A L K i A E P® K i t

ATLAS■ ヒストファイン ALK iAEP® キット

3― 株式会社ニチレイバイオサイエンス ―

開発経緯

3

ヒストファイン ALK iAEP® キットの利用価値

3

使用目的と臨床的有用性3

自動染色装置3

判定基準

4

臨床性能試験

4

臨床的意義

5

染色に適した検体

6■ i Score について

7

― 竹内 賢吾 ―i Score による診断

7

i Score 判定例

8■ セルブロック標本 染色例

anaplastic lymphoma kinase― 城光寺 龍・1

本 正彦 ―

26

1981 年にがんによる死亡数が脳血管疾患や心疾患による死亡者数を抜いて国内第 1 位になって以降、がんによる死亡数は増加の一途をたどっています。国立がん研究センターの 2017 年がん罹患数予測によると、がん全体で約 101.4 万人、そのうち肺がんは、1 位である大腸がん ( 約 15.0 万人 )、第 2 位の胃がん ( 約 13.3 万人）に次ぎ
約 12.9 万人と発表されています。肺がんは先進国で最も死亡者数の多いがんで、我が国においても顕著に増加しております。1998 年以降、肺がんによる死亡者数は第 1 位が続いており、2017 年の肺がん死亡数は約 7.8 万人と予測されています。
これまで、抗癌剤としては細胞毒性を示す化学療法剤が多く使用されてきましたが、近年、高い腫瘍選択性とこれに伴う低毒性プロファイルを有する分子標的治療薬が数多く開発され、実際にこれらのいくつかについては、臨床試験においてがん患者の生存期間を延長する有効性が確認されており、がん細胞に強く発現が亢進している分子やシグナル伝達系などを標的とした薬剤が開発されています。
様々ながん種の中でも、非小細胞肺癌に対する分子標的治療薬は、EGFR、KRAS、c-MET、BRAF など、遺伝子

anaplastic lymphoma kinase

はじめに変異や遺伝子増幅による癌遺伝子の異常活性化を標的とした多くの薬剤が開発されている状況になっています。
このような状況の下、非小細胞肺癌における分子標的治療薬の新たな標的として、EML4-ALK (echinoderm
microtubule-associated protein-like 4 anaplastic lymphoma kinase) 融 合 遺 伝 子 が、2007 年 に 日 本 の 研 究 グ
ループにより同定されました（1）。Anaplastic lymphoma kinase（以下、ALK）は、1994 年、ヌクレオフォスミン(NPM：nucleophosmin) と の 融 合 分 子 と し て 未 分 化 大 細 胞 型 リ ン パ 腫 [anaplastic large cell lymphoma,(ALCL)] において同定された受容体型チロシンキナーゼです（2）（3）。肺腺癌の細胞から同定された EML4-ALK 融合遺伝子によって作られる EML4-ALK 融合タンパクは二量体を形成し、そのチロシンキナーゼドメインは恒常的に活性化しており、癌化及びその後の癌細胞の増殖に関与していることが示唆されています。更に、非小細胞肺癌においては EML4 のみならず、これまでに KIF5B、KLC1、STRN などの分子も ALK の融合パートナーとして同定され、それら遺伝子との融合遺伝子（以下、ALK 融合遺伝子）の発現も報告されています（4）より。

ALK 融合遺伝子に起因する肺癌（以下、ALK 陽性肺癌）は、ALK を阻害する低分子経口製剤が有効です。ALKのチロシンキナーゼ活性を阻害することにより、腫瘍細胞の成長と生存に必要と考えられる数々の細胞内シグナル伝達を遮断し、効果を示します（5）。
ALK 陽性肺癌の診断には、ALK 阻害剤である XALKORI®（一般名：クリゾチニブ）のコンパニオン診断薬として承認されたアボット ジャパン株式会社の蛍光 in situ Hybridization（FISH）法を用いた診断キット「Vysis ALK
Break Apart FISH プローブ キット」が使用されていますが、弊社では世界に先駆けて ALK 陽性肺癌の診断に用いていただける体外診断用医薬品承認を取得した免疫染色キットを発売致しました。
本アトラスは ALK 陽性肺癌を的確に診断していただけることを目的として作成致しました。ヒストファイン
ALK iAEP® キットをご使用いただきまして、ALK 阻害剤による治療が対象になる患者さんと対象にならない患者さんをより早く、より確実に区別することができるようになり、医療現場における治療戦略の早期立案、治療開始時期の短縮に繋がり、患者さんの治療に貢献できましたら幸いです。

