Techniques d’ingénierie reproductive de la Souris
Techniques d’ ingénierie reproductive de la souris

Manuel Technique

Naomi Nakagata
Division d’ingénierie reproductive
Centre de Ressources Animales et de Développement (CARD)
Université de Kumamoto, Japon
Version française

Fabien DelerueTechniquesd’ingénierie
reproductive

de la Souris

Manuel Technique

Manuel Technique
Na o mi Na ka ga t a
Ve r si o n fran ç ai s e

Fabien Delerue

10187

Techniquesd’Ingénierie
Reproductive
de la Souris
Manuel Technique
Naomi Nakagata
En collaboration avec Shuuji Tsuchiyama
Division dʼingénierie reproductive
Centre de Ressources Animales et de Développement (CARD)
Université de Kumamoto, Japon
Version française : Fabien Delerue3ème édition
Publié par COSMO BIO CO., LTD.
Toyo-Ekimae Bldg., 2-20, Toyo 2-Chome, Koto-ku, Tokyo 135-0016,
Japon
Téléphone; +81-3-5632-9617
Conception de la couverture: COSMO BIO CO., LTD.
Droits dʼauteur© 2018 Naomi Nakagata
TOUS DROITS RESERVES. IMPRIME AU JAPONCe manuel nʼest pas destiné à la vente.
La reproduction (même partielle), la sauvegarde dans un système dedonnées ou la transmission sous quelque forme ou par nʼimportequel moyen électronique, mécanique, par photocopie,
enregistrement ou autres, sont strictement interdites sans accord
préalable de lʼauteur.

PréfaceCes dernières années, la production de souris génétiquement modifiées s’est
largement accrue. De plus, les progrès réalisés dans le domaine destechniques d’altération des génomes (par TALEN et CRISPR/Cas9)
appliquées en biologie moléculaire sont sans précèdent. A tel point qu’unelignée de souris génétiquement modifiées est désormais aisément produite
en quelques mois. Une telle production a largement été rendue possible
grâce à l’apport de techniques d’ingénierie reproductive de la souris telles
que la fécondation in vitro, la congélation d’embryons et de sperme, et lestechniques de transfert d’embryons. Ces techniques périphériques sontdevenues incontournables, et leur utilisation ne cesse d’augmenter.
Par conséquent, plusieurs manuels techniques faisant référence à certaines
techniques d’ingénierie reproductive de la souris ont été publiés, mais il
n’existe pas encore de manuel complet décrivant en détail toutes lestechniques de pointe nécessitant l’utilisation de microscope stéréoscopique.
C’est dans cette optique que nous avons créé ce manuel de techniquesd’ingénierie reproductive de la souris, dans un souci de compréhension par
tous. Ce manuel contient de nombreuses illustrations graphiques, photos etvidéos, et les explications étape par étape qui les accompagnent se veulent
les plus complètes possibles, dans un souci de clarté. Nous espérons que cemanuel deviendra le guide de référence pour tous les étudiants, techniciens,
chercheurs, ou toute personne désireuse d’étudier les techniquesd’ingénierie reproductive de la souris.

Naomi Nakagata

Techniques dʼingénierie reproductive de la souris

TABLE DES MATIERES
Chapitre

１ Fécondation In Vitro (FIV)

1-1 Préparation et assemblage de pipettes pour la manipulation dʼembryons
1-2 Fécondation(FIV)
1-3 Fécondation(FIV) après Ultra-Superovulation
Chapitre

2

Transport de sperme

2-1 Collection et transport réfrigéré de queues dʼépididymes
2-2 Fécondation
avec sperme épididymaire réfrigéré
Chapitre

3

4

14
18

Congélation de sperme

3-1 Congélation de spermatozoïdes murins
3-2 Fécondation
avec spermatozoïdes congelés
3-3 Méthode de ressuscitation de lignées par Fécondation
congelésChapitre

20
26
avec spermatozoïdes
32

Préparation d’ovocytes & d’embryons

4-1 Préparation dʼovocytes microdisséqués au Laser
4-2 Dissection Partielle de la membrane Pellucide (DPP)
4-3 Collection dʼembryons au stade 2 cellules

Chapitre

5

36
39
42

Transport d’ovocytes & d’embryons

5-1 Transport dʼembryons réfrigérés au stade 2 cellules
5-2 Transport réfrigéré dʼoviductes de souris contenant des embryons au stade 2 cellules

Chapitre

6

7

54
59
62

Autres techniques

7-1 Vasectomie pour la production de males stériles
7-2 Transfert dʼembryons dans lʼoviducte
7-3 Transfert utérin dʼembryons
7-4 Césarienne et adoption
Chapitre

8

46
52

Congélation d’ovocytes & d’embryons

6-1 Vitriﬁcation simple dʼembryons murins
6-2 Vitriﬁcation simple dʼovocytes murins
6-3 Vitriﬁcation et transport dʼovaires de souris

Chapitre

4
6
12

64
66
72
76

Milieux

8-1 Stockage de milieux et solutions en ampoules sous atmosphère azotée
8-2 Tableaux de composition des milieux

*

78
79

voir détails en page 90

3

Chapitre

1

Fécondation In Vitro (FIV)

1-1 Préparation et assemblage de pipettes pour la
manipulation dʼembryons
Matériel et Equipement
1. Capillaires en verre (Micropipettes calibrées; 2-000-200; Compagnie Scientiﬁque Drummond, USA)
2. Lampe à pétrole (ou bec benzène No. RK4102; REKROW INDUSTRIAL INC.)

Note
Capillaires et aspirateurs buccaux
pré-assemblés pour la manipulation dʼembryons sont disponibles
à la vente chez Cosmo Bio Co., Ltd.
(Embryo manipulation instrumentset, Cat. No. KYD-S036)

3. Lime4. Hématimètre
5. Pipette Pasteur
6. Cotton
7. Tube en silicone
8. Bouchon en silicone
9. Aspirateur buccal

Procédure
Nettoyage et stérilisation des capillaires en verre
1.

Immerger les capillaires en verre dans un mélange (99:1) dʼéthanol à 70% et dʼacidehydrochlorique concentré pendant au moins 12 heures.

2.

Rincer les capillaires en verre à lʼeau courante pendant au moins 3 heures.

3.

Rincer les capillaires en verre 4 ou 5 fois à lʼeau distillée.

4.

Stériliser les capillaires en verre à 180℃ pendant au moins 3 heures.

Préparation de pipettes pour la manipulation dʼembryons
1.

Chauﬀer le centre du capillaire en verre en utilisant la partie supérieure de la ﬂamme dela lampe à pétrole. Dès que le verre commence à fondre, retirer le capillaire de la ﬂamme
et immédiatement étirer le capillaire en tirant simultanément sur les deux bouts.

2.

Placer le centre du capillaire (partie ﬁne étirée) dans la ﬂamme et laisser fondre jusquʼàobtenir deux morceaux.

3.

Ajuster la longueur du capillaire à environs 10 cm en faisant une entaille sur la partieétirée du capillaire avec une lime, puis en appuyant sur lʼextrémité du capillaire pour laNotebriser.
4.

Vériﬁer le diamètre du bout du capillaire en utilisant un hématimètre sous le microscope.

[Lorsque le bord du capillaire est en focus][Lorsque lʼhématimètre est en focus]

300 µm 200 µm[Fabrication de pipettes pour la manipulation dʼembryons]

4No. 01-01

Le s d im e n s io n s d u cap illairedépendent du temps passé dansla ﬂamme et du timing utilisé pourétirer le capillaire.
La fabrication de capillaires aux
dimensions constantes requiert unpeu de pratique.
Le diamètre externe du capillaire
une fois étiré doit at teindre ap proximativement 200-250 µm.

Fécondation In Vitro (FIV)
5.

Chapitre

1

Polir et stériliser le bout du capillaire en le passant très rapidement dans la ﬂamme.
Prendre soin de ne pas rester trop longtemps dans la ﬂamme pour ne pas boucher lecapillaire.
[Bout du capillaire avant polissage][Bout du capillaire une fois poli][Polissage du bout du capillaire] No. 01-02

Assemblage des capillaires avec lʼaspirateur buccal pour la
manipulation dʼembryons
1.

Couper le bout du capillaire avec une lime (en laissant approximativement 1 cm).

2.

Polir le bout du capillaire en le passant dans la ﬂamme de la lampe à pétrole.

3.

Insérer un morceau de coton dans le capillaire.

4.

Insérer le bouchon en silicone du côté le plus large du capillaire.

5.

Enﬁler un tube en caoutchouc du côté le plus ﬁn du capillaire.

6.

Couper le tube en caoutchouc à une longueur convenable, et ﬁxer lʼaspirateur buccal
au bout du tube.

[Capillaire et aspirateur buccal pour la manipulation dʼembryons]

Pipette Pasteur
CouperCapillaire Embout
Pipetteen verre en silicone Pasteur

Morceaude coton

Tube ensilicone

Aspirateur
buccalManipuler les embryons
1.
2.

Placer lʼaspirateur buccal en bouche.
Sous le microscope, placer le bout du capillaire dans une goutte de milieu. Laisser leliquide monter dans le capillaire par capillarité.

3.

Lorsque le liquide cesse de monter par capillarité, aspirer avec précaution les embryons.
Pour déposer les embryons, souﬄer avec précaution dans le capillaire.

[Manipulation dʼembryons] No. 01-03

5

Chapitre

1

Fécondation In Vitro (FIV)

1-2 Fécondation In Vitro (FIV)

Matériel et équipement
1. PMSG (Sérum de Gonadotrophine de jument enceinte Cat. No. 80056-608; VWR
SCIENTIFIC INC.) (37.5UI/mL en solution saline stérile)
2. hCG (Gonadotrophine Chorionique humaine, CG-10; Sigma) (37.5UI/mL en solution
saline stérile)
3. Seringue à usage unique 1mL
4. FERTIUP®(Milieu de Préincubation: PM, Cat. No. KYD-002-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)
5. CARD MEDIUM®(Cat. No. KYD-003-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)
6. mHTF (Fluide tubal humain modiﬁé)7. Paraﬃne liquide
8. Micropipettes
9. Embouts de pipettes pour la préparation des boites de culture
10. Embouts de pipettes pour insémination (Pipette Tip Cat. No.114; Quality Scientific
Plastics)
11. Boites de Pétri en plastique (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
12. Ciseaux de précision
13. Une paire de forceps watchmaker's #5
14. Ciseaux à micro-ressorts (lame de 5mm)
15. Aiguille de dissection
16. Papier ﬁltre
17. Capillaires en verre pour manipulation dʼembryons
18. Microscope
19. Etuve humidiﬁée (37℃, 5% CO2 )ProcédureSuperovulation
1.

Induire la superovulation avec 7.5UI de sérum de jument (PMSG) par femelle mature(âgées de 8-12 semaines) par injection intrapéritonéale (i.p.). (Le sérum de jument est en
général injecté durant la phase lumineuse du cycle, entre 14h00 et 18h00).

2.

48 à 52 heures plus tard, injecter 7.5UI de Gonadotrophine humaine (hCG) par voie
intrapéritonéale.

Préparation de boites de culture1.

Préparer les boites de culture comme indiqué ci-dessous and placer-les dans lʼétuve (37℃,
5% CO2) pour équilibrer les milieux de culture.

Pipeter une gouttede milieu
dans la boite de Pétri.

6

Verser de la paraﬃneliquide dans la boite de Pétri.

Recouvrir la goutte demilieu avec la paraﬃne liquide

Fécondation In Vitro (FIV)

Chapitre

1a. Boite contenant le sperme
Placer 1 goutte (100 µL / goutte) de FERTIUP®(PM) dans une boite de Pétri et recouvrer avec
de la paraﬃne liquide 30 minutes avant de collecter le sperme, puis placer la boite danslʼétuve.

【Boite contenant le sperme】
Paraﬃne liquideFERTIUP®(PM) 100 µL

b. Boite de fécondation
Placer 1 goutte (200 µL / goutte) de CARD MEDIUM®dans une boite de Pétri et recouvrer
avec de la paraﬃne liquide 10 minutes avant de collecter les ovocytes, puis placer la boite
dans lʼétuve.

Note
Il y a trois méthodes différentes
pour préparer le CARD MEDIUM®,
selon que la fécondation in vitro est
faite à partir de sperme frais, con-【Boite de fécondation】

g elé, ou réfrig éré. Reportez-vous
au manuel dʼinstruction du CARD
MEDIUM®pour plus de détails.

Paraﬃne liquide

CARD MEDIUM®200 µL

c. Boite de rinçage
Placer 4 gouttes (80 µL / goutte) de mHTF dans une boite de Pétri et recouvrer avec de laparaﬃne liquide. Placer la boite dans lʼétuve 30 minutes minimum.

【Boite de rinçage】

Paraﬃne liquide

mHTF 80 µL

7Chapitre
Chapter1

Fécondation In Vitro (FIV)Collection de spermatozoïdes
1.

Sacrifier un ou deux males matures (âgés de 3 à 6 mois) et disséquer leurs queuesdʼépididymes en évitant au maximum de prélever graisse, sang ou autres ﬂuides.

2.

Placer lʼéchantillon sur du papier ﬁltre pour se débarrasser de ﬂuides potentiels.

Incision

Mur abdominal● Pincer la peau, la soulever et faire une

incision le long de la ligne pointillée
indiquée sur le diagramme ci-dessus.
● Saisir la peau au niveau de lʼincision, et

ouvrir en tirant vivement et simultanément
la peau en sens opposés (vers la tête et versla queue), comme indiqué par les ﬂèches duschéma.

● Disséquer le mur abdominal, en prenant soin

Epididymede ne pas endommager les organes
internes.

Amas graisseux
Testicules

Vessie[Prélever les têtes dʼépididymes] No. 02-01

3.

Placer les queues dʼépididymes dans la goutte de FERTIUP® (PM) (boite contenant lesperme).

【Boite contenant le sperme】

Paraﬃne liquideTêtes dʼépididymes

4.

FERTIUP®(PM) 100 µL

Disséquer le canal de chaque queue dʼépididyme avec les ciseaux à micro-ressorts, puis
presser doucement sur la surface des queues dʼépididymes avec lʼaiguille de dissection
pour faire sortir le sperme.

5.

Avec lʼaiguille de dissection, introduire les amas de spermatozoïdes (expulsés des queuesdʼépididymes) dans la goutte de FERTIUP®(PM).

8Fécondation In Vitro (FIV)

Chapitre

1

Aiguille à dissectionTête dʼépididyme

Amas de spermatozoïdes

Note

Introduire dans la goutte
Forceps

Ciseaux àmicro-ressorts

peuvent être observés à la périphérie de la goutte de milieu de culture,après avoir procédé à des mouvements de rotation de la boite de[Expulser les spermatozoïdes] No. 02-02

6.

Le degré de fertilité varie énormément selon le type de spermatozoïdes utilisés.
Les spermatozoïdes les plus fertiles

Placer la suspension dans lʼétuve (37 ℃ , 5% CO2) pendant 60 minutes pour permettreau sperme de féconder les ovocytes avant insémination.

Pétri.
A contrario, les spermatozoïdes les
moins fertiles sont peu mobiles et
non homogènes.

Collection des Ovocytes
1.

Sacriﬁez une femelle superovulée mature (âgée de 8 à 12 semaines) approximativement
15-17 heures après administration de Gonadotrophine humaine (hCG).

2.

Disséquez la souris pour exposer la cavité abdominale.

3.

Poussez lʼappareil digestif sur le côté pour exposer les utérus, oviductes, et ovaires.

4.

Prélevez les utérus, oviductes, et ovaires et placez-les sur le papier ﬁltre stérile.

5.

Disséquez les oviductes, en se débarrassant au maximum des graisses, sang, et autres
ﬂuides.

Rein
Foie

Rate

Oviducte
UtérusOvaireVessieTube digestif

Utérus
Oviducte
Ovaire[Prélever les oviductes] No. 02-03

6.

Immergez les oviductes dans la paraﬃne liquide de la boite de fécondation.

【Boite de fécondation】

Paraﬃne liquide

CARD MEDIUM®200 µL

Oviductes

9Chapitre
Chapter1
7.

