動物細胞や組織からの RNA 抽出キット

ISOSPIN Cell & Tissue RNA
マニュアル（WEB 版）
Ver.1-2409

Code No. 314-08211

NIPPON GENE CO., LTD.

I

製品説明

ISOSPIN Cell & Tissue RNA（アイソスピン セル アンド ティシュー アールエヌエー）は、動物培養細胞や動物組織から RNA を抽出・精製するためのキットです。
本キットは、カオトロピックイオン存在下で RNA がシリカへ吸着する原理を応用しており、フェノールやクロロホルムを使用しません。使用するスピンカラムは、カラム容積を最大限確保しており、内封されたシリカゲル膜は、充分な RNA 吸着容量と高い溶出効率を確保しています。
本キットでは、夾雑物を遠心分離により除去する方法とシリカゲル膜上での DNase I 処理を採用しており、約 1 時間で高純度の RNA を抽出・精製できます。

II キット内容
キット内容品

容量（50 回用）

備考

PT Extraction Buffer（組織用）

30 ml × 1 本C Extraction Buffer（細胞用）

30 ml × 1 本

PT Binding Buffer（組織・細胞用）

40 ml × 1 本

エタノール含有PT Wash1 Buffer

40 ml × 1 本

エタノール含有（洗浄液）

PT Wash2 Buffer

40 ml × 1 本

エタノール含有（洗浄液）

DNase I (RNase free)

2,000 units × 1 本

10×DNase I Buffer

1 ml × 1 本

ddWater (RNase free)

1 ml × 8 本

Spin Column

50 本 × 1 袋

III

DNase I 溶液調製用・溶出用
上部パーツ：カラム
下部パーツ：Collection Tube

保存・ DNase I (RNase free)

冷凍保存（－20℃）

・ 上記以外の試薬と Spin Column

室温保存※エタノール含有の PT Binding Buffer（組織・細胞用）、PT Wash1 Buffer、PT Wash2 Buffer
をご使用後は、蒸発を防ぐため速やかに蓋を閉め、保管して下さい。

1

IV 使用上の注意・ 本品は、試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。
・ 試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないで下さい。
・ 本品の取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行って下さい。
・ マニュアル記載内容と異なった取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。
・ 安全性データシート（SDS）は、ニッポンジーンホームページよりご覧になれます。
https://www.nippongene.com/siyaku/list.html

V プロトコール
全ての遠心操作は 4℃で行って下さい。
＊ただし、4℃冷却できない場合は室温（25℃）での遠心も可能です。

＜キット以外に必要なもの＞
・遠心分離機（4～25℃）
・マイクロピペット
・ピペットチップ・ペッスル注）・1.5 ml マイクロチューブ注）注）効率よく組織を破砕できるようにチューブの形状に応じたペッスルをご使用ください。

＜必要に応じて別途用意するもの＞
・液体窒素

2

＜動物培養細胞用抽出プロトコール＞
最大 6×106 細胞から培養液などは可能な限り除去し、必要に応じて PBS①等で軽く洗浄する。
注）1×104 個など少ない細胞数から抽出する場合は、精製プロトコール⑪で添加する溶出液の量を減らして RNA の濃度を調整する。

600 µl の C Extraction Buffer（細胞用）を加え、ピペッティングで細胞を溶②解する。
注）細胞全体に直接 C Extraction Buffer (細胞用) をマイクロピペットでふりかけ、細胞が溶けて粘性の高い液体状になるまでピペッティングする。
注）はがれにくい接着細胞の場合は、C Extraction Buffer (細胞用) を加えた後、溶解しやすくなるようセルスクレーパーで細胞をはがし集める。
注）遠心で回収した細胞がペレット状になっている場合は、タッピング等でペレットをほぐしてから C Extraction Buffer (細胞用) を加える。

溶解した細胞を含む溶液を全量 1.5 ml マイクロチューブへ移し替え、30 秒③間以上ボルテックスする。
注）はじめから 1.5 ml マイクロチューブを使用していた場合は、移し替えは省略してそのまま進める。
注）ボルテックスの不足は Spin Column の目詰まりにつながるので確実に行う。

遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、上清を新しいマイクロチューブに回収する。
注）細胞数や細胞の種類によっては沈殿が見えない場合がある。
注）沈殿が見えない場合は、上清を全量回収する。

④

上清に等量の PT Binding Buffer（組織・細胞用）を加えて、数回転倒混和する。混合液を軽くスピンダウンする。
例）上清 550 µl の場合は 550 µl の PT Binding Buffer（組織・細胞用）を添加する。

↓⑤

メンブレンに RNA を吸着させるため、600 µl の④の混合液を Spin Columnに添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
注）Spin Column のカラムを外し、Collection Tube の中のろ液を捨てた後、カラムを同じCollection Tube の上に戻す。(以降、「ろ液を捨てる」は同様)⑥

