保健科学研究 9(2)：27―33，2019【原著】
弘前市周辺の河川等の水系における汚染状況
工藤美里*1

吉岡翔*1 吉田千賀雄*2

藤岡美幸*3（ 2018 年 12 月 20 日受付， 2019 年 3 月 4 日受理）
要旨：病原微生物に汚染された水の摂取により起こる感染症を水系感染症といい，現在の日本では低頻度ながらも発生の報告がある。本研究では 2018 年 6 月から 2018 年 8 月にかけて弘前市周辺から採取された河川水 20 検体を対象として，水系感染症および食中毒の主要な原因菌である Escherichia 属，Campylobacter 属，Vibrio 属について調査した。調査の結果，18 検体から E. coli が検出された。E. coli 未検出の 2 検体の塩分濃度はいずれも高値を示し，高濃度域での発育抑制が示唆されたが，一方で高濃度で E. coli 検出を認めた検体もあったことから，E. coli が発育可能な塩分濃度について詳細な調査が必要であると考えられた。また，E. coli 検出時における HI ブイヨンの前培養温度を 37℃から 40℃へ変更した結果，E. coli 検出率が増加したことから，前培養温度は 40℃がより適切であると考えられた。さらに，対象河川水 3 検体から astA 遺伝子を持つ E. coli が検出され，河川水を飲用することによる水系感染症発生の危険性が予想された。
キーワード：弘前市周辺河川，水系感染症，Escherichia 属，astA 遺伝子

Ⅰ．はじめに容量 100 mL の滅菌瓶を水中に横向きに入れ，直接採水を行った。採水時には，採水日時および時間，河川名およ病原微生物に汚染された水の摂取により起こる感染症

び採水地点名，採水者名，前日および当日の天候，気温おを水系感染症という 1)。近年の日本では上下水道の普及によび水温，塩分濃度（塩分計，測定範囲 0～10.00 ppt，ニ伴い，水系感染症の発生は著しく減少したものの，現在もッコー・ハンセン），pH（pH メーター，測定範囲-2.00～19.99，

低頻度ながら発生の報告がある 2,3)。我が国における飲料水アズワン），試料の外観およびその他の備考を測定し記録しの汚染事故の主要な原因菌である下痢原性大腸菌およびカた。

ンピロバクターによる感染は，井戸水や湧水の飲用による

2）採水後の処理ものが多い 4,5)。一方，食品の摂取により発症する食中毒の硬質ガラス製ロートおよび定性濾紙 No.2（ADVANTEC）

うち，我が国において主要な原因菌である腸炎ビブリオ 6)を用いて検体を濾過したものを濾液検体とした。1.5 mL チは，河口域～沿岸域に存在する 7)。弘前市周辺では河川等

ューブ 3 本に濾液検体を 1 mL ずつ分注し 3,000 rpm，5 分の水系汚染について，その調査が積極的に行われていない間遠心し，上清を捨てた沈渣成分を濃縮検体とした。沈渣

ことから，本研究では，弘前市周辺を中心に河川等の汚染

量は Escherichia 属検査用を 100 μL，Campylobacter 属検査

状況を把握するために，河川等の水を対象として，用を 500 μL，Vibrio 属検査用を 100 μL とした。

Escherichia 属，Campylobacter 属，Vibrio 属について調査し

3）Escherichia 属の検査手順た。

濾液検体 1 mL を EC ブロス（栄研）10 mL に接種し，40℃，24 時間培養した。同時に，濃縮検体 0.1 mL を HI ブ

Ⅱ．対象および方法イヨン（ニッスイ）2 mL に接種し，37℃（検体 7 以降は1．対象河川水40℃に変更），24 時間前培養後，HI ブイヨン 1 mL を EC

