研究最前線

細胞内には微小管と呼ばれる管状の繊維が張り巡らされ、その微小管に沿ってさまざまな物質が輸送されることで生体の機能は保たれている。
「細胞内の物質輸送の仕組みを解き明かそうと、多くの研究者は物質の運び手であるキネシンやダイニンに注目して研究を進めてきました。
しかし私はある観察をきっかけに、道路である微小管は柔らかく、構造がダイナミックに変化しており、それが運び手を助けているのではないか、と考えるようになりました」
理研 脳科学総合研究センター（BSI）分子動態解析技術開発チームの武藤悦子チームリーダー（TL）はそう語る。
武藤TLたちは10年以上の試行錯誤の末、世界に先駆けて、ヒトの微小管の材料であるチューブリンの発現系の開発に成功。
その新しい技術を駆使して 柔らかい微小管 の実体に迫ろうとしている。

世界初の発現系で“柔らかい微小管”の実体に迫る■ 微小管の奇妙な振る舞い

経細胞のネットワークを構築する。ヒトが軸索の先端へ運ばれ、逆に軸索の先神経細胞は細胞体から軸索という長の神経細胞には1m に及ぶ長い軸索もあ端から細胞体へも物質が運ばれる必要

い突起を伸ばし、情報を伝える相手のる。神経細胞の複雑なネットワークの構がある。その軸索輸送における道路の細胞との間に配線することによって、神築には、細胞体でつくられたタンパク質役割をしているのが微小管である。微小管に沿って、細胞体から軸索の先端へはキネシン、逆方向へはダイニンとい神経細胞

うモータータンパク質が物質を輸送して細胞体

軸索末端
核

軸索−

ダイニン輸送＋いる（図1）。

1992〜97 年、 ERATO 柳田生体運動子プロジェクト のメンバーだった武藤TL は、微小管の奇妙な振る舞いに気がシナプスキネシン輸送微小管付いた。武藤 TL は、エネルギー物質である ATP の存在下で、キネシンをまぶした蛍光性のビーズ（キネシンビーズ）が1 本の微小管と相互作用する様子を顕微鏡で観察した（図 2）。すると、キネシンダイニンが運ぶ物質

キネシンが運ぶ物質

ビーズが 1 個も付いていない微小管にはキネシンビーズはなかなか結合しないが、1 個結合すると、その近くの領域でキネシン新たな結合が起きやすくなった。結合がダイニン立て続けに起きる結果、一時的に微小管上にキネシンビーズが数珠つなぎに並
チューブリンα−

微小管β＋

図 1 神経細胞における軸索輸送
神経細胞の細胞体からシナプスを結ぶ軸索には、複数の微小管が並んでおり、これらの微小管に沿って、キネシンは細胞体からシナプスへ、ダイニンは逆方向へ物質を運ぶ。

10 R I KE N NE WS 2016 Au gu st

んで移動する 集団登校 のような様相を呈した。しかし、最後のキネシンビーズが離れて1 個も結合していない状態になると、再び微小管にキネシンビーズは結合しにくくなり、次の結合が起きるまで長い時間がかかった。
「この観察結果は、私たちが歩く固い道路とは違って微小管は柔らかく、キネ撮影：STUDIO CAC

武藤悦子（むとう・えつこ）

脳科学総合研究センター
分子動態解析技術開発チーム
チームリーダー1956年、東京都生まれ。理学博士。名古屋大学大学院理学研究科博士課程修了。
愛知県立芸術大学 講師、ERATO研究員などを経て、2000年、理研脳科学総合研究センター（BSI）上級研究員。2004年、
BSIユニットリーダー。2008年より現職。

シンの動きに伴って構造がダイナミック合成経路が複雑なため、試験管内でノ酸を別のアミノ酸に置き換えた変異に変化している可能性を示しています。

チューブリンをつくる発現系は実現不可チューブリンをつくることができる。武

少なくとも、キネシンの結合しやすさと能ともいわれていた。
「私たちは参考文

藤 TL たちは、変異チューブリンから合いう点で微小管は常に同じ状態ではな献もほとんどない中で、手探りで発現系成した微小管ではキネシンやダイニンといのです」と武藤 TL は指摘する。の開発を始めました」の相互作用がどう変化するかを調べ、

香月美穂 研究員（現 福岡大学）、内■ チューブリン発現系の開発に成功

相互作用に重要なチューブリン上のアミ村誠一 研究員（現 ㈱ダイセル）たちをノ酸を次々と明らかにしていった。

柔らかい微小管に興味をかき立てら中心に試行錯誤を重ね、チーム発足か「その一連の研究から、驚くべきことれた武藤 TL は、BSI の研究員となったら 6 年後の 2006 年、出芽酵母を利用しが明らかになりました。その一つは、2000 年から、本格的にその研究に着手て、出芽酵母の単一遺伝子からチューチューブリンのまったく同じ場所が、キした。

