TissueCyte 1400FC
Hig ht-Sp eed A utoM ate d W hole Org an Hist olog y

2 フォトン共焦点顕微鏡対応

全自動多光子マルチセクショニング画像収録システム

TissueCyte 1400FC は、例えばマウスの摘出脳を上部から、内臓される高性能ス
ライサーで順次自動セクショニングを行い、2 フォトン共焦点顕微鏡にて高倍率にて、X-Y-Z 方向に画像ファイリングします。切片厚 100μm、1.4μm/ピクセルの条件の場合、全脳の詳細な画像ファイリング作業は、全自動で４時間で行えます。

マウス脳による画像ファイリング時間の一例
1.4μm/ピクセル ｘ100μm 切片厚1.4μm/ピクセル ｘ 50μm 切片厚0.35μm/ピクセル ｘ100μm 切片厚150 セクション 4ｈ
300 セクション 8ｈ150 セクション 20ｈ

本器搭載全自動セクショニングシステムの性能
切削表面全域に亘る２光子スキャンを行っても画像に影響が出ないような、ゆがみの少ない高精度なセクショニングが、最小 50 ミクロン厚のセクションニングが行えます。また、切削したサンプルは回収可能です。

原理・構成図2 Photon(STP) Tomography としてのTissueCyte1400FC には、通常のtwo-photon microscope が配置されます。共焦点顕微鏡については様々な論文に記載されていますので説明は省略します。対物レンスの配下には、専用ワークステーションで制御される高性能 XYZステージが配置され、脳固定チャンバーの位置制御を行います。
Coronal に固定された脳は、上面から、最小 40μm(一般的には 100 μm)毎に、内臓される高性能スライサーによってセクショニングされます。セクショニング終了、電動ステージによって最初の撮像開始ポジションに顕微鏡の対物レンズ下に移動され撮像を開始します。撮像された
い解像度は対物レンズに依存されます。
よって、各セクションの画像ファイリング時間は異なってきます。解像度を高めるほど時間は要します。セクション毎の画像は、2080x2080(16bitTIFF)で保存され、セクショニング+二次元的画像ファイリ
ングの繰り返しで、標本の三次元的画像ファイリングを全自動にて行います。
TissueCyte1400FC 用ワークステーショ
ンには、充実したソフトウエアが付属され、連続する二次元的ファイルは、三次元的ファイルに集約されます。研究目的によって標識ラベルされた部位は、どこの方向からも切り出しが行え、二次元のみならず、三次元的に標的物質の局在が把握することができます。C：3D 表示
されたマウス脳を、任意の部位でカット。
コロナルセクション(GFPM,20xObject,0.5μm XY 撮像)、スケー
ルバーは、d-e は、25μm、d の枠内は、 5μm です。

NIH Public Access: Serial two-photon tomography: an automated method for ex-vivo mouse brain imaging
Timothy Ragan1,*, Lolahon R. Kadiri2,*, Kannan Umadevi Venkataraju2, Karsten Bahlmann1,Jason Sutin1, Julian Taranda2,Ignacio Arganda-Carreras3, Yongsoo Kim2, H. Sebastian Seung3, and Pavel Osten2
1TissueVision, Inc., One Kendall Square, Cambridge, MA 02139
2Cold Spring Harbor Laboratory, One Bungtown Road, Cold Spring Harbor, NY 11724
3Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Howard
Hughes Medical Institute, Cambridge, MA 02139
装置論文より掲載

Figure 2.
Retrograde tracing by CTB-Alexa-488.
(a) 3D view of a coronal section
comprising the injection site (i) andseveral retrogradely labeled regions(ii-iv). Lower left: position of the sectionin the whole brain (approximately −1.15
mm from Bregma). (b) Coronal(top),sagittal (bottom), and horizontal
views of the injection site. (c) Corticalregions marked up in (a), comprising: (i)the injection site in the barrel field of the
primary somatosensory cortex (S1BF),(ii) ipsilateral secondary somatosensory
cortex (S2), (iii) granular insular cortex(GI), and (iv) contralateral S1BF. The
panels (ii-iv) are shown with enlarged
regionsfrom supragranular and infragranular
cortical layers comprising CTB labeledcells. The scale bar is 250 μm in panel (i)and 50 μm in the enlarged view of panel(ii).
Alzheimer's Disease

Models

Viral Vector Bio-Distribution

システム構成1) 装置基本ユニット●多光子画像収録ユニット●全自動セクショニングユニット
2) 付属対物レンズセット(16x, 10x) ・・・・・・・・
3) システムワークステーション ・・・・・・・・・・
4) システム用ソフトウエア ・・・・・・・・・・
5) 画像収録用拡張ストレージ部 ・・・・・・・・・・
6) 多重スキャンシステム ・・・・・・・・・・
7) 多光子励起用レーザー ・・・・・・・・・・

