平成 26 年度 共同利用・共同研究報告2014 Fiscal Year Cooperative Research Program Report
研究課題

’14－１

発現に AtrR と SrbA がどのように関与しているかを明ら

Aspergillus fumigatus のアゾール系薬剤耐性に関与する転写因子 AtrR と SrbA の協調的発現制御機構の解明

かにすることを目的とした .

A. oryzae において AtrR-GFP 融合タンパクの観察から ,AtrR は薬剤の有無や低酸素などの条件にかかわらず常に核内に局在することが示された . 一方 , GFP-SrbA 融合タンパク質を用いた解析により , SrbA は薬剤添加や

五味勝也

低酸素条件下で核膜または小胞体から核内へ移行するこ（東北大学大学院農学研究科）とが認められ , ２種類の転写因子の活性化機構は異なる

川本進・清水公徳・萩原大祐

ことが示唆された . atrR 破壊株と srbA 破壊株を用いて互（千葉大学真菌医学研究センター）

いの転写因子の細胞内局在を調べたが , いずれの破壊株

Concerted regulator y mechanism for gene
expression involved in azole drug resistanceby transcription factors, AtrR and SrbA, in
Aspergillus fumigatus
Katsuya Gomi

も野生株と細胞内局在に違いは認められなかった . 同様に , 転写因子の発現も一方の遺伝子破壊によって影響は受けなかった . エルゴステロール生合成に関わる遺伝子

はどちらか一方の遺伝子破壊によって著しい発現低下が認められたものの , srbA 破壊では ABC トランスポーター遺伝子の発現に影響は見られなかった .

一方 , A. fumigatus でも同様に作製した atrR 破壊株と（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku

srbA 破壊株は低酸素条件下では生育が著しく悪くなり ,Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu, Daisuke
Hagiwara

低下したが , ABC トランスポーター遺伝子（cdr1B）のUniversity）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
麹 菌 Aspergillus oryzae に お い て 見 出 さ れ た ア ゾ ー ル
系 薬 剤 耐 性 に 関 す る 新 規 Zn2Cys6型 転 写 因 子 AtrR は ,Aspergillus nidulans や Aspergillus fumigatus に も 共 通 の オ ー
ソログとして見出され , それぞれの atrR 遺伝子の破壊
株では , 野生株より100倍も低い薬剤濃度でも感受性を示すことを見出した . 興味深いことに , A. fumigatus のRNA-seq 解析により , AtrR は Cdr1B/AbcC トランスポー
ターだけでなく , Cyp51A を含むエルゴステロール生合
成酵素遺伝子の発現にも関わっていることが示され , エルゴステロール生合成酵素の発現は , すでに報告のある
bHLH 型転写因子 SrbA と協調的に制御されている可能性が示唆された . そこで , 本研究ではエルゴステロール

ともにエルゴステロール生合成経路の遺伝子の発現量が発現は atrR 破壊株のみで顕著な低下が観察された . ま

た , マウスを用いた感染性試験により , いずれの破壊株

も病原性の著しい低下が認められた . さらに , 千葉大学病院から単離された A. fumigatus のアゾール耐性株（IFM
61567）において atrR 破壊を行ったところ , イトラコナ

ゾールなどのアゾール薬だけでなくもともと効果が認められないフルコナゾールに対しても高い感受性を示す
ことが明らかになった . 異なるタイプの耐性変異を有す

る耐性株における atrR 破壊株の取得を目指すとともに ,AtrR と SrbA のシスエレメントの同定ならびに共免疫沈降試験による両転写因子の相互作用の有無を解析している .

合成経路ならびに薬剤排出トランスポーターの遺伝子の

50

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

研究課題

’14－２

２週後の肺内での IFN-Y 産生が非トランスジェニック

新興強毒性真菌Cryptococcus gattii の高病原性機序の免疫学的解析

C. neoformans と C. gattii に共通な OVA 抗原に対するヘルパーT 細胞応答と , それぞれの真菌感染下での影響について詳細に解析することが可能となった . 今後は , 本実

川上和義・石井恵子

験系を用いることで , C. neoformans, C. gattii 感染下にお（東北大学大学院医学系研究科）

川本

マウスに比べ有意な増強を示した . これらの結果から ,ける免疫応答の相違点について解析を進め , C. gattii 感進・清水公徳染症の高病原性機序の解明を目指したい .

（千葉大学真菌医学研究センター）

研究課題

Immunological analysis of a mechanism for highpathogenicity of Cryptococcus gattii
Kazuyoshi Kawakami, Keiko Ishii（Tohoku University Graduate School of Medicine,

Sendai）

Cryptotoccus neoformans の特異なゲノム安定化機構の分子基盤－それを標的とした新規治療戦略を目指して－
その２
松浦Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果

’14－３

彰・今成百利子（千葉大学大学院融合科学研究科）

川本進・東江昭夫・高橋弘喜（千葉大学真菌医学研究センター）

1999年にカナダのバンクーバー島で Cryptococcus gattii

によるクリプトコックス症のアウトブレイクが発生し ,その後アメリカ合衆国の北西沿岸地域を中心に拡大しつ つ あ る（CDC-Morbidity and Mortality Weekly Report

Vol.59, No.28, 2010）. 2007年には , わが国でも国内感染と考えられる C. gattii によるクリプトコックス症例が報告されている（Emerg. Infect. Dis. 16: 1155-1157, 2010）.

通常の C. neoformans によるクリプトコックス症と異なり , 健常者でも中枢神経感染症を発症し , その高い致死率から高病原性クリプトコックス症とも呼ばれており ,今後新興感染症として大きな問題に発展することが懸念される . 本研究では , C. gattii と C. neoformans に対する

Molecular basis for specific regulation of
genome integrity in Cryptococcus neoformans
and its application to the development of novel
therapeutic strategies
Akira Matsuura, Yuriko Imanari（Graduate School of Advanced Integration Science,

Chiba University）

Susumu Kawamoto, Akio Toh-e, Hiroki Takahashi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

C. neoformans, C. gattii に遺伝子銃を用いて OVA 発現

研究成果
Cryptococcus neoformans は環境に常在する担子菌酵母であり , 主に免疫機能の低下した人に感染し重篤なクリプ

６マウスの気管内に OVA 遺伝子導入菌株を感染させ ,れている . 本菌は , 環状プラスミドが維持できない , 遺生を検出することで菌体内における OVA の発現を確認

DNA 断片の末端に高頻度でテロメア反復配列が付加さ

免疫応答性を比較することで , 本感染症の病態解明の手掛かりを探ることを目的とする .

ベクターを導入し , それぞれ９株 , ８株を得た . C57BL/
２週後の所属リンパ節細胞を同抗原で再刺激し IFN-Y 産

トコックス症を引き起こす日和見感染真菌として知ら

伝子ターゲティングの効率が悪く , 導入された直鎖状した . MHC クラス II 拘束性に OVA を認識する T 細胞受れる , など DNA 修復に関連するユニークな性質をもつ

気 管 内 に OVA 発 現 C. neoformans を 感 染 さ せ た と こ ろ ,染色体末端の維持機構という観点から C. neoformans 特有

容体を発現するトランスジェニックマウス（OT-II）の千葉大学

ことが明らかにされている（Edman, 1992）. 本研究では ,真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

51

のゲノム維持機構を明らかにし , さらにこのような特有のゲノム維持機構が C. neoformans の生活環とどのように関連し , あるいはどのように制御されているかを明らかにすることを目的とした .

