ISSN 1347−6920

MMRC
ANNUAL REPORT OF MEDICAL MYCOLOGYRESEARCH CENTER, CHIBA UNIVERSITY 2015
千葉大学 真菌医学研究センター

19

平成27年

報告

目

次

Content

はじめに Preface

感染免疫分野 米山 PI（感染応答）プロジェクト

Project for Immune Response in Infections Diseases

3

Project for Cytokine Research

6

Project for Host-Microbial Interactions in Symbiosis and Pathogenesis

9Canjida glabrata Phenome Project11

Project to Link Basic Sciences and Clinical Medicine

14

Project for Host Response Network of Bacterial Infection

20

Project for Molecular Signaling Analysis

24

Project for Infection Control and Prevention

26

感染免疫分野 西城 PI（サイトカイン）プロジェクト
感染免疫分野 後藤 PI（微生物・免疫制御）プロジェクト

病原機能分野 知花 PI（カンジダ・グラブラーダ・フェノーム）プロジェクト
臨床感染症分野 亀井 PI（臨床感染症）プロジェクト
臨床感染症分野 山本（感染宿主応答ネットワーク）プロジェクト
臨床感染症分野 川本（分子細胞シグナリング解析）プロジェクト
感染症制御分野 石和田（感染症制御）プロジェクト

微生物資源分野 五ノ井 PI（真菌・放線菌と宿主の分子相互作用研究）プロジェクト
Project for Host Pathogen（fungi/actinomycetes）Molecular Interaction
33
微生物資源分野 高橋 PI（微生物創生）プロジェクト

Project for Systems Biology of Microorganisms

40

Management Unit of Microbiological Resources

43

Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology
National BioResource Project Pathogenic Microorganisms

46

Cooperative Research of Priority Areas with NEKKEN, Nagasaki University

47

The Project Controlling Aspergillosis and the Related Emerging Mycoses

48

微生物資源分野 バイオリソース管理室

文部科学省 ナショナルバイオリソースプロジェクト「病原微生物」

長崎大学熱帯医学研究拠点特定領域共同研究

アスペルギルス症を中心とした新興真菌症制圧プロジェクト
平成26年度 共同利用・共同研究報告2014 Fiscal Year Cooperative Research Program Report

感染症研究グローバルネットワークフォーラム2014
Global Network Forum on Infection and Immunity 20142015年講演会
2015 Scientific Meeteing & Seminars

50
68
70

は

じ

め

に

我が国は超高齢社会に突入し , 高度医療や生活習慣病に起因した日和見感染症 , 慢性閉塞性肺疾患（COPD）

をはじめとする呼吸器病における真菌・細菌感染症は増加の一途を辿り , また経済のグローバリゼーションに伴う輸入真菌症など , 真菌症をはじめとするさまざまな感染症の脅威に直面しています . このような状況で , 我が国唯一の真菌症の研究・教育機関として , 又千葉大学においては , 感染症・免疫・病原体の研究プラットホーム
として , 本センターの使命は以前にも増して重要になっています . 本センターは , 病原真菌研究の共同利用・共同研究拠点として , 文部科学省より平成22年度から27年度まで拠点認定を受け , 大学 , 国公立研究機関 , 千葉大学

関係部局 , 医療機関 , 企業と緊密に連携して , 共同利用 , 共同研究 , 教育活動を積極的に行ってきました . また本
年には , 共同利用・共同拠点として文部科学省の期末評価を受け , その結果 , 平成28年度より再認定を受ける運

びとなりました . 本センターでは , 病原微生物のナショナルバイオリソースプロジェクト中核的拠点として , 本
事業を大阪大学 , 長崎大学 , 岐阜大学と分担して活動を行っています . さらにこれらの事業と平行して , 独立研究グループリーダーによる基盤研究を推進しています . 一方 , 平成26年10月には臨床感染症研究分野が , 附属病院
において我が国初の真菌症専門外来を開設しました . したがって本センターでは , 「共同利用・共同研究・バイオ

リソース拠点事業」, 「感染症・免疫基盤研究」, 「真菌症臨床研究」の三つを柱として , 今後も我が国の真菌医学の発展に先導的な役割を果たす所存です .

平 成 28 年 １ 月
千葉大学真菌医学研究センター長

笹

川

千

尋

Preface
Major challenges facing a super-aging society include a rising number of immunocompromised hosts andpatients with pneumonia, particularly chronic obstructive pulmonary disease（COPD）. Moreover, the dramaticincrease in worldwide trade concomitant with the spread of severe fungal infectious diseases are being recognized

as key issues within the aging population. The Medical Mycology Research Center（MMRC）at Chiba University

has become increasingly important because it serves dual functions as a research organization as well as promotes

educational activities to raise public awareness. MMRC has been actively engaged in medical mycology research andrelated educational activities through partnerships with universities, public institutions, medical institutions, andpharmaceutical companies. Since 2002, MMRC has been a key institution in the National BioResource Project（NBRP）and continues to be a leader in the field of pathogenic microbes through collaborations with the University ofOsaka, Nagasaki University, and Gifu University. MMRC continues to support research activities by providing fungal
research resources to expand the understanding of fungal pathogenesis and host innate immune responses. In fact, a

specialty clinical research facility for fungal infection was opened at the Chiba University Hospital in October 2014.

It is important to highlight that in 2015, MMRC underwent a 5-year research activity evaluation by the Ministry of

Education, Culture, Sports, Science, and Technology-Japan（MEXT）, and received high commendation including

renewed funding support for the next six years. We, therefore, envision MMRC to be the leading institution for

scientific research excellence in microbiology and immunology, clinical fungal infectious research, and a key resourcefor pathogenic fungi and actinomycetales, ultimately advancing the field of medical mycology.
January 21, 2016

Chihiro Sasakawa
Director of MMRC

米山 PI（感染応答）プロジェクト
Project for Immune Response in Infections Diseases
研究概要（Summary）

感染に対する生体防御は , 自然免疫と獲得免疫によって協調して行われている . 本プロジェクトでは , ウイルス感染に応答した自然免疫誘導に注目し , 感染センサーRIG-I-like 受容体（RLR）によるウ
イルス由来の非自己 RNA 検知の分子機構の解明と , それによって引き起こされる免疫応答の生理機能を解析することにより , ウイルス感染症に対する新たな治療戦略の開発を目指した解析を行っている .

Innate immune system plays an essential role for self-defense against infection of a variety of pathogens. In
this project, we focus on antiviral innate immunity, especially molecular machinery for detection of viral RNA
by retinoic acid-inducible gene I（RIG-I）-like receptors（RLRs）and the subsequent immune responses. The
results obtained from the studies will help us to establish a novel therapeutic or preventive strategy against
RNA virus-induced infectious diseases.
教

授

助

教

非常勤技術職員
技 術 補 佐 員
技 術 補 佐 員

1.

米山 光俊
尾野本浩司
滝澤香代子
常喜 儒彦
滝沢みゆき

Professor

Assistant Professor

Adjunct Research Technician

Research Promotion Technician
Research Promotion Technician

Viral RNA detection by RIG-I-like receptors

Mitsutoshi Yoneyama1, Koji Onomoto 1 , Michihiko Jogi 1 ,Teppei Akaboshi and Takashi Fujita
1

1

2, 3

Division of Molecular Immunology, Medical Mycology

Mitsutoshi Yoneyama
Koji Onomoto
Kayoko Takizawa
Michihiko Jogi
Miyuki Takizawa

the three RLR family members RIG-I and melanoma

differentiation-associated gene 5（MDA5）recognize distinct

viral RNA species with differential molecular machinery andactivate signaling through mitochondrial antiviral signaling（MAVS, also known as IPS-1/VISA/Cardif）, which leads tothe expression of cytokines including type I and III interferons

Research Center, Chiba University, 1-8-1, Inohana, Chuo-（ IFNs ）to restrict viral propagation. In this review, we

Genetics, Institute for Virus Research, Laboratory ofsignal transduction by RLRs and MAVS/IPS-1.

Kyoto University, Kyoto 606-8507, Japan2.

ku, Chiba 260-8673, Japan. Laboratory of Molecular2

3

Molecular Cell Biology, Graduate School of Biostudies,

In higher vertebrates, recognition of the non-self signatureof invading viruses by genome-encoded pattern recognition

receptors initiates antiviral innate immunity. RLRs detect

viral RNA as a non-self pattern in the cytoplasm and activate

downstream signaling. Detection of viral RNA also activates

stress responses resulting in stress granule-like aggregates,
which facilitate RLR-mediated antiviral immunity. Among

千葉大学

summarize recent knowledge regarding RNA recognition andFunctional analysis of RNA binding proteins（RBPs）,

which are responsible for induction of anti-viral innate

immunity via RNA-granule formation.

Koji Onomoto, Takaaki Ito, Marie Ban and Mitsutoshi
Yoneyama

We demonstrated that viral infection induces RIG-I toaccumulate in cytoplasmic granular-like structure, antiviral

真菌医学研究センター報告

第 19 巻20153

stress granule（avSG）. We further revealed that avSG plays

To understand RLR-mediated signaling, we established thea critical role as platform for initiation of RIG-I-mediatedartificial RLR activation system that is based on chemically-

for avSG formation, we identified several RBPs that are

RIG-I（ARIAD Pharmaceuticals）. This system can deliver

their function in antiviral immune responses. As a result,

The recent data indicated that the RLR-mediated signaling

antiviral signaling. To understand the molecular machinery

associated with RIG-I in virus-infected cells, and examined

we found out that several RBPs play an important role forregulation of both RIG-I-mediated signal activation and avSG

induced oligomerization of caspase recruitment domain of

RLR-mediated signaling into the cells without viral infection.
induces growth inhibition of the cells in IFN-independent

manner. We are trying to reveal the molecular machinery forformation. This work was supported by MEXT KAKENHI,

this RLR-induced growth inhibition.

（15H01252）and JSPS KAKENHI, Grant-in-Aid for Young

5.

3.

Mitsutoshi Yoneyama

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas
Scientist（B）（26293101）.

Recognition of viral ribonucleoprotein complex（RNP）
by RIG-I.

Identification of new innate immune receptor（s）for
fungal infection.

Pattern recognition receptors（ PRRs ）, such as RLRs,

recognize pathogen-associated molecular patterns（PAMPs）

Michihiko Jogi and Mitsutoshi Yoneyama
It has remained unc lear how RIG-I detects viralribonucleoprotein complex（RNP）, which consists of viraland initiate innate immune responses. Although it is wellknown that the fungal cell wall components, β-glucans andα -mannans, are recognized by the C-type lectin receptors

genomic RNA and viral proteins, in the virus-infected cells.

（CLRs）, Dectin-1 and Dectin-2, respectively, it remains

RIG-I activation and examined whether viral RNP canchitin, is recognized by innate immune receptor（s）. We

artificial influenza A virus（IAV）RNP generated in 293T

for chitin recognition in anti-fungal innate responses. This

Recently, we established in vitro reconstitution system foractivate RIG-I in vitro. As a model RNP, we preparedcells and confirmed that the artificial RNP forms a horseshoe-

like structure using the atomic force microscope, as reported

in the previous report. Our data indicated that IAV RNP

can activate recombinant RIG-I（ rRIG-I ）-mediatedantiviral signaling in our assay system. However, we failed toobserve direct interaction between viral RNP and rRIG-I by

density gradient centrifugation analysis, suggesting possible

to be determined how another fungal cell wall component,
are trying to identify a novel PRR（s）, which is responsible

work was supported by JSPS KAKENHI, Grant-in-Aid for
Challenging Exploratory Research（26670209）.

Publications

1）Iijima S, Matsuura K, Watanabe T, Onomoto K, Fujita T,

Ito K, Iio E, Miyaki T, Fujiwara K, Shinkai N, Kusakabe

A, Endo M, Nojiri S, Joh T, Tanaka Y. Influence of

requirement of additional molecule（ s ）for the interaction

genes suppressing interferon effects in peripheral blood

Grant-in-Aid for Scientific Research（B）（26293101）.

chronic hepatitis C. PLoS One, 10:e0118000, 2015.

between them. This work was supported by JSPS KAKENHI,

4.

Functional analysis of RLR-mediated signal transduction.

Koji Onomoto, Koutaro Okita and Mitsutoshi Yoneyama
RLRs are viral RNA sensors to initiate antiviral innate

immunity, including gene activation of type I and III IFNs.

4

千葉大学

mononuclear cells during triple antiviral therapy for2）Okazaki T, Higuchi M, Takeda K, Iwatsuki-Horimoto

K, Kiso M, Miyagishi M, Yanai H, Kato A, Yoneyama

M, Fujita T, Taniguchi T, Kawaoka Y, Ichijo H, Goto Y.

The ASK family kinases differentially mediate inductionof type I interferon and apoptosis during the antiviral

response. Sci Signal, 8:ra78, 2015.

3）Yoneyama M, Jogi M, Onomoto K. Regulation of

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

antiviral innate immune signaling by stress-induced RNA
granules. J Biochem, in press.

4）Yoneyama M, Onomoto K, Jogi M, Akaboshi T, Fujita T.

千葉大学

Viral RNA detection by RIG-I-like receptors. Curr Opin

Immunol, 32:48-53, 2015.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

5

西城 PI（サイトカイン）プロジェクト
Project for Cytokine Research
研究概要（Summary）

生体は , 多種多様な細胞や組織が互いに時空的に作用することにより恒常性が維持される一つシス
テムであり , その維持においてサイトカインは中心的な役割を担っている . 多くの疾病は単に一つの臓器 , 組織の異常ではなく , 免疫系を始めとする種々のシステムの異常であることから , これらを統合するサイトカインの役割を知ることは非常に重要である . 本プロジェクトでは , 感染性疾患や炎症性疾患の病態形成におけるサイトカインの役割を解明し , 最終的に新たな治療薬の標的分子を見出すことを目的とする .

Cytokines play a central role in maintenance of homeostasis. Because, a disease is not caused by only one
problem of an organ, but caused by a systemic disorder, which is regulated by cytokines, it is important tostudy their functions. We aim to find new therapeutic targets for inflammatory diseases and infectious diseases
by investigating the roles of cytokines in pathogenesis.
准
特

教
任

授
助

教

技 術 補 佐 員
技 術 補 佐 員

1.

西城
矢部
森本
鈴木

忍
力朗
雅子
智明

Associate Professor

Research Assistant Professor

Research Promotion Technician
Research Promotion Technician

Dectin- 1 and Dectin- 2 in innate immunity against

fungal infection.

Shinobu Saijo
Rikio Yabe
Masako Morimoto
Tomoaki Suzuki

domain family member 9（CARD9）–nuclear factor-κB axis,
resulting in the activation of various genes including those
encoding pro-inflammatory cytokines. Both β-glucans and α-

Shinobu Saijo and Rikio Yabe

mannans are major cell wall components of fungi including

Division of Molecular Immunology, Medical Mycology

carinii）. Recently, it was reported that Dectin-1 is important

Research Center, Chiba University, Chiba 260-8673, Japan

Dectin- 1 and Dectin- 2 are type II transmembraneproteins of the C-type lectin family with single carbohydrate

recognition domains（CRDs）in their extracellular region.

They are expressed mainly in dendritic cells and macrophages.

Dectin-1 recognizes β -glucans with its CRD and transduces
signals through its immunoreceptor tyrosine-based activation

Candida albicans（C. albicans）and Pneumocystis carinii（P.

in protection against P. carinii by inducing reactive oxygen

species, whereas both Dectin-1 and Dectin-2 play importantroles in defense against C. albicans by preferentially inducing
Th17 cell differentiation. In this review, we briefly revisit

the structures, ligands, signal transduction and functionalroles of Dectin-1 and Dectin-2 in host defense against fungal
infection.

motif（ ITAM ）-like motif in the cytoplasmic domain,
whereas Dectin-2 recognizes α-mannans and transduces its

signal through association with the ITAM-containing Fc

receptor γ chain. Upon ligand binding, spleen tyrosine kinase
is recruited to the ITAM and activates the caspase recruitment

6

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

2.

Inhibition of Dectin-1 Signaling Ameliorates Colitis

Lactobacillus species. These observations suggest that

Expansion in the Intestine.

controlling Treg cell differentiation through modification of

by Inducing Lactobacillus-Mediated Regulatory T Cell

Tang C 1, Kamiya T 1 , Liu Y 2 , Kadoki M 1 , Kakuta S 3 ,Oshima K 4 , Hattori M 4 , Takeshita K 5 , Kanai T 5 , Saijo S 6 ,Ohno N , Iwakura Y .
7

1

1

Center for Animal Disease Models, Research Institute formicrobiota.

3.

4

5

6

autoimmune arthritis due to intrinsic activation of IL17-producing CCR2+V γ6+γδ T cells.

Akitsu A1, Ishigame H 2 , Kakuta S 2 , Chung SH 1 , Ikeda

and Systems Biology, Institute of Medical Science, Thezaki G 3 , Yoshikai Y 4 , Saijo S 5 , Iwakura Y 1 .

Center for Animal Disease Models, Research Institute for

1

University of Tokyo, Minato-ku, Tokyo 108-8639, JapanS 2 , Shimizu K 1 , Kubo S 1 , Liu Y 2 , Umemura M 3 , Matsu-

Biological Sciences, Tokyo University of Science, Chiba

3

IL- 1 receptor antagonist-deficient mice develop

Biomedical Sciences, Tokyo University of Science, Noda,
Chiba 278-0022, Japan; Center for Experimental Medicine

2

Dectin-1 regulates the homeostasis of intestinal immunity by

278-0022, Japan.

Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The

The Institute of Medical Science, The University of Tokyo,

2

University of Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan.

Graduate School of Frontier Sciences, The University ofTokyo, Kashiwa, Chiba 277-8561, Japan.

Medicine, Tokyo 160-5882, Japan.

4Japan.

Dectin-1, the receptor for β-glucans, protects the hostagainst fungal infection; however, its role in intestinal immunity is incompletely understood. We found that Dectin-1-de-ficient（ Clec 7 a ）mice were refractory to both dextran
sodium sulfate（DSS）- and CD45RB（high）CD4+ T cell-/-induced colitis, and that this resistance was associated with anincrease in regulatory T（Treg）cells. The proportion of lac-

tobacilli, especially Lactobacillus murinus, in the commensal

microflora was increased in Clec 7 a -/- mouse colons, andaccompanied by a decrease in antimicrobial peptides inducedby Dectin-1 signaling. L. murinus colonization increased

Treg cells in the colon. Oral administration of laminarin, a
Dectin-1 antagonist, suppressed the development of DSS-

278-0022, Japan.

Tropical Biosphere Research Center, University of the
Ryukyus, Okinawa 903-0213, Japan.

Research Center for Prevention of Infectious Diseases,
Medical Institute of Bioregulation, Kyushu University,

Division of Molecular Immunology, Medical Mycology

Research Center, Chiba University, Chiba 260 - 8673 ,Tokyo 108-8639, Japan

Center for Animal Disease Models, Research Institute for

Biological Sciences, Tokyo University of Science, Chiba

3

Department of Internal Medicine, Keio University School ofCenter for Experimental Medicine and Systems Biology,

5

Fukuoka 812-8582, Japan.

Division of Molecular Immunology, Medical Mycology

Research Center, Chiba University, Chiba 260 - 8673 ,Japan.

Interleukin-17（IL-17）-producing γδ T（γδ17）cells havebeen implicated in inflammatory diseases, but the underlying

pathogenic mechanisms remain unclear. Here, we show thatboth CD4+and γδ17 cells are required for the development of

autoimmune arthritis in IL-1 receptor antagonist（IL-1Ra）-deficient mice. Specifically, activated CD4+ T cells direct γ
δ T-cell infiltration by inducing CCL2 expression in joints.

Furthermore, IL-17 reporter mice reveal that the Vγ6+ subsetof CCR 2 + γδ T cells preferentially produces IL- 17 in

inflamed joints. Importantly, because IL- 1 Ra normallycolitis, associated with an increase of L. murinus and Treg

suppresses IL-1R expression on γδ T cells, IL-1Ra-deficient
mice exhibit elevated IL-1R expression on Vγ6+ cells, whichfound to have a decreased proportion of closely related

findings demonstrate a pathogenic mechanism in whichcells. Human patients with inflammatory bowel disease were

千葉大学

play a critical role in inducing them to produce IL-17. Our

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

7

adaptive and innate immunity induce an autoimmune disease
in a coordinated manner.

R, Tada T, Kubo S, Sato N, Liu Y, Hattori M, Saijo S,

Matsushita M, Fujita T, Sumida T, Iwakura Y. CTRP6

is an endogenous complement regulator that can effectively

Publications

treat induced arthritis. Nat Commun. 6:8483. 2015.

1）Akitsu A, Ishigame H, Kakuta S, Chung SH, Ikeda S,

5）Nakamura Y, Sato K, Yamamoto H, Matsumura K,

Yoshikai Y, Saijo S, Iwakura Y. IL-1 receptor antagonist-

E, Tachi M, Yamasaki S, Saijo S, Iwakura Y, Kawakami

Shimizu K, Kubo S, Liu Y, Umemura M, Matsuzaki G,

deficient mice develop autoimmune arthritis due tointrinsic activation of IL-17-producing CCR2+Vγ6+γδ T
cells. Nat Commun. 6:7464. 2015.

2）Herbst S, Shah A, Mazon Moya M, Marzola V, Jensen

K. Dectin-2 deficiency promotes Th2 response and mucin
production in the lungs after pulmonary infection with

Cryptococcus neoformans. Infect Immun. 83:671-81.
2015.

B, Reed A, Birrell MA, Saijo S, Mostowy S, Shaunak S,

6）Tang C, Kamiya T, Liu Y, Kadoki M, Kakuta S, Oshimaof a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates

Iwakura Y. Inhibition of Dectin-1 Signaling Ameliorates

Armstrong-James D. Phagocytosis-dependent activation

innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Mol
Med. 7:240-58. 2015.

3）Higashino-Kameda M, Yabe-Wada T, Matsuba S,

K, Hattori M, Takeshita K, Kanai T, Saijo S, Ohno N,

Colitis by Inducing Lactobacillus-Mediated Regulatory

T Cell Expansion in the Intestine. Cell Host Microbe.

18:183-97. 2015.

Takeda K, Anzawa K, Mochizuki T, Makimura K, Saijo

7）Uryu H, Hashimoto D, Kato K, Hayase E, Matsuoka

Dectin-1 in hypersensitivity pneumonitis. Inflamm Res.

Miyamoto T, Saijo S, Iwakura Y, Hill GR, Akashi K,

S, Iwakura Y, Toga H, Nakamura A. A critical role of2015 online ahead.

4）Murayama MA, Kakuta S, Inoue A, Umeda N,

Yonezawa T, Maruhashi T, Tateishi K, Ishigame H, Yabe

R, Ikeda S, Seno A, Chi HH, Hashiguchi Y, Kurata

8

Matsumoto I, Nomura T, Miyasaka T, Ishii K, Kanno

千葉大学

S, Ogasawara R, Takahashi S, Maeda Y, Iwasaki H,
Teshima T. α -Mannan induces Th17-mediated pulmo-nary graft-versus-host disease in mice. Blood. 125:3014-

23. 2015.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

後藤 PI（微生物・免疫制御プロジェクト）
Project for Host-Microbial Interactions in Symbiosis and Pathogenesis
研究概要（Summary）

腸管は食餌性抗原や腸内細菌・真菌など多種多様な抗原に常に曝されている特殊な組織である . これら無数の抗原に対処するため , 腸管では免疫細胞と上皮細胞が相互に作用しながら病原性微生物を排除
し , 非病原性微生物と共存する基盤を形成することで腸管の恒常性維持に寄与している . この腸内微生物との共生関係の破綻は , 炎症性腸疾患に代表される腸疾患のみならず , 肥満や糖尿病などの全身性の疾患発症の素因となることから , 腸内微生物との共生システムや腸管免疫細胞と上皮細胞による腸管恒常性制御システムを理解することは重要な命題である . 本プロジェクトでは , 宿主と腸内細菌間の共生因子であり腸管上皮細胞が発現するα１ , ２ - フコースの誘導および制御機構を明らかにし , 腸管恒常性維持システムの解明とその破綻によって引き起こされる様々な疾患の治療法の開発を目的としている .

Gastrointestinal tract is a unique organ which is constitutively exposed by various antigens including
dietary materials and commensal bacteria and fungi. In order to exclude pathogens and create symbiotic
environment to non-pahogenic microorganisms, intestinal epithelial cells（ECs）and immune cells contributeto establish homeostasis of intestinal microenvironment. Disruption of symbiotic relationship between hostand commensals predisposes to the development of inflammatory bowel diseases and systemic disorders suchas obesity and diabetes. Therefore, it is important to understand the mechanism of symbiotic and homeostatic
condition regulated by intestinal ECs and immune cells. In this project, we aim to uncover the inductive andregulatory mechanism of epithelial α1, 2-fucose which is a symbiotic factor between host and commensal
bacteria. We further investigate the role of commensal microbes in the establishment of intestinal homeostasis
and develop novel therapeutic approaches for the treatment of diseases caused by the disruption of intestinal
homeostasis.
准

1.

教

授

後藤

義幸

Yoshiyuki Goto

Associate Professor

IL- 10 -producing CD 4 + T cells negatively regulate3

fucosylation of epithelial cells in the gut

Division of Mucosal Immunolog y, Department ofMicrobiology and Immunology, The Institute of Medical
Science, The University of Tokyo, Tokyo 108-8639, JapanRIKEN Center for Integrative Medical Sciences（IMS）,

Yoshiyuki Goto 1, 2 , Aayam Lamichhane 3 , Mariko Kamioka 3 ,4Kiyono5

Laboratory of Vaccine Materials, National Institute of

6Core Research for Evolutional Science and Technology,

Shintaro Sato3 , Kenya Honda 4, 6 , Jun Kunisawa 5 and Hiroshi

1

2

3, 6

Division of Molecular Immunology, Medical Mycology
Research Center, Chiba University, Chiba 260-8673, Japan

Division of Mucosal Symbiosis, International Research andDevelopment Center for Mucosal Vaccine, Institute for

Kanagawa 230-0045, Japan

Biomedical Innovation, Osaka 567-0085, Japan

Japan Science and Technology Agency, Saitama 332-0012,
Japan

Medical Science, The University of Tokyo, Tokyo 108-8639,

Japan

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

9

α1, 2-fucosylated glycan expressed on the intestinal epithelial

surfaces contributes to regulate gut homeostasis by serving

as a nutrient source for some species of commensal bacteria.
However, the detail mechanism of the regulation of epithelial

α1, 2-fucose is still unknown. We showed that epithelial

fucosylation is negatively regulated by IL-10 -producing
CD4+ T cells. The number of fucosylated ECs was increased

with their host. These commensals contribute to prevent

infection of pathogenic microorganisms. However, it isstill unclear what kind of and how commensal bacteria andfungi interrupt the pathogenic infections. In our study, weinvestigate the mechanism of symbiotic colonization bybacteria and fungi in the intestine. We also aim to isolate
beneficial commensal bacteria and fungi for the development

in mice lacking T cells, especially those expressing αβ T

of novel therapeutic targets for human infectious diseases.

was observed in mice lacking B cells and other subsets to
T cells. Adoptive transfer of TCRαβ chain+ CD4+ T cells

human diseases such as inflammatory bowel diseases, allergy,

epithelial fucosylation. These findings suggest that IL- 10
produced by CD4+ T cells contribute to the maintenance of

Publications

cell receptor（TCR）, CD4, and IL-10. No such effectfrom normal mice, but not IL-10-deficient mice, normalized

the fucosyation of ECs.
2.

The role of commensal bacteria and fungi against
infection of pathogenic microorganisms

Yoshiyuki Goto1

2

cancer, and metabolic syndrome.

1）Farkas AM*, Panea C*, Goto Y*, Nakato G, Galan-Diez

M, Narushima S, Honda K and Ivanov II. Colonizationand induction of Th17 cells by segmented filamentous

bacteria in the murine intestine. J Immunol Methods, 421:
104-111. 2015 *equally contribution2）Goto Y, Kurashima Y, Kiyono H. The gut microbiota andinflammatory bowel disease. Curr Opin Rheumatol, 27:

1, 2

Division of Molecular Immunology, Medical Mycology
Research Center, Chiba University, Chiba 260-8673, Japan

Division of Mucosal Symbiosis, International Research andDevelopment Center for Mucosal Vaccine, Institute for

Medical Science, The University of Tokyo, Tokyo 108-8639,

Japan

In our gastrointestinal tract, numerous numbers of bacteria

and fungi peacefully colonize and create mutual relationship

10

After the establishment of this system, we further target other千葉大学

388-396, 2015.

3）Goto Y, Lamichhane A, Kamioka M, Sato S, Honda

K, Kunisawa J and Kiyono H. IL-10-producing CD4+ T
cells negatively regulate fucosylation of epithelial cells in

the gut. Sci Rep, 5: 15918, 20154）Panea C, Farkas AM, Goto Y, Abdollahi-Roodsaz S,

Lee C, Koscso B, Gowda K, Hohl TM, Bogunovic M

and Ivanov II. Intestinal Monocyte-Derived Macrophages

Control Commensal-Specific Th17 Responses. Cell Rep,
12: 1314-1324, 2015.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

知花 PI（カンジダ・グラブラータフェノーム）プロジェクト
Candida glabrata phenome project
研究概要（Summary）

病原性酵母カンジダ・グラブラータの全遺伝子改変株を作製し , 病原性に関する遺伝子の特定と機能解析ならびに抗真菌薬の開発を行う .

Using the pathogenic yeast Candida glabrata, we are systematically constructing mutants for gene
identification and functional analyses working on the pathogenicity and for developing of anti-fungal drug
targets.
准

教

授

技

術

職

員

特

任

助

教

グランドフェロー
研

究

員

客 員 研 究 員
技 術 補 佐 員
技 術 補 佐 員

1.

