個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証（S1201037）（平成 24 年度～平成 28 年度）
私立大学戦略的研究基盤形成支援事業
研究成果報告書

平成 29 年 5 月

学校法人名 関西文理総合学園
大学名

長浜バイオ大学

研究組織名 長浜バイオ大学バイオサイエンス学部研究代表者 永井 信夫

1

はしがき

私ども、長浜バイオ大学バイオサイエンス学部の研究グループは、文部科学省からの支援を受け「個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証」のプロジェクトを平成 24
年度より 5 年かにわたって進めて参りました。この間、研究代表者としてプロジェクトを指揮された
山本章嗣先生が入院の後ご逝去され、大変困難な状況ではありましたが、研究に参加して頂いた
皆様、プロジェクトの事務的業務を支えてご協力を頂きました皆様の努力により研究を遂行することが出来ましたことを深く感謝申し上げます。
この 5 年間の成果は、論文は４２件、著書は８件、学会発表は５１件、さらにその他のメディアが２件におよび、研究成果が社会に対して大きく発信されました。このプロジェクトの成果が、今後の研究の進展に貢献できることを期待いたします。
最後に、山本章嗣先生のご冥福を心よりお祈り申し上げますとともに、プロジェクトに参加して頂
いた先生、研究者、学生諸君の今後益々のご活躍を願います。

永井 信夫

2

目

次

研究成果報告書概要
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4
中間評価報告書 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・20
最終評価報告書 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・22
山本 章嗣
テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」
免疫金法を用いた特定タンパク分子の分布イメージング（腸粘膜における IgA の分布のイメージングと機能解析）
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・24
低真空クライオ走査電顕法による生体試料観察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・28
新蔵 礼子
テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」
免疫金法を用いた特定タンパク分子の分布イメージング（腸粘膜における IgA の分布のイメージングと機能解析）
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・32
蔡 晃植
テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」
セリウム塩法による活性酸素種発生のイメージング ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・45
テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」
YC3.6 を用いたカルシウムイメージング系の確立
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・49
大腸菌を用いた BiFC 法によるタンパク質間相互作用の検定系確立
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・52
野村 慎太郎
テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」
個体レベルでの新たな遺伝子発現イメージング・マウス頭蓋骨における力学的付加応答遺伝子の経時的発現パターンモニタリング系の確立、個体レベルでの時空間的タンパク質相互作用イメージング ・・・・・・・64
テーマ３：「X 線 CT イメージング技術の開発・改良とその有用性の検証」
サブトラクション法により組織構造の変化を解析するシステムの開発
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・68
造影剤を用いた撮影技術の確立による血管構造の測定精度の向上
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・71
山本 博章
テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」
CT 血管造影法と対応可能な微細血管観察法の開発 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・75
テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」
個体レベルでの時空間的タンパク質相互作用イメージング「毛周期に関わるβカテニンと LEF/TCF の
時空間的相互作用のモニタリング」 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・79
テーマ３：「X 線 CT イメージング技術の開発・改良とその有用性の検証」
低粘性造影剤を用いた撮影技術の確立による血管構造の測定精度の向上
・・・・・・・・・・・・・・・・・・82
永井 信夫
テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」
蛍光タンパク質を用いた特定タンパク質の組織・個体レベルにおける空間的イメージング
・・・・・・・・・・89
河内 浩行
テーマ３：「X 線 CT イメージング技術の開発・改良とその有用性の検証」
ビワマス筋肉内の脂肪分布・含有率の測定技術の確立とその応用

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私立大学戦略的研究基盤形成支援事業「個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証」（平成 24 年度～平成 28 年度）
研究成果報告書

テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」
研究課題：免疫金法を用いた特定タンパク分子の分布イメージング（腸粘膜における IgA の分布のイメージングと機能解析）
研究課題：低真空クライオ走査電顕法による生体試料観察

研究機関・研究室名：バイオサイエンス研究科・細胞組織構造学研究室担当者職名・氏名：教授・山本 章嗣
研究協力者：ポストドクター・市村 薫

研究課題： 免疫金法を用いた特定タンパク分子の分布イメージング（腸粘膜における IgA の分布のイメージン
グと機能解析）１．研究目的新蔵らは、結合力の低い IgA 抗体しか産生できないマウスでは腸炎を自然発症することを発見し、野生型マウス
腸管 IgA 産生細胞由来のハイブリドーマのスクリーニングより、多種類の腸内細菌に強い結合力を持つモノクロ
ーナル IgA 抗体（W27 抗体）と細菌にほとんど反応しない W2 抗体を得た。結合力の強い W27 IgA 抗体を腸炎マ
ウスに経口投与すると、腸内細菌叢が変化し腸炎が改善した。W2 抗体投与ではこれらの効果は見られなかった。つまり、腸内細菌叢を制御し炎症性腸疾患などの病気を防ぐためには細菌に対して結合力の高い IgA が必要であることを我々は明らかにした（Okai S. et.a.l Nat Microbiol. 2016;1(9):16103）。
本研究では、この分泌型 IgA がどのように腸内に分布し腸内細菌と結合しているのかを明らかにする為、走査電顕による IgA の分子イメージングを行った。

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２．研究成果①金標識による細胞表面分子の検出
我々は一次抗体、金標識 2 次抗体と反応後、金増感反応を行い電子顕微鏡下で検出する方法を確立している（Ymamoto and Masak。Methods Mol Biol. 2010; 657: 225-35.）本方法では、小胞体に局在する microsomal
aldehyde dehydrogenase （mADH）あるいは Heat shock protein 47 (HSP47)の C 末端に GFP を結合したタンパ
ク質を発現した COS-1 細胞を、固定し抗 GFP 抗体および金標識 2 次抗体で反応した後、エポキシレジン樹脂に包埋し超薄切片を作成し、透過電子顕微鏡で観察する。標識の金粒子は 1.4nm である。本法により、これらのタンパク質が小胞体に分布することを金粒子の空間分布により示すことを可能とする（図１）。

abc
図１． 金標識法による細胞内タンパク質分布の同定
固定した細胞を包埋前に一次抗体、金標識二次抗体で標識し、樹脂包埋後透過電顕で観察した。抗mADH抗体で処理した細胞の光学顕微鏡（a、矢印）と電顕写真（b、矢印が金粒子）、および抗HSP47抗体で処理した細胞電顕写真（C、矢印が金粒子陽性の小胞体）。Mはミトコンドリアを示す。バーは1μm。
この方法は、多くのタンパク質を電子顕微鏡で可視化することが可能であり、以下の実験に応用を試みた。
②マウス腸管における内在性分泌型 IgA の検出①の金標識法を応用し、マウス腸内在性 IgA の検出を試みた。IgA は腸管内に分泌される免疫グロブリンであり、腸内にその存在が確認できる可能性が強く示唆される。そこで、摘出後固定したマウス大腸を IgA 抗体および金
標識抗 Fab フラグメントで処理し金増感を行った後、走査電顕で観察した。標識の金粒子は 1.4nm であり、金増感法は Nanoprobes 社の方法（kit 2113）に従った。その結果、明瞭な金粒子の空間分布イメージを得ることはできなかったものの、EDX のスペクトラム解析により金元素の検出に成功した。（図２）。
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a

b

図２． マウス大腸におけるIgA分布の測定
マウス大腸の組織に抗IgA抗体、金標識抗Fabフラグメントを反応させ、増感反応後に測定を行った。観察では明確な金粒子は認められなかった（a）ものの、スペクトラム解析では明瞭な金粒子を認めた（ｂ、矢印）。バーは１μm。
以上の結果より、IgA は腸管壁に存在するものの、本法における金標識抗体および金増感法では走査電子顕微鏡および EDX での解析に十分な大きさの金粒子が得られないことが示唆された。
③W27 抗体と培養腸内細菌との結合のイメージング
次に、多種類の腸内細菌に強い結合力を持つモノクローナル IgA 抗体 W27 抗体が細菌に結合する可能性を検討した。
培養した大腸菌に W27 抗体、抗 IgA 抗体、金標識 Fab2 フラグメントを処理し、金増感法により金粒子径を増加させた後、走査電顕で観察した。金増感法は②と同様金増感法は Nanoprobes 社の方法（kit 2113）によった。
その結果、細菌表面への W27 抗体が結合を示すことに成功した（図３、図４）。

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a

b

c

d

図３． 大腸菌に対するIgA（W27）の結合
透過電子顕微鏡下の菌体の分布（a)と一致する金粒子の分布（ｂ）が認められた。また、生体分子である酸素（ｃ）も菌体の分布と一致した。
ｄはこれらのイメージの重ね合わせ。

ab

図４． 大腸菌に対するIgA（W27)の結合とEDX
透過電子顕微鏡下の菌体と一致する金粒子（矢印）の分布が認められた（a）。
一方、EDXのスペクトラムでは金と考えられる粒子の存在を確認できた。しかし、画像から得られ面積比（約５％）に対応する強度は得られなかった（ｂ）。
これらの結果より、W27 抗体が腸内細菌表面に結合している様子を今回開発した免疫走査電顕法を用いてイメージング化することができ、腸管分泌型 IgA がどのように腸内細菌を認識し、制御しているかを明らかにすることが可能になった。一方、しかし、EDX による金元素の同定には至らなかった。特に、図４で示すように、画像上の粒子径と EDX スペクトラムの解離が認められ、金粒子の増感がうまくいっていない可能性が強く示唆された。

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④菌、細胞表面の抗体のイメージング②および③において、EDX による金元素の同定が出来なかったのは、金増感法による金粒子径の増大が十分でないことに起因する。そこで、金標識抗体の金粒子を成長させる方法を、Staphylococcus Auleus を用いて検討した。その結、菌表面の金標識抗体の EDX による金元素同定に成功した。。さらに培養細胞系を用いた評価でも表面抗原に対する一次抗体と金標識二次抗体による EDX のイメージングと金元素の同定に成功した。ただし、画像化にはさらなる成長が必要であった。これらの方法により、EDX による評価が困難な金標識抗体の金標
識を試料上で成長させて金元素を同定する方法を確立し、同標識の EDX 分析法の基盤を確立した。
３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
今後は本方法に預金粒子の成長方法を検討して、腸管内の IgA の分布および W27 抗体の細菌への結合の
EDX 解析を検討する予定である。

研究課題：低真空クライオ走査電顕法による生体試料観察
１．研究目的
琵琶湖産のカビ臭産生、藍藻の１つに Phormidium tenue がある。P. tenue には、カビ臭を発生する緑色のものと産生しない褐色のものが存在するとされていた（図 5）。

これらの違いの理由は明らかになっておらず、カビ臭の除去のためにはその違い系を明確にする必要があった。
そこで、両者の比較を、低真空クライオ走査電顕法を用いて行った。

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２．研究成果
SEM で観察を行った結果、緑色種が細胞の周囲に鞘を持たないのに対して褐色種が鞘を持つことが明らかとなった（図６）。

さらに EDX による細胞内顆粒の元素分析を行ったところ、緑色種はポリリン酸顆粒を持つことが示された
（図７）。

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以上のように、細胞形態や細胞内顆粒に違いが見られることから、両者は異なる種であることが示された。この違いは、リボソーム RNA の解析からも追認されている。
３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
琵琶湖は近畿圏に広く水道水を供給しており、その水質の管理は極めて大切な課題である。 Phormidium

tenue には、カビ臭を発生する緑色のものと産生しない褐色のものが存在するとされていたが、これらは異なる種であることが明らかとなった。これらの知見は今後の琵琶湖の水質管理において重要な知見であると考える。

４．研究発表の状況＜雑誌論文＞
1) Ole1, fatty acid desaturase, is required for Atg9 delivery and isolation membrane expansion during autophagy in
Saccharomyces cerevisiae. Ogasawara Y, Kira S, Mukai Y, Noda T, Yamamoto A. Biol Open. 2017 Jan
15;6(1):35-40. 査読有
2) Ehrlichia secretes Etf-1 to induce autophagy and capture nutrients for its growth through RAB5 and class III
phosphatidylinositol 3-kinase. Lin M, Liu H, Xiong Q, Niu H, Cheng Z, Yamamoto A, Rikihisa Y. Autophagy. 2016
Nov;12(11):2145-2166. 査読有
3) The Ankrd13 Family of Ubiquitin-interacting Motif-bearing Proteins Regulates Valosin-containing Protein/p97
Protein-mediated Lysosomal Trafficking of Caveolin 1. Burana D, Yoshihara H, Tanno H, Yamamoto A, Saeki Y,
Tanaka K, Komada M. J Biol Chem. 2016 Mar 18;291(12):6218-31. 査読有
4) The drs tumor suppressor regulates glucose metabolism via lactate dehydrogenase-B. Tambe Y, Hasebe M, Kim
CJ, Yamamoto A, Inoue H. Mol Carcinog. 2016 Jan;55(1):52-63. 査読有5) γ-SNAP stimulates disassembly of endosomal SNARE complexes and regulates endocytic trafficking pathways.
Inoue H, Matsuzaki Y, Tanaka A, Hosoi K, Ichimura K, Arasaki K, Wakana Y, Asano K, Tanaka M, Okuzaki D,
Yamamoto A, Tani K, Tagaya M. J Cell Sci. 2015 Aug 1;128(15):2781-94. 査読有
6) GM130 is a parallel tetramer with a flexible rod-like structure and N-terminally open (Y-shaped) and closed(I-shaped) conformations. Ishida R, Yamamoto A, Nakayama K, Sohda M, Misumi Y, Yasunaga T, Nakamura N.
FEBS J. 2015 Jun;282(11):2232-44. 査読有
7) Low cytoplasmic pH reduces ER-Golgi trafficking and induces disassembly of the Golgi apparatus. Soonthornsit
J, Yamaguchi Y, Tamura D, Ishida R, Nakakoji Y, Osako S, Yamamoto A, Nakamura N. Exp Cell Res. 2014 Nov
1;328(2):325-39. 査読有
8) Impairment of vesicular ATP release affects glucose metabolism and increases insulin sensitivity. Sakamoto S,
Miyaji T, Hiasa M, Ichikawa R, Uematsu A, Iwatsuki K, Shibata A, Uneyama H, Takayanagi R, Yamamoto A, Omote H,
Nomura M, Moriyama Y. Sci Rep. 2014 Oct 21;4:6689. 査読有
9） Stearoyl-CoA desaturase 1 activity is required for autophagosome formation. Ogasawara Y, Itakura E, Kono N,
Mizushima N, Arai H, Nara A, Mizukami T, Yamamoto A. J Biol Chem. 2014 Aug 22;289(34):23938-50. 査読有
10） Essential role of vesicular nucleotide transporter in vesicular storage and release of nucleotides in platelets.

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Hiasa M, Togawa N, Miyaji T, Omote H, Yamamoto A, Moriyama Y. Physiol Rep. 2014 Jun 6;2(6). pii: e12034. 査
読有*11) 琵琶湖産の糸状カビ臭産生藍藻 Phormidium tenue の細胞内微細構造観察: 軟 X 線顕微鏡と透過型電子顕微鏡および低真空クライオ走査型電子顕微鏡を用いた比較観察。竹本邦子、山本章嗣、水田鋼、一瀬諭、吉村真史、難波秀利、木原裕。日本水処理生物学会誌 48, 157-163, 2012. 査読有＜図書＞*1) Yamamoto A, Masaki R. Pre-embedding Nanogold Silver and Gold Intensification. in High-Resolution Imaging of
Cellular Proteins, Methods Mol Biol. 2016;1474:269-7
2) オートファジー 生命を支える細胞の自己分解システム 水島昇、吉森保編、電子顕微鏡を用いたオートファジー
解析。山本章嗣、西野-林美都子、小笠原裕太。187－200、化学同人、京都、230 ページ 2012 年＜学会発表＞*1) Microscopy methods applied to research on musty odor producing filamentous cyanobacteria. Takemoto K,
Yoshimura M, Yamamoto A, Ichise S, Namba H, Kihara H. 第 12 回 X 線顕微鏡国際会議 (XRM2014)、メルボルン、
2014 年*2) Phormidium tenue とされている琵琶湖産糸状藍藻の微細構造観察 ― XM，TEM，低真空クライオ SEM にる ―竹本邦子，山本章嗣，一瀬 諭、吉村真史，塩野正道，西村雅子，水田 剛，難波秀利，木原 裕。 第５０回日本
水処理生物学会、神戸、 2013 年

31私立大学戦略的研究基盤形成支援事業「個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証」（平成 24 年度～平成 28 年度）
研究成果報告書

テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」
研究課題：免疫金法を用いた特定タンパク分子の分布イメージング（腸粘膜における IgA の分布のイメージングと機能解析）

研究機関・研究室名：バイオサイエンス研究科・生体応答学研究室（現・奈良先端科学技術大学院大学）
担当者職名・氏名：教授・新蔵 礼子
研究協力者：岡井 晋作、臼井 文人

１．研究目的近年、腸内細菌叢の異常(dysbiosis)が炎症性腸疾患だけではなく多くの疾患の発症に関連すると報告されており、腸内細菌叢を改善することは健康維持に重要である。腸内細菌叢は腸管に分泌される IgA 抗体によって認識し制御されていることが知られている。しかし、各 IgA 抗体が常在細菌の何を認識して常在細菌叢にどのような変化を与えるのか、などその詳細は明らかではない。

２．研究成果私たちはマウス小腸由来 IgA 産生細胞からモノクローナル IgA 抗体をクローニングし、各クローンが認識する細菌由来分子を探索した。まず、単離した IgA 抗体の中で、多くの種類の細菌に最も強く結合する能力を持つ W27抗体に着目した。Ｗ２７抗体が強く結合するのは大腸菌など腸炎の原因菌であり、乳酸菌やビフィズス菌といったプロバイオティクスに利用されるいわゆる善玉菌に対しての結合は弱かった。W27 抗体は多くの細菌が共通に持つ大腸菌の代謝酵素（sserine hydroxymethyltrasnferase）中の４アミノ酸の違いを識別しており、この特定のアミノ酸配列を認識して結合することで大腸菌の増殖を抑制した。一方で W27 抗体は良い菌の増殖を妨げないので、マウスへ W27 抗体経口投与を行ったところ、全体として良い菌が優位になる腸内環境へと変化する効果が見られた。W27 抗体を腸炎モデルマウスに経口投与すると、腸内細菌叢が変化し、その結果腸炎が抑制された。以上の結果から、IgA 抗体の経口投与が腸内細菌叢改善薬として応用できる可能性を示すことができた。
詳しい内容については添付の論文を参照にされたい。
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３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
IgA 抗体と腸内細菌との相互作用は、まだ未知の部分が多く、今後のさらなる基礎研究が必要である。そのために目的として掲げていたイメージング技術の完成は必須と考えられ、今後も継続して開発につなげたい。

４．研究発表の状況＜雑誌論文＞*1) Okai S, Usui F, Yokota S, Hori-I Y, Hasegawa M, Nakamura T, Kurosawa M, Okada S, Yamamoto K, Nishiyama E,
Mori H, Yamada T, Kurokawa K, Matsumoto S, Nanno M, Naito T, Watanabe Y, Kato T, Miyauchi E, Ohno H,
Shinkura R. High-affinity monoclonal IgA regulates gut microbiota and prevents colitis in mice. Nat Microbiol.
2016 1(9):16103. 査読有＜学会報告＞
1) 腸内細菌制御における腸管 IgA 抗体体細胞突然変異の役割。新蔵礼子。第 18 回腸内細菌学会、特別講演 （招待講演） 2014 年。
2) 腸管 IgA 抗体は多種類の腸内細菌の同一タンパク質を認識し制御している。臼井文人、岡井晋作、長谷川慎、
山本和也、西山依里、森宙史、山田拓司、黒川顕、新蔵礼子。第 37 回日本分子生物学会、パシフィコ横浜 2014年。
*3) 腸炎モデルマウスに対する腸管ＩｇＡ抗体の作用機序の解明。岡井晋作、臼井文人、野村慎太郎、中村肇伸、山本和也、西山依里、森宙史、山田拓司、黒川顕、加藤保、大野博司、新蔵礼子。第 37 回日本分子生物学会、パ
シフィコ横浜 2014 年。
*4) Oral administration of dimeric monoclonal IgA antibody as a candidate therapeutic approach for spontaneous
colitis in mice. Shinkura R. 第２２回日本消化器関連学会週間 (招待講演) 神戸国際展示場 2014 年。
*5) Oral administration of poly-reactive high-affinity IgA monoclonal antibody against intestinal microbiota improved
inflammatory colitis in mice (invited).. Okai S,, Horii Y, Shiraki,Y, Matsumoto S, Naitoh, T, Nanno M, Nomura S,
Shinkura R.13th International Congress of Immunology, Milan, Italy, 2013
6) Monoclonal intestinal IgAs are poly-reactive against commensal bacteria but recognize a single protein
expressed by multiple bacteria. Usui F, Shinsaku Okai, Hasegawa M, Shinkura R. 13th International Congress of
Immunology, Milan, Italy, 2013*7) Oral administration of poly-reactive high-affinity IgA monoclonal antibody against intestinal microbiota

improved

inflammatory colitis in mice.. Okai S,, Horii Y, Shiraki,Y, Matsumoto S, Naitoh, T, Nanno M, Nomura S, Kurokawa K,
Yamamoto K, Mori,H, Yamada T, Shinkura R. 第４２回日本免疫学会学術集会、幕張、2013.
8) Monoclonal intestinal IgAs are poly-reactive against commensal bacteria but recognize a single protein
expressed by multiple bacteria. Usui F, Shinsaku Okai, Hasegawa M, Shinkura R. 第４２回日本免疫学会学術集会、幕張、2013.

