●プリオン病――［ II ］プリオン蛋白の代謝とプリオン複製

3．プリオン類似分子―Doppel―
片峰

茂＊

われわれは，近年 PrP 遺伝子の 16 kb 下流に PrP 類似蛋白（PrPLP!
Dpl）をコードする新規の遺伝子を見いだした．PrP と PrPLP!
Dpl の相同性は一次構造レベルでは25％ 程度であるが，ともに GPI アンカー型膜糖蛋白であり，後者が N 末の繰り返し配列領域を欠く以外は類似した二次構造を有する．
そもそも PrPLP!
Dpl は，加齢にしたがい Purkinje 細胞変性をきたす系統の PrP
遺伝子欠損マウス（Ngsk-Prnp0!0）の神経細胞で，異所性に発現する遺伝子として同定したものである．Ngsk-Prnp0!0 では，PrP 遺伝子スプライス・アクセプター破壊に基づく遺伝子間スプライシングというユニークな機構により，PrPLP!
Dpl が PrP 遺伝
子プロモーターにドライブされて神経細胞に発現する．Purkinje 細胞変性が起こらなでは PrPLP!
Dpl の発現はない．
い 2 系統の PrP 欠損マウス（Zrch-and Rcm-Prnp0!0）0!
0
Ngsk-Prnp の Purkinje 細胞変性は，野生型 PrP 遺伝子再導入により回避されるこの機能消失ととはすでに判明しているため，この神経細胞変性には正常 PrP（PrPc）
PrPLP!
Dpl の異所性発現の 2 要因が必要であることが強く示唆された．
（PrPLP!
Dpl
同じころ，スイスのグループが Zrch-Prnp0!0 に N 末領域欠損型 PrPと類似の構造）を発現させると，同様の神経細胞死が起こることを明らかにした．すな
Dpl（あるいは N 末領域欠損型 PrP）
わち，PrPc と結合する未知の機能分子を PrPLP!
が占拠し，細胞生存に必須のシグナル伝達を阻害する（あるいは細胞死シグナルをプロモートする）との仮説が成立する．
プリオン病では，構成的 PrP 立体構造変換により PrPc の機能消失が起こり，蓄積しが PrPLP!
Dpl と同様の機能を果たすとすれば，Ngsk-Prnp0!0 は格
た異常 PrP（PrPSc）
好のプリオン病神経変性モデルということになる．実際われわれは，最近 NgskPrnp0!0 の中枢神経系に生後早期よりプリオン病の特徴的病理所見であるグリオーシスが起こることを見出した．
初のプリオン類似蛋白である PrPLP!
Dpl は，その生理機能や「第 2 のプリオン」としての病原性の有無など興味の尽きない分子であり，プリオン研究におけるその重要性は大きい．

Molecular and biological aspects of a novel prion-like protein, Doppel.
SHIGERU KATAMINE Department of Cellular and Molecular Biology, Nagasaki University, Graduate School of Biomedical Sciences

かたみね・しげる：長崎大学大学
院医歯薬学総合研究科感染分子病態学教授．昭和51年長崎大学医学部卒業．昭和58
年長崎大学医学部
助手．昭和60
年米国国立がん研究所国際研究員．平成３年長崎大学
医学部助教授．平成10年現職．主研究領域／ウイルス学（プリオン，HTLV-1）．
＊Key words

プリオン類似蛋白
神経変性
遺伝子改変マウス
RN
Aスプライシング

プリオン病 65

がって，PrPc は中枢神経系で必須の生理機能

1．プ リ オ ン 蛋 白 欠 損 マ ウ ス（NgskPrnp0!0）の作製を有すると想像される．作製した PrP 欠損マウスに特発性に何らかの異常が出現すれば，生理機能解明の大きな手がかりとなる．PrP

