第２６回

動物生殖工学研究会

プログラム・抄録集

平成２３年１２月４日（日）
北里本館

大会議室

プログラム

開会挨拶

会長

横山峯介

１．特別講演座長

横山峯介

器官培養法を用いた in vitro 精子形成法の開発
小川毅彦先生（横浜市立大学大学院医学研究科泌尿器病態学）

２．特別講演座長

横山峯介

顕微授精によって誘導される遺伝子発現の変化
幸田 尚先生（東京医科歯科大学・難治疾患研究所・エピジェネティクス分野）

３．一般講演座長

板垣佳明

１） マウス体外受精におけるメチル--シクロデキストリンと還元型グルタチオンの応用○竹尾 透、堤 晶、大丸泰知、福本紀代子、春口幸恵、近藤朋子、中牟田裕子、
竹下由美、松永寛子、浦川真由子、岩本まり、高橋 郁、土山修治、酒匂一仁、
中尾聡宏、吉本英高、中潟直己（熊本大学生命資源研究・支援センター（CARD）資源開発分野）
２） 近交系マウス体外成熟卵子を用いた産子作出方法の改善と母性制御機構が発生に与える影響○西村愛美 1) 、石束祐太 2) 、松浦悟 2)、杉本奈央 2)、石川裕子 2) 、三谷匡 3)、
細井美彦 1,2,3) 、安齋政幸 3) （ 1) 近畿大学大学院生物理工学研究科、 2) 近畿大学生物理
工学部、 3) 近畿大学先端技術総合研究所 ）３） マイクロサテライトマーカーを用いたマウス系統の遺伝学的モニタリングの確立とその応用○海野あゆみ 1)、飯名瑞希 1)、大久保喬司 1) 、新妻大介 1) 、石原直樹 1) 、伊藤正人 1) 、藤井功輔 1) 、武笠功 2)、上野渉 3)、早尾辰雄 3) 、西川哲 4) （ 1） （株）サイエンス・サービス 、
2)（株）島津製作所、 3) （独）放射線医学総合研究所 基盤技術センター 研究基盤技術部

生物研究推進課、 4) （独）放医研 基盤技術センター
４）入墨法によるマウス新生仔の個体識別○前田宜俊（新潟大学脳研究所）

座長
５）

福井えみ子

ニワトリ初期胚に存在する生殖巣生殖細胞(GGCs)の新規分離法開発と生殖系列キメラの作製○中島友紀・田島淳史（筑波大学大学院生命環境科学研究科）

６）Effect of naloxone, a mu-opioid receptor antagonist, on oocyte maturation andembryonic development in pigs
○Thanh Quang DANG-NGUYEN 1,2 , Nguyen VIET LINH 3,4 , Rosa MINOIA5 , Masahiro
KANEDA2 ,Tamas

SOMFAI 2 ,Seiki

HARAGUCHI 2,

SatoshiAKAGI 2 ,Kazuhiro

KIKUCHI 4, Michiko NAKAI 4 , Atsushi TAJIMA1 and Takashi NAGAI 2 （ 1 University ofTsukuba; 2 National Institute of Livestock and Grassland Science; 3 The University ofTokyo; 4 National Institute of Agrobiological Sciences; 5 University of Bari, Italy）
７） X、Y 精子選別によるイヌの雌雄産み分け技術の開発― FISH 法によるイヌ精子の性判別法の確立 ―○大井真矢 １） 、山田圭介 ２） 、早川宏之 ２） 、鈴木宏志 １） （ １） 帯広畜産大学原虫病研究センター、 ２） 社団法人ジェネティクス北海道）

