学術奨励賞受賞者論文

哺乳類の概日時計システムを分子レベルで理解する
吉種 光✉
東京大学 大学院理学系研究科 生物科学専攻
１. 謝辞と序論

子生物学の研究に自分が強く惹かれることがわかり、この度、第 15 回 日本時間生物学会学術奨励賞（基特に 1999 年入学というタイミングもあり、睡眠とい礎科学部門）を受賞できましたことを、大変光栄に存う高次機能が遺伝子のフィードバックループで制御じます。私は、修士 1 年生の時から 15 年連続で時間されている可能性を知り、深田研究室のある生物化学生物学会の学術大会に参加してきました。そして、初科へと進学した。その後、深田研で学部、修士、博士めて参加した第 10 回大会＠札幌において学術奨励賞と過ごし、学位取得後には助教として、哺乳類の概日がスタートし、全 14 回の受賞者講演を拝聴してきま時計システムを分子レベルで解析してきた。これで終した。当該分野を牽引してきた過去の受賞者の方々と了、という訳にもいかないと思うので、それぞれの研名を連ねさせていただけることを大変嬉しく思うと究成果にその当時の思いを追加して説明していきた同時に、身が引きしまる思いです。じゃじゃ馬で生意いと思う。

気な私を見捨てず、ここまで導いてくださった深田吉孝教授に心より感謝申し上げます。また、いつも一緒

２. CLOCK のリン酸化リズムにサイエンスを追求してくれる吉種グループの全メ

希望通りに深田研究室に配属され、卒業研究では岡ンバーに、この場を借りて感謝の気持ちを伝えさせて野講師（現 早稲田大学 教授）のご指導のもとで、時いただきたいと思います。私は時間生物学会が大好き

計タンパク質 CLOCK と BMAL1 を軸に生化学的なで、学術大会や関連学会において著名な先生・先輩方解析を行った。当初の目的は CLOCK の新規相互作と交流する機会に恵まれ、多くのことを学ぶことがで用分子を同定する、というテーマであった。この当初きました。時間生物学分野のますますの発展に微力なの目的は完遂できないこととなるのだが、その過程でがら貢献できるよう全力を尽くしたいと思いますの

単クローン抗体を自作し（現在は MBL 社より販売すで、今後ともご指導ご鞭撻のほどどうぞよろしくお願る に 至 っ た ）、 マ ウ ス 肝 臓 に お い て CLOCK とい申し上げます。最後に、学生時代からずっと近くでBMAL1 が時刻依存的にリン酸化されていることを研究をサポートしてくれた、そして夜中でも日曜日で見出した。ここからが泥沼であったが、質量分析によも研究というと不満を一言も言わずラボに送り出し

りマウス個体におけるリン酸化部位の同定を目指してくれる妻と、時に沈みきった心を笑顔で癒してくれた。大阪大学の質量分析装置を使用させていただいてる息子たちに感謝を伝えたいと思います。いつもありいたため、生化学をしては試料を持って大阪大学に出がとう。

張し、同定できずにトボトボと帰宅する、という小旅

さて、本稿の執筆にあたり、過去の受賞者論文をい行をひたすら繰り返した。研究者としてやっていけるくつか拝見した。自分の研究成果を交えつつも、研究のであろうかと、自信を喪失した時期でもあったが、のスタートポイント、時間生物学との出会い、留学経この過程で身につけた質量分析を駆使した生化学は、験、そしていまの研究へと展開し、格言を残している

最新 MS のオペレーターとなった現在、強力なパワー例が多いようだ。このようにストーリー性の多い研究を発揮し、自分を色付けしてくれている。こうしてよ者人生を送られてきた過去の受賞者と比較して私は、うやく至適化した条件で、CLOCK のリン酸化部位非常にシンプルな経歴を持つ。物理・化学選択で大学

Ser38、Ser42、Ser427 を同定した。このうち Ser38に入学したものの、大学では生命科学を学びたいと当と Ser42 はちょうど CLOCK の DNA 結合部位に位初から考えていた。大学で最先端の研究について学ぶ置しており、これらのリン酸化模倣変異体は、DNAうちに、疫学調査やケーススタディーと比較して、分結合能が強力に抑制されており、E-box 依存的な転写✉stane@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
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活性が消失することを見出した 1。つまり、夜になる

