【大賞】 2008日本ストックホルム青少年水大賞

オオサンショウウオの保全は水辺を守る―放流実現に向けた遺伝子研究―広島県立広島国泰寺高等学校理数ゼミ生物班
1. 序論

能性がある。そこで、オオサンショウウオが減少

西日本の河川にはオオサンショウウオ（大山椒魚）した河川に幼生を放流し、繁殖に必要な個体数をと呼ばれる両生類が生息している（図1）。最大の確保して、集団が健全に生き延びる手助けをする。

特徴はその桁外れな大きさにある。最大で150cm

これによって生態ピラミッドを回復・維持し、水に及び、およそ3億6千万年前の古生代、地球上を環境を保全できないかと考えた。

闊歩していた巨大両生類を彷彿とさせる。まさにまず、放流実現のためには、オオサンショウウオ生きた化石と言われる所以である。現在、世界でが地域的にどの程度遺伝的に分化しているのか、は日本、中国、アメリカのわずか三か国に3種が生その遺伝情報を詳しく把握し、遺伝子撹乱を防ぐき残るにすぎない。世界でも代表的な希少種のひことが絶対的な必要条件となる。しかし、この動とつとなっている。我が国では、1826年、オラン物の生態や行動には謎が多く、とくに遺伝的情報ダの医師、シーボルトが江戸参府の際に個体を入手は皆無に等しかった。そこで私たちは、オオサンし、世界の学会で初めて紹介した。それ以来、我がショウウオの遺伝的地域差の解明を最終目標とし国の自然と文化の象徴として手厚く守られてきた。て遺伝子研究に取組んだ。その結果、日本のオオ

私たちの地球は海が大半を占める水惑星である。

サンショウウオは遺伝的地域差が極端に小さいこ

生命体は水を背景として構成されており、水と生とがわかった。この遺伝的均一性は、水環境の変命は切り離す事ができない。それゆえ、水環境を化が一瞬にしてオオサンショウウオの減少を引き守ることはすなわち、生命を守ることに等しい。

起こす危険性を警告している。私たちは、改めて私たちは、この水環境を守るために、大きく2つの水環境保護の重要性を知らされることとなった。

方法があると考えた。一つは、水そのものを浄化一方、中国を訪れてオオサンショウウオ保全の活する直接的方法であり、もう一つは、河川生態系動を学び、アメリカの高校と協力して、アメリカに確立した生態ピラミッドを保持する方法である。

オオサンショウウオの遺伝子解析にも着手した。

オオサンショウウオは里山の河川生態系の頂点にそして最後に、私たち自身が解析した遺伝子配列君臨する。それゆえ、オオサンショウウオの数にをもとに遺伝子音楽を作成した。清流を彷彿とさアンバランスが生じると生態ピラミッドは瞬く間せるその美しい遺伝子メロディーによって、オオに崩壊し、その結果、水環境も一変してしまう可サンショウウオを広く認知してもらい、里山河川の水環境保護の重要性について一人でも多くの人に気づいてほしいと願う。

2. 研究材料と研究方法（1）研究材料
遺伝子解析に用いた個体を表1に示す。広島集団については、広島大学と広島市安佐動物公園から提供を受けた。地域差解析に用いる全国33のサンプルは、日本動物園水族館協会の協力により、文図1 オオサンショウウオ

化庁からの許可を得た後、各機関からの提供を受

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表1 研究材料

図2 XbaIで切断したDNAの電気泳動
M, 分子量マーカー

けた。そして、アメリカの個体は、共同研究校でを占める反復DNA配列であることが推測された。

あるAAST校がライコミング大学の協力を得て入手断片を切り出し、クローニングを行って塩基配列したものである。

を決定したところ、258bpの配列が内部の1kbpを（2）研究方法挟んで両端に逆向きに配置していることがわかっa）DNAの抽出た。さらに、その258bpの内部にはTGACATCAのDNAの抽出と精製において、広島の胚組織はフ8塩基パリンドロームが4塩基ごとに12回繰り返すェノール法を用い、固定標本と各地方の組織サン構造をとっていた（図3）。日本の他のサンショウ