Vasculature Assays

掲載文献
Oh, Seung Wook, Julie A. Harris, Lydia Ng, Brent Winslow, Nicholas Cain,
Stefan Mihalas, Quanxin Wang, et al. “A Mesoscale Connectome of theMouse Brain.” Nature 508, no. 7495 (April 10, 2014): 207–14.
Vélez-Fort, Mateo, Charly V. Rousseau, Christian J. Niedworok, Ian R.
Wickersham, Ede A. Rancz, Alexander P. Y. Brown, Molly Strom, and Troy W.
Margrie. “The Stimulus Selectivity and Connectivity of Layer Six Principal
Cells Reveals Cortical Microcircuits Underlying Visual Processing.” Neuron
83, no. 6 (September 17, 2014): 1431–43.
Feng, David, Chris Lau, Lydia Ng, Yang Li, Leonard Kuan, Susan M. Sunkin,Chinh Dang, and Michael Hawrylycz. “Exploration and Visualization ofConnectivity in the Adult Mouse Brain.” Methods, Spatial mapping ofmulti-modal data in neuroscience, 73 (February 2015): 90–97.
Kim, Yongsoo, Kannan Umadevi Venkataraju, Kith Pradhan, Carolin Mende,
Julian Taranda, Srinivas C. Turaga, Ignacio Arganda-Carreras, et al.
“Mapping Social Behavior-Induced Brain Activation at Cellular Resolution inthe Mouse.” Cell Reports 10, no. 2 (January 13, 2015): 292–305.
Vousden, Dulcie A., Jonathan Epp, Hiroyuki Okuno, Brian J. Nieman, Matthijsvan Eede, Jun Dazai, Timothy Ragan, et al. “Whole-Brain Mapping ofBehaviourally Induced Neural Activation in Mice.” Brain Structure andFunction, (April 24, 2014): 1–15.
Ragan, T., Kadiri, L.R., Venkataraju, K.U., Bahlmann, K., Sutin, J., Taranda,J., Arganda-Carreras, I., Kim, Y., Seung, H.S., and Osten, P. Serial
two-photon tomography: an automated method for ex-vivo mouse brain
imaging. Nature Methods, 2012.
Ragan, T., et al., High-resolution whole organ imaging using two-photon
tissue cytometry. Journal of Biomedical Optics, 2007. 12(1): p. 014015.
Gleave, Jacqueline A., Jason P. Lerch, R. Mark Henkelman, and Brian J.
Nieman. “A Method for 3D Immunostaining and Optical Imaging of the Mouse
Brain Demonstrated in Neural Progenitor Cells.” PLoS ONE 8, no. 8 (August6, 2013):
Kim, K.H., et al., Three-dimensional tissue cytometer based on high-speed
multiphoton microscopy. Cytometry. Part A : The Journal of the International
Society for Analytical Cytology, 2007. 71(12): p. 991-1002.
Bahlmann, K., et al., Multifocal multiphoton microscopy (MMM) at a framerate beyond 600 Hz. Optics Express, 2007. 15(17): p. 10991-10998.

Figure 3.
Anterograde tracing by AAV-GFP and brain warping. (a) 3D view of a coronal section
comprising the injection site (i) and several anterogradely labeled regions (ii-v). Lower left:
position of the section in the whole brain (approximately −1.9 mm from Bregma). (b)Coronal (top) and sagittal (bottom) views of the injection site. (c) The injection site (S1BF).
(d) Brain regions (ii-v) marked up in (a), comprising: (ii) ipsilateral caudoputamen (CP);(iii)axon fibers in the internal capsule (ic) (iv) ventral posteromedial thalamus (VPM) andposterior thalamus (PO), and (v) contralateral barrel cortex (S1BF). The enlarged views
show inverted grayscale images for better visualization of axon fibers and varicosities. The
scale bar in (c) and (d-ii) and the enlarged view of (d-ii) is 250 μm. (e) One section from a
combined “virtual” two-tracer dataset generated by warping AAV-GFP brain onto
CTBAlexa-488 brain (see Supplementary Video 8). (f) Brain region marked up in (e)comprising motor cortex (M1) with overlapping anterograde (AAV-GFP, red color) andretrograde (CTB-Alexa-488, green color) labeling.

1400FC

標準還流固定法、一般的切片、アガロース標本固定

自動セクショニング、
画像収録