タンパク質結晶構造解析

大規模結晶化スクリーニングシステム

KEK-PFでは5本の放射光ビームラインを運用し研究支援を行っています（ https://www2.kek.jp/imss/sbrc/beamline/px.html）

結晶化スクリーニング後In-situ測定を行い、タンパク質結晶かの判別や結晶性について迅速に評価する（LCPによる膜タンパク質の結晶化にも対応）

全自動回折データ収集・データ解析
ビームラインに送付された凍結結晶に対して、全自動システムにより回折データ収集とデータ解析が自動的に行われる
X線回折スキャンによる結晶センタリング
In-situ データ測定@BL-17A

大規模結晶化ロボット
結晶化の様子はWEBから閲
覧可能
結晶化実験の情報はin-situ
測定の情報とともに実験デー
タ管理システムPReMoで管理される

PReMoによる実験データ管理と自動データ処理

タンパク質結晶加工技術とNaitive SAD構造決定

193nm固体レーザーヘッド

試料結晶の加工やヘリウム環境下での回折データ収集などによる高精度測定により、タンパク質に元来含まれる硫黄の異常分散シグナルから構造を決定する
加工例

ガルバノ光学系

サンプル交換ロボット

球状加工溶媒除去

回折データは実験データ管理システムPReMoによって自動処理され、実験条件等の情報と共にWebブラウザから閲覧可能

利用目的
タンパク質結晶を波長193nmの深紫回折計

レーザー加 • X線回折データ収集における溶媒部分やルー
深紫外レーザー光
外レーザーで任意の形状に加工プ部分の除去、不意均一部分の除去
工機

長波長回折実験@BL-1A• 結晶加工技術を利用したNative-SAD解析• タンパク質結晶の定量的な顕微分光測定

創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム(BINDS)

B2-1 KEK-PFタンパク質結晶構造解析プラットフォーム
B2-2 KEK-PF天然タンパク質に含まれる硫黄原子を利用したタンパク質の構造解析
C9-1 X線結晶構造解析のための全自動大規模結晶化スクリーニング

松垣直宏/Naohiro Matsugaki
naohiro.matsugaki@kek.jp

⼭⽥悠介/Yusuke Yamada
yusuke.yamada@kek.jp

引⽥理英/Masahide Hikita
masahide.hikita@kek.jp

KEK-IMSS-Photon Factory
BioSAXSを活⽤した相関構造解析例

⽣体⾼分⼦X線溶液散乱解析
SAXSビームライン＋BioSAXS最新の測定環境

ü 溶液中の構造状態（分子サイズ、分子量、会合状態）の推定・評価
ü Ab initioモデリングによる溶液概形解析

⾼精度複合体/分⼦間相互作⽤解析

u SEC-SAXSシステム@BL-10C@BL-15A2

ü Rigid bodyモデリングによる結晶構造等を用いた複合体の分子配置解析
ü 溶液中に存在する構造分散とアンサンブルの推定ü MD-SAXS法による精密溶液構造解析（計算科学との連携）
ü 分子複合系を含む多分散溶液試料の測定・解析
Ø ゲル濾過を組み合わせたSEC-SAXS/MALS測定・解析
Ø 連続滴定SAXS測定による多成分平衡状態の分子間相互作用解析

溶液中の複数の分子を分離しながら測定・解析
u SEC-MALS測定システム

u μ流路型⾃動サンプリングシステム●MD-SAXS相関構造解析
ビタミンD受容体リガンド結合ドメインの溶液構造解析←詳細はこちら︕●Ab initio モデリング
分⼦モーターKIF2とTubulin
複合体の溶液構造解析●Rigid bodyモデリング
複合tRNAメチル化酵素の溶液構造解析

溶液中の分子量や化学両論比の推定

分子間相互作用/溶液構造解析

創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム(BINDS)
B2-3 KEK-PF生体高分子X線溶液散乱
PFの小角散乱ビームラインではSEC-SAXSや連続滴定SAXSを活用して蛋白質やDNA等の溶液中の生体高分子の構造解析を進めてきました。近年では結晶化しにくい高次複合体や柔軟性の高い蛋白質等も対象にした難易度の高い試料の測定・解析も可能になってきました。溶液中における分子の振る舞いについて明らかにしたい系がございましたら、是非ご相談下さい!!

