M1講義 2020年5月21日

細菌III型分泌系を科学する

本間研 助教寺島浩行
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細菌べん毛は生物の持つナノマシンである

ビブリオ菌の遊泳

生物ナノマシン/分子機械としての特徴
1. 2万分子以上のべん毛タンパク質が秩序立って構築される
2. 回転する2

生物界における回転ナノモーター
回転モーター

細菌べん毛

FoF1-ATP合成酵素(べん毛基部構造)(大腸菌)

1700 Hz (ビブリオ菌)

真核生物の鞭毛- 微小管-ダイニン系- 鞭打ち運動- ATPがエネルギー源

Sperm

精子、ユーグレナ、クラミドモナス等

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細菌の持つタンパク質分泌装置
宿主細胞
べん毛、線毛毒素
T2SS

外膜

T5SS

T7SS

T8SS
T9SS

細胞膜

T1SS

T4SS

Secトランスロコン

T6SS

T3SS
(III型分泌装置)→細菌べん毛やインジェクチソームの構造構築・エフェクター分泌に働く
Desvaux et al, 2009, Trend Micro. 4

III型分泌装置系
Salmonella enterica

52050年での薬剤耐性菌による死亡者数の推定
耐性化の原因• 排出ポンプ• 変異による作用点の変化• バイオフィルム

臨床における対策• 適切な抗菌薬の使用• 薬剤耐性菌の拡大阻止• 新規抗生物質の開発
では、基礎研究でできることは、、→細菌の生理活性や機能をコント
Antimicrobial Resistance: Tackling a crisis for the health and wealth ofnations The Review on Antimicrobial Resistance Chaired by Jim O’Neill
December 2014

ロールする新規手法の発見・開発
できたら素晴らしいのでは？

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病原性細菌はテロリスト？
細菌べん毛や線毛などの運動器官→乗り物で都市に侵入

コロニー＆バイオフィルム
形成→潜伏・拠点作り

毒素、エフェクター、分泌装置→爆弾や銃器で攻撃

細胞傷害・細菌叢の乱れ→インフラや住民に危害

免疫・細菌叢による病
原菌排除→警察・自警団による治安維持

抗生物質投与→無差別爆弾投下(効果は抜群！
しかし、周囲に被害も、、、)
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III型分泌装置阻害剤の一例

Iwatsuki et al 2008

Aiello et al 2010

Kauppi et al 2003
Nordfelth et al 2005

遺伝子発現やIII型分泌装置の構築・分泌過程のどこかを阻害している。
→作用点が不明
阻害剤探索系の問題点
細菌細胞に対する実験系は、栄養状態などグローバルな遺伝子発現の変化が、III型分泌装置の発現・構築・機能に影響するため、阻害剤の効果の検証が難しい。
→特定タンパク質や、特定の機能に絞って阻害剤探索する必要性
8複雑なべん毛遺伝子群の発現制御
Class 1細胞の生理状態
栄養状態
外環境からの刺激

FliZ

flhDC
70

特定タンパク質(ターゲット！)

FlhD4C2
complexFliT

ロッド

Class 3flgAMN
flgBCDEFGHIJKL
flhBAEfliAZYfliDSTfliE
fliFGHIJK
fliLMNOPQR

flgMN
flgKL
fliAZYfliC
fliDST
fljBA
motAB-cheAW
Tar-cheRBYZ
tsraerFliA(28)

FlgM-FliA (28)complex

フィラメントフックClass 2FlgM

FlgN-FlgK/FlgL complex
complexFlgN FliT-FliD
FliS-FliC complex

特定の機能：分泌(ターゲット！)
外膜細胞膜

FliK
FlgM
Rod/hook-type

Filament-type

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研究目的
III型分泌装置による分泌自体を阻害する薬剤の開発

問題点：
1. III型分泌装置によるタンパク質の分泌機序の理解• エネルギー源はどのように使われているのか？
• 一分子レベルでの分泌過程は？
2. 細菌細胞(in vivo)での実験系は、グローバルな遺伝子発現の変化が、III型分泌装置の構築・機能に影響する。
• 細胞内の栄養・エネルギー状態が変わるだけでも遺伝子発現が影響受けるため、阻害剤の効果の検証が難しい。

