Técnicas de Ingeniería Reproductiva del Ratón
Técnicas de Ingeniería Reproductiva del Ratón Manual Técnico

Manual Técnico
Naomi Nakagata

División de Ingeniería Reproductiva
Centro de Recursos Animales y Desarrollo (CARD)
Universidad de Kumamoto, Japón
Tr aduc c i ó n p o r

Jorge Sztein

Técnicas deIngeniería 
Reproductivadel Ratón
Manual Técnico
Naomi Nakagata
Traducción por

J o r g e Sz t e i n

10168

Técnicas deIngeniería
Reproductivadel Ratón
Manual Técnico
Por Naomi Nakagata
En colaboración con Shuuji Tsuchiyama
División de Ingeniería Reproductiva
Centro de Recursos Animales y Desarrollo (CARD)
Universidad de Kumamoto, Japón
Traducción por Jorge Sztein
Corrección por Josep Marimon
3ra edición, Publicado por COSMO BIO CO., LTD.
Toyo-Ekimae Bldg., 2-20, Toyo 2-Chome, Koto-Ku, Tokio 135-0016
Japón
Tel: +81-3-5632-9617
Diseño de Tapa COSMO BIO CO., LTD.
Copyright©2015 Naomi Nakagata , Todos los derechos Reservados.
Impreso en Japón. No está permitida la venta de este libro
No está permitida la reproducción parcial o total de este documento,
copiar en un sistema de recuperación o transmisión en cualquierforma o por cualquier medio, electrónico, mecánico, fotocopias,
grabaciones o por cualquier otro método, sin autorización previa deltitular de los derechos de autor.

Introducción
El número de ratones genéticamente modificados producidos en los últimos
años ha incrementado dramáticamente. Por otra parte, ha sido notable elrápido progreso en el desarrollo de nuevas técnicas destinadas a la edición
del genoma (TALEN y CRISPR/Cas9) en estudios de biología molecular, demanera tal que un ratón genéticamente modificado puede producirse
fácilmente en un tiempo relativamente corto. Esta producción ha sido
apoyada por técnicas de reproducción como la fertilización in vitro, lacriopreservación de embriones, de esperma y las técnicas de transferencia
embrionaria. Estas técnicas se han convertido en inestimables métodos
periféricos y su uso se ha popularizado rápidamente.
La rápida popularidad alcanzada, ha provocado la publicación de varios
manuales técnicos relacionados con la tecnología de la reproducción delratón (como este mismo) . Sin embargo, aun no ha sido publicado un manual
con suficiente detalle dado que las técnicas de reproducción asistida delratón involucran mayoritariamente delicadas operaciones bajo un
microscopio estereoscópico.
Con ese objetivo en mente, en este libro hemos tratado de crear un manualsobre las técnicas reproductivas del ratón que pueda ser fácilmentecomprendido por todos. En nuestro manual hemos incluido un número
generoso de diagramas, fotografías y videos para explicar paso a paso cadatécnica en la forma más clara y minuciosa que hemos podido. Sinceramente
deseamos que nuestro manual se convierta en una guía definitiva para
estudiantes, técnicos, investigadores y otras personas que desean estudiar
las técnicas de reproducción asistida en ratón.
Naomi Nakagata

Técnicas de ingeniería reproductiva del ratón

CONTENIDO
１ Fertilización In Vitro (FIV)

Capítulo

1-1 Preparación y ensamblado de pipetas para manipular embriones
1-2 Fertilización(FIV)
1-3 Fertilización(FIV) usando el reactivo para ultra-superovulación
Capítulo

2

Transporte de esperma

2-1 Recolección y transporte en frio de la cola (Cauda) del epidídimo
2-2 Fertilización
usando esperma del epidídimo transportado en frio
Capítulo

3

4

5

6

7

8

46
52

54
59
62

Otras técnicas

7-1 Vasectomía para la obtención de machos estériles
7-2 Transferencia Embrionaria en Oviducto
7-3 Transferencia Embrionaria en Útero
7-4 Cesárea y adopción
Capítulo

36
39
42

Criopreservación de ovocitos y embriones

6-1 Vitriﬁcación simple de embriones de ratón
6-2 Vitriﬁcación simple de ovocitos de ratón
6-3 Vitriﬁcación y trasplante de ovarios de ratón
Capítulo

32

Transporte de ovocitos y embriones

5-1 Transporte en frio de embriones a 2-células
5-2 Transporte en frio de oviductos de ratón con embriones a 2-células
Capítulo

20
26

Preparación de los ovocitos y embriones

4-1 Preparación de ovocitos micro-diseccionados con laser
4-2 Disección parcial de la zona pelúcida (DPZ)
4-3 Recolección de embriones en estadio de 2-Celulas
Capítulo

14
18

Criopreservación de esperma

3-1 Criopreservación de esperma de ratón
3-2 Fertilización
usando esperma criopreservado
3-3 Método de fertilizaciónpara el rescate de un stock legado
de esperma criopreservado
Capítulo

4
6
12

64
66
72
76

Medios

8-1 Almacenamiento de medios y soluciones en ampollas con gas de nitrógeno
8-2 Tabla de composición de los medios

*

78
79

Por favor, para más información consulte la página 90.

3

Capítulo

1

Fertilización In Vitro (FIV)

1-1 Preparación y ensamblado de pipetas para manipular embriones

Materiales y equipo
1.

Pipetas capilares de vidrio (Calibrated Micropipettes; 2-000-200; Drummond ScientiﬁcCompany, USA)

2.

Mechero de alcohol (o mechero Bunsen recto de laboratorio; Cat. No. RK4102; REKROW
INDUSTORIAL INC.)

3.

Lápiz de diamante o cortador de ampollas de vidrio

4.

Hemocitómetro

5.

Pipeta pasteur

6.

Algodón

7.

Tubo de silicona

8.

Tapón de silicona

9.

Boquilla

Nota
Las pipetas capilares para
manipulación embrionaria ya
ensambladas están disponibles
en Cosmo Bio Co., Ltd. (Embr yo
manipulation instrument set, Cat.
No. KYD-S036)

Procedimientos
Limpieza y esterilización de pipetas capilares de vidrio
1.

Sumerja las pipetas capilares de vidrio en una solución de 99:1 de 70% etanol y acido
clorhídrico concentrado durante más de 12 horas.

2.

Enjuague las pipetas bajo agua corriente durante no menos de 3 horas.

3.

Enjuáguelas 4 o 5 veces con agua destilada.

4.

Esterilice los capilares de vidrio por calor seco a 180℃ durante 3 horas.

Elaboración de pipetas para la manipulación del embrión
1.

Caliente en la zona alta de la llama de un mechero de alcohol en la parte central de uncapilar de vidrio. Cuando el vidrio del capilar este lo suﬁcientemente blando, retírelo dellama y rápidamente tire de los dos extremos.

2.

Divida los capilares en dos poniendo el centro de la sección aﬁnada nuevamente sobre
la llama.

3.

Evalúe la sección aﬁnada y usando un cortador de ampollas corte las pipetas de una
longitud apropiada (10 cm) y elimine la parte sobrante.

4.

Controle el diámetro del extremo del capilar bajo un microscopio usando un hemocitómetro.
[Cuando el borde del capilar esta en foco][Cuando el hemocitómetro está en foco]

Nota
Las dimensiones de los capilares
dependerán tanto de latemperatura a la que se someta elvidrio como del periodo de tiempo
en que se tira del capilar.
Con práctica, se dominara la técnicay p odrá conver tir los capilaresen pip et as de las dimensiones
requeridas

300 µm 200 µm[Elaboración de pipetas para manipular embriones] No. 01-01

4

El diámetro externo de laspipetas producidas debe seraproximadamente de 200-250 µm.

Fertilización In Vitro (FIV)
5.

Capítulo

1

Pula y esterilice la punta de la pipeta calentándola suavemente sobre la llama. Tenga cuidado de no sobrecalentar la punta del capilar ya que puede cerrar la abertura.
[La pipeta con la punta pulida][El extremo del capilar antes de pulirlo][Pulido de la punta de la Pipeta de vidrio] No. 01-02

Ensamblado de la pipeta de transferencia para manipulación de embriones
1.

Corte la punta ﬁna de una pipeta Pasteur con un cortador de ampollas (dejando aproximadamente 1 cm).

2.

Use la llama de un mechero de alcohol para pulir la punta cortada.

3.

Inserte un algodón dentro de la pipeta.

4.

Coloque el tapón de silicona en el extremo de la pipeta con boca ancha.

5.

Conecte un tubo ﬂexible de goma en el extreme ﬁno de la pipeta.

6.

Corte el tubo de goma de una longitud que sea cómodo para su uso, e inserte la boquilla en el otro extremo.
[Pipeta de transferencia y manipulación de embriones]

pipeta Pasteurcorte

pipetacapilartapón desilicona

pipetaPasteur

tapón dealgodón

tubo desiliconaboquilla

Como manipular los embriones
1.

Coloque la boquilla de la pipeta de transferencia en su boca.

2.

Observando bajo un microscopio, introduzca la punta del capilar en la gota de medio.
Deje que el medio llene la punta de la pipeta; esto se produce por un fenómeno naturalllamado capilaridad.

3.

Cuando la capilaridad se termine, use la boquilla para succionar los embriones dentrodel capilar solo aspirando, para liberarlos exhale suavemente.
[Como manipular los embriones] No. 01-03

5

Capítulo

1

Fertilización In Vitro (FIV)

1-2 Fertilización In Vitro (FIV)

Materiales y equipo
1.
2.

PMSG (Gonadotroﬁna sérica de yegua preñada, Cat. No. 80056-608; VWR
SCIENTIFIC INC.) (37.5 IU/mL en solución ﬁsiológica estéril)hCG (Gonadotroﬁna coriónica humana, CG-10; Sigma) (37.5 IU/mL en solución

ﬁsiológica estéril)3.

Jeringas descartables de 1 mL

4.

FERTIUP® (medio de pre-incubación: PM, Cat. No. KYD-002-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

5.

MEDIO CARD® (CARD MEDIUM® Cat. No. KYD-003-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

6.

mHTF

7.

Aceite mineral

8.

Micropipetas

9.

Puntas de pipeta para preparar las placas

10.

Puntas de pipeta para inseminación (Pipette Tip Cat. No. 114; Quality Scientiﬁc Plastics)

11.

Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

12.

Tijeras de disección

13.

Pinza de relojero #5

14.

Tijeras de micro-disección con muelle (hoja de 5 mm)

15.

Aguja de disección

16.

Papel de ﬁltro

17.

Pipetas capilares de vidrio para la manipulación del embrión

18.

Microscopio

19.

Estufa de incubación humidiﬁcada (37℃ , 5% CO₂ en aire)

Procedimientos
Superovulación
1.

Inducir la superovulación inyectando 7.5 IU i.p. de la gonadotrofina sérica de yegua
preñada (PMSG) en cada ratón hembra madura (8-12 semanas). (La PMSG usualmente seadministra durante el ciclo de luz, entre las 14:00 y las 18:00 horas).

2.

Seguidamente, 48-52 horas más tarde se inyectan 7.5 IU i.p. de la hormona gonadotroﬁ
na coriónica humana (hCG).

Preparación de las placas
1.

Prepare las placas como se muestra debajo y manténgalas en la estufa (37℃ , 5% CO₂ enaire) para permitir que se equilibren con el gas.

Coloque una gota
de medio en la placa
usando una micropipeta

6

Vierta el aceite
mineral en la placa

Cubra la gota de medio
con el aceite mineral

Fertilización In Vitro (FIV)

Capítulo

1a. Placa de esperma
Coloque 1 gota (100 µL / gota) de FERTIUP® (PM) en una placa y cúbrala con elaceite mineral 30 minutos antes de recolectar el esperma; coloque la placa en el
incubador.

【placa para el esperma】
aceite mineral

100 µL FERTIUP® (PM)Notab. Placa de fertilización
Ponga 1 gota (200 µL / gota) del MEDIO CARD® en una placa y cúbralo con aceite mineral
10 minutos antes de recolectar los ovocitos, coloque la placa en el incubador.

【placa de fertilización】

Hay tres métodos distintos
d e p r e p a r a r e l M E D I O C A R D ®,dependiendo si la fer tiliz ación
in-vitro se hara usando esperma
fresco, congelado y descongelado oesperma transportado en frio.
Por favor consulte las instrucciones
del MEDIO CARD®.

aceite mineral

200 µL MEDIO CARD®

c. Placa de lavado
Coloque 4 gotas (80 µL / gotas) de mHTF en una placa y cúbrala con aceite mineral. Ponga
la placa en el incubador al menos por 30 minutos.

【placa de lavado】

aceite mineralgotas de 80 µL de mHTF

7

Capítulo
Chapter1

Fertilización In Vitro (FIV)

Recolección de esperma
1.

Sacrifique 1 or 2 ratones machos adultos (de 3 a 6 meses ) y saque las colas de losepidídimos evitando al máximo posible la grasa, sangre y ﬂuidos.
Coloque el organo sobre un papel ﬁltro estéril para absorber toda sangre o ﬂuidos.

corte

2.

pared
abdominal● Pince la piel, y levantándola haga unpequeño corte a lo largo de la línea discontinua indicada en el diagrama de arriba.

● Sostenga con sus dedos la piel cortada y tireﬁrmemente hacia la cabeza y la cola delratón, como lo marca las ﬂechas en elmismo diagrama.

● Diseccione la pared abdominal, teniendo

cuidado de no dañar los órganos internos.

epidídimos

vejigacumulo grasotestículos[Extrayendo las colas de los epidídimos] No. 02-01
3.

Coloque las colas de los epidídimos en la placa de esperma cubierta de aceite mineral.

【placa de esperma】

aceite mineralcolas de los epidídimos

4.

100 µL FERTIUP® (PM)Corte el conducto de cada cola del epidídimo usando unas micro- tijeras con muelle,
después use una aguja de disección para presionar suavemente la superficie delepidídimo para forzar la salida del esperma.

5.

Use la aguja de disección para introducir los grumos de esperma liberados del epidídimo
en la gota de FERTIUP® (PM).

8Fertilización In Vitro (FIV)

Capítulo1

aguja de disección
cola del epidídimo

Nota

grumo de esperma

Introducir en la gota
pinzasmicro tijeras dedisección con muelle

El esperma con niveles altos
de fer tilidad puede obser varse
moviéndose en vórtice con granmotilidad en los bordes del medio
de incubación.

[Recolección de esperma] No. 02-02
6.

Deje capacitar el esperma colocando la suspensión en un incubador (37 ℃ , 5% CO₂ enaire) durante 60 minutos previos a la inseminación.

Recolección de ovocitos
1.

El grado de fertilidad variara en
gran me dida dep endiendo delesperma utilizado.

Por el contrario, el esperma que
muestra baja motilidad y pobre
homogeneidad tiende a tener bajos
niveles de fertilidad.

Sacriﬁque una hembra adulta (8-12 semanas) superovulada aproximadamente entre las
15-17 horas después de administrarle la hCG.

2.

Diseccione el ratón abriendo la cavidad abdominal.

3.

Mueva a un lado el tracto digestivo para exponer el útero, oviductos y ovarios.

4.

Extraiga el útero, oviducto y ovarios y colóquelo sobre un papel ﬁltro estéril.

5.

Retire solo los oviductos (ámpulas), evitando en lo posible la grasa, sangre y ﬂuidos.

higadooviducto

riñón
bazo

ovarioútero

vejigaútero
tracto digestivo

oviducto
ovario[Disección del oviducto] No. 02-03
6.

Sumerja los oviductos en el aceite mineral de la placa de fertilización.

【placa de fertilización】

aceite mineral

200 µL MEDIO CARD®

oviductos

9Capítulo
Chapter1

Fertilización In Vitro (FIV)7.

