液体試料からの small RNA 精製キット

ISOSPIN Liquid Sample miRNA
マニュアル（第 1 版）

Code No. 318-09191

NIPPON GENE CO., LTD.

目次

I

製品説明 .............................................................................................................................. 2II

キット内容・保存温度 ........................................................................................................ 3

III

使用上の注意 ..................................................................................................................... 4IV プロトコール ..................................................................................................................... 4■ small RNA 精製プロトコール（large RNA 除去あり） ........................................ 5■ small RNA 精製プロトコール ............................................................................... 7■ スケールアップ small RNA 精製プロトコール（large RNA 除去あり） ............. 9■ スケールアップ small RNA 精製プロトコール .................................................. 10■ 200 µl 核酸溶液からの small RNA 濃縮プロトコール........................................ 11■ 370 µl 核酸溶液からの small RNA 濃縮プロトコール（スケールアップ） ....... 12■ オプションプロトコール（DNA 回収） ............................................................. 13
V トラブルシューティング .................................................................................................. 141

I

製品説明

ISOSPIN Liquid Sample miRNA（アイソスピン リキッドサンプル マイクロ RNA）は、液体試料から micro RNA（miRNA）などの small RNA を精製するためのキットです。本キットは、カオトロピックイオン存在下で核酸がシリカへ吸着する原理を応用しており、操作にフェノールやクロロホルムなどの毒劇物を使用しません。使用するスピンカラムは、カラム容積を最大限確保しており、内封されたシリカゲル膜は、充分な核酸の吸着容量を確保し、高い溶出効率を有しています。また、ゲノム DNA の除去にスピンカラムを用いた効率的な方法を採用しているため DNase 処理等で生じる短鎖 DNA の混入が少なく、高純度の small RNA を
約 90 分間で抽出することができます。
＜特長＞
・血漿、血清、全血、唾液、尿などの液体試料から約 90 分間で small RNA を精製可能
・フェノールやクロロホルムなどの毒劇物を使用しない
・自社開発のスピンカラムにより、高い操作性を実現
・DNase を使用せず、ゲノム DNA を除去可能

small RNA 精製の流れ
Step 1. DNA の除去
Spin Column へ選択的に DNA を吸着

DNA

total
RNA

Step 2. large RNA の除去
遠心分離で large RNA を沈殿

small
RNA

※血漿、血清の場合、省略可能

largeRNA

Step 3. small RNA の精製
Spin Column Blue に small RNA を吸着、洗浄、溶出

small
RNA2smallRNA

II

キット内容・保存温度

ISOSPIN Liquid Sample miRNA（Code No. 318-09191）
キット構成品

容量（50 回用）

保存温度

備考

Proteinase K

1 ml × 1 本–20℃

LR Extraction Buffer

18 ml × 1 本

室温LR Wash1 Buffer

60 ml × 1 本室温

エタノール含有＊2）

LR Wash2 Buffer

60 ml × 1 本

室温エタノール含有＊2）

ddWater

1 ml × 5 本

室温Spin Column

50 本室温＊3）

Spin Column Blue

50 本

室温＊3）

＊1）

＊1） キットは室温で輸送します。製品到着後、Proteinase K は–20℃保存して下さい。
＊2） LR Wash1 Buffer、LR Wash2 Buffer にはエタノールが含まれています。 ご使用後は、蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め、保管して下さい。
＊3） Spin Column、Spin Column Blue は、蓋付きのシリカメンブレンカラム（上部パーツ）と Collection Tube（下部パーツ）で構成されています。

3III

使用上の注意・ 作業検査環境への汚染を防ぐため、使用の際には溶液を飛散させたり、溶液に触れたピペットチップが他の器具や試薬に接触したりしないようご注意下さい。
・ 本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 安全性データシート（SDS）は、ニッポンジーン Web サイト（www.nippongene.com）
よりご覧になれます。

