2020年度（第45回）学術研究振興資金

学

校

学術研究報告東 京 慈 恵 会 医 科 大 学

名

研究所名等

研 究 課 題がんにおける型破り分泌の機序解明と制御研究―がんと型破り分泌の関係解明―

キーワード①型破り分泌 ② PKCδ ③ 肝がん

研究分野

医役

割分

担

役

割分

担

○研究代表者

吉氏

名

田清

所
嗣

属

東京慈恵会医科大学生化学
講座

職

名

教

授

職

名

研究の総括

○研究分担者
氏

名

山田

幸

司

東京慈恵会医科大学生化学講座

講師

実験・データ解釈・論文

及

川恒

一

東京慈恵会医科大学医学部
消 化 器 ・ 肝 臓 内 科

講師

臨床研究の計画・実施

吉田

彩

舟

東京慈恵会医科大学生化学講座

講師

マウス作出と解析所

属学

がんにおける型破り分泌の機序解明と制御研究－がんと型破り分泌の関係解明－
1．研究の目的(1) PKCδ 型破り分泌の定量システムの構築①HiBiTシステムの構築②最適時間の制定(2) PKCδ 型破り分泌に必要な因子の同定①オートファジー因子の関与②阻害剤を用いた検討(3) PKCδの型破り分泌様式の予測①超遠心法によるプロテクションアッセイ

2．研究の計画(1) PKCδ 型破り分泌の定量システムの構築①HiBiTシステムの構築：promegaのHiBiT配列をPKCδのC末端側に配置した融合タンパク質を発現するプラスミドを作製した。発現系はTet-on HepG2細胞を用いて、安定細胞株を作製した。クライテリアは、ドキシサイクリンで誘導され、かつ分泌抑制が過去に見つけたPMA処理により分泌が抑制させる株をスクリーニングした。
②最適時間の制定：ドキシサイクリン誘導後の分泌動態の評価をHiBiTアッセイにより検討した。
(2) PKCδ 型破り分泌に必要な因子の同定①オートファジー因子の関与：オートファジー因子に関するsiRNAを購入し、PKCδの分泌量をHiBiT評価系で確認作業を行った。
②阻害剤を用いた検討：PKCδの分泌はオートファジー阻害剤であるクロロキン（CQ）やバフィロマイシンA1 (BafA1)で処理した。
(3) PKCδの型破り分泌様式の予測①超遠心法によるプロテクションアッセイ：3Kでの遠心操作で死細胞等を取り除いた後、100Kで超遠心したペレット成分を得た。その後、プロテアーゼKで30分処理し、再度100Kで遠心し、immunoblot解析を行った。その結果、PKCδの貯留を確認した。このPKCδの貯留はPMA処理した細胞からは得られなかった。このことから、PKCδの型破り分泌は膜輸送系が関与していることが示唆された。

3．研究の成果(1) PKCδ 型破り分泌の定量システムの構築①HiBiTシステムの構築：promegaのHiBiTシステムを利用した細胞外PKCδ測定系の構築を行った。Tet-on誘導用のHepG2細胞を用いて、安定細胞株を作製した。クライテリアは、ドキシサイクリンで誘導され、かつPMA処理により分泌が抑制させる株をスクリーニングした。
②最適時間の制定：ドキシサイクリン誘導後の分泌動態の評価を行った。結果として、6時間から24時間で十分評価可能であることを確認した。
(2) PKCδ 型破り分泌に必要な因子の同定①オートファジー因子の関与：過去にIL-1βの型破り分泌にオートファジー因子が使用されているという報告があったので、確認実験につきHiBiTシステムを用いて行った。結果として、ATG5をはじめとする因子をノックダウンすることでPKCδの分泌の有意な抑制が示された。
②阻害剤を用いた検討：PKCδの分泌はオートファジー阻害剤であるクロロキン（CQ）やバフィロマイシンA1 (BafA1)で処理しても変化なかった。このことから、型破り分泌hオートファジーとは別の機構を利用していることが推察された。
(3) PKCδの型破り分泌様式の予測①超遠心法によるプロテクションアッセイ：3Kでの遠心操作で死細胞等を取り除いた後、100Kで超遠心したペレット成分を得た。その後、プロテアーゼKで30分処理し、再度100Kで遠心し、immunoblot解析を行った。その結果、PKCδの貯留を確認した。このPKCδの貯留はPMA処理した細胞からは得られなかった。このことから、PKCδの型破り分泌は膜輸送系が関与していることが示唆された。

