第 32 回

動物生殖工学研究会

プログラム・抄録集

平成２７年１２月５日（土）（公財）実験動物中央研究所

レクチャールーム

プログラム総会 １２：４０～１３：００

開会挨拶

会長

横山峯介

（公財）実験動物中央研究所

１３：００～
話題提供
司会：横山峯介
コモンマーモセットの初期胚操作
高橋

司 先生

（（公財）実験動物中央研究所 マーモセット研究部

応用発生学研究センター）

１３：５０～
一般講演
座長：後藤元人
１．CRISPR/Cas9 システムを利用した遺伝子編集マウス作製の実際○宮地 均１、北野さつき１、伊藤克彦２、生田宏一１（１京都大学ウイルス研究所、２京都大学大学院医学研究科）

２．自然繁殖では系統維持が困難な SNAP-25 ノックインマウス系統に対する生殖工学
技術の適用◯久保地誠司１、佐藤貴文１、阿部真悟１、梶原雄也１、高橋
高橋正身２、佐藤俊哉１、３、東晃１、山森沙織２、

貞宏１、３（１北里大学医学部遺伝子高次機能解析センター、２生化学、３実験動物学）

３．Cysteine dioxygenase 欠損マウスにおける雄性不妊メカニズムの解明○浅野敦之 1、Heather Roman2、Lawrence Hirschberger2、Martha Stipanuk2、Jacqueline Nelson3、Alexander Travis3(1 筑波大学生命環境、2 コーネル大学人類生態学部、3 コーネル大学獣医学部)

座長：竹尾透

４．環状オリゴ糖による生体膜脂質環境の変化と精子受精能の向上○中尾聡宏 1, 2、酒匂一仁 2、竹本賢司 2、吉本英高 2、堀越裕佳 2、石束祐太 2、
竹尾 透 2、中潟直己 2、笹岡俊邦 2（１新潟大脳研 動物資源、2 熊本大学 生命資源研究・支援センター(CARD)）

５．ニワトリ精子へのコレステロール充填は凍結融解後の生存率を向上させる○牛山 愛１，田島淳史２，石川尚人２，浅野敦之２（１筑波大院生命環境，２生命環境系）

座長：宮地

均

６．マウス二細胞期胚の冷蔵保存における N-アセチル-L-システインの有用性○堀越裕佳、竹尾 透、中潟直己（熊本大学 生命資源研究・支援センター(CARD)資源開発分野）

７．メチル--シクロデキストリンがマウス冷蔵精子の受精能および精子生体膜中コレ

ステロール量に及ぼす影響○吉本英高、武氏志保里、廣瀬優美子、竹尾 透、中潟直己（熊本大学 生命資源研究・支援センター(CARD)資源開発分野）

８．ドーパミンD1受容体を介する神経伝達は大脳基底核の直接路の情報伝達と運動の発現に不可欠である○笹岡俊邦1,2,3, 佐藤朝子2,3, 知見聡美4, 大久保直3, 前島 純3, 新井 慧3,

砂山智子2,5, 小田佳奈子1, 酒井清子1, 前田宜俊1, 神保幸弘1, 馬川恵梨子1,
佐藤俊哉1,3, 藤澤信義1, 横山峯介1,6, 南部 篤4(1新潟大脳研, 2基生研, 3北里大医, 4生理研, 5東大院, 6実中研)

座長：東 貞宏
９．化学物質の許容濃度等の勧告と生殖毒性物質リストの活用について○奥田裕計（中央労働災害防止協会(中災防)・日本バイオアッセイ研究センター）

１０．マウス咬傷事故の対応について－マウス咬傷防止（軽減）手袋について－○石倉知征、松田正史、辰巳宏美、川元由里衣、飯塚裕介、山本貴子、大縄悟志、
望月 忍、長谷川孝徳（理化学研究所横浜事業所 統合生命医科学研究センター（IMS））

