遺伝工学基盤技術室
Bioresource Engineering Division室長小倉淳郎（農博）

Atsuo OGURA, D.V.M., Ph.D.

当研究室では、理研バイオリソースセンターが各リ開発を行っている。また、これらの開発した技術が広く

ソース、特に実験動物および幹細胞をより高度なクオリ

研究コミュニティに活用されるべく、研修事業も行ってティにて維持供給するために必要な以下の遺伝関連技術

いる。

事業内容
1. 体細胞核移植クローン技術の開発

4. 新規幹細胞の開発

2. 顕微授精技術の開発

5. 技術研修

3. 効率的な胚 ･ 配偶子の凍結保存法の開発

職員とメンバー構成室長

小倉淳郎（平成 14 年 2 月〜）

研究員

井上

貴美子（平成 14 年 3 月〜）

専任技師

持田

慶司（平成 14 年 2 月〜）

技師

越後貫

基礎科学特別研究員

三木成美（平成 14 年 3 月〜）
洋美（平成 19 年 4 月〜）

日本学術振興会
BRC 協力研究員

特別研究員（平成 18 年 4 月〜 19 年 3 月）

脇阪紀子（平成 19 年 1 月〜）

本多

新（平成 19 年 10 月〜）

基礎科学特別研究員（平成 16 年 10 月〜 19 年 9 月）
BRC 研究協力員

廣瀬美智子（平成 16 年 4 月〜）

毛塚 芙由子（平成 17 年 5 月〜 19 年 3 月）
BRC 研究協力員（事務）

中村

訪問研究員

金

可奈子（平成 14 年 5 月〜）

鎮文（平成 19 年 9 月〜

（日本学術振興会

外国人特別研究員）

BRC 協力研究員（平成 19 年 2 月〜 8 月）
研修生

遠藤圭介（平成 17 年 2 月〜 19 年 3 月）

相澤健太郎（平成 19 年 4 月〜 20 年 4 月）

森
パートタイマー真菜実（平成 20 年 7 月〜）

冨島俊子（平成 19 年 4 月〜）― 113 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

遺伝工学基盤技術室
Bioresource Engineering Division

廣瀬
持田

井上

本多

中村

小倉室長

金

冨島

脇阪

三木

越後貫

年次計画と成果
らかにしているが、その後の研究により、発生効率が大

1. 体細胞核移植クローン技術の開発

幅に改善することが報告されている Trichostatin A 処理

マウスにおいて再現性が極めて低い体細胞クローン技したクローン胚でもこれらの遺伝子発現が改善していな術の効率の改善および安定化をめざすとともに、再プロ

いことが明らかとなった（図 1）。一方で、eIF-1A 上流

グラム化機構の解明をめざす。

の転写因子である Spi-C は、卵丘細胞クローン胚に比べ（1）体細胞クローン二細胞期胚における遺伝子発現パ

発現量が有意に改善していることが明らかとなり、個々ターンの解析

の胚を用いて解析を行うと、Spi-C の発現が改善していマウス胚では、二細胞期に多数の胚性遺伝子発現が開る胚では eIF-1A の発現量も上昇している傾向がある事始される。従って二細胞期胚における遺伝子発現パターが明らかとなった（図 1）。従って、Spi-C の発現パター

ンはその後の発生運命を決定する重要な要素であると言ンはクローン胚発生の指標として利用出来る可能性があえる。我々は以前の研究で、卵丘細胞クローンを用いる。更にマイクロアレイ解析を用いて、Spi-C と同様のて解析した場合、eukaryotic translation initiation factor 1A

発現パターンを示す遺伝子発現制御因子の探索を行って(eIF-1A) と murine endogenous retroviral sequence L (ERV-L)いる。

の遺伝子発現量が受精卵に比べて低下していることを明― 114 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

