新規キノン分析
○微生物量
○多様性

キノンプロファイル法

Quinones
Q-8
Q-9

○活性汚泥
○土壌
微生物の群集構造○堆肥○廃水微生物

抽出

溶媒抽出

キノン種

Q-10

MK-6
MK-7
MK-8
PQ-9, VK1

分離

SFE with CO2

応用範囲拡大●分析会社の設立

Bacteria species
Burkholderia, Comamonas, Acinetobacter,
Azotobacter, Alcaligenes,
Pseudomonas, Hyphomicrobium,
Acinetobacter
Acidiphilium, Rhodobacter
Cytophaga
Flavobacterium, Bacillus,
Staphylococcus
Aeromonas, Proteus, Lactobacillus,
Micrococus
Cyanobacteria, Synecococus

キノン定性・定量○迅速・操作が容易○有機溶媒不要○SFC分離の可能性○MS利用の可能性

New quinone analysis○Amount ofmicroorganisms○Diversity

Quinone profile method

Quinones
Q-8
Q-9○Activated sludge
Q-10
○Soil
MK-6
○Compost
Structure of microbial community MK-7
○Waste waterMK-8
Microorganisms

PQ-9, VK1

Burkholderia, Comamonas, Acinetobacter,
Azotobacter, Alcaligenes,
Pseudomonas, Hyphomicrobium,
Acinetobacter
Acidiphilium, Rhodobacter
Cytophaga
Flavobacterium, Bacillus,
Staphylococcus
Aeromonas, Proteus, Lactobacillus,
Micrococus
Cyanobacteria, Synecococus

Separation

Extraction

Solvent extraction

Bacteria species

Quinone type

Quinone qualification,
determination

SFE with CO2○Quick and easy to operate○Organic solvent isunnecessary○Possibility of SFC separation○Possibility of MS utilization

Expansion ofapplication range●Foundation of company on analysis

SFE-HPLC装置の直接結合による Lab. Meeting 7月17日 M2 阪本崇
微量試料キノンプロファイル法の開発
Quinone profiling ……微生物の群集構造を解析する手法
菌体 Quinone
ユビキノン

排水処理場 活性汚泥

キノン種類・割合の変化

O
CH3O

農場

キノン含有量→微生物量

抽出

土壌CH3

CH3O

HnO

解析

→微生物群集の変化

メナキノン

発酵汚泥 微生物群集

O
CH3

メタン発酵槽H
O

一般的特徴

n 分離・培養が不要である
 微生物の量・種類の変化を定量的に把握できる

当研究室における既存研究
SFE (Supercritical Fluid Extraction)の導入

クロロホルム未使用

解析前処理の省略・簡便化

分析の迅速化

有機溶媒量低減

誤操作によるリスク削減

Lab. Meeting

Development of online SFE-HPLC for quinone

July/17 M2 阪本崇

profile method using small volume of sample

Quinone profiling ……microorganism community analysis method
Quinonewaste water Active sludge
treatment
plantsoil
farm

Quinone content→Slight biomass

Ubiquinone
OCH3O

Extraction CH O

CH3Hn3O

Change of a quinone kind, the ratio→Change of the microbe crowd
Analysis

Menaquinone
OFermentation
Methanesludge

microorganism
communityfermenter

CH3HOn Isolation, culture is unnecessary
general features
 Can understand the change of quantity, the kindof the microbe quantitatively
Current study in our laboratory
Application of SFE (Supercritical Fluid Extraction)
Simplication of the analysis pretreatment

Not use chloroform
Risk reduction by the erroneous operation
Acceleration of the analysis

Organic solvent reduction

キノンの化学構造式
キノン：微生物の呼吸鎖における電子伝達物質
OO
CH3 O

CH 3(CH3 OO)Hn

CH3ユビキノン(UQ-n(Hx))

O
CH3CH3OCH3)H(CH3 n

メナキノン(MK-n(Hx))O
CH3()HnO
H
C 3プラストキノン(PQ-n)(OCH3CH3ビタミン(V) K1)HnChemical structural formula of quinone
Quinone：Electron transport material in the respiratory chain of the microbe

OOCH3 O

CH 3(CH3 OO)Hn

CH3Ubiquinone(UQ-n(Hx))

O
CH3CH3OCH3)H(CH3 nMenaquinone(MK-n(Hx))O
CH3()HnO
H
C 3Plastoquinone(PQ-n)(OCH3CH3Bitamin(V) K1)Hn

新規キノンプロファイル法の特徴
菌体キノン抽出（有機溶媒抽出)

従来法

夾雑物除去

粗分画・試料調整

現段階
菌体キノン抽出（ＳＦＥ)

