TEM トモグラフィ
古

.

は じ

め

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弘

光

. TEM トモグラフィの手順とソフトウエア

今世紀の初頭くらいから透過型電子顕微鏡(Transmission

TEM は文字通り試料を電子線で透かし観る装置で，電子Election Microscopy 以下 TEM )の技法の 1 つにトモグラフ

線の波長が可視光より遙かに短いという特性から光学顕微鏡

ィ(tomography)が加わり，今日では電子線/ EB トモグラフの数千倍という高い分解能での観察・撮影を可能としていま

ィ，電顕/ EM トモグラフィ， TEM トモグラフィ等といっす．この TEM を使って試料を多方向から撮影し，撮影画像た名称で広く知られるようになりました．本稿ではこのの三次元再構成及び，三次元構造の観察を計算機と専用ソフ

TEM によるトモグラフィ(以下 TEM トモグラフィ)につい

トウエアによって実行する，というのが TEM トモグラフィて，実践的なノウ・ハウを中心に解説いたします．

の手順となります．

“電子線”あるいは“電顕”＋“トモグラフィ”というキー前半の撮影プロセスは試料の同一視野の撮影を傾斜角度を

ワ ー ド で あ れ ば ， 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 ( Scanning Election

変えながら繰り返すという単純なもので，TEM には視野のMicroscopy 以下 SEM )で撮影した連続切片像から三次元を

移動を伴わずに試料の傾斜角度を変えることができるユーセ

構築するアレイ(Array)・トモグラフィや FIBSEM トモグ

ントリックという機能を備えたゴニオメータ(試料の位置，

ラフィと呼ばれる手法もありますが，“物体を透過した信号

角度を調整する機構)が標準で装備されていますので，TEMを計算することで内部構造の再構成を行う”という狭義のトトモグラフィの導入に際しては装置自体の改造や付加装置のモグラフィの概念から外れていることから対象外としました．

購入は不要です．

また，トモグラフィの基本理論や三次元データの可視化，

ただ，TEM で常用されている倍率となるとその視野は数特定の分野への TEM トモグラフィの応用に関しては，本特

nm から数 mm というスケールですので，いくら高精度の機集でもそれらを専門とされている執筆陣が控えておられます

構であっても試料を傾斜すれば視野が移動することになりまのでここでは掘り下げません．

す．また試料の見掛けの厚さが変わる事で焦点位置も外れて改めて述べるまでも無く，トモグラフィが最も応用されてしまいます．これらの調整を試料の傾斜の度に手動で行い，いる事例は CT ( Computerized Tomography )の略称で知ら

撮影を繰り返す作業は結構な労力です．そこで，各部が電子れる X 線を用いたトモグラフィで，その強力な透過力を活制御となった新しい設計の TEM では連続傾斜像の撮影にはかし，生体はもちろん美術品や大型の機械装置まであらゆる専用のソフトウエアを使用することがほぼ常識となっていま

物体の内部構造を非破壊で観察することを可能としています．

す．それに比べ電子線の透過力は遙かに弱く，また高真空中

これに加えて，三次元再構成や三次元構造を観察・解析すにある試料しか観察できないという制約はありますが，ナノる各種ソフトウエアも TEM トモグラフィに特化した形で商メートルという微細スケールで三次元構造を直視できる手法

品化・シェアウエア化され，TEM メーカーからもそれらをとして，生命科学，材料科学といった分野で活用されていま統合したソフトウエアパッケージが販売されていますので，す．

装置に合わせたシステムを導入することが TEM トモグラフ

株式会社システムインフロンティア 代表取締役 社長(〒1900012 東京都立川市曙町 283)
TEM Tomography; Hiromitsu Furukawa(President & CEO, SYSTEM IN FRONTIER INC., Tokyo)
Keywords: electron beam, tomography, transmission electron microscope, 3dreconstruction
2021年 8 月19日受理[doi:10.2320/materia.61.35]

ま て り あ 第61巻 第 1 号(2022)
Materia Japanィの準備の第一歩となります．

.

TEM トモグラフィの実践にあたって

筆者は特定の分野の研究者ではなく，こうした TEM トモ
グラフィ用のアプリケーションソフトウエアの開発・販売を行っている会社の代表で，TEM トモグラフィの導入や応用に関するコンサルティングやサポートをさせて頂いています．
20 年程前に世界に先駆けて TEM トモグラフィ用の商用ソ

フトウエアを企画・開発して以来，世代や加速電圧の異なる装置で，生物・材料分野の多様な試料における三次元構造の

図1

試料の柱状加工(1)．

観察を様々な国や地域のお客様と行ってきました．そうした経験を通して“TEM トモグラフィの撮影及び再構成において，その成否の 80 ～ 90 はソフトウエアを起動する前に決まっている．”という持論に至りました．
ソフト屋の社長がこんなことを特筆大書すると失笑・苦笑
されるのは当然と思われますが，つまりは，正確な三次元構
造を観察するには試料の調整や装置の設定を TEM トモグラ
フィに適するように工夫する事が重要である，と考える次第です．
もちろん TEM トモグラフィは TEM の技法の一つですから，その試料の作成方法も装置の操作も培われてきた技術・知見の延長線上にありますが，試料が厚くなること，試料を大きく傾斜すること，同一の視野に対して百回以上の撮影を行う，という三点において少々の配慮をして頂く必要があり
ます．
図2

.