遺伝工学基盤技術室
Bioresource Engineering Division

2.5

3.0

2.5

eIF-1A

ERV-L

2.0

2.0

1.5

1.5

1.0

1.0

Spic

2.0

1.0

b

中央：ERV-L

MII：未受精卵
◆：単一胚

TSA+

B129sc

BDF1cc

IVF

TSA+

129cc

IVF

右：Spi-C

IVF：受精卵

+：平均値

MII

２細胞期胚における遺伝子発現パターン解析

左：eIF-1A

129cc

BDF1cc

図1

B129scIVF

0.0

B129sc

0.0

a

BDF1cc

0.0

TSA+

0.5

MII

0.5

BDF1cc：B6D2F1 卵丘細胞クローン

TSA+：TSA 処理 BDF1 卵丘細胞クローン

a vs b：p<0.05（2）マウス過形成胎盤の電顕組織学的形態観察（図 2）

ホブラスト層の拡大が ciICSI 胚の胎盤でも確認された。

過形成胎盤は誕生する体細胞クローンマウスの特徴でさらに透過電顕像でも共通した異常が観察された。すなあることから、本研究は胎盤の異常に注目した。体細胞

わち、迷路層トロホブラスト細胞内の空胞増加、そしてクローンマウス胎盤以外にも亜種間交雑胚および細胞質

ST 細胞の粗面小胞体の顕著な拡張とゴルジ体の増加がを卵子に注入した顕微授精 (ciICSI) 胚の胎盤は過形成と観察された。一方、胎仔内皮（尿膜）由来細胞に異常はなることが報告されている。そこで、これら 3 種の過形認められず、過形成胎盤の発生においては特にトロホブ

成胎盤モデルの電顕組織学的観察を行い、その超微形態

ラスト系列細胞が影響を受やすいことが示唆された。病における共通性について検討を行った。過形成胎盤モデ

因学的に全く異なる３種類の過形成胎盤モデルが微細形

ルの組織学的な特徴は、3 種間で類似していた。体細胞

態レベルを含めて共通した異常を示したことから、マウクローンマウス胚や亜種間交雑胚の胎盤の特徴である、

ス胎盤の過形成はさまざな誘因により開始される一定の迷路層とスポンジオトロホブラスト層の境界の不規則化

反応機序に伴う表現型と言えるのかもしれない。

およびグリコーゲン細胞の増加によるスポンジオトロ

図2

体細胞クローンマウスの電顕像

A 迷路層トロホブラスト細胞内の空胞増加（矢頭）、B スポンジオトロホブラスト細胞の粗面小胞体 (rER) の顕著な拡張、C ゴルジ体の増加（アスタリ
スク）がマウス過形成胎盤で共通して観察された。
BM, 基底膜 ; FC, 胎仔血 ; FE, 胎仔性血管内皮細胞 ; LI, LII, and LIII, トロホブラスト細胞 I, II, and III; MBS, 母体血洞． Bars = 1 μm (A)、5 μm(B、C)― 115 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

遺伝工学基盤技術室
Bioresource Engineering Division（3）体細胞クローン胚のクロマチン修飾解析技術の開発

2. 顕微授精技術の開発 ･ 応用

体細胞の再プログラム化におけるクロマチン修飾変化

正常精子だけでなく、通常は受精能のない不動精子、の関与を解明する事を目的として、クロマチン免疫沈

形態異常精子、未成熟精子などでも受精卵および産仔を降法 (ChIP) による受精卵のクロマチン修飾パターン解作出する顕微授精技術の開発をめざす。また、その技術

析実験を行った。O’Neill 等が 2006 年に報告した Carrierの生殖工学実験系への幅広い応用を実施する。

ChIP 法を参考に Drosophila S2 細胞株をクロマチン回収（1）顕微授精技術を利用した超迅速コンジェニック化技術の確立

キャリアーとして用い、マウス亜種間ゲノム多型が多く存在する C57BL/6 系統 (Mus musculus domesticus) と JF1

新たなコンジェニックマウス系統の樹立には、性成熟

系統野生マウス (Mus musculus molossinus) の体外受精にマウスを用いた戻し交配を行うために１世代約 2.5-3 ヶよって作成した受精卵から細胞核を回収し、特異的な月かかり、系統樹立までに 2 年以上という長い月日を要