最終段階

分離・分析
（HPLC)

約6時間

約3時間

微生物相変化のモニタリングには不適

キノン種分離・分析（ＵＰＬＣ)

ＳＦＥ－ＵＰＬＣ/ＭＳ

約1.5時間

1サンプルに要する時間☆短時間の微生物相変化を簡便にモニタリング可能☆適応範囲が広がり様々な生物系環境技術の評価に利用可能☆高分離能・高感度、脱クロロホルムの使用☆自動化が容易Characteristic of the new quinone profile methodBefore

Cell quinone extraction
Impurity removing（Organic solvent extraction) apparatus

Currentstates

3 hours
Cell quinone extraction（ＳＦＥ)

FutureFault compart mentation, Separation, Analysis
Sample adjustment（HPLC)

6 hours

Unsuitable for monitoring ofthe microbe phase conversion

Quinone separation, analysis（ＵＰＬＣ)

ＳＦＥ－ＵＰＬＣ/ＭＳ

1.5 hours
Time required for 1 sample☆Can monitor microbe phase conversion easily☆An adaptation range spreads out and is available for an evaluation ofvarious biological system environmental technology☆High separation ability, high sensitivity, no chloroform☆Automation is easy

キノンプロファイル法による微生物相変化の応用○汚染物質による土壌生態系への影響評価○汚染物質による水系生態系への影響解析○微生物同定作業の迅速化○生物学的水処理技術の制御○土壌微生物診断

キノンプロファイル法
微生物の多様性と量の解析○汚染土壌修復の最適化○水質モニタリングと評価○化学物質の毒性試験への応用
これまで技術者の経験に頼ることが多かった現場での微生物相変化に対し、客観的な情報を提供する。

Application of microbe phase transition by quinone profile method○Assessing impact on soil ecosystem by contaminant.
○Analyzing impact on water ecosystem by contaminant.
○Rapid identification of microbe○Controlling biological water treatment technique○Assessment of soil microbe

Quinone profile method
Analyzing diversity and quantity of microbe○Optimizing soil pollutions for restoration○Water quality monitoring and the assessment.

○Applying chemical material toxicity test.

This method provides an objective information about microbe phase transition
which has depended on engineer's experiences on the spot until now.

まとめ
高温高圧の水（120～450℃、1.5～350atm）
Tc=374℃、Pc=220atm

超臨界流体二酸化炭素（30～250℃、80～350atm ）Tc=31℃、Pc=73atm●有機物～無機物、●廃棄物処理～ものづくり●応用～基礎、●知的財産、●技術の評価
メリット・デメリット・応用範囲＞＞＞焼却炉設置の敬遠、最終処分地問題＞＞＞環境規制の強化と将来への不安＞＞＞新産業の創出、原油価格高騰、炭酸ガス排出量低減
過去の研究をしっかりと調査をした後なら、まだまだチャンスあり。
ただし、研究の位置づけをしっかりと！

Conclusion
Water on high temperature and pressure（120～450℃,1.5～350atm）
Tc=374℃,Pc=220atm

Supercritical fluid carbon dioxide（30～250℃,80～350atm ）Tc=31℃,Pc=73atm●Organic to Inorganic ●Waste treatment to manufacturing●Application to basic ●Intellectual properties ●Assessment of technology
Advantage・Disadvantage・Application range＞Concern about incinerator foundation, problems of final disposal places＞Strengthening environmental regulation and worry for the future.
＞New industry creation, increase of crude oil price, decrease in CO2 gas discharge

If you have studied the past studies firmly, you would know thatyou still have the chance.
Just make sure that you know where you stand.

ジャガイモからのデキストリンの回収
本研究
高温高圧水反応
未出荷ジャガイモ58万トン/年

従来法
精製
澱粉用ジャガイモ

難消化性デキストリン
水溶性食物繊維
特定保健用食品
生理機能・整腸効果
・血糖調節効果

熱加水分解
澱粉塩酸添加処理時間：9時間・単価400円/kg
・市場規模20億円

目的ジャガイモから、短時間、無触媒で難消化性デキストリンを生成○蒸煮爆砕装置を用いた難消化性デキストリンの製造方法

Collecting dextrin from potato
In this studyHigh-temperature highpressure water reaction

Non-shipment potato 580,000 tons/year
Conventional method

Water soluble dietary fiber
Food for specified health uses
Physiological function
・Intestinal regulation effect・Blood suger regulatory effectThermalhydrolysis

Refining

Potato for starches

Indigestible dextrin

StarchAddition of hydrochloric acid
Processing time：9hours

・Unit price 400yen/kg
・Market scale 2 billion yen

Objective
The Indigestible dextrin is produced without catalyst under short time by potato.
○Production method for dextrin hard to digest, using steam blasting apparatus.