閉会挨拶

副会長 浜野晴三（社）家畜改良事業団

話 題 提 供

コモンマーモセットの初期胚操作

高橋 司(公財)実験動物中央研究所 マーモセット研究部 応用発生学研究センター

トランスジェニック（Transgenic: Tg）マウスは、これまで様々なヒト疾患モデル動物が作出され、病態発症機構の解明や治療法の開発研究に貢献している。しかしながら、疾患モデルマウスではヒトと同様の症状が観察されない例も見られ、マウスのヒト疾患モデル動物で得られた研究結果を直接ヒトに外挿できないこともある。そこで開発中の治療法や薬の有効性と安全性の検証にはマウスよりも系統発生学的にヒトに近い、非ヒト霊長類の実験動物が必要となる。
コモンマーモセット(以下マーモセットと略す）は小型で取り扱いが容易な霊長類であり、繁殖能力が高いという性質から実験動物として高い有用性をもつ。マウスと比較してヒトに近い実験動物としてバイオメディカル研究分野で用いられており、2009
年には、実中研の Sasaki らによって、レンチウイルスベクター法により、緑色蛍光タ
ンパク質（Green fluorescent protein：GFP）発現遺伝子を導入した Tg マーモセットの作出と次世代への伝達に成功したことが報告された。今後、遺伝子改変によるヒト疾患モデルマーモセットの前臨床研究への貢献が期待されている。
しかしながら、マーモセットは生殖工学研究の歴史が浅く、マウスや家畜と比べると、十分に生殖工学技術が確立していなかった。我々は Tg マーモセットを効率的に作出するために、マーモセットの性周期管理から採卵手術、初期胚培養さらには移殖手術にいたるまでの一連の生殖工学技術の改良・開発を行ってきた。現在、IVMFC 後の胚盤胞率は他の家畜と同程度までに向上し、体外培養を経た胚による個体も続々生まれてきている。しかしながら、未だ胚盤胞移植による産仔獲得率は低く、更なる検討の余地がある。
今回、我々が取り組んできた Tg マーモセット作製に至るまでの一連のマーモセットの初期胚操作技術の改良・開発と、作製した Tg マーモセットについて紹介する。

コモンマーモセット(Callithrix jacchus)
Size

200-500g

Pregnancy period 145-148 day
Litter size

1-3

Sexual maturation 1.5 years old

一般講演

1．CRISPR/Cas9 システムを利用した遺伝子編集マウス作製の実際○宮地 均１、北野さつき２、伊藤克彦２、生田宏一１(１京都大学ウイルス研究所、２京都大学大学院医学研究科)

近 年 、 人 工 ヌ ク レ ア ー ゼ の Zinc Finger Nucleases (ZFNs) や Transcription
Activator-Like Effector Nucleases (TALENs)を用いてゲノム上の標的遺伝子の破壊・変異導入やレポータ遺伝子のノックインを行う、ゲノム編集技術が実用化されてきた。
なかでも Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)を使った CRISPR/Cas9 システムは、簡易な技法ではあるが、マウスを始め他の種においても多くの成果を上げており、ゲノム編集技術の主流となりつつある。
2013 年に Wang らは、guide RNA と Cas9 mRNA をマウス前核期受精卵の細胞質にイン
ジェクションし、CRISPR/Cas9 システムを用いた最初の遺伝子編集マウス作製の報告をした。その後、2013 年に大阪大学微生物病研究所の Mashiko ら（伊川研）は、guide RNAと Cas9 を発現するプラスミドを前核にインジェクションし、同様の結果を得た事を報告した。我々も、どちらの方法でもマウスにおいて遺伝子編集が行える事を追試し確認した。また、エレクロトポレーションを利用し、マウス前核期受精卵の細胞質に RNA を導入する方法も報告されており、高価な倒立顕微鏡等が不要なため、今後多くの機関で行われるのではないかと予想される。
これまで我々は、CRISPR/Cas9 システムを用いて、総数３０種類ほどの遺伝子編集マ
ウスの作製を行ってきた。主に、Mashiko ら（伊川研）の方法に準じて実施し、標的部位ゲノムの単純欠損を持つマウスは、効率良く作製する事が可能であった。また、同時に合成塩基配列をインジェクションする事で、２−３塩基の置換（アミノ酸の点変異）を持つマウスも、比較的効率良く作製する事が可能であった。一方、数十塩基配列を標的部位にノックインさせたマウスは、上記に比べ頻度が低い傾向にあるが、作製可能であった。しかし、数キロベースの塩基配列を、標的部位にノックインさせる事には成功していない。
今回紹介する我々の結果が、ゲノム編集マウス作製の参考になれば幸いである。

