平成 27 年度 共同利用・共同研究報告2015 Fiscal Year Cooperative Research Program Report
研究課題

’15－１

の生物学的機能があると思われる . 我々は A. nidulans の糸状菌の感染免疫応答と形態形成を支配する
細胞表層 α-1, 3- グルカンの生合成制御（東北大学大学院農学研究科 生物産業創成科学専攻）

啓（東北大学未来科学技術共同研究センター）

川本

ことを明らかにしたが , その他の生物学的機能はいまだ不明である . A. nidulans には無性世代と有性世代の生活環が存在することが知られている . 有性生殖器官（ク

阿部敬悦
吉見

AG 欠損株を用いて , AG が菌糸同士の接着因子である進・清水公徳・萩原大祐

ライストセシア）の形成には , 菌糸先端にある細胞の菌糸融合が必要である . そこで , ２種ある AG 合成酵素
遺伝子 agsA および agsB の遺伝子破壊株を用いて , 有性生殖能を検討した結果 , agsAΔ 株および agsBΔ 株は有性世代不全であることを見出した . 有性世代不全は agsA

（千葉大学真菌医学研究センター）

Δ 株でより顕著であった . 以上より , AG の接着因子とBiogenesis of cell wall α-1, 3-glucan controlling
fungi-host immune-responses and fungal
morphogenesis
Keietsu Abe（Graduate School of Agricultural Science, Tohoku

University）

Akira Yoshimi

しての機能が有性生殖にも寄与することが予想された .

A. nidulans の栄養生長時には , agsB が主として機能して

おり , CWI 経路による制御を受ける（総説１, 関連原著

関連総説１）. 以上の知見を総合すると , A.

論文１,nidulans に存在する２種の α-1,3- グルカン合成酵素は ,栄養生長時と有性生殖器官形成時に AG 合成の役割分担をしており , agsA がフェロモン経路の制御により有性生殖へ寄与するという全く新しい知見を与える可能性が考えられた . 現在 , フェロモン経路の人為的活性化株を作（New Industry Creation Hatchery Center, Tohoku

出中であり , 引き続き , フェロモン経路の人為的活性化

Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu, Daisuke
Hagiwara（２）「Aspergillus 属糸状菌における α-1,3- グルカンの細University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
（１）
「A. nidulans の CWI 経路 , フェロモン経路 , AG 生
合成酵素遺伝子の各欠損株の有性生殖能の解析」および「AG 合成酵素遺伝子の転写制御の CWI 経路とフェロモン経路への依存度の評価」

糸状菌の細胞壁 α-1, 3- グルカン（AG）は , 細胞壁の最外層に位置し , 内層の β-1, 3- グルカン（BG）やキチンを被覆することで感染宿主の免疫認識を回避するス

テルス因子として機能することが知られている . しかし , 麹菌などの非感染性の糸状菌にも AG が存在することから , 宿主に対するステルス性以外にも AG には未知

48

千葉大学

時の agsA および agsB 遺伝子の転写レベルを確認する予定である .

胞接着性への寄与の検証」

糸状菌は液体培養において菌糸が絡まり菌糸塊となってしまうことが多いことから , AG が Aspergillus 属糸状菌一般の菌糸接着因子であることが予想された . モデ

ル糸状菌 A. nidulans においても , 産業糸状菌 Aspergillus

oryzae で も 液 体 培 養 時 に 菌 糸 塊 が 形 成 さ れ る . 麹 菌

Aspergillus oryzae は agsA, agsB, agsC の３種の AG 合成酵素

遺伝子を有していることから , これら３種の遺伝子を破壊した agsAΔagsBΔagsCΔ 株（AG 欠損株）を造成した .

その結果 , 液体培養において , 麹菌の AG 欠損株の菌糸は , A. nidulans のような菌糸の完全分散性状にはならなかったが , 野生株に比べて小さな菌糸塊を形成し（野生株比直径が約60% に減少）, 培養総菌体量は増加した .

真菌医学研究センター報告

第 20 巻2016

さらに , 組換えタンパク質の生産量も野生株比1.7倍に増加した . これらの結果は , 麹菌においても AG は菌糸接着因子であるが , AG の他にも菌糸接着因子が存在することを示唆している . AG 欠損株における酵素生産性の向上は , AG 欠損株を物質生産用の宿主株として用いることにより , 従来よりも一培養当たりの生産性の大幅菌である Aspergillus fumigatus にも共通のオーソログとして見出され , それぞれの atrR 遺伝子の破壊株では , 野生株より100倍も低い薬剤濃度でも感受性を示すことが見出された . A. fumigatus において AtrR の機能解析を行った結果 , AtrR がアゾール耐性に関わる ABC トランス

ポーターCdr1B の発現を制御していることを世界で初な改善が可能であることを示唆した（論文投稿中）.

めて明らかにするとともに , アゾール薬標的分子である

発表論文
１）Yoshimi A, Fujioka T, Mizutani O, Marui J, Hagiwara
D, Abe K: Mitogen-activated protein kinases MpkAand MpkB independently affect micafungin sensitivity inAspergillus nidulans. Biosci Biotech Biochem, 79: 836-

する酵素遺伝子の発現にも関わっていることを見出し

844, 2015

研究課題

た . AtrR が本菌のアゾール薬耐性メカニズムにおいて中心的な役割を果たしており , AtrR の機能阻害剤の開発はアゾール薬の治療効果を格段に高め , 耐性株に対しても卓効を示すことが期待される . 本研究では AtrR による

cdr1B および cyp51A 遺伝子の発現調節機構の解明を目指すとともに , Cyp51A に耐性変異を有するアゾール耐性’15－２

A. fumigatus 株における AtrR の機能阻害の重要性を検証

Aspergillus fumigatus の転写因子 AtrR による
アゾール系薬剤耐性関連遺伝子の発現制御の分子メカニズム

することを目的とした .

Cyp51A を含むエルゴステロール生合成酵素遺伝子の発現制御を担う転写因子としてすでに bHLH 型転写因子 SrbA が報告されていたことから , A. fumigatus の atrR

破壊株に加えて srbA 破壊株も作製して , アゾール耐性や

五味勝也

低酸素条件下における生育 , マウスに対する病原性な（東北大学大学院農学研究科）

川本

Cyp51A をはじめとしてエルゴステロール生合成に関与

どの違いを比較した . atrR 破壊株と srbA 破壊株ともにア進・清水公徳・萩原大祐

ゾール薬剤に感受性が高くなっていたが , atrR 破壊株の（千葉大学真菌医学研究センター）

方が感受性が高くなっていた . 一方 , 低酸素条件下におMolecular mechanisms for the regulation ofgenes involved in azole drug resistance by
the transcription factor, AtrR, in Aspergillus
fumigatus

ける生育はともに悪くなったが , 株間での差異はほとん

ど認められず , マウスに対する病原性も同等に低下していた . 両破壊株ともに cyp51A, erg3B, erg24A, erg25A のエルゴステロール生合成遺伝子の顕著な発現量低下を示したが , ABC トランスポーター遺伝子（cdr1B）の発現は atrR 破壊株のみで著しく低下していた . また , マウス

Katsuya Gomiを用いた感染性試験により , いずれの破壊株も病原性のUniversity）

AtrR を用いたクロマチン免疫沈降（ChiP）解析を行っ（ Graduate School of Agricultural Science, Tohoku

Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu, Daisuke
Hagiwara（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
麹菌 Aspergillus oryzae において見出されたアゾール系
薬剤耐性に関する新規 Zn2Cys6型転写因子 AtrR は , モデ
ル糸状菌の Aspergillus nidulans やアスペルギルス症起因

千葉大学

著しい低下が認められた . さらに , HA タグを付加したたところ , コントロールのアクチン遺伝子（act1）プロ

モーターは濃縮されなかったのに対して , cyp51A および

cdr1B のプロモーターはそれぞれ20倍 , 33倍に濃縮されたことから , AtrR がこれらのプロモーター領域に結合することが示された . また , AtrR は cyp51A の上流－69～－415の領域に , cdr1B の上流－675～－982の領域に強く結合することが示唆された . Cyp51A の G54E 置換変異による A. fumigatus のアゾール耐性株（IFM 61567）につ

真菌医学研究センター報告

第 20 巻201649

いて atrR の破壊を行ったところ , イトラコナゾールやポいにより正確な解析が妨げられる可能性が懸念されるた野生株でも耐性を示すフルコナゾールに対しても感受性

真菌種における共通抗原として発現させた C. neoformans

サコナゾールに対して高い感受性を示しただけでなく ,を示すことが分かった . これはアゾール耐性株の atrR 破壊によって cyp51A および cdr1B のいずれも発現量が著しく低下したことによるものと考えられた .