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私立大学戦略的研究基盤形成支援事業「個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証」（平成 24 年度～平成 28 年度）
研究成果報告書

テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」
テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」

研究機関・研究室名：バイオサイエンス研究科・植物分子環境生理学研究室
担当者職名・氏名：教授・蔡 晃植
研究協力者：神村 麻友、上坂 有矢、金谷 俊明、鬼頭 信貴、奥坂 綾太、
髙橋 弘輝、韓 宇龍、木村 誠、千坂 麻美

１．研究目的
植物は病原菌を認識すると、一過的な細胞内の Ca2+濃度の上昇やキナーゼの活性化などが認められ、それに引き続き活性酸素種の発生、免疫応答遺伝子の発現誘導、過敏感細胞死の誘導などの様々な免疫反応を誘導することが知られている。しかし、これら病原菌認識情報の細胞内伝達機構や免疫反応の誘導機構についてはまだ未知の部分が多い。近年、光学機器の発展や蛍光イメージングの技術革新により、今までは観察出来なかった分子の挙動を非破壊で観察することが可能になりつつある。そこで、生体イメージング装置を用いて植物免疫反応の誘導機構を解析できる新たな蛍光イメージング技術の開発を試みた。このような蛍光イメージン
グ技術を用いることで、免疫反応誘導時における植物体内での分子の挙動を可視化し、より俯瞰的に病原菌認
識機構や免疫反応の誘導機構を解析することが可能となる。本プロジェクトでは、走査電子顕微鏡を用いて細胞レベルでの活性酸素種発生のイメージングし、細胞内のどの部分から活性酸素種が発生しているのかを明らかにする。また、蛍光タンパク質を用いて細胞内 Ca2+濃度の変化を時空間的にイメージングし、植物の病原菌認識における Ca2+濃度変化の役割について知見を得る。さらに、大腸菌を用いたタンパク質相互作用の新しいイメ
ージング系を確立し、酵素基質反応のような一過的な相互作用を個体レベルで解析しうる検定系を構築し、構築した検定系の有効性について検証する。

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２．研究内容
１）テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」①セリウム塩法による活性酸素種発生のイメージング
イネは、イネ褐条病細菌 Acidovorax avenae のイネに対して非病原性の N1141 菌株を認識して免疫反応の一つである活性酸素種の発生を誘導する。そこで、このときの活性酸素種発生を時空間的に解析できる系の構築を行った。塩化セリウム（CeCl3）は、過酸化水素と反応すると直ちにセリウム水酸化物（Ce(OH)2OOH）の沈殿を生じ、沈着する。この反応産物は有機溶媒にも不溶で電子線を透過しないことから、活性酸素種の発生部位を詳細に解析するうえで有用であると思われる。イネ非病原性 N1141 菌株をイネ培養細胞に接種した後、この細胞をセリウム溶液で処理し、低真空走査型電子顕微鏡で観察した。その結果、非病原性菌株接種後 3 時間のイ
ネ培養細胞では、表面に点状のコントラストの高い部分を持つ細胞が全細胞数の約 5％で見られ、この部位は接種後６時間でさらに広がった(図 1)。このような高コントラスト部位は、イネに対して免疫反応を誘導しない非病
原性 H8201 菌株を接種した細胞や蒸留水を処理したコントロール細胞ではほとんど見られなかった。

図 1. A. avenae 非病原性 N1141 菌株または病原性 H8201 菌株接種後のイネ培養細胞における過酸化水素発
生部位の低真空 SEM による検出（a）非病原性の N1141 菌株接種後、3 時間のイネ培養細胞。矢印はセリウム反応物が反射電子像として白く見られる。（b）A. avenae N1141 菌株接種後、6 時間のイネ培養細胞。四角 1、2 は X 線解析を行った部位を表している。(c) 病原性の H8201 菌株接種後、6 時間のイネ培養細胞。(d)滅菌水処理したイネ培養細胞。バーは 5 µm
を示す。

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このセリウムと過酸化水素の反応物がコントラストの高い部分に存在することを確かめるために、X 線解析を行ったところ、高コントラスト部位では Ce-Lα、Ce-Lβによるピークが認められたのに対し、周りの部位ではそのよ
うなピークは検出されなかったことから、この高コントラスト部位にはセリウムが局在していることが確かめられた(図 2)。以上のことから、非病原性菌株の接種によりイネ培養細胞で認められる活性酸素の発生は一部の細胞で認められ、さらにこの産生部位は細胞表面で局所的であることが示された。

図 2. 非病原性 N1141 菌株接種後のイネ培養細胞における X 線スペクトラム
図 1(b)の(1)枠 1 部分、(2)2 枠部分の X 線解析し、Ce-Lαと Ce-Lβを検出した。ピークは高い方から Ce-Lα、Ce-Lβ1、Ce-Lβ2 を示す。

さらにイネ培養細胞での過酸化水素発生部位における菌体への影響を観察するために、セリウム反応物の沈
着部位について詳細に観察した。反射電子像により確認されたセリム反応物の沈着部位を拡大すると、高コント
ラスト部位の近傍に存在する非病原性 N1141 菌株はセリウム沈着物質に一部覆われていることが観察された(図 3)。これらのことから、非病原性 N1141 菌株によって誘導された過酸化水素は菌体の付着している細胞表面側へと拡散し、その結果、菌体の周囲では高濃度の過酸化水素が存在し、菌体の増殖抑制に関与していることを示唆している。

47

図 3. A. avenae N1141 菌株接種により誘導される過酸化水素発生部位の検出(a) 塩化セリウム処理をしたイネ培養細胞の反射電子像 (b)同じ細胞の二次電子像(c)(b)拡大像。白の矢印は細胞表面の非親和性菌はセリウム反応物によって覆われている。バーは(a)(b)=5 µｍ、(c)=1 µm

次に、イネ培養細胞の表面構造と過酸化水素の発生部位との関連を明らかにするために、反応産物の集積部位を透過型電子顕微鏡により観察した。その結果、非病原性菌株接種後６時間では、菌体が付着している培
養細胞の表層部分にイネ細胞膜の陥入が見られ、セリウム反応産物の著しい蓄積が細胞壁と細胞膜外側で認められた(図 4)。また陥入した細胞膜部分や細胞内のベシクル内でも反応産物が見られた。以上のように、活性酸素の発生部位を細胞レベルで、サブオルガネラレベルで調べることができるイメージング系を確立することが出来た。

図 4. イネ培養細胞への非病原性 N1141 菌株接種により誘導される過酸化水素発生部位の透過型電子顕微鏡
による検出(a) セリウム反応物(CD)は細胞壁(W)、細胞膜、細胞内ベシクル(矢印)と細胞表面の菌体周囲で認められる。
ER: 小胞体、MVB: multivesicular body、Ｐ: パピラを表す。バーは 0.5 µm を示す。

48

２）テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」①YC3.6 を用いたカルシウムイメージング系の確立
植物細胞において、環境応答、ホルモン応答、病害応答などの様々な刺激により細胞外やオルガネラから細胞質中へ Ca2+の流入が誘導され、セカンドメッセンジャーとして細胞内シグナル伝達系において重要な役割を果たしている。特に、この Ca2+の流入はそれぞれの刺激特有の時間的・空間的なパターンがあり、このパターンの違いによって情報が識別されていると考えられている。そこで、細胞内 Ca2+シグナルを可視化し、Ca2+動態の解析をモニターする系の構築することを目的とした。Ca2+動態の解析には、Yellow cameleon 3.6 （YC 3.6）という、ECFP、Calmodulin、M13、EYFP からなる Ca2+センサータンパク質を用いた。YC 3.6 は、Ca2+存在下で Calmodulinが活性化されて構造変化を生じ、励起された ECFP (Donor) から EYFP (Acceptor) に蛍光エネルギーの共鳴移
動 FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) が起こり、ECFP の強度が減少し、EYFP の強度が上昇する。
この ECFP と EYFP の蛍光強度比 (Ratio) をモニターすることで、細胞内の Ca2+の変動を可視化することが出来る（図 5）。

図 5. YC3.6 が Ca2+を認識するメカニズム

植物病原細菌 A. avenae のイネに対して非病原性 N1141 菌株の鞭毛構成タンパク質であるフラジェリンがイネ
免疫反応を誘導するが、病原性 K1 菌株のフラジェリンは免疫反応を誘導しないことが明らかになっている。そこ
で、YC3.6 を用いて、N1141 菌株及び K1 菌株のフラジェリン処理後のイネ培養細胞内の Ca2+動態の解析を試みた。植物の過剰発現プロモーターである Ubiquitin プロモーター下に制御された YC 3.6 遺伝子をパーティクルボ
ンバードメント法によりイネ培養細胞に導入し、約 12 時間静置培養した後、イネ培養細胞に N1141 菌株のフラジ
ェリンまたは K1 菌株のフラジェリンを処理し、その直後より共焦点レーザー蛍光顕微鏡 FV-1000 を用いて FRETの測定を開始した。その結果、N1141 菌株フラジェリン処理では、測定開始約 20 秒後から細胞内 Ca2+濃度の上昇が認められ、処理 3 分後には 2.5 倍まで上昇することが明らかとなった。また、Ratio 値の強度を擬似カラーで49表示したところ、この Ca2+濃度の上昇はイネ培養細胞内に均一に広がり、また細胞全体で上昇していることが明らかになった。この細胞内 Ca2+濃度の上昇は測定を終了した 6 分後まで続いたが、病原性 K1 菌株のフラジェリ
ン処理では、このような細胞内 Ca2+濃度上昇は認められなかった(図 6)。このことから、イネ培養細胞は N1141
菌株のフラジェリンを認識し、特異的に細胞内 Ca2+濃度の上昇を引き起こしていることが示された。

図 6. N1141 菌株または K1 菌株のフラジェリンを処理した後の Ca2+濃度の動態
YC3.6 を一過的に発現させたイネ培養細胞に精製フラジェリンを処理後、細胞内の Ca2+濃度の動態をモニターした。YC3.6 発現培養細胞から得られた EYFP/ECFP の Ratio 画像を 3×3 pixel で平均化し、Ratio 値の強度を 256
階調の擬似カラーで表示した。
さらに非病原性 N1141 菌株フラジェリンによって特異的に引き起こされる Ca2+濃度の上昇はフラジェリンの濃度依存的に認められるのかを明らかにするために、フラジェリン終濃度 10〜50 µg/ml となるようにイネ培養細胞に処理し、Ca2+濃度の動態を観察した。その結果、K1 フラジェリンではどの濃度においても Ca2+濃度の上昇は認められなかったのに対して、N1141 菌株のフラジェリンではフラジェリン濃度依存的な Ca2+濃度の上昇が認められた(図 7)。

図 7. N1141 菌株または K1 菌株のフラジェリンを処理した後の Ca2+濃度の動態
YC3.6 を一過的に発現させたイネ培養細胞に精製フラジェリンを処理後、細胞内の Ca2+濃度の動態をモニターした。

50

次に、このような N1141 菌株フラジェリン特異的な細胞内 Ca2+濃度上昇へのカルシウム阻害剤が及ぼす影響について調べた。カルシウム阻害剤としては、10 mM EGTA、1 mM nifedipine、5 mM LaCl3、1 mM GdCl3 を用いることとした。非病原性である N1141 菌株の精製フラジェリンをイネ培養細胞に処理し、Ca2+動態を解析したところ、10 mM EGTA、および 1 mM nifedipine 存在下では N1141 菌株フラジェリン処理による一過的で強い Ca2+濃度上
昇は完全に抑制されていることが明らかになった。一方、5 mM LaCl3、および 1 mM GdCl3 存在下では N1141 菌
株フラジェリン処理により中程度の Ca2+濃度上昇が認められることが明らかとなった（図 8）。これらのことから、
N1141 菌株のフラジェリン処理によって誘導される一過的な細胞内 Ca2+濃度上昇は、細胞外から細胞内へのCa2+流入によることを示している。
以上のことから、YC3.6 を用いて細胞内 Ca2+濃度の動態をイメージングする系が確立できたと言える。さらに、
このイメージング系はフラジェリン処理濃度依存的な Ca2+濃度の変化についてもモニタリングすることが可能であり、非常に詳細に Ca2+濃度の動態をモニターできることが示された。

図 8. YC3.6 発現イネ培養細胞を用いたカルシウム阻害剤の細胞内 Ca2+動態への影響
YC3.6 を一過的に発現させたイネ培養細胞を用いて、N1141 菌株の精製フラジェリン処理後の細胞内 Ca2+濃度の動態へのカルシウム阻害剤の影響を調べた。(A) 10 mM EGTA、(B) 1 mM nifedipine、(C) 5 mM LaCl3、(D) 1
mM GdCl3 を加え、終濃度 25 µg/ml の N1141 菌株の精製フラジェリンをイネ細胞内に処理し Ca2+濃度の変動をモニターした。

51

②大腸菌を用いた BiFC 法によるタンパク質間相互作用の検定系確立
キナーゼのような酵素の基質分子を探索することを目的とし、一過的な相互作用でも検出することが出来る検定系を Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC) 法を用いて構築した。BiFC 法は GFP などの蛍光タン
パク質を分割し、その分割した蛍光タンパク質同士が再会合することによって再び蛍光を発するようになるということを利用した方法である。この検定系の評価分子には、一般的によく知られているキナーゼである MAPK を用いることにした。これまでに、イネの MAPK の一つである OsMAP1 は MAPKK である OsMEK1 と相互作用し、
OsMAP2 や OsMAP3 とは相互作用しないことが明らかになっている。まず、OsMEK1 と OsMAP1 との特異的な相互作用が BiFC 法によって観察出来るかどうかをイネプロプラストで確認した。OsMEK1-Vn、OsMAP1-Vc、
OsMAP2-Vc だけを発現させたプロトプラストは、BiFC 由来の蛍光が観察されなかった。次に、相互作用が確認されている OsMEK1-Vn と OsMAP1-Vc を発現させたところ、核と細胞質で BiFC 由来の蛍光が観察された。一方、相互作用しないことが明らかとなっている OsMEK1-Vn と OsMAP2-Vc を発現させたプロトプラストでは BiFC
由来の蛍光は観察されなかった。以上のことから、BiFC 法によって OsMEK1 と OsMAP1 の特異的な相互作用を検出することが可能であると明らかになった(図 9)。

図 9. イネプロトプラストにおける BiFC 法を用いた OsMEK1 と OsMAP1、OsMAP2 のタンパク質間相互作用の解
析
OsMEK1-Vn、OsMAP1-Vc、OsMAP2-Vc のそれぞれ単体と、OsMEK1-Vn と OsMAP1-Vc、OsMEK1-Vn とOsMAP2-Vc の組み合わせでイネ培養細胞に発現させ、共焦点レーザー顕微鏡により蛍光を観察した。これらのプロトプラストには全て形質転換を確認するために DsRed を発現させている。バーは 10 µｍを示す。

52

次に、相互作用タンパク質を簡便にスクリーニング可能な検出系を構築するために、大腸菌 Rosetta-gamiB
内でも OsMEK1 と OsMAP1 の特異的な相互作用が BiFC 法で観察出来るかを検討した。各組み合わせで遺伝子導入した Rosetta-gamiB に IPTG を添加し、BiFC 由来の蛍光を検出したところ、IPTG 添加後、3 時間から
OsMEK1-Vn と OsMAP1-Vc を発現させた Rosetta-gamiB で BiFC 由来の蛍光が認められた(図 10)。このような蛍光は、相互作用しないことが報告されているタンパク質間では認められないことも明らかとなり、本検定系はキナーゼと基質の特異的な相互作用を検出出来ることが示された。
A
1

Venus

6

OsMEK1-Vn/

Vn/

GUS-VcOsMAP1-Vc

OsMEK1-Vn/
OsMAP3-Vc

OsMEK1-Vn/

5

2

OsMAP1-Vc

OsMEK1-Vn/
OsMAP2-Vc

3

4
B
4

1

2

1

234 5 6

3

5

6
GUS-VcOsMEK1-Vn
OsMAP1-Vc
OsMAP2,3-Vc

*
Venus

Vn
Sliver staining

図 10. 大腸菌 Rosetta-gamiB を用いた BiFC 法による特異的な相互作用の検出（A）LB 寒天培地（スペクチノマイシン終濃度 50 µg/ml、トリメトプリム終濃度 50 µg/ml）に画線した大腸菌
Rosetta-gamiB の BiFC 蛍 光 を 検 出 し た 。 そ れ ぞ れ の ベ ク タ ー （ 1: Venus/pETTp 、 2: Vn/pETTp とOsMAP1-Vc/pCDF 、 3:

OsMEK1-Vn/pETTp

OsMAP1-Vc/pCDF 、 4:とOsMEK1-Vn/pETTpとOsMAP2-Vc/pCDF、5: OsMEK1-Vn/pETTp と OsMAP3-Vc/pCDF、6: OsMEK1-Vn/pETTp と GUS-Vc/pCDF）
を大腸菌 Rosetta-gamiB にエレクトロポレーション法で共導入し、生育してきたコロニーを掻き取り、LB 寒天培
地上に乗せたナイロンメンブレンに画線した。37℃、16 時間培養後、メンブレンを持ち上げ、その下の培地に 1mM IPTG 溶液 500 µl を添加し，遮光して 25℃、6 時間静置後，蛍光イメージング装置 FLA-3000 で BiFC 由来の蛍光を観察した。（B）形質転換した Rosetta-gamiB 内で目的タンパク質が発現しているかを抗 GFP 抗体で確認した。*は非特異的なバンドである。

53

この構築した検定系を用いて、植物の情報伝達に非常に重要であるカルシウム依存性プロテインキナーゼ、
OsCPK8 の基質分子をスクリーニングしたところ、OsCPK8 と相互作用を示す分子として CS-1、CS-2、CS-3 の 3つを同定することが出来た(図 11)。これらはそれぞれ Enolase 1、Guanine-nucleotide exchange factor for
ADP-ribosylation factor GTPase (ARF-GEF)、Peptidyl prolyl isomerase (PPIase) をコードすることが明らかになった。これらタンパク質は実際にイネ細胞内でも OsCPK8 と相互作用することが確認されたことから(図 12)、構築
したスクリーニング系で酵素基質反応のような一過的に相互作用するタンパク質を同定することが出来ることが示された。

図 11. 大腸菌 Rosetta-gamiB を用いたスクリーニング
大腸菌 Rosetta-gamiB 内で OsCPK8-Vn と相互作用を示す CS-1、CS-2、CS-3 の BiFC 蛍光を蛍光イメージン
グ装置 FLA-3000 で観察した。

図 12. イネプロトプラストにおける OsCPK8，CS1，CS2，CS3 の細胞内局在性の解析とタンパク質間相互作
用の解析（A） OsCPK8-Venus、CS1-Venus、CS2-Venus、CS3-Venus を発現させた細胞を共焦点レーザー顕微鏡により観察し、それぞれのタンパク質の細胞内局在を確認した。（B） 各 Vn 融合タンパク質 CS1-Vn、CS2-Vn、CS3-Vn と OsCPK8-Vc との相互作用を確認した。B. F. : Bright field

54

③GFP 発現植物病原性細菌の植物内における経時的分布変化モニタリング系の確立
病原性細菌が植物に感染後にどのように分布するのかを非破壊で時空間的に解析できる系の構築を試みた。
まず、検定に用いる菌株と宿主植物を選定するためにいくつかの菌株をそれぞれの植物に接種し、病徴発現を
観 察 し た と こ ろ 、 タ バ コ 野 火 病 菌 で あ る Pseudomonas syringae pv. tabaci 6606 株 を タ バ コ （ Nicotiana

benthamiana）に接種した時には病徴が認められず、病害抵抗性反応の一つである過敏感細胞死が認められたことから、この病原細菌株とタバコは非親和性関係にあると結論づけられた(図 13)。

