第２４回

動物生殖工学研究会

プログラム・抄録集

平成２２年１２月４日（土）
北里本館

大会議室

プログラム
開会挨拶

会長

横山峯介

１．特別講演座長

浜野晴三

初期卵胞の体外発育培養
佐々田比呂志・諸白家奈子 ＊ 先生
(北里大学獣医学部動物資源科学科・ ＊ 日本学術振興会特別研究員)
２．一般講演座長

日野敏昭

１）高齢者の介護～いざという時のために～○小田切弘司（医療法人社団大坪会北多摩病院看護部）

２）ブタ卵子の体外成熟におけるコレステロール合成の役割○渡部浩之 1,2 、吉沢昌弘 1 、平井沙織 1 、日下部博一 2 、日野敏昭 2 、立野裕幸 2 、
福井豊 1 （ 1 帯広畜産大・畜産生命、 2 旭川医大・生物）
３）マウス初期胚の低温保存における各種糖類の効果○小田佳奈子 1) 、長谷川歩未 1)2) 、前田宜俊 1) 、横山峯介 1) (1) 新潟大脳研・動物資源、
2)

現所属：理研 BRC・遺伝工学基盤技術室）
座長

後藤元人

４）マウス 1 細胞期胚の染色体解析における簡易ガラス化法の有用性の検討○日野敏昭、日下部博一、立野裕幸（旭川医大・生物）
５）マウス胚の超急速凍結保存にガラス化溶液は必要か？
◯東貞宏、金子裕一、中村忠治、古館専一（北里大医・実験動物）
６）マウス精子凍結における保存容器の影響と最適条件の検討○長谷川歩未、持田慶司、小倉淳郎（理研 BRC・遺伝工学基盤技術室）

３．技術領域指定演題〜マウスの精子凍結法〜

座長

中潟直己

１）カルシウムフリー培地での前培養による C57BL/6J マウス凍結精子の受精率向上○右島理可 1,2、日野敏昭 ３、小田佳奈子 １、右島富士男 ２、横山峯介 １（新潟大学脳研・動物資源 1 、立川 ART レディースクリニック 2 、旭川医大・生物 3 ）２）C57BL/6J 凍結精子からの個体復元に効果的な体外受精法の確立○田熊究一、金田秀貴（理研 BRC・実験動物開発室）
３） マウス精子の凍結保存法の紹介○ 竹尾 透（熊本大生命資源研究・支援センター資源開発分野）
４．懇親会（北里本館１階職員食堂）

１．特別講演
初期卵胞の体外発育培養
佐々田比呂志・諸白家奈子 ＊（北里大学獣医学部動物資源科学科・ ＊ 日本学術振興会特別研究員）
哺乳類卵巣には、雌性生殖 細胞である卵子が原 始卵胞内に卵母細胞として存在し、卵胞発育を経て排卵されるが、その割合は1％未満であるとされている。ウシやブタなどの産業動物
ではこれまでに多数の卵子を利用する方法として、ホルモン処理による過剰排卵処置や1980年代以降は胞状卵胞由来の卵母細胞を体外で成熟させる技術の開発が行われてきている。
しかしながら、これらの技術で利用できる卵子の数は限られており、この点で卵巣内卵母細胞を最大限に利用するものとして体外で卵胞発育させる技術が考えられる。1996年続いて2003
年にEppigらがマウス卵巣の器官培養による原始卵胞の体外発育培養により産子を作出しているものの、他の動 物や単 離 初 期 卵 胞の体 外 発 育 培 養についてはいまだ、確 立されていない。
現在、演者らは新生子マウス卵巣を利用し、初期 卵胞の体外発育 培養系の開発を進めてい る 。 今 回 は こ れ ま で 行 っ て きた 、 卵 巣 に 血 管 増 殖 因 子 VEGF 、 あ る い は 卵 胞 発 育 因 子
GDF-9を導入した in vivo での研究さらにPten インヒビター導入による初期卵胞の体外発育培養の研究を紹介する。