４．懇親会（北里本館１階職員食堂）

１．特別講演
器官培養法を用いた in vitro 精子形成法の開発
小川毅彦（横浜市立大学大学院医学研究科泌尿器病態学）
哺乳類の精子形成を in vitro で行う研究には 1 世紀におよぶ長い歴史がある。しかしながらこれまで in vitro での精子形成は部分的な成功にとどまり、精原幹細胞から精子完成までの完全な精子形成を再現する方法は確立していなかった。精子形成の分子・細胞レベルでの機構とその障害の機序を研究するためには、in vitro 精子形成系の開発が必要不可欠であるとの考えから、我々は in vitro 精子形成の研究を 2007 年に開始した。その際、1960 年代に精力的に研究された器官培養法の手法を再検討することを主眼とした。
実験には、減数分 裂特異 的に GFP を発現する 2 種類のトランスジェニックマウス（Tg）（Acr-GFP と Gsg2-GFP）を用いた。これら Tg マウスの仔の精巣組織を器官培養し、様々な培養条件を検討する実験を繰り返し行なった。その結果、組織片をアガロースゲルに乗せて培養
液と気体層の境界に置き、34℃、無血清培地を用いた条件で、Acr-GFP と Gsg2-GFP が発現し、減数分裂を経て、精子形成が完成できることを見出した。産生された精子からは、顕微授精により健康な産仔が得られた。この結果は、これまでパキテン期で停止してしまうとされていた
過 去の知 見 を翻し、器 官 培 養 法で完 全な精 子 形 成が哺乳 類において可 能であることを示した。
一方、精子幹細胞の培養法が 2003 年に開発され、げっ歯類の精子幹細胞に関しては invitro においてそれらの自己複製増殖が可能になっている。しかしながらこれらの培養精子幹細胞（GS 細胞）を in vitro において分化誘導することはこれまで不可能であった。我々は、上述した器官培養法と精細管内移植法を組み合わせた体外移植培養法とも呼ぶべき手法を開発
し、GS 細胞からの精子産生を試みた。その結果、GS 細胞からの in vitro 精子形成が認められ、精子産生にも成功した。GS 細胞由来の円形精子細胞を用いた顕微授精により産仔も得られた。
今回開発された器官培養 法と体 外移植 培養法をさらに発展させ、多種 動 物の精子形 成が in vitro で可能となれば、発生工学への貢献も期待でき、疾患モデル動物作成に応用できると思われる。

２．特別講演
顕微授精によって誘導される遺伝子発現の変化
幸田 尚（東京医科歯科大学・難治疾患研究所・エピジェネティクス分野）
顕微授精(ICSI)の技術は発生率も高く、作られたマウスには外見上の異常は認められない。
一方、ヒトにおいては 1992 年に確立して以来、日本においても 2008 年末までに 64,174 人の子供がこの技術により誕生しており、現在の生殖補助医療の約半数がこの技術の適用を受けている。この技術がヒトの個体発生や成長に与える影響は、これまでも長く議論されてきたが、明確な影響は認められないとする多くの疫学調査に加えて、ゲノムインプリンティング異常の率が高まるという報告をはじめ影響があるとする論文もいくつか発表されており、結論が出ていな
い。
我々は、遺伝的に均一なマウスを用い ICSI の操作それ自身が遺伝子発現に及ぼす影響を検討した。その結果、自然交配と IVF の間には有為な差が認められなかったが、ICSI により作出された個体の出生時の産仔の脳、肝臓、腎臓の３つの臓器 で、それぞれ５％弱の遺伝子の発現量が２倍以上変化していることを見いだした。この変化は次世代にこの影響はマウスの成長とともに消失していき、また通常の交配では次世代に伝わらないことから、エピジェネティクスな影響であると考えられる。成体時での表現型には軽微な影響があるものの、その変化は正常なマウスの集団の中でみられるばらつきの中に収まる範囲であることも確認された。さらに、これらの影響を受ける遺伝子はマウスの系統によって異なること、変化は着床前の時期に既に認められることも明らかにした。
受精時の操作がその後発生の過程を経ても消えることのない変化を及ぼすことは、胎仔期のエピゲノム修飾がその後の個体の個 性に影響 を及ぼすという意味で、エピジェネティクスの重要性を示す現象であると考えている。また、顕微授精の影響が出生後も残っていることが確認されたのは初めてのことであり、今後、ヒトにおける新生児・幼児期の詳細な疫学研究と生殖補助医療へのフィードバックが進む必要があると考えている。