傾斜角度の範囲と再構成結果(1)．

試料の傾斜とその調整

TEM トモグラフィの撮影は連続して試料の傾斜角度を変この図において左上の画像は全周分の連続傾斜像を使ったえながら撮影を行うだけと既に述べました．ここで，トモグ再構成結果で，傾斜軸が紙面に垂直となる断面を表示していラフィの原理を忠実に適用するのであれば，一つの傾斜軸にから±40°
までます．再構成に使う連続傾斜像の範囲を±90°

対してあらゆる角度からの透過像が必要とされますので，試毎に減らしていくと樹脂中の粒子の断面形状，試料の外形
5°

料を＋90°
から－90°の範囲で傾斜して撮影することになりま

共に，徐々に上下に引き延ばされその境界も曖昧になっていす．

く様子が観察されます．どれくらいの傾斜範囲まで許容でき

しかし， TEM トモグラフィでは， TEM のゴニオメータ

るかという判断に明確な基準はありませんが，この試料の形

こそ垂直までの傾斜に対応しているものの，試料やその保持状であれば大凡± 65°くらいまでは傾斜させないと，正しい機構の物理的制約によって傾斜可能な角度範囲が制限される

三次元構造が再現されていないと言えます．

という本質的な問題があります．

それでは実際に，試料を最大± 65°
傾斜させた状態での撮では実際，TEM トモグラフィにおいて必要十分な傾斜角度はどれくらいになるのでしょうか

ここでは，試料を柱状に加工することで傾斜角度の制約を取り払うという，東北影を行うために考慮すべき点について以下に説明します．
 ホルダ試料の調製◯

大学の陣内教授らの研究(1)の成果を参考にさせて頂きます．

既に述べた通り TEM のゴニオメータ自体は高傾斜が可能

まず，図の様に FIB を使ってジルコニア粒子を樹脂中にな構造になっているので，TEM メーカーの純正品やホルダ分散させた試料を柱状に加工してから，先端を切り落としたメーカーのカタログを観れば±60°～±80°の傾斜を可能とす

試料ホルダに接着することで，＋90°
から－90°
における連続る試料ホルダを見つけることができると思います．

傾斜像の撮影を実現しています．

但し，TEM の電子レンズのタイプによって使用の可否がそうして得られた連続傾斜像の一部を使って再構成を行あるので注意が必要です．図は日本電子株式会社製の高傾

い，傾斜角度の制限が再構成結果にどう影響するかを示した

斜用ホルダ先端部分のイラストです．右が超高分解能タイプのが図です．

のレンズ用で左が一般用です．超高分解能タイプの電子レン




特

集

図3

高傾斜用ホルダの先端部(図版提供日本電子株式会社)．
(左一般用 右超高分解能用)

ズの場合，対物レンズの磁片の隙間( polepiece gap )が試料
グリッドの径である 3 mm よりずっと小さい為，ホルダの先端をいかに工夫しても傾斜させることは物理的に不可能にな
ります．このため，半裁したグリッドをホルダに載せることになりますが，グリッドを巧い具合に切断するのには慣れが必要ですし，なにより半分に切ってしまったグリッドではホ
ルダ上で回転できませんので，観察対象の形状に合わせて傾
斜方向を最適化したいという場合の対応が出来なくなります．


図4

試料の傾斜と観察可能エリアの変化．

 グリッド
試料の調製◯

ホルダに続きグリッドの選択にも配慮が必要です．図で示した様に，試料の傾斜角度を大きくしていくと試料がグリッド自体の影に入り観察可能なエリアが狭くなっていく様子が分かります．
この影響を抑えるために，TEM トモグラフィには図で紹介している様な開口面積の大きなグリッドの使用をお奨めしています．
ただ，そうした目の粗いグリッドや単孔のグリッドだと支持膜が破損し易かったり，試料が不安定になりやすいので注意が必要です．また，スリット状のグリッドは，スリットの長手方向がホルダの中心線に直交するように配置することで高傾斜まで視野を確保できますが，グリッドを半裁した際と図5グリッドの形状と TEM トモグラフィとの適性．

