2020年度（第45回）学術研究振興資金

学

校

兵名

庫

医科

学術研究報告

大学

共同

研

究研究分野

医学

役

担

研究所名等

研 究 課 題細菌叢変化による潰瘍性大腸炎発症機構の解明―抗菌剤による潰瘍性大腸炎の治療戦略への道―キーワード①炎症性腸疾患 ②腸内細菌叢 ③腸管免疫 ④ノトバイオート○研究代表者
氏
石

名
戸所
聡

医属
学

職
部

名

主 任 教 授割

分研究統括、細菌叢解析、細菌数解析、動物実験○研究分担者
氏

名

小椋

英樹

医学

部

講

池

内

浩

基

医学

部

主 任 教 授臨床サンプル収集のマネージメント・統括

基

医学部

准

臨床データの収集・解析司

理 化 学 研 究 所
生命医科学研究センター

チ ー ム
リ ー ダ ー

臨床と細菌叢のデータの統計学的解析の指導

内
大野野

博

所属職

名
師

教授役

割分

担

細菌叢解析、細菌数解析、動物実験

加藤完理 化 学 研 究 所
生命医科学研究センター

研

究員

臨床と細菌叢のデータの統計学的解析

中 西裕 美 子

理 化 学 研 究 所
生命医科学研究センター

研

究員

臨床サンプルの代謝産物解析

細菌叢変化による潰瘍性大腸炎発症機構の解明－抗菌剤による潰瘍性大腸炎の治療戦略への道－
1．研究の目的(1)潰瘍性大腸炎(UC)の発症にかかる異常細菌叢の関与を検討し、発症機構の解明を目指すことを目的としている。具体的には、潰瘍性大腸炎術後回腸嚢炎を UC のモデルとして解析することを目的としている。

2．研究の計画(1)回腸嚢炎患者の糞便における細菌叢解析①回腸嚢炎患者の糞便におけるMiseqによる細菌叢解析をおこなう。
②回腸嚢炎患者の臨床スコア(mPDAI)と細菌叢との関連を調べる。
(2)病因と関連する可能性のある細菌の培養分離①(1)にて変化が認められた細菌群からpathobiontあるいはsymbiontと考えられる細菌を選択し、MinIONを用いて同定単離培養する。
(3)マウスを用いた細菌叢、および単離細菌の病理学的検討①(1)にて得られた疾患スコアの高い患者糞便サンプル、あるいは、(2)にて得られた病因に関連する可能性のある単離細菌を、予め抗生剤にて常在細菌叢を欠失させたマウスに投与し、それらの炎症誘起作用について検討する。

3．研究の成果(1)回腸嚢炎患者の糞便における細菌叢解析①Enterobacteriaceaeが回腸嚢炎（臨床スコア(mPDAI)が5以上）にて優位に増加しており、mPDAIスコアとの正の相関を認め、最大90%を占めている回腸嚢炎患者を認めた（図1）②抗生剤治療が著効した患者において、治療前に約40%を占めていたFusobacteriaceaeがほぼ消失した例を3例認めた。
③Lachnospiraceae、Bifidobacteriaceaeが回腸嚢炎にて優位に減少しており、それぞれmPDAIスコアと負の相関を認めた。
(2)病因を関連する可能性のある細菌の分離①炎症あるいは病原性常在細菌(Pathobiont)として、Fusobacteriaceae、Pasteurellaceae、Enterobacteriaceae、Erysipelotrichaceaeを上げることが出来、一部の細菌を単離培養し保存した。
②恒常性維持に関わる細菌群(Symbiont)として、Lachnospiraceae、Bifidobacteraceae、Bacteroidaceae、Clostridiaceaeを上げることが出来、一部の細菌を単離分離し、保存した。
(3)マウスを用いた細菌叢、及び単離細菌の病理学的検討（図 2）①mPDAI high scoreサンプルは、low scoreサンプルに比べて、マウス大腸において炎症細胞を優位に増加させた。
②(1)②にて示した症例から得られた細菌は、マウス大腸にて炎症細胞を優位に増加させた。
③これらの結果から、①mPDAI highの患者サンプルには、炎症を引き起こしうる細菌が存在することが示され、その候補として、Fusobacteriaceae、Enterobacteriaceaeを上げることが出来た。さらに、②mPDAI lowの患者サンプルには、可能性として炎症を抑制する細菌が存在することを示し、その候補として、Lachnospiraceae、Bifidobacteriaceaeを上げることが出来た。