２．一般講演
１）高齢者の介護～いざという時のために～○小田切弘司（医療法人社団大坪会

北多摩病院看護部）

高齢者(老年期)とは？
老化とは？
高齢者に多い症状
聴力の低下―

全周波数領域にみられる（特に高音域が顕著）。

脱水

脱水の症状・脱水の予防

骨折―

基礎疾患に骨粗鬆症があることが多く、骨折のリスクが高い。

高齢者に多い骨折
圧迫骨折・大腿部頸部骨折・骨折の予防・再発の予防
誤嚥性肺炎

―

嚥下障害によって、飲食物、唾液に含まれる口腔内の細菌、胃内容物が肺に入ることで起こる肺炎。

誤嚥・誤嚥の原因・食事摂取時の注意点（とくに嚥下障害のある場合）
認知症
認知症の種類・認知症の症状・徘徊時の対応
認知症の人との接し方
褥瘡

―

組織への血流を妨げる圧力により虚血や毛細血管内圧の上昇を生じる。その結果、浮腫や多数の静脈血栓を生じ、炎症反応を起こす圧迫が解除されないと、虚血部位は壊死に陥り潰瘍が生じる。

褥瘡の原因・褥瘡の予防
廃用症候群

―

身体活動の低下によってもたらされる２次的障害
長期臥床、非活動により生じ身体のあらゆる器官や組織に起こる。

介護保険制度
介護保険の利用法
要介護度
高齢者虐待

２）ブタ卵子の体外成熟におけるコレステロール合成の役割○渡部浩之 1,2 、吉沢昌弘 1 、平井沙織 1 、日下部博一 2 、日野敏昭 2 、立野裕幸 2 、
福井豊 1 （ 1 帯広畜産大・畜産生命、 2 旭川医大・生物）【目的】卵子の体外成熟培養（IVM）は体外胚生産を行う上で最も基本的な技術の一つであるが，IVM 卵子の胚発生能は未だ満足のいくものではない。また，IVM 卵子の胚発生能は回収個体の性成熟度に依存することが報告されており，成熟個体から回収した卵子の発生能は未成熟個体から回収されたものよりも高い。このような卵子の違い（成熟 vs. 未成熟）を引き起こす原因を特定することは，IVM 技術の向上に繋がると考えられる。そこで本研究では，ブタ卵子の IVM においてその後の発生能に影響を及ぼす因子について検討を行った。
【方法】実験 1 では性成熟した個体の卵巣に見られる黄体に着目した。食肉処理場由来ブタ卵巣から，黄体数（0 個，1-5 個，6-10 個，11 個以上）に応じて卵胞液および卵丘− 卵子複合体（COC）を回収した。回収した COC は常法に従い 44 時間の IVM を行った後，顕微授精を施し，その後の胚発育を観察した。また卵胞液はプロジェステロン（P4）濃度の測定に供試した。実験 1 の結果から，実験 2 ではステロイドホルモンの前駆体であるコレステロール（Cho）の合成過程に着目した。未成熟個体の卵巣（黄体 0 個）から回収した COC を Cho 包接能を有する methyl-β-cyclodextrin（MBCD: 1mg/ml）存在下で 22 時間培養し Cho を一旦減少させ，その後の再合成を促した。その後，成熟卵子に顕微授精を行い Cho 合成促進が胚発育に及ぼす影響を検討した。
【結果】実験 1 では，黄体数の増加に伴い受精率（50− 74%），胚盤胞発生率（17− 38%）および卵胞液中 P4 濃度（61− 791 ng/ml）が上昇した。また免疫組織染色の結果，Cho合成のための律速酵素（lanosterol 14α-demethylase）が成熟個体由来卵巣中に多く局在しており，さらに成熟個体由来 COC 中の Cho 量は未成熟個体由来のものより高かった。実験 2 では，MBCD 添加時の COC 中 Cho 量減少と除去後の再合成が観察された。
また受精率は，MBCD 添加区（80%）が対照区（65%）に比べ有意に高くなったが，胚盤胞発生率は有意に低くなった（8% vs. 24%）。この発生率の低下は IVM 培養液中にエストラジオール− 17β および P4 を添加することで解消したことから，MBCD 添加・Cho減少により COC のステロイドホルモン合成が阻害されたことが原因であると考えられた。以上の結果から，卵巣組織中での Cho 合成は卵子成熟に影響を及ぼす重要な因子であることが明らかとなった。また，前周期でのゴナドトロピン感作や黄体による P4産生に伴う卵巣組織中の Cho 合成が次周期の卵子成熟およびその後の胚発育をサポートするといった持続的サイクルが存在する可能性が示唆された。

