●医とゲノム――第1セッション ヒトゲノム解析の最前線（1）骨系統疾患遺伝子のポジショナルクローニング（位置的単離）
長崎大学医学部原爆後障害医療研究施設分子医療部門

新 川 詔 夫*
ヒトゲノムのドラフトシーケンスが完成した現状でも，大部分の疾病遺伝子は未知であり，疾患座の位置情報から遺伝子を単離・同定する位置的単離法の重要性は変わらない。一方，ミレニアムプロジェクトの標的である生活習慣病の遺伝学的解析が進展しているが，数千種におよぶ単一遺伝子病の解析の重要性も忘れてはならない。本稿では，２つの骨系統疾患遺伝子について，連鎖領域および染色体転座切断点などの位置情報を基にした単離・同定を概説する。

位置的候補遺伝子探索法による
Camurati-Engelmann 病（CED）遺伝子の同定が，デキサメサゾン（DEX）投与で症状改善がみられることがある。CED 遺伝子を同定するため，日本人２家系（図１）1）を対象とした連鎖解析，および別の９家系を含む計

CED は過剰な骨膜性骨形成による骨皮質11家系（白人２家系と日本人９家系）におけの肥厚と長管骨の紡錘形肥大を特徴とする常る位置的候補遺伝子解析を行った。罹患者は染色体性優性遺伝性の稀な骨系統疾患であすべて骨レ線により診断した。

る。病変は進行性で下肢痛，筋力低下，あひインフォームドコンセントを得た後に，被る様歩行，低栄養と痩身，時に骨折などの症検者 DNA を調整し，450種のマイクロサテ状が呈する。これらの病変・症状は遅くともライト多型と疾患との連鎖を検討した。その30歳までに発症する。根本的な治療法はない

結果，２点最大ロッド得点は D19S918 座で………………………………………………………………………………………

Positional cloning of genes responsible for systemic bone diseases
Norio Niikawa (Department of Human Genetics, Nagasaki University School of Medicine)………………………………………………………………………………………
*にいかわ・のりお：昭和４２年３月 北海道大学医学部卒業。昭和４７年５月 スイスジュネーブ州立大学助手（産婦人科・胎生学細胞遺伝学）。昭和５１年４月 文部教官助手（北海道大学医学部・小児科学）。昭和５９年１０月
長崎大学医学部原爆後障害医療研究施設分子医療部門教授（現職）。平成１２年４月 長崎大学遺伝子実験施設長（併任）Key words¡位置的遺伝子単離¡位置的候補遺伝子アプローチ¡Camurati-Engelmann 病¡鏡像多指趾症

テーマ／「医とゲノム」 27

7.41（p=1.00 ; θ=0.00）であり（表１），さ子となりうる。特に TGFB1 は，骨芽細胞のらにハプロタイプ解析により，罹患者共通ハ分化・増殖に深い関係があることから，プロタイプは 19q13.1-q13.3 の D19S881 とCED の最も有力な候補遺伝子と考えた。

D19S606 間にみられた（図１）。このことか

データべース上の TGFB1 塩基配列から，ら，CED 座は両マーカー間の15.1cM に局在７つのエクソン，イントロン境界領域およびすることが判明した 。同様な結果がベルギ

5’-/3’-UTR を増幅するプライマーを設計し，ー，アメリカのグループから報告され，筆者

PCR 増幅産物の直接シークエンシングによ

2）

3,4）

らの連鎖解析の結果が支持された 。

る変異解析を行った。11家族からの各患者は同連鎖領域には，いくつかの骨格組織由来

全て，エクソン４内の cDNA 位 +673のＴ→の EST や，CALM3，ZFP36，TGFB1 など

Ｃ置換（C225R），+653のG→A 置換（R218H），の既知遺伝子があり，各々 CED の候補遺伝+652のＣ→Ｔ置換（R218C），+667のT→C置

図１

28 第３回日本医学会特別シンポジウム

CED２家系とハプロタイプ

換（C223R）の４種のいずれかを有すること

vitro での効果は培養細胞を用いて解析した。

が判明した（図２）。これらのミスセンス変

CED 患 者 の LAP-TGF-b1 複 合 体 （ 潜 在 型

異は罹患者のみにみられ，家系の非罹患者おTGF-b1）では，TGF-b1 と LAP の複合体形よび正常日本人200名と白人100名にはないこ成が不安定であり，TGF-b1 がLAPから早期5）とから，疾患特異的であると結論した 。既6）に遊離し常に活性化状態にある（図３）。変知の TGFB1 内外の SNP を用いたハプロタ