知花 博治
高橋
梓
佐藤美智代
山口 正視
宇野
潤
コスタ カタリナ
相田 優子
大岩 真理

Associate Professor

Research Technician

Research Assistant Professor
Grand Fellow
Researcher

Guest Researcher

Research Promotion Technician
Research Promotion Technician

Validation of antifungal drug targets in Candida

78

Chibana H *, Hiruma J , Harada K , Aoyama T , Maeda
1

2

2

A , Takahashi-Nakaguchi A , Costa C
4

1

3

1, 5, 6

Mizuno T 4 , Takagi H 7 , Hiruma M 8 , Uno J 1, Yaguchi T ,1

1

Medical Mycology Research Center（ MMRC ）, Chiba

2

Department of Dermatology, Tokyo Medical University,

Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute of

Science and Technology, Nara, Japan, （NAIST）, Nara,glabrata using a tetracycline gene regulation system in asilkworm（Bombyx mori）infection model

Hiroji Chibana
Azusa Takahashi
Michiyo Sato
Masashi Yamaguchi
Jun UnoCatarina Costa
Yuko Aida
Mari Ohiwa

Japan;

Ochanomizu Institute for Medic al Mycolog y andAllergology, Tokyo, Japan.

Objectives: Opportunistic infections caused by Candida

glabrata is increasing because this yeast can be resistant tocurrently used antifungal drugs. Thus the development of

University, Chiba, Japan;

new antifungal drugs preferentially focused on C. glabrata isTokyo, Japan;

vivo gene regulation system, based on a tetracycline promoter

required. Our goal was to validate drug targets using an in3

Department of Electronic and Information Engineering,switch（Tet-off）to control selected gene expression, and an

4

Faculty of Engineering, Tokushima Bunri University,

Methods: C. glabrata mutant strains were created using a

Suzuka National College of Technology, Suzuka, Japan;

Sanuki, Japan;

5

Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico,6

Biological Sciences Research Group, Instituto Superior

Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal;
Técnico, Lisboa, Portugal;

千葉大学

insect model of infection.

Tet-off promoter switch targeting each of several individual
genes（ ERG 1 , ERG 7 , ERG 11 , ERG 25 , ERG 26 and

ERG 27）in the synthetic pathway of the essential cell

membrane component ergosterol, as well as TAH 18

encoding the flavoprotein involved in the cytosolic Fe-S

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201511

protein assembly machinery and nitric oxide synthesis, andon the action of membrane transporters, including drug efflux

infection in a silkworm infection model was determined in the

Drug:H（+）antiporter（DHA）（1）family, an iTRAQ-based

TUB2, encoding beta-tubulin. The mutants ability to cause
presence and absence of tetracycline and survival determinedat intervals over a three days period.

Results: For all mutants, survival was significantly greater

pumps from the ATP-binding cassette family or from themembrane proteomics analysis was performed to identify all

the membrane-associated proteins whose abundance changes

in C. glabrata cells exposed to the azole drug clotrimazole.

for groups of infected worms treated with tetracycline thanProteins found to have significant expression changes in thisrequired for virulence.

metabolism, oxidative phosphorylation, mitochondrialfor untreated groups, indicating that all the genes tested wereConclusions: Given the low homology of the gene products

context were clustered into functional groups, namely: glucose

import, ribosome components and translation machinery,of ERG25, ERG26, ERG27 and TAH18 in Candida species

lipid metabolism, multidrug resistance transporters, cellpotential as targets for Candida-specific antifungal drugs andof 37 proteins. Among these, the DHA transporter

with equivalent human proteins, our study has identified their
the product of ERG25 in C. glabrata may also represent atarget to develop an antifungal drug with a wide spectrum ofactivity with expected effect against Aspergillus, Coccidioides,

Cryptococcus and Trichophyton.
2.

overexpressed in the C. glabrata membrane in response toclotrimazole. Functional characterization of this putative
drug:H（+）antiporter, and of its homolog CgTpo1_1（ORF

CAGL 0 G 03927 g ）, allowed the identification of these

proteins as localized to the plasma membrane and conferring

the Transcription Factor CgPdr1 and the Drug:H+

extruding the drug to the external medium. The cell wall

Drug Clotrimazole in Candida glabrata: Role ofPais P , Costa C , Pires C , Shimizu K , Chibana H ,
1

1

1

2

2

Teixeira MC 1 .

Department of Bioengineering and Institute for

Bioengineering and Biosciences, Biological Research Group,

Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, Lisbon,

2

CgTpo 1 _ 2（ ORF CAGL 0 E 03674 g ）was identified as

Membrane Proteome-Wide Response to the Antifungal

Antiporters CgTpo1_1 and CgTpo1_2 .

1

wall assembly, and stress response, comprising a totalazole drug resistance in this fungal pathogen by actively

protein CgGas1 was also shown to confer azole drug resistancethrough cell wall remodeling. Finally, the transcription
factor CgPdr1 in the clotrimazole response was observed tocontrol the expression of 20 of the identified proteins, thus

highlighting the existence of additional unforeseen targets ofthis transcription factor, recognized as a major regulator ofazole drug resistance in clinical isolates.

Portugal,

Medical Mycology Research Center（ MMRC ）, Chiba

University, Chiba, Japan

Azoles are widely used antifungal drugs. This family ofcompounds includes triazoles, mostly used in the treatmentof systemic infections, and imidazoles, such as clotrimazole,often used in the case of superficial infections. Candida

glabrata is the second most common cause of candidemia

worldwide and presents higher levels of intrinsic azole

resistance when compared with Candida albicans, thus

being an interesting subject for the study of azole resistancemechanisms in fungal pathogens. Since resistance often relies

12

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

3.

The Ubiquitin Ligase SCFUcc1 Acts as a Metabolic
Switch for the Glyoxylate Cycle

Nakatsukasa K , Nishimura T , Byrne SD , Okamoto M ,
1

1

1

2

Takahashi-Nakaguchi A 2, Chibana H 2 , Okumura F 1 ,Kamura T 1
1

2

Division of Biological Sciences, Graduate School of Science,

Analysis in S. cerevisiae. Teixeira MC. PLoS One. 12;10（8）:e0135110. 2015.

２）Kopecka M, Yamaguchi M, Kawamoto S: The effects of

the F-actin inhibitor latrunculin A on the budding yeast

Saccharomyces cerevisiae. Microbiology 161: 1348-1355,
2015.

３）Nakatsukasa K, Nishimura T, Byrne SD, Okamoto

M, Takahashi-Nakaguchi A, Chibana H, Okumura F,

Nagoya University, Nagoya, Aichi 464-8602, Japan,

Kamura T. The Ubiquitin Ligase SCF（Ucc1）Acts as a

Chiba, Chiba, 260-8673, Japan

2;59（1）:22-34. 2015.

Medical Mycology Research Center, Chiba University,

Despite the crucial role played by the glyoxylate cyclein the virulence of pathogens, seed germination in plants,

and sexual development in fungi, we still have much to

Metabolic Switch for the Glyoxylate Cycle. Mol Cell.

４）Nakayama M, Hosoya K, Shimizu-Imanishi Y, Chibana

H, Yaguchi T. Development of rapid identification andrisk analysis of Moniliella spp. in acidic processed foods.
Biocontrol Sci.（in press）

learn about its regulation. Here, we show that a previously５）Stepanova AA, Vasilyeva NV, Yamaguchi M, Chibana

proteasomal degradation of citrate synthase in the glyoxylate

through the cells of murine tracheobronchial epithelium

uncharacterized SCF（ Ucc 1）ubiquitin ligase mediates

cycle to maintain metabolic homeostasis in glucose-grown

H, Bosak IA. The Aspergillus fumigatus penetration

cells. Problems in Medical Mycology17: 45-50, 2015.

cells. Conversely, transcription of the F box subunit Ucc1 is６）Stepanova AA, Vasilyeva NV, Yamaguchi M, Shimizu

increased metabolic flux for gluconeogenesis. Moreover, infrom the human brain Cryptococcosis and AIDS. Problems

downregulated in C2-compound-grown cells, which require

vitro analysis demonstrates that oxaloacetate regenerated

K, Kawamoto S: Electron microscopy of autopsy material

in Medical Mycology 17: 35-40, 2015.

through the glyoxylate cycle induces a conformational

７）Takahashi-Nakaguchi A, Muraosa Y, Hagiwara D,

ubiquitination by SCF（Ucc1）, suggesting the existence of an

Kamei K, Gonoi T, Takahashi H: Genome sequencechange in citrate synthase and inhibits its recognition andoxaloacetate-dependent positive feedback loop that stabilizes

Sakai K, Toyotome T, Watanabe, A Kawamoto S,
comparison of Aspergillus fumigatus strains isolated

citrate synthase. We propose that SCF（ Ucc 1）-mediatedfrom patients with pulmonary aspergilloma and chronic

the glyoxylate cycle in response to changes in carbon source,

53（4）: 353-360, 2015.

regulation of citrate synthase acts as a metabolic switch forthereby ensuring metabolic versatility and flexibility.

Publications

１）Costa C, Ponte A, Pais P, Santos R, Cavalheiro M,

Yaguchi T, Chibana H, New Mechanisms of Flucytosine

Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics

千葉大学

necrotizing pulmonary aspergillosis. Medical Mycology

８）Yamada H, Yamaguchi M, Chikamatsu, Aono A,

Mitarai S: Structome analysis of virulent Mycobacterium

tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at

density per 0.1 fl cytoplasm. PLoS ONE 10: e0117109,
2015.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201513

亀井 PI（臨床感染症）
プロジェクト
Project to Link Basic Sciences and Clinical Medicine
研究概要（Summary）

附属病院の真菌症専門外来における診療と並行して全国から寄せられる真菌症のコンサルテーショ
ンに対応するなど特色ある臨床活動を行うとともに , 一般施設では実施困難な特殊検査を年400件あまり受け入れるなど , 名実ともに我が国における真菌症リファレンスセンター（輸入真菌症を含む）として機能している . 研究面ではこれらの活動を通じた臨床研究に加えて , Bedside to bench to bedside に基づく研究を行っている . 特にアスペルギルス症に代表される難治性真菌症の感染機構の研究とこれに基づく診断・治療法の開発を中心的テーマとしているが , 近年はアスペルギルス耐性株の疫学と耐性機構の研究なども進めている .

We have been doing basic and clinical research, primarily on fungal infections, as well as seeing patients in
the Specialty Clinic for Fungal Infections at the University Hospital. We receive approximately 400 referral
consults on fungal diseases from all over the country every year. Thus, our laboratory is also working as areference center for fungal infections in Japan. In our research activities, finding solutions to the problems
of managing and treating patients with fungal infections is our primary concern. To this end, we areinvestigating the mechanisms of infection of intractable fungal diseases, particularly aspergillosis, whiledeveloping diagnostic methods and therapeutic modalities in collaborative efforts with various universities
and pharmaceutical companies. The epidemiology of fungal infections and the mechanisms of antifungal
resistance present in the infecting organisms also is a prominent part of our research.

亀井
渡辺
村長
萩原
八尋

克彦
哲
保憲
大祐
真希

Professor

Research Assistant Professor

Katsuhiko Kamei
Akira Watanabe
Yasunori Muraosa
Daisuke Hagiwara
Maki Yahiro

技 術 補 佐 員
（６月から）

八尋

真希

Research Promotion Technician

Maki Yahiro

グランドフェロー

田口
東江
鎗田
関
井上

英昭
昭夫
響子
里亜
京子

Grand Fellow

Hideaki Taguchi
Akio Toh-e
Kyoko Yarita
Rio Seki
Kyoko Inoue

教

授

准

教

授

特

任

助

教

特

任

助

教

特 任 助 教（５月まで）

研
技

究
術

員
職

員

技 術 補 佐 員
技 術 補 佐 員

14

Associate Professor

Research Assistant Professor
Research Assistant Professor

Researcher

Research Technician

Research Promotion Technician
Research Promotion Technician

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

1.

including cyp51A encoding a target protein of azoles. The

Drug resistance of fungi
Epidemiology of azole-resistant Aspergillus fumigatus

and the mechanism of resistance.

（Akira Watanabe, Daisuke Hagiwara, Katsuhiko Kamei）

Among clinical isolates of Aspergillus fumigatus deposited

to MMRC from 2000 , 18 strains revealed to have azole
resistance. Of these strains, 13 had point mutation（s）in theiratrR deletion mutant showed impaired growth under hypoxic

condition and attenuation in virulence in mice infection model

for aspergillosis. These results were in accordance with thephenotypes for the mutant of SrbA that was well characterized

as a direct regulator for cyp 51A gene. Notably, AtrR was

responsible for the expression of cdr1B that encodes an ABC
transporter related to azole resistance, whereas SrbA was not

involved in the regulation. According to the significance of

cyp51A gene, which encodes the cyp51A enzyme responsible

AtrR in azole resistance mechanism, we deleted the atrR genestrain harboring TR 46 /Y 121 F/T 289 A mutations in

a mutant cyp 51A（G54R）, resulting in a hypersensitivity

mutations are thought to be accounted for by fungicide

pivotal role in azole resistance mechanism co-regulating thefor one of the step in ergosterol biosynthesis. Most notably,

cyp51A was firstly detected in Japan. TR46/Y121F/T289A

used in agriculture, and the strains with the mutations havebeen found from both environment and patients worldwide,

particularly in Europe. This finding may have a strong impact
in treatment strategy of aspergillosis.

Moreover, strains with G448S mutation in cyp51A become

the most common for last few years. The strains with

G 448S are resistant to voriconazole, and all of the strains

were isolated from the patients given voriconazole. The

relationship between this mutation and voriconazole exposurein vivo is unclear but warrants examination.

2.

in a clinically isolated itraconazole resistant strain harboring

to any azole drugs. Together with the result, AtrR plays adrug target（cyp51A）and putative drug efflux pump（Cdr1B）,

regardless of the resistance mutation in cyp51A.

Investigation of conidia-specific secondary metabolites

in Aspergillus fumigatus.

（Daisuke Hagiwara, Katsuhiko Kamei）

Transcriptomic analyses for resting and germinatedconidia of Aspergillus species.

（Daisuke Hagiwara, Katsuhiko Kamei）

Pathogenicity of fungi
Functional analysis of the novel transcription factor

AtrR regulating an ergosterol biosynthesis pathway inAspergillus fumigatus.

（Daisuke Hagiwara, Akira Watanabe, Katsuhiko Kamei）

Treatment of aspergillosis caused by Aspergillus fumigatus

is confronted with an increasing drug resistance problem.
This is a non-negligible situation where the strain resistantto azoles, the major antifungal drugs for aspergillosis,

Relationship between the infection type of fusariosis

and cryptic species of Fusarium solani species complex（FSSC）.

（Yasunori Muraosa, Misato Oguchi, Maki Yahiro, Akira

Watanabe, Katsuhiko Kamei）

Species belonging to the genus Fusarium are well known

as major plant pathogens and soil habitants. For humans,

Fusarium species are common pathogenic fungi that cause

has been widely disseminated in the world. To elucidate

superficial and disseminated deep-seated infection, the latternovel transcriptional factor whose deletion mutant showed

complex（FSSC）which is a group of morphologically cryptic

mechanisms underlying azole resistance, we identified theof which could be life-threatening. Fusarium solani species

hypersensitivity to azole in A. fumigatus. The fungal-specificspecies is known to be the most common causative agents inexpression of the genes related to ergosterol biosynthesis,of human fusariosis, the complex consists of several cryptic

C6-type transcription factor AtrR was found to regulate the

千葉大学

fusariosis. Although FSSC is known to be the major cause

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201515

species, and the relationship between the infection types

ahead of print]）

not been clarified. We have re-identified 79 Fusarium clinical4.

by sequencing of elongation factor 1 alpha（EF-1 alpha）gene（Akio Toh-e, Katsuhiko Kamei）

and the causative species.

components of the PHO system of Saccharomyces cerevisiae（superficial and disseminated）and the species in FSSC has

isolates recovered from superficial and disseminated fusariosis

and are analyzing the relationship between the infection types

3.

Phosphate regulation in Cryptococcus neoformans

By BLAST searches using the amino acid sequences of the（ Sc ）, we found potential counterparts to ScPHO genes

in C. neoformans, namely, acid phosphatase（CnPHO2）,

Development of diagnostic methods

the cyclin-dependent protein kinase（ CDK ）inhibitor

Detection of Histoplasma capsulatum from clinical（ CnPHO 81）, Pho 85 -cyclin（ CnPHO 80）, and CDK

nested real-time PCR.

CnPHO85, followed by phenotypic analysis, identified most

specimens by cycling probe-based real-time PCR and（CnPHO85）. Disruption of each candidate gene, exceptof the basic components of the CnPHO system. We found（ Yasunori Muraosa, Maki Yahiro, Akira Watanabe,that CnPHO85 was essential for the growth of C. neoformans,

We developed new cycling probe-based real-time PCR andscreening and ChIP analysis, showed that CnPHO4 encodes

Katsuhiko Kamei）

nested real-time PCR assays for the detection of Histoplasma

capsulatum that were designed to detect the gene encoding

having regulatory function in the CnPHO system. Genetic

a transcription factor that binds to the CnPHO genes in a

Pi-dependent manner. By RNA-seq analysis of the wild-

N-acetylated α -linked acidic dipeptidase（NAALADase）,

type and the regulatory mutants of the CnPHO system, wereacting with sera from patients with histoplasmosis. Bothby the regulators of the CnPHO system. Thus the CnPHO

which we previously identified as an H. capsulatum antigen

assays specifically detected the DNAs of all H. capsulatum
strains but not those of other fungi or human DNA. The

limited of detection（ LOD ）of the real-time PCR assay

was 10 DNA copies when using 10-fold serial dilutions of

the standard plasmid DNA and 50 DNA copies when using
human serum spiked with standard plasmid DNA. The

found C. neoformans genes whose expression is controlled

system shares many properties with the ScPHO system, but
expression of those CnPHO genes that encode regulators

is controlled by phosphate starvation, which is not the casein the ScPHO system（except ScPHO81）. We also could

identify some genes involved in the stress response of thepathogenic yeast, but CnPHO4 appeared to be responsible

nested real-time PCR improved the LOD to 5 DNA copies

only for phosphate starvation.

DNA, which represents a 10-fold higher than that observed

5.

when using human serum spiked with standard plasmidwith the real-time PCR assay. To assess the ability of thetwo assays to diagnose histoplasmosis, we analyzed a small

Improvement of experimental methods in Cryptococcus
neoformans

number of clinical specimens collected from five patients with

（Akio Toh-e, Katsuhiko Kamei）

embedded（FFPE）tissue（n = 4）, and bronchoalveolar lavage

pathogenic yeast, has been widely used in research fields inreal-time PCR assay was insufficiently sensitive（33%）, theidentification of the gene responsible for a mutation of interest

histoplasmosis, such as sera（n = 4）, formalin-fixed paraffin-

fluid（BALF）（n = 1）. Although clinical sensitivity of thenested real-time PCR assay increased the clinical sensitivity（77%）, suggesting it has a potential to be a useful methodfor detecting H. capsulatum DNA in clinical specimens.

（Published in Med Mycol, 2015 Dec 24. pii: myv106. [Epub

16

千葉大学

Cryptococcus neoformans, a basidiomycetous human

medical mycology as well as in basic biology. Gene cloning or

is a key step for functional analysis of a particular gene. The
availability, therefore, of the multiple methods for cloning isdesirable. We proposed a method for a mapping-based gene

identification/cloning（ positional cloning ）method in C.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

43-53, 2015.

neoformans.
6.

Biosynthetic pathway of sulfur-containing amino acids

in Cryptococcus neoformans

３）Bühler N, Hagiwara D, Takeshita N: Functional analysisof sterol transporter orthologues in the filamentous

fungus Aspergillus nidulans. Eukaryot Cell 14（9）: 90821, 2015.

（Akio Toh-e, Katsuhiko Kamei）

We elucidated a unique feature of sulfur metabolism

in C. neoformans. C. neoformans produces cycteine solely

by the serine pathway that consists of serine-o-acetyltransferase and cysteine synthase. We identified the gene４）Bom VL, de Castro PA, Winkelströter LK, Marine

M, Hori JI, Ramalho LN, dos Reis TF, Goldman
MH, Brown NA, Rajendran R, Ramage G, Walker

LA, Munro CA, Rocha MC, Malavazi I, Hagiwara D,

Goldman GH: The Aspergillus fumigatus sitA phosphatase

encoding the enzyme catalyzing the former reaction as

homologue is important for adhesion, cell wall integrity,

as CYS 1（ CNL 05880）. A disruptant of either gene is728-44, 2015.

CYS2（CNE02740）and that catalyzing the latter reaction
viable and requires cysteine. Methionine practically did notsuppport the growth of the cys 1 strain and cysteine did notsupport the growth of the methionine auxotroph, the met 2
strain, either. These results indicate that the both directionsof the transsulfuration pathway are not functional in C.

biofilm formation, and virulence. Eukaryot Cell 14（8）:５）Fagnani R, Resende MR, Trabasso P, Mikami Y,

Schreiber AZ, Lopes AF, Muraosa Y, Kamei K,

Moretti ML: Mortality related to candidemia and risk

factors associated with non-Candida albicans. Infect Dis（Lond）47（12）: 930-931, 2015.

neoformans. This fact explains why methionine is a poor

６）Ishiwada N, Takeshita K, Yaguchi T, Nagasawa

to be prodouced from methionine via the transsulfuration

K, Shimojo N: The First case of invasive mixed-moldfrom homoserine to methionine, the gene corresponding to

and Rasamsonia piperina in a patient with chronic

sulfure source in C. neoformans; hydrogen sulfide is believed

pathway. Among the genes participating in the reactions

K, Takeuchi N, Hishiki H, Watanabe A, Kamei

infections due to Emericella nidulans var. echinulata

the Saccharomyces cerevisiae MET17 has not been identified in

granulomatous disease. Mycopathologia, 2015 Nov 13.

by Agrobacterium tumefaciens-mediated mutagenesis, we found７）Kawakami H, Inuzuka H, Hori N, Takahashi N, IshidaC. neoformans. By genetic analysis of Met- mutants obtainedthat C NC01220 is C. neoformans version of MET17. The

cys1 strain lost pathogenicity against mice and mammals do

not have cysteine synthase, indicating that cysteine synthase,serine-o-acetyltransferease as well, is a promising target for
anti-Cryptococcus-drug development.

[Epub ahead of print]

K, Mochizuki K, Ohkusu K, Muraosa Y, Watanabe
A, Kamei K: Inhibitory effects of antimicrobial agentsagainst Fusarium species. Med Mycol 53（6）: 603-611,

2015.

８）Matsudate Y, Murao K, Urano Y, Yarita K, Kamei K,

Takeichi H, Kubo Y: Primary cutaneous mucormycosis

Publications: original articles

１）Asahina A, Kobayashi M, Nakano K, Saito I, Yarita

K, Kamei K, Tokura Y: Deep cutaneous infection with

Microsphaeropsis arundinis: report of two Japanese cases.

caused by Mucor irregularis in an immunocompetentpatient. J Dermatol 42（3）: 267-268, 2015.

９）Muraosa Y, Toyotome T, Yahiro M, Watanabe

A, Shikanai-Yasuda MA, Kamei K: Detection of

Acta Derm Venereol 95（7）: 855-857, 2015.

Histoplasma capsulatum from clinical specimens by cycling

T, Noguchi K, Terashima I, Uesono Y: Tetracaine, a

Med Mycol, 2015 Dec 24. pii: myv106. [Epub ahead of２）Araki T, Toh-e A, Kikuchi Y, Watanabe CK, Hachiya

local anesthetic, preferentially induces translational
inhibition with processing body formation rather thanphosphorylation of eIF2α in yeast. Curr Genet 61（1）:

千葉大学

probe-based real-time PCR and nested real-time PCR.
print]

10）Segawa S, Nishimura M, Sogawa K, Tsuchida S,

Murata S, Watanabe M, Matsushita K, Kamei K,

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

17

Nomura F: Identification of Nocardia species using

179（1-2）: 53-62, 2015.

matrix-assisted laser desorption/ionization–time-of-flight18）Ueno K, Kinjo Y, Okubo Y, Aki K, Urai M, Kaneko Y,11）Shimizu K, Nakagawa H, Hashimoto R, Hagiwara

K, Mizuguchi Y, Kawamoto S, Kamei K, Ohno H,

Yokoyama K: The α –oxoamine synthase gene fum8 is

immunization ameliorates pulmonary infection withmass spectrometry. Clinical Proteomics 12: 6, 2015.

D, Onji Y, Asano K, Kawamoto S, Takahashi H,

involved in fumonisin B2 biosynthesis in Aspergillus niger.
Mycoscience 56（3）: 301-308, 2015.

Shimizu K, Wang DN, Okawara A, Nara T, Ohkouchi

Niki Y, Shibuya K, Miyazaki Y: Dendritic cell-based

highly virulent Cryptococcus gattii. Infect Immun 83（4）:1577-1586, 2015.

12）Takahashi-Nakaguchi A, Muraosa Y, Hagiwara D,19）Winkelströter LK, Dolan SK, Fernanda Dos Reis

Kamei K, Gonoi T, Takahashi H: Genome sequence

R, Jones GW, Doyle S, Brown NA, Goldman GH:

Sakai K, Toyotome T, Watanabe A, Kawamoto S,
comparison of Aspergillus fumigatus strains isolated

from patients with pulmonary aspergilloma and chronic

necrotizing pulmonary aspergillosis. Med Mycol 53（4）:353-360, 2015.

13）Tamiya H, Ochiai E, Kikuchi K, Yahiro M, Toyotome T,

T, Bom VL, Alves de Castro P, Hagiwara D, Alowni
Systematic global analysis of genes encoding protein

phosphatases in Aspergillus fumigatus. G3（Bethesda）5（7）: 1525-39, 2015.

20）Winkelströter LK, Bom VL, de Castro PA, Ramalho

LN, Goldman MH, Brown NA, Rajendran R, Ramage

Watanabe A, Yaguchi T, Kamei K: Secondary metabolite

G, Bovier E, Dos Reis TF, Savoldi M, Hagiwara

fumigatus and closely related species, A. lentulus, A.

PtcB phosphatase is important for Aspergillus fumigatus

profiles and antifungal drug susceptibility of Aspergillus
udagawae, and A. viridinutans. J Infect Chemother 21: 385-391, 2015.
（5）14）Toh-e A, Ohkusu M, Li HM, Shimizu K, Takahashi-

Nakaguchi A, Gonoi T, Kawamoto S, Kanesaki Y,

Yoshikawa H, Nishizawa M: Identification of genes
involved in the phosphate metabolism in Cryptococcus

neoformans. Fungal Genet Biol 80: 19-30, 2015.

D, Goldman GH: High osmolarity glycerol response

virulence. Mol Microbiol 96（1）: 42-54, 2015.

21）Yoshimi A, Fujioka T, Mizutani O, Marui J, Hagiwara

D, Abe K: Mitogen-activated protein kinases MpkAand MpkB independently affect micafungin sensitivity inAspergillus nidulans. Biosci Biotechnol Biochem 79（5）:836-44, 2015.

15）Toh-e A, Ohkusu M, Shimizu K, Kawamoto S:

Publications: reviews, reports, books and the related

application for identification and cloning of the gene22）亀井克彦（分担）, 豊留孝仁（研究協力者）, 村長保Positional cloning in Cryptococcus neoformans and its

encoding methylenetetrahydrofolate reductase. Fungal

publications

憲（研究協力者）：輸入真菌症の国内発生状況調査

Genet Biol 76: 70-7, 2015.

とヒストプラズマ症の迅速診断法改良・開発へ向け

N-acetylated α -linked acidic dipeptidase is identified as

ンフルエンザ等新興・再興感染症研究事業）「真菌16）Toyotome T, Watanabe A, Ochiai E, Kamei K:

た基礎的研究 . 厚生労働科学研究費補助金（新型イan antigen of Histoplasma capsulatum. Biochem Biophys

感染症の病態解明及び検査・治療法の確立とサーベ

Res Commun 485（3）: 483-487, 2015.

17）Trabasso P, Matsuzawa T, Fagnani R, Muraosa

報告書

p. 45-51, 2015.

Y, Tominaga K, Resende MR, Kamei K, Mikami23）亀井克彦（分担）：ABPM の原因真菌に関する菌学

susceptibility of Candida parapsilosis sensu lato and other（難治性疾患等克服研究事業）（難治性疾患等実用化

blood stream infections and proposal of a novel LAMP

免疫アレルギー疾患実用化研究分野）「アレルギー

Y, Schreiber AZ, Moretti ML: Isolation and drug
species of C. parapsilosis complex from patients withidentification method for the species. Mycopathologia18

イランスに関する研究」平成26年度総括・分担研究

千葉大学

的及び血清学的解析 . 厚生労働科学研究費補助金
研究事業（免疫アレルギー疾患等実用化研究事業性気管支肺真菌症の診断・治療指針確立のための調真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

査研究」平成26年度総括・分担研究年度終了報告書

p. 34-37, 2015.

24）萩原大祐：真菌感染症分野が直面している薬剤耐性の現状 . 化学と生物

53（5）: 277-279, 2015.

25）亀井克彦 , 渡辺哲：真菌と院内アウトブレイク . 感
18（4）: 407-410, 2015.

染と抗菌薬26）渡辺哲 , 亀井克彦：〈特集関連情報〉播種性クリプ

トコックス症と鑑別をすべき他の真菌症について .

病原微生物検出情報

36（10）: 10-11, 2015.

27）渡辺哲 , 亀井克彦：肺ノカルジア症 . 呼吸
1004-10087, 2015.

34（10）:

28）亀井克彦 , 渡辺哲 : 肺真菌感染症の診断と治療 . 呼吸
63（9）: 893-897, 2015.

と循環29）渡辺哲：今月の表紙
査と技術

慢性肺アスペルギルス症 . 検43（3）: 244-245, 2015.

30）渡辺哲：Photo Quiz : Deep-seated mycosis

シュウ酸カルシウム結晶 . Med Mycol J 56（1）: J1-J2, 2015.

31）渡辺哲 , 亀井克彦 : 各種真菌感染症の取り扱いと課
題ナル

健常者で鑑別すべき深在性真菌症 . 医薬ジャー
51（6）: 1547-1551, 2015.

32）渡辺哲：今月の表紙と技術

肺クリプトコッカス症 . 検査

43（8）: 730-731, 2015.