３）マウス初期胚の低温保存における各種糖類の効果○小田佳奈子 1)
2)

長谷川歩未 1)2)

前田宜俊 1)

横山峯介 1) (1) 新潟大脳研・動物資源、

現所属：理研 BRC・遺伝工学基盤技術室）［目的］マウス初期胚の保存には簡易ガラス化法など胚を凍結させる方法が一般的である。しかし胚の凍結方法は各機関で様々であり、またそれに合わせ開発された融解法を行なわなければならずそれらの操作にはある程度の経験が必要である。マウス初期胚を低温保存することは短期間の保存や胚の簡便な輸送等に利点が大きくその利用が近年見直されている。しかしながら低温保存を行い良好な胚を高率で得る方法の検討は未だ不十分である。そこで我々は初期胚を一定期間低温保存することを目的とし各種糖類の効果について検討を行った。
［方法］実験には B6C3F1 マウスを使用した。胚は過排卵誘起した雌より採卵した卵子を体外受精し、2 細胞期胚で実験に供した。低温保存は 4℃に保たれた冷蔵庫内で行った。保存液は
mW 培地、DMEM 培地、PB1 培地で検討を行った。その後保存液に単糖類、2 糖類、3 糖類の計 11種類の糖を添加して胚の状態について観察した。さらに成績の良好なものについては 24、48、72 時間培養し、発生について観察した。
［結果および考察］４℃保存条件下における 24 時間後の成績は mW 培地、DMEM 培地と比較しPB１培地において良好だった。その後 PB１培地を基本とし各種糖を添加した結果、72 時間後0.1M 濃度において 2 糖類のラクトース(77.1%)、単糖類のグルコース(85.0%)、ガラクトース(87.5%)で PB１培地単独よりも高い胚盤胞への発生率が得られた。これらの結果から、低温保存で 72 時間 PB1 培地にラクトース、グルコース、ガラクトースの各糖を添加した保存液を用いた場合良好な結果が得られることが分かった。またこれらの条件において移植を行った結果，低温保存を行っていないものと遜色のない成績で産仔が得られた。

４）マウス 1 細胞期胚の染色体解析における簡易ガラス化法の有用性の検討○日野敏昭、日下部博一、立野裕幸（旭川医大・生物）【目的】

精子の染色体正常性を調べるために 1 細胞期胚の染色体解析が行われている。マウスを用いる場合、受精の時間によっては染色体標本の作製が早朝になったり、過排卵誘起のためのホルモン注射が夜遅くになる等の時間的制約がある。これらの制約を軽減する方法の１つは、一時的な胚の凍結保存である。本研究では、簡易ガラス化法による凍結保存の有用性と遺伝的安全性を検討するため、凍結保存した 1 細胞期胚の染色体異常率を新鮮胚と比較した。さらに、アルキル化剤によって DNA 損傷を誘発された精子に由来する 1 細胞期胚を使って、染色体異常頻度におよぼす凍結保存の影響を調査した。
【方法】

1 細胞期胚は体外受精により作製した。過排卵誘起した B6D2F1 成熟雌マウスから卵子を採取し、TYH 培地中で２時間前培養した精子を媒精した。媒精後 4、6、および 8 時間で 1 細胞期胚を簡易ガラス化法にて凍結した。5～28 日後、融解した胚を第一卵割中期まで培養し、漸進固定空気乾燥法を用いて染色体標本を作製した。標本をギムザ染色して構造的染色体異常の有無を確認した。さらに、異数性と二動原体染色体を検出するために C-バンド染色を行った。アルキル化剤で処理した精子に由来する 1 細胞期胚を作製するために、100μg/ml の methyl methanesulfonate（MMS）を含む TYH 培地内中で精子を 2 時間培養した。媒精後 8 時間で胚を凍結保存し、同様に染色体解析を行った。
【結果】

