特集「視交叉上核発見から 50 年」

ファブ・ファイブ論文からの視交叉上核研究展開中村 渉 1,✉，高須 奈々1，中村 孝博 2
1 長崎大学大学院 医歯薬学総合研究科 加齢口腔生理学分野、2 明治大学 農学部 動物生理学研究室
今年 2022 年は哺乳類におけるサーカディアンペースメーカーとして視交叉上核が同定されてから 50年の節目にあたる。著者は視交叉上核発見 25 周年の 1997 年に、培養視交叉上核組織から生理機能活性のサーカディアンリズムを記録する手法の手ほどきを受けて時間生物学研究を開始した。はからずもその年は哺乳類の時計遺伝子フェーズ元年にあたり、時計遺伝子のクローニングに関する論文が国内外から相次いで公開された。当時、新規クローニングされた遺伝子が視交叉上核で強く発現していることが時計遺伝子として認識される必要条件となっていったことは、すでに時計中枢としての視交叉上核が確立されていたことを示している。本稿では、著者が視交叉上核研究に出会う以前に公表された 5 編の論文（ファブ・ファイブ論文： Fabulous Five Papers）を提示し、ポスト時計遺伝子世代の立場から、視交叉上核研究の展開について概説する。
1.

A Functional Analysis of Circadian Pacemakers

して、哺乳類のサーカディアンペースメーカーの実体

in Nocturnal Rodents. (1976) 1-5が同定された年代に公表されたこれらの論文を挙げる

1976 年に Journal of Comparative Physiology 誌ことにする。一連の論文では、4 系統の夜行性齧歯類；

106 巻 3 号に掲載された 5 編の論文 1-5 は総ページ数

M.auratus（ハムスター）、P.leucopus（シロアシネズ

133 頁に及ぶ。Pittendrigh と Daan によって書かれたミ）、M.musculus（ハツカネズミ）、P.maniculatus（シこの名著に対して、本稿著者の独断によりポップなカネズミ）をモデル動物に用い、輪回し行動リズムを“ファブ・ファイブ論文” に選定することはあまりにも指標として比較生理学的観点からサーカディアンリズおこがましい。しかしながら、本稿における「原点」とムの機能解析をおこなっている。解析パラメーターは

図１ 夜行性げっ歯類（4系統）のサーカディアンペースメーカー機能特性（左）恒常暗環境下における輪回し行動リズムの自由継続周期分布をヒストグラム表示している。○は系統内平均周期を示す。
（右）輪回し行動リズムの15 分光パルスに対する位相反応曲線。
文献 1,2 より引用

✉wataru_nakamura@nagasaki-u.ac.jp
時間生物学 Vol. 28, No. 2 (2022)
126

恒常環境下における自由継続周期と単発光パルスに対する位相反応性である（図１）。輪回し行動リズムの長期安定記録の特性を活用し、恒常暗（明）、重水投与、光照度、履歴効果、加齢等の要素を比較検討して“サーカディアンペースメーカー”の機能を見事に体系づけた。この論文で記述される“pacemaker”の実体は明らかにされていない。しかし、一連の論文を総括する最終 章 「 V. Pacemaker Structure: A Clock for AllSeasons」5 のなかで “The recent work6-8 leaves little
doubt that our pacemaker is neural and probably
located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of thehypothalamus.” の記述がある。本稿著者自身が視交叉上核研究を開始した 1997 年にはすでに公表されていたこれらの論文は、その後の研究において視交叉上核に関する論文をまとめるたびに読み返し、その都度目からうろこが落ちるような発見がある。本来、実験計画時点で想定しておくべきであろうが、実際に得られた実験データをもとに論文を読み返すことで解釈が深まるということは、自身の視交叉上核研究の「原点」であり「原典」と呼ぶにふさわしいといえる。
2.

