第 34 回

動物生殖工学研究会

プログラム・抄録集

平成２８年１２月３日（土）（公財）実験動物中央研究所

レクチャールーム

プログラム総会

１３：００～１３：３０

開会挨拶

会長：横山 峯介

１３：３０～１４：２０
特別講演

1

座長：東貞宏

顕微授精技術の開発およびその応用研究について
小倉 淳郎 先生
（理化学研究所バイオリソースセンター、筑波大学大学院生命環境化学研究科)

１４：２０～１５：１０
特別講演

2

座長：後藤 元人

データから見た女性の年齢と妊娠における日本の生殖医療
福永 憲隆 先生
（医療法人浅田レディースクリニック 培養研究部）

休憩

１５：１０～１５：２５

１５：２５～１６：１０
教育講演

座長：中潟直己

座長：宮地均History of cryo
Dr Jorge M. Sztein(Barcelona)１６：１０～１７：３０
一般講演

1

１. マウス生殖工学技術を支えるデータ環境の作製と管理について○土山修治、中潟直己(熊本大学 生命資源研究・支援センター(CARD)資源開発分野)

２.精子生体膜中チオールの酸化による受精能獲得の抑制○白角一樹 1、中尾聡宏 2、田村香菜 1、池田真由美 3、異島優 4、竹尾透 1、中潟直己 1(1 熊本大学生命資源研究・支援センター資源開発分野、2 新潟大学脳研究所動物資源開発研究分野、3 熊本大学薬学部薬剤学分野、4 徳島大学薬学部薬物動態制御学分野)
座長：的場 理子
３.コウノトリおよびホオアカトキ胚から分離された生殖巣生殖細胞(GGCs)におけるニワトリ胚生殖巣への移住能解析○中島友紀 1,2、福田はるか 1、大沼学 3、村田浩一 4,5,6、植田美弥 4、須永絵美 5、
白石利郎 5、田島淳史 1(1 筑波大学、2 現九州大学、3 国立環境研究所、4 よこはま動物園ズーラシア、
5 横浜市繁殖センター、6 日本大学)

４.いわゆる「健康食品」について○奥田 裕計
（独立行政法人 労働者健康安全機構・日本バイオアッセイ研究センター）

１７：３０～
報告１． マウス咬傷防止手袋の使用感の調査結果報告○石倉知征、松田正史、辰巳

大縄 悟志、望月宏美、川元由里衣、飯塚裕介、山本 貴子、忍、長谷川孝徳(国立研究開発法人

理化学研究所統合生命医科学研究センター)

２．第３３回動物生殖工学研究会シンポジュウム（城崎温泉:兵庫県)報告

閉会挨拶

副会長：浜野晴三

１８：００～２１：００
懇親会
2特別講演1

顕微授精技術の開発およびその応用研究について
Development of ICSI techniques in mammals and their applications to biomedicalresearches

小倉 淳郎
Atsuo Ogura

理化学研究所バイオリソースセンター、筑波大学大学院生命環境化学研究科
RIKEN BioResource Center
University of Tsukuba Graduate School of Life and Environmental Sciences

ほ乳類の受精は、精子の受精能獲得、先体反応、透明帯通過、卵子との細胞膜融合など、数々の複雑な細胞生化学的な過程を経て成立する。受精にかかわる補助技術は、これらの過程を人為的に再現、あるいは省略することにより発達してきた。その過程を最も単純化した技術が、顕微授精である。顕微授精技術の歴史は、柳町らによる 1970 年
代のハムスターの実験に始まる。当初は、前核形成の条件などの研究に用いられていたが、1990 年前後より産子の獲得を目的に技術改良が進められ、ウサギ、ウシ、ヒト、マウスなどで産子の作出が報告された。特に 1995 年、木村－柳町によるピエゾマイクロマニピュレーターの開発によるマウス ICSI の成功は、顕微授精の歴史における一大ブレークスルーと言える。マウスは最も広く使われている実験動物であるため、このピエゾ ICSI の成功後、顕微授精を用いた研究が飛躍的に拡大した。現在、日常的な貴重な遺伝資源の保存だけでなく、遺伝子機能の解析、体外操作生殖細胞を用いた産子の作出、トランスジェニック動物作出、世代期間の短縮などに顕微授精が広く用いられている。
そしてこれらの応用研究は、マウス以外の動物にも広がっている。本講演では、顕微授精技術の開発の歴史および応用研究の可能性について解説をする。