媒精後 4、6、および 8 時間で凍結保存した胚の融解後の生存率はそれぞれ92.5、92.8、および 91.3％であった。4 時間区と 6 時間区の生存胚のうち、10.5%と20.9%が融解直後に膨張を示した。各凍結時間区における構造的染色体異常の出現頻度
は、4 時間区で 4.3%（n=141)、６時間区で 4.5%（n=134)、8 時間区で 0.7%（n=146）であり、いずれも新鮮胚（2.0%、n=150）に比べて有意な増加はなかった。異数性の出現頻度も凍結胚(1.4～3.0%)と新鮮胚(1.4%)の間に有意差はなかった。MMS 処理精子に由来する１細胞期胚の構造的染色体異常の出現頻度は凍結胚で 60.5%、新鮮胚で 53.5%であり、両者に有意差はなかった。以上の結果は、簡易ガラス化法の凍結・融解操作が染色体異常の原因にならないことを示している。この方法は、今後、1 細胞期胚の染色体研究に有用な手段になり得ると考えられる。

５）マウス胚の超急速凍結保存にガラス化溶液は必要か？
◯東貞宏、金子裕一、中村忠治、古館専一（北里大医・実験動物）【目的】現在，哺乳類胚の凍結保存法として，完全に細胞質内を脱水する緩慢凍結法，細胞質内に細胞傷害を起こさない程度の水分が残った状態で凍結する急速法、 細胞質内外に氷晶を作らないガラス化法などがある。近年ではガラス化法の改良が急速に進み，極めて簡易なガラス化法がいくつか開発されたが，そのほとんどの保存液は融解時に溶液のガラス化状態が壊れ結晶化させるものである。それにも関わらず高い生存率が得られるのは，凍結時にのみ細胞障害を起こす氷晶を形成させなければ，急速凍結法と同様に融解時に急激に温度を上昇させ氷の再結晶化温度を瞬時に通過させる ことで，胚の凍結が達成できることを意味していると考えられる。そこで我々はガラス化凍結法同様の速さで細胞質内からの脱水時間を与えず，植氷もせず，氷晶を形成してしま う保 存液 でも 直接 －196℃の液体 窒素 中へ放 り込 むこ とで 胚の 凍結保 存は 可能か否かを数種類の凍害保護物質を組み合わせたガラス化保存液と非ガラス化保存液で比較検討した。
【方法】実験には ICR マウスの体外受精由来 2 細胞期胚を用いた。 胚の凍結は室温で0M(前処理なし), 又は 1M，2M，3M の Dimethyl Sulfoxide(DMSO)溶液に胚を導入し前処理を行った後，5μl の溶液と共に予め 0℃付近に冷却しておいたチューブ内に胚を移し 5 分静置後，保存液を 95μl 添加，更に５分静置し液体窒素中に投入することで行った。１つのチューブには 10～20 個の胚を入れ，保存期間は 2 時間から 3 週間の間であ る 。 保 存 液に は ガ ラ ス 化 溶 液 で あ る DMSO 2M と Acetamide 1M お よ び PropyleneGlycol(PG) 3M からなる DAP213，Ethylene Glycol(EG) 5M と PG 3M から成る EP53，非ガラス化保存液として DMSO 2M と PG 3M から成る DP23，EG 2M と PG 3M から成る EP23，
EG 3M と PG 3M から成る EP33 を用いた。融解は，室温で行い, 非ガラス化保存液(DP23・EP23・EP33)で凍結した場合は速やかに，ガラス化保存液(DAP213・EP53)で凍結した場
合 30～60 秒置いてから, 37℃に加温した 0.3M 蔗糖溶液を加えることで行った。融解後は PB1 にて洗浄後，EDTA を加えた Whitten 培地(mWM)に移し，１時間後に胚の生存性を判定，生存胚は融解後 96 時間(受精後 120 時間)まで培養を行った。また，一部の胚は仮親の卵管に移植し，胎仔への発生を観察した。
【結果】凍結胚の回収率は前処理に用いる凍害保護物質の濃度や凍結保存液に関係なく全ての実験区で 95%以上であった。胚の生存率は凍害保護物質による前処理を施さなかった場合, ほとんどのもので生存胚は得られず僅かに DP23 で生存が確認された程度であった。3M の DMSO あるいは PG で前処理をした場合は DP23 で 1%と 0%、EP33 で 29%と 12%、DAP213 で 56%と 48%と低い値となった。しかし，1M の DMSO あるいは PG で前処理をした場合での生存率は非ガラス化保存液の DP23 で 87%と 97%, EP23 で 89%と 87%,
EP33 で 85%と 87%, ガラス化保存液の DAP213 で 89%と 95%, EP53 で 92%と 99%とガラス化の有無に関わらず全ての実験区で高い値を示した。また, 胚盤胞への発生率は 1M あ