異 TGFB1 全長を導入した線維芽細胞では増イプ解析と孤発例の解析結果から，少なくと殖抑制が起こり，この導入線維芽細胞と骨芽も４個の独立した突然変異が生じていたの細胞を共培養すると，骨芽細胞の増殖が促進で，多くは新生変異によると考えられる。

された。一方， DEX を変異 TGFB1 導入線維TGFB1 遺 伝 子 産 物 は ， 分 泌 シ グ ナ ル ，芽細胞培養系に添加すると，線維芽細胞の増TGF-b1 蛋白，およびその活性を抑制・潜在殖抑制が緩和された。このことは，DEX に化させる潜在型結合蛋白（LAP）の3つのドよる患者の症状改善が線維芽細胞と骨芽細胞メインからなる。CED 患者で同定した変異の機能の正常化によることを示す。
これら一連はすべて LAP をコードする第４エクソンにの実験結果から，変異 TGF-b1 による CED存在している（図２）。LAP は TGF の潜在の発症を図４に示すようにモデル化した。

化だけでなく，LTBP と結合して骨に TGF-本 研 究 で 同 定 し た CED 変 異 は す べ て
TGFB1 のエクソン４限局性なので，大多数b1 を蓄積させる役割をもつ。
変異 TGFB1 による TGF-b1 蛋白の病的変の CED 患者の遺伝子診断は同エクソンのみ

化は pulse chase 解析と ELISA 法，および inを増幅するプライマーを利用すれば容易であ

表１CED 家系連鎖解析における２点ロッド得点

Locusp

D19S4221.00.81.00.81.00.81.00.81.00.81.00.81.00.81.00.81.00.81.00.8

D19S223
D19S211
D19S913
D19S408
D19S217
D19S918
D19S219
D19S902
D19S606

Recombination fraction(u)
0.00
-∞
-7.13
3.60
3.13
5.44
5.03
4.92
4.37
4.22
4.09
5.84
5.18
7.41
6.55
4.25
3.94
2.54
2.28
-∞
-2.34

0.001
-3.38
-3.52
3.59
3.12
5.44
5.03
4.91
4.36
4.22
4.09
5.84
5.18
7.39
6.54
4.24
3.93
2.54
2.27
0.23
-0.02

0.05
0.01
-0.17
3.25
2.81
5.14
4.65
4.65
3.95
4.08
3.80
5.36
4.70
6.77
5.96
3.90
3.59
2.32
2.06
1.68
1.43

0.1
0.50
0.31
2.88
2.48
4.73
4.22
3.99
3.50
3.81
3.46
4.82
4.19
6.10
5.35
3.52
3.23
2.07
1.82
1.71
1.47

0.15
0.68
0.49
2.50
2.13
4.27
3.77
3.49
3.05
3.45
3.08
4.24
3.65
5.44
4.72
3.12
2.83
1.80
1.58
1.60
1.37

0.2
0.71
0.54
2.111.79
3.75
3.28
2.97
2.58
3.03
2.67
3.62
3.08
4.67
4.06
2.68
2.41
1.52
1.33
1.41
1.21

テーマ／「医とゲノム」 29

る。本研究結果の報告後，ベルギーのグルーTGFB1 変異がない CED Ⅱ型（？）が存在

プが上記とは異なる２種類の変異（LLL12-する。現在，ヒトと同一の変異 Tgfb1 をも13insとY81H）を報告した 。変異はともに

つノックインマウスの作成とその骨変化の解第１エクソン内（LAP内）に存在する。しか析，発症機構を利用した治療法の開発，およし筆者らがスクリーニングした11名の患者でびその骨粗鬆症治療への応用などに研究が進は，日本人，白人を問わずこれらの変異は検展している。

7）

出されていない。また，19番染色体に連鎖しない家系中に， CEDと類似の症状をもつが

図２

TGF-b1 蛋白構造(a)、TGFB1 遺伝子構造(b)、およびCED患者におけるTGFB1 変異(c)。

30 第３回日本医学会特別シンポジウム

染色体転座切断点解析による鏡像多指趾症（MPD）候補遺伝子の単離がない。転座 t（2;14）（p23.3;q13）をもつ
MPD患者 8） の 14q13 の切断点クローニングを開始した。
FISH 解 析 に よ り ， AFM200ZH4 とMPD は，後軸指趾が第１〜３指あるいはD14S306 間の YAC クローンが同切断点をカ第１〜４趾の鏡像を示し，結果として後軸性バーしたので，D14S75 と D14S728 間（36-多指趾となる非常に稀な先天異常症である。