図 13. P. syringae pv. tabaci 6606 株を接種したタバコ葉の経時的変化
1×10８cfu/µl となるように調製した P. syringae pv. tabaci 6606 株を播種 3 週間後のタバコの葉にインフィルトレーションし、接種後 2 日目と 9 日目を観察した。

一方、トマト Solanum lycopersicum (Money Maker)に斑点病菌である Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000(PstDC3000) 株を接種したところ、明瞭な病徴が観察されたことから、この病原性細菌とトマトは親和性関係にあることが示された(図 14)。

図 14. PstDC3000 を接種したトマトの葉の経時的変化
1×10８cfu/ml となるように調製した PstDC3000 を播種 3 週間後のトマトの葉にインフィルトレーションし、接種後4 日目を観察した。

55

次に、PstDC3000 をトマトに接種したときの時空間的分布を解析する系を構築するため、まず、カナマイシン耐性遺伝子のプロモーターに GFP を連結させた pPNptGreen ベクターを PstDC3000 に導入した。作製した組換え
PstDC3000 は明瞭な GFP 蛍光を有していたので、この菌をトマトに接種し、生体イメージング装置 Lumazon で観察した。その結果、接種 1 日後には接種部位全体で GFP 蛍光が認められ、接種 2 日後から徐々に葉全体へ
GFP 蛍光が広がることが認められた(図 15)。

図 15. GFP を発現した PstDC3000 を接種したトマトの葉における経時的な蛍光画像
1×10８cfu/ml となるように調製した GFP 発現 PstDC3000 を播種 3 週間後のトマトの葉にインフィルトレーション
し、接種後 1〜7 日目のトマトの葉を、蛍光イメージング装置 Lumazon を用いて GFP 蛍光を観察した。白矢印は接種部位を示す。

56

さらに、この葉を実体蛍光顕微鏡で観察したところ、接種 1 日後には GFP 蛍光が認められ、その GFP 蛍光は葉脈に沿ってドット状に認められることが示された。また接種後 2 日目からは接種部位以外でも病斑が認められ、その蛍光は徐々に病斑全体に広がっていくことが観察された(図 16)。

図 16. GFP を発現した PstDC3000 を接種したトマトの葉を実体顕微鏡で観察したときの明視野像（上段）と蛍光像（下段）
1×10８cfu/ml となるように調製した GFP 発現 PstDC3000 を播種 3 週間後のトマトの葉にインフィルトレーション
し、接種後 1〜7 日目のトマトの葉を実体顕微鏡により経時的に観察した。

さらに詳細に PstDC3000 の存在部位を明らかにするために、GFP 蛍光が消失しない状態で植物を脱色することが出来る Clear See 脱色液を用いてトマト葉を脱色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、PstDC3000
は葉脈と葉全体の細胞間隙に多数存在していることが明らかになった(図 17)。また、このときの菌体数を測定したところ、接種後 7 日目で 100 倍程度増加していることが認められた(図 18)。以上のことをまとめると、
PstDC3000 の病徴は経時的に葉全体へ広がり、このときの病斑形、病斑の形成と菌株の増加は時空間的に一致していることが初めて明らかになった。

57

図 17. GFP 発現 PstDC3000 を接種したトマトの葉の内部構造
1×10８cfu/ml となるように調製した GFP 発現 PstDC3000 を接種 3 週間後のトマトの葉にインフィルトレーション
し、接種後 7 日目のトマトの葉を ClearSee 脱色液で脱色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて GFP 蛍光の観察を行った。（A）接種部位、(B)病徴が認められた部位。バーは 10 µm を示す。

Growth of bacteria (cfu/leaf)

1010
108

*

*
*

106
104
102
0
0

1

3

5

7

Time after inoculation (day)
図 18. トマトの葉における GFP 発現 PstDC3000 の菌体数の推移
生育 3 週間目のトマトの葉に GFP 発現 PstDC3000 が 1×106cfu となるようにインフィルトレーションし、接種後 0、1、3、5、7 日目の葉をすり潰し、菌体数を測定した。t-test(*: p<0.05)

58次に、PstDC3000 と N. benthamiana を用いて非親和性関係における病原菌の時空間的分布についても調べた。GFP を発現した PstDC3000 を N. benthamiana に接種すると、接種１日後に過敏感細胞死斑が認められ、7 日後まで変化がなかった(図 19)。この時の GFP 蛍光を観察したところ、接種直後はほとんど GFP 蛍光が認められなかったが、接種後１日目から接種部位で GFP 蛍光が認められた。この GFP 蛍光は 7 日経っても接種部位
より外に広がることはなく、その蛍光は徐々に弱くなることが示された(図 20)。

図 19. GFP を発現した PstDC3000 を接種したタバコの葉の明視野像（上段）と蛍光像（下段）
1×10８cfu/ml となるように調製した GFP 発現 PstDC3000 を播種 3 週間後のタバコの葉にインフィルトレーショ
ンし、接種後 1〜7 日目のタバコの葉を、蛍光イメージング装置 Lumazon を用いて明視野像と GFP 蛍光像の観察を行った。白矢印は接種部位を示す。

59

図 20. GFP を発現した PstDC3000 を接種したタバコの葉の明視野像（上段）と蛍光像（下段）
1×10８cfu/ml となるように調製した GFP 発現 PstDC3000 を播種 3 週間後のタバコの葉にインフィルトレーショ
ンし、接種後 1〜7 日目のタバコの葉を実体顕微鏡により経時的に観察した。

図 21. タバコの葉における GFP 発現 PstDC3000 の菌体数の推移
生育 3 週間目のタバコの葉に GFP 発現 PstDC3000 が 1×106cfu となるようにインフィルトレーションし、接種
後 0、1、3、5、7 日目の葉をすり潰し、菌体数を測定した。t-test(*: p<0.05)

60またこのときの菌体数についても調べてみたところ、接種 3 日目に 80 倍に上昇したものの 7 日目では接種時と同程度まで減少していた(図 21)。この増減は、GFP 蛍光像を観察したときにも同様に認められており、GFP 蛍光の強さは菌体数と比例していることが示された。このことから、非親和性関係においては、病原菌が接種部位で若干増加するものの、それ以上その存在部位が広がることがなく、接種部位に限局することが明らかとなった。

３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
本プロジェクト研究において、活性酸素種をセリウム反応物として沈着させ、可視化することに成功した。これ
により、活性酸素は局所的に発生することで、部分部分では非常に高濃度になっていること、実際に活性酸素発生部位には正常な菌体は存在せず、その周辺の菌体も大きなダメージを受けていることがこの研究で明らかになった。この研究結果は、植物の免疫反応によって誘導される活性酸素種の濃度では病原菌は死滅しないことから、活性酸素が直接的に病原菌の生育を抑制していないのではないかという長い間の論争に終止符を打つことになった。今後はこのような活性酸素種の発生の直接的な分子を特定し、どのようなメカニズムで活性酸素が発生しているのかより詳細に研究を進めていく必要があるだろう。
また、YC3.6 を用いた細胞内の Ca2+濃度の動態のイメージング系では、病原菌認識に関与する Ca2+濃度の動態を非破壊で、連続的に明らかにすることが出来た。他にも植物の様々な環境応答における Ca2+の動態を調べていくことにより、Ca2+のセカンドメッセンジャーとしての役割を明らかにすることが出来ると考えられる。
また、大腸菌を用いた BiFC 法は、タンパク質間相互作用の新しいイメージング系として、酵素基質反応のような一過的なタンパク質相互作用の解析をより簡便に行うことが出来る系である。本法は、酵母 Two-hybrid 法では解析不可能であった自立活性を有している転写因子の相互作用解析にも有用であると思われる。本技術は植物だけにとどまらず動物においても十分に応用可能な技術であり、今後様々なところで使用されることが期待される。

４．研究発表の状況＜雑誌論文＞
1) Identification of interacting proteins for calcium dependent protein kinase 8 by a novel screening system basedon bimolecular fluorescence complementation. Kamimura, M., Han, Y., Kito, N. Che, F. S. Biosci. Biotech.
Biochem., 78, 438-447, 2014.
2) Two distinct EF-Tu epitopes induce immune responses in rice and Arabidopsis. Furukawa, T., Inagaki, H., Takai,R., Hirai, H., Che, F. S. Mol. Plant Microb. Interact., 27,113-124,2014.
3) Glycan moiety of flagellin in Acidovorax avenae K1 prevents the recognition by rice that causes the induction of
immune responses. Hirai H, Takai R, Kondo M, Furukawa T, Hishiki T, Takayama S, Che FS. Plant Signal Behav.,
9,11, 20144) CD2-1, the C-Terminal Region of Flagellin, Modulates the Induction of Immune Responses in Rice. Katsuragi Y,
Takai R, Furukawa T, Hirai H, Morimoto T, Katayama T, Murakami T, Che FS. Mol Plant Microbe Interact., 28（6）61648-58, 2015
5)

IREN, a novel EF-hand motif-containing nuclease, functions in the degradation of nuclear DNA during thehypersensitive response cell death in rice. Ootsubo Y, Hibino T, Wakazono T, Mukai Y, Che FS. Biosci Biotechnol
Biochem., 80(4), 748-60, 2016.

6)

Frameshift Mutation Confers Function as Virulence Factor to Leucine-Rich Repeat Protein from Acidovorax

avenae. Kondo M, Hirai H, Furukawa T, Yoshida Y, Suzuki A, Kawaguchi T, Che FS. Front Plant Sci. 4, 7, 1988.
2017.

＜総説＞
1) BiFC を基盤とした大腸菌を用いた新規相互作用検定法。神村麻友、蔡晃植。植物の生長調節 51, 1, 52-55,
2016 年＜学会発表＞
1) イネとシロイヌナズナに存在する異なるフラジェリン認識機構のキメラ受容体を用いた分子解析。片山貴等、村上貴彦、河合美咲、高井亮太、蔡晃植。農芸化学会 2016 年度大会、北海道、2016 年
2) イネの Ca2+依存性エンドヌクレアーゼである IREN は過敏感細胞死において認められる DNA 断片化の実行因子である。若園貴仁、大坪由佳、日比野孝紀、向由起夫、蔡晃植。日本農芸化学会 2015 年度大会、岡山、2015 年
3) イネの病害抵抗性に関与する PR7 と PR8 遺伝子の転写を制御する新規 NAC 転写因子の同定。奥山愛梨、平井洋行、宇野雄太、寺沢勇治、堀家史哉、久保健一、仲下英雄、蔡晃植。第 38 回日本分子生物学会、神戸、2015 年
4) Ca2+依存性プロテインキナーゼ 8 を介したイネの病原菌認識情報伝達機構。鬼頭信貴、上坂有矢、韓宇龍、神村麻友、蔡晃植、第 37 回日本分子生物学会、横浜、2014 年
5) カルシウム依存性プロテインキナーゼ 12 を介したイネの病原菌認識情報伝達機構。神村麻友、韓宇龍、鬼頭信
貴、蔡晃植。第 55 回日本植物生理学会年会、富山、2014 年
6) イネにおける植物病原細菌の鞭毛タンパク質フラジェリンの受容とその情報伝達機構の解析。桂木雄也、小栗章成、森本匠、片山貴等、村上貴彦、高井亮太、蔡晃植。第 55 回日本植物生理学会年会、富山、2014 年
7) イネにおける植物病原細菌の鞭毛タンパク質フラジェリンの受容機構解析。桂木雄也、小栗章成、森本匠、片山
貴等、村上貴彦、高井亮太、蔡晃植。第 36 回日本分子生物学会年会、神戸、2013 年
8) Ca2+依存性プロテインキナーゼ 12 を介したイネの病原菌認識情報伝達機構。神村麻友、韓宇龍、千坂麻美、鬼頭信貴、黎芷瑜、蔡晃植。第 36 回日本分子生物学会年会、神戸、2013 年
9) イネにおける鞭毛タンパク質フラジェリン認識後の情報伝達機構の解析。桂木雄也、小栗章成、森本匠、高井亮
太、蔡晃植。第 54 回日本植物生理学会年会、岡山、2013 年
10)

Ca2+依存性プロテインキナーゼ 8 を介した病原菌認識情報の伝達機構。神村麻友、韓宇龍、上坂有矢、蔡晃植。
第 54 回日本植物生理学会年会、岡山、2013 年

11)

イネ過敏感細胞死誘導における転写因子 OsNAC3 の役割。大坪由佳、青木友里、四井翔太、蔡晃植。第 54 回
日本植物生理学会年会、岡山、2013 年

12)

植物病原細菌の鞭毛タンパク質フラジェリンのイネにおける認識と免疫反応誘導機構。桂木雄也、小栗章成、
森本匠、高井亮太、蔡晃植。第 35 回日本分子生物学会、福岡、2012 年

62

13)

イネの免疫反応を誘導する病原細菌由来タンパク質の同定とその認識機構。古川岳人、平井洋行、近藤真千子、蔡晃植。第 35 回日本分子生物学会、福岡、2012 年

14)

植物免疫反応である活性酸素発生の Ca2+依存性プロテインキナーゼによる制御機構。神村麻友、韓宇龍、千坂麻美、蔡晃植。第 35 回日本分子生物学会、福岡、2012 年

63私立大学戦略的研究基盤形成支援事業「個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証」（平成 24 年度～平成 28 年度）
研究成果報告書

テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」
研究課題：個体レベルでの新たな遺伝子発現イメージング・マウス頭蓋骨における力学的負荷応答遺伝子の経時的発現パターンモニタリング系の確立
研究課題：個体レベルでの時空間的タンパク質相互作用イメージング

テーマ３：「X 線 CT イメージング技術の開発・改良とその有用性の検証」
研究課題：サブトラクション法により組織構造の変化を解析するシステムの開発
研究課題：新規造影剤を用いた精度の高い血管撮影技術の開発

研究機関・研究室：バイオサイエンス研究科・時空動物学研究室
担当者職名・氏名：教授・野村 慎太郎
研究協力者：契約研究員・増元 文子

１．テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」
１）研究課題：個体レベルでの新たな遺伝子発現イメージング・マウス頭蓋骨における力学的付加応答遺伝子の経時的発現パターンモニタリング系の確立
研究課題：個体レベルでの時空間的タンパク質相互作用イメージング①研究目的
個体は外部環境に対して生理学的、解剖学的変化をもって対応することが知られており、長い生物学の歴史はこの過程の解明に充てられてきた。現在最も研究の余地が残されている分野は力学的負荷に対応した解剖学的変化、つまり形態変化の分子機構解明である。その主たる原因は細胞レベルと個体レベルの形態変化をつなぐ手法が限定されていたことであると考えられる。生体イメージングとＣＴ装置を駆使して力学的負荷と形態変化をつなぐ分子としてオステオポンチン(OPN)を設定し、OPN 発現細胞の分布をプロモータートランスジェニッ
クマウスの骨組織と膀胱において可視化することを試みた。

64

②研究成果骨拘縮モデルおよび尿閉症モデルにおいて、遺伝子発現イメージングを試みた。
(1)骨拘縮モデル
力学的負荷に対応して発現上昇が認められるオステオポンチン遺伝子プロモーターにおける力学負荷対応領域を決定し、この配列に GFP cDNA を結合させた遺伝子を導入したトランスジェニックマウスに骨拘縮モデル
により骨形態変化を起こし、経時的に得た骨組織を脱灰、透明化し、GFP の発現を可視化した。
骨拘縮モデルは、大腿骨の股関節最大伸展位、膝関節最大屈曲位での固定により骨拘縮を誘導するモデルである。この骨拘縮モデルマウスでは、後ろ足を背中側に持ち上げ、足に負荷がかからない状態になるようテー
プで固定した。背中側に持ち上げることにより、動物は当該領域に力を加えることができなくなる。この状態を持続することにより大腿骨に骨拘縮が起こる。

上記の方法で標本から微弱な蛍光を検出することに成功した。

以下に示す図は画像処理を行い、蛍光強度を補足する感度を最大限に増強したものである。

イメージアナライザーによる OPN 発現細胞の分布。赤で表示された領域は骨吸収の盛んな部位であり、骨吸収に OPN が関わっていることを示している。しかしながら生きた個体における生体イメージングを成功させることは現時点で困難であるという結果を得た。

65

(2)尿閉症モデル
マウスの尿道を縫合糸で結索し、尿閉症モデルを作成した。膀胱内の尿圧は著しく上昇し、術後 24 時間において膀胱は排尿後の約 10 倍の重量を示した。膀胱被覆上皮細胞は円柱上皮細胞から重層扁平上皮細胞への形
態変化が観察された。膀胱上皮が尿圧の上昇による力学的負荷を感受した結果であるマイクロアレイ法による解析で、Keratin 6,Keratin 14 の遺伝子発現が劇的に上昇していることが示された。
Gene symbol bScale Sig eSc aleSig * Log2Ratio
Prss27520.98870.2
4.1
Col17a1
207.8
3217.1
4.0
Thbs1
601.6
8938.0
3.9
Omp
360.4
3944.3
3.5
Slc16a3689.1
8990.6
3.7
S100a2124.4
1526.9
3.6
Ch25h
136.8
2596.2
4.2
Ctgf
793.1
23070.3
4.8
Pole
134.7
1542.93.5
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1479.2
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Krt14
215.8
22812.9
6.7
Zdhhc22443.2
4785.5
3.4
Krt6a
352.3
48484.0
7.1
D17H6S56E-5
217.6
3398.1
4.0
Reg3g
171.3
14922.1
6.4
Tnfrsf23
345.4
4827.6
3.8
S100a3
149.4
1814.0
3.6
Itga3
490.1
5863.1
3.6
Lcn2
150.5
3561.4
4.5
Ripk3
365.5
3917.1
3.4
Ccne1
184.6
2301.8
3.6
DUSP5
275.3
2785.13.3
Saa3
1356.449662.1
5.2
Plat
678.9
10189.3
3.9
Galnt3544.8
5356.73.3

解析結果から krt6a では手術群で対照群の約 139 倍の遺伝子発現が認められた。また krt14 では手術群で対照群の約 101 倍の遺伝子発現を認めた。
keratin は細胞の形態保持に必要不可欠な細胞骨格であり、酸性を示す typeⅠと、塩基性～中性を示す typeⅡに分類されている。大部分の keratin 分子は typeⅠ keratin のポリペプチド鎖 2 本と typeⅡ keratin のポリペプチド鎖 2 本が重合した 4 量体として存在する。krt6a にコードされる Keratin 6 は分子量約 56 kDa の typeⅡ

66

keratin であり、Keratin 16 と 4 量体を形成し、正常細胞では主に増殖期の扁平上皮細胞に発現していることが報告されている。krt14 にコードされる Keratin 14 は分子量約 50 kDa の typeⅠ keratin であり、Keratin 5 と 4 量体を形成し、正常細胞では主に基底細胞、筋上皮細胞、中皮細胞に発現していることが報告されている。
マイクロアレイの結果は膀胱組織全体に存在する RNA 量のなかで特定の遺伝子にコードされる mRNA の量的変動を示している。また、特定遺伝子の mRNA において発現の増減が認められた場合でも翻訳されているかどうかの情報を含んでいない。手術によって我々が観察した上皮組織細胞構成成分のダイナミックな変化とKeratin 6 と Keratin 14 の発現状況に相関を求めることを目的として、術後 8 時間、16 時間、24 時間に摘出した
膀胱と、対照の膀胱より作成した厚さ 3 µm のパラフィン切片の免疫染色を Keratin 6 と Keratin 14 に対する特異的な抗体を用いて行った 。
これらの遺伝子産物は免疫染色によって上皮細胞に特異的な発現を示していた。膀胱組織を摘出後 CLARITY
法にて透明化を行い、オステオポンチン、Keratin 6,Keratin 14 抗体と 4 日間反応させ、さらに Scale 法にて再度透明化を 10 日間行い、実態蛍光顕微鏡にて尿管口付近の上皮組織に明確な蛍光の存在を認めた。しかしながらイメージアナライザーによる蛍光の検出は困難であった。
本研究において生体イメージングの効果を充分に得ることには困難が伴うことが予想されるが、力学的負荷による個体の生体反応を非破壊的に検出するシステムの構築は今後重要な課題となることが予想されるので引き続き検討を行う。

67

２．テーマ３：「X 線 CT イメージング技術の開発・改良とその有用性の検証」
１）研究課題：サブトラクション法により組織構造の変化を解析するシステムの開発①研究目的
X 線 CT 装置を用いて得られた情報と組織化学的手法によって得られた情報の間に存在する解像度の差異という質的な差異をつなぐ方法の開発を主眼とし、新たに非侵襲骨拘縮モデルを開発し、その評価を四次元的に行うことを検討した。
②研究成果
１）卵巣摘出によるエストロゲン低下に伴う骨代謝速度亢進および骨吸収促進モデル
２）大腿骨の股関節最大伸展位、膝関節最大屈曲位での固定による骨拘縮モデル
において経時的に X 線 CT 装置により骨組織の立体構築した CT 画像を任意の方向からスライスし、骨の内部を透視する技法を開発し、骨の立体的な形態が経時的に変化する過程を可視化することに成功した。
(1)卵巣摘出によるエストロゲン低下に伴う骨代謝速度亢進および骨吸収促進モデル
において腰椎は L3 を中心に解析を行った。この部位は骨形態計測によく使われる領域であり、ホルモンの影響を大きく受けることが知られているからである。また大腿骨は骨盤と接する骨頭から膝関節を経て腓骨脛骨の中間部を摘出し測定に用いた。

画像取得領域において組織学的に骨吸収が起こっていることを確認した。

卵巣摘除後、経時的な石灰化領域の比較を行い、どの部分において骨吸収が起こったかを正確に表示することに成功した。

68

!
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!
!
!
!
!
!
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同一個体において骨の微細構造を詳細に検討することができた最初の例となる。

69

(2)大腿骨の股関節最大伸展位、膝関節最大屈曲位での固定による骨拘縮モデル
前述の大腿骨の股関節最大伸展位、膝関節最大屈曲位での固定による骨拘縮モデルにおいても当該骨石
灰化領域の経時的変化を測定した。

!
!
!
!
!