対象は 2018 年 6 月から 2018 年 8 月までに弘前市，能代

ブロス 10 mL に接種し 40℃，24 時間培養した。その後の市，八戸市および青森市で採取された河川水 20 検体とした。

手順は共通であり，EC ブロスを EMB 培地（栄研）に 1 白2．方法

金耳塗抹し，37℃，24 時間培養した。EMB 培地上の金属1）採水法

光沢を伴うコロニーは Escherichia coli を疑い， E. coli 16S*1 弘前大学医学部保健学科 検査技術科学専攻
Hirosaki University Graduate School of Health Sciences〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*2 弘前大学大学院保健学研究科 博士前期課程
Hirosaki University Graduate School of Health Sciences〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-33-5111
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japan*3 弘前大学大学院保健学研究科
Hirosaki University Graduate School of Health Sciences〒036-8564 青森県弘前市本町 66-1 TEL:0172-39-5970
66-1, Honcho, Hirosaki-shi, Aomori, 036-8564, Japanⓒ2019 Health sciences Research.

rRNA を標的とした PCR を実施した。ここで E. coli と同定されたものは，さらに下痢原性大腸菌関連遺伝子を標的とした PCR を実施した。EMB 培地上の金属光沢を伴わない無色透明なコロニーはソルビトールマッコンキー培地（ニッスイ）に塗抹し，37℃，24 時間培養した。ソルビトールマッコンキー培地上の無色透明なコロニーは Escherichia
albertii を疑い，PCR による同定を進めることとした。今回，PCR による同定まで至ったのは E. coli のみであったため，

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弘前市周辺の河川等の水系における汚染状況

表1

使用プライマー塩基配列

実際に使用した E. coli 関連遺伝子のプライマー塩基配列をた。いずれの遺伝子検索も 1 検体当たりの PCR 反応量は滅表 1 に示す。

菌 蒸 留 水 18.375 µL ， 10 × ExTaqTM buffer(TaKaRa)

4）Campylobacter 属の検査手順

2.5 µL， dNTP mixture(TaKaRa)1 µL， 10×5 U Ex Taq TM

濃縮検体 0.5 mL をボルトンブイヨン（関東化学）2.5 mLpolymerase(TaKaRa) 0.125 µL，テンプレート 2.5 µL，25 µMに接種し，ウマ血 150 μL およびボルトンサプリメント（関プライマー各 0.25 µL とし，全量を 25 µL とした。PCR の東化学）30 µL を加え，37℃，24 時間微好気培養（アネロ

条件は，前熱変性を 94℃1 分間行い，熱変性 94℃1 分間，パック，三菱ガス化学）した。ボルトンブイヨンを 1 白金

アニーリング 60℃1 分間，伸長反応 72℃1 分間を 25 サイク

耳バツラー培地（関東化学）に塗抹し，37℃ ，48 時間微ル，最終伸長反応を 72℃10 分間行った。PCR 産物はエチ好気培養後，培地上のコロニーについてグラム染色を行い，ジウムブロマイド加 2.5%アガロースゲルにて 100V 30 分らせん状の陰性桿菌を確認した。その後はオキシダーゼ試間電気泳動（Mupid-21，コスモバイオ社）を行い，UV 照験を実施し，陽性の場合には馬尿酸塩加水分解試験 16)およ射にて遺伝子の存在を確認した。

び PCR により種の同定を行った。
5）Vibrio 属の検査手順
3%NaCl 加アルカリペプトン水（ニッスイ）3 mL に濃縮検体 0.1 mL を接種し，37℃，24 時間培養後，アルカリペプトン水を 1 白金耳 TCBS 培地（ニッスイ）に塗抹し，37℃，24 時間培養した。培地上のコロニーについてオキシダーゼ試験を実施し，陽性の場合には PCR により種の同定を行った。
6）PCR
各選択培地上のコロニーを HI 寒天培地に塗抹し，37℃，24 時間分離培養した。培地上の 1 コロニーを TE buffer（pH8.0，和光純薬工業）1.0 mL に懸濁し，100℃5 分間加熱後 10,000 rpm で 5 分間遠心した上清をテンプレートとしⓒ2019 Health sciences Research.

