LARGE
Laboratory for
Animal Resources andGenetic Engineering
RIKEN, Center for Developmental Biology

06. ゲノム抽出からサザン解析

1. ゲノム抽出
1)ES細胞から(1) lysis buﬀer(注1)を667.5ul加える(2)P1000でピペッティング(3)10％SDSを7.5ul加える(4)10mg/ml ProKを75ul加える(5)55℃ 8hr〜Overnight 緩やかにシェイキング
(6)100ug/mlのRNase A を10ul加える(7)37℃ 1hr(8)フェノールを750ul(RT)加えて、ローテート(TAITEC RT-5)15min(注2)(9)cfg at 12,000rpm for 5min RT(10)同様にフェノール/クロロホルム処理２回(11)クロロフォルム処理1回(12)イソプロパノールを750ul加えて、ゲノムが析出するまでinvert(13)cfg at 3,000rpm for 15min RT（3,000rpmでやるとゲノムが解けやすい）(14)70%エタノールを1ml加える(15)cfg at 3,000rpm for 15min RT(16)もう一度(14)〜(15)(17)風乾(18)200ulのTE(pH8.0)に溶解する(解けにくい場合は50℃で暖めたり、P200のピペットでピペティングするスムースに通るようになれば解けた状態)。
(19)吸光度測定、電気泳動で濃度を確認する

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2) tailから(1)1〜2cmのtailを細かく切る(2)lysis buﬀer(注1)を675ul加える(3)10mg/ml ProKを75ul加える(4)55℃ 8hr〜overnight 緩やかにシェイキング
(5)100ug/mlのRNase A を10ul加える(6)37℃ 1hr(7)フェノールを750ul(RT)加えて、ローテート(TAITEC RT-5)15min(注2)(8)cfg at 12,000rpm for 5min RT(9)同様にフェノール/クロロホルム処理1回、クロロフォルム処理1回(10)イソプロパノールを750ul加えて、ゲノムが析出するまでinvert(11)cfg at 3,000rpm for 15min RT(12)70%エタノールを1ml加える(13)cfg at 3,000rpm for 15min RT(14)もう一度(12)〜(13)(15)風乾(15)200ulのTE(pH8.0)に溶解(解けにくい場合は50℃で暖める)(16)同様にフェノール/クロロホルム1回した後、エタノール沈殿(cfg at 3,000rpm for15min RT)(17)70%エタノールを1ml加える(18)cfg at 3,000rpm for 15min RT(19)もう一度(17)〜(18)(20)風乾(21)200ulのTE(pH8.0)に溶解(解けにくい場合は50℃で暖めたり、P200のピペットでピペティングするスムースに通るようになれば解けた状態。tailの場合はやりすぎると壊れるので程々にする。)(22)吸光度測定、電気泳動で濃度を確認
Tail 1cmあたり100ng/ul〜500ng/ul回収可能

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3) フェイズロックゲルを用いた場合(1)〜(7)まで同じ(8) フェイズロックゲル(QIAGEN MaXtract Low Density Cat. No. 129016)のチューブにデカントで移す(9) フェノール750ul(RT)加えて、ローテート15min(10)cfg at 12,000rpm for 5min 4℃(11)同様にフェノクロ２回
以下同様

4)泳動写真左:tail由来、右:ES由来
各２レーンずつ泳動(200ng/lane)
35V 60min、0.7%agarose gel、marker：1kbp ladder(最高段10kbp)

Tailは壊れ易いので破壊されたGenomeでスメアを引く

注1)lysis buﬀerの組成 (ES細胞からの場合はSDSを含まない)
10mM Tris-HCl(pH8.0)
150mM NaCl
10mM EDTA
0.5% SDS

注2) ゲノムはドロドロしているので1000ul用チップの先をはさみで数ミリカットして使用するとよい

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2. 制限酵素処理
注）一回で消化できない場合は2〜3回行う(08.サザンに使う制限酵素を参照)。酵素処
理後はボルテックスしても構わない。
(1)反応体積200ul(酵素20〜40U)で10ugのゲノムを消化する(2) Overnight(3) フェノール/クロロホルム処理(cfg at 1,2000rpm)(4) エタノール沈殿 (cfg at 1,2000rpm)(5) 70% EtOHでWash(6) 15ulのTE(pH8.0)で溶解