Nucleus Suprachiasmaticus: The Biological
Clock in the Hamster? (1976) 9
視交叉上核の実験的破壊により、輪回し行動と飲水行動 6、副腎コルチコステロン含有量 7、松果体セロト
ニン N-アセチルトランスフェラーゼ活性 8、睡眠-覚醒リズム 10、摂食タイミング 11 等、様々な動物個体生理機能のサーカディアンリズムが消失することが報告された。とりわけ目を引くのが視交叉上核の学名（ラテン語名）を冠したこの論文 9 である。
Stetson と WatsonWhitmyre は論文の冒頭で、ハムスターにおいてよく研究されているサーカディアンリズムとして、輪回し行動・発情周期・光周性の三つの事象を挙げている。論文のタイトルが、「視交叉上核：ハムスターの生物時計なのか？」と疑問符がついており断定的ではないことも興味深い。実験的破壊によりこれらの周期性が消失することをもって視交叉上核=生物時計といってよいものか注意深く考察を加えている。それでは、そもそ
もげっ歯類では通常 4 日間周期である発情周期が「サーカディアンリズム」であるとはどういうことだろうか。雌性げっ歯類の場合、発情周期は排卵周期と一致しており、卵胞の成熟とそれに応じたエストロゲン濃度の上昇が視床下部-下垂体-性腺（卵巣）-軸の制御により排卵前黄体化ホルモン（LH）のサージ状分泌を引き起こし、4 日間の排卵周期をもたらす。Everett とSawyer は 5:00-19:00 明期/19:00-5:00 暗期の 14 時間：

時間生物学 Vol. 28, No. 2 (2022)
127

図 2 排卵を引き起こすクリティカルな「時間窓」（A）4 日性周期を示すラット卵胞の模式図。くり通常 LH サージ状分泌の時間、排卵（OV）の時間は規定されている。
（B）特定時刻のネンブタール（NBTL）処置により、その日の排卵はスキップし、翌日に持ち越される。
（C）特定時間帯（時間窓）前後に連日 NBTL 処置をおこなうことにより、排卵は生じず閉鎖卵胞となる。
文献 13 より引用

10 時間明暗サイクルで飼育した雌性ラットに対して発情前期の 14:00 にネンブタールを投与することにより、続く真夜中に排卵がなされず翌日も発情前期が継続することを明らかにした（図 2）。一方、16:00 に同様の処置を行った場合、同夜間に排卵が生じており、排卵を引き起こすためにクリティカルな「時間窓」のコンセプトを提唱している 13。さらに Sawyer らは卵巣摘出を施術した雌性ハムスターにエストロゲンカプセルを埋入し血中濃度を高値に保った場合、連続して3 日間毎日 15:00 に LH サージ状分泌が生じることを報告した。これらの結果は、性周期は卵胞成熟により十分なエストロゲン濃度に達するために必要な絶対時間（＞96 時間）で規定されると共に、生物学的な１日の時刻依存的な「タイミングシグナル」が排卵前 LH サージ状分泌をトリガーしていることを示している 14。
また Fitzgerald と Zucker は、恒常薄明下における雌ハムスターは、輪回し行動の自由継続周期が延長するのに伴い、発情周期は輪回し行動開始位相と一定の位相角差を維持しながらサーカディアン Day ×４サイクル（＞96 時間）の周期性を示すことを報告した。この発情行動開始と輪回し行動との位相角差は、飲水中の重水投与により自由継続周期を延長させた場合も維持されており、複数のサーカディアン振動体による共役制御が示唆される 15。光周性動物である雌性ハムスタ

ーは、恒常暗環境下で光感受性位相に光入力が得られ側に局在する LH-RH 含有神経細胞の活動亢進が明らない場合、性周期が消退し膣上皮組織像は発情休止期かになった 21。これらを統合して考察すると、輪回しに固定される。一方、視交叉上核破壊による性周期消行動の E 要素と M 要素とをそれぞれ駆動するペース退後の膣上皮組織像は角化上皮細胞が顕著な発情期にメーカー、HPG-axis 「時間窓」位相をセットする振動固定された。この論文では 9、さらなる検証が必要であ体、そして「タイミングシグナル」を出力する振動体、ると断った上で、視交叉上核はハムスターの「生物時いずれの機能的振動体は片側単一の視交叉上核に内包計」であると結論している。

されていると考えられる 18。行動リズム Splitting の二つの行動要素が反対位相で安定するまでには、E 要素

3.

