo Bok and Nancy P. Keller, Eucaryotic Cell, 3, p.527-535(2004)
Aspergillus oryzae Lae affects production of kojic acid.
Ken Oda, Motoaki Sano, Akiko Kobayashi,*

Hiromoto Hisada, *Hiroki Ishida, * Youji Hata,

Shinichi*Ohashi(Kanazawa Inst. Tech., Res.Inst.Gekkeikan)

P-98
Aspergillus nidulans の亜硝酸耐性に関わる遺伝子の単離と解析
鳴神寿昭，行木弥鈴，桝尾俊介，星野貴行，高谷直樹（筑波大・生命環境）

亜硝酸は、核酸のアミノ基と反応し変異原性を示すことや、ニトロソ化合物を生成し細胞毒性を示すことが知られている。亜硝酸は Aspergillus nidulans に対しても毒性を示すが、その耐性化機構についての報告は少ない。
そこで、本研究では、A.nidulans に A.nidulans の全 DNA ライブラリーを導入することによって、亜硝酸への耐性化に関わる遺伝子の単離を試みた。その結果、A.nidulans の亜硝酸耐性を増強する遺伝子 AN0121 が単離された。本遺伝子の推定アミノ酸配列は、原核生物から高等真核生物に至る広範囲の生物のポルホビリ
ノーゲンデアミナーゼ(PBG-D)のそれと高い相同性を示した。本遺伝子を２コピー持つ株（PD1 株）を作製し、高濃度の亜硝酸に曝露した際の細胞抽出液の PBG-D 活性を測定したところ、野生株のそれと比較して約２倍高かった。また、本株は、高濃度の亜硝酸を含む培地でも生育が可能であり、野生型株で見られる亜硝酸による菌糸の形態異常や分生子の発芽阻害を示さなかった。また、PD1 株の細胞抽出液中の亜硝酸還元酵素（Nir）活性も約７倍上昇していた。現在のところ、PBG-D と Nir の関係の詳細は不明であるが、PBG-D
はヘム生合成経路に含まれる酵素であり、Nir はシロヘムを構造内に有していることから、AN0121 の発現が上昇することにより PBG-D 活性が上昇しシロヘムの生成量が増える可能性が考えられた。また、A.nidulans
は、高濃度の亜硝酸に曝露されたとき、Nir の働きによって亜硝酸を消費し、亜硝酸に耐性化すると考えられた。
Isolation and analysis of the gene involved in nitrite tolerance from Aspergillus nidulans
Toshiaki Narukami, Misuzu Nameki, Shunsuke Masuo, Takayuki Hoshino, Naoki Takaya(Graduate School of Life and Environmental Sciences, Univ. of Tsukuba)

95

P-99
Fusarium oxysporum の硫黄還元機構
佐藤育男，安部剛史, 星野貴行, 高谷直樹

（筑波大院・生命環境）【目的】近年、カビが低酸素条件下において硝酸呼吸やアンモニア発酵といった多様なエネルギー獲得機構を発現することが報告されている。また、我々はカビが S0 を還元し硫化水素を生成し、嫌気的に生育することを明らかにしている。今回、この反応機構を解明するために Fusarium oxysporum JCM11502 の硫黄還元酵
素（SR）について検討した。
【方法および結果】SR 活性は、S0 の還元により生成する硫化水素をメチレンブルー法で定量することによって測定した。供試菌株は、エタノールを炭素源、S0 を電子受容体として用い低酸素条件下で培養した。得られた菌体の無細胞抽出液の可溶性画分から NADH および NADPH 依存の SR 活性が検出された。SR 活性は透析により失活したが、これに各種金属イオン、ビタミン、SH 化合物を添加したところ、還元型または酸化型グルタチオンの添加によって SR 活性が回復した。このグルタチオン依存性 SR を各種クロマトグラ
フィーにより電気泳動的に単一となるまで精製した。本酵素はサブユニットの分子量 55000 のホモダイマーであった。精製 SR の MALDI TOF/MS および N 末端配列解析の結果、本酵素はグルタチオンレダクターゼ（GR）と同定された。また、精製 SR はグルタチオン依存性の SR 活性および GR 活性を有していた。ゲノム情報が公開されている FGSC4286 株の GR 遺伝子配列をもとにプライマーを作製し、PCR を用いてJCM11502 株の SR(GR)遺伝子をクローニングした。JCM11502 の SR（GR）の推定アミノ酸配列は 506 アミノ酸からなり、
FGSC4286 株の GR と 99％の相同性を示した。還元型グルタチオンは非酵素的に S0 を還元し、硫化水素を生成することから、供試菌株はグルタチオンならびに GR によって S0 を還元していることが示唆された。
Sulfur reduction by Fusarium oxysporum
Ikuo Sato, Tsuyoshi Abe, Takayuki Hoshino, Naoki Takaya(Grad. Sch. of Life and Enviromental Sciences, Univ. of Tsukuba)