AEnterobacteriaceae
FusobacteriaceaeB*p=0.0109

CXY data: Correlation of MIcrobiota-mPDAI
0.8

6100%

2w

0102w

094w

Lachnospiraceae**P=0.0014
090%
80%

D

40%
30%
20%0.010%0510150%mPDAI score

IBD2 IBD11510150.6
0.40.20.0

IBD41 IBD47 IBD42 IBD46

00.8***P=0.0005
Bifidobacteriaceae

Enterobacteriaceae

50%

0.80.20.2

mPDAI score
XY data: Correlationof MIcrobiota-mPDAI

1.00.40.40.070%

XY data: Correlation of MIcrobiota-mPDAI60%

0.60.6051015mPDAI score

図 1. 回腸嚢における Pathobiont と Symbiont の候補(A)回腸嚢炎患者(ｍPDAI が 5 以上:上グラフの二番目のカラム)にて Enterobacteriaceae が優位に増加しており（上）、その細菌叢における割合とｍPDAI score との間には優位な正の相関を認めた(R=0.2628, P=0.0032)（下）。(B)IBD41-47、IBD42-46、IBD2-11 の 3 人の患者のシプロキサン治療による細菌叢変化を示す。上の矢印（治療経過を示している）が示すように、mPDAI スコアが 2-4 週間の間に顕著に改善しており、その間にFusobacteriaceae が消失している。(C,D)回腸嚢を持つが回腸嚢炎ではない患者では、Lactospiraceae とBifidobateriaceae が優位に増加している。それぞれの割合とｍPDAI スコアとの間に、優位な負の相関を認めた(Lactospiraceae：R=-0.2708,P=0.0024, Bifidobateriaceae:R=-0.259, P=0.0037)。

neutrophil number

4000

P=0.0057

P=0.0360

3000

neutrophil number

6000

4000

2000

2000

1000

4．研究の反省・考察

Low
IB
D
42-Fmw
Lo

IB
D
80-trenoIB
D86ow
PD
A
IL
mig
hAIhm
PD

no-trea
tedat
ed

00

図 2. mPDAI high のサンプル（糞便）と Fuso1 による炎症（左）mPDAI スコアが高い患者(mPDAI high)、低い患者のサンプル(mPDAI Low)をマウスに移植し、移植しなかったマウス(no-treated)と比較した。大腸粘膜固有層における neutrophil が、スコアの高い患者由来サンプルの移植によって優位に増加した。
（右）Fusobacteriaceaeが優位で抗生剤治療にて完全に消失し、寛解となった患者(IBD42)から嫌気培養にて Fuso1 を分離し、マウスに移植した。その結果、スコアの低い患者サンプル(IBD86,80)に比較し、顕著に neutrophil を増加させた。

現在まで、概ね計画通り研究を遂行することが出来ている。すでに、病因に関連する可能性がある細菌の単離が行われ、マウスへの投与による検討実験が進められている。マウスへの投与実験は、予め抗生剤によるマウス常在細菌の除去をもとに行っているため、マウスの水分摂取が落ち（抗生剤入の水をマウスが嫌うため）、細菌投与前にやや脱水状態となる。これらの影響、さらに、常在細菌叢の除去率などを考慮して、実験結果を考える必要がある。したがって、細菌叢によるマウスへの病原性に関する検討に、無菌マウスを用いた検討も視野に入れて今後の検討を進める予定である。さらに、細菌を種レベルまで決定する必要があるため、さらに deep sequence を行うことも視野に入れて検討を行っていく予定である。

5．研究発表(1)学会誌等なし(2)口頭発表なし(3)出版物なし