2．自然繁殖では系統維持が困難な SNAP-25 ノックインマウス系統に対する生殖工学技術の適用◯久保地誠司１、佐藤貴文１、阿部真悟１、梶原雄也１、高橋 晃１、山森沙織２、高橋正身２、佐藤俊哉１、３、東 貞宏１、３（１北里大学医学部遺伝子高次機能解析センター、２生化学、３実験動物学）【背景】SNAP-25はシナプス前神経末端からの神経伝達物質の放出に関与している蛋白質である。プロテインキナーゼC(PKC)によるリン酸化はシナプス小胞のリクルートを促進するが、それにはSNAP-25の特異的リン酸部位(Ser187)が関与している。我々はSNAP-25のSer187をAlaに置換したノックインマウス(SNAP-25変異マウス)を作成したが、ホモ動物が離乳に至ることは無く分娩後致死であると考えていた。しかし、変異
マウスのバックグラウンド系統である129とC57BLの子育ての悪さが影響している可能性が考えられ、ICR系統を乳母とすることでホモマウスも離乳に到ることが判明した。
そこで系統維持と解析実験用のマウスを生産するため体外受精、凍結保存および胚移植等の一連の生殖工学技術を１１年間運用しているのでその結果を報告する。
【方法】基本的な年間スケジュールは4〜12週令のC57BL雌に過排卵処理を施し、12週令以上のSNAP-25変異ホモ雄と体外受精を行う。その後2細胞期で卵管移植し、産仔を生産。3〜4週後生産したSNAP-25変異ヘテロ雌に過排卵処理をして以前の生産サイクルで生産した12週令以上のヘテロ雄と体外受精を行う。その後凍結保存と胚移植を行ってSNAP-25変異が野生型、ヘテロ型、ホモ型の動物を生産する。特にヘテロ同士の体外受精の場合に供試卵の数を増やして多くの2細胞期胚を凍結保存しSNAP-25変異マウスの行動試験等の解析実験の予定に合わせて胚を融解移植して動物を生産する。
体外受精はTYH培地を用い受精の場はCa2+濃度を2倍にした培地を用いた。授精後6時間に受精の判定を行い100μM EDTA添加のWhitten培地で2細胞期まで培養し凍結保存と胚移植を行った。年度始めにその年の解析に使用する動物の数を検討しそれに合わせて体外受精する卵子の数を割り出して年に3〜10回程度の体外受精を行った。2細胞期胚の凍結保存はDAP213を用い定期的に融解と移植を繰り返し系統維持と実験用のマウスの生産を行った。
【結果】体外受精の成績はC57BL雌とSNAP-25変異ホモ雄間で約75%〜約98%、SNAP-25変
異ヘテロ間の体外受精成績は約87%〜約95%であった。また、イレギュラーに行った
SNAP-25変異ホモ個体同士の体外受精成績は約91%〜約95%であった。凍結融解成績は

C57BL雌とSNAP-25変異ホモ雄間の胚で回収率が約96%、生存率が約76%であり、SNAP-25
変異ヘテロ間の胚では回収率が約94%、生存率が69%であった。またSNAP-25変異ホモ個体同士の胚の成績は約98%の胚が回収できそのうちの約68%が生存していた。移植成績
は体外受精のみの胚を移植した結果と凍結融解処置も施した胚を移植した結果を合わせるとC57BL雌とSNAP-25変異ホモ雄間、SNAP-25変異ヘテロ間およびSNAP-25変異ホモ
個体間の胚の産仔への発生率はともに約45%程度であった。離乳率はC57BL雌とSNAP-25
変異ホモ雄間とSNAP-25変異ヘテロ間でともに約84%、ホモ間で約81%と遺伝子型による離乳率に大きな差はみられなかった。またヘテロ間で生産された動物のPCRによる遺伝
子型判定ではメンデリズムに沿った結果を確認することができた。尚、生産した動物を用い行動学的な分析などが行なわれ、ホモマウスがオープンフィールド内で多動と無動を繰り返したり、明暗実験では暗部に閉じこもることなどの行動異常を示し、注
意欠陥多動性障害や統合失調症のモデルに成り得る結果が得られつつ有る。
（ Kataoka M, et al. (2011) A Single Amino Acid Mutation in SNAP-25 Induces
Anxiety-Related Behavior in Mouse. PLoS ONE 6(9): e25158.
doi:10.1371/journal.pone.0025158）