33）藤内智（座長）, 渡辺哲（演者）：学会ハイライト
第90回日本結核病学会総会ランチョンセミナー

肺アスペルギルス治療と , これからの課題〜耐性 , 抗酸菌症合併例を含めて〜. メディカメント

ニュー

ス 2202号：10-11, 2015.

34）Hagiwara D, Yoshimi A, Sakamoto K, Gomi K, Abe K:

Response and adaptation to cell wall stress and osmotic
stress in Aspergillus species. Stress Biology of Yeasts and千葉大学

Fungi . Eds. Takagi H and Kitagaki H, Springer,
p. 199-218, 2015.3.19.

35）亀井克彦：抗真菌薬 . 「Pocket Drugs 2015」, 監修 : 福
井次矢 , 編集：小松康宏 , 渡邉裕司 , p. 800-801, 医学書院 , 2015. 1. 1発行 .

36）亀井克彦：真菌学総論 . 「標準微生物学

第12版」,

編集：中込治 , 神谷茂 , p. 325-333, 医学書院 , 2015.
2. 15発行 .

37）亀井克彦（分担執筆 , 編集協力者）, ほか1,262名：「南山堂医学大辞典
行.

第20版」, 南山堂 , 2015. 4. 1発38）亀井克彦 , 渡辺哲 : カンジダによる深在性カンジダ症 . 「微生物学・感染看護学−微生物から感染防, 岡田忍 , 小池和子 , 白澤浩編 , p. 65-66,
止を考える−」
医歯薬出版 , 2015. 2. 10発行 .

39）亀井克彦 , ほか85名：「感染症予防必携第３版」, 財団法人日本公衆衛生協会 , 2015. 6. 15発行 .

40）亀井克彦：肺真菌症 .「今日の診断指針

第7版」
, 総

編集：金沢一郎 , 永井良三 , p. 987-990, 医学書院 ,2015. 3. 31発行 .

41）渡辺哲：クラミジア肺炎 . 「今日の診断指針

第7, 総編集：金沢一郎 , 永井良三 , p. 971-971, 医学版」

書院 , 2015.3.31発行 .

42）渡辺哲 , 亀井克彦：キャンディン系薬 . 「深在性真, 編者：河野茂 , p. 73-78, 医薬菌症のマネジメント」

ジャーナル社 , 2015. 8. 20発行 .

43）亀井克彦：輸入真菌症が疑われたときの対応 . 「深在性真菌症のマネジメント」, 編者：河野茂 , p. 341346, 医薬ジャーナル社 , 2015. 8. 20発行 .

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201519

山本（感染宿主応答ネットワーク）プロジェクト
Project for Host Response Network of Bacterial Infection
研究概要（Summary）

本プロジェクトでは , 細菌感染と発症のメカニズムを分子レベルで解明し , 研究成果を感染症の予防と治療へ役立てることを目指している . 感染現象は , ２つの異なる生物（病原体と宿主）の間に形成される新たな生命現象である . 細菌感染のメカニズムを分子レベルで解き明かすことにより , 細菌と生体の間に展開される複雑系の生命現象を解き明かすことを合わせて目指している .
「主要な研究テーマ」（Ⅰ）サルモネラ属細菌をモデルとした , 食細胞内寄生性を有する病原細菌の全身感染症発症機序並びに持続感染機構の解明（Ⅱ）RNA エピジェネティクスとリボソームターゲッティング薬の抗菌活性（Ⅲ）AAA+ プロテアーゼ ClpXP の研究成果に基づいた慢性感染症治療薬となる anti-persister の探索研究

Research Focus（I）Dissecting the molecular mechanisms of systemic infection and persistent infection by facultative
intracellular bacteria through the study of Salmonella-host interplay: We focus on the Salmonella effectors,
which we have identified through a meta-analytic approach to the accurate prediction of effectors, toelucidate the dynamic interplay with their host targets and bacterial strategies for withstanding the host
innate- and acquired-immune systems.
（II）RNA epigenetics and bacterial susceptibility to ribosome-targeting antibiotics: This project is basedon our recent findings that post-transcriptional modifications（epigenetic alterations）of 23S rRNA byintrinsic enzymes are essentially responsible for susceptibility of pathogenic bacteria to several ribosometargeting antibiotics.
（III）Identification and development of anti-persister compounds as a new class of antibiotics to treat
chronic infection: Our previous studies on the AAA+ protease, ClpXP allowed us to hypothesize that thedysregulation of proteolysis by activation of ClpP core in the absence of the regulatory ClpX ATPase maylead to corruption of bacterial physiology and eventually death of dormant cells. The compounds leading
such uncontrolled proteolysis could be potential as a new class of antibiotics to treat chronic infection
特

任

教

授

技 術 補 佐 員

20

山本 友子
野村祐理子

Professor

Research Promotion Technician

千葉大学

真菌医学研究センター報告

Tomoko Yamamoto
Yuriko Nomura

第 19 巻2015

1.

Host response network of Salmonella infection:
Suppression of humoral immune memory by Salmonella

2.

persistent infection

Invasive non-typhoidal Salmonella（ iNTS ）disease:

Host pathogen interaction in iNTS infection andappropriate vaccine candidate

Tomoko Yamamoto 1 , Akiko Takaya 2 and Koji Tokoyoda 3

Tomoko Yamamoto 1, Akiko Takaya 2 , Hiroki Takahashi 3 ,1Project for Host Response Network of Bacterial Infection,

Motomichi Takahashi 4

2

Department of Microbiology and Molecular Genetics,

1

German Rheumatism Research Center Berlin, Germany

2

3

Medical Mycology Research Center, Chiba University

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba University

Salmonella can escape from the host immune surveillance

Yuriko Nomura1, Kentaro Miyamoto 4 , Kentaro Oka 4 and3Since most myeloid cells are short-lived, Salmonella is assumed4

to relocate to new myeloid cells via fluid for the persistencein the host. However, it remains unknown how Salmonella

Medical Mycology Research Center, Chiba University

Department of Microbiology and Molecular Genetics,
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba

and thereby cause persistent infection. It has been reported

that Salmonella is resident in myeloid cells of host organs.

Project for Host Response Network of Bacterial Infection,

University

Project for Systems Biology of Microorganisms, Medical
Mycology Research Center, Chiba University

Tokyo R&D Center, Miyarisan Pharmaceutical Co., Ltd
Non-typhoidal Salmonella（NTS）serovars such as serovar

escapes from humoral immunity, especially antibodies in fluid.

Typhimurium generally cause in humans, self-limited

IgG-secreting plasma cells was diminished within 4 days

diarrhea. Nevertheless, in developed countries up to 5 % of

We showed that the great majority（≥80%）of bone marrow

after intraperitoneal and oral infection of live Lon-deficient

gastroenteritis, associated with intestinal inflammation and

NTS cases may be invasive, extra-intestinal disease leading toattenuated Salmonella, whereas bone marrow IgM-secretingbacteremia and focal systemic infections. Moreover, in Sub-

infection also reduced total IgG titers in serum, resulting inhave emerged as a major cause of bloodstream infection inand splenic IgG-secreting plasma cells were unaffected. The

impaired production of previously-generated antibodies against
Salmonella. This selective diminishment was also induced

Saharan Africa invasive non-typhoidal Salmonella（iNTS）
immunocompromised and debilitated host. Transmissionof iNTS has been demonstrated to be primarily human to

by culture supernatants from Salmonella but not Escherichia

human, rather than zoonotic, but little is known about theresults that the culture supernatant depleting ligands for Toll-

To understand the iNTS diseases, we focus on the host-coli within 24 hours after intraperitoneal injection. From thelike receptors, lipopolysaccharide and flagellin, reduced therelationship of invasive disease to diarrheal Salmonella disease.

pathogen interaction, i.e. bacterial pathogenesis and hostplasma cells, we suggest that Salmonella-specific component

immune responses, in iNTS infection. To attain the goal, we

the bone marrow. Salmonella also reduced B cell precursors

isolated in Sub-Saharan Africa during the period 2011-2014

is involved in the reduction of IgG-secreting plasma cells inin the bone marrow and presumably blocked the provision of
B cells for the periphery. Thus, Salmonella inhibits humoral

initially analyzed the whole genomes of various iNTS strainsusing next generation sequencing.

immunity targeting the secretion of antibodies and provisionof new B cell subsets. To identify a Salmonella component

reducing IgG-secreting plasma cells and B cell precursors inthe bone marrow, genetical and biochemical studies are now

in progress.

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

21

3.

RNA epigenetics and bacterial susceptibility toribosome-targeting antibiotics

Tomoko Yamamoto1, Akiko Takaya 2 , Naruhiko Ishiwada 3

and Tsutomu Suzuki 4
1

2

3

4

Project for Host Response Network of Bacterial Infection,susceptible. Moreover, we have found that another intrinsic
methylation of the adjacent uridine at position 747 enhances

G748 methylation by RlmAII . U747 and another nucleotide,
U1939, were methylated by the dual-specific methyltransferase

RlmCD encoded by SP_ 1029 . Inactivation of RlmCD

reduced N 1 -methylated level of G 748 by RlmA II in vivo,

leading to TEL resistance. In vitro methylation of rRNA

Medical Mycology Research Center, Chiba University

showed that RlmA II activity was significantly enhanced by

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba

results suggest that RlmCD-mediated U 747 methylation

Project to link infection control and prevention, Medical

facilitating TEL binding to the ribosome（published）.

Department of Microbiology and Molecular Genetics,
University

Mycology Research Center, Chiba University

Department of Chemistry and Biotechnology, Graduate
School of Engineering, University of Tokyo

In prokaryotic cells, ribosomal RNAs（rRNAs）undergo

specific post-transcriptional modifications, i.e. epigenetic

alterations, by a wide variety of enzymes during maturation.

Most of modified residues of the 23S rRNA are clustered

RlmCD-mediated pre-methylation of 23 S rRNA. These

promotes efficient G748 methylation by RlmA II , thereby（ii）Intrinsic rRNA methylation responsible for linezolid（ LZD ）susceptibility: The defects of the gene encoding

intrinsic RlmN which methylates 23 S rRNA nucleotide

A2503 were revealed to link to the resistance to LZD, thefirst agent of oxazolidinone class, in clinical isolates of
Staphylococcus.

From these findings, we hypothesize that the epigenetic

alterations of 23S rRNA are possibly involved in the bacterial

around the nascent peptide exit tunnel, which starts at thesusceptibility to a wide variety of ribosomal PTC-targetinglarge ribosomal subunit. We have found that some of post-

selecting antibacterial targets and developing antibiotics.

peptidyl transferase center（PTC）and spans the body of thetranscriptional modifications of 23S rRNA are essentially

responsible for bacterial susceptibility to several ribosome
PTC-targeting antibiotics.

（i）Interplay between two rRNA methylations responsible

for telithromycin（TEL）susceptibility: Inactivation of theantibiotics. This study will provide innovative perspectives on

4.

Identification and development of anti-persistercompounds as a new class of antibiotics

Tomoko Yamamoto 1 , Akiko Takaya 2 , Yuriko Nomura 1 , andintrinsic methyltransferases RlmA , which methylates the

Walid Houry 3

domain II of 23S rRNA, resulted in increased resistance of1

Project for Host Response Network of Bacterial Infection,

Primer extension analysis showed the degree of methylation at

2

Department of Microbiology and Molecular Genetics,

II

N- 1 position of nucleotide G 748 located in helix 35 ofStreptococcus pneumoniae to TEL, a member of ketolides.

G 748 in all TEL-resistant mutants is significantly reduced by
a mutation in the gene encoding RlmA . Adenine at position

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba

II

752 in a loop of helix 35 from positions 745 to 752 is involved

in binding to the ribosome of TEL. RNA footprinting andthe molecular modeling study have suggested that the

Medical Mycology Research Center, Chiba University

3

University

Department of Biochemistry, University of Toronto, Canada
Chronic infections are difficult to treat with antibiotics,

methylation of G748 enhances binding of TEL to A752 andwhich kill bacteria by corrupting their targets but these are

domain II of 23 S rRNA. This novel finding shows thatreasoned that a compound capable of corrupting a target

thereby contributes to the stable interaction of TEL withmethylation of G748 by RlmAII renders S. pneumoniae TEL-

22

千葉大学

inactive in dormant persisters, leading to tolerance. We

in dormant, energy-deprived cells will kill persisters. Our

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

previous studies on the energy-dependent ClpXP-proteaseallowed us to hypothesize that the dysregulation of proteolysis

pediatric patient. J Infect Chemother. doi:10 . 1016/

j.jiac.2015.10.004. 2015.

by activation of ClpP core in the absence of the regulatory

３）Matsui H, Fukiya S, Kodama-Akaboshi C, Eguchi

and eventually death of dormant cells. The compounds

protective efficacy of oral non-typhoidal Salmonella

ClpX ATPase may lead to corruption of bacterial physiology
leading such uncontrolled proteolysis could be potential

as a new class of antibiotics to treat chronic infection. To

identify those compounds, we initially established a system

M, Yamamoto T. Mouse models for assessing the cross-vaccine candidates harbouring in-frame deletions of theATP-dependent protease lon and other genes. J Med
Microbiol. 64:295-302. 2015.

for evaluating ClpP proteolysis in vitro and have been４）Shoji T, Takaya A, Sato Y, Kimura S, Suzuki T,

chemical libraries. Very recently, we have found that one

promotes efficient G748 methylation by methyltransferase

conducting high-through-put screening by exploiting various

of such compounds, ACPb1（ ACP: Activators of Self-

Compartmentalizing Protease）originally showing no anti-

microbial activity can kill a variety of bacteria under certain
condition.

Yamamoto T: RlmCD-mediated U 747 methylation

R l m A II in 23 S rRNA in Streptococcus pneumoniae;

interplay between two rRNA methylations responsible fortelithromycin susceptibility. Nucleic Acids Research,
43:8964-7972. 2015.

５）Takaya A, Kimura A, Sato Y, Ishiwada N, Watanabe

Publications

１）Hirai S, Yokoyama E, Etoh Y, Seto J, Ichihara

S, Suzuki Y, Maeda E, Sera N, Horikawa K, SatoS, Yamamoto T. Putative classification of clades ofenterohemorrhagic Escherichia coli O 157 using an IS-

printing system. Lett Appl Microbiol. 61 : 267 - 273 .
2015.

２）Ishiwada N, Takaya A, Kimura A, Watanabe M, Hino

M, Ochiai H, Matsui M, Shibayama K, Yamamoto
T. Linezolid-resistant Staphylococcus epidermidis

M, Matsui M, Shibayama K, Yamamoto T. Molecularcharacterization of linezolid-resistant coagulase-negative

Staphylococcus isolates in Japan. J. Atimicrob. Chemother.

70:658-63. 2015.

６）Takeuchi M, Yamamoto T. Apoptosis induced by

NAD depletion is inhibited by KN-93 in a CaMKII-

independent manner. Exp Cell Res. 335:62-67. 2015.

７）山本友子：プラスミドによる薬剤耐性の菌種間伝播と施設内感染：マクロライド / ケトライド耐性 . 化

学療法の領域

associated with long-term, repeated linezolid use in a

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻31:1458-1468. 2015.

2015

23

川本（分子細胞シグナリング解析）プロジェクト
Project for Molecular Signaling Analysis
研究概要（Summary）

生化学・分子生物学・細胞生物学等の手法を用い , 病原真菌の分子細胞研究を行い , 抗真菌薬シーズ
創出など真菌症の分子制御に向けた分子細胞医真菌学への貢献を目指す .
１）病原酵母 Cryptococcus neoformans の細胞周期と低酸素ストレス応答の分子細胞解析
２）病原真菌における一酸化窒素（NO）の生成機構と生理機能の解析
３）マイコウイルスタンパク質の作用機序解析

We are conducting basic research on the molecular and cellular biology of pathogenic fungi using, mainly,
biochemistry and molecular biology methods based on gene and protein science.
１）Molecular and cellular analysis of cell cycle regulation and hypoxic adaptation in Cryptococcus neoformans.
２）Analysis of biosynthesis and physiological function of nitric oxide（NO）in pathogenic fungi.
３）Functional analysis of mycovirus protein.

川

客員教授・グランドフェロー

1.

本

進

Guest Professor・Grand Fellow

Identification of genes involved in the phosphatemetabolism in Cryptococcus neoformans.

Akio Toh-e 1, Misako Ohkusu 1 , Hao-Man Li 1 , Kiminori
Shimizu , Azusa Takahashi-Nakaguchi , Tohru Gonoi
111

Susumu Kawamoto , Yu Kanesaki Hirofumi Yoshikawa ,1Masafumi Nishizawa

1

2

3

4

2

2, 3

4

Medical Mycology Research Center, Chiba University,

Susumu Kawamoto

cellular signaling pathways and is also an essential componentof nucleic acids and phospholipids. Thus it is reasonable

to assume that C. neoformans（Cn）possesses a phosphate
regulatory system（PHO system）analogous to that of otherfungi. By BLAST searches usingthe amino acid sequences of

the components of the PHO system of Saccharomyces cerevisiae（ Sc ）, we found potential counterparts to ScPHO genes

in C. neoformans, namely, acid phosphatase（CnPHO2）,
the cyclin-dependent protein kinase（ CDK ）inhibitor

Chiba, Japan（ CnPHO 81）, Pho 85 -cyclin（ CnPHO 80）, and CDK

Agriculture, Tokyo, JapanCnPHO85, followed by phenotypic analysis, identifiedmost

NODAI Genome Research Center, Tokyo University of
Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture,（CnPHO85）. Disruption of each candidate gene, exceptof the basic components of the CnPHO system. We foundTokyo, Japanthat CnPHO85 was essential for the growth of C. neoformans,

University School of Medicine, Tokyo, Japan

screening and ChIP analysis, showed that CnPHO4 encodes

Department of Microbiology and Immunology, Keio

Cryptococcus neoformans is a pathogenic basidiomycetous

having regulatory function in the CnPHO system. Genetic
a transcription factor that binds to the CnPHO genes in a

Pi-dependent manner. By RNA-seq analysis of the wild-

yeast that can cause life-threatening meningoencephalitis in

type and the regulatory mutants of the CnPHO system, webody, this organism has to acquire phosphate that functions inby the regulators of the CnPHO system. Thus the CnPHO

immuno-compromized patients. To propagate in the human

24

千葉大学

found C. neoformans genes whose expression is controlled

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

system shares many properties with the ScPHO system, but
expression of those CnPHO genes that encode regulators

is controlled by phosphate starvation, which is not the casein the ScPHO system（except ScPHO81）. We also could

identify some genes involved in the stress response of thepathogenic yeast, but CnPho4 appeared to be responsible

only for phosphate starvation.
2.

Electron microscopy of autopsy material from thehuman brain cryptococcosis and AIDS.

Amaliya A Stepanova , Natalya V Vasilyeva , Masashi
1

1

Yamaguchi 2 , Kiminori Shimizu 2 , Susumu Kawamoto

1１）Kopecká M, Yamaguchi M, Kawamoto S: The effectsof F-actin inhibitor latrunculin A on pathogenic yeast

Cryptococcus neoformans. Chemotherapy 60（3）: 185-190,
2015.

２）Shimizu, K Nakagawa H, Hashimoto R, Onji Y, Asano

K, Kawamoto S, Takahashi H, Yokoyama K: The α-oxoamine synthase gene fum8 is involved in fumonisin

B 2 biosynthesis in Aspergillus niger. Mycoscience 56:
301-301, 2015.

３）Stepanova AA, Vasilyeva NV, Yamaguchi M, Shimizu

K, Kawamoto S: Electron microscopy of autopsy

material from the human brain cryptococcosis and AIDS.
Problems in Medical Mycology 17（1）: 35-40, 2015.

North-West State Medical University named after I.I.

４）Takahashi-Nakaguchi A, Muraosa Y, Hagiwara D,

Mycology and Chair of Medical Microbiology, St.

Kamei K, Gonoi T, Takahashi H: Genome sequence

Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical

2

PublicationsPetersburg, Russia

Medical Mycology Research Center, Chiba University,
Chiba, JapanThe cells of Cryptococcus neoformans var. neoformans

and human brain macrophages in autopsy material of
cryptococcosis AIDS patient has been studied by lightand transmission electron microscopy. Use of paraffinblocks for electron microscopic investigation of human

Sakai K, Toyotome T, Watanabe, A Kawamoto S,
comparison of Aspergillus fumigatus strains isolated

from patients with pulmonary aspergilloma and chronic

necrotizing pulmonary aspergillosis. Medical Mycology

53（4）: 353-360, 2015.

５）Toh-e A, Ohkusu M, Li H-M, Shimizu K, Takahashi-

Nakaguchi A, Gonoi T, Kawamoto S, Kanesaki Y,

Yoshikawa H, Nishizawa M: Identification of genes

involved in the phosphate metabolism in Cryptococcus

neoformans. Fugal Genet. Biol. 80: 19-30, 2015.

brain cryptococcosis was proposed. 1. The use of paraffin６）Toh-e A, Ohkusu M, Shimizu K, Kawamoto S:

microscopic studies were acceptable, in particular, to study

application for identification and cloning of the generevealing the structural peculiarity of fungal cells. They can

Genet. Biol. 76: 70-77, 2015.

blocks of the autopsy material for subsequent electron

the pathogenesis of cryptococcosis of the human brain andPositional cloning in Cryptococcus neoformans and its

encoding methylenetetrahydrofolate reductase. Fungal

be used also for studies of virus-like particles in human tissues

７）Ueno K, Kinjo Y, Okubo Y, Aki K, M. Urai, Kaneko Y,

detected only dead cells of the C. neoformans var. neoformans

K, Mizuguchi Y, Kawamoto S, Kamei K, Ohno H,of the dynamics of their distribution in human body. 2. We

both, as outside and, just inside of the macrophages in thebrain tissue of dead patient. We described the 6 types of deadyeast cells in the human brain tissue investigated.

Shimizu K, Wang DN, Okawara A, Nara T, Ohkouchi

Niki Y, Shibuya K, Miyazaki Y: Dendritic cell-based
immunization ameliorates pulmonary infection withhighly virulent Cryptococcus gattii. Infect. Immun. 83（4）: 1577-1586, 2015.

８）浦山俊一 , 森山裕允 , 寺岡

徹 , 川本進 : ウイルスの毒性遺伝子を用いた病原菌の生育制御 . バイオサ
イエンスとインダストリー 74（4）: 306-307, 2015.

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201525

石和田（感染症制御）プロジェクト
Project for Infection Control and Prevention
研究概要（Summary）

インフルエンザ菌の病原性解析ならびにインフルエンザ菌感染症と肺炎球菌感染症の疫学調査を継続的に行っている . 結合型ワクチン導入後 , 新しく問題となっているワクチン非含有型株による病原因子の解析を行い , 新たな予防法の開発を目指す . また , 難治性呼吸器感染症の診断 , 治療法開発のための臨床研究を実施している . 同時に , 附属病院における小児科・感染症内科・感染制御部での診療活動
及び学内外でのコンサルテーションを行っている .

Our research focuses on sero-epidemiology and pathogenesis of Haemophilus influenzae and Streptococcus
pneumoniae. We organize several clinical researches for the development of diagnostic and therapeutic
methods for respiratory infectious diseases collaborating with clinicians and also care for patients in the clinicof the University Hospital.
教術

1.

Molecular characterization of linezolid-resistant CoNS

職

授
教
員

石和田稔彦
竹内 典子
大楠美佐子

准
助
技

isolates in Japan.

Takaya A , Kimura A , Sato Y , Ishiwada N , Watanabe
1

1

1

2

M 3 , Matsui M 4 , Shibayama K 4 , Yamamoto T 5 .
1

3

4

5

study was to characterize the linezolid-resistance mechanisms

in the linezolid-resistant CoNS strains isolated in Japan.

Staphylococcus capitis strains exhibiting linezolid MICs >8

mg/L isolated from inpatients between 2012 and 2014 werescreened for cfr and mutations in 23S rRNA, L3 and L4 by

PCR/sequencing. Isolates were also examined for mutations

Department of Microbiology and Molecular Genetics,

in the rlmN gene. S. capitis had six 23S rRNA alleles. Five S.

University, Chiba, Japan.

G2576U mutations were detected in three, four or five copies

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba

2

Naruhiko Ishiwada
Noriko Takeuchi
Misako Ohkusu

Associate Professor
Assiatant Professor
Research Technician

Division of Control and Treatment of Infectious Diseases,

capitis isolates displayed linezolid MICs of 8, 16 and 32 mg/L.

of 23S rRNA in all isolates. In two isolates exhibiting the

Chiba University Hospital, Chiba, Japan.

highest linezolid MIC（32 mg/L）there was a large deletion

Hospital, Chiba, Japan.

were found in both 16S and 23S rRNAs, suggesting deletion

Division of Laboratory Medicine, Chiba University
Department of Bacteriology II, National Institute of
Infectious Diseases, Musashimurayama, Tokyo, Japan.

Department of Microbiology and Molecular Genetics,
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba

University, Chiba, Japanin a single copy of 23S rRNA. Repeated 10 bp sequencesby recombination between the repeats. One isolate had themutation Ala-142→ Thr in the ribosomal protein L3. Alllinezolid-resistant isolates also demonstrated mutations in

the gene encoding RlmN methyltransferase, leading to Thr-

62→ Met and Gly-148→ Ser. Multiple mechanisms appeared

to be responsible for the elevated linezolid resistance in S.

Linezolid has been reported to remain active against

capitis isolates: a G 2576U mutation in different numbers

Staphylococcus aureus and 1.4% of CoNS. The objective of thisand a mutation in the ribosomal protein L3, suggesting the

98% of staphylococci with resistance identified in 0.05% of

26

千葉大学

of copies of 23S rRNA, loss of a single copy of 23S rRNA

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

h in the pediatric patients were 3.3（2.5, 4.4）μg/mL andaccumulation of independent mutational events.
2.

175.1（139.3, 220.1）μg hr/mL, respectively, which were

Pharmacokinetics, efficacy, and safety of caspofungincomparable to those in Japanese adult patients [3.2（2.8, 3.5）

and invasive aspergillosis.

Among the 20 patients, 10（50%）had at least 1 drug-related

in Japanese pediatric patients with invasive candidiasis

Mori M , Imaizumi M , Ishiwada N , Kaneko T , Goto
1

2

3

4

H , Kato K , Hara J , Kosaka Y , Koike K , Kawamoto
5

6

7

8

9

H 10, Maeda N 11 , Yoshinari T 12 , Kishino H 12 , Takahashi

μ g/mL and 144.9（131.7, 159.3）μg hr/mL, respectively].

adverse event which was considered related to caspofungintherapy. No drug-related serious adverse event and no deathoccurred. The most common drug-related adverse eventswere events relating to hepatic function（mainly increases in

K , Kawahara S , Kartsonis NA , Komada Y .

ALT and AST）. The overall success in efficacy was observed

Department of Pediatrics, Yokohama City Universityof caspofungin（70 mg/m（2）on Day 1, followed by 50 mg/

Kanagawa, Japan.

the same dosage being used in overseas, achieved sufficient

12

1

12

13

14

Medical Center, Urafune 4-57, Minami-ku, Yokohama,

2
3
4

5
6
7
8
9
10
11

in 13 of 20 patients. In conclusion, once daily administrationm（2）[maximum daily dose not to exceed 70 mg]）, which is

Miyagi Children s Hospital, Miyagi, Japan.

drug exposure and a favorable efficacy and acceptable safety

Tokyo Metropolitan Children s Medical Center, Tokyo,

infections.

Kanagawa Children s Medical Center, Kanagawa, Japan.

3.

Chiba University Hospital, Chiba, Japan.
Japan.

Japanese Red Cross Nagoya Daiichi Hospital, Aichi, Japan.

profile in Japanese pediatric patients with invasive fungal

from three Japanese children with invasive H. influenzae
infection

Osaka City General Hospital, Osaka, Japan.

Hyogo Prefectural Kobe Children s Hospital, Hyogo, Japan.

Analysis of Haemophilus influenzae serotype f isolated

Ibaraki Children s Hospital, Ibaraki, Japan.

Hoshino T 1, Hachisu Y 2 , Kikuchi T 2 , Tokutake S 3 , Okui

National Hospital Organization Nagoya Medical Center,

Shimizu H 5 , Ito M 6 , Takahashi Y 7 , Ishiwada N 8 .

National Cancer Center Hospital, Tokyo, Japan.
Aichi, Japan.

H 3 , Kutsuna S 3 , Fukasawa C 3 , Murayama K 4 , Oohara A 5 ,Japan Development, MSD K.K., Tokyo, Japan.

1

Division of Infectious Diseases, Chiba Children s Hospital,Corp., Upper Gwynedd, PA, USA.

2

Mie University Hospital, Mie, Japan.

3

Chiba Prefectural Institute of Public Health, Chiba, Japan.

The antifungal agents approved in Japan for pediatric use

4

without clear instruction for dosage. We investigated the5candidiasis and invasive aspergillosis in 20 Japanese pediatric6

surface area. Caspofungin was administered intravenously

7（2）per day. Five or 4 point blood sampling were done in 15

8

12
13

14

Merck Research Laboratories, Merck Sharp & Dohme

are limited and many unapproved drugs are actually usedpharmacokinetics of caspofungin for the treatment of invasive

patients using a pediatric-specific dosage based on bodyover 60 min as 70 mg/m（2）on Day 1, followed by 50 mg/m

patients on Day 4-5 to calculate AUC0-24 h. The geometricmeans（95% confidence interval）of C24 h and AUC0-24

千葉大学

Chiba, Japan

Division of Infectious Diseases, Chiba Children s Hospital,
Chiba, Japan.

Department of Metabolism, Chiba Children s Hospital,
Chiba, Japan.

Children s Medical Center, Fujisawa City Hospital,
Kanagawa, Japan.

Department of Pediatrics, Nagoya City West Medical
Center, Aichi, Japan.

Department of Pediatrics, Graduate School of Medicine,
Chiba University, Chiba, Japan.

Department of Infectious Diseases, Medical Mycology
Research Center, Chiba University, Chiba, Japan.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

27

In Japan, publicly subsidized Haemophilus influenzae

serotype b vaccines became available in 2011; consequently,
the incidence of invasive H. influenzae infection in paediatricHeptavalent pneumococcal conjugate vaccine（ PCV 7）

was introduced to Japan in 2010. We investigated the impactof PCV 7 on childhood community-acquired pneumonia

patients of less than 5 years of age decreased dramatically.