プル及びアメリカの個体はカラム法（キアゲン社

ウオやイモリ、カエルでは同じような反復配列がおよびAmbion社）を用いた。

電気泳動では見つからなかったことから、オオサb）遺伝子の増幅と塩基配列の決定

ンショウウオに特異的配列である可能性が考えら

50-500ngのDNAを鋳型に用いて、耐熱DNA合れた。

成酵素により35サイクルのPCR増幅を行った。
6％ポリアクリルアミド電気泳動で増幅断片を確認
後、カラム精製を行い、ラベル反応後、当校にあるABI370を用いて塩基配列を決定した。固定標本から抽出したDNAでは、 PCR装置による増幅を2回連続で行った。塩基配列は解析ソフトGenetyxで解析した。

3. 成果（1）オオサンショウウオ遺伝子情報の基盤づくり

図3 XbaIで切断したDNAの反復構造

オオサンショウウオの遺伝的地域差の解析に向けて、マクロサテライトとして個体変異が期待されb）ミトコンドリアDNAる核ゲノムの反復配列の探索と、遺伝子進化の速オオサンショウウオのミトコンドリアDNAの全度が一般的に核DNAよりも速いとされるミトコン

長16298bpには、37個の遺伝子が含まれ、脊椎動ドリアDNAの全塩基配列の決定に取組んだ。

物に典型的な配置パターンを示した（図4）。ただ

a）反復DNAし、短いNon-coding領域が存在し、これは有尾両広島集団の胚から抽出したDNA（10μg）を13生類に特徴的な配列として知られている。チュウ

種の制限酵素を用いて切断しアガロース電気泳動

ゴクオオサンショウウオの塩基配列と比較すると、を行ったところ、Xba Iの切断によって約1.5kbpの各遺伝子は90.1〜97.6％の相同性を示し、両者が長さをもつ特に濃いバンドが検出された（図2）。

非常に近縁であることが遺伝学的に裏付けられた。

その濃さのおおまかな計測からゲノム全体の約1％

なお、本校が決定したオオサンショウウオのXba反100

とができる。そこで、まず、広島県太田川のホルマ
リン固定標本について遺伝子解析に取り組んだ。
太田川水系の5個体の固定標本からDNAを抽出し、4つのミトコンドリア遺伝子（ATPase8,ND3,ND6、tRNA-Ser）と1つの領域（Non-coding領域）を増幅してアクリルアミド電気泳動した（図5）。
なお、t-RNAとNon-Coding領域については増幅後、バンドを確認できなかった。
図4 オオサンショウウオのミトコンドリア遺伝子配置
NC, non-coding 領域。まず、３つの断片（８kbp、６kbp、３kbp）を増幅し、次に500bp ずつ塩基配列を決め、全体を網羅した。

増幅できた産物の塩基配列を決定した結果、
ATP8とND3においては、遺伝子バンクに登録した配列と異なる配列が増幅されていることがわかっ

復配列とミトコンドリア全ゲノム配列は、日本た。オオサンショウウオのミトコンドリアDNAにDNAデータバンク（DDBJ）に登録し、平成17年9は各遺伝子が1つずつしか存在しないことから、こ月28日から世界に向けて公開されている。

れらの配列は核ゲノムに由来するものと推測され（http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html；

る。なお、それ以外の配列、すなわち、ミトコン

Xba反復配列,AB208678;ミトコンドリア全ゲノム

ドリア本来の遺伝子の配列には固定標本すべてに配列,AB208679）。

おいて差が見られなかった。

（2）オオサンショウウオのミトコンドリア遺伝子配b）広島と和歌山間の遺伝的地域差
次に,遺伝的地域差の検出に適したミトコンドリ

列における地域差の解析
ミトコンドリアの各遺伝子を増幅するプライマー

ア遺伝子を探すため、広島の集団と分布が東限に近を自由に設計することが可能になったことで、オい和歌山集団の個体を用いて両者の違いを調べた。

オサンショウウオ地域集団の遺伝的違いを調べる

5つの遺伝子と一つの領域のうち、3つの遺伝研究を開始した。

子,ND5, ND6, ATP8およびD-loop領域では2集団

a）太田川水系の遺伝的地域差（固定標本からの間で塩基配列が完全に一致した。一方、ND3では1

DNA抽出と遺伝子解析）

塩基、CytBでは2塩基の違いが見つかった（表2）。

オオサンショウウオの生体組織の入手は極めて難

いずれもアミノ酸の置換は生じていない（図6）。

しい状況にあるが、固定標本からDNAを抽出して、解析した5つの遺伝子と1つの領域の総塩基数は遺伝子配列を解析することができれば、将来的に2994塩基であり、そのうち2集団間で異なる塩基サンプルの入手数が増え、しかも過去と現存するは3個、わずか0.1％と極めて変異の小さいことがオオサンショウウオ集団の遺伝子配列を比較するこわかった（表2）。