同様に傾斜方向の調整の自由度は失われます．
 支持膜試料の調製◯

ちなみに筆者の経験では，三次元再構成結果から計測されグリッドの目より試料が小さい場合には支持膜が必要になる切片試料の厚さは製作者の意図と比べて3050くらい薄りますが，粉体や粉砕した試料の観察によく使われるマイク

くなっていることがほとんどです．これは，電子線よって切

ログリッドと呼ばれる網目状の支持膜は TEM トモグラフィ

片が収縮することと，ミクロトームという装置の特性の両方との相性は良いとは言えません．こうした支持膜を使う場に原因があると考えています．(電子線の照射による試料の合，通常は網目の穴部分に突き出した試料を観察領域としま

厚さの変化に関しては，久留米大学の太田教授らの論文(2)中すが，グリッドの選択の話と同じ様に傾斜していくと網目構にある写真が解りやすいと思います．）

造そのものが遮蔽物になってしまいます．



 厚さ
試料の調整◯

試料がミクロトーム切片の場合，目的の構造が含まれるくらいの厚さで切り出すことが前提となりますが，その一方で電子線照射に伴う試料の変形は不可避ですが，連続傾斜像の撮影を開始する前にビームシャワー等である程度試料の変形を落ち着かせることで安定した撮影が可能となります．



 染色
試料の調整◯

電子線が透過できる厚さでなければなりません．切片形状試

通常，生物組織や高分子等の試料は，そのままでは十分な料を傾斜すると，電子線が通過するパス，即ち見掛けの厚コントラストが得られないので，重金属を吸着させることでさ，は傾斜角のコサインの逆数となり，切片の厚さに対して染色を行います．特に TEM トモグラフィは内部構造の再構

で 2 倍， 75 °で約 4 倍と増加しますのでこの点を考慮し60 °成が目的ですから，切片の表面だけでなく内部まで十分に染て切片の厚さを調整する必要があります．

色されている必要があります．

ま て り あ 第61巻 第 1 号(2022)
Materia Japanしかし試料内部の染色状態を把握するのは難しく，実際に染色が不十分だった為に三次元再構成が終わってみると表面 金属材料
試料の調整◯だけで“餡子のない最中”の様な結果が得られた経験も少な

金属試料を TEM で観察する場合は，研磨やミリングといくありません．反面，染まりすぎると電子線の透過が悪くなった方法で調整された極薄い部分を観察しますが，試料の傾り高傾斜時の撮影が難しくなりますので，試料の材質，構造

斜後厚さや形状の変化が大きく，TEM トモグラフィとの相といった特性に合わせた塩梅を経験から得て頂く他はありま

性は良くありません．
最近では FIB で棒(針)状に加工した試料を，専用のグリ

せん．
クライオ試料等で染色ができない場合は，画像処理に必要ッド( Omniprobe 社製等)を使って真空中に突き出させてトなコントラストが得られない事が多く，自動での撮影は難し

モグラフィを行う方法が主流になりつつあります．棒状の試

くなります．しかし，比較的低い(ゴニオメータの機械的な料の長手方向と傾斜軸を合せれば，傾斜角度による試料の厚再現性が期待できる程度)倍率であれば，各傾斜角度におけさの変化がありませんので高角度での撮影が可能となります

る視野及び焦点の移動量をあらかじめ計測しておき，撮影時が，傾斜方向に垂直な画像情報が少ないためアライメントのにそれを参照することで自動撮影を行うといった機能を搭載

精度が十分でないという欠点があります．

したソフトウエアもあります．

これを避けるために，棒状の試料を支持膜付きの通常メッ

また，金粒子等をマーカーとして試料に混載する方法も良シュの上に置いて撮影し，アライメントに支持膜のコントラく知られていますが，こうしたマーカーは再構成結果に悪影ストを利用することで理想的な再構成が可能となります．

響を及ぼす可能性ありますので使用時には注意が必要です．


樹脂等，非導電体の切片試料の傾斜角度を大きくしていくと試料が周期的な動きを見せることがたまにあります．いわ
ゆる電荷の蓄積によるドリフトなのですが，既に述べた様に試料を傾斜することで試料の見掛けの厚みが増して電荷が蓄積しやすくなるため発生していると考えられます．こうした場合は，カーボン等，導電性を高めるコーティングを施すことが一般的ですが，TEM トモグラフィの場合は，これを試料の両面に行うとより安定します．


. TEM の 設 定 導電コート
試料の調整◯

 形状
試料の調整◯

調整した試料ホルダを TEM にセットした後は，TEM ト
モグラフィに向けた装置設定を行っていきます．



 倍率
TEM の設定◯

ここで適正な倍率について説明する前に，TEM トモグラ
フィが適用できる倍率の上限と下限ついて考察します．
まず上限ですが撮影された画像のスケール情報(nm/pix.)
が各装置の仕様書に記載された点分解能(200 kV の LaB6 機
で 0.2 nm / pix. 程度)と同じになる辺りと考えられます．こ
れはカメラが蛍光板の下に設置されている構成で，150 k か