３．一般講演
１） マウス体外受精におけるメチル--シクロデキストリンと還元型グルタチオンの応用○竹尾 透、堤 晶、大丸泰知、福本紀代 子、春口幸恵、近藤朋子、中牟田 裕子、竹下由美、松永寛子、浦川真由子、岩本まり、高橋 郁、土山修治、酒匂一仁、中尾聡宏、吉本英高、中潟直己（熊本大学 生命資源研究・支援センター（CARD）資源開発分野）
近年、生命科学研究において遺伝子改変マウスが汎用されるようになり、マウス生殖工学技術の有用性が高まってきている。特に、マウス体外受精は、一度に大量の受精卵を作出できることから、胚移植を利用した遺伝子改変マウスの増産、あるいは胚の凍結保存を目的とした二細胞期胚の作製において、極めて有用な技術として利用されている。
これまでに私達は、通常の体外受精法では高い受精率を得ることが困難であった C57BL/6
マウスの凍結/融解精子において、受精率の改善に有用な体外受精法の開発を進めてきた。
本検討の中で、メチル--シクロデキストリン（MBCD）を用いて精子の受精能獲得を誘起し、さらに還元型グルタチオン（GSH）によって透明帯の形態を変化させ精子の侵入を容易にすること で 、 受 精 を 促 進 せ し め るこ と を 見 出 し た (Takeo et al, Biol Reprod; 2008, Takeo andNakagata, Biol Reprod; 2011)。
本報告では、種々のマウス系統の凍結/融解精子、海外の研究機関で採用されている精子凍結保存 法で作製された凍結/融解精 子、および冷蔵保存した精子を用いた体外受 精に対する MBCD および GSH の有用性を評価し、若干の知見が得られたので紹介する。

２） 近交系マウス体外成熟卵子を用いた産子作出方法の改善と母性制御機構が発生に与える影響○西村愛美 1)、石束祐太 2)、松浦悟 2)、杉本奈央 2) 、石川裕子 2)、三谷匡 3) 、細井美彦 1,2,3)、
安齋政幸 3)（ 1) 近 畿大 学大 学院 生 物理 工学 研究 科、 2) 近畿 大 学生 物理 工学 部、 3) 近畿 大学 先端 技術
総合研究所）

マウスにおける体外初期発生の研究において、未成熟卵子を用いた体外成熟後の体外受精などが以前から研究されている。さらに、体外成熟卵子を用いた体外受精により産子が得られている 1)。しかし、使用されたマウスの系統は交雑種あるいはクローズドコロニーが多く、近交系に由来する報告は少ない。本発表では、近交系 C57BL/6 マウスを用いた卵巣内卵子の有効利用を目的に、生殖補助技術を用いた体外成熟由来卵子からの初期発生および卵子内在性因子の検出方法について紹介させて頂きます。

体外成熟卵子を用いた体外受精操作
近交系マウスからの体外成熟培地には、FBS を添加した修正 TaM 培地 2) を用いており、こらら発 生した体 外 成 熟 卵 子 における体 外 受 精 操 作 には、レーザー穿 孔 装 置 (XYClone：ニッコ
ー・ハンセン(株))を用いて体外受精を行なうことが効率的であることを見出した 3） 。また、レーザ
ー照射時間変更による体外受精成績は、それぞれ 28%～60％であり、レーザー穿孔処理を施すことによって顕著に向上することが認められた。また産子成績は 26～6%とレーザー照射時間が短い程、産子成績が向上することが認められ、レーザー光の熱量が胚発生に影響する可能性が示唆された。また、低処理時間でのレーザー穿孔処の理受精成績向上のため、精子濃度を 2.0～8.0×10 2 /µL,と調整し体外受精成績の検討と産子への発生能を検討した。精子濃度
処 理 区 に お け る 受 精 成 績 は 33% ～ 61% で あ り、 対 照 区 と 比 較 し 、 有 意 な 差 が 認 め ら れ た(P<0.05)。精子濃度を調節する事で受精成績が向上することが示され、またレーザー穿孔を併用することで、安定した受精成績を得ることができることが示された 4） 。