1982 年 Prusiner 博士によりプリオン仮説

欠損マウスは正常に発生し，生後の発育も良が Science 誌上に発表され，世界に衝撃を与好で，50 週齢（1 年）を過ぎても何の異常も観えた．その後の紆余曲折を経て，現在の仮説察されなかった．ところが，70 週齢を過ぎたでは「α-helices 構造主体の正常プリオン蛋白ころより歩行異常と振戦が出現し，以後増悪（PrPc）の，β-sheet 構造に富む異常プリオン蛋した．病理検索の結果，加齢とともに小脳ScSc白（PrP ）への立体構造変換に基づく PrP のPurkinje 細胞の変性・脱落が惹起されること蓄積がプリオン病の本態であり，感染因子プが判明した2）．続いて西田が，行動学試験にリオンの本体は PrPSc そのものである」と説より PrP 欠損マウスには記憶・学習などの明される．遺伝子（核酸）の関与なしに蛋白質高次大脳機能にも障害があることを明らかに分子そのものが感染・増殖の実体として挙動した3）．すなわち，PrPc は神経細胞の生存維するというこの仮説の検証は，生物学史の中持・機能発現に重要な機能を有し，その機能でも重要な意味をもつ．1990 年代に入り，動不全により神経細胞の機能障害，ひいては変物個体レベルでの遺伝子改変技術が一般化し性が起こることを強く示唆するものであった時点で，「PrP が存在しない個体では，プリた．このことは後日，PrP 欠損マウスに正常オンの感染・増殖やプリオン病発症は本当にPrP 遺伝子を再導入することで神経症状の出起こらないのか」という最も直截的な仮説検現が回避されることにより証明された4）．

証実験が可能となった．坂口らは，筆者の畏友である野田哲生博士（癌研究所）の協力を得て PrP 欠損マウスを作製し，福岡 1 株を脳内に接種した．果たして，PrP 欠損マウスは600 日以上の長期観察でもプリオン病を発症
Sc

3．PrP 類似蛋白をコードする新規遺伝子の発見
この時点で，大きな謎がひとつ残った．そすることなく，PrP の蓄積やプリオン感染価れは，われわれのマウス（Ngsk-Prnp0!0）でみの 増 殖 も 全 く 起 こ ら な か っ た1）．相 前 後 しられた Purkinje 細胞変性が，スイスおよび英て，世界の 2 施設からも同様の成績が発表さ

国 で 作 製 さ れ た 2 系 統 の PrP 欠 損 マ ウ ス

れ，PrP が発症とプリオン増殖に必須であり，（Zrch-and Rcm-Prnp0!0）
では起こらず，この表PrPc から PrPSc への構造変換が病気の本態で現型の乖離をどう説明するかという点であっあることがほぼ証明された．これはプリオンた．
Li Aimin らは，両者の PrP 遺伝子破壊範囲仮説を強力に支持する知見であり，1997 年のが異なり，Ngsk-Prnp0!0 の破壊領域のみがイPrusiner 博士ノーベル賞受賞に大きく貢献しントロンのスプライス・アクセプターにまでたものと考えている．

及ぶことに目をつけ，「Ngsk-Prnp0!0 の PrP ゲノム領域が非通常の転写産物をコードする」

2．プリオン蛋白の生理機能との仮説のもと検索を開始した．そして遂に
Ngsk-Prnp0!0 の中枢神経系でのみ発現する非PrP 遺伝子は全ての哺乳動物に保存されて通常 mRNA を同定したのである．構造解析の存在し，特に中枢神経系で高発現する．した

結果，PrP 遺伝子スプライス・アクセプター

66 第 121 回日本医学会シンポジウム

破壊に基づく遺伝子間スプライシングというDpl と類似の構造）を発現させると同様の神ユニークな機構による，PrP 遺伝子と下流の経細胞死が起こることを明らかにした．すな

新規遺伝子の癒合 mRNA であることが判明

わ ち，PrPc と 結 合 す る 未 知 の 機 能 分 子 を5）した ．この mRNA は下流遺伝子の翻訳領域

PrPLP!
Dpl（あるいは N 末領域欠損型 PrP）が全長を含むため，PrP 遺伝子プロモーターに占拠し，細胞生存に必須のシグナル伝達を阻

ド ラ イ ブ さ れ て，下 流 遺 伝 子 産 物 が Ngsk-害する（あるいは細胞死シグナルをプロモー0!
0の神経細胞では異所性に発現する．米トする）との仮説が成立する．プリオン病で国の Prusiner のグループも，異なるアプロー

は，構成的 PrP 立体構造変換により PrPC の機

チから PrP 遺伝子の下流の遺伝子を同定し，能 消 失 が 起 こ り，蓄 積 し た PrPSc が PrPLP!