ブリンをつくる発現系の開発についに成ネシンの運動とダイニンの運動の両方に功した。

必要だったことです」■ 発現系で重要なアミノ酸を特定-H12 ループ という4 個のアミノ酸から微小管は、αチューブリンとβチューブリンという2 種類のタンパク質が重合したペアが基本単位となり、太さ 25nm

そ れ は、αチ ュ ー ブ リン の H11′

微小管にキネシンビーズが 1 個結合す成る場所だ（図 3）。
「そのうちの 1 個であると、その近くで結合が起きやすくなっるグルタミン酸を別の種類のアミノ酸にαチューブリンとβチューブリンにはたのはなぜか。その謎に迫るため、武藤置き換えると、キネシンとダイニンの両それぞれ複数の遺伝子がある。武藤 TL

TL たちはキネシンやダイニンの結合や方とも、運動のエネルギー源である ATPが BSI で研究をスタートした当時、試験運動に必要なチューブリン上のアミノ酸を加水分解することも、微小管上を動く管内で単一遺伝子から特定の種類の群を特定する実験を始めた。

こともできなくなってしまったのです。

（1nm＝10 億分の 1m）ほどの筒状の繊維をつくっている（図1）。

チューブリンを発現させて微小管を合成開発した発現系を用いて、特定の場チューブリンはαとβを合わせて 900 個する技術が世の中にまだなく、実験では所に変異を入れた遺伝子を発現させる以上のアミノ酸から構成されています

主にウシやブタの脳から生化学的に精製ことで、チューブリン分子の特定のアミが、そのうちのたった 4 個でできたルーした微小管が使われていた。
「食肉処理場でウシやブタの脳を分け＋てもらい、2日間かけて脳から微小管を抽出します。しかし脳のチューブリンにれが、さまざまな化合物が付く 翻訳後修飾 を受けるため、全部合わせると20②種類以上のチューブリンが入り混じった微小管で実験をすることになります。αとβがそれぞれ単一種類のチューブリンでできた微小管を使って実験ができるよ
うにならないと、 柔らかい微小管 の実体に分子レベルで迫ることができません」③

微小管は複数の種類があることに加え、それぞ①

図 2 キネシンビーズと微小管の相互作用

出典：J. Cell Biol.,168,691-696 (2005).

−

ATP を加えた状態で、キネシンビーズが 1本の微小管と相互作用する様子を1秒間隔で連続撮影し、時間順に並べたもの。
微小管に初めて結合したキネシンビーズの位置を赤色、その後、微小管を移動する時々刻々の位置を黄色で示している。
①のキネシンビーズの近くの領域に②が結合し、続いて②の近くに③が結合し、同様のことが繰り返し起きた結果、最後のフレームでは微小管の＋端付近に複数のキネシンビーズが数珠つなぎに並んだ。

R I K E N N E W S 2 0 1 6 Au g u s t 11

研究

最キネシンの場合

前線
ダイニンの場合

H11′-H12 のループ

図 4 神経疾患とその発症原因となるチュー
ブリン遺伝子
神経疾患

βチューブリンαチューブリン

チューブリン遺伝子

滑脳症

TUBA3（α 1A）

筋萎縮性側索硬化症（ALS)

TUBA4A（α 4A）皮膚の発達異常（Kunze type）

TUBB（β 1）

多小脳回症

TUBB2B（β 2）3 型先天性外眼筋繊維症（CFEOM3）

TUBB3（β 3）大脳皮質形成異常

TUBB3（β 3）

小頭症

TUBB5（β 5）

図 3 ダイニン・キネシンの運動に必要なアミノ酸
酵母チューブリンの変異解析により、ダイニンとキネシン、それぞれのモータータンパク質が運動するのに必要な微小管上のアミノ酸群が明らかになった。どちらのモータータンパク質も、ATP を分解して微小管上を動くには、αチューブリンの H11′-H12 のループ（マゼンタ）にあるアミノ酸との結合を必要としていた。オレンジ色で示されたβチューブリンのH12 のアミノ酸群は、運動を安定化する補助的な役割を担う。に比べて精製効率が 100 倍近く向上し、生化学の実験が格段に容易になった。

