秋田県立秋田南高等学校自然科学部
佐々木晴香，佐藤春佳，吉岡絵里（顧問：遠藤金吾）

香料の抗変異原性に関する研究

本 研 究 は， 日 本 農 芸 化 学 会 2014 年 度（平 成 26 年 度） 大 会（開 催 地： 明 治 大 学 生 田 キ ャ ン パ ス）「ジ ュ ニ ア 農 芸 化 学 会2014」 で 発 表 さ れ た も の で あ る． 香 料 と し て な じ み 深 い バ ニリンの突然変異抑制作用に注目し，酵母を用いてそのメカニズムを解析している．身近な食品による発がん抑制の可能性を探ったたいへん興味深い研究であった．

本研究の背景・目的，方法，結果および考察【背景・目的】の不安定性に対して，バニリンがどのように作用するかを出芽酵母（）をモデルとして用いて検証した．
【方法】
実験 1.

1 倍体酵母YAS106 を用いた点突然変異の検出①酵母 YAS106 を YPD 液体培地において 30°C で 3 日間培養した．
②①に DNA 酸化損傷を誘発する H2O2，およびバニリン

がんは日本国民の主要な死亡要因の一つであり，秋田を加え，30°C で 3 時間培養した．

県をはじめとする東北地方では，がん死亡率が毎年上位③それを適当な希釈率で YPD 寒天培地とカナバニン含である．突然変異はがんの原因の一つであり，われわれ有最少寒天培地（SC 寒天培地）にまいた．

は，突然変異を抑制する物質の探索を通して，日本国民④ 30°C で 3 日培養した後，生えてきたコロニー数を数の健康の維持増進に貢献したいと思い，本研究を着想しえて生菌数を測定した．

た．われわれは，食品に使われる香料に着目し，香料の⑤生菌数の割合を H2O2 非処理時を 1.0 として求めた．ま中から突然変異を抑制する機能をもつものを発見し，香た，カナバニン耐性をもたらす点突然変異（本稿では一りを楽しむのと同時に健康の維持増進を実現することを塩基置換のほか，フレームシフト変異も含める）の頻度研究の目的とした．

を，（カナバニン含有 SC 培地のコロニー数）／（YPD 寒バニラの香りの主成分であるバニリンは代表的な香料の一つである．バニリンは大腸菌を用いたエームス試験において突然変異抑制効果が認められており，これは天培地のコロニー数）として求めた．
実験 2.

2 倍体酵母YAS3001 を用いた相同染色体間の組換えと染色体喪失の検出

DNA 修復系の中でも組換え修復によるものであること①酵母菌 YAS3001 を YPD 液体培地において 30°C で 2 日が示唆されている（1, 2）．また，チャイニーズハムスター間培養した．

細胞において紫外線や X 線による突然変異の抑制が認②①を H2O2，バニリンとともに 30°
C で 3 時間培養した．

められ，マウスにおいてエチルニトロソウレアによる突③それを適当な希釈率で YPD 寒天培地とカナバニン含然変異の抑制が認められている（3）．変異原によって誘発有 SC 寒天培地にまいた．

される染色体異常の頻度を哺乳動物細胞において減少さ④ 30°C で 2 日培養した後，生えてきたコロニー数を数（1）せることも報告されている ．
本研究では，DNA 酸化損傷による突然変異やゲノム化学と生物 Vol. 52, No. 12, 2014

えて生菌数を測定した．
⑤生菌数の割合を H2O2 非処理時を 1.0 として求めた．ま843

た，LOH（Loss of heterozygosity）頻度を，（カナバニ10

1.0E-02-2ン含有 SC 培地のコロニー数）／（YPD 寒天培地のコロ

YAS106+DMSO
point mutation

ニー数）として求めた．
-3
1.0E-0310⑥カナバニン含有培地に生えたコロニーを YPD 寒天培

YAS106+バニリン7.0μM
point mutation

地とリシンを含まない SC 寒天培地にレプリカし，30 Cで 2 日間培養した．YPD 寒天培地上でのコロニーの色（Ade＋酵母：白，Ade−酵母：赤），およびリシンを含
ま な い SC 寒 天 培 地 上 で の 生 育 の 有 無 を 指 標 と し て，

