茗溪学園高等学校
繁森有紗（顧問：鈴木朋子）

日本農芸化学会

ネジバナと菌根菌の関係を探る
ネジバナの種子を発芽させるにはどうすればよいだろうか
本 研 究 は， 日 本 農 芸 化 学 会 2017 年 度 大 会（開 催 地： 京 都 女子大学）の「ジュニア農芸化学会」で発表された．菌根菌は植 物 と 共 生 す る 菌 類 で ， 陸 上 植 物 の 80 ％ 以 上 と 共 生 関 係 に●あ る． 本 研 究 は， 菌 従 属 栄 養 植 物 で あ る ラ ン 科 の ネ ジ バ ナ（） の 種 子 が， そ の 発 芽 に 必 要 な 菌 根 菌と 共 生 す る イ ネ 科 の オ ヒ シ バ（）の側で発芽 し て 生 育 し た こ と を 植 生 調 査， 発 芽 試 験， 菌 根 菌 同 定 と化学と生物

い っ た 実 験 で 提 示 し， 菌 根 菌 を 介 し た 植 物 間 コ ミ ュ ニ ケ ーションを示したものである．

1.

植生調査
茨城県つくば市の赤塚公園内 47 地点で植生調査を行った．調査地点において 1 m2 内に 1〜4 本ネジバナが存在していた地点を単生地，5 本以上存在していた地点を群生地とした．調査地点では，単生地においても群生地においても 1 本のネジバナを中心に 30×30 cm2 の方形枠を置き，枠内の植物の被度を調査し，種別の優占度を求めた．優占度の算出方法は次式のとおりである．
①被度の相対値は，オヒシバの被度合計を 10 として計算．
（被度の相対値）＝（被度合計）×10／（オヒシバの本研究の目的・方法および考察【目的】
菌従属栄養植物は菌根菌がいないと有機物合成や発芽ができない．そのため，菌根菌に共生してもらい，菌根菌に有機物を作ってもらって生きている (1)．菌従属栄養植物の一種であるネジバナの種子は，翼部分を除くと長径が 0.15〜0.20 mm と非常に小さく，発芽に必要な栄養分をもっていない．そのため，ラン菌（ラン科植物に寄生する菌根菌）が寄生しないと発芽できない (2)．以上の背景から，ネジバナがどのような環境に生息しているのかを調査し，ネジバナ種子を発芽させる能力のある菌根菌を見つけ出し，ネジバナの発芽条件を明らかにすることを目的とした．
【方法】
第一に，植生調査を行い，ネジバナの生息地と周辺の植物との関係を調べた．第二に，植生調査よりネジバナとの関係性が高いと考察された植物から菌根菌を単離してネジバナ種子の発芽試験を行い，その菌がネジバナ種子を発芽させることに関与しているかを調べた．

被度合計）②頻度の相対値は，調査区数を 10 として計算．
（頻度の相対値）＝（出現した区画数）
×10／（調査区数）③①と②用いて優占度を計算．
（優占度）＝①（被度の相対値）＋②（頻度の相対値）
2.

菌の単離
植生調査の結果，群生地での優占度が第1 位と第 2 位のオヒシバとウラジロチチコグサを，ネジバナが生息していない地域から採取した．オヒシバは茗溪学園の第二食堂前で，ウラジロチチコグサは赤塚公園で採取した．採取したオヒシバとウラジロチチコグサの根から菌を分離した．
①根をよく洗い，根の先端 5 mm を切り取った．
②マイクロチューブに切った根を入れ，無菌水 1 mL を加え混和した後，5,600×g で 2 分遠心分離を行い，上清を取り除いた（2 回繰り返す）．
③ 1 M の次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素 0.5％）1 mLを加え 2 分間混和した後，5,600×g で 2 分遠心分離を行い，上清を取り除いた．
④無菌水 1 mL を加え混和した後，5,600×g で 30 秒遠心分離を行い，上清を取り除いた．この作業を 4 回繰り

化学と生物 Vol. 55, No. 12, 2017841

返した後，最後に無菌水を 1 mL 加えた．の条件下で第1 位であり，その優占度合計に対する優占度⑤表面殺菌をした根を，グルコースを除いたポテトデキストロース培地（PDA 培地）に接種した．の割合は，単生地16.6％に対して群生地は17.6％と高くなっている．全体での優占度の順位が高いオオバコとカタ⑥ 25 C 明所で 1 週間培養した後，発生した菌糸を白金耳

バミは，群生地では優占度の順位が下がる．反対にウラで掻き取り別の培地に植え替えることを繰り返した．

ジロチチコグサ，タチハイゴケ，ニワゼキショウは全体で発芽試験の優占度の順位は高くはないが群生地において高くなる．

3.