3．Cysteine dioxygenase 欠損マウスにおける雄性不妊メカニズムの解明○浅野敦之 1、Heather Roman2、Lawrence Hirschberger2、Martha Stipanuk2、Jacqueline Nelson3、Alexander Travis3(筑波大学生命環境、コーネル大学人類生態学部、コーネル大学獣医学部)【目的】Cysteine dioxygenase(CDO)は Cysteine を Cysteinesulfinate に変換する酸素添加酵素で、Hypotaurine/Taurine 合成経路を調節している。最近、CDO 欠損(CDO-/-)マ
ウスは自然交配試験により雄性不妊を呈することが報告されたがそのメカニズムについては不明である(Ueki et al., 2011)。本研究では、CDO-/-マウスにおいて雄性不妊の原因について調べた。
【方法】CDO-/- および野生型(WT)マウスは CDO+/-マウスを交配させ得た(Ueki et al.,2011)。CDO-/-および WT 精子の受精能力の比較には、 体外受精試験、受精能獲得条件下におけるタンパク質チロシンリン酸化試験および先体反応試験を用いた。また精巣、精巣上体および精子においてウェスタンブロット(WB)あるいは免疫染色を用いて CDO の発現状況を調べた。Taurine および Hypotaurine 合成量の定量には、CDO-/-および WT 精
巣上体管内容物 から分離した内腔液および精子細胞質分画を用いた。精子の浸透圧的膨張に対する耐性を評価するため、様々な浸透圧条件下(160mOsm、320mOsm および420mOsm)で培養した精子において尾部の屈曲率を調べた。同様の試験を 5mM Taurine 存
在下でも行った。
【結果】CDO-/-精子は WT 精子と同様に受精能獲得および先体反応を起こすが、体外受精
能は低いことが示された。WB および免疫染色の結果、CDO は精巣上体頭部に発現するが、精巣および精子には存在しないことが分かった。Taurine および Hypotaurine は精巣上体管内腔液および精子細胞質に存在するが、CDO 欠損により消失することから、精子は精巣上体で内腔液から両物質を取り込む可能性が示唆された。CDO-/-精子の尾部屈
曲率は WT 精子と比べて浸透圧低下にしたがい増加したが、Taurine 存在下でその増加は抑制された。以上の結果から、CDO-/-マウスの雄性不妊は、Taurine および Hypotaurineを欠く精子が浸透圧的膨張への耐性を喪失することで、尾部の形態異常を誘起することに起因することが示唆された。

4．環状オリゴ糖による生体膜脂質環境の変化と精子受精能の向上○中尾聡宏 1, 2、酒匂一仁 2、竹本賢司 2、吉本英高 2、堀越裕佳 2、石束祐太 2、
竹尾 透 2、中潟直己 2、笹岡俊邦 2（1 新潟大学脳研究所動物資源開発研究分野、2 熊本大学生命資源研究支援センター(CARD)資源開発分野）【目的】近年、CRISPR/Cas9 を利用したゲノム編集技術の登場により、様々な動物種において遺伝子改変動物の作製が可能になった。本法を用いた遺伝子改変動物の作製には、受精卵の段階で遺伝子操作を行うため、材料となる受精卵を効率的に作製することが必要である。これまでに私達は、環状オリゴ糖であるメチル -b-シクロデキストリン(MBCD) が、マウス体外受精において精子の受精能を飛躍的に向上させることを見出している。MBCD は、水溶性の化合物であるが、化合物内に疎水性空洞を有しており、脂質を空洞内に取り込んで複合体を形成することが知られている。MBCD による精子に対する受精促進効果は、生体膜脂質との相互作用が関与していると考えられるが、その詳細なメカニズムは不明である。そこで本研究では、脂質との親和性が異なる 3 種類のシク
ロデキストリン (MBCD、ジメチル-b-シクロデキストリン: DMBCD、ジメチル-a-シクロ
デキストリン: DMACD) を用いて、精子の受精能、生体膜脂質の変化および活性化経路に及ぼす影響を検討した。
【方法】C57BL/6J マウスの成熟雄の精巣上体尾部から、精子を採取して実験に供した。
各種シクロデキストリンを含有した培地中で、精子を培養し、精子の受精能の指標として体外受精における受精率および先体反応の誘起率を評価した。次に、各種シクロデキ
ストリン処理が、精子生体膜コレステロールおよびリン脂質の漏出量に及ぼす影響を調べた。さらに、シクロデキストリンによるによる活性化経路を明らかにするために、各種阻害剤が精子の受精能に及ぼす影響を検討した。
【結果・考察】全てのシクロデキストリンにおいて、精子の体外受精率および先体反応
誘起率が上昇した。コレステロール漏出量は、MBCD および DMBCD において増加した。
一方、リン脂質の漏出量は、全ての化合物において増加した。さらに、阻害剤による検討から、シクロデキストリンによる精子の活性化には、Protein Kinase A および Dynaminが関与することが示された。本研究により、各種シクロデキストリンにより生体膜脂質の漏出が生じ、生体膜脂質環境が変化することにより、精子が活性化されていることが示された。本知見は、体外受精における各種シクロデキストリンの有用性を示すと同時に、精子活性化機構における生体膜脂質環境の重要性を示唆している。