解決策：
遺伝子発現に影響を受けず、条件を厳密に制御可能な、生化学的なin vitroでのタンパク質分泌再構成系の構築
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反転膜小胞を用いたin vitro分泌測定系
アプローチ１：III型分泌装置の精製・脂質膜再構成➔難易度が高すぎる
1. 膜タンパク質複合体
2. 約200サブユニット、分子量7MDa以上アプローチ2：反転膜小胞を用いたin vitro再構成
1. 細胞質側が外側を向くため、条件を制御しやすい
2. 精製する必要がない
サルモネラ菌細胞

反転膜小胞

細胞質
細胞外側
細胞外

細胞質側

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電子線クライオトモグラフィーによる反転膜の観察
IMVfliHI+

IMVΔfliHI
FlhA

C-ringFliH/FliI

Titan Krios (FEI), 300kV, Tilt angle: ±70
camera: direct detector (Falcon II)

Terashima et al, mBio, 201812

反転膜小胞を用いたin vitro分泌計測系

反転膜pH6.0
300mM NaCl

ADP
ATP

H+H + H + H+H+ H + +H+HFoF1-ATPase
H+

プロトン駆動力反転膜内へ輸送された基質タンパク質の検出

pH7.5115mM K+
5mM MgCl2

III型分泌装置
ATPADP べん毛軸構造タンパク質

III型分泌装置のタンパク質分泌のためのエネルギー源
1: プロトン駆動力が分泌を駆動
2: ATP加水分解エネルギーが分泌を促進

Terashima et al, mBio, 201813

反転膜小胞内へのべん毛タンパク質の輸送

プロトン駆動力依存的な分泌

ATP加水分解エネル
ギーによる分泌促進

Terashima et al, mBio, 201814

III型分泌装置に対する阻害剤の探索・開発
蛍光標識した基質タンパク質を使った実験の場合。

問題点• 蛍光標識した基質タンパク質では、超遠心で反転膜を回収しないと、小胞内と外の蛍光を区別できない。
↓解決策• 小胞内に輸送されたときだけ蛍光を発するような実験系を作る。

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III型分泌装置に対する阻害剤の探索・開発
サルモネラ菌細胞

LacZのα相補性を使った実験の場合

細胞質

細胞外

LacZΩを含む菌懸濁液
で反転膜を作製する
反転膜小胞細胞外側細胞質側16LacZα融合基質タンパク質の機能確認

Salmonella ΔflgD/pBAD33-flhB + pTrc99aNde-flgD
TG 0.3% agar plate, 30ºC, 6hrs

FlgDLacZα ②FlgDLacZα ①FlgD

細胞抽出液

vec

FlgDLacZα ②flgDlacZα
コロニー12FlgDLacZα ①

培養上清

vec

vector flgD WT

細菌細胞からのタンパク質分泌

FlgD

軟寒天培地中での運動のアッセイ

FlgDLacZαFlgDa-FlgD

LacZα融合基質タンパク質(FlgDLacZa)は機能的であり、細胞からべん毛III型分泌装置を介して培養上清中に分泌される。
17マイクロプレート上での輸送活性測定
Fluorescence intensity

2500

タンパク質分泌に伴う蛍光強度の上昇

2000
1500

課題：
バックグラウンド蛍光の問題

1000
500032FlgDLacZa

25kDa

12uM 12uM 0uM 0uM 0uM 12uM 12uM 12uM FlgDLacZa
0mM 5mM 0mM 1mM 5mM 0mM 1mM 5mM ATP
0uM 0uM 1uM 1uM 1uM 1uM 1uM 1uM

Spider-bgal
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III型分泌系阻害剤は何に使える？
腸内細菌叢には、べん毛を持つ菌も持たない菌もいる。
↓阻害剤でべん毛形成を阻害したら何が起きる？
↓誰も知らない！！
もしかしたら腸内細菌叢の構成が大きく変化し、宿主に大きく影響するかもしれない。
↓良い影響？悪い影響？
乳酸菌などはべん毛を持たないし、腸内で優勢な嫌気性菌もべん毛を持たないことが多い。
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III型分泌装置系
Salmonella enterica

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細菌べん毛からインジェクチソームへの進化

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人工進化実験

病原性が上がった変異体の取得繰り返し感染させる（腸内での選択圧）

遺伝子操作
べん毛からインジェクチソームの病原性タンパク質が分泌されるようにしたサルモネラ菌変異体

ゲノム解析
どのような変異が起きると、べん毛からインジェクチソームへの進化が促進されるのか、実験的に証明する。
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