第42回動物⽣殖⼯学研究会
SARB : SOCIETY OF ANIMAL REPRODUCTIVE BIOTECHNOLOGY

令和4年12⽉3⽇（⼟）
北⾥⼤学⽩⾦キャンパス
プラチナタワー １２階 会議室

Stage 14 Chick Embryo
Original drawing by Hayashi & Tajima

cited in J. Poultry Scinece 50:1-8,2013

ウシ７⽇⽬体外受精卵（国研）農業・⾷品産業技術総合研究機構 的場理⼦

イヌ

胚盤胞

帯広畜産⼤学 鈴⽊ 宏志

ウシ体外受精卵

８細胞胚

北⾥⼤学 桃沢健⼆

ミーアキャット

マウス未受精卵GV-1

近畿⼤学 安齋政幸

熊本⼤学 中潟直⼰
2第４２回動物生殖工学研究会プログラム
２０２２年１２月３日
北里大学白金キャンパス■総会

１２：３０～１２：５０■開会挨拶 １２：５５

会長：横山 峯介

■特別講演 １３：００～１４：００

座長：濱野 晴三
的場 理子

X 精子に発現する TLR7/8、その局在と作用の動物種間差を考慮した雌雄産み分け法の開発
島田 昌之 先生（広島大学大学院統合生命科学研究科）■休憩 １４：００～１４：１５■一般講演 １４：１５～１７：１５（発表１０分質疑応答５分）

座長：鈴木宏志
1. 黒毛和種における胚移植前黄体の血流量の調査（14:15-14:30）○神田沙織、芦野大地、中原大輝、吉岡 一、的場理子（独立行政法人家畜改良センター）
2. ミナミイワトビペンギンにおける凍結保存精液を用いた人工授精の成功について（14:30-14:45）○伊藤このみ 1、冨澤奈美 1、小林由和 1、林 成幸 1、野島大貴 2、内山 幸 2、
杉本悠真 2、吉澤 円 3（1 大阪・海遊館、2 葛西臨海水族園、3 上野動物園）
3. ニワトリ胚の無卵殻培養について（14:45-15:00）○小原勝也 1、浅野敦之 1、内藤 充 2、田島淳史 1（1 筑波大・生命環境、2 生物資源研）
4. 生殖毒性の種差とリスク評価（15:00-15:15）○奥田裕計（独立行政法人労働者健康安全機構 日本バイオアッセイ研究センター、
一般財団法人 化学物質評価研究機構）■休憩 １５：１５～１５：３０

3

座長：松田正史
5. 過剰排卵処理マウスにおける排卵・交配タイミングの同期化による効率的な受精卵の作製（15:30-15:45）○中尾聡宏 1、伊藤琴乃 1、須賀原千明 1、若杉理乃 1、中潟直己 2、竹尾 透 1（1 熊本大学生命資源研究・支援センター資源開発分野、2 熊本大学生命資源研究・支援センター生殖工学共同研究分野）
6. 発生動態を利用したマウス初期胚の性判別（15:45-16:00）○小林陽歌、小野寺梨紗、樋口久美、鈴木宏志、渡部浩之（帯広畜産大学）
7. 無発情期の雌イヌにおける抗インヒビン血清投与による発情誘起と交配成績（16:00-16:15）○古村奈瑚 1、土田萌衣 1、桜井大地 1、松村花月 1、中潟直己 2、鈴木宏志 1（1 帯広畜産大学、2 熊本大学）■休憩 １６：１５～１６：３０

座長：清成 寛8. ラット精子を通じて生殖工学の理解を深める（16:30-16:45）○山鹿優真 1、中尾聡宏 1、三小田伸之 2,3、中務 胞 4、中潟直己 2、竹尾 透 1（1 熊本大学生命資源研究・支援センター資源開発分野、2 熊本大学生命資源研究・支援センター生殖工学共同研究分野、3 九動株式会社、4 新潟大学脳研究所モデル
動物開発分野）9. 各種系統ラット卵子の体外受精（16:45-17:00）○中潟直己 1、三小田 伸之 1,2、中尾 聡宏 3、山鹿 優真 3、竹尾 透 3（1 熊本大学生命資源研究・支援センター（CARD）生殖工学共同研究分野、2 九動株式会社、3 熊本大学生命資源研究・支援センター（CARD）資源開発分野）
10. 変異コモンマーモセットの作製（17:00-17:15）○中尾和貴 1,2、阿部由希子 2、後藤元樹 2、玉野萌恵 2、中尾晴美 2、饗場 篤 2（1 大阪大学大学院医学系研究科医学部附属動物実験施設、2 東京大学大学院医学系
研究科附属疾患生命工学センター動物資源学部門）■閉会挨拶 １７：１５

副会長：浜野 晴三

4注意事項
会場となる北里大学の以下の感染予防対策をご確認いただきご対応をお願いします。
１、次の場合は入構を制限させていただきます。
１）風邪の症状や 37.5 度以上の発熱、咳、倦怠感のある方
２）医療機関において新型コロナウイルスに感染していると診断された方。
２、施設内への入構時の対応について
１）建物入口等に設置の手指消毒アルコールでの消毒をお願いします。
２）マスクの着用を推奨します。