図5 固定標本のＤＮＡ増幅結果
1, 分子量マーカー; 2, タニガワ; 3, オキガワ; 4, コウザン; 5, ウシロヤマ; 6, ムシムシ; 7, ギオン ○はプライマーS2A1，その他はプライマー
S1A2 を使用図の矢印が予想されるサイズの増幅産物を示す

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表2 塩基配列の比較

図8 ND3の解析結果

図6 異なる３つの塩基とコードするアミノ酸c）ミトコンドリア遺伝子の地域差解析
平成18年からは,日本動物園水族館協会の協力を得て、7府県、13水系、33個体の生体サンプルが集まった（図7）。現段階において、ND3とCytBの解析結果を示す（図8、9）。
西日本の集団は鈴鹿山脈を境に大きく2つに別れ、

図9 チトクロームB遺伝子の解析結果

西グループはさらに3つの異なるグループを形成していると推測される。人為的に移動された個体の存在も推測された（図8 大阪市、図9姫路市）。

（3）世界3種のオオサンショウウオの保全活動の体験と国際交流
a）アメリカオオサンショウウオ保全活動への参加
アメリカではライコミング大学の協力を受け、アメリカオオサンショウウオの生息地における保全活動に参加した。オオサンショウウオの生息地を訪問し、実際に個体の捕獲やタグ（標識）の埋め込みな
図7 解析中の地域集団

図10 捕獲、タグの埋め込み、カウンター計測の様子

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ど、生態調査の体験をすることができた（図10）。

本校の活動に触発されたアメリカのAAST校（バーゲンカントリーアカデミー）とアメリカオオサンショウウオの遺伝子解析について共同研究がスタートした。AAST校の生徒がアメリカオオサンシ
ョウウオのDNAを抽出し、私たちが設計したプライマーを利用して遺伝子増幅に取組んだ。増幅が

図12 中国・日本・アメリカオオサンショウウオの12SrRNAの系統関係成功した遺伝子について、今度は私たちが塩基配列を決定した。
ミトコンドリア遺伝子の増幅と解析増幅産物をアクリルアミド電気泳動したところ、16SrRNA遺伝子の増幅はうまくいかなかったが、12Sr遺伝子について予想通りのサイズを確認することができた（図11）。

図13

アメリカオオサンショウウオの12SrRNAの系統関係（図13）、それぞれに違いが見られた。12SrRNA遺伝子は進化速度がもっとも遅い遺伝子と考えられていることから、アメリカオオサンショウウオの場合、日本とは異なり、地域ごとの遺伝的違いはかなり大きいものと推測できる。
b）チュウゴクオオサンショウウオ
中国のオオサンショウウオについては、四川省農業科学院水産研究所の保全事業を見学し、中国科学院成都生物研究所と研究成果の交換を行うことで共同研究の連携を開始した（図14）。チュウゴク
図11 アメリカオオサンショウウオの12S 及び16SrRNAの増幅

オオサンショウウオは、日本のオオサンショウウオと大きさや形態はよく似ている（図15）。その人

そこで、得られた増幅産物の塩基配列を決定し、工飼育による保全活動の難しさや問題点を教えて遺伝子バンクに既に登録されている中国や日本の頂いた。中国のオオサンショウウオは、日本とのオオサンショウウオの12SrRNA配列と比較して遺進化歴史上つながりが非常に深いことから、今後、伝子系統樹を作成した（図12）。形態に基づいた分保全や研究を共同して行っていきたいと考えている。

類通り、アメリカオオサンショウウオが日本や中（4）オオサンショウウオの遺伝子メロディーの作成

国と系統学的に大きく離れることが遺伝子の配列

平成16年には、遺伝子を身近に感じ、オオサンからも支持された。次に、解析後、遺伝子バンクショウウオについて多くの人に広く知ってもらいに登録されたアメリカオオサンンショウウオのたい、そして、とくに里山の水環境に対する意識