（CAP）and pneumococcal pneumonia（PP）. Children aged

meningitis in a Japanese infant was reported, and another case

hospitals were enrolled to estimate the incidence of CAP

In 2013, the first case of H. influenzae serotype f（Hif）
of Hif meningitis in a Japanese infant was observed in 2013.

We experienced a fatal paediatric case of Hif bacteraemia<5 years living in Chiba city, Japan, who were admitted tobased on the mid-year population. PP was determined by
the presence of Streptococcus pneumoniae in cultured bloodin 2004; therefore, we conducted an analysis of the three

and/or sputum samples of CAP patients. The incidence

invasive Hif infections. All three strains were β-lactamase-compared before（April 2008-March 2009）and after（April

Hif strains isolated from these three Japanese children with

non-producing, ampicillin-sensitive strains, with MICsof CAP and S. pneumoniae isolated from PP patients was

2012-March 2013）the introduction of PCV7 immunization.

of 1 μ g ml（-1）or less. However, one of the three strains

The annual incidence of CAP was reduced [incidence rate

cefotaxime（0.25 μ g ml（-1））and meropenem（0.13 μg ml

comparing post-vaccine with pre-vaccine periods, the odds

identified all three strains as sequence type（ST）124, which024）. PCV7-covered serotypes markedly decreased（66・6%

digested PFGE showed variable DNA fragmentation patterns

serotypes 6C, 15A, 15C and 19A increased. Multidrug-

showed slightly elevated MICs for ampicillin（1 μg ml（-1））,（-1））. A molecular analysis by multilocus sequence typing

is a predominant invasive Hif strain in many countries. SmaI-

among the strains, suggesting that some highly virulent

ratio 0・81, 95% confidence interval（CI）0・73-0・90]. Whenratio for PP incidence was 0・60（95% CI 0・39-0・93, P = 0・in pre-vaccine vs. 15・6% in post-vaccine, P < 0・01）, andresistant international clones in the pre-vaccine period

strains have originated from a single ST124 clone and caused（Spain6B-2/ST90, Taiwan19F-14/ST236）decreased, while

to determine the factors that have led to the clonal expansion

vaccine period. A significant reduction in the incidence

invasive Hif infections in Japan. Additional studies are neededof virulent ST124 strains.
4.

The impact of heptavalent pneumococcal conjugate
vaccine on the incidence of childhood community-

acquired pneumonia and bacteriologically confirmed
pneumococcal pneumonia in Japan.

Naito S , Tanaka J , Nagashima K , Chang B , Hishiki112

Ishiwada N .
41

Department of Pediatrics, Chiba University Graduate

2

Clinical Research Centre, Chiba University Hospital, Chiba

4of both CAP hospitalizations and culture-confirmed PPof vaccine serotypes was observed at 2 years after PCV 7
vaccination.

5.

School of Medicine, Chiba City, Japan.

Infectious Diseases, Tokyo, Japan.

Department of Infectious Diseases, Medical Mycology
Research Center, Chiba University, Chiba City, Japan.

28

千葉大学

pneumococcal disease in Japanese children: Effects ofSuga S 1 , Chang B 2 , Asada K 3 , Akeda H 4 , Nishi J 5 , Okada

K 6, Wakiguchi H 7 , Maeda A 8 , Oda M 9 , Ishiwada N 10 ,Saitoh A 11 , Oishi T 11 , Hosoya M 12 , Togashi T 13 , Oishi K 2 ,Ihara T 3 .
1

City, Japan.

Department of Bacteriology I, National Institute of

Nationwide population-based surveillance of invasive
the seven-valent pneumococcal conjugate vaccine.

3

H 1 , Takahashi Y 1 , Oikawa J 1 , Nagasawa K 1 , Shimojo N 1 ,3

Sweden15A-25/ST63 was the dominant clone in the post-

Infectious Disease Center and Department of ClinicalResearch, National Hospital Organization Mie Hospital,

23Mie, Japan.

National Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan.

Infectious Disease Center and Department of ClinicalResearch, National Hospital Organization Mie Hospital,

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

4

5

6

7
8

9

10

11

12

13

Mie, Japan.

IPD incidence caused by PCV7 serotypes in children aged <5Medical Center, Okinawa, Japan.

shows the importance of continuing surveillance of serotypes

Okinawa Prefectural Nanbu Medical Center & Children s
Kagoshima University Graduate School of Medical andyears and serotype replacement after PCV7 introduction. This
responsible for IPD and their antimicrobial resistance in

Dental Sciences, Kagoshima, Japan.

Japan.

Oral and Medical Management, Fukuoka Dental College,

6.

Section of Pediatrics, Department of Medicine, Division of
Fukuoka, Japan.

Hospital, Kochi, Japan.

Okayama University Graduate School of Health Sciences,
Okayama, Japan.

Department of Infectious Diseases, Medical Mycology
Research Center, Chiba University, Chiba, Japan.

Nagasawa K 1, Hirano E 2 , Kobayashi M 3 , Ryo A 4 , Oishi

K 5, Obuchi M 6 , Ishiwada N 7 , Noda M 5 , Kuroda M 8 ,Shimojo N 9 , Kimura H 10 .
1

Department of Pediatrics, Fukushima Medical University

2

Sapporo City University School of Nursing, Hokkaido,

3

School of Medicine, Fukushima, Japan.
Japan.

4

In Japan, the seven-valent pneumococcal conjugate vaccine（ PCV 7）was introduced in 2010 . PCV 13 has replaced

PCV7 since November 2013. The effectiveness of PCV75

in protecting against invasive pneumococcal disease（IPD）

6

active population-based surveillance of IPD in 2008-2013

7

in children aged < 5 years was evaluated in a nationwide
in 10 prefectures in Japan.

1181 cases were identified;711 pneumococcal strains were analyzed for serotyping and

Department of Pediatrics, Graduate School of Medicine,

Chiba, Japan; Infectious Disease Surveillance Center,

Department of Pediatrics, Niigata University Graduate
School of Medical and Dental Sciences, Niigata, Japan.

attachment glycoprotein gene in human respiratorysyncytial virus subgroup B genotypes BA9 and BA10.

Kochi University, Kochi, Japan.

Department of Pediatrics, Kochi Prefectural Hata-Kenmin

Molecular evolution of the hypervariable region of the

National Institute of Infectious Diseases, Tokyo , Japan.

Fukui Prefectural Institute of Public Health andEnvironmental Science, Fukui, Japan.

Gunma Prefectural Institute of Public Health andEnvironmental Sciences, Gunma, Japan.

Department of Microbiology, Yokohama City University,
Graduate School of Medicine, Kanagawa, Japan.

Infectious Disease Surveillance Center, National Institute of
Infectious Diseases, Tokyo, Japan.

Department of Virology, Toyama Institute of Health,
Toyama, Japan.

Division of Infection Control and Prevention Medical

Mycology Research Center, Chiba university, Chiba,

Japan.

antimicrobial resistance. Compared with the baseline IPD

8Pathogen Genomics Center, National Institute of Infectious

by PCV 7 serotypes was found after the introduction of

9

Department of Pediatrics, Graduate School of Medicine,of IPD caused by PCV 13 minus PCV7 and non-PCV13

10incidence（25.0 per 100,000）, a 98% decline in IPD caused

PCV7. This was partially offset by an increased incidence

serotypes, resulting in a 57% decline in overall IPD incidence.

Absolute increases in the incidence rates of IPD caused by
PCV13 minus PCV7 and non-PCV13 serotypes were 2.1 and
2.8 per 100,000 during the study period, respectively. The

proportion of meropenem-nonsusceptible strains, especiallywith serotypes 19A and 15A, increased significantly after
PCV7 introduction. Our data confirmed a 98% decline in

千葉大学

Diseases, Tokyo, Japan.

Chiba University, Chiba, Japan.

Infectious Disease Surveillance Center, National Institute of

Infectious Diseases, Tokyo, Japan; Department ofMicrobiology, Yokohama City University, Graduate Schoolof Medicine, Kanagawa, Japan.

We studied the molecular evolution of the C-terminal 3rd

hypervariable region in the attachment glycoprotein gene ofhuman respiratory syncytial virus subgroup B（HRSV-B）

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201529

genotypes BA 9 and BA 10 . We performed time-scaled

nidulans var. echinulata was isolated from his sputum. After

Carlo methods. We also performed a genetic distancethe rib swelling. A combination therapy of voriconazole

phylogenetic analyses using Bayesian Markov chain Montestarting voriconazole, Rasamsonia piperina was isolated fromanalysis（p-distance analysis）, positive and negative selection

and micafungin effectively eradicated this invasive mixed-

found that genotype BA9 diverged from the common ancestor

pathogenic diagnosis is clinically useful for administration ofanalyses, and a Bayesian skyline plot（BSP）analysis. We

mold infection. In immunocompromised patients, a preciseof genotypes BA7, BA8, and BA10, while genotype BA10

an appropriate treatment regimen.

Strains of both genotypes were distributed worldwide. BA98.

diverged from the ancestor of genotypes BA 7 and BA 8 .
and BA10 diverged between 1999 and 2001. Both BA9 andBA 10 evolved rapidly（ about 4 . 8×10（ - 3）substitutions/site/year）and formed three distinct lineages in a 10-year

period. BA10 strains belonging to lineage 3 had large genetic
distances（p-distance>0.07）. Thus, it may be possible toclassify these strains as a new genotype, BA11. No positive

Ishiwada N 1 , Takaya A 2 , Kimura A 2 , Watanabe M 3 , Hino

M 4 , Ochiai H 4 , Matsui M 5 , Shibayama K 5 , Yamamoto T 6 .
1decreased gradually since 2010 and BA9 slightly decreased

2since 2009. The results suggested that the recently prevalent

HRSV-B genotypes BA9 and BA10 evolved uniquely, leadingwith long-term, repeated linezolid use in a pediatricpatient.

selection site was detected in either genotype. Phylodynamic
analyses showed that the effective population size of BA10

Linezolid-resistant Staphylococcus epidermidis associatedDepartment of Infectious Diseases, Medical Mycology
Research Center, Chiba University, Chiba, Japan.

Department of Microbiology and Molecular Genetics,
Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba

University, Chiba, Japan.

to epidemics of HRSV-B worldwide over a 15-year period.

3

7.

The first case of invasive mixed-mold infections due

4

Department of Pediatrics, Chiba University Hospital,

piperina in a patient with chronic granulomatous

5

Department of Bacteriology II, National Institute of

to Emericella nidulans var. echinulata and Rasamsonia
disease.

6

Ishiwada N , Takeshita K , Yaguchi T , Nagasawa K ,
1

2

3

2

Takeuchi N 4, Hishiki H 2 , Watanabe A 4 , Kamei K 4 ,Shimojo N 2 .
1

2

3

4

Department of Infectious Diseases, Medical Mycology
Research Center, Chiba University, Chiba, Japan.

Department of Pediatrics, Graduate School of Medicine,
Chiba University, Chiba, Japan.

Division of Bioresources, Medical Mycology Research

Division of Laboratory Medicine, Chiba University
Hospital, Chiba, Japan.

Chiba, Japan.

Infectious Diseases, Musashimurayama, Tokyo, Japan.

Department of Infectious Diseases, Medical Mycology

Research Center, Chiba University, Chiba, Japan;

Department of Microbiology and Molecular Genetics,

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba

University, Chiba, Japan.

We report an 8 -year-old patient with catheter-related

bacteremia caused by linezolid-resistant Staphylococcus

epidermidis that was isolated after the long-term, repeateduse of linezolid. Three S. epidermidis strains isolated fromCenter, Chiba University, Chiba, Japan.

this patient were bacteriologically analyzed. While the

Research Center, Chiba University, Chiba, Japan.

linezolid, two strains after linezolid therapy displayed low-

A 16-year-old boy with chronic granulomatous disease

resistance（MIC, 16 mg/L）. T2500A mutation in two copies

Department of Infectious Diseases, Medical Mycology

presented with pneumonia and rib osteomyelitis. Emericella

30

千葉大学

strain isolated prior to linezolid initiation was susceptible tolevel linezolid susceptibility（MIC, 4 mg/L）and linezolid
and G2575T mutations in three copies of 23S rRNA were

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

detected in the low-susceptible strain and the resistant strain,

confirmed pneumococcal pneumonia in Japan. Epidemiolrare, but may occur with the long-term administration of７）Suga S, Chang B, Asada K, Akeda H, Nishi J, Okada K,

respectively. Linezolid-resistant S. epidermidis infection islinezolid.

Infect. 30:1-13, 2015.

Wakiguchi H, Maeda A, Oda M, Ishiwada N, Saitoh

A, Oishi T, Hosoya M, Togashi T, Oishi K, Ihara T.:

Publications: original articles

１）Hoshino T, Hachisu Y, Kikuchi T, Tokutake S, Okui

Nationwide population-based surveillance of invasive
pneumococcal disease in Japanese children: Effects of theH, Kutsuna S, Fukasawa C, Murayama K, Oohara A,

seven-valent pneumococcal conjugate vaccine. Vaccine.

of Haemophilus influenzae serotype f isolated from three８）Takaya A, Kimura A, Sato Y, Ishiwada N, Watanabe

Shimizu H, Ito M, Takahashi Y, Ishiwada N.: Analysis
Japanese children with invasive H. influenzae infection. J

Med Microbiol. 64: 355-8, 2015.

２）Ishiwada N, Takeshita K, Yaguchi T, Nagasawa

K, Takeuchi N, Hishiki H, Watanabe A, Kamei

K, Shimojo N.: The first case of invasive mixed-mold

infections due to Emericella nidulans var. echinulata
and Rasamsonia piperina in a patient with chronic

granulomatous disease. Mycopathologia. 2015 [Epubahead of print]

３）Ishiwada N, Takaya A, Kimura A, Watanabe M, Hino

M, Ochiai H, Matsui M, Shibayama K, Yamamoto T.:

Linezolid-resistant Staphylococcus epidermidis associated33, 6054-60, 2015.

M, Matsui M, Shibayama K, Yamamoto T. : Molecularcharacterization of linezolid-resistant CoNS isolates inJapan. J Antimicrob Chemother. 70:658-63, 2015.

９）宇田和宏 , 森川和彦 , 伊藤健太 , 廣瀬慎太郎 , 磯貝
美穂子 , 森野紗衣子 , 為

智之 , 後藤薫 , 内藤幸

子 , 石和田稔彦 , 堀越裕歩：小児病院における肺炎球菌結合型ワクチン導入後の侵襲性肺炎球菌感染症の血清型の推移
10）朽名

27:9-15, 2015.

小児感染免疫悟 , 星野直 , 深沢千絵 , 徳武翔子 , 奥井秀

由起 , 澤田恭子 , 佐藤洋子 , 高橋喜子 , 石和田稔彦：小児臨床検体由来インフルエンザ菌非 b 型莢膜株に
関する検討

感染症誌

89: 237-43, 2015.

with long-term, repeated linezolid use in a pediatric

11）菱木はるか , 石和田稔彦 , 内藤幸子 , 長澤耕男 , 染４）Mori M, Imaizumi M, Ishiwada N, Kaneko T, Goto H,

鈴木和男：2013/2014シーズンのインフルエンザ小patient. J Infect Chemother. 2015 [Epub ahead of print]

谷知宏 , 井上紳江 , 原木真名 , 黒崎知道 , 亀岡洋祐 ,Kato K, Hara J, Kosaka Y, Koike K, Kawamoto H, Maeda

児症例に対するノイラミニダーゼ阻害薬の臨床効果

Kartsonis NA, Komada Y. : Pharmacokinetics, efficacy,12）竹内典子 , 菱木はるか , 石和田稔彦：多剤耐性結核

N, Yoshinari T, Kishino H, Takahashi K, Kawahara S,
and safety of caspofungin in Japanese pediatric patientswith invasive candidiasis and invasive aspergillosis. J

Infect Chemother. 21:421-6, 2015.

の比較 JJA 68: 337-44, 2015.

菌陽性母体の周産期感染管理の経験と問題点
呼誌

日小26: 218-25, 2015.

５）Nagasawa K, Hirano E, Kobayashi M, Ryo A, Oishi K,

Publications: reviews, reports, books and the related

N, Kimura H.: Molecular evolution of the hypervariable

13）石和田稔彦：1. Hib ワクチン , 肺炎球菌結合型ワク

respiratory syncytial virus subgroup B genotypes BA9 and

14）石和田稔彦：臨床医が語る

Obuchi M, Ishiwada N, Noda M, Kuroda M, Shimojo
region of the attachment glycoprotein gene in humanBA10. Infect Genet Evol. 36: 217-23, 2015.

６）Naito S, Tanaka J, Nagashima K, Chang B, Hishiki

H, Takahashi Y, Oikawa J, Nagasawa K, Shimojo N,
Ishiwada N. : The impact of heptavalent pneumococcal

conjugate vaccine on the incidence of childhoodcommunity-acquired pneumonia and bacteriologically

千葉大学

publications

チンの普及と効果
インパクト

49:11-16, 2015.

日小医会報

新薬の治療・市場への小児における肺炎球菌ワクチン「シンフロリックス」のインパクト
15:44-47, 2015.

15）石和田稔彦：特集

ファームステージ

小児呼吸器疾患をあなどるな !

Ⅱ . 検査にチャレンジしよう !

呼吸器感染症診断 :迅速かつ正確に行うための極意

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

小児科診療

78:

31

み・はな・のど診療Ⅱ巻

945-951, 2015.

16）石和田稔彦：特集

子どものかぜ薬

何がホント？

４ 抗 生 物 質 は 必 要 で す か？ チ ャ イ ル ド ヘ ル ス
18:17-20, 2015.

小児感染症2015のマネージメント
68:2478-2484, 2015.

18）石和田稔彦：視点

小児市中肺炎

小児感染症
小児科臨床

最近注目されているヒトパレコ
東京小児科医34:73-76, 2015.

まるわかりワクチン Q&A

日本医事新報社

p217-226, 2015.

20）石和田稔彦：感染症

32

３．診

医薬ジャーナル社

p52-62,

2015.

永井良三編

今さら聞けない !

千葉大学

中野貴司編
小児のみ

12

炎）医学書院

感染性疾患

①細菌検査

第7版

砂

金澤一郎・

ポリオ（急性灰白髄

p1356-57, 2015.

弘 , 岡田隆文 , 佐藤友紀 , 竹内典子 , 藤野元

子 , 森谷邦彦 , 山遠

剛：WS-2コンジュゲートワク

チンで小児の中耳炎はどう変わるか？

68:485-487, 2015.

真菌医学研究センター報告

全改訂版Ⅰ . 総論

３）原因診断〜意義と問題点

川慶介・尾内一信編

23）吉野

19）石和田稔彦：８肺炎球菌（小児）予防接種の現場で困らない

21）石和田稔彦：小児の肺炎

22）石和田稔彦：今日の診断指針

ウイルス・ヒトボカウイルス感染症
会報

日本病院出版会 p89-95, 2015.

断17）石和田稔彦：特集

山中昇・加我君孝編

第 19 巻

2015

小児科臨床

五ノ井 PI（真菌・放線菌と宿主の分子相互作用研究）プロジェクト
Project for Host Pathogen（fungi/actinomycetes）Molecular Interaction
研究概要（Summary）

微生物資源分野では , バイオリソース管理室と協力し , 日本国内および海外のヒトや動物に由来する
病原真菌・病原放線菌を収集 , 管理 , 分譲している . これらの菌株数は , 現在約２万に達するが , 菌のマーカー遺伝子やゲノムを解析し , また薬剤感受性や電子顕微鏡による形態観察 , ２次代謝産物の解析などを行い菌株資源 , 遺伝子資源としての付加価値の向上に努めている . さらなる独自の研究テーマ（PI プロジェクト）については下記『主なテーマ』を参照してください .
主なテーマ（Research Focus）
１）ヒト・動物の病原真菌・病原放線菌の収集 , 分類 , 系統解析 , ２次代謝産物の解析 , 病原因子解析 ,２次代謝産物生合成遺伝子 , ゲノムの解析を行っている .
２）真菌・放線菌のヒトへの感染機構の解明を分子生物学的手法 , 動物モデル , ゲノム解析などを用いて行っている . 特に , 近年は ,（１）糖鎖と糖鎖受容体を介した菌と宿主の相互作用解明 ,（II）ヒ
ト病原糸状菌の寄生ウイルスが病原性に及ぼす影響を調べることに力を入れている .
３）真菌感染発症と宿主の栄養状態やストレス状態との関連を , 動物モデルなどを用いて研究している . 特に代謝関連分子と免疫関連分子の機能的リンクに焦点を当てている .

In cooperation with Bio-Resource management office, we collect pathogenic fungi and actinomycetes inboth inside and outside of Japan. We identify pathogenic fungi and actinomycetes as a public service, andanalyze their phylogenetic relations. We store fungi and actinomycetes with the support of the National
BioResource Projects in Japan, and distribute them upon request. Currently we stock approximately 20,000
strains. We analyze sequences of marker genes and genomes, drug-sensitivities, and observe fine structuresusing electron-microscopy, to enhance biodiversity values. Other projects are listed below.
１）We collect, identify and phylogenetically analyze of human and animal pathogenic fungi andactinomycetes. We also analyze 2nd metabolites and their synthetic enzymes, pathogenic factors, andgenomes.
２）We analyze infection mechanisms of human pathogenic fungi and actinomycetes using molecularmethods, animal models, and genome analysis. In particular, we are trying to understand（I）roles ofcell surface glycans and their receptors（lectins）of human and fungi in infection, and also（II）studying
influence of mycovirus on pathogenicity of filamentous fungi.
３）We study effects of diets and mental stresses on fungal infections mainly using animal models andmolecular methods. We are trying to clarify yet unknown links between metabolism and immune-related
molecules.
教

授

助

教

特

任

助

教

技 術 補 佐 員

五ノ井 透
大荒田素子
酒井香奈江
川名 直美

Professor

Assistant Professor

Research Assistant Professor

Research Promotion Technician

千葉大学

真菌医学研究センター報告

Tohru Gonoi
Motoko Oarada
Kanae Sakai
Naomi Kawana

第 19 巻

2015

33

1.

Identification and Functional Analysis of the Nocardithiocin
Gene Cluster in Nocardia pseudobrasiliensis

1

2

2

dyspnea, mucopurulent bilateral nasal discharge and abnormallung sounds. Microbiological culture, cytological examinationand molecular identification（16S rRNA gene sequence）were

Sakai K , Komaki H , Gonoi T .
1A horse with recurrent airway disease was presented with1

Medical Mycology Research Center, Chiba University,
Chiba, Japan

Biological Resource Center, National Institute of Technology
and Evaluation, Chiba, Japan

performed with the transtracheal wash material and allowed

the identification of Nocardia nova, an uncommon agent
associated with equine respiratory abnormalities.

3.

pattern of seven clinical isolates of Nocardia spp. in

Brazil.

Nocardithiocin is a thiopeptide compound isolated fromthe opportunistic pathogen Nocardia pseudobrasiliensis. It

Molecular identification and antimicrobial resistanceshows a strong activity against acid-fast bacteria and is also

Condas LAZ 1, Ribeiro MG 1 , Muro MD 2 , de Vargas

Here, we report the identification of the nocardithiocin

T 1 , Lara GHB 1 , Risseti RM 1 , Ferreira KS 5 , Gonoi T 4 .

active against rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis.
gene cluster in N. pseudobrasiliensis IFM 0761 based on

APC 3, Matsuzawa T 4 , Yazawa K 4 , Siqueira AK 1 , Salerno

conserved thiopeptide biosynthesis gene sequence and the1

confirmed by gene disruption and complementation. As

2

Univ Fed Parana, Clin Hosp, BR80060000 Curitiba, PR,produce nocardithiocin while gene complementation restored

3

Univ Fed Santa Maria, Dept Vet Prevent Med, Rio Grande

cluster was further analyzed using RNA-seq which showed

4

whole genome sequence. The predicted gene cluster was

expected, strains containing the disrupted gene did notnocardithiocin production in these strains. The predictedthat the nocardithiocin gene cluster contains 12 genes within

a 15.2-kb region. This finding will promote the improvementof nocardithiocin productivity and its derivatives production.

2.

Nocardia nova identification in a transtracheal wash of ahorse with recurrent airway obstruction

5

Univ Estadual Paulista, FMVZ UNESP, Dept Vet Hyg &Publ Hlth, BR18618970 Botucatu, SP, Brazil.
Brazil.

Do Sul, Brazil.

Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chiba, Japan.

Univ Fed Sao Paulo, UNIFESP, Immunol & Parasitol
Sector, Dept Biol Sci, Microbiol, Sao Paulo, SP, Brazil.

Nocardia is a ubiquitous microorganism related topyogranulomatous infection, which is difficult to treat

in humans and animals. The occurrence of the disease
is on the rise in many countries due to an increase in

Condas LAZ , Ribeiro MG , Olivo G , Franco MMJ ,immunosuppressive diseases and treatments. This report ofBorges AS 2 .

the antimicrobial susceptibility pattern using the disk-diffusion

1

1

2

1

Gonoi T , Matsuzawa T , Yazawa K , Goncalves R ,
3

3

3

2

cases from Brazil presents the genotypic characterization andmethod and inhibitory minimal concentration with E-test

1

Univ Estadual Paulista, Sch Vet Med & Anim Sci, Dept Vet（R）strips. In summary, this report focuses on infections

2

Univ Estadual Paulista, Sch Vet Med & Anim Sci, Dept Vet

two pulmonary, one neurological and one systemic. The

3

Hyg & Publ Hlth, Botucatu, SP, Brazil.
Clin Sci, Botucatu, SP, Brazil.

Chiba Univ, Res Ctr, Dept Res Mycol Med, Chuo Ku,
Inohana, Japan.

in young adult men, of which three cases were cutaneous,

pulmonary, neurological and systemic cases were attributed

to immunosuppressive diseases or treatments. Sequencing
analysis of the 16S rRNA segments（1491 bp）identified

four isolates of Nocardia farcinica, two isolates of Nocardia

nova and one isolate of Nocardia asiatica. N. farcinica was

34

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

involved in two cutaneous, one systemic and other pulmonary（ CnPHO 81）, Pho 85 cyclin（ CnPHO 80）, and CDK

pulmonary case; and Nocardia asiatica in one cutaneous case.

CnPHO85, followed by phenotypic analysis, identified mostcases; N. nova was involved in one neurological and one
The disk-diffusion antimicrobial susceptibility test showed（CnPHO85）. Disruption of each candidate gene, exceptof the basic components of the CnPHO system. We foundthat the most effective antimicrobials were amikacin（100%）,

that CnPHO85 was essential for the growth of C neoformans,

ceftiofur（100%）, while isolates had presented most resistancescreening and ChIP analysis, showed that CnPHO4 encodesamoxicillin/clavulanate（100 % ）, cephalexin（100 % ）andto gentamicin（43%）, sulfamethoxazole/trimethoprim（43%）

having regulatory function in the CnPHO system. Genetic

a transcription factor that binds to the CnPHO genes in a

and ampicillin（29%）. However, on the inhibitory minimal

Pidependent manner. By RNA-seq analysis of the wildtypeof Nocardia farcinica was resistant to sulfamethoxazole/found C neoformans genes whose expression is controlled byconcentration test（MIC test）, only one of the four isolates
trimethoprim.
4.

Identification of genes involved in the phosphatemetabolism in Cryptococcus neoformans

Tohe A 1, Ohkusu M 1 , Li HM 1 , Shimizu K 1 , Takahashi-

Nakaguchi A , Gonoi T , Kawamoto S , Kanesaki Y ,
1

1

1

2

and the regulatory mutants of the CnPHO system, we

the regulators of the CnPHO system. Thus the CnPHO

system shares many properties with the ScPHO system, but
expression of those CnPHO genes that encode regulators

is controlled by phosphate starvation, which is not the casein the ScPHO system（except ScPHO81）. We also could

identify some genes involved in the stress response of thepathogenic yeast, but CnPho4 appeared to be responsible

Yoshikawa H , Nishizawa M .

only for phosphate starvation.

Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chiba, Chiba 260-8673,

5.

2, 3

1

4

Japan.

2

Tokyo Univ Agr, NODAI Genome Res Ctr, Setagaya Ku,

3

Tokyo Univ Agr, Dept Biosci, Setagaya Ku, Tokyo 156-

4

Genome sequence comparison of Aspergillus fumigatus

strains isolated from patients with pulmonar yaspergilloma and chronic necrotizing pulmonar yTokyo 156-8502, Japan.

aspergillosis.

8502, Japan.

Takahashi-Nakaguchi A 1, Muraosa Y 1 , Hagiwara D 1 , Sakai

160-8582, Japan.

Gonoi T 1 , Takahashi H 1 .

Keio Univ, Sch Med, Dept Microbiol & Immunol, TokyoK 1 , Toyotome T 2 , Watanabe A 3 , Kawamoto S 1 , Kamei K 1 ,Cryptococcus neoformans is a pathogenic basidiomycetous1

immunocompromised patients. To propagate in the human2cellular signaling pathways and is also an essential component

3

yeast that can cause life threatening meningoencephalitis inbody, this organism has to acquire phosphate that functions inof nucleic acids and phospholipids. Thus it is reasonable

to assume that C. neoformans（Cn）possesses a phosphate

regulatory system（PHO system）analogous to that of otherfungi. By BLAST searches using the amino acid sequences of

Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chuo Ku, Chiba 2608673, Japan.

Obihiro Univ Agr & Vet Med, Diagnost Ctr Anim Hlth &Food Safety, Obihiro, Hokkaido 080-8555, Japan.

Chiba Univ Hosp, Div Control & Treatment Infect Dis,
Chuo Ku, Chiba 260-8673, Japan.