プが、キネシンの運動とダイニンの運動とは縁遠い分野だと思っていましたが、の両方に決定的な役割を果たしている

CFEOM3 の発症に関与するアミノ酸群のです」

は、私たちが示したキネシンと微小管のヒトチューブリンの発現系を使った、相互作用に必要なチューブリンのアミノ

武藤 TL たちの最新の研究成果を紹介し酸群とほぼ一致していたのです」

よう。

生物進化の過程で、キネシンとダイニンは、それぞれ G タンパク質と AAA ファ■ 分子から神経細胞、脳へ

ミリーATPase というタイプの異なるタン

ダイニンの場合も同様に、武藤 TL た「神経変性疾患 CFEOM3 の遺伝子変パク質 群から生まれ たため、構 造もちがダイニンの運動に必須であると同定異に対応するアミノ酸は、これまで私たATP を加水分解する仕組みも異なり、したチューブリンのアミノ酸に変異が起

ちが変異解析で明らかにしたアミノ酸群共通点がほとんどない。
「それにもかかこると、滑脳症など重篤な脳の発達障害とだいたい一致していたのですが、異なわらずどちらも、αチューブリン上のが起きることを、神経疾患の研究者が報るものもありました。その一つがβ3かつのうH11′-H12 ループとの結合を必要として告している。
「ますますもって、微小管チューブリンの 262 番目にあるアルギニいることは、微小管には単なる道路以上は単なる道路以上の重要性を持っていン、R262 です」の機能があることを示唆しています。私ることが分かってきたのです」

は、H11′-H12 ループは微小管が構造変化を引き起こすスイッチかもしれないとタンパク質を構成するアミノ酸（アミノ酸残基）のうち、アルギニンやリジン■ ヒトチューブリンの発現系を開発

はプラス電荷を持ち、アスパラギン酸や想像しています。キネシンやダイニンがチューブリンの変異が神経疾患に関グルタミン酸はマイナス電荷を持つ。キH11′-H12 ループに結合すると、このス与していることを知った武藤 TL たちは、ネシンと微小管の相互作用には、キネシイッチがオンになって微小管側の構造

ヒトのチューブリン発現系の開発に挑戦

ン表面のプラス電荷を持ったアミノ酸変化を引き起こし、ほかのキネシンやダすることにした。
「ヒトのチューブリンをと、微小管側のマイナス電荷を持ったアイニンが結合しやすい状態になるのかも合成できるようになれば、神経疾患の研ミノ酸の結合が重要とされ、微小管側のしれません」

究に役立つだけでなく、チューブリンをアミノ酸としては例外的なプラス電荷の標的とした抗がん剤の開発などにも利用

R262 は見逃されていた。

■ チューブリン変異が神経疾患の原因に意外な展開もあった。チューブリンとが可能になり、基礎から応用まで幅広い分野に貢献できます」

箕浦研究員は、R262 のアミノ酸を、CFEOM3 の患者によく見られるようにヒトの神経疾患との関連性だ（図 4）。
「私酵母に比べ、ヒトのチューブリンは合電 気的に中性のアミノ酸に置き換え

たちはキネシンの運動に必要なチューブ成の分子回路が複雑で、発現系の開発（R262A）、顕微鏡下でキネシンと変異リンのアミノ酸群についての研究成果

みの うら いつ しはちは困難を極めた。箕浦逸史 研究員、八くぼ

あゆ かわ

微小管の相互作用を調べた（図 5B 中央）。

を、2006 年と2010 年に論文発表しまし久保 有 研究員、鮎川理恵 技術員たち「R262A の変異が入ったチューブリンた。2 報目の発表と同じころ、ハーバーが力を合わせ、バキュロウイルスを利用から成る微小管に、キネシンは結合できド大学の研究グループが、3 型先天性外してヒトのチューブリン遺伝子を昆虫細ませんでした。微小管表面のアミノ酸と眼筋繊維症（CFEOM3）という神経発胞で発現させる手法で、ついに 2013 年、しては例 外的なプラスの電 荷を持つ達障害はβ3 チューブリン遺伝子の変異世界に先駆けてヒトチューブリンの発現R262 が、キネシンとの相互作用に重要が原因である、という論文を発表しまし系の開発に成功した。その新しい発現とは、私たちにとって意外な発見でした」

た。神経疾患の研究は、私たちの研究

系は従来の出芽酵母を利用した発現系と武藤 TL。

がいがん きん

12 R I KE N NE WS 2016 Au gu st

A

キネシン

キネシンの運動軌跡
左脳側（試験管内）−マウスの脳梁形成（胎仔マウスの脳断面）

先天性外眼筋繊維症に伴う神経発達異常の仕組みを2015年1月12日プレスリリース
軸索の先端−− R262 −−＋

2016年1月18日プレスリリース
解明

引き合う

B

右脳側

5秒＋＋ D279 ＋＋

β3チューブリン

関連情報

ダイニン分子モーターの活性化機構の解明に向け大きく前進

5μm
β3 チューブリン側のプラス電荷 R262 とキネシン側のマイナス電荷 D279 が引き合い結合する（左）。正常なキネシンの運動（中）と、正常なマウスの脳梁形成（右）。