Multiple Circadian Oscillators Regulate theと M 要素とが乖離していく移行期間が認められる。移Timing of Behavioral and Endocrine Rhythms

行期間中に左右の視交叉上核はそれぞれ E 要素と M

in Female Golden Hamsters (1985)

16

要素との位相関係に同調して再構成され、特定の位相雌性げっ歯類におけるサーカディアンペースメーカ関係で安定する 5。実験的な恒常明条件下とはいえ、左、輪回し行動、そして性周期を関係づー（視交叉上核）

右一対の神経核が交互に活性化し、それぞれが生体レけるうえでユニークな実験結果を提示するのがこの論ベルで生理機能を制御する、あまりにも美しい事象と文である。Swann と Turek は雌性ハムスターを長期間いえよう 16。

恒常明環境下におき輪回し行動が反対位相で二度生じる “Split”した状態にあるとき、LH サージも 1 日に二4.

Aging alters the circadian rhythm of glucose

度起きる Split Surge を呈することを報告した 16。これ

utilization in the suprachiasmatic nucleus

以前に Turek らは輪回し行動 Splitting ハムスターの(1988) 22

片側視交叉上核を破壊することによって、一方の輪回

前述のとおり、HPG-axis の性周期制御に視交叉上核し行動リズム構成要素が消失し、単相行動リズムに収の神経性タイミングシグナルが不可欠であることがわlaかっていた。Wise らは雌性ラットにおいて中年期閉経

Iglesia らは行動 Splitting 時の視交叉上核冠状断組織への移行期間に生じがちな性周期不整が、加齢にとも切片を作成して時計遺伝子の発現を検証したところ、なう視交叉上核の機能変容に起因している可能性につ左右の視交叉上核に偏在する概日リズムを明示した 18。

いて検証した 22。14 時間：10 時間明暗サイクル下（明行動リズムの Splitting 現象はサーカディアンペース

期 4:00-18:00）で飼育した雌性ラット若齢群（3-4 カ月束することを明らかにしていた17 。さらに、deメーカーを構成する Evening (E) 振動体と Morning齢）と中年群（12-14 カ月齢）の LH サージを比較する(M) 振動体との相互共役で説明される 5。ややもするとと、若齢群では 17:00-19:00 付近に平時の 10 倍に達す

左右の視交叉上核がそれぞれＥ振動体とＭ振動体である LH サージが確認できるのに対し、中年群では 17:00るとの結論に至るかもしれないが、そうではなかった。に有意な血中濃度の増加が認められるものの上昇レベ

本稿著者らはラット新生仔の視交叉上核冠状断組織切ルは約 2 倍程度にとどまっていた。この経過における片を多電極培養皿上で培養し、電極上に載った複数の視交叉上核の活動性を、放射性ラベルしたグルコース神経細胞から同時に連続的に神経発火頻度のサーカデ取り込みを指標に検証すると、視交叉上核背側（SCN-ィアンリズムを記録した。その観察において、左右のD）および腹側（SCN-V）における神経活動リズム位相

視交叉上核では大半の神経細胞が同期したサーカディに変容がみられ、加齢に伴い視交叉上核全体として日アンリズムを発出する一方、同側の神経核内でも反対内リズム振幅の低下がみとめられた。我々は視交叉上位相の発火リズムを示す神経細胞が存在することを見

核神経活動の加齢に伴う機能変容を検証するため、輪出した 19。また、Davis と Gorski は、片側視交叉上核回し行動の同時測定が可能なマウスを対象にして inをあらかじめ実験的に破壊したハムスターでも行動リ

vivo multi-unit neural activity (MUA) 記録法を適用

ズムの E 要素と M 要素の乖離が生じることを報告しした。視交叉上核研究の歴史的観点からみると、in vivoて い る 20 。 de la Iglesia ら の 続 報 は 行 動 リ ズ ム

MUA 記録法は Inouye と Kawamura がラット視交叉Splitting と Split LH サージの関係性を明確に示した。

上核のサーカディアンリズムを記録した卓越した手法

行動リズム Splitting 雌性ハムスターにおいて、視交叉である 23。視交叉上核の自律振動性とペースメーカー

上核および LH 分泌を制御する性腺刺激ホルモン放出出力機能を証明するために、in vivo 記録に加え島状隔ホルモン（LH-RH）含有神経細胞の興奮性を組織学的離手術を行っている点は特筆すべきである。Yamazakiに検証したところ、視交叉上核の片側活動性と共に同らは in vivo MUA 記録法をハムスターに適用し視交叉時間生物学 Vol. 28, No. 2 (2022)128