Aspergillus fumigatus is the Aspergillus species mostcommonly associated with aspergillosis. Of the various

the components of the PHO system of Saccharomyces cerevisiaepresentations of aspergillosis, one of the most frequently

in C. neoformans, namely, acid phosphatase（CnPHO2）,

is aspergilloma（PA）. In such infections one finds a fungus（ Sc ）, we found potential counterparts to ScPHO genes

the cyclin-dependent protein kinase（ CDK ）inhibitor

千葉大学

observed in cases involving A. fumigatus pulmonary infections

ball composed of fungal hyphae, inflammatory cells, fibrin,

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

35

mucus, and tissue debris. Chronic necrotizing pulmonary
aspergillosis（ CNPA ）, also known as semi-invasive orinvasive aspergillosis, is locally invasive and predominantly
seen in patients with mild immunodeficiency or with a chroniclung disease. In the present study, with the aid of a next
generation sequencer, we conducted whole genome sequence（WGS）analyses of 17 strains isolated from patients in Japan

7.

Miki T 3 , Gonoi T 1 .
1with PA and CNPA. A total of 99,088 SNPs were identified

Af293, and according to genome-wide phylogenetic analysis,

3

there were no correlations between the whole-genome

sequence typing results and pathologic conditions of patients.
Here, we conducted the first multi-genome WGS study tofocus on the A. fumigatus strains isolated from patients with

PA and CNPA, and comprehensively characterized genetic

variations of strains. WGS approach will help in better

understanding of molecular mechanisms of aspergillosis cases
caused by A. fumigatus.

6.

Aspergillus arcoverdensis, a new species of Aspergillus

section Fumigati isolated from caatinga soil in State ofPernambuco, Brazil

Matsuzawa T , Takaki GMC , Yaguchi T , Okada K ,
1

2

1

2

Abliz P 3 , Gonoi T 1 , Horie Y 1 .

1

Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chuo Ku, Chiba 260-

2

Univ Catolica Pernambuco, BR 50050900, Recife, PE,

3greater hepatic inflammatory gene expression in mice

Oarada M 1 , Takahashi-Nakaguchi A 1 , Abe T 2 , Nikawa T 2 ,2

by mapping the reads to A. fumigatus genome reference strain

Refeeding with glucose rather than fructose elicits

Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chiba, Japan.

Univ Tokushima, Sch Med, Dept Nutr, Tokushima 770,
Japan.

Chiba Univ, Grad Sch Med, Dept Med Physiol, Chiba,
Japan.

Objective: We previously reported that refeeding after a

48h fast, used as a study model of starvation and refeeding,promotes acute liver inflammatory gene expression, which

is at least partly mediated by toll-like receptor 2（TLR2）.

We also previously demonstrated that dietary carbohydrates

play critical roles in this process. The aim of this study

was to compare the outcomes of refeeding with different
carbohydrate sources.

Methods: Mice were fasted for 46 h and then refed with

1.5%（w/w）agar gel containing 19% carbohydrate（sources:

alpha-cornstarch, glucose, sucrose, or fructose）. The liver

expression of inflammatory and other specific genes wasthen sequentially measured for the first 14 h after refeeding

initiation.

Results: Fasting for 46 h upregulated the liver expression

8673, Japan.

of endogenous ligands for TLRs（ HspA 5 , Hsp 90 aal,

Brazil.

cornstarch or glucose increased the liver expression of Tlr2,

Xinjiang Med Univ, Affiliated Hosp 1, Dept Dermatol,
Urumqi 830053, Xinjang, Peoples R China.

Aspergillus arcoverdensis, a new species isolated fromand Hspd 1）. Refeeding with agar gel containing alpha-pro-inflammatory genes（Cxcl2, Cxcl10, Cxcl1, Nfkb1,
Nfkb2, RelB, Sectm1 alpha, 1110）, stress response genes（ Atf 3 , Asns, Gadd 45 a, Perk, Inhbe ）, detoxification

genes（Hmox1, Gsta1, Abca8b）, genes involved in tissuesemi-desert soil in a caatinga area, State of Pernambuco,

regeneration（Gdf15, Krt23, Myc, Tnfrsf12a, Mthfd2）, andAutonomous Region, China, is described and illustrated. It

This refeeding also moderately but significantly elevated theBrazil, and a similar environment in the Xinjiang Uygur

genes involved in tumor suppression（p53, Txnrd1, Btg2）.

is characterized by relatively long conidiophores for Aspergillus

serum levels of alanine aminotransferase. These effects wereand smooth conidia. The delimitation of this new species isfructose.

calmodulin and actin gene sequences.

critical role in refeeding induced acute liver inflammatory genesection Fumigati, and subglobose to broadly ellipsoidal

supported further by phylogenetic analyses of the betatubulin,

36

千葉大学

attenuated in mice refed with agar gel containing sucrose orConclusion: Dietary glucose, rather than fructose, plays a

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

expression and moderate hepatocyte destruction. Further

method, and NMR chemical shift comparison withstudies are recommended regarding the role of these effects insynthetic analogues. Amphidinin G（1）was expected to8.

antifungal activity against Trichophyton mentagrophytes.

liver inflammation and, consequently, liver dysfunction.

Tyrokeradines G and H, new bromotyrosine alkaloids

from an Okinawan Verongid sponge

Kubota T , Watase S , Sakai K , Fromont J , Gonoi T ,
1, 2

2

3

4

3

be a biosynthetic precursor of amphidinin A（2）, a known

linear dinoflagellate polyketide. Amphidinin G（1）showed

10.

Prenylated Benzophenones from Triadenum japonicum

Kobayashi J 2 .

Oya A1, Tanaka N 1, 2 , Kusama T 1 , Kim SY 3 , Hayashi S 4 ,Showa Pharmaceut Univ, Machida, Tokyo 194-8543, Japan.

T 5 , Kobayashi J 1 .

Hokkaido 060-0812, Japan.

1

Western Australian Museum, Welshpool Dc, WA 6986,

2

Univ Tokushima, Grad Sch Pharmaceut Sci, Tokushima

3

Hlth Sci Univ Hokkaido, Fac Pharmaceut Sci, Tobetsu 061-

1
2

3
4

Hokkaido Univ, Grad Sch Pharmaceut Sci, Sapporo,
Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chiba 2600856, Japan.
Australia.

Two new bromotyrosine alkaloids, tyrokeradines G（1）Kojoma M3, Hishida A 4 , Kawahara N 4 , Sakai K 5 , Gonoi

Hokkaido Univ, Grad Sch Pharmaceut Sci, Sapporo,
Hokkaido 060-0812, Japan.

770-8505, Japan.
0293, Japan.

and H（2）, have been isolated from an Okinawan marine

4

Natl Inst Biomed Innovat, Res Ctr Med Plant Resources,

elucidated on the basis of spectroscopic data. Tyrokeradine

5Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chiba 260-8673, Japan.

sponge of the order Verongida. The structures of 1 and 2 wereG（1）is the first bromotyrosine alkaloid possessing abeta-alanine unit, while tyrokeradine H（2）is a rare

Hokkaido Div, Nayoro, Hokkaido 090-0065, Japan.

Six new prenylated benzophenones,（-）- nemorosonol（1）bromotyrosine alkaloid possessing a Nsubstituted pyridinium

and trijapins AE（26）, were isolated from the aerial parts ofactivity.

AC（24）have a common tricyclo[ 4 . 3 . 1 . 0（3 , 7）]decane

ring. Tyrokeradines G（1）and H（2）showed antifungal

9.

Amphidinin G, a putative biosynthetic precursor ofamphidinin A from marine dinoflagellate Amphidinium sp.

Kubota T , Iwai T , Ishiyama H , Sakai K , Gonoi T ,
1

1

1

2

2

Triadenum japonicum. （-）-Nemorosonol（1）and trijapins

skeleton, while 1 is an enantiomer of（ + ）-nemorosonol
previously isolated from Clusia nemorosa. The absoluteconfiguration of（-）-nemorosonol（1）was assigned by ECD

spectroscopy. Trijapins AC（24）are analogues of 1 possessing

an additional tetrahydrofuran ring. Trijapins D（5）and E

Kobayashi J .

（6）are prenylated benzophenones with a 1,2dioxane moiety

Hokkaido Univ, Grad Sch Pharmaceut Sci, Sapporo,exhibited antimicrobial activity against Escherichia coli（MIC,

1

1

2

Hokkaido 060-0812, Japan.

Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chiba 260-0856, Japan.
A new linear polyketide, amphidinin G（1）, has been

isolated from a symbiotic marine dinoflagellate Amphidinium

sp. The planar structure of 1 was established mainly based on
the 2D NMR data and the stereochemistry was elucidated

by the combination offvalue analysis, modified Mosher's

千葉大学

and a hydroperoxy group, respectively.（-）-Nemorosonol（1）8 mu g/mL）, Staphylococcus aureus（MIC, 16 mu g/mL）,

Bacillus subtilis（ MIC, 16 mu g/mL ）, Micrococcus luteus（MIC, 32 mu g/mL）, Aspergillus niger（IC50, 16 mu g/mL）, Trichophyton mentagrophytes（IC50, 8 mu g/mL）, andCandida albicans（IC50, 32 mu g/mL）, while trijapin D（5）showed antimicrobial activity against C. albicans（IC50, 8 mu

g/mL）.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

37

11.

Halichonadins M Q , sesquiter penes from an

Okinawan marine sponge Halichondria sp.

from an Okinawan marine sponge Agelas sp. Spectroscopic
analyses of these compounds revealed the structures of 13 tobe 2-debromonagelamide U, 2-debromomukanadin G, andTanaka N , Suto S , Asai M , Kusama T , Takahashi-

2-debromonagelamide P, respectively. Antimicrobial activity

1

Hokkaido Univ, Grad Sch Pharmaceut Sci, Sapporo,

Publications

2

Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chiba 260-8673, Japan.

1

1

1

1

Nakaguchi A 2 , Gonoi T 2 , Fromont J 3 , Kobayashi J 1 .

3Hokkaido 060-0812, Japan.

of 13 was evaluated.

１）Condas LAZ, Ribeiro MG, Muro MD, de Vargas APC,

Matsuzawa T, Yazawa K, Siqueira AK, Salerno T, Lara

Western Australian Museum, Welshpool Dc, WA 6986,

GHB, Risseti RM, Ferreira KS, Gonoi T. Molecular

Four new dimeric sesquiterpenes, halichonadins

Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 57: 251-56.

Australia.

MP（14）, and one new sesquiterpene, halichonadin Q

identification and antimicrobial resistance pattern ofseven clinical isolates of Nocardia spp. Brazil. Revista do

2015.

（5）, were isolated from an Okinawan marine sponge２）Condas LAZ, Ribeiro MG, Olivo G, Franco MMJ,

skeleton in common Halichonadin M（1）is a symmetrical

AS. Nocardia nova identification in a transtracheal wash

Halichondria sp. The sesquiterpenes have eudesmane

Gonoi T, Matsuzawa T, Yazawa K, Goncalves R, Borges

dimer linked to a nitrilotriacetic acid fragment throughof a horse with recurrent airway obstruction. Archivos dedimeric sesquiterpene connected via a pyrrolidine unit, while

３）Kubota T, Iwai T, Ishiyama H, Sakai K, Gonoi T,

of a piperidine unit. Halichonadin Q（5）is a sesquiterpene

precursor of amphidinin A from marine dinoflagellate

amide bonds. Halichonadin N（2）is a structurally uniquehalichonadins 0（3）and P（4）have linker moieties consisting

possessing a pyrrolidine unit. The structures of 15 were

elucidated by spectroscopic analysis. Halichonadin 0（3）showed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus,

Micrococcus luteus, and Trichophyton mentagrophytes.
12.

Debromonagelamide U, 2-debromomukanadin G,

and 2 -debromonagelamide P from marine sponge
Agelas sp.

Nakamura K , Kusama T , Tanaka N , Sakai K , Gonoi
1

1

1

2

T 2 , Fromont J 3 , Kobayashi J 1 .

Medicina Veterinaria. 47: 231-5. 2015.

Kobayashi J. Amphidinin G, a putative biosynthetic

Amphidinium sp. Tetrahedron Lett. 56: 990-3. 2015.

４）Kubota T, Watase S, Sakai K, Fromont J, Gonoi T,

Kobayashi J. Tyrokeradines G and H, new bromotyrosine
alkaloids from an Okinawan Verongid sponge. Bioorg

Med Chem Lett. 25: 5221-3. 2015.

５）Matsuzawa T, Takaki GMC, Yaguchi T, Okada K,

Abliz P, Gonoi T, Horie Y. Aspergillus arcoverdensis, a
new species of Aspergillus section Fumigati isolated from

caatinga soil in State of Pernambuco, Brazil. Mycosci.
56: 123-31. 2015.

６）Nakamura K, Kusama T, Tanaka N, Sakai K, Gonoi

T, Fromont J, Kobayashi J. Debromonagelamide U,

1

Hokkaido Univ, Grad Sch Pharmaceut Sci, Sapporo,

2-debromomukanadin G, and 2-debromonagelamide P

2Chiba Univ, Med Mycol Res Ctr, Chiba 260-8673, Japan.

2015.

3

Hokkaido 060-0812, Japan.

Western Australian Museum, Welshpool DC, WA 6986,
Australia.

Two new monomeric bromopyrrole alkaloids（1 and 2）

and one new dimeric bromopyrrole alkaloid（3）were isolated

38

千葉大学

from marine sponge Agelas sp. Heterocycles. 90: 425-31.

７）Oarada M, Takahashi-Nakaguchi A, Abe T, Nikawa

T, Miki T, Gonoi T. Refeeding with glucose rather

than fructose elicits greater hepatic inflammatory gene
expression in mice. Nutrition. 31: 757-65. 2015.

８）Oya A, Tanaka N, Kusama T, Kim SY, Hayashi S,

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

Kojoma M, Hishida A, Kawahara N, Sakai K, Gonoi T,
Kobayashi J. Prenylated Benzophenones from Triadenum

japonicum. J Nat Prod. 78: 258-64. 2015.

９）Sakai K, Komaki H, Gonoi T. Identification andFunctional Analysis of the Nocardithiocin Gene

necrotizing pulmonary aspergillosis. Med Mycol J. 53:
353-60. 2015.

11）Tanaka N, Suto S, Asai M, Kusama T, Takahashi-

Nakaguchi A, Gonoi T, Fromont J, Kobayashi J.
Halichonadins MQ, sesquiterpenes from an Okinawan

Cluster in Nocardia pseudobrasiliensis. PLoS ONE.

marine sponge Halichondria sp. Heterocycles. 90: 173-

10）Takahashi-Nakaguchi A, Muraosa Y, Hagiwara D,12）Tohe A, Ohkusu M, Li HM, Shimizu K, Takahashi-

Kamei K, Gonoi T, Takahashi H. Genome sequence

Yoshikawa H, Nishizawa M. Identification of genes

DOI:10.1371/journal.pone.0143264. 2015.

Sakai K, Toyotome T, Watanabe A, Kawamoto S,

comparison of Aspergillus fumigatus strains isolated

from patients with pulmonary aspergilloma and chronic

千葉大学

85. 2015.

Nakaguchi A, Gonoi T, Kawamoto S, Kanesaki Y,
involved in the phosphate metabolism in Cryptococcus

neoformans. Fungal Genet Biol. 80:19-30. 2015.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201539

高橋 PI（微生物創生プロジェクト）
Project for Systems Biology of Microorganisms
研究概要（Summary）

当分野では , 計算機を駆使して新たな生物学的知見の発見を目指しています . 一つは , 膨大な実験
データを対象にデータ処理技術の開発を通した生命の理解を目指した「バイオインフォマティクス」の研究を行っています . また , 生命を真にシステムとして理解することを目的とした「システムズバイ
オロジー」の研究も進めています .

Our research areas are Systems Biology and Bioinformatics. Our Bioinformatics approach aims to deeply andclearly understand massive biological experiment data, e.g., sequence data by next generation sequencers.
Systems Biology aims to understand how biological systems work and help the experimental design mainly bymathematical modelling approach.
准

教

特

任

授
助

教

技 術 補 佐 員

高橋
楠屋
守

弘喜
陽子
涼子

Associate Professor

Research Assistant Professor

Research Promotion Technician

Human EP2 prostanoid receptors exhibit more constraints

1.

to mutations than human DP prostanoid receptors.

Tanimoto J 1 , Fujino H 1 , Takahashi H 2 , Murayama T 1 .
1

2

Laboratory of Chemical Pharmacology, Graduate School of2.

Medical Mycology Research Center, Chiba University,2

Human D-type prostanoid（DP）and E-type prostanoidtranscript errors in paused RNA polymerases in vivo.

Bubunenko M 1 , Court DL 1 , Kashlev M 1 .
1

1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba, Chiba 260-8673, Japan

Visualizing translocation dynamics and nascent

Imashimizu M 1 , Takahashi H 2 , Oshima T 3 , McIntosh C 1 ,Pharmaceutical Sciences, Chiba University, 1-8-1 Inohana,Chuo-ku, Chiba, Chiba 260-8675, Japan

Hiroki Takahashi
Yoko Kusuya
Ryoko Mori

3

Center for Cancer Research, National Cancer Institute,Frederick 21702, MD, USA

Medical Mycology Research Center, Chiba University,
1-8-1 Inohana, Chuo-ku, China, Chiba 260-8673, Japan

Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute of

Science and Technology, 8916-5, Ikoma 630-0192, Nara,

2（EP2）receptors are regarded as the most closely relatedJapan

tors are generated by tandem duplication, their physiological

Backgroundextracted mutations occurring in the coding regions of bothpausing signals in DNA, with downstream effects on genethat EP2 receptors have 8-fold fewer amino acid mutations.

ing, which can lead to a destabilized genome by interfering

receptors among prostanoid receptors. Although these recep-

outputs often oppose one another. In the present study, we

receptors using the 1000 genome project database and found

We speculate that EP2 receptors exhibit more constraints tomutations than DP receptors.

40

千葉大学

Transcription elongation is frequently interrupted byexpression. Transcription errors also induce prolonged paus-with DNA replication. Mechanisms of pausing associatedwith translocation blocks and misincorporation have been

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

Sutton Bonington Campus, Sutton Bonington, Loughbor-characterized in vitro, but not in vivo.
Results

We investigate the pausing pattern of RNA polymerase

4（RNAP）in Escherichia coli by a novel approach, combining

reveal that the G-dC base pair at the 5 end of the RNA-DNA hybrid interferes with RNAP translocation. The

Laboratory of Molecular Medical Microbiology, Department of Biomedical Informatics, Osaka University Graduate

native elongating transcript sequencing（ NET-seq）with
RNase footprinting of the transcripts（ RNET-seq ）. We

ough LE12 5RD, UK.

School of Medicine, 1-7 Yamadaoka, Suita, Osaka 5655

0871, Japan.

Graduate School of Information Science, Nara Institute of
Science and Technology, 8916-5, Takayama, Ikoma, Naradistance between the 5 G-dC base pair and the 3 end of

630-0192, Japan.

G-dC base pair can induce pausing in post-translocated, pre-Zinc is essential for life, but toxic in excess. Thus all cells

RNA fluctuates over a three-nucleotide width. Thus, thetranslocated, and backtracked states of RNAP. Additionally,must control their internal zinc concentration. We used a sys-

active site of RNAP inhibits elongation and induces G-to-A

to further elucidate the zinc control systems in Escherichia

efficiently proofread the errors and rescue the backtracked

zinc import and export systems in the wild-type, and a seriesa CpG sequence of the template DNA strand spanning theerrors, which leads to backtracking of RNAP. Gre factors

tems approach, alternating rounds of experiments and models,coli. We measured the response to zinc of the main specificcomplexes. We also find that pausing events are enrichedof deletion mutant strains. We interpreted these data withmRNA genes and are reduced in rRNA genes.

routines. There are three key findings: first, that alternate,in the 5 untranslated region and antisense transcription ofConclusions

a detailed mathematical model and Bayesian model fitting

non-inducible importers and exporters are important. Second,

In E. coli, robust transcriptional pausing involves RNAP

that an internal zinc reservoir is essential for maintaining the

DNA hybrid, which interferes with translocation. CpG

propose that the cells mount a heterogeneous response to zinc:interaction with G-dC at the upstream end of the RNA-DNA sequences induce transcriptional pausing and G-to-A

errors.
3.

cell counts in the mutant strain tested exposed to excess zinc,

response to stress.

levels of the ZntA exporter protein, reinforcing this proposal.

Escherichia coli suggests a heterogeneous population

Clayton SR , Iqbal M , Hill PJ , Tobe T , Ogasawara N ,
3

3

4

2

Kanaya S , Stekel DJ .
5

3

a further round of experiments, we demonstrated lower viableconsistent with this hypothesis. A stochastic model simula-3

2

some respond effectively, while others die or stop growing. In

The dynamic balance of import and export of zinc in

Takahashi H 1, Oshima T 2 , Hobman JL 3 , Doherty N 3 ,1internal zinc concentration. Third, our data fitting led us to3

Medical Mycology Research Center, Chiba University,
1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba, Chiba 260-8673, Japan

Graduate School of Biological Science, Nara Institute oftion demonstrated considerable fluctuations in the cellular

We hypothesize that maintaining population heterogeneity
could be a bet-hedging response allowing a population of cells

to survive in varied and fluctuating environments.
4.

Genome sequence comparison of Aspergillus fumigatus

strains isolated from patients with pulmonary aspergilloma and chronic necrotizing pulmonary aspergillosis.

Science and Technology, 8916-5, Takayama, Ikoma, Nara

Takahashi-Nakaguchi A 1 , Muraosa Y 1 , Hagiwara D 1 , Sakai

School of Biosciences, The University of Nottingham,

K 1 , Gonoi T 1 , Takahashi H 1 .

630-0192, Japan.

千葉大学

K 1, Toyotome T 1, 2 , Watanabe A 1, 3 , Kawamoto S 1 , Kamei

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

41

1

2

Medical Mycology Research Center, Chiba University,
1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba, Chiba 260-8673, Japan（6）:876-883. 2015.

Diagnostic Center for Animal Health and Food Safety,2）Han R, Takahashi H, Nakamura M, Yoshimoto N,

Nishi 2-11 Inada-cho, Obihiro, Hokkaido 080-8555, Japan

tomic landscape of Pueraria lobata demonstrates potential

Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine,

3

Ingredients in Sophora flavescens. Biol. Pharm. Bull. 38

Division of Control and Treatment of Infectious Diseases,
Chiba University Hospital, 1 - 8 - 1 Inohana, Chuo-ku,

Chiba, Chiba 260-8673, Japan

Suzuki H, Shibata D, Yamazaki M, Saito K. Transcripfor phytochemical study. Front. Plant Sci. 6:426. 2015.

3）Imashimizu M, Takahashi H, Oshima T, McIntosh

C, Bubunenko M, Court DL, Kashlev M. Visualizing

Aspergillus fumigatus is the Aspergillus species most com-monly associated with aspergillosis. Of the various presenta-

tions of aspergillosis, one of the most frequently observedin cases involving A. fumigatus pulmonary infections is
aspergilloma（PA）. In such infections one finds a fungus

ball composed of fungal hyphae, inflammatory cells, fibrin,mucus, and tissue debris. Chronic necrotizing pulmonary

aspergillosis（CNPA）, also known as semi-invasive or inva-

sive aspergillosis, is locally invasive and predominantly seenin patients with mild immunodeficiency or with a chronictranslocation dynamics and nascent transcript errors inpaused RNA polymerases in vivo. Genome Biol. 16:98. 2015.
（1）4）Kusuya Y, Sakai K, Takahashi H, Yaguchi T. Draft

genome sequence of the pathogenic filamentous fungus

Aspergillus lentulus IFM 54703T. Genome Announcements 2015 in press.

5）Kusuya Y, Takahashi-Nakaguchi A, Takahashi H,

Yaguchi T. Draft genome sequence of the pathogenic
filamentous fungus Aspergillus udagawae strain IFM

46973T. Genome Announcements. 3（4）. 2015.

lung disease. In the present study, with the aid of a next-6）Takahashi H, Oshima T, Doherty N, Clayton SR, Iqbal（WGS）analyses of 17 strains isolated from patients in Japan

S, Stekel DJ. The dynamic balance of import and export

generation sequencer, we conducted whole genome sequencewith PA and CNPA. A total of 99,088 SNPs were identified

M, Hill PJ, Hobman JL, Tobe T, Ogasawara N, Kanaya

of zinc in Escherichia coli suggests a heterogeneousby mapping the reads to A. fumigatus genome reference

population response to stress. J R Soc Interface. 12（106）.

analysis, there were no correlations between the whole

7）Takahashi-Nakaguchi A, Muraosa Y, Hagiwara D, Sakai

strain Af293, and according to genome-wide phylogenetic

genome sequence typing results and pathologic conditions ofpatients. Here, we conducted the first multi-genome WGS
study to focus on the A. fumigatus strains isolated frompatients with PA and CNPA, and comprehensively character-ized genetic variations of strains. WGS approach will help in
better understanding of molecular mechanisms of aspergillosis

cases caused by A. fumigatus.

K, Toyotome T, Watanabe A, Kawamoto S, Kamei K,

Gonoi T, Takahashi H. Genome sequence comparisonof Aspergillus fumigatus strains isolated from patientswith pulmonary aspergilloma and chronic necrotizing

pulmonary aspergillosis. Med Mycol. 53（4）:353-360.
2015.

8）Tanimoto J, Fujino H, Takahashi H, Murayama T.

Human EP2 prostanoid receptors exhibited more con-straints to mutations than human DP prostanoid receptors.

Publications

1）Han R, Takahashi H, Nakamura M, Somnuk B, Yoshi-

moto N, Yamamoto H, Suzuki H, Shibata D, Yamazaki

M, Saito K. Transcriptome Analysis of 9 Tissues to

Discover Genes Involved in the Biosynthesis of Active

42

2015.

千葉大学

FEBS Letters. 589（6）:766-772. 2015.

9）Toyotome T, Takahashi H, Kamei K. MEIS3 is repressedin A549 lung epithelial cell by deoxynivalenol and therepression contributes to the deleterious effect. The
Journal of Toxicological Sciences 2015 in press.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

バイオリソース管理室
Management Unit of Microbiological Resources
研究概要（Summary）

病原真菌・放線菌の「保存・管理・提供」体制を整備し , 最新情報が付加された信頼できる菌株の提供を通じて , 真菌症ならびにその原因菌の研究・教育の基盤を支援している .

We are developing a system for preservation, management and distribution of pathogenic fungi andactinomycetes. We support the base of research and education of mycoses and their pathogens in order tosupply reliable strains that are added new information.

准

教

助
技

矢口
田中
伊藤
長村
山中

授
教

術

職

員

技 術 補 佐 員
技 術 補 佐 員

1.

貴志
玲子
純子
由美
美花

Associate Professor
Assistant Professor

Research Technician

Research Promotion Technician
Research Promotion Technician

New species in Aspergillus section Fumigati fromreclamation sites in Wyoming（U.S.A.）and revision of

2.

Abliz P , Gonoi T , Horie Y
3

1

1

Medical Mycology Research Center, Chiba University,

2

Nucleus of Research in Environmental Sciences and2

Department of Dermatology, The First Affiliated Hospital

3

Biotechnology, Catholic University of Pernambuco, Brazilof Xinjiang Medical University, China

Aspergillus arcoverdensis, a new species isolated from

Institute of Agrophysics, Polish Academy of Sciences,
Department of Plant and Soil System, Laboratory of

13

characterization of heat-resistant fungi in soils and

M. Frąc 1 , S. Jezierska-Tys 2 , T. Yaguchi 3
1

Japan

Occurrence, detection and molecular and metabolic
plants and their risk to human healthA. viridinutans complex

Matsuzawa T 1, Takaki GMC 2 , Yaguchi T 1 , Okada K 2 ,Takashi Yaguchi
Reiko Tanaka
Junko Ito
Yumi Osamura
Mika Yamanaka

Molecular and Environmental Microbiology, Poland

Department of Environmental Microbiology, University ofLife Sciences, Poland

Medical Mycology Research Center, Chiba University,
Japan

Heat-resistant fungi are often factors causing spoilage ofsemi-desert soil in a caatinga area, State of Pernambuco,

heat-processed products, especially fruit. Contamination ofAutonomous Region, China, is described and illustrated. It

with the soil. Materials contaminated by spores of heat-

Brazil, and a similar environment in the Xinjiang Uygur
is characterized by relatively long conidiophores for Aspergillus

section Fumigati, and subglobose to broadly ellipsoidal andagricultural raw materials is often as a result of their contact
resistant fungi can be a risk to consumers health by toxic

metabolites（mycotoxins）produced by these microorganisms.

smooth conidia. The delimitation of this new species is

Due to the resistance of the fungus to high temperatures

calmodulin and actin gene sequences.

Therefore, the only way to prevent the development of

supported further by phylogenetic analyses of the β-tubulin,

千葉大学

they are able to survive the industry pasteurization process.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201543

these microorganisms in the product is suitable selecting
material by conducting tests for the presence of heat-resistantfungi. The use of traditional culture methods is long and,4. Draft genome sequence of the pathogenic filamentous

fungus Aspergillus udagawae strain IFM 46973T

therefore, does not apply in the selecting raw materials for

Kusuya Y, Takahashi-Nakaguchi A, Takahashi H, Yaguchi T

acceptance or rejection of a given batch of raw material, due

Medical Mycology Research Center, Chiba University, Japanproduction. However, time is a critical factor in assessing theto the necessity of processing the raw material fresh, which

is very important especially in the case of fruit. Due to the

The incidence of aspergillosis by Aspergillus infection has

sparse literature on rapid detection techniques for heat-dramatically increased in recent years. Aspergillus udagawae, A.

researchers are looking for methods, effective in the detectionof aspergillosis. Here, we present the draft genome sequence

resistant fungi in agricultural raw materials in recent yearsof these pathogens. This review includes characterizationof occurrence, detection and molecular and metabolic

characterization of heat-resistant fungi and their risk tohuman health.

3. Development of rapid identification and risk analysis ofMoniliella spp. in acidic processed foods

Nakayama M , Hosoya K , Shimizu-Imanishi Y , Chibana
1

1

2

H 3 , Yaguchi T 3
1
2

3

Global R&D-Safety Science, Kao Corporation, Japan

fumigatus-related species, is known as the emerging pathogenof A. udagawae strain IFM 46973T .

Publications

１）Costa C, Ponte A, Pais P, Santos R, Cavalheiro M,

Yaguchi T, Chibana H, Teixeira MC. New mechanismsof flucytosine resistance in C. glabrata unveiled by achemogenomics analysis in S. cerevisiae. PLoS One
2015 Aug 12;10（8）:e0135110.

