分析用超遠心システム

Optima AUC
オプティマ分析用超遠心システムとはOptima AUC
Analytical Ultracentrifugation (AUC)
分析用超遠心システム（Analytical Ultracentrifuge、AUC）

駆使して、溶液中でのタンパク質の挙動の正確な測定が可能です。とは、分離用超遠心機と同様に遠心力を利用して溶液中のタン

また、AUCで測定したデータを最先端のソフトウエアで解析するパク質などの分子を沈降させつつ、その分子の沈降の様子を内ことで、包括的な結果が得られます。

蔵された光学系の検出システムによりリアルタイムに測定できる

AUCは、タンパク質だけでなくそれ以外の物質の分子量や流体解析装置です。

力学的および熱力学的な特性を証明するための、最も汎用性が２種類の光学系（紫外可視吸光測定計並びにレイリー干渉計）を高く、厳密かつ正確な解析装置です。

AUC アプリケーション
沈降係数
分子量
化学量論
タンパク質凝集体
リガンド結合結合効率
多分散性

先 進 的な特 長である新しく画 期 的な多波 長 解 析により、混合物中の複数の発色団を利用したスペクトル分解が可能になり、完全に新しい次元の実験デザインが初めて可能になりました。

Borries Demeler(University Texas Health Science Center)

Brilliance at Every Turn2

利点
サンプル回収が可能
非破壊分析
マトリックスフリー
最小限のバッファー制約
低濃度での検出少ないサンプル容量（最少量：沈降速度法100μL、平衡法 25μL）
標準サンプルが不要
簡便な操作性新しいOptima AUCは、15インチのタッチスクリーンにより、操作性が大幅に向上しました。さらに、光学系はロータチャンバーの外側に収納されており、光学系は汚れることなく、ツマミを回すだけで簡単にセッティングが完了できます。光学系の性能も一新し、迅速なスキャンと波長再現性の改善により、多波長分析が可能になりました。このため、最大同時20波長測定できる多波長分析により、複数の発色団を利用した分析が可能です。また、迅速なスキャンにより、より大きな複合体や重たいナノ粒子の測定ができます。

使い勝手と光学系を一新

より正確に、より再現性高く、より簡便に
次世代 分析用超遠心システム

3

分析用超遠心システムの原理
レイリー干渉計

60,000 rpm
290,000 xg

紫外可視吸光測定計

光ロータ

20℃

遠心しながら沈降の様子を継続的にスキャン

紫外可視吸光測定計

光学系

レイリー干渉計AȦMeniscus

ウィンドウ

BottomAirSolution

サンプル浮力

ウィンドウ

摩擦力

遠心力

速度r=0arb

Svedberg の式
移動してスキャン

検出器§ dr ·¨ ¸© dt ¹
Z 2r

m 1 vUf

M 1 vU{sNA f

分析用超遠心システムは、「遠心中に起こるサンプルの沈降の様入れ遠心します。回転数と温度を制御しつつ、セルが光学検出器子を測定することができる装置」です。データは、ロータ内のセの上を通過するタイミングを合わせて光をあて、セル内の沈降ル中の各位置での濃度のグラフとして得られます。濃度情報はの様子（濃度勾配）を測定します。さらに時間を追ってスキャンを溶質の光学的吸収または干渉縞の変位として記録されます。試繰り返すことで経時的な沈降の様子（濃度勾配）の変化を記録し料となる溶液を上下が光を透過するウィンドウに挟まれたセルにていきます。

AUCの光学系としては、2種類使用できます。
• 紫外可視吸光測定計
吸収光学系では光源にキセノンフラッシュランプを使い、回転ミングを合わせて光を当てます。さらにセルの半径方向（回転中のセル（対照セルとサンプルセル）に、ある波長（ＵＶや可視の中心側から外側の方向）に沿って、スキャンをして各位置での光）の光を照射します。数万回転で回っているセルに対してタイサンプルによる吸光度を記録します。

• レイリー干渉計

干渉縞（フリンジ）

干渉光学系には光源にレーザーを用い、2つの小さいスリットでセル全体の画像としてとらえ、そこから濃度レーザー光を分離し、対照となる溶媒側セルとサンプルが含まれる情報を得ることができます。干渉光学系は溶液側セルにそれぞれ照射されます。セルを通過した光が作る屈吸収を持たないサンプルや高濃度溶液の折率の違いから生じる干渉縞（フリンジ）を、高感度CCDカメラで、サンプルに対して有効な検出法になります。 Meniscus