図３ 環境周期（T）の最適化による中年期 Cry
KO 雌性マウスの不妊症改善
通常の飼育環境下において、中年期 Cry1 KO 雌性マウス（上段左）、または Cry2 KO 雌性マウス（上段右）は、発情期に一致する輪回し行動の亢進が不整または消失していた。環境明暗周期（T）をマウスの内因性周期（τ）に調和させることにより、発情期（★）の周期性が安定化し、不妊症は改善された（下段）。文献 30 より引用

上核と外部神経核領域とのリズム位相関係を解析した提唱者である Sawyer 博士によって入念に査読されたが 24、当時、本命の標的領域は LHRH 含有神経細胞がであろうことが伺える。

散在する内側視索前野であったとのことである。研究プロジェクトは違えども、視交叉上核を対象とした知見はどこかで必ず関連が見いだされるものである。In5.

A Mutation of the Circadian System in GoldenHamsters. (1988) 27

vivo MUA 記録法は視交叉上核内のリズム位相局在を

tau ミュータントハムスターは哺乳類で得られた最比較するだけの空間解像度はないものの加齢に伴う機初のサーカディアンリズム変異体である。ミュータジ能変容に注目すると、若齢雄性マウス（4 カ月齢）ではェネシス法で人為的に変異を起こしたショウジョウバ

昼夜差のメリハリがはっきりとした高振幅のリズム変エの per 変異体と異なり、実験動物納入業者からリズ動を示すのに対し、中年雄性マウス（15 カ月齢）では、ム研究用に購入された動物の中に見出された。サーカ

単位時間当たりの神経発火頻度にばらつきが大きく、ディアンリズム周期（tau: τ）が 22 時間と短いことか視交叉上核としてのリズム振幅は低下することを明ら

ら、通常消灯時刻と共に活動期を開始する野生型ハム25。さらに発光レポーターイメージングによスターと比較して、明期のうちに活動が活発になる。

かにしたり、中年雄性マウス視交叉上核組織切片を観察すると、著者の拙い研究経験からすると、活動期に入ったげっ細胞レベル振動体間相互のリズム位相角差が不安定に歯類の取扱いは難しく、しっぽが短いハムスターは単なっており、視交叉上核総体としてのリズム振幅が減に保持するだけで困難を極める。勝手な想像であるが、衰していくことが明らかになった 26。Wise らの論文でMenaker Lab.に動物が届き、その日の夕方に大学院生議論されていた LH サージに必須となる視交叉上核かRalph が飼育ケージに移そうとした時点で、この奇跡らのタイミングシグナルは、数時間の時間窓位相に到のようなリズム変異体は見出されたのかもしれない。

達する必要がある。つまり、中年期に生じる視交叉上tau ミュータントハムスターの発見による視交叉上核核の機能変容は、タイミングシグナル位相と時間窓位研究の発展への貢献は枚挙にいとまがない。なかでも相にずれを生じやすく、結果として性周期不整を招来ミュータジェネシス法によるマウスサーカディアンリするのではないだろうか。この論文 22 はコンセプトのズム変異体の大規模スクリーニング 28 には、リズム特

時間生物学 Vol. 28, No. 2 (2022)
129性として輪回し行動リズムの自由継続周期が大変有効
で あ る こ と を 示 し て い る 。 一 方 、 Shimomura とMenaker はホモ接合体（τss； τ＝20 時間）の光反応性について詳細な行動解析を行い、ユニークな同調特性を明らかにしている 29。当時、tau ミュータントハム

Aschoff 先生の言葉「to do the right thing at the righttime.」32 は、当時から視交叉上核の本質的な位相設定機能を予見している。今後は将来展望豊かな論文を目指し、視交叉上核の生理的時間制御機構の全容解明に貢献していきたい。

スターの系統維持のために、確実な遺伝型判定は個体行動の自由継続周期しか方法がなかったと推測される。

参考文献

ここでもサーカディアンリズムと性周期、そして光周

1

Pittendrigh, C.S. & Daan, S. A FunctionalAnalysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal

性のすべてに精通した Menakar Lab.の特性が最大限Rodents.に発揮された。τss は通常 24 時間周期の明暗サイクル

I.