※次回以降のお知らせ※
第４３回動物生殖工学研究会宇都宮シンポジウム（仮称）２０２３年５月２７日（土）、場所：宇都宮大学他

第４４回動物生殖工学研究会
２０２３年１２月２日（土）予定、場所：北里大学白金キャンパス

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特別講演

X 精⼦に発現する TLR7/8、その局在と作⽤の動物種間差を考慮した
雌雄産み分け法の開発
島⽥昌之
広島⼤学⼤学院統合⽣命科学研究科

精⼦形成過程において、減数分裂過程では性染⾊体は XY ボディを形成し、性染⾊体の転写と相同組換えを抑制している。⼀⽅、精⼦には X 染⾊体にコードされる遺伝⼦から翻訳されたタンパク質も存在することから、減数分裂が完了した円形精⼦細胞では X 染⾊体から転写が⽣じていると考えられえる。この時、Y 染⾊体をもつ円形精⼦細胞は、X 染⾊体をもつ円形精⼦細胞と細胞間架橋でつながっているので、それを介して X 染⾊体由来 mRNA やタンパク質を共有することで、どちらの性染⾊体を有する
円形精⼦細胞も正常な精⼦へと変態する。さらに、細胞間架橋が消失するステージでは、RNA polymerase II 発現がほとんど認められなくなること、DNA 結合タンパク質がプロタミンに置換されて核が著しく凝縮することで転写が抑制されるので、X 精⼦と Y 精⼦の間に機能差はないとされてきた。しかし、特殊な環境下では、X 精⼦と Y
精⼦の運動パターンが異なることが報告されている。さらに、私たちが確⽴したブタの凍結精液を⽤いた⼈⼯授精において、得られる産仔の性が、複数個体の平均値では
50：50 に近づくが、１頭ごとで⾒ると（ブタは多胎なので、⼀腹当たりの雌雄⽐）⼤きくばらついていることに気が付いた。そして、⾃然交配や液状精液を⽤いた⼈⼯授精と⽐較して、⼀腹の雌雄⽐におけるばらつきが有意に⼤きいことを⾒出したことか
ら、⾮⽣理的条件において、X 精⼦と Y 精⼦の潜在的機能差が発揮されるのではないかと考えた。そこで、「何らかの条件に反応する X 精⼦と Y 精⼦の機能差」を解明するため、以下の研究を⾏った。
1.

マウスの精巣上体精⼦から RNA を抽出し、分解された断⽚を含めて RNAseq により X 染⾊体由来 mRNA を網羅的に検出した。

2.

X 染⾊体由来 mRNA の中から、「何らかの条件に反応する」≒「受容体」として、絞り込みを⾏った。

3.

精巣切⽚を⽤いた細胞間架橋が消失した精⼦で発現する sp56 と候補受容体の⼆重染⾊を⾏い、半数の sp56 陽性細胞で候補受容体が陽性となるものを探索した。

4.

Immuno-FISH 法やフローサイトメトリー、whole mount 標本による免疫蛍光染⾊などにより、X 精⼦にのみ発現する受容体を同定し、その局在も解明した。
6

その結果、マウス精⼦において、X 精⼦にのみ TLR7 が尾部、TLR8 が中⽚部に局在していることが明らかとなった。そこで、両受容体を刺激する R848 添加培地でマウス
精巣上体精⼦を培養した結果、X 精⼦は解糖系活性が低下して運動性を消失し沈降したが、Y 精⼦はリガンドの影響を受けず解糖系により ATP を産⽣し、上向した。それ
ぞれを回収して体外受精に供試した結果、上層精⼦から XY 胚が、下層精⼦から XX 胚が 80%以上で⽣産され、胚移植により正常な産仔が得られた。このマウスにおける成果をウシ凍結融解/新鮮射出精⼦、ブタ新鮮射出精⼦、イルカ新鮮射出精⼦への応⽤を⽬指している。ここでの問題は、イルカ精⼦では、TLR8 は X 精⼦のみ発現するが TLR7
が X と Y 精⼦に発現するなど、おそらく精⼦形成過程で TLR7 と TLR8 の発現ステー
ジがマウスとは異なることで、特異性がない場合があることである。さらに、TLR7 とTLR8 は⼩胞体上に局在するため、⼩胞体ストレスが⾼まっている凍結融解精⼦では分解されている場合もあることがわかった。このような動物種による違い、凍結と新鮮の違いなどを理解し、それぞれの動物種でマウス同様に簡便な雌雄産み分けを可能とする技術開発を⾏っている。