Use un par de pinzas para mantener fijo el oviducto en el fondo de la placa defertilización, y use una aguja de disección para desgarrar y abrir la ámpula del oviducto
para liberar los complejos cúmulos-ovocitos (COCs). Arrastre los cúmulos dentro de lagota de MEDIO CARD® (200 µL).
[Introduciendo el complejo cúmulos-ovocito (COCs) en la gota de MEDIO CARD ®]pinzasampulaaguja para rasgar

desgarrar

Introducir en la gota

oviducto

Nota
Asegúrese de llevar a cabo todas
las operaciones desde el sacrificio
de la hembra y la obtencion sus
oviductos hasta la introduccion los
COCs en la gota de MEDIO CARD®,
en el menor tiempo posible (unos
30 segundos).

COCs

ampulaCOCs

gota de MEDIO CARD®

No. 02-04

8.

Mantenga la placa de fertilización con los COCs en un incubador (37℃ , 5% CO₂
balanceado en aire) durante 30-60 minutos antes de la inseminación.

Inseminación
1.

Use la punta de pipeta (Pipette tip Cat. No. 114; Quality Scientiﬁc Plastics) para agregar
cantidades apropiadas (usualmente unos 3 µL) de la suspensión de esperma a la gota de
MEDIO CARD® que contiene los COCs.

2.

Coloque la placa de fertilización en un incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire).

【placa de fertilización】

3

3

suspensiónde espermaµLµL【placa de esperma】

COCs
Incubar

100 µL FERTIUP® (PM)10200 µL MEDIO CARD®

Es más, cuando realice esta tarea
solo, no sacriﬁque muchos ratones
a la vez; por el contrario, sacriﬁque
un ratón y obtenga rápidamente
sus oviductos antes de comenzar
con otro animal.

Fertilización In Vitro (FIV)
3.

Capítulo

1

3 horas después de la inseminación, lave los ovocitos 3 veces en medio mHTF (80 µL) enla placa de lavado, evitando transferir el MEDIO CARD ®.

【placa de fertilización】

4.

【placa de lavado】

Seis horas después de la inseminación, observe los ovocitos en la tercer gota de mHTF yelimine todos los ovocitos partenogénicos que tengan solo un pronúcleo.
[Aspecto de los ovocitos fertilizados, no fertilizados y partenogenicos]
ovocitos no
fertilizados (C)segundo corpúsculo polar
pronúcleo femenino
pronúcleo masculino

corpúsculo polar
pronúcleo

ovocito fertilizado (A)ovocito partenogénico (B)5.

Después de incubar los ovocitos durante la noche, transﬁera a la cuarta gota de mHTF
de la placa de lavado solo los embriones en 2-celulas. Estos embriones pueden ser
vitrificados, transferidos a una hembra receptora o cultivados hasta el estadio deblastocito. ( Por favor, consulte los capítulos de Vitrificación simple de embriones deratón en la página 54 y de Transferencia embrionaria en oviducto en la página 66.)

【placa de lavado】

Nota
En este estadio es importante que
usted pueda identificar y eliminarlos ovocitos partenogénicos.
Es impor tante ya que si no loselimina en es te es t adio, al día
siguiente se encontraran en elestadio de 2-celulas y será imposible
distinguir los ovocitos fertilizados
de los ovocitos partenogenéticos.

Nota
Los ovocitos fer tilizados tienen
ambos pronúcleos (A) masculino yfemenino.
Por otra par te, los ovocitos
par tenogénicos tienen solo un
pronúcleo (B) y los ovocitos no
fer tilizados no tienen ningún
pronúcleo (C).

Referencias
1.

Toyoda Y., Yokoyama M., and Hosi T. 1971. Studies on the fertilization of mouse eggs invitro. Jpn. J. Anim. Reprod. 16: 147-151.

11

Capítulo

1

Fertilización In Vitro (FIV)

1-3 Fertilización In Vitro (FIV) usando el reactivo para
ultra-superovulación
Materiales y equipo
Reactivo para ultra-superovulación (CARD HyperOva)

1.

Los otros materiales son los mismos que los usados para la FIV usando PMSG.
(Por favor consulte el capítulo de fertilización in vitro en la página 6.)

Procedimientos
Ultra-superovulación
1.

Inyectar un ratón hembra de 26 ‒ 30 días (contando 0 el día de su nacimiento) 0.10.2 mL i.p del CARD HyperOva para inducir superovulación. (EL CARD HyperOva se
administra durante el ciclo de luz, normalmente entre las 17:00 y 18:00 horas).

2.

Continuar 48 horas más tarde con una inyección i.p de 7.5 IU de la gonadotrofina
coriónica humana (hCG).

Preparación de las placas y recolección de esperma1.

Prepare las placas y recolecte el esperma de igual manera que para la FIV utilizando
PMSG.
(Por favor consulte el capítulo de fertilización in vitro en la página 6.)

Recolección de ovocitos
Cuando se utilice CARD HyperOva los oviductos de las hembras superovuladas aumentan detamaño considerablemente. Por favor asegúrese de manipular los oviductos con cuidado deno romperlos siguiendo el método descripto debajo.
1.

Extraiga los oviductos (Ámpulas) de la cavidad abdominal de las hembras.

2.

Colóquelos sobre un ﬁltro de papel estéril y con suavidad elimine sangre y ﬂuidos.

3.

Sumerja los oviductos en el aceite mineral de la placa de fertilización.

4.

Use una gota de MEDIO CARD® (200µL) por hembra (2 oviductos).

Para los procedimientos siguientes, por favor consulte el capítulo de fertilización in vitro enla página 9.

Inseminación
1.

Para la inseminación use 6 µL de la suspensión pre-incubada de esperma de forma
idéntica a la detallada para la FIV usando PMSG.

Para los otros procedimientos en relación con la inseminación, por favor consulte el capítulo
de fertilización in vitro en la página 10.

12Fertilización In Vitro (FIV)

Capítulo

1

Referencias
1.

Takeo T., Nakagata N. 2015. Superovulation using the combined administration of
inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated
oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE 10(5): e0128330. doi:10.1371/journal.
pone.0128330

2.

Takeo T., Nakagata N. 2016. Immunotherapy using inhibin antiserum enhanced theefficacy of equine chorionic gonadotropin on superovulation in major inbred andoutbred mice strains. Theriogenol . doi:10.1016/j.theriogenology.2016.04.076

13

2

Transporte de esperma

2-1

Recolección y transporte en frio de la cola (cauda) delCapítulo

epidídimo
Materiales y equipo
1.

Ratón macho (más de 12 semanas de edad)

2.

Anestésico

3.

Placa térmica (37℃ )4.

Tijeras de disección

5.

Pinzas de relojero #5

6.

Grapas quirúrgicas (Autoclip 9mm; Clay Adams 427631) y aplicador de grapas (Mik-Ron
Autoclip Applier; Clay Adams 427630)

7.

Registro de temperatura (Thermochron iButton Cat. No. DS1921G; Maxim Integrated
Products)

8.

Solución para almacenado en frio de epidídimos (Cat. No. KYD-007-EX, Cosmo Bio Co.,
Ltd.)

9.

Kit de transporte en frio CARD (Cat. No. KYD-006-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)・Termo (Cat. No. JMK-501; Thermos K.K.)
・Caja de cartón (en donde se pueda ubicar un tubo de 0.2 mL)・Algodón・Bolsas de gel refrigerante (pequeña y grande)・Caja de transporte de espuma de Poliestireno (KARUX KC-3)
Tanto el kit de transporte CARD a baja temperatura como la solución de mantenimiento
deben ser enfriadas a 4-8℃ antes de su uso.

Procedimientos
Obtención de la cola del epidídimo
1.

Anestesie un ratón macho.

2.

Haga una pequeña incisión en el escroto y exponga la cola del epidídimo.

escrotopata

cola

cola delepidídimo

vaso deferente

Corte el vaso deferente y el cuerpo del epidídimo, y saque la cola del epidídimo.

cortecola delepidídimo

14

cuerpo delepidídimo

testículo

corte

3.

cabeza delepidídimocola delepidídimoTransporte de esperma

Capítulo

2[Cola del epididimo]grasa

cola delepidídimo[Obtención de una cola de epidídimo de un macho anestesiado] No. 03-01
4.

Empuje el testículo dentro del abdomen y cierre la herida con una grapa quirúrgica.

Comentario

5.

Mantenga el ratón sobre una placa térmica a 37℃ hasta que se recupere de los efectos

Una semana después de laoperación el macho ya puede ser
apareado.

de la anestesia.

Embalado y transporte de la cola del epidídimo
Todos los elementos a ser utilizados en el embalado de la cola del epidídimo deben
mantenerse a 4-8℃ hasta el momento de su uso.
Aún más, el procedimiento de embalado debe completarse lo más rápido posible para
prevenir que la cola del epidídimo y los elementos del utilizados se calienten.
1.

Ponga la cola del epidídimo en el tubo de 0.2 mL que contiene la solución paraalmacenamiento en frio.

pinzascola del epidídimo

tubo de 0.2 mL
2.

solución
almacenamiento en frio

Coloque el tubo con la cola del epidídimo, un registrador de datos temperatura y un
poco de algodón en la caja de cartón.

registro detemperatura

tubo de 0.2 mL

algodón

tapa

caja de cartón

15

Capítulo

2
3.

Transporte de esperma
Introduzca la caja de cartón con la cola del epidídimo en el termo.

termo

caja de cartón

Introduzca

4.

Introduzca 2 bloques refrigerantes (pequeños) dentro del termo.

2 bloques refrigerantes(pequeños)

termo

Introduzca

5.

Cierre el tapa del termo.

bloquesrefrigerantes
tapa

Nota
Tenga cuidado de colocar la caja decartón con la tapa hacia arriba.

Nota

6.

Coloque el bloque refrigerante (grande) en el fondo de la caja de transporte, y ponga eltermo sobre él.

7.

Ponga un bloque refrigerante (grande) a cada lado del termo, y un bloque (grande) más
sobre él. Cierre la caja con su tapa.

16

Solo es posible colocar el termo enel centro de la caja de transporte yno en el mismo fondo, por que ellargo del termo es el mismo que ellargo interno de la caja.
Esto es para proteger el termo
durante el envío.

Transporte de esperma
8.

Capítulo

2

Cierre la tapa de la caja de transporte usando cinta adhesiva.

bloque de gel

termo

bloque de gel

bloque de gel

Nota
Las muestras deben transferirsea b aja te mp e r at ur a . Po r f avo r,
consulte con el servicio de trasporte
sobre las condiciones durante eltransporte.

Sellar con cinta de embalaje

9.

Mantenga la caja de transporte en el refrigerador hasta que el transportista llegue abuscarlo.

10.

Envíe las muestras por correo regular.

Comentario
El esperma del epidídimo en friomantiene la fertilidad durante

References
1.

72 horas.

Takeo T., Tsutsumi A., Omaru T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Nakamuta Y.,
Takeshita Y., Matsunaga H., Tsuchiyama S., Sakoh K., Nakao S., Yoshimoto H., ShimizuN., and Nakagata N. 2012. Establishment of a transport system for mouse epididymal
sperm at refrigerated temperatures. Cryobiology . 65(3): 163-168.

17

Capítulo

2

Transporte de esperma

2-2 Fertilización In Vitro usando esperma del epidídimo
transportado en frio
Materiales y equipo
1.

Epidídimo transportado en frio

2.

FERTIUP® (Medio de Pre-incubación: PM, Cat. No. KYD-002-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

3.

mHTF

4.

Aceite mineral

5.

Micro pipetas

6.

Placas de cultivo (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

7.

Tijeras de disección

8.

Pinzas de relojero #5

9.

Papel de ﬁltro

10.

Incubador humidiﬁcado (37℃ , 5% CO₂ en aire)

Procedimientos
Recolección de esperma de la cola del epidídimo
1.

Treinta minutos antes de obtener el esperma del epidídimo transportado en frio ponga
una gota (100 µL / gota) de FERTIUP®(PM) en una placa, cúbralo con aceite mineral, ycoloque la placa en el incubador (37℃ , 5% en aire).
【Placa de esperma】

aceite mineral

100 µL FERTIUP® (PM)2.

Saque el tubo de 0.2 mL con la muestra de la caja de transporte.
[Retirando la muestra] No. 04-01

3.

Abra el tubo, saque el epidídimo y seque todo rastro de la solución de transporte usando
un ﬁltro de papel.

pinzasepidídimo
papel deﬁltro

solución demantenimiento
en frio18

Transporte de esperma
4.

Lave el epidídimo en cada una de las tres gotas de mHTF de la placa de lavado.

Capítulo

2

Comentario
Para preparar la placa de lavado,
justo antes de su uso ponga 3 gotas(aprox. 100 µL / gota) de mHTF en
una placa sin aceite mineral.

【placa de lavado】
papel de ﬁltro

5.

Ponga el epidídimo en la placa de esperma cubierta de aceite mineral. El esperma delepidídimo transportado en frío puede utilizarse para fertilización in vitro de lamisma forma que el esperma fresco.
Por favor, consulte el capítulo de Fertilización in vitro en la página 6.

Nota
Si encuentra difícil obtener espermade la cola del epidídimo, haga unnuevo corte para que salga másesperma.

Nota

Referencia
1.

Takeo T., Tsutsumi A., Omaru T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Nakamuta Y.,
Takeshita Y., Matsunaga H., Tsuchiyama S., Sakoh K., Nakao S., Yoshimoto H., Shimizu N.,
and Nakagata N. 2012. Establishment of a transport system for mouse epididymal spermat refrigerated temperatures. Cryobiology . 65(3): 163-168.

Hay tres formas distintas de prepararel MEDIO CARD®, dependiendo ensi la fertilización in vitro se harácon esperma fresco, congelado oenfriado.
Por favor consulte con el manual de
instrucciones del MEDIO CARD®.

19

Capítulo

3

Criopreservación de esperma

3-1 Criopreservación de Esperma de ratón

Materiales y equipo
1.

Ratón macho ( mas de 12 semanas)

2.

Tijera de micro-disección con muelle (5 mm de hoja)

3.

Pinza de relojero #5

4.

FERTIUP® (Crioprotector: CPA, Cat. No. KYD-001-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

5.

mHTF

6.

Aceite mineral

7.

Placas de plastico. (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

8.

Puntas de pipeta

9.

Pajuelas de semen (10 pieces x 10 units, EOG sterilized, Cat. No. KYD-S020X10, Cosmo BioCo., Ltd.)

10.

Micropipetas

11.

Conector de pajuela (Cat. No. KYD-S025, Cosmo Bio Co., Ltd.)

12.

Sellador por impulso

13.

Canastilla para la congelación (Cat. No. KYD-S018, Cosmo Bio Co., Ltd.)

14.

Casete triangular (10 units, Cat. No. KYD-S021 or KYD-S035, Cosmo Bio Co., Ltd.)

15.

Tanque de nitrógeno líquido o tanque de transporte en seco16.

Placa térmica (37 ℃ )Procedimientos
Preparación de la canastilla de congelación
1.

Inserte un trozo bien ajustado de poliestireno en el fondo de la jeringa.

2.

Selle con calor el pico de la jeringa.

3.

Fije la jeringa a la varilla de acrílico.

Varilla de acrílico
(5 mm X 5 mm X 50 cm)

Fijación de la jeringa
a la varilla de acrílico
jeringa descartablede 50 mL
poliestireno(30 mm de espesor)
Fijación de la jeringa
a la varilla de acrílico

sellado por calor

20

Criopreservación de esperma

Capítulo3

Preparación del conector de pajuelas
1.

Haga un conector de pajuela como lo muestra el diagrama de abajo usando una jeringade 1 mL, una llave de 3-vias, un trozo de tubo de silicona, un tubo plástico y un tapón desilicona.

2.

Para usar el conector de pajuelas, corte el tapón de algodón de la pajuela, después conecte la pajuela a través del tapón de silicona ubicado al ﬁnal de conector.
[Conexión de la pajuela al conector]
rotulado

corte

tapón depajuela silicona

tubo plástico

tubo desilicona

llave de 3-vias

jeringa de 1 mL(conector de pajuelas)Preparación de la suspensión de esperma1.

Prepare una placa plástica de 35 mm con una gota de 60 µL de FERTIUP® (CPA) y cúbralo
con aceite mineral.

2.

Agregue a la gota una alícuota de 60 µL de la misma solución (volumen ﬁnal: 120 µL)
para crear una gota alta y semiesférica. Mantenga la placa sobre una placa térmica a
37℃ hasta su uso.