いままで，主に切片やバルクの試料で TEM トモグラフィ

株 日本電子製
ら 200 k 倍程度となります．(一部機種を除く

を行う際のポイントを説明させて頂きましたが，TEM トモ

TEM の倍率表示において．顕微鏡メーカーによってこの倍グラフィに向いていると考えられる他の形態の例を紹介しま

率の表記がまちまちなので注意が必要．）

す．


これ以上の倍率での撮影になると，撮影画像の解像度がレプリカ傾けても厚さの変化が小さいので高傾斜が可TEM の光学分解能を上回ってしまい，撮影画像 1 pix. に有能で，像のコントラストも高く，撮影も容易なことが多いで意な情報が含まれない場合が生じることになります．そのた

す．更に再構成結果も立体的で見栄えがするので装置やソフ

め，ソフトウエアでの位置合わせや焦点調整の動作が不安定

トウエアのデモ等にもよく使われます．ただ，試料自体に内になります．仮に，手動での撮影を行ったとしても，上限倍部構造が無いので物体内部を再構成できるという TEM トモ

率で撮影した画像をデジタル処理で引き延ばした以上の画質

グラフィの特徴は活かせません．

は得られないことになります．

パーティクル材質にもよりますが， 200 nm くらいま

反対に倍率の下限ですがこれは試料の厚さで規定されるとでの粒径のパーティクルやフラグメントは比較的疎な状態で考えられます．即ち，試料の厚さが 200 nm の時に画像のス支持膜上に分散できれば高傾斜可能で理想的な撮影が出来ま

ケール情報が 10 nm / pix. 程度の倍率で撮影したとすると，

す．

再構成される三次元像の Z 方向のピクセル数は 20 pix. とな







ファイバーパーティクル同様に分散の状況次第で高傾ります． X Y 方向が 1000 pix. ないし 2000 pix. に対して Z

斜が可能です．複数のファイバーが絡まった状態を撮影するが 20 pix. 程度という結果が三次元データとして有効なのか

際は傾斜しても他の凝集体と重ならない視野を探します．フ

疑問になりますが，だいたいこの辺りが下限になると考えてァイバー 1 本を高倍率で撮影する際は，グリッドを回転さ良いと思います．これは，先ほどと同じくカメラが蛍光板のせてファイバーの方向を傾斜軸に近づけると良好な結果を得下に設置されている構成の場合で 1500倍から 2000 倍に相当られます．

し，ほぼ通常観察モードの下限倍率とも一致するので特に配慮する必要はありませんが，カメラが蛍光板の上に設置され




特

集

ている場合は下限の倍率について意識する必要があります．
上記の範囲内で適当な倍率を選択しますが，目安は試料を 撮像モード
TEM の設定◯

傾斜しない状態で，撮影範囲の上下，左右をそれぞれ三等分

TEM ト モ グ ラ フ ィ を TEM モ ー ド で 行 う 方 が 良 い かしたラインで構成される中央部のセクションと三次元観察しSTEM モードで行う方が良いかという質問を受けることがたい関心領域がほぼ同じか，少し大きくなるくらいの倍率が多くあります．

基準となります．これは，傾斜に伴い予期しない構造が現れ

STEM のメリットは一点に収束された電子線による強いる可能性に備える目的の他，撮影後の連続傾斜像を処理する

透過力と暗視野像による回折コントラストの低減，それと引際の回転等の自由度を持たせる為でもあります．

き換えのデメリットはコンタミネーションの付き易さです．

 絞りと照射条件
TEM の設定◯

TEM の操作に習熟した方であれば，像質の改善や試料保護の為に観察に適した絞りを選択されると思いますが，本特集の後編で九州大学の波多教授が STEM トモグラフィについて専門的な記事を書かれていると思いますので，ここでは TEM /STEM の使い分けに対する私見だけ述べさせて頂く事とします．

TEM トモグラフィで自動撮影を行う場合は多少像質が低下

試料がさほど厚くない場合，試料の特性がよく分からない

しても視野に余裕を持たせる事を優先して，大きめの絞りあ場合はまず TEM モードで連続傾斜像の撮影を試みてくださ

るいは開放での撮影をお奨めしています．同様に，蛍光板上い．試料を傾斜させると TEM モードでは観察できなくなるのビーム径も撮影素子に対して十分に大きめにしておくこと

くらい試料が厚い際には STEM の明視野像に切り替えて撮が好ましいです．その理由は，自動撮影では結像位置や焦点

影を，結晶性の試料で回折コントラストの影響が大きい場合の調整の為に偏向系のコイルや照射系・結像系のレンズを制には， STEM の暗視野像で撮影というのが私の選択基準で御しますが，これらの条件が大きく変化した際にビームや絞す．

りの端が撮影エリアに入り込んでしまうことを避けるためで

ちなみに， STEM モードの場合は再構成時に像を回転さす．もちろん，ソフトウエアにはビームの中心を維持する仕せる必要が無いので，先に説明した TEM モードでの倍率の組みや，絞りの影が検出されたら警告する機能が備わってい基準より少し高めの倍率で撮影してかまいません．

ますが，安定した連続傾斜像の撮影を行うために TEM 側の.

