2022年6月24日 12:05-12:45 ＠WEB
⽂科省と国⽴⼤学附置研・センターとの定例ランチミーテイング

ヒトiPS細胞を用いた新型コロナウイルス研究
京都大学iPS細胞研究所
増殖分化機構研究部門

高山和雄

高山研究室の紹介
2020年3月～ 高山研究室発足（＠京都大学iPS細胞研究所）
メンバー（11名）
講師（主任研究者）：高山（35歳）
研究員：橋本技術員：三村、坂本、小杉、野辺、安原
学生：出口、Yi、He、横井研究内容• iPS細胞、オルガノイド、臓器チップ技術を用いた呼吸器モデルの開発• 上記モデルの感染症創薬などへの応用
CiRAでの研究業績（2020年3月以降）• 英文学術論文35報• 特許出願4件

COVID-19治療薬開発の現状
レムデシビル、モルヌピラビル、パキロビッド、デキサメタゾン、バリシチニブなどの薬が承認されているが、いまだにCOVID-19特効薬と呼べる薬は開発されていない。
幹細胞生物学の技術を駆使して、感染症創薬を加速化できるモデル開発＆応用研究を行う。
幹細胞生物学

ウイルス学

薬学

SARS-CoV-2研究に使用できる細胞と動物動物実験が必要か？

YES大量の動物が必要？

YES

マウス、ハムスター

NO

霊長類での実験が必要か？

YESNO

Takayama, Trend Pharm Sci., 2020

NO
ヒト臓器に近いモデルが必要か？

NO

YES

ウイルスを増やすことのみが目的か？

NOオルガノイド

YES

Vero細胞サル
フェレット、ネコ

他の細胞株(airway epithelial, Caco-2, Calu-3,
HEK293T, Huh7細胞)

オルガノイドを用いたSARS-CoV-2研究
Type

OriginKey points

References

ヒト気道上皮細胞

Commercially available from variousvendors (Lonza, PromoCell, etc.)

Human airway epithelial cells can isolate SARS-CoV-2 andmimic infected human lung cells. After SARS-CoV-2infection, cytopathic effects were observed.

[5]

ヒト気管支オルガノイド

Generated from commercially available
human bronchial epithelial cells

After SARS-CoV-2 infection, not only the intracellular viralgenome, but also progeny virus, cytotoxicity, pyknotic cells,
and moderate increases of the type I interferon signal canbe observed.

[17]

ヒト肺オルガノイド

Generated from human embryonic stem
cells

The lung organoids, particularly alveolar type II cells, arepermissive to SARS-CoV-2 infection.

[18]

ヒト腎臓オルガノイド

Generated from human embryonic stem
cells

Human kidney organoids produce infectious progeny virus.

[19]

ヒト肝臓オルガノイド

Generated from primary bile ducts
isolated from human liver biopsies

Human liver ductal organoids are permissive to SARS-CoV2 infection, and SARS-CoV-2 infection impairs the bile acid [20]transporting functions of cholangiocytes.

ヒト腸管オルガノイド

Generated from primary gut epithelial
stem cells

Human intestinal organoids were readily infected by SARSCoV-2 as demonstrated by confocal- and electronmicroscopy. Significant titers of infectious viral particles
were detected.

[22, 23]ヒト血管オルガノイド

Generated from human induced
pluripotent stem cells

SARS-CoV-2 can directly infect human blood vesselorganoids.

[19]

Takayama, Trend in Phar Sci., 2020（2020年5月時点の情報）

オルガノイドとiPS細胞を用いたSARS-CoV-2研究（2021年7月時点の情報）

合計50本のコロナ論文をtableにして紹介

Deguchi et al., STEM CELLS Transl Med. 2021

研究成果の紹介
1. iPS細胞を用いたCOVID-19個人差再現
2. 気道オルガノイドを用いたSARS-CoV-2研究

iPS細胞バンクを用いたSARS-CoV-2研究
SARS-CoV-2
500名以上の個人から樹立されたiPS細胞
iPS細胞はほぼあらゆる個人から樹立可能。ドナーバリエーションの豊富さがCiRAの強みの一つ。
COVID-19の個人差をiPS細胞を用いて再現可能か検討する。

