TA-Enhancer Cloning Kit
マニュアル（第 5 版）
Code No. 316-08271 (25 回分)

Ⅰ

製品説明

Taq DNA ポリメラーゼ等のターミナルトランスフェラーゼ（TdT）活性を有する PCR 酵素を用いて合成される PCR 産物の多くは、3’ 末端にデオキシアデノシン（dA）が一塩基付加された形になっているため、T ベクターの 3’ 末端に突出しているチミジン（dT）と相補的に対合し、簡便に PCR 産物のクローニングを行うことができます。この方法は TA クローニン
グとして知られています。
「TA-Enhancer Cloning Kit」は、T ベクターとライゲーション用試薬を組み合わせた TA クローニング用キットです。ライゲーション用試薬は、ニッポンジーン独自のバッファー組成と10×Enhancer Solution に含まれる PprA タンパク質によって、これまで効率が低いとされてきた TA クローニングを高効率に行うことができます。
■

特 長・ これまで効率が低いとされてきた TA クローニングを高効率に行うことができる。
・ LacZ を用いた青白判定が可能。
・ pANT Vector に PCR 産物が挿入されると Hind lll と Bgl ll の制限酵素サイトが新たに形成。

Ⅱ

製品内容製品（25 回分）保 存

pANT Vector (25 ng/μl)

45 µl×1 本-20℃

5 × Ligation Mix

100 µl×1 本-20℃

10 × Enhancer Solution

50 µl×1 本-20℃

Control Insert DNA (10 ng/μl)

10 µl×1 本-20℃

・ 包装単位は 20 µl の反応系で使用した場合の回数です。
・ 5 × Ligation Mix と 10 × Enhancer Solution は TA-Blunt Ligation Kit（Code No. 311-06543)
として別途購入可能です。
1Ⅲ

保存-20℃保存
・ 5 × Ligation Mix および 10 × Enhancer Solution は-20℃保存では凍結しませんので、凍結融解による安定性低下の心配がなく、面倒な融解操作の必要もありません。
・ 使用時は、氷上で操作して下さい。

Ⅳプロトコール＜操作手順＞
1.

インサート DNA の調製①Hot-Start Gene Taq NT 等の TdT 活性のある PCR 酵素を用いて目的の配列を増幅します。校正活性のある PCR 酵素を用いると、3’ 突出末端が平滑化されるため、PCR 酵素の種類をご確認下さい。

②

反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供して、増幅産物の確認を行います。

③

ISOSPIN PCR Product 等を用いて PCR 産物の精製を行います。非特異的なバンドが確認された場合は、目的サイズのバンドをゲルから切り出して ISOSPIN
Agarose Gel 等を用いて精製を行って下さい。

④
2.

PCR 産物の一部を ddH2O または TE（pH8.0）で適した濃度に希釈します。注 1)

ライゲーション
①

新しいチューブに以下の内容でライゲーション液を調製して下さい。注 2)
PCR 産物

反応液
pANT Vector（25 ng/μl）

Positive Control

1.8 µl

1.8 µlPCR 産物X µl-

Control Insert DNA（10 ng/µl）-2 µl

5 × Ligation Mix

4 µl

4 µl

10 × Enhancer Solution

2 µl

2 µl

Up to 20 µl

Up to 20 µl

ddH2O◆ 以下は、ニッポンジーンで様々な長さのインサート DNA をライゲーション、形質転換した結果、特定の条件で最も良い結果が得られたインサート量です。ライゲーション液調製の際のご参考にして下さい。注 3)

インサートサイズ

200 bp500 bp

1 kbp

3 kbp

インサート量 (ng)20.0～32.0

24.0～50.08.0～100.0

24.0～50.0

20 µl 反応系（pANT Vector 45 ng）の場合②

ライゲーション反応液を 16°C で 30 分間反応させます。

2

3.