るいは 2M の DMSO または PG で前処理を行った場合にも発生率への大きな違いは認められず，非ガラス化保存液の DP23 と EP23 および EP33 で 71%〜92%, ガラス化保存液のDAP213 と EP53 で 71%〜86%であり, 生存率同様ガラス化の有無に関わらず全ての実験区で同様の高い値を示し，未凍結胚の発生率 87%と遜色のない値であった。さらに卵管移植の結果は, 1M の DMSO または PG で前処理をした場合, 非ガラス化保存液である DP23で 67%と 60%, EP23 で 48%と 60%, EP33 で 44%と 53%が胎仔へと発生し, ガラス化保存液である DAP213 で 61%と 54%, EP53 で 54%と 50%と全ての実験区で未凍結胚の発生率55%と変わらない値を示し, 生存率，発生率と同様に胎仔への発生においてもガラス化の有無に関わらず全ての保存液で良好な結果が得られた。

６）クライオチューブを用いたマウス精子凍結における最適条件の検討○長谷川歩未、持田慶司、小倉淳郎（理研 BRC・遺伝工学基盤技術室）
理研バイオリソースセンターでは、2001 年よりマウス系統の収集・保存・提供を業務として進めており、既に 5,000 系統以上のマウス系統が開発者から寄託されているが、近年では凍結精子での寄託導入のケースが徐々に増えてきている。特に海外からは、クライオチューブに封入された凍結精子が送られてくることも多い。
本実験では、クライオチューブで凍結保存された精子をより良い状態で利用するために、クライオチューブを用いた精子の凍結および融解方法、更に体外受精の最適な条件を検討したので報告する。
[材料と方法]マウス：ICR および C57BL/6J 系統について、雄はそれぞれ 10 週齢以上と 12 週齢以上、雌はそれぞれ、17-21 週齢と 10-12 週齢で実験に用いた。
精子凍結・融解および運動性の測定：精巣上体尾部より採取した精子を凍結液（R18S3：18％ raffinose、3％ skim milk） に 1 分間拡散後、ストローおよびクライオチュー
ブに封入して液体窒素の気相もしくは液相で凍結し、10 分間以上経過後に液体窒素に浸漬して保存した。
凍結精子は実験区の各条件にて融解後、HTF 培地で 1 時間前培養を行い、精子運動性解析機（TOXIVOS：Hamilton Thorne）によって生存率（運動精子率、前進性精子率）および運動性（速度、直線性、うねり）を計測した。
体外受精：過排卵処置として雌マウスに PMSG（7.5IU/匹）を投与し、48 時間後に hCG（7.5IU/匹）を腹腔内投与した。hCG 投与から 16～17 時間後に卵管より卵子を採取し、0.4mM Methyl-beta-cyclodextrin (MBCD) を添加した PVA-HTF 培地で、１時間前培養した同系雄マウスの凍結・融解精子を用いて媒精を行った。
受 精 用 培 地 に は HTF 培 地 お よ び 還 元 型 グ ル タ チ オ ン （ M.L.Bath ： PLoSONE,Vol.5,2010）を添加した HTF 培地を用いた。
媒精約 4-5 時間後に卵洗浄を行い、2.5％グルタルアルデヒドで固定、酢酸オルセイン染色して、雌雄両前核形成および精子尾部を確認したものを受精卵と判定して、受精率を算出した。
実験 1：凍結速度の検討
精子液をクライオチューブに封入し、チューブの底から液体窒素液面までの距離をそれぞれ 5、3、1、-1、-3 cm （液面より下をマイナスとした）と設定して 10 分間静置した後、液体窒素中で保存した。融解は 37℃の温水中に 2 分間浸漬して行い、前培養後に生存率および運動性を計測して評価を行った。