SARS-CoV-2がヒトiPS細胞に感染するためにはACE2発現が必要

Sano et al., iScience, 2021

SARS-CoV-2(感染2日目)

ACE2発現iPS細胞

TCID50/mL

感染可能なウイルスの量

100 μmSARS-CoV-2(感染4日目)

100 μmOCT3/4 / SARS-CoV-2 N蛋白質/核感染したACE2発現iPS細胞におけるSARS-CoV-2 N蛋白質の染色画像

非感染

SARS-CoV-2感染

50 μm

50 μm

感染したACE2発現iPS細胞における電顕画像
ヒトiPS細胞に侵入しよ ERGICにおいて出芽してうとするSARS-CoV-2
いるSARS-CoV-2

Sano et al., iScience, 2021

二重膜小胞

Relative gene expression(female iPS = 1.0)

Sano et al., iScience, 2021
CTMPRSS2
Relative RNA copy
number (female iPS = 1.0)

BRelative gene expression(female iPS = 1.0)

A
Relative RNA copy
number (female iPS = 1.0)

8名（女性4名、男性4名）のiPS細胞を用いたSARS-CoV-2感染実験＊＊

DTMPRSS2

p=0.0972

iPS細胞バンクを用いた新型コロナウイルス
感染の個人差の再現と原因究明• ACE2発現iPS細胞に新型コロナウイルスは効率よく感染する。
• ACE2発現iPS細胞を用いて、新型コロナウイルス感染症のための治療薬を評価できる。

• iPS細胞バンクを用いて、新型コロナウイルス感染症の個人差を再現できる。

Sano et al., iScience, 2021

研究成果の紹介
1. iPS細胞を用いたCOVID-19個人差再現
2. 気道オルガノイドを用いたSARS-CoV-2研究ヒト気道オルガノイド基底細胞(KRT5陽性)

線毛細胞(acetylated α-tubulin+)

線毛構造

9 + 2構造1 μm2 μm

SARS-CoV-2の初期感染部位である気道のモデルを作製することから着手。
基底細胞から気道オルガノイドを作製する方法を開発。
Sano et al., Commun Biol., 2022

SARS-CoV-2は線毛細胞に感染するが、基底細胞にはほとんど感染しない
分散後、トランスウェル上に播種
ヒト気道オルガノイド

新型コロナウイルス
感染実験

気液界面培養

感染2日目

感染2日目

20 μm

感染2日目

KRT5/SARS-CoV2 S蛋白質/核×2,000>

acetyl-α-tubulin/SARSCoV-2 S蛋白質/核TCID50/mL

*

20 μm

Sano et al., Commun Biol., 2022

COVID-19治療薬の評価
IFN-α

IFN-β

ISG56

ISG15

** **

**
** **

*
** **

** **

SARS-CoV-2

SARS-CoV-2

SARS-CoV-2

SARS-CoV-2TCID50/mL

relative gene expression(mock=1.0)***

SARS-CoV-2

COVID-19治療薬の抗ウイルス効果を評価できる。

ウイルス作用後に、強い自然免疫誘導効果が確認できる。
また、その誘導はCOVID-19治療薬によって消失する。

Sano et al., Commun Biol., 2022

virus copy number/mL

8種類の変異株を用いた感染実験

B

B.1.351

B.1

P.1

B1.1.214

B.1.617.2

B.1.1.7

B.1.1.529

どのバリアントも効率よく複製するが、オミクロン株（B.1.1.529）の複製力はやや弱い。
（参考：10バリアント、36種類のSARS-CoV-2を保有。）
Sano et al., Commun Biol., 2022

10名の個人の細胞を用いた感染実験
donor #1
donor #2
donor #3
donor #4
donor #5
donor #6
donor #7donor #8
donor #9
donor #10