冷蔵輸送操作による産子作出
バイオリソース分野では冷蔵輸送技術が開発され凍結輸送に代わる技術として注目されている。私たちは、排卵障害などをもつマウスを想定して、体外成熟体外成熟由来 2 細胞期胚の輸送を試みた。得られた体外成熟由来 2 細胞期胚は、近畿大学先端技術総合研究所（和歌山）から熊本大学・CARD（熊本）冷蔵輸送したところ、約 48 時間後における冷蔵保存胚は、100％の生存率であり、それらの一部の胚を移植した結果、10％の産子を得た。以上の結果より、体外成熟由来 2 細胞期胚の冷蔵輸送・冷蔵保存が可能であることが示された 5） 。
未成熟卵子を用いた遺伝子発現制御の検出方法
本実験では、卵細胞質内の発現機構を探求する手段として、QuantiGene ViewRNA を用いて in situ hybridization 法を行い、未成熟卵子からの形態学的特性および遺伝子発現制御の検出方法を、単一卵子を用いることにより、その実験手法の確立を行った。今回観察する発現
因子は、卵子の成熟に関与する因子 Gdf9 および、ハウスキーピング因子 Gapdh の各プローブを用いて実験手法を検討した。本 kit を用いた in situ hybridization 法では、いずれの因子においても、4 細胞期胚までの発現を認め、それ以降の初期胚の発現を検討している。また、実験操作時間は、1～2 日間であり短時間での処理が可能であった。さらに、本実験ではプレートを用いてキャピラリー操作にて卵子を取り扱うため、効率よく卵子の回収が可能で有り、より簡便であると考えられ、今後、未成熟 卵子あるいは成熟卵子そして初期胚における単一卵子での遺伝子発現の解析に有効なツールとなることが示された 6） 。

参考文献
1. Eppig JJ,Schroeder AC.(1989).Biol Reprod.41(2):268-76.
2. 佐東春香,西村愛美,森田真裕,古田祐奈,柳美穂,安齋政幸.(2009).
実験動物技術.44(2):43-48.
3. 西村愛美,大本夏未,西山有依,柳美穂,三谷匡,細井美彦,入谷明,安齋政幸.
(2010).近畿大学先端技術総合研究所紀要.15:27-35.
4. 西村愛美,西山有依,柳美穂,川辺敏晃,三谷匡,細井美彦,安齋政幸.(2010).
J.Mamm.Ova Res.27(2):62.
5. 西村愛美,中牟田裕子,福本紀代子,近藤朋子,春口幸恵,竹下由美,土山修治,
石川裕子,石束祐太,細井美彦,三谷匡,竹尾透,中潟直己,安齋政幸.
近畿大学生物理工学部紀要(投稿中).
6. 西村愛美,近藤健二,木我敬太,東佳澄,田部和宏,中川隆生,加藤博己,細井美彦,安齋政
幸.(2011).近畿大学先端技術総合研究所紀要.16:35-42.

３） マイクロサテライトマーカーを用いたマウス系統の遺伝学的モニタリングの確立とその応用○海野あゆみ 1)、飯名瑞希 1)、大久保喬司 1) 、新妻大介 1) 、石原直樹 1) 、伊藤正人 1) 、藤井功輔 1)、武笠功 2) 、上野渉 3) 、早尾辰雄 3) 、西川哲 4)（ 1) （株）サイエンス・サービス 、 2) （株）島津製作所、 3) （独）放射線医学総合研究所 基盤技術センター 研究基盤技術部 生物研究推進課、 4) （独）放医研 基盤技術センター）
第 45 回日本実験動物技術者協会全国総会（2011）において「MultiNA を用いたマイクロサテ
ライトマーカーによるマウス系統の遺伝学的モニタリングの試み」（実験動物技術、第 45 巻 1 号、9-14、2010）と題する論文で第 30 回研究奨励賞を受賞いたしました。
受賞の対象となった論文は５報一連の論文の第 2 報目であり、本発表では、現在投稿中の５報目を除いた１報目から４報目 1)2)3)4)までの内容を発表致します。
複数のマウス系統を維持している機関では、同一毛色の異系統マウス間での誤った交配、つまり遺伝学的汚染（遺伝的コンタミネーション）はケージラベルの差し違えなどが原因でどんなに注意していても常に起こりうる事故です。そのため系統としての遺伝的品質を保証するための遺伝学的モニタリング（モニタリング）は定期的に行わなければなりません。
放射線医学総合研究所（放医研）では、年に一度、生化学的・免疫学的標識遺伝子を用いたモニタリングを行い、系統間の遺伝学的コンタミネーションが無いことと、系統の遺伝的斉一性を確認してきました。
しかし、生化学的・免疫学的標識遺伝子を用いた方法は非常に煩雑な方法です。そこでマイクロサテライトマーカー（MSMｓ）を用いたマウスやラットのモニタリングの報告がありました 5)6)ので、ＭＳＭｓを用いることで、生化学的・免疫学的標識遺伝子を用いた方法より簡単な、放医研
独自のモニタリングシステムの確立、さらにそのデータの客観性の向上、放医研独自の MSMsの選択、その応用として B10 コンジェニック系統のモニタリングを行いましたので報告いたします。
（参考文献）
1）海野あゆみ，上野渉，飯名瑞希，新妻大介，伊田大貴，宮沢正光，早尾辰雄，西川哲，（2008），
マイクロサテライトマーカーを用いたマウス系統の遺伝学的モニタリングシステムの確立，実験動物技術，43（2），47-52．
2）海野あゆみ，飯名瑞希，大久保喬司，新妻大介，石原直樹，伊藤正人，藤井功輔，武笠功，上野渉，早尾辰雄，西川哲，（2010），MultiNAを用いたマイクロサテライトマーカーによるマウスの遺伝学的モニタリングの試み，実験動物技術，45（1），9-14．
3）飯名瑞希，海野あゆみ，大久保喬司，上野渉，早尾辰雄，西川哲，（2011），放医研におけるマ
イクロサテライトマーカーを用いたマウスの遺伝学的モニタリングシステムとその応用，実験動物技術，45（2），65-72．
4）飯名瑞希，海野あゆみ，大久保喬司，上野渉，早尾辰雄，西川哲，（2011），マイクロサテライト