Thestabilityandlabilityof（L/D＝14 時間/10 時間）に同調することができない。

spontaneous frequency. J. Comp. Physiol. A 103,

そこで Virginia 大学の動物舎では常時 τss 同士の繁殖

223-252 (1976).

ペアを L/D＝11.7 時間/8.3 時間の長日条件で飼育する

2of phase response curves. J. Comp. Physiol. Aことで安定した繁殖効率を得ていた。個人的な感想で103, 253-266 (1976).

恐縮だが、Virginia 大学でこの動物繁殖ストラテジーを聞いたときには思わず感嘆してしまった。しばらく

3は Cry2 KO マウス（τcry2 KO: 24.3 ± 0.2 時間）が、通常

Daan, S. & Pittendrigh, C.S. III. Heavy waterand constant light: Homeostasis of frequency? J.

後に、我々は、ホモ接合体同士の繁殖ペアで維持していた Cry1 KO マウス（τcry1 KO: 22.4 ± 0.3 時間）、またDaan, S. & Pittendrigh, C.S. II. The variabilityComp. Physiol. A 103, 267-290 (1976).
4

Pittendrigh, C.S. & Daan, S. IV. Entrainment:

十分に繁殖可能な中年期（8-12 ヶ月齢）に不妊症を呈Pacemaker as clock. J. Comp. Physiol. A 103,することを見出した。この時、真っ先に思い出したの291- 331 (1976).

は τss ハムスターの繁殖ストラテジーである。中年期

5structure: A clock for all seasons. J. Comp.

（8-12 ヶ月齢）に性周期不整を呈した Cry1 KO 雌マ
ウスを L/D＝11.25 時間/11.25 時間の 22.5 時間明暗サ
イクル下で、Cry2 KO 雌マウスを L/D＝12.25 時間

Physiol. A 103, 333- 355 (1976).
6

are eliminated by hypothalamic lesions. Proc.

により、性周期不整は劇的に改善し、交配により妊娠

Natl. Acad. Sci. USA. 69, 1583-1586 (1972).
7

確に方向づけている 5。視交叉上核の実態解明が進展しサーカディアンリズム表出を単一細胞レベルで観察してみると、それぞれがげっ歯類個体行動解析から得られたような独自の周期と位相反応特性を備えており、多様な振動特性を示す集合体として視交叉上核を構成することにより、生体のあらゆる生理機能に最適な活性位相を設定しているのではないだろうか 31。Jurgen

Moore, R.Y. & Eichler, V.B. Loss of a circadian
adrenal6.

おわりに視交叉上核発見 50 周年にあたり、シルバーアニバー
サリー後世代（ポスト時計遺伝子世代）の筆者は、本来であれば十分に蓄積された知見を踏まえて研究を発展させていくべき立場にある。しかしながら得てして論文検索を主体とするディスカッションは懐古的な記述に偏りがちで、過去の偉大な論文に記述されている範疇を超えることができない。比べることもおこがまし
いが、本稿の最初に紹介した 5 編の論文におけるCircadian Pacemakers に関する記述は将来展望が満載されており、後の半世紀に及ぶ視交叉上核研究を明Stephan, F.K. & Zucker, I. Circadian rhythms indrinking behavior and locomotor activity of rats

/12.25 時間の 24.5 時間明暗サイクル下で飼育することが成立することを確認した（図 3）30。

Pittendrigh, C.S. & Daan, S. V. Pacemakercorticosterone

rhythmfollowingsuprachiasmatic lesions in the rat. Brain Res. 42,
201-206 (1972).
8Rusak, B. & Zucker, I. Biological rhythms andanimal behavior. Annu. Rev. Psychol. 26, 137171 (1975).

9Stetson, M.H. & Watson-Whitmyre, M. Nucleus
suprachiasmaticus: the biological clock in thehamster? Science 191,197-199 (1976).

10 Moore, R.Y. & Klein, D.C. Visual pathways andthe central neural control of a circadian rhythmin pineal serotonin N-acetyltransferase activity.

Brain Res. 71, 17-33 (1974).
11 Ibuka, N. & Kawamura, H. Loss of circadianrhythm in sleep-wakefulness cycle in the rat bysuprachiasmatic nucleus lesions. Brain Res. 96,76-81 (1975).