昨年度の共同利用・共同研究において , C. neoformans

一倍体細胞でテロメア DNA 伸長酵素テロメラーゼの相同遺伝子 CnEST2の遺伝子破壊を行い , CnEST2遺伝子の細胞増殖における機能を解析した結果 , 本菌においても他生物種と同様 , 染色体末端の維持にはテロメラーゼの活性が必須であることが明らかにしている . 本年度はさAnalysis of synthetic mechanism and physiologicalrole of nitric oxide in pathogenic fungus
Hiroshi Takagi（Graduate School of Biological Sciences, Nara Instituteof Science and Technology）

Susumu Kawamoto, Hiroji Chibana, Akio Toh-e, Daisuke

Hagiwara（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

らに , S. cerevisiae においてテロメラーゼ欠損時に染色体

研究成果

換え , 非相同末端結合に関する遺伝子に注目し , それら

幅広い生命現象に関与している . 最近 , 高木らは酵母のように関わっているかに焦点を当て解析を進めた . まフェラーゼ Mpr1およびフラボタンパク質 Tah18依存的末端維持に関与することが明らかになっている相同組が C. neoformans における特異な DNA 修復経路選択にどず , ゲノム中に RAD52, RAD51, MRE11, DMC1の相同遺伝子を見いだし , それらの遺伝子破壊株を作製してその表現型を解析した結果 , 本菌では RAD52の DNA 修復

における重要性は低く , 一方で RAD51欠損はより severe

な表現型となることが明らかになった . この傾向は , 相

一酸化窒素（NO）はシグナル分子として , 哺乳類のSaccharomyces cerevisiae において , NO がアセチルトランスにアルギニンから合成され , 酸化ストレス耐性に寄与することを見出した . 一方 , 病原真菌はヒトに感染する際 ,自然環境と生体内の劇的な環境変化（温度 , 酸素濃度 ,栄養など）によるストレスに曝される . 真菌はこれらのストレスに応答し , 耐性を獲得することで , 増殖や病原同組換えが優先的におきる S. cerevisiae とは異なり , むし

性を示すことから , NO が真菌のストレス耐性や病原性

おり , 興味深い . 今後は , テロメラーゼ活性の制御に必

cerevisiae と同様の NO 合成経路の存在が示唆される病原え関連因子を含めた DNA 末端修復機構の選択制の違い

fumigatus）について , NO 合成と増殖 , ストレス耐性なろ高等動物における相同遺伝子破壊の表現型と類似して要な分子の探索をさらに進めつつ , テロメラーゼ , 組換の発揮に関与する可能性が考えられる . 本研究では , S.
真菌（Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Aspergillusが生じる機構を分子の側から解析することで , この生物

どとの関連性を解析する . 平成26年度には , 以下の研究明らかにしたいと考えている .

１）C. glabrata：Tah18のオルソログ遺伝子（CgTAH18）

種の特異な DNA 損傷修復のメカニズムと生理的意義を研究課題の発現抑制株をマウスのマクロファージに貪食させ’14－４たところ , 野生型株に比べてマクロファージ内での病原真菌における一酸化窒素の合成機構と生理機能の解析

増殖率が高かったことから , CgTAH18が病原性に関与している可能性が示唆された .

２）C. neoformans：Tah18のオルソログ遺伝子（CnTAH18）が生育に必須であることが判明したため , 銅イオン

高木博史
（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科）

川本

成果が得られた .

進・知花博治・東江昭夫・萩原大祐（千葉大学真菌医学研究センター）で発現を誘導する系を構築し , 銅キレーターの添加によって生育が悪化することを確認した . また ,NO 特異的蛍光プローブを用いて , アルギニンの添加により細胞内に NO が生成していることが観察できた .

３）A. fumigatus：Mpr1のオルソログ遺伝子（AfMPR1）の破壊株と高発現株を作製し , 表現型を解析したところ , Mpr1と同様に AfMPR1がアセチルトランス

52

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

フェラーゼをコードしていることが示唆された . しタンパク質サイズを短縮化することを目的として , ま

レスに対して , 野生型株と変わらない表現型を示し

MoCV1-A ORF4の抗菌活性領域を短縮化する研究を水素の添加により細胞内に NO が生成していること

全長 ORF と同等の抗菌をパン酵母に対して示すことがかしながら , これらの株は高温ストレスや酸化スト
た . また , NO 特異的蛍光プローブを用いて , 過酸化が観察できた .

今後 , Mpr1, Tah18のオルソログ遺伝子の破壊株 , 発

ず, パン酵母遺伝子発現系を利用することにより,行った . その結果 , ORF4中心領域の250アミノ酸が , 完

明らかにされた . 次に同定された短縮化されたタンパク質に相当する遺伝子配列を , 川本進教授の研究室で開現抑制株 , 高発現株を用いて , 細胞内 NO レベルを定量発された C. neoformans 発現ベクターに連結させる作業とで , 病原真菌において Mpr1や Tah18が NO の合成と生は , C. neoformans にこれらべクターを導入して , 完全長

研究課題

原真菌 Aspergillus fumigatus に対する新たな薬剤開発を目するとともに , ストレス耐性などの表現型を観察するこ

理機能に関与するかどうか検討する .

ORF4と同等な抗菌活性を有することを検討していく .

アスペルギルス症の原因となり , 重篤化をもたらす病’14－５

病原性真菌を弱毒化するマイコウイルスの探索と抗菌性素材開発に向けた検討的として , 五ノ井教授の研究グループは , A. fumigatus を弱毒化する新規なマイコウイルスの探索とその応用研究
を , 高橋梓博士を中心として行っているが , 本研究課題においては , マイコウイルス探索や同定に関して共同研

森山裕充

究を行っている . これまでの探索研究の結果 , ４種のマ

（東京農工大学大学院農学研究院）

川本を行い , ベクターを完成させることことが出来た . 今後

イコウイルス由来の２本鎖 RNA ゲノムが同定されてお進・五ノ井透・東江昭夫

り , このうち , ２種に関しては , 宿主菌に生育阻害をも（千葉大学真菌医学研究センター）

たらすことなどが確認できており , マイコウイルスであDevelopment of antifungal proteins derived
from mycoviruses which attenuate host fungus
Hiromitsu Moriyama（Graduate School of Agriculture, Tokyo University ofAgriculture and Technology）

Susumu Kawamoto, Tohru Gonoi, Akio Toh-e（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
これまでの研究において , 我々はイネいもち病菌に感染して生育阻害をもたらすマイコウイルス Magnaportheoryzae chrysovirus, MoCV1-A 由来のタンパク質のうち ,る Partitiviridae 属と Chrysoviridae 属に分類されるが , 既報のウイルスとは類似性は示すが同一ではなく , 新種であることが確認されている . 今後 , 宿主菌に対する作用機作などについての検討や , 短縮化した MoCV1-A ORF4の効能などについても , 共同研究を継続させることで実施していくことが望まれる .

発表論文
１）Urayama S, Fukuhara T, Moriyama H, Toh-E A,
Kawamoto S. Heterologous expression of a gene of
Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 strain A disrupts
growth of the human pathogenic fungus Cryptococcus

neoformans. Microbiol Immunol. 58（ 5）: 294 - 302（2014）

ORF4が抗菌活性を有することをパン酵母 Saccharomyces

cerevisiae の遺伝子発現系の利用により明らかにしてきた .

