17沼津工業高等専門学校研究報告
第 58 号，2024 年 2 月

香煎茶の糖または脂質消化酵素阻害成分  ：ゲルろ過
クロマトグラフィーによる成分分離
芳野恭士 *1・坂間秀剛 *2・萩倉深月 *1・髙須麗奈 *1・石川安美 *1
Inhibitory Components in Kosencha on Activities of Saccharide- or Lipid-Digestive
Enzymes (1): Separation of Components by Gel Filtration Chromatography
YOSHINO Kyoji *1, SAKAMA Hidetake *2, HAGIKURA Mitsuki *1,TAKASU Rena *1, ISHIKAWA Ami *1
Abstract: Kosencha is a secondary fabricated tea product which is made from green tea by atreatment with high temperature and high pressure. Kosencha has been reported to have aweight-reducing effect on obese patients and an improvement effect on cardiovascular function.
To determine specific components contained in Kosencha, two fractions were fractionated bySize-Exclusion Chromatography. The resulting Fr. A and Fr. B had absorption at 280 nm and
460 nm, and were expected to include brown components with polyphenol structures. Fr. A ofKosencha, in particular, contained more brown components than that of green tea. Theirestimated molecular weights were about 710 and 590, respectively, and the polymerizationdegrees of catechins were thought to be about 2.0 and 1.7. Fr. A and Fr. B of Kosencha
contained catechin structures, but known tea catechin monomers and dimers, nor gallic acid
were not detected. Fr. B might contain caffeine and flavonols, but Fr. A does not seem tocontain these components. In addition, these fractions had the inhibitory effect on the activityof maltase, a sugar-digesting enzyme, and it was speculated that the contained polyphenol
components contribute to this effect. Therefore, it is expected that the components contained inthese fractions are partly responsible for the effect of slowing the absorption of sugar.
Key Words:

Kosencha, Tea, Polyphenol, Gel filtration, Maltase


１．はじめに 香煎茶葉中の総ポリフェノール量は 8.29%(w/w) で、原料緑茶中の量の約 89% を保持している[2]。一方で、カテ香煎茶は、チャ（Camellia sinensis L.）の葉から作られキンモノマーの総量は 4.40%(w/w) と緑茶に比較して半る一次加工茶である緑茶を飽和水蒸気下で高温（160～減しているが、残存しているカテキンモノマーは、その糖200℃）、高圧処理することで、カテキン類の没食子酸エス吸収抑制作用に寄与しているものと考えられる[4]。残りのテルの一部を分解して渋みを軽減するとともに、香ばしさ半分に当たるポリフェノール類の化学構造は不明であるを高め、飲み易さを向上させた二次加工茶である[1,2]。香が、同じ二次加工茶の一つで、緑茶を加熱処理することで煎茶には、肥満患者に対する痩身効果と心血管機能の改善製造されるほうじ茶ではカテキンのポリマーや分解物が効果が報告されており[3]、その作用機序の一つとして、マ含まれると考えられることから[5,6]、我々は香煎茶にも同ルターゼ等のα- グルコシダーゼ活性阻害作用による糖吸様にカテキンのポリマーや分解物が含まれるものと予想収抑制作用が考えられる[2]。

している。
 本研究では、カテキンよりも大きな分子量を持つポリフ*1 物質工学科
Department of Chemistry & Biochemistry*2 専攻科総合システム工学専攻
Advanced Course, Multidisciplinary Engineering
Courseェノール画分をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（SEC）により分取し、その化学構造の特性と糖消化酵素活性に対する阻害作用について検討した。

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沼津工業高等専門学校研究報告

２．材料および方法
２．１ 茶のエキスの調製サンダイヤ社製の香煎茶および原料のやぶきた緑茶の第 58 号

２．５ ラット小腸マルターゼ活性阻害作用の測定
香煎茶エキスの画分 A および画分 B について、ラット小腸マルターゼ活性に対する阻害作用を、in vitro の系[9]を用いて測定した。