IV プロトコール
液体試料の例：・血漿・血清・全血・唾液・尿・細胞懸濁液
・培養細胞上清・核酸溶液
本品以外に必要な試薬、機器など：
・エタノール（96～100％）・マイクロピペット
・ピペットチップ・ボルテックスミキサー
・ヒートブロック（37℃）
・卓上遠心機・遠心分離機・1.5 ml マイクロチューブ
・2.0 ml マイクロチューブ（スタート試料量が 350～370 µl の場合）
＊ RNase free の試薬、チューブを使用して下さい。
＊ 核酸低吸着チューブの使用をお勧めします。

4

■ small RNA 精製プロトコール（large RNA 除去あり）
対象：large RNA と small RNA を含む液体試料
血清や血漿など large RNA が含まれない試料の場合、「small RNA 精製プロトコール」（p. 7）をご参照下さい。

Step 1. DNA の除去（カラムへ選択的に DNA を吸着）＊①

1.5 ml チューブに 180 µl の液体試料、20 µl の Proteinase K、180 µl のLR Extraction Buffer を加えた後、15 秒間ボルテックスで撹拌する。

②

37℃で 15 分間インキュベート（5 分間おきに計 3 回撹拌する）。

③

軽くスピンダウンしてチューブの壁面に付着している液体を落とす。

④

Spin Column に③の混合液を全量（380 µl）添加する。

⑤

遠心（13,000×g、15 秒間、室温）する。
＊ カラムに DNA と一部の large RNA が吸着する。ろ液には、small RNA と large RNA が含まれている。

Step 2. large RNA の除去（遠心分離で large RNA を沈殿）⑥

ろ液を新しい 1.5 ml チューブに移す。

⑦190 µl のエタノールを⑥に加えて 15 秒間ボルテックスする。

⑧

遠心（13,000×g、15 分間、室温）する。

Step 3. a) small RNA 精製（カラム吸着）⑨

上清を全量（～570 µl）回収して、新しい 1.5 ml チューブに移す。

⑩380 µl のエタノールを加えて 15 秒間ボルテックスした後、軽くスピンダウンする。

⑪

Spin Column Blue に混合液を全量（～950 µl）添加する。

⑫

遠心（13,000×g、15 秒間、室温）する。

⑬

ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す。

↓（次のページに続く）5

（前のページからの続き）↓
Step 3. b) small RNA 精製（カラム洗浄）⑭

Spin Column Blue に 500 µl の LR Wash1 Buffer を添加する。

⑮

遠心（13,000×g、15 秒間、室温）する。

⑯

ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す。

⑰

Spin Column Blue に 500 µl の LR Wash2 Buffer を添加する。

⑱

遠心（13,000×g、2 分間、室温）する。

⑲

ろ液を廃棄する。ろ液がカラムに付かないよう注意する。

Step 3. c) small RNA 溶出⑳

カラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す。

㉑

50 µl の ddWater をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。

㉒

遠心（13,000×g、2 分間、室温）する。

㉓

small RNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブに回収される。

6■ small RNA 精製プロトコール
対象：血漿や血清など large RNA が含まれない液体試料
Step 1. DNA の除去（カラムへ選択的に DNA を吸着）＊①

1.5 ml チューブに 180 µl の液体試料、20 µl の Proteinase K、180 µl の LR
Extraction Buffer を加えた後、15 秒間ボルテックスで撹拌する。

②

37℃で 15 分間インキュベート（5 分間おきに計 3 回撹拌する）。

③

軽くスピンダウンしてチューブの壁面に付着している液体を落とす。

④

Spin Column に③の混合液を全量（380 µl）添加する。

⑤

遠心（13,000×g、15 秒間、室温）する。
＊ カラムに DNA と一部の large RNA が吸着する。ろ液には、small RNA と large RNA が含まれている。

Step 2.