Brilliance at Every Turn4Bottom

AUCには、2つの解析方法があります。
分かること
Main Peak (Monomer) 45.5%

0.40.30.20.1002468□ 沈降係数
□ 分子量

Heptamer 0.1%

0.5

Hexamer 0.4%

0.70.6

Tetramer 5.3%

Dimer 30.6%

0.8Pentamer 1.4%

1.00.9Trimer 14.6%

沈降方向

Normalized c(s) [Total Area =1]

(Abs)

沈降速度法

10 12 14 16 18 20 22 24

Sedimentation Coefficient (Svedbergs)□ 形状□ 均一性
□ 分散性

沈降速度法は、タンパク質などの溶質分子がサンプルセルの底選択される手法です。この沈降の様子から、分子量、形状や分散に到達するまでの分子の沈降の様子を経時的に測定する時間依性などの情報を得ることができます。

存的な解析方法で、最新のAUCのアプリケーションでは最初に沈降平衡法

分かること
□ 分子量
In Abs

沈降方向
この直線の傾きで分子量が計算できる□ 分散性□ 相互作用

半径の二乗（r2–r02）

沈降平衡法は、タンパク質などの溶質分子がサンプルセルの底よって移動し、分子の濃度勾配ができます。その後、分子の沈降に沈降しないような低い遠心力で遠心し、分子を平衡状態に到達と拡散がちょうど釣り合ったとき、この濃度勾配は収束し、分子はさせてから測定する非時間依存的な解析方法です。遠心を開始平衡状態となります（上図の左、赤線の状態）。平衡状態のカーブ

すると、サンプルセル内部の溶質分子は沈降と拡散の2つに力にから、検量線によらない分子量を決定することができます。

ウィンドウ

サンプルセル

分析用セルの断面図（正面が沈降方向）

5医薬品開発での分析用超遠心システム（AUC）の使用用途基礎研究ステージ• ウイルスベクター開発
治療用遺伝子を導入したウイルスベクターの性状解析が可能です。アデノ随伴ウイルスベク
ター等研究開発者にとって、Optima AUCは強力なツールとなります。

• タンパク質の性状解析
AUCはタンパク質を溶液の状態のままで、分子量測定や純度検定が可能なゴールドスタンダードです。さらに、溶液中でのタンパク質のコンホメーション変化、均質性、形態に関する情報を得ることができます。

• 医薬品の特性評価
AUCは、抗体医薬品（ADCs）やナノ粒子と低分子医薬品の複合体の特性評価において、日常的に使用されています。

AUCから得られる結果は明確で信頼性があり、また再現性もあります。巨大分子の特性解析やタンパク質相互作用解析などの研究にはAUCが最適です。このため、私はAUCを選択します。

Jia Ma, Ph.D. Director BioanalyticalCore, Purdue University

Brilliance at Every Turn6我々のサンプルのコンホメーションの不均一性とその大きなサイズのためほかの分析手法では不可能でしたが、AUC の沈降速度法の実験により製剤開発ステージ

クロマチン凝集メカニズムについての多くの発展性のある研究結果が得られました。

Jeffrey C. Hansen, Ph.D., Colorado State University• 製剤• 凝集物の確認

AUCは溶液の状態で測定が可能でAUCにより、ペプチドやポリマーの分子の状態（立体構造や安定すので、製剤の溶媒条件検討、滴定、性）を分析することができます。

製剤化の研究に最適です。

特に、溶液中でのペプチドなどの分子同士の非共有結合的な凝集物の分析にAUCは有効です。

USP Insulin Assembly

ペプチドポリマー• ナノ粒子AUCは、製剤を包括する前後のナノ粒子におAUいて粒子径測定や形状の変化を調査するのに有効です。

金ナノ粒子

ミセル

リポソーム

前臨床並びに治験ステージ• ロット間差評価（毒性試験）• 製剤化開発• 製剤評価（特性解析、安定性、ロットリリース試験）• 医薬品の加速安定性試験• 製造方法バリデーション（ストレス試験）