5．ニワトリ精子へのコレステロール充填は凍結融解後の生存率を向上させる○牛山 愛１，田島淳史２，石川尚人２，浅野敦之２（１筑波大院生命環境，２生命環境系）【背景および目的】鳥類における精子の凍結保存は効率的な家禽生産のみ成らず希少遺伝資源の保全に欠かせない技術である。しかし、鳥類凍結融解精子では新鮮精子と比較して著しい受精能力の低下が認められる。一般的に精子の凍結処理に伴う受精能低下は細胞膜特性の変化に起因することが知られていた。最近我々は、ニワトリ精子において凍結融解処理がコレステロール流出を誘起することでアポトーシスを促進することを明らかにした。そこで本研究では、ニワトリ精子へのコレステロール充填が凍結融解処理後の生存性に及ぼす影響を検討した。
【材料と方法】性成熟ロードアイランドレッドの射出精液を、0-6 mg/ml コレステロー
ル充填シクロデキストリン(CLC)で処理した。なお、凍結融解処理は常法に従って行った（Tajima et al., 1989）。実験 1: CLC 処理した凍結融解精子(2x108 精子)を超音波破砕に供した。高速遠心分離にて分離・回収した細胞膜分画をコレステロール定量に用いた。実験 2: Propidium Iodide および FITC-Peanut agglutinin を用いて CLC 処理した
凍結融解精子の生存性および先体の正常性をそれぞれ調べた。実験 3: CLC 処理した凍結融解精子において、Annexin V-FITC と Propidium iodide を用いてアポトーシスの発生率を調べた。実験 4: BODIPY-コレステロールを用いて精子に充填されたコレステロ
ールの局在を調べた。
【結果】実験 1: CLC 処理によってコレステロールは濃度依存的に精子細胞膜へ充填された(0、0.5、1.5、3、6mg/mL CLC：2.21、2.71、3.59、3.87、5.02μg)。実験 2: 1.5mg
CLC 処理は 0mgCLC 処理と比較して、融解後生存率を有意に増加させた(48.5 vs 71.8%)。
さらに、CLC1.5mg 処理において先体の正常性が保たれることが明らかとなった。(75.0
vs 76.8%)。実験 3：CLC1.5mg 処理精子におけるアポトーシス発生率は CLC 0mg 精子と比較して有意に減少した。（32.4 vs 14.2%）。実験 4: CLC 処理によって充填された
BODIPY-コレステロールは精子細胞膜全体、特に頭部に集中して局在していた。
【考察】本研究の結果は、CLC 処理は鳥類精子細胞膜へのコレステロール充填に有用であり、凍結処理によるコレステロール流出の影響を軽減できることを示唆している。さらに、1.5mg/ml CLC 処理は精子の融解後生存率を増加させること、またこの増加はコレステロール流出に伴うアポトーシスの発生が抑制されたことに因ると考えられる。
【結論】1.5mg /ml CLC 処理はコレステロール流出に伴うアポトーシスを抑制すること