ネジバナの種子を殺菌して播種した (3) 後，オヒシバと以上より，ネジバナの生育環境と関係のある植物はオウラジロチチコグサから単離した菌根菌を接種して発芽

ヒシバ，ウラジロチチコグサ，タチハイゴケ，ニワゼキ試験を行った．ネジバナ種子が共生発芽する菌根菌の一ショウの 4 種の可能性がある．

種であるをポジティブコントロール

2.

①種子（0.1 mL 容）に無菌水 1 mL を加え混和した後，3.

オヒシバとウラジロチチコグサの根から菌が採取できた．

として用いた．

日本農芸化学会●

発芽試験
発芽試験の結果を図 1 と表 2 に示す．

5,600×g で 2 分遠心分離を行い，上清を取り除く作業の培地では種子が発芽したが，菌を接種していなを 2 回繰り返した．
② 1 M の次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素 0.5％）1 mLいネガティブコントロール培地では種子の肥大も見られを加え 2 分間混和した後，5,600×g で 2 分遠心分離をなかったことから，菌根菌が存在していることがネジバ行い，上清を取り除いた．

ナ種子の発芽条件であると考えられた．また，オヒシバ③無菌水 1 mL を加え混和した後，5,600×g で 30 秒遠心から単離した菌の一種にポジティブコントロールと同様分離を行い，上清を取り除いた．この作業を 4 回繰りの発芽率を示すものがあったが，ウラジロチチコグサか返した後，最後に無菌水を 1 mL 加えた．

ら単離した菌では発芽しなかった．このことから，ネジ④マイクロピペットを使いオートミール培地に殺菌種子ことがわかった．
菌根菌の同定4.

る寒天培地を 5 mm 角に切って接種した．
菌根菌の同定4.

バナ種子を発芽させることのできる菌根菌は，オヒシバの根には生息しているがウラジロチチコグサにはいない混濁液を 100 µL 播種した．
⑤ 25 C 暗所で 1 週間培養したのち，菌根菌を培養してい化学と生物菌の単離オヒシバの根から単離された菌は，①実験に使用したオヒシバの菌根菌をPDA 培地で培養した．

sp. と，5.8S を 含 む rDNA ITS 領 域 に お い て 100％，② PCR により，核 rDNA 遺伝子の転写領域内部スペンrDNA LSU（28S）領域において 99％一致した．よっサー（ITS）領域と核 rDNA 遺伝子の大サブユニットて，この菌は，ハラタケ綱アンズタケ目ツノタンシキン（LSU）領域を増幅した（4）．

科ツノタンシキン属に属していると考えられた．
は，③ダイレクトシークエンス（国立科学博物館保坂健太郎

門に分類される代表的な 5 属の一つである (5)．また，ネ先生に委託）を行い，塩基配列を決定した．

ジバナの菌根菌として既知である④ NCBI の GenBank で BLAST 検索を行った．
【結果】とは ITS 領域において 0.5％，

植生調査

1.

属菌の有性世代で担子菌亜とは ITS 領域において 2％，LSU（28S）領域に結果は表 1 に示す．オヒシバの優占度の順位は，すべておいて 2.5％異なる塩基配列を示したため，別種の菌根表 1 ■ 赤塚公園における植生調査結果（優占度上位 10 位まで）
全体

