液体試料からの small RNA 精製キット

ISOSPIN Liquid Sample miRNA
Code No. 318-09191
簡易マニュアル（第 1 版）R311ND

Ⅰ 製品説明Ⅳ プロトコールISOSPIN Liquid Sample miRNA（アイソスピン リキッドサンプル マイクロRNA）は、液体試料から micro RNA (miRNA) などの small RNA を精製するためのキットです。フェノールやクロロホルムを使用せず、カラム精製や遠心操作により DNA や高分子 RNA を除くことにより small RNA を濃縮することができます。

＜small RNA 精製の流れ＞
Step 1 DNA の除去
カラムへ選択的に DNA を吸着＜特長＞
・ 血漿、血清、全血、唾液、尿などの液性生体試料からsmall RNA を効率よく精製
・ フェノールやクロロホルム等の毒劇物を使用しない
・ DNase を使用せず、ゲノム DNA を除去可能

DNAtotalRNA

Step 2 large RNA の除去
遠心分離で large RNA を沈殿※血漿、血清の場合、省略可能

smallRNAlarge
RNA

Ⅱ 製品内容Code No. 318-09191 （50 回用）
内 容容 量

保存温度

Proteinase K

1 ml×1 本－20℃＊1)

LR Extraction Buffer

18 ml×1 本

室温

LR Wash1 Buffer

60 ml×1 本

室温＊2)

LR Wash2 Buffer

60 ml×1 本

室温＊2)ddWater

1 ml×5 本

室温Spin Column

50 本＊3)

室温

Spin Column Blue50 本＊3)

室温＊1） キットは室温で輸送します。製品到着後、Proteinase K は－20℃保存して下さい。
＊2） LR Wash1 Buffer、LR Wash2 Buffer にはエタノールが含まれています。 ご使用後は、蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め、保管して下さい。
＊3） Spin Column、Spin Column Blue は、蓋付きのシリカメンブレンカラ
ム（上部パーツ）と Collection Tube（下部パーツ）で構成されています。
Ⅲ 使用上の注意
・ 作業検査環境への汚染を防ぐため、使用の際には溶液を飛散させたり、溶液に触れたピペットチップが他の器具や試薬に接触したりしないようご注意下さい。
・ 本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 安 全 性 デ ー タ シ ー ト （ SDS ） は 、 ニ ッ ポ ン ジ ー ン Web サ イ ト（www.nippongene.com）よりご覧になれます。

株式会社ニッポンジーン

Step 3 small RNA の精製
カラムに吸着、洗浄、溶出smallRNA＜液体試料の例＞
・ 血漿・ 血清・ 全血・ 唾液・尿・ 細胞懸濁液
・ 培養細胞上清・ 核酸溶液

＜本品以外に必要な試薬、機器など＞□ エタノール（96～100％）□ マイクロピペット□ ピペットチップ□ ボルテックスミキサー□ ヒートブロック（37℃）□ 卓上遠心機□ 遠心分離機□ 1.5 ml マイクロチューブ□ 2.0 ml マイクロチューブ（スタート試料量が 350～370 µl の場合）
＊ RNase free の試薬、チューブを使用して下さい。
＊ 核酸低吸着チューブの使用をお勧めします。

TEL 076-451-6548
www.nippongene.com

FAX 076-451-6547

＜small RNA 精製プロトコール（large RNA 除去あり）＞
対象： large RNA と small RNA を含む液体試料＜small RNA 精製プロトコール＞
対象：血漿や血清など large RNA が含まれない液体試料

1.5 ml チューブ

1.5 ml チューブ

180 µl 液体試料

Step 1＊1)

Step 1180 µl 液体試料

20 µl Proteinase K＊1)

20 µl Proteinase K

180 µl LR Extraction Buffer

180 µl LR Extraction Buffer＊2)

15 秒間ボルテックスで混合＊2)

15 秒間ボルテックスで混合

37℃で 15 分間インキュベートする間、5 分間おき計 3 回ボルテックスで混合

37℃で 15 分間インキュベートする間、＊3)

5 分間おき計 3 回ボルテックスで混合＊3)

軽くスピンダウン

軽くスピンダウン

Spin Column に混合液を全量（380 µl）添加する

Spin Column に混合液を全量（380 µl）添加する

遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）

カラムに DNA が吸着、ろ液を回収＊4)

カラムに DNA が吸着、ろ液を回収＊4)

ろ液を新しい 1.5 ml チューブに移す

Step 2190 µl エタノール

ろ液を新しい 1.5 ml チューブに移す

15 秒間ボルテックスで混合

15 秒間ボルテックスで混合

遠心（13,000×g, 15 分間, 室温）

軽くスピンダウン

長めの遠心分離で large RNA を沈殿させる
上清を新しい 1.5 ml チューブに移す

Step 3570 µl エタノール

Step 3380 µl エタノール
15 秒間ボルテックスで混合
軽くスピンダウン
Spin Column Blue に混合液を全量（～950 µl）添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）
ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す
500 µl LR Wash1 Buffer
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）
ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す
500 µl LR Wash2 Buffer
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
ろ液を廃棄（ろ液がカラムに付かないよう注意する）

Spin Column Blue に混合液を全量（950 µl）添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）
ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す
500 µl LR Wash1 Buffer
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）
ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す
500 µl LR Wash2 Buffer
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
ろ液を廃棄（ろ液がカラムに付かないよう注意する）
カラムを新しい 1.5 ml チューブの上に移す
50 µl ddWater をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
small RNA 溶液＊5)

カラムを新しい 1.5 ml チューブの上に移す
50 µl ddWater をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
small RNA 溶液＊5)＊1） 新鮮な試料を用いる。試料採取後、すぐに RNA を抽出するか速やかに凍結させる。凍結・融解を繰り返した試料は RNA 抽出に使用しない。

製品詳細やその他のプロトコールはニッポンジーン Web サイトより製品マニュアルをダウンロードしてご参照下さい。

ISOSPIN 318-09191＊2） 試料の溶解不十分は RNA 収量の低下につながるため、よく混合する。
＊3） 最終的に得られた small RNA 溶液中に DNA の混入が見られた場
合、DNA と RNA が複合体を形成している可能性がある。その場合、同種の試料で small RNA 精製プロトコールを行う際は、37℃のインキュベートの後に、80℃で 5 分間、氷冷 5 分間の反応を追加する。
＊4） カラムに DNA と一部の large RNA が吸着する。ろ液には、smallRNA と large RNA が含まれている。
＊5） DNA が混入している場合、DNase 処理を行うか、濃縮プロトコールを試す。

株式会社ニッポンジーン＜その他のプロトコール＞
スケールアッププロトコール
・ 350 µl 液体試料からの small RNA 精製（large RNA 除去あり）
・ 350 µl 液体試料からの small RNA 精製.
濃縮プロトコール・ 200 µl 核酸溶液からの small RNA 濃縮
・ 370 µl 核酸溶液からの small RNA 濃縮
オプションプロトコール
・ 180 µl（または 350 µl）液体試料からの DNA 回収

ISOSPIN Liquid Sample miRNA 簡易マニュアル（第 1 版）R311ND