テーピング 24 日後において最も大きな骨構造の変化が認められたのは骨端線の領域である。この部分を拡大し、比較検討を行った。

!
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!
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70

さらに骨密度測定ソフトウェアを新たに導入し、卵巣摘除、あるいは骨拘縮処置を行ったマウスにおける骨密度変化を経時的に測定し、定量化を行った。その結果、卵巣摘除によって骨の代謝回転速度が上昇するが、力学的負荷は圧迫、牽引いずれの部位においても骨密度の変化を生ぜず、結果的には骨強度にも変化を与えないということが示された。

２）研究課題：造影剤を用いた撮影技術の確立による血管構造の測定精度の向上①研究目的
血管内皮に対して負荷される圧力、つまり血圧を決定する抵抗血管の走行性とサイズをＣＴ装置によって可視化する技術を開発するため、実験動物における小動脈（直径 20 μm）を高解像度で造影する技術の開発を行った。
②研究内容
CT 装置による実験動物血管造影法の開発を行った。動脈系の血管造影はマウスの左心室より、静脈から肺動脈にかけては尾静脈より造影剤の注入を行った。造影剤としてとして CT で明確に検出できる二酸化チタンを使用した。担体としてメチルセルロース、あるいはグリセロールが有効であった。しばしば造影剤の凝集、担体に生じる気泡が問題となったので分散剤と消泡剤を併用した。造影すべき臓器、血管のサイズによって造影剤の組成を変更することによって対応した。一般的に 0.1%メチルセルロース — 2.5%二酸化チタンという組成の造影剤に分散、消泡剤（SN デスパーサント SN デフォーマー265 など（サンノブコ社））を加えたものが下図に示すように高い造影効果をあらわした。

頭部（左）および腹部（右）の動脈系血管造影

71

担体としてグリセリンを用いた場合、分散、消泡剤の選択の幅が広く造影も容易であった。以下に示す図は 50%
グリセロール — 2.5%二酸化チタンを造影剤として用いたときの血管造影像である。

頭部（左）および腹部（右）の動脈系血管造影

このような組成の造影剤を用いて造影される血管の最小直径を計測した。0.2%メチルセルロース — 2.5%二酸
化チタンを造影剤として用いている。

腎臓における造影。左図赤枠内を右に拡大した。計測の結果、矢印で示された血管の直径は 25 ㎛であった。
また、グリセロールを担体として用いた場合にも同様の計測を行った。下図は以下に示す図は 50%グリセロール— 2.5%二酸化チタンを造影剤として用いたときの血管造影像である。

72

計測の結果、矢印で示された血管の直径は 20 ㎛であった。
上記の結果は本学に設置されている CT 装置（R_mCT2）を用いて得られたものである。現在より高い解像度を有する CT 装置が販売されており、さらに解像度の高い造影像を得ることが期待される。よって我々の得た結果はCT 装置によってさらに改善する可能性が高い。

３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
我々は実験動物に適した新規組成の造影液を開発することによって直径最小 20 ㎛の血管の造影に成功した。
これは最も小さい細動脈の直径に匹敵する。この方法を用いて「抵抗血管」とよばれる血圧をコントロールする
血管の動向を探ることができるようになっただけでなく、結節性動脈周囲炎、播種性血管内凝固症候群、バージャー病など細動脈に変化が現れる病変を小動物で再現し、評価する手法が開発されたと考えられる。

４．研究発表の状況＜雑誌論文＞
1) Sputum Leucine-Rich Alpha-2 Glycoprotein as a Marker of Airway Inflammation in Asthma.Honda H, Fujimoto M,
Miyamoto S, Ishikawa N, Serada S, Hattori N, Nomura S, Kohno N, Yokoyama A, Naka T. PLoS One. 11:e0162672(2016). 査読有
2) Human Dynactin-associated protein transforms NIH3T3 cells to generate highly vascularized tumors with weakcell-cell interaction. Kunoh T, Wang W, Kobayashi H, Tog Y, Tokuyama M, Hosoi M, Koseki K, Wada S, Nagai N,
Nakamura T, Nomura S, Hasegawa M, Sasaki R, Mizukami T. PLos One. 10: e1035836 (2015). 査読有
3) CTLA4-Ig suppresses development of experimental autoimmune uveitis in the induction and effector phases:
comparison with blockade of interleukin-6. Iwaashi C, Fujimoto M, Nomura S, Serada S, Nakai K, Ohguro N, Nishida
K, Naka T. Exp Eye Res. 140:53-64. (2015). 査読有734) Leucine-rich α-2-glycoprotein promotes TGFβ1-mediated growth suppression in the Lewis lung carcinoma celllines. Takemoto N, Serada S, Fujimoto M, Honda H, Ohkawara T, Takahashi T, Nomura S, Inohara H, Naka T.
Oncotarget. 10:11009-22. (2015). 査読有
5) Periostin Accelerates Human Malignant Melanoma Progression by Modificating the Melanoma Microenvironment.
Kotobuki Y, Yang L, Serada S, Tanemura A, Yang F, Nomura S, Kudo A, Izuhara K, Murota H, Fujimoto M, Katayama
I, Naka T. Pigment Cell Melanoma Res. 27:630-9. (2014). 査読有
6) Molecular mechanism underlying the antiproliferative effect of suppressor of cytokine signaling-1 in
non-small-cell lung cancer cells. Shimada K, Serada S, Fujimoto M, Nomura S, Nakatsuka R, Harada E, Iwahori K,
Tachibana I, Takahashi T, Kumanogoh A, Kishimoto T, Naka T. Cancer Sci. 104:1483-91. (2013). 査読有
7) Iwahori K, Serada S, Fujimoto M, Ripley B, Nomura S, Mizuguchi H, Shimada K, Takahashi T, Kawase I, Kishimoto T,
Naka T. SOCS-1 gene delivery cooperates with cisplatin plus pemetrexed to exhibit preclinical antitumor activity
against malignant pleural mesothelioma. Int J Cancer. 132, 459-71. (2013). 査読有
8) Chean T, Konnno T, Egashira M, Bai R, Nmoura N, Nomura S, Sakurai T, Imakawa K. Estrogen-dependent uterine
secretion of osteopontin activates blastocyst. adhesion competence. PLoS One 7(11), e48933. (2012). 査読有＜図書＞
1) マウス解剖イラストレイテッド、1-105 頁、秀潤社、2013 年

74

私立大学戦略的研究基盤形成支援事業「個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証」（平成 24 年度～平成 28 年度）
研究成果報告書

テーマ１：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」
研究課題：CT 血管造影法と対応可能な微細血管観察法の開発

テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」
研究課題：蛍光タンパク質を用いた特定タンパク質の組織・個体レベルにおける空間的イメージング
研究課題：個体レベルでの時空間的タンパク質相互作用イメージング

テーマ３：「X 線 CT イメージング技術の開発・改良とその有用性の検証」
研究課題：造影剤を用いた撮影技術の確立による血管構造の測定精度の向上

研究機関・研究室名：バイオサイエンス研究科・環境応答遺伝学研究室担当者職名・氏名：教授・山本 博章
研究協力者：澁谷 仁寿、渡邊 隆太郎、田端 裕正、小乾 彰紘、
福井 達也、浦野 愛理

テーマ１：走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発
研究課題：CT 血管造影法と対応可能な微細血管観察法の開発
１．研究目的
ごく微小な血管網が発達した組織の構造を、当該脈管系に着目して解析するためには、低粘度の造影剤を用いた非侵襲的な CT 観察により、3 次元の再構築像の取得ができれば有利である。
本目的は、通常の CT 解像度を超えて、より詳細な組織構造を比較的容易に観察できるように、脈管系を対象として開発した CT 血管造影法により得られた 3 次元再構築像と対応可能で、より詳細な高次構造観察を可能にする SEM 像の取得を目指した。

２．研究内容テーマ 3 において、マウス眼球の脈絡膜脈管系の微細血管 X 線 CT イメージングに適した樹脂として Microfil75

（テーマ３参照）を見出したが、この樹脂を充填した脈管系の周囲組織を溶かしてレプリカを作製し、走査型電顕での観察を試みようと計画したものの、本樹脂で置換された脈管系のうち特に微小な毛細血管において血管像が途切れる箇所のあることが判明した(図 1)。
図 1 は野生型マウスを用いて、血管造影剤 Microfil（黄色）を心臓からの還流により脈管系に満たして固化後、眼球を摘出し、視神経側から(脳に近い側から)実体顕微鏡により観察したものである。野生型マウスでは、脈絡膜血管はメラニン色素細胞・メラノサイトに覆われていて、その全容を見ることができない（図１A）。そこで過酸化水素を利用してメラニンを漂白したものが図 1B である。

図 1. 野生型マウス脈絡膜血管の可視化現れてきた脈管系をよく見ると、CT で観察するまでもなく、細い毛細血管の所々が不連続になっていることがわかる(図１B)。
そこで、Mercox の商品名で販売されている超低粘度の樹脂を用いてレプリカを作製し、脈絡膜と内耳の血管網の抽出を行った。まず還流固定後、2 ml/min の流速で Mercox を 20 ml 還流し、50℃にて 12 時間重合させた。
眼球を摘出後、30%の KOH で 7 日間、周囲の組織を溶解・除去した。水で洗浄後、凍結乾燥処理を行い、常法でSEM 観察を行った(図２、図 3)。還流時の流速条件は、Microfil を用いて見出した条件と同じである（テーマ３参照）。

図 2．Mercox による脈絡膜脈管系の SEM 像

76

図３．Mercox による脈絡膜脈管系の SEM 像
この手法により、脈絡膜脈管系を広視野でまた通常の CT 像より高解像度で観察できることができた。なお、
血管鋳型標本の作成ステップとしては、上述のように、1.樹脂の還流、2.組織の溶解、3.走査型電子顕微鏡による観察である。特に 2 のステップは重要であり、組織溶解の条件検討に苦労を重ねてきた。幸い眼球脈絡膜についてはほぼ満足な結果が得られるようになった。内耳血管条についてはさらなる条件検討を重ねる必要がある。
Mercox と Microfil(テーマ３参照)を用いた眼球脈絡膜の高次構造解析は、論文として投稿できるまでの再現性を得ることができるようになった。

３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
以上のように、走査型電子顕微鏡用の血管鋳型標本試料作製時の組織溶解は、鋳型の損傷を抑えて、再現性良く像を得ることが要点であるが、マイクロ CT 用試料作製にはこの操作を必要とせず、現時点ではその再現性が高い状況である。 しかしながら、微小領域の血管の超微細構造については、走査型電子顕微鏡の観察像の方が、解像度の点で良い像が得られる。なお Mercox レプリカの高次構造解析に、そのままでは X 線 CT 装置は利用できない。Microfil やヨウ素系造影剤と Mercox の混液を利用できるようにする案等、今後の課題が明らかになったことは大きな収穫である。

４．研究成果の発表
章末に記載

77

テーマ２：生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証
研究課題：個体レベルでの時空間的タンパク質相互作用イメージング
毛周期に関わるβカテニンと LEF/TCF の時空間的相互作用のモニタリング
１．研究目的
研究目的：周期性を持つ生命現象とその機構の解明は古くから研究者の興味を惹きつけてきた。本課題では、
とりわけ長い周期をもつ毛周期の進行を可視化できる系を構築し、その分子機序の解明に資することを目指す。
意義：毛周期機構の分子機序の解明に大きな貢献となる。特に、方法論的に重要な点は、各毛穴の毛周期の判定（一毛周期中のどの段階にあるか）を、非侵襲的に行うことが容易になることである。現在、これを判定するには、生検試料を得ることが必須である。その際、試料の取り出し(切り出し)操作そのものにより、新たな毛周期を誘導することが問題である。例えば抜毛のみでも、その毛のもとの毛包に、新たな毛周期への移行を促し(てしまい)、一毛周期中の特定の段階にある毛穴を得るには、勢い広範囲の皮膚試料を必要としてきた。この点について、今回の手法が使用できるようになれば、非侵襲的に「容易に」、特定のステージにある毛包を同定、解析できるようになる。

２．研究内容毛周期に関わる Wnt シグナル系の重要な因子である β−カテニン、および核内移行してこの因子と複合体を形成するコアクチベーターの LEF/TCF に N-luciferase と C-luciferase をそれぞれ融合させたタンパク質をメラノサイトで特異的に発現させる系を構築することにより、Split luciferase complementation assay 法によるタンパク
質相互作用を、マウスの個体レベルで検出できる新たな蛍光・発光イメージング技術の開発に繋げることを目論んだ(図１)。

当時、生体におけるこの手法の適用はまだ黎明期にあり、まずこのシステムを、どのように本学で構築するか、が課題となった。まずは luciferase をコードする配列を持つプラスミドで、比較的利用しやすく加工されたものを探すことにした。報告者が関わる別の共同研究プロジェクトの研究者の示唆により、海外のグループが構築したプ
ラスミドが加工しやすいことを見出した。さらに利用するプロモーターについては、神経冠(堤)由来の色素細胞であるメラノサイトの系譜内で発現し、上記毛周期で発現する遺伝子のプロモーターを利用すべきであるが、当初は上記因子をコードする遺伝子の当該配列を利用しようとした。この計画を策定したところで、当該手法に代わ78

る FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) マウスの作製が着目されるようになり、加えて、前述の手法では問題となる基質の供給の問題もあり、FRET を利用することに変更した。新学術領域「生体蛍光イメージン
グ」の研究で作出され、供給もされている YPet と ECFP の利用を決め、その基礎となるプラスミドの情報の解析を行った。すなわち、YPet-EV linker-β-catenin を一方に、他方に LEF/TCF-EV linker-ECFP を持つ 2 種のトラ
ンスジェニックマウスを作製する計画を立てた(図 2)。

懸案のプロモーターは、当初の計画では、相同組換えにより内在性のプロモーターを用いる(内在性のプロモーターの下流に挿入する)ことにしたが、当該の遺伝子はハプロインサフィシェンシー（haploinsufficiency）を引き起こす可能性があった。そこで、この心配がないメラニン合成系の遺伝子で、細胞腫特異性が極めて高く、メラ
ニン合成の鍵酵素をコードするチロシナーゼ(Tyrosinase)遺伝子のプロモーターの利用を計画した。このプロモーターはその調節領域がよく研究され、我々自身も当該プロモーターを用いて、トランスジェニックマウスの最初の報告に成功している(Tanaka ら、Development 108, 223-227, 1990)。
その後、上記プラスミドの改編に必要な情報について我々自身で明らかにすべき DNA 領域があることに気付き、この解析に時間を要したが、ようやく 2015 年度に入り、分子間型 FRET バイオセンサー法を用いる系に必要な、蛍光物質とその可動性を上げる linker をコードしたベクターの分与を依頼できる段階になり、供与を受けた。
開示されていない当該ベクターの詳細な配列情報を解析し、インサートの組み込みサイトを設計したが、目的とする組換え体を得ることが出来なかった。そこで、制限酵素サイトとその周辺配列情報から、目的遺伝子の挿入部位を改めて予測しなおした。同時にマウス皮膚より調製された cDNA を用いて、標的遺伝子のクローニングも並行して行った。ベクターはインサートの挿入部位で直鎖化し、In-Fusion にて、標的遺伝子の挿入を行う計画を立てた。その後、マウス皮膚より調製された cDNA を用いて、標的遺伝子のクローニングを行った。2015 年度に供与されたベクターについて、ようやくインサートの挿入部位の正しい配列が判明したので、そのサイトで直鎖化
し、In-Fusion にて、標的遺伝子の挿入を行う段階に達した。計画してきた当該ベクター2 種のうち１種は使用できる段階であるが、2 種目のコンストラクト作製に必要な標的遺伝子のクローニングに問題が生じたため、2 系統
マウスの樹立と掛け合わせによる生体イメージング用マウスの成立に時間を要している。しかしながら、このクローニングは必ず解決できる問題であり、本計画終了時に間に合うか否か、微妙ではあるが、その成果を目前としているところまで到達した。

79

３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
本研究の遂行において、ベクターとインサートの、部分的ではあるものの、配列解析に多大な時間を要した。
それは塩基配列が通常のシーケンサーで読み取れない部分に対してであったが、前述の制限酵素サイトと周辺の配列情報を用いて首尾よくコンストラクトが得られなかった場合は、塩基配列解析の黎明期によく用いられた
マキサム・ギルバート法に戻っても、当該部位の配列解析を行う覚悟を持った。旧式ではあるが、マニュアルでのシステムを保有しておく重要性を再認識した。今後は、上記のコンストラクトを用いて、トランスジェニックマウ
スの作製をぜひ進めていきたい。

４．研究成果の発表
章末に記載

80

テーマ３：X 線 CT イメージング技術の開発・改良とその有効性の検証
研究課題：低粘性造影剤を用いた撮影技術の確立による血管構造の測定精度の向上
１．研究目的
組織学的手法での解析が困難な有色組織である眼球脈絡膜内の微細血管構造の解析に活用できる、低粘性の造影剤・造影剤担体の選抜・開発と、それを用いた撮影技術の確立を行う。開発した造影剤により、メラノ
サイトの発生異常を示す mi (Mitf)マウス突然変異体の血管形成異常を検証し、脈絡膜また蝸牛血管条における血管形成に及ぼす色素細胞の機能を解明する。
背景：
報告者が対象とする神経冠(堤)由来のメラニン色素細胞・メラノサイトは、いくつかの組織・器官で脈管系に近接して、場合によっては脈管系の周囲をびっしり覆って分布する。この色素細胞と脈管系からなる高次構造を、
X 線 CT 装置による再構築像で解析しようとしたところにこの計画は始まる。
その端緒は、メラノサイトを欠損する Mitfmi-bw (black-eyed white allele at the mouse mi locus。遺伝子座名は、クローニングされて後に Microphthalmia-associated transcription factor と改名される)ホモ接合体マウスの、眼球の外側を覆う脈絡膜に発達する脈管系の断面構造が、野生型マウスに比して押しつぶされた(ひしゃげた)構
造を取ることを、光顕レベルで観察した 10 年ほど前にさかのぼる。後にこの観察は、内耳血管条の中間層に張り巡らされた血管網と、それを覆う聴覚に必須のメラノサイトからなる当該中間層の構造にも当てはまることに気付いた。
以来、これら組織の立体構造をメラノサイトの有無と対応させて解析したいと強く望んできた。それには今回の
X 線 CT 装置による再構築像の観察が欠かせないと判断した。

２．研究内容脈管系は CT 値が低く、そのままでは構築像が取得できない。そこで、当初はヒトでよく利用されるヨウ素系の造影剤を利用し、上記脈管系がよく発達する脈絡膜内の血管と色素細胞の位置取りを解析しようとした。
当初、テイラーメイドのヨウ素系造影剤や、実験動物用に開発された Fenestra（ヒト用の、短時間で排泄され、臓器への滞留も少ない性質を改め、肝臓や血管に特異的に長時間滞留し、かつ、毒性が低いもの）や、ミルテ
ニー ExiTron nano 12000 等の造影剤を用いて脈絡膜血管の再構築像を得ようと試みた。
この手法を用いる際の最大の問題点は、観察対象領域の構造である。すなわち、眼窩に埋まる眼球の外側(体内側)を観察するには、周囲の頭蓋骨の高い CT 値が邪魔をして、当該領域の再構築像が得られないことであった。そこで、眼球全体を摘出することにしたが、その間に視神経と一緒に眼球内に配向する太い血管や、脈絡膜に出入する太い血管を切断せざるを得ず、その際に造影剤が漏れ、高コントラストの高次構造像の取得に大きな影響を及ぼすことであった。
そのために、眼球摘出時に当該部分を結索することにしたが、それでも当該手術ステップまでに（眼の奥側にアクセスする際に）造影剤の漏れは避けられなかった。
そこで、まず器官を取り出し、ヨウ素系の造影剤に近い組成を持つ薬液に浸漬後、CT 観察することにした。しかしながら、脈管系と周囲の組織の像が重なってしまい(十分に分離できず)適当ではないことが判明した。
一方 Microfil (Flow Tech, Inc., Carver, MA, USA)と呼ばれるクロム酸鉛と硫酸鉛粒子を含み、シリコンラバーを81