4．研究の反省・考察(1) PKCδ 型破り分泌の定量システムの構築①HiBiTシステムの構築：immunoblot解析に比べてはるかに定量性・再現性のある簡便なデータ取得が可能となった。本HiBiT実験の結果は、当然immunoblot解析でも再現しているため、過剰発現による影響は余り無いと考えられる。加えて、ドキシサイクリンの濃度を調整することで、発現量を制御できることも分かり、システムとしては汎用性が高いものと考えられる。今後はPKCδ以外に肝がん細胞で型破り分泌されるタンパク質（importinα1やヌクレオリン）についても応用展開し、現象の再現に務めていきたいと考える。また本
実験は10%FBS条件下で行えるため、型破り分泌研究で度々問題視される、細胞死（ネクローシス）や物理的刺激などによる細胞膜崩壊による漏出の影響を限りなくなくすことが出来る。
②最適時間の制定：Tet-onの誘導系の動態をモニターできたので、実験の信頼性確保が可能となった。24時間を汎用したが、この理由は、分泌したPKCδ量が安定的になる時間であることが挙げられる。今回、10%FBS条件下でのアッセイが可能であることから、時間についての配慮は比較的自由であり、24時間は最も適当とも考えられた。逆に、IL-1βなどでよく見られる刺激後2時間という時間では、培地交換の物理的刺激の影響か、分泌量の抗増進傾向がみられた。この点、6時間以上おくことで分泌量が安定することが分かった。今後の実験もなるべく6時間以上後にアッセイすることが望ましいと考えられる。
(2) PKCδ 型破り分泌に必要な因子の同定①オートファジー因子の関与：オートファジー因子は分解のみならず分泌にも関与していることは過去の報告からも間違いない事実かも知れない。今回同定したオートファジー因子は一連のオートファジーの初期のphaseで関係する因子である。つまり、オートファジーに関わるオートファゴソーム形成と分泌に関わる小胞とは別の局在や他の因子を利用している可能性が考えられる。今後は、その差別化を図る実験が必要になると推察される。
②阻害剤を用いた検討：本阻害剤はオートファゴソームとリソソームの融合に関する阻害なので、分泌に依存しないデータが出ても矛盾がない。オートファジーとの相違を早急に見出す必要があると考えられる。また、今回試験したオートファジー因子は全てPKCδ分泌に関与していたが、実際は関与しないものもあるかもしれない。この点で、網羅的な解析を行うことで、差別化にバイアスをかけなくても良い可能性があるので、今後の検討に生かしたい。さらに重要な課題として、なぜ、型破り分泌にオートファジー因子が関わるのかを今後明確にする必要がある。共通するのは、細胞内成分を定期的に入れ替える役割があるが、型破り分泌に関しては細胞外機能が明らかに明確でありプログラムされている可能性が高く、更なる考察が必要だと考えられる。
(3) PKCδの型破り分泌様式の予測①超遠心法によるプロテクションアッセイ：PKCδが小胞内に存在することが分かったがその移行機構や具体的な小胞分画の同定は今後の課題となる。スクロース等による密度勾配法を用いて、PKCδ画存在する分画を同定し、マーカーを当てはめていくことで関連するオルガネラを決定する必要がある。この解析は今後、新規オルガネラを特定するプロテオミクス等の手法に応用する際に必須なので、早々に着手する予定である。オルガネラが特定できれば、蛍光染色法や免疫電子顕微鏡観察などの可視的な解析により、確認作業ができる。

5．研究発表(1) 学会誌等① Yamada K, Oikawa T, Kizawa R, Motohashi S, Yoshida S, Kumamoto T, Saeki C,
Nakagawa C, Shimoyama Y, Aoki K, Tachibana T, Saruta M, Ono M, Yoshida K.
Unconventional Secretion of PKCδ Exerts Tumorigenic Function via Stimulation ofERK1/2 Signaling in Liver Cancer. Cancer Research 81: 414-425 (2021)(2) 口頭発表なし(3) 出版物なし