難消化性デキストリン
n=10000~

澱粉OHCH2O

O

100~

n

分解

デキストリン
直鎖構造

重合
分子内脱水

分岐構造

易消化性

分解

難消化性

分解
2~（重合度）糖類

マルトース、グルコース

体内酵素によって消化されない

市販品は、難消化部を多く含む混合物（難消化性デキストリン）

Indigestible dextrin
n=10000~

StarchOH
CH2O

O

100~

n

Resolve

DextrinLinear structure

Polymerization

Divergence structure

Dehydration in molecules

Easy to digest

Resolve
Resolve2~（Polymerization）

Saccharide
Maltose, glucose

Difficult to digest

Undigested byan internal enzyme

The marketing products contain rich-indigestible mixture (Indigestive dextrin)

反応装置・実験手順
ジャガイモ
浸透②膨張

衝突

③①① 加熱炉② 反応容器③ ボールバルブ
④ 受器

④ 反応物

蒸煮爆砕反応（蒸煮）高温高圧水による熱加水分解（爆砕）
急激な減圧による破砕効果

固液分離（遠心分離、ろ過）
液相 デキストリン定量：HPLC
全有機炭素定量：TOC計

固相 粒径分布測定

Reaction Device and Experiment Procedure
Steaming and Blasting Reaction

Potato(Steaming)

Soak
②

Swell

Heat hydrolysis by hightemperature-high pressure① ① Heating furnace② Reaction containerwater③ Ball valve④ Receiver③(Blasting)Crush effect by sudden
decompression④ Reaction productCollideSolid-liquid separation (centrifugal separation, filtration)
Liquid phase Dextrin determinate：HPLCTotal organic carbon
determinate：TOC meter

Solid phase Measure grain size distribution

コラーゲンの反応に伴う炭素・窒素収支
260℃、4.7MPa
窒素収支

炭素収支

200100010

タンパク質(ペプチド）不明分 (アミン類等)
アンモニア1603000

遊離アミノ酸不明分 (アミン類等)
有機酸

窒素濃度 [mg-N/g-dry]

炭素濃度 [mg-C/g-dry]

遊離アミノ酸タンパク質(ペプチド)
4003060

12080400

反応時間 [min]0103060

Carbon and nitrogen balance by reaction of collagen
260℃、4.7MPa
Nitrogen balance

Carbon balanceProtein(Peptide)

Unknown(Amines, etc.)
Organic acid

40030020010000103060

Free amino acids

Nitrogen concentration[mg-N/g-dry]

Carbon concentration[mg-C/g-dry]

Free amino acids

Protein(Peptide)

Unknown(Amines, etc.)
Ammonia

16012080400Reaction time[min]0103060

自動車排ガス処理触媒からの貴金属回収
自動車触媒の増加

使用済み触媒Pt : 300-1000 mg/g
Pd: 200-800 mg/g
Rh: 50-100 mg/g

長年の課題
埋め立て
違法投棄など低リサイクル率(16% in USA)SFC with CO2
各金属を分離・回収

錯化剤 : Tributyl Phosphate

SFE with CO2（酸化剤、錯化剤の添加）

金属を抽出・
残渣有効利用○ 二次汚染なし○低環境負荷○低コスト○特殊設備不要○高い回収効率

年間100億円以上の市場
豊橋市は「自動車特区」

CH3(CH2)2CH2

O

CH3(CH2)2CH2

O

CH3(CH2)2CH2O

P

既存の技術:電解法、溶融法、浸漬法、溶解沈殿法など
課題:
高コスト、廃液処理、低回収率

O

Noble metals recovery from exhaust gas catalyst of automobile
Increase ofautomobile catalyst

Used catalyst

Pt : 300-1000 mg/g
Pd: 200-800 mg/g
Rh: 50-100 mg/g Longtime problem

Landfill
Illegal dumping, etc.

Low recycling rate
(16% in USA)SFC with CO2
Separation andrecovery of each metal○No secondry
pollution○Low environmental
impact○Low cost○No special facilities○High recovery rate

Complexing agent

SFE with CO2: Tributyl Phosphate（Addition of oxidizing agent
and complexing agent）

Extraction of metal ・residue utilization

Market of 10 billion yen
per year
Toyohashi city is“Specific district of automobile”

CH3(CH2)2CH2

O

CH3(CH2)2CH2

O

CH3(CH2)2CH2OPO

Existing technology:
Electrolysis、Fusion、Dipping、Dissolution-Precipitation
Problem:High cost、Liquid waste treatment、
Low recovery rate