Fécondation In Vitro (FIV)

Maintenez chaque oviducte en position ﬁxe au fond de la boite de Pétri avec un forceps,
et déchirez lʼampoule avec lʼaiguille de dissection pour faire sortir les complexes cumulusovocytes (CCOs). Déplacez les CCOs dans la goutte de CARD MEDIUM®(200 µL).
[Introduire les Complexes Cumulus-Ovocytes (CCOs) dans une goutte de CARD MEDIUM®]

Forceps

Aiguille à déchirer

Déchirer

AmpouleIntroduire dans la goutte

Oviducte

Note
Assurez-vous dʼeffectuer toutes lesopérations, depuis lʼabatag e des(CCOs)

Ampoule(CCOs)

Goutte de CARD MEDIUM®

No. 02-04

8.

femelles et la collecte des oviductes
jusquʼà lʼimmersion des CCOs dansla goutte de CARD MEDIUM® en un
minimum de temps (30 secondes
maximum).
Si vous eﬀectuer la procédure sansassistance, assurez-vous de ne pas

Maintenez la boite de fécondation avec les CCOs dans lʼétuve (37℃, 5% CO2 ) pendant
30-60 minutes avant insémination.

sacrifier plusieurs souris à la fois. Il
est préférable de nʼabattre quʼunesouris et prélever ses oviductes
rapidement avant de procéder à ladissection de la souris suivante.

Insémination
1.

Pipetez (embouts de pipettes Cat. No.114; Quality Scientiﬁc Plastics) un volume approprié(en général 3 µL) de sperme en suspension dans la goutte de CARD MEDIUM®contenant
les CCOs.

2.

Placez la boite de fécondation dans lʼétuve (37℃, 5% CO2).

【Boite de fécondation】

3

3

Sperme ensuspensionµLµL【Boite contenant le sperme】

CCOs
Incuber

FERTIUP®(PM) 100 µL

10

CARD MEDIUM®200 µL

Fécondation In Vitro (FIV)
3.

Chapitre1

3 heures après insémination, rincez les ovocytes 3 fois dans du mHTF frais (80 µL) de laboite de rinçage, en évitant de transférer du CARD MEDIUM®.

【Boite de fécondation】

4.

【Boite de rinçage】

6 heures après insémination, observez les ovocytes dans la 3ème goutte de mHTF etéliminez tout ovocyte parthénogénétique (nʼayant quʼun seul pronucléus).
[Apparence des ovocytes fécondés, non-fécondés, ou parthénogénétiques]

Ovocytenon-fécondé (C)Deuxième globule polaire
Pronucléus femelle
Pronucléus male
Ovocytefécondé (A)Globule polaire
Pronucléus
Ovocyteparthénogénétique (B)NoteLors de cette étape, il est importantde repérer les ovocytes parthénogénétiques et des les éliminer.
Si cette étape est occultée, les ovocytes parthénog énétiques auront
atteint le stade deux-cellules dès lelendemain, et il sera alors impossible de les distinguer des ovocytes
fécondés.

Note
5.

Après une nuit de culture, transférez uniquement les embryons ayant atteint le stade2 cellules dans la 4ème goutte de mHTF de la boite de rinçage. Ces embryons peuventêtre vitrifiés, réimplantés, ou cultivés jusquʼau stade blastocyste. (Reportez-vous
aux chapitres Vitrification rapide dʼembryons murins en page 54 et Réimplantationdʼembryons dans lʼoviducte en page 66).

Un ovocyte fécondé a deux pronucléi, un male et un femelle (A). Au
contraire, un ovocyte parthénogénétique nʼa quʼun pronucléus (B) et
un ovocyte non fécondé nʼa pas depronucléus (C).

【Boite de rinçage】

Références
1.

Toyoda Y., Yokoyama M., and Hosi T. 1971. Studies on the fertilization of mouse eggs invitro. Jpn. J. Anim. Reprod. 16: 147-151.

11

Chapitre

1

Fécondation In Vitro (FIV)

1-3 Fécondation In Vitro (FIV) après ultra-superovulation

Matériel and Equipement
1. Agent dʼUltra-superovulation (CARD HyperOva®)
2. Le reste du matériel est similaire à celui utilisé pour la FIV avec sérum de jument (PMSG).

Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en page 6.

Procédure
Ultra-superovulation
1.

Induire la superovulation par injection intrapéritonéale de 0.1 à 0.2mL de CARD
HyperOva® sur une femelle âgée de 26 à 30 jours (le jour de naissance est compté
comme Jour 0).

2.

48 heures plus t ard, procéder à une inject ion int rapérit onéale de 7.5UI de
gonadotrophine humaine (hCG).

Préparation des boites de Pétri et collection de spermatozoïdes
1.

Préparer les boites de Pétri et collecter les spermatozoïdes de manière similaire à celle dela FIV avec sérum de jument (PMSG). Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en
page 6.

Collection des ovocytes
Après injection de CARD HyperOva®, les oviductes des femelles superovulées enflent demanière significative. Prenez donc soin de les manipuler avec précaution en suivant laméthode décrite ci-dessous pour ne pas les endommager.
1.
2.

Retirer les oviductes (avec ampoules) de la cavité abdominale des femelles.
Placer les oviductes rapidement sur du papier ﬁltre stérile pour éliminer lʼexcès de sanget ﬂuides.

3.

Immerger les oviductes dans la paraﬃne liquide de la boite de fécondation.

4.

Utiliser une goutte de CARD MEDIUM®(200 µL) par femelle (2 oviductes).

Procéder aux étapes suivantes comme indiqué au chapitre Fécondation In Vitro en page 9.

Insémination
1.

Pour lʼinsémination, pipeter 6 µL de sperme en suspension (pré-incubé de manière
identique à la FIV avec sérum de jument ‒ PMSG).

Les autres procédures relatives à lʼinsémination sont décrites au chapitre Fécondation In

Vitro en page 10.

12Fécondation In Vitro (FIV)

Chapitre1

Références
1.

Takeo T., Nakag ata N. 2015. Superovulation using the combined administrationof inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number ofovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE 10(5): e0128330. doi:10.1371/
journal.pone.0128330

2.

Takeo T., Nakagata N. 2016. Immunotherapy using inhibin antiserum enhanced theefficacy of equine chorionic gonadotropin on superovulation in major inbred andoutbred mice strains. Theriogenol. doi:10.1016/j.theriogenology.2016.04.076

13

Chapitre

2

Transport de sperme

2-1 Collection et transport réfrigéré de têtes dʼépididymes

Matériel and Equipement
1.

Souris male (âgée de 12 semaines)

2. Anesthésiants
3. Plaque chauﬀante (37℃)
4. Ciseaux de précision
5. Une paire de forceps watchmaker's #5
6. Clips de suture (Autoclip 9 mm; Clay Adams 427631) et applicateur de clips (Mik-Ron

Autoclip Applier; Clay Adams 427630)
7. Moniteur de température (Thermochron iButton Cat. No. DS1921G; Maxim Integrated

Products)
8. Solution pour transport réfrigéré de têtes dʼépididymes (Cat. No. KYD-007-EX, Cosmo

Bio Co., Ltd.)9. Kit de transport réfrigéré CARD (Cat. No. KYD-006-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)• Thermos (Cat. No. JMK-501; Thermos K.K.)• Boite en papier (pouvant contenir des tubes de 0.2mL)• Un morceau de coton• Blocs réfrigérants (petits et grands)• Conteneur de transport en Polystyrène (Cat. No. KC-3, KARUX)

Le kit de transport CARD et la solution de préservation doivent tous les deux êtreréfrigérés à 4-8℃ avant utilisation.

ProcédureCollection des têtes dʼépididymes
1.

Anesthésier la souris male.

2.

Faire une petite incision au niveau du scrotum pour faire sortir la tête dʼépididyme.

Scrotum
Patte dederrière

Queue

Tête
dʼépididyme

Canal déférent

Couper le canal déférent et le corps de lʼépididyme, puis collecter la tête dʼépididyme.

IncisionTêtedʼépididyme

14

Corps
dʼépididyme

Testicule

Incision3.

QueuedʼépididymeTêtedʼépididyme

Transport de sperme

Chapitre2[Collecte de tête dʼépididyme]

Amas graisseuxTête dʼépididyme[Collection de la tête dʼépididyme sur un male anesthésié] No. 03-01
4.

Replacer les testicules dans lʼabdomen et suturer à lʼaide de clips.

5.

Maintenir la souris sur la plaque chauﬀante à 37℃ jusqu'à ce que lʼeﬀet desanesthésiants ait complètement disparu.

Emballage et transport des têtes dʼépididymes
Le matériel utilisé pour emballer les têtes dʼépididymes doit être maintenu à 4-8 ℃

RemarqueUne se maine ap rès lʼo p é rat io nchirurg icale le male peut être ànouveau accouplé.

jusqu'à utilisation. De plus, la procédure dʼemballage doit être effectuée le plus
rapidement possible pour éviter le réchauﬀement des têtes dʼépididymes.

1.

Transférez les têtes dʼépididymes dans le tube de 0.2mL contenant la solution detransport.

ForcepsTête dʼépididyme

Tube de 0.2mL2.

Solution pour transport réfrigéré

Placez le tube contenant les têtes dʼépididymes, le moniteur de température, et lemorceau de coton dans la boite en papier.

Moniteur de température

Tube de 0.2mL

Coton

Couvercle

Boite en papier

15Chapitre

2

Transport de sperme

3. Placez la boite en papier dans le thermos.

Thermos

Boite en papierInsérer

4. Placer deux petits blocs réfrigérants dans le thermos.

Thermos

Blocs réfrigérants

Insérer

5. Visser le couvercle du thermos.

Bloc réfrigérant
Couvercle du thermos

Note
Prenez soin de ne pas placer laboite en papier à lʼenvers.

Note
6. Mettre un grand bloc réfrigérant au fond du conteneur en polystyrène et placer lethermos par dessus.
7. Ajouter un grand bloc réfrigérant de chaque côté du thermos, et un dernier par dessus.
8. Mettre le couvercle du conteneur en place et attacher le avec du scotch.

16

Il nʼest pas possible de mettre lethermos au fond du conteneur carla taille du thermos est la mêmeque celle du conteneur. Le thermos
doit donc être placé au centre duconteneur en polystyrène, ce qui
assure une plus grande protection
durant le transport.

Transport de sperme

Bloc réfrigérant

Thermos

Blocs réfrigérants

Bloc réfrigérant

Chapitre2

Note
Le conteneur doit être maintenu
réfrigéré durant le transport.
Assurez-vous des conditions detransport auprès du service postal.

Fermer hermétiquement à lʼaide de scotch.

9. Maintenir le conteneur réfrigéré jusqu'à arrivée du transporteur.
10. Envoyer le conteneur par service postal.

RemarqueLes capacités de fertilisation dusp erme ép ididymaire réfrig éré
restent maximales jusquʼà 72 heures.

Références
1.

Takeo T., Tsutsumi A., Omaru T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Nakamuta Y.,
Takeshita Y., Matsunaga H., Tsuchiyama S., Sakoh K., Nakao S., Yoshimoto H., ShimizuN., and Nakagata N. 2012. Establishment of a transport system for mouse epididymal
sperm at refrigerated temperatures. Cryobiology. 65(3): 163-168.

17

Chapitre

2

Transport de sperme

2-2 Fécondation In Vitro avec sperme épididymairetransporté à basse température
Matériel et Equipement
1. Queues dʼépididymes transportées à basse température
2. FERTIUP®(Milieu de Préincubation: PM, Cat. No. KYD-002-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)
3. mHTF (Fluide tubal humain modiﬁé)4. Paraﬃne liquide
5. Micropipettes
6. Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
7. Ciseaux de précision
8. Une paire de forceps watchmaker's #5
9. Papier ﬁltre
10. Etuve humidiﬁée (37℃ , 5% CO2)

ProcédureCollection des queues dʼépididymes
1.

Pipetez une goutte (100 µL / goutte) de FERTIUP®(PM) dans une boite de Pétri andrecouvrez-la avec de la paraﬃne liquide 30 minutes avant de collecter le spermeépididymaire transporté à basse température, et placer la boite dans lʼétuve (37℃, 5%
CO2 )【Boite contenant le sperme】

Paraﬃne liquide
2.

FERTIUP®(PM) 100μL

Retirez le tube de 0.2mL du conteneur de transport en polystyrène.
[Collecter les queues dʼépididymes] No. 04-01

3.

Ouvrez le tube, collectez les queues dʼépididymes et placez-les sur un papier ﬁltre
rapidement pour égoutter la solution de transport.

ForcepsTête dʼépididyme
Papier ﬁltre
Solution pourtransport réfrigéré

18

Transport de sperme
4.

Chapitre

2

Rincez les queues dʼépididymes dans chacune des trois gouttes de mHTF de la boite deRemarquerinçage. Apres rinçage, égouttez lʼexcès de mHTF sur le papier ﬁltre.

Préparer les boites de rinçage juste
avant leur utilisation en disposant
3 gouttes de mHTF (100µL / goutte)【Boite de rinçage】

dans une boite de Pétri sans recouvrir de paraﬃne liquide.

Papier ﬁltre

5.

Placez les queues dʼépididymes dans la boite de Pétri contenant le sperme. Les
spermatozoïdes épididymaires transportés à basse température peuvent être utiliséspour la fécondation in vitro de la même manière que le sperme fraichement prélevé.
Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en page 6.

Références
1. Takeo T., Tsutsumi A., Omaru T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Nakamuta Y.,
Takeshita Y., Matsunaga H., Tsuchiyama S., Sakoh K., Nakao S., Yoshimoto H., ShimizuN., and Nakagata N. 2012. Establishment of a transport system for mouse epididymal
sperm at refrigerated temperatures. Cryobiology. 65(3): 163-168.

Note
Si le sperme ne sort que difficilem e nt , p ro cé de z à une incisio n
supplémentaire dans les queuesdʼépididymes pour libérer plus desperme.

Note
Il y a trois méthodes différentes
pour préparer le CARD MEDIUM®,
selon que la fécondation in vitro est
faite à partir de sperme frais, cong elé, ou réfrig éré. Reportez-vous
au manuel dʼinstruction du CARD
MEDIUM®pour plus de détails.

19Chapitre

3

Congélation de sperme

3-1 Cryopréservation de spermatozoïdes murins

Matériel and Equipement
1. Souris male (âgée de 12 semaines)
2. Ciseaux à micro-ressorts (lame de 5 mm)
3. Une paire de forceps watchmaker's #5
4. FERTIUP®(Agent CryoProtecteur: ACP, Cat. No. KYD-001-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)
5. mHTF (Fluide tubal humain modiﬁé)6. Paraﬃne liquide
7. Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
8. Embouts pour pipettes
9. Paillettes pour sperme (10 Pièces x 10 lots, EOG stérilisées, Cat. No. KYD-S020X10,

Cosmo Bio Co., Ltd.)
10. Micropipettes
11. Connecteur de paillettes (Cat. No. KYD-S025, Cosmo Bio Co., Ltd.)12. Scelleuse thermique à impulsions
13. Gobelet pour la congélation (Cat. No. KYD-S018, Cosmo Bio Co., Ltd.)
14. Cassette triangulaire (10 unités, Cat. No. KYD-S021 or KYD-S035, Cosmo Bio Co., Ltd.)
15. Cuve ou conteneur à azote liquide
16. Plaque chauﬀante (37℃ )Procédure
Préparation du gobelet pour la congélation
1. Insérer fermement un morceau de polystyrène au fond de la seringue.
2. Obturez le bout de la seringue en le faisant fondre dans une ﬂamme.
3. Attachez la seringue à une barre en acrylique.

Barre acrylique(5 mm X 5 mm X 50 cm)

Attachez la seringue
à la barre acrylique
Seringue à usage
unique de 50 mL
Polystyrène(30mm dʼépaisseur)
Attachez la seringue
à la barre acrylique
Obturez à la ﬂamme

20Congélation de sperme

Chapitre3

Préparation du connecteur de paillettes
1. Assemblez une seringue 1 mL, un robinet 3 directions, un tube en silicone, un embout
en plastique, et un bouchon de silicone comme indiqué sur le schéma ci-dessous.

2. Pour utiliser le connecteur de paillettes, il suﬃt de couper la paillette pour sedébarrasser du bouchon en coton, puis enﬁler la paillette dans le bouchon de silicone.
1. [Assemblage du connecteur de paillettes]

Label

Paillette

CouperBouchonen silicone

Tube enplastique

Tube ensilicone

Robinet 3 directions

Seringue 1 mL

(Connecteur de paillettes)

Préparation de la suspension de sperme
1.

Pipeter une goutte de 60 µL de FERTIUP®(ACP) sur une boite de Pétri de 35 mm etrecouvrez-la de paraﬃne liquide.

2.

Ajouter 60 µL de la même solution à la première goutte (volume ﬁnal: 120 µL) pourcréer une goutte semi-sphérique et minimiser le diamètre de la base. Placer la boite surune plaque chauﬀante à 37℃ jusqu'à utilisation.

60µL de FERTIUP®(ACP)

Ajoutez 60µL de FERTIUP®(ACP)à la goutte

Paraﬃne liquide

3.