その産物を Doppel と命 名 し た6）．驚 い た こ

Dpl と同様の機能を果たすとすれば，Ngsk-とに，この新規遺伝子産物（PrPLP!
Dpl）は，Prnp0!0 は格好のプリオン病神経変性モデル

PrP の N 末領域約 100 アミノ 酸 を 欠 く 以 外ということになる．新らは，Ngsk-Prnp0!0 の中は PrP と 高 い 相 同 性 を 有 す る 膜 糖 蛋 白 で枢神経系に生後早期よりプリオン病の特徴的Prnp

5）あった（図）．

病理所見であるグリオーシスが起こることを見いだし，この考えをさらに支持した7）．

4．異所性PrPLP!
Dpl発現と神経細胞死
この時点で，Ngsk-Prnp0!0 の Purkinje 細胞

5．PrPLP!
Dpl の正常マウスにおける発現と生理機能変性には PrPc の機能消失と PrPLP!
Dpl の異所性発現の 2 要因が必要であることが強く

正常マウスの各臓器 に お け る PrPLP!
Dpl

示唆された．同じころ，スイスのグループがmRNA の 発 現 を in situ hybridization に よ り0!
0

Zrch-Prnpに N 末領域欠損型 PrP（PrPLP!

調べると，成体マウス脳組織では発現は認め

S-S
S-S
Dpl
A
124

B
99
CHO

C
155

111
CHO
S-S179GPIPrP
A
12358

89

Signal peptides
A,B,C：helix domains

C180 198
CHO CHO

Repeat region
CHO：Glycosylation sites

図B232

254

GPI

C-terminal hydrophobic region
GPI：Glycosylphosphatidylinositol anchor

Dpl!
PrPLP と PrP の構造比較

プリオン病 67

られなかった．しかしながら，新生児マウスれた．また，プリオン接種 Ngsk-Prnp0!＋マウス

脳では生直後から PrPLP mRNA の発現が認

脳内にはプロテアーゼ抵抗性 PrPLP!
Dpl はめられ，生後 6 日にそのピークを迎え，その検出されず，プリオンによる PrPLP!
Dpl 構造後減少し，8 週には検出できなくなった．第変換を示唆する証拠は得られなかった．さら8 因子抗体の免疫組織化学との二重染色によに，プリオン接種 Ngsk-Prnp0!＋マウス脳乳剤