なお , 以上の得られた成果を取りまとめた論文を５月

め , 卵白アルブミン（OVA）遺伝子を導入することで両株（YC-13, YC-11, H99） と C. gattii 株（R265） を 作

製した . その中で , YC-13と H99に OVA 遺伝子を導入した各１株（YC-13-OVA6, H99-OVA4）において OVA

mRNA の発現が検出され , YC-13-OVA6では感染マウス

中旬に PLoS Pathogen 誌に投稿した .

の所属リンパ節細胞が OVA の刺激により IFN-γ 産生を

研究課題

スジェニックマウス（OT-II）の脾細胞は YC-13-OVA6

示した . また , OVA 特異的な TCR を高発現したトラン’15－３

新興強毒性真菌Cryptococcus gattii の高病原性機序の免疫学的解析 — その２に YC-13ま た は YC-13-OVA6を 感 染 さ せ る と , YC-13-

OVA6感染マウスにおいて肺内の IFN-γ 産生及び菌の排除が有意に亢進していた . 一方 , OT-II マウス由来の脾川上和義・石井恵子

細胞を抗原エピトープである OVA323-339で刺激する際に ,（東北大学大学院医学系研究科）

川本に反応して IFN-γ を産生した . さらに , OT-II マウス

H99または R265の破砕物を添加したところ , H99の破砕

進・清水公徳物でのみ有意な IFN-γ 産生の増加が認められた . この違（千葉大学真菌医学研究センター）

いは各菌種の DNA に起因しており , TLR9を介すること

Immunological analysis of a mechanism for highpathogenicity of Cryptococcus gattii
Kazuyoshi Kawakami, Keiko Ishii（Tohoku University Graduate School of Medicine）

Susumu Kawamoto, Kiminori Shimizu（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
1999年にカナダのバンクーバー島で Cryptococcus gattiiが明らかとなった . さらに , H99由来の DNA は R265と比較して , 骨髄由来樹状細胞からの IL-12産生をより強く誘導する結果が得られた . 現在 , 両菌種で TLR9を刺激する CpG DNA のメチル化に相違がないか検討しているところである .

本研究を通して C. gattii 感染症の高病原性における免疫機序が明らかになることにより , 新たな治療・予防法の開発に繋がることが期待される . これらの成果は , 第

26回日本生体防御学会学術総会及び第44回日本免疫学会
学術集会にて報告した .

によるクリプトコックス症のアウトブレイクが発生し ,その後アメリカ合衆国の北西沿岸地域を中心に拡大しつつある . 2007年には , わが国でも国内感染と考えられる

C. gattii によるクリプトコックス症例が報告され , その後も症例が増加している . 通常の C. neoformans によるク

リプトコックス症と異なり , 健常者でも中枢神経感染症を発症し , その高い致死率から高病原性クリプトコックス症とも呼ばれており , 今後新興感染症として重要な問題に発展することが懸念される . 本研究では , C. gattiiと C. neoformans に対する免疫応答性を比較することで ,本感染症の病態解明の手掛かりを探ることを目的とした.

異なるクリプトコックス菌種での解析では抗原性の違

50

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻

2016

研究課題

’15－４

の CnEST2破壊株の取得率は極めて低く , CnEST2遺伝子が増殖に極めて重要な役割を果たしていることが示

Cryptococcus neoformans の特異な染色体末端維持機構を標的とした新規治療戦略の開発に向けて
松浦

遺伝子を欠損した後 , 数十回は正常に分裂を続けることが可能であることが知られている . 我々の発見は , C.

neoformans 特有のゲノム維持機能にテロメラーゼが深く

彰・久保田俊介

関与し , テロメラーゼの欠損が早期に増殖阻害をもたら（千葉大学大学院融合科学研究科）

川本

唆された . S. cerevisiae など他の生物種ではテロメラーゼ

進・高橋弘喜・清水公徳・東江昭夫（千葉大学真菌医学研究センター）

す可能性を示唆している .

そこで本年度は , 二倍体 C. neoformans において CnEST

２欠損のヘテロ接合体を取得した . 胞子形成により一倍

Towards development of novel therapeuticstrategies targeting the specific regulation of
telomere maintenance in Cryptococcus neoformans
Akira Matsuura, Shunsuke Kubota（Graduate School of Advanced Integration Science,

Chiba University）

Susumu Kawamoto, Hiroki Takahashi, Kiminori
Shimizu, Akio Toh-e（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
Cryptococcus neoformans は環境に常在する担子菌酵母であり , 主に免疫機能の低下した人に感染し重篤なクリプ
トコックス症を引き起こす日和見感染真菌として知ら体を取得し , テロメラーゼ欠損後どのタイミングで増殖が低下するかを確認したところ , テロメラーゼと相同組換え遺伝子との二重欠損株が取得できなかったのみならず , テロメラーゼ単独変異株の出現率も極めて低いことが示された . この結果により , テロメラーゼを抑制した条件で C. neoformans の増殖率が大幅に低下することが確認され , テロメラーゼを標的として C. neoformans 特異的治療が可能であることが示された .

今後は , テロメラーゼ活性の制御に必要な分子の探索をさらに進めつつ , テロメラーゼ , 組換え関連因子を含めた DNA 末端修復機構の選択制の違いが生じる機構

を分子の側から解析することで , この生物種の特異なDNA 損傷修復のメカニズムと生理的意義を明らかにし ,本菌に対する新規治療戦略の開発につなげたいと考えている .

れている . 本菌は , 環状プラスミドが維持できない , 遺伝子ターゲティングの効率が悪く , 導入された直鎖状DNA 断片の末端に高頻度でテロメア反復配列が付加される , など DNA 修復に関連するユニークな性質をもつ

ことが明らかにされている（Edman, 1992）. 本研究では ,染色体末端の維持機構という観点から C. neoformans 特有のゲノム維持機構を明らかにし , さらにこの特有なゲノム維持機構と C. neoformans の生活環との関連を明らかにすることを目的としている .

これまでに , C. neoformans よりテロメア DNA 伸長酵

素テロメラーゼ触媒サブユニットの相同遺伝子 CnEST2を単離している . C. neoformans 一倍体細胞で CnEST2の遺伝子破壊を行い , CnEST2遺伝子の細胞増殖における機能を解析した結果 , 本菌においても他生物種と同様 , 染色体末端の維持にはテロメラーゼの活性が必須であることが明らかになった . しかし , 一倍体細胞で千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻

2016

51

研究課題

’15－５

Tah18のオルソログ遺伝子（CgTAH18）が C. grabrata の生育および病原性の発現に必須であることを示す結果を

病原真菌における一酸化窒素の合成機構と生理的役割の解析

２）C. neoformans：プロモーター部位を改変して Tah18のオルソログ遺伝子（CnTAH18）の発現抑制株を構築

高木博史（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科）

川本

得た（知花 , 高木ら：論文投稿中）.

進・知花博治・東江昭夫・萩原大祐（千葉大学真菌医学研究センター）

したところ , 生育が抑制されたことから , CnTAH18 は必須遺伝子であることが示唆された .

３）A. fumigatus：培養時に , 過酸化水素添加や高温ストレス処理すると , NO 特異的蛍光プローブによる染色が菌糸内に確認できたことから , これらのストレスに応答

Analysis of synthetic mechanism andphysiological role of nitric oxide in pathogenic
fungusHiroshi Takagi（Graduate School of Biological Sciences, Nara Instituteof Science and Technology）

Susumu Kawamoto, Hiroji Chibana, Akio Toh-e,
Daisuke Hagiwara（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

した NO の生成が示唆された .