3特別講演2

データから見た女性の年齢と妊娠における日本の生殖医療
Data showing the current status between age and pregnancy of
reproductive medicine in Japan

福永 憲隆
Noritaka Fukunaga

医療法人浅田レディースクリニック 培養研究部
Asada Ladies Clinic Research and Assisted Reproductive Laboratory
今や、生殖医療は国の助成制度も普及し年間 30 万件以上と症例数を増やしてきた。
この症例数は世界の国々でも圧倒的な多さである。更に体外受精-胚移植を実施している登録施設数は 500 施設以上であり、施設数でも日本は世界で一番多い国となっている。
日本の技術と知識は世界の生殖医療において体外受精技術普及の黎明期から影響を与えてきたことは言うまでも無い。技術を支える培養関連機器も日本企業の製品は品質と安定性が高く世界の ART(Assisted Reproductive Technology)Lab においても絶大なシェアを有している。では、技術・知識・機器で抜きん出ている日本の生殖医療はその成功率も「世界 1 位」なのか？
日本における生殖医療の現状では、女性の社会進出も背景に晩婚・晩産化により受診時の年齢が高齢化している。人間の生殖年齢の限界を考えると受診された女性にお子さんを授かるためリミットは残り僅かである。患者が適切な治療が受けられる生殖医療の発展を目指していきたい。
本講演では、日本と世界の生殖医療事情をデータから比較すると共に、日本の現状を年齢と妊娠をポイントに発信させて頂くことを目的にまとめさせて頂きます。

4

教育講演

Title: History of cryoJorge M. Sztein
Barcelona
There is a popular statement saying that the history depends in who wrote it.
In the case of cryopreservation the milestone commonly established is theglycerol discovery. However, in this quick review the starting point will be in
the 1700 with the first documented observation by L. Spallanzani

whodescribed that sperm from testis of dead horses covered by snow maintain themotility because of that cold conditions. Indeed, preservation became feasible
in 1949 when Polge, Smith and Parkes discovered glycerol as cryoprotectant.
Later in 1972, D. Whittingham, S. Leibo, and P. Mazur using a slow freezing
process achieved the first embryo freezing (mouse). Following that new
milestone cryobiology was established as an entity, also many theoreticalconcepts were scientifically proven. Among those principles, Peter Mazur
demonstrated the speed of freezing and the consequences of the intracellular
ice formation, and from Staley Leibo that each cell type has their uniquefreezing curve. After the protective aspect of glycerol was discovered, spermfrom many mammals were frozen, but the mouse. It was in the early 90’s
when the mouse sperm freezing becomes achallenge for many groups, but

the technique using Skim milk- raffinose described
beginning of a different story….

5by Dr Nakagata was the一般講演 1. マウス生殖工学技術を支えるデータ環境の作製と管理について
Data management for supporting activities using
mouse reproductive engineering techniques

土山修治、中潟直己
Shuuji Tsuchiyama and Naomi Nakagata

熊本大学 生命資源研究・支援センター(CARD)資源開発分野
Center for Animal Resources and Development (CARD), Kumamoto University.