設定でゆとりを設けておくことは極めて有効です．

撮影ソフトウエアの設定“像質に妥協するのは TEM 屋の矜持に反する”という方もおられるとは思いますが，通常 TEM の撮影は一つの視野

TEM の設定が終わったら，いよいよ自動撮影ソフトウエ

で最良な一枚を撮影できれば成功であるのに対して，TEM

アを使用しての連続傾斜像撮影となります．もちろん，ソフ

トモグラフィの撮影は±60°とか±70°
といった範囲で均質なトウエアによって異なりますが，ここで留意すべき点は撮影

画像を撮影することが目的となります．傾斜していない時の時の画素数と傾斜における角度の間隔程度です．

画質だけ素晴らしくても高傾斜時に有意な撮影が出来なくては意味がありません．これは試料へのコーティングや支持膜 撮影画素数
撮影ソフトウエアの設定◯の選択においても言えることです．画質が悪くなると敬遠さ撮像素子の画素数は増える一方で，最近では 16 M pix.

れがちな厚めのコーティングや穴無しの支持膜も TEM トモ( 4096 pix. × 4096 pix. )相当が一般的になりました．もちろ

グラフィにおいては，画質以上のメリットをもたらす場合がん，そのままの画素数でも撮影を行う事は可能ですが，再構あります．

成や可視化の処理を通常の PC で行う事を考えると現状では 加速電圧TEM の設定◯

既に述べてきたように，TEM トモグラフィの撮影におい4 M pix.(2048 pix.×2048 pix.)程度の画素数での撮影が画質と効率のバランスが良いと考えています．
16 M pix. の撮像素子で 4 M pix. の撮影を行う場合，撮像て透過力は重要なファクタです．したがって加速電圧は使用

素子全面を使ってビニング( binning)機能で画素を少なくすする TEM の最大電圧が基本となります．ただ，電子線損傷

る方法と，撮像素子の中心部のみをクロップして使う方法がを受けやすい試料の場合は撮影が可能となる電圧まで下げざあります．撮像素子が CCD だった頃は感度を上げる目的でるを得ません．この場合でも，コーティング等の処理で試料前者が主流でしたが，撮像素子が CMOS となった今日での強度をコントロール出来るなら可能な限り高い加速電圧をは，後者の方が TEM のイメージサークルを無駄に広げるこ選びたいところです．

と無く高倍率の撮影ができるので有利です．

撮影の際の露出も同様です．高傾斜時を想定すれば，なる
べく明るい条件が望ましいのですが，ビーム径が小さくなり過ぎることや，撮影途中で試料が焼損してしまうことは避けなくてはなりません．

 傾斜角度の間隔
自動撮影ソフトウエアの設定◯が基本です．ソフトウエア的には 1°
傾斜角度の間隔は 1°未満の設定も可能ですが，その場合，設定角度に対する機械的な応答性は TEM の機種や個体差に依存すると考えられます．

ま て り あ 第61巻 第 1 号(2022)
Materia Japan試料のダメージやコンタミネーションが心配される場合

果次第で再構成される断面形状が大きく変わってしまうにもは，間隔を大きくして撮影枚数を減らしますが，それも 2°

かかわらず，アライメントの良否の評価が難しい点にありま程度までが目安です．それ以上の角度だと情報量が不足します．アライメントが再構成結果に及ぼす影響を図に示してすので再構成時に後述する代数的解法を選択する必要がありいます．

ます(3)．

アライメントの評価を容易にするため，試料にマーカーを生物分野からのニーズでサクストン・スキーム( saxton

配置する方法もありますが，マーカー自体が測定中に移動しscheme)という角度設定があります．これは，傾斜角度に応たり，試料の収縮の影響を受ける事もありますので絶対的なじて角度の間隔を連続的に変化させる方式なのですが，前提指標とはなり得ません．なによりマーカー自体が再構成結果としているモデルが二次元形状の射影なので，ごく薄い試料にノイズ(アーチファクト)を生じさせる原因となりますかを低倍率で観察する場合以外の使用は適切ではありません．

ら，使用する場合には粒径や分散の具合に十分な注意が必要です．(一応，そうした影響を抑える機能を有するソフトウ

.