（スキップ）

Step 3. a) small RNA 精製（カラム吸着）⑥

ろ液を新しい 1.5 ml チューブに移す。

⑦570 µl のエタノールを加えて 15 秒間ボルテックスした後、軽くスピンダウンする。

⑧

Spin Column Blue に混合液を全量（950 µl）添加する。

⑨遠心（13,000×g、15 秒間、室温）する。

⑩

ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す。

↓（次のページに続く）

7

（前のページからの続き）↓
Step 3. b) small RNA 精製（カラム洗浄）⑪

Spin Column Blue に 500 µl の LR Wash1 Buffer を添加する。

⑫

遠心（13,000×g、15 秒間、室温）する。

⑬

ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す。

⑭

Spin Column Blue に 500 µl の LR Wash2 Buffer を添加する。

⑮遠心（13,000×g、2 分間、室温）する。

⑯

ろ液を廃棄する。ろ液がカラムに付かないよう注意する。

Step 3. c) small RNA 溶出⑰カラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す。

⑱50 µl の ddWater をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。

⑲

遠心（13,000×g、2 分間、室温）する。

⑳small RNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブに回収される。

8

■ スケールアップ small RNA 精製プロトコール（large RNA 除去あり）
対象：large RNA と small RNA を含む液体試料（350 µl）

1.5 ml チューブ
350 µl の液体試料を添加
20 µl の Proteinase K を添加
350 µl の LR Extraction Buffer を添加し、ボルテックスで 15 秒間撹拌37℃で 30 分間インキュベートする間、10 分間おき計３回ボルテックスで撹拌
軽くスピンダウン
Spin Column に混合液を全量（720 µl）添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）ろ液を新しい 1.5 ml チューブに移す
360 µl のエタノールを添加し、ボルテックスで 15 秒間撹拌遠心（13,000×g, 15 分間, 室温）
上清を新しい 2.0 ml チューブに移す
720 µl のエタノールを添加し、ボルテックスで 15 秒間撹拌、軽くスピンダウン
Spin Column Blue に混合液の半分量（900 µl）を添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）
混合液の残りを全量（～900 µl）添加遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）
500 µl の LR Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）
500 µl の LR Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）し、ろ液を廃棄
カラムを新しい 1.5 ml チューブの上に移す
50 µl の ddWater をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
small RNA 溶液

9■ スケールアップ small RNA 精製プロトコール
対象：血漿や血清など large RNA が含まれない液体試料（350 µl）

1.5 ml チューブ
350 µl の液体試料を添加
20 µl の Proteinase K を添加
350 µl の LR Extraction Buffer を添加し、ボルテックスで 15 秒間撹拌37℃で 30 分間インキュベートする間、10 分間おき計 3 回ボルテックスで撹拌
軽くスピンダウン
Spin Column に混合液を全量（720 µl）添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）ろ液を新しい 2.0 ml チューブに移す
1,080 µl のエタノールを添加し、ボルテックスで 15 秒間撹拌
軽くスピンダウン
Spin Column Blue に混合液の半分量（900 µl）を添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）混合液の残りを全量（～900 µl）添加
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）
500 µl の LR Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）
500 µl の LR Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）し、ろ液を廃棄
カラムを新しい 1.5 ml チューブの上に移す
50 µl の ddWater をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
small RNA 溶液

10■ 200 µl 核酸溶液からの small RNA 濃縮プロトコール

1.5 ml チューブ
200 µl の核酸溶液を添加
180 µl の LR Extraction Buffer を添加
転倒混和
軽くスピンダウン
Spin Column に混合液を全量（380 µl）添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）ろ液を新しい 1.5 ml チューブに移す
190 µl のエタノールを添加し、ボルテックスで 15 秒間撹拌遠心（13,000×g, 15 分間, 室温）
上清を全量（～570 µl）新しい 1.5 ml チューブに移す
380 µl のエタノールを添加
ボルテックスで 15 秒間撹拌した後、軽くスピンダウン
Spin Column Blue に混合液を全量（～950 µl）添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）
ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す
500 µl の LR Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）
ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す
500 µl の LR Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
ろ液を廃棄（ろ液がカラムに付かないよう注意する）
カラムを新しい 1.5 ml チューブの上に移す
50 µl の ddWater をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
small RNA 溶液