2

■ヒストファイン ALK iAEP® キット
開発経緯
従来、リンパ腫などにおける ALK 融合遺伝子陽性腫瘍の診断に際しては、免疫組織染色（IHC）法による ALK 融合
タンパクの検出は標準的な手法でありましたが、EML4-ALK 融合遺伝子陽性肺癌においては、標準的な IHC法では
検 出 感 度 が 不 十 分 で あ る こ と が 欧 州 の 研 究 者 ら に よ っ て 報 告 さ れ ま し た（6）。2009 年、竹 内 ら は iAEP®法（intercalated antibody-enhanced polymer）と名付けられた高感度IHC法を開発し、EML4-ALK 融合遺伝子陽性肺癌における ALK 融合タンパクの検出を可能としました（7）。
弊社では2010年11月より、iAEP®法に基づいて開発された研究用試薬「ヒストファインALK検出キット」の販売を開始致しました。その後、この研究用試薬をベースに体外診断用医薬品の承認申請に着手しました。
一方、中外製薬株式会社では、自社で開発していたALK阻害剤（有効成分名：アレクチニブ塩酸塩、治験成分記号CH5424802、以下、アレクチニブ塩酸塩）の国内第I/II相試験（以下、AF-001JP試験）において、本キットが被験者候補の ALK 融合遺伝子発現の有無の確認に用いられました。当該キットにより陽性（スコア 3）と判定された患者さんにおいては、アレクチニブ塩酸塩による奏効率が 92.3% と、極めて高い有効性が示されたことから、アレクチ
ニブ塩酸塩のコンパニオン診断薬として、当該キットの臨床的有用性が確認されました（8）。
このことから、弊社はアレクチニブ塩酸塩のコンパニオン診断薬としてヒストファイン ALK iAEP® キットを承認申請し、2014年 6 月 16 日に体外診断用医薬品承認を取得致しました。
2022年3月現在、ヒストファイン ALK iAEP® キットは、アレクチニブ 塩酸塩に加えて、クリゾチニブ、セリチニブ、
ブリグチニブおよびロルラチニブのコンパニオン診断薬として承認されております。

ヒストファイン ALK iAEP® キットの利用価値
ALK 阻害剤の効能・効果は「ALK 融合遺伝子陽性の切除不能な進行・再発の非小細胞肺癌」であるため、ALK阻害剤の適応可否を診断する上で ALK 融合遺伝子の診断は必要不可欠です。
ヒストファイン ALK iAEP® キットは、IHC 法を用いて、ALK融合タンパクの有無を検出し、FISH 法と組み合わせる
ことにより、 ALK 融合遺伝子陽性の非小細胞肺癌患者における薬剤（アレクチニブ塩酸塩、クリゾチニブ、

anaplastic lymphoma kinase

セリチニブ、ブリグチニブ又はロルラチニブ）の適応判定を行うことができる体外診断用医薬品です。

3

使用目的と臨床的有用性
がん組織、細胞中に発現する ALK 融合タンパクの検出（アレクチニブ塩酸塩、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリグチニブ又はロルラチニブの非小細胞肺癌患者への適応を判定するための補助に用いる）

自動染色装置
自動染色装置を用いて染色を行う場合は下記の装置をご使用ください。
・ヒストステイナー 36A（届出番号 13B3X10013036000）
・ヒストステイナー 48A（届出番号 13B3X10013048000）
・ヒストステイナー A T（届出番号 13B3X10013036100）
他の自動染色装置によるヒストファイン ALK iAEP® キットの使用は検証されておりません。