60 µL de FERTIUP® (CPA)

Agregue a la gota deaceite mineral

60 µL de FERTIUP® (CPA)3.

Sacriﬁque un ratón macho (>12 semana de edad) mediante dislocación cervical y obten-

4.

Coloque los epidídimos sobre un trozo de papel de ﬁltro y bajo microscopio elimine

ga los dos epidídimos asépticamente.
completamente la sangre y la grasa del tejido.
5.

Transﬁera los epidídimos a la gota de FERTIUP® (CPA). Use unas pinzas de relojero #5 yunas tijeras de micro-disección con muelle para hacer 5 o 6 incisiones en el epidídimo.
colas del epidídimo
colas del epidídimo

aceite mineral
FERTIUP® (CPA)FERTIUP® (CPA)21

Capítulo

3
6.

Criopreservación de esperma
Coloque la placa sobre la platina térmica a 37 ℃ por 3 minutos. Durante este periodo
de tiempo, a cada minuto rote la placa para dispersar el esperma del órgano al medio
FERTIUP® (CPA).

[Cortando el epidídimo y preparando la suspensión de esperma] No. 05-01

Preparación de la pajuela con la suspensión de esperma
1.

Ponga una pajuela en el conector de pajuelas.

2.

Con cuidado aspire las soluciones en la pajuela en el siguiente orden:
a. 100 µL de mHTF,
b. 15 mm de aire,c. 10 µL de la suspensión de esperma,d. otra columna de 15 mm de aire.

a.
pajuelaampolla de vidrio

conector de pajuelas

mHTF

b.

mHTF
15 mm de airec.
pajuela

10 µL suspensiónde esperma

mHTF

15 mm de aire

d.

mHTF
15 mm de airesuspensión de esperma
15 mm de aire22

Criopreservación de esperma
3.

Capítulo

3

Selle los dos extremos de la pajuela usando un sellador de impulso.

Comentario
suspensión de esperma

15 mmde airemHTF

Cargando la pajuela con 100 µL de
mHTF previene que esta flote enla superficie del nitrógeno líquido.
Esto sucede por que el mHTF haced e co ntr ap es o qu e f u e r z a a lapajuela a hundirse en el nitrógeno
líquido.

15 mmde airesellarsellar4.

Generar 10 muestras por ratón de la misma forma que la descripta arriba.

Congelación de esperma utilizando un tanque de nitrógeno líquido1.

Coloque las muestras en la canastilla de congelación y déjelas ﬂotar sobre el nitrógeno
líquido del tanque.

2.

Después de 10 minutos, sumerja la canastilla en forma rápida en el nitrógeno líquido.

canastilla de congelación

pajuelasnitrógenolíquido[La canastilla de congelación ﬂotante]

10 minutos[Sumergiendo la canastilla de congelación]

canastilla decongelación

10 minutos
pajuelas[Congelación de pajuelas] No. 05-02

23

Capítulo

33.

Criopreservación de esperma
Saque la canastilla de congelación llena de nitrógeno líquido, y transﬁera las pajuelas a
un casete triangular para almacenarlos en el tanque de nitrógeno líquido.

Transﬁera las pajuelas
congeladas

casete triangularcanisternitrógenolíquidocanastilla decongelación

Congelación de esperma utilizando un tanque de transporte en seco
1.

Transﬁera las pajuelas congeladas a un casete triangular.

Comentario

2.

Ponga el casete triangular en un canister previamente enfriado.

3.

Vuelva a poner el canister en el tanque seco y déjelo por 10 minutos.

La congelación de esperma usando
un tanque de transporte en secopuede ser utilizada para el envío deesperma criopreservado.

casetetriangularpajuelacanisterpajuelacasete triangular24tanqueen secoCriopreservación de esperma

Capítulo

3

Referencias
1.

Nakagata N., and Takeshima T. 1992. High fertilizing ability of mouse spermatozoa diluted slowly after cryopreservation. Theriogenol . 37: 1283-1291.

2.

Nakagata N., Ueda S., Yamanouchi K., Okamoto K., Matsuda Y., Tsuchiya T., Nishimura M.,
Oda S., Koyasu K., Azuma S., and Toyoda Y. 1995. Cryopreservation of wild mouse spermatozoa. Theriogenol . 43: 635-643.

3.

Nakagata N. 1996. Use of cryopreservation techniques of embryos and spermatozoa for
production of transgenic (Tg) mice and for maintenance of Tg mouse lines. Lab. Anim.

Sci. 46: 236-238.
4.

Okamoto M., Nakagata N., Ueda O., Kamada N., and Suzuki H. 1998. Cryopreservation ofgene disrupted mouse spermatozoa. J. Mamm. Ova. Res. 15: 77-80.

5.

Takeo T., Hoshii T., Kondo Y., Toyodome H., Arima H., Yamamura KI., Irie T., and Nakagata N.
2008. Methyl-beta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm after
freezing and thawing by facilitating cholesterol eﬄux from the cells. Biol Reprod. 78(3):546-551.

6.

Nakagawa Y., Fukumoto K., Kondo T., Koga M., Takeshita Y., Nakamuta Y., Sakaguchi M.,
Haruguchi Y., Tsuchiyama S., Kaneko T., and Nakagata N. 2009. Fertilization ability of
C57BL/6J mouse spermatozoa frozen in a dry shipper. Exp. Anim. 58(3) Suppl: 297.

7.

Takeo T., and Nakagata N. 2010. Combination medium of cryoprotective agents containing L-glutamine and methyl- β -cyclodextrin in a preincubation medium yields a highfertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab. Anim. 44(2): 132-137.

8.

Nakagata N. 2011. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.

Methods Mol Biol. 693: 57-73.
9.

Takeo T., Nakagata N. 2011. Reduced glutathione enhances fertility of frozen/thawed
C57BL /6 mouse sperm after exposure to methyl-beta-cyclodextrin. Biol Reprod. 85(5):1066-1072.

25

Capítulo

3

Criopreservación de esperma

3-2 Fertilización In Vitro usando esperma criopreservado
Materiales y equipo
1.

Ratones hembra superovuladas con PMSG y hCG

2.

FERTIUP® (medio de preincubación: PM, Cat. No. KYD-002-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

3.

MEDIO CARD® (Cat. No. KYD-003-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

4.

mHTF

5.

Aceite mineral

6.

Puntas de pipetas (Cat. No. 3520; Thermo SCIENTIFIC)

7.

Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

8.

Conector de pajuela (Cat. No. KYD-S025, Cosmo Bio Co., Ltd.) (Por favor, consulte alcapí-tulo de criopreservación de esperma de ratón en la página 21.)

9.

Baño de agua a 37℃

10.

Flotador para el descongelado

11.

Micropipetas

12.

Incubador humidiﬁ cado (37℃ , 5% CO₂ en aire)

Procedimientos
Preparación del ﬂotador para el descongelado
1.

Haga un ﬂotador como el que se muestra a continuación usando poliestireno y un tubode centrífuga de 50 mL.

Insertartubo de centrífuga
de 50 mL

Poliestireno

26

Criopreservación de esperma

Capítulo3

Preparación para el descongelado
1.

Prepare el baño de agua a 37℃ .

2.

Llene de agua (37℃ ) el tubo de centrífuga de 50 mL insertado en el poliestireno, y déjelo ﬂotar en el baño de agua.

3.

Treinta minutos antes de descongelar la pajuela prepare una placa con 1 gota (90 µL /gota) de FERTIUP®(PM) y cúbrala con aceite mineral; coloque la placa en el incubador(37℃ , 5% CO₂ en aire).

【placa de esperma】
aceite mineral

90 µL FERTIUP® (PM)4.

Diez minutos antes de recolectar los ovocitos prepare una placa con 1 gota (90 µL / gota)
de MEDIO CARD® y cúbrala con aceite mineral; coloque la placa en el incubador (37℃ ,5% CO₂ en aire).

【placa de fertilización】

Nota
Hay tres formas distintas de prepararel MEDIO C ARD®, dependiendo
en si la fertilización in vitro se harácon esperma fresco, congelado orefrigerado.
Por favor consulte el manual de
instrucciones del MEDIO CARD®.

aceite mineral

90 µL MEDIO CARD®

5.

Ponga 4 gotas (80 µL / gota) de mHTF en una placa y cúbrala con aceite mineral. Coloquela placa en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) durante al menos 30 minutos.

【placa de lavado】

aceite mineral

80 µL mHTF

27

Capítulo

3

Criopreservación de esperma

Obtención de ovocitos
1.

Sacriﬁque las hembras 15-17 horas después de la inyección de hCG y extraiga los oviductos. (Por favor consulte al capítulo de fertilización In Vitro en la página 9.)

2.

Usando agujas de disección, coloque hasta 4-6 masas de complejos cumulos-ovocito(COCs) en cada gota de MEDIO CARD® (90 µL) (placa de fertilización).

3.

Mantenga la placa de fertilización con los COCs en un incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire)por 30-60 minutos antes de la inseminación.

Nota
Asegúrese de realizar todo el trabajo,
desde el sacrificio de la hembra yobtener sus oviductos a introducir
l o s CO C s e n l a g ot a d e M ED I O
CARD®, en el menor tiempo posible(dentro de los 30 segundos).
Es más, cuando en este proyecto
trabaje solo, no sacrifique muchos
r ato n e s a la ve z , e s p re fe r ib l e,
sacrificar un ratón y rápidamente
obtener sus oviduc tos antes decontinuar con el próximo.

【placa de fertilización】

Incubar por
30-60 minutos

90 µL MEDIO CARD®

Descongelación del esperma de ratón
1.

Saque del nitrógeno líquido una pajuela congelada y manténgala en el aire por 5 segundos.

2.

Una vez pasado ese corto tiempo, inmediatamente sumerja la pajuela en el tubo ﬂotando en el baño de agua a 37℃ por 10 minutos.

3.

Luego de 10 minutos, retire la pajuela del tubo.

4.

Seque el agua de la pajuela con una toalla de papel.

Saque pajuela congelada

mHTF

poliestireno

baño deagua

10 minutos

37℃

nitrógenolíquidosuspensión deesperma (10 µL)[Descongelado del esperma de ratón]

28

Para asegurarse la descongelación dela pajuela, sumerja completamente
en el baño de agua la parte de lapajuela que contiene el esperma.
Es más, el esperma descongelado essensible a los cambios ambientales.

pinzasMantenga en el airepor 5 segundos

Notatubo plástico de centrífuga de 50 mL
No. 06-01

Si la pajuela no es mantenida en el
baño de agua el tiempo suﬁciente (10minutos), la motilidad del esperma
criopreservado se verá reducido.

Criopreservación de esperma

Capítulo

3

Transferencia y pre-incubación de la muestra de esperma descongelado
1.

Tire el embolo de la jeringa del conector hacia atrás, y corte la pajuela entre las columnasdel mHTF y el extremo sellado.

[conector de pajuela][pajuela]selladoselladosuspensiónde esperma

2.

mHTF

Corte la pajuela.

Antes tire del embolo.

Inserte la pajuela cortada en el conector.

Inserte3.

Como la inserción de la pajuela en el conector crea presión dentro de la pajuela, gire lallave para liberar la presión.

Si se ha olvidado de tirar del embolo de la jeringa,
puede hacerlo ahora girando la llave hacia la izquierda.

4.

Vuelva la llave a su posición original (hacia arriba), y corte la pajuela en el extreme sellado y la suspensión de esperma.

Posición de la llave hacia arriba.

Corte la pajuela.

29

Capítulo

3
5.

Criopreservación de esperma
Empuje el embolo para transferir solo la suspensión de esperma a la gota de FERTIUP®
(PM) (placa de esperma), coloque la placa en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) por 30
minutos

Nota
No mueva las placas que contienen
el esperma criopreservado hasta
que se observe suﬁciente motilidad
en el medio.

FERTIUP® (PM)Si las placas son agitadas antes
de que el esperma comience amoverse, no se recobrara la toda la
motilidad.

suspensiónde esperma

mHTF【placa de esperma】[Transferencia de la suspensión de esperma descongelado] No. 06-02

Inseminación
1.

Usando una punta de pipeta de boca ancha (Cat. No. 3520; Thermo SCIENTIFIC), aspiredel borde de la gota 10 µL de la suspensión de esperma pre-incubada.

2.

Ponga 10 µL del esperma a cada gota de fertilización del MEDIO CARD® que tienen los
COCs.

3.

Incube los ovocitos y el esperma durante 3 horas en un incubador (37℃ , 5% CO₂ enaire).

【placa de esperma】

Comentario
Lo s e s p e r m atozo i d e s co n a l t amotilidad tienden a estar cerca delborde de la gota.

Comentario
E s p osible obtener 10 µL de lasuspensión de esperma hasta 3-4
veces por gota.

【placa de fertilización】

10

µL

COCs

10

90 µL of
FERTIUP® (PM)

µL

Nota
Incubarpor 3 horas[Aspirar la suspensión de esperma del borde de la gota]

90 µL de FERTIUP® (PM)

punta

punta
90 µL de FERTIUP® (PM)esperma movil

aceite mineralmasa de esperma sin-motilidad[Recolección del esperma pre-incubado e inseminación de los ovocitos]
No. 06-03

4.

Después de 3 horas de incubación, lave los ovocitos 3 veces en mHTF (80 µL) en una
placa de lavado, evitando transferir el MEDIO CARD®

30

Haga el trabajo con la pipeta
descripto en los pasos 1 y 2 lo más
cuidadosamente posible.

Criopreservación de esperma【placa de fertilización】

5.

Capítulo

3【placa de lavado】

Seis horas después de la inseminación, observe los ovocitos en la tercer gota de mHTF yelimine todo embrión partenogénico que tenga solo un pronúcleo. (Por favor, consulte
al capítulo de fertilización in vitro en la página 11)

6.

Después de incubar los ovocitos toda la noche, transﬁera a la cuarta gota de mHTF solo
los embriones en estadio de 2-celulas. Estos embriones pueden ser ahora vitriﬁcados otransferidos. (Por favor , consulte a los capítulos de vitriﬁcación simple de embriones deratón en la página 54 y Transferencia embrionaria en oviducto en página 66.)

【placa de lavado】

Referencias
1.

Nakagata N., and Takeshima T. 1992. High fertilizing ability of mouse spermatozoa diluted slowly after cryopreservation. Theriogenol . 37: 1283-1291.

2.

Nakagata N., Ueda S., Yamanouchi K., Okamoto K., Matsuda Y., Tsuchiya T., Nishimura M.,
Oda S., Koyasu K., Azuma S., and Toyoda Y. 1995. Cryopreservation of wild mouse spermatozoa. Theriogenol . 43: 635-643.

3.

Nakagata N. 1996. Use of cryopreservation techniques of embryos and spermatozoa for
production of transgenic (Tg) mice and for maintenance of Tg mouse lines. Lab. Anim.

Sci. 46: 236-238.
4.

Okamoto M., Nakagata N., Ueda O., Kamada N., and Suzuki H. 1998. Cryopreservation ofgene disrupted mouse spermatozoa. J. Mamm. Ova. Res. 15: 77-80.

5.

Takeo T., Hoshii T., Kondo Y., Toyodome H., Arima H., Yamamura KI., Irie T., and Nakagata
N. 2008. Methyl-beta-cyclodextrin improves fertilizing ability of C57BL/6 mouse sperm
after freezing and thawing by facilitating cholesterol eﬄux from the cells. Biol Reprod .
78(3): 546-551.

6.

Nakagawa Y., Fukumoto K., Kondo T., Koga M., Takeshita Y., Nakamuta Y., Sakaguchi M.,
Haruguchi Y., Tsuchiyama S., Kaneko T., and Nakagata N. 2009. Fertilization ability of
C57BL/6J mouse spermatozoa frozen in a dry shipper. Exp. Anim. 58(3) Suppl: 297.

7.

Takeo T., and Nakagata N. 2010. Combination medium of cryoprotective agents containing L-glutamine and methyl- β -cyclodextrin in a preincubation medium yields a highfertilization rate for cryopreserved C57BL/6J mouse sperm. Lab. Anim. 44(2): 132-137.