ヒストン修飾抗体による免疫沈降を行った。C57BL/6

する。このため本来の研究開始まで長期間待たなければ系 統 と JF1 野 生 マ ウ ス の ゲ ノ ム 間 に 存 在 す る Length

ならないのが最大の欠点である。自然交配の代替として

polymorphism や Single strand conformation polymorphism

未成熟マウスの生殖細胞を用いた顕微授精技術と多型マを利用することで、刷り込み遺伝子の片親性発現を調節

イクロサテライトマーカーによる選抜システムを併用しする刷り込み制御領域のクロマチン構造を解析した結た超スピードコンジェニック法の確立を試みた。生後

果、刷り込み制御領域では特定のクロマチン修飾状態に

22-24 日齢以降の円形精子細胞を用いて顕微注入を行い、ゲノムの親由来に依存する偏りが存在することが分かっ

その後胚移植をすることで産仔を得た。次の顕微授精をた。微量サンプルでの ChIP 解析法の確立によって、再行うまでに雄産仔の目的遺伝子存在の確認およびマイク

プログラム化におけるクロマチン修飾の関与をより詳細

ロサテライトがより多く受容系統の遺伝子型に置換してに調べられる事が期待できる。

いる個体の選抜を行う。これを繰り返すことによってコ（4）クローン胚のテトラプロイドレスキューに関する

ンジェニック化を進行させていく。現在までにトランス
ジェニックマウス（バックグラウンド：BDF1）2 系統

試み
マウス体細胞核移植の効率、特に産仔率は大変低い。

についてはそれぞれ 5 世代 188 日および 230 日でコン

この原因の一つとしては、胎盤形成の異常が考えられて)3）。またノッジェニック化が完了した (74 マーカー （図おり、この異常をレスキューすることで、効率の向上に

クインマウス（B6x129）も 3 世代 106 日でコンジェニッ

つながることが期待できる。本研究では、クローン胚とク化が完了した (86 マーカー )。顕微授精技術と多型マー個体形成おいて胎盤のみに寄与することが知られているカーによる選抜を組み合わせることにより、従来の約半

テトラプロイド IVF 胚とのアグリゲーションキメラ胚分以下の期間でコンジェニック化できることが明らかにを作出し、その発生を観察した。その結果、BDF1 の卵なった。

ラプロイド IVF 胚をアグリゲートさせた胚 (1:1) や 1:2
よりも、1:3 および 1:4 で産仔率が若干良い傾向が見られた (2.4%, 0.0% vs. 6.3%, 4.3%)。さらに、C57BL/6 をドナー細胞とした場合、1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 2:2, 2:3 の 5 グルー
プで比較したところ、唯一 2:1 胚で移植胚 13 個から 1匹の産仔が得られた。これらの結果から、テトラプロイ
ド IVF 胚との割合によっては、それらがクローン胚のB6 type homozygous (%)

丘細胞をドナー細胞とした場合、1 クローン胚と 1 テト
100
95

22+20 日90

21+20 日22+20 日85
80

23+20 日

75
70

20 日

用いた雄の日齢65発生を向上させる可能性が示唆された。

60
0

図3

50

100

150

188 日 200

未成熟雄の円形精子細胞を用いたスピードコンジェニック

22-24 日齢の雄を用いることにより、１世代が 42-44 日に短縮される。
このトランスジェニック系統の例では、188 日ですべてのマーカーが
C57BL/6 ホモになり、コンジェニックの期間はほぼ半分になった。

― 116 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

遺伝工学基盤技術室
Bioresource Engineering Division㪈㪇㪇（2）円形精子細胞を用いたマウス雄核発生胚の作出
同性由来の 2 倍体ゲノムセットを持つ雌核および雄核発生胚は、ゲノムインプリンティングなどの重要な研究資源となりうる。そこで、より効率の良い雄核発生㪏㪇胚作出法の確立を目的とし、ROSI ( 円形精子細胞注入 )义

法を応用した。すなわち、2 個の円形精子細胞核の注入

乊

後に雌性核を除去するという方法を試みた。再構築胚

a

ฃ
♖ 㪍㪇
₸
䋦 㪋㪇

a’
ᣂ 㞲 ♖ ሶ 䇭 㪙㪪 㪘㪄㪟㪫㪝䇭 㪙㪪 㪘㪄㪟㪫㪝㪙㪪 㪘㪄㪟㪫㪝 㪂㪤 㪙㪚 㪛㪧 㪭㪘㪄㪟㪫㪝 㪂㪤 㪙㪚 㪛

㪉㪇は培養後、2 細胞期で胚移植を行うか、一部の胚につい㪇

ては、そのまま胚盤胞に発生させて ES 細胞樹立に用い㪇 㪅㪌 㪿

た。 注入後の卵子の生存率 (BDF1 卵子の場合で 88.3%)㪈㪿㪉㪿♖ሶ೨ၭ㙃ᤨ㑆は、円形精子細胞 1 個を注入した場合と変わらず、実用的な効率であった。胚移植後、9.5 日齢胎仔への発生