また , MoCV1-A ORF4完全長（820残基）が , ヒト病原性酵母 Cryptococcus neoformans に対しても , 異常な液胞化や生育速度の減少 , そして莢膜多糖形成の抑制が生育阻.
害効果を有することが確認されてきた（原著論文１）

そこで本研究においては , C. neoformans に導入する

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

53

研究課題

’14－６

乗り血液脳関門を通過後 , 脳内に至って髄膜炎等を起こ

Cryptococcus neoformans の低酸素応答転写
因子 Crz1/Sp1のシグナリング解析

すと考えられており , 高酸素環境（自然環境 , 肺）から

低酸素環境（血流 , 脳内）への劇的な酸素濃度変化などに打ち勝って初めて増殖し病原性を示す . 本菌の「低酸素状態に対する環境応答」は本菌の病原性発揮にも深く
川本進・清水公徳・大楠美佐子・萩原大祐

酸素応答遺伝子として「転写因子 Crz-1/Sp-1」を得て低（千葉大学真菌医学研究センター）

酸素応答機構の分子解析を進めているが , 更に , 本菌のRaclavsky, Vladislav（チェコ・パラツキー大学）

新たな別の低酸素応答遺伝子を以下のようにして得た .
まず , Agrobacterium 法による形質転換を用いて , ゲノム

Sipiczki, Matthias（ハンガリー・デブレツェン大学）

ランダム挿入ミュータントライブラリーを作製し , その中から低酸素環境非適応株を選抜した . 次に , 選抜され関水和久・松本靖彦

た菌株の T-DNA 挿入部位をシーケンス解析によって特（東京大学大学院薬学系研究科）
田村

定することができ , 相同組換えによりその遺伝子破壊株裕を作製した . そして , その遺伝子破壊株の低酸素条件下（千葉大学大学院医学研究院）
三浦

関連する病原因子のひとつと考えられ , 我々は本菌の低における性質を解析するために , 生存率測定や RT-PCR

恵や薬剤感受性試験を行った . 生存率測定から , 遺伝子破（横浜市立大学大学院医学研究科）

壊株が野生株よりも低酸素条件下の生存率が低いことがSignaling analysis of transcription factor Crz1 /Sp 1 for
hypoxia adaptation in Cryptococcus neoformans

Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu, Misako Ohkusu,

確認できた . また , RT-PCR によって , 野生株は低酸素条件下で真菌細胞膜合成に関わる遺伝子の発現量の増加が認められたが , 遺伝子破壊株においてはその遺伝子発現の増加はあまり認められなかった . 新たに得た低酸素

Daisuke Hagiwara

応答遺伝子と , すでに本菌の低酸素応答遺伝子として解Vladislav Raclavsky

調べつつあり , C. neoformans の低酸素ストレスに対する（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Palacky University, Czech）

析を進めている「転写因子 Crz-1/Sp-1」との関連を更に

環境応答シグナリング機構の解明を目指している .

上記のように , 我々は C. neoformans の細胞周期制御機

Matthias Sipiczki（University of Debrecen, Hungary）

構の研究の中で , 特異な低酸素応答現象を見出し , 解析

Kazuhisa Sekimizu, Yasuhiko Matsumoto（Graduate S chool of P harmaceutic al S ciences,

University of Tokyo）

を進めて来たが , 従来すでに詳細な研究が進められ , 多くの知見が蓄積されて来ているモデル酵母 Saccharomyces

cerevisiae の細胞周期制御機構についても , バイオインフォ

Yutaka Tamura

マテイクス解析などを用いて更なる解析 , 考察を行った

Satoshi Miuraな役割を果たしていると言われる制御因子「サイクリン -（Graduate School of Medicine, Chiba University）（Graduate School of Medicine, Yokohama City University）

研究成果
病原酵母 Cryptococcus neoformans は , 我が国に常在する真菌のうちで最も病原性が強く , 易感染患者 , 特に , エ
イズ患者の直接死因としても臨床的に極めて重要な真菌である . 本菌は生育に酸素が必須な偏性好気性酵母であるが , 自然環境からヒトに感染時 , 肺に感染して血流に

54

千葉大学

ところ , S. cerevisiae の細胞周期制御において , 最も重要

１分子（Cln1）」と「サイクリン - ２分子（Cln2）」の分子構造機能的な差異が , ユビキチン - プロテアソーム経路によるという , 新たな重要な知見を得て , その分子機構のモデルも提出して , 論文として発表した .

発表論文
１）Suganami A, Takase N, Sugiyama H, Virtudazo EV,
Kawamoto S, Tamura Y: Structure based functional

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

distinction between Cln 1 and Cln 2 depends on theubiquitin-proteasome pathway.

J. Proteomics Bioinformatics 7: 102-107（2014）

研究課題

’14－７

ン染色後にフローサイトメトリーにより評価した . 解析の結果（n ＝３）, 平均値が37℃の抗原に対して39℃の抗原で1.6倍の IL-17産生能を示した（p ＜0.1）. ２℃の温度変化による T 細胞の分化誘導は弱いながら認められたので , 39℃で何らかの抗原変化があると考えられる .

温和な加温に対する菌体の薬剤感受性の変化および宿病原真菌の mild heat stress 応答分子の機能評価と診断・治療への分子基盤
長

主細胞の応答の変化は , 薬剤投与法などへの応用も考え
られる .

研究課題

環・永尾潤一・田中芳彦’14－８（福岡歯科大学）

Candida glabrata の糖鎖合成に関与する遺伝
子欠損株の性質の解析

知花博治（千葉大学真菌医学研究センター）

Functional evaluation and application of mildheat stress responded molecules in pathogenic
fungi.
Tamaki Cho, Junichi Nagao, Yoshihiko Tanaka（Fukuoka Dental College）

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
ヒトの発熱や外部加温による mild heat stress（39℃〜41℃）は , ヒト常在病原性真菌 Candida albicans のバイ

オフィルムに対する薬剤感受性を亢進した（Cho T et

al: BPB, 2012）. 平成25年度センター共同利用研究にて ,37℃および39℃における C. albicans のバイオフィルム形
成時の遺伝子発現を網羅的に探索した . 平成26年度はさ柴田信之・工藤敦・伊藤文恵・田中

大（東北薬科大学薬学部）

知花博治（千葉大学真菌医学研究センター）

Analysis of the cell wall integrity of Candida
glabrata glycosyltransferase deletion mutants
Nobuyuki Shibata, Atsushi Kudoh, Fumie Itoh, Yutaka
Tanaka（Tohoku Pharmaceutical University）

Hiroji Chibana,（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
Candida glabrata の細胞壁糖鎖生合成に関与する各種のらに解析を進め , 37℃と比較して39℃で発現が増加する

遺伝子欠損株について細胞壁の構造および性質の解析をする）, 逆に39℃で発現が減少する遺伝子として YWP（酵について細胞壁に与える影響を詳細に解析した . 細胞壁遺伝子として HYR（菌糸形細胞壁タンパク質をコード

行い , 特に大きく変化の見られた alg6Δ株と mnn2Δ 株

母形細胞壁タンパク質をコードする）や TEP1（酵母形グルカンはアルカリ可溶性画分 , 酸可溶性画分 , アルカ

細胞壁関連タンパク質をコードする）など細胞壁に関連する遺伝子群に変化が見られることを明らかにした .

以上の結果は温度による菌体の表層構造の変化を示

リ・酸不溶性画分に分画し解析した . キチンの定量はエルソン・モルガン法により行った . グルカン結合性キ

ラートキシンに対する感受性は増殖阻止円の測定により唆するものであり , 抗原性に変化が見られる可能性も考行った . マンナンの構造解析はアセトリシス ,フィルムを抗原として , マウス骨髄細胞由来樹状細胞とよびマンナン層の形態変化は透過型電子顕微鏡により解を産生するヘルパーT 細胞の誘導能を細胞内サイトカイ

alg6Δ株は SDS, Calcofluor white 等の薬剤感受性 , β-1,3-

えられる . そこで各温度で増殖した C. albicans のバイオ

ナイーブ T 細胞の培養系で抗原応答を検討した . IL-17

千葉大学

1

H NMR

分析 , メチル化分析により行った . 細胞壁グルカン層お析した .