Sacriﬁez un male (> 12 semaines) par dislocation cervicale et disséquez les deux têtes
dʼépididymes de manière aseptique.

4.

Placez les têtes dʼépididymes sur le papier ﬁltre pour égoutter au microscope le sang etla graisse.

5.

Transférez les têtes dʼépididymes dans une goutte de FERTIUP®(ACP) et faites 5 à 6incisions dans les épididymes à lʼaide des forceps watchmaker's #5 et des ciseaux à
micro-ressorts.
Têtes dʼépididymesTêtes dʼépididymes

Paraﬃne liquideFERTIUP®(ACP)FERTIUP®(ACP)21

Chapitre

3
6.

Congélation de sperme
Placer la boite sur la plaque chauﬀante à 37℃ pendant 3 minutes et faites faire de petites
rotations à la boite pour disperser le sperme dans le FERTIUP®(ACP) chaque minute.

[Dissection des têtes dʼépididymes et préparation de la suspension de sperme] No. 05-01

Préparer les paillettes contenant le sperme en suspension
Attachez une paillette au connecteur.

1.

Aspirer délicatement dans la paillette et dans lʼordre suivant:2.
a.

100 µL de mHTF,

b.

15mm dʼair,c.

10 µL de sperme en suspension,d.

15 mm dʼair.

a.
Ampoule en verre

Paillette
Connecteur de paillettes

mHTF

b.
15mm
dʼair

mHTF

c.
Paillette

Suspension de sperme (10µL)

mHTF

15mm dʼair

d.

mHTF

15mm dʼair
Suspension de sperme
15mm dʼair

22

Congélation de sperme
3.

Chapitre

3

Scellez les deux côtés de la paillette avec la scelleuse à impulsions.

Remarque
Suspension de sperme

mHTF

Le mHTF est ajouté dans la paillette pour éviter que celle-ci flotteà la surface de lʼazote liquide car le
mHTF augmente le poids de la paillette, lui permettant de couler.

15mm 15mmdʼair dʼair
Obturez hermétiquement

Obturez hermétiquement

4.

Répétez la procédure pour collecter 10 échantillons par souris de la même manière.

Congélation de sperme dans une cuve cryobiologique
1.

Placez les paillettes dans un gobelet pour congélation, et laissez-le ﬂotter dans le

2.

Au bout de 10 minutes, immergez rapidement le gobelet dans lʼazote liquide.

conteneur cryobiologique.

Gobelet pour la congélation

Paillettes

Azote
liquide10 minutes[Gobelet ﬂottant sur lʼazote liquide][Gobelet immergé dans lʼazote liquide]

Gobelet pour la congélation

10 minutes
Paillettes[Congélation des paillettes] No. 05-02

23

Chapitre

3
3.

Congélation de sperme
Retirez le gobelet de lʼazote liquide et transférez les paillettes dans une cassettetriangulaire pour un stockage à long terme dans une cuve à azote liquide.

Cassette triangulaire
Transférez lespaillettes congelées

Azote
liquideGobeletGobelet pour lacongélation

Congélation de sperme dans un conteneur cryobiologique
1. Transférez les paillettes dans une cassette triangulaire.
2. Placez la cassette triangulaire dans un gobelet pré-frigoriﬁé.
3. Placez le gobelet dans le conteneur à azote liquide pendant 10 minutes.

Cassette
triangulaire

Paillette
GobeletPaillettes
Cassette triangulaire

Conteneurcryobiologique

Remarque
La congélation de sperme dans unconteneur cryobiologique peut êtreutilisée à des fins de transport dusperme.

24

Congélation de sperme

Chapitre3

Références
1.

Nakagata N., and Takeshima T. 1992. High fertilizing ability of mouse spermatozoa

2.

diluted slowly after cryopreservation. Theriogenol. 37: 1283-1291.
Nakagata N., Ueda S., Yamanouchi K., Okamoto K., Matsuda Y., Tsuchiya T., Nishimura
M., Oda S., Koyasu K., Azuma S., and Toyoda Y. 1995. Cryopreservation of wild mouse3.

spermatozoa. Theriogenol. 43: 635-643.
Nakagata N. 1996. Use of cryopreservation techniques of embryos and spermatozoa

4.

Anim. Sci. 46: 236-238.
Okamoto M., Nakagata N., Ueda O., Kamada N., and Suzuki H. 1998. Cryopreservation

5.

of gene disrupted mouse spermatozoa. J. Mamm. Ova. Res. 15: 77-80.
Takeo T., Hoshii T., Kondo Y., Toyodome H., Arima H., Yamamura KI., Irie T., andfor production of transgenic (Tg) mice and for maintenance of Tg mouse lines. Lab.

Nakagata N. 2008. Methyl-beta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6
mouse sperm after freezing and thawing by facilitating cholesterol eﬄux from the6.

cells. Biol Reprod. 78(3): 546-551.
Nakagawa Y., Fukumoto K., Kondo T., Koga M., Takeshita Y., Nakamuta Y., Sakaguchi M.,
Haruguchi Y., Tsuchiyama S., Kaneko T., and Nakagata N. 2009. Fertilization ability of7.

C57BL/6J mouse spermatozoa frozen in a dry shipper. Exp. Anim. 58(3) Suppl: 297.
Takeo T., and Nakagata N. 2010. Combination medium of cryoprotective agents
containing L-glutamine and methyl- β -cyclodextrin in a preincubation medium
yields a high fertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab. Anim.

8.

44(2): 132-137.
Nakagata N. 2011. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.

9.

Methods Mol Biol. 693: 57-73.
Takeo T., Nakagata N. 2011. Reduced glutathione enhances fertility of frozen/thawed
C57BL /6 mouse sperm after exposure to methyl-beta-cyclodextrin. Biol Reprod.
85(5): 1066-1072.

25

Chapitre

3

Congélation de sperme

3-2 Fécondation In Vitro avec spermatozoïdes congelés

Matériel and Equipement
1.

Souris femelle superovulée avec PMSG et hCG

2.

FERTIUP®(Milieu de Préincubation: PM, Cat. No. KYD-002-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)3.

CARD MEDIUM®(Cat. No. KYD-003-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

4.

mHTF (Fluide tubal humain modiﬁé)5.

Paraﬃne liquide

6.

Embouts pour pipette (Cat. No. 3520; Thermo SCIENTIFIC)

7.

Boites de Pétri en plastique (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)

8.

Connecteur de paillettes (Cat. No. KYD-S025, Cosmo Bio Co., Ltd.) (Se référer au chapitre
Congélation de spermatozoïdes murins en page 21)
Bain-marie maintenu à 37℃

9.

10. Morceau de polystyrène pour la décongélation
11. Micropipettes
12. Etuve humidiﬁée (37℃ , 5% CO2 )Procédure
Préparation du polystyrène pour la décongélation
1.

Découpez un morceau de polystyrène capable de faire ﬂotter un tube de 50 mL, comme
indiqué sur le schéma ci-dessous.

InsérerTube enplastique de 50mL

Polystyrène

26Congélation de sperme

Chapitre3

Préparation pour la décongélation
1.

Maintenez le bain-marie à 37℃ .

2.

Versez de lʼeau (37℃ ) dans le tube de 50 mL puis insérez-le dans le morceau depolystyrène avant de laissez ﬂotter le tout dans le bain-marie.

3.

Mettre une goutte (90 µL / goutte) de FERTIUP®(PM) dans une boite de Pétri etrecouvrez-la de paraﬃne liquide 30 minutes avant de commencer la décongélation.
Placez la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃, 5% CO2 ).

【Boite de Pétri contenant le sperme】
Paraﬃne liquide

90µL de FERTIUP®(PM)

4.

Mettre une goutte ( 90 µL / goutte ) de CARD MEDIUM®dans une boite de Pétri etrecouvrez-la de paraﬃne liquide 10 minutes avant de collecter les ovocytes. Placez laboite de Pétri dans lʼétuve (37℃,5% CO2 ).

Note【Boite de fécondation】

Il y a trois méthodes différentes
pour préparer le CARD MEDIUM®,
selon que la fécondation in vitro est
faite à partir de sperme frais, cong elé, ou réfrig éré. Reportez-vous
au manuel dʼinstruction du CARD

Paraﬃne liquide

MEDIUM®pour plus de détails.

90µL de CARD MEDIUM®

5.

Mettre quatre gouttes (80 µL / goutte ) de mHTF dans une boite de Pétri et recouvrezles de paraﬃne liquide. Placez la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃ ,5% CO2) au minimum
30 minutes.

【Boite de rinçage】

Paraﬃne liquide

80µL de mHTF

27

Chapitre

3

Congélation de sperme

Collection des Ovocytes
1.

Sacriﬁez une femelle 15-17 heures après injection dʼhCG et disséquer les oviductes.

Note(Se référer au chapitre Fécondation In Vitro en page 9)2.

Collectez les complexes cumulus-ovocytes (CCOs) à lʼaide dʼaiguilles de dissection
Fécondation).

opérations, depuis lʼabatag e desfemelles et la collecte des oviductes
jusquʼà lʼimmersion des CCOs dans

Maintenez la boite de fécondation avec les CCOs dans lʼétuve (37℃ , 5% CO2) pendantla goutte de CARD MEDIUM® en un

30-60 minutes avant insémination.

minimum de temps (30 secondes
maximum).

pointues et placez 4-6 CCOs par goutte de CARD MEDIUM®(90 µL) (Boite de3.

Assurez-vous dʼeffectuer toutes lesSi vous effectuer la procédure sansassistance, assurez-vous de ne pas【Boite de fécondation】

Incuber30-60 minutes

sacrifier plusieurs souris à la fois. Il
est préférable de nʼabattre quʼunesouris et prélever ses oviductes rapidement avant de procéder à la dissection de la souris suivante.

90µL de CARD MEDIUM®

Décongélation de spermatozoïdes murins
1.

Sortez une paillette de lʼazote liquide et maintenez-la à lʼair ambiant pendant
5 secondes.

2.

Placez immédiatement la paillette dans le tube de 50 mL ﬂottant dans le bain-marieà 37℃ pendant 10 minutes.

3.

Dix minutes après immersion, retirez la paillette du bain-marie.

4.

Essuyez la paillette avec du papier ﬁltre.

Note
Assurez-vous dʼimmerger complètement la partie de la paillette contenant le sperme lors de la décongélation dans le bain-marie.
Le s sp e rm at o zo ïd e s ayant é t écong elés puis réanimés sont particulièrement sensibles aux changements environnementaux.

Sortir une
paillette congelée

mHTF
Azote
liquideForceps

Suspension desperme (10µL)à

10 minutes

37℃
50 mL

Tube en plastique de

No. 06-01

Si la paillette nʼest pas maintenue
dans le bain-marie assez longtemps(10 minutes) la motilité des spermatozoïdes décongelés sera réduite.

Maintenir à lʼair
pendant 5 secondes Bain marie[Décongélation de Spermatozoïdes murins]

28

Polystyrène

Congélation de sperme

Chapitre

3

Transfert et préincubation de la suspension de sperme décongelée
1.

Tirez légèrement le piston hors de la seringue du connecteur de paillettes, et coupez lapaillette aux ciseaux entre le mHTF et lʼextrémité de la paillette.

< Connecteur de paillette>< Paillette>

Extrémité close

Extrémité close

Suspension
de sperme

mHTF
Couper la paillette.

2.

Tirez le piston à lʼavance.

Insérez la paillette dans le connecteur.

Insérer3.

Ouvrir le robinet aﬁn de relâcher la pression créée par lʼinsertion de la paillette dans leconnecteur.

Si vous avez omis de tirer le piston à lʼavance, vous pouvez le faire après
avoir ouvert le robinet (en le tournant vers lʼavant).

4.

Refermez le robinet et coupez la paillette entre lʼextrémité et la suspension de sperme.

Refermez le robinet en le mettant en position verticale.

Couper la paillette.

29

Chapitre

3
5.

Congélation de sperme
Poussez le piston avec précaution aﬁn de ne transférer que la suspension de sperme
dans la goutte de FERTIUP®(PM) (boite de Pétri contenant le sperme), puis placez la boite
dans lʼétuve (37℃ , 5% CO2) pendant 30 minutes.

Note
Assurez-vous de ne pas manipuler
les boites de Pétri contenant les
spermatozoïdes décong elés avant
quʼils ne soient suffisamment mobiles dans le milieu. En cas de manipulation excessive des boites de

FERTIUP®(PM)
Suspension de sperme

Pétri avant que les spermatozoïdes
commencent à boug er, ceux-ci nerécupèreront pas totalement leurmotilité.

mHTF【Boite de Pétri contenant le sperme】[Transfert de paillettes contenant le sperme décongelé] No. 06-02

Insémination
1.

Pipetez 10 µL de sperme préincubé à la périphérie de la goutte au moyen dʼun emboutde pipette conique (Cat. No. 3520; Thermo SCIENTIFIC).

Remarque2.

Ajoutez 10 µL de sperme à chaque goutte de CARD MEDIUM®contenant les CCOs.

3.

Incubez les ovocytes et spermatozoïdes pendant 3 heures dans une étuve (37℃ , 5%
CO2).

Les spermatozoïdes à haute motilité
ont tendance à se reg rouper à lapériphérie de la goutte.

Remarque【Boite de Pétri contenant le sperme】【Boite de fécondation】

Il est possible de pipeter 10 µL de la

Note

10

µL

CCOs

10

90µL de milieu
FERTIUP®(PM)µL

suspension de sperme jusquʼà 3-4
fois depuis la même goutte.

Incuber
pendant 3 heures[Pipetage du Sperme en Suspension depuis la périphérie de la goutte]

EmboutEmbout90µL de milieu FERTIUP®(PM)

90µL de milieu FERTIUP®(PM)
Sperme mobile

Paraﬃne liquide

Amas de sperme non-mobile[Aspiration de la Suspension de Sperme Préincubé et Insémination des Ovocytes]
No. 06-03

4.

Après incubation, rincez les ovocytes 3 fois dans du mHTF frais dans une boite derinçage, en évitant de transférer du CARD MEDIUM®.

30

Effectuez le pipetage des étapes 1
et 2 avec le plus de précaution possible.

Congélation de sperme【Boite de fécondation】

5.

Chapitre

3【Boite de rinçage】

Six heures après insémination, observez les ovocytes dans la troisième goutte de mHTF
et éliminez le ovocytes parthénogénétiques nʼayant quʼun seul pronucléus.
(Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en page 11)

6.

Après une nuit de culture, transférez uniquement les embryons ayant atteint le stade 2
cellules dans la 4ème goutte de mHTF de la boite de rinçage.
Ces embryons peuvent être vitriﬁés ou réimplantés.
(Reportez-vous aux chapitres Vitriﬁcation rapide dʼembryons murins en page 54 etTransfer dʼembryons dans lʼoviducte en page 66).

【Boite de rinçage】

Références
1.

Nakagata N., and Takeshima T. 1992. High fertilizing ability of mouse spermatozoa

2.

diluted slowly after cryopreservation. Theriogenol. 37: 1283-1291.
Nakagata N., Ueda S., Yamanouchi K., Okamoto K., Matsuda Y., Tsuchiya T., Nishimura
M., Oda S., Koyasu K., Azuma S., and Toyoda Y. 1995. Cryopreservation of wild mouse3.

spermatozoa. Theriogenol. 43: 635-643.
Nakagata N. 1996. Use of cryopreservation techniques of embryos and spermatozoa for

4.

Sci. 46: 236-238.
Okamoto M., Nakagata N., Ueda O., Kamada N., and Suzuki H. 1998. Cryopreservation of

5.

gene disrupted mouse spermatozoa. J. Mamm. Ova. Res. 15: 77-80.
Takeo T., Hoshii T., Kondo Y., Toyodome H., Arima H., Yamamura KI., Irie T., and Nakagata

production of transgenic (Tg) mice and for maintenance of Tg mouse lines. Lab. Anim.

N. 2008. Methyl-beta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm
after freezing and thawing by facilitating cholesterol eﬄux from the cells. Biol Reprod .

6.

78(3): 546-551.
Nakagawa Y., Fukumoto K., Kondo T., Koga M., Takeshita Y., Nakamuta Y., Sakaguchi M.,
Haruguchi Y., Tsuchiyama S., Kaneko T., and Nakagata N. 2009. Fertilization ability of7.

C57BL/6J mouse spermatozoa frozen in a dry shipper. Exp. Anim. 58(3) Suppl: 297.
Takeo T., and Nakagata N. 2010. Combination medium of cryoprotective agents
containing L-glutamine and methyl- β -cyclodextrin in a preincubation medium yields
a high fertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab. Anim. 44(2):8.