時間生物学 Vol. 28, No. 2 (2022)
130

12 Nagai, K., Nishio, T., Nakagawa, H., Nakamura,hormone-releasing hormone neurons involves aS. & Fukuda, Y. Effect of bilateral lesions of theneural rather than a humoral pathway. J.

suprachiasmatic nuclei on the circadian rhythmof food-intake. Brain Res. 142, 384-389 (1978).

Neurosci. 23, 7412-7414 (2003).
22 Wise, P.M., Cohen, I.R., Weiland, N.G. & London,

13 Everett, J.W. & Sawyer, C.H. A 24-hour

E.D. Aging alters the circadian rhythm of glucose

periodicity in the "LH-release apparatus" ofutilization in the suprachiasmatic nucleus. Proc.

female rats, disclosed by barbiturate sedation.

Endocrinology 47, 198-218 (1950).
14 Norman, R.L., Blake, C.A. & Sawyer, C.H.
Estrogen-Dependent

Natl. Acad. Sci. USA. 85, 5305-5309 (1988).
23 Inouye, S.T. & Kawamura, H. Persistence ofTwenty-four-Hourcircadianrhythmicity

hypothalamicin"island"amammaliancontaining

thePeriodicity in Pituitary LH Release in thesuprachiasmatic nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci.

Female Hamster. Endocrinology 93, 965-970

USA. 76, 5962-5966 (1979).

(1973).

24 Yamazaki, S., Kerbeshian, M.C., Hocker, C.G.,
Circadian

Block, G.D. & Menaker M. Rhythmic properties

organization of the estrous cycle of the goldenof the hamster suprachiasmatic nucleus in vivo.

hamster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 2923-J. Neurosci. 18, 10709-10723 (1998).

15 Fitzgerald,K.

&Zucker,I.

25 Nakamura T.J. et al. Age-related decline in2927 (1976).
16 Swann, J.M. & Turek, F.W. Multiple circadianoscillators regulate the timing of behavioral andendocrine rhythms in female golden hamsters.

Science 228, 898-900 (1985).

circadian output. J. Neurosci. 31, 10201-10205(2011).
26 Nakamura T.J. et al. Age-related changes in thecircadiansystem

unmaskedbyconstant

17 Pickard, G.E. & Turek, F.W. Splitting of theconditions. eNeuro. 2, e0064-15.2015 1-10 (2015).

circadian rhythm of activity is abolished by

27 Ralph, M.R. & Menaker, M. A Mutation of theunilateral lesions of the suprachiasmatic nuclei.

Circadian System in Golden Hamsters. ScienceScience 215, 1119-1121 (1982).

241, 1225-1227 (1988).

18 de la Iglesia, H.O., Meyer, J., Carpino, A.Jr. &28 Vitaterna, M.H. et al. Mutagenesis and mapping

Schwartz, W.J. Antiphase oscillation of the leftof a mouse gene, Clock, essential for circadianand right suprachiasmatic nuclei. Science 290,behavior. Science 264, 719-725 (1994).

799-801 (2000).

29 Shimomura, K. & Menaker, M. Light-induced

19 Nakamura, W., Honma, S., Shirakawa, T. &Honma, K. Regional pacemakers composed ofphase shifts in tau mutant hamsters. J. Biol.

Rhythms 9, 97-110 (1994).

rat

30 Takasu, N.N. et al. Recovery from Age-Related

suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 14,

Infertility under Environmental Light-Dark

666-674 (2001).

Cycles Adjusted to the Intrinsic Circadian Period.

multipleoscillator

neurons

inthe20 Davis, F.C. & Gorski, R.A. Unilateral lesions of

Cell Rep. 12, 1407-1413 (2015).

the hamster suprachiasmatic nuclei: evidence

31 Pittendrigh, C.S. The photoperiodic phenomena:

for redundant control of circadian rhythms. J.

seasonal modulation of the "day within". J BiolComp. Physiol. A 154, 221–232 (1984).

Rhythms 3, 173-188 (1988).

21 de la Iglesia, H.O., Meyer, J. & Schwartz, W.J.
Lateralization of circadian pacemaker output:
Activation of left- and right-sided luteinizing

時間生物学 Vol. 28, No. 2 (2022)
131

32 Aschoff, J. Circadian rhythms in man. Science148, 1427-1432 (1965).