図4

凍結保存精子を用いた体外受精技術の改良

新鮮精子（▲実線）および凍結 - 融解精子を BSA-HTF 液（▲破線）、

率は、系統により異なるが、( 移植胚あたり ) 0.2-7.7 %BSA-HTF+ MBCD (0.4mM Methyl-β-cyclodextrin)（■）
、PVA-HTF+MBCDであった。これらのインプリント遺伝子 (H19, Igf2r, IG-（●）の各液で 0.5 〜 2 時間前培養し、BSA-HTF 液中で媒精した場合の体DMR) のメチル化状態の解析から、これら胎仔は、雄核外受精成績 (n= ♂ 4)。
a-aʼ 間で有意差有り（p<0.05）

発生胚型のインプリントを持つことが示された。
さらに、
C57BL/6xDBA2 胚から得られた胎仔についてマイクロサテライトマーカーによる遺伝子多型解析を行ったとこ

範囲は 400-525 mOsm/Kg であった。

ろ、確実にその両方のゲノムを持っていることが確認さ（2）マウス体外受精における前培養条件の検討についれた。一方、C57BL/6xJF1 胚 (C57BL/6 と JF1 の円形精て（図 4）

子細胞核 1 個ずつから構築された胚 ) の in vitro での胚

凍 結 - 融 解 し た C57BL/6Cr 精 子 を BSA-HTF（A 液 )盤胞形成率は ( 分割胚あたり ) 43.5 % であり、20 個の胚

ま た は、methyl-β-cyclodextrin（MBCD:Choi et al.,1998)

盤胞から 9 ラインの ES 細胞が樹立された。性染色体構をそれぞれ 0.4mM 添加した BSA-HTF（B 液）と PVA-

成と遺伝子多型を、現在解析中である。以上の結果より、HTF （C 液）の各液で 1 時間前培養し、体外受精に用本技術は、効率的に多様な遺伝子型を持つ雄核発生胚をいたところ、受精率はそれぞれ 44.5%、54.1%、69.6%

作出するための新たな方法として有効であると考えられであった。なお、MBCD 濃度と前培養時間はこの条件る。

が最適であった。次に C57BL/6J 凍結精子で A 液と C 液を比較したところ、受精率は 26.7％と 43.4％ (n=♂6) であり、同様に MBCD の添加で改善が認められた。しか3．効率的な胚・配偶子の凍結保存法の開発
胚および配偶子の凍結保存技術は、実験動物バイオリ

し、BALB/cA 凍結精子においては効果が認められなかっソース保存の核となる技術である。さまざまな条件設定

た（10.4％と 7.6%, n=♂3）ことから、系統差の影響が考（凍害防止剤の調製、温度設定など）により、効率的なえられ、更に詳細な検討が必要と思われた。
新 鮮 精 子 で 受 精 率 が 低 い 129x1/SvJ で は、12.7 ％ と凍結保存技術とその周辺技術の開発をめざす。

32.5％（n=♂5）の受精率が得られ、MBCD 添加による（1）マウス精子の凍結保存液の改良について
C57BL/6Cr 精子を用いて、各濃度（9, 12, 15, 18, 21%）のラフィノース水溶液を凍結液として凍結 - 融解したと改善が C57BL/6 系統の凍結精子と同様に認められた。
（3）マウス精巣上体精子の冷蔵保存による影響についてころ、ラフィノース濃度が高いほど生存率や精子運動速度は良好で膜の損傷度は低い傾向がみられたが、先体

以 前 の 我 々 の 実 験 結 果（Mochida et al., 2005） か らの損傷度（PNA 陽性率）は 21% でやや高い傾向であっ

精 巣 上 体 尾 部 を ミ ネ ラ ル オ イ ル に 浸 漬 し て 2 日 間、た。次にラフィノースを 15,18,21% 含む 0×, 0.25×, 0.5×,

4-5.5℃と 6-8℃の条件で保存後に体外受精に用いたとこ

0.75×, 1×SD-PBS をそれぞれ凍結液として用いると、精ろ、BDF1 では 73％と 78% の受精率がそれぞれ得られ、子の生存率（標準運動精子率）は、18％ラフィノース

C57BL/6Cr の場合は、59％と 71% であり冷蔵温度の影-0.25×SD-PBS 液で 56.2% と最も高かった。これら糖濃響が認められた。今回、C57BL/6J の精巣上体尾部を 7℃