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

55

グルカナーゼ感受性が上昇し , TEM でもマンナン層が研究成果

ラートキシンに対する感受性は逆に低下し , キチン含量の主要起因菌の一種で，この真菌種が医療デバイス等のンの構造に変化が見られなかったが分子サイズは低下しを有することが知られている．そこで , 我々は未だあま

薄く不鮮明になっていた . しかし , micafungin およびキ

病原真菌 Candida glabrata は種々のカンジダ症（真菌症）

は野生株の２倍以上に増加していた . alg6Δ 株はマンナ

表面にバイオフィルムを形成すると，高い抗真菌剤耐性ていた . mnn2Δ株はマンナンの側鎖が失われ α-1,6- 結

り研究が進んでいない C. glabrata のバイオフィルム形成

合の直鎖構造に変化していた . しかし , 薬剤感受性等に機構に注目し，この真菌の細胞壁結合タンパク質を網羅

著しい変化は見られなかった . カイコを用いた感染実験的に解析することで , その分子機構を明らかにし，当該下していることが明らかとなった . これらの結果は特にとした .

胞壁 integrity の低下から病原性の低下につながっている

れる分泌シグナルペプチド領域と膜貫通領域を有するとよる認識に影響を与えている可能性も検討している .

し，それら遺伝子の破壊株用いてプラスチックプレート

研究協力者
川上和義

ものと比較解析した．

の結果 , alg6Δ株は野生株と比較して大きく病原性の低alg6Δ株では細胞壁合成系の酵素活性の低下が生じ , 細ことを示唆している . 細胞壁構造の変化が免疫系細胞に考えられる102のタンパク質をコードする遺伝子を選定上でのバイオフィルム形成を観察し , それらを野生株のにおいて，C. glabrata のバイオフィルム形成量が明らか

梓 , 山口正視に減少したことが分かった . それら遺伝子は , 脂質ト（千葉大学真菌医学研究センター）

研究課題

C. glabrata のバイオフィルム形成に関係すると考えら

その結果，102の遺伝子の中の５つの遺伝子の破壊株（東北大学大学院医学系研究科）

高橋

真菌症の治療や対策の礎となりうる情報を提供すること

ランポーターArv1p，MFS トランスポーターQdr2p，２つの ER からゴルジ体へのタンパク質輸送に関わるタン’14－９

パク質 Syc2p と Syn8p，細胞ストレスに関係するタンパ

Candida glabrata バイオフィルム形成に関与する遺伝子群の機能解析

ク質 Frt2p をコードしていると推測された．その中で，SYC2と SYN8遺伝子についてさらに詳細に解析したところ，これらの遺伝子破壊株が医療デバイス材料として用いられているシリコン表層でもバイオフィルム形成が梶原

将・Xinyue Chen

（東京工業大学大学院生命理工学研究科）

野生株よりも減少し , それらバイオフィルムを SEM で観察したところ，バイオフィルム形成の初期過程での知花博治

細胞接着性が特に減少していることが分かった．加え（千葉大学真菌医学研究センター）て , これらの株は，ハイグロマイシン B, コンゴレッド，

Function analysis of genes related with thebiofilm formation in Candida glabrata

SDS に対する感受性が増加することも分かった．一方 ,Q DR2を破壊した株でも，シリコン表層上でのバイオフィルム形成では，野生株と比べ明確な差が認められた .
今後 , さらに詳細な解析を進めることで , これらのタンパク質がどのようにしてバイオフィルム形成に関わっ

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）ているのかのメカニズムを明らかにする予定である．

Susumu Kajiwara, Xinyue Chen

（Graduate School of Bioscience and Biotechnology,

Tokyo Institute of Technology）

56

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

研究課題

’14－10

された . また , 限られた量の化合物を使用するにあたり ,線虫を用いたin vivo 抗真菌活性物質スクリー
ニングと作用点の研究

より高感度な実験系の開発を試みた . 腸内に定着したカ
ンジダ・グラブラータは , CTC 染色によりライブイメー

ジが観察可能であり , 線虫内の生菌数を推定することができる . 本実験系は96穴プレートでの解析が可能となっ水野貴之・文谷政憲（徳島文理大学大学院工学研究科ナノ物質工学専攻）

知花博治

た . 現在 , 東大の創薬オープンイノベーションセンター

より分与された化合物ライブラリーを用いて , スクリー
ニングを進めている .

（千葉大学真菌医学研究センター）

研究課題

Constraction of the drug screening system of Candida
glabrata pathogenicity vsing Caenorhabadutis
elegans as a host

’14－11

ショウジョウバエを使った真菌の感染実験系の開発

Takayuki Mizuno, Masanori Bun-ya

倉石貴透・倉田祥一朗

Hiroji Chibana

知花博治（Tokushima Bunri University）（東北大学大学院薬学研究科）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
我々は , 線虫とカンジダ・グラブラータを用いた新しいアッセイ系を確立させ , 殺菌効果をもつ化合物のスクリーニングを目指している .
カンジダ・グラブラータを餌として一時間 , 線虫に摂取させ , その後大腸菌を餌とし , 20℃で飼育するとカン
ジダ・グラブラータは腸内に定着し , 25℃で培養すると腸内でのカンジダ・グラブラータが増加し致死率が上昇することを我々はこれまでに報告した . 本研究におい（千葉大学真菌医学研究センター）

Development of a fugal infection system using
Drosophila
Takayuki Kuraishi, Shoichiro Kurata（Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Tohoku

University）

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）て , 抗真菌薬フルコナゾールを線虫に投与した場合 , 腸

研究成果

内のカンジダ・グラブラータは減少し致死率も未感染

日和見感染症に代表される感染症を引き起こす病原のレベルまで回復することが分かった . これに対して真菌の病原性発現機構は , 依然として不明であり , 大きの実験を行ったところ , 25℃の培養で致死率が著しく増は , Candida glabrata を用いて , ゲノムワイドに5150遺伝

sek-1（自然免疫系の遺伝子）に欠損を持つ線虫で同様加するが , フルコナゾールの投与した場合 , sek-1欠損系

統においても , 生残率が改善した . 野生型と sek-1欠損を持つ系統をすりつぶして生菌数を調べたところ , 野生型

な脅威となっている . 真菌医学研究センター知花准教授

子を組換えた変異体ライブラリーを作成している . このリソースを用いると , 病原性の発現に関わる遺伝子を網羅的に探索できる . しかしながら , マウスなどの哺乳動では , フルコナゾールの添加によって腸内のカンジダ・物を宿主として用いて , 網羅的に解析することは , 現実

は少ないものの生菌が一定レベルで存在していることがているショウジョウバエは , 遺伝子操作が容易であるばグラブラータが死滅しており , sek-1欠損系統では , 菌数分かった . これらの結果から , 線虫体内においてフルコ

ナゾールがカンジダ・グラブラータに対して静菌的に作用し , 自然免疫系によって殺菌されていることが示唆

千葉大学

的に不可能である . 一方 , 自然免疫研究によく利用されかりか , 生活環が短く網羅的解析に優れている . また ,すでに確立されている自然免疫変異体を用いることで ,病原性がどのように発現しているのかを分子レベルで解真菌医学研究センター報告

第 19 巻201557析できる .