素材とした樹脂状の血管造影剤は、前出の造影剤に比して粘度が高いものの、比較的細い血管まで侵入し、固化すれば漏れ出すことが無く、眼球摘出にも耐えられることが判明した。初期に取得された図 1 の像は、細い血管網の CT 再構築像取得は十分ではないが、操作の改良でより良い再構築像が得られることを期待させるものであった。

図 1 C57BL/6 マウスにおける脈絡膜血管の再構築像
還流固定後、造影剤・マイクロフィルを導入し、眼球を摘出後、マイクロ CT 装置で観察した。ファイルを DICOM(Digital Imaging and Communication in Medicine) ファイルに変換、画像処理ソフトウェア OsiriX で解析したものである。発達した血管網が観察される。
この像に意を強くし観察を重ねたが、当初予想しなかった問題点に気付いた。それは、造影剤注入の条件検討が必須であることであった。
図 2 は図 1 に比して、再構築される脈管系がはるかによく観察されるが、明らかに脈管系から造影剤が漏れ出している。脈絡膜脈管系はその有窓化が顕著であり、そこからの漏出であろうと予想されるが、いずれにしても、変異体と野生型の比較には、造影剤の注入速度と注入量を正確にコントロールする必要があることを納得した。

図2

C57BL/6 マウスにおける脈絡膜血管の再構築像
手法は図１に同じ。

82

本造影剤は粘度が比較的高いので、ペリスタポンプを用いて注入している。流速また注入量を種々検討してみたが、流速は約 2 ml/min、総注入量は 5 ml 位が、漏れ出しが少なく、微細な高次構造の観察に適していると判断した。
図 3 はこの条件で脈絡膜脈管系の比較を行ったものである。予想通り、メラノサイトを欠損すると脈絡膜脈管系
は疎になることを示唆している。

図 3 野生型マウスの脈絡膜脈管系構造
これを定量的に解析する手法の検討が今後必須である。変異体では血管断面が扁平になる傾向があり、切片上での専有面積は野生型に比して小さい。この機構を探ることが次の課題となる。
加えて、CT 観察時の条件設定を検討し、再構築像改善に向けた努力を継続する必要がある。
これら眼球を用いた Microfil の還流条件の検討により、論文として投稿できるまでの再現性を得ることができるようになった。
そこで、ここで見出したマイクロフィル使用の適正条件下で、内耳血管条脈管系の解析を行った。その結果、内耳血管条にマイクロフィルを配送させるには、脈絡膜では過剰と思われる流速が必要であることなど、組織に依存した手法の検討が必要であることがわかった。現在内耳血管条の比較的大きい内径をもつ血管の造影には成功しているが、当該領域の非常に細い毛細血管からなる構造の全容については、まだこの方法ではうまく構築できないでいる(図 4)。

83

図 4. 野生型マウスの内耳蝸牛管血管への造影剤の送出
マイクロフィル造影剤に置換された内耳蝸牛管血管の実体顕微鏡による観察
次に発想を変えて、ヨウ素系造影剤による蝸牛脈管系のネガティブ造影法を試行した。この方法は、組織を当該造影剤に浸漬し、ネガティブ像を構築することにより、脈管系を浮かび上がらせようとするものである。染色条
件を検討した結果、血管条を造影することができたが、micro-CT の空間分解能の限界のため、血管を確認する
ことはできなかった。今後は、より解像度の高い CT、例えばナノ CT を用いて解析を行う必要があろう。なお予備的な結果は、メラノサイトの存否が、内耳血管条組織においても、脈管系の構造構築に寄与することを強く示唆するものであった。

３．研究成果の副次的効果と今後の展開①副次的効果この間、思わぬ副産物が得られた。貴重な実験動物からできるだけ多くの情報を得たいと思い、全身の脈管系についても比較解析しようした。全身を対象とした CT 像の取得は本学の CT 機器の得意とするところであり、データ取得も迅速に行うことができる。この解析を行う際、心臓から造影剤を注入しているが、戻ってきた造影剤が周囲に漏れ、仰向けの個体の背側に回り込み、皮膚に付着する。この造影剤が内部の CT 情報取得を阻害するので、いつも皮膚を除去して CT 像の観察を行ってきた。これまでのところ、眼や内耳を除いて、他の全身の脈管系に、野生型、変異体に顕著な違いを見つけられずにいるが、驚いたことに、除去された皮膚の裏側(個体内部側)に、きれいな血管網が残されていることに気付いた(図 5)。

84

図 5 Mitfmi-bw ヘテロ接合体における皮膚脈管系の配行

Mitfmi-bw アレルは劣勢であるので、ヘテロ接合体は野生型と区別がつかない。メラノサイトを欠損する皮膚においては脈管系の発達が十分ではないことを示唆する結果を得た。この再現性と、もしそれが確かであるならば、当該機構の解析は新たなチャレンジとなる。
現状の手法下で使用する CT の再構築像に限界を感じたため、一つの展望として、より粘度の低い試薬を用いて、脈管系のレプリカを取る試みも始めた(テーマ 1：「走査電子顕微鏡による個体レベルの分子イメージング技術の開発」参照)。

②今後の展開走査型電子顕微鏡用の血管鋳型標本試料作製には組織の溶解を必要とするため、その操作中に鋳型が壊れ、再現性良く像を得ることが困難であることが判明した(テーマ 1 参照)。この点については、マイクロ CT 用試料作製にはこの操作を必要とせず、再現性良く血管のイメージング像が得られる点で優れていることが判明した。
しかしながら、微小領域の血管の超微細構造については、走査型電子顕微鏡で観察した像の方が、解像度の点で良い像が得られた。より低粘度の造影剤を開発し、かつ、解像度の高い nano-CT 装置であれば、脈管構造の超微細形態像を再現性良く獲得できる可能性がある。
なお新しい低粘度の造影剤の開発は、当初、努力項目の一つとして設定したが、現在商品化されている当該薬剤の使用方法、特にごく微小な血管への送出法に関する詳細な検討に時間が必要で、まだ完成できていない。しかし、これまでの試行から、Microfil やヨウ素系造影剤と Mercox の混液を利用できるようにする案等、今後の課題が明らかになったことは大きな収穫であった。なお、他の研究課題で開発された低粘土造影剤を用いた

85

試行も行ったが、本研究課題が対象とする超微細血管への適応には、克服すべき点がいくつかあることが判明した。特に造影剤の均一性を保持しながら当該血管内に送出する技術の開発が欠かせない課題であることが明らかになった。すなわち次の一目標が明確にできたことも重要な成果であった。
なお、CT 像取得の技術修得については、学内機器、また学外機器、それぞれ現時点でも完璧とは言えないが、試料のハンドリングや位置決め等々も含め、満足できるレベルになったのではないかと自己評価する。

４．研究発表の状況＜学術論文＞
1) Impaired development of melanoblasts in the black-eyed white Mitfmi-bw mouse, a model for
auditory–pigmentary disorders. Hozumi, H, Takeda, K., Yoshida-Amano, Y., Takemoto, Y, Kusumi, R., Urara
Fukuzaki-Dohi, U., Higashitani, A., Yamamoto, H. and Shibahara, S. Genes to Cells 17, 494～508, 2012. 査読有
2) Otx2 is involved in the regional specification of the developing retinal pigment epithelium by preventing theexpression of Sox2 and Fgf8, factors that induce neural retina differentiation. Nishihara, D., Yajima, I., Tabata, H.,
Nakai, M., Tsukiji, N., Katahira, T., Takeda, K., Shibahara, S., Nakamura, H. and Yamamoto, H. PLOS ONE 7 (11),e48879 (12 pages), 2012. 査読有
3) A subpopulation of smooth muscle cells, derived from melanocyte-competent precursors, prevents patent ductus
arteriosus. Yajima, I., Colombo, S., Puig, I., Champeval, D., Kumasaka, M., Belloir, E., Bonaventure, J., Mark, M.,
Yamamoto, H., Taketo, M. M., Choquet, P., Etchevers, H. C., Beermann, F., Delmas, V., Monassier, L. and Larue, L.
PLOS ONE 8(1), e53183 (13 pages), 2013. 査読有
4) Insertion of long interspersed element-1 in the Mitf gene is associated with altered neurobehavior of theblack-eyed white Mitf(mi-bw) mouse. Genes Cells. 19, 126-140, 2014. 査読有
5) Microphthalmia-associated transcription factor is expressed in projection neurons of the mouse olfactory bulb.
Ohba K, Takeda K, Yamamoto H, Shibahara S. Genes Cells. 20(12), 1088-1102, 2015. 査読有
6) Regional Fluctuation in the Functional Consequence of LINE-1 Insertion in the Mitf Gene: The Black Spotting
Phenotype Arisen from the Mitfmi-bw Mouse Lacking Melanocytes. Takeda K, Hozumi H, Ohba K., Yamamoto H,
Shibahara S. PLoS One 11(3), e0150228 (23 pages), 2016.

査読有7) Microphthalmia-associated transcription factor ensures the elongation of axons and dendrites in the mouse
frontal cortex. Ohba, K., Takeda, K., Furuse, T., Suzuki, T., Wakana, S., Suzuki, T., Yamamoto, H. and Shibahara, S.
Genes Cells 21, 1365-1379, 2016.

査読有*8) Melanocytes support the vasculature of the choroid. Shibuya, H., Watanabe, R., Maeno, A., Ichimura, K., Tamura, M.,
Wakana, S., Shiroishi, T., Ohba, K., Takeda, K., Shibahara, S. and Yamamoto, H.

(submitted)＜書籍＞
1) 色素細胞の多様な機能発現について。 山本博章 Fragrance Journal 11、37-40, 2012.
2) ネズミの毛色発現に関与する遺伝子。 庫本高志、山本博章 色素細胞第 2 版-基礎から臨床へ―(伊藤祥輔、
柴原茂樹、錦織千佳子 監修 慶応大学出版会) pp71-86、2015．
3) 皮膚以外に存在するメラノサイトの機能。 矢嶋伊知朗、大神信孝、山本博章、加藤昌志 色素細胞第 2 版-基86

礎から臨床へ―(伊藤祥輔、柴原茂樹、錦織千佳子 監修 慶応大学出版会)

pp223-235、2015．

＜学会発表＞
1) 色素細胞の発生と機能発現機構、環境ストレス緩和（招待講演）。山本 博章 日本香粧品学会（東京） 2012
年 6 月 7 日～8 日
2) Involvement of Pax6 in the retinal pigment epithelium development.

Nishihara, D., Kawasaki-Nishihara, A.,

Nakamura, H. and Yamamoto, H. 第 24 回日本色素細胞学会学術大会（長浜） 2012 年 11 月 24 日～25 日*3) Functional divergence of mammalian melanin pigment cells (in dimly lit organs) (Invited) Yamamoto, H., Uehara, S.
and Shibuya, H. 日本実験動物科学技術さっぽろ 2014. （札幌）*4) Functional divergence of mammalian melanocytes. (Invited) Yamamoto, H. XXII International Pigment Cell
Conference, Singapore, 2014.
*5) Do melanocytes contribute to the structure of their niches? Shibuya, H. and Yamamoto, H. XXII International
Pigment Cell Conference, Singapore, 2014.
6) How is regionalization of the chicken developing eye primordium regulated? Tabata, H. and Yamamoto, H. XXIIInternational Pigment Cell Conference (IPCC), Singapore*7) 眼球と内耳メラノサイトハビタットにおける血管構造の解析。 澁谷仁寿 山本博章 2014/9/17～9/19 日本遺伝学会第 86 回大会 長浜バイオ大学*8) メラノサイトが関わる蝸牛血管条形成過程の発生遺伝学的解析。 澁谷仁寿、渡辺隆太郎、前野哲輝、田村勝、若菜茂晴、城石俊彦、山本博章 2015/09/24-2015/09/26 日本遺伝学会第 87 回大会 東北大学
9) マウス Mitf 変異体を用いた眼球脈絡膜構造の解析。 澁谷仁寿、市村薫、前野哲輝、上田明弘、田村勝、若菜茂晴、城石俊彦、山本章嗣、山本博章 2016/09/07-2016/09/09 日本遺伝学会第 88 回大会 日本大学国際関係学部(三島)87

私立大学戦略的研究基盤形成支援事業「個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証」（平成 24 年度～平成 28 年度）
研究成果報告書

テーマ２：「生体イメージング装置を用いた新規蛍光・発光イメージング法の開発とその有効性の実証」
研究課題：蛍光タンパク質を用いた特定タンパク質の組織・個体レベルにおける空間的イメージング

研究機関・研究室名：バイオサイエンス研究科・動物生理学研究室
担当者職名・氏名：教授・永井 信夫
研究協力者：湯川 直人、俣野 泰毅、足立 悠太

１．研究の目的
本研究目的は、生体イメージング装置（Lumazone）を用いた組織、個体レベルでの新規のイメージング技術を確立し、その技術を動物、植物の機能調節メカニズムの解明に用いることで、新しく開発した技術の有用性を実証することである。

２．研究成果１）蛍光波長の異なる蛍光タンパク質による生体イメージングの比較
励起・蛍光波長の異なる 2 種類のタンパク質を導入した細胞をマウスに移植し、イメージの比較により、マウスの蛍光イメージングの特徴と技術開発における問題点を検討した。
①腫瘍を誘導したマウスにおける蛍光イメージング
がん遺伝子の Ras および EGFP (励起波長 488nm、蛍光波長 509nm) の遺伝子導入した NIH3T3 細胞の移植により、ヌードマウスに腫瘍を形成し、Lumzone で蛍光を測定した。
その結果、腫瘍部位の全部（図１c）あるいは一部（図１g）において蛍光を認めた。摘出した腫瘍は両者とも全体が蛍光を示した（図１d,h）この結果は EGFP の励起光の透過性が低いため、皮膚直下の細胞の発現する GFPのみが観察されたことが示唆された。

88

a

b

c

d

e

f

g

h

図１

腫瘍形成とイメージング

3T3-Ras-GFP細胞（1ｘ10６個）の皮下移植15日目の明視野（a,e）と蛍光(c.g）イメージおよび摘出腫瘍の明視野（b,f）と蛍光(d,h）イメージ。マウス１（a-d）では生体内で腫瘍部位全体に蛍光が認められた（c）が、マウス２では一部のみに蛍光が認められた（g）。しかし、摘出した腫瘍は、全体に蛍光が認められた。

②蛍光タンパク質発現細胞を移植したマウスの蛍光イメージング
Ras および DeRed(励起波長 557nm、蛍光波長 579nm)の遺伝子導入をした NIH3T3 細胞（1.2ｘ105-1.2ｘ106 個）をヘアレスマウス（HRM2）の皮下および小腸に移植し、直後に蛍光を観察した。
その結果、皮下に移植した細胞では容量依存性の蛍光が観察された（図２a-d）。一方、皮皮膚表面より約４ｍｍの深さに位置している小腸に移植した細胞（1.2ｘ106 個）の蛍光は全く観察されなかった。以上の結果より
DeRed の蛍光は皮下であれば明瞭に観察されるが、皮膚表面より約４mm 深度では 1.2ｘ106 個の細胞では観察できないことが明らかとなった。

89

図2 3T3-Ras-DeRed細胞の移植直後のイメージング
ヘアレスマウス皮下に1.2ｘ106個（①）、 4.0ｘ105個（②）、4.0ｘ105個（②）の細胞を移植（a）。ヘアレスマウスの小腸内（④）に1.2ｘ106個の細胞を移植し、腹部を縫合（ｂ）。移植後のマウスの明視野（c）と蛍光（d）イメージ。
皮下移植では用量依存的な蛍光が認められたものの、小腸移植での蛍光は認められなかった。観察には
Cy3フィルター（励起552nm、蛍光565nm）を使用。

③マウスストレインによる生体イメージングの比較
Ras/DeRed 3T3 細胞（1.2ｘ105 -1.2ｘ106 個）をヘアレス（HRM2）、BALB/c、C57BL/6 の各マウスの皮下に移植し、直後に直後に蛍光を観察した。
その結果、ヘアレスマウスでは容量依存性の蛍光が観察されたが（図３a-c）、BALB/c マウス（図３d-f）、
C57BL/6 マウス（図３g-i）では感度が低くなること、特に白毛系のマウスでは毛の自家蛍光がイメージングの著
しい障害となることが明らかとなった（図３d-f）。

90

図３ Ras/DeRed 3T3細胞の移植直後のイメージング
ヘアレスマウス（a-c）、BALB/c（d-f）、C57BL/6（g-h）の各マウスの明視野（a,d,g）、GFPフィルター（b,e,h）、
Cy3フィルター（c,f,i）のイメージ。1.2ｘ106個（①）、 4.0ｘ105個（②）、4.0ｘ105個（②）の細胞を皮下投与した。
ヘアレスマウスではすべての量の投与で皮下のシグナルが明瞭に認められた。BALB/cではGFPフィル
ターおよびCy3フィルターのイメージにおいて、毛のシグナルが強く認められた。C57BL/6マウスでは毛のシグナルは認められず、DeRedのシグナルは1.2ｘ106個のシグナルのみ認められた。

④小括１
マウス生体イメージングにおいて EGFP では生体深部のイメージングに適していないことが示唆された。また
DeRed でも比較的低密度の細胞で発現している場合は皮下４ｍｍ以下の深度では検出できないことが明らかとなった。
さらに体毛（特に白色体毛）は蛍光イメージングの障害となることから、蛍光タンパク質の遺伝子組換マウスを作成し生体イメージングを行う場合は、剃毛あるいはヘアレスマウスと交配して無毛化する必要があることが示された。

２）PROsense および MMPsense によるプロテアーゼ活性の可視化
PROsense680 と MMPsense680 によるプロテアーゼ活性の局在を、腫瘍形成モデルおよび脳梗塞モデルを用いて検討した。特に脳梗塞モデルでは Lumazone と長波長蛍光観察システムによる組織レベルの蛍光観察を組み合わせることにより、個体から組織・細胞レベルの連続した可視化技術の確立を目指した。
91PROsense680 はプラスミンあるいはカテプシンの切断、MMPsense680 はマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMPs）の切断により蛍光波長 700 nm（励起光 680 nm）の蛍光を発する指示薬である。プラスミンは血栓の主成分であるフィブリンや細胞外マトリックスタンパク質の分解を担う細胞外プロテアーゼであり、血栓溶解や組織のリモデリングに寄与する。生体内でのプラスミン活性化因子として、組織型プラスミノゲン活性化因子（tPA）およびウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(uPA)の 2 つのプロテアーゼが存在している。これらの因子を総称
して線溶系と呼ぶ（図４）。MMPs も細胞外マトリックスタンパク質の分解を介して組織リモデリングに重要な役割を担う。組織リモデリングは、正常な生体の成長プロセスに加え、病態形成、傷害修復、腫瘍形成などの形態の変化に広く認められる反応である。また、MMPs のうち MMP3, MMP9,MMP12 はプラスミンによって不活性前駆体から活性化されることが知られている。
tPA, uPA
切断

プラスミノゲン（Plg）

プラスミン
切断

フィブリン

フィブリン分解産物

ECM

ECM分解産物

proMMPs

activeMMPs

血栓溶解
組織リモデリング

組織リモデリング

図４ 線溶系
プラスミンは血栓の主成分であるフィブリンや細胞外マトリックスタンパク質（ECM）の分解を担う細胞外プロテアーゼであり、血栓溶解や組織のリモデリングに寄与する。生体内でのプラスミン活性化因子として、組織型プラスミノゲン活性化因子（tPA）およびウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（uPA）の2つが存在する。これらの因子を総称して線溶系と呼ぶ。またプラ
スミンは不活性前駆体MMP（proMMPs）を活性型MMP（activeMMP）に活性化する。MMPsもECMの分解を介して組織リモデリングに重要な役割を担う。