図1

検出結果

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工藤，吉表2岡，吉田，藤岡

各検体の測定結果

Ⅲ．結果

検体からは E. coli の検出は認められなかった（図 3）。対象

対象河川水全 20 検体から，前培養検体では 12 検体，前河川水 3 検体のべ 4 検体（前培養検体 2 検体，EC ブロス

培養なしの EC ブロス単独培養検体では 14 検体の E. coli

単独培養検体 2 検体，うち 1 検体は同一検体）から，astAが検出された。E. albertii，Campylobacter 属，Vibrio 属は未遺伝子を持つ E. coli が検出された（図 2）。

検出であった（図 1）。各検体の測定結果を表 2 に示す。今Ⅳ．考察

回，検体 1～6 までは HI ブイヨンの前培養温度を 37℃に設

E. coli の検出法として，検体を EC ブロスに接種し培養定していたが，検体 7 以降は 40℃に変更した。E. coli 検出後，EMB 培地に塗抹・培養する方法 17)が報告されている

率は，前培養温度 37℃の場合の前培養検体では 50%，ECが，本研究では検体中の菌量が少ない場合の検出率を高めブロス単独培養検体では 83%であった。また，前培養温度るために，検体を HI ブイヨンで前培養した後に EC ブロス40℃の場合は前培養検体および EC ブロス単独培養検体とに接種する方法を併用した。E. coli 検出率は，HI ブイヨン

もに 64%であった。さらに，青森市の浅虫海水浴場付近 2の前培養温度が 37℃の場合には，EC ブロス単独培養検体が前培養検体よりも高くなった。一方で，HI ブイヨンの前MPC

NC12培養温度が 40℃の場合には，EC ブロス単独培養検体と前3培養検体とで E. coli 検出率は同様であった。
このことから，前培養温度が 37℃の場合では，E. coli 以外の菌が増殖し，目的とする E. coli を検出できない可能性が考えられる。E.
coli は腸内細菌科の他の菌種と比較して熱に抵抗性を持つ
18,19)ことから，E.

coli 以外の菌を抑制するために前培養温度は 40℃がより適切であると考える。また，EC ブロス単独培養と HI ブイヨンで前培養を行う方法のどちらがより←astA
図 2 PCR による遺伝子検索結果の一例
M ：Marker (100-bp ladder)

適した検査手順であるかについては検討が必要であり，今後検体数をより増やして調査する必要があると思われる。
今回，いずれの検査手順でも E. coli が検出されなかった

PC：陽性コントロール（astA, 106 bp）

検体は全 20 検体中 2 検体であり，これらの塩分濃度はいずNC：陰性コントロール

れも 10.00 ppt(1.00%)以上であった。これは，E. coli がよく1, 2：astA 陽性株発育する普通寒天培地の塩分濃度 5.00 ppt(0.50%)20)の 2 倍以上の値である。仲山 21)によると，E. coli は非好塩菌に分ⓒ2019 Health sciences Research.

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弘前市周辺の河川等の水系における汚染状況

図 3 各採水地点での E. coli 検出結果

ⓒ2019 Health sciences Research.

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工藤，吉岡，吉田，藤類され，塩により増殖が阻害されるが，本研究においても引用文献

高塩分濃度域での E. coli の発育抑制が示唆された。一方で

1)

今回，塩分濃度 10.00 ppt 以上で E. coli 検出を認めた検体も東京都健康安全研究センター：くらしの健康.
http://www.tokyo-eiken.go.jp/assets/issue/health/05/2-1.ht

あった。石田ら 22)が人工海水用いて海水環境における E.
coli の増殖及び耐塩性誘導ついて調査した研究では，E. coli

岡ml(2018-11-27)
2)

奥沢英一，濱田篤郎：開発途上国における水系感染症

は酵母エキスのような有機物の存在によって耐塩性が誘導とその実態. J Natl Inst Public Health, 49(3):236-244,

され，河口周辺や海水のような高塩分濃度環境に適応する2000.

ことができ，また耐塩性の保持に有効な人工海水の成分を

3)

金子光美：水の安全性と病原微生物－その歴史と現状，検討した結果，浸透圧を維持する NaCl と Mg イオンおよ

そして未来. モダンメディア［水中の健康関連微生物

び Ca イオンの共存が必要であったと報告している。したシリーズ］，52(3):76-83, 2006.