96

人名索引
Ａ

Ｈ

阿部歩 ················································ 40, 59
阿部敬悦 ···················· 42, 44, 56, 60, 82, 83, 89
安部剛史 ·················································· 96
阿部有生 ·················································· 36
足立浩美 ············································· 71, 72
赤木靖典 ·················································· 47
赤松創 ····················································· 47
赤尾健 ····················································· 58
紅朋浩 ····················································· 61
Taki Koffi Alphonse·································· 66
天野 良彦················································· 74
安藤晃規 ············································· 40, 74
青木考 ····················································· 41
荒井基夫 ········································ 67, 71, 72
有江力 ················································ 39, 48
有岡学 ·················· 46, 53, 54, 55, 67, 73, 75, 77
旭井亮一 ·················································· 44
浅野行蔵 ·················································· 59
芦澤武人 ·················································· 40

芳賀楓 ····················································· 58
萩原大祐 ········································ 60, 83, 84
Dong-Min Han············································ 86
Kap-Hoon Han············································ 86
原田祐佳 ·················································· 57
原山重明 ·················································· 41
播本佳明 ·················································· 47
長谷川史彦 ··············································· 56
長谷川祥子 ··············································· 87
長谷山陽平 ··············································· 65
秦洋二 ······································ 65, 70, 88, 95
畑本修 ····················································· 44
服部貴澄 ·················································· 52
林梨咲 ····················································· 72
林理恵 ····················································· 52
林幸男 ····················································· 69
樋口裕次郎 ··········································· 46,55
平田恭子 ·················································· 53
久田博元 ············································· 65, 95
本田裕樹 ·················································· 52
堀千明 ····················································· 64
堀尾哲也 ·················································· 61
堀内裕之 ··································· 23, 58, 59, 60
星由紀子 ·················································· 79
星野貴行 ············································· 95, 96
細内敦 ····················································· 41

Ｂ
馬場悟史 ·················································· 36
馬場崎勝彦 ··············································· 62
坂東弘樹 ·················································· 65
坂野真平 ·················································· 83

ＣＩ

Xinai CHEN··············································· 75
Yoon-Hee Cheon ········································· 86

一宮維幸 ·················································· 59
五十嵐圭日子 ····························· 39, 61, 62, 64
五十嵐康弘 ··············································· 93
飯田祐一郎 ··············································· 49
飯島陽子 ·················································· 41
池正和 ····················································· 70
池田凉子 ·················································· 72
今井峻介 ·················································· 48
伊奈慎太郎 ··············································· 87
石田博樹 ···················· 65, 70, 73, 79, 89, 90, 95
石田卓也 ·················································· 62
石黒真希 ·················································· 61
石川絵理 ·················································· 54
一色邦夫 ·················································· 41
伊藤尚志 ·················································· 43
伊藤崇敬 ·················································· 91
伊藤幸成 ·················································· 54
岩崎健太郎 ·········································· 45, 56
岩下和裕 ··································· 44, 72, 82, 84

Ｅ
海老塚豊 ········································ 91, 92, 94
Cristopher Salazar ESCAÑO ······················ 45, 55

Ｆ
藤田健作 ·················································· 43
藤井勲 ································· 34, 91, 92, 93, 94
藤井達也 ·················································· 43
藤川貴志 ·················································· 51
藤村真 ················································ 83, 85
藤岡智則 ············································· 42, 60
福田明 ····················································· 64
福田一治 ·················································· 58
福田清春 ·················································· 63
福森文康 ············································· 83, 85
福岡真里 ·················································· 76
古川育代 ············································· 73, 90
古川健太郎 ·········································· 42, 60
古川隆紀 ·················································· 66

Ｊ
Gregory Jedd ·············································· 17
城島透 ····················································· 38
Praveen Rao JUVVADI ································· 55

