永田・田島・塩村：ANAMMOX菌による環境浄化の基礎研究（２）資料

ANAMMOX菌による環境浄化の基礎研究（２）−循環式リアクター内に生息するANAMMOX菌の遺伝子解析−永田１．目善明*・田島政弘*・塩村隆信*した．また，２週間毎にリアクター内の培地1．5Lを新し的く調製した培地と交換した．

排水からの新しい窒素除去法として，ANAMMOX菌に2．1．2

連続式培養よる脱窒処理が注目されている．ANAMMOX菌はアンモリアクター内で培地を循環させながら，窒素ガス曝気にニアを水素供与体とすることで亜硝酸を還元し，脱窒を行より脱酸素を行った新しい培地を３L／日，押し出し流れう独立栄養生物であるため，水素供与体としてメタノール方式で連続供給した．などの有機物を必要とする従来型の硝化脱窒法と比較した

2．1．3

場合，処理費用の大幅な削減が期待できる１）．

脱窒状態の確認

リアクター内のアンモニウムイオン，亜硝酸イオン，硝島根県内のK浄化センター（下水処理施設）で稼働して酸イオンの各濃度をイオンクロマトグラフ法で測定し，そいる生物脱臭槽内の循環水では，アンモニア・亜硝酸の比れぞれの値から脱窒状態を考察した．

が年間を通じてほぼ１：１で安定しており，ANAMMOX

2．2

ANAMMOX菌16SrDNAの解析菌による脱窒処理に適した条件を備えている．筆者らは，リアクター内に生息する微生物のDNAは，培養開始後この生物脱臭槽の循環水をANAMMOX菌によって脱窒処

177日目にポリエステル綿に付着している汚泥よりISOIL理することを目的として，槽内に生息する微生物群の菌相（ニッポンジーン製）を用いて抽出した．ANAMMOX菌解析を行った２）．その結果，ANAMMOX菌の存在が確認

16S rDNAの増幅用プライマーには， ana16s-F／ana16S-R2できたため，この生物脱臭槽内の汚泥および循環水を種菌の組み合わせとana16S-F／Bac1513Rの組み合わせを用いたとしてANAMMOX菌の集積培養に取り組むとともに，培２）．各プライマーの塩基配列及び16S rDNA中での位置を養中の汚泥よりANAMMOX菌DNAを増幅し，既に報告さ図２に示す．PCR用酵素にはKOD plus DNAポリメラーゼ

れているANAMMOX菌DNAとの塩基配列比較を行ったの（東洋紡製）を用い，94℃−15秒，50℃−２秒，68℃−90で,その結果について報告する．

秒を１サイクルとして40サイクルの増幅を行った．反応終２．方2．1

了後，アガロース電気泳動によりANAMMOX菌16S rDNA法の増幅確認を行った．得られたPCR産物はpBluescript II SK

循環式リアクターによるANAMMOX菌の集積培養＋ベクター（STRATAGENE製）にサブクローニングし，ANAMMOX菌の集積培養には，図１の模式図に示す循

塩基配列決定に供した．塩基配列の決定は，LIC-4200S-環式リアクターを用いた．リアクターにはA，Bそれぞれ1.1Lの容積を有するアクリル樹脂製円筒を用い，内部に生物担体としてポリエステル綿を充填した．配管及び脱ガス槽を含むリアクターの総容積は３Lである．培地は文献３）に従い，塩化アンモニウム，亜硝酸ナトリウムを主成分とする無機塩を水道水に溶解し作成した．リアクター外部はラバーヒーターで被覆し，培地を30℃に保温した．種汚泥にはK浄化センター生物脱臭槽より採取した汚泥１Lを用い，培地1.5Lとともに９L／分の流速でリアクター内を循環させ，生物担体に付着させた．
2．1．1

回分式培養

脱窒により消費されたアンモニア，亜硝酸は約７日間隔で補充した．pHは0．5mol/L硫酸により7．2となるよう調整*環境技術グループ

図１− 4 −

循環式リアクターの模式図島根県産業技術センター研究報告第43号（2006）

図２ プライマーの塩基配列及びANAMMOX菌
16S rDNA中における各プライマーの位置
図３ 回分式培養におけるリアクター内の形態別窒素濃度の変化（1-177日）