ただいた時間生理学への考え方は、かけがえのない財と CLOCK はリン酸化されてその転写活性が抑制さ産となった。この場を借りてお礼申し上げたい。

れるというフィードバックループの鍵となる 1 ステ

深田研究室では、時計タンパク質の翻訳後制御の重ップを見つけることができた。こうして 1.1 年のオー要性を、翻訳後修飾部位の決定や新規修飾酵素の同定

バードクターを経て、無事に学位を取得することがでを含めて報告してきた。例えば CRY2 は、Ser557 がきたのである。

DYRK1A によってリン酸化されると、これを足場にSer553 が GSK-3β によって二次リン酸化され、プロ

３. 翻訳後制御の重要性

テアソームによって分解される 4,5。この Ser557 を学位取得後も特任研究員さらに助教として研究をAla に置換したノックインマウスは輪回し行動リズ継続した。学生時代のテーマの延長として、ムが長周期化する 6。一方、CRY をユビキチン化してCLOCK-BMAL1 複合体をリン酸化するキナーゼを分解に導く E3 リガーゼ FBXL3 が知られていたが、探索し、阻害剤スクリーニングから JNK が BMAL1

FBXL21 は CRY をユビキチン化するにもかかわらずをリン酸化することを見出した。細胞レベルでのデーCRY を安定化する 7。この FBXL21 によって CRY にタも順調に取れて、個体まで展開するか悩んでいたそ付加されたユビキチン鎖の意義についても、現在、興の時、北海道大学の本間研究室から共同研究のお誘い味深い知見が得られつつあるが、これも別の機会でごを受けた。本間研では、神経特異的な Jnk アイソフ紹介できればと思う。

ォームである Jnk3 の欠損マウスの行動リズムデータ

我々は、CRY の相互作用因子を探索し、CRY を安を元に、その分子基盤となるメカニズムを追求してい定化する 2 つの分子を同定した。筋萎縮性側索硬化症

たが、両研究室のデータを統合すると論文が完成した（ALS）の原因遺伝子の一つである TDP-43 は、のである 2。しかしここからの道のりも簡単ではなかFBXL3 依存的な CRY の分解を拮抗的に抑制し、脱った。査読者からのコメントで「露骨に両研究室のデユビキチン化酵素 USP7 は CRY に付加されたユビキータを融合しており、その間にギャップがある」といチン鎖を除去する 8。FBXL3 と FBXL21 の両者を失う主張である。まるで我々の事情を知っているようなうと時計振動体は崩壊するので、分解と安定化の拮抗コメントであるが、ここから SCN での生化学という作用は時計振動の鍵を握ると考えられる。これに加え魔の領域に突入する。世界的に見ても SCN の単離技て、CLOCK リン酸化酵素 CaMKII 9、 BMAL1 ユビ

術が高い本間研究室で集められたタンパク質試料をキチン化酵素 UBE3A/E6-AP 10、PER2 リン酸化酵素

東大に輸送してもらい生化学実験を行う。一回の実験

SIK3 11 など、修飾酵素の研究に共同研究者として貢で 120 匹分の SCN を扱う実験はミスが許されず、手献できたことは大きな経験となった。このように、哺が震えた。また一部の細胞レベルのデータは、査読コ乳類の概日時計は、転写フィードバック制御という基メントにより撤退を余儀なくされたが、このデータは本骨格に対して、数多くの修飾酵素による翻訳後制御

次の論文の種となり、最近、大きな花を咲かせてくれにより適切なタイミングで分子の活性を巧みに調節た 3。これはまた次の機会にでも紹介できたらと思う。

していると考えられる。各時刻に、どの分子のどのアさらに某雑誌のリバイズ中に、論文最終稿の相談のたミノ酸残基が、どの酵素によりどんな修飾を受け、どめに本間さと教授が東京まできてくれたのだが、空港のように活性が制御されているのか、それらが組み合からのモノレールの上で東日本大震災が発生した。強わせとしてどのようにして時計振動を生み出していい余震に怯えながら大学で様子を見ていた我々だが、るのか、実体の全貌解明に向けて取り組んで行きたい。