12SrRNA遺伝子の他の塩基配列と比較したところを強めてほしいという願いから、遺伝子音楽の作

図14

四川省農業科学院水産研究所と中国科学院成都生物研究所での発表の様子

図15 人工飼育されていたチュウゴクオオサンショウウオ

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成に取り組んだ。

が高い。この結果から、私たちは、水環境の保全

大野乾博士（遺伝学者）が提唱した変換ルールの重要性を改めて強く自覚させられた。一方、地（1986年）に基づき、私たちが決定したオオサンシ

域差が小さいながらも鈴鹿山脈を境に2つに分かョウウオDNAの塩基配列を音符に変換し、そのDNAれ、西の集団はさらに3つに分かれた。この結果は、を音楽として表現した（図16,17）。曲は清流を流れ放流がグループ間を越えてはいけないことを遺伝る美しいメロディーに仕上がった。この試みは、朝子撹乱の観点から警告するものと考える。今後、

日新聞の『天声人語』を始め多くのマスメディアにさらに多くの遺伝子、とくに核の遺伝子のデータも取り上げられ、希少種オオサンショウウオについも増やし、遺伝的地域差の実態を明らかにするこて、国民に広くアピールすることができた。とで、放流実現に少しでも寄与したい。最終的にオオサンショウウオが守られ、生態ピラミッドが正常に保たれることで、水環境がしっかり守られていくものと強く信じている。
最後に、私たちが作った遺伝子音楽によって、ひとりでも多くの人がオオサンショウウオの存在を

図16

Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇの塩基を音符に変換するルール意識し、オオサンショウウオの保護には水環境の保護が重要であることに気づいてほしいと思う。
また、世界各国にも絶滅危惧種・希少種は存在し、それぞれの国の自然や文化の象徴となっている例は数多い。それゆえ、「一つの希少種の保全に取組むことは、水環境保護のモチベーションを高めると共に、生態ピラミッド本来のバランスを保ち、水環境がしっかりと守られていく」という私たちのコンセプトが、世界の水環境の保全に必ずや貢献できるものと願っている。
参照文献
・ 平成18年度スーパーサイエンスハイスクール特別枠研究実施報告書『時空を超えて挑む、オオサンショウウオ進化の4次元的ゲノム解析』 広
島県立広島国泰寺高等学校理数ゼミ生物班
・ オオサンショウウオの遺伝子解析-反復DNA、ミトコンドリアゲノム、そして遺伝子音楽-平成16年

広島県立広島国泰寺高等学校理数ゼミ生

物班

図17 ミトコンドリアのNon-coding 領域の塩基配列を音符に表現
バイオサイエンスとインダストリー63(3), 2005 のＣＤに収録

・ オオサンショウウオの遺伝子メロディーを奏でる

バイオサイエンスとインダストリー、63（3）、2005 三浦郁夫
・ Wu, Z. (1987) Satellite DNA from the Chinese fat newt,Pachytriton brevipes, and related species. Sci. Rep. Lab.

4. 考察と結論
オオサンショウウオの遺伝的地域差は極端に小さく、広島と和歌山の間ではミトコンドリア遺伝子の塩基配列の違いがわずか0.1%に過ぎなかった。
これは、アメリカオオサンショウウオの結果と対照的である。日本のオオサンショウオの遺伝的均一性は、もし河川の水環境が激変すれば、オオサンショウウオの集団は瞬く間に減少の一途を辿る危険性を警告している。そして、既に過去に一度、激減を経験してボトルネック現象が生じた可能性

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Amphibian Biol., Hiroshima Univ. 9, 213-259.
・ Ogata M., Ohtani H., Igarashi T., Hasegawa Y., Ichikawa Y.
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Immunogenetics 24: 71-78.
・ 大野乾（1988）
生命の誕生と進化 東京大学出版会

5. 追捕本活動は、日本動物園水族館協会（総裁は、スーパーサイエンスハイスクールの特別枠の秋篠宮指定を受けている。

殿下）、広島市安佐動物公園、広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設（三浦郁夫准教授）の代表

大垰勝寛

新田理人支援を受けている。また、平成18年及び平成19年

指導教諭 三 浦 淳 子

森田達己

木内美波

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