7

■ 凝集物の確認- 分散性・凝集性評価 -沈降速度法

0.1%の凝集体を定量可能モノクローナル抗体製剤に含まれる凝集物の解析
モノクローナル抗体製剤などのバイオ医薬品において、その会合体の存在は薬効に影響を及ぼし、副作用の原因となりえます。このため、さまざまな研究開発ステージにおいて、バイオ医薬の原料並びに製剤の凝集体を解析することはきわめて重要です。
バイオ医薬品の品質管理は、「生物薬品（バイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医薬品）の規格及び試験方法」に準じ実施されています。AUCはバイオ医薬品中の凝集物を0.1%オーダーで定量できることから非常に重要な分析方法に位置付けられており、FDA (Food and Drug Administration, USA）は、バイオ医薬品の品質管理技術としてAUCを高く評価しています。

図B 製造直後のモノクローナル抗体試料の沈降係数分布

沈降速度法において、モノマーにくらべて凝集体は速く沈降します。この沈降の様子から沈降係数の分布として凝集体の含量を測定することができます（図A）。
図Bは、製造直後のモノクローナル抗体試料の沈降パターンから、2つのロットの違いを解析した沈降係数分布です。2%以下しか含まれない凝集体の存在が確実に定量的に測定されているとともに、わずか0.1%の凝集体も検出できます。
図Cは、過酷試験により凝集体を形成させたモノクローナル抗体試料の測定結果です。各凝集体の割合を正確に得ることができ、Heptamerが0.1%含まれていることも分かります。

図C
図A

過酷試験後のモノクローナル抗体試料の沈降係数分布

沈降速度法におけるデータ解析イメージ
Source J. S. Philo, Alliance Protein Laboratories■ 相互作用解析

沈降平衡法

担体への固定が不要、溶液中での相互作用解析が可能
溶液中の分子間相互作用解析
AUCはタンパク質などの分子を担体（基盤）等に固定することなく、水溶液のサンプルをそのまま測定することができるので、不自然でない状態での解離定数を求めることができます。例えば、2量体の分子間相互作用を測定する場合、片方を担体に固定したときの解離定数Kʼよりも、溶液状態で測定した解離定数Kの方が、より現実的な値が得られます。

タンパク質A

Brilliance at Every Turn
8タンパク質B

溶液中の会合反応+K+

K

固定した場合の会合反応

担体

■ タンパク質の性状解析

沈降速度法

複合体を構成する分子のモル比の決定が可能
TRAPとanti-TRAPの複合体形成の確認
複合体を形成しているタンパク質の結晶化やX線回析の解析の際に、溶液中で分子同士が何対何で結合しているか示唆するデータを取得することは非常に有用です。
タンパク質 翻 訳を 調 整しているTRAP（trp RNA-Binding Attenuation Protein）
は、anti-TRAPの複合体を形成します。TRAPに対し、anti-TRAPをモル比で0.5、1、2、6、10倍加えて沈降係数の分布がどう変化するか測定した結果が、右図です。anti-TRAPを全く入れていない場合、TRAPの沈降係数は4.7 Sですが、anti-TRAPの含量が増加すると沈降係数が大きい方（右側）へシフトしていきます。6倍以上では、それ以上大きい方へシフトしないことから、TRAPとanti-TRAPが1：6で複合体を形成していることが示唆されます。
この濃度比で結晶化を行い、X線回析データの収集を経て、立体構造の決定することができます。 このように、AUCにより立体構造の根拠を示すデータを得ることができます。

+TRAP

anti-TRAP

TRAP-anti-TRAP complex

Watanabe, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 106(7):2176-81, 2009

■ ウイルスベクターの開発

沈降速度法

ウイルスに内包された核酸量を推定可能
アデノ随伴ウイルスの解析
アデノ随伴ウイルス(AAV)は遺伝子治療のアプローチに使用され、治療用大きくなり、沈降係数も大きくなります。このため、沈降係数から導入さ遺伝子が導入されていないAAVと導入されたAAVを見分けることは、治れている遺伝子量を推察できることから、作成した、AAVの品質管理等に療効果や副作用に関わるため非常に重要です。内包された遺伝子量に応使用することができます。