都内の交通網が混乱し、空港が陸の孤島となっている

さらにこの複雑な修飾ネットワークが、発生から老化ことを知り、深田先生の車で本間先生をお迎えに上がのライフステージにおいてどう変化し、また温度や光、ることとなった。いつもは 1 時間程度の道のりだが、食事によるエネルギー条件などの環境変化に対してやはり交通網の混乱はひどく、本間先生にお会いできどのような意義を持って応答するのか、興味深い問い

たのは深夜で、大学近傍のホテルに到着したのは明けが未解明である。

方であった。無事に論文採択へとたどり着いたのだが、乗り越えた荒波の数だけ、振り返ると思い出深い論文

４. 転写リズムからの時計出力となる 2。今、荒波に飲み込まれそうになっている人

翻訳後修飾に下支えされるフィードバック制御機がいたら、前向いてまず一歩を踏み出してみて欲しい。

構により、約半数の遺伝子はいずれかの臓器においてまた、この共同研究において本間先生らからご教授いリズミックに発現しており 12,13、各臓器の生理機能が時間生物学

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約 24 時間周期のリズムを刻んでいる。概日時計の破定する研究に応用されることが期待できる 14。

綻は睡眠障害のみならず、癌や高血圧などの発症リスクを増大させるため、概日時計と各機能リズムとを結

５. A-to-I RNA 編集リズムの発見

ぶ分子経路を明らかにすることは、新たな創薬ターゲ

我々は CLOCK の ChIP-Seq 解析と並行して、マウットの発掘につながる。我々はこれまで、CLOCK のス肝臓の RNA から poly(A)-tailed RNA および small

リズミックなリン酸化が DNA 結合を強力に抑制する

RNA を超並列型シーケンサーに供し、全転写産物のことを見出した 1。つまり、CLOCK のリン酸化リズ発現時刻プロファイルを記述した 14。不規則な生活やムが、CLOCK-BMAL1 複合体の DNA 結合リズムを交代勤務がもたらす体内時計の破綻は、睡眠障害のみ生み出す可能性が考えられた。そこで、自作単クローならず多くの疾病リスクを増大させるため、遺伝子レン抗体を用いて定量的に CLOCK 結合 DNA 断片を単ベルでのリズムが生理機能リズムへと伝わる仕組み

離 する実 験条件 を 確 立 し 、 ChIP-Seq 解 析 に よりの解明が期待されている。例えば、この CLOCK 結7,978 の CLOCK 結合領域を同定した 14。これら結合合リズムの制御下では Keap1-Nrf2 シグナルが作動領域では、その CLOCK の結合に昼に高く夜に低いしており、抗酸化遺伝子の発現リズムが肺繊維化リスという顕著なリズム性が観察された。実はこれは、当クの時刻依存性を生み出している 19。また Bmal1 欠初の研究計画からするとネガティブな結果であった。

損マウスでは、軟骨細胞における Nfatc2 の発現リズ

これまでに我々は、BMAL1 と BMAL2 の嗜好性のムが乱れ、変形性関節症の発症時期が顕著に早まると違いから、E-box の類似配列またはその周辺配列の違いう早老症様の表現型を示すことが分かってきていいにより、誘導される転写活性化レベルが変化するこる 20。約半数の遺伝子はいずれかの臓器においてリズとを見出していた 15。また、同じ E-box 制御を受けるミックに発現しており 12,13、このような多岐に渡る時遺伝子でも、RRE など他の DNA シスエレメントと計出力リズムの理解には極めて多くの生命研究領域の総和として転写リズムが決定され 16、転写リズムはとの融合が鍵を握ると考えられる。2010 年に発足し遺伝子近傍のヒストン修飾リズムとその位相がよくた生物リズムの若手の会をはじめとする、研究者が集一致していることが報告されていた 17。このことから、う「場」が重要な役割を担うであろう。どんな研究もE-box の配列や位置効果による”個性”が ChIP-Seq 解

自分とは関係ないとは思わず、耳を傾けてみると大発析から浮かび上がる可能性に期待していたのである。

見のヒントが隠れているのかもしれない。

しかし逆に、DNA 結合リズムが先で、これらの総和

この分野融合の 1 例として最近、E-box によりリズによりヒストン修飾リズムが生み出されるのであろミックに転写制御される新たな遺伝子 Adar2 を同定う、ということが理解できた 14。

