平成 20 年 8 月 30 日

The 21st Meeting of Society of Animal Reproductive Biotechnology

第 21 回動物生殖工学研究会（熊本シンポジウム）
プロ

グラ

ム・講演抄録集

日時：平成 20 年 8 月 30 日（土）13:00〜18:00
場所：熊本大学生命資源研究・支援センター
遺伝子実験施設（RI/GTC）6 階セミナー室
世話人：中潟直己（熊本大学 ＣＡＲＤ）

プログラム特別講演

13:00〜13:30「ＴＹＨ誕生の頃の思い出」
豊田 裕（帯広畜産大学名誉教授）
座長：横山峯介

シンポジウム１）「体外受精を活用した家畜生産の現状」13:30〜14:30
浜野晴三（家畜バイテクセンター）
２）「身体障害者補助犬の人工繁殖の現状と将来」14:30〜15:30
鈴木宏志（帯広畜産大学）
座長：中潟直己−

休憩

15:30〜15:50−

３）「ベーコン型アプローチとしての遺伝子トラップ法の重要性」15:50〜16:50
山村研一（熊本大学）
４）「老化卵子救済のための核置換」16:50〜17:50
田中 温（セントマザー産婦人科医院）
座長：鈴木宏志特別講演
ＴＹＨ誕生の頃の思い出
豊田裕（帯広畜産大学・名誉教授）

マウス体外受精のための培地として、ＴＹＨ（１）が報告されてから、37 年の歳月が経過した。その間、ほとんど処方の変更なしに現代に生き続けているのは、日進月歩の科学技術を考えると驚異的とさえ言える。しかし一方では、当初目指した目標が未だに達成されていないという一面もある。演者はすでに７年前に「ＴＹＨ誕生の頃（２）」と題して当時の状況を振り返り、そこから得られる教訓について私見を述べたが、今回は、「１」ＴＹＨのルーツ、「２」ＴＹＨの目指した目標、の 2 点に絞って当時の歴史的な背景を述べてみたいと思う。若い世代の研究者にとって温故知新の糧となれば幸いである。
（１）豊田 裕・横山峯介・星冬四郎：家畜繁殖誌 16(4):147-151, 1971.
（２）豊田 裕：J Reprod Dev：47(5), 2001.

シンポジウム１）体外受精を活用した家畜生産の現状
浜野晴三（社家畜改良事業団家畜バイテクセンター）

牛の繁殖は経済動向に左右されるといっても過言ではなく、それは約４～５年程度の周期で活性と衰退が繰り返されてきた。そこで、畜産経営に有益な副産物を誕生させるべく、様々な繁殖技術が開発利用されてきた。その中で、体外受精技術も実務的な技術として定着した。
和子牛生産を目的とした黒毛和種体外受精卵の利用は、牛肉の輸入自由化が開始された平成３年度からであった。安価な牛肉が輸入されることで、酪農家が生産する交雑種等の価格暴落を防ぐ国の意向を受け、黒毛和種体外受精卵を乳牛に移植して価値の高い和子牛を生産することが目的であった。しかし、当時は受精卵移植自体が普及途上にあり、体外受精技術を畜産農家に理解して貰うことは殆ど不可能であった。また、「ホルスタイン種へ移植した黒毛和種受精卵の産子は交雑種になる」との誤った認識が強く、黒毛和種の登録問題も含め普及は困難を極めた。その後、僅かながら生産した体外受精卵産子の肥育結果が良好であったことから、一転して体外受精卵は和子牛生産のための繁殖素材であるとの認識が強まり、利用件数も増加傾向へ転じていった。
ところが、口蹄疫（Ｈ１２年３月）や牛海綿状脳症（Ｈ１３年８月）の発生、度々発覚する牛肉の偽装販売等が消費者の一時的な牛肉離れを引き起こすことになり、連鎖的に子牛の取引価格にまで影響をおよぼす事象が度々生じたが、黒毛和種体外受精卵の移植による和子牛生産が安定的な経営へ寄与するメリットが明確となったことから、移植頭数は飛躍的な発展を遂げた。
しかし、最近になって生乳の減産型調整や飼料や燃料費の高騰により畜産経営を取り巻く環境はさらに変化をし始めており、余計な手間暇を要する受精卵移植自体に暗い影を落とし始めている。
花田らにより世界初の体外受精卵産子が生産されたのは１９８６（Ｓ６１）年であったが、上述の経過を経て普及に至るには約１５年を要した。
牛を素材とする限り、経済動向等に伴い生産者が要求する繁殖素材は刻々と変化している。経営に有利な性判別受精卵や性選別精液を用いた体外受精卵の供給が望まれる一方、廃用される繁殖雌牛の卵巣と性選別精液との組み合わせで繁殖雌牛生産向けの受精卵、ホルスタイン種の雌の体外受精卵、さらには低受胎牛（繁殖障害）を対象とした交雑種体外受精卵等、方向性を拡大している。

