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技術解説：ペプチド合成とDL分析についてラセミ化とは 炭素原子には4つの結合手があるが、その4つの手に結合する原子がすべて異なる場
合、その分子はキラリティ（不斉）を持つという。
 キラリティを持つ分子は、右手と左手のように互いに鏡像である1対の立体異性体を持ち、これを鏡像異性体（エナンチオマー：Enantiomer、対掌体）と呼ぶ。対掌体は偏光面の回転方向を除けば全く同じ物理的・化学的性質を持っている。
 立体異性体のうち、鏡像異性体でないものをジアステレオマーという。通常行われているHPLCによる標識試薬による分析は、ジアステレオマーの分離分析である。
 鏡像異性体の関係にある分子は、一方をL体、もう一方をD体と呼び区別する。アミノ酸は天然ではL体であるが化学合成ではD体もできる。
 化学合成の過程でL体、D体の等量混合物が生成されることをラセミ化という。

ペプチドの構成アミノ酸の一部がラセミ化すると、HPLC で完全に区別することはできない
生物学的作用は構造に依存するため、D体・L体の定量分析は重要である
ハイペップ研究所のロゴはアミノ酸の分子が鏡に映っているところを示している。原子の並び方によって鏡像異性体ができる。図のように半透明の鏡扉に写っている分子を詳しく見るため、この扉を開き、分子認識を解明するのがハイペップ研究所の技術ノウハウである。

ペプチド含量、アミノ酸分析、エナンチオマーラベリング法
ペプチドには付着水や酸あるいはNaなどの塩が共存している場合が多く、実際のペプチドの含有量を正確に知るには、質量分析やシーケンサーでは不可能で、アミノ酸組成分析が不可欠である。エナンチオマーラベリング法（ELAB法）は、ペプチド、タンパク質中のSer, Thr, Trp, Tyrなども含めすべてのアミノ酸を正確に定量分析できる方法である。
本法は、醗酵生成物や食品の検定、加齢や疾病の解明研究のための生体組織・体液分析にも威力を発揮する。

開発から30年経って重要視されてきたDL分析の歴史
1980年頃：ドイツでDL分析法の開発が始められる。ドイツから帰国したハイペップ研究所の創業者はその後、島津製作所で自動DL分析装置を開発したが、なかなか広まらなかった
2000年頃：その後も軒原らは改良を続け、装置販売から受託分析に移行。当時盛んに行われたコンビケムで使われる非天然アミノ酸にまで、当該分析法の適応範囲を拡張した
2010年頃：当該分析法はFDAのGLP／GMP承認を得た（バリデーション確立）さらに、同一システムを用いて微量検体に残存する水分定量、有機溶媒・有機酸（残存TFA）の定量もGLP/GMP承認を得た

アミノ酸組成、エナンチオマー分析法に関する基礎的論文／過去の資料

エナンチオマーラベリング法を用いた自動の分析システム(2000)