□ ヒストファイン ALK iAEP® キットによる ALK融合タンパクのスコアリングおよび判定方法
スコア

適合条件

判

定

3

陽性腫瘍細胞率＞80％

陽

性

2

80％≧陽性腫瘍細胞率＞50％境界域

150％≧陽性腫瘍細胞率＞0％

境界域

0

陽性腫瘍細胞なし

陰性

判定上の注意（9）より改変(1) 試薬対照スライドと比較して染色強度が強い細胞を陽性細胞としてください。
(2) 印環細胞など高度に粘液を含有する細胞は染色されるべき細胞質の領域が少なく、ALK融合タンパク陽性であっても染色されにくいことがあります。陽性細胞が見られる検体で、高度粘液含有細胞が陰性である
場合、それらは陽性腫瘍細胞率の算定には加えないでください。
(3) 陽性腫瘍細胞率が 80% を超えていても、checker board pattern（陰性〜弱陽性細胞と陽性〜強陽性細胞が頻繁に隣り合っている染色像。陰性細胞と陽性細胞が頻繁に隣り合っている染色像。）はスコア2としてください。

anaplastic lymphoma kinase

判定基準

患者への適応判定上の留意事項
スコア 3：明らかな腺癌以外の組織型の場合※、既承認品の FISH 法による ALK 融合遺伝子の確認を行ってください。例えば、全長 ALKタンパク発現等の可能性も考えられます。
※HE 染色等により組織型の鑑別を行ってください。
スコア 2：既承認品の FISH 法による ALK 融合遺伝子の確認を行ってください。例えば、ALK 融合遺伝子が陰性にもかかわらず一部もしくはすべての細胞が神経内分泌系への分化を呈している、又は、ALK 融合遺伝子が陽性にもかかわらず扁平上皮への分化を呈する部などで限局性に ALK 融合蛋白量が低下している、などの可能性が考えられます。
スコア 1：既承認品の FISH 法によるALK 融合遺伝子の確認を行ってください。例えば、ALK 融合遺伝子陰性の可能性が高いことが考えられます。

臨床性能試験
肺がん患者検体（合計 244 検体）のホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍切片を用いて、Vysis ALK Break Apart FISH
プローブ キットとの相関性を確認しました。その結果、陽性一致率は 98.0％、陰性一致率は 99.0％、全体一致率
98.8% という高い一致率が得られ、ヒストファイン ALK iAEP® キットが ALK 融合遺伝子の診断に有用であり、ALK阻害剤の適応可否の診断においても臨床的に有用であることが示唆されました。
□ 肺がん患者検体のヒストファイン ALK iAEP® キットの判定と Vysis ALK Break Apart FISH
プローブキットの判定の相関性
Vysis F I S H
スコア

判定

スコア 3

陽性

ALK 融合遺伝子陽性50例（98.0％）

ALK 融 合 遺 伝 子 陰 性
0 例 （0.0％）
＊1

合計
50 例

スコア 2

境界域

0例 （0.0％）

1 例 （0.5％）

1例

スコア 1

境界域

0例 （0.0％）

1 例 （0.5％）

1例

1例 （2.0％）

191 例 （99.0％）

192 例

陽性一致率 ＝ 98.0% ( 50例/ 51例)

51例

193 例

244 例

全体一致率 ＝ 98.8% (241例/244例)

スコア 0
総数

陰性

＊2

陰性一致率 ＝ 99.0% (191例/193例)*1

大細胞神経内分泌癌で70%≧〜 60%超の腫瘍細胞に陽性反応を示しましたが、腫瘍細胞間での染色強度の差が著しい Checker board
pattern（陰性・弱陽性細胞と陽性・強陽性細胞が頻繁に隣り合っている染色パターン）であり、Multiplex RT-PCR では陰性でした。breakpoint より上流および下流の ALK 領域の発現を RT-PCRで確認したところ、全長ALKによるタンパク発現であることがわかりました。
*2 切片上の腫瘍部（約 250mm2）の FISH 陽性細胞率は 5.0% でしたが、一部の領域（約 0.15mm2）に限局して FISH 陽性細胞率が 44.0% であった症例で FISH 法陽性と分類されました。

4臨床的意義アレクチニブ塩酸塩の適応判定
アレクチニブ塩酸塩の国内第I/II 相試験（AF-001JP試験）において、ヒストファイン ALK iAEP® キットが被験者候
補のALK 融合タンパク発現の有無の確認に用いられました。ヒストファイン ALK iAEP® キットで陽性（スコア 3）
であった125例のうち、研究機関で設定されたFISH法で陽性と判定され、試験参加の同意が得られた39例が第 II
相部分に登録され、奏効率は 92.3%（95%CI：79.1 〜 98.4）でした。また、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
法を用いて陽性と判定された患者を含めた 46 例の奏効率は、93.5%（95%CI：82.1 〜 98.6）でした（8）。
□ AF-001JP 試験の被験者候補におけるヒストファイン ALK iAEP® キットおよび研究機関で設定された FISH 法の結果の相関性
FISH 法
陽性