今後 , Mpr1, Tah18, Dre2のオルソログ遺伝子の破壊

株 , 発現抑制株 , 高発現株を用いて , 細胞内 NO レベルを定量するとともに , カイコやマウスの感染実験によって NO がストレス耐性や病原性に及ぼす影響を多面的に評価する .

研究課題

’15－６

マイコウイルス由来タンパク質の異種発現シ
ステムを利用した病原性真菌の生育制御系の開発

研究成果
一 酸 化 窒 素（NO） は シ グ ナ ル 分 子 と し て , 哺 乳類の幅広い生命現象に関与している . 高木らは酵母

Saccharomyces cerevisiae において , NO がアセチルトランス

フェラーゼ Mpr １およびフラボタンパク質 Tah18依存
的にアルギニンから合成され , 酸化ストレス耐性に寄与することを見出した . また , Tah18と複合体を形成す

る Dre2タンパク質が酸化ストレスセンサーとして働き ,Tah18依存的な NO 合成を制御する機構を提唱した . 一
方 , 病原真菌はヒトに感染する際 , 温度・低酸素などのストレスに応答して耐性を獲得し , 病原性を示すことから , NO がストレス耐性や病原性に関与する可能性がある.

本研究では , S. cerevisiae と同様の NO 合成経路の存在が示唆される病原真菌（Candida glabrata, Cryptococcus

neoformans, Aspergillus fumigatus）について , NO と増殖・

森山裕充
（東京農工大学大学院農学府研究院）

五ノ井透・川本進（千葉大学真菌医学研究センター）

Development of novel regulation system for thehuman pathogenic fungi utilizing mycoviralproteins.
Hiromitsu Moriyama（Graduate School of Agriculture, Tokyo University ofAgriculture and Technology）

Susumu Kawamoto, Tohru Gonoi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

感染・病原性との関連性を解析する . 平成27年度には ,研究成果

１）C. glabrata：カイコ幼虫のテトラサイクリン転写

Magnaporthe oryzae chrysovirus, MoCV1-A が 宿 主 菌 に 対以下の研究成果が得られた .

抑制系を用いた in vivo 必須遺伝子の判定法を開発し ,

52

千葉大学

我々はイネいもち病菌に感染するマイコウイルス
して , 菌糸生育抑制 , 異常な色素沈着や分生子形成抑

真菌医学研究センター報告

第 20 巻2016

制などの生育阻害現象をもたらすことを見出しており ,

研究課題

うち , パン酵母 Saccharomyces cerevisiae の遺伝子発現系の抗真菌薬標的タンパクのインシリコ予測と実験的検証

MoCV1-A ウイルスの遺伝子がコードするタンパク質の利用により ORF4が抗菌性タンパク質をコードすることを明らかにしてきた . また , メタノール資化酵母（Pichia’15－７

pastoris）で産生させた ORF4タンパク質をイネいもち病

中井謙太

菌の分生子に添加すると菌糸の伸長抑制が見られること（東京大学医科学研究所）

も示してきた .

知花博治・宇野本研究成果として ORF4タンパク質の部分領域をパン酵母に発現させることで , 抗菌活性領域を調査したところ , MoCV1-A の近縁ウイルス間で保存性の高い , 中

央部の領域（SUa 領域）に活性があることが確認された . そこで , ピキア酵母の高密度培養による SUa タンパ

An in silico prediction and exper imental
evaluation of antifungal drug targets

ク質の産生を試みている . さらに , パン酵母細胞内でのKenta Nakai

現した , 生育促進を示す変異株を利用した抗菌活性タン

Tokhyo）

ORF4タンパク質の C 末端側領域（24領域）発現時に出パク質産生法の検討中である .

病原真菌 Aspergillus fumigatus はアスペルギルス症の主な原因菌である . 五ノ井教授の研究グループにより , マ

潤（千葉大学真菌医学研究センター）（The Institute of Medical Science, The University of

Hiroji Chibana, Uno Jun（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

ウスに対する A. fumigatus の病原性を抑制する２種のマ研究成果の応用を目指している . 本共同研究プロジェクトにお点を絞り , 実験研究者と連携することで生物学的な発見

タンパク質（以下 ORF）のうち , 宿主菌の病原性抑制

菌感染症は増加傾向にあるが , 既存の抗真菌薬は４系統

fumigatus（KU 株）にウイルス由来の各 ORF をそれぞれ

こで , 本研究課題では , 新しい抗真菌薬の開発に貢献す

イコウイルスが見出されており , 新規抗真菌薬としていては , マイコウイルスの各ゲノムがコードする ORFに関与する ORF を特定するため , ウィルス未保有株 A.

我々の研究分野は , ゲノム情報（in silico）の解析に焦や医療などへの貢献を目的としている . 近年 , 深在性真しか存在せず , 副作用や耐性菌の問題が生じている . そ個別に強制発現させ , 宿主の形態 ･ 生育速度 ･ ストレスることを目的に , 副作用が少なく , 広域性の高い抗真菌

ORF が存在することが確認され , 病原性の抑制に , マイ

る . まず , パン酵母 , 分裂酵母を中心とする真菌の培地

た.

ダグラブラータのゲノムに含まれる相同遺伝子 , 1,160

耐性などの表現型を比較した結果 , 生育不良が生じる
コウイルス由来のタンパク質が関与する事が示唆され

今後 , C. neoformans に短縮など加工された ORF4タンパ

ク質を発現させたり , 異種発現させた ORF4タンパク質を外部から作用させた時の生育抑制効果などを検討していきたい . また A. fumigatus に関しても , MoCV1-A 由来の ORF4タンパク質や , 短縮配列である SUa 配列を発現させて , その生育阻害効果を評価する .

薬の開発が期待できる分子標的の同定を目的としてい上での（in vitro）生育必須遺伝子情報を収集し , カンジ個を抽出した . それら1,160遺伝子について知花准教授が作製した遺伝子改変株を用いてカンジダグラブラー

タにおいて生育上必須か否かの評価を行ったところ , 約

900についての生育上必須であるとの判定が出された .

これら900遺伝子についてヒト遺伝子との相同性解析を行った結果 , 192遺伝子が極めて低い相同性しか示さなかった . 現在 , これらの192遺伝子の改変株を用いてカ

イコあるいはマウスを用いた感染時（in vivo）必須遺伝

子の評価実験を進めている .

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻

2016

53

研究課題

’15－８

が失われ α-1,6- 結合マンノースからなる主鎖のみに変化

Candida glabrata 細胞壁構築関連遺伝子欠損
が菌体の性質に及ぼす影響
柴田信之・佐々木雅人・伊藤文恵・田中

大（東北医科薬科大学感染生体防御学教室）

知花博治・山口正視

していた . Alg6p は小胞体での糖タンパク質合成に関与しているが , Δalg6株は細胞壁へのストレスをシグナル伝達する MAPK（Slt2p）の活性化が起きていた . これは Alg6p の欠損で生じる小胞体ストレスが細胞壁の構築不全が起きており , その結果が Slt2の活性化に表れているものと考えられる . カイコを用いた感染実験でも野生型と比較して Δalg6株では病原性が低下していたが , 復（千葉大学真菌医学研究センター）

帰株では野生株と同等の病原性を示したことから , 細胞

Deletion effect of genes involved in cell wall
integrity of Candida glabrata

壁の強度の維持は病原性に関与すると考えられる . この

細胞壁構築不全に関連する遺伝子は , 抗真菌薬の新たなターゲットとなる可能性を示唆している .