で、結果的に凍結融解精子の生存率を向上させることが明らかとなった。今後は、人工授精を用いて CLC 処理した凍結融解精子の受精能を検討する。

6．マウス二細胞期胚の冷蔵保存における N-アセチル-L-システインの有用性○堀越裕佳、竹尾 透、中潟直己（熊本大学 生命資源研究・支援センター（CARD）資源開発分野）【目的】二細胞期胚の冷蔵保存技術は、研究施設間における遺伝子改変マウスの簡便な輸送法として利用されている。二細胞期胚の冷蔵輸送の利点は、生体輸送に比べて安価であることや凍結胚の輸送で必要となる輸送容器や胚を融解するための技術を必要としないことである。これまでに私達は、マウス二細胞期胚の冷蔵保存において、M2 培地が有用であることを明らかにしている。しかしながら、胚の保存期間が延長することにより、発生能が低下するという問題がある。冷蔵保存した二細胞期胚における発生能の低下には、酸化ストレスが関与する可能性が考えられるが、胚の冷蔵保存と酸化ストレスの関係は不明である。そこで本研究では、マウス二細胞期胚の冷蔵保存における酸化ストレスを評価し、抗酸化剤である N-アセチル-L-システイン（NAC）が冷蔵保存した二細胞期胚の発生能に及ぼす影響を検討した。
【方法】C57BL/6J マウスから採取した卵子および精子を用いて体外受精を行い、二細胞期胚を作製した。二細胞期胚の冷蔵保存は、M2 培地あるいは M2 培地に NAC を添加した保存液中で保存した。二細胞期胚の細胞質中チオール量は、チオール選択的蛍光試薬
にて細胞質中チオール基を標識し、各細胞における蛍光強度を測定した。また、冷蔵保存した胚の発生能は、体外培養および胚移植により評価した。
【結果・考察】冷蔵保存した二細胞期胚は、保存期間の延長に伴い、細胞質中のチオー
ル量が減少した。一方、冷蔵胚におけるチオール量の減少は、冷蔵保存液に NAC を添加することにより改善された。また、NAC は、96 時間冷蔵保存した二細胞期胚の胚盤胞期胚への発生率を改善した。最後に、NAC を添加した冷蔵保存液中で、96 時間保存した二細胞期胚から、胚移植により産子が得られた。以上、本研究により、二細胞期胚の冷蔵保存における発生能の低下において、細胞質内チオールの減少が関与することが示唆された。また、NAC を冷蔵保存液に添加することにより、冷蔵胚の発生能の改善が可能であることを明らかにした。本知見は、二細胞期胚の冷蔵保存における発生能の低下の要因を明らかにすると共に、マウス二細胞期胚の冷蔵保存技術の改良に有用な知見を提供するものである。

7．メチル-b-シクロデキストリンがマウス冷蔵精子の受精能および精子生体膜中コレ
ステロール量に及ぼす影響○吉本英高、武氏志保里、廣瀬優美子、竹尾 透、中潟直己（熊本大学 生命資源研究・支援センター (CARD) 資源開発分野）【目的】現在、世界中で遺伝子改変マウスの生体輸送が行われている。しかしながら、遺伝子改変マウスの輸送は、輸送中の逃亡や死亡、微生物学的汚染の拡大、遺伝子組換
え生物の使用に関する法規制および実験動物の福祉の観点から、生体輸送に代替する輸送法を使用することが望まれている。そこで我々は、遺伝子改変マウスの新規輸送法として、精巣上体尾部の冷蔵輸送法を開発した。本法では、冷蔵輸送した精巣上体尾部から精子を採取し、体外受精および胚移植により産子を得ることができる。冷蔵精子は、保存期間の延長に伴い受精能が低下するが、メチル-b-シクロデキストリン (MBCD)を精子前培養時に処理することで、受精能の改善が可能である。しかしながら、マウス冷蔵
精子における MBCD の受精能改善作用に関する詳細な検討は行われていない。そこで本研究では、MBCD がマウス冷蔵精子の受精能及び精子生体膜中コレステロール量に及ぼす影響を検討した。
【方法】精子および卵子は、C57BL/6 マウスの成熟雄および雌マウスから採取した。
雄マウスから採取した精巣上体尾部を冷蔵保存培地 (Lifor: Cell Preservation
Solutions, LLC 社)) 中で、2 日間冷蔵保存した。冷蔵保存した精巣上体尾部から精子を採取し、modified Krebs-Ringer bicarbonate solution (TYH) から bovine serum
albumin (BSA) を除去した free-TYH (control) あるいは、free-TYH に BSA あるいは
MBCD を添加した精子前培養培地中で培養した。雌マウスから採取した卵子卵丘細胞複合体を体外受精培地 (modified human tubal fluid, mHTF) 中に導入し、前培養した精子と共培養した。媒精の翌日、二細胞期胚への発生を確認し、受精率を算出した。
また、各種培養条件下で処理した精子について、lectin peanut agglutinin (PNA) 法
により、先体反応誘起率を評価した。最後に、精子中コレステロール量について、
filipin 染色により中コレステロールを蛍光標識し、フローサイトメーターにて蛍光強度を測定した。
【結果】MBCD は、冷蔵精子を用いた体外受精において、受精率を上昇させた (control:
19.5%、BSA: 22.5%、MBCD: 79.1%)。MBCD 処理精子は、先体反応誘起率が最も高かった(control: 36.7%、BSA: 55.6%、MBCD: 68.5%)。MBCD は、冷蔵精子の生体膜中コレステ
ロールを低下させた(control: 93.3%、BSA: 85.4%、MBCD: 46.7%)。