残りの④の混合液を Spin Column に全量添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓3⑦500 µl の PT Wash1 Buffer を Spin Column に添加する。
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）し、ろ液を捨てる。
注）⑦のろ液を捨てる操作は省略することができる。

↓⑧

1.5 ml マイクロチューブに以下の試薬を加えて、DNase I 溶液 100 µl を調製する。
10×DNase I Buffer

10 µl

DNase I (RNase free)

30 units

ddWater (RNase free)

up to 100 µl↓
用事調製した 100 µl の DNase I 溶液を Spin Column に添加し、静置（15 分間、室温）する。

↓⑨300 µl の PT Wash1 Buffer を Spin Column に添加する。
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓⑩

洗浄のため 600 µl の PT Wash2 Buffer を Spin Column に添加する。
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）する。ろ液と Collection Tube を捨てる。
↓⑪

Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上にのせる。
RNA を溶出させるため、50 µl の ddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
注）溶出液量を減らしてもよいが、20 µl より減らさない。

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。
RNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される。

4

＜動物培養細胞用簡易プロトコール＞
動物培養細胞試料（≦6×106 cells）
600 µl の C Extraction Buffer（細胞用）を添加し、ピペッティングで細胞を溶解
ボルテックスで 30 秒間以上激しく攪拌
遠心（13,000×g、10 分間、4℃）
上清を回収
上清と等量の PT Binding Buffer（組織・細胞用）を添加し、転倒混和混合液 600 µl を Spin Column に添加（2 回に分けて全量添加）
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる
残りの混合液を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる
DNase I 溶液（用時調製）全量 100 µl
500 µl の PT Wash1 Buffer を添加

・ ddWater (RNase free)

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）

・ 10 x DNase I Buffer

10 µl

ろ液を捨てる・ DNase I (RNase free)

30 units

用事調製した 100 µl の DNase I 溶液を添加
室温静置 15 分間300 µl の PT Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる600 µl の PT Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）
Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す
50 µl の ddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下
室温静置 3 分間
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
RNA 溶液5

＜動物組織用抽出プロトコール＞①

最大 20 mg までの新鮮な動物組織または凍結組織を 1.5 ml マイクロチュー
ブに採取する。
注）
・採取した組織は速やかに液体窒素中で凍結させるか、すぐに②の処理に進む。
・試料量が少ない場合は、精製プロトコール⑪で添加する溶出液の量を減らしてRNA の濃度を調整する。
・RNase の活性を抑制するため、秤量は氷冷しながら速やかに行うか、マイクロチューブにあらかじめ PT Extraction Buffer（組織用）を入れておく。

↓②

試料に 600 µl の PT Extraction Buffer（組織用）を加え、直ちにペッスルですり潰す。試料が液中で浮遊する場合、スピンダウンするとすり潰しやすくなる。
注）ホモジナイズの不足は低収量につながるので念入りにすり潰す。

③

30 秒間以上ボルテックスする。
注）ボルテックスの不足は Spin Column の目詰まりにつながるので確実に行う。

遠心（13,000×g、10 分間、4℃）し、上清を新しいマイクロチューブに回収する。
注）・脂質を多く含む試料は液表面に油分が浮遊していることがあるので、なるべく取らないようにする。
・析出物を多く含む場合は回収した上清を再度、遠心（13,000×g、10 分間）し、上清を回収する。

④

上清に等量の PT Binding Buffer（組織・細胞用）を加えて、数回転倒混和する。軽くスピンダウンする。
例）上清 550 µl の場合は 550 µl の PT Binding Buffer（組織・細胞用）を添加する。

↓メンブレンに RNA を吸着させるため、600 µl の④の混合液を Spin Column④に添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
注）Spin Column のカラムを外し、Collection Tube の中のろ液を捨てた後、カラムを同じ Collection Tube の上に戻す。(以降、「ろ液を捨てる」は同様)⑥

残りの④の混合液を Spin Column に全量添加し、遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。ろ液を捨てる。
↓6⑦500 µl の PT Wash1 Buffer を Spin Column に添加する。
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）し、ろ液を捨てる。
注）⑦のろ液を捨てる操作は省略することができる。

↓⑧

1.5 ml マイクロチューブに以下の試薬を加えて、DNase I 溶液 100 µl を調製する。
10×DNase I Buffer

10 µl

DNase I (RNase free)

30 units

ddWater (RNase free)

up to 100 µl↓
用事調製した 100 µl の DNase I 溶液を Spin Column に添加し、静置（15 分間、室温）する。

↓⑨300 µl の PT Wash1 Buffer を Spin Column に添加する。
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）し、ろ液を捨てる。
↓⑩