陰性

判定不能

NT＊

性（スコア 3）

122

1

2

0

境 界 域（スコア 2）

0

0

0

0

境 界 域（スコア 1）

0

3

0

0

0

48

4

194

0

0

0

10

本キット

陽

陰

＊＊
性（スコア 0）

判定不能＊：検査実施せず＊ ＊：別途同意が得られた被験者候補 52 例についてレトロスペクティブに FISH 法
検査を実施※研究機関で設定されたFISH法とVysis ALK Break Apart FISH プローブ キットは、十分な相関性が得られています（ニチレイバイオサイエンス社内資料より）。

クリゾチニブ、ブリグチニブの適応判定
ヒストファイン ALK iAEP® キットの臨床性能試験の結果に基づき、ヒストファイン ALK iAEP® キットと既承認品の FISH 法との同等性が評価され、本キットを非小細胞肺癌患者におけるクリゾチニブ、ブリグチニブの適応判定に用いることの有用性が示されました。

セリチニブ、ロルラチニブの適応判定
ヒストファイン ALK iAEP® キットの同等性試験の結果に基づき、ヒストファイン ALK iAEP® キットと既承認品の免疫組織染色法との同等性が評価され、本キットを非小細胞肺癌患者におけるセリチニブ、ロルラチニブの適応判定に用いることの有用性が示されました。

5□ 本キットと既承認品（IHC 法）による判定結果の比較
既承認品（IHC 法）
既承認品（IHC法）
スコア
本キット

anaplastic lymphoma kinase

同等性試験
非小細胞肺癌患者の検体を対象として、ヒストファイン ALK iAEP® キットと既承認品の免疫組織染色法（IHC 法）
により、それぞれ ALK 融合タンパクの判定を行い、その結果を比較しました。

判定

陽性

陰性

合計

3

ALK融合タンパク陽性

48 例

0例

0例

2

境界域

0例

0例

0例

1

境界域

0例

0例

0例

0

ALK融合タンパク陰性

0例

100 例

100 例

48 例

100 例

148 例

合

計

※試験に供した150例のうち2例は、既承認品（IHC法）で判定保留であったため、上記の表から除いています。
当該2 例は、本キットでスコア3・陽性およびFISH法で陽性と判定されました。

□ 本キットと既承認品（IHC 法）による判定の一致率
一致率

両側 90% 信頼区間

陽性100%（ 48例 / 48例）

93.9−100

陰性

100%（100 例/100例）

97.0−100

全体

100%（148 例/148例）

98.0−100

■ 検体の準備
検 体 に は 非 小 細 胞 肺 癌 を 含 む 組 織 を 用 い て、ホ ル マ リ ン 固 定 パ ラ フ ィ ン 包 埋（Formalin-Fixed
Paraﬃn-Embedded: FFPE）したブロックを使用してください。非小細胞肺癌患者から採取した非小細胞肺癌を含む小さな組織 ( 約 1cm×1cm×0.5cm) は、採取後すぐに固定してください。すぐに固定できない場合は生理食塩水で湿らせたガーゼで包んで冷蔵庫等で保管し、24 時間以内に、下表に従い、固定を行ってください。
固定液
10％（緩衝）ホルマリン
20％ホルマリン

固定時間【操作上の注意】
1. 高濃度の固定液にさらしたり、長時間の固定を行ったりすると、組織崩壊や抗原

6−48 時間

2. 包埋の際には使用するパラフィンの融解温度を大きく超えないように注意してく変性を生じさせることがあるので、指定された固定液を使用してください。
ださい。

固定後、水洗い、エタノールにて脱水、キシレンに浸して脱アルコール後、パラフィン浸透をしてパラフィン包
埋ブロックを作製してください。

anaplastic lymphoma kinase

染色に適した検体■ 切片および標本の準備[ パラフィン包埋切片 ]切片を 4μm に薄切し、poly-L-lysine またはシラン等の切片用接着剤をコーティングしたスライドに付着させてください。37℃の乾燥器内で 24 時間乾燥させてください。
注）：薄切後 9 週間以上経過した組織切片を用いて染色した場合、切片中の抗原が劣化して、偽陰性の染色結果を示す可能性があります。
薄切後 9 週間以内に使用してください。