Nobuyuki Shibata, Masato Sasaki, Fumie Itoh,
Yutaka Tanaka（Tohoku Medical and Pharmaceutical University）

Hiroji Chibana, Masashi Yamagushi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
真菌の細胞壁は環境に対する適応に必要なだけでなく病原性にも関与していることが指摘されている . そこで

C. glabrata の細胞壁糖鎖生合成に関与する各種の遺伝子

欠損株について細胞壁の構築 , 化学構造さらに病原性を含む性質を調べることにより , ALG6, MNN2, MNN10,

HOC1の細胞壁構築への関与について解析した . マンナンの構造解析はアセトリシス , 1H NMR 分析 , メチル化

分析により行った . 細胞壁成分はアルカリ可溶性画分 ,酸可溶性画分 , アルカリ・酸不溶性画分に分画し , キチンの定量はエルソン・モルガン法により行った . 細胞壁
グルカン層およびマンナン層の形態変化は透過型電子顕微鏡により解析した . また , 病原性の変化はカイコへの感染実験により解析した . Δalg6株は細胞壁成分に親和性を示す Calcofluor White, Congo Red, SDS などの薬剤に対する感受性 , β-1,3- グルカナーゼ感受性が上昇していた . 一方 , micafungin に対する感受性は逆に低下し ,キチン含量は野生株の２倍以上に増加していた . 電子顕微鏡による細胞壁の解析でもマンナン層が薄く不鮮明になっていた . 野生株と比較してマンナンの主鎖と側鎖から成るくし型構造に変化は見られなかったが , その分子量はかなり低下していた . 一方 , Δmnn2株では薬剤感受性に著しい変化は見られなかったが , マンナンの側鎖

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千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻

2016

研究課題

’15－９

を行い , 同データベースに追加した . 相同性検索の結果 ,10種の既知カビアレルゲン遺伝子と類似のアレルゲン候

ゲノム情報を利用したAspergillus niger 及び醸造黒麹菌のアレルゲン遺伝子の同定

補遺伝子が , 上記麹菌等にあることを明らかにした . 複

数種の Aspergillus 属菌からゲノム DNA および RNA を抽出した . RNA は cDNA 化し , DNA と共に次世代シーク

鎌田洋一

エンシンサーによるゲノムおよび発現遺伝子解析を行っ（岩手大学農学部）

た . その成績をカビアレルゲンデータベースと照合する

山田修

ことによって , 実験を行わずに , アレルゲン遺伝子を選（酒類総合研究所）

抜できるか検討した . Aspergillus 属中に , 未同定であるが , 現在までに報告されているアレルゲン遺伝子と高度

高橋治男に相同性のある遺伝子が10種以上検出された . cDNA の（山形大学農学部）

橋本ルイコ

次世代シークエンシングでは , その塩基配列の解析結果（千葉県衛生研究所）

が直ちに遺伝子のクローニングに有効だった . 合計６種

渡辺麻衣子のアレルゲン候補遺伝子の全長のクローニングと , 発現

（国立医薬品食品衛生研究所）

ベクターへの導入 , 大腸菌における組換えアレルゲンタ

川上裕司・橋本一浩

ンパク質の発現が確認された . ６種の内 , 可溶性タンパ（エフシージー総合研究所）

ク質としてペルオキシゾーム局在性のタンパク質が精製

知花博治・清水公徳

された . 同組換えアレルゲンタンパク質は , アレルギー（千葉大学真菌医学研究センター）性気管支肺アスペルギルス症患者血清中の IgE 抗体と結Identification of allergen genes of Aspergillus
niger and its related koji molds by using of theirgenomic information
Yoichi Kamata（Department of Agriculture, Iwate University）

Osamu Yamada

合した . 同組換えアレルゲンの接種は , マウスに IgE 抗体産生を誘導した . 以上の成績は , カビアレルゲンの同定に , 従来の粗アレルゲンと患者血清との反応 , 粗アレ

ルゲンの精製・アミノ酸配列解析・遺伝子クローニング ,さらに組換えタンパク質の調製という過程を経ずにカビ

アレルゲンが同定できることを示し , カビアレルゲンの同定にゲノム情報を利用する有効性が確認された .

（National Research Institute of Brewing）

Haruo Takahashi, Ruiko Hashimoto（Chiba Prefecture Institute of Public Health）

Maiko Watanabe（National Institute of Health Sciences）

Yuji Kawakami, Kazuhiro Hashimoto（FCG Research Institute）

Hiroji Chibana, Kiminori Shimizu（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
これまでの千葉大学真菌医学研究所共同研究の成果として , カビアレルゲンに特化したデータベースを作製していた . 麹菌 , 白麹菌 , A. niger のゲノム情報を入手し ,作製したカビアレルゲンデータベースとの相同性検索

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻

2016

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研究課題

’15－10

研究課題

千葉大学が保有する化合物ライブラリーを用いた抗真菌薬シーズ開発’15－11

新規ユビキチンリガーゼ SCFUcc1によるカンジダ・グラブラータの感染制御機構の解明

荒井孝義

中務邦雄

（千葉大学大学院理学研究科）（名古屋大学大学院理学研究科）

知花博治・佐藤（岡本）美智代

知花博治・佐藤（岡本）美智代（千葉大学真菌医学研究センター）（千葉大学真菌医学研究センター）

Development of antifungal seeds from chemicalcompound library owned by Chiba University
Takayoshi Ari（ Graduate School of Science and Tecnology, Chiba

University）

Hiroji Chibana, Michiyo Okamoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
千葉大学が保有する1,000種類のオリジナル合成化合物のうち450種類の化合物について , 一次スクリー

Functional analysis of a novel ubiquitin ligase
complex, SCFUcc1, in the virulence of Candida
glabrata
Kunio Nakatsukasa（Division of Biological Science, Graduate School of

Science, Nagoya University）

Hiroji Chibana, Michiyo Okamoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
微生物や植物に特有の代謝経路であるグリオキシル酸

ニングを終了した. その結果, ６種類の化合物につ回路は , 病原性酵母の感染や植物の種子の発芽においてCryptococcus neoformans 等の主要な病原真菌に対して生育はグルコースが不足すると酢酸や脂肪酸を材料にグリオ

マウスの培養細胞を用いて呼吸阻害活性を指標とした細反応によりグルコースを合成する . これまで , 代謝酵素

いて Candida albicans, C. glabrata, Aspergillus fumigatus,

必須の役割を果たすことが知られている . これらの生物阻害活性が確認された . 次にこれらの化合物について ,キシル酸回路→クエン酸回路→糖新生という一連の代謝

胞毒性を測定したところ , １種類の化合物に細胞毒性がの転写を介したグリオキシル酸回路の活性化 , 不活性化行った . また , 日本化学療法学会のこれを元に製薬企業

キチン・プロテアソーム系を介した代謝酵素の分解に

同研究契約を締結することになった . 平成28年度は550

キシル酸回路において最初の反応を触媒するクエン酸合

確認されず , 抗真菌薬「シーズ候補」とし , 特許出願をの機構は報告されていた . 我々は本研究において , ユビに対して抗真菌薬の共同研究を提案し , 平成28年度に共よるグリオキシル酸回路の制御機構を見出した . グリオ

種類の化合物について , これまでと同様に , シーズ候補

成酵素 Cit2は , グルコースが豊富にあるとユビキチンリ解明に取組んで行くことにした .

ロテアソームによって分解された . また , グルコースがのスクリーニングを進めると共に , 化合物の作用機序のガーゼ複合体 SCF Ucc1によるユビキチン修飾を受け , プ

不足して酢酸や脂肪酸からグルコースを合成する必要が生じると , SCF Ucc1は Cit2をユビキチン化できなくなり安定化した Cit2がグリオキシル酸回路を活性化した . この研究は , 代謝経路の活性が代謝酵素の分解により制御されるというユニークなスイッチング機構を明らかにしたものと言える . 現在 , Candida glabrata の感染におけるSCF Ucc1ホモログの役割について , in vivo 解析を進めた .

56

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻2016

まず , カイコ幼虫の体液中に菌体を感染させ生存率を比菌によって壊された免疫グロブリンをリガンドとして較した結果 , Cit2の欠損株は野生株と比較して有意差が認識することを発見した . しかしながら , 真菌感染にお貪食実験系を確立させ , 現在本実験を用いた Cit2の機能において , 病原真菌カンジダアルビカンスから分泌され得られなかった . 次にマウスのマクロファージを用いた解析を進めている .

発表論文
１）Nakatsukasa K, Nishimura T, Byrne SD, Okamoto
M, Takahashi-Nakaguchi A, Chibana H., Okumura
F, Kamura T: The Ubiquitin Ligase SCF Ucc1 Acts as a
Metabolic Switch for the Glyoxylate Cycle. MolecularCell, 59: ２-34, 015

研究課題’15－12

ける LILRA2の役割は明らかではなかった . 本研究課題
たプロテアーゼによって分解された免疫グロブリンも

LILRA2を介した生体防御機構を活性化することを明らかにし , これまでの成果と合わせて論文発表を行った .

