第 44 回動物⽣殖⼯学研究会プログラム2023 年 12 ⽉ 2 ⽇（⼟）
北⾥⼤学⽩⾦キャンパス■総 会

１３：００〜■開会挨拶 １３：３０〜

会⻑：横⼭峯介■特別講演 １３：４０〜１４：５０

座⻑：福永憲隆

マウスにおける原始内胚葉幹細胞の樹⽴と⼈⼯胚作製の試み⼤⽇向康秀先⽣（千葉⼤学⼤学院医学研究院）■休 憩

１４：５０〜１５：００■⼀般講演 １５：００〜１５：４５（発表１０分質疑応答５分）
座⻑：松⽥正史1.

オンライン技術研修システムを活⽤した⽣殖⼯学に関する⼈材育成の取り組み（15:00-15:15）○古閑礼涼 1、中尾聡宏 1、⼟⼭修治 1、宮地均 2、中潟直⼰ 3、⽵尾透 1（1 熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター資源開発分野、

2.

2

京都⼤学医⽣物学研究所附属感染症モデル研究センター、

3

熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター⽣殖⼯学共同研究分野）

広⾓タイムラプス解析を⽤いたマウス受精卵における卵割タイミングの評価（15:15-15:30）○若杉理乃 1、伊藤琴乃 1、中尾聡宏 1、中潟直⼰ 2、⽵尾透 1（1 熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター資源開発分野、23.

熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター⽣殖⼯学共同研究分野）

マルチカラーFISH によるマウス卵⺟細胞の核型解析法の開発とその応⽤（15:30-15:45）○⽇野敏昭、⽇下部博⼀（旭川医科⼤学医学部⽣物学教室）■休 憩

１５：４５〜１５：５５■⼀般講演 １５：５５〜１６：４０（発表１０分質疑応答５分）
座⻑：⽥熊究⼀4.

リン脂質指向型環状オリゴ糖による受精能獲得の誘導（15:55-16:10）○中尾聡宏 1、伊藤琴乃 1、酒匂⼀仁 1、⽵本賢司 1、渡邊仁美 2、近藤⽞ 2、⼊江徹美 3、中潟直⼰ 4、⽵尾透 1

1

（1 熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター資源開発分野、

5.

2

京都⼤学医⽣物学研究所統合⽣体プロセス分野、

3

熊本⼤学グローバル天然物科学研究センター医薬品包装学寄附講座、

4

熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター⽣殖⼯学共同研究分野）

感染症研究における遺伝⼦組み換えマウスの利⽤（16:10-16:25）○後藤元⼈、盛林ひとみ、⼩林喜美男、⾼橋利⼀（公益財団法⼈ 実験動物中央研究所 動物資源技術センター）

6.

Deep learning 技術を⽤いた Time Lapse 画像の機械学習による2 前核⾃動検出システムの開発（16:25-16:40）○福永憲隆、渡邊紘之、吉村友邦、⽊⽥雄⼤、辻暖永、浅⽥義正（医療法⼈浅⽥レディースクリニック 浅⽥⽣殖医療研究所）■休 憩

１６：４０〜１６：５０■特別企画 １６：５０〜１７：３０柳町隆造先⽣との研究を振り返って⽇野敏昭（旭川医科⼤学医学部⽣物学教室）他、ビデオレター等■閉会挨拶 １７：３０

副会⻑：濱野晴三

注意事項会場となる北⾥⼤学の以下の感染予防対策をご確認いただきご対応をお願いします。
１、次の場合は⼊構を制限させていただきます。
１）⾵邪の症状や 37.5 度以上の発熱、咳、倦怠感のある⽅２）医療機関において新型コロナウイルスに感染していると診断された⽅。
２、施設内への⼊構時の対応について１）建物⼊⼝等に設置の⼿指消毒アルコールでの消毒をお願いします。
２）マスクの着⽤を推奨します。