研究課題

染させる感染実験系を確立した . そのために , 研究目

感染に応答した自然免疫誘導の分子機構の解析

本研究では , まず C. glabrata をショウジョウバエに感的 , すなわち , 真菌リソースを利用した網羅的解析を達’14－12成させるために , 通常の感染実験で用いるマイクロイン

藤田尚志・加藤博己

た体表傷害法を検討し , 数千レベルでの感染実験が可能

米山光俊・尾野本浩司

ジェクション法ではなく , タングステンニードルを用いとなった . 一方 , 真菌医学研究センターでは , 体表傷害法に適した真菌の培養法と , 東北大学に輸送可能な方法を確立した . 次に , 免疫系に関与することが知られている遺伝子の欠損ショウジョウバエに野生型の C. glabrata（京都大学ウイルス研究所）（千葉大学真菌医学研究センター）

Innate immune responses against pathogen infection

を感染させ , その後の生存率を測定することで , 易感染

Takashi Fujita

ウバエ系統を探索した . その結果 , 真菌感染抵抗性を制

Hiroki Katoを欠損させた変異体において , 感染後の生存率が有意にMitsutoshi Yoneyama

グに最適であることがわかった . そこで , 真菌の生育にKoji Onomoto

宿主のモデルとしてスクリーニングに適したショウジョ
御している Toll 受容体の上流の因子である psh と modSP

低下しており , 易感染宿主のモデルとしてスクリーニン

は必須ではない約2,500遺伝子を欠損した系統について ,感染実験を行い , 病原性が低下した系統を58系統 , 病原性が高まった系統を30系統同定した（第37回日本分子生物学会年会で発表：カンジダ酵母の病原性を規定する遺伝子の網羅的同定：ショウジョウバエ成虫への殺傷能力を指標としたカンジダ非必須遺伝子欠損株のスクリーニ（Institute for Virus Research, Kyoto University）（Institute for Virus Research, Kyoto University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
高等脊椎動物における抗ウイルス自然免疫において ,RIG-I-like 受容体（RLR）は細胞内に侵入した非自己RNA を検知するセンサー分子として必須な役割を担っ

ング：渡辺亮 , 倉石貴透 , 青山俊弘 , 中山浩伸 , 知花博ている . 本研究は , 最近明らかにした細胞内ストレス顆

理由を明らかにすることで , 病原真菌の病原性発現機構について解析することを目的とした .

治 , 倉田祥一朗）. これらの変異体で病原性が変化したの一端が明らかに出来るものと期待している .

粒（SG）の形成を介した RLR シグナル誘導の分子機構
これまでの共同研究から , Pumilio と呼ばれる RNA 結合タンパク質が , RLR を介したシグナルに何らかの役割を担っていることを示唆する結果を得ていた . そこで
本研究では , この Pumilio のウイルス感染応答および SG

形成への関与などについて詳細な解析を行った . その結

果 , １）Pumilio が三種の RLR のうち LGP2と特異的に会合していること , ２）ウイルス感染に応答して SG に共局在すること , ３）Pumilio が LGP2とウイルス由来二本鎖 RNA との会合の増強に補助的に働くことなどが明らかとなった . これらの結果は , RLR による非自己ウイ

ルス RNA 認識における Pumilio タンパク質の新たな機能を明らかにしている . さらに , これらの成果を含め RLRの機能とウイルス RNA 検知の分子メカニズム , SG 形成とその重要性などについての総説を共同で２報執筆し報
告した .

58

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

発表論文
１）Yoneyama M, Onomoto K, Jogi M, Akaboshi T, Fujita
T: Viral RNA detection by RIG-I-like receptors. Curr
Opin Immunol, 32: 48-53, 2015.

２）Narita R, Takahasi K, Murakami E, Hirano E,

不明な点が多い . また , これまでの研究から Arf/Arl ファ

ミリー分子は RIG-I を始めとする自然免疫系を制御することも示唆されている . これらのことから我々は Arl

ファミリー分子群に着目し , これらに対する発現ベク

ターを構築し MDA5とともに培養細胞へ発現させイン

Yamamoto SP, Yoneyama M, Kato H, Fujita T: A novel

ターフェロンβ遺伝子プロモーター活性化を指標にスク

sensing of viral infection. PLoS Pathog, 10: e1004417,

によるインターフェロンβ遺伝子プロモーター活性化を

３）Onomoto K, Yoneyama M, Fung G, Kato H, Fujita T:

することを見いだした . また , MDA5に対する抑制効果

function of human Pumilio proteins in cytoplasmic
2014.

Antiviral innate immunity and stress granule responses.
Trends Immunol, 35: 420-428, 2014.

研究課題

リーニングを行ったところ , Arl5B の過剰発現が MDA5
有為に抑制した . 更なる解析から MDA5と Arl5B が結合

は Arl5B の GTP/GDP 結合活性に依存しなかった . これらのことから Arl5B は MDA5に直接結合することでその機能を抑制すると考えられた . そこで Arl5B 欠損マウ

’14－13

スを作成し解析を行った . Arl5B 欠損マウスは胎生致死

自然免疫受容体を介した真菌核酸認識機構の解析であったため胎児繊維芽細胞を樹立し解析に用いた . その結果 , Arl5B 欠損細胞においては MDA5アゴニストである Poly I:C や脳心筋炎ウイルスに対するインターフェ
ロ ン β の 発 現 や 転 写 因 子 IRF3と NF- κ B の 活 性 化 が 野

河合太郎（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研

生型と比して上昇していた . 以上の結果から , Arl5B は

MDA5の抑制因子として機能していることが示された .
今後 , 真菌核酸に対する Arl5B ならびに RLRs の役割を究科）

米山光俊・尾野本浩司

明らかにしていく予定である .

（千葉大学真菌医学研究センター）

Recognition of fungal nucleic acids by patternrecognition receptors
Taro Kawai（Graduate School of Biological Sciences, Nara Instituteof Science and Technology）

発表論文
１）Kitai Y, Takeuchi O, Kawasaki T, Ori D, Sueyoshi T,
Murase M, Akira S, Kawai T: Negative regulation of
Melanoma Differentiation-associated Gene 5（MDA5）-dependent antiviral innate immune responses by Arf-likeProtein 5B. J Biol Chem, 290: 1269-80, 2015.

Mitsutoshi Yoneyama（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Koji Onomoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
自然免疫を介する核酸認識機構を理解する上で細胞内 RNA ヘ リ カ ー ゼ RIG-I-like receptors（RLRs） に 着 目

し研究を行った . その結果 , RLRs ファミリーの一つである MDA5の機能を負に制御する新たな制御因子 Arl5Bを同定することができた . Arl5B は Arf/Arl ファミリーに属する低分子量 G 蛋白質であるが , その機能については

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

59

研究課題

’14－14や強制発現によって検討したところ , RIG-I は RNA サ

宿主免疫応答と RNA サイレンシングのクロス
トークの分子機構

イレンシング活性を抑制する作用があることがわかり ,TRBP と何らかの機構で拮抗することが想定された . さらに , 小分子 RNA と TRBP やウイルスセンサータンパ

ク質との相互作用をゲルシフトアッセイで解析した結程久美子

果 , TRBP のみでなく , RIG-I と LGP2も小分子 RNA と（東京大学大学院理学系研究科）

相互作用することが明らかになった . これらの機能的米山光俊・尾野本浩司

意味を明らかにし , より詳細な解析を行うため , 現在 ,CRISPR ゲノム編集システムを用いたこれらの因子のヒ（千葉大学真菌医学研究センター）

Crosstalk between RNA silencing and hostimmune responses
Kumiko Ui-Tei（Graduate School of Science, The University of Tokyo）

Mitsutoshi Yoneyama

トノックアウト細胞株の作製を進めている .

さらに , 我々は , アポトーシスで活性化されるカス

パーゼによって , TRBP がプロセシングを受けて構造変換することも明らかにしている . そこで , 免疫応答反応と RNA サイレンシング機構において , プロセシングによる構造変換によって , TRBP が異なる機能を示す可能性についても検討した . その結果 , プロセシングされた（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

後の TRBP は RNA サイレンシング活性を促進する効果（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

シング前後の TRBP と相互作用する二本鎖 RNA を RNA

Koji Onomoto

研究成果
高等真核生物では , ウイルス感染に対する生体防御機

構としてインターフェロンの誘導を伴う自然免疫応答機構が発達している . 自然免疫応答では , 米山らが見出した RIG-I, MDA-5, LGP2などのウイルスセンサータンが消失していることが明らかになった . さらに , プロセ

免疫沈降シークエンスによって解析した結果 , 相互作

用している二本鎖 RNA の種類が大きく異なることがわ
かってきた . 今後は , プロセシング前後の TRBP と相互作用する二本鎖 RNA の特徴を明らかにし , TRBP の免疫応答機構における機能の解明を目指す .