39cM）の16個の BAC と６個の PAC（９種筆者らの知るかぎり，世界中で８例しか報告の EST と総計34個の新しい STS）からなる

図３

A, CED患者（R218H）の線維芽細胞の pulse chase 解析（変異 TGF-b1 はsmall latent form の早期
dissociation を示す）。
B, TGFB1 の northern 解析（患者と正常間に発現差はない）。
C, 培養液中の TGF-b1 分泌量（変異 TGFB1 では発現が増加する）。
D, 変異 TGFB1 による骨芽細胞系（MG-63）の増殖増加とデキサメサゾンによる増加抑制。

テーマ／「医とゲノム」 31

約1.2 Mb のコンティグを構築した（図５）。

PstI/SacI, PstI/BssHII, PstI/EagI などを２つのクローン（B368とP29）は２つの派生用いた２重消化産物のサブクローニング，ラ染色体［der（2）と der（14）］双方に FISH

ンダムクローニング，およびエクソントラッシグナルを表出した。９個の EST のうちピングなどにより，これらの切断点クローン

T99065（胎児肝脾由来の3’-cDNA）は BAC

から CpG island-rich な配列を単離し，塩基クローン（B102とB319）内にあることを確配列を決定した。その結果，500 kbのこの領認したが，ホメオティック遺伝子 FKHL1 は域には既知の遺伝子 HNF3A と未知の新規本コンティグ中には存在しなかった。

遺伝子様配列の２種類しか存在しないことが

図４

図５

変異 TGF-b1 の変化モデル

ヒト MIT1 領域 1.2Mb の PAC/BAC コンティング (a) と MIP1 遺伝子構造 (b)。

32 第３回日本医学会特別シンポジウム

判明し，単離した新規遺伝子を MIP1 と命

鏡像多指趾症転座症例は，埼玉小児医療セン名した（図５）。MIP1 はエクソン５内の最ターの大橋博文先生のご協力を得て患者試料初の ATG 配列からエクソン15の終止コドンを解析した。
ここに諸先生に深く感謝します。

まで 1,329-bp の ORF を含み，Ｃ末側に２つの coiled-coil ドメインをもつ443個のアミノ酸から成る蛋白をコードしている。ノザン解析の結果，ヒト MIP1 は心，肝，骨格筋，腎，膵，および胎児腎で軽度に発現するが，脳，胎盤，肺では発現がみられない。心では少なくとも３種の転写物がみられ，骨格筋にみられる2 kbの転写物は筆者らが同定したcDNA と一致した。 E10.5 - E13.5齢の全マウ
ス胎児標本上における in situ hybridizationの結果は，マウス Mip1 は胎児全体で発現し，肢芽には限局していなかった。現在，
MIP1 の変異解析を行っている。
14q13 切断点クローンを用いて他方の切断点 (2p23.3) をクローニングし，2p23.3 領域の解析を行ったが，遺伝子配列は確認できなかった。この結果，14q13 切断点から単離した MIP1 が MPD の最大の疾患候補遺伝子である。