り，新生児マウス脳における発現細胞は，血を，PrP は発現せず PrPLP!
Dpl のみを発現す

8）

管内皮細胞であることが明らかとなった ．

る Ngsk-Prnp0!0 マウスに脳内接種したが，接この時期は脳血管内皮細胞の増殖が最も顕著

種後 400 日以上経過しても発症はみられてであることから，PrPLP!
Dpl の血液脳関門形

い な い．す な わ ち，プ リ オ ン に よ っ て は成における役割を推測させる．成体マウス組

PrPLP!
Dpl の構造変換を誘導することはで織では精巣に高い発現を認める．最近，スイきず，病原性も獲得しないことが示唆された．

スで樹立された PrPLP!
Dpl 欠損マウスの雄に，高頻度に不妊が認められるとの報告がなされている．

6．PrPLP!
Dpl によるプリオン病の病態修飾の可能性の検討
PrPLP!
Dpl は初のプリオン類似 蛋 白 で あり，立体構造変換による病原性獲得の可能性（第 2 のプリオンの可能性）が最大の興味である．また，PrP との相同性から，PrPLP!
Dplの神経細胞における発現がプリオン病における PrPSc の蓄積あるいは病態に影響を与える可能性があり，遺伝子改変マウスを用いて検討した．まず，神経細胞で PrPLP!
Dpl を異所性に発現するマウス（Ngsk-Prnp0!＋）にプリオン（Fukuoka-1 株）を脳内接種し，発症までの潜伏期，病理変化，PrPSc 蓄積を解析し，PrPを同等レベルに発現するが PrPLP!
Dpl は発現しないマウス（Zrch-Prnp0!＋）と比較検討した．両者の潜伏期の平均はそれぞれ 282±23および 286±27 日と有意差を認めず，病理学的にも同様の部位（大脳皮質と海馬）に同レベルの海綿状変性とグリオーシスが検出された．蓄積した PrPSc 量にも差はなく，糖鎖付加パターンも同様であった．すなわち，PrPLP!
Dpl はプリオン病マウスモデルにおいては，その病態を正にも負にも修飾しないと結論さ
68 第 121 回日本医学会シンポジウム〔文献〕
1）Sakaguchi S, Katamine S, Shigematsu K, et al . : Accumulation of proteinase K-resistant prion protein is restricted by the expression level of normal PrP in miceinoculated with a mouse-adapted strain of theCreutzfeldt-Jakob disease agent. J Virol 1995 ; 69 :7586―7592.
2）Sakaguchi S, Katamine S, Nishida N, et al . : Loss ofcerebellar Purkinje cells in aged mice homozygous for
disrupted PrP gene. Nature 1996 ; 380 : 528―531.
3）Nishida N, Katamine S, Shigematsu K, et al . : Prionprotein is necessary for latent learning and long-term
memory retention . Cell Mol Neurobiol 1997 ; 17 :537―545.
4）Nishida N, Tremblay P, Sugimoto T, et al . : A mouseprion protein（PrP）transgene rescues Purkinje celldegeneration and demyelination in mice deficient forPrP. Lab Invest 1999 ; 79 : 689―697.
5）Li A, Sakaguchi S, Atarashi R, et al . : Identification of
a novel gene encoding a PrP-like protein expressed as
chimeric transcripts fused to PrP exon 1!2 in ataxic
mouse line with a disrupted PrP gene. Cell Mol Neurobiol 2000 ; 20（5）: 553―567.
6）Moore RC, Lee IY, Silverman GL, et al . : Ataxia inprion protein（PrP）deficient mice associated withupregulation of the novel PrP-like protein doppel .
J Mol Biol 1999 ; 292（4）: 797―817.
7）Atarashi R, Sakaguchi S, Shigematsu K, et al . : Abnormal activation of glial cells in the brains of prion
protein-deficient mice ectopically expressing prion
protein-like protein, PrPLP !Dpl . Mol Med 2001 ; 7（12）: 803―809.
8）Li A, Sakaguchi S, Shigematsu K, et al . : Physiologicalexpression of the gene for PrP-like protein, PrPLP!
Dpl, by brain endothelial cells and its ectopic expres-sion in neurons of the PrP deficient mice ataxic due toPurkinje cell degeneration. Am J Pathol 2000 ; 157（5）: 1447―1452.

片峰

同腹のワイルドタイプです．ヘテロ

ザイガスブリーディングを行ったときに出てくる同腹のワイルドタイプをコントロールに使っています．
座長

質疑応

答

そうしますと，Doppel はある時期ワイルドタイプのマウスできちんと発現している遺伝子であるといってよいわけですね．

座長（品川） どうもありがとうございまし片峰

成体の脳では発現はありませんが，た．それではどなたかご質問がございますで新生児期には発現があります．あるいは睾丸

しょうか．

や心臓では正常に発現があります．

小野寺

節（東京大） 小脳の Doppel を染め出しておられて，プルキンエ細胞がよく染座長

最初にそれをわかっていただいたう

えで，山内先生，どうぞ．

まっていますが，周りの顆粒細胞も染まって山内一也（日本生物科学研） いまの続きでいたような染まっていなかったような感じにすが，そうしますとワイルドタイプの場合に見えますが，あそこも多少は染まっているのも，Doppel は同じ PrP のプロモーターを使っですか．て い ま す か．そ れ と も Doppel 特 有 の プ ロ

片峰

染まっています．

小野寺

それは量が少ないから，顆粒細胞モーターがあるのですか．
片峰

Doppel 特有のプロモーターがあっのほうでは細胞死が起きないということですて，それがドライブするかたちで睾丸や内皮，か．

心臓には出ています．ところが私たちのノッ

片峰

PrP のプロモーターにドライブされクアウトマウスで は，ど う い う わ け か PrPて全部発現しているわけですから，私たちののプロモーターにドライブされて，intergenic

ノックアウトマウスには PrP の発現レベルsplicing という非常に珍しいメカニズムで発と同じ Doppel の発現があります．そういっ現しています．

た意味では，海馬の錐体細胞にも非常にたくさん発現しています．
小野寺
片峰

あれは mRNA ですか．

山内

そ の と き に は Doppel の プ ロ モ ー

ターは働いていないのですか．
片峰

先ほど小野寺先生が言われました

はい．でも海馬の錐体細胞は死にまが，非常におもしろいことがあって，もともせん．
グリア細胞もいまのところ死にません．と Doppel 特有のプロモーターがアクティブ