度と SD-PBS 濃度の組み合わせにおいて、最適な浸透圧

で 2 日間保存したところ、受精率は 9.1％（n=♂5）と低― 117 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

遺伝工学基盤技術室
Bioresource Engineering Division

かった。しかし前培養液に MBCD を添加した前項の条件で体外受精を行ったところ 24％が受精し、その後の培養で胚盤胞へ発生することを確認した。以上から冷蔵保存した精巣上体尾部の受精能には、系統差および亜系
統間の差も顕著であることが認められ、受精率の改善に
は前培養液への MBCD 添加がこの場合も有効であった。
（4）マウスにおける人工授精の試みについて
過排卵誘起を施し、精管結紮雄との交尾を確認した雌マウスの卵管に精子を注入することで人工授精による受精卵作出を試みた。BDF1 雌マウスに新鮮な精子を注入した場合、7 腹のうちすべての腹から、翌日に平均 7.3
個の 2 細胞期胚を回収することができた。凍結 - 融解精子を用いた場合、11 腹のうち 9 腹から平均 4.0 個の胚を図5回収した。次に ICR を用いた場合では 9 腹中 7 腹から

各種幹細胞の樹立・利用技術開発

体外発育中の卵子は、莢膜細胞との共培養で発育率が向上する。

平均 5.7 個、C57BL/6J を用いた場合では 8 腹中 4 腹から胚が回収できたが平均 1.3 個と非常に少なかった。系
統によって胚作出効率が大きく異なることから、系統にチとしての応用が期待されている。また、我々はマウス応じた条件検討が必要であると思われた。

新生仔卵巣由来の発育期卵子の体外発育・成熟や莢膜幹（5）マウス胚のより簡便かつ安定なガラス化保存方法

細胞の分離・分化誘導技術も開発した。これらは雌性生殖細胞の新しい研究ツールとしての発展が期待されていの検討について
マウス卵子の凍結保存に有効であった 8%D8%E-PB1
および 16%D16%EFS-PB1 液を用いた 2 段階ガラス化保る（図 5）。
（1）マウス ES 細胞株樹立とその利用存方法は、シュークロス濃度と平衡時間を調整すること

マウス ES 細胞は最も多く利用されている ES 細胞でで、クライオトップではなく凍結チューブを容器としてあり、その研究分野は多岐にわたっている。一般的な用いた場合でも 2 細胞期胚の生存率 100％（70/70）、培

ES 細胞は 129 系統のマウスから樹立するものであり、養後の胚盤胞形成率 94％（66/70）の成績を得た。更に他の系統から樹立するのは困難とされてきた。しかし、この方法は、ガラス化保存の際にピペッター用チップを

当研究室ではこれまでに 129 系統以外の系統から B6 マ

用いた室温操作が可能であり、誰にでも簡単迅速に行え

ウスや野生マウスとラボマウスの F1 を含む 6 種類（37

る画期的な方法と期待される。
今後は融解操作が容易で、ライン）の ES 細胞株を樹立している。また、体細胞核

多くのマウス系統に対応できるよう、修正を加えてこの移植クローン胚からは 5 種類（32 ライン）の ntES 細胞

ガラス化保存法を確立したい。

株樹立にも成功している。クローン個体がほとんど得られない近交系でも ntES 細胞を経由する事で体細胞から4. 各種幹細胞株の樹立、解析、および利用技術の個体作出の可能性が高まり、交配不可能なマウス系統の開発の復活・維持へも応用できると期待される。また、均一

近年、induced pluripotent stem cell (iPS 細胞 ) の創出にな遺伝的背景が必要な研究には C57BL/6 由来の ES 細胞より、幹細胞を用いた再生医療研究に多大な注目が集まが強く求められているが、特に樹立が困難であることや、り、それに付随して胚性幹細胞だけでなく組織幹細胞に生殖系列への分化能の乏しさから一般的ではなかった。

対する関心も高まっている。我々はヒト再生医療のモデ

そこで、4 ラインの C57BL/6 由来の ES 細胞を樹立し、ルに資するために、複数の新規幹細胞の開発・応用技術

キメラマウス (4 ライン ) と生殖系列への寄与 (2 ライン )を確立してきた。これまでに、マウスやウサギからの胚を確認した。これらは BRC の細胞材料開発室（細胞バ