エキスは、それぞれの茶葉 8.0 g に熱水 1 L を加えて 10

さらに、画分 A と画分 B について、固相抽出（SPE）分間抽出し、定性ろ紙 No.2 でろ過して得られたろ液を凍法を用いて複数の画分に分画した。SPE は、Sep-pak Plus結乾燥させることで調製した。葉からの各エキスの収量は、

C18 ミニカラム（Waters 社製）を用いて次のように行っ25.5%および 17.8%であった。

た。SEC で得られた画分 A または画分 B の 20 mL をミニカラムに通し、カラムから溶出された画分を A-1、B-1 と２．２ 茶エキスの SEC による分離した。次に 8 mL の水、5 mL の 20%(v/v)メタノール、5 mL

SEC カラムとして TOSOH 社製 TSKgel G3000 SWXLの 40%(v/v)メタノール、5 mL のメタノールを順次通し、カラム（7.8 x 300 mm）を、溶出溶媒として水を用い、カ溶出されたそれぞれの画分を A-2～5、B-2～5 とした。こラム温度室温、流速 1.0 mL/分の条件で香煎茶および緑茶れらの操作を 20 回繰り返し、得られたそれぞれの画分をのエキスの分離を行った。成分の検出は、カテキンなどの適宜減圧濃縮して水溶液として、総ポリフェノール量の測ポリフェノール等の成分について 280 nm の吸光度を、ま定およびマルターゼ活性阻害作用の測定に用いた。

た、カテキンの酸化重合物のような褐色成分について 460nm の吸光度を測定した。
２．３ SEC による分子量の推定
分子量既知のポリフェノール類を２．２の測定条件の３．結果および考察
３．１ 香煎茶および原料緑茶の SEC による分離
香煎茶と原料緑茶のエキスの SEC におけるクロマトグ

SEC にかけ、その保持時間と分子量の関係式を求めた。得ラムを、図 1 に示す。280 nm の吸収を測定した結果、約られた関係式と、香煎茶エキスの画分 A および画分 B の8 分に小さなピークが、また、約 14.5 分に大きなピークがピークの保持時間から、これらの画分に含まれる主要な成見られた。一方、460 nm の吸収では、約 9 分に大きなピ分の分子量を推定した。ポリフェノール類としては、 (-)-

ークが、また、約 13 分に小さなピークがそれぞれ見られエピガロカテキンガレート（EGCG : 分子量 458.37）、テた。そこで、保持時間 4 分から 11.5 分の溶出液を回収しアフラビン（TF : 分子量 564.5）、プロシアニジン B2たものを画分 A，保持時間 11.5 分から 20 分の溶出液を回（PCB2 : 分子量 578.5）、テアフラビン-3 ガレート収したものを画分 B として採取した。香煎茶と緑茶につい（TF-3G : 分子量 716.6）、テアフラビン-3’ガレートて、それぞれの画分のピーク面積を比較したものを図 2 に（TF-3’G : 分子量 716.6）、テアフラビン-3,3’ジガレート示す。どちらの波長においても、画分 A，画分 B ともに香（TF-3,3’DG : 分子量 868.7）の 6 種を用いた。

煎茶の方が緑茶よりも量が多く、特に香煎茶における画分B の量が緑茶に比較して多いことがわかった。従って、こ２．４ 茶葉既知成分の測定

れらの画分には香煎茶加工により生成した特異成分が含 香煎茶エキスの画分 A および画分 B に含まれる可能性まれているものと推測される。なお、1 回の分取においてのある成分について、以下の測定を行った。

十分な分離が得られる茶エキスの量が約 0.1 mg と微量で フォーリン－チオカルトー法[7]により、総ポリフェノーあったため、分取を 60 回行ったが画分 A および画分 B のル量を測定した。
値は3 回の測定の平均値±標準偏差とし、収量は確認できなかった。

没食子酸エチル相当量で表記した。
220～600 nm における吸光スペクトルを測定し、含まれる成分の示す特異な吸収を確認した。
カテキン骨格に特有の励起波長 280 nm、ケイ光波長310 nm 付近のケイ光スペクトルを測定した。

３．２ 香煎茶エキスの画分 A と画分 B の分子量
SEC における既知のポリフェノール類の保持時間と分子量の関係を図 3 に示す。これを用いて、香煎茶の画分 Aと画分 B のピークの保持時間からそれぞれの推定分子量