謝 辞
本研究は文部省科研費「ゲノムサイエンス（代表榊佳之教授）により行われた。連鎖・変異解析に用いた家族は，蒔田芳男（旭川医大），福嶋義光，吉田邦広（信州大），比佐健二（国療中信松本病院），中込直（岡山旭川療育園），斉藤晴樹（秋田大），杉本健郎（関西医大男山病院），亀ヶ谷真琴（千葉こども病院），林裕美（札幌医大）の諸先生の御協力を得て行われ，また Cy5- プライマーは東大中村祐輔教授より供与された。変異TGFB1 の生化学的解析は，阪大の斉藤貴志［文献］
1） Makita Y, Nishimura G, Ishii T, Ito Y, Okuno A.
Intrafamilial Phenotypic Variability in Engelmann
Disease (ED): Are the Disease and Ribing Disease theSame Entity? Am J Med Genet 91:153-156, 2000.
2）Ghadami M, Makita Y, Yoshida K, Fukushima Y,Wakui K, Ikegawa S, Yamada K, Kondo S, Niikawa N,
Tomita H: Genetic mapping of the CamuratiEngelmann disease locus to chromosome 19q13.2q13.3. Am J Hum Genet 66: 143-147, 2000.
3） Janssens K, Gershoni-Baruch R, Van Hul E, Brik R,
Guanabens N, Migone N, Verbruggen LA, Ralston SH,
Bonduelle M, Van Maldergem L, Vanhoenacker F, Van
Hul W: Localisation of the gene causing diaphyseal
dysplasia Camurati-Engelmann to chromosome 19q13.
J Med Genet 37: 245-249, 2000.
4）Vaughn SP, Broussard S, Hall CR, Scott A, Blanton SH,
Milunsky JM Hecht JT: Confirmation of the mapping of
the Camurati-Englemann locus to 19q13.2 andrefinement to a 3.2-cM region. Genomics 66: 119-121,2000.
5）Kinoshita A, Saito T, Tomita H-A, Makita Y, Yoshida K,Ghadami M, Yamada K, Kondo S, Ikegawa S,
Nishimura G, Fukushima Y, Nakagomi T, Saito H,
Sugimoto T, Kamegaya M, Hisa K, Murray JC,
Taniguchi N, Niikawa N, Yoshiura K: Domain specificmutations in the human transforming growth factor
beta 1 gene (TGFB1) result in Camurati-Engelmanndisease. Nat Genet 26(1): 19-20, 2000.
6）Saito T, Kinoshita A, Yoshiura K, Makita Y, Wakui K,Honke K, Niikawa N, Taniguchi N: Domain-specificmutations of a Transforming growth factor (TGF)-b1
latency-associated peptide cause Camurati-Engelmanndisease because of the formation of a constitutively
active form of TGF-b1. J Biol Chem 276: -11469-11472,2001.
7）Janssens K, Gershoni-Baruch R, Guanabens N, Migone
N, Ralston S, Bonduelle M, Lissens W, Van Maldergem
L, Vanhoenacker F, Verbruggen L, Van Hul W:
Mutations in the gene encoding the latency-associatedpeptide of TGF-b1 cause Camurati-Engelmann disease.
Nat Genet 26: 273-275, 2000.
8） Ohashi H, Kim Y, Iwasaki M, Ohno T, Sato M,Imaizumi S, Aihara T, Yamagishi A, Wakui K,Fukushima Y: Tetramelic mirror-image like polydactyly
and de novo balanced autosomal translocation [46, XY,t(2;14)(p23.3;q139)]. Am J Hum Genet 57: A98. 1995.

氏と谷口直之教授との共同研究で行われた。

テーマ／「医とゲノム」 33

●討論

司会：新川先生本当にどうもありがとうござa山：違う形になってたんぱく質としての機いました。時間も少しございますので，会場能を果たすのでしょうか？の方からご質問をお受けしたいと思います。

新川：ええそうだと考えられます。TGF-b1

質問の前に所属とお名前をおっしゃってマイが本来の機能を果たす蛋白で，LAP は TGF-

クロフォンの前でご質問をお願いします。どb1 を骨のマトリックスにホールドし，不活なたかいらっしゃいますでしょうか。質問が化しているのだろうと考えられます。

ないと私がしなきゃならないので…。
どうぞ。

a山：LAP には生理的な働きはないと？

a山：北大のa山です。先生，素敵なお話を

新川：ええ。TGF-b1 の活性を制御しているありがとうございました。最初の骨の病気のと思います。

患者さんのことですが，これは TGF-b1 遺伝

司会：どうもありがとうございました。ほか子の異常で起きている病気と考えてよろしいにもございますでしょうか？のでしょうか？

ょっと関係しているのですが，新川さんもち今の質問にち

新川：はい，TGFB1 遺伝子の変異による最ょっとおっしゃったと思いますが，TGF-b1初の遺伝病です。のような，非常に影響の大きい蛋白ですとね，

a山：TGF-b1 遺伝子の発現というのは，一恐らくその機能がおかしくなった場合には般的に主として骨に起こるわけですね？

lethal になると考えられますので，エンゲル

新川：そうです。

マン病では非常に微妙な形の変異だろうと思

a山：TGF-b1 は，多分身体の中ではもっとうのですね。私はこの分野はよくは知らない広く発現している遺伝子ですよね。それがどのですけれど，実際に，例えば，ノックアウうして骨の変化が中心の病気になるのかといトマウスなどでやはり似たような症候がでるうことを説明できるのでしょうか？どういうかどうかということと，もう１つは，遺伝子ふうに考えたらよいのでしょうか？の特別な部分に deletion を入れると致死が多新川：まず，TGF-b1 という蛋白は，骨のマくなるとか，そういう evidence はございま