[ 検体標本スライドの準備 ]検体標本スライドとして 1 検体あたり、2 枚準備してください。
1 枚は、試薬対照スライドとして、第一抗体のかわりに陰性コントロール ( マウス IgG) を使用して染色操作を行ってください。

[ 検体対照スライドの準備 ]ALK コントロールスライド［ホルマリン固定パラフィン包埋細胞株（セルブロック）2 種類（NCI-H2228
及び SK-BR-3）を貼付したスライド］を検体対照スライドとして用いるか、あるいは ALK 融合タンパクの陽性対照スライド（スコア 3 相当）と ALK 融合タンパクの陰性対照スライド（スコア 0 相当）を準備してください。

・陽性対照スライド（スコア 3 相当）
検体標本スライドと同様の方法で作製され、あらかじめ ALK融合タンパクの発現を確認している組織、細胞スライドを準備してください。

・陰性対照スライド（スコア 0 相当）
検体標本スライドと同様の方法で作製され、あらかじめ ALK融合タンパクの発現がないことを確認している組織、細胞スライドを準備してください。

染色例
ALK 陽性コントロール細胞

ALK陰性コントロール細胞

細胞の細胞質に強い陽性反応を示す。

すべての細胞に陽性反応を示さない。

以上の検体対照スライドを用意し、検体標本スライドおよび試薬対照スライドと並行して、検体の準備から染色処理、検鏡までの全工程を行ってください。

6

■ iScore について
ヒストファイン ALK iAEP® キットの添付文書にあるスコアリングおよび判定方法は、公益財団法人がん研究会がん研究所 分子標的病理プロジェクト竹内 賢吾先生により考案された iScoreに基づいています。
2018 年 3 月に改訂された ALK iAEP® キットの添付文書（第 4 版）では、スコア 3 であった場合の患者への適応
判定上の留意事項が、iScore に記されている原案（指針 instruction）と同等の内容に改訂されました。

anaplastic lymphoma kinase

iScore による診断

7□ iScore に基づいた ALK 検査アルゴリズム

ALK iAEP IHC

iScore 3

iScore 2 または 1

iScore 0

F ISH＋
AL K 遺伝子再構成陽性−
A LK遺 伝 子 再 構 成 陰 性

anaplastic lymphoma kinase

iScore 判定例

ALK iScore 3．ALK split FISH 陽性．EML4-ALK 陽性．

上段

腺癌

中段

小細胞癌

下段

扁平上皮癌

ALK iScore 2．ALK split FISH 陰性．EML4-ALK 陰性．
ALK iScore 1．ALK split FISH陰性．EML4-ALK 陰性．

ALK 融合遺伝子はひとつの癌におけるすべての腫瘍細胞に存在する．したがって，iAEP 法などの感度が適切に設定された抗 ALK 免疫染色においては，すべての腫瘍細胞が染色される．同一癌内における染色強度は組織像に応じて強弱を呈することがあるが，基本的に ALK 融合遺伝子陽性肺癌において抗 ALK免疫染色陰性細胞は混在しない．逆に言えば，陽性細胞と陰性細胞が混在する場合，
ALK 融合遺伝子は陰性である可能性が高い．すなわち，抗 ALK 免疫染色の強度は ALK 融合遺伝子の有無とは相関しない（融合遺伝子の数とは相関するかもしれない）．したがって iScore では，より主観的な判断になりやすい染色強度は判定基準に含めず，陽性腫瘍細胞の割合のみを判定基準としている．
分化度の低い癌では，ときに一部の腫瘍細胞が抗 ALK免疫染色陽性所見を呈することがあり，生理的な全長 ALK 発現によると思われる．生理的な発現では通常，陰性細胞が混在する．大細胞神経内分泌癌では，ALK
iScore 3 となる症例とならない症例が存在し，前者の場合 ALK 融合遺伝子陽性となる．扁平上皮癌や小細胞癌では通常，ALK iScore 3 になることはなく，ALK 融合遺伝子も検出されない（上段 ,中段（10）より , 下段（11）より）．