1G DNAシーケンサー（NEN製）を用いてダイプライマー法により行った．ANAMMOX菌の遺伝子配列データ
ベースにはGenBankを利用し，系統樹解析にはGENETYXversion7（ゼネティックス製）を用いた．

３．結果および考察
3．1

回分式によるANAMMOX菌の集積培養

回分式による培養開始後177日目を経過するまでの，リアクター内の形態別窒素濃度を図３に示す．全窒素濃度が大きい時はリアクターに窒素分が補充されたことを示しており，また濃度の減少は脱窒により窒素分が系外に排出さ

図４ リアクター汚泥DNAより増幅した
ANAMMOX菌16SrDNA PCR産物（M）DNAマーカーφ174/Hae III，（1）プライマーana16SF/ana16S-R2の組み合わせによるPCR産物，（2）プライマーana16S-F/Bac1513Rの組み合わせによるPCR産物れたことを示している．よって図３から，このリアクターにおいて脱窒が起こっていることがわかる．ANAMMOXANAMMOX菌の16S rDNAとの相同性が高く，特に日本菌による脱窒では，実験式からアンモニア1molと亜硝酸

国内で集積培養されたKU-2(AB054007)６）とは塩基配列の1．32molを消費し，硝酸を0．23mol生成するとされている

98.4%が一致しており，極めて近い類縁関係にあることが４）,５）．しかし，本リアクターにおける窒素収支を考えるわかった．と，脱窒により消費される主な基質は亜硝酸イオンで，ア

ここで，リアクター内にANAMMOX菌が明らかに存ンモニウムイオンの減少はわずかである．従って，この時在したという結果をもとに，回分式による集積培養で点で現象としてANAMMOX菌による脱窒が起こっている

ANAMMOX活性が得られなかったことについて考察すと判断するには至らなかった．本培養で使用した種汚泥る．ANAMMOX活性の発現を現象として確認するために中にANAMMOX菌が存在することは前述したが，ここでは，ある程度菌体の量が必要となる．ANAMMOX菌の脱再度リアクター内の汚泥を採取し，塩基配列を決定して窒活性の発現を確認した培養日数を見ると，82日６）からANAMMOX菌の有無を確認することとした．

370日７）とばらついているが，かなりの培養日数が必要な

3．2

ことが報告されている．これは，ANAMMOX菌の増殖速

ANAMMOX菌16S rDNAの塩基配列決定および系統樹解析度が極めて小さいため，ある程度の菌体を集積するのに要培養開始後177日目にリアクターより汚泥を採取し，した日数と考えられる．従って，本回分式培養においてPCR法によるANAMMOX菌16S rDNAの増幅を行った．

ANAMMOX活性が発現しなかった理由としては，培養日

PCR産物のアガロース電気泳動結果を図４に示す．この数の不足で増殖しなかった，あるいは増殖はしたが流亡し図に示されるように，ana16S-F/ana16S-R2およびana16S-F/てしまった，の二つが考えられた．

Bac1513Rのいずれの組み合わせからも良好な増幅結果が3．3連続式によるANAMMOX菌の集積培養得られたため，これらのPCR産物をベクターにサブクロー

培養開始後178日経過後に，１）リアクター内の培地濃ニングした後，塩基配列を決定した．図５に，決定した度の変動を小さくするため，培地を押し出し流れ式による

ANAMMOX菌16S rDNAの塩基配列を示す．今回決定し連続供給とする，２）定常状態にあるリアクター内と供給たのは，16S rDNAの後半部分652塩基である．この塩基する培地中の溶存酸素を予め排除しておくことで，硝化配列を用いて，すでに報告されているANAMMOX菌16S反応を抑制する，という２条件を設定し，連続式によるrDNAとの系統樹解析を行った結果をGenBank Accession

ANAMMOX菌の集積培養を行った．連続式培養におけるNO.とともに図６に示す．この結果から，リアクターから各形態の窒素除去量の経時変化を図７に示す．この培養期得られたANAMMOX菌16S rDNAはすでに報告されている

