●プリオン病――［ II ］プリオン蛋白の代謝とプリオン複製

4．新しいプリオン関連因子
八谷如美＊

蛋白質が本来与えられた機能を発揮するには，正しい立体構造を形成していることが必要である．合成されたアミノ酸の自発的な折りたたみは効率も悪く間違いも多い
ので，細胞にはシャペロンと呼ばれる立体構造を手助けする分子が存在する．プリオン蛋白質は正常な細胞に発現しており（正常型プリオン蛋白質），プリオン病を引き起こす異常感染型のプリオン蛋白質とはその立体構造が異なるだけである．この異常感
染型への高次構造変換の鍵を握るシャペロンはプロテイン X と呼ばれ，その解明が待たれている．
また，蛋白質の代謝においては，分解酵素によってプロセシングを受け活性分子となるものや，役目を終えたため分解酵素で処理を受ける過程が存在する．プリオン蛋
白質は分泌蛋白質としての通常の経路で合成され，細胞膜に輸送されて，カルボキシル末端に付いている GPI アンカーでラフトとよばれる脂質二重層の特殊化した部位に留め置かれる．
プリオン蛋白質の一生のうちで，どこで分解酵素によるプロセシングを受けるかは定かではなく，またその分解酵素すらきちんと同定されていないものの，細胞内で分解を受けたプリオン蛋白質はもはや異常感染型への高次構造変換を起こさないことがすでに明らかなことから，分解酵素の精製はプリオン病の治療および予防に重要な要素となりうる．われわれはプリオン蛋白質の代謝過程を可視化する系を立ち上げ，生化学的手法と合わせてこれらの新しいプリオン関連因子の同定を行っている．

Approaches to identifying prion related factors
NAOMI S. HACHIYA Department of Cortical Function Disorders, National Institute of Neuroscience, National Centerof Neurology and Psychiatry

はちや・なおみ：国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第７部研究員．平成７年九州大学大学
院医学研究院修了．同年学術振興会特別研究員．平成８年科学技術振興事業団月田プロジェクトグ
ループリーダー． 平成13年現職．
主研究領域／生化学，細胞生物学．
＊Key words

プリオン
プリオン病
シャペロン
分解酵素プリオン病 71

スパラギン型の糖鎖およびシアル酸の付加をはじめに受ける．ゴルジを出たプリオン蛋白質は，さすべての蛋白質は正しい立体構造をとり，らにトランスゴルジネットワークを経て，カ本来働くべき場所へ輸送され，局在してはじルボキシル末端に付加された GPI アンカーめて機能する分子となる．それゆえ，立体構によって細胞膜上の脂質ドメインであるラフ造の形成の失敗や輸送の不具合が起これば，トに係留される．この輸送過程のどこかで，当然疾患の原因となりうる．正常型プリオン

プリオン蛋白質は何らかのプロテアーゼに蛋白質と異常感染型プリオン蛋白質の差は立よって代謝分解を受けるが，いつ，どこで，体構造の差に基づくものであることから1,2），どのプロテアーゼによってこの過程が起こる

プリオン病もそうした，いわゆる立体構造形のかは確実にわかってはいない．プリオン蛋成不全によって引き起こされる疾患のひとつ

白質が正常にこの分解代謝を受けることがでであり，未だ解明されていないプリオン蛋白

きれば，代謝された分子は立体構造不全を引質の高次構造形成のしくみや生理機能を明らき起こさない，つまり異常感染型へとはならかにしていくことは，根本的なプリオン病のないことから3），この分解過程の解明および治療や予防への応用へとつながる．

分解酵素の同定は，プリオン病の治療および予防に重要な情報となるのみならず，生理機

1．プリオン蛋白質の分解過程および立体構造変換にかかわるシャペロン
プリオン蛋白質は小胞体膜上で分泌蛋白質として合成され，おそらくは COPII とよばれ能を解明するうえでも貴重なデータとなる．
そこでわれわれは，この過程を明らかにすることを目的として，プリオン蛋白質の動きを可視化し，さらに分解の過程をも可視化しうる系を構築した．
まず，プリオン蛋白質のアミノ末端付近にる小胞に乗ってゴルジ体に運ばれ，そこでアA

B
図1

融合蛋白質における発現観察

A：プリオン蛋白質のアミノ末端に GFP を融合させ N2a 細胞で発現させデルタビジョン蛍光顕微鏡で観察．
B：プリオン蛋白質のカルボキシル末端に DsRed を融合させ N2a 細胞で発現させデルタビ
ジョン蛍光顕微鏡で観察．