がって今回高塩分濃度域で E. coli 検出を認めた検体では，

4)

厚生労働省：水質汚染事故等の発生状況.

上記のような有機物やイオンの含有条件が整っていたため，

https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/topics/bu

E. coli が存在可能であったと推測される。

kyoku/kenkou/suido/kikikanri/03.html(2018-11-27)

さらに今回，対象河川水 3 検体のべ 4 検体から astA 遺伝5)子を持つ E. coli が検出された。これらは河川水の pH が6.66~7.24 域で検出され，他水域より低い pH であった。E.

山堂，東京，2013.
6)coli は発育可能な pH 域が pH4~10 であり，さらに低い pHにも抵抗性がある 18)とされることから，今回の pH 域につ岡田淳，設楽政次，他：臨床検査学講座 微生物学／臨床微生物学. pp164-166，医歯薬出版，東京，2010.

7)

いて E. coli の生育に影響はないものと考える。ヒトに下痢症を引き起こす E. coli はその病原性の違いから，腸管出血

吉田眞一，柳雄介，他：戸田新細菌学. pp214-215，南中込治，神谷茂：標準微生物学. p221，医学書院，東京，2015.

8)

Sabat G, Rose P, et al.:Selective and sensitive rnethod for性，腸管病原性，腸管毒素原性，腸管組織侵入性，腸管凝PCR amplification of Escherichia coli 16S rRNA genes in

集付着性の 5 種類に大別される 5)。astA 遺伝子は耐熱性エ

Soil. Appl Environ Microbiol, 66(2):844-849, 2000.

ンテロトキシン EAST-1 をコードし、腸管凝集付着性の E.
coli も保有されるが，他の E. coli も保有するとの報告もある 23)。また健常人から検出されるとの報告 23)がある一方で，

9)

小林一寛：腸管出血性大腸菌の PCR 法による検出. 臨
床と微生物，18:507-513, 1991.

10) Yatsuyanagi J, Saito S, et al.:Characterization of entero-

単独でのアウトブレイクの報告 24)もある。涌島ら 25)は，astA

pathogenic and enteroaggregative Escherichia coli isolated

遺伝子を持つ E. coli が下痢原性を発揮するには，腸管定着from diarrheal outbreaks. J CIin Microbiol, 40(1):294-297,因子を併せ持つ必要があり，健常人から検出される場合に2002.

はこの定着因子を持たないために，通過菌として作用する

11) Gunzberg ST, Tornieporth NG, et at.:Identification ofのではないかと述べている。また，Vila ら 26)は astA 遺伝子

enteropathogenic Escherichia coli by PCR-based detection

保有菌と下痢症との間に有意な関連性があると報告していof the bundle-forming pilus gene. J Clin Microbiol,る。astA 遺伝子保有菌による下痢症発生の機序については

33(5):1375-1377, 1995.

未だ明らかでない部分も多いが，各下痢原性大腸菌も保有

12) Ratchtrachenchai OA et al.:lnvestigation on enteroaggrega-しているとの報告 23)もあることから，下痢症に関与していtive Escherichia coli infection by rnultiplex PCR. Buitる可能性は否定できない。よって，河川水を直接飲用する

Dept Med Sci, 39:211-220, 1997.

ことで，菌量が多数であればもちろん，たとえ微量であっ

13) Pollard DR, Johnson WM, et al.:Rapid and specificても astA 遺伝子保有菌が体内に取り込まれ，単独での増菌

detedction of verotoxin genes in Escherichia coli by the

あるいは他菌との共生により，水系感染症が発生する危険

polymerase chain reaction. J CIin Microbiol, 28(3):性が予想された。

540-545, 1990.