近年、次々と新しいマウス生殖工学技術が開発され、それら技術による外部支援活動としてのマウスバンク運営や技術研修会の開催といった事業が必須となっている。マウ
スバンク・研修会のいずれにおいても、データベース運営や技術手技の解説を必要とし、そのためのデータ作製・公開などの作業を行わなければならない。熊本大学生命資源研
究・支援センターでは、データベースサーバの運営や生殖工学技術マニュアルの公開を行っており、生殖工学技術を活用した支援活動を下支えする環境を整えている。
データベースサーバ運営のために、データベース管理ソフト oracle を利用し、SQL 言語によるデータテーブルへの問い合わせやデータテーブル自体の管理を行っている。データテーブルから取得されたデータは、JAVA による自動計算や Tomcat との連携による整形を経て、ユーザに提供されている。
マニュアルの作製については、主に web での技術解説ページの公開を行うために、図表の作成や各技術の相関を考えたページ構成やリンクを設置し、Dreamweaver によるサイト管理を行っている。作製されたコンテンツは、技術研修会で使用するマニュアル冊子作製のためにも利用され、日本語版・英語版・スペイン語版をこれまでに作製している。
データベースやマニュアルの作成といったコンピュータを利用した環境の整備は、コンピュータ・ネットワーク・いくつかのソフトウェアのみを必要とし、手軽に始めることが可能である。本発表では、生殖工学技術を用いた以下の活動を実現するための環境を整えるための方法を紹介したい。

1-マウスバンクによる研究者コミュニティへの貢献
2-生殖工学技術研修会による技術者コミュニティへの貢献

6

2．精子生体膜中チオールの酸化による受精能獲得の抑制
Oxidation of sperm membrane thiols inhibits the capacitation

白角一樹 1、中尾聡宏 2、田村香菜 1、池田真由美 3、異島 優 4、竹尾 透 1、中潟直己 1
Kazuki Shirakado1, Satohiro Nakao2, Kana Tamura1, Mayumi Ikeda3, Yu Ishima4,Toru Takeo1, Naomi Nakagata1

1)熊本大学生命資源研究・支援センター資源開発分野、2)新潟大学脳研究所動物資源開発研究分野、3)熊本大学薬学部薬剤学分野、4)徳島大学薬学部薬物動態制御学分野
1) Division of Reproductive Engineering, Center for Animal Resources andDevelopment (CARD), Kumamoto University 2) Brain Reseach Institute Niigata
University 3) Department of Biopharmaceutics School of Pharmacy, Kumamoto
University 4) Faculty of Pharmaceutical sciences, Tokushima University

哺乳類精子は、雌性生殖道内あるいは体外培養条件下において、受精能獲得と呼ばれる変化を起こすことで受精可能となる。受精能獲得には、コレステロールの漏出、カルシウムイオンや重炭酸イオンの流入、cAMP の上昇、各種タンパク質のリン酸化の関与が知られている。近年、私達は、生体中硫黄、特にチオール基（-SH）選択的酸化剤である 5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)が、受精阻害作用を有することを明らかにしている。しかしながら、受精能獲得における生体硫黄の役割は不明である。そこで本研究では、精子の受精能獲得における生体硫黄の役割を明らかにするために、
DTNB による精子生体膜中チオール基の酸化が受精能獲得に及ぼす影響を検討した。本
検討では、C57BL/6 系統の雄マウスから精子を採取し、DTNB を含有した cTYH 中で培養した。次に、DTNB による精子中チオール基の酸化効率を評価するために、DTNB と精子中チオールの反応により産生された TNB 量を分光光度計にて定量した。また、DTNB 処理精子の受精能は、体外受精により評価した。体外受精では、各濃度の DTNB を処理した精子と過剰排卵処理した C57BL/6 系統の雌マウスから採取した卵子を共培養し、体外受精の翌日に二細胞期胚数をカウントし、受精率を評価した。精子の運動性は、精子運動性解析装置 IVOS を用いて評価した。DTNB は、濃度依存的に精子膜中チオール基を酸化し、0.25mM 以降で平衡に達した。また、0.25 mM DTNB 処理精子は、受精率が低下した。一方、透明帯を除去した卵子を用いた体外受精では、DTNB 処理精子の受精率が改善された。DTNB 処理精子の運動能を解析した結果、運動精子率に変化は認められなかったが、ハイパーアクチベーションの指標の一つである精子頭部の振り幅 (Amplitude of7