72 第 121 回日本医学会シンポジウム

図2

プリオン蛋白質分解の様子

A：プリオン蛋白質の分解過程を可視化するためのコンストラクト模式図
B：A のプラスミドを N2a 細胞に発現させデルタビジョン蛍光顕微鏡で観察．

緑の蛍光を示す GFP を融合させたキメラ蛋

端に DsRed を付加し
（図 2 A），N2a で細胞で白質を構築し，マウス神経芽細胞腫由来の細発現させ観察した．この場合，プリオン蛋白胞 N 2 a にトランスフェクトを行い，生細胞質が分解酵素での分解を受ける以前は緑と赤での発現の様子をデルタビジョン蛍光顕微鏡が合わさった黄色のシグナルが検出され，一にて観察した（図 1 A）．また，同じくプリオ方，分解を受けた後の分子は明らかに緑と赤ン蛋白質のカルボキシル末端に赤の蛍光を示の蛍光分子の局在が異なって観察された（図す DsRed を融合させ発現し，観察を行った2 B）．
しかもその分解の過程は，これまで細胞（図 1 B）
．その結果，いずれの融合蛋白質の発膜上，つまり細胞外でおこるとの予測が大半

現観察においても，プリオン蛋白質は主としを占めていたが4,5），今回のわれわれの系にてゴルジ体付近，および細胞膜上に局在してよって，明らかに細胞内で分解が起こっていいる様子が観察された．次に，プリオン蛋白る様子が示された．

質分解の様子を可視化するために，プリオンさらに，生化学的に分解酵素を同定する試一分子のアミノ末端に GFP，カルボキシル末験管内アッセイ系を作成した．試験管内でのプリオン病 73

Wheat Germ Synthesized-PrPUnfolding
Mouse Liver Extract
WG-PrP
1mM ATP@37℃ for 20 min

図3

プリオン分解酵素アッセイの模式図

けることを見いだし，この活性を指標としてマウス肝臓のホモジネートの超遠心ペレット画分から，現在のところ，3,600 倍の精製度で活性成分を回収している（図 3）．
また，このアッセイの過程において，ウレアでプリオンの高次構造をアンフォールドさせたが，細胞内では未だ同定されていないシャペロン分子がこの過程を行っていると考えられており，プロテインXと仮称されている6,7）．

2．
プリオン蛋白質の輸送機構
プリオン蛋白質が細胞膜に行き着くまでの輸送過程を詳細に解析するべく，図 1 で用い
図4

微小管上にプリオン分子が局在する様子

A6 細胞に蛍光プリオン蛋白質，および蛍光チューブリンを共発現させて観察．

た蛍光プリオン蛋白質と，蛍光蛋白質を融合させた微小管およびアクチンをともに共発現させ，その挙動を観察した．この観察には，分解活性を効率よく検出するために，小麦胚細胞骨格の観察が比較的容易な Xenopus 腎芽系で in vitro 合成したプリオン蛋白質を，細尿管由来の A6 細胞を使用した．ちなみにウレアを用いて変性，アンフォールドさせ，この A6 細胞を用いてプリオン蛋白質単独で基質として使用した．ここにマウス肝臓のホ発現させた場合でも，N2a 細胞での観察時とモジネートを超遠心したペレット画分を添加は何ら局在の変化はなく，主にゴルジ付近とすると，その添加量に応じて基質が分解を受細胞膜に観察された．これら細胞骨格系の分74 第 121 回日本医学会シンポジウム

子との共発現の結果，微小管上にプリオン分子が局在する様子が観察された（図 4）．このこっていると考えています．
村本

PrP を wheat germ でつく ら せ て 放ことは，微小管によってプリオン分子が細胞っ て お く と ア グ リ ゲ ー ト す る の で，ア ン膜へ輸送されていることを示唆している．細フォールドしたものをアッセイに使うという

胞骨格系依存のプリオン分子の輸送のしくみことですが，先生のアクティビティの濃縮，取や，それに関わるその他の因子の同定など現られてきた分画はもちろんアンフォールドし在解析中である．

た PrP を切ると思いますが，アグリゲートしたものを切る力はアッセイされていますか．

〔文献〕
1）Pan KM, et al . : Proc Natl Acad Sci USA 1993 ; 90 :10962―10966.
2）Huang Z, et al . : Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 91 :7139―7143.
3） Borchelt DR , et al . : J Biol Chem 1992 ; 267 :16188―16199.
4）Taraboulus A, et al . : J Cell Biol 1995 ; 129 : 121―132.
5）Kaneko K, et al . : Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 90 :2333―2338.
6）Telling GC, et al . : Cell 1995 ; 83 : 79―90.
7）Kaneko K, et al . : Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 94 :10069―12338.

