（様式 20）成果報告書

TSUBAME 共同利用 令和元年度 共同利用 成果報告書

利用課題名 分子動力学シミュレーションを用いた抗関節リウマチ分子標的薬の設計
英文：Molecular design of anti-rheumatic drugs with molecular dynamics simulation
利用課題責任者 和久井直樹
First name Surname Naoki Wakui
所属 独立行政法人国立高等専門学校機構 長岡工業高等専門学校
Affiliation National Institute of Technology (KOSEN), Nagaoka CollegeURL http://www.nagaoka-ct.ac.jp/
邦文抄録（300 字程度）
関節リウマチは全身性の自己免疫疾患であり、滑膜関節炎と破壊性関節病変により身体機能障害をきたす疾患である。関節リウマチの原因タンパク質として Protein Arginine Deiminase4（以下、PAD4）が同定されている。本研究では PAD4 選択的阻害剤として知られる GSK199 と PAD4 の相互作用ならびに GSK199 とPAD4 のアイソザイムである PAD1、PAD2、PAD3 との相互作用を分子動力学シミュレーションを用いて解析した。相互作用解析の結果、PAD4 と GSK199 の間にだけπ-πスタッキングが形成されることが分かった。ππスタッキングを形成する Phe634 に対応する PAD1～PAD3 のアミノ酸の側鎖は芳香環を持たないことから、Phe634 が GSK199 の標的選択性に関与していることが示唆された。
英文抄録（100 words 程度）
Rheumatoid arthritis is a systemic autoimmune disease that causes physical dysfunction due to synovial
arthritis and destructive joint lesions. Protein Arginine Deiminase4 (PAD4) has been identified as a causative
protein in rheumatoid arthritis. In this study, we analyzed the interaction between GSK199, which are known as
selective PAD4 inhibitor, and PAD4 and the interaction between GSK199 and PAD1, PAD2, and PAD3, which are
PAD4 isozymes, with molecular dynamics simulations. These interaction analyses showed that π-π stacking wasformed only between PAD4 and GSK199. the amino acids corresponding to Phe634, which forms the π-π stacking,from PAD1 to PAD3 do not have an aromatic ring, suggesting that Phe634 is involved in the target selectivity ofGSK199.

Keywords: Molecular dynamics, Drug discovery, Protein Arginine Deiminase

背景と目的PAD6 の 5 つのアイソザイムが存在しており、PAD1 か関節リウマチは全身性の自己免疫疾患であり、滑膜ら PAD4 はシトルリン化活性を有しているが PAD6 は関節炎と破壊性関節病変により身体機能障害をきたす多数の変異があるためシトルリン化活性がない。PAD1疾患である。患者数も年々増加傾向にあり、特に 50 代

から PAD4 のうち、PAD4 のシトルリン化活性が高くなから 70 代の女性での発症が多いのが特徴である。既ることが関節リウマチの発症と進行に寄与していること

存の関節リウマチに対する治療は免疫抑制剤またはから、標的タンパク質として注目されている 1。しかし、生物学的製剤の使用による寛解が限界である。リウマアイソザイム間でのアミノ酸配列一致度が 50%を超えチ専門医の数が限られ、生物学的製剤を使用する場ているため、PAD4 阻害剤として開発した場合であって合は月 1 回の点滴投与または 2 週間に 1 回の皮下注

も PAD1、PAD2、PAD3 に結合し阻害する場合がある。

射となっており、特に患者数の多い 50 代から 70 代の標的タンパク質以外を阻害してしまう場合、副作用など患者に対しての身体的負担が大きい。これまでの基礎の重篤な症状が出る場合があり、高い標的選択性を持研究結果から、関節リウマチ患者はシトルリン化したタった PAD4 阻害剤の開発が求められている。本研究でンパク質に対する自己抗体を多く生産していることが明は PAD4 のシトルリン化活性阻害を作用機序とするらかになっており、タンパク質をシトルリン化する酵素とPAD4 選択的阻害剤の設計を分子動力学シミュレーシして Protein Arginine Deiminase（以下、PAD）が同ョンにより行うことを目的とした。TSUBAME3.0 でサポ定されている。PAD には PAD1、PAD2、PAD3、PAD4、ートされている Schrödinger Small Molecule Drug（様式 20）成果報告書
Discovery Suite を用いて、アイソザイム（ PAD1～PAD4/GSK199 複合体にのみ、Phe634 とのπ-πスタPAD3）と候補化合物の複合体構造のモデリングならびッキングによる相互作用が全シミュレーション時間のうに分子動力学シミュレーションを実施し、PAD4 への選ち約 80%の割合で形成されることが確認された（図 1）。