【考察】MBCD は、マウス冷蔵精子において体外受精における受精率および先体反応誘起率を向上させた。また、MBCD は、BSA と比較して高いコレステロールの除去能を示した。これらの結果から、冷蔵精子における MBCD の高い受精能改善作用は、強力なコレ
ステロールの除去能が関与していることが示唆された。以上、本知見は、マウス冷蔵精子における受精能低下に対して MBCD の有用性を示すと共に、コレステロールの除去が冷蔵精子の受精機能の改善に重要であることを示している。

8．ドーパミンD1受容体を介する神経伝達は大脳基底核の直接路の情報伝達と運動の発現に不可欠である○笹岡俊邦1,2,3, 佐藤朝子2,3, 知見聡美4, 大久保 直3, 前島 純3, 新井 慧3,
砂山智子2,5, 小田 奈子1, 酒井清子1, 前田宜俊1, 神保幸弘1,馬川恵梨子1,
佐藤俊哉1,3, 藤澤信義1, 横山峯介1,6, 南部 篤4(1新潟大脳研, 2基生研, 3北里大医, 4生理研, 5東大院, 6実中研)

ドーパミンの情報は、運動調節・認知・動機付け学習・報酬学習など様々な行動の制御に深く関連することが知られている。D1ドーパミン受容体(D1R)及びD2ドーパミン受容体(D2R)は、線条体への投射神経細胞に高く発現し、運動の調節に重要な働きを持つ。D1Rを介する情報は、運動を促進すると考えられているが、D1Rを欠損しているD1R
ストレートノックアウト(D1RKO)マウスは運動量の過剰を示す。D1Rの欠損に対する発達期の適応を避けるため、D1R欠損の背景にテトラサイクリンで発現制御されるD1Rを導入した遺伝子操作マウスを開発した。本マウスは、ドキシサイクリン(Dox)投与前は、D1Rプロモーター制御下でD1Rが高く発現し、D1RKOマウスの運動量の過剰をレスキューする。
成熟期のD1Rの働きを明らかにする目的で、Doxの投与によりD1R発現を抑制し、運動量の計測・ロタロッド試験などの行動解析を行った。3週間のDox投与によりD1R発現は、生化学的・組織化学的に検出限界以下に低下した。運動量は、徐々に減少し、Dox投与の4週目には、投与前の33％程度まで低下した。また、ロタロッド試験の成績は、対照マウスよりも有意に低下した。
大脳皮質を電気的に刺激して運動の指令をシミュレートすると、指令は大脳基底核の３つの経路を通って伝達され、正常な状態では３相性（興奮－抑制－興奮）の神経活動として大脳基底核出力部（脚内核）で観察されるが、D1R欠損の状態では抑制が見られなかった。従来の定説とは異なり、D1Rを介する情報伝達がない状態であっても、大脳基底核出力部の自発的な神経活動は変化しなかった。抑制は大脳基底核の「直接路」を通って伝えられ、運動を誘発すると考えられている。
このことから、D1Rを介する情報伝達は、大脳基底核の「直接路」の情報伝達と、運動の発現に不可欠であると考えられる。