11■ 370 µl 核酸溶液からの small RNA 濃縮プロトコール（スケールアップ）

1.5 ml チューブ
370 µl の核酸溶液を添加
350 µl の LR Extraction Buffer を添加し、転倒混和
軽くスピンダウン
Spin Column に混合液を全量（720 µl）添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）ろ液を新しい 1.5 ml チューブに移す
360 µl のエタノールを添加し、ボルテックスで 15 秒間撹拌遠心（13,000×g, 15 分間, 室温）
上清を全量（～1,080 µl）新しい 2.0 ml チューブに移す
720 µl のエタノールを添加し、ボルテックスで 15 秒間撹拌、軽くスピンダウン
Spin Column Blue に混合液の半分量（900 µl）を添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）
混合液の残りを全量（～900 µl）添加
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）
500 µl の LR Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）し、ろ液を廃棄（カラムは戻す）
500 µl の LR Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）し、ろ液を廃棄
カラムを新しい 1.5 ml チューブの上に移す
50 µl の ddWater をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
small RNA 溶液

12■ オプションプロトコール（DNA 回収）
180 µl（または 350 µl）液体試料からの DNA 回収

1.5 ml チューブ
180 µl（または 350 µl）の液体試料を添加
20 µl の Proteinase K を添加
180 µl（または 350 µl）の LR Extraction Buffer を添加
ボルテックスで 15 秒間撹拌37℃で 15 分間（または 30 分間）インキュベートする間、5 分間（または 10 分間）おきに計 3 回ボルテックス
軽くスピンダウン
Spin Column に混合液を全量（380 µl、または 720µl）添加する
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）ろ液（small RNA が含まれている）から small RNA を精製する場合、ろ液を別のチューブに移して、small RNA 精製プロトコール⑥へ進む。
カラム（DNA が吸着している）を Collection Tube に戻す
500 µl の LR Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 15 秒間, 室温）
ろ液を廃棄し、カラムを Collection Tube に戻す
500 µl の LR Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）
ろ液を廃棄（ろ液がカラムに付かないよう注意する）
カラムを新しい 1.5 ml チューブの上に移す
50 µl の ddWater をメンブレン中央に滴下
室温で 3 分間静置
遠心（13,000×g, 2 分間, 室温）DNA 溶液13

V トラブルシューティング
トラブル

予想される原因

対策

・ 新鮮な試料を用いる。
抽出前に、試料中の RNA が分解している。

・ 試料採取後、すぐに RNA を抽出するか、速やかに凍結させる。
・ 凍結・融解を繰り返した試料は RNA 抽出に使用しない。
・ RNase フリーのチューブを使用する。

RNase がコンタミしている。
低収量

・ RNase フリーの試薬を使用する。
・ フィルター付きピペットチップを使用する。
・ 各プロトコールの Step 1.①で、試料とProteinase K と LR Extraction Buffer を確実

試料の溶解が不十分である。に混和させる。
RNA がチューブに吸着している。
試料中の RNA 量が少ない。

・ 核酸低吸着チューブを使用する。
・ 濃縮プロトコールを試す。
・ 精製して得られた RNA 溶液の DNase 処理

試料中の DNA 量が多い。

を行う。
・ 濃縮プロトコールを試す。

DNA の混入DNA と RNA が複合体を形成

・ プロトコールの Step 1. ②の 37℃15 分間のインキュベートの後で、80℃で 5 分間、している。

氷冷 5 分間の反応を追加する。

【関連製品】・ Distilled Water, Deionized, Sterile（ニッポンジーン Code No. 316-90101, 318-90105）
・ DNase I (RNase free) （ニッポンジーン Code No. 314-08071）
・ RNase Inhibitor （ニッポンジーン Code No. 315-08121）
・ Collection Tube （ニッポンジーン Code No. 319-08141, 315-08143）

14マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部
TEL
URL

学術営業課

076 - 451 - 6548
https://www.nippongene.com/siyaku/

お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。

ISOSPIN Liquid Sample miRNA マニュアル（第 1 版）R311ND

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