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⼀般演題

1. ⿊⽑和種繁殖⽜における胚移植前⻩体⾎流量の調査〇神⽥沙織、芦野⼤地、中原⼤輝、吉岡 ⼀、的場理⼦
独⽴⾏政法⼈ 家畜改良センター【⽬的】⾁⽤⽜である⿊⽑和種の分娩間隔は現在 13.2 か⽉であるが、農林⽔産省が 5
年ごとに策定する新たな家畜改良増殖⽬標においては 12.5 か⽉とされており、1 年 1産を実現させるためにも、分娩間隔の短縮が重要である。⼦⽜⽣産には⼈⼯授精または胚移植技術の利⽤が⼀般的であるが、早期妊娠診断による不受胎の検知には超⾳波画像診断装置を⽤いることが効率的である。最近、カラードプラ機能を有する超⾳波
画像診断装置により⻩体⾎流⾯積を出⼒し、早期の受胎性予測の実現が報告された（⾦澤ら, 2019）が、この⽅法はフィールドからデータを持ち帰ったのちに画像を解析して⻩体⾎流⾯積を算出する必要があり煩雑となる。ごく最近、我々は、独⾃に設けた⻩体
⾎流量指標を⽤い、フィールドでリアルタイムに⼈⼯授精後の不受胎⽜の早期検知が可能となることを報告した（⽥村ら, ⽇本胚移植技術研究会, 2020）。本研究では、この指標を⽤い、受胚⽜の胚移植前における⻩体機能（⾎流量と⻩体⻑径）からその後の不受胎を予測可能であるか調査した。
【材料および⽅法】⿊⽑和種経産⽜ 51 頭（平均 3.4±1.0 歳）を⽤い、発情から 7〜8⽇⽬の胚移植前に卵巣の⻩体⾎流量と⻑径を評価した。さらに受胎⽜（n=19）および不受胎⽜(n=32)で⽐較した。⻩体⾎流量は、カラードプラ機能を有する超⾳波画像診断装置（MyLabOne VET、Esaote Europe B.V.）にリニア型探触⼦（Ｂモード周波数
10.0MHｚ）を装着して直腸に挿⼊し、⻩体の⾎流ドプラ像を我々の上記既報の基準に従って 1（最⼩）から 12（最⼤）までの 12 段階に分類したドプラスコアを⽤い、各ス
コアは、⾎流範囲に応じて時計の⽂字盤の⽬盛の合計として評価した。⻩体⻑径は、⻩
体断⾯が最⼤となった画像における最⻑を計測し評価した。受胚⽜の胚移植は、発情から 8 ⽇⽬に、⻩体側⼦宮⾓へ⼦宮頸管経由法により実施した。移植後の妊娠鑑定は、発情後約 40 ⽇⽬に上述した超⾳波画像診断装置と探触⼦を⽤い、移植側卵巣の⻩体の有無および移植側⼦宮⾓の⽺膜腔内の胎⼦の⼼拍の有無により実施した。
【結果および考察】ドプラスコアは受胎⽜ 4.6±1.4、不受胎⽜ 5.0±2.4 であり、受胎の成否に差は認められなかったが、受胎⽜ではばらつきが⼩さかった。⻩体⻑径においても受胎⽜ 2.2±0.4 cm、不受胎⽜ 2.1±0.3 cm で受胎の成否に差は認められなかった。ドプラスコアと⻩体⻑径に有意な相関（r=0.02, P=0.91）は認められなかった。以上のことより、フィールドにおいてリアルタイムに胚移植前⻩体機能の診断は可能であったが、ドプラスコアおよび⻩体⻑径と受胎の成否に関係は認められず、受胎ある
いは不受胎を検知することはできなかった。今後は、発情後 7〜8 ⽇に加えて 19〜21
⽇にも⻩体⾎流量を調査し、経時的な⻩体機能や⼈⼯授精同様に不受胎⽜の早期検知が可能であるか検討する。
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2. ミナミイワトビペンギンにおける凍結保存精液を⽤いた
⼈⼯授精の成功について〇伊藤このみ 1 、冨澤奈美 1 、⼩林由和 1 、林成幸 1 、
野島⼤貴 2 、内⼭幸 2 、杉本悠真 2 、吉澤円 3
1

⼤阪・海遊館、 2 葛⻄臨海⽔族園、 3 上野動物園【⽬的】ミナミイワトビペンギン（Eudyptes chrysocome）は IUCN（国際⾃然連合）のレッドリストで絶滅危急種（Vulnerable）に指定されており、かつ、飼育下での受精率、孵化率、雛⽣育率が低いことから⽇本国内での飼育個体数は減少している。こういった状況の中、海遊館では、低い受精率への解決策としての本種の⼈⼯繁殖技術確⽴を⽬的に、2011 年度より繁殖⽣理に関する研究を実施してきた。2016 年度には葛⻄臨
海⽔族園（以下、葛⻄）から精⼦の提供を受け、液状保存精液を⽤いた⼈⼯授精（以下、AI）に成功した。研究を更に発展させるため、2017 年度以降は葛⻄と共同研究契約を締結し、凍結精液を⽤いて⼈⼯授精を実施してきた。今回、世界で初めて凍結保存精液を⽤いた AI に成功したので報告する。
【材料および⽅法】精液ドナー雄は海遊館所有の♯205（11 才、ペアなし）、♯206（11才、ペアなし）、♯306（12 才、ペアあり）、♯308（9 才、ペアあり）の合計 4 ⽻とした。採精は精管乳頭圧搾法を⽤いて保定下で実施した。採取した精液はベルツビル液（Sexton, 1977）で約 2 倍に⼀次希釈し、直ちに性状検査を実施後、氷⽔で冷却した。
メチルアセトアミド（榛澤ら、2010）を最終濃度が 7.5%となるよう予めベルツビル液に混和して⼆次希釈液とし、氷⽔で冷却して⼀次希釈液と温度を合わせた後に混和し、氷⽔内で 30 分静置した。それをストローに吸い、再度 5 分間氷⽔で冷却後、液体窒素
気相下で 30 分間冷却した後、液体窒素に浸漬し凍結保存した。AI 対象の雌は葛⻄所有の＃102（6 才、ペアあり）とし、この個体の過去の産卵⽇と⾎液⽣化学値の変動か
ら産卵⽇を予想し（4 ⽉ 6 ⽇）、⼈⼯授精⽇を 2 回（3 ⽉ 28 ⽇、31 ⽇）設定した。また、⼈⼯授精実施直前に超⾳波検査を⾏い、卵胞の発育と未排卵であることを確認した。AI は、ペンギンを伏臥にて保定して⾏った。直前に解凍して性状検査を実施した
精液にペニシリン 10 単位/μl 添加後、先端挿⼊部 φ5 ㎜、⻑さ 40 ㎜ガラス製の鶏⽤精液注⼊器をガイドとして卵管⼊⼝に挿⼊し、外径 2 ㎜、⻑さ 10 cm の多⽤途カテー
テルを⽤いて精液を注⼊した。
【結果と考察】＃102 は 4 ⽉ 4 ⽇に 1 卵⽬（有精）、8 ⽇に 2 卵⽬（無精）を産卵し、5 ⽉ 8 ⽇に 1 卵⽬の雛が孵化した。雛は孵化 2 ⽇後に死亡したが、雛の肝臓組織と親⿃、ドナー雄の⾎液を⽤いて DNA 検査を⾏ったところ、ドナー雄＃306 が⽗親である
9