トリックスに最も多いのです。ですから，そすか？

こにメインの症状が集中すると考えられま

新川：最初のご質問ですが，今そのマウスをす。私は免疫学は素人なものですから，深く作成しています。患者さんと同じ mutation

言及しなかったのですが，エンゲルマン病のをもつノックインマウスを作成して解析して患者さんには軽度な免疫異常や骨膜に炎症反みないと同じ症候がでるかどうかわからない応らしき症状が起きます。ですから，これらですね。先程申しました骨粗鬆症との関係もの症状も TGF-b1 の作用で説明されると考えみたいと思います。遺伝子に deletion を起こられます。でもメインは骨の変化です。

したり，active form の TGF-b1 に相当する部

a山：骨なんですか。
もう１つ。
ホモダイマー分に色々な変異を入れたりしたノックアウトの TGF-b1 と LAP は遺伝子から最終的に１つマウスや変異マウスの仕事は過去たくさんごのたんぱく質として作られてくるわけですか？

ざいますが，しかし，患者さんでみられた領新川：ええそうです。１つの TGFB1 遺伝子域の変異マウスはありません。これらのマウから一連のポリペプチドが作られて，最終的スの表現型は，変異の領域によって，CEDには LAP 蛋白と TGF-b1 蛋白ができ，それに類似する症状や，逆に骨粗鬆症様の症状をぞれがホモダイマーを形成します。

示したり，また致死になったりしています。

36 第３回日本医学会特別シンポジウム

つまり，結果に若干の conflict があります。

こないという問題はあります。検査会社にお一方，TGF-b1 が osteoblast でその機能が主いて発見されても，倫理問題がありますから，として発揮されるのか，osteoclast で発現す研究者に貴重なその情報がすぐには渡ることるのかは問題の１つです。私どもの in vitroはありません。の実験ではヒトにおいて osteoclast が利用で司会：最後に，新川先生のご意見をお伺いしきませんので，osteoblast 由来の細胞で行いたいのですけれど，いわゆるモノジェニックました。最終的には，現在作成中のモデルマな病気というのは，一応方法論は確立したとウスで確かめる必要があると思います。

は申しませんが，色々な成功例は多いのです

司会：もう１つ，もしフロアからどなたかごが，ポリジェニックな病気となりますと，次質問がございますか？の門脇先生のお話しになりますが，なかなかどうぞ。

亘理：北海道大学歯学部の亘理と申します。

尋常ではいかないと思われますが，先生の今歯科材料を扱っております。先生が講演の後までのご経験から，ポリジェニックな病気の半部で提示された鏡像多指趾症の原因は転座

遺伝子同定に関して何かサジェスチョン，まによる遺伝子異常であろうという理解をした

たは意見がございますでしょうか？のですが，その転座ができた原因としては原

新川：ポリジェニックな疾患は私も研究をス

爆は関係があるのでしょうか？

タートしたばかりでございますので，サジェ全く関係がないのでしょうか？

スチョンすることはできませんが，真の意味

新川：あの患者さんは原爆とはまったく無関で理論基盤がまだ確立されていないと考えら係の家族の方です。

れ，解析手段もあと３段階位のアップが必要

司会：ほかにございますでしょうか？

でかなと思っております。モノジェニックな疾は，私からもう１つ。新川先生，日本人には患は，確かにテクニックは利用可能だし，材染色体転座，もちろん異常のひとつなのです

料がそろえば遺伝子単離・同定は可能です。

が，それが多いというようなことをちょっとしかし，私が強調したいのは，モノジェニッおっしゃったのですが？

クな疾患をリサーチの場から捨ててしまうの

新川：染色体転座自体の頻度は世界中で差がはまだ危険かなと思います。その中にまだ宝なかろうと思います。発見率が日本では高いが埋まっているのではないか，そこからまだのだろうと思います。諸外国では，染色体検出てくるのではないかと思っています。ポリ査は一般的に自費であり，高いのです。検査

ジェニックな疾患は，大多数の国民が生活習をするお医者さんにモチベーションがあると慣病にかかりますから，大きな発展が予想さ検査しますが，そうでないとなかなか検査をれ重要ですが，理論的基盤も解析手段も構築しないのです。日本では健康保険に組み込ましていかなくてはならない。しかし一方，モれているので，容易に検査できますので，あノジェニックな疾患もまだ重要であるというる検査会社などでは年間数万検体の検査が行風に考えております。

われています。そのために転座がよく発見さ司会：どうもありがとうございました。これれると考えられます。したがって，遺伝子疾で第一セッションの２人の先生方のご講演を患と染色体転座という稀な組み合わせも見つ終わらせていただきます。清水先生，新川先かってくるのだと思います。但し，そのよう生ありがとうございました。

な試料がリサーチの場になかなか集積されてテーマ／「医とゲノム」 37