これが何を意味しているのか，なぜプルキンな組織，たとえば睾丸や心臓といったところエ細胞だけなのか，いつも聞かれるのですが，では，intergenic splicing は起こりません．私

いまのところお答えできるエビデンスを持ちたちのマウスでもともと Doppel のプロモーません．

ターがサイレントな組織，たとえば成体の脳座長

私が誤解しているかどうかわからなのニューロンが典型的だと思いますが，そこいものですから，まず確認したいと思います．

では intergenic splicing が非常に効率よく起この Ngsk-Prnp，プリオン蛋白のノックアウこって，あのように出ます．ただし RT-PCR

トは 0!
0 でよいわけですが，＋!
＋というので見ると，非常に少ない量ながら正常のマウはあとから入れてレスキューしたものです

スでも intergenic splicing は起こっています．

か．それとも完全にワイルドタイプですか．

ひょっとしたら intergenic splicing 自体，生理プリオン病 69

学的に何か意味があるのかもしれません．
山内

この Doppel の場合も，PrP と同様，かなり下等な動物からずっと保存されているのでしょうか．
片峰

常プリオンの感染力との関係はいかがでしょうか．
片峰

それは抄録に書きましたが，もう一つ非常に重要なポイントは，初めてプリオン私たちは行っていませんが，Prusi-蛋白とホモロジーがある蛋白質が見つかった

ner のグループのデータでは，少なくとも哺ので， Doppel がプリオン蛋白と同じように，乳類では保存されています．

プリオンとしての挙動をするのかどうか．あ八谷如美（国立精神・神経セ神経研） 教える い は conformational change で 病 原 性 を 発ていただきたいのですが，新生児の睾丸で一揮する可能性があるのかどうか．そこは非常時的に発現ということですが，胎児では見らにおもしろいところだと思います．

れたことがありますか．また，最後のスライ

少なくともいま私たちが持っているデータ

ドで Doppel だけが出ているところと PrP だ

では，PrP プリオンでは何も起きません．たとけが出ているところがあったと思います．な

えば脳で Doppel が過剰発現しているマウス

ぜそういう分布になるのか，その特異性につに，プリオンを打ち込んでも何も起きません．

いて，何か知見があるのでしょうか．

ただし，以前金子先生が行われたように，試片峰

胎児はけっこういろいろなところに

験 管 の 中 で Doppel 自 体 の コ ン フ ォ ー メ ー発現があって見にくいのですが，血管の内皮ションを β シートに変えたときに，正常の細胞には確実に出ています．二つ目は何の特Doppel が conformational change を 起 こ し て異性でしたか．

病原性を発揮する可能性はまだ残っていると

八谷

最後のほうのラットの睾丸の切片の思います．ただ，Prusiner のグループも言ってスライドで，Doppel だけが染まっているとこいるように，SS 結合が一つか二つかというのろ，PrP だけが染まっているところ，Doppelはきわめて重要なところで，ひょっとしたらと PrP 両方が染まっているところがありま

第 2 のプリオンの可能性は少ないかもしれました．そういう特異性ができる仕組みはどうせん．

なっているのですか．
片峰座長

最後に教えていただきたいのは，わかりません．あれはたまたまだとノックアウトマウスをつくる場合，いまは構思いますが，精巣というのは一方で細胞が分造遺伝子ばかりいじっています．そうではな

裂していて，一方でどんどん死んでいるといく，プロモーター自身をつぶすという考え方う組織なので，PrP と Doppel と両方あったりはないのでしょうか．

片方だけあったりするのは，何かそういうことが起こっているのではないかと言いたいわ

片峰んが，プロモーターが特定できていれば．
座長

けです．

そのあたりについて私はわかりませ
プリオンの場合は，プロモーターが八谷

では時間の差ということでしょうか．

特定できますね．第 1 エクソンを含めて上流

片峰

それと場所ですね．まだ全然エビデの 1 kb くらいのデリーションを起こしてしンスはありません．蛋白レベルで見ると，実まえば，なくなってしまうだろうと思います．

は精子にもあります．
金子清俊（国立精神・神経セ神経研） 大変重要な点だと思うのでおうかがいしたいのですが，Doppel の過剰発現，ノックアウトと異70 第 121 回日本医学会シンポジウム

片峰

Cryptic なものがなければそれでう

まくいくと思いますが，ほかの先生のほうがよくおわかりかもしれません．
座長

どうもありがとうございました．