細 胞 運 命 情 報 解 析 技 術 開 発 サブチーム

RIKEN BRC Annual Report

Subteam for Manipulation of Cell Fate2009 〜 2010

サブチームリーダー Subteam Leader

三好 浩之（理博）
Hiroyuki MIYOSHI, Ph.D.

Development of methods for ex vivo

expansion of hemat

Age-related changes in the functional andphenotypic properties of murine HSCs

細胞運命情報解析技術開発サブチーム

FACS analysis•Surface phenotype•HSC frequency

Subteam for Manipulation of Cell Fatein vitro analysis
HSC proliferative
activityin vivo analysis

BrdU labeling
Cell cycle
analysis invivo

ミッションと事業概要 Mission

Hematopoietic cell-specific effect ofmitochondrial respiration defects
Mitochondrial
disease model
mouse

Microarray analysis

Cultured Young
HSC
Cultured Old
HSC

Young HSC
Reconstituted
HSC
Old HSC

Aanalysis

BMT
HSC repopulating
activity

Comparison of gene
expression profile•The number and frequency of HSCs significantly increased in old mice,although repopulating ability was reduced.
•HSCs in old mice exhibited a significant delay in cell cycle progression.
•When cultured in vitro, HSCs from old mice have a greater capacity togive rise to cells with a primitive phenotype and reduced HSC activity.

細胞は、自己複製能と多分化能を持つ未分化な細胞で、近年、再生医療への応用に大きな期待が寄せられている。

•The repopulating activity of HSCs significant decreased, although
the number of HSCs increased.
•Differentiation of HSPCs into progenitors was suppressed.

幹 当チームでは、特に造血幹細胞と多能性幹細胞を研究対象として、どのようなメカニズムによって幹細胞の未分化性の維持、増殖、分化といった細胞の運命が決定されているのかを解明し、幹細胞の試験管内での人工操作を可能にするよ

Development of lentiviral vectors

うな技術開発を目指している。

Development of lentiviral vectors
Shuttle vectors for cDNA and siRNA expression
Vectors containing various marker genes
Vectors with various promotersTet-inducible and Cre-loxP vector system
Non-integrating vectors
Vectors for generating iPS cells

Stem cells are deﬁned as primitive cells capable of both self-renewal and multi-lineage diﬀerentiation. In recent years, stem
cells have received much attention for their use in regenerative therapy. We study the molecular mechanisms that regulate
stem cell fate and hopes to develop technologies for manipulating stem cells in vitro.

and their use in

Research and Development in 2009-2010

stem cell research

Generation and analysis of iPS cells
Generating iPS cells from fibroblasts
Generation and analysis of iPS cells fromsenescent cells

Human fibroblasts

平成21年度の成果

opoietic stem cells

Collaboration
Generation of transgenic monkeys
Gene transfer into
germline stem cells,HSCs, T cells, etc.

iPS cells

プログラミング技術を利用して細胞老化のメカニズムを明らかにしクターを使用してコモンマーモセットの受精卵にGFP遺伝子を導represent a diﬃculty of ex vivo expansion of HSCs without loss

たいと考えている。現在、老化前後のヒト線維芽細胞とそれらの入することによりトランスジェニックサルを作出し、次世代にわたっof stem cell activity. Therefore, understanding the mechanisms

細胞から作製したiPS細胞の遺伝子発現やエピジェネテックな変て導入遺伝子を受け継がせることに霊長類では世界で初めて成of HSC aging would provide useful information in achieving ex化の差異の解析を行っている。

功したことである。

vivo expansion of HSCs. We investigated age-related changes in（1）造血幹細胞の体外増幅のための技術開発
造血幹細胞の老化のメカニズムを解明することにより、加齢に

number and frequency of HSCs signiﬁcantly increased in old（2）Investigation of the molecular mechanisms underlying cellular senescence

伴う血液疾患の治療やin vitroでの造血幹細胞増幅技術の開

mice, although repopulating ability of HSCs was reduced, which

Most mammalian somatic cells have a limited replicative（3）Development of lentiviral vectors and their use instem cell research

発に繋 がると考え、老 齢 マウスの 造 血 幹 細 胞を解 析した。i nis consistent with other previous studies. HSCs in old micepotential and therefore they undergo a terminal growth arrest

We have made many modiﬁcations to lentiviral vectors forvivoでの細胞分裂を調べたところ、若齢マウスと比較して老齢マ

exhibited a signiﬁcant delay in cell cycle progression. Whenafter a ﬁnite number of divisions in culture, a process termedusing basic research and distributed these vectors to more than

ウスの造血幹細胞は細胞分裂周期が顕著に遅く、加齢に伴い造cultured in vitro, HSCs from old mice showed a greater capac-cellular senescence. To establish conditions for stable and350 Japanese and overseas scientists. In recent years, we have

血幹細胞の数は約2倍に増加するが造血幹細胞の個々の能力

ity to give rise to cells with a primitive cell surface phenotype

inﬁnite expansion of cultured cells, we study the molecularconstructed several lentiviral vectors for generating iPS cells.