研究課題’15－13

ショウジョウバエ感染系を用いた真菌病原性発現機構のゲノムワイド解析
倉田祥一朗・倉石貴透（東北大学大学院薬学研究科）

真菌感染におけるペア型受容体を介した生体防御機構の解明荒瀬尚

知花博治・佐藤（岡本）美智代（千葉大学真菌医学研究センター）

Genome-wide analysis of fungal virulencemechanism using Drosophila infection system（大阪大学微生物病研究所）

平安恒幸（大阪大学免疫学フロンティア研究センター）

知花博治・佐藤（岡本）美智代

Shoichiro Kurata, Takayuki Kuraishi（Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Tohoku（千葉大学真菌医学研究センター）

University）

Host defense mechanism by paired immune
receptors in fungal infection

Hiroji Chibana, Michiyo Okamoto（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
日和見感染症に代表される感染症を引き起こす病原真Hisashi Arase（ Research Institute for Microbial Diseases, Osaka

University）

Kouyuki Hirayasu

菌の病原性発現機構は , 依然として不明であり , 大きな脅威となっている . 真菌医学研究センター知花准教授は ,Candida glabrata を用いて , 5249遺伝子を組換えた変異体（WPI Immunology Frontier Research Center, Osaka

ライブラリーを作成している . このリソースを用いる

Hiroji Chibana, Michiyo Okamoto

できる . しかしながら , マウスなどの哺乳動物を宿主とUniversity）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
ペア型受容体は , 細胞外ドメインが非常に相同性の高と , 病原性の発現に関わる遺伝子をゲノムワイドに探索して用いて網羅的に解析することは , 現実的に不可能である . 一方 , 自然免疫研究によく利用されているショウ

ジョウバエは , 生活環が短く網羅的解析に優れている .

また , すでに確立されている自然免疫変異体を用いるこい活性化型と抑制化型のペアからなる受容体であり , 主とができる . そこで , 本研究では , センターの有する真レセプターの一つである活性化レセプターLILRA2が細ら病原真菌の病原性発現機構の解明に迫ることにした .

に自然免疫系の細胞に発現している . 代表者は , ペア型

千葉大学

菌のリソースを利用した , ショウジョウバエでの解析か

真菌医学研究センター報告

第 20 巻2016

57

そのために , 昨年度の本共同利用・共同研究（採択番号14-11）で確立した易感染ショウジョウバエ系統を用いた網羅的感染実験系を用いて , 倍地上での生育が正常

virus（NDV）感染に応答した RIG-I の挙動と SG 形成について詳細に解析した . その結果 , NDV 感染細胞内では , まず RIG-I は NDV ウイルスの増殖複合体に集積すな2,026の遺伝子欠損株を解析した . 合計７万匹以上のることで少量の I 型インターフェロン産生を誘導するこい , 病原性が低下した57株同定した . さらに , このうちことにより SG を足場としてさらに強力なインターフェ

ショウジョウバエを用いた四次スクリーニングまで行と , またそのあと遅れて形成されてくる SG へ移動する

14株において , ショウジョウバエ体内での菌の増殖を調

ロン産生を誘導すること , さらに , この時 NDV 由来の調べた . その結果 , 14株中11株では , 宿主体内での増殖

SG に共局在しており , この RNA が非自己として RIG-I

べ , 宿主体内での菌の増殖と , 病原性の低下との関係を能が低下していたが , ３株では野生型と同等の増殖能を示した . 本菌において , このような病原因子を示唆する

報告は未だない . 今後 , これら３株において , 宿主体内で増殖しているにもかかわらず , 病原性が低下する理由を明らかにすることで , 病原真菌の病原性発現機構の本質を明らかにすることが期待できる .

研究課題’15－14５’ 末端にキャップ構造を持たないリードスルーRNA がにより検知されていることを明らかにした .
発表論文

１）Yoneyama M, Onomoto K, Jogi M, Akaboshi T, Fujita

T: Viral RNA detection by RIG-I-like receptors. Curr
Opin Immunol, 32: 48-53, 2015.

研究課題

感染に応答した自然免疫誘導の分子機構の解析’15－15

真菌核酸に対する自然免疫応答の解析
河合太郎

藤田尚志・加藤博己（奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研（京都大学ウイルス研究所）究科）

米山光俊・尾野本浩司

米山光俊・高橋（千葉大学真菌医学研究センター）（千葉大学・真菌医学研究センター）

Innate immune responses against pathogen
infection

梓

Recognition of fungal nucleic acids by patternrecognition receptors

Takashi Fujita, Hiroki Kato

Taro Kawai

Mitsutoshi Yoneyama, Koji Onomotoof Science and Technology）（Institute for Virus Research, Kyoto University）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
高等脊椎動物における抗ウイルス自然免疫において ,RIG-I-like 受容体（RLR）は細胞内に侵入した非自己RNA を検知するセンサー分子として必須な役割を担っ（Graduate School of Biological Sciences, Nara InstituteMitsutoshi Yoneyama, Azusa Takahashi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
本研究では , ウイルスや真菌由来の RNA に対する自然免疫応答惹起のメカニズムを明らかにすることを目ている . 本研究は , 最近明らかにした細胞内ストレス顆

指した . そこで , 自然免疫による RNA 認識機構の詳細について解析することを目的とした . 本年度は , これま発現誘導可能な分子の発現スクリーニングを行い , Hu

粒（SG）の形成を介した RLR シグナル誘導の分子機構での SG についての共同研究を進め , New castle disease

58

千葉大学

をさらに理解するため , I 型インターフェロン遺伝子のAntigen R（HuR）を得た . HuR は RNA 結合ドメインを

真菌医学研究センター報告

第 20 巻2016

持つタンパク質であり , AU リッチ配列をもつ mRNA の研究課題

編集技術を用いて HuR を欠損するマウスマクロファー

遺伝子サイレンシングと自然免疫反応のス
イッチング機構の解析

安定化に寄与することが知られている . そこで , ゲノム

ジ RAW264.7細胞を樹立した . 合成二本鎖 RNA アナロ

グ Poly（I:C）に対する応答を解析したところ , HuR 欠’15－16損細胞ではインターフェロン β やケモカイン遺伝子の発程久美子・高橋朋子

現が野生型細胞と比べ顕著に限弱していた . また , HuR（東京大学大学院理学系研究科）

は未刺激状態では核に局在しており , Poly（I:C）刺激に

より細胞質内に移行し顆粒状の局在を示した . このドッ
トはストレス顆粒であることが示されている . ストレス顆粒は , ストレス刺激やウイルス感染によって形成される細胞質内顆粒であり , mRNA, RNA 結合蛋白質 , リボ

ゾーム等が含まれており , ストレス時における翻訳抑

米山光俊・尾野本浩司（千葉大学真菌医学研究センター）

Switching mechanism between gene silencing
and innate immune response

制に関与すると考えられている . ウイルス RNA もスト

Kumiko Ui-Tei, Tomoko Takahashi

RNA がここで認識されることが示唆される . 今後 , HuR

Mitsutoshi Yoneyama, Koji Onomoto

レス顆粒に局在することが報告されており , 病原体のの細胞内局在の詳細や結合する RNA の同定を通して ,真菌やウイルスに対する防御機構における HuR の役割を明らかにしていく必要がある .