YAS3001+DMSO
recombination-41.0E-04
頻 10度

Ade＋Lys＋，Ade＋Lys−，Ade−Lys−に分類し，それぞYAS3001+バニリン7.0μM
recombination
YAS3001+DMSO
chromosome loss

-5
1.0E-05
10れの割合と LOH 頻度の積を算出し，出現頻度を求めた．

YAS3001+バニリン7.0μM
chromosome loss

⑦ Ade＋Lys＋のコロニーに対して PCR 法を用いて染色-61.0E-06
10体の構造を調べ，Point mutation と Gene conversion を判別した．

0100 200 300 400 500

H2O2濃度[μM]【結果および考察】
実験 11 倍体酵母 YAS106 で H2O2 とバニリン処理時の生菌数

図 1 ■ 1 倍体酵母での点突然変異頻度と 2 倍体酵母での相同染色体間の組換えと染色体喪失の頻度の割合，点突然変異頻度を調べた．突然変異体の検出に用いたカナバニンは，アルギニンの類似物質であり，ア有無を 1 倍体酵母で調べることは困難であるため，2 倍ルギニン代謝系に取り込まれることにより，酵母の生育

体 酵 母 YAS3001 を 用 い て そ の 可 能 性 を 検 討 し た．

を阻害する．しかし，

YAS3001 は，遺伝子が（+/−）のヘテロ接合体た酵母では，カナバニンを取り込まなくなり，カナバニであり，これが（−/−）となる，すなわちカナバン耐性となる．われわれは YPD 培地とカナバニン含有ニン感受性がカナバニン耐性へと変わる過程を解析し培地に生えてきたコロニー数をそれぞれ計測して，生菌た．YAS3001 では，遺伝子を含む領域での相同数の割合と突然変異頻度を算出した．

染色体間の組換えや，遺伝子を含む染色体の脱遺伝子に突然変異が起こっ生菌数の割合を H2O2 を添加しないとき（0 μM）を 1.0

落，遺伝子の点突然変異によって，遺伝子として求めると，バニリン非添加時には 500 μM の H2O2が（+/−）→（−/−） ま た は（−/o） へ と 変 化 す る．

によって 0.17 まで減少したのに対して，バニリン添加時

YAS3001 のには生菌数の減少は見られなかった．これより，DNAデニン合成にかかわる酸化損傷に起因する細胞死の抑制にバニリンが関与してわるいることが示唆された．

るため，これらの要求性を調べることにより，遺伝子を含む染色体の両末端にはア遺伝子とリシン合成にかか遺伝子が染色体マーカーとして挿入されてい遺YAS106 は相同染色体をもたないので，点突然変異し伝子が（+/−）→（−/−）または（−/o）へと変化したか検出されない．バニリン非添加時には 500 μM の H2O2ときに，相同染色体間での組換えが起こったかどうかをによって点突然変異頻度が自然突然変異に比べて 100 倍明らかにできる（図 2）．すなわち，カナバニン耐性か上昇するが（図 1 □），バニリン添加時は，点突然変異

つ Ade＋，Lys＋であれば Point mutation（遺伝子頻度の上昇は 3 倍に抑えられた（図 1 ■）．よって，バニ内の点突然変異）または Gene conversion（

遺伝

リンが H2O2 による点突然変異を抑制していることがわ子を含むごく狭い範囲での鎖の交換）が起こったと考えかった．一方，自然 DNA 損傷（H2O2 無添加）についてられる．このとき，はバニリンによる点突然変異抑制効果は見られなかっ行 い，Point mutation の 入 っ た

た．

1.5 kb の DNA 断片と実験 2断片の両方が増幅されれば Point mutation が起こったも実験 1 より，バニリンの作用としては，のと分類し（図 2a），遺伝子の周辺領域で PCR を遺伝子を含む⊿を含む領域の 0.8 kb の DNA⊿を含む領域の 0.8 kb の DNA① DNA 酸化損傷自体が生じるのを抑制している．

断片のみが増幅されれば Gene conversion が起こったも② DNA 酸化損傷が生じたときに，組換え修復を活性化の（図 2b） と 判 断 し た． カ ナ バ ニ ン 耐 性 か つ Ade＋，させ，損傷を正常に復帰させる．