Lateral Head) が低下した。以上の結果より、DTNB による精子生体膜中チオール基の酸化は、精子のハイパーアクチベーションを抑制し、透明帯の通過障害が生じることで、受精能が低下することを明らかにした。本知見は、精子生体膜中チオールの酸化が受精能獲得の抑制に関与し、生体中硫黄が受精能獲得の制御および受精機能の改善に対する標的となることが示唆された。

83．コウノトリおよびホオアカトキ胚から分離された生殖巣生殖細胞(GGCs)におけるニワトリ胚生殖巣への移住能解析
Migratory ability of gonadal germ cells (GGCs) isolated from Ciconia boyciana andGeronticus eremita embryos into the gonad of developing chicken embryos
中島友紀 1,2、福田はるか 1、大沼学 3、村田浩一 4,5,6、植田美弥 4、
須永絵美 5、白石利郎 5、田島淳史 1
Yuki NAKAJIMA1,2, Haruka FUKUDA1, Manabu ONUMA 3, Koichi MURATA 4,5,6,
Miya UEDA4, Emi SUNAGA5, Toshiro SHIRAISHI5, Atsushi TAJIMA1
1)

筑波大学、2) 現九州大学、3)国立環境研究所、

4)よこはま動物園ズーラシア、5)横浜市繁殖センター、6)日本大学
1)University of Tsukuba 2)Current affiliation: Kyushu University 3)National
Institute for Environmental Studies 4)Zoorasia Yokohama Zoological Gardens5)Preservation and Research Center, The City of Yokohama 6)Nihon University［目的］生殖系列キメラの作製技術を応用することにより絶滅危惧鳥類(EB)を増殖できる可能性がある。特に、家禽をレシピエントとした異種間生殖系列キメラを作製することができれば、EB や人工繁殖技術が確立されていない鳥類種の増殖が可能となる。そこで本研究では、コウノトリおよびホオアカトキ胚の生殖細胞（GGC）を用いた異種間生殖系列キメラ胚の作製により GGC の生殖巣への移住能を解析した。
［方法］コウノトリおよびホオアカトキそれぞれの胚から生殖巣を取り出し、PBS(-)に浸漬し、37.8℃、１時間培養することにより GGC を分離した。分離した GGC を蛍光標識した後、30〜200 個をニワトリ胚 2 日胚の背側大動脈に移植した。移植 5 日後、移植した GGC 数に対するニワトリ生殖巣および中腎に移住した GGC 数の比率（移住率）を測定した。
［結果］ニワトリにおける発生ステージ（H＆H）28〜37 および 30〜45 に相当するコウノトリおよびホオアカトキそれぞれの胚から GGC 分離が可能であることが示された。また、移植されたコウノトリおよびホオアカトキの GGC における移植 5 日後のニワトリ胚生殖巣への移住率は、それぞれ 12.5〜39.6％および 6.0〜26.5％であった。一方、移植されたコウノトリおよびホオアカトキの GGC におけるニワトリ胚中腎への移住率は、それぞれ 18.0〜92.5％および 22.8〜52.1％であった。
［結論］本研究の結果より、ニホンコウノトリおよびホオアカトキ胚の GGC はニワトリ胚生殖巣への移住能を有することが示された。
9ABSTRACT

We conducted experiments to evaluate the ability of gonadal germ cells (GGCs),
isolated from the embryonic gonads of Ciconia boyciana or Geronticus eremita, tomigrate into the gonads of developing chicken embryos.
Fluorescently labeled GGCs, isolated by the PBS(-) method, were transferred into
the dorsal aorta of 2-day-old chicken embryos. Five days after transfer, fluorescent
GGCs were detected in the gonads of recipient embryos.
Our results indicate that GGCs from Ciconia boyciana and Geronticus eremita arecapable of migrating into the gonads of developing chicken embryos.