発表論文
１）Kumar S, Ingle H, Mishra S, Mahla RS, Kumar A,
Kawai T, Akira S, Takaoka A, Raut AA, Kumar H:
IPS- 1 differentially induces TRAIL, BCL2, BIRC3
and PRKCE in type I interferons-dependent and-independent anticancer activity. Cell Death Dis, 6:e1758, 2015

（Graduate School of Science, The University of Tokyo）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
近年 , ゲノムからはタンパク質をコードしないノ
ンコーディング RNA が多く転写されることが明らかになっている . ノンコーディング RNA の中でも smallinterfering RNA（siRNA）, microRNA（miRNA）, PIWIinteracting RNA（piRNA）といった内在性の小分子２本鎖 RNA は , 遺伝子サイレンシングという塩基配列特異的な遺伝子抑制機構によって , 広く多様な生命現象を制御している . 一方 , ウイルスは , ほぼすべての生物に感染する病原体であり , 生物はウイルス感染に対するさま
ざまな防御機構を発達させてきているが , 哺乳類特異的な現象として , ウイルスなどの外来性２本鎖 RNA により惹起される抗ウイルス応答反応が存在する . これら２つの機構は , 共通に RNA によって惹起される機構であるにも関わらず , 相互の関連は不明である . 申請者
らは , 両方の経路に共通に関わる因子として TAR-RNAbinding protein（TRBP）を同定している . 本研究では ,TRBP の機能を足がかりに , これら２つの経路のクロス
トークやスイッチングの分子機構を明らかにすることを目指している .

RNA サイレンシングでは , 小分子 RNA が Argonauteと呼ばれるタンパク質へ取り込まれて , 初めてその遺 伝 子 抑 制 機 能 を 発 揮 す る . TRBP は 小 分 子 RNA のArgonaute への取り込みを促進して RNA サイレンシン

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻201659

グ活性を促進する . 米山らはウイルス感染を細胞質内研究成果

MDA-5, LGP2を発見している . TRBP は , これらのう化し致命率も高い . また , 移植患者で感染症とならんでで感知するウイルスセンサータンパク質として RIG-I,

同種造血幹細胞移植後の真菌感染症は , しばしば重症

ち LGP2と直接相互作用するが , RIG-I や MDA5とは相危険な合併症である移植片対宿主病（GVHD）は , ドウイルスセンサータンパク質の RNA サイレンシング効

胞を攻撃する難治性の疾患である . GVHD は細菌感染

互作用しないことが明らかになった . そこで , これらの果に対する影響を , それらのノックダウンによるレポー

ターアッセイや強制発現系をもちいて検討したところ ,RIG-I と LGP2は RNA サイレンシング活性を抑制する作用があるが , MDA5には抑制作用はないことがわかった . さらに , 小分子 RNA と TRBP やウイルスセンサー

タンパク質との相互作用をゲルシフトアッセイで解析した結果 , TRBP だけでなく , RIG-I と LGP2も小分子

RNA と結合するが , MDA5はほとんど結合しないことが明らかになった . RNA サイレンシング活性と siRNA結合活性の結果は , RIG-I と LGP2の siRNA への結合が遺伝子サイレンシング活性を何らかの形で制御している結果と推定された . 今後は , このような遺伝子サイレン

シング活性制御の機構と TRBP との相互作用の関連を明らかにすることで , ２つの経路のクロストークの機構をナーの移植片に混入した T リンパ球がレシピエントの細によって増悪をきたすことが知られているが , 真菌感染症が GVHD に及ぼす影響は不明であった . そこで , 本

研究ではマウスモデルを利用して真菌感染症が GVHDに及ぼす影響を解明し , 移植後の真菌感染症予防の意義について再検討することを目的とした .

まず , マウス GVHD モデルに C. albicans 死菌 , あるいはその細胞壁構成糖鎖である α- マンナンを投与したと

ころ , 病態は有意に悪化し , 特に肺で顕著であった . そのメカニズムを解析するため , 肺に浸潤している炎症性細胞を調べたところ , α- マンナンを投与したレシピエントマウスで , ドナー由来 T 細胞が顕著に Th17細胞への分化していることが明らかとなった . また , この Th17細胞分化の亢進は , レシピエントマウスの Dectin-2を介したものであった . これらの結果から , 同種造血幹細胞移解明する予定である .

植後の真菌感染症は , 単に感染症として問題になるばか

研究課題な病態を引き起こしている可能性が示唆された .

りではなく , 肺における GVHD の悪化要因として重篤’15－17

同種造血幹細胞移植後の Candida 感染による移植免疫反応の修飾
豊嶋崇徳（北海道大学大学院医学研究科）

橋本大吾

pulmonary graft-versus-host disease in mice. Blood, 125:

（北海道大学病院）

西城

発表論文
１）Uryu H, Hashimoto D, Kato K, Hayase E, Matsuoka
S, Ogasawara R, Takahashi S, Maeda Y, Iwasaki H,
Miyamoto T, Saijo S, Iwakura Y, Hill GR, Akashi
K, Teshima T: α -Mannan induces Th 17 -mediated3014-3023, 2015.

忍（千葉大学真菌医学研究センター）

α-Mannan induces Th17-mediated pulmonary

graft-versus-host disease in mice

Takanori Teshima, Daigo Hashimoto（Department of Hematology, Hokkaido University

Graduate School of Medicine）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

60

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻

2016

研究課題

’15－18innate lymphoid cells（ILC3）と γδT 細胞であることが明カンジダ感染に対する IL-17A/F を介した皮膚真菌症防御機構の解明らかとなった . これらの結果から , 皮膚では Th17細胞ではなく , ILC3と γδT 細胞から分泌される IL-17が感染防御に必須であることが示された .

研究課題

岩澤真理・松岡悠美・若林正一郎’15－19（千葉大学医学部附属病院）

西城

肺炎球菌認識と感染防御における Dectin- ２の役割に関する研究忍（千葉大学真菌医学研究センター）

IL- 17 is pivotal for host defense against
epicutaneous candidiasis
Mari Iwasawa, Yuumi Nakamura, Seiichiro
Wakabayashi（Chiba University Graduate School of Medicine）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
Candida albicans（C. albicans）は , 健常人においては皮膚や粘膜に常在真菌として定着し , 通常は症状を起こすことはない . 一方 , 多湿や不衛生 , 抗生剤投与による菌交代現象などにより , 主に間擦部に紅斑 , 鱗屑 , 小膿疱 ,びらんなどを生じる . ヒトの慢性皮膚粘膜カンジダ症においては Dectin-1, CARD9, STAT3, IL-17レセプター遺伝子など複数の遺伝子異常が報告され , これらの分子を介した生体防御機構が C. albicans 排除に重要であることが示唆される . しかしながらマウスの経皮感染モデルは確立されておらず , その詳細な分子機構は不明である .
そこで本研究では , １）経皮感染マウスモデルの作成 ,２）各種ノックアウトマウスを用いた感染防御機構の解川上和義・石井恵子（東北大学大学院医学系研究科）

西城

忍（千葉大学真菌医学研究センター）

Role of Dectin- 2 in the host defense topneumococcal infection
Kazuyoshi Kawakami, Keiko Ishii（Tohoku University Graduate School of Medicine）

Shinobu Saijo（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
肺炎球菌は市中肺炎の原因細菌として最も頻度が高
い . 特に , 高齢者や慢性心肺疾患 , 糖尿病などの基礎疾患を有する患者では重症化することが多く , 高齢化社会のわが国では重要な問題となっている . これらのハイリ
スク患者には莢膜多糖ワクチンが用いられ一定の予防効
果を上げてきたが , 胸腺非異存性抗原であるため臨床効
果に十分でない点も存在し , より有効なワクチンの開発が望まれている . 肺炎球菌は , 真菌と同様に多糖に富む

明 , を目的とし研究を開始した . まず , マウスの背部を莢膜を有しており , 免疫細胞による認識に何らかの C タ付・密封したところ , Day2をピークに感染局所で好中球る.