洗浄のため 600 µl の PT Wash2 Buffer を Spin Column に添加する。
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）する。ろ液と Collection Tube を捨てる。
↓⑪Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上にのせる。
RNA を溶出させるため、50 µl の ddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下した後、3 分間室温で静置する。
注）溶出液量を減らしてもよいが、20 µl より減らさない。

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）する。
RNA 溶液が 1.5 ml マイクロチューブの中に回収される。

【補足】改変プロトコールについて
心臓、骨格筋組織などは通常プロトコールでは RNA 抽出が困難です。Proteinase K を用いる改変プロトコールをお試し下さい（ニッポンジーンホームページ参照）。

7

＜動物組織用簡易プロトコール＞
動物組織試料（≦20 mg）
600 µl の PT Extraction Buffer（組織用）を添加
PT Extraction Buffer（組織用）中でペッスルを用いて試料をよくすり潰し、ボルテックスで 30 秒間以上激しく攪拌
遠心（13,000×g、10 分間、4℃）
上清を回収
上清と等量の PT Binding Buffer（組織・細胞用）を添加し、転倒混和混合液 600 µl を Spin Column に添加（2 回に分けて全量添加）
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる
残りの混合液を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる
DNase I 溶液（用時調製）全量 100 µl
500 µl の PT Wash1 Buffer を添加

・ ddWater (RNase free)

遠心（13,000×g、1 分間、4℃）

・ 10 x DNase I Buffer

10 µl

ろ液を捨てる・ DNase I (RNase free)

30 units

用事調製した 100 µl の DNase I 溶液を添加
室温静置 15 分間
300 µl の PT Wash1 Buffer を添加
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
ろ液を捨てる600 µl の PT Wash2 Buffer を添加
遠心（13,000×g、2 分間、4℃）
Spin Column のカラムを新しい 1.5 ml マイクロチューブの上に移す
50 µl の ddWater (RNase free)をメンブレン中央に滴下
室温静置 3 分間
遠心（13,000×g、1 分間、4℃）
RNA 溶液8

VI

トラブルシューティング

トラブル

原因と対策

低収量

サンプルのホモジナイゼーションが不十分または溶解を速やかに行わないと操作中に RNA 分解が進む。組織の摘出を素早くすることと効果的にホモジナイズすることが重要である。

RNA の分解

新鮮な試料を採取後、すぐに Extraction Buffer 中でホモジナイズする。または速やかに液体窒素で凍結させる。
凍結試料は－70℃以下で保存する。
RNA 溶解用の溶液やチューブは、RNase フリーのものを使用する。

DNA の混入最終産物の DNase 処理を行う。DNase 処理を行ったサンプルはプロトコールの最初から行うことで精製することができる（この時メンブレン上でのDNase 処理 ⑧ は不要）。

吸光値のばらつき

低純度である。多糖類などの夾雑物が混入している。トラブル「低純度」および「夾雑物の混入」の対策を参照。

低純度

Extraction Buffer に対してサンプルが多すぎると夾雑物の除去が不十分となるので、サンプル量を半分に減らすか、または添加する Extraction Buffer の量を 2 倍に増やす。

夾雑物の混入上清を再度、遠心（13,000×g、10 分間、4℃）して、油分や不溶物を除去する。

上記の対策を行っ

心臓、骨格筋組織、軟骨などは硬く繊維等も多いため、通常プロトコールでても解決しないは RNA 抽出が困難です。Proteinase K を用いる改変プロトコールをお試し下さい（ニッポンジーンホームページ参照）。

9VII データ
＜製品性能＞RNA 吸着容量

100 µg

カラム容量900 µl＜RNA の収量の目安＞
試料

収量の目安

HeLa 細胞15 µg RNA/106 cells

Jurkat 細胞

10 µg RNA/106 cells

Vero 細胞15 µg RNA/106 cells

マウス脳

1.0 µg RNA/mg tissue

マウス肝臓

3.5 µg RNA/mg tissue

マウス腎臓

3.0 µg RNA/mg tissue

マウス精巣

1.5 µg RNA/mg tissue＜RNA の吸光スペクトル＞
0.12
マウス脳0.1

マウス肝臓

Abs

0.08

マウス腎臓
マウス精巣

0.06
0.04
0.02
0220240260
280
Wavelength (nm)

10300

320

VIII 関連製品
製品名Code No.

包装単位318-90105

Distilled Water, Deionized, Sterile

500 ml

314-08071

DNase I (RNase free)

2,000 units

315-08121

RNase Inhibitor

2,000 units

マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課
TEL
URL076 - 451 - 6548
https://www.nippongene.com/siyaku/

お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております。

ISOSPIN Cell & Tissue RNA マニュアル（WEB 版）Ver.1-2409_4th edition:201508-201709

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