２）Eguchi H, Toibana T, Hotta F, Miyamoto T, Mitamura

Y, Yaguchi T. Severe fungal sclerokeratitis caused by

Metarhizium anisopliae: A case report and literature
review. Mycoses 58（2）: 88-92, 2015.

Department of Public Health, School of Medicine, Kurume３）Fr ą c M, Jezierska-Tys S, Yaguchi T. Occurrence,

Medical Mycology Research Center, Chiba University,of heat-resistant fungi in soils and plants and their risk to

University, JapanJapan

Recently the numbers of spoilage accidents in food industry

by the species of Thermoasus are increasing, but the risk offood spoilage have never been evaluated. It became obviousthat their heat-resistances were higher than those of otherdetection and molecular and metabolic characterization

human health. Advances Agronomy 132: 161-204, 2015.

４）Furuya M, Hong SB, Tanaka R, Kuroda N, Nagashima

Y, Nagahama K, Suyama T, Yao M, Nakatani Y.
Distinctive expression patterns of GPNMB and folliculin

in renal tumors in patients with Birt-Hogg-Dubé

syndrome. Cancer Sci 106: 315-323, 2015.

heat-resist fungi, Byssochlamys, Hamigera and Neosartorya

５）Hadano Y, Yoshii H, Hayashi M, Oono H, Tanaka R.

B. verrucosa had the idh gene, but they showed no patulin

infection caused by Cryptococcus arboriformis. Intern Med

by our analyses. On the other hand, T. aurantiacus andproduction in Potato dextrose broth or Czapek-glucose

A rare case report of central line-associated bloodstream

54: 1141-1143, 2015.

medium. Therefore, Thermoascus must be discriminated from

６）Hosoe T, SaitoT, Itabashi T, Wakana D, Takeda H,

highly-sensitive method of detecting Thermoascus in the genus

of new phthalide and phthalane derivatives, isolated asother fungi in the food industry. We developed a rapid andlevel by using PCR. This method is expected to be extremely

beneficial for the surveillance of raw materials in the foodproduction process.

44

千葉大学

Yaguchi T, Kawai K. Isolation and structure elucidation
antimicrobial agents from Emericella sp. IFM 57991. J

Antibiot doi:10. 1038/ja. 2015.85

７）Iribe Y, Kuroda N, Nagashima Y, Yao M, Tanaka R,

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

Gotoda H, Kawakami F, Imamura Y, Nakamura Y,

from caatinga soil in State of Pernambuco, Brazil.

M. Immunohistochemical characterization of renal12）Nakayama M, Hosoya K, Shimizu-Imanishi Y, Chibana

Ando M, Araki A, Matsushima J, Nakatani Y, Furuya

tumors in patients with Birt-Hogg-Dubé syndrome.
Pathol Int 65: 126-32, 2015.

８）Ishiwada N, Takeshita K, Yaguchi T, Nagasawa

Mycoscience 56（2）: 123–131, 2015.

H, Yaguchi T. Development of rapid identification andrisk analysis of Moniliella spp. in acidic processed foods.

Biocontrol Sci（in press）.

K, Takeuchi N, Hishiki H, Watanabe A, Kamei

13）Okada A, Hirono T, Watanabe T, Hasegawa G, Tanaka

infections due to Emericella nidulans var. echinulata

pneumothorax in patients with Birt-Hogg- DubéK, Shimojo N. The first case of invasive mixed-moldand Rasamsonia piperina in a patient with chronic

R, Furuya M. Partial pleural covering for intractable
Syndrome. Clin Respir J doi: 10.1111/crj.12328, 2015.

granulomatous disease. Mycopathologia doi: 10.1007/

14）Ogawa A, Matsumoto Y, Yaguchi T, Shimmura S,９）Kusuya Y, Takahashi-Nakaguchi A, Takahashi H,

fungal keratitis with topical voriconazole. J Infects11046-015-9963-5.

Yaguchi T. Draft genome sequence of the pathogenic

filamentous fungus Aspergillus udagawae strain IFM

46973 . Genome Announc 2015 Aug 6 ; 3（4）. pii:
Te00834-15.

10）Kusuya Y, Sakai K, Kamei K, Takahashi H, Yaguchi T.

Draft genome sequence of the pathogenic filamentous
fungus Aspergillus lentulus IFM 54703 . Genome
T

Announc（in press）.

11）Matsuzawa T, Takaki GMC, Yaguchi T, Okada K,

Abliz P, Gonoi T, Horie Y. Aspergillus arcoverdensis,
a new species of Aspergillus section Fumigati isolated

千葉大学

Tsubota K. Successful treatment of Beauveria bassiana
Chemother 2015 Nov 18. pii: S1341-321X（15）00248-2.

15）Tamiya H, Ochiai E, Kikuchi K, Yahiro M, Toyotome

T, Watanabe A, Yaguchi T, Kamei K. Secondary

metabolite profiles and antifungal drug susceptibilityof Aspergillus fumigatus and closely related species, A.
lentulus, A. udagawae, and A. viridinutans. J InfectChemother 21（5）: 385-91, 2015.

16）Yanagihara S, Kobayashi H, Riei K, Hirata C, Hiruma

M, Nishimura K, Yaguchi T, Yoshida Y, Yamamoto O,

Tsuruta D. Chromoblastomycosis caused by Fonsecaea

nubica in Japan. J Dermatol 42: 1-2, 2015.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201545

文部科学省 ナショナルバイオリソースプロジェクト ｢ 病原微生物 ｣Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology
National BioResource Project Pathogenic Microorganisms

文部科学省では2002年度からナショナルバイオリソー

development by the national government. After the reviewing

スプロジェクト（NBRP）を開始し , 国が戦略的に整備

the NBRP every five years, in FY2012, the third phase has

供などを行うための体制を整備してきた . その後５年ご

C h ib a U n ive rs it y s M e di c al M yc ol og y Re s e a rc h

することが重要なものについて体系的に収集 , 保存 , 提との見直しを行い , 2012年度より第３期が開始された .

NBRP 病原微生物中核機関である千葉大学真菌医学研

stared.

Center（MMRC）is the NBRP Center for pathogenic

microorganism, and this project is carried out by MMRC

, 大阪大学微生物病研究究センター（病原真菌・放線菌）（pathogenic fungi/actinomycetes）, Osaka University s Research

大学熱帯医学研究所（病原性原虫）は , 相互の機関の連University s Graduate School of Medicine（ pathogenic制を整備して , 高度情報を賦与した信頼できる病原微生

Medicine（pathogenic protozoa）. Working together, they

人々を支援している .

pertaining to infectious diseases and pathogens. Specifically,

所および岐阜大学大学院医学研究科（病原細菌）と長崎携を図り , これらの病原微生物株の収集・保存・提供体
物株として提供し , 感染症と病原体の教育・研究をする

本プロジェクトは , 今後いかなる感染症が発生しても対応できる病原微生物コレクションを目指している .

In FY2002, the Ministry of Education, Culture, Sports,

Science and Technology（MEXT）implemented the National

BioResource Project（NBRP）to construct the frameworkfor systematic collection, preservation, and distribution ofbioresources, with a focus on those that required strategic

46

千葉大学

Institute for Microbial Diseases（pathogenic bacteria）, Gifu
bacteria）, and Nagasaki University s Institute of Tropicalcooperate in various efforts to support education and research

they are developing a system for collection, preservation, anddistribution of pathogenic microorganisms, and they supply
reliable strains of pathogenic microorganisms that are backed byhigh-level information.

The project aims to establish a reliable and sufficient at

the collection to deal with infectious diseases carried by any

pathogenic microorganisms.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015長崎大学熱帯医学研究拠点特定領域共同研究「熱帯地域 , 特にアフリカおよびベトナムで発生している真菌症・放射菌症の原因菌の収集と形態学的 , 生理学的 , 分子生物学的解析」プロジェクト

Cooperative Research of Priority Areas with NEKKEN, Nagasaki University
Project for Morphological, Physiological and Molecular Biological Analysis of
Pathogenic Fungi and Actinomycetes Collected in Africa and Vietnam.
長崎大学熱帯医学研究所ケニア拠点の助力を得て , ケ

ニアを中心に上記プロジェクトを展開しています . 現在

までにケニア全土の主要穀物（トウモロコシ , 小麦）やミルクなどを汚染するカビ毒（発がん性アフラトキシン他）とその生産菌の解析を進め , 現地の食糧の多くが , 世界の安全基準値を大きく上回るカビ毒で汚染されていることを明らかにしてきました . 結果は昨年度 , 現地のマス

コミにも取り上げられ , 大きな反響を呼び起こしました .

また現地に滞在する米国の医師団等と協力し新たに , エ

イズ患者の命を奪う主な原因である真菌感染症 , 特にク

2012 年 2 月

ケニア国キスム市の病院・研究施設問

リプトコッカス属菌による感染を中心に疫学的調査を計画しています . 海外での研究は , 現地の研究者や監督官

Under assistance of Kenya Research Station, Inst. NEKKEN,

庁と信頼関係を築き , 適切な許可を得るなど多くの問題

Nagasaki Univ., we are analyzing toxins contaminating majorに貢献し , 人々の生活の質（QOL）の向上を図り , さらWe found the local foods are contaminated by the toxins atを解決しなければ前進できません . しかし , 現地の医療に日本との友好を深めるために努力を重ねています . 一

方これらの研究は地球のグローバル化 , 温暖化 , 環境・食糧事情の悪化が進む中で , 日本の人々の医療や QOL の維持にも , 将来大きく貢献するはずです .

local grains（maze, wheat）and milks, and also producer fungi.
concentrations far above the international standards. The result

has been announced in newspapers, and received large attention.

A new project for epidemiological study of Cryptococcal fungi in

HIV-infected patients is launched in collaboration with Kenya

特に平成27年度には , ケニアの地域に伝わり冠婚葬祭

Medical Res. Insti.（KEMRI）and doctors from UCSF, USA.

ヒエなどに生息するカビの産生する毒によって , 人体にof the domestic beer, busaa, which is very popular in Kenyan. さらにケニア中央研（論文参照 . また地元の新聞に掲載）

were published in an academic journal and also announced in

時に愛飲される地ビールが , 原料となるトウモロコシ ,有害なレベルまで汚染されていることを発表しました

究所の研究院 Olga 氏を半年間に渡り日本に招き , ケニアの食糧を汚染するカビとカビ毒 , 皮膚真菌症 , エイズ患者のクリプトコッカス症などについて共同で研究を続けています .

In 2014 we published on the high risk mycotoxin contamination

local areas and served in several types of celebrations. The results

nationwide papers. In October 2014, we invited Ms. Olga,a research officer of Kenya Medical Research Institute to

Medical Mycology Research Center, Chiba University, andstarted collaborative works on food contaminating fungi andmycotoxins, human pathogenic Cryptococcus in HIV patients,
and dermatophytes in Kenya.

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201547

アスペルギルス症を中心とした新興真菌症制圧プロジェクト
The Project on Controlling Aspergillosis and the Related Emerging Mycoses
アスペルギルス症のなかでも慢性肺アスペルギルス症はその高度な難治性と不良な予後のため深刻な問題である . 慢性肺アスペルギルス症は環境中で増殖した A.

fumigatus の胞子が主にヒト下気道に取り込まれて発症すfumigatus の臨床分離株18株のアゾール耐性株について新たに耐性機構を検討し , Cyp51A をコードする遺伝子の point mutations を確認するとともに , 新しいタイプの変異株（TR46/Y121F/T289A）をわが国で始めて検出

るが , その病態・重症度・経過などは多彩である . 本症

し本邦での拡大について警鐘を鳴らした（Hagiwara, et

主および菌・胞子双方にあると考えられるが , H27年度

耐性機構についてゲノム解析により検討中である . さら

クリプトーム解析 , 遺伝子破壊・相補実験 , 二次代謝産

細な菌種および薬剤感受性 , cyp51A 遺伝子配列を臨床分の難治化と密接に関係している多彩な病態の原因は , 宿の研究で我々は , 胞子・菌側の要因について , トランス物の解析等を行い様々な角度から検討した .

Aspergillus 属菌の胞子は，高温・UV・乾燥などの環境

ストレスに対して耐性を示すが，その機構はほとんど

al. J. Infect Chemother, in press）. 現在 cyp51A 変異以外のに , A. fumigatus に次ぐ重要な原因菌である A. niger の詳

離株・環境分離株の双方を用いて疫学的に調査した . その結果 , これまで cryptic species とされて重視されて来な

かった A. welwitschae が実際には原因菌として最多であ明らかにされていない . 胞子のストレス耐性能に関する事に加えて , これらの菌種におけるアゾール耐性の頻niger, A. oryzae を対象に比較トランスクリプトーム解析

機序が A. fumigatus と大きく異なっている事を示唆した .

の中には胞子のストレス制御に関連する転写因子 AtfA

Aspergillosis mainly develops by inhalation of spores ofる新しい知見を得るために，A. fumigatus および類縁菌 A.

を行い , 胞子で特異的に発現する遺伝子を選抜した . こ

度を明らかにするとともに , 遺伝子解析によりその耐性の下流遺伝子が多数含まれた . atfA 遺伝子破壊株の胞Aspergillus fumigatus grown in several different environments,

AtfA がストレス耐性能の制御のみならず，発芽の抑制

disease differ significantly among patients. The variety of

AtfA によるストレス制御および胞子発芽を制御機
積し，

fungus/spores. Finding a solution to this itractable disease is

子では複数の発芽特異的遺伝子の発現上昇も観察され，にも機能することが示唆された . 今後更なるデータを蓄

and the pathogenic conditions, severities, and courses ofpathogenic conditions may arise from states of hosts and能について解析する .

the aim of this project. In 2015, we performed transcriptomic,

fumigatus の胞子を形成させた . トランクリプトームおfactors of spore/fungal side in the disease.

胞子が作られる自然環境を想定し , 異なる温度で , A.

よび代謝産物の解析により , ２種の二次代謝産物 , 病原因 子 メ ラ ニ ン（dihydroxynaphthalene-melain） と カ ビ 毒gene-targeting, and secondary metabolite analyses to study
Spores of A. fumigatus are resistant to environmental

stresses such as high temperatures, UV and drying, of which

trypacidin の発現・産生が37℃に較べ25℃で大きく上昇

mechanisms are mostly unknown. We performed comparative

ターの遺伝子発現を制御する因子について実験により検oryzae for obtaining a new knowledge on stress tolerance

していることが明らかになった . さらに , これらクラス

討し , 本菌の病原性発現機構との関連を報告した .

transcriptomic analysis of A. fumigatus, A. niger, and A.
mechanisms, and found several genes specifically expressed in

また , 近年 , 慢性肺アスペルギルス症の難治化の要

spores. Many of these genes were downstream genes of AtfA,

ル耐性化について検討を重ねた . 同一患者においてgene and found upregulation of several germination specific

因として大きな問題となっている A. fumigatus のアゾーvoriconazole 治 療 中 に 患 者 体 内 の A. fumigatus が 頻 繁 に遺伝子変異を繰り返しつつ次第に耐性を獲得する現象を明らかにしてきたが , センターに保存されている A.

48

千葉大学

a stress-related transcriptional factor. We knockout atfA

genes in the knockout strains, suggesting AtfA suppresses

germination as well as endowing stress resistance. We arerevealing the regulatory mechanisms of AtfA by further

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

analysis.

mutations coding Cyp51A. An isolate which has a new typewere formed at different temperatures. Transcriptomic andtime in Japan, and we issued an alert against the spread ofof two secondary metabolites, dihydroxynaphthalene-melain

Chemother, in press）. We are now making an investigation

to 37 ℃ and 45 ℃. We experimentally analyzed other genes

Cyp genes. To understand the mechanism of this intractable

Mimicking a natural environment, A. fumigatus spores

metabolites analyses revealed gene-expression and production

and trypacidin, were significantly enhanced at 25℃ comparedof mutation（TR46/Y121F/T289A）was found for the first

this new resistance in the country（Hagiwara, et al. J. Infectinto the new resistance mechanism other than mutations in（ aflR/aflS, tpcE/tpcD ）controlling production of these

disease, we started an analysis of A. niger, another important

metabolite production, temperature and pathogenicity.

and its mechanism using both clinical and environmental

secondary metabolites, and reported relationship between the

We made a further investigation into the development

pathogen of CPA, for the epidemiology, drug resistanceisolates. A. welwitschae, a cryptic species of A. niger, which
has been given little consideration as a pathogen, was foundof azole resistance in A. fumigatus, which is an emerging

to be most common among A. niger complex as the causative

pulmonary aspergillosis（CPA）. We examined 18 clinicalwith the analysis of mutations in CYP51A and suggested theirserious problem in the treatment of intractable chronic

isolates of A. fumigatus stored in our Center and found

千葉大学

agents of CPA. We also examined their drug resistance along

resistance mechanism different from that of A. fumigatus.

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201549

平成 26 年度 共同利用・共同研究報告2014 Fiscal Year Cooperative Research Program Report
研究課題

’14－１

発現に AtrR と SrbA がどのように関与しているかを明ら

Aspergillus fumigatus のアゾール系薬剤耐性に関与する転写因子 AtrR と SrbA の協調的発現制御機構の解明

かにすることを目的とした .

A. oryzae において AtrR-GFP 融合タンパクの観察から ,AtrR は薬剤の有無や低酸素などの条件にかかわらず常に核内に局在することが示された . 一方 , GFP-SrbA 融合タンパク質を用いた解析により , SrbA は薬剤添加や

五味勝也

低酸素条件下で核膜または小胞体から核内へ移行するこ（東北大学大学院農学研究科）とが認められ , ２種類の転写因子の活性化機構は異なる

川本進・清水公徳・萩原大祐

ことが示唆された . atrR 破壊株と srbA 破壊株を用いて互（千葉大学真菌医学研究センター）

いの転写因子の細胞内局在を調べたが , いずれの破壊株

Concerted regulator y mechanism for gene
expression involved in azole drug resistanceby transcription factors, AtrR and SrbA, in
Aspergillus fumigatus
Katsuya Gomi

も野生株と細胞内局在に違いは認められなかった . 同様に , 転写因子の発現も一方の遺伝子破壊によって影響は受けなかった . エルゴステロール生合成に関わる遺伝子

はどちらか一方の遺伝子破壊によって著しい発現低下が認められたものの , srbA 破壊では ABC トランスポーター遺伝子の発現に影響は見られなかった .

一方 , A. fumigatus でも同様に作製した atrR 破壊株と（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku

srbA 破壊株は低酸素条件下では生育が著しく悪くなり ,Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu, Daisuke
Hagiwara

低下したが , ABC トランスポーター遺伝子（cdr1B）のUniversity）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
麹 菌 Aspergillus oryzae に お い て 見 出 さ れ た ア ゾ ー ル
系 薬 剤 耐 性 に 関 す る 新 規 Zn2Cys6型 転 写 因 子 AtrR は ,Aspergillus nidulans や Aspergillus fumigatus に も 共 通 の オ ー
ソログとして見出され , それぞれの atrR 遺伝子の破壊
株では , 野生株より100倍も低い薬剤濃度でも感受性を示すことを見出した . 興味深いことに , A. fumigatus のRNA-seq 解析により , AtrR は Cdr1B/AbcC トランスポー
ターだけでなく , Cyp51A を含むエルゴステロール生合
成酵素遺伝子の発現にも関わっていることが示され , エルゴステロール生合成酵素の発現は , すでに報告のある
bHLH 型転写因子 SrbA と協調的に制御されている可能性が示唆された . そこで , 本研究ではエルゴステロール

ともにエルゴステロール生合成経路の遺伝子の発現量が発現は atrR 破壊株のみで顕著な低下が観察された . ま

た , マウスを用いた感染性試験により , いずれの破壊株

も病原性の著しい低下が認められた . さらに , 千葉大学病院から単離された A. fumigatus のアゾール耐性株（IFM
61567）において atrR 破壊を行ったところ , イトラコナ

ゾールなどのアゾール薬だけでなくもともと効果が認められないフルコナゾールに対しても高い感受性を示す
ことが明らかになった . 異なるタイプの耐性変異を有す

る耐性株における atrR 破壊株の取得を目指すとともに ,AtrR と SrbA のシスエレメントの同定ならびに共免疫沈降試験による両転写因子の相互作用の有無を解析している .

合成経路ならびに薬剤排出トランスポーターの遺伝子の

50

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

研究課題

’14－２

２週後の肺内での IFN-Y 産生が非トランスジェニック

新興強毒性真菌Cryptococcus gattii の高病原性機序の免疫学的解析

C. neoformans と C. gattii に共通な OVA 抗原に対するヘルパーT 細胞応答と , それぞれの真菌感染下での影響について詳細に解析することが可能となった . 今後は , 本実

川上和義・石井恵子

験系を用いることで , C. neoformans, C. gattii 感染下にお（東北大学大学院医学系研究科）

川本

マウスに比べ有意な増強を示した . これらの結果から ,ける免疫応答の相違点について解析を進め , C. gattii 感進・清水公徳染症の高病原性機序の解明を目指したい .

（千葉大学真菌医学研究センター）

研究課題

Immunological analysis of a mechanism for highpathogenicity of Cryptococcus gattii
Kazuyoshi Kawakami, Keiko Ishii（Tohoku University Graduate School of Medicine,

Sendai）

Cryptotoccus neoformans の特異なゲノム安定化機構の分子基盤－それを標的とした新規治療戦略を目指して－
その２
松浦Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果

’14－３

彰・今成百利子（千葉大学大学院融合科学研究科）

川本進・東江昭夫・高橋弘喜（千葉大学真菌医学研究センター）

1999年にカナダのバンクーバー島で Cryptococcus gattii

によるクリプトコックス症のアウトブレイクが発生し ,その後アメリカ合衆国の北西沿岸地域を中心に拡大しつ つ あ る（CDC-Morbidity and Mortality Weekly Report

Vol.59, No.28, 2010）. 2007年には , わが国でも国内感染と考えられる C. gattii によるクリプトコックス症例が報告されている（Emerg. Infect. Dis. 16: 1155-1157, 2010）.

通常の C. neoformans によるクリプトコックス症と異なり , 健常者でも中枢神経感染症を発症し , その高い致死率から高病原性クリプトコックス症とも呼ばれており ,今後新興感染症として大きな問題に発展することが懸念される . 本研究では , C. gattii と C. neoformans に対する

Molecular basis for specific regulation of
genome integrity in Cryptococcus neoformans
and its application to the development of novel
therapeutic strategies
Akira Matsuura, Yuriko Imanari（Graduate School of Advanced Integration Science,

Chiba University）

Susumu Kawamoto, Akio Toh-e, Hiroki Takahashi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

C. neoformans, C. gattii に遺伝子銃を用いて OVA 発現

研究成果
Cryptococcus neoformans は環境に常在する担子菌酵母であり , 主に免疫機能の低下した人に感染し重篤なクリプ

６マウスの気管内に OVA 遺伝子導入菌株を感染させ ,れている . 本菌は , 環状プラスミドが維持できない , 遺生を検出することで菌体内における OVA の発現を確認

DNA 断片の末端に高頻度でテロメア反復配列が付加さ

免疫応答性を比較することで , 本感染症の病態解明の手掛かりを探ることを目的とする .

ベクターを導入し , それぞれ９株 , ８株を得た . C57BL/
２週後の所属リンパ節細胞を同抗原で再刺激し IFN-Y 産

トコックス症を引き起こす日和見感染真菌として知ら

伝子ターゲティングの効率が悪く , 導入された直鎖状した . MHC クラス II 拘束性に OVA を認識する T 細胞受れる , など DNA 修復に関連するユニークな性質をもつ

気 管 内 に OVA 発 現 C. neoformans を 感 染 さ せ た と こ ろ ,染色体末端の維持機構という観点から C. neoformans 特有

容体を発現するトランスジェニックマウス（OT-II）の千葉大学

ことが明らかにされている（Edman, 1992）. 本研究では ,真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

51

のゲノム維持機構を明らかにし , さらにこのような特有のゲノム維持機構が C. neoformans の生活環とどのように関連し , あるいはどのように制御されているかを明らかにすることを目的とした .

昨年度の共同利用・共同研究において , C. neoformans

一倍体細胞でテロメア DNA 伸長酵素テロメラーゼの相同遺伝子 CnEST2の遺伝子破壊を行い , CnEST2遺伝子の細胞増殖における機能を解析した結果 , 本菌においても他生物種と同様 , 染色体末端の維持にはテロメラーゼの活性が必須であることが明らかにしている . 本年度はさAnalysis of synthetic mechanism and physiologicalrole of nitric oxide in pathogenic fungus
Hiroshi Takagi（Graduate School of Biological Sciences, Nara Instituteof Science and Technology）

Susumu Kawamoto, Hiroji Chibana, Akio Toh-e, Daisuke

Hagiwara（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

らに , S. cerevisiae においてテロメラーゼ欠損時に染色体

研究成果

換え , 非相同末端結合に関する遺伝子に注目し , それら

幅広い生命現象に関与している . 最近 , 高木らは酵母のように関わっているかに焦点を当て解析を進めた . まフェラーゼ Mpr1およびフラボタンパク質 Tah18依存的末端維持に関与することが明らかになっている相同組が C. neoformans における特異な DNA 修復経路選択にどず , ゲノム中に RAD52, RAD51, MRE11, DMC1の相同遺伝子を見いだし , それらの遺伝子破壊株を作製してその表現型を解析した結果 , 本菌では RAD52の DNA 修復

における重要性は低く , 一方で RAD51欠損はより severe

な表現型となることが明らかになった . この傾向は , 相

一酸化窒素（NO）はシグナル分子として , 哺乳類のSaccharomyces cerevisiae において , NO がアセチルトランスにアルギニンから合成され , 酸化ストレス耐性に寄与することを見出した . 一方 , 病原真菌はヒトに感染する際 ,自然環境と生体内の劇的な環境変化（温度 , 酸素濃度 ,栄養など）によるストレスに曝される . 真菌はこれらのストレスに応答し , 耐性を獲得することで , 増殖や病原同組換えが優先的におきる S. cerevisiae とは異なり , むし

性を示すことから , NO が真菌のストレス耐性や病原性

おり , 興味深い . 今後は , テロメラーゼ活性の制御に必

cerevisiae と同様の NO 合成経路の存在が示唆される病原え関連因子を含めた DNA 末端修復機構の選択制の違い

fumigatus）について , NO 合成と増殖 , ストレス耐性なろ高等動物における相同遺伝子破壊の表現型と類似して要な分子の探索をさらに進めつつ , テロメラーゼ , 組換の発揮に関与する可能性が考えられる . 本研究では , S.
真菌（Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Aspergillusが生じる機構を分子の側から解析することで , この生物

どとの関連性を解析する . 平成26年度には , 以下の研究明らかにしたいと考えている .

１）C. glabrata：Tah18のオルソログ遺伝子（CgTAH18）

種の特異な DNA 損傷修復のメカニズムと生理的意義を研究課題の発現抑制株をマウスのマクロファージに貪食させ’14－４たところ , 野生型株に比べてマクロファージ内での病原真菌における一酸化窒素の合成機構と生理機能の解析

増殖率が高かったことから , CgTAH18が病原性に関与している可能性が示唆された .

２）C. neoformans：Tah18のオルソログ遺伝子（CnTAH18）が生育に必須であることが判明したため , 銅イオン

高木博史
（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科）

川本

成果が得られた .

進・知花博治・東江昭夫・萩原大祐（千葉大学真菌医学研究センター）で発現を誘導する系を構築し , 銅キレーターの添加によって生育が悪化することを確認した . また ,NO 特異的蛍光プローブを用いて , アルギニンの添加により細胞内に NO が生成していることが観察できた .

３）A. fumigatus：Mpr1のオルソログ遺伝子（AfMPR1）の破壊株と高発現株を作製し , 表現型を解析したところ , Mpr1と同様に AfMPR1がアセチルトランス

52

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

フェラーゼをコードしていることが示唆された . しタンパク質サイズを短縮化することを目的として , ま

レスに対して , 野生型株と変わらない表現型を示し

MoCV1-A ORF4の抗菌活性領域を短縮化する研究を水素の添加により細胞内に NO が生成していること

全長 ORF と同等の抗菌をパン酵母に対して示すことがかしながら , これらの株は高温ストレスや酸化スト
た . また , NO 特異的蛍光プローブを用いて , 過酸化が観察できた .

今後 , Mpr1, Tah18のオルソログ遺伝子の破壊株 , 発

ず, パン酵母遺伝子発現系を利用することにより,行った . その結果 , ORF4中心領域の250アミノ酸が , 完

明らかにされた . 次に同定された短縮化されたタンパク質に相当する遺伝子配列を , 川本進教授の研究室で開現抑制株 , 高発現株を用いて , 細胞内 NO レベルを定量発された C. neoformans 発現ベクターに連結させる作業とで , 病原真菌において Mpr1や Tah18が NO の合成と生は , C. neoformans にこれらべクターを導入して , 完全長

研究課題

原真菌 Aspergillus fumigatus に対する新たな薬剤開発を目するとともに , ストレス耐性などの表現型を観察するこ

理機能に関与するかどうか検討する .

ORF4と同等な抗菌活性を有することを検討していく .

アスペルギルス症の原因となり , 重篤化をもたらす病’14－５

病原性真菌を弱毒化するマイコウイルスの探索と抗菌性素材開発に向けた検討的として , 五ノ井教授の研究グループは , A. fumigatus を弱毒化する新規なマイコウイルスの探索とその応用研究
を , 高橋梓博士を中心として行っているが , 本研究課題においては , マイコウイルス探索や同定に関して共同研

森山裕充

究を行っている . これまでの探索研究の結果 , ４種のマ

（東京農工大学大学院農学研究院）

川本を行い , ベクターを完成させることことが出来た . 今後

イコウイルス由来の２本鎖 RNA ゲノムが同定されてお進・五ノ井透・東江昭夫

り , このうち , ２種に関しては , 宿主菌に生育阻害をも（千葉大学真菌医学研究センター）

たらすことなどが確認できており , マイコウイルスであDevelopment of antifungal proteins derived
from mycoviruses which attenuate host fungus
Hiromitsu Moriyama（Graduate School of Agriculture, Tokyo University ofAgriculture and Technology）

Susumu Kawamoto, Tohru Gonoi, Akio Toh-e（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
これまでの研究において , 我々はイネいもち病菌に感染して生育阻害をもたらすマイコウイルス Magnaportheoryzae chrysovirus, MoCV1-A 由来のタンパク質のうち ,る Partitiviridae 属と Chrysoviridae 属に分類されるが , 既報のウイルスとは類似性は示すが同一ではなく , 新種であることが確認されている . 今後 , 宿主菌に対する作用機作などについての検討や , 短縮化した MoCV1-A ORF4の効能などについても , 共同研究を継続させることで実施していくことが望まれる .