性幹細胞（Embryonic Stem (ES) cell）や体細胞核移植由ンク）に寄託して一般に公開している。

来（nt）ES 細胞の効率的な樹立技術を開発した。ウサ（2）ウサギ ES 細胞株樹立とその利用

ギは小型実験動物として唯一ヒト型の ES 細胞を生じる

マウス以外の実験動物で ES 細胞が一般的に利用され動物であり、医療分野へのトランスレーショナルリサーているのはサルのみであり、他の動物種からの ES 細胞― 118 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

遺伝工学基盤技術室
Bioresource Engineering Division

樹立は、自己複製能や未分化性維持能の乏しさから非常

本研究を応用する事により、これまで不明だった莢膜細に困難とされている。このような背景の中でウサギは古胞の本質を詳細に解析することが可能となり、幅広い応

くから実験動物として利用されてきた歴史を有している用が期待できる。

だけでなく、ヒト疾患モデル動物としても注目されてお（4）未成熟卵子の効率的な発生・発育法開発

り、もしもウサギで ES 細胞が樹立されれば、その利用

新生仔卵巣には数万個の未発育卵子が含まれている価値は高い。我々はこれまでにウサギ ES 細胞の効率的が、生後まもなくその大多数が退行してしまい、ごく少な樹立方法と維持方法を開発した。樹立したウサギ ES

数のみしか機能的な卵子としての役割を果たすことはで細胞は長期にわたる培養にも安定であり、各種未分化

きない。もしも、退行していくはずの未発育卵子を体外マーカー陽性なだけでなく多分化能（体外・体内）も確で発育させることが可能になれば、これらの卵子は研究認されている。また、様々な点（その形態や成長因子に材料としてだけでなく、生殖医療や実験動物学的な関点

対する反応性等）においてウサギ ES 細胞はヒト ES 細からもその利用価値は高い。我々はマウス莢膜幹細胞の胞に酷似しており、現在使用されている小型実験動物由培養中に stem cell factor (c-kit ligand) を添加することに来の ES 細胞として、唯一ヒト型の ES 細胞を生じる動より、非常に高効率（一産仔から約 800 個）に未発育卵物であることが明らかになった。今後は未分化性維持機

子を調製する方法を開発した。一般的に卵子の発育には構の解析、in vitro 分化法の確立とトランスレーショナ

顆粒膜細胞との直接的な相互作用が重要で、それ無しにルリサーチへの応用、およびウサギでのジーンターゲ

は 20 μm 程度にまでにしか発育しないと信じられてきティングやノックダウンも視野に入れて研究を展開する

たが、この卵子は雌特異的なインプリント遺伝子のメチ予定である。

ル化が生じるまでに発育し、直径も最大で約 70 μm ほ（3）マウス新生仔由来莢膜幹細胞の単離と分化誘導

どにまで到達した。雄性生殖細胞である精子に比べて、卵巣莢膜は卵胞形成、卵胞構造の物理的な強化、ステ

雌性生殖細胞の卵子はその量的な問題から研究の幅が限

ロイドホルモンの産生などの卵巣機能に重要な役割を果られていたが、本研究開発を発展させれば、精子と同様たしている。しかしながら、その新生機序、成長、分化に幅広い解析が可能になるかもしれない。

などの詳細は莢膜幹細胞の存在が明らかになっていな
かったことから不明な点が多かった。我々は世界で初め

5. 技術研修て卵巣由来の幹細胞として莢膜幹細胞をマウス新生仔卵

平成 18 年度および 19 年度「マウス精子・胚の凍結保巣から単離し、体外で増殖させただけでなく段階的な分存方法に関する技術研修」において、所外からの研修生化誘導を成し遂げた。また、卵巣に移植することにより、を対象にマウスの体外受精、胚培養、胚凍結、精子凍結、卵巣内で莢膜様の構造に寄与させることにも成功した。

および胚移植の研修を行った。

研究発表（誌上発表）【原著論文】 * は査読制度がある論文誌
1. Inoue K., Wakao H., Ogonuki N., Miki H., Seino K.,

3. Miki H., Inoue K., Kohda T., Honda A., Ogonuki N.,

Nambu-Wakao R., Noda S., Miyoshi H., Koseki H.,

Yuzuriha M., Mise N., Matsui Y., Baba T., Abe K., Ishino

Taniguchi M., Ogura A.: “Generation of cloned mice by

F., Ogura A.: “Birth of mice produced by germ cell

direct nuclear transfer from natural killer T cells.” Curr.