ことが判明した。今回、1 卵⽬産卵の 7、4 ⽇前に AI を実施し、AI が成功したことから、凍結精液を⽤いた本種の AI 適期は 1 卵⽬産卵の 7-4 ⽇前であることが⽰唆された。また、今回⽤いた凍結保存⽅法は、本種の精⼦の受精能を妨げない⽅法であることが実証された。凍結保存は半永久的に精⼦を保存でき、国内外を問わず輸送が可能で、かつ AI に最適なタイミングで利⽤できるため、より効率的な AI が可能となる。また、
AI を補助的に⾏うことで、飼育下での受精率の向上や計画的な⾎統管理に役⽴てることできると考えられた。

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3. ニワトリ胚の無卵殻培養について〇⼩原勝也 1 、浅野敦之 1 、内藤 充 2 、⽥島淳史 11

筑波⼤・⽣命環境、 2 ⽣物資源研

脊椎動物の中で、⿃類は哺乳類と同じ⽺膜類に属しており、⺟体外で発⽣が進むことから、発⽣学のモデル動物として古くから⽤いられてきた。しかし、⿃類の卵はカルシウムを主体とした卵殻により覆われているため、割卵しない限りその発⽣過程を観察することができない。そのため、ニワトリ胚の発⽣過程を可視化する⽅法として、これまで卵殻の⼀部に⽳を開けて観察する窓開け法あるいは胚を⼆⻩卵等の⼤型の卵殻に移し替えた後に、フィルム等で蓋をした上で培養を継続する代替卵殻法が⽤いられてきた。
近年、ニワトリの孵卵 3 ⽇胚を⼈⼯培養容器内に移した後培養を継続することにより 正 常 な 雛 を 孵 化 さ せ る 技 術 で あ る 無 卵 殻 培 養 法 (Chick Shell-Less Culture System;cSLCS)が開発された (Tahara and Obara, 2014)。この cSLCS は、胚を覆う卵殻膜を透明なポリメチルペンテン製⾷品⽤ラップに置き換えたことにより、胚発⽣を連続的に、しかも全⽅位から観察できるのが特徴であるが、現時点での孵化率は低く実験間での孵化率の違いも⼤きい。そこで、cSLCS における孵化率を安定させることを⽬的とした⼀連の研究を⾏った。
胚の孵化率に関与する多くの要因の中から、まず培養開始直後(3-5 ⽇⽬：P1 期)におけるカルシウム添加の効果について検討した。その結果、P1 期に添加されたカルシ
ウムは、⾎液に移⾏し、脛⾻の⾻密度を正常値まで上昇させたが、脛⾻のサイズ(⻑さ・太さ)は有意に⼩型であった(Obara et al, 2022a)。次に、培養後期(17-19 ⽇⽬：P2 期)における酸素添加の効果について検討した。その結果、P2 期における酸素の添加により、⾎液中の酸素飽和度は正常値にまで上昇したが、臓器には酸素不⾜の病理所⾒が観察された(Obara et al, 2022b)。これらの結果から、cSLCS における孵化率向上のた
めには、単に⾎液中のカルシウムおよび酸素濃度を正常値にするだけでは不⼗分であり、⽣理的に利⽤されるための条件を整える必要があることが明らかになった。
cSLCS は、発⽣学を始め、胚操作、毒性試験、組織⼯学、さらには再⽣医療の基礎研究など、さまざまな分野への応⽤が期待されることから、本発表においては、cSLCS の可能性と課題についても紹介する。
11