マーカーを用いたB10コンジェニック系統の遺伝学的モニタリングの試み，実験動物技術，46（1），21-24．
5）Hirayama N., Kuramoto T., Kondo Y., Yamada J., Serikawa T., (1994), Genetic profiles of 12
inbred rat strains for 46 microsatellite loci selected as genetic monitoring markers, Jikken
Dobutsu, 43(1), 129-132.
6）F. Benaivdes, E. Glasscock, G. Coghlan, M. C. Sterm, D. A. Weiss, C. J. Conti, (2001),
PCR-based Microsatellite analysis for differentiation and genetic monitoring of nine inbred
SENCAR mouse strains, Lab. Animals, 35, 157-162.

４） 入墨法によるマウス新生仔の個体識別○前田宜俊、小田佳奈子、酒井清子、藤澤信義、横山峯介（新潟大学脳研究所生命科学リソース研究センター動物資源開発研究分野）【目的】我々は昨年の日本実験動物技術者協会総会において、出生当日のマウスの浅側頭
動静脈から微量採血を行い、安全に採血できる有用な方法であることを報告した。この採血法によりマウス新生仔の早期遺伝子解析が可能であることから、確実な個体識別法を開発することで新たな実験系を構築できる可能性が出てきた。
一般的な個体識別法として永久識別法と暫定識別法があり、耳パンチ、IC タグ埋込法、色素塗布法、毛刈り法、耳タグなどが挙げられる。いずれも新生仔に応用するのは難しく、入墨法のみが応用可能であると考えられた。しかし入墨の場合には皮膚を繰り返し穿刺して真皮から皮下組織に色素をいれるため、穿刺回数を減らし苦痛の軽減をはかる必要がある。また不用意な処置は親の哺乳拒否や喰殺を誘発する危険性が高まる。仔マウスへの入墨の影響を調べた報告は少なく、出生当日に個体識別を行った報告はない。そこで出生当日から一般的な個体識別法が可能となる離乳までの 4 週間の識別を目的として入墨法を試みた。また苦痛を軽減するため、できるだけ少ない穿刺回数で安定的に色素を入れる入墨針を試作したので、これらの作製方法も併せて紹介する。
【方法】出生当日の C57BL/6 マウス新生仔に対し、実体顕微鏡下で後肢の指に入墨を行った。入墨専用のインクは夏目製作所より入手して用いた。入墨用の針は数種類の注射針、注射筒および極細の針金（注射針にセットされているガード針）を用いて自作した。入墨を行った新生仔は MCH(ICR)を里親とし、7 日毎に 28 日まで体重測定を行い、同時に入墨の状態を観察した。
【結果と考察】今回の実験では後肢の指に入墨を行い、一部には不明瞭となるものがあっ
たが 4 週間の識別が可能であった。肉眼的に入墨部位の炎症や化膿などは観察されなかった。また入墨の処置が親の哺乳行動や離乳率に影響を与える可能性を考慮して仔の体重を定期的に測定したが、影響はないと考えられた。
有色マウスの新生仔では、入墨ができる場所が少なく範囲も非常に狭い。また１ヶ所に入れられる色素の量も極めて少ない。新生仔の皮膚は非常に薄いため、真皮から皮下組織に色素が留まるように深さをコントロールするのは技術的に困難である。不明瞭になった
例では浅すぎるために入墨インクごと脱落したと推測された。