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特別講演

マウスにおける原始内胚葉幹細胞の樹⽴と⼈⼯胚作製の試み⼤⽇向康秀千葉⼤学⼤学院医学研究院我々の⽣命は唯⼀つの受精卵から派⽣する。受精卵は卵割を繰り返し、やがて胚盤胞と呼ばれる初期胚を形成する。胚盤胞は、着床前エピブラスト、栄養膜、原始内胚葉の 3 種類の細胞系譜で構成される数 10 個の細胞の集合であるが、このような単純な組織が個体⽣命を発⽣させる能⼒を保持する理論は解明されていない。ES/iPS 細胞が持つ多能性概念の研究分野が成熟期を迎えつつある今⽇、研究の最先端が、上位の本来受精卵のみが保持する全能性概念に向かうのは必然であるが、近年の幹細胞研究分野の急速な発展によって、試験管内で幹細胞のみから⼈⼯胚を作製することに現実のテーマとして挑戦し得る時機が来ている。マウスにおいては、胚盤胞からは、従来、着床前エピブラストの幹細胞として ES 細胞(Evans & Kaufman, Nature 1981)、栄養膜の幹細胞である TS 細胞(Tanaka et al, Science 1998)が樹⽴されていたが、しかしこれらだけでは、原始内胚葉系列組織を派⽣することができないため、胚を再構成することはできないと予想される。
本研究において我々は、残る原始内胚葉の幹細胞を樹⽴するため、様々な増殖因⼦や低分⼦化合物およびそれらの組み合わせについて培養条件を探索し、無⾎清培養条件下、GSK3 を阻害する低分⼦化合物である CHIR99021、FGF4、PDGF-AA を組み合わせて⽤いることで、原始内胚葉幹細胞(Primitive Endoderm Stem Cell, PrES 細胞)を樹⽴できることを⾒出した。PrES 細胞は、特徴的なドーム型のコロニーを形成し、試験管内での⻑期培養が可能で、多能性マーカー(OCT4、E-Cadherin)と内胚葉マーカー(GATA6)を共発現していた。ES 細胞、TS 細胞、XEN 細胞との単⼀細胞解析による⽐較では、PrES 細胞は、既知のいずれの幹細胞とも類似しておらず、E3.5 及びE4.5 の内部細胞塊の細胞との⽐較では、形成直後の原始内胚葉と良く似た遺伝⼦発現パターンを⽰した。胚盤胞への注⼊によっては、PrES 細胞は速やかに胚の原始内胚葉に取り込まれ、またそれら胚盤胞注⼊を⾏なった胚を⼦宮へ移植することによっては、壁側卵⻩嚢の壁側内胚葉、境界領域内胚葉、臓側卵⻩嚢の臓側内胚葉に⾼効率に寄与し、卵⻩嚢キメラを形成した。さらに原始内胚葉を⽋失した胚性致死の胚盤胞を宿主として⽤いれば、PrES 細胞は、胚の致死を救済し、全ての原始内胚葉系列細胞系列組織を補完することができた。

3

PrES 細胞の樹⽴により、マウスにおいては、胚盤胞を構成する全ての細胞系譜の幹細胞が揃ったこととなり、概念的にはこれら 3 種の幹細胞を組み合わせることによって、胚を再構成できる可能性が⽰唆される。次に我々は、ES 細胞、TS 細胞、PrES 細胞の共培養によって胚オルガノイドを作製した。ES 細胞と PrES 細胞の共培養では、速やかに ES 細胞の塊を PrES 細胞が取り囲み、内部細胞塊様構造が形成された。さらに TS 細胞を追加することでは着床後胚様構造が形成された。これら胚オルガノイドの⼦宮への移植によっては、⾼効率に着床し、脱落膜を誘導することができた。また脱落膜内部には 2 重の卵⻩嚢様シートに取り囲まれた胚様構造が形成されたが、正常な胚は⽣じなかった。今後は、幹細胞培養技術および胚盤胞オルガノイド作製技術のさらなる洗練によって現在の胚オルガノイドの問題を解決し、発⽣能を保持する胚の再構成を実現したい。

参考⽂献：Ohinata Y et al, Science 375, 574-578 (2022)