三次元再構成エアもありますが，試料レベルでの配慮ができればそれに越したことはありません．）

撮影が終わったら，連続傾斜像のファイルを三次元再構成用のソフトウエアに読み込んで処理を進めていきます．
 アライメント
三次元再構成◯ 解析的解法による再構成
三次元再構成◯透過信号から断面が再構成される原理は 1917 年に数学者
Johann Radon によって証明されたラドン逆ラドン変換対

三次元再構成は多数(～150枚程度)の TEM 画像(二次元)で説明されます．TEM トモグラフィにおいては傾斜を伴うを入力して立体構造(三次元)を計算するプロセスですが，実試料撮影がラドン変換に相当しますので，撮影した連続傾斜際は図に図説するように，各 TEM 画像から傾斜軸に直交像に対して逆ラドン変換を行えば元の試料の構造が戻せるこ

する同じ位置の直線成分(一次元)を取り出し，それらから一とになります．

断面の再構成を実行，その処理を傾斜軸に沿って繰り返し行

ここでは数式を使った解説はいたしませんが，逆ラドン変うことで三次元を積み上げるという手順になります．このた換で一断面を再構成するには，一次元の FFT を撮影枚数とめ，各画像上における傾斜軸の位置を正確に知る必要があり同じ回数，二次元の IFFT を 1 回行うだけですので，非常ます．

に高速に演算を実行することができます．

X 線 CT 装置では線源と検出器の軌道は装置側で固定されていますので傾斜軸の位置は既知情報となります．

それぞれの変換の物理的作用からラドン変換をプロジェク
ション(投影)，逆ラドン変換をバックプロジェクション(逆一方，TEM の場合は，ゴニオメータの構造的にも，傾斜投影)と表すことも多く，逆ラドン変換が積分式であること

後に視野を調整するプロセスがあることからも，傾斜軸の位から，この再構成方法は解析的解法とも呼ばれています．

置に関する情報は装置側では決められません．よって，連続解析的とはいえ，実データを使って計算する場合には積分

傾斜像を解析することで傾斜軸の位置を求めなくてはなりま

では無く，撮影ステップ毎の離散的な処理になってしまいま

せん．こうした解析を行うことを TEM トモグラフィではアす．このためフーリエ空間で周波数の均衡が崩れてしまい，

ライメント(alignment)と呼んでいます．

図で示した様に高周波数成分を持ち上げるハイパスフィル

実は，撮影後の処理においては，このアライメントが一番
重要かつクリティカルです．その理由は，アライメントの結タを使った補正が必要になります．
こうしたフィルタ処理が含まれる事から，トモグラフィで行われるバックプロジェクションは，フィルタードバックプ

図6




再構成のプロセス．

図7

アライメントの良・不良と再構成結果．

特集

ロジェクション( Filtered Back Projection ，以降 FBP )と呼ばれています．まれに filtered ではなく weighted と表現して WBP と呼ばれていることもありますが処理内容は同じです．逆ラドン変換を忠実に計算機用に最適化したとも言える処理で，高速演算が可能ですので CT の商用機において半世紀以上もの間，主流の再構成方法とされています．
 代数的解法による再構成
三次元再構成◯医療用の CT 装置開発においては，低線量，高速スキャン
といったニーズに対応すべく， S / N 比の悪い信号や少ない
プロジェクションでも高画質の再構成ができるよう， FBP
図8に代わるアルゴリズムが研究されてきました．(本特集でもハイパスフィルタ処理の有・無と再構成結果．

筑波大学の工藤教授が専門的な解説を書かれておられると思います．）
すでに非常に多くの解法が提唱されていますが，基本となる考え方は共通で，再構成したい断面を未知数の行列とし，この行列のプロジェクションと実際に撮影されたプロジェク
ションの比較を行い，その結果を未知数の行列に反映，再び，その行列のプロジェクションと実際に撮影されたプロジェクションを比較するという手順を繰り返し，両者の差が無くなれば，未知数の行列が解けた(＝再構成ができた)とする
方法で，逐次近似法とか反復法と呼ばれます．また，行列演
算を使う事から先の解析的解法に対し，こちらを代数的解法と区別しています．
比較や反映方法の多様性から，多くの名称のアルゴリズムが存在し，いずれも原理的に演算時間が FBP の数十数千
倍と非常にコストの高い演算となりますが，計算機の性能向
図9上，特に GPU を使った並列演算技術の進歩でその欠点が解

クライオ撮影されたウイルス．

消されつつあります．
また，統計力学の手法や各種の先見情報を加味することでより性能を高めたとされるアルゴリズムが次々と発表されてを避けるためにコロイド金がない右下の正方形部分を再構成