参考⽂献

Obara K, Obara(Henmi) C, Naito M, Mitsui I, Une Y, Asano A, Tajima A. (2022b)
Effects of Oxygen Gas Injection on the Subsequent Development of Chick Embryos
under Shell-Less Culture System. Journal of Poultry Science.59(3):371-377.
Obara K, Obara(Henmi) C, Naito M, Mitsui I, Une Y, Asano A, Tajima A. (2022a)
Effects of Calcium Lactate on the Development of Chicken Embryos in a Shell-lessCulture System up to Day Seventeen of Incubation. Journal of Poultry Science.
59(2):168-174.
Tahara Y, Obara K, Kamihira M. (2021)
Calcium Carbonate Supplementation to Chorioallantoic Membranes Improves
Hatchability in Shell-less Chick Embryo Culture. Journal of Bioscience andBioengineering. 131(3):314-319.
Tahara Y, Obara K. (Equal contribution) (2021)
Ex Ovo Culture System for Avian Embryos and its Application (Review). Journal of
Poultry Science. 58(1):1-4.
Tahara Y, Obara K. (2014)
A Novel Shell-less Culture System for Chick Embryos Using a Plastic Film as Culture
Vessels. Journal of Poultry Science. 51(3):307-312.

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4. ⽣殖毒性の種差とリスク評価〇奥⽥裕計
独⽴⾏政法⼈労働者健康安全機構 ⽇本バイオアッセイ研究センター、
⼀般財団法⼈化学物質評価研究機構
⽣殖機能に有害な影響を及ぼす産業化学物質から労働者の健康を守ることは重要な課題であり、⽣殖毒性を適切に評価し、それに対応した管理が求められている。このため、⽇本産業衛⽣学会の許容濃度等に関する委員会による許容濃度等の勧告では、産業化学物質の⽣殖毒性に関する症例報告や疫学的研究等でのヒトにおける証拠、および動物実験から得られた証拠にもとづき、分類を⾏っている。
ヒトの⽣殖発⽣に対する有害性評価にとって動物試験データは有⽤な情報となるものの、利⽤する場合の注意点としては、動物試験がテストガイドラインを使⽤して正しく実施されたものであり、化学物質によって⽣じる障害や異常の種類が明らかになり、⽣殖発⽣に対する有害性が確認され、曝露量と有害事象の発現との量−反応関係を明確に⽰す陽性データが得られた場合には、ヒトに対して⽣殖毒性を⽰す可能性がある
ものと判断されることになる。それにより、ヒトの健康障害予防に活⽤可能と考えられるが、発現した⽣殖発⽣の障害や発現閾値が必ずしも動物とヒトで同⼀とは限らないとされている。ヒトと動物の⽣殖異常の発現を⽐較することは、曝露の⽤量と期間、
薬物動態、感受期の特異性、胎盤形成の時期、妊娠期間、種・系統特異性などの条件が異なるために、極めて困難ではあるが、これらの条件を適切に考慮して⽐較した場合、最も感受性が⾼いと考えられている動物種における最⼩毒性発現量は、多くの場合ヒトのそれの 10 倍程度と考えられている。⼀⽅、ある動物試験で陰性データが得られたとしても、ヒトに対して⽣殖毒性が否定されたとの判断には⾄らないものとされている。
1961 年のサリドマイド事件以降に構築された医薬品の⽣殖発⽣毒性試験では、2 動物種（げっ⻭類及び⾮げっ⻭類）の使⽤が⻑く続いているが、近年、レギュラトリーサ
イエンスの伸展に合わせて、動物種を減らす試験⽅法の検討も進みつつある。ラットとウサギの発⽣毒性においては、全体的に類似の感受性が確認されたが、物質によっては 10 倍以上の違いがみられたとの報告がある。その要因としては、同じ動物種間での⺟体毒性や薬物動態等の評価の差に混乱を⽣じていると考えられる。
⽣殖毒性のリスク評価においては、曝露の状況から毒性反応や感受性、有害影響に⾄る⼀連の経過（AOP: Adverse Outcome Pathway）が毒性評価に必要にもかかわらず、
ヒトに対する⽣殖毒性データは限定的であるため、実験動物による⽣殖発⽣毒性試験に頼らざるを得ない状況が続いている。
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5. 過剰排卵処理マウスにおける排卵・交配タイミングの同期化による効率的な受精卵の作製〇中尾聡宏 1 、伊藤琴乃 1 、須賀原千明 1 、若杉理乃 1 、中潟直⼰ 2 、⽵尾 透 1
1
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熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター資源開発分野、

熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター⽣殖⼯学共同研究分野

哺乳動物の精⼦は、膣内に射精されたのち、⼦宮から卵管へ移動し、排卵卵⼦へと到達することで受精に⾄る。成熟雌マウスでは、発情周期に従い、8-10 個の卵⼦が排卵され、雄マウスとの交配によりほぼ全ての卵⼦が受精する。⼀⽅で、インヒビン抗⾎清（IAS）とウマ絨⽑性ゴナドトロピン（eCG）の合剤（IASe）により、100 個の卵⼦を排卵させる超過剰排卵処理マウスでは、雄マウスと交配しても受精する卵⼦は約 20 個程度である。超過剰排卵処理マウスでは、卵管内に過剰に卵⼦が存在するため、受精できないことが推測できるが、その詳細は不明である。そこで本研究では、超過剰排卵処
理雌マウスの排卵タイミングの観察、排卵タイミングに基づいた交配が受精率に及ぼす影響を検討した。
まず、IASe 投与後の排卵タイミングを確認し、排卵前（従来の交配）、排卵中、排卵後の３つの時期に分類した。次に、各時期の雌マウスと雄マウスを交配させた結果、排卵前に交配した雌マウスと⽐較して、排卵中および排卵後に交配した雌マウスの受精率が⾼かった。また、排卵後の雌マウスから得られた受精卵数は、排卵前の交配で得られた受精卵数の３倍であった。最後に、本法で得られた胚の発⽣能を胚移植により調べた結果、正常に産⼦へと発⽣することを確認した。
以上の結果より、超過剰排卵処理雌マウスにおいても、排卵・交配タイミングを同期化することで受精卵の作製効率が⾼まることが明らかになった。本知⾒は、超過剰排卵処理雌マウスが、遺伝⼦改変マウスの作製やエピゲノム解析に使⽤する⽣体内由来の受精卵作製に有⽤であり、卵⼦ドナー数の削減による 3R の実現に貢献することが期
待できる。