パク質が重要な役割を果たす . 一方で , 小分子非コード

RNA による RNA サイレンシングも , ２本鎖 RNA の侵入やウイルス感染に対する生体防御機構の１つであり ,これら２つの機構は , 共通に RNA によって惹起される
ため , 相互に調節し合うクロストークの機構が存在することが想定される . 平成26年度には , 両経路に共通に関わる因子であることを独自に見出した Trans-activating

response（TAR）RNA-binding protein（TRBP） と , ウ イ

ルスセンサータンパク質の RNA サイレンシング機構における機能を解析した .

RNA サイレンシングでは , 小分子 RNA が Argonauteと呼ばれるタンパク質へ取り込まれて , 初めてその遺 伝 子 抑 制 機 能 を 発 揮 す る . TRBP は 小 分 子 RNA のArgonaute への取り込みを促進することで , RNA サイレ
ンシング活性を促進する . そこで , ウイルスセンサー

タンパク質の RNA サイレンシング効果に対する影響
を , それらのノックダウンによるレポーターアッセイ

60

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

研究課題

’14－15

ムを解析中である .

真菌認識機構 Dectin を標的とした新規難治性喘息の治療機軸の確立

研究課題

廣瀬晃一・中島裕史（千葉大学大学院医学研究院’14－16アレルギー・臨床免

結核菌細胞壁成分を認識する新規受容体の探索と免疫賦活への応用

疫学）

西城

発表論文
Am J Respir Cell Mol Biol. 2014 ;51:201-9. doi: 10.1165/
rcmb.2013-0522OC.

忍（千葉大学真菌医学研究センター

感染免疫分野）Roles of Dectin-1 and Dectin-2 in the developmentof allergic airway inflammation.

米川晶子・三宅靖延・石川絵里・
大洞将嗣・山崎 晶（九州大学生体防御医学研究所）

西城

忍・米山光俊（千葉大学真菌医学研究センター）

Koichi Hirose, Hiroshi Nakajima（Allergy and Clinical Immunology, Graduate School of

Medicine, Chiba University）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
真菌への暴露 , 感作は喘息の重症化に関与することが知られているが , そのメカニズムに関しては不明な点が多い . 本研究では真菌認識機構である Dectin-1, Dectin-2のアレルギー性気道炎症発症における働きを解析した .

Dectin-2 is a direct receptor for mannose-capped
lipoarabinomannan of mycobacteria.
Akiko Yonekawa, Yasunobu Miyake, Eri Ishikawa, Ohhora, Sho Yamasaki（Medical Insititute of Bioregulation, Kyushu University）

Shinobu Saijo, Mitsutoshi Yoneyama（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

野生型マウス , Dectin-1欠損マウス , Dectin-2欠損マウ

研究成果

炎症を惹起し , 気管支肺洗浄液（BALF）中の炎症細胞

ンノース付加リポアラビノマンナンは宿主の免疫応答にイトカイン産生能を比較検討した . その結果 , Dectin-2いる．しかし，その多面的な作用を説明しうるような受スを用いてチリダニ（HDM）誘発性アレルギー性気道

結核菌などの抗酸菌に特有の細胞壁の成分のうち，マ

浸潤 , 気道過敏性 , 縦隔リンパ節 T 細胞分化 , およびサ

対し抑制性と刺激性の両方の活性を示すことが知られて欠損マウスでは , 野生型マウスに比べて HDM 投与後の容体は，はっきりとは同定されていない．本研究では ,BALF 中への好酸球浸潤 , 肺組織における気道周囲へのC 型レクチン受容体である Dectin-2がマンノース付加リ

好酸球 , リンパ球浸潤が減少しており , 気道過敏性も低

ポアラビノマンナンの受容体であることを見い出した．

節 T 細胞からの IL-5, IL-13, IL-17産生が低下している

して樹状細胞を活性化し，炎症性サイトカインおよび抑た結果 , Dectin-2は肺に局在する CD11b 陽性樹状細胞か介して樹状細胞において抗原に特異的な T 細胞の応答を下していた . また , Dectin-2欠損マウスでは縦隔リンパことが明らかとなった . さらにそのメカニズムを解明しマンノース付加リポアラビノマンナンは Dectin-2に依存制性サイトカインの産生を誘導した．また，Dectin-2をらのサイトカイン産生を制御することにより HDM 特異

増強することもわかった．さらに，マウス自己免疫疾患

らかとなった .

もつアジュバント活性が明らかにされた．実際の感染にることを示唆するデータを得ており , 現在そのメカニズの悪化を示した．以上より，病原真菌に対する感染防御的 Th2細胞分化 , Th17細胞分化を促進していることが明

モデルにおいてマンノース付加リポアラビノマンナンの既に我々は Dectin-1もアレルギー性気道炎症に関与す

おいて，Dectin-2ノックアウトマウスは肺における病態

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

61

に必須の役割を示す Dectin-2が , 真菌だけではなく , マ

ンノース付加リポアラビノマンナンを認識することにより抗酸菌に対する宿主の免疫応答にも寄与することが明らかになった．
尚 , 本研究は Nature Review Immunology 誌の Highlightで紹介された（Nat. Rev. Immunol., 14, 648-649, 2014）.

IL-2, GM-CSF の産生が有意に低下していた . さらに ,SOC 流入欠損 BMDC による T 細胞のプライミングも部分的に低下していた .

次に , 真菌感染防御における樹状細胞のカルシウムシ

グナルの役割を個体レベルで解析するために , 樹状細胞特異的に SOC 流入を欠損するマウスにカンジダ菌のSC5314株を投与した . その結果 , コントロールとノッ

発表論文
Dectin-2 is a direct receptor for mannose-capped lipoarabinomannanof mycobacteria.
Yonekawa A, Saijo S, Hoshino Y, Miyake Y, Ishikawa E,
Suzukawa M, Inoue H, Tanaka M, Yoneyama M, Oh-Horaて , 樹状細胞の SOC 流入の関与はそれほど大きくない

Immunity. 41（3）:402-13. 2014.

いる可能性を排除することはできず , さらなる解析が必

M, Akashi K, Yamasaki S.

研究課題

クアウトマウスの生存率に変化はなかった . そこで , 別

株の ATCC18804株を投与した場合 , ノックアウトマウ

スでは生存率が低下していたが , 統計的な有意差は出な
かった . 以上から , カンジダ菌に対する感染防御におい可能性が示唆された . しかし , 他の免疫応答に関与して要である .

’14－17

研究課題
真菌感染に対する免疫応答におけるカルシウ
ムシグナル役割の解明’14－18スエヒロタケ感作による気管支喘息重症化メ
カニズムの解明

大洞将嗣（九州大学生体防御医学研究所）

廣瀬晃一・中島裕史

西城（千葉大学大学院医学研究院

忍（千葉大学真菌医学研究所）

アレルギー・臨床免

疫学）

亀井克彦

Elucidation of the role of calcium signaling in
immune response to fungal infection
Masatsugu Oh-hora（Medical Insititute of Bioregulation, Kyushu University）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
骨髄由来樹状細胞（BMDC）を用いて , 真菌感染防（千葉大学真菌医学研究センター

渡邊哲（千葉大学医学部附属病院

Koichi Hirose, Hiroshi Nakajima（Allergy and Clinical Immunology, Graduate School of

Medicine, Chiba University）

Katsuhiko Kameiと機能を解析した . PLC- γの下流で活性化される

Akira Watanabe

ア作動性カルシウム（SOC）流入

ストを欠損する BMDCを用いた解析の結果 , Dectin ファミリーはリガンド刺激によって SOC 流入を活性化することが明らかとなった .