8

anaplastic lymphoma kinase9

大細胞神経内分泌癌 ALK iScore 2．ALK split FISH陰性．
視野や観察者によっては，陽性腫瘍細胞>80%と判断されるかもしれないが，「checker board
pattern の場合，iScore 2b とする」という規定により，いずれにせよ ALK iScore 2となる．全長
ALK 発現症例においては通常，免疫染色陰性細胞が混在する．したがって，本例における抗ALK免ALK 融合遺伝子は陰性である．ただし，大細胞神経内分泌
疫染色陽性所見も全長 ALK 発現により，癌には ALK 融合遺伝子陽性例も存在し，その場合は ALK iScore 3となる．

anaplastic lymphoma kinase

腺癌（signet-ring cell）ALK iScore 3． ALK split FISH陽性．EML4-ALK 陽性．
印環細胞など高度に粘液を含有する細胞は染色されるべき細胞質の領域が少なく，ALK 融合遺伝子陽性であっても染色されにくい．陽性細胞が見られる検体で，高度粘液含有細胞が陰性である場合，それらは陽性細胞率の算定には加えない．

10

anaplastic lymphoma kinase
11

腺癌（acinar / mucinous cribriform pattern）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．EML4-ALK 陽性．

anaplastic lymphoma kinase

腺癌（acinar / mucinous cribriform pattern）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．EML4-ALK 陽性．

12

anaplastic lymphoma kinase13

腺癌（acinar / mucinous cribriform pattern）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．EML4-ALK 陽性．

anaplastic lymphoma kinase

腺癌（micropapillary pattern）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．EML4-ALK 陽性．
砂粒体（石灰化）もみられる．

14

anaplastic lymphoma kinase
15

腺癌（micropapillary pattern）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．EML4-ALK 陽性．

EML4-ALK に対する抗 ALK 免疫染色においては，細胞質がびまん性に染色されるが，ときに微細顆粒が見られることがある．マクロファージの非特異的染色に注意．

anaplastic lymphoma kinase

腺癌（papillary pattern）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性． EML4-ALK 陽性．

16

anaplastic lymphoma kinase17

腺癌（solid + acinar pattern）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．EML4-ALK 陽性．

anaplastic lymphoma kinase

上皮内腺癌（気管支肺胞上皮癌）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．KLC1-ALK 陽性．
（下段（12）より）

18

anaplastic lymphoma kinase
19

腺癌

ALK iScore 3．ALK split FISH 陽性．KIF5B-ALK 陽性．

anaplastic lymphoma kinase

腺癌（solid + acinar pattern）ALK iScore 3． ALK split FISH陽性．EML4-ALK 陽性．
充実部に比べ，左下の腺房様構造において発現強度が高い．iScoreでは染色強度は評価せず，陽性
腫瘍細胞の割合のみを判定基準としているので，本例は ALK iScore 3となる．

20

anaplastic lymphoma kinase
21

腺癌

ALK iScore 3．ALK split FISH 陽性．

抗 ALK 免疫染色パターンないし強度が，腫瘍細胞の部位により異なる非定型例．免疫染色所見に対応して，HE 染色における細胞形態も異なっている．iScoreでは染色強度を判定基準に含まないので iScore 3 となる．

anaplastic lymphoma kinase

肉腫様癌（多形癌）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．
明らかな腺癌部分は容易に判定できるが，紡錘形細胞に転化した部位では陽性腫瘍細胞の算定が困難かもしれない．非定型例として FISH等で ALK の再構成の有無を確認すべきである．

22

anaplastic lymphoma kinase
23

肉腫様癌（多形癌）ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．
図に示した巨細胞癌の部位とともに明らかな腺癌の像を呈する部も混在しており，両者ともに ALK
iScore 3 であった．非定型例として FISH等で ALK の再構成の有無を確認すべきである．

anaplastic lymphoma kinase

腺扁平上皮癌ALK iScore 3．ALK split FISH陽性．

扁平上皮への分化傾向を呈する部で，染色強度が落ちている．このような症例では，サンプリングの仕方や，減弱の程度・面積により ALK iScore 2または1になるかもしれない．いずれにせよ，非定型例として FISH 等で ALK の再構成の有無を確認すべきである．