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6. 発⽣動態を利⽤したマウス初期胚の性判別〇⼩林陽歌、⼩野寺梨紗、樋⼝久美、鈴⽊宏志、渡部浩之
帯広畜産⼤学

雌雄の産み分け技術は様々な産業での応⽤が期待されており、性判別精液やバイオプシー法による初期胚の性判別はすでに実⽤レベルにまで到達している。しかし、精⼦へのレーザー照射による DNA ダメージや胚の⼀部を切り取ることによる損傷が問題視される。そのため、⾮侵襲的な性判別法の実⽤化が望まれる。本研究では、組成の異なる培地で培養したマウス初期胚の発⽣動態を詳細に観察し、発⽣スピードの性差について調査した。
ICR 雌マウスに、eCG および hCG（5 単位ずつ）を 48 時間間隔で腹腔内投与することにより、過排卵処理を施した。精⼦および卵⼦を回収し、TYH 培地内で体外受精を⾏った（150 sperm/µl）。媒精後、得られた受精卵を mW または KSOM 培地へ移し、タイムラプスインキュベーターを⽤いて 37℃、5% CO2、95%空気下で 120 時間培養した。各胚の発⽣動態は、15 分間隔で写真を撮影することで取得し、各ステージへの到達時間を記録した。培養終了後、全ての胚を個別に回収し、PCR・⾼分解能融解曲線
解析で雌雄判定を⾏った。
mW 培地で胚を培養したとき、媒精後 49 時間以内に 5 細胞期に発⽣した胚のうち雄の割合は 82%となり、発⽣スピードを指標とした性判別が可能であることが⽰された。
しかし、KSOM 培地で培養したとき、媒精後 49 時間以内に 5 細胞期に発⽣した胚のうち雄胚の割合は 48％となり、雄胚の発育速度に優位性は⾒られなかった。胚の発⽣スピードに影響を与える物質として ATP の基質であるグルコースとグルタミンに着⽬
し、KSOM 培地のグルコースとグルタミンの濃度を mW 培地のものと同じにした場合、5 細胞期までの発⽣速度で雄胚を選択することができた。
以上の結果から、発⽣スピードを観察するという完全に⾮侵襲的な⽅法でマウス初期胚の性判別が可能であることが明らかとなった。この発⽣スピードの違いは、初期胚のエネルギー代謝の性差に起因する可能性があるため、今後、解糖系関連遺伝⼦の発現タイミングを調査していく予定である。

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7. 無発情期の雌イヌにおける抗インヒビン⾎清投与による発情誘起と交配成績〇古村奈瑚 1 、⼟⽥萌⾐ 1 、桜井⼤地 1 、松村花⽉ 1 、中潟直⼰ 2 、鈴⽊宏志 1
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帯広畜産⼤学、 2 熊本⼤学