形質転換 （ECOSTM Competent E.coli JM109 を用いた方法）
ライゲーション反応液は、そのまま形質転換に使用できます。形質転換に用いる反応液
量はコンピテントセルの 10%以下にして下さい。また、ニッポンジーンの ECOSTM
Competent E.coli を用いると 6 分間高速プロトコールが利用できます（6 分間高速プロトコールはアンピシリンの場合にのみ有効です）。なお ECOSTM Competent E.coli を使用する場合、添加する DNA 溶液の量はコンピテントセルの容量に対して 5%以下にして下さい。
＜ECOSTM 6 分間プロトコール＞①

氷上でコンピテントセルを融解します。

②

ECOSTM Competent E.coli JM109 にライゲーション反応液を加えます。注 4), 注 5)

③1 秒間ボルテックスを行います。

④氷上で 5 分間インキュベートを行います。

⑤42℃で 45 秒間インキュベートを行います。

⑥

1 秒間ボルテックスを行います。

⑦LB プレートに、反応させた ECOSTM Competent E.coli を均一に塗布し 37℃で 16時間培養を行います。

＜青白判定用プレートの作製＞
LB プレート（約 20 ml）に対して、以下の内容で調製して下さい。
・アンピシリン 50 mg/ml を 20 µl（最終濃度 50 µg/ml）
・X-gal 20 mg/ml を 40 µl（最終濃度 40 µg/ml）
・1 M IPTG を 4 µl（最終濃度 0.2 mM）

3

4.

コロニーPCR によるインサートチェック
目的とする DNA 断片が組み込まれた組み換え体を確認する方法として、大腸菌が持つプラスミドのインサートサイズをコロニーPCR という方法で推定することができます。
pANT Vector では M13 Primer が使用できます。
2×M13 Primer Mix と Gene RED PCR Mix Plus を組み合わせて使用することで、迅速かつ簡単にコロニーPCR を行うことができます。
①②チューブに以下の組成で試薬を調整し、50 µl ずつ PCR チューブに分注します。
Gene RED PCR Mix Plus (2×)

25 μl

2×M13 Primer Mix

25 μl

Total

50 μl

爪楊枝やチップでコロニーを軽く突き、反応液中でけん濁します。このとき、コロニーの多量持ち込みに注意して下さい。

③④PCR を以下の条件で行います。
94°C

3 min

94°C

20 sec55°C

20 sec72°C

10 sec/kbp (1 kbp 以下は 10 sec)

25 サイクル

PCR 終了後、各反応液をそのままアガロースゲルにアプライし、電気泳動を行って下さい。

◆ Control Insert DNA のサイズは 600 bp です。ニッポンジーンの 2×M13 Primer Mixを用いた場合は 760 bp に増幅産物が確認されます。

Ⅴ注意点

注 1)

高塩濃度のバッファーおよび EDTA が高濃度に含まれたバッファーに DNA を溶解させると、ライゲーション効率が著しく低下します。DNA 溶液は ddH2O または TE（pH8.0）にて調製して下さい。

注 2)

添加する 10×Enhancer Solution の量は正確に測りとって下さい。指定量より多く添加したり、少なく添加したりするとライゲーション効率が著しく低下する場合があります。

注 3)

ライゲーション反応に用いる DNA の精製度、使用する制限酵素の違いによってライゲーション効率が異なる場合があります。

注 4)

形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの 1/10 量以下にして下さい。ECOSTM
Competent E.coli を使用する場合、形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの容量に対して 5%以下にしてください。多量の反応液を使用すると、形質転換効率が低下することがあります。

注 5)

反応液の量がコンピテントセルの 1/10 量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）処理、クロロホルム/イソアミルアルコール（24：1）処理を行い、エタノール沈殿法によって DNA を回収し、その DNA をコンピテン
トセルの 1/10 量以下になるように ddH2O または TE（pH8.0）に溶解してから形質転換を行って下さい。
4ⅥpANT Vector