24

左 大脳
右 大腸（アウエルバッハ神経叢）
正常神経細胞は全長 ALK を発現しているが発現レベルは低い（神経系への分化傾向を呈する小細胞
癌や大細胞神経内分泌癌における全長 ALK発現も同様の生理的機序と思われる）．したがって，通常の抗 ALK 免疫染色では検出しがたいがiAEP法であれば検出しうる．すなわち，ALK肺癌が入手できていない施設において，神経細胞は抗 ALK iAEP 免疫染色法の陽性コントロールとなり得る．

anaplastic lymphoma kinase

左
上

25

ALK split FISH 陽性例
EML4-ALK, KIF5B-ALK,KIF5B-RET, CCDC6-RET を
one tube で検出可能な
multiplex RT-PCR

EML4 と ALK は，2 番 染 色 体 短 腕上の近傍に位置しているため，
EML4-ALK 融合遺伝子におけるALK split FISHの陽性シグナル像（赤 と 緑 が 離 れ て 見 え る）で は，各シグナルが比較的近傍に位置
す る．こ の た め，野 生 型 ALK 遺伝子に対する陰性シグナル像（赤と緑が重なって見える）との判別が困難になりやすく，偽陰性を招く可能性がある．また，FISH プローブの設計によっては，陰性シグナル像において各シグナルが若干離れて見える場合もあり，偽陽性を招く可能性がある．左図は，偽陽性となる可能性が軽減す
るような設計を施したプローブを用いている．
EML4-ALK には，
EML4 上の切断点の位置によって，多数の融合バリアントがある．したがって，多数の融合バリアントに対応できるプライマー設定にしなければ，それだけ感度が低下する．また，
ALK の融合パートナーは複数知られているため，それらに対応したプライマー設定をしない限り，
その融合パートナーには対応できず感度が低下する．これは RET 融合遺伝子においても同様である．上図では，7 本のプライマーを用いた 1回のmultiplex RT-PCRにより，EML4-ALK, KIF5B-ALK,KIF5B-RET, CCDC6-RET におけるあらゆる融合バリアントを検出できることが示されている．
1, EML4-ALK, E13;A20 (432 bp). 2, E20;A20 (1185 bp). 3, E6;A20 (913 bp). 4, E14;ins11del49A20 (546bp). 5, E2;A20 (454 bp). 6, E13;ins69A20 (501 bp). 7, E14;del14A20 (570 bp). 8, KIF5B-ALK, K17;A20(1,483 bp). 9, K24;A20 (814 bp). 10, KIF5B-RET, K15;R12 (1,104 bp). 11, K16;R12 (1,293 bp). 12,
K22;R12 (420 bp). 13, K23;R12 (525 bp). 14, K24;R11 (999 bp). 15, CCDC6-RET, C1;R12 (352 bp). M,
マーカー (100-bp ラダー ). N, 鋳型無しコントロール（13）より．

anaplastic lymphoma kinase■セルブロック標本 染色例
H＆E 染色

×20

×60

×20

×60

ヒストファイン ALK iAEP® キット

腺癌． ALK split FISH 陽性．
EBUS 下穿刺吸引細胞診検体を 15% ホルマリンで2時間固定し,セルブロック標本を作製した.

謝 辞本アトラスの作成にあたり、多大なるご協力を頂きました公益財団法人がん研究会がん研究所分子標的病理
プロジェクト プロジェクトリーダー 竹内 賢吾先生、一般財団法人大阪府警察協会 大阪警察病院 病理診断科部長
本 正彦先生、公益財団法人日本生命済生会付属日生病院 病理診断科 城光寺 龍先生および各施設関係者の皆様にこの場を借りて深謝の意を表します。

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ALK iAEP Kit
R■ 参考文献（1）Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identiﬁcation of the transforming EML4-ALK fusion gene in
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（4）竹内 賢吾 1.腫瘍のコンパニオン診断 b. ALK 病理と臨床 [臨時増刊号] 2014 vol.32（5）U.S. Food And Drug Administration Approves Pﬁzer̀s XALKORI (crizotinib) As First And Only Therapy
Speciﬁcally For Patients With Locally Advanced Or Metastatic ALK-Positive Non-Small Cell Lung
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2022.03（第6版）