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法[8]を用いて、を求めたところ、画分 A は約 710、画分 B は約 590 とな

茶葉の既知のカテキン類およびそのダイマー、没食子酸、った。いずれの値も、茶のカテキンモノマーとしては最もカフェインの測定を行った。

大きい EGCG の分子量 458.37 よりも高いことから、カテキンの酸化ポリマーの可能性が考えられた。これらの画分

19

香煎茶の糖または脂質消化酵素阻害成分 (1)：ゲルろ過クロマトグラフィーによる成分分離

1000
TF-3,3'DG800

分子量280 nmままたは460 nmににお け る吸収強度

画分A 画分B

TF-3G

600

y = -19.1x + 862.9

TF-3'GTF
PCB2400

EGCG

2000
香煎茶エキス（280 nm））

010

保 持 時 間 (分 )20

図 3 ポリフェノール標品における SEC の保持時間と分子量緑茶エキス（280 nm））の関係
画分 B は重合度約 1.7 と推定される。

香煎茶エキス（460 nm））

３．３ 香煎茶エキスの画分 A と画分 B 中の既知成分の確認

緑茶エキス（460 nm））

010

 香煎茶エキスの画分 A と画分 B の総ポリフェノール量は、それぞれエキス重量の 1.78±0.002%(w/w)と 2.69±0.002%(w/w)であった。香煎茶エキス中の総ポリフェノー

2030
溶出時間 (分分)ル量は，エキス重量の 38.4%(w/w)である[2]。その中で代図 1 香煎茶と緑茶のエキスの SEC クロマトグラム

表的な 4 種のカテキンモノマーは 14.0%(w/w)、そのエピマーが 5.6%(w/w)であるため、残りのポリフェノールはピーク面積（任意単位）

400
300

280 nm画分A
画分Bの不明のポリフェノールが含まれることになる。香煎茶加工により増加するポリフェノールとして知られているも200のに、カテキンの分解物である没食子酸があるが、その増100

加量は失われたカテキンモノマーの約 2%であり、これはエキス重量の 0.38%(w/w)にすぎない。従って、香煎茶加0

香煎茶
80

ピーク面積（任意単位）18.8%(w/w)となり、画分 A と画分 B 以外に 14.3%(w/w)

460 nm60

緑茶

工で生成するポリフェノールとしては、カテキンからの他の分解物や酸化重合物などが予想される。

画分A

 次に、香煎茶エキスとその画分 A および画分 B につい画分Bて、220～600 nm の吸光スペクトルを測定した結果を図 4に示す。香煎茶エキスでは、270～280 nm と 350～360 nm40に吸収ピークが見られた。これらの吸収は緑茶エキスにも20見られるが、270～280 nm の吸収ピークは緑茶に比較し0
香煎茶

緑茶て低く、350～360 nm の吸収ピークは同程度であった。
270～280 nm の吸収ピークはポリフェノールやカフェイ

図 2 香煎茶と緑茶のエキスから分取した画分 A と画分 B のンなどに由来し[10]、350～360 nm のピークはケルセチン

SEC クロマトグラムのピーク面積などのフラボノール配糖体などに由来するものと予想される[11]。香煎茶エキスの画分 B の吸光スペクトルはそのがカテキンのポリマーを含むと仮定した場合、緑茶から香エキスのものと類似していたが、350～360 nm のピーク

煎茶を製造する際の代表的なカテキンモノマー4 種とそのがわずかに高かった。一方、画分 A では 350～360 nm にエピマー4 種の減少量[2]から、減少した分のカテキンの平ピークは見られず、270～280 nm のみにピークが見られ均分子量を 353.2 と算出すると、画分 A は重合度約 2.0、た。

20

沼津工業高等専門学校研究報告

第 58 号

2.5

テアフラビン類分析結果

香 煎 茶 エキ ス

テ ア フ ラビン類

1.5

カテキン類分析結果

10.50200300400
波長 (nm)