実験 2：凍結精子液量の検討
クライオチューブに封入する精子液量を 1、10、50 l とし、チューブの底から液体窒素液面までの距離を-1cm に設定して 10 分間静置した後、液体窒素液中で保存した。
融解は 37℃の温水中に 2 分間浸漬して行い、前培養後に生存率および運動性を計測して評価を行った。
実験 3：融解条件の検討
クライオチューブに封入する精子液量を 10 l、チューブの底から液体窒素液面までの距離を -1cm として 10 分間静置した後、液体窒素中で保存した。融解は 37℃温水、37℃または 50℃に設定したアルミブロック（チルヒート）を用いて行い、前培養後に生存率および運動性を計測して評価を行った。
実験 4：体外受精条件の検討
実験 1-3 で良好だった条件で精子の凍結および融解を行い、得られた精子を用いて体外受精を行った。
[結果]
実験 1：凍結速度の検討
クライオチューブの底から液体窒素液面まで 5、3、1、-1、-3cm と距離を変えて凍結速度の検討を行ったところ、それぞれの生存率は ICR では 1.8%、2.4%、9.1%、21.0%、10.8%、C57BL/6J では 1.9%、6.0%、6.3%、14.0%、11.1%となり、ICR、C57BL/6J ともに液体窒素に 1ｃｍほど浸漬した場合に生存率が高かった。
実験 2：凍結精子液量の検討
凍結速度を一定にし、精子液量を 1、10、50 μl と変えて凍結精子液量の検討を行ったところ、それぞれの生存率は ICR では 8.0%、25.2%、13.6%、C57BL/6J では 5.4%、17.7%、11.3%となり、ICR、C57BL/6J とも凍結精子液量は 10 μl の場合に生存率が高かった。
実験 3：融解条件の検討
凍結速度、精子液量を一定にし、融解に 37℃温水、37℃チルヒート、50℃チルヒー
トを用いた場合とで比較したところ、それぞれの生存性は ICR では 24.5%、23.9%、27.3%、
C57BL/6J では 13.9%、19.6%、21.8%となり、ICR、C57BL/6J ともに 50℃のチルヒートを用いて融解した場合に生存性、運動性が高い傾向であった。
実験 4：体外受精条件の検討
クライオチューブに封入する精子液量を 10 μl、チューブの底から液体窒素液面までの距離を -1cm として 10 分間静置した後、液体窒素中で保存し、50℃に設定したチルヒートで融解した精子を用いて同系統雌との体外受精を行った。その結果、ストローとクライオチューブでの受精率は ICR では 56.2％、63.1％、C57BL/6J では 34.0％、28.2％であった。更に、グルタチオンを 1.25mM で添加した HTF 培地を用いたところ、
C57BL/6J ではそれぞれの容器で 75.0％、62.3％と、受精率の改善が認められた。

[まとめ]
クライオチューブで保存した凍結精子の生存性および運動性は、ストローを用いた成績には及ばなかった。しかし、凍結・融解方法および封入する精子液量の検討により改善することができ、ICR ではストローとクライオチューブ間で同等の体外受精率が得られた。C57BL/6J では、ストロー、クライオチューブともに受精率は 30％前後であったが、体外受精培地へのグルタチオンの添加により、大幅な受精率の改善が認められた。このグルタチオンの添加は、既に凍結保存してある精子での受精率改善につながることから、受精卵の作出に有用な手段であると考えられる。
以上から、精子凍結保存の際に、クライオチューブを容器として用いても、凍結・融解および体外受精条件を最適化することで受精卵の獲得に有効であることが理解された。更に本実験によって、クライオチューブを用いた精子凍結保存方法のプロトコールが確立された。