Sex
FemaleFemaleFemaleFemaleFemale
Male
Male
Male
Male
Male

Race
Caucasian
Caucasian
Caucasian
Caucasian
Caucasian
Caucasian
Caucasian
Caucasian
Caucasian
Caucasian

Cell type
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells
Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cells**Cvirus copy number/mL

B

Age
65Y
43Y
65Y
71Y
41Y
70Y
36Y
40Y
29Y
49Y

virus copy number/mL

A

Sano et al., Commun Biol., 2022

acetyl-α-tubulin/
KRT5/核20 μm

Sano et al., Commun Biol., 2022

acetyl-α-tubulin/
KRT5/核基底細胞

100 μm50 μmacetyl-α-tubulin/ SARSCoV-2 S蛋白質/核感染実験前

KRT5/SARS-CoV-2
S蛋白質/核KRT5/acetylated αtubulin/核ウイルス感染後、生存した基底細胞によって気道上皮細胞層が再生される

感染15日後

感染7日後

20 μm

感染7日後

20 μm

気道オルガノイドを用いた新型コロナウイルス研究
気液界面モデル気道オルガノイド• 気道オルガノイド由来の気液界面モデルは新型コロ
ナウイルスの感染・複製を評価可能• 新型コロナウイルスは線毛細胞に感染する• 生き残った基底細胞は、破壊された気道上皮細胞層を再生する

新型コロナウイルス• 基底細胞による再生能はFGF10に依存している
線毛細胞

Sano et al., Commun Biol., 2022

SARS-CoV-2の研究成果

COVID-19 papers (17 papers)
Commun Biol 2022, Polymers 2022, PeerJ 2022, Antiviral Res 2022, Arch Biochem Biophys 2022, Nature Aging 2022, Mol Ther
Nuc Acid 2021, Int J Biol Macromol 2021a, Int J Mol Sci 2021, Environ Res 2021, ACS Omega 2021, Int J Mol Sci 2021, iScience2021, Int J Biol Macromol 2021b, Comput Biol Med 2021, Polymers 2021, Molecules 2020

COVID-19 review papers (12 papers)
Epidemiologia 2022, ACS Appl Mater Interfaces 2021, Viruses 2021, Autoimmun Rev 2021a, Mater Lett 2021, Stem Cells Transl
Med 2021, Autoimmun Rev 2021b, Biomolecules 2021, ACS Nano 2021, FEBS J 2021, Cell Stem Cell 2020, Trends Pharmacol
Sci 2020

謝辞•Takayama Lab Member (S. Deguchi, E. Sano, R. Hashimoto, N. Mimura, A. Sakamoto, K. Kosugi, T. Nobe, R. Yi, S. He, N. Yasuhara)•

T. Yamamoto, M. Nagao, Y. Matsumura, M. Yamamoto, S. Yamanaka, K. Takahashi, MK Saito, M. Nakawawa, A. Hotta, P. Karagiannis, Y. Torisawa, Y.
Koyanagi, K. Shimura, N. Misawa, T. Noda, Y. Muramoto, A. Hirabayashi, R. Yokokawa, K. Fujimoto, R. Kameda, H. Saito, H. Ono (Kyoto University)•

A. Serrano-Aroca (Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir)•

M. Tambuwala (Ulster University)•Y. Mishra, P. Panda (University of Southern Denmark)•B. Uhal (Michigan State University)•

T. Okamoto, T. Suzuki, Y. Itoh, D Motooka, D. Okuzaki, S. Minami, T. Kobayashi, E. Hara, S. Tsuji, Y. Okada, Y. Fujio, Y. Matsuura (Osaka University)•

A. Saito (Miyazaki University)•

A. Brufsky (UPMC Hillman Cancer Center)•

K. Watashi, H. Ohashi, Y. Sakai (Yamaguchi University)•

N. Morone (University of Cambridge)•S. Hassan (Pingla Thana Mahavidyalaya)•

T. Takebe, N. Saiki (TMDU)•T. Takasaki, J. Sakuragi (Kanagawa Prefectural Institute of Public Health)•Many companies