５） ニワトリ初期胚に存在する生殖巣生殖細胞(GGCs)の新規分離法開発と生殖系列キメラの作製○中島友紀・田島淳史（筑波大学大学院生命環境科学研究科）
生殖系列キメラの作製技術を応用することにより、鳥類における遺伝資源を保存することが可能である。生殖系列キメラの作製は、これまで主としてニワトリを用いて技術開発が行われ、通常 2 日胚の血液中から回収された始原生殖細胞（PGCs）もしくは初期胚生殖巣から回収された生殖巣生殖細胞（GGCs）を 2 日胚の血管内に移植する方法が用いられてきた。GGCs を用いて生殖系列キメラを作製する場合には、生殖巣をタンパク質分解酵素で処理する方法が用いられてきたが、多数の体細胞の中から比較的少数の GGCs を回収するためには技術的熟練が必要であった。そこで、本研究ではニワトリ初期胚の生殖巣から GGCs を分離する新規分離法の開発を試みた。
ニワトリ 7 日胚から取り出した生殖巣を Ca 2+ および Mg 2+ を含まないリン酸緩衝生理
食塩水（PBS[-]）に浸漬し、37.8℃で 24 時間培養した。培養開始後 30 分に生殖巣から GGCs が遊離されるのが観察された。遊離した GGCs 数は培養開始後 12 時間まで増加した。一方、遊離した総細胞数に対する GGCs 数の比率（純度）は培養開始後 90
分までは約 50％であったが、その後低下した。
次に、上記の新規分離法を用いて回収された GGCs の分化・発生能力を検討するた
め、PBS[-]中に遊離した 100 個の GGCs を 2 日胚の血管内に移植することにより、生殖系列キメラの作製を試みた。レシピエントが性成熟に達した後、後代検定を行った結果、雌雄の生殖系列キメラから 7 日胚 GGCs に由来する後代が得られた。
以上の結果より、初期胚由来の生殖巣を PBS[-]内で培養することにより、正常な分化・発生能力を有する GGCs を効率よく回収することが可能であることが示された。
本法を用いることにより、鳥類において生殖系列キメラを効率的に作製することが可能となると考えられる。

６）Effect of naloxone, a mu-opioid receptor antagonist, on oocyte maturation and embryonicdevelopment in pigs
○Thanh Quang DANG-NGUYEN 1,2 , Nguyen VIET LINH 3,4, Rosa MINOIA 5 , Masahiro
KANEDA2 , Tamas SOMFAI 2 , Seiki HARAGUCHI 2 , Satoshi AKAGI 2 , Kazuhiro
KIKUCHI 4, Michiko NAKAI 4 , Atsushi TAJIMA1 and Takashi NAGAI 2（ 1 University of Tsukuba; 2 National Institute of Livestock and Grassland Science; 3 The
University of Tokyo; 4 National Institute of Agrobiological Sciences; 5 University of Bari,
Italy）In the studies on horses, cattle and dogs, the proportion of metaphase II (M-II)embryo was decreased when naloxone (Nx), a mu-opioid receptor antagonist, has been
added to the maturation medium. In contrary, an increase in the rate of M-II oocytes wasobserved at low concentration of Nx.. The purposes of this study are to investigate theexpression of mu-opiod receptor (MOR) gene in oocytes and embryos at different stagesof development, to examine the effect of Nx on nuclear and cytoplasmic maturation ofoocytes, and on embryonic development in pigs. Also the combined effect of cAMP and
Nx on maturation of oocytes was studied. MOR gene was expressed in oocytes at germinal
vesicle and M-II stages, as well as 1-, 4-cell embryos and blastocysts. At concentration of
10 -8 M Nx increased the M-II rate (P<0.05), but at concentration of 10 -4 M it reduced(P<0.05) the rate. However, Nx had no effects on fertilization status and embryonicdevelopment (P>0.05). The supplementation of Nx into culture medium did not improvethe blastocyst formation rate and cell number in blastocysts (P>0.05). At concentration of
10 -4 M, Nx decreased the blastocyst formation rate (P<0.05). The addition of both cAMPand Nx into the maturation medium improved the M-II rate (P<0.05) compared with theaddition of either cAMP or Nx individually. In conclusion, MOR gene was expressed in
porcine oocytes and embryos during the maturation and developmental culture,
respectively. Nx improved M-II rate at low concentration, but reduced the rate at highconcentration. However, Nx did not promote cytoplasmic maturation and improveembryonic development. The addition of Nx and cAMP into maturation medium display asynergistic effect on oocyte maturation.