発表論文
１）Urayama S, Fukuhara T, Moriyama H, Toh-E A,
Kawamoto S. Heterologous expression of a gene of
Magnaporthe oryzae chrysovirus 1 strain A disrupts
growth of the human pathogenic fungus Cryptococcus

neoformans. Microbiol Immunol. 58（ 5）: 294 - 302（2014）

ORF4が抗菌活性を有することをパン酵母 Saccharomyces

cerevisiae の遺伝子発現系の利用により明らかにしてきた .

また , MoCV1-A ORF4完全長（820残基）が , ヒト病原性酵母 Cryptococcus neoformans に対しても , 異常な液胞化や生育速度の減少 , そして莢膜多糖形成の抑制が生育阻.
害効果を有することが確認されてきた（原著論文１）

そこで本研究においては , C. neoformans に導入する

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

53

研究課題

’14－６

乗り血液脳関門を通過後 , 脳内に至って髄膜炎等を起こ

Cryptococcus neoformans の低酸素応答転写
因子 Crz1/Sp1のシグナリング解析

すと考えられており , 高酸素環境（自然環境 , 肺）から

低酸素環境（血流 , 脳内）への劇的な酸素濃度変化などに打ち勝って初めて増殖し病原性を示す . 本菌の「低酸素状態に対する環境応答」は本菌の病原性発揮にも深く
川本進・清水公徳・大楠美佐子・萩原大祐

酸素応答遺伝子として「転写因子 Crz-1/Sp-1」を得て低（千葉大学真菌医学研究センター）

酸素応答機構の分子解析を進めているが , 更に , 本菌のRaclavsky, Vladislav（チェコ・パラツキー大学）

新たな別の低酸素応答遺伝子を以下のようにして得た .
まず , Agrobacterium 法による形質転換を用いて , ゲノム

Sipiczki, Matthias（ハンガリー・デブレツェン大学）

ランダム挿入ミュータントライブラリーを作製し , その中から低酸素環境非適応株を選抜した . 次に , 選抜され関水和久・松本靖彦

た菌株の T-DNA 挿入部位をシーケンス解析によって特（東京大学大学院薬学系研究科）
田村

定することができ , 相同組換えによりその遺伝子破壊株裕を作製した . そして , その遺伝子破壊株の低酸素条件下（千葉大学大学院医学研究院）
三浦

関連する病原因子のひとつと考えられ , 我々は本菌の低における性質を解析するために , 生存率測定や RT-PCR

恵や薬剤感受性試験を行った . 生存率測定から , 遺伝子破（横浜市立大学大学院医学研究科）

壊株が野生株よりも低酸素条件下の生存率が低いことがSignaling analysis of transcription factor Crz1 /Sp 1 for
hypoxia adaptation in Cryptococcus neoformans

Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu, Misako Ohkusu,

確認できた . また , RT-PCR によって , 野生株は低酸素条件下で真菌細胞膜合成に関わる遺伝子の発現量の増加が認められたが , 遺伝子破壊株においてはその遺伝子発現の増加はあまり認められなかった . 新たに得た低酸素

Daisuke Hagiwara

応答遺伝子と , すでに本菌の低酸素応答遺伝子として解Vladislav Raclavsky

調べつつあり , C. neoformans の低酸素ストレスに対する（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Palacky University, Czech）

析を進めている「転写因子 Crz-1/Sp-1」との関連を更に

環境応答シグナリング機構の解明を目指している .

上記のように , 我々は C. neoformans の細胞周期制御機

Matthias Sipiczki（University of Debrecen, Hungary）

構の研究の中で , 特異な低酸素応答現象を見出し , 解析

Kazuhisa Sekimizu, Yasuhiko Matsumoto（Graduate S chool of P harmaceutic al S ciences,

University of Tokyo）

を進めて来たが , 従来すでに詳細な研究が進められ , 多くの知見が蓄積されて来ているモデル酵母 Saccharomyces

cerevisiae の細胞周期制御機構についても , バイオインフォ

Yutaka Tamura

マテイクス解析などを用いて更なる解析 , 考察を行った

Satoshi Miuraな役割を果たしていると言われる制御因子「サイクリン -（Graduate School of Medicine, Chiba University）（Graduate School of Medicine, Yokohama City University）

研究成果
病原酵母 Cryptococcus neoformans は , 我が国に常在する真菌のうちで最も病原性が強く , 易感染患者 , 特に , エ
イズ患者の直接死因としても臨床的に極めて重要な真菌である . 本菌は生育に酸素が必須な偏性好気性酵母であるが , 自然環境からヒトに感染時 , 肺に感染して血流に

54

千葉大学

ところ , S. cerevisiae の細胞周期制御において , 最も重要

１分子（Cln1）」と「サイクリン - ２分子（Cln2）」の分子構造機能的な差異が , ユビキチン - プロテアソーム経路によるという , 新たな重要な知見を得て , その分子機構のモデルも提出して , 論文として発表した .

発表論文
１）Suganami A, Takase N, Sugiyama H, Virtudazo EV,
Kawamoto S, Tamura Y: Structure based functional

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

distinction between Cln 1 and Cln 2 depends on theubiquitin-proteasome pathway.

J. Proteomics Bioinformatics 7: 102-107（2014）

研究課題

’14－７

ン染色後にフローサイトメトリーにより評価した . 解析の結果（n ＝３）, 平均値が37℃の抗原に対して39℃の抗原で1.6倍の IL-17産生能を示した（p ＜0.1）. ２℃の温度変化による T 細胞の分化誘導は弱いながら認められたので , 39℃で何らかの抗原変化があると考えられる .

温和な加温に対する菌体の薬剤感受性の変化および宿病原真菌の mild heat stress 応答分子の機能評価と診断・治療への分子基盤
長

主細胞の応答の変化は , 薬剤投与法などへの応用も考え
られる .

研究課題

環・永尾潤一・田中芳彦’14－８（福岡歯科大学）

Candida glabrata の糖鎖合成に関与する遺伝
子欠損株の性質の解析

知花博治（千葉大学真菌医学研究センター）

Functional evaluation and application of mildheat stress responded molecules in pathogenic
fungi.
Tamaki Cho, Junichi Nagao, Yoshihiko Tanaka（Fukuoka Dental College）

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
ヒトの発熱や外部加温による mild heat stress（39℃〜41℃）は , ヒト常在病原性真菌 Candida albicans のバイ

オフィルムに対する薬剤感受性を亢進した（Cho T et

al: BPB, 2012）. 平成25年度センター共同利用研究にて ,37℃および39℃における C. albicans のバイオフィルム形
成時の遺伝子発現を網羅的に探索した . 平成26年度はさ柴田信之・工藤敦・伊藤文恵・田中

大（東北薬科大学薬学部）

知花博治（千葉大学真菌医学研究センター）

Analysis of the cell wall integrity of Candida
glabrata glycosyltransferase deletion mutants
Nobuyuki Shibata, Atsushi Kudoh, Fumie Itoh, Yutaka
Tanaka（Tohoku Pharmaceutical University）

Hiroji Chibana,（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
Candida glabrata の細胞壁糖鎖生合成に関与する各種のらに解析を進め , 37℃と比較して39℃で発現が増加する

遺伝子欠損株について細胞壁の構造および性質の解析をする）, 逆に39℃で発現が減少する遺伝子として YWP（酵について細胞壁に与える影響を詳細に解析した . 細胞壁遺伝子として HYR（菌糸形細胞壁タンパク質をコード

行い , 特に大きく変化の見られた alg6Δ株と mnn2Δ 株

母形細胞壁タンパク質をコードする）や TEP1（酵母形グルカンはアルカリ可溶性画分 , 酸可溶性画分 , アルカ

細胞壁関連タンパク質をコードする）など細胞壁に関連する遺伝子群に変化が見られることを明らかにした .

以上の結果は温度による菌体の表層構造の変化を示

リ・酸不溶性画分に分画し解析した . キチンの定量はエルソン・モルガン法により行った . グルカン結合性キ

ラートキシンに対する感受性は増殖阻止円の測定により唆するものであり , 抗原性に変化が見られる可能性も考行った . マンナンの構造解析はアセトリシス ,フィルムを抗原として , マウス骨髄細胞由来樹状細胞とよびマンナン層の形態変化は透過型電子顕微鏡により解を産生するヘルパーT 細胞の誘導能を細胞内サイトカイ

alg6Δ株は SDS, Calcofluor white 等の薬剤感受性 , β-1,3-

えられる . そこで各温度で増殖した C. albicans のバイオ

ナイーブ T 細胞の培養系で抗原応答を検討した . IL-17

千葉大学

1

H NMR

分析 , メチル化分析により行った . 細胞壁グルカン層お析した .

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

55

グルカナーゼ感受性が上昇し , TEM でもマンナン層が研究成果

ラートキシンに対する感受性は逆に低下し , キチン含量の主要起因菌の一種で，この真菌種が医療デバイス等のンの構造に変化が見られなかったが分子サイズは低下しを有することが知られている．そこで , 我々は未だあま

薄く不鮮明になっていた . しかし , micafungin およびキ

病原真菌 Candida glabrata は種々のカンジダ症（真菌症）

は野生株の２倍以上に増加していた . alg6Δ 株はマンナ

表面にバイオフィルムを形成すると，高い抗真菌剤耐性ていた . mnn2Δ株はマンナンの側鎖が失われ α-1,6- 結

り研究が進んでいない C. glabrata のバイオフィルム形成

合の直鎖構造に変化していた . しかし , 薬剤感受性等に機構に注目し，この真菌の細胞壁結合タンパク質を網羅

著しい変化は見られなかった . カイコを用いた感染実験的に解析することで , その分子機構を明らかにし，当該下していることが明らかとなった . これらの結果は特にとした .

胞壁 integrity の低下から病原性の低下につながっている

れる分泌シグナルペプチド領域と膜貫通領域を有するとよる認識に影響を与えている可能性も検討している .

し，それら遺伝子の破壊株用いてプラスチックプレート

研究協力者
川上和義

ものと比較解析した．

の結果 , alg6Δ株は野生株と比較して大きく病原性の低alg6Δ株では細胞壁合成系の酵素活性の低下が生じ , 細ことを示唆している . 細胞壁構造の変化が免疫系細胞に考えられる102のタンパク質をコードする遺伝子を選定上でのバイオフィルム形成を観察し , それらを野生株のにおいて，C. glabrata のバイオフィルム形成量が明らか

梓 , 山口正視に減少したことが分かった . それら遺伝子は , 脂質ト（千葉大学真菌医学研究センター）

研究課題

C. glabrata のバイオフィルム形成に関係すると考えら

その結果，102の遺伝子の中の５つの遺伝子の破壊株（東北大学大学院医学系研究科）

高橋

真菌症の治療や対策の礎となりうる情報を提供すること

ランポーターArv1p，MFS トランスポーターQdr2p，２つの ER からゴルジ体へのタンパク質輸送に関わるタン’14－９

パク質 Syc2p と Syn8p，細胞ストレスに関係するタンパ

Candida glabrata バイオフィルム形成に関与する遺伝子群の機能解析

ク質 Frt2p をコードしていると推測された．その中で，SYC2と SYN8遺伝子についてさらに詳細に解析したところ，これらの遺伝子破壊株が医療デバイス材料として用いられているシリコン表層でもバイオフィルム形成が梶原

将・Xinyue Chen

（東京工業大学大学院生命理工学研究科）

野生株よりも減少し , それらバイオフィルムを SEM で観察したところ，バイオフィルム形成の初期過程での知花博治

細胞接着性が特に減少していることが分かった．加え（千葉大学真菌医学研究センター）て , これらの株は，ハイグロマイシン B, コンゴレッド，

Function analysis of genes related with thebiofilm formation in Candida glabrata

SDS に対する感受性が増加することも分かった．一方 ,Q DR2を破壊した株でも，シリコン表層上でのバイオフィルム形成では，野生株と比べ明確な差が認められた .
今後 , さらに詳細な解析を進めることで , これらのタンパク質がどのようにしてバイオフィルム形成に関わっ

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）ているのかのメカニズムを明らかにする予定である．

Susumu Kajiwara, Xinyue Chen

（Graduate School of Bioscience and Biotechnology,

Tokyo Institute of Technology）

56

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

研究課題

’14－10

された . また , 限られた量の化合物を使用するにあたり ,線虫を用いたin vivo 抗真菌活性物質スクリー
ニングと作用点の研究

より高感度な実験系の開発を試みた . 腸内に定着したカ
ンジダ・グラブラータは , CTC 染色によりライブイメー

ジが観察可能であり , 線虫内の生菌数を推定することができる . 本実験系は96穴プレートでの解析が可能となっ水野貴之・文谷政憲（徳島文理大学大学院工学研究科ナノ物質工学専攻）

知花博治

た . 現在 , 東大の創薬オープンイノベーションセンター

より分与された化合物ライブラリーを用いて , スクリー
ニングを進めている .

（千葉大学真菌医学研究センター）

研究課題

Constraction of the drug screening system of Candida
glabrata pathogenicity vsing Caenorhabadutis
elegans as a host

’14－11

ショウジョウバエを使った真菌の感染実験系の開発

Takayuki Mizuno, Masanori Bun-ya

倉石貴透・倉田祥一朗

Hiroji Chibana

知花博治（Tokushima Bunri University）（東北大学大学院薬学研究科）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
我々は , 線虫とカンジダ・グラブラータを用いた新しいアッセイ系を確立させ , 殺菌効果をもつ化合物のスクリーニングを目指している .
カンジダ・グラブラータを餌として一時間 , 線虫に摂取させ , その後大腸菌を餌とし , 20℃で飼育するとカン
ジダ・グラブラータは腸内に定着し , 25℃で培養すると腸内でのカンジダ・グラブラータが増加し致死率が上昇することを我々はこれまでに報告した . 本研究におい（千葉大学真菌医学研究センター）

Development of a fugal infection system using
Drosophila
Takayuki Kuraishi, Shoichiro Kurata（Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Tohoku

University）

Hiroji Chibana（Medical Mycology Research Center, Chiba University）て , 抗真菌薬フルコナゾールを線虫に投与した場合 , 腸

研究成果

内のカンジダ・グラブラータは減少し致死率も未感染

日和見感染症に代表される感染症を引き起こす病原のレベルまで回復することが分かった . これに対して真菌の病原性発現機構は , 依然として不明であり , 大きの実験を行ったところ , 25℃の培養で致死率が著しく増は , Candida glabrata を用いて , ゲノムワイドに5150遺伝

sek-1（自然免疫系の遺伝子）に欠損を持つ線虫で同様加するが , フルコナゾールの投与した場合 , sek-1欠損系

統においても , 生残率が改善した . 野生型と sek-1欠損を持つ系統をすりつぶして生菌数を調べたところ , 野生型

な脅威となっている . 真菌医学研究センター知花准教授

子を組換えた変異体ライブラリーを作成している . このリソースを用いると , 病原性の発現に関わる遺伝子を網羅的に探索できる . しかしながら , マウスなどの哺乳動では , フルコナゾールの添加によって腸内のカンジダ・物を宿主として用いて , 網羅的に解析することは , 現実

は少ないものの生菌が一定レベルで存在していることがているショウジョウバエは , 遺伝子操作が容易であるばグラブラータが死滅しており , sek-1欠損系統では , 菌数分かった . これらの結果から , 線虫体内においてフルコ

ナゾールがカンジダ・グラブラータに対して静菌的に作用し , 自然免疫系によって殺菌されていることが示唆

千葉大学

的に不可能である . 一方 , 自然免疫研究によく利用されかりか , 生活環が短く網羅的解析に優れている . また ,すでに確立されている自然免疫変異体を用いることで ,病原性がどのように発現しているのかを分子レベルで解真菌医学研究センター報告

第 19 巻201557析できる .

研究課題

染させる感染実験系を確立した . そのために , 研究目

感染に応答した自然免疫誘導の分子機構の解析

本研究では , まず C. glabrata をショウジョウバエに感的 , すなわち , 真菌リソースを利用した網羅的解析を達’14－12成させるために , 通常の感染実験で用いるマイクロイン

藤田尚志・加藤博己

た体表傷害法を検討し , 数千レベルでの感染実験が可能

米山光俊・尾野本浩司

ジェクション法ではなく , タングステンニードルを用いとなった . 一方 , 真菌医学研究センターでは , 体表傷害法に適した真菌の培養法と , 東北大学に輸送可能な方法を確立した . 次に , 免疫系に関与することが知られている遺伝子の欠損ショウジョウバエに野生型の C. glabrata（京都大学ウイルス研究所）（千葉大学真菌医学研究センター）

Innate immune responses against pathogen infection

を感染させ , その後の生存率を測定することで , 易感染

Takashi Fujita

ウバエ系統を探索した . その結果 , 真菌感染抵抗性を制

Hiroki Katoを欠損させた変異体において , 感染後の生存率が有意にMitsutoshi Yoneyama

グに最適であることがわかった . そこで , 真菌の生育にKoji Onomoto

宿主のモデルとしてスクリーニングに適したショウジョ
御している Toll 受容体の上流の因子である psh と modSP

低下しており , 易感染宿主のモデルとしてスクリーニン

は必須ではない約2,500遺伝子を欠損した系統について ,感染実験を行い , 病原性が低下した系統を58系統 , 病原性が高まった系統を30系統同定した（第37回日本分子生物学会年会で発表：カンジダ酵母の病原性を規定する遺伝子の網羅的同定：ショウジョウバエ成虫への殺傷能力を指標としたカンジダ非必須遺伝子欠損株のスクリーニ（Institute for Virus Research, Kyoto University）（Institute for Virus Research, Kyoto University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
高等脊椎動物における抗ウイルス自然免疫において ,RIG-I-like 受容体（RLR）は細胞内に侵入した非自己RNA を検知するセンサー分子として必須な役割を担っ

ング：渡辺亮 , 倉石貴透 , 青山俊弘 , 中山浩伸 , 知花博ている . 本研究は , 最近明らかにした細胞内ストレス顆

理由を明らかにすることで , 病原真菌の病原性発現機構について解析することを目的とした .

治 , 倉田祥一朗）. これらの変異体で病原性が変化したの一端が明らかに出来るものと期待している .

粒（SG）の形成を介した RLR シグナル誘導の分子機構
これまでの共同研究から , Pumilio と呼ばれる RNA 結合タンパク質が , RLR を介したシグナルに何らかの役割を担っていることを示唆する結果を得ていた . そこで
本研究では , この Pumilio のウイルス感染応答および SG

形成への関与などについて詳細な解析を行った . その結

果 , １）Pumilio が三種の RLR のうち LGP2と特異的に会合していること , ２）ウイルス感染に応答して SG に共局在すること , ３）Pumilio が LGP2とウイルス由来二本鎖 RNA との会合の増強に補助的に働くことなどが明らかとなった . これらの結果は , RLR による非自己ウイ

ルス RNA 認識における Pumilio タンパク質の新たな機能を明らかにしている . さらに , これらの成果を含め RLRの機能とウイルス RNA 検知の分子メカニズム , SG 形成とその重要性などについての総説を共同で２報執筆し報
告した .

58

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

発表論文
１）Yoneyama M, Onomoto K, Jogi M, Akaboshi T, Fujita
T: Viral RNA detection by RIG-I-like receptors. Curr
Opin Immunol, 32: 48-53, 2015.

２）Narita R, Takahasi K, Murakami E, Hirano E,

不明な点が多い . また , これまでの研究から Arf/Arl ファ

ミリー分子は RIG-I を始めとする自然免疫系を制御することも示唆されている . これらのことから我々は Arl

ファミリー分子群に着目し , これらに対する発現ベク

ターを構築し MDA5とともに培養細胞へ発現させイン

Yamamoto SP, Yoneyama M, Kato H, Fujita T: A novel

ターフェロンβ遺伝子プロモーター活性化を指標にスク

sensing of viral infection. PLoS Pathog, 10: e1004417,

によるインターフェロンβ遺伝子プロモーター活性化を

３）Onomoto K, Yoneyama M, Fung G, Kato H, Fujita T:

することを見いだした . また , MDA5に対する抑制効果

function of human Pumilio proteins in cytoplasmic
2014.

Antiviral innate immunity and stress granule responses.
Trends Immunol, 35: 420-428, 2014.

研究課題

リーニングを行ったところ , Arl5B の過剰発現が MDA5
有為に抑制した . 更なる解析から MDA5と Arl5B が結合

は Arl5B の GTP/GDP 結合活性に依存しなかった . これらのことから Arl5B は MDA5に直接結合することでその機能を抑制すると考えられた . そこで Arl5B 欠損マウ

’14－13

スを作成し解析を行った . Arl5B 欠損マウスは胎生致死

自然免疫受容体を介した真菌核酸認識機構の解析であったため胎児繊維芽細胞を樹立し解析に用いた . その結果 , Arl5B 欠損細胞においては MDA5アゴニストである Poly I:C や脳心筋炎ウイルスに対するインターフェ
ロ ン β の 発 現 や 転 写 因 子 IRF3と NF- κ B の 活 性 化 が 野

河合太郎（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研

生型と比して上昇していた . 以上の結果から , Arl5B は

MDA5の抑制因子として機能していることが示された .
今後 , 真菌核酸に対する Arl5B ならびに RLRs の役割を究科）

米山光俊・尾野本浩司

明らかにしていく予定である .

（千葉大学真菌医学研究センター）

Recognition of fungal nucleic acids by patternrecognition receptors
Taro Kawai（Graduate School of Biological Sciences, Nara Instituteof Science and Technology）

発表論文
１）Kitai Y, Takeuchi O, Kawasaki T, Ori D, Sueyoshi T,
Murase M, Akira S, Kawai T: Negative regulation of
Melanoma Differentiation-associated Gene 5（MDA5）-dependent antiviral innate immune responses by Arf-likeProtein 5B. J Biol Chem, 290: 1269-80, 2015.

Mitsutoshi Yoneyama（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

Koji Onomoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
自然免疫を介する核酸認識機構を理解する上で細胞内 RNA ヘ リ カ ー ゼ RIG-I-like receptors（RLRs） に 着 目

し研究を行った . その結果 , RLRs ファミリーの一つである MDA5の機能を負に制御する新たな制御因子 Arl5Bを同定することができた . Arl5B は Arf/Arl ファミリーに属する低分子量 G 蛋白質であるが , その機能については

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

59

研究課題

’14－14や強制発現によって検討したところ , RIG-I は RNA サ

宿主免疫応答と RNA サイレンシングのクロス
トークの分子機構

イレンシング活性を抑制する作用があることがわかり ,TRBP と何らかの機構で拮抗することが想定された . さらに , 小分子 RNA と TRBP やウイルスセンサータンパ

ク質との相互作用をゲルシフトアッセイで解析した結程久美子

果 , TRBP のみでなく , RIG-I と LGP2も小分子 RNA と（東京大学大学院理学系研究科）

相互作用することが明らかになった . これらの機能的米山光俊・尾野本浩司

意味を明らかにし , より詳細な解析を行うため , 現在 ,CRISPR ゲノム編集システムを用いたこれらの因子のヒ（千葉大学真菌医学研究センター）

Crosstalk between RNA silencing and hostimmune responses
Kumiko Ui-Tei（Graduate School of Science, The University of Tokyo）

Mitsutoshi Yoneyama

トノックアウト細胞株の作製を進めている .

さらに , 我々は , アポトーシスで活性化されるカス

パーゼによって , TRBP がプロセシングを受けて構造変換することも明らかにしている . そこで , 免疫応答反応と RNA サイレンシング機構において , プロセシングによる構造変換によって , TRBP が異なる機能を示す可能性についても検討した . その結果 , プロセシングされた（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

後の TRBP は RNA サイレンシング活性を促進する効果（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

シング前後の TRBP と相互作用する二本鎖 RNA を RNA

Koji Onomoto

研究成果
高等真核生物では , ウイルス感染に対する生体防御機

構としてインターフェロンの誘導を伴う自然免疫応答機構が発達している . 自然免疫応答では , 米山らが見出した RIG-I, MDA-5, LGP2などのウイルスセンサータンが消失していることが明らかになった . さらに , プロセ

免疫沈降シークエンスによって解析した結果 , 相互作

用している二本鎖 RNA の種類が大きく異なることがわ
かってきた . 今後は , プロセシング前後の TRBP と相互作用する二本鎖 RNA の特徴を明らかにし , TRBP の免疫応答機構における機能の解明を目指す .

パク質が重要な役割を果たす . 一方で , 小分子非コード

RNA による RNA サイレンシングも , ２本鎖 RNA の侵入やウイルス感染に対する生体防御機構の１つであり ,これら２つの機構は , 共通に RNA によって惹起される
ため , 相互に調節し合うクロストークの機構が存在することが想定される . 平成26年度には , 両経路に共通に関わる因子であることを独自に見出した Trans-activating

response（TAR）RNA-binding protein（TRBP） と , ウ イ

ルスセンサータンパク質の RNA サイレンシング機構における機能を解析した .

RNA サイレンシングでは , 小分子 RNA が Argonauteと呼ばれるタンパク質へ取り込まれて , 初めてその遺 伝 子 抑 制 機 能 を 発 揮 す る . TRBP は 小 分 子 RNA のArgonaute への取り込みを促進することで , RNA サイレ
ンシング活性を促進する . そこで , ウイルスセンサー

タンパク質の RNA サイレンシング効果に対する影響
を , それらのノックダウンによるレポーターアッセイ

60

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

研究課題

’14－15

ムを解析中である .

真菌認識機構 Dectin を標的とした新規難治性喘息の治療機軸の確立

研究課題

廣瀬晃一・中島裕史（千葉大学大学院医学研究院’14－16アレルギー・臨床免

結核菌細胞壁成分を認識する新規受容体の探索と免疫賦活への応用

疫学）

西城

発表論文
Am J Respir Cell Mol Biol. 2014 ;51:201-9. doi: 10.1165/
rcmb.2013-0522OC.

忍（千葉大学真菌医学研究センター

感染免疫分野）Roles of Dectin-1 and Dectin-2 in the developmentof allergic airway inflammation.

米川晶子・三宅靖延・石川絵里・
大洞将嗣・山崎 晶（九州大学生体防御医学研究所）

西城

忍・米山光俊（千葉大学真菌医学研究センター）

Koichi Hirose, Hiroshi Nakajima（Allergy and Clinical Immunology, Graduate School of

Medicine, Chiba University）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
真菌への暴露 , 感作は喘息の重症化に関与することが知られているが , そのメカニズムに関しては不明な点が多い . 本研究では真菌認識機構である Dectin-1, Dectin-2のアレルギー性気道炎症発症における働きを解析した .

Dectin-2 is a direct receptor for mannose-capped
lipoarabinomannan of mycobacteria.
Akiko Yonekawa, Yasunobu Miyake, Eri Ishikawa, Ohhora, Sho Yamasaki（Medical Insititute of Bioregulation, Kyushu University）

Shinobu Saijo, Mitsutoshi Yoneyama（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

野生型マウス , Dectin-1欠損マウス , Dectin-2欠損マウ

研究成果

炎症を惹起し , 気管支肺洗浄液（BALF）中の炎症細胞

ンノース付加リポアラビノマンナンは宿主の免疫応答にイトカイン産生能を比較検討した . その結果 , Dectin-2いる．しかし，その多面的な作用を説明しうるような受スを用いてチリダニ（HDM）誘発性アレルギー性気道

結核菌などの抗酸菌に特有の細胞壁の成分のうち，マ

浸潤 , 気道過敏性 , 縦隔リンパ節 T 細胞分化 , およびサ

対し抑制性と刺激性の両方の活性を示すことが知られて欠損マウスでは , 野生型マウスに比べて HDM 投与後の容体は，はっきりとは同定されていない．本研究では ,BALF 中への好酸球浸潤 , 肺組織における気道周囲へのC 型レクチン受容体である Dectin-2がマンノース付加リ

好酸球 , リンパ球浸潤が減少しており , 気道過敏性も低

ポアラビノマンナンの受容体であることを見い出した．

節 T 細胞からの IL-5, IL-13, IL-17産生が低下している

して樹状細胞を活性化し，炎症性サイトカインおよび抑た結果 , Dectin-2は肺に局在する CD11b 陽性樹状細胞か介して樹状細胞において抗原に特異的な T 細胞の応答を下していた . また , Dectin-2欠損マウスでは縦隔リンパことが明らかとなった . さらにそのメカニズムを解明しマンノース付加リポアラビノマンナンは Dectin-2に依存制性サイトカインの産生を誘導した．また，Dectin-2をらのサイトカイン産生を制御することにより HDM 特異

増強することもわかった．さらに，マウス自己免疫疾患

らかとなった .

もつアジュバント活性が明らかにされた．実際の感染にることを示唆するデータを得ており , 現在そのメカニズの悪化を示した．以上より，病原真菌に対する感染防御的 Th2細胞分化 , Th17細胞分化を促進していることが明

モデルにおいてマンノース付加リポアラビノマンナンの既に我々は Dectin-1もアレルギー性気道炎症に関与す

おいて，Dectin-2ノックアウトマウスは肺における病態

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

61

に必須の役割を示す Dectin-2が , 真菌だけではなく , マ

ンノース付加リポアラビノマンナンを認識することにより抗酸菌に対する宿主の免疫応答にも寄与することが明らかになった．
尚 , 本研究は Nature Review Immunology 誌の Highlightで紹介された（Nat. Rev. Immunol., 14, 648-649, 2014）.

IL-2, GM-CSF の産生が有意に低下していた . さらに ,SOC 流入欠損 BMDC による T 細胞のプライミングも部分的に低下していた .