①腫瘍形成モデルにおける観察
これまでに腫瘍の形成において、プラスミンおよび MMP 細胞外プロテアーゼの発現が亢進していることが報告されている。これらを踏まえて、Lumazone を用いた ROsense680 と MMPsense680 の可視化を、腫瘍形成モデル
を用いて検討した。
ヌードマウス（BALBｃnu/nu）の皮下に 4×105 個の Ras/GFP 遺伝子導入 NIH3T3 細胞を移植した。移植 2 週間後に明瞭な腫瘍の形成を確認し、PROsense 50 μl、あるいは MMPsense 75 μl 静注し、24 時間後に
Lumazone にて蛍光を観察した。
その結果、形成された腫瘍は GFP 陽性であった（図５）。この観察は２－１で示した結果に一致する。さらに、腫瘍の内部および周囲において PROsense680（図５）および MMPsense680（図６）の蛍光が観察された。さらに腫瘍を被覆する皮膚において活性が顕著であった。

92

反射

GFP

PROsense680

重ね合わせ

a

b

c

d

e

f

g

h

経皮

皮膚
剥離

図５ PROsenseによる腫瘍イメージ
経皮（a-d)および皮膚剥離（e-f)）の明視野（a,e)、GFP（b,f)、PROsense（c,f）、
GFPとPROsenseの重ね合わせ。GFPに対してPROsenseのシグナルは腫瘍組織間隙に強く認められた。aのバーは1cmを示す。
反射

GFP

PROsense680

重ね合わせ

a

b

c

d

e

f

g

h

経皮

皮膚
剥離

図６ MMPsenseによる腫瘍イメージ
経皮（a-d)および皮膚剥離（e-f)）の明視野（a,e)、GFP（b,f)、MMPsense（c,f）、
GFPとMMPsenseの重ね合わせ。GFPに対してMMPsenseのシグナルは皮膚に強く認められた。aのバーは1cmを示す。

これらの結果より、Lumazone を用いてプラスミン/カテプシンの活性の分布あるいは MMP の活性の分布の可視化法を確立した。また、腫瘍形成時に腫瘍を被覆する皮膚においてこれらの細胞外プロテアーゼの活性化が誘導されることを見いだした。

次に、本評価システムを用いて、新規がん遺伝子 dynactin-associated protein（dnAP）の腫瘍形成能の検討を行った。dynAP は AktSer473 のリン酸化活性を有する膜貫通タンパク質である。

93

ヌードマウス（BALBｃnu/nu）の皮下に LacZ および GFP 遺伝子を導入した NIH3T3 細胞（LacZ）、dynAP および GFP 遺伝子を導入した NIH3T3 細胞（dynAP）、H-Ras および GFP 遺伝子を導入した NIH3T3 細胞（H-Ras）、dynAP,H-Ras および GFP 遺伝子を導入した NIH3T3 細胞(H-Ras dynAP)を各 4×105 個を移植し、その後の腫瘍形成を観察した。その結果 dynAP の導入により腫瘍形成が認められた（図 7a）。その腫瘍形成能は H-ras よりも少なかったものの、H-ras との共導入により相加的に形成能を促進した。（図 7a）。これらの結果は、dynAP ががん遺伝子として機能し、その作用は H-ras と異なる機序に因ることを示唆する。また、dynAP 導入により形成された腫瘍は H-ras 導入により形成された腫瘍に比べて血管が多く、形成される腫瘍の性質に差が認められた（図
7b）。

a

b

図７ dynAPの腫瘍形成の評価
ヌードマウス（BALBｃnu/nu）の皮下にLacZおよびGFP遺伝子を導入したNIH3T3細胞（LacZ）、dynAPおよびGFP遺伝子を導入したNIH3T3細胞（dynAP）、H-RasおよびGFP遺伝子を導入したNIH3T3細胞（H-Ras）、dynAP,H-RasおよびGFP遺伝子を導入したNIH3T3細胞(H-Ras dynAP)を各4×105個を移植、腫瘍サイズ（a）および腫瘍の形態（ｂ)を評価した。
その結果dynAPの導入により腫瘍形成が認められた（a）。また、dynAP導入により形成された腫瘍はH-ras導入により形成された腫瘍に比べて血管が多く、形成される腫瘍の性質に差が認められた（b）。

94

②脳梗塞モデルにおける観察
C57Bl/6J マウスに光化学凝固反応を用いて脳梗塞を誘導し、誘導後 3 日目に PROsense680 150 μl を静注した。また安楽死 1 時間前に血管透過性マーカーである FITC-デキストランを静注した。PROsense680 投与 24 時
間後に FITC-デキストランおよび PROsense の観察を Lumazone で行ったものの、陽性は観察されなかった。その後、安楽死を誘導し、脳を摘出し観察を行った。その結果、全脳および前額断切片において、傷害外周囲部に FITC-デキストランの漏出を認めた。さらにその領域とその周囲に PROsense680 の蛍光を認めた（図８）。

同様の評価を、プラスミノゲン遺伝欠損（Plg+/+）マウスとおよび対照野生型（Plg-/-）マウスを用いて行った。その結果、脳梗塞 4 日目の脳において両マウスで血管透過性の亢進が認められたものの、Plg-/- マウスではPROsense の陽性を認められなかった。これらの結果より脳梗塞 4 日目の PROsense 陽性はプラスミン活性を反映することが明らかとなった。

次に、傷害部位の前額断切片を長波長蛍光顕微鏡観察システムで観察した。その結果、傷害周囲部では浸潤性細胞様、および血管様の構造に PROsense680 の活性の分布を見いだした（図９）。

95さらに、血管透過性マーカーである FITC-デキストランとの比較を行ったところ、傷害周囲部の FITC 陽性部位
およびその周囲の陰性部位でプラスミン活性を認めた（図 10）。特に FITC 陽性領域においては、プラスミン活性との強い共在（図 11c、矢印）認められた。一方、FITC 陰性領域においても、プラスミン活性が顕著な領域では、微弱な FITC 陽性を認めた（図 11f、矢頭）。これらの結果より、プラスミン活性は透過性が亢進した血管に局在する可能性が強く示唆された。

96

③PROsense および MMPsense によるプロテアーゼ活性の可視化の応用
脳血管は血液脳関門によりその透過性が極めて低く制御されているが、脳梗塞に伴い脳梗塞周囲部で血管透過性が亢進することが知られている。しかしながら、血管透過性亢進の影響の検討はほとんど行われていない。
我々は、脳定量傷害モデルを確立し、傷害後の修復プロセスを定量的に検討するモデルを確立した（Nagai N
et.al. Brain Res. 2010; 1322:109-117）。このモデルを用いて、血管透過性の亢進は急性期には神経細胞の生死に影響を与えないもの、虚血ストレスによる神経細胞死を促進することを明らかにした（投稿中）。
また、上述のように、脳梗塞に伴い傷害周囲部においてプラスミン活性が認められたことから、プラスミン活性の生理的意義と活性発現メカニズムについて検討を行った。

まず、PROsense 陽性がプラスミン活性に起因することを確認するため、PROsense の陽性を、プラスミノゲン遺伝子欠損（Plg-/-）マウスを用いて検討した。その Plg-/-および対照野生型（Plg+/+）マウスに脳梗塞を誘導し、誘導
後 1、4、7 日目の血管透過性マーカーの FITC-デキストランおよび PROsense 陽性の分布を検討した。その結果、両マウスでは、傷害 4 日目に傷害周囲に血管透過性の亢進を認め、その領域は脳梗塞 7 日まで経時的に縮小した。PROsense 陽性の分布は脳梗塞 4 日後の（Plg+/+）マウスの傷害周囲とその外縁に認められ、この活性は傷害 7 日目の傷害内部にも認められた。一方、Plg-/-マウスでは脳梗塞 4 日目の活性は消失したものの、97

傷害 7 日目では傷害周囲部に分布が認められた（図 11）。これらの結果より、傷害 4 日目の傷害周囲に認められた PROsense 陽性はプラスミン活性に由来すること、また傷害 7 日目に認められる PROsense 陽性の一部はプラスミンに依存しないことが示された。
次に、脳梗塞 4 日目の血管透過性領域のサイズを Plg+/+マウスと Plg-/-マウスで比較した。その結果、血管透過性亢進領域は Plg+/+マウスに比べ Plg-/-マウスで有意に増加していた（図 12）。血管透過性は脳梗塞後 1 日目
から 7 日目まで経時的に縮小する（図 12）ことを考え合わせると、Plg の欠損により血管透過領域の縮小が遅延することが明らかとなり、プラスミン活性が血管透過性の修復に寄与する可能性が示唆された。また、プラスミンの活性が脳梗塞 4 日後に血管透過性亢進領域の血管様構造に局在していること（図 11）もプラスミンが血管透過性亢進を修復する可能性を支持する。

④小括２
以上のように、Lumazone と長波長蛍光顕微鏡システムを組み合わせた、個体から組織・細胞レベルまでの連続した可視化・評価技術を確立した。また、本技術を用いて腫瘍形成および脳梗塞の血管透過性における細胞
外プロテアーゼ活性の分布の可視化に成功した。特に、脳梗塞後の血管透過性亢進の修復においてプラスミン
活性が寄与する可能性を明らかにした。血管透過性亢進は脳梗塞の増悪要因と考えられており、その修復プロ
セスにプラスミン活性が寄与することを示唆したことは、脳梗塞治療において重要な知見と考える。

３）活性酸素種の発生の可視化
DHE を用いて、活性酸素種（ROS）発生の局在を、脳梗塞モデルを用いて検討した。
ROS はミトコンドリアでのエネルギー産生に伴い生成するが、細胞内の抗酸化システムにより除去される。しかし、紫外線照射などの刺激により発生する過剰な ROS は DNA を含む細胞内分子を破壊し、細胞の生存に影響

98

を及ぼす。一方、マクロファージは体内に侵入した細菌の除去のために、活性酸素の生成を行うことも知られている。
ROS 産生は Dihydroethidium（DHE）の酸化物の蛍光を指標とした。DHE は脂質膜透過性を持ち、ROS により酸化された後、核に移行して DNA に結合して蛍光波長を変化させる（励起光 480-530nm、蛍光 510-630nm）。
また低分子で生体に対する毒性が低く、脳を含む多くの臓器を対象にした生体イメージングに利用可能と考えられる。
①培養細胞を用いた ROS の可視化の検討
DHE による ROS 産生の可視化を確認するため、マウス脳由来血管内皮細胞株である bEnd.3 を用いて UV 照射に伴う活性酸素種の生成を可視化した。可視化には CellROX green および DHE を用いた。CellROX green は
ROS による酸化により、核に移行して蛍光を発する試薬（励起光 485nm/蛍光 520nm）であり、培養細胞用でのROS 生成指示薬として市販されているものの個体への使用はできない。

観察の結果、CellROX および DHE は添加しても蛍光を認めないが、UV 照射により GFP フィルターで観察される核染色が両者とも顕著に誘導された(図 13)。この結果より、ROS 産生に伴う酸化 DHE の可視化が GFP フィ
ルターにより可能であることが確認できた。
②脳梗塞における ROS 産生の可視化と血管透過性亢進の検討
脳梗塞においては、脳血管閉塞とそれに続く再灌流により ROS の生成が起こり、脳梗塞を増悪すると考えら99れている。しかし、多発性硬化症において脊髄での血管透過性の亢進に伴い血漿中の Fibrinogen(Fbg)が漏出し、ミクログリアの活性化により ROS を産生して軸索を損傷する可能性が提唱された（Ryu et.al. Nat Comm 2010;
doi: 10.1038 /ncomms9164.）。脳梗塞においても急性期に血管透過性が亢進することから、同様のメカニズムで神経障害が誘導される可能性が考えられる。この可能性を検証するため、生体内で ROS 産生と血管透過性を同時に可視化するシステムを確立し、脳梗塞に伴う血管透過性の亢進と ROS の産生を検証した。
マウス脳定量傷害モデルにおいて、脳梗塞後 4 時間で傷害周囲部に血管透過性マーカーの Cy5-デキストラ
ンの漏出の亢進が認められた。一方、GFP フィルターによる観察において、脳全体に自家蛍光が認められるものの、DHE 投与に伴い傷害周囲での酸化 DHE の蛍光の増強が認められた。さらに、DHE と Dextran-Cy5 の同時に投与した結果、傷害周囲部の Dextran の陽性の領域と DHE 蛍光の陽性領域が一致した（図 14）。

次に、各脳の切片を、各種フィルターを用いて比較した（図 15）。傷害周囲部の酸化 DHE は GFP フィルターのみで観察された。一方、DsRed フィルターは DHE 投与に依存した全脳での蛍光を認め、還元型の DHE の蛍光を観察していると考えられた。Cy5-デキストランは Cy5 および Cy5.5 フィルターで観察されたが、Cy5 フィルターのほうがより明瞭であった。これらの結果より、酸化 DHE の分布は GFP フィルターでのみ観察され、ROS 産生と血管透過性亢進がそれぞれ GFP フィルターおよび Cy5 フィルターでの観察により比較可能であることが明らかとなった。
また、切片の観察においても、全脳の観察同様に酸化 DHE の示す ROS 産生（GFP フィルター）と Cy5 陽性の100

示す血管透過性亢進領域分が一致していた（図 15）。

さらに、組織レベルの ROS 産生と血管透過性の関連を、長波長蛍光観察システムを用いて検討したところ、ROS 産生細胞が傷害周囲部に認められ、その分布は血管透過性亢進領域と一致していた（図 16）。

上記の評価に利用した光化学血栓モデルは光感受性色素である Rose Bengal を静注し、局所に光を当てて一重項酸素を生成し、血管障害とそれに続く血栓形成により脳梗塞を誘導するモデルである。このモデルは、傷101

害形成時に活性酸素の生成が誘導されている可能性があるため、よりヒトの病態に近い中大脳動脈結紮モデ
ルを用いて、同様の評価を行った。
その結果、傷害後 4 時間では血管透過性の亢進と酸化 DHE の蛍光は認められなかったものの、1 日目、4 日
目 7 日目に傷害内部での血管透過性亢進（Cy5）とそれに一致する DHE 蛍光の増加を認めた（図 17）。これらの結果より、動物モデルを問わず、血管透過性亢進と ROS 産生は関連していることが明らかとなった。

③小括３
以上のように Lumazone と長波長蛍光観察システムを用いて、ROS 産生と血管透過性亢進を同時に評価するシステムを確立した。また、このシステムを用いて、脳梗塞の急性期の血管透過性亢進が ROS 産生を誘導する可能性を明らかにした。

３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
本研究室の研究テーマは、抗脳梗塞薬を開発する基盤を確立することである。本プロジェクトにおいて確立した、生体イメージング装置を用いたプロテアーゼ活性の局在、機能的血管造影および ROS 産生の可視化の技術は、脳梗塞に伴う血管透過性、プロテアーゼ活性および ROS 産生が脳梗塞に及ぼす影響の検討において有用な技術であり、これらを用いた検討により脳梗塞の病態形成のあたらしい一面がが明らかになりつつある。今後はこれらの分子メカニズムの解明を進める予定である。

102

４．研究発表の状況＜雑誌論文＞
1) Okada K, Ueshima S, Kawao N, Yano M, Tamura Y, Tanaka M, Sakamoto A, Hatano M, Arima M, Miyata S, Nagai N,
Tokuhisa T, Matsuo O. Lack of both α2-antiplasmin and plasminogen activator inhibitor type-1 induces high IgEproduction. Life Sci. 査読有 93:89-95. 2013.
*2) .Kunoh T, Wang W, Kobayashi H, Matsuzaki D, Togo Y, Tokuyama M, Hosoi M, Koseki K, Wada S, Nagai N,
Nakamura T, Nomura S, Hasegawa M, Sasaki R, Mizukami T.

Human Dynactin-Associated Protein Transforms

NIH3T3 Cells to Generate Highly Vascularized Tumors with Weak Cell-Cell Interaction. 査読有 PLoS One. 10:
e0135836. 2015.
3) Suzuki Y, Nagai N, Yamakawa K, Muranaka Y, Hokamura K, Umemura K. Recombinant tissue-type plasminogenactivator transiently enhances blood-brain barrier permeability during cerebral ischemia through vascularendothelial growth factor-mediated endothelial endocytosis in mice. J Cereb Blood Flow Metab. 査読有 35:
2021-31. 20154) Suzuki Y, Nagai N, Umemura K. Front Cell Neurosci A Review of the Mechanisms of Blood-Brain Barrier
Permeability by Tissue-Type Plasminogen Activator Treatment for Cerebral Ischemia.

査読有 Front Cell

Neurosci. 25;10:2. 2016.

＜図書＞
1) マウス解剖イラストレイテッド、1-105 頁、秀潤社、2013 年
2) バイオテクノロジー入門、建帛社、1-157 頁、2016 年＜学会発表＞
1) 第 90 回日本生理学会大会、山田雅香、永井信夫、脳傷害修復プロセスにおける α２アンチプラスミンの役割、
東京、2013 年 3 月。
2) 第 36 回日本血栓止血学会学術集会、木村七海、長谷川慎、永井信夫、血管内皮細胞表面のプラスミンの基質の検討、大阪、2014 年 5 月*3) 第 36 回日本血栓止血学会学術集会湯川直人、鈴木康裕、梅村和夫、永井信夫、脳梗塞に伴う傷害部位周辺
での血管透過性の亢進におけるプラスミンの関与、大阪、2014 年 5 月
4) 第 36 回日本血栓止血学会学術集会、酒井祐輔、森田真弘、大森智恵美、鈴木康裕、梅村和夫、永井信夫、脳梗塞における組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA）による神経機能障害の回復への関与の検討、大阪、2014 年 5 月
5) 第 36 回日本血栓止血学会学術集会、大森智恵美、高島里美、鈴木康裕、梅村和夫、永井信夫、脳梗塞後の神経機能制御におけるプラスミノーゲンの寄与の検討 、大阪、2014 年 5 月
6) 第 36 回日本血栓止血学会学術集会、高島里美、岩前拓志、永井信夫 血管内皮細胞での Tie-1 および Tie-2の発現における tPA の作用 第 36 回日本血栓止血学会学術集会、大阪、2014 年 5 月
7) 第 92 回日本生理学会大会、永井信夫、酒井祐輔、脳梗塞後の修復における tPA の関与、神戸、2015 年 3 月
8) 第 37 回日本血栓止血学会学術集会、酒井祐輔、鈴木康裕、梅村和夫、永井信夫 組織型プラスミノーゲン活性103

化因子（tPA）の脳梗塞後の組織学的回復への関与の検討、山梨、2015 年 5 月
9) 第 93 回日本生理学会大会、Miyabi Ono, Nobuo Nagai Effect of high-fat diet on alpha・2-antiplasmin knock out
mice.札幌 2016 年 3 月
10) 第 93 回日本生理学会大会、Nanami Kimura, Makoto Hasegawa, Nobuo Nagai. Identification of novel substratesof plasmin on endothelial cell.札幌 2016 年 3 月
11) 第 93 回日本生理学会大会、Yusuke Sakai, Chiemi Omori, Yasuhiro Suzuki, Kazuo Umemura, Nagai Nobuo. Roleof tissue plasminogen activator/ plasmin system on the functional recovery and histological repair in ischemic
stroke in mice. 札幌 2016 年 3 月
12) 第 38 回日本血栓止血学会学術集会、永井 信夫、木村 七海、長谷川 慎. 血管内皮細胞上のプラスミンの新規の基質の同定。奈良、2016 年 6 月。
*13) 第 94 回日本生理学会大会、Yasuki Matano, Kumiko Takayama, Ryosuke Ohi, Nobuo Nagai. Reactive oxygen
species generation and neural network rearrangement is associated with the increase in vascular permeability
after ischemic stroke.浜松、2017 年 3 月
14) 第 38 回日本血栓止血学会学術集会、脳梗塞の傷害部位周辺での血管透過性亢進の修復におけるプラスミンの寄与。名古屋、2017 年 6 月

104私立大学戦略的研究基盤形成支援事業「個体レベルの新規分子イメージング技術の開発とその有効性の検証」（平成 24 年度〜平成 28 年度）
研究成果報告書

テーマ３：「X 線 CT イメージング技術の開発・改良とその有用性の検証」
研究課題：ビワマス筋肉内の脂肪分布・含有率の測定技術の確立とその応用研究機関・研究室名：バイオサイエンス研究科・食品分子機能学研究室
担当者職名・氏名：准教授・河内 浩行
研究協力者：眞田 的貴、沢田 直規、今井 良政、藤井 壮生、青田 昇大