Ｇ
五味勝也 ··································· 56, 57, 87, 88
後藤正利 ············································· 21, 57

97

黒田克利 ·················································· 49
久城哲夫 ············································· 91, 94
楠本憲一 ···················· 70, 73, 74, 76, 79, 89, 90

Ｋ
加治木佑紀子 ············································ 78
加治佐平 ·················································· 39
鎌田堯 ····················································· 25
亀井克彦 ·················································· 75
金田貴詳 ·················································· 68
金丸京子 ········································ 42, 68, 84
金政真 ····················································· 71
金山典生 ·················································· 48
金子真也 ············································· 38, 62
柏木豊 ······································ 73, 74, 76, 90
片瀬徹 ················································ 79, 89
加藤雅士 ························· 42, 66, 68, 84, 86, 87
加藤直樹 ·················································· 43
勝川志穂 ·················································· 38
川端砂矢香 ··············································· 48
川口剛司 ········································ 67, 71, 72
川本進 ····················································· 75
Nancy Keller ·············································· 16
菊間隆志 ·················································· 53
Hye-Ryun Kim············································ 86
Jong Hwa Kim ············································ 86
金鋒杰 ····················································· 81
金鋒傑 ····················································· 55
木村 真 ·················································· 29
木村信弥 ·················································· 77
木野邦器 ·················································· 52
木下浩 ····················································· 93
桐村光太郎 ··············································· 52
北上巨樹 ·················································· 66
北川治恵 ·················································· 78
北本勝ひこ · 45, 46, 53, 54, 55, 56, 67, 73, 75, 77,
79, 85, 91, 92, 93
木谷茂 ····················································· 93
北爪達也 ·················································· 43
鬼頭英樹 ·················································· 51
神太郎 ····················································· 80
小林亜紀子 ··············································· 95
小林遼太 ·················································· 68
小林哲夫 ························· 42, 66, 68, 84, 86, 87
児玉基一朗 ··············································· 47
小出芳直 ······························ 70, 73, 79, 89, 90
小池英明 ··································· 44, 80, 81, 82
小牧久幸 ·················································· 41
近藤昭彦 ·················································· 65
近藤花菜 ·················································· 78
小竹学 ····················································· 82
小山泰二 ·················································· 93
河野美乃里 ··············································· 44
小山泰二 ······························ 44, 55, 68, 81, 88
久保康之 ············································· 49, 50
窪田哲也 ·················································· 68
工藤俊章 ·················································· 51
熊谷明夫 ·················································· 74
國武絵美 ·················································· 72

Ｌ李皓曼 ····················································· 75

Ｍ
町田雅之 ······························ 44, 80, 81, 82, 88
前田浩 ················································ 56, 89
丸井淳一郎 ·········································· 60, 82
丸山潤一 ·········· 19, 45, 75, 54, 55, 56, 73, 77, 85
桝尾俊介 ············································· 43, 95
松林良博 ·················································· 84
松井哲児 ·················································· 42
松本翔 ····················································· 57
松尾一郎 ·················································· 54
松島健一朗 ··············································· 81
松下真由美 ····································· 73, 76, 90
三上重明 ··································· 44, 72, 82, 84
三ツ口尚志 ··············································· 94
宮崎安将 ············································· 38, 62
水野猛 ················································ 83, 84
水谷治 ················································ 42, 60
森口智美 ·················································· 92
森川康 ······································ 66, 67, 68, 70
森田寛人 ············································· 89, 90
守屋智博 ·················································· 92
本山愛 ····················································· 48
本山高幸 ·················································· 51
村口元 ····················································· 25

Ｎ中川浩志 ·················································· 78
中原光一 ·················································· 48
中井喬彦 ·················································· 67
中島大輔 ·················································· 41
中島廣光 ·················································· 32
中島琢自 ·················································· 41
中島佑 ····················································· 42
中村雅哉 ·················································· 62
中澤光 ····················································· 68
中沢威人 ·················································· 38
中出啓子 ·················································· 63
行木弥鈴 ·················································· 95
南部夏希 ·················································· 94
鳴神寿昭 ·················································· 95
根本崇 ····················································· 73
仁平卓也 ·················································· 93
西北広信 ·················································· 70
西村麻里江 ··············································· 51
西浦未華 ············································· 44, 84
野口祐二 ·················································· 68ＯBerl R. Oakley ············································ 61