8.

Nakagata N. 2011. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.

Methods Mol Biol. 693: 57-73.
9.

Takeo T., Nakagata N. 2011. Reduced glutathione enhances fertility of frozen/thawed
C57BL/6 mouse sperm after exposure to methyl-beta-cyclodextrin. Biol Reprod.
85(5):1066-1072.

31

Capítulo

3

Criopreservación de esperma

3-3 Método de fertilización In Vitro para el rescate de un stock
legado de esperma criopreservado.
Materiales y equipo
1.

Stock legado de esperma cryopreservado

2.

Ratones hembra superovuladas com PMSG y hCG

3.

FERTIUP® (Preincubation medium: PM, Cat. No. KYD-002-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

4.

MEDIO CARD® (Cat. No. KYD-003-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)

5.

mHTF

6.

Aceite mineral

7.

Baño de agua a 37℃

8.

Flotador para el descongelado

9.

Tubo de1.5 mL (Quality Scientiﬁ c Plastics 1.5 mL Graduated Microcentrifuge Tube
with Flat Top Cap, Natural Cat. No. 509-GRD-Q)

10.

Centrífuga

11.

Micropipetas

12.

Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

13.

Incubador humidiﬁ cado (37℃, 5% CO2 en aire)

Procedimientos
Preparación del ﬂotador para el descongelado
1.

Haga un ﬂotador como el que se muestra a continuación usando poliestireno y un tubode centrífuga de 50 mL.

Insertartubo de centrífuga de 50 mL

poliestireno

Preparación para el descongelado
1.

2.

3.

Prepare el baño de agua a 37℃ .
Ponga agua (37℃ dentro del tubo de centrífuga de 50 mL del conjunto poliestireno/
tubo de centrífuga que ﬂ ota en el baño de agua.
Treinta minutos antes de descongelar la muestra de esperma, ponga una gota 100 µL/gota) de FERTIUP® (PM) en una placa de plástico y cúbrala con aceite mineral. Coloque laplaca en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire).

32

Criopreservación de esperma

Capítulo

3【placa de esperma】
aceite mineral

100 µLFERTIUP® (PM)4.

Diez minutos antes de recolectar los ovocitos ponga una gota (200 µL/gota) de MEDIOCARD® en una placa y cúbrala con aceite mineral. Coloque la placa en el incubador (37℃ ,5% CO₂ en aire).

Nota
Hay tres formas distintas de prepararel MEDIO C ARD®, dependiendo
en si la fertilización in vitro se harácon esperma fresco, congelado oenfriado.

【placa de ovocitos】
aceite mineral

Por favor consulte el manual de
instrucciones del MEDIO CARD®

200 µLMEDIO CARD®
5.

Ponga 4 gotas (80 µL / gota) de mHTF en una placa y cúbrala con aceite mineral. Coloque la placa en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) al menos por 30 minutos.

【placa de lavado】
aceite mineral

80 µL mHTF

Recolección y pre-incubación de ovocitos
1.

Sacriﬁque los ratones hembras 15 a 17 horas después de la inyección de hCG y obtenga
los oviductos. (Por favor consulte al capítulo de In vitro fertilización en la página 9)

2.

Usando agujas ﬁnas y ﬁlosas, libere entre 6 y 20 masas de complejos ovocitos-cúmulos(COCʼs) en una gota de MEDIO CARD® (200 µL) (placa de ovocitos) y pre-incúbelo por 60
minutos.

【placa de ovocitos】

Pre-incúbelo
por 60 minutosNota
A s e g ú r e s e d e r e a l i z a r to d o e lt r ab aj o, d e s d e e l s a cr i f i ci o d ela hembra para obtener sus
ov iduc tos has t a intro ducir l os
COCs en la gota de MEDIO CARD®,
en el menor tiempo posible(d e n t r o d e l o s 3 0 s e g u n d o s).
Es más, cuando este trabajo lo hagasolo, no sacriﬁque muchos ratones
a la vez, es preferible, sacriﬁcar un
ratón y rápidamente obtener sus
oviductos antes de continuar con el
próximo.

200 µL MEDIO CARD®

33

Capítulo

3

Criopreservación de esperma

Descongelación del esperma de ratón
1.

Extraiga una muestra de esperma del nitrógeno líquido. Si la muestra fue archivada en
un criotubo, abra el tapón y descarte el nitrógeno líquido que exista dentro del tubo.
Sumerja la muestra en un baño de agua mantenida a 37℃ (utilizando el poliestireno o elensamblado de poliestireno/tubo de centrífuga) por 10 minutos.
pajuelacriotubo

10 minutos

poliestireno

nitrógenolíquido2.

baño deagua a 37℃
tubo plástico de centrífuga de 50 mL

Transﬁera la suspensión de esperma del criotubo o pajuela a un tubo de 1.5 mL. Lentamente adicione al tubo 1.2 mL de mHTF equilibrado a 37℃ , centrifugue a 300 g atemperatura ambiente durante 5 minutos.

pajuela o criotubo

1.2 mLmHTF

Tubo de 1.5 mL
3.

suspensiónde esperma

Centrifugue 300 g
5 minutos

Luego de centrífugado, elimine la mayor cantidad posible del sobrenadante y agregue altubo 70 µL de FERTIUP® (PM) mantenido a 37℃ (el volumen ﬁnal será aprox. 100 µL).

70 µL
FERTIUP® (PM)pellet de esperma
4.

Luego de pipetear en forma suave, transﬁera todo el contenido del tubo a la gota de
FERTIUP® (PM) (placa de esperma). Coloque la placa en el incubador (37℃ , 5% CO₂ enaire) por 30 minutos.

34

Criopreservación de esperma

Capítulo3

Pre-incube
por 30 minutos【placa de esperma】

Inseminación
1.

Usando una punta de pipeta, aspire los COCs pre-incubados en la gota de MEDIO CARD®
(placa de ovocitos) con una cantidad mínima de medio. Luego, colóquelos dentro de lagota de suspensión de esperma (placa de esperma) e incúbelos en un incubador. (37℃,
5% CO2 en aire).
【placa de ovocitos】【placa de esperma】

Cs

2.

o

al

oj

c
Re

O
sC

e

er

Lib

s
lo

Cs

CO

Después de incubar por 3 horas, lave los ovocitos 3 veces en mHTF fresco (80 µL) en laplaca de lavado.
【placa de esperma】

3.

【placa de lavado】

Seis horas después de la inseminación, observe los ovocitos en la tercer gota de mHTF ydeseche todo ovocito partenogénico que tenga solo un pronúcleo. (Favor de remitirse alcapítulo de Fertilización in vitro en la página 11.)4.

Después de cultivar los ovocitos durante la noche, transﬁera los embriones en estadiode 2-celulas que se hayan obtenido a la cuarta gota de mHTF. Estos embriones puedenahora ser vitriﬁcados o transferidos. (Por favor, consulte el capítulo de vitriﬁcación simple
de embriones de ratón en la página 54 y de Transferencia embrionaria en oviducto en lapágina 66.)
【placa de lavado】

Referencias
1.

Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Haruguchi Y., Kondo T., Takeshita Y., Nakamuta Y.,
Umeno T., and Tsuchiyama S. 2014. Rescue in vitro fertilization method for legacy stockof frozen mouse sperm. J Reprod Dev. 60(2): 167-170.

35

Capítulo

Preparación de losovocitos y embriones

44-1 Preparación de ovocitos micro-diseccionados con laser

Algunas cepas de esperma congelado, como muchas de las líneas endogámicas, pueden
tener una baja fertilidad. Con el ﬁn de superar ese impedimento, hemos usado para la fertilización in vitro ovocitos que han sido micro diseccionados con laser.

Materiales y equipo
1.

Placas plásticas (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING )

2.

mHTF

3.

Aceite mineral

4.

Hialuronidasa en mHTF (Hyaluronidase, Cat. No. H-3506, Sigma)

5.

Sistema de laser saturn 3 (Research Instruments Ltd, Cornwall, UK)

6.

Incubador humidiﬁcado (37℃, 5% CO2 en aire)

Procedimientos
Preparación del esperma y las placas
1.

Para la FIV, el esperma debe ser preparado con los métodos descriptos en los capítulosde Fertilización in vitro en la página 8, Fertilización in vitro usando esperma epididimariotransportado a baja temperatura en la página 18 y Fertilización in vitro usando esperma
criopreservado en la página 28.

2.

Ponga una gota de 200 µL de mHTF en una placa. Cúbrala con aceite mineral y colóquela en un incubador (37℃, 5% CO2 en aire) al menos durante 30 minutos.

【placa de hialuronidasa】
Aceite mineral

200 µL mHTF
3.

Coloque 4 gotas (80 µL/gota) de mHTF en una placa. Cúbrala con aceite mineral y colóquela en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) al menos durante 30 minutos.

【placa de lavado】
aceite mineral

80 µL mHTF

36

Preparación de losovocitos y embriones

Capítulo

4

Preparación de los ovocitos denudados
1.

Obtenga de los ratones hembras superovuladas los complejos ovocitos-cúmulos (COCs)y póngalos en la gota de 200 µL de mHTF (placa de hialuronidasa). (Por favor, consulte alcapítulo de Fertilización in vitro en la página 6 y 9.)2.

Agregue 20 µL de 1% hialuronidasa a la gota de mHTF que contienen los COCs y mantenga la placa en incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) por 1 minuto.

e
gu

re

Ag

1%

µL

20

a

as

id

n
ro

u

al

hi

de

Incubar a 37℃
por 1 minuto
COCs

3.

ovocitos

Rápidamente recolecte y transﬁera los ovocitos a la gota de 80 µL de mHTF (placa delavado) y en turnos, lávelos pasándolos por las distintas gotas de la placa de lavado.

Comentario
Si algunas células del cúmulos
siguen adheridas a la zona pelúcida
de los ovocitos, pueden sereliminados con la manipulación
con el capilar de vidrio.

Disección de la zona pelúcida usando un laser1.

Coloque una gota de 100 µL de mHTF en una placa. Cúbrala con aceite mineral y colóquela en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) al menos por 30 minutos.

2.

Transﬁ era 50 ovocitos denudados a la gota de 100 µL mHTF.

3.

Coloque los ovocitos en línea en el fondo de la placa.

ovocitos

gota de mHTF

37

Capítulo

44.
5.

Preparación de losovocitos y embriones
Coloque la placa con los ovocitos bajo el sistema de laser Saturno 3.
Enfoque la zona pelúcida al punto adyacente al primer corpúsculo polar y diséquelo con
el rayo laser (vea la ﬂecha)

Nota
Para evitar dañar la membrana
plasmática de los ovocitos, apunte
el laser al área donde la zona
pelúcida este más distanciada de la
membrana plasmática.

Nota
El diámetro del oriﬁcio es de 10-12.5µm y la duración del pulso de 0.550.60 ms.

[Disección por laser de la zona pelúcida] No. 08-01

6.

Después de disecar la zona pelúcida de todos los ovocitos, transﬁéralos a la gota de
MEDIO CARD® de fertilización. Coloque la placa en el incubador de CO₂.
Por favor, consulte a los capítulos de Fertilización in vitro en la página 6, Fertilización invitro usando esperma del epidídimo transportado en frio en página 18 y Fertilización invitro usando esperma criopreservado en página 26.)

Referencias
1.

Kaneko T., Yanagi M., Nakashima T., and Nakagata N. 2006. The improvement in fertilityof cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility using laser-microdissected
oocytes. Reprod. Med. Biol. 5(4): 249-254.

2.

Anzai M., Nishiwaki M., Yanagi M., Nakashima T., Kaneko T., Taguchi Y., Tokoro M., ShinSW., Mitani T., Kato H., Matsumoto K., Nakagata N., and Iritani A. 2006. Application oflaser-assisted zona drilling to in vitro fertilization of cryopreserved mouse oocytes with
spermatozoa from a subfertile transgenic mouse. J Reprod Dev. 52(5): 601-606.

38

Preparación de losovocitos y embriones

Capítulo

4

4-2 Disección parcial de la zona pelúcida (DPZ)

Si usted no puede utilizar un instrumento de laser para micro-disección, también puede disecar la zona pelúcida de los ovocitos bajo un microscopio estereoscópico.

Materiales y equipo
1.

Ratón hembra superovulada con PMSG y hCG(Por favor, consulte al capítulo de Fertilización in vitro en la página 6.)

2.

mHTF

3.

mHTF con Hialuronidasa (Hyaluronidase, Cat. No. H-3506, Sigma)

4.

Sacarosa 0.3M (BSA-)

5.

Sacarosa 0.3M (BSA+)

6.

Aceite mineral

7.

Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

8.

Puntas de pipetas (volumen 10-100 µL)

9.

Micropipetas

Procedimientos
Preparación de la aguja para DPZ
1.

Una jeringa descartable de 1mL con una aguja 30 G deberá ser modiﬁcada para el uso en
DPZ tal como muestra en el diagrama de abajo.

Coja una jeringa de 1 mL con una aguja 30 G.

Quite y elimine el embolo.
Quite el capuchón de la aguja y úselo para doblar la aguja unos 30°.

unos 30°

Si usted es diestro, el
agujero en la aguja debe
mirar a usted tal comolos muestra el diagrama.
Terminado39

Capítulo

Preparación de losovocitos y embriones

4
DPZ
1.

Recolecte los ovocitos de los oviductos de hembras superovuladas 14-15 horas después

Comentario

de la inyección con hCG. Denude los ovocitos con hialuronidasa. (Consulte a los capítu-

Cuando se ponen los ovocitos en
una solución de sacarosa 0. 3M(BSA-), el ooplasma se contrae porlas fuerzas osmóticas y ocurre una
interacción electrostática entre lazona pelúcida de los ovocitos y lasuperﬁcie de la placa.

los de Fertilización in vitro en la página 9 y preparación de ovocitos micro-diseccionados
con laser en página 37.)
2.

Coloque los ovocitos denudados en la parte superior de la gota de 10 µL de sacarosa 0.3
M (BSA-) en una placa.

3.

Cuando los ovocitos se hundan al fondo de la placa, cubra la gota con aceite mineral.

aceite mineralsacarosa 0.3 M (BSA-)

4.

Como resultado. El espacio
p e r i v i te li n o s e e ns a n c ha y l o sovocitos se adosan al fondo de laplaca.

Bajo un microscopio binocular, diseccione parcialmente la zona pelúcida (DPZ) de losovocitos mediante un simple movimiento hacia abajo con una aguja 30 G.

aguja 30G
zona pelúcida

[DPZ] No. 09-01

5.
6.

Después de la DPZ, neutralice la atracción electrostática entre la zona pelúcida y la su-

Comentario

perﬁcie de la placa adicionando a la gota 20 µL de sacarosa 0.3 M (BSA+).

El rociado debe aplicarse desde ellado opuesto al corte para prevenir
que los ovocitos escapen fuera de lazona pelúcida.

Para despegar los ovocitos con DPZ de la superﬁcie del fondo de la placa, rocíe los ovocitos con una solución de sacarosa usando una micropipeta.

pipeteo7.

Lavar con cuidado los ovocitos con DZP 3 veces en MEDIO CARD® para remover el restode sacarosa.

40Preparación de losovocitos y embriones

Capítulo

4[Micrifotograﬁa: Ovocitos DZP]

Fertilización in vitro y transferencia embrionaria
1.

Coloque los ovocitos DZP en la gota de MEDIO CARD® que contiene los espermatozoides preparados previamente (inseminación).
(Por favor, consulte los capítulos de Fertilización in vitro en la página 6. Fertilización invitro usando esperma epididimario transportado en frio en la página 18 y Fertilización invitro usando esperma criopreservado en la página 26.)
2.

Lave los ovocitos fertilizados, con cuidado, dos veces en mHTF 3 horas después de lainseminación, luego póngalos en cultivo por 3 días hasta que se desarrollen al estadiode blastocisto temprano.
[Microfotograﬁa: Ovocitos fertilizados]ovocitos
fertilizados

ovocitos
fertilizados

ovocitos
fertilizados

ovocitos
fertilizados

3.