2)

身体障害者補助犬の人工繁殖の現状と将来
鈴木宏志（帯広畜産大学）

我が国では、約 1,000 頭の盲導犬が実動しているが、その需要は 7,800 頭ともいわれている。毎年、120 頭程度の盲導犬が育成され視覚障害者に提供されているが、これらの多くは、老齢盲導犬のリタイアに伴う更新に充当されるため、これまで盲導犬を利用した経験のない視覚障害者への新規貸与は、毎年 50 頭程度にとどまっている。したがって、優良な盲導犬の育成・供給体制の充実が求められるところであるが、我が国の繁殖犬の総数は約 150 頭と少なく、また、盲導犬候補犬の訓練後の合格率は 30-40％と低率であるため、質と量の双方からの改善が急務となっている。我が国において、盲導犬の育成・普及が進まない
原因には社会、文化的背景を含めて様々な要因が関与していると思われるが、繁殖学的側面からは、極めて特徴的な盲導犬の繁殖・育成システムが挙げられる。すなわち、盲導犬候補犬は訓練前に例外なく雌雄ともに生殖器摘出術を受けるために、例え、優秀な盲導犬に育成されても、その子孫を残す術がない。
このような状況を改善するためには、人工繁殖技術の導入・開発が効果的であると考えられるが、イヌにおける人工繁殖技術の開発は、繁殖生理の理解と同様に他の動物種と比較して大きく立ち遅れている。イヌの体細胞クローン技術は、一部の研究機関においては実用化段階にあるものの、凍結胚あるいは体外受精卵の移植による産仔への発生は、未だに報告されていない。凍結精子を用いた人工授精については、諸外国においては十数年前から盲導犬事業への応用が図られ、遺伝子資源の流動化に貢献しているが、我が国において盲導犬の生産育成に応用されたのは 2004 年になってのことである。イヌ精子の凍結保護剤には、ニワトリの卵黄が構成成分として汎用されているが、トリインフルエンザの発生・蔓延にともない、一部の国においてはニワトリの生物材料含むイヌ凍結精子の移動が禁止された事実もあり、新たな課題が生まれてきている。
演者の研究室では、視覚障害者の QOL の向上に資することを目的として幾つかの盲導犬事業所と協力し、ラブラドールリトリバーを対象に、新規の精子凍結保存法の開発に加え、卵巣や精巣の凍結保存と移植、胚の凍結保存と移植、あるいは遺伝子多型解析による盲導犬適性診断系の開発など、生殖工学を駆使した盲導犬の効率的育成システムの開発に取り組んでいるので、その概要を紹介する。

3)

ベーコン型アプローチとしての遺伝子トラップ法の重要性山村研一（熊本大学発生医学研究センター）
2002年のノーベル医学生理学賞を受賞したJohn Sulstonによれば、研究方法論には２つあるという。第１は、仮説検証型(Hypothesis driven)であり、これは通常の研究でよく用いられる方法で、過去のデータに基づき仮説をたて、その仮説を実証するために研究計画を立て、実験を行い、結果に基づき仮説が正しいかどうかを検証する方法である。第２は、無知出発型(Ignorance driven)と呼ばれるもので、博物学がその例である。観察による事実を淡々と積み上げていく方法で、大胆な仮説があるわけではなく、突然理解が深まることもない。
よって、世間で評価されることが少ないともいえる。John Sulstonは、前サンガーセンターの所長でもあるが、ヒトゲノムプロジェクトの推進者として広く知られている。しかし、より有名なのは、線虫を使って、一個の受精卵から出発し、成体にいたる細胞分裂の順序、つまり細胞系譜をすべて明らかにしたことであり、大きな貢献をなした。この研究は、無知出発型の典型的な方法論であるが、この研究からプログラムされた細胞死が明らかとなり、大きな研究分野に発展した。ゲノムの配列を読むゲノムプロジェクトも、無知出発型であり、始められた当初は、研究者がやることではないと公言している人も多数いた。
マウスノックアウトプロジェクトも無知出発型といえ、我が国ではことに理解が低いプロジェクトである。いわく、外国でやるのならそれをもらえばよいという意見もある。しかし、すでにヨーロッパ、カナダ、米国、中国で国家プロジェクトとして始まっているように、重要なのである。そして、2007年にはInternational Knockout Mouse Consortiumが、結成され、EC、ゲノムカナダ、米国NIHの3つの助成団体間でのLetter of Intentが締結された。その狙いは、プロジェクトを実施している国の間で、データやリソース、技術やアプローチの方法、凍結や供給を強調して行おうとするもので、これは逆に言えば、プロジェクトを実施していない我が国は蚊帳の外に置かれかねない状況になっていることを示している。
我々は、早くから我が国においては国際競争力のあるノックアウトマウスプロジェクトの立ち上げの必要性を述べているが、まだ実現していない。その重要なポイントとしては2点ある。第1は、ノックアウトプロジェクトというより、ヒト化マウスプロジェクトを立ち上げるべきという点である。第2は、我が国の野生マウス由来の系統を使うべきであるという点である。これらについて、我々が開発した可変型遺伝子トラップ法を紹介しながら、議論したい。
4) 老化卵子救済およびミトコンドリア病治療のための核置換田中温（セントマザー産婦人科医院）