択性に寄与していると考えられる相互作用を同定した。

PAD1 ～ PAD4 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 比 較 し て み る と 、PAD4 の Phe634 に対応する PAD1、PAD2 および概要

PAD3 ではそれぞれ Leu634、Ser636 および Thr635

関節リウマチの原因タンパク質として PAD4 が同定であった。これらのアミノ酸はいずれも側鎖に芳香環がされている。PAD4 選択的阻害剤の開発には、PAD4ないため、PAD4/GSK199 複合体で見られたようなπ-とのアミノ酸配列一致度が 50%を超えるアイソザイムとπスタッキングが形成できないと考えられる。の基質認識機構の違いを明らかにする必要がある。本
研究では、PAD4-阻害剤複合体とアイソザイム-阻害剤複合体に対して分子動力学シミュレーションを行い、基質認識機構に影響を与えるアミノ酸残基の同定を行った。

結果および考察
複合体構造のモデリング
Lewis らの先行研究より、GSK199 と呼ばれる化合物が PAD4 を選択的に阻害する可能性があることが示唆された 2。また、Lewis らは PAD4 と GSK199 との複合体構造の決定に成功している。PAD4 を選択的に阻

図 1 各複合体構造における相互作用害する化合物を設計するためには、PAD4 のアイソザイムとして知られている PAD1、PAD2 および PAD3 とGSK199 との相互作用と PAD4 と GSK199 の相互作

GSK199 とタンパク質間の結合自由エネルギーの推定用の差異を見つける必要がある。しかし、これらアイソ

Molecular Mechanics-Generalized Born Surface

ザイムと GSK199 の複合体構造は未だ報告されていArea(MM-GBSA)法を用いて、GSK199 と各タンパクないため、PAD1～PAD3 と GSK199 の複合体構造を質との結合自由エネルギーを推定した。Run1、Run3モデリングする必要がある。PAD4/GSK199 複合体構および Run4 において PAD4/GSK199 複合体がエネ造に基づき、ホモロジーモデリングと呼ばれる手法を用ルギー的に有利であることが示唆された。

いて PAD1/GSK199 複合体構造、PAD2/GSK199 複合体構造、PAD3/GSK199 複合体構造のモデリングを行った。

表 1 結合自由エネルギー推定結果
ΔGbind (kcal mol-1)

複合体
Run1

Run2

Run3

Run4

PAD1/GSK199-72.6±3.3-63.4±4.3-67.0±4.6-70.4±5.7

TSUBAME3.0 および D. E. Shaw Research がアカ

PAD2/GSK199-72.5±7.9-81.9±5.2-73.7±7.1-75.4±3.5

デミア向けに無償提供している Desmond を用いて各PAD3/GSK199-65.3±2.3-63.0±6.0-62.1±5.1-63.0±4.5複合体構造に対する 200 ns の分子動力学シミュレー

PAD4/GSK199-74.7±4.8-78.6±5.6-77.4±6.7-77.4±5.7

GSK199 とタンパク質間の相互作用解析

ションを実施し、分子動力学シミュレーションの結果得られたトラジェクトリに対して相互作用解析を行った。
PAD1 ～ PAD4 の 相 互 作 用 を 比 較 し た と こ ろ 、まとめ、今後の課題
PAD4 選択的阻害剤として報告されている化合物

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GSK199 の標的選択性を明らかにするために、複合体構造のモデリング、分子動力学シミュレーション、相互作用解析、結合自由エネルギーの推定を行った。相互作 用 解 析 の 結 果 、 GSK199 の 標 的 選 択 性 に は
Phe634 とのπ-πスタッキングが影響していることが示唆された。PAD4/GSK199 複合体にのみπ-πスタッキングがあるため、結合自由エネルギーを調べた際に、PAD4/GSK199 複合体が最も安定であると考えられる。
今後は GSK199 よりも PAD4 選択性が高くなる化合物の設計を行う必要がある。

参考文献
1.

Schellekens, Gerard A., et al. "Citrulline isanessential

determinants

constituent
recognizedarthritis-specificofbyantigenic
rheumatoid

autoantibodies."

The

Journal of clinical investigation 101.1 (1998):
273-281.
2.

Lewis, Huw D., et al. "Inhibition of PAD4
activity is sufficient to disrupt mouse andhuman NET formation." Nature chemicalbiology 11.3 (2015): 189.