した 21。ADAR2 は、RNA のアデノシン (A) を脱ア以上の研究成果をまとめている過程で、同じくミノ化してイノシン (I) へと変換する酵素であり、修CLOCK の ChIP-Seq 解析を含む大規模な研究成果が飾によって生じた I は C と塩基対を形成するため、遺Takahashi らのグループから発表されてしまった 18。

伝情報上は A からグアノシン (G) に編集される。筆そこで少し方向転換をして本研究では、東京大学の岩頭著者の寺嶋君は、東京大学の工学部の出身で、崎渉准教授らと共同で、ChIP-Seq データから転写因A-to-I RNA 編集の研究に従事していたが、マウス個子が認識する配列を抽出するバイオインフォマティ

体などを用いたより生理的な研究を行いたいという

ク ス 技 術 を 開 発 し 、 MOCCS （ Motif Centrality

ことで、博士課程の学生として深田研究室で研究をス

Analysis of ChIP-Seq ） と 名 付 け た 。 こ れ を 、タートした。ちょうどこの頃、前述した CLOCK

CLOCK-ChIP-Seq の デ ー タ に 適 用 し た 結 果 、 約

ChIP-Seq データと全 RNA の発現時刻プロファイル

8,000 の結合部位の近傍において CACGTG がもっとを持ち合わせていた我々は、Adar2 が CLOCK によも高いスコアーで出現することから、この解析が先行る転写制御を受ける遺伝子の一つであることに気が研究の知見を再現できたことを示している。興味深い付いた。せっかくラボを変えたにもかかわらず寺嶋君

ことに、1 塩基 miss match の配列の中でも CACGTT

は、Adar2 が時計の制御下で A-to-I RNA 編集リズムや CACGNG が選択的に CLOCK に認識されており、を生み出しているか否かを調べる、という研究をスタ

２塩基 miss match の CATGCG が非典型的な E-boxートした。実際にマウス時計臓器において A-to-I配列として浮かび上った。MOCCS 解析は、時計研究

RNA 編集の効率は時刻依存的に変動し、この A-to-Iに限らず、DNA に結合するさまざまなタンパク質にRNA 編集リズムは Bmal1 欠損マウスや Adar2 欠損ついて、実際に結合する DNA モチーフを網羅的に決マウスでは一日を通して低い状態に保たれることを

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明らかにした。この A-to-I 編集リズムは RNA-Seqていきたい。

解析からも抽出されることから、これまで超並列型シーケンサーやその前処理時の技術的なエラーとして扱われてきた miss matched read の中には、生体内参考文献で編集された RNA が含まれることが判明した。つま1.

Yoshitane,

etH.

al.

Roles

in

suppressionofCLOCKり、数多くの転写産物において遺伝情報が A から G

phosphorylationにリズミックに書き換えられており、RNA の高次構

E-box-dependent transcription. Mol. Cell. Biol.

造や翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列が変化し29, 3675-3686 (2009).ていると考えられる。

2.

Yoshitane, H. et al. JNK regulates the photic
response of the mammalian circadian clock.

ここまでは珍しく筋書き通りに進んだ本研究だが、EMBO Rep. 13, 455-461 (2012).

さらにここからラッキーパンチを量産することとなる。RNA 編集リズムを調べるために行った RNA-Seqof

3.

Imamura, K. et al. ASK family kinases

解析のデータを詳しく調べていると、Adar2 欠損マウ

mediate cellular stress and redox signaling toスでは A-to-I 編集リズムが消失するだけでなく、数circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115,

多くの転写産物においてその発現量のリズムが停止

3646-3651 (2018).

することが判明した。これまで転写リズムが重要と考

4.

Harada, Y., Sakai, M., Kurabayashi, N., Hirota,

えられてきた時計出力のメカニズムにおいて、転写後T., & Fukada, Y. Ser-557-phosphorylated

調整の重要性を示したということで当該分野に強いmCRY2

インパクトを与えることができた。さらに、この変異

phosphorylation

マウスの輪回し行動リズムを調べるとその周期が有kinase-3 beta. J. Biol. Chem. 280, 31714-31721

意に短いことが判明した。時計出力リズムを研究して(2005).