３．技術領域指定演題〜マウスの精子凍結法〜

１）カルシウムフリー培地での前培養による C57BL/6J マウス凍結精子の受精率向上○右島理可 1,2 、日野敏昭 ３ 、小田佳奈子 １ 、右島富士男 ２ 、横山峯介 １（新潟大脳研・動物資源 1 、立川 ART レディースクリニック 2 、旭川医大・生物 3 ）【目的】精子凍結はマウス系統保存にきわめて有効な手段であるが、最も広く用いられている C57BL/6 系統の融解後の受精能は著しく低下することが知られている。今回
我々は凍結融解精子の受精率が、カルシウムフリー培地での前培養により著しく向上することを見出したので報告する。
【材料と方法】成熟 C57BL/6J マウスの精巣上体尾部から精子を採取し、18％ラフィノース液に懸濁後、14μl をストロー内に封入した。ストローは液体窒素気相中に 10 分間放置後、液体窒素へ投入した。融解は室温 5 秒間、54℃ウォーターバスに 5 秒間浸漬して行った。融解後、精子は HTF またはカルシウムフリーHTF 培地で 30 分間前培養し、その後スイムアップにて運動精子を選別、過排卵処理した成熟 B6C3F1 マウスより得た卵子と体外受精した。
【結果】HTF またはカルシウムフリーHTF での前培養後の受精率は、それぞれ 39±5％（85/214）または 80±3％（217/278）であり、カルシウムフリーHTF での前培養により有意に受精率が向上した（ P < 0.05）。
【結論】これまで受精率の低かった C57BL/6 系統の精子凍結保存において、培地からカルシウムを除くことにより受精率が向上することが明らかとなった。他の種においても効果が期待される。

２）C57BL/6J 凍結精子からの個体復元に効果的な体外受精法の確立○田熊究一

金田秀貴（理研 BRC・実験動物開発室）

C57BL/6J は、多くの Tg や KO マウスのバックグラウンド系統として用いられ、汎用性の高い系統であるが、凍結融解後の精子の受精率が著しく低下することが報告されている（Sztein,J.M et al. ）。これまで、その改善方法について試みられてきているが、すでに多くの C57BL/6J 系統の凍結精子が保存されてきているものの、効率良い個体復元の方法はなく、凍結精子をもちいた新しい体外受精系の確立は生殖工学に関わる技術者共通の課題であった。今回我々は、精子の受精能獲得を効率良く誘起させる精子前培養培地と、融解後の精子から運動精子のみを選択的に採取する方法を開発し、C57BL/6J 凍結精子の体外受精率の改善を試みたので報告する。すなわち、精子の前培養に Methyle-β-cyclodextrin、D-Penicillamine/ml、tri-Sodium Citrate Dihydrate、Hypotaurine を含む Modified Tyrode’s solution を使用して受精能獲得を誘起させ、さらに、4-well multi dish の 220μl 培地中では死滅精子が外側に集まるという性質を利用して運動精子と不動精子を分離、運動精子のみを媒精することで受精率 を改善し、高効率で産仔を作出することを可能とした。本研究会では、より詳しい方法やポイントを具体的なデータを交えて紹介する。
Taguma et al. A Practical Novel Method for Ensuring Stable Capacitation ofSpermatozoa from Cryopreserved C57BL-6J Sperm Suspension. Exp.Anim. 58(4),395-401,2009