nuclear transfer.” Genesis 41, 81-86 (2005).*

Biol. 15, 1114-1118 (2005).*
4. Mochida K., Wakayama T., Takano K., Noguchi Y.,
2. Ogonuki N., Inoue K., Miki H., Mochida K., Hatori M.,

Yamamoto Y., Suzuki O., Matsuda J., Ogura A.: “Birth

Okada H., Takeiri S., Shimozawa N., Nagashima H.,of offspring after transfer of mongolian gerbil (Meriones

Sankai T., Ogura A.: “Differential development of rabbit

unguiculatus) embryos cryopreserved by vitrification.”embryos following microinsemination with sperm andMol. Reprod. Dev. 70, 464 – 470 (2005).*spermatids.” Mol. Reprod. Dev. 72, 411-417 (2005).*
5. Mochida K., Ohkawa M., Inoue K., Valdez Jr. DM., Kasai― 119 ―

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

遺伝工学基盤技術室
Bioresource Engineering Division

M., Ogura. A.: “Birth of mice after in vitro fertilization

control during spermatogenesis.” Biol. Reprod. 73, 29-35

using C57BL/6 sperm transported within epididymides at(2005).*

refrigerated temperatures.” Theriogenology 64, 135-143(2005).*

13. Yamaguchi-Yamada M., Manabe N., Kiso M., Goto Y.,
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5. 廣瀬 美智子 , 本多 新 , 樋浦 仁 , 杉本 道彦 , 杠 美佐

直巳 , 小倉 淳郎： “ 単為発生と顕微授精によるマウ子 , 阿部 訓也 , 篠原 隆司 , 河野 友宏 , 小倉 淳郎：“ マスおよびウサギガラス化未受精卵の発生能の評価 ”,

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第 99 回日本繁殖生物学会大会 , 名古屋 , 9 月 (2006).

16. 井上 貴美子 , 越後貫 成美 , 三木 洋美 , 野田 真一 , 井
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7. 小倉 淳郎：“ 実験動物のクローン研究の現状につい淳郎： “ マウス交雑系 (B6x129/Sv-ter)F1 由来組織幹て ”, 第 25 回未来医療セミナー（大阪大学医学部未細胞クローンの発生効率の比較 ”, 第 54 回日本実験

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8. 小倉 淳郎： “ 実験動物の生殖工学技術の現状と今

17. 小倉 淳郎：“ 哺乳動物における顕微授精の誕生と展後の可能性 ”, 東京大学疾患生命工学センターセミ

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ナー , 東京 , 12 月 (2006).

開講演会 , 仙台 , 8 月 (2007).

9. 小倉 淳郎：“ 実験動物の核移植クローンから何がわ

18. 廣瀬 美智子 , 本多 新 , 井上 貴美子 , 越後貫 成美 , 三

かるか ”, 近畿大学 21 世紀 COE プログラム「食資木 洋美 , 脇阪 紀子 , 下澤 律浩 , 山海 直 , 小倉 淳郎：

源動物分子工学研究拠点」
第 7 回国際シンポジウム ,“ ウサギ ES 様細胞の樹立と解析 ”, 第 24 回日本疾

泉佐野市 , 12 月 (2006).

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10. 越後貫 成美：“ さまざまな条件下の雄性生殖細胞を19. 本多 新 , 廣瀬 美智子 , 井上 貴美子 , 越後貫 成美 , 三

用いた顕微授精による産仔作出 ”, 近畿大学 COE セ

木 洋美 , 脇阪 紀子 , 下澤 律浩 , 羽鳥 真功 , 山海 直 ,

ミナー , 和歌山 , 12 月 (2006).

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11. 越後貫 成美：“ さまざまな条件下の雄性生殖細胞を用いた顕微授精による産仔作出 ”, 第 38 回精子研究20. 井上 貴美子 , 小倉 淳郎：“ 体細胞クローンの低効率

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京 , 10 月 (2007).

12. 藤田 麻衣子 , 持田 慶司 , 宮崎 史恵 , 大川 美佳 , 小木
曽 彩 , 高島 梨香 , 横山 ちひろ , 平岩 典子 , 吉木 淳 ,小倉 淳郎：“ マウス体外受精における雄の週齢と受21. 井上 貴美子 , 三木 洋美 , 小倉 淳郎：“ 第一極体を用

精率の関連性について ”, 日本実験動物技術者協会

いたミトコンドリア DNA ハプロタイプ完全転換マ

関東支部第 32 回懇話会 , 東京 , 2 月 (2007).