いたつもりが、時計振動そのものの異常に気がついた5.

isdegraded
by

upon

synergistic

glycogensynthase

Kurabayashi, N., Hirota, T., Sakai, M., Sanada,

こととなる。しかし、RNA-Seq データを見ても、実K., & Fukada, Y. DYRK1A and glycogen

際に RT-PCR を行っても、時計遺伝子で RNA リズム

synthaseに異常が見られる遺伝子は見つからない。そこで生化

mechanism directing proteasomal degradation

学的な解析を行うと、唯一、CRY2 タンパク質が異常of CRY2 for circadian timekeeping. Mol. Cell.

蓄積していることが分かった。実際に、Cry2 欠損マBiol. 30, 1757-1768 (2010).

ウスと交配すると、Adar2 欠損による時計の短周期化

6.

Hirano,kinaseA.

et3beta,al.

Ina

dual-kinasevivo

roleofは見られなくなることから、CRY2 の異常蓄積が時計

phosphorylation of cryptochrome 2 in theの短周期化の原因であると結論づけた 21。

mouse circadian clock. Mol. Cell. Biol. 34,4464-4473 (2014).
7.

６. おわりに

Hirano, A. et al. FBXL21 regulates oscillation

Adar2 欠損による生理機能の異常は多岐に渡る。そof the circadian clock through ubiquitination

れぞれの機能発現において ADAR2 がどの遺伝子のand stabilization of cryptochromes. Cell 152,

どの A を G に書き換えることが重要なのか、全貌の1106-1118 (2013).

解明には多くの研究が必要になるであろう。同じよう

8.

Hirano, A. et al. USP7 and TDP-43: Pleiotropicに、Bmal1 遺伝子の欠損は様々な臓器機能の低下を

regulation of cryptochrome protein stability

も た ら す が 、 ど の 遺 伝 子 の ど の E-box 配 列 に

paces the oscillation of the mammalian

CLOCK-BMAL1 が結合することが重要なのか、時計

circadian clock. PLOS ONE 11, e0154263

出力の鍵を握る DNA シスエレメントはほとんど分か(2016).っていない。時計の転写フィードバック制御において

9.

Kon, N. et al. CaMKII is essential for the

ですら、どの遺伝子のどの DNA シスエレメントによcellular clock and coupling between morning

る制御が時計振動に不可欠か、順番にメスを入れて現and evening behavioral rhythms. Genes Dev.

状の分子モデルを見つめ直すことが必要ではないだ

28, 1101-1110 (2014).

ろうか。過去の知見を尊重しつつも、盲信することな

10. Gossan, N. C. et al. The E3 ubiquitin ligase

く、哺乳類の概日時計システムを分子レベルで理解しUBE3A is an integral component of the

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molecular circadian clock through regulating
the BMAL1 transcription factor. Nucleic Acids

Res. 42, 5765-5775 (2014).
11. Hayasaka, N. et al. Salt-inducible kinase 3
regulates the mammalian circadian clock bydestabilizing PER2 protein. Elife 6, e24779(2017).

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16. Ueda, H.

R. et al. System-level identification

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17. Ripperger, J. A. & Schibler, U. Rhythmic
CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box

12. Zhang, R., Lahens, N. F., Balance, H. I.,

motifs drives circadian Dbp transcription andHughes, M. E., & Hogenesch, J. B. A circadianchromatin transitions. Nat. Genet. 38, 369-374

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expression

atlas

inmammals:

implications for biology and medicine. Proc.

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clock in mammals. Science, 338, 349-354

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(2012).
19. Pekovic-Vaughan, V. et al. The circadian clock
regulates

14. Yoshitane,H.

etal.

CLOCK-controlled

rhythmic

activation

NRF2/glutathione-mediatedoftheantioxidant

polyphonic regulations of circadian rhythms

defense pathway to modulate pulmonary

through canonical and non-canonical E-boxes.

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Mol. Cell. Biol. 34, 1776-1786 (2014).

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15. Sasaki, M., Yoshitane, H., Du, N. H., Okano, T.,&Fukada,Y.

BMAL2-CLOCK

Preferential
activity

inhibitionbyofPER2

Bmal1 controls cartilage homeostasis andintegrity. J. Clin. Invest. 126, 365-376 (2016).
21. Terajima,H.

etal.

ADARB1

catalyzes

reemphasizes its negative role and a positive

circadian A-to-I editing and regulates RNA

role of BMAL2 in the circadian transcription. J.

rhythm. Nat. Genet. 49, 146-151 (2017).

時間生物学

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