キネシン−＋＋ D279 ＋＋
反発し合う−− R262A −−

を進めるつもりなのか？

中性
変異チューブリンC

β3 チューブリン側のプラス電荷 R262 を中性アミノ酸に置き換えると（左）、キネシンの運動は起こらなくなった（中）。この変異チューブリンをマウス胎仔の脳に発現させたところ、軸索の伸長が損なわれ脳梁の形成不全が見られた（右）。

「生化学実験にも応用可能なチューブリンの大量発現系ができ、 柔らかい微小管 の実体に迫る実験が、ようやく実変異キネシン＋現可能になりました。その手始めとして＋＋ D279R ＋＋

私たちは今、微小管が何通りの構造を取引き合う−− R262A −−
中性変異チューブリン

500μm
さらにキネシン側のマイナス電荷 D279 をプラス電荷のアミノ酸に置き換えると（左）、変異キネシンは変異微小管上を運動することができた（中）。変異チューブリンと変異キネシンの両方を発現させたマウス胎仔の脳では、脳梁の軸索伸長はほぼ正常なレベルに回復した（右）。
画像出典：Nat. Commun.,7,10058 (2016).

り得るのか調べようとしています。これまで、間接的なデータから推測するしかなかった微小管の複数の構造を、分子レベルで定義することが、 柔らかさ の実体を明らかにする第一歩だと考えます」
そのスタートラインに立てるようにな

図 5 キネシンの運動とマウスの脳梁形成の関係を調べる実験

るまでに 10 年以上の歳月を要してまで、

し も ごおり

この結果を当時すでに知られていた究チーム（下 郡 智美 TL）との共同研究

ヒトチューブリンの発現系の開発にこだ構造データと見比べ、箕浦研究員たちに発展した。R262A の変異を導入した

わった武藤 TL は、「実現不可能ともいわは、微小管上で例外的なプラス電荷でチューブリンを胎仔マウスに発現させるれた技術の開発に取り組んだのは、大きある R262 は、キネシンの L12 ループにと、CFEOM3 の患者で見られるように、なギャンブルでした」と振り返る。

ある、キネシン上では例外的なマイナス左右の脳をつなぐ脳梁という場所の軸索何が武藤 TL を支えたのか。
「進歩は、電荷のアスパラギン酸 D279と結合しての 長さが 短くなること、し かし 変 異新しい手法、技術ができたときに起きまいるのではないかと考えた（図 5A 左 ）。

チューブリンと同時に変異キネシンも発す。本当の進歩をもたらしたいという強電気的性質の点で例外的なアミノ酸同現させた場合には、脳梁の軸索の長さい思いが、心の支えになりました。最近、たい じの う りょう

士が静電的に引き合っているのではないはほぼ正常なレベルに回復することが分細胞内輸送における微小管の役割が研かと想像したのである。

かった（図 5C 右）。

究者の関心を集めるようになり、私たち「もしその推理が正しければ、キネシ「変異微小管と変異キネシンを同時にの開発したチューブリン発現の技術をン L12 のマイナス電荷の D279 をプラス発現させ、両者の分子間の相互作用を使って、世界中の多くの研究者たちが実電荷のアミノ酸（D279R）に変えてやれ回復させると、軸索の伸長も正常に戻っ験を始めています」

ば、変異キネシンは変異微小管上を動たのです。分子レベルの実験で得られ「キネシンやダイニンが微小管に沿っけるようになるかもしれません。まさにた知見を、BSI 内の共同研究により、神て物質を運ぶとき、道路である微小管の“割れ鍋にとじぶた”です（図 5C 左）。実経細胞や脳のレベルの現象と関連づけ側もダイナミックに構造を変化させてい際に試してみると予想は的中し、この変ることができました。これからもBSI 内るのではないか？ これは常識外の考え異を持つキネシンは、R262A 変異チュー

外の研究室と協力して、異なる階層で方で、これまで多くの研究者から否定さブリンでできた微小管の上を動くことが起こる現象を統合的な視点で解き明かれてきましたが、研究の発展とともに、できました！（図 5C 中央）」と武藤 TL はしていきたいと思います」

それが当たり前のことになる時代はもうすぐでしょう」

解説する。
この結果はさらに BSI の神経成長機構■ 本当の進歩は新しい技術がもたらす研究チーム（上口裕之 TL）、視床発生研チームは今後、どのような方向に研究

かみぐち（取材・構成：立山 晃／フォトンクリエイト）

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