3. トランスファー(1)泳動サンプルをボルテックスして完全に溶かし、20〜50mAでBPBがゲルの中央から末端までOvernight(午後7時頃から翌朝9時頃)で泳動する(2)翌朝、10X loading dyeを5ul加える(以降の目印となる)(3)EtBr染色（定規を添えて写真をとる）(4) 50mM HCl (D.W 480ml+HCl 2ml)でBPBが黄色になるまでシェイク（約15分）(5) Sol A 45min シェイク(BPBが黄色から青色に戻り、XCが緑色に変わる)(6) Sol B 45min シェイク

注1)コームは7.5mm以上の広めのものを必ず使用する
注2)loading dyeはXylen cyanol FF(XC)+ Bromophenole blue(BPB)を使用する
注3)ゲノムはコームは7.5mmで5ug程度ローディングする組成
Sol A : 500ml
5M NaCl 150ml
5N NaOH 50ml +D.W

Sol B：500ml
5M NaCl 300ml
2M Tris-HCl(pH7.5) 125ml +D.W

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(7)キャピラリートランスファー
トランスファーに関しては20xSSCを用いた一般的な方法で行っております(下図参照)。

注1)メンブレンはAnersham Biosciences社製の Hybond-N+を使用しています。
注2)ゲルより上に載せる3MMろ紙はD.Wで濡らしたものを2枚、乾いたものを3枚の計5枚を使用。
注3)ペーパータオルはクレシア社製のコンフォートサービスタオル200を200枚使用しています。
(8)ハイブリダイゼーションバッファーの作製
Hybridization buﬀer 100mlの組成
1)2M NaH2PO4 (MW 156.01)

7.9ml2)1M Na2HPO4 (MW 358.14)

34.2ml3)70mlぐらいまでD.Wを加える
4)BSA(Fraction V、pH5.2)を1g加えて完全に溶かす
5)0.5M EDTAを0.2ml加える
6)65℃に暖める
7)SDSを7g加えて完全に溶かす
8)100mlにメスアップ
注)TOYOBOのPerfect Hyb(Code No.HYB-101)で代用可能(9)プレハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションバッグを用いて13.5cm X 13.5cmのメンブレンに対して約15mlのハイブリダイゼーションバッファーを加え、65℃で2hr〜8hrシェイキング
(10)プローブの標識
TAKARA社製の Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2を使用して、α32P-dCTPで標識する
Page. 5(プローブはBACを鋳型としたPCRにて増幅し、そのPCR産物をゲルから切り出して25ng/reaction使用、α32P-dCTPは1.25ul加える。)(11)ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションバッグを用いて13.5cm X 13.5cmのメンブレンに対して15mlのハイブリダイゼーションバッファーを加え、プローブを13.5cm X 13.5cmのメンブレンに対して鋳型25ng分のプローブを加え、65℃で12hr〜17hrシェイキングする(14)Washing
Washing 条件はプローブに依存しますので下記に示す方法はあくまでも目安として下
さい1)0.1XSSC+0.1%SDS (室温)で15minシェイキング
2 ) ガ イ ガ ー カ ウ ン タ ー を 1 c m 離 して 測 定 し た 場 合 に 、 バ ッ ク グ ラ ン ド が 1 0 0 〜200cpm、目的の位置のシグナルが200〜1kcpmであればWashingを止めオートラジオ
グラフィーを行う
もしそうでなければ以下の行程へ進む
3)0.1XSSC+0.1%SDS(65℃)で30min〜シェイギング
4)0.1XSSC+0.1%SDS(65℃) 30min〜
5)0.1XSSC+0.1%SDS(65℃) 30min〜
注1)Tail由来のGenome DNAは不純物が多くバックグランドが高くなる傾向があるので0.1XSSC+0.1%SDSでのWashingを75℃で行うこともある。
注2)ES細胞で上手くいって、マウスtailでは上手くいかない場合は、ゲノムが壊れている可能性が高いので、ゲノムを泳動して、先の写真と比較する。スメアがひどい場合は壊れているので、精製し直す必要がある。また検出するバンドのサイズが10kb以上はかなり難しく、短い制限酵素にかえるか、5ʼ側か3ʼ側の短い方へ変えてみるのがよい。

参考1)プローブ配列の選び方
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatのWebでプローブの候補配列500〜1kbpをBlastにかける。このBlastで全く他に相同領域が無ければプローブとしてはほぼ優良な配列である。Neo probeはNeoのORFをPCRで増幅してProbeとする。

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2)例注）
シグナル強度はこのぐらいは必要で、バックグランドも低く抑える。またNeoプローブはランダムインテグレーションを検出するため、露光を長めに行ったものも必要である。

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