【背景・⽬的】イヌは年に 1〜2 回しか発情期を迎えず、効率的な繁殖のために有効な発情誘起法の確⽴が求められている。本研究では、eCG と抗インヒビン⾎清(IAS)の併⽤による無発情期の雌イヌの発情誘起および妊孕能を検討した。
【⽅法】無発情期の雌イヌを以下の 3 群に分けた。I 群では IAS (0.5 ml/kg)、II 群では eCG (50 IU/kg)、III 群では IAS （0.5 ml/kg）と eCG （50 IU/kg）の混合溶液を
臀部筋⾁内注射し、この⽇を Day 0 とした。II 群及び III 群では Day 7 に hCG （500IU）を投与した。次いで Day 0〜14 まで外陰部の腫脹および発情出⾎などの発情徴候の観察、⾎中プロゲステロン（P4）濃度およびエストラジオール（E2）濃度の測定、超⾳波検査による卵巣の観察を⾏い、発情状況を評価した。III 群では発情誘起後に交配実験を実施し、受胎の有無を検証した。
【結果・考察】I 群（n=3）では、全ての個体で発情徴候や卵胞発育、さらに P4 および E2 濃度の上昇は観察されず、発情を誘起することができなかった。II 群（n=4）では、全ての個体で発情徴候や卵胞の発育が観察された。平均卵胞数は 8.3 個で、⾃然発
情時（7.4 個、n=32）と同等であったが、平均⻩体数は 4.5 個と少なく、排卵率は 54.5%であった。P4 濃度は Day 7〜8 に 2 ng/ml を超え LH サージが起こったと推定されたが、その後の P4 濃度の上昇は⾃然発情時と⽐べて有意に⼩さかった。LH サージ前のE2 濃度は⾃然発情時と同等であった。III 群（n=11）では、全ての動物で発情徴候や卵胞の発育が観察された。平均卵胞数、平均⻩体数ともに 12.3 個であり、排卵率は100%であった。P4 濃度は Day 6〜10 に 2 ng/ml を超え、LH サージ後の P4 濃度は II
群と⽐べて顕著に⾼かった。さらに LH サージ前の E2 濃度も⾃然発情時より有意に⾼かった。III 群の交配実験(n=6)では、3 例が妊娠・分娩に⾄り、産仔数はそれぞれ 1 頭、4 頭、11 頭であった。全 6 例の妊娠率は 50%、平均産仔数は 2.7 頭であった。妊娠群と⾮妊娠群を⽐較すると、妊娠群では平均 10.7 個排卵したのに対し、⾮妊娠群では平均 18.3 個と 7 個以上多い結果であった。また、⾮妊娠群の P2 濃度は LH2 以降、妊娠群の 1.8〜3.0 倍⾼く、E2 濃度は LH サージの 3 ⽇前から 2.0〜2.8 倍⾼いレベルを維持していた。さらに、⾮妊娠群は⾃然発情時と⽐較しても LH サージ前後の P4 およびE2 濃度が有意に⾼いことが明らかとなり、P4 および E2 の⾮⽣理上昇が妊娠を阻害する可能性が⽰唆された。
【結論】本研究により、IAS 単独では発情が誘起されないが、IAS と eCG の併⽤により全ての雌イヌに発情が誘起され、過剰排卵を⽰す可能性が⽰唆された。また、eCG
単独でも発情は誘起されるが、LH サージ後の P4 濃度および排卵率の低下が認められ、これが産仔数減少の原因であると推測された。以上から IAS と eCG の併⽤は無発情期の雌イヌにおける発情誘起プロトコルとして有⽤であると⾔える。しかし、⼀部の検体では P4 および E2 濃度が⾮⽣理的に上昇し、妊娠が阻害された可能性がある。今後は適切な P4 および E2 濃度を維持できる IAS 投与量を検討していく必要がある。
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8. ラット精⼦を通じて⽣殖⼯学の理解を深める〇⼭⿅優真 1 、中尾聡宏 1 、三⼩⽥伸之 2,3 、中務 胞 4 、中潟直⼰ 2 、⽵尾 透 1
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熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター資源開発分野、

熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター⽣殖⼯学共同研究分野、
3九動株式会社、 4 新潟⼤学脳研究所モデル動物開発分野

ラットは、実験動物として有⽤性が⾼いにも関わらず、⽣殖⼯学技術の開発が他の動物種に⽐べて遅れている。ラットの⽣殖⼯学の課題は、過剰排卵誘起法、精⼦の受精
能獲得、多精⼦受精、胚の凍結保存、胚の体外培養などがある。これらの課題を解決するために、⽣殖⼯学の研究が進んでいるマウスと⽐較することで、ラットの⽣殖⼯学に関する理解を深め、新たなラットの⽣殖⼯学システムを確⽴したいと考えている。
本報告では、現在取り組んでいるラット精⼦の冷蔵保存技術に関する最新の知⾒を紹介する。
ラットは、マウスより個体が⼤きく、動物施設間を簡便に輸送するための技術が必要である。マウスでは、簡便な輸送技術として精⼦の冷蔵輸送法があり、ジメチルスル
フォキサイド (DMSO)およびケルセチンを⽤いることで冷蔵温度下における⽣存期間が延⻑する。しかしながら、ラット精⼦の冷蔵保存に関する知⾒は少なく、実⽤に耐えうる技術は開発されていない。そこで本研究では、ラット精⼦冷蔵輸送法の開発を⽬的として、マウスで有⽤であった DMSO およびケルセチンがラット精⼦の冷蔵保存
期間の延⻑に有⽤であるか否かを検討した。
その結果、DMSO およびケルセチンは、ラット冷蔵精⼦の運動能および受精能の維持に有効であり、５⽇間保存した精⼦からも体外受精により受精卵が得られた。さらに、冷蔵精⼦由来胚は、胚移植により産⼦へと発⽣した。また、冷蔵輸送後の精巣上体尾部から採取した精⼦でも、体外受精により受精卵が得られ、胚移植により産⼦を作出できた。以上、本研究により、ラット精⼦の冷蔵保存において DMSO およびケルセチンが有効であることが⽰された。今後は、ラット精⼦の冷蔵輸送法の改良やその他の⽣殖⼯学技術も開発し、世界中で利⽤されるラット⽣殖⼯学システムの構築を⽬指
したい。

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9. 各種系統ラット卵⼦の体外受精〇中潟直⼰ 1 、三⼩⽥伸之 1,2 、中尾聡宏 3 、⼭⿅優真 3 、⽵尾 透 3
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熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター（CARD）⽣殖⼯学共同研究分野、

