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ホタルルシフェリンの励起状態に関する理論的研究（京大院工 1、京大福井セ 2） ○中谷 直輝 1、 長谷川 淳也 1、 中辻 博 1,2【緒言】
ホタルの生物発光に関しては古くから数多くの実験的な研究がなされており、また色素であるルシフェリンは化学発光することも知られているため、化学発光に関する研究も数多く行われてきた。化
学発光に関しては発光体であるオキシルシフェリン（OxyLH2）が酸塩基環境の違いにより keto-enol互変異性を起こし keto 型から赤色の光が、enol 型から緑色の光が放出されることが知られている。しかしながら生物発光については発光反応の酵素であるルシフェラーゼの立体構造についての知見が無かったため、理論的な研究はほとんど行われてこなかった。しかし 1996 年にアメリカホタル(Photinus pyralis)のルシフェラーゼの X 線構造が初めて解明された。また、生物発光において、keto 型から緑色の光が出たという実験も報告されている。本研究ではこのアメリカホタルに着目し、量子化学的な手法を用いて、理論的な立場から発光色の再現と emitting state の決定を行った。また、ルシフェラーゼ中にある色素が受ける影響について解析し、ホタルの発光色に与える影響について考察を行った。
【計算内容】
まず化学発光について keto-enol、cis-trans 異性体など OxyLH2 の幾つかの構造を考え、それぞれCIS 法により励起状態の構造最適化を行った。得られた構造を用いて、気相中および液相中（DMSO 中）における発光エネルギーを SAC-CI 法により計算した。溶媒効果については連続誘電体モデル（PCM）を用いて取り込んだ。
次に、emitting state の構造と性質を特定するため、OxyLH2 keto 型の分子面の回転に対するポテンシャルエネルギー曲線を CIS 法により生成し考察を行った。
さらに生物発光の発光エネルギーに対するルシフェラーゼの影響を考えるため、X 線構造と実験的な研究から予測されている活性部位の位置から OxyLH2 および反応副生成物である AMP を含んだモデル構造を作成し、分子動力学シミュレーションにより構造を緩和させて安定構造を推定した。
さらに、OxyLH2 に関しては CIS を用いてルシフェラーゼ中での構造最適化を行い、SAC-CI 法により生物発光の発光エネルギーを計算した。
【結果と考察】まず化学発光に関する発光エネルギーの計算値を以下の表・1 にまとめた。表・1 から気相中の発光エネルギーは中性の構造を除いて全体的に実験値より低い値となっており、実験の傾向も再現できていない。しかしながら、溶媒効果を加えることにより keto 型では 0.14 eV、enol 型では 0.18~0.68
eV の青方シフトが見られ特に 1 価のアニオン構造において実験を高い精度で再現することができた。
これらの青方シフトは OxyLH2 と溶媒分子との双極子‐双極子相互作用により OxyLH2 の基底状態が特異的に安定化されたものと考えることができ、基底状態の双極子モーメントが大きい enol 型におい表・1: SAC-CI法による化学発光の発光エネルギーの計算値
Emission energy / eVin DMSO
Gas phase
Eemit
Eemit
StructureShiftExptl.
keto-s-trans3.15
2.95-0.20
1.97
keto-s-trans(-1)
1.84+0.14
2.08
keto-s-cis(-1)
1.84+0.14
2.08
enol-s-trans
2.88
2.83
-0.05
enol-s-trans(-1)
1.92+0.33
2.25
2.20
enol-s-cis(-1)
1.93+0.37
2.30
enol-s-trans(-1)'
1.46+0.68
2.14
enol-s-trans(-2)
1.89
2.07+0.18( )内の数字は電荷、"Shift"は気相中からの発光エネルギーシフト

90.0るポテンシャルエネルギー曲線を以下の図・1 に示した。図・1 から keto 励起状態においては trans 型の平面構造が最も安定であり、ねじれ構造では発光強度も著しく低下することから化学発光においても生物発光においても emitting state は平面性を保っている可能性 が高いと考えられる。しかしながら、分子面の 2 面角が 91°

1.691°1.4になるところで局所安定点が存在し、ねじOsc. strength

energy / kcal mol-1

次に、OxyLH2 の分子面の回転に対す

2.080.070.0る。

11.4 kcal/mol 1.8

100.0

7.0 kcal/molてその効果が顕著に現れたと考えられれ構造が準安定な状態として存在する可60.0

1.250.0

1.040.00.8

30.00.6

また、 OxyLH2 keto-s-trans(-1) の構造を20.00.4用いて計算したルシフェラーゼ中 での発10.00.2

光エネルギーを以下の表・2 にまとめた。

0.00.0090180Excited

表・2 から AMP を含まないモデルでは発光エネルギーが 1.89 eV と気相中に比べ、

dihedral / degree
Ground能性は否定できないと考えられる。

Osc. strength

図・1: OxyLH2の分子面の回転に対するポテンシャル曲線

0.04 eV しか違わないのに対し、AMP を含むモデルでは 0.2 ~ 0.3 eV 程度の青方シフトが見られることから AMP のリン酸部

表・2: SAC-CI法による生物発光の発光エネルギーの計算値
Emission energy / eVAMP
QM region
position
SAC-CI
Exptl.
Gas phaseGas phase
1.84 (Ref.)
×1.89 (0.04)
In-Protein
OxyLH2 only 2.10 (0.26)
not QMaoptimizedb
2.17 (0.33)
a2.02 (0.18)
OxyLH2 only
2.23
b1.82 (-0.02)
In-Protein
OxyLH2 +a2.07 (0.23)
Optimized
ARG218b1.90 (0.06)
Structure
OxyLH2 + ARG218
a2.33 (0.49)+ HIS245 +b2.13 (0.29)
Phosphate( )内の数字は気相中からのシフト分の負電荷が発光エネルギーに大きな影響を与えていることが分かった。また、ルシフェラーゼ中で CIS により OxyLH2 の構造最適化を行うと立体障害などの影響を受け、分子面がわずかにねじれ、赤方シフトすることが分かる。さらに発光エネ
ルギー計算の際に、QM region に周辺残基である ARG218 や HIS245、AMP のリン酸部分を加え た計 算 では、OxyLH2 とARG218 との水素結合の影響はほとんど現れなかったが、AMP のリン酸部分からHIS245 への電荷移動により HIS245 の正電荷による OxyLH2 の LUMO への安定化の寄与が弱くなり、大きな青方シフトを与えている可能性がある。
以上の計算結果と実験事実などを踏まえると、アメリカホタルの生物発光では本来赤色の光を放出する keto 型の OxyLH2 が AMP のリン酸部分の負電荷や HIS245 上の正電荷の減少により発光色が大きく青方シフトしていることが示唆された。