Transﬁera los blastocistos tempranos a los cuernos uterinos de una receptora con una

Comentario

pseudopreñez de 3 días (Día 1 es el día en que se observa el tapón vaginal).

Si los embriones en estadio de
2- celulas son transferidos en el
oviducto de una receptora en el día
1 de pseudopreñez, el porcentaje
de desarrollo a animales nacidos
será muy baja.

Por favor, consulte el capítulo de transferencia embrionaria en útero en la página 72.

Referencias
1.

Nakagata N., Okamoto M., Ueda O., and Suzuki H. 1997. The positive eﬀect of partial
zona-pellucida dissection on the in vitro fertilizing capacity of cryopreserved C57BL/6J
transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol. Reprod. 57: 1050-1055.

Esto se debe a que los blastómeros
qu e co nf o r man l os e m b r i o n e sescapan de la zona pelúcida por la
acción peristáltica del oviducto ensu paso a través del oviducto hacia
el útero.

41

Capítulo

Preparación de losovocitos y embriones

44-3 Recolección de embriones en estadio de 2-Celulas

Materiales y equipo
1.

Pinzas de relojero #5

2.

Tijeras de disección

3.

KSOM/AA

4.

Aceite mineral

5.

Placas plasticas (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

6.

Jeringas de 1 mL

7.

Aguja de lavado (aguja 30G de punta roma)

8.

Pipetas de transferencia

Procedimientos
Superovulación y selección de las hembras con tapón
1.

Inyecte las hembras (de 8-12 semanas de edad) i.p con 7.5 IU de PMSG (14:00-18:00).

2.

Inyecte las hembras i.p. con 7.5 IU de hCG 48-52 horas después de la inyección de PMSG.

3.

Veriﬁque los tapones vaginales a la mañana siguiente.
(Por favor, consulte el capítulo de Transferencia embrionaria en oviducto en la página
66.)

Preparación de las placas1.

Coloque 3 gotas (100 µL / gota) de KSOM/AA en una placa y cúbralas con aceite mineral.
Ponga la placa en un incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) por un mínimo de 30 minutes.

【placa de lavado】

aceite mineral

100 µL KSOM/AA

42

Preparación de losovocitos y embriones

Capítulo

4

Preparación de la aguja de lavado
1.

Llene una jeringa con medio KSOM/AA y conecte una aguja de lavado con la punta
roma.

2.

Pruebe la jeringa para asegurarse de que está libre de burbujas de aire, y que le KSOM/
AA ﬂuye fácilmente.

aguja delavadoKSOM/AA

jeringa de 1 mL

Obtención de embriones
1.

El día después en que se observe el tapón vaginal, obtenga el útero, oviducto y ovariosde las hembras y colóquelas sobre un papel de ﬁltro estéril.
(Por favor, consulte con el capítulo Fertilización in vitro en la página 9.)

2.

Pince en la unión útero-tubal y haga un corte en la región uterina.

pinzasoviducto

bursa ovárica

ovario

útero
corte

ligamento ovárico
unión útero-tubal
3.

Tire de la unión útero-tubarica para separar el infundíbulo del ovario, y corte la bursa
ovárica.

uniónútero-tubal

tire
corte

43

Capítulo

Preparación de losovocitos y embriones

44.

Después de lavar el oviducto en una gota de KSOM/AA, póngalo en otra gota de KSOM/AA.

oviducto

5.

KSOM/AA

KSOM/AA

Mire detenidamente al oviducto para ubicar el infundíbulo, que es un tubo de un diámetro mayor que el oviducto.

6.

Coloque el oviducto para que la aguja de lavado pueda insertarse fácilmente.

[Microfotografía: un oviducto antes de lavarlo]

Nota
Como usualmente el infundíbulo
se encuentra escondido entre lascircunvoluciones del oviducto, sedebe rotar suavemente con una
pinz a el oviduc to y buscar con
cuidado para encontrarlo.

infundíbulo

Comentario
Si us te d es dies tro, co l o qu e e loviduc to como lo muestra el
dia gr ama infe r i o r. E s más f á cil
insertar la aguja en el infundíbulo
con esta posición.

7.

Mantenga ﬁrme el infundíbulo en el fondo de la placa usando unas pinzas e inserte laaguja en su extremo.

44

Nota
El infundíbulo es extremadamente
frágil, de manera que use las pinzas
con cuidado.

Preparación de losovocitos y embriones
8.

Empuje el embolo y despacio lave el oviducto con KSOM/AA.

pinzas4

Nota
Cuando el lavado se hacecor re c t am ente, s e deb er ía ver
como el oviducto se inﬂa a medida
que se inyecta el medio.

oviducto
aguja de lavado

uniónútero-tubal

Capítulo

infundíbulo

No pinche a ciegas el oviducto si no
se puede encontrar el infundíbulo.
Haciendo eso puede destruir
el infundíbulo lo que impediráinsertar la aguja.

fondo de la placa[lavado]9.

No. 10-01

Utilizando una pipeta aspire los embriones y lávelos pasándolos por varias gotas de
KSOM/AA (placa de lavado).
[Microfotografía: oviducto luego del lavado]

Nota
Asegúrese de completar todos las
pasos, desde el sacrificio de lashembras hasta el lavado de sus
oviduc tos en el menor tiempo
posible (dentro de los 5 minutos).
Además, cuando esté trabajandosolo, no sacriﬁque muchos ratones
a la vez, es mejor sacrificar uno ylavar sus oviductos antes de pasar ala siguiente hembra.

Referencias
1.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0-87969-591-9.

45

Capítulo

Transporte deovocitos y embriones

5

5-1 Transporte en frio de embriones a 2-células

Materiales y equipo
1.

Embriones a 2-celulas (adaptable a embriones frescos y congelados)

2.

Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

3.

Punta de pipeta para cargar geles (Cat. No. 010-R204S; Bio Medical Instrument)

4.

M2 (Cat. No. M7167; Sigma)

5.

Tubos de 0.5 mL (Fisherbrand Flip Cap Microtubes 0.5 mL; Fisher Scientiﬁc Cat. No. FS-MCT060-C)

6.

Pipetas de transferencia

7.

KSOM/AA

8.

Aceite mineral

9.

Registrador de datos de temperatura (Thermochron iButton Cat. No. DS1921G; Maxim
Integrated Products)

10.

Kit para transporte en frio CARD (Cat. No. KYD-006-EX, Cosmo Bio Co., Ltd.)・Termo (Cat. No. JMK-501; Thermos K.K.)
・Caja de papel (in which a 0.5 mL tube can stand)・Algodón・Bloques de gel refrigerante (pequeño y grande)・Caja de transporte de poliestireno (Cat.No. KC-3, KARUX)

Procedimientos
Mantenimiento en frio de embriones a 2-celulas
1.

Ponga en una placa de plástico dos gotas de 100 µL de M2.

2.

Transﬁera los embriones a 2-celulas del medio de cultivo a la gota de M2.

aceite mineralembriones
3.

gota de 100 µL de M2

Cambie la pipeta capilar para la manipulación de embriones y aspire los embriones con
un capilar nuevo, asegurándose de evitar acarrear aceite mineral a la gota de M2. Transﬁera los embriones a la gota de M2 preparada en el paso 1.

aceite mineral existenteen la superﬁcie

46

Transporte deovocitos y embriones
4.

Capítulo

5

Llene un tubo de 0.5 mL con 0.6 mL de M2 a temperatura ambiente. Si hubiera una burbuja en fondo del tubo, golpee en la punta para que se desprenda.

tubo de 0.5 mL
0.6 mL de M2
aire
5.

Recoja y transﬁera los embriones al fondo del tubo (40 embriones/tubo).

capilarde vidrio

M2
6.

tubo
de 0.5 mL

Coloque en la caja de papel el tubo con los embriones, el registrador de datos de temperatura y el algodón.

registrador de datos de temperatura
tubo de 0.5 mL

caja de papel
7.

algodón

Coloque la caja de papel en el refrigerador (4-8℃ ).

tapa

Comentario
Lo s e m b r i o n e s ma nte n d r á n l acapacidad de desarrollo por un
máximo de 72 horas.

47

Capítulo

5

Transporte deovocitos y embriones

Embalaje y transporte de embriones a 2-celulas
Prepare una caja de papel con los embriones de 2-celulas de la misma forma que se describió
anteriormente (Mantenimiento en frio de embriones de 2-celulas)
Los bloques de gel frio (grandes) y la caja de transporte de poliestireno debe ser enfriada a
4-8℃ antes de su uso. Use los bloques pequeñas de gel y el termo a temperatura ambiente.
1.

Introduzca la caja de papel con los embriones dentro del termo.

termo

caja de papel

introduzca

2.

Introduzca dos bloques pequeños de gel frio dentro del termo.

termo

bloques de gel

introduzca

3.

Tape el termo.

bloques de gel
termo tapa

48

Transporte deovocitos y embriones
4.

Capítulo5

Coloque un bloque grande de gel en el fondo de la caja de transporte, luego coloque eltermo sobre ella.

5.

Ponga un bloque grande de gel a cada lado del termo, después coloque uno más (grande)
encima del termo y tape la caja.

6.

Selle la tapa de la caja de transporte usando cinta de embalaje.

bloques de gel

termo

Nota
Tenga cuidado de no colocar la caja
de papel boca abajo.

bloques de gel

bloques de gel

Nota
Solo es posible colocar el termo enel centro de la caja de transporte
y no en fondo de la misma, dado
que el largo del termo es el mismo
que el largo interior de la caja detransporte.
Esto es para proteger el termo
durante el transporte.

Sellar con cinta de embalaje
7.

Mantenga la caja de transporte en el refrigerador hasta que el transportista llegue abuscarlo.

8.

Envíe las muestras por correo regular.

49

Capítulo

5

Transporte deovocitos y embriones

Recuperación de los embriones de 2-celulas de la caja de transporte
1.

Ponga 3 gotas de (100 µL / gota) de KSOM/AA en una placa y cúbrala con aceite mineral.
Coloque la placa en un incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) por un mínimo de 30 minutos.

【placa de lavado】

Nota
Las muestras deben transferirsea b aja te mp e r at ur a . Po r f avo r,
consulte con el servicio de trasporte
sobre las condiciones durante eltransporte.

Comentario

aceite mineral

Los embr ion es manten dr án su
capacidad de desarrollo por un
máximo de 72 horas.

100 µL KSOM/AA
2.

Retire del termo la caja de papel con los embriones.

3.

Deje la caja de papel a temperatura ambiente por 30 minutos.
[Retirando la muestra] No. 11-01

4.

Abra la caja de papel y con cuidado retire el algodón. Una vez quitado, saque y abra eltubo con los embriones.

5.

Recoja 200 µL del M2 de la capa superior del tubo usando una punta de pipeta para
cargar geles y transﬁera la alícuota al borde de una placa.

Comentario
Los embriones se hundirán al fondodel tubo durante esos 30 minutos.

tubo de 0.5 mL
M2embriones50

Transporte deovocitos y embriones
6.

Con cuidado recupere desde el fondo del tubo todo el medio M2 que contiene los embriones usando una punta para cargar geles, y transﬁera la alícuota al centro de la placa.

7.

Capítulo5

NotaPara una manipulación fácil, tenga
cuidado de evitar las burbujas en la
punta de pipeta.

Saque los embriones del M2, transﬁera y lávelos en cada una de las 3 gotas de 100 µL de
KSOM/AA (placa de lavado).

Nota
Si no puede recuperar todos losembriones, enjuague el interior deltubo usando 200 µL de M2 en elborde de la placa.

8.

Transﬁera los embriones a los oviductos de un ratón hembra pseudopreñada.

Referencias
1.

Takeo T., Kaneko T., Haruguchi Y., Fukumoto K., Machida H., Koga M., Nakagawa Y., Takeshita Y., Matsuguma T., Tsuchiyama S., Shimizu N., Hasegawa T., Goto M., Miyachi H., Anzai

Comentario
Idealmente, la trasferencia
embrionaria en hembras
pseudopreñadas debería llevarse acabo inmediatamente después dela llegada de los embriones.
(Por favor, consulte al capítulo
de Transferencia embrionaria en
oviducto en la página 66.)

M., Nakatsukasa E., Nomaru K., and Nakagata N. 2009. Birth of mice from vitriﬁed/warmed 2-cell embryos transported at a cold temperature. Cryobiology . 58(2): 196-202.
2.

Takeo T., Kondo T., Haruguchi Y., Fukumoto K., Nakagawa Y., Takeshita Y., Nakamuta
Y., Tsuchiyama S., Shimizu N., Hasegawa T., Goto M., Miyachi H., Anzai M., Fujikawa R.,
Nomaru K., Kaneko T., Itagaki Y., and Nakagata N. 2010. Short-term storage and transport
at cold temperatures of 2-cell mouse embryos produced by cryopreserved sperm. J Am

Assoc Lab Anim Sci. 49(4): 415-419.

51

Capítulo

Transporte deovocitos y embriones

5

5-2 Transporte en frio de oviductos de ratón con embriones a2-células
Materiales y equipo
1.

Sacarosa 0.8 M

2.

PB1

3.

KSOM/AA

4.

Bolsa plástica

5.

Termo

6.

Hielo picado

7.

Criotubos con fondo conico (Cat. No. 366656; NUNC)

8.

Placa de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

Procedimientos
Disección de los oviductos de una hembra superovulada y con tapón
1.

Inyecte las hembras i.p. (8-12 semanas de edad) con 7.5 UI de PMSG (14:00-18:00).

2.

Inyecte las hembras i.p. con 7.5 UI de hCG 48-52 horas después de administrarles lainyección de PMSG, y aparee machos y hembras durante la noche.

3.

Temprano a la mañana y hasta el mediodía del día siguiente revise las hembras si tienen
tapón vaginal. (Por favor, consulte al capítulo de Transferencia embrionaria en oviductoen la página 66.)

4.

En 44-46 horas después de la administración de hCG, sacriﬁque la hembras con tapón.

5.

Extraiga los oviductos de las hembras y colóquelos en una gota de 100-200 µL de sacarosa 0.8 M (0℃ ). (Por favor, consulte al capítulo de Fertilización in vitro en la página 9.)

Transporte de los oviductos de ratón
1.

Transﬁera los oviductos en un criotubo que contenga 1mL de sacarosa 0.8M (0℃ ).

2.

Ponga el tubo en una bolsa plástica y séllela usando sellador por calor.

3.

Coloque la bolsa plástica en un termo que contenga hielo picado y envíelo usando unservicio de puerta a puerta.

hielo picado

sacarosa 0.8M en
PB1 (0℃, 1 mL)
oviductos

52

termo

bolsa plásticaTransporte deovocitos y embriones

Capítulo

5

Obtención de embriones
Nota

1.

Retire el tubo del termo.

2.

Retire los oviductos del tubo y manténgalos en PB1 (0℃ ) por 30-60 minutos.

3.

Lave los oviductos con PB1 (0℃ ). (Por favor, consulte al capítulo de Obtención de embriones en estadio de 2-celulas en la página 42.)

4.

Nota

Lave los embriones 3 veces en gotas de KSOM/AA (37℃ ).

0℃

extraiga

oviductos

Los oviductos no deben
permanecer en el tubo más de48 horas o los embriones sedegeneraran. Los embriones deben
ser congelados si no se utilizaran
inmediatamente.

30 - 60 minutos
lavadosacarosa 0.8M en PB1

Los embriones se degeneraranrápidamente si elimina el paso 2.

(Por favor, consulte al capítulo devitrificación simple de embriones
de ratón en la página 54.)

PB1

Referencias
1.

Kamimura E., Nakashima T., Ogawa M., Ohwada K., and Nakagata N. 2003. Study of lowtemperature (4℃) transport of mouse two-cell embryos enclosed in oviducts. Comp.

Med. 53: 393-396.
2.

Ogawa M., Fuchiwaki M., Valdez Jr. Delgado M., Yanagita T., Ide Y., Fukumoto K., Machida H., Kawabe T., Kaneko T., Kasai M., and Nakagata N. 2005. Development after freezethawing of mouse embryos collected from oviducts transported at 0℃. Exp.Anim. 54(3)Suppl: 242.