は低下していることがわかった。
またin vitro培養系では、老齢マ

and reduced HSC activity. These results suggest that themechanisms underlying cellular senescence using the technol-Using non-integrating lentiviral vectors for transient expression

ウスの造血幹細胞は未分化表現型を維持しながら分裂増殖すincreased number of HSCs in old mice may compensate for theogy for reprogramming cells. Currently, we generate inducedof SV40 large T antigen or shRNA targeting p53, we were able

る傾向があるが、増幅された未分化表現型細胞の幹細胞能力

decline in individual HSC activity and thus maintain steady-pluripotent stem (iPS) cells from senescent human ﬁbroblasts

to signiﬁcantly increase the eﬃciency of iPS cell generation. Weは、若齢マウスのものに比べ大きく低下していることがわかった。

state hematopoiesis.

and characterize global gene expression proﬁles and epigenetichave also developed an all-in-one tetracycline-inducible lentivi-

老齢マウスでは、造血幹細胞の増殖能力が低下するとともに幹To investigate the hematopoietic cell-speciﬁc eﬀect of mitochon-status.

ral vector system for inducible cDNA expression, and have

細胞能力の低下した未分化表現型の細胞を多く作り出すような

drial respiration defects, we performed transplantation analysis

機能変化が生じていることが強く示唆された。

the functional and phenotypic properties of murine HSCs. The

demonstrated that this vector system can be used to generateusing a mouse model of mitochondrial disease. The results（3）レンチウイルスベクターの開発と幹細胞研究での利用ミトコンドリア病モデルマウスを利用して、血球細胞におけるミト

showed that mitochondrial respiration defects resulted in a細胞への遺伝子導入技術として基礎研究に幅広く利用できる

One of the successful results from collaborative work is the

コンドリア呼吸欠損の影響を解析した。その結果、ミトコンドリア呼signiﬁcant decrease in the total number and repopulating

よう、レンチウイルスベクターに様々な改良を行い、国内外の多数

generation of transgenic monkeys by injecting a lentiviral

iPS cells.

吸欠損により造血幹細胞の幹細胞能力が低下するが、これは造activity of bone marrow cells, although the number of hemato-の研究者に提供している。今年度は、iPS細胞樹立のための様々

vector containing the GFP transgene into embryos of the

血幹細胞および前駆細胞の増殖には影響ないものの分化が阻

poietic stem and progenitor cells (HSPCs) increased. Our

なレンチウイルスベクターを作製し、ヒトおよびマウス胎児線維芽common marmoset, and the transgene has been passed to the

害されることに起因することが示唆された。

ﬁndings indicate that mitochondrial respiration defects modu-細胞等からiPS細胞を樹立した。染色体に組み込まれないレンチ

next generation for the ﬁrst time in the world.

late diﬀerentiation but not proliferation of HSPCs.

ウイルスベクターを作 製し、一 過 性にp 5 3 遺 伝 子のs h R N Aや（2）細胞老化の分子メカニズムに関する研究を高めることにも成功した。
また、Tet発現調節機構を利用して１（1）Development of methods for ex vivo expansionof hematopoietic stem cells

SV40 large T抗原を発現させることにより、iPS細胞の樹立効率

Hematopoietic stem cell (HSC) function is known to decline

線維芽細胞や造血幹細胞など多くの初代培養細胞には寿命

during replicative stress such as serial transplantation, ex vivoがあり、in vitroでの分裂回数は有限で老化する。in vitroで細culture with cytokines, or even normal aging. This may

胞を不変的かつ無限に増幅するための技術開発を行うため、
リ

42

つのベクターでcDNA発現のOn、Oﬀ調節が可能なベクターを作製し、iPS細胞の樹立にも使用した。
共同研究の中でも特筆すべき成果の１つは、レンチウイルスベ43