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⼀般演題 1

オンライン技術研修システムを活⽤した⽣殖⼯学に関する⼈材育成の取り組み○古閑礼涼 1、中尾聡宏 1、⼟⼭修治 1、宮地均 2、中潟直⼰ 3、⽵尾透 1123

熊本⼤学 ⽣命資源研究・⽀援センター 資源開発分野

京都⼤学 医⽣物学研究所 附属感染症モデル研究センター

熊本⼤学 ⽣命資源研究・⽀援センター ⽣殖⼯学共同研究分野

熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センターは、⽣命科学研究や疾患モデルとして有⽤な遺伝⼦改変マウスに関する研究⽀援のため、遺伝⼦改変マウスの作製、保存および供給を⾏うマウスバンクを運営している。また、当研究室では、マウスバンク運営に有⽤な⽣殖⼯学技術の開発に取り組み、本技術に関する研修会を通じて⽣殖⼯学に関する⼈材育成も⾏っている。
研修会では、講義および⼿技の実演・指導を対⾯で⾏っているが、近年はデジタルトランスフォーメーション(Dx)を利⽤した、場所にとらわれない⼈材育成の需要が⾼まっている。そこで私たちは、⽣殖⼯学研修会の Dx を実践するために、オンライン技術研修システムを構築した。本システムは、オンライン化した⽣殖⼯学技術に関する機器および Zoom 等の会議ツールを利⽤することで、遠隔からの技術研修参加を可能とした。これまでに本システムを⽤いて、熊本⼤学からタイのコンケン⼤学における⽣殖⼯学研修会の開催やスリランカ実験動物学会のシンポジウムにおいて⽣殖⼯学技術の実演を⾏った。また、今年開催した⽣殖⼯学オンラインセミナーでは、マウス⽣殖⼯学技術の基礎から応⽤に⾄る講義を⾏った。
本発表では、国際的に⾼まる⽣殖⼯学技術に関わる⼈材育成を Dx を利⽤し解決する、オンライン技術研修システムを紹介する。

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⼀般演題 2広⾓タイムラプス解析を⽤いたマウス受精卵における卵割タイミングの評価○若杉理乃¹、伊藤琴乃¹、中尾聡宏¹、中潟直⼰²、⽵尾 透¹¹熊本⼤学 ⽣命資源研究・⽀援センター 資源開発分野²熊本⼤学 ⽣命資源研究・⽀援センター ⽣殖⼯学共同研究分野

体外受精は、遺伝⼦改変マウスの作製、繁殖および保存に有⽤な技術として、多くの研究施設で利⽤されている。体外受精における受精率の評価は、前核期受精卵や⼆細胞期胚の数を顕微鏡下でカウントするため、技術者による受精の判別や作業が必要である。近年、デジタル技術を活⽤した研究のデジタルトランスフォーメーション(DX)が進められており、体外受精技術もデジタル化することで DX の実現が期待できる。そこで本研究では、体外受精技術のデジタル化の取り組みとして、マウス体外受精により作製した複数の受精卵を同時に観察できる広⾓タイムラプス観察システムの構築を試みた。

本研究では、倒⽴型顕微鏡 BioRevo を使⽤し、培養環境および培地を検討した。本観察システムにおける前核期受精卵の⼆細胞期胚への発⽣率は、CO₂インキュベーター内の発⽣率と同等であった。さらに、本システムは、インターネットを介した操作も可能であり、遠隔での受精卵の観察も可能であった。

以上、本研究により、体外受精における受精卵の観察に有⽤な広⾓タイムラプス観察システムを構築した。本システムを活⽤することで、体外受精における客観的な研究データの収集、⾃動化、リモート化を推進し、研究 DX の実現や働き⽅改⾰に対応していきたいと考えている。

