茗溪学園中学校高等学校
今野駿介，磯山怜佑，大泉祐介，古屋敦大（顧問：鈴木朋子）

タマネギの体細胞分裂にリズムはあるか
細胞と遺伝子からのアプローチ

本 研 究 発 表 は， 平 成 25（2013）年 度 日 本 農 芸 化 学 会 大 会（開催 地・ 仙 台） で の「ジ ュ ニ ア 農 芸 化 学 会」 に お い て， 銀賞に選ばれた．発表者らは，植物の体細胞分裂が光や概日リズムによって調節されるかについて，タマネギの根を題材として詳細に観察し，これを細胞生物学と分子遺伝子学レベルで明らかにしようとしている．得られた研究成果は，関連研究者にとっても示唆に富むものであり，高く評価された．

2.

つ ぶ し た 後，1.5 mL の ア セ ト ン を 用 い て 抽 出 し た．
5,000 rpm で 2 分間遠心分離した上清を適宜希釈後，660nm, 650 nm, 640 nm の波長の吸収を測定しクロロフィル 量を定量した．
3.

本研究の背景，実験方法および結果【目的】「タマネギの体細胞分裂の観察は，分裂が盛ん

クロロフィルの定量発根させた種子を 90％アセトン（5 μL）とともにすりサイクリン B 遺伝子の単離と発現
NCBI のデータからタマネギがシロイヌナズナの cy-clin B 遺伝子と相同性の高い遺伝子をもっていないかを調べ，一つの遺伝子を候補として選び出した．この遺伝な午前 9 時〜 10 時ごろが良い」という定説があるが，こ子の塩基配列からプライマーを設計し，タマネギの全の理由を明らかにした研究成果は少ない．そこで，私たDNA を用いた PCR を行い，電気泳動上で単一の DNA

ちはこの定説が正しいのかを検証するために，タメネギ断片を得た．この遺伝子の DNA 配列を決定した．既知の根の体細胞分裂のリズムを探る研究を行った．また，の遺伝子の DNA 配列との比較には MEGA を用いた．根

そのリズムが何によって制御されているのかを明らかとの試料から調製した cDNA を鋳型として PCR を用いてすることにも取り組んだ．

cyclin B 遺伝子の転写産物を検出した．発現量はアクチ【方法】

ンのそれとの相対値として定量した．

1.

タマネギの発芽と体細胞分裂の観察
シャーレにろ紙を 3 枚重ねて敷き，蒸留水を 6 mL 入

【結果と考察】1.

光条件の違いによる体細胞分裂のリズムの変化

れ，1 枚のシャーレ当たりタマネギの種子（ベビーオニ

恒暗条件と明暗条件（12 時間明期・12 時間暗期）の 2

オン，（株）サカタのタネ）を 40 粒播種し，温度 22℃の条件下でタマネギの種子を発芽させた．播種後 5 日目の恒温器内で発芽させた．この際，恒暗条件と明暗条件根を 24 時間にわたり経時的に採取し，固定・染色後，（12 時間明期・12 時間暗期）の 2 条件で保温した．播種

顕微鏡で体細胞分裂の様子を観察した．その結果，恒暗

後 5 日目から，根を数時間ごとに採取し，40% 酢酸で固条件で発芽させた場合には 16 〜 20 時ごろに分裂期の細定した．これを 4％塩酸で 60℃処理した後，種子と根を胞数のピークが現れたが，明暗条件ではこのピークは見切り離し，根に酢酸オルセインを 1 滴滴下して 5 分放置られなかった（図 1A）．このことから，体細胞分裂にはした．プレパラートは押しつぶし法を用いて作製し，顕内生リズムが存在し，光がそのリズムに影響を与えるこ

微鏡下で，細胞分裂間期・前期・中期・後期・終期の細とがわかった．これはネギを用いたときも同様であっ胞数を計測した．

た．明暗条件下で生育させたタマネギの根のクロロフィル量が，播種後 3 日目から上昇していたことから（図化学と生物 Vol. 51, No. 8, 2013583

図 1 ■ タマネギの根の体細胞分裂と光の影響A, 分裂期の細胞数の経時変化．播種
後 5 日目の根を用い経時的に観察した．B, 播種後のクロロフィル量の経日変化．

