Agilent AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムとオリゴヌクレオチド標準試料

信頼性、経済性、柔軟性を向上

AGILENT ADVANCEBIO オリゴヌクレオチドカラムとオリゴヌクレオチド標準試料

HPLC および UHPLC 分析で、オリゴヌクレオチドの高分離能分析と長寿命を実現するカラムが登場しました。

合成オリゴヌクレオチドは、ウィルス感染症や癌など、さまざまな疾患に対する有望な治療薬として注目されています。治療への応用に向け、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉 RNA (siRNA)、アプタマなどの一部の核酸クラスの研究が進んでいます。一方、連結反応時の不完全なキャッピングにより生じる不純物、合成時に生成される不純物、出発物質に含まれる不純物、合成後処理で生じる不純物など、合成の過程で混入する可能性のあるさまざまな不純物を監視・同定し、除去しなければなりません。
すなわち、オリゴヌクレオチド治療薬の開発および製造では、不純物を分離および同定する分析メソッドが重要な課題となります。

• 結果の信頼性の向上 – Poroshell の効率的な粒子形態により高分離能分析を実現• コストの削減 – 高 pH に対して優れた耐性を持つ堅牢な化学修飾シリカによりカラムを長寿命化• 柔軟性の向上 – 直径 2.7 μm の粒子を採用し、HPLC および UHPLC システムにも対応

2オリゴヌクレオチドの分離
オリゴヌクレオチドの分離に一般的に使用されている
3 つの UHPLC/HPLC 手法:• トリチルオンオリゴのイオンペア逆相分離: dMT

順は比較的簡単に実行できますが、得られる分• トリチルオフの 脱保護オリゴのイオンペア 逆相分離: この手法では、有機溶媒と、酢酸トリエチルアンモニウム (TEAA) やトリエチルアミンとヘキサフルオロイソプロパノール (TEA-HFIP) など析情報が限られるため、一般には精製メソッドとの移動相添加物を使用して、オリゴヌクレオチドして考えられています。の 負帯電性リン酸ジエステル主鎖とのイオンペ基が結合したままの全長ターゲットオリゴを、脱保護された不完全配列から分離します。この 手• トリチルオフの脱保護オリゴのイオン交換分離:
このメソッドでは、 オリゴの 主鎖上 の 負電荷 を利用して分離を促進します。短鎖オリゴは良好に分離しますが、鎖長が長くなるにつれて分離能は低下します。また、この 手法では水溶性溶離液を使用しますが、オリゴは高帯電性であり、アリングを行 います。高性能カラムを使用 すれば、非常に明確な分離が可能です。また、移動相に TEA-HFIP などの揮発性成分を用いるメソッドは LC/MS に適しており、オリゴヌクレオチドの構造および配列の特性解析に有効な情報が得られます。

カラムからの 溶出に高濃度 の 塩を必要とするため、LC/MS には適していません。

Agilent AdvanceBio オリゴヌクレオ チドカ ラ ム は、
TEAA または TEA-HFIP を用いたトリチルオフの脱保護オリゴのイオンペア逆相分離用に設計されています。
アジレントは、その他のオリゴヌクレオチド手法のためのソリューションも用意しています。詳細については、最後のページをご覧ください。

3優れた分離能と長寿命を同時に実現

優れた分離能と長寿命に対するニーズに応えるカラム

トリチルオフの 脱保護オリゴのイオンペア逆相分離には 、分離能が高く、比較的過酷な分析条件にも十分耐えられる堅牢性を備えたカラムが必要です。
十分 な 分離能がないと、測定 の 真度と精度が低下し、信頼性の低い分析結果につながります。
また、堅牢性に劣るカラムは寿命が短 いため、頻繁に交換する必要があります。交換 のたびにワークフローを中断しなければならないうえ、コストもかさむことになります。

Agilent AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムは、高効率の 2.7μm 表面多孔質 Poroshell 粒子を採用しています。この粒子は、アジレント独自の技術により化学修飾されており、高 pHの移動相に対してもきわめて高い耐性を示します。また、エンドキャップ処理された C18 結合相を持ち、オリゴヌクレオチドに対して優れた選択性を実現します。

AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムで高 い 分離能を確保するために、すべてのバッチに対して、アジレントオリゴヌクレオチド分離能標準試料 を 用 いた 試験 を 実施しています。詳細については、6 ページをご覧ください。

Agilent AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムで使用されている Poroshell 2.7 μm 粒子は、高 pH に対する優れた耐性を備え、エンドキャップ処理されています。オリゴヌクレオチドを高分離能で分離できるため、信頼性の高い結果が得られます。また、HPLC および UHPLC システムで長いカラム寿命が実現されるため、コストを削減できます。

結合相

ポアサイズ

温度上限

C18100 Å

65 °
C

pH 範囲
3.0〜11.0

エンドキャップ
ダブル

アジレントによる革新: 高 pH で優れた安定性を発揮する、オリゴヌクレオチド分析のための初の表面多孔質粒子による LC カラム

AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムで採用されている直径 2.7 μm の Poroshell 粒子と 600 bar の圧力定格により、HPLC および UHPLC システムにも対応できます。

Agilent 1260 Infinity LC

Agilent 1260 Infinity

Agilent 1290 Infinity II LCシステム

Bio-inert クォータナリシステム

LC システム

4酢酸トリメチルアンモニウム (TEAA) を用いた
オリゴヌクレオチドの分離

未修飾シリカ粒子は塩基性の移動相中で溶解が起こりやすく、カラム寿命が短くなる傾向にあります。

AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムは、TEAA を含む高 pH 移動相でもきわめて高い安定性を発揮します。

mAU
50カラム:

10 回目

4030
20100mAU

050

12345分

12345分

150 回目4030

移動相 A:
移動相 B:
流量:
グラジエント:20100mAU0300 回目

5040

サンプル:

30

注入量:
温度:
検出:

2010001234リテンションタイム4.54.44.34.2
4.14
3.93.83.73.63.5050100150200250300350

400

0.110.1
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.010分

5AdvanceBio オリゴヌクレオチド、2.1 x 50 mm(部品番号 659750-702)
100 mM TEAA 水溶液
100 mM TEAA アセトニトリル溶液
0.69 mL/min
5 分で B を 7 % から 11 % まで増加
5.01 分で B を 11 % から 80 % まで増加
B を 80 % で 5.50 分間維持
5.56 分で B を 80 % から 7 % まで減少
総分析時間 8.5 分
25 mer DNA
0.5mg/mL を 1 μL
65 °CUV、260 nm

ピーク幅0100200300400

正確な特性解析を行うには、ヌクレオチドが 1 つ異なるオリゴヌクレオチドを分離できることが重要になります。
AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムは、アジレントのオリゴヌクレオチド分離能標準試料 (14、17、20、および 21mer) による分析において N と N-1 を分離することができることを示しています。
カラム:

移動相 A:
移動相 B:
グラジエント:ストップタイム:
ポストラン:

mAU
20

流量:
サンプル:

15

温度:
注入量:
検出:

105

AdvanceBio オリゴヌクレオチド、2.1 x 50 mm (部品番号 659750-702)
100 mM TEAA 水溶液
100 mM TEAA アセトニトリル溶液
12 分で B を 6 % から 8 % まで増加
13 分
5分
0.6 mL/min
アジレントオリゴヌクレオチド分離能標準試料 (部品番号 5190-9028)
17 mer
65 °C
14 mer
0.5 μLUV、260 nm

21 mer (N)20 mer (N-1)

0012345678分

95トリエチルアミンとヘキサフルオロイソプロパノール(TEA-HFIP) を用いたオリゴヌクレオチドの分離
HFIP を含む移動相は MS での分析に使用できます。AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムの優れたクロマトグラ
フィー分離能と精密質量 MS を組み合わせることにより、オリゴヌクレオチドの構造と配列の特性解析を行えます。
カラム:
標準
800