今後は河川の上流，中流，下流別検体や，井戸水や湧水

14) Schultsz C, Pool GJ, et al.:Detection of enterotoxigenic

由来の検体など，様々な条件下での水系検体を対象に調査

Eseherichia coli in stool samples by using nonradioactivelyを進めることで，弘前市周辺の水系における汚染状況がよlabeled oligonucleotide DNA probes and PCR. J Clin

り明らかになると考えられる。

Microbiol, 32(10):2393-2397, 1994.
15) 伊藤文明，荻野武雄，他：混合プライマーを用いた PCR

利益相反 本論文に関して，開示すべき利益相反はありません。

による下痢原性大腸菌の病原因子の同時検出法. 日本臨床，50:343-347, 1992.
16) 藤岡美幸，大友良光，他： Campylobacter jejuni と C. coliを同定する馬尿酸塩加水分解試験に用いる至適菌濃ⓒ2019 Health sciences Research.

31弘前市周辺の河川等の水系における汚染状況

度. 医学検査，63(2):168-172, 2014.
17) 一戸正勝，金子精一，他：図解 食品衛生学実験. p52，
講談社，東京，2004.
18) 坂 崎 利 一 ： 新 訂

食水系感染症と細菌性食中毒.

p210-297，中央法規出版，東京，2000.
19) Ryan M, Oanh N, et al.:Functional Analysis of Genes Comprising the Locus of Heat Resistance in Escherichia coli.
Appl Environ Microbiol, 83(20):1400-1417, 2017.
20) 日水製薬製品コード：普通寒天培地（顆粒）. https://cosmokai.com/youran/05514.pdf(2018-11-27)
21) 仲山英樹：好塩菌の塩ストレス適応機構とその応用.
生物工学，90(11):696-700, 2012.
22) 石田昭夫，上野友美：海水環境における大腸菌の増殖と耐塩性誘導. Microbes Environ, 11(3):67-72, 1996.
23) 藤岡美幸，月足正辰，他：MultiplexPCR を用いた健常人における下痢原性大腸菌の保有状況. 医学検査，
60(6):871-874, 2011.
24) Yatsuyanagi J, Saito S, et al.:Characterization of atypicalenteropathogenic Escherichia coli strains harboring theastA gene that were associated with a waterborne outbreakof d iarrhea in Japan. J Clin Microbiol, 41(5):2033-2039, 2003.
25) 涌島三津子，王麗麗，他：非定型下痢原性大腸菌について 1 ―腸管凝集接着性大腸菌耐熱性腸管毒素（ EAST1 ） 遺 伝 子 保 有 大 腸 菌 ― . 生 活 衛 生 ，54(4):271-284, 2010.
26) Vila J, Gene A, et al.:A case-control study of diarrhea inchildren caused by Escherichia coli producing heat-stableenterotoxin(EAST-1). J Med Microbiol, 47:889-891, 1998.

ⓒ2019 Health sciences Research.

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工藤，吉岡，吉田，藤岡【Original article】
The study of water contamination in the riverine system
around Hirosaki area
MISATO KUDO*1

SHO YOSHIOKA*1 CHIKAO YOSHIDA *2MIYUKI FUJIOKA*3（Received November 27, 2018 ; Accepted March 4, 2019）

Abstract: Waterborne diseases are caused by intake of water contaminated by pathogenic microorganisms, and at present,
outbreaks of waterborne diseases are sometimes reported in Japan. During June 2018 to August 2018, 20 water samples werecollected from the rivers around Hirosaki area, and Escherichia spp., Campylobacter spp., and Vibrio spp. that are known tocause waterborne diseases or foodborne diseases were investigated. As a result, E. coli was detected from 18 samples, andsalinity concentration of 2 samples that did not contain E. coli were both over 10.00 ppt. In the progress of detection of E.
coli, pre-culture temperature was changed from 37℃ to 40℃, and detection rate of E. coli was increased. Therefore, it isconsidered that 40℃ is much suitable for pre-culture temperature. E. coli that harbored the astA gene was detected from 3samples. The astA gene is one of the diarrheagenic E. coli-related gene, and has been reported to be detected from healthy
participants. On the other hand, it has been reported that the astA gene causes outbreaks alone, so in this study, it is estimatedthat intake of these water from the rivers may cause waterborne diseases.
Keywords: Hirosaki area, Waterborne disease, Escherichia spp., astA geneⓒ2019 Health sciences Research.

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