Frank, H, et al. Rapid gas chromatographic separation of amino acid enantiomers with a novel chiral stationary phase, J. Chromatogr. Sci., 15,174-176, 1977
Frank, H, et al. Enantiomer labeling, a method for the quantitative analysis of amino acids J. Chromatogr., 167,187-196, 1978
Gerhardt, J, et al. Automated Pre-Column Derivatization in Gas Chromatography Amino Acid Analysis via Enantiomer Labelling: An application ofAutoderivat 100, Chromatographia, 19, 251-253, 1984
Frank, H, et al. Quantitative Gas Chromatography Using a New Automated Derivatizer, J. High Resolution Chrom. & Chrom. Comm, 8, 411-414, 1985
Bayer, E, et al. Capillary Gas Chromatographic Analysis of Amino Acids by Enantiomer Labelling, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 70, 234-240, 1987
軒原清史他, エナンチオマーラベリング法による新規のＤ／Ｌおよび定量アミノ酸分析システム,島津評論,48, 247-252, 1991
Nokihara, K, et al. Instrumentation and Applications of a Novel Amino Acid Analyzer, Frontiers and Horizons in Amino Acid Research, ed. K. Takai, Elsevier
Science Publishers BV, Amsterdam, The Netherlands, 391-395, 1992
Gerhardt, J, et al. Design and applications of a novel amino acid analyzer for D/L and quantitative analysis with the use of gas chromatography. In: Smith, JA
and Rivier, JE, editors. Peptides: Chemistry, Structure and Biology. Leiden: Escom Science Publishers BV p 531-532, 1992
Gerhardt, J and Nicholson, GJ. Unambiguous determination of the optical purity of peptides via GC-MS. In: Hodges, RS and Smith, JA, editors. Peptides:Chemistry, Structure and Biology. Leiden: Escom Science Publishers BV, p 241-243, 1994
Schurig, V, et al. Gas-chromatographic enantiomer separation of proteinogenic amino acid derivatives: Comparison of Chirasil-Val and Chirasil-γ-Dex used aschiral stationary phases. Enantiomer, 4,297-303, 1999
Nokihara, K., and Gerhardt, J., Development of an Improved Automated Gas-chromatographic Chiral Analysis System: Application to Non-natural Amino
Acids and Natural Protein Hydrolysates, Chirality, 13, 431-434, 2001（株）ハイペップ研究所 〒602-8158 京都市上京区下立売通千本東入中務町486-46
TEL: 075-813-2101, FAX: 075-801-0280, E-mail: info@hipep.jp, URL: http://www.hipep.jp/

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エナンチオマーラベル法によるアミノ酸組成分析とキラル分析
ペプチド・タンパク質の構成ユニットはアミノ酸組成分析のためにペプチド結合を切断する➡ 加水分解でバラバラにしたアミノ酸を分析する
アミノ酸の種類
Amino acid 1 , Amino acid 2アミノ酸の比率アミノ酸の絶対量 → ペプチド含量

一般の分析方法

Amino acid 1

Amino acid 2ペプチド結合問題点① 微量分析ではコンタミネーションが問題となる② Trp, Tyr, Ser, Thr, Met, Cys: 正確にでない③ Ile-Ile, Val-Val など加水分解されにくい配列(1) 酸加水分解 6N HCl, 110°C, 24 hrs (標準条件)(2) 検出、分析
分離 → 誘導体化 → 検出 (ポストカラム誘導体化)
誘導体化 → 分離 → 検出 (プレカラム誘導体化)※加水分解中にもラセミ化は起きる（配列特異的）誘導体化せずにそのまま分離*※逆相HPLCではD/L体を完全に区別できない

エナンチオマーラベリング法（ELAB）
各々の鏡像異性体（エマンチオマー）を内部標準にする
段階的誘導体化：
Fully automated pre-column derivatization
アミノ酸キラル分析受託サービス

http://hipep.jp/?p=1127

1st. Step:

エステル化

2nd. Step:

アセチル化

セントラルドグマ
DNA

ｍRNA

GCによる分離・定量

tRNA
Proteins/Peptides

L-Amino Acid

ラセマーゼ*

ラセミ体含有*真核生物はラセマーゼを持っていない。腸内細菌が産生する。

原料はOK ?
ジェネリックペプチドの品質管理？

ペプチド化学合成
ラセミ体は活性が大きく低下することが有る

配列特異的ラセミ化
合成条件によりラセミ化
後処理・精製中にラセミ化※アルカリ条件下で加熱すると容易にラセミ化下手な合成

HPLC single
peakならOK?

周辺機器：ハイスループットで確実な加水分解
Standard: 110°C 24 hrs 空気遮断
加水分解の温度は高くても、低くてもラセミ化を起こし易い*迅速加水分解法：Nokihara, K., Tominaga, Y., Kitagawa, A., Hirata,
A. and Kasama, T. Peptide Science 2015, The Japanese Peptide
Society, pp 69-72, 2016

Hydrolysis resistant 配列: Ile-Ile, Val-Val etc
110°C 24 hrs
110°C 48 hrs
外挿法で求める
110°C 72 hrs

商品名：AHST-16

同時多種加水分解・誘導体化システム

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