１．研究目的ビワマスはサケ目サケ科に属する琵琶湖固有の淡水魚である。主にアユやスジエビ、イサザなどを捕食している。天然のビワマスは餌としてアユやスジエビ、イサザなどを捕食している。他のサケ科の魚類と同様に母川回帰本能を持つため、成魚は 10 月中旬から 11 月下旬にかけて琵琶湖北部を中心とする
生まれた川に帰り、産卵を行う。そのため、10 月 1 日から 11 月 30 日は禁漁期間と定められている。ビ
ワマス漁には自然条件に加え、漁師の経験や腕が必要とされており、漁獲量が限定されている。大きい
ものでは 60cm にもなり、旬である初夏のビワマスのその身は非常に脂が乗りマグロのトロにも負けないとされ、琵琶湖の宝とも言われている。ビワマスは人に慣れないため、養殖不可能な魚とされていたが現在では養殖法が確立されている。しかし、旬の天然ビワマスと比べると脂ののりが少なく味が劣るとされている。そのため旬の天然ビワマスのように美味しい養殖ビワマスを年中食べられることが求められている。
ビワマスと同様に筋肉内脂肪(霜降り)が価格、味に影響するウシでは筋肉内にいつ脂肪が入るのか分かっているため、その時期に脂肪が入りやすい肥育用飼料に切り替え効率良く肥育管理が行われているが、ビワマスにおいてはいつ筋肉内に脂肪が入るのかは明らかになっていない。
本研究では、ビワマスの脂肪量の評価法を、CT を用いて確立し、その方法を用いて筋肉内に脂肪が入る時期を決定し、ビワマスに効率の良く脂肪を蓄積させる養殖法の開発につなげるのが目的である。
脂の乗りを評価する方法として現在主に用いられている方法が Bligh＆Dyer 法である(Bligh ら 1959)。
この方法は生体材料から総脂質を抽出する方法で、特に、水溶性のものと脂溶性のものの分離にも頻用され、動物組織や脂肪細胞、食品など様々なものを対象として行われている。本研究では、Bligh＆Dyer
105

法と CT を用いた測定法を比較し、CT を用いたビワマスの筋肉内脂肪の評価を検証した。次に、筋肉内の脂肪量の成長に伴う変化を、CT を用いて検討し、ビワマスの筋肉内に脂肪が蓄積する時期の解析を試みた。さらに、測定が簡便かつ安価な魚類の新しい脂肪率測定方法として Fish Analyzer(Yamato)が登場し、漁業関係者から俄然注目を集めたことから、今回 Fish Analyzer がビワマスの脂肪含有測定にも適するどうかの検討を行った。

２．研究成果１）ビワマスの筋肉内脂肪の CT を用いた評価①緒言
動物組織の脂質含量の研究において、現在主に脂質抽出及び脂質量測定に用いられている方法が Bligh＆Dyer 法である。これは簡便な生体材料からの脂質抽出法であり、クロロホルム、メタノール、低濃度の酢酸をボルテックス、遠心分離することで 3 層に分離し、有機溶媒層である下層に脂質分子が回収されるという方法である。これは脂質量測定として確立された実験法であるのに対し、CT を利用したビワ
マスを含めた魚類の脂質量測定はまだ確立されてはいない。そこで本研究では、Bligh＆Dyer 法と CT を用いた測定法を比較し、CT を用いたビワマスの筋肉内脂肪の評価を検証する。

写真：養殖ビワマス（1 歳 9 ヵ月）②方法
CT を利用した脂質量の算出
CT ではビワマス個体の頭部、腹部、尾部の 3 ヵ所を撮影し、そのデータから解析ソフト Metabolic
analisis により部位ごとの CT の解析画像をインポートし、3 次元平滑化（SOFT）、その後 2 値化をし、画像解析を行う。脂肪組織の CT 値はマウスでは upper レベル‑145.0、lower レベル‑350.0 であるが、ビワマスの内臓脂肪より脂肪組織のみと思われる部分を採取し、CT 値を測定したところ、‑100 から‑300 の間であったので、ビワマスでは upper レベルを‑100.0、lower レベルを‑300.0 に設定した。画像解析は、
X 軸、Y 軸が 0 になっているか確認後、解析する範囲を選択する。下部に表示される上から見たビワマス
106の CT の解析画像では、全体を選択し、上部に表示されるビワマスの CT の解析画像では、全体、背側、腹側、内臓脂肪の計 4 通りを右クリックで囲い込み選択する。解析後、X 軸、Y 軸がずれるため 0 に戻した後、レポート作成を選択し、脂質量を算出する。
Bligh＆Dyer 法による脂質量の算出
Bligh＆Dyer 法ではまず、個体の頭部、腹部、尾部の 3 ヵ所における背側と腹側から約 1 g をメス等で身を剥ぎ、量り取る。それをそれぞれビーカーに入れ、そこに 0.1％CH3COOH を 10 mL、メタノールを 25 mL、
CHCl3 を 12.5 mL 入れ、ボルテックスで 30 秒撹拌し、30 分放置する。30 分後、CH3COOH を 10 mL、CHCl3
を 12.5 mL 入れ、ボルテックス 30 秒撹拌し、アルミホイル等でビーカーを塞ぎ、一晩放置する。その後、3 層にしっかり分離したかどうかを確認し、3 層に分かれていれば、上層と、中層をしっかりと取り除く。
下層の有機溶媒層に脂質成分は集まっている。ピンセットでビーカー内のビワマスの身を取り除いた後、その下層をそれぞれろ過し、ナスフラスコに移す。また、ナスフラスコに有機溶媒層を移す前に、ナス
フラスコの重さをそれぞれ正確に量っておく。そしてこの有機溶媒層入りナスフラスコを水に浸し、恒温槽を約 40℃に設定したロータリーエバポレーターにかけ有機溶媒を飛ばす。この抽出した脂質分子の重さを算出し、脂肪の割合を算出する。
③結果と考察
図１は、CT によるビワマスの断面写真である。この図の黄色く染まった部分がビワマスに含まれる脂肪である。また、腹側に見える楕円上の大きな脂肪部分は内臓脂肪である。本研究は、全体の脂肪から
この内臓脂肪を除いたデータを出している。この図からわかるように、CT の解析画像で、筋肉組織と筋肉組織の間に脂肪が入っている様子が観察できた。

図１、CT によるビワマスの断面写真

107

ビワマスを個体番号 A‑1 から A‑12 までの合計で 12 匹の個体の CT、Bligh＆Dyer 法による脂肪の割合の算出データを頭部、腹部、尾部を背側と腹側に分け、それぞれ比較を行った結果を図２に示した。

108

図２、ビワマスの部位ごとの CT と Bligh＆Dyer 法の比較

また、表１は 12 匹のビワマス個体の CT と Bligh＆Dyer 法で測定した脂質量の割合の比較である。

109

表 1、ビワマスの部位ごとの脂肪の割合と体重、体長のデータ
脂質割合・ ％（ A- 1 ）CTBligh ＆Dye r 法

脂質割合・ ％（ A- 2 ）CTBligh ＆Dye r 法

頭部 背側脂肪3.4

6.2

頭部 背側脂肪4.2

6.6

頭部 腹側脂肪3.35.7

頭部 腹側脂肪3.8

6.7

腹部 背側脂肪23.1

腹部 背側脂肪1.8

4.1

腹部 腹側脂肪2.3

5.2

腹部 腹側脂肪2.1

4.8

尾部 背側脂肪1.4

1.5

尾部 背側脂肪1.4

2.5

尾部 腹側脂肪体重： 1 7 4 g

1.7

1.9
体長： 2 7 0 m m

尾部 腹側脂肪体重： 1 9 7 g

1.8

2.1
体長： 2 8 0 m m

脂質割合・ ％（ A- 3 ）CTBligh ＆Dye r 法

脂質割合・ ％（ A- 4 ）CTBligh ＆Dye r 法

頭部 背側脂肪

12.9

14.9

頭部 背側脂肪9.1

8.7

頭部 腹側脂肪

12.8

12.9

頭部 腹側脂肪76.5

腹部 背側脂肪66.2

腹部 背側脂肪3.319

腹部 腹側脂肪7.28

腹部 腹側脂肪4.6

7.8

尾部 背側脂肪2.1

3.6

尾部 背側脂肪1.6

2.5

尾部 腹側脂肪体重： 3 2 5 g

24.1
体長： 3 2 0 m m

尾部 腹側脂肪体重： 3 4 6 g2

脂質割合・ ％（ A- 5 ）CTBligh ＆Dye r 法

脂質割合・ ％（ A- 6 ）CTBligh ＆Dye r 法

頭部 背側脂肪9.74.4

頭部 背側脂肪5.2

2.5

頭部 腹側脂肪6.2

3.6

頭部 腹側脂肪5.1

1.1

腹部 背側脂肪2.94.2

腹部 背側脂肪2.61.9

腹部 腹側脂肪3.3

2.3

腹部 腹側脂肪3.93

尾部 背側脂肪1.4

2.1

尾部 背側脂肪1.5

1.4

尾部 腹側脂肪体重： 3 3 5 g

1.9

4.6
体長： 3 3 8 m m

尾部 腹側脂肪体重： 3 2 3 g

1.5

3.5
体長： 3 1 5 m m

脂質割合・ ％（ A- 7 ）CTBligh ＆Dye r 法

脂質割合・ ％（ A- 8 ）CTBligh ＆Dye r 法

頭部 背側脂肪6.3

1.8

頭部 背側脂肪3.60.9

頭部 腹側脂肪6.9

14.8

頭部 腹側脂肪3.90.9

腹部 背側脂肪4.1

14.8

腹部 背側脂肪1.8

3.8

腹部 腹側脂肪4.72.8

腹部 腹側脂肪2.4

9.4

尾部 背側脂肪1.2

1

尾部 背側脂肪11.7

尾部 腹側脂肪体重： 3 6 3 g

1.6

尾部 腹側脂肪体重： 4 0 9 g

1.5

2.7
体長： 3 2 2 m m

5.4
体長： 3 3 4 m m

2.9
体長： 3 5 0 m m

脂質割合・ ％（ A- 9 ）CTBligh ＆Dye r 法

脂質割合・ ％（ A- 1 0 ）CTBligh ＆Dye r 法

頭部 背側脂肪4.7

1.4

頭部 背側脂肪20.9

頭部 腹側脂肪53

頭部 腹側脂肪2.6

2.8

腹部 背側脂肪2.8

3.1

腹部 背側脂肪1.5

2.6

腹部 腹側脂肪54

腹部 腹側脂肪2.2

3.2

尾部 背側脂肪11

尾部 背側脂肪0.80.4

尾部 腹側脂肪体重： 5 2 9 g

1.7

尾部 腹側脂肪体重： 3 9 9 g13.5
体長： 3 6 0 m m

1.8
体長： 3 4 3 m m

脂質割合・ ％（ A- 1 1 ）CTBligh ＆Dye r 法

脂質割合・ ％（ A- 1 2 ）CTBligh ＆Dye r 法

頭部 背側脂肪2.6

2.6

頭部 背側脂肪3.1

3.1

頭部 腹側脂肪2.6

1.8

頭部 腹側脂肪3.2

5.2

腹部 背側脂肪2.4

3.1

腹部 背側脂肪2.35.7

腹部 腹側脂肪2.95.1

腹部 腹側脂肪34.1

尾部 背側脂肪0.8

1.4

尾部 背側脂肪10.2

尾部 腹側脂肪体重： 5 2 7 g

1.2

3.3
体長： 3 8 2 m m

尾部 腹側脂肪体重： 3 8 1 g

1.9

3.3
体長： 3 1 0 m m

魚類は頭部、腹部、尾部の順に脂が多く、背側と腹側については、マグロでいう大トロ（大阪黒門市
場）、サケでいうハラスと呼ばれる脂が非常にのった部位が腹側にあるため、基本的に腹側の方が脂肪の110

量が多い。このデータを見てわかるのが、CT では、頭部と腹部で多少誤差があるものがあったものの、
ほぼどのデータも頭部、腹部、尾部の順に脂質が多く含まれているのがわかる。これに対し Bligh＆Dyer
法では、体長 300mm 以下の A‑1、A‑2 と、300〜320mm の A‑3、A‑6、A‑12、320mm 以上の A‑4、A‑5、A‑7、
A‑8、A‑9、A‑10、A‑11 に分け比較してみると、300mm 以下では CT と同様に頭部、腹部、尾部の順に脂質が多く、また、背側と腹側では腹側の方が多いことがわかるが、300〜320mm ではこれらの逆転が見られはじめ、320mm 以上では腹側の方で脂質が多い傾向にあるが、頭部、腹部、尾部の順で脂質が多くなっているものが少なく、データがバラついているのがわかる。
この結果より、恐らく体重や体長が小さければ Bligh＆Dyer 法は正確な測定が可能であるが、個体が大きくなればなるほど、組織を採集した部分によって測定値がバラつくのではないかと推察できる。それは、個体が大きくなれば表面積が大きくなるのに対し、無作為に約１g 量り取るという採取法のため、どこから採集するかにより誤差が生じてしまうのではないかと考えられる。本研究では、個体の中で最も大きなものが A‑11 であったが、これでもビワマスの中では大きいと言えるサイズではない。今後の研究では、より大きなサイズの個体でもこれらを比較していく必要があると思われる。だが、ビワマスの脂肪量測定において CT を利用した方法と Bligh＆Dyer 法ではどちらが適当かという点では、体調 300mm
以下のサイズのビワマスに対して Bligh＆Dyer 法は適用可能といえるが、320mm 以上になれば Bligh＆Dyer 法ではさらにサンプリング領域を増やさなければ対応できないと考えられ、その点では CT の方が簡便に実像評価できていると思われる。従って、今後はさらにより大きいサイズのビワマスでも CT により
筋肉内脂肪を測定、検証することで CT を利用した方法の確立を目指して行きたい。
さらに、図 3 はこれらのビワマスの体長に対する脂肪割合を部位ごとにプロットしたものである。

図 3、ビワマスの部位ごとの脂肪割合111今回の測定では、サンプル数が少なく、いつどの部位に脂肪が入り出すのかその傾向は明らかではない。本研究の最終目標は、マグロでいう大トロ、サケでいうハラスの部分にビワマスではいつ脂が入るかを知ることにある。肉牛ではビワマス同様、筋肉内脂肪の量により価値が決まる産業動物である。脂肪組織は、腎臓、筋肉間、皮下、筋肉内の順で増加し、13 ヶ月齢から 19 ヶ月齢にかけて最長筋内の脂肪細胞数が増加すること、最長筋内の脂肪細胞数と脂肪交雑は高い相関関係を有することが報告されている。これにより肉牛は 15 ヶ月から 17 ヶ月齢にかけて脂肪が増えやすい飼料（ビタミン A 欠乏飼料）が与えられている。ビワマスでも、いつ大トロ、ハラスの部分に脂肪が入るのかわかれば、その時期にウシと同様に脂肪が増えやすい飼料を与え、効率よく脂が乗せられ、養殖ビワマスが天然ビワマスに負けないくらいの味になるのではないかと期待している。そのためにも今後サンプル数を増やし、この研究を続けていく必要がある。

２）CT 解析によるビワマスの筋肉組織中の脂肪含有量測定法の確立、および Bligh&Dyer 法との比較①緒言
ビワマスの養殖においては天然のビワマスと比較し脂の乗りが劣ることが課題となっている。また、
サケやマスにおいて頭部から腹部の腹側のハラスと呼ばれる脂が乗りやすい部位に、ビワマスではどれくらいの大きさに成長すれば、脂が乗るのか明らかになっておらず、検討していく必要がある。
その為には脂肪含有量の測定が必要であり、これまで CT を用いて測定を行っている。CT は X 線の吸収量が組織によって異なることを利用し、生体内部の 3 次元構造を非侵襲的に可視化する技術であり、CTにおいて脂肪の X 線吸収値（CT 値）は筋肉組織より低い。これまでに簡便な生体材料からの脂質抽出法
である Bligh‑Dyer 法と比較し CT の方がビワマスの脂肪含有測定において優れていることを報告した。
前章に引き続き Bligh‑Dyer 法と CT の比較を行うが、前章で最もばらつきが大きな中央部・腹側を 9 分割し Bligh&Dyer 法による解析を行い、より詳細な比較検討を行った。
これとともに、ビワマスのハラス部分にいつ脂が入るのかについても検討して行きたい。本研究室では脂肪細胞分化のマスターレギュレーターである Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ(PPARγ)のアゴニストの探索を行ってきており、幾つかその候補分子が見つかっている。この内１つの醤油油についてビワマスの飼料に添加し 3 ヶ月間飼育後食味試験を行い、醤油油添加によるビワマスの食味改善効果があることが示唆された。この飼育の際、ビワマスの筋肉内脂肪を経時的に測定していたが、体重約 100 g〜300 g の幼魚のサンプルデータは無い。そこで本研究では幼魚からの養殖ビワマスの筋肉内
脂肪を経時的に測定していくことで、いつどの時期に筋肉内に肪が入るかを明らかにすることを目的とする。
ここで明らかになった養殖ビワマスの筋肉内に脂が入る時期に合わせて醤油油を与えることで、効率良く天然のビワマスと同等の脂の乗りを実現することができると考えられている。これにより養殖ビワ
マスの効率の良い肥育管理を目指す。
②材料と方法
＜材料＞
本実験では株式会社びわ鮎センターで育成された醤油油を飼料として与えたビワマスと、コントロー
ルとして既存の飼料を与えたビワマスを用いた。Bligh&Dyer 法で用いた溶媒、メタノール(MeOH と略記)、

112

クロロホルム(chloroform)、酢酸(AcOH と略記)はすべて、和光純薬工業社製を使用した。
＜CT を用いた脂質含有量の算出＞
ビワマスの頭部、腹部、尾部の背側と腹側、計 6 ヵ所（図 4）をサンプルとして測定した。

①

②

③

④

⑤

⑥

① 頭部 背側 ②腹部 背側 ③尾部 背側① 頭部 腹側 ⑤腹部 腹側 ⑥尾部 腹側

図４：ビワマスの CT 測定領域
測定は実験動物用 3D マイクロＸ線 CT R̲mCT2(Rigaku)で撮影し、そのデータから解析ソフト Metabolic
analisis により部位ごとの CT の解析画像をインポートし、3 次元平滑化（SOFT）と脂質とそれ以外を区別するために 2 値化を行った(図 5)。ここでは二値化することにより脂肪組織が緑色で表される。

図５： ビワマスの二値化画像
二値化を行った後、測定範囲を指定し、画像解析を行った(図 6)。測定された部分は黄色で表される。
次に内臓脂肪量を除去する為に、今度は内臓脂肪の領域を選択し内臓脂肪含量の測定を行い(図 7)、全体の脂肪量から引くことで内臓脂肪以外の脂肪量を算出した。

113

図 6：測定終了後の画像

図 7：内臓脂肪測定後の画像＜Bligh&Dyer 法を用いた脂質含有量の算出＞
CT で測定した頭部、中央部、尾部の背側と腹側、計 6 ヵ所の領域(図４)から身を約 1 g メスで剥ぎ取り軽く刻んだ後、100 mL ビーカーに入れた。また、同じ領域内でも身を取る場所によって結果が変動する可能性があるため、一番脂肪量が多いと考えられる中央部・腹側の領域⑤を 9 分割した後、約 1 g を計りとった(図８)。そこに 0.1 N 酢酸を 10 mL、メタノールを 25 mL、クロロホルムを 12.5 mL 加えスターラーで撹拌後、30 分間静置する。そして、0.1 N 酢酸を 10 mL、クロロホルムを 12.5 mL 加えて撹拌し、アルミホイルでビーカーを塞ぎ、常温で一晩放置した。その後、下層にある脂質抽出液を Whatman
フィルター グレード 2(GE ヘルスケア・ジャパン)に通し、ロータリーエバポレーター(YAMATO)で溶媒を飛ばした後、抽出物の重量を測定し脂質含有量を算出した。

A

B

C

D

E

F

G

H

I

図８：9 分割した際の採取領域③結果
脂肪組織の CT 値はマウスでは upper レベル‑145.0、lower レベル‑350.0 であるが、ビワマスの内臓脂
肪より脂肪組織のみと思われる部分を採取し、CT 値を測定したところ、‑100 から‑300 の間であったので、ビワマスでは upper レベルを‑100.0、lower レベルを‑300.0 に設定し測定した。
まず初めに、通常の餌で飼育した養殖ビワマスについて解析を行った。比較的小さい 300 mm 以下の個体においては、CT と Bligh&Dyer 法であまり差を確認することが出来なかった(図９)。
114

図９：通常飼料で肥育した体長 300 mm 以下の養殖ビワマスの部位ごとの CT と Bligh&Dyer 法の比較
また、両者とも脂肪の割合が頭部から尾部にかけて減少しており、背側より腹側の脂肪の割合が多いという結果となった。しかし、体長が大きくなるにつれて Bligh&Dyer 法ではばらつきが大きくなり、特115

に中央部・腹側の値に大きな変化を確認することが出来た(図 10)。これに対し、CT ではそのような大きなばらつきを確認することは出来ず、小さいサイズと同様に頭部の方が高く腹側の方が高い傾向を示した。