と炎症の収束が認められ , C. albicans 経皮感染モデルので , 本細菌に対する感染防御への Dectin-2の役割につい

剃毛し , 一定量の C. albicans 懸濁液に浸したガーゼを貼の浸潤を伴う炎症が認められ , Day7で C. albicans の排除

イプレクチン受容体が関与している可能性が予想され

本研究では , マウス肺炎球菌肺炎モデルを用いること確立に成功した . そこで , IL-17のノックアウト（KO）て , Dectin-2遺伝子欠損（KO）マウスと野生型コントロー

C. albicans が排除できず , 皮膚における感染防御に IL-17

マウス , Dectin-2KO マウスの肺内に血清型３型の肺炎マウスを用いて同様の実験を行ったところ , Day7でもが必須であることが示された . さらに , IL-17の産生細胞を探索したところ , これまで考えられてきた Group3

千葉大学

ル（WT）マウスを比較検討することで解析した . WT球菌を感染させたところ , KO マウスでは WT マウスに比べて生存期間が短縮し , ３日後の肺内菌数が有意に増

真菌医学研究センター報告

第 20 巻2016

61

加した . Dectin-2KO マウスでは , 好中球の感染局所への集積の異常はみられなかったが , 好中球による菌の貪

定着しバイオフィルムを形成すると , 化学療法や宿主防御機構に対する抵抗性が増強することが知られてい食が有意に低下した . 一方 , 肺炎球菌のオプソニン化にる . 近年 , 真菌においても Aspergillus fumigatus や Candida

特異的な IgG 量が Dectin-2KO マウスでは WT マウスとた . 感染症は , 単独の病原体だけでなく , 複数の病原体重要と考えられる血清や気管支肺胞洗浄液中の莢膜多糖

albicans がバイオフィルムを形成することが報告され比べて有意な低下 , もしくは低下傾向を示した . また ,によるもの（混合感染 , 重複感染）もあり , 複数の病からの IL-12p40産生が , Dectin-2KO マウスでは WT マ

き , 重症化の可能性もある . 臨床例として , Streptococcus

ち , ConA-sepharose 結合性物質が BM-DCs の Dectin-2にる . 本研究では , 未だ知見の乏しい S. pneumoniae と A.

から , Dectin-2による肺炎球菌多糖の認識が , 感染局所

析した .

肺炎球菌培養上清による骨髄由来樹状細胞（BM-DCs）
ウスに比べ有意に低下していた . 肺炎球菌由来成分のう
よって認識され , IL-12p40産生を誘導した . 以上の結果

への好中球動員よりも好中球による貪食機能に関与することで , 感染防御において重要な役割を担うことが明ら

原体による場合は , 異なる病原体の間で相互作用が起pneumoniae と A. fumigatus の 重 複 感 染 が 報 告 さ れ て い

fumigatus の混合バイオフィルムの構造・性状について解S. pneumoniae と A. fumigatus を24ウェルプレートにおいて同時にバイオフィルム形成開始させると , 24時間かになった .

後では既に S. pneumoniae のみからなるバイオフィルム

らかになることで , より有効なワクチンの開発に繋がる

オフィルムに S. pneumoniae を加えると , バイオフィル

本研究を通して免疫系による肺炎球菌の認識機構が明が観察された . 予め24時間形成させた A. fumigatus バイ

ことが期待される .

ムの減少および菌糸の減少・切断が観察された . この

研究課題

る血清糖タンパク質 fetuin を添加しても観察された . S.

現象は , A. fumigatus のバイオフィルム産生を増強させ’15－20

肺 炎 球 菌 混 合 感 染 に お け るAspergillus
fumigatus バイオフィルム産生についての研
究
渡邊

浩・岩橋

pneumoniae 培養上清を A. fumigatus バイオフィルムに加えると , バイオフィルムの減少および菌糸の減少・切断が見られたが , 培養上清を熱処理すると影響は見られず ,S. pneumoniae 培養上清中の熱感受性因子が A. fumigatus
バイオフィルム破壊に関与することが示唆された .

潤

今後は , S. pneumoniae 培養上清中の A. fumigatus バイオ（久留米大学医学部感染制御学講座）

フィルム破壊因子の同定を行う予定である .

亀井克彦（千葉大学真菌医学研究センター）

Studies on biofilm formation by Aspergillus
fumigat us co-cultured with St reptococcus
pneumoniae
Hiroshi Watanabe, Jun Iwahashi（ Department of Infection Control and Prevention,

Kurume University School of Medicine）

Katsuhiko Kamei（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
ヒトの病原体となる細菌の多くが , ヒト体内において

62

千葉大学

真菌医学研究センター報告

第 20 巻

2016

研究課題

’15－21とから , ５つの分泌蛋白質が血清刺激に応答したバイオ

アスペルギルスのバイオフィルム形成および抗真菌薬耐性に関連する新規遺伝子群の探索
梅山

フィルム形成に関与することが示唆された . 今後 , 血清

刺激に応答したバイオフィルム形成におけるシグナル伝達機構の役割を解明していく .

今後の新規遺伝子探索に応用するために , 幅広い生物

隆・宮㟢義継種で用いられている Cas9/CRISPR ゲノム編集技術を A.

（国立感染症研究所）

fumigatus で利用可能にした . ゲノム上の標的部位の20塩

亀井克彦

基を含む sgRNA と Cas9蛋白質を一度の形質転換で導入（千葉大学真菌医学研究センター）するためのプラスミドを構築した . このシステムを用い

Screening of novel genes involved in biofilm
formation and antifungal resistance in Aspergillus
fumigatus

ることにより , ゲノムの特定の部位を切断し , 変異導入などの編集を行うことが可能になる . 今後 , この技術を用いて , 血清刺激に応答する新しい遺伝子群の探索に応用したい .

Takashi Umeyama, Yoshitsugu Miyazaki

研究課題

Katsuhiko Kamei

動物感染モデルを用いたボリコナゾール局所投与による真菌症治療に向けた基礎研究（National Institute of Infectious Diseases）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果’15－22

長内理大・山崎伸吾・石井伊都子

深在性真菌症の中でも Aspergillus fumigatus を主要病原菌とするアスペルギルス症は増加傾向にあり , 予後が非
常に悪い . 近年 , アスペルギルスのバイオフィルム形成（千葉大学医学部附属病院薬剤部）

渡辺哲・亀井克彦・五ノ井透・高橋梓（千葉大学真菌医学研究センター）がアスペルギルス感染に関与することが示唆されている . 特にアスペルギローマ（菌球）の菌糸塊に見られる菌糸周囲には厚い細胞外マトリクスが観察されている .

このようなバイオフィルムを形成する状態では , いくつ

Effects of local administration of voriconazole
onto mycosis in animal infection model

かの抗真菌薬に対する感受性が低下する現象が示され ,Arihiro Osanai, Shingo Yamazaki, Itsuko Ishii

ながら , バイオフィルム形成 , および , それによる抗真Tetsu Watanabe, Katsuhiko Kamei, Toru Gonoi,
Azusa Takahashi

難治性の原因の１つになっていると考えられる . しかし
菌薬耐性の詳細な分子メカニズムは不明な点が多い . 本

研究では , バイオフィルム形成に関わる新規遺伝子を同定し , 抗真菌薬耐性との関連性を明らかにすることを目的とする . 平成27年度では , 分泌蛋白質と予測される A.

fumigatus の５遺伝子について血清刺激によるバイオフィ

ルム形成に及ぼす影響を検討した . また , Cas9/CRISPR（Pharmacy, Chiba University Hospital）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果
ボリコナゾール（VRCZ）はカンジダやアスペルギル

ス症などの真菌感染症に対して広く用いられる抗真菌

ゲノム編集技術を A. fumigatus に導入した .

薬である . 有効性が高く , 広く利用されることが期待さを A. fumigatus AfS35株に形質転換し , ５つの分泌蛋白質

内の変動が大きいことから治療濃度を管理するのが難し

ハイグロマイシン耐性マーカーを含むカセット DNA

をコードする遺伝子の破壊株をそれぞれ作製した . 親株
では血清添加によってバイオフィルム形成量が増加す

るが , 遺伝子破壊株ではその増加は観察できなかったこ

千葉大学

れる反面 , 治療域が狭く薬物動態の個体間あるいは個体い薬物である . 本研究ではアスペルギルス膿胸に対し ,VRCZ を胸腔内投与することにより , 胸腔内での VRCZ

濃度並びに全身での血中濃度がどのように変動するか ,真菌医学研究センター報告

第 20 巻201663

また胸腔内投与による治療効果を検討することを目的と

研究成果
インフルエンザ菌ｂ型ワクチン導入後に分離された小した .