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⼀般演題 3

マルチカラーFISH によるマウス卵⺟細胞の核型解析法の開発とその応⽤○⽇野 敏昭、⽇下部 博⼀旭川医科⼤学医学部⽣物学教室

卵⺟細胞の減数分裂における染⾊体分配異常は加齢にともない増加し、異数性を誘発することから、その⽣成機序や⽣成要因を解明するための研究が盛んに⾏われている。マウスはその⽬的で最もよく⽤いられる実験動物であり、マウスで利⽤できる染⾊体研究のための様々な⼿法や遺伝⼦改変マウスは染⾊体分配異常の理解に⼤きく貢献してきた。しかし、マウスの卵⺟細胞においては信頼性の⾼い核型解析法が確⽴されておらず、染⾊体分配異常における染⾊体特異性に着⽬した包括的な研究は進んでいない。
本研究では、卵⺟細胞の染⾊体標本作製法の⼀つであり、段階的な卵⺟細胞の固定により染⾊体の⼈為的流失を抑えることのできる漸進固定空気乾燥法と、マルチカラーFISH による染⾊体分染法を組み合わせることで、効率よく確実にマウス卵⺟細胞を核型解析できる⼿法の開発を⾏った。
はじめに、美⽢と上⼝ら(1983, Radiation-Induced Chromosome Damage in Man)の⽅法に従い、減数第⼀分裂と減数第⼆分裂期の卵⺟細胞の染⾊体標本を作製した。次に、染⾊体標本にマルチカラーFISH ⽤の DNA プローブをプロトコールに従いハイブリダイズさせ、得られた染⾊体蛍光画像をもとに核型解析を⾏った。その結果、解析した卵⺟細胞の多くで細胞質のバックグラウンド蛍光が強くでてしまい、染⾊体の蛍光シグナルがそれに覆い隠され、およそ 70%の卵⺟細胞で核型解析に失敗した。そこでバックグラウンド蛍光を抑えるために、スライドガラスに固着した卵⺟細胞の"扁平化 "を⾏い、染⾊体標本のハイブリダイゼーションの温度を室温から 4℃に変更したところ、バックグラウンド蛍光は⼤きく抑えられ、核型解析成功率は 90％以上と⼤きく向上した。染⾊体の⼈為的な流失もなかった。最後に、⽼齢雌マウス、ならびにコルヒチンで染⾊体分配異常を誘発した雌マウスの卵⺟細胞における核型解析に本⼿法を応⽤し、その妥当性を検証した。その結果、採取した卵⺟細胞の 80％以上で核型解析でき、分配異常を起こしたすべての染⾊体において、染⾊体の種類や異常型を正確に同定できた。加えて、コルヒチンで誘導される染⾊体異常はすべての染⾊体で起きうることも明らかになった。以上、我々は、マウス卵⺟細胞における効率的で信頼性の⾼い核型解析法の開発に成功した。

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⼀般演題 4リン脂質指向型環状オリゴ糖による受精能獲得の誘導○中尾聡宏 1、伊藤琴乃 1、酒匂⼀仁 1、⽵本賢司 1、渡邊仁美 2、近藤 ⽞ 2、⼊江徹美 3、中潟直⼰ 4、⽵尾 透 11

熊本⼤学 ⽣命資源研究・⽀援センター 資源開発分野23

京都⼤学 医⽣物学研究所 統合⽣体プロセス分野

熊本⼤学 グローバル天然物科学研究センター 医薬品包装学寄附講座4

熊本⼤学 ⽣命資源研究・⽀援センター ⽣殖⼯学共同研究分野精⼦の受精能獲得は、哺乳動物の精⼦が受精能⼒を得るための⽣理的かつ物理的な変化である。精⼦膜からのコレステロールの流出は、受精能獲得のトリガーとして知られている。⼀般的に体外受精では、受精能獲得を誘起するために、コレステロールアクセプターであるウシ⾎清アルブミン(BSA)や、コレステロール指向型環状オリゴ糖であるメチル-b-シクロデキストリン(MBCD)が⽤いられている。BSA や MBCD を精⼦に処理することで、精⼦膜からのコレステロールの漏出が促進され、精⼦の受精率が向上する。本年、私たちは、リン脂質指向型の環状オリゴ糖であるジメチル-a-シクロデキストリン(DMACD)も、精⼦の受精能獲得を誘起することを報告した。

DMACD をマウス精⼦に処理することで、体外受精における受精率が向上した。
DMACD 処理精⼦由来の受精卵は、胚移植により正常に産⼦へと発⽣した。また、興味深いことに、DMACD は、これまで精⼦の受精能獲得に重要と考えられてきたコレステロールの漏出を促進せず、リン脂質の漏出を促進することで、精⼦の受精能を向上させることが明らかになった。さらに、DMACD を処理した精⼦の機能解析を⾏なったところ、これまでに精⼦の受精能獲得マーカーとして知られている、膜流動性の増加、脂質ラフトの局在変化、先体反応が起きていることも確認した。