図 10：通常飼料で肥育した体長 300 mm 以上の養殖ビワマスの部位ごとの CT と Bligh&Dyer 法の比較
そこで、最もばらつきが大きな中央部・腹側を 9 分割し、Bligh&Dyer 法による解析を行った。その結果、予想通り腹側の脂肪の割合が高い値を示し、背骨に向かうにつれて脂肪の割合が低くなるという結116

果となり、Bligh&Dyer 法では 1 g を採取する部位によって大きく結果が異なることが分かった(図 11)。

図 11：中央部・腹側を 9 分割した Bligh&Dyer 法の結果
以上の結果、Bligh&Dyer 法と比較し CT の方が簡便で正確にビワマスの脂肪含有量を評価出来ているのではないかと考え、CT を用いて醤油油を与えたビワマスと既存の飼料を与えたビワマスの脂肪含有量の比較を行った。

図 12： CT による頭部の脂肪割合の比較

117その結果、頭部、中央部の背側、腹側の両方で醤油油群の方が大きく上回ることが分かった(図 12)。
醤油油群も通常群と同様に脂肪の割合が頭部から尾部にかけて減少しており、背側より腹側の脂肪の割合が高いという結果となった。また、尾部の脂肪割合は通常群とあまり変わらない結果となった(図 12)。
④考察
Bligh&Dyer 法では、330 mm 程度の個体では CT と同様の傾向で脂肪の割合が変動したが、個体が大きくなるにつれてばらつきが見られるようになった。これは、個体が大きくなれば表面積が大きくなるのに対し、無作為に約１g 量り取るという採取法のため、どの部分から採集するかにより誤差が生じてしまうのではないかと考える。そこで、一番ばらつきが大きく見られた中央部・腹部をさらに 9 分割し、肉片を採取する場所によりどの程度脂肪含有量が異なるかを検討した。その結果、腹側の脂肪の割合が高い値を示し、背骨に向かうにつれて脂肪の割合が低くなるという結果となった。このことから、予想された通り採取する場所により脂肪含量が大きく変動することが示唆された。一方、CT は測定領域内を全て測定するため、測定ごと、サンプルごとの脂肪割合の変動はほぼ起こらず正確である。また、CT は１回の測定時間は約１分で非常に簡便にデータ収集が出来る。従って、ビワマスの脂肪含有量を測定する
際には Bligh&Dyer 法ではなく CT の方が適しているのではないかと考える。
本研究では養殖ビワマスの効率の良い肥育管理を目指している。CT の結果から、醤油油を飼料に添加することでハラスの部分に脂がより多く乗ることが分かった。さらに体長が 350 mm ぐらいまでは通常群とあまり差はないが、350 mm を超える大きさになると脂の乗りが良くなるという結果から、ビワマスの体長が 350 mm を超える辺りからハラスの部分に脂肪が付くと考える。そのため、350 mm までは通常の飼料を給餌し 350 mm 以降で飼料に醤油油を添加することで、効率の良い肥育管理を行うことが出来るとのではないかと思われる。

３）CT 解析と Fish Analyzer による解析の比較、および経時的なビワマスの筋肉組織中脂肪含有量測定①諸言
ビワマスはサケ目サケ科に属する琵琶湖固有の淡水魚である。旬である初夏のビワマスのその身は非
常に脂が乗りマグロのトロにも負けないとされ、琵琶湖の宝とも言われている。しかし琵琶湖での漁獲量は年間 30 ｔ弱と少なくなってきており、ビワマスの養殖への期待は高まっているのだが、天然のビワマスと比較し脂の乗りが劣ることが課題となっている。また、サケやマスにおいて頭部から腹部の腹側のハラスと呼ばれる脂が乗りやすい部位に、ビワマスではどれくらいの大きさに成長すれば、脂が乗るのか明らかになっておらず、検討していく必要がある。
その為には脂肪含有量の測定が必要であり、これまで CT(Computed Tomography:コンピュータ断層撮影)
を用いて測定を行っている。CT は X 線の吸収量が組織によって異なることを利用し、生体内部の 3 次元構造を非侵襲的に可視化する技術であり、CT において脂肪の X 線吸収値（CT 値）は筋肉組織より低い。
これまでに簡便な生体材料からの脂質抽出法である Bligh‑Dyer 法(Bligh ら 1959)と比較し CT の方がビ
ワマスの脂肪含有測定において優れていることを報告した(今井 2015)。
ところが、CT よりも測定が簡便かつ安価な魚類の新しい脂肪率測定方法として Fish Analyzer(Yamato)が登場し、漁業関係者から俄然注目を集めている。この Fish Analyzer は４つの電極を用いて魚体に微弱な電流を流し、その流れにくさを示す抵抗値から脂肪率を推定する生体電気インピーダンス法で測定118

するものである。そこで、今回 Fish Analyzer がビワマスの脂肪含有測定にも適すのか検討を行った。
これとともに、ビワマスのハラス部分にいつ脂が入るのかについても検討して行きたい。本研究室では脂肪細胞分化のマスターレギュレーターである Peroxisome Proliferator Activated Receptor γ(PPARγ)のアゴニストの探索を行ってきており、幾つかその候補分子が見つかっている(眞田 2015)。この内１つの醤油油についてビワマスの飼料に添加し 3 ヶ月間飼育後食味試験を行い、醤油油添加によるビワ
マスの食味改善効果があることが示唆された(Sugiura ら 2015)。この飼育の際、ビワマスの筋肉内脂肪を経時的に測定していたが、体重約 100 g〜300 g の幼魚のサンプルデータは無い。そこで本研究では幼魚からの養殖ビワマスの筋肉内脂肪を経時的に測定していくことで、いつどの時期に筋肉内に肪が入るかを明らかにすることを目的とする。
ここで明らかになった養殖ビワマスの筋肉内に脂が入る時期に合わせて醤油油を与えることで、効率良く天然のビワマスと同等の脂の乗りを実現することができると考えられている。これにより養殖ビワ
マスの効率の良い肥育管理を目指す。
②材料と方法
＜材料＞
本実験では鮎茶屋で育成された既存のニジマス育成用飼料に飼料全体の 5%となるように醤油油を添加した混合飼料(醤油油飼料)を与えたビワマスと、コントロールとして既存のニジマス育成用飼料(通常飼料)を与えたビワマスを用いた。添加試験開始時より 1 ヶ月ごとに各試験区 4 匹ずつサンプリングを行った。
<方法＞
CT を用いた脂肪測定手順
脂肪組織の CT 値はマウスでは upper レベル‑145.0、lower レベル‑350.0 であるが、ビワマスの内臓脂
肪より脂肪組織のみと思われる部分を採取し CT 値を測定したところ、‑100 から‑300 の間であることが明らかになっていた(今井ら 2015)。しかし、この数値は Target の CT 値が 20、air の CT 値が‑1000 の条
件下で測定していなかったため、再度正確に CT 値校正を行った上で内臓脂肪の脂肪組織の CT 値を測定した所、‑40 から‑300 の間であったため upper レベルを‑40.0、lower レベルを‑300.0 に設定し測定した。
ビワマスの頭部、中部のそれぞれを背側・腹側の 4 ヵ所に分けた(図 13)。

図 13：サンプル部位
119それぞれの部位を実験動物用 3D マイクロＸ線 CT R̲mCT2(Rigaku)で撮影し、そのデータから解析ソフ
ト Metabolic analisis により部位ごとの CT の解析画像をインポートし、3 次元平滑化（SOFT）と脂質とそれ以外を区別するために 2 値化を行った(図 14)。ここでは 2 値化することにより脂肪組織が緑色で表される。

図 14: ビワマスの CT の 2 値化
ビワマスの CT の 2 値化後、測定範囲を指定し画像解析を行った(図 15)。測定された部分は黄色で表される。次に内臓脂肪の領域を選択し内臓脂肪含量の測定を行い(図 16)、全体の脂肪量から引くことで内臓脂肪以外の脂肪量を算出した。

図 15:CT の脂肪測定範囲指定

図 16：CT の内臓選択

Fish Analyzer を用いた脂肪測定手順
測定を行う前に、魚体の表面や内部の温度を均一にする為、ビワマスを約 1 時間氷上で保存した。測定は、Fish Analyzer DFA100(Yamato)を使用し、登録されているアジ、サバ、ブリ、マグロ背、マグロ
腹、検量線の魚類測定モードで行った。測定位置は、背側では魚体背側中心、腹側では腹部中央部とし120

側線より上方に軽く電極を当てた(図 13)。尚、検量線モードでの測定位置は背側中心で行った。また測定結果は、アジ、サバ、ブリ、マグロ背、マグロ腹の測定モードでは脂肪率(%)で表示されるが、検量線モードではインピーダンス値(Ω)で表示される。
③結果
まず通常の飼料で飼育した養殖ビワマスについて解析を行った。
ビワマスの中部背側の脂肪含有量を Fish Analyzer に登録されているアジ、サバ、ブリ、マグロ背側の魚類モードで測定した値と CT で測定した値との比較を行った(図 17)。

図 17: 通常飼料で肥育した養殖ビワマスの中部背側の CT 値と Fish Analyzer 魚類モード値の比較
アジ、サバの魚類モードで測定した値と CT 値との間には低い負の相関(アジ:r=‑0.31,サバ:r=‑0.22)が見られ、ブリ、マグロ背側の魚類モードで測定した値と CT 値との間にはほとんど相関は見られなかった(ブリ:r=‑0.16,マグロ背側:r=0.05)(図 17)。
また、ビワマスの中部腹側の脂肪含有量に対しても Fish Analyzer に登録されているアジ、サバ、ブリ、マグロ腹側の魚類モードで測定した値と CT で測定した値との比較を行った(図 18)。サバの魚類モードで測定した値と CT 値との間には低い正の相関(サバ:r=0.25)が見られたが、アジ、ブリ、マグロ腹側の魚類モードで測定した値と CT 値との間にはほとんど相関は見られなかった(アジ:r=‑0.03,ブ
リ:r=0.13,マグロ腹側:r=0.08)(図 18)。

121

図 18: 通常飼料で肥育した養殖ビワマスの中部腹側の CT 値と Fish Analyzer 魚類モード値の比較
そこで、ビワマスの中部背側の脂肪含有量を Fish Analyzer に登録されていない魚類の脂肪含有量を測定する際に推奨されている検量線モードで測定した値と CT で測定した値との比較も行ったが、低い負の相関しか見られなかった(r=‑0.22)(図 19)。

図 19: 通常飼料で肥育した養殖ビワマスの中部背側の CT 値と Fish Analyzer 検量線モード値の比較
以上の結果より、ビワマスの脂肪含有量測定には少なくとも Fish Analyzer は適用できないと結論付
けた。
そこで CT を用い通常飼料を与えた養殖ビワマスと醤油油飼料を与えた養殖ビワマスの脂肪含有量の体
重、体長に対する経時的な変化の比較検討を行った。その結果、体重において頭部背側と腹側、中部背側と腹側両方で筋肉内脂肪の割合に大きな変化は見られなかった(図 20)。体長においても同様に頭部背側と腹側、中部背側と腹側両方で筋肉内脂肪の割合に大きな変化は見られなかった(図 21)。

122

図 20: CT による体重と筋肉内脂肪割合の比較

図 21: CT による体長と筋肉内脂肪割合の比較
そこで、内臓脂肪含有量に注目し、体重、体長に対する経時的な変化の比較検討を行った。すると、醤
油油飼料を与えた体重約 350 g、体長約 330 mm までの個体では頭部の腹側、中部の腹側共に通常飼料を与えたビワマスよりも内臓脂肪含有量が大きく上回る結果となった(図 22)。

123

図 22：CT による体重・体長と内臓脂肪割合の比較
さらに幼魚からの通常飼料を与えた養殖ビワマスの筋肉内脂肪を経時的に測定したグラフより、体長
約 370 mm、体重約 550 g を超えた辺りからハラス内に脂肪含有量が増加を始めることが観察できた。
（図23）。

図 23: 通常飼料給与のビワマスの中部背側の筋肉内脂肪含量
また、2 値化した画像を見てみると、皮下脂肪については測定を開始した幼魚である 120 g 前後から既に皮下に脂の層が見られ、かなり早い時期から皮下脂肪がまず入り出すことが分かった（図 24）。一方、

124内臓脂肪については、120 g の頃にはあまり存在しないがその直後から徐々に増加する傾向が観察できた。
さらに体重 250 g 前後の個体において筋肉と筋肉の間、つまり筋間に脂が入っているのが観察でき、この頃に筋間に脂が入り出すことが示唆された（図 24）。

図 24:ビワマスの脂肪分布の経時的比較
また、醤油油飼料を与えた体重約 350 g、体長約 330 mm までの個体ではコントロールであるニジマス用飼料を与えた個体に比べ内臓脂肪含有量が大きく上回るという結果から、体重約 350 g、体長約 330 mm

125

までの個体に PPARγアゴニストを含む醤油油飼料を給与してもハラス内に脂は入らず、内臓に脂肪が蓄積することが示唆された（図 24）。さらに成長し、体重約 550 g、体長約 370 mm を超えた辺りからハラス内に徐々に脂肪含有量が増加を始めることも観察できた（図 24）。
④考察
Fish Analyzer に登録されている魚類モードでビワマスの中部背側、腹側の脂肪含有測定を行ったが、CT 値との相関は負、あるいはほとんど確認できなかった(図 17,18)。Fish Analyzer を使用した際、測定位置や電極の向きが僅かに異なるだけで値が大きく変わるという印象だったことから、Fish Analyzer を用いた計測には正確に再現性良く電極を魚体に当てるといった熟練の技術が必要と思われる。また、Fish
Analyzer に登録されていない魚類を測定する際に推奨されている検量線モードで測定を行ったが CT 値との間には低い負の相関を示した(図 19)。脂肪率が高くなるとインピーダンス値も高くなることから、正の相関を期待したが逆の結果となった。従って、ビワマスの脂肪含有測定には少なくとも Fish Analyzer
は適用できないと結論付けることが出来る。
本研究では養殖ビワマスの効率の良い肥育管理を目指している。筋肉内脂肪の含有量は通常飼料、醤油油飼料を与えた個体の間で大きな変化が見られなかった(図 20、21)。このことからこの頃にはまず筋間に脂が入り出すことが示唆された。また、醤油油飼料を与えた体重約 350 g、体長約 330 mm までの個体では内臓脂肪含有量が大きく上回るという結果から(図 22)、体重約 350 g、体長約 330 mm までの個体に PPARγアゴニストを含む醤油油飼料を給与してもハラス内に脂は入らず、内臓に脂肪が蓄積することが示唆された。
また、2 値化した画像を見てみると、皮下脂肪については測定を開始した幼魚である 120 g 前後から既に皮下に脂の層が見られ、かなり早い時期から皮下脂肪がまず入り出すことが分かった（図 24）。一方、内臓脂肪については、120 g の頃にはあまり存在しないがその直後から徐々に増加する傾向が観察できた。
さらに体重 250 g 前後の個体において筋肉と筋肉の間、つまり筋間に脂が入っているのが観察でき、この頃に筋間に脂が入り出すことが示唆された（図 24）。また、醤油油飼料を与えた体重約 350 g、体長約330 mm までの個体ではコントロールであるニジマス用飼料を与えた個体に比べ内臓脂肪含有量が大きく上回るという結果から、体重約 350 g、体長約 330 mm までの個体に PPARγアゴニストを含む醤油油飼料を給与してもハラス内に脂は入らず、内臓に脂肪が蓄積することが示唆された（図 24）。さらに成長し、
体重約 550 g、体長約 370 mm を超えた辺りからハラス内に徐々に脂肪含有量が増加を始めることも観察できた（図 24）。この結果、ビワマスにおいては、皮下脂肪−内臓脂肪−筋間脂肪−筋肉内脂肪の順で脂肪が入り出し、ウシやブタで言われている内臓脂肪−筋間脂肪−皮下脂肪−筋肉内脂肪という順とは異なることが示唆された。

３．研究成果の副次的効果、今後の計画など
ビワマスと同様に筋肉内脂肪(霜降り)が価格、味に影響するウシでは、13 カ月齢から 19 カ月齢にかけて最長筋内の脂肪細胞数が増加することが分かっている。また、この筋肉内脂肪が増加する 15 カ月齢から
脂肪細胞分化が促進することが知られているビタミン A 欠乏飼料を給与すると脂肪交雑は向上するが、23 カ月以降にビタミン A 欠乏飼料を給与しても効果が認められないことが報告されており、適切な時期に適切な飼料を付与することによる効率的な飼育が可能となっている。今回の研究により、ビワマスは126

体長が 350 mm を超える頃からハラスの部分に脂肪が入り出す事が分かった。今後はさらに成長したビワ
マスのハラスの部分の脂肪含量を計測する事で、いつ頃まで脂肪が入り続けるのか調べる。その時期を特定することで、その期間にのみ醤油油添加飼料を与え、内臓脂肪量や皮下脂肪量を出来るだけ抑え、ハラスの部分にのみより脂の乗った養殖ビワマスの肥育を目指したい。
ビワマスの養殖の歴史は昭和 50 年代からが始まりで、養殖を行っている施設も非常に少ないため、まだビワマスの養殖という点では現時点でわかっていないことが多く、研究していかなければならないことが多く存在する。まだ全国的には知名度の低いビワマスだが、今後、よりビワマスが注目されていき、様々な機関、施設でビワマスの研究が盛んになっていくことを願いたい。

４．研究発表の状況＜雑誌論文＞*1) 4’,6-dimethoxyisoflavone-7-O-β-D-glucopyranoside (wistin) is a peroxisome proliferator-activated receptor
γ (PPARγ) agonist that stimulates adipocyte differentiation. M Sanada, R Hayashi, Y Imai, F Nakamura, T Inoue,
S Ohta and H Kawachi Animal Science Journal. 86, 1347 頁～1351 頁 2016 年 11 月 1 日 査読有*2) Effects of dietary soy sauce oil supplementation on growth performance and sensory characteristics of Biwa
salmon Oncorhynchus S Sugiura, Y Tonoyama, H Kawachi, M Tsukada, G Oka, Y Imai, M Sanada, Y Shimizu, T
Kawase, N Hori and N Shimizu. Aquaculture Science. 63, 291 頁～297 頁 2015 年 9 月 1 日査読有
3） Bmp4 expressed in preadipocytes is required for the onset of adipocyte differentiation. M Suenaga, N Kurosawa,
H Asano, Y Kanamori, T Umemoto, H Yoshida, M Murakami, H Kawachi, T Matsui and M Funaba Cytokine. 64, 138頁～145 頁 2013 年 8 月 1 日 査読有*4） ノダフジ(Wisteria floribunda)種子に含まれる抗糖尿病因子の探索 井上朋世・菊永竜太郎・山田敬博・太田伸
二・河内浩行 微量栄養素研究. 29, 36 頁～40 頁 2012 年 12 月 1 日 査読有＜図書＞
1） バイオテクノロジー入門 建帛社 1-157 頁 2016 年2） ペット栄養管理学テキストブック アドスリー 44 頁～55 頁 2013 年＜学会発表＞*1) 17th AAAP Animal Science Congress

Y Imai, Y Yamada, M Sanada, F Nakamura, T Hayashi, S Ohta, H Kawachi

Fractionation and identification of 5-nonadecylresorcinol as an agonist of PPARγ in soy sauce oil 九州大学
2016 年 8 月 23 日
*2) アクアゲノム研究会 殿山泰弘、今井良政、塚田匡輝 真田的貴、岡郷平、河内浩行、 杉浦省三、堀伸明、清水淑子、清水信義 メダカを用いた脂肪細胞分化に影響を与える物質の評価系の開発 東京海洋大学 2015 年 5月 30 日*3） 第 16 回日本ペット栄養学会大会日本獣医生命科学大学 眞田的貴、鈴木美里、河内浩行 ノダフジ(Wisteria
floribunda)種子に含まれる Wistin の抗肥満作用 2014 年 7 月 19 日
*4） 第１４回日本ペット栄養学会大会 ヤマザキ学園大学 山田敬博、井上朋世、太田伸二、河内浩行 醤油粕中に含まれる PPARγ活性化因子の探索 2012 年 7 月 22 日

1275） 第２９回日本微量栄養素学会学術集会 京都リサーチパーク 菊永竜太郎、井上朋世、山田敬博、太田伸二、
河内浩行 ノダフジ（Wisteria floribunda）種子に含まれる抗糖尿病活性物質 2012 年 6 月 2 日＜その他の研究成果等＞*1) 淡海の宝石ビワマス 市民広報誌「ながはま」8 月号 長浜 2014 年*2) ビワマス特集 インターネット放送局 STUDIO こほく 長浜 2014 年

128