次に , 真菌感染防御における樹状細胞のカルシウムシ

グナルの役割を個体レベルで解析するために , 樹状細胞特異的に SOC 流入を欠損するマウスにカンジダ菌のSC5314株を投与した . その結果 , コントロールとノッ

発表論文
Dectin-2 is a direct receptor for mannose-capped lipoarabinomannanof mycobacteria.
Yonekawa A, Saijo S, Hoshino Y, Miyake Y, Ishikawa E,
Suzukawa M, Inoue H, Tanaka M, Yoneyama M, Oh-Horaて , 樹状細胞の SOC 流入の関与はそれほど大きくない

Immunity. 41（3）:402-13. 2014.

いる可能性を排除することはできず , さらなる解析が必

M, Akashi K, Yamasaki S.

研究課題

クアウトマウスの生存率に変化はなかった . そこで , 別

株の ATCC18804株を投与した場合 , ノックアウトマウ

スでは生存率が低下していたが , 統計的な有意差は出な
かった . 以上から , カンジダ菌に対する感染防御におい可能性が示唆された . しかし , 他の免疫応答に関与して要である .

’14－17

研究課題
真菌感染に対する免疫応答におけるカルシウ
ムシグナル役割の解明’14－18スエヒロタケ感作による気管支喘息重症化メ
カニズムの解明

大洞将嗣（九州大学生体防御医学研究所）

廣瀬晃一・中島裕史

西城（千葉大学大学院医学研究院

忍（千葉大学真菌医学研究所）

アレルギー・臨床免

疫学）

亀井克彦

Elucidation of the role of calcium signaling in
immune response to fungal infection
Masatsugu Oh-hora（Medical Insititute of Bioregulation, Kyushu University）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
骨髄由来樹状細胞（BMDC）を用いて , 真菌感染防（千葉大学真菌医学研究センター

渡邊哲（千葉大学医学部附属病院

Koichi Hirose, Hiroshi Nakajima（Allergy and Clinical Immunology, Graduate School of

Medicine, Chiba University）

Katsuhiko Kameiと機能を解析した . PLC- γの下流で活性化される

Akira Watanabe

ア作動性カルシウム（SOC）流入

ストを欠損する BMDCを用いた解析の結果 , Dectin ファミリーはリガンド刺激によって SOC 流入を活性化することが明らかとなった .

（Medical Mycology Research Center, Chiba University）（Department of Control and Treatment of Infectious

Diseases, Chiba University Hospital）

また SOC 流入欠損 BMDC では , リガンド刺激による

62

千葉大学

感染症管理治療部）

Roles of sensitization to Schizophyllum commune
in the development of severe asthma

御に重要な C 型レクチン受容体 Dectin ファミリーにおけるカルシウム流入−カルシウムシグナルの制御機構

臨床感染症分野）

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

研究成果
真菌への暴露 , 感作は喘息の重症化に関与することが知られている . スエロタケ（SC）は喘息 , アレルギー性（Division of Clinical Research, Medical Mycology

Research Center, Chiba University）

気管支肺真菌症（ABPM）の発症に関与することが報告

研究成果

的なスクリーニング方法の報告は無く , 喘息患者におけは非常に重要であり , 近年 , 感染の増加傾向が報告されされている真菌だが , これまでに SC 特異的抗体の効率

人に感染症を引き起こす病原体として Aspergillus fumigatus

る SC 感作率は不明である . 我々はこれまでの共同研究ている . A. fumigatus は主に経気道感染し , 侵襲性アスペ索・同定し , この主要抗原を用いて SC 特異的抗体測定

ギルス症などを引き起こす . また , 肺病変から全身性播により SC による ABPM 患者血清を用いて主要抗原を探ELISA 法を確立した . この ELISA 法を用いて喘息患者における感作率を検討した結果 , 47名の喘息患者（Step2

６名 , Step3 29名 , Step4 12名）中 , ４名が SC 特異的 IgG

ルギルス症 , アスペルギローマや慢性壊死性肺アスペル

種性病変をつくることもある . 感染防御能の低下した患者において , アスペルギルス症などの深在性真菌症は ,発症件数ならびに治療の困難さの面でみても , 臨床治陽性 , ６名が SC 特異的 IgE 陽性であることが明らかと療上重要な課題とされている . 近年 , 亀井 , 渡邊らは A.

患者の呼吸機能を比較した結果 , SC 特異的 IgE 陽性喘息

生育因子として Fetuin との濃度依存性的な関連を示唆しなった . さらに SC 特異的抗体陽性喘息患者と陰性喘息

fumigatus によるバイオフィルムの産生を報告し , 重要な患者は陰性喘息患者に比較し１秒率（FEV1.0）が有意た（Int J Med Microbiol., 2012）. アムホテリシン B はア

陽性患者はアスペルギルスに対しても感作が成立しているが , 同病原体が産生するバイオフィルムに対する抑制に低下していることが明らかとなった . SC 特異的抗体る傾向がみられたが , SC 特異的 IgE 抗体価とアスペルギ
ルス特異的 IgE 抗体価は相関しなかった . 今後は SC 感

作とアスペルギルス感作 , それぞれの気管支喘息重症化における働きを解析するため予定である .

研究課題’14-19亮・渡邊

効果については未だ明らかになってはいない .

我 々 は96穴 マ イ ク ロ プ レ ー ト に A. fumigatus を 接 種

し , バイオフィルムの産生を確認後 , 0.1xMIC, 1xMIC,

10xMIC のアムホテリシン B を添加し , バイオフィルムの抑制効果について Microtiter biofilm assay で評価した .
アムホテリシン B の0.1xMIC 存在下では OD595で2.69,

アムホテリシン B によるAspergillus fumigatus
バイオフィルム産生の抑制効果についての研究秦

スペルギルス感染症に対しての臨床効果は認められてい

1xMIC 存在下で0.057, 10xMIC 存在下で0.056と濃度依存性のバイオフィルムの抑制効果が確認された . 今後は様々な状態においても同様な効果が得られるかどうかを確認し , 臨床効果との相関についても検討していく予定

浩（久留米大学医学部感染制御学講座：2014年４月に久留米大学医学部感染医学講座臨床感染医学部門
より教室名称変更）

亀井克彦（千葉大学真菌医学研究センター臨床感染症分野）

Basic research for anti-bioflim effect formed byAspergillus fumigatus using amphotericin B

である .

発表論文
１）Qin L, Kida Y, Ishiwada N, Ohkusu K, Kaji C, Sakai Y,
Watanabe K, Furumoto A, Ichinose A, and Watanabe H.
The relationship between biofilm formations and capsulein Haemophilus influenzae. J Infect Chemother, 20: 151156, 2014.

Liang Qin, Hiroshi Watanabe（Department of Infection Control and Prevention,

Kurume University School of Medicine）

Katsuhiko Kamei

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

63

研究課題

’14－20

大幅に低下した . 親株では血清添加によってバイオフィ

アスペルギルスのバイオフィルム形成および
抗真菌薬耐性に関連する新規遺伝子群の探索
梅山

ルム形成量が増加するが , 遺伝子破壊株ではその増加は観察できなかったことから , AUK4が血清刺激に応答したバイオフィルム形成に関与することが示唆された . 今

後 , AUK4を手がかりとして , 血清刺激に応答したバイ

隆・宮﨑義継オフィルム形成におけるシグナル伝達機構の役割を解明（国立感染症研究所）していく .

亀井克彦

研究課題（千葉大学真菌医学研究センター）

Screening of novel genes involved in biofilm
formation and antifungal resistance in Aspergillus
fumigatus’14－21

Sialylglycopeptide が Aspergillus fumigatus
生育と biofilm 形成に及ぼす影響
豊留孝仁（帯広畜産大学）

Takashi Umeyama, Yoshitsugu Miyazaki

亀井克彦・高橋弘喜・八尋真希（National Institute of Infectious Diseases）（千葉大学真菌医学研究センター）

Katsuhiko Kamei（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
深在性真菌症の中でも Aspergillus fumigatus を主要病原

Effect of sialylglycopeptide on the growth andbiofilm formation of Aspergillus fumigatus

菌とするアスペルギルス症は増加傾向にあり , 予後が非Takahito Toyotome

がアスペルギルス感染に関与することが示唆されていKatsuhiko Kamei, Hiroki Takahashi, Maki Yahiro

常に悪い . 近年 , アスペルギルスのバイオフィルム形成る . 特にアスペルギローマ（菌球）の菌糸塊に見られる菌糸周囲には厚い細胞外マトリクスが観察されている .

（Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

株を作製した . さらに , 遺伝子を戻し , 相補株を作製し研究成果
近年 , Aspergillus fumigatus がその感染過程においてバ
イオフィルムを形成することが明らかとなってきた . こ
れまでの研究で血清糖タンパク質フェツイン A がバイオ
フィルム形成を促進することが明らかとなってきた . さらなる検討から , フェツイン A の N- 結合型糖鎖が重要な役割を果たしていると推測された . また , 新たな観点からの研究としてフェツイン A 添加が A. fumigatus の遺伝子発現にどのような影響を及ぼすかを検討してきた .
そこで , 本研究ではフェツイン A の N- 結合型糖鎖構造の A. fumigatus の遺伝子発現に及ぼす影響について , N結合型糖鎖構造をもつシアリルグリコペプチド（SGP）
を用いて検討を行った .

を行った . 遺伝子破壊株の寒天培地上のコロニー生育の結果 , SGP 添加時に A. fumigatus において発現が４倍

このようなバイオフィルムを形成する状態では , いくつかの抗真菌薬に対する感受性が低下する現象が示され ,難治性の原因の１つになっていると考えられる . しかしながら , バイオフィルム形成 , および , それによる抗真菌薬耐性の詳細な分子メカニズムは不明な点が多い . 本

研究では , バイオフィルム形成に関わる新規遺伝子を同定し , 抗真菌薬耐性との関連性を明らかにすることを目的とする . 平成26年度では , 一次配列からプロテインキ

ナーゼと予測される A. fumigatus の AUK4が菌糸生育やバ

イオフィルム形成に及ぼす影響を検討した .

ハイグロマイシン耐性マーカーを含むカセット DNA

を A. fumigatus AfS35株に形質転換し , AUK4遺伝子破壊
た . これらの株を用いて , 生育および分生子形成の観察

速度は親株と比べて約75% に低下し , 分生子形成効率は

64

千葉大学

次世代シークエンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析

以上上昇する遺伝子もしくは低下する遺伝子をそれぞ

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

れ42遺伝子 , 75遺伝子見いだした . これら遺伝子のうち ,を生産している事が明らかになったが , 新規化合物の単もしくは低下する遺伝子はそれぞれ１遺伝子 , ６遺伝子

また , 次世代シーケンサーによりゲノム解析が行わ

フェツイン A 添加時にも共通して４倍以上発現が上昇

離には至らなかった .

が見いだされた . フェツイン A および SGP のいずれをれている数種の Nocardia 属放線菌に関して , 構造の新規（MFS）型トランスポーターをコードしている . 一方 ,trans-AT タイプのポリケチド合成酵素遺伝子の探索を添加しても上昇する遺伝子は Major facilitator superfamily

共通して低下する遺伝子のうち , ３つの遺伝子はゲノム上で近接していた . この３つの遺伝子を含むゲノム領域
では９つの遺伝子がいずれも SGP 添加により発現量が大きく低下しており , 共通して遺伝子発現制御を受けていることが示唆された .

これらの遺伝子について , これまでに詳細な解析はな性が高い化合物の生合成遺伝子である事が期待される行ったが , 存在を確認する事はできなかった .

一方 , 渦鞭毛藻 Amphidinium sp. 2012-7-4A 株の培養

上清の成分を精査し , 新規鎖状ポリケチド amphidinin

C〜G を単離 , 構造決定した . これら新規化合物および同時に得られた既知の鎖状ポリケチド amphidinin A お

よびマクロリド amphidinolide Q の抗菌活性を評価した

されていない . 今後 , これら遺伝子の機能を解析するこ結 果 , amphidinin C〜G お よ び amphidinolide Q 全 て がな分子メカニズムが明らかになると期待される .

た . また , amphidinin A は Bacillus subtilis, Aspergillus niger

研究課題

Staphylococcus aureus に , amphidinolide Q は Escherichia coli,とにより , A. fumigatus バイオフィルム形成に関する詳細’14－22

病原真菌・放線菌の休眠遺伝子を利用した新規抗感染症薬リード化合物の獲得
久保田高明（北海道大学大学院薬学研究院）

五ノ井透（千葉大学真菌医学研究センター）

Development of lead compound for new antiinfective agent using silent gene of pathogenic
fungi and bacteria

Trichophyton mentagrophytes に抗菌活性を示す事が分かっに , amphidinin C および E は Bacillus subtilis, Aspergillus niger,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicanss に 抗菌活性を示す事が分かった .

発表論文
１）Kubota, T.; Iwai, T.; Sakai, K.; Gonoi, T.; Kobayashi,
J. Amphidinins C-F, amphidinolide Q analogues frommarine dinoflagellate Amphidinium sp. Org. Lett. 2014,
16, 5624-5627.
２）Kubota, T.; Iwai, T.; Ishiyama, H.; Sakai, K.; Gonoi, T.;
Kobayashi, J. Amphidinin G, a putative precursor ofamphidinin A from marine dinoflagellate Amphidinium
sp. Tetrahedron Lett. 2015, 56, 990-993.

Takaaki Kubota（Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido

University）

Tohru Gonoi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
化合物生産性が明らかにされていない病原性放線菌のうち Nocardia terpenica IFM0555の生産する成分について精査した結果 , Nocardia terpenica IFM0406の生産する

brasilicardin A（アミノ酸トランスポーターSystem L の強力な阻害により免疫抑制活性を示す）および関連化合物

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

65

研究課題

’14－23研究課題

膣カンジダ症発症とカンジダ・アルビカンスの遺伝子型に関する研究’14－24

真菌認識に重要な自然免疫受容体 Dectin-1及び Dectin-2の抗腫瘍応答における役割の解析

神戸俊夫

柳井秀元・谷口維紹（名古屋大学大学院医学系研究科附属神経疾患・（東京大学生産技術研究所）

西城

腫瘍分子医学研究センター）

矢口貴志・田中玲子

忍（千葉大学真菌医学研究センター）（千葉大学真菌医学研究センター）

Study on Candida albicans genotypes relatingwith vaginal candidiasis
Toshio Kanbe

（Center for Neurological Diseases and Cancer, Nagoya

University）

Takashi Yaguchi, Reiko Tanaka（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
Candida albicans は口腔 , 皮膚 , 膣などの常在性真菌として知られ , カンジダ症のほとんどがこれら常在性カンジダ酵母による内因性感染である . これまでに , 健常者
口腔に由来する C. albicans のマイクロサテライト領域に基づいた遺伝子型解析で５つの主要遺伝子型（genotype
１, ２, ３, ４, ５）の中で , genotype ５は健常者に由来する C. albicans のみにみられる型であり , genotype ２, ３
はカンジダ症病巣部に由来する C. albicans の主要遺伝子型であることを示してきた . 本研究では , 膣カンジダ症
患者病変部より分離した86株の C. albicans の遺伝子型を２種類のマーカー（CDC ３, CAI）により解析し , これまでの結果と比較した . 結果 , 膣カンジダ症の場合も ,genotype 5（ 健 常 者 由 来 C. albicans 特 異 的 ）C. albicansは認められなかった . カンジダ症病巣部に由来する C.
albicans でみられる genotype 2および３については , ほ
とんどが genotype 2 C. albicans（７%）で , genotype 3 C.
albicans の分離率は１% であった . これらの結果はカンジ
ダ血症患者に由来する C. albicans と同じであった . 現在 ,genotype 2 C. albicans の健常者膣における分布に関する解析に加え , genotype 2および5 C. albicans の生物学性状についての比較を進めている .

66

千葉大学

Recognition of tumor cells by Dectin-1 orchestrates
innate immune cells for anti-tumor responses
Hideyuki Yanai, Tadatsugu Taniguchi（Institute of Industrial Science, The University ofTokyo）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
がんに対する新たな治療法として , 最近 , 免疫療法に大きな期待が寄せられている . 古くから自身の免疫系ががん細胞を認識し , 排除することがわかっていたが , その機構としては , 獲得免疫系によるがん細胞の認識機構がよく知られており , 免疫系のもう一つの軸である自然免疫系がどのようにしてがん細胞を認識し , その排除を促しているのか , という点については不明な点が多く残されていた .

本研究では , 免疫細胞の一種であるマクロファージが樹状細胞に発現する C 型レクチンファミリー分子のDectin-1が , がん細胞を直接認識することで , 自然免疫系が活性化され , その結果がん細胞が体内から排除されることを明らかにした .

本研究は , 病原真菌に対する感染防御に必須の役割を担っている自然免疫受容体ががん細胞を認識し , その排除を促していることを世界に先駆けて明らかにしたもの
で , 今後 , 新しいがんの治療法や予防法の開発へとつながることが期待される .

尚 , 本研究は eLife 誌の Insight で紹介された .

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

発表論文
Recognition of tumor cells by Dectin-1 orchestrates innate
immune cells for anti-tumor responses.
Chiba S, Ikushima H, Ueki H, Yanai H, Kimura Y, Hangai

千葉大学

S, Nishio J, Negishi H, Tamura T, Saijo S, Iwakura Y,
Taniguchi T.

eLife. ３:e04177. 2014（doi: 10.7554/eLife.04177.）

真菌医学研究センター報告

第 19 巻201567

感染症研究グローバルネットワークフォーラム2014（共催：千葉大学真菌医学研究センター共同利用・共同

セッション１

研究拠点事業 , 千葉大学 COE スタートアップ「病原体座長：白澤

感染と免疫応答の統合的解析拠点」, 東京大学医科学研
究所細菌感染生物学社会連携研究部門・特別推進研究「病原細菌の自然免疫克服戦略の解明とその応用」, 基盤
研究 A「エフェクターと宿主標的分子間相互作用を基盤としたサルモネラ感染分子機構の解明」, 厚生労働省科教授）

浩（千葉大学大学院医学研究院

相馬亜希子（千葉大学園芸学研究科

助教）「病原性大腸菌 O157株の宿主感染に関わる低分子 RNAの同定と機能解析」

高屋明子（千葉大学薬学研究院

准教授）

学研究費補助金「肝炎等克服実用化研究事業」（B 型肝「グラム陽性菌の内因性 rRNA 修飾と薬剤耐性」の機能解明とその制御による発癌抑止法開発」）

村田武士（千葉大学理学研究科

炎創薬実用化等研究事業）「Ｂ型肝癌における自然免疫教授）「創薬標的膜蛋白質の体系的構造解析技術の確立に向けて」

研究成果
平成24年度から千葉大における感染症研究のネット

特別講演１

ワーク化を目指して「千葉大学感染症研究ネットワー

座長：亀井克彦（千葉大学真菌医学研究センター 教授）

ク」として開始された本会も今年度で第３回となった .

長谷耕二（慶応義塾大学薬学部大学院薬学研究科

昨年から日本あるいは世界の第一級の先生方による国際

東大医科学研究所国際粘膜ワクチン開発研究的な意見交換の場となる研究会を目指し , 名称を「感染センター粘膜バリア学分野

症研究グローバルネットワークフォーラム」に変更しているが , 本年度は平成26年11月15日（土）に千葉大学医学部記念講堂にて開催された . 一般演題に加え , さまざ

教授

客員教授）

「腸内細菌によるエピジェネティクス制御を介した Treg
分化誘導機構の解明」

まな感染症領域で活躍しておられる５名の先生方によセッション２る特別講演が行われ , まさに研究会レベルをはるかに超座長：猪狩英俊（千葉大学医学部附属病院

達し , 発表のみならずレベルの高い活発な議論が行われ

猪狩英俊（千葉大学医学部附属病院

日時：平成26年11月15日（土）９：30〜16：50「Non-communicable Diseases が日本の塗抹陽性結核治療

えた国際的な研究発表の場となった . 参加者は116名にた . なお , プログラムは以下のとおりである .

亀井克彦（千葉大学真菌医学研究センター）

猪狩英俊（千葉大学医学部附属病院）

白澤浩（千葉大学医学研究院）

山本友子（千葉大学薬学研究院）

准教授）「肝炎ウイルス制御後の肝発がん抑止戦略」
特別講演２
座長：横須賀

開会の挨拶

68

收（千葉大学医学研究院

感染症管理治療部部長）

加藤直也（東京大学医科学研究所先端ゲノム医科学分野

收（千葉大学医学研究院）

横須賀

部長）

成績の及ぼす影響について」

場所：千葉大学医学部記念講堂
横須賀

治療部

感染症管理

收（千葉大学医学研究院

脇田隆字（国立感染症研究所
教授）

千葉大学

教授）

ウイルス第二部「DAA 時代における C 型肝炎ウイルス研究」

真菌医学研究センター報告

第 19 巻

2015

部長）

特別講演３

特別講演５

座長：山本友子（千葉大学薬学研究院
山崎教授）

晶（九州大学生体防御医学研究所感染ネットワー
ク研究センター免疫制御学分野

教授）「結核菌を認識する受容体と免疫応答」

座長：野田公俊（千葉大学医学研究院
中山俊憲（千葉大学医学研究院

教授）

免疫発生学

教授）

「Pathogenic 記憶 Th2細胞の形成と維持機構」

特別講演４

閉会の挨拶

座長：米山光俊（千葉大学真菌医学研究センター 教授）

笹川千尋（千葉大学真菌医学研究センター長 , 東京大学

荒瀬尚（大阪大学免疫学フロンティア研究センター免疫化学研究室教授

名誉教授 , 日本生物科学研究所長）

大阪大学微生物病研究所 免疫化学分野 教授）「ペア型レセプターを介した宿主病原体相互作用」

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

69

2015年講演会
2015 Scientific Meetings & Seminars
１）東京大学医科学研究所−千葉大学真菌医学研究セン
ター 共同利用・共同研究拠点事業 平成26年度
成果報告会【午後の部】
東京大学医科学研究所−千葉大学真菌医学研究セン
ター 合同成果報告会【特別講演】
藤田尚志（京都大学ウイルス研究所・教授）
ウイルス感染が誘導する自然免疫シグナルの時空間解析【合同成果報告会（領域３： 感染症・ 免疫共同研究
領域）】

日本人 HIV 感染者の HIV アクセサリー遺伝子の解析
立川 愛（東京大学医科学研究所 准教授）
HIV 感染細胞における HIV 抗原の抗原提示動態に
関する研究
今井正樹
（岩手大学 准教授）
インフルエンザウイルスのヒト上気道細胞での増殖を制御する因子の同定とその解析
小柴琢己（九州大学大学院 准教授）
インフルエンザウイルス由来・タンパク質と宿主ミトコンドリアとの相互作用解析［千葉大学真菌医学研究センター成果報告］
五味勝也（東北大学大学院農学研究科 教授）
Aspergillus 属糸状菌のアゾール系薬剤耐性に関与する
転写因子 AtrR と SrbA の協調的発現制御機構の解析

水島恒裕（兵庫県立大学大学院 教授）
赤痢菌病原因子の構造解析による作用機構の解明と創薬への応用

倉田祥一朗（東北大学大学院薬学研究科 教授）
カンジダ・グラブラータの遺伝子欠損株ライブラリーの構築とショウジョウバエ成虫への殺傷能力を指標とした病原性を規定する遺伝子のスクリーニング（沖縄科学技術大学院大学

豊留孝仁（帯広畜産大学動物・食品衛生研究センター 講師）
Aspergillus fumigatus バイオフィルム形成とその機構
柳井秀元（東京大学生産技術研究所 特任准教授）
自然免疫受容体 Dectin- １及び Dectin- ２の抗腫瘍応
答における役割の解析［感染症・免疫共同研究領域］
上野貴将（熊本大学エイズ学研究センター

70

准教授）

千葉大学

Kun-Yi Hsin

研究員）

Discovery of anti-influenza agents and drug targets using
curated pathway map（ FluMap ）and high-precision
molecular docking simulation
横田恭子（東京工科大学 教授）
HIV-1の潜伏感染とその長期生体内維持に関わる分子機構の解析
日時：平成27年３月６日（金）13：00 〜 16：50
場所：東京大学医科学研究所 講堂
２）感染 症研 究グロ ーバル ネッ トワーク フ ォーラ ム2015（共催：千葉大学真菌医学研究センター 共同利用・共同研究拠点事業 東京大学医科学研究所細菌感
染生物学社会連携研究部門・特別推進研究「病原真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

細菌の自然免疫克服戦略の解明とその応用」【午前の部】
谷口俊文（千葉大学医学部附属病院 感染制御部
米国における HIV 診療最前線

and its host
日時：平成27年11月14日（土）９：30 〜 16：40
場所：千葉大学医学部記念講堂

助教）

加藤誠也
（公益財団法人 結核予防会結核研究所 副所長）
結核をめぐる国際的な課題と国内の課題について松本智成（一般財団法人 大阪府結核予防会
断検査部長）
結核菌のゲノム解析
伊藤功朗（京都大学医学部附属病院

大阪病院

診

３）真菌医学研究センター Monthly セミナー
（東京大学医科学研究所細菌感染生物学社会連携研
究部門共催）
後藤義幸（Colombia University Medical Center, Department ofMicrobiology and Immunology 特別研究員
東京大学医科学研究所 国際粘膜ワクチン開発研究センター 特任准教授）『セグメント細菌による腸管免疫制御機構の解明』
日時：平成27年２月17日（火）10：30 〜

呼吸器内科学助教）

COPD と感染症
加藤康幸（国立研究開発法人国立国際医療研究センター 医長）
エボラ出血熱など輸入感染症について【午後の部】International Forum

Cevayir Coban（IFReC, Osaka University Professor）

Tissue-specific immunopathology during malaria

Gordon Brown（The Institute of Medical Sciences, University ofAberdeen, UK Professor）
C-type lectins: key players in antifungal immunity
Yoshiyuki Goto
（Medical Mycology Research Center, Chiba University
Associate Professor）（The Institute of Medical Science, The University ofTokyo Visiting Lecturer）
Innate lymphoid cells regulate intestinal epithelial
barrier system against bacterial infection

場所：真菌医学研究センター
４）真菌医学研究センター
授 最終講義大会議室

川本進教授・横山耕治准教

横山耕治（千葉大学真菌医学研究センター『３＋40年のカビ研究』

准教授）

川本 進
（千葉大学真菌医学研究センター 教授）『基礎生命医科学（生化学・微生物学）研究者として』
日時：平成27年３月17日（火）10：00 〜
場所：真菌医学研究センター 大会議室
５）真菌医学研究センター Monthly セミナー
（東京大学医科学研究所細菌感染生物学社会連携研
究部門共催）

Yumiko Imai

Jean-Marc Reichhart（Professor, The University of Strasbourg, CNRS,France）『Inside the Nobel-Prize Winning Research on Toll-like
Receptors: Drosophila as a model to study the innate
immune response.』

Dynamic nuclear interactions between influenza virus

日時：平成27年３月17日（火）16：00 〜
場所：真菌医学研究センター 大会議室

（Graduate School of Medicine, Akita University
Professor）

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

71６）真菌医学研究センター Monthly セミナー

（東京大学医科学研究所細菌感染生物学社会連携研
究部門共催）
別役智子（慶應義塾大学 医学研究科 教授）『COPD の増悪因子としての感染症の重要性』
日時：平成27年５月26日（火）17：00 〜
場所：真菌医学研究センター 大会議室

７）真菌医学研究センター Monthly セミナー
（東京大学医科学研究所細菌感染生物学社会連携研
究部門共催）
浅野 桂（米国カンザス州立大学 生物学科 教授）『eIF5類似タンパク質5MP による翻訳制御』
日時：平成27年６月30日（火）16：00 〜
場所：真菌医学研究センター 大会議室
８）真菌医学研究センター

セミナー

Fabio Seiti Yoshikawa-Yamada（千葉大学真菌医学研究センター 大学院生）『CLRs and I L- 1 7 in the immune response to
Tricophyton rubrum』
日時：平成27年７月28日（火）13：00 〜
場所：真菌医学研究センター 大会議室

10）真菌医学研究センター Monthly セミナー
（東京大学医科学研究所細菌感染生物学社会連携研
究部門共催）

Benoit Marteyn（Institut Pasteur, France, Unité de Pathogénie moléculaireet Microbienne）『Oxygen modulation of Shigella flexneri virulence andneutrophils physiology』
日時：平成27年７月30日（木）16：00 〜
場所：東京大学 医科学研究所 ２号館２階
議室

小会11）真菌医学研究センター Monthly セミナー
（東京大学医科学研究所細菌感染生物学社会連携研
究部門共催）

Catarina Costa（University of Lisbon, Portugal
千葉大学 真菌医学研究センター 外国人研究者）『The underestimated role of MFS transporters in thepathogenic fungi Candida glabrata』
日時：平成27年11月17日（火）11：00 〜
場所：真菌医学研究センター 大会議室
12）真菌医学研究センター Monthly セミナー
（東京大学医科学研究所細菌感染生物学社会連携研
究部門共催）
岩倉洋一郎

９）真菌医学研究センター Monthly セミナー
（東京大学医科学研究所細菌感染生物学社会連携研
究部門共催）
萩原大祐（千葉大学真菌医学研究センター 特任助教）『深在性真菌感染症領域で顕在化してきた薬剤耐性問題〜農業から医療 , 越境する薬剤耐性〜』（東京理科大学 生命医科学研究所 教授
千葉大学 真菌医学研究センター 客員教授）『腸管免疫の恒常性維持に於ける C 型レクチンの役割』
日時：平成27年12月15日（火）16：00 〜
場所：真菌医学研究センター 大会議室

日時：平成27年７月28日（火）16：00 〜
場所：真菌医学研究センター 大会議室

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千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 19 巻2015

平成 28 年 3 月発行
発行者

千葉大学真菌医学研究センター
センター長

笹川

〒260-8673

千葉市中央区亥鼻 1−8−1

電話千尋

043−222−7171（代表）March 2016
Published by

Chihiro Sasakawa, Ph. D.

Director, Medical Mycology Research Center
Chiba University

1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba 260-8673, Japan

TEL: 81-43-222-7171
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