500

画分B

画分B
吸光度0.05

3004005000280 nmににお け る吸収強度

画分A

200

画分A

600

0.10280 nmににお け る吸収強度

吸光度

210
溶出時間 (分分)

香 煎 茶 エキス

画分B

600

波長 (nm)画分A
a b cd、画分 B の吸光スペクトル
図 4 香煎茶エキスと画分 A、

0317

288

10i

2030、画分 B の HPLC クロマトグラ
図 6 香煎茶エキスと画分 A、

2蛍光強度e f g h

溶出時間 (分分)

2.5

ム

1.5289エ
成分標品の溶出位置 : a, 没食子酸 ; b, カフェイン ; c, (-)-エ

317

画分B

ピガロカテキン ; d, PCB2 ; e, テアシネンシン A ; f, テアシネンシン D ; g, (-)-エ
エピカテキン ; h, EGCG ; i, (-)-エエピカテキ

1

ンガレート.

画分A0.5励起波長ケ イ光 波 長分の含有の有無を HPLC 法で確認した。まず、通常の茶028020290300310320330

波長 (nm)、画分 B のケイ光スペクトル
図 5 香煎茶エキスの画分 A、カテキンモノマーを分析する条件での測定結果を、香煎茶エキスとともに図 6 に示す。香煎茶エキスでは緑茶エキスに含まれるものと同様の成分として、4 種のカテキンモノ
マーと没食子酸、カフェインが検出された。カテキンのダ(+)‐カテキンのようなカテキンモノマーには励起波長イマーである PCB2、テアシネンシン A、テアシネンシン

280 nm、ケイ光波長 310 nm のケイ光があることが知らD は検出されなかった。一方、画分 A と画分 B では、これている[12]。また、カテキンのポリマーであるプロシア

れらの成分のうちカフェインのみが検出され、特に画分 Bニジン型オリゴマーにも、同様のケイ光が見られる[13]。にはエキス中のカフェインの約 57.4%(w/w)が含まれていそこで、香煎茶エキスの画分 A と画分 B のケイ光スペクた。さらに、画分 A と画分 B には、発酵茶に見られるカトルを測定した結果を図 5 に示す。いずれにおいても、カテキンダイマーである TF、TF-3G、TF-3’G、TF-3,3’DG

テキンと同様に励起波長 288～289 nm、ケイ光波長 317の 4 種のテアフラビンは検出されなかった。

nm のケイ光が認められ、画分 A と画分 B のポリフェノー

 以上のことから、
香煎茶エキスの画分 A と画分 B には、ル成分にはカテキン骨格を保持した化学構造が含まれる茶葉に含まれる既知のカテキンモノマーおよびダイマーことが推測された。

は含まれないものの、そのポリフェノール成分としてカテ 香煎茶エキスの画分 A と画分 B について、既知の茶成キンの骨格を残したポリマーが含まれる可能性が示唆さ21

香煎茶の糖または脂質消化酵素阻害成分 (1)：ゲルろ過クロマトグラフィーによる成分分離れた。
３．４ 香煎茶エキスの画分 A および画分 B のラット小腸マルターゼ活性阻害作用
香煎茶の画分 A および画分 B の総ポリフェノール濃度とマルターゼ活性阻害率の関係を図 7 に示す。用いた濃度範囲では、画分 A の方が画分 B よりもその作用が強い傾向が見られた。ただし、それぞれの関係式を外挿して求め

マルターゼ活性阻害率（%））

5040y = 0.22x + 19.68
画分A3020y = 0.38x + 1.30

10

た 50%阻害濃度の試算値は、画分 A で 136.6 g/mL、画0分 B で 128.6 g/mL と同程度であった。

画分B020 香煎茶エキスの画分 A と画分 B から SPE 法により得ら

406080ポリフェノール濃度（mg/mL））

100れた画分の総ポリフェノール量を測定したところ、エキス

図 7 香煎茶エキスの画分 A および画分 B のラット小腸マルの重量に対する収量は 、A-1 で 3.5%(w/w) 、 A-2 でターゼ活性阻害作用1.2%(w/w)、A-3 で 1.0%(w/w)、A-4 で 0.8%(w/w)、A-5