9．化学物質の許容濃度等の勧告と生殖毒性物質リストの活用について

奥田裕計（中央労働災害防止協会(中災防)・日本バイオアッセイ研究センター）「健康と安全チェックが作業の基本 しっかり守ってゼロ災職場」中災防が掲げている来年の年間標語です。
近年、印刷工場において従業員が胆管がんを発症し、その原因は洗浄作業に用いた化学物質の長期間曝露とされています。また、当該作業場ではその化学物質のリスクアセ
スメント（化学物質の危険性・有害性の同定、量－反応（影響）関係の分析、曝露の状
況、リスクの低減措置の検討等）が適切に実施されていませんでした。そのため、国の方針としてヒトに対する一定の危険性・有害性が明らかになっている化学物質（640 物
質）については、労働災害を未然に防止するために、事業者の責務として労働安全衛生法で定める労働災害防止のための措置を徹底するとともに、快適な職場環境の実現と労働条件の改善を通じて、職場における労働者の安全と健康を確保しなければならないとしています。
実際に職場でリスクアセスメントを行うに際し、有害性評価に基づき設定されている
許容濃度等は有効に利用できます。
「許容濃度等の勧告*」は、化学物質に対する許容濃度、生物学的許容値、発がん性分類、感作性物質、生殖毒性物質、ならびに物理的要因（騒音、衝撃騒音、高温、寒冷、全身振動、手腕振動、電場・磁場）に対する許容基準で構成され、職場におけるこれら環境要因による労働者の健康障害を予防するための手引きに用いられることを目的にしています。
「許容濃度等の勧告」には生殖毒性物質のリストが公表されています。生殖毒性を示
す物質を証拠の確からしさに基づいて第 1 群・第 2 群・第 3 群に分類して示したもの
で、生殖毒性の定義、分類各群の定義・判定基準、分類された物質の表から構成されています。生殖毒性を「男女両性の生殖機能に対して有害な影響を及ぼす作用または次世代児に対して有害な影響を及ぼす作用とする。」と定義しており、生殖機能のみならず胚の発生から離乳後の発育等、発生・発達毒性を含めたものとしています。また、授乳への影響や授乳による影響も含むとしています。
有害性に基づいた（ハザードベース）生殖毒性物質リストのリスクアセスメントへの活用について、まず有害性の同定（生殖毒性の確認）で有用であり、該当すれば母性保護の観点からの配慮が必要になります。また、許容濃度よりも低い曝露レベルで影響が認められた物質（現在 3 物質）については、注意喚起の表示をし、リスクの判定において配慮が必要となります。限定的な証拠しかなく生殖毒性が疑われる物質（第 3 群）については、予防的対応の原則に基づく配慮が必要と考えています。
*日本産業衛生学会（URL https://www.sanei.or.jp）参照
許容濃度とは、「労働者が 1 日 8 時間、週間 40 時間程度、肉体的に激しくない労働強度で有害物質に曝露される場合に、当該有害物質の平均曝露濃度がこの数値以下であれ
ば、ほとんどすべての労働者に健康上の悪い影響が現れないと判断される濃度である。」と定義されており、もともと規制を目的とした数値ではありません。科学的立場に基づいた許容基準として広く受け入れられていますが、完全なる安全を保障する数値ではありません。また、有害要因に対する感受性には個人差があることを認識していなければなりません。

10．マウス咬傷事故の対応について－マウス咬傷防止（軽減）手袋について－○ 石倉知征、松田正史、辰巳宏美、川元由里衣、飯塚裕介、山本貴子、大縄悟志、
望月忍、長谷川孝徳(理化学研究所横浜事業所 統合生命医科学研究センター(IMS))

動物実験従事者において、実験動物アレルギーに対する危機管理は近年高まっており、
日本実験動物学会でも動物アレルギー検討ワーキングループが立ち上がり、予防指針のとりまとめも進められている。1985 年に「実験動物アレルギーの現状と対策に関する研究班」が行ったアンケート調査結果によると、
わが国の大学での有症者の割合は 22.1%
であり、4 人ないし 5 人に１人が実験動物アレルギーであると報告している１）。
また、近年アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギーなどのアレルギー疾患のある人が国民の 30％を超えると推定され、年々増加の傾向にある。
このような事態は実験動物アレルギーに関しても例外ではなく増加しており、実験動物従事者の職業病の一つして認識されている２）。
実験動物アレルギーの中でも、マウスによる咬傷事故は場合によってはアナフィラキシーショック(血圧低下、抹消循環障害、意識障害)などの重篤な症状を引き起こす可能性があり、動物実験従事者にとって咬傷防止対策は重要となる。
空調設備、飼育ラック、ケージ交換設備等のアレルゲンの暴露を抑制する機器や機材はかなり開発されたが実験動物アレルギーの発生率は抑制できておらず、動物に直接触れる動物実験従事者への十分な実験動物アレルギー対策が必要である。当施設においても過去に数回、マウス咬傷により重篤な症状を引き起こした事故が発生し、労働基準監督署からの改善指示、立ち入り検査があった。それらを踏まえて動物施設利用におけるルールを改正するとともに、従事者全員に対して「マウスの保定」の確認を行った。当施設における施設利用にあたっての動物実験従事者登録ルールと、新たに検討している咬傷防止（軽減）手袋についても紹介したい。また各研究機関における動物実験開始時の教育方法など広く意見をいただければと思う。

引用文献
１）川内忠平.わが国における実験動物アレルギーの発生状況 .実験動物.36：95101,1987. ２）日本実験動物技術者協会. 第 44 回総会. 講演要旨集.2010.

お知らせ
第３３回動物生殖工学研究会シンポジュウム期

日 平成２８年６～７月（予定）場

所 城崎温泉(兵庫県)