おり，目的と手段がマッチすれば良い結果を期待できます．

エリアとしました．TEM 写真を見て解る通り無染色の為，対象物のあらゆる角度から数千回ものスキャンを行える

ウイルスのコントラストは非常に低くなっています．また，

X 線 CT の場合，通常の条件であれば FBP で十分な画質がステップでの撮影と言電子線による損傷を避けるために 2 °得られますが，プロジェクション数が CT の 1 / 10 以下で，う条件も重なり， FBP での再構成結果では目的のウイルス

傾斜角の制限もある TEM トモグラフィでは， FBP が適用の形状はほとんど判別できません．

出来るぎりぎりの条件であるとも言えます．従って，像質や一 方 ， 代 数 的 解 法 の 一 つ で あ る SIRT ( Simultaneous

撮影枚数が厳しい場合には，代数的解法を適用する必要があReconstruction Technique )で再構成した結果ではウイルス

ります．

の形状がはっきり再構成できています．

ただ，いずれの代数的解法もアルゴリズムによってその指向とも云える特徴がありますので，データの特性に合わせて適切な解法を選択しなくてはなりません．以下，代表的な代数的解法による再構成の効果を紹介します．


コントラストが低い試料

図の試料は非晶質の氷に包埋されたウイルスです．いわ

ハイパスフィルタの影響が顕著な試料

図の試料は神経細胞の一部でニューロンの周りにオリゴ
デンドロサイトが巻き付いてミエリン鞘を形成している様子を捉えています．TEM 像では，バウムクーヘンの様な環状の層をなしているミエリン鞘がはっきり観察できますが，
FBP で再構成を行うとミエリンの層が画面の水平と近くな

ゆるクライオ試料で，試料保持部を液体窒素で冷却することる辺りの構造が消えて見えます．これは， FBP の計算過程で，凍った状態のままの試料を観察出来るホルダにセットしで行われるフィルタ処理によって低周波成分の信号が弱まっています．中央部の黒い小さなパーティクルは撮影の指標とてしまった為に生じた結果です．代数的解法であればフィルするために配置したコロイド金です．アーチファクトの影響

タ処理は行われませんのでそういった影響は発生しません．

ま て り あ 第61巻 第 1 号(2022)
Materia JapanFe や Pt の粒子が ISER の結果では明確に再構成されていることが分かります．

. TEM トモグラフィに有効な画像・信号
海外での事例ですが，弊社の製品( TEMographyTM )を導入頂いた研究者が，反射電子像を使った TEM トモグラフィの結果を学会で発表していたことがありました．原理的には反射電子や二次電子の画像では TEM トモグラフィはできま
せんが，ソフトウエアの厄介なところは，入力する画像の物
理的な意味にかかわらず，フォーマットさえ合っていれば処
図10

ミエリン鞘の断面．

理ができてしまうところです．もちろん，そうして得られた結果は全くのデタラメであることは言うまでもありません．
では，どういった画像が TEM トモグラフィに適用可能であるのか少し考察してみます．
トモグラフィとは X 線や電子線が物体を透過する間に減衰する量をいろいろな経路上で計測することで，入射した波の通りにくさのマップを作成する事と言い替えられます．ですから，TEM トモグラフィの再構成ソフトウエアに入力できるのは，“試料を透過した像であること”，“吸収・散乱の状態を反映した像であること”という二つが条件になります．
TEM 像でも通常の吸収・散乱コントラストは問題ありま

せんが，位相コントラストでは再構成ができません．
同様に位相板を使ったコントラスト増強は，散乱・吸収以外の条件が反映されているので再構成結果の物理的な意味が不明です．
結晶性の材料で生じる回折コントラストは，TEM トモグ
ラフィにとってはノイズです．最近では，試料を傾斜させな
図11

FePt 粒子(撮影枚数14枚)．

がら撮影した回折像から立体構造を決定するマイクロ ED が注目されていますが，当然，全く別の原理ですので TEM ト
モグラフィ用のソフトウエアは使えません．

こうした方向に依存して再構成結果の一部のコントラスト

STEM の場合，BF 像は TEM 像と同じ原理なので問題はが消えてしまう原因が傾斜角度の制限による影響(ミッシンありませんし，DF 像は散乱した電子線を画像化しているのグウエッジ問題)にあるとして，二軸トモグラフィの必要性

で，コントラストが逆転している事と，輝度と厚みの関係がのエビデンスとされることがありますがそれは間違いです．

BF 像と異なる点を再構成計算時に考慮すればトモグラフィ

撮影枚数が少ないケース

は成立します．
EELS ( Electron Energy Loss Spectroscopy 電子エネル

2013 年から 17 年の 4 年間，九州大学，バージニア工科大

ギー損失分光法)は原理的には問題ありませんが傾斜角度が学，大阪大学，筑波大学と弊社で，科学技術振興機構の先端大きくなった時に有効な信号が得られるか否か，という別の機器開発プログラムの支援のもと，リアルタイム・トモグラ問題が生じてきます．