で 2.1%(w/w)、B-4 で 2.9%(w/w)、B-5 で 0.9%(w/w)となった。この SPE 条件では、茶のカテキンモノマーは疎水性の 20%(v/v)メタノール溶出画分、すなわち A-3 や B-3に相当する画分に溶出されるため[14]、カテキンモノマー以上の疎水性を持つと考えられる A-3～5 と B-3～5 の 6つの画分の濃縮液を用いて、ラット小腸マルターゼ活性に対する阻害作用を測定した。図 8 に示すように、6 つの画分の溶液の総ポリフェノール濃度とマルターゼ活性阻害60
総ポリフェノール濃度 (mg/mL)

で 0.3%(w/w)、B-1 で 5.2%(w/w)、B-2 で 1.4%(w/w)、B-3B-4

 = 0.96

40A-320A-50

B-30.0率との間の相関係数は= 0.96 であり、F 検定において正5.0

B-5A-4

10.0
15.0
20.0
マルターゼ活性阻害率 (%)

25.0の有意な相関が認められたことから、これらの画分が示す

図 8 香煎茶エキスから SEC と SPE により得られた 6 画分

マルターゼ活性阻害作用に関して、含有されるポリフェノのマルターゼ活性阻害作用ール成分が寄与しているものと考えられた。
その作用に寄与しているものと推測された。従って、これ４．まとめ
香煎茶に含まれる特異成分を検索する目的で、緑茶よりも多く含まれる画分として 2 つの画分を、SEC で分画しらの画分に含まれる成分は、香煎茶の糖の吸収を穏やかにする効果の一部に関連しているものと考えられる。今後、画分 A や画分 B に含まれるポリフェノール成分の化学構造について、さらに検討する必要がある。

た。得られた画分 A と画分 B は、280 nm と 460 nm に吸収を持ち、ポリフェノール構造を持つ褐色の成分であると予想された。特に、画分 A は褐色が強く、また緑茶に比較参考文献して香煎茶に多く含まれていた。それぞれの推定分子量は[1] 清水康夫 (2014) : 交流, 53, 20-21.

約 710 と 590 であり、カテキンの重合度で考えると 2.0 お[2] 芳野恭士，清水康夫，他 (2015) : New Food Industry,よび 1.7 程度であった。香煎茶の画分 A と画分 B について

57, 1-10.

その成分特性を検討したところ、それぞれカテキン骨格を[3] Katanasaka, Y., Miyazaki, Y., et al. (2020) : Biol.

含むが、既知の茶カテキンモノマーおよびダイマー、さらPharm. Bull., 43, 675-681.には没食子酸は検出されなかった。このうち、画分 B には

[4] Honda, M., Hara, Y. (1993) : Biosci. Biotech.

カフェインやフラボノール類が含まれる可能性があった

Biochem., 57, 123-124.

が、画分 A にはこれらは含まれていないものと考えられた。

[5] Nakagawa, M. (1967) : Agr. Biol. Chem., 31,

また、これらの画分には糖消化酵素であるマルターゼの活1283-1287.

性を阻害する効果があり、含有するポリフェノール成分が[6] 芳野恭士，青木実苗，他 (1995) : 日本食品化学学会誌,

22

沼津工業高等専門学校研究報告

2, 9-13.
[7] Julkunen Tiittoo J. (1985) : J. Agric. FoodChem., 33,213-217.
[8] 芳野恭士, 原 征彦 (1993): 沼津高専研究報告, 27,87-91.
[9] K. Yoshino, Y. Miyauchi, et al. (2009): Biosci.

Biotechnol. Biochem., 73, 1096-1104.
[10] 奥村寿子, 一谷正己, 他 (2007) : 日本食品化学学会
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[11] Palma, M. S., Malaspin, O. (1999) : ミツバチ科学,20, 85-88.
[12] Carando, S., Teissedre, P.-L., et al. (1998) : J.

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[13] Cho, D., Mattice W. L., et al. (1989) : Polymer, 30,1955-1958.
[14] 島田和子 (2003) : 日本家政学会誌, 54, 957-962.

第 58 号