（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Department of Control and Treatment of Infectious

Diseases, Chiba University Hospital）

また SOC 流入欠損 BMDC では , リガンド刺激による

62

千葉大学

感染症管理治療部）

Roles of sensitization to Schizophyllum commune
in the development of severe asthma

御に重要な C 型レクチン受容体 Dectin ファミリーにおけるカルシウム流入−カルシウムシグナルの制御機構

臨床感染症分野）

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

研究成果
真菌への暴露 , 感作は喘息の重症化に関与することが知られている . スエロタケ（SC）は喘息 , アレルギー性（Division of Clinical Research, Medical Mycology

Research Center, Chiba University）

気管支肺真菌症（ABPM）の発症に関与することが報告

研究成果

的なスクリーニング方法の報告は無く , 喘息患者におけは非常に重要であり , 近年 , 感染の増加傾向が報告されされている真菌だが , これまでに SC 特異的抗体の効率

人に感染症を引き起こす病原体として Aspergillus fumigatus

る SC 感作率は不明である . 我々はこれまでの共同研究ている . A. fumigatus は主に経気道感染し , 侵襲性アスペ索・同定し , この主要抗原を用いて SC 特異的抗体測定

ギルス症などを引き起こす . また , 肺病変から全身性播により SC による ABPM 患者血清を用いて主要抗原を探ELISA 法を確立した . この ELISA 法を用いて喘息患者における感作率を検討した結果 , 47名の喘息患者（Step2

６名 , Step3 29名 , Step4 12名）中 , ４名が SC 特異的 IgG

ルギルス症 , アスペルギローマや慢性壊死性肺アスペル

種性病変をつくることもある . 感染防御能の低下した患者において , アスペルギルス症などの深在性真菌症は ,発症件数ならびに治療の困難さの面でみても , 臨床治陽性 , ６名が SC 特異的 IgE 陽性であることが明らかと療上重要な課題とされている . 近年 , 亀井 , 渡邊らは A.

患者の呼吸機能を比較した結果 , SC 特異的 IgE 陽性喘息

生育因子として Fetuin との濃度依存性的な関連を示唆しなった . さらに SC 特異的抗体陽性喘息患者と陰性喘息

fumigatus によるバイオフィルムの産生を報告し , 重要な患者は陰性喘息患者に比較し１秒率（FEV1.0）が有意た（Int J Med Microbiol., 2012）. アムホテリシン B はア

陽性患者はアスペルギルスに対しても感作が成立しているが , 同病原体が産生するバイオフィルムに対する抑制に低下していることが明らかとなった . SC 特異的抗体る傾向がみられたが , SC 特異的 IgE 抗体価とアスペルギ
ルス特異的 IgE 抗体価は相関しなかった . 今後は SC 感

作とアスペルギルス感作 , それぞれの気管支喘息重症化における働きを解析するため予定である .

研究課題’14-19亮・渡邊

効果については未だ明らかになってはいない .

我 々 は96穴 マ イ ク ロ プ レ ー ト に A. fumigatus を 接 種

し , バイオフィルムの産生を確認後 , 0.1xMIC, 1xMIC,

10xMIC のアムホテリシン B を添加し , バイオフィルムの抑制効果について Microtiter biofilm assay で評価した .
アムホテリシン B の0.1xMIC 存在下では OD595で2.69,

アムホテリシン B によるAspergillus fumigatus
バイオフィルム産生の抑制効果についての研究秦

スペルギルス感染症に対しての臨床効果は認められてい

1xMIC 存在下で0.057, 10xMIC 存在下で0.056と濃度依存性のバイオフィルムの抑制効果が確認された . 今後は様々な状態においても同様な効果が得られるかどうかを確認し , 臨床効果との相関についても検討していく予定

浩（久留米大学医学部感染制御学講座：2014年４月に久留米大学医学部感染医学講座臨床感染医学部門
より教室名称変更）

亀井克彦（千葉大学真菌医学研究センター臨床感染症分野）

Basic research for anti-bioflim effect formed byAspergillus fumigatus using amphotericin B

である .

発表論文
１）Qin L, Kida Y, Ishiwada N, Ohkusu K, Kaji C, Sakai Y,
Watanabe K, Furumoto A, Ichinose A, and Watanabe H.
The relationship between biofilm formations and capsulein Haemophilus influenzae. J Infect Chemother, 20: 151156, 2014.

Liang Qin, Hiroshi Watanabe（Department of Infection Control and Prevention,

Kurume University School of Medicine）

Katsuhiko Kamei

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

63

研究課題

’14－20

大幅に低下した . 親株では血清添加によってバイオフィ

アスペルギルスのバイオフィルム形成および
抗真菌薬耐性に関連する新規遺伝子群の探索
梅山

ルム形成量が増加するが , 遺伝子破壊株ではその増加は観察できなかったことから , AUK4が血清刺激に応答したバイオフィルム形成に関与することが示唆された . 今

後 , AUK4を手がかりとして , 血清刺激に応答したバイ

隆・宮﨑義継オフィルム形成におけるシグナル伝達機構の役割を解明（国立感染症研究所）していく .

亀井克彦

研究課題（千葉大学真菌医学研究センター）

Screening of novel genes involved in biofilm
formation and antifungal resistance in Aspergillus
fumigatus’14－21

Sialylglycopeptide が Aspergillus fumigatus
生育と biofilm 形成に及ぼす影響
豊留孝仁（帯広畜産大学）

Takashi Umeyama, Yoshitsugu Miyazaki

亀井克彦・高橋弘喜・八尋真希（National Institute of Infectious Diseases）（千葉大学真菌医学研究センター）

Katsuhiko Kamei（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
深在性真菌症の中でも Aspergillus fumigatus を主要病原

Effect of sialylglycopeptide on the growth andbiofilm formation of Aspergillus fumigatus

菌とするアスペルギルス症は増加傾向にあり , 予後が非Takahito Toyotome

がアスペルギルス感染に関与することが示唆されていKatsuhiko Kamei, Hiroki Takahashi, Maki Yahiro

常に悪い . 近年 , アスペルギルスのバイオフィルム形成る . 特にアスペルギローマ（菌球）の菌糸塊に見られる菌糸周囲には厚い細胞外マトリクスが観察されている .

（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

株を作製した . さらに , 遺伝子を戻し , 相補株を作製し研究成果
近年 , Aspergillus fumigatus がその感染過程においてバ
イオフィルムを形成することが明らかとなってきた . こ
れまでの研究で血清糖タンパク質フェツイン A がバイオ
フィルム形成を促進することが明らかとなってきた . さらなる検討から , フェツイン A の N- 結合型糖鎖が重要な役割を果たしていると推測された . また , 新たな観点からの研究としてフェツイン A 添加が A. fumigatus の遺伝子発現にどのような影響を及ぼすかを検討してきた .
そこで , 本研究ではフェツイン A の N- 結合型糖鎖構造の A. fumigatus の遺伝子発現に及ぼす影響について , N結合型糖鎖構造をもつシアリルグリコペプチド（SGP）
を用いて検討を行った .

を行った . 遺伝子破壊株の寒天培地上のコロニー生育の結果 , SGP 添加時に A. fumigatus において発現が４倍

このようなバイオフィルムを形成する状態では , いくつかの抗真菌薬に対する感受性が低下する現象が示され ,難治性の原因の１つになっていると考えられる . しかしながら , バイオフィルム形成 , および , それによる抗真菌薬耐性の詳細な分子メカニズムは不明な点が多い . 本

研究では , バイオフィルム形成に関わる新規遺伝子を同定し , 抗真菌薬耐性との関連性を明らかにすることを目的とする . 平成26年度では , 一次配列からプロテインキ

ナーゼと予測される A. fumigatus の AUK4が菌糸生育やバ

イオフィルム形成に及ぼす影響を検討した .