104．いわゆる「健康食品」について
奥田

裕計

So-called "Health Food"

Hirokazu Okuda

独立行政法人 労働者健康安全機構・日本バイオアッセイ研究センター
Japan Bioassay Research Center (JBRC),
Japan Organization of Occupational Health and Safty (JOHAS)
昨年 12 月、食品安全委員会は「いわゆる「健康食品」に関する報告書」を取りまとめました。この報告書は事例に基づく科学的な観点から、消費者に対して「健康食品」について知っておくべき事項に関する、分かりやすいメッセージを出すことを方針に掲げています。報告書には、「健康食品」の摂取状況や問題点（健康被害の要因、消費者からの相談事例）、安全性に係るリスク要因（製品側の要因、摂取者側に関する要因、情報に関する要因）等が詳細に記述されています。また、別添のように「健康食品」の摂取に関して消費者に注意を呼び掛けています。
その一方で、1990 年代欧米では、胎児の神経管閉鎖障害（受胎後およそ 28 日で閉鎖する神経管の形成異常であり、臨床的には二分脊椎・無脳症・髄膜瘤などの異常を呈する）のリスク低減に、受胎前後の葉酸（プテロイルモノグルタミン酸）の投与が有効であることが多数の研究から明らかになっています。このため、米国・カナダなどにおいては、小麦粉などへの葉酸添加が義務付けられています。日本においては、2000 年代になり、二分脊椎の発症が増加傾向にあるという報告がなされ、国民健康・栄養調査からは、食生活の多様化により葉酸摂取が不十分な者が増加する懸念があることが明らかとなりました。消費者に対して疾病リスク低減のために明確な情報を提供する観点から、葉酸の食事摂取基準（妊娠時の付加量）を示すとともに、医学的、栄養学的な科学的根拠（作用機序、有効性）が広く認められ確立された表示が求められ、葉酸を「特定保健用食品（疾病リスク低減表示）*」として、表示が許可されることとなりました。
先天異常学会（Teratology Society）は、先天異常および胎生期に生じる疾患の予防を使命としており、会員は自国において葉酸添加の義務化を率先して推進するよう求めています。
食品安全委員会 新開発食品専門調査会では、現在申請中の葉酸サプリメントの安全性について審査中ですが、いくつかの問題点（例えば、摂取時期の限定（妊娠前から妊娠 3 か月まで）や過剰摂取の影響、他の疾病をマスクする等）が上っています。
*：「特定の保健の用途に係る表示」
この食品は葉酸を豊富に含みます。適切な量の葉酸を含む健康的な食事は、女性にとって二分脊椎などの神経管閉鎖障害を持つ子どもが生まれるリスクを低減するかもしれません。

1112報告１
マウス咬傷防止手袋の使用感の調査結果報告
Survey results on usage of rodent handling gloves forprotection against mouse bite

○石倉知征、松田正史、辰巳宏美、川元

大縄 悟志、望月由里衣、飯塚裕介、山本 貴子、忍、長谷川孝徳

Tomoyuki Ishikura、Masashi Matsuda、Hiromi Tatsumi、Yurie Kawamoto、Yusuke Iizuka、Takako Yamamoto、Satoshi Oonawa、Shinobu Mochizuki、Takanori Hasegawa

国立研究開発法人

理化学研究所

統合生命医科学研究センター

RIKEN Center for Integrative Medical Sciences ( I M S )Yokohama Campus「第 32 回動物生殖工学研究会にて『マウス咬傷事故の対応について－マウス咬傷防止（軽減）手袋について－』報告しました。各研究機関で動物実験をされる方々にマウス咬傷防止（軽減） 手袋を使用して頂き、安全性、操作性・耐久性・経済性についてアンケート調査にご協力頂きましたのでその調査結果を報告いたします。

13

報告２
第３３回動物生殖工学研究会シンポジュウム（城崎温泉:兵庫県）報告

第３３回生殖工学研究会は城崎シンポジュウムとして２０１６年７月１６日（土）に兵庫県豊岡市城崎町の城崎温泉しののめ荘にて開催されました。
前日に実施されたサテライト報告会と兵庫県立コウノトリの郷公園でのバックヤードツアーを含め報告をさせていただきます。

14

お知らせ
第３５回動物生殖工学研究会期日

平成２９年１２月（予定）

場

所

北里大学

15

白金キャンパス