八谷

アッセイしておりません．

村本

私の勝手な憶測ですが，分解酵素はPrP がアグリゲートするのを防ぐ働きをしていると想像しておりまして，そういうアクティビティを調べておられたらと思いました．
八谷

Wheat germ の基質は以前からよく使っていますが，合成した時点でアグリゲートを構成します．その理由はおそらく，その中に HSP などの高次構造を安定にするシャペロンがほとんどないか失活しているからです．あの系を使って高次構造の安定，プラス，プロセッシングを見ようと思えば，見たいファクターが二つになってしまうので，なか質疑応答

なか困難ではないかと思います．
村本座長（品川） どうもありがとうございました．いまのお話はプリオン蛋白の modifica-Wheat germ の系で発現させる理由は何でしょうか．
八谷

in vitro 系で生成，合成させる簡便

tion に関係する蛋白といえると思いますが，さから，reticulocyte か wheat germ というこ

それについてどなたかご質問はございますでとになりますが，wheat germ は合成量が多いしょうか．

ことが一つです．それから，reticulocyte はい村本環（東北大） いくつか教えていただ

ろいろなシャペロンが入っていますので，余きたいのですが，まずどこで切れるかという計なファクターを見てしまう可能性があり，ことについては，いまのところトランスゴルその可能性を排除したいということです．

ジネットワークと細胞表面の間と考えてよろしいのでしょうか．
八谷

水澤英洋（東京医科歯科大） 先生のモデルは非常にわかりやすかったのですが，それで実際にどこで切れるかということにいきますと，もし感染性のあるプリオン蛋白関するデータは私どもでは持っておりませんと会合する場合，どのへんで会合するのでが，精製のスターティングマテリアルがラッしょうか．
膜上のラフトのあたりで会合して，ト肝のホモジネートの超遠心ペレットですの異常化されたもの，増殖したものはどこに貯で，おそらく先生がおっしゃった画分で起まっていってトキシックになるのか，教えてプリオン病 75いただけませんか．
八谷

私どもには感染実験施設がありませんので，治験ができません．通常いわれていがあります．
あれと先生の系は違うのですね．
八谷

違うと考えています．

片峰

もう一つ，プロテアゾームなどの各ますのは，ラフトのところに運ばれて，GPI

種インヒビターを使われるといろいろなことアンカーで繋留され，そこで変換する．正常がわかってくるのではないかと思いますが，型から異常感染型への変換はそこで起こるとそういうデータはありますか．

考えられています．
水澤

外で起こるのですか．

八谷

そうですね．

水澤

それがトキシックになるためには，中に入る必要がありますね．エンドゾームに取り込まれて，それから悪さをするということですか．
八谷

いまあるプリオンの基礎データで八谷まだ行っておりませんが，ぜひ行いたいと思っています．
座長

動画が交じっていた神経細胞のスライドですが，あれはトランスフェクションしたものですか．
八谷

そうです．トランスフェクションしたものです．
座長あそこで赤くあるいはグリーンに染は，そのあたりのうまいモデルができていな

まってくるのは，1 分子が検出できているわ

いと思っています．いつの日か感染実験施設

けですか．

を持って，そういうところも込みで明らかに八谷していきたいと思っています．
水澤

GFP や Ds Red に関してそういう問題がいつも起こりますが，基本的には GFP外にいてトキシックになっているとや Ds Red をフュージョンした分子によりまいうデータはあるのでしょうか．一番初期にす．あ る 分 子 で は 明 ら か に 1 分 子 に GFP 1

どうかということで，佐藤先生のお話にあっ個だけを見ています．自然の状態で会合してたように，電顕で見たときの初期像で細胞内しまう，オリゴマーをつくるようなものは，に変化が起きています．ただ，それは細胞内1 個の丸い光が数個の分子を見ている．仮にになくてもよいかもしれないので，最初外にプリオン蛋白がオリゴマーを形成するようなあって細胞を障害する可能性もあるといわれものであれば，生理的な状態ではあの光は分ているのでしょうか．

子を何個か合わせたものです．もし単独であ八谷

外で変換が起きていることを示唆す

るデータはたくさんあります．
片峰

る よ う な も の な ら，光 は 1 分 子 で す．GFPの光の定量からだいたいの予測はできます

茂（長崎大） N 末フラグメントあるが，いまのところ私どものデータは 1 分子のいはフルレングスでもよいのですが，細胞か光の強さで見えていると考えています．ただら外に分泌してどんどん出ていくような絵はすべてがそうではありませんので，プリオン見えませんか．

に関してはまだデータはありません．
座長

PrPc を見ておられますが，PrPSc を外八谷見えません．

片峰

分泌されていないのですか．

部から加えたときにどうなるか，非常におも八谷おそらくされていません．

しろいなと思いながら見ていました．

片峰

一つの考え方として，GPI アンカー

八谷

PrPSc は使えないのです．

で一度外に出てか，フルレングスが出てから，座長それはよく存じています．
それでは，外で ADAM みたいなもので切れてという話

76 第 121 回日本医学会シンポジウム

どうもありがとうございました．