群生地

単生地

順位

植物名

優占度

植物名

優占度

植物名

優占度

12345678910

オヒシバ
オオチドメ
オオバコ
カタバミ
タチハイゴケウラジロチチコグサ
シロツメクサニワゼキショウ
ハルジオン
スズメノヤリ

17.4
8.5
8.2
7.6
76.4
4.5
4.4
3.9
3.3

オヒシバ
ウラジロチチコグサ
タチハイゴケオオバコ
ニワゼキショウ
オオチドメ
カタバミ
ハルジオン
シロツメクサ
ササガヤ

18.2
8.4
8.3
7.2
7.2
6.5
4.7
443

オヒシバ
オオチドメ
カタバミオオバコ
タチハイゴケスズメノヤリウラジロチチコグサ
シロツメクサ
ハルジオン
ヘビイチゴ

179.7
9.4
8.96.2
5.4
5.1
4.7
3.93.8

合計

842102.7103.3

102.4

化学と生物 Vol. 55, No. 12, 2017

日本農芸化学会

図 1 ■ ネジバナ種子の肥大
A. ネジバナ種子の長径の変化．B. ネジバナ種子の短径の変化．C. ネジバナ種子の肥大傾向（顕．
微鏡下 160 倍で撮影，バーは 100 μm を表す）

発芽という 2 つの事実がつながったところに，本研究の化学と生物●

表 2 ■ ネジバナの発芽率
接種菌

発芽数

総種子数

発芽率（％）

オヒシバ菌
ウラジロチチコグサ菌

370390164
216250457

22.6015.60

菌なし（コントロール）菌である可能性がある．
【考察】
植生調査の結果より，ネジバナの自生地における優占種はオヒシバとウラジロチチコグサであると考えた．この 2 種の内生菌根菌を用いた発芽試験の結果，オヒシバから単離された菌根菌にはポジティブコントロールと同様の発芽率を示すものがあった．しかしながらウラジロチチコグサから単離された菌根菌にはネジバナ種子を発芽させる能力が見られなかった．このことから，ある特定の菌根菌がいることがネジバナ種子の発芽条件の一つであることが考えられた．また，オヒシバの根にはネジバナ種子の発芽能力がある菌根菌が共生しているために，ネジバナの自生地とオヒシバの自生地が重なっているという結果が得られた可能性が考えられた．
本研究の意義と展望
本研究では，オヒシバから菌根菌を単離し，その菌の寄生によりネジバナの種子が発芽することを実証した．
ネジバナの生息地において優占度が高かった 2 つの植物に注目してネジバナとの関係性を仮定したが，マクロレ意義があると考える．すなわち風で散布されたネジバナの種子のうち，オヒシバの近くに着地したネジバナの種子が高い確率で発芽し生育するために，2 つの植物の頻度が同調するという仮説の提示である．
今後は，ウラジロチチコグサの菌根菌での追試を含め，よりさまざまな種類の菌根菌での検証実験が必要である．発芽率の比較を行い，自然界での菌根菌の寄与率が菌の種類によってどのようになっているのかを明らかにできると，なお一層自然の理解につながると考える．
謝辞：本研究は，筑波大学の藤森祥平氏，阿部淳一ピーター先生，山岡裕一先生，国立科学博物館の保坂健太郎先生に，種子と菌の提供および研究のご指導をいただきました．この場をお借りして感謝いたします．

文献1) 小川 眞編： 作物と土をつなぐ共生微生物̶菌根の生態学̶ ，社団法人農山漁村文化協会，1987.
2) 山本真紀編：「共生」に学ぶ̶生き物の知恵̶ ，裳華房，2005.
3) 植竹ゆかり： ネジバナ種子の共生発芽における 2 核
AG-C の侵入と菌毬形成 ，財団法人日本きのこセンター菌蕈研究所研究報告，28，307（1990）.
4) 糟谷大河・小林孝人・黒川悦子・H. N. D. Pham・保坂健
太郎・寺嶋芳江：日本から新たに発見された 3 種のチャツ
ムタケ属菌，日本菌学会会報，2016.
5) 荒川征夫・稲垣公治：属菌における菌糸融合群判定および集団遺伝学解析のための分子マーカー ，
日植病報，80, 81（2014）.

（文責「化学と生物」編集委員）

Copyright © 2017 公益社団法人日本農芸化学会
DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.55.841

ベルの植生の実態とミクロレベルの菌根菌による種子の化学と生物 Vol. 55, No. 12, 2017843