⽶澤健⼈/Kento Yonezawa
ykento@post.kek.jp

清⽔伸隆/Nobutaka Shimizu
nobutaka.shimizu@kek.jp

B2-4
KEKクライオ電⼦顕微鏡による単粒⼦解析に向けたデータ測定

KEK cryo-EM

2018年3⽉、⾼エネルギー加速器研究機構 (KEK) はAMEDの⽀援で200kVクライオ電顕 (TFS社Talos Arctica) を導⼊し、2018年10⽉より共同利⽤型の運⽤を開始しました。
ほぼ全てのマシンタイムを外部利⽤者に供出し、ほぼ全てのマシンタイムで測定⽀援を⾏い、必要に応じた解析⽀援を⾏なっています。
ご利⽤希望の⽅は担当者にメールをご送信ください。
〜ご利⽤の流れ〜<BINDS申請>
担当者に打診のメール
事前打ち合わせ
BINDS⽀援コンサル申請&⽀援申請
⽀援承認→許可→⽀援開始<マシンタイム希望⽇をメールで連絡>
KEKの公開カレンダー参照 (“KEKクライオ電顕”で検索︕)<マシンタイム配分>
各グループ、およそ⽉1枠を配分
スクリーニング⽤の1⽇枠 (⽕,⽔,⽊) か
⾼分解能データ測定⽤の3⽇枠 (⾦⼟⽇) を選択<実験⽇の10⽇前まで>
施設利⽤申請書を提出
施設利⽤許可書が発⾏<マシンタイム当⽇>
09:30 構造⽣物実験準備棟に集合
10:00
11:30
17:00
19:00

(持ち物: サンプル, 希釈⽤Buffer, 4TB HDD)
グリッド作製 (6枚以内)
スクリーニング (1枚あたり1時間程度)
連続測定の設定開始
連続測定開始・利⽤報告書提出・解散<マシンタイム翌⽇以降>
KEKスタッフがデータをHDDにコピーして返送
後⽇、KEK事務より請求書を送付させていただきます〜事前打ち合わせでの質問事項〜
純度 (SDS-PAGEでシングルバンドが望ましい)、分散性 (ゲルろかやDLSでシングルピークが望ましい)、濃度 (まずは10-30µM, 沈殿の有無)、体積 (ひとまず15µL)、分⼦量 (100kDa以上が望ましい)、対称性(⾼い⽅が解析に有利)、バッファー条件 (グリセロール濃度10%以上や塩濃度500mM以上は不適)。これまでに負染⾊像観察をしたことはあるか。複合体ならサブユニット構成の均⼀性、サブユニット間結合の強さ、結合様式の均⼀性、形状の均⼀性、など。
〜解析例〜
導⼊から26ヶ⽉で、5Å以上の分解能のマップを27種類得ています。2020年6⽉時
点で最⾼到達分解能は2.05Åで、モデルタンパク質であるApoferritinを除けば、200kVクライオ電顕では世界第1位の分解能が得られています。

硫⻩酸化還元酵素
860kDa2.05Å

亜硝酸還元酵素110kDa2.85Å

〜施設利⽤料に関するお願い〜
消耗品費 (グリッド・液体窒素・液体エタン・HDD) や保守契約費などの確保のため、施設利⽤料をお願いしています。
アカデミア

4.8万円/⽇ (+付添測定無料)

企業

24万円/⽇ (+付添測定24万円/8時間)〜その他のお願い〜
クライオ電顕はサンプルの合う合わないが激しいため、初回はラボ内の100kDa・⾼純度のサンプルを4種類ほどお持ち下さい。スループットが⾼くない点を体感していただくため、初回はPIの⽅にも実験への参加をお願いしております。

千⽥俊哉

安達成彦

toshiya.senda@kek.jp

naruhiko.adachi@kek.jp

川﨑政⼈

守屋俊夫

masato.kawasaki@kek.jp

toshio.moriya@kek.jp/Toshiya Senda/Masato Kawasaki/Naruhiko Adachi/Toshio Moriya