ウスの作出 ”, 第 100 回日本繁殖生物学会 , 東京 , 10
月 (2007).

13. 宮崎 史恵 , 持田 慶司 , 藤田 麻衣子 , 小木曽 彩 , 大川
美佳 , 小貫 克也 , 高島 梨香 , 藤本 裕子 , 平岩 典子 ,22. 持田 慶司： “ 体外受精法の紹介 ”, 第 20 回動物生殖

吉木 淳 , 小倉 淳郎： “ 理研 BRC における自然交配

工学研究会 , 東京 , 12 月 (2007).

由来胚の利用について ”, 日本実験動物技術者協会
関東支部第 32 回懇話会 , 東京 , 2 月 (2007).

23. 小倉 淳郎：“ 新生仔マウス卵巣から分離された莢膜
幹細胞と卵子の特徴について ”, 文部科学省科学研

14. 遠藤 圭介 , 持田 慶司 , 大川 美佳 , 三木 洋美 , 柏崎

― 125 ―

究費補助金特定領域研究「幹細胞の可塑性と未分化

RIKEN BRC Annual Report 2006 〜 2007

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Bioresource Engineering Division

維持機構」成果公開シンポジウム「幹細胞研究を支える新しいテクノロジー」, 東京 , 2 月 (2008).
24. 小倉 淳郎：“ 新生仔マウス卵巣から分離された莢膜
幹細胞と卵子の特徴について ”, 第 10 回麻布大学「生
殖・発生工学セミナー」, 相模原 , 2 月 (2008).
25. 小倉 淳郎： “ 雄性生殖細胞の発生と受精能 ”, 第 10回生殖工学研究会 , 東京 , 3 月 (2008).
26. 小倉 淳郎： “ 胚を組み立てる−顕微授精と核移植 ”,
第 55 回日本実験動物学会総会 , 仙台 , 5 月 (2008).
27. 持田 慶司 , 相澤 健太郎 , 田熊 究一 , 金田 秀貴 , 越本
知大 , 枝重 圭祐 , 太田 昭彦 , 若菜 茂晴 , 小倉 淳郎：“C57BL/6 系統マウス凍結精子におけるラフィノー
ス濃度と浸透圧の生存性への影響について ”, 第 55
回日本実験動物学会総会 , 仙台 , 5 月 (2008).
28. 三木 洋美 , 井上 貴美子 , 越後貫 成美 , 毛塚 芙由子 ,本多 新 , 岩舩 浩孝 , 石野 史敏 , 小倉 淳郎：“ 円形精子細胞を用いたマウス雄核発生胚作出の試み ”, 第55 回 日本実験動物学会総会 , 仙台 , 5 月 (2008).
29. 本多 新 , 廣瀬 美智子 , 井上 貴美子 , 樋浦 仁 , 三木
洋美 , 越後貫 成美 , 杉本 道彦 , 阿部 訓也 , 篠原 美都 ,河野 友宏 , 篠原 隆司 , 小倉 淳郎：“ マウス発育期卵子の効率的な調製と体外発育法の開発 ”, 第 55 回日
本実験動物学会総会 , 仙台 , 5 月 (2008).
30. 越後貫 成美：“ 実験動物の未熟精子を用いた受精について ”, 第 4 回東京受精・胚移植研究会 , 東京 , 7
月 (2008).
31. 越後貫 成美 , 三木 洋美 , 井上 貴美子 , 廣瀬 美智子 ,持田 慶司 , 三浦 郁生 , 佐藤 崇裕 , 三瀬 名丹 , 若菜
茂晴 , 栗原 裕基 , 阿部 訓也 , 小倉 淳郎： “ 顕微授精技術を利用した超迅速コンジェニック化技術の確立 ”, 第 101 回日本繁殖生物学会 , 福岡 , 9 月 (2008).
32. 脇阪 紀子 , 井上 貴美子 , 越後貫 成美 , 三木 洋美 , 関
田 洋一 , 花木 賢一 , 赤塚 明 , 金児 - 石野 知子 , 石野史敏 , 小倉 淳郎： “ ３種の過形成胎盤モデルマウス
における胎盤の電顕組織学的形態観察 ”, 第 101 回
日本繁殖生物学会 , 福岡 , 9 月 (2008).
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