じてAAV粒子の密度が変化します。つまり、遺伝子量が多いほど、密度がEmpty Particle0.8

Normalized c(s)Normalized c(s)Empty Particles
31.32 g/cm
63-64 S

64S

0.6
0.4
0.2
0

Full Particle

11020406080

100120140

Sedimentation Coefficient (Svedbergs)

0.8
93S
0.6
0.4
0.2
0050

100

150

Full Particles
31.41-1.45 g/cm
75-110 S

Sedimentation Coefficient (Svedbergs)

B.Burnham, et.al, HUMAN GENE THERAPY METHODS, Vol26 No6, 20159

■ ナノ粒子

沈降速度法

0.1 nmの驚異的な分解能似て非なる物質の解析が可能

白金コロイド分析データ

カーボンナノチューブ分析データ

直径が0.1 nm異なるコロイド粒子の分布を測定できます。

単層カーボンナノチューブ（SWCNT）と２層カーボンナノチューブ(DWCNT)を簡単に区別することができます。

0.450/50 DW CNT +(6.5) SWCNT

0.12

Normalized c(s)

0.6

0.14

1.92 nm0.8IntegralDifferential

1.30 nm1.40 nm1.50 nm1.59 nm1.68 nm1.77 nmSum of mass fractions

1.0

0.83 nm

0.2

0.10

SWCNT

0.08
0.06
0.04

DWCNT

0.02

0.0
0.4

0.6

0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Particle diameter [nm]

1.8

0.00

2.015

H. Cölfen and T. Pauck, Colloid Polym Sci 1997; 275:175-180

新旧比較

30 4560 75 90 105 120 135

Sedimentation Coefficient(Svedbergs)

Beckman Coulter APP Note

Optima AUC vs ProteomeLab
Optima AUC

Optima AUCは、吸光度測定においてデータ取得速ProteomeLab

度が、ProteomeLabよりも12倍以上高く、レイリー干渉測定において、干渉縞が2倍以上多いため、測定誤差が少なく、ノイズが低くなります。そのため、データの再現性が高く、より正確で分解能の高い結果が得られます。 また、データ取得速度が速くなったた
め、より大きい粒子の測定が可能となりました。

主な仕様 *項目
データ取得速度Optima AUC
ABS: <7 sec/cell
INT : <5 sec/scan
20波長

1波長

波長再現性（ABS）± 0.5 nm

± 3 nmレイリー干渉縞数≧10縞/cell≧4縞/cell

ABS: 0.005 ‒ 2 mg/mL
INT : 0.025 ‒ 5 mg/mL* ABS：紫外可視光吸収、INT：レイリー干渉

10ABS: 90 sec/cellINT : 5 sec/scan

最大解析数（ABS）

測定濃度範囲ABS: Luteinizing
Hormone
INT: BSA

Brilliance at Every Turn

ProteomeLab（旧製品）

ABS: 0.005 ‒ 1.5 mg/mL
INT : 0.025 ‒ 4 mg/mL

■ 主な仕様
最高回転数

60,000 rpm

最大遠心力290,000 xg

寸法

940 (W) x 681 (D) x 1,257 (H) mm

重量508.5 kg

電源

AC単相. 200 V, 50/60 Hz, 30 A
Optima AUC■ ロータおよび分析用セル
製品情報
製品番号

製品名

B86436

分析用超遠心システム Optima AUC（紫外可視光吸収）

B86437

分析用超遠心システム Optima AUC（紫外可視光吸収、レイリー干渉）

361964

分析用ロータ An-60 Ti、4穴ロータ

363782

分析用ロータ An-50 Ti、8穴ロータ392773

ダブルセクターフロースルーセルアセンブリ（Epon charcoal-ﬁlled、サファイアウィンドウタイプ）

392772

ダブルセクターフロースルーセルアセンブリ（Epon charcoal-ﬁlled、クオーツウィンドウタイプ）

360219カウンターバランス（おもりセット付）

361318トルクスタンドアセンブリ

An-60 Ti

An-50 Ti

ダブルセクターフロースルーセルアセンブリ

カウンターバランス

ソフトウエア・インターフェース

11

1947

2017

Model E

Optima AUC

Beckman CoulterおよびBeckman Coulterロゴは、Beckman Coulter, Inc.の商標です。

注意 正しく安全にお使いいただくために、ご使用の前に必ず「取扱説明書」をお読みください。

B90042 2018.10-2000（L）