次世代型微生物指標解析
○微生物量
○多様性

キノンプロファイル法○活性汚泥法制御○土壌改良
微生物の群集構造○堆肥評価○メタン発酵制御など

Quinones
Q-8
Q-9

Q-10

MK-6
MK-7
MK-8
PQ-9, VK1

抽出

キノン種

分離

Bacteria species
Burkholderia, Comamonas, Acinetobacter,
Azotobacter, Alcaligenes,
Pseudomonas, Hyphomicrobium,
Acinetobacter
Acidiphilium, Rhodobacter
Cytophaga
Flavobacterium, Bacillus,
Staphylococcus
Aeromonas, Proteus, Lactobacillus,
Micrococus
Cyanobacteria, Synecococus

キノン定性・定量

微生物
溶媒抽出

SFE with CO2

応用範囲拡大●分析会社の設立○迅速・自動化が容易○分析感度の向上○SFC分取の可能性○有機溶媒使用量低減

Next generation type microbial index analysis○Amount of
microorganisms○Diversity

Quinone profile method

Quinones
Q-8○Control for active
sludge method○Soil improvement
Structure of○Compost evaluation microbial community○Methane fermentation contorol
Microorganisms

Q-10

MK-6
MK-7
MK-8PQ-9, VK1

Burkholderia, Comamonas, Acinetobacter,
Azotobacter, Alcaligenes,
Pseudomonas, Hyphomicrobium,
Acinetobacter
Acidiphilium, Rhodobacter
Cytophaga
Flavobacterium, Bacillus,
Staphylococcus
Aeromonas, Proteus, Lactobacillus,
Micrococus
Cyanobacteria, Synecococus

Separation

Extraction

Solvent extraction

Q-9

Bacteria species

Quinone type

Quinone qualification,
determination

SFE with CO2○Quick and easy to operate○Organic solvent isunnecessary○Possibility of SFC separation○Possibility of MS utilization

Expansion ofapplication range●Foundation of company on analysis

キノンの化学構造式キノン：微生物の呼吸鎖における電子伝達物質
O

O
CH3 O

CH 3(CH3 OO)Hn

CH3ユビキノン(UQ-n(Hx))

O
CH3CH3OCH3)H(CH3 n

メナキノン(MK-n(Hx))

OCH3()HnO
H
C 3プラストキノン(PQ-n)(OCH3CH3

ビタミン(V) K1)Hn

キノン含有量(μmol/kg-MLSS)

SFE法を用いたキノン分析
800
700
600
500
400
300
200
100
0

MK-9(H10)
MK-9(H8)
MK-9(H6)
MK-8(H6)
MK-7(H6)
MK-6(H6)
MK-10(H4)MK-9(H4)
MK-8(H4)
MK-7(H4)
MK-11(H2)
MK-10(H2)MK-9(H2)
MK-8(H2)

MK-7(H2)
MK-6(H2)
MK-12
MK-11
MK-10
MK-9
MK-8
MK-7
MK-6
UQ-10(H2)
UQ-11
UQ-10
UQ-9
UQ-8
UQ-7

本学

好気
嫌気
中島処理場

好気嫌気
アイシンAW

好気
嫌気
平松食品

7.17

2.07

3.05

10.04

MLSS（g/L)

1.89

2.71

17.87

本学
中島処理場
平松食品

アイシンAW

好気
嫌気
好気
嫌気
好気
嫌気

群間平均法

非類似度(-)
0.1

0.2

0.3

0.4

(μmol/kg-MLSS)

Total amount of quinone

SFE for Quinone Analysis
800
700
600
500
400
300
200
100
0

MK-9(H10)
MK-9(H8)
MK-9(H6)
MK-8(H6)
MK-7(H6)
MK-6(H6)
MK-10(H4)MK-9(H4)
MK-8(H4)
MK-7(H4)
MK-11(H2)
MK-10(H2)MK-9(H2)
MK-8(H2)

Aerobic Anaerobic Aerobic Anaerobic Aerobic Anaerobic
Hiramatsu Food
Nakashima Treating Site
Aisin AW

TUT
MLSS（g/L)

MK-7(H2)
MK-6(H2)
MK-12
MK-11
MK-10
MK-9
MK-8
MK-7
MK-6
UQ-10(H2)
UQ-11
UQ-10
UQ-9
UQ-8
UQ-7

7.17

2.07

1.89

3.05

2.71

10.04

17.87

TUT
Nakashima Treating Site
Hiramatsu Food

Aisin AW

Aerobic
Anerobic
Aerobic
Anerobic
Aerobic
Anerobic

Group averagemethodeDissimilarity (-)
0.1

0.2

0.3

0.4