ハイグロマイシン耐性マーカーを含むカセット DNA

を A. fumigatus AfS35株に形質転換し , AUK4遺伝子破壊
た . これらの株を用いて , 生育および分生子形成の観察

速度は親株と比べて約75% に低下し , 分生子形成効率は

64

千葉大学

次世代シークエンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析

以上上昇する遺伝子もしくは低下する遺伝子をそれぞ

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

れ42遺伝子 , 75遺伝子見いだした . これら遺伝子のうち ,を生産している事が明らかになったが , 新規化合物の単もしくは低下する遺伝子はそれぞれ１遺伝子 , ６遺伝子

また , 次世代シーケンサーによりゲノム解析が行わ

フェツイン A 添加時にも共通して４倍以上発現が上昇

離には至らなかった .

が見いだされた . フェツイン A および SGP のいずれをれている数種の Nocardia 属放線菌に関して , 構造の新規（MFS）型トランスポーターをコードしている . 一方 ,trans-AT タイプのポリケチド合成酵素遺伝子の探索を添加しても上昇する遺伝子は Major facilitator superfamily

共通して低下する遺伝子のうち , ３つの遺伝子はゲノム上で近接していた . この３つの遺伝子を含むゲノム領域
では９つの遺伝子がいずれも SGP 添加により発現量が大きく低下しており , 共通して遺伝子発現制御を受けていることが示唆された .

これらの遺伝子について , これまでに詳細な解析はな性が高い化合物の生合成遺伝子である事が期待される行ったが , 存在を確認する事はできなかった .

一方 , 渦鞭毛藻 Amphidinium sp. 2012-7-4A 株の培養

上清の成分を精査し , 新規鎖状ポリケチド amphidinin

C〜G を単離 , 構造決定した . これら新規化合物および同時に得られた既知の鎖状ポリケチド amphidinin A お

よびマクロリド amphidinolide Q の抗菌活性を評価した

されていない . 今後 , これら遺伝子の機能を解析するこ結 果 , amphidinin C〜G お よ び amphidinolide Q 全 て がな分子メカニズムが明らかになると期待される .

た . また , amphidinin A は Bacillus subtilis, Aspergillus niger

研究課題

Staphylococcus aureus に , amphidinolide Q は Escherichia coli,とにより , A. fumigatus バイオフィルム形成に関する詳細’14－22

病原真菌・放線菌の休眠遺伝子を利用した新規抗感染症薬リード化合物の獲得
久保田高明（北海道大学大学院薬学研究院）

五ノ井透（千葉大学真菌医学研究センター）

Development of lead compound for new antiinfective agent using silent gene of pathogenic
fungi and bacteria

Trichophyton mentagrophytes に抗菌活性を示す事が分かっに , amphidinin C および E は Bacillus subtilis, Aspergillus niger,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicanss に 抗菌活性を示す事が分かった .

発表論文
１）Kubota, T.; Iwai, T.; Sakai, K.; Gonoi, T.; Kobayashi,
J. Amphidinins C-F, amphidinolide Q analogues frommarine dinoflagellate Amphidinium sp. Org. Lett. 2014,
16, 5624-5627.
２）Kubota, T.; Iwai, T.; Ishiyama, H.; Sakai, K.; Gonoi, T.;
Kobayashi, J. Amphidinin G, a putative precursor ofamphidinin A from marine dinoflagellate Amphidinium
sp. Tetrahedron Lett. 2015, 56, 990-993.

Takaaki Kubota（Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido

University）

Tohru Gonoi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
化合物生産性が明らかにされていない病原性放線菌のうち Nocardia terpenica IFM0555の生産する成分について精査した結果 , Nocardia terpenica IFM0406の生産する

brasilicardin A（アミノ酸トランスポーターSystem L の強力な阻害により免疫抑制活性を示す）および関連化合物

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

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研究課題

’14－23研究課題

膣カンジダ症発症とカンジダ・アルビカンスの遺伝子型に関する研究’14－24

真菌認識に重要な自然免疫受容体 Dectin-1及び Dectin-2の抗腫瘍応答における役割の解析

神戸俊夫

柳井秀元・谷口維紹（名古屋大学大学院医学系研究科附属神経疾患・（東京大学生産技術研究所）

西城

腫瘍分子医学研究センター）

矢口貴志・田中玲子

忍（千葉大学真菌医学研究センター）（千葉大学真菌医学研究センター）

Study on Candida albicans genotypes relatingwith vaginal candidiasis
Toshio Kanbe

（Center for Neurological Diseases and Cancer, Nagoya

University）

Takashi Yaguchi, Reiko Tanaka（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
Candida albicans は口腔 , 皮膚 , 膣などの常在性真菌として知られ , カンジダ症のほとんどがこれら常在性カンジダ酵母による内因性感染である . これまでに , 健常者
口腔に由来する C. albicans のマイクロサテライト領域に基づいた遺伝子型解析で５つの主要遺伝子型（genotype
１, ２, ３, ４, ５）の中で , genotype ５は健常者に由来する C. albicans のみにみられる型であり , genotype ２, ３
はカンジダ症病巣部に由来する C. albicans の主要遺伝子型であることを示してきた . 本研究では , 膣カンジダ症
患者病変部より分離した86株の C. albicans の遺伝子型を２種類のマーカー（CDC ３, CAI）により解析し , これまでの結果と比較した . 結果 , 膣カンジダ症の場合も ,genotype 5（ 健 常 者 由 来 C. albicans 特 異 的 ）C. albicansは認められなかった . カンジダ症病巣部に由来する C.
albicans でみられる genotype 2および３については , ほ
とんどが genotype 2 C. albicans（７%）で , genotype 3 C.
albicans の分離率は１% であった . これらの結果はカンジ
ダ血症患者に由来する C. albicans と同じであった . 現在 ,genotype 2 C. albicans の健常者膣における分布に関する解析に加え , genotype 2および5 C. albicans の生物学性状についての比較を進めている .

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千葉大学

Recognition of tumor cells by Dectin-1 orchestrates
innate immune cells for anti-tumor responses
Hideyuki Yanai, Tadatsugu Taniguchi（Institute of Industrial Science, The University ofTokyo）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
がんに対する新たな治療法として , 最近 , 免疫療法に大きな期待が寄せられている . 古くから自身の免疫系ががん細胞を認識し , 排除することがわかっていたが , その機構としては , 獲得免疫系によるがん細胞の認識機構がよく知られており , 免疫系のもう一つの軸である自然免疫系がどのようにしてがん細胞を認識し , その排除を促しているのか , という点については不明な点が多く残されていた .

本研究では , 免疫細胞の一種であるマクロファージが樹状細胞に発現する C 型レクチンファミリー分子のDectin-1が , がん細胞を直接認識することで , 自然免疫系が活性化され , その結果がん細胞が体内から排除されることを明らかにした .

本研究は , 病原真菌に対する感染防御に必須の役割を担っている自然免疫受容体ががん細胞を認識し , その排除を促していることを世界に先駆けて明らかにしたもの
で , 今後 , 新しいがんの治療法や予防法の開発へとつながることが期待される .

尚 , 本研究は eLife 誌の Insight で紹介された .

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

発表論文
Recognition of tumor cells by Dectin-1 orchestrates innate
immune cells for anti-tumor responses.
Chiba S, Ikushima H, Ueki H, Yanai H, Kimura Y, Hangai

千葉大学

S, Nishio J, Negishi H, Tamura T, Saijo S, Iwakura Y,
Taniguchi T.

eLife. ３:e04177. 2014（doi: 10.7554/eLife.04177.）

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

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