98

小畑浩 ····················································· 88
落合奈緒子 ··············································· 51
織田健 ················································ 82, 95
小田忍 ··········································· 41, 76, 78
小笠原博信 ··············································· 88
小笠原渉 ··································· 66, 67, 68, 70
緒方綾 ····················································· 49
小川順 ················································ 40, 74
小川真弘 ············································· 81, 88
大箸信一 ······························ 76, 78, 80, 81, 95
大北由佳 ·················································· 44
大町鉄雄 ·················································· 58
大野絢子 ·················································· 77
太田明徳 ········································ 58, 59, 60
太田一良 ·················································· 69
太田康司 ·················································· 70
岡田宏文 ··································· 66, 67, 68, 70
岡田和士 ·················································· 68
岡本綾子 ············································· 89, 90
岡崎孝映 ·················································· 41
小野寺朋子 ··············································· 68
大澤貴紀 ·················································· 50
大澤靖子 ··················································· 88
長田裕之 ·················································· 43
尾谷浩 ····················································· 47
尾関健二 ············································· 76, 78

志水元亨 ·················································· 43
曾根輝雄 ············································· 40, 59
角田洋輔 ·················································· 40
炭谷順一 ············································· 71, 72
砂川政英 ·················································· 62
砂川美佐緒 ·········································· 44, 88
鈴木麻子 ············································· 42, 84
柴田大輔 ·················································· 41
鈴木宏和 ·················································· 43
鈴木秀幸 ·················································· 41
鈴木聡 ······································ 73, 74, 76, 90

Ｔ
多田功生 ············································· 74, 76
Naimeh Taheri-Talesh ··································· 61
高木海 ····················································· 43
高木義弘 ·················································· 76
高橋明珠 ·················································· 86
高橋正和 ·················································· 83
高橋砂織 ·················································· 88
高橋俊二 ·················································· 43
高橋徹 ····················································· 56
高橋理 ································· 44, 55, 81, 88, 93
高見絵里香 ··············································· 84
高谷康平 ·················································· 79
高谷直樹 ········································ 43, 95, 96
竹下典男 ·················································· 60
竹谷博子 ·················································· 76
竹内道雄 ···················· 70, 73, 77, 79, 80, 89, 90
滝口鉄也 ·················································· 55
玉野孝一 ············································· 44, 82
田鍋康子 ·················································· 56
田中瑞己 ·················································· 57
谷修治 ················································ 71, 72
寺林靖宣 ········································ 44, 80, 81
寺岡徹 ··········································· 39, 48, 49
戸田智美 ············································· 44, 88
徳岡昌文 ··································· 57, 81, 88, 93
冨村健太 ·················································· 44
戸谷希一郎 ··············································· 54
辰巳晶紀 ·················································· 53
柘植尚志 ·················································· 47
對崎真楠 ·················································· 60
辻篤史 ····················································· 71
堤浩子 ····················································· 27
坪井基枝 ·················································· 49
柘植尚志 ············································· 47, 49
辻元人 ················································ 49, 50

Ｐ
Kanoktip Pansukusan ···································· 93

Ｓ齋藤勇司 ·················································· 67
坂口 歩 ·················································· 50
坂本和俊 ··································· 44, 72, 82, 84
坂本裕一 ·················································· 63
櫻谷英治 ············································· 40, 74
櫻井望 ····················································· 41
鮫島正浩 ··································· 39, 61, 62, 64
佐野元昭 ···················· 44, 78, 80, 81, 82, 86, 95
佐々木堯 ·················································· 74
佐藤育男 ·················································· 96
佐藤奈津子 ·········································· 42, 60
佐藤利次 ·················································· 63
関口裕久 ·················································· 67
關波直子 ·················································· 39
勢〆康代 ··································· 91, 92, 93, 94
渋谷雅明 ·················································· 94
志田洋介 ·················································· 66
清水公徳 ·················································· 75
清水 昌··············································· 40, 74
下飯仁 ····················································· 82
篠島里江 ·················································· 78
塩澤あずさ ··············································· 85
宍戸和夫 ············································· 38, 62
正路淳也 ··································· 46, 53, 54, 55

Ｕ
内田博教 ·················································· 59
内田隆史 ·················································· 89
上原健二 ·················································· 56
海附玄龍 ············································· 44, 68
牛丸拓磨 ·················································· 49