移動相 A:
移動相 B:
流量:
グラジエント:

700
600
500
400

サンプル:

300
200
100
0246分

8x10254

温度:
検出:
検出:
最小範囲:
最大範囲:
スキャン速度:
イオン極性:

VCap:

ノズル電圧:

3

フラグメンタ:2

AdvanceBio オリゴヌクレオチド、
2.1 x 50 mm (部品番号 659750-702)
HFIP:TEA (400 mM:15 mM) 水溶液
MeOH:移動相 A (50:50)
0.4 mL/min
0.5 分で B を 30 % から 40 % まで増加、5 分で B を 40 % から 70 % まで増加
25 mer DNA
65 oC
UV、260 nm
MS
400 m/z
1,700 m/z
3.00 スペクトル/秒-ve
3,500
1,000 V200

10,30,40,50,60,70,80,9

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,71,81,92

2,12,22,32,42,52,62,70,30,40,50,60,70,80,9

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,61,71,8

1,92

2,12,2

2,32,42,52,62,7FLP-6

FLP-3 to FLP-5

FLP-2

FLP-1

0

22,12,2x102

レスポンス vs. 採取時間 (分)

5432
10

レスポンス vs. 採取時間 (分)

x105
4,54

******TTTGCTGCTGTTTTGCTGT

3,52,5

FLP-7

FLP-8

FLP-9

FLP-10

FLP-11

FLP-12

FLP-13

FLP-14FLP-15

FLP-16

FLP-17

FLP-191

FLP-18

21,5FLP

30,50

0,40,50,60,70,80,9

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

カウント vs. 採取時間 （分）1,81,92,32,42,52,6

AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムは、TEA と HFIP を含む移動相でもきわめて高い安定性を示します。

6ピーク

レスポンス %

FLP
FLP-1
FLP-2
FLP-3
FLP-4
FLP-5
FLP-6
FLP-7
FLP-8
FLP-9
FLP-10
FLP-11
FLP-12
FLP-13
FLP-14FLP-15
FLP-16
FLP-17
FLP-18
FLP-1950898971656225304129303848218243113062104555110327134341
13408018694735883325169027284441630623820530433340303845934442251811482765

合計

44.33 %
14.42 %
2.65 %
2.65 %
1.90 %
0.98 %
0.91 %
0.96 %
1.17 %
1.17%
1.63 %
3.12 %
2.19 %
2.38 %
3.63 %2.07 %2.65 %
3.51 %
4.00 %
3.68 %
100%

確かな性能AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムで高い分離能を確保するために、すべてのバッチに対して、アジレントオリゴヌクレオチド分離能標準試料を用いた試験を実施しています。
オリゴヌクレオチド分離能試験標準試料には 14、17、20、および 21 mer の合成ヌクレオチドが含まれ、N/N-1 分離能を実証できるよう設計されています。
カラム:

移動相 A:
移動相 B:
グラジエント:ストップタイム:
ポストラン:

0,205mAU

20

8,569

流量:

5,666

3,291

10

0,359

50012345678

アジレントオリゴヌクレオチド分離能
標準試料 (部品番号 5190-9028)
温度: 65 °C
注入量: 10 μL
検出: UV、260 nm

サンプル:

8,092

15

AdvanceBio オリゴヌクレオチド、2.1 x 50 mm(部品番号 659750-702)
100 mM TEAA 水溶液
100 mM TEAA アセトニトリル溶液
10 分で B を 10 % から 14 % まで増加
11 分
5分
0.6 mL/min

9分

アジレントは、15、20、25、30、35、および 40 mer の合成オリゴデオキシチミジンを含むオリゴヌクレオチドラダー

標準試料も用意しています。この標準試料を使用することで、カラムの選択性と再現性を実証できます。
カラム:

7,782

移動相 A:
移動相 B:
グラジエント:ストップタイム:
ポストラン:
流量:

4,036

5,406

20

7,159

6,388

0,189mAU

カラム温度:

2,160

15

サンプル:

100,323
0,439
0,502

500123456789分

AdvanceBio オリゴヌクレオチド、2.1 x 50 mm(部品番号 659750-702)
100 mM TEAA 水溶液
100 mM TEAA アセトニトリル溶液
12 分で B を 6 % から 8 % まで増加
13 分5分
0.6 mL/min
65 °C
アジレントオリゴヌクレオチドラダー

標準試料 (部品番号 5190-9029)
注入量: 0.5 μL
検出: UV、260 nm

アジレントオリゴヌクレオチドラダー標準試料の詳細情報については、最後のページをご覧ください。

7

詳細情報

Agilent AdvanceBio オリゴヌクレオチドカラムとオリゴヌクレオチド標準試料
説明

部品番号

AdvanceBio オリゴヌクレオチド、2.1 x 50 mm、2.7 µm
AdvanceBio オリゴヌクレオチド、2.1 x 100 mm、2.7 µm
AdvanceBio オリゴヌクレオチド、2.1 x 150 mm、2.7 µm
AdvanceBio オリゴヌクレオチド、2.1 mm Fast Guard
AdvanceBio オリゴヌクレオチド、4.6 x 50 mm、2.7 µm
AdvanceBio オリゴヌクレオチド、4.6 x 100 mm、2.7 µm
AdvanceBio オリゴヌクレオチド、4.6 x 150 mm、2.7 µm
AdvanceBio オリゴヌクレオチド、4.6 mm Fast Guard

659750-702
655750-702
653750-702
821725-921
659950-702
655950-702
653950-702
820750-921

オリゴヌクレオチド分離能標準試料
オリゴヌクレオチドラダー標準試料

5190-9028
5190-9029

アジレントのオリゴヌクレオチド用ソリューション
オリゴヌクレオチドの精製
Agilent PLRP-S および PL-SAX
オリゴヌクレオチドの 精製において、許容できるカラム寿命で高純度を達成するには、化学的 および熱的に安定性 の 高 いポ
リマー性 HPLC カラムが必要です。PLRP-S カラムは、トリチルオンオリゴとトリチルオフオリゴを分離するために TEA などのイオンペアリング剤を用いて 80 °C で使用しても性能が劣化しません。一方、PL-SAX 1000Å カラムは、高 pH の変性条件下で脱保護オリゴを分離できます。ポリマー性粒子の 4 級アミン機能により高 pH でイオン交換分離を行えるため、自己相補的配列についてより正確なクロマトグラフィー分析を実施できます。

TOP-DNA および TOP-RNA 精製カートリッジ
Agilent TOP-DNA および TOP-RNA 精製カートリッジは、トリチル
基 の 付 いた 合成オリゴ DNA および RNA の 精製をハイスループットで 行う専用カートリッジです。干渉 する塩類、不完全 な合成物質や不純物を簡単に除去できるため、高い純度の合成DNA および RNA オリゴヌクレオチドを提供します。96 ウェルプ
レートで 96 本までの同時処理が可能であり、スループットを高く保つことができます。

核酸ソリューション
柔軟な治療用オリゴの製造および開発サービス

アジレントの核酸ソリューション部門では、患者の健康および安ホームページ

www.agilent.com/chem/jp
カストマコンタクトセンタ

0120-477-111
email_japan@agilent.com

全という共通の目標を掲げ、オリゴ候補物質を臨床段階から市場へと効率的に導く業界最高のサービスを提供しています。あらゆるクラスのオリゴ API に関する知識を駆使し、毒物学研究から商品化まで、 お客様を幅広くサポートします。コロラド州
ボールダーにあるアジレントの GMP 施設には、多様な合成 および精製機器が設置されています。毒物学研究や前臨床試験に使用する数グラムのオリゴから、後期臨床試験および商品化のための数十キログラムのオリゴまで、さまざまな要件にお応えします。

すべて研究用です。診断目的では使用できません。
本資料掲載の製品は、本資料記載の情報は予告なしに変更されることがあります。
アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2016, 2018
Published in Japan, April 1, 20185991-5845JAJP