九動株式会社、 3 熊本⼤学⽣命資源研究・⽀援センター（CARD）資源開発分野【⽬的】近年、ゲノム編集ツール、CRISPR-Cas9 が登場したことで、マウスのみならず、様々な動物種において遺伝⼦改変動物が作製されるようになった。特にラットは、
⽣理試験、薬理試験、毒性試験、⾏動解析などで、広く利⽤されている実験動物であり、マウスに⽐べてはるかに⼤きく、外科的処置を⽐較的簡単に⾏え、かつ⾎液や尿などの試料を多量に繰り返し採取することが可能であると⾔う特⻑があることから、ヒト疾患モデル、創薬・毒性ヒト代謝、脳機能⾏動解析および再⽣医療移植モデル等の遺伝⼦改変ラットが急速に作製されつつある。⼀⽅、それを⽀える周辺技術、すなわち、ラットにおける⽣殖⼯学技術はマウスのそれに⽐べて遅れており、安定した⽅法が未だ確⽴されていないのが現状である。特に体外受精は⽣殖⼯学の基本技術であり、Toyoda and Chang（1974 年）が精巣上体尾部精⼦を⽤いてラット体外受精に初めて成功して以来、多くの報告が成されているが、そのほとんどが SD あるいは Wistar を⽤いたものである。そこで本研究では、各種系統（SD, Wistar, LE, F344, BN, LEW およ
び SD-Tg(CAG-EGFP)）のラットを⽤いて体外受精を⾏い、受精率および産⼦への発⽣について検討した。
【⽅法】受精⽤培地には mHTF を⽤い、体外受精は成熟雄（11 週齢以上）から採取した精⼦と過排卵処理を施した幼若雌（4~5 週齢）から採取した卵⼦との間で⾏った（受精の場の精⼦濃度：500 精⼦/μL）。受精の有無は、媒精後 22 時間に倒⽴顕微鏡下で⾏い、⼀部の受精卵については、偽妊娠第⼀⽇⽬の受容雌の卵管に移植して産⼦への発⽣を検討した。
【結果】すべての系統において、体外受精率は平均 90％以上であり、移植した受精卵の⼀部は、産⼦へ発⽣した。

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10. 変異コモンマーモセットの作製〇中尾和貴 1,2 、阿部由希⼦ 2 、後藤元樹 2 、⽟野萌恵 2 、中尾晴美 2 、饗場 篤 2
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⼤阪⼤学⼤学院医学系研究科医学部附属動物実験施設、

東京⼤学⼤学院医学系研究科附属疾患⽣命⼯学センター動物資源学部⾨

近年、ゲノム編集の⼀つである CRISPR/Cas システムの登場により、これまで極論すればマウスでしか⾃在に作製することができなかった変異動物を、様々な種において作製できるようになってきている。そこで我々は⼩型霊⻑類の⼀種であるコモンマ
ーモセットを⽤いて、新たな変異コモンマーモセットの作製法を開発した。
これまで多種多様な変異マウスが樹⽴されてきた背景には、⽣殖⼯学技術の発展があった。変異動物を作製するには、その動物種に応じた⽣殖⼯学技術の成熟が必須であり、とりわけ効率よく受精卵を得ること、受精卵を培養すること、受精卵を移植することが重要である。⼩型霊⻑類マーモセットは、妊娠期間が短く多産であるとはいえ、マウスと同⽔準の⽣殖⼯学技術を確⽴することが短時⽇には困難であることは想像に難くない。
我々は最近、霊⻑類などで⾏われる⼀般的な⽅法とは全く異なるアプローチで、極めて効率的に変異コモンマーモセットを作製することに成功したので紹介する。
⼀般的な変異コモンマーモセットの作製過程は、次のようになる。まず過排卵処理したメスの卵巣から卵胞卵を採取し、体外成熟後-体外受精で受精卵を作製する。続いて受精卵を体外培養により胚盤胞期胚へと発⽣させ、レシピエントメスの⼦宮内に移植する。その後約 5 ヶ⽉間の妊娠期間を経て産仔が誕⽣する。しかし、個体までの発⽣成績は必ずしも良好でなく、⼀頭の変異個体を得るために多くの個体が必要となる。
また、マウスと違いレシピエントメスは出産経験が必須であり、性成熟期間を含めて数年間の予備飼育の期間を要する。
研究開始当初、移植後の妊娠成⽴を確認できていなかった我々のグループは受精卵の⻑期間にわたる体外培養を避けるため、卵管内移植法を採⽤した。卵管内移植法はマウスでこそ⼀般的だが、コモンマーモセットではあまり⽤いられていない。この卵管内移植法によって、安定的に妊娠個体が得られることがわかった。しかしゲノム編集処理した受精卵を卵管内移植したメスは、そのほとんどが妊娠中期で流産し、変異個体を得ることはできなかった。そこでさらに受精卵の負担が⼩さくなる⼿段として、
過排卵処理、体外成熟、そして体外受精などを全て排除した⾃家移植法(Autologous

Embryo Transfer: ATE)を開発した。
この ATE 法では、⾃然交配で受精した受精卵を短時間だけ体外に取り出し、ゲノム編集処理後すぐに元のメス卵管内に戻すため、受精卵に及ぼす環境要因が最⼩と期待できる。その結果、極めて⾼効率に変異コモンマーモセットを作製することが可能になった。またこの ATE 法は、⼀頭の変異個体を得るために⼀頭のメス個体しか必要としないため、動物愛護的観点からも⾮常に優れた⽅法である。

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