フィ開発に取り組みました(4)．この時の課題の一つにトモグ
ラフィの高速化に向けてどこまでプロジェクション枚数を減

TEM トモグラフィと EDS

らすことができるか，というものがありました．この命題に電子線によって励起された特性 X 線を解析することで元対して筑波大学の工藤教授と共同で開発したアルゴリズムが素組成を明らかにする EDS(Energy Dispersive xray Spec-ISER(Iterative Series Reduction)です(5)．

圧 縮 セ ン シ ン グ ( Compressed Sensing ) の 原 理 を 取 り 込み，少ない撮影枚数からの再構成を可能にしています．

troscopy )は分析を目的とした TEM には欠かせない付属機器となっています．
従来の検出器と比較して高感度を実現した，SDD(Silicon

図では，－65°
から＋65°
まで 10°
ステップで撮影した，

Drift Detector )登場がきっかけで各 TEM メーカーは EDS

わずか 14 枚の連続傾斜像から再構成を行った例を示していトモグラフィ( STEM EDS で得られた元素マップ像から三ます． FBP による結果ではノイズに埋もれてしまっている

次元の元素マップを再構成する手法)を新機能と謳っていま




特

集

すが，厳密には“透過信号ではない”という理由から TEM化された TEM と専用のソフトウエアにより，TEM トモグ

トモグラフィの適用は適切ではありません．

ラフィは誰もが試せる手法となりました．

ただし， TEM に装着した EDS の場合は同視野の STEM

今後も TEM のシステムや撮像素子，計算機の性能は更に像が同時に撮影できますので， STEM 像が撮影できている

向上するものと思われますが，TEM トモグラフィの原理やなら電子線は透過できているだろう．故に入射した電子線が物理は未来永劫に変わることはありません．本稿が TEM ト

試料内部で特性 X 線に置き換わったと考えればトモグラフ

モグラフィの活用を考えておられる方の一助となれば幸いでィも可能，という少々グレーな理屈の上に正当化されています．

す． EDS トモグラフィを行う際は試料の厚さに注意して，最後になりますが，本稿の執筆にあたり多くの御助言を頂

必ず STEM 像の再構成結果と元素マップの再構成結果を見いたバージニア工科大学の村山光宏教授に御礼を申し上げま

比べて結果の妥当性についての確認・検討が必要です．

す．




TEM トモグラフィと収差補正機

文

献TEM の性能を飛躍的に向上させた立役者である球面収差補正機(Cscorrector)ですが，これによって得られる像自体
は TEM も STEM も当然ながら TEM トモグラフィの適用対象です．
しかし残念な事に自動撮影との相性は良いとは言えません．その理由は収差補正機が常に厳密な調整を必要とすることにあります．既に述べた様に TEM トモグラフィ( TEM /STEM 共に)では試料を傾斜させる毎に視野や焦点位置を再調整します．このため，最適に合わせたはずの収差補正機のセッティングがすぐにずれてしまい，収差補正の性能が100維持できません．

( 1 ) N. Kawase, M. Kato, H. Nishioka and H. Jinnai: Ultramicroscopy, 107(2007), 815.
( 2 ) K. Ohta, R. Higashi, A. Sawaguchi and K. Nakamua: Journal of
Structural Biology, 177(2012), 513519.
( 3 ) Y. P. Yu, H. Furukawa, N. Holii and M. Murayama: Metallurgical and Matelials Transactions A, 51(2020), 2027.
( 4 ) S. Hata, S. Miyazaki, T. Gondo, K. Kawamoto, N. Horii, K.
Sato, H. Furukawa, H. Kudo, H. Miyazaki and M. Murayama:
Microscopy, (2016), 111.
( 5 ) 工藤博幸，董建，加茂勝己，堀井則孝，古河弘光，波多聰，村山光宏，佐藤和久，宮崎伸介顕微鏡，51(2016), 48
53.
( 6 ) D. J. DE ROSIER and A. KLUG: Nature, 217(1968), 130134.

収差補正機の調整も自動化されてはいますが，試料傾斜の★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
2010 年 7 月

株式会社システムインフロンティアを設立，取締役・副社長に就任
2019年 2 月 代表取締役・社長に就任◎電子線トモグラフィ用ソフトウエアの他，透過型電子顕微鏡・走査型電子顕微鏡向けの応用ソフトウエ
ア，画像解析ソフトウエアのコンサルティング，ユーザーサポートといった活動を国内外で展開．
https://www.sifi.co.jp/about/

度にこれを行うというのも現実的ではありません．

.

お わ

り

に

TEM トモグラフィに関する最初の論文は 1968 年に D. J.
DE ROSIER と A. KLUG によって Nature 誌に発表されて古河弘光★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★

います(6)．それから半世紀が経過し，制御や撮像がデジタル

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