53

Capítulo

6

Criopreservación deovocitos y embriones

6-1 Vitriﬁcación simple de embriones de ratón

Materiales y equipo
1.

1 M DMSO

2.

DAP213

3.

Placa de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

4.

Filtro (Millex-GV 0.22 µm Cat. No. SLGV013SL; MILLIPORE)

5.

Punta de pipeta para cargar geles (MBP Gel 200, Cat. No. 3621; Molecular BioProducts)

6.

Pipetas de transferencia

7.

Criotubos (Se recomienda el Cryogenic Vials Cat. No. MS-4501W; Sumitomo Bakelite,
Japan. Si no puede obtenerlo, use Cat. No. 366656; NUNC.)

8.

Micropipeta

9.

Caña de viales o tubos

10.

Nalgene Labtop Cooler (Cat. No. 5115-0012; NALGENE, USA)

11.

Nitrógeno líquido

12.

Microscopio

13.

Sacarosa 0.25 M

14.

KSOM/AA

15.

Aceite mineral

Procedimientos
Preparación del bloque refrigerante y de los criotubos1.

Un día previo a su uso coloque el bloque refrigerante (Cat. No. 5115-0012; NALGENE,
USA) en un congelador a -20.

2.

Unos 10 minutos antes de comenzar la vitriﬁcación saque el bloque refrigerante delcongelador.

3.

Ponga algunos criotubos en el bloque refrigerante. Unos 40 embriones por criotubo
es fácil de manipular, en otras palabras, cuando se quiera vitriﬁcar 120 embriones, sedebería colocar tres tubos en el bloque refrigerante.

4.

Justo antes de comenzar el procedimiento, veriﬁque que la temperatura dentro de lostubos esta a 0℃ .

Comentario

Vitriﬁcación1.

Filtre el DMSO 1M y ponga 4 gotas (~100 µL/gota) en una placa. Una gota es para lavar
los embriones sacados del medio de recolección, mientras que las otras es para contenerlos embriones lavados.

1 M DMSO 100 µL

54

Se puede usar hielo picado en lugar
del bloque refrigerante.

Criopreservación deovocitos y embriones
2.

Capítulo

6

Coloque un grupo de embriones en una de las 4 gotas para enjuagarlos del medio derecolección. Distribuya los embriones ya enjuagados en partes iguales entre las otras
gotas. Estas alícuotas eventualmente serán transferidas al criotubo. Por ejemplo, si uno
tuviera que recolectar 120 embriones y vitriﬁcarlos en alícuotas de 40 embriones, losembriones serian colocados primero en la gota de enjuague y luego se dividen equitativamente entre las 3 otras gotas.

embriones
3.

Usando un pipeta de 20 µL y una punta para cargar geles, transﬁera los embriones contenidos en 5 µL de la solución de DMSO 1M a un criotubo. Una vez transferidos, coloqueel criotubo en el bloque refrigerante a 0℃ y espere 5 minutos.

Nota
Es posible mantener los criotubose n e l b l o q u e r e f r i g e r a nte p o r
más tiempo que 5 minutos (<20minutos).

Nota

Espere5 minutos

Si los embriones son agrupados
en el centro de la gota, es más fácil
aspirarlos todos juntos en 5 µL de lasolución de DMSO 1M.

Nota
criotubos

4.

0℃ bloque refrigerante

Agregue 45 µL de la solución crioprotectora (DAP213) a 0℃ al criotubo y equilíbrelo por
5 minutos en el bloque refrigerante a 0℃ .

DAP213

No ajusten con fuerza la tapas delos tubos después de agregarle el
DAP213, sino, será muy dificultoso
quitarla rápidamente cuando lasmuestras sean extraídas del tanquede nitrógeno.

criotubos

Equilibre por
5 minutosµL
45
0℃ bloque refrigerante

55

Chapter

Criopreservación deovocitos y embriones

6
5.

Rápidamente ponga los criotubos en una caña de aluminio y sumerja directamente lasmuestras en el nitrógeno líquido.

criotubos
DAP213caña

nitrógenolíquido[Vitriﬁcando embriones] No. 13-01

Preparación para el descongelado
1.

Ponga 3 gotas (100 µL/gota) de KSOM/AA en una placa y cúbralo con aceite mineral.
Coloque la placa en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) por al menos 30 minutos.

【placa de lavado】

KSOM/AA 100 µL
2.

Caliente una solución de sacarosa 0.25M en un incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) antes
de su uso.

Recuperación de embriones vitriﬁcados
1.

Saque del nitrógeno líquido la muestra elegida y abra la tapa del criotubo. Descarte todo
resto de nitrógeno líquido que haya en el tubo y déjelo a temperatura ambiente por 30
segundos.

2.

Agregue al criotubo 0.9 mL de sacarosa 0.25M (precalentado a 37℃ ) y descongele lamuestra rápidamente pipeteando las soluciones. Cuando pipetee tenga cuidado de no
generar mucha cantidad de burbujas y de no dañar físicamente los embriones pipeteando muy rápido. Una vez descongelado, transﬁera el contenido del criotubo a una placa
de cultivo.

56

Criopreservación deovocitos y embriones

Capítulo

6

pulsadorprimera vez
luego de la
segunda vez

micropipeta

puntasacarosa
0.25M
embriones
vitriﬁcados
La punta de pipeta no deberá tocar el
fondo del criotubo. Si lo hiciera, lasacarosa 0.25M que se encuentra en la
punta se congelara y no podrá descargar la solución en el tubo.

3.

En la primer pulsada será expulsado el volumen
total de 0.9 mL de sacarosa 0.25M. En las
pulsadas subsiguientes, se limita la presión acerca de un decimo del volúmen de sacarosa
0.25M que se ha aspirado serán expulsados. De
esta forma pipeteando volúmenes pequeños
se previene la formación de burbujas en lasolución de sacarosa.

Coloque unos 0.4-0.5 mL de sacarosa 0.25M mas en el criotubo y transﬁera el contenido
a una placa. Esto diluye aun más el crioprotector y asegura que todos los embriones
hayan sido transferidos.
[Recuperación de embriones vitriﬁcados]

No. 13-02

Nota
Es muy impor tante descongelar
rápidamente la muestra paraevitar dañar los embriones
con la toxicidad de la solución
crioprotectora (DAP213).

[Pipeteando para recuperar los embriones vitriﬁcados] No. 13-03

4.

Aspire los embriones del medio y cuidadosamente transﬁéralos a una gota de KSOM/AA(placa de lavado), después manténgalos en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire).

KSOM/AA 100 µL

57

Chapter

Criopreservación deovocitos y embriones

6[Microfotografía: Embriones recuperados después de la vitriﬁcación]

embriones
normalesembriones
degenerados

5.

Después de 10 minutos, lave los embriones pasándolos consecutivamente por 2 gotas
de KSOM/AA (placa de lavado).

Referencias
1.

Nakagata N. 1989. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitriﬁcation.

J. Reprod. Fert. 87: 479-483.
2.

Nakagata N. 1993. Production of normal young following transfer of mouse embryos
obtained by in vitro fertilization between cryopreserved gametes. J. Reprod. Fert. 99: 7780.

3.

Nakagata N. 1995. Studies on cryopreservation of embryos and gametes in mice. Exp.

Anim. 44: 1-8.
4.

Nakao K., Nakagata N., and Katsuki M. 1997. Simple and eﬀcient procedure for cryopreservation of mouse embryos by simple vitriﬁcation. Exp. Anim. 46: 231-234.

58

Criopreservación deovocitos y embriones

Capítulo

6

6-2 Vitriﬁcación simple de ovocitos de ratón

Materiales y equipo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

10.
11.
12.

Ratones hembra superovuladas con PMSG y hCG
Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)
Aceite mineral
Micropipeta
Puntas de pipeta
mHTF
Hialuronidasa 1% en mHTF
Suero fetal bovino (FBS Cat. No. 26140-087; Gibco)
Filtro (Millex-GV 0.22 µm Cat. No. SLGV013SL; MILLIPORE)
Capilares de vidrio para la manipulación de embriones
Incubador humidiﬁcado (37℃ , 5% CO₂ en aire)
Materiales y equipo usado para la vitriﬁcación y descongelamiento de los embriones (Parael lavado de ovocitos descongelados se utilizan gotas de mHTF) (Por favor, consulte alcapítulo de vitriﬁcación simple de embriones de ratón en la página 54.)

Procedimientos
Preparación de las placas1.

Coloque un agota de 200 µL de mHTF en una placa. Cúbrala con aceite mineral y colóquela en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) al menos durante 30 minutos.

【placa de ovocitos】

aceite mineral

200 µL mHTF
2.

Ponga 4 gotas (80 µL/gota) de mHTF en una placa. Cúbralo con aceite mineral y coloquela placa en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) al menos durante 30 minutos.

【placa de lavado】

aceite mineral

80 µL mHTF

59

Chapter

6
3.

Criopreservación deovocitos y embriones
Prepare mHTF con 20% de SFB, esterilícelo por ﬁltración. Ponga 2 gotas (100 µL/gota) delmedio en una placa. Cúbralo con aceite mineral y colóquelo en un incubador (37℃ , 5%CO₂ en aire) al menos durante 30 minutos.

【placa de SFB】

aceite mineral

100 µL mHTF con 20% SFB

Preparación de los ovocitos denudados
1.

Obtenga de un ratón hembra superovulada los complejos ovocitos-cúmulos (COCs) ycolóquelos en una gota de 200 µL de mHTF (Placa de ovocitos). (Por favor, consulte alcapítulo de Fertilización in vitro en la página 9.)2.

Añada a la gota de mHTF que contiene los COCs 20 µL de hialuronidasa al 1% y mantenga la placa en el incubador (37℃ , 5% CO₂ en aire) por 1 minuto.

【placa de ovocitos】

Nota
Asegúrese de llevar a cabo todas lasoperaciones, desde el sacriﬁcio de la
hembra para obtener sus oviductos
hasta introducir los COCs en la gota
de mHTF (placa de ovocitos) en elmenor tiempo posible (dentro de
30 segundos).

hiAd
al icio
ur n
on e
id 20
as µ
a Ld
al e
1%

Más aun, cuando trabaje solo, nosacrif ique muchos ratones a lavez; es preferible sacrificar uno yrápidamente obtener los oviductos
antes de continuar con el ratón
siguiente.

Incubar a 37℃
por 1 minuto
COCs

3.

Rápidamente recolecte y transﬁera los ovocitos a un gota de 80 µL de mHTF ( Placa deComentario

lavado), lávelos pasándolos por las gotas en la placa de lavado.

Si algunas células del cúmulos
siguen adheridas a la zona pelúcida
de los ovocitos, pueden sereliminados con la manipulación conel capilar de vidrio.

【placa de ovocitos】

60

ovocitos【placa de lavado】

Criopreservación deovocitos y embriones

Capítulo

6

Cultivo de ovocitos en una gota con SFB
1.

Transﬁera los ovocitos a la primer gota de la placa SFB para enjuagarlos. Después, trans-

Comentarioﬁéralos a la segunda gota para incubarlos (37℃ , 5% CO₂ en aire) por 10 minutos.

El SFB ayuda a prevenir elendurecimiento de la zona pelúcida
del ovocito durante la vitriﬁcación ydescongelación.

【placa de lavado】【placa de SFB】

Incubar por
10 minutos
100 µL mHTF con 20% SFB

Vitriﬁcación simple de ovocitos de ratón
1.

Los ovocitos puedes ser vitriﬁcados usando el método de vitriﬁcación para embriones.
Se han de remover las células del cúmulo y cultivarlos en una gota que contenga SFB.
Más aun, el método de descongelamiento es el mismo que para los embriones. Por
favor, consulte el capítulo de Vitriﬁcación simple de embriones de ratón en la página 54.

Fertilización in vitro usando ovocitos vitriﬁcados-descongelados.
1.

Los ovocitos vitriﬁcados y descongelados pueden usarse para fertilización in vitro usando esperma fresco, transportados en frio o congelado y descongelado. Consulte a loscapítulos de Fertilización in vitro en la página 6, Fertilización in vitro usando esperma
epididimaria trasportado en frio en la página 18 y Fertilización in vitro usando esperma
criopreservado en la página 26.

References1.

Nota
Hay tres métodos diferentes
d e p r e p a r a r e l M E D I O C A R D ®,dependiendo en si la fertilización
in vitro será llevada a cabo usando
esperma fresco, congelado ydescongelado o transportado en
frio. Por favor, consulte el manual de
instrucciones del MEDIO CARD®.

Nakagata N., Takeo T., Fukumoto K., Kondo T., Haruguchi Y., Takeshita Y., Nakamuta Y.,
Matsunaga H., Tsuchiyama S., Ishizuka Y., Araki K. 2013. Applications of cryopreserved
unfertilized mouse oocytes for in vitro fertilization. Cryobiology. 67(2):188-92.

61

Capítulo

Criopreservación deovocitos y embriones

6

6-3 Vitriﬁcación y trasplante de ovarios de ratón

Materiales y equipo
1.

Placas de cultivo 35-mm estériles

2.

mWM

3.

Donante: Ratón hembra (1 día a 30 semanas de edad)

4.

Receptora: Ratón hembra de cuatro semanas (una cepa que sea histocompatible con elovario trasplantado)

5.

Anestesia

6.

Tijeras de micro-disección con muelle (5 mm de hoja)

7.

Pinzas de relojero #5

8.

Grapa de sutura (Autoclip 9 mm; Clay Adams Cat. No. 427631) y aplicador (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams Cat. No. 427630)

9.

Placa térmica (37℃ )Procedimientos
Obtención de los ovarios
1.

Sacriﬁque la hembra donante y extraiga sus ovarios. (Por favor, consulte al capítulo deFertilización in vitro en la página 9.)2.

Coloque los ovarios en una placa que contenga un volumen adecuado de mWM.

Vitriﬁcación
1.

Los ovarios se pueden criopreservar con el mismo método usado para embriones.
(Consulte al capítulo de Vitriﬁcación simple de embriones de ratón en la página 54.)

Transplante
1.

Anestesie la hembra receptora.

Comentario

2.

Extraiga el ovario, oviducto y parte del cuerno uterino como en el procedimiento con-

Usando las tijeras de micro disección con la hoja curva es más
fácil colocar el ovario donante sobre
el ovario residual de la receptora.

vencional. (Por favor, consulte al capítulo de transferencia embrionaria en oviducto en lapágina 67.)
3.

Usando unas tijeras de micro-disección con muelle, corte aproximadamente 1/4 de labursa ovárica de la receptora y algo de la grasa que la rodea. Levante el colgajo de grasa
para poder ver el ovario.

4.

62Corte 1/2-2/3 del ovario usando las tijeras de micro-disección con muelle de hoja curva.

Criopreservación deovocitos y embriones
tijeras de micro-disección
con muelle

Capítulo

6

tijeras de micro-disección
con muellepinzascumulo graso

oviducto
Corte aquíuteroovariocumulograso

bursa ovárica

bursa ovárica

ovario de la receptora

5.

Implante el ovario de la donante en el ovario residual de la receptora y cúbralo con labursa ovárica.

ovario de la donanteovario de la receptora

bursa ovárica

[Trasplante de ovario de ratón] No. 15-01

6.

Empuje el ovario, oviducto y parte del cuerno uterino dentro del abdomen y cierre la
incisión usando grapas de sutura.

7.
8.

Repita el mismo proceso descrito anteriormente con el otro ovario de la receptora.
Mantenga el ratón sobre una placa térmica a 37℃ hasta que se recupere de los efectosde la anestesia.

Referencias
1.

Migishima F., Suzuki-Migishima R., Song S.Y., Kuramochi T., Azuma S., Nishijima M., andYokoyama M. 2003. Successful cryopreservation of mouse ovaries by vitriﬁcation. Biol.

Reprod. 68: 881-887.
2.

Tsuchiyama S., and Nakagata N. 2009. Cryopreservation of ovaries from elderly female
mice. Exp. Anim. 58(3) Suppl: 248.

63

Capítulo

7

Otras técnicas

7-1 Vasectomía para la obtención de machos estériles

Materiales y equipo
1.