132-137.
Nakagata N. 2011. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.

9.

Methods Mol Biol. 693: 57-73.
Takeo T., Nakagata N. 2011. Reduced glutathione enhances fertility of frozen/thawed
C57BL/6 mouse sperm after exposure to methyl-beta-cyclodextrin. Biol Reprod. 85(5):1066-1072.

31

Chapitre

3

Congélation de sperme

3-3 Méthode de ressuscitation de lignées parfécondation In Vitro avec spermatozoïdes congelés
Matériel and Equipement
1. Stock de spermatozoïdes congelés
2. Souris femelle superovulée avec PMSG et hCG
3. FERTIUP®(Milieu de Préincubation: PM, Cat. No. KYD-002-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)
4. CARD MEDIUM®(Cat. No. KYD-003-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)
5. mHTF (Fluide tubal humain modiﬁé)6. Paraﬃne liquide
7. Bain-marie maintenu à 37℃
8.

Morceau de polystyrène pour la décongélation

9. Tube de 1.5mL (Quality Scientiﬁc Plastics 1.5ml Graduated Microcentrifuge Tube avec

Flat Top Cap, Natural Cat. No. 509-GRD-Q)
10. Centrifugeuse
11. Micropipettes
12. Boites de Pétri en plastique (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
13. Etuve humidiﬁée (37℃ , 5% CO2)

Procédure
Préparation du polystyrène pour la décongélation
1.

Découpez un morceau de polystyrène capable de faire ﬂotter un tube de 50 mL, comme
indiqué sur le schéma ci-dessous.

InsérerTube en plastique de 50mL

Polystyrène

Préparation pour la décongélation
1.

Maintenez le bain-marie à 37℃ .

2.

Versez de lʼeau (37℃ ) dans le tube de 50 mL puis insérez-le dans le morceau depolystyrène avant de laissez ﬂotter le tout dans le bain-marie.

3.

Mettre une goutte (100 µL / goutte) de FERTIUP®(PM) dans une boite de Pétri etrecouvrez-la de paraﬃne liquide 30 minutes avant de commencer la décongélation.
Placez la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃ ,5% CO2 in air).

32

Congélation de sperme

Chapitre

3【Boite de Pétri contenant le sperme】
Paraﬃne liquide

100 µL de FERTIUP®(PM)

4.

Mettre une goutte (200 µL / goutte) de CARD MEDIUM®dans une boite de Pétri etrecouvrez-la de paraﬃne liquide 10 minutes avant de collecter les ovocytes. Placez laboite de Pétri dans lʼétuve (37℃ ,5% CO2 in air).

Note
Il y a trois méthodes différentes【Boite de Pétri contenant les ovocytes】
Paraﬃne liquide

pour préparer le CARD MEDIUM®,
selon que la fécondation in vitro est
faite à partir de sperme frais, cong elé, ou réfrig éré. Reportez-vous
au manuel dʼinstruction du CARD

MEDIUM®pour plus de détails.

200 µL de CARD MEDIUM®

5.

Mettre quatre gouttes (80 µL / drop) de mHTF dans une boite de Pétri et recouvrezles de paraﬃne liquide. Placez la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃ , 5% CO2 in air) au
minimum 30 minutes.

【Boite de rinçage】

Paraﬃne liquide

80 µL de mHTF

Collection et préincubation des Ovocytes
1. Sacriﬁez une femelle 15-17 heures après injection dʼhCG et disséquer les oviductes.
(Se référer au chapitre Fécondation In Vitro en page 9)

2. Collectez les complexes cumulus-ovocytes (CCOs) à lʼaide dʼaiguilles de dissection
pointues et placez 6-20 CCOs par goutte de CARD MEDIUM®(200 µL) (boite contenant
les ovocytes). Préincubez pendant 60 minutes dans lʼétuve.

Note
Assurez-vous dʼeﬀectuer toutes lesopérations, depuis lʼabatag e desfemelles et la collecte des oviductes
jusquʼà lʼimmersion des CCOs dansla goutte de CARD MEDIUM®en un
minimum de temps (30 secondes
maximum).
Si vous eﬀectuer la procédure sansassistance, assurez-vous de ne passacriﬁer plusieurs souris à la fois. Il【Boite de Pétri contenant
les ovocytes】

Préincuber pendant
60 minutes

est préférable de nʼabattre quʼunesouris et prélever ses oviductes
rapidement avant de procéder à ladissection de la souris suivante.

200 µL de CARD MEDIUM®

33

Chapitre

3

Congélation de sperme

Décongélation de spermatozoïdes murins
1.

Sortez une paillette de lʼazote liquide.
Si le sperme est conservé dans un cryotube, ouvrir le bouchon et vider lʼazote liquide
hors du tube. Immerger le cryotube dans un bain-marie à 37℃ (en utilisant le tube de
50mL et le morceau de polystyrène).

Paillette
Cryotube

10 minutes

Polystyrène
Bain marie à

37℃

Azote
liquide

2.

Tube
en
plastiquede 50mLTransférez la suspension de sperme du cryotube ou de la paillette dans un tube de 1.5mL.
Ajouter avec précaution 1.2mL de mHTF maintenu à 37℃ , et centrifugez à 300g a
température ambiante pendant 5 minutes.

Paillette ou cryotube

1.2 mL de mHTF
Centrifugez à 300g
pendant 5 minutes
Tube de 1.5 mL
3.

Suspension
de sperme

Après centrifugation, éliminez autant de surnageant que possible, et ajoutez
70 µL de FERTIUP®(PM) maintenu à 37℃ dans le tube (le volume ﬁnal doit êtreapproximativement 100 µL).

70 µL de FERTIUP®(PM)
Amas de sperme
4.

Pipetez avec précaution, puis transférez tout le contenu dans la goutte de 100 µL de
FERTIUP®(PM) (boite de Pétri contenant le sperme). Placez la boite dans lʼétuve (37℃ ,5% CO2 ) pendant 30 minutes.

34

Congélation de sperme

Chapitre3

Préincuber
pendant 30 minutes【Boite de Pétri contenant le sperme】

Insémination
1.

Pipetez les CCOs préincubés en minimisant le volume de CARD MEDIUM®transféré(boite de Pétri contenant les ovocytes). Transférez les CCOs dans la goutte de spermeen suspension (boite de Pétri contenant le sperme), puis incubez dans lʼétuve (37℃ ,5% CO2 ).
【Boite de Pétri contenant【Boite de Pétri contenant
les ovocytes】
p
As

2.

r
ire

le

s
CO
sC

le sperme】
e
ch
la
Re

Os
CC
s
e
rl

Après 3 heures dʼincubation, rincez les ovocytes 3 fois dans du mHTF frais (80 µL) dansla boite de rinçage.
【Boite de Pétri contenant le sperme】

3.

【Boite de rinçage】

Six heures après insémination, observez les ovocytes dans la troisième goutte de mHTF
et éliminez les ovocytes parthénogénétiques nʼayant quʼun seul pronucléus.
(Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en page 11)

4.

Après une nuit de culture, transférez uniquement les embryons ayant atteint le stade 2
cellules dans la 4ème goutte de mHTF de la boite de rinçage.
Ces embryons peuvent être vitriﬁés ou réimplantés.
(Reportez-vous aux chapitres Vitriﬁcation rapide dʼembryons murins en page 54 etTransfer dʼembryons dans lʼoviducte en page 66).
【Boite de rinçage】

Références
1. Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Takeshita Y., Nakamuta
Y., Umeno T., and Tsuchiyama S. 2014. Rescue in vitro fertilization method for legacy
stock of frozen mouse sperm. J Reprod Dev. 60(2): 167-170.

35

Chapitre

4

Préparationd’ovocytes & d’embryons

4-1 Préparation dʼovocytes microdisséqués au laser

Les spermatozoïdes cryopréservés provenant de certaines lignées, particulièrement de lignées
consanguines, peuvent avoir de faibles capacités de fécondation. Aﬁn de contrecarrer ceci, il
est possible de microdisséquer les ovocytes au laser avant de procéder à la fécondation in vitro .

Matériel and Equipement
1. Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
2. mHTF (Fluide tubal humain modiﬁé)3. Paraﬃne liquide
4. Hyaluronidase diluée dans du mHTF (Hyaluronidase, Cat. No. H-3506, Sigma)
5. Système laser Saturn 3 (Research Instruments Ltd, Cornwall, UK)
6. Etuve humidiﬁée (37℃, 5% CO2)

Procédure
Préparation du sperme et des boites de culture
1.

Pour la FIV, le sperme doit être préparé en suivant les méthodes décrites aux chapitres
Fécondation In Vitro en page 8, Fécondation In Vitro avec sperme épididymairetransporté à basse température en page 18, ou Fécondation In Vitro avec spermatozoïdes
congelés en page 28.

2.

Placer 1 goutte de 200 µL de mHTF dans une boite de Pétri et recouvrer la avec de laparaﬃne liquide. Placer la boite dans lʼétuve (37℃, 5% CO2) au minimum 30 minutes.

【Boite contenant la Hyaluronidase】
Paraﬃne liquide

200µL de mHTF

3.

Placer 4 gouttes (80 µL / goutte) de mHTF dans une boite de Pétri et recouvrer avec de laparaﬃne liquide. Placer la boite dans lʼétuve (37℃, 5% CO2) 30 minutes minimum.

【Boite de rinçage】
Paraﬃne liquide

80µL de mHTF

36

Préparationd’ovocytes & d’embryons

Chapitre

4

Préparation des ovocytes dénudés
1.

Collecter les complexes cumulus-ovocytes (CCOs) des femelles superovulées
et introduisez-les dans une goutte de 200 µL de mHTF (boite contenant de laHyaluronidase).
(Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en page 6 et 9).

2.

Ajouter 20 µL de hyaluronidase (1%) à la goutte de mHTF contenant les CCOs, et placer
la boite dans lʼétuve (37℃,5% CO2) pendant 1 minute.

e)
L d 1%
0µ se (
2rate
id
ou ronAjualhy

Incuber à 37°
Cpendant 1 minute
CCOs

Ovocytes

Remarque3.

Transférer rapidement les ovocytes dans la première goutte de 80 µL de mHTF (boite
de rinçage), puis rincer les ovocytes dans les gouttes successives.

Si les cellules folliculaires collent àla zone pellucide, celles-ci peuventêtre décollées par simple trituration
avec la pipette en verre.

Dissection de la zone pellucide au laser
1.

Placer une goutte de 100 µL de mHTF dans une boite de Pétri et recouvrer la avec de laparaﬃne liquide. Placer la boite dans lʼétuve (37℃, 5% CO2) au minimum 30 minutes.

2.

Transférer 50 ovocytes dénudés dans une goutte de 100 µL de mHTF.

3.

Aligner les ovocytes sur le fond de la boite.

Ovocytes

Goutte de mHTF

37

Chapitre

4

Préparationd’ovocytes & d’embryons

4.

Placer la boite contenant les ovocytes en position dans le système laser Saturn 3.

5.

Cibler la zone pellucide à proximité du premier globule polaire and perforer-la avec lefaisceau laser.

Note
Pour éviter dʼendommager la membrane plasmique des ovocytes, il
est recommandé dʼorienter le laserlà où la zone pellucide est la plus
détachée de lʼovocyte.

Note
Le diamètre du trou doit être 1012.5 µm et la durée du pulse 0.550.60 ms.

[Dissection de la Zone Pellucide au Laser] No. 08-01

6.

Une fois la zone pellucide de tous les ovocytes perforée, transférer-les dans une goutte
de CARD MEDIUM®pour y être fécondés.
Placer la boite dans lʼétuve.
(Reportez-vous aux chapitres Fécondation In Vitro en page 6, Fécondation In Vitro avec
sperme épididymaire transporté à basse température en page 18, et Fécondation In Vitro
avec spermatozoïdes congelés en page 26).

Références1.

Kaneko T., Yanagi M., Nakashima T., and Nakagata N. 2006. The improvement in fertilityof cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility using laser-microdissected
oocytes. Reprod. Med. Biol. 5(4): 249-254.

2.

Anzai M., Nishiwaki M., Yanagi M., Nakashima T., Kaneko T., Taguchi Y., Tokoro M., ShinSW., Mitani T., Kato H., Matsumoto K., Nakagata N., and Iritani A. 2006. Application oflaser-assisted zona drilling to in vitro fertilization of cryopreserved mouse oocytes with
spermatozoa from a subfertile transgenic mouse. J Reprod Dev. 52(5): 601-606.

38

Préparationd’ovocytes & d’embryons

Chapitre

4

4-2 Dissection Partielle de la Zone Pellucide (DPZ)
Si vous ne disposez pas dʼinstruments de microdissection assistée au laser, vous pouvez toutde même disséquer la zone pellucide des ovocytes manuellement avec un stéréomicroscope.

Matériel and Equipement
1. Souris femelles superovulées par PMSG et hCG(Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en page 6)
2. mHTF (Fluide tubal humain modiﬁé)
3. Hyaluronidase diluée dans du mHTF (Hyaluronidase, Cat. No. H-3506, Sigma)
4. sucrose 0.3M (BSA-)
5. sucrose 0.3M (BSA+)
6. Paraﬃne liquide
7. Boites de Petri en plastique (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
8. Embouts de pipettes (volume de 10 -100 µL)
9. Micropipette

Procédure
Préparation de lʼaiguille pour la DPZ
1.

Préparer une seringue à usage unique montée avec une aiguille de 30 gauges en suivant
la procédure décrite sur le schéma ci-dessous.

Préparer une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G.

Retirez et débarrassez-vous du piston.

Retirez le capuchon de lʼaiguille et servez-vousde celui-ci pour tordre lʼaiguille de 30°environs.

approximativement30°

Si vous êtes droitiers,
la pointe de lʼaiguille doit se retrouver en face de vous,comme indiqué sur le schéma.

Assemblage ﬁnalisé

39

Chapitre

Préparationd’ovocytes & d’embryons

4

DPZ
1.

Collecter les ovocytes des femelles superovulées 14 à 15 heures après les avoir injectées
avec lʼhCG. Puriﬁer les ovocytes avec la hyaluronidase.
(Reportez-vous aux chapitres Fécondation In Vitro en page 9 et préparation des ovocytes
microdisséqués au laser en page 37).

2.

Introduire les ovocytes dénudés dans la phase supérieure dʼune goutte de 100 µL desucrose 0.3M (BSA-) dans une boite de culture.

3.

Une fois que les ovocytes touchent le fond de la goutte, recouvrez-la de paraﬃne liquide.

RemarqueLorsque les ovocytes sont placés
dans le sucrose 0.3M (BSA-), lʼovoplasme se contracte à cause desforces osmotiques et électrostatiques qui se créent entre la zone
pellucide et la surface de la boite deculture.
Il en résulte un élarg issement delʼespace périvitellin et les ovocytes
se retrouvent collés au fond de laboite de culture.

Paraﬃne liquide

sucrose 0.3 M (BSA-)

4.

Sous le stéréomicroscope, disséquer partiellement la zone pellucide (DPZ) des ovocytes
en exerçant un mouvement descendant unique de lʼaiguille de 30 gauges.

aiguille de 30G
Zone pellucide[DPZ] No. 09-01

5.

Après dissection partielle, neutraliser les attractions électrostatiques entre la zone
pellucide et la surface de la boite de culture en ajoutant 20 µL de sucrose 0.3M (BSA+) àla goutte.

6.

Pour détacher les ovocytes partiellement disséqués de la boite de culture, ajouter lasolution de sucrose sur les ovocytes au moyen dʼune micropipette.

Pipetage

7.

Rincer les ovocytes partiellement disséqués 3 fois dans le CARD MEDIUM®pour éliminer lesucrose résiduel.

40

RemarqueAppliquez le sucrose à lʼo pposé dela fente pour éviter aux ovocytesdʼêtre expulsés de leur zone pellucide.

Préparationd’ovocytes & d’embryons

Chapitre4[Micrographe : Ovocytes partiellement disséqués]Fécondation In Vitro et transfer dʼmbryons
1.

Introduire les ovocytes partiellement disséqués dans le CARD MEDIUM®contenant lesperme préparé au préalable (insémination).
(Reportez-vous aux chapitres Fécondation In Vitro en page 6, Fécondation In Vitro avec
sperme épididymaire transporté à basse température en page 18, et Fécondation In

Vitro avec spermatozoïdes congelés en page 26).
2.

Trois heures après insémination, rincer les ovocytes fécondés avec précaution dans du
mHTF, puis placez-les en culture pendant 3 jours jusqu'à ce quʼils atteignent le stadeblastocyste.
[Micrographe : Ovocytes fécondés]

Ovocytefécondé

Ovocytefécondé
Ovocytefécondé

OvocytefécondéRemarque3.

Transférez les blastocystes dans lʼutérus dʼune femelle receveuse synchronisée au 3èmejour de pseudogestation.
Reportez-vous au chapitre Réimplantation dʼembryons par lʼutérus en page 72.

Références
1.

Nakagata N., Okamoto M., Ueda O., and Suzuki H. 1997. The positive eﬀect of partial
zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J
transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol. Reprod. 57: 1050-1055.

Le transfert dʼembryons au stade2 cellules dans lʼoviducte de receveuses synchronisées au 1er jour depseudogestation résulte en un très
faible taux de développement desembryons. Ceci est dû au fait queles blastomères des embryons sontexpulsés de la zone pellucide car ils
subissent lʼaction péristaltique delʼoviducte lors de leur progressionde lʼoviducte jusquʼà lʼutérus.

41

Chapitre

4

Préparationd’ovocytes & d’embryons

4-3 Collecte dʼembryons au stade 2 cellules

Matériel and Equipement
1. Une paire de forceps watchmaker's #5
2. Ciseaux de dissection
3. KSOM/AA
4. Paraﬃne liquide
5. Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
6. Seringue de 1 mL
7. Aiguille (30G tordue)
8. Micropipettes en verre

ProcédureSuperovulation et sélection des femelles synchronisées
1.

Injecter les femelles (âgées de 10 à 12 semaines) par voie i.p. avec 7.5 IU de PMSG (14:0018:00).

2.

Injecter les femelles par voie i.p. avec 7.5 IU de hCG 48 à 52 heures après lʼinjection de
PMSG, puis accouplez-les immédiatement avec les males.

3.

Le lendemain, examiner les femelles pour identiﬁer celles présentant un bouchon vaginal(synchronisées).

Préparation des boites de culture
1.

Placer 3 gouttes (100 µL / goutte) de KSOM/AA dans une boite de Pétri et recouvrer avec
de la paraﬃne liquide. Placer la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃, 5% CO2) au minimum
30 minutes.

【Boite de rinçage】

Paraﬃne liquide

100µL de KSOM/AA

42

Préparationd’ovocytes & d’embryons

Chapitre

4

Préparation de lʼaiguille1.
2.

Remplir une seringue de KSOM/AA et connectez-la a une aiguille tordue.
Tester la seringue en vous assurant quʼelle ne contienne pas de bulles dʼair, et que le ﬂux
de KSOM/AA est régulier.

aiguille KSOM/AA seringue de 1mL

Collection dʼembryons
1.

Le jour suivant lʼidentiﬁcation du bouchon vaginal, disséquer les utérus, oviductes etovaires, et placez le tout sur un papier ﬁltre stérilisé.
( Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en page 9. )2.

Immobiliser la jonction utéro-tubale et inciser du côté de lʼutérus.

Forceps
Oviducte

Ligament tubo-ovarien

OvaireUtérusCouperFimbria ovarienne
Jonction utéro-tubale

3.

Tirer sur la jonction utéro-tubale pour séparer lʼinfundibulum de lʼovaire et couper leligament tubo-ovarien.

Jonction
utéro-tubale

Tirer
couper43

Chapitre

4
4.

Préparationd’ovocytes & d’embryons
Après avoir rincé lʼoviducte dans une goutte de KSOM/AA, placer-le dans une nouvellegoutte de KSOM/AA.

Oviducte

KSOM/AA

KSOM/AA

Note
5.

Examiner lʼoviducte pour localiser lʼinfundibulum, qui est lʼélargissement de lʼoviducte à
son extrémité.

6.

Orienter lʼoviducte pour permettre à lʼaiguille dʼêtre insérée facilement.

Lʼinfundibulum est souvent caché àlʼintérieur des replis de lʼoviducte.
Par conséquent, lʼutilisation de forceps est fortement recommandée
pour dérouler avec précaution lʼutérus et localiser lʼinfundibulum.

[Micrographe : Un oviducte avant manipulation]

RemarqueInfundibulum

Si vous êtes droitier, positionnerlʼoviducte comme indiqué sur leschéma ci-dessous. Il est plus faciledʼintroduire lʼaig uille dans lʼinfundibulum dans cette position (commelʼindique la ﬂèche jaune).

7.

Maintenez lʼinfundibulum au fond de la boite de Pétri à lʼaide de forceps et insérez-ylʼaiguille.

NoteLʼinfundibulum est extrêmementfragile. Les forceps doivent par conséquent être utilisés avec précaution.

44

Préparationd’ovocytes & d’embryons
8.

Presser délicatement le piston pour créer un ﬂux de KSOM/AA dans lʼoviducte.

Forceps

Oviducte
Aiguille

Jonction
utéro-tubale

Infundibulum

Chapitre

4Note
La visualisation de lʼexpansion delʼoviducte g énérée par le flux deKSOM/AA indique une manipulation
réussie. Il nʼest pas recommandédʼintroduire lʼaig uille nʼimporteoù dans lʼoviducte à lʼaveugle souspeine dʼabimer lʼinfundibulum etde compromettre la pénétration delʼaiguille.

Base de la boite de Pétri[Manipulation]

9.

No. 10-01

Collecter les embryons avec un aspirateur buccal et rincer-les dans plusieurs gouttes deKSOM/AA.
[Micrographe : Après avoir expulsé les embryons des Oviductes]

Note
Assurez-vous dʼeﬀectuer toutes lesopérations, depuis lʼabatag e desfemelles jusquʼà la manipulation
des oviductes en un temps minimum (moins de 5 minutes).
Si vous eﬀectuer la procédure sansassistance, assurez-vous de ne passacriﬁer plusieurs souris à la fois. Il
est préférable de nʼabattre quʼunesouris et manipuler ses oviductes
rapidement avant de procéder à ladissection de la souris suivante.

Références
1. Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0-87969-591-9.

45

Chapitre5

Transportd’ovocytes & d’embryons

5-1 Transport dʼembryons au stade 2 cellules
à basse température
Matériel and Equipement
1. Embryons au stade 2 cellules (fraichement préparés ou décongelés).
2. Boites de Pétri en plastique (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
3. Embouts pour dépôt sur gel (Cat. No. 010-R204S; Bio Medical Instrument)
4. M2 (Cat. No. M7167; Sigma)
5. Tube de 0.5mL (Microtubes 0.5mL Fisherbrand Flip Cap; Fisher Scientiﬁc Cat. No. FSMCT-060 -C)
6. Pipettes de transfert
7. KSOM/AA
8. Paraﬃne liquide
9. Moniteur de température (Thermochron iButton Cat. No. DS1921G; Maxim Integrated
Products)
10. Kit de transport réfrigéré CARD (Cat. No. KYD-006-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)• Thermos (Cat. No. JMK-501; Thermos K.K.)• Boite en papier (pouvant supporter un tube de 0.5 mL)• Coton• Blocs réfrigérants (petits et grands)• Boite de transport en polystyrène (Cat. No. KC-3, KARUX)

Procédure
Stockage réfrigéré dʼembryons au stade 2 cellules
1.

Placer deux gouttes de 100 µL de M2 dans une boite de Pétri.

2.

Transférer les embryons au stade 2 cellules du milieu de culture à la goutte de M2.

Paraﬃne liquide

Embryons Gouttes de M2 (100µL)
3.

Monter un nouveau capillaire à lʼaspirateur buccal et aspirer les embryons dans ce
nouveau capillaire, en évitant de toucher la paraﬃne liquide restée sur la goutte de M2.
Transférer les embryons dans la goutte de M2 préalablement préparée à lʼétape 1.

La paraﬃne liquide
reste à la surface

46

Transport
d’ovocytes & d’embryons
4.

Chapitre5Remplissez un tube de 0.5 mL avec 0.6 mL de M2 à température ambiante. Si vous
observez la présence de bulles au fond tu tube, tapoter le tube pour évacuer les bulles.

tube de 0.5mL
0.6mL de M2
Air

5.

Déposer les embryons au fond du tube (40 embryons/tube).

Capillaire
en verre

M2
6.

tube de
0.5mL

Placer le tube contenant les embryons, le moniteur de température, et un morceau decoton dans la boite en papier.

Moniteur detempératuretube de 0.5mL

Boite en papier
7.

Coton

Placer la boite en papier dans le réfrigérateur (4-8℃).

Couvercle

RemarqueLes embryons maintiennent leurs
capacités développementales pendant 72 heures.

47

Chapitre5

Transportd’ovocytes & d’embryons

Emballage et transport dʼembryons au stade 2 cellules
Préparez une boite en papier contenant les embryons au stade 2 cellules comme détaillé
précédemment (Stockage réfrigéré dʼembryons au stade 2 cellules).
Les grands blocs réfrigérants et la boite en polystyrène doivent être refroidis au préalable (48℃) avant utilisation. Ceci nʼest pas nécessaire pour les petits blocs réfrigérants et le thermos.
1.

Placer la boite en papier contenant les embryons dans le thermos.

Thermos

Boite en papierInsérer

2.

Insérer deux petits blocs réfrigérants dans le thermos.

Thermos

Blocs réfrigérants

Insérer

3.

48

Visser le bouchon du thermos.

Transport
d’ovocytes & d’embryons

Chapitre

5

Bloc réfrigérant
Bouchon du thermos

4.

Placer un grand bloc réfrigérant au fond de la boite en polystyrène et allonger lethermos dessus.

5.

Placer un grand bloc réfrigérant de chaque côté du thermos, puis un dernier par-dessus
avant de fermer le couvercle.

6.

Note
Prenez soin de ne pas retourner laboite en papier.

Fermer hermétiquement à lʼaide de scotch.

Note
Il nʼest pas possible de placer lethermos tout au fond de la boite
de transport. Les dimensions duthermos ne lui permet tent quedʼêtre placé au centre de la boite.
Ce desig n est intentionnel afindʼoptimiser la protection du ther-

Bloc réfrigérant

Blocs réfrigérants

Thermos

mos lors du transport.

Bloc réfrigérant

Fermer hermétiquement avec du scotch
7.

Garder la boite de transport au réfrigérateur jusqu'à la prise en charge par le service postal.

8.

Expédier les échantillons par voie postale traditionnelle.

49Chapitre5

Transportd’ovocytes & d’embryons

Collection des embryons au stade 2 cellules à lʼarrivée de la boite deTransport.
1.

Placer 3 gouttes (100 µL / goutte) de KSOM/AA dans une boite de Pétri et recouvrer avec
de la paraﬃne liquide. Placer la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃, 5% CO2) au minimum
30 minutes.

【Boite de rinçage】

Note
Les embryons doivent être maintenus réfrig érés pendant toute ladurée du transport. Assurez-vousque ces conditions soient remplies
auprès du service postal.

RemarqueLes embryons maintiennent leursParaﬃne liquide

capacités développementales pendant 72 heures.

KSOM/AA (100µL)
2.

Sortir la boite en papier contenant les échantillons du thermos.

3.

Laisser la boite en papier à température ambiante pendant 30 minutes.
[Réceptionner les échantillons] No. 11-01

4.

Ouvrir la boite en papier et retirer le coton avec précaution. Saisissez le tube contenantles embryons et ouvrez-le.

5.

Prélever 200 µL de M2 de la phase supérieure en utilisant un embout pour dépôt sur gel,puis déposer le M2 sur le bord de la boite de Pétri.

RemarqueCe temps de repos de 30 minutes
permet de sʼassurer que les embryons reposent au fond du tube.

tube de 0.5mL
M2
Embryons
6.

Prélever avec précaution le reste de M2 avec un embout pour dépôt sur gel, puis déposer
le M2 sur au centre de la boite de Pétri.

50

Note
Prenez soin de ne pas aspirer debulles dʼair dans lʼembout p ourdépôt sur gel.

Transport
d’ovocytes & d’embryons
7.

Prélever les embryons du M2, et transférer-les successivement dans les trois gouttes de100 µL de KSOM/AA pour les rincer.

Chapitre

5Note
Si quelques embryons sont restés
dans le tube après transfert, rincerles parois internes du tube avec 200µL de M2.

8.

Transférer les embryons dans lʼoviducte dʼune souris en pseudogestation.

RemarqueDans lʼidéale, la réimplantation desembryons sur les souris pseudoges-

Références1.

tatives doit être eﬀectuée immédiatement à lʼarrivée.

Takeo T., Kaneko T., Haruguchi Y., Fukumoto K., Machida H., Koga M., Nakagawa Y.,
Takeshita Y., Matsuguma T., Tsuchiyama S., Shimizu N., Hasegawa T., Goto M., Miyachi H.,
Anzai M., Nakatsukasa E., Nomaru K., and Nakagata N. 2009. Birth of mice from vitriﬁed/
warmed 2-cell embryos transported at a cold temperature. Cryobiology. 58(2): 196-202.

2.

Takeo T., Kondo T., Haruguchi Y., Fukumoto K., Nakagawa Y., Takeshita Y., Nakamuta
Y., Tsuchiyama S., Shimizu N., Hasegawa T., Goto M., Miyachi H., Anzai M., Fujikawa
R., Nomaru K., Kaneko T., Itagaki Y., and Nakagata N. 2010. Short-term storage andtransport at cold temperatures of 2-cell mouse embryos produced by cryopreserved
sperm. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49(4): 415-419.

51

ChapitreTransportd’ovocytes & d’embryons

5

5-2 Transport dʼoviductes contenant des embryons au stade 2
cellules à basse température (0℃ )Matériel and Equipement
1. Sucrose 0.8 M
2. PB1
3. KSOM/AA
4. Sachet en plastique
5. Thermos
6. Glace pillée
7. Cryotubes à fond conique (Cat. No. 366656; NUNC)
8. Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)

Procédure
Dissection des oviductes de femelles superovulées avec bouchonsvaginaux
1.

Injecter les femelles (âgées de 10 à 12 semaines) par voie i.p. avec 7.5 IU de PMSG (14:0018:00).

2.

Injecter les femelles par voie i.p. avec 7.5 IU de hCG 48 à 52 heures après lʼinjection de
PMSG, puis accouplez-les immédiatement avec les males.

3.

Le lendemain matin (jusqu'à midi), examiner les femelles pour identiﬁer celles présentant
un bouchon vaginal (Reportez-vous au chapitre Réimplantation dʼembryons parlʼoviducte en page 66).

4.
5.

Sacriﬁer les femelles sélectionnées 44 à 46 heures après lʼinjection de hCG.
Disséquer les oviductes des femelles et transférez-les dans une goutte de sucrose à 0℃
(100-200 µL ‒ 0.8 M). (Reportez-vous au chapitre Fécondation In Vitro en page 9).

Transport des oviductes
1.

Transférer les oviductes dans un cryotube contenant 1 mL de sucrose 0.8 M (0℃).

2.

Placer le tube dans un sachet en plastique et fermer hermétiquement.

3.

Placer le sachet en plastique dans le thermos contenant la glace pilée et expédier le tout
par service postal.

Glace pilée

Sucrose 0.8 M dilué dansdu PB1 (0°C, 1mL)
Oviductes

52

Thermos

Sachet en plastiqueTransport
d’ovocytes & d’embryons

Chapitre5

Réception des embryons
1.

Retirer le tube du thermos.

2.

Collecter les oviductes et placer-les dans la solution de PB1 (0℃) pendant 30 à 60
minutes.

3.

Rincer les oviductes avec du PB1 (0℃). (Reportez-vous au chapitre Collecte dʼEmbryons

Note
Les embryons dég énèrent rapidement si lʼétape 2 est omise.

au stade 2 cellules en page 42. )4.

Rincer les embryons dans 3 cycles successifs de KSOM/AA (37℃) fraichement préparé.

Note
Les oviductes ne doivent pas êtremaintenus dans le tube au-delà de

0℃

Transférer

Sucrose 0.8 M dilué
dans du PB1
Oviductes

30 - 60 minutes

Collecte
PB1

48 heures, auquel cas les embryons
dégénèrent.
Les embryons doivent être transportés cong elés sʼils ne sont pas
utilisés immédiatement à lʼarrivée.
(Reportez-vous au chapitre Vitriﬁcation simple dʼembryons murins en
page 54).

Références1.

Kamimura E., Nakashima T., Ogawa M., Ohwada K., and Nakagata N. 2003. Study of lowtemperature (4℃) transport of mouse two-cell embryos enclosed in oviducts.

Comp. Med. 53: 393-396.
2.

Ogawa M., Fuchiwaki M., Valdez Jr. Delgado M., Yanagita T., Ide Y., Fukumoto K.,
Machida H., Kawabe T., Kaneko T., Kasai M., and Nakagata N. 2005. Development after
freeze-thawing of mouse embryos collected from oviducts transported at 0℃.

Exp.Anim. 54(3) Suppl: 242.

53

Chapitre

6

Congélationd’ovocytes & d’embryons

6-1 Simple vitriﬁcation dʼembryons murins

Matériel and Equipement
1. DMSO 1 M
2. DAP213
3. Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
4. Microﬁltre (Millex-GV 0.22 µm Cat. No. SLGV013SL; MILLIPORE)
5. Embouts pour dépôt sur gel (MBP Gel 200, Cat. No. 3621; Molecular BioProducts)
6. Pipettes de transfert
7. Cryotubes (Cryogenic Vials Cat. No. MS-4501W; Sumitomo Bakelite, Japan - alternative :Cat. No. 366656; NUNC.)
8. Micropipette
9. Porte-tubes
10. Bloc réfrigérant Nalgene (Cat. No. 5115-0012; NALGENE, USA)
11. Azote liquide
12. Microscope
13. Sucrose 0.25 M
14. KSOM/AA
15. Paraﬃne liquide

Procédure
Préparation du bloc réfrigérant et des cryotubes
1. La veille de la vitriﬁcation placer le bloc réfrigérant (Cat. No. 5115-0012; NALGENE, USA)au congélateur à -20℃ .
2. Retirer le bloc réfrigérant du congélateur dix minutes environ avant de commencer lavitriﬁcation.
3. Placer les cryotubes dans le bloc réfrigérant. Pour calculer le nombre de cryotubes
nécessaires, considérez que chaque cryotube contienne environ 40 embryons.
4. Juste avant de commencer la procédure, vériﬁer que la température dans les tubes est
bien 0℃ .

Vitriﬁcation
1.

RemarqueFiltrer le DMSO 1 M et disposez 4 gouttes (~ 100 µL / goutte) dans une boite de Pétri.
La première goutte sert à rincer les embryons, alors que les autres gouttes servent à
contenir les embryons préalablement rincés.

DMSO 1 M (100μL)

54

Le block réfrigérant peut être substitué par de la glace pilée.

Congélationd’ovocytes & d’embryons
2.

Chapitre

6

Déposer les embryons dans la première goutte pour les rincer du milieu de collection.
Diviser le total en lots égaux et transférer les embryons dans les gouttes respectives.
Par exemple, si vous disposez de 120 embryons dans la goutte de rinçage, séparez-lesen groupes de 40 dans les trois autres gouttes. Ces échantillons seront ensuite placés
dans les cryotubes pour être vitriﬁés.

Embryons

3.

Monter un embout pour dépôt sur gel sur une pipette de 20 µL et pipeter les embryons
dans un volume total de 5 µL de DMSO 1 M. Déposer les embryons dans un cryotube etplacer le tube dans le bloc réfrigérant à 0℃ pendant 5 minutes.

Note
Maintenir les cryotubes dans le bloc
réfrigérant pour plus de 5 minutes
nʼest pas un problème (< 20 minutes).

Note
Attendre
5 minutes
Cryotubes

4.

bloc réfrigérant à 0℃

Ajouter 45 µL dʼagent cryoprotecteur (DAP213) à 0℃ dans le cryotube et équilibrez letout pendant 5 minutes dans le bloc réfrigérant.

DAP213

Cryotubes

Il est recommandé de regrouper lesembryons au centre de la g outte
pour faciliter le pipetag e dans unvolume limité à 5 µL de DMSO 1 M.

Note
Prenez garde de ne pas trop visser
le bouchon après avoir ajouté leDAP213, sans quoi il risque dʼêtredifficile de le dévisser rapidement
pour raviver les embryons.

Equilibrer pendant
5 minutesµL
45
bloc réfrigérant à 0℃

55

Chapitre

6
5.

Congélationd’ovocytes & d’embryons
Placer les cryotubes rapidement sur le porte-tubes et immergez les tubes directement
dans lʼazote liquide.

Cryotubes
DAP213
Porte-tubes

Azote
liquide[Vitriﬁcation des Embryons] No. 13-01

Préparation pour la décongélation
1.

Placer 3 gouttes (100 µL/goutte) de KSOM/AA dans une boite de Pétri et recouvrez-lesde paraﬃne liquide. Placer la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃, 5% CO2) au minimum 30
minutes.

【Boite de rinçage】

KSOM/AA 100 µL
2.

Préchauﬀer la solution de sucrose 0.25 M dans lʼétuve (37℃, 5% CO2) avant de lʼutiliser.

Raviver les embryons congelés
1.

Retirer un cryotube de lʼazote liquide et ouvrir le bouchon. Vider lʼazote liquide restantdans le tube et laisser le tube se réchauﬀer à température ambiante pendant 30
secondes.

2.

Ajouter 0.9 mL de sucrose 0.25 M (préchauﬀé à 37℃) dans le cryotube et pipeter
plusieurs fois pour réchauﬀer lʼéchantillon. Lors du pipetage, prenez soin de ne pas trop
créer de bulles ou dʼendommager les embryons. Transférer le contenu du cryotube dansune boite de Pétri.

56

Congélationd’ovocytes & d’embryons

Chapitre

6

Piston1ère poussée

Micropipette

A partir de la2ème poussée

Emboutsucrose 0.25 M
Embryons Vitriﬁés
Lʼembout ne doit pas toucher le fonddu cryotube, sinon la solution desucrose 0.25 M congèle immédiatement et il devient impossible de la
pipeter.

3.

Pressez une première fois sur le piston jusquʼà ladeuxième butée pour libérer le volume entier (0.9 mL) desucrose 0.25 M.
Subséquemment, pressez sur le piston une dizaine defois jusqu'à la première butée pour ne déplacer quʼunpetit volume de sucrose 0.25 M.
Ceci permet dʼéviter la formation de bulles dans lesucrose 0.25 M.

Ajouter 0.4-0.5 mL de sucrose 0.25 M dans le cryotube and transférer à nouveau lecontenu dans la boite de Pétri. Cette opération permet de diluer lʼagent cryoprotecteur
et sert aussi à récupérer les derniers embryons restés dans le tube.

4.

[Raviver les Embryons Vitriﬁés]No. 13-02[Pipetage pour Raviver les Embryons Vitriﬁés]No. 13-03Note
Il est très important de réchaufferlʼéchantillon le plus rapidement
possible pour éviter que lʼag ent
cryoprotecteur (DAP213) devienne
toxique pour les embryons.

Aspirer les embryons et transférer-les dans une goutte de KSOM/AA (boite de rinçage)puis placer la boite dans lʼétuve (37℃, 5% CO2).

KSOM/AA (100 µL)

57

Chapitre

6

Congélationd’ovocytes & d’embryons[Micrographe : Embryons Ravivés après Vitriﬁcation]

Embryons
normaux

Embryonsdégénérés

5.

Au bout de 10 minutes, rincer les embryons dans 2 cycles successifs de KSOM/AA (37℃)
fraichement préparé.

Références
1.

Nakagata N. 1989. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitriﬁcation.

J. Reprod. Fert. 87: 479-483.
2.

Nakagata N. 1993. Production of normal young following transfer of mouse embryos
obtained by in vitro fertilization between cryopreserved gametes.

J. Reprod. Fert. 99: 77-80.
3.

Nakagata N. 1995. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice.

Exp. Anim. 44: 1-8.
4.

Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and eﬀcient procedure forcryopreservation of mouse embryos by simple vitriﬁcation.

Exp. Anim. 46: 231-234.

58

Congélationd’ovocytes & d’embryons

Chapitre

66-2 Simple vitriﬁcation dʼovocytes murins

Matériel and Equipement
1. Souris femelles superovulées avec PMSG et hCG
2. Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
3. Paraﬃne liquide
4. Micropipette
5. Embouts de pipettes
6. mHTF
7. Hyaluronidase (1%) diluée dans du mHTF
8. Sérum fœtal de bœuf (FBS Cat. No. 26140-087; Gibco)
9. Microﬁltre (Millex-GV 0.22 µm Cat. No. SLGV013SL; MILLIPORE)
10. Capillaires en verre pour manipuler les embryons
11. Etuve humidiﬁée (37℃, 5% CO2)
12. Matériel et équipement utilisés pour la vitriﬁcation et la décongélation des embryons(Reportez-vous aux chapitre Vitriﬁcation simple dʼembryons murins en page 54).

Procédure
Préparation des boites de Pétri
1.

Placer 1 goutte de 200 µL de mHTF dans une boite de Pétri et recouvrez-la de paraﬃneliquide. Placer la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃, 5% CO2 ) au minimum 30 minutes.

【Boite contenant les Ovocytes】

Paraﬃne liquide

mHTF (200µL)
2.

Placer 4 gouttes (80 µL/goutte) de mHTF dans une boite de Pétri et recouvrez-les deparaﬃne liquide. Placer la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃, 5% CO2) au minimum 30
minutes.

【Boite de rinçage】

Paraﬃne liquide

mHTF (80µL)

59

Chapitre

6

Congélationd’ovocytes & d’embryons

Diluer le sérum fœtal de bœuf (FBS) à 20% dans le mHTF et stérilisez par ﬁltration. Placer 2

3.

gouttes (100 µL/goutte) de ce milieu dans une boite de Pétri et recouvrez-les de paraﬃneliquide. Placer la boite de Pétri dans lʼétuve (37℃, 5% CO2 ) au minimum 30 minutes.

【Boite contenant du FBS】

Paraﬃne liquide

FBS dilué à 20% dans le mHTF
(100 µL)

Préparation des ovocytes dénudés
1.

Collecter les complexes cumulus-ovocytes (CCOs) des oviductes de femelles
superovulées et placer-les dans la goutte de 200 µL de mHTF (boite contenant lesNoteovocytes).
2.

Ajouter 20 µL de hyaluronidase (1%) à la goutte de mHTF contenant les CCOs et placer laboite de Pétri dans lʼétuve (37℃, 5% CO2 ) pendant 1 minute.

【Boite contenant les ovocytes】

Ade jo
hy uteal r 2
ur 0
on µL
id
as
e

(1
%

)

jusquʼà lʼimmersion des CCOs dansla goutte de mHTF en un minimum
de temps (30 secondes maximum).
Si vous eﬀectuer la procédure sansassistance, assurez-vous de ne passacriﬁer plusieurs souris à la fois. Il
est préférable de nʼabattre quʼunesouris et prélever ses oviductes
rapidement avant de procéder à ladissection de la souris suivante.

Incuber à 37℃
pendant 1 minute

CCOs

3.

Assurez-vous dʼeﬀectuer toutes lesopérations, depuis lʼabatag e desfemelles et la collecte des oviductes

Ovocytes

Collecter et transférer rapidement les ovocytes dans la première goutte de 80 µL de
mHTF (boite de rinçage), puis transférer les ovocytes dans les 3 autres gouttes.

【Boite contenant les ovocytes】【Boite de rinçage】

Remarque
Si les cellules folliculaires collent àla zone pellucide, celles-ci peuventêtre décollées par simple trituration
avec la pipette en verre.

60Congélationd’ovocytes & d’embryons

Chapitre

Culture des ovocytes dans une goutte contenant du FBS

Remarque1.

Le FBS joue un rôle de prévention
du durcissement de la zone pellucide durant la vitrification et ladécongélation.

Placer les ovocytes dans la première goutte de FBS pour les rincer, puis les transférer
dans la deuxième goutte où ils seront incubés 10 minutes dans lʼétuve (37℃, 5% CO2 ).

【Boite de rinçage】【Boite contenant du FBS】

6

Incuber pendant
10 minutes
FBS dilué à 20% dans le mHTF (100 µL)

Simple vitriﬁcation dʼovocytes murins
1.

Les ovocytes peuvent être vitriﬁés en utilisant la méthode de simple vitriﬁcation.
Toutefois il est nécessaire de se débarrasser au préalable des cellules folliculaires et deplacer les ovocytes en culture dans une goutte contenant du FBS.
En outre, la méthode de décongélation est similaire à celle utilisée pour les embryons(Reportez-vous au chapitre Vitriﬁcation rapide dʼembryons murins en page 54).

Fécondation In Vitro à partir dʼovocytes congelés
1.

Les ovocytes vitriﬁés peuvent être utilisés pour eﬀectuer une fécondation in vitro à partirde sperme frais, transporté à basse température, ou même congelé.

2.

(Reportez-vous aux chapitres Fécondation In Vitro en page 6, Fécondation In Vitro avec
sperme épididymaire transporté à basse température en page 18, et Fécondation In Vitro
avec spermatozoïdes congelés en page 26).

Références
1.

Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Kondo T., Haruguchi Y., Takeshita Y., Nakamuta Y.,
Matsunaga H., Tsuchiyama S., Ishizuka Y., Araki K. 2013. Applications of cryopreserved
unfertilized mouse oocytes for in vitro fertilization. Cryobiology. 67(2):188-92.

Note
Il y a trois méthodes différentes
pour préparer le CARD MEDIUM®,
selon que la fécondation in vitro est
faite à partir de sperme frais, cong elé, ou réfrig éré. Reportez-vous
au manuel dʼinstruction du CARD
MEDIUM®pour plus de détails.

61

Chapitre

6

Congélationd’ovocytes & d’embryons

6-3 Vitriﬁcation et transplantation dʼovaires

Matériel and Equipement
1. Boites de Pétri de 35mm stériles
2. mWM
3. Donneuse : souris femelle (âgée de 1 jour à 30 semaines)
4. Receveuse : souris femelle âgée de 4 semaines et de lignée histocompatible aveclʼovaire à transplanter).
5. Anesthésiants
6. Micro-ciseaux à ressorts (lame de 5mm)
7. Une paire de forceps watchmaker's #5
8. Agrafes de suture (Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) et applicateur dʼagrafes(Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)
9. Plaque chauﬀante (37℃ )Procédure
Dissection des ovaires
1.

Sacriﬁez la femelle donneuse et disséquez ses ovaires (Reportez-vous au chapitre
Fécondation In Vitro en page 9).

2.

Placez les ovaires dans une boite contenant suﬃsamment de mWM.

Vitriﬁcation
1.

Les ovaires sont vitriﬁés en utilisant la même méthode que pour les embryons(Reportez-vous au chapitre Vitriﬁcation simple dʼembryons murins en page 54).

Transplantation
1.

Anesthésiez la femelle receveuse.

2.

Saisir lʼappareil reproducteur (ovaire, oviducte et corne utérine) de manière
conventionnelle (Reportez-vous au chapitre Réimplantation dʼembryons par lʼoviducteen page 67).

3.

A lʼaide de micro-ciseaux inciser approximativement 1/4 du ligament tubo-ovarien,ainsi quʼune partie de lʼamas de graisse adjacent.

4.

62Retirer 1/2 - 2/3 de lʼovaire avec les micro-ciseaux (à lame courbée).

RemarqueLe fait que les micro-ciseaux soient
courbés facilite la mise en place delʼovaire donneuse.

Congélationd’ovocytes & d’embryons
Forceps

Chapitre6

Micro-ciseaux à ressorts

Amas graisseux
Oviducte

Couperici

OvaireMicro-ciseaux à ressorts
AmasgraisseuxUtérusLigament tubo-ovarien

Ligament tubo-ovarien

Ovaire de la souris receveuse

5.

Insérer lʼovaire de la femelle donneuse en lieu et place de lʼovaire retirée et recouvrez-laavec le ligament tubo-ovarien.

Ovaire de la souris donneuse

Ovaire de la souris receveuse

Ligament tubo-ovarien[Transplantation dʼovaire de la souris] No. 15-01
6.

Repositionner lʼappareil reproducteur dans lʼabdomen et refermer lʼincision avec desclips de suture.

7.

Répéter lʼopération pour le second ovaire.

8.

Maintenez la température corporelle de la souris (37℃) en la plaçant sur la plaquechauﬀante jusqu'à ce que les eﬀets de lʼanesthésie aient complètement disparu.

Références
1.

Migishima F., Suzuki-Migishima R., Song S.Y., Kuramochi T., Azuma S., Nishijima M., andYokoyama M. 2003. Successful cryopreservation of mouse ovaries by vitriﬁcation. Biol.

Reprod. 68: 881-887.
2.

Tsuchiyama S., and Nakagata N. 2009. Cryopreservation of ovaries from elderly female
mice. Exp. Anim. 58(3) Suppl: 248.

63

Chapitre

7

Autres techniques

7-1 Vasectomie pour la stérilisation des males

Matériel and Equipement
1. Souris males (âgées de 5 semaines)
2. Anesthésiants
3. Ciseaux de dissection
4. Une paire de forceps watchmaker's #5
5. Agrafes de suture (Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) et applicateur dʼagrafes(Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams 427630)
6. Plaque chauﬀante (37℃)

Procédure
Vasectomie
1.

Anesthésier une souris male.

2.

La procédure traditionnelle commence par une incision débutant au haut de la cuisse(pattes inferieures) et sʼétendant sur 1cm environ en direction de la tête de la souris.
Une fois lʼabdomen incisé, exposez le testicule, lʼépididyme, et le canal déférent.

Amas graisseuxTête de lʼépididyme

Testicule

Queue de lʼépididyme

64Autres techniques
3.

Chapitre

7

Attraper le canal déférent avec un forceps et insérer le second forceps sous le canal
déférent pour le détacher du tissu conjonctif.

Tête de lʼépididymeTête de lʼépididyme

TesticuleAmasgraisseuxCorpsde lʼépididyme
Amas graisseux

Testicule

Corps de lʼépididyme
Canal déférent
Queue delʼépididyme
Insérer leforceps ici

4.

Queue de lʼépididyme

Canal déférent

Maintenez le canal déférent avec un forceps puis cautériser le canal déférent de part etdʼautre avec le second forceps chauﬀé à blanc, comme indiqué sur le schéma ci-dessous.

5.

Couper la partie du canal déférent située entre les deux zones cautérisées.

Forceps de maintien

Forceps chauﬀé à blancTesticule

Canal déférent
Canal déférent
Forceps chauﬀé à blancCiseaux
Forceps demaintien

Forceps demaintien
Forceps chauﬀé à blanc

6.

Replacer le testicule, lʼépididyme, et le canal déférent dans la cavité abdominale, puis
refermer lʼincision avec des clips de suture.

7.

Répéter les étapes 2 à 6 pour le deuxième testicule.

Références
1.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0-87969-591-9.

RemarqueUne fois la procédure terminée,placer les males individuellement
dans les cag es. Lorsque les males
sont regroupés, ils ont tendance à
se battre et peuvent subséquemment décéder. Les males vasectomisés sont prêts à être utilisés dès
quʼils atteignent 8 semaines.

65

7

Chapitre

Autres techniques

7-2 Réimplantation dʼembryons par lʼoviducte

Dans notre laboratoire, nous avons mis au point une technique de réimplantationdʼembryons au stade 2 cellules au travers de la paroi de lʼoviducte.
Cette procédure est bien plus simple et facile à exécuter que la méthode traditionnelle parlʼinfundibulum. Cette méthode est donc idéale lorsque le personnel technique ne possèdeque peu dʼexpérience.

Matériel and Equipement
1.

Souris femelles au premier jour de pseudogestation (avec un bouchon vaginal)[Apparence du vagin en proestrus][Bouchon vaginal]

Accoupler avec lesmales vasectomisés

Bouchonvaginal2.

Anesthésiants

3.

Micro-ciseaux à ressorts (lame de 5mm)

4.

Une paire de forceps watchmaker's #5

5.

Clamp (Serreﬁne)

6.

Agrafes de suture (Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) et applicateur dʼagrafes (Mik-Ron
Autoclip Applier; Clay Adams 427630)

66

7.

Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)

8.

Capillaires en verre pour manipuler et réimplanter les embryons

9.

Plaque chauﬀante (37℃)

Autres techniques

Chapitre

7

Procédure
Préparation des souris
1.

Anesthésier une souris femelle.

2.

Disséquer lʼappareil reproducteur (ovaire, oviducte et corne utérine).

Amas graisseux

Ligament tubo-ovarien

Infundibulum

OvaireAmpouleOviducte

Utérus3.

Clamper lʼamas de graisse attaché au ligament tubo-ovarien.

Clamp
Amas graisseux

OvaireOviducte
Utérus67

Chapitre

7

Autres techniques

Positionner lʼoviducte
Comme indiqué sur le schéma ci-dessous, la réimplantation par lʼoviducte comporte troisétapes : inciser lʼoviducte, insérer le capillaire, et décharger les embryons dans lʼoviducte en
direction de lʼampoule.
[Schéma]Air
Forceps

Incision
Embryons
AmpouleInfundibulum
Ligament tubo-ovarien

OvaireLe schéma ci-dessous montrant un oviducte exposé (A) illustre le fait que les oviductes
murins sont non seulement petits, mais aussi courbés dans tous les sens.
Ceci rend la réimplantation assez diﬃcile car elle doit se faire en direction de lʼampoule.
Pour faciliter la réimplantation, nʼhésitez pas à repositionner le clamp jusqu'à ce quelʼampoule soit bien visible et accessible.

A

B

Capillaire contenantembryons et bulles dʼair

Infundibulum
OvaireIncision

Incision

OvaireAmpoulevers lʼutérus
Infundibulumvers lʼutérus

1.

AmpouleObservez lʼoviducte au microscope et exposer lʼinfundibulum et lʼampoule à lʼaide desforceps. Replacer le clamp si nécessaire.

2.

Placer lʼoviducte dans la position la plus accessible en repositionnant entièrement lasouris si nécessaire.

Note
Chaque souris ayant des oviductes
avec des replis diﬀérents, prenez letemps de bien observer et positionner lʼoviducte pour faciliter la réimplantation.

Remarque
Si vous êtes gaucher, adaptez le positionnement pour une réimplantation du côté gauche.

68Autres techniques

Chapitre

7

Préparation des embryons et des capillaires en verre
1.

Placer une goutte de 200 µL de KSOM/AA dans une boite de Pétri (ne pas recouvrir deparaﬃne liquide) et déposer 20 embryons dans cette goutte.

Capillaire en verre pourmanipulation dʼembryons
Paraﬃne liquide

Goutte deKSOM/AA (200μL)

2.

Embryons

Aspirer alternativement un peu de milieu et dʼair pour créer des bulles de 2 à 3 mmdans le capillaire, puis aspirer 10 embryons dans le capillaire.

Remarque
Capillaire en verre pourréimplantation dʼembryons
Paraﬃne liquide déposéeà la surface

Lorsque le capillaire est inséré dansla goutte pour la première fois, laAirparaffine liquide se dépose à lasurface de la goutte du côté de lapénétration du capillaire.
Aspirez les embryons dans le capillaire par le côté opposé pour éviter
la présence de paraffine liquide
dans et sur le capillaire.
La paraffine liquide est potentiellement néfaste au bon développement des emb ryons jusquʼà lamise-bas.

Paraﬃne liquide
déposée à la surface

Embryons

69

Chapitre

7

Autres techniques

Réimplantation
1.

Positionnez lʼoviducte avec les forceps watchmaker's #5 et faites une petite incision
avec les micro-ciseaux dans la paroi de lʼoviducte, entre lʼinfundibulum et lʼampoule.

OvaireInfundibulum

Micro-ciseaux
à ressortsvers lʼutérus
Ampoule2.

Insérer le bout du capillaire dans lʼincision puis enfoncer le capillaire un peu plus
profondément en direction de lʼampoule.

Incision

Capillaire contenantembryons et bulles dʼair

3.

Maintenez lʼoviducte et le capillaire avec un forceps.

4.

Décharger les embryons et 2 à 3 bulles dʼair dans lʼampoule.

RemarqueForceps

Lo rsq u e la ré im p lant at io n e s t
opérée correctement, les bullesdʼair sont visibles à travers la paroide lʼampoule.

Note
Si vous ne parvenez pas à expulser
les embryons dans lʼoviducte, retirer
très lég èrement le capillaire pourdécoller le bout du capillaire de laparoi de lʼoviducte et libérer ainsi lesembryons.

70

Autres techniques
5.

Retirer délicatement le capillaire par lʼincision.

Chapitre

7

Note
Ne ré im p lant e z le s e m b ryo ns

Incisionquʼune fois la position et la direction de lʼoviducte ajustées.
Lorsque lʼoviducte et le capillairesont placés en parallèle, lʼinsertion
du capillaire est facilitée.

Air

AmpouleEmbryons[Réimplantation dʼembryons par lʼoviducte] No. 17-01
6.

Replacer lʼappareil reproducteur (ovaire, oviducte et corne utérine) dans la cavité
abdominale et suturer avec des agrafes.

7.

Répéter lʼopération de manière similaire pour réimplanter 10 autres embryons dans lesecond oviducte.

8.

Maintenez la température corporelle de la souris (37℃) en la plaçant sur la plaquechauﬀante jusqu'à ce que les eﬀets de lʼanesthésie aient complètement disparu.

Références
1.

Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp.

Anim. 41: 387-388.
2.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press .
ISBN 0-87969-591-9.

71Chapitre

7

Autres techniques

7-3 Réimplantation dʼembryons par lʼutérus

Matériel and Equipement
1. Souris femelles au troisième jour de pseudogestation (les femelles sélectionnées ont unbouchon vaginal au premier jour).
2. Anesthésiants
3. Ciseaux de dissection
4. Une paire de forceps watchmaker's #5
5. Clamp (Serreﬁne)
6. Aiguille de 27 gauges
7. Agrafes de suture (Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) et applicateur dʼagrafes (Mik-Ron

Autoclip Applier; Clay Adams 427630)
8. Boites de Pétri (35mm X 10mm Cat. No. 430588; CORNING)
9. Capillaires en verre pour réimplanter les embryons
10. Plaque chauﬀante (37℃)

Procédure
Réimplantation
Préparer les souris receveuses, les embryons (du stade 8 cellules au stade blastocyste) et un
capillaire en verre en suivant la même méthode que pour la réimplantation par lʼoviducte(Reportez-vous au chapitre Réimplantation par lʼoviducte en page 67).
1.

Saisir lʼappareil reproducteur (ovaire, oviducte, corne utérine) de manière
conventionnelle.

2.

Clamper lʼamas de graisse attaché au ligament tubo-ovarien.

3.

Aspirer alternativement un peu de milieu et dʼair pour créer des bulles de 2 à 3 mm dansle capillaire, puis aspirer 10 embryons dans le capillaire comme indiqué sur le schéma cidessous.

Note

Capillaire
Air

Embryons

72

MilieuLors de la préparation des capillaires en verre, évitez de toucher laparaﬃne liquide.

Autres techniques
4.

Chapitre

7

Tenez lʼaiguille de 27 gauges et le capillaire de réimplantation de la manière illustrée
ci-dessous. Observez simultanément le bout du capillaire et lʼutérus au microscope, etassurez-vous de placer les deux dans le même plan focal.

Capillaire en verre
Pipette pour la réimplantation

Aiguille

5.

Maintenez avec précaution la corne utérine à lʼaide des forceps, et insérer lʼaiguille de 27
gauges dans la paroi de lʼutérus jusqu'à pénétration dans la cavité utérine.

Forceps

UtérusAiguille

Ovaire73

Chapitre

7
6.

Autres techniques
Retirez lʼaiguille et positionnez le capillaire en verre comme indiqué sur les photos a et b.
Insérez le bout du capillaire contenant les embryons profondément dans lʼutérus en lepassant par le trou préalablement percé avec lʼaiguille (photo c).

abcForcepsCapillaire en verre

Clamp (Serreﬁne)
UtérusOvaireNote

7.

Déchargez les embryons dans la cavité utérine ainsi que 2 à 3 bulles dʻair.

8.

Retirez délicatement le capillaire de lʼutérus.

Tout en maintenant la corne utérine, ne quittez pas des yeux le trouque vous avez fait dans lʼutérus
jusquʼà ce que la réimplantation
soit terminée. Si vous perdez des[Réimplantation dʼEmbryons par lʼUtérus] No. 18-01

yeux le trou, il sera diﬃcile de le retouver.

Note[Démonstration de la procédure] No. 18-02

Si vous ne parvenez pas à expulser
les embryons dans lʼutérus, retirer
très lég èrement le capillaire pourdécoller le bout du capillaire de laparoi de lʼutérus et libérer ainsi lesembryons.

Note
Pour vous aider à ne pas perdre
le trou des yeux, tenez à la foislʼaig uille et le capillaire en verre
avec votre main dominante avantde commencer la procédure.

74

Autres techniques
9.

Chapitre

7

Replacer lʼappareil reproducteur (ovaire, oviducte et corne utérine) dans la cavité
abdominale et suturer avec des agrafes.

10. Répéter lʼopération de manière similaire pour réimplanter 10 autres embryons dans laseconde corne utérine.
11. Maintenez la température corporelle de la souris (37℃ ) en la plaçant sur la plaquechauﬀante jusqu'à ce que les eﬀets de lʼanesthésie aient complètement disparu.

Références
1.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0-87969-591-9.

75

Chapitre

7

Autres techniques

7-4 Césarienne et adoption

Si la femelle porteuse nʼa pas mis bas à la date estimée, une césarienne est nécessaire.

Matériel and Equipement
1. Mère adoptive (souris ayant mis bas le même jour ou le jour précédant la datethéorique de la mise-bas de la souris enceinte).
2. Ciseaux de dissection
3. Une paire de forceps watchmaker's #5
4. Plaque chauﬀante (37℃)
5. Souris enceinte (ayant un retard de mise-bas par rapport à sa date théorique).

Procédure
Césarienne
1.

Sacriﬁer la souris enceinte et passer un coton imbibé dʼalcool à 70% sur son abdomen.

2.

Inciser immédiatement lʼabdomen et collecter les utérus contenant les souriceaux avec
une paire de ciseaux de dissection.

3.

Placer les utérus sur un essuie-tout et inciser la paroi utérine.

4.

Retirer rapidement les souriceaux de la membrane vitelline et de lʼamnios, puis couper lecordon ombilical de chaque souriceau.

[Disséquer le cordon ombilical]

Placenta

Souriceau

76

Cordon ombilicalAutres techniques
5.

Chapitre

7

Nettoyer le corps des souriceaux avec un essuie-tout pour enlever le liquide amniotique,les secrétions, et le sang.

6.

Placer les souriceaux sur la plaque chauﬀante à 37℃ et pincer délicatement les pattes
des souriceaux plusieurs fois avec des forceps jusqu'à ce quʼils commencent à respirer
par eux-mêmes et que leur teint devienne rosé.
[De la Dissection des Utérus aux premières respirations des souriceaux]No. 19-01

Adoption
Sélectionner une mère adoptive dont les souriceaux ont une couleur de pelage diﬀérente decelle des souriceaux issus de la césarienne, aﬁn de les diﬀérencier plus tard.
1.
2.

Retirer la mère adoptive de la cage.
Réduire la portée de moitié (par exemple, si la mère adoptive a 10 souriceaux, retirez-en
4 ou 5).

3.

Rouler les souriceaux issus de la césarienne dans la litière et mélangez-les avec lesautres souriceaux (en essayant de garder le nombre de souriceaux dʼorigine).

4.

Replacer la mère adoptive dans la cage.

[Adoption] No. 19-02

Références
1.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0-87969-591-9.

77Chapitre

8

Milieux

8-1 Stockage des milieux et solutions
dans des ampoules en atmosphère azotée
Matériel and Equipement
1. Appareil de fermeture hermétique à jet double (Adelphi Manufacturing, West Sussex, UK)
2. Ampoule (stérilisée à haute température (180℃, 3 hours))
3. Milieu
4. Seringue avec aiguille de 18 gauges
5. Forceps
6. Azote gazeux

Procédure
Nettoyage et stérilisation des ampoules en verre
1.

Rincer les ampoules en verre à lʼeau courante.

2.

Rincer les ampoules à lʼeau distillée deux fois.

3.

Stériliser les ampoules à haute température (180℃ pendant 3 heures minimum).

Ignition1.

Ouvrez le robinet de lʼappareil de fermeture hermétique à jet double.

2.

Ajuster la puissance de la ﬂamme jusqu'à ce quʼelle devienne bleue.

Fermeture hermétique des ampoules
1.
2.

Remplir chaque ampoule avec la quantité souhaitée de milieu.
Remplisser une ampoule dʼazote gazeux et immédiatement après fermer
hermétiquement lʼampoule avec lʼappareil à jet double. Répéter la procédure pourchaque ampoule.

Seringueot e
Az

Aiguille de 18 gauges

AmpouleMilieu[Remplissage des Ampoules avec du Milieu] No. 20-01

78

ux
ze
ga

AmpouleMilieux

Chapitre

8

8-2 Tableaux de composition des milieux

mHTF
Composition du mHTF

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

593.8

Sigma

S 5886

KCl

35.0

Sigma

P 5405

MgSO4・7H2O

4.9

Sigma

M 2773

KH2PO4

5.4

Sigma

P 5655

CaCl2

57.0

Sigma

C 5670NaHCO3

210.0

Sigma

S 5761

Glucose

50.0

Sigma

G 6152Na-lactate**

0.34 mL

Sigma

L 7900Na-Pyruvate

3.7

Sigma

P 4562

Penicillin G

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277400

MERCK/CALBIOCEM

1265750.04 mLSigma

P 0290

BSA(Sérum dʼAlbumine de Bovin,
Fraction V sans acide gras)

0.5% phenol red*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503**Solution à 70%
Le mHTF doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

Références
1.

Kito S., Hayao T., Noguchi-Kawasaki Y., Ohta Y., Hideki U., and Tateno S. 2004. Improved in vitro fertilization anddevelopment by use of modiﬁed human tubal ﬂuid and applicability of pronucleate embryos for cryopreservation
by rapid freezing in inbred mice. Comp. Med. 54(5): 564-570.

79

Chapitre

8

Milieux
Hyaluronidase
Composition de la hyaluronidase
Préparer une solution mère à 1% comme indiqué ci-dessous. Stériliser par ﬁltration et congeler (-20 ℃ ) en parties
aliquotes de 100 µL. Lors de lʼutilisation, diluer la solution mère au dixième. Par exemple, ajouter 20 µL à une goutte(200 µL ‒ volume ﬁnal) de mHTF contenant les ovocytes pour obtenir une solution ﬁnale de 0.1%.

Composémg*

Vendeur

Code de référence

Hyaluronidase

10

Sigma

H 3506*mg/mL diluée dans du mHTF

80

Milieux

Chapitre8

sucrose 0.3 M (BSA-)
Composition du sucrose 0.3 M (BSA-)

Composémg*

Vendeur

Code de référence

Sucrose2053.8Sigma

S 1888*mg/20 mL de PB1

Composition du PB1 (BSA-)

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2 PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2 O

10.0

Sigma

M 2393Na2 HPO4

115.0

Sigma

S 5136

Na-Pyruvate

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le sucrose 0.3 M (BSA-) doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

81

Chapitre

8

Milieux
sucrose 0.3 M (BSA+)
Composition du sucrose 0.3 M (BSA+)

Composémg*

Vendeur

Code de référence

Sucrose2053.8Sigma

S 1888*mg/20 mL de PB1

Composition du PB1 (BSA+)

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2 PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2 O

10.0

Sigma

M 2393Na2 HPO4

115.0

Sigma

S 5136

Na-Pyruvate

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

BSA

300.0

Sigma

A 4378*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le sucrose 0.3 M (BSA+) doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

82

Milieux

Chapitre

8

KSOM/AA
Composition du KSOM/AA

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

555.0

Sigma

S 5886

KCl

18.5

Sigma

P 5405KH2 PO4

4.75

Sigma

P 5655

MgSO4・7H2 O

4.95

Sigma

M 2773

CaCl2・2H2 O

25.0

Sigma

C 7902NaHCO3

210.0

Sigma

S 5761

Glucose

3.6

Sigma

G 6152

Na-Pyruvate

2.2

Sigma

P 4562DL-Lactic Acid sodium
salt

0.174 mL

Sigma

L 137510 mM EDTA

100 µL

Sigma

E 6635

Streptomycin

5.0

Sigma

S 9137

Penicillin

6.3

Sigma

P 7794

0.5% phenol red

0.1 mLSigma

P 0290

L-Glutamine

14.6

Sigma

G 8540MEM Essential Amino
Acids solution

1.0 mL

GIBCO

11130-051

MEM Non-essential
Amino acid solution

0.5 mLSigma

M 7145

BSA

100.0

Sigma

A 4378*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le KSOM/AA doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

Références1.

Lawitts J. A., and Biggers J. D. 1993. Culture of preimplantation embryos. Methods Enzymol. 225:153-164.

83

Chapitre

8

Milieux
sucrose 0.8 M
Composition du sucrose 0.8 M

Composémg*

Vendeur

Code de référence

Sucrose5476.8Sigma

S 1888*mg/20 mL de PB1

Composition du PB1

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

Na-Pyruvate

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

BSA

300.0

Sigma

A 4378*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le sucrose 0.8 M doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

84

Milieux

Chapitre

8

PB1
Composition du PB1

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

Na-Pyruvate

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

BSA

300.0

Sigma

A 4378*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le PB1 doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

85

Chapitre

8

Milieux
DMSO 1 M
Composition du DMSO 1 M

ComposémL*

Vendeur

Code de référence

DMSO

1.56

Sigma

D 2650

PB1

18.44

-

-

*Volume ﬁnal : 20 mL

Composition du PB1

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

Na-Pyruvate

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

BSA

300.0

Sigma

A 4378*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le DMSO 1M doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

86

Milieux

Chapitre

8

DAP213
Méthode de préparation du DAP213
1.

Les solutions A et B sont préparées et entièrement dissoutes.

2.

Un volume égal de chaque solution (A et B) sont ensuite mélangés pour obtenir le DAP213.

Solution A

ComposémL*

Vendeur

Code de référence

PB1

2.3088--DMSO

3.1252Sigma

D 2650

Propylene glycol
(PG)

4.556

Sigma

134368

Attention

La solution peut devenir turbide lorsque le DMSO est ajouté.

Solution B

Composémg*

Vendeur

Code de référence

Acetamide (AA)1181.4Sigma

A 0500*mg/10 mL de PB1

Composition du PB1

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

Na-Pyruvate

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

BSA

300.0

Sigma

A 4378*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le DAP213 doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

87

Chapitre

8

Milieux
sucrose 0.25 M
Composition du sucrose 0.25 M

Composémg*

Vendeur

Code de référence

Sucrose1711.5Sigma

S 1888*mg/20 mL de PB1

Composition du PB1

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

Na-Pyruvate

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

BSA

300.0

Sigma

A 4378*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le sucrose 0.25 M doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

88Milieux

Chapitre

8mWM
Composition du mWM

Composémg/100 mL*

Vendeur

Code de référence

NaCl

640.0

Sigma

S 5886

KCl

35.6

Sigma

P 5405

KH2PO4

16.2

Sigma

P 5655

MgSO4・7H2O

29.4

Sigma

M 7774NaHCO3

190.0

Sigma

S 5761

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Na-Pyruvate

2.5

Sigma

P 4562

Ca-lactate pentahydrate

46.0

Sigma

C 8356

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

Penicillin G

7.5

Sigma

P 7794

0.5% phenol red

0.2 mLSigma

P 029020 mM 2-ME

10.0 µL

Sigma

M 7522

100 mM EDTA

50.0 µL

Sigma

E 6635

BSA

300.0

Sigma

A 4378*Dilution dans de lʼeau testée sur embryons ; Sigma W1503
Le mWM doit être préservé à 4℃ dans des récipients opaques.

89

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Cryoprotecteur et® Agent Cryoprotecte
Milieueu de Préincuba
Préincubation

Pour Fécondationin vitro chez la souris

CARD MEDIUM®

FIV inconsistante ? Utilisez FERTIUP®® !!
Reimplantationdʼembryons

Fécondation In vitro

Portées
multiples

Collectedʼovocytes♂

Cryoprotectionde spermatozoïdes

Décongélation despermatozoïdes

Préservation

FERTIUP®MS CPA
EX
KYD-001-EX♀

Préincubation

FERTIUP®MS PM
KYD-002-EX

La combinaison de l’agent Cryoprotecteur desperme murin ERT UP du milieu depréincubation pour sperme murin ERT UP et du
CARD MED UM pour la fécondation in vitro offre
les avantages suivants

T
Taux de fécondation dépassant les 0Management amélioré de lignées de souris transgéniquess
M
Réduction des coûts d’entretien et de reproduction dans
R
lles
le
e animaleries
Réduction du temps nécessaire à l’expansion desRcoloniesc
Production améliorée des lignées peu fertilesP

Fécondation à partir de sperme congelé et ravivé
grâce aux milieux FERTIUP® et CARD MEDIUM®
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

>80%

Taux de ertilization
fécondationrate 0>30%rate 30
Tauxertilizationde fécondation

Méthodeusualtraditionnelle
methodFERTIUP® Milieu de Préincubation : PM

CARD MEDIUM®

ilieu de Préincubation pour sperme murin x1 flacon (1 m )FERTIUP® PM 0.5ML & kit CARD MEDIUM
E T P®

ilieu de Préincubation pour sperme murin x1 flacon (0.5 m )

CA D

CA D

ERT UP

Code de référence
KYD-001-EX

uantité1m

KYD-001-EX-X5

5x1m

KYD-001-05-EX

0.5 m

KYD-001-05-EX-X5

5 x 0.5 m

KYD-002-EX

1m

KYD-002-EX-X5

5x1m

KYD-002-05-EX

0.5 m

KYD-002-05-EX-X5

5 x 0.5 m

KYD-003-EX

1 it

KYD-004-EX

1 set

KYD-005-EX

1 set

Le kit inclut 1 ampoule contenant le milieu (A), 1 ﬂacon avec la poudre (B), un tube en plastique de 1.5 mL (C),un tube en plastique de 1.5 mL (D), une seringue à usage unique de 2.5 mL, 1 aiguille, 1 ﬁltre (taille des pores : 0.22 µm)
E T P®

ERT UPCARD MED UM®

Description
FERTIUP® Agent CryoProtecteur : ACPFERTIUP® PM 1ML & kit CARD MEDIUMCARD MEDIUM®
KYD-003-EX

E T P et CA D ED
sont des milieuxde qualité qui améliorent os performances
pour ra i er le sperme congelé et effectuer desfécondations in itro che la souris.

Taux de fécondation in vitro (%)

RechercheEDED

x 1 itx 1 itKIT DE TRANSPORT A BASSE TEMPERATURE CARD
Spécialement étudié pour le transport à bas prix et sécurisé de queues d’épididymes
et embryons à basse température.
température
Réduit les coûts de transport de souris vivantes
Elimine les risques de décès ou d’évasions durant le transport
Prévient la transmission de pathogènes
Essentiel pour la méthode de ressuscitation de lignées par fécondation invitro avec spermatozoïdes congelés
KYD-006-EX♂

Queuesdʼépididymes

Spermatozoïdes

Transport à basse
température

Taux élevé de survie du sperme !

Description

Code de référence

QuantitéKit de transport à basse température CARD

KYD-006-EX

1 set

1 boite de transport en polystyrène, blocs réfrigérants (4 larges, 2 petits), 1 Thermos, 1 boite en papier, matériel anti-choc (coton)

FERTIUP® et CARD MEDIUM produits complémentaires
Description

Code de référence

Quantité

Paillettes pour Sperme (10 Pièces x 10 Unités)KYD-S020X10

10 pc

Gobelet pour la congélation

KYD-S018

1 unitéConnecteur pour Paillettes (5 parties inclues)

KYD-S025

1PC

Cassette Triangulaire Courte (10 unités)KYD-S021

10 unitésCassette Triangulaire Longue (10 unités)KYD-S035

10 unitésKit pour la Manipulation d’Embryons

KYD-S036

1 set

Capillaire en Verre 20PC

KYD-S037

1 set

Bec Benzène automatique APT-3

PHD-APT3-EX

10 unitésGobelet pour lacongélation
KYD-S018

505 mmConnecteur pour
Paillettes
KYD-S025
Cassette Triangulaire Longue
KYD-S035

Kit pour la Manipulation d’Embryons
KYD-S036

Cassette Triangulaire Courte
KYD-S021

Capillaire avec
bouchon en silicone

X10 unités
Capillaire(contenance : 20 capillaires)

X10 unités

Pipette Pasteur(morceau de coton pouréviter les contaminations)

Longueur ducapillaire(8-10 cm)

Paillettes pour Sperme
KYD-S020X10
Embout buccal

Bec Benzène automatique APT-3
PHD-APT3-EX

Tube ensilicone(60 cm)(10 pièces )x 10 unités

5 cm

Cherchez!

fertiup®

Agent Amélioré de Superovulation pour la Souris

Souriceaux obtenus par FIV à partir d’UNE SEULE
femelle C57BL/6J ayant été superovulée avec
CARD HyperOva®
([FHOOHQWSRXUOD),9
&KRLVLVVH]+\SHU2YDSRXUREWHQLUSOXVGbRYRF\WHVRYXOËVy(QYLURQRYRF\WHVSHXYHQWÌWUHFROOHFWËVÃSDUWLUGbXQHVHXOHVRXULV&%/y2SWLPLVH]YRWUH),9HQXWLOLVDQW+\SHU2YDHQFRPELQDLVRQDYHFObDJHQW&U\RSURWHFWHXUGHVSHUPHPXULQ)(57,83OHPLOLHXGHSUËLQFXEDWLRQSRXUVSHUPHPXULQ)(57,83HWOH&$5'0(',80SRXUODIËFRQGDWLRQLQYLWURFKH]ODVRXULVSuperovulation Reagent for mouse®

1 mL
Store at -80°C to -20°C
For research use only. Not for human or medicinal use.

Cat. No. KYD-010-EX

Manufactured by
KYUDO CO., LTD.

&RPSRVLWLRQ
8QPËODQJHRSWLPLVËGbDQWLFRUSVDQWLLQKLELQHHWGHJRQDGRWURSKLQHFKRULRQLTXHSXULILËHGHMXPHQW H&*

3URFËGXUHSRXUOD6XSHURYXODWLRQ,QMHFWH] LS XQHVRXULVIHPHOOHÅJËHGHÃMRXUVDYHFÃP/GH&$5'+\SHU2YD/HV
LQMHFWLRQVVHIRQWHQJËQËUDOGHMRXUHQWUHKDQGK,QMHFWH] LS ODPÌPHVRXULVKSOXVWDUGDYHF8,GHJRQDGRWURSKLQHFKRULRQLTXHKXPDLQH
K&*  QRQLQFOXH 

5ËIËUHQFHV7DNHR71DNDJDWD16XSHURYXODWLRQXVLQJWKHFRPELQHGDGPLQLVWUDWLRQRILQKLELQDQWLVHUXPDQGHTXLQHFKRULRQLFJRQDGRWURSLQLQFUHDVHVWKHQXPEHURIRYXODWHGRRF\WHVLQ&%/IHPDOH
PLFHųůƒŶŃŲűŨ  HGRLMRXUQDOSRQH
7DNHR71DNDJDWD1,PPXQRWKHUDS\XVLQJLQKLELQDQWLVHUXPHQKDQFHGWKHHIILFDF\RIHTXLQHFKRULRQLFJRQDGRWURSLQRQVXSHURYXODWLRQLQPDMRULQEUHGDQGRXWEUHGPLFHVWUDLQVŷƋƈƕƌƒƊƈƑƒƏGRLMWKHULRJHQRORJ\

Description

Code de référence
KYD-010-EX

CARD HyperOva®

QuantitéConservation

1 mL

-20℃

KYD-010-EX-X5

5x 1 mL-20℃

KYD-010-06-EX

0.6 mL-20℃

KYD-010-06-EX-X5

5x 0.6 mL-20℃

Transport : Glace carbonique

Cherchez !

card hyperova

Vitrification/Décongélation/ liquides et Milieux
Pour la Souris, le Rat
et la Manipulation d’Embryons
SourisDescription
HTF
HTF
mHTF
mHTF
mHTF
mHTF
KSOM
KSOM
mWM
mWM
sucrose 0.25M
sucrose 0.25M
DMSO 1M
DAP213

Application
Fécondation
Fécondation
Fécondation
Fécondation
Fécondation
Fécondation
CultureCultureCultureCultureCongélation/décongélation
Congélation/décongélation
Cryopréservation
Cryopréservation

Code de référence
CSR-R-B071
CSR-R-B070
KYD-008-02-EX
KYD-008-02-EX-X5
KYD-008-05-EX
KYD-008-05-EX-X3
CSR-R-B075
CSR-R-B074
CSR-R-B081
CSR-R-B080
CSR-R-Y078
CSR-R-Y077
CSR-R-T072
CSR-R-T073

Quantité
5 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 1 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons
5 mL x 1 ﬂacons
5 mL x 10 ﬂacons
5 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons
5 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons
5 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons
1 mL x 10 ﬂacons

Conservation
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃

Application
CultureCultureCode de référence
CSR-R-M174
CSR-R-M191

Quantité
5 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons

Conservation
4℃
4℃

Code de référence
CSR-R-M084
CSR-R-M083
CSR-R-P183
CSR-R-P185
CSR-R-P187
CSR-R-P186

Quantité
5 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons
5 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons
1 mL x 10 ﬂacons
2 mL x 10 ﬂacons

Conservation
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃

Rat
Description
mR1ECM
mR1ECM

Manipulation d’ Embryons
Description
M2
M2
PB1
PB1
PEPeS
P10

Application
Manipulation
Manipulation
Manipulation
Manipulation
Cryopréservation
Cryopréservation

Cherchez! cosmobio