図 1 pANT Vector のマップ
M13 Forward Primer

T7 Promoter

Kpn I Sma I

EcoR I{ Bgl II } BamH I{ Hind III }PCR Product

Xba I

Sal I

Pst I

Hind III

M13 Reverse Primer

図 2 pANT Vector のマルチクローニングサイト

Multiple cloning region429-494

M13 forward primer

359-378

M13 reverse primer

502-521

T7 promoter

402-419
5

ⅦQ&A

Q： ライゲーション産物を保存する場合はどうしたら良いですか？
A： -20°C で凍結保存して下さい。融解後は、そのまま形質転換実験に用いることができます。
Q： サンプル数が多いのですが、あらかじめ 10 × Enhancer Solution と 5 × Ligation Mix を混ぜたプレミックスを作製してから使用することはできますか？
A： プレミックスを作製して使用できます。ただし、プレミックスは使用直前に調製し、調製後すぐに使用して下さい。
Q： ライゲーション反応を 4°C オーバーナイトで行うことはできますか？
A： 4°C オーバーナイト（16 時間）でもライゲーション可能です。
Q： ライゲーション産物をそのままエタノール沈殿してもよいですか？
A： ライゲーション産物をそのままエタノール沈殿するとコロニー数が著しく減少します。フェノール/クロロホルム精製してからエタノール沈殿して下さい。

6

Ⅷ

トラブルシューティング
トラブル

コロニーが全く生じない

白 コ ロニ ー が ほ と ん ど得られない、白コロニーが全く得られない

ほとんど白コロニー、全部が白コロニー

トランスフォーメーション
効率が低い

予想される原因

対策

末端の不一致TdT 活性のある PCR 酵素を用いてインサートの 3’末端に dA を必ず付加していることをご確認下さい。
（マニュアルⅣ-1 参照）

コンピテントセルの形質転換
効率が低い

形質転換効率が 1×107 cfu/μg 以上のコンピテントセ
ルをご使用下さい。

ライゲーション産物をそのままエタノール沈殿した

ライゲーション産物をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）処理、クロロホルム・イソアミルアルコール（24：1）処理後、エタノール沈殿法により DNA を回収し、ddH2O または TE（pH8.0）に溶解してから形質転換を行って下さい。

末端の不一致TdT 活性のある PCR 酵素を用いてインサートの 3’末端に dA を必ず付加していることをご確認下さい。
（マニュアルⅣ-1 参照）

ベクター3’末端の dT が欠失している・pANT Vector の室温での放置や凍結融解の繰り返しは避けて下さい。
・dT を分解するヌクレアーゼのご使用は避けて下さい。

ライゲーション時間が短い

・ライゲーション時間を延ばして下さい。
・4°C でオーバーナイト反応を行って下さい。

インサート量が不適マニュアルに載っているインサート量を参考に、ライゲーションを行って下さい。（マニュアルⅣ-1 参照）

使用する Enhancer Solutionの量が不適当

Enhancer Solution 添加量は反応系の 1/10 量にして下さい。

使用するベクター量が不適
当pANT Vector 量は 20 μl 反応系で 1.8 μl を使用して下さい。

EDTA 等のキレート剤濃度が高い

キレート剤を含まない水または TE（pH8.0）で DNAを溶解し、ライゲーション反応を行って下さい。

DNA 溶液が高塩濃度塩を含まない水または TE（pH8.0）で DNA を溶解し、ライゲーション反応を行なって下さい。

PCR 産物に夾雑物が含まれている

PCR 産物の精製を ISOSPIN PCR Product 等で行って下さい。

フレームシフトによって lacZ遺伝子が発現している

青コロニーや薄い青コロニーをチェックしてみて下さい。インサートが入っている場合があります。

ピリミジンダイマーが形成されている

アガロースゲルから切出しを行う時は、UV 照射時間を短くして下さい。

ア ン ピ シ リ ン 、 X-gal 、 IPTG
濃度が不適当アンピシリン/X-gal/IPTG の濃度を確認し、作り直して下さい。（マニュアルⅣ-3 参照）

多量の反応液を使用した形質転換に用いる反応液量はコンピテントセルに対して 1/10 量にして下さい。
ECOS™ Competent E. coli を使用する場合は、添加する反応液量をコンピテントセルに対して 5%以下にして下さい。

コンピテントセルの形質転換効率が低い

形質転換効率が 1×107 cfu/μg 以上のものを使用して下さい。

7

記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
TEL 076-451-6548
www.nippongene.com
お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。

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