まず , 千葉大学医学部附属病院における患者症例を

児侵襲性感染症由来インフルエンザ菌株を収集し PCR

VRCZ200mg/ 回 , １日２回を静脈内で投与したが , 血中判定した28株について , 臨床背景 , 薬剤感受性 , 生物型 ,腔内に VRCZ200mg を投与し , 血中濃度の推移を検討し検討を行った . 臨床背景として発症年齢が新生児から学検討した . 71歳 , アスペルギルス膿胸の患者に対し ,濃度は1.45mg と目標濃度に到達しなかった . そこで , 胸たところ , 12時間後濃度は一過性に1.69mg まで上昇したが , 24時間後では再び1.53mg と低下した . そこで , 肺ド

レーンを留置し , 週２～３回繰り返し投与することとし

法で血清型解析を実施した . 血清型解析で無莢膜株とMLST 解析 , バイオフィルム産生能 , 付着因子について童まで幅広い年齢層に認められた . 基礎疾患を有する症

例からの分離例が多く , 全体の42.9％を占めた . ３例が死亡しており , 予後不良例も認めた . 薬剤感受性は良好

投与量も300mg/ 回 , 400mg/ 回と増量したところ , 血中な株が多かったが , ２株が β ラクタマーゼ産生クラブラ

ため , 300mg/ 回に戻して治療した . B-D- グルカン値はなる可能性が示唆された . ST 型は28株中26株が異なっ

濃度は5.63mg まで上昇した . 血中濃度が中毒域となった

開窓術を行った Day51には陰性化し , その後患者は回復し退院することができた . 以上のことから , アスペルギ

ルス膿胸に対する VRCZ の胸腔内局所投与は臨床上有効な治療法であることが示唆された .

なお , マウスでのアスペルギルス膿胸のモデル作成を試みたが , 安定した胸腔内注入モデルの作製に手間取

ン酸アモキシシリン耐性株であり , 今後臨床的に問題とており多様であった . 生物型はⅡ型が最も多くついでⅢ型であり , インフルエンザ菌ｂ型株とは異なっていた .

バイオフィルム産生能 , 付着因子保有状況は多様であり , 呼吸器から分離される無莢膜株との大きな違いは認めなかった .

り , データを得るに至らなかったため報告書には記載し

研究課題や投与スケジュールについて詳細な検討がなされること

天然物を素材とした新規抗感染症薬リード化合物の獲得なかった . 今後 , 動物実験感染モデルを確立し , 投与量が期待される .

研究課題’15－23’15－24久保田高明（昭和薬科大学）

侵襲性感染症由来インフルエンザ菌の病原因子に関する研究西順一郎（千葉大学真菌医学研究センター）

Development of lead compound for new antiinfective agent from natural resources（鹿児島大学大学院医歯学総合研究科）

石和田稔彦（千葉大学真菌医学研究センター）

Takaaki Kubota

Pathogenesis of Haemophilus influenzae isolated
from patients with invasive disease（Showa Pharmaceutical University）

Tohru Gonoi（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果

Junichiro Nishi（Kagoshima University Graduate School of Medical and

Dental Sciences）

Naruhiko Ishiwada（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

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五ノ井透

千葉大学

沖 縄 で 採 取 し た Verongida 目 の 海 綿 か ら , 単 離 し た

新規ブロモチロシンアルカロイド Tyrokeradine G および H を単離 , 構造決定した . Tyrokeradine G および H はAspergillus niger に対して穏やかな抗真菌活性を示した .

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第 20 巻2016

Tyrokeradine G は Cryptococcus neoformans に対しても穏やか

おいて , アゾール薬に対して耐性があることが知られまた , 沖縄で採取した Hyrtios 属の海綿から , 単離した

報告はこれまでになく , その分布の実態は解明されてルカロイド Hyrtinadine B および C を単離 , 構造決定し

み , その遺伝子型および薬剤感受性を解析し , 耐性株

真菌活性を示した . Hyrtinadine C は Escherichia coli および比べ低頻度ではあるが南北問わず幅広い地域の土壌かな抗細菌活性を示した .

アゼピノインドール骨格を持つ新規ビスインドールア

た . Hyrtinadine B は , Aspergillus niger に対して穏やかな抗ている . しかし , 国内の環境中から関連種の正式な分離いない . そこで , 国内各地の土壌から関連種の分離を試の分布の実態把握を行った . この結果 , A. fumigatus にBacillus subtilis に対して穏やかな抗細菌活性を示した .

ら A. fumigatus 関連種である A. lentulus, A. udagawae, A.

継続して行う予定である .

これら関連種が生息していることが確認された . また ,今後も , 顕著な抗菌活性を示す新たな天然物の探索を

発表論文
１）Kubota T, Watase S, Sakai K, Fromont J, Gonoi T,
Kobayashi J: Tyrokeradines G and H, new bromotyrosine
alkaloids from an Okinawan Verongid sponge. Bioorg
Med Chem Lett, 25: 5221-5223, 2015.

研究課題’15－25薬剤感受性は , A. lentulus, A. udagawae においては臨床および環境分離株の多くにおいて ITCZ に耐性があるのに対して , A. viridinutans は臨床株 , 環境株とも多くの株において ITCZ, VRCZ に耐性みられた . これらの耐性は環境株 , 臨床株とも同程度であることから , 自然耐性と推定される .

研究課題

Aspergillus fumigatus 関連種における臨床株と環境株の比較広瀬

viridinutans を分離することができ , 国内の自然環境中に’15－26

白癬菌が産生・分泌するプロテアーゼによる
表皮角層ケラチン分解様式に関する形態学的解析

大（日本大学薬学部）

山田

矢口貴志

（帝京大学医真菌研究センター）剛（千葉大学真菌医学研究センター）

矢口貴志・田中玲子（千葉大学真菌医学研究センター）

Studies on comparison between clinical andenvironmental isolates on relatives of Aspergillus
fumigatus

Morphological analyses of keratin degradation
mechanisms by dermatophytes

Dai Hirose

Tsuyoshi Yamada

Takashi Yaguchi

Takashi Yaguchi, Reiko Tanaka（School of Pharmacy , Nihon University）（Teikyo University Institute of Medical Mycology）（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果（Medical Mycology Research Center, Chiba University）

研究成果

ア ス ペ ル ギ ル ス 症 主 要 原 因 菌 で あ る Aspergillus

白癬の原因菌である白癬菌による表皮角化組織へのfumigatus のアゾール薬に対する耐性株の増加は世界的

侵入様式は今なお不明な点が多いが , タイプの異なる

所 , 耐性株は殆ど発見されていないのが現状である . 一

への菌の侵入初期の重要なプロセスであると長年考えに問題視されているが , 日本国内においてはこれまでの方 , A. fumigatus の関連種は国内の多くの臨床分離株に

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プロテアーゼ群を段階的に利用した酵素的分解が組織られてきた . 申請者らは , 角化組織の酵素的分解への関

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与が指摘されているメタロプロテアーゼ４（MEP ４）,間を利用して菌糸が組織内部に伸長していることが判明

ロイシンアミノペプチダーゼ２（Lap ２）およびジペした . さらに , 作出に成功した MEP ４/DPPIV 二重破壊

織への菌の侵入様式との関連性を解析した . 白癬菌 A.

子を全て破壊した五重破壊株においても同様の解析結果

プチジルペプチダーゼ４（DPPIV）について , 角化組

株 , そして別途作出したゲノム上に５個ある MEP 遺伝

vanbreuseghemii をホストに用いて , 上記プロテアーゼ遺が得られた .

爪を唯一のタンパク質源とする最小寒天培地（簡易的 inの白癬菌の侵入様式に対し , MEP ファミリー, Lap2お伝子の一重および多重破壊株を作出し , （ヒト由来の）vitro 爪白癬モデル）を用いて感染実験を行った . しかし ,すべての一重破壊株とホスト株との間で爪への感染（増以上のことから , 酵素的分解に基づく表皮角化組織へ

よび DPPIV の関与の可能性は低いと考えられる . また ,ホスト株および MEP4一重破壊株感染爪の走査型電子顕殖）速度の差が認められなかった他 , 光学顕微鏡観察に

微鏡観察結果から , 酵素的分解よりもむしろ組織表面のト株および MEP4一重破壊株の菌糸で覆われた爪の走査

内への菌の侵入を促す重要な要素になっているのではな

おいても形態学的差異は認められなかった . また , ホス型電子顕微鏡観察を行ったところ , 爪表面に見られる隙

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物理的なスペース（細胞間の隙間 , 傷など）が角化組織いかと考えられる .

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