図 2 ■ タマネギの根の伸長と体細胞分裂
A, 根の伸長領域の細胞長径．播種後 5 日目の根を用い経時的に観察した．●，恒暗条件；■，明暗条件．実線と点線は，それぞれ恒暗条
件と明暗条件の測定値の平均を表す．B, 播種後の根と子葉の長さ．●，恒暗条件；■，明暗条件．C, タマネギの種子の発芽の様子．

1B），この植物体が実際に光応答可能であることも確認

マーを用いて PCR を行った．得られたゲノム DNA 断片できた．の DNA 配列（DDBJ アクセション番号 AB819891）は，体細胞分裂と細胞伸長

2.

推定イントロン部位を除いてタマネギ EST クローン；

顕微鏡観察により，タマネギの根の表皮細胞では根端EST665443 と完全に一致した．この遺伝子の発現量のから 5 mm 以内の細胞伸長が活発であることが確認でき

経時変化を調べたところ，明暗条件よりも恒暗条件で高たので，この領域の細胞の長径をレプリカ法を用いて測いことが示されたことから（図 3），タマネギの根は，定した．その結果，明暗条件では恒暗条件に比べ細胞長光に応答して cyclin B の発現量を低下させ，体細胞分径が長いことがわかった（図 2A）．一方，明暗条件では裂の速度を低下させると考えられた．また，cyclin B の恒暗条件に比べ根の伸長が遅かった（図 2B, C）．以上の発現量の極大の午前 6 時ごろよりも体細胞分裂のリズム結果から，明暗条件では，光によって細胞の伸長ではなの極大（図 1）がやや遅れていた．このことから，cy-く体細胞分裂の頻度が低下することによって根の伸長がclin B の発現量を指標とすることによってタマネギの体抑制されると考えられた．

細胞分裂のリズムを判別できると考えられた．

Cyclin B 遺伝子の発現と体細胞分裂3.

本研究では，分裂期の細胞数に加えて cyclin B の発現

高等植物の体細胞分裂において，cyclin B は分裂期へ量を観察することによって，昔から言われている「細胞の移行に関与する．NCBI データベースから，シロイヌ分裂が盛んな時間帯がある」という定説を検証することナズナの cyclin B 遺伝子と相同性の高いタマネギ由来遺ができた．また，根の体細胞分裂が光によって遺伝子発伝子を選抜し，この DNA 配列をもとに設計したプライ現レベルで抑制され，それにより根の伸長も阻害される584

化学と生物 Vol. 51, No. 8, 2013

有名な生物学実験の一つといってもよいだろう．しかし，「ではなぜ午前中に観察するのがよいか」と改めて聞かれると明確な答えは得られていないのではないだろうか．本研究は，この素朴な疑問を解き明かそうという試みであり，この着眼はとてもユニークである．顕微鏡
観察と統計処理，クロロフィルの定量，遺伝子クローニングなどハイレベルの機器や技術を導入した研究は素晴らしいものであるが，それにもまして，昼夜に及ぶサンプリング作業などをはじめ，高校生たちが熱心に根気よく研究を進めようとした様子がうかがえる力作である．
また，データのばらつきが大きくなりがちな体細胞分裂
図 3 ■ タマネギの根における cyclin B 遺伝子の発現アクチン遺伝子の発現量との相対値として表した．実線，恒暗条
件；点線，明暗条件．の観察実験をなんとかして定量化しようと，総計で 2 万個を超える細胞の顕微鏡観察を行うだけでなく，生徒自身が試行錯誤と模索を繰り返し，cyclin B の発現量を指標にする新たな研究方法の着想に至ったと聞いている．

可能性が示された．葉とは異なり，根は本来，暗い場所ユニークな着眼と地道な実験で研究を展開するという農にあるものである．おそらく，この仕組みによって，光芸化学の大切さを高校生たちに教えられたジュニア農芸が根の体細胞分裂のリズムを乱しているのではないかと化学会であった．

考えている．

（文責「化学と生物」編集委員）

本研究の意義と展望
タマネギを用いた体細胞分裂の観察は，教科書で最も化学と生物 Vol. 51, No. 8, 2013585