７） X、Y 精子選別によるイヌの雌雄産み分け技術の開発― FISH 法によるイヌ精子の性判別法の確立 ―○大井真矢 １） 、山田圭介 ２） 、早川宏之 ２） 、鈴木宏志 １）（１） 帯広畜産大学原虫病研究センター、 ２） 社団法人ジェネティクス北海道）
イヌの繁殖管理を行うにあたって、雄よりも雌の産仔を多く得ることは、コロニーの維持、拡大を図る上でその効率性を大いに高めることができる。また盲導犬をはじめとした補助犬では、ユーザーの需要の面で求められる性別に差があることからも、イヌの雌雄産み分け技術の開発が望まれている。近年、ウシ人工授精において、フローサイトメーターにより X 精子と Y 精子の
DNA 量の差を利用して両者を分離した、性選別精液を用いた雌雄産み分け技術が商業的に普及してきている。性選別精液において最も重要な要素の一つは、その精度が確保されていることであり、フローサイトメーター自体の選別能の評価には、フローサイトメーターによる蛍光強度測定とは独立した性選別精液の精度検証法が必要とされる。これまでに X、Y 染色体を特異的に検出することが可能な蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）法によって選別後の精子の性判別を行う方法が、性選別精液の有効な精度検証法として多くの動物種で開発されてきた。しかし FISH 法によって精子内の染色体の検出を行うには、前処理として、それぞれの動物種ごとに適した精子頭部の DNA クロマチン構造の脱凝集処理が必要不可欠とされている。
そこで本実験では、イヌ精子における FISH 法での染色体検出に適した精子頭部 DNA クロマ
チン構造の脱凝集処理条件を検討し、FISH 法によるイヌ精子の性判別法を確立した。また、ウシの性選別精液と同様の方法でイヌ精子の性選別を試み、その精度を FISH 法によって検証した。
3 個体のイヌの精液標本を用い、脱凝集処理として 1M NaOH 溶液へ 3、4、5 分間浸漬させたのち、イヌ Y 染色体特異的プローブを用いて単染色 FISH を行った。その結果、Y 精子検出率は、1M NaOH 溶液へ 4 分間浸漬した標本において、3 個体全ての標本で理論値との有意差が認められなかった（P>0.05）。さらに、同条件で脱凝集処理した標本でイヌ X、Y 染色体特異的プローブを用いた 2 重染色 FISH を行った場合も、得られた X、Y 精子検出率は理論性比（X：Y＝50：50）に対して有意差が認められず（P>0.05）、約 98%以上の精子で性染色体特異的な蛍光シグナルが検出される高いハイブリダイゼーション効率であった。加えて NaOH 溶液による脱凝集処理後も、精子の形態は保たれていた。以上より、FISH 法によるイヌ精子の性判別に適した脱凝集処理条件として、精液標本を 1M NaOH 溶液へ 4 分間浸漬させる処理が有効であることが示唆された。また、イヌ X、Y 染色体特異的プローブを用いた 2 重染色 FISH において高いハイブリダイゼーション効率を示す有効な FISH 法によるイヌ精子の性判別法を確立することができた。
次いで、ウシの性選別精液作製と同様の方法で、フローサイトメーターによってイヌ精子の性選別を行い、イヌ X、Y 染色体特異的プローブを用いた 2 重染色 FISH によって、選別分画中の精子の性比を検証した。その結果、X および Y 精子の選別精度はいずれも 90%前後であった。今後、イヌの人工授精に性選別精液を利用することにより、高精度な雌雄産み分けが可能

になると期待できる。

第 27 回動物生殖工学研究会開催のお知らせ
期日

平成２４年９月１６日（日）場所

北里大学獣医学部（青森県十和田市）