99

山口正視 ·················································· 75
山本幹博 ·················································· 47
山根倫子 ········································ 44, 80, 81
山下和宏 ············································· 83, 85
山下修一 ············································· 45, 58
山崎丘 ················································ 38, 62
山崎ゆかり ··············································· 42
吉田誠 ····················································· 63
吉田孝 ····················································· 58
吉見啓 ··········································· 42, 60, 82
吉原浩司 ·················································· 69
結城健介 ·················································· 79

Ｗ和田昌久 ·················································· 62
脇山元気 ·················································· 69
渡辺哲 ····················································· 75
渡邊節子 ············································· 83, 85
渡邉泰祐 ·················································· 54

Ｙ
矢部希見子 ··············································· 32
山田和成 ·················································· 58
山田修 ································· 44, 58, 72, 82, 84
山形洋平 ···················· 42, 56, 70, 73, 79, 89, 90
山口悠 ····················································· 85

100糸状菌分子生物学研究会

会則

本会を糸状菌分子生物学研究会（Fungal Molecular Biology Society of Japan）と呼ぶ。また本会が開く研究会を糸状菌分子生物学コンファレンス（Conference on Fungal Genetics and Molecular Biology）と呼ぶ。
2. 本会は糸状菌の分子生物学、細胞生物学、生化学、生理学、遺伝学などの普及発展を目的とする。
3. 本会はその目的を達成するために次の事業を行う。
(1) 研究会及び総会の開催。
(2) 会報の発行。
(3) 関連研究団体との協力事業。
(4) その他、必要と思われる事業。
4. 本会はその目的に賛同して入会した個人会員及び総会において承認された名誉会員を持って構成する。
5. 本会入会希望者は所定の入会申込書を提出し、別に定める入会金を納入するものとする。
6. 本会はその運営のため、会長、運営委員若干名および会計監査 1〜2 名をおく。任期は 2 年とし、改選は運営委員の推薦と総会の承認による。
(1) 会長は本会を代表し、会務を統括する。
(2) 運営委員は運営委員会を構成し会務を審議する。運営委員には庶務、会計、編集担当、広報担当をおく。
(3) 会計監査は本会の会計を監査する。
7. 本会は事業運営に必要な実費を年会費として個人会員から徴収する。
8. 本会の事務年度は研究会の開催準備開始から「次期」研究会の開催準備開始直前までとする。
9. 前事務年度の庶務、会計については、これを総会において報告し、承認を得るものとする。
10. 本会則の改定には総会出席者過半数の賛成を必要とする。
以上
1.

補則
(1) 本会則は 2001 年 7 月 1 日より発効する。
(2) 本会入会金は 1,000 円とする。
(3) 年会費は一般会員 2,000 円、学生会員 1,000 円とする。
(4) 研究会の通知及び会報は、当該年度までの会費を納入した会員に送付する。
(5) 2 年度にわたって会費納入のない会員は、その資格を失うものとする。
(6) 研究会の発表者は、会員に限るものとする。新入会員の演題申し込みは会費納入の確認を持って受理する。

101

糸状菌分子生物学研究会運営委員会名簿（2006 年度）
会

長

北本勝ひこ
東京大学大学院農学生命科学研究科（〒113-8657

東京都文京区弥生 1-1-1）

運営委員
秋田

修

実践女子大学生活科学部（〒191-8510

五味

東京都日野市大坂上 4-1-1）

勝也

東北大学大学院農学研究科（〒981-8555

鮫島

仙台市青葉区堤通雨宮町 1-1）

正浩

東京大学大学院農学生命科学研究科（〒113-8657

秦

東京都文京区弥生 1-1-1）

洋二
月桂冠・総合研究所（〒612-8385

京都市伏見区下鳥羽小柳町 101）

会計担当
有江

力

東京農工大学農学部（〒183-8509

竹内

東京都府中市幸町 3-5-8）

道雄

東京農工大学農学部（〒183-8509

東京都府中市幸町 3-5-8）

編集担当
小林

哲夫

名古屋大学大学院生命農学研究科（〒464-8601

名古屋市千種区不老町）

広報担当
川口

剛司

大阪府立大学大学院農学生命科学研究科（〒599-8531

大阪府堺市学園町 1-1）

庶務担当
堀内

裕之

東京大学大学院農学生命科学研究科（〒113-8657

東京都文京区弥生 1-1-1）

102