Ratón macho (5 semanas de edad)

2.

Anestésico

3.

Tijeras ﬁnas

4.

Pinzas de relojero #5

5.

Grapa de sutura (Autoclip 9 mm; Clay Adams Cat. No. 427631) y aplicador (Mik-Ron Autoclip Applier; Clay Adams Cat. No. 427630)

6.

Placa térmica (37℃)

Procedimientos
Vasectomía
1.

Anestesie un ratón macho.

2.

De acuerdo con el procedimiento convencional haga una incisión en la línea media.
La incisión deberá comenzar a nivel del punto superior de la pata trasera y extenderseaproximadamente 1cm de este punto hacia la cabeza del ratón. Luego de hacer la incisión, saque los testículos, el epidídimo y parte del vaso deferente de la cavidad abdominal.

cumulo graso
cabeza del epidídimo

testículocola del epidídimo

64

Otras técnicas
3.

Capítulo

7

Con las pinzas levante el vaso deferente e introduzca otras pinzas por debajo para separar el vaso deferente de los otros tejidos.
cabeza del epidídimo

cuerpo delepidídimo

testículo
cumulograso

cumulograso

testículo

cuerpo delepidídimocola delepidídimo

Introduzca la pinza aquí4.

cabeza del epidídimo

vaso
deferentecola del epidídimo

vaso deferente

Sujete el vaso deferente con unas pinzas y cauterice el vaso en dos puntos usando unas
pinzas calientes como se muestra en el diagrama de abajo.

5.

Corte la porción del vaso deferente que ha quedado entre las dos cauterizaciones.
pinzaspinzascalientes
testículo

vaso deferente
vaso deferente
pinzas calientes
tijeraspinzaspinzaspinzas calientes

6.

Empuje el testículo, epidídimo y parte del vaso deferente dentro de la cavidad abdominal, después cierre la incisión usando grapas de sutura.

7.

Repita los pasos 2-6 con el otro testículo.

Referencias
1.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0-87969-591-9.

Comentario
Después de completar la
cirugía, estabule cada ratón
individualmente. Si el ratón esestabulado en grupo, es myposible que peleen y puede que
algunos se maten. Los machos
vasectomizados estarán listos para
ser empleados no antes de las 8
semanas de vida.

65

Capítulo

7

Otras técnicas

7-2 Transferencia embrionaria en oviducto

En nuestro laboratorio transferimos los embriones de 2-celulas a través de la pared deloviducto de las receptoras pseudo-preñadas. Este procedimiento es más fácil y simple derealizar que el procedimiento de trasferencia embrionaria convencional, y es por lo tanto
conveniente para técnicos sin experiencia.

Materiales y equipo[aspecto de la vagina en proestro][tapón vaginal]

Aparee con un
macho
vasectomizado

tapón
vaginal1.

Ratón hembra en día 1 de pseudo-preñez (el día en que se observa el tapón vaginal)

2.

Anestésico

3.

Tijeras de micro-disección con muelle (hoja de 5 mm)

4.

Pinzas de relojero #5

5.

Pinza Bulldog (serraﬁne)

6.

Grapa de sutura (Autoclip 9mm; Clay Adams Cat. No. 427631) y aplicador de grapas (MikRon Autoclip Applier; Clay Adams Cat. No. 427630)

66

7.

Placas de plástico (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

8.

Capilares de vidrio para manipulación y transferencia embrionaria

9.

Placa térmica (37℃)

Otras técnicas

Capítulo

7

Procedimientos
Preparación del ratón
1.

Anestesie un ratón hembra.

2.

Extraiga el ovario, oviducto y parte del cuerno uterino.

cumulo graso
bursa ovárica

infundíbulo

ovarioámpulaútero

3.

oviducto

Coloque la pinza bulldog en el cumulo graso adosado a la bursa ovárica.

pinza serraﬁna
cumulo graso

ovariooviducto
útero67

Capítulo

7

Otras técnicas

Colocando el oviducto
Como se indica en el diagrama siguiente, la trasferencia embrionaria en oviducto se lleva
a cabo cortando el oviducto, insertando el capilar dentro y liberando los embriones en
dirección a la ámpula.
[Diagrama esquemático]

aire

ampulapinzascorte
embriones

infundíbulo
bursa ovárica

ovarioDesafortunadamente los oviductos del ratón son pequeños y los conductos están plegados
de una manera complicada, como se muestra en el diagrama del oviducto exteriorizado
esquematizado abajo (A). Esto hace muy difícil introducir el capilar en el oviducto en
dirección a la ámpula por que la inserción se hace por arriba.
Para hacer este procedimiento más simple, posicione el oviducto cambiando la posición dela pinza serraﬁna y del ratón antes de comenzar la operación (B).

Ael capilar con losembriones y el aireB

infundíbulo

Nota

ovario
corte

corte

ovarioámpulainfundíbulo
1.

al úteroal úteroámpulaObserve el oviducto bajo una lupa estereoscópica y conﬁrme la posición del infundíbulo
y la ámpula usando la punta de unas pinzas, o cambiando la posición de la pinza serraﬁna.

2.

68

Posicione el oviducto cambiando la posición de la pinza serraﬁna y del ratón.

Como los pliegues del oviducto
varían entre ratón y ratón, miredetenidamente y ajuste la posicióndel oviducto para hacer el trabajo
más fácil.

Comentario
Si usted es zurdo, posicione eloviducto de manera que le sea más
fácil realizar el procedimiento con
su mano izquierda.

Otras técnicas

Capítulo

7

Preparación de los embriones y de los capilares de vidrio
1.

Prepare una placa con una gota de 200 µL de KSOM/AA (sin aceite mineral) y ponga 20
embriones en la gota.

capilar de vidrio para la
manipulación embrionaria
aceite mineralgota de 200 µL
de KSOM/AA
2.

embriones

Para preparar el capilar de vidrio para una transferencia embrionaria aspire aire y medio
en intervalos alternados de 2-3 mm cada uno. Coloque diez embriones en el capilar.

capilar de vidrio paratransferencia embrionaria.
aceite mineralen la superﬁcie

aceite mineralen la superﬁcie

aire

Comentario
Cuando el capilar de vidrio es
introducido en la gota, algo dela aceite mineral quedara en lasuperficie de la gota tal como se
muestra debajo. Los embriones
deberán juntarse con la pipeta enel lado opuesto a la mancha enla gota para así evitar aspirar laaceite mineral. Hay evidencias quesugieren que la aceite mineral quepase al oviducto puede provocar
efectos adversos en el desarrollo
de los embriones a llegar atérmino.

embriones

69

Capítulo

7

Otras técnicas

Transferencia embrionaria
1.

Con un par de pinzas de relojero #5 y tijeras de micro-diseccion con muelle diseque lapared del oviducto entre el infundíbulo y la ámpula.

ovarioinfundíbulo

micro tijeras
con muelleal úteroámpula2.

Inserte por el corte la punta del capilar que contiene los embriones, luego empuje elcapilar dentro del corte hacia la ámpula.

cortecapilar con losembriones y aire3.

Use las pinzas para sostener la parte del oviducto donde se ha insertado el capilar.

Comentario

4.

Libere los embriones y 2-3 gotas de aire dentro de la ámpula.

Si se ha realizado correctamente,
usted podrá observar las burbujas
de aire a través de la pared de laámpula.

pinzasNota
Si usted no puede soltar losembriones y las burbujas de aire enel oviducto, retire un poco el capilar
y trate nuevamente.

70Otras técnicas
5.

Con cuidado retire el capilar del corte.

Capítulo

7

Nota
Transf iera los embriones luego
de ajustar la posición y direccióndel oviducto. Si el oviducto estáalineado en paralelo al capilar,
entonces será más fácil insertarlo
dentro del oviducto.

corte

aire

ámpulaembriones[Transferencia de embriones en oviducto] No. 17-01

6.

Empuje el ovario, oviducto y el cuerno uterino hacia dentro del abdomen y cierre la herida usando grapas de sutura.

7.

Repita el proceso para transferir los 10 embriones restantes en el otro oviducto tal comofue descrito anteriormente.

8.

Mantenga el ratón sobre una placa térmica a 37℃ hasta que se recupere de los efectosde la anestesia.

Referencias
1.

Nakagata N. 1992. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Exp.

Anim. 41: 387-388.
2.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press . ISBN
0-87969-591-9.

71

7

Capítulo

Otras técnicas

7-3 Transferencia embrionaria en útero

Materiales y equipo
1.

Ratón hembra en el 3er día de pseudopreñez (Día 1 es el día en que observo el tapón
vaginal)2.

Anestésico

3.

Tijeras ﬁnas

4.

Pinzas de relojero #5

5.

Pinza serraﬁna

6.

Aguja 27G

7.

Grapa de sutura (Autoclip 9mm; Clay Adams Cat. No. 427631) y aplicador de grapas (MikRon Autoclip Applier; Clay Adams Cat. No. 427630)

8.

Placas plásticas (35 mm X 10 mm Cat. No. 430588; CORNING)

9.

Capilares de vidrio para transferencia embrionaria

10. Placa térmica (37℃)

Procedimientos
Transferencia embrionaria
Prepare la receptora, los embriones (en estadio de 8-celulas a blastocisto) y el capilar devidrio como para el método usado para transferir embriones en oviducto.
(Por favor, consulte al capítulo de transferencia embrionaria en oviducto en la página 67.)
1.

Extraiga el ovario, oviducto y parte del cuerno uterino como en el procedimiento convencional.

2.

Fije la pinza serraﬁna en el cumulo graso que está adosado a la bursa ovárica.

3.

En preparación para la transferencia embrionaria, aspire en el capilar de vidrio aire y medio alternados y separados por intervalos de 2-3 mm.

capilaraire

embriones

72

medio

Nota
Cuando prepare el capilar de vidrio,
evite dejar el capilar en contacto
con el aceite mineral.

Otras técnicas
4.

Capítulo

7

Sostenga la aguja de 27G y la pipeta de transferencia como muestra la foto de abajo,
simultáneamente observe bajo la lupa estereoscópica ambos, la punta de la aguja y elútero. Asegúrese de mirar a la aguja y el útero simultáneamente bajo la lupa estereoscópica para conﬁrmar la posición de la aguja en relación con el útero.

capilar de vidrio

pipeta de transferencia

aguja

5.

Con cuidado, sostenga la parte superior del cuerno uterino usando unas pinzas ﬁnas e
inserte la aguja 27G en la pared del útero hacia la cavidad uterina.

pinzas

aguja

útero

ovario73

Capítulo

7
6.

Otras técnicas
Deje la aguja y sostenga la pipeta de transferencia como lo muestran los diagrama a yb. Inserte la punta del capilar que contiene los embriones y las burbujas de aire profundamente en la cavidad uterina a través del oriﬁcio hecho con la aguja, como muestra eldiagrama c.

a

b

c

pinzascapilar de vidrio

pinza serraﬁnaúteroovario7.

Libere los embriones en la cavidad uterina junto con 2-3 burbujas de aire.

8.

Suavemente retire el capilar del oriﬁcio.

Nota
Us t e d d e b e s o s t e n e r l a p a r t e
superior del cuerno uterino y seguir
observando el orificio hecho conla aguja hasta que la transferencia
embrionaria se termine. Si usted
aparta la vista del oriﬁcio antes deque se complete el procedimiento,
puede ser difícil encontrar elnuevamente el sitio del oriﬁcio.

Nota[Transferencia embrionaria en útero] No. 18-01[Realizando la operación]

No. 18-02

Si usted no puede liberar losembriones y las burbujas de aire enel oviducto, retire un poco el capilare intentelo nuevamente.

Nota
Para facilitar mantener la vista en
el orificio hecho con la guja usted
deberá sostener la aguja y la pipeta
de trasferencia, ambas en su mano
dominante, antes de comenzar elprocedimiento.

74

Otras técnicas
9.

Capítulo

7

Empuje el ovario, oviducto y cuerno uterino dentro del abdomen y cierre la incisión con
grapas de sutura.

10. Repita el proceso para trasferir 10 embriones en el otro cuerno uterino como ha sido
descripto anteriormente.
11. Mantenga el ratón en una placa térmica a 37℃ hasta que se recupere de los efectos dela anestesia.

Referencias
1.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0-87969-591-9.

75

7

Capítulo

Otras técnicas

7-4 Cesárea y adopción

La cesárea deberá realizarse si la receptora preñada no ha parido las crías para la fecha
estimada de parto.

Materiales y equipo
1.

Madre nodriza (Una nodriza es una hembra que haya parido el mismo día o el día anterior
al día estimado de parto de la hembra preñada.)

2.

Tijeras ﬁnas

3.

Pinzas de relojero #5

4.

Placa térmica (37℃)

5.

Ratón hembra preñada

Procedimientos
Cesárea1.

Sacriﬁque la hembra preñada y limpie el abdomen con un algodón embebido en etanol
70%.

2.

Abra inmediatamente el abdomen y con una tijeras ﬁnas retire el útero con las crías.

3.

Coloque el útero sobre un papel absorbente y corte la pared uterina.

4.

Rápidamente retire las crías del saco vitelino y del amnios y corte el cordón umbilical.

[Cortando el cordon umbilical]

placenta
cordon umbilical

cría

76

Otras técnicas
5.

Capítulo

7

Use pañuelos de papel para limpiar el cuerpo de las crías el ﬂuido amniótico, secreciones
y sangre.

6.

Coloque las crías sobre una placa térmica a 37℃ , suavemente pellizque varias veces lacola de cada una con unas pinzas hasta que comiencen a respirar y se tornen suﬁcientemente rosados.

[Desde la extracción del útero a la primera respiración de las crías] No. 19-01

Adopción
Seleccione una madre nodriza cuyas crías tengan un color de capa diferente que los nacidos
por cesárea, para luego poder distinguir entre ellos.
1.

Quite la madre nodriza de la caja.

2.

Reduzca el número de crías de la nodriza a la mitad (por ejemplo, si el número de crías
de la nodriza es 10, quite 4-5 crías).

3.

Frote las crías obtenidas por cesárea y que serán adoptadas (el mismo número de crías
que las que se han retirado) con el material de la cama, luego mézclelas con las crías
restantes de la nodriza.

4.

Ponga la nodriza nuevamente en la caja.
[Adopción] No. 19-02

Referencias
1.

Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., and Behringer R. 2003. Manipulating the Mouse
Embryo, A Laboratory Manual (Third edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN
0-87969-591-9.

77

Capítulo

8

Medios

8-1 Almacenamiento de medios y soluciones en ampollas bajo
gas de nitrógeno
Materiales y equipo
1.

Sellador de doble llama (Adelphi Manufacturing, West Sussex, UK)

2.

Ampollas (sterilized via hot air sterilization (180℃, 3 horas))

3.

Medio

4.

Jeringa y aguja 18 G

5.

Pinza

6.

Gas de nitrógeno

Procedimientos
Limpieza y esterilizado de las ampollas de vidrio
1.

Enjuague las ampollas de vidrio solo una vez con agua corriente.

2.

Enjuague las ampollas 2 veces con agua destilada.

3.

Esterilice las ampollas por calor a 180℃ durante 3 horas.

Encendido
1.

Abra la llave del gas y encienda el sellador de ampollas de doble boca.

2.

Ajuste las llamas del sellador de ampollas para que la llama sea azul.

Sellando las ampollas
1.

Agregue la cantidad apropiada de medio a cada ampolla.

2.

Introduzca el gas de nitrógeno en la ampolla e inmediatamente selle la punta de la misma usando las llamas del sellador. Repita con todas las ampollas restantes.

jeringa

ga[Llenado de ampollas con medio] No. 20-01

78

no

medio

ge

ampollaitró

ampollaensd

aguja 18G

Medios

Capítulo

8

8-2 Tabla de composición de medios

mHTF
Formula del mHTF

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

VendedorNúmero de catalogo

NaCl

593.8

Sigma

S 5886

KCl

35.0

Sigma

P 5405

MgSO4・7H2O

4.9

Sigma

M 2773

KH2PO4

5.4

Sigma

P 5655

CaCl2

57.0

Sigma

C 5670NaHCO3

210.0

Sigma

S 5761

Glucose

50.0

Sigma

G 6152Na-lactate**

0.34 mL

Sigma

L 7900Na-Pyruvate

3.7

Sigma

P 4562

Penicillin G

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277400

MERCK/ALBIOCEM

126575Sigma

P 0290

BSA(Albumin, Bovine serum
Fraction V Fatty Acid-Free)

0.5% phenol red

0.04 mL*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503**Ensayo; 70%
El mHTF se envasa en ampollas oscuras y almacena a 4℃ .