間中，全窒素除去量はほぼ5-10mgN／日程度で安定的に推− 5 −永田・田島・塩村：ANAMMOX菌による環境浄化の基礎研究（２）

図５ リアクターから得られたANAMMOX菌16S rDNAの塩基配列
PCRプライマーの配列を除く16S rDNAの後半部分652塩基の配列．下線部はPCRプライマー由来の塩基配列．
による脱窒ではないと考えられる．
最終的に，培養開始後611日に至ってもアンモニウムイオンの減少は観察されなかった．また，窒素除去量がわずかであること，外部から有機物を添加していないことか
ら，脱窒は主にリアクター内に生息する脱窒菌の内性呼吸によるものと考えられた．
リアクターから得られたANAMMOX菌16S rDNAと既報のANAMMOX菌16S rDNAの系統樹解析結果

図６

今回の培養では，リアクター内に既報のANAMMOX菌と類縁関係のあるANAMMOX菌の存在が確認できたが，集積培養においては最終的にANAMMOX活性を得ることができなかった．文献３）によると，成功例の培地は地下水によって作成されていたため，培地中に微量元素を豊富に含んでいる可能性が高いと判断される．よって，今回ANAMMOX活性が得られなかった理由としては，培地中の微量元素の不足によるANAMMOX菌の増殖不良が考えられる．

文

図７ 連続式培養におけるリアクターからの各形態別窒素除去量の経時変化（178-611日）
移したが，その中心は亜硝酸イオンの消費によるものであり，アンモニウムイオンの減少は見られなかった．
培養開始後350日経過以降は，リアクターB内の生物担体をポリエステル綿からポリビニルアルコール（以下PVAと称す）球体８）に変更し，また421日目，506日目に種汚泥を各１L補充した．PVA球体充填直後，および種汚泥追加直後に一時的な窒素除去量の上昇が見られたが，これらはPVA球体，種汚泥中に含まれる有機物を水素供与体とする通常の脱窒反応によるものであり，ANAMMOX菌

献１）古川憲治，嫌気性アンモニア酸化（anammox）の発見とその後の研究開発動向，水環境学会誌，27，2−7（2004）
２）永田善明，田島政弘，塩村隆信，ANAMMOX菌による環境浄化の基礎研究（１），島根県産業技術センター研究報告，
41，5−9（2004）
３）Fujii, T., Sugino, H., Rouse, J.D., Furukawa, K., Characterization of
the Microbial Community in an Anaerobic Ammonium-Oxidizing
Biofilm Cultured on a Nonwoven Biomass Carrier, J. Biosci.
Bioeng., 94, 412-418 (2002)
４）Van de Graaf, A.A., De Bruijn, P., Rovertson, L.A., Jetten, M.S.M.,
Kuenen, J.G., Metabolic Pathway of Anaerobic Oxidation on theBasis of 15N Studies in a Fluidized Bed Reactor, Microbiology,
143, 2415-2421 (1997)
５）Strous, M., Heijnen, J.J., Kuenen, J.G., Jetten, M.S.M., The
Sequencing Batch Reactor as a Powerful Tool for the Study ofSlowly Growing Anaerobic Ammonium-Oxidizing Microorganisms,Appl. Environ. Microbiol., 50, 589-596 (1998)
６）今城麗，安井秀斉，石田浩昭，藤井隆夫，杉野浩幸，古川憲治，活性汚泥からのANAMMOX微生物の集積培養，水環境− 6 −島根県産業技術センター研究報告
学会誌，27，413−418（2004）７）對馬郁夫，金田一智規，岡部聡，渡辺義公，ANAMMOX集
積汚泥の微生物構造および機能解析，第38回日本水環境学会
年会講演集，370（2004）

第43号（2006）

８）吉田憲治，Rouse,. J. D.，今城麗，古川憲治，嫌気性アンモニ
ア酸化（Anammox）汚泥の調整に関する研究，土木学会年次
学術講演会講演概要集，323−333（2001）− 7 −