本結果より、DMACD は、コレステロールの漏出に依存しない、リン脂質の漏出を介した新たなメカニズムによって、精⼦の受精能獲得を誘導し、体外受精率を向上させることが明らかとなった。本知⾒は、リン脂質の漏出を標的とした、新たな受精能獲得誘導技術の開発に繋がると考えられる。

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⼀般演題 5感染症研究における遺伝⼦組み換えマウスの利⽤〇後藤元⼈、盛林ひとみ、⼩林喜美男、⾼橋利⼀公益財団法⼈ 実験動物中央研究所 動物資源技術センター

我が国は国家戦略としてワクチン開発を迅速に推進するために平時からの研究開発を主導する体制として先端的研究開発センター(SCARDA)を⽇本医療研究開発機構(AMED) 内に設置した。SCARDA は「ワクチン開発のための世界トップレベル研究開発拠点の形成事業」を公募し、我々実験動物中央研究所は「感染症研究に有⽤な⼩型実験動物の開発と供給に関するサポート機関」に採択された。
本事業では「⽀援」として、様々な感染症研究で⽤いられる動物実験系統の収集、保存、供給、さらにはモデル動物に関する様々な情報を収集し、データベース化する取り組みを進めている。さらに「⾼度化」として新たなヒト化感染症モデル、マーモセット感染モデルの開発を⾏なっている。
我々「⽀援」チームでは、バイオリソースバンクとして収集頒布活動のみならず、遺伝⼦改変マウスの迅速な作製と供給にも取り組んでいる。今回は我々の⽀援での取り組みと感染症研究に使⽤されている遺伝⼦改変マウスを紹介するとともに感染症研究の問題点をお話しできればと思う。

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⼀般演題 6Deep learning 技術を⽤いた Time Lapse 画像の機械学習による2 前核⾃動検出システムの開発〇福永 憲隆、渡邊 紘之、吉村 友邦、⽊⽥ 雄⼤、辻 暖永、浅⽥義正医療法⼈浅⽥レディースクリニック浅⽥⽣殖医療研究所【⽬的】我々は⽣殖医療分野において胚の培養環境を最適化する⽬的で低酸素を維持し胚を空気中へ晒すことのない連続培養系の確⽴を⽬指して Time Lapse 機器を全症例に導⼊した。Time Lapse 機器は培養しながら連続撮影し胚の成⻑を経時的に観察できるが得られた画像データは膨⼤であり、その処理が新たな課題となっている。そこで我々は近年、医療分野でも注⽬されている Deep learning 技術を⽤いた画像解析に着⽬した。Deep Learning は脳の神経回路と同様な深い構造を作り出し機械学習を繰り返すことで精度を⼤幅に向上できる技術である。この技術を活⽤し媒精から前核消失までの画像を解析することによって前核とその個数を⾃動で検出するアルゴリズムの開発を⽬指した。
【⽅法】前核数を検出するアルゴリズムは⼊⼒した Time Lapse 画像に対して前核数を出⼒するニューラルネットとして実現させた。このニューラルネットは、胚培養⼠が評価した前核数を正解データとし Deep learning 技術によって学習させた。学習には前核数が明らかになっている Time Lapse 画像をそれぞれ 300 胚⽤い、検出精度の評価は学習に使⽤していない Time Lapse 画像を 100 胚⽤いた。ニューラルネットの構築は⼀般的な Deep learning 技術を適⽤した⽅法と Time Lapse 画像による受精卵の特徴を重み付けした改良法を⾏った。
【結果】⼀般的な Deep learning 技術を適⽤した⽅法では 2 前核検出率が91%(91/100)であった。これに対し重み付けをした改良法の 2 前核検出率は99%(99/100)に達し正解データの前核数と⾮常に⾼い相関性を⽰す検出精度となった。
【考察】今回の解析により 2 前核の検出精度は⾮常に⾼い相関性を得ることができた。⽣殖医療分野において、 短時間に多数の受精判定をするためには経験を積み⾝に付ける必要があるが Deep learning による機械学習はその精度が短期間で⾝に付いた事になる。現在は複数の前核数を検出するアルゴリズムを開発しており合わせて報告する。今後、画像データを更に学習させ Time Lapse 機器とセットにした Deeplearning による⾃動前核検出システムの開発を⽬指す。

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