Lys−であるならば，Allelic crossover（という 2 つの可能性が考えられる．組換え修復活性化の含む染色体末端領域での鎖の交換）が起こったものと判

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遺伝子を

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YAS3001
ADE2[Canｓ]

CAN1can1⊿

LYS2[Ade+ Lys+][ CanR][ CanR]

LOH(Loss of heterozygosity)[ CanR][CanR]ｖ[Ade+ Lys+][Ade- Lys-][Ade+ Lys+][Ade+ Lys-]a) Point mutation b) Gene conversion c) Allelic crossover d) Chromosome loss

図 2 ■ 2 倍体酵母における LOH の過程と生じた細胞の分類断した（図 2c）．カナバニン耐性かつ Ade−，Lys−であ誘発物質に対しては突然変異抑制効果が期待できる．まるならば，Chromosome loss（正常遺伝子を含むた，食品の酸化防止剤としての利用価値もあると考えら相同染色体の一方の喪失）が起こったものと判断した

れる．一方で，自然突然変異の抑制効果はないことがわ（図 2d）．図 2 の a〜d の各現象の頻度は，カナバニン耐かった．過剰な期待をせず，適量で香りとともに食を楽性になった頻度（LOH 頻度）×各現象の起こった割合にしむことを第一に考えるべきである．

よって算出した．

今後は，同様の実験をほかの香料や食品成分に関してどの実験区でも Point mutation（図 2a）は検出されなも行い，突然変異を抑制する物質，特に DNA 修復系をかった．相同染色体間での組換え（図 2b と図 2c）につ活性化したり，染色体異常を抑制する物質を探索していいては，自然 DNA 損傷（H2O2 無添加）の場合，3.3×くことで，人の健康の維持増進に貢献していきたい．

−410の頻度で検出され（図 1 △），バニリンを添加して−4

本研究は東北地方の課題である「がん」に生徒が興味とその頻度はほとんど変わらなかったことをもち，調べていくうちにエームス試験を探し当て，高から（図 1 ▲），バニリンは相同染色体間での組換えを校の生物実験室でも実施可能な実験であるとして，自ら促進しないことがわかった．H2O2 単独処理では，図 2b提案してきたことと，「香料」への興味も加わったことと図 2c の合算である相同染色体間での組換え頻度は増で始まった研究である．何かに興味を抱くことができる

も 4.0×10−3加 し，500 μM の H2O2 処 理 で は 10 倍（4.4×10 ） とことと，興味をもったことについて調べ，妥当な検証方なったが（図 1 △），H2O2 とバニリンの同時処理では相法を選択し，地道に検証を続けていけるというのは研究

同染色体間での組換えの上昇は見られなかった（図 1

者として重要な素養である．未来の農学・生命科学を支▲）． 一 方， 染 色 体 喪 失（図 2d） に つ い て は， 自 然える研究者となるであろう彼女たちの最初の第一歩と−4

DNA 損 傷（H2O2 無 添 加） の 場 合，1.4×10の頻度で見られるが，H2O2 単独処理によってその頻度は増加し，−3500 μM の H2O2 処 理 で は 10 倍（1.5×10 ） と な っ た（図 1 ○）．しかし，H2O2 とバニリンの同時処理では染色体喪失の上昇も見られなかった（図 1 ●）．
以上のように，バニリンは DNA 酸化損傷による点突然変異を抑制し，相同染色体間での組換えや染色体喪失も引き起こさないことがわかった．

本研究の意義と展望
バニリンは抗酸化作用により外因性の DNA 酸化損傷

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なった研究であるという意味でもたいへん意義のある研究である．
謝辞：本研究は，科学技術振興機構「中高生の科学部活動振興プログラム」の支援を受けて行っています．この場を借りて御礼申し上げます．

文献1) Y. Kuroda & T. Inoue:, 202, 387 (1988).
2) T. Ohta, M. Watanabe, Y. Shirasu & T. Inoue:, 201, 107 (1988).
3) H. Imanishi, Y. F. Sasaki, K. Matsumoto, M. Watanabe,T. Ohta, Y. Shirasu & K. Tutikawa:, 243, 151(1990).

（文責「化学と生物」編集委員）

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