３）マウス精子の凍結保存法の紹介○竹尾透（熊本大学 生命資源研究・支援センター (CARD) 資源開発分野）

マウス精子の凍結保存は、マウスバンクシステムを支える基幹技術として利用されている。精子凍結保存の利点は、操作が簡単であること、個体に比べて低コストで保管できること、体外受精により大量の受精卵を作製できることが挙げられる。そのため、マウスバンクでは、遺伝子改変マウスの精子が、積極的に凍結保存されている。
近年、保管されている凍結精子から、個体を作製する機会が増加している。凍結精子から効率的に個体を作製するためには、体外受精により高い受精率を達成する必要がある。そのため、我々は、高い受精率を実現できるマウス精子の凍結保存法および体外受精法の確立を目指し、研究を続けている。
一方で、今後、遺伝子改変マウスを用いた研究がさらに盛んに行われるようになれば、マウス精子の凍結保存技術あるいは凍結精子を用いた体外受精技術を必要とする人が、増加することが予測される。そこで、我々は、マウス精子の凍結保存技術を必要とする人が、簡便に利用できる技術の開発を進めている。
本報告では、現在、熊本大学 CARD で利用している精子の凍結保存法および凍結精子を用いた体外受精法について紹介する。
【マウス精子の凍結保存法】
1．35 mm ディッシュ上に、パラフィンで被覆した 120 L 精子凍結保存液 (18% ラフィノース・3% スキムミルク溶液 + 100 mM L-グルタミン) のドロップを作製する。
2．安楽死させた成熟雄 マウス(12 週齢以降) から、左右の精巣上体尾部を採取する 。
3．濾紙上で、精巣上体尾部に付着している血液や脂肪を丁寧に除去する。
4．少量の精子凍結保存液中で、精巣上体尾部を洗浄する。
5．事前に作製していた 120 μL の精子凍結保存液のドロップに、2 個の精巣上体尾部を導入する。
6．ノエス剪刀を用いて、精巣上体尾部に 5-6 箇所切り込みを入れる。
7．37℃のホットプレート上で、ディッシュを保温しながら、均一な精子懸濁液を調製するために、1 分毎にディッシュを攪拌する。
8．3 分後、ディッシュ上に、精子懸濁液を 10 μL ずつ分取する。
9．精子凍結用ストローに、90 μL の精子前培養培地 (TYH + 0.75 mM メチル--シクロデキストリン) を充填する。
10．10 mm 空気を吸引した後に、分取していた 10 μL 精子懸濁液を充填し、さらに10 mm 空気を吸引する。
11. シーラーを用いて、精子凍結ストローの両端を封じる。
12. 精子懸濁液を下方に向け、精子凍結ストローを精子凍結用フロートに置く。
13．精子凍結用フロートを液体窒素保管器内の液体窒素液面に浮かべ、10 分静置後、精子凍結用フロートを液体窒素中に浸漬する。
【マウス凍結精子を用いた体外受精法】
A. 凍結精子の融解および精子前培養
1. 37℃の湯浴中に、液体窒素中から取り出した精子凍結ストローを浸漬し、10 分間静置する。
2. 湯浴中から、精子凍結ストローを取り出し、ストロー表面の水分を十分に拭き取る。
3. ストローの両端を切断した後に、おもりとして使用した 90 μL の精子前培養培地をディッシュ上に置き、流動パラフィンで被覆して精子前培養用ドロップを作製する。
4. 精子前培養用ドロップに、10 μL の精子懸濁液を導入し、インキュベーター (37℃、5% CO 2 ) 内に 30 分間静置する。
B. 体外受精1. ディッシュ上に、90 μL HTF を置き、流動パラフィンで被覆して体外受精用ドロップを作製する。
2. 過排卵処理した成熟雌マウス (8-12 週齢) から、卵子卵丘複合体を採取し、体外受精用ドロップに導入する (2 匹/drop)。
3. 精子前培養用ドロップから、10 μL の精子懸濁液を採取し、卵子卵丘複合体を含んだ体外受精用ドロップに導入する。
4. 媒精後 6-8 時間後に、卵子を体外受精用ドロップから、卵子洗浄用ドロップ (100 μL HTF) に移動する。
5. 卵子洗浄用ドロップ中で、3 回卵子を洗浄し、翌日までインキュベーター (37℃、5% CO 2 )内に静置する。
6. 翌日、得られた二細胞期胚は、胚移植あるいは凍結保存する。