1997 年 Cohen 等が報告した細胞質注入の効果を更に高めた最終的な治療法は100%細胞質をドナーとレシピエントとの間で交換することである。すなわち、核置換ということになる。この核置換によって、老化卵子が救えるかどうかに関しては相対する意見がある。No の根拠としては、１．加齢により chiasma が減少する。centromere が消失していく。non-dysjunction が増加する、２．栄養状態の低下に伴い、chiasma が減少する、３．genetic 又は environmental
factor の変化で正常な spindle の生成能が低下する、４．卵胞数が減少するとnon-dysjunction が増加する、５．老化遺伝子, apoptosis の発生は、防止できない。一方、Yes であるという根拠としては、１．遺伝子の機能発現には転写因子が必要。良好な卵細胞質内には正常な転写因子が豊富に存在している、２．
DNA 修復酵素（トポイソメラーゼ）が、chiasma の減少を修復するが考えられる。
次に M-Ⅱ期における核置換が有用と考えられる根拠としては、１．M-Ⅱ期卵子における核置換後の胚発生率は、GV 期より明らかに高い（マウス）、２．GV 期卵子を用いた場合には、第一極体放出後、M‐Ⅱ期卵子と核置換する必要がある、
３．ヒト正常 M‐Ⅱ期卵子の細胞質注入は、発生能の低下した卵子の機能を正常に戻す（J．Cohen）、４．第一減数分裂、又は第二減数分裂における染色体異常の発生率に優位差はない（ハムスター）、５．体外受精後の染色体異常の大部分はモザイクである、６．18 トリソミーは、第二減数分裂で生じるが上げられる。
以上の点より、老化卵子の救済法として、M-Ⅱ期卵子における核置換の基礎実験を行った【方法】１．卵子は、ICSI 目的で採取した卵子の中の未成熟卵子（GV、M-I）を、体外で成熟させた M-Ⅱ期卵子を recipient とし、採卵時の提供卵子を donor 卵子とした。本実験は全て日本産婦人科学会の倫理委員会の承認を得ている。２．ノマルスキー微分干渉装置の装着した倒立顕微鏡下に、染色体の位置を確認した。３．染色体真上の透明帯を切除した。４．サイトカラシ
ンＢ 5μg/ul の入った、HTF の中に、15 分間卵子を注入した。内径 10~12mm のピペットで、recipient 卵子の染色体を karyoplast として一旦除去し、その後除核した donor 卵子の囲卵腔内に注入した。５．HTF 内で、30~60 分培養後、Zimmerman の 融 合 液 で 電 気 融 合 を 行 っ た （ 交 流 8V6 秒 + 直 流 1.36 ㎸/cm40microsec）。６．電気融合後、HTF 内で 2 時間培養し、夫の精子で ICSI を行った。【結果】①M-Ⅱの染色体はほぼ全例で確認できた。約 80%は第一極体の近傍にあり、約 20%は離れた部位に認められた。②カリオプラスト除去の成功率は約 85%であった。③電気融合後 ICSI までの培養時間は、30 分より 60～90分の方が胚発生率は高かった。④第一極体の有無の影響：第一極体（+）、（－）

における融合率は、43.8%（7/16）、64.3%（9/14）であった。⑤カリオプラストの大きさ：大および小における融合率は 66.7%（12/18）、33.3%（4/12）であった。⑥核置換後の受精率、分割率は、59.2%（45/76）、30.3%（23/76）であった。
以上の結果より、核置換の技術にはいまだ改良の余地が残されているが、将来老化卵子救済およびミトコンドリア病に対する有望な治療法となることが期待できた。

メモ