Referencias
1.

Kito S., Hayao T., Noguchi-Kawasaki Y., Ohta Y., Hideki U., and Tateno S. 2004. Improved in vitro fertilization anddevelopment by use of modiﬁed human tubal ﬂuid and applicability of pronucleate embryos for cryopreservation by rapid freezing in inbred mice. Comp. Med. 54(5): 564-570.

79

Capítulo

8

Medios
Hialuronidasa
Composición de la hialuronidasa
Prepare una solución de stock al 1% como se indica abajo. Esterilize por ﬁltración en y guardelo en alicuotas de 100µL a -20ºC. Antes de usar, diluya la solución de stock 10 veces. Ej.: agregue 20 µL de la solución de stock (1%) a lagota de 200 µL de mHTF que contiene los ovocitos para obtener una solución diluida al 0.1%.

Nombre del compuesto
Hialuronidasa

mg*VendedorNúmero de catalogo

Sigma

H 350610*mg/mL en mHTF

80

Medios

Capítulo

8

Sacarosa 0.3 M (BSA-)
Composición de la sacarosa 0.3M (BSA -)Nombre del compuestomg*

VendedorNúmero de catalogo

Sacarosa

2053.8Sigma

S 1888*mg/20mL en PB1

Composición del PB1 (BSA-)

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

VendedorNúmero de catalogo

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2 PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2 O

10.0

Sigma

M 2393Na2 HPO4

115.0

Sigma

S 5136

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

Na-Pyruvate*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503
La sacarosa 0.3M (BSA-) se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

81

Capítulo

8

Medios
0.3 M Sucrose (BSA +)Composición del 0.3 M sucrose (BSA+)

Nombre del compuestomg*

Sucrose2053.8VendedorNúmero de catalogo

Sigma

S 1888VendedorNúmero de catalogo*mg/20 mL en PB1

Composición del PB1(BSA+)

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2 PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2 O

10.0

Sigma

M 2393Na2 HPO4

115.0

Sigma

S 5136

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

300.0

Sigma

A 4378

Na-Pyruvate

BSA*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503
La sacarosa 0.3M (BSA+ ) se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

82

Medios

Capítulo

8

KSOM/AA
Composición del KSOM/AA

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

VendedorNúmero de catalogo

NaCl

555.0

Sigma

S 5886

KCl

18.5

Sigma

P 5405KH2 PO4

4.75

Sigma

P 5655

MgSO4・7H2 O

4.95

Sigma

M 2773

CaCl2・2H2 O

25.0

Sigma

C 7902NaHCO3

210.0

Sigma

S 5761

Glucose

3.6

Sigma

G 6152

Na-Pyruvate

2.2

Sigma

P 45620.174 mL

Sigma

L 137510 mM EDTA

100 µL

Sigma

E 6635

Streptomycin

5.0

Sigma

S 9137

Penicillin

6.3

Sigma

P 7794

0.1 mLSigma

P 0290

14.6

Sigma

G 8540MEM Essential Amino
Acids solution

1.0 mL

GIBCO

11130-051

MEM Non-essential
Amino acid solution

0.5 mLSigma

M 7145

BSA

100.0

Sigma

A 4378DL-Lactic Acid sodium
salt

0.5% phenol red
L-Glutamine*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503
KSOM/AA se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

Referencias
1.

Lawitts J. A., and Biggers J. D. 1993. Culture of preimplantation embryos. Methods Enzymol. 225:153-164.

83

Capítulo

8

MediosSacarosa 0.8M
Composición de la sacarosa 0.8M

Nombre del compuestomg*

VendedorNúmero de catalogo

Sucrose5476.8Sigma

S 1888VendedorNúmero de catalogo*mg/20 mL en PB1

Composición del PB1

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

300.0

Sigma

A 4378

Na-Pyruvate

BSA*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503
La sacarosa 0.8M se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

84

Medios

Capítulo

8

PB1
Composición del PB1

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

VendedorNúmero de catalogo

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

300.0

Sigma

A 4378

Na-Pyruvate

BSA*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503

PB1 se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

85

Capítulo

8

MediosDMSO 1M
Composición del DMSO1M

Nombre del compuestomL*

VendedorNúmero de catalogo

DMSO

1.56

Sigma

D 2650

PB1

18.44

-

-

VendedorNúmero de catalogo*Volumen ﬁnal: 20mL

Composición del PB1

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

300.0

Sigma

A 4378

Na-Pyruvate

BSA*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503
El DMSO 1M se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

86Medios

Capítulo

8

DAP213
Método de preparación del DAP213
1.

Primero se preparan la solución A y la solución B para que estén totalmente disueltas.

2.

Se mezclan volúmenes iguales de A y B para obtener el DAP213.

Solución A

Nombre del compuestomL*

VendedorNúmero de catalogo

PB1

2.3088--DMSO

3.1252Sigma

D 2650

Propylene glycol (PG)

4.556

Sigma

134368

Atención

La solución puede volverse opaca cuando se le agrega el DMSO.

Solution B

Nombre del compuestomg*

VendedorNúmero de catalogo

Acetamide (AA)1181.4Sigma

A 0500*mg/10 mL en PB1

Composición del PB1

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

VendedorNúmero de catalogo

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

300.0

Sigma

A 4378

Na-Pyruvate

BSA*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503
El DAP213 se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

87

Capítulo

8

MediosSacarosa 0.25M
Composición de la sacarosa 0.25M

Nombre del compuestomg*

VendedorNúmero de catalogo

Sucrose1711.5Sigma

S 1888VendedorNúmero de catalogo*mg/20 mL en PB1

Composición del PB1

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

NaCl

800.0

Sigma

S 5886

KCl

20.0

Sigma

P 5405

CaCl2

12.0

Sigma

C 5670KH2PO4

20.0

Sigma

P 5655MgCl2・6H2O

10.0

Sigma

M 2393

Na2HPO4

115.0

Sigma

S 5136

3.6

Sigma

P 4562

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Penicillin

7.5

Sigma

P 7794

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

300.0

Sigma

A 4378

Na-Pyruvate

BSA*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503
La sacarosa 0.25M se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

88Medios

Capítulo

8

mWM
Composición del mWM

Nombre del compuesto

mg/100 mL*

VendedorNúmero de catalogo

NaCl

640.0

Sigma

S 5886

KCl

35.6

Sigma

P 5405

KH2PO4

16.2

Sigma

P 5655

MgSO4・7H2O

29.4

Sigma

M 7774NaHCO3

190.0

Sigma

S 5761

Glucose

100.0

Sigma

G 6152

Na-Pyruvate

2.5

Sigma

P 4562

Ca-lactate
pentahydrate

46.0

Sigma

C 8356

Streptomycin

5.0

Sigma

S 1277

Penicillin G

7.5

Sigma

P 7794

0.5% phenol red

0.2 mLSigma

P 029020 mM 2-ME

10.0 µL

Sigma

M 7522

100 mM EDTA

50.0 µL

Sigma

E 6635

300.0

Sigma

A 4378BSA*Agua para transferencia embrionaria; Sigma W1503
El mWM se envasa en ampollas oscuras y se almacena a 4℃ .

89

Información

Todos los videos de este manual se encuentran en la memoria
extraíble USB/DVD. Si tiene alguna pregunta, por favor no dudeen contactarnos.

Contacto:
Cosmo Bio Co., Ltd.
International Sales Dept.
Toyo-Ekimae Bldg., 2-20, Toyo 2-Chome, Koto-ku, Tokyo 135-0016, Japan
Tel: +81-3-56329617
Fax: +81-3-56329618
Email: export@cosmobio.co.jp
Web: www.cosmobio.com

90

FERTIUP® Crioprotector

Medio de p
pre-incubac
pre-incubación

Medio de Fertilización in vitro de ratónn

CARD MEDIUM®

Baja FIV? FERTIUP® le permitirá mejorar!!
Transferencia
embrionaria

Fertilización in vitro

Recolecciónde ovocitos

Investigación♂

Pre- incubación

Descongeladodel esperma

Criopreservaciónde esperma

Preservación
El uso combinado del crioprotector FERTIUP® y elmedio de pre-incubación FERTIUP® junto con el
MEDIO CARD® de fertilización de ratón ofrece lossiguientes beneficios:
Porcentajes de fertilización sobre el 80%
P
Mejora el manejo de los animales transgénicos
M
Reduce el tiempo de expansión de la colonia
R♀

FERTIUP® MS CPA
EX
KYD-001-EX

FERTIUP® MS PM
KYD-002-EX

CARD MEDIUM®
KYD-003-EX

FERTIUP® y el MEDIO CARD® son valiosos
compuestos para mejorar la recuperación delesperma de ratón congelado y mejorar laeficiencia de la fertilización in vitro del ratón
de laboratorio.
Fertilización con esperma criopreservado y descongelado
usando FERTIUP® y MEDIO CARD®

Porcentaje de fertilización invitro (%)

Nacimientode las crías

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Porcentaje defertilización

80% <Porcentaje defertilización

Métodoconvencionalusual
method30% <FERTIUP®

Producción eficiente con líneas difíciles de criarP

FERTIUP®
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Reduce el trabajo, las instalaciones y el costo de manutención
R
uten
ut
te
en
nci
ció
ión
ón
Descripción
FERTIUP® Crioprotector: CPA

FERTIUP® Medio de pre-incubación: PM

Cat. No.
KYD-001-EX

Cantidad
1 mL

KYD-001-EX-X5

5 x 1 mL

KYD-001-05-EX

0.5 mLKYD-001-05-EX-X5

5 x 0.5 mL

KYD-002-EX

1 mL

KYD-002-EX-X5

5 x 1 mL

KYD-002-05-EX

0.5 mLKYD-002-05-EX-X5

5 x 0.5 mL

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1 juegoConjunto FERTIUP® PM 0.5ML- MEDIO CARD®

KYD-005-EX

1 juegoEl kit incluye 1 ampolla con medio (A), 1 vial con materia en polvo (B), un tubo plástico de 1.5 mL (c),un tubo plástico de 1.5 mL (D), una jeringa descartable de 2.5 mL, 1 aguja, 1 filtro (tamaño de poro: 0.22 ȝm)FERTIUP® Medio de pre-incubación: PM (1 mL) x 1 vial, MEDIO CARD® x 1 Kit

FERTIUP® Medio de pre-incubación: PM (5 mL) x 1 vial, MEDIO CARD® x 1 Kit

Kit para transporte en frio
Especialmente designado para un transporte económico y seguro de los epidídimos
y embriones de ratón a bajas temperaturas.
temperaturas
Reduce el costo de transporte de ratones vivos
Elimina el riesgo de fatalidades o escape de los ratones durante el transporte
Previene la transmisión de patógenos
Importante para el rescate por el método de fertilización in vitro de un stock legado
de esperma criopreservado
KYD-006-EX♂

Esperma

Cola del epidídimo

Transporte en frio

Mayor supervivencia del esperma!

Descripción

Kit para transporte en frio CARD

Cat. No.

Cantidad

KYD-006-EX

1 juegoCaja de trasporte de espuma de poliuretano (1 caja), Bolsas refrigerantes (4 grandes, 2 pequeñas),termo (1 botella), caja de papel (1 caja), material protector (1 pieza)

FERTIUP® & y MEDIO CARD® productos periféricos
Descripción

Cat
Cat. No
No.

Cantidad

Pajuelas de semen (10 piezas x 10 unidades)

KYD-S020X10

10 pzaCanasta de congelación

KYD-S018

1 unidad

Conector de pajuelas (incluye 5 partes)

KYD-S025

1 pza

Casete triangular corto (10 unidades)

KYD-S021

10 unidad

Casete triangular largo (10 unidades)

KYD-S035

10 unidad

Canastilla decongelado
KYD-S018

505 mmConjunto de instrumentos para manipular embriones KYD-S036

1 juegoCapilares de vidrio 20 Pzas

KYD-S037

1 juegoMechero APT-3

PHD-APT3-EX

10 unidad

Conector depajuelasKYD-S025
Casete triangular largo
KYD-S035

Conjunto de instrumentos para la manipulación de embriones
KYD-S036
Casete triangular corto
KYD-S021

Tapón de silicona para el
uso de capilares
Capilares(Envases de 20)

X10 unidades
X10 unidades

Pipetas Pasteur de vidrio(contienen un tapón de algodón
para prevenir la contaminación)

Longitud delos capilares(8-10 cm)

Mechero APT-3
PHD-APT3-EX

Pajuelas de semen(10 piezas)
KYD-S020X10

Boquilla
Tubo de silicona(60 cm)

5 cm(10 pieces )x 10 unidades

Busca!

fertiup®

Reac t i v o pa r a a u m e n ta r la super o vula ció n en ratón

Crías nacidas por FIV de una sola hembra
superovulada con CARD HyperOva®
([FHOHQWHSDUD),98VH+\SHU2YDSDUDREWHQHUPÄVRYRFLWRVRYXODGRV
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PHGLRGHIHUWLOL]DFLÕQLQYLWURSDUDUDWÕQ0(',2&$5'Superovulation Reagent for mouse®

1 mL
Store at -80°C to -20°C
For research use only. Not for human or medicinal use.

Cat. No. KYD-010-EX

Manufactured by
KYUDO CO., LTD.

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Descripción
CARD HyperOva®

Cat. No.

Cantidad

Almacenamiento

KYD-010-EX

1 mL

-20℃

KYD-010-EX-X5

5x1 mL-20℃
Envío: Nieve carbónica (Hielo seco)

Búsqueda!

card hyperova

Líquidos y medios para Vitrificación/ descongelado/Para la manipulación de embriones de rata y ratón
Para ratón
Descripción

Aplicación

Cat. No.

Cantidad

Almacenaje

HTF
HTF
mHTF
mHTF
mHTF
mHTF
KSOM
KSOM
mWM
0.25M sucrose
0.25M sucrose
1M DMSO
DAP213

Fertilización in vitro
Fertilización in vitro
Fertilización in vitro
Fertilización in vitro
Fertilización in vitro
Fertilización in vitro
Cultivo in vitro
Cultivo in vitro
Cultivo in vitro
Congelado- descongelado
Congelado- descongelado
Criopreservación
Criopreservación

CSR-R-B070
CSR-R-B071
KYD-008-02-EX
KYD-008-02-EX-X5
KYD-008-05-EX
KYD-008-05-EX-X3
CSR-R-B074
CSR-R-B075
CSR-R-B081
CSR-R-Y077
CSR-R-Y078
CSR-R-T072
CSR-R-T073

10 x 2 mL
10 x 5 mL
1 x 2 mL
5 x 2 mL
1 x 5 mL3 x 5 mL
10 x 2 mL
10 x 5 mL
10 x 5 mL
10 x 2 mL
10 x 5 mL
10 x 2 mL
10 x 1 mL

4℃
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4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
4℃
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4℃
4℃

Descripción

Aplicación

Cat. No.

Cantidad

Almacenaje

mR1ECM
mR1ECM

Cultivo in vitro
Cultivo in vitro

CSR-R-M174
CSR-R-M191

10 x 5 mL
10 x 2 mL

4℃
4℃

Para rata

Para manipulación del embrión
Descripción
M2
M2
PB1
PB1
P10
PEPeS

Aplicación

Manipulación in vitro
Manipulación in vitro
Manipulación in vitro
Manipulación in vitro
Criopreservación
Criopreservación

Cat. No.

CSR-R-M083
CSR-R-M084
CSR-R-P183
CSR-R-P185
CSR-R-P186
CSR-R-P187

Cantidad

Almacenaje

10 x 2 mL
10 